i Properties and Changes during Fermentation of Salted Shrimp Paste as Affected by Quality of Raw Material and Selected Halophilic Bacteria Jaksuma Pongsetkul A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Food Science and Technology Prince of Songkla University 2018 Copyright of Prince of Songkla University ii Thesis Title Properties and changes during fermentation of salted shrimp paste as affected by quality of raw material and selected halophilic bacteria Author Miss Jaksuma Pongsetkul Major Program Food Science and Technology Major Advisor Examining Committee: …………………….……….................. ….……………………...…......Chairperson (Prof. Dr. Soottawat Benjakul) (Asst. Prof. Dr. Saowakon Wattanachant) ……………………….…...…....Committee Co-advisor: (Prof. Dr. Soottawat Benjakul) …………………….……….................. ……………………….…….......Committee (Asst. Prof. Dr. Punnanee Sumpavapol) (Asst. Prof. Dr. Punnanee Sumpavapol) …………………….……….................. ……………………….………...Committee (Assoc. Prof. Dr. Kazufimi Osako) (Asst. Prof. Dr. Kitiya Vongkamjan) ……………………….…….......Committee (Assoc. Prof. Dr. Sappasith Klomklao) The Graduate School, Prince of Songkla University, has approved this thesis as partial fulfillment of the requirements for the Doctor of Philosophy Degree in Food Science and Technology. ……………..…………………….……...... (Prof. Dr. Damrongsak Faroongsarng) Dean of Graduate School iii This is to certify that the work here submitted is the result of the candidate’s own investigations. Due acknowledgement has been made of any assistance received. …………………………….…….Signature (Prof. Dr. Soottawat Benjakul) Major Advisor …………………………….…….Signature (Miss Jaksuma Pongsetkul) Candidate iv I hereby certify that this work has not been accepted in substance for any degree, and is not being currently submitted in candidature for any degree. …………………….…………….Signature (Miss Jaksuma Pongsetkul) Candidate v ชื่อวิทยานิพนธ์ ผลของคุณภาพของวตั ถุดิบและแบคทีเรียชอบเค็มที่คดั เลือกไดต้ ่อสมบตั ิ และการเปลี่ยนแปลงระหวา่ งหมกั กะปิ ผู้เขียน นางสาวจักรสุมา พงศ์เศรษฐ์กุล สาขาวิชา วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีอาหาร ปีการศึกษา 2560 บทคัดย่อ จากการตรวจวิเคราะห์ตวั อยา่ งกะปิทางการคา้ ทว่ั ประเทศไทย จา นวน 11 ตวั อยา่ ง พบวา่ กะปิมีองคป์ ระกอบทางเคมีแตกต่างกนั โดยมีโปรตีนเป็นองค์ประกอบหลัก (ร้อยละ 29.44- 53.27 คิดบนฐานน้า หนักแห้ง) ปริมาณเกลือและค่าวอเตอร์แอคติวิต้ีของกะปิ อยู่ในช่วงร้อยละ 22.77-35.47 และ 0.695-0.774 ตามล าดับ ปริมาณฟอร์มอลไนโตรเจน (11.96-22.87 มิลลิกรัม ไนโตรเจน/กรัมตวั อยา่ ง) และระดับการไฮโดรไลซิส (ร้อยละ 12.68-20.76) ที่แตกต่างกนั แสดงให้ เห็นถึงการยอ่ ยสลายของสายเปปไทด์ที่แตกต่างกนั ของตวั อยา่ ง กะปิมีสีและปริมาณแคโรทีนอยด์ ท้งั หมด (0.54-1.97 มิลลิกรัม/กรัมตวั อย่าง) แตกต่างกนั รวมท้งั มีองค์ประกอบกรดอะมิโนและ สารระเหยได้แตกต่างกัน โดยมีกรดอะมิโนกลูตามิก/กลูตามีนและอนุพันธ์ไพราซีนเป็น องค์ประกอบหลกั ที่พบในทุกตวั อย่าง นอกจากน้ีกะปิ ทุกตวั อยา่ งมีกิจกรรมการตา้ นออกซิเดชัน ดงั น้นั กะปิจึงจดั เป็นเครื่องปรุงที่อุดมไปดว้ ยโปรตีนและคุณคา่ ทางโภชนาการ เมื่อศึกษาเปรียบเทียบกุง้ เคย 2 สายพันธุ์คือ Acetes vulgaris และ Macrobrachium lanchesteri เพื่อนา มาใชเ้ ป็นวตั ถุดิบทางเลือกส าหรับผลิตกะปิ พบวา่ กุง้ ท้งั 2 สายพันธุ์ประกอบด้วย เอนไซม์กลุ่มซีรินโปรติเอสเป็นหลักและถูกยบั ย้งั ด้วย PMSF และ SBTI เอนไซม์โปรตีเอสของ กุง้ A. vulgaris และ M. lanchesteri มีกิจกรรมสูงสุดที่พีเอช 7 อุณหภูมิ 60°ซ และพีเอช 8 อุณหภูมิ 60°ซ ตามลา ดบั เอนไซมโ์ ปรตีเอสจากกุง้ ท้งั 2 สายพนั ธุ์มีกิจกรรมลดลงเมื่อความเขม้ ขน้ ของเกลือ เพ่ิมสูงข้ึน (ร้อยละ 0-30) กิจกรรมของเอนไซมโ์ ปรตีเอส ทริปซิน และไคโมทริปซินสามารถตรวจ พบตลอดกระบวนการผลิตกะปิ กิจกรรมเหล่าน้ีลดลงในข้นั ตอนการหมกั เกลือ แตเ่ พ่ิมสูงข้ึนเรื่อย ๆ เมื่อระยะเวลาการหมกั เพ่ิมสูงข้ึน การเปลี่ยนแปลงดงั กล่าวสอดคลอ้ งกบั การเพ่ิมข้ึนของปริมาณเปป ไทด์ที่ละลายในกรดไตรคลอโรแอซิติกและการจางหายของแถบโปรตีนไมโอซินและแอคติน เอนไซมโ์ ปรตีเอสเหล่าน้ีมีส่วนเกี่ยวขอ้ งกบั การยอ่ ยสลายโปรตีนของกุง้ ระหวา่ งการผลิตกะปิ ระยะเวลาการเกบ็ รักษาหลงั การตายของกุง้ ก่อนนา กุง้ มาหมกั เกลือมีผลต่อคุณภาพ กะปิ กุง้ ท้งั 2 สายพนั ธุ์เกิดการเสื่อมเสียเมื่อวางทิ้งไวท้ ี่อุณหภูมิห้อง (28-30°ซ) บ่งช้ีได้จากการ เพ่ิมข้ึนของค่าพีเอช ปริมาณด่างระเหยได้ท้งั หมด ปริมาณไตรเมทิลเอมีน ปริมาณ TBARS และ vi ปริมาณจุลินทรียท์ ้งั หมด กะปิมีสีคล้า มากข้ึน รวมท้งั มีปริมาณสารระเหยไดแ้ ละกิจกรรมการตา้ น ออกซิเดชนั เพ่ิมสูงข้ึนเมื่อกุง้ ที่ใชเ้ ป็นวตั ถุดิบมีระยะเวลาการเก็บรักษาหลงั การตายสูงข้ึน อยา่ งไรก็ ตาม คะแนนดา้ นกล่ินและความชอบรวมของกะปิลดลงเมื่อใชก้ ุง้ ไม่สดเป็นวตั ถุดิบ (เมื่อระยะเวลา การเก็บรักษาหลังการตายของกุ้ง A. vulgaris และ M. lanchesteri มากกว่า 6 และ 12 ช่ัวโมง ตามลาดับ) จากการเปรียบเทียบคุณภาพของกะปิ ที่ผลิตจากกุ้ง A. vulgaris (KA) และ M. lanchesteri (KM) พบว่ากะปิ ท้งั สองตวั อย่างมีองค์ประกอบทางเคมี กายภาพและคุณสมบัติทาง ประสาทสัมผสั แตกต่างกนั กะปิ KM มีปริมาณโปรตีนสูงกวา่ ในขณะที่มีปริมาณไขมนั ต่า กวา่ เมื่อ เปรียบเทียบกบั กะปิ KA อย่างไรก็ตาม กะปิ KA มีระดับการย่อยสลาย ปริมาณเพอร์ออกไซด์ ปริมาณ TBARS และการเกิดสีน้า ตาลสูงกว่ากะปิ KM ซ่ึงบ่งช้ีถึงการย่อยสลายโปรตีน การเกิด ปฎิกิริยาเมลลาร์ดและการเกิดออกซิเดชันของไขมนั ที่สูงกว่าของตวั อย่างกะปิ KA นอกจากน้ี กิจกรรมการตา้ นออกซิเดชนั ในตวั อยา่ งดงั กล่าวมีคา่ สูงกวา่ เช่นกนั ดงั น้นั กุง้ A. vulgaris มีศักยภาพ ในการใชเ้ ป็นวตั ถุดิบทางเลือกสา หรับการผลิตกะปิสูงกวา่ เมื่อเปรียบเทียบกบั กุง้ M. lanchesteri จากการศึกษาการเปลี่ยนแปลงทางเคมีและจุลินทรียข์ องกุง้ A. vulgaris ระหว่าง การผลิตกะปิ ประกอบดว้ ยข้นั ตอนการหมกั เกลือ การตากแดด และการหมกั พบวา่ พีเอชของกุง้ สด มีค่าลดลงจนถึงวนั ที่ 10 ของการหมกั และเพ่ิมสูงข้ึนอยา่ งต่อเนื่องเมื่อระยะเวลาการหมกั เพ่ิมข้ึน สีของกะปิ เปลี่ยนเป็นสีน้า ตาลหรือคล้า มากข้ึนเมื่อระยะเวลาการหมกั เพ่ิมข้ึน การเปลี่ยนแปลง องค์ประกอบอื่น ๆ เกิดข้ึนตลอดกระบวนการผลิตกะปิ ซ่ึงส่วนใหญ่เกิดในข้นั ตอนการหมักเป็น หลัก ประกอบด้วย การย่อยสลายโปรตีนและสารประกอบอะดีโนซีนไตรฟอสเฟต การเกิด ออกซิเดชันของไขมนั และการผลิตสารระเหยได้ การเปลี่ยนแปลงดงั กล่าวมีผลต่อคุณลกั ษณะ สุดทา้ ยของกะปิ โดยเฉพาะดา้ นรสชาติและกล่ินรส กุง้ A. vulgaris มีปริมาณน้า มนั ร้อยละ 4.21 คิดบนฐานน้า หนกั แหง้ น้า มนั ดงั กล่าว ส่วนใหญ่ประกอบด้วยไตรเอซิลกลีเซอรอล (ร้อยละ 28.03) และสเตอรอล (ร้อยละ 24.03) องคป์ ระกอบดงั กล่าวมีปริมาณลดลงตลอดกระบวนการผลิตกะปิ ในขณะที่ปริมาณกรดไขมนั อิสระ เพ่ิมสู งข้ึ นแล ะ ก ล าย เป็ นองค์ป ระ ก อบ หลัก ใ น ผลิ ต ภัณฑ์ก ะ ปิ (ร้ อย ล ะ 49.29) ไตรเอซิลกลีเซอร์รอลและกรดไขมนั อิสระประกอบดว้ ยกรดไขมนั ชนิดอ่ิมตวั และกรดไขมันชนิด ไม่อ่ิมตวั ที่มีพนั ธะคู่ 1 พันธะเป็นกรดไขมันหลัก กรดไขมนั ชนิดไม่อ่ิมตวั ที่มีพนั ธะคู่หลายพนั ธะ โดยเฉพาะกรดอีโคซะเพนตะอีโนอิก (C20:5(n-3)) และกรดโดโคซะเฮกซะอีโนอิก (C22:6(n-3)) พบมากในฟอสฟาติดิลเอตทาโนลามีนและฟอสฟาติดิลโคลีน การย่อยสลายไขมนั และการเกิด ออกซิเดชนั ของไขมนั เกิดข้ึนตลอดกระบวนการผลิตกะปิ บ่งช้ีไดจ้ ากการเพ่ิมสูงข้ึนของปริมาณ vii เพอร์ออกไซด์ ปริมาณ TBARS และปริมาณกรดไขมนั อิสระ การเปลี่ยนแปลงดงั กล่าวมีผลต่อ คุณลักษณะของกะปิ โดยเฉพาะด้านกล่ินรส จากการศึกษาคุณลักษณะเช้ือ Bacillus spp. K-C3 ที่คัดแยกจากกะปิทางการค้า พบวา่ การเจริญเติบโตและการผลิตเอนไซมท์ ี่หลง่ั ออกมานอกเซลลป์ ระกอบดว้ ยเอนไซมโ์ ปรตีเอส ไลเปส และไคติเนสเกิดข้ึนสูงสุดที่พีเอช 6-8 อุณหภูมิ 25-35°ซ ในสภาวะที่มีเกลือร้อยละ 10 เมื่อศึกษาเปรียบเทียบคุณลักษณะของกะปิที่เติม Bacillus spp. K-C3 ที่ระดับ 102-106 CFU/กรัม ตวั อยา่ ง (คิดบนฐานน้า หนกั แห้ง) กบั กะปิชุดควบคุม (ไม่มีการเติมหัวเช้ือ) จากการตรวจติดตาม ด้วยเทคนิคพีซีอาร์-ดีจีจีอี พบว่าเช้ือ Bacillus spp. K-C3 สามารถตรวจพบได้ทุกข้นั ตอนตลอด กระบวนการผลิตกะปิ กะปิที่มีการเติมหวั เช้ือมีกิจกรรมการยอ่ ยสลายโปรตีน ไขมนั และไคตินสูง กวา่ สอดคลอ้ งกบั ปริมาณเปปไทด์ที่ละลายในกรดไตรคลอโรแอซิติก ระดบั การไฮโดรไลซิส และ ปริมาณกรดไขมนั อิสระที่สูงกวา่ เมื่อเทียบกบั กะปิ ชุดควบคุม อตั ราการหมกั ที่สูงกว่าในตวั อย่าง กะปิ ที่มีการเติมหัวเช้ือส่งผลโดยตรงต่อคุณลกั ษณะของกะปิ ซ่ึงประกอบด้วยการเกิดสีน้ าตาล การเกิดออกซิเดชันของไขมนั กิจกรรมการตา้ นออกซิเดชัน และการสร้างสารระเหยได้ ดงั น้ัน การเติมเช้ือ Bacillus spp. K-C3 ลงในกุง้ A. vulgaris ระหวา่ งการผลิตกะปิมีผลทา ให้ระยะเวลาการ หมักลดลงและสามารถปรับปรุงคุณภาพกะปิ viii Thesis Title Properties and changes during fermentation of Kapi, salted shrimp paste, as affected by quality of raw material and selected halophilic bacteria Author Miss Jaksuma Pongsetkul Major Program Food Science and Technology Academic Year 2017 ABSTRACT Eleven commercial Kapi, obtained from various places of Thailand, were characterized. The samples had varying compositions, but protein constituted as the major component (29.44-53.27%, dry weight basis). Salt content and Aw of all samples were in the range of 22.77-35.47% and 0.695-0.774, respectively. Various formal nitrogen contents (11.96-22.87 mg N/g sample) and degree of hydrolysis (DH) (12.68-20.76%) suggested the varying cleavage of peptides among the samples. The samples had different colors with different total carotenoid contents (0.54-1.97 mg/g sample). Amino acid composition and volatile compounds were also varied. Glu/Gln and pyrazine derivatives were dominant in all samples. Moreover, all samples also possesses antioxidative activities. Thus, Kapi could be a good source of protein and served as the nutritious condiment. When small shrimp Acetes vulgaris and Macrobrachium lanchesteri, used as alternative sources for Kapi production, were characterized, both shrimp mainly contained serine proteases, which were strongly inhibited by PMSF and SBTI. Maximal proteolytic activity of A. vulgaris and M. lanchesteri was found at pH 7, 60°C and pH 8, 60°C, respectively. Activity of both proteases decreased with increasing NaCl concentration (0-30%). During Kapi production, protease, trypsin and chymotrypsin activities were detectable throughout all processes. Activities were decreased when salting was implemented but continuously