UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ LUIZ CARLOS KLEIN JÚNIOR CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE Polygala Cyparissias Sain

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

LUIZ CARLOS KLEIN JÚNIOR

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE): ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO

Itajaí – 2011

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS

LUIZ CARLOS KLEIN JÚNIOR

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE): ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO

Dissertação submetida ao Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade

Itajaí, Fevereiro de 2011 3

K672c Klein Júnior, Luiz Carlos, 1985- Contribuição ao estudo farmacognóstico de Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE) [manuscrito] : aspectos químicos e avaliação de seu potencial gastroprotetor e anti-hipernociceptivo / Luiz Carlos Klein Júnior. – 2011. 152 f. : il. ; 30 cm

Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró- reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2011. “Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho”. Bibliografia: f. 130-144.

1. Produtos naturais. 2. Plantas medicinais. 3. Farmacognosia. 4. Química vegetal. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.

CDU: 615.32 4

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE): ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO Luiz Carlos Klein Júnior

Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.

______Valdir Cechinel Filho, Doutor Orientador

______Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora Coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______Valdir Cechinel Filho, Doutor (UNIVALI) Presidente

______Sérgio Faloni de Andrade, Doutor (UNIVALI) Co-orientador

______Nara Lins Meira Quintão, Doutora (UNIVALI) Membro interno

______Vanderlan da Silva Bolzani, Doutora (UNESP) Membro externo 5

Itajaí, 24 de fevereiro de 2011

Dedico esta dissertação àqueles que sempre se dedicam a mim: Maria Luiza e Luiz Carlos, meus dedicados pais!!!

AGRADECIMENTOS

Certa vez ouvi dizer que deveríamos agradecer apenas àquelas pessoas que não são da família e que não receberam nenhuma remuneração por seu “auxílio”. As primeiras não deveriam ser agradecidas pois não fizeram mais que sua obrigação de apoiar o estudante, afinal são membros da família. Já os profissionais remunerados, da mesma forma, fizeram o que lhes é incumbido conforme contrato de trabalho. Então também não mereceriam agradecimentos. Permito-me discordar veementemente desta opinião alheia. A família não é obrigada a suportar ausências nos finais de semana pois artigos precisam ser terminados. Da mesma forma, ela não precisa aturar o mau humor quando uma coluna cromatográfica não sai conforme o esperado ou quando isolamos “uma mistura de glicose e frutose para adoçar o café” (by FDM). Os profissionais... Sim, são remunerados! Mas esta remuneração inclui responder e- mails desesperados nos sábados, a meia-noite e quatorze minutos? O contrato de trabalho prevê um orientador “caixa eletrônico” (disponível 24 horas por dia)? Duvido! Assim sendo, nada mais justo e mandatório que fazer meus agradecimentos: Mãe... impossível seria sem você. Me ouvindo, me fazendo ouvir, me colocando os pés no chão quando a cabeça queria voar. Sendo Mãe, com letra maiúscula. A distância nunca me deixou esquecer que você sempre foi e será o meu exemplo a ser seguido. Meu norte (mesmo estando ao sul). Te amo; Pai... impossível seria sem você. Sempre com sua opinião mais sensata e racional. Ouvindo, pesando e expressando o essencial. Obrigado! E obrigado também por sua compreensão e respeito ao meu ritmo e espaço. Te amo; Família... especialmente Rodrigo, Taiana e Bety. Obrigado por me apoiarem, cada qual à sua maneira, neste período, me respeitando e me aconselhando. Sempre “segurando as pontas”; Cechinel... meu orientador. Eterno pai científico e, sem dúvidas, amigo! Não há no dicionário de língua portuguesa palavra para expressar meus mais sinceros agradecimentos. Te admiro enquanto pesquisador, orientador, amigo, compositor, escritor... ufa! Obrigado por me fazer uma pessoa melhor! Faloni... meu “co-chefe”, como tenho mania de chamar. Obrigado por seu apoio e por sua amizade. Um dos melhores “conselheiros” que tive. Obrigado também pela colaboração neste e noutros projetos; 7

Tania... te agradeço enquanto professora, coordenadora e amiga. Grato por sua colaboração nesta dissertação, bem como por seu enorme apoio enquanto mestrando. Seu profissionalismo e dedicação são inspiradores; Nara... agradeço especialmente a você por vários motivos: professora, colaboradora importante desta dissertação e por suas valiosas considerações enquanto membro interno da banca. Ainda, obrigado por sua disponibilidade, mesmo com a Julia “no colo”; Márcia e Ângela... obrigado por suas sugestões como banca interna, bem como por suas atuações como Professoras; Niero e Christiane Meyre... obrigado por sempre estarem dispostos a sanar minhas dúvidas e pela colaboração no Laboratório de Pesquisa em Fitoquímica; Profa. Dra. Vanderlan da Silva Bolzani... agradeço por ter aceito participar da minha banca de defesa de dissertação, o que, indubitavelmente, irá contribuir significativamente para o melhoramento deste trabalho; Prof. Franco Delle Monache (FDM)... grato por seu auxílio na determinação estrutural dos compostos isolados, bem como por seus e-mails bem humorados; Demais docentes do PMCF... obrigado por, em maior ou menor grau, contribuírem para minha formação; Funcionários... especialmente Joel, Helenize, Maggie, Juliano , Pedro e Luciana que auxiliaram de forma tão signficativa para a concretização desta dissertação; Amigos e colegas do PMCF... Aline, Philipe, José, Isabel, Marivane, Jaqueline, Thaisa, Alessandro, Gislaine e Nicole. A muitos, devo parte desta dissertação. A todos, grande parte da diversão! Obrigado. Zhelmy... mi hermanita! Muchas gracias por tu amistad, por tu conocimiento y por tus oídos! 2010 fue mucho mejor con tu presencia. Colegas de laboratório… especialmente Priscila, Bruna, Luisa e Mariana. Tanto aprendemos juntos, rimos juntos e erramos juntos. Se fosse diferente, nem teria graça. Amigos fora da UNIVALI... especialmente Joi, Daia, Má e Ale por terem me apoiado, das mais diversas formas, enquanto mestrando. Obrigado por seus ouvidos (ou olhos)! Instituições... UNIVALI e CAPES por seu apoio financeiro direto ou indireto. FAPESC e CNPq pelas bolsas de mestrado que me foram concedidas enquanto mestrando. Os demais... que de alguma forma contribuíram para meu crescimento científico, profissional e/ou pessoal durante estes dois anos, meu muito obrigado. Desculpem-me se não incluo o nome de todos, mas infelizmente seria inviável. Nada seria obtido, nenhum objetivo atingido, nenhuma meta alcançada, se não fossem as colaborações. Esta dissertação é fruto de um importante trabalho conjunto. Nenhum mérito é individual. Obrigado a todos...

“Ninguém pode construir em teu lugar as pontes que precisarás passar para atravessar o rio da vida - ninguém, exceto tu, só tu. Existem, por certo, atalhos sem números, e pontes, e semideuses que se oferecerão para levar-te além do rio; mas isso te custaria a tua própria pessoa; tu te hipotecarias e te perderias. Existe no mundo um único caminho por onde só tu podes passar. Onde leva? Não perguntes, segue-o!”

Nietzche CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE): ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO

Luiz Carlos Klein Júnior 9

Fevereiro/2011

Orientador: Valdir Cechinel Filho, Doutor Co-orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de páginas: 152.

Polygala cyparissias é uma planta popularmente conhecida como pinheiro da praia ou gelol. É etnofarmacologicamente utilizada como analgésico local de aplicação tópica, já tendo sido evidenciada a atividade antinociceptiva da planta. Caracteriza- se quimicamente pela presença de xantonas. Considerando que tais metabólitos já possuem atividade anti-úlcera descrita, objetivou-se o estudo químico da espécie e a avaliação do potencial gastroprotetor e anti-hipernociceptivo. Para tanto, foram utilizados métodos cromatográficos clássicos no isolamento dos metabólitos principais de P. cyparissias e métodos in vivo e in vitro para verificar seu potencial farmacológico. A partir do extrato acetônico (EA), foi possível isolar: espinasterol (PC1), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4) e 1,7dihidroxi-2,3- dimetoxixantona (PC5). Da fração metanólica obteve-se pela primeira vez para a planta um flavonóide denominado astragalina (PC6). Para avaliar a atividade gastroprotetora do EA e da fração metanólica (FM) de P. cyparissias utilizou-se os modelos de lesão gástrica induzida por etanol/HCl e indometacina/betanecol. Nesses modelos, respectivamente, para o EA obteve-se um índice de gastroproteção (IG) na dose de 250 mg/kg de 67,4 ± 4,8% e 77,9 ± 7,2%. Já para a FM, os IGs nas mesmas doses foram 74,5 ± 6,1% e 75,0 ± 2,9%. Além disto, através dos modelos de úlcera induzida por etanol/HCl associada a um inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME) e a um quelante dos grupamentos sulfidrila (NEM) foi evidenciada a significativa (p<0,01) participação do óxido nítrico (NO) e dos grupamentos sulfidrila (SHs) na gastroproteção promovida pelo extrato e fração de P. cyparissias. No modelo curativo de úlcera crônica induzida por ácido acético, o EA e a FM geraram um índice de cura de 67,5 ± 5,5% e 58,4 ± 4,4%, respectivamente. Avaliando o efeito gastroprotetor de PC1, PC2 e PC3 no modelo de lesão induzida por etanol/HCl, obteve-se os seguintes IGs: 86,2 ± 3,4%, 71,3 ± 9,4% e 81,1 ± 5,8%, respectivamente. Também, objetivando verificar a ação de P. cyparissias sobre Helicobacter pilory , realizou-se o ensaio de diluição do extrato e fração em ágar sólido, porém não foi observado efeito sobre o crescimento bacteriano. A atividade anti-hipernociceptiva, foi avaliada frente a diferentes agentes: carragenina, lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante completo de Freund (CFA), prostaglandina E 2 (PGE 2) e epinefrina. Foi realizado também o modelo de constrição parcial do nervo ciático (CPNC). Nos modelos de hipernocicepção inflamatória (carragenina, LPS, CFA e PGE 2) as inibições encontradas para as doses mais efetivas do extrato metanólico (EM) de P. cyparissias foram: 67,8 ± 3,4%, 89,0 ± 4,8%, 42,6 ± 3,4% e 88,5 ± 11,5%, respectivamente. Na hipernocicepção induzida por epinefrina, o extrato apresentou atividade anti-hipernociceptiva apenas nos primeiros 15 minutos. Já no modelo de CPNC, a maior inibição foi de 44,4 ± 4,6%. Os compostos PC1 a PC4 foram avaliados na hipernocicepção induzida por carragenina, sendo que apenas PC1, PC3 e PC4 foram ativos, com inibições de: 41,6 ± 6,2%, 47,8 ± 5,2% e 63,6 ± 4,4%, para as doses mais efetivas. Assim sendo, foi possível isolar seis metabólitos diferentes de P. cyparissias , sendo um deles o 10

flavonóide astragalina, obtido pela primeira vez para a espécie. Além disto, demonstrou-se o potencial gastroprotetor e curativo do EA, FM e de alguns metabólitos, estando estas atividades relacionadas ao NO e aos SHs. Por fim, o EM e PC1, PC3 e PC4 evidenciaram ação anti-hipernociceptiva, principalmente em modelos de hipernocicepção inflamatória.

Palavras-chave: Polygala cyparissias . Gastroproteção. Anti-hipernocicepção. Xantonas

CONTRIBUTION TO THE PHARMACOGNOSTIC STUDY OF Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE): CHEMICAL ASPECTS AND EVALUATION OF THE GASTROPROTECTIVE AND ANTI-HYPERNOCICEPTIVE POTENTIAL

Luiz Carlos Klein Júnior February/2011

Supervisor: Valdir Cechinel Filho, PhD. Co-Supervisor: Sérgio Faloni de Andrade, PhD. Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 152.

Polygala cyparissias is a plant popularly known as “pinheiro da praia” or “gelol”. It is ethnopharmacologically used as topical anesthetic, and its antinociceptive activity has already been demonstrated. It is chemically characterized by the presence of xanthones. Considering that these metabolites display antiulcer activity, the aim of this work was to carry out a chemical study of the species, and evaluate its gastroprotective and anti-hypernocicetive potential. Traditional chromatographic methods were used to isolate the major metabolites of P. cyparissias , and in vivo and in vitro methods were used to verify the pharmacological activity. From the acetone extract (AE), it was possible to isolate the following: spinasterol (PC1), 1,3-dihydroxy- 7-methoxyxanthone (PC2), 1,7-dihydroxy-2,3-methylenedioxyxanthone (PC3), 1,3,6,8-tetrahydroxy-2,7-dimethoxyxanthone (PC4) and 1,7-dihydroxy-2,3- dimethoxyxanthone (PC5). From the methanol fraction, a flavonoid was isolated for the first time, which was named astragalin (PC6). To evaluate the gastroprotective activity of the AE and the MF (Methanolic Fraction) of P. cyparissias , the ethanol/HCl- and indomethacin/bethanecol-induced ulcer models were used. For the AE, at a dose of 250 mg/kg, a gastroprotection index (GI) of 67.4 ± 4.8% and 77.9 ± 7.2% was obtained, respectively. For the MF, the GIs at in the same dose were 74.5 ± 6.1% and 75.0 ± 2.9%. Also, using the ethanol/HCl-induced ulcer model with a nitric oxide synthase inhibitor (L-NAME) and a chelant of the sulphydril groups (NEM), a significant (p<0.01) involvement of the nitric oxide (NO) and sulphydril groups (SHs) in gastroprotection was demonstrated, a response elicited by the extract and the fraction of P. cyparissias. In the chronic curative model of ulcer induced by acetic acid, the AE and the MF demonstrated cure indices of 67.5 ± 5.5% and 58.4 ± 4.4%, respectively. Evaluating the gastroprotector effect of PC1, PC2 and PC3 in the ethanol/HCl-induced ulcer, GIs of: 86.2 ± 3.4%, 71.3 ± 9.4% and 81.1 ± 5.8% were obtained, respectively. Also, seeking to verify the action of P. cyparissias on Helicobacter pilory , the agar solid dilution assay was used, but no effect was observed on bacterial growth. The anti-hypernociceptive activity was evaluated in models induced by: carrageenan, lipopolysaccharide (LPS), Freund’s complete adjuvant (FCA), prostaglandin E 2 (PGE 2) and epinephrine. The partial constriction of the sciatic nerve model (PCSN) was also used. In the models of inflammatory hypernociception (carrageenan, LPS, FCA and PGE 2), the inhibitions, demonstrated at the most effective doses of the methanol extract (ME) of P. cyparissias were: 67.8 ± 3.4%, 89.0 ± 4.8%, 42.6 ± 3.4% e 88.5 ± 11.5%, respectively. In the hypernociception induced by epinephrine, the extract demonstrated anti- hypernociceptive activity in the first 15 minutes. In the neuropathic model of hypernociception induced by PCSN, the inhibition was 44.4 ± 4.6%. Compounds PC1 to PC4 were also evaluated in the hypernociception induced by carrageenan, but only PC1, PC3 and PC4 were effective, with inhibitions of: 41.6 ± 6.2%, 47.8 ± 5.2% and 63.6 ± 4.4%. Thus, it was possible to isolate six different metabolites from P. cyparissias, one of them the flavonoid astragalin, being obtained for the first time for the plant. The gastroprotector and curative potential of AE, MF and some metabolites 12

was also demonstrated, these activities being related to the NO and SHs. Finally, the EM and PC1, PC3 and PC4 elicited anti-hypernociceptive activity, particularly in models of inflammatory hypernociception.

Key words: Polygala cyparissias . Gastroprotection. Anti-hypernociception. Xanthones.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação do ramo de Polygala cyparissias...... 34 13

Figura 2: Foto de Polygala cyparissias...... 34

Figura 3: Foto da flor de Polygala cyparissias...... 34

Figura 4: Estrutura química dos compostos isolados de Polygala cyparissias : espinasterol (1), salicilato de metila (2), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (3), 1,7- dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4), 1,3,6-trihidroxi-2,7-dimetoxixantona (5), 1,7- dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8)...... 35

Figura 5: Esquema demonstrando a sensibilização dos neurônios secundários. Esta sensibilização ocorre quando há um estímulo sustentado emitido pelos nociceptores periféricos. Na fase aguda há a liberação de glutamato e substância P, ligando-se a receptores NMDA, AMPA e NK-1 (A). Todavia, com uma estimulação sustentada, há uma expressão exagerada de receptores, especialmente NMDA através de c-fos e c-jun, levando à sensibilização do neurônio secundário (B). (Fonte: adaptado de MARCHAND, 2008)...... 45

Figura 6: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-1). Em cinza destacado os compostos isolados...... 53

Figura 7: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-15). Em cinza destacado os compostos isolados...... 57

Figura 8: Organograma de isolamento dos compostos da fração metanólica de Polygala cyparissias (PCTL-2B). Em cinza destacado os compostos isolados...... 60

Figura 9: Espinasterol...... 76

Figura 10: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado...... 77

Figura 11: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado expandido na região de 0,70 a 2,10 ppm...... 77

Figura 12: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterada expandido na região de 3,45 a 3,80 ppm e 4,90 a 5,30 ppm...... 78

Figura 13: Espectro de RMN ¹³C do composto PC1 em CDCl 3...... 79

Figura 14: 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona...... 82

Figura 15: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada...... 83

Figura 16: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada expandido na região de 6,5 a 8,0 ppm...... 83

Figura 17: 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona...... 84

Figura 18: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada...... 85 14

Figura 19: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada expandido na região de 7,3 a 8,1 ppm...... 86

Figura 20: 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona...... 86

Figura 21: Espectro de RMN ¹H do composto PC4 em piridina deuterada...... 87

Figura 22: 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona...... 88

Figura 23: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada...... 89

Figura 24: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada expandido na região de 3,5 a 9,0 ppm...... 89

Figura 25: Kaempferol 3-O-β-D-glicosilado...... 90

Figura 26: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD 3OD...... 91

Figura 27: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD 3OD expandido na região de 5,0 a 9,0 ppm...... 91

Figura 28: Espectro de RMN ¹³C do composto PC6 em CD 3OD...... 92

Figura 29: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 1 descrito na Tabela 10...... 95

Figura 30: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 2 descrito na Tabela 11...... 96

Figura 31: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 3 já descrito...... 96

Figura 32: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 4 descrito na Tabela 12...... 97

Figura 33: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 5 descrito na Tabela 13...... 98

Figura 34: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 6 descrito na Tabela 14...... 99

Figura 35: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 7 descrito na Tabela 15...... 99 Figura 36: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 8 descrito na Tabela 16...... 100

Figura 37: Cromatograma obtido para PC2 isolado de P. cyparissias , conforme método 8 descrito na Tabela 16...... 101

Figura 38: Cromatograma em três dimensões obtido para PC3 isolado de P. cyparissias , conforme método 8 descrito na Tabela 16...... 101

Figura 39: Cromatograma obtido para o solvente utilizado para a solubilização de PC2, conforme método 8 descrito na Tabela 16...... 102

Figura 40: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM...... 104

Figura 42: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM...... 106

Figura 43: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM...... 107

Figura 44: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou L-NAME (70 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. ** p<0.01 quando comparados com o grupo controle. ∆ mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com L-NAME e pré-tratados com salina (p<0,01)...... 109

Figura 45: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou NEM (10 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. ** p<0.01 quando comparados com o grupo controle. ∆ mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com NEM e pré-tratados com salina (p<0,01)...... 110

Figura 46: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.), pelo extrato acetônico (125 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por ácido acético 20% (50 µl) em camundongos (n = 6), no modelo de úlcera crônica. Os resultados estão expressos em média ± EPM...... 112

Figura 47: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e pelos compostos isolados de P. cyparissias em lesões induzidas por etanol/HCl 16

(60%/0,3M) em camundongos (n = 6): espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3- dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.) e 1,7-dihidroxi-2,3- metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.). Os resultados estão expressos em média ± EPM...... 114

Figura 49: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3- 30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 118

Figura 50: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (0,3-3 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20 µl/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 120

Figura 51: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3- 30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de PGE 2 (0,1 nmol/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 121

Figura 52: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3- 30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de epinefrina (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 123

Figura 53: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3 e 10 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a constrição parcial do nervo ciático. Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001. FOP = falso operado...... 123

expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 126

Figura 55: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados PC2 (0,04 – 0,39 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 127

Figura 56: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados PC3 (0,04 – 0,37 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 127

Figura 57: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados PC4 (0,03 – 0,31 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001...... 128

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato acetônico de P. cyparissias...... 51

Tabela 2: Junção das frações obtidas na CC1...... 51

Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento do extrato acetônico de P. cyparissias...... 55

Tabela 4: Junção das frações obtidas na CC2...... 55

Tabela 5: Junção das frações obtidas na CC flash 11...... 56

Tabela 6: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da fração metanólica de P. cyparissias...... 58

Tabela 7: Junção das frações obtidas na CC3...... 58 Tabela 8: Gradiente de eluição da CC4 na purificação da fração 13-15 da CC3. ....59

Tabela 9: Junção das frações obtidas na CC4...... 59

Tabela 10: Descrição do método 1. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = MeOH. Fluxo de 1 ml/min...... 62

Tabela 11: Descrição do método 2. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min...... 62

Tabela 12: Descrição do método 4. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min...... 62

Tabela 13: Descrição do método 5. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min...... 62

Tabela 14: Descrição do método 6. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min...... 63

Tabela 15: Descrição do método 7. A = H 2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min...... 63

Tabela 16: Descrição do método 7. A = H 2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 0,8 ml/min...... 64

Tabela 17: Rendimentos dos extratos e frações obtidos de P. cyparissias...... 75

Tabela 18: Valores de deslocamento químico ( δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC1 em comparação com dados da literatura para o espinasterol, ambos em CDCl 3...... 79 Tabela 19: Valores de deslocamento químico ( δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC6 e comparação com dados da literatura para a astragalina, ambos em CD 3OD...... 94

Tabela 20: Efeito do extrato acetônico e frações clorofórmica e metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001...... 103

Tabela 21: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e veículo em úlcera induzida por indometacina (100 mg/kg; v.o.)/betanecol (5 mg/kg; i.p.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001...... 105

Tabela 22: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) na dose de 125 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético 20% (ensaio curativo). Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05 e ** p<0,01...... 111

Tabela 23: Efeito do espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7- metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.), omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001...... 114

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABTS – Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolino)-6-sulfônico ACN – Acetonitrila AcOEt – Acetato de etila AINE – Anti-inflamatório não-esteróide AMP – Adenosina monofosfato AMPA – Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico ANOVA – Análise de variância ASIC – Canal iônico sensível ao ácido ATCC – Coleção de cultura do tipo Americana ATP – Adenosina trifosfato AUC – Área sob a curva BK – Bradicinina CC – Cromatografia em coluna CCD – Cromatografia em camada delgada CCDP – Cromatografia em camada delgada preparativa CFA – Adjuvante completo de Freund cGMP – Guanosina monofosfato cíclico CGRP – Peptídeo relacionado ao gene de calcitonina CIM – Concentração inibitória mínima CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência COX – Ciclooxigenase CPNC – Constrição parcial do nervo ciático DCM - Diclorometano EPM – Erro padrão da média FOP – Falso operado IC – Concentração inibitória IG – Índice de gastroproteção IL – Interleucina i.p. – Intraperitoneal i.pl. – Intraplantar J – Constante de acoplamento L-NAME – N-nitro-L-arginina metil éster LPS – Lipopolissacarídeo MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno 21

MEK – Quinase ativadora da MAPK NEM – N-etilmaleimida NGF – Fator de crescimento neuronal NIQFAR – Núcleo de investigações químico-farmacêuticas NMDA – N-metil-D-aspartato NO – Óxido nítrico NOS – Óxido nítrico sintase PC1 – Espinasterol PC2 – 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona PC3 – 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona PC4 – 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona PC5 – 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona PC6 – Astragalina PG – Prostaglandina

PGE 2 – Prostaglandina E 2 PKA – Proteína quinase A PKC – Proteína quinase C RMN ¹H e ¹³C – Ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 e carbono-13 SH – Grupamento sulfidrila SNC – Sistema nervoso central TFA – Ácido trifluoracetico TNF-α – Fator de necrose tumoral α ULI – Índice de lesão ulcerativa UNIVALI – Universidade do Vale do Itajaí v.o. – Via oral WDR – Neurônio de faixa ampla δ – Deslocamento químico

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 24 2 OBJETIVOS ...... 26 2.1 Objetivo geral ...... 27 2.2 Objetivos específicos ...... 27 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 28 3.1 Plantas medicinais ...... 28 3.2 Família Polygalaceae ...... 31 3.3 Gênero Polygala ...... 32 3.4 Espécie Polygala cyparissias ...... 33 3.5 Aspectos gerais relacionados à úlcera ...... 36 3.5.1 Úlcera relacionada à infecção por Helicobacter pylori ...... 37 3.5.2 Úlcera relacionada ao uso de anti-inflamatórios não-esteróides...... 38 3.5.3 Úlcera relacionada ao estresse...... 39 3.6 Algumas plantas estudadas com potencial gastroprotetor ...... 39 3.7 Aspectos gerais relacionados à dor ...... 41 3.7.1 Fisiologia da nocicepção aguda ...... 41 3.7.2 Cronificação da dor ...... 43 3.8 Algumas plantas estudadas com potencial antinociceptivo ...... 47 4 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 49 4.1 Materiais e equipamentos ...... 49 4.2 Análise fitoquímica ...... 49 4.2.1 Material vegetal...... 49 4.2.2 Obtenção dos extratos ...... 50 4.2.3 Purificação e identificação dos compostos isolados...... 50 4.2.4 Perfil cromatográfico do extrato de P. cyparissias ...... 61 4.2.4.1 Preparo das amostras ...... 61 4.2.4.2 Desenvolvimento do método cromatográfico ...... 61 4.3 Testes farmacológicos ...... 65 4.3.1 Animais ...... 65 4.3.2 Avaliação da atividade gastroprotetora ...... 65 4.3.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl ...... 65 4.3.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteróide associada à estimulação parassimpaticomimética ...... 66 4.3.2.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético...... 67 23

4.3.3 Estudo do mecanismo de ação gastroprotetor...... 68 4.3.3.1 Participação do óxido nítrico ...... 68 4.3.3.2 Participação dos grupamentos sulfidrilas ...... 68 4.3.4 Avaliação da atividade anti-Helicobater pilory ...... 69 4.3.4.1 Cepa de Helicobater pilory...... 69 4.3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ...... 69 4.3.5 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva...... 70 4.3.5.1 Análise do limiar mecânico através do von Frey eletrônico e monofilamento de Von Frey ...... 70 4.3.5.2 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina ...... 71 4.3.5.3 Hipernocicepção mecânica induzida por lipopolissacarídeo (LPS) .....72 4.3.5.4 Hipernocicepção inflamatória induzida pelo adjuvante completo de Freund (CFA) ...... 72

4.3.5.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela prostaglandina E 2 (PGE 2) .73 4.3.5.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina ...... 73 4.3.5.7 Hipernocicepção mecânica induzida por constrição parcial do nervo ciático (CPNC) ...... 73 4.3.6 Análise estatística ...... 74 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 75 5.1 Análise fitoquímica ...... 75 5.1.1 Extratos obtidos...... 75 5.1.2 Identificação dos compostos obtidos...... 76 5.1.2.1 PC1 ...... 76 5.1.2.2 PC2 ...... 81 5.1.2.3 PC3 ...... 84 5.1.2.4 PC4 ...... 86 5.1.2.5 PC 5 ...... 87 5.1.2.6 PC 6 ...... 90 5.1.3 Perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias ...... 94 5.2 Testes farmacológicos ...... 102 5.2.1 Avaliação da atividade gastroprotetora ...... 102 5.2.2 Avaliação da atividade anti-Helicobacter pilory ...... 116 5.2.3 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva...... 116 6 CONCLUSÕES ...... 130 24

REFERÊNCIAS ...... 132 ANEXO A – Artigo publicado ...... 147 ANEXO B – Artigo de revisão aceito para publicação ...... 151

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais é provavelmente a terapêutica mais antiga utilizada, com evidências que remetem à aproximadamente 3000 anos a.C. (HALBERSTEIN, 2005; GURIB-FAKIM, 2006; LIU; WANG, 2008). Hoje em dia, as plantas medicinais continuam sendo muito utilizadas, especialmente na atenção primária à saúde, apesar do avanço da química sintética (GANESAN, 2008). Além do seu uso etnofarmacológico, as plantas medicinais são importantes fontes de moléculas biologicamente ativas como potenciais fitofármacos (BARREIRO; BOLZANI, 2009). De fato, grande parte dos medicamentos hoje disponíveis são de origem vegetal ou inspirados nestes (MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007; BARREIRO; BOLZANI, 2009). Entretanto, mesmo com todo o arsenal terapêutico atualmente disponível, estima-se que apenas 1% das espécies presentes em florestas tropicais foram estudadas sob o âmbito farmacêutico (GURIB-FAKIM, 2006), o que justifica fortemente estudos abordando tais aspectos. Além da variada constituição química inter-espécies, outro motivo para a ampliação do número de moléculas potencialmente bioativas é a variação intra- espécies (SCHUFFENHAUER; BROWN, 2006; ROLLINGER, 2009). Alguns fatores que podem influenciar tal variação são: exposição solar, umidade, constituição do solo, localização geográfica, período do ano, dentre outros (FIRENZUOLI; GORI, 2007). Isto sempre deve ser levado em consideração quando se estuda e utiliza uma determinada planta medicinal, visto que estes fatores podem promover variações na concentração de metabólitos secundários (moléculas potencialmente bioativas) e, inclusive, modificá-los (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Considerando o uso de plantas medicinais como alternativa terapêutica, duas patologias carentes de tratamento farmacológico efetivo e que vêm sendo foco de estudos sob esta temática são a úlcera (FALCÃO et al., 2008) e a dor de caráter persistente (CALIXTO et al., 2000). A úlcera se caracteriza por um desequilíbrio entre os fatores agressivos e de proteção da mucosa gástrica (CHAN; LEUNG, 2002; LU; GRAHAM, 2006; RODRIGUES et al., 2008). Dentre os fatores etiológicos, destacam-se a infecção por Helicobacter pylori , o uso de anti-inflamatórios não- esteróides e o estresse (LU; GRAHAM, 2006). Já a dor crônica pode ser definida como um processo sem estímulo contínuo ou patologia definida que dura mais que o período normal de cura e recuperação (MEYR; SAFFRAN, 2008). 26

Estudos vêm demonstrando a atividade anti-úlcera e anti-hipernociceptiva de espécies do gênero Polygala (LAPA et al., 2007, 2009). Particularmente, Polygala cyparissias , utilizada popularmente por sua ação analgésica, já demonstrou atividade sobre a nocicepção aguda induzida por diferentes mediadores químicos (CAMPOS et al., 1997). Em adição, P. cyparissias é fitoquimicamente caracterizada por xantonas (PINHEIRO et al., 1998), uma classe de metabólitos secundários relacionada com atividade gastroprotetora (BO; LIU, 2004; BANERJI et al., 1994), deixando indícios de que P. cyparissias possa apresentar atividade anti-úlcera. Uma vez que a espécie apresenta ampla distribuição no Brasil, especialmente em Santa Catarina (WURDACK; SMITH, 1971), no presente estudo propô-se o estudo químico e farmacológico da espécie apresentada.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Estudar a composição química de Polygala cyparissias St. Hil. & Moq., além de verificar a potencial atividade gastroprotetora e anti-hipernociceptiva de seus extratos, frações e compostos isolados.

2.2 Objetivos específicos

a) Isolar por métodos cromatográficos os principais constituintes químicos presentes no extrato acetônico e na fração metanólica de P. cyparissias ; b) Identificar através de métodos espectroscópicos de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e/ou de carbono-13 (RMN 13 C) os compostos isolados; c) Obter perfil cromatográfico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) do extrato metanólico de P. cyparissias ; d) Avaliar a atividade gastroprotetora em camundongos do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias através dos modelos de úlcera aguda induzida por etanol/HCl e por anti-inflamatório não-esteróide (AINE) associado à estimulação parassimpaticomimética, bem como suas atividades sobre o sistema oxinitrérgico, grupamentos sulfidrilas (SHs) e sobre Helicobacter pilory por diluição em ágar sólido; e) Avaliar a atividade curativa do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético em camundongos; f) Avaliar a atividade gastroprotetora dos compostos isolados através do modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl em camundongos; g) Investigar o efeito preventivo do extrato metanólico bruto de P. cyparissias frente à hipernocicepção mecânica persistente induzida pela injeção i.pl. de

adjuvante completo de Freund (CFA), prostaglandina E 2 (PGE 2), lipopolissacarídeo (LPS), carragenina e epinefrina em camundongos; h) Avaliar o efeito curativo do extrato metanólico bruto de P. cyparissias sobre a dor neuropática induzida pela contrição parcial do nervo ciático (CPNC) em camundongos; 28

i) Avaliar o efeito preventivo dos compostos isolados sobre a hipernocicepção mecânica induzida pela injeção i. pl. de carragenina em camundongos;

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Plantas medicinais 29

Diversas evidências demonstram que o uso de plantas medicinais é o modo mais antigo e difundido de tratamento de várias enfermidades. Há aproximadamente 5000 anos, plantas já eram utilizadas com fins terapêuticos de forma empírica, encontrando-se tal prática disseminada entre o povo mesopotâmico, egípcio e grego (HALBERSTEIN, 2005; GURIB-FAKIM, 2006; LIU; WANG, 2008). A história também evidencia o uso de plantas medicinais, em diversas épocas, pelos chineses, indianos, tibetanos, astecas, maias, dentre outros (HALBERSTEIN, 2005). Já na história mais recente, o uso de plantas medicinais tornou-se mais avançado, envolvendo o isolamento de princípios ativos como potenciais fitofármacos (LARSSON; BACKLUND; BOHLIN, 2008; RISHTON, 2008). Esta tendência foi iniciada em 1804 pelo farmacêutico Friedrich Wilhelm Adam com o isolamento da morfina do ópio obtido de Papaver somniferum , inspirando a obtenção de uma série de análogos e não-análogos, os quais vieram a fazer parte da classe de hipnoanalgésicos (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LIU; WANG, 2008; BARREIRO; BOLZANI, 2009). De fato, a farmacologia contemporânea encontra suas bases firmadas no conhecimento adquirido em diversos estudos com plantas medicinais (LIU; WANG, 2008), inclusive auxiliando na descoberta de novos mecanismos de ação (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LAM, 2007; HARVEY, 2008). Durante algum tempo, diversos fármacos puramente sintéticos foram lançados no mercado (GANESAN, 2008). Pesquisas envolvendo o desenvolvimento de fitofármacos acabaram dividindo espaço com estudos guiados por relação estrutura-atividade, química combinatória, desenvolvimento de fármacos in silico , dentre outras técnicas (SCHMIDT et al., 2008). Isto acabou fazendo com que diversas indústrias farmacêuticas reduzissem o investimento na pesquisa de produtos naturais, apesar de seu sucesso já evidenciado (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LAM, 2007; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007; HARVEY, 2008; SCHMIDT et al., 2008). Porém, nos últimos anos, a importância dos estudos envolvendo plantas medicinais foi reavivada, especialmente por seus avanços na atividade anticacerígena, voltando a despertar o interesse social e econômico sobre os produtos naturais, permanecendo estes como uma importante fonte de novas moléculas bioativas (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LAM, 2007; SCHMIDT et al., 2008; SHINDE; DHALWAL; MAHADIK, 2008; BRAZ-FILHO, 2010). A maioria dos 30

fármacos atualmente disponíveis ou são de origem natural ou foram inspirados em produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2007; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). De 1994 até 2007, aproximadamente metade dos fármacos aprovados e liberados para uso foram baseados em fitoconstituintes, sendo que de 2005 a 2007, dos 30 fitomedicamentos lançados, cinco representaram os primeiros membros de novas classes terapêuticas. Mais de cem compostos de origem natural estão em estudos clínicos e aproximadamente a mesma quantidade, em estudos pré-clínicos (HARVEY, 2008). Cerca de 50% dos fitofármacos hoje disponíveis foram obtidos de plantas superiores. Estima-se que existam no mundo aproximadamente 300,000 espécies de plantas, sendo que em torno da metade localizam-se em florestas tropicais (GURIB-FAKIM, 2006; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). De fato, as florestas tropicais são grandes fontes de novas moléculas potencialmente bioativas, visto que apenas 1% das espécies foi estudada do ponto de vista farmacêutico, sendo esta uma justificativa importante a ser considerada para a preservação da biodiversidade (GURIB-FAKIM, 2006; BARREIRO; BOLZANI, 2009). Muitas das moléculas bioativas são geradas pelo metabolismo secundário dos organismos vegetais (BARREIRO; BOLZANI, 2009). O metabolismo secundário é responsável pela sobrevivência da espécie no meio em que se encontra (HARTMANN, 2007), adotando um perfil adaptativo frente ao progresso evolutivo do ambiente, conhecido como “efeito rainha vermelha”, o que justifica serem fontes de moléculas potencialmente ativas (SCHUFFENHAUER; BROWN, 2006; ROLLINGER, 2009). Assim sendo, a composição química das plantas depende de uma série de fatores, como espécie vegetal, exposição solar, umidade, constituição do solo, localização geográfica, período do ano, dentre outros (FIRENZUOLI; GORI, 2007; GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Considerando isto, a variedade de moléculas geradas pelos organismos vegetais é enorme, constituindo uma fonte quase que inesgotável de estruturas químicas (LAM, 2007; ROLLINGER, 2009). Além da diversidade molecular, outro aspecto que justifica o interesse por metabólitos secundários é sua complexidade estrutural. Muitas vezes tais estruturas são desafiadoras para a síntese orgânica (BALUNAS; KINGHORN, 2005; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007; PHILLIPSON, 2007), uma vez que envolvem diversos centros estereogênicos, muitos anéis aromáticos, alto grau de insaturações, grande número de heteroátomos, dentre outros (BALUNAS; 31

KINGHORN, 2005). Porém, mesmo com este abismo molecular entre fitofármacos e fármacos sintéticos, muitos deles seguem de forma semelhante às regras de Lipinski (GANESAN, 2008; HARVEY, 2008). Tais regras relacionam a estrutura do fármaco com a sua potencial farmacocinética, estabelecendo que não deve haver mais de 5 grupos doadores de ligações hidrogênio, massa molecular inferior a 500 Da, log P inferior a 5 e menos de 10 grupos aceptores de ligações de hidrogênio para que se tenha uma absorção e permeabilidade adequadas (ZHANG; WILKINSON, 2007). Contudo, eventualmente algumas modificações moleculares se fazem necessárias, tanto por motivos farmacocinéticos quanto farmacodinâmicos. Dentre as estratégias utilizadas, destacam-se homologação linear e ramificada e introdução de grupos vinílogos, fenílogos e benzílogos (BARREIRO; BOLZANI, 2009). Porém, o desenvolvimento de fármacos a partir de produtos naturais enfrenta grandes desafios. Talvez o maior deles esteja relacionado ao baixo rendimento que geralmente é obtido de produtos isolados, inviabilizando, inclusive, seus estudos clínicos (BALUNAS; KINGHORN, 2005). Além disto, quando comercializado, a demanda é variável, podendo atingir centenas a milhares de quilogramas por ano do composto isolado (MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). Ainda, há uma grande necessidade de colaboração interdisciplinar, uma vez que os estudos ligados a plantas medicinais envolvem diversas áreas, como a botânica, a bioquímica, a farmacognosia, a farmacologia, a fitoquímica, a medicina, a toxicologia, a biotecnologia, dentre outras (PHILLIPSON, 2007).

3.2 Família Polygalaceae

Polygala é uma união das palavras gregas poly (muito) e gala (leite), referenciando suas propriedades lactantes quando em infusão. Porém, as espécies atualmente pertencentes à família Polygalaceae não apresentam tal característica, visto que este nome foi primeiramente utilizado para designar a espécie atualmente conhecida como Gallega officinalis (Fabaceae) e, equivocadamente, foi empregado por botânicos do século XVI em uma espécie diferente, tendo este erro originado a família Polygalaceae (PASTORE, 2006). A família é constituída de ervas, arbustos, pequenas árvores, trepadeiras e algumas saprófitas (FURNESS; STAFFORD, 1995), dividida em três tribos: Polygaleae , Moutabeae e Xanthophylleae (ERIKSEN, 1993). Engloba em torno de 32

17 gêneros e mais de 1000 espécies, sendo aproximadamente metade destas pertencentes ao gênero Polygala . É uma família quase cosmopolita, estando ausente apenas na Nova Zelândia e no Círculo Ártico, encontrando-se presente principalmente em regiões de clima temperado e tropical. A maior parte das espécies européias está restrita à região sul e mediterrânea, com apenas 10 espécies do gênero Polygala na região norte do continente (FURNESS; STAFFORD, 1995). No Brasil, a família é representada por sete gêneros envolvendo 240 espécies em todas as formações vegetais (AGUIAR; ARANHA-FILHO, 2008). Além das espécies pertencentes ao gênero Polygala , diversas outras já demonstraram potencial farmacológico. Raízes de Securidaca longepedunculata foram avaliadas, demonstrando atividades antinociceptivas, antidepressivas (ADEBIYI et al., 2006), antimicrobianas (JUNAID et al., 2008) e relaxante da musculatura lisa dos corpos cavernosos (MEYER; RAKUAMBO; HUSSEIN, 2008). O extrato alcoólico das folhas de Carpolobia lutea inibiu significativamente diarréia e úlcera experimentalmente induzidas em roedores (NWAFOR; BASSEY, 2007). Raízes de Securidaca inappendiculata demonstraram possuir atividade citotóxica em macrófagos (YUI et al., 2001). Assim sendo, destaca-se o grande interesse na família Polygalaceae, visto que sua importância medicinal ainda é economicamente pouco explorada, além do interesse taxonômico, com espécies de ocorrência em praticamente todas as formações vegetais, ideal para estudos comparativos (AGUIAR; ARANHA-FILHO, 2008).

3.3 Gênero Polygala

O gênero Polygala possui aproximadamente 350 espécies, com ampla distribuição, especialmente nas áreas neotrópicas. Estima-se que este gênero seja aquele que tenha maior representatividade da família Polygalaceae no Brasil, com aproximadamente 110 espécies e 30 variedades. Geralmente apresentam-se como ervas ou arbustos, sendo árvores extremamente raras (WURDACK; SMITH, 1971; COELHO; AGRA; BARACHO, 2008). Diversos estudos destacam as propriedades farmacológicas de espécies do gênero Polygala, especialmente relacionados às suas potencias atividades sobre o sistema nervoso central (SNC). Todavia, existem estudos também demonstrando 33

suas atividades anti-nociceptivas e gastroprotetoras. Meotti et al. (2006) verificaram que as frações diclorometano, acetato de etila e butanol, além de três dihidroestiril-2- pironas, α-espinasterol, escopoletina, acetilescopoletina e benzoilescopoletina obtidas de P. sabulosa foram capazes de inibir as contorções provocadas por ácido acético em camundongos. O extrato hidroalcoólico também foi capaz de inibir a nocicepção induzida por glutamato, N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido α-amino-3- hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA), fator de necrose tumoral α (TNF-α) e interleucina 1 β (IL-1β) (RIBAS et al., 2008). Lapa et al. (2009) demonstraram que o extrato hidroalcoólico de P. paniculata teve ação inibitória sobre contorções abdominais induzidas por ácido acético, sobre as duas fases do teste da formalina, bem como nocicepção induzida por capsaicina, glutamato, NMDA, IL-1β, TNF-α e cinamaldeído. Para a mesma espécie, foi evidenciado seu potencial gastroprotetor em modelos de úlcera induzida por etanol e por AINEs, sem alterar o volume e acidez da secreção gástrica (LAPA et al., 2007). Além das espécies já citadas, diversas outras demonstram atividade biológica, destacando-se a espécie Polygala cyparissias (COELHO; AGRA; BARACHO, 2008).

3.4 Espécie Polygala cyparissias

Popularmente conhecida como pinheiro da praia, avenca da praia e gelol, a espécie Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin é encontrada no Brasil, da Paraíba ao Rio Grande do Sul, na Argentina e no Uruguai (WURDACK; SMITH, 1971; COELHO; AGRA; BARACHO, 2008). É uma erva glabra, de 12-50 cm de comprimento, com folhas numerosas e alternas e com flores que variam da cor branca à roxa (Figuras 1-3). Também é uma planta muito ramifica, estando seus ramos geralmente sobre a superfície da areia, crescendo em zonas planas ou pequenas depressões, próximas ao lençol de água. É característica da restinga litorânea do sul do Brasil (WURDACK; SMITH, 1971).

Figura 1: Representação do ramo de Polygala Figura 2: Foto de Polygala cyparissias. cyparissias. (Fonte: AUTOR) (Fonte: COELHO; AGRA; BARACHO, 2008)

Figura 3: Foto da flor de Polygala cyparissias.

(Fonte: STEFANI, 2010)

A espécie P. cyparissias é popularmente utilizada como anestésico local, especialmente de aplicação tópica. Considerando isto, Campos et al. (1997) avaliaram o efeito do extrato hidroalcoólico de P. cyparissias , demonstrando sua ação antinociceptiva pronunciada contra nocicepção inflamatória e neurogênica, além de prevenir a hiperalgesia induzida por bradicinina e substância P. Seguindo a mesma linha, Sayah et al. (1999) verificaram que o mesmo extrato e o composto isolado 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona antagonizaram, por mecanismo de ação não-competitivo, mas de modo reversível, a contração de traquéia promovida por diversos mediadores da inflamação, como bradicinina, substância P, prostaglandina

E2, tromboxano A 2, análogo estável da prostaglandina H 2 U 46619, histamina e acetilcolina em cobaias ex vivo . Também, tanto o extrato quando a xantona demonstraram atividade antagônica às contrações promovidas por ovalbumina. 35

A espécie também já foi estudada quimicamente. Do extrato hexânico, foram isolados o α-spinasterol (1) e altas concentrações de salicilato de metila (2) . Do extrato obtido com acetato de etila foram isoladas seis xantonas: 1,3-dihidroxi-7- metoxixantona (3) , 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4) , 1,3,6-trihidroxi-2,7- dimetoxixantona (5) , 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6) , 1,3,6,8-tetrahidroxi- 2,7-dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8) (Figura 4) (PINHEIRO et al., 1998). O

H3C CH O 3 CH3 CH3 (2) OH CH3 CH 3 H C CH3 OOH 3 O HO (3) O OH (1)

O OH CH3 O OH HO O O O CH3 CH3

O O (5) HO O OH

(4) CH3

OOH CH3 OH OOH

HO O O O CH3 (6) O O (7) HO O OH OOH

HO O CH3 (8) O OH Figura 4: Estrutura química dos compostos isolados de Polygala cyparissias : espinasterol (1), salicilato de metila (2), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (3), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4), 1,3,6- trihidroxi-2,7-dimetoxixantona (5), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7- dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8).

Além disto, conforme demonstrado por Weinhold et al. (2008), o óleo-resina extraído por CO 2 de P. cyparissias apresentou ser constituído por p-benzoquinona, acetileugenol, éster metílico do ácido 11,14-octadecanóico, cadineno, óxido de β- 36

cariofileno, N,N-bis(2-hidroxietil)dodecanamida, α-spinasterol, ácido hexadecanóico, dodecano, n-tridecano, tetradecano, pentadecano, hexadecano, heptadecano, octadecano e nonadecano. Em outro estudo, Pizzolatti et al. (2009) demonstraram que o principal constituinte dos compostos voláteis presentes nas raízes de P. cyparissias é o salicilato de metila (97,8%), enquanto que para as flores são acetato de bornila (19,2%) e 1,8-cineol (7,2%). Visto que apenas o extrato hexânico e o extrato com acetato de etila foram estudados para fins de isolamento, percebe-se quão promissora pode ser a investigação química do vegetal por outros métodos extrativos. Da mesma forma, considerando que poucas atividades farmacológicas foram avaliadas, especialmente dos compostos isolados, cabe vislumbrar outros estudos na área da farmacologia. Assim, considerando o exposto, o presente trabalho visa isolar por métodos cromatográficos os compostos já relatados na literatura, dando ênfase às xantonas, além de buscar metabólitos secundários ainda não descritos para a espécie. Ademais, objetiva-se a obtenção de um perfil cromatográfico por CLAE para futuros fins de quantificação. Finalizando, o estudo propõe-se a avançar em testes farmacológicos relacionados a duas atividades: anti-hipernociceptiva, considerando seu uso popular e os estudos já apresentados; e atividade gastroprotetora, por existir espécie do gênero com tal potencial e pela presença significativa de xantonas, metabólitos secundários estes com atividade anti-úlcera já descrita (BANERJI et al., 1994; BO; LIU, 2004).

3.5 Aspectos gerais relacionados à úlcera

A úlcera é causada por um desequilíbrio entre os fatores agressivos e de proteção da mucosa gástrica. Tem sido, por mais de um século, uma importante causa de morbidade e mortalidade. Também, avalia-se que os gastos com o tratamento desta doença alcancem mais de cinco bilhões de dólares por ano nos Estados Unidos, além dos custos de medicamentos, não computados neste valor (CHAN; LEUNG, 2002; LU; GRAHAM, 2006; RODRIGUES et al., 2008). Em países industrializados, estima-se que aproximadamente 10% da população seja afetada por esta patologia, sendo que apenas no continente americano mais de dois milhões de adultos sofrem desta doença em alguma fase de sua vida. Em termos de 37

prevalência, verifica-se que a úlcera afeta mais homens (11 a 20%) do que mulheres (8 a 11%) (KLOPELL et al., 2007). De modo geral, na úlcera gástrica, a lesão é provocada por uma redução da capacidade protetora da mucosa, diminuindo a secreção de bicarbonato e de muco, além de reduzir a reepitelização. Com isto, a mucosa fica mais suscetível à permeação do ácido gástrico, sendo assim lesionada e permitindo, também, a lesão da submucosa. Os mastócitos presentes nesta submucosa, bem como na lâmina própria, degranulam e liberam a histamina, um dos agentes responsáveis por estimular a secreção de ácido clorídrico e promover a inflamação local. O ácido ainda pode atingir vasos sanguíneos e estimular nervos presentes na parede gástrica, gerando contrações exacerbadas (RODRIGUES et al., 2008). A reepitelização também serve como mecanismo de defesa na garantia de funcionamento da barreira mucosa. Fatores que reduzem a proliferação celular, como radicais livres, citocinas inflamatórias e estresse fisiológico, acabam por propiciar o desenvolvimento de lesão. Também, o rompimento desta barreira, especialmente por AINEs, facilita a entrada de íons H +, aumentando a acidose tecidual, o que contribui para a formação da úlcera (RODRIGUES et al., 2008). Assim, diversos fatores são responsáveis por sua formação, destacando-se a infecção por Helicobacter pylori , AINEs e estresse (LU; GRAHAM, 2006).

3.5.1 Úlcera relacionada à infecção por Helicobacter pylori

Durante a maior parte do século 20, acreditava-se que a principal causa da úlcera estomacal estava relacionada com a hiperestimulação estomacal, ou seja, o estômago, quando hiperestimulado, secretava ácido clorídrico de modo excessivo, gerando assim as lesões (HOBSLEY; TOVEY; HOLTON, 2008). Porém, mais recentemente, após o isolamento de H. pylori a partir de fragmentos de biópsia gástrica de pacientes com gastrite crônica e úlcera péptica por Warren e Marshall (Prêmio Nobel de Medicina 2005), vem se admitindo a interação deste microganismo na formação de úlceras (SIQUEIRA et al., 2007). Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativa, microaerófila e espiralada, em forma de S ou de bastonete curvo, com parede celular externa lisa, possuindo quatro a seis flagelos unipolares embainhados e com bulbo terminal. Provavelmente é o agente de infecção crônica mais comum em seres humanos, colonizando 38

especificamente a mucosa gástrica e microvilosidades gástricas das células epiteliais (SIQUEIRA et al., 2007). Geralmente o indivíduo é infectado na infância, porém H. pylori permanece latente por um longo período (LU; GRAHAM, 2008). Estima-se que metade da população esteja infectada por H. pylori , apesar de 80% destes não apresentarem evidências clínicas da doença. Porém, mesmo assim, a bactéria está relacionada à maioria das úlceras duodenais (90-95%) e gástricas (60-70%) (SIQUEIRA et al., 2007). H. pylori contribui diretamente na lesão das células gástricas através da liberação de citotoxinas vacuolizantes, bem como de enzimas tóxicas, como lipase, urease e protease, propiciando a formação da úlcera (SIQUEIRA et al., 2007). Além disto, a bactéria reduz a secreção de bicarbonato pelo duodeno, permitindo uma penetração substancial de íons H + e de outros agentes lesivos na mucosa, destruindo as células presentes. Também, a infecção por H. pylori parece estimular o reflexo vago-vagal que, somado com o dano direto à mucosa, inibição das células D e estimulação das células G, resulta em uma hipergastrinemia e aumenta a secreção de H +, contribuindo para a ulcerogênese (KONTUREK; KONTUREK; OCHMA ŃSKI, 2004).

3.5.2 Úlcera relacionada ao uso de anti-inflamatórios não-esteróides

Apesar de na década de 1950 as internações hospitalares por úlceras em países desenvolvidos terem começado a diminuir, foi observado um aumento significativo em internações por úlceras hemorrágicas e perfurações especificamente entre idosos. Este aumento foi justificado pelo maior uso de AINEs por estes indivíduos (CHAN; LEUNG, 2002). O uso destes anti-inflamatórios aumenta o risco de desenvolvimento de úlcera em quase vinte vezes. Dentre os fatores de risco associados estão o histórico de úlcera, idade avançada, altas doses de AINEs, uso de diferentes medicamentos desta classe e uso concomitante de corticosteróides e anticoagulantes (LU; GRAHAM, 2006). Os AINEs inibem a enzima ciclooxigenase (COX), importante na conversão de ácido araquidônico em prostaglandinas. Existem três isoformas desta enzima: COX-1, COX-2 e COX-3. Acredita-se que a última esteja de alguma forma relacionada à inflamação crônica, bem como ao Alzheimer e ao câncer (KAM; SO, 2009). Já a COX-2 está ligada ao processo inflamatório, enquanto que a COX-1 está 39

relacionada à manutenção da mucosa gástrica e à agregação plaquetária (LU; GRAHAM, 2006). Assim, com a inibição da COX-1, há um enfraquecimento na defesa da mucosa contra agentes agressores luminais (CHAN; LEUNG, 2002). Além da atuação sobre a COX, acredita-se que os AINEs estejam de alguma forma relacionados à diminuição da secreção de óxido nítrico (NO). Com isto há uma redução no fluxo sanguíneo local e na secreção de muco, além de estimular a adesão de neutrófilos através da promoção de síntese de TNF-α e leucotrienos. De fato, a adesão de neutrófilos à mucosa provoca a produção de espécies reativas de oxigênio, liberando proteases e obstruindo o fluxo sanguíneo capilar, sendo todos estes fatores relacionados à ulcerogênese (CHAN; LEUNG, 2002).

3.5.3 Úlcera relacionada ao estresse

Apesar de H. pylori e AINEs estarem presentes em muitos pacientes com úlcera, uma substancial porção destes (5-20%) apresenta a doença sem etiologia definida. Além disto, diversos indivíduos estão infectados pela bactéria ou usam um anti-inflamatório do tipo não-esteróide e não desenvolveram úlcera. Isto deixa claro que a ulcerogênese está atrelada, também, a fatores psicossomáticos. Apesar de não existirem estudos que indiquem uma relação direta entre o estresse psicológico e a úlcera, acredita-se que este seja um fator importante e passível desencadear a lesão (JONES, 2006). Sabe-se que o estresse fisiológico pode provocar úlcera de diversas formas. Uma delas envolve a peroxidação lipídica, que acaba por gerar espécies reativas de oxigênio, ocasionando comumente dano oxidativo na mucosa gástrica (RODRIGUES et al., 2008). Além disto, há um aumento na secreção de ácido clorídrico, redução no fluxo sanguíneo local e de produção de mucina (JONES, 2006). As lesões provocadas geralmente apresentam perda do epitélio superficial e necrose, porém raramente geram perfurações ou sangramento (STOLLMAN; METZ, 2005).

3.6 Algumas plantas estudadas com potencial gastroprotetor

O tratamento da úlcera evoluiu da vagotomia aos inibidores da bomba de prótons. Porém, mesmo com tamanho avanço, o interesse por terapias alternativas e o uso de plantas medicinais vem crescendo. De fato, os extratos de plantas são 40

promissoras fontes de novos fitofármacos, inclusive para o tratamento da úlcera (FALCÃO et al., 2008). Existem diversos estudos de produtos obtidos de fontes naturais que demonstram sua atividade gastroprotetora (SCHMEDA-HIRSCHMANN; YESILADA, 2005; ZAYACHKIVSKA et al., 2005). O Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) já estudou uma série de plantas com atividade gastroprotetora pronunciada. Através de uma abordagem quimiossistemática, Andrade et al. (2007; 2008) avaliaram o efeito do extrato hidroalcoólico, frações e de 3,15-dioxo-21-α-hidroxifriedelano obtidos de Maytenus robusta . O extrato foi testado frente a três diferentes modelos de indução de úlcera: por etanol, por AINEs e por estresse. Em todos eles, M. robusta demonstrou potencial gastroprotetor, além de ter sido capaz de diminuir o volume de secreção e a acidez do suco gástrico. Ademais, as frações hexano, clorofórmio e acetato de etila, bem como o terpeno isolado, foram capazes de prevenir a formação de úlcera pelo modelo de etanol/HCl em camundongos. Em outro estudo do grupo, foi evidenciado o potencial gastroprotetor de Eugenia umbelliflora , sendo esta atividade justificada parcialmente pela presença de diversos terpenos já descritos na literatura com atividade anti-úlcera (BITTENCOURT et al., 2009). Zanatta et al. (2009) avaliaram a atividade protetora sobre a mucosa gástrica do extrato alcaloídico de Galipea longiflora . Este foi capaz de inibir significativamente as lesões provocadas por etanol, AINEs e estresse, além de reduzir o volume e acidez de secreção gástrica. Verificando seu possível mecanismo de ação, foi evidenciado que essa atividade parece estar relacionada à via oxinitrérgica. Também, o alcalóide 2-fenilquinolina, isolado da planta, demonstrou prevenir a úlcera induzida por etanol. Santin et al. (2010), em um estudo de abordagem etnofarmacológica, validaram o potencial gastroprotetor de Achyrocline satureoides . O extrato hidroalcoólico da planta foi capaz de promover a proteção gástrica contra etanol e AINEs, além de produzir um aumento na secreção de muco, essencial para a proteção da parede gástrica. Também, Santin et al. (2011) demonstraram que o óleo essencial de Syzygium aromaticum e o seu constituinte majoritário, eugenol, inibiram a úlcera induzida por etanol e AINEs, estando este potencial gastroprotetor relacionado ao aumento de produção de muco, não sendo dependente da via oxinitrérgica nem dos grupamentos SHs. 41

3.7 Aspectos gerais relacionados à dor

No ano de 1996, a Associação Internacional para o Estudo da Dor definiu como dor “uma experiência sensorial e emocional desagradável, associada a dano presente ou potencial, ou descrita como tal” (STEEDS, 2009). Assim, a dor pode ser influenciada por diversos fatores intrínsecos à existência humana, tal como emoção e cognição (FARQUHAR-SMITH, 2007). Todavia, ao descrever dor como uma “experiência”, faz-se necessária uma distinção em relação à nocicepção. Esta se refere ao processo neuronal envolvendo a transdução e transmissão de um estímulo doloroso ao cérebro, enquanto que a dor já envolve uma relação com diversos outros sistemas sinalizadores e moduladores do SNC, além de abranger a percepção única de cada indivíduo ao estímulo (STEEDS, 2009). Este é o motivo pelo qual, ao estudarmos a dor em modelos animais, a referenciamos como nocicepção, visto que a percepção emocional do animal ao estímulo doloroso ainda não pode ser medida ou quantificada.

3.7.1 Fisiologia da nocicepção aguda

Quando o estímulo nociceptivo (seja ele mecânico, químico ou térmico) ativa os nociceptores periféricos, o sinal é conduzido através dos neurônios primários até o corno dorsal da medula espinhal. No corno dorsal, o neurônio primário realiza sinapse com o neurônio secundário que, cruzando a medula espinhal, envia a informação até o SNC. Suas aferências realizam uma segunda sinapse com neurônios terciários no núcleo lateral e medial do tálamo. Por fim, estes neurônios enviam sinais ao córtex somatossensorial primário e secundário, envolvidos com localização, duração e intensidade do estímulo nociceptivo (FARQUHAR-SMITH, 2007; VANDERAH, 2007; MARCHAND, 2008). Conforme mencionado, os estímulos nociceptivos podem ser diversos, porém, dependendo do tipo, a ativação dos nociceptores se dará de forma distinta. O estímulo mecânico é causado por um estiramento físico da terminação nervosa, ativando canais transmembranares. Estes canais, geralmente fechados, quando estimulados permitem o influxo de íons, resultando na despolarização da célula. Os 42

nociceptores térmicos respondem tanto ao estímulo frio (através de receptores TRAAK, TRPM8 e TREK-1) quanto quente (através de receptores TRPV1). Já os nociceptores químicos são ativados por íons e citocinas específicas, sendo estas substâncias pertencentes ao meio ou liberadas por células danificadas. Elas incluem íons (H + e K +), espécies reativas de oxigênio, histamina, serotonina, cininas, prostaglandinas, substância P, dentre outras (MEYR; STEINBERG, 2008; BASBAUM et al., 2009). A ativação dos nociceptores por estes diferentes estímulos acarretará em uma cascata de eventos. Moléculas inflamatórias pró-nociceptivas são liberadas na periferia produzindo hiperalgesia (resposta aumentada a um estímulo já doloroso). Estes mediadores estimulam os nociceptores diretamente ou os sensibilizam para estímulos subsequentes, ambos por meio de receptores ligados a segundos mensageiros (FAQUHAR-SMITH, 2007). Os nociceptores, que também são responsáveis pela transmissão do sinal, são divididos em três grupos: fibras A β, fibras A δ e fibras C. As fibras A β estão principalmente ligadas à condução de estímulos não-nociceptivos, como vibração e movimento. São mais mielinizadas com uma velocidade de condução rápida (35-75 m/s), estando relacionadas à modulação da nocicepção, ativando interneurônios inibitórios para a redução do estímulo nociceptivo. As fibras A δ são relativamente mielinizadas, com uma velocidade de condução menor que das fibras A β (5-30 m/s). São divididas em mecanonociceptores (sensíveis a estímulos mecânicos intensos e potencialmente danosos) e em polimodais (sensíveis a estímulos mecânicos, térmicos e químicos), sendo responsáveis pela primeira sensação dolorosa. Por fim, as fibras C são de pequeno calibre e amielinizadas, tendo uma velocidade de condução bem inferior às demais fibras (0,5-2 m/s). Possuem caráter polimodal, sendo responsáveis pela sensação dolorosa tardia (FARQUHAR-SMITH, 2007; VANDERAH, 2007; MARCHAND, 2008). Considerando a diferença de velocidade de transmissão do estímulo entre as fibras A δ e C, a nocicepção se apresenta de uma forma característica. Primeiramente, as fibras A δ transmitem rapidamente uma sensação nociceptiva breve e aguda, percebida exatamente no ponto de estímulo. Em seguida, as fibras C transmitem a sua informação com um pequeno retardo, resultando em uma sensação dolorosa mais profunda e difusa (MARCHAND, 2008). 43

Em seguida, o sinal nociceptivo é transmitido pelas fibras A δ e C até a medula espinhal, onde ocorre a primeira sinapse com os neurônios secundários, principalmente localizados nas regiões superficiais do corno dorsal (lâminas I e II) e lâmina V. Estes neurônios podem ser divididos em neurônios nociceptores específicos e em neurônios de faixa ampla (wide dynamic range – WDR). Os primeiros, como pode ser deduzido pelo nome, respondem exclusivamente ao estímulo nociceptivo. Já os do tipo WDR, respondem a estímulos que variam desde inofensivos até nociceptivos, visto que recebem informação tanto das fibras A δ e C quanto da A β (MARCHAND, 2008). Posteriormente, estes neurônios alcançam o tálamo por dois caminhos principais: trato espinatalâmico e trato espinoreticular. No tálamo, ocorre a segunda sinapse: os neurônios terciários do núcleo ventrobasal se conectam ao córtex primário e secundário, responsáveis pela sensação nociceptiva, enquanto que os do núcleo centromediano se conectam ao sistema límbico, responsável pelo caráter emocional da dor (MARCHAND, 2008).

3.7.2 Cronificação da dor

A dor aguda geralmente é descrita como sendo uma resposta normal e fisiológica a alguma forma de estímulo nociceptivo. Muitas vezes é, inclusive, descrita como uma reação saudável do organismo, permitindo identificar um desequilíbrio homeostátitco, indicando que alguma atitude deve ser tomada em relação à fonte geradora do estímulo (MEYR; STEINBERG, 2008). Porém, apesar de muitas vias de sinalização serem as mesmas já descritas para a dor aguda, a dor crônica passa a ser considerada um processo patológico (MEYR; SAFFRAN, 2008). A dor crônica pode ser definida como uma dor sem estímulo contínuo ou patologia definida que dura mais que o período normal de cura e recuperação (MEYR; SAFFRAN, 2008). Ela tipicamente é de origem inflamatória ou neuropática, sendo caracterizada pelo aumento da percepção dolorosa a um estímulo nociceptivo (hiperalgesia) e pela percepção alterada de estímulos táteis e térmicos (alodínia) (VANDERAH, 2007). A cronificação da dor é resultante de um processo de sensibilização periférica e central, processo este possível devido ao caráter dinâmico da dor e das vias 44

envolvidas, através de mecanismos excitatórios e inibitórios (MARCHAND, 2008; MEYR; SAFFRAN, 2008). A sensibilização periférica é resultante de mudanças no ambiente químico dos nociceptores associadas à inflamação. Assim, com o dano tecidual, há um acúmulo de fatores liberados tanto pelos próprios nociceptores quanto por células não-neurais, tais como mastócitos, basófilos, plaquetas, macrófagos, neutrófilos, células endoteliais, queratinócitos e fibroblastos. Dentre tais fatores encontram-se neurotransmissores, peptídeos, eicosanóides, neurotrofinas, citocinas, quimiocinas, proteases extracelulares e íons H +. Toda esta “sopa inflamatória” ativa os nociceptores, sensibilizando-os (FARQUHAR-SMITH, 2007; BASBAUM et al., 2009). Já a sensibilização central está associada a uma alta frequência de estimulação de fibras C, que pode acabar provocando um somatório de seus potenciais, visto a condução relativamente lenta destas fibras. Isto gera um aumento na percepção ao segundo estímulo, promovendo uma excitabilidade dos neurônios secundários, podendo levar à sensibilização central. Além disto, a estimulação de uma área maior irá ativar mais nociceptores que em uma área menor, resultando em uma percepção dolorosa mais intensa. Ainda, a ativação intensiva das fibras C, tanto por estímulo repetido, quanto por um estímulo tônico, leva à sensibilização central mudando a resposta dos neurônios secundários. A ativação prolongada de receptores NMDA leva à transcrição de genes de expressão imediata (c-fos, c-jun), resultando na expressão aumentada destes receptores e sensibilizando as fibras secundárias (MARCHAND, 2008) (Figura 5).

Epidemiologicamente, a dor crônica causa um grande impacto à saúde dos indivíduos, aos serviços de saúde e à sociedade de uma forma geral, podendo ser considerada uma síndrome mundial (SMITH; MACFARLANE; TORRANCE, 2007). Tomando como exemplo a dor lombar, nos Estados Unidos, estima-se que ela seja responsável pela perda de mil e quatrocentos dias de trabalho por mil habitantes por ano. Na Europa, é a causa mais frequente de limitação em pessoas com menos de 45 anos e a segunda causa mais frequente de consulta médica (KRELING; CRUZ; PIMENTA, 2006). No Brasil, em estudo realizado por Kreling, Cruz e Pimenta (2006) com 505 servidores da Universidade Estadual de Londrina (Paraná), com idade variando entre 22 e 69 anos, demonstrou uma prevalência de 61,4% de dor crônica. Também observaram que houve uma maior frequência de dor crônica em mulheres e que a maior prevalência de local da dor foi face e boca (26,7%), seguido de região lombar, sacro e cóccix (19,4%). O estudo citado corroborou com dados já consistentes na literatura, visto que as mulheres apresentam maiores riscos de desenvolverem dor crônica ao longo de sua vida. Além disto, estima-se que com o aumento da idade do indivíduo, há também um aumento na prevalência de dor crônica, sendo este risco potencializado pela predisposição genética. Dentre os fatores ambientais, pode-se destacar como potencialmente predisponentes o estresse, a ansiedade, depressão, estilo de vida e aspectos ocupacionais (SMITH; MACFARLANE; TORRANCE, 2007; MARCHAND, 2008). Conforme apontado recentemente por Grubb (2010), ainda há uma grande carência no diagnóstico e métodos de prevenção da dor crônica. Tão preocupante quanto, há uma falta de alternativas terapêuticas efetivas. Esta é uma informação inquietante, visto que dados recentes evidenciam que 44% de indivíduos com dor crônica em tratamento com opióides fizeram o uso de alguma terapia complementar e alternativa nos últimos 12 meses, sendo que a prevalência de usuários deste tipo de terapia varia, conforme o estudo, de 35 a 63%. Se considerarmos que pouquíssimas terapias alternativas têm comprovação científica e são consideradas efetivas, temos uma informação realmente alarmante (LEE; RAJA, 2010). Porém, apesar da complexidade fisiopatológica da dor crônica, existem diversos alvos potenciais para o desenvolvimento de novos fármacos, destacando- se: agonistas dos receptores canabinóides, bloqueadores dos canais de K + e dos 47

canais de Na + e Ca 2+ voltagem dependentes, inibidores do fator de crescimento neural, de quimiocinas e de citocinas pró-inflamatórias, além de antagonistas dos receptores de glutamato, neurocininas e cininas. Assim, estes dados reforçam a necessidade de maiores investigações quanto a novos fármacos potencialmente ativos (GRUBB, 2010).

3.8 Algumas plantas estudadas com potencial antinociceptivo

O tratamento da dor, especialmente crônica, é bastante limitado, geralmente envolvendo o uso de AINEs e, algumas vezes, de fármacos de ação central, como opióides, anticonvulsivantes ou antidepressivos (MARCHAND, 2008). Porém, o uso de tais medicamentos acarreta em uma série de efeitos adversos, além de sua baixa eficácia, o que muitas vezes acaba por reduzir a adesão ao tratamento. Assim, diversas plantas já foram estudadas como potenciais fontes de fitomedicamentos para o tratamento da dor (CALIXTO et al., 2000). O NIQFAR/UNIVALI já estudou uma série de plantas com potencial antinociceptivo, tendo publicado diversos artigos científicos na área. Algumas plantas merecem especial destaque, como Marrubium vulgare . Foi demonstrado que o extrato hidroalcoólico desta planta promoveu efeito antinociceptivo em modelos de dor aguda em camundongos, estando sua ação atrelada à inibição de diferentes agentes pró-inflamatórios (DE SOUZA et al., 1998). Seu constituinte majoritário, marrubiina, foi eficaz enquanto inibindo a nocicepção induzida por diferentes agentes em modelos clássicos de dor em camundongos (DE JESUS et al., 2000) De grande importância também foram os estudos realizados com espécies do gênero Rubus . Niero et al. (2002) evidenciaram o potencial antinociceptivo do extrato metanólico dos ramos e das raízes de R. imperialis , bem como das frações obtidas por particionamento com hexano, clorofórmio e acetato de etila. Também demonstraram o efeito do niga-ichigosídeo F1, isolado da fração acetato de etila das partes aéreas de R. imperialis nos modelos de dor induzida por ácido acético e por formalina (NIERO et al., 1999). Posteriormente, Ardenghi et al. (2006) verificaram que a atividade do niga-ichigosídeo F1 está relacionada aos sistemas dopaminérgico, colinérgico, glutamatérgico, taquicinérgico e oxinitrérgico. Em estudos realizados com a espécie R. rosaefolius , pôde-se constatar a ação 48

antinociceptiva dose-dependente de seu extrato hidroalcoólico das partes aéreas, bem como do composto isolado ácido 28-metoxitormentico (KANEGUSUKU et al., 2000). Outra planta que vem sendo estudada exaustivamente pelo grupo é a Aleurites moluccana . Demonstrou-se que o extrato bruto e, especialmente, a fração hexânica da planta apresentaram significativa atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. A via de ação parece não envolver o sistema opióide, tampouco a liberação de glicocorticóides endógenos (MEYRE-SILVA, 2003). Um dos metabólitos isolados que explica, em parte, a ação do extrato de A. moluccana é o flavonóide 2”-O-ramnosil-swertisina, que foi cerca de 16 vezes mais potente do que a aspirina no modelo de contorções abdominais (MEYRE-SILVA, 1999). Estes promissores resultados viabilizaram uma parceria entre a UNIVALI e a indústria Eurofarma, propiciando o desenvolvimento de um novo fitoterápico de ação analgésica e anti-inflamatória de uso oral que já conta com patente depositada nacional e internacionalmente (CECHINEL-FILHO, 2009). Mais recentemente, De Souza et al. (2009) descreveram a atividade antinociceptiva de filiceno, um triterpeno isolado das folhas de Adiantum cuneatum . O composto foi capaz de inibir de forma dose-dependente as contorções abdominais induzidas por ácido acético. Através do estudo de mecanismo de ação, foi evidenciado que parece envolver uma interação entre os sistemas colinérgico, dopaminérgico, glutamatérgico, GABAérgico e taquicinérgico. Também, Da Silva et al. (2010) demonstraram a capacidade inibitória de contorções abdominais induzidas por ácido acético e de nocicepção induzida por capsaicina e carragenina do composto orientina, isolado de Piper solmsianum . Hess et al. (2010) averiguaram o potencial antinociceptivo do ácido mirsinóico B, isolado de espécies do gênero Rapanea , constatando que ele possui capacidade inibitória sobre diferentes modelos de avaliação, envolvendo principalmente vias relacionadas ao NO, aos α-adrenoceptores, bem como os sistemas serotoninérgico e colinérgico. Quintão et al. (2010) demonstraram a atividade anti-hipernociceptiva do óleo essencial obtido das folhas de Ugni myricoides . Sua atividade, bem como de seu constituinte majoritário α-pireno, foi evidenciada em modelos de hipernocicepção mecânica induzida por carragenina e CFA. Também, o óleo essencial inibiu a hipernocicepção neuropática após constrição parcial do nervo ciático.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais e equipamentos

Os seguintes solventes e drogas foram utilizados: hexano, clorofórmio, acetato de etila, acetona, etanol, metanol, ácido clorídrico, ácido acético e hidróxido de sódio (Dinâmica ®); acetonitrila e metanol grau CLAE (Tedia ®); piridina, metanol e clorofórmio deuterados (CIL.Inc); éter etílico (Isofar ®); indometacina, omeprazol, cimetidina, carragenina, adjuvante completo de Freund, L-NAME, NEM e betanecol (Sigma ®); hidrado de cloral (Vetec ®). Além disto, foram utilizadas placas de sílica gel 60 F254 e sílica gel 60 (0,063-0,200 para cromatografia em coluna aberta e 0,040-0,063 para cromatografia flash) fornecidas pela Merck ®; coluna cromatográfica para CLAE C 18 (Phenomenex ®). Os principais equipamentos utilizados foram os seguintes: espectrômetro de RMN AC-300 (Bruker ®), cromatógrafo líquido de alta eficiência (Shimadzu ®) e von Frey eletrônico (Insight®)

4.2 Análise fitoquímica

4.2.1 Material vegetal

Polygala cyparissias foi primeiramente coletada em novembro de 2007 na Praia da Esplanada, em Santa Catarina, sendo esta utilizada para fitoquímica inicial e ensaios gastroprotetores. Posteriormente foi coletada em março de 2009 e em janeiro de 2010 na praia de Navegantes, também em Santa Catarina. Com o extrato oriundo da coleta de 2009 foram realizados os ensaios anti-hipernociceptivos e os experimentos por CLAE. Já o obtido da coleta de 2010 foi utilizado para isolar novamente metabólitos já isolados, objetivando obter maior quantidade dos mesmos. Um exemplar foi submetido para análise botânica no Herbário FLOR da Universidade Federal de Santa Catarina, sendo este identificado pela Professora Leila da Graça Amaral, sob o número de depósito 22.744. Após a secagem a temperatura ambiente em sala com controle de umidade por um tempo médio de três semanas, o material vegetal foi triturado e acondicionado para posterior preparação dos extratos.

4.2.2 Obtenção dos extratos

O material obtido em 2007 (1,3 kg de material fresco) e, posteriormente, o de 2010 (1,55 kg de material seco), foram triturados e submetidos a um processo de extração com acetona por sete dias, objetivando a extração direcionada das xantonas já descritas (PINHEIRO et al., 1998), obtendo-se os extratos denominados PCTL-1 (2007) e PCTL-15 (2010). Em seguida, os materiais vegetais foram submetidos à extração com metanol pelo mesmo período, visando a extração dos compostos mais polares não obtidos no primeiro processo. Por fim, os extratos metanólicos foram particionados com clorofórmio para extrair compostos mais apolares do extrato que não foram totalmente extraídos pela acetona, gerando as frações clorofórmicas PCTL-2A e PCTL-16A e as frações metanólicas PCTL-2B e PCTL-16B, de 2007 e 2010, respectivamente. Após filtragem dos extratos, o solvente foi removido por destilação em evaporador rotatório sob pressão reduzida, para obtenção dos respectivos extrato e frações. Já o material coletado em 2010 (13,57 g) sofreu o mesmo procedimento descrito acima, porém a extração foi realizada direta e unicamente com metanol.

4.2.3 Purificação e identificação dos compostos isolados

Em um primeiro momento, 23,5 g do extrato acetônico (PCTL-1) obtido da planta coletada em 2007 foi submetido à cromatografia em coluna aberta (CC1), utilizando 290g de sílica, coluna de Ø de 6 cm e frações coletadas com volume de aproximadamente 20 ml. O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 1. Tal gradiente foi escolhido baseado na observação prévia do comportamento do extrato frente a diferentes eluições do mesmo em cromatografia em camada delgada (CCD). As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente, agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 2.

Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato acetônico (23,5g) de P. cyparissias. Eluente % Volume eluído (ml) Frações obtidas Hexano/AcOEt 95:5 500 1-14 Hexano/AcOEt 90:10 500 15-55 Hexano/AcOEt 80:20 500 56-93 Hexano/AcOEt 50:50 250 94-118 AcOEt 100 250 119-141 AcOEt/MeOH 80:20 250 142-166 AcOEt/MeOH 50:50 150 167-181 MeOH 100 200 182-193

Tabela 2: Junção das frações obtidas na CC1. Frações Rendimento (mg) Rendimento (%) PCTL-3A (1-16) 212 0,90 PCTL-3B (17-54) 205 0,87 PCTL-3C (55-78) 189 0,80 PCTL-3D (79-95) 192 0,81 PCTL-3E (96-139) 242 1,03 PCTL-3F (140-158) 513 2,18 PCTL-3G (159-191) 5910 25,15

As frações estudadas, considerando seu perfil cromatográfico em CCD, foram: PCTL-3C, -3D e -3E. A fração PCTL-3C foi submetida à cromatografia em coluna flash (CC flash 1) (Ø = 2 cm) com 19 g de sílica. A eluição foi realizada de modo isocrático com hexano/AcOEt (80:20), levando à obtenção de 60 frações de aproximadamente 8 ml cada, sendo que a fração PCTL-4A (61 mg) apresentou perfil cromatográfico promissor em CCD. A esta fração foi adicionado metanol e levado a aquecimento brando. Em seguida, após solubilização do material obtido na fração, este foi levado à refrigeração, promovendo a recristalização de um material amorfo e de coloração branca. O material foi filtrado e o retido (PCTL-5) (32,3 mg) demonstrou apenas uma banda quando eluído com diferentes fases móveis em CCDs e reveladas com anisaldeído sulfúrico, sendo denominado como PC1. 52

A fração PCTL-3D foi cromatograda em CC flash (CC flash 2) (Ø = 2 cm), com 20 g de sílica e eluída isocraticamente com hexano/AcOEt (60:40). Foram obtidas 18 frações de aproximadamente 8 ml cada, sendo que PCTL-6B (18 mg) formou cristais de coloração amarelada e, quando eluído em CCDs com diferentes fases móveis, obteve-se apenas uma banda quando reveladas com cloreto férrico ou anisaldeído sulfúrico. Foi denominado PC2 e enviado para elucidação estrutural por RMN. A fração PCTL-3E foi submetida à cromatografia flash (CC flash 3) (Ø = 2 cm), com 22 g de sílica. A eluição foi isocrática com hexano/AcOEt (60:40), obtendo- se 66 frações de aproximadamente 8 ml cada. A fração PCTL-7B (9,5 mg) formou cristais amarelados e, em CCDs eluída com diferentes fase móveis e reveladas com cloreto férrico ou anisaldeído sulfúrico, apresentou apenas uma banda, denominado como PC3. O material foi encaminhado para RMN para elucidação estrutural. Todas as CC flash que seguem foram eluídas com hexano/AcOEt (60:40). A fração PCTL-7C (73 mg) foi cromatografada novamente (CC flash 4) (Ø = 1 cm; 5,5 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se 66 frações. PCTL-8A (54 mg) foi novamente cromatografada (CC flash 5) (Ø = 1 cm; 6,4 g de sílica; frações de 5 ml), sendo isolado mais 3,5 mg do composto PC3 (PCTL-9A). A fração PCTL-9B (23 mg) foi recromatografada (CC flash 6) (Ø = 1 cm; 7,1 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo- se a fração PCTL-10A (1,2 mg), identificada como PC3, PCTL-10C (5,7 mg), identificada como PC4 e PCTL-10B (16 mg), uma mistura de ambos. Assim, PCTL- 10B foi novamente submetida à CC flash (CC flash 7) (Ø = 1 cm; 8,7 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se fração PCTL-11A (3,2 mg) como PC3, PCTL-11B (5 mg) como mistura de PC3 e 4 e PCTL-11C (6,1 mg) como PC4. A fração PCTL-9C (15 mg) da CC flash 5 foi recromatografada (CC flash 8) (Ø = 1 cm; 8,7 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se as frações PCTL-12A (2,1 mg), identificada como PC3, PCTL-12B (3 mg), como mistura de PC3 e 4 e PCTL-12C (5,1 mg) como PC4. A fração PCTL-7D (18 mg) da CC flash 3 foi submetida a nova cromatografia (CC flash 9) (Ø = 1 cm; 8,6g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se a fração PCTL-13B (0,9 mg) de PC4 e a fração PCTL-13C (7 mg), como mistura de PC3 e 4. Esta foi cromatografada (CC flash 10) (Ø = 1 cm; 8,7 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se as frações PCTL-14A (1,0 mg), identificada como PC3, PCTL-14B (0,4 mg), uma mistura de PC3 e 4 e PCTL-14C (0,1 mg) como PC4. Na figura 6 encontra-se um organograma da sequência de isolamento. 53

CC1

CC flash 1 CC flash 2 CC flash 3

Recristalização CC flash 4 CC flash 9

CC flash 5 CC flash 10

CC flash 6 CC flash 8

CC flash 7

Figur

54 a 6: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-1). Em cinza destacado os compostos isolados. 55

Posteriormente foram realizados novos procedimentos de purificação com parte do extrato obtido a partir da coleta de janeiro de 2010. Todavia, visando a obtenção direcionada dos compostos já isolados (PC1-4), adotou-se nova metodologia para o isolamento destes. Assim, 20 g do extrato acetônico (PCTL-15) foi submetido à coluna aberta (CC2), utilizando 397 g de sílica, coluna de Ø de 6 cm e frações coletadas com volume de aproximadamente 250 ml (exceto quando observada alteração de coloração da fração). O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 3.

Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento do extrato acetônico de P. cyparissias. Eluente % Volume eluído (ml) Frações obtidas Hexano/Acetona 85:15 1200 1-4 Hexano/Acetona 75:25 1200 5-8 Hexano/Acetona 65:35 800 9-11 Hexano/Acetona 50:50 800 12-15 Acetona 100 800 16-19 MeOH 100 500 20

As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente, agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 4.

Tabela 4: Junção das frações obtidas na CC2. Frações Rendimento (mg) Rendimento (%) PCTL-17A (1-2) 2450 12,25 PCTL-17B (3) 313 1,56 PCTL-17C (4-5) 421 2,10 PCTL-17D (6-7) 1523 7,62 PCTL-17E (8-9) 170 0,85 PCTL-17F (8’-9’+10-11) 958 4,79 PCTL-17G (12-13) 342 1,71 PCTL-17H (14-20) 7999 40,00

As frações 8 e 9 foram reunidas e lavadas repetidas vezes com clorofórmio, originando a fração 8’-9’ (solúvel em clorofórmio) que foi reunida às frações 10 e 11 por semelhança química. Objetivando o reisolamento das xantonas PC2-4, optou-se por seguir a purificação com a fração PCTL-17E, visto que esta se encontrava enriquecida nas mesmas. Assim, realizou-se cromatografia flash (CC flash 11) (Ø = 2 cm; 21 g de sílica; 3 ml por fração), eluída com DCM/AcOEt (80:20), levando a obtenção de 80 frações. Estas foram reunidas por semelhança química conforme a tabela 5.

Tabela 5: Junção das frações obtidas na CC flash 11. Frações Rendimento (mg) Rendimento (%) PCTL-18A (1-22) 18 0,09 PCTL-18B (23-31) 45 0,22 PCTL-18C (32-40) 35 0,17

As frações PCTL-18B e -18C foram submetidas, separadamente, a repetidas CCDs preparativas (CCDPs). Em cada placa (20 x 20 cm) não foram aplicados mais que 10 mg de amostra, sendo a altura de eluição de 16 cm, com fase móvel constituída de benzeno/AcOEt (8:2). Cada placa foi eluída por três vezes objetivando uma melhor separação dos constituintes. Ao fim das repetidas CCDPs, obteve-se 22,6 mg de PC3, além de ter sido possível isolar outro composto ainda não isolado até então, denominado PC5 (12,3 mg). Um organograma para o adequado entendimento encontra-se ilustrado na figura 7. 57

CC2

CC flash 11

CCDPs

Figur a 7: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-15). Em cinza destacado os compostos isolados.

Além do extrato acetônico, a fração metanólica (14,2 g) obtida da coleta de 2007 (PCTL-2B) também foi estudada fitoquimicamente. Esta foi submetida à cromatografia aberta (CC3), utilizando 246 g de sílica e uma coluna de Ø = 5 cm. As frações foram coletadas com volume de aproximadamente 250 ml (exceto quando observada alteração de coloração da fração). O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 6. Da mesma forma que na CC1, o gradiente foi escolhido baseado na observação prévia do comportamento do extrato frente a diferentes eluições do mesmo em CCD.

Tabela 6: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da fração metanólica de P. cyparissias. Eluente % Volume eluído (ml) Frações obtidas DCM 100 500 1 DCM/MeOH 95:05 1300 2-9 DCM/MeOH 90:10 400 10 DCM/MeOH 80:20 700 11-13 DCM/MeOH 50:50 800 14-16 MeOH 100 400 17

As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente, agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 7.

Tabela 7: Junção das frações obtidas na CC3. Frações Rendimento (mg) Rendimento (%) PCTL-20A (1-3) 93 0,46 PCTL-20B (4-9) 407 2,04 PCTL-20C (10-12) 524 2,62 PCTL-20D (13-15) 4429 22,14 PCTL-20E (16) 3034 15,17 PCTL-20F (17) 1253 6,26

Considerando os perfis cromatográficos e os rendimentos, a fração PCTL-20D foi recromatografada em coluna aberta (CC4) (226 g de sílica; Ø = 4,5 cm; 10 ml por fração). O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 8.

Tabela 8: Gradiente de eluição da CC4 na purificação da fração 13-15 da CC3. Eluente % Volume eluído (ml) Frações obtidas DCM/AcOEt/MeOH 60:20:20 800 1-45 DCM/AcOEt/MeOH 50:30:20 400 46-77 DCM/AcOEt/MeOH 30:40:30 300 78-100 MeOH 100 300 101

As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente, agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 9.

Tabela 9: Junção das frações obtidas na CC4. Frações Rendimento (mg) Rendimento (%) PCTL-21A (1-7) 32 0,22 PCTL-21B (8-26) 38 0,27 PCTL-21C (27-82) 577 4,06 PCTL-21D (83-100) 734 5,17 PCTL-21E (101) 1012 7,13

A fração PCTL-21B foi submetida a repetidas CCDPs. Em cada placa (20 x 20 cm) não foram aplicados mais que 10 mg de amostra, sendo a altura de eluição de

16 cm, com fase móvel constituída de AcOEt/Acetona/MeOH/H 2O/MeCOOH (25:8:3:1:1). Cada placa foi eluída por três vezes objetivando uma melhor separação dos constituintes. Ao fim das repetidas CCDPs, obteve-se 16,8 mg de PC6. Um organograma para o adequado entendimento encontra-se ilustrado na figura 8.

CC3

CC4

CCDPs

Figura 8: Organograma de isolamento dos compostos da fração metanólica de Polygala cyparissias (PCTL-2B). Em cinza destacado os compostos isolados.

4.2.4 Perfil cromatográfico do extrato de P. cyparissias

Para a obtenção de perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias foi utilizada CLAE acoplada a detector de arranjo de diodos. Este método foi escolhido pelas características químicas dos compostos obtidos, especialmente das xantonas. Estes metabólitos são caracterizados pela presença de quatro bandas de intensidade decrescente de absorção em espectros de ultravioleta. As bandas situam-se nos respectivos comprimentos de onda: 225 a 245 nm (banda I), 245-270 nm (banda II), 300 a 345 nm (banda III) e 335 a 410 (banda IV) (KUSTER; ROCHA, 2007).

4.2.4.1 Preparo das amostras

Foram pesados exatamente cerca de 20 mg de extrato metanólico de P. cyparissias (coleta de 2009), sendo este solubilizado por sonicação em metanol e o volume ajustado em balão volumétrico para 10 ml. A solução foi filtrada em filtro de celulose regenerada (Ø do poro = 0,45 µm), sendo posteriormente disponibilizada para as análises. Já como padrão, foi eleita a xantona PC3 visto a quantidade de material disponível. Para verificar seu grau de pureza, foi preparada uma solução 0,55 mg/ml, solubilizada em uma mistura de ACN/MeOH (1:1), com auxílio de sonicação. Esta solução também foi filtrada conforme já descrito e analizada.

4.2.4.2 Desenvolvimento do método cromatográfico

Objetivando uma adequada separação dos compostos presentes no extrato de P. cyparissias , vários métodos cromatográficos foram testados. Em todos eles a temperatura do forno foi de 30 °C, o volume de injeção de 20 µl, o monitoramento em 254 nm e a coluna utilizada foi uma C 18 (250 mm). O único método isocrático utilizado (método 3) empregou como fase móvel uma mistura de ACN, MeOH e água acidificada (TFA 0,0125%, pH = 2,9) em uma proporção de 10:10:80. Os métodos com gradiente encontram-se descritos nas Tabelas 10 a 16.

Tabela 10: Descrição do método 1. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = MeOH. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) 0 95 5 60 0 100

Tabela 11: Descrição do método 2. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) 0 80 20 5 70 30 6 60 40 60 0 100 65 0 100 70 80 20

Tabela 12: Descrição do método 4. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) 0 98 2 10 80 20 11 70 30 31 50 50 41 30 70 46 30 70 48 98 2 53 98 2

Tabela 13: Descrição do método 5. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) 0 98 2 60 0 100

Tabela 14: Descrição do método 6. A = H 2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) C (%) 0 97 1 2 60 0 30 70

Para os dois últimos métodos empregados, optou-se por acidificar a água com ácido acético a uma concentração de 2%, a fim de verificar o potencial impacto da mudança do agente acidificante sobre o perfil cromatográfico. Apesar desta mudança, o pH foi mantido (pH = 2,9).

Tabela 15: Descrição do método 7. A = H 2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) C (%) 0 97 1 2 5 97 1 2 10 80 10 10 15 80 10 10 18 70 15 15 23 70 15 15 33 60 20 20 36 60 20 20 41 50 20 30 46 50 20 30 51 30 20 50 54 30 20 50 59 20 25 55 62 20 25 55 67 10 30 60 70 10 30 60 75 0 30 70 80 0 30 70 85 97 1 2

O método 8, descrito na tabela 16, foi considerado adequado para obtenção do perfil cromatográfico do extrato metanólico. Levando isto em consideração, o padrão (PC3) também foi analisado conforme o mesmo método.

Tabela 16: Descrição do método 7. A = H 2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 0,8 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) C (%) 0 90 5 5 5 80 10 10 7 80 10 10 10 75 10 15 15 75 10 15 20 70 15 15 25 70 15 15 30 65 15 20 35 65 15 20 40 60 20 20 45 60 20 20 47 55 20 25 50 55 20 25 55 50 20 30 60 40 20 40 65 30 20 50 70 30 20 50 75 20 25 55 80 10 35 55 85 0 60 40 90 90 5 5

4.3 Testes farmacológicos

4.3.1 Animais

Nos testes farmacológicos foram utilizados camundongos Swiss machos e fêmeos, pesando entre 25-40 g provenientes do Biotério Central da UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em sala com temperatura mantida a aproximadamente 25 °C e ciclo claro/escuro controlado, com ração e água ad libitum . Para os experimentos de atividade gastroprotetora, os animais foram mantidos em jejum por doze horas antes da realização dos experimentos, sendo adicionada à caixa uma grade para inibir a coprofagia e tiveram livre acesso à água. Os protocolos experimentais foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVALI, sendo aprovado sob o número 414/09 (Anexo C).

4.3.2 Avaliação da atividade gastroprotetora

Na avaliação da atividade anti-úlcera foram realizados experimentos embasados nos fatores etiológicos da doença no homem, como o aumento da acidez e da secreção do suco gástrico, uso de AINEs e abuso de álcool etílico. Cada experimento constituiu-se dos grupos testes, controle positivo e negativo (veículo), dependendo da necessidade de cada modelo. Todos os experimentos foram realizados com o auxílio da equipe do Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade.

4.3.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl

A metodologia que foi utilizada foi descrita por Mizui e Doteuchi (1983), com modificações. Após jejum de 12 horas, os camundongos foram divididos em diferentes grupos (n=6). O controle positivo foi tratado com omeprazol 30 mg/kg (0,08 mmol/kg), o controle negativo recebeu o veículo e os grupos tratados receberam o extrato/frações nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg. Quando utilizado os compostos isolados, as doses foram de 0,12 mmol/kg (PC1), 0,19 mmol/kg (PC2) e 0,18 mmol/kg (PC3). Transcorrido uma hora e meia, foram administrados aos animais 0,5 ml de solução etanol/HCl (60%/0,3 M) (agente lesivo) por via oral e, após mais uma hora e 66

meia, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, os estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior e, após serem esticados, foram colocados entre placas de vidro para que as imagens pudessem ser captadas através de scanner e analisadas pelo software EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e seus tamanhos. Posteriormente, realizou-se a determinação da área total de lesão (mm²), o percentual de área lesada, o índice de gastroproteção (IG) em porcentagem e o índice de lesões ulcerativas (ULI) calculado através da severidade das lesões da mucosa gástrica. Para tanto, as úlceras foram classificadas em tipo 1 (área de úlcera menor que 1mm²), tipo 2 (área de úlcera entre 1 e 3 mm²) e tipo 3 (área de úlcera maior que 3 mm²). Em seguida, o ULI foi calculado com base na seguinte fórmula:

ULI = 1 x (T1) + 2 x (T2) + 3 x (T3) onde T1, T2 e T3 são, respectivamente, o número de úlceras do tipo 1, do tipo 2 e do tipo 3. O IG foi calculado através da seguinte fórmula:

IG = 100 – (ULI tratado x 100 / ULI controle )

4.3.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteróide associada à estimulação parassimpaticomimética

A metodologia utilizada foi adaptada daquela descrita por Rainsford (1980). Após o jejum de 12 horas, os camundongos foram divididos em diferentes grupos (n=6). O controle positivo foi tratado com cimetidina 100 mg/kg, o controle negativo com o veículo e os grupos tratados com o extrato/fração nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg. Após uma hora e meia da administração, os animais receberam 100 mg/kg de indometacina por via oral, associada à betanecol via intraperitonial na dose de 5 mg/kg em solução fisiológica. Após cinco horas da administração de indometacina os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao longo da curvatura maior. Após serem esticados, os estômagos foram colocados entre placas de vidro para que as imagens pudessem ser captadas através de scanner e analisadas pelo software EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e seus 67

tamanhos. Posteriormente realizou-se a determinação da área total de lesão, percentual de área lesada, IG e ULI, conforme descrito anteriormente.

4.3.2.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético

A metodologia utilizada foi adaptada daquela descrita por Takagi, Okabe e Saziki (1969). Antes da indução da úlcera, os animais sofreram uma adaptação contra o estresse causado durante a administração das doses, sendo necessária a restrição alimentar por 2 horas diárias (9:00 às 10:00 e 17:00 às 18:00). O acesso à água foi mantido livre e duas vezes ao dia (10:30 e 18:30) foi administrado 0,5 ml de água, por três dias. Passado este período, os animais foram deixados em jejum de 12 horas nas condições já descritas. Após anestesia com tiopental sódico, foram e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide. Com a exposição do estômago, foi injetado na camada subserosa da parede externa do órgão 50 µl de solução de ácido acético 20% na face posterior e 50 µl de solução salina na face anterior. O local foi pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do líquido injetado. O estômago foi lavado com salina e a parede abdominal suturada. Após a recuperação dos animais, iniciou-se o tratamento (2x/dia). Por 7 dias o controle positivo foi tratado com cimetidina 100 mg/kg, o controle negativo com o veículo e os grupos tratados com o extrato/fração na dose de 125 mg/kg. Ao final do período de tratamento os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, e os estômagos retirados e abertos ao longo da curvatura maior. Após serem esticados, os estômagos foram colocados entre placas de vidro para que as imagens pudessem ser captadas através de scanner e analisadas pelo software EARP, a fim de determinar-se se houve regressão da lesão nos tratamentos quando comparados com o controle, onde realizou-se a determinação da área total de lesão e o percentual de área lesada.

4.3.3 Estudo do mecanismo de ação gastroprotetor

4.3.3.1 Participação do óxido nítrico

Para a realização deste experimento, foi utilizado o método descrito por Arrieta et al. (2003), com algumas modificações. Os camundongos foram separados em oito grupos (n=6), sendo que quatro grupos receberam o pré-tratamento com L- NAME (N-nitro-L-Arginina metil éster), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase, na dose de 70 mg/kg, i.p. e os quatro grupos restantes foram pré-tratados com salina, i.p. Após 30 minutos dos pré-tratamentos, aplicou-se o teste de indução de úlcera por etanol, utilizando como tratamento o extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissiass , na dose de 125 mg/kg, controle positivo (carbenoxolona 200 mg/kg) e controle negativo (veículo). Passado o tempo do teste (3h), os animais foram sacrificados e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o % de área lesada.

4.3.3.2 Participação dos grupamentos sulfidrilas

Para a avaliação dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção foi adotado o modelo de Matsuda e Yoshikawa (1999). Os animais foram separados em oito grupos (n=6), sendo que quatro grupos receberam o pré-tratamento com NEM (N- etilmaleimida), um quelante de grupamentos sulfidrila, na dose de 10 mg/kg, i.p. e os quatro grupos restante foram pré-tratados com salina, i.p. Após 30 minutos dos pré- tratamentos, foi aplicado o teste de indução de úlcera por etanol, utilizando como tratamento o extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias, na dose de 125 mg/kg, controle positivo (carbenoxolona 200 mg/kg) e controle negativo (veículo). Passado o tempo do teste (3h), os animais foram sacrificados e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se a % de área lesada.

4.3.4 Avaliação da atividade anti-Helicobater pilory

4.3.4.1 Cepa de Helicobater pilory

A cepa de Helicobater pilory ATCC 43504 utilizada foi cedida pelo laboratório de micro-organismos de referência da Fiocruz-RJ. Foi mantida congelada a – 70 ⁰C

no laboratório de imunologia da Universidade Regional de Blumenau. Para ativação, foi semeada em caldo Brucella e incubada a 35⁰C por 24-48 horas. Após esse

período, foi inoculada em ágar Brucella acrescido de 10% de sangue de carneiro e

incubada 48-72 horas a 35 ⁰C em condições de microaerofilia (85% N 2, 10% CO 2 e

5% O 2) e alta umidade. A identificação bacteriana foi realizada através da morfologia característica na coloração de Gram e testes bioquímicos de catalase, oxidase e urease positivos.

4.3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

O teste foi realizado pelo aluno de mestrado Alessandro Conrado de Oliveira Silveira, sob a orientação do Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz. A CIM foi determinada pelo método de diluição em ágar sólido, de acordo com as recomendações do Clinical Laboratory Standards Institute (2007). A partir de soluções estoque dos extratos de 40 mg/ml, foram realizadas diluições seriadas. Em vidros individuais, 50 70

µl de cada diluição foi adicionado à 950 µl de ágar Brucella acrescido de 10 % de sangue carneiro, líquido a 45-50 ⁰C, atingindo concentrações de 2.000, 1.000, 500,

250, 125, 62,5, 31,25 e 15,625 µg/ml. O inóculo bacteriano foi preparado baseado na escala turbidimétrica 0,5 de MacFarland. Após solidificação do meio de cultura, foi semeado 1 µl da suspensão bacteriana em cada vidro com os extratos diluídos em

ágar. Foram incubados em condições ideais de microaerofilia e umidade, a 35 ⁰C por

48-72 horas. A CIM foi definida como a menor concentração do extrato capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

4.3.5 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva

4.3.5.1 Análise do limiar mecânico através do von Frey eletrônico e monofilamento de Von Frey

Todos os experimentos foram realizados pela aluna de mestrado Nicole Anzanello Meira, sob a orientação da Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão. Para avaliar a hipernocicepção mecânica, os animais submetidos aos modelos de hipernocicepção mecânica induzida por diferentes agentes ou por procedimento cirúrgico foram colocados individualmente em compartimentos de acrílico transparentes (9 x 7 x 11 cm), localizados em uma plataforma de arame elevada para permitir o acesso à superfície ventral das patas traseiras. Os animais foram aclimatados por, pelo menos, 1 hora antes dos testes comportamentais para determinar o limiar mecânico basal. Após determinado esse parâmetro, os animais 71

foram tratados com o extrato, compostos isolados ou veículo e posteriormente, receberam uma injeção intraplantar do agente irritante. A hipernocicepção mecânica dos animais que receberam carragenina por via i.pl. foi avaliada através de um anestesiômetro eletrônico, que consiste em um transdutor de pressão conectado a um contador digital de força expressa em gramas. O contato do transdutor de pressão à pata dos animais é realizado por meio de uma ponteira descartável de polipropileno com 0.5 mm de diâmetro adaptada a este, que entre as malhas da rede de arame, é exercida uma pressão linearmente crescente no centro da planta da pata do camundongo até que o animal produza uma resposta caracterizada como sacudida (“ flinch ”) da pata estimulada. Os estímulos são repetidos por até seis vezes, em geral até o animal apresentar três medidas similares com uma clara resposta de “ flinch ” após a retirada da pata. A intensidade de hipernocicepção é quantificada como a variação na pressão obtida subtraindo-se a média de três valores expressos em gramas (força) observada antes do procedimento experimental (limiar basal dos animais) da média de três valores em gramas (força) após a administração do agente em diferentes intervalos de tempo (CUNHA et al., 2004). Nos demais modelo, foi utilizado o monofilamento de von Frey 0,6 g, que consiste em um filamento de nylon de 0.6 mm de diâmetro. Com este aparato foi exercida uma pressão no centro da planta da pata do camundongo até que o animal produzisse o “flinch ” da pata estimulada. Os estímulos foram repetidos dez vezes com a finalidade de se obter a freqüência de resposta em porcentagem de cada animal.

4.3.5.2 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina

A indução da hipernocicepção de origem inflamatória em camundongos foi realizada através da injeção i.pl. de 50 µl de carragenina (300 µg/pata) na superfície plantar da pata direita traseira. De acordo com dados descritos na literatura, esta dose é capaz de produzir edema, hipernocicepção e aumento significativo do tamanho da pata injetada, porém os animais continuam apresentando comportamento normal (DE CAMPOS et al., 1996; BORTOLANZA et al., 2002; QUINTÃO et al., 2005). Inicialmente, os animais foram pré-tratados com o extrato 72

metanólico de P. cyparissias (3, 10 e 30 mg/kg, i.p.) ou compostos obtidos, nas doses de 0,02, 0,07 e 0,24 µmol/kg para PC1, 0,04, 0,12 e 0,39 µmol/kg para PC2, 0,04, 0,11 e 0,37 µmol/kg para PC3 e 0,03, 0,09 e 0,31 µmol/kg para PC4, todos via i.p.. Após 30 minutos, os animais foram levemente sedados com éter para receber uma injeção i.pl. de carragenina, sendo posteriormente avaliados quanto à hipernocicepção mecânica através von Frey eletrônico, nos intervalos de 1, 3, 4, 6, 24 e 48 horas após a injeção de carragenina.

4.3.5.3 Hipernocicepção mecânica induzida por lipopolissacarídeo (LPS)

Na indução da hipernocicepção mecânica por LPS bacteriano, a medida basal de todos os camundongos foi avaliada e em seguida, os animais foram pré-tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias nas mesmas doses já citadas. Após 30 minutos, os animais foram levemente anestesiados e receberam uma injeção intraplantar de LPS (100 ng/pata, 20 µl) na pata direita traseira. Posteriormente, foi avaliada a hipernocicepção mecânica através do monofilamento de von Frey nos intervalos de tempo de 1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas (SAFIEH-GARABEDIAN et al., 2000) após a injeção do agente irritante.

4.3.5.4 Hipernocicepção inflamatória induzida pelo adjuvante completo de Freund (CFA)

Para induzir a resposta inflamatória persistente, os animais receberam injeção i.pl. de 20µl de CFA (1 mg/ml de bacilo de Mycobacterium tuberculosis inativado por calor; cada mililitro de veículo contém 0,85ml de óleo de parafina + 0,15ml de monooleato de manida) na superfície plantar da pata direita traseira, sendo que a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do monofilamento de von Frey. Para avaliar o efeito preventivo sobre a hipernocicepção mecânica, os animais foram previamente tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias nas doses de 0,3, 1 e 3 mg/kg. Após 30 minutos, os animais receberam uma injeção i.pl. de CFA, e a hipernocicepção mecânica foi avaliada em diferentes intervalos de tempos (1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas) com o monofilamento de Von Frey (CAO et al., 1998). 73

4.3.5.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela prostaglandina E 2 (PGE 2)

Na indução da hipernocicepção mecânica pela PGE 2, a medida basal dos animais foi previamente avaliada através do von Frey eletrônico antes de serem pré- tratados. Os animais do grupo tratado receberam o extrato metanólico de P. cyparissias nas mesmas doses já citadas e, após 30 minutos, os animais foram anestesiados levemente com éter para receber injeção intraplantar de 20 µl de PGE 2 (0,1 nmol/pata) na pata direita traseira. Em seguida, a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do monofilamento de von Frey, nos intervalos de tempo de 1, 2, 4 e

6 horas após a injeção i.pl. de PGE 2 (INCEOGLU et al., 2006).

4.3.5.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina

Primeiramente foi avaliada a medida basal dos animais através do von Frey eletrônico antes de serem tratados. Nos camundongos dos grupos tratados foi administrado o extrato metanólico de P. cyparissias nas doses já citadas e, 30 minutos após, os animais foram levemente anestesiados e receberam injeção intraplantar de 20 µl de epinefrina (100 ng/pata) na pata direita traseira. Em seguida, a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do monofilamento de von Frey nos intervalos de tempo de 10, 30 minutos, 1, 2, 4 e 6 horas após a injeção de epinefrina (KHASAR et al., 2005).

4.3.5.7 Hipernocicepção mecânica induzida por constrição parcial do nervo ciático (CPNC)

Antes da cirurgia, foi avaliada a medida basal do limiar dos animais para posterior comparação e confirmação do desenvolvimento da neuropatia. Inicialmente, os camundongos foram anestesiados com hidrato de cloral 7% (8 ml/kg, i.p.) e a CPNC foi realizada amarrando 1/3 a ½ da porção dorsal do nervo ciático com fio de seda 8.0. Um grupo de animais teve o nervo ciático exposto, no 74

entanto não foi efetuada a amarração (grupo falso-operado). No 7º dia pós- operatório os animais foram avaliados quanto à hipernocicepção mecânica através do monofilamento de von Frey. Depois de confirmado o desenvolvimento de neuropatia, foi iniciado o tratamento com o extrato metanólico de P. cyparissias nas doses de 3 e 10 mg/kg. O tratamento foi realizado 2 vezes ao dia (no início da manhã e no final da tarde) por 4 dias consecutivos, e a hipernocicepção mecânica foi avaliada 6 horas após a primeira administração do dia (SELTZER; DUBNER; SHIR, 1990; MALMBERG; BASBAUM, 1998).

4.3.6 Análise estatística

Os resultados estão apresentados como a média ± erro padrão da média (EPM, 95%). Para os dados referentes à gastroproteção, utilizou-se a análise de variância (ANOVA) com pós-teste de Dunnett ou de Tukey. Para os dados referentes à atividade anti-hipernociceptiva, as porcentagens de inibição são citadas como a média ± EPM da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas obtidas para cada experimento individual em relação ao grupo controle correspondente. A análise estatística dos dados foi realizada por meio de ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni. Para ambas as atividades, valores de p menores que 0,05 (p<0,05) são considerados como valores significantes. Todas as análises citadas acima foram realizadas utilizando o programa Graphpad PRISM 4.0® ou Graphpad Instat®.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise fitoquímica

5.1.1 Extratos obtidos

Os rendimentos dos extratos e frações encontram-se na Tabela 17.

Tabela 17: Rendimentos dos extratos e frações obtidos de P. cyparissias.

Material Coleta Solvente Massa (g) Rendimento (g) Rendimento (%) Extrato 2007 Acetona 1300* 43,50 3,35 Fração 2007 Clorofórmio 1300* 4,70 0,36 Fração 2007 Metanol 1300* 24,30 1,87 Extrato 2009 Metanol 13,57 3,98 29,33 Extrato 2010 Acetona 1550 83,81 5,41 Fração 2010 Clorofórmio 1550 15,04 0,97 Fração 2010 Metanol 1550 46,66 3,01 76

* Material fresco

Através da comparação por CCD dos extratos e frações obtidos em 2007 e em 2010, observou-se que não houve variação dos seus perfis químicos qualitativos.

5.1.2 Identificação dos compostos obtidos

5.1.2.1 PC1

Obteve-se 32,3 mg do composto PC1. Este foi identificado através de co-CCD com padrão conhecido, RMN ¹H (figuras 10-12) e RMN ¹³C (figura 13). Assim, considerando todas as informações obtidas, foi confirmado a estrutura de (24 S)-24- etil-5α-colesta-7,E-22-dien-3β-ol (PM = 412), também conhecido como espinasterol (Figura 9).

21 29 22 28 18 20 12 26 17 24 25 11 23 19 13 H 16 27 1 9 14 2 10 8 15 H H 3 7 HO 5 4 6 Figura 9: Espinasterol.

Os simpletos em 0,55 e 0,80 ppm correspondem aos hidrogênios das metilas C-18 e C-19, respectivamente. Os sinais dos prótons das metilas C-21, C-26, C-27 e C-29 encontram-se centrados em: 1,03 ppm ( d, J = 6Hz), 0,82 ppm ( d, J = 6 Hz), 0,85 ppm ( d, J = 6Hz) e 0,80 ppm ( dd , J indeterminado). Os hidrogênios olefínicos de C-22 e C-23 foram detectados pelos dupletos de dupletos centrados em 5,16 ppm ( J = 15 e 9 Hz) e em 5,02 ( J = 15 e 9 Hz). Já o próton de C-7 foi identificado pelo sinal em 5,15 ppm. Por fim, o tripleto de tripleto centrado em 3,60 ppm refere-se ao hidrogênio de C-3.

Figura 10: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado.

Figura 11: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado expandido na região de 0,70 a 2,10 ppm. 78

Figura 12: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterada expandido na região de 3,45 a 3,80 ppm e 4,90 a 5,30 ppm.

Figura 13: Espectro de RMN ¹³C do composto PC1 em CDCl 3.

Os sinais referentes aos carbonos estão apresentados na tabela 18, bem como os de hidrogênio, sendo esses comparados à literatura (GAZONI, 2009).

Tabela 18: Valores de deslocamento químico ( δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC1 em comparação com dados da literatura para o espinasterol, ambos em CDCl 3. 80

RMN ¹H RMN ¹H RMN ¹³C RMN ¹³C Carbono δ (ppm); mult; J (Hz) δ (ppm); mult; J (Hz) δ (ppm) δ (ppm) PC1 Literatura PC 1 Literatura 1 - - 37,2 37,1 2 3,60; tt 3,61; tt 31,5 31,5 3 - - 71,1 71,0 4 - - 38,0 38,0 5 - - 40,3 40,2 6 - - 29,7 29,6 7 5,15 5,16 117,5 117,4 8 - - 139,6 139,5 9 - - 49,5 49,4 10 - - 34,3 34,2 11 - - 21,6 21,5 12 - - 39,5 39,4 13 - - 43,3 43,3 14 - - 55,2 55,1 15 - - 23,0 23,0 16 - - 28,5 28,5 17 - - 55,9 55,8 18 0,55 0,55 12,1 12,0 19 0,80 0,80 13,1 13,0 20 - - 40,8 40,8 21 1,03; d; 6 1,03; d; 6,5 21,4 21,4 22 5,16; dd; 15,0/9,0 5,16; dd; 15,5/8,5 138,2 138,2 23 5,02; dd; 15,0/9,0 5,03; dd; 15,5/8,5 129,5 129,4 24 - - 51,3 51,2 25 - - 31,9 31,9 26 0,82; d; 6,0 0,80; d; 6,0 19,0 19,0 27 0,85; d; 6,0 0,85; d; 6,5 21,1 21,1 28 - - 25,4 25,4 29 0,80; t; indeterminado 0,81; t; 7,5 12,2 12,2 81

Diversos estudos farmacológicos já foram realizados com o espinasterol. Através de um estudo bioguiado, Villaseñor et al. (1996) verificaram a atividade antigenotóxica do esteróide frente ao teste do micronúcleo e, posteriormente, sua atividade antimutagênica, visto que foi capaz de diminuir a incidência de tumor de pele em ratos na ordem de 55,6 % (VILLASEÑOR; DOMINGO, 2000). Jeon et al. (2005) demonstraram a eficácia do espinasterol contra células cancerosas de seio e ovário. Mais recentemente, Ravikumar et al. (2010) evidenciaram que o esterol foi capaz de inibir a proliferação celular contra linhagem CACO-2, além de proteger contra a mutação induzida por metil metano sulfonado. Jeong et al. (2010) verificaram que espinasterol aumentou a resistência de células hipocampais HT22 ao dano oxidativo causado por glutamato, além de suprimir a expressão de enzimas e mediadores pró-inflamatórios induzida por LPS, inibindo, também, a produção de

NO, PGE 2, TNF-α e IL-1β. Em outro estudo, Jeong et al. (2004) demonstraram a capacidade do espinasterol em inibir a proliferação de células mesangiais glomerulares induzida pela alta concentração de glicose, sendo em torno de mil vezes mais potente que a sinvastatina, além de reduzir o aumento nos níveis séricos de triglicérides, bem como a excreção de proteínas na urina de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. Meotti et al. (2006) e Boller et al. (2010) demonstraram a atividade antinociceptiva do esterol no modelo de contorções induzidas por ácido acético e, posteriormente, contra a nocicepção induzida por glutamato (RIBAS et al., 2008), enquanto que Mata et al. (1997) demonstraram sua capacidade espasmolítica sobre íleo de rato.

5.1.2.2 PC2

Através de CCDs eluídas com diferentes fases móveis e reveladas com diferentes reveladores, confirmou-se o isolamento de 18 mg de um composto fenólico. O espectro de RMN ¹H (Figuras 15 e 16), obtido com piridina deuterada, confirmou a estrutura já descrita por Pinheiro et al. (1998), 1,3-dihidroxi-7- metoxixantona (PM = 258) (Figura 14).

CH3 OOH O 8 1 7 2 6 3 5 4 O OH Figura 14: 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona.

O simpleto presente em 13,61 ppm indica um próton do grupo hidroxila quelado na posição C-1. Outro simpleto em 3,71 ppm refere-se aos três hidrogênios do grupo metoxila em C-7. O dupleto centrado em 6,73 ppm com constante de acoplamento meta J = 1,8 Hz é referente ao H-4, enquanto que o centrado em 6,76 ppm com acoplamento meta J = 1,8 Hz refere-se ao H-2. Observa-se que estes dados encontram-se descritos na literatura (PINHEIRO et al., 1998), todavia, pela pequena diferença de deslocamento químico, eles podem ser intercambiáveis. H-8 é definido pelo dupleto centrado em 7,81 ppm com constante de acoplamento meta J = 2,7 Hz. Os sinais em 7,40 ppm referem-se a H-5 e H-6. Todos estes dados confirmam a estrutura de 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona. Também chamada de isogentisina, 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona já foi isolada anteriormente de Gentiana lutea (ABERHAM et al., 2007) e Polygala alpestris (DALL’ACQUA et al., 2004), tendo sido estudada farmacologicamente frente a diferentes potenciais atividades. Savikin et al. (2009) demonstraram sua atividade antimicrobiana contra várias bactérias gram-positivas e gram-negativas, bem como contra Candida albicans . Já em outro estudo, Capettini et al. (2009) evidenciaram o efeito vaso relaxante da xantona em anéis de aorta de forma dose dependente, não estando esta atividade atrelada a propriedade antioxidante do metabólito. Schmieder et al. (2007) verificaram que isogentisina foi capaz de proteger o dano no epitélio vascular causado pelo cigarro, estando esta propriedade relacionada à ativação das funções de reparo celular, não interferindo diretamente com os componentes químicos do cigarro.

Figura 15: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada.

Figura 16: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada expandido na região de 6,5 a 8,0 ppm. 84

5.1.2.3 PC3

O isolamento de um composto fenólico foi determinado por revelação de diferentes CCDs, utilizando eluentes distintos, com cloreto férrico. O espectro de RMN ¹H (Figuras 18 e 19) demonstrou o isolamento de 43,1 mg de 1,7-dihidroxi-2,3- metilenodioxixantona (PM = 272) (Figura 17). OOH

HO O 8 1 7 2 6 3 5 4 O O Figura 17: 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona.

Em 13,50 ppm há um sinal referente ao hidrogênio de uma hidroxila quelada em C-1. O simpleto em 6,15 ppm caracteriza os dois prótons refrente a um grupo metilenodioxi, encontrado em C-2 e C-3. O simpleto em 6,70 ppm refere-se ao H-4, estabelecendo a substituição do anel A. H-8 é definido pelo dupleto centrado em 8,04 ppm ( J = 3,0 Hz) com constante de acoplamento meta. O dupleto centrado em 7,48 ppm ( J = 9,0 Hz) é atribuído a H-5 orto relacionado. Assim, há a confirmação da estrutura de 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona. O metabólito já foi isolado também de Polygala fallax (MA et al, 2003), sendo que ainda não investigado farmacologicamente.

Figura 18: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada. 86

Figura 19: Espectro de RMN ¹H do composto PC3 em piridina deuterada expandido na região de 7,3 a 8,1 ppm.

5.1.2.4 PC4

Por diferentes CCDs com revelação por cloreto férrico e anisaldeído sulfúrico, foi possível detectar o isolamento de 17,9 mg de um composto fenólico. O espectro de RMN ¹H (Figura 21) confirmou se tratar do composto 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7- dimetoxixantona (PM = 320) (Figura 20).

CH3 OH OOH

O O 8 1 7 2 CH3 6 3 5 4 OH HO O Figura 20: 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona.

Pelo RMN ¹H pôde-se deduzir uma estrutura simétrica, visto que o espectro apresentou apenas três sinais. O simpleto em 3,96 ppm é atribuído aos seis prótons 87

de dois grupos metoxílicos (C-2 e C-7). O simpleto em 12,56 ppm indica a presença de dois hidrogênios de hidroxilas queladas em C-1 e C-8. O simpleto em 6,74 ppm refere-se aos dois prótons CH aromáticos. Assim, tem-se a estrutura de 1,3,6,8- tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona, uma xantona não estudada do ponto de vista farmacológico e até então só descrita para P. cyparissias .

Figura 21: Espectro de RMN ¹H do composto PC4 em piridina deuterada.

5.1.2.5 PC 5

Através de CCDs com posterior revelação com cloreto férrico, detectou-se o isolamento de 12,3 mg de um composto fenólico. O espectro de RMN ¹H (Figuras 23 e 24), obtido com piridina deuterada, confirmou a estrutura já descrita por Pinheiro et al. (1998), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (PM = 288) (Figura 22).

OOH

HO O 8 1 7 2 CH3 6 3 5 4 O O CH3 Figura 22: 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona.

O simpleto presente em aproximadamente 13,47 ppm indica um próton de grupo hidroxila quelado na posição C-1. Já os simpletos em 3,87 ppm e 3,98 ppm são referentes aos três hidrogênios de grupos metoxílicos da posição C-2 e C-3. Juntamente com o simpleto em 6,62 ppm, referente a H-4, tem-se a estrutura do primeiro anel. No segundo anel há um dupleto em 8,05 ppm ( J = 2,6 Hz), indicando acoplamento meta, referente a H-8. Os demais sinais encontram-se encobertos pelo sinal da piridina. Porém, conforme a literatura (PINHEIRO et al., 1998), deveria-se observar um dupleto em aproximadamente 7,54 ppm com J próximo a 8,5 Hz, referente a H-5 acoplando em orto com H-6. Ainda, um duplo dupleto centrado em aproximadamente 7,60 ppm ( J aproximadamente 9,0 e 2,9 Hz), atribuído a H-6, orto- e meta-acomplando com H-5 e H-8.

Figura 23: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada.

Figura 24: Espectro de RMN ¹H do composto PC5 em piridina deuterada expandido na região de 3,5 a 9,0 ppm. 90

Até o momento, PC5 já foi isolado também de Polygala tenuifolia (FUJITA et al., 1991) e de Polygala alpestris (DALL’ACQUA et al., 2004), existindo apenas dois estudos farmacológicos realizados. Sayah et al. (1999), verificaram que a xantona foi capaz de antagonizar, por mecanismo de ação não-competitivo, mas de modo reversível, a contração promovida por diversos mediadores em traquéia de cobaias in vitro . Ademais, de Campos et al. (1997) demonstraram sua atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.

5.1.2.6 PC 6

Por meio de CCD eluída com diferentes fases móveis, revelada com anisaldeído sulfúrico e cloreto férrico, foi possível detectar o isolamento de 16,8 mg de um composto fenólico. Através do espectro de RMN ¹H (Figuras 26 e 27) e de ¹³C

(Figura 28) em CD 3OD, confirmou-se a estrutura de kaempferol 3-O-β-D-glicosilado, também conhecido como astragalina (PM = 448) (Figura 25).

OH 2' 3' 4' 1' 5' HO O 6' 8 1 7 2 6 3 5 4 O OH O OH 6" O 5"

4" OH 1" 3" 2" HO

OH Figura 25: Kaempferol 3-O-β-D-glicosilado. 91

Figura 26: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD 3OD.

Figura 27: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD 3OD expandido na região de 5,0 a 9,0 ppm.

Figura 28: Espectro de RMN ¹³C do composto PC6 em CD3OD.

No espectro de RMN ¹H, centrado em 8,05 ppm, há um dupleto ( J = 7,8 Hz) referente a dois hidrogênios da genina: H-2’ e H-6’. O sinal referente a H-3’ e H-5’ é visualizado no dupleto ( J = 7,8 Hz) centrado em 6,89 ppm. Em 6,38 ppm há um dupleto ( J não identificável) indicativo do H-8, enquanto que em 6,19 ppm há outro dupleto ( J não identificável), indicando H-6. Ademais, o dupleto referente ao hidrogênio anomérico encontra-se em aproximadamente 5,14 ppm, com um J de 6,0 Hz, indicativo de acoplamento axial-axial. Já no espectro de RMN ¹³C pode-se observar os seguintes sinais para a genina e seus carbonos atribuídos: 179,5 ppm (C-4), 167,9 ppm (C-7), 163,0 ppm (C-5), 161,8 ppm (C-4’), 159,2 ppm (C-2), 158,8 ppm (C-9), 135,6 ppm (C-3), 132,5 ppm (C-2’, 6’), 122,8 ppm (C-1’), 116,3 ppm (C-3’, 5’), 105,3 ppm (C-10), 100,7 ppm 93

(C-6) e 95,4 ppm (C-8). Os demais sinais são referentes à porção glicosídica da molécula: 104,5 ppm (C-1”), 78,5 ppm (C-5”), 78,1 ppm (C-3”), 75,7 ppm (C-2”), 71,4 ppm (C-4”) e 62,6 ppm (C-6”). Tomados os dados em conjunto e os comparando à literatura (FENG et al., 2007), conforme Tabela 19, é possível determinar a estrutura como sendo astragalina. Destaca-se que esta é a primeira vez que este composto é isolado da espécie em estudo. Farmacologicamente, a astragalina já foi bastante estudada. Lee et al. (1981) demonstraram sua atividade anti-leucêmica, enquanto que Kameda et al. (1987) verificaram seu potencial inibitório sobre a enzima conversora de angiotensina. Mais recentemente, demonstrou-se sua capacidade inibitória sobre o desenvolvimento de dermatites, envolvendo a redução de liberação de histamina e de IgE (KOTANI et al., 2000). Ni et al. (1999) evidenciaram sua propriedade inibitória de proliferação de células humanas mesangiais, indicando sua potencial aplicabilidade para prevenção de doenças crônicas renais. Seu potencial antioxidante também já foi demonstrado pelo método ABTS (HAN et al., 2004), bem como sua atividade lipolítica (OHKOSHI et al., 2007). Ademais, Inaba et al. (2008) demonstraram sua atividade inibitória sobre a produção de PGE 2 em células epiteliais da gengiva.

Tabela 19: Valores de deslocamento químico ( δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC6 e comparação com dados da literatura para a astragalina, ambos em CD 3OD.

RMN ¹H RMN ¹H RMN ¹³C RMN ¹³C Carbono δ (ppm); mult; J (Hz) δ (ppm); mult; J (Hz) δ (ppm) δ (ppm) PC6 Literatura PC 6 Literatura 2 - - 159,2 159,1 3 - - 135,6 135,4 4 - - 179,5 179,5 5 - - 163,0 163,3 6 6,19; d; indeterminado 6,19; d; 1,3 100,7 99,9 7 - - 167,9 166,2 8 6,38; d; indeterminado 6,39; d; 1,3 95,4 94,8 9 - - 158,8 158,5 10 - - 105,3 105,7 1’ - - 122,8 122,8 2’ 8,05; d; 8,4 8,04; d; 8,8 132,5 132,3 3’ 6,89; d; 7,8 6,87; d; 8,8 116,3 116,1 4’ - - 161,8 161,6 5’ 6,89; d; 7,8 6,87; d; 8,8 116,3 116,1 6’ 8,05; d; 8,4 8,04; d; 8,8 132,5 132,3 1’’ 5,14; d; 6,0 5,24; d; 7,2 104,5 104,1 2’’ - - 75,7 75,7 3’’ - - 78,1 78,0 4’’ - - 71,4 71,4 5’’ - - 78,5 78,4 6’’ - - 62,6 62,6

5.1.3 Perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias

Como metodologia inicial, foi utilizado o sistema gradiente apresentado na

Tabela 10 (gradiente linear H 2O/MeOH). A partir desta, obteve-se o cromatograma demonstrado na Figura 29.

50 50

40 40

30 30 mAU mAU

20 20

10 10

0 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Minutes Figura 29: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 1 descrito na Tabela 10.

Neste cromatograma foi possível observar que a maioria dos compostos foram eluídos ao fim da corrida. Além disto, provavelmente pela presença de metanol no método, a linha base não ficou estável após os 25 minutos. Assim, partiu-se para o método 2, descrito na Tabela 11 (gradiente linear H 2O/ACN). Com a mudança do metanol pela acetonitrila, esperou-se obter uma eluição menos tardia dos compostos presentes no extrato, visto o aumento de força (hidrofobicidade) do solvente, bem como uma melhor estabilização da linha base. O cromatograma obtido está apresentado na Figura 30. 96

70 70

60 60

50 50

40 40 mAU mAU

30 30

20 20

10 10

0 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Minutes Figura 30: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 2 descrito na Tabela 11.

Com o método 2, ao contrário do que ocorreu com o primeiro método, os compostos eluíram muito precipitadamente, obtendo-se uma baixa separação entre eles. Na sequência, objetivando facilitar o método, partiu-se para uma eluição isocrática de H 2O/ACN/MeOH 80:10:10 (método 3 já descrito). O cromatograma está apresentado na Figura 31.

100 100

80 80

60 60 mAU mAU

40 40

20 20

0 0

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 Minutes Figura 31: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 3 já descrito. 97

Observa-se uma piora na resolução dos picos, já que praticamente todos os compostos eluíram de forma conjunta no início da corrida. Com isto, descartou-se metodologias isocráticas, partindo para novo gradiente no método 4, descrito na

Tabela 12 (gradiente com steps H 2O/ACN). O cromatograma está disposto na Figura 32.

50 50

40 40

30 30 mAU mAU

20 20

10 10

0 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Minutes Figura 32: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 4 descrito na Tabela 12.

No cromatograma observa-se que muitos compostos eluíram conjuntamente após 10 minutos de corrida. Assim, testou-se o método 5, descrito na Tabela 13

(gradiente linear H 2O/ACN), diminuindo a força de eluição, obtendo-se o cromatograma apresentado na Figura 33. 98

100 100

80 80

60 60 mAU mAU

40 40

20 20

0 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Minutes Figura 33: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 5 descrito na Tabela 13.

Observou-se uma melhora na separação dos compostos, porém demonstrou- se a necessidade de diminuir ainda mais a força do solvente orgânico. Assim, tentou-se o método 6 com metanol, descrito na Tabela 14 (gradiente linear

H2O/ACN/MeOH). O uso de 2 solventes orgânicos diferentes (metanol e acetonitrila) foi escolhido para propiciar diferentes interações entre o extrato, a coluna e a fase móvel, objetivando uma melhor separação entre os picos. O cromatogroma é apresentado na Figura 34.

40 40

35 35

30 30

25 25

20 20 mAU mAU

15 15

10 10

5 5

0 0

-5 -5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Minutes Figura 34: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 6 descrito na Tabela 14.

Através do cromatograma obtido, observa-se uma melhor separação entre os compostos. Porém, também, é demonstrada a necessidade de trabalhar com steps visando aumentar a resolução entre picos. Assim, o método 7, descrito na Tabela 15

(gradiente com steps H 2O/ACN/MeOH), foi empregando, obtendo-se o cromatograma da Figura 35.

70 70

60 60

50 50

40 40

30 30 mAU mAU

20 20

10 10

0 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 Minutes Figura 35: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 7 descrito na Tabela 15. 100

Observa-se uma significativa melhora na resolução dos picos. Todavia, mesmo assim, optou-se por evoluir mais na separação. Além de mudar o método, optou-se por mudar o fluxo para aumentar a interação entre a fase móvel, fase estacionária e o extrato. Com isto o método 8, descrito na Tabela 16 (gradiente com steps H 2O/ACN/MeOH, fluxo 0,8 ml/min), foi testado. O cromatograma obtido está apresentado na Figura 36.

25 25

20 20

15 15 mAU mAU

10 10

5 5

0 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 Minutes Figura 36: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 8 descrito na Tabela 16.

Conforme pode ser observado, a resolução dos picos melhorou significativamente. Assim, optou-se por injetar o padrão de PC3 para verificar sua pureza e identificá-la no extrato em estudo. Com isto, obteve-se o cromatograma apresentado na figura 37 e sua representação em três dimensões na figura 38.

101

2: 254 nm, 8 nm 161110 Metilenodioxixantona em 091209 161110 Metilenodioxixantona em 091209-Rep2

1000 1000

800 800

600 600 mAU mAU

400 400

200 200

0 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 Minutes Figura 37: Cromatograma obtido para PC2 isolado de P. cyparissias , conforme método 8 descrito na Tabela 16.

Figura 38: Cromatograma em três dimensões obtido para PC3 isolado de P. cyparissias , conforme método 8 descrito na Tabela 16.

102

Objetivando verificar a presença de pequenas impurezas, foi injetado apenas o solvente e eluído também conforme método 8, obtendo-se o cromatograma da figura 39.

500 500 mAU mAU

400 400

300 300

200 200

100 100

0 0

-100 -100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 Minutes Figura 39: Cromatograma obtido para o solvente utilizado para a solubilização de PC2, conforme método 8 descrito na Tabela 16.

Descontando as áreas dos picos presentes no cromatograma do solvente, pôde-se determinar a pureza de PC3, sento esta estimada em 90%. Conforme o cromatograma do extrato é possível detectar a presença da xantona PC3 (aos 70 minutos de eluição), porém, para futuros fins de quantificação de PC3, faz-se necessário ajustes no método para aumentar a resolução entre os picos próximos à xantona.

5.2 Testes farmacológicos

5.2.1 Avaliação da atividade gastroprotetora

Os resultados referentes à gastroproteção demonstrada pelo extrato e frações obtidos de P. cyparissias coletada em 2007 no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl encontram-se resumidos na Tabela 20. Os grupos tratados com 50, 125 e 250 mg/kg da fração clorofórmica não demonstraram uma redução significativa no índice de lesão e percentual de lesão, apesar de ter demonstrado uma redução significativa na área total de lesão quando comparado ao grupo controle (p<0,05). O percentual de inibição para as três doses foi de 50,9 ± 9,3 %, 54,6 ± 7,3 % e 60,3 ± 5,5 %, respectivamente. Também, o índice de lesão não foi reduzido de forma 103

significativa na dose de 50 mg/kg do extrato acetônico e fração metanólica. Por outro lado, as doses de 125 e 250 mg/kg reduziram significativamente este índice (p<0,05). O extrato acetônico também reduziu de forma significativa a área total de lesão e o percentual de lesão em todas as doses (p<0,05). Um efeito semelhante foi observado para a fração metanólica (p<0,05). Os percentuais de inibição de úlcera foram 45,2 ± 12,9 %, 63,0 ± 3,5 % e 67,4 ± 4,8 % para o extrato acetônico (Figura 40) e 43,7 ± 5,1 %, 64,6 ± 5,6 % e 74,5 ± 6,1 % para a fração metanólica (Figura 41).

Tabela 20: Efeito do extrato acetônico e frações clorofórmica e metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós- teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001.

Tratamento Dose Área total % de área Índice de Índice de (v.o.) (mg/kg) de lesão lesada lesão gastroproteção (mm²) ulcerativa (%) Controle - 71,1 ± 12,7 5,8 ± 2,8 30,3 ± 3,1 - Omeprazol 30 18,3 ± 5,2 *** 3,4 ± 0,8 *** 13,6 ± 2,3 *** 67,8 ± 5,3 50 23,0 ± 4,5 * 4,4 ± 0,7 * 23,2 ± 5,5 45,2 ± 12,9 Extrato 125 5,0 ± 1,0 *** 1,3 ± 0,3 *** 15,7 ± 1,5 * 63,0 ± 3,5 acetônico 250 4,8 ± 1,7 *** 1,0 ± 0,3 *** 13,8 ± 2,0 * 67,4 ± 4,8 50 26,1 ± 7,9 * 6,0 ± 1,9 20,8 ± 3,9 50,9 ± 9,3 Fração 125 23,1 ± 5,7 * 5,8 ± 1,8 10,2 ± 3,1 54,6 ± 7,3 clorofórmica 250 26,1 ± 7,9 * 11,1 ± 4,8 16,8 ± 2,3 60,3 ± 5,5 50 26,0 ± 4,2 * 4,6 ± 0,7 * 23,8 ± 2,2 43,7 ± 5,1 Fração 125 18,2 ± 2,7 ** 3,7 ± 0,5 ** 15,0 ± 2,4 ** 64,6 ± 5,6 metanólica 250 11,9 ± 4,5 ** 2,1 ± 0,6 ** 10,8 ± 2,6 ** 74,5 ± 6,1

104

100 Omeprazol (mg/kg; v.o.)

25 Índice de gastroproteção (%) gastroproteção de Índice 0 Controle 30 50 125 250 Extrato acetônico (mg/kg; v.o.)

Etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.)

100 Omeprazol (mg/kg; v.o.)

25 Índice de gastroproteção (%) gastroproteção de Índice 0 Controle 30 50 125 250 Fração Metanólica (mg/kg; v.o.)

Etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.)

Figura 41: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM. A formação de lesões na mucosa gástrica por agentes necrosantes, como o etanol, é reportada por envolver a redução de mecanismos de defesa gástricos 105

(KINOSHITA et al., 1995). A formação destas lesões que seguem à administração de etanol envolve diversos mecanismos: (1) uma redução no fluxo sanguíneo gástrico, contribuindo no desenvolvimento de hemorragia e necrose; (2) solubilização do muco presente no estômago, resultando em uma redução da diferença de potencial transmucosa, aumentando o fluxo de íons Na + e K + ao lúmen, secreção de pepsina e perda de íons H + e histamina no lúmen; (3) indução do estresse oxidativo; (4) aumento da atividade de xantina oxidase e níveis de malondialdeído; e (5) redução nos níveis totais de glutationa nas células da mucosa gástrica (SZABO; VATTAY, 1990; MAROTTA et al., 1999). O HCl presente no modelo acelera o processo de ulcerogênese gástrica e intensifica as lesões, reduzindo a proteção da mucosa contra agentes químicos (SUN; MATSUMOTO; YAMATA, 1991). Sabe-se que a úlcera gástrica é causada por um desequilíbrio entre os fatores agressivos (HCl, pepsina) e a habilidade da mucosa gástrica de se proteger e curar - a si própria (muco e secreção de HCO 3 , prostaglandinas, fluxo de sangue e óxido nítrico) (LU; GRAHAM, 2006). Diversos fatores podem aumentar o risco de incidência de úlcera, tais como o estresse, o fumo, deficiências nutricionais, uso de AINEs, predisposição hereditária e infecção por H. pilory (BARROS et al., 2008). Considerando o exposto, optou-se por prosseguir os experimentos avaliando o comportamento do extrato e fração frente ao modelo de úlcera induzida por indometacina/betanecol. Todavia, visto que a fração clorofórmica demonstrou apenas uma atividade superficial, este modelo foi realizado apenas com o extrato acetônico e a fração metanólica. Os resultados são apresentados na Tabela 21. Os percentuais de inibição de úlcera foram 28,1 ± 12,4 %, 60,2 ± 6,6 % e 77,9 ± 7,2 % para os grupos tratados com 50, 125 e 250 mg/kg do extrato acetônico de P. cyparissias (Figura 42). Para os grupos tratados com a fração metanólica, o percentual de inibição de úlcera foram 46,1 ± 6,9 %, 67,4 ± 4,4 % e 75,0 ± 2,9 %, respectivamente (Figura 43).

Tratamento Dose Área total % de área Índice de Índice de (v.o.) (mg/kg) de lesão lesada lesão gastroproteção (mm²) ulcerativa (%) Controle - 6,4 ± 0,6 1,4 ± 0,2 25.,6 ± 4,4 - Cimetidina 100 1,8 ± 0,6 *** 0,4 ± 0,2 *** 6,5 ± 1,0 *** 74,4 ± 4,0 50 1,3 ± 0,4 *** 0,4 ± 0,1 ** 18,4 ± 3,2 28,1 ± 12,4 Extrato 125 0,9 ± 0,1 *** 0,4 ± 0,1 ** 10,2 ± 1,7 ** 60,2 ± 6,6 acetônico 250 0,4 ± 0,1 *** 0,2 ± 0,1 *** 5,7 ± 1,8 *** 77,9 ± 7,2 50 6,0 ± 0,9 1,2 ± 0,2 13,8 ± 1,8 46,1 ± 6,9 Fração 125 3,2 ± 0,6 ** 0,5 ± 0,1 * 8,3 ± 1,1 *** 67,4 ± 4,4 metanólica 250 2,7 ± 0,3 ** 0,6 ± 0,1 * 6,4 ± 0,8 *** 75,0 ± 2,9

100 Cimetidina (mg/kg; v.o.)

25 Índice de gastroproteção (%) gastroproteção de Índice 0 Controle 100 50 125 250 Extrato acetônico (mg/kg; v.o.)

Indometacina (100 mg/kg; v.o.)

107

100 Cimetidina (mg/kg; v.o.)

25 Índice de gastroproteção (%) gastroproteção de Índice 0 Controle 100 50 125 250 Fração metanólica (mg/kg; v.o.)

Indometacina (100 mg/kg; v.o.)

Os AINEs, como é o caso da indometacina, têm capacidade de bloquear a COX, demonstrando fortes evidências que o efeito ulcerogênico destes está amplamente correlacionado à sua capacidade de suprimir a síntese das prostaglandinas (PGs). PGs endógenas regulam o fluxo sanguíneo da mucosa, proliferação de células epiteliais, regeneração epitelial, atividade imune da mucosa, - secreção de muco e de HCO 3 e secreção basal de ácido. Assim, com a inibição da síntese de prostaglandinas, há um enfraquecimento nas defesas da mucosa, diminuindo a sua capacidade de resistir a agressores (CHAN; LEUNG, 2002). Porém, a diminuição na síntese de PGs não é a única via responsável pela formação de úlcera por AINEs. Paralelamente, os AINEs levam a um aumento dos níveis de mieloperoxidase e malondialdeído, ambos responsáveis pelo dano oxidativo, além de reduzir a síntese de NO, relacionado à secreção de muco, regulação do fluxo sanguíneo e prevenção da peroxidação lipídica (SULEYMAN et al., 2010). Mesmo não sendo um modelo específico, pode-se inferir que a gastroproteção gerada por P. cyparissias provavelmente relaciona-se com as PGs. O extrato acetônico e a fração metanólica podem tanto estar aumentando a síntese de PGs, especialmente através da COX-1, constitutiva e relacionada à 108

gastroproteção, quanto possuir um efeito antagônico à indometacina, impedindo sua ação. Outra possibilidade é que os consituintes presentes no extrato e fração tenham um efeito que mimetiza os efeitos das PGs, como é o caso do misoprostol, um análogo da PGE 2 que atua inibindo a secreção gástrica e estimulando a produção de muco (ARONSSON et al., 2007). Considerando que o modelo de úlcera induzida por etanol é bastante geral e inespecífico e que o modelo de úlcera induzida por indometacina, apesar de evidenciar uma forte relação com as PGs, não é adequado para o estabelecimento de um possível mecanismo de ação, realizaram-se experimentos para verificar o potencial envolvimento do NO e de SHs. Para a avaliação da participação do NO no mecanismo de gastroproteção induzida por P. cyparissias , realizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol associada ao L-NAME, um bloqueador da óxido nítrico sintase (NOS). O L-NAME é um análogo da L-arginina e é hidrolisado em L-nitroarginina, gerando a inibição da NOS (GRANGER et al., 1994). Portanto, conforme se pode observar na figura 44, os tratamentos com o extrato acetônico e a fração metanólica nos animais que receberam L-NAME, não foram capazes de diminuir significativamente o percentual de área lesada quando comparados com o controle. Já os animais que receberam o extrato e a fração e foram pré-tratados com solução salina exibiram uma redução significativa (p<0,01) no percentual de área lesada quando comparado ao controle (0,95 ± 0,30% e 2,12 ± 0,64%, respectivamente), também sendo estes resultados significativamente diferentes aos observados nos grupos que receberam o L-NAME (p<0,01). Consequentemente, demonstra-se a participação importante do NO no mecanismo de gastroproteção induzido pelo extrato acetônico e pela fração metanólica de P. cyparissias .

109

# #

% de área lesada área de % 10

** ** ** 0 Controle Controle 125 125 125 125 200 200 L-NAME (70 mg/kg; i.p.)- + - + - +- + Solução salina +--- + + + - Veículo (v.o.) Ext. acetônico Fr. metanólica Carbenoxolona (mg/kg; v.o.) (mg/kg; v.o.) (mg/kg; v.o.)

Etanol/HCl (60%/0,3M)

Figura 44: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou L-NAME (70 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. ** p<0.01 quando comparados com o grupo controle. # mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com L-NAME e pré-tratados com salina (p<0,01).

O NO é um transmissor endógeno que possue diversas funções no sistema gastrointestinal. Ele é principalmente associado à proteção da mucosa contra agentes vasoconstritores e com a inibição da secreção ácida das células parietais (GRANGER et al., 1994). Também, diminui a degranulação de mastócitos, a liberação de TNF-α por macrófagos e o recrutamento de neutrófilos, além de aumentar a produção de muco (WALLACE, MA, 2001). Para avaliar a participação de SHs no mecanismo gastroprotetor de P. cyparissias , utilizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol associada ao NEM, um quelante destes grupamentos. Observando a figura 45, pode-se verificar que tanto o extrato acetônico quanto a fração metanólica, quando associados ao pré- tratamento com NEM, não foram eficazes na diminuição do percentual de área lesada quando comparados ao controle. Porém, os animais que receberam apenas o tratamento com o extrato ou a fração, demonstraram uma redução significativa 110

(p<0,01) no percentual de área lesada quando comparado ao controle (0,95 ± 0,30% e 2,12 ± 0,64%, respectivamente). Além disto, estes resultados foram significativamente diferentes àqueles observados para os grupos que receberam NEM (p>0,01). Com isto, demonstra-se a participação dos grupamentos sulfidrila no mecanismo de gastroproteção induzido pelo extrato acetônico e pela fração metanólica de P. cyparissias .

## 20

% de área lesada área de % # 10

** ** ** 0 Controle Controle 125 125 125 125 200 200 NEM (10 mg/kg; i.p.)- + - + - +- + Solução salina +--- + + + - Veículo (v.o.) Ext. acetônico Fr. metanólica Carbenoxolona (mg/kg; v.o.) (mg/kg; v.o.) (mg/kg; v.o.)

Etanol/HCl (60%/0,3M)

Figura 45: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou NEM (10 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. ** p<0.01 quando comparados com o grupo controle. # mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com NEM e pré-tratados com salina (p<0,01).

Os SHs são importantes protetores da mucosa gástrica, principalmente quando espécies reativas de oxigênio estão envolvidas no processo de lesão gástrica. Estudos afirmam que as lesões causadas pelo etanol estão fortemente associadas com uma redução nos níveis de SHs na mucosa (BARBASTEFANO et al. 2007). 111

Os modelos empregados até o momento objetivaram a determinação do potencial gastroprotetor do extrato. Porém, sabe-se que a úlcera gástrica é comumente uma doença crônica, podendo persistir por 10 a 20 anos (OKABE; PFEIFFER, 1972). Levando isto em consideração, foi realizado o modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético. Este modelo foi escolhido pois produz lesão gástrica de forma similar à úlcera crônica humana, sendo os extratos utilizados de uma forma curativa, com o tratamento após a ulcerogênese, mimetizando o uso clínico. Neste modelo, o ácido acético promove dano à mucosa principalmente pela liberação de histamina, que aumenta a permeabilidade capilar e a difusão de HCl (TAKAGI et al., 1969), confinado ao estômago glandular (DHARMANI et al., 2004). O tratamento com 125 mg/kg do extrato acetônico e da fração metanólica reduziram de forma significativa a área total de lesão (p<0,01) e o percentual de área lesada (p<0,05). Ambos os tratamentos induziram um índice de cura de 67,5 ± 5,5% e 58,4 ± 4,4%, respectivamente (Tabela 22 e Figura 46). Os fatores presentes na cicatrização da úlcera crônica estão relacionados particularmente a fatores de crescimento, propiciando a angiogênese, re-epitelização, migração e proliferação celular (SZABO; VINCZE, 2000).

Tratamento Dose Área total de % de area Índice de cura (vo) (mg/kg) lesão (mm²) lesada (%) Controle - 9,2 ± 1,2 3,5 ± 0,5 - Cimetidina 100 4,1 ± 0,8 ** 1,3 ± 0,4 * 61,3 ± 11,9 Extrato 125 4,5 ± 1,0 ** 1,1 ± 0,2 * 67,5 ± 5,5 acetônico Fração 125 4,9 ± 1,0 ** 1,4 ± 0,2 * 58,4 ± 4,4 metanólica

112

125 Cimetidina (mg/kg; v.o.) Extrato acetônico (mg/kg; v.o.) 100 Fração metanólica (mg/kg; v.o.)

Índice de cura (%) cura de Índice 25

0 Controle 100 125 125 Ácido acético 20% (50 µµµl)

Através do modelo de úlcera crônica, também foi demonstrado o importante papel de P. cyparissias na via histaminérgica. No sistema gastrointestinal, a histamina é liberada por células enterocromafins que estão em contato próximo com as células parietais. Assim, de forma parácrina, a histamina atua em receptores H 2 das células parietais e promove o aumento da secreção ácida gástrica através da elevação dos níveis intracelulrares de AMP cíclico (MERCHANT, 2007). De fato, antagonistas dos receptores H 2 são largamente empregados na terapia antiúlcera (SUNG, 2006). Corroborando com estes resultados, Sayah et al. (1999) já haviam demonstrado a capacidade antagônica do extrato hidroalcoólico de P. cyparissias contra a histamina. Outra espécie do mesmo gênero também foi estudada quanto a seus efeitos gastroprotetores, porém as vias envolvidas parecem se diferenciar daquelas descritas para P. cyparissias . Lapa et al. (2007), avaliaram o potencial gastroprotetor do extrato hidroalcoólico de Polygala paniculata . A espécie foi estudada fitoquimicamente, sendo descrita a presença de xantonas, uma cumarina, o flavonol rutina e os esteróis espinasterol e ∆25 -espinasterol (CRISTIANO et al., 2003). No estudo foi demonstrado que o extrato foi capaz de reduzir significativamente o índice de úlcera no modelo induzido por etanol nas doses de 100 e 300 mg/kg (v.o.) e de 113

10 e 30 mg/kg (i.p.). Este efeito foi parcialmente explicado pelo aumento de secreção de muco, que é estimulada principalmente pelo NO e pelas PGs. Todavia, o extrato de P. paniculata foi incapaz de inibir de forma significativa as lesões geradas por indometacina, relacionado à síntese de PGs, bem como demonstrou não ser dependente do NO. O mecanismo de gastroproteção da planta também não está relacionado à diminuição da acidez do conteúdo gástrico nem ao volume de secreção, porém pode apresentar relação com seu potencial antioxidante, verificado também para a rutina, um dos seus compostos isolados. Objetivando verificar os potenciais compostos responsáveis pela atividade gastroprotetora, optou-se por realizar procedimentos cromatográficos para o isolamente de metabólitos secundários, conforme descrito no item 4.2.3. Após o isolamento dos compostos, três deles foram testados frente a sua atividade gastroprotetora no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl em camundongos: PC1, PC2 e PC3. Os resultados encontram-se sumarizados na Tabela 23 e na Figura 47. PC2 (0,19 mmol/kg; v.o.) reduziu significativamente o percentual de lesão, a área total de lesão e o ULI (p<0,001, p<0,001 e p<0,01, respectivamente), assim como PC3 (0,18 mmol/kg; v.o.) (p<0,001 para todos os parâmetros). Os percentuais de inibição de úlcera foram 71,3 ± 9,4 % e 81,1 ± 5,8 %, respectivamente. PC1 (0,12 mmol/kg; v.o.) também reduziu significativamente o percentual de lesão, área total de lesão e o ULI (p<0,001 para todos os parâmetros) e demonstrou um percentual de inibição de úlcera de 86,2 ± 3,4 %.

114

Tabela 23: Efeito do espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.), omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001.

Tratamento Dose Área total % de área Índice de Índice de (vo) (mmol/ de lesão lesada lesão gastroproteção kg) (mm²) ulcerativa (%) Controle - 71,1 ± 12,7 15,8 ± 2,9 30,3 ± 3,1 - Omeprazol 0,08 18,3 ± 5,2 *** 3,4 ± 0,8 *** 13,6 ± 2,3 *** 67,8 ± 5,3 PC1 0,12 1,6 ± 0,7 *** 0,6 ± 0,3 *** 5,8 ± 1,4 *** 86,2 ± 3,4 PC2 0,19 5,6 ± 1,3 *** 1,7 ± 0,4 *** 12,2 ± 4,0 ** 71,3 ± 9,4 PC3 0,18 2,1 ± 0,9 *** 0,7 ± 0,3 *** 8,0 ± 2,4 *** 81,1 ± 5,8

150 Omeprazol (mmol/kg; v.o.) PC1 (mmol/kg; v.o.) PC2 (mmol/kg; v.o.)

100 PC3 (mmol/kg; v.o.)

50 Índice de gastroproteção (%) gastroproteção de Índice 0 Controle 0,08 0,12 0,19 0,18 Etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.)

Figura 47: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e pelos compostos isolados de P. cyparissias em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos (n = 6): espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.) e 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.). Os resultados estão expressos em média ± EPM.

Com isto, demonstra-se a potencial participação dos compostos ensaiados no mecanismo de atividade gastroprotetora do extrato acetônico de P. cyparissias, corroborando com resultados já demonstrados na literatura. Além de estudos que relatam a atividade antiúlcera de xantonas (SHANKARANARAYAN; GOPALAKRISHNAN; KAMESWARAN, 1979; BANERJI et al., 1994), já foi descrito o 115

potencial antiulcerogênico de uma série de compostos fenólicos (HAMAUZU et al., 2008; BARROS et al., 2008; PRIYA, SABU, JOLLY, 2009). Considerando que o dano oxidativo é um causador comum da ulcerogênese, as propriedades antioxidantes intrínsecas aos compostos fenólicos podem ser uma das vias responsáveis pela gastroproteção, atuando também como citoprotetores (BARROS et al., 2008). Reyes-Chilpa et al. (2006) também demonstraram a capacidade das xantonas 6-desoxijacareubina, jacareubina, 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)- xantona e 1-hidroxi-3,5,6-tri-O-acetil-2(3,3-dimetilalil)-xantona, isoladas de Calophyllum brasilienses , bloquearem a atividade da bomba H +, K +-ATPase, última etapa envolvida com a secreção ácida no estômago, com IC 50 variando de 47 µM a 1,6 mM. No estudo puderam inferir sobre a relação estrutura-atividade de xantonas, evidenciando que a presença de hidroxila na posição C-6 parece ser essencial para a atividade. Além disso, grupamentos volumosos em C-2 poderiam diminuir a potência do metabólito. Considerando as xantonas PC2 e PC3 isoladas de P. cyparissias , pode-se observar que nenhuma das duas apresenta a hidroxila em C-6, o que indicaria que ambas exercem sua atividade gastroprotetora por outras vias que não o bloqueio da bomba H +, K +-ATPase. Todavia, trata-se apenas de uma inferência, não podendo ser descartado tal mecanismo de ação gastroprotetor. Já em outro estudo avaliando a atividade antiúlcera da mangiferina, uma xantona glicosilada isolada de Mangifera indica , Carvalho et al. (2007) demonstraram, nos modelos de úlcera induzida por etanol e por indometacina, índices de gastroproteção variando de 22 a 63%. Seu efeito demonstrou estar associado à diminuição do volume de secreção ácida, bem como à sua capacidade antioxidante avaliada pelo modelo de úlcera induzida por etanol associada ao pré- tratamento com NEM. Assim, reforça-se que as xantonas possam apresentar atividade gastroprotetora por sua capacidade antioxidante. O esterol PC1 também apresentou índice de gastroproteção bastante significativo (86,2 ± 3,4%), muito semelhante ao encontrado para o β-sitoesterol (85,6 ± 6,3%) por Navarrete, Trejo-Miranda, Reyes-Trejo (2002). Neste estudo também afirma-se que a hidroxila presente em C-3 é essencial para o potencial antiulcerogênico de esteróis e triterpenos, também presente em PC1, sendo sugerido que seu efeito estaria relacionado à restauração dos níveis de PGs, de uma forma similar à ação da carbenoxolona. Todavia, a classe de fitoesteróis foi 116

pouco estudada quanto ao seu potencial gastroprotetor, não apresentando estudos que possam delimitar um provável mecanismo de ação.

5.2.2 Avaliação da atividade anti-Helicobacter pilory

Sabe-se que um importante agente etiológico da úlcera é a infecção por H. pilory . É uma bactéria gram-negativa que tem como habitat específico a mucosa gástrica, contribuindo diretamente na lesão das células gástricas através da liberação de citotoxinas vacuolizantes, bem como de enzimas tóxicas, como lipase, urease e protease, propiciando a formação da úlcera (SIQUEIRA et al., 2007). Assim, objetivando-se determinar o potencial anti-H. pilory do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias , realizou-se o seu estudo in vitro através de diluição destes em ágar sólido. Observou-se que, mesmo na maior concentração (2000 µg/ml), nem o extrato nem a fração foram capazes de inibir o crescimento da bactéria.

5.2.3 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva

Os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo demonstrado pelo extrato metanólico de P. cyparissias (coleta 2009) no modelo de hipernocicepção induzida por carragenina encontram-se apresentados na figura 48. Pode-se observar que o tratamento preventivo (i.p.) com o extrato metanólico de P. cyparissias foi capaz de reduzir significativamente a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle (p<0,05), com inibições de 30,7 ± 7,8 %, 46,7 ± 7,1 % e 67,8 ± 3,4 %, para as doses de 3, 10 e 30 mg/kg. O extrato na dose de 30 mg/kg pôde reduzir significativamente a hipernocicepção inflamatória até as 24h após a administração do agente irritante.

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Carragenina (300 µg/pata) Extrato bruto (3 mg/kg, i.p.) 50 11 Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.) 10 Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.) 9 40 8 * 7 30 6 ** *** ** 5 AUC *** 20 4 *** *** ** 3 *** *** *** *** 10 2 *** 1

Intensidade de hipernocicepção de Intensidade 0 0 1 3 4 6 24 48 Controle 3 10 30 Tempo (h) Extrato MeOH bruto (mg/kg, i.p.) Carragenina (300 µµµg/pata)

Figura 48: Intensidade de hipernocicepção, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001. A carragenina é um agente pró-inflamatório muito conhecido e utilizado em estudos envolvendo a hiperalgesia inflamatória em ratos e camundongos (MORRIS, 2003). Ela promove, inicialmente, a liberação de TNF-α que, por sua vez, poderá agir por dois caminhos distintos: indução da COX-2 e subsequente síntese de eicosanóides por IL-1β; e indução da produção de aminas simpaticomiméticas por IL-8 (RIBEIRO et al., 2000). A resposta induzida pela carragenina é caracterizada por ser bifásica: até 2,5h após a adminstração do agente, há a liberação principalmente de histamina, serotonina e bradicinina; em seguida, na segunda fase, há um aumento na produção de prostaglandinas e radicais livres (PANTHONG et al., 2004). Outro modelo utilizado para a avaliação da atividade anti-hipernociceptiva foi o de hipernocicepção inflamatória induzida por LPS. Na Figura 49 estão apresentados os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo demonstrado pelo extrato metanólico de P. cyparissias nesse modelo. Primeiramente, destaca-se que a injeção i.pl. de LPS foi capaz de reduzir o limiar de sensibilidade mecânica dos camundongos quando comparado aos valores basais. Além disto, o tratamento preventivo (i.p.) com o extrato metanólico de P. cyparissias foi capaz de reduzir significativamente a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle (p<0,01), com inibições de 52,6 ± 7,4 %, 83,5 ± 5,0 % e 89,0 ± 4,8 % para as doses de 3, 10 e 30 mg/kg. O extrato pôde reduzir significativamente, em todas 118

as doses, a hipernocicepção inflamatória durante todo o período de acompanhamento do teste (48h).

LPS (100 ng/pata) Extrato bruto(3 mg/kg, i.p.) Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.) 500 90 Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.) 80 400 70 60 300 ** 50 *** ** *** ***

*** AUC 40 *** 200 *** *** ** 30 *** *** ** 20 *** *** 100 *** 10 *** *** *** *** Frequência de de Frequência resposta (%) *** 0 0 B 1 2 4 6 24 48 Basal Controle 3 10 30 Tempo (h) Extrato MeOH bruto (mg/kg) LPS (100ng/pata)

Figura 49: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001.

O LPS é uma endotoxina bacteriana e está envolvido com a produção de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, prostaglandinas e, especialmente, óxido nítrico (BONATERRA et al., 2010). O óxido nítrico é um radical livre gasoso, sendo rapidamente metabolizado a nitrato e nitrito. É produzido por uma enzima denominada NOS, que é dividida em três isoformas: as constitutivas cNOS e eNOS e a induzida iNOS. Esta última é estimulada por agentes pró-inflamatórios, como é o caso do LPS (KASSIM et al., 2010). Com a liberação do NO há a ativação direta de fibras sensoriais cerebrais, levando à liberação do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e ao aumento das concentrações de cGMP e cAMP. Estes segundos mensageiros, através de fosforilações, aumentam o fluxo de Na + e Ca 2+ , diminuindo de K +, o que gera a sensibilização das fibras nociceptivas (CODERRE, 2009; DRAY, 2009). No modelo de úlcera induzida por etanol associada ao L-NAME (bloqueador da NOS), foi observado que o extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias agiam de forma a induzir a produção de NO, visto que a gastroproteção demonstrada foi dependente do sistema oxinitrérgico. Já no modelo de 119

hipernocicepção induzida por LPS, causada especialmente pelo aumento da síntese de NO, o extrato metanólico da planta apresentou capacidade antagônica, seja por inibir a ação do NO ou por reduzir sua síntese. Porém, conforme já relatado, existem diferentes isoformas de NOS. As envolvidas com a gastroproteção são as isoformas constitutivas, enquanto que aquela envolvida com a hipernocicepção inflamatória é a induzida (WALLACE, MA, 2001). Consequentemente, é possível que os extratos e fração de P. cyparissias atuem tanto de forma antagônica quanto agônica com NO e NOS. Clark et al. (2010) recentemente demonstraram que o LPS também induz a liberação de IL-1β e a fosforilação do MAPK p38 através de receptores P2X7 (classe de receptores purinérgicos). A IL-1β ativa os nociceptores diretamente, gerando sua sensibilização através da ativação de quinases intracelulares, além de indiretamente poder gerar sensibilização pela indução de produção de cininas e prostanóides. Já a ativação de MAPK p38, assim como de outras quinases, são importantes reguladores da excitabilidade das fibras através da alteração de transcrição gênica (DRAY, 2009). Em comparação com a carragenina, o LPS induz uma resposta inflamatória mais branda, com o pico de edema atingido após 3h, enquanto que na carragenina o pico ocorre após 6h de indução (KASSIM et al., 2010). Investigando ainda a ação do extrato metanólico de P. cyparissias sobre a hipernocicepção inflamatória, este foi testado frente ao modelo induzido por CFA. Conforme pode ser observado na figura 50, o pré-tratamento com o extrato metanólico de P. cyparissias , nas doses de 1 e 3 mg/kg, foi capaz de inibir de forma significativa a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle (p<0,01), com índices de inibição de 42,6 ± 3,4 % e 24,7 ± 9,0 % respectivamente. Porém, ao se observar a resposta obtida variando conforme o tempo, pode-se perceber que sua eficácia limitou-se até a quarta hora, perdendo seu potencial anti- hipernociceptivo após este período.

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CFA (20 µL/pata) Extrato bruto (0,3 mg/kg, i.p.) Extrato bruto (0,1 mg/kg, i.p.) Extrato bruto (1 mg/kg, i.p.)

90 80 600

70 500 60 ** ** 400 50 * ** 40 ** 300 *** *** AUC 30 200 20 100

Freqüência de resposta (%) resposta de Freqüência 10 0 0 B 1 2 3 4 6 24 48 Basal Controle 0,3 1 3 Tempo (h) Extrato MeOH bruto (mg/kg, i.p.) CFA (20 µµµl/pata)

A administração local de CFA causa extravasamento plasmático, infiltração de células inflamatórias com um aumento nos níveis de diversos mediadores inflamatórios, tais como citocinas, neutrofinas e eicosanóites (BURSTEIN et al., 2004). Todavia, uma das principais vias de ação do CFA é a liberação do fator de crescimento neuronal (NGF) (WOOLF, C. J., 1997). O NGF é uma neutrofina especialmente relacionada à sensibilização neuronal. Ele é capaz de aumentar a expressão de receptores do tipo: TRPV1, especialmente sensíveis a temperaturas elevadas e a variações de pH; P2X3, relacionados à dor produzida por ATP; ASIC, associados, juntamente com TRPV1, à dor causada por acidose tecidual; BK, sensíveis às bradicininas, atuando tanto na manutenção da hiperalgesia inflamatória persistente, quanto na amplificação da formação de edema; e canais de Na + e K +, relacionados à despolarização do nociceptor (MENDELL, 2009). Objetivando verificar o papel do extrato diretamente sobre um importante mediador inflamatório, realizou-se o modelo de hipernocicepção induzida pela injeção de PGE 2. Os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo demonstrado pelo extrato metanólico de P. cyparissias nesse modelo encontram-se apresentados na figura 51. Pode-se observar que o tratamento preventivo (i. p.) com 121

o extrato metanólico de P. cyparissias foi capaz de reduzir significativamente a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle (p<0,01), com inibições de 88,5 ± 11,5 % e 73,6 ± 7,3 % para as doses de 3, 10 mg/kg. Todavia, para a dose de 30 mg/kg, não foi observado um efeito anti-hipernociceptivo. Este comportamento contrário ao esperado muitas vezes se deve à saturação de receptores, o que acaba levando à ação pró-nociceptiva por vias paralelas onde, normalmente, o extrato não agiria. Além disso, observa-se que o melhor efeito foi observado após uma hora de injeção do agente lesivo, sendo que após as seis horas, nenhuma dose do extrato foi capaz de inibir significativamente a hipernocicepção provocada por PGE 2.

PGE 2 (0,1 nmol/pata) Extrato bruto (3 mg/kg, i.p.) Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.) 90 Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.) 400 80

70 300 60 * * 50 * * ** 200 **

40 AUC 30 *** *** *** 100 20 10

Freqüência de resposta (%) resposta de Freqüência 0 0 Basal Controle 3 10 30 B 1 2 4 6 Tempo (h) Extrato MeOH bruto (mg/kg) PGE 2 (0,1 nmol/pata)

Figura 51: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de PGE 2 (0,1 nmol/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001.

As PGs, de uma forma geral, são consideradas mediadores finais da dor inflamatória, visto que podem ativar diretamente os nociceptores, independendo da liberação de outros mediadores, promovendo a sua sensibilização para uma dada estimulação posterior, não causando dor espontânea (FERREIRA et al., 2009). De uma forma geral, a PGE 2 pode aumentar a permeabilidade vascular e a produção de IL-6, promover a vasodilatação, além de diminuir o limiar de disparos de potenciais de ação, facilitando a ativação neuronal, levando à hiperalgesia (CALDER, 2009; 122

FERREIRA et al., 2009). A sensibilização central é decorrente do aumento de liberação de glutamato, despolarização direta dos neurônios no corno dorsal e inibição dos receptores de glicina sensíveis à estricnina (ZEILHOFER, 2007). No modelo de úlcera induzida por AINEs, observou-se que o extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias foram capazes de proteger o estômago contra os danos causados principalmente pela inibição da COX. Todavia, o extrato metanólico da planta foi capaz de inibir a ação hipernociceptiva da PGE 2, principal

PG envolvida na gastroproteção. De fato, a ação da PGE 2 é bastante paradoxal e complexa, envolvendo efeitos pró- e anti-inflamatórios (HATA, BREYER, 2004), sendo os extratos e a fração da planta em estudo capazes de inibirem os seus efeitos nociceptivos e promoverem sua ação gastroprotetiva.

Em outro modelo, objetivou-se verificar o papel dos adrenoceptores α1 e α2, envolvidos mais diretamente com a dor neuropática (DRAY, 2009). Assim, o efeito anti-hipernociceptivo do extrato metanólico de P. cyparissias foi avaliado frente ao modelo de hipernocicepção mecânica induzida por epinefrina. Os resultados referentes a este modelo estão demonstrados na Figura 52. Como pode-se observar, o extrato metanólico de P. cyparissias não foi capaz de antagonizar a hipernocicepção mecânica promovida pela epinefrina, sugerindo que, provavelmente, o efeito anti-hipernociceptivo do extrato esteja mais envolvido com o bloqueio de vias envolvidas na hipernocicepção inflamatória, não atuando por meio dos adrenoceptores.

Epinefrina (100 ng/pata) Extrato bruto (3mg/kg, i.p.) Extrato bruto (10mg/kg, i.p.) Extrato bruto(30mg/kg, i.p.) 100 200

75 150

50 100

* AUC ** *** 25 *** 50

Freqüência de resposta (%) resposta de Freqüência 0 0 B 0.25 0.5 1 2 4 6 Basal Controle 3 10 30 Tempo (h) Extrato MeOH bruto (mg/kg, i.p.) Epinefrina (100 ng/pata)

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Figura 52: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de epinefrina (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001.

A epinefrina é uma catecolamina que, através da ativação de segundos mensageiros envolvendo cAMP e PKA, promove a redução do limiar dos nociceptores e aumenta a excitabilidade da membrana neuronal (MANJAVACHI et al., 2010). A exposição prolongada à epinefrina também gera uma expressão aumentada de α-adrenoceptores nas fibras, além de promover o brotamento de terminações nervosas simpáticas no gânglio da raiz dorsal, aumentando o contato entre estas terminações e as fibras nociceptivas (STEEDS, 2009), o que provoca a sua sensibilização. Considerando ainda a possível atuação de P. cyparissias sobre a dor neuropática, realizou-se o experimento de CPNC. Na figura 53 observa-se o efeito do extrato metanólico de P. cyparissias neste modelo. Conforme os gráficos apresentados, o tratamento com o extrato dos animais expostos a este modelo foi capaz de reverter a sensibilização mecânica induzida, com inibição de 44,4 ± 4,6 % e 40,0 ± 4,0 % para as doses de 3 e 10 mg/kg, mantendo seu efeito por até 12 dias após a cirurgia.

Operado Extrato MeOH bruto (3mg/kg, i.p.) Extrato MeOH bruto (10mg/kg, i.p.) Falso-operado

90 600 80 500 70 400 60 ** ** *** 50 *** *** 300 *** *** AUC *** * 40 *** *** *** 200 *** *** 30 100 20 0 10 Basal FOP Controle 3 10 Freqüência de resposta (%) resposta de Freqüência 0 Extrato MeOH B C 7 8 9 10 11 12 13 14 (mg/kg, i.p.) Dias

Diversos mecanismos estão envolvidos na hiperalgesia provocada pela CPNC. Após a lesão, ocorre uma ativação constante das fibras lesadas, promovendo a liberação de mediadores nociceptivos e de citocinas pró- inflamatórias, como IL-1β e TNF-α, gerando a sensibilização dos nociceptores periféricos (CUI et al, 2001). A lesão do nervo ciático promove descargas ectópicas, tanto pelas fibras lesionadas quanto pelas intactas. Esta característica é explicada, ao menos em parte, pela liberação periférica de NGF, que acarreta na sensibilização das fibras não lesionadas. Esta sensibilização se dá pela ativação de receptores trkA pelo NGF que, por consequência, fosforilam através de cascatas ligadas à PKA, PKC, MEK e MAPK os receptores TRPV1, gerando a sensibilização. Ademais, o NGF promove a liberação de fator neurotrófico derivado de células da glia, substância P e de fator neurotrófico derivado do cérebro. Também, o complexo trkA-NGF é internalizado na fibra, sendo direcionado ao gânglio da raiz dorsal, onde ativa uma série de cascatas sinalizadoras, promovendo a expressão aumentada de TRPV1 (OSSIPOV; PORRECA, 2009). A lesão das fibras também promove uma expressão aumentada de canais voltagem-dependentes de sódio, especialmente do tipo Na v1.3, Na v1.8 e Na v1.7. Estes canais estão amplamente relacionados à geração de potenciais de ação presentes na excitação neuronal, levando à sensibilização das fibras nociceptivas. Outros canais importantes são os canais de cálcio do tipo N. Sua expressão e atividade aumentadas resultam em uma liberação expressiva de substância P, CGRP e de glutamato (OSSIPOV; PORRECA, 2009). Grande parte destes eventos são apenas periféricos, sendo o mecanismo responsável pela manutenção da dor neuropática atrelado à sensibilização central. Esta ocorre pela diminuição do limiar de despolarização e pelo aumento do número de fibras responsivas à estimulação nociceptiva (OSSIPOV; PORRECA, 2009). O aumento de liberação de diversos mediadores nociceptivos (substância P, CGRP e glutamato) pelas fibras periféricas causa resposta prolongada do corno dorsal, promovendo o recrutamento de receptores NK1, AMPA e NMDA, sensibilizando os neurônios secundários, o que causa a hiperalgesia e alodínia (MARCHAND, 2008). Anteriormente, já foram realizados estudos com P. cyparissias evidenciando seu potencial anti-nociceptivo. O extrato hidroalcoólico da planta foi capaz de inibir a 125

nocicepção neurogênica induzida pela formalina (primeira fase) e pela capsaicina, demonstrando sua potencial ação sobre diferentes mediadores químicos, como as cininas, taquicininas e prostaglandinas. A nocicepção inflamatória, característica da segunda fase do modelo da formalina, foi inibida de forma mais significativa pelo extrato, além de inibir o edema causado por este agente. Diferentemente da primeira fase, na fase inflamatória apenas as cininas e as prostaglandinas parecem estar envolvidas, mas não o sistema taquicinérgico. O extrato também foi capaz de antagonizar a hipernocicepção induzida por bradicinina e por substância P. O estudo também sugere que o efeito anti-nociceptivo de P. cyparissias não parece ter relação com o sistema opióide (DE CAMPOS et al., 1997). Em outro estudo, foi evidenciado o efeito inibitório do extrato hidrolacoólico de P. cyparissias sobre contrações induzidas por diferentes agentes inflamatórios em traquéias isoladas de cobaias (SAYAH et al., 1999). Dentre tais agentes, destacam- se bradicinina, substância P, PGH 2, análogo estável de tromboxano A 2 U46619, histamina e acetilcolina, todos mediadores envolvidos com a resposta nociceptiva e inflamatória nas vias aéreas. Baseado nos estudos prévios e tomando os resultados obtidos para a atividade anti-hipernociceptiva de P. cyparissias de forma conjunta, verifica-se que sua ação foi evidenciada principalmente em modelos de hipernocicepção inflamatória. De fato, os extratos da planta demonstraram antagonismo a diversos mediadores da inflamação, bem como a agentes pró-inflamatórios, como a carragenina, CFA e LPS. Em contrapartida, o extrato não apresentou atividade anti- hipernociceptiva no modelo de nocicepção induzida por epinefrina. Todavia, gerou resultados promissores no modelo de CPNC. Como descrito, este último modelo promove a sensibilização periférica e central por diferentes e variados mecanismos, envolvendo mediadores inflamatórios e mediadores nociceptivos centrais. Com isto demonstra-se uma atuação potencialmente sinérgica do extrato metanólico de P. cyparissias , envolvendo uma série de distintos mecanismos para gerar sua atividade anti-hipernociceptiva. Esta ação sinérgica é bastante comum para extratos, visto a variabilidade molecular existente em sua constituição, permitindo que atue por diferentes vias. Objetivando a verificação do papel dos diferentes compostos isolados de P. cyparissias , PC1 a PC4 foram avaliados no modelo de hipernocicepção induzida por carragenina. Os resultados estão apresentados nas figuras 54 a 57. Para PC1, 126

observou-se uma redução significativa na resposta à hipernocicepção mecânica (p<0,05) em todas as doses, com inibições de 21,2 ± 5,8 %, 37,3 ± 5,8 % e 41,6 ± 6,2 %, respectivamente para 0,02, 0,07 e 0,24 µmol/kg. Todavia, esta atividade foi observada apenas para os períodos iniciais após o tratamento. Já PC2 não foi capaz de inibir significativamente a resposta nociceptiva, evidenciando que, provavelmente, não participe do potencial anti-hipernociceptivo de P. cyparissias . PC3 foi capaz de inibir a resposta dos animais à estimulação mecânica em todas as doses (p<0,01), sendo o composto mais efetivo, com inibições de 34,2 ± 3,6 %, 47,8 ± 5,2 % e 22,1 ± 5,0% para as doses de 0,04, 0,11 e 0,37 µmol/kg, respectivamente. Além disto, sua atividade perdurou durante todas as 48h de avaliação. Porém, não demonstrou apresentar um perfil dose-resposta. Por fim, PC4 também foi efetivo quanto à redução da hiperalgesia induzida pela carragenina (p<0,01), porém apenas nas doses de 0,09 e 0,31 µmol/kg, com inibições de 63,6 ± 4,4 % e 40,4 ± 7,7 %, respectivamente. Sua atuação limitou-se à 24h após a administração do agente lesivo.

Carragenina (300 µg/pata) PC1 (0,02 µmol/kg, i.p.) PC1 (0,07 µmol/kg, i.p.) PC1 (0,24 µmol/kg, i.p.)

90 600

75 500 ** * 60 400 ** ** 45 ** * 300 ** AUC ** 30 ** *** *** 200 *** 15 100 Freqüência de de resposta (%) Freqüência 0 0 B 1 3 4 6 24 48 Basal Controle 0,02 0,07 0,24 Tempo (h) PC1 ( µµµmol/kg, i.p.) Carragenina (300 µµµg/pata)

Figura 54: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados PC1 (0,02 – 0,24 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001. 127

Carrageenina (300 µg/pata) PC2 (0,04 µmol/kg, i.p.) PC2 (0,12 µmol/kg, i.p.) PC2 (0,39 µmol/kg, i.p.) 600 90 500 75 400 60 300 45 *** AUC 200 30 15 *** 100 ***

Freqüência de resposta (%) resposta de Freqüência 0 0 B 1 3 4 6 24 48 Basal Controle 0,04 0,12 0,39 Tempo (h) PC2 ( µµµmol/kg, i.p.) Carragenina (300 µµµg/pata)

Carragenina (300 µg/pata) PC3 (0,04 µmol/kg, i.p.) PC3 (0,11 µmol/kg, i.p.) PC3 (0,37 µmol/kg, i.p.) 600 90 500 75 ** 400 ** 60 ** 300

45 AUC *** * * 200 30 ** *** * *** *** *** 100 15 *** * ** 0

Freqüência de resposta resposta (%) de Freqüência 0 B 1 3 4 6 24 48 Basal Controle 0,04 0,11 0,37 Tempo (h) PC3 ( µµµmol/kg, i.p.) Carragenina (300 µµµg/pata)

Carragenina (300 µg/pata) PC4 (0,03 µmol/kg, i.p.) 600 PC4 (0,09 µmol/kg, i.p.) PC4 (0,31 µmol/kg, i.p.) 90 500 75 400 ** 60 *** * *** 300 **

*** AUC 45 *** *** *** 200 30 *** *** 15 100

Freqüência de resposta (%) Freqüência 0 0 B 1 3 4 6 24 48 Basal Controle 0,03 0,09 0,31 Tempo (h) PC4 ( µµµmol/kg, i.p.) Carragenina (300 µµµg/pata)

Estes resultados sugerem que os compostos PC1, PC3 e PC4 podem ser parcialmente responsáveis pela atividade anti-hipernociceptiva de P. cyparissias . Ademais, considerando apenas as xantonas, pode-se inferir que um maior volume molecular existente nas suas posições 2 e 3 contribui para a atividade, visto que: em PC4 há a presença de um substituinte metóxi em C-2 e uma hidroxila em C-3; em PC3 há um anel metilenodióxi substituindo C-2 e C-3; já em PC2, há apenas uma hidroxila em C-3. Assim, com o aumento do volume dos substituintes, há um aumento na atividade. Ademais, a presença de grupos aceptores de prótons também pode estar relacionado ao aumento da atividade anti-hipernociceptiva. Em PC2 há um grupo doador e aceptor (hidroxila) em C-3. Já em PC3 há a presença do mesmo grupo na mesma posição, porém há um grupo aceptor em C-2 (metóxi). Todavia, em PC3, há apenas grupos aceptores em ambas as posições (metilenodióxi), podendo este fator ser parcialmente responsável pela melhor atividade. Alguns estudos já demonstraram a atividade anti-nociceptiva de xantonas. Em um estudo com xantonas sintéticas 2-carboxiladas, foi evidenciada a atividade destas moléculas sobre a nocicepção inflamatória (ECKSTEIN; MARONA; MAZUR, 1983). Já Bianco et al. (1989) sintetizaram 2-hidroxiacetil-7-acetilxantona, que, quando avaliada frente ao modelo de contorções abdominais e edema de pata em 129

camundongos, foi capaz de gerar respostas anti-nociceptiva e anti-inflamatória pronunciadas. Ainda, De Campos et al. (1997) verificaram que a 1,7-dihidroxi-2,3- dimetoxixantona, identificada como PC5 no presente trabalho, foi capaz de reduzir o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Mais recentemente, Dar et al. (2005) objetivaram determinar o mecanismo de ação da mangiferina, uma xantona glicosilada. Ela foi capaz de inibir as contorções abdominais induzidas por ácido acético, sendo sugestionado que está ação envolveria o sistema opióide. Também, diversas xantonas sintéticas foram testadas por Librowski et al. (2005), demonstrando que várias delas apresentaram atividade anti-nociceptiva e anti-inflamatória, além de não provocarem efeitos adversos sobre a mucosa gástrica. Já Cui et al. (2010) evidenciaram que tanto a α-mangostina quanto a γ-mangostina, ambas xantonas preniladas, apresentaram efeito antinociceptivo nos modelos da placa quente e de formalina, estando esta ação relacionada, periféricamente, à inibição da síntese de PGs e ao seu efeito antioxidante e, centralmente, ao seu efeito antagonista sobre a histamina e a serotonina. Quanto ao espinasterol, Jeong et al. (2010) demonstraram seu efeito supressor sobre mediadores pró-inflamatórios induzidos por LPS, inibindo, também, a produção de NO, PGE 2, TNF-α e IL-1β. Também, Meotti et al. (2006) e Boller et al. (2010) verificaram a atividade antinociceptiva do esterol no modelo de contorções induzidas por ácido acético e, posteriormente, contra a nocicepção induzida por glutamato (RIBAS et al., 2008). Assim, os resultados farmacológicos obtidos para o extrato e compostos isolados ensaiados nos modelos propostos, demonstram a potencial atividade gastroprotetora e anti-hipernociceptiva de P. cyparissias . Cabe salientar que um extrato ou metabólito isolado que apresente ambas as atividades é de extremo interesse, visto que os AINEs, comumente utilizados por suas propriedades analgésicas, podem gerar úlceras gástricas, conforme relatado anteriormente. Destaca-se que avanços para delineamento de mecanismo de ação para ambas as atividades farmacológicas são necessários, tanto para o extrato quanto para os compostos isolados. Em adição, estes metabólitos podem servir como protótipos para futuros estudos de derivatização de suas estruturas, objetivando melhoramento farmacocinético e farmacodinâmico, enriquecendo ainda mais as 130

potencias aplicabilidades de produtos de origem natural para o tratamento da úlcera e da dor.

6 CONCLUSÕES

a) Através de métodos cromatográficos clássicos, foi possível isolar 5 compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias : α-espinasterol (PC1), 1,3- dihidroxi-7-metoxixantona (PC2), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4) e 1,7dihidroxi-2,3- dimetoxixantona (PC5). Além disto, da fração metanólica obteve-se, pela primeira vez para o gênero Polygala , o flavonóide astragalina; b) Obteve-se um perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias que, futuramente, deverá ser aprimorado para fins de quantificação do marcador PC3 em extratos de coletas sazonais e de diferentes partes da planta; 131

c) O extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias apresentaram atividade gastroprotetora frente a dois modelos de indução de lesão gástrica: etanol/HCl e indometacina/betanecol; d) Tanto o extrato acetônico quanto a fração metanólica demonstraram atividade curativa das lesões ulcerativas no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético; e) Nem o extrato acetônico nem a fração metanólica foram capazes de inibir o crescimento de H. pilory ; f) O extrato acetônico e a fração metanólica da planta em estudo promovem gastroproteção de forma dependendete do NO e dos SHs; g) O espinasterol (PC1) e as xantonas 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) e 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) demonstraram atividade gastroprotetora frente ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl; h) O extrato metanólico bruto de P. cyparissias foi capaz de antagonizar a

hipernocicepção mecânica induzida por carragenina, LPS, CFA e PGE 2; i) Aparentemente o efeito anti-hiperálgico de P. cyparissias não se relaciona às vias adrenérgicas, visto que foi incapaz de reverter o estado hiperálgico induzido por epinefrina; j) O extrato metanólico evidenciou ser capaz de inibir a hipernocicepção mecânica persistente induzida pela CPNC até o 12° dia; k) Os compostos isolados espinasterol (PC1), 1,7-dihidroxi-2,3- metilenodioxixantona (PC3) e 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4) apresentaram atividade anti-hipernociceptiva no modelo de nocicepção inflamatória induzida por carragenina; 132

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ANEXO A – Artigo publicado

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ANEXO B – ARTIGO DE REVISÃO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO