Virus De La Maladie De Newcastle (Apmv-1) Circulant Dans Le District De Fandriana

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

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DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

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MEMOIRE DE RECHERCHE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN SCIENCES DE LA VIE

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Option: BIOCHIMIE APPLIQUEE AUX SCIENCES MEDICALES

VIRUS DE LA MALADIE DE NEWCASTLE (APMV-1) CIRCULANT DANS LE DISTRICT DE FANDRIANA

Présentée par

RAZAFINDRAFARA Mirantsoa Suzanne

Maître ès Sciences

Le 30 avril 2015

Devant le jury composé de :

Président : Pr RAHERIMANDIMBY Marson

Rapporteurs : Pr ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel

Dr MAMINIAINA Olivier Fridolin

Examinateurs : Dr RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna

Dr TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina

DEDICACES

A dieu qui m’a donné sa grâce, son amour et son aide. Que toute louange et gloire te revienne Seigneur. A ma très chère mère, pour tout le sacrifice que tu ne cesse de faire pour nous tes enfants. Tu n’as pas ménagé tes efforts depuis toutes nos enfances jusqu’à aujourd’hui. J’espère que tu trouveras dans ce travail le couronnement de toutes ces années d’efforts et de sacrifice. A ma sœur et sa famille qui a toujours montré son aide et sa gentillesse envers moi. A mes deux frères Menja et Santatra. A mes nièces Angelina et Larissa. A toute ma famille. Vos prières, votre aide et vos soutiens durant la réalisation de ce travail sont très importante pour moi. Que dieu vous bénisse tous et vous récompense tous ce que vous avez faits pour moi.

REMERCIEMENTS Le présent travail est effectué dans le laboratoire de FOFIFA/DRZV : Centre Nationale de la Recherche et du Développement Rural/Département de la Recherche Zootechnique et Vétérinaire. Mon premier remerciement s’adresse au Seigneur Tout Puissant qui m’a donné la force et le courage d’accomplir ce travail. Louange et gloire à Notre Seigneur. Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance au Professeur RAHERIMANDIMBY Marson d’avoir accepté la présidence de ce mémoire malgré ces innombrables occupations. Mes plus sincères remerciements au Docteur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna et au Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina qui ont bien voulu accepter de juger ce travail et de figurer parmi les membres du jury. J’adresse ma profonde reconnaissance et ma sincère gratitude au Professeur ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel. Vous n’avez pas épargné ni votre temps ni vos conseils à la réalisation de ce travail malgré vos lourdes tâches. J’adresse mes vifs remerciements et mon profond respect au Docteur MAMINIAINA Olivier Fridolin, pour la confiance que vous m’avez faite en proposant ce sujet de mémoire et en acceptant l’encadrement de ce mémoire. Je vous remercie pour toutes les connaissances que vous m’avez transmises et pour vos nombreux conseils durant la réalisation de ce travail. Veuillez trouver ici l’expression de notre profonde gratitude. Je tiens à remercier vivement : Le Docteur Ando Lalaniaina RANDRIANIERENANA, pour toutes les connaissances et la formation dont vous m’avez fait part durant mes études universitaires. Le Professeur Victor JEANNODA, pour toutes les connaissances et les valeurs morales que vous m’avez transmises. Le Docteur RALINIAINA Modestine, Chef de Département de Recherche Zootechnique et Vétérinaire pour m'avoir accueillie dans son laboratoire. Je remercie également tous les enseignants de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo pour les connaissances qu’ils m’ont transmises durant mon cursus universitaire. Mes chaleureux remerciements s’adressent également à ma famille pour leur soutien moral et leurs encouragements permanents. Pour terminer, je remercie très vivement toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce mémoire. GLOSSAIRE ...... i LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ...... iii LISTE DES FIGURES ...... v LISTE DES TABLEAUX ...... vii Chapitre. 1 INTRODUCTION ET SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 1 I INTRODUCTION ...... 1 II SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 3 II.1 Généralités sur la maladie de Newcastle ...... 3 II.2 Virus de la maladie de Newcastle (APMV-1) ...... 4 II.2.1 Classification ...... 4 II.2.2 Pathogénicité ...... 5 II.2.3 Structure ...... 6 II.2.4 Cycle de multiplication ...... 11 II.2.5 Génotype ...... 13 Chapitre. 2 MATERIELS ET METHODES ...... 15 I Site d‟étude ...... 15 II Enquêtes ...... 17 III Prélèvement ...... 17 IV Mesures de sécurité ...... 17 V Préparation de l‟inoculum ...... 18 VI Extraction d‟acide nucléique ...... 18 VII Criblage par reverse transcriptase PCR en temps réel ...... 21 VIII Isolement viral ...... 24 IX Amplification et séquençage ...... 26 X Simulation des séquences ...... 31 XI Analyse phylogénétique ...... 31 Chapitre. 3 RESULTATS ET INTERPRETATION ...... 34 I Enquêtes sur terrain ...... 34 I.1 Importance de l’aviculture dans le district de Fandriana ...... 34 I.2 Connaissance de la MN par les villageois ...... 35 I.3 Symptômes de la maladie ...... 36 I.4 Incidence de la maladie ...... 36 II Diagnostic de la présence d‟APMV-1 ...... 37 II.1 Reverse transcriptase PCR en temps réel ...... 37 II.2 Isolement viral ...... 39 II.3 PCR conventionnelle ...... 41 III Résultats de la simulation ...... 42 Chapitre. 4 DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES ...... 46 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 46 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 50 ANNEXES ...... I ANNEXE 1 : Localisation et description des lésions de la maladie de Newcastle ...... I ANNEXE 2 : Vaccins anti-Newcastle commercialisés à Madagascar...... I ANNEXE 3 : Préparation de mélange d'antibiotiques ...... II ANNEXE 4 : Préparation des réactifs de l‟extraction...... III ANNEXE 5 : Protocole d‟inoculation du virus sur œuf embryonné...... III ANNEXE 6 : Génotypes des APMV-1 utilisés pour la construction des arbres phylogénétiques...... IV ANNEXE 7 : Identification des échantillon ...... IV ANNEXE 8 : Schéma du format FASTA des séquences...... V ANNEXE 9: Fiche d‟enquete utilisée sur le terrain...... VI ANNEXE 10 : Appareils utilisés en biologie moléculaire...... XIII ABSTRACT RESUME

GLOSSAIRE

Amorce : Oligonucléotide qui, hybridé avec une matrice d'acide nucléique, permet à une polymérase d'initier la synthèse du brin complémentaire. Antibiotique : Substance capable d'empêcher le développement des microorganismes. Aviculteurs : Nom des personnes qui élèvent les volailles. Aviculture : Elevage de volaille. Cas : Désigne un animal infecté par un agent pathogène, présentant ou non des signes cliniques manifestés. Cheptel : Désigne un groupe d'animaux d'une espèce donnée, élevés ensemble sous le contrôle de l'Homme. Conjonctivites : Inflammation de la conjonctive des yeux provoquée par un virus (conjonctivite virale), une bactérie (conjonctivite bactérienne), une allergie (conjonctivite allergique) ou une irritation. Epizootie : Maladie frappant, dans une région plus ou moins vaste, une espèce animale ou un groupe d'espèces dans son ensemble. Foyer : Désigne l'apparition d'un ou plusieurs cas au sein d'un même endroit. GenBank : Banque de données de séquences d‟acides nucléiques basée à Cambridge (USA). Génotype : Ensemble des caractères génétiques d‟un individu. Son expression conduit au phénotype. Glycosylation : Modification post-traductionnelle des protéines par ajout des sucres. Les protéines glycosylées sont destinées à être sécrétées ou intégrées à la membrane. Hématome : Collection sanguine enkysté. Incidence : Nombre de nouveaux cas d'une pathologie observés pendant une période et pour une population déterminée. Critères les plus importants pour évaluer la fréquence et la vitesse d'apparition d'une pathologie, exprimé généralement en pourcentage. Larmoiement : Production de larmes par les glandes lacrymales, provoquée par une irritation de l'œil ou par des émotions. Pétéchies : Variété d‟hémorragie cutanée caractérisée par de petite tache d‟un

rouge violacée dont les dimensions varient d‟une tête d‟épingle à une lentille. Pathotype : Ensemble de micro-organismes quelquefois très éloignés les uns des autres (n'appartenant pas la même classification) mais possédant la capacité d'être à l'origine de la même maladie. Phylogénie : Etude des liens existant entre espèces apparentées. La notion de phylogénie est indissociable de l‟évolution, puisqu‟elle part du principe que les organismes possèdent entre eux un lien de parenté. Prophylaxie Ensemble de méthodes destinées à éviter l'apparition et la propagation des maladies. Torticolis : Signe clinique des maladies aviaires montré par une tête mobile. Virulence : Faculté de multiplication d‟un agent pathogène dans un organisme. Volaille : Ensemble des oiseaux domestiques qui sont utilisés pour la production de viandes ou d'œufs de consommation. Virose : Maladie causée par un virus. Zoonose : Maladie animale transmissible à l„homme.

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

AA : Acide aminé. ADN : Acide désoxyribonucléique. ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire. APMV-1 : Avian paramyxoviruses type-1 (Virus de paramyxovirus aviaire). ARN : Acide ribonucléique. ARNm : Acide ribonucléique messagers. Ct : Cycle thresold. dNTP : désoxyribonucléotide tri-phosphate. DRZV : Département de Recherche Zootechnique et Vétérinaire. EDTA : Ethyl diamine tétra acétique. ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay. EOPS : Exempts d‟organismes pathogènes spécifiques. F : Fusion. FOFIFA : Foiben‟ny FIkarohana ho Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra : (Centre de Recherche Appliquée au Développement Rural). HB1 : Hitchner B1. HN : Hémagglutinine-neuraminidase. IHA : Inhibition de l‟hémagglutination. IPIC : Indice de pathogénicité intracérébrale. IPIV : Indice de pathogénicité intraveineuse. kDa : Kilo Dalton. K2P : Kimura à deux paramètres. L : Polymérase. M : Matrice. MDT : Mean Death Time (Temps moyen de survie). MEGA : Molecular evolution genomic assay. MN : Maladie de Newcastle. NCBI. : National Center for Biotechnology Information. NJ : Neighbor joining. NP : Nucléoprotéine. OIE : Office international des épizooties. OMSA : Organisation Mondiale de la Santé Animale.

iii

ORF : Open reading frame. P : Phosphoprotéine. Pb : Paire de base. PCR : Polymerase Chain Reaction. PM : Poids moléculaire. RT-PCR : Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction. RAV1 : Tampon RAV1. RAV3 : Tampon RAV3. RAW : Tampon RAW. RIG : Région intergénomique. RNC : Région non codante. RNP : Ribonucléoprotéine. rpm : Rotation par minute. RT : Reverse transcriptase. TAE : Tris Acetate EDTA. Taq : Thermus aquaticus. Tm : Temprature melting (Température de fusion). UI : Unité Internationale. µg : Microgramme. µl : Microlitre. UV : Ultra violet.

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Signes cliniques de la MN. Figure 2 : Alignement de la protéine F (0 à 199 AA) montrant les acides aminés en position 112 à 117. Figure 3 : Structure schématique d‟un Avulavirus (© Swiss institute of bioinformatics). Figure 4 : Structure du génome d‟un Avulavirus (Yan, 2008). Figure 5 : Glycoprotéine F (Yusoff and Tan, 2001). Figure 6 : Glycoprotéine HN (Yusoff and Tan, 2001). Figure 7 : Cycle de multiplication des APMV-1. Figure 8 : Arbre phylogénétique des APMV-1. Figure 9 : District de Fandriana représentant les deux communes d‟étude. Figure 10 : Diagramme d‟analyse virologique. Figure 11 : Principe de la chromatographie d‟affinité (Ladram and Camus, 2012). Figure 12 : Extraction de l‟acide nucléique viral à l‟aide du kit NucleoSpin® RNA Virus (MACHEREY-NAGELTM). Figure 13 : Incorporation du SYBR Green lors de la RT- PCR en temps réel. Figure 14 : Courbe théorique de quantification des amplicons en RT-PCR en temps réel. Figure 15: Schéma de la RT-PCR en temps réel. Figure 16 : Inoculation par la cavité allantoïdienne (Young et al., 2012). Figure 17 : Mirage et récolte du liquide allantoïdien. Figure 18 : Principe de la transcription inverse. Figure 19 : Schéma de la PCR conventionelle. Figure 20 : Dosage de l‟ADNc. Figure 21 : Cycle d‟amplification de l‟ADNc. Figure 22 : Schéma d‟électrophorèse (BIORad®). Figure 23 : Matrice de distance suivant la méthode de Kimura à deux paramètres. Figure 24 : Composition moyenne du cheptel (n=422) pour les 38 éleveurs visités. Figure 25 : Histogramme représentant la connaissance de la MN par les villageois. Figure 26 : Evolution de la fréquence de la MN. Figure 27 : Courbe de quantification des amplicons montrant l‟évolution de la quantité d‟amplicon en fonction du nombre de cycles PCR. Figure 28 : Courbes de fusion obtenue par RT-PCR en temps réel en utilisant le SYBR Green. Figure 29 : Hématome trouvé chez l‟embryon.

Figure 30 : Courbe de dosage d‟ADNc. Figure 31 : Migration sur gel d‟agarose des amplicons. Figure 32 : Arbre phylogénétique (enraciné) de l'APMV-1 généré à partir des séquences simulées. Figure 33 : Arbre phylogénétique (enraciné) de l'APMV-1 généré à partir des séquences simulées motrant la position des souches moins évoluées que le génotype XI. Figure 34 : Arbre phylogénétique (enraciné) de l'APMV-1 généré à partir des séquences simulées montrant la position des deux souches plus évoluées que le génotype XI.

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Méthodes de détermination de la pathogénicité des APMV-1 (Maminiaina, 2011). Tableau 2 : Les différentes tailles du génome et les protéines correspondantes (Maminiaina, 2011). Tableau 3 : Primers utilisés en RT-PCR en temps réel. Tableau 4 : Amorces utilisés pour l‟amplification du gène F. Tableau 5 : Nombre de volaille enregistré durant l‟enquête. Tableau 6 : Connaissance de la MN par les villageois. Tableau 7: Valeurs de Ct des amplicons obtenues après criblage par RT-PCR en temps réel. Tableau 8 : Valeur de la Tm des amplicons. Tableau 9 : Durée de vie de l‟embryon pendant l‟incubation faisant suite à l‟inoculation virale. Tableau 10 : Concentration d‟ADNc dans les échantillons Tableau 11 : Antibiotiques utilisés dans cette étude.

vii

INTRODUCTION ET SYNTHESE BIBLIOGRAHIQUE

Introduction

Chapitre. 1 INTRODUCTION ET SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I INTRODUCTION L‟aviculture est une activité importante dans les pays en voie de développement (Copland and Alders, 2009; Robyn and Spradbrow, 2000). A Madagascar, le cheptel aviaire est estimé à 40 millions de têtes. Soixante-sept pour cent (67%) de la population rurale exerce l‟élevage aviaire. Deux grands types d‟aviculture sont pratiqués à Madagascar : l‟aviculture villageoise (ou traditionnelle) basée sur l‟élevage de races locales suivant un système extensif et l‟aviculture commerciale (ou moderne), basée sur l‟élevage de races importées. L‟aviculture villageoise est très répandue face à l‟aviculture commerciale : elle englobe 95% de l‟aviculture malgache (Ocean consultant., 2004). L‟aviculture représente un moyen d‟épargne, d‟investissement et d‟assurance pour les fermiers et procure une source de revenu aux populations (Sonaiya and Swan, 2004). Cependant, cette activité est limitée par plusieurs facteurs (prédations, vols, maladies) dont le principal est la maladie de Newcastle (Alexander, 1991; Spradbrow, 1988; Young et al., 2012). En aviculture commerciale où la vaccination est très importante, la maladie de Newcastle n‟est plus redoutable et est devenue très secondaire par rapport aux autres viroses aviaires (maladie de Marek, bronchite infectieuse, maladie de Gumboro). Par contre, elle est encore le principal obstacle du développement de l‟aviculture villageoise à Madagascar. Elle entraine une perte économique considérable aux aviculteurs car elle renferme des souches capables de provoquer 90 à 100 % de mortalité parmi les oiseaux atteints (Parent et al., 1989). La maladie de Newcastle (MN) est une virose aviaire hautement contagieuse. Elle est apparue pour la première fois en 1926 et fait partie de la liste des maladies à déclaration obligatoire par l'OMSA ou l‟Organisation Mondiale de la Santé Animale, ex-OIE ou Office Internationale des Epizooties (OIE, 2009). Elle affecte principalement les Galliformes et entraine des signes cliniques variables allant d‟une forme asymptomatique à une forme mortelle, suivant la virulence de la souche et l'espèce hôte (Young et al., 2012). Le virus de la MN ou APMV-1 (Avian Paramyxovirus) est un membre du genre Avulavirus (Alexander, 1988). Par analyse phylogénétique, les APMV-1 sont divisés en 2 classes distinctes, classe I et classe II. Les APMV-1 dans la classe II se repartissent phylogénétiquement dans 15 génotypes de I à XV (de Almeida et al., 2013). A Madagascar, une étude effectuée sur les Hautes Terres a montré la circulation des souches virulentes des APMV-1 appartenant génotype XI (Maminiaina, 2011).

Introduction

Dans la région d‟Analamanga et autour du lac Alaotra, la circulation des souches virulentes des APMV-1 appartenant au génotype XI a déjà été mise en évidence lors d‟une étude antérieure (Maminiaina, 2011). En revanche, dans les autres régions de Madagascar notamment la région d‟Amoron‟i Mania, aucune étude concernant la MN n‟est faite jusqu‟à présent. C‟est pourquoi la présente étude porte sur « le virus de la MN circulant dans le district de Fandriana », un district situé dans la région d‟Amoron‟i Mania. Elle doit apporter des éléments de réponse aux trois questions suivante : - Les APMV-1 circulent-ils vraiment dans cette région ? - Est-ce qu‟ils sont connus par les aviculteurs ? - Les souches circulantes sont-elles de génotype XI ou d‟un génotype différent ? Ainsi, les objectifs de cette étude sont d‟évaluer les connaissances des villageois sur la MN, d‟identifier la circulation des APMV-1 dans le district de Fandriana et de caractériser génétiquement les souches circulantes. Ce document se divise en 4 chapitres : Le premier chapitre concerne l‟introduction et la synthèse bibliographique. Le deuxième chapitre rapporte les matériels et méthodes utilisés. Les résultats obtenus sont présentés dans le troisième chapitre et le quatrième chapitre est consacré aux discussions, aux conclusions et aux perspectives.

Synthèse bibliographique

II SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE II.1 Généralités sur la maladie de Newcastle La première description d‟une maladie aviaire ressemblant à la MN date de 1926 à Java, Indonésie (Kraneveld, 1926). Un an après, Doyle a identifié l‟agent causal de la maladie lors d‟une épizootie des poulaillers à Newcastle Sur-Tyne (Angleterre) et donné ainsi le nom « Maladie de Newcastle » (Doyle, 1927). Depuis cette année, elle a été trouvée dans de nombreuses parties du Sud-Est asiatique, d‟Amérique du Sud, d‟Europe et d‟Afrique (Ganière, 2008). A Madagascar, le premier foyer de la MN a été décrit en Août et Septembre1946 dans le port de Toamasina (Rajaonarison, 1991). Actuellement, elle est signalée dans toute l‟Ile (Maminiaina et al., 2007). La MN, aussi appelée «pseudopeste aviaire» ou «pneumoencéphalite aviaire» est une virose très contagieuse à déclaration obligatoire selon l‟OIE (OIE, 2009). Elle affecte les oiseaux domestiques ou sauvages dans les Familles des Numididae (Pintades) des Phasianidae (Poule, perdrix, faisans, cailles, paons, dindons) et des Colombidae (Pigeon). Chez ces dernières, la maladie est appelée « paramyxovirose de pigeon » (Sylla et al., 2003). La MN est transmise par voie respiratoire ou digestive. L‟inhalation d‟aérosol (gouttelettes, poussières contaminées) et l‟ingestion de matière virulente (eaux, aliments contaminés) sont les modes les plus fréquents (Acha and Szyfres, 1982; Heinz, 1969). Les signes cliniques de la MN sont diverses mais la paralysie des membres et le torticolis sont le plus souvent observés (Figure 1a et 1b). Quelques fois, les poules infectées pondent des œufs anormaux (Figure 1c). La MN occasionne des pétéchies et des hémorragies au niveau du proventricule (Figure 1d et 1e) mais rarement ces lésions peuvent être aussi observées au niveau des autres organes (Cf annexe 1) (Bulden et al., 1996; Ganière, 2008). La MN est considérée comme une zoonose mineure qui provoque des conjonctivites et des larmoiements (Maminiaina, 2011). Plusieurs méthodes sont disponibles pour diagnostiquer la MN (PCR, ELISA, IHA, isolement viral). Pourtant le traitement spécifique de la maladie n‟existe pas encore, la prophylaxie étant la seule voie de protection. La prophylaxie sanitaire est variable selon la situation du pays face à la maladie, selon les moyens disponibles (humains et financiers) et selon l‟apparition de la maladie. Ainsi, des mesures de biosécurité comme le nettoyage et désinfection réguliers des locaux, l‟utilisation des bottes et des vêtements à usage unique peuvent être adoptées avant l‟infection. En cas d‟infection, il faut abattre les animaux infectés ou suspectés et détruire les cadavres. Une désinfection totale et un vide sanitaire sont

Synthèse bibliographique obligatoires avant le repeuplement du milieu quand l‟infection est passée (Robyn and Spradbrow, 2000). La prophylaxie médicale repose sur la vaccination (Robyn and Spradbrow, 2000).Plusieurs vaccins contre la MN sont commercialisés à Madagascar (Cf annexe 2). Ils sont fabriqués essentiellement à partir de trois souches : La Sota, HitchnerB1 (HB1) et Mukteswar. Le choix du vaccin par les éleveurs se fait en fonction du type d‟élevage et de vaccin disponibles (monovalent ou polyvalent). Ainsi, les aviculteurs pratiquant l‟élevage commercial utilisent les vaccins à base des souches La Sota ou HB1 tandis que les aviculteurs villageois préfèrent généralement le vaccin PESTAVIA® à base de la souche Mukteswar (Maminiaina, 2011).

(d) (e)

Figure 1 : Signes cliniques de la MN. (a) paralysie des membres (b) torticolis (c) œufs déformés et de petite taille (e) Pétéchies (f) hémorragies (cliché D.Balloy).

II.2 Virus de la maladie de Newcastle (APMV-1) II.2.1 Classification Le virus de la MN est classé dans l‟ordre des Mononégavirales, famille des Paramyxoviridae, sous-famille des Paramyxovirinae et genre Avulavirus. Ce genre regroupe 9 sérotypes de paramyxovirus d‟origine aviaire (APMV pour avian paramyxovirus), désignés d‟APMV-1 à APMV-9. Toutes les souches du virus de la MN appartiennent au sérotype 1 d‟où leur nom APMV-1 (Alexander, 2003; Mayo, 2002).

Synthèse bibliographique

II.2.2 Pathogénicité La virulence des souches est variable chez les APMV-1. Selon les symptômes observés chez les poulets, les souches sont classées en 3 pathotypes. Les souches lentogènes qui sont des souches avirulentes. Les souches mésogènes qui sont faiblement virulentes mais pouvant entrainer une légère mortalité. Les souches velogènes sont très virulentes et capables d‟entrainer une mortalité élevée (jusqu‟à 100%) chez les sujets infectés (Alexander, 2003). La virulence de la souche (ou pathogénicité) peut être déterminée soit in vitro par l‟analyse moléculaire du site de clivage de la glycoprotéine F, soit in vivo par le calcul en calcul de l‟indice de pathogénicité intra cérébrale ou l‟indice de pathogénicité intraveineuse (Tableau 1). Parfois, l‟analyse in ovo qui consiste à la recherche du temps moyen de survie de l‟embryon est utilisée (Maminiaina, 2011).

Tableau 1 : Méthodes de détermination de la pathogénicité des APMV-1 (Maminiaina, 2011).

Pathotypes IPIC IPIV MDT Site de clivage

Lentogène < 0.7 < 2.5 > 90h 112RR/KQ/KR*F117 Mesogène [1.5-0.7] < 2.5 [60-90h] 112RR/KQ/KR*F117 Velogène > 0.7 > 2.5 < 60h 112RR/KQ/KR*F117

IPIC : L’indice de pathogénicité intracérébrale est calculé après infection intracérébrale de poussins d’un jour. IPIV : L’indice de pathogénicité intraveineuse est calculé de manière similaire à l’ICPI mais chez des volailles infectées par voie intraveineuse à l’âge de six semaines. MDT ou MeanDeath Time : Délai correspond à la durée moyenne, en heure, nécessaire pour obtenir la mort de tous les embryons des œufs inoculés.

La glycoprotéine F est impliquée dans le déterminisme de la virulence des APMV-1. Le site de clivage qui se trouve entre les positions 112 à 117 du précurseur de la glycoprotéine constitue la base moléculaire de la pathogénicité (Figure 2). En effet, la présence d‟au moins trois acides aminés (AA) basiques (Arginine : R et/ou Lysine : K) entre les positions 112 à 116 et d‟une phénylalanine (F) en position 117 est caractéristique des souches velogènes et mesogènes tandis que la présence de leucine (L) à cette même position (position 117) représente les souches lentogènes (de Leeuw et al., 2005; Peeters et al., 1999).

Figure 2 : Alignement de la protéine F (0 à 199 AA) montrant les acides aminés en position 112 à 117. 5

Synthèse bibliographique

II.2.3 Structure L‟APMV-1 est un virus enveloppé de forme sphérique et de diamètre compris entre 100 nm à 300 nm (Yusoff and Tan, 2001). La Figure 3 montre l‟organisation d‟un APMV-1.

Figure 3 : Structure schématique d‟un Avulavirus (© Swiss institute of bioinformatics).

II.2.3.1 Génome Le génome est un ARN simple brin de polarité négative (ARN-), non segmenté et constitué de 15186 ou 15192 ou 15198 nucléotides (nt) (Czeglédi et al., 2006; de Leeuw et al., 2005). Il est formé par deux séquences non codantes (leader et trailer) et par des régions 3‟ et 5‟ non codantes (3‟RNC et 5‟RNC). En plus de ces régions, le génome contient six gènes de structure : gènes NP, P, M, F, HN, L codant les six protéines structurales du virus. Deux protéines additionnelles, V et W (Figure 4, cf p.7) peuvent être produites durant la transcription du gène P (Yan, 2008).

 Séquences non codantes Le leader, formant les 55 premiers nucléotides du génome de l‟APMV-1 (Figure 4 et Tableau 2, cf p.7 et 8), est situé dans l‟extrémité 3‟ du génome viral (Krishnamurthy and Samal, 1998). Il s‟associe avec la région 3‟NC (66nt) du gène NP pour constituer le promoteur génomique. Celui-ci est utilisé par l‟enzyme polymérase virale pour la synthèse des ARN messagers (ARNm) et des ARN intermédiaires ou ARN+ (Kurilla et al., 1985).

Synthèse bibliographique

Le trailer composé de 114 nt se situe à l‟extrémité 5‟ du génome (Figure 4 et Tableau 2). Il s‟associe avec la région 5‟NC (77nt) du gène L et forme le promoteur anti génomique, utilisé par la polymérase virale pour la réplication des ARN- à partir des ARN+ (Kolakofsky and Bruschi, 1975; Phillips et al., 1998).

 Régions non codantes Les régions 3‟NC et 5‟NC sont des séquences nucléotidiques encadrant le cadre de lecture ouvert (Open Reading Frame ou ORF). La région 3‟NC se trouve à l‟extrémité 3‟ (en amont) de chaque ORF tandis que la région 5‟NC est à l‟extrémité 5‟ (en aval). La taille de ces régions est variable selon les ORF entourés (Tableau 2, cf p.8).

 Gènes de structure Les gènes de structure sont au nombre de six : NP, P, M, F, HN et L. Ces gènes codent 6 protéines structurales à partir de 6 cadres de lecture ouvert ou ORF. Entre les ORF existent des séquences intergéniques (Figure 4 et Tableau 2) intervenant dans la régulation post transcriptionnelle des gènes (Finke et al., 2000). Chaque ORF est initié par le gène start : 3'– GCCCAUCU(C)U-5', suivi par la séquence codant les protéines et terminé par le gène end 3'– AA(U)CUUUUUU-5' (Krishnamurthy and Samal, 1998).

Figure 4 : Structure du génome d‟un Avulavirus (Yan, 2008).

Synthèse bibliographique

Tableau 2 : Les différentes tailles du génome et les protéines correspondantes (Maminiaina, 2011).

Région ou Taille génomique (nt)

gène PM Total 3'RNC ORF 5'RNC RIG Protéine(AA) (kDa) Leader 55 ------1746 210 CA

NP 1747 66 1470 211 A 489 53 1753 217

P 1463 83 1200 180 A 399 42 1188 395

M 1241 311 1095 112 G 364 40-42

F 17742 46 1662 112 31 553 55 2001 91 1719-1758 152-192 48 572-585

1851 60 47 616 63 HN 2002 1734 177 577-581

1716 195 571

L 6703 11 6615 77 - 2204 249 15198

Génome 15186

15192

RNC : Région non codante ; ORF : Open reading frame (cadre de lecture ouvert) ; RIG : région inter génique.PM : Poids moléculaire

II.2.3.2 Capside La capside est constituée principalement par la nucléoprotéine et présente une symétrie hélicoïdale. Des protéines structurales comme la phosphoprotéine et la polymérase viennent s‟ajouter à la nucléocapside pour former le complexe ribonucléoprotéine (RNP) qui est une petite structure virale douée de propriété auto réplicative dans la cellule (Kho et al., 2001). La Figure 3 (cf p.6) montre la structure de RNP.

 Nucléoprotéine La nucléoprotéine (NP) est une protéine formée de 489AA et de PM 53kDa. Plusieurs monomères de NP s‟associent formant un canal dans lequel se loge l‟ARN. L‟ensemble NP- ARN(-) forme la nucléocapside qui est un complexe extrêmement stable (Iseni et al., 1998; Kho et al., 2001). La nucléoprotéine est impliquée dans la protection du génome viral contre les activités nucléasiques de la cellule hôte (Yusoff and Tan, 2001).

Synthèse bibliographique

 Phosphoprotéine La phosphoprotéine (P) est un polypeptide formé par 395 AA et de PM=42 kDa (Yusoff and Tan, 2001). Elle fait partie du complexe transcriptase-réplicase des APMV-1 en associant avec la polymérase. Elle constitue donc un cofacteur de la polymérase dans la transcription et la réplication (Hamaguchi et al., 1985).

 Protéine large ou polymérase La polymérase (L) est une grande protéine de PM environ 249 kDa et formée de 2204 AA. Il s‟agit d‟une ARN polymérase ARN dépendante catalysant les réactions de transcription et de réplication avec l‟aide des NP et P (Smallwood et al., 1994; Yusoff et al., 1987).

II.2.3.3 Enveloppe L‟enveloppe est acquise lors du bourgeonnement du virus au travers la membrane cytoplasmique de la cellule hôte. Elle est formée par la couche externe représentée par deux spicules glycoprotéiques, la glycoprotéine F (ou protéine de fusion) et la glycoprotéine HN (ou hémagglutinine-neuraminidase) et par la couche interne formée par la protéine de matrice (Romer-Oberdorfer et al., 1999).

 Glycoprotéine F La glycoprotéine F, constituée de 553AA et de PM 55kDa, est une glycoprotéine transmembranaire de type I où l‟extrémité N-terminale est dirigée vers l‟extérieur de l‟enveloppe (Lamb and Parks, 2007). Elle correspond à une protéine glycosylée possédant trois domaines HR ou heptad repeats : HRa, HRb et HRc adoptant la conformation en hélice(Hernandez et al., 1996; Yusoff and Tan, 2001). La glycosylation se fait par l‟ajout de six résidus de carbohydrate de mannose aux niveaux des sites Asparagine-X-Serine/threonine ou N-X-S/T, aux positions 85, 191, 366, 447, 471 et 541 (Figure 5b, cf p.10). Ces glycosylations sont impliquées dans le transport des protéines F néoformées vers la surface de la cellule (Panda et al., 2004b). La glycoprotéine F est activée par l‟attachement de l‟HN sur des récepteurs cellulaires. La forme active est composée de deux sous-unités, F1 (48 à 54kDa) et F2 (10 à 16 kDa) (Figure 5a, cf p.10) (Bossart and Broder, 2007; Yusoff and Tan, 2001). Cette forme active assure la fusion de l‟enveloppe virale avec la membrane cellulaire lors de la pénétration du virus dans la cellule cible (Mahon et al., 2008).

Synthèse bibliographique

(a) (b)

Figure 5 : Glycoprotéine F (Yusoff and Tan, 2001).

(a) Structure 3D (trimère) de la glycoprotéine F. (b) Diagramme schématique des domaines important et caractéristiques de la glycoprotéine F. La barre représente le précurseur F0. Les sous-unités de la protéine de fusion F2 et F1 sont figurés au-dessus de la barre. Les sites de glycosylation sont indiqués par des ronds gris. Les chiffes désignent les positions d’acides aminés. HR : Heptad repeats.

 Glycoprotéine HN Contrairement à la glycoprotéine F, l‟HN est une glycoprotéine transmembranaire de type II où l‟extrémité N-terminale est fixée dans l‟enveloppe du virus (Lamb and Parks, 2007). Par contre, elle est aussi glycosylée grâce à l‟ajout de six résidus de carbohydrate de mannose lors de la maturation post traductionnelle. La glycosylation est aussi aux niveaux Asparagine- X-Thréonine et située aux positions 119, 341, 433, 481, 508 et 538 (Figure 6b) (Panda et al., 2004a; Seal, 2004). L‟HN a un PM 63kDa et elle est formée par un nombre variable d‟AA variant de 571 à 616 (Yusoff and Tan, 2001). Elle est activée par l‟interaction avec des molécules (acides sialiques) présentes à la surface cellulaire. La forme active, représentée dans la Figure 6a, est formée par deux dimères liés entre eux par un pont disulfure (Iorio et al., 2001). L‟HN est une protéine multifonctionnelle : elle possède à la fois l‟activité hémagglutinante (HA) en s‟attachant au récepteurs des cellules cibles mais aussi l‟activité neuraminidasique (NA) en coupant la liaison entre l‟hémagglutinine et l‟acide sialique de la cellule hôte lors de la libération du virus néo-synthétisé (Huang et al., 2004).

Synthèse bibliographique

(a)

(b)

Figure 6 : Glycoprotéine HN (Yusoff and Tan, 2001). . (a) Représentation schématique d‟un dimère de protéine (AA 124-AA 570) HN d‟un virus de la MN, en structure cristalline (vue de dessus). L’extrémité N-terminale est colorée en bleu tandis que la C- terminale, en vert.

(b) Diagramme schématique des domaines important et caractéristiques de la glycoprotéine HN. La barre représente la protéine HN avec les différentes longueurs. Les résidus cystéiques sont indiqués en C au-dessous de la barre. Les ponts disulfures sont présentés par des lignes reliant les résidus cystéiques (C). Le pont disulfure intermoléculaire (position 123) est indiqué avec une flèche. Les sites de glycosylation sont indiqués par des ronds gris. Les nombres désignent les positions d’acides aminés.

 Protéine de matrice Formée de 364AA, la protéine de matrice est une protéine non glycosylée et localisée dans la face interne de l‟enveloppe virale (Bellini et al., 1986; Garcia-Sastre et al., 1989). La protéine M est l‟organisateur central de la morphologie et de l‟assemblage du virion. Elle est impliquée dans la compaction de la RNP principalement dans les étapes d‟assemblage (Griffin, 2001).

II.2.4 Cycle de multiplication II.2.4.1 Adsorption et pénétration du virus L‟adsorption et la pénétration du virus sont assurées par l‟action coordonnée des deux glycoprotéines de l‟enveloppe, l‟HN et F (Figure 7a, cf p.12). L‟HN interagit avec les récepteurs cellulaires constitués de deux résidus d‟acide sialique : N-acetylneuraminique ou N-glycolylneuraminique (Suzuki et al., 1985).Cette interaction provoque le changement de conformation de l‟HN, d‟où son activation qui active ensuite la protéine F (Lamb and Kolakofsky, 2001). La protéine F activée entraine le rapprochement des membranes virales et

Synthèse bibliographique cellulaires, la fusion de ces deux membranes, et l‟injection de RNP dans le cytoplasme de la cellule (Hernandez et al., 1996).

(a)

(b) Figure 7 : Cycle de multiplication des APMV-1. (a) Interaction entre la protéine F et HN lors de la fusion de la membrane cellulaire avec l‟enveloppe virale (Zaitsev et al., 2004) (b) Transcription et réplication du génome des APMV-1 (Yan, 2008).

II.2.4.2 Transcription et réplication de l’ARN viral Une fois dans le cytoplasme, l‟ARN- va être impliqué dans deux réactions majeures : la transcription suivie de la traduction pour former les protéines virales et la réplication permettant l‟obtention d‟un très grand nombre de copies du génome (Figure 7b). Ces deux réactions sont catalysées par la polymérase virale (Hamaguchi et al., 1985).

Synthèse bibliographique

L‟ARN- est transcrit en ARN messagers (ARNm) par la polymérase virale. Cette enzyme utilise le promoteur génomique formé par le leader et la région 3‟NC du gène NP pour initier la transcription. L‟ARNm est ensuite coiffé et polyadénylé pour être traduit en protéines structurales dans les ribosomes cellulaires (Krishnamurthy and Samal, 1998). Concernant les protéines virales néo synthétisées, les protéines NP, P, et L s‟associent avec l‟ARN- et forment le complexe RNP. La protéine M se fixe sur la face interne de la membrane cellulaire tandis que les protéines HN et F sont transportées à travers le réticulum endoplasmique et l‟appareil de golgi où elles sont oligomérisées et glycosylées, avant de gagner la membrane plasmique (Garcia-Sastre et al., 1989). Juste après la traduction du premier transcrit, la polymérase virale réplique l‟ARN- en ARN+ qui sert à son tour de matrice pour la synthèse d‟un nouveau ARN-. La réplication de l‟ARN+ en ARN- est initiée au promoteur anti-génomique formé par le trailer et la région 5‟NC du gène L (Kolakofsky and Bruschi, 1975; Phillips et al., 1998).

II.2.4.3 Encapsidation, assemblage et bourgeonnement du virus L‟ARN- est encapsidé par les protéines NP, P et L formant ainsi le complexe RNP. Ce complexe s‟associe ensuite à la protéine M tapissant la face interne de la membrane cytoplasmique. Après l‟assemblage, le complexe RNP associé à la protéine M s‟invagine à la membrane cytoplasmique dans laquelle les glycoprotéines HN et F sont insérées. À la fin, le nouveau virion finit par s‟individualiser et de nouveau interagit avec les récepteurs cellulaires. Il est détaché de la cellule par l‟activité neuraminidasique de l‟HN (Kho et al., 2001).

II.2.5 Génotype Même si toutes les souches du virus de la MN appartiennent à un seul sérotype qui est l‟APMV1, elles sont génétiquement très diverses (Courtney et al., 2013; Diel et al., 2012; Snoeck et al., 2013). Le séquençage du génome des APMV-1 a révélé l‟existence de 2 classes distinctes, classe I et classe II (Czeglédi et al., 2006; Seal et al., 2005). La classe I est formée généralement par des souches avirulentes tandis que la classe II renferme des souches à virulence variée (faible à forte) (Kim et al., 2007). Actuellement, 15 génotypes ont été décrits dans la classe II (Courtney et al., 2013; de Almeida et al., 2013; Snoeck et al., 2013).Le génotype XI, isolé chez les oiseaux domestiques circule uniquement à Madagascar. Son analyse phylogénétique montre qu‟il s‟est évolué à partir du génotype IV(Maminiaina, 2011; Snoeck et al., 2013). L‟arbre phylogénétique montrant les différents génotypes de l‟APMV-1 est montré dans la Figure 8.

Synthèse bibliographique

I Ulster/67 AY562991 Génotype I I 01-1108 AY935489 86 100 HB92 (V4) Génotype II La sota AF077761 US (MD)/03-632/03 Génotype X 100 US (OH)/04-411/04 71 100 Mukteswar JF950509 Génotype III JS/9/05 FJ430160 87 Italie EU293914 Génotype IV Herts/33 AY741404 100 MG Meola/08 MG 39-04/08 Génotype XI 75 MG 725C/08 100 MG 1992 FJ-1/85 AF458009 Génotype IX Classe JS-1/97 AF456435 100 II 89 ZA-18/90 AF136766 Génotype VIII ZA-5/68 AF136762 97 US/largo/AY562290 Génotype V US/92 GQ288387

Pigeon PMV-1 Génotype VI US (CA) AY562988 99 China/00 DQ485256 Génotype VII BP01 JN599167 83 Sweden/97 Génotype XIII 89 Karachi/SPVC/07 99 MB076/05 GQ901892 Génotype XII DE372/86 AF525390 Niger/ 08 Génotype XIV 81 Mali/10 Dominican rep/08 JX119193 Génotype XV 98 Dominican rep/86 JX915242 Cl I NP/US (AK 98 )/ Classe I

0.05

Figure 8 : Arbre phylogénétique des APMV-1. (Source : auteur, 2015)

MATERIELS ET METHODES Matériels et méthodes

Chapitre. 2 MATERIELS ET METHODES

I Site d’étude I.1 District de Fandriana L‟enquête sur la MN est conduite pendant trois semaines (du 21 aout 2014 jusqu‟au 12 septembre 2014) dans deux communes, Alakamisy Ambohimahazo (20°22'51.52''S et 47°26‟52.14‟‟E) et Mahazoarivo (20°21'57.91''S et 47°25'32.63''E). La Figure 9 indique le district de Fandriana ainsi que les deux communes d‟étude.

Figure 9 : District de Fandriana représentant les deux communes d‟étude La carte a été construite avec le logiciel DIVA -GIS version 7.5.(Hijmans et al., 2012)à télécharger dans http : // www.diva- gis.org.

I.2 FOFIFA/DRZV L‟analyse des échantillons prélevés sur terrain est réalisée au laboratoire du FOFIFA- DRZV sis à Ampandrianomby. Il s‟agit d‟un Institut de recherche qui contribue à l‟étude des maladies animales afin de permettre le développement de l‟élevage à Madagascar. Le FOFIFA-DRZV possède sept (7) laboratoires de recherche : laboratoires de microbiologie, de biologie moléculaire, de sérologie, de parasitologie, de reproduction, de chimie et de l‟alimentation. L‟analyse est effectuée dans le laboratoire de microbiologie et de biologie moléculaire. La procédure d‟analyse est exposée dans la Figure 10.

Matériels et méthodes

Préparation de l‟échantillon Isolement viral

Inoculum

Extraction d‟ARN

Screening

RT-PCR RT-PCR en temps réel conventionnelle

RT Synthèse d‟ADNc

Dosage d‟ADNc

PCR avec détection en PCR temps réel des amplicons

Électrophorèse sur gel

d‟agarose

Amplicons positifs en APMV-1

Séquençage

Figure 10 : Diagramme d‟analyse virologique.

Matériels et méthodes

II Enquêtes Deux enquêtes différentes sont menées dans le site d‟étude. En premier lieu, la connaissance qu‟ont les villageois de la MN est évaluée. Pour cela, les villageois sont classés en 3 catégories selon leur activité quotidienne. Les aviculteurs sont classés en catégorie I. Les personnes œuvrant dans le domaine d‟élevage comme les techniciens vétérinaires et les marchands de volailles sont dans la catégorie II. La catégorie III regroupe les personnes qui ne sont pas du tout concernées par ce domaine (agriculteurs, commerçants, enseignants). En second lieu, les aviculteurs ont fait l‟objet d‟une deuxième enquête. Quatre sous-objectifs sont visés dans cette deuxième enquête : observation du type d‟aviculture et du nombre de cheptel existant dans cette zone, recherche des cas cliniques de la MN, description des symptômes cliniques de la maladie selon les aviculteurs et étude de l‟incidence de la MN. Les deux fiches d‟enquête utilisées sont montrées dans l‟annexe 9.

III Prélèvement En cas d‟une suspicion de la MN, les têtes des volailles sont coupées et conservées au froid. Au moment de prélèvement, les têtes sont mises dans une glacière avec accumulateurs de froid. Elles sont ensuite placées dans le congélateur -20°C et transférées dans la glacière pendant l‟acheminement au laboratoire. Arrivées au laboratoire, elles sont stockées au congélateur -80°C en attendant l‟analyse. Le respect de la chaine de froid est très important pour la conservation du virus.

IV Mesures de sécurité IV.1 Risque microbiologique Les déchets de matériels biologiques (tête de volaille, œufs embryonnés) sont emballés dans des sachets fermés et brulés afin d‟éviter la dissémination du virus dans le milieu extérieur. Les matériels utilisés et le milieu de manipulation sont stérilisés pour éliminer la contamination microbienne. Après lavage avec de l‟eau et du savon, les matériels sont stérilisés dans une autoclave à 110°C pendant 3 h dans une atmosphère humide. La surface de travail est lavée avec de l‟alcool 70°C. Toutes les manipulations du virus sont effectuées sous hotte (MSC II NF II®).

Matériels et méthodes

IV.2 Risque dans un laboratoire de biologie moléculaire L'organisation physique du laboratoire doit être pensée en fonction des activités et des risques. On distingue deux grands types d'activités : - les activités pré-PCR où l'on manipule des acides nucléiques (ARN ou ADN) non amplifiés (extraction, purification, préparation des mix). - les activités post-PCR où l'on manipule des molécules amplifiés (purification de produits PCR, réaction de séquençage, clonage de produits PCR). Cette séparation a pour but de réduire les risques de contaminations (l'ADN amplifié étant très contaminant pour l'ADN non amplifié). Tout échange de matériel entre ces deux zones est strictement interdit (tout particulièrement les micropipettes qui sont une source importante de contamination du fait des aérosols). À l'intérieur de la zone pré-PCR, les manipulations d‟ARN et d‟ADN doivent être faites dans des salles séparées.

V Préparation de l’inoculum Des sables fins sont tamisés, rincés avec de l‟eau distillée et séchés pendant une journée. Le cerveau est ensuite prélevé à l‟aide d‟un ciseau après fracturation du crane puis broyé avec du sable fin dans des sérums physiologiques (NaCl 8°/00). Le liquide recueilli après décantation du broyat représente l‟inoculum. Il est mélangé avec des solutions d‟antibiotiques contenant : Pénicilline 2000 UI/ml (p/v), Streptomycine 2 mg/ml (p/v), Gentamicine 50 µg/ml (v/v), Fungizone 2 mg/ml (p/v), pour éliminer la contamination bactérienne et fongique. L‟inoculum mélangé avec la solution d‟antibiotique représente la solution de départ pour l‟analyse. La préparation de la solution de mélange d‟antibiotiques est présentée dans l‟annexe 3.

VI Extraction d’acide nucléique VI.1 Principe L‟extraction d‟acide nucléique utilise le principe de la chromatographie d‟affinité résumé dans la Figure 11. Le principe est basé sur la fixation sélective des molécules sur une résine, contenue dans une colonne centrifugeable, par l‟intermédiaire d‟un ligand spécifique. Seules les molécules possédant l‟affinité pour la résine, attachée à la matrice chromatographique, vont se lier et être éluées à la fin de l‟extraction (Ladram and Camus, 2012). Dans le cadre de cette étude, le carrier RNA représente le ligand.

Matériels et méthodes

Figure 11 : Principe de la chromatographie d‟affinité (Ladram and Camus, 2012).

VI.2 Etapes de l’extraction Toutes les manipulations sont réalisées sous hotte à flux laminaire (MSC II NF II). L‟extraction des ARN totaux est réalisée selon les recommandations du kit NucleoSpin® RNA Virus commercialisé par Macherey-Nagel (www.mn-net.com). La préparation des réactifs de l‟extraction est présentée dans l‟annexe 4 tandis que le schéma des appareils utilisés est dans l‟annexe 9.L‟extraction s‟est déroulée en 5 phases : phase de lyse, phase de précipitation, phase de fixation, phase de lavage et phase d‟élution (Figure 12). L‟inoculum (150 µl) et le tampon de lyse RAV1 (600 µl) additionné de « carrier RNA »sont d‟abord mélangés dans des microtubes (Eppendorf®). Cette étape est nécessaire pour entrainer une lyse virale permettant la libération des contenus viraux. Après une incubation de 10 min à 70°C (Bain marie Fischer Scientic® Cryo-polystat 24), l‟ARN est précipité par l‟éthanol à 95°C (600 µl) et la solution est mélangée pendant 15 secondes au vortex (Heidolph ® TOP-MIX 94323). Une brève centrifugation (Sigma ®) fait tomber les gouttes du bouchon et permet d‟obtenir la solution A (1350 µl). Pendant la phase de fixation de l‟ARN, la solution A (700 µl) est déposée délicatement dans une colonne elle-même placée sur un tube collecteur de 2000 µl puis centrifugée (1 min à 8000 rpm). Après avoir placée la colonne sur un deuxième tube collecteur, la solution restante (650 µl) y est déposée et centrifugée de nouveau (1 min à 8000 rpm). Les molécules non fixées (protéines) sont ensuite éliminées de la colonne par lavage. La colonne est soumise à 3 lavages, avec le tampon RAW (500 µl) et le tampon RAV3 (600 µl puis 200 µl) et à des centrifugations (1 min, 1 min et 5 min respectivement). Enfin l‟ARN tapissant la membrane silicaté de la colonne est élué avec de l‟eau RNase free (50 µl), centrifugé (1 min à 11000 rpm) et conservé à -80°C.

Matériels et méthodes

Inoculum (150 µl) + Tampon RAV1 avec carrier RNA (600 µl)

PHASE DE LYSE Incubation (70°C, 10 min)

+ Ethanol 95°C (600 µl)

PHASE DE Homogénéisation (15 sec) PRECIPITATION Centrifugation (8000 rpm, 5 sec)

Solution A (1350 µl)

Solution A (700 µl)

Déposition sur colonne Centrifugation (8000 rpm, 1 min) PHASE DE FIXATION

Solution A restante (650 µl)

Déposition sur colonne Centrifugation (8000 rpm, 1 min)

+ Tampon RAW (500 µl)

Centrifugation (8000 rpm, 1 min)

+ Tampon RAV3 (600 µl) PHASE DE LAVAGE Centrifugation (8000 rpm, 1 min)

+ Tampon RAV3 (200 µl)

Centrifugation (8000 rpm, 5 min)

+ Eau RNase free (50 µl)

PHASE D‟ELUTION Centrifugation (11000 rpm, 5 min)

Extrait d‟ARN 1.

Figure 12 : Extraction de l‟acide nucléique viral à l‟aide du kit NucleoSpin® RNA Virus (MACHEREY- NAGELTM).

Matériels et méthodes

VII Criblage par reverse transcriptase PCR en temps réel VII.1 Principe Depuis sa découverte par Kary Mullis en 1985, la Polymerase Chain Reaction (PCR) est rapidement apparue comme un outil indispensable en biologie moléculaire (Saiki et al., 1985). Il s‟agit d‟une amplification in vitro d‟un segment d‟ADN en un très grand nombre de copies à partir d‟une quantité minime d‟ADN source. L‟amplification est effectuée par la répétition de cycles de dénaturation/ hybridation/extension qui assure une duplication exponentielle de chaque brin (Kaplan and Delpech, 1989). La PCR est utilisée pour la détection de l‟ADN (PCR) ou de l‟ARN (RT-PCR) dans un échantillon. La RT-PCR en temps réel combine à la fois l‟amplification et la détection des molécules amplifiées à l‟aide d‟un signal fluorescent. L‟augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d‟amplicons générés durant la réaction de PCR (Elyse, 2002).

VII.2 Technique Pour détecter la présence de l‟APMV-1 dans les échantillons (extrait d‟ARN1), la technique de QRT-PCR basée sur l‟utilisation de fluorophore SYBR Green est adoptée avec le kit Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master mix, STRATAGEN®. Le SYBR Green est une molécule intercalant de l‟ADN double brin. L‟émission fluorescente du SYBR Green augmente lorsqu‟il est intercalé à l‟ADN double brin. Lorsque la PCR est suivie en temps réel, l‟augmentation du signal de fluorescence est observée en fin de chaque étape de polymérisation.

Figure 13 : Incorporation du SYBR Green lors de la RT- PCR en temps réel.

Matériels et méthodes

VII.3 Préparation des témoins positifs et témoins négatifs Le témoin est utilisé pour le contrôle de la PCR. Les témoins positifs ont été préparés à partir d‟ARN d‟un APMV-1 connu (souche V4). Cinq dilutions différentes (10-1,10-2,10-3, 104, 10-5) ont été arrangées à partir d‟extrait d‟ARN de la souche V4. En théorie, les quatre premiers points doivent avoir des valeurs de Ct inférieures à 39 et le 5ème point doit être à la limite du seuil de détection (Figure 14). Le témoin négatif est formé par le mélange réactionnel seulement. Le Ct (cycle seuil ou « cycle threshold ») correspond au nombre de cycle minimum nécessaire pour que la fluorescence dépasse le seuil. La courbe de fusion ou Tm (melting- temperature) définit la température pour laquelle la moitié (50%) de l‟ADN double brin est dissociée. Pour les résultats, les valeurs de Ct et de la Tm de l‟extrait d‟ARN 1 sont comparées avec celles du témoin pour savoir l‟existence d‟une amplification ou pas.

Témoins positifs

Témoins négatifs

Figure 14 : Courbe théorique de quantification des amplicons en RT-PCR en temps réel. Pour les témoins positifs, la courbe présente 3 phases distinctes : - Phase de bruit de fond : Elle est caractérisée par une faible quantité de fragments amplifiés qui ne pourront pas ainsi générer un signal fluorescent. - Phase exponentielle : La quantité de fragment amplifié est suffisamment élevée pour générer un signal fluorescent puis le nombre amplifiés double à chaque cycle. - Phase de plateau (ou de saturation): certains composants de la réaction (en particulier le nombre de molécules de Taq disponibles) deviennent limitants. Le système ne permet plus une amplification exponentielle, le taux d‟amplification décroît et ainsi très peu de nouveaux amplicons sont générés. Pour le témoin négatif, une ligne horizontale traduit l‟absence de l‟ARN cible dans le milieu.

Matériels et méthodes

VII.4 Préparation mix et ajout des ARN à cribler Le mélange réactionnel est versé dans une microplaque à 96 puits avec un volume final de 25 µl. Il est composé de 8,375 µl d‟eau RNase free, 0,375 µl de rox ref dilué, 12,5 µl de mix, 1 µl du couple d‟amorces, 1 µl de mix enzyme et 2 µl d‟ARN. La microplaque est ensuite déposée dans le thermocycleur (Mx 3000P stratagène®), (Figure 15a). Le programme d‟amplification est schématisé dans la Figure 15b.

Thermocycleur (a

) (Mx 3000P Stratagène®)

Figure 15: Schéma de la RT-PCR en temps réel. (a) Appareil (thermocycleur) relié à l‟ordinateur.

(b) Cycle d‟amplification de l‟ARN.

Dans la présente étude, le couple d‟amorces utilisé pour le criblage est le F259/F488rev, (Tableau 3) basé sur le gène F. Le couple d‟amorce est dégénéré c'est-à-dire qu‟une partie des nucléotides sera préséntée par une autre lettre (Y). Y remplace la thymine (T) ou la cytosine (C). Y=T ou C. Tableau 3 : Primers utilisés en RT-PCR en temps réel.

Matériels et méthodes

VIII Isolement viral L‟isolement viral sur œuf embryonné est une technique de diagnostic virologique. A la différence de la PCR, l‟isolement viral sur œuf embryonné est une amplification in vivo du virus. Les œufs embryonnés sont choisis puisqu‟ils fournissent un environnement idéal pour le développement du virus. Ils sont bactériologiquement stériles et ils contiennent des nutriments complets nécessaires à la multiplication virale (Young et al., 2012). L‟isolement des APMV-1 est réalisé sur œufs embryonnés de 9 à 11 jours et exemptes d‟organismes pathogènes spécifiques (EOPS) selon le protocole recommandé par l‟OIE (OIE, 2009).

VIII.1 Inoculation du virus et incubation Pendant l‟inoculation du virus sur l‟œuf embryonné, l‟inoculum est centrifugé au bout de 10 min à 1000 g. Les surnageant sont dilués au 1/3 dans une solution d‟antibiotiques (Pénicilline 2000 UI/ml, Streptomycine 2 mg/ml, Gentamicine 50 µg/ml, Fungizone 2mg/ml), et quatre cents microlitres de la dilution sont inoculés dans la cavité allantoïdienne d‟œuf (Figure 16). Le protocole d‟inoculation adopté doit permettre d‟éviter la contamination et de réussir l‟isolement du virus (Annexes 5). Après l‟inoculation, les œufs sont incubés à 37°C (Memmert®) afin que l‟embryon puisse se développer normalement. Au total 24 œufs sont inoculés.

Figure 16 : Inoculation par la cavité allantoïdienne (Young et al., 2012).

Matériels et méthodes

VIII.2 Mirage Les œufs sont mirés quotidiennement pour vérifier la survie de l‟embryon. Le mirage se fait dans une chambre noire avec un appareil de mirage formé par une petite boîte cubique contenant une ampoule de 60 W (lampe de mirage) et présentant à sa face supérieure un trou par laquelle la lumière peut sortir. Au moment du mirage, la lumière traverse la coquille et permet une observation sur l‟embryon : les embryons vivants bougent sous l‟action du flux lumineux de la lampe tandis que les embryons morts sont immobiles (Figure 17a). Généralement, une souche sauvage tue l‟embryon entre 24 heures et 90 heures après l‟inoculation. Les œufs morts avant 24 h sont jetés car leur mort est considérée comme non spécifique de la multiplication virale. Par contre, les œufs morts entre 24 h et 90 h d‟incubation sont gardés à +4°C. Après 90 h, les restes des œufs vivants sont aussi portés à +4°C.

VIII.3 Récolte des liquides allantoïdiens. Après stérilisation du contour du sac à air, une ouverture est faite à l‟aide d‟un ciseau stérile. La membrane coquillère et la membrane allantoïdienne sont ensuite découpées. Les liquides allantoïdiens sont récupérés à l‟aide de pipette stérile dans des tubes individuels et gardés à -20°C avant l‟utilisation (Figure 17b). Au moment de la récolte, une autopsie de l‟embryon est nécessaire pour noter les éventuels changements au niveau des organes. À partir du liquide allantoïdien, une deuxième extraction d‟ARN est faite (Figure 17c). Le protocole est identique à celui déjà décrit précédemment et l‟ARN obtenu est désigné « extrait d‟ARN 2 ». Cet extrait est ensuite analysé par la technique de QRT-PCR développée antérieurement.

(a) (b) (c)

Figure 17 : Mirage et récolte du liquide allantoïdien. (a) Mirage (b) Liquide allantoïdien c) extraction manuel d‟ARN.

Matériels et méthodes

IX Amplification et séquençage IX.1 Choix de la région génomique étudiée La région du gène F est ciblée dans cette étude puisqu‟elle possède un site de clivage qui permet la détermination de la pathogénicité des APMV-1. L‟amplification du gène F suit le criblage. Dans l‟étude, la réaction est faite en deux étapes séparément : une réaction de synthèse d‟ADNc par transcription inverse suivie du dosage de l‟ADNc obtenu par spectrophotométrie, et une réaction d‟amplification de l‟ADNc par PCR conventionnelle.

IX.2 Synthèse d’ADNc IX.2.1 Principe La transcription inverse est une technique qui repose sur l‟utilisation d‟une enzyme : la reverse transcriptase. En présence des amorces et de désoxyribonucléotides, la reverse transcriptase qui est une ADN polymérase ARN dépendante, est capable de synthétiser l‟ADNc (complémentaire de la séquence d‟ARN) à partir de l‟ARN (Figure 18).

Figure 18 : Principe de la transcription inverse.

IX.2.2 Réaction de la synthèse La transcription inverse est réalisée à l‟aide du kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (THERMO SCIENTIFICTM). Le mix est composé de 12 µl d‟eau RNase free, 4 µl de réaction buffer, 1 µl de Ribolock RNase inhibitor (20 U/µl), 2 µl de dNTP Mix (10 mM), 1 µl de Random Hexamer, 1 µl de RevertAid-MultiV RT (200 U/µl), et 2 µl d‟ARN. Ce mix est ajouté dans une microplaque à 96 puits sous un volume final de 25 µl. La microplaque est ensuite placée dans la machine PCR (BIO Rad C1000 Touch ®, Figure 19a) et le programme de synthèse est lancé (Figure 19b).

Matériels et méthodes

(b)

(a) Figure 19 : Schéma de la PCR conventionelle. (a) Thermocycleur C1000 Touch (b) Programme de synthèse d‟ADNc.

IX.3 Dosage de l’ADNc IX.3.1 Principe La spectrophotométrie est une technique basée sur l‟absorbance des molécules à une longueur d‟onde donnée. Les molécules de même nature absorbent à une longueur d‟onde spécifique. Les protéines absorbent majoritairement à 280 nm, les composés humiques et phénoliques à 230 nm, et l‟ADN à 260 nm (William et al., 1997).

IX.3.2 Technique Le dosage de l‟ADNc permet de connaitre la concentration en ADN dans une solution. Il permet également d‟évaluer la pureté de l‟ADNc à l‟aide de deux rapports A260/A280 et A260/A230. Pour considérer une solution d‟ADN pur, le rapport A260/A280 doit être compris entre 1,8 et 2,0. Si ce rapport est inférieur à 1,8, la contamination en protéines existe et s‟il est supérieur à 2,0, cela indique une forte présence d‟ARN dans la solution. Le rapport A260/A230 doit être proche de 2, 0 afin de pouvoir considérer la solution exempte de contaminant. Le spectrophotomètre Nanodrop 2000/2000C (Thermo Ficher Scientic ®) relié à un ordinateur est utilisé dans cette étude. Lorsque le bras de l‟appareil est relevé, une goutte d‟ADNc est déposée sur la surface inférieure de lecture après avoir nettoyé la surface avec de l‟eau distillée (Figure 20a). Le bras est ensuite abaissé, un système d‟aimant est activé et le bras compresse la goutte de liquide (Figure 20b). L‟échantillon est maintenu entre les deux surfaces de lecture permettant ainsi la mesure (Figure 20c). Une fois la mesure terminée, le résultat est affiché sur l‟ordinateur. Le bras est ensuite relevé et l‟échantillon est tout simplement essuyé sur les deux surfaces de lecture avec un papier absorbant couramment utilisé au laboratoire (Figure 20d et 20e).

Matériels et méthodes

(a)

(d) (e)

Figure 20 : Dosage de l‟ADNc.

IX.4 Amplification d’ADNc par PCR conventionnelle IX.4.1 Principe La PCR est une amplification exponentielle des gènes. Elle repose sur l‟utilisation de l‟ADN polymérase thermostable (Taq polymérase) qui est capable d‟amplifier l‟ADN de manière répétitive permettant ainsi l‟obtention de millions de copies (Kaplan and Delpech, 1989). La méthode de PCR conventionnelle est une technique qui peut être utilisée dans l‟amplification des ADN. À la différence de la PCR en temps réel, les résultats d‟amplification ne sont obtenus qu‟après utilisation des techniques de révélation. La technique d‟électrophorèse sur gel d‟agarose est choisie dans cette étude pour révéler la présence ou l‟absence d‟amplification de l‟ADNc.

IX.4.2 Préparation du mélange réactionnel L‟amplification est réalisée à l‟aide du kit Master Mix PCR (QIAGEN®) selon les recommandations du fabricant. Un volume final de 25 µl du mix est ajouté dans la microplaque à 96 puits. Le mix est composé de 23 µl de PCR Master mix (Taq polymérase, dNTP, MgCl2), 1 µl de primer F2A, 1 µl de primer F2AS et 2 µl d‟ADNc. La microplaque est mise dans le thermocycleur (C1000 Touch, Figure 19a) et la réaction d‟amplification est lancée selon le programme schématisée dans la Figure 21.

Matériels et méthodes

Le couple d‟amorce F2A/F2ASRev basé sur l‟amplification de 200 pb du gène F est utilisé. Le Tableau 4 présente les nucléotides formant ces deux amorces F2A/F2AS Rev. Tableau 4 : Amorces utilisés pour l‟amplification du gène F.

Primer Séquence nucléotidique Amplicon Tm (°C)

F2A 5‟-AACAGGACACTGACCACT-3‟ 200pb 40

F2AS 5‟-TGGCAGCATTCTGGTTGGCT-3‟ (295-375) 57,8

Figure 21 : Cycle d‟amplification de l‟ADNc.

IX.5 Révélation par électrophorèse sur gel d’agarose IX.5.1 Principe Le principe d‟électrophorèse sur gel d‟agarose repose sur la migration des molécules d‟acides nucléiques et sur leurs séparations selon leur taille. A potentiel Hydrogène (pH) basique, l‟ADN (ou l‟ARN) est chargé négativement. Dans du tampon TAE (Tris, Acétate, éthylène diamine tétra-acétate ou EDTA, 1X, pH 8) et sous l‟impulsion d‟un champ électrique, l‟ADN va donc migrer vers l‟anode (pole positif du champ) en fonction de sa taille (Ladram and Camus, 2012). Le fragment de migration est visualisé à l‟aide du Gel Red®, contenant une molécule qui va s‟intercaler entre les bases des nucléotides de l‟ADN et émettre une fluorescence une fois excitée par les rayons UV.

IX.5.2 Etapes d’électrophorèse Une quantité de 0,25 g de poudre d‟agarose et de 25 µl de TAE sont mélangés dans un erleinmeyer de 100 ml. Le mélange est chauffé (four à microonde SHARP ® 1600 W/R-23 GT) jusqu'à ce que la poudre d‟agarose se dissout complètement (liquide transparent et limpide, Figure 22a). Il est ensuite refroidi à une température environ 60°C et additionné de 10 µl de GelRed ®. Puis, le gel est coulé dans une moule à électrophorèse muni de peignes à 8 dents

Matériels et méthodes

(Figure 22b). Ces peignes servent à la formation des puits nécessaires au dépôt des échantillons et ils sont retirés du gel quand celui-ci se solidifie. Après avoir transféré le gel dans la cuve à électrophorèse (Figure 22c), 8 µl d‟amplicons additionnés de 2 µl de bleu de bromophénol sont déposés dans les puits ; une quantité de 8 µl de marqueurs de taille (PM 100 pb et ladder 50 pb chacun) est aussi déposée sur le gel à titre de référence. Le bleu de bromophénol est un tampon de charge qui densifie et colore la solution, ce qui permet le suivi du front de la migration. La migration s‟effectue dans du tampon TAE sous un champ électrique de 150 volts et à une intensité de 120 milliampères pendant 30 min. Quand la migration est terminée, le gel est photographié sous UV (Transilluminator, BIORad®). La taille d‟amplicons est estimée en comparant l‟intensité de la bande d‟amplicons à celle des marqueurs de taille. Dans cette étude, un témoin positif correspondant à l‟amplicons d‟un APMV-1 connu (souche La Sota) et un témoin négatif représenté par un puits vide sont également employés.

Figure 22 : Schéma d‟électrophorèse (BIORad®).

(a) (b) (c)

IX.6 Séquençage Normalement, tous les échantillons sont prévus être envoyés à Cogenics Genome Express (S.A Meylan, France) avec les réactifs correspondants pour être séquencés. Au retour des séquences de Cogenics, nous devrons utiliser la bioinformatique pour déterminer les génotypes circulants dans le district de Fandriana. Cependant, nous n‟avons pas encore pu envoyer les échantillons à cause d‟un problème impersonnel qui ne dépend pas de nous (déblocage de fond, achat des réactifs et des amorces spécifiques) alors que notre troisième objectif est de caractériser génétiquement les souches circulantes dans le district de Fandriana. Une alternative est donc proposée pour essayer de prédire les génotypes circulants dans le district de Fandriana. Elle consiste à une simulation qui est réalisée en deux étapes. Premièrement, nous simulons six séquences correspondant aux six échantillons collectés. Deuxièmement, nous procédons à l‟analyse phylogénétique des séquences simulées avec les séquences répertoriées dans le GenBank. L‟arbre phylogénétique est donc obtenu à partir de la simulation.

Matériels et méthodes

X Simulation des séquences Dans la simulation, nous travaillons sur des séquences appartenant à deux génotypes différents : quatre séquences appartenant au génotype XI (MG_725C/08, MG_1992, MG_39_4/09 et MG_Meola) et deux séquences appartenant au génotype IV (Herts/33 et Italie). Nous effectuons ensuite des substitutions d‟acides aminés à partir de ces séquences afin de simuler les séquences des isolats. Le choix de ces séquences repose sur le fait que le génotype XI circule déjà sur les hauts plateaux de Madagascar et le génotype IV est l‟ancêtre commun du génotype XI.

XI Analyse phylogénétique La phylogénie, terme introduit par Haeckel en 1866, est la reconstruction de l‟histoire évolutive des êtres vivants (Haeckel, 1866). La phylogénie moléculaire est donc la reconstruction de l‟histoire évolutive des espèces par comparaison de leurs gènes ou de leurs protéines. Elle essaye de trouver toutes les différences, du point de vue génétique, des souches inconnues par rapport aux autres souches répertoriées dans les banques de gène afin de pouvoir construire des arbres phylogénétiques. L'analyse phylogénétique comporte plusieurs étapes : recherche des séquences, alignement des séquences, calcul de la matrice de distance, construction de l‟arbre phylogénétique et évaluation de la fiabilité de l‟arbre. L‟arbre est construit en utilisant des séquences disponibles dans le GenBank (Annexe 6).

XI.1 Recherche des séquences Les séquences sont recherchées dans le site américain NCBI ou National Centre of Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) et téléchargées sous forme FASTA. Il s‟agit d‟un format de séquence commençant par une ligne simple de description de la séquence alors que les lignes suivantes correspondent à la séquence elle-même (nucléotidique ou protéique). La ligne de description est caractérisée par le symbole supérieur «> » par lequel elle débute, suivi d'un identificateur (choisi par l'utilisateur) ne contenant pas d'espace. Il est recommandé d'avoir une longueur de ligne inférieure à 80 caractères. Les points (.), les tirets hauts (-), ou les tirets bas (_) doivent être utilisés pour représenter des gaps (Cf Annexe 8).

Matériels et méthodes

XI.2 Alignement des séquences L‟alignement est une opération qui consiste à déposer des séquences similaires les unes en dessous des autres, à comparer deux à deux les séquences et à les aligner. Il est effectué avec le logiciel MEGA 6 (Tamura et al., 2013). d‟après la méthode Muscle (Edgar, 2004). À la fin de l‟alignement, les séquences peuvent être coupées pour avoir la même taille en caractères (nucléotides, acides aminés, « gaps ») pour chaque isolat.

XI.3 Construction de l’arbre phylogénétique Il existe essentiellement 4 grandes familles de méthodes pour reconstruire un arbre phylogénétique : la méthode de distance, la méthode de parcimonie, la méthode de maximum vraisemblance et la méthode d‟inférence Baysienne (Edwards and Sforza, 1963; Fitch and Margoliash, 1967). Dans cette étude, l‟arbre est construit par la méthode de distance (die phénétique) qui est basée sur la mesure de ressemblance globale entre deux ou plusieurs séquences c'est-à-dire le nombre de substitutions entre ces séquences (Edwards and Sforza, 1964).

XI.3.1 Méthode de distance Le moyen le plus simple pour déterminer la distance serait de compter la proportion de nucléotides qui sont différents dans les séquences. Toutefois, à moins que les séquences comparées ne soient très proches, ce simple comptage des différences observées sous-estime le nombre réel d'événements de substitutions qui ont eu lieu parce qu'il ignore la possibilité de changements multiples (successifs) en un même site. Ces changements nous sont cachés. Pour en tenir compte, des modèles comme le modèle de Jukes-Cantor (JC), modèle de Kimura (K2P), modèle de Tajima-Nei (TN) ont été développés afin de corriger les distances observées (Jukes and Cantor, 1969; Kimura, 1980; Tajima and Nei, 1984). Dans notre étude, le modèle de Kimura à deux paramètres ou K2P (Kimura, 1980) est adopté afin d‟estimer la « vraie » distance. Ce modèle tient compte de la proportion entre le nombre de transitions (α) et transversions (β). En effet, les probabilités de subir une transition (α) ou une transversion (β) sont différentes. Dans la majorité des cas, l‟événement de α est plus fréquent que le β (Figure 23).

Matériels et méthodes

Figure 23 : Matrice de distance suivant la méthode de Kimura à deux paramètres. Formule :

Où α représente le taux de transition et β le taux de transversion entre les séquences.

XI.3.2 Génération de l’arbre phylogénétique avec la méthode de « Neighbor-Joining » ou NJ L‟arbre est généré avec la méthode du plus proche voisin dit « Neighbor-Joining ou NJ» (Saitou and Nei, 1987) après le calcul de la distance avec le modèle K2P.

XI.4 Évaluation de l’arbre phylogénétique La robustesse (ou la fiabilité) de l‟arbre est évaluée par la méthode de bootstraping (ré- échantillonage) avec 1000 réitérations (Felsenstein, 1985). Le test du « bootstrap » est une méthode de ré-échantillonnage des données. Il consiste à effectuer un tirage des sites au hasard avec remise c'est-à-dire que dans certaines réplications de bootstrap, certains sites peuvent être présents plusieurs fois, tandis que d‟autres peuvent être absents. Chaque réplication produit un nouvel alignement "artificiel" qui sera utilisé pour construire un arbre "artificiel" (Efron et al., 1996). Le résultat du test du « bootstrap » est présenté sous la forme d'un arbre correspondant à un consensus majoritaire des arbres obtenus pour tous les échantillons. Chaque nœud possède alors un pourcentage appelé valeur de « bootstrap » qui correspond à la robustesse interne du jeu de données. La valeur d‟un seuil à partir duquel un nœud peut être considéré soutenu de façon robuste est de 70%.

RESULTATS ET INTERPRETATION

Résultats et interprétation

Chapitre. 3 RESULTATS ET INTERPRETATION I Enquêtes sur terrain I.1 Importance de l’aviculture dans le district de Fandriana L‟aviculture villageoise constitue une activité importante dans le district de Fandriana. Elle est pratiquée de façon extensive : les volailles sont laissées en liberté (en divagation) le jour et enfermées la nuit. Le Tableau 5 et la Figure 24 montrent la composition en moyenne du cheptel obtenu lors de l‟enquête. Tableau 5 : Nombre de volaille enregistré durant l‟enquête.

Espèces de volaille Nombre de volaille %

Poulet 336 79,62

Canard 59 13,98

Oie 22 5,21

Dinde 5 1,18

Pintade 0 0

Total 422 100

Dinde (1,18%) Oie (5,21%) Pintade (0%)

Canard (13,98)%

Poule (79,62)%

Figure 24 : Composition moyenne du cheptel (n=422) pour les 38 éleveurs visités.

Résultats et interprétation

Dans les deux communes d‟étude, le cheptel de volailles présente 422 têtes et composé essentiellement de poulets, de palmipèdes, de dindes et d‟oies. La famille possède un petit troupeau de volailles formé en moyenne 11 têtes. L‟élevage de poulets est le plus fréquent et constitue 79,62% (336/422) du cheptel. Selon les aviculteurs, les poulets sont faciles à élever par rapport aux autres volailles. L‟élevage des palmipèdes vienne en deuxième position avec 13,98% du cheptel. Les oies forment la troisième espèce la plus élevée avec 5,21% du cheptel. Les dindes tiennent le quatrième rang avec 1,18% du cheptel. Aucun cas d‟élevage de pintade n‟est trouvé pendant cette période.

I.2 Connaissance de la MN par les villageois La MN est très connue par les aviculteurs. Selon la totalité (100%) des individus dans cette catégorie, la maladie est passée dans leurs basse-cours au moins une fois avant l‟enquête. Les personnes de la catégorie II confirment l‟existence de la MN avec un taux de 88% (23/26). Par contre, la catégorie III montre un taux de connaissance de 72% (13/18). Ainsi d‟après l‟enquête, 90% (74 sur 82) des villageois résidant dans le district de Fandriana connaissent la MN. Par ailleurs, nous avons constaté une diminution du pourcentage de la connaissance de la maladie selon les activités des gens. Cela peut être expliqué par le fait que plus les gens travaillent loin du domaine d‟élevage, moins, ils connaissent cette maladie. Le Tableau 6 et la Figure 26 présentent la connaissance des villageois sur la MN. Tableau 6 : Connaissance de la MN par les villageois.

Connaissance de la MN Répartition Activités Oui Non Total Nombre % Nombre % Poulets 10 0 Canards 5 0 Catégorie I Eleveurs 100 0 38 Oies et Dindes 2 0 espèces mixes 21 0 Techniciens - vétérinaires 3 0 Catégorie II 88 12 26 Marchands de - volaille 20 3 Agriculteurs - 12 0 Catégorie Commerçants - 0 72 2 28 18 III Fonctionnaires - 1 3 Total - - 74 90 8 10 82

Résultats et interprétation

100% 100 88% 90 80 72% 70 Oui (%) 60 Non (%) 50

40 28% Pourcentage 30 20 12% 10 0% 0 Catégorie I Catégorie II Catégorie III catégorie des villageois

Figure 25 : Histogramme représentant la connaissance de la MN par les villageois.

I.3 Symptômes de la maladie Tous les aviculteurs confirment que leurs volailles sont déjà victimes d‟une maladie très meurtrière et contagieuse appelée par deux noms vernaculaires « boarika » et « ramoletak’akoho » présentant des symptômes très divers : le torticolis, la paralysie des membres, la tête lourde et la prostration.

I.4 Incidence de la maladie Tous les aviculteurs signalent le passage annuel de cette maladie sous forme d‟une épizootie meurtrière. La Figure 26 montre la fréquence de la MN selon les aviculteurs. D‟après la figure 26, la MN est surtout présente du mois de mai au mois de novembre. Selon la totalité des aviculteurs, l‟incidence de cette maladie présente un pic au mois d‟octobre, période pendant lequel le nombre d‟animaux atteints de la maladie est le plus important. En analysant ces résultats, il apparaît clairement deux périodes de la MN : une période d‟explosion du foyer entre le mois de mai au mois de novembre et une période d‟accalmie entre le mois de décembre et le mois d‟avril. Durant cette dernière période, les aviculteurs n‟ont signalé aucun cas de MN.

Résultats et interprétation

18 16 14 12 10 8 6 4 2

Nombre de fois dit par les de ditparfois les Nombre aviculteurs 0

Mois d'apparition

Figure 26 : Evolution de la fréquence de la MN.

II Diagnostic de la présence d’APMV-1 Au cours de notre enquête, six échantillons suspectés infectés de la MN sont ramenés au laboratoire du FOFIFA-DRZV. Pour confirmer que ces échantillons sont vraiment issus d‟un poulet atteint de la MN, deux méthodes de diagnostic sont utilisées: la méthode de biologie moléculaire RT-PCR en temps réel et l‟isolement viral sur œuf embryonné.

II.1 Reverse transcriptase PCR en temps réel II.1.1 Courbe de quantification Après la quantification des extraits d‟ARN 1 et ARN 2, les valeurs de Ct des amplicons (témoins et échantillons) sont obtenues. La Figure 27 montre les courbes de quantification (ou d‟amplification) obtenues au cours de la RT-PCR en temps réel.

(A) (B) (C)

Figure 27 : Courbe de quantification des amplicons montrant l‟évolution de la quantité d‟amplicon en fonction du nombre de cycles PCR.(A) Témoins positifs et témoins négatifs. (B) Amplicons d’extrait d’ARN 1. (C) Amplicons d’extrait d’ARN 2.

Résultats et interprétation

Pour les deux extraits d‟ARN, des courbes identiques avec celui des témoins positifs sont obtenues. Elles montrent les 3 phases caractéristiques de l‟amplification par RT-PCR en temps réel. Les valeurs de Ct sont présentées dans le Tableau 7. Tableau 7: Valeurs de Ct des amplicons obtenues après criblage par RT-PCR en temps réel. Ct Témoins Avant isolement viral Après isolement viral Echantillons (extrait d'ARN 1) (extrait d'ARN 2) 1 20,85 20,87 22,37 2 21,55 23,65 25,09 3 24,55 26,26 27,03 4 27,29 24,82 27,94 5 33 26,14 28,07 6 - 26,66 29,63

Les témoins positifs présentent un Ct entre 21 à 33 cycles pour les dilutions 10-1 à 10-5. Pour la dilution (10-6) qui sert de témoin négatif, nous n‟avons pas obtenu de Ct. Pour l‟extrait d‟ARN 1, le Ct est obtenu après 21 à 27 cycles et pour l‟extrait d‟ARN 2, il est entre 22 à 29 cycles. Ces valeurs sont en accord avec celle obtenue avec le témoin positif c'est-à-dire inférieure à 33 cycles.

II.1.2 Courbe de fusion. La courbe de fusion permet de prouver réellement l‟existence d‟une amplification des APMV-1 en fonction des températures de fusion ou « melting temperature » ou Tm. La Figure 28 présente les courbes de fusion des amplicons obtenues après la RT-PCR en temps réel.

(A) (B) (C)

Figure 28 : Courbes de fusion obtenue par RT-PCR en temps réel en utilisant le SYBR Green. (A) Témoins positifs et témoins négatifs. (B) Amplicons d’extrait d’ARN 1. (C) Amplicons d’extrait d’ARN 2.

Résultats et interprétation

Les témoins positifs fournissent des pics sur la courbe de fusion à une Tm autour de 83°C. Aucun pic n‟est observé avec le contrôle négatif. La valeur de la Tm obtenue au cours de l‟amplification est représentée dans le Tableau 8. Tableau 8 : Valeur de la Tm des amplicons. Tm Témoins Avant isolement viral Après isolement viral Echantillons (extrait d'ARN 1) (extrait d'ARN 2) 1 83,6 83,7 83,65 2 83,65 83,15 83,65 3 83,65 83,1 83,7 4 83,7 83,1 83,1 5 81,1 83,08 83,1 6 - 83,08 83,1

Ce tableau montre que les valeurs de la Tm obtenues avant et après l‟isolement viral sont autour de 83°C, ce qui correspond avec les valeurs des témoins positifs. L‟amplification par la réaction RT-PCR en temps réel d‟une partie du gène F est donc positive pour les 6 échantillons traités dans cette étude.

II.2 Isolement viral Les embryons sont tous morts avant 72 h d‟incubation (Tableau 9). La mort de l‟embryon prouve l‟existence d‟une multiplication des APMV-1 et témoigne de la présence du virus dans l‟inoculum. Lors de la récolte du liquide allantoïdien des embryons morts, des autopsies de l‟embryon révèlent la présence des hématomes Figure 29. L‟hématome fait partie des lésions causées par les APMV-1 dans leurs hôtes. L‟isolement viral sur œuf embryonné de 9 à 11 jours s‟est révélé donc positif.

Hématome

Figure 29 : Hématome trouvé chez l‟embryon.

Résultats et interprétation

Tableau 9 : Durée de vie de l‟embryon pendant l‟incubation faisant suite à l‟inoculation virale.

Incubation 1er jour (24 h) 2ème jour (48 h) 3ème jour (72 h) Œufs Témoin 1 - - - Témoin 2 - - -

1 - - +

2 - - + 1 3 - - + 4 - - +

5 - - +

6 - - + 2 7 - - + 8 - - + 9 - + 10 - + 3 11 - + 12 - +

13 - - +

14 - - + 4 15 - - + 16 - - + 17 - - + 18 - - + 5 19 - - + 20 - - +

21 - - +

22 - - + 6 23 - - + 24 - - +

vivant (-) mort (+) 1 2 3 4 5 6

Numéro de l’échantillon

Résultats et interprétation

II.3 PCR conventionnelle II.3.1 Dosage de l’ADNc Le dosage spectrophotométrique de l‟ADNc montre à 260nm un pic (Figure 30) correspondant vraiment à l‟absorbance d‟ADN. La synthèse de l‟ADNc avec le kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (THERMOSCIENTIFICTM) est donc réussie. Les résultats du dosage d‟ADNc obtenus avec le Nanodrop sont exposés dans le tableau 10.

Figure 30 : Courbe de dosage d‟ADNc.

Tableau 10 : Concentration d‟ADNc dans les échantillons

Echantillons [ADNc] (ng/µl) A260/A280 A260/A230

cDNA_1 1982 1,73 2,04 cDNA_2 1921,1 1,72 2,02 cDNA_3 1905,6 1,74 2,14 cDNA_4 1903,9 1,72 2,04 cDNA_5 1882,7 1,72 2,02 cDNA_6 1853,6 1,72 2,01

Les rapports A260/A280 et A260/A230 permettent d‟évaluer la pureté de l‟ADNc. D‟après le tableau 9, le rapport A260/A280 est autour de 1,7 tandis que le rapport A260/A230 est autour de 2. En comparant ces valeurs avec la norme standard, nous pouvons dire que le degré de pureté de l‟ADNc des échantillons est satisfaisant malgré une faible contamination par les protéines.

Résultats et interprétation

II.3.2 Amplification du gène F D‟après la photographie du gel présentée dans la Figure 31, différentes bandes sont observées. Les bandes dans les pistes 1 et 8 correspondent à des marqueurs de taille de 100 pb et 50 pb respectivement (DNA Ladder). Les marqueurs de taille sont des molécules d‟ADN de poids moléculaires (PM) connu, ils sont utilisés pour contrôler la taille des amplicons d‟échantillon obtenus. Les pistes 2 à 6 sont celles des échantillons à amplifier ; la piste 7 correspond au contrôle positif d‟amplification (témoin positif) et la piste 8 au contrôle négatif (témoin négatif).

Figure 31 : Migration sur gel d‟agarose des amplicons.

Le témoin positif présente une bande correspondante à la taille attendue tandis que le témoin négatif n‟en présente pas. Les résultats du gel sont donc exploitables. Nous observons une bande unique pour l‟ensemble des couples d‟amorces utilisés. De plus, les produits PCR migrent à la taille attendue (200 pb). L‟amplification du gène F est donc positive et les couples d‟amorces utilisés sont bien spécifiques des séquences amplifiées.

III Résultats de la simulation Lors de la simulation des séquences, nous avons considéré 3 hypothèses possibles concernant le génotype circulant dans le district de Fandriana. Puisque le génotype XI est déjà prouvé, lors d‟une étude antérieure, circulant dans les Hautes Terres de Madagascar, il est possible que les souches de la MN qui circulent dans le district de Fandriana appartiennent également a ce génotype XI (Figure 32). Par ailleurs, sous l‟influence du phénomène d‟évolution virale, il est fort probable qu‟elles appartiennent à un génotype différent du génotype XI. Elles peuvent être soit moins évoluées que le génotype XI (Figure 33) soit plus évoluées que le génotype XI (Figure 34).

Résultats et interprétation

 Première hypothèse : souches appartenant au génotype XI.

97 MG_ BBS_ 09 MG_ 725C _08

MG _1992

AMM_04FAN_ 14

100 AMM _03FAN _14

MG_ MNJ_ 09 95 MG _39_ 4 _08 Classe 72 MG _Meola _08

MG_ 1595_ 10 Génotype II XI MG_ 1130 _10 MG_ 192C_ 10

MG_ 120T _10

MG_ 015C_ 10 MG_ 003C _10 99 MG_ 082 _10

MG_ 166_ 10 Herts/33 AY741404 Génotype 99 Italie EU293914 IV

DCKI AY626266 class Classe I

0.01

Figure 32 : Arbre phylogénétique (enraciné) de l'APMV-1 généré à partir des séquences simulées. L’analyse a été effectuée avec l’algorithme Neighbor-Joining (Saitou and Nei, 1987) en utilisant la méthode de Kimura à deux paramètres(Kimura, 1980)avec 1000 bootstraps (Felsenstein, 1985) avec le logiciel MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

Cette figure montre la position des souches appartenant au génotype XI. Les chiffres présents dans les nœuds de ramification représentent la valeur de bootstrap obtenus après 1000 répétitions. La ressemblance ou la différence d‟une souche par rapport à une autre est en fonction de la distance génétique. Elle est souvent calculée à l‟aide d‟un logiciel, par exemple le logiciel MEGA. Toutefois, elle peut être aussi estimée à partir d‟un arbre phylogénétique en analysant la longueur des lignes horizontales qui relient les souches dans un arbre phylogénétique. En effet, les souches qui présentent une distance génétique élevée, indiquées par des lignes horizontales longues, sont très différentes génétiquement : tel est le cas de la souche de la classe I (DCKI AY626266 class) et celui de toutes les souches de la classe II. En revanche,

Résultats et interprétation celles qui présentent une distance génétique faible (ligne horizontale courte) sont apparentées génétiquement : tel est le cas des six souches du génotype XI (MG_ 1595_ 10/ MG_ 1130 _10/ MG_ 192C_ 10/ MG_ 120T _10/ MG_ 015C_ 10/ MG_ 003C _10) et les deux souches du génotype IV (Herts/33 AY741404/ Italie EU293914) et du génotype XI (MG_725C_08/ MG_BBS_09).

 Deuxième hypothèse : génotype moins évolué que le génotype XI. La Figure 33 montre la position des souches moins évoluées que le génotype XI.

Ulster/67 AY562991 Génotype I HB92 (V4) AY225110

100 La sota AF077761 Génotype II TW/69 AF083959 100 TW/95 AF083970 Génotype X

100 GO JS/05 FJ430160 Génotype III Mukteswar EF201805 TJ/03 DQ227244 Génotype IX Classe 100 SD/02 DQ227252 II MG_003C_10 99 MG_015C_10

98 MG_082T_10

MG_39_4_08 Génotype XI 100 100 MG_Meola_08 MG_725C_08 99 MG_1992 AMM_01FAN_14 98 99 AMM_02FAN_14

Herts/33 AY741404 Génotype IV 96 Italie EU293914 DCKI AY626266 class Classe I

. 0.01

Figure 33 : Arbre phylogénétique (enraciné) de l'APMV-1 généré à partir des séquences simulées motrant la position des souches moins évoluées que le génotype XI.L’analyse a été effectuée avec l’algorithme Neighbor- Joining (Saitou and Nei, 1987) en utilisant la méthode de Kimura à deux paramètres (Kimura, 1980) avec 1000 bootstraps (Felsenstein, 1985) avec le logiciel MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

Résultats et interprétation

 Troisième hypothèse : génotype plus évolué que le génotype XI. La Figure 34 montre la position des souches plus évoluées que le génotype XI.

Ulster/67 AY562991 Génotype I HB92 (V4) AY225110

100 La sota AF077761 Génotype II

TW/69 AF083959 Génotype X 100 TW/95 AF083970

100 GO JS/05 FJ430160 Génotype III Mukteswar EF201805

TJ/03 DQ227244 Génotype IX 100 SD/02 DQ227252 Classe

AMM _04FAN _14 II AMM_ 03FAN_ 14 100 MG_ 015C_ 10 97 MG _082T_ 10

99 MG_ 003C _10 Génotype XI MG_ 39_ 4_ 08 88 74 100 MG _Meola _08

MG_ 725C_ 08 Herts/33 AY741404 Génotype IV 97 Italie EU293914

DCKI AY626266 class Classe I

0.01

Figure 34 : Arbre phylogénétique (enraciné) de l'APMV-1 généré à partir des séquences simulées montrant la position des deux souches plus évoluées que le génotype XI.L’analyse a été effectuée avec l’algorithme Neighbor-Joining (Saitou and Nei, 1987) en utilisant la méthode de Kimura à deux paramètres(Kimura, 1980)avec 1000 bootstraps (Felsenstein, 1985)avec le logiciel MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

DISCUSSION CONCLUSION ET PERSPECTIVES Discussion, conclusion et perspectives

Chapitre. 4 DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Les objectifs de notre étude sont d‟identifier la circulation des APMV-1 dans le district de Fandriana et de faire la caractérisation moléculaire des souches circulantes. Ainsi, nous avons en premier lieu effectué une enquête dans deux communes du district de Fandriana, d‟une part pour essayer de connaitre l‟importance de l‟aviculture et la situation de la MN dans cette zone, d‟autre part pour prélever des échantillons cliniquement infectés par la MN dans la basse-cour des aviculteurs. En second lieu, nous avons utilisé les techniques de diagnostic virologique afin de confirmer la présence des APMV-1 dans les échantillons. A la fin de cette étude, à défaut des séquences, suite à la non disponibilité des réactifs, nous avons essayé de simuler des séquences pour faire quelques analyses phylogénétiques. L‟importance de l‟aviculture villageoise est constatée durant cette étude. Dans les deux communes d‟étude, 100% du cheptel provient de ce type d‟aviculture. Un résultat similaire est trouvé au Niger où 97,2% du cheptel est fourni par l‟aviculture villageoise (Idi and Ganda, 2010). Cette dernière est en général basée sur l‟exploitation de petits effectifs de volaille locale (généralement 10 à 25 têtes par famille). Elle est marquée par la mixité des espèces (constituées en majorité de poulets et de palmipèdes, accessoirement de dindons et d‟oies) et caractérisée par des volailles en divagation (Guèye, 2003; Kabatange and Katule, 1990; Traoré, 1997). Elle est donc facile à pratiquer à défaut d‟un investissement énorme et ne demande aucune attention particulière (Boko et al., 2012). Dans les deux communes d‟étude, les poulets constituent 79,62% du cheptel. La facilité d‟élevage de poulets est un facteur qui favorise son expansion. En effet, les poulets trouvent leur nourriture en errant seulement entre les endroits du village : ils valorisent les restes de la récolte et de la cuisine domestique. De plus, ils constituent une source de revenus réguliers et facilement mobilisables pour les aviculteurs (Sonaiya and Swan, 2004). L‟aviculture villageoise joue un rôle important dans le système de production agricole. En effet, la volaille est utilisée comme source de cash pour l‟achat des produits de première nécessité et des semences (Idi, 1996). En outre, elle est utilisée pour recouvrir les besoins en argent de la famille en cas des problèmes majeurs (insuffisance de récolte, lors d‟une fête,...). A ce titre, elle contribue grandement à la sécurité alimentaire des ménages et constitue donc, un outil excellent pour lutter contre la pauvreté (Idi, 1996). Pourtant, elle reflète le niveau de vie d‟un pays. Des auteurs ont affirmé que l‟aviculture villageoise est très importante dans les pays économiquement faibles (Copland and Alders, 2009; dos Anjos, 2007; Sonaiya and Swan, 2004).

Discussion, conclusion et perspectives

Malgré l‟essor de l‟aviculture dans les pays en développement, de multiples facteurs menaçants existent. Le passage annuel des épizooties meurtrières des volailles appelées MN représente une contrainte majeure de l‟aviculture villageoise (Alders and Spradbrow, 2000). Les villageois résidant dans le district de Fandriana ont bien affirmé au moins un passage d‟une épizootie meurtrière connue sous le nom de « boarika » et «ramoletak’akoho ». La première appellation « boarika » désigne la maladie spécifique du genre Gallus, ou bien celle qui affecte en même temps les palmipèdes. L‟autre nom vernaculaire «ramoletak’akoho» est tiré du symptôme clinique de la maladie (paralysie des membres) et désigne plutôt la maladie qui frappe spécialement les poulets, genre Gallus gallus (Maminiaina et al., 2007). Selon les régions de Madagascar, comme dans les autres pays, les aviculteurs attribuent plusieurs appellations en langue locale à la maladie de Newcastle. Si dans la partie centrale de Madagascar, sur les Hautes Terres, les deux noms vernaculaires, « boarika » et « ramoletak’akoho » sont utilisés. D‟autres appellations comme « moafon’akoho » et « pest’akoho » sont enregistrées dans la partie Est de Madagascar (Maminiaina, 2011), « Maikitsoka » et « Koropoke » dans la partie Sud. Dans la partie Nord de Madagascar, englobant les régions d‟Analanjirofo, de Sofia et d‟Antsiranana, la MN est désignée sous le terme de « Ramibomogno » (traduit littéralement : « qui explose »), maladie d‟évolution extrêmement rapide avec un taux de mortalité très élevé, anéantissant le cheptel en un laps de temps très court (Maminiaina et al., 2007). Une terminologie similaire « the bomb » a été retrouvée en Afrique, chez les éleveurs de la région ouest de la République démocratique du Congo (Guéye, 2002). La MN elle est appelée « konoku », « twase-obgo », « nkokoyare » au Ghana, « muzungo », « mbendeni », « mte-éma », « chigubo-gubo » au Mozambique, et maladie de « ranikhet » en Asie (Alders and Spradbrow, 2000). Ainsi, la MN est bien connue des aviculteurs villageois de différents pays en développement, comme le prouve l‟existence des noms en langues locales pour la désigner, (Alders and Spradbrow, 2001). La manifestation de la MN est annuelle avec deux périodes dans l‟année : une période d‟explosion allant de mai à novembre et une période d‟accalmie allant de décembre à avril. Des observations similaires ont été rapportées par Maminiaina et al (2007) sur les Hautes Terres de Madagascar (Maminiaina et al., 2007). Des études menées au Niger, au Zaïre et en côte d‟Ivoire ont montré aussi que la MN est apparue chaque année dans les basse-cours (Bahus, 1993; Eyanga, 1991; Sylla et al., 2003). L‟augmentation du nombre de sujets séronégatifs dans le cheptel durant la période d‟accalmie et l‟introduction des volailles infectées à cette période entraînent l‟apparition

Discussion, conclusion et perspectives annuelle de la MN (Maho et al., 2004). En effet, après chaque épizootie, les sujets séronégatifs ont disparu, laissant derrière eux des oiseaux guéris séropositifs ayant survécu aux foyers. Ces individus sont le plus souvent résistants à la nouvelle infection de la MN (Ban-Bo et al., 2013).Pour le cas de Madagascar, les éleveurs reconstituent leur cheptel à partir des individus rescapés (individus séropositifs) car ils savent pertinemment que ces volailles sont devenues résistantes à la maladie (Maminiaina et al., 2007). Le repeuplement s‟effectue donc majoritairement à partir de la reproduction interne du cheptel (Koko et al., 2002). Or, selon Guèye (Guèye, 2002), les poussins issus de poules rescapées d‟une infection due au virus de la MN héritent tous des anticorps d‟origine maternelle dirigés contre cette maladie. Le temps d‟écoulement s‟étale de trois à quatre semaines, période à l‟issue de laquelle les anticorps maternels ont disparu, laissant ainsi les poussins séronégatifs (Alexander, 1991). En l‟absence d‟une nouvelle infection, pendant la période d‟accalmie allant du mois de décembre au mois d‟avril, des générations de poussins se sont succédées, générant ainsi une nouvelle population de poulets naïfs dépourvus d‟anticorps (Maminiaina et al., 2007). Par ailleurs, selon Alders et Spradbrow, la source habituelle du virus de la MN est la volaille infectée et la dissémination est souvent due aux mouvements des volailles liés à leur collecte et à leur vente aux marchés (Alders and Spradbrow, 2001). En effet, l‟introduction d‟un tel individu vers les mois de mai ou de juin, au sein de la population hautement réceptive (populations séronégatives nombreuses) pourrait être à l‟origine annuelle de l‟épizootie dont le pic est observé au mois d‟octobre. Après son explosion, la diffusion de la maladie se fait de diverses manières, en fonction du comportement des éleveurs (Maminiaina et al., 2007). Au premier signe de l‟infection dans la basse-cour, les éleveurs se débarrassent des volailles apparemment saines en les vendant ou en les transférant dans un autre endroit jugé encore indemne alors que les malades et les mortes sont éliminés pour la consommation. Par contre, les restes des volailles consommées ne subissent aucun traitement particulier. Toutes ces pratiques contribuent à la diffusion rapide du virus, qui passe facilement d‟un élevage à un autre dans le même village ou dans les villages voisins, entraînant ainsi l‟extension de la maladie. La MN peut être également transmise d‟un village à l‟autre par l‟homme, les animaux et les objets contaminés (Villate, 2001). Au cours de l‟enquête dans les deux communes de Fandriana, nous avons pu prélever 6 échantillons provenant des volailles présentant des symptômes cliniques de la MN. La faible taille de l‟échantillon s‟explique par le fait que l‟explosion des foyers de la MN dans ce

Discussion, conclusion et perspectives district a lieu au mois d‟octobre alors que nous avons dû effectuer les études sur le terrain aux mois d‟août et septembre, période pendant laquelle quelques foyers uniquement sont apparus. Les résultats du diagnostic moléculaire en utilisant les techniques de RT-PCR en temps réel, RT-PCR conventionnelle et isolement viral, sur les six échantillons de cerveau de poulet (Gallus gallus) confirment que la maladie appelée par ces aviculteurs« ramoletak’akoho » ou « boarika » dans la région de Fandriana, est bien la MN causée par le paramyxovirus aviaire type 1 (APMV-1). L‟isolement viral est à la fois une technique de diagnostic et une technique d‟obtention des souches isolées. En raison de leur parasitisme absolu, les virus ne sont capables de se multiplier qu‟à l‟intérieur d‟un organisme vivant. Cette propriété est utilisée dans cette étude pour multiplier le virus mais en même temps pour isoler les souches. D‟après le résultat, la mort de l‟embryon a lieu avant 72 h d‟incubation consécutive à l‟administration d‟inoculum. Cette observation confirme bien la présence de souches virulentes qui circulent dans le district de Fandriana. Ces souches peuvent être mesogènes ou vélogènes. En conclusion, cette étude nous a apporté les premières informations concernant la MN dans le district de Fandriana. En appliquant différentes techniques de diagnostic, nous avons pu confirmer la suspicion de la circulation des APMV-1 dans ce district. La simulation dans cette étude nous a permis d‟orienter une analyse prédictive des génotypes circulants dans le district de Fandriana. Même si nous n‟avons pas pu atteindre notre troisième objectif qui est de caractériser les génotypes circulants dans le district de Fandriana, nous avons eu des résultats satisfaisants au cours de cette étude. Nous avons pu découvrir la MN dans le district de Fandriana (connaissance de la maladie, appellation, période d‟apparition, symptômes), affirmer la circulation réelle du virus de MN (APMV-1) dans ce district et isoler des souches qui seraient indispensables au séquençage. Afin de compléter ces études, il serait intéressant de : - (i) terminer le séquençage de la partie du gène F obtenu dans cette étude ; - (ii) de continuer le séquençage du gène F complet et du génome entier des souches isolées dans cette étude ; - (iii) de poursuivre les activités de recherche portant sur l‟identification et la caractérisation des APMV-1 dans les autres bassins avicoles de Madagascar.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Références bibliographiques

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Acha, P.N. & Szyfres, B. (1982). Zoonose et maladies transmissibles communes à l'Homme et aux animaux. (ed. by OIE), p. 693p, Paris. Alders, R. & Spradbrow, P. (2000). Newcastle disease in village chickens. In: SADC planning workshop on Newcastle disease control in village chickens, p. 45 pp, 6-9 March - Maputo – Mozambique. Alders, R. & Spradbrow, P.B. (2001). Controlling Newcastle Disease in Village Chickens: a field manual. Canberra. Australian Centre for International Agricultural Research. Monograph, 82 - 112. Alexander, D.J. (2003). Newcastle disease, other avian paramyxoviruses and pneumovirus infections. Diseases of Poultry 11, 63-99. Alexander, D.J. (1988). Preface in Newcastle Disease. Boston MA, Kluwer Academic Publishers, XI Alexander, D.J. (1991). Newcastle disease and other paramyxovirus infections. . In: Diseases of poultry (ed. by Calnek BW, Barnes, H.J., Beard, C.W., Reid, W.M., Yoder, H.W.), pp. 496-519. Iowa State University Press, Ames. Bahus, J. (1993). La maladie de Newcastle aux premières loges. Afrique agriculture 200, 15- 16. Ban-Bo, B.A., Kebkiba B. & Nadjilem D. (2013). Facteurs favorisant l'apparition de la maladie de Newcastle au Tchad. J. Appl. Biosci 70, 5591-5598. Bellini, W.J., Englund, G., Richardson, C.D., Rozenblatt, S. & Lazzarini, R.A. (1986). Matrix genes of measles virus and canine distemper virus: cloning, nucleotide sequences, and deduced amino acid sequences. J Virol 58, 408-416. Boko, K.C., Kpodekon, T.M., Dahouda, M., Marlier, D. & Mainil, J.G. (2012). Contraintes techniques et sanitaires de la production traditionnelles de pintade en Afrique subsaharienne. Ann.Méd.Vét. 156, 25-36. Bossart, K.N. & Broder, C.C. (2007). Paramyxovirus entry. in Viral entry into host cells. In: Landes Bioscience (ed. by Simmons PaG), Georgetown TX. Bulden, A., Parent, R., Steyaert, P. & Legrand, D. (1996). Aviculture semi-industrielle en climat subtropical : guide pratique. (ed. by Les presses agronomiques de Gembloux. A.S.B.L. B-), p. 122p, Gembloux (Belgique).

Références bibliographiques

Copland, J.W. & Alders, R.G. (2009). The Comparative Advantages of Village or Smallholder Poultry in Rural Development. In: Village Chickens, Poverty Alleviation and the Sustainable Control of Newcastle Disease. Canberra: Australian Centre for International Agricultural Research (ACIAR). Proceedings of an international conference, Dar es Salaam, Tanzania, October 5-7, 2005. Proceedings No 131. 11-14. Courtney, S.C., Susta, L., Gomez, D., Hines, N.L., Pedersen, J.C., Brown, C.C., Miller, P.J. & Afonso, C.L. (2013). Highly divergent virulent isolates of Dominican Republic are members of a new genotype that may have evolved unnoticed for over 2 decades. J. Clin. Microbiol. 51, 508-517. Czeglédi, A., Ujvári, D., Somogyi, E., Wehmann, E., Werner, O. & Lomnicz, B. (2006). Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications. Virus Research 120, 36-48. de Almeida, R.S., Hammouni, S., Gil, P., Briand, F.X., Molia, S., Gaidet, N., Capelle, J., Chevalier, V., Balanca, G., Traoré, A., Grillet, C., Maminiaina, O.F., Guendouz, S., Dakouo, M., Samaké, K., Bezeid, O.E.M., Diarra, A., Chaka, H., Goutard, F., Thompson, P., Martinez, D., Jestin, V. & Albina, E. (2013). New Avian Paramyxoviruses Type I Strains Identified in Africa Provide New Outcomes for Phylogeny Reconstruction an Genotype Classification. PLoS ONE 8, 1-16. de Leeuw, O.S., Koch, G., Hartog, L., Ravenshorst, N. & Peeters, B.P.H. (2005). Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin-neuraminidase protein. J Gen Virol 86, 1759-1769. Diel, D.G., da Silva, L.H., Liu, H., Wang, Z. & Miller, P.J. (2012). Genetic diversity of avian paramyxovirus type 1 : Proposal for a unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotype. Infect Genet Evol 12, 1770-1779. dos Anjos, F. (2007). The Epidemiology of Poultry Diseases, Structure and Importance of Commercial and Village Based Poultry Industry in Mozambique. FAO report. Doyle, T.M. (1927). A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter passing virus. J. Comp. Pathol. 40, 144-169. Edgar, R.C. (2004). MUSCLE : multiple sequence alignment method with high accuracy and high throughput. Nucleic Acid Res.32, 1792-1997. Edwards, A.W.F. & Sforza, C. (1963). The reconstruction of evolution. Heredity 18, 60-72. Edwards, A.W.F. & Sforza, C.L.L. (1964). Phenetic and Phylogenetic Classification, chapter Reconstruction of evolutionary trees,. Systematics Association Publ. London 6, 67-76.

Références bibliographiques

Efron, B., Halloran, E. & Holmes, S. (1996). Bootstrap confidence levels for phylogenetic trees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 13429-13435. Elyse, P. (2002). La PCR en temps réel : principe et application. Biology and biotechnology., 2-11. Eyanga, E. (1991). La maladie de Newcastle au Zaire. In: Proceeding workshop Newcastle disease vaccine for rural Africa. (ed. by PANVAC DZ), pp. 69-72, Addis Ababa, Ethiopia. Felsenstein, J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39, 783-791. Finke, S., Cox, J.H. & Conzelmann, K.-K. (2000). Differential Transcription Attenuation of Rabies Virus Genes by Intergenic Regions: Generation of Recombinant Viruses Overexpressing the Polymerase Gene. J. Virol.74, 7261-7269. Fitch, W.M. & Margoliash, E. (1967). Construction of phylogenetic trees. Science 155, 279- 284. Ganière, J.P. (2008). Maladie de Newcastle-Influenza aviaire : Maladies réputées contagieuse ou à déclaration obligatoire. (ed. by Ecole Normale Vétérinaire française), p. 1-9. Garcia-Sastre, A., Cabezas, J. A. & Villar, E. (1989). Proteins of Newcastle disease virus envelope: interaction between the outer hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein and the inner non-glycosylated matrix protein. Biochim Biophys Acta. 999 (2), 171- 175. Griffin, D.E. (2001). Measles virus. Fieds Virology, In knipe, D.M. and Howley, P.M., 1401 - 1441. Guèye, E.F. (2002). Family poultry research and development in low-income food-deficit countries: approaches and prospects. In: Outlook Agric, p. 13-21. Guèye, E.F. (2003). Gender issues in family poultry production system in low-income food- deficit countries. Am.J.Alternative Agr 18, 185-195. Haecke,l E. (1866). Generelles Morphologie der Organismen., Reimer, Berlin. Hall, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser.41, 95-98. Hamaguchi, M., Nishikawa, K., Toyoda, T., Yoshida, T., Hanaichi, T. & Nagai, Y. (1985). Transcriptive complex of Newcastle disease virus. II. Structural and functional assembly associated with the cytoskeletal framework. Virology 147, 295-308.

Références bibliographiques

Heinz, R. (1969). Traité des maladies à virus des animaux. In: Tome 1 : Partie générale. (ed. by Frères V), 859p, Paris. Hernandez, L.D., Hoffman, L.R., Wolfsberg, T.G. & White, J.M. (1996). Virus-cell and cell- cell fusion. Annu Rev Cell Dev Biol 12, 627-661. Hijmans, R.J., Guarino, L. & Mathur, P. (2012). DIVA-GIS version 7.5 : Manual., 71p. Huang, Y., Wan, H.Q., Liu, H.Q., Wu, Y.T. & Liu, X.F. (2004). Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated from an outbreak in geese: a novel six nucleotide insertion in the non-coding region of the nucleoprotein gene. Brief report. In: Archives of Virology, pp. 1445–1457. Idi, A. (1996). La méléagriculture au Niger : rapport final de l'activité "Connaissance des systèmes de production des pintades au niger". (ed. by INRA/DRZV), 23p. Idi, A. & Ganda, I.O. (2010). Revue du secteur avicole : Niger., 69p. Iorio, R.M., Field, G.M., Sauvron, J.M., Mirza, A.M., Deng, R., Mahon, P.J. & Langedijk, J.P. (2001). Structural and Functional Relationship between the Receptor Recognition and Neuraminidase Activities of the Newcastle Disease Virus Hemagglutinin- Neuraminidase Protein: Receptor Recognition Is Dependent on Neuraminidase Activity. J. Virol.75, 1918-1927. Iseni, F., Barge, A., Baudin, F., Blondel, D. & Ruigrok, R.W. (1998). Characterization of rabies virus nucleocapsids and recombinant nucleocapsid-like structures. J Gen Virol 79, 2909-2019. Jukes, T.H. & Cantor, C.R. (1969). Evolution of protein molecules. in Mammalian protein metabolism Academic Press, New York, N.Y, 21-132. Kabatange, M.A. & Katule, A.M. (1990). Rural poultry production systems in Tanzania. In: Proceedings of an International Workshop on Rural Poultry Development in Africa. (ed. by Sonaiya, E.B.), p 171-6, Ile-Ife. Kaplan, J.-C. & Delpech, M. (1989). Biologie moléculaire et médecine 610p. Kho, C.L., Tan, W.S. & Yusoff, K. (2001). Sequence analysis of the nucleocapsid of a Newcastle disease virus heat resistant strain: comparison with other members of the Paramyxoviridae. J Biochem Mol Biol Biophys 5, 463-471. Kim, L.M., King, D.J., Suarez, D.L., Wong, C.W. & Afonso, C.L. (2007). Characterization of Class I Newcastle disease virus isolates from Hong Kong bird markets and detection using real-time reverse transcription PCR. J Clin Microbiol . 1310–1314.

Références bibliographiques

Kimura, M. (1980). A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16, 111-120. Koko, M., Maminiaina, O.F., Ravaomanana, J., Rakotonindrina, S.J., (2002). Aviculture villageoise à Madagascar: Productivité et Epidémiologie. Kolakofsky, D. & Bruschi, A. (1975). Antigenomes in Sendai virions and Sendai virus- infected cells. Virology 66, 185-191. Kraneveld, F.C. (1926). A poultry disease in the Dutch East Indies. In: Nederlands-Indische Bladen voor Diergeneeskunde, pp. 448-450. Krishnamurthy, S. & Samal, S. (1998). Nucleotide sequences of the trailer, nucleocapsid protein gene and intergenic regions of Newcastle disease virus strain Beaudette C and completion of the entire genome sequence. J Gen Virol 79, 2419-2424. Kurilla, M.G., Stone, H.O. & Keene, J.D. (1985). RNA sequence and transcriptional properties of the 3' end of the Newcastle disease virus genome. Virology 145, 203-212. Ladram, A. & Camus, G. (2012). La chromatographie. 7p. Lamb, R.A. & Kolakofsky, D. (2001). Paramyxoviridae: the viruses and their replication. In: Lippincott William, Wilkins (ed. by Knipe DM, Howley, P.M., Griffin, D.E., Lamb, R.A.,Martin, M.A., Roizman, B., Straus, S.E.). Fields Virology 1, 689-724., Lippincott-Raven, Philadelphia. Lamb, R.A. & Parks, G.D. (2007). Paramyxoviridae: the viruses and their replication In: Howley, D. M., Wolters, P. M., Fields virology 5th. Knipe, Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins, PA. Philadelphia 1449-1496. Maho, A., Ndeledje Gondje, N., Mopate, L.Y. & Ganda, K. (2004). La maladie de Newcastle au sud du Tchad : périodes de pic épidémique et impact de la vaccination. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.23 (3), 777-782. Mahon, P.J., Mirza, A.M., Musich, T.A. & Iorio, R.M. (2008). Engineered Intermonomeric Disulfide Bonds in the Globular Domain of Newcastle Disease Virus Hemagglutinin- Neuraminidase Protein: Implications for the Mechanism of Fusion Promotion. J. Virol. 82, 10386-10396. Maminiaina, O.F. (2011). Caractérisation des virus de la maladie de Newcastle (APMV-1) circulant sur les haute terre de Madagascar. 207p. Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée (BDFA) - Faculté des Sciences; Université d'Antananarivo, Thèse de Doctorat d'Université (PhD), Antananarivo.

Références bibliographiques

Maminiaina, O.F., Koko, Ravaomanana, J. & Rakotonindrina, S.J. (2007). Epidémiologie de la maladie de Newcastle en aviculture villageoise à Madagascar. Rev. Sci Tech Off. Int. Epi 26, 691-700. Mayo, M.A. (2002). Virus Taxonomy - Houston 2002. Archives of Virology 147, 1071-1076. Ocean consultant. (2004). Filière aviculture traditionnelle. In: Filière de l'Agriculture, de l'Elevage et de la Peche. (ed. by Ministry of agriculture). OIE (2009). Newcastle disease. Chapter 2.3.14. OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, in Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals: Mammals, Birds and Bees. Office International des Epizooties, Paris (May 2009), 576-589. Panda, A., Elankumaran, S., Krishnamurthy, S., Huang, Z. & Samal, S.K. (2004a). Loss of N- Linked Glycosylation from the Hemagglutinin- Neuraminidase Protein Alters Virulence of Newcastle Disease Virus. J. Virol.78, 4965-4975. Panda, A., Huang, Z., Elankumaran, S., Rockemann, D.D. & Samal, S.K. (2004b). Role of fusion protein cleavage site in the virulence of Newcastle disease virus. Microbial Pathogenesis 36, 1-10. Parent, A., Bulden, A., Steyaert, P. & Legrand, D. (1989). Guide pratique d'aviculture moderne en climat sahelo-soudanien de l'afrique de l'Ouest. (ed. by V E), 85p, Senegal. Peeters, B.P.H., de Leeuw, O.S., Koch, G. & Gielkens, A.L.J. (1999). Rescue of Newcastle Disease Virus from Cloned cDNA: Evidence that Cleavability of the Fusion Protein Is a Major Determinant for Virulence. J. Virol.73, 5001-5009. Phillips, R.J., Samson, A.C.R. & Emmerson, P.T. (1998). Nucleotide sequence of the 5′- terminus of Newcastle disease virus and assembly of the complete genomic sequence: agreement with the “rule of six”. Archives of Virology 143, 1993-2002. Rajaonarison, J.J. (1991). Note sur la maladie des volailles tout nouvellement observé à Madagascar Buck. G., 1947. In Production de vaccin contre la maladie de Newcastle à Madagascar. In: PANVAC, Debre Zeit, FAO, pp. 135-137, Debre Zeit, Addis Ababa, 22 - 26 April . Robyn, A. & Spradbrow, P. (2000). La maladie de Newcastle dans les aviculteurs villageoises : manuel de terrain. In: Monographie no 131 (ed. by ACIAR), 70p, Canberra. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. & Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1354.

Références bibliographiques

Saitou, N. & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4, 406-425. Seal, B.S. (2004). Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virus isolates. Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences. Functional & Integrative Genomics 4, 246-257. Seal, B.S., Wise, M.G., Pedersen, J.C., Senne, D.A., Alvarez, R., Scott, M.S., King, D.J., Yu, Q. & Kapczynski, D.R. (2005). Genomic sequences of low-virulence avian paramyxovirus-1 (Newcastle disease virus) isolates obtained from live-bird markets in North America not related to commonly utilized commercial vaccine strains. Veterinary Microbiology 106, 7-16. Smallwood, S., Ryan, K.W. & Moyer, S.A. (1994). Deletion Analysis Defines a Carboxyl- Proximal Region of Sendai Virus P Protein That Binds to the Polymerase L Protein. Virology 202, 154-163. Snoeck, C.J., Adeyanju, A.T., Owoade, A.A., Couacy, H.E., Alkali, B.R., Ottosson, U. & Muller, C.P. (2013). Genetic diversity of NDV in wild bird and pigeons in west Africa. Applied an Environmental Microbiology.79, 7867-7874. Sonaiya, E.B. & Swan, S.E. (2004). Production en Aviculture familiale. (ed. by FAO), 140p, Rome. Spradbrow, P.B. (1988). Geographical distribution. In: Newcastle disease (ed. by Alexander, D.J.), 247p, Boston, MA. Suzuki, M., Suzuki, A., Yamakawa, T. & Matsunaga, E. (1985). Characterization of 2,7- anhydro-N-acetylneuraminic acid in human wet cerumen. J Biochem 97, 509-515. Sylla, M., Traoré, B., Sidibé, S., Keita, S., Diallo, F.C., Koné, B., Ballo, A., Sangaré, M. & N'G. Koné. (2003). Epidémiologie de la maladie de Newcastle en milieu rural au Mali. Revue d‟élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux Revue d'élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux 56, 7-12. Tajima, F. & Nei, M. (1984). Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences. Molecular Biology and Evolution 1, 269-285. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. & Kumar, S. (2013). MEGA 6 : Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30, 2725-2729.

Références bibliographiques

Traoré, B. (1997). Caractérisation des élevages avicoles traditionnels en zone soudanienne et soudano-guinéenne du Mali. In: Proceeding International Network for Family Poultry Development workshop, M'Bour., p. 133-139, Senegal. Villate, D. (2001). Les paramyxoviroses. In: Manuel pratique. Maladie des volailles (ed. by France Agricole), p. 148-161, Paris. William, W.W., Mackey, K. & Chomczynski, P. (1997). Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. Biotechniques 22, 474- 481. Yan, Y. (2008). Role of noncoding regions in newcastle disease virus replication and pathogenis. In: Departement of veterinary medecine, 208p. University of maryland. Young, M., Alders, R., Grimes, S., Spradbrow, P., da Silva, A. & Lobo, Q. (2012). Controle de la Maladie de Newcastle chez les poulets de village : un manuel de la boratoire. (ed. by ACIAR), 153p. Yusoff, K., Millar, N.S., Chambers, P. & Emmerson, P.T. (1987). Nucleotide sequence analysis of the L gene of Newcastle disease virus: homologies with Sendai and vesicular stomatitis viruses. Nucleic Acids Res 15, 3961-3976. Yusoff, K. & Tan, W.S. (2001). Newcastle disease virus: macromolecules and opportunities. Avian Pathology 30, 439-455. Zaitsev, V., von Itzstein, M., Groves, D., Kiefel, M., Takimoto, T., Portner, A. & Taylor, G. (2004). Second Sialic Acid Binding Site in Newcastle Disease Virus Hemagglutinin- Neuraminidase: Implications for Fusion. J. Virol.78, 3733-3741.

ANNEXES Annexes

ANNEXES ANNEXE 1 : Localisation et description des lésions de la maladie de Newcastle

Localisation des lésions Lésions

Pétéchies à la jonction de la muqueuse de l‟œsophage Ventricule succenturié et du ventricule.

Gésier Lésions hémorragique sous la cuticule.

Tube digestif Piquetés hémorragique plus ou moins intenses.

cloaque Pétéchie

Cœur Pétéchie sur l‟épicarde et sur la graisse du myocarde.

Péritoine Pétéchie sur l‟épicarde et sur la graisse du myocarde.

Ovaire Ovaires congestionnés avec des ovules hémorragiques.

ANNEXE 2 : Vaccins anti-Newcastle commercialisés à Madagascar.

Doses Nom Type de Souche Voie par Fabriquant commerciale vaccin vaccinale d’administration flacon Vivant et IMVAVET PESTAVIA® Mukteswar Sous cutané 50 lyophilisé Madagascar Oculonasal, Vivant et Hitchner 1000- HYPRA HIPRAVIARBI® orale, lyophilisé B1 5000 Espagne nébulisation Oculonasal, orale Vivant et 1000- HYPRA HIPPAVIARS® La Sota ou par lyophilisé 5000 Espagne nébulisation Oculonasal, orale LohmanAnimale TAD® ND Vivant et 1000- La Sota ou par Health vacLaSota lyophilisé 5000 nébulisation Allemagne Inactivé La Sota Injection 100- ITANEW® Laprovet France huileux inactivé intramusculaire 500

Annexes

ANNEXE 3 : Préparation de mélange d'antibiotiques  Définition d’un antibiotique : Les antibiotiques sont des substances naturelles ou synthétiques capables d‟inhiber ou de tuer les microorganismes. Ils agissent uniquement contre les bactéries et n‟ont aucun effet sur les virus. Nous avons utilisés une solution de mélange d‟antibiotiques possédant une action différente afin d‟éviter une contamination bactérienne ou fungique, contamination qui pourrait être survenu lors de la manipulation. La Pénicilline qui interfère avec l‟étape finale de la synthèse de la paroi des bactéries Gram (+). La Streptomycine et la Gentamicine qui fixent les sous unité 30S du ribosome des bactéries Gram (+) et Gram (-) en provoquant des erreurs de lecture. Enfin le Fungizone interfère avec la perméabilité de la membrane cellulaire des champignons par fixation des stéroïdes. Les quatre antibiotiques utilisés dans cette étude sont présentés dans le Tableau 11. Tableau 11 : Antibiotiques utilisés dans cette étude. Antibiotiques Concentration initiale Concentration finale Pénicilline 1000000UI/ml 2000UI/ml Streptomycine 1000mg/ml 2mg/ml Gentamicine 4000µg/ml 50µg/ml Fungizone 250mg 2mg

 Préparation du mélange d’antibiotiques : Nous avons dilué l‟antibiotique initial puisqu‟une concentration élevée en antibiotique dans l‟inoculum pourrait provoquer un effet sur le virus. Les antibiotiques sont d‟abord préparés un à un puis mélangés volume à volume afin d‟obtenir un volume final de 1000 ml. Voici un exemple de mode de préparation de la solution d‟antibiotique. Pénicilline : Pour aboutir à la concentration 1000000UI/ml, 1ml d‟eau physiologique (NaCl

8°/00) est versé dans le flacon contenant de pénicilline lyophilisé puis agité. Ensuite, la solution est diluée 100 fois avec NaCl 8°/00 pour avoir une concentration intermédiaire de 10000UI/ml. La solution à concentration 2000UI/ml est obtenue en diluant 5 fois cette solution. Pour les autres antibiotiques, la préparation suit la même démarche que celle de la pénicilline.

1/100 1/5 1000000UI/ml 10000UI/ml 2000UI/ml

Concentration Concentration Concentration initiale (Ci) intermédiaire (Cint) finale (Cf)

ooooonon II

Annexes

ANNEXE 4 : Préparation des réactifs de l’extraction.  Tampon RAV-1 : Il s‟agit d‟un tampon de lyse, nécessaire à la destruction de la membrane virale pour libérer les contenus viraux. Il contient du sel guanidine thiocyanate et il est additionné de carrier RNA avant d‟être utilisé. Ce dernier (carrier RNA) sert de ligand pour la fixation de l‟ARN sur la membrane de la colonne. Le RAV1 est un tampon de 25 ml de volume. Pour la préparation, 1 ml de ce tampon est prélevé puis transféré dans une boite contenant de la poudre de carrier RNA. Après agitation, le mélange est versé dans la boite de tampon de RAV1 et cette solution est prête à être utilisé. Le tampon de lyse RAV1 peut être gardé à la température ambiante pendant deux semaines, à 4°C pendant un mois et à -20°C pendant une longue période. Par contre, le tampon RAV1 congelé ne peut pas être utilisé plus de 4 fois.  Tampon RAV-3 et tampon RAW : Ils correspondent à des tampons de lavage utilisés pour éliminer les molécules qui ne sont pas fixées à la colonne. Ils ont besoin de l‟éthanol pour pouvoir être fonctionnels. Le tampon RAV3 est additionné de 100 ml d‟éthanol. Le tampon RAW peut être directement utilisé en raison de la présence du sel guanidine hydrochloride et de l‟éthanol inférieur à 50% dans sa composition. Ces deux tampons peuvent être gardés à la température ambiante pendant plus de un an.

ANNEXE 5 : Protocole d’inoculation du virus sur œuf embryonné.  Mirage des œufs de l‟incubateur pour déterminer leur viabilité.  Essuyage de la surface de l‟œuf (au point d‟inoculation) avec un désinfectant (alcool 40°C).  Désinfection de l‟instrument de perçage avec de l‟alcool 40°C. Laisser sécher.  Perçage de l‟endroit marqué pour l‟inoculation (petit trou dans la coquille) en évitant de rompre la membrane coquillère.  Remplissage de la seringue : 400µl d‟inoculum injecté dans 4 œufs (100µl chacun). L‟aiguille est insérée dans la coquille en penchant la seringue et l‟aiguille comme indiqué à la figure 15 (cf page 22).  Injection d‟inoculum dans la cavité allantoïdienne et recouvrement du site d‟injection par la paraffine.  Retour des œufs dans l‟incubateur et mirage toutes les 24h.

III

Annexes

ANNEXE 6 : Génotypes des APMV-1 utilisés pour la construction des arbres phylogénétiques. Numéro Classes Génotypes Identification d'accession I - DCKI class AY626266 II I Ulster/67 AY562991 II HB92 (V4) AY225110 II La Sota AF077761 III GO JS/05 FJ430160 III Mukteswar EF201805 IV Herts/33 AY741404 IV Italie EU293914 IX TJ/03 DQ227244 IX SD/02 DQ227252 X TW/69 AF083959 X TW/95 AF083970 XI MGBBS/09 JX518875 XI MG725C/08 HQ266602 XI MG 1992 HQ266603 XI MG MNJ/09 JX518882 XI MG 39-4 /09 HQ266605 XI MG Meola/08 HQ266604 XI MG 1595T/10 JX518883 XI MG1130T/10 JX518883 XI MG192C/10 JX518881 XI MG120T/10 JX518879 XI MG 015C/10 JX518877 XI MG 003C/10 JX518876 XI MG 082T/10 JX518878 XI MG 166/10 JX518880

ANNEXE 7 : Identification des échantillon

Echantillons Région District Commune Lat dec Long dec Sexes Ages 1 Amoron‟i Mania Fandriana Alakamisy -20.36972 47.41722 Poule Adulte 2 Amoron‟i Mania Fandriana Alakamisy -20.36973 47.41723 Coq 3 mois 3 Amoron‟i Mania Fandriana Alakamisy -20.38083 47.44778 Poule Adulte 4 Amoron‟i Mania Fandriana Mahazoarivo -20.36583 47.42556 Poule Adulte 5 Amoron‟i Mania Fandriana Mahazoarivo -20.36194 47.42389 Poule 2 mois 6 Amoron‟i Mania Fandriana Mahazoarivo -20.35917 47.42083 Coq 3 mois

Lat dec : latitude décimale Long dec : longitude décimale

Annexes

ANNEXE 8 : Schéma du format FASTA des séquences.

>gi|154813805|gb|EF612277.1|_Newcastle_disease_virus_strain_Northern_Pintail/US(AK)/196/1998_fusion_pr otein_(F)_mRNA_complete_cds ATGGATCCCAAGCCTTCTACCAGCTATTTGCACACTTTCCCACTGATCTTCGTGGCTATCATTTTAGT ATTCATGGCTGGAAGGGCATCGGCACTGGATGGGCGGCCGCTCGCTGCCGCAGGAATAGTAGTCA CAGGAGACAAGGCAGTTAATATATACACATCGTCGCAAACAGGGACAATTATCATCAAATTATTAC CCAATATGCCCAAAGACAAAGAACAATGTACTAAGGGCCCCCTAGACGCATACAATAGGACCCTT ACAACCCTCCTTGCCCCGCTCGGCGATTCGATTAGGAGGATCCAAGAGTCGGTAACCACATCAGGA GGAGAACGGCAGGAGCGTTTGGTAGGGGCAATAATAGGAGGTGT >gb|AY562991.1|:4544- 6205_Newcastle_disease_virus_isolate_chicken/N._Ireland/Ulster/67_complete_genome ATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCTCTGATGCTGACCGTCCGGGTCGCGCTGGAA CTGAGTTGCGTCTGTCCGACAAGCTCCCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTGGTG ACAGGAGACAAAGCAGTCACCATTTCCACCTCATCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTC CCAAATTTGCCCAAAGATAAAGAGGCGTTTGCAAAAGCCCCGCTGGAGGCGTTCAACAGGACATT GACTACTTGGCTCACCCCCCTTGGTGATTCTATCCGTAGGATACAAGAGTCTGTGACTACATCTGGA GGAGGGAAACAGGGACGCCTTATAGGCGCCATTATCGGCGGTGC >gb|JF950509.1|:4544-6205_Newcastle_disease_virus_strain_Mukteswar_complete_genome ATGGGCCCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCTCTAATGCTGACCATACGGATCACGCTGGCA CTGAGTTATGTCCGTCTGACAAGTTCTCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCCGCAGGGATCGTGGTA ACAGGGGATAAAGCAGTTAACATATACACCTCATCCCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTC CCAAATATGCCCAAGGACAAAGAGGCATGTGCAAAAGCCCCATTGGAGGCTTACAACAGGACACT GACTACTTTGCTTACCCCCCTTGGTGATTCTATCCGCAGGATACAAGAGTCTGTGACTACATCCGGA GGAAGGAGACAGAGACGCTTTATAGGTGCCATTATTGGCAGTGT >gb|HQ266605.1|:148- 1809_Newcastle_disease_virus_strain_MG_39_4_08_fusion_protein_(F)_gene_complete_cds_and_hemagglutin in-neuraminidase_protein_(HN)_gene_partial_cds ATGGGCTCTCAATCTTCTACTTGGATCCCGATATTTCCAATGCCGACCATCCTAATTGCATTGGCAC TGGGCTGTGTCCGTTCGACAAGCTCTCTTGATGGCAGGCCGCTTGCAGCTGCGGGGATCGTGGTAA CGGGAGATAAAGCAGTCAACATATACACCTCATCCCAGACAGGATCAATTATAATCAAGTTACTCC CAAACATGCCCAAAGATAGAGAGGCATGCGCAAAATCCCCAGTAGAAGCATACAATCGGACACTG ACTACTCTGCTCACCCCCCTTGGCGATTCTATCCGTAGGATACAAGAGTCTGCGACTATCTCCGAAG GAAGGAGGCGGAGACGCTTTGTAGGTGCCATCATAGGCAGTGT >gb|HQ266602.1|:4493-6154_Newcastle_disease_virus_strain_MG_725_08_complete_genome ATGGGCTCTAAATCTTCTACTTGGATCCCGATATCTCCAATGCCGACCATCCTAATTGCATTGGCAT TGGGCTGTGTCCGTTTGACAAGCTCTCTCGATGGCAGGCCGCTTGCAGCTGCGGGGATCGTGGTGA CGGGAGATAAAGCAGTCAACATATACACCTCATCCCAGACAGGATCAATCATAGTCAAGTTACTCC CGAATATGCCCAAAGATAAAGAGGCGTGCGCAAAAGCCCCAGTGGAGGCATACAATCGGACACTG ACTACTCTGCTCACCCCCCTTGGCGATTCTATCCGTAGGATACAAGAGTCTGCGACTACCTCTGGAG GAAGGAGGCGGAGACGCTTTGTAGGTGCCATCATCGGCAGTGT

Annexes

ANNEXE 9: Fiche d’enquete utilisée sur le terrain. Fiche d’enquête n° 1 : destinée aux villageois résidant dans le district de Fandriana. EVALUATION DE LA CONNAISSANCE DE LA MN PAR LES VILLAGEOIS DE DISTRICT DE FANDRIANA. Fiche de collecte des données n°………….. . Date : . Nom du quartier : . FKT : . Commune : . Nom de l’enquêté : Est-ce qu‟il y a des éleveurs dans votre entourage ? Oui Non

Si la réponse est non, l‟enquête est arrêtée Connaissez-vous leur nombre ?

Oui Non

Si oui, combien sont-ils ?

[1-5] [6-10] Plus de 10

Est-ce que vous avez remarqué une quelconque maladie frappant les volailles de ces éleveurs ?

Oui Non

Si la réponse est non, l‟enquête est arrêtée ?

Annexes

Quelles sont les symptômes que vous avez vus ?

Prostration Paralysie des membres Torticolis Diarrhée verdâtre Manque d‟appétit Autres

Est-ce que cette maladie survienne d‟habitude ?

Oui

Non

Si oui, Combien de fois dans une année et dans quelle période ?

Une seule fois Deux fois Plus de deux fois

Automne Été Hiver

Comment s‟appelle cette maladie chez vous ?

Est-ce vous tous appellent cette maladie comme ça ?

Oui Non

Si non, lequel est l‟autre appellation. ?

VII

Annexes

Fiche d’enquête n° 2 : destinée aux aviculteurs seulement. CONNAISSANCE DE L’AVICULTURE ET RECHERCHE DES CAS CLINIQUE DE LA MN. Fiche de collecte des données n°………….. . Date : . Nom du quartier : . FKT : . Commune : . Nom de l’enquêté : Informations concernant l’animal : De quelle race de volaille élevez-vous ? Race locale (race gasy) Race améliorée (race importée)

Quelles nourritures donnez-vous aux volailles ?

Provende Riz Mais Autres Rien

Où laissez-vous les volailles le jour ? Rester dans leur cage Errant dans la cour Dans les rizières

Et la nuit ? Dans leur cage Autres

Est-ce que vous les avez vaccinées ? Oui

Non

VIII

Annexes

Si oui, à quelle période ?

Quel est le nom du vaccin ?

Donnez-vous des pilules contre les ascaris (odin-kakana) aux volailles ?

Oui

Non

Si oui, lesquelles ?

Combien de volailles élevez- vous ?

Moins de 10 Plus de 10 Plus de 20

Est-ce qu‟elles sont toutes de même race ?

Oui

Non

Si oui, Lequel ? Si non, lesquels ?

Poulets Pintade Oies Canards Dindes

Annexes

Est-ce que les volailles sont toujours en bonne santé ?

Oui Non

Si non, quelle maladie frappe souvent vos volailles ?

Est-ce que vous avez des volailles malades maintenant ?

Oui

Non

Si la réponse est non, l‟enquête est arrêtée ? Combien sont-ils ?

Moins de cinq

Plus de cinq

Plus de dix Toutes les volailles

Pouvez-vous nous montré ces volailles malades ?

Oui

Non

Si la réponse est oui l‟enquête se poursuit. Combiens de mois sont ces volailles ?

[1jour-30jours]

[1mois-4mois]

Plus de quatre mois Inconnu

Annexes

Quels symptômes trouvez-vous dans ces volailles ?

Prostration Paralysie des membres Torticolis Diarrhée verdâtre Manque d‟appétit Autres

Est-ce que cette maladie frappe souvent vos volailles ?

Oui

Non

Si oui, combien de fois dans une année et dans quelle période ? Une seule fois Deux fois Plus de deux fois Pendant toute l‟année

Automne Été Hiver

Est-ce que cette maladie est contagieuse ?

Oui

Non

Est-ce que les volailles infectées sont toutes morts ?

Oui

Non XI

Annexes

Si oui, dans quel jour de l‟infection ?

Moins de deux jours Plus de deux jours Plus d‟une semaine

Si non, combien sont sorties vivantes ?

Moindre Beaucoup Tous

Comment s‟appelle cette maladie chez vous ?

Réponse

Est-ce vous tous appellent cette maladie comme ça ?

Oui Non

Si non, quelle est l‟autre appellation. ?

XII

Annexes

ANNEXE 10 : Appareils utilisés en biologie moléculaire.

Centrifugeuse PCR Micro ONE ® Centrifugeuse (SIGMA®) Centrifugeuse (SIGMA 113®)

Thermoshaker (confort ®) Heidolph Top Mix 94323® Balance de précision (Sartoruis ®)

Appareil de photographie du gel (Transillumination, BIORad ®)

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Annexes

Hotte à flux laminaire (MSC II NF II®) Hotte PCR Filtre HEPA (captair ®Bio)

XIV

ABSTRACT Nom : RAZAFINDRAFARA Prénoms : Mirantsoa Suzanne Spécialité : Biochimie Fondamentale et Appliquée aux Sciences Médicales Titre : Virus de la Maladie de Newcastle (APMV-1) circulant dans le district de Fandriana. Newcastle disease (ND) is the main obstacle of village poultry in Madagascar. It is an infectious disease of domestic and wild poultry caused by a virulent form of avian paramyxovirus type 1 (APMV-1). APMV-1 is phylogenetically classified into two classes (I and II). The strains responsible for outbreaks of ND generally belong to the class II which is further subdivided into five different genotypes (I to XV). In Madagascar, studies conducted in the highlands reveal the movement of the NDV strains belonging to the XI genotype. However, no study on APMV-1 has been undertaken in the area of Amoron'i Mania. Thus our study has set three different objectives: to assess the knowledge of the Newcastle disease farmers in the district of Fandriana, a district belonging to the region of Amoron'i mania, diagnose the presence of Newcastle disease in this district and characterized by molecular biology circulating strains. A survey of villagers followed by samples of samples, in case of suspicion of MN, was carried out in public Alakamisy Ambohimahazo and Mahazoarivo two communes Fandriana District. Statistical analysis of the collected data was made with the Microsoft office Excel 2007 software. Subsequently, a molecular analysis (RT-PCR real time, viral isolation, conventional PCR) to diagnose the APMV-1 was carried out on samples collected from the field. The uncompleted sequencing deflected the final objective of our study to a prediction of genotypes circulating in the district. During the investigation, 38 poultry farmers (100%) confirmed the annual appearance of a very deadly avian disease that extends from May to November. 47% (18/38) reported a peak of the disease in October. Poultry farmers call this disease by two common names, "boarika" and "ramoletak'akoho". Molecular analysis of samples confirms that the disease evoked by poultry farmers ("boarika" and "ramoletak'akoho") corresponds to the MN. Indeed, the six samples obtained during the investigation are positive in APMV-1 by both technical: virus isolation and RT-PCR real time. By phylogenetic analysis on a few sequences XI genotypes and genotype IV, three possible hypotheses concerning the genotypes circulating strains in Fandriana district have been proposed: the strains belong to genotype XI, or are genetically less evolved than the genotype XI, or they are more advanced than the XI genotype. This study showed that the ND virus actually circulating in the district Fandriana. This viral disease is responsible for the deadly outbreak in poultry that appeared each year in this area. Keys words : Newcastle disease, Avian paramyxivirus-1, QRT-PCR, isolement viral, enquête, génotype et analyse phylogénétique. Encadreurs : Professeur ANDRIANTSIMAHAVANDY A. Abel Docteur MAMINIAINA Olivier Fridolin Laboratoire :Virology and Molecular biology FOFIFA-Département de Recherche Zootechniques et vétérinaires (DRZV)

RESUME Nom : RAZAFINDRAFARA Prénoms : Mirantsoa Suzanne Spécialité : Biochimie Fondamentale et Appliquée aux Sciences Médicales Titre : Virus de la Maladie de Newcastle (APMV-1) circulant dans le district de Fandriana. La maladie de Newcastle(MN) est le principal obstacle de l‟aviculture villageoise à Madagascar. Il s‟agit d‟une maladie infectieuse des volailles domestiques et sauvages causée par une forme virulente de Paramyxovirus aviaires type 1 (APMV-1). Les APMV-1 sont classifiés phylogénétiquement en deux classes (I et II). Les souches responsables des épizooties de la MN, en général, appartiennent à la classe II qui est encore subdivisée en quinze génotypes différents (I à XV). À Madagascar, les études effectuées sur les hautes terres révèlent la circulation des souches du virus de la MN (APMV-1) appartenant au génotype XI. Cependant, aucune étude sur les APMV-1 n‟a été entreprise dans la région d‟Amoron‟i Mania. Ainsi notre étude s‟est fixée trois objectifs différents : évaluer la connaissance des éleveurs de la MN dans le district de Fandriana, un district appartenant à la région d‟Amoron‟i mania, identifier la circulation du virus de la MN dans ce district et caractériser par la biologie moléculaire les souches circulantes. Une enquête auprès des villageois suivie par des prélèvements des échantillons, en cas de suspicion de la MN, a été réalisée dans les communes d‟Alakamisy Ambohimahazo et de Mahazoarivo, deux communes du district de Fandriana. L‟analyse statistique des données collectées a été faite avec Microsoft office Excel 2007. Par la suite, une analyse moléculaire (RT-PCR en temps réel, isolement viral, PCR conventionnelle) pour diagnostiquer l‟APMV-1 a été effectuée sur les échantillons collectés du terrain. L‟inachèvement du séquençage a dévié le dernier objectif de notre étude vers une prédiction des génotypes circulants dans ce district. Pendant l‟enquête, 38 aviculteurs (100%) ont confirmé l‟apparition annuelle d‟une maladie aviaire très meurtrière qui s‟étend du mois de mai au mois de novembre. 47% (18/38) ont noté un pic de cette maladie au mois d‟octobre. Les aviculteurs appellent cette maladie par deux noms vernaculaires, « boarika » et « ramoletak’akoho ». L‟analyse moléculaire des échantillons confirme bien que la maladie évoquée par les aviculteurs (« boarika » et « ramoletak’akoho ») correspond bien à la MN. En effet, les six prélèvements obtenus lors de l‟enquête sont positifs en APMV-1 tant par l‟isolement viral que par RT-PCR. Par l‟analyse phylogénétique sur quelques séquences du génotypes XI et génotype IV, trois hypothèses possibles concernant les génotypes des souches circulantes dans le district de Fandriana ont été proposées : les souches appartiennent au génotype XI, ou elles sont génétiquement moins évoluées que le génotype XI, ou encore elles sont plus évoluées que le génotype XI. Cette étude a montré que le virus de la MN circule réellement dans le district de Fandriana. Cette maladie virale est responsable de l‟épizootie meurtrière des volailles qui est apparue chaque année dans cette zone.

Mots clés : Maladie de Newcastle, Avian paramyxovirus aviaire -1, QRT-PCR, isolement viral, enquête, génotype et analyse phylogénétique. Encadreurs : Professeur ANDRIATSIMAHAVANDY A. Abel Docteur MAMINIAINA Olivier Fridolin Laboratoire : Virologie et Biologie moléculaire FOFIFA-Département de Recherche Zootechniques et vétérinaires (DRZV) Rue Farafaty-Ampandrianomby BP 04-Antananarivo