TÜRK ĐYE CUMHUR ĐYET Đ ANKARA ÜN ĐVERS ĐTES Đ SA ĞLIK B ĐLĐMLER Đ ENST ĐTÜSÜ
ESTRAD ĐOL VALERAT VE D ĐENOGEST’ ĐN FARMASÖT ĐK
PREPARATLARDA AYNI ANDA M ĐKTAR TAY ĐNLER Đ
Mehmet Gökhan ÇA ĞLAYAN
ANAL ĐTĐK K ĐMYA ANAB ĐLĐM DALI YÜKSEK L ĐSANS TEZ Đ
DANI MAN Prof. Dr. Feyyaz ONUR
2009- ANKARA
TÜRK ĐYE CUMHUR ĐYET Đ ANKARA ÜN ĐVERS ĐTES Đ SA ĞLIK B ĐLĐMLER Đ ENST ĐTÜSÜ
ESTRAD ĐOL VALERAT VE D ĐENOGEST’ ĐN FARMASÖT ĐK PREPARATLARDA AYNI ANDA M ĐKTAR TAY ĐNLER Đ
Mehmet Gökhan ÇA ĞLAYAN
ANAL ĐTĐK K ĐMYA ANAB ĐLĐM DALI YÜKSEK L ĐSANS TEZ Đ
DANI MAN Prof. Dr. Feyyaz ONUR
2009 ANKARA
ii
Ankara Üniversitesi Sa ğlık Bilimleri Enstitüsü
Analitik Kimya Yüksek Lisans Programı
Çerçevesinde yürütülmü olan bu çalı ma a ağıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmi tir.
Tez Savunma Tarihi : 03/07/2009
Prof. Dr. Feyyaz ONUR Ankara Üniversitesi Jüri Ba kanı
Prof. Dr. Nilgün GÜNDEN GÖ ĞER Prof. Dr. Sibel A. ÖZKAN Gazi Üniversitesi Ankara Üniversitesi
Doç. Dr. Uğur TAMER Doç. Dr. Bengi USLU Gazi Üniversitesi Ankara Üniversitesi
iii
ĐÇĐNDEK ĐLER Kabul ve Onay ii
Đçindekiler iii
Önsöz vii
Simgeler ve Kısaltmalar viii
ekiller x
Çizelgeler xii
1. G ĐRĐ 1
1.1. Giri ve Amaç 1
1.2. Kimyasal ve Fiziksel Özellikler 3
1.2.1. Estradiol Valerat 3
1.2.2. Dienogest 7
1.3. Türkiye’de Dienogest Đçeren Ticari Preparat 10
1.4. Türkiye’de Dienogest ve Estradiol Valerat Đçeren Preparat 10 (CLIMODIEN ®) ile Đlgili Bilgiler
1.5. Dünyada Dienogest Đçeren Ticari Preparatlar 12
1.6. Türkiye’de Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar 13
1.7. Dünyada Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar 14
1.8. Üzerinde Çalı ma Yapılan Etken Maddelerin Miktar Tayinleri 31 Konusunda Günümüze Kadar Yapılmı Çalı malar
1.8.1. Estradiol Valerat Miktar Tayini Đçin Yapılmı Çalı malar 31
1.8.1.1. Spektrofotometrik Yöntemler 31
1.8.1.2. Kromatografik Yöntemler 32
1.8.1.3. Voltametrik Yöntemler 34
1.8.1.4. Kapiler Elektroforez 34 iv
1.8.2. Dienogest Miktar Tayini Đçin Yapılmı Çalı malar 35
1.8.2.1. Radyoimmunoassay 35
1.8.2.2. Kromatografik Yöntemler 36
2. GEREÇ ve YÖNTEM 37
2.1. Kullanılan Yöntemler 37
2.1.1. Türev Spektrofotometri 37
2.1.2. Kemometrik Yöntemler 43
2.1.2.1. Temel Bile en Regresyon Yöntemi ve Kısmi En Küçük Kareler 45 Yöntemi
2.1.2.2. Đstatistiksel De ğerlendirme 48
2.1.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi 50
2.1.3.1. Sistem Uygunluk Testleri 60
2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Orijinleri 66
2.3. Kullanılan Cihazlar 66
2.4. Kullanılan Bilgisayar Programları 66
2.5. Kullanılan Bilgisayar Konfigürasyonu 67
2.6. Üzerinde Çalı ma Yapılan Farmasötik Preparat 67
2.7. Standart Maddelerin Stok Çözeltileri 67
2.7.1. Türev Spektrofotometride 67
2.7.2. Kemometrik Yöntemlerde 67
2.7.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinde 68
3. BULGULAR 69
3.1. Kullandı ğımız Etken Maddelerin Saflık Kontrolleri 69
3.1.1. Dienogest için Saflık Kontrolü 69 v
3.1.2. Estradiol Valerat için Saflık Kontrolü 69
3.2. Kemometrik Tekniklerle Spektroskopik Verilerin De ğerlendirilmesi 74 Yöntemleri ile Elde Edilen Sonuçlar
3.2.1. Kemometrik Çalı malar 74
3.2.2. Dienogest - Estradiol Valerat Karı ımında Dienogest ve Estradiol 75 Valerat’ın, TBR Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde Kullanılması ile Miktar Tayini
3.2.3. Dienogest - Estradiol Valerat Karı ımında Dienogest ve Estradiol 79 Valerat’ın, KEK Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde Kullanılması Đle Miktar Tayini
3.2.4. ANOVA Testi 81
3.2.5. TBR ve KEK Yöntemlerinin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 82
3.2.5.1 Seçicilik 82
3.2.5.2. Farmasötik Preparata Uygulama 85
3.2.6. Kemometrik Yöntemlerle Elde Edilen Sonuçlara Göre TSH, KSH ve 88 THKT De ğerlerinin Hesaplanması
3.2.7. 91
3.3. Türev Spektrofotometri ile Yapılan Miktar Tayini Çalı maları 92
3.3.1. Dienogest – Estradiol Valerat Karı ımında Dienogest ve Estradiol 94 Valerat ’ın Miktar Tayini
3.3.2. 1D Yönteminin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 102
3.3.2.1. Seçicilik 102
3.3.2.2. Farmasötik Preparata Uygulama 104
3.3.2.3. ANOVA Testi 106
3.4. YPSK Đle Yapılan Çalı malar 108
3.4.1. ANOVA Testi 114
3.4.2. YPSK Yönteminin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 114
3.4.2.1 Seçicilik 114 vi
3.4.2.2. Farmasötik Preparata Uygulama 117
4. TARTI MA 119
4.1. Dienogest – Estradiol Valerat Karı ımının Analizi Đçin Yapılan 119 Çalı malar 4.1.1. Kemometrik Yöntemlerin Kullanılı ı 119
4.1.1.1 Temel Bile en Regresyonu (TBR) Yöntemi Kullanılarak Yapılan 119 Çalı malar
4.1.1.2. Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (KEK) ile Yapılan Çalı malar 122
4.1.2. Türev Spektrofotometri ile Yapılan Çalı malar 127
4.1.3. YPSK ile Yapılan Çalı malar 128
4.1.4. 129
4.2. Yöntemlerin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 130
4.3. Geli tirilen Yöntemlerin Birbirleriyle Kar ıla tırılmaları 133
5. SONUÇ ve ÖNER ĐLER 135
ÖZET 136
SUMMARY 138
KAYNAKLAR 140
ÖZGEÇM Đ 145
vii
ÖNSÖZ
Bu tez çalı masında hormon replasman tedavisinde kullanılan, estradiol valerat ve dienogest ikili karı ımını içeren farmasötik preparatlarda aynı anda miktar tayinleri için 1. Türev Spektrofotometri, Temel Bile en Regresonu, Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi yöntemleri geli tirilmi tir .
Yüksek lisans tezimin hazırlanmasında ve Analitik Kimya Anabilim Dalı’ndaki akademik çalı maların sırasında bana her konuda yardımcı olan ve deste ğini esirgemeyen danı man hocam Prof. Dr. Feyyaz ONUR’a te ekkür ediyorum.
Anabilim Dalımız tüm öğretim üyelerine her konuda bana yaptıkları yardımlardan ve anlayı larından dolayı te ekkür ediyorum.
Tezin her a amasında bilgi ve deneyimlerinden yararlandı ğım Ara tırma Görevlisi Dr. Đsmail Murat PALABIYIK’a te ekkür ediyorum.
Tez çalı ması sırasında benden yardımlarını esirgemeyen çalı ma arkada larım Uzman Eczacı Ara tırma Görevlisi Özgür ÜSTÜNDA Ğ, Uzman Eczacı Ara tırma Görevlisi Burcu DO ĞAN TOPAL, Eczacı Burçin BOZAL, Kimyager Elif KARACAN’a te ekkür ediyorum.
Bütün ya antım ve görevim sırasında maddi ve manevi hiçbir fedakarlıktan kaçınmayan, bana her türlü konuda destek olan aileme ve e im Hacer SELAMO ĞLU ÇA ĞLAYAN’a sonsuz te ekkürlerimi sunuyorum.
viii
SĐMGELER ve KISALTMALAR
EV Estradiol Valerat
DNG Dienogest
TBR Temel Bile en Regresyonu (PCR, Principle Component Regression)
TBA Temel Bile en Analizi (PCA, Principal Component Analysis)
YPSK Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)
1D 1. Türev Spektrofotometri (First derivative spectrophotometry)
GC – MS Gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (Gas Chromatography Mass Spectrometry)
TEK Ters En Küçük Kareler (ILS, Invers Least Squares)
KEK Kısmi En Küçük Kareler (PLS, Partial Least Squares)
ĐTK Đnce Tabaka Kromatografisi (TLC, Thin Layer Chromatıgraphy)
SUT Sistem Uygunluk Testleri
YS Yakalama Sınırı (LOD, Limit of Detection)
TAS Tayin Alt Sınırı (LOQ, Limit of Quantitation)
SS Standart Sapma (Standard Deviation)
BSS Ba ğıl Standart Sapma (RSD, Relative Standard Deviation)
GA Güven Aralı ğı
UV Ultraviole
IR Infrared
THKT Tahmin Hatalarının Karelerinin Toplamı (PRESS, Prediction Error Sum of Squares)
KSH Kalibrasyonun Standart Hatası (SEC, Standard Error of Calibration)
TSH Tahminin Standart Hatası (SEP, Standard Error of Prediction)
RMS Karekök Ortalama (Root Mean Squares)
RIA Radyoimmunoassay ix
HRT Hormon Replasman Tedavisi
CA Siproteron Aseatat
MEEKC Microemulsion electrokinetic chromatography
NACE Non-aqueous capillary electrophoresis
UPSK Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC, Ultra performance Liquid Chromatgoraphy
x
EK ĐLLER
ekil 1.1. EV’ın metanol – su (3:1 h/h) karı ımındaki 90 g/mL çözeltisinin UV 4 spektrumu
ekil 1.2. DNG’in metanol – su (3:1 h/h) karı ımındaki 12 g/mL çözeltisinin UV 8 spektrumu
ekil 2.1. Gauss tipindeki bir e ğrinin belirli noktalardaki tanjantları ve kar ılıkları 38
ekil 2.2. Türev e ğrilerinin ekilleri 39
ekil 2.3. Pikten pike ölçüm 41
ekil 2.4. Pikten sıfıra ölçüm 42
ekil 2.5. Te ğet yöntemi ile ölçüm 42
ekil 2.6. Bir YPSK cihazının eması 53
ekil 2.7. Teorik tabaka sayısı hesabını gösterir kromatogram 61
ekil 2.8. Pik asimetri faktörü ve kuyruklanma faktörü hesabını gösterir kromatogram 62
ekil 2.9. Kapasite faktörü hesabını gösterir kromatogram 62
ekil 2.10. Rezolüsyon faktörünün kromatogramlara göre de ği imi 64
ekil 3.1. Metanol-su (3:1) içerisinde 12 µg/mL DNG çözeltisinin UV absorpsiyon 70 spektrumu
ekil 3.2. ’ DNG’in IR spektrumu 71
ekil 3.3. Metanol - su (3:1) içerisinde 120 µg/mL EV çözeltisinin UV absorpsiyon 72 spektrumu
ekil 3.4. EV’ın IR spektrumu 73
ekil 3.5. Metanol - su (3:1) içerisinde a) 120 µg/mL EV, b) 12 µg/mL DNG 74 çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
ekil 3.6. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV, b) 12 g/mL DNG 92 çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
ekil 3.7. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV, b) 12 g/mL DNG 92 çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
xi
ekil 3.8. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV, b) 12 g/mL DNG 93 çözeltilerinin ikinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
ekil 3.9. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV, b) 12 g/mL DNG 93 çözeltilerinin üçüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
ekil 3.10. Metanol - su (3 : 1) içerisinde 120 g/mL EV ve 12 g/mL DNG 94 çözeltilerinin dördüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
ekil 3.11. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG b) 90 g/mL EV c) 120 95 g/mL EV ve d) 150 g/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
ekil 3.12. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG b) 90 g/mL EV c) 120 95 g/mL EV ve d) 150 g/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktör:30 ∆λ=2 nm)
ekil 3.13. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV b) 8 g/mL DNG c) 12 96 g/mL DNG ve d) 20 g/mL DNG çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
ekil 3.14. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV b) 8 g/mL DNG c) 12 96 g/mL DNG ve d) 20 g/mL DNG çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)
ekil 3.15. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG, 90 g/mL EV b) 12 g/mL 97 DNG, 120 g/mL EV c) 12 g/mL DNG, 150 g/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
ekil 3.16. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG, 90 g/mL EV b) 12 g/mL 97 DNG, 120 g/mL EV c) 12 g/mL DNG, 150 g/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)
ekil 3.17. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 8 g/mL DNG, 120 g/mL EV b) 12 g/mL 98 DNG, 120 g/mL EV c) 20 g/mL DNG, 120 g/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
ekil 3.18. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 8 g/mL DNG, 120 g/mL EV b) 12 g/mL 98 DNG, 120 g/mL EV c) 20 g/mL DNG, 120 g/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)
ekil 3.19. a) DNG (8 g/mL), b) Siproteron asetat (iç standart) (1.25 g/mL) ve c) EV 108 (64 g/mL)’ın geli tirilen YPSK yöntemindeki kromatogramı
ekil 3.20. (a) CLIMODIEN ® draje preparatı a) DNG, b) siproteron asetat (IS) ve c) EV 115 (b) plasebo’nun YPSK kromatogramı
xii
ÇĐZELGELER
Çizelge 1.1. Dünyada DNG içeren ticari preparatlar, bile imleri ve ülkeleri 12
Çizelge 1.2. Dünyada EV içeren kombine ticari preparatlar, bile imleri ve ülkeleri 14
Çizelge 1.3. Dünyada sadece EV içeren ticari preparatlar 28
Çizelge 3.1. DNG ve EV için TBR ve KEK yönteminde kullanılan kalibrasyon seti 77
Çizelge 3.2. DNG ve EV’ın standart karı ımları için TBR yöntemiyle elde edilen 78 ortalama % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.3. DNG ve EV’ın standart karı ımları için KEK yöntemiyle elde edilen 80 ortalama % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.4. Preparatlara standart ilavesinden sonra TBR yöntemi ile hesaplanan DNG 83 ve EV miktarları
Çizelge 3.5. Preparatlara standart ilavesinden sonra KEK yöntemi ile hesaplanan DNG 84 ve EV miktarları
Çizelge 3.6. CLIMODIEN ® (71112 E) preparatına TBR yöntemi uygulandı ğında DNG 86 ve EV için elde edilen sonuçlar (preparatın üzerinde yazılı miktar:2 mg DNG + 2 mg EV/draje)
Çizelge 3.7. CLIMODIEN ® (71112 E) preparatına KEK yöntemi uygulandı ğında DNG 87 ve EV için elde edilen sonuçlar (2 mg DNG + 2 mg EV/draje)
Çizelge 3.8. DNG + EV karı ımı analizinde uygulanan TBR yöntemindeki parametreler 90
Çizelge 3.9. DNG + EV karı ımı analizinde uygulanan KEK yöntemindeki 90 parametreler
Çizelge 3.10. DNG’in standart karı ımları için farklı dalga boylarında 1. türev 99 spektrofotometri yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.11. DNG ve EV’ın standart karı ımları için 1.türev spektrofotometri 101 yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.12. Preparatlara standart ilavesinden sonra 1.türev spektrofotometri ile 103 hesaplanan DNG ve EV miktarları
Çizelge 3.13. CLIMODIEN ® (71112 E) preparatına 1.türev spektrofotometri yöntemi 105 uygulandı ğında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar (preparat üzerinde yazılı miktar; 2 mg DNG + 2 mg EV/draje) xiii
Çizelge 3.14. Önerilen yöntemler için DNG + EV karı ımlarında ANOVA testi sonuçları 107
Çizelge 3.15. Kromatografik ko ullar optimize edildi ğinde EV ve DNG için elde edilen 110 validasyon parametreleri
Çizelge 3.16. DNG ve EV için geli tirilen YPSK yönteminde sistem 111 uygunluk testi sonuçları
Çizelge 3.17. Sentetik karı ımlara YPSK yöntemi uygulandı ğında elde edilen ortalama 113 % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.18. Preparata standart ilavesinden sonra YPSK yöntemi ile hesaplanan DNG 116 ve EV miktarları
Çizelge 3.19. CLIMODIEN ® (71112E) preparatına YPSK yöntemi uygulandı ğında DNG 118 ve EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde yazılı olan miktar: 2 mg DNG + 2 mg EV/ draje )
Çizelge 4.1. TBR ve KEK yöntemlerinde bulunan TSH, KSH, THKT ve r de ğerleri 125
Çizelge 4.2. Sentetik karı ımlara geli tirilen yöntemler uygulandı ğında elde edilen 126 validasyon parametreleri
Çizelge 4.3. CLIMODIEN ® (71112E) preparatına geli tirilen yöntemler 132 uygulandı ğında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde yazılı olan miktarlar : 2 mg DNG + 2 mg EV/draje ) 1
1. GĐRĐ
1.1. GĐRĐ VE AMAÇ
Estradiol valerat ( EV ) menopoz sonrası hormon tedavisinde kullanılan ve klimakterik yakınmaları etkin bir ekilde tedavi eden bir ilaçtır. Dienogest ( DNG ) ise endometrial hiperplazi geli imini engeller; kanamanın azalmasına ve olguların ço ğunda giderek kesilme ile sonuçlanan endometrium atrofisine yol açar. EV + DNG kombinasyonu ise en az bir yıllık menopoz geçmi i olan kadınların menopoza ba ğlı östrojen yetmezli ğinin belirti ve semptomları için hormon replasman tedavisinde kullanılır.
Türkiye ilaç piyasasında, EV + DNG içeren bir adet draje preparatı, EV + siproteron asetat kombinasyonunu içeren bir adet draje preparatı, EV + norgestrel içeren bir adet draje preparatı, EV + hidroksiprogesteron kapronat içeren bir adet ampul preparatı ve EV + medroksiprogesteron asetat içeren iki adet tablet preparatı bulunmaktadır.
Bu ilaçlar içinde bir adet draje preparatı içerisinde karı ım halinde birlikte yer alan EV ve DNG ’nin aynı anda miktar tayinleri için, rutin analizlerde kullanılabilecek kolay, hızlı ve duyarlı analiz yöntemleri geli tirmek tez çalı masının temel amacı ve ba lı ğı olarak seçilmi tir. Türkiye dı ında ondört ülkede (Portekiz, Đspanya, Almanya, Avusturya, Norveç, Đsveç, Belçika, Danimarka, Yunanistan, Rusya, Đspanya, Fransa, Çek Cumhuriyeti, Macaristan) EV + DNG kombinasyonunu içeren be adet preparat vardır (Climodiene, Klimodien, Mevaren, Climodien, Lafamme) ve bu nedenle geli tirilecek yöntemlerin geni bir alanda ilaç analizlerinde kullanımı sa ğlanmı olacaktır.
Yapılan literatür çalı malarında EV ve DNG ’nin farmasötik preparatlarda tek ba larına veya ba ka etken maddeler ile birlikteyken çe itli yöntemlerle miktar tayinlerinin yapıldı ğı anla ılmı tır. EV + DNG karı ımı içeren preparatın verilmesi sonucunda deneklerin kan plazmasında miktar tayinlerinin farmakokinetik amaçlı çalı malarda EV nin gaz kromatografi, DNG nin ise radyoimmunoassay yöntemiyle yapıldı ğı gözlenmi tir (ZIMMERMANN VE ARK. 2000). 2
Daha önce yapılmı olan tüm çalı malar gözden geçirildi ğinde yukarıda bahsedilen ve plazmada yapılan çalı ma haricinde EV ve DNG ’in bir arada bulunuyorken aynı anda miktar tayinleri için geli tirilmi herhangi bir yöntemin bulunmadı ğı gözlenmi tir. Dolayısıyla bu konuda yapılacak çalı malar tamamen orijinal olacaktır. Bu amaçla yeni spektrofotometrik ve yüksek performanslı sıvı kromatografik yöntemler geli tirerek herhangi bir ön i leme gerek duymaksızın EV ve DNG ’nin farmasötik preparatlarda aynı anda miktar tayinlerinin yapılabilmesini ve bu yöntemlerin rutin analizlerde kullanabilirli ğini sa ğlamak tezimizin amacı olarak belirlenmi tir.
Bu yüksek lisans tezi kapsamında yukarıda belirtilen amaca ula abilmek için ikili karı ım halinde bulunan EV ve DNG ’in aynı anda miktar tayinlerinin yapılabilmesi için öncelikle spektrofotometrik analizler temel alınmı ve gerek ölçülen absorbans de ğerlerini kemometrik teknikler ile de ğerlendirerek ve gerekse de türev spektrofotometri yardımıyla karı ım içerisindeki bu iki etken maddenin hiçbir ayırma i lemine ihtiyaç duymadan miktar tayinlerinin yapılabilmesi için yöntemler geli tirilmesi amaçlanmı tır. Kemometrik teknikler olarak temel bile en regresyonu (TBR) ve kısmi en küçük kareler (KEK) tekniklerinin uygulanması planlanmı tır. Ayrıca hem aynı anda miktar tayinlerinin gerçekle tirilebilmesi hem de elde edilen sonuçların kar ıla tırılması için yeni bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK) yöntemi geli tirilmesi de amaçlanmı tır. Ardından, geli tirilen tüm yöntemlerin EV + DNG ikili karı ımını içeren farmasötik preparatlara uygulamasının sa ğlanması ve onların rutin analizlerinde kullanılabilir hale getirilmesi yine tezimizin amaçları arasındadır.
3
1.2. Kimyasal ve Fiziksel Özellikler
1.2.1. Estradiol valerat
Formül :
O O CH3
CH3 H
H H
HO
Kapalı formül : C23 H32 O3
Kimyasal yapısı : Estra-1,3,5(10)-trien-3,17-diol (17 β)-, 17-pentanoat
Fiziksel özellikleri:
Estradiol valerat beyaz renkte toz kristallerdir. Pratik olarak suda çözünmez. Etil alkol, aseton ve kloroformda iyi çözünürken, bitkisel ya ğda dü ük çözünürlü ğe sahiptir. Ağzı kapalı ve ı ık geçirmez kaplarda saklanır. Molekül a ğırlı ğı 356.51 g dır. Erime noktası aralı ğı 143–150 0C’dir.
UV spektrumu:
EV ’ın metanol - su (3:1 h/h) karı ımındaki çözeltisinin UV spektrumunda 278.8 nm’de bir maksimum ve 285,4 nm’de bir omuz görülür. 90 g/ml EV çözeltisinin 278.8 nm’deki absorbansı 0.476’dir ( ekil 1.1).
4
ekil.1.1. EV ’ın metanol – su (3:1, h/h) karı ımındaki 90 g/mL çözeltisinin UV spektrumu.
Genel Farmakolojik Etkisi :
Menopoz sonrası için hormon replasman tedavisi (HRT) sa ğlar.
Tanım :
Estradiol valerat (EV) menopoz sonrası için hormon HRT sa ğlar ve klimakterik yakınmaları etkin bir ekilde tedavi eder (klimakterik yakınmalar; sıcak basması, terleme, uyku bozuklukları, sinirlilik, irritabilite, ba dönmesi, ba a ğrısı gibi mental ve vejetatif semptomlar; üriner inkontinans, vajinal kuruluk ve yanma, disparöni gibi genitoüriner sistemin deri ve müköz membranlarının dejeneratif semptomları). Di ğer estrojenler gibi intramüsküler yoldan uygulanabildi ği gibi oral yoldan tablet formunda da kullanılabilir.
Farmakolojik etkileri :
EV ve DNG kombinasyonunda; EV, estrojen yetmezli ği nedeniyle olu an postmenopozal kemik kaybını engeller. Bu etki esas olarak osteoklast fonksiyonunun inhibisyonu ile kemik remodelling sürecinin kemik formasyonu yönüne çekilmesine 5
ba ğlıdır. EV’ın bu etkisi alkalen fosfataz ile piridinolin ve dezoksipiridinolin çapraz ba ğları gibi kemi ğe özgü belirteçlerle gösterilmi tir
Endikasyonları :
Atrofik vajinit, hipogonadizm, menopoz semptomları, oforektomi, osteoporoz profilaksisi, over yetmezli ği, prostat kanseri, sıcak basması gibi semptomların giderilmesinde kullanılır.
Kontrendikasyonları :
Astım, cerrahi, çocuklar, depresyon, diyabet (diabetes mellitus), endometrium hiperplazisi, endometrium karsinomu, endometriyoz, epilepsi hastalı ğı, gebelik, hepatik hastalık, hepatoselüler karsinom, hiperkalsemi, hiperkolesterolemi, hiperlipoproteinemi, hipertansiyon, intravenöz uygulama, kalp hastalı ğı, kontakt lensler, koroner arter hastalı ğı, meme hastalı ğı, migren, over kanseri, pankreatit, porfiri, renal hastalık, safra kesesi hastalı ğı, sarılık, serebrovasküler hastalık, serviks karsinomu, strok, süt verme (emzirme), tromboembolik hastalık, tromboflebit, tütün içme, uterus karsinomu, uterus leyomiyomu (fibroid), vajinal kanama, vajinal karsinom ve yeni do ğanlarda kullanılmamalıdır.
Yan etkileri :
Abdominal (epigastrik) a ğrı, akne, alopesi (saç dökülmesi), amenore, anksiyete, anoreksi, ara kanama, ba a ğrısı, biliyer tıkanma, bulantı/kusma, depresyon, dı gebelik (ektopik gebelik), diplopi, dismenore, diyare, endometrium karsinomu, enjeksiyon yeri reaksiyonu, ertiem, eritema nodosum, fatig, fotosensitivite, galaktore, hepatik enzim düzeylerinde yükselme, hepatit, hepatoma, hiperglisemi, hipertansiyon, jinekomasti, jinjivit, kandidiyazis, ka ıntı (pruritus), keratokonüs, kilo alma, kolelityaz (safra ta ı olu umu), kolesistit (safra kesesi iltihabı), kolestraz, libido artı ı, libido azalması, makülopapüler döküntü, mastalji (meme a ğrısı), melazma, meme akıntısı, meme kanseri, memelerde büyüme, memelerde duyarlılık, menoraji, miyokard infarktüsü, oprik nörit, over kanseri, ödem, pankreatit, peliosis hepatis, pulmoner embolizm, retinal tromboz, ruhsal labilite, sarılık, servikal displazi, servikal karsinom, servisit (serviks uteri iltihabı), 6
sıvı retansiyonu, strok, teratojenez, tromboembolizm, tromboz, uykusuzluk (insomnia), ürtiker, vajinal kanama, vajinit
Saklama ko ulları :
EV, 15-30 oC arasındaki kontrollü oda sıcaklı ğında ve hava geçirmeyen kaplarda saklanmalıdır. I ıktan korunmalıdır.
7
1.2.2. Dienogest
Formül :
OH CH3 N
H
H
O
Kapalı formül : C20 H25 NO 2
Kimyasal yapısı : 17 α-Siyanometil-17 β-hidroksiestra-4, 9-dien-3-on
Fiziksel özellikleri :
DNG beyaz renkte ve kokusuz bir tozdur. Suda çözünmez, etanol ve asetonitrilde çözünür. Spesifik rotasyonu 290 o’dir. Molekül a ğırlı ğı 311.42 gramdır. Ağzı kapalı ve ı ık geçirmez kaplarda saklanır. Erime noktası 204 – 214 oC aralı ğındadır
UV spektrumu :
DNG ’in metanol - su (3:1, h/h) karı ımındaki çözeltisinin UV spektrumunda, 308.2 ve 216.0 nm’lerde maksimum görülür. 12 g/ml DNG çözeltisinin 308.2 nm’deki absorbans de ğeri 0.759’dur ( ekil 1.2). 8
ekil.1.2. DNG ’in metanol – su (3:1, h/h) karı ımındaki 12 g/mL çözeltisinin UV spektrumu
Genel Farmakolojik Etkisi :
Dienogest oral yoldan kullanılan güçlü bir sentetik projestindir.
Tanım :
Dienogest HRT için kullanılan bir estrojen-projestin kombinasyonunun bile imine girer. 19-nortestosteronun bir türevidir, ancak on yedinci karbonda alkil grubu yerine, maddeye e siz farmasötik profilini kazandıran siyanometil grubu içerir. Maddenin farmakokinetik özellikleri tekrarlanan dozlarda birikme olmadan ilacın oral uygulamasını sa ğlar.
Farmakolojik etkileri:
HRT’ndeki estrojen-projestin formülasyonuna dienogest eklenmesi endometrial hiperplazi geli imini engeller, kanamanın azalmasına ve olguların ço ğunda giderek kesilmesiyle sonuçlanan endometrium atrofisine yol açar. Endometriyum üzerindeki etkisinin gücü, projestin potansiyelinin di ğer herhangi 9
projestinden dört kat daha büyük olmasında görülür. Globuline bağlı sex hormonuna ba ğlanmaz, bu özellik dienogestin serbest serum seviyelerini yüksek, serbest testesteron seviyelerini dü ük tutar. Dienogestin güçlü in vivo projestojenik etkisi, oral alımı takiben, %10’u serbest steorid olmak üzere serumdaki yüksek konsantrasyonu ile açıklanabilir. Dienogestin etki mekanizmasının in vitro olarak sitokrom P 450 inhibisyonu ile ilgisi yoktur, dolayısıyla dienogestin bu düzeyde di ğer ilaçlarla etkile imi beklenmez.
Endikasyonları:
Endometriyozis
Kontrendikasyonları :
Hepatik hastalık, hepatoselüler karsinom, hipertrigliseridemi, meme kanseri, tromboembolik hastalık, trombositoz, vajinal kanama, hamilelerde ve emziren bayanlarda kullanılmamalıdır.
Yan etkileri :
Dienogestin yan etkileri di ğer progestojenlerden beklenilen yan etkiler gibidir. Bunlar; kilo alma, kan basıncının artı ı, gö ğüs duyarlılı ğı, mide bulantısı gibi etkileri içerir. Diernogestin herhangi bir androjen yan etkisine rastlanmamı tır. Ayrıca metabolik ve lipit hemostatik parametreler üzerinde çok az etkisi vardır.
Saklama ko ulları :
Oda sıcaklı ğında, ağzı kapalı ve ı ık geçirmez kaplarda saklanmalıdır.
10
1.3. Türkiye’de Dienogest Đçeren Preparat
CLIMODIEN ® draje (Schering) Estradiol valerat ...... 2 mg Dienogest ...... 2 mg / draje
1.4. Türkiye’de Dienogest ve Estradiol Valerat Đçeren Preparat (CLIMODIEN ® Draje) Đle Đlgili Bilgiler
Farmakolojik etkileri :
Climodien 17 β- estradiol’ün ön maddesi olan, estradiol valerat ve sentetik progestagen olarak dienogest içerir. Bu preparattaki estradiol menopoz sonrası için hormon replasman tedavisi (HRT) sa ğlar ve klimakterik yakınmaları etkin bir ekilde tedavi eder (sıcak basması, terleme, uyku bozuklukları, sinirlilik, irritabilite, ba dönmesi, ba a ğrısı gibi mental ve vejetatif semptomlar; üriner inkontinans, vaginal kuruluk ve yanma, disparoni gibi genitoüriner sistemin deri ve müköz membranlarının dejeneratif semptomları). Formülasyona sürekli dienogest eklenmesi endometriyal hiperplazi geli imini engeller, kanamanın azalmasına ve olguların ço ğunda giderek kesilmesiyle sonuçlanan endometriyum atrofisine yol açar.
Kullanılırken dikkat edilmesi gereken noktalar :
A ağıdaki ko ullardan herhangi birinin varlı ğında HRT’ye ba lanmamalıdır. HRT kullanımı sırasında bu ko ullardan herhangi birinin ortaya çıkması durumunda tedavi derhal kesilmelidir: − Gebelik ve laktasyon − Tanı konmamı vaginal kanama − Bilinen ya da üphelenilen meme kanseri − Bilinen ya da üphelenilen premalign durumlar ya da seks steroidlerinden etkilenen maligniteler − Karaci ğer tümörü varlı ğı ya da öyküsü (benign ve malign) 11
− A ğır karaci ğer hastalı ğı − Akut arteriyel tromboembolizm (örn. miyokard infarktüsü, inme) − Aktif derin ven trombozu, tromboembolik bozukluklar veya bu durumlarla ilgili kayıtlı öykü − A ğır hipertrigliseridemi − Climodien’in içeri ğindeki bile enlere kar ı bilinen a ırı duyarlılık
Yan etkileri:
Çekilme kanaması, meme duyarlı ğı/a ğrı, endometriyal kalınlıkta artma, vul- vovajinit, bulantı, abdominal a ğrı, diyare, g-GT artı ı, ba a ğrısı, migren, ba dönmesi, yorgunluk, anksiyete, hipertansiyon/a ğırla an hipertansiyon, sıcak basma- ları, vücut ağırlı ğında de ği iklikler, oral kandidiazis görülebilir.
12
1.5. Dünyada Dinogest Đçeren Ticari Preparatlar
Çizelge1.1 Dünyada DNG içeren ticari preparatlar, bile imleri ve ülkeleri
Dienogestin yanındaki Preparatın Adı Ülkesi etken maddeler
Certostat Etinil estradiol Almanya
Climodiene Estradiol valerat Fransa
Çek Cumhuriyeti, Klimodien Estradiol valerat Macaristan
Mevaren Estradiol valerat Đspanya
Portekiz, Đspanya, Almanya, Avusturya, Climodien Estradiol valerat Norveç, Đsveç, Belçika, Danimarka, Yunanistan, Rusya
Çek Cumhuriyeti, Rusya, Jeanine Etinil estradiol Avusturya
Lafamme Estradiol valerat Almanya, Avusturya
Valette Etinil estradiol Almanya, Avusturya
13
1.6. Türkiye’de Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar
1. CL ĐMEN ® Draje (Bayer) Estradiol valerat ………………….…. 2 mg Siproteron asetat ……………….….. 1 mg/draje
2. CYCLO-PROGYNOVA ® Draje (Schering) Estradiol valerat ……………..………. 2 mg Norgestrel …………………………...0.5 mg /draje
3. GRAV ĐBĐNAN ® Steril Ampul (Schering) Estradiol valerat ………………………. 2 mg Hidroksiprogesteron kapronat ……….. 500 mg / 2 mL
4. DĐVĐNA ® Tablet (Abdi Đbrahim) Estradiol valerat ………………………. 2 mg Medroksiprogesteron asetat ………….. 10 mg/tablet
5. DĐVĐTREN TABLET ® Tablet (Abdi Đbrahim) Estradiol valerat ………………………. 2 mg Medroksiprogesteron asetat ………….. 20 mg/tablet
14
1.7. Dünyada Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar
Çizelge1.2 Dünyada EV içeren kombine ticari preparatlar, bile imleri ve ülkeleri
Estradiol valeratın Preparatın Adı yanındaki etken Ülkesi maddeler Testosterone, Ablacton Đtalya, Đspanya Noretindron
Absorlent Plus Noretindron Đspanya
Alüminyum asetat, Acetonel Vaginale Almanya Sülfanilamit
Activella Noretindron ABD
Arjantin, Portekiz, Đspanya, Brezilya, Đtalya, Almanya, Hollanda, Avusturya, Norveç, Đsveç, Đsviçre, Belçika, Çek Cumhuriyeti, Activelle Noretindron Danimarka, Finlandiya, Fransa, Yunanistan, Hong Kong, Đrlanda, Đsrail, Güney Afrika Cumhuriyeti, Singapur, Tayland, Malezya, Macaristan, ili
Agurin Algestone ili
Aknefug Hekzaklorofen Çek Cumhuriyeti
Aknefug-Emulsion Hekzaklorofen Almanya
Prednizolon, Salisilik Đsviçre, Almanya, Çek Alpicot F asit Cumhuriyeti, Macaristan
Anafertin Algestone Meksika
Andro/Fem Testosterone ABD
Androfemon Testosterone Almanya
Arjantin, Holland, Đngiltere, Angeliq Drospirenon Güney Afrika Cumhuriyeti
Atrimon Algestone Arjantin
Auroclim Norgestrel Đspanya 15
Avaden Gestoden Hollanda, Çek Cumhuriyeti
Avadene Gestoden Fransa
Binodian Prasteron Meksika
Biormon Progesteron Đtalya
Ciclocur Norgestrel Arjantin
Cicloprimogyna Norgestrel Brezilya
Ciclovular Algestone Brezilya
Cicnor Algestone Portekiz
Brezilya, Meksika, Yeni Cliane Noretindron Zelanda, ili
Climabelle Norgestrel Avusturya
Climacteron Testosterone Kanada
Climagest Noretindron Đngiltere
Portekiz, Çek Cumhuriyeti, Climara Duo Norgestrel Finlandiya
ClimaraPro Norgestrel ABD
Climaston Didrogesteron Fransa
Đtalya, Portekiz, Đspanya, Almanya, Avusturya, Norveç, Đsviçre, Avustralya, Belçika, Çek Cumhuriyeti, Climen Siproteron Danimarka, Rusya, Güney Afrika Cumhuriyeti, Singapur, Tayland, Malezya, Macaristan
Climen 28 Siproteron Hong Kong
Arjantin, Brezilya, Meksika, Climene Siproteron Hollanda, ili, Fransa
Climesse Noretindron Đngiltere
Portekiz, Đspanya, Almanya, Avusturya, Norveç, Đsveç, Climodien Dienogest Belçika, Danimarka, Yunanistan, Rusya 16
Climodiene Dienogest Fransa
Clionara Noretindron Almanya
Clisin Siproteron Đspanya
Clym-Depositum Testosterone Đtalya
CombiPatch Noretindron ABD
Combiseven Norgestrel Đtalya
Convaden Gestoden Çek Cumhuriyeti
Crinohermal FEM Flupredniden Almanya
Cristerona Progesteron Arjantin
Cyclabil Norgestrel Norveç, Đsveç, Finlandiya
Cyclacur Norgestrel Đtalya, Avusturya, Đsviçre
Cyclocur Norgestrel Hollanda, Beçlika
Cyclofem Medroksiprogesteron ili
Cyclofemina Medroksiprogesteron Meksika, Brezilya
Almanya, Çek Cumhuriyeti, Cyclo-Menorette Estriol, Norgestrel Macaristan
CycloOstrogynal Estriol, Norgestrel Almanya, Çek Cumhuriyeti
CycloPolar Medroksiprogesteron Almanya
Cyclo-Progynon Norgestrel Danimarka
Almanya, Đrlanda, Rusya, Cyclo-Progynova Norgestrel Tayland
Cyclo-Progynova 1 mg Norgestrel Đngiltere
Cyclo-Progynova 2 mg Norgestrel Đngiltere
Damax Progesteron Meksika
Deladumone Testosteron ABD depAndrogyn Testosteron ABD
Depo-Testadiol Testosteron ABD
Depotestogen Testosteron ABD 17
Despamen Testosteron Meksika
Arjantin, Brezilya, Meksika, Dilena Medroksiprogesteron Portekiz, Hong Kong
Nandrolon , Dinatrofon Đspanya Progesteron
Güney Afrika Cumhuriyeti, Hollanda, Avustralya, Çek Divina Medroksiprogesteron Cumhuriyeti, Đsveç, Danimarka, Finlandiya, Rusya, Fransa, Macaristan
Divina Plus Medroksiprogesteron Đsveç, Danimarka
Diviplus Medroksiprogesteron Belçika
Norveç, Đsviçre, Çek Diviseq Medroksiprogesteron Cumhuriyeti, Fransa, Đrlanda, Rusya
Finlandiya, Rusya, Divitren Medroksiprogesteron Macaristan
Diviva Medroksiprogesteron Belçika
Etinil estradiol, Dos Dias N Hidroksiprogesteron, Arjantin Norgestrel
Duo-Cyp Testosteron ABD
Duofemme Noretindron Đspanya
Duogex LA Testosteron Kanada
Duo-Ormogyn Progesteron Đtalya
Duoton Progesteron Tayland
Duova Medroksiprogesteron Fransa
Duratestrin Testosteron ABD
Elamax Siproteron Brezilya
Deksametazon, Ell-Cranell Almanya Salisilik asit
Elleste Duet Conti Noretindron Đngiltere 18
Elleste-Duet Noretindron Đngiltere
Emenovister Progesteron Đspanya
Emmenovis Progesteron Portekiz
Enadiol CC Medroksiprogesteron ili
Enadiol MP Medroksiprogesteron ili
Estalis SQ Noretindron Brezilya
Arjantin, Brezilya, Portekiz, Đspanya, Avusturya, Norveç, Estalis Noretindron Đsveç, Đsviçre, Kanada, Çek Cumhuriyeti, Finlandiya, Yunanistan, Đrlanda
Estalis Continuous Noretindron Avustralya
Estalis Sekvens Noretindron Norveç, Đsveç, Finlandiya
Estalis Sequens Noretindron Avusturya
Arjantin, Đtalya, Portekiz, Đspanya, Almanya, Đsviçre, Estalis Sequi Noretindron Avustralya, Kanada, Çek Cumhuriyeti, Đrlanda
Estandron Testosteron Đtalya, Avusturya
Estandron P Testosteron Brezilya
Estandron Prolongado Testosteron Đspanya, ili
Estandron Prolongatum Testosteron Hollanda, Đsviçre
Estranova 30 simple Medroksiprogesteron ili
Estiamen Estriol, Estron Đtalya
Estiamen B Estriol, Estron Đtalya
Estopause Medroksiprogesteron Yunanistan
Estra-C Noretindron Çek Cumhuriyeti
Estrace Plus Noretindron Çek Cumhuriyeti
Meksika, Arjantin, Brezilya, Estracomb Noretindron Đtalya, Portekiz, Đspanya, Almanya, Hollanda, Avusturya, Norveç, Đsveç, 19
Đsviçre, Kanada, ili, Çek Cumhuriyeti, Danimarka, Finlandiya, Hong Kong, Singapur, Macaristan
Estracomb TTS Noretindron Yunanistan
Đngiltere, Avustralya, Estracombi Noretindron Belçika, Đrlanda, Güney Afrika Cumhuriyeti
Estrafemol Medroksiprogesteron Almanya
Avusturya, Arjantin, Brezilya, Almanya, Đsviçre, Estragest Noretindron ili, Çek Cumhuriyeti, Macaristan
Estrand Testosteron Kanada
Estranova CC Medroksiprogesteron ili
Estrapak Medroksiprogesteron Avustralya
Estra-Testrin Testosteron ABD
Estro-Pause N Noretindron Güney Afrika Cumhuriyeti
Evitas Algestone Brezilya
Evo-Conti Noretindron Danimarka
Arjantin, Meksika, Đngiltere, Evorel Conti Noretindron Finlandiya, Đrlanda, Đsrail, Güney Afrika Cumhuriyeti
Evorel Micronor Noretindron Đsveç
Evorel Pak Noretindron Đngiltere
Arjantin, Đngiltere, Evorel Sequi Noretindron Finlandiya, Đsrail, Güney Afrika Cumhuriyeti
Evo-Sequi Noretindron Danimarka
Farludiol Medroksiprogesteron Arjantin
Farludiol Ciclo Medroksiprogesteron Arjantin
Farlupost Medroksiprogesteron ili 20
Arjantin, Almanya, ili, Fem 7 Combi Norgestrel Đsviçre
Fem 7 Sequi Norgestrel Hollanda
Femanor Noretindron Đsveç, Danimarka
Femapak Didrogesteron Đngiltere
Femasekvens Noretindron Đsveç, Danimarka
Femaston Didrogesteron Yunanistan
Femilar Siproteron Finlandiya
Femineo Algestone Brezilya
Feminova Plus Norgestrel Belçika
Femipak Medroksiprogesteron Avusturya
Brezilya, Đtalya, Almanya, Hollanda, Avusturya, Đsviçre, Đngiltere, Avustralya, Belçika, Çek Femoston Didrogesteron Cumhuriyeti , Finlandiya, Hong Kong, Đrlanda, Rusya, Güney Afrika Cumhuriyeti, Singapur, Malezya, Macaristan
Femoston 1/5 Didrogesteron Portekiz, Rusya
Femoston 2/10 Didrogesteron Portekiz
Brezilya, Đtalya, Almanya, Femoston Conti Didrogesteron Avusturya, Đsviçre, Đngiltere, Belçika, Finlandiya, Đrlanda
Fempack Progesteron Arjantin
Femphascyl Didrogesteron Avusturya
Femphascyl Conti Didrogesteron Avusturya
Femplan-MA Medroksiprogesteron Đrlanda
FemseptCombi Norgestrel Fransa
FemSeve Conti Norgestrel Đngiltere
FemSeven Combi Norgestrel Avusturya, Finlandiya 21
FemSeven Sequi Norgestrel Đngiltere
FemTab Continuous Noretindron Đngiltere
FemTab Sequi Norgestrel Đngiltere
Đtalya, Avusturya Filena Medroksiprogesteron
Diklorofen, Bizmut Fissan-Brustwarzensalbe Almanya bile ikleri
Folivirin Testosteron Çek Cumhuriyeti
Gestadinona Hidroksiprogesteron Brezilya
Gianda Medroksiprogesteron Almanya
Ginecoside Progesteron Brezilya
Ginedisc 50 Plus Noretindron Brezilya
Ginoplan Algestone Meksika
Gravibinan Hidroksiprogesteron Đtalya, Fransa
Gravibinon Hidroksiprogesteron Almanya, Avusturya, Đsviçre
Gravidinona Hidroksiprogesteron Meksika, ili
Gynamon Noretindron Almanya
Arjantin, Đtalya, Đspanya, Almanya, Avusturya, Gynodian Depot Prasteron Đsviçre, ili, Çek Cumhuriyeti, Fransa, Rusya
Progesteron, D Hormonigase Brezilya vitaminleri
Hormonin Estriol, Estron Đngiltere, Hong Kong
Hosterona Progesteron Arjantin
Icht-Oestren Đhtiyol, Üre Almanya
Almanya, Avusturya, Çek Indivina Medroksiprogesteron Cumhuriyeti, Danimarka, Finlandiya, Đsveç, Đsviçre, Đngiltere, Đrlanda, Norveç, 22
Rusya, Tayland
Jephagynon Progesteron Almanya
Kloramfenikol, Kemicetine Antiozena Hindistan Dvitaminleri
Kilios Medroksiprogesteron ili
Kliane Noretindron Çek Cumhuriyeti
Klimalet Medroksiprogesteron Danimarka
Klimaxil Medroksiprogesteron Danimarka
Çek Cumhuriyeti, Klimodien Dienogest Macaristan
Almanya, Çek Cumhuriyeti, Klimonorm Norgestrel Hong Kong, Rusya, Tayland, Malezya
Kliofem Noretindron Đngiltere
Arjantin, Portekiz, Brezilya, Đtalya, Hollanda, Avusturya, Norveç, Yeni Zelanda, Đsveç, Avustralya, Belçika, Çek Cumhuriyeti, Danimarka, Kliogest Noretindron Finlandiya, Fransa, Yunanistan, Hong Kong, Đrlanda, Đsrail, Güney Afrika Cumhuriyeti, Singapur, Tayland, Malezya, Macaristan, ili
Kliogest N Noretindron Almanya, Đsviçre
Kliovance Noretindron Yeni Zelanda, Đngiltere
Lafamme Dienogest Almanya, Avusturya
Lindisc Duo Norgestrel Brezilya
Linoladiol Gamolenik asit Đsviçre
Almanya, Çek Cumhuriyeti , Linoladiol-H N Prednizolon Macaristan
Liseta Dezogestrel Avusturya 23
Lubriderm Progesteron Arjantin
Lunelle Medroksiprogesteron ABD
Lutalmin Didrogesteron Meksika
Lutoginestryl F Proesteron Meksika
Lynandron Testosteron Almanya
Meno-MPA Medroksiprogesteron Đsrail
Meno-Net Noretindron Đsrail
Menovis Progesteron Đtalya
Menstrogen Progesteron Arjantin
Brezilya, Almanya, Mericomb Noretindron Avusturya, Đsviçre, Finlandiya
Brezilya, Đspanya, Almanya, Merigest Noretindron Avusturya, Đsviçre, Finlandiya
Merigest Sequi Noretindron Đspanya
Brezilya, Arjantin, Meksika, Mesigyna Noretindron ili
Metrigen Fuerte Progesteron Meksika
Mevaren Dienogest Đspanya
Minique Trimegestone Avusturya
Etinil estradiol, Güney Afrika Cumhuriyeti, Mixogen Metiltestosteron, Hindistan Testosteron
Naemis Nomegesterol Hollanda, Fransa
Natifa Pro Noretindron Brezilya
NeoOstrogynal Estriol Almanya
Neo-Pause Testosteron Kanada
NeyNormin Đnsan koriyonik N(Revitorgan-Dilutionen gonadotropini, Almanya N Nr 65) Liyotironin, Prednizolon, Vitamin 24
B12 , E vitaminleri Normomensil Progesteron Brezilya
Novafem Medroksiprogesteron ili
Almanya, Hollanda, Avusturya, Norveç, Đsveç, Novofem Noretindron Đsviçre, Đngiltere, Belçika, Danimarka, Finlandiya, Đrlanda, Đsrail
Novofemme Noretindron Fransa
Đtalya, Portekiz, Đspanya, Yeni Zelanda, Đngiltere, Nuvelle Norgestrel Danimarka, Đrlanda, Yunanistan
Nuvelle Continuous Noretindron Đngiltere
Nuvelle TS Norgestrel Đtalya, Đngiltere
OestroTabs Plus Cyclic Medroksiprogesteron Đsviçre
Ominol Progesteron Meksika
Osmil Medroksiprogesteron Almanya
Ostranorm Noretindron Danimarka
Ostrolut Hidroksiprogesteron Avusturya
Ostronara Norgestrel Almanya
Patector Algestone Meksika
Pausene Siproteron Đtalya
Çek Cumhuriyeti, Rusya, Pausogest Noretindron Macaristan
Perifem Medroksiprogesteron Đspanya
Perikliman Noretindron Avusturya
Perludil Algestone Meksika
Perlutal Algestone Arjantin, Meksika
Perlutan Algestone Brezilya
Plenifem Norgestrel Arjantin 25
Güney Afrika Cumhuriyeti, Postoval Norgestrel Brezilya, ili
Arjantin, Brezilya, Meksika, Prefest Norgestimate ABD
Prefesta Norgestimate Güney Afrika Cumhuriyeti
Preg-Less Algestone Brezilya
Primaquin MP Medroksiprogesteron ili
Primaquin MP Medroksiprogesteron ili Continuous
Đtalya, Đspanya, Almanya, Avusturya, Đsviçre, Primodian Depot Testosteron Avustralya, Güney Afrika Cumhuriyeti, Tayland
Primosiston Hidroksiprogesteron Arjantin, Meksika
Primosiston Fuerte Hidroksiprogesteron Đspanya
Primoson-F Progesteron Meksika
Procyclo Medroksiprogesteron Almanya
Progediol Progesteron Meksika
Proger-F Progesteron Meksika
Etinil estradiol, Progest Hidrokisprogesteron, Brezilya Progesteron
Progestrol Algestone Hong Kong
Meksika, Portekiz, Đspanya, Progyluton Norgestrel ili, Đsrail, Singapur, Malezya
Sebohermal Đhtiyol, Rezorsin Almanya
Senikolp Broksikinolin, Estron Finlandiya
Sisare Medroksiprogesteron Almanya
Sisare 28 Medroksiprogesteron Almanya
Substitol Morfin Avusturya 26
Successia Gestoden Fransa
Supligol Testosteron Arjantin
Supligol NF Prasteron Arjantin
Suprema Noretindron Brezilya
Syngynon Hidroksiprogesteron Almanya
Brezilya, Đsviçre, Çek Systen Conti Noretindron Cumhuriyeti
Brezilya, Đsviçre, Çek Systen Sequi Noretindron Cumhuriyeti
T-E Cypionate Testosteron ABD
Tesor-C Noretindron Đtalya
Testaval 90/4 Testosteron ABD
Test-Estro Testosteron ABD
TOM Triotrisin Fransa
Topasel Algestone Đspanya
Totelle Trimegestone ili, Danimarka, Đtalya, Đsveç
Totelle Ciclico Trimegestone Arjantin
Totelle Continuo Trimegestone Arjantin, Meksika
Totelle Cycle Trimegestone Belçika
Totelle cyclo Trimegestone Avusturya
Totelle Secuencial Trimegestone Meksika
Totelle Sekvens Trimegestone Finlandiya, Norveç, Đsveç
Trevina Medroksiprogesteron Danimarka
Triaklim Noretindron Çek Cumhuriyeti, Rusya
Trial Combi Noretindron Arjantin
Trial Gest Noretindron Arjantin
Trial Pack Noretindron Arjantin
Triaval Medroksiprogesteron Đsviçre 27
Tridestra Medroksiprogesteron Đngiltere, Đrlanda
Tri-Filena Medroksiprogesteron Avusturya
Hidroksiprogesteron, Trinestril Brezilya Testosteron
Trinorm Noretindron Danimarka
Trioestrine-Retard Hidroksiprogesteron Monako
Norveç, Đsveç, Finlandiya Trisekvens Noretindron Danimarka
Arjantin, Portekiz, Đspanya, Brezilya, Đtalya, Almanya, Hollanda, Avusturya, Yeni Zelanda, Đsviçre, Đngiltere, Avustralya, Belçika, Çek Trisequens Noretindron Cumhuriyeti, Fransa, Yunanistan, Hong Kong, Đrlanda, Đsrail, Rusya, Güney Afrika Cumhuriyeti, Singapur, Tayland, Macaristan, ili
Güney Afrika Cumhuriyeti, Trivina Medroksiprogesteron Đsveç, Belçika
Tyliculine Triotrisin Đsviçre
Unalmes Algestone Brezilya, ili
Uno-Ciclo Algestone Brezilya
Valertest Testosteron ABD
Vitrena Medroksiprogesteron Almanya
Vivelle Norgestimate Avusturya
Yectames Algestone Meksika
Zumeston Didrogesterom Avusturya
28
Çizelge 1.3. Dünyada sadece EV içeren ticari preparatlar
Absorlent Adgyn Estro Aerodiol
Agofollin Alcis Alora
Armistor Armonil Avicis
Benzo-Ginestryl Benzo-Ginoestril Benzo-Gynoestryl
Bisteron Calidol Cerella
Cerina Climaderm Climaval
Cliogan Cutanum Cycloderm
Deladiol Delestrogen Delidose depGynogen Depogen Dermatrans
Dermestril Dimenformon Dimenformon Prolongatum
Dioval Disequens Divigel
Duokliman Dura-Estrin Duragen
E-Cypionate Elleste Elleste-Solo
Enadiol Endomina Ephelia
Epiestrol Esclim Esclima
Esotran Essventia Estrabeta
Estrace Estracutan Estra-D
Estradelle Estraderm TTS Estradot
Estrahexal Estra-L Estramon
Estranaova E Estrapatch Estrasorb
Estrena Estreva Estrifam
Estrimax Estring Estroclim
Estro-Cyp Estrodose Estrofem
Estrofem N Estroffik Estrogel 29
Estroject Estronar Estronorm
Estro-Pause Etrosteron Eutocol
Evafilm Evopad Evorel
Farlutes Fem 7 Femalon
Femanest Fematab Fematrix
Femiderm Femigel Feminova
Femoston mono FemPatch Femring
Femsept FemSeven FemSieben
FemTab Femtrace Femtran
Gelestra Ginaikos Ginatex
Ginedisc Ginoderm Gynodiol
Gynogen Gynokadin GynPolar
Hormodiol Hormodose Klimapur
Klimareduct Lindisc Linoladiol N
Malun Menaval Meno_patch
MenoImplant Menorest Menoring
Menostar Meriestra Merimono
Mirion Natifa Neofollin
Octodiol Oesclim Oestraclin
Oestring Oestro Gel Oestrodose
Oestrogel Oromone Ovatest
Pantostin Primaquin Primofol Depot
Primogyn Primogyn Depot Primogyna
Progynon Progynon B Progynon Depot
Progynon Depot 10 Progynon Depot 100 Progynon Depot 40 30
Progynova Provames Reglovar
Replasyn Riselle Ronfase
Rontagel Sandrena Sisare Mono
Sprediol Sterigin Systen
Thais Tradelia Transdiol
Transvital Trial Gel Trial Sat
Vagifem Valergen Vivelle Dot
Vivelledot Zerella Zumenon
Benztrone Climara Femogex
31
1.8. ÜZER ĐNDE ÇALI MA YAPILAN ETKEN MADDELER ĐN M ĐKTAR TAY ĐNLER Đ KONUSUNDA GÜNÜMÜZE KADAR YAPILMI ÇALI MALAR
1.8.1 Estradiol valerat miktar tayini için yapılmı çalı malar
1.8.1.1. Spektrofotometrik yöntemler
YÜCESOY C. ve EROL S. (2000) yaptıkları bir çalı mada estradiol valerat (EV) ve siproteron asetat’ın (CA) aynı anda miktar tayininin türev ve fark (difference) spektrometri ile yapılabilece ğini göstermi lerdir. Birinci türev spektrofotometride bu iki etken maddenin 0.1 N metanolik NaOH içerisindeki çözeltilerinin birinci türev spektrumunda CA için 269.9 ve 297.7 nm’lerde, EV için ise 283.1 nm’deki dA/d λ de ğerleri okunarak aynı anda miktar tayinleri gerçekle tirilmi tir. Fark spektrometrisi yönteminde ise sadece EV’nin CA ve EV karı ımında, 0.1 N metanolik NaOH içerisindeki çözeltilerinin 245.4 nm’deki fark spektrumunda okunan absorbans de ğerlerinden hareketle her ikisininde aynı anda miktar tayini gerçekle tirilmi tir. Birinci türev spektrometrisinde do ğrusal çalı ma aralıkları CA için 5–25 µg/mL ve EV için 8–40 µg/mL olarak bulunmu tur. Fark spektrometride EV için çalı ma aralı ğının yine 8–40 µg/mL arasında oldu ğu hesaplanmı tır. Birinci türev spektrometride hesaplanan ba ğıl standart sapma de ğerleri ise CA ve EV için sırasıyla % 2.12 ve % 0.95 olarak hesaplanmı tır. Fark spektrometride hesaplanan ba ğıl standart sapma de ğeri ise EV için % 0.99 olarak bulunmu tur. Yöntemin farmasötik bir preparata (draje) ba arıyla uygulandı ğı çalı mada belirtilmektedir.
YÜCESOY C.(2000) yaptı ğı bir ba ka çalı mada estradiol valerat (EV) ve siproteron asetatın (CA) ikili karı ımlarında aynı anda miktar tayinlerini Vierordt ve absorbans oranları yöntemleri ile tayin edilebilece ğini göstermi lerdir. Bu yöntemlerde EV ve CA’nın 0.1 N metanollü NaOH çözeltileri kullanılmı ve yöntemler uygulanmı tır. Her iki yöntemde de ortalama yüzde geri kazanım EV için % 98.1, CA için ise % 101.9 olarak bulunmu tur. Ba ğıl standart sapma de ğerleri ise EV ve CA için her iki yöntemde de sırasıyla %1.03 ve % 0.97 olarak bulunmu tur. Her iki yöntemde de EV için do ğrusal çalı ma aralı ğı 8–40 µg/mL, CA için ise 5–25 32
µg/mL oldu ğu saptanmı tır. Geli tirilen yöntemlerin CA ve EV içeren bir draje formülasyonuna ba arıyla uygulandı ğı çalı mada belirtilmektedir.
DĐNÇ ve arkada ları (2003) yaptıkları bir çalı mada siproteron asetat (CA) ve estradiol valeratın (EV) farmasötik preparatlarda oran spektrumu, birinci türev spektrofotometri ve iki kemometrik yöntemle (CLS ve ILS) aynı anda miktar tayininin yapılabilece ğini göstermi lerdir. Oran spektrumu birinci türev spektrofotometride CA ve EV’nin 0.1 M NaOH-metanol (1:9) içerisindeki çözeltilerinin spektrumları kullanılmı ve elde edilen oran spektrumlarının birinci türevinde EV için 235.4 ve 249.5 nm’ler, CA için 261.1 ve 277.1 nm’deki analitik sinyaller okunarak miktar tayinleri gerçekle tirilmi tir. Kemometrik yöntemlerde ise EV ve CA’nın yine aynı çözücü içerisindeki çözeltilerinin 230–320 nm’ler arasında ∆λ=5 nm olarak 14 dalga boyunda okunan absorbans de ğerleri kullanılmı tır. Geli tirilen üç yöntemde de do ğrusal çalı ma aralıkları EV için 16–48 µg/mL, CA için ise 4–32 µg/mL olarak bulunmu tur. Oran spektrumu birinci türev spektrofotometri, ILS ve CLS’de ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla EV için % 1.18, % 0.71 ve % 1.21 ve CA için % 1.49, % 0.69 ve % 0.54 olarak hesaplanmı tır. Geli tirilen yöntemlerin bir farmasötik preparata ba arıyla uygulandı ğı çalı mada belirtilmektedir.
1.8.1.2. Kromatografik Yöntemler
SEGALL ve arkada ları (1999) tablet formülasyonlarında estradiol valerat (EV) ve medroksiprogesteron asetatın (MA) aynı anda tayini için bir YPSK yöntemi geli tirmi lerdir. Yöntemde C18 ters faz kolonu ve mobil faz olarak amonyum nitrat tampon-asetonitril (30:70, h/h) kullanılmı tır. Tayin 280 nm’de gerçekle tirilmi , akı hızı ise 2 ml/dk olarak seçilmi tir. Yöntemde MA için alıkonma zamanının 4 dk, EV için ise 12 dk oldu ğu gözlenmi tir. Yöntemde do ğrusal çalı ma aralıklarının EV için 0.32–0.48 mg/mL, MA için ise 0.8–1.2 mg/mL oldu ğu saptanmı tır. Yöntemdeki ba ğıl standart sapma de ğerleri EV ve MA için sırasıyla % 0.6 ve % 1.16 olarak hesaplanmı tır. 33
CARIGNAN ve arkada ları (1980) estradiolün diasetat, benzoat, dipropionat, spiyonat ve valerat esterlerinin ayrılması ve miktar tayini için bir YPSK yöntemi geli tirmi lerdir. Yöntemde kolon olarak RP–8 ve mobil faz olarak asetonitril-su (70:30, h/h) sistemi kullanılmı tır. Yöntemde akı hızı 3 mL/dk olarak seçilmi , deteksiyon ise 220 nm’de yapılmı tır. Yöntemde iç standart olarak testesteron enantat kullanılmı tır. Yöntemdeki ba ğıl standart sapma de ğeri estradiol valerat için % 0.6 olarak hesaplanmı tır. Yöntemde estradiol valerat için alıkonma zamanı 4.1 dk olarak bulunmu tur. Geli tirilen yöntem estradiol valeratı içeren iki enjeksiyon formülasyonuna ba arıyla uygulanmı tır.
CARIGNAN ve arkada ları (1984) estradiol valerat (EV) ve testesteron enantat’ın (TE) aynı anda ya ğlı formülasyonlar içerisinde miktar tayinlerinin yapılabilmesi için bir YPSK yöntemi geli tirmi lerdir. Yöntemde Li Chrosorb (10µm, 250 x 4.6mm) kolonu ve asetonitril-su (70:30, h/h) sistemi mobil faz olarak kullanılmı tır. Tayin 210 nm’de yapılmı , akı hızı 1.5 mL/dk olarak seçilmi tir. Yöntemde EV ve TE için alıkonma zamanları sırasıyla 7.70 ve 18.28 dk olarak gözlenmi tir. Yöntemdeki ba ğıl standart sapma de ğerleri EV için % 0.39, TE için % 0.37 bulunmu tur. Yöntemdeki do ğrusal çalı ma aralıklarını EV için 0.08 – 0.5 µg/mL ve TE için ise 5 – 30 µg/mL oldu ğu hesaplanmı tır.
AMIN (1989) estradiol valerat (EV) ve dehidroepiandrosteron enantat’ın (DE) farmasötik preparatlarda ve kanda kantitatif tayinini yapabilmek için bir ĐTK yöntemi geli tirmi tir. Yöntemde silika jel 60 F 254 kaplı plaklar üzerinde benzen- kloroform (65:35, h/h) mobil fazıyla yakla ık 30 dakikalık bir yürütme sonucunda elde edilen lekeler 2,4-dinitrofenilhidrazin püskürtülerek görünür hale getirildikten sonra dansitometrik olarak bu lekelerin ölçümü sonucunda miktar tayini gerçekle tirilmi tir. Yöntemde ba ğıl standart sapma de ğerleri DE için % 3.7, EV için % 2.9 olarak hesaplanmı tır. Geli tirilen yöntemin iki adet tablete ve bir ya ğlı çözeltiye ba arıyla uygulandı ğı çalı mada belirtilmektedir. Kan çalı malarında ba ğıl sapma de ğerlerinin DE için % 3.4’den, EV için ise % 2.74’den küçük oldu ğu çalı mada belirtilmektedir.
ZIMMERMAN ve arkada ları (2000) yaptıkları çalı mada menopoza girmi sa ğlıklı kadınlarda içerisinde EV ve DNG bulunan “CLIMODIEN ®” preparatı 34
verildikten sonra farmakokineti ği GC-MS ile takip edilmi tir. Yöntemde negatif kimyasal iyonizasyon modunda çalı ılmı ve m/z = 608 ve m/z = 510’daki iyonlar EV için takip edilmi ve ölçülmü tür. Çalı mada plazma numuneleri eter-hekzan karı ımıyla ekstre edildikten sonra C18 kartu undan geçirilerek temizlenmi tir. Daha sonra kalıntı 3,5-bis-(triflorometil)benzoilklorür ve N-metil-bis-(trifloroasetamid) ile türevlendirildikten sonra EV, GC-MS ile analiz edilmi tir. Yöntemde EV için çalı ma aralı ğı 100–400 ng/L olarak hesaplanmı tır. Yöntemdeki TAS de ğeri ise 10 ng/L olarak bulunmu tur. Bu yöntem kullanılarak etken maddelerin seçilen deneklerde C max , t max , t 1/2 ,AUC 0→∞ de ğerleri hesaplanmı tır. Buna kar ılık DNG, radioimmunoassay yöntemiyle tayin edilmi ve yöntemdeki kalibrasyon aralı ğı 5– 500 pg/tüp olarak bulunmu tur. TAS de ğeri ise 1 µg/L olarak tayin edilmi tir.
1.8.1.3. Voltametrik Yöntemler
DUAN ve arkada ları (1999) estradiol valeratın (EV) civa elektrot üzerinde elektrokimyasal davranı larını incelemi lerdir. Bu çalı mada siklik voltametri, lineer tarama voltametri ve kronokulometri kullanılmı tır. Bunlara dayanarak adsorptif sıyırma kare dalga voltametrik yöntem EV için miktar tayininde kullanılmı tır. Yöntemde %18 alkol içeren Britton-Robinson tamponunda (pH=9.5) –1.29 V da EV’ın bir indirgenme piki verdi ği ve pik akımının 2x10 –8 – 2.5x10 –6 mol/L konsantrasyon aralı ğında do ğrusal ili kili oldu ğu bulunmu tur. YS de ğeri ise 1.1x10 –8 mol/L olarak hesaplanmı tır. Bu yöntemin biyolojik sıvılar için kullanılabilece ği çalı mada belirtilmektedir. Yöntemi di ğer steroid estrojenlerin etkilemedi ği çalı mada belirtilmektedir. Biriktirme zamanı 300 sn seçilmi , tarama hızı 120 mV/sn olarak deneyde kullanılmı tır.
1.8.1.4. Kapiler Elektroforez
TRIPODI ve arkada ları (2006) do ğal ve sentetik estrojenlerin aynı anda miktar tayinlerinin yapılabilmesi için bis(2-etilhekzil)sulfosiksonata (AOT) dayalı yeni bir mikro emülsiyon tekni ğinden yararlanmı lardır (MEEKC). Mikro emülsiyon 35
sistemi % 1.4 AOT, % 1 oktan, % 71 bütanol ve % 90.6 20 mM 3- siklohekzilamino–2-hidroksi–1-propan sülfonik asit (CAPSO) ve 10 mM fosfat tamponundan (pH=12.5) olu maktadır. Yöntemde estron, 17-β estradiol, estriol, estradiol–17-hemisüksinat, etinil estradiol, estradiol–3-benzoat ve estradiol–17- valerat’ın 15 dakikadan daha kısa bir zaman içerisinde ayrıldı ğı ve miktarlarının tayin edildi ği anlatılmaktadır. Optimize edilmi elektroforetik artlar; 60 cm total uzunlukta ve 75 µm iç çaplı kaplanmamı silika kapiler, 25 kV voltaj, 25 0C sıcaklık ve 214 nm’de deteksiyon olarak belirlenmi tir. Estradiol valerat için yöntemde ba ğıl standart sapma de ğeri % 1.5, do ğrusal çalı ma aralı ğı 10–75 µg/mL olarak hesaplanmı tır. TYS de ğeri 2.1 µg/mL olarak tayin edilmi tir. Yöntemin farmasötik preparatlar içerisinde yukarıda sayılan etken maddelerin miktar tayinlerinde ba arıyla uygulandı ğı çalı mada belirtilmektedir.
DU ve arkada ları (2007) steroidlerin analizi için bir susuz kapiler elektroforez (NACE) yöntemi geli tirmi lerdir. Elektrolitin cinsi ve organik çözücünün bile imi de dahil elektroforetik parametreler optimize edildikten sonra EV için 20 mM sodyum asetat içeren metanol-asetonitril (95:5, h/h) tamponu (pH=7) kullanılarak, 45 cm x 75 m iç çaplı silika kapilerde 280 nm’de deteksiyon yapıldı ğında en uygun artların olu tu ğu görülmü tür. Potansiyel 25 kV ve sıcaklık 15 oC olarak seçilmi tir. Göç zamanı estradiol valerat için 6 dak. civarındadır. Yöntemin tabletlere ba arılı bir ekilde uygulandı ğı çalı mada gösterilmi tir.
1.8.2 Dienogest Miktar Tayini Đçin Yapılmı Çalı malar
1.8.2.1. Radyoimmunoassay
HIEU ve arkada ları (1986) dienogestin plazmada miktar tayini için bir radioimmunoassay (RIA) yönteminden yararlanmı lardır. Yöntemde, plazmadan dikloroetan ile ekstraksiyondan sonra ve dikloroetan ile ekstraksiyon yapılmadan dienogestin RIA ile tayini yapılmı tır. Yöntemde % geri kazanım dikloroetan ile ekstraksiyondan sonra % 97.6 – 109.2, ekstraksiyon yapılmadan do ğrudan 36
uygulamada ise % 99.2 – 103.1 arasında oldu ğu bulunmu tur. Yöntemde ekstraksiyonlu ve ekstraksiyonsuz i lemde TAS de ğeri 3.2 pg olarak hesaplanmı tır.
HOBE ve arkada ları (1986) plazma ve tükrük sıvısı içerisinde dienogestin radioimmünolojik olarak miktar tayinini gerçekle tirmi lerdir. 2 mg dienogest’in oral yolla verilmesinden sonra plazma ve tükürükten dikloroeten ile ekstre edilmi dienogestin miktarı radioimmunoassay yöntemiyle tayin edilmi tir. Yöntemin dienogest için farmakokinetik olarak incelenmesinde C max , t max , t 1/2 , AUC ø→∞ gibi parametrelerin hesaplanmasında kullanıldı ğı da çalı mada belirtilmektedir. Kullanılan radioimmunoassay yönteminin HOBE ve arkada ları tarafından daha önce geli tirilen yöntem oldu ğu çalı mada belirtilmektedir.
1.8.2.2. Kromatografik Yöntemler
FEKETE ve arkada ları (2008) yedi etken madde (dienogest, finasterid, gestoden, levonorgestrel, estradiol, etinil estradiol ve noredisteron asetat) kalıntısının aynı anda tayini için bir ultra performans sıvı kromatografisi yöntemi geli tirmi lerdir. Çe itli ilaçların üretildi ği, steroid üreten üretim bandının temizli ğinin onaylanmasına imkan veren yeni ve kapsamlı bir yöntem geli tirilmi tir. Yöntemde sabit faz olarak UPSK TM BEH C18 kolonu (1.7 µm parçacık büyüklü ğü ve 50 mm x 2.1 mm boyutlarında), mobil faz olarak asetonitril-su (48:52, h/h), akı hızı 0.55 mL/dak. olarak kullanılmı tır. Yöntemde DNG için çalı ma aralı ğı 0.12 – 4.55 µg/mL, tayin alt sınırı 0.12 µg/mL, yakalama sınırı 0.06 µg/mL’olarak bulunmu tur. Alıkonma zamanı 0.45 dak. dır.
37
2. GEREÇ ve YÖNTEM
2.1. Kullanılan Yöntemler
2.1.1. Türev spektrofotometri
Türev spektrofotometri, kalitatif ve kantitatif analiz için dalga boyuna kar ı absorbansın birinci veya daha fazla türevini kullanır. Ancak bu teknik ilk bulundu ğunda çok fazla ilgi görmedi, çünkü o dönemki UV-Vis spektrofotometreleriyle türev spektrumu almak zordu. Deneysel e ğrilerin ölçüm aletleri ile türevlerinin alınması oldukça eskiye dayanır ve 1920 lerde ilk defa Rutherford tarafından kütle spektrumlarının yorumlanmasında kullanılmı tır. Genel kullanma ise 1950’li yılları bulmu tur. Günümüzde mikro i lemcilerin yaygın olarak kullanılması, bu yöntemin kolaylıkla analizlere uygulanmasına imkân tanımaktadır ve geli tirilen spektrofotometreler de bu ekilde donanmı lardır. Son yıllarda yayınlanan ilaç analizleri ara tırmalarının ço ğunda bu yöntemle ilgili çalı malar bulunmaktadır.
UV-görünür bölgedeki bir spektrum, madde üzerine gönderilen ı ığın dalga boylarına kar ı absorbans de ğerlerinin grafi ğe geçirilmesi ile elde edilir. Yani A= f( λ) fonksiyonudur. Bu fonksiyonun her bir noktasındaki türevi hesaplanabilir (dA/ dλ).
E ğer bu türev de ğerleri dalga boyuna kar ı grafi ğe geçirilecek olursa “türev spektrumu” meydana gelir ve 1 den n’e kadar derecede olabilir.
dA d 2A dnA ………. dλ dλ2 d λn Türev spektrofotometri ise türev spektrumlarının kullanılması esasına dayalı bir analiz yöntemidir.
Esasında türev; e ğrinin üzerine çizilen te ğetin e ğimidir yani tanjantıdır. ( ekil 2.1.) 38
ekil 2.1. Gauss tipindeki bir e ğrinin belirli noktalardaki tanjantları ve kar ılıkları (OWEN 1995)
Buna göre gauss tipindeki bir e ğride tanjantın en yüksek oldu ğu yarı yüksekliklerde maksimum veya minimumlar gözlenir.
Türev E ğrilerinin ekilleri:
Günümüzde 1. den 4. ye kadar türev e ğrisi çizilmekte ve anlam kazanmaktadır. A ağıdaki ekilde de görüldü ğü gibi 1. türev e ğrisi orjinal spektrumdaki e ğrinin te ğetlerinin e ğimini göstermektedir. Burada orjinal spektrumun maksimum noktası kaybolmu buna kar ılık orjinal spektrumda absorbansın yükseldi ği kısımlar için pozitif, azaldı ğı kısımlar için ise negatif de ğerler almaktadır. Orjinal spektrumdaki eğri üzerinde e ğimin en büyük oldu ğu noktalara yani e ğrinin yarı yüksekliklerine kar ılık bir maksimum ve bir minimum göstermekte e ğimin en dü ük oldu ğu tepe noktasında ise sıfır olmaktadır. Buna göre gauss e ğrisindeki maksimum noktasına 1. türev e ğrisinde bir “kesim noktası (zero-crossing)” kar ılık gelmektedir. Bu noktanın her iki tarafında pozitif ve negatif bantta absorbans e ğrisinin e ğim noktasında (inflection) maksimum ve minimum yapar. Bu iki kutuplu fonksiyon bütün tek sayılı türevlerin karakteristi ğidir. 2. türev e ğrisinde ise aynı i lemler sonucunda orjinal e ğrinin maksimum noktasına kar ılık gelen bir minimum görülmektedir. Ayrıca ana pikin iki tarafında ve pozitif bölgede iki adet uydu pik 39
verir. Çift sayılı türevlerin karakteristik özelli ği, absorbans spektrumunun maksimum yaptı ğı dalga boyunda, λmax , pozitif veya negatif bölgede güçlü bir maksimum veya minimum vermesidir. 3.türev e ğrisinde orjinal e ğrinin maksimum noktasına aynen 1. türev e ğrisinde oldu ğu gibi bir kesim noktası kar ılık gelmektedir. 4.türev ise orjinal spektrumdaki maksimum noktaya yine bir maksimum nokta kar ılık gelmektedir. Bu nedenle tek maddenin kantitatif tayinlerinde 2. ve 4. türev e ğrileri kullanılmaktadır. Ayrıca orjinal Gauss e ğrisi tipindeki bir pik’e
ekil 2.2. Türev e ğrilerinin ekilleri
40
kar ılık n. türevde n + 1 tane maksimum ve minimuma rastlanmaktadır. Yani 1. türevde 2, 2. türevde 3, 3. türevde 4 tane gibi maksimum ve minimum noktası gözlenmektedir ( ekil 2.2).
Önemli bir nokta ise, türev e ğrilerinin aynı dalga boyu aralı ğı içerisinde alınması nedeniyle piklerin geni li ğinin azalmasıdır, Bu azalma yakla ık 1. türevde yarısına, 2. türevde üçte birine ve 4. türevde yüzde 40’ına inmektedir.
Türev spektrumlarında, kesim noktası çok önemlidir. Çünkü bu noktada ait oldu ğu maddenin di ğer madde veya maddelerin spektrumuna katkısı yoktur. Dolayısıyla karı ım içerisinde herhangi bir ayırma i lemi gerekmeksizin bazı maddelerin di ğerleri yanında miktar tayinlerinin yapılabilmesi mümkündür. Bu da özellikle karı ım halinde maddeleri etken maddeler olarak içeren farmasötik preparatların analizi için yöntemin çok etkili ve kolay bir miktar tayini yöntemi olmasını sa ğlar.
Bu yöntem ikili karı ımlarda oldu ğu kadar daha fazla sayıda bile en içeren karı ımlarda da uygun kesim noktaları bulundu ğunda uygulanabilir.
ekil 2.2 türevlendirmenin basit Gauss absorbans e ğrisinin görünümünde ne gibi de ği iklikler yaptı ğını bilgisayar simülasyonları halinde gösteriyor. Türev spektrumu her zaman normal e ğriden daha komplekstir.
Yöntemin Özellikleri :
— Avantajları:
a) Türev çalı ması orjinal spektrumun e ğimleri hakkında bilgi verir ve bunun omuz noktaları ile dönüm noktalarının daha belirgin hale gelmesine neden olur. Böylece bir bile ik daha kolay ve kesin olarak tanınabilir.
b) Ço ğunlukla orjinal spektrumda elde edilen e ğriler birçok pikin üst üste gelmesi ile meydana gelmi tir. Türev alma ile bu absorpsiyon eğrileri daha ayrıntılı ekle girer ve böylece birarada bulunan piklerin tek tek görülmesi sa ğlanır. 41
c) Bilindi ği gibi spektrofotometride bulanık çözeltiler ile çalı ılırken çökme hızı, tanecik büyüklü ğü gibi faktörlere ba ğlı olarak büyük oranda hata yapılabilir. Türev eğrilerinin hazırlanması ile bulanıklı ğın olu turdu ğu bu olumsuz etki ortadan kaldırılabilir.
d) Birden fazla maddenin karı ım halinde bulundu ğu ortamlarda ekstraksiyon ve kromatografi gibi herhangi bir ayırma i lemine ba vurmaksızın tek tek miktarları tayin edilebilir.
e) Reaksiyon ortamından kaynaklanan gürültü piklerinin yok edilmesi sa ğlanır.
— Dezavantajları:
a) Kullanımı çok kolay olmasına kar ılık pahalı spektrofotometrelere ve oldukça karma ık bir elektronik yapıya ihtiyaç vardır.
Türev Spektrometrisinde Ölçüm Yöntemleri
Pikten pike ölçüm: Bir spektrumda ard arda gelen maksimum ve minimum noktalar alınarak, bu iki noktanın mutlak de ğer olarak farkı ölçülür. Birkaç nokta var ise, ordinat farkının en büyük oldu ğu bir biti ik çift seçilir. Bu ölçüm genelde çok bile enli nicel analizlerde kullanılır.
ekil 2.3. Pikten pike ölçüm (TALSKY 1994)
42
Pikten sıfıra ölçüm: Ölçümü yapılacak pikin maksimum yada minimumu ile sıfır arasındaki uzaklık ölçülür. Özellikle absise göre simetrik sinyaller içeren yüksek derece türevler için ve üst üste çakı an e ğrilerden biri sıfırdan geçti ğinde kullanılır.
ekil 2.4. Pikten sıfıra ölçüm (TALSKY 1994)
Te ğet yöntemi ile ölçüm: bir spektrumda ard arda gelen iki maksimum üzerinden geçirilen te ğetin a ağıdaki minimuma izdü ümü uzaklı ğı ölçülür. Bu yöntem do ğrusal geri zemine çok rahat uygulanabilir. Özellikle zemin absorpsiyonunun belirlenemedi ği bulanık örneklere uygulanır. Bulanık örneklerde, bulanıklık arttıkça spektrum daha kısa dalga boylarına kayar. Birinci derece ve ikinci derece türevleri alınarak bu etki ortadan kaldırılabilir.
ekil 2.5. Te ğet yöntemi ile ölçüm (TALSKY 1994)
Pik-pik oranı yöntemi: Pik-pik oranı yöntemi birbirine kom u bir pik çiftinin oranına dayanır. E ğer bu de ğerler fark gösterirse, o zaman background giri imi ve dolayısıyla numunenin dü ük kalitede ölçülmesiyle sonuçlanır. Ayrıca ekil 10’da gösterilen P 1 ve P 2 sinyalleri numunedeki farklı sinyallerden kaynaklanabilir. 43
Konsantrasyonların oranı de ği medi ği sürece, p 1 ve p 2 yüksekliklerinin oranı her zaman sabit kalacaktır. Kesin konsantrasyonlar farklı olsa ve modifiye edilse bile bu de ği meyecektir. Di ğer bir deyi le pik-pik oranı sadece saf maddeler için de ğil, karı ımlar için de karakteristik bir niceliktir. Bu özellik analiste bir maddenin konsantrasyonu sabit tutuldu ğunda (standart olarak), ikinci maddenin konsantrasyonundaki de ği imi tahmin edebilmesine olanak sa ğlar. Bu, özellikle karma ık türev spektrumlarındaki küçük farklar ara tırıldı ğında kullanı lıdır.
2.1.2. Kemometrik Yöntemler
1972 de ismi konulan kemometri, kimyasal verilerin analizlenmesi yardımıyla optimum ölçüm i lemleri ve yöntemlerinin seçimi ve tasarlanması, ve maksimum kimyasal bilgi edinilmesi için matematik ve istatistik yöntemlerin kullanıldı ğı bir alan olarak tarif edilmektedir. Bu özellikleri nedeniyle de analitik kimyada çok yaygın olarak kullanılmaktadır. Kemometrinin en çok kullanıldı ğı analiz yöntemlerinin ba ında spektroskopi gelmektedir. Spektroskopik yöntemler ise günümüzde pek çok amaçla analizciler tarafından kullanılmaktadır. Özellikle UV- Görünür alan spektroskopi çok fazla kullanım alanına sahip olup üzerinde çalı ılan numune için hem kalitatif hem de kantitatif açıdan bilgiler elde etmemizi sa ğlar. Kantitatif analitik spektroskopi açısından önemli olan analiz edilecek maddenin miktarıdır. Miktar tayinleri için öncelikle kalibrasyon i leminin gerçekle tirilmesi gerekir. Kalibrasyon i lemlerinde cihazdan elde edilen analitik sinyallerin analiz edilen maddenin konsantrasyonu ile orantılı olması esastır. Kalibrasyon i lemleri yıllardır kullanılmasına ra ğmen bilgisayar teknolojisinin ve geli mi cihazların kullanılmasıyla büyük bir atılım göstermi (Cowe ve McNicol, 1985; Fredericks ve Ark., 1985; Thomas, 1994) olup günümüzde ticari olarak satılan pek çok analiz cihazının içerisinde bunların çözümü için geli tirilen programlar standart olarak yer almaktadır.
Spektrokimyasal analizlerde; de ği ik pek çok kalibrasyon yöntemleri geli tirilmi tir (Atkinson, 1985; Beebe ve Kowalski, 1987; Booksh ve Kowalski, 1994; Box, 1980; Cook ve Weisberg, 1982; Geladi ve Kowalski, 1986; Haaland ve 44
Thomas, 1988; Hawkins, 1993; Miller, 1991; Roecker, 1991; Stromberg, 1993; Wentzell ve Ark., 1997). Bu yöntemler içerisinde klasik olanı tek deği kenli kalibrasyondur, ki bunda basit lineer regresyon yöntemleri kullanılır ve ölçülen cevaplarda herhangi bir ba ka giri imin olmadı ğı kabul edilir. Bundan sonra pek çok giri imin hesaba katıldı ğı kompleks kimyasal karı ımların analizi için çok de ği kenli kalibrasyon yöntemleri geli tirilmi tir. Analiz edilecek madde ile elde edilen analitik sinyal arasındaki ili kinin non-lineer oldu ğu (do ğrusal olmayan) çok sayıda multivariate (çok de ği kenli) kalibrasyon yöntemi de geli tirilmi tir (Frank, 1990; Dutter ve Huber, 1981; Lawrence ve Arthur, 1990; Ratkowsky, 1990; Sekulic ve Ark., 1993; Stromberg ve Ruppert,1989). Analiz için hangi kalibrasyon yönteminin seçilece ği bu tekniklerin temeline göredir.
Modern spektroskopik cihazlar içinde birden fazla bile ik içeren bir numune için bir dakika içinde yüzlerce spektrum alabilecek kadar hızlı hale getirilmi lerdir. Tek de ği kenli kalibrasyon yöntemleri bu tip veriler için uygun de ğildir. Çok de ği kenli analizler çok sayıdaki matematik i lemlerden meydana gelmi tir ve her numune için cihazdan bir veya daha fazla cevabın ölçüldü ğü kimyasal analizlere uygulanabilir (Beebe ve Kowalski, 1987; Jochum ve Schrot, 1984; Kisner ve Ark., 1983; Rencher, 1995).
Spektroskopide çok de ği kenli kalibrasyon yöntemleri, birden fazla bile en içeren numunelerin çok sayıdaki dalga boyunda ölçülen cihaz cevaplarını içeren verilerle ilgilenir. Çok de ği kenli kalibrasyon yöntemleri tek de ği kenli kalibrasyon yöntemlerindeki problemleri yok edebilir. Çünkü verilen bir numune için analit konsantrasyonunun tahmininde verilerin pek çok parçası kullanılır. Örne ğin; cihazdaki noise (gürültü) sinyallerinin ortalaması alınmak suretiyle azaltılabilir. Ayrıca çok de ği kenli kalibrasyon yöntemiyle numunedeki giri im yapan maddelerin miktarı da tayin edilebilir.
Geçen son yıllarda kemometrideki geli meler kompleks kimyasal karı ımların analizi için pek çok multivariate (çok de ği kenli) kalibrasyon yönteminin geli mesine yol göstermi tir. Günümüzde modern bilgisayarlar bu i lemi daha kolaylıkla yapabilir hale gelmi tir. Günümüzde spektrokimyasal analizde en çok kullanılan yöntemler klasik en küçük kareler , ters en küçük kareler, ki bunlar bazen 45
çoklu lineer regresyon (MLR) olarak ifade edilir, kısmi en küçük kareler ve temel bile en regresyonudur (Beebe ve Kowalski, 1987; Booksh ve Kowalski, 1994; Haaland ve Thomas, 1988; Lorber ve Ark.,1987; Martens ve Naes, 1984; Naes ve Martens, 1984; Sjostrom ve Ark., 1983; Thomas, 1994) . Klasik en küçük kareler ve ters en küçük kareler yöntemleri univariate (tek de ği kenli) kalibrasyonlarda kullanılan modellerin üzerine kurulmu tur ve genellikle K ve P matris yöntemleri olarak da adlandırılırlar. Bununla birlikte kısmi küçük kareler ve temel bile en regresyonu yöntemleri cihaz cevap matrislerinin iki daha küçük matrise parçalandı ğı modelleme yöntemleridir.
2.1.2.1. Temel Bile en Regresyon Yöntemi (TBR) ve Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (KEK)
Temel bile en regresyonu ve kısmi en küçük kareler modelleme tekniklerinde veriler orijinal verilerin lineer kombinasyonlarının yeni de ği kenlerine parçalanır. Bu yeni de ği kenler temel bile enler veya faktörler olarak adlandırılırlar. Temel bile en regresyonu basitçe temel bile en analizinin (TBA) ardından regresyon uygulamasıdır. Đçinde yeni de ği kenlerin yaratılması iki boyutlu sistem ile gerçekle tirilebilir. E ğer cihaz cevabı iki dalga boyunda (n=2) m sayıdaki numune için birbirlerine kar ı grafi ğe geçirilirse, yeni bir aks meydana gelir ki bunun yönü verilerin maksimum de ği ebilirli ğini gösterir. Bu yeni aks, birinci temel bile en veya birinci eigen (öz) vektör olarak adlandırılır. E ğer bütün numuneler bu yeni aksın üzerine dü üyorsa, bütün de ği imler sadece bir eigen vektör kullanılarak ifade edilebilirler. Aksi takdirde; ikinci bir eigen vektör bulunabilir ki, bu birinci eigen vektöre diktir. Đkinci eigen vektör veri seti içerisinde birinciye uymayan residuallerin maksimum miktarını ifade eder. E ğer iki dalga boyundan fazlası cihaz cevap matrisinin içerisinde yer alıyorsa; cismin yapıldı ğı uzay çok boyutlu olur ve çok sayıda eigen vektör bulunur. Her birisi kalan de ği ebilirli ğin mümkün olan maksimumunu içerir veya her birisi di ğerlerine ortogonal olur. Genel olarak numune sayısına e it ya da ondan daha az sayıda temel bile en veya faktör olu turulabilir. 46
Temel bile en regresyonu ve kısmi en küçük kareler teknikleri tüm spektrumu içeren yöntemler oldu ğu için klasik en küçük kareler yönteminin tüm spektrum avantajlarını da ta ır. Bununla birlikte bütün bile enlerin konsantrasyonlarının bilinmesi gerekmemektedir. Çünkü kısmi en küçük kareler yöntemi, temel bile en regresyonu ve klasik en küçük kareler yöntemi dalga boyu seçme problemi olmaksızın bir bile enin analizini yapabilir.
Kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bile en regresyonu spektrum matrisinin iki daha küçük matrise parçalanmasındaki teknik nedeniyle birbirlerinden ayrılırlar. Temel bile en regresyonu yönteminde parçalanma analit konsantrasyonundan ba ğımsız olarak yapılır. Buna kar ılık kısmi en küçük kareler yönteminde konsantrasyon bilgileri ekstraksiyon faktörleri için kullanılır.
Kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bile en regresyonu için model a ağıdaki gibi ifade edilir :
A = TB + E A (28)
Burada A önceki gibidir. B ise temel vektörlerin veya yüklenmi (loaded) spektrumun h x n matrisi, T ise h yükleme vektörüyle tanımlanan yeni koordinat sisteminde absorpsiyon iddeti ve skorların m x h matrisidir. E A, faktör modeline uymayan spektral residuallerin m x n matrisidir. Klasik en küçük kareler yöntemi ile di ğer faktör yöntemleri arasındaki fark yükleme vektörü B’nin içinde saf bile enin spektrumunu de ğil orijinal kalibrasyon spektrumlarının do ğrusal kombinasyonlarının yer almasıdır. Đlaveten yeni koordinat sistemindeki iddetler klasik en küçük kareler yönteminde oldu ğu gibi do ğrudan C ile sınırlandırılmamı tır. Fakat T’deki skorlar bile enlerin konsantrasyonlarıyla orantılıdır.
Bazı verilerin sayısı (h) kalibrasyon basamakları içerisinde bir algoritma kullanılarak tayin edilir. Yeni koordinat sistemindeki spektral iddetler, ters en küçük kareler modelinde oldu ğu gibi analit konsantrasyonuna ba ğlanabilir:
C = TV + E c (29) 47
Burada C, bile en konsantrasyonlarının m x 1 vektörü, V, bile en konsantrasyonlarıyla spektral iddetleri bir araya getiren katsayıların h x 1 vektörü ve
Ec , analiz edilen bile iğin referans de ğerindeki hataların m x 1 vektörüdür.
V’ye göre en küçük kareler çözümü 27 e itli ğinin ters en küçük kareler yöntemindeki çözümüne benzer. Burada T matrisinin kolonları ortogonaldir. Diagonal (T ′ T) matrisi ihmal edilir ve v vektörü a ağıdaki gibi hesaplanır.
^ ′ –1 ′ v h = (T T) T C (30)
^ Burada v h , V’nin en küçük kareler de ğeridir. T ve B matrisleri istenen model elde edilene kadar basamaklar halinde (her defasında bir vektör) hesaplanır. Daha önce de söylendi ği gibi kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bile en regresyonu, T ve B matrislerinin yaratılması yönündeki farklılıklarla ayrılırlar. Temel bile en regresyonu modelinde NIPALS (Non-lineer Iterative Partial Least-squares) algoritması, ki bu WOLD (1966) tarafından kullanılmı tır, geli tirilir.
Kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bile en regresyonu gibi kalibrasyon yöntemlerine dayalı faktörlerin klasik en küçük kareler ve ters en küçük kareler gibi çok de ği kenli kalibrasyon yöntemlerindeki pek çok eksikli ği gidermesine ra ğmen bu yöntemler matematik açıdan spektral matrisin çözümü ve baz vektörlerin elde edilmesi açısından çok karma ıktır.
Temel bile en regresyonu yönteminin avantajları: a) Dalga boyu seçimi için özel kurallar gerekmez. Herhangi bir sayıdaki dalga boyu ki genellikle spektrumun tamamı veya geni bir bölgesi kullanılabilir. b) Çok sayıda dalga boyu seçimi gürültü piklerinin etkisinin minimuma indirilmesi için yararlıdır. c) Temel bile en analizi (TBA) yöntemindeki veriler ile sadece bizi ilgilendiren bile iğin kalibrasyonu için gerekli katsayıların hesaplanmasına imkan tanır. d) Çok karma ık karı ımlar için uygulanabilir bir yöntemdir. Çünkü yalnızca ilgilenilen bile en için gerekli bilgiler yeterlidir. 48
e) Bazen bu yöntem orijinal kalibrasyon kar ımlarında var olmayan di ğer bile enlerin miktarlarının tayini içinde kullanılabilir.
Temel bile en regresyonu yönteminin dezavantajları: a) Hesaplamalar klasik yöntemden çok yava tır. b) Hazırlanan modeller anla ılır olmaları ve yorumlanabilmeleri bakımından oldukça karma ıktır. c) Temel bile en analizinde elde edilen vektörler ilgilenilen bile iğe tam kar ı gelmeyebilir. d) Genellikle do ğru bir kalibrasyon elde edebilmek için çok sayıda standart numune gereklidir. e) Kalibrasyon numunelerinin hazırlanması zordur ve bile en konsantrasyonlarındaki ko-lineariteden kaçınmak gerekir.
2.1.2.2. Đstatistiksel de ğerlendirme
Her ayrılan numunenin konsantrasyonu onun orijinal de ğeriyle kar ıla tırılır ve tahmin hatası her ilave edilen faktör için THKT (Tahmin hatalarının karelerinin toplamı) tayin edilir. THKT, ölçümün kalibrasyon verilerine ne kadar uydu ğunu ifade eder.
m ^ 2 THKT = ∑ (ci – c i ) (31) i=1
^ Burada c i, i. numunenin referans (bilinen) konsantrasyonu; ci ise i. numunenin m kalibrasyon standardı için tahmin edilen konsantrasyondur.
Mutlaka THKT de ğerinin minimum olması gerekmez. Bununla birlikte bu de ğer kısmi en küçük kareler yöntemi faktörlerinin optimal seçimi için kullanılır. Çünkü minimum olursa sonuçların üst üste uyması, tahminde daha zayıf sonuçların elde edilmesine neden olur. 49
Kalibrasyondaki standart hata (KSH) uygunluk fonksiyonu olarak kullanılır ve en küçük kareler modelinde bilinen konsantrasyonlara göre hesaplanır. KSH, standart hatanın (SH)’nin bir türevidir.
m ^ 2 ∑ ( c i – c i ) i=1 SH = (32) D f
m ^ 2 ∑ ( c i – c i ) i=1 KSH = (33) m – 2 ^ Burada c i ve ci sırasıyla bilinen ve bulunan analit konsantrasyonunu ifade eder. m ise numune sayısıdır. E ğer lineer bir model kabul ediliyorsa ki bunda iki parametre (e ğim ve kesim) söz konusudur, bu durumda serbestlik derecesi (D f ) m-2’ye e it olur.
Yöntemlerin ba arısı validasyon setlerindeki tahmin modellerine ba ğlıdır ve bu tahminin standart hatası (TSH) olarak verilir.
m ^ 2 ∑ ( c i – c i ) i=1 TSH = (34) m Burada m kalibrasyon numunelerinin sayısını ifade eder.
Kemometri ile ilgili teorik bölümün hazırlanmasında Haaland ve Thomas 1988 yılında yayınlanan “Partial least-squares methods for spectral analyses. 1. Relation to other quantitative calibration methods and the extraction of qualitative information” isimli makalesinden, Brian C. Smith’in 2002 yılında basılan “Quantitative Spectroscopy: Theory and Practice (Academic Press; An Elsevier 50
Science Imprint (California, USA)” isimli kitabından, Matthias Otto’nun 1999 yılında basılan “Chemometrics : Statistics ad Computer Application in Analytical Chemistry (WILEY-VCH, Germany)” kitabından ve Özdemir, 1999 (DOKTORA TEZ Đ); bilgilerden yararlanılarak hazırlanmı tır.
2.1.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
Kromatografi, karı ım halinde bulunan bir örnekteki bile enlerin ayrılması, tanınması ve tayini için kullanılan yöntemlerin genel adıdır. Bütün kromatografik ayırmalarda numune gaz, sıvı veya süperkritik akı kanı olan hareketli faz ile ta ınır. Bu hareketli faz bir kolonda veya bir katı yüzeyde sabitle tirilmi kendisi ile karı mayan bir durgun faz içinden geçmeye zorlanır. Bu iki faz, numune bile enlerinin hareketli ve sabit fazlarda farklı oranlarda da ğıtılaca ğı ekilde seçilir. Sabit faz tarafından kuvvetli tutulan numune bile enleri, hareketli fazın akı ıyla çok yava hareket ederler. Buna kar ılık sabit faz tarafından zayıfça tutulan bile ikler hızlı hareket ederler. Bu hareket hızlarının farklılı ğı sonucu, numune bile enleri birbirlerinden kalitatif veya kantitatif olarak analizlenebilen farklı bantlar veya bölgeler eklinde ayrılırlar.
Kromatografik yöntemler iki ekilde sınıflandırılabilir. Đlk sınıflandırma, sabit fazın birbirleri ile temas ettirilmesi için uygulanan fiziksel ekle göre yapılır. Kolon kromatografisinde, sabit faz dar bir kolon içinde tutulurken hareketli faz basınç altında veya yerçekimi etkisi ile sabit faz arasından geçmeye zorlanır. Düzlemsel kromatografide ise sabit faz düz bir plaka üzerine veya bir ka ğıdın gözeneklerine tutturulur. Burada hareketli faz, sabit faz boyunca kapiler etkisi veya yerçekimi etkisi ile hareket eder. Kromatografinin daha temel bir sınıflandırması kullanılan durgun ve hareketli fazların tipleri ve fazlar arasında madde aktarımını sa ğlayan dengelerin cinslerine göre yapılır. Bu sınıflandırma a ağıdaki gibidir.
1. Sıvı Kromatografi Sıvı – sıvı veya da ğılma Sıvı – katı veya adsorbsiyon Đyon de ği imi Boyut eleme 51
2. Gaz Kromatografi Gaz – sıvı Gaz – katı
Sıvı kromatografi:
Daha önce de anlatıldı ğı gibi hareketli fazı sıvı olan kromatografi çe itleri da ğılma kromatografisi, adsorbsiyon kromatografisi veya sıvı – katı kromatografi, iyon de ği imi kromatografisi ve boyut eleme veya jel kromatografisidir.
Tswett’in orijinal çalı maları da dahil ilk sıvı kromatografi, çapı 1- 5 cm ve uzunlu ğu 50 – 500 cm olan cam kolonlarında uygulanmı tır. Uygun akı hızları temin etmek için, katı sabit fazı olu turan partiküllerin çapı, genellikle 150 – 200 µm aralı ğındaydı. Bu durumda bile, akı hızları dü üktü. Ayırma zamanları çok uzundu ve ço ğu zaman birkaç saat alıyordu. Bu klasik kromatografi i lemlerini hızlandırmak için vakum veya basınç uygulama giri imleri de ayırma veriminin dü mesinden dolayı yararlı olmadı. Sıvı kromatografinin geli ti ği ilk yıllarda, bilim adamları, kolon veriminin, dolguda kullanılan tanecik boyutunun azaltılması ile önemli ölçüde artaca ğını göstermi lerdir. Bu teknoloji, klasik yer çekimi – akı lı sıvı kromatografinin basit cam kolonlardaki durumun aksine, yüksek basınçta çalı an, geli mi cihazlara ihtiyaç göstermekteydi. Böylece YPSK ismi, preparatif amaçla kullanılan temel yöntemlerden, daha yeni i lemleri ayırt etmek için kullanılmaya ba landı.
YPSK bütün analitik ayırma teknikleri arasında en yaygın kullanılanıdır. Yöntemin bu kadar yaygın olmasının sebepleri, duyarlılı ğı, kantitatif tayinlere uygulanabilir olması, uçucu olmayan türlerin veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen türlerin ayrılmasına uygun olması ve sanayinin, birçok bilim dalının ve halkın birinci derecede ilgilendi ği ilaçlar ve gıda bile enleri gibi maddelere geni bir ekilde uygulanabilirli ğidir.
Kolon teknolojisindeki geli meler, yüksek basınçlı pompa sistemleri ve hassas dedektörler sıvı kolon kromatografi yöntemini yüksek hızlı ve yüksek performanslı 52
ayırma kapasitesine ula tırmı tır. Kolon teknolojisinde 2-5 mm çapında kolonlar ve
3-5 µm çapında küçük taneciklerin kullanılır. Böylece mobil ve sabit faz arasında çok hızlı denge kurulur. Bu küçük tanecikli kolonlar için mobil fazı ml/dk akı hızında akıtabilmek için 300 atm basıncı sa ğlayabilen pompa sistemleri gerekir.
Ayrıca µg seviyesinde analiz edilecek madde kullanıldı ğı için hassas dedektörlere gerek vardır. Bu teknoloji ile yüksek hızda ayrım sa ğlanabilir ki uçucu olmayan veya sıcakta bozunan maddelerin parçalanmadan veya bunların uçucu türevlerinin hazırlanmasına gerek kalmadan bu yöntemle gaz kromatografisine üstünlükleri ile ayrım sa ğlanabilir. Ayrıca özel artlarda preparatif olarak da çalı ılabilir.
Sabit faz, sıvı veya polimerlerin katı tanecikler üzerine ince bir film tabakası olarak kaplanması veya kimyasal olarak ba ğlanması ile meydana gelir. Böylece sabit ve mobil faz arasında kütle transferi direncini azaltarak hızlı bir dengenin meydana gelmesi sa ğlanır.
53
Sıvı kromatografisi cihazları
ekil 2.6. Bir YPSK cihazının eması (SKOOG, WEST, HOLLER, 1998)
Hareketli faz (mobil faz) hazneleri ve çözücü muamele sistemleri
Modern bir YPSK cihazı, bir veya daha fazla her biri 200 – 1000 mL çözücü içeren camdan veya çelikten yapılmı hazne içermektedir. Bu hazneler ço ğunlukla kolonda veya dedektör sisteminde gaz olu turarak bozucu etkilere sebep olan çözünmü gazların giderilmesi için bir cihazla donatılmı tır. Ço ğunlukla bu sistemler, çözücü içinde bulunabilecek toz ve partikül halindeki maddelerin pompaya veya enjeksiyon sistemine zarar vermemesi veya kolonu tıkamaması için toz ve partikül maddeleri süzmeye yarayan bir süzme düzene ği de içerirler.
Sabit bile imdeki tek bir çözücü kullanılarak yapılan bir ayırma izokratik elüsyon olarak adlandırılır. Gradient elüsyonda ise polariteleri önemli derecede birbirinden farklı iki veya üç çözücü sistemi kullanılır. Modern YPSK ekipmanları ço ğu zaman çözücülerin hacimsel oranı zamanla do ğrusal olarak veya üstel olarak de ği tirilebilecek ekilde iki veya daha fazla hazneden aldı ğı çözücüleri bir karı tırma odasında sürekli olarak de ği en hızlarda bir araya getiren sistemlerle donatılmı tır. 54
Pompalama sistemleri
Bir YPSK pompalama sistemi için gerekli artlar unlardır.
1) 400 atm’ye kadar basınç üretimi 2) Puls içermeyen basınç çıkı ı 3) 0.1 – 10 mL/dakika aralı ğında akı hızları 4) % 0.5 veya daha iyi bir tekrarlabilirlikle akı kontrolü 5) Korozyona dayanıklı parçalar Üç tip pompa vardır:
• Pistonlu pompalar: Genellikle motor kontrollü bir pistonun ileri ve geri hareketiyle çözücünün pompalandı ğı küçük bir silindirden meydana gelmi tir. • Sürgülü pompalar: Bir kademeli motordan güç olan vidalı güdüm mekanizması ile kumanda edilen sızdırmaz bir sürgüsü olan ırınga benzeri silindirik bir kaptan ibarettir. • Pnömatik Pompalar: Sıvı hareketli, sıkı tırılmı bir gaz ile basınçlandırılabilen bir kap içine yerle tirilmi , portatif bir kap içine konur.
Birçok YPSK cihazı çözücünün bile imini ya sürekli ya da basamaklı olarak de ği tiren bir sisteme de sahiptir. Bu sistemde bilgisayarla kontrol edilen, pompa çıkı ına yerle tirilmi bir geri tepme tıkacı boyunca basınç dü mesini belirleyerek akı hızını ölçen bir sistemle donatılmı tır.
Numune enjeksiyon sistemleri
Daha önceki ırınga ile basit bir enjeksiyon sistemini takiben olu turulan akı durdurma enjeksiyonunda tekrarlanabilirli ğin kötü olmasından dolayı, günümüzde en yaygın olarak kullanılan yöntem numune giri sarımlarının kullanılması esasına dayanmaktadır. Bu sarımlar de ği tirilebilir nitelikte olup 5 µL’den 500 µL’ye kadar de ği en hacimlerde numune hacmi seçimine olanak tanımaktadır ve iyi bir tekrarlanabilirlik vermektedir. 55
Sıvı kromatografi kolonları
Sıvı kromatografi kolonları normal olarak düzgün iç çaplı paslanmaz çelik borulardan yapılır, ancak ara sıra kalın cidarlı cam borular da kullanılır. Sıvı kromatografi kolonlarının büyük bir ço ğunlu ğu 10 – 30 cm arasındadır. Kolonların iç çapı ço ğu zaman 4 – 10 mm ve yaygın olarak kullanılan birçok kolon dolgu maddesinin tanecik büyüklü ğü 5 – 10 µm arasındadır. Son yıllarda üreticiler iç çapı 1 – 4.6 mm ve 3 – 5 µm tanecik büyüklü ğüne sahip dolgu materyali ile doldurulmu kolonlar üretmektedirler. Bu kolonların yüksek tabaka sayısı, hız ve minimum çözücü sarfiyatı gibi avantajları vardır.
Analitik kolonun ömrünü artırmak amacıyla analitik kolondan önce genellikle kısa bir kolon yerle tirilir. Emniyet kolonu olarak da adlandırılan bu kolonların görevi sadece partikül haldeki maddeleri ve çözücü içindeki yabancı maddeleri tutmak de ğil, aynı zamanda numune içinde bulunan ve sabit faza tersinmez olarak ba ğlanan bile enleri de tutmaktır. Đlave olarak hareketli fazı sabit faz ile doyurarak analitik kolondaki çözücü kaybının en aza indirilmesini sa ğlar.
Gerekli oldu ğu zaman kolon sıcaklı ğının uygun olarak ayarlandı ğı zamanlarda daha iyi kromatogramlar elde edilmektedir. Birçok modern cihaz bu nedenden dolayı kolon sıcaklı ğını ayarlayabilecek kolon ısıtıcıları ile donatılmı tır.
Sıvı kromatografide temel olarak iki tip kolon dolgu maddesi kullanılmaktadır. Bunlar film dolgular ve gözenekli dolgulardır. Film dolgular küresel, gözeneksiz, çapları 30 – 40 µm olan cam veya polimer tanelerinden olu ur. Bu tanelerin yüzeyine silis, alumina, polistiren – divinil benzen sentetik reçinesi veya bir iyon de ği tirici reçineden olu an ince gözenekli film ile kaplanmı tır. Gözenekli partiküller ise çapları 3 – 10 µm arasında olan gözenekli partiküllerdir. Partiküller silis, alumina, polistiren divinil benzen sentetik reçinesi veya bir iyon de ği tirici reçineden meydana gelmi tir. Silis, sıvı kromatografide en yaygın kullanılan bir dolgu maddesidir ve elde edilen partiküller ço ğu zaman, yüzeye kimyasal olarak veya fiziksel ba ğlanan, ince bir organik film ile kaplanır.
56
Dedektörler
Sıvı kromatografi dedektörleri temel olarak iki tiptir. Yı ğın özelli ği dedektörleri hareketli fazın kırma indisi, dielektrik sabiti ve yo ğunlu ğu gibi analit tarafından de ği tirilen yı ğın özelliklerine cevap veren detektörlerdir. Bunun tersine analit özelli ği dedektörleri, analitin UV absorbansı, floresans iddeti veya difüzyon akımı gibi hareketli fazın sahip olmadı ğı, bazı özelliklerine cevap veren dedektörlerdir.
• Absorbans Dedektörleri: Kromatografik kolondan çıkan elüentlerin absorbans ölçümü için içinden aktı ğı, Z eklindeki tipik bir akı hücresinden ibarettir. Filtreli absorbans dedektörlerinin en basiti bir civa lambası kullanılan filtreli fotometrelerdir. Giri im filtresi bulunan döteryum veya tungsten telli ı ın kaynakları da, bir kolondan elüe edilen absorblayıcı türlerin te hisi için basit araçlardır. Monokromatörlü ultraviyole absorbans dedektörleri optik a ğlı spektrofotometreden olu maktadır. En güçlü ultraviyole spektrofotometrik dedektörler spektrumun tamamı için gerekli olan verileri yakla ık bir saniyede toplayabilecek diyod serili cihazlardır. Đnfrared absorbsiyon dedektörlerinden ilki dalga boyu taraması üç tane yarı dairesel filtre kanalları ile yapılan cihazlardır. Di ğeri ise fourier dönü ümlü cihaza benzer olan infrared dedektörlerdir. • Floresans dedektörler: Bunların ço ğunda floresans, uyarıcı ı ına 90 derecede yerle tirilmi bir fotoelektrik dedektör yardımıyla gözlenmektedir. En basit dedektörlerde uyarıcı ı ık kayna ğı olarak civa lambası ve yayılan ı ınların belli bir bandın izole etmek için bir veya birkaç filtre kullanılır. Daha geli mi cihazlar, kaynak olarak ksenon lambası ve floresans ı ımasını izole etmek için ise optik a ğ monokromatör kullanır. • Kırılma indisi dedektörü: Bu dedektörde çözücü kolonun yolu üzerinde bulunan hücrenin bir yarım bölmesinden geçer; elüent ise daha sonra di ğer bölmenin içinden geçer. Bu iki bölme, iki çözeltinin kırma indisi birbirinden farklı ise, gelen ı ın kırılacak ekilde uygun bir açıda yerle tirilmi bir cam plaka ile ikiye ayrılmı tır. Fotoduyarlı dedektörün yüzeyine gelen ı ın demetinin yolundan sapması, çıkı sinyalinin de ği mesine sebep olur, bu de ği iklik yükseltilerek kaydedildi ğinde kromatogram elde edilir. 57
• Buharla tırmalı ı ık saçma dedektörleri (Evaporation light scattering dedector): Kolondan çıkan çözelti, bir sisle tirici içinden geçirilmekte ve burada azot veya hava akımı ile çok ince sis haline dönü türülmektedir. Küçük damlalar daha sonra, hareketli fazın buharla tı ğı ve tayin edilecek maddenin çok küçük partiküllerinin olu tu ğu sıcaklık kontrolü sürükleme borusuna gönderilir. Tayin edilecek maddenin olu turdu ğu partikül bulutu, daha sonra bir lazer ı ın demetinin içinden geçirilir. Akı yönüne dik açıda saçılan ı ınlar bir silisyum fotodiyod dedektör yardımıyla ölçülür.
• Elektrokimyasal dedektörler: Günümüzde çe itli tipteki elektrokimyasal dedektörler amperometri, polarografi, kulometri ve kondüktometri esasına göre çalı maktadır. Bu dedektörler duyarlılık, basitlik, kullanı lılık ve yaygın kullanım alanı gibi çe itli avantajlar sunmaktadır.
• Kütle spektrometrik dedektörler: Kütle spektrometre dedektörleri son zamanlarda peptitler ve nükleotitler gibi uçucu olmayan ve termal olarak kararlı, geni bir madde grubu için spektrumlar veren dedektörlerdir. Bu dedektörler kullanıldı ğında gözlenebilme sınırının 1 – 10 pg’a kadar dü tü ğü rapor edilmi tir. Son zamanlarda hem elektron impakt hem de kimyasal iyonla ma spektrumu elde etmeyi mümkün kılan yeni tip ba ğlantılar piyasaya çıkmı tır.
Da ğılma Kromatografisi
Da ğılma kromatografisi dört ayrı tip sıvı kromatografi içinde en yaygın kullanılanıdır. Dü ük ve orta mol kütleli iyonik olmayan polar moleküllerin bu yöntemle analizi yanında son yıllarda türev hazırlama ve iyon çifti olu turma gibi teknikler kullanılarak iyonların ayrılması içinde yöntemler geli tirilmi tir. Da ğılma kromatografisi sıvı – sıvı ve ba ğlı – faz kromatografi olmak üzere iki alt sınıfa ayrılabilir. Sıvı – sıvı kromatografide sıvı bir sabit faz dolgu maddesinin yüzeyine fiziksel absorpsiyonla tutturulmu tur. Dezavantajlarından dolayı daha sonra ba ğlı faz da ğılma kromatografisi yöntemi geli tirilmi tir. Ba ğlı faz dolgu maddelerinin büyük 58
bir kısmı için kullanılan destek katıları rijit silis veya silis esaslı bile imlerden hazırlanmaktadır. En kullanı lı ba ğlı – faz kaplaması hidrolizlenmi yüzeyin organoklorosilan ile reaksiyonundan meydana gelen siloksanlardır.
Da ğılma kromatografisi, hareketli ve sabit fazların ba ğıl polarlı ğına ba ğlı olarak iki kısma ayrılır. Sıvı kromatografi ile yapılan ilk çalı malar, silika veya alümina partiküller üzerine tutturulmu su veya trietilenglikol gibi oldukça polar sabit faz ve heksan veya i-propil eter gibi nispeten az polar çözücüler kullanılmaktaydı. Bu tip kromatografi normal kromatografi olarak adlandırılmaktadır. Ters faz kromatografide sabit faz polardır ve ço ğu zaman bir hidrokarbondur. Hareketli faz ise su, metanol veya asetonitril gibi polar çözücülerden meydana gelmektedir. Ters faz kromatografide kaplamalardaki siloksandaki R grubu bir C 8 veya C 18 zinciridir. Piyasada bulunan normal – faz ba ğlı dolgu maddelerinde siloksan yapısındaki R, siyano, diol, amino ve dimetilamino gibi polar fonksiyonlu bir gruptur. Normal faz kromatografide en dü ük polaritedeki bile enler hareketli fazda nispeten çok çözündükleri için en önde elüe edilirler ve hareketli fazın polaritesindeki artı elüsyon zamanının azalması ile sonuçlanır. Bunun aksine ters – faz yönteminde en çok polar bile enler en önde yürür ve hareketli fazın polaritesindeki artı , elüsyon zamanını artırır.
Adsorbsiyon Kromatografisi
Adsorbsiyon veya sıvı – katı kromatografi yirminci yüzyılın ba larında Tswett tarafından ilk olarak ortaya atılan klasik bir sıvı kromatografi tipidir. Bu yöntemde kullanılan sabit fazlar sadece silis ve alüminadır. Đlk sabit faz, yüksek numune kapasiteli ve kullanı lı de ği ik tipleri oldu ğu için uygulamaların ço ğunda tercih edilmektedir. Bu kromatografi çe idi mol kütlesi yakla ık 5000’den küçük olan polar olmayan bile ikler için en uygundur. Genellikle polar olmayan çözücülerde çözülebilen ve ters – faz da ğılma kromatografide kullanılan sulu çözücülerde sınırlı çözünürlü ğü olan numuneler için en uygun yöntemdir. Adsorbsiyon kromatografinin di ğer yöntemlerde görülmeyen özel bir gücü, izomerik karı ımların bile enlerini ayırma kabiliyetidir. 59
Đyon – De ği tirme Kromatografi
Ço ğu zaman iyon kromatografi olarak da adlandırılan bu kromatografi çe idi iyon de ği tirici reçinelerin kullanımına dayanan iyonların ayrılması ve tayini için modern ve etkili bir yöntemdir. Daha önceden bu teknikte kullanılan stiren ve divinilbenzenin kopolimerizasyonu ile olu an gözenekli polimerik taneciklerin, analit moleküllerin mikrogözeneklerden geçmesi, polimer matriksindeki difüzyonun yava olması ve matriksin sıkı tırılabilmesinden dolayı yeni tip dolgu maddeleri geli tirilmi tir. Bunlardan biri yüzeyi ba ğıl olarak büyük, gözenekli olmayan küresel sentetik iyon de ği tirici reçine ile kaplanmı cam veya polimer tanelerden meydana gelen zar kaplamalı yatak dolgusudur. Đkinci bir tipteki dolgu maddesi, adsorbsiyon kromatografide kullanılan silisten ibaret gözenekli mikropartiküllerin, iyon de ği tiricinin ince bir filmi ile kaplanmasıyla hazırlanır. Đyon de ği tirme kromatografinin inorganik uygulamaları elüent baskılayıcı kolonlu iyon – de ği tirme kromatografi ve tek kolonlu iyon kromatografi kullanılarak gerçekle tirilir. Bu kromatografi çe idi ilaçlar ve bunların metabolitleri, serumlar, gıda koruyucu maddeler, vitamin karı ımları, ekerler ve farmasötik preparatlar gibi çok farklı organik ve biyokimyasal sistemlere uygulanmaktadır.
Đyon eleme kromatografi, iyonlardan çok nötral türlerin ayrılmasından dolayı tam bir iyon kromatografisi çe idi olmamasına ra ğmen, iyon – de ği tirici kolonlar kullanılmaktadır. Bu kromatografi çe idi iyon – eleme kromatografi süt, kahve, arap ve di ğer ticari ürünler gibi çok sayıdaki maddenin te hisi ve tayini için kullanılabilir.
Boyut Eleme Kromatografi
Jel geçirgenlik veya jel süzme kromatografi adı da verilen bu kromatografi çe idi özellikle yüksek mol kütleli türlere uygulanabilen güçlü bir tekniktir. Dolgu maddeleri, çözünen madde ve çözücü moleküllerinin içine difüzlenebilece ği düzgün bir gözenek a ğı içeren küçük boyutlu silis veya polimer partiküllerden meydana gelmi tir. Gözenekler içinde moleküller etkin bir ekilde yakalanır ve hareketli faz akımı ile uzakla tırılır. Gözenek içinde ortalama kalma süresi, analit molekülünün etkin büyüklü ğüne ba ğlıdır. 60
Jel süzme kromatografisinde sulu çözücüler ve hidrofilik dolgu maddeleri kullanılırken, jel süzme kromatografisinde polar olmayan organik çözücüler ve hidrofobik dolgu maddeleri kullanılır. Eleme sınırı birkaç bin olan bir jel, proteinleri, amino asitlerden ve dü ük mol kütleli peptitlerden kolayca ayrılabilir. Di ğer uygulamaları ise, homologların ve oligomerlerin ayrılması, büyük polimer veya do ğal ürünlerin mol kütlelerinin veya mol kütlesi da ğılımının hızlı bir ekilde tayin edilmesidir.
2.1.3.1. Sistem Uygunluk Testleri
Kromatografik yöntemlerin kabul edilebilir do ğruluk ve kesinlikte oldu ğunu belirten Sistem Uygunluk Testleri (SUT) için gerekli i lem ve hesaplamalar yöntem geli tirilmesi ve validasyon i lemlerinin tamamlanmasından sonra veya i lemler sırasında yapılır.
Avrupa Farmakopesi tarafından tanımlanan SUT parametreleri
• Teorik Tabaka (Plaka) sayısı (N) • Kuyruklanma Faktörü (T) • Kapasite Faktörü (k) • Seçicilik faktörü ( α) • Ayırım Gücü (Resolution) (Rs) • Pik yüksekli ği veya alanının % Ba ğıl standart sapması • Cihaz tekrarlanabilirli ği Bu kriterlerden en az 2 tanesinin gerekli artları sa ğlaması yöntemin sistem uygunlu ğunu göstermektedir.
Teorik Tabaka Sayısı (N)
Kolonun en önemli parametresidir. Kolondan çıkan pikin sivri ve dar olması ve piklerin birbirlerinden iyi ayrılması ile ilgilidir. N’in sayısal de ğeri, analizi yapılan maddenin cinsine ba ğlı oldu ğu gibi, deney ko ullarına, akı hızı, sıcaklık, kolon 61
kalitesi ve dolumun tek biçimlili ği gibi çe itli faktörlere de ba ğlıdır. Tavsiye edilen de ğer N> 2000’dir.
Alıkonma zamanı
Pik geni li ği
ekil 2.7. Teorik tabaka sayısı hesabını gösterir kromatogram (KAZAKEVICH ve LoBRUTTO, 2007)
2 tR N = 16 W
tR: Maddenin alıkonma zamanı
W : Elde edilen pikin taban geni li ği
Kuyruklanma faktörü (T) ve Asimetri faktörü (A S)
Bu faktör pikin simetrik olması ile ilgilidir. Çalı malarda daima simetrik pikler seçilmelidir. Simetrik olmayan piklerde;
1. Do ğru olmayan tabaka sayısı ve ayırım gücü sonuçları 2. Kararlı olmayan miktar tayinleri 3. Gözlemlenemeyen pik kuyruklanmaları 4. Alıkonmanın tekrarlanabilirli ğinin dü ük olması gibi sorunlarla kar ıla ılır. 62
Pik asimetrisi taban yüksekli ğinin % 10’u civarında, kuyruklanma faktörü ise % 5’i civarında ölçülür. Uygun de ğerler pik asimetrisi için 0.95 – 1.2 arasında, kuyruklanma faktörü için ise 2’nin altında olmasıdır.
Pik Pik kuyru ğu önü
Pik maksimumu
ekil 2.8. Pik asimetri faktörü ve kuyruklanma faktörü hesabını gösterir kromatogram (USP 23, NF 18, 1995)
Kapasite Faktörü (k’)
Analizi yapılan maddelerin alıkonma zamanları veya alıkonma hacimleri yardımı ile hesaplanır. Kolonun performansı ve alıkonmanın uzun süreli tekrarlanabilirli ği ile ilgilidir.
ekil 2.9. Kapasite faktörü hesabını gösterir kromatogram (SKOOG, WEST, HOLLER, 1998) 63
t − t V −V k′ = r 0 = r 0 t0 V0
tr/V r : Maddenin alıkonma zamanı / hacmi t0/V 0 : Hareketli fazın alıkonma zamanı / hacmi
Elde edilen bu de ğerin genel çalı malarda 2 – 8 arasında, eser madde miktar tayininde 1 – 3 arasında, stabilite belirleyici çalı malarda ise 4’ten büyük olması istenir.
Seçicilik Faktörü ( α) Ba ğıl alıkonmayı ifade eder.
t −t α = 2 0 t1 −t0
t1: 1. maddenin alıkonma zamanı t2: 2. maddenin alıkonma zamanı t0: Hareketli fazın alıkonma zamanı 2 pikin elde edildi ği sistemlerde kullanılır. Genel olarak bu de ğerin 1’den büyük olması istenir.
Ayırım Gücü (Resolution (R S))
Ayırım kantitatif kromatografi çalı malarının ba lıca gereklili ğidir. Genellikle 5 veya daha az madde içeren numunelerde bu de ğerin 1.5’dan büyük olması kolaylıkla sa ğlanabilir. Bu sonuç, maksimum kesinli ğin göstergesidir. Ayırım gücü, bir kolonun eskili ğini, günler arası ayırım artlarındaki de ği iklikleri gösterir.
64
ekil 2.10. Rezolüsyon faktörünün kromatogramlara göre de ği imi (SKOOG, WEST, HOLLER, 1998)
(2 t2 −t1) Rs = W1 +W2
t1: 1. maddenin alıkonma zamanı t2: 2. maddenin alıkonma zamanı
W1: 1. maddenin taban geni li ği
W2: 2. maddenin taban geni li ği Genel ayırımlarda bu de ğer 2’nin, miktar tayini çalı malarında 1.5’un, biyolojik sıvılardan yapılan çalı malarda 1.2’nin üstünde olması kabul edilebilir de ğerlerdir.
Cihaz, Pik Alanı veya Yüksekli ğinin Tekrar Edilebilirli ği
En az 6 defa tekrarlanan deneyler sonucu elde edilen pik alanı veya yüksekliklerinin ba ğıl standart sapmalarının hesaplanması ile elde edilir. Genel ayırımlarda % ba ğıl standart sapma de ğerinin 1.5’un, biyolojik sıvılardan yapılan çalı malarda 5.0’ın altında olması ve eser madde miktar tayininde 5 – 15 arasında 65
olması istenen de ğerlerdir. Cihaz tekrarlanabilirli ği için alıkonma zamanlarının % ba ğıl standart sapmasının 5’den daha çok sayıda tekrar edilen enjeksiyonlar için % 1’den küçük olması istenir.
66
2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Orijinleri
1. Estradiol valerat…………………… Eczacıba ı
2. Dienogest…………………………...Schering
3. Metanol……………………………..Riedel
4. Asetonitril………………………… LabScan
5. NH 4NO 3………………………….…Merck
Bu etken maddeler ve çözeltiler ayrıca bir safla tırma i lemi uygulamaksızın do ğrudan deneylerde kullanılmı tır
2.3. Kullanılan Cihazlar
1. UV-Visible spektrofotometre : SHIMADZU UV – 1601
2. Manyetik Karı tırıcı : VELP SCIENTIFICA ARE
3. IR spektrofotometre : JASCO FT/IR – 420 Fourier
4. Erime noktası tayin cihazı : BUCHI SMP – 20
5. Terazi : OHAUS ADVENTURER-PRO
6. pH metre : WTW pH 538
7. YPSK : Agilent 1100
8. Ultrasonik banyo : P SELECTA
2.4. Kullanılan Bilgisayar Programları
1. Multivariate Analysis Add-in for MS Excel v1.3 software (Brereton, 2002)
2. UV-PC 1601
3. Microsoft Excel 2003 67
4. Microsoft Word 2003
2.5. Kullanılan Bilgisayar Konfigürasyonu
Intel® Celeron® CPU 2,26 GHz, 1 GB RAM Masaüstü Bilgisayar
2.6. Üzerinde Çalı ma Yapılan Farmasötik Preparat
CLIMODIEN ® Draje (Schering) (71112 E)
Estradiol valerat………2 mg
Dienogest …………….2 mg / draje
2.7. Standart Maddelerin Stok Çözeltileri
2.7.1. Türev spektrofotometride
Estradiol valerat; metanol - su (3:1, v/v) karı ımı içerisinde 250 mg / 500 mL çözeltisi
Dienogest; metanol - su (3:1, v/v) karı ımı içerisinde 20 mg / 100 mL çözeltisi
2.7.2. Kemometrik yöntemlerde
Estradiol valerat için; metanol - su (3:1, v/v) karı ımı içerisinde 250 mg / 500 mL çözeltisi 68
Dienogest için; metanol - su (3:1, v/v) karı ımı içerisinde 20 mg / 100 mL çözeltisi
2.7.3. YPSK de
Estradiol valerat; asetonitril içerisinde 25 mg / 100 mL çözeltisi
Dienogest; asetonitril içerisinde 10 mg / 100 mL çözeltisi
Siproteron asetat; asetonitril içerisinde 5 mg / 100 mL çözeltisi
3.33 x 10 -2 M amonyum nitrat çözeltisinin hazırlanması (pH:5.4): 1.3356 gram
NH 4NO 3 bir miktar suda çözülür ve 500 mL’ye tamamlanır.
69
3. BULGULAR
3.1. Kullandı ğımız Etken Maddelerin Saflık Kontrolleri
Deneylerde kullanılan standart maddeleri saflık kontrolleri için; erime noktaları, UV spektrumları ve IR spektrumları alınmı ve referanslarla kar ıla tırılmı tır.
3.1.1. DNG için saflık kontrolü
UV spektrumu : DNG ’in metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltisinin 200 – 400 nm arasındaki spektrumu ekil 3.1’de görülmektedir. Bu spektrumda 215.6 nm ve 308.0 nm’de iki tane maksimum 258.2 nm’de bir adet minimum görülmektedir.
IR spektrumu : KBr diski halinde basılmı DNG ’in 400 – 4000 cm-1 arasındaki IR spektrumunda temel pikler görülmü tür. ( ekil 3.2)
Erime Noktası : DNG ’in erime noktası 204 – 214 oC aralı ğındadır.
3.1.2. EV için saflık kontrolü
UV spektrumu : EV ’ın metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltisinin 200 – 400 nm arasındaki spektrumu ekil 3.3’de görülmektedir. Bu spektrumda 207.4 ve 278.8 nm’lerde iki adet maksimum ve 246.4 nm’de bir adet minimum gözlenmektedir.
IR spektrumu : KBr diski halinde basılmı EV ’ın 400 – 4000 cm -1 arasındaki IR spektrumunda temel pikler 1245, 1054, 1227, 1493, 1276, 821 cm -1’de görülmektedir ( ekil 3.4). Bu da referansla uyum göstermi tir (ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS, CLARKE’S).
Erime Noktası: EV’ın erime noktası 144 oC’dir.
70
ekil 3.1 . Metanol-su (3:1) içerisinde 12 µg/mL DNG çözeltisinin UV absorpsiyon spektrumu
71
ekil 3.2. DNG ’in IR spektrumu 71
72
ekil 3.3 . Metanol - su (3:1) içerisinde 120 µg/mL EV çözeltisinin UV absorpsiyon spektrumu
73
ekil 3.4. EV ’ın IR spektrumu 73
74
3.2. Kemometrik Tekniklerle Spektroskopik Verilerin De ğerlendirilmesi Yöntemleri ile Elde Edilen Sonuçlar
3.2.1. Kemometrik çalı malar
Estradiol Valerat ( EV ) ve dienogest ( DNG )’in metanol – su (3:1) karı ımı içerisindeki çözeltilerinin 200-400 nm arasındaki UV spektrumları ( ekil 3.5) çizdirildi ğinde 200-300 nm’ler arasında EV ve DNG ’in spektrumlarının giri im yaptı ğı görülmektedir. Dolayısıyla karı ımlarında her iki etken maddenin aynı anda hiçbir ayırma i lemi gerekmeksizin miktar tayinlerinin do ğrudan bu spektrum aralı ğında absorbans de ğerlerinin ölçülmesi ile yapılması mümkün de ğildir. ekil 3.5 de görüldü ğü gibi 300-360 nm arasındaki bölgede DNG’ in EV ’ın giri imi olmaksızın do ğrudan absorbans de ğerinin ölçülmesiyle tayini yapılabilmesine ra ğmen EV için böyle bir aralık bulunmamaktadır. Bu nedenle karı ımlarında DNG ve EV ’ın, miktar tayinlerinin bu iki maddenin karı ımlarının çözeltilerinde okunan absorbans de ğerlerinin kemometrik yöntemler kullanılarak de ğerlendirilmesi ile yapılabilece ği dü ünülmü tür. Bu amaçla TBR ve KEK yöntemleri uygulanmı ve bu yöntemlerden iyi sonuçlar alınmı tır.
a b
ekil 3.5. Metanol - su (3:1) içerisinde a) 120 µg/mL EV , b) 12 µg/mL DNG çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
75
3.2.2. Dienogest – Estradiol Valerat Karı ımında Dienogest ve Estradiol Valerat’ın, TBR Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde Kullanılması ile Miktar Tayini:
Öncelikle; dalga boyu aralı ğı ve λ belirlenmesi için çalı malar yapılmı tır. Bu çalı malar sonucunda bu yöntemden en iyi sonuçların; DNG için 300 -350 nm aralı ğında λ = 1 nm aralıkla 51 dalga boyunda, EV için ise 260-300 nm aralı ğında λ = 1 nm aralıkla 41 dalga boyunda absorbans de ğerlerinin ölçülmesi ile elde edildi ği bulunmu tur.. Bu karı ımda her iki maddenin de miktar tayini için EV ve DNG nin metanol - su (3:1) içerisinde de ği ik konsantrasyonlarındaki karı ım çözeltilerinden hazırlanan kalibrasyon setine (Çizelge 3.1) temel bile en regresyonu yöntemi paket programlar kullanılmak suretiyle uygulanmı ve kalibrasyon verileri elde edilmi tir.. Kalibrasyon seti hazırlanırken kullanılan karı ım konsantrasyonları Çizelge 3.1’de gösterilmi tir.. Yapılan çalı malarda 25 karı ım numunesinde 2 temel bile en alındı ğında DNG , 5 temel bile en alındı ğında EV için en iyi sonuçların elde edildi ği bulunmu tur. Bu yöntemde lineer kalibrasyon aralı ğının DNG için 2.0 – 24.0 µg/mL, EV için ise 20.0 – 270.0 µg/mL oldu ğu saptanmı tır.
Yöntemde tayin alt sınırı (TAS) DNG ve EV için sırasıyla 2.0 g/mL ve 20.0 g/mL olarak seçilmi yakalama sınırı (YS) ise DNG için 0.2 g/mL ve EV için 2.5 g/mL olarak bulunmu tur. TAS hesaplamasında RIBONE ve ark. 2001 ın çalı masındaki i lemler temel alınmı tır. Bu i lemler: TAS = 3 || ε || || b || den hesaplanmı tır.
Bu paket programlar içerisinde en iyi sonucu alabilmek için ön i lem yapmadan, ortalama merkezli (mean center) ve standardize edilmi veriler denenmi , bunların içerisinde en uygun analiz sonuçlarının a ağıda gösterilen formüle göre ortalama merkezli verilerle ula ıldı ğı gözlenmi tir.
Z = x - x
Burada z ortalama merkezli de ğer, x veri, x ortalamadır. Kullandı ğımız paket programlarla çalı ma (kalibrasyon) setindeki konsantrasyonlara (Çizelge 3.1) kar ılık
76
gelen score matrisleri ve okunan absorbanslara kar ılık gelen loading (yükleme) matrisleri kurulmu tur. Sonra aynı i lem bilinmeyen konsantrasyonlarda bu iki etken maddeyi içeren karı ımlara uygulanmı ve elde edilen veriler kalibrasyon regresyonu yardımıyla hesaplanmı tır. Standart çözeltilerden hareketle hazırlanan sentetik karı ımlara yöntem uygulandı ğında elde edilen ortalama % geri kazanım ve % ba ğıl standart sapma de ğerleri Çizelge 3.2’de gösterilmi tir. Buna göre; ortalama % geri kazanım ve ba ğıl standart sapma (BSS) de ğerleri sırasıyla DNG için % 99.33 ve % 0.34, EV için ise % 100.48 ve % 1.58 olarak bulunmu tur.
77
Çizelge 3.1. DNG ve EV için TBR ve KEK yönteminde kullanılan kalibrasyon seti DNG EV Karı ım No g/mL g/mL
1 16 120 2 2 120 3 2 20
4 24 270 5 8 270
6 24 60 7 16 270 8 8 120
9 8 60 10 20 60
11 24 200 12 20 270
13 16 200 14 24 120 15 24 270
16 2 270 17 20 20
18 2 200 19 16 20 20 20 120
21 20 200 22 8 200
23 2 60 24 8 20
25 16 60
78
Çizelge 3.2. DNG ve EV ’ın standart karı ımları için TBR yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
KONULAN BULUNAN GER Đ KAZANIM KARI IM µg/mL µg/mL (%) NO
DNG EV DNG EV DNG EV
1 12 90 11.87 87.60 98.94 97.33
2 12 120 11.92 121.02 99.30 100.85
3 12 150 11.90 151.96 99.13 101.31
4 8 120 7.96 120.70 99.56 100.58
5 12 120 11.90 121.95 99.18 101.63
6 20 120 19.98 121.40 99.88 101.17
* x 99.33 100.48
** SS 0.34 1.58
***BSS % 0.34 % 1.58
**** GA(p=0.05 için) x ± 0.36 x ± 1.30
* x : Ortalama ** SS : Standart sapma *** BSS : Ba ğıl standart sapma
.st **** GA : Güven aralı ğı : n
79
3.2.3. Dienogest – Estradiol Valereat Karı ımında Dienogest ve Estradiol Valerat’ın, KEK Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde Kullanılması ile Miktar Tayini:
Temel bile en regresyonunda oldu ğu gibi kısmi en küçük kareler yönteminde de en iyi sonuçlar; DNG için 300 - 350 nm aralı ğında λ = 1 nm aralıkla 51 dalga boyunda, EV için ise 260-300 nm aralı ğında λ = 1 nm aralıkla 41 dalga boyunda absorbans değerlerinin ölçülmesiyle elde edildi ği bulundu.
Bu karı ımda her iki maddenin de miktar tayini için bu maddelerin konsantrasyonlarını içeren metanol - su (3:1) içerisindeki karı ım çözeltilerinin kalibrasyon setine (Çizelge 3.1) temel bile en regresyonu yöntemi paket programlar kullanılmak suretiyle uygulanmı tır. Kalibrasyon seti hazırlanırken kullanılan karı ım konsantrasyonları Çizelge 3.1’de görülmektedir. Bu kalibrasyon seti TBR yönteminde de kullanılan settir.
Yapılan çalı malarda 25 karı ım numunesinde 1 temel bile enin alındı ğında DNG, 3 temel bile en alındı ğında EV için en iyi sonuçların elde edildi ği bulundu. Bu yöntemde lineer kalibrasyon aralı ğının DNG için 2.0 – 24.0 µg/mL, EV için ise 20.0 – 270.0 µg/mL oldu ğu saptandı.
Yöntemde tayin alt sınırı DNG ve EV için sırasıyla 2.0 g/mL ve 20.0 g/mL, yakalama sınırı ise DNG için 0.2 g/mL ve EV için 2.5 g/mL olarak bulunmu tur. TAS hesaplamasında RIBONE ve ark. 2001 ın çalı masındaki i lemler temel alınmı tır. Bu i lemler: TAS = 3 || ε || || b || den hesaplanmı tır.
Bu paket programlar içerisinde en iyi sonucu alabilmek için ön i lem yapmadan, ortalama merkezli (mean center) ve standardize edilmi veriler denenmi , bunların içerisinde en uygun analiz sonuçlara ortalama merkezli verilerle ula ıldı ğı gözlenmi tir.
80
Çizelge 3.3. DNG ve EV ’ın standart karı ımları için KEK yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
KONULAN BULUNAN GER Đ KAZANIM KARI IM µg/mL µg/mL (%) NO
DNG EV DNG EV DNG EV
1 12 90 11.87 87.64 98.89 97.38
2 12 120 11.90 121.14 99.16 100.95
3 12 150 11.90 152.03 99.14 101.35
4 8 120 7.95 120.82 99.39 100.68
5 12 120 11.87 122.01 98.95 101.68
6 20 120 19.91 121.46 99.57 101.21
x 99.18 100.54
SS 0.26 1.59
BSS % 0.26 % 1.58
GA(p=0.05 için) x ± 0.27 x ± 1.67
81
Standart çözeltilerden hareketle hazırlanan sentetik karı ımlara yöntem uygulandı ğında elde edilen ortalama % geri kazanım ve ba ğıl standart sapma de ğerleri Çizelge 3.3’de gösterilmi tir. Buna göre; ortalama % geri kazanım ve ba ğıl standart sapma (BSS) de ğerleri sırasıyla DNG için % 99.18 ve % 0.26, EV için ise % 100.54 ve % 1.58 olarak bulunmu tur.
3.2.4. ANOVA testi
DNG + EV karı ımlarının metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin gün içi absorbans de ğerleri okunarak (2’ er saat aralıkla 5 kez) ve günler arası de ğerleri (3 gün boyunca) okunarak temel bile en regresyonu ve kısmi en küçük kareler yöntemleri uygulanmı ve bunların sonucunda DNG + EV karı ımlarında hesaplanan DNG ve EV miktarları ANOVA testi ile kar ıla tırılmı ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.13’de gösterilmi tir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F de ğerlerinin serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge de ğeri olan 5.91 de ğerinden küçük oldu ğu gözlenmi tir. DNG için TBR yönteminde güniçi ve günler arası ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla % 0.46 ve 0.87, KEK yönteminde % 0.66 ve 0.76’dır. EV için TBR yönteminde güniçi ve günler arası ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla % 0.25 ve 0.42, KEK yönteminde ise bu de ğerler sırasıyla % 0.19 ve 0.36’dır.
82
3.2.5. TBR ve KEK yöntemlerinin farmasötik preparatlara uygulanması:
3.2.5.1. Seçicilik Đçerisinde DNG ve EV bulunan CLIMODIEN ® draje preparatına uygulamasının yapılması için de çalı malar yapılmı tır. Amacımız etken maddelerin miktarını tayin etmek oldu ğu için öncelikle bu preparatlardaki yardımcı maddelerin yöntemi etkilemedi ğinin saptanması gerekir. Bu nedenle CLIMODIEN ® draje preparatının hazırlanan çözeltilerine standart olarak ayrı ayrı DNG ve EV ilave edilerek (DNG için %25, %50 ve %75; EV için % 50, % 100 ve % 150 oranında ilave yapılarak) miktar tayini yapılmı ve elde edilen sonuçlara göre yardımcı maddelerin yöntemi etkilemedi ği bulunmu tur (Çizelge 3.4 ve 3.5).
83
Çizelge 3.4. Preparatlara standart ilavesinden sonra TBR yöntemi ile hesaplanan DNG ve EV miktarları
KONULAN BULUNAN GER Đ KAZANIM
IM IM NO (%)
DNG EV DNG EV
KARI DNG EV µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
1 2.5 10.0 2.55 10.15 101.92 101.46
2 2.5 10.0 2.52 9.97 100.66 99.67
3 5.0 10.0 5.18 10.19 103.50 101.87
4 5.0 10.0 5.05 10.06 101.04 100.59
5 7.5 10.0 7.75 10.32 103.37 103.21
6 7.5 10.0 7.77 10.36 103.66 103.62
7 5.0 5.0 5.20 5.09 104.04 101.86
8 5.0 5.0 5.17 5.06 103.30 101.23
9 5.0 15.0 5.29 15.73 105.77 104.86
10 5.0 15.0 5.22 15.51 104.44 103.42
x 103.17 102.18
SS 1.56 1.57
BSS % 1.51 % 1.54
GA(p=0.05 için) x ± 1.12 x ± 1.12
84
Çizelge 3.5. Preparatlara standart ilavesinden sonra KEK yöntemi ile hesaplanan DNG ve EV miktarları
GER Đ KAZANIM KONULAN BULUNAN KARI IM (%) NO
DNG EV DNG EV DNG EV µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
1 2.5 10.0 2.54 10.13 101.70 101.33
2 2.5 10.0 2.51 9.96 100.51 99.56
3 5.0 10.0 5.17 10.17 103.31 101.70
4 5.0 10.0 5.04 10.05 100.87 100.46
5 7.5 10.0 7.74 10.32 103.21 103.19
6 7.5 10.0 7.76 10.35 103.51 103.53
7 5.0 5.0 5.19 5.08 103.84 101.60
8 5.0 5.0 5.16 5.05 103.13 101.00
9 5.0 15.0 5.28 15.72 105.55 104.78
10 5.0 15.0 5.21 15.50 104.19 103.35
x 102.98 102.05
SS 1.54 1.61
BSS % 1.50 % 1.58
GA(p=0.05 için) x ± 1.12 x ± 1.10
85
3.2.5.2. Farmasötik preparata uygulama :
6 adet CLIMODIEN ® draje tartılmı ve 25 mL’lik balon jojede metanol - su (3:1) içerisinde çözülmü tür. 30 dakika manyetik karı tırıcıda karı tırıldıktan sonra süspansiyon, Whatman No:42 ka ğıdından süzülerek süzüntüden alınan 6.25 mL’lik kısım 25 mL’lik balon joje içerisinde metanol – su (3:1) çözeltisi ile tamamlanmı tır. Yöntem bu çözeltilere uygulandıktan sonra elde edilen sonuçlar Çizelge 3.6 ve 3.7’de gösterilmi tir.
86
Çizelge 3.6. CLIMODIEN ® (71112 E) preparatına TBR yöntemi uygulandı ğında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar (preparatın üzerinde yazılı miktar:2 mg DNG + 2 mg EV /draje)
DNG EV DENEY NO (mg) (mg)
1 2.05 2.03
2 2.05 1.93
3 2.07 1.99
4 2.07 2.04
5 2.07 2.04
6 2.07 2.05
x 2.06 2.01
SS 0.01 0.05
*SH ±0.00 ±0.02
** BH % 3.16 % 0.70
s *S.H. : Standart hata : ( ) n n x − x ∑ ( n .100 ) x ** B.H. : Ba ğıl hata : ( 1 ) n
87
Çizelge 3.7. CLIMODIEN ® (71112 E) preparatına KEK yöntemi uygulandı ğında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar (2 mg DNG + 2 mg EV/draje)
DNG EV DENEY NO (mg) (mg)
1 2.07 2.02
2 2.07 2.03
3 2.05 2.01
4 2.05 1.93
5 2.07 2.04
6 2.07 1.98
x 2.06 2.00
SS 0.01 0.04
SH ±0.00 ±0.02
BH % 3.17 % 0.08
88
3.2.6. Kemometrik yöntemlerle elde edilen sonuçlara göre TSH, KSH ve THKT de ğerlerinin hesaplanması
Temel bile en regresyonu ve kısmi en küçük kareler yöntemlerinde elde edilen veriler de ğerlendirilmi ve a ağıdakiler hesaplanmı tır :
a) TSH : Tahmindeki standart hata :
m ^ 2 ∑ ( ci – c i ) i=1 TSH = m formülü yardımıyla hesaplanmı ve elde edilen de ğerler Çizelge 3.8 ve 3.9’de gösterilmi tir. ^ Burada c i i. numunenin referans (bilinen) konsantrasyonu, ci ise i. numunenin bulunan konsantrasyondur.
b) KSH : Kalibrasyondaki standart hata :
m ^ 2 ∑ ( c i – c i ) i=1 KSH = m – 2 formülü yardımıyla hesaplamı ve elde edilen de ğerler Çizelge 3.8 ve Çizelge 3.9’de gösterilmi tir. ^ Burada c i i. numunenin referans (bilinen) konsantrasyonu, ci ise i. numunenin m kalibrasyon standardı için tahmin edilen konsantrasyondur.
c) THKT : Tahmin hatalarının karelerinin toplamı:
m ^ 2 THKT = ∑ ( ci – c i ) i=1
89
formülü yardımıyla hesaplamı ve elde edilen de ğerler Çizelge 3.8 ve Çizelge 3.9’de gösterilmi tir. ^ Burada c i i. numunenin referans (bilinen) konsantrasyonu, ci ise i. numunenin m kalibrasyon standardı için tahmin edilen konsantrasyondur. Ayrıca, konulan ile bulunan de ğerler grafi ğe geçirildi ğinde elde edilen do ğrunun korelasyon katsayısı (r), e ğimi ve kesimi de aynı çizelgelerde gösterilmi tir. Yöntemde hesaplanan TSH, KSH, r, kesim, eğim, RMS ve THKT de ğerleri Çizelge 3.8 ve Çizelge 3.9’de gösterilmi tir.
90
Çizelge 3.8. DNG + EV karı ımı analizinde uygulanan TBR yöntemindeki parametreler
TSH KSH r Kesim Eğim RMS THKT
DNG 0.00948 0.0979 0.9990 0.1347 0.9848 0.319969 2.2523
EV 0.676187 0.23953 0.9996 -1.1776 1.0168 0.538477 5.509188
Çizelge 3.9. DNG + EV karı ımı analizinde uygulanan KEK yöntemindeki parametreler
TSH KSH r Kesim Eğim RMS THKT
DNG 0.01193 0.098634 0.9989 0.1416 0.9821 0.31406 2.268578
EV 0.71302 0.250931 0.9996 -1.2630 1.0181 0.524242 5.771418
r’nin 1’e yakın olması konulan ile bulunan miktarlar arasındaki do ğrusal ili kinin çok iyi oldu ğunu göstermektedir.
91
3.2.7. ekil 3.5’de görüldü ğü gibi DNG + EV karı ımının metanol – su (3:1) içerisindeki UV spektrumlarında 308,2 nm’de DNG ’in EV ’ın etkisi olmaksızın miktar tayininin yapılabilece ği görülmektedir. Bu konuda yapılan çalı malarımız
308,2 nm’de EV ’ın çok küçük de olsa absorpsiyona katkısının var oldu ğunu göstermi tir.
Seçilen farmasötik preparatta bu dalga boyunda DNG ’in miktar tayini yapmaya çalı ıldı ğında ise DNG için kötü sonuçlar elde edilmi tir.
92
3.3. Türev Spektrofotometri ile Yapılan Miktar Tayini Çalı maları
DNG + EV karı ımında DNG ve EV ’nin aynı anda miktar tayinlerini yapabilmek için türev spektrofotometri yöntemi kullanılmı tır. Bu amaçla çe itli türevleri alınmı ( ekil 3.7 – 3.10) ama en iyi ayrımın 1. türevde ( 1D) oldu ğu görülmü tür.
a b
ekil 3.6. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV , b) 12 g/mL DNG çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
b
a
ekil 3.7. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV , b) 12 g/mL DNG çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
93
a
b
ekil 3.8. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV , b) 12 g/mL DNG çözeltilerinin ikinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
a
b
ekil 3.9. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV , b) 12 g/mL DNG çözeltilerinin üçüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
94
ekil 3.10. Metanol - su (3 : 1) içerisinde 120 g/mL EV ve 12 g/mL DNG çözeltilerinin dördüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
3.3.1. DNG – EV Karı ımında Dienogest ve Estradiol Valerat’ın 1D ile Miktar Tayini:
Yaptı ğımız çalı malarda DNG ’in miktar tayinini yapabilmek için öncelikle
DNG ve EV ’ın metanol - su (3:1, v/v) içerisindeki spektrumlarının 200 – 400 nm arasındaki birinci türevi alınarak sıfırı kesti ği noktalar belirlenmi tir ( ekil 3.7) .
Buna göre ; EV’nin 1. türevinde sıfırı kesti ği 247.2 nm, 279.0 nm ve 328.8 nm ler
DNG’ in tayini için belirlenmi ; aynı ekilde DNG ’in 1. türevinde sıfırı kesti ği nokta olarak da 258.4 nm EV ’ın tayini için belirlenmi tir ( ekil 3.11-3.18). EV’ ın sıfırı kesti ği noktalardan 328.8 nm’deki de ğerlerin DNG ’in tayini için di ğer dalga boylarına göre daha iyi sonuçlar verdi ği yapılan denemeler sonucunda görülmü tür
(Çizelge 3.10.).
95
d a c b
ekil 3.11. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG b) 90 g/mL EV c) 120 g/mL EV ve d) 150 g/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
a b c d
ekil 3.12. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG b) 90 g/mL EV c) 120 g/mL EV ve d) 150 g/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktör:30, ∆λ=2 nm)
96
d
c a b
ekil 3.13. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV b) 8 g/mL DNG c) 12 g/mL DNG ve d) 20 g/mL DNG çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
d c b
a
ekil 3.14. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 g/mL EV b) 8 g/mL DNG c) 12 g/mL DNG ve d) 20 g/mL DNG çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
97
c b a
ekil 3.15. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG + 90 g/mL EV, b) 12 g/mL DNG + 120 g/mL EV c) 12 g/mL DNG + 150 g/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
a b c
ekil 3.16. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 g/mL DNG + 90 g/mL EV b) 12 g/mL DNG + 120 g/mL EV c) 12 g/mL DNG + 150 g/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
98
c
b a
ekil 3.17. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 8 g/mL DNG + 120 g/mL EV b) 12 g/mL DNG + 120 g/mL EV c) 20 g/mL DNG + 120 g/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
a b c
ekil 3.18. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 8 g/mL DNG + 120 g/mL EV b) 12 g/mL DNG + 120 g/mL EV c) 20 g/mL DNG + 120 g/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)
99
Çizelge 3.10. DNG ’in standart karı ımları için farklı dalga boylarında 1. türev spektrofotometri yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
KONULAN BULUNAN GER Đ KAZANIM (%) µg/ml µg/ml IM IM NO
247.2 279.0 328.8 247.2 279.0 328.8
KARI nm nm nm nm nm nm
1 12 12.43 12.12 12.03 103.59 101.00 100.27
2 12 12.71 11.57 11.85 105.91 96.38 98.78
3 12 12.34 11.89 11.94 102.82 99.04 99.46
4 8 7.53 7.34 7.81 94.10 91.77 97.59
5 12 11.51 11.18 11.95 95.88 93.18 99.59
6 20 19.37 19.65 20.00 96.85 98.25 99.99
x 99.86 96.60 99.28
SS 4.84 3.55 0.97
BSS % 4.85 % 3.68 % 0.98
100
Standart çözeltilerden hareketle hazırlanan sentetik karı ımlara yöntem uygulandı ğında elde edilen ortalama % geri kazanım ve % ba ğıl standart sapma (%
BSS) de ğerleri Çizelge 3.11’da gösterilmi tir. Buna göre ortalama % geri kazanım ve
% BSS de ğerleri sırasıyla DNG için % 99.28 ve % 0.98, EV için ise % 98.56 ve %
0.96 olarak bulunmu tur.
101
Çizelge 3.11. DNG ve EV ’ın standart karı ımları için 1. türev spektrofotometri yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
KONULAN BULUNAN GER Đ KAZANIM KARI IM µg/ml µg/ml (%) NO
DNG EV DNG EV DNG EV
1 12 90 12.03 87.16 100.27 96.84
2 12 120 11.85 119.00 98.78 98.28
3 12 150 11.94 147.42 99.46 99.16
4 8 120 7.81 118.21 97.59 98.51
5 12 120 11.95 119.26 99.59 99.38
6 20 120 20.00 119.00 99.99 99.16
x 99.28 98.56
SS 0.97 0.94
BSS % 0.98 % 0.96
GA (p=0.05 için) x ± 1.02 x ± 0.99
102
3.3.2 1D Yönteminin Farmasötik Preparatlara Uygulanması:
3.3.2.1. Seçicilik
Đçerisinde DNG ve EV bulunan CLIMODIEN ® draje preparatına uygulamasının yapılması için de çalı malar yapılmı tır. Amacımız etken maddelerin miktarını tayin etmek oldu ğu için öncelikle bu preparatlardaki yardımcı maddelerin yöntemi etkilemedi ğinin saptanması gerekir. Bu nedenle CLIMODIEN ® draje preparatının hazırlanan çözeltilerine standart olarak ayrı ayrı DNG ve EV ilave edilerek (DNG için %25, %50 ve %75; EV için % 50, % 100 ve % 150 oranında ilave yapılmı tır) miktar tayini yapılmı ve elde edilen sonuçlara göre yardımcı maddelerin yöntemi etkilemedi ği bulunmu tur (Çizelge 3.12).
103
Çizelge 3.12. Preparatlara standart ilavesinden sonra 1.türev spektrofotometri ile hesaplanan DNG ve EV miktarları
GER Đ KAZANIM KONULAN BULUNAN KARI IM (%) NO
DNG EV DNG EV DNG EV µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
1 2.5 10.0 2.51 9.67 100.39 96.69
2 2.5 10.0 2.49 9.74 99.46 97.44
3 5.0 10.0 5.11 9.97 102.23 99.70
4 5.0 10.0 5.06 9.93 101.13 99.32
5 7.5 10.0 7.63 10.27 101.73 102.70
6 7.5 10.0 7.75 10.20 103.27 101.95
7 5.0 5.0 5.20 5.24 103.92 104.79
8 5.0 5.0 5.12 5.18 102.45 103.62
9 5.0 15.0 5.13 15.38 102.57 102.55
10 5.0 15.0 5.15 15.30 103.06 101.99
x 102.02 101.07
SS 1.37 2.67
BSS % 1.34 % 2.64
GA(p=0.05için) x ± 0.98 x ± 1.91
104
3.3.2.2. Farmasötik Preparata Uygulama:
6 adet CLIMODIEN ® draje tartılmı ve 25 mL’lik balon jojede metanol - su (3:1) içerisinde çözülmü tür. 30 dakika manyetik karı tırıcıda karı tırıldıktan sonra süspansiyon, Whatman No:42 ka ğıdından süzülerek süzüntüden alınan 6.25 mL’lik kısım 25 mL’lik balon joje içerisinde metanol – su (3:1) çözeltisi ile tamamlanmı tır. Yöntem bu çözeltilere uygulandıktan sonra elde edilen sonuçlar Çizelge 3.13’de gösterilmi tir.
105
Çizelge 3.13. CLIMODIEN ® (71112 E) preparatına 1.türev spektrofotometri yöntemi uygulandı ğında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar (preparat üzerinde yazılı miktar; 2 mg DNG + 2 mg EV/ draje)
DNG EV DENEY NO (mg) (mg)
1 2.07 1.93
2 2.06 2.00
3 2.06 1.93
4 2.02 1.93
5 2.04 1.95
6 2.06 2.03
x 2.05 1.96
SS 0.02 0.04
SH ±0.01 ±0.02
BH % 2.58 % -1.92
106
3.3.2.3. ANOVA testi
DNG + EV karı ımlarının metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin gün içi absorbans de ğerleri okunarak (2’ er saat aralıkla 5 kez) ve günler arası de ğerleri (3 gün boyunca) okunarak 1D yöntemi uygulanmı ve bunların sonucunda DNG + EV karı ımlarında hesaplanan DNG ve EV miktarları ANOVA testi ile kar ıla tırılmı ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.14’da gösterilmi tir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F de ğerlerinin serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge de ğeri olan 5.91 de ğerinden küçük oldu ğu gözlenmi tir. DNG için gün içi ve günler arası ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla % 0.68 ve 0.58, EV için ise sırasıyla % 0.84 ve 1.17’dir.
107
Çizelge 3.14. Önerilen yöntemler için DNG + EV karı ımlarında ANOVA testi sonuçları
1 D TBR KEK YPSK Parametreler EV DNG EV DNG EV DNG EV DNG
Günler arası 3.1242 0.0021 0.4065 0.0049 0.3067 0.0037 0.0643 0.0054 varyans
Gün içi 1.6332 0.0029 0.1432 0.0013 0.1031 0.0028 0.1083 0.0035 varyans
F oranı 1.9129 1.3816 2.8390 3.6173 2.9764 1.2913 1.6852 1.5483
Ortalama de ğer 150.77 7.87 152.54 8.04 152.59 8.00 24.15 8.18 ( g/mL)
Günler arası % BSS 1.17 0.58 0.42 0.87 0.36 0.76 1.05 0.90
Gün içi % BSS 0.84 0.68 0.25 0.46 0.19 0.66 1.35 0.73
Günler arası ve gün içi sonuçları 4 ve 12 serbestlik derecesinde hesaplanmı tır. Bu serbestlik derecesinde ve %95 olasılıkla F oranı 5,91’dir. 107
108
3.4. YPSK Đle Yapılan Çalı malar
Yöntemi optimize etmek için çalı malar yapılmı tır. Bu amaçla kolon, mobil faz, pH, akı hızı, enjeksiyon hacmi ve deteksiyon dalga boyu ara tırılmı tır. Bu çalı malar sonucunda kolon olarak ACE C8 (25cm x 4.6 mm) ters faz kolonu seçilmi tir. Mobil faz için yapılan çalı malarda ise asetonitril-NH 4NO 3 (pH:5.4, 3.33 x10 -2 M) (70:30 h/h) nun en iyi sonucu verdi ği görülmü tür. Yine en iyi sonuçlar için enjeksiyon hacmi 20 L, akı hızı 2 mL/dk ve deteksiyon dalga boyu 280 nm olarak belirlenmi tir. Đç standart için yapılan denemelerden sonra siproteron asetat iç standart olarak seçilmi tir. Yöntemde alıkonma zamanları siproteron asetat için 3.01 dakika, DNG için 1.85 dakika ve EV için 5.95 dakika olarak bulunmu tur.
a
c
b
ekil 3.19. a) DNG (8 g/mL) b) Siproteron asetat (iç standart) (1.25 g/mL), ve c) EV (64 g/mL)’ın geli tirilen YPSK yöntemindeki kromatogramı
Miktar tayini i lemlerinde kalibrasyon grafiklerinden yararlanılmı tır. Bu grafikler için pik alanları ölçülmü ve kromatogramda etken maddeler için ölçülen pik alanları iç standart için ölçülen pik alanlarına bölündükten sonra elde edilen de ğerler konsantrasyona kar ı grafi ğe geçirilmi tir (N = 10). Böylece elde edilen do ğrusal kalibrasyon e ğrisinin denklemleri:
109
EV için y = 0.1413 x + 0.0774 (r 2 = 0.9999)
DNG için y = 0.7945 x – 0.0052 (r 2 = 0.9998) olarak bulunmu tur.
(Burada x, g/mL cinsinden konsantrasyonu, y ise pik alanı madde/pik alanı iç standart oranını göstermektedir.)
Yöntemde çalı ma aralıkları; DNG için ise 3.0 – 45.0 EV için 18.0 – 100.0. g/mL oldu ğu saptanmı tır. Yöntemde DNG için TAS 3.0 g/mL, YS ise 0.06 g/mL, EV için ise TAS 18.0 g/mL ve YS 0.58 g/mL olarak bulunmu tur. Elde edilen sonuçlar Çizelge 3.15’de gösterilmi tir. Tayin alt sınırı 10 SS/m, yakalama sınırı ise 3 SS/m (SS = standart sapma, m= e ğim) formülünden hesaplanmı tır.
110
Çizelge 3.15. Kromatografik ko ullar optimize edildi ğinde EV ve DNG için elde edilen validasyon parametreleri
EV DNG
Lineer çalı ma aralı ğı 18.0 – 100.0 3.0 – 45.0 ( g/mL)
Eğim 0.1413 0.7945
±±± ± ±
Eğimin standart hatası 0.0003 0.0010
Kesim 0.0774 -0.0052
±±± ± ±
Kesimin standart 0.025 0.014 hatası
r 0.999 0.999
YS ( g/mL) * 0.58 0.06
TAS ( g/mL) ** 18.0 3.0
* YS : Yakalama sınırı (LOD) ** TAS : Tayin sınırı (LOQ)
111
Yöntemde sistem uygunluk testleri ara tırılmı elde edilen sonuçlar Çizelge 3.16’ de gösterilmi tir.
Çizelge 3.16. DNG ve EV için geli tirilen YPSK yönteminde sistem uygunluk testi sonuçları
Olması gereken Parametreler DNG EV de ğerler
Teorik tabaka sayısı 5487 14175 N>2000
Kapasite faktörü 0.75 4.62 k’ = 2 – 8
Seçicilik faktörü 6.178 6.178 α > 1
Ayırım gücü 11.54 19.64 R > 1.5
Asimetri faktörü 1.00 1.01 A = 0.95 – 1.20
Çizelge 3.16’da gösterilen seçicilik faktörleri DNG ’in EV ’a göre hesaplanan de ğerleridir. Đç standart hesaba katıldı ğında EV ile siproteron asetat (IS) pikleri için 2.514, DNG – IS pikleri için 2.455 olarak hesaplanmı tır.
112
Standart çözeltilerden hareketle hazırlanan sentetik karı ımlara yöntem uygulandı ğında elde edilen ortalama % geri kazanım ve ba ğıl standart sapma de ğerleri Çizelge 3.17’de gösterilmi tir. Buna göre ortalama % geri kazanım ve % ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla DNG için % 101.10 ve % 0.49, EV için % 100.32 ve % 1.18 olarak bulunmu tur (Çizelge 3.17).
113
Çizelge 3.17. Sentetik karı ımlara YPSK yöntemi uygulandı ğında elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
GER Đ KAZANIM KONULAN BULUNAN (%) KARI IM NO DNG EV DNG EV DNG EV µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
1 8 24 8.15 24.02 101.93 100.08
2 8 48 8.06 48.04 100.78 100.07
3 8 72 8.04 72.26 100.55 100.36
4 16 24 16.27 24.68 101.66 102.82
5 16 48 16.22 47.83 101.36 99.64
6 16 72 16.20 71.71 101.28 99.59
7 32 24 32.31 24.40 100.97 101.67
8 32 48 32.27 47.59 100.86 99.14
9 32 72 32.16 71.67 100.49 99.54
x 101.10 100.32
SS 0.49 1.18
BSS % 0.49 % 1.18
GA (p=0.05 için) x ± 0.38 x ± 0.91
114
3.4.1. ANOVA testi
DNG + EV karı ımları için gün içi absorbans de ğerleri okunarak (2’ er saat aralıkla 5 kez) ve günler arası de ğerleri okunarak kromatografik yöntemler uygulanmı ve bunların sonucunda DNG + EV karı ımları için 3 gün aynı saat aralıklarında kar ıla tırılarak bulunan miktarlar ANOVA testi ile kar ıla tırılmı ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.14’de gösterilmi tir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F de ğerlerinin serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge de ğeri olan 5.91 de ğerinden daha küçüktür. Dolayısıyla her iki etken maddenin miktarlarında 3 gün içerisinde önemli bir de ği im gözlenmemi tir. YPSK yönteminde DNG için gün içi ve günler arası ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla % 0.73 ve 0.90, EV için ise sırasıyla % 1.35 ve 1.05 olarak bulunmu tur.
3.4.2. YPSK yönteminin farmasötik preparatlara uygulanması :
3.4.2.1. Seçicilik
Đçerisinde DNG ve EV bulunan CLIMODIEN ® draje preparatına uygulamasının yapılması için de çalı malar yapılmı tır. Amacımız etken maddelerin miktarını tayin etmek oldu ğu için öncelikle bu preparatlardaki yardımcı maddelerin yöntemi etkilemedi ğinin saptanması gerekir. Bu nedenle drajelerin çözeltilerine standart olarak DNG ve EV ayrı ayrı ilave edilerek ( DNG için %60, % 70, % 80 ve %110; EV için % 70, % 105, % 125, % 155 oranında ilave yapılmı tır) miktar tayini yapılmı ve elde edilen sonuçlara göre yardımcı maddelerin yöntemi etkilemedi ği bulunmu tur (Çizelge 3.18). Ayrıca optimize edilen artlarda DNG , EV ve iç standardın piklerini etkileyecek piklere rastlanmamı tır ( ekil 3.15).
115
(a) (b) a
c b
ekil 3.20. (a) CLIMODIEN ® draje preparatı a) DNG , b) siproteron asetat (IS) ve c) EV (b) plasebo’nun YPSK kromatogramı 114
116
Çizelge 3.18. Preparata standart ilavesinden sonra YPSK yöntemi ile hesaplanan DNG ve EV miktarları
GER Đ KAZANIM KONULAN BULUNAN KARI IM (%) NO
DNG EV DNG EV DNG EV µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
1 14 14 14.00 14.49 100.01 103.50
2 14 14 13.86 14.27 99.02 101.93
3 14 21 14.06 20.82 100.45 99.15
4 14 21 14.20 20.72 101.40 98.65
5 12 31 12.08 31.09 100.68 100.30
6 12 31 11.90 31.23 99.20 100.74
7 16 25 16.10 25.16 100.65 100.65
8 16 25 16.12 24.85 100.73 99.39
9 22 25 22.43 24.48 101.95 97.94
10 22 25 22.66 24.36 103.01 97.45
x 100.71 99.97
SS 1.20 1.85
BSS % 1.19 % 1.85
GA(p=0.05için) x ± 0.86 x ± 1.32
117
3.4.2.2. Farmasötik Preparata Uygulama
6 adet CLIMODIEN ® draje tartılıp havanda toz edildikten sonra içerisinden 1 drajenin miktarına kar ılık gelecek kadar alınıp 25 mL’lik balon jojede asetonitril içerisinde çözüldü. 30 dakika karı tırıldıktan sonra çözelti 0.45 m yava süzen milipore filtreden 25 mL’lik balonjojeye süzüldü. Bu süzüntüden alınan 10 mL ye siproteron asetat’ın stok çözeltisinden 0.625 mL ilave edildikten sonra 25 mL’lik balon jojede asetonitril ile 25 mL’ye tamamlandı. Yöntemin hazırlanan çözeltilere uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar Çizelge 3.19’de gösterilmi tir.
118
Çizelge 3.19. CLIMODIEN ® (71112 E) preparatına YPSK yöntemi uygulandı ğında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde yazılı olan miktar: 2 mg DNG + 2 mg EV / draje )
DNG EV DENEY NO mg mg
1 2.05 1.99
2 2.05 1.98
3 2.05 1.95
4 2.03 2.00
5 2.07 1.94
6 2.03 1.94
x 2.05 1.97
SS 0.02 0.03
SH ± 0.01 ± 0.01
BH 2.33 -1.67
119
4. TARTI MA
4.1. DĐENOGEST – ESTRAD ĐOL VALERAT KARI IMININ ANAL ĐZĐ ĐÇĐN YAPILAN ÇALI MALAR
4.1.1. Kemometrik yöntemlerin kullanılı ı
Kemometrik yöntemler, temelde kendileri analitik yöntemler olmayıp matematiksel ve istatistiksel yöntemlerdir. Yani her türlü veri için uygulanabilir. Biz
çalı malarımızda spektrofotometrik analizleri tez konumuz olarak seçti ğimiz ve ikili karı ımlara uygulamayı amaçladı ğımız için spektrumlarda okunan absorbans de ğerleri bu kemometrik yöntemlerle de ğerlendirilerek karı ımdaki etken maddelerin miktar tayinleri gerçekle tirilmi tir. Yapılan çalı malarda TBR ve KEK teknikleri paket programlar kullanılarak DNG + EV karı ımında DNG ve EV ’ın miktar tayini için uygulamaya çalı ılmı ve iki yöntemde de tutarlı sonuçlar elde edilmi tir.
4.1.1.1. Temel bile en regresyonu (TBR) yöntemi kullanılarak yapılan
çalı malar
DNG + EV karı ımında bu iki etken maddenin de aynı anda miktar tayini için temel bile en regresyonu yöntemi spektrofotometrik verilerin (absorbansların) de ğerlendirilmesinde kullanılmı tır. Yöntemde bu iki maddenin karı ımlarının metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin 260 – 350 nm’ler arasındaki UV absorpsiyon spektrumları kullanılmı tır ( ekil 3.5). ekil 3.5’te görüldü ğü gibi 200 –
300 nm’ler arasında her iki maddenin spektrumları giri im yapmaktadır. Dolayısıyla di ğerinin etkisi olmaksızın DNG veya EV ’ın yalnızca absorbans de ğerlerini okuyarak bu karı ımda seçici olarak miktar tayinlerini gerçekle tirmek imkansızdır.
120
Hiçbir ayırma i lemi yapmaksızın DNG ve EV ’ın ikili karı ımlarında miktar tayinlerinin yapılabilmesi için spektral verilerin temel bile en regresyonu yöntemiyle analizinden yararlanılmı tır. Buna göre ekil 3.5’teki spektrumun 240 – 360 nm’ler arasındaki bölümünün istenen amaç için yeterli olduğu yapılan analizler sonucunda bulunmu tur. Buna göre 240 – 360 nm’ler arasındaki spektrumda hangi dalga boylarının seçilmesi gerekti ği konusunda yapılan denemeler sonucunda 25 karı ım numunesi için (kalibrasyon seti) (Çizelge 3.1) λ = 1 nm olarak DNG için 300–350 nm’ler arasında 51 dalga boyunda, EV için ise 260–300 nm’ler arasında 41 dalga boyunda absorbans de ğerlerinin okunmasının ve bu yöntemdeki hesaplamada kullanılmasının yeterli oldu ğu anla ılmı tır. Sonra 3.2.2 bölümünde anlatıldı ğı gibi okunan absorbans de ğerlerine göre hazırlanan matris ve konsantrasyon matrislerini kullanarak önce kalibrasyon matrisi ve katsayıları hesaplanmı daha sonra bilinmeyen numune için belirlenen dalga boylarında yapılan ölçümler bu matris ve katsayılar yardımıyla analiz edilerek bilinmeyen numunedeki bile enlerin konsantrasyonları hesaplanmı tır (Çizelge 3.2). Bu hesaplamada 2.4 bölümünde gösterilen paket programlardan yararlanılmı tır.
Yöntemde 3.2.2 bölümünde anlatıldı ğı gibi ortalama merkezli veriler kullanıldı ğında daha iyi sonuçlar elde edildi ği saptanmı tır.
TSH ve KSH de ğerlerinin mümkün oldu ğu kadar dü ük olması istenir.
Çizelge 4.1’deki de ğerlere bakıldı ğında TSH ve KSH de ğerlerinin gerçekten küçük oldu ğu görülmektedir.
r de ğeri, konulan ile bulunan arasındaki korelasyonun ölçüsüdür. Bu de ğerin
1’e yakın olması çalı manın hassasiyetinin yüksek oldu ğunu ifade eder ki Çizelge
121
4.1’deki verilere göre hesaplanan r de ğerlerinin 1’e çok yakın oldukları görülmektedir.
THKT de ğerleri ise her zaman minimum olması beklenmeyen de ğerlerdir.
Buna ra ğmen THKT de ğerlerinin çok dü ük oldu ğu Çizelge 4.1’de görülmektedir.
Bu sonuç TSH ve KSH için elde edilen sonuçlarla uyum göstermektedir.
Hazırlanan standart karı ımlara yöntem uygulanarak ortalama % geri kazanım de ğerleri ve % ba ğıl standart sapma de ğerleri hesaplanmı tır (Çizelge 3.2 ve
4.2). Çizelge 4.2’de görüldü ğü gibi % geri kazanım de ğerleri DNG için % 99.33, EV için % 100.48 olarak bulunmu tur ki bu de ğerler yöntemdeki do ğrulu ğun yüksek oldu ğunu göstermektedir. Yöntemdeki kesinli ği göstermek için ise % ba ğıl standart sapma (% BSS) de ğerleri hesaplanmı ve sırasıyla DNG ve EV için % 0.34 ve %
1.58 olarak bulunmu tur (Çizelge 3.2 ve 4.2). Bulunan de ğerler yeterli olarak de ğerlendirilmi tir.
Yaptı ğımız çalı malarda DNG + EV karı ımında temel bile en regresyonu tekni ğinin spektrofotometriye uygulanması ile DNG ve EV ’ün miktarının tayin edilmesi yönteminde çalı ma aralı ğının DNG için 2.0 – 24.0 g/mL, EV için 20.0 –
270.0 g/mL oldu ğu saptanmı tır. Bu çalı ma aralıkları örnek için seçilen draje preparatındaki DNG ve EV ’ın aynı anda miktar tayinine imkan vermektedir.
Yöntemde TAS; DNG için 2.0 g/mL, EV için 20 g/mL olarak seçilmi ,
YS ise DNG için 0.20 g/mL, EV için ise 2.50 g/mL olarak hesaplanmı tır. Bu sonuçlar da yöntemin oldukça duyarlı oldu ğunu göstermektedir.
DNG + EV karı ımlarının metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin gün içi absorbans de ğerleri okunarak (2’ er saat aralıkla 5 kez) ve günler arası de ğerleri
122
(3 gün boyunca) okunarak temel bile en regresyonu yöntemleri uygulanmı ve bunların sonucunda DNG + EV karı ımlarında hesaplanan DNG ve EV miktarları
ANOVA testi ile kar ıla tırılmı ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.14’de gösterilmi tir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F de ğerlerinin serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge de ğeri olan 5.91 de ğerinden küçük oldu ğu gözlenmi tir. Elde edilen bu sonuçlar ile, 3 gün içerisinde TBR yönteminin hazırlanan çözeltilere uygulanmasında elde edilen sonuçların (p = 0.05 olarak) birbirlerinden istatistiksel olarak anlamlı farkının bulunmadı ğını ve bu süre içerisinde yöntemin geçerli oldu ğunu göstermektedir. Bu aynı zamanda stabilitenin de göstergesidir.
4.1.1.2. Kısmi en küçük kareler yöntemi (KEK) ile yapılan çalı malar
DNG + EV karı ımınında bu iki etken maddenin aynı anda tayini için kısmi en küçük kareler yöntemi de uygulanmı tır. Yöntemde bu iki maddenin karı ımlarının metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin 260 – 350 nm’ler arasındaki UV absorpsiyon spektrumları kullanılmı tır ( ekil 3.5). ekil 3.5’te görüldü ğü gibi 200 – 300 nm’ler arasında her iki maddenin spektrumları giri im yapmaktadır. Dolayısıyla di ğerinin etkisi olmaksızın DNG veya EV ’ın yalnızca bu aralıkta absorbans de ğerlerini okuyarak bu karı ımda seçici olarak miktar tayinlerini gerçekle tirmek olanaksızdır. Hiçbir ayırma i lemi yapmaksızın DNG ve EV ’ın ikili karı ımlarında miktar tayinlerinin yapılabilmesi için spektral verilerin kısmi en küçük kareler (KEK) yöntemiyle analizinden yararlanılmı tır. Buna göre ekil
3.5’teki spektrumun 240 – 360 nm’ler arasındaki bölümünün istenen amaç için
123
yeterli oldu ğu yapılan analizler sonucunda bulunmu tur. Buna göre 240 – 360 nm’ler arasındaki spektrumda hangi dalga boylarının seçilmesi gerekti ği konusunda yapılan denemeler sonucunda 25 karı ım numunesi için (kalibrasyon seti) (Çizelge 3.1) λ =
1 nm olarak DNG için 300-350 nm’ler arasında 51 dalga boyunda, EV için ise 260-
300 nm’ler arasında 41 dalga boyunda absorbans de ğerlerinin okunmasının ve bu yöntemdeki hesaplamada kullanılmasının yeterli olduğu anla ılmı tır. Okunan absorbans de ğerlerine göre hazırlanan matris ve konsantrasyon matrislerini kullanarak önce kalibrasyon matrisi ve katsayıları hesaplanmı daha sonra bilinmeyen numune için belirlenen dalga boylarında yapılan ölçümler bu matris ve katsayılar yardımıyla analiz edilerek bilinmeyen numunedeki bile enlerin konsantrasyonları hesaplanmı tır (Çizelge 3.2). Bu hesaplamada 2.4 bölümünde gösterilen paket programlardan yararlanılmı tır.
Yöntemde 3.2.3 bölümünde anlatıldı ğı gibi ortalama merkezli veriler kullanıldı ğında daha iyi sonuçlar elde edildi ği saptanmı tır.
Temel bile en regresyonunda oldu ğu gibi kısmi en küçük kareler yönteminde de TSH, KSH, r ve THKT de ğerlerinin uygun de ğerler oldu ğu Çizelge 4.1’de görülmektedir.
Hazırlanan standart karı ımlara yöntem uygulanarak ortalama % geri kazanım de ğerleri ve % ba ğıl standart sapma de ğerleri hesaplanmı tır (Çizelge 3.3 ve
Çizelge 4.2). Çizelge 4.2’de görüldü ğü gibi % geri kazanım de ğerleri DNG için %
99.18, EV için % 100.54 olarak bulunmu tur ki bu de ğerler yöntemdeki do ğrulu ğu göstermektedir. Yöntemdeki kesinli ği göstermek için ise % ba ğıl standart sapma
(%BSS) de ğerleri hesaplanmı ve sırasıyla DNG ve EV için % 0.26 ve % 1.58
124
olarak bulunmu tur (Çizelge 3.3 ve Çizelge 4.2). Bulunan de ğerler tatmin edici olarak de ğerlendirilmi tir.
Yaptı ğımız çalı malarda DNG + EV karı ımında kısmi en küçük kareler tekni ğinin spektrofotometriye uygulanması ile DNG ve EV ’ün miktarının tayin edilmesi yönteminde çalı ma aralı ğının DNG için 2.0 – 24.0 g/mL, EV için 20.0 –
270.0 g/mL oldu ğu saptanmı tır. Bu çalı ma aralıkları örnek için seçilen draje preparatındaki DNG ve EV ’ın aynı anda miktar tayinine imkan vermektedir.
TAS (tayin alt sınırı), DNG için 2.0 g/mL, EV için 20 g/mL olarak seçilmi ,YS (yakalama sınırı) ise DNG için 0.2 g/mL, EV için ise 2.5 g/mL olarak hesaplanmı tır. Bu sonuçlar da yöntemin oldukça duyarlı oldu ğunu göstermektedir.
DNG + EV karı ımlarının metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin gün içi absorbans de ğerleri okunarak (2’ er saat aralıkla 5 kez) ve günler arası de ğerleri
(3 gün boyunca) okunarak kısmi en küçük kareler yöntemleri uygulanmı ve bunların sonucunda DNG + EV karı ımlarında hesaplanan DNG ve EV miktarları
ANOVA testi ile kar ıla tırılmı ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.11’de gösterilmi tir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F de ğerlerinin serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge de ğeri olan 5.91 de ğerinden küçük oldu ğu gözlenmi tir. Elde edilen bu sonuçlar ile, 3 gün içerisinde KEK yönteminin hazırlanan çözeltilere uygulanmasında elde edilen sonuçların (p = 0.05 olarak) birbirlerinden istatistiksel olarak anlamlı farkının bulunmadı ğını ve bu süre içerisinde yöntemin geçerli oldu ğunu göstermektedir. Bu aynı zamanda stabilitenin de göstergesidir.
125
Çizelge 4.1. TBR ve KEK yöntemlerinde bulunan TSH, KSH, THKT ve r de ğerleri
TBR KEK
DNG EV DNG EV
TSH 0.0095 0.6762 0.0119 0.7130
KSH 0.0979 0.2395 0.0986 0.2509
r 0.9990 0.9996 0.9989 0.9996
THKT 2.2523 5.5092 2.2686 5.7714
126
Çizelge 4.2. Sentetik karı ımlara geli tirilen yöntemler uygulandı ğında elde edilen validasyon parametreleri TBR KEK 1D YPSK
n = 6 n = 6 n = 6 n = 9
DNG EV DNG EV DNG EV DNG EV
Ortalama % geri 99.33 100.48 99.18 100.54 99.28 98.56 101.10 100.32 kazanım (±SS) (±0.34) (±1.58) (±0.26) (±1.59) (±0.97) (±0.94) (±0.49) (±1.18)
BSS % 0.34 %1.58 % 0.26 %1.58 % 0.98 % 0.96 % 0.49 % 1.18
Çalı ma Aralı ğı 2.0-24.0 20.0-270.0 2.0-24.0 20.0-270.0 2.0-24.0 10.0-275.0 3.0-45.0 18.0-100.0 ( g/mL)
TAS ( g/mL) 2.0 20.0 2.0 20.0 2.0 10.0 3.0 18.0
YS ( g/mL) 0.2 2.5 0.2 2.5 0.2 2.5 0.06 0.58
SS : Standart Sapma BSS: Ba ğıl Standart Sapma TAS: Tayin Alt Sınırı YS: Yakalama Sınırı 126
127
4.1.2. Türev Spektrofotometri ile yapılan çalı malar
DNG + EV karı ımımda bu iki maddenin aynı anda tayini için absorpsiyon spektrumlarına birinci türev spektrofotometri (1D) yöntemi uygulanmı ve iyi sonuçlar elde edilmi tir. Bu amaçla, EV ve DNG ’in metanol- su (3:1) çözeltilerinin
1. türevi alındıktan sonra, türev spektrumlarının sıfırı kesti ği noktalar belirlenmi ve
DNG için 328.8 nm, EV için ise 258.4 nm’de ölçüm yapılması kararla tırılmı tır
( ekil 3.7). 1.türev spektrumları alınırken ∆λ = 2 nm, skala faktörü ise 30 seçildi ğinde optimal de ğerlere ula ıldı ğı yapılan denemeler sonucunda görülmü tür.
Hazırlanan standart karı ımlara yöntem uygulanarak ortalama % geri kazanım de ğerleri ve % ba ğıl standart sapma de ğerleri hesaplanmı tır. Yöntemdeki do ğrulu ğu gösteren % geri kazanım de ğerleri Çizelge 3.11 ve 4.2’de görülmektedir.
Buna göre % geri kazanım de ğerleri DNG için % 99.28, EV için % 98.56 olarak bulunmu tur. Yöntemdeki kesinli ği göstermek için ise % ba ğıl standart sapma de ğerleri hesaplanmı ve DNG ve EV için sırasıyla % 0.98 ve % 0.96 olarak bulunmu tur (Çizelge 3.11 ve 4.2). Bulunan de ğerler tatmin edici olarak de ğerlendirilmi tir.
DNG ve EV karı ımının 1. türev spektrofotometri yöntemiyle tayininde
çalı ma aralıkaları DNG için 2.0 – 24.0 g/mL ve EV için ise 10.0 – 275.0 g/mL oldu ğu bulunmu tur. Bu çalı ma aralıkları kullanılarak örnek için seçilen draje preparatına da yöntem kolaylıkla uygulanabilmektedir.
1. türev spektrofotometri yönteminde TAS; DNG için 2.0 g/mL, EV için
10.0 g/mL olarak seçilmi YS ise DNG için 0.20 g/mL, EV için ise 2.50 g/mL olarak hesaplanmı tır.
128
4.1.3. YPSK ile yapılan çalı malar
Yöntemi optimize etmek için yapılan çalı malar sonucunda; en iyi ayrımın
ACE C8 ters faz kolonu (250 mm x i.d. 4.6 mm, 5 m) üzerinde hareketli (mobil) faz olarak asetonitril – amonyum nitrat (pH:5.4, 0.03 M) (70:30 h/h) ve 20 L enjeksiyon hacmi kullanılarak 2 mL/dak akı hızı ile elde edildi ği saptanmı tır.
Dedeksiyon 280 nm’de yapılmı tır. Đç standart olarak çe itli maddeler denenmi ve en uygun piki veren siproteron asetat seçilmi tir. Yöntemde alıkonma zamanları
(retention time) DNG için 1.86 dakika, siproteron asetat (iç standart) için 3.01 dakika ve EV için 5.95 dakika olarak bulunmu tur ( ekil 3.19).
Yöntemdeki do ğrusal çalı ma aralı ğının DNG için 3.0 – 45.0 g/mL, EV için
18.0 – 100.0 g/mL oldu ğu saptanmı tır. TAS, DNG için 3.0 g/mL, EV için ise
18.0 g/mL’dir. YS ise DNG için 0.06 g/mL, EV için 0.58 g/mL’dir.
Yöntemin validasyonu konusunda yapılan çalı malarda; ortalama % geri kazanım de ğerleri DNG için % 101.10, EV için % 100.32, % ba ğıl standart sapma de ğerleri ise sırasıyla DNG ve EV için % 0.49 ve % 1.18 olarak bulunmu tur
(Çizelge 3.17 ve Çizelge 4.2). Bu de ğerler yöntemin do ğrulu ğu ve kesinli ği açısından tatmin edicidir.
4.1.4. ekil 3.5’de DNG ve EV ’ın metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin UV spektrumlarında DNG ’in 308.2 nm’de bir maksimum absorpsiyon verdi ği, buna kar ılık EV ’ın bu dalga boyunda absorpsiyona sahip olmadı ğı gözlenmektedir.
129
Yapılan çalı malar, EV ’ın her ne kadar absorpsiyona katkısı yok gibi görünse de, pratikte çok küçük bir miktarda katkısının oldu ğunu göstermi tir. Dolayısıyla DNG
+ EV karı ımında yalnızca 308.2 nm’de absorbans de ğerleri okunarak DNG ’in miktarının tayin edilemeyece ği anla ılmı tır.
Ayrıca, farmasötik preparatlarda DNG ’in yine 308.2 nm’de ölçüm yapılarak tayini yapılmaya çalı ıldı ğında daha da kötü sonuçlar elde edilmi tir. Bunun nedeninin belki de preparattaki yardımcı maddelerin olabilece ği dü ünülmü tür.
4.2. Yöntemlerin farmasötik preparatlara uygulanması
130
DNG + EV karı ımında her iki etken maddenin de miktar tayini için geli tirilen 1D, TBR, KEK ve YPSK yöntemlerinin bu iki etken maddeyi içeren farmasötik preparatlara uygulanabilirli ği ara tırılmı tır:
Bilindi ği gibi farmasötik preparatların içerisinde etken maddelerin yanında
çe itli yardımcı maddeler de bulunmaktadır. Bizim seçmi oldu ğumuz draje preparatındaki yardımcı maddelerin yöntemi etkileyip etkilemedi ğinin öncelikle saptanması gerekir. Bunu yapabilmek için DNG + EV karı ımını içeren
CLIMODIEN ® draje içerisindeki DNG ve EV ’ın miktarı önerilen tüm yöntemlerle tayin edilmi tir. Sonra tayin i leminde kullanılan preparata bilinen miktarlarda ayrı ayrı DNG ve EV eklenmi ve bu miktarlar tayinde kullanılan çözücülerdeki
çözeltileri seyreltilerek her iki maddenin de yöntemdeki çalı ma aralıklarına getirildikten sonra miktarları tayin edilmi tir. Hem standart ilavesinden önce hem de sonra tayin edilen DNG ve EV ’ın miktarlarının arasında önemli bir fark olmadı ğı saptanmı tır. Böylece bu preparatdaki yardımcı maddelerin yöntemi etkilemedi ği sonucuna varılmı tır. Dolayısıyla 3.2.5.2 , 3.3.2.2 ve 3.4.2.2 bölümlerinde anlatıldı ğı
ekilde yöntemler CLIMODIEN ® draje preparatına uygulanmı ve çalı ılan seriler için bulunan DNG ve EV ’ın miktar tayini sonuçları Çizelge 3.6, 3.7, 3.13 ve 3.19’da gösterilmi tir.
Geli tirilen yöntemlerin seçilen farmasötik preparata uygulanması konusunda ise, dikkati çeken CLIMODIEN ® drajede 1D, KEK, TBR ve YPSK yöntemleriyle bulunan DNG miktarlarının preparatın üzerinde belirtilenden biraz yüksek bulunmasıdır (Çizelge 4.3).
131
Tüm yöntemlerde bu farmasötik preparatlar içerisindeki DNG ve EV için bulunan de ğerlerin ortalama miktarları, birbirleriyle student’s t testi yardımı ile kar ıla tırılmı tır (Çizelge 4.3) ve hesaplanan de ğerin p = 0.05 için çizelge de ğerinden (bu çalı ma için 2.26 dır) küçük olması nedeniyle CLIMODIEN ® drajeye uygulanan yöntemlerde DNG ve EV için bulunan sonuçlar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadı ğı anla ılmı tır. Ayrıca uygulanan yöntemlerin standart sapmaları birbirleriyle F testi ile kar ıla tırılmı (Çizelge 4.3) ve bulunan de ğerler çizelge F de ğerinden (bu çalı ma için 5.05’dir) küçük oldu ğu, dolayısıyla uygulanan yöntemlerde DNG ve EV için bulunan sonuçlar arasında kesinlik açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadı ğı sonucuna varılmı tır.
132
Çizelge 4.3. CLIMODIEN ® (71112 E)preparatına geli tirilen yöntemler uygulandı ğında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde yazılı olan miktarlar : 2 mg DNG + 2 mg EV/draje )
DNG EV Kullanılan Yöntemler Hesaplanan Hesaplanan Hesaplanan Hesaplanan x ± SS x ± SS t de ğerleri F de ğerleri t de ğerleri F de ğerleri
TBR 2.06 ± 0,01 2.01 ± 0.05 TBR-KEK = 0.02 TBR-KEK = 1.43 TBR-KEK = 0.48 TBR-KEK = 1.23
1 1 1 TBR - D = 1.36 TBR - D = 3.16 TBR - D = 2.08 TBR - 1D = 1.17 KEK 2.06 ± 0,01 2.00 ± 0.04 YPSK - TBR = 0.10 YPSK - TBR = 2.13 YPSK - TBR =2.16 YPSK - TBR = 3.08
1 1 1 KEK - D = 1.31 KEK - D =2.21 KEK - D = 1.69 KEK - 1D = 1.05
1 D 2.05 ± 0,02 YPSK – KEK = 2.11 YPSK – KEK = 1.49 1.96 ± 0.04 YPSK – KEK = 1.72 YPSK– KEK = 2.50
1 1 1 YPSK - D = 0.52 YPSK - D = 1.49 YPSK - D = 0.48 YPSK - 1D = 2.63
YPSK 2.05 ± 0,02 1.96 ± 0.03
P = 0.05 için Çizelge de ğeri t = 2.26 Çizelge F de ğeri = 5.05 132
133
4.3. Geli tirilen yöntemlerin birbirleriyle kar ıla tırılmaları
Yaptı ğımız literatür taramasına göre bu karı ım için analitik yöntemle elde edilen verilere kemometrik teknikleri uygulayarak, YPSK ve 1.türev spektrofotometri ile veya ba ka bir yöntemle DNG ve EV ’ı içeren karı ımlarda ve bu karı ımları içeren preparatlarda DNG ve EV ’ın aynı anda miktar tayinlerinin yapıldı ğı bir çalı maya rastlanmamı tır. Dolayısıyla yapılan çalı malar tamamen orijinaldir. Bu nedenle de geli tirilen yöntemler ne bir ba ka literatürdeki yöntemle ne de bir farmakope yöntemiyle kar ıla tırılamamı tır. Ancak kendi aralarında kar ıla tırılmı lardır. Buna göre; spektrofotometrik verilere kemometrik yöntemler
(TBR ve KEK) uygulayarak geli tirdi ğimiz miktar tayini i lemlerinde orijinal (0. derece) spektrumların kullanılabilmesi bir avantaj olurken hesaplamaların yapılması için mutlaka bilgisayarda istatistik programlarının kullanılmasının gereklili ği bir dezavantaj olarak ortaya çıkmaktadır. 1.türev spektrofotometri yöntemi ise cihaz
üzerindeki bilgisayar programı ile gerçekle tirilmekte ama duyarlı sonuçlar vermektedir. DNG ve EV karı ımında DNG ve EV ’ın miktar tayini için TBR, KEK,
1D ve YPSK yöntemleriyle elde edilen sonuçlar uyumludur ve her dört yöntemde de hiçbir ayırma i lemi gerekmeksizin bu karı ımda DNG ve EV ’ın aynı anda miktar tayinleri yapılabilmektedir. YPSK yönteminde TBR ve KEK yöntemleriyle elde edilenlere göre EV için daha dü ük TAS görülürken, 1D yöntemiyle YPSK, TBR ve
KEK yöntemlerine nazaran daha dü ük TAS de ğerlerine ula ılmı tır. DNG için ise
TBR, KEK ve 1D yöntemleriyle YPSK’ya göre çok az da olsa daha dü ük tayin alt sınırı görülmü tür. Yakalama sınırları açısında de ğerlendirecek olursak YPSK yöntemi di ğer yöntemlere oranla çok daha dü ük yakalama sınırı de ğerlerine sahiptir.
YPSK yönteminde çalı ma aralıkları DNG için TBR, KEK ve 1D yöntemlerine göre
134
daha geni ken, EV için 1D yöntemi; YPSK, TBR ve KEK’e göre daha geni oldu ğu bulunmu tur. (Çizelge 4.2)
YPSK bir ayırma tekni ğidir ve hem uzun i lemleri gerektirmekte hem de kullanılan çözücülerin saflı ğı nedeniyle oldukça pahalı bir yöntemdir. Buna kar ılık optimize edilmi artlarda yakla ık 7 dakika içerisinde sonuç alınması ve giri im yapan di ğer maddelerden ayırım yapıldıktan sonra etken maddelerin tayinlerinin yapılması ve bu nedenle spesifik olması bir avantajdır. Seçilen preparatlara bu üç yöntem uygulandı ğında elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak kar ıla tırıldıklarında aralarında anlamlı bir farkın olmadı ğı yani elde edilen sonuçların güven aralı ğı içerisinde birbirleri ile uyumlu oldu ğu anla ılmı tır.
135
5. SONUÇ ve ÖNER ĐLER
Tez kapsamı içerisinde DNG ve EV içeren karı ımlarda DNG ve EV ’ın aynı anda miktar tayinlerinin yapılabilmesi için 4 de ği ik yöntem geli tirilmi tir. Bunlar; spektrofotometrik verilere temel bile en regresyonu (TBR) tekni ğinin uygulanması, spektrofotometrik verilere kısmi en küçük kareler (KEK) uygulanması, 1. türev spektrofotometri ( 1D) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK)’dir.
TBR ve KEK yöntemlerinde; standart çözeltiler kullanılarak hazırlanan kalibrasyon matrisleri yardımıyla DNG için 300 – 350 nm’ler arasında 51 dalga boyunda, EV için ise 260-300 nm’ler arasında λ = 1 nm olarak 41 dalga boyunda okunan absorbansların de ğerledirilmesi ile karı ımdaki DNG ve EV ’ın aynı anda miktarı tayini gerçekle tirilmi tir.
1D yönteminde; DNG ve EV ’ın metanol – su (3:1) çözeltisi içerisindeki karı ım çözeltilerinin ayrı ayrı 1. türev spektrumları çizdirilerek spektrumlarında sıfır oldu ğu noktalar bulunarak, o dalga boylarında di ğer madde için dA/d λ de ğerleri okunmu ve hazırlanan kalibrasyon grafikleri yardımıyla, karı ımdaki DNG ve EV ’ın aynı anda miktarı tayini gerçekle tirilmi tir.
YPSK’de ise; ACE C8 kolonu üzerinde asetonitril – amonyum nitrat (pH: 5.4, 0.03 M) (70:30, h/h) mobil fazı kullanılarak, 280 nm’de deteksiyon ile elde edilen kromatogramlardaki pik alanlarının, iç standart olarak seçilen siproteron asetatın pik alanına bölünmesi ile elde edilen de ğerlerin, konsantrasyona kar ı grafi ğe geçirilmesi ile hazırlanan kalibrasyon e ğrileri yardımıyla, karı ımdaki DNG ve EV ’ün aynı anda miktarı tayini gerçekle tirilmi tir. Sayılan dört yöntem de optimize edildikten sonra valide edilmi lerdir. Sonra bu dört yöntemin Türkiye ilaç piyasasında bulunan bir adet draje preparatına uygulaması için optimal artlar belirlenmi ve hiçbir ayırma i lemi gerekmeden preparatın içerisinde bulunan DNG ve EV ’ın aynı anda miktarı tayini gerçekle tirilmi tir. Böylece tez çalı malarımıza ba larken belirledi ğimiz amaca ula ılmı tır.
DNG + EV karı ımında DNG ve EV ’ın aynı anda tayini için kapiler elektroforez yöntemininde uygulanabilece ğini dü ünüyoruz. Đleriki çalı malarda bu yöntemin farmasötik preparatlara uygulamasının yapılmasını planlıyoruz.
136
ÖZET
Dienogest ve estradiol valerat’ın farmasötik preparatlarda spektrofotometrik yöntemlerle aynı anda miktar tayinleri Bu tez kapsamında; dienogest ( DNG ) ve estradiol valerat ( EV ) içeren bir karı ımda her iki maddenin aynı anda miktar tayininin yapılabilmesi için yeni yöntemler geli tirilmesi amacıyla çalı malar yapılmı tır. Çalı malarda spektrofotometrik analizler temel alınmı ve 1. türev spektrofotometri ( 1D), spektrofotometrik verilerin temel bile en regresyonu (TBR) ve kısmi en küçük kareler (KEK) yöntemleriyle analizi kullanılmı tır.
1D yönteminde, DNG + EV karı ımının metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin 200 – 400 nm arasındaki spektrumlarının 1. türevinde, DNG için 328.8 nm’ de, EV için ise 258.4 nm’de analitik sinyaller okunmu tur ( ∆λ = 2 nm, skala faktörü = 30). TBR ve KEK yöntemlerinde ise, DNG için metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin UV spektrumunlarının (0. derece) 300 - 350 nm’ler arasındaki bölgede ∆λ = 1 nm olarak 51 adet dalga boyundaki absorbansları, EV için 260-300 nm’ler arasındaki bölgede ∆λ = 1 nm olarak 41 adet dalga boyundaki absorbansları okunmu ve TBR ve KEK ile analizleri yapılmı tır. Yöntemlerdeki ortalama % geri kazanım ve % ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla DNG için; 1D’de % 99.28 ve % 0.98, TBR’de % 99.33 ve % 0.34, KEK’de % 99.18 ve % 0.26, EV için; 1D’de % 98.56 ve % 0.96, TBR’de % 100.48 ve % 1.58, KEK’de % 100.54 ve % 1.58 olarak bulunmu tur. Yöntemlerdeki çalı ma aralıklarının 1D’de DNG için 2.0 – 24.0 g/mL, EV için 10.0 – 275.0 g/mL oldu ğu, TBR ve KEK’de DNG için 2.0 – 24.0 g/mL, EV için 20.0 – 270.0 g/mL oldu ğu saptanmı tır. Geli tirilen bu üç spektrofotometrik yöntem Türkiye ilaç piyasasında bulunan draje preparatına ba arıyla uygulanmı tır. Ayrıca yeni bir YPSK yöntemi geli tirilmi tir ki yöntemde kolon olarak ACE C8 ters faz kolonu, mobil faz olarak asetonitril – amonyum nitrat (pH: 5.4, 0.03 M) (70:30 h/h) kullanılmı ve deteksiyon 280 nm’de yapılmı tır. Đç standart olarak siproteron asetat seçilmi tir. Yöntemde alıkonma zamanları DNG için 1.85 dakika, siproteron asetat için 3.01 dakika ve EV için 5.95 dakikadır. Yöntemdeki ortalama % geri kazanım ve % ba ğıl standart sapma de ğerleri sırasıyla DNG için % 101.10 ve % 0.49, EV için % 100.32 ve % 1.18 olarak bulunmu tur.
137
Yöntemdeki çalı ma aralı ğının DNG için 3.0 – 45.0 g/mL EV için 18.0 – 100.0 g/mL oldu ğu saptanmı tır. Geli tirilen YPSK yöntemi de aynı preparata uygulanmı ve elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak birbirleriyle kar ıla tırılmı tır.
Anahtar kelimeler: Farmasötik preparat; Dienogest; Estradiol valerat; Sıvı kromatografi; Türev spektrofotometri; Temel bile en regresyonu; Kısmi en küçük kareler.
138
SUMMARY
Simultaneous spectrophotometric determination of dienogest and estradiol valerate in pharmaceutical preparations
In the scope of this thesis, studies were conducted in order to develop new methods for the simultaneous determination of dienogest ( DNG ) and estradiol valerate ( EV ) in their binary mixture. In the studies; spectrophotometric analysis were essential and first derivative spectrophotometry ( 1D), principle component regression (PCR) and partial least squares (PLS) methods were used in the analysis.
In 1D method, analytical signals were measured at 328.8 nm for DNG , and 258.4 nm for EV in the first derivative spectra of the solution of DNG + EV mixture in methanol – water (3:1) in 200 – 400 nm range (∆λ = 2 nm, scaling factor = 30). In PCR and PLS methods, absorbances were measured at 51 wavelengths between 300- 350 nm ( ∆λ = 1 nm) for DNG and at 41 wavelengths between 260-300 nm ( ∆λ = 1 nm) for EV in original absorption spectra of DNG + EV mixture in methanol – water (3:1) and, PCR and PLS analysis were achieved. For DNG; mean recoveries and relative standard deviations were found as % 99.28 and % 0.98 in 1D; % 99.33 and % 0.34 in PCR; % 99.18 and % 0.26 in PLS methods respectively. They are % 98.56 and % 0.96 in 1D; % 100.48 and % 1.58 in PCR; %100.54 and % 1.58 in PLS for EV respectively. Working ranges were 2.0 – 24.0 g/mL in 1D, PCR and PLS for DNG . It is 10.0 – 275.0 g/mL in 1D and 20 – 270 g/mL in PCR and PLS for EV . These three methods were successfully applied to a sugar coated tablet marketed in Turkey. Moreover we developed an HPLC method in which ACE C8 reverse phase column and acetonitril – ammonium nitrate (pH: 5.4, 0.03 M) ( 70:30 v/v ) mobil phase was used and 280 nm was selected for detection. Cyproteron acetate were chosen as internal standard. Retention times were 1.85 min. for DNG , 3.01 min. for cyproteron acetate and 5.95 min. for EV . Mean recoveries and relative standard deviations are % 101.10 and % 0.49 for DNG ; % 100.32 and % 1.18 for EV respectively. In HPLC method, working ranges were found as 3.0 – 45.0 g/mL for DNG and 18.0 – 100.0 g/mL for EV . HPLC method was also applied to the same formulation selected and the results were compared with each other statistically.
139
Keywords: Pharmaceutical preparation; Dienogest; Estradiol valerate; Liquid chromatography; Derivative spectrophotometry; Principal component regression; Partial least squares.
140
KAYNAKLAR
AMIN, M. (1989). Quantitative thin-layer chromatographic analysis of dehydroepiandrosterone enanthate and estradiol valerate in pharmaceutical preparations and blood, Pharmazeutische Industrie 51 , Nr.1
ATKINSON, A.C. (1985). Plots, Transformation and Regression . Oxford University Press, New York
BEEBE, K.R., KOWALSKI, B.R. (1987). An introduction to multivariate calibration and analysis. Analytical Chemistry , 59 : 1007 A – 1017 A
BOOKSH, K.S., KOWALSKI, B.R. (1994). Theory of analytical chemistry. Analytical Chemistry , 66 : 782 A – 791 A
BOX, G.E.P. (1980). Sampling and Bayer inference in scientific modeling and robustness. Journals of The Royal Statistical Society, Series A. 143 : 383 – 404
BRITISH PHARMACOPOEIA. Stationary Office Books; 99 Edition., 1999 London
CARIGNAN, G., LODGE, B. A., SKAKUM, W. (1984). High-performance liquid chromatographic analysis of estradiol valerate-testosterone enanthate in oily formulations, Journal of Chromatography A , 301 , 292-296
CARIGNAN, G.; LODGE, B. A.; SKAKUM, W. (1980), Determination of estradiol esters in oily solution by high-performance liquid chromatography, Canadian Journal of Pharmaceutical Sciences,15 (1), 10-12
COOK, R.D., WEISBERG,S. (1982). Residuals and influence in regression . Chapman and Hill, New York
COWE, I.A., McNICOL, J.W. (1985). The use of principal components in the analysis of near – infrared spectra. Applied Spectroscopy , 39 : 257 - 266
DĐNǸ E., YÜCESOY, C., PALABIYIK, Đ. M., ÜSTÜNDA Ğ, Ö., ONUR, F. (2003 ), Simultaneous spectrophotometric determination of cyproterone acetate and estradiol valerate in pharmaceutical preparations by ratio spectra derivative and chemometric methods, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis , 32 (3), p.539-547
DU, B., SONG, S., SHI, X., ZHANG, Z., (2009). Analysis of steroids by nonaqueous capillary electrophoresis, Journal of Analytical Chemistry, 64 (1), 59-64
141
DUAN, J. P., CHEN, G. N., CHEN, M. L., WU, X. P., CHEN, H. Q. (1999). Adsorptive and electrochemical behaviors of estradiol valerate at a mercury electrode , The Analyst , 124(11), 1651-5.
DUTTER, R., HUBER, P.J. (1981). Numerical methods for the nonlinear robust regression. Journal of Statistical Computation and Simulation. 13 : 79 –114
FEKETE, S., FEKETE, J., GANZLER, K. (2009). Validated UPLC method for the fast and sensitive determination of steroid residues in support of cleaning validation in formulation area, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 49 , 833-838
FOSTER R.H., WILDE M.I. (1998). Dienogest. Drugs 56 (5): 825–33; discussion 834–5
FRANK, I.E. (1990). Nonlinear PLS model. Chemometrics International Laboratuary System, 8 : 109 – 119
FREDERICKS, P.M., LEE, J.B., DSBORN, P.R., SWINK, D.A. (1985). An excellent reference to PCR and PCA methods. Applied Spectroscopy, 39 : 303 – 310
HAALAND D.M., THOMAS, E.V., (1988). Partial least-squares methods for spectral analyses. 1.Relation to other quantitative calibration methods and the extraction of qualitative information, Analytical Chemistry , 60 1193-1202.
HAWKINS, D.M. (1993). The feasible set algorithm for least median of squares regression. Computational Statistics and Data Analysis. 16 : 81 – 101
HIEU, D.K., REDDERSEN, G., WEHRBERGER, K., HOBE, G. (1986). Radioimmunoassay of the progestagen Dienogest using different methods of plasma sample preparation Pharmazie , 41 (10), 711-14.
HOBE, G., KLINGER, G., REDDERSEN, G., ERDMANN, A.; KLINGER,G., (1986). Determination of the progestagen dienogest in plasma and saliva by radioimmunoassay, Pharmazie , 41 (11), 772-4.
GALBRAITH, A., SHANE, B., ELIZABETH M., BARRY H., ANN R. (2007). Fundamentals of Pharmacology: An Applied Approach for Nursing and Health. United Kingdom: Pearson Education LTD. pp. 632.
GELADI, P., KOWALSKI, B.R. (1986). Partial least squares regression A: Tutorial. Analytica Chimica Acta , 185 : 1 - 17
142
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS, CLARKE’S. Littenhouse Book Distributions. Inc., 1986. Pennsylvania, USA.
JOCHUM, P., SCHROT, E.L. (1984). Deconvulation of multicomponent ultraviolet and visible spectra. Analytica Chimica Acta, 157 : 211 - 216
KAZAKEVICH, Y., LoBRUTTO, R. (2007). HPLC for Pharmaceutical Scientist , John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, USA
KISNER, H.J., BRIWN, C.W., KAVARNOS, G.I. (1983). Multiple analytical frequencies and standards for the least – squares spectrophotometric analysis of serum lipids. Analytical Chemistry, 55 : 1703 – 1707
LAWRENCE, K.D., ARTHUR, J.L. (1990). Robust nonlinear regression. Analysis and Application. Marcel Dekker, New York. 59 - 86
LORBER, A., WANGEN, L.E., KOWALSKI, B.R. (1987). A therotical foundatiton for the PLS algorithm. Journal of Chemometrics , 19 : 1 - 18
MARTENS, L., NAES, T. (1984). Multivariate calibration. I. Concepts and distinction. Trends in Analytical Chemistry, 3: 204 – 211
MILLER, J.N. (1991). Basic statistical methods for analytical chemistry. Part 2: Calibration and regression review. Analyst , 116 : 3 – 14
NAES, T., MARTENS, L. (1984). Multivariate calibration. II. Chemometric methods. Trends in Analytical Chemistry, 3: 266 - 271
OWEN A. J., (1995). Uses of Derivative Spectroscopy; UV-visible Spectroscopy, Application Note, Agilent Technologies, Germany.
ÖZDEM ĐR, D. “Multi-instrument calibration using genetic regression in UV-visible and near-infrared spectroscopy”. Doktora tezi, Mayıs 1999. Clemson University, South Carolina, USA.
PALABIYIK, Đ.M. “dekstrometorfan hidrobromür içeren çoklu preparatlardaki etken maddelerin spektrofotometrik, kromatografik ve kapiler elektroforetik yöntemlerle miktar tayinleri”. Doktora tezi, Kasım 2008. Ankara Üniversitesi, Türkiye.
RATKOWSKY, D.A. (1990). Handbook of nonlinear regression models . Marcel Dekker. New York
143
RENCHER, A.C. (1995). Methods of multivariate analysis , John Wiley & Sons Inc. New York RILEY ve ROSANSKE,1996; Development And Validation Of Analytical Methods, Tarrytown, N.Y., Pergamon, 1996.
ROECKER, E.B. (1991). Prediction error and its estimation for subset – selected models. Tecnometrics . 33 : 459 – 468
RXMEDIAPHARMA ® ĐNTERAKT ĐF ĐLAÇ B ĐLG Đ KAYNA ĞI, (2009), GEMA GENEL MÜHEND ĐSL ĐK Mekanik Sanayi ve Tic. A. ., Đzmir
SEGALL,A., HORMAECHEA, F.,VITALE, M., PEREZ, V., PIZZORNO, M. T., (1999). Development and validation of a reversed-phase liquid chromatographic method for analysis of estradiol valerate and medroxyprogesterone acetate in a tablet formulation, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis , 19 (5), p.803-808,
SEKULIC, S., SEASHOLTZ, M.B., WANG, Z., KOWALSKI, B.R., LEE, S.E., HOLT, B.R. (1993). Nonlinear multivariate calibration methods in analytical chemistry. Analytical Chemistry , 65 : 835A – 845 A
SJOSTROM, M., WOLD, S., LINDBERG, W., PERSSON, J.A., MARTENS, H. (1983). A multivariate calibration problem in analytical chemistry solved by partial least squares models in latent variables. Analytica Chimica Acta, 150 : 61 – 70
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. (1998). (Çeviri editörleri Prof. Dr. Esma KILIÇ, Prof. Dr. Fitnat KÖSEO ĞLU, Doç Dr. Hamza YILMAZ) Enstrümental Analiz Đlkeleri , birinci baskı, Bilim Yayıncılık, Ankara, Türkiye
STROMBERG, A.J. (1993). Computing the exact least median of squares estimate and stability diagnostics in multiple linear regression. SIAM Journal on Scientific and Statistical Computing .14 : 1289 – 1299
STROMBERG, A.J., RUPPERT,D. (1989). Breakdown in nonlineer regression. Journal of the American Statistical Association. 87 : 991 – 997
TALSKY G. (1994). Derivative Spectrophotometry Low and Higher Order , First ed., VCH Publishers, New York, NY, .
THE MERCK INDEX. 13 th Edition. Merck & Co. Inc. Whitehouse Statition New Jersey 2001
144
THOMAS, E.V. (1994). A primer on multivariate calibration. Analytical Chemistry , 66 : 795 A – 804 A
TOPTAN S.; “Sitrik asit ve sakaroz içeren gıdalarda kullanılan ikili boya karı ımlarının analizi”, Doktora tezi, 1999. Hacettepe Üniversitesi Sa ğlık Bilimleri Enstitüsü
TRIPODI, V., FLOR, S., CARLUCCI, A., LUCANGIOLI, S. (2006). Simultaneous determination of natural and synthetic estrogens by EKC using a novel microemulsion, Electrophoresis , 27 , 4431-4438
USP 23 - NF 18 (1994). The United States Pharmacopeia & The National Formulary , United States Pharmacopeial Convention, Inc, US Pharmacopeia, Washington
WENTZELL, P.D., ANDREWS, D.T., KOWALSKI, B.R. (1997). Maximum likelihood multivariate calibration. Analytical Chemistry , 69 : 2299 - 2311
WIEGRATZ, I., LEE, J.H., KUTSCHERA, E., BAUER, H.H., VON HAYN, C., MOORE, C., MELLINGER, U., WINKLER, U.H., GROSS, W., KUHL, H. (2002). Effect of dienogest-containing oral contraceptives on lipid metabolism. Contraception 65 (3): 223–9.
YÜCESOY, C., EROL S. (2000). Derivative and difference spectrophotometric determination of cyproterone acetate and estradiol valerate in formulations, FABAD J. Pharm. Sci. , 25 , 85-90,
YÜCESOY, C. (2000). Simultaneous spectrophotometric determination of estradiol valerate and cyproterone acetate, Ankara Universitesi Eczacilik Fakultesi Dergisi , 29 (1), 9-19.
ZIMMERMAN, H., THEBAULT, J. J., DUVAUCHELLE, T., MIGNOT, A., RENOUX, A., GUALANO, V. (2000). Pharmacokinetics of estradiol valerate 2mg + dienogest 2mg (climodien 2/2) after single and repeated oral administration in healthy postmenopausal women, Clinical Drug Investigation , 20 (2), 123-134.
145
ÖZGEÇM Đ
I- BĐREYSEL B ĐGĐLER
Adı : M. Gökhan
Soyadı : Ça ğlayan
Do ğum Yeri ve Tarihi : Đstanbul / 08.06.1982
Uyru ğu : T.C.
Đleti im Adresi ve Telefonu :Aydınlar mah. Cahit Sıtkı sok. No:24/19
Dikmen Çankaya / Ankara
Tlf : 0 312 479 75 16
0 505 203 37 32
II- EĞĐ TĐMĐ
Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı - Tezli yüksek lisans-2007-2009
Orta Do ğu Teknik Üniversitesi – Kimya Ö ğretmenli ği (lisansla birle tirilmi tezsiz yüksek lisans programı)-2000–2005
Yakacık Meslek Lisesi – Kimya Bölümü-1996–1999
Fuat Köprülü Đlkö ğretim Okulu-1993–1996
Kavakpınar Đlkokulu-1988–1993
Yabancı dili: Đngilizce
146
III- ÜNVANLARI
Kimya Teknisyeni 1999
Kimya Ö ğretmeni 2005
IV- MESLEK Đ DENEY ĐMĐ
09.1998- 06.1999 -Đller Bankası 1. Bölge Müdürlü ğü – Đçme suyu analiz laboratuarı – su analizleri
09.2005-06.2006 -Pendik Anadolu Denizcilik Meslik Lisesi – Kimya Ö ğretmeni
09.2005-02.2006 -80.yıl Nuh Çimento Lisesi – Kimya Ö ğretmeni
09.2007-12.2007 -Orta Do ğu Teknik Üniversitesi Çevre Analiz Laboraturarı – Su analizleri
01.2008 – -Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı – Ara tırma Görevlisi