Les Sarms (Selective Androgen Receptor Modulators)

Nora CESBRON

Mémoire présenté en vue de l’obtention du grade de Docteur d'Oniris - École Nationale Vétérinaire Agroalimentaire et de l'Alimentation Nantes-Atlantique sous le sceau de l’Université Bretagne Loire

École doctorale : Biologie-Santé (BS)

Discipline : Santé Publique Spécialité : Epidémiologie, Analyse de Risque, Recherche Clinique Unité de recherche : Oniris-LABERCA

Soutenue le 07 juin 2017 Thèse N° :

Les SARMs (Selective Androgen Receptor Modulators) :

une nouvelle famille d'agents anabolisants. Etude des effets zootechniques associés et développement de stratégies analytiques visant la mise en évidence de leur utilisation chez le jeune bovin

JURY

Rapporteurs : Philippe SCHMIDELY, Professeur, AgroParisTech, Paris, France Philippe DELAHAUT, DVM, Directeur de Recherche, CER Groupe, Marloie, Belgique

Examinateurs : Henri SEEGERS, Professeur, Président, INRA Centre Angers Nantes, Nantes, France Gianfranco BRAMBILLA, DVM, EAVPT Diplomate, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italie

Directeur de Thèse : Gaud DERVILLY-PINEL, Docteur, Oniris-LABERCA, Nantes, France

Co-directeur de Thèse : Bruno LE BIZEC, Professeur, Oniris-LABERCA, Nantes, France

Aux membres de notre jury de thèse

Monsieur le Docteur vétérinaire Philippe DELAHAUT, Directeur de Recherche au CER Groupe (Centre d'Economie Rurale), Département Santé, Marloie, Belgique,

Monsieur le Professeur Philippe SCHMIDELY, Enseignant Chercheur à l'Institut des sciences et industries du vivant et de l'environnement (AgroParisTech), Paris, France,

Monsieur le Docteur vétérinaire Gianfranco BRAMBILLA, Directeur de Recherche à l'Istituto Superiore di Sanità (ISS), Rome, Italie,

Monsieur le Professeur Henri SEEGERS, Président du Centre de Recherche Pays de la Loire, de l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Nantes, France,

Monsieur le Professeur Bruno LE BIZEC, Directeur du Laboratoire d‘Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA), à l‘Ecole Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l‘Alimentation Nantes-Atlantique (Oniris), Nantes, France,

Madame le Docteur Gaud DERVILLY-PINEL, Responsable Scientifique adjointe au Laboratoire d‘Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA), à l‘Ecole Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l‘Alimentation Nantes-Atlantique (Oniris), Nantes, France,

qui m‘ont fait l‘honneur et le plaisir d‘accepter de juger ce travail de thèse, et que je remercie pour le temps consacré à la lecture, l‘évaluation et la discussion autour de ces travaux.

Table des matières

Listes des sigles et abréviations

Liste des figures et tableaux

Introduction générale

Chapitre 1

Introduction

1. Nouveaux agents anabolisants : les SARMs

1.1. Originalités des SARMs

1.2. Focus particulier sur l'enobosarm

2. Mécanisme d'action d'un effet anabolique

2.1. Synthèse protéique et voies métaboliques impliquées

2.2. Croissance du muscle squelettique

2.3. Mode d'action des SARMs

3. Utilisation des anabolisants en élevage

3.1. Utilisation des anabolisants en France et en Europe

3.2. Evaluation du "risque anabolisant" : données toxicologiques des composés interdits

3.3. Gestion du "risque anabolisant" : réglementation européenne et commerce international

3.4. Contrôle des anabolisants en France et en Europe

4. Détection de l'utilisation des anabolisants chez les bovins

4.1. Utilisation de paramètres zootechniques : recherche d'une signature phénotypique

4.2. Stratégies analytiques ciblées : recherche d'une signature analytique

4.3. Stratégies analytiques non ciblées : recherche d'une signature métabolique

Conclusion

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Objectif

Introduction

Expérimentation

Mise en œuvre

1. Optimisation d'un protocole de préparation de la matrice urine

2. Elaboration d'un protocole de préparation de la matrice fèces

Résultats

1. Matrice urine

1.1. Cinétique d'élimination

1.2. Métabolisme

2. Matrice fèces

2.1. Cinétique d'élimination

2.2. Métabolisme

Conclusion

Chapitre 3 - Développement d’outils zootechniques. Application à l’évaluation des performances de croissance chez le veau après une administration orale d'enobosarm

Objectif

Introduction

Résultats

1. Choix et validation d'outils et de mesures

2. Evaluation des effets de l'administration d'enobosarm

Conclusion

Chapitre 4 - Mise au point et application d’une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Objectif

Introduction

Moyens mis en œuvre et optimisation

1. Protocoles de prise d'empreintes métabolomiques

2. Préparation et analyse des échantillons

Résultats

1. Précautions préalables nécessaires

2. Application des protocoles sur les matrices urine et fèces en LC-HRMS

3. Etude des empreintes

3.1. Traitement des données et analyses statistiques

3.2 Etudes des empreintes urinaires

3.3. Etudes des empreintes fécales

Conclusion

Conclusion et perspectives

Références bibliographiques

Annexes

Liste des sigles et abréviations

5α-DHT : 5α-dihydrotestostérone ACN : acétonitrile ADN : acide désoxyribonucléique AR : androgen receptor (récepteur aux androgènes) AUC : area under the curve (aire sous la courbe) BEH : Ethylene Bridged Hybrid BVD : bovine viral diarrhea (diarrhée virale bovine)

Cmax : pic de concentration plasmatique CRIP : centre de recherche et d’investigation préclinique GC : gas chromatography (chromatographie en phase gazeuse) GC-MS : chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse GH : growth hormone (hormone de croissance) CV : coefficient de variation de répétabilité DBD : DNA-binding domain (domaine de liaison à l’ADN)

DE50 : dose efficace 50 DGAL : direction générale de l’alimentation DGER : direction générale de l’enseignement et de la recherche DU : dose unique EDE : établissement de l'élevage ELISA : enzyme linked immunosorbent assay ESI : electrospray ionisation (ionisation par électronébulisation) GMQ : gain moyen quotidien HAP : hydrocarbure aromatique polycyclique HG : hauteur au garrot HRMS : spectrométrie de masse haute résolution HSP : heat shock protein (protéine de choc thermique) IC : indice de consommation IGF-I : insulin-like growth factor-I INRA : institut national de la recherche agronomique IPI : infecté permanent immunotolérant LABERCA : laboratoire d’étude des résidus et contaminants dans les aliments LBD : ligand-binding domain (domaine de liaison au ligand) LC : liquid chromatography (chromatographie en phase liquide) LC-MS : chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse LC-MS/MS : chromatographie en phase liquide couplée avec la spectrométrie de masse en tandem LLE : liquid-liquid extraction (Extraction liquide-liquide) LH : largeur de hanches LNR : laboratoire national de référence MAAF : ministère de l’agriculture, de l’agroalimentaire et de la forêt MAAPRAT : ministère de l’agriculture, de l’alimentation, de la pêche, de la ruralité et de l’aménagement du territoire MS : mass spectrometry (spectrométrie de masse) MS/MS : spectrométrie de masse en tandem NC : non calculable NEC : notation d’état corporel

NR : non renseigné NTD : N-terminal domain (domaine N-terminal) PO : per os (voie orale) PV : poids vif RMN : résonance magnétique nucléaire RP: reversed phase (phase inverse) SAA : stéroïde anabolisant androgénique SARMs : selective androgen receptor modulators (modulateurs sélectifs du récepteur aux androgènes) SC : sous-cutané SERMs : selective estrogen receptor modulators SHBG : sex hormone-binding globulin (globuline liant les hormones sexuelles) SPE : solid phase extraction (extraction sur phase solide) SRM : selected reaction monitoring t1/2 : temps de demi-vie plasmatique TBA : trenbolone acetate (acétate de trenbolone) TIC : total ionic current (courant ionique total)

Tmax : temps à l’issue duquel est atteint le pic de concentration plasmatique TP : tour de poitrine UHPLC : ultra high performance liquid chromatography (Chromatographie liquide ultra-haute performance) VOS : velocity of sound (vitesse des ultrasons) WADA : world anti-doping agency (Agence mondiale de lutte contre le dopage)

Liste des figures et tableaux

FIGURES

Chapitre 1

Figure 1 : Position 12 du Chromosome X - Localisation Xq12

Figure 2 : Organisation structurale du récepteur androgène humain

Figure 3 : Mécanisme d’action du récepteur androgène au niveau cellulaire

Figure 4 : Exemples de structures chimiques des ligands de type aryle propionamide

Figure 5 : Structures chimiques du a) bicalutamide et de b) l'enobosarm

Figure 6 : Principaux rôles physiologiques de la testostérone et des SARMs non stéroïdiens

Figure 7 : Schéma du mécanisme d'action moléculaire de la sélectivité tissulaire des SARMs

Figure 8 : Structure chimique de l’enobosarm [(2S)-3-(4-Cyanophénoxy)-N-[4-cyano-3- (trifluorométhyl)phényl]-2-hydroxy-2-méthylpropanamide (IUPAC)]

Figure 9 : Structure chimique et tridimensionnelle de l'enobosarm

Figure 10 : Interaction entre la 17β-testostérone et les processus métaboliques observés dans le muscle squelettique

Figure 11 : Mécanisme physiologiques décrivant l'effet anabolisant provoqué par les androgènes et les œstrogènes

Figure 12 : Action des anabolisants sur les voies métaboliques de la cellule musculaire entrainant croissance des fibres et une augmentation de la synthèse protéique

Figure 13 : Formule du composé S-II, synthétisé par Dalton (2010) et présent dans un mix de SARMs additionné à un aliment pour animal de production et testé dans le cadre d'un brevet

Figure 14 : Cinétique d'excrétion de la 17β-trenbolone, 17α-trenbolone, 17β-estradiol et 17α- estradiol dans les urines de bovins charolais âgés de 10 à 14 mois, traités par un implant auriculaire de Revalor-XS Implant

Figure 15 : Cinétique d'élimination de l'enobosarm dans les urines d'un veau avant et après administration orale

Figure 16 : Modèle métabolomique permettant de prédire le statut, traité ou non traité, d’un animal sur la base de son empreinte urinaire

Chapitre 2

Figure 17 : Illustrations relatives à la mise en œuvre de l’expérimentation. Logement des veaux et système d'alimentation

Figure 18 : Structure chimique de l’enobosarm

Figure 19 : Calendrier de prélèvement des échantillons

Figure 20 : Protocole de préparation des échantillons d'urine pour la détection de l'enobosarm

Figure 21 : Conditions chromatographiques mises en œuvre

Figure 22 : Protocole de préparation des échantillons de fèces pour la détection de l'enobosarm

Figure 23 : Excrétion de l'enobosarm dans l'urine de bovin (avec et sans hydrolyse des formes conjuguées). Cinétique d'élimination urinaire chez un veau ayant reçu une forte dose unique d'enobosarm par voie orale à J0 (200 mg/animal)

Figure 24 : Excrétion de l'enobosarm dans l'urine de bovin (avec et sans hydrolyse des formes conjuguées). Cinétique d'élimination urinaire chez un veau ayant reçu une dose quotidienne d'enobosarm par voie orale à J0 (2,38 mg/animal/jour durant 21 jours)

Figure 25 : Chromatogrammes d’ions enregistrés dans le mode Full-scan et SRM des principaux métabolites non conjugués urinaires de l'enobosarm à J0+3h (transitions majoritaires)

Figure 26 : Excrétion de l'enobosarm dans les fèces de bovin. a) Cinétique d'élimination fécale chez un veau ayant reçu une forte dose unique d'enobosarm par voie orale à J0 (200 mg/animal) b) Cinétique d'élimination fécale chez un veau ayant reçu de l’enobosarm par voie orale à raison de 2,38 mg/animal/jour durant 21 jours

Chapitre 3

Figure 27 : Schéma général de la phase expérimentale de la partie zootechnique

Figure 28 : Illustrations relatives aux mesures a) du poids vif, b) du tour de poitrine et c) de la hauteur au garrot et de la largeur des hanches, d) de la largeur d'encolure, e) de la note d'état corporel, f) du muscle fessier, g) Echogramme : + tissu adipeux sous-cutané, * muscle fessier moyen (gluteus medius), # muscle fessier accessoire (gluteus accessories)

Figure 29 : Evolutions moyennes (± écart-types) des paramètres zootechniques mesurés (ou calculés) des lots Témoins et Traités au cours du temps

Chapitre 4

Figure 30 : Processus analytiques conduisant à l’observation (ou pas) de marqueurs d’effets consécutifs à l’exposition d’un animal de production à une substance active

Figure 31 : Premières étapes de l'approche métabolomique. Génération d'empreinte métabolomique sur des échantillons résultant de la mise en place d'un design expérimental adapté

Figure 32 : Conditions de chromatographie liquide (LC) en phase inverse (RPC) couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) en mode d'ionisation electrospray (HESI) négatif et positif

Figure 33 : Protocole de préparation de l'urine en vue d'une analyse métabolomique non ciblée par LC-HRMS

Figure 34 : Empreinte par analyse LC-HRMS. En haut, TIC (Total Ion Current) d'un échantillon contrôle qualité (QC) représentatif des 30 échantillons d'urine avec normalisation par la densité optique et la solution aqueuse au 1/5ème. En bas, TIC d'un QC représentatif des 30 échantillons d'urine sans normalisation

Figure 35 : Protocole de préparation de fèces de veau en vue d'une analyse métabolomique en LC- HRMS

Figure 36 : Chromatogrammes d’ions (LC-HRMS Full scan) en mode ESI- (a)) et ESI+ (b)) correspondant à la prise d’empreinte d’un échantillon de fèces de veau

Figure 37 : Chromatogrammes d’ions correspondant à la prise d’empreinte d’un échantillon de fèces de veau. Extraction des signaux spécifiques de quelques molécules d'intérêt mise en évidence en mode ESI+

Figure 38 : Score Plot de l’analyse multivariée non supervisée de type ACP « Analyse en Composante Principale » représentant la modélisation d’un jeu de données d’empreintes fécales a) en mode négatif, b) en mode positif. Echantillon contrôle qualité (QC), bovin femelle Prim'Holstein de 7 ans avec troubles métaboliques en pâture depuis 6 mois (2765 en bleu), bovin femelle Prim'Holstein de 7 ans sans trouble clinique en pâture depuis 6 mois (6979 en vert) et bovin femelle Prim'Holstein âgé de 11 mois en retard de croissance et avec une malformation de la face en stabulation stricte et avec une alimentation à base de concentré et fourrage (5644 en rouge)

Figure 39 : Protocole de préparation de fèces de veau en vue d'une analyse métabolomique non ciblée par LC-HRMS. Application aux échantillons de fèces prélevés sur 5 animaux contrôles et 5 animaux ayant reçu une administration orale d’enobosarm

Figure 40 : Chromatogramme d’ions (Full scan) en mode ESI positif. Profil chromatographique d’une urine d’un animal traité à J14

Figure 41 : Chromatogrammes d’ions (full scan) en mode ESI négatif. Profils chromatographiques des fèces de 5 animaux traités a) à J0 et b) à J21

Figure 42 : Etapes de l'approche métabolomique. Retraitement des données et application des analyses statistiques

Figure 43 : Analyse multivariée non supervisée de type ACP (Analyse en Composantes Principales) et représentation du jeu de données combinant animaux traités à différents points de cinétiques (T7, T14 et T21) et témoins (C7, C14 et C21). Les contrôles qualités (QC) sont représentés en jaune. Hormis les QC, chaque point représente un animal à un temps de cinétique donné

Figure 44 : Analyse multivariée supervisée de type PLS (Partial Least Square) (Score plot) et représentation du jeu de données urinaire combinant animaux traités (entourés en rouge) à différents points de cinétiques (T7, T14 et T21) et animaux contrôles (entourés en bleu) (C7, C14 et C21). Chaque point représente un animal

Figure 45 : Représentation S-plot des molécules ayant contribué à la séparation des groupes témoins et traités à l'enobosarm sur les échantillons urinaires. En rouge, les molécules les plus éloignées, potentiels marqueurs de la séparation

Figure 46 : Validation du jeu de données urinaire par test de permutation. P-value = 2.68725e-005

Figure 47 : Analyse multi-variée non supervisée de type ACP (Analyse en Composantes Principales) et représentation du jeu de données fécal acquis en mode négatif, combinant animaux traités (en rouge) et contrôles (en vert). Les contrôles qualités sont représentés en bleu par QC. Hormis les QCs, chaque point représente un animal à un point de cinétique donné (i.e. 5 points par animal)

Figure 48 : Figure 48 : En haut : Analyse multi-variée supervisée de type PLS (Partial Least Square) (Score plot) et représentation du jeu de données combinant animaux traités (T, carré bleu) et contrôles (C, rond vert). Chaque point représente un animal à temps cinétique (T0, T3, T7, T14 et T21 ; C0, C3, C7, C14 et C21). En bas : Validation du jeu de données par le test de permutation

Figure 49 : Représentation S-plot des molécules ayant contribué à la séparation des groupes témoins et traités à l'enobosarm sur les échantillons fécaux en mode négatif. Un ion se dégage caractérisé par sa masse et son temps de rétention M388T691 : l'enobosarm (flèche rouge)

Figure 50 : Informations complémentaires relatives à la détection de l’enobosarm dans l’empreinte fécale globale. A gauche, chromatogrammes d’ions correspondant à l'échantillon fécal d'un animal traité avec de l'enobosarm depuis 14 jours (animal n°2309, traité, prélèvement à J14) a) pic chromatographique de l'ion M388T691 correspondant à l'enobosarm [M-H]- observé à m/z 388 et de temps de rétention 11,5 minutes (691 secondes). b) Chromatogrammes d’ions (LC-HRMS) en mode ESI- (Full Scan) et c) en mode ESI+ (Full Scan) correspondant à la prise d’empreinte d’un échantillon de fèces de veau traité. d) absence de pic chromatographique de l'enobosarm en mode positif. A droite en haut, chromatogrammes de l'ion M388T691 pour les fèces d’un veau contrôles (en vert) et les fèces d’un veau traité (en rose) à différents points de cinétique et à droite en bas représentation en Box Plot de l’évolution moyenne des intensités du signal de l’enobosarm en fonction du temps

Figure 51 : Analyse multi-variée supervisée de type O-PLS (Orthogonal Partial Least Square) (Score plot) et représentation du jeu de données fécal acquis en mode négatif, combinant animaux traités (T, carré bleu) et contrôles (C, rond vert). Chaque point représente un animal à un temps cinétique (T3, T7, T14 et T21 ; C0, C3, C7, C14 et C21)

Figure 52 : Graphe des pics d'intensité de la lysine, la proline, la glycylproline et l'hydroxyproline dans les échantillons fécaux de l'étude

Figure 53 : Analyse multivariée supervisée de type O-PLS (Orthogonal Partial Least Square) (Score plot) et représentation du jeu de données fécal acquis en mode d’ionisation positif combinant animaux traités (T, triangle rouge) et contrôles (C, rond vert). Chaque point représente un animal à temps cinétique (T3, T7, T14 et T21, C3, C7, C14 et C21). Les temps C0 et T0, et l'animal n°8471 ont été retirés du jeu de données

Figure 54 : Caractéristiques associées à l'ion M274T555

Figure 55 : Caractéristiques associées à l'ion M280T586

TABLEAUX

Chapitre 1

Tableau I : Classification structurale des SARMs et quelques exemples

Tableau II : Affinité (Ki) de ligands au récepteur AR et mesure de l'activité de transcription

Tableau III : Synthèse bibliographique des études pharmacodynamiques réalisées chez le rat mâle castré pour les principales classes de SARMs

Tableau IV : Synthèse bibliographique des études de la résorption des SARMs analogues des aryl- propionamides

Tableau V : Dispositif de surveillance des promoteurs de croissance

Tableau VI : Extrait des références des méthodes d'analyses officielles pour la détection et l'identification des stéroïdes de la note de service DGAL/SDPRAT/N2011-8166

Tableau VII : Synthèse bibliographique des méthodes de détection et d'identification des SARMs et de leurs métabolites

Chapitre 2

Tableau VIII : Conditions d'acquisition des signaux

Chapitre 3

Tableau IX : Sélection de paramètres zootechniques : sept mesures et deux indices

Tableau X : Programme d'étude de la répétabilité des mesures sélectionnées

Tableau XI : Répétabilité des mesures

Introduction générale

Un travail de thèse entre veau et anabolisants...

En 2015, 640 000 veaux (soit 70 % des naissances en France) ont été intégrés dans les ateliers d’engraissement d’après les données des établissements de l’élevage (EDE). Ces mises en place représentent une baisse de 5,6 % par rapport à l’année 2014 (- 38 000 têtes) alors que les conditions étaient favorables pour produire du veau de boucherie à moindre coût. En effet, l'indice des prix d'achat des moyens de production agricole (IPAMPA) indique que le prix de l'aliment pour veaux a régressé de 9,5 % en 2015 par rapport à 2014, du fait de la baisse du prix de la poudre de lait (France AgriMer, 2016). La production de viande de veau est une particularité européenne et est développée dans certains pays comme l'Italie et les Pays-Bas ; pour la France, il s'agit d'une production typique bien ancrée dans ces différents territoires. La filière "veau de boucherie", nom générique donné à une filière d'engraissement du veau, se caractérise par une hétérogénéité des modalités d’élevage. Les principaux modes de production représentés en France sont les veaux sous la mère, issus de races allaitantes, et les veaux en élevage "intensif" (ceux qui sont perçus comme "veaux de boucherie") et fermiers, issus de races laitières. Ces deux derniers modes de production, du fait d’une alimentation pauvre en fer à base de lait ou de sous-produits laitiers, permettent l’obtention d’une viande rose pâle, encore appelée "viande blanche". Produite en bien moindre quantité, la viande rosée est quant à elle obtenue par distribution d’un aliment à plus forte teneur en fer, qu’il s’agisse d’un fourrage et/ou d’un concentré (Veissier, 2003).

D’après les données de Kantar Worldpanel (société d'étude (TNS UK Limited, Londres, Royaume Uni) de panel de consommateurs), les achats des ménages français de viande fraîche vitelline ont poursuivi leur diminution en 2015 (- 7,6 %, en volume par rapport à 2014). Entre 2013 et 2014, la baisse était moins marquée (- 5,3%, en volume). La viande vitelline reste parmi les viandes les plus chères (15 €/kg en moyenne), après la viande chevaline (16,3 €/kg en moyenne), bien que le prix moyen ait diminué de 0,4 % entre 2014 et 2015. Elle ne représente que 6 % des volumes achetés de viandes de boucherie et 7,7 % des sommes dépensées. La consommation de viande de veau est marquée géographiquement. Le Sud-ouest, zone de production traditionnelle, est la région la plus consommatrice avec 1,2 kg par personne et par an (1,0 kg/pers/an pour la moyenne nationale en 2014). Viennent ensuite le Centre-Ouest (proche des zones de production) et l’Est. La Région Parisienne, en raison du revenu moyen élevé, est également une zone fortement consommatrice. Quant au Nord et à l’Ouest, ce sont des régions sous-consommatrices de viande vitelline (respectivement 800 g/pers/an et 900 g/pers/an) (France AgriMer, 2016).

Le constat est donc que d'un côté il y a un type de production de viande, typique et historique en France, intégré dans une filière d'élevage dynamique, participant à la réputation de la gastronomie française et de l'autre une consommation de produits vitellins en constant déclin et surtout finalement une demande de viande de veau de moins en moins convoitée par les consommateurs. Dans un tel contexte, l’augmentation de productivité dans les élevages de veaux pourrait être un levier recherché par les professionnels de l'élevage. Il s’agirait alors de "faire mieux" économiquement avec moins d'animaux, ceci face à des consommateurs qui voudraient retrouver une confiance dans la viande au niveau de leur assiette et dans "l'utilisation" d'un jeune bovin comme animal de production en adéquation avec les courants de pensées sociétaux des années 2000.

Introduction générale

L’usage des anabolisants en élevage s’est développé dans les années soixante. Leur impact sur le gain de masse musculaire, consécutif à l’augmentation de l’efficacité alimentaire, en faisait des substances intéressantes pour augmenter la production de viande dans la situation économique de l'époque, en pleine période de construction de l'Europe, et où la demande de viande était une volonté politique commune. Cependant, les autorités publiques européenne et nationales ont appliqué le principe de précaution quant à l'utilisation de promoteurs de croissance en production animale : face à l’absence de "preuves" de leur innocuité sur la santé humaine au travers de la consommation de viande et face à la pression sociétale à l’encontre de cette pratique. Ces deux derniers éléments ont été exprimés massivement par les consommateurs lors de la première grande crise alimentaire médiatisée, celle du veau "aux hormones" au début des années 80. D'autres crises entamant la confiance du consommateur suivront : la crise de la "vache folle" avec l'ESB (Encéphalopathie Spongiforme Bovine) en 1996 et la découverte que les vaches, paisibles herbivores, étaient nourries aux farines animales. Le "horsegate", en 2013, où des plats cuisinés annoncés avec du "bœuf" présentaient des compositions à base de viande chevaline, a participé à cette défiance du consommateur vis-à-vis de la consommation de viande et de protéines d’origine animale. Ces affaires plus récentes ne concernent pas les "hormones", mais elles pointent les angoisses et les doutes du consommateur sur la sécurité des denrées alimentaires d'origine animale, de la ferme jusqu'à la transformation en viande, et ensuite les interrogations et inquiétudes du consommateur sur les méthodes d'élevage et la place de l'animal dans notre société. Ces affaires ont eu pour conséquences des chutes parfois spectaculaires de la consommation de viande et un rejet marqué des pratiques d'élevage et d'abattage.

Les enjeux sont importants. Economiquement, même si le conflit du "bœuf aux hormones" semble aujourd’hui lointain, le commerce des animaux et de la viande s'établit bien en fonction des volontés politiques des pays concernés et des réglementations en vigueur ; les Etats-Unis, le Canada autorisent en élevage les promoteurs de croissance et cette pratique fait partie intégrante du développement de leurs systèmes de production versus l'Europe qui interdit totalement l'usage de ces substances en bannissant tous les composés promoteurs de croissance et donc en développant plutôt les stratégies de contrôle ad hoc. Les investissements et la recherche dans le domaine des anabolisants à des fins de production accrue ne se font donc pas sur les mêmes terrains ni à la même échelle. D'un point de vue sanitaire, la question de la toxicité et les conséquences pour l'homme de l'utilisation d'agents anabolisants chez l'animal demeure en manque de consensus dans les communautés scientifiques entre l'Europe et l'Amérique du Nord, les consommateurs eux se rangeant assez vite du côté "s'il y a doute, cela doit être interdit" ; le discours autour des anabolisants ne devrait plus être polémique et s'appuyer sur des données scientifiques reconnues par tous. Ethiquement, voire philosophiquement, il n'est plus possible de faire l'impasse sur le regard de nos sociétés envers les animaux de production, leurs conditions d'exploitation, leur place, leur utilité, et sur les "nouveaux" régimes alimentaires et le devenir de la planète en matière de ressources agricoles et de nourriture.

C'est pourquoi, encore aujourd'hui, la place des anabolisants est au cœur des accords politiques et commerciaux et bien à l’esprit de chaque citoyen. Ce contexte justifie la poursuite des études à leurs sujets, tant au niveau sociétal autour de la nourriture et de l'alimentation des populations (place de l'élevage des animaux de production et des pratiques anabolisantes), qu'au niveau des connaissances sur les hormones et autres agents anabolisants (synthèse de nouveaux composés disponibles

Introduction générale facilement à partir des réseaux mondiaux d'Internet) et du contrôle de leur utilisation en conformité avec les réglementations relatives à la sécurité chimique et sanitaire des produits d'origine animale.

C’est dans ce contexte qu’a été élaboré ce projet de recherche. Le travail associé a été réalisé au sein du Laboratoire d‘Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA), unité de recherche de l‘Ecole Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l‘Alimentation de Nantes Atlantique (Oniris), UMR INRA 1329, et Laboratoire National de Référence (DGAl, MAAF) pour le contrôle des promoteurs de croissance en élevage. Ce travail de thèse s'inscrit pleinement dans le schéma stratégique des activités de recherche du laboratoire, notamment en ce qui concerne le développement d’approches analytiques innovantes visant la détection de substances anabolisantes interdites en élevage.

Plus précisément, le sujet du travail développé ci-après ambitionne de générer de la connaissance nouvelle autour de composés anabolisants qualifiés d’émergents, les modulateurs sélectifs des récepteurs androgènes (Selective Androgen Receptor Modulators ou SARMs). Cette nouvelle famille de molécules synthétiques se caractérise par sa capacité à procurer les effets anabolisants musculaires et osseux des stéroïdes anabolisants androgéniques (SAA) classiques en s’affranchissant des effets indésirables, notamment sur l’appareil reproducteur mâle. L’enobosarm, composé faisant actuellement l’objet d’essais cliniques les plus avancés chez l'homme (phase III), a d’ailleurs permis d’obtenir des résultats prometteurs pour le traitement et la prévention de l’atrophie musculaire chez les patients atteints de cancer. Les athlètes de haut niveau et les bodybuilders ont déjà saisi l'opportunité d'utiliser ces nouveaux produits disponibles "d’un clic" sur les plate-forme internet dédiées à l'augmentation des performances sportives et musculaires. Ces composés bénéficient également d’une notoriété certaine dans ces communautés car ils sont réputés moins nocifs que les molécules dopantes historiques et que les moyens de contrôles sont pour le moment imparfaitement établis. Pour les sportifs, l'interdiction des SARMs est effective ; ces composés sont officiellement listés par l’Agence Mondiale Antidopage (WADA) comme substances prohibées en compétition et à l’entraînement depuis 2008. Elles sont classées S1.2 sur la liste de l’Agence « other anabolic agents ». Plusieurs athlètes ont été sanctionnés depuis 2010 pour usage illégal de SARMs. Si leurs propriétés chez l’homme sont désormais bien établies, il est tout à fait légitime de s’interroger sur la transposition de leur usage chez l’animal. En particulier, en raison de leurs propriétés anabolisantes, les SARMs sont susceptibles d’être utilisés comme promoteurs de croissance dans les diverses filières de production animale, d'autant plus qu'aux Etats-Unis est déposé en 2014 et octroyé en 2016, un brevet permettant de fabriquer et de commercialiser un aliment additionné de SARMs en tant que promoteur de croissance chez les animaux d'élevage en engraissement. Ainsi, l'étude des SARMs dans un contexte de sécurité chimique des aliments devient un sujet d'actualité majeur où l'urgence est de mieux connaitre cette nouvelle famille de composés chimiques, de proposer rapidement des stratégies analytiques permettant de caractériser la présence de résidus dans les denrées alimentaires d’origine animale et de mettre en place les moyens appropriés pour un contrôle efficace de leur éventuel usage en Europe.

C‘est dans ce contexte que se sont placés mes travaux de recherche au sein du LABERCA. Le rationnel de cette thèse repose sur le constat (i) d’une connaissance parcellaire de la communauté "chemical food safety" de ces substances de type SARMs et par conséquent (ii) de l'absence de stratégies analytiques appropriées. Nous orienterons ainsi nos efforts vers le développement de stratégies visant à mettre en évidence l’administration d’une substance inconnue à des animaux d'élevage.

Introduction générale

Il s'agira donc de réunir les informations disponibles sur les SARMs, tant chez l'homme que chez l'animal, et de s'appuyer, pour le développement des méthodes analytiques, de ce qui a récemment été développé en contrôle antidopage et de l'expérience du laboratoire en matière de contrôle des promoteurs de croissance. Dans un contexte où la fraude est inventive et que les stratégies analytiques classiques, maitrisées de longue date par le LABERCA, pourraient se révéler dans certains cas hypothétiquement mises à mal, il conviendra également de compléter l’approche méthodologique classique de nouvelles approches innovantes basées sur l’appréciation d’un effet anabolisant.

Pour traiter ce sujet pluridisciplinaire, il nous a semblé pertinent de recruter une doctorante, vétérinaire en production animale, praticien hospitalier à Oniris, ayant été sensibilisée depuis plusieurs années auparavant aux thématiques du LABERCA via des collaborations nombreuses et répétées dans le temps. Le défi associé était alors la capacité à s'immerger dans le milieu expert de la chimie analytique du LABERCA pour allier l'expérience et les compétences relatives aux différents domaines d'activité que sont la découverte d'une nouvelle famille de composés, l'expérimentation animale et la zootechnie, les stratégies analytiques physico-chimiques ciblées et non ciblées basées sur la chromatographie liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) ou très haute résolution (HRMS) associées à la biologie.

Le présent manuscrit propose dans un premier chapitre une revue bibliographique qui a permis de dresser un état des lieux des connaissances sur les SARMs, du mode d'action des anabolisants en général et des SARMs en particulier, des méthodes de contrôle des pratiques anabolisantes à partir des données issues de l'utilisation des stéroïdes anabolisants androgéniques et des quelques données disponibles pour les SARMs. Ce travail de synthèse nous a permis de bien préciser la question de recherche associée à ce doctorat, à savoir : "quelle(s) signature(s) pertinente(s) pour la mise en évidence de l’utilisation de SARMs chez le jeune bovin ?"

Nous avons en conséquence proposé d’établir une signature de la pratique anabolisante à trois niveaux différents et complémentaires :

. une signature analytique permettant de mettre en évidence un résidu de SARMs, et dans ce travail l'enobosarm a été sélectionné comme composé modèle, dans deux matrices, une classiquement utilisée en surveillance et contrôle des promoteurs de croissance, l'urine et une plus originale, les fèces, qui présente des avantages dans sa collecte et sa gestion en tant que prélèvement en élevage mais constitue un défi méthodologique pour son utilisation en chromatographie et spectrométrie de masse. Cette partie de développement méthodologique puis de résultats en termes de concentration, profil d'excrétion et fenêtre de détection de l'enobosarm et de ses métabolites seront rapportés dans le chapitre 2. . une signature phénotypique des animaux "anabolisés" basée sur des modifications visibles chez les animaux et mesurables avec des outils zootechniques existants, adaptés au veau en croissance. Le choix des paramètres zootechniques sélectionnés et leur mise en application sur des animaux ayant reçu de l'enobosarm en tant qu'anabolisant et en conditions expérimentales se rapprochant d'une conduite à risque d'usage d'un promoteur de croissance seront décrits et discutés dans le chapitre 3. Une signature métabolique, basée sur l'approche métabolomique. Cette approche qui ne repose sur aucun a priori offre une alternative prometteuse pour compléter la détection et l'identification des composés

Introduction générale

anabolisants et leur utilisation. La substance n‘est plus directement au cœur des stratégies mais plutôt l‘effet qu‘elle a induit chez l‘animal. La caractérisation d‘une perturbation de l‘homéostasie suite à l‘exposition de l‘animal à des promoteurs de croissance peut conduire à la mise en évidence de profils et/ou de facteurs biologiques qui sont en intensités significativement différentes entre les populations étudiées et représentés sous forme d'empreinte et/ou de biomarqueurs. L'approche métabolomique par LC-HRMS sera présentée dans le chapitre 4

Ces travaux ont donné lieu à plusieurs publications, communications orales ou écrites, références signalées par une astérisque (*) et citées en violet. Les autres productions scientifiques en tant que co-auteur s'intègrent dans les travaux que j’ai menés en collaboration avec le LABERCA depuis 12 ans.

RELEVE DE PRODUCTION SCIENTIFIQUE

ARTICLES

Rambaud L, Bichon E, Cesbron N, André F and Le Bizec B. Study of 17 ß-estradiol-3-benzoate, 17α- methyltestosterone and medroxyprogesterone acetate fixation in bovine hair. Analytica Chimica Acta 2005;532:165-176.

Pinel G, Mathieu S, Cesbron N, Maume D, De Brabander H, André F, Le Bizec B. Evidence that urinary excretion of thiouracil in adult bovine submitted to a cruciferous diet can give erroneous indications of the possible illegal use of thyrostats in meat production. Food additives and contaminant 2006;23(10):974-980.

Bichon E, Kieken F, Cesbron N, Monteau F, Prévost S, André F and Le Bizec B. Development and application of stable carbon isotope analysis to the detection of cortisol administration in cattle. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2007;21:2613-2620.

Le Breton M.-H, Rochereau-Roulet S, Pinel G, Cesbron N and Le Bizec B. Elimination kinetic of recombinant somatoropin in bovine. Analytica Chimica Acta 2009;637:121-127.

Anizan S, Bichon E, Monteau F, Cesbron N, Antignac JP and Le Bizec B. A new reliable sample preparation for high throughput focused steroid profiling by Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Journal of Chromatography A 2010;1217:6652-6660.

Anizan S, Di Nardo D, Bichon E, Monteau F, Cesbron N, Antignac JP, Le Bizec B. Targeted phase II metabolites profiling as new screening strategy to investigate natural steroid abuse in animal breeding. Analytica Chimica Acta 2011;700:105-113.

Anizan S, Bichon E, Di Nardo D, Monteau F, Cesbron N, Antignac, JP, Le Bizec B. Screening of androstenedione misuse in cattle by LC-MS/MS profiling of glucuronide and sulfate steroids in urine. Talanta 2011;86:186-194.

Anizan S, Bichon E, Monteau F, Cesbron N, Antignac JP, Le Bizec B. Gas chromatography coupled to mass spectrometry based metabolomic to screen anabolic practice in cattle. Journal of Mass Spectrometry 2012;47:131–140.

Kaabia Z, Dervilly-Pinel G, Hanganu F, Cesbron N, Bichon E, Popot MA, Bonnaire Y, Le Bizec B. Ultra high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry based identification of steroid esters in serum and plasma: An efficient strategy to detect natural hormone abuse in breeding and racing animals. Journal of Chromatography A 2013;1284:126-140.

Introduction générale

Dervilly-Pinel G, Chereau S, Cesbron N, Monteau F, Le Bizec B. LC-HRMS based metabolomics screening model to detect various β-agonists treatments in bovines. Metabolomics 2015;11:403–411.

Doué M, Dervilly-Pinel G, Cesbron N, Stefani A, Moro L, Biancotto G, Le Bizec B. Clinical biochemical and hormonal profiling in plasma: a promising strategy to predict growth hormone abuse in cattle. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2015;407:4343–4349.

Beucher L, Dervilly-Pinel G, Cesbron N, Penot M, Gicquiau A, Monteau F, Le Bizec B. Specific detection in urine of non-steroidal Selective Androgen Receptor Modulators using supercritical fluid chromatography coupled to ion-mobility mass spectrometry. Drug Testing and Analysis 2017;9(2), doi: 10.1002/dta.1951

Cesbron N, Dorso L, Royer AL, Dervilly-Pinel G, Hervé J. Amino-aciduria detection using LC-HRMS suggests a renal Fanconi syndrome in a heifer. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2017;31(2):598-603. doi: 10.1111/jvim.14605. Epub 2017 Jan 21.

*Rojas D, Dervilly-Pinel G, Cesbron N, Penot M, Sydor A, Prévost S, Le Bizec B. Selective Androgen Receptor Modulators: comparative excretion study of Bicalutamide in bovine urine and feces. Drug Testing and Analysis 2016 ; doi: 10.1002/dta.2113. [Epub ahead of print]

*Cesbron N, Sydor A, Penot M, Prevost S, Le Bizec B and Dervilly-Pinel G. Analytical strategies to detect enobosarm administration in bovines. Food Additives and Contaminants 2017; 34(4), 632– 640. doi: 10.1080/19440049.2016.1258122. Epub 2016 Nov 28.

*Cesbron N, Royer AL, Guitton Y, Sydor A, Le Bizec B, Dervilly-Pinel G. Optimization of fecal sample preparation for untargeted LC-HRMS based metabolomics. Metabolomics 2017 Submitted

*Cesbron N, Vernet C, Penot M, Dervilly-Pinel, Le Bizec B. Development and implementation of zootechnical measurement tools in calves: Application to the study of growth performances after an oral administration of enobosarm. Journal of Agriculture and Food Chemistry 2017 Submitted

PROCEEDINGS

Bichon E, Kieken F, Cesbron N, Monteau F, Prevost S and Le Bizec B. Control of cortisol misuse in cattle by GC-C- IRMS after a single dose administration. Proceedings of the Euroresidue VIth Conference, Egmond ann Zee, The Netherlands, 19th-21th may 2008.

Dervilly-Pinel G, Chéreau S, Cesbron N, Deceuninck Y, Prévost S, Monteau F, Le Bizec B. Comparative fixation and pharmacokinetics of β-agonist compounds in calves matrices. Proceedings of the Euroresidue VIIth Conference, Egmond ann Zee, The Netherlands, 14th-16th may 2012.

Rochereau S, Bichon E, Courant F, Monteau F, Prévost S, Hanganu F, Cesbron N, Dervilly-Pinel G, Le Bizec B. Quantification of estrogens at ppt levels in bovine plasma by molecularly imprinted solid-phase extraction and GC-MS/MS analysis. Proceedings of the Euroresidue VIIth Conference, Egmond ann Zee, The Netherlands, 14th- 16th may 2012.

Dervilly-Pinel G, Prévost S, Beucher L, Cesbron N, Botta M, Bozzetta G, Monteau F, Le Bizec B. Detecting β- agonists treatments in food producing animals: an overview of analytical possibilities. Euroresidue VIIIth Conference, Egmond aan Zee, The Netherlands, 23rd-25th May 2016.

*Cesbron N, Rojas D, Sydor A, Penot, Prevost S, Dervilly-Pinel G, Le Bizec B. Analytical strategies to detect selective androgen receptor modulators (SARMs) admininistration in bovine. Euroresidue VIIIth Conference, Egmond aan Zee, The Netherlands, 23rd-25th May 2016.

Introduction générale

POSTERS

Bichon E., Kieken F., Cesbron N., André F. et Le Bizec B. Mise au point d’une méthode de dosage du cortisol par GC-C-IRMS en vue du contrôle de son usage frauduleux en élevage. 23èmes Journées Françaises de Spectrométrie de Masse, Nantes, France, 11-14 septembre 2006.

Bichon E, Kieken F, Cesbron N, Monteau F, Prevost S and Le Bizec B. Control of Cortisol Misuse in Cattle by GC- C-IRMS after a Single Dose Administration. Euroresidue VIth Conference, Egmond ann Zee, The Netherlands, 19th-21th may 2008.

Bichon E, Kieken F, Cesbron N, Monteau F, Prevost S and Le Bizec B. GC-C-IRMS as the Definitive Analytical Tool to demonstrate Cortisol Administration to Cattle. Joint European Stable Isotope User meeting (JESIUM), presqu'île de Giens, France, 31th August – 5th September 2008.

Pinel G, Girault G, Cesbron N, Prevost S, Deceuninck Y, Monteau F and Le Bizec B. Comparative pharmacokinetics of -Agonist compounds in calves. 6th International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis, Ghent, Belgium, 1stth-4th June 2010.

Dervilly-Pinel G, Chéreau S, Cesbron N, Deceuninck Y, Prévost S, Monteau F, Le Bizec B. Comparative fixation and pharmacokinetics of b-agonist compounds in calves matrices. Euroresidue VIIth Conference, Egmond ann Zee, The Netherlands, 14th-16th may 2012

Rochereau S, Bichon E, Courant F, Monteau F, Prévost S, Hanganu F, Cesbron N, Dervilly-Pinel G, Le Bizec B. Quantification of estrogens at ppt levels in bovine plasma by molecularly imprinted solid-phase extraction and GC-MS/MS analysis. Euroresidue VIIth Conference, Egmond ann Zee, The Netherlands, 14th-16th may 2012.

Bichon E, Prevost S, Béasse A, Kaabia Z, Courant F, Rambaud L, Christien S, Cesbron N, Hanganu F, Dervilly-Pinel G, Monteau F, Bonnaire Y, Le Bizec B. Steroid esters analysis in hair and serum by lc-ms/ms to confirm their administration in cattle. Euroresidue VIIth Conference, Egmond ann Zee, The Netherlands, 14th-16th may 2012.

*Cesbron N, Dervilly-Pinel G, Vernet C, Penot M, Gicquiau A, Monteau F, Le Bizec B. Selective androgen receptor modulators : zootechnical effects and analytical strategies to detect their administration in bovines. 7th International Symposium on Hormone and Veterinary Drug Residue Analysis, Ghent, Belgium, 2nd-5th June 2014

Dervilly-Pinel G, Prévost S, Cesbron N, Botta M, Bozzetta E, Monteau F, Le Bizec B. Detecting β-agonists treatments in food producing animals: an overview of analytical possibilities. 7th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis, Prague, Czech Republic, 3rd–6th November 2015.

*Cesbron N, Dervilly-Pinel G, Vernet C, Sydor A, Penot M, Rojas D, Le Bizec B. Développement et validation d'outils de mesures zootechniques : Application à l'étude des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm. Congrès 3R (Rencontre Recherche Ruminants), Paris, France, 2-3 Décembre 2015.

Dervilly-Pinel G, Prévost S, Beucher L, Cesbron N, Botta M, Bozzetta E, Monteau F, Le Bizec B. Detecting β- agonists treatments in food producing animals: an overview of analytical possibilities. Euroresidue VIIIth Conference, Egmond aan Zee, The Netherlands, 23rd-25th May 2016.

*Cesbron N, Rojas D, Sydor A, Penot M, Prevost S, Dervilly-Pinel G, Le Bizec B. Analytical strategies to detect selective androgen receptor modulators (SARMs) admininistration in bovine. Euroresidue VIIIth Conference, Egmond aan Zee, The Netherlands, 23rd-25th May 2016.

Introduction générale

*Cesbron N, Dervilly-Pinel G, Vernet C, Sydor A, Penot M, Rojas D, Le Bizec B. SARMs : Zootechnical effects and analytical strategies to detect their administration in calves. World Buiatrics Congress, Dublin, Ireland, 3-8 Juillet 2016.

AUTRES

Poster aux Journées Scientifiques de l'Ecole Doctorale Biologie Santé *Cesbron N, Dervilly-Pinel G, Vernet C, Penot M, Gicquiau A, Monteau F, Le Bizec B. Selective Androgen Receptor Modulators : Zootechnical effects and analytical strategies to detect their administration in bovines. Journée Scientifique de l'EDBS, Nantes. Décembre 2014

Communication orale MT180s - Ma thèse en 180 secondes. Finaliste du regroupement Université Nantes-Angers-Le Mans *Cesbron N. Les SARMs (Selective Androgen Receptor Modulators) une nouvelle famille d'agent anabolisant : étude des effets zootechniques et développement de stratégies analytiques visant la mise en évidence de leur utilisation chez le jeune bovin. Nancy, Avril 2015.

CHAPITRE 1 - Revue bibliographique

Chapitre 1 - Revue bibliographique

Introduction

Ce premier chapitre intitulé "Revue bibliographique" se propose dans un premier temps de faire le point sur une nouvelle famille d'agents anabolisants, les SARMs ou Selective Androgen Receptor Modulators. Ces substances chimiques, initialement développées à des fins thérapeutiques, voient désormais leur usage dévié par l'homme en tant que promoteurs de performance dans le milieu du bodybuilding et plus généralement du sport de haut niveau ; en raison des propriétés exercées par ces composées, les SARMs représentent dès lors un potentiel comme promoteurs de croissance chez les animaux de production. Dresser le panorama des SARMs et s’attarder en particulier sur un composé phare, l'enobosarm, nous a également conduit à revoir les connaissances du mode d'action des promoteurs de croissance, et plus précisément celui des stéroïdes anabolisants androgéniques auxquels les SARMs sont apparentés. Dans un second temps, un historique éclairé de l'interdiction de l'usage des promoteurs de croissance en Europe et en France nous rappelle l'importance économique et politique de cette pratique au cœur de certains systèmes de productions animales (aux Etats-Unis par exemple) mais aussi l'importance du contrôle de leur usage au travers de la réglementation en Europe, de l'interdiction par "précaution" jusqu'aux approches de détection et techniques analytiques devant être mises œuvre, continuellement adaptées face à la fraude.

L'ensemble des informations issues des publications scientifiques et réglementaires, relatées dans ce chapitre, permettront d'appuyer et de nourrir la démarche adoptée dans cette thèse en présentant le contexte de l'étude et les hypothèses de travail permettant de contribuer à l'étude des SARMs et au développement de stratégies méthodologiques et analytiques de mise en évidence d'une utilisation chez le jeune bovin.

1- Nouveaux agents anabolisants : les SARMS

La première description et la synthèse d’androgènes non stéroïdiens sont décrites en 1998 (Dalton, 1998 ; Edwards, 1998) à la faveur de travaux réalisés autour de la recherche de nouveaux traitements de l’hypogonadisme et des troubles hormonaux liés à l’âge chez l’homme (cancer de la prostate en particulier). L’étude de ces molécules synthétiques montre alors leur très grande affinité pour les récepteurs aux androgènes (ou récepteurs androgéniques ou androgen receptor, AR) et leur capacité à activer la transcription des gènes induits par le complexe ligand "androgène"/récepteur "AR" ainsi formé. Ce phénomène est à l’origine d’une réponse physiologique majoritairement de type anabolique, similaire à celle provoquée par les stéroïdes anabolisants. C’est en s’appuyant sur ces observations et sur la structure chimique d’un anti-androgène non stéroïdien déjà caractérisé, le bicalutamide, que furent découverts et synthétisés les premiers SARMs (Selective Androgen Receptor Modulators) (Dalton, 1998 ; Edwards, 1998 ; Yin, 2003a ; Marhefka, 2004).

La structure chimique des SARMs permet de les répartir en quatre principales classes de composés non stéroïdiens : les analogues des aryl-propionamides, des hydantoïnes bi-cycliques et tri-cycliques, des quinolines et des tétrahydroquinolines (Tableau I).

Chapitre 1 - Revue bibliographique

Tableau I. Classification structurale des SARMs et quelques exemples (adapté de Gao, 2006). Classe Structure chimique générale

Analogues des aryl-propionamides

Ex : Andarine, Enobosarm (Ostarine®, MK- 2866, GTx-024 and S-22)

Analogues des hydantoïnes bi-cycliques

Ex :BMS 564929

Analogues des quinolines

(tri-cycliques)

(bi-cycliques)

Ex : LGD 2226

Analogues des tétrahydroquinolines

Ex : S-40503

Pour tous ces composés, le concept de "Selective Androgen Receptor Modulators" repose sur trois critères fondamentaux : il s’agit de composés synthétiques non stéroïdiens (i) ayant une forte spécificité pour le récepteur androgène, (ii) dont l’activité pharmacologique est spécifique du tissu cible et (iii) dotés de propriétés pharmacocinétiques autorisant une administration journalière par voie orale. De plus, ils possèdent la capacité, à des degrés différents en fonction des molécules, d’exercer un effet agoniste sur les récepteurs androgènes des cellules des tissus musculaires striés squelettiques et osseux, responsables ainsi de leur pouvoir anabolisant et d’exercer un effet agoniste partiel voire antagoniste sur les récepteurs androgènes des cellules des glandes annexes de l’appareil reproducteur mâle, notamment la prostate (Chen, 2005b).

Les SARMs ont ainsi fait l’objet :

Chapitre 1 - Revue bibliographique

. D’études précliniques chez l’animal dans le cadre de remplacement des thérapies hormonales à base de testostérone et dérivés stéroïdiens : hyperplasie bénigne de la prostate (Gao, 2004 ; Nejishima, 2012), contraception masculine (Chen, 2005a ; Jones, 2009), ostéoporose (Gao, 2005 ; Kearbey, 2007), hypogonadisme (Gao, 2005), cancer de la prostate (Chisamore, 2016). Récemment, des études précliniques s’appuyant sur les effets attendus des SARMs sur le muscle, concernent le traitement de l’incontinence urinaire (Ponnusamy, 2017) et de la myopathie de Duchenne (Ponnusamy, 2016). . D’études cliniques chez l’homme dans la prévention et/ou le traitement du cancer du sein (Coss, 2014), mais aussi en tant qu’agent anabolisant, dans le traitement symptomatique de la perte musculaire induite par des maladies chroniques dont les cancers (Dalton, 2013 ; Dobs, 2013 ; Crawford, 2016) et le traitement de la sarcopénie (Papanicoleaou, 2013). . D’un dépôt de brevet depuis 2004 visant à produire un aliment supplémenté en plusieurs SARMs en tant que promoteur de croissance à destination des animaux de production. L’autorisation de commercialisation a été donnée le 8 mars 2016 (Dalton, 2016).

Parmi les SARMs, les dérivés des aryl-propionamides furent les premiers à démontrer une spécificité tissulaire in vivo pour le tissu musculaire strié squelettique (Dalton, 2010a) avec en tête de file l’enobosarm (désigné également sous les termes S-22, GTx-024, MK-2866 ou Ostarine®) et plus récemment la molécule MK-0773. Les études précliniques et cliniques montrent d’ailleurs leur forte propriété anabolisante : augmentation de la masse musculaire maigre au profit de la masse graisseuse et augmentation des capacités physiques sans les effets secondaires habituellement associés aux traitements anabolisants stéroïdiens (acné, virilisation, gynécomastie, hirsutisme, favorisant les cancers de la prostate et du sein, atteinte hépatique). Ce qui en fait des molécules candidates à l’utilisation par les athlètes voulant augmenter leur masse musculaire et leurs performances en toute sécurité. Les SARMs ont été inscrits sur la liste des substances prohibées par WADA (World Anti Doping Agency) depuis 2008 (Thevis, 2017a, 2017b). Mais de nombreux SARMs restent très accessibles sur Internet et sont utilisés largement dans les milieux du bodybuilding (Andarine® ou S-4, Ostarine® ou S-22, Ligandrol® ou LGD-4033).

Et enfin, l'octroi récent par les autorités américaines d’un brevet pour un aliment contenant des SARMs (dont l'enobosarm), afin d’augmenter les performances zootechniques chez le porc et les bovins à l’engraissement (Dalton, 2016 US Patent 9278914 B2), pose la question en Europe du contrôle de l’utilisation de ces nouveaux composés comme promoteur de croissance en élevage.

1.1 Originalités des SARMs

Les SARMs, composés synthétiques, appartiennent à la classe des ligands qui se fixent sélectivement sur les récepteurs aux androgènes (AR), super-famille des récepteurs nucléaires, stéroïdiens et qui peuvent stimuler ou inhiber l’activité physiologique de différents tissus/organes cibles (agonistes ou antagonistes) c.-à-d. la capacité d’activer ou d’inhiber le signal pour la transcription des gènes cibles (Gao, 2007 ; Bhattacharya, 2016).

Pour rappel, la testostérone et la 5-dihydrotestostérone (5-DHT) sont des androgènes endogènes agonistes stéroïdiens des AR. Ils ne sont pas bio-disponibles par voie orale. Leur utilisation permet de traiter l’hypogonadisme par exemple mais augmente l’incidence de l’hyperplasie bénigne de la

Chapitre 1 - Revue bibliographique prostate et du cancer de la prostate chez le sujet âgé. Des modifications de structure chimique (alkylation en position 17, chloration en position 4, déshydrogénation ont permis la synthèse de molécules stéroïdiennes alors disponibles par voie orale telles la méthandrosténolone (Dianabol) ou la 4-chlorodéhydrométhyltestostérone (oral-Turinabol) par exemple. Ces androgènes de synthèse 17-alkylés conduisent toutefois à des profils pharmacocinétiques trop instables pour une utilisation thérapeutique et montrent une hépatotoxicité lors d’utilisation chronique. De plus, ces composés sont moyennement voire peu agonistes des AR, entrainant une faible sélectivité tissulaire. D’où la recherche de ligands non-stéroïdiens, biodisponibles par voie orale, avec une grande spécificité pour les récepteurs AR et donc une sélectivité tissulaire. Les premiers utilisés dans le traitement du cancer de la prostate (années 70) sont des anti-androgènes non stéroïdiens, le bicalutamide (Casodex®), le flutamide (Eulexin®) appartenant au groupe des aryl-propionamides et le nilutamide (Nilandron®) appartenant au groupe des hydantoïnes. La disponibilité orale et la spécificité aux AR sont bien présents mais ces molécules montrent peu de sélectivité tissulaire. Se développent alors des androgènes non stéroïdiens de synthèse : les SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators) et les SARMs. Il s’agit toujours de mettre en avant l’affinité pour le récepteur AR et la sélectivité tissulaire, donc de minimiser les effets indésirables qui sont normalement associés aux androgènes stéroïdiens et d'éventuellement capitaliser l’effet anabolique (Gao, 2007 ; Choi, 2015). Pour développer et comprendre les caractéristiques des SARMs et leur intérêt en tant qu’agent anabolisant, le choix se porte ici sur l’étude des SARMs non stéroïdiens et agonistes des AR.

 Les SARMs ont une grande affinité pour le récepteur AR.

La sélectivité des SARMs est due à leur capacité à se lier spécifiquement au récepteur AR et non aux autres récepteurs nucléaires des hormones stéroïdes : PR (progestérone), ER (estrogène), MR (minéralo-corticoïdes).

Il n’existe qu’un seul type de récepteur androgénique (AR) contrairement aux récepteurs estrogéniques (Erα et Erβ) et codé par un seul gène décrit chez l’homme en position 12 du chromosome X (Figure 1). Le récepteur androgène fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires, également appelés récepteurs facteurs de transcription. Les principaux ligands endogènes de ce récepteur sont la testostérone et la 5-dihydrotestostérone (5-DHT). Le récepteur androgène est une protéine intracellulaire composée chez l’Homme de 919 acides aminés (Dalton, 2010a).

Figure 1 : Position 12 du Chromosome X - Localisation Xq12 https://ghr.nlm.nih.gov/gene/AR#location Chez le bovin, les informations de la localisation chromosomique du gène codant pour le récepteur AR ainsi que la caractérisation des acides aminés de la protéine sont parcellaires et non publiées à ce jour (Bos taurus genome survey sequence, isolate AR, pseudogene, genomic survey sequence, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucgss/16304595?report=genbank).

Chapitre 1 - Revue bibliographique

Le récepteur aux androgènes, décrit chez l'homme, est divisé en trois principaux domaines fonctionnels : (1) le domaine N-terminal (N-terminal domain, par la suite NTD) modulant l’activité du récepteur, (2) un domaine de liaison à l’ADN (DNA-binding domain, par la suite DBD) lui-même composé de doigts de zinc et (3) un domaine de fixation du ligand (ligand-binding domain, par la suite LBD) (Figure 2). Dans son état inactif, le LBD est en interaction avec une protéine chaperonne faisant partie des heat shock proteins (HSP).

Figure 2 : Organisation structurale du récepteur androgène humain (adapté de Gao, 2006). DBD : DNA-binding domain ; LBD : ligand-binding domain ; NTD : N-terminal domain.

La fixation d’un agent agoniste sur le récepteur en position cytoplasmique provoque un changement de conformation responsable de la dissociation des HSP, d’une homodimérisation du récepteur et de sa translocation vers le noyau (Figure 3). Elle entraine également la formation d’une région d’activation au niveau du LBD et d’une interaction entre les parties N-terminale et C-terminale du récepteur stabilisant sa liaison avec le ligand. En position intranucléaire, l’homodimère se lie aux éléments de réponse aux androgènes de la région promotrice du gène à transcrire. La fonction d’activation du LBD permet quant à elle le recrutement de co-activateurs qui, associés à la machinerie de transcription, permet la transcription du gène cible. Les protéines ainsi synthétisées (de structure ou enzymatiques) entrainent alors une hyperplasie et/ou une hypertrophie cellulaire responsables de la croissance du tissu cible. D’autres hypothèses proposent un effet antagoniste lié au simple blocage de l’accès à la région d’activation suite à la liaison du ligand sur le LBD, ou encore le recrutement de co-répresseurs lors de la fixation du récepteur à l’ADN (Dalton, 2010a).

Figure 3. Mécanisme d’action du récepteur androgène au niveau cellulaire. RA (récepteur androgène), HSP (heat shock protein) (adapté de Pignon, 2010).

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La plupart des SARMs sont des agonistes du récepteur AR et entrainent une régulation de l’expression du gène AR par changement de conformation du complexe ligand/AR lors de l’accrochage au récepteur AR et/ou par modification de recrutements des co-facteurs ; c'est la voie d'activation génomique, la mieux connue (Gao, 2007). La voie non génomique, dont le mécanisme est encore mal connu, serait responsable d’une action plus rapide des ligands agonistes (de l’ordre de quelques secondes contre plusieurs heures pour la voie génomique). Elle serait liée à l’interaction des récepteurs androgènes avec des protéines membranaires ou cytosoliques ayant pour conséquence l’activation de certaines voies de transduction ou métaboliques, telles que celles impliquant des protéines kinases (Dalton, 2010a). Les conséquences de l’activation de cette voie sont encore peu claires.

Ainsi, la structure commune du groupe des aryle-propionamides (molécules non stéroïdiennes agonistes aux AR) représentée sur la Figure 4 possède donc la capacité de se fixer au récepteur en tant que ligand et d’induire l’activation de la transcription génomique lié au récepteur.

Figure 4 : Exemples de structures chimiques des ligands de type aryle propionamide

L’affinité d’un SARM pour le récepteur AR est classiquement mesurée par le facteur Ki (mesure de l’affinité de la molécule synthétisée) et étudiée par mise en compétition avec un ligand de référence tritié, la 17α-methyl-3H-Mibolerone, un dérivé 17α-alkylé de la nandrolone (Dalton, 1998). Egalement, dans la plupart des études disponibles, la mesure de l’activation de la transcription et sa puissance se fait sur test cellulaire (CV-1) avec vecteurs (luciférase, galactosidase) où l’activité de transcription est exprimée en pourcentage par rapport à celle induite par 1nM de ligand de référence, la 5-dihydrotestostérone (5-DHT) (Tableau II). A titre de comparaison, le bicalutamide, dans sa forme R-isomère qui présente la capacité d’activer la transcription suite à la formation du complexe ligand-récepteur est également reporté ci-dessous.

Tableau II : Affinité (Ki) de ligands au récepteur AR et mesure de l’activité de transcription (d'après Dalton, 1998)

Ligand Ki (nM) Activité de transcription (nM)

DHT 0.28 +/- 0.02 1

R-Bicalutamide 11.0 +/-1.5 1000

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Le bicalutamide présente une affinité 10 fois supérieure au récepteur AR par rapport à la 5-DHT et une activité de transcription nettement supérieure. Les SARMS, antagoniste comme le bicalutamide ou agoniste comme l'enobosarm (Figure 5), ont une excellente affinité pour le récepteur, très supérieure aux androgènes naturels (DHT) ou de synthèse (mibolerone) (Dalton, 1998).

a b

Figure 5 : Structures chimiques du a) bicalutamide et de b) l'enobosarm

Cette affinité pour le récepteur AR et donc la sélectivité des aryle-propionamides est également dépendante du nombre de ces récepteurs présents dans les différents tissus de l’organisme, majoritairement dans la prostate, les muscles squelettiques, le foie, la peau et le liquide cérébro- spinal et s’exprime fortement dans la prostate, les surrénales et l’épididyme. Chez les bovins, les AR sont présents dans le tissu musculaire mais aussi dans le foie, le rein, le rumen et l'épithélium intestinal, le tissu osseux et au niveau hypothalamo-hypophysaire même si la concentration globale en récepteur est faible par rapport à l'homme (Sauerwein, 1989). La distribution et la concentration du ligand face aux récepteurs sont également des facteurs de sélectivité. L’activation de transcription de la voie génomique est supérieure avec une concentration importante de SARMs jusqu’à atteindre un plateau à de très fortes concentrations dans un organe cible. Mais l’efficacité et la puissance d’action résultante de la transcription (action agoniste) est variable d’un SARMs à l’autre quelle que soit la concentration. (Dalton, 1998).

 Les SARMs non stéroïdiens ne sont pas un substrat pour l’aromatase ou la 5α-réductase

La 5α-réductase, une enzyme, permet de transformer la testostérone en métabolite androgénique biologiquement plus actif, la 5-dihydrotestostérone (5-DHT). Elle est présente dans certains tissus, comme la prostate. Si la 5α-réductase est très présente dans un organe ou tissu donné, il y aura conversion du stéroïde androgène et réponse physiologique androgénique et anabolique, mais si une molécule est non substrat, comme un SARMs, il n’y a en conséquence pas d’action androgénique. De même, si on élimine l’enzyme du tissu ou l’enzyme n’est naturellement pas présente, il n’y aura pas d’effet androgénique. Le mécanisme est le même pour l’interaction avec l’aromatase.

Concrètement, les SARMs non stéroïdiens ne sont pas métabolisés par la 5α-réductase en DHT, ni par l’aromatase en estrogène. Ainsi un des mécanismes de sélectivité tissulaire des SARMs est probablement expliquée par la non action des enzymes 5α-réductase et aromatase (Figure 6) (Gao, 2007 ; Srinath, 2014).

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Figure 6 : Principaux rôles physiologiques de la testostérone et des SARMs non stéroïdiens. Parmi les SARMs non stéroïdiens, structures chimiques du bicalutamide en haut et de l'enobosarm en bas et principaux organes cibles possédant des récepteurs aux androgènes (AR, en bleu) et des récepteurs aux estrogènes (ER, en vert) (d'après Zilbermint, 2009).

 Les SARMs ont une action anabolisante sur les muscles squelettiques

La testostérone, principal anabolisant androgène du muscle squelettique, augmente la taille des muscles et leur force chez l'homme. Cette augmentation de la masse musculaire est en partie due à un mécanisme d'hypertrophie des fibres musculaires (augmentation du nombre de noyaux des myofibrilles des fibres musculaires de type I et II). L'action anabolisante des composés androgènes et en particulier la testostérone a été largement étudiée chez l'homme (Dubois, 2012). Egalement, la réponse physiologique, androgénique ou anabolique, dans l'objectif de différencier ces deux propriétés, est mesurée sur des modèles animaux (souvent le rat) et des organes ou tissus choisis comme modèles expérimentaux. L’évaluation de l’activité androgénique des SARMs se fait par la mesure du poids des organes androgéniques cibles (prostate, vésicules séminales) chez des animaux castrés ayant reçu un dosage déterminé de la molécule durant une certaine période. Les performances sont évaluées par comparaison avec les mesures effectuées sur des animaux non castrés. La démarche est similaire pour l’évaluation de l’activité anabolique qui se fait sur les organes anaboliques cibles (muscle squelettique périnéal levator ani ou muscle releveur de l'anus par exemple) (Tableau III). Les muscles squelettiques bulbo-caverneux et levator ani des rongeurs sont les muscles les plus réceptifs aux androgènes et les effets anaboliques induits par les SARMs sur ces

Chapitre 1 - Revue bibliographique muscles sont extrapolés sur l’augmentation de la masse corporelle maigre et l’amélioration des capacités physiques, critères d’intérêt et évalués dans les études cliniques qui suivent (Bhattacharya, 2016).

Une synthèse des études des études pharmacodynamiques réalisées chez le rat mâle castré pour les principales classes de SARMs est présentée ci-après (Tableau III). Il apparait que le plus anabolique des SARMS, est le composé S4 (ou andarine) avec une DE50 muscle élévateur de l’anus la plus élevée et que les composés les moins androgéniques appartiennent à la famille des analogues des hydantoïnes bi-cycliques avec une DE50 prostate faible. L'enobosarm, quant à lui présente une bonne activité anabolique sur le muscle squelettique, et une action agoniste partielle sur la prostate.

Tableau III. Synthèse bibliographique des études pharmacodynamiques réalisées chez le rat mâle castré pour les principales classes de SARMs.

Classe Composé Posologie rétablissant le poids DE50 muscle Taille de la DE50 Réf. administré du muscle élévateur de l’anus élévateur de prostate à cette prostate a l’anus posologie (%) a (mg/kg) (mg/kg)

Analogues des LGD-2226 3 mg/kg/j – 2 sem.(PO) ~ 1,0 NR ~ 10,0 (Miner, 2007) quinolines bi- cycliques LGD-3303 1 mg/kg/j – 2 sem.(PO) NR 20 NR (Vajda, 2009)

LGD-2941 1 mg/kg/j – 2 sem.(PO) NR 50 NR (Martinborough, 2007)

Analogues des BMS-564929 0,1 mg/kg/j – 2 sem.(PO) 0,0009 NR 0,14 (Ostrowski, 2007) hydantoïnes bi-cycliques BMS-564929 0,1 mg/kg/j – 8 sem.(PO) 0,001 NR 0,09 (Ostrowski, 2007)

Analogues des S-2 0,5-1,5 mg/kg/j – 2 sem.(PO) NR 39-60 NR (Dalton, 2010) aryl- propionamides S-4 7,5 mg/kg/j – 2 sem.(SC) 1,4 14,9 4,3 (Yin, 2003)

S-4 3 mg/kg/j – 8 sem.(SC) NR 20 NR (Gao, 2005)

S-23 0,15 mg/kg/j – 2 sem.(PO) NR 37 NR (Dalton, 2010)

S-24 1,5 mg/kg/j – 2 sem.(PO) NR 54 NR (Dalton, 2010)

S-25 0,5 mg/kg/j – 2 sem.(PO) NR 51 NR (Dalton, 2010)

Enobosarm ~ 0,25 mg/kg/j – 2 sem.(SC) 0,15 ~ 20 0,6 (Kim, 2005) a Valeur obtenue chez le rat castré traité avec un SARM en comparaison au rat témoin entier non traité.

DE50 : dose efficace 50, soit dose permettant l’obtention de 50% de l’effet maximal obtenu par l’administration de la molécule. DU : dose unique. NR : non renseigné. PO : per os (voie orale). SC : voie sous-cutanée.

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Ainsi la présence de récepteurs androgènes AR spécifiques des ligands androgènes au sein des organes cibles, l'absence d'interaction avec les enzymes cytoplasmiques réductase et aromatase des organes androgéniques et la présence de facteurs d'activation ou de répression nucléaires peuvent expliquer la grande sélectivité tissulaire des SARMs (Figure 7). Quand les SARMs exercent une forte et totale activité agoniste dans les tissus cibles (muscle squelettique ou os), le recrutement de facteurs de co-activation et l'activation de la transcription des gènes associés provoquent des effets biologiques de type anabolique. A contrario, quand les SARMs se lient sur les récepteurs AR de tissus androgéniques (prostate) et non cibles pour un effet anabolique, ils possèdent une action agoniste partielle ou antagoniste par le recrutement de facteurs répresseurs de la transcription et ne participent pas à la production de métabolites encore plus androgéniques (DHT) car ils ne sont pas des substrats pour la 5α-réductase.

Figure 7 : Schéma du mécanisme d'action moléculaire de la sélectivité tissulaire des SARMs. HSP (Heat shock protein) . En violet, les co-activateurs recrutés lors d'une action agonistes des SARMs et en noir, les co-répresseurs recrutés lors d'une action antagoniste ou agoniste partielle (adapté de Choi, 2015).

 Les SARMs présentent peu ou pas d’effets secondaires liées aux caractéristiques des androgènes

Malgré leur capacité à augmenter la masse maigre, justifiant leur intérêt dans le traitement des maladies cachectisantes, les stéroïdes androgéniques induisent/sont responsables de plusieurs effets secondaires. Ainsi, ils sont responsables de troubles cardio-vasculaires liés à l’augmentation des lipoprotéines de basse densité au détriment des lipoprotéines de haute densité. Les composés 17 - alkylés, oraux-disponibles sont également associés à une toxicité hépatique. Les effets indésirables

Chapitre 1 - Revue bibliographique majeurs concernent l’appareil reproducteur mâle et s’expriment majoritairement par des hyperplasies bénignes de la prostate, voire même des carcinomes prostatiques (Kopera, 1993). Pour rappel, les SARMs non stéroïdiens ne sont pas métabolisés par la 5α-réductase, ce qui réduit le risque d’hyperplasie de la prostate, de l’hirsutisme et de la virilisation chez la femme. Ils ne sont pas métabolisés par l’aromatase en estrogène, ce qui évite la gynécomastie chez l’homme et la virilisation chez la femme.

 Les SARMs sont disponibles par voie orale

La résorption correspond au passage du principe actif dans la circulation sanguine à partir de son lieu d’administration. L’évaluation de cette résorption repose sur le calcul de la biodisponibilité, se définissant comme la fraction de la dose de principe actif qui atteint la circulation sanguine (ou plus précisément la fraction mise à la disposition de l’organisme au site d’action) et la vitesse à laquelle il y parvient. La quantité de principe actif résorbée s’obtient par calcul des aires sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps (Area Under the Curve, par la suite AUC). La fraction résorbée par une certaine voie d’administration peut alors être obtenue en calculant le coefficient de biodisponibilité F correspondant au rapport des AUC par la voie considérée à la voie intraveineuse (pour laquelle la résorption est complète puisque le principe actif est directement introduit dans la circulation sanguine). La vitesse de résorption est quant à elle appréciée par le pic de concentration plasmatique (Cmax) et le temps nécessaire pour atteindre cette concentration (Tmax).

Avec des Tmax inférieurs à 11h et des coefficients de biodisponibilité F pouvant atteindre 100%, les SARMs sont rapidement résorbés suite à une administration orale chez le rat, et ce de façon importante (Tableau IV). Il est à remarquer que la biodisponibilité orale des SARMs chez le rat semble constante quelle que soit la dose administrée avec le composé S-1 (molécule voisine de l'enobosarm, pour laquelle les recherche ont été abandonnées depuis) avec un coefficient F de 60 % aux doses de 0,1, 1, 10 et 30 mg/kg (Wu, 2006) et totale avec un coefficient de 100 % pour l'enobosarm (composé S-22) à la dose de 10 mg/kg (Kim, 2013).

Tableau III. Synthèse bibliographique des études de la résorption des SARMs analogues des aryl- propionamides.

Composé Espèce Dose Fréquence Voie Tmax (h) Coef. F Réf. administré (mg/kg) (%)

C-6 Rat 10 DU PO 7-11 76 (Chen,2005)

S-1 Rat 0,1, 1, 10, DU PO 4,6 - 8,5 60 (Wu, 2006) 30

S-1 Rat 10 DU PO NR 55 (Kim, 2005)

S-9 Rat 10 DU PO NR 85 (Kim, 2005)

S-10 Rat 10 DU PO NR 69 (Kim, 2005)

S-11 Rat 10 DU PO NR 84 (Kim, 2005)

Enobosarm Rat 10 DU PO 4 100 (Kim, 2013)

DU : dose unique. NR : non renseigné.

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La sélectivité des SARMs, leur principal atout, repose sur des mécanismes moléculaires, apparentés aux mécanismes connus pour les stéroïdes androgéniques, et en particulier une action génomique directe entrainant, après liaison spécifique avec le récepteur AR des organes cibles, une activation de la transcription et une orientation des mécanismes cellulaires vers l'obtention d'un effet anabolisant majoritaire, la croissance musculaire par exemple, sans effets secondaires associés (Figure 6).

1.2 Focus particulier sur l’enobosarm

L’enobosarm (SARM S-22 ou MK-2866), (2S)-3-(4-Cyanophénoxy)-N-[4-cyano-3- (trifluorométhyl)phényl]-2-hydroxy-2-méthylpropanamide (IUPAC), est une molécule de synthèse, composé modulateur spécifique du récepteur androgène, non stéroïdien développé par GTx, Inc. sous le nom d'Ostarine® (GTx-024) (Figure 8) (GTx Inc. http://www.gtxinc.com/science/selective- androgen-receptor-modulator-sarm/sarms-in-muscle-diseases/). L’enobosarm présente la formule brute suivante : C19H14F3N3O3 et une masse moléculaire (Mw) de 389 g/mol.

Figure 8 : Structure chimique de l’enobosarm [(2S)-3-(4-Cyanophénoxy)-N-[4-cyano-3- (trifluorométhyl)phényl]-2-hydroxy-2-méthylpropanamide (IUPAC)].

 Affinité de l’enobosarm pour le récepteur AR

L’enobosarm appartient à la classe des aryle-propionamides, dérivé de l’anti-androgène bicalutamide. Sa structure est composée d’un résidu phényl parasubstitué sur un group 2-hydroxy-2- methypropionamide contenant un groupe biphényle substitué. L’affinité pour le récepteur AR est liée à sa structure chimique offrant deux groupements -CN en para-position permettant un pont hydrogène, et sa sélectivité agoniste est due à sa configuration spatiale (Figure 9a) : l’oxygène de liaison du cycle B est d’encombrement stérique plus réduit que le groupe de liaison –SO2 du cycle B du bicalutamide. Ainsi, lors de la jonction de l’enobosarm avec l’AR, le changement de conformation se fait normalement. Dans le cas du bicalutamide, le groupe –SO2 gène la modification spatiale du complexe ligand/AR en excluant une partie protéique (hélice H12) du récepteur probablement à l’origine du caractère antagoniste du bicalutamide (Figure 9b) (Kim, 2005 ; Duke, 2011).

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Figure 9 : Structure chimique et tridimensionnelle de l'enobosarm. a) Structure chimique commune du bicalutamide et de l’enobosarm, groupe de liaison du cycle B (X) b) Structure spatiale du complexe enobosarm/AR (Pubchem) MMDB https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=90361&dps=2

Comme déjà vu précédemment, l'enobosarm possède une très grande affinité pour le récepteur AR

(Ki de 3,8 nM, comparé au Ki de 0,28 nM de la 5-DHT) et également des caractéristiques pharmacodynamiques et pharmacocinétiques intéressante parmi les aryle-propionamides : une clearance faible (1,4 +/- 0,3 ml/min/kg), une biodisponibilité orale excellente (AUC de 127 µg h/mL, coefficient F de 100 %). Ce qui augure pour cette molécule des propriétés anabolisantes intéressantes.

 Propriété anabolisante

Kim (2005) a montré chez le rat avec une dose de 0,03 mg/jour per os, que l’enobosarm, possédait la propriété anabolique sélective in vivo la plus intéressante des SARMs du groupe des aryle- propionamides (ratio du rapport anabolique/androgénique de 1/1 pour la testostérone et 10/1 pour l'enobosarm). L’enobosarm entraine l’augmentation du poids des organes androgéniques (vésicules séminales et prostate) et surtout une augmentation nettement supérieure du muscle levator ani (muscle squelettique périnéal) (Tableau III, Kim, 2005).

Chez l’homme, l’enobosarm est en phase d’études avancées, précliniques pour la pharmacocinétique et la pharmacodynamie (Phase I, sur modèle animal), et cliniques chez l'homme sur sujets sains et sujets atteints de cancers (Phase II) ainsi que dans l’évaluation d’un traitement pour la prévention de l’atrophie musculaire associé à un cancer des poumons (Zilbermint, 2009 ; Srinath, 2014).

Srinath (2014) détaillent les différents essais cliniques concernant l'enobosarm. Von Haehling et Anker (2015) mettent en lumière dans leur revue, la place de l'enobosarm dans les traitements de la cachexie suite à des maladies chroniques :

- Etude de Phase I : Peu de données ont été publiées sur cette phase, étude aléatoire, en double aveugle et contrôlée. Il y est montré une différence significative (P-value<0,0001) dans

Chapitre 1 - Revue bibliographique l’augmentation de la masse corporelle maigre au bout de 12 semaines avec une dose journalière orale de 3 mg et une augmentation non significative du volume de la cuisse et de la force musculaire des jambes chez l’homme (P-value non disponible) (Jones, 2013).

- Etudes de Phase II : Dans l’étude de phase IIa, l’enobosarm améliore la masse musculaire maigre chez les sujets sains âgés et les femmes ménopausées après un traitement de 12 semaines. Cette étude a suggéré que l’activité de l’enobosarm était donc sélective en fonction des tissus cibles et pouvait prétendre à être un traitement de la perte musculaire plus sûr et sans effets secondaires que l’utilisation de la testostérone (Dalton, 2011). Lors de la phase IIb, les études ont montré les mêmes avantages chez les patients atteints de cancers cachectisants c'est-à-dire une amélioration de la prise de masse corporelle maigre et de l’activité physique (Dobs, 2013 ; étude multi-centrée, randomisée, placebo en double aveugle, cancer avec perte de poids >2%, 100 patients, 1mg/jour per os et 113 jours, 3 mg/jour per os, mesure de la masse musculaire maigre par DEXA -Dual-Energy X- Ray Absorptiometry- et mesure de la puissance musculaire par le test du "grimper des escaliers").

- Etudes de Phase III : L’enobosarm est évalué en tant que molécule utilisée dans la prévention de l’atrophie musculaire associée au cancer à non-petite cellule du poumon. (Crawford, 2016 ; étude multi-centrée, aléatoire, placebo en double aveugle, cancer pulmonaire, 641 patients, 5 mois, 3 mg/jour per os, mesure de la masse musculaire) Ces dernières études plus récentes de Phase III (Prevention and Treatment of Muscle Wasting in Patients with Cancer, POWER 1 et POWER 2), ne concordent cependant pas avec les précédentes et ne montrent pas les mêmes tendances c'est-à- dire une augmentation de la masse corporelle maigre et une amélioration des capacités physiques.

 Mode d'action sur les cellules musculaires squelettiques

Dubois (2015) a investigué le mode d'action de l'enobosarm sur la cellule musculaire via le récepteur AR. L’enobosarm n’agit pas que sur les AR des cellules satellites car il existe une réponse anabolique à l’administration d’enobosarm sur des rats dépourvus d’AR cellules satellites (modèle satARKO). Les cellules satellites sont situées entre la lame basale et la membrane plasmatique des fibres musculaires. Elles sont reconnues comme la cible principale des androgènes à l'origine de l'augmentation de la masse musculaire par hypertrophie de la cellule musculaire. Ainsi l’enobosarm prend pour cible la voie des AR des cellules en dehors de cette lignée contribuant aussi à l’effet anabolique Ces cellules extérieures réceptives à l’enobosarm permettent la co-expression de la vimentine (marqueur de transition epithélio mésenchymateuse –de la lignée fibroblastique).

L’étude bibliographique a mis en lumière que parmi les SARMs non stéroïdiens agonistes aux récepteurs AR, les aryle-propionamides présentent les caractéristiques anabolisantes les plus intéressantes. Ceci est le résultat d’une forte activité anabolique sur le muscle squelettique et les os, et une action agoniste partielle sur la prostate. L’enobosarm en particulier apparait comme la molécule la plus prometteuse de par son design pharmacologique puisqu’elle présente une efficacité après administration par voie orale et que des doses journalières sont possibles.

Chapitre 1 - Revue bibliographique

2. Mécanisme d'action d'un effet anabolique

De nombreuses données existent sur les effets obtenus de type anabolique par l'utilisation de stéroïdes androgènes au niveau de la croissance musculaire chez l'homme (mesure des diamètres et du poids des muscles, de la puissance musculaire), ... aspects visible et "physique" (Bhasin, 2009 ; Sinha-Hikim, 2002, Herbst, 2004). Depuis les années 90, un certain nombre de revues publiées ont fait le point sur les mécanismes biologiques qui sous-tendent la prise de masse musculaire et la croissance en général chez les animaux de production (Schmidely, 1993a, 1993b ; Paris, 2006 ; Sillence 2004 ; Dayton 2014). L'androgène le plus étudié sur son mode d'action anabolique au niveau moléculaire et cellulaire est bien sûr la testostérone chez l'homme mais les études ont également été menées sur les animaux de production, particulièrement axée sur les cellules du muscle squelettique pour son intérêt économique (Johnson, 2007). Parmi ces études, celles impliquant l'acétate de trenbolone sont intéressantes car ce composé montre une efficacité plus importante utilisé en tant que promoteur de croissance chez les bovins en production, il n'est pas, à l’instar des SARMs, un substrat de l'aromatase ni de la 5α-réductase. Il est le plus utilisé/commercialisé des promoteurs de croissance sous forme d'implant, seul ou associé avec l'œstradiol (par exemple le Revalor®XS qui combine 40 mg d’estradiol et 200 mg d'acétate de trenbolone).

Le point de départ de l’effet anabolisant, déjà exposé précédemment, est que, les androgènes (endogènes ou exogènes, nouveaux comme les SARMs) circulant dans un organisme se fixent sur le récepteur spécifique aux androgènes (AR) des cellules musculaires affectant le mécanisme moléculaire par une voie génomique (la formation du ligand "androgène"/récepteur "AR" entraine une réponse spécifique au niveau des zones régulatrices d'un certain nombre de gènes) et une voie non génomique (activation de voies métaboliques via des protéines kinases par exemple). Le mécanisme d'action des SARMs par la voie directe, génomique est mieux connue et décrite (Chapitre 1, 1.1 Originalité des SARMs, paragraphe Les SARMs ont une action anabolisante sur les muscles squelettiques, Figure 3, 6 et 7) ; c'est celle qui explique en grande partie la sélectivité tissulaire des SARMs la séparation des activités androgéniques et anabolique (Mohler, 2009).

2.1 Synthèse protéique et voies métaboliques impliquées

Les voies non génomiques du mode d'action des stéroïdes androgènes, complémentaires de la voie génomique directe déjà évoquée précédemment, sont moins connues pour les SARMs et leurs études reposent sur une première hypothèse que les androgènes, comme la testostérone, agissent sur la régulation de la balance anabolisme/catabolisme des protéines (Urban, 2011)). Dans ce métabolisme des protéines, il a été mis en évidence la place prépondérante de l'activation de protéines kinase de la famille des phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) et des protéines kinases B (Akt) intervenant sur l'axe métabolique PI3K/Akt, voie de promotion et de croissance cellulaire en réponse à des signaux extracellulaires, ouvrant ainsi la voie à la recherche de moyens de contrôle du turnover protéique du muscle squelettique qu'il soit naturel (croissance d'un individu) ou induit par une prise d'anabolisant (Urban, 2011 ; White, 2013).

De façon générale, face à l'environnement et aux conditions de disponibilité des éléments fondamentaux, c'est à dire la quantité circulante dans l'organisme de nutriments et d'énergie, les

Chapitre 1 - Revue bibliographique mammifères sont capables de passer, au niveau cellulaire, d'un mode anabolique à un mode catabolique et vice versa. Par exemple, des forts taux de nutriments (acides aminés) et de facteurs de croissance au sens large (signaux systémiques représentés par les hormones, la testostérone par exemple, les facteurs de croissance comme la myostatine (Mst) ou l'IGF-I (insuline-like growth factor- I), les cytokines) orientent les cellules vers la synthèse glycogénique dans les muscles, le foie et la lipo-mobilisation des tissus adipeux, réduisent le catabolisme protéique dans les muscles, la néoglucogenèse dans le foie et la lipolyse dans les tissus adipeux. C'est possible chez les mammifères, par une voie métabolique, dont le point central est une protéine kinase mTOR (mammalian Target of rapamycine), qui enclenche l'utilisation et/ou la production cellulaire à partir des nutriments et de l'énergie disponibles. Cette voie métabolique joue un rôle majeur dans l'orientation des mécanismes cellulaires tel que la croissance (accumulation de masse) et la prolifération (multiplication). Les dysfonctionnements du "pathway" mTor sont impliqués dans certaines maladie (diabètes type 2, obésité, cancer) et mTor devient une cible potentielle dans les stratégies d'études pharmacologiques (utilisation de la rapamycine). mTor est une protéine kinase atypique formée de sérine/thréonine (appartenant à la famille des PI3K-kinases, Phosphatidyl Inositol-3 kinase) qui interagit avec de nombreuses autres protéines pour former les complexes mTorC1 et mTorC2. Deux revues rassemblent des études menées in vitro principalement, car l'inactivation totale de la voie mTor chez des souris modifiées entraine une létalité de l'embryon, au vu de son rôle majeur dans les processus cellulaires de croissance (Laplante, 2012 ; Huang, 2014)

En détail, le plus étudié des complexes est le mTorC1. La régulation en amont de l'activation du complexe mTorC1 se fait par les signaux cellulaires et extracellulaires tels les facteurs de croissance, le stress, le statut énergétique, l'oxygène et les acides aminés disponibles, permettant ainsi d'orienter les processus cellulaires de synthèses protéique, lipidique et d'autophagie. Les facteurs de croissance impliqués sont principalement l'insuline, l'IGF-I (Insulin like Growth Factor-I). Leur mécanisme est connu. Le TNFα (Tumor Necrosis Factor α) active mTorC1 de façon similaire aux facteurs de croissance. Les acides aminés impliqués fortement dans l'activation de mTor1, et qui doivent obligatoirement être présents avec les facteurs de croissance sont la leucine et l'arginine, la glutamine. Leur mécanisme d'action est peu connu à ce jour. La réponse en aval du complexe mTorC1 activé est caractérisée principalement par le processus cellulaire de synthèse protéique (intervention sur les structures cellulaires ribosome, ARNm, ARNr, ARN polymérase), au travers du contrôle de la protéine 4E-BP1 (prolifération cellulaire) et de la kinase S6K1 (croissance cellulaire). Ces dernières sont les promoteurs importants des modifications cellulaires impliquée dans la synthèse au niveau cellulaire des protéines. En même temps, mTorC1 contrôle la synthèse des lipides nécessaires à la fabrication des membranes générées par la prolifération cellulaire. Cela passe par la protéine SREBP1/2, élément de contrôle de l'expression des gènes impliqués dans la synthèse des acides gras et du cholestérol. mTorC1 agit également au niveau du métabolisme énergétique.

La voie mTorC2, bien moins connue, est a priori insensible aux nutriments et à la rapamycine, mais répond bien à l'activation des facteurs de croissance, l’insuline notamment, via la voie PI3K kinase. mTorC2 active des protéines kinases de la famille des glucocorticoïdes, en particulier SGK1 et PKC-α, la première impliquée dans la croissance cellulaire et le transport des ions via la phosphorylation, la seconde impliquée dans la régulation du cytosquelette d'actine.

D'après Philp (2011) et cité par Laplante (2012), il est intéressant de noter que les contractions musculaires augmentent l'activité de mTorC1, l'exercice augmente le taux d'hormones anaboliques

Chapitre 1 - Revue bibliographique circulantes ; 5 fois plus de testostérone totale, 3 fois plus de testostérone libre et 10 fois plus d'hormone de croissance et d'IGF-I. Pour mémoire, l'hypertrophie des muscles squelettiques est liée à i) un niveau de base d'activité de mTorC1 (évalué par le taux de phosphorylation de S6K1) bas, ii) l'addition d'acides aminés augmente l'activité de mTorC1 et la synthèse protéique, iii) la capacité des acides aminés et de la charge exercice augmentant la synthèse protéique est dépendant du niveau d'activité hormonale iv) les facteurs de croissance et l'exercice peuvent activer mTorC1 et la synthèse protéique plus efficacement en présence d'acides aminés. L'hypothèse qu'un système mécano- sensible soit à l'interface de la stimulation du processus mTorC1 a été posée, système mécano sensible situé dans une position permettant de connecter l'architecture interne de la cellule à la matrice extracellulaire et les autres cellules.

La testostérone active la voie métabolique PI3K/Akt via la stimulation directe de l'IGF-I et la répression de la myostatine. Indirectement, l'activation de la protéine kinase Akt entraine la phosphorylation et l'activation de la voie métabolique mTor orientant les cellules vers un processus anabolique (synthèses), mais favorise aussi indirectement la croissance en réprimant (régulation négative) l'autophagie, c'est le processus global de dégradation/recyclage des cellules. Egalement, l'activation de Akt, réprime des protéines de transcription FoxO (Forkhead box proteins). Ces protéines sont des facteurs de transcriptions qui jouent un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes impliqués dans la croissance cellulaire, la prolifération et la différenciation ainsi que la longévité cellulaire et nécessaires dans la voie du métabolisme catabolique des protéines. Enfin, la testostérone inhibe l'expression et l'activité de la myostatine (Mst), inhibitrice de l'axe PI3K/Akt où la myostatine agit normalement comme un inhibiteur de la croissance du muscle squelettique (Figure 10).

La croissance musculaire est bien la résultante d'une balance entre catabolisme/anabolisme protéique mais également stimulation/inhibition des voies métaboliques d'hypertrophie/atrophie des cellules musculaires. On peut supposer que de tels mécanismes sont communs aux androgènes et aux SARMs.

Figure 10 : Interaction entre la 17β-testostérone et les processus métaboliques observés dans le muscle squelettique (adapté de Dubois, 2012).

Chapitre 1 - Revue bibliographique

2.2 Croissance du muscle squelettique

Pour poursuivre sur les voies non génomiques du mode d'action des stéroïdes androgènes, déjà évoquée précédemment, une seconde hypothèse est que les androgènes, comme la testostérone, agissent sur les différentes cellules composant le muscle squelettique.

Le nombre et la taille des fibres musculaires déterminent la taille du muscle. Chez les bovins, le nombre total de fibres musculaires est fixé à la naissance. En revanche une augmentation de la taille des fibres musculaires et de la masse musculaire (croissance musculaire, hypertrophie) est normale au cours du développement en réponse à une activité (exercice) et/ou à une stimulation hormonale anabolique (œstrogènes et androgènes). Ces processus de différentiation et de croissance cellulaire des cellules musculaires sont sous la dépendance d'hormones (androgènes, œstrogènes, hormone de croissance ou GH pour Growth Hormone, IGF-I). L'utilisation d'anabolisant, de promoteurs de croissance, par les mêmes mécanismes peuvent donc renforcer la croissance musculaire (Figure 11).

Figure 11 : Mécanisme physiologiques décrivant l'effet anabolisant provoqué par les androgènes et œstrogènes. GNRH (gonadotropin releasing hormone), SRIF (somatotropin release-inhibiting factor ou somatostatine), GH (growth hormone ou hormone de croissance), IGF1 (insulin-like growth factor 1), IGFBPs (insuline-like growth factor binding proteins) (Meyer, 2001 repris par Paris, 2006).

Une protéine de la famille TGF-β (Transforming Growth Factor-β), la myostatine (Mst) ou GDF-8 agit comme inhibiteur de la croissance du muscle squelettique et l'altération du gène codant la myostatine se traduit par le caractère culard sélectionné en race Blanc Bleu Belge par exemple (Grobet, 1997). La myostatine secrétée par le muscle squelettique serait un inhibiteur de la différentiation et de la croissance des fibroblastes (Arnold, 2001)

Depuis quelques années, le rôle des cellules satellites dans la croissance musculaire est étudié largement au travers de modèles cellulaires in vitro et sur le modèle du muscle longissimus, in vivo : ces cellules situées au niveau de la lame basale de la cellule musculaire peuvent, sous l'influence de

Chapitre 1 - Revue bibliographique signaux anaboliques, se multiplier et se différentier pour fusionner avec la cellule musculaire, lui apporter un noyau supplémentaire entrainant une hypertrophie de la fibre musculaire. Les cellules satellites sont plutôt actives pendant la période de croissance et deviennent quiescentes à l'âge adulte. Leur rôle est donc essentiel pour la croissance musculaire lors de la période de développement de l'animal (Dayton, 2014). Johnson (1998) et collaborateurs ont montré qu'avec un implant de 120 mg d'acétate de trenbolone associé à 24 mg d'œstradiol 17β chez de jeunes femelles, il y a, entre autre, une augmentation de la surface du muscle longissimus et l'isolation dans ce même muscle de 50 % de cellules satellites en plus par rapport à des animaux témoins. Kamanga-Sollo (2008) rapporte sur des études in vitro (cellules satellites bovines fusionnées) que la trenbolone stimule la prolifération des cellules satellites par le biais des AR impliquant ainsi la voie PI3K/Akt. Et ensuite Kamanga-Sollo (2011) poursuit en mettant en évidence, sur le même modèle cellulaire, une augmentation du taux de synthèse protéique avec un ajout d'acétate de trenbolone par rapport à des cultures sans trenbolone et une réduction de 70 % du taux de dégradation protéique ; en utilisant le flutamide (antagoniste des récepteurs AR) et un autre composé compétiteur des récepteurs d'IGF-1, il met bien en évidence que la trenbolone agit sur la synthèse/dégradation des protéines par le biais des récepteurs AR avec la participation du facteur de croissance IGF-1.

L'Insuline-like growth factor-I (IGF-I) (et le facteur IGFBP, Insuline-like Growth Factor Binding Protein intervenant dans l'activité biologique) stimule la croissance musculaire à plusieurs niveaux. Ce facteur de croissance augmente le taux de prolifération et de différentiation des cellules satellites et stimule le taux de synthèse protéique mais plus encore il diminue le taux de dégradation protéique (études menées sur culture cellulaire bovine, Dayton, 2008). En tant que principal médiateur de l'hormone de croissance (Growth Hormone, GH) dans une action vers le muscle squelettique Johnson (1998) ont démontré que le taux sérique d'IGF-I est augmenté significativement lors de l'utilisation de trenbolone chez de jeunes bovins femelles par rapport à des témoins. En revanche, la trenbolone ne semble pas agir directement sur la production locale d'IGF-1 et son expression (mesurée par le taux de ARNm IGF-1 dans le muscle longissimus à la dose habituellement retrouvée dans les implants commercialisés (Pampusch, 2008).

La recherche du mode d'action des anabolisants s'intéresse aussi au rôle des corticostéroïdes (Sillence 2004). A la différence de la testostérone, la trenbolone, antagoniste des récepteurs aux glucocorticoides (GCR) également, entraine la suppression de la production d'hormones corticostéroïdes chez le rat et le mouton diminuant indirectement l'effet catabolique des corticoïdes sur le métabolisme protéique et supprimant leur effet négatif sur la production de facteurs de croissance comme l'IGF-1. Cela renforce la connaissance du mode d'action principal de la trenbolone qui est plutôt une diminution importante du taux de dégradation protéique qu'une augmentation importante de la synthèse protéique montré pour la testostérone (Meyer 2001).

La revue de Schiaffino (2013) rassemble les données des mécanismes biologiques, cellulaires et moléculaires associés à l'augmentation de la masse musculaire (Figure 12). La voie Akt/mTOR est donc un point de convergence avec les autres chemins métaboliques connus lors d'une croissance musculaire normale mais c'est aussi le cas avec le recours à des agents anabolisants comme les stéroïdes androgènes ou les β-agonistes. Schiaffino replace leur mode d'action dans un schéma d'explication d'augmentation de la masse musculaire obéissant aux mêmes processus que lors d'une croissance normale. Un taux bas de testostérone chez la souris diminue l’ARNm-IGF-I musculaire, la phosphorylation Akt, et le taux de synthèse protéique des myofibrilles (toutes ces altérations sont

Chapitre 1 - Revue bibliographique réversibles avec la nandrolone). Schiaffino souligne que le rôle de la prolifération des cellules satellites et de leur fusion pouvant contribuer à l'hypertrophie musculaire est sujet de débat mais quelques éléments tangibles à retenir cependant : la fusion des myoblastes est essentielle pour la croissance musculaire dans les premiers stades, les interleukines IL-6 et IL-4 favorisent la prolifération et la fusion des cellules satellites, la fusion des cellules satellites participent à la croissance musculaire par l'apport de nouveaux noyaux aux cellules musculaires

Figure 12 : Action des anabolisants sur les voies métaboliques de la cellule musculaire entrainant croissance des fibres et une augmentation de la synthèse protéique (adapté de Schiaffino, 2013).

2.3 Mode d'action des SARMs

L'Enobosarm est la molécule ayant reçu le plus d'attention de la part de la communauté scientifique sur son mode d'action en tant qu'agent anabolisant chez l'homme (essais cliniques) et sur modèles murins pour tenter de comprendre en général la différence entre les SARMs et les autres stéroïdes connus.

L'enobosarm augmente la masse musculaire avec des effets limités sur les vésicules séminales dans les études pré-cliniques sur modèles animaux, l’activité anabolique étant toujours testée sur l’augmentation du poids du muscle levator ani (Kim, 2005). Dans les études cliniques chez l'homme, l’enobosarm augmente la masse musculaire maigre et la force physique (Dalton, 2011 ; Dobs, 2013).

La principale et seule étude du mode d’action anabolique au niveau moléculaire et cellulaire de l’enobosarm a été fait sur un modèle souris satARKo (satellite cell-specific AR knockout) par l'équipe de Dubois et du professeur Claessens (Dubois, 2012, 2014, 2015). Il a été réalisé une castration suivie d’une thérapie de remplacement sur ces souris (la DHT étant l’androgène de contrôle). L’hypothèse

Chapitre 1 - Revue bibliographique est de vérifier que le mécanisme est direct via les récepteurs AR de la cellule musculaire ce qui a été le cas. Tout d'abord, les différents muscles étudiés ont montré une réponse très différente à l’action anabolisante de l’enobosarm. Les muscles squelettiques périnéaux (levator ani, LA et bulbo- caverneux) sont hautement réceptifs aux androgènes et dépendent des androgènes pour maintenir leurs fonctions tandis que les muscles squelettiques des membres (extenseur des doigts, muscle gastrocnémien) sont moins réceptifs et ne dépendent pas des androgènes pour maintenir leur structure. La suppression des AR ne modifie pas la masse des muscles des membres au contraire des muscles périnéaux à cause de la présence d’un nombre bien moins important d’AR dans les muscles squelettiques par rapport aux muscles androgéniques. La sensibilité est également visible sur le temps où le traitement avec l’enobosarm ou la DHT entraine une augmentation de la masse musculaire maigre au bout de 8 semaines alors qu’au bout de 2 semaines, l’augmentation de la masse du LA est seulement visible (DHT et enobosarm). De plus, l'enobosarm exercent une activité inhibitrice/régulatrice sur la myostatine, expression du gène Mstn via les récepteurs AR (Dubois, 2014). Ce phénomène est particulièrement intéressant car signifierait qu’en combinant un anabolisant et un inhibiteur Mtsn, l’effet anabolisant sur les muscles serait augmenté. Ce que cette étude a aussi révélé, c'est l’existence pour l'enobosarm d’une action indirecte "non musculaire" avec le support d'autres cellules, les fibroblastes (cellules de soutien du tissu conjonctif) et via des récepteurs AR, mécanisme encore à élucider. Peut-être s’agit-il d’une interaction avec l’IGF-I ?... en particulier les IGF-I locaux produits et présents au sein de la fibre musculaire (IGF-IEa). L'IGF-I serait bien impliquée dans l'augmentation de la masse musculaire par un mécanisme indirect non lié aux récepteurs AR ; en effet, dans leur étude les concentrations sériques d'IGF-I sont à des taux similaires entre les souris satARKO et les contrôles et non modifiées par la castration avec ou sans DHT (Dubois, 2015).

Les stéroïdes androgènes ont une action stimulatrice des mécanismes moléculaires et biochimiques de la croissance, soit par stimulation soit par inhibition et surtout par une balance entre les phénomènes de multiplication et prolifération des cellules composantes du muscle. Les stéroïdes androgènes possèdent aussi la capacité d'orienter le métabolisme protidique en association avec les métabolismes lipidique et énergétique. Pour les SARMs, et l'enobosarm en particulier, l'action anabolisante sur les muscles squelettiques est dépendante des récepteurs AR des cellules musculaires elles-mêmes mais également d'autres cellules non musculaires voisines et participant à l'architecture globale du muscle. La sélectivité tissulaire de l'enobosarm ne passe pas forcément par la très bonne affinité pour le récepteur AR des cellules musculaires. Les mécanismes plus précis au niveau moléculaire et voies métaboliques sont encore à étudier par rapport aux androgènes.

2- Utilisation des anabolisants en élevage

L’usage des stéroïdes anabolisants androgéniques date de la fin du XIXème au cours duquel Charles Edouard Brown-Séquard s’injecta un extrait liquide de testicules de chien et de cochon d’inde, révélant alors les vertus rajeunissantes de cette substance. Ce n’est qu’en 1931 qu’Adolf Butenandt isola la première hormone sexuelle, l’androstérone, de l’urine de l’Homme, suivi en 1935 par l’extraction et l’isolement de la testostérone à partir de testicules de taureaux réalisés par Ernst Laqueur. La même année, Adolf Butenandt et Günter Hanisch publièrent une méthode de synthèse chimique de la testostérone à partir du cholestérol. Dès lors, la testostérone fut disponible pour

Chapitre 1 - Revue bibliographique l’usage thérapeutique (traitement de l’hypogonadisme chez l’homme, des troubles de la libido chez la femme ou de la cachexie liée à des maladies chroniques) ... et disponible aussi pour une utilisation détournée, centrée sur son potentiel anabolique afin d'améliorer masse musculaire et performance physique chez les athlètes et bodybuilders dès le début des années 50 sur la côte Ouest des Etats- Unis (Dotson, 2007).

En 1947, démarrent les premiers essais d'application, en tant que promoteur de croissance, d'un œstrogène de synthèse, le diéthylstilbestrol (DES) chez le jeune bovin femelle. Cette pratique se répand au début des années 50 dans les ateliers d'engraissement de jeunes bovins et de veaux (Raun, 1997, 2002). Le DES finira totalement interdit en production animale en 1979 par la FDA (Food and Drug Administration, Etats-Unis) et en 1981 par la CEE (Communauté Economique Européenne, Directive 81/602/CEE), reconnu comme cancérigène et tératogène pour le fœtus lorsqu'il est utilisé en traitement chez la femme enceinte (les "bébés DES", Herbst, 1971 ; Barclay, 1979) et suspecté de manière très polémique d'être dangereux pour la santé humaine s'il est absorbé lors de la consommation de viande issue d'animaux traités au DES (JECFA 1961 ; Jukes 1976). D'autres molécules seront alors développées et utilisées pour favoriser la croissance des animaux et la production de viande : des hormones sexuelles (testostérone, œstradiol, progestérone), des hormones stéroïdiennes synthétiques (acétate de trenbolone et acétate de mélengestrol), des antithyroïdiens de synthèse (thiouracile, tapazole, …), des β2-agonistes adrénergiques (clenbutérol, ractopamine, …), l'hormone de croissance bovine (somatotropine recombinée)... sous forme facilement manipulable (premix via l'alimentation, implant auriculaire), potentialisées (association œstradiol/testostérone, association per os/implant) et a priori sans autres effets clairement démontrés sur les animaux et les viandes issues de ces derniers. Les "anabolisants" ou "hormones" restent néanmoins des médicaments prescrits chez les animaux de production laissant la possibilité d'en utiliser certains pour des indications thérapeutiques (traitement de l'infertilité chez la vache adulte avec un dispositif intra-vaginal de progestérone, effet broncho-dilatateur du clenbutérol chez le cheval) ou zootechniques (synchronisation des chaleurs avec l'altrenogest chez la truie), sous réserve que ces substances entrent dans la composition de médicaments vétérinaires ayant reçu une autorisation de mise sur le marché (AMM) (Index des médicaments vétérinaires autorisés en France, http://www.ircp.anmv.anses.fr/, Instruction technique DGAL/SDSPA/2015-914 du 30 octobre 2015. Programme national d’inspection dans le domaine de la pharmacie vétérinaire pour 2016) et que les contrôles analytiques de recherche de résidus correspondants soient disponibles (Note de service DGAL/SDPAL/2016-747 du 22-09- 2016. Référencement des méthodes officielles pour la détection et l’identification des stéroïdes, corticostéroïdes, β- agonistes, thyréostatiques et hormones de croissance). Dans le RCP des médicaments vétérinaires (Résumé des Caractéristiques du Produit http://www.ircp.anmv.anses.fr/index.aspx?letter=V ), une distinction est bien faite entre le traitement thérapeutique autorisé et le traitement anabolisant interdit.

3.1 Utilisation des anabolisants en France et en Europe

L'utilisation des hormones en élevage en France est encadrée par les autorités publiques depuis 1959 autant sur l'alimentation du bétail que sur les animaux (Décret 53-450 paru au JO du 24 mars 1959, visant à "...interdire la détention en vue de la vente ou la vente d'aliments additionnés de certaines substances chimiques ou biologiques et destinés aux animaux dont la chair ou les produits sont consommés par l'homme.... sont d'ores et déjà interdites la détention..., la vente d'aliments additionnés de substances arsenicales, antimoniales ou œstrogènes" et à "interdire la détention en vue de la vente, la mise en vente ou la vente pour la consommation humaine, des animaux ou des

Chapitre 1 - Revue bibliographique denrées alimentaires en provenance d'animaux auxquels ont été administrés par quelque procédé que ce soit des substances arsenicales, antimoniales ou œstrogènes..." en précisant que les dispositions citées précédemment "...ne concernent pas les produits administrés pour un traitement thérapeutique..."). Ce décret devait normalement prendre effet deux mois après sa parution au Journal Officiel ! Mais, l'usage des traitements "anabolisants" ou "stimulants de croissance" en production animale en France était toléré et largement répandu dans le milieu agricole en vue d'optimiser la croissance musculaire des animaux par une meilleure l'efficacité alimentaire, d'améliorer les qualités des carcasses et donc de réduire indirectement les coûts de production. Les œstrogènes sont les hormones les plus utilisées, la plupart des spécialités destinées à cet usage étant constituées d'estradiol, seul ou associé aux progestagènes ou androgènes sous forme d'implant (Willemart 1988). C'était pour l'élevage français, un moyen d'être compétitif sur le marché agricole européen des années 60-70. Cependant, les consommateurs s'inquiètent des conséquences de l'utilisation d'hormones sur leur propre santé et a fortiori du danger associé aux résidus d'hormones qu'ils pourraient retrouver dans leur alimentation (Brander, 1970 ; Wade 1972). En 1976, la loi Ceyrac, inscrite au code de santé publique, interdit directement l’usage des œstrogènes en tant que promoteur de croissance pour les animaux d'élevage destinées à la consommation humaine (Loi n° 76-1067 du 27 novembre 1976). Mais cette loi n'est pas appliquée ("Il est interdit d'administrer des substances à action œstrogène aux animaux dont la chair ou les produits sont destinés à la consommation humaine..." et "Les infractions aux dispositions de la présente loi sont punies..."), détournée ("...sauf lorsque lesdits produits sont administrés à des femelles adultes, afin d'assurer la maîtrise de leur cycle œstral...") et surtout fortement remise en question d'un point de vue scientifique et économique ("Toute denrée animale ou d'origine animale contenant des substances à action œstrogène de structure stéroïdique ou non, décelées à des teneurs supérieures ou égales à celles fixées par les arrêtés prévus à l'article 2, ci-dessus, est retirée de la consommation humaine"). En Europe à cette époque, les pratiques sont différentes entre les états membres : les Pays-Bas, le Benelux, l'Italie et la République Fédérale d'Allemagne interdisent complètement l'usage des anabolisants, la France choisit de sélectionner les produits utilisables sous couvert scientifique, les autres pays européens les autorisent largement favorisant la production d'une viande à moindre coût. En parallèle, de nombreuses fraudes sont portées à la connaissance de l'opinion publique française par la presse, en particulier dans le système d'élevage du veau de boucherie. Des scandales sont relatés racontant l'utilisation d'hormones ou de produits illicites sur des jeunes animaux par des éleveurs ou des vétérinaires, avec description de souffrance animale ternissant l'image de l'élevage et d'une production de qualité mais surtout mettant en avant un danger volontairement masqué sur la santé du consommateur de viande (aliment pour bébé contaminé par du DES en 1980 en Italie, Loizzo, 1984a, 1984b). A l'automne 1980, une association de consommateurs (Union Fédérale des Consommateurs-Que Choisir) lance un appel au boycott de la viande de veau au travers de son magazine Que Choisir ?. L'association demande un débat public, un respect de la loi existante ("Ceyrac") avec renforcement de la législation en matière de contrôle ("Que voulons-nous pour cesser le boycott", lettre ouverte à Mr Mehaignerie, Secrétaire d'Etat à l'Agriculture) et aborde les prémices des concepts de bien-être des animaux, de production durable et de risque sanitaire. Ce boycott est massivement suivi illustrant une réelle et déterminée prise de conscience populaire. L'affaire du "veau aux hormones" éclate en France ainsi, mettant en lumière l'inquiétude des populations en matière de santé et obligeant les pouvoirs publics à agir rapidement au niveau national et européen (Journal Libération, "Les 9 interdisent l'usage de toutes les hormones dans l'élevage", 1 octobre 1980). La loi Ceyrac de 1976 interdisant l'usage des œstrogènes en médecine

Chapitre 1 - Revue bibliographique vétérinaire sera abrogée par la loi "Rocard", "relative à l'usage vétérinaire de substances anabolisantes et à l'interdiction de diverses autres substances" (Loi n° 84-609 du 16 juillet 1984) suivant les Directives de la Communauté Européenne prises dès 1981 par la Directive 81/602/CEE). Le scandale du veau aux hormones deviendra la crise du "bœuf aux hormones" révélant les implications fortes entre les domaines de la santé publique et de la politique agricole dans une Europe en construction. Les Etats membres vont légiférer ensemble pour préserver la santé du consommateur et protéger les échanges commerciaux intra-communautaires en donnant un cadre réglementaire d'accompagnement de l'élevage sans promoteurs de croissance ouvrant ainsi la porte aux mesures visant à garantir la sécurité des denrées produites et échangées. Les directives européennes relatives aux promoteurs de croissance seront transposées en droit français dans les articles du Code rural et de la pêche maritime (R-234-1 à R-234-14).

3.2 Evaluation du "risque anabolisant" : données toxicologiques des composés interdits

Les règles internationales de l’expertise toxicologique sont définies au niveau du JECFA (comité mixte d’experts de la FAO et de l’OMS) qui statue en matière de résidus d’additifs alimentaires ou de médicaments vétérinaires, de contaminants ou de substances toxiques d’origine naturelle dans les aliments. En ce qui concerne les molécules à évaluer, elles intègrent des données métaboliques, des données analytiques (concentrations résiduelles des composés administrés ou de leurs métabolites dans les denrées d’origine animale) ainsi que des données toxicologiques acquises sur plusieurs espèces animales exposées de manière aiguë ou chronique aux composés d’intérêt, afin d’en déterminer les impacts en termes de toxicologie de la reproduction, de tératogénicité, génotoxicité, cancérogénicité, neurotoxicité, etc. Lorsque cela est possible, une DJA (Dose Journalière Admissible) est dérivée de ces études en appliquant des facteurs de sécurité ad hoc qui tiennent compte des incertitudes inter-espèces et intra-espèces (généralement 100, soit 10 pour chacune des incertitudes). L’expertise s’attache ensuite à déterminer – sur la base des données de déplétion disponibles – des limites maximales de résidus (LMR) pour les principaux tissus issus de l’animal (muscle, foie, rein, tissu adipeux, et lait/œuf le cas échéant) qui soient compatibles avec des délais d’attente raisonnables d’un point de vue économique pour l’éleveur. L‘évaluation associée à l’usage des stéroïdes en élevage considère les résidus du composé et de ses métabolites dans la viande, le foie, le rein et la graisse des animaux traités. Du fait de leur similitude avec les hormones endogènes, ces résidus peuvent entraîner des perturbations endocriniennes chez l‘Homme dépendamment de leur concentration et de la quantité de produit consommé. Sur la base des études disponibles, le JECFA a défini une DJA pour l’Homme de 0-2 μg/kg et de 0-0,05 µg/kg de poids corporel par jour pour la testostérone et pour l‘estradiol (52nd JECFA, 1999), respectivement. Des DJA ont également été fixées pour l’acétate de mélengestrol (0-0,03 µg/kg pc/j) (66th JECFA 2006), la progestérone (0-30 µg/kg pc/j) (JECFA 1999), le zéranol (0-0,5 µg/kg pc/j) (32nd JECFA 1988) et l’acétate de trenbolone (0-0,02 µg/kg pc/j) (34th JECFA 1989). Le JECFA a pu fixer des limites maximales de résidus (LMR) pour ces six stéroïdes. Les effets d‘une exposition chronique à une faible dose et touchant des populations spécifiques plus particulièrement vulnérables comme les nourrissons et les enfants pré- pubères n‘ont toutefois pas été pris en compte du fait du manque d‘études sur ce sujet.

L'avis scientifique émis le 10 avril 2002, par le Comité Scientifique des Mesures Vétérinaires en charge des affaires de Santé Publique au niveau de la Commission Européenne, réaffirme pour ces hormones utilisées en tant que promoteurs de croissance que le risque pour le consommateur ne peut être considéré comme nul : pour l'œstradiol son potentiel hormonal résiduel est montré

Chapitre 1 - Revue bibliographique

(Daxenberger, 2001) et doit être affiné en fonction de certaines populations (enfant, garçon prépubère) ; en revanche, son potentiel génotoxique est démontré sur des modèles animaux (Cavalieri 2000 ; Liehr 2000). Saisi sur la question en 2007, le panel CONTAM de l’EFSA a conclu, à la lumière des données récentes produites dans l’intervalle, que les conclusions de l’évaluation du Comité Scientifique des Mesures Vétérinaires étaient toujours d’actualité (EFSA 2007). Les SARMs n’ont fait à ce jour fait l’objet d’aucune évaluation du risque dans un contexte de sécurité des aliments.

3.3 Gestion du "risque anabolisant" : Réglementation européenne et commerce international

L’utilisation des promoteurs de croissance en élevage est désormais régie par un cadre réglementaire strict, aux niveaux européen et nationaux, permettant de garantir aux consommateurs européens que les denrées d’origine animale produites sur le territoire européen ou importées de pays tiers autorisant ces pratiques ne présentent pas de risque sanitaire associé.

Ainsi, le Conseil des communautés européennes propose en 1981 de bannir l'utilisation des "hormones" avec l’adoption de la Directive 81/602/CEE "concernant l’interdiction de certaines substances à effet hormonal et des substances à effet thyréostatique ", incluant à ce titre les "substances à effet œstrogène, androgène ou gestagène" et les "substances à effet thyréostatique" (Conseil des communautés européennes, 1981). La Directive 85/649/CEE du 31 décembre 1985 interdit alors "l’utilisation de certaines substances à effet hormonal dans les spéculations animales" (Conseil des communautés européennes, 1985). Cette interdiction entre en vigueur le 1er janvier 1988 suite à la Décision 87/562/CEE du Conseil (Conseil des communautés européennes, 1987). Les directives arrêtées ultérieurement par le Conseil de l’Union européenne ont confirmé cette position et notamment la Directive 96/22/CE abrogeant les Directives 81/102/CEE, 88/146/CEE et 88/200CEE et contient en Annexe I la liste des substances prohibées (Conseil de l’Union européenne, 1996). La Directive 96/22/CE sera modifiée ensuite par les directives 2003/74/EC et 2008/97/EC.

En 1996, suite à toutes les directives européennes s'appliquant sur la production animale (Directive 96/22/CE) et le corollaire logique d'interdire en même temps l'importation de viande provenant d'animaux élevés avec des promoteurs de croissance, le Canada et les Etats-Unis contestent officiellement cet "embargo commercial" et déposent un recours auprès du comité de règlement des litiges (Organe de Règlement des Différends) de l'Organisation Mondiale du Commerce (OMC) avec l'argument que les risques sanitaires invoqués par l'Union Européenne n'ont pas de bases scientifiques reconnues et validées (JEFCA 1987). En effet, quelques années auparavant, de 1985 où il est demandé aux états membres de la CEE de ne pas importer de viandes issues d'animaux ayant reçu des substances à effet hormonal (Directive 85/649/CEE) jusqu'à 1995 où la Commission plénière du Codex Alimentarius adopte des Limites Maximales de Résidus (LMR) pour les hormones de synthèse, i.e. l’acétate de trenbolone, le zéranol et l’acétate de mélengestrol, mais aucune pour les hormones naturelles estradiol, progestérone et testostérone (sur la base des rapports JEFCA 1988 et 1989). En outre, la Conférence Fischler (Commissaire Agricole alors en place), organisée par l'Union Européenne, débat de la stimulation de la la production de viande et des substances promoteurs de croissance ; les conclusions n’alimentent pas les doutes émis en faveur d'un risque pour la santé liée aux hormones. La "dispute" liée aux mesures sanitaires et phytosanitaires de l'OMC (Accord SPS) héritées du GATT (General Agreement of Tarifs and Trade) est alors engagée de part et d'autre de l'Atlantique. L'Europe est finalement condamnée pour l'embargo des viandes "hormonées" sous

Chapitre 1 - Revue bibliographique prétexte qu'il n'est pas étayé par une évaluation scientifique des risques. L'Europe adopte le principe de précaution et poursuit son effort de législation en ce sens : l'utilisation d'anabolisants en élevage n'est pas acceptable et doit être interdite car la preuve scientifique de leur innocuité sur la santé humaine n'est pas suffisante (questions posées, recherches de toxicité (Hardstaf, 2000)). En effet, le Codex Alimentarius gestionnaire du risque au niveau international en sécurité sanitaire des aliments, permet d'adopter des normes autorisant la présence de résidus d'hormones dans les viandes pouvant être échangées entre l'Europe, le Canada et les Etats-Unis. La crise du "bœuf aux hormones" est en fait un conflit entre l'évaluateur du risque anabolisant au niveau mondial qu'est le JECFA et le gestionnaire de ce risque qu'est le Codex (CCRVDF) avec au milieu de la partie les échanges commerciaux de denrées alimentaires au niveau des Etats (OMC) (Powell 1998 ; Dangy 2015).

Mais l'Europe refuse de renoncer à l'interdiction des importations de viande nord-américaines et n'accepte pas les sanctions administrées par l'OMC. Elle reste sur le respect et le développement des lois concernant l'usage des anabolisants. Les Etats-Unis et le Canada ripostent en imposant des sanctions douanières sur l'importation d'un certain nombre de produits alimentaires en provenance de France et d'Europe (roquefort, chocolat, échalote, moutarde, truffe, etc..). A partir de 1990, la Confédération Paysanne (Syndicat agricole français) reprend au sein de ses mobilisations citoyennes le flambeau de la lutte du "bœuf aux hormones" contre l'utilisation d'anabolisants en élevage et proteste directement contre les sanctions douanières américaines (démontage en 1999 du Mac Donalds de Millau pour protester contre les sur-taxations américaines à l'importation de denrées alimentaires en provenance de France, "la bataille du roquefort") ; elle poursuivra ses actions par voie diplomatique et au sein des groupes politiques représentés au Parlement Européen à Bruxelles jusqu'au 14 mars 2012, date à laquelle le Parlement adopte enfin un accord avec les Etats-Unis et le Canada mettant fin au conflit "commercial" des viandes "hormonées" qui existait depuis 1996 : l'Europe autorise l'importation de viande (48200 tonnes de viande de "haute qualité") en provenance des Etats-Unis et du Canada (règlement UE n° 464/2012), viande garantie sans hormones et répondant aux critères de contrôle européens en échange de la levée totale des sanctions douanières (Johnson, 2015). La politique européenne vis-à-vis de l'utilisation des anabolisants vise bien à garantir que les produits importés par tous les pays de l'UE en provenance de pays tiers, présentent les mêmes qualités de sécurité sanitaire que les produits issus des élevages d'Europe. En 2013, de nouvelles négociations ont été initiées entre les Etats-Unis et l’Union Européenne dans le cadre du TTIP (Transatlantic Trade and Investment Partnership), encore appelé TAFTA (TransAtlantic Free Trade Agreement) ou en français PTCI pour « Partenariat Transatlantique sur le Commerce et l’Investissement ». Ce projet vise à établir les règles communes d'une future zone de libre-échange regroupant 800 millions de consommateurs américains et européens et concernerait notamment le libre-échange de produits agricoles comme la viande bovine.

3.4 Contrôle des anabolisants en Europe et en France

Depuis 1988, les autorités publiques européennes ont légiféré en interdisant totalement l'usage des promoteurs de croissance en production animale sur la base du principe de précaution (i) face à la pression sociétale à l’encontre de l'utilisation d'anabolisants en élevage, (ii) en l’absence de preuves de leur innocuité aussi bien à court terme qu’à long terme.

L'application de cette réglementation européenne est surveillée grâce à un dispositif de contrôle harmonisé. Celui-ci consiste en une détection et identification d'éventuels résidus de ces substances

Chapitre 1 - Revue bibliographique ou de leurs marqueurs dans des matrices animales ou d'origine animale. Les "mesures de contrôle à mettre en œuvre à l’égard de certaines substances et de leurs résidus dans les animaux vivants et leurs produits" sont précisées dans la Directive 96/23/CE du 29 avril 1996.

La directive 96/23/EC impose aux États membres le développement de méthodes analytiques fiables pour le contrôle de l’utilisation frauduleuse des anabolisants en élevage, sous la coordination des laboratoires de référence de l’Union européenne (EU-RL) désignés par la Commission européenne. Le RIKILT (Wageningen, Pays-Bas) est l’EU-RL pour les promoteurs de croissance présentant une activité hormonale et le BVL (Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebenmittelsicherheit, Office Fédéral de la Protection des Consommateurs et de la Sécurité Alimentaire, Berlin, Allemagne) est l’EU-RL pour les substances de type β-agonistes. Les missions de ces laboratoires sont de contribuer à l’évolution des méthodes analytiques, leur validation et l’harmonisation des performances sur le territoire européen. Cette directive met également en avant l'obligation pour les Etats membres de désigner des laboratoires nationaux de référence (LNR) chargés d'animer un réseau de laboratoires agréés pour la réalisation des analyses officielles (Décision d’exécution (UE) 2016/1365 de la Commission du 9 août 2016 modifiant la décision 98/536/CE en ce qui concerne la liste des laboratoires nationaux de référence). A l'heure actuelle, pour la France, les deux LNR en lien avec cette problématique des substances vétérinaires sont le LABERCA-Oniris (LABoratoire d'Etudes des Résidus et Contaminants dans les Aliments) pour les substances anabolisantes interdites et l’Anses-Fougères (Agence nationale de sécuritaire sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail à Fougères) pour les résidus de médicaments vétérinaires. Les LNR sont un appui technique auprès des autorités en matière de contrôle mais assurent également une activité de recherche et de développement méthodologique des techniques analytiques et de prélèvements pour faire évoluer le contrôle face à la fraude. Les stratégies de contournement de la loi sont souvent innovantes.

Cette directive 96/23/EC est complétée par la décision 97/747/CE qui fixe le niveau et la fréquence d'échantillonnage pour certaines filières (Tableau V), la décision 98/179/CE qui fixe les modalités d’échantillonnage officiel, la décision 2002/657/CE qui porte sur la modalité d'application de la directive 96/23 en ce qui concerne les performances des méthodes d'analyse et l'interprétation des résultats.

Tableau V. Dispositif de surveillance des promoteurs de croissance. Bulletin de Veille Sanitaire ANSES - Décembre 2016 n°77 (Prévost, 2015).

Chapitre 1 - Revue bibliographique

En France, La DGAL (Direction Générale de l'Alimentation), en collaboration avec la Commission européenne met en œuvre les plans annuels de contrôle et de surveillance. Les groupes de promoteurs de croissance recherchés annuellement dans le cadre des plans de surveillance et de contrôle sont conformément à la directive 96/23 : les stilbènes et dérivés de stilbènes (groupe A1), les antithyroïdiens de synthèse (groupe A2), les stéroïdes (groupe A3), les lactones de l’acide résorcylique (groupe A4) et les β-agonistes (groupe A5). La recherche des corticostéroïdes (Groupe B2f) est traditionnellement associée à celle des promoteurs de croissance, car historiquement, en Europe, ils ont été retrouvés dans le cadre d’investigations liées à des fraudes avec les β-agonistes et/ou les stéroïdes.

La directive 96/23/EC impose aux Etats membres le développement de méthodes analytiques fiables pour le contrôle de l’utilisation frauduleuse de facteurs de croissance en élevage. Afin de réaliser une surveillance et une détection efficaces, un grand nombre d‘échantillons est inclus dans les plans de contrôle nationaux. En conséquence, l’analyse de première intention réalisée sur un échantillon, dite de dépistage, doit être rapide, facile à mettre en œuvre, peu onéreuse, sensible, robuste. Ces méthodes présentent une grande capacité de traitement et sont appliquées pour passer au crible de nombreux échantillons en vue de trier rapidement les conformes des suspects. Cette première étape doit permettre la sélection d‘échantillons suspects qui devront ensuite être diagnostiqués conformes ou non par une méthode de confirmation. Les performances des méthodes ainsi développées doivent satisfaire, pour l’étape de dépistage un taux de résultats faux-conformes (faux négatifs) inférieur à 5% et pour l’étape de confirmation un taux de résultats faux non-conformes (faux positifs) inférieur à 1%. Les exigences relatives aux performances des méthodes ainsi qu’à l’interprétation des résultats sont décrites dans la Décision 2002/657/EC .

Les analyses conduites au niveau européen en matière de détection de l’utilisation illégale de substances à activité hormonale constituent une base d’information pour apprécier l’évolution des pratiques interdites. Le nombre de cas positifs stagne depuis une dizaine d’années et est en très net recul par rapport à la situation qui prévalait au début des années 1990. Les quelques cas actuellement rapportés concernent des stéroïdes et des -agonistes. Si aucun cas de traitement à l’hormone de croissance n’a pu être mis en évidence ces dernières années, les preuves de la circulation en Europe des produits injectables correspondants existent (Stephany 2010, EFSA 2014). Cette diminution apparente du nombre de cas pourrait s’expliquer ainsi : . Les substances administrées ne sont pas retrouvées en raison de leur élimination rapide, . La sensibilité de détection des méthodes connues demeure insuffisante, . Le recours à des substances naturelles dont le caractère exogène des résidus reste très difficile à démontrer, . Le recours à des substances de synthèse nouvelles et inconnues des laboratoires, . Le recours à des cocktails ou faibles doses de molécules qui agissent en synergie mais dont la détection est mise à mal en raison des niveaux d’ultra-traces que les technologies de mesure aujourd’hui pourraient peiner à détecter.

Cet état des lieux s’avère fortement incitatif pour la conduite de recherches analytiques innovantes qui intègrent les performances instrumentales en amélioration permanente. Ces approches innovantes ont ainsi été appliquées à la problématique des stéroïdes de synthèse ou naturels, des

Chapitre 1 - Revue bibliographique stéroïdes extraits d’insectes (Destrez 2009), des -agonistes, des sécrétagogues de l’hormone de croissance (e.g. hexarelin, GHRPs, etc.) ou encore très récemment des SARMs (de Rijke,2013).

L'Europe a donc choisi d'interdire totalement l'usage des stéroïdes anabolisants chez les animaux de production et d'imposer le contrôle harmonisé des denrées alimentaires d'origine animale devant le danger pour la santé du consommateur et un déficit d'évaluation du risque consécutif à l'utilisation d'hormones. Les Etats-Unis et le Canada ont préféré s'appuyer sur des limites maximales de résidus dans le cadre d'une utilisation appropriée des promoteurs de croissance, pratique intégrée largement dans les systèmes d'élevage et économiquement souhaitée par les filières de productions. Aucun consensus n'émerge des différentes commissions chargées de statuer, à partir de l'évaluation du risque et des preuves scientifiques disponibles, sur la dangerosité de la viande provenant d'animaux ayant été traités avec des "hormones". Le principe de précaution versus l'absence de preuves suffisantes. Mais des enjeux politiques et financiers énormes sont engagés dans la production de viande et sa commercialisation à travers le monde. Le différend scientifique se retrouve au cœur de deux visions de politique agricole de part et d’autre de l’Atlantique engendrant des systèmes de lois, d'autorisation et de contrôle de l'utilisation des anabolisants très différents. Si l‘Union Européenne a formellement interdit l‘utilisation des promoteurs de croissance en élevage par application du principe de précaution au regard des connaissances actuelles, dans certains pays non membres de l’Union Européenne l’utilisation des différentes hormones stéroïdiennes ne subit pas une restriction aussi stricte. Aux Etats-Unis, Canada, Australie, Nouvelle-Zélande et certains pays d’Amérique du sud, d’Asie et d’Afrique, l’utilisation de certains stéroïdes (17β-testostérone, 17β- estradiol, progestérone, acétate de trenbolone, zéranol et acétate de mélengestrol), β-agonistes (ractopamine, zilpatérol) ou hormones de croissance (bGH, pGH) est autorisée. En Europe, le respect de la réglementation se fait au travers des plans de surveillance et de contrôle réalisés sur l'ensemble du territoire français en lien avec les autres pays européens. L'utilisation de substances à visée anabolisante chez les bovins relève donc de la fraude et devient répréhensible. Les SARMs font partie des composés potentiellement anabolisants et leur facilité d'accès (via internet principalement) en font des candidats à une utilisation en tant que promoteur de performance avéré chez les sportifs et promoteurs de croissance chez les animaux surtout depuis le premier octroi d'un brevet pour un aliment additionné de SARMs destiné aux bovins engraissement (Dalton, 2016). Il est donc urgent de s'intéresser à cette famille de nouveaux agents anabolisants et de penser/anticiper les méthodes de contrôles d'un usage frauduleux de SARMs.

3- Détection de l’utilisation des anabolisants chez les bovins

Par ces mécanismes connus, les effets attendus de l'utilisation des anabolisants stéroïdiens chez les animaux de production, les bovins en particuliers, sont une augmentation de la vitesse de croissance, des modifications de la composition corporelle (répartition os-muscle-gras dans la carcasse,

Chapitre 1 - Revue bibliographique répartition protéines-lipides-eau dans le tissu musculaire) et sur la rétention azotée (Schmidely, 1993b ; Sillence, 2004 ; Dayton, 2008 ; Paris, 2006, ). Différentes approches et différents outils sont disponibles pour évaluer l’efficacité de l'utilisation des anabolisants en élevage, pour en caractériser les effets sur l'animal, leur devenir dans les viandes et, à partir de 1988, pour en contrôler leur totale interdiction en Europe (Stephany, 2010) :

. Le suivi des performances zootechniques a permis de caractériser le gain "profitable" de l'utilisation de stéroïdes anabolisants et ses répercussions physiques sur les animaux reflétés par le changement de conformation et l'effet sur la qualité des viandes au travers de l'amélioration de la croissance et de l'efficacité alimentaire (VanderWal, 1975 ; Schmidely, 1993a). Ainsi, dans le même ordre d'idée, la mise en évidence d’un usage illégal d'anti- thyroidiens de synthèse (ATS) chez les animaux de production peut dans un premier temps s’appuyer sur des critères morphologiques et histologiques reposant sur l’hypothyroïdie des animaux (Griem, 1971, 1973). L’étude gravimétrique de thyroïdes (poids supérieur à 60 g chez les bovins) est ainsi un test de dépistage simple. . Les mesures de résidus dans les produits d'origine animale ont permis de contrôler et de quantifier la présence de ces substances ; les recherches du mode d'action plus précis des anabolisants ont permis de comprendre le métabolisme et de mettre en évidence d'autres traces mesurables du promoteur de croissance, avec l'identification de métabolites issus des transformations biologiques après administration dans des fenêtres de détection basées sur des cinétiques de présence et d'élimination dans diverses matrices biologiques (De Brabander, 2007).

4.1 Utilisation de paramètres zootechniques : recherche d’une signature phénotypique

Il n'existe pas d'études spécifiques montrant l'intérêt et/ou l'utilisation de données zootechniques pour suspecter, à défaut de détecter, l'utilisation frauduleuse d'anabolisants chez les animaux de production. En fait, les idées reçues persistent sur la vision d'un animal "bodybuildé" et de pratiques cachées lors des travaux quotidiens dans l'élevage (injection "d'hormones" ou distribution d'un aliment "complémenté"). Les examens cliniques d'animaux pour évaluer les effets d'un agent anabolisant et l'inspection macroscopique des carcasses à l'abattoir (modifications de certains organes) font suite à des découvertes de promoteurs de croissance dans les matrices habituellement prélevées (sang, urine, poils) dans le cadre des plans de surveillance aléatoires (Groot, 2002) ou suite à des enquêtes en abattoir mandatées par les autorités publiques (sur les sites d'injection par exemple, Vanoosthuyze, 1994).

Les élevages de production de veaux ou d'engraissement de jeunes bovins de boucherie sont particulièrement suivis en terme de performances techniques et économiques par de nombreux paramètres zootechniques (poids vif, poids de carcasse) associés à des critères de performance (durée d'engraissement, gain moyen quotidien, IC) renseignant l'éleveur et sa filière sur la bonne croissance globale de l’animal et sa rentabilité au sein de la production (Institut de l'élevage, 2014 ; Loy, 1998 ; Wilson, 1997). Les hormones ont pu être utilisées par le passé pour "promouvoir" la croissance dans tous ces aspects et dégager ainsi des performances techniques (plus de viande) et économique (durée d'engraissement raccourcie et moins d'aliment donné). Si la croissance peut être définie par l'association d'une croissance pondérale et d'une croissance staturale évoluant chez le

Chapitre 1 - Revue bibliographique jeune animal, plusieurs paramètres descriptifs peuvent décrire cette croissance même si les principaux paramètres de la croissance staturale ne sont pas d’usage courant en élevage de veaux de boucherie ou atelier d'engraissement, associée à l'évaluation du développement des tissus et en particulier, le muscle squelettique et le tissu adipeux qui présentent un intérêt dans la description des performances zootechniques des bovins.

Ainsi le choix de paramètres pertinents à mesurer avec des outils adaptés aux jeunes animaux ainsi que la connaissance des effets zootechniques attendus pourraient alors se révéler être un moyen de repérer les animaux "traités" par des promoteurs de croissance parmi d'autres et surtout de donner l'alerte sur la fraude "anabolisant" au niveau de l'élevage.

 Croissance

La croissance pondérale rend compte de l'évolution de la masse corporelle d'un animal jusqu'au stade adulte. Des outils existent pour mesurer cette croissance. La pesée à la balance est la mesure la plus précise du poids vif. L’estimation du poids vif obtenue par barymétrie est certes moins coûteuse et plus facile de réalisation sur des animaux de grande taille et/ou en grand nombre, mais elle est aussi de moins bonne précision. En effet, la corrélation entre tour de poitrine et le poids vif mesuré par pesée varie toutefois en fonction de la race, du sexe, de l’âge, du poids et de la formule barymétrique utilisée. Les coefficients de corrélation ainsi obtenus sont donc très variables, variant de 0,32 à 1,00 (Wanderstock et Salisbury, 1946 ; Heinrichs, 1992 ; Wilson, 1997 ; Porhiel, 2005 ; Özlütürk., 2006 ; Ozkaya et Bozkurt, 2009 ; Yan, 2009 ; Dim, 2012 ; Milla, 2012). L’estimation du poids vif réalisée par observation de l’animal est subjective. Elle est effectivement influencée par l’opérateur (connaissances théoriques et pratiques) et par les conditions d’observation. L’estimation faite à l’aide d’abaques peut elle aussi subir un biais par défaut de justesse des tables utilisées (lié aux facteurs génétiques et/ou environnementaux influençant la croissance de l’animal.

Des outils pour mesurer la croissance staturale existent également essentiellement dans les programmes de suivi de l'évolution des races bovines (Oliveira, 2013) En plus d’être précises, les mesures permettant d’évaluer la croissance staturale sont caractérisées par de bonnes répétabilité et reproductibilité. En effet, les études réalisées sur les corrélations des mesures réalisées par un même opérateur sur un même animal ou par deux opérateurs sur un même animal montrent des coefficients élevés pour chacune des quatre mesures précédemment citées (0,88

 Développement

Le développement correspond à la mise en place des tissus et organes ainsi que de leurs fonctions. Le muscle étant la principale cible des promoteurs de croissance, ce paramètre peut être évalué par quelques outils, plus facilement sur les carcasses que du vivant de l'animal. Les appréciations visuelles du développement musculaire sont rendues peu précises par leur subjectivité. Aussi, les notes de pointage du bovin vivant ainsi que la note de conformation de sa carcasse s’avère peut prédictives de la teneur en viande de la carcasse (0,52

Chapitre 1 - Revue bibliographique reproductibilité (0,78

Le développement musculaire se fait en corrélation avec le développement du tissu adipeux et c'est le rapport de l'un par rapport à l'autre qui présente un réel intérêt. En effet, si les anabolisants augmentent la masse musculaire (masse maigre), ils entrainent en conséquence une diminution de la masse grasse. L’appréciation visuelle du développement adipeux est également soumise à la subjectivité de l’évaluation, la NEC (Note d'Etat Corporel) possède toutefois le meilleur pouvoir prédictif de la composition en gras de la carcasse (0,85

 Effets attendus

Les premiers effets, mesurés avec des outils zootechniques, concernent l'utilisation du DES. VanderWal et ses collaborateurs (1975) comparent le poids vif ou le gain de poids vif cumulé, l'indice de consommation et les qualités de carcasse suite à l'injection sous-cutanée de 25 ou 100 mg de DES à 9 semaine d'âge pour un groupe et avec répétition de l'injection à 13 semaines d'âge pour deux autres groupes. Les auteurs montrent une augmentation significative du gain de poids vif par rapport aux témoins (de + 7 à 9 % en fonction des groupes sur l'ensemble de la croissance sur la période expérimentale couvrant 5 à 15 semaines d'âge et + 4 à 7 % post-traitement), une diminution significative de l'indice de consommation (de - 4.2 à 7.0 % en fonction des groupes sur l'ensemble de la croissance sur la période expérimentale et - 7.2 à 10.5 % post-traitement). L'effet maximum étant constaté à 6 semaines post-traitement. Aucune différence significative n'est rapportée concernant la qualité des carcasses. L'étude porte aussi sur le moment de l'injection du DES et les effets obtenus. Quand les animaux sont traités à 5 semaines d'âge (groupe 1) ou 8 semaines d'âge (groupe 2), il y a une très légère augmentation de la croissance (mesure du gain de poids vif cumulé) non significative par rapport aux veaux témoins et ce jusqu'à 7 semaines post-injection pour les premiers (groupe 1) alors que les seconds voient leur croissance améliorée de façon significative (groupe 2) mais ensuite, une croissance "négative" par rapport aux témoins est visible pour les deux groupes ! Ce n'est pas le

Chapitre 1 - Revue bibliographique cas pour les animaux qui ont eu une injection à 11 semaines d'âge (groupe 3) ou 14 semaines d'âge (groupe 4) : la croissance est significativement augmentée de 6.4 kg/animal pour le groupe 3 et de 9.1 kg/animal pour le groupe 4, 4 semaines post-traitement et ce jusqu'à l'abattage. Les auteurs concluent que le traitement avec des anabolisants sur des animaux âgés (à partir de 11 semaines d'âge) permet d'obtenir les effets escomptés sur la croissance pondérale (VanderWal, 1975).

Encore aujourd'hui, essentiellement menées par les pays autorisant les anabolisants, de nombreuses autres études rapportent toujours les effets zootechniques pour la gamme de substances disponibles mais aussi l'impact physiologique de ces molécules et des programmes d'utilisation des promoteurs de croissance (effet sur l'immunité, période optimale de mise en place d'un implant, Moriel, 2016). Quelques unes de ces études se sont concentrées sur l'usage en particulier de stéroïdes anaboliques androgènes (SAA) chez le veau mâle entier en croissance, destiné à une production traditionnellement européenne :

- le stanozolol (encore appelé Win 14,833 (17-hydroxy-17-methylandrostano(3,2- c)pyrazole, WIN I) et le Win 18,792 (17-(3-cyclohexylpropionoxy)androstano(2,3-5)isoxazole, WIN II), ont ainsi été administrés par injection sous cutanée à la base de l'oreille. L’étude réalisée, chez le veau mâle Prim’Holstein de 6 jours d’âge nourri au lait jusqu'à 8 semaines, a permis d’observer une augmentation significative de la croissance pondérale (amélioration du poids vif de + 16 kg pour le WIN I et + 14 kg pour le WIN II, du GMQ de 34% et de l'IC de 10%), une légère tendance non significative au développement musculaire (mesure du poids muscle rond de l'épaule (kg) et de la surface du muscle inter-costal en cm2), une diminution du gras musculaire (mesure du pourcentage de gras dans le muscle rond) et d'aucune différence sur le développement statural (mesure de la hauteur au garrot, de la longueur et de la largeur des hanches) (MacFadden et Belden, 1967).

- l'acétate de trenbolone (40 mg) implantée au niveau du fanon à 5 semaines d'âge, utilisée seule, affecte de manière très légère mais non significative la croissance (mesure du gain de poids vif cumulé) des animaux 5 semaines post-traitement. L'indice de consommation suit la même tendance en revanche, aucun effet n'est rapporté sur la composition et la qualité de la carcasse (pas de précision sur les mesures faites par les règles en vigueur dans les abattoirs hollandais) (VanderWal, 1975).

- l’acétate de trenbolone (TBA, trenbolone acetate), où le TBA n’a montré aucun effet sur la croissance (mesure du gain de poids vif et de l'IC) du jeune bovin mâle entier Angus de 9-10 mois d’âge par rapport à des animaux témoins (sans implants) et par rapport à des animaux mâles castrés et des femelles avant la mise d'un implant auriculaire avec 120 mg de TBA ou pour un autre groupe de deux implants (un avec 120 mg de TBA et l'autre avec 24 mg d'estradiol). Les auteurs suggèrent que les mâles entiers ont besoin de terminer leur croissance pour être réceptifs à un traitement anabolisant en phase d'engraissement et de finition (Hunt, 1991).

- toujours quant à l'effet des anabolisants sur la composition corporelle et la qualité des carcasses, Wilson et al. (1999), aux USA, ont étudié l'utilisation de différents implants avec des combinaisons oestrogènes/androgènes chez des veaux mâles entiers Prim'Holstein. Sur 7 programmes "d'implants" (placebo, zeranol-36 mg, estradiol-20 mg/testostérone-200 mg, estradiol- 10 mg/progestérone-100 mg, estradiol-20 mg/progestérone-200 mg, estradiol-24 mg/acetate de trenbolone-120 mg), les auteurs rapportent une absence de différence du pourcentage des poids de carcasses entre les animaux implantés et les animaux "placebo", une légère tendance à

Chapitre 1 - Revue bibliographique l'augmentation du muscle longissimus chez les animaux traités avec une association estrogène/androgène et surtout aucune différence entre les différentes séquences d'implants sur la conformation de la carcasse, la couverture graisseuse, la texture et la couleur du muscle, sur le persillé graisseux et la composition chimique de la viande. Cette étude suggère, que même avec l'utilisation d'implants bien dosés en promoteurs de croissance, chez des jeunes animaux laitiers entiers mâles dans un système de production type "veau de boucherie", il n'y a pas de réel gain sur la production de viande à suivre et que cette pratique est plutôt utile sur des animaux plus âgés, castrés pour les mâles, entières pour les femelles en production type "feedlot" (Wilson, 1999).

 Cas particulier des SARMS :

A ce jour, aucune étude n'a permis d’évaluer les effets zootechniques consécutifs à l’administration d’un SARMs chez les bovins. Les seules données relatives aux effets zootechniques d'un SARMs sur un animal de production concernent l’espèce porcine dans le cadre d'un brevet américain déposé dès 2010 et finalement accordé le 8 mars 2016 (US 9278914 B2), avec l’évaluations du SARM de formule S-II (Figure 13) sur les performances de croissance et la composition des carcasses de porcs en finition (Dalton, 2016).

Figure 13 : Formule du composé S-II, synthétisé par Dalton (2010) et présent dans un mix de SARMs additionné à un aliment pour animal de production et testé dans le cadre d'un brevet (Dalton, 2016).

Les expériences ont ainsi été menées chez quarante porcs mâles castrés pesant environ 95 kg, répartis en quatre groupes de dix animaux selon la dose journalière de S-II administrée. Les lots 1, 2, 3, et 4 ont respectivement reçu un aliment dont la concentration en S-II était de 0, 1, 3 et 10 mg de S- 2 par kg d’aliment sur la durée totale de l’étude, soit 28 jours. Aucun effet significatif n’a pu être démontré. Toutefois, des tendances à l’augmentation du GMQ et à la diminution de l’indice de consommation ont été mises en évidence, et ce de façon plus marquée pour la dernière semaine (du 21ème au 28ème jour), quelle que soit la dose administrée. De la même manière, une tendance à l’augmentation de la masse maigre (évaluée par la mesure de l’aire du muscle long dorsal sur carcasse) et une diminution de la masse grasse (évaluée par l’épaisseur de gras sous-cutané au niveau des 1ère, 10ème et dernière côtes sur carcasse) ont été observées. Aucune variation significative de poids vif ou de carcasse n’a été constatée.

Ainsi ces observations, menées chez le porc, ne permettent pas d’envisager, pour cette espèce, le dépistage de pratiques à base de SARMS sur la base d’investigations zootechniques uniquement. Il conviendrait en conséquence de réaliser chez les bovins une évaluation zootechnique de l'effet d'une

Chapitre 1 - Revue bibliographique administration de SARMs, avec des outils adaptés à cette espèce et des paramètres reflétant au mieux la croissance et le développement des animaux comme pratiqué avec les stéroïdes androgéniques anabolisants.

Ainsi, le recours aux agents anabolisants en élevage entraine logiquement des effets sur la croissance et le développement des animaux, résultant en une signature phénotypique objective et mesurable. Dans l’hypothèse où des outils de zootechnie robustes et d’utilisation aisée seraient disponibles, cette signature particulière, pourrait être utilisée comme une stratégie de dépistage conduisant à la mise en évidence en élevage ou à l’abattoir de conformations suspectes. Dans un second temps, les cas suspects devraient ensuite être caractérisés par des stratégies plus ciblées visant la mise en évidence du résidu de la substance suspectée ou de ses métabolites directs. Il convient de souligner qu’à ce jour, aucune étude n'a permis d’évaluer les effets zootechniques consécutifs à l’administration d’un SARMs chez les bovins et que de ce fait aucune description de signature phénotypique associée n’est disponible.

4.2 Stratégies analytiques ciblées : recherche d’une signature analytique ciblée

Tel que détaillé au §3 précédent, il existe une interdiction réglementaire d’utilisation de substances à effet anaboliques chez les animaux de production d’après la directive 96/22/CE du 29 avril 1996. Le contrôle de l’utilisation de ces substances repose depuis cette période sur la détection de résidus de ces substances et est réglementé par la directive 96/23/CE du Conseil du 29 avril 1996. Les modalités d’applications étant précisées par la décision de la commission 2002/657/CE du 12 août 2002.

Les stratégies analytiques mises en œuvre dans ce contexte sont dites « ciblées », puisqu’elles sont développées afin de permettre de détecter de manière spécifique le résidu de la substance administrée ou ses métabolites directs, comme autant de signatures de la pratique anabolisante. Les méthodes officielles répertoriées ainsi permettent la détection et l'identification d'environ 70 promoteurs de croissance, les résidus et leurs métabolites issus des transformations métaboliques dans différents échantillons d'origine animale (Note de service DGAL/SDPRAT/N2011-8166, 12 juillet 2011). Ces méthodes sont basées essentiellement sur la chromatographie (en phase gazeuse, GC ou liquide, LC) couplée à la spectrométrie de masse (MS) (en tandem MS/MS, de rapport isotopique) sur matrices poil, urine, tissus, graisse pour des substances stéroïdiennes sous différentes formes (ester) ou leurs conjugués (Tableau VI). Le nombre de prélèvements à réaliser par filière et par lieu de prélèvement (élevage ou abattoir) pour les plans de contrôle des promoteurs de croissance est annuellement calculé pour répondre aux dispositions de la directive 96/23/CE et pour répondre à une priorisation fonction du nombre de non conformités relevées les années précédentes.

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Tableau VI : Extrait des références des méthodes d’analyses officielles pour la détection et l’identification des stéroïdes de la note de service DGAL/SDPRAT/N2011-8166.

Outre les familles listées dans l’annexe I de la directive 96/23/EC, d’autres substances non réglementées peuvent faire l’objet de surveillance ciblée. C’est notamment le cas des SARMs. Ces substances sont aujourd’hui recherchées en France dans le cadre d'un plan exploratoire (Prévost, 2015)

 Détection et identification des SARMs

Les SARMs représentent, analytiquement parlant, de nouvelles classes de molécules cibles qui ne sont pas à l’heure actuelle intégrées dans les méthodes de détection existantes du fait de leurs propriétés physicochimiques variées. Plus spécifiquement, les SARMs appartenant à la famille des aryle-propionamides sont plus difficilement détectés en GC-MS(/MS), procédure qui est couramment appliquée à l’analyse des stéroïdes anabolisants et de leurs métabolites. En contraste avec la majorité des stéroïdes anabolisants androgéniques et de leurs métabolites, les SARMs ont démontré d’excellentes limites de détection pour des méthodes de détection par LC-ESI-MS(/MS) en mode SIM ou SRM du fait de leur structure plus polaire que celle des stéroïdes. Les principales méthodes décrites pour la détection et le dosage des SARMs dans les matrices telles que le sang ou l’urine sont très récentes et font appel principalement à des méthodes de screening multi-résidus utilisées dans le contrôle anti-dopage humain (Thevis, 2017).

L’optimisation de la technique de séparation et d’identification des SARMs passe par le couplage entre la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse chez l'homme et chez les animaux (Tableau VII). Chez les bovins c’est actuellement la seule technique rapportée pour la détection de l’enobosarm et de ses métabolites (de Rijke, 2013 ; Beucher, 2017). Il convient également de souligner que si pour d’autres espèces (rongeurs en particulier) les fèces sont une matrice de choix pour la mise en évidence d’une élimination de SARMs, chez les bovins seule l’urine a à ce jour été étudiée pour la détection des métabolites, principalement de phase II.

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Tableau VII : Synthèse bibliographique des méthodes de détection et d'identification de SARMs et de leurs métabolites

Modèle d'étudesMatrice Séparation et identification (Références)

Rat : SARM S-4 HPLC-MS (molécule, métabolites) Urine, feces LC-MS/MS (métabolites de phase I et II) (Perera et al. 2006) Ionisation par électrospray (ESI) en mode ion négatif Chien : SARM S-4 HPLC-MS (molécule, métabolites) Urine, feces LC-MS/MS (métabolites de phase I et II) (Perera et al. 2006) Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) en mode ion positif Rat : SARM S-26 HPLC-MS (molécule, métabolites) Urine, feces LC-MS/MS (métabolites de phase I et II) (Yang et al. 2010) Ionisation par électrospray (ESI) en mode ion positif Homme : Enobosarm LC-MS/MS (métabolites de phase I et II) Urine (Thevis, 2011) Homme : SARM LY2452473 HPLC-MS (molécule, métabolites) Urine LC-MS/MS (métabolites de phase I et II) (Yi et al. 2012) Ionisation par électrospray (ESI) en mode ion positif et négatif Rat : Enobosarm HPLC en phase inverse Urine, Feces Ionisation par électrospray (ESI) en mode ion positif et négatif (Kim et al. 2013) Bovin : Enobosarm LC-MS/MS (métabolites de phase II) Urine (De Rijke, 2013) Cheval : Enobosarm LC-MS/MS (métabolites de phase II) Urine (Hansson, 2015) Bovin : Enobosarm Chromatographie en phase supercritique (SFC) Urine Spectrométrie à mobilité ionique (IM-MS) (Beucher, 2017)

 Cinétiques d’excrétion des SARMs (profil, fenêtre)

A titre de comparaison et en ce qui concerne les stéroïdes (du DES interdit à l'implant d'œstradiol/acétate de trenbolone), il est désormais bien documenté que les concentrations de résidus correspondants sont maximales au site d'administration (pour la substance d'origine), dans la bile, les fèces et l'urine pour les fluides d'élimination et le rein et le foie pour les tissus pour la molécule administrée mais aussi pour ses métabolites issus des passages hépatiques et intestinaux (Heitzman, 1983). Récemment Biancotto (2016) lors d’une expérimentation impliquant des bouvillons traités par du Revalor XS (œstradiol/trenbolone acétate) montre que les cinétiques d'excrétion dans les urines sont possible jusqu'à 200 jours (avec ici une période d'étude de 71 jours) : très faible concentration des molécules implantées et concentration faible de leurs principaux métabolites (Figure 14). Face à ces nouveaux dosages basses doses, il en conclut que les techniques de détection et de quantification doivent s'adapter au design des agents anabolisants (formulation ou voie administration) et être très sensibles pour détecter ce genre de résidus dans les contrôles officiels.

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Figure 14 : Cinétique d'excrétion des 17β-trenbolone, 17α-trenbolone, 17β-estradiol et 17α-estradiol dans les urines de bovins charolais âgés de 10 à 14 mois, traités par un implant auriculaire de Revalor-XS Implant [200 mg d'acétate de trenbolone/40 mg d'estradiol] (en ligne pointillé) et de bovins charolais témoin (en ligne pleine) (Biancotto, 2016).

En ce qui concerne les SARMs, chez les bovins, seule une étude disponible rapporte l’excrétion urinaire : une cinétique d’élimination de l’enobosarm a ainsi été réalisée sur urine de veau après administration per os de 200 mg d'enobosarm (Figure 15). Une concentration élevée d'enobosarm est détectable un jour après l'administration avec une fenêtre de détection possible entre quelques heures et 6 jours. Si cette étude montre la faisabilité d’étudier en matrice animale la signature ciblée de l’administration d’enobosarm à un bovin, il convient toutefois de souligner que cette cinétique ne correspond pas à une administration "normale" en cas d'utilisation à des fins de promotion de la croissance (trop forte dose, utilisée dans ces travaux pour élucider le métabolisme et valider la méthode) (de Rijke, 2013).

Figure 15 : Cinétique d'élimination de l'enobosarm dans les urines d'un veau avant et après administration orale (de Rijke, 2013).

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Cependant les études mettent en évidence que les SARMs peuvent être excrétés autant par voie fécale que par voie urinaire. Elles montrent également que différents SARMs ont différents profils d’excrétion. Une étude sur le rat a permis de comparer la cinétique d’élimination de l’enobosarm dans les urines et dans les fèces (Kim, 2013). En supposant que l’élimination de l’enobosarm chez le rat est semblable à celle du veau, on considère que les concentrations fécales seront au minimum trois fois supérieures à celles des urines.

Les études sur le métabolisme in vivo de l'enobosarm montrent que l'on peut identifier le composé et ses principaux métabolites de phase II dans les urines humaines (Thevis, 2011) et équines (Hansson, 2015) en vue d'un contrôle anti-dopage mais sans proposer toutefois de fenêtre de détection bien établies. L'idéal en analyse ciblée serait donc d’identifier le résidu de la molécule administrée, d'identifier ses principaux métabolites au cas où elle ne serait plus détectable et de déterminer des fenêtres de détection en fonction des molécules recherchées et des matrices utilisées.

Un résidu est la trace laissée par l’administration d’une substance chimique à un animal de production. L’absence de résidus dans les denrées alimentaires d'origine animale est le moyen le plus direct d’assurer la sécurité chimique des aliments. Pour les molécules dont l’utilisation est interdite, il est possible de vérifier leur absence chez les animaux de productions par divers prélèvements en élevage ou à l’abattoir dans des matrices biologiques pertinentes telles que le sang, l’urine, les phanères, les fèces, les muscles, la graisse, la rétine… Les résidus de substances anabolisantes sont généralement présents à des concentrations de l’ordre du microgramme au nanogramme par kilogramme de matrice (De Brabander, 2007). Les faibles concentrations de ces résidus associées aux critères d’identification imposés par la commission européenne nécessitent la mise en œuvre de stratégies analytiques de pointe, relevant quasi-systématiquement de l’association de techniques de chromatographie avec la spectrométrie de masse (De Brabander 2007). Ces méthodes analytiques mises en œuvre dans un contexte de sécurité chimique des aliments sont sensiblement les mêmes que celles utilisées au niveau mondial pour le contrôle anti-dopage (Thevis, 2017), elles sont conçues pour répondre à des exigences de spécificité et sensibilité et sont de ce fait particulièrement efficaces lorsque les molécules recherchées sont connues et leur métabolisme propre caractérisé

4.3 Stratégies analytiques non ciblées : recherche d’une signature métabolique globale

La détection ciblée de promoteurs de croissance (produits et métabolites) passe donc essentiellement par le recherche de molécules connues et étudiées plus particulièrement en Europe face à l'interdiction de leur usage. L'accès très facile à présent via Internet à des substances anabolisantes utilisées largement par les sportifs ou les populations non compétitrices comme les bodybuilders ou adolescents en mal de corps d'athlète et de performances physiques, entrainent la circulation, dans un marché noir mondial important, de nouveaux produits au design pharmacologique permettant d'échapper aux contrôles (Dotson, 2007). Il est tout à fait probable que la situation soit la même pour des promoteurs de croissance en élevage. C'est pourquoi, le contrôle analytique ciblé seul ne suffit plus et le développement de stratégies de dépistage d'une utilisation d'anabolisants sans a priori sur le ou les produits utilisés devient nécessaire. Il s'agit de mettre en

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évidence un profil biologique et/ou les marqueurs de la réponse physiologique d'un organisme à l'utilisation d'un anabolisant (Pinel, 2010 ; Nebbia, 2012). En effet, en ce qui concerne la détection de composés inconnus, ou plus largement de manipulations physiologiques frauduleuses, des approches d’exploration globale du fonctionnement de l’organisme ont été investiguées au cours de la dernière décennie et ont d’ores et déjà fait leurs preuves. Ces stratégies ne cherchent pas à identifier directement la présence de molécules suspectées ou de leurs métabolites directs, mais bien à révéler une signature métabolique ou physiologique spécifique pouvant être associée à une pratique anabolisante. Ces approches dites « indirectes » ou « non ciblées » (Pinel, 2010; Nebbia, 2012) reposent sur des méthodes telles la transcriptomique (Riedmaier 2009a ; Riedmaier 2009b ; Riedmaier 2009c ; Riedmaier 2012 ; Riedmaier & Pfaffl, 2013 ; Riedmaier 2015), la protéomique (Cacciatore, 2009; Cunningham, 2009; Kinkead,. 2015) ou la métabolomique (Dervilly-Pinel 2011 ; Kouassi Nzoughet 2015b, Royer, 2017), incluant ses déclinaisons que sont la lipidomique (Kouassi Nzoughet 2015a) et la stéroïdomique (Kaabia 2014) en particulier. Ces nouvelles approches permettent ainsi de découvrir des marqueurs moléculaires d’effets, qui peuvent ensuite faire l’objet d’un suivi spécifique et ciblé dans un contexte de dépistage de pratiques anabolisantes.

Ces évolutions récentes pourraient s’avérer efficaces pour augmenter la pression de contrôle et in fine permettre la détection d’un panel élargi et réaliste de pratiques anabolisantes.

D’un point de vue pratique, le processus conduisant à la détection et à l’identification de biomarqueurs d’exposition ou d’effet débute nécessairement par une expérimentation animale bien calibrée. La puissance statistique doit être raisonnablement ajustée de manière à donner de la robustesse aux signaux détectés dès les premières observations. L'expérimentation est conduite sur deux groupes d’animaux, l’un étant considéré comme témoin, l’autre recevant l’administration de la substance (la posologie et la durée du traitement sont définies sur la base de conditions d’usage pré- supposées).

Puisque ces stratégies non ciblées de recherche de biomarqueurs sont conduites en « aveugle », c'est-à-dire sans a priori sur les molécules d’intérêt, certaines précautions doivent être prises afin de limiter la variabilité expérimentale et favoriser ainsi la détection de l’effet recherche (Royer, 2017). Ainsi il est recommandé que les deux groupes d’animaux possèdent des caractéristiques intrinsèques (races, âge,…) et d’élevage (conditions physiques, alimentation, stress…) – à défaut d’identiques – les plus proches possibles de manière à ne pas entraîner de biais dans l’interprétation des observations, en raison d’un paramètre qui ne serait pas lié à l’administration de la molécule. Les fluides biologiques (sang et urine) des animaux sont prélevés de manière homogène entre individus avant et après administration à pas de temps réguliers. La conservation des échantillons doit être identique du début à la fin de l’expérimentation et entre animaux ; une température de -80°C est requise pour prévenir la dégradation de composés labiles du métabolome. Le processus analytique débute par la préparation des échantillons en se plaçant dans les meilleures conditions de comparabilité. Une normalisation est fréquemment réalisée ; pour illustration, une mesure de la gravité spécifique de chaque échantillon permet par dilution de ramener tous les échantillons à la même valeur. Ensuite, puisque par principe une telle stratégie analytique ne s’appuie pas sur des a priori en termes d’analyse, l’échantillon est amené lorsque possible tel quel à l’analyseur. Une étape de filtration reste toutefois nécessaire pour éliminer les molécules à haut poids moléculaire (> 10 000 Da). On considère qu’une vaste majorité des molécules caractérisées sous le vocable métabolome possède des masses moléculaires inférieures à 1 000 Da. Deux types principaux d’enregistreurs sont utilisés

Chapitre 1 - Revue bibliographique par la communauté ; d’une part la résonance magnétique nucléaire (RMN), d’autre part la spectrométrie de masse très haute résolution. La RMN ne donne en pratique accès qu’à une faible fraction du métabolome, limite due sa relative faible sensibilité (détection possible au-dessus de plusieurs dizaines de microgrammes). La spectrométrie de masse en revanche produira des signaux interprétables jusqu’à quelques centaines de picogrammes, donnant ainsi accès à la plus grande partie du métabolome. N’importe quel spectromètre de masse ne peut pas produire ces empreintes métaboliques ; seuls ceux opérant en très haute résolution (Résolution > 30,000) pourront, par la spécificité du signal produit, donner une information sur la masse exacte des molécules donc leur formule brute. Les spectromètres de masse compétents pour cette opération sont essentiellement les temps de vol (TOF) et les trappes orbitales de type « Orbitrap » ; ils sont le plus souvent couplés à de la chromatographie en phase liquide ou gazeuse. Les empreintes chromato-spectrométriques produites pour chaque échantillon sont extrêmement riches en informations si bien que la comparaison des profils entre échantillons n’est possible que par l’usage d’outils chimio-métriques puissants et dédiés

Un tout premier exemple de suivi de biomarqueurs identifiés via une approche métabolomique est mis en œuvre depuis 2013 en France pour le contrôle officiel (Dervilly-Pinel, 2015). Un modèle statistique dédié à la mise en évidence d’un usage d’une substance dont l’activité pharmacologique est celle d’un β-agoniste par mesure des proportions relatives de 3 marqueurs urinaires a été établi. La modification des proportions relatives des biomarqueurs permet ainsi d’orienter vers une suspicion d’usage de ce type de substance (Dervilly-Pinel, 2015). Il s’agit d’une première mondiale en la matière.

Figure 16 : Modèle métabolomique permettant de prédire le statut, traité ou non traité,d’un animal sur la base de son empreinte urinaire. Analyse multi-variée supervisée de type OPLS (Orthogonal Projections to Latent Structures) et représentation d’un jeu de données combinant animaux traités (en noirs) et témoins (verts). Chaque point représente un animal. Une séparation significative des deux groupes d’animaux est observée sur ce graphique (Dervilly-Pinel, 2017).

Chapitre 1 - Revue bibliographique

La maitrise actuelle de l'approche métabolomique et le succès de son application sur les β-agonistes permettent raisonnablement d'envisager son utilisation pour une autre classe d'anabolisant comme les SARMs.

Les approches analytiques globales basées sur la mise en évidence de l’action physiologique des substances anabolisantes, sont prometteuses et désormais bien maîtrisées par certains laboratoires de recherche. A contrario des stratégies ciblées historiques qui s’intéressent à des marqueurs d’exposition, ces approches sans a priori s’intéressent à des segments plus ou moins larges de la biologie de l’animal avec pour ambition la mise en évidence de biomarqueurs d’effet des substances interdites ; le métabolome est un vivier pour ces indicateurs. Le profilage métabolique peut ainsi couvrir une famille de composés ou une voie métabolique particulière potentiellement impactée par l’usage d’une classe d’anabolisants (comme le stéroïdome par exemple), mais peut être aussi beaucoup moins focalisée en s’intéressant à une fraction plus large du métabolome (par prise d’empreinte) au moins celle que la stratégie analytique retenue permet d’investiguer. Il est évident que les étapes de préparation d’échantillons (normalisation et dilution, filtration, extraction en phase liquide (LLE) ou solide (SPE)), la chromatographie séparative choisie (en phase super critique (SFC) versus gazeuse (GC) ou liquide (LC)) ou non (DART, DESI, ASAP), l’interface d’ionisation retenue (par électronébulisation (ESI), ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI), par impact électronique (EI), ...) tout comme les caractéristiques de l’analyseur (haute résolution, multidimensionnelle) détermineront le type de sub‐metabolome investigué et in fine la nature des biomarqueurs révélés. Cette approche s'appuie aujourd’hui sur un workflow complet et partagé par la communauté scientifique depuis le design de l’expérimentation animale jusqu’à la validation des biomarqueurs.

Conclusion

En Europe, la recherche d'une exposition des animaux de production à un produit anabolisant est réglementée et cadrée, de la définition des substances cibles en passant par l'échantillonnage jusqu’aux méthodes officielles à employer. Cette recherche repose sur la détection des résidus dans les produits d'origine animale avec des techniques analytiques ciblées dirigées vers des composés anabolisants connus (historiques pour certains comme la testostérone) et suivis dans leurs évolutions lorsqu'ils sont utilisés illégalement (modification des structures chimiques, adaptation à des voies d'administration nouvelles, dosages diminués en cocktails synergiques avec d'autres composés). Les SARMs rentrent dans la catégorie des substances anabolisantes émergentes potentiellement utilisables en production animale et l'actualité dans le monde sportif et aux Etats-Unis où les promoteurs de croissance sont autorisés, montrent qu'il est urgent de s'intéresser à ces composés.

La revue bibliographique réalisée dans le cadre de ce travail de doctorat permet de disposer d'élément à la fois sur les caractéristiques et propriétés des SARMs, comparés aux stéroïdes androgènes desquels ils se rapprochent, permettant d'appréhender et d'anticiper les possibilités offertes pour réaliser la détection de tels composés et devancer la fraude. En particulier et en parallèle des approches ciblées performantes mais pour lesquelles des limitations ont ici été

Chapitre 1 - Revue bibliographique présentées, il nous a semblé nécessaire de faire le point sur des stratégies alternatives et innovantes, raison pour laquelle un focus a été mis sur les stratégies analytiques non ciblées :

. la zootechnie, vue sous un aspect "conformation", comme un sportif ayant tellement changé de morphologie qu'on le soupçonne d'être dopé. Cette approche non ciblée est orientée sur la physiologie et la connaissance des modifications corporelles visibles attribuables à l'administration d'anabolisants. Une telle approche n’est pour le moment pas mise en œuvre dans un contexte de dépistage officiel. . la métabolomique, qui à travers la génération d’empreintes métaboliques non ciblées, permet la mise en évidence de profils discriminants d’animaux traités versus non traités et la mise en avant de biomarqueurs d’effet associés. Considérés comme des biomarqueurs de pratiques anabolisantes, ces composés peuvent ensuite être « mis en musique » dans des modèles statistiques permettant de prédire le statut d’un animal.

Cette revue bibliographique a principalement mis en lumière l'étendue des domaines impliqués (les produits, les pratiques, la réglementation), la complémentarité et la diversité des approches analytiques (ciblées et non ciblées) et la transdisciplinarité nécessaire (de la chimie analytique à la biologie en passant par les statistiques adaptées) pour appréhender la mise en évidence de l'utilisation frauduleuse des promoteurs de croissance en élevage.

L'ensemble des informations disponibles recueillies au cours de notre recherche bibliographique a apporté les supports nécessaires à l'élaboration des axes de travail de cette thèse. Le travail de doctorat consistant à répondre à la question de recherche « quelle(s) signature(s) pertinente(s) pour la mise en évidence de l’utilisation de SARMs chez le jeune bovin ? » a pu alors être décliné en trois grands axes suivants :

. Connaitre les SARMs, leur originalité et leurs caractéristiques structurale et fonctionnelle pour appréhender leur éventuelle utilisation en tant que promoteur de croissance en élevage.

. Proposer une stratégie analytique de détection ciblée de l'enobosarm et de ses métabolites basée sur les techniques de chromatographie (LC) couplée à la spectrométrie de masse (MS/MS), cœur de métier du LABERCA.

. Développer des stratégies analytiques non ciblées de détection de pratiques anabolisantes, basées sur la mesure de paramètres zootechniques de croissance d'une part et sur la métabolomique en mode LC-HRMS d'autre part, approche innovante et avant-gardiste développée par le LABERCA.

CHAPITRE 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Objectif

Il s'agit d’une part de développer une stratégie analytique ciblée permettant d’analyser l'enobosarm et ses principaux métabolites pour en dresser une signature analytique, et d’autre part de déterminer les caractéristiques d'élimination de ces composés (cinétique d'excrétion et fenêtre de détection) dans une matrice classique, l'urine, et une matrice plus originale, les fèces, telles que potentiellement utilisables dans un cadre de surveillance de l’utilisation des promoteurs de croissance en élevage.

Introduction

Plusieurs études disponibles se sont proposées d’analyser le devenir pharmacocinétique des SARMs et principalement celui des aryl-propionamides. La majorité d’entre elles ont utilisé le rat comme modèle animal. Comme précédemment présenté dans la revue bibliographie, avec un Tmax de 4h (temps nécessaire pour atteindre le pic plasmatique de concentration maximale) et un coefficient de biodisponibilité F de 100%, l'enobosarm est rapidement résorbé suite à une administration orale de 100 mg/kg chez le rat, (Kim, 2013). Par ailleurs, la biodisponibilité orale des SARMs semble constante quelle que soit la dose administrée (Wu, 2006). Les SARMs ont fait l’objet de peu d’études de leur distribution au sein de l’organisme. Les seules données actuellement disponibles, réalisées avec des composés radio-marqués chez le rat, montrent qu’ils ne semblent pas se répartir de façon prédominante au sein des tissus riches en récepteurs androgènes, mais ont plutôt une distribution étendue à tout l’organisme (Yang, 2010 ; Kim, 2013). Pour l'enobosarm, après administration orale, l’absorption gastro-intestinale est rapide ; des concentrations plasmatiques significatives sont retrouvées dans le plasma dès les 15 premières minutes et atteignent une concentration maximale 4h post-administration. Aussi, les concentrations tissulaires maximales d'enobosarm sont atteintes dans l’heure suivant une administration intraveineuse et entre 4 et 8 heures après administration orale Les concentrations les plus importantes ont été décrites dans les tissus des systèmes liés à l’alimentation, à l’excrétion et au métabolisme, ainsi que dans les tissus du système endocrine (Kim, 2005, 2013). Les biotransformations, ou métabolisme, sont les réactions chimiques modifiant la structure des composés pour les convertir en métabolites facilement éliminables. Si ces réactions peuvent intervenir dans de nombreux tissus, elles se produisent très souvent de façon majoritaire dans le foie. Elles peuvent être regroupées en réaction de phase I, ou réactions de dégradation (oxydations, réductions, hydrolyses), et en réactions de phase II, ou réactions de conjugaison (glucurono-conjugaison par exemple). Les études réalisées sur les biotransformations des SARMs mettent en évidence une forte métabolisation de ces composés. Les dérivés des aryl-propionamides, font l’objet de nombreuses réactions aussi bien de phase I que de phase II. Parmi les réactions de dégradation, l’hydroxylation du cycle B et l’hydrolyse de la liaison amide sont les plus fréquentes chez le rat. Concernant les réactions de conjugaison, les dérivés des aryl-propionamides subissent souvent des réactions de sulfo-conjugaison et de glucurono-conjugaison ; les études montrent que les dérivés des aryle-propionamides subissent ces biotransformations de façon similaire chez le rat (Wu, 2006 ; Yang, 2010 ; Kim, 2013), le cheval (Hansson, 2015) et le veau (de Rijke, 2013), et avec quelques variations chez l’Homme (présence d'un conjugué hydrolysé de phase I dans l'urine humaine) (Thevis, 2011). Enfin l’élimination d’un composé exogène peut être appréciée par l’évaluation de la demi-vie d’élimination, ou demi-vie plasmatique (t1/2), correspondant au temps

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm nécessaire pour que la concentration plasmatique de ce composé décroisse de moitié. Avec des demi-vies variant de 4 à 20 heures, les SARMs, et plus particulièrement les analogues des aryl- propionamides, sont rapidement éliminés de l’organisme chez le rat, sauf cas particulier de l’étude pharmacocinétique du composé S-1 réalisée par Wu (2006) avec des valeurs de 9 à 13 jours. Ces valeurs ne sont par ailleurs pas ou peu influencées par la voie d’administration, orale ou intraveineuse, du composé (Chen, 2005b, Kim, 2005 ; Wu, 2006). L’unique étude ayant permis d’objectiver les proportions d’excrétion urinaire et fécale montre que l’enobosarm est très majoritairement excrété dans les fèces du rat : environ 70% de la dose administrée serait retrouvés dans les fèces, contre un peu plus de 20% dans les urines. De surcroit, plus de 50% de la dose administrée seraient éliminés dans les fèces et l’urine dans les 24h suivant l’administration, et plus de 75% le seraient dans les 48h post-administration (Kim, 2013). En supposant que l’élimination de l’enobosarm chez le rat est transposable à celle survenant chez le veau, nous pouvons dès lors émettre l’hypothèse que les concentrations fécales seront au minimum trois fois supérieures à celles des urines chez le jeune bovin. Il existe par ailleurs un décalage de temps entre l’élimination biliaire d’un xénobiotique et sa présence dans les fèces. Ce temps correspond au temps de transit intestinal depuis le canal cholédoque jusqu’au rectum, qui est d’environ 18 h chez les bovins (Morrow, 2002). Ainsi nous pouvons supposer que des concentrations fécales d'enobosarm comprises entre 0 µg/kg et 100 µg/kg dès 18 h après administration (ce qui correspond au délai de transit intestinal), et au minimum jusqu’à sept jours post-administration, pourront être observées.

Comme le développement des SARMs est récent, les études pour en dresser la signature analytique sont encore peu nombreuses. Chez l'homme, la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) a été mise en œuvre pour mettre en évidence l'enobosarm, ses métabolites glucurono-conjugués de phase II et un métabolite hydroxylé de phase I dans l'urine après une administration orale (Thevis, 2011). La même stratégie analytique LC-MS/MS a été employée pour étudier l'élimination de l'enobosarm dans les urines d'espèces animales. Ainsi, sept métabolites ont été identifiés chez le cheval (glucurono- et sulfo-conjugués de phase II) permettant de les utiliser comme marqueurs spécifiques d’exposition à des fins de contrôle anti- dopage chez le cheval (Hansson, 2015). Egalement, dans l'éventualité d'une utilisation de l'enobosarm comme agent anabolisant chez les animaux de production, de Rijke et ses collaborateurs (2013) ont identifié ses mêmes métabolites de phase II (glucurono- et sulfo- conjugués) dans l'urine de veau. Au cours de cette dernière étude à partir d'une administration d'une forte dose unique d'enobosarm (200 mg), de Rijke propose une cinétique d'élimination urinaire de l'enobosarm mettant en évidence une excrétion de la molécule avec un pic de concentration (40 µg/L) 24 heures post-administration suivi d'une décroissance jusqu'à ne plus détecter de résidu à 6 jours post-administration.

La pharmacocinétique des SARMs et de l'enobosarm en particulier, principalement étudiée chez le rat, laisse donc la voie à la recherche directe de l'enobosarm et de ses métabolites plutôt de phase II dans les urines mais aussi potentiellement dans les fèces. De par l'avantage principal qu'est la facilité d'obtention des matières fécales, et au vu du profil d’excrétion plus importante d’enobosarm dans les fèces que dans les urines chez le rat, la détection de cette molécule dans les fèces de bovins peut être envisagée. Les techniques analytiques à développer et mettre en œuvre pour identifier l'enobosarm et ses métabolites peuvent s'appuyer sur celles décrites dans le cadre du contrôle anti- dopage humain ou équin et de la seule étude concernant le veau (de Rijke, 2013).

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Notre travail s'inscrit dans ce contexte et propose de décrire la signature analytique directement imputable à l’administration quotidienne d’enobosarm par voie orale (2,38 mg) durant 21 jours via la démarche exposée ci-après. Dans le cadre d’un design expérimental classique (administration unique d'une très forte dose per os de 200 mg d'enobosarm) mais surtout dans le cadre d’un design expérimental se rapprochant des conditions d'une possible utilisation (frauduleuse) en élevage en tant que promoteur de croissance (administration quotidienne à raison de 1 ppm dans l’aliment), il s’agira :

- de détecter, par une méthode analytique basée sur la chromatographie en phase liquide ultra haute performance (UHPLC) couplée à la spectrométrie en tandem (MS/MS), l'enobosarm dans la matrice urine, traditionnellement utilisée dans le contrôle des promoteurs de croissance, afin d'établir des seuils et fenêtres de détection mais également de détecter avec les mêmes techniques, l'enobosarm dans une matrice plus originale, les fèces, facilement accessible chez les bovins, en contexte d'élevage.

- d'investiguer le métabolisme de l’enobosarm chez le jeune bovin afin de déterminer les principaux métabolites formés (de phases I et II).

- d'identifier les principaux métabolites de l'enobosarm dans l'urine et les fèces, deux voies d'élimination complémentaires, afin de les utiliser comme marqueurs d'une administration frauduleuse.

Expérimentation

L'ensemble de la phase expérimentale s'est déroulé au CRIP (Centre de Recherche et d'Investigation Préclinique) à Oniris (Ecole Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l'Alimentation Nantes- Atlantique). Le protocole expérimental a été enregistré et approuvé par les instances françaises (Autorisation d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques n°02323.01, conformément aux dispositions de l'article R. 214-124 et R. 214-125 du Code Rural).

Douze veaux mâles entier Prim'Holstein ont été achetés à Ter'Elevage (Union de coopérative assurant la commercialisation d'animaux de production) et élevés durant 25 jours au sein des bâtiments d'élevage du CRIP avec une période d'acclimatation de 4 jours (Figure 17). Dans le cadre de cette étude, ces animaux ont reçu une alimentation (fourrage à volonté, concentré en quantité rationnée, eau) classiques des systèmes de production de veaux sevrés destinés à l'abattage à 3 mois d'âge tel que proposé par Ter'Elevage. A l’issue de la période d’acclimatation, une partie (n= 5) des animaux a reçu une administration quotidienne d'enobosarm (2,38 mg/jour/animal durant 21 jours), nommé également SARM S-22 ou MK-286, de structure chimique (2S)-3-(4-Cyanophénoxy)-N-[4- cyano-3-(trifluorométhyl)phényl]-2-hydroxy-2-méthylpropionamide (IUPAC), présentant la formule brute suivante C19H14F3N3O3 et une masse moléculaire (Mw) de 389 g/mol et développé par GTx, Inc. (GTx Inc. http://www.gtxinc.com/science/selective-androgen-receptor-modulator-sarm/sarms-in- muscle-diseases/) sous le nom d'Ostarine® (GTx-024). Il s’agit du SARMs étudié dans le cadre de cette thèse en tant qu'agent anabolisant (Figure 18). Au cours de l’expérimentation et pour les besoins des autres phases de ce travail de thèse, les matrices suivantes ont été collectées : urine, fèces, sang, poils, muscle fessier. L'ensemble des prélèvements réalisés constitue ainsi une banque de données

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm importante et complète permettant d'étudier l'enobosarm, sa présence dans l'organisme des veaux, son métabolisme, son élimination mais aussi de pouvoir associer les données issues des analyses sur ces différentes matrices afin de mieux caractériser l'effet global de l'enobosarm (Figure 19).

Figure 17 : Illustrations relatives à la mise en œuvre de l’expérimentation. Logement des veaux et système d'alimentation.

Figure 18 : Structure chimique de l’enobosarm [(2S)-3-(4-Cyanophénoxy)-N-[4-cyano-3- (trifluorométhyl)phényl]-2-hydroxy-2-méthyl-propionamide (IUPAC)].

Figure 19 : Calendrier de prélèvement des échantillons.

Mise en œuvre

Dans les objectifs de cette partie de l'étude figurent (i) l'étude du métabolisme de l'enobosarm et (ii) l'identification de marqueurs d'une utilisation frauduleuse de ce composé. C'est pourquoi dans le premier cas, un veau a reçu une très forte dose de 200 mg d'enobosarm en prise unique, de façon à être certain de pouvoir détecter, en concentration suffisante, le composé mais aussi un large panel de métabolites en vue de les identifier. Dans le second cas, cinq animaux ont reçu la dose

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm quotidienne de 2,38 mg d'enobosarm correspondant à un apport théorique de 1 ppm dans l'aliment comme cela pourrait être "proposé" en tant que promoteur de croissance (confère la bibliographie et le brevet américain de Dalton (2016)). Les animaux étaient suivis quotidiennement ; lors des examens cliniques, des échantillons d'urine et de fèces ont été collectés sur miction et défécation spontanée à J-3, J-2, J-1 (3 jours avant administration), J0, J0+3h, J0+5h (jour de l'administration de l'enobosarm), J1, J2, J4, J3, J5, J6, J7, J9, J11, J14, J18, J21 (jours post-administration). Puis ils ont été stockés à -20°C jusqu'à la préparation en vue de leur analyse.

1- Optimisation d'un protocole de préparation et d’analyse de la matrice urine

Le protocole de préparation de l'urine s'est appuyé sur les préparations décrites pour l'enobosarm dans les travaux de Thevis (2011) chez l'homme, Kim (2013) chez le rat et de Rijke (2013) pour le veau. Dans la littérature, les conditions de préparation des échantillons dédiées aux SARMs font en général appel à une technique d’extraction liquide-liquide (LLE) ou sur cartouche en phase solide (SPE), précédée ou non d’une étape de déconjugaison par hydrolyse enzymatique. En effet, notre travail comportant une étude des cinétiques d’élimination de l’enobosarm et une étude de son métabolisme, il était important de pouvoir analyser les résidus libres comme les résidus conjugués.

En Figure 20 sont présentés les protocoles finaux de l'étape d'optimisation de la préparation de l'urine et le protocole retenu basé sur une étape d'extraction en SPE de type Oasis HLB (copolymère hydrophile-lipophile permettant une séparation en phase inverse) est encadré en rouge sur la même Figure 20. La comparaison des intensités des signaux obtenus après LLE et SPE sur les mêmes échantillons injectés le même jour a permis de mettre en évidence un signal plus intense après SPE. De surcroit, une plus grande robustesse de la technique d’extraction a été obtenue en SPE plutôt qu’en LLE. C’est donc le protocole SPE qui a été retenu pour la préparation des échantillons en vue d'une analyse par RPLC-(ESI-)-MS/MS. Les détails relatifs aux conditions chromatographiques et spectrométriques sont indiqués en Figure 21 et Tableau VIII.

Figure 20 : Protocole de préparation des échantillons d'urine pour la détection de l'enobosarm.

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Figure 21 : Conditions chromatographiques mises en œuvre.

Tableau VIII : Conditions d’acquisition des signaux (mode d’ionisation ESI NEG).

Composé Masse Ion Ions Tension de Energie de molaire(g/mol) précurseur(m/z) produits(m/z) cône(V) collision (eV)

Enobosarm 389,3 388,2 118,0 30 18

269,0 30 18

185,0 30 38

Bicalutamide d4 434,4 433,2 255,1 30 14

185,0 30 40

177,0 30 20

2- Elaboration d'un protocole de préparation de la matrice fèces

Le protocole de préparation des fèces s'est appuyé sur les préparations décrites pour d'autres SARMs chez le rat (Yin, 2003 ; Perera, 2006 ; Yang 2010), chez le chien (Perera, 2006), chez l'homme (Yi, 2012) et plus particulièrement pour l'enobosarm chez le rat (Kim, 2013). Les différentes étapes de ces protocoles ne montrent pas de différence majeure entre elles et les conditions de préparation des échantillons font appel aux techniques classiques d’extraction liquide-liquide (LLE) ou phase solide (SPE). Il est à noter dans la bibliographie, l’absence de phase de purification par extraction sur phase solide ou liquide-liquide dans certains protocoles, parfois remplacée par une simple filtration. Le solvant utilisé pour l’extraction est le plus souvent le méthanol. On notera que le seul protocole disponible relatif à l’extraction de l’enobosarm à partir des fèces utilise un autre solvant, l'acétonitrile (Kim, 2013). Cependant, il ne semble pas lui être spécifique puisqu’un autre SARM (LY2452473) est extrait avec ce même solvant (Yi, 2012). Il est à remarquer aussi que l'étape d'hydrolyse n'est pas décrite dans les protocoles d'extraction des SARMs dans les fèces contrairement à la préparation de l'urine. L'étape de déconjugaison par hydrolyse enzymatique est

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm en revanche décrite dans un protocole d'extraction de stéroïdes anabolisants dans les fèces de veau (Sangiorni, 2005).

En Figure 22 est présenté le protocole final issu de l'optimisation de la préparation des fèces. Après une première étape d’extraction solide-liquide, le protocole implique une purification réalisée par extraction liquide-liquide (LLE) suivie d’une extraction sur phase solide (SPE). Comparativement à la préparation des urines, les étapes de préparation des échantillons de fèces de bovins sont plus nombreuses ce qui peut s’expliquer par la nécessité d’éliminer de nombreux composés très variés pouvant encrasser les systèmes d’analyse et perturber la détection. L’augmentation du nombre d’étapes de purification a logiquement été à l’origine de la diminution de la récupération des analytes d’intérêts.

Figure 22 : Protocole de préparation des échantillons de fèces pour la détection de l'enobosarm.

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

La séparation et la détection des composés cibles ont été réalisées par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem, en utilisant le mode d’ionisation ESI- tel que décrit au paragraphe précédent (Figure 21 et Tableau VIII).

Les exigences en termes d’identification et de quantification des composés ont été respectées via l’utilisation d’un étalon interne marqué, le bicalutamide d4 et sont conformes aux recommandations de la Décision 2002/657/EC.

L'optimisation de la préparation des échantillons était un préalable indispensable avant l'analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem d'autant plus pour les fèces, matrice peut exploitée jusqu’alors au sein du LABERCA.

Résultats

1- Matrice urine

1.1- Cinétique d’élimination

La mise en œuvre du protocole de préparation des urines a permis d’étudier l’élimination de l’enobosarm, sous ses formes libre et totale (i.e. somme des formes libres et déconjuguées). Les deux cinétiques d’élimination, avec ou sans hydrolyse enzymatique (Figure 23) présentent un profil proche, avec un accroissement abrupt de la quantité d’enobosarm dans les urines au cours des premières heures (entre 3 et 24h) après l’administration suivi d’un appauvrissement rapide de ces mêmes urines en 4-6 jours (entre J1 et J5-J7).

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Malgré une diminution notable de la concentration d’enobosarm dans la matrice urinaire durant la première semaine suivant l’administration, la molécule reste tout de même détectable jusqu'à J9 (traces jusqu’à J21 mais identification incertaine selon les critères de la Décision 2002/657/CE) lorsque les échantillons ont subi une hydrolyse enzymatique. Tel n’est pas le cas pour les échantillons analysés sans hydrolyse, pour lesquels le composé n’est plus détecté dès J6. Les échantillons ayant subi une hydrolyse et ceux pour lesquels ce n’est pas le cas atteignent des concentrations maximales en enobosarm à des heures différentes (38,20 µg/L à J0+5h sans hydrolyse contre 155 µg/L à J1 avec déconjugaison). La concentration en enobosarm dans les échantillons ayant subi une étape d’hydrolyse reflète la quantité totale d’enobosarm (i.e. enobosarm libre et enobosarm conjugué). Il est donc tout à fait attendu que cette concentration soit supérieure et également qu’un léger décalage dû à la métabolisation soit observé. La comparaison des courbes de cinétiques d’élimination de l’enobosarm avec et sans hydrolyse permet donc d’établir la présence dans l’urine de ce veau d’un nombre important de formes conjuguées de la molécule. La concentration en enobosarm est environ quatre fois supérieure après hydrolyse (formes totales).

Nos résultats sont similaires à ceux décrits dans la littérature. Au cours de son étude suite à une administration d'une forte dose unique d'enobosarm (200 mg per os), de Rijke (2013) propose une cinétique d'élimination urinaire de l'enobosarm mettant en évidence une excrétion de la molécule avec un pic de concentration (40 µg/L) 24 heures post-administration suivi d'une décroissance jusqu'à ne plus détecter de résidu à 6 jours post-administration.

Les urines des veaux ayant reçu une faible dose quotidienne d’enobosarm pendant 21 jours présentent exactement les mêmes profils d’excrétion avec hydrolyse et sans hydrolyse (Figure 24), tout en observant des concentrations moindres en cohérence avec les doses d’exposition employées.

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Avec hydrolyse, la concentration en enobosarm dans les urines commence par croître de manière relativement abrupte dans les premières heures et les premiers jours de l’expérimentation (entre J0 et J2-J3) avant de diminuer légèrement (entre J2-J3 et J7) pour atteindre un pallier à 1,7 µg/L environ (entre J7 et J21). Sans hydrolyse ce phénomène est moins important (le plateau étant atteint assez rapidement), la quantité d’enobosarm retrouvée dans les urines étant croissante dans les heures suivant la première administration, entre J0 et J0+5h, heure à partir de laquelle elle atteint un plateau à 0,7 µg/L environ.

De même que précédemment observé dans les urines du veau ayant reçu 200 mg d’enobosarm, de nombreuses formes conjuguées de la molécule d’enobosarm ont été révélées par l’hydrolyse enzymatique, preuve d’un métabolisme important du composé. En effet, la concentration en enobosarm dans les échantillons est environ deux fois plus élevée après hydrolyse.

1.2-Métabolisme

A l’issue de cette étape de caractérisation de l’élimination du résidu d’enobosarm et la mise en évidence d’une forte métabolisation, il s’est agi d’étudier plus finement ces métabolites. Dans ce contexte, les urines ont été préparées sans étape d’hydrolyse enzymatique et analysées d’une part en mode full scan, d’autre part en mode SRM (Single Reaction Monitoring) sur la base d’hypothèses de structures des métabolites décrits dans la littérature (Thevis, 2011 ; De Rijke, 2013). Les chromatogrammes d’ions correspondants sont présentés en Figure 25. Les hypothèses émises quant à la nature des métabolites (phase I et II) ont alors pu être vérifiées.

Pour les 3 pics répondant au rapport m/z = 404, témoin d’une hydroxylation de l’enobosarm, il pourrait s’agir de trois isomères de position : il y aurait donc trois sites de fixation possibles pour un groupement hydroxyle sur la molécule d’enobosarm. A ce jour, dans la littérature seule ne sont décrits que deux isomères hydroxylés (Thevis, 2011) ; en l’absence de composés de référence, il n’est à ce stade pas possible de conclure définitivement quant à ces 3 isomères hydroxylés. De même, trois pics ont été repérés pour le rapport m/z = 580, pouvant indiquer ici encore trois isomères de position et donc trois sites possibles pour une hydroxylation et une glucurono-conjugaison sur la molécule d’enobosarm. Dans la publication citée ci-dessus, trois isomères de masse 580 ont également été décrits, confirmant ici nos observations chez le bovin. Alors que Thevis (2011) avait décrit deux isomères pour la masse 484, nous n’avons dans notre étude pu mettre en évidence qu’une seule de ces deux possibles formes de ce métabolite (oxydation et sulfo-conjugaison). Pour le pic correspondant à la transition 301 > 257, des signaux intenses sont présents dans les urines exemptes de toute trace d’enobosarm, et le profil est atypique au cours de la cinétique puisque le signal décroit entre J-2 et J0+5h avant d’augmenter fortement entre J0+5h et J3-J7 puis de décroitre progressivement (le signal est encore relativement important à J21). Le comportement de cet ion serait à investiguer mais il est peu probable qu’il s’agisse d’un métabolite de l’enobosarm.

Par comparaison avec les travaux de de Rijke (2013), dont l’étude in vitro (fraction S9 de foie de bovin) et in vivo (un veau ayant reçu une dose unique de 200 mg d’enobosarm) avait permis l’identification de certains métabolites de l’enobosarm chez le bovin (m/z = 201 in vitro, et m/z = 287,

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301, 404, 484, 564 et 580 in vitro et in vivo), le métabolite de masse 201 semblerait être présent dans les échantillons de notre étude. De plus de Rijke n’avait fait état d’aucun isomère alors qu’ici il semblerait que la réaction d’hydroxylation conduisant aux ions de masse 404 et 580 puisse se produire en différents points de la molécule d’enobosarm.

A la fin de cette étape, l’identification des métabolites reste à confirmer, soit par la procuration puis l’analyse des standards analytiques correspondants, la fragmentation plus importante des composés (afin d’obtenir davantage de détails structurels) et/ou par l’analyse des échantillons urinaires en spectrométrie de masse haute résolution (HRMS). L’identité des ions m/z = 564 et 580 est cependant relativement certaine de par la corrélation des résultats des trois approches et notamment grâce au mode Neutral Loss (suivi spécifique de la perte de neutre correspondant au groupement glucuronide).

En termes de cinétique, tous les métabolites présumés présentent un profil similaire, avec un accroissement rapide de la quantité de métabolite supposé dans l’urine dès les premières heures suivant l’administration. Et en termes de fenêtres de détection, les métabolites potentiellement identifiés sont pour la plupart détectables jusqu'à 5 voire 7 jours post-administration.

L'étude du métabolisme de l’enobosarm a mis en évidence des réactions (parfois combinées) de O- déphénylation, d’oxydation, d’hydrolyse et d'hydroxylation d’une part (métabolisme de phase I), et des réactions de sulfo- et de glucurono-conjugaisons d’autre part (métabolisme de phase II). En comparaison avec les données disponibles dans la bibliographie, il s’avère que le métabolisme du bovin est assez similaire à celui décrit chez humain, la différence se portant sur la production de d'avantage de métabolites glucurono-conjugués chez l'homme.

La cinétique d'élimination urinaire (Figure 24) obtenue au cours de la partie expérimentale pouvant se rapprocher d'une utilisation de l'enobosarm comme promoteur de croissance sur des veaux en fin d'engraissement, donne des indications importantes : (i) même si l'excrétion est faible, la concentration plateau de l'enobosarm est non négligeable et continue (1,7 µg/L avec hydrolyse et 0,7 µg/L sans hydrolyse), (ii) six métabolites de l'enobosarm ont été identifiés pouvant être suivi de la même manière sur une cinétique d'élimination et devenir des marqueurs de l'administration de l'enobosarm. La stratégie analytique proposée dans ce travail et les résultats observés permettent donc de décrire une signature analytique spécifique, parfaitement adaptée à la mise en évidence d’un anabolisant émergent dans l’urine.

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Figure 25 : Chromatogrammes d’ions acquis en modes Full-scan et SRM des principaux métabolites de l'enobosarm détectés dans l’échantillon d’urine non hydrolysé prélevé à J0+3h (transitions majoritaires).

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2- Matrice fèces

2.1- Cinétique d'élimination

La mise en œuvre du protocole de préparation des fèces développé précédemment a permis d’étudier l’élimination fécale de l’enobosarm. Dans le cadre d’une administration per os de 200 mg d’enobosarm, le composé est identifiable et quantifiable dans les fèces sur l’ensemble des 21 jours de l’expérimentation (Figure 26a).

Figure 26 : Excrétion de l'enobosarm dans les fèces de bovin. Cinétique d'élimination fécale chez un veau ayant reçu une forte dose unique d'enobosarm par voie orale à J0 (200 mg/animal) b) Cinétique d'élimination fécale chez un veau ayant reçu une dose quotidienne d'enobosarm par voie orale à J0 (2,38 mg/animal/jour durant 21 jours).

Les concentrations observées sont très élevées et varient de l’ordre de 20 ng/g à 50 000 ng/g et permettant une détection aisée et une identification non ambiguë (critères Décision 2002/657/EC) du résidu dans tous les échantillons collectés post administration. La faible différence entre les concentrations des échantillons hydrolysés et non hydrolysés ne nous permet pas de conclure quant à la présence de métabolites conjugués de l’enobosarm dans les fèces.

Dans le cadre d’une administration per os quotidienne de 2,38 mg d’enobosarm, le composé est également identifiable et quantifiable dans les fèces sur l’ensemble des 21 jours de l’expérimentation (Figure 26b).

La concentration fécale d’enobosarm augmente les trois premiers jours jusqu’à atteindre 1800 ng/g puis se stabilise dès J4 à un plateau d’environ 1200 ng/g, attestant d’une excrétion privilégiée de l’enobosarm via cette matrice. La faible différence entre les concentrations des échantillons hydrolysés et non hydrolysés ne nous permet pas de conclure quant à la présence de métabolites conjugués de l’enobosarm dans les fèces.

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

2.2- Métabolisme

L’hydrolyse enzymatique n’a pas mis en évidence la présence de formes conjuguées de l’enobosarm dans les fèces pour le veau traité oralement avec une forte dose ni pour les veaux traités quotidiennement par voie orale avec une faible dose. L’absence de mise en évidence de formes conjuguées de l’enobosarm par hydrolyse enzymatique, laisse supposer que ce composé est principalement excrété sous sa forme libre dans les fèces de veau. Cette tendance à l’absence d’augmentation de la concentration fécale d’enobosarm après hydrolyse enzymatique diffère des résultats obtenus sur l’urine de ces mêmes animaux. Chez les bovins, aucune donnée n’est disponible sur l’excrétion fécale des SARMS et de leurs métabolites. Les résultats portant sur l’élimination fécale des stéroïdes semblent confirmer le fait qu’il n’est pas possible de retrouver de grande quantité de composés conjugués dans les fèces. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus chez le rat, pour qui l’enobosarm est retrouvé entre 75 % et 100 % sous sa forme libre dans les fèces après administration orale (Kim, 2013). Autres exemples, une étude a mis en évidence l’absence de boldénone (stéroïde anabolisant) conjuguée dans des bouses séchées comparativement aux résidus retrouvés dans l’urine de ces mêmes bovins (Nielen, 2004) ; une autre étude a montré l’absence de trenbolone (stéroïde anabolisant) conjuguée dans des fèces de bœufs (Blackwell, 2014). Ces études sont en accord avec le postulat selon lequel l’ensemble des stéroïdes conjugués potentiellement excrétés dans les fèces sont hydrolysés par les bactéries intestinales (Van Puymbroeck, 1998). Toutefois, les SARMs ne sont pas tous éliminés majoritairement sous forme libre dans les fèces, ainsi, le composé LY2452473 n’est retrouvé qu’en faible quantité (2 % de la dose administrée) sous sa forme libre dans les fèces d’homme (Yi, 2012). Certains SARMs, peuvent également être détectés sous forme glucurono- conjuguée, comme le composé S-1 dans les fèces de rat (Wu, 2006). Le bicalutamide est excrété par voie biliaire sous forme conjuguée puis déconjuguée par les bactéries intestinales chez le rat, le chien (Boyle, 1993) et le veau (Rojas, 2016).

En comparaison des six métabolites de phase I et II de l'enobosarm mis en évidence dans l’urine des bovins, la recherche ciblée de métabolites dans les fèces a toutefois permis de mettre en évidence quatre métabolites potentiels. Parmi ces métabolites potentiels, aucun d’eux n’est l’enobosarm sous forme conjuguée, en accord avec les observations reportées ci-dessus. Trois d'entre eux seraient des métabolites de phase I : un serait issu d’une oxydation de l’enobosarm (m/z 301), et deux autres seraient deux isomères issus d’une hydroxylation de l’enobosarm. Un seul métabolite serait de phase II et issu d’une hydroxylation suivie d’une sulfo-conjugaison de l’enobosarm. L’absence de composés conjugués de l’enobosarm par rapport à l’urine est en adéquation avec l’absence d’impact de l’hydrolyse sur les concentrations fécales d’enobosarm. Etant donné qu’à l'heure actuelle, il n’existe pas de solutions standards de métabolites purifiés, il ne nous est pas possible de les identifier avec certitude ni de les quantifier dans les échantillons de fèces. Dans le cadre des protocoles utilisés lors de cette expérimentation, l’hydrolyse enzymatique des échantillons ne permet pas non plus d’augmenter la quantité d’enobosarm détecté dans les fèces, ce qui pourrait éventuellement permettre une fenêtre de détection allongée.

La stratégie analytique proposée dans ce travail et les résultats observés permettent donc de décrire une signature fécale spécifique, parfaitement adaptée à la mise en évidence d’un anabolisant émergent.

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm

Au vu des résultats analytiques probants, conjointement obtenus sur l'urine et les matières fécales, l'intérêt des fèces comme matrice support du contrôle de l’usage de promoteurs de croissance de type SARMs apparait comme évident, d’autant plus si l’on considère les aspects de praticité de prélèvement.

. La facilité de collecte est en effet l'atout majeur de cette matrice (Van Puymbroeck, 1998). Le prélèvement sur défécation spontanée ne nécessite aucune compétence médicale ou technique. Le prélèvement est abordable directement auprès des animaux (non traumatisant) en bonne condition de sécurité (contention simple), par les professionnels du milieu rural (éleveur, technicien mandaté des services vétérinaires, etc.) et dans les règles déjà connues et réglementées permettant l'acheminement, la traçabilité et la sécurité sanitaire relatives à la manipulation des échantillons biologique. . Ensuite la pertinence de son utilisation par rapport à l'urine se fait sur certaines caractéristiques "physiologique" liées à l'excrétion. Lors d'un prélèvement d’urine sur miction spontanée (ou volontaire), une contamination fécale est toujours possible et peut être à l’origine de résultats de type faux positif comme déjà observé pour la détection de certains stéroïdes (Pompa, 2006 ; Arioli, 2008). . Un autre avantage de la matrice fèces est l’atténuation des variations journalières d’excrétion de divers métabolites. L’excrétion plus lente des fèces par rapport à l’urine permet d’obtenir des renseignements sur une excrétion moyenne d’une période donnée et non pas sur une excrétion ponctuelle (Weltring, 2012). . Enfin il existe des molécules qui permettent de masquer certains produits dopants dans les urines. Les diurétiques sont des molécules qui augmentent la quantité d’urine émise en augmentant l’excrétion de certains ions comme le sodium ou les chlorures. Ces produits ont la capacité de masquer certains produits présents dans les urines par effet de dilution ou par modification du pH urinaire. Cette dernière action peut inhiber l’excrétion passive de composés acides, en acidifiant les urines, et inversement pour les substances basiques (Morra, 2006 ; Cadwallader, 2010). Il existe actuellement plusieurs classes de diurétiques, dont certaines sont autorisées pour le traitement de certaines maladies chez les veaux (furosémide, spironolactone). A contrario, il n'existe pas de molécules permettant de diluer les fèces.

Conclusion

Les profils d’élimination fécale de l’enobosarm obtenus sur les animaux étudiés mettent en évidence une excrétion fécale d’enobosarm dans des fèces de veau. Les concentrations atteintes dans les fèces sont très importantes, environ 500 fois plus élevées comparativement aux urines après hydrolyse (sous forme totale). Les résultats obtenus ont abouti à (i) optimiser des protocoles d’extraction et d’analyse de l'enobosarm dans les urines et les fèces de veau (ii) identifier l'enobosarm et quantifier son excrétion (iii) mettre en évidence la forte excrétion fécale de l'enobosarm par rapport à l'urine et (iv) de proposer une fenêtre de détection de 21 jours dans les fèces, supérieure aux 9 jours dans les urines. L’absence de mise en évidence de formes conjuguées de l’enobosarm par hydrolyse

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm enzymatique dans les fèces, laisse supposer que ce composé est principalement excrété sous sa forme libre dans les fèces de veau alors qu'il est excrété libre et conjugué dans les urines.

Cette partie de la thèse était l'occasion de mettre en avant les avantages de l'utilisation de la matrice fèces et de la faisabilité de son exploitation dans un cadre de contrôle et de prélèvement à large échelle en élevage. L’avantage majeur de la matrice fèces est la facilité de prélèvement sur le terrain. Cette facilité de collecte des fèces est mise également en avant par les techniciens chargés des prélèvements en élevage auprès de la DGAL (Direction Générale de l’Alimentation). Cette dernière incite donc le développement de méthodes adaptées à l’analyse des fèces afin de savoir si l’utilisation de cette matrice est pertinente et applicable. Dans ce contexte et à titre d’illustration, la DGAL a récemment incité le LABERCA à développer une stratégie analytique visant notamment la détection des stéroïdes anabolisants dans les fèces (méthode LABERCA/S-fe.0.01 "Promoteurs de croissance dans les fèces. Détection et identification d’esters de stéroïdes anabolisants par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem"). Cette phase de notre étude constitue une première étape à la mise en place d’un protocole de détection de l’enobosarm ou de ses métabolites sur fèces de veaux afin de détecter des utilisations illicites. La stratégie analytique développée dans le cadre de ce travail a fait l’objet d’une formalisation de méthode interne "LABERCA/SARMs-u.0.03, Détection et identification des SARMs dans l’urine de bovin par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem", éprouvée dans le cadre d’un plan expérimental de la DGAl en 2017. La validation de cette méthode conformément aux exigences réglementaires et guides de validation en vigueur est maintenant nécessaire pour une mise en œuvre officielle dans des plans de surveillance et de contrôle de la DGAL. En parallèle, il conviendra de finaliser la caractérisation et l’identification des métabolites fécaux afin d’en déterminer les fenêtres de détection et possibles implications en termes de marqueurs pour le contrôle de l’usage des SARMs en élevage.

Les études métaboliques comme celle présentée dans ce présent chapitre, et particulièrement celles considérant les réactions produisant des métabolites actifs, sont d’intérêt majeur pour le contrôle des pratiques anabolisantes afin de caractériser les métabolites majoritaires et leur propriétés physicochimiques, et ce dans le but d’inclure des composés cibles dans les procédures de contrôle effectuées en routine en plus des résidus de la substance administrée. La mise en œuvre de stratégies analytiques combinant la chromatographie avec la spectrométrie de masse en vue de l’identification et la caractérisation des produits métaboliques issus de substances prohibées permet de caractériser précisément la signature analytique de promoteurs de croissance tels les SARMs. Cette signature dite ciblée est actuellement celle privilégiée dans les stratégies analytiques mises en œuvre dans les plans de surveillance et de contrôle. Elles sont particulièrement efficaces lorsque les substances suspectées sont connues et leur métabolisme décrit. Cependant, ces approches ciblées se heurtent au recours par d’éventuels fraudeurs à de nouveaux composés synthétiques inconnus, tels les SARMs, ou encore l’usage de cocktails basses doses. Ces pratiquent demeurent un défi pour les scientifiques et une problématique toujours d’actualité pour les structures de contrôle. Le développement de nouvelles approches apparaît aujourd’hui nécessaire pour faire progresser l’efficacité de la surveillance de l’utilisation de ces substances en élevage. Dans ce contexte, des stratégies dites "globales" ou "indirectes" sont proposées afin de mettre en évidence, non pas la molécule administrée, mais l’effet qu’elle produit sur l’animal. Le travail de thèse s’oriente désormais vers la caractérisation de signatures non ciblées, ainsi, le chapitre 3 de ce manuscrit propose d’envisager les effets anabolisants via la signature zootechnique, le chapitre 4 s’attachera à

Chapitre 2 - Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm caractériser une signature métabolique globale permettant d’identifier des biomarqueurs de pratiques anabolisantes.

Le travail réalisé dans le cadre de cette partie d'étude analytique ciblée a fait l’objet de deux stages :

. L'optimisation de la préparation et de l’analyse de l'urine a été réalisé dans le cadre d'un stage et décrit dans un Mémoire de Master 2ème année Chimie des Molécules Bioactives de l'Université d'Orléans (Penot, 2014 : Développement méthodologique pour l’étude des cinétiques et du métabolisme d’un SARMs, l’enobosarm). . L'optimisation de la préparation des fèces a été réalisée dans le cadre d'un stage et décrit dans un Mémoire de 5ème Année Vétérinaire Productions Animales à Oniris, Nantes (Sydor, 2015 : Développement méthodologique associé à l’étude de la cinétique de l’enobosarm et de ses métabolites dans les fèces de veaux).

Les développements analytiques et l’application sont détaillés dans l’article cité ci-dessous.

Les principaux résultats et discussion associés à cette partie des travaux de thèse ont fait l’objet d’un article scientifique publié à l’issue du congrès Euroresidue VIII, dans Food Additives & Contaminants Part A et présenté ci-après.

Cesbron N, Sydor A, Penot M, Prevost S, Le Bizec B, Dervilly-Pinel G. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2017 Apr;34(4):632-640. doi: 10.1080/19440049.2016.1258122. Epub 2016 Nov 28.

CHAPITRE 3 - Développement d’outils zootechniques. Application à l’évaluation des performances de croissance chez le veau après une administration orale d'enobosarm

Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm

Objectif

Il s'agit de valider des outils de mesures zootechniques adaptés au veau en croissance et de les appliquer chez le veau sevré afin de disposer de moyens d'évaluer l'impact de l'administration orale d'un potentiel et nouvel agent anabolisant, l'enobosarm, sur les performances de croissance.

Introduction

Un maillon crucial dans la stratégie de contrôle de l’utilisation des promoteurs de croissance en élevage est l'étape de dépistage. Ces analyses de première intention doivent être rapides, faciles à mettre en œuvre, peu onéreuses, sensibles, robustes et présenter une grande capacité analytique de traitement. L'objectif est de passer au crible de nombreux échantillons en vue de trier rapidement les conformes des suspects. Les échantillons suspects pourront ensuite être "diagnostiqués" conformes ou non par une méthode de confirmation. Pour rappel, le nombre de prélèvements à réaliser par filière et par lieu de prélèvement (élevage ou abattoir) pour les plans de contrôle des promoteurs de croissance est annuellement calculé pour répondre aux dispositions de la directive 96/23/CE soit au prorata, dans le cadre de la filière bovine, d’une part du nombre d’animaux abattus pour les animaux de boucherie et le gros gibier et d’autre part pour répondre à une priorisation fonction du nombre de non conformités relevées les années précédentes.

Le dépistage est principalement réalisé en laboratoire par des analyses relevant de technologies variées (par exemple, chromatographie liquide ou gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, technique immuno-enzymatique de type ELISA) sur des matrices de natures différentes collectées en exploitation (prélèvements sanguins, d'urine, de poils) ou récupérées à l'abattoir (graisse, muscle). Ces procédures peuvent limiter le nombre d’échantillons traités : premièrement par les capacités technologiques et analytiques des méthodes employées et deuxièmement par les contraintes liées au stockage, conditionnement et acheminement des échantillons (l'urine reste plus stable que le sang par exemple). L'idéal serait de pouvoir réaliser un premier tri directement sur les animaux vivants, en condition d’élevage permettant de concentrer les efforts analytiques sur les suspects ainsi rapidement détectés. Par le passé ce type d'approche a pourtant été efficace en élevage ou en abattoir : œil averti des maquignons pour détecter les bêtes "artificiellement" viandeuses à bon prix lors des échanges d'animaux, recensement par les personnels d'abattoir des traces d’injection, mise à l’écart des animaux présentant de manière atypique des thyroïdes particulièrement volumineuses... Si la détection visuelle des conformations suspectes est toujours pratiquée par les services vétérinaires, force est de constater que cette aptitude de certains personnels des services vétérinaires est aujourd’hui rare et demeure de surcroit subjective. Ce principe n’est en conséquence en pratique pas efficacement mis en œuvre pour le dépistage des pratiques frauduleuses. Or, il est pourtant pertinent de considérer la conformation des animaux comme un critère de suspicion. Des outils permettant une estimation objective des performances de croissance et qui seraient à même de détecter les cas sur lesquels focaliser l’attention seraient un moyen pertinent de renforcer l’efficacité des contrôles, tout en s’affranchissant à ce stade du type d’anabolisant utilisé puisqu’une telle stratégie aurait l’avantage d’être relativement générique. Et le plus simple, le plus rapide, le moins coûteux serait finalement d'utiliser des outils déjà existant permettant de caractériser des signes extérieurs d'une pratique anabolisante, des indices visibles et/ou mesurables en fonction de la connaissance des effets biologiques liés au traitement par un promoteur de croissance (prise de

Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm masse musculaire, modification de la couverture graisseuse, raccourcissement de la période d'engraissement, etc.).

Comme décrit dans la revue bibliographique, il existe depuis longtemps des outils de mesures, de calculs de paramètres, largement utilisés d'ailleurs, pour suivre des jeunes bovins en production en terme de performances zootechniques mais aussi pour quantifier la plus-value obtenue lors de l'utilisation d'agents anabolisants lorsque ceux-ci sont autorisés dans certains pays. Ces outils zootechniques, en général simples à mettre en œuvre et à exploiter, permettent également de bien décrire la croissance et le développement de jeunes bovins destinés à des productions parfois différentes (veau de boucherie, jeune bovin de boucherie, bovin mâle castré "bœuf"). Dans le cas de l'utilisation des stéroïdes anabolisants androgéniques, l’évaluation de la croissance pondérale des jeunes bovins s'appuie préférentiellement sur la mesure du poids vif permettant le calcul d'indices (GMQ, IC) ; la mesure du poids vif présente une bonne répétabilité et reproductibilité quelques soit l'outil mis en œuvre (direct par la pesée à la balance ou estimé avec le ruban barymétrique mesurant le tour de poitrine). Les mesures de la stature reflétant le développement général de l'animal (gabarit) et aussi le développement des différents tissus de l'animal en croissance (muscle, os, gras) sont moins utilisées dans un but économique mais demeurent toutefois des outils jugés répétables et reproductibles pour la plupart. Ces paramètres plus spécifiques sont majoritairement mis en œuvre chez les vaches laitières (Note d'Etat Corporel) dans le suivi de leur cycle de production ou chez de jeunes génisses laitières en fin de croissance au moment de la première mise à la reproduction (largeur des hanches, hauteur au garrot, distance épaule-hanche). Ces mesures sont aussi utiles dans un contexte de suivi sanitaire afin de détecter et objectiver des problèmes d'élevage ayant eu pour conséquence ou étant à l'origine de troubles de la croissance entrainant des pertes économiques.

Le constat est donc qu'il existe bien des moyens d'évaluer la croissance et le développement des bovins, plutôt utilisés pour mesurer les performances économiques de ces animaux au sein de leur production et que l'application de ces mêmes moyens sur des animaux stimulés par des promoteurs de croissance permettrait de les distinguer des animaux en croissance normale. De nombreuses études concernant la prise d'hormones stéroïdiennes par de jeunes bovins montrent, entre autre, l'augmentation de la masse musculaire ou le changement du rapport masse maigre sur masse graisseuse, l'amélioration de l'IC et du GMQ par exemple (Mac Fadden, 1967 ; Sauerwein, 1989 ; Wilson, 1999 ; Moriel, 2016). Ainsi, sur la base de telles mesures objectives, répétables et reproductibles, il serait possible de contrôler les animaux de leur vivant, dans leur milieu de vie et de dépister les "hors norme".

Cette partie de notre travail s'est donc intéressée à choisir parmi les outils zootechniques existant, déjà validés pour évaluer la croissance, ceux qui pourraient s'appliquer à détecter des modifications zootechniques (croissance pondérale et staturale) liées à l'utilisation de produits anabolisants. Après ce choix, basé sur les données et études de la littérature, l'attention s'est portée sur la validation d'outils plus adaptés au jeune animal et en croissance. Le paramètre "répétabilité" a été investigué en particulier afin de pouvoir utiliser, dans un second temps, ces outils zootechniques sélectionnés dans le cadre d'une étude cas-témoin sur les effets de l'enobosarm sur la croissance. Dans ce contexte, une expérimentation animale a été conçue et mise en œuvre dans le cadre de ce travail de doctorat. Pour rappel, le design de l'expérimentation animale est décrit dans le chapitre 2 "Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm".

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Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm Les principales étapes de la phase expérimentale concernant la partie zootechnique sont résumées sur la Figure 27. L'étude de la répétabilité des mesures sélectionnées s'est déroulée sur les jours suivant l'arrivée des animaux, durant la phase d’acclimatation (J-4 à J-1). L'étude des effets zootechniques consécutifs à l'administration d'enobosarm s'est appuyée sur les mesures réalisées à J-1, J7, J14 et J20.

Figure 27. Schéma général de la phase expérimentale de la partie zootechnique.

Résultats

1- Choix et validation d'outils et de mesures

Le choix des outils et des mesures possibles a été réalisé en prenant tout d'abord en considération les évaluations décrites dans la littérature (répétabilité, reproductibilité, coefficient de variation et coefficient de corrélation). Ensuite le choix des paramètres s'est fait sur leur pertinence pour décrire au mieux la croissance et le développement de veau mâle non castré âgé de 3 mois. Enfin le dernier critère de choix a reposé sur la facilité de réalisation des mesures et de la mise en place des outils (contention et matériel nécessaires notamment) dans l'optique d'une utilisation sur le terrain, en élevage.

Dans un premier temps, neuf paramètres ont été sélectionnés avec leurs méthodes de mesure ou de calcul associées pour décrire la croissance, le développement et les performances zootechniques de veaux Prim'Holstein sevrés en phase d'engraissement (Tableau IX). Afin de s’assurer de la validité de tels critères avec le matériel et dans les conditions expérimentales propres à ce protocole, la répétabilité de chacune des mesures a été évaluée. Le but était de s’assurer de la pertinence de leur utilisation dans l’évaluation des effets zootechniques de l’enobosarm chez le veau. Du fait que l’évaluation de la précision nécessite de réaliser des mesures sur carcasses (gold standard) et celle de la reproductibilité implique la réalisation des mesures par différents opérateurs, ces deux autres critères de fiabilité n’ont quant à eux pas été investigués.

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Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm

Tableau IX : Sélection de paramètres zootechniques : sept mesures et deux indices.

Paramètres Méthodes de mesure

Evaluation de la croissance

Poids Vif (PV) pesée à la balance (kg)

Taux de croissance Gain Moyen Quotidien (GMQ)a

Efficacité alimentaire Indice de Consommation (IC)b

Evaluation du développement

Développement osseux "stature"

Hauteur au Garrot (HG) toise (cm)

Largeur des Hanches (LH) règle (cm)

Développement musculaire

Tour de Poitrine (TP) mètre-ruban (cm)

Largeur d'encolure (LE) compas et règlec (cm)

Epaisseur muscle fessier (EMF) d échographie mode-Bd (cm)

Développement du tissu adipeux

Note d'Etat Corporel (NEC) grille d'évaluatione a δ PV/jour (g/j) b δ ingéré/ δ PV c Outil spécialement développé pour cette étude permettant de mesurer la largeur de l'encolure afin d'évaluer cette région. Chez le veau en croissance, le développement de l'avant-main se fait précocement au développement de l'arrière-main. d L'échographie a été utilisée pour mesurer l'épaisseur des muscles de la croupe chez le veau en s'inspirant des mesures faites du tissu adipeux sous-cutané. e La grille d'évaluation utilisée chez le veau dans cette étude est une adaptation la grille d'évaluation proposée par l'Institut de l'élevage (Bazin, 1984) et du score d'état corporel proposé par Edmonson en 1989, grilles en général utilisées chez les vaches adultes laitières.

L’étude de la répétabilité des mesures précédemment décrites a été réalisée au cours de la période d’acclimatation et/ou en début de phase expérimentale. Chaque mesure a ainsi été réalisée cinq fois (Tableau X).

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Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm Tableau X : Programme d’étude de la répétabilité des mesures sélectionnées.

Mesures J-4 J-3 J-2 J-1 J0 J1 J2 J3

AM PM AM PM AM PM AM PM AM PM AM PM AM PM AM PM

PV X X X X X

Tour de poitrine X X X X X

Hauteur au garrot X X X X X

Largeur des hanches X X X X X

NEC X X X X X

Largeur d’encolure Xa Xa Xa Xa Xa

Epaisseur musculaire X X X X Xb a Mesures réalisées durant le début de la phase expérimentale car l'outil n'était pas encore terminé dans sa construction b Dernière mesure réalisée en décalé suite à un problème technique sur le matériel échographique AM : ante meridien, matin PM : post meridien, après-midi

Les résultats observés sont présentés dans le Tableau XI ; ils montrent de faibles dispersions des valeurs autour de la moyenne avec des coefficients de variation de répétabilité compris entre 1,3 et 3,7 % pour les mesures de poids vif, de tour de poitrine, de hauteur au garrot, de largeur des hanches et de largeur d’encolure. Avec des valeurs atteignant respectivement 12,0 et 15,5 %, la NEC et la mesure de l’épaisseur du muscle fessier par échographie présentent des coefficients de variation plus élevés. Si ces valeurs restent raisonnables, ces écarts à la moyenne un peu plus importants peuvent s’expliquer d’une part par la subjectivité de la notation de l’état d’engraissement, basée sur l’observation de la couverture graisseuse des proéminences osseuses de l’arrière-main et du flanc, et d’autre part par le fait que l’épaisseur du muscle fessier peut varier légèrement en fonction du positionnement de la sonde, de la contraction du muscle en question et de l’interprétation faite des images échographiques. Ainsi, la pertinence de l’utilisation des mesures sélectionnées pour l’évaluation des effets zootechniques de l’enobosarm chez le veau est a minima justifiée dans ce protocole par leur caractère répétable.

Tableau XI : Répétabilité des mesures.

Mesures CVa (%) Interprétation

Poids vif (kg) 2,7

Tour de poitrine(cm) 1,5 Mesures très répétables Hauteur au garrot (cm) 1,3 CV<5% Largeur des hanches (cm) 3,7

Largeur d'encolure (cm) 2,4

NECb (score) 12,0 Mesures répétables

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Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm

Epaisseur m. fessier (cm) 15,5 CV<20% a CV (Coefficient de Variation) b NEC (Note d'Etat Corporel)

Le bon déroulement des mesures, la simplicité d'emploi des outils décrits précédemment et les résultats obtenus quant à leur répétabilité nous ont amené à les retenir pour l'étude spécifique concernant l'évaluation des effets zootechniques associés à l'administration d'enobosarm chez les veaux.

Il convient de souligner le caractère générique d’une telle stratégie, en effet, ce développement d'outils pourrait être appliqué dans d'autres études s’intéressant aux effets des promoteurs de croissance et pour d'autres familles de composés anabolisants. Les qualités de faisabilité et de répétabilité sont de réels atouts d'investigation d'autant plus que le matériel employé et proposé est commun et manipulable par la majorité des professionnels de l'élevage.

2- Evaluation des effets de l'administration d'enobosarm

Aucune étude à ce jour n'avait été entreprise sur la description des effets "physiques" d'une administration de SARMs et de l'enobosarm en particulier chez des bovins. Il n'existe pas de données sur les performances de croissance due à l'utilisation de SARMs en tant qu'agent anabolisant même si le concept est déjà présent et accessible sous la forme d'un brevet pour la fabrication d'un aliment contenant des SARMs en tant que promoteurs de croissance, "affectant la composition des carcasses des animaux de production en augmentant leur masse maigre et réduisant leur masse grasse et/ou en réduisant le pourcentage de masse graisseuse dans un contexte d'amélioration du système d'engraissement de type feedlot en jouant sur l'efficacité alimentaire et la composition qualitative de la viande" (Dalton, 2016). Ce brevet concerne les animaux de production en général, les bovins sont mentionnés (en engraissement type « feedlot » ou en extensif, en finition) même si le principal propos et l'expérimentation sur laquelle s'appuie le dossier concernent le porc. En effet une partie du brevet vise à proposer un remplaçant de l'hydrochloride de ractopamine (Paylean®) utilisé en tant qu'additif alimentaire comme promoteur de croissance (amélioration de la croissance et de l'efficacité alimentaire, diminution du gras dorsal et augmentation de l'épaisseur des longes) dans la production porcine mais responsable d'effets secondaires non négligeables (augmentation du stress, mort subite). Ce brevet, déposé depuis 2014 vient d'être octroyé en mars 2016, ouvrant la voie de l'exploitation de SARMs comme composé anabolisant et additif alimentaire. L'évaluation des effets des SARMs, et a fortiori de l'enobosarm, revêt donc une grande importance pour anticiper la fraude avec des composés non seulement disponibles sur le marché parallèle (plateformes internet des bodybuilders) mais aussi sur le marché des produits autorisés dans certaines régions du monde.

Dans notre étude, le groupe de veaux "traités" (n=5) a reçu quotidiennement et ce pendant 21 jours, une administration orale de 2,38 mg d'enobosarm en solution, mélangé avec du jus de pomme appétant (les animaux contrôles ont reçu un placebo avec du jus de pomme aussi). La réalisation des mesures sélectionnées s'est déroulée selon le calendrier expérimental présenté en Figure 27 et selon les modalités présentées en Figure 28.

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Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm

a b c

d e

* #

dors al cra cau nia dal l vent ral

f g

L’impact zootechnique de l’administration orale quotidienne d’enobosarm à des veaux pendant 21 jours a donc été évalué par neuf paramètres distincts, comprenant sept mesures et deux paramètres calculés (GMQ et IC) et dont les résultats sont présentés en Figure 29. Malgré l’augmentation des valeurs relatives au tour de poitrine, hauteur au garrot et largeur des hanches dans les deux lots du fait de la croissance physiologique des veaux, les résultats obtenus ne permettent pas de mettre en

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Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm évidence d’évolution significativement différente des croissances staturales entre les lots "Traités" et "Témoins".

Les données publiées à ce jour sur l'effet des SARMs concordent avec ces résultats et ne mettent en évidence qu’une augmentation de la densité minérale osseuse chez les rats mâles castrés et femelles ovariectomisées (Kearbey, 2007 ; Miner, 2007 ; Furuya, 2012), ce dernier paramètre plus expérimental qu'est la mesure de la densité osseuse, n'ayant pas été choisi dans notre étude. De la même manière, les mesures du poids vif, ainsi que les calculs de GMQ et d’indice de consommation, ne montrent pas d’évolution significativement différente entre les croissance pondérale, taux de croissance et efficacité alimentaire des lots "Traités" et "Témoins". S’il a été montré que les stéroïdes anabolisants androgéniques étaient responsables d’une augmentation du poids vif du fait d’une meilleure efficacité alimentaire (diminution de l’IC) chez des veaux mâles entiers (MacFadden et Belden, 1967 ; Hunt 1991), les données actuellement disponibles sur les SARMs s’accordent à dire qu’ils n’entrainent pas de variation du poids vif, mais plutôt une stabilité pondérale du fait d’un déplacement de la masse grasse vers la masse maigre, aussi bien chez le rat que chez l’Homme (Chen, 2005a ; Dalton, 2011). De plus, les résultats obtenus ne permettent pas de mettre en évidence de différence significative entre les développements des tissus musculaires (mesure de la largeur d’encolure, mesure échographique de l’épaisseur du muscle fessier) et adipeux (NEC) des lots "Traités" et "Témoins".

Figure 29 : Evolutions moyennes (± écart-types) des paramètres zootechniques mesurés (ou calculés) des lots Témoins et Traités au cours du temps.

Plusieurs autres hypothèses peuvent être formulées pour tenter d'expliquer l'absence d'effets visibles et quantifiables de l'enobosarm en tant qu'agent anabolisant :

. un défaut d’absorption de l’enobosarm dans le tractus digestif de ces animaux. L’analyse des urines prélevées sur ces veaux (par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem réalisée tel que présenté dans le chapitre 2 précédent) a permis de montrer que l’enobosarm est éliminé aussi bien sous forme non métabolisée que sous forme

106

Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm de métabolites, témoignant ainsi de son absorption digestive et de sa biotransformation. Ces résultats ont également été observés par de Rijke (2013) sur des prélèvements urinaires d'un veau. . un défaut de sensibilité des veaux à l’action des SARMs, soit du fait de leur jeune âge et de la grande sensibilité de l’axe hypothalamo-hypophysaire au rétrocontrôle négatif (Schmidely, 1993b), soit du fait qu’il s’agit d’animaux entiers présentant une moins grande quantité de récepteurs libres aux androgènes, donc de récepteurs susceptibles de générer un effet (Schmidely, 1993b). Aucune étude ne permet par ailleurs de savoir si l’enobosarm a la capacité d’agir sur les récepteurs androgènes des bovins, tel que cela a été démontré chez le rat ou l’Homme (Gao, 2005 ; Dalton, 2013). . une posologie non adaptée. La dose de 1 mg d’enobosarm par kg d’aliment (1 ppm) administré aux veaux de notre expérimentation, par voie orale, a été adaptée de l’unique étude à caractère zootechnique existante jusqu’alors ayant utilisé comme modèle animal le porc (Dalton, 2010b). Celle-ci a consisté en l’évaluation des effets du composé S-2 sur les performances de croissance du porc en finition consécutivement à son administration orale. Si une amélioration des performances a bien été observée suite à une administration quotidienne de S-2 pendant 28 jours, aucun des résultats ne s’est révélé être significatif. Pour le modèle animal qu’est le veau, la dose et la durée de traitement peuvent avoir été insuffisantes pour engendrer des effets significatifs sur leur croissance et/ou leur développement. De nouvelles expérimentations seraient alors nécessaires pour évaluer si à des doses et/ou des durées de traitement supérieures, l’enobosarm a la capacité d’entrainer des effets zootechniques chez le veau. . la présence d’éléments ayant pu perturber la croissance des veaux, tel que leur état sanitaire. En effet, malgré la répartition des veaux en deux lots homogènes en termes de poids vif, âge et statut sanitaire, les affections ombilicales présentées par certains d’entre eux peuvent avoir eu une influence sur l’expression des effets zootechniques. De surcroit, certains animaux ont présenté durant la phase expérimentale des troubles respiratoires ayant également pu perturber leur croissance.

Conclusion

Alors que des outils robustes permettant d’évaluer la croissance de jeunes bovins ont été développés et validés dans le cadre de ce travail, leur application à la question de recherche posée n’a mis en évidence aucune modification significative des paramètres de croissance et de développement consécutivement à l’administration d’enobosarm à des veaux, notamment relative à une diminution de l’indice de consommation et une stimulation du développement musculaire. S’agissant d’une cible potentielle de l’utilisation frauduleuse d’anabolisants tels que les SARMs, le veau s’avère être un modèle animal pertinent, d’autant qu’aucune donnée actuellement disponible ne permet de prédire les effets zootechniques de tels composés chez des bovins. Aucune donnée ne permet à ce jour également de proposer l'image d'un bovin ayant reçu un SARMs, de dresser une signature

107

Chapitre 3 - Développement d'outils zootechniques. Aplication à l'évaluation des performances de croissance chez le veau après administration orale d'enobosarm "phénotypique" de l’enobosarm, c’est à dire de décrire "l'ensemble des caractères visibles et des performances chez le veau" ou "une empreinte anabolisante" perceptible.

Même si l'approche "zootechnique" n'a pas répondu aux attentes escomptées pour l'enobosarm, le développement des outils présentés dans ce travail mériterait d'être évalué pour d'autres composés et d'autres familles d'anabolisants. La recherche de signes extérieurs de "dopage" serait d'une aide précieuse dans le dépistage des pratiques illégales.

En complément des approches décrites dans les chapitres 2 et 3, une signature métabolique globale permettant d’identifier des biomarqueurs de pratiques anabolisantes apparaitrait pertinente dans le cadre de notre question de recherche. La métabolomique, qui à travers la génération d’empreintes métaboliques permet la mise en évidence de profils discriminants d’animaux traités versus non traités et la mise en lumière de biomarqueurs d’effet associés fera ainsi l’objet des développements du chapitre 4. Ce chapitre s’attachera ainsi à justifier le choix de développer une approche métabolomique basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (LC-HRMS) avec un focus particulier sur la matrice fèces.

Le travail réalisé dans le cadre de ce chapitre relatif au développement et à l'application d'outils zootechniques a fait l’objet d'un mémoire de stage 5ème Année Vétérinaire Productions Animales à Oniris en 2014 :

Vernet C. Etude des effets zootechniques d’une nouvelle famille d’agents anabolisants, les SARMs chez le veau.

Les principaux résultats associés à cette partie des travaux de thèse ont fait l’objet d’un article scientifique soumis au Journal of Agricultural and Food Chemistry et présenté ci-après.

N. Cesbron, C. Vernet, M. Penot, G. Dervilly-Pinel, B. Le Bizec. Development and implementation of zootechnical measurement tools in calves: Application to the study of growth performances after an oral administration of enobosarm.

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Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

Growth performances in calves

Development and implementation of zootechnical measurement tools in calves: Application to the study of growth performances after an oral administration of enobosarm1

N. Cesbron*2, C. Vernet*, M. Penot*, G. Dervilly-Pinel*, B. Le Bizec*

*LUNAM , LaBoratoire d'Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA), INRA UMR 1329, Oniris, BP 50707, 44307 Nantes Cedex 3, France

1 This paper was originally presented as a proceeding paper at 3R conference, Paris, France, 2- 3 December 2015

2 Corresponding author. Email: [email protected]

109

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

ABSTRACT

Among potential lever to increase the efficiency of controlling growth promoters ’use in livestock, tools allowing measuring gains of performance are powerful ones that are worth developing and implementing; main challenge to overcome being the measurement repeatability. Therefore, the objective of the present study was to investigate the relevance of a set of zootechnical parameters describing growth and development in young growing animals. Seven parameters and associated coefficients of variation (CV) related to the repeatability of the measurement were thus studied on twelve Prim’Holstein entire male calves as follows: body weight (BW) (CV 2.7%), withers height (WH) (1.3%), heart girth

(HG) (CV 1.5%), neck width (NW) (CV 2.4%), hips width (HW) (CV 3.7%), body condition score (BCS) (CV 12.0%) and pelvis muscle depth (PMD) (CV 15.5%). These results lead to the conclusions that associated measurements are robust and can be implemented for further studies. In a second step, the strategy was applied to evaluate the zootechnical performances of a new growth promoter, a selective androgen receptor modulator namely enobosarm, administered to five calves by means of comparison with five control animals. Measures of body weight (P > 0.79) together with average daily gain (P > 0.35) and food conversion ratio

(P > 0.31) values showed no significant difference in growth rate and feed efficiency between treated and control animals. Furthermore, no significant development in the treated group could be observed for the other parameters (WH (P > 0.53), HG (P > 0.64), NW (P > 0.49),

HW (P > 0.74), PMD (P > 0.90) and BCS (P > 0.28)). Therefore, no significant zootechnical effect induced by enobosarm administration in favour of treated animal versus control could be concluded. Such observations are in agreement with previous studies in other animal species and concordant with current knowledge about enobosarm. The present study proposes simple and repeatable tools to assess the growth of calves which may be applied for rapid screening of suspicious zootechnical modifications on live animals.

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Key words: anabolic practice, calves, growth, OSTARINE, selective androgen receptor modulators, screening

INTRODUCTION

The use of growth promoters in food-producing animals is differently regulated worldwide and an ever increased knowledge about anabolic products and their in vivo effects is essential for appropriate use and efficient control strategies. Dairy calf in particular is susceptible to growth promoting practices (Nebbia et al., 2011; Chiesa et al., 2016). Although efficient analytical strategies are available in laboratories to detect in various matrices (urine, feces, hair or blood) the use of anabolic agents, the efficiency of this system would be greatly improved in terms of number of animals covered and ease of implementation, when screening could be performed directly at the farm level, especially if simple measurements could predict the status of the animals in relation with the application of novel designer promoters.

Selective androgen receptor modulators (SARMs) are a class of androgen receptors (AR) ligands investigated for medical properties in treatment of cachectic diseases to enhance muscular gain without side effects on human health (Molfino et al., 2016). These molecules are banned according to the World Anti-Doping Agency (Thevis et al., 2016). Regarding their anabolic potential, although no cases in livestock have been reported up to now, a patent application is now available in the US for an administration of mixed SARMs compounds through animal feed as a new method to improve carcass characteristics and increase lean mass gain in feedlot animal’s production (Dalton et al., 2016). However, the observable impact on livestock production animals, following administration of SARMs, has not been described to date.

While calves suffer a lack of zootechnical tools, unlike adult animals, the aim of this work was to validate simple repeatable tools for measuring parameters of growth and development.

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Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

As a very first application, the developed tools have been applied to investigate a potential zootechnical effect following an oral administration of enobosarm in calves.

MATERIALS AND METHODS

All procedures for the experiment conducted at the center of research and preclinical investigation (CRIP of Oniris-Nantes Atlantic National College of Veterinary Medicine, Food

Science and Engineering, Nantes, France) were approved by the French Ethical Committee

(registered accreditation N° 02323.01).

Experimental design

Twelve Prim'Holstein entire male weaned calves were purchased from the same producer

TER'ELEVAGE. They were acclimatized for four days prior to the initiation of the experiments. The twelve calves were reared during 25 days.

For the first part of the study, they were clinically followed every day and all measurements were realized on each animal at days (D): D-4, D-3 AM, D-3 PM, D-2, and D-1 by the same operator. The calves were housed on straw free-stall. They were fed with roughage, water ad libitum and concentrate according a classical feed ration. The same source of feed was used within each of the two groups of calves. The quantity of hay ingested by each group during the experimental period was weighed. Each pen had headlock with individual buckets authorizing the separate concentrate distribution per calf in two daily administrations. At the end of the day, refusals were weighed to assess the quantity daily ingested by each calf.

For the second part of the study, among these twelve calves, ten of them have been randomly chosen to create a group "treated" with five animals and a group "control" with five animals for subsequent study of the zootechnical effects associated to an oral administration of enobosarm. They were allotted into two homogeneous groups in terms of health status, age

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Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

(mean= 81 days and 78.2 days for the control and the treated groups respectively) and weight

(mean=86.2 kg and 87.2 kg for the control and the treated groups respectively). These ten selected animals were followed clinically every day and measurements were realized at D-1,

D7, D14 and D20 by the same operator.

Development: zootechnical tools

To assess growth and development in calves, nine different parameters have been selected: seven measurements related to the assessment of growth and development and two indices as follows (Table 1):

- Live weight gain was assessed by measurement of body weight (BW), expressed in

kg, which was performed by weighing the calf on a balance where the animal was

blocked within a restraining cage.

- Growth rate was calculated through the average daily gain (ADG = gain weight

BW/day expressed in g/day).

- Intake efficiency was assessed using the food conversion ratio (FG = food intake (kg)/

BW (kg).

- Withers height (WH), expressed in cm, was performed by measuring with a meter the

vertical distance between the floor and the top of the withers, over the shoulders, on a

standing restrained calf (Fig. 1).

- Heart girth (HG), expressed in cm, was performed using a tape by measuring the

minimal circumference of the chest back to the elbows on a standing restrained calf

(Fig. 1).

- -Hips width (HW), expressed in cm, was performed using a ruler by measuring the

113

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

distance between the medial dorsal-caudal portions of iliac spines on a standing

restrained calf (Fig. 1).

- - Neck width (NW), expressed in cm, was reported by measuring the greatest

horizontal distance of the bottom neck, the calf was blocked at the headlock and

pushed forward so as to press its shoulders against the headlock. This measurement

was performed using a compass coupled with branches and then the distance between

the branches was transferred with a rule (Fig. 1).

- The measurement of the pelvis muscle depth was performed by measuring thickness

of gluteus muscles group with ultrasonography. The ultrasonographic examinations

were made while the animals were standing using an 8-10 MHz linear transducer

(AQUILA VET, EASOTE Pie Medical, HospiMedi France) in 2-D Mode B. The

pelvis (rump) was ultrasonographically examined on the right side in one position

determined to observe under the skin the subcutaneous fat and the muscle gluteus

medius. The probe was placed on shaved skin and applied with an ultrasound gel

between the iliac tuberosity (hooks) and the ischial tuberosity (pins). Echograms of

this area were obtained for all animals at D-1, D7, D14, D20, and the group of muscles

were measured by the same operator during the experiment (Fig. 2).

- Finally, the assessment of adipose tissue development on calves was performed by

assigning a body condition score (BCS) adapted with some modifications from the

rating scale established by the Technical Institute of Cattle Breeding, France (Bazin,

1984) and the body condition scoring chart established by Edmonson and co-workers

(Edmonson et al.,1989). The observations of the fat covers of bony prominences allow

attributing a note on a scale of 0-5 for each animal by the same operator (Fig. 3).

Application: Evaluation of animal growth after an oral administration of enobosarm

114

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

Enobosarm was daily administered at the equivalent concentration of 1 mg/kg feed (1 ppm).

Enobosarm reconstituted with absolute ethanol in solution form and mixed with palatable apple juice was individually administered per os with a syringe every morning over the 20- day experimental period: 50 kg of total feed per calf were provided in the experiment; the amount of enobosarm administered was therefore 50 mg per calf over 20 days i.e.2.38 mg/day/calf.

Statistical analysis

Robustness of the proposed approach was investigated through the repeatability of the selected parameters’ measurements. Each measurement was performed five times per animal at five different time points.The data obtained were used to calculate the coefficient of

variation, defined by the following formula: CV (%) = x 100 where S(Y): residual standard deviation of each measure Y and E(Y): average of each measure Y.

To study the effect of a daily oral administration of enobosarm between treated calves compared to control calves, each selected parameters was measured prior to administration of enobosarm at D-1, then once a week on all the ten selected calves until the end of the study at

D20 (i.e. D7, D14 and D20). The data were analyzed with software R. Analysis were performed by using a statistic ANOVA with fixed effects group, time and group*time.

Significance was established for a P-value < 0.05.

RESULTS AND DISCUSSION

Zootechnical parameters assessment

The first step of this work was to implement zootechnical tools adapted to young animals to assess their growth and development through nine selected parameters and associated

115

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry methods. A selection of seven measurements was then tested for their repeatability: body weight (BW), withers height (WH), heart girth (HG), neck width (NW), hips width (HW), pelvis muscle depth (PMD) and body condition score (BCS). Such parameters were selected based on previous studies performed on adult cattle that reported their good accuracy, repeatability and reproducibility performances. T here is however a lack of zootechnical tools directed for calves mainly because young animals are not in production during their first months of life and because also they are continuously growing. These parameters were further selected on the basis of feasibility and reliability criteria as presented in Table 1.

In the present study, to investigate the repeatability of the selected parameters, the standard deviation S(Y) for each (Y) measurement repeated five time on twelve animals and the coefficient of variation of repeatability (CV) have been calculated. The results presented in

Table 2 show low dispersion values around the average with coefficients of variation (CV) in the range [1.3 - 3.7%] for BW, HG, WH, HW and NW measurements, leading to the conclusions that associated measurements are repeatable. With CV values reaching 12.0 and

15.5% respectively, the BCS and PMD demonstrated lower repeatability of the measurement.

Although still acceptable, such measurements exhibiting larger deviations can be explained first for BCS by the subjectivity of rating the degree of fat performed by the operator, and secondly for the PMD by the fact that the thickness of the gluteus medius muscle can vary depending on the positioning of the probe, the contraction of the muscle during the manipulation and the interpretation of ultrasound images by the operator conditioned by experience and well-trained technic.

When calves are early integrated in fattening productions different parameters can be used to monitor the "economic" growth: the "weight growth" is essentially parameter and is based on weighing to quantify the weight gain (body or live body weight, BW),to calculate the growth rate (average daily gain, ADG) and the intake efficiency (food conversion ratio, FC) 116

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

(MacFadden and Belden, 1967; Loy et al., 1998; Institut de l’Elevage, 2014). Weighing with a scale is the most accurate measurement of body weight, which is further easy to realize

(Heinrichs et al., 2007; Wilson et al.; 1997; Porhiel et al., 2005). So, one parameter measured

(BW) and two indices calculated (ADG and FC) are considered enough to describe the weight growth of an animal and to give information about relevant economic performances. Our results regarding BW are consistent with repeatability reported for this parameter in adult animal (Sieber et al., 1988) and constitute a first step to assess growth.

Other parameters are used independently of body weight to observe "stature growth" such as heart girth, girth circumference or heart circumference (Wilson et al., 1997), withers height or height over shoulder, body length and width hips or width of hips (Gilbert et al., 1993; Wilson et al., 1997). Besides their accuracy, measurements for evaluating growth in stature are characterized by good repeatability and reproducibility (Heinrichs et al., 2007; Alphonsus et al., 2009). These parameters have been more investigated, developed and applied in adult cattle, particularly in dairy production (economic parameters) or to compare different cow breeds (genetic trends) (Oliveira et al., 2013; Bonin et al., 2015). These parameters however are not fully suitable nor applied in young animal because morpho-structural characters in breeding calves are indicators less associated with an economic performance. Our results demonstrated a good repeatability of HG, WH, HW applied in young growing cattle and present therefore an interesting potential to complete the evaluation of calves growth.

Since mainly the development of bone, muscle and fat present an interest in the description of production performances in cattle, we have focused our efforts on tools directed to these aspects. Based on literature review, we have thus selected zootechnical tools as follows: (i) for bone development: an association of statural measurements (HG, WH, HW) with a particular development related to the neck width (NW) which was selected as morphological area of interest since in calves, the development of the forequarter starts first and gradually 117

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry continues together with the hindquarter and sensitivity to steroid hormones are more pronounced in the neck and the shoulders (Sauerwein and Meyer, 1989), (ii) for muscle development: an adapted use of ultrasonography to measure the pelvis muscle gluteus medius instead of subcutaneous adipose tissue as previously described (Brethour, 1992 ; Bergen et al.,

2004) and (iii) for fat development: the creation of a special rating scale for young animals based on mixed and existing BCS of adult animals normally used to assess the amount of metabolizable energy stored in fat and muscle on a live animal (Loy et al., 1998). Regarding muscle development, its visual assessment as historically performed is rendered inaccurate by its subjectivity (Bergen et al., 2004; Drennan et al., 2008; Conroy et al., 2009). Real-time ultra-sound measurement as proposed in the present work may be an interesting alternative.

Characterized by a high correlation with the fat thickness of gluteus medius muscle or longissimus dorsi muscle measured directly on carcass (Brethour, 1992; Perkins et al., 1992;

Greiner et al., 2003; Bergen et al., 2004; Schröder and Staufenbiel, 2006; Conroy et al., 2009), real-time ultrasound is an accurate tool to measure body composition and particularly fatty traits (Tait et al., 2005; Ribeiro and Tedeshi, 2012) with a good repeatability and reproducibility (Hassen et al., 1998). In addition, ultrasound technology is found to be relevant in the assessment of a better predicting percentage of retail product by measuring depth of gluteus medius in the rump of fed cattle (Tait et al., 2005). The observations and measured variations depend on the operator, the equipment used and the interpretation of acquired images which therefore requires qualified trained manipulators as observed during the current study. The visual assessment of adipose development is subjective also. The proposed visual scale, body condition score (BCS), as developed in the present work offers a good repeatability and reproducibility, exhibiting further low cost and ease of application characteristics (Wildman et al., 1982; Remond et al., 1988; Bullock et al., 1991; Denoyelle et al., 1995; Williams et al., 1997; Realini et al., 2001; Conroy et al., 2009).

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Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

To conclude on this first part dedicated to tools assessment, it is important to indicate that their choice was also driven by the fact that professionals are already familiar with these parameters and their application in the calves may consequently be more easily accepted. We therefore propose simple, economic and "field" tools to assess growth in calves in breeding conditions.

Application: study of growth after an oral administration of enobosarm

Based on the results above, confirming the possibility to confidently measure a set of parameters related to animal growth and development, the strategy was concluded relevant and subsequently applied to compare two groups of animals, one of them being exposed to a new generation of growth promoters.

The use of anabolic drugs in breeding has been developed in the sixties. The impact on muscle gain, consequential to the increase in feed efficiency, makes such practice interesting to improve meat production (Perry et al., 1991; Schmidely, 1993a; Moriel et al., 2016).

However, European public authorities, in a context of high societal pressure, have applied the precautionary principle in the absence of strong evidence regarding either the associated efficacy or safety both in the short and long term and consequently banned such practices since the late eighties (European council directives, 1996a-b ; Chevalier, 2011; EFSA, 2016).

Detection of illegal practices classically relies on residue monitoring in a targeted approach and methods based on gas or liquid chromatography coupled to (tandem) mass spectrometry are considered state of the art (De Brabander et al., 2007; Le Breton et al., 2008, Scarth et al.,

2012). However, these strategies fail when faced with new xenobiotic growth-promoting agents or new ways of application, such as administration of low-dose cocktails. Therefore, innovative strategies allowing detection of the physiological response resulting from administration of anabolic compounds are promising approaches to detect misuse. While in

119

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry this context, omics strategies have recently proven their efficiency for screening purposes

(Dervilly-Pinel et al., 2014; Gallart-Ayala et al., 2015), a better knowledge of anabolic products and their effects in vivo are in parallel required to better adapt control strategies

(Schmidely, 1993b). Enobosarm, a selective androgen receptor modulators (SARMs), may have a high potential in breeding practice for growth promoting purposes and consequently considered in countries where growth promoters are allowed (Dalton et al., 2016), although no data either on the (mis-)use or on the efficiency as growth promoter in livestock is available yet.

The impact of a daily oral administration of 2.38 mg enobosarm to calves during 21 days was assessed through the nine different parameters selected previously for their repeatability and feasibility. Natural growth of the animals as well as impact of the treatment are presented in

Table 3 and detailed below:

- WH, BW, HW, PDM parameters demonstrated the physiological growth and muscle

development of all calves (P < 0.001)) during the length of the experiment, whatever

their group (control or treated).

- The linear development of the animals, as measured by WH (P = 0.53) and HW (P =

0.74), was not observed as significantly different between enobosarm-treated and

control groups (Fig. 4, Table 3). In the same way, there was no statistical difference

between the body weight of control group and enobosarm-treated group (BW with P =

0.79) (Fig. 4, Table 3).

- Particularly when comparing control and enobosarm-treated groups, the results didn’t

allow identifying any significant differences for the development neither of muscle

tissue assessed by NW (P = 0.49), HG (P = 0.64) and PMD (P = 0.90) nor of adipose

tissue assessed by BCS (P = 0.28) (Fig. 5 and 6).

120

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

- Similarly, the growth rate was not significantly different between the two groups

(ADG with a P = 0.35), although this indice was observed significant during the

breeding period (P = 0.04), attesting for its suitability in assessing natural growth of

the animals; Finally, FC was not found significant whatever the considered situation.

Besides confirming the applicability of the developed tools to monitor young animals’ growth and developments, these observations allow concluding on the absence of effect on the measured parameters as a consequence of enobosarm application. No significant zootechnical effect induced by enobosarm administration in favour of treated animal versus control could therefore be concluded.

Such observations are in agreement with previous studies in other animal species and concordant with current knowledge about SARMS and especially enobosarm in rat

(Hengevoss et al., 2015, Kim et al., 2013) and mice (Dubois et al., 2015; Ponnusamy et al.,

2016b), In their study, Ponnusamy and co-workers observed a modestly increased of the total body weight in enobosarm-treated mice without statistical significance (Ponnusammy et al.,

2016b). In our study, a small but not significant reduction in body weight compared with the control group was observed in the treated group. This phenomenon has been described already in previous study where the SARMs S-1 was tested at low dose level on rats

(Hengevoss et al., 2015) alone or in association with androgenic anabolic steroids (AAS).

AAS were responsible for a small increase or a little reduction in body weight associated with an improvement of daily gain and feed efficiency in calves (McFadden and Belden, 1967;

VanderWal et al., 1975; Perry et al., 1991). This slightly weight difference may be related to a change in body composition between lean muscle mass and fat mass.

The main chemical properties of SARMs and especially enobosarm which is a non-steroidal molecule, can explain some of these observations. Described since 1998 (Dalton et al., 1998),

121

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

SARMs were developed for medical purposes included in the treatment of muscle wasting in breast and prostate cancers and recently in Duchenne muscular dystrophy and stress urinary incontinence (Gao, 2010; Dalton et al., 2011-2013; Crawford et al., 2016; Ponnusamy et al.,

2016a, 2016b). SARMs action is directed on androgen receptors of muscles (growth and strength) and bones (development) showing an interesting agonistic activity with a tissue- selective action in the steroidal signaling pathway (Naranayan et al., 2008; Haendler and

Cleve, 2012; Aikawa et al., 2015) and can have the same effect as androgenic drugs but be much more selective in their action retaining the anabolic activity with the feature of reducing side-effects due to the androgenic activity (Gao et al., 2006; Otto-Duesselet al., 2013; Dubois et al., 2015). Enobosarm exhibit properties that makes it an attractive anabolic agent to develop sporting performances among athletes and sporting animals, without side-effects and easy availability via Internet-based suppliers (Grata et al., 2011; Starcevic et al., 2013;

Hansson et al., 2014; Thevis et al., 2016). In this context, the zootechnical observations of the present study however on the effects of enobosarm on muscle tissue are not those that may have been expected in relation with the muscle anabolic action of AAS., Currently available data on SARMs agree that they do not lead to changes in body weight, but rather a weight stability due to a shift of fat to lean mass, both in rat (Kim et al., 2005) than in man (Dalton et al., 2011). Dubois et al. (2015) studied effects and action of enobosarm on muscle. They reported that body weight and body composition were not different between all groups of tested-mice. The same demonstration was obtained by Ponnusamy et al. (2016b), where body weight measurements and trend in lean muscle mass assessed by magnetic resonance imaging

(MRI) were not significantly affected. Likewise, all authors insist on the fact that the effect of an anabolic treatment is different depending on the considered categories of muscles. The action of enobosarm on live animal lean body mass (all skeletal muscles) is visible 8 weeks’ post-treatment while in experimental protocol the increase of levator ani muscle mass

122

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(specific androgenic muscle) is rapidly visible after 2 weeks post treatment, depending from the number of androgen receptors (AR) present. So, Dubois et al. (2015) showed that anabolic specific effect of enobosarm is due to a directly muscle AR activation and indirectly to a non- muscle AR pathway. In the same way, Ponnusamy et al. (2016 b) showed the ability of

SARMs to activate a little specific part of the androgen receptor without interaction with the amino-carboxy ends of the receptor probably responsible of the androgenic effects.

Furthermore, androgenic skeletal muscles are highly responsive on androgens whereas skeletal muscles of limb are relatively unresponsive to androgens depending of the great difference of number of AR protein presents in each kind of muscle (Sauerwein and Meyer,

1989; Dubois et al., 2015, Ponnusamy et al., 2016b).

Several additional hypotheses may be elaborated to further explain the absence of visible effects on live animals. The non-absorption of enobosarm in the digestive tract of the animals may be hypothesized, however, the analysis assessed by liquid chromatography coupled with spectrometry (LC/MS) of urine and feces taken from the calves highlighted the elimination of both phase I and phase II metabolites, demonstrating its digestive absorption and biotransformation (Beucher et al., 2017; Cesbron et al., 2017; Rojas et al., 2016). These results were also observed by de Rijke et al. (2013) on urine samples of calves. A second hypothesis may be that calves are not sensitive to the action of SARMs, either because of their young age and the high sensitivity of the hypothalamic-pituitary axis to negative feedback or because such stationary animals present less free androgen receptors that would be able to induce an effect (Sauerwein and Meyer, 1989; Schmidely, 1993b).

The dose and length of treatment in the present work was adapted from the only available study in livestock reporting pig as animal model (Dalton et al., 2016) and which consisted in the assessment of SARM S-2 on finishing pig growth performance after oral administration for 28 days. While the authors could observe a performance improvement it was not found 123

Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry significant. In a rat study published by Shankaran et al., the SARM GSK212A enhanced a dose-related increase in body weight and fat-free mass compared with control: modest and non significant effect at 10 days of treatment and a maximal response at 28 days at 0.3 mg/kg dose (low effect at 0.1 mg/kg and a plateau in effect at 1.0 mg/kg). Interestingly, the impact on phenotypic characteristics such as the animal size as assessed by body weight and fat mass were not observed while metabolic modifications of skeletal muscle proteins were highlighted after only 10 days of treatment (Shankaran et al., 2016).

In summary, zootechnical tools using a set of selected parameters evaluated by body measurements, ultrasonography and visual body score have been successfully assessed as eligible to monitor growth and development of calves in fattening production.

In the proposed application consisting in the evaluation of a new anabolic compound efficiency (in vivo bovine model), no effect on growth and development could be measured due to (i) a different androgen-base approached usually experimented with nonclinical in vivo models (AR ligands actions of levator ani muscle and measure of muscle weight) (ii) a dose- dependent treatment (ii) a short treatment course associated with a lack of sensibility of enobosarm on skeletal muscles (versus androgenic muscles) mostly involved in the general growth of living animals.

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Table 1: Selection of zootechnical parameters: seven measurements and two indices.

Parameters Methods

Assessment of growth

Body weight (BW) weighing scale (kg)

Growth rate average daily gain (ADG) a

Intake efficiency food conversion ratio (FC) b

Assessment of development

Bone development

Withers Height (WH) meter (cm)

Hips Width (HW) ruler (cm)

Muscular development

Heart Girth (HG) tape (cm)

Neck Width (NW) compass and rule c (cm)

Pelvis Muscle Depth (PMD) d ultrasonography mode-B (cm)

Adipose tissue development

Body Condition Score (BCS) rating scale e a δ BW/day (g/d) b δ intake/ δ BW c Tool developed for this study to measure the width of the neck in order to obtain an assessment of this area. The development of the forequarter is done first gradually in young growing animal. Figure 3 d Ultrasonography was used like to assess fat but oriented in this study to estimate the depth of the muscular part of the rump e This scale was adapted for young animal for this study with some modifications from the rating scale established by the Technical Institute of Cattle Breeding (Bazin, 1984) and the body condition scoring chart established by Edmonson (Edmonson et al.,1989) normally used for adult animals

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Table 2: Assessment of the repeatability of zootechnical parameters: five measurements for each selected parameter performed on 12 calves before the start of the study.

Parameters - method S(Y) a CV (%)b

Body weight (BW) – weighing scale 2.31 kg 2.7

Withers Height (WH) - meter 1.20 cm 1.3

Heart Girth (HG) - tape 1.53 cm 1.5

Neck Width (NW) - compass and rule 0.30 cm 2.4

Hips Width (HW) – ruler 0.58 cm 3.7

Pelvis Muscle Depth (PMD) – ultrasonography mode-B 0.24 cm 15.5

Body Condition Score (BCS) – rating scale 0.19 12 a standard deviation b coefficient of variation

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Table 3: Comparison of the 2 groups: five calves “control” and five calves “treated” a.

b c d Mean SD P-values P-values P-values

a a Control Treated Control Treated

Body weight (kg) 106.1 104.4 20 16 0.87 <0.001 0.79

e Average daily gain (g/d) 1200 867 261 477 0.12 0.04 0.35

f Food conversion ratio 2.43 2.79 0.25 0.72 0.26 0.23 0.31

Withers Height (cm) 96.0 96.8 5 4 0.23 <0.001 0.53

Heart Girth (cm) 108.4 108.4 10 6 0.91 <0.001 0.64

Neck Width (cm) 12.3 12.4 0.8 0.8 0.38 0.16 0.49

Hips Width (cm) 16.2 16.2 0.8 0.8 0.53 <0.001 0.74

Pelvis Muscle Depth 3.13 2.92 0.53 0.52 0.31 0.001 0.90 (cm)

Body Condition Score 1.7 1.8 0.4 0.4 0.75 0.46 0.28 a oral administration of 2.38 mg of enobosarm per day and per calf during 21 days b ANOVA, Group*Time effect: combined effect of treatment (growth resulting from enobosarm administration) and time (natural growth of the animal). Significate for P-value < 0.05 c ANOVA, Time effect: natural growth of the animal. Significate for P-value < 0.05 d ANOVA, Group effect: comparison between “control” group and “treated” group independently the time effect (growth due to enobosarm treatment). Significate for P-value < 0.05 e only for the periods D7-D13 and D14-D20 f only for the periods D7-D13 and D14-D20 and for four animals (exclusion of one animal)

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Figure 1. Body size measurements. WH: wither height with a meter, HG: heart girth with a tape, NW: neck width with a compass and a rule and HW: hips width with a ruler.

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Figure 2. Measurement of the pelvis muscle depth. A. Ultrasound scanning site corresponding to rump fat and gluteus medius muscle. Images was collected midway between the ilium and ischium. a) ischial tuberosity (pins). b) ilial tuberosity (hooks). c) great trochanter of femur. B. Echograms obtained in B-mode using 8-10 MHz linear transducer at 8 MHz frequency at a depth of 6 cm. +) subcutaneous adipose tissue, *) gluteus medius muscle, #) gluteus accessories muscle,

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Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

Figure 3. Body Condition Score (BCS) adapted with some modifications from the rating scale established by the Technical Institute of Cattle Breeding (Bazin, 1984) and the body condition scoring chart established by Edmonson (Edmonson et al.,1989).

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Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

Figure 4. Results of four statural measurements between group “Control” and group “Treated”.

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Article soumis à Journal of Agricultural and Food Chemistry

Figure 5. Results of pelvic muscle depth (in centimeters) between group “Control” and group “Treated”.

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Figure 6. Comparison of BCS between group “Control” and group “Treated”. The pictures represent the same “Control” calf at the beginning and the end of the study in the conditions to be observed for the notation.

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CHAPITRE 4 – Mise au point et application d’une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Objectif

Une approche globale de type métabolomique sera mise en œuvre sur différentes matrices biologiques afin de générer des profils discriminants signant l’administration d’enobosarm et de rechercher des biomarqueurs génériques de cette nouvelle famille d’agents anabolisants.

Introduction

Très rapidement, et en complément des stratégies analytiques de détection de résidus et de leurs métabolites, s'impose la recherche d'autres moyens et/ou marqueurs de l'usage des anabolisants car la fraude est aussi "innovante" et avant-gardiste que les techniques analytiques employées dans le contrôle. Concevoir de nouveaux designs pharmacologiques, masquer un produit en le mélangeant avec d'autres, le combiner en cocktail sous faible dose, le camoufler en molécules endogènes, amène à considérer la pertinence de rechercher les effets du résidu plutôt que sa présence en tant que telle. Le premier élément de réponse apporté est bien sûr l'identification et la caractérisation des métabolites d'un agent anabolisant issus des transformations biologiques et notamment ceux issus des biotransformations hépatiques (métabolites de phase I et de phase II). La molécule administrée n'est plus détectable mais son administration peut être objectivée via l'identification des molécules transformées retrouvées dans les matrices d'excrétion comme l'urine et les fèces. Cette approche est présentée dans le chapitre 2 pour l'enobosarm, notre travail ayant amené à la caractérisation d'une signature analytique de l'administration de l'enobosarm en termes de cinétique d'excrétion de l'enobosarm et d'identification de ses principaux métabolites en particulier de phase II. Ce type de signature reste toutefois ciblée puisqu’étroitement liée à la nature du résidu et que les composants de la signature sont des métabolites directs de la molécule administrée, pouvant être qualifiés de biomarqueurs d’exposition. Mais la démarche peut se poursuivre en recherchant les effets biologiques plus généraux générés par la prise d'anabolisant, et rechercher ainsi des biomarqueurs d’effet. Dans le chapitre 3, un premier axe de travail était de visualiser une modification de conformation des animaux et de l'objectiver en dressant une signature "phénotypique" des animaux "anabolisés". Même si les résultats ne sont pas significatifs quant à l'évaluation de la croissance par des paramètres zootechniques, la réaction biologique de l'organisme des veaux suite à l'administration orale d'enobosarm, était bien présente et la métabolisation de l'enobosarm effective. Dans ce sens, la recherche de biomarqueurs reflétant des modifications plus subtiles, physiologiques, de l'utilisation d'un anabolisant, semble être une alternative prometteuse. La métabolomique est une approche méthodologique apparue à la fin des années 2000, dans la continuité des autres "-omiques" que sont la génomique, la transcriptomique et la protéomique (Riedmaier, 2009). Tout comme ces autres approches, la métabolomique est utilisée dans divers domaines pour générer, de façon simultanée, un ensemble le plus large possible de descripteurs moléculaires caractéristiques d’un système biologique. In fine, ces descripteurs permettent de révéler des différences, souvent ténues, entre différents états (typiquement exposé versus contrôle) de ce système. La métabolomique est définie comme l'étude, à un instant donné, des métabolites (molécule de petite taille) dans un système délimité (une matrice) et accessible à l'analyse (chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse par exemple) qui permet de dresser une empreinte métabolique d'un individu ; il s'agit de caractériser un système biologique choisi (l'urine par exemple) via la mesure simultanée de tous les métabolites présents dans ce système afin

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique d'explorer les perturbations métaboliques sans impératif d’identification de la molécule en cause (l'enobosarm par exemple) et permettant de générer et de comparer des empreintes métaboliques pour de vastes ensembles d’échantillons (en élevage, animaux "traités" versus animaux "normaux").

Dans la détection de pratiques anabolisantes chez les animaux de production l'approche métabolomique et la caractérisation de métabolomes urinaire et plasmatique ont déjà été réalisées au sein du LABERCA basée sur le savoir-faire et les ressources en matière de chromatographie et de spectrométrie de masse : principalement en LC-HRMS, chez le cheval pour l'hormone de croissance (Kieken, 2009 ; Boyard-Kieken, 2011), chez le bovin pour les stéroïdes (Dervilly-Pinel, 2011 ; Regal, 2011a ; Jacob, 2014) et les β-agonistes (Courant, 2009 ; Dervilly-Pinel, 2014). Notre étude s'inscrit donc dans la continuité de ces travaux où il s'agira d'appliquer l'approche métabolomique à une nouvelle classe d'anabolisant les SARMs, sur une matrice déjà éprouvée, l'urine, et d'investiguer avec les mêmes techniques analytiques l'obtention d'empreintes métabolomiques sur des fèces de veaux traités par administration per os d'enobosarm.

Le schéma général de l’approche métabolomique employé dans le cadre de ce travail est représenté sur la Figure 30.

Prise d’empreintes métabolomiques Retraitement des données Expérimentation Préparation Acquisition des profils Déconvolution des données brutes Animale d’échantillons Échantillons Variables

m/z Filtration, Dilution, Contrôle conditions d’élevage GC-MS / LC-MS / RMN Récupération matrice d’intérêts Lyophilisation XCMS / MetAlign Analyse statistique Identification des biomarqueurs

Interprétation Robustesse des Elucidation structurale Contrôles biologique biomarqueurs

Composante principale 2 principale Composante Traités m/z Composante principale 1 Echantillons supplémentaires Littérature HRMS / MS-MS / RMN Analyse ciblée (SRM) ACP / OPLS

Figure 30 : Processus analytiques conduisant à l’observation (ou pas) de marqueurs d’effets consécutifs à l’exposition d’un animal de production à une substance active.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique Moyens mis en œuvre et optimisations

1. Protocoles de prise d'empreintes métabolomiques

Cette étape du protocole correspond à la partie du "workflow" tel que représenté sur la Figure 31.

Il s’agit ici d’une part de concevoir l’expérimentation animale support de l’étude, et de réaliser la préparation des échantillons et la prise d’empreinte analytique dans le respect des exigences inhérentes à ces stratégies analytiques, notamment en ce qui concerne la qualité associée au processus. Les précautions particulières relatives à cette étape sont détaillées ci-après.

Figure 31 : Premières étapes de l'approche métabolomique. Génération d'empreinte métabolomique sur des échantillons résultant de la mise en place d'un design expérimental adapté.

 Design expérimental

Lors de la définition du design expérimental, il est nécessaire de s’assurer que les variations biologiques d’intérêt (si petites soient-elles) puissent être valablement mesurées et qu’elles soient supérieures aux variations induites par la simple réalisation de l’expérience (variabilité biologique et biais expérimentaux) (Dunn, 2011). Il convient donc d’adapter le design expérimental afin d’être en accord avec le niveau d’interprétation biologique souhaité, et ce, en gardant à l’esprit qu’il impactera toutes les étapes suivantes du workflow. Lors de la planification du design expérimental, il est donc crucial de s’entourer, en amont de l’étude, de l’ensemble des chercheurs impliqués dans l’étude (biologistes, chimistes, statisticiens, bio-informaticiens…), ceci permettant de limiter au mieux les sources de variabilité grâce à l’expertise de tous.

Pour rappel, le design de l'expérimentation animale est décrit dans le chapitre 2 "Stratégies analytiques de détection de l'enobosarm" ; cette phase s'est déroulée selon le planning de prélèvements décrit dans le chapitre 2, Figure 19.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

2. Préparation et analyse des échantillons

 Matrice urinaire

De manière globale, l’urine est un fluide de choix pour l’analyse du métabolome de par son caractère non-invasif. Son niveau de complexité permet une préparation d’échantillons réduite ce qui limite la variabilité analytique classiquement inhérente à cette étape de préparation d’échantillon. S’agissant des études non-ciblées, les étapes de préparation idéales sont : non-sélectives, rapides, simples (peu d’étapes) et reproductibles (Vuckovic, 2012) tout en garantissant l’obtention d’une vue la plus globale possible de diversité des métabolites présents dans la matrice.

Dans la cadre de ces travaux de thèse, la préparation de l'urine a été adaptée des travaux précédents réalisés au sein du LABERCA (i) avec un focus sur la normalisation basée sur la mesure de la densité optique (Jacob, 2013), (ii) selon des conditions chromatographiques et spectrométriques optimisées pour la prise d'empreinte en LC-ESI(+)-HRMS (Courant, 2009 ; Boyard-Kieken, 2011 ; Dervilly-Pinel, 2014).

Trente échantillons (5 animaux "traités"/5 animaux "contrôles" pour trois temps cinétiques J7, J14 et J21) ont ainsi été préparés. La décongélation s'est effectuée dans la glace (+ 4°C) durant 2 heures (l'urine avait été préalablement aliquotée en eppendorf de 2,5 ml et congelée, quelques mois auparavant). Chaque échantillon a été homogénéisé (60 s de vortex) puis centrifugé (5 min, 5°C, 4000 tpm). La mesure des densités optiques a donné des valeurs comprises entre 1.007 et 1.030 et la normalisation a été effectuée en prenant comme référence la densité la plus faible. Le processus de normalisation s'est poursuivi par une dilution aqueuse de tous les échantillons au 1/5ème. Un volume de 200 µL d’urine normalisée est ensuite filtré/centrifugé (filtre à 10kDa à 30 min, 10 000 tpm, 5°C). Pour l'injection, 60 µL d'urine filtrée est mis en vial avec 10 µL de solution standard (Annexe IV)

Afin d’évaluer la qualité des empreintes analytiques obtenues, deux types de précautions analytiques sont prises comme suit :

. Des étalons internes deutérés (n=4) (L-leucine-5,5,5-d3, L-tryptophane-2,3,3-d3, indole-

2,4,5,6,7-d5-3_acide acétique, 1,14-acide tetradecanedioic-d24), chacun à une concentration finale de 5 ng/µL sont ajoutés dans chaque échantillon avant injection. . Des échantillons de contrôle qualité (QC) sont préparés. Le QC est un pool de l'ensemble des échantillons préparés et soumis à la même analyse ; il est préparé de façon systématique. Ce dernier permet d’évaluer les potentielles dérives analytiques. Il est donc réalisé en mélangeant des volumes équivalents provenant de chacun des échantillons de l’expérimentation. Lorsque la matrice est liquide, le QC pool peut être réalisé avant la préparation d’échantillon. Dans notre travail, le QC a été préparé après l'étape de normalisation (alignement sur la densité optique la plus basse et dilution aqueuse au 1/5ème).

Les conditions d’acquisition sont indiquées sur la Figure 32 ci-dessous :

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Figure 32 : Conditions de chromatographie liquide (LC) en phase inverse (RPC) couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) en mode d'ionisation électrospray (HESI) négatif et positif.

L’ensemble du protocole mis en œuvre pour la préparation des urines est schématisé sur la Figure 33.

Figure 33 : Protocole de préparation de l'urine en vue d'une analyse métabolomique non ciblée par LC-HRMS.

Un exemple d’empreintes globales chromatographiques est présenté ci-après sur la Figure 34, il illustre notamment l’importance de l’étape de normalisation des échantillons. Ainsi, le chromatogramme d’ions est plus exploitable après normalisation des urines.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

RT: 0.00 - 22.01 4.11 NL: 100 4.09 4.81E8 5.79 TIC F: FTMS 80 5.82 {1,1} - p ESI Full 4.07 5.77 ms 6.49 [65.00-1000.00] 60 5.74 MS 4.18 20150106-011 4.20 40 0.49 0.60 Relative Abundance 20 2.64 6.59 7.56 4.28 8.34 11.01 11.33 13.55 15.73 19.38 19.74 21.70 0 5.46 NL: 100 8.65E8 4.93 3.91 TIC F: FTMS 80 3.80 {1,1} - p ESI Full ms [65.00-1000.00] 60 3.70 MS 3.34 6.36 20141015-005 40 6.38 1.63 3.28 6.86 20 6.99 7.98 18.22 10.89 14.19 15.07 15.82 18.35 19.88 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Time (min) Figure 34 : Empreinte par analyse LC-HRMS. En haut, TIC (Total Ion Current) d'un échantillon Quality Control (QC) représentatif des 30 échantillons d'urine avec normalisation par la densité optique et la solution aqueuse au 1/5ème. En bas, TIC d'un échantillon contrôle qualité (QC) représentatif des 30 échantillons d'urine sans normalisation.

 Matrice fécale  Développements analytiques préalables

En ce qui concerne la matrice fèces, elle n'avait été investiguée au LABERCA que dans le cadre de recherche ciblée d'agents anabolisants déjà connus (stéroïdes) à l'intérieur d'un cadre de surveillance "exploratoire" des promoteurs de croissance ou nouveaux comme le bicalutamide (Rojas, 2016), mais jamais dans le cadre d’une étude métabolomique. La littérature rapporte peu d'utilisation de la matrice fèces dans le cadre de l'approche métabolomique non ciblée et il n'existe pas à ce jour de consensus de préparation des échantillons dans cette optique (Deda, 2015). Le cahier des charges de la préparation des échantillons en vue d'une analyse LC-HRMS non ciblée est un peu différent par rapport à une recherche ciblée. Les grandes tendances restent cependant (i) d'avoir à disposition un matériel facile à obtenir de façon non traumatisante et sur une large en échelle (idéalement en élevage avec prélèvement de nombreux animaux), (ii) supportant l'analyse en chromatographie et spectrométrie de masse et (iii) de manipuler le moins possible la matrice lors du processus métabolomique afin de préserver le maximum d'informations susceptibles d'enrichir les empreintes métabolomiques. Les précédents travaux en recherche ciblée ont déjà permis d'appréhender la complexité de la matrice fèces dans sa constitution (peu homogène car présence de nombreux éléments de nature différente, des bactéries au débris végétaux et des teneurs en eau variables) et la particularité, non négligeable, d'être une matrice d'excrétion non seulement de l'organisme mais d'être aussi un constituant indissociable du microbiote intestinal (Han, 2010 ; Matysik, 2016).

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique Dans notre travail, la première étape pour répondre à l'objectif d'utilisation des fèces en métabolomique non ciblée a été de "cerner" cette matrice à partir de la bibliographie, de proposer et d'optimiser un protocole de préparation des fèces avant de l'appliquer sur les échantillons prélevés dans le cadre de l’expérimentation animale conduite pour les besoins du présent projet. Plusieurs séries de tests ont été effectuées en s'inspirant de la préparation "classique" de l'urine en métabolomique (décrite précédemment) et des quelques méthodes de préparation fécale décrites dans la littérature dans le cadre d’études métabolomiques et lipidomiques chez le rat et l'homme (Gregory, 2013 ; Hou, 2016). De nombreuses optimisations relatives à la nature des fèces (fraiches ou lyophilisées), leur quantité initiale, les solvants d’extraction utilisés ont été réalisées dans le cadre de ces travaux et sont détaillées dans l’article scientifique présenté ci-après.

Le protocole retenu est celui qui répondait le plus aux critères de faisabilité, répétabilité et reproductibilité permettant d'obtenir des empreintes riches, répétables et reproductibles (Figure 35). De manière synthétique, le point départ de ce protocole est la manipulation de fèces dites "fraiches" sans étapes de lyophilisation ou de normalisation. Ensuite, les échantillons sont traités simplement et donc rapidement : homogénéisation mécanique "à la main", extraction au méthanol (1/3, M/V), centrifugation et filtration (filtre à seuil de coupure de 10 kDa). 10 µL d’étalons internes deutérés

(n=4) (L-leucine-5,5,5-d3, L-tryptophane-2,3,3-d3, indole-2,4,5,6,7-d5-3_acide acétique, 1,14-acide tetradecanedioic-d24)à 5 ng/µL sont ajoutés à 30 µL de fèces ainsi préparés avant injection.

Figure 35 : Protocole de préparation de fèces de veau en vue d'une analyse métabolomique en LC- HRMS.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique c:\26-sarms\data 2\20160310-047 03/11/16 08:46:33 FM A RT: 0.00 - 22.02 0.59 NL: 1.07E8 100 TIC F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms 80 0.62 [65.00-1000.00] 0.65 MS 20160310-047 7.43 Les 60conditions0.73 de chromatographie et de spectrométrie de masse sont identiques à celles appliquées 1.23 7.65 40 1.28 8.53 11.98 19.65 7.38 sur les échantillons1.50 2.88 3.89 d'urine4.94 5.91 telles6.29 que8.30 décrites9.21 précédemment11.30 (Figure 32). L'analyse19.80 d'échantillons 20 9.73 9.79 19.56 21.83 12.15 13.14 14.47 15.34 15.74 16.24 17.02 19.24 0 fécaux 0.57"test" a permis d'obtenir des profils chromatographiques apparemment richesNL: 9.67E7 en 100 0.60 TIC F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms 80 informationsc:\26-sarms\data 2\20160310-047 (Figure 36) et en03/11/16 particulier 08:46:33 sur la fraction polaire des métabolites ainsi [65.00-1000.00]que des MS 20160310-048 FM A60 0.73 7.44 RT: 0.00 - 22.02 1.31 métabolites40 moins polaires spécifiques7.56 de la matrice fèces. Ont ainsi rapidement19.68 été identifiés à ce 0.50 1.38 8.52 11.98 NL: 1.49E8 100 1.67 3.83 5.00 5.33 6.27 6.75 8.39 9.22 2.82 9.74 11.27 19.76 21.67Base Peak F: 20 12.13 13.18 13.93 15.28 19.50

Relative AbundanceRelative 15.68 FTMS {1,1} + p stade80 la stercobiline issue du métabolisme porphyrique par exemple16.24 17.14ou les dérivés des acides 0 ESI Full ms 0.59 NL: 8.15E7 60 [65.00-1000.00] 100 TIC F: FTMS {1,2} biliaires 0.86(Figure 37). MS 20160310-047 40 - p ESI Full ms 80 [65.00-1000.00] 0.63 MS 20160310-049 20 1.32 7.44 60 0.67 2.53 3.47 4.68 5.11 6.166.55 7.43 7.78 8.56 9.15 19.67 21.30 21.96 1.23 7.65 10.12 11.28 11.97 12.27 13.21 15.53 19.46 15.10 15.93 16.94 17.57 19.68 400 7.37 8.52 11.98 0.46 0.51 1.38 5.37 5.34 6.28 9.22 NL: 1.56E8 100 2.58 3.57 4.63 8.32 11.31 9.74 21.52 21.90Base Peak F: 20 12.13 19.54 12.77 13.85 15.02 15.48 FTMS {1,1} + p 80 15.88 16.68 19.24 0 ESI Full ms 0.58 [65.00-1000.00]NL: 9.92E7 10060 MSTIC 20160310-048 F: FTMS {1,2} 40 - p ESI Full ms 80 0.84 [65.00-1000.00] 20 1.33 MS 20160310-050 60 0.73 5.15 5.73 6.42 7.38 7.69 19.67 21.96 Relative AbundanceRelative 1.42 3.25 4.71 8.51 9.08 9.80 11.28 11.57 12.35 19.53 21.53 7.43 7.64 13.1515.29 15.67 16.12 16.94 400 1.33 0.48 5.36 11.99 19.66 NL: 1.70E8 100 1.52 2.78 3.86 5.31 6.40 7.36 8.53 9.21 11.30 9.75 19.83 21.91Base Peak F: 20 12.22 12.98 13.63 14.90 19.54 FTMS {1,1} + p 80 15.61 16.08 16.94 17.60 ESI Full ms 0 60 [65.00-1000.00] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22MS 20160310-049 Time (min) a 40 0.84 0.88 20 1.34 2.22 3.40 4.61 6.646.275.40 7.82 8.36 8.88 9.48 11.28 19.65 21.26 21.48 11.99 12.14 12.9615.01 15.47 15.93 16.88 17.51 19.53 0 0.49 NL: 1.63E8 100 Base Peak F: 80 FTMS {1,1} + p ESI Full ms 60 [65.00-1000.00] MS 20160310-050 40 0.84 0.87 1.32 20 1.98 2.48 3.43 3.80 4.12 5.37 6.55 7.41 7.92 8.41 9.22 9.83 11.29 19.67 21.39 21.73 11.98 12.30 13.11 14.91 15.44 15.84 16.64 17.46 19.49 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 b Time (min)

Figure 36 : Chromatogrammes d’ions (LC-HRMS Full scan) en mode ESI- (a) et ESI+ (b) correspondant à la prise d’empreinte d’un échantillon de fèces de veau.

Ces empreintes fécales obtenues, résultat d'une stratégie métabolomique non ciblée, sont rarement décrites dans la littérature, voire inexistantes en ce qui concerne l’espèce bovine. Lors de la

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique recherche bibliographie, le constat fait est que la plupart des études s'attachent à trouver des biomarqueurs, chez l’homme, signalant une discrimination entre deux populations (malades versus sains), révélant précocement une maladie ou la différentiant d'une autre (carcinome hépatique et cirrhose hépatique par Cao (2011)) ou fournissant des pistes d'explication d'un processus physiopathologique (les mécanismes de malabsorption chez les patients cirrhotiques par Huang (2013) ou de rejet de transplantation intestinale par Girlanda (2012)). Les chromatogrammes reportés dans les publications sont peu nombreux et souvent parcellaires car centrés sur les pics des molécules d'intérêts pour l'étude. L'intérêt de notre travail est bien de proposer une approche globale des modifications métaboliques résultant d'une pratique anabolisante. Par exemple, sur les Figure 36 et 37, sont bien visibles les zones d’élution des composés très polaires (temps de rétention compris entre 0,8 et 1 minute) avec des familles de composés de type amino-acides (hydroxyproline) et des zones où sont élués des composés moins polaires voire lipophiles tels les acides biliaires (temps de rétention entre 11 et 12,5 min). A noter sur cette même Figure, la présence d'une zone intéressante dans le cadre de l'investigation métabolique des fèces, celle correspondant aux produits de dégradation de l'hémoglobine (temps de rétention entre 7 et 8,5 min) naturellement éliminés dans l'urine et les fèces (urobilinogène et stercobiline).

 Faisabilité et pertinence du protocole développé – Preuve de concept.

Le protocole de préparation et de prise d’empreinte des fèces tel que développé plus haut a été éprouvé sur un premier jeu d’échantillons afin de s’assurer de sa pertinence à révéler des différences fines de métabolisme animal. Dans ce contexte, trois animaux du cheptel bovin résident d'Oniris ont été prélevés sur défécation spontanée :

- l'animal n°2765, bovin femelle Prim'Holstein de 7 ans avec troubles métaboliques en pâture depuis 6 mois par rapport au prélèvement, - l'animal n°6979, bovin femelle Prim'Holstein de 7 ans sans troubles cliniques en pâture depuis 6 mois par rapport au prélèvement, - l'animal n°5644 bovin femelle Prim'Holstein âgé de 11 mois en retard de croissance et avec une malformation de la face en stabulation stricte avec une alimentation à base de concentré et fourrage.

Ces animaux sont différents par leur âge (11 mois -jeune- versus 7 ans -adulte-), par leur alimentation (herbe et fourrage versus concentré et fourrages) et par leur état médical (trouble métabolique - carence en vitamine B12- versus déficit staturo-pondéral sévère et malformation versus aucun trouble). La pertinence de l’approche métabolomique-fèces développée précédemment a donc été évaluée au regard de son aptitude à différencier ces animaux. Les caractéristiques associées à ces animaux nous permettent en effet d’être en mesure d’attendre de la stratégie, non seulement des "séparations" entre individus à cause de leurs différences mais aussi des "regroupements" en fonction de caractéristiques communes (l'âge par exemple avec un jeune et deux adultes), sur la base de métabolisme et de productions de métabolites reflétant les statuts rapportés pour chaque animal. Une attention particulière a également été portée à la qualité des empreintes générées de sorte que chaque prélèvement a été traité cinq fois afin de vérifier la répétabilité de la préparation et de l'analyse.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique L’analyse de ces différents échantillons d’intérêt (et QC associés) est représentée sur la Figure 38. Les QC (n=10) apparaissent regroupés ce qui permet de répondre au critère de robustesse de l’analyse. Cette robustesse apparait encore plus forte selon une acquisition en mode positif. Les échantillons (n=5) par prélèvement de fèces de chaque animal apparaissent bien regroupés pour chaque bovin, montrant là encore la répétabilité de la préparation et de l’analyse ; cette observation là aussi est encore plus marquée après une acquisition en mode positif. Un échantillon de l'animal n°6979 et deux échantillons de l'animal n°5644 ont été exclus de l’analyse des données (outliers) suite à des problèmes techniques rencontrés durant leur préparation et ne permettant pas leur l'analyse.

L’application du protocole ainsi optimisé a bien permis de séparer statistiquement des clusters d'animaux en fonction de leur âge, de leur statut sanitaire et de leur alimentation. Cela est visible sur les scores plot en analyse en composante principale (ACP) et reflète le potentiel de discrimination sous-jacent pour la problématique associée au projet de thèse.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Figure 38 : Score Plot de l’analyse multivariée non supervisée de type ACP "Analyse en Composante Principale) représentant la modélisation d’un jeu de données d’empreintes fécales a) en mode négatif, b) en mode positif. Quality Control (QC), bovin femelle Prim'Holstein de 7 ans avec troubles métaboliques en pâture depuis 6 mois par rapport au prélèvement (2765 en bleu), bovin femelle Prim'Holstein de 7 ans sans troubles cliniques en pâture depuis 6 mois par rapport au prélèvement (6979 en vert) et bovin femelle Prim'Holstein âgé de 11 mois en retard de croissance et avec une malformation de la face en stabulation stricte et avec une alimentation à base de concentré et fourrage (5644 en rouge).

Ainsi, le protocole de préparation des fèces proposé dans ce travail, optimisé pour s'intégrer dans un processus métabolomique, est facile à mettre en œuvre : fèces dites "fraiches" rapidement utilisables post-prélèvement et supportant l'analyse par LC-HRMS. De plus, il répond aux critères de répétabilité et de reproductibilité permettant d'obtenir des empreintes riches, répétables et reproductibles. Lors de son application sur un premier jeu d’échantillons, ce protocole de préparation et de prise d’empreinte a montré sa pertinence à révéler des différences du métabolisme de chaque animal. La démarche adoptée de produire des empreintes et d'analyser les métabolites fécaux dans les deux modes, positif et négatif, présente également l'intérêt d’ainsi élargir le panel des composés analysés et par là même proposer une extension du métabolome investigué. Cette double caractérisation présente de surcroit l’avantage, lorsqu’un composé est ionisable en modes positif et négatif, d’avoir accès à des informations structurales additionnelles et complémentaires ce qui présente une forte valeur ajoutée lors des étapes ultérieures d’identification structurales des métabolites.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

L'ensemble des protocoles testés et l'optimisation d'un protocole est décrit dans une "Short Communication" soumise au journal Metabolomics et présenté à la fin de ce chapitre :

Cesbron N, Royer A-L, Guitton Y, Sydor A, Le Bizec B, Dervilly-Pinel G. Optimization of fecal sample preparation for untargeted LC-HRMS based metabolomics. Metabolomics 2017 Submitted

L'étape suivante de ce travail consiste à appliquer ce protocole développé pour la préparation des fèces à notre question de recherche, à savoir : la caractérisation non ciblée des fèces de bovins est- elle une stratégie pertinente pour mettre en évidence des profils spécifiques, voire des biomarqueurs, associés à une administration d’agents anabolisants ?

Résultats

Forts de la robustesse des protocoles développés ci-dessous, les travaux de thèse se sont ensuite attachés à générer des empreintes pour dresser une signature métabolique sur deux matrices d'excrétion, l'urine et les fèces, à partir des échantillons collectés lors de la phase expérimentale décrite dans le paragraphe "Expérimentation" du chapitre 2, sur deux catégories d'animaux, des veaux "Contrôle" (C) et des veaux "Traités" (T) à cinq temps cinétiques, à J0 (premier jour de l'administration per os d'enobosarm à la concentration de 1 ppm pour les animaux traités) et à J3, J7, J14, J21 (post administration quotidienne de la même quantité d'enobosarm aux mêmes animaux traités).

1. Précautions préalables nécessaires

Dans ce contexte, l'objectif est de générer des empreintes fiables pour discriminer deux populations par rapport à un traitement (administration d'enobosarm par voie orale). L'hypothèse est faite que les animaux ayant reçu l'enobosarm auront un métabolisme modifié du fait de l’action de l'anabolisant et donc présenteront dans les fèces des métabolites différents. Le défi est aussi que la maitrise du design expérimental doit permettre de ne voir que la différence liée au traitement et non les autres variabilités animales et/ou expérimentales. C'est pourquoi, une vigilance particulière a été portée sur la phase d'élevage des veaux durant l'expérimentation déjà présentée. Afin de minimiser les variabilités expérimentales, facteurs de biais pour notre étude, tous les animaux sélectionnés sont nés dans le même élevage et ont été soumis aux mêmes conditions (logement, alimentation lactée, prophylaxie) jusqu'à leur arrivée à Oniris. Ce sont tous des mâles entiers Prim'Holstein âgés de deux mois et demi (moyenne de 79 jours +/- 7,5 jours) et de poids similaires (86,5 kg +/ 9,5 kg). Ces veaux ont été élevés durant 25 jours dans le même lieu soumis aux mêmes conditions d'ambiance et de manipulation (2 manipulateurs vétérinaires pour la partie expérimentale et dans le cadre de cette thèse et deux animaliers du centre d'expérimentation).

2. Application des protocoles sur les matrices urine et fèces et analyse en LC-HRMS

L'approche métabolomique non ciblée par LC-HRMS a donc été appliquée pour étudier le profil métabolique lié à l'administration d'un anabolisant (l'enobosarm), per os à 5 veaux traités comparés à 5 veaux contrôles durant 21 jours via l’étude comparée de leurs urines et de leurs fèces.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique Le protocole de préparation des échantillons urinaires tel que décrit en Figure 33 a été appliqué. En ce qui concerne les fèces, le protocole de préparation des échantillons est basé sur le protocole décrit précédemment (Figure 35) mais avec un ajustement. En effet, une étape de filtration supplémentaire a été réalisée (filtre micropore à seuil de coupure 0,45 µm) pour s'assurer de l’élimination des particules plus grosses présentes dans les échantillons et par là même aboutir à une concentration des métabolites d’intérêt dans le filtrat ainsi obtenu (Figure 39).

Figure 39 : Protocole de préparation de fèces de veau en vue d'une analyse métabolomique non ciblée en LC-HRMS. Application aux échantillons de fèces prélevés sur 5 animaux contrôles et 5 animaux traités avec de l’enobosarm.

L’application des protocoles dédiés à la caractérisation des matrices urinaires et fécales tels que présentés précédemment a permis de générer les empreintes métabolomiques telles qu’illustrées ci- dessous en Figures 40 et 41.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Figure 40 : Chromatogramme d’ions (Full scan) en mode ESI positif. Profil chromatographique d’une urine d’un animal traité à J14. c:\26-sarms v6\data\20161109-012 11/09/16 20:08:11 9469 D0 RT: 0.00 - 22.02 12.07 NL: 1.55E8 100 Base Peak m/z= 7.01 65.0000-1000.0000 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms 0.82 7.82 19.68 50 9.41 11.22 19.78 [65.00-1000.00] MS 0.58 5.70 8.70 15.70 0.88 3.86 5.63 6.55 14.29 20161109-012 1.36 8.57 11.02 16.30 19.91 2.11 4.33 12.17 13.95 20.40 3.13 4.81 5.91 16.52 17.61 19.32 0 7.80 NL: 1.11E8 100 0.82 Base Peak m/z= 7.62 8.69 19.66 65.0000-1000.0000 F: 0.58 0.87 2.06 2.09 9.42 FTMS {1,2} - p ESI Full ms 50 8.57 [65.00-1000.00] MS 1.37 11.80 12.08 16.30 11.03 13.52 15.70 20161109-014 7.02 7.57 20.00 20.49 3.90 5.65 5.70 10.88 13.15 13.78 14.48 3.47 16.47 17.61 19.30 0 8.71 NL: 1.40E8 100 7.80 Base Peak m/z= 65.0000-1000.0000 F: 0.88 7.60 19.68 FTMS {1,2} - p ESI Full ms 50 1.99 12.10 [65.00-1000.00] MS 1.33 2.54 19.81 7.42 9.42 11.47 15.68 20161109-050 3.90 7.02 8.59 11.03 12.18 16.29 19.98 3.63 4.24 5.90 9.89 14.09 14.69 20.54 17.17 17.43 19.34

Relative AbundanceRelative 0 8.68 NL: 1.12E8 100 Base Peak m/z= 0.82 6.52 7.79 19.68 65.0000-1000.0000 F: 0.57 FTMS {1,2} - p ESI Full ms 0.86 5.68 7.06 1.97 12.10 [65.00-1000.00] MS 50 5.61 9.39 15.69 1.29 2.40 8.23 11.01 14.29 16.30 19.87 20161109-060 3.90 13.51 20.05 2.72 4.01 10.76 12.50 16.36 20.56 16.86 19.31 0 6.99 NL: 1.98E8 100 Base Peak m/z= 65.0000-1000.0000 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms 1.99 0.82 [65.00-1000.00] MS 50 2.38 7.60 19.67 6.57 7.78 8.68 12.10 20161109-069 1.01 5.72 9.39 16.31 5.62 9.71 11.39 13.54 14.30 15.31 20.05 2.73 3.92 5.84 13.22 17.64 19.34 20.57 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 a Time (min) c:\26-sarms v6\data\20161109-015 11/09/16 21:23:29 9469 D21 RT: 0.00 - 22.02 12.12 NL: 1.34E8 100 9.41 7.69 Base Peak m/z= 65.0000-1000.0000 F: 8.72 19.68 FTMS {1,2} - p ESI Full ms 0.59 6.54 7.10 50 0.62 5.71 7.83 [65.00-1000.00] MS 15.72 1.29 8.26 9.90 11.24 14.30 20161109-015 1.37 2.12 3.88 12.20 13.97 15.32 16.31 20.00 4.48 5.01 5.93 10.92 20.51 16.68 17.21 19.33 0 8.70 NL: 1.41E8 100 0.82 Base Peak m/z= 6.53 65.0000-1000.0000 F: 2.02 5.63 9.41 12.10 0.87 7.68 FTMS {1,2} - p ESI Full ms 0.59 7.06 19.66 50 1.35 8.58 11.02 [65.00-1000.00] MS 2.42 2.55 3.92 13.51 20161109-048 5.87 12.50 14.29 19.96 2.72 4.10 5.42 10.92 15.70 16.30 20.52 16.77 18.91 19.33 0 8.70 NL: 1.35E8 100 Base Peak m/z= 7.66 9.42 65.0000-1000.0000 F: 7.07 12.10 19.69 FTMS {1,2} - p ESI Full ms 0.59 0.82 7.79 50 5.71 6.53 [65.00-1000.00] MS 5.63 8.46 11.37 15.70 9.90 12.18 20161109-018 1.34 2.04 2.09 3.92 5.93 11.01 13.52 14.28 16.32 19.97 4.60 20.44 16.54 17.01 19.32

Relative AbundanceRelative 0 8.69 NL: 1.65E8 100 6.99 Base Peak m/z= 65.0000-1000.0000 F: 7.80 9.39 FTMS {1,2} - p ESI Full ms 50 0.82 5.69 6.53 12.09 19.67 19.76 [65.00-1000.00] MS 5.62 7.57 15.68 1.30 8.23 11.36 20161109-026 3.86 6.30 11.02 13.51 14.29 16.29 2.04 2.53 12.50 15.30 19.98 20.53 4.27 9.99 16.58 17.29 19.52 0 8.67 NL: 2.23E8 100 Base Peak m/z= 65.0000-1000.0000 F: 7.57 FTMS {1,2} - p ESI Full ms [65.00-1000.00] MS 50 0.86 7.65 12.09 1.97 7.03 9.39 19.66 19.76 20161109-064 1.35 2.38 6.52 11.46 14.27 3.88 5.56 5.69 8.43 11.37 12.50 16.30 19.97 3.53 9.87 14.09 15.65 17.63 19.33 20.48 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 b Time (min)

Figure 41 : Chromatogrammes d’ions (full scan) en mode ESI négatif. Profils chromatographiques des fèces de 5 animaux traités a) à J0 et b) à J21.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Pour les deux matrices d’intérêts, les profils chromatographiques apparaissent à première vue exploitables et riches en informations puisque nombreux pics sont visibles, fins et répartis sur l'ensemble du tracé en fonction du temps de rétention. Les différences de profils entre les empreintes urinaires et fécales permettent d’ores et déjà de spéculer sur la complémentarité des empreintes et donc l’accès à des métabolites différents. Ces profils ont donc été validés et leur exploitation initiée tel que présenté ci-après en détail.

3. Etudes des empreintes

3.1 Traitement des données et analyses statistiques

Dans l’objectif de comparer les empreintes métabolomiques entre les deux groupes d’intérêt, une étape préalable de traitement des données afin de les rendre exploitables et comparables a été réalisée par alignement et normalisation des signaux. Les données brutes ont ainsi été soumises à la correction des dérives de temps de rétention (alignement), la recherche des pics chromatographiques (peak picking), leur intégration et l'imputation des valeurs manquantes. Le pré- traitement des données a également permis une toute première analyse statistique des données (calculs de P-value, de coefficient de variation des QC) afin de traiter "manuellement" les données (tri et élimination selon des critères déterminés comme l’élimination des ions présentant un CV dans les QC >30% ou l’élimination des ions avec un temps de rétention trop faible, juste après le volume mort).

L’analyse des données ainsi "formatées" a ensuite pu être réalisée au moyen de statistiques multivariées, adaptées à ce type de données. L’objectif est ainsi d’extraire l’information pertinente en lien avec la question de recherche posée, i.e. de caractériser des empreintes spécifiques, voire des biomarqueurs, signant l’exposition des animaux à l’enobosarm. Classiquement ces outils statistiques mettent en œuvre une analyse non supervisée en composante principale (ACP) qui permet de vérifier la qualité de l’empreinte, notamment via le regroupement attendu des QCs, mais aussi de déterminer les éventuels échantillons de type ‘outliers’. Ensuite, une analyse de type supervisée telle l’(Orthogonal)-Partial Least Squares ((O)-PLS) est mise en œuvre pour étudier plus spécifiquement la question de recherche. Ces étapes s’insèrent dans le protocole métabolomique global, tel qu’illustré ci-dessous (Figure 42).

Figure 42 : Etapes de l'approche métabolomique. Retraitement des données et application des analyses statistiques.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Au cours des travaux de cette thèse et pour cette partie de retraitement et d’analyse des données, les logiciels utilisés sont les suivants :

- MSConvert pour convertir les fichiers bruts en .Raw en fichiers exploitables en .mzXML sur un tableur Excel. - Package R xcms et camera pour rechercher les pics chromatographiques et leur appliquer les modifications préalables à leur traitement (alignement, correction des temps de rétention, etc...) puis transformer le fichier de données tridimensionnelles (TR, temps de rétention, m/z, rapport masse sur charge et intensité) obtenu en un unique tableau bidimensionnel avec des lignes de variables "ion" nommé MxTy (x est le rapport masse sur charge m/z et y le temps de rétention de l'ion) et des colonnes avec l'aire/intensité du pic chromatographique associé à chacun des échantillons de l'étude.

Le choix des paramètres pour le traitement des données s’est appuyé sur les expériences passées en métabolomique au LABERCA et l'ensemble de ces paramètres a été enregistré afin d'en assurer la traçabilité et la reproductibilité ultérieure.

Ensuite le traitement statistique en analyses multi-variées a été mené avec le logiciel SIMCA P+, logiciel classiquement employé par les équipes de recherche dans le processus métabolomique et largement représenté dans les résultats publiés dans les revues internationales.

3.2 Etude des empreintes urinaires

Les échantillons d'urine des animaux traités (n=5) et contrôles (n=5), collectés à J7, J14 et J21, ont été analysés selon le protocole de préparation des échantillons et des conditions d'analyse LC-HRMS décrits précédemment (§ "Moyens mis en œuvre et optimisation", Figures 32, 33). Le traitement des données obtenues a permis de générer une liste de 1355 ions en mode positif, constitutifs de l’empreinte urinaire. Les données transformées pour diminuer la variabilité (mise en échelle logarithmique, Log et application d'un Pareto scaling) ont ensuite été soumises au traitement statistique multi-varié. Seule l'étude des empreintes urinaires en mode positif est présentée ci-après, le mode négatif n'ayant pas généré d’information supplémentaire pertinente au regard de la question de recherche posée.

 Analyse non supervisée en composante principale (ACP)

Cette étape sert surtout à visualiser une première fois le jeu de données et à trier les informations relatives aux qualités analytiques (robustesse et répétabilité).

Sur la Figure 43, les échantillons QC (en jaune) sont regroupés traduisant comme attendu une bonne répétabilité de l’ensemble du processus analytique, témoignant ainsi de la robustesse du protocole, et garantissant que la variabilité biologique étudiée devrait être supérieure à la variabilité analytique. Sont également observables sur cette même figure quelques échantillons dits "outliers " (1, 4, 10), ie. décrits comme en dehors de l’intervalle de confiance à 95 % (Ellipse de Hotelling). Ces échantillons ont été identifiés et la cause de leur dérive évaluée et reconnue (des problèmes techniques de

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique traitement lors de la préparation et des incidents de traitement lors de l'analyse chromatographique et spectrométrique). Ils ont alors été éliminés par la suite du traitement statistique.

Figure 43 : Analyse multi-variée non supervisée de type ACP (Analyse en Composantes Principales) et représentation du jeu de données urinaire combinant animaux traités à différents points de cinétiques (T7, T14 et T21) et contrôles (C7, C14 et C21). Les contrôles qualités (QC) sont représentés en jaune. Hormis les QC, chaque point représente un animal à un temps de cinétique donné.

Une fois la qualité de l'analyse vérifiée, l'étape suivante est de s'intéresser aux données recueillies caractérisant les deux groupes d'animaux étudiés.

 Analyse supervisée en PLS (Partial Least Square)

L’analyse PLS présentée ci-après (Figure 44) permet de séparer les deux classes d’animaux traités versus non traités. En plus de la séparation des échantillons "contrôles" (C) et des échantillons "traités" (T) on peut noter une dispersion plus importante des "traités" que des "contrôles" qui apparaissent quant à eux bien regroupés.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Figure 44 : Analyse multi-variée supervisée de type PLS (Partial Least Square) (Score plot) et représentation du jeu de données urinaire combinant animaux traités (entourés en rouge) à différents points de cinétiques (T7, T14 et T21) et animaux contrôles (entourés en bleu) (C7, C14 et C21). Chaque point représente un animal.

La séparation entre les deux catégories d'animaux apparait assez nettement, à défaut d'être bien marquée et on peut s'interroger sur la répartition en fonction des points de cinétique de l’expérimentation animale. Les clusters de temps sont plus dispersés dans le groupe des Traités que dans le groupe des Contrôles. Pour rappel, les animaux soumis à cette expérimentation sont en croissance et le temps impacte forcément sur la croissance ; en plus du traitement avec un anabolisant, les veaux, normalement, grandissent. Il apparait donc ici que les empreintes urinaires reflètent non seulement l’exposition à l’enobosarm mais également la croissance des animaux.

 Etude des ions impliqués dans la discrimination par analyse du S-Plot

Une représentation sous forme de S-plot permet de mieux visualiser les marqueurs responsables de la différence entre groupes (Figure 45). Chaque point (=une variable) sur ce graphique correspond à un ion. La forme du nuage indique au global une bonne discrimination des deux populations étudiées : plus il est en S par rapport à l'axe vertical, plus les extrémités sont représentées par des molécules contribuant le plus à la différence observée. Ces molécules sont dès lors considérées comme marqueurs potentiels de l’effet. Les deux extrémités du nuage de points correspondent, d’un côté aux signaux sur-représentés dans les urines de ces animaux traités, de l’autre à ceux sous- représentés chez ces mêmes animaux traités. A ce stade du processus, des signaux, donc des

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique candidats biomarqueurs, peuvent se dégager spécifiquement dans chacun des deux groupes d’animaux et expliquer la séparation entre groupes. Deux informations sont accessibles, le temps de rétention du marqueur et sa masse exacte.

Sur la Figure 45, le S n'est pas très proche de la ligne verticale, il est plutôt aligné sur une diagonale ne permettant pas de penser que les molécules formant le nuage sont très différentes pour un groupe ou pour un autre. Cependant, quelques ions semblent se dégager sur les extrémités et ont été investigués plus avant. Malheureusement, leur analyse approfondie (profil chromatographique notamment) n'a pas permis de mettre en évidence des marqueurs robustes et intéressants.

 Validation du modèle

Si aucun candidat biomarqueur ne nous a semblé individuellement pertinent après analyse du S-plot, il nous a toutefois paru nécessaire d’évaluer les performances d’un modèle descriptif voire prédictif qui combinerait l’ensemble des signaux précédemment retenus et expliquant la discrimination observée sur le score plot de l’analyse PLS (Figure 44). Ainsi, si la qualité analytique du processus métabolomique est assurée via l’utilisation de contrôles qualités (QCs, étalons internes, ….), la qualité du retraitement statistique et les performances des modèles proposés doivent être évaluées et validées. Plusieurs outils sont disponibles dans le domaine parmi lesquels le test de permutation, un exemple de test combinatoire. Ce test permet d'évaluer la robustesse du modèle généré par le traitement statistique. Les coefficients regardés et comparés sont R2 qui décrit le modèle obtenu avec le jeu de données (si R2 = 1, la description est parfaite) et Q2 qui relève du potentiel de prédiction associé au modèle (si Q2 = 1 la prédiction est parfaite ; le logiciel et la littérature recommande un Q2 > 0,5 pour une très bonne prédiction). Le test est considéré comme valide lorsque les valeurs de R2et Q2 obtenues par permutation successives conduisent à des valeurs

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique nettement inférieures aux valeurs d'origine. Dans ce cas, et tel qu’illustré en Figure 46, le modèle est considéré comme valide, c'est-à-dire qu’il n’est pas le fruit du hasard.

Sur la Figure 46, le jeu de données testé comprend 2 composantes explicatives. Les performances du modèle initial sont les suivantes : un R2 = 0,85 et Q2 = 0,63. Après 20 permutations, le test, en particulier pour le critère descriptif R2 ne permet pas de conclure à la validité du modèle, en dépit d’une significativité du test éprouvée par calcul de la p-value du modèle (p-value = 2.68725e-005).

Figure 46 : Validation du jeu de données urinaire par le test de permutation. P-value = 2.68725e-005

Finalement, la génération des empreintes et le traitement statistique des données issues de l'analyse urinaire n'ont pas amené à conclure à une discrimination significative entre les veaux "Contrôles" et les veaux "Traités". Il existe une légère tendance à la séparation des deux catégories d'animaux (deux "groupes" distincts visibles sur la Figure 44) mais le S-Plot ne permet pas de dégager de signaux pertinents (Figure 45) et malgré une significativité du modèle évaluée pertinente (p-value < 0,05), le test de permutation s'est révélé invalide (Figure 46). Les différences entre les deux populations d'animaux sont probablement très ténues et d’éventuels biomarqueurs d’effets n’ont pu être mis en évidence par cette approche dans les urines étudiées.

La même démarche va être appliquée sur la matrice fèces afin de voir si celle-ci est plus pertinente et si la génération des empreintes et l'analyse statistique se révèlent plus informatives et significative.

3.3 Etude des empreintes fécales

Les échantillons de fèces des animaux traités (n=5) et contrôles (n=5), collectés à J0, J3, J7, J14 et J21, ont été analysés selon le protocole de préparation des échantillons (Figure 39) et des conditions d'analyse LC-HRMS décrits précédemment (Figure 32). Le traitement des données obtenues a permis de générer une liste de 1299 ions en mode négatif et 810 ions en mode positif. Les données transformées pour diminuer la variabilité (mise en échelle logarithmique, Log et application d'un Pareto scaling) ont ensuite été soumises au traitement statistique multi-varié.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

 Analyse non supervisée en composante principale (ACP)

Sur la Figure 47, sont visibles (i) le regroupement des QC (sauf l'échantillon n°11, erratique car le vial s'est renversé lors de l'analyse) et la dispersion des échantillons pour tous les animaux, traités représenté en rouge et contrôles représentés en vert. Une première lecture critique nous a permis de noter le regroupement et l'isolement des échantillons pour différents temps cinétiques d’un même animal : n°8471 pour les échantillons 058, 061 et 068. Cette tendance se retrouve pour les échantillons 044 et 057 de l'animal n°5136. Ces deux animaux faisant partie du groupe « contrôle ».

Les mêmes observations ont à ce stade été faites sur le jeu de données acquis selon une ionisation en mode positif. Cette analyse en ACP oriente bien vers la confirmation de la robustesse de l'analyse réalisée sur les fèces, autorise l'élimination des outliers mais amène également à se poser la question de la différence entre certains individus comme vu lors de la phase de test de la matrice fèces (paragraphe "Faisabilité et pertinence du protocole développé – Preuve de concept"). Ainsi et tel que visible sur cette ACP, l'animal 8471 se détache du jeu de données global. Ce type de graphique, sensé le mieux représenter la variabilité des échantillons, laisserait ainsi supposer que cet animal présenterait une particularité biologique par rapport aux autres animaux, d'autant plus qu'il fait partie du lot Contrôle et qu'il n'a pas reçu d'agent anabolisant. La reprise des informations relatives à l'expérimentation animale nous a permis de constater a posteriori que cet animal était un IPI (Infecté

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique Permanent Immnuno-tolérant) vis à vis du virus de la diarrhée virale bovine (BVD, Bovine Viral Diarrhea). Cette infection, lorsqu'elle est contractée par des femelles bovines gestantes entre le 40ème et 125ème jours, entraine le développement in utéro et la naissance ensuite de veaux devenus tolérants vis à vis du virus mais normaux en apparence ou pouvant présenter des retards de croissance (retard marqué voire absence de développement staturo-pondéral de l'animal) et dans une moindre mesure des malformations (du système nerveux central, des poumons et du squelette appendiculaire). Malheureusement une partie de notre question de recherche concerne la croissance (staturale et pondérale), ses modifications suite à l'administration d'un promoteur de croissance...et heureusement les outils statistiques employés déjà à ce stade nous confortent toujours dans la partie de notre question de recherche qui est de discriminer "biologiquement" des animaux présentant des différences physiologiques suite à un traitement avec un agent anabolisant. Un tel animal vient donc perturber le jeu de données et sera suivi particulièrement pour la suite du traitement statistique. A remarquer que cet animal n'avait pas été "repéré" lors de l'étude des empreintes urinaires, en revanche il avait été très bien repéré lors du suivi de ses performances de croissance et que la métabolomique sur fèces est peut-être en conséquence bien une méthode pertinente pour dépister métaboliquement les modifications de la croissance.

 Analyse supervisée en PLS (Partial Least Square), test de permutation et S-Plot en mode négatif

Contrairement à l'urine, dont l'analyse a principalement été faite selon un mode d’ionisation positif (comme vu dans la littérature et avec les travaux précédents menés au LABERCA), c'est le mode d’ionisation négatif qui a été investigué en premier avec la matrice fèces, les empreintes globales paraissant plus informatives.

Sur la Figure 48, en haut, le score plot de la PLS permet d’observer la séparation entre les animaux contrôles (entourés en vert) et les animaux traités (entouré en bleu) ; Il apparait également que cette analyse permet d’identifier des clusters relatifs aux points de cinétique de l’expérimentation. En particulier le temps cinétique 0 où les contrôles (C0) et les traités (T0) sont assez proches. Ce qui est logique puisque les échantillons correspondent, pour les deux populations, au même moment où il n'y pas encore de différence attribuable à l'administration de l'enobosarm.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Figure 48 : En haut : Analyse multi-variée supervisée de type PLS (Partial Least Square) (Score plot) et représentation du jeu de données combinant animaux traités (T, carré bleu) et contrôles (C, rond vert). Chaque point représente un animal à temps cinétique (T0, T3, T7, T14 et T21 ; C0, C3, C7, C14 et C21). En bas : Validation du jeu de données par le test de permutation.

Sur la Figure 48, en bas, le jeu de données intégrant 3 composantes explicatives a été testé par 200 permutations. Les performances du modèle initial sont les suivantes : un R2 = 0,85 et Q2 = 0,65. Après 200 permutations, le test, en particulier pour le critère descriptif R2 ne permet pas de conclure à la validité du modèle.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique Sur la figure 49, La forme du nuage de molécule s'aligne sur l'axe vertical et une molécule se détache très nettement. L'analyse de l’ion correspondant (M338T691) nous a très rapidement conduit à identifier l'enobosarm.

Au regard des résultats relatifs à l’élimination de l’enobosarm tels que décrits dans le chapitre 2, il n’est pas étonnant que ce résidu soit présent dans l’empreinte globale, notamment en raison des quantités excrétées et du mode d’ionisation utilisé similaire à celui mis en œuvre dans l’approche ciblée. Il est aussi tout à fait attendu que si détectable, cet ion, marqueur d’exposition, soit le marqueur principal de la discrimination entre les deux populations. Si sa détection dans l’empreinte valide l’approche analytique, en revanche, elle ne renseigne pas à ce stade sur d’éventuels marqueurs d’effet pertinents.

La détection de l’enobosarm dans l’empreinte globale a toutefois permis de compléter les informations relatives à son élimination. Ainsi plusieurs aspects ont été repris à partir des empreintes fécales obtenues (Figure 50 et 51) confortant les observations réalisées au chapitre 2.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Figure 50 : Informations complémentaires relatives à la détection de l’enobosarm dans l’empreinte fécale globale. A gauche, chromatogrammes d’ions correspondant à l'échantillon fécal d'un animal traité avec de l'enobosarm depuis 14 jours (animal n°2309, traité, prélèvement à J14) a) pic chromatographique de l'ion M388T691 correspondant à l'enobosarm [M-H]- observé à m/z 388et de temps de rétention 11,5 minutes (691 secondes). b) Chromatogrammes d’ions (LC-HRMS) en mode ESI- (Full Scan) et c) en mode ESI+ (Full Scan) correspondant à la prise d’empreinte d’un échantillon de fèces de veau traité. d) absence de pic chromatographique de l'enobosarm en mode positif. A droite en haut, chromatogrammes de l'ion M388T691 pour les fèces d’un veau contrôles (en vert) et les fèces d’un veau traité (en rose) à différents points de cinétique et à droite en bas représentation en Box Plot de l’évolution moyenne des intensités du signal de l’enobosarm en fonction du temps.

Mais cette approche métabolomique non ciblée n'avait pas pour objectif de retrouver le résidu de molécule administrée. Nous restons bien dans une optique de développer une approche sans a priori sur le composé utilisé et la mise en lumière de métabolites biomarqueurs spécifiques de la signature métabolique d'un phénomène de croissance lié à la prise d'un agent anabolisant.

Pour explorer plus avant le jeu de données et faciliter l’interprétation de la séparation des deux groupes C et T, le jeu de données a ensuite été travaillé afin de maximiser les conditions pour observer les différences. Sur la Figure 51est ainsi représenté le résultat de l’analyse de type Orthogonal-Partial Least Squares ((O-PLS), mise en œuvre pour représenter plus spécifiquement la question de recherche et n’explorer que la variabilité associée. Les animaux traités apparaissent ainsi

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique nettement séparés des contrôles d'autant plus que les données relatives au temps cinétique J0 du groupe traité ont été retirées afin d'éclaircir la représentation.

Ainsi en mode négatif, sur la base d'empreintes obtenues à partir des échantillons de fèces, (i) il est possible de séparer les animaux contrôles des animaux traités avec de l'enobosarm (ii) de séparer sur un ensemble de métabolites, au moins un animal différent fondamentalement sur l'aspect de la croissance (staturale et pondérale, un IPI) (ii) et de mettre en évidence le résidu de la substance administrée, quoique d’intérêt relatif dans ce contexte.

Il apparait ainsi à ce stade de l’étude que le protocole développé donne accès à une empreinte fécale globale pouvant être considérée comme une signature de l’exposition à un agent anabolisant émergent.

La recherche d'ions discriminants, potentiels biomarqueurs n'a toutefois pas été fructueuse. Ceci peut être dû au fait que la discrimination entre les deux groupes d’animaux est la résultante de l’empreinte totale, constituée d’un très grand nombre de métabolites et qu’en extraire quelques-uns uniquement ne permet plus de soutenir le modèle. En d’autres termes, au sein de cette empreinte fécale acquise après ionisation en mode négatif, aucun ion ou sous-groupe de quelques ions ne peut être considéré comme biomarqueur.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

 Discussion

Au regard du protocole mis en place (extraction de la fraction polaire de métabolome fécal et ionisation en mode négatif), et sur la base des connaissances relatives au métabolisme animal, nous aurions pu nous attendre à ce que certains métaboliques soient repérés comme pertinents, en particulier certains acides aminés. Par exemple, la lysine, acide aminé essentiel, est fortement impliquée dans la croissance et l'immunité d'un organisme ou la proline avec ses composés métabolisés, comme l'hydroxyproline, sont impliquées dans la voie de la synthèse du collagène VI, constituant de la matrice extracellulaire du muscle squelettique. Ces molécules, sur la base de leur participation au processus anabolique, pourrait être un reflet quantitatif du turnover anabolisme/catabolisme des protéines présentes dans le métabolisme de la masse musculaire maigre, et donc de potentiels biomarqueurs d’intérêt. Une étude plus approfondie et ciblée des empreintes a alors été entreprises en ce sens. Sur la Figure 52, sont représentées les intensités des pics chromatographiques d’intérêt ; proline, lysine et hydroxyproline sont détectés dans les fèces avec des intensités de signaux relativement élevées. A première vue pas de différences visibles toutefois pour ces acides aminés entre les animaux traités (à droite de la figure) et les animaux contrôles (à gauche de la figure). Cependant, nous constatons que les intensités les plus fortes sont retrouvées chez des animaux particuliers : parmi les animaux "contrôles" l'animal n°8471 (encadré en rouge), l'IPI, en retard de croissance avéré et "physiologiquement" dans l'incapacité de grandir et parmi les animaux traités", l'animal n°2220 (encadré en jaune), veau arrivé petit en début d'expérimentation, est toujours resté le plus petit du lot durant la phase d'engraissement. Aucune récupération du retard de croissance n’avait de surcroit été mise en évidence chez cet animal suite au traitement à l’enobosarm.

Figure 52 : Graphe des pics d'intensité de la lysine, la proline, la glycylproline et l'hydroxyproline dans les échantillons fécaux de l'étude.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

 Analyse en O-PLS (Partial Least Square) et S-Plot en mode positif

De manière similaire à l’analyse de l’empreinte acquise en mode négatif tel que décrit plus haut, nous avons lors de cette étape, volontairement exclu des données les échantillons du jour J0. De plus, nous avons exclu l'animal IPI, trop atypique dans le lot contrôle et perturbant l'analyse statistique et l’établissement du modèle.

L’O-PLS présenté sur la Figure 53 et relative à l’empreinte fécale acquise selon le mode d’ionisation positif, montre une séparation nette entre animaux traités (entourés en rouge) et animaux contrôles (entourés en vert). Les animaux traités sont d'ailleurs assez regroupés sur les clusters temps J14 et J21, soit après 15 jours de traitement quotidien avec l'enobosarm. Il semble ici que la croissance naturelle des animaux soit un facteur moins présent dans l’empreinte et que cette dernière soit en conséquence plus spécifique à la question de recherche.

Figure 53: Analyse multi-variée supervisée de type O-PLS (Orthogonal Partial Least Square) (Score plot) et représentation du jeu de données fécal acquis en mode d’ionisation positif combinant animaux traités (T, triangle rouge) et contrôles (C, rond vert). Chaque point représente un animal à temps cinétique (T3, T7, T14 et T21, C3, C7, C14 et C21). Les temps C0 et T0, et l'animal n°8471 ont été retirés du jeu de données.

Le jeu de données intégrant 3 composantes explicatives a également été testé par 200 permutations. Bien que les performances initiales du modèle soient encourageantes (R2 > 0,9 et Q2 > 0,6) le test ne permet pas de conclure à la validité complète du modèle, en particulier pour le critère de prédiction Q2. Le pouvoir descriptif du modèle en revanche mérite qu’il soit retenu à ce stade et que les ions intéressants soient caractérisés car spécifiques de la différence entre les deux groupes d’animaux.

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique Les ions associés à cette discrimination ont alors été étudiés via la représentation S-Plot de ce jeu de données (Figure 54). La forme du nuage de molécule s'aligne sur l'axe vertical et des ions se détachent spécifiquement. Une sélection de certains ions d’intérêt a ensuite été réalisée, sur la base (i) de la P-value calculée lors de l'étape de prétraitement des données, (ii) des profils chromatographiques associés si jugés pertinents et (iii) de l’évolution cinétique si corrélée à l’administration d’enobosarm. Ont ainsi retenus notre attention quelques ions de la famille des acides aminés et en particulier ceux se présentant sous la forme de dipeptides (molécule constituée de deux résidus d'acides aminés liés par une liaison peptidique, issue de la dégradation des protéines alimentaires). Ces molécules peuvent présenter un intérêt car elles sont issues du métabolisme incomplet ou perturbé des protéines (catabolisme ou anabolisme). Comme le mode d'action des anabolisants est supposé agir sur cette voie métabolique, de tels métabolites pourraient se révéler d’intéressants biomarqueurs d'une réponse anabolique. Ont ainsi été caractérisés plus avant les ions M274T555 (Figures 54) et M280T586 (Figure 55). Ces deux ions, présents dans la partie supérieure droite du S-plot sont ainsi sur-excrétés dans les fèces des animaux traités en comparaison de l’excrétion chez les animaux non traités. Il a été possible de proposer des structures associées, et d’assigner l’ion M274T555 au dipeptide composé d’arginine et de lysine et l’ion M280T586 au dipeptide constitué d’asparagine et de phénylalanine.

Figure 54 : Caractéristiques associées à l'ion M274T555

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique

Figure 55 : Caractéristiques associées à l'ion M280T586

Il conviendrait à présent d’explorer plus avant les voies biologiques impliquées pour comprendre les raisons sous-jacentes à cette excrétion accrue de ces di-peptides dans les fèces en réponse à un traitement anabolisant. Au regard du nombre de signaux a priori impliqués dans la discrimination et tels que visibles aux extrémités du S-plot, il conviendrait également de poursuivre l’identification des ions responsables de la spécificité de l’empreinte au regard de la question de recherche posée.

Pour conclure sur les empreintes fécales acquises en mode positif, il a été possible de générer des empreintes informatives autorisant la séparation des animaux contrôles et des animaux traités. La manipulation du jeu de données par les exclusions d'échantillons jugés peu informatifs ou d'échantillons trop atypiques pour la question de recherche a permis de mettre en évidence une bonne capacité de cette stratégie à discriminer les deux catégories d'animaux étudiés, et valider ainsi le type de signature proposée dans le cadre de ces travaux de thèse.

De même que ce qui avait été observé en mode négatif, le modèle proposé s’il permet une bonne description du métabolome fécal (R2) ne démontre pas les performances de prédiction (Q2) attendues à ce stade pour être considéré comme un outils de prédiction du statut des animaux. Il est toutefois classique dans ce type d’études métabolomiques que les modèles générés sur la base d’une

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique première expérimentation animale ne présentent pas les performances de prédiction souhaitées. En effet, le design expérimental, quoi que répondant a minima aux exigences et contraintes associées à ce type d’étude, ne permet pas, pour des raisons de faisabilité et économiques évidentes, d’impliquer un grand nombre d’individus et en conséquence de disposer d’un grand nombre d’échantillons. Ceci impacte forcément la significativité des modèles générés, et plus particulièrement l’extrapolation des modèles, c'est-à-dire leur pouvoir de prédiction. Les études disponibles dans la littérature ont en effet montré une augmentation très nette du paramètre Q2 lorsque davantage d’échantillons sont ajoutés dans les modèles. Cette étape est nécessaire et constitue l’étape suivante à ce travail.

Conclusion

Dans le cadre de ces travaux de thèse, l'approche métabolomique non ciblée ambitionnait de proposer une signature spécifique permettant de dépister des animaux ayant reçu un traitement anabolisant sur la base d'un profil métabolique modifié par rapport à des animaux non exposés.

Dans cet objectif, nous avons imaginé et mis en œuvre un design expérimental répondant aux contraintes de ce type d’approche non ciblé. Afin de compléter l’empreinte urinaire, nous avons développé un protocole permettant de caractériser le métabolome fécal également. L’application de ces protocoles robustes aux matrices collectées dans le cadre de l’expérimentation animale a montré la pertinence de la stratégie puisque des empreintes spécifiques aux animaux traités ont pu être obtenues. La démarche adoptée de produire des empreintes et d'analyser les métabolites fécaux dans les deux modes d’ionisation, positif et négatif, présente également l'intérêt d'avoir élargi le panel des métabolites potentiels marqueurs sur des voies métaboliques d'intérêt lors d'une pratique anabolisante. A ce stade un petit nombre de candidats biomarqueurs a pu être listé. Ces métabolites n’avaient pour le moment jamais été mis en évidence dans la cadre d’études métabolomiques dont l’objet d’étude était les anabolisants (stéroïdes, -agonistes).

Comme dans toute approche métabolomique, cette première étude constitue la preuve de concept et montre qu’il y a matière à poursuivre les travaux. En effet il conviendrait maintenant de conforter ces premières observations par la réalisation d’un "challenge" test, étape nécessaire en métabolomique et consistant en la reconduite de l’expérimentation animale impliquant d’autres individus. L’observation des mêmes empreintes et candidats biomarqueurs permettra alors de conclure à la pertinence des modèles proposés. Ces derniers devront ensuite être validés, i.e. que leurs performances soient établies sur les aspects notamment de spécificité, sensibilité, performances (% faux positifs, faux négatifs), etc…

Dans un contexte de mise en place de l’outil pour le contrôle d'une pratique anabolisante, nos résultats ont montré que l'approche métabolomique sur la matrice urinaire était peu sensible et que les modifications biologiques visibles au travers de l'élimination urinaire étaient ténues pour permettre de discriminer des animaux dopés. En revanche l'approche métabolomique sur la matrice fèces a donné des résultats plus prometteurs : la séparation des groupes traités et contrôles s'est bien faite et l'approche a même permis de distinguer un individu au profil métabolique de croissance

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Chapitre 4 - Mise au point et application d'une stratégie analytique globale, non ciblée, de type métabolomique très atypique. De plus, le protocole de préparation des fèces proposé dans ce travail, optimisé pour s'intégrer dans un processus métabolomique, est facile à mettre en œuvre, adapté au contrôle de séries sur une large échelle.

Enfin, il convient de rappeler que les protocoles ici mis en œuvre ont permis d’explorer le métabolome polaire. Au regard des connaissances du métabolisme des jeunes bovins, il serait intéressant de générer, via une extraction spécifique de type Bligh & Dyer (1959), une empreinte moins polaire et rechercher dans ces empreintes des métabolites pertinents associés à la question de recherche. Ainsi, des métabolites issus du métabolisme des acides gras polyinsaturés comme l'acide arachidonique présent dans les phospholipides, abondants dans le cerveau le muscle et le foie, précurseur dans la biosynthèse d'une grande famille que sont les eicosanoïdes (avec les leucotriènes, les prostaglandines, les prostacyclines, les thromboxanes, par exemple) seraient d’intérêt. Egalement, dans la fraction lipidique, il est possible de retrouver les métabolites issus du métabolisme des acides biliaires (acide cholique produit par le foie, acide dimérique chénodeoxycholique, acide biliaire secondaire et sous-produit du microbiote intestinal) et les produits de dégradation de l'hème (l'urobilinogène glucuronide de phase II de la bilirubine, l'urobiline résultant de l'oxydation de l'urobilinogène et éliminée par les urines, stercobiline résultant de l'oxydation de l'urobilinogène aussi mais éliminée par les fèces). Ces voies métaboliques sont fortement ancrées dans les organes que sont le foie, les muscles et le tube digestif et fortement impliquées dans les processus de croissance cellulaire et organique. Cet aspect lipidique du métabolome fécal mériterait d'être étudié via la mise en œuvre de stratégies analytiques adaptées (chromatographie en phase HILIC, lipidomique).

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Article soumis à Metabolomics

Optimization of fecal sample preparation for untargeted LC-HRMS based metabolomics

N. Cesbron1, A.-L. Royer, Y. Guitton, A. Sydor, B. Le Bizec, G. Dervilly-Pinel1

LUNAM, LaBoratoire d'Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA), Oniris, BP 50707, 44307 Nantes Cedex 3, France 1 Corresponding author. Email: [email protected] Tel: +33 2 40 68 78 80 Fax: +33 2 40 68 78 78

ABSTRACT . Introduction: Collecting feces is easy. It offers direct outcome to endogenous and microbial metabolites. . Objectives: In a context of lack of consensus about fecal sample preparation, especially in animal species, we optimised a robust protocol allowing untargeted LC-HRMS fingerprinting. . Methods: The conditions of extraction (quantity, preparation, solvents, dilutions) were investigated in bovine feces. . Results: A rapid and simple protocol involving feces extraction with methanol (1/3, M/V) followed by centrifugation and a step filtration (10 kDa) was optimised. . Conclusion: The workflow generated repeatable and informative fingerprints for robust metabolome characterization.

KEY WORDS Feces, Fingerprinting, Sample preparation, High-throughput, Ruminants, Bovine

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Article soumis à Metabolomics

INTRODUCTION

Feces has long been considered a reference matrix in the following contexts: (i) in parasitology for the detection of eggs, larvae and even DNA of intestinal parasites (Van Lieshout and Roestenberg 2015), (ii) in microbiology for the detection of various pathogens (Rhoades et al. 2009), (iii) for monitoring the use of veterinary drugs (Berendsen et al. 2015) or banned substances such as growth promoters (Cesbron et al. 2016; Rojas et al. 2016). The composition of feces is complex and contains, besides unabsorbed metabolites, elements of different nature (solids, plant debris, bacteria). The bacteria come from the digestive tract and constitute the intestinal microbiota. This gut microbiota varies according to species, age and also according to diet. Variations of the gut microbiota in terms of population of bacteria and metabolites produced can be observed together with modifications of host metabolism affected by e.g. disease, dietary modulation or therapeutic intervention (Han et al. 2010). Recently, Hou et al. (2016) reported on the range of metabolites accessible through feces-based metabolomics. Overall, feces presents the main advantage over urine and blood of the collection ease directly on the animal in breeding conditions. In a context of developing innovative analytical strategies to screen for the misuse of historical or emerging growth promoters, urine and serum-based metabolomics have proved relevance and efficiency in highlighting specific patterns and biomarkers associated to a range of anabolic practices (Regal et al. 2010; Dervilly-Pinel et al. 2015, Kouassi Nzoughet et al. 2015). While feces has never been considered in such context, the potential of the corresponding metabolome needs however being investigated since it would offer studying endogenous and microbial metabolites, for complementary biomarkers discovery. Therefore, any analytical developments involving feces as a target matrix is fully encouraged by competent authorities with the objective of assessing the relevance and applicability of the tool. While many reviews have focused on the metabolomics analysis of urine or plasma, the characterisation of fecal samples has received less attention. Recently, Matysik et al. (2016) and Deda et al. (2016) reviewed some practical aspects of fecal metabolomics. They provided comprehensive overview related to sample preparation for both NMR and MS analysis including some critical aspects. It is noteworthy that these reviews highlighted the lack of consensus about fecal sample preparation. Furthermore, most available studies relate to human or rat feces characterization, which is far different in terms of composition from ruminants. The present study aimed at developing a robust workflow to prepare bovine feces in the objective of generating informative and reproducible fingerprints through LC-HRMS measurements. Different parameters have been tested and optimised.

MATERIALS AND METHODS

Samples All procedures performed in studies involving animals were in accordance with the ethical standards of the institution or practice at which the studies were conducted. All feces samples originated from animals belonging to the resident bovine herd of the Clinic for Ruminants (Oniris-Nantes Atlantic National College of Veterinary Medicine, Food Science and Engineering, Nantes, France). Feces were collected on spontaneous defecation ("free catch") by the same operator. A 3-month-old entire male calf was enrolled to provide feces matrices used for sample preparation optimisation step. The animal was fed with roughage, water ad libitum and concentrate according a classical feed ration. Optimised sample preparation protocol was then applied to feces collected on three different animals: (i) a female Prim’Holstein seven years-old with metabolic trouble in pasture since 6 months, (ii) a female Prim’Holstein seven years-old without clinical trouble in pasture for 6 months and (iii) a female Prim’Holstein eleven months-old with growth retardation and facial malformation fed with roughage, water ad libitum and concentrate according a classical feed ration only distributed in stalling. All fresh fecal samples were stored at -20°C until analysis. Before extraction or freeze drying they were thawed at room temperature during 24 hours.

1. CHEMICALS, REAGENT AND SOLUTIONS Unless otherwise specified, all solvents and reagents used in this study were of LC-MS grade quality:

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Article soumis à Metabolomics

Chloroform (CHCl3, analytical grade) was purchased from Carlo Erba Reactifs (SDS, Peypin, France). Acetic acid, acetonitrile (MeCN), methanol (MeOH) and water were sourced from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Isotope labeled internal standards, namely, L-Leucine-5,5,5-d3, L-Tryptophan-2,3,3-d3, Indole-2,4,5,6,7-d5-3-acetic acid and 1,14-Tetradecanedioic-d24 acid were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France) and CDN Isotopes (Québec, Canada). A working standard mixture (5 ng/µL) was prepared by dilution in ethanol (75/25 MeOH/water). MSCAL6 ProteoMass LTQ/FT-Hybrid, standard mixtures used for calibration of the MS instrument (positive and negative ionization mode) were obtained from Sigma- Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Ultra-pure water was obtained from Nanopure Barnstead of Thermo Scientific.

2. SAMPLE PREPARATION Parameters such as feces quantity, preparation (fresh vs freeze-dried), solvents and dilution factors have been investigated as described in Table 1 and corresponding illustrations are provided in Supplementary Information (S1 to S4).

3. LC-HRMS CONDITIONS Sample fingerprinting was performed on an Agilent 1200 HPLC system and was coupled to a Finnigan hybrid mass spectrometer (Exactive, Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France). Chromatographic separation was performed on reversed phase with a Hypersil GOLD C18 column (1.9 µm particle size, 100x2.1 mm) connected with a heated electrospray ionization source (H-ESI). The separation was achieved using a being mobile phase of water (95 %) and acetonitrile (5 %) each containing 0.1 % acetic acid. The optimized gradient elution was 0-2.40 min, 25 % B; 2.40-4.50 min, 70 % B; 4.50-11 min, 100 % B with a hold for 3 min; 14-16.5 min, linear decrease to 5 % B then a hold for 3.5 min. The LC flow was 0.4 mL/min, the column temperature was set at 35°C, the vial rack temperature at 10°C and the injection volume was 5 µL. The electrospray voltage was set to -3.00 kV in negative mode and 3.00 kV in positive mode, the capillary voltage to 30 V and the tube lens offset to 100 V. The sheath and auxillary gas flows were set to 55 and 6 arbitrary units, respectively, and the drying gas temperature was set to 350 °C. Mass spectra were recorded from m/z 65.0 to m/z 1000.0 at a resolution of 25,000 FWHM in switch polarity. A pooled quality control (QC) sample, deriving from all the study’ subject population was prepared, to ensure that no or minimal metabolic information was lost. QC samples were extracted along with each samples batch and analysed throughout the analytical run, in order to provide robust quality assurance for each metabolic feature detected.

4. DATA PROCESSING AND ANALYSIS The data processing and analysis was adapted and applied as previously reported for urine-based metabolomics analysis (Dervilly-Pinel et al. 2014; Jacob et al. 2014; Kouassi Nzoughet et al. 2015). LC-HRMS data were processed to allow conversion of the three-dimensional raw date (m/z, retention time, ion current) to time- and mass-aligned chromatographic peaks with associated peak areas. The data processing was achieved using xcms R package and exported to SIMCA-P+ (Version 13, Umetrics AB, Umea, Sweden) software for multivariate statistical analysis (principal component analysis).

RESULTS AND DISCUSSION

Protocol optimisation The aim was to propose an optimal procedure for the preparation of bovine feces allowing the use of this matrix in untargeted fingerprinting by LC-HRMS based metabolomics. Based on literature review describing human and rodent fecal metabolomics protocols (Cao et al. 2011; Deda et al. 2015, 2016; Gregory et al. 2013; Hou et al. 2016; Matysik et al. 2016), an experimental design was implemented to investigate the best parameters to be applied to bovine feces in terms of quantity, solvent, extraction targeting both richness of information, robustness and measurement repeatability (Table 1). The optimum conditions were studied and selected by comparison of associated resulting fingerprints (TIC, Base Peak, Supplementary Information S5 to S8). In protocol A and B, feces was extracted starting from freeze dried materiel. The objective was to normalise the

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Article soumis à Metabolomics samples, on a dry mass basis here, for subsequent comparability purposes, as usually performed in metabolomics study using excretion matrices such as urine (Jacob, 2014). Two different lyophilized feces quantities (150 mg and 1 g) were tested as well together with different dilution factors using water. The two amounts of feces were subjected to freeze drying in order to guarantee a similar concentration of sample for the analysis after subsequent resuspension (50 mg feces/mLwater), and to optimize the initial fecal weight. The preparation of the smallest quantity (150 mg) caused issues in weighting the too small and volatile resulting dry mass, potentially associated to repeatability and contamination issues as already reported (Deda et al. 2016). Furthermore, and as already observed by Gregory et al. (2013) and Ng et al. (2012) who investigated different initial feces amount together with different extraction conditions (nature of solvent, volume), we also noticed that the 1g starting material was time consuming in the preparation and hindered proper fecal homogenization. In parallel three dilution factors using water were tested on reconstituted freeze-dried samples starting with an initial concentration of 50 mg feces/mL water as follows: 1:1, 1:3, 1:10. The objective was to study the effect of sample dilution on polar metabolites extraction. Surprisingly, LC-HRMS chromatograms were found poor in information particularly in 1:3 and 1:10 dilution conditions (Supplementary material S5 to S6). At the same time, two extracting solvent conditions were evaluated (i) in protocols A and B a Bligh & Dyer-like protocol (Bligh &

Dyer, 1959) involving MeOH and CHCl3 was used in order to obtain two phases highlighting the complexity of fecal sample: a superficial phase with polar metabolites directed for metabolomics LC-HRMS analysis and an apolar phase containing the lipids directed for further complementary lipidomics analysis (Gregory et al. 2013; Royer et al. 2014), (ii) in protocol C methanol was used alone, as reported in the literature (Deda et al. 2016). Analysis of the resulting extracts led to the conclusion that methanol alone, compared to methanol/chloroform extraction provided much better chromatographic profiles, higher number of peaks which were furthermore sharper and more symmetrical with a stable base line (Supplementary Information S5 to S7), offering thus wider metabolite extraction as already observed by Ng et al. (2012). Finally, protocols C and D, involving only methanol as extraction solvent, were compared with regard to initial fecal preparation. In an objective of reducing the number of preparation steps, fresh feces extraction was thus tested in order to select the most appropriate sample able to be directly prepared for metabolomic analysis. The fingerprints corresponding to protocol D were characterized by a higher number of symmetrical peaks and a better base line (Supplementary Information S7 to S8), associated with acceptable Internal standard's peak areas variabilities (mean CVs < 20% in positive mode and < 12% in negative mode). According to previous observations, fresh feces with a simple methanolic extraction was then selected as rapidly leading to robust and informative fecal fingerprints. Such protocol developed for ruminant feces is therefore in agreement with protocols applied in human and rodent, as recently rewieved by Deda et al. (2016) and Matysik et al. (2016).

Protocol application Three cows differing by their age, status health and breeding conditions were involved in this part of the study. Their feces have been collected, and extracted in five replicates according to protocol D as described above . Performed on a larger number of samples, this part of study also allowed further investigating the potential need for sample normalisation, therefore the specific gravity of each extract was measured by refractometry and values (n= 15) were found in a very close range [1.018-1.022] with a mean of 1020.4 +/- 0.33 and a standard deviation of 1.30, which did not required any normalisation. As a consequence, no further adjustments were made to the protocol. The acquired LC-HRMS profiles were visually inspected. Internal standard's (IS) peak areas showed satisfactory precision (CV of IS in all samples ranging from 23 to 36% in negative mode and 10 to 33% in positive mode) and comparison of quality control (QC) samples chromatographic traces (Repeatedly injecting QC sample n=10, with a filter of CV’QCs < 30%, 90% of ions were retained (n=625) in negative mode and 81 %, (n=461) in positive mode), indicated that data were reliable for further analysis. The fingerprinting and data process/analysis steps resulted in the principal component analysis (PCA) presented in Figure 1. While each individual was tightly clustered attesting for the reproducibility of the whole protocol, it appeared that the animals were separated from each other, evidencing that feces fingerprints are individual-specific and reflects their own biological status related to (i) the age since it could be highlighted that the young animals were gathered and separated from the oldest one, (ii) their health since three clusters corresponding to metabolic disorder, health and growth delay were obtained or (iii) their breeding conditions as illustrated by the clusters related to pasture/forage on the one hand and stalling/forage on the other. These observations can be considered

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Article soumis à Metabolomics as a first proof of concept of the applicability of the developed protocol to provide informative fingerprints reflecting individual’s status.

CONCLUSION

A high throughput and robust extraction protocol for bovine feces directed to untargeted LC-HRMS analysis was developed in the present study. While minimal sample preparation is applied, the protocol enables the acquisition of informative fingerprints, focusing on the polar fraction of the metabolites. Such fraction revealed its ability to distinguish different individuals based on their age, health status and breeding conditions, which opens the way to a variety of applications in veterinary medicine. For instance, the interaction between the host and the gut microbiota and so the impact on intestinal metabolome could be investigated using such protocol. It could also assist in biomarker discovery (prognosis and diagnosis), to reveal underlying physiological pathways or to investigate the effect of various treatment (therapeutic, misuse) and particularly effect on the fecal metabolome resulting from an anabolic treatment is currently under investigation.

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Article soumis à Metabolomics

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Article soumis à Metabolomics

Table 1: Sample preparation of bovine feces in four procedures PROTOCOL A B C D NUMBER OF 2 4 3 4 EXPLOITED REPLICATES INITIAL AMOUNT lyophilized lyophilized lyophilized fresh 150 mg 1 g 150 mg 285 mg FECES Reconstitution with water: 50 mg feces / mL water PREPARATION NORMALISATION Freeze-drying: 48h DILUTION 50 mg feces / mL 50 mg feces / mL FACTOR water water 50 mg feces / 3 mL 50 mg feces / 3 mL water water 50 mg feces / 10 50 mg feces / 10 mL water mL water EXTRACTION 190 µL MeOH 190 µL MeOH Methanol Methanol 150 µL MeOH 855 µL MeOH 333 g feces / mL MeOH 333 g feces / mL MeOH 0,333 g feces / mL MeOH 0,333 g feces / mL MeOH

380 µL CHCL3 380 µL CHCL3

120 µL H2O 120 µL H2O

FILTRATION 10 kDa 10 kDa

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Article soumis à Metabolomics

Figure 1. PCA in a) negative mode; b) in positive mode. (QC) Quality Control, (2765) female Prim’Holstein seven years-old with metabolic trouble in pasture since 6 months, (6979) female Prim’Holstein seven years-old without clinical trouble in pasture for 6 months and (5644) female Prim’Holstein eleven months-old with growth retardation and facial malformation fed with roughage, water ad libitum and concentrate according a classical feed ration only distributed in stalling.

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Conclusion et perspectives

La veille réalisée ces dernières années avaient mis en lumière le fait que les SARMs représentaient des composés anabolisants dont la facilité d'accès (via internet principalement) en a fait des candidats potentiels à une utilisation en tant que promoteurs de performance chez les sportifs et promoteurs de croissance chez les animaux d'élevage. Le brevet américain récemment déposé pour un aliment contenant des SARMs (i.e. l’enobosarm) et destiné aux bovins à l'engraissement nécessitait que nous nous saisissions de cette question. Il était donc "urgent" de s'intéresser à cette famille de nouveaux agents anabolisants et de penser/anticiper les méthodes de contrôles d'un usage frauduleux de SARMs. Ce constat a permis de dresser les contours du projet de thèse dont la question de recherche a été affinée suite à l’étude bibliographique.

Le travail de ce doctorat a ainsi consisté à répondre à la question "quelle(s) signature(s) pertinente(s) pour la mise en évidence de l’utilisation de SARMs chez le jeune bovin ?". La réponse a été de proposer une signature générale de la pratique anabolisante à trois niveaux complémentaires : une signature analytique ciblée, une signature phénotypique et une signature métabolique.

Dans un premier temps, la connaissance des SARMs, au travers de la littérature et de leur comparaison structurale et fonctionnelle avec les stéroïdes anabolisants androgéniques auxquels ils sont apparentés, a permis d'appréhender leur éventuelle utilisation en tant que promoteur de croissance en élevage. L’étude bibliographique a ainsi mis en lumière (i) que parmi les SARMs non stéroïdiens agonistes aux récepteurs aux androgènes, les aryl-propionamides présentaient une forte activité anabolique sur le muscle squelettique et que l’enobosarm en particulier apparaissait comme la molécule la plus prometteuse de par son design pharmacologique, car biodisponible après une administration par voie orale avec des doses journalières (ce composé sera retenu pour la phase expérimentale) (ii) que le mécanisme d'action anabolisant des SARMs est probablement similaire à celui connu des stéroïdes androgènes par une action stimulatrice des mécanismes moléculaires, cellulaires et biochimiques de la croissance (balance entre les phénomènes de multiplication et prolifération des cellules composantes du muscle et orientation vers un métabolisme protidique anabolique) et (iii) que les méthodes de contrôle appliquées aux SARMs pour les animaux d’élevage sont encore à un stade exploratoires et uniquement basées sur une stratégie analytique ciblée.

Dans un second temps, en guise de support d'étude, une expérimentation animale a été mise en place dans le cadre du travail de cette thèse et bâtie dans l'optique d'une "potentielle" utilisation de l'enobosarm per os sur une période correspondant à une fin de cycle d'engraissement chez des veaux Prim'Holstein, entier et sevré de 3 mois. Le design d'administration s'est appuyé sur les données pharmacodynamiques et pharmacocinétiques connues pour l'enobosarm afin de proposer un choix de paramètres zootechniques à mesurer et de matrices d'intérêt à prélever en vue des investigations analytiques, phénotypiques et métaboliques.

. La première étape a été de proposer une stratégie analytique de détection ciblée de l'enobosarm et de ses métabolites directs, basée sur les techniques de chromatographie (LC) couplée à la spectrométrie de masse (MS/MS). La stratégie mise en œuvre s’est avérée pertinente puisqu’il a été possible de caractériser sans ambiguïté la présence d’enobosarm et de ses principaux métabolites dans l'urine et les fèces (en concentration 500 fois plus élevée par rapport à l'urine) des animaux traités avec une fenêtre de détection longue (9 jours pour l'urine et 21 jours pour les fèces) compatible avec l’éventuelle mise en œuvre

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Conclusion et perspectives

d’un contrôle officiel de cette substance. Les développements associés ont fait l’objet d’une formalisation de méthode interne "LABERCA/SARMs-u.0.03, Détection et identification des SARMs dans l’urine de bovin par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem", d’ores et déjà éprouvée dans le cadre d’un plan expérimental de la DGAL en 2016. La validation de cette méthode conformément aux exigences réglementaires et guides de validation en vigueur est maintenant nécessaire pour une mise en œuvre officielle dans des plans de surveillance et de contrôle de la DGAL. . La seconde étape a été de compléter cette signature ciblée par des approches globales basées sur la mesure de paramètres zootechniques de croissance d'une part et sur la métabolomique (LC-HRMS) d'autre part. Alors que des outils zootechniques robustes permettant d’évaluer la croissance de jeunes bovins ont été développés et validés dans le cadre de ce travail, leur application à la question de recherche posée n’a mis en évidence aucune modification significative des paramètres de croissance et de développement consécutivement à l’administration d’enobosarm à des veaux, notamment relative à une diminution de l’indice de consommation et une stimulation du développement musculaire. La signature phénotypique ambitionnée n'a ainsi pu être établie. En revanche, concernant la signature métabolique, les résultats ont montré que l'approche métabolomique sur la matrice fèces est plus prometteuse puisqu’elle permet d’établir des profils discriminants conduisant à la séparation des groupes traités et contrôles. De surcroit, il convient de souligner que l'optimisation du protocole de préparation des fèces proposé dans ce travail permet d’entrevoir une mise en application rapide qui, sous réserve de disposer de modèles statistiques robustes, s'intègrerait parfaitement à un processus de contrôle en série et à grande échelle (en élevage et sur de nombreux animaux). En parallèle, la mise en œuvre de l’outil a révélé sa capacité à discerner des situations métaboliques particulières, telle une croissance atypique, mettant ainsi en lumière la finesse et le potentiel de l’approche pour répondre à d’autres problématiques de recherche en élevage.

Les travaux menés au cours de cette thèse ont également été l'occasion de mettre en avant les avantages de l'utilisation de la matrice fèces et de la faisabilité de son exploitation dans un cadre de contrôle et de prélèvement à large échelle en élevage. L’avantage majeur de la matrice fèces est la facilité de prélèvement sur le terrain. Cette facilité de collecte des fèces est mise également en avant par les techniciens chargés des prélèvements en élevage auprès de la DGAl. Nous avons apporté les éléments méthodologiques et analytiques permettant la poursuite des investigations sur cette matrice (sa composition, son traitement) et surtout sa mise en pratique.

L'ensemble du travail réalisé a valorisé la complémentarité et la diversité des approches analytiques investiguées (ciblées et non ciblées) et montré leur pertinence à être menées conjointement. La transdisciplinarité nécessaire et entretenue tout au long des étapes de cette thèse (des personnes aux domaines d'activité sollicités) a été un réel atout pour répondre à la question de recherche. Enfin pour le LABERCA, ce travail de doctorat à répondu, dans le cadre de ses missions en matière de sécurité chimique des aliments (de l'éleveur au consommateur), aux attentes de développement des connaissances et des méthodes de détection de produits émergents, en particulier des SARMs potentiellement utilisés comme promoteur de croissance en élevage.

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Conclusion et perspectives

Perspectives

Les travaux de recherche conduits au cours de cette thèse ont permis de répondre à plusieurs objectifs initialement fixés. A la lumière des résultats ici présentés et au regard de la littérature, il semble raisonnable de proposer aujourd’hui de nouvelles pistes d’investigations :

. Si l'approche "zootechnique" n'a pas répondu aux attentes escomptées pour l'enobosarm, les outils de mesures développés et évalués dans ce travail mériteraient d'être évalués dans le cadre d’autres expérimentations animales impliquant d'autres d’autres SARMs ou d'autres familles d'agents anabolisants. A l’heure où les stratégies de dopage se diversifient et font montre d’inventivité, il nous semble toujours d’actualité de rechercher des signes extérieurs de "dopage" et la caractérisation d'une signature phénotypique serait d'une aide précieuse et alternative dans le dépistage des pratiques illégales. . Ces outils pourraient également trouver leur place dans l'abord sanitaire des animaux en production. Le milieu de la médecine vétérinaire (individuelle et collective) est souvent confronté au défi que représentent non seulement la description objective mais le diagnostic des animaux en "retard de croissance", véritable enjeu économique quant à leur devenir au sein d'une exploitation. . L’approche métabolomique conduite sur la matrice fèces a révélé le potentiel de la stratégie à proposer une signature métabolique différentielle suite à l’administration d’enobosarm à de jeunes bovins. Ces résultats préliminaires ont apporté la preuve de concept, étape nécessaire à la poursuite des investigations. Ainsi, il s’agira désormais de mettre en œuvre un « challenge test » pour tester ce premier modèle et permettre de passer ensuite à l’élaboration d’un modèle plus robuste et aux capacités de prédiction renforcées. L’inclusion d’un plus grand nombre d’animaux permettra notamment de passer ce cap. Les modèles confortés seront alors exploités pour la mise en évidence des biomarqueurs associés à la signature spécifique. Finalement, la validation de modèles centrés sur le suivi de quelques marqueurs pertinents permettra d’envisager la mise en application de l’outil à des fins de dépistage. La «boucle sera ainsi bouclée » puisque la stratégie globale aura permis la mise en œuvre d’un outil ciblé, de mise en œuvre plus aisée en routine. . Si toutefois l’exploration du métabolome fécal polaire ne permettait pas de conclure positivement, il conviendrait alors d’explorer un métabolome alternatif (autre fraction, autre matrice, …) afin de rechercher d’autres signatures spécifiques. En ce sens, le lipidome (fécal, sanguin, …) ou le stéroïdome (urinaire, sanguin, …) représentent des compartiments pertinents. . Finalement dans un contexte mondialisé où certains pays annoncent la mise en place de filières sans hormones (hormone-free meat) afin d’être en mesure d’exporter de la viande vers l’Europe, et pour laquelle l’affichage d’une double filière pose la question de la traçabilité des denrées et de l’efficacité du cloisonnement entre filières, il nous semble encore et toujours d’actualité de proposer des stratégies compatibles avec le contrôle aux frontières. Dans cette optique, les matrices d‘intérêts étudiés au cours de cette thèse, en l‘occurrence l‘urine et les fèces, ne sont tout simplement pas adaptées. Il s‘avère alors nécessaire d‘entreprendre des études complémentaires portant sur les perturbations biologiques induites sur le tissu musculaire car il constituera la matrice unique sur laquelle la

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Conclusion et perspectives

surveillance pourra opérée. Ainsi, la matrice, la stratégie, la méthode analytique, le(s) composé(s) ciblé(s) ne doivent jamais être considérées comme acquis et un questionnement et une remise en question perpétuelle se doivent de faire partie du quotidien des analystes et des services de contrôle, afin d‘assurer une protection optimale de la sécurité chimique des aliments en France et en Europe et une protection durable des consommateurs et de leur santé.

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Annexes

Annexe I : Structures chimiques des principales molécules citées dans le manuscrit

Annexe II : Cesbron N, Dervilly-Pinel G, Vernet C, Penot M, Gicquiau A, Monteau F, Le Bizec B. Selective androgen receptor modulators: zootechnical effects & analytical strategies to detect their administration in bovines. Poster présenté au 7th VRDA Symposium, Ghent, Belgique, 2-5 juin 2014..

Annexe III : Cesbron N, Rojas D, Sydor A, Penot M, Prevost S, Dervilly-Pinel G, Le Bizec B. Analytical strategies to detect selective androgen receptor modulators (SARMs) administration in bovine. Poster présenté à l’Euroresidue VIIIth Conference, Egmond aan Zee, The Netherlands, 23-25 Mai 2016.

Annexe IV : Structures chimiques des standards métabolomiques

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Nora Cesbron Les SARMs (Selective Androgen Receptor Modulators) : une nouvelle famille d'agents anabolisants. Etude des effets zootechniques associés et développement de stratégies analytiques visant la mise en évidence de leur utilisation chez le jeune bovin SARMs (Selective Androgen Receptor Modulators): a new class of anabolic agents. Zootechnical effects and analytical strategies to detect their administration in bovines

Résumé Abstract

De nouveaux composés anabolisants sont devenus New compounds with anabolic properties have recently accessibles via Internet : les modulateurs spécifiques become accessible via Internet-based suppliers: des récepteurs androgènes (SARMs) actuellement selective androgens receptor modulators (SARMs) développés pour le traitement des pertes musculaires. currently developed for the treatment of chronic L’Ostarine® (MK-2866, GTX-024, enobosarm) en diseases with wasting muscle. Ostarine® (MK-2866, particulier, exerce ses effets sur les muscles GTX-024, enobosarm), in particular, exerts its anabolic squelettiques et ne présente pas d'activité effects exclusively on the skeletal muscles and has no androgénique. Sur la base de son mécanisme d’action androgenic activity. Based on its mechanism of action et des résultats cliniques préliminaires, ce produit and clinical preliminary results, this product could pourrait être utilisé comme promoteur de croissance en potentially be used as a growth promoter in cattle. In élevage bovin. Dans ce contexte, les objectifs de la this context, the aims of this thesis are to validate tools thèse sont de valider des outils permettant de décrire allowing to describe the zootechnical effects that may les effets zootechniques pouvant être induits par be induced by an oral administration of enobosarm in l’administration orale d'enobosarm à des bovins et de calves and to develop analytical strategies dedicated to développer des stratégies analytiques dédiées à la mise highlight its fraudulent use. Following a comparison en évidence de son utilisation frauduleuse. En between control animals and enobosarm treated comparant animaux contrôles et animaux traités avec animals, no morphological effect was visible and l'enobosarm, aucun effet morphologique n'a été mis en measurable in terms of growth and conformation. It was évidence en termes de croissance ou de conformation. then demonstrated that enobosarm and its main phase Il a été ensuite démontré que l'enobosarm et ses II metabolites are eliminated in urine and feces at principaux métabolites de phase II sont éliminés dans concentrations allowing their detection with analytical les urines et les fèces à des concentrations permettant techniques using a liquid chromatography-mass leur détection par des techniques analytiques impliquant spectrometry coupling. Finally, a metabolomics le couplage chromatographie en phase liquide et approach on urine and fecal matrices led to the spectrométrie de masse. Enfin, une stratégie de type description of specific and discriminant fingerprints métabolomique conduite sur matrices urinaire et fécale signaling the administration of enobosarm. This a conduit à la description d’empreintes spécifiques et multidisciplinary research work helps to generate discriminantes pouvant signer l’administration knowledge on a new class of anabolic substance and d'enobosarm. Ce travail de recherche pluridisciplinaire therefore contributes to guarantee a more chemically- contribue à générer des connaissances sur une safe food of animal origin to the consumer. nouvelle classe d'anabolisants, permettant par extension de contribuer à garantir au consommateur une sécurité chimique accrue des denrées d’origine animale. Key Words Mots clés Growth promoters, anabolic substance, enobosarm, Promoteur de croissance, anabolisant, enobosarm, zootechnical tool, mass spectrometry, chromatography, zootechnie, spectrométrie de masse, chromatographie, metabolomics, fingerprinting, screening, confirmation, métabolomique, empreinte, dépistage, confirmation, metabolites, biomarkers, chemical food safety, risk métabolites, biomarqueurs, sécurité des aliments, analysis. analyse de risque.

L’Université Bretagne Loire