UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA Y FARMACIA

“Aplicación de bacterias lácticas en el desarrollo de alimentos novedosos a

base de granos andinos”

Lic. Silvana Lorena Carrizo 2018

CERELA - CONICET

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUÍMICA Y FARMACIA Ayacucho 471 - T. E. 0054 381 4107215 - FAX 0054 381 4248169 T4000CAN– San Miguel de Tucumán – República Argentina

HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO Dra. Patricia Eugenia Álvarez Dra. Gabriela Perdigón Bioq. Farm. Ana María del Valle González Dra. María Eugenia Mónaco Dra. Carolina Serra Barcellona Dra. María José Rodríguez Vaquero Farm. Verónica Pastoriza Sr. Walter Ricardo Gómez Sr. Francisco Andrés Díaz Srta. Ivana Micaela Núñez Sr. Gonzalo Andrés Lascano

DECANA Dra. Silvia Nelina González

VICE-DECANO Dr. Edgardo Hugo Cutin

SECRETARIA DE ASUNTOS ACADEMICOS Dra. Marta Elena Cecilia

JEFA DEL DEPARTAMENTO POSGRADO Lic. Marta Quinteros

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUÍMICA Y FARMACIA Ayacucho 471 - T. E. 0054 381 4107215 - FAX 0054 381 4248169 T4000CAN– San Miguel de Tucumán – República Argentina

DEPARTAMENTO DE POSGRADO AUTORIDADES

DIRECTOR Dr. Sergio Enrique Pasteris

CONSEJO TITULAR Dra. Inés del Carmen Ramos Dra. María Carolina Navarro Dra. María Cristina Gaudioso Dra. Paula Andrea Vincent Dra. María Cristina Rubio

Suplentes Dra. María Graciela Benzal Dra. Clara del Valle Silvia de Ruiz Dra. María Inés Nieva Moreno

REPRESENTANTE DE POSGRADO ANTE LA SECRETARÍA DE POSGRADO DE LA UNT

Dra. Paula Andrea Vincent

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUÍMICA Y FARMACIA Ayacucho 471 - T. E. 0054 381 4107215 - FAX 0054 381 4248169 T4000CAN– San Miguel de Tucumán – República Argentina

TRABAJO DE POSGRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO SUPERIOR DE DOCTOR/A EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

CARRERA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

Acreditado y Categorizado A ante la Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU) Resolución nº: 615/07

Acreditado y Categorizado A ante la Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU) Resolución nº: Resolución 750- CONEAU -13

Director Dr. Atilio Pedro Castagnaro

Vice-Directora Dra. Viviana Andrea Rapisarda

Comité Académico Dr. Alfredo Grau Dr. Raúl Pedraza Dra. Lucia Clapz Dra. Silvina Fadda

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUÍMICA Y FARMACIA Ayacucho 471 - T. E. 0054 381 4107215 - FAX 0054 381 4248169 T4000CAN– San Miguel de Tucumán – República Argentina

TRABAJO DE POSGRADO TITULADO:

“Aplicación de bacterias lácticas en el desarrollo de alimentos novedosos a base de granos andinos”

TESISTA Lic. Silvana Lorena Carrizo

DIRECTORA Dra. Graciela Rollán

DIRECTOR ASOCIADO Dr. Jean Guy Joseph LeBlanc

COMISIÓN DE SUPERVISIÓN Dra. María Pía Taranto Dr. Carlos Gabriel Nieto

Esta Tesis Doctoral se desarrolló en el Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA), dependiente de CONICET, de la Fundación Miguel Lillo y de la Fundación para la Educación, la Ciencia y la Cultura (FECIC).

Este trabajo de Tesis Doctoral se financió a través de becas y subsidios provistos por las siguientes instituciones: el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCYT) y el Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumán (CIUNT).

Dedicatoria

Con gran amor y cariño dedico este trabajo:

A Dios por darme el don de la sabiduría y el entendimiento para culminar mi mayor reto y la fortaleza para enfrentar cada día.

A mis padres y hermanos quienes me han apoyado en todo lo que he querido hacer en la vida, me han impulsado en los momentos en que he querido dar marcha atrás, a su inmenso cariño y apoyo incondicional. Por haber sufrido y reído conmigo.

A mis dos pilares, mi esposo e hijo, José y Miguel Ángel, quienes me sostuvieron, alentaron y me dieron todo su amor para no bajar los brazos y poder seguir adelante en este largo y duro camino, ¡los amo!

Para ustedes todos los frutos de esta experiencia.

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por el otorgamiento de las becas que posibilitaron la realización de esta Tesis.

A la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, a la Universidad Nacional de Tucumán y al Estado Argentino por brindarme la posibilidad de realizar mis estudios de grado y posgrado de forma gratuita.

A la Directora de CERELA, por permitirme realizar mi trabajo de Tesis en las instalaciones de esta institución.

A mis directores de Tesis, Dra. Graciela Rollán y Dr. Jean Guy LeBlanc, quienes durante el transcurso de mi tesis me guiaron responsablemente siempre llenos de paciencia, energía y motivación, y que me transmitieron su pasión por la investigación durante todos estos años.

A los integrantes de la Comisión de supervisión de mi Tesis, Dra. María Pía Taranto y al Dr. Carlos Nieto Peñalver, que me guiaron durante mi tesis siempre con buena predisposición, aportando generosamente sus conocimientos y experiencia.

A toda la gente que ha colaborado para que esta Tesis salga adelante, a las Dras.

Lucila Saavedra y Hebert Elvira, Vicky y Yoly (cepario), a la Dra. Marta Medici, Eduardo villamil y Jose Luis Alvarado (Bioterio), a las Dras. Luciana Gerez y Alejandra de Moreno. Muchas gracias por todo.

A todo el personal de CERELA, por haberme recibido tan bien y haberme hecho parte de esa gran familia. Por su disposición, amabilidad y paciencia. A Mabel, Ricardo, Pierina, Luis, Sebastian, Pablo, Mario.

A todos y cada uno de mis compañeros y amigos del laboratorio de tecnología y genética de CERELA que tuve la suerte de conocer, quienes me contagiaron su alegría y ayudaron a relajarme, por permitirme disfrutar buenos momentos a su lado y por el importante apoyo que siempre me han brindado en los momentos más difíciles vividos durante este largo camino, Luciana, Juliana, Antonieta, Nadia, Lucrecia, Alejandra, Pablo, Fernando, Carolina, Romina. A los chicos nuevos y a los que pasaron y siguieron con sus carreras en otros lugares, Cecilia, Jonhatan, Marianela, Lucía, Julieta, Silvina, Kitty y Guille. A los chicos de los laboratorios de Inmuno, carne y la vidriera. A todos ellos que no solo compartieron conmigo largas horas de trabajo, sino también divertidos debates en el cyber, salidas, viajes, reuniones y partidos, y que en todo momento hicieron más ameno el ambiente de trabajo con su buen humor y su generosidad.

A mi familia (padres y hermanos), que en todo momento me apoyaron en mis decisiones y me alentaron a cumplir con todos mis sueños y metas con pasión, optimismo y esperanza, por más imposibles y lejanos que fueren; que me inculcaron ante todo los valores de respeto, humildad y generosidad, y que me motivaron para que mi objetivo principal sea cada día convertirme en una mejor persona.

A mi esposo José, compañero y amigo, gracias por TODO tu apoyo, esfuerzo, consejos, dedicación, paciencia y AGUANTE. Gracias a vos y nuestro hijo Miguel Ángel, me dieron las fuerzas necesarias para poder culminar con este reto: Mi Tesis.

Finalmente agradezco a todas las personas que de distinta manera hicieron posible la realización de esta labor y han contribuido a que culminase con mi carrera profesional.

¡GRACIAS A TODOS!

ÍNDICE

RESUMEN ...... 1 INTRODUCCIÓN ...... 4 GRANOS ANDINOS ...... 7

ÁCIDO FÍTICO (mio-inositol 1,2,3,4,5,6 hexafosfato, InsP6) ...... 11 BACTERIAS LÁCTICAS (BL) ...... 17 Generalidades ...... 17 Clasificación taxonómica ...... 18 Metabolismo ...... 20 Propiedades tecnológicas y funcionales de BL ...... 22 VITAMINAS ...... 23

Riboflavina (B2) ...... 24 Función ...... 24 Fuentes y requerimientos de riboflavina ...... 27 Deficiencia ...... 28

Folatos (B9) ...... 29 Función ...... 31 Fuentes y requerimientos de folatos ...... 33 Deficiencia ...... 34 ALIMENTOS FORTIFICADOS ...... 35 OBJETIVOS ...... 38 OBJETIVO GENERAL ...... 40 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 40 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 42 1. Microorganismos ...... 44 1.1. Origen ...... 44 1.2. Conservación ...... 44 1.3. Propagación ...... 44 2. Medios de cultivo ...... 44 2.1. Medio Protector LEL-Glicerol ...... 44 2.2. Caldo MRS (de Man y col., 1960) ...... 45 2.3. Caldo MRS-5 (Modificado de Meroth y col., 2003) ...... 45 2.4. MRS y MRS-5 agar ...... 45 2.5. Hongos y Levaduras agar (H y L) (Britania) ...... 45 2.6. Mac Conkey agar (Britania) ...... 46 2.7. Recuento en placa agar (PCA) (Britania) ...... 46

ÍNDICE

2.8. BHI (Brain heart infusión) agar (Britania) ...... 46 2.9. Riboflavin Assay Medium (RAM) (Difco) ...... 46 2.10. Folic Acid Casei Medium (FACM) (Difco) ...... 47 2.11. Caldo Chalmers modificado (Modificado de Vanos y Cox, 1986) (CCM) ...... 47 Aislamiento e identificación de bacterias lácticas (BL) de quínoa y amaranto ...... 47 3.Muestras utilizadas ...... 47 3.1. Harinas ...... 47 3.1.1. Preparación de las masas ...... 48 3.1.2. Aislamiento de BL a partir de masas de quínoa y amaranto ...... 48 3.2. Granos ...... 49 3.2.1. Aislamiento de BL a partir de granos de quínoa y amaranto ...... 49 4. Identificación de las colonias aisladas ...... 50 4.1. Protocolo de extracción de ADN cromosomal...... 50 4.2. Amplificación aleatoria de ADN polimórfico ...... 51 4.3. Identificación de los aislamientos seleccionados mediante amplificación de la región variable del gen que codifica para el ARN ribosomal 16S ...... 52 4.3.1. Purificación de productos de PCR por precipitación con polietilenglicol (PEG) ...... 53 4.3.2. Secuenciación y análisis de secuencias de ADN ...... 53 Caracterización y selección de bacterias lácticas aisladas de quínoa y amaranto ...... 53 5. Microorganismos ...... 53 6. Caracterización de las bacterias lácticas ...... 54 6.1. Capacidad de acidificación ...... 54 6.2. Capacidad de degradar el almidón ...... 55 6.3. Producción de filancia y/o polisacárido capsular (CPS) ...... 55 6.4. Capacidad de degradar fitato ...... 56

6.5. Capacidad de producir vitaminas del grupo B: riboflavina (B2) y folatos (B9) .. 57 6.5.1. Capacidad de BL de producir riboflavina ...... 57 6.5.1.1. Selección de cepas ...... 57 6.5.1.2. Preparación de las muestras ...... 58 6.5.1.3. Medida de la concentración de riboflavina ...... 58 6.5.2. Capacidad de BL para producir folatos ...... 59 6.5.2.1. Selección de cepas ...... 59 6.5.2.2. Preparación de las muestras ...... 60

ÍNDICE

6.5.2.3. Medida de la concentración de folatos ...... 60 Ensayos in situ en masa de quínoa. Formulación del alimento prototipo ...... 61 7. Muestras utilizadas ...... 61 7.1. Harina ...... 61 8. Pruebas realizadas en masa ...... 61 8.1. Preparación del inóculo ...... 61 8.2. Preparación de las masas...... 62 8.3. Determinación de riboflavina y folatos en masas ...... 63 8.3.1. Preparación de las muestras ...... 63

8.3.2. Determinación de folatos (B9) ...... 64

8.3.3. Determinación de riboflavina (B2) ...... 65 8.4. Determinación de fitato residual ...... 65 9. Compatibilidad entre cepas ...... 66 10. Formulación de un alimento a base de harina de quínoa bio-enriquecido en vitaminas y minerales: “ñoquis de quínoa.” ...... 67 10.1. Elaboración de pasta de quínoa ...... 67 10.2. Determinación de riboflavina, folatos, minerales y fitato en pasta de quínoa ...... 69 Evaluación de la funcionalidad de pasta fermentada bio-enriquecida en vitaminas y minerales en un modelo animal ...... 70 11. Animales de experimentación ...... 70 12. Protocolo de prevención de deficiencia nutricional en riboflavina y folatos ...... 72 13. Obtención y procesamiento de muestras ...... 73 13.1. Muestras de sangre periférica ...... 73 13.1.1. Muestras de sangre periférica para hemograma ...... 73 13.1.2. Muestras de sangre entera y plasma ...... 73 13.1.3. Muestras de suero ...... 74 13.2. Muestras de órganos (hígado, bazo y riñón) para dosaje de folatos ...... 74 13.3. Obtención de las muestras histológicas de los animales de experimentación ...... 74 13.4. Procesamiento de sangre entera y plasma para la determinación de folatos 75 13.5. Procesamiento de órganos para la determinación de folatos ...... 75 14. Evaluación de las muestras ...... 76 14.1. Determinación de la concentración de folatos en sangre entera, plasma y órganos ...... 76 14.2. Determinación del estado de riboflavina ...... 76

ÍNDICE

14.3. Evaluación histológica del intestino delgado ...... 77 14.4. Peso corporal ...... 77 15. Determinación de minerales en suero ...... 78 16. Análisis estadístico ...... 79 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 80 Capítulo I: ...... 82 Aislamiento e identificación de bacterias lácticas de quínoa y amaranto ...... 82 1.1. Introducción ...... 84 1.2. Resultados ...... 86 1.2.1. Aislamiento e identificación de BL ...... 86 1.3. Discusión ...... 93 1.4. Conclusiones parciales ...... 96 Capítulo II ...... 98 Caracterización y selección de cepas de bacterias lácticas aisladas de quínoa y amaranto ...... 98 2.1. Introducción ...... 100 2.2. Resultados ...... 100 2.2.1. Capacidad de acidificación ...... 100 2.2.2. Capacidad de degradar el almidón ...... 103 2.2.3. Capacidad de producir filancia y polisacárido capsular (CPS) ...... 103 2.2.4. Capacidad de degradar fitato ...... 104

2.2.5. Produccion de vitaminas del grupo B: riboflavina (B2) y folatos (B9) por BL 108 2.3. Discusión ...... 115 2.4. Conclusiones parciales ...... 119 Capítulo III: ...... 122 Ensayos in situ en masa de quínoa. Formulación del alimento prototipo ...... 122 3.1. Introducción ...... 124 3.2. Resultados ...... 124 3.2.1. Crecimiento de cepas de bacterias lácticas en masas de quínoa ...... 124 3.2.2. Determinación de riboflavina y folatos en masas de quínoa ...... 125 3.2.3. Evaluación de cultivos mixtos en la producción de vitaminas y degradación de fitato en masa de quínoa ...... 126 3.2.4. Formulación de un alimento prototipo a base de harina de quínoa bio- enriquecido en vitaminas y minerales: “ñoquis de quínoa.” ...... 129 3.3. Discusión ...... 134 3.4. Conclusiones parciales ...... 140

ÍNDICE

Capítulo IV: ...... 142 Evaluación de la funcionalidad de pasta fermentada bio-enriquecida en vitaminas y minerales en un modelo animal de experimentación deficiente en vitaminas ...... 142 4.1. Introducción ...... 144 4.2. Resultados ...... 145 4.2.1. Evaluación de la funcionalidad de la pasta de quínoa (tipo ñoquis) fermentada, naturalmente fortificada con riboflavina y folatos para prevenir la deficiencia de ambas vitaminas en un modelo animal ...... 145 4.2.1.1. Peso corporal y consumo de alimento ...... 145 4.2.1.2. Peso relativo de órganos internos ...... 147 4.2.1.3. Parámetros bioquímicos ...... 148 4.2.1.4. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera ...... 150 4.2.1.5. Dosaje de folatos en órganos ...... 151 4.2.1.6. Evaluación histológica de intestino ...... 153 4.2.1.7. Determinación de riboflavina ...... 154 4.2.2. Determinación de minerales en sangre ...... 156 4.3. Discusión ...... 157 4.4. Conclusiones parciales ...... 161 CONCLUSIONES ...... 162 PROYECCIONES ...... 166 BIBLIOGRAFÍA ...... 170 ABREVIATURAS Y SIGLAS ...... 198

RESUMEN

RESUMEN

PALABARAS CLAVES: Quínoa, Amaranto, Bacterias lácticas

RESUMEN Actualmente existe una revalorización de los granos andinos (quínoa y amaranto) por sus propiedades nutricionales, funcionales y libres de gluten. Las bacterias lácticas (BL) son ampliamente utilizadas como fermentos en una gran variedad de sustratos. Ciertas BL tienen capacidad de sintetizar vitaminas del grupo B, incrementando el valor nutricional del alimento. La quínoa y el amaranto contienen fitato, compuesto antinutricional, que forma complejos insolubles con oligoelementos afectando su biodisponibilidad. Existen antecedentes de que ciertas BL tienen actividad fitasa capaz de degradar fitato. En base a estos antecedentes, el Objetivo General de esta Tesis fue determinar la biodiversidad de BL de quínoa y amaranto del NOA y diseñar alimentos con mayor valor nutricional y funcional empleando BL autóctonas. La microbiota láctica evaluada en granos y masas ácidas de quínoa y amaranto permitió identificar 73 cepas pertenecientes a diferentes géneros y especies: Lactobacillus (L.) plantarum, L. rhamnosus, L. sakei, Pediococcus (P.) pentosaceus, Enterococcus (E.) casseliflavus, E. mundtii, E. hermaniensis, E. hirae, E. gallinarum, Enterococcus sp., Leuconostoc (Lc.) mesenteroides, E. durans. De acuerdo a la producción de riboflavina (B2) y folatos (B9), capacidad de hidrolizar fitato, degradar almidón, acidificación y producción de exopolisacaridos, se seleccionaron 11 cepas aisladas de quínoa y 7 de amaranto para estudios in situ (masa ácida de quínoa). A partir de estos resultados, se diseñaron cultivos mixtos que fueron evaluados determinándose las combinaciones adecuadas que produzcan mayor concentración de vitaminas y menor concentración de fitato residual. Los resultados llevaron a seleccionar el cultivo mixto (C.M) formado por L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964 (1:1). La masa fermentada por CM presentó la mayor concentración de B2 y B9 (5,1 ± 0,4 y 1,6 ± 0,2 µg/g masa, respectivamente) y menor concentración de fitato residual (17,4 ± 1,3 mg/g masa). A fin de evaluar la eficiencia biológica de B9 y B2 producidas por CM en prevenir la deficiencia nutricional en ambas vitaminas, se realizaron ensayos in vivo. Los resultados revelaron que los animales alimentados con la pasta fermentada con el C.M (ACM) tuvieron mayor peso, mayor concentración de B9 en sangre y en órganos y mayor concentración de minerales, comparados con el grupo deficiente (AGD) y/o con el grupo control (AGC). La evaluación histológica del intestino evidenció que los AGD presentaban atrofia de las vellosidades intestinales, mientras que los ACM mostraron una tendencia a la normalización de la forma y del tamaño de las vellosidades. Respecto al estado de B2, los AGD mostraron un valor de EGRAC mayor a 1,3, indicando una deficiencia en B2, mientras que los ACM mostraron valores de EGRAC menores a 1,3, demostrando que la pasta de quínoa fermentada con BL fue capaz de prevenir la deficiencia de B2. De esta manera, se concluye que este trabajo de Tesis puso en evidencia el valor funcional de BL autóctonas y plantea nuevas perspectivas de aplicación de BL con capacidad de degradar fitatos y de producir vitaminas B2 y B9 para el diseño de alimentos bio-enriquecidos con funcionalidad comprobada.

~ 2 ~

ABSTRACT

KEY WORDS: Quinoa, Amaranth, Lactic acid bacteria

ABSTRACT There is currently a revaluation of Andean grains (quinoa and amaranth) because of their nutritional, functional and gluten-free properties. Lactic acid bacteria (LAB) are widely used as ferments on a wide variety of substrates. Some LAB have the ability to synthesize B group vitamins, increasing the nutritional value of foods. Quinoa and amaranth contain phytate, an antinutritional compound, which forms insoluble complexes with trace elements affecting their bioavailability. There is evidence that certain LAB have phytase activity capable of degrading phytate. Based on this background, the General Objective of this thesis was to determine the biodiversity of LAB from NOA quinoa and amaranth and to design foods with greater nutritional and functional value using autochthonous LAB. The lactic microbiota was evaluated in grains and quinoa and amaranth sourdoughs: 73 strains were identified belonging to different genera and species: Lactobacillus (L.) plantarum, L. rhamnosus, L. sakei, Pediococcus (P.) pentosaceus, Enterococcus (E.) casseliflavus, E. mundtii, E. hermaniensis, E. hirae, E. gallinarum, Enterococcus sp., Leuconostoc (Lc.) mesenteroides, E. durans. According to the production of riboflavin (B2) and folates (B9), ability to hydrolyze phytate, degrade starch, acidification and production of exopolysaccharides, 11 strains from quinoa and 7 from amaranth were selected for in situ studies (sourdough of quinoa). From these results, mixed cultures were designed using suitable combinations that produce higher concentration of vitamins and decrease the concentration of residual phytate. The results showed that the best mixed cultures (MC) were L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964 (1: 1). The dough fermented by MC presented the highest concentration of B2 and B9 (5,1 ± 0,4 y 1,6 ± 0,2 µg / g mass, respectively) and lower concentration of residual phytate (17,4 ± 1,3 mg / g mass). In order to evaluate the biological efficiency of B9 and B2 produced by MC in preventing nutritional deficiency in both vitamins, in vivo trials were performed. The results showed that the animals fed with the MC-fermented paste (PG) had higher live weights, higher concentration of B9 in blood and in organs and higher concentrations of minerals compared to the deficient group (DG) and / or group control (CG). The histological evaluation of the intestine showed that DG presented atrophy of the intestinal villi, whereas the PG group showed normal histology of the intestinal villi. Regarding the state of B2, the DG showed a value of EGRAC greater than 1.3, indicating a deficiency in B2, whereas the PG showed values of EGRAC lower than 1.3, demonstrating that the quinoa paste fermented with LAB was able to prevent B2 deficiency. Thus, it can be concluded that this thesis work showed the functional value of autochthonous LAB and poses new perspectives of LAB application with ability to degrade phytates and to produce vitamins B2 and B9 for the design of bio-enriched foods with proven functionality.

~ 3 ~

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas, los cambios socio-económicos, en la mayoría de los países desarrollados, han modificado sustancialmente los hábitos alimenticios hacia un aumento en el consumo de grasas y proteínas de origen animal, y un descenso en el nivel de la actividad física de la población. Esta tendencia se refleja en un aumento de la incidencia de enfermedades, directa o indirectamente, relacionadas con una dieta inadecuada. Particularmente, el incremento de la prevalencia de enfermedades asociadas al síndrome metabólico ha generado un continuo interés en el consumo de productos elaborados con granos enteros, como los cereales, seudocereales y harinas integrales o con salvado, entre otros (Aleixandre y Miguel, 2008).

Los productos de granos de cereales se dividen en dos categorías: a) productos de granos integrales y b) refinados. Los granos refinados poseen menor valor nutricional porque los granos integrales son una buena fuente de fibra, vitaminas y minerales y contienen también una variedad de otros fitoquímicos y antioxidantes (Slavin, 2004; Katina y col., 2005). Debido a ello, existe un creciente interés en el desarrollo de productos alimenticios ricos en fibra dietética. Además, estudios epidemiológicos confirmaron que el consumo de cereales integrales y seudocereales se asocia con un riesgo reducido de diabetes tipo 2, estreñimiento, obesidad, enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer (Aleixandre y Miguel, 2008).

En la actualidad, los cereales comunes como el trigo y el maíz se utilizan como ingredientes para la elaboración de la mayoría de los productos de grano entero. Sin embargo, la fracción de proteínas de gluten presentes en el trigo, avena, cebada y centeno no es tolerada por personas que sufren la enfermedad celíaca (EC).

La EC es una enteropatía autoinmune de carácter crónico gatillada por el gluten dietario que se encuentra en el trigo, cebada y centeno (James, 2009). Las proteínas de estos cereales pueden ser subdivididas en prolaminas y gluteninas de acuerdo a su solubilidad en alcohol y ácidos, las cuales son parcialmente resistentes a las proteasas humanas. Posterior a su ingestión en pacientes con EC, se generan varios péptidos inmunogénicos de gluten, los cuales activan el sistema inmune a través de múltiples

~ 6 ~

INTRODUCCIÓN

vías celulares, resultando en envejecimiento prematuro de los enterocitos de la mucosa que cubren las vellosidades del intestino (Schuppan y col., 2009; Di Sabatino y Corazza, 2009; Tjon y col., 2010). El principal tratamiento para los pacientes celíacos es seguir una estricta dieta libre de gluten (DLG) de por vida, lo que mantiene la estructura normal de la mucosa intestinal, y reduce el riesgo de complicaciones y la tasa de mortalidad en pacientes celíacos (West y col. 2004; Nachman y col. 2010). Los productos libres de gluten son elaborados principalmente con harinas de maíz, arroz, mandioca, lo cual afecta su palatabilidad, valor nutricional y precio. Los granos libres de gluten enriquecidos con las vitaminas y minerales que los granos con gluten contienen, son escasos. Debido a esto, pueden ocurrir deficiencias de vitaminas y minerales (See y col., 2015).

La creciente demanda por productos alimenticios e ingredientes alternativos para incrementar el valor nutritivo de la DLG ha conducido a la industria y pacientes a buscar nuevas fuentes para elaborar alimentos aptos para celíacos; entre ellos los granos andinos como la quínoa (Chenopodium quinoa Willd.) y el amaranto (Amaranthus sp.) (Valcárcel-Yamani y da Silva Lannes, 2012).

La quínoa y el amaranto son libres de gluten y han recibido mucha atención en los últimos años debido a su excepcional valor nutricional y beneficios potenciales para la salud considerándose buenos candidatos para la suplementación o sustitución de cereales comunes como centeno, avena o trigo (Lamothe y col., 2015).

GRANOS ANDINOS

La quínoa (Chenopodium quinoa Willd.) y el amaranto (Amaranthus sp.), son originarios de la región andina de Sudamérica. Estos cultivos indígenas, junto con la papa y el maíz, fueron alimentos sagrados de las civilizaciones Inca, Azteca y Maya. Estos cultivos son eco-sustentables ya que crecen perfectamente en la región sin necesidad de agregar fertilizantes o agentes químicos para su producción, evitando daños ambientales. Además, poseen la capacidad para prosperar en condiciones ~ 7 ~

INTRODUCCIÓN

adversas como, por ejemplo, salinidad de suelos, pH extremo, sequía, heladas, entre otros (Jacobsen y col, 2003; Rosell y col., 2009a; Fuentes y Bhargava, 2011).

La quínoa y el amaranto son conocidos como seudocereales, porque si bien no pertenecen a la familia de las gramíneas, que incluye a los cereales “tradicionales”, al igual que éstos, contienen un alto contenido de almidón y desde la antiguedad han sido usados de igual forma que los cereales: molidos, como harina y en una variedad de productos, como por ejemplo, el pan (Alvarez-Jubete y col., 2010). En la Tabla 1 se muestra la clasificación botánica de ambos cultivos (Valcárcel-Yamani y da Silva Lannes, 2012).

Tabla 1: Clasificación botánica de los cultivos andinos

Amaranto Quínoa Clase Dicotiledóneas Subclase Caryophillidae Orden Caryophyllales Familia Amaranthaceae Chenopodiaceae Género Amaranthus Chenopodium Especies Existen alrededor de 60 Existen alrededor de 250 especies, las principales son especies la principal es Amaranto (A.) hypochondriacus, Chenopodium (Ch.) quínoa A. cruentus y A. caudatus. Willd. Tabla adaptada de Valcárcel-Yamani y da Silva Lannes, 2012

Estos cultivos han ganado recientemente atención mundial debido a su elevado valor nutricional, funcional y potencial aplicación farmacéutica (Guerra-Matias y Arêas, 2005; Bhargava y col., 2006; Hirose y col., 2010; Vega-Gálvez y col., 2010; Delgado y col., 2015). En este contexto, diversos estudios han reportado la composición nutricional de la quínoa y el amaranto, destacando en particular el valor biológico de sus granos debido a su excelente calidad (particularmente rica en aminoácidos esenciales como lisina, cisteína y metionina) y cantidad de proteínas (entre 14-17%) (Tabla 2) (Repo-Carrasco y col., 2003; Jancurová y col., 2009; Vegas-Gálvez y col., 2010; Nowak y col., 2016). Diferentes estudios revelaron que los porcentajes relativos

~ 8 ~

INTRODUCCIÓN

de aminoácidos del amaranto y la quínoa, contienen mayores proporciones de lisina (5,1-6,1%) que los cereales (2,6%) (Tabla 3) (Jancurová y col., 2009; Repo-Carrasco- Valencia y Serna y col., 2011). También presentan mayor contenido de almidón y fibra dietaria (alrededor de 60% y 20%, respectivamente) (Tabla 2), de ácidos grasos saturados e insaturados principalmente oleico, linoleico y palmítico (Ruales y Nair, 1993a; Wood y col., 1993; Repo-Carrasco-Valencia y Serna y col., 2011; Srichuwong y col., 2017).

Tabla 2: Composición química de granos de amaranto, quínoa y trigo

Granos Proteínas a Grasa Almidón total Fibra dietaria Cenizas Amaranto 16,5±0,3 5,7±0,3 61,4±0,8 20,6±1,1 2,8±0,0 Quínoa 14,5±0,3 5,2±0,1 64,2±1,3 14,2±0,6 2,7±0,0 Trigo 12,0±0,1 2,5±0,1 63,0±1,4 17,4±1,2 1,5±0,0

Tabla adaptada de Alvarez-Jubete y col., 2009. Datos presentados en porcentajes sobre peso seco ± desviación estándar. a Los factores de conversión de nitrógeno a proteína son 5.85, 5.96 y 5.70 para semillas enteras de amaranto, quínoa y trigo molido, respectivamente.

Asimismo, se identificaron en estos granos andinos cantidades significativas de componentes bioactivos tales como fitoesteroles, betainas, esqualeno, ecdisteroides, fagopiritoles, carotenoides, y polifenoles (kaempferol y quercetina) (De Simone y col., 1990; Taylor y Parker, 2002; Dini y col., 2004; 2005; Wijngaard y Arendt, 2006; Álvarez-Jubete y col., 2010). Estos compuestos han sido ampliamente reportados por tener efectos benéficos para la salud (anticancerígenos, antidiabéticos y antiinflamatorios) (Dini y col., 2010). También se identificaron otros componentes relacionados con la prevención de enfermedades cardiovasculares y propiedades antihipertensivas (Caselato-Sousa y col., 2012; Taylor y col., 2014; Quiroga y col., 2015).

Además, estos cultivos son considerados por ser una buena fuente de riboflavina, tiamina, folatos, α- y γ-tocoferol, así como también cuentan con un mayor contenido de calcio, fósforo, magnesio, hierro, zinc, potasio y cobre en comparación con otros granos (Tablas 4 y 5) (Ruales y Nair, 1993a; Alvarez-Jubete y col., 2009; Jancurová y ~ 9 ~

INTRODUCCIÓN

col., 2009; Vegas-Gálvez y col., 2010; Repo-Carrasco-Valencia y Serna y col., 2011; Miranda y col., 2012). Sin embargo, gran parte de las vitaminas y minerales se pierden durante el procesamiento de los granos.

Figura 1: a) Imagen representativa de las distintas variedades de quínoa; b) planta de amaranto

Tabla 3: Composición de aminoácidos esenciales de quínoa, amaranto y trigo y los requisitos sugeridos por la FAO / OMS

Requisitos sugeridos por Quínoa Amaranto Trigo la FAO / OMS Aminoácido Niños Niños edad (g/100 g proteínas) edad Adultos escolar preescolar Histidina 3,2 2,5 – 3,0 2,0 1,9 1,9 1,6 Isoleucina 4,4 2,7 – 4,1 4,2 2,8 2,8 1,3 Leucina 6,6 4,2 – 6,3 6,8 6,6 4,4 1,9 Lisina 6,1 5,1 – 6,1 2,6 5,8 4,4 1,6 Metionina 4,8 4,1 – 4,9 3,7 2,5 2,2 1,7 + Cisteína Fenilalanina 7,3 6,0 – 8,5 8,2 6,3 2,2 1,9 + Tirosina Treonina 3,8 3,3 – 4,0 2,8 3,4 2,8 0,9 Triptófano 1,1 0,9 – 1,82 1,2 1,1 0,9 0,5 Valina 4,5 3,9 – 4,7 4,4 3,5 2,5 1,3 Tabla adaptada de Valcárcel-Yamani y da Silva Lannes, 2012.

~ 10 ~

INTRODUCCIÓN

Tabla 4: Composición de vitaminas de quínoa, amaranto y trigo

Vitaminas (mg/100g)a Granos Ácido Piridoxina Niacina Tiamina Riboflavina Folatos ascórbico Amaranto 2,8–3 nd 1–1,2 0,1–0,3 0,29–0,32 0,07 Quínoa nd 0,487 1,2–1,5 0,3–0,4 0,3–0,32 0,1–0,2 Trigo nd nd 0,7 0,3 0,03 0,01 Tabla adaptada de Dini y col., 2012. a en base seca, nd: no determinado

Tabla 5: Composición mineral de quínoa, amaranto y trigo

Contenido Mineral (mg/100g)a Granos Macro-minerales Micro-minerales K Na Ca Mg P Fe Zn Cu Amaranto 563 23 180–244 279–342 600 9,2–53 1,6 nd Quínoa 714–855 2.7–93 70–86 161–232 22–462 2,6–6,3 3,2–3,8 0,7–7,6 Trigo 132,4 nd 28–34,8 45,5–96,4 139 1,53–3,3 0,84–1,2 nd Tabla adaptada de Dini y col., 2012. a en base seca, nd: no determinado

Los granos de quínoa y amaranto contienen, asimismo en su composición, compuestos llamados anti-nutricionales, incluyendo taninos, inhibidores de proteasas, ácido fítico y saponinas (Chauhan y col., 1992; Ruales y Nair, 1993b). El ácido fítico en la quínoa y el amaranto oscila entre 10,5 y 13,5 g/kg y entre 2,9 y 7,9 g/kg, respectivamente (Yao Tang y Rong Tsao, 2017).

Algunos tratamientos a los que son sometidos los granos pueden reducir el porcentaje de estos anti-nutrientes. Por ejemplo, el lavado previo de los granos de quínoa con agua permite eliminar casi la totalidad de las saponinas (Haros y col., 2009).

ÁCIDO FÍTICO (mio-inositol 1,2,3,4,5,6 hexafosfato, InsP6)

El ácido fítico, mio-inositol 1,2,3,4,5,6 hexafosfato, o InsP6, es un ácido orgánico con una importante función fisiológica en la planta como reservorio de fósforo y cationes. Este compuesto está ampliamente extendido en sistemas naturales, especialmente

~ 11 ~

INTRODUCCIÓN

en los vegetales, sobre todo en semillas, frutos secos, leguminosas y en menor medida en tubérculos y hortalizas (Febles y col., 2002; Kumar y col., 2010).

El ácido fítico está formado por un polialcohol cíclico de seis átomos de carbono llamado mio-inositol, donde cada residuo alcohol está fosforilado.

Figura 2: Estructura del Ácido Fítico. Fuente: PubChem. URL: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov

El ácido fítico se encuentra cargado negativamente a pH fisiológico, lo que le confiere un extraordinario poder quelante con afinidad por diferentes componentes presentes en los alimentos que se encuentran cargados positivamente como proteínas (la porción libre de los aminoácidos básicos como Lys, Arg, His), minerales y elementos traza, formando complejos estables e insolubles a pH fisiológico impidiendo su absorción (Figura 3 a y b) (Cheryan, 1980; Konietzny y Greiner, 2003).

b a

Figura 3: a) Complejo fitato-metal. (Figura extraída de Oh y col., 2004); b) Interacciones fitato-minerales, fitato- aminoácidos (Figura extraida de http://www.gallospedragliofarm.com/usodeenzimas.html).

~ 12 ~

INTRODUCCIÓN

La interacción del ácido fítico no se limita solamente a las proteínas ingeridas con el alimento, sino que también se ha reportado la inhibición de enzimas digestivas endógenas, tales como la α-amilasa (Desphande y Cheryan, 1984; Knuckles y Betschart, 1987), lipasas (Knucckles, 1988) y proteasas tales como tripsina, pepsina y quimotripsina (Singh y Krikorian, 1982; Inagawa y col., 1987). Esta inhibición, puede ser debida a la interacción del fitato con las proteínas, que tienen en su sitio activo un residuo del aminoácido histidina, el cual al pH del duodeno se encuentra con un 50% de carga negativa. También, debido a la acción quelante del fitato sobre el ión calcio, el cual es esencial para la actividad de la tripsina y la α-amilasa (Greiner y Konietzny, 2006). El fitato es considerado como un factor antinutricional debido a su acción quelante sobre cationes divalentes, como Ca2+, Zn2+ y Fe2+, y a la interacción con proteínas importantes desde el punto de vista nutricional, disminuyendo la biodisponibilidad de estos nutrientes (Lopez y col., 2002; Kumar y col., 2010).

Esta característica del fitato hace que se lo considere como factor de riesgo sobre todo para grupos vulnerables como mujeres embarazadas y en etapa de lactancia, niños en edad preescolar, individuos con alteraciones gastrointestinales (no pueden absorben el hierro normalmente).

Asimismo, también ciertos reportes indican que los fitatos pueden tener actividades anti-carcinógenas y antioxidantes mediante la inhibición de la producción de radicales hidroxilos y la normalización de la homeostasis celular (Shamsuddin y col., 2002; Vucenik y col., 2003; Bohn y col., 2008; Kumar y col., 2010).

El fitato puede ser hidrolizado por la enzima fitasa, la cual es una fosfomono- esterasa capaz de hidrolizar secuencialmente al InsP6 vía penta-, tetra-, tri-, di- y monofosfato de mio-inositol (InsP5, InsP4, InsP3, InsP2, InsP1, respectivamente) y fosfato inorgánico (Sanz-Penella y col., 2012). Esta enzima, está ampliamente distribuida en la naturaleza, presente en plantas, microorganismos (hongos y bacterias) y ciertos tejidos animales (Liu y col., 1998).

~ 13 ~

INTRODUCCIÓN

En general, las fitasas son proteínas monoméricas, con algunas excepciones son tetraméricas (Oh y col., 2004). Basado en sus propiedades bioquímicas (pH óptimo, mecanismos catalíticos, especificidad de hidrólisis) y alineación de la secuencia de aminoácidos, las fitasas pueden ser categorizadas en dos clases principales: Clase I) fitasa ácida de histidina (HAP), que a su vez se clasifican en tres grupos diferentes (PhyA, PhyB y PhyC) y Clase II) fitasa alcalina (PhyD) (Oh y col., 2004). La mayoría de las fitasas vegetales, bacterianas y fúngicas pertenecen a la clase HAP. En la Tabla 6 se enumeran las características de las fitasas ácidas de histidina y alcalinas (Oh y col., 2004).

Tabla 6: Características moleculares y bioquímicas de las fitasas HAP y alcalinas

HAP Alcalinas Características PhyA PhyB PhyC PhyD Masa molec. (KDa) 62–128 270 42–45 38–45 Glicosilación Si Si No No pH óptimo 2,5–5,0 2,5 5,0–6,0 7,0–8,0 Temp. óptima (°C) 55–60 55–60 40–60 55–70 Estabilidad térmica Baja (60°C) Baja (60°C) Baja 60°C) Alta (85–95°C) Efecto del Ca+2 Inhibición Inhibición Inhibición Estimulación Efecto del EDTA Estimulación Inhibición Inhibición Inhibición Naturaleza del fitato Fitato libre de M Fitato libre de M Fitato libre de M Ca-fitato Especificidad de Posición 3 Posición 3 Posición 6 Posición 3 posición

Producto final InsP1 + 5Pi InsP1 + 5Pi InsP1 + 5Pi InsP3 + 3Pi Sitio activo a.a cargado (+) a.a cargado (+) a.a cargado (+) a.a cargado (-)

Tabla adaptada de Oh y col., 2004. M: metal; InsP1: mio-inositol monofosfato; InsP3: mio-inositol trifosfato; Pi: fosfato inorgánico; a.a: aminoácido.

La hidrólisis del fitato tiene un doble beneficio, por un lado, mejora la absorción de minerales en el tracto gastrointestinal y, por otro los fosfatos de mio-inositol de menor grado de fosforilación generados podrían afectar positivamente la salud humana (García-Mantrana y col., 2016).

Los animales monogástricos son incapaces de utilizar el fitato, ya que éstos carecen o presentan una baja actividad fitasa en su tracto digestivo (Haros y col., 2007).

Existen algunas estrategias para reducir el fitato, las cuales incluyen cambios en los tratamientos y procesamiento de alimentos que activan las fitasas endógenas de la

~ 14 ~

INTRODUCCIÓN

planta o el sustrato usado como alimento y de los microorganismos que están presentes naturalmente en ese sustrato (Greiner y Konietzny, 2006). Como ejemplo podemos citar los procesos de remojo y malteado de cereales (Türk y col., 1992; Haros y col., 2001) o el proceso de germinación (Greiner y col., 1998) con el cual la fitasa endógena del vegetal se activa hidrolizando el fitato liberando el fósforo necesario para el crecimiento y desarrollo de la planta.

Greiner y col. (1998) observaron una reducción de casi el 50% en el contenido de fitatos en centeno durante los 2 primeros días de germinación, llegando hasta el 84% de hidrólisis después de 10 días. Debido a que se necesitan largos períodos de tiempo para hidrolizar el fitato a través de la germinación, no es un método económico para ser aplicado a nivel industrial para el procesamiento de alimentos.

Otras estrategias usadas en la disminución del contenido de fitatos incluyen el uso de fitasas exógenas (fuente bacteriana o fúngica). Numerosas investigaciones evaluaron la efectividad de las fitasas comerciales sobre los fitatos en productos para consumo humano (Türk y Sandberg, 1992; Haros y col., 2001ab; Porres y col., 2001; Frontela y col., 2008; 2009; Rosell y col., 2009b). En la elaboración de pan integral, la adición de fitasa de Aspergillus (A.) niger resultó en una reducción significativa del fitato, hasta el 78% (Türk y Sandberg, 1992). Posteriormente, su uso como ingrediente en la producción de pan integral a fin de aumentar la absorción de hierro en humanos produjo una efectiva y completa hidrólisis de los fitatos (Sandberg y col., 1996).

Porres y col. (2001) utilizaron dos fitasas fúngicas (A. niger y A. fumigatus) y una bacteriana (Escherichia coli) en la preparación de pan integral para maximizar la degradación de InsP6, logrando porcentajes de hidrólisis superiores al 75% luego de dos horas y media de fermentación. Posteriormente, Haros y col. (2001 a, b) empleando fitasa de A. niger obtuvieron porcentajes de hidrólisis de hasta 59% en pan integral, mientras que alcanzaron valores cercanos al 80 y 90% en el caso de pan con fibra de algarroba y salvado, respectivamente. Esta estrategia resulta inviable

~ 15 ~

INTRODUCCIÓN

para ser aplicada a nivel industrial debido al tedioso y costoso proceso de recuperación y purificación de la enzima.

El uso de fitasas de origen microbiano (Schizosaccharomyces pombe, Penicillium funiculosum, Trichoderma reesei, A. niger y A. oryzae) está actualmente autorizado para su empleo en alimentación animal por los Reglamentos (UE) Nº 785/2007, Nº 1141/2007, Nº 891/2010, Nº 327/2010 y Nº 171/2011 de la Comisión Europea, sin embargo, al no ser enzimas de grado alimentario, no pueden ser adicionadas en alimentos destinados al consumo humano.

Otro proceso para disminuir el contenido de fitatos es mediante la fermentación, el cual abarca una amplia gama de procesamientos microbiano y enzimático de alimentos e ingredientes para lograr características deseables, como vida útil prolongada, mayor seguridad, mejores características organolépticas, enriquecimiento nutricional, eliminación de compuestos antinutricionales (Leroy y De Vuyst, 2004; Hugenholtz, 2008).

Los microorganismos utilizados para la fermentación de alimentos pueden ser parte de la microbiota natural que se encuentra en la materia prima o pueden ser cultivos iniciadores (o “starters”), especialmente seleccionados para producir cambios específicos en el sustrato (Greiner y col., 2006). El tipo de microorganismo, las condiciones de fermentación utilizadas (pH, temperatura, contenido de agua, sales minerales, etc.) y la cantidad inicial de fitato presente en la materia prima, afectan significativamente el grado de eliminación de fitato durante el proceso de fermentación (Türk y Sandberg, 1992).

En el caso de los productos integrales, el contenido de fitatos se encuentra en concentraciones elevadas y la acción enzimática de la fitasa endógena durante el proceso es insuficiente para degradar todo el fitato (Greiner y col., 1998; Haros y col., 2001a).

En general, las levaduras muestran baja actividad fitasa y para incrementarla, las condiciones deben favorecer la expresión de los genes de fitasa (Andlid y col., 2004).

~ 16 ~

INTRODUCCIÓN

En los procesos de fermentación se considera el uso de microorganismos con carácter GRAS “Generally Regarded As Safe” (Generalmente Reconocido Como Seguro) como las bifidobacterias y las bacterias lácticas (BL). En la bibliografía existen antecedentes de que ciertas bifidobacterias han sido utilizadas en procesos de elaboración de alimentos para la disminución de fitatos y el aumento en la biodisponibilidad de minerales (Sanz-Penella y col., 2009, 2012a). Sin embargo, sus exigencias nutricionales y la necesidad de una anaerobiosis estricta limitan su uso en la fermentación de alimentos. Por otro lado, existen antecedentes de que ciertas BL poseen la capacidad de degradar el fitato (López y col., 2000; De Angelis y col., 2003; Anastasio y col., 2010; Nuobariene y col., 2015; Cizeikiene y col., 2015).

BACTERIAS LÁCTICAS (BL)

Generalidades

Las bacterias lácticas son un grupo de microorganismos representado por varios géneros con características morfológicas, metabólicas y fisiológicas en común. En general, las BL son cocos o bacilos Gram positivos, no esporulados, no móviles, anaeróbicos, microaerofílicos o aerotolerantes; oxidasa y catalasa negativos, carentes de citocromos, son incapaces de reducir nitrato y producen ácido láctico como único o principal producto de fermentación de carbohidratos (Carr y col., 2002; Vázquez y col., 2009). Además, las BL son ácido tolerante pudiendo algunas crecer a valores de pH tan bajos como 3,2, otras a valores de pH tan altos como 9,6 y la mayoría a valores de pH entre 4,0-4,5 (Carr y col., 2002).

Estas bacterias presentan requerimientos nutricionales complejos que incluyen hidratos de carbono, sales, aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas y ésteres de ácidos grasos (Makarova y col., 2006). Las BL están generalmente asociadas con hábitats ricos en nutrientes, diversos productos alimenticios como leche, carne,

~ 17 ~

INTRODUCCIÓN

bebidas, verduras, frutas (Yang y Chang, 2010; Brosnan y col., 2012; Crowley y col., 2013; Delavenne y col., 2013), así también, algunas están asociadas a la flora normal del tracto nasofaríngeo, urogenital y gastrointestinal del hombre y animales (Zhang y col., 2012; Liévin-Le Moal y Servin, 2014), ejerciendo un efecto benéfico en estos ecosistemas (Fuller, 1989).

Clasificación taxonómica

En la 1ª edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology de 1986 (Sneath y col., 1986), las BL aparecían agrupadas en 5 géneros dentro de la clase Bacilli y del orden Lactobacillales: Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococccus. Desde entonces, estos géneros han sufrido sucesivos cambios, reordenamientos y divisiones, pasando de 13 géneros bacterianos en 2009 (Ruas‐

Madiedo y col., 2009) a los 38 géneros actuales con más de 200 especies. De acuerdo con la clasificación taxonómica actual, las BL pertenecen al filo Firmicutes, clase Bacilli y orden Lactobacillales. Este grupo filogenético está compuesto por alrededor de 500 especies, pertenecientes a 6 familias (Tabla 7) (Mattarelli y col., 2014; Felis y col., 2015).

Desde el punto de vista industrial, los géneros de mayor importancia incluyen: Lactobacillus, Lactococcus, Enterocococcus, Streptococcus, Pediococcus y Leuconostoc. Su participación es fundamental en la mayoría de los procesos de elaboración de alimentos fermentados ya que, de un modo parcial o total, intervienen en el desarrollo de textura y de caracteres organolépticos y/o en la preservación de una gran variedad de productos alimenticios, tanto de origen vegetal (pickles, vino, cerveza, ensilados) como de origen animal (quesos, leches fermentadas, embutidos) (Leroy y De Vuyst, 2004; Pothakos y col., 2015).

~ 18 ~

INTRODUCCIÓN

Tabla 7: Clasificación taxonómica de bacterias lácticas

Filo Clase Orden Familia Género Abiotrophia, Aerococcus, Facklamia, Dolosicoccus, Firmicutes Bacilli Lactobacillales Aerococcaceae Eremococcus, Globicatella, Ignavigranum Alkalibacterium, Alloiococcus, Allofustis, Atopobacter, Atopococcus, Atopostipes, Carnobacterium, Carnobacteriaceae Desemzia,

Dolosigranulum, Granulicatella, Isobaculum, Lacticigenium, Marinilactibacillus, Pisciglobus, Trichococcus Bavariicoccus, Catellicoccus,

Enterococcus,

Melissococcus,

Pilibacter, Enterococcaceae Tetragenococcus, Vagococcus Lactobacillus, Lactobacillaceae Pediococcus Fructobacillus,

Leuconostoc, Leuconostocaceae Oenococcus, Weissella Lactococcus, Streptococcaceae Lactovum, Streptococcus Tabla adaptada de Felis y col., 2015

~ 19 ~

INTRODUCCIÓN

Metabolismo

Las BL presentan un metabolismo estrictamente fermentativo y pueden clasificarse de acuerdo a las vías de degradación de azúcares que utilizan en: homofermentativas obligadas, heterofermentativas facultativas y heterofermentativas obligadas (Axelsson, 2004). Estos grupos se diferencian por la presencia o ausencia de enzimas involucradas en el metabolismo de azúcares (fructosa-1,6-difosfato aldolasa y fosfocetolasa).

Las BL homofermentativas obligadas sólo usan la ruta de la glucólisis o vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) para la fermentación de las hexosas, ya que son bacterias que carecen de fosfocetolasa y presentan una fructosa‐1,6‐bifosfato aldolasa (FDP-aldolasa) constitutiva. Estas bacterias son incapaces de metabolizar pentosas. El ácido láctico es el principal producto de fermentación (Axelsson, 2004). Las bacterias homofermentativas pueden sufrir un cambio metabólico hacia una fermentación ácido-mixta cuando el flujo glicolítico es bajo, afectando los niveles de los intermediarios y posteriormente, las actividades de las enzimas que compiten por el piruvato, dando lugar a otros productos además de lactato, como acetato, formiato y etanol (Figura 4) (Axelsson, 2004; Gänzle, 2015).

Por otro lado, las BL heterofermentativas obligadas fermentan no sólo las hexosas sino también las pentosas por la via del 6‐fosfogluconato (PK, del inglés phosphoketolase), también conocida como vía de las pentosas fosfato o vía de Warburg-Dickens, ya que presentan una fosfocetolasa constitutiva y carecen de fructosa‐1,6‐bifosfato aldolasa clave de la vía EMP. Los productos obtenidos por esta vía son además del ácido láctico, etanol, ácido acético y CO2 (Figura 5) (Carr y col., 2002).

Las BL heterofermentativas facultativas, fermentan hexosas por la vía EMP y pentosas y otros sustratos por la vía PK, debido a que tienen la enzima FDP-aldolasa constitutiva y la fosfocetolasa inducible (Carr y col., 2002).

~ 20 ~

INTRODUCCIÓN

Figura 4: Vía homofermentativa o glucólisis en bacterias lácticas. Las reacciones son catalizadas por las siguientes enzimas: 1: glucoquinasa; 2: glucosa-fosfato isomerasa; 3: fosfofructoquinasa; 4: fructosa‐1,6‐ bifosfato aldolasa; 5: triosa-fosfato isomerasa; 6: 1,3-P-glicerato; 7: fosfoglicerato quinasa; 8: fosfoglicerato mutasa; 9: enolasa; 10: piruvato quinasa; 11: lactato deshidrogenasa. Figura extraída de http://www.probioticosysalud.com/tesis-doctoral/introduccion/ii-metabolismo-de-hexosas-y-pentosas-en- bacterias-lacticas/ii-3-via-homofermentativa-glucolisis/ii-3-1-fermentacion-homolactica-de-la-glucosa/.

~ 21 ~

INTRODUCCIÓN

Figura 5: Vía heterofermentativa en bacterias lácticas. Las reacciones son catalizadas por las siguientes enzimas: 1: hexoquinasa; 2: glucosa-6-p deshidrogenasa; 3: 6-fosfogluconato deshidrogenasa; 4: ribulosa-5-p-3- epimerasa; 5: xilulosa-5-p-fosfocetolasa; 6: fosfotransacetilasa; 7: acetaldehído deshidrogenasa; 8: alcohol deshidrogenasa; 9: pentosa quinasa; 10: pentosa fosfato epimerasa o isomerasa; 11: acetato quinasa. Figura extraída de http://www.probioticosysalud.com/tesis-doctoral/introduccion/ii-metabolismo-de-hexosas-y- pentosas-en-bacterias-lacticas/ii-4-via-heterofermentativa-ruta-de-las-pentosas-fosfato/ii-4-1-fermentacion- heterolactica-de-la-glucosa/

Propiedades tecnológicas y funcionales de BL

Actualmente, las BL por ser microorganismso GRAS se emplean como iniciadores de la fermentación industrial de diversos alimentos. Un cultivo iniciador (starter) se puede definir como una preparación microbiana de un gran número de células de al menos un microorganismo previamente seleccionado, que se añade a una materia prima para acelerar el proceso de fermentación (Leroy y De Vuyst, 2004).

Las BL juegan un papel muy importante en la fermentación de productos como la leche, carne, bebidas alcohólicas y vegetales, no sólo por incrementar su vida de

~ 22 ~

INTRODUCCIÓN

estante (mediante la producción de ácido láctico, bacteriocinas o peróxido de hidrógeno), sino también por mejorar sus características organolépticas (textura, aroma y sabor), proporcionándoles, además un valor nutricional añadido a los alimentos. Además, algunas BL presentan características beneficiosas para la salud (propiedades probióticas) o capacidades metabólicas extraordinarias como son la producción de enzimas (amilasas, fitasas), vitaminas (folatos, riboflavina) o exopolisacáridos (EPS), de especial interés para la industria agroalimentaria y para la formulación de nuevos alimentos funcionales (Leroy y De Vuyst, 2004; Fontana y col., 2013; Pothakos y col., 2015; Thapa y Tamang, 2015; Di Cagno y col., 2016; LeBlanc y col., 2015).

VITAMINAS

Las vitaminas son micronutrientes esenciales para el metabolismo de todos los organismos vivos. Son compuestos orgánicos de estructuras químicas variadas, relativamente simples, distintos de carbohidratos, lípidos o proteínas. Estos compuestos son esenciales para mantener buena salud y crecimiento normal (Ekinci y Kadakal, 2005). La mayoría de las vitaminas deben ser aportadas a través de la alimentación, ya que el cuerpo humano no puede sintetizarlas (excepto la vitamina D) (LeBlanc y col., 2011). Cuando no son aportados con la dieta o no son absorbidos en el intestino, se puede desarrollar en el individuo un cuadro patológico de carencia o avitaminosis o deficiencias subclínicas. Aunque la mayoría de las vitaminas están presentes en una gran variedad de alimentos, las deficiencias vitamínicas todavía existen en muchos países, incluyendo a países industrializados (LeBlanc y col., 2011).

Pese a su carácter de nutriente esencial, las vitaminas no desempeñan funciones energéticas, aunque participan en numerosos procesos fisiológicos. Muchas integran sistemas enzimáticos en carácter de coenzimas, necesarias en la regulación de reacciones bioquímicas vitales en la célula (Blanco, 2006).

~ 23 ~

INTRODUCCIÓN

Generalmente, la clasificación de las vitaminas se realiza en función de la solubilidad, y así las dividimos en: a) liposolubles, están asociadas a los lípidos de los alimentos naturales e incluye las vitaminas A, D, E y K; b) hidrosolubles, las vitaminas incluidas en este grupo son solubles en agua e incluye la vitamina C y las del grupo B (tiamina,

B1; riboflavina, B2; niacina, B3; ácido pantoténico, B5; piridoxina, B6; biotina, B8; folatos, B9 y cobalamina, B12) (Fox y Cameron, 2004).

Riboflavina (B2)

La riboflavina es una vitamina B hidrosoluble, también conocida como vitamina B2. Es una vitamina termoestable y, por tanto, no se destruye durante los procesos de cocción de los alimentos, pero es muy sensible a la luz (Pérez Ríos y Ruano, 2004).

En el cuerpo, la riboflavina es principalmente encontrada como un componente integral de las coenzimas flavín adenín dinucleótido (FAD) y flavín mononucleótido (FMN) (Figura 6). Las coenzimas derivadas de la riboflavina se denominan flavocoenzimas, y enzimas que usan estas coenzimas son llamadas flavoproteínas (Fischer y Bacher, 2005).

Función

La riboflavina juega un papel importante actuando como coenzima en el metabolismo energético (Thakur y col., 2015). Los organismos vivos obtienen la mayoría de su energía de las reacciones redox, las cuales son procesos que involucran la transferencia de electrones, como el ciclo de Krebs. Las flavocoenzimas participan en las reacciones redox en numerosas rutas metabólicas. Son críticas para el metabolismo de los carbohidratos, lípidos, y proteínas. El FAD es parte de la cadena de transporte (respiratoria) de electrones, la cual es fundamental para la producción de energía (Food and Nutrition Board, 1998; Massey, 2000).

~ 24 ~

INTRODUCCIÓN

La piruvato deshidrogenasa, una enzima FAD dependiente, es responsable de la conversión de piruvato a acetil CoA, el cual es sometido a la oxidación total en el ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs) para la obtención de energía (Figura 7). En el esquema se muestran también otras enzimas que participan en el ciclo de Krebs dependientes de FAD como la α-cetoglutarato deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa (Blanco, 2006).

a b

c

Figura 6. Estructura de la riboflavina y sus coenzimas. a) riboflavina, b) FMN, c) FAD.

La riboflavina también cumple funciones antioxidantes. La glutatión reductasa es una enzima dependiente de FAD que participa en el ciclo redox del glutatión. El ciclo redox del glutatión juega un papel fundamental en la protección de organismos de especies reactivas del oxígeno, como los hidroperóxidos.

~ 25 ~

INTRODUCCIÓN

Figura 7: Esquema del ciclo de Krebs. Las enzimas marcadas con  son FAD dependientes. Figura extraída de http://www.ciclodekrebs.com/media/Ciclo_de_Krebs.png

La glutatión reductasa requiere de FAD para regenerar dos moléculas de glutatión reducido a partir del glutatión oxidado. La deficiencia de riboflavina ha sido asociada con un incremento del estrés oxidativo (Powers, 1999). La medición de la actividad de la glutatión reductasa en los glóbulos rojos es comúnmente usada para evaluar el estatus nutricional de la riboflavina (Ziegler y Filer, 1996).

La xantina oxidasa, otra enzima dependiente de FAD, cataliza la oxidación de hipoxantina y xantina a ácido úrico. El ácido úrico es uno de los antioxidantes hidrosolubles más efectivos en la sangre. Por lo tanto, la deficiencia de riboflavina puede derivar en una actividad disminuida de la xantina oxidasa, reduciendo los niveles sanguíneos de ácido úrico (Harrison, 2002; Hille, 2005).

Las flavoproteínas están involucradas en el metabolismo de varias otras vitaminas:

(vitamina B6, niacina, y folato). Por lo tanto, una deficiencia severa de riboflavina podría afectar varios sistemas de enzimas.

~ 26 ~

INTRODUCCIÓN

La 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) es una enzima dependiente de FAD que juega un papel importante en el mantenimiento de una coenzima folato específica, requerida para formar metionina a partir de homocisteína (Figura 8) (Powers, 2003).

Figura 8: Esquema de síntesis de metionina a partir de homocisteína. Figura extraida de http://lpi.oregonstate.edu/es/mic/vitaminas/riboflavina#funcion

Fuentes y requerimientos de riboflavina

La riboflavina es un micronutriente esencial en la dieta de los humanos, puesto que no somos capaces de sintetizarla, a diferencia de lo que ocurre con las plantas y la mayoría de los microorganismos (Powers, 2003). En general los alimentos de origen animal son más ricos en riboflavina que los de origen vegetal. Debido a las altas concentraciones de vitaminas del complejo B presentes en carnes y leche, estos alimentos son considerados como las mejores fuentes naturales de riboflavina en la dieta del hombre en todo el mundo (Silva y col., 2005). El hígado de cerdo o ternera constituyen la principal fuente de esta vitamina. Asimismo, las semillas y el germen de los cereales, el pescado y los huevos también son buenas fuentes (Tabla 8). El contenido de riboflavina en quínoa y amaranto es alrededor de 0,30 mg/100g base seca (Dini y col., 2012).

~ 27 ~

INTRODUCCIÓN

Tabla 8. Contenido en riboflavina de algunos alimentos

Alimento mg de B2/100 g Alimento mg de B2/ 100 g Almendra 0,67 Ostras 0,35 Champiñón 0,44 Queso de bola 0,30 Guisantes 0,25 Queso de Burgos 0,30 Hígado de cerdo 3,00 Queso Roquefort 0,70 Hígado de pollo 2,50 Soja en grano 0,40 Hígado de ternera 3,00 Yema de huevo 0,45 Huevo entero 0,30 Tabla adaptada de Pérez Ríos y Ruano, 2004

Deficiencia

Ariboflavonosis es la deficiencia clínica de riboflavina. Una deficiencia de riboflavina es raramente encontrada de manera aislada, ocurre con frecuencia en combinación con deficiencia de otras vitaminas hidrosolubles (Blanco, 2006).

Los síntomas de una deficiencia de riboflavina incluyen dolor de garganta, enrojecimiento e hinchazón de la mucosa de la boca y garganta, grietas o llagas en el exterior de los labios (quelosis) y en las comisuras de la boca (estomatitis angular), inflamación y enrojecimiento de la lengua (lengua magenta), y una inflamación cutánea húmeda y escamosa (dermatitis seborreica). Otros síntomas podrían involucrar la formación de vasos sanguíneos en la capa transparente del ojo (vascularización de la córnea) y conteo disminuido de glóbulos rojos en el cual los glóbulos rojos existentes contienen niveles normales de hemoglobina y son de tamaño normal (anemia normocítica normocrómica) (Azizi-Namini y col., 2012). Toda esta sintomatología se ve agravada si hay carencia de otras vitaminas del grupo B (Powers, 2003).

La deficiencia de riboflavina altera el metabolismo del hierro. Aunque el mecanismo no está aún claro, estudios en animales sugieren que la deficiencia de riboflavina podría perjudicar la absorción del hierro, incrementar la pérdida intestinal de hierro

~ 28 ~

INTRODUCCIÓN

y/o afectar la utilización del hierro para la síntesis de hemoglobina (Hb) (Powers y col., 1993).

La deficiencia subclínica de riboflavina ha sido observada en personas con trastornos alimentarios y patologías del sistema digestivo, principalmente las que inciden en el tracto gastrointestinal y las que provocan inflamación intestinal como la enfermedad de Crohn (Powers, 2003).

La cantidad diaria para cubrir requerimientos fisiológicos varía con la edad y el sexo. En general, se recomienda una ingesta regular de 0,3-0,6 mg/día en niños y de 0,9-1,1 mg/día en adultos (Food and Nutrition Board, 2000) (Tabla 9). Estados fisiológicos especiales como el embarazo y la lactancia, requieren mayor ingesta de riboflavina.

En los humanos, esta vitamina no se almacena y el exceso se elimina por orina.

Tabla 9: Ingesta recomendada de riboflavina según sexo y grupo de edad y estado fisiológico

Grupo Edad (años) B2 (mg/día) Infantes 0-0,5 0, 3 0,5–1 0,4 Niños 1–3 0,5 4–8 0,6 Hombres 9–13 0,9 14–70+ 1,3 Mujeres 9–13 0,9 14–18 1,0 19–70+ 1,1 Embarazo 1,4 Lactancia 1,6

Folatos (B9)

En la literatura, los términos folato y ácido fólico se usan indistintamente para esta vitamina B soluble en agua, que también es conocida como vitamina B9 o folacina. En este trabajo de tesis nos referiremos como “folatos,” a las formas encontradas en

~ 29 ~

INTRODUCCIÓN

alimentos o en el cuerpo, mientras que la forma sintética (ácido pteroil-L-glutámico) utilizada en suplementos o alimentos fortificados como “ácido fólico.”

Los folatos producidos naturalmente existen en diferentes formas químicas; se encuentran en los alimentos, como también en formas metabólicamente activas en el cuerpo humano. El ácido fólico es la mayor forma sintética encontrada en alimentos fortificados y suplementos vitamínicos (Quinlivan y col., 2006), no tiene actividad biológica a menos que sea convertido en folatos.

El folato dietario existe predominantemente en la forma de poliglutamilo (el cual contiene varios residuos de glutamato como por ejemplo, derivados de tetrahidrofolato, tal como el 5-metiltetrahidrofolato, 5-formil-tetrahidrofolato y 5,10- metilen-tetrahidrofolato) mientras que la forma sintética de la vitamina (el ácido fólico), es un monoglutamato, es decir que contiene sólo una fracción del glutamato. Además, los folatos naturales son moléculas reducidas, mientras que el ácido fólico es completamente oxidado.

a

b

Figura 9: Estructuras químicas de: a) ácido fólico (ácido pteroilglutámico), b) folatos naturales y sus sustituyentes. Figura extraida de Blanco, 2006.

Todos los folatos tienen en común la estructura del ácido pteroilglutámico (APG). Esta molécula está constituida por la unión de los siguientes constituyentes: i) un anillo de pteridina, proveniente de la guanosina-5’-trifosfato (GTP), ii) una parte central,

~ 30 ~

INTRODUCCIÓN

proveniente del ácido p-aminobenzoico (pABA) formado a partir de la vía del corismato, y iii) una cadena de glutamato cuya longitud varía según el número de unidades glutámicas (1-12) (Figura 9a). La forma totalmente oxidada de esta molécula es la que se conoce como ácido fólico (DeVries y col., 2005).

Los distintos folatos se diferencian en el anillo de pteridina, que puede presentar varias formas reducidas y varios tipos de sustituciones, y en el residuo de p- aminobenzoglutamato, que puede presentar unidos en enlace peptídico un número variable de residuos de glutamato. Los folatos que presentan los anillos de pteridina completamente reducidos son denominados “tetrahidrofolatos” (THF) y aquellos que están parcialmente reducidos son llamados “dihidrofolatos” (DHF).

Las unidades de C1 transportadas por esta vitamina constituyen los sustituyentes localizados en la posición N-5 y N-10 del anillo de pteridina, los cuales pueden ser el grupo metilo (-CH3), grupo formilo (-HCO), grupo formimino (-CHNH), grupo metenilo

(-CH=) y el grupo metileno (-CH2-) (Figura 9B). La mayoría de los folatos naturales son pteroilpoliglutamatos, es decir que contienen 2 a 7 glutamatos unidos por enlaces amida (peptídico) al grupo γ-carboxilo del glutamato. Los principales folatos intracelulares son pteroilpentaglutamatos, mientras que los extracelulares son pteroilmonoglutamatos (McGuire y col., 1984; Andreassi Li y col., 2002).

Función

En la célula, la función de los folatos reside principalmente en su capacidad para donar y captar unidades de carbono en una variedad de reacciones críticas para el metabolismo de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) y los aminoácidos (Figura 10).Estas reacciones son comúnmente conocidas como el ciclo de un carbono dependiente de folato. En estos ciclos, el folato o el ácido fólico es sometido a una serie de cambios metabólicos, en los que la forma THF, actúa como aceptor y dador de unidades de C1 (Lucock, 2000; Smulders y col., 2005).

~ 31 ~

INTRODUCCIÓN

Figura 10: Ciclos de un carbono dependientes de folato. TH4-folato: Tetrahidrofolato; SAM: S-adenosilmetionina; SHA: S-adenosilhomocisteína. Figura extraída de http://lpi.oregonstate.edu/es/mic/vitaminas/folato#definiciones.

El primero de estos ciclos está asociado con la producción de purinas y timidinas que son esenciales para la síntesis del ADN. En este ciclo el folato actúa como dador de una unidad de C1. Durante períodos de rápida división y crecimiento celular, como la infancia y el embarazo, el folato o el ácido fólico es crítico para el mantenimiento normal de la división celular. El segundo ciclo se relaciona con el metabolismo de la homocisteína y la metionina. Homocisteína es un producto intermedio del metabolismo de la metionina y ésta se metaboliza por dos vías: la remetilación, regenerado metionina, y la transulfuración, que convierte la homocisteína en cisteína. La vía de la metilación se compone a su vez de dos vías bioquímicas de intersección, una en la que participa 5-metil-THF y vitamina B12 y otra en la que participa la betaína (Figura 11).

~ 32 ~

INTRODUCCIÓN

Figura 11: Metabolismo de la homocisteína. TH4-folato: Tetrahidrofolato. Figura extraída de http://lpi.oregonstate.edu/es/mic/vitaminas/folato#definiciones.

La metionina puede ser a su vez utilizada para la síntesis de S-adenosilmetionina (SAM), que es el principal dador de grupos metilos, esenciales para procesos metabólicos como: metilación del ADN, de proteínas, neurotransmisores y fosfolípidos. (Blakley y col., 1984; Hanson y col., 2001; Quinlivan y col., 2006).

Fuentes y requerimientos de folatos

Los seres vivos son incapaces de sintetizar de novo los folatos por lo que éstos deben ser ingeridos de una fuente exógena, como i) alimentos de origen animal y vegetal: son ricos en folatos los vegetales frescos de hojas verdes y amarillas, las legumbres, los cereales y las frutas cítricas. Entre los alimentos de origen animal se destacan por su alto contenido de esta vitamina los órganos tales como el hígado y el riñón (Ohio State University, 2005). ii) Los provenientes de microorganismos comensales del intestino grueso que poseen la capacidad de sintetizar folatos, los cuales son absorbidos por el huésped (Said y col., 2000). Los productos lácteos (yogur, queso),

~ 33 ~

INTRODUCCIÓN

aceites, mermeladas y dulces también contienen folatos (Ohio State University, 2005). En la Tabla 10 se muestra el contenido de folato de algunos alimentos.

Aunque determinados alimentos contienen elevadas cantidades de folatos, esta vitamina es termolábil en condiciones fisiológicas y sensible a la luz (oxidación) (Maruyama y col., 1978; Lewis y col., 1979; Bailey, 2009). De esta manera, una parte considerable de folatos se destruye (hasta un 80% de su contenido) (Winkels y col., 2007) durante el procesamiento de los alimentos, o por el tratamiento de cocción, factores que pueden afectar la biodisponibilidad de la vitamina (McNulty y col., 2004).

Las ingestas recomendadas de folatos se calculan en base al requerimiento mínimo de ácido fólico puro aumentando la cantidad para cubrir la biodisponibilidad incompleta, la variación individual y la necesidad de reservas adecuadas. Los requerimientos diarios en adultos son de 200-400 µg y durante el embarazo estos aumentan a 400-600 µg (LeBlanc y col., 2015).

Tabla 10. Contenido en folatos en alimentos

Alimento mg de B9/100 g Alimento mg de B9/100 g Acelga 90 Espinacas 140 Palta 66 Hígado de pollo 590 Almendra 96 Hígado de ternera 240 Avena 60 Queso Roquefort 50 Brotes de soja 160 Yema de huevo 52 Maní 110 Tabla adaptada de Pérez Ríos y Ruano, 2004

Deficiencia

Por lo general, una deficiencia de folato es causada por una insuficiencia alimentaria; sin embargo, puede también presentarse en otras situaciones. Por ejemplo, el consumo crónico de alcohol está asociado con una disminución de la absorción del folato (sumada a una ingesta dietaría baja), las cuales pueden conducir a una

~ 34 ~

INTRODUCCIÓN

deficiencia de folato. Fumar esta también asociado con un estatus bajo de folato

(Halsted y col., 2002; Pfeiffer y col., 2013). Por otra parte, la deficiencia de folato puede resultar de condiciones de malabsorción, incluyendo enfermedades inflamatorias intestinales (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) y la enfermedad celíaca (Stabler, 2010). Finalmente, un cierto número de enfermedades genéticas (malabsorción del folato hereditaria, síndrome de la deficiencia de folato cerebral y la deficiencia de dihidrofolato reductasa) que afectan la absorción, el transporte, o el metabolismo y pueden causar una deficiencia de folato o impedir sus funciones metabólicas (Zhao y col., 2007; Banka y col., 2011; Grapp y col., 2012; Frye y col., 2013).

Debido al importante rol que cumplen los folatos en el organismo, la baja ingesta de ellos conduce a la etiología de varias enfermedades como cánceres (colon y mama, entre otros) (Kim, 1999; Novakovic y col., 2006; Xu y col., 2009), enfermedades cardiovasculares (Li y col., 2005), defectos del tubo neural (Scott y col., 2000; Basset y col., 2005). Asimismo, las relacionadas con la salud reproductiva y embarazo (Scholl y col., 2000; Tamura y col., 2006; Goh y col., 2008), alteraciones del sistema nervioso central y anemia megaloblástica, entre otras.

ALIMENTOS FORTIFICADOS

La adición de nutrientes en los alimentos con el fin de prevenir una deficiencia nutricional, o restaurar los nutrientes perdidos en el proceso, se conoce como fortificación. Para erradicar la deficiencia nutricional de vitaminas, la FAO (Food and Agriculture Organization) y la OMS (World Health Organization), han establecido principios generales de fortificación con vitaminas y minerales en alimentos (Allen y col., 2006). Sin embargo, cada país determina su propia política o reglamentos; en consecuencia, los enfoques de fortificación varían en el mundo. EE.UU., Canadá y

~ 35 ~

INTRODUCCIÓN

Argentina han desarrollado diferentes programas de fortificación de alimentos con vitaminas.

En Argentina, la Ley Nº 25630 del 2002 (modificada en el diciembre 2015) “Prevención de anemias y malformaciones del tubo neural” establece la adición de hierro, ác. fólico, tiamina, riboflavina y niacina, en harina de trigo, en sus presentaciones destinadas al consumo humano como la harina de trigo pan, sémola y semolín, la harina de maíz o sémola de maíz y la harina de mandioca comestible, que se comercializan en el mercado nacional (Tabla 11).

Tabla 11. Adición de nutrientes a la harina de trigo destinada al consumo en Argentina

Nutriente Forma del compuesto Nivel de adición (mg/Kg) Hierro Sulfato ferroso 30,0 Ácido fólico Ácido fólico 2,2 Tiamina Mononitrato de tiamina 6,3 Riboflavina Riboflavina 1,3 Niacina Nicotinamida 13,0 Fuente: Ley 25630 publicada en el Boletín Oficial el 23 de agosto del 2002(modificada en el diciembre 2015)

Sin embargo, algunos países no han adoptado un programa nacional de fortificación con ácido fólico a causa de los potenciales efectos adversos del mismo, como el enmascaramiento de la deficiencia de vitamina B12, lo que demora su diagnóstico (Bailey et al., 2003). Es importante señalar que los síntomas de la anemia resultante de una deficiencia de folato son idénticos a los resultantes de una deficiencia de vitamina B12, y ensayos clínicos adicionales son requeridos para diagnosticar la verdadera causa de la anemia megaloblástica (Sweeney y col., 2007). Grandes dosis de ácido fólico, administradas a un individuo con deficiencia de vitamina B12 no diagnosticada, pueden corregir la anemia megaloblástica sin corregir la deficiencia de vitamina B12 subyacente, dejando al individuo en riesgo de desarrollar un daño neurológico irreversible (Herbert y col., 1996; Shane, 2000). Los folatos naturales

~ 36 ~

INTRODUCCIÓN

(tales como el THF producido por las bacterias), a diferencia del ácido fólico, no enmascaran la anemia producida por déficit de vitamina B12 (Scott, 1999).

Las vitaminas, usadas en la fortificación de alimentos, son sintetizadas químicamente. Sin embargo, en los últimos años, es común el agregado de estos oligoelementos provenientes de procesos biotecnológicos empleando fuentes renovables (Stahmann y col., 2000). La fermentación mediante microorganismos productores de folatos y/o riboflavina constituiría una alternativa a la fortificación con las formas sintéticas de B2 y B9. Recientemente, la comunidad científica ha centrado su interés en la producción de vitaminas por BL. Si bien la mayoría de estas bacterias son auxótrofas para varias vitaminas, ciertas cepas tienen la capacidad de sintetizar cantidades significativas de vitaminas del grupo B, las cuales pueden ser usadas para combatir las deficiencias de

B2 y B9 (Capozzi col., 2011; Laiño y col., 2012; del Valle y col., 2014; Russo y col., 2014). Por esta razón las BL son candidatas ideales para producir compuestos específicos, como vitaminas o incrementar su concentración en los alimentos.

~ 37 ~

OBJETIVOS

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar la biodiversidad de bacterias lácticas (BL) en granos andinos (quínoa y amaranto) del noroeste argentino (NOA) y desarrollar nuevos alimentos funcionales a partir de los mismos empleando BL autóctonas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Aislar e identificar BL presentes en la microbiota natural de cultivos de quínoa y amaranto de la región del NOA.  Determinar las propiedades funcionales de las BL aisladas:  Selección de BL productoras de vitaminas del grupo B, específicamente folato y riboflavina.  Selección de BL capaces de hidrolizar fitato: actividad fitasa  Evaluar la funcionalidad de las BL seleccionadas en el diseño de nuevos alimentos usando los granos andinos como sustrato .

~ 40 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Microorganismos

1.1. Origen

En este trabajo de tesis doctoral se aislaron e identificaron cepas de bacterias lácticas de quínoa y amaranto (tanto de masas como de granos). Las mismas fueron luego depositadas en la Colección de Cultivo del Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA), San Miguel de Tucumán, Argentina.

1.2. Conservación

Con el fin de conservar las cepas en estudio a largo plazo, se prepararon cultivos stock de la siguiente manera: las cepas se cultivaron en caldo MRS a 30°C durante 16 h (fase estacionaria). Las células se cosecharon por centrifugación (10.000 x g, 5 min), se re-suspendieron en medio protector LEL-Glicerol estéril, concentrando el cultivo 10 veces y se fraccionó en viales estériles (1 mL) que se conservaron a -80°C hasta su uso.

1.3. Propagación

Se obtuvo un cultivo activo de la cepa en estudio mediante dos transferencias sucesivas en caldo MRS (inóculo al 2%, v/v) y una tercera en el medio a utilizar, incubadas a 30°C durante 16 h. La tercera propagación constituyó el cultivo activo, el cual se usó como inóculo.

2. Medios de cultivo

Los medios de cultivo utilizados en el presente trabajo fueron:

2.1. Medio Protector LEL-Glicerol

Medio LEL: Leche descremada en polvo 10 g, extracto de levadura 0,5 g, glucosa 1 g, agua destilada c.s.p. 100 mL. Se esterilizó a 115°C (0,6-0,7 atm de presión) ~ 44 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

durante 20 min. Se agregó glicerol puro (esterilizado por separado a 121°C, 20 min) al medio LEL en una concentración final del 20% (v/v).

2.2. Caldo MRS (de Man y col., 1960)

Peptona 10 g, extracto de carne 10 g, extracto de levadura 10 g, glucosa 20 g,

Tween 80 1 g, K2HPO4 2 g, acetato de sodio 5 g, citrato triamónico 2 g,

MgSO4.7H20 0,2 g, MnSO4.4H20 0,05 g, agua destilada c.s.p. 1000 mL. Se esterilizó a 121°C durante 20 min. El pH final del medio fue 6,2-6,4.

2.3. Caldo MRS-5 (Modificado de Meroth y col., 2003)

Peptona 10 g; extracto de carne 10 g; extracto de levadura 5 g; glucosa 20 g;

Tween 80 1 g; K2HPO4 2 g; acetato de sodio 5 g; citrato triamónico 2 g;

MgSO4.7H2O 0,2 g; MnSO4.4H2O 0,05 g; fructosa 5 g; maltosa 10 g; cisteína 0,5 mg; 1 mL de una mezcla de vitaminas conteniendo 0,2 g/L de cobalamina, ácido fólico, nictotinamida, ácido pantoténico, piridoxal fosfato y tiamina; agua destilada, c.s.p. 1000 mL; pH 5,8-6,0. La mezcla de vitaminas y la cisteína se esterilizaron por filtración. Los azúcares se esterilizaron a 121°C durante 20 min separado del resto de los componentes, los cuales se esterilizaron también a 121°C durante 20 min.

2.4. MRS y MRS-5 agar

Se preparó a partir del caldo de cultivo homónimo suplementado con 15 g/L de agar.

2.5. Hongos y Levaduras agar (H y L) (Britania)

Composición del medio en g/L: extracto de levadura 5 g; Glucosa 20 g; Cloranfenicol 0,1 g; agar 15g. pH del medio 6,6-6,8. El medio se preparó según especificaciones del comerciante y se esterilizo a 121°C durante 15 min.

~ 45 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

2.6. Mac Conkey agar (Britania)

Composición del medio en g/L: peptona de carne 1,5 g; peptona de gelatina 17 g; tripteina 1,5 g; lactosa 10 g; mezcla de sales biliares 1,5 g; Cloruro de sodio 5 g; Rojo neutro 0,03 g; Cristal violeta 0,001 g; agar 13,5 g. El pH final del medio es 7,3-7,5. El medio se preparó según especificaciones del comerciante y se esterilizo a 121°C durante 15 min.

2.7. Recuento en placa agar (PCA) (Britania)

Composición del medio en g/L: extracto de levadura 2,5 g; tripteína 5 g; glucosa 1 g; agar 15 g. El pH final del medio es 7,0-7,2. El medio se preparó según especificaciones del comerciante y se esterilizo a 121°C durante 15 min.

2.8. BHI (Brain heart infusión) agar (Britania)

Composición del medio en g/L: infusión de cerebro de ternera 200 g; infusión de corazón 250 g; peptona 10 g; cloruro de sodio 5 g; glucosa 2 g; fosfato disódico 2,5 g; agar 15 g. pH final de medio 7,2-7,4. El medio se preparó según especificaciones del comerciante y se esterilizo a 121°C durante 15 min.

2.9. Riboflavin Assay Medium (RAM) (Difco)

Dextrosa 20 g; acetato de sodio 15 g; casaminoácidos 10 g; fosfato monopotásico 1 g; fosfato dipotásico 1 g; L-asparagina 0,6 g; DL-triptofano 0,2 g; L-cisteína 0,2 g; sulfato de magnesio 0,4 g; sulfato de adenina 0,02 g; xantina 0,02 g; sulfato ferroso 0,002 g; guanina (HCl, 0,02 g; uracilo 0,02 g; sulfato de manganeso 0,02 g; cloruro de sodio 0,02 g; piridoxina (HCl) 0,004 g; piridoxal (HCl) 0,004 g; ácido p-aminobenzoico 0,002 g; pantotenato de calcio 0,0008 g; ácido fólico 0,0008 g; ácido nicotínico 0,0008 g; tiamina (HCl) 0,0004 g; biotina 0,000001 g; agua destilada c.s.p. 1000 mL, pH 6,6–6,8.

~ 46 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

2.10. Folic Acid Casei Medium (FACM) (Difco)

Digesto pancreático de caseína tratado con carbón 10 g; dextrosa 40 g; acetato de sodio 40 g; Tween 80 1 g; fosfato monopotásico 1 g; fosfato dipotásico 1 g; DL-triptófano 0,2 g; Larginina 0,6 g; L-cisteína (HCl) 0,5 g; adenina sulfato 0,010 g; guanina (HCl) 0,010 g; uracilo 0,010 g; xantina 0,020 g; polisorbato 80 0,010 g; glutatión (reducido) 0,005 g; sulfato de magnesio (anhidro) 0,20 g; cloruro de sodio 0,020 g; sulfato ferroso 0,020 g; sulfato de manganeso 0,015 g; riboflavina 0,001 g; ácido p-aminobenzoico (pABA) 0,002 g; piridoxina (HCl) 0,004 g; tiamina (HCl) 0,004 g; pantotenato de calcio 0,008 g; ácido nicotínico 0,008 g; biotina 0,0002 g; agua destilada c.s.p. 1000 mL. El pH final del medio de cultivo fue 6,6–6,8.

2.11. Caldo Chalmers modificado (Modificado de Vanos y Cox, 1986) (CCM)

Peptona 0,5 g; extracto de carne 0,5 g; extracto de levadura 0,5 g; glucosa 2 g; lactosa 2 g; fitato de sodio (Sigma-Aldrich Co; St. Louis, MO) 1g; agua destilada c.s.p. 100 mL. El fitato de sodio se esterilizó por filtración ajustando previamente el pH de la solución a pH=6. El resto de los componentes se disolvieron en agua, se ajustó el pH a 6 y se esterilizó a 121°C durante 20 min.

Aislamiento e identificación de bacterias lácticas (BL) de quínoa

y amaranto

3. Muestras utilizadas

3.1. Harinas

Se emplearon harinas comerciales de quínoa (Sturla, QS, lote Nº 0102011) y amaranto (Sturla, AS, lote Nº 0104011), además se utilizó harina de quínoa

~ 47 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

provista por la Cooperativa Agropecuaria y Artesanal Unión Quebrada y Valles (Quínoa Cica Hornillos, QC; CAUQUEVA, Argentina).

3.1.1. Preparación de las masas

A partir de las harinas se realizó una fermentación de masa espontánea durante 10 días empleando protocolo tradicional (“sourdough” Tipo I), sin el agregado de cultivos iniciadores o levadura de panadería para el aislamiento de BL.

Las masas ácidas o “sourdough” se prepararon en recipientes estériles de 500 mL utilizando 100 g de harina de amaranto o quínoa, 100 mL de agua estéril con 2 g de glucosa, DY (rendimiento de la masa [(peso masa / peso de harina) x 100] = 200. Las fermentaciones se llevaron a cabo a 30ºC durante 24 h. Después de la primera fermentación, se realizó un “backslopping” mezclando el 10% de la masa previamente fermentada con harina y agua (DY = 200). Esta etapa de “backslopping” se repitió cada 24 h durante 10 días. Se tomaron muestras los días 0, 1, 3, 6, 8 y 10 para la determinación del valor de pH y análisis microbiológico. La determinación de pH se realizó utilizando un pHmetro introductor portátil (Sartorius PT-10, Alemania).

3.1.2. Aislamiento de BL a partir de masas de quínoa y amaranto

Para determinar la microbiota presente en las masas ácidas, se tomaron 5 g de muestra (días: 0, 1, 3, 6, 8 y 10), se colocaron en bolsas estériles y se añadieron 45 mL de solución salina estéril 0,85% (p/v) (SSE) y se homogenizaron las muestras durante 1,5 min en un homogeneizador (Stomacher 400, UK). Luego se realizaron diluciones seriadas decimales de cada homogenato en SSE, se tomaron 100 μl de cada una de las diluciones y se plaquearon en los siguientes medios de cultivo: PCA agar (PCA (Plate Count Agar, Britania), MacConkey agar (Britania), BHI agar (Britania). Las placas fueron incubadas durante 48 h a 30°C. Para el aislamiento y el recuento de BL a partir de masa ácida, se utilizó MRS-5 agar (Meroth y col., 2003) con 0,1 g/L de cicloheximida, las placas se incubaron

~ 48 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

en anaerobiosis (AnaeroGen y AnaeroJar, Oxoid, UK) a 30°C por 48 h. Transcurrido el tiempo de incubación, se procedió a realizar el recuento de UFC/g masa. Se picaron colonias de las placas agarizadas de cada tiempo de fermentación y se transfirieron a placas de MRS-5 para conseguir cultivos puros. Las colonias (10) se recogieron aleatoriamente de las placas de agar que contenían entre 30 y 300 colonias. Luego se procedió a la caracterización de los aislamientos mediante observación microscópica, tinción de Gram y determinación de actividad catalasa. Se seleccionaron aquellos cultivos con morfología bacilar o cocoide y que tuvieran fenotipo Catalasa (—), Gram (+), a los cuales se realizó la extracción de ADN para su posterior identificación. Se conservaron a -80°C en medio Leche Extracto de Levadura (LEL) con glicerol (20 % de concentración final) para estudios posteriores.

3.2. Granos

Se usaron granos de quínoa de diferente procedencia [quínoa Cica de INTA Hornillos (QCH), quínoa Real de Coop. Cauqueva (QRC) y quínoa Real de INTA Hornillos (QRH)] y granos de amaranto (Amaranthus caudatus de INTA Hornillos (A1) y amaranto comercial “El peoncito” (A2).

3.2.1. Aislamiento de BL a partir de granos de quínoa y amaranto

Para el aislamiento de BL de granos se pesaron 2,5 g de granos y se mezclaron con 22,5 mL de caldo MRS-5 con 0,1 g/L de cicloheximida en bolsa estéril con filtro para homogeneizador. La muestra fue homogeneizada en agitador (Stomacher 400, Seward, UK) con dos pulsos de 30 seg e incubadas durante 30 min a 30°C. Luego, el contenido fue filtrado por el sistema filtrante (tamaño de poro de aproximadamente 330 µm), para eliminar restos de semillas y trasvasado a un recipiente estéril. Las muestras se incubaron durante 10 días a 30°C en condiciones estáticas y en microaerofília, tomándose muestra los días 0, 2, 7 y 10. Se midió el valor de pH de las muestras y se sembraron, mediante

~ 49 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

diluciones seriadas, en placas de MRS-5 agar, para realizar los aislamientos de BL. Las placas fueron incubadas a 30°C en microaerofília. Además, las muestras del día 0 se sembraron, mediante diluciones seriadas, en placas de PCA agar, H y L agar y MacConkey agar, para realizar los recuentos de microorganismos totales. Las placas fueron incubadas 48 h a 30°C en aerobiosis. Aproximadamente 40 colonias fueron picadas de cada variedad de grano y se transfirieron a placas de MRS-5 agar para aislar cultivos puros. Se examinaron los aislamientos de las tentativas BL según su morfología microscópica y se realizó tinción de Gram y determinación de actividad catalasa. Los aislamientos Gram (+) y catalasa negativa se conservaron a -80°C en glicerol (concentración final del 20%) para su posterior análisis e identificación usando técnicas moleculares.

4. Identificación de las colonias aisladas

4.1. Protocolo de extracción de ADN cromosomal

El aislamiento de ADN cromosomal se realizó mediante el protocolo descripto por Pospiech y Neumann (1995). Las células, provenientes de 5 mL de un cultivo en MRS en fase estacionaria de crecimiento, se centrifugaron 1 min a 9200 x g, se lavaron con 500 µL de tampón TE (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 75 mM, EDTA 25 mM) y se resuspendieron en 0,85 mL de tampón TE conteniendo 15 mg/mL de lisozima. Luego de incubar 2 h a 37°C, se agregaron 85 µL (1/10 vol) de SDS 10 % y 20 µl de proteinasa K 20 mg/mL, y se incubaron a 58°C durante 2 h. A continuación, se adicionaron 330 µL (1/3 vol) de NaCl 5 M y 1 vol de cloroformo dejando la mezcla a temperatura ambiente por 30 min. Después de centrifugar a 15.600 x g durante 10 min, se transfirió la fase acuosa a otro tubo, y a partir de la misma se recuperó el ADN mediante precipitación con isopropanol (1:1 v/v). El precipitado se lavó con 500 µL etanol 70%, se centrifugó durante 5 min a

~ 50 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

15600 x g, el ADN se secó dejando evaporar el alcohol y se resuspendió en 50 µL de agua miliQ.

4.2. Amplificación aleatoria de ADN polimórfico

La amplificación aleatoria de ADN polimórfico, más conocida por el acrónimo inglés RAPD (“Random Amplification of Polymorphic DNA”), es un tipo de marcador molecular basado en la reacción en cadena de la polimerasa. Los fragmentos de ADN obtenidos por medio de esta técnica se amplifican en regiones aleatorias del genoma ya que los cebadores de la reacción son secuencias arbitrarias de ADN sintético. Es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990 (Williams y col., 1990).

Las reacciones de RAPD-PCR se llevaron a cabo en termociclador My CyclerTM (BIO-RAD Laboratories, Inc, Hercules, CA, EE.UU.), utilizando los cebadores descriptos por Fontana y col. (2005): XD9 (5' GAA GTC GTC C 3') y M13b (5´ GAG GGT GGC GGT TCT 3´), sintetizados por la empresa Genbiotech SRL (Buenos Aires, Argentina). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µL conteniendo 2,5 µL de Tampón 10x [200 mM Tris-HCl

(pH 8,4), 500 mM KCl]; 1,5 µL de MgCl2 [50 mM]; 1 µL de una mezcla de desoxiribonucleósidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 5 mM); 1 U de Taq polimerasa (Invitrogen, Brasil); 1 µL del cebador correspondiente (10 µM); agua miliQ y como molde 3 µL del ADN cromosómico purificado, o bien 4 µL del lisado de los cultivos mencionados anteriormente. El programa de amplificación con el primer XD9 consistió en 5 min de desnaturalización inicial a 94°C, seguido por 45 ciclos de 94°C (1 min), 36°C (1min) y 72°C (1min), seguidos por un paso de elongación de 5 min a 72°C. El programa de amplificación con el primer M13b consistió en 10 min de desnaturalización inicial a 94°C, seguido por 40 ciclos de 94°C (1 min), 45°C (20 seg) y 72°C (2min), seguidos por un paso de elongación de 10 min a 72°C. Los amplicones resultantes se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% (p/v) sembrando 5 µL de los

~ 51 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

mismos. Se emplearon cubas de electroforesis de BioRad (BioRad, Richmond, California, USA) y una fuente de poder de la misma marca. La electroforesis se llevó a cabo a un voltaje constante de 80 V en tampón TAE [Tris-acetato 2 M, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] durante 105 min y se visualizaron por transiluminación UV después de la tinción con GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, Hayward, CA, EE. UU). En una calle de cada gel, se sembró marcador de tamaño molecular de 1 Kb (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se realizó la documentación de imagen digital usando una cámara CCD (Canon, Tokio, Japón). Los perfiles RAPD_PCR obtenidos fueron analizados mediante el software Scientific Image Processing (Image J 1.47v). El análisis de los geles permite distinguir diferentes perfiles o patrones, cada uno de los cuales corresponde a una cepa diferente.

4.3. Identificación de los aislamientos seleccionados mediante amplificación de la región variable del gen que codifica para el ARN ribosomal 16S

Para la identificación de los aislamientos se seleccionó un representante de cada perfil o patrón para ser identificado. Se amplificó por PCR la región variable V1 del gen que codifica para el ARN ribosomal 16S utilizando los cebadores PLB16 (5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’) y MLB16 (5’ GGC TGC TGG CAC GTA GTT AG 3’) (Hebert y col., 2000). Se utilizó una mezcla de reacción (volumen final = 50 µL) conteniendo 5 µL de tampón 10x [20 mM Tris-HCl (pH

8,4), 500 mM KCl]; 2.5 µL de MgCl2 [50 mM]; 2 µL de una mezcla de desoxiribonucleósidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 5 mM); 1 U de Taq polimerasa (Invitrogen, Brasil); 5 µL de cada uno de los cebadores [10 µM]; agua miliQ y como molde 3 µL del ADN cromosómico purificado previamente. El programa de amplificación consistió en 3 min de desnaturalización inicial a 94°C, seguido por 30 ciclos de 94°C (30 seg), 52°C (30 seg) y 72°C (45 seg); y finalmente un paso de elongación de 10 min a 72°C.

~ 52 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

4.3.1. Purificación de productos de PCR por precipitación con polietilenglicol (PEG)

A partir de un volumen de 50 µL de las reacciones de PCR, se sembró 5 µL en un gel de agarosa al 1% para verificar la amplificación. Al resto de la reacción de PCR se agregó 50 µL de una solución de 20% PEG- 2,5 M NaCl, se mezcló bien, y se incubó a 37°C durante 2 h. Luego, se centrifugó a 15.600 x g durante 15 min a temperatura ambiente, se descartó el sobrenadante, quedando el pellet adherido a la pared del tubo. Se agregaron 125 µL de etanol 70 %, se centrifugó nuevamente y se descartó el sobrenadante, eliminando la mayor cantidad posible del etanol. El pellet se secó a 37°C durante 10-15 min, y posteriormente se resuspendió completamente en 20 µL de agua miliQ.

4.3.2. Secuenciación y análisis de secuencias de ADN

Después de la purificación, los productos se secuenciaron en el Instituto CERELA-CONICET usando un secuenciador de ADN ABI 3130 (Applied Biosystems, Foster, CA). Las alineaciones de secuencias de genes de ARNr se realizaron utilizando el método de alineación de secuencias múltiples utilizando el algoritmo Blast, donde se compararon las secuencias de los ADNr 16S compilados con las depositadas en el National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Caracterización y selección de bacterias lácticas aisladas de quínoa y amaranto

5. Microorganismos

Bacterias lácticas (73 cepas) aisladas de masas ácidas y granos de quínoa (44) y de amaranto (29) e identificadas en la sección anterior fueron caracterizadas. Las mismas pertenecen a los siguientes géneros y especies: L. plantarum, L.

~ 53 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

rhamnosus, L. sakei, P. pentosaceus, E. casseliflavus, E. mundtii, E. hermaniensis, E. hirae, E. gallinarum, Enterococcus sp., Lc. mesenteroides, E. durans.

6. Caracterización de las bacterias lácticas

Se evaluaron las siguientes propiedades de las BL:

a) Capacidad de acidificación b) Capacidad de degradar el almidón c) Producción de filancia y/o polisacárido capsular (CPS) d) Capacidad de degradar fitato

e) Capacidad de producir vitaminas del grupo B: riboflavina (B2) y folatos

(B9)

6.1. Capacidad de acidificación

La capacidad de acidificación de las BL in vitro fue determinada según el método de Alfonzo y col. (2013). Se prepararon extractos estériles de harina (EEH) de quínoa y de amaranto: 200 g de harina se colocaron en agua destilada (1 L) y se esterilizó en autoclave a 121°C durante 20 min. Luego se dejó decantar la harina y se retiró el sobrenadante, el cual fue usado como medio de cultivo en los experimentos posteriores. Los cultivos de BL crecidos en MRS, se cosecharon por centrifugación a 5000 x g durante 5 min, se lavaron con solución salina estéril (NaCl 85% p/v) (SSE) y se estandarizó el inóculo resuspendiendo las células en SSE y ajustando la densidad óptica a DO600nm = 1,00, medido en espectrofotómetro (Spectronic 20, Bausch y Lomb, Nueva York, EE.UU.) que corresponde, aproximadamente a 109 UFC/mL. Luego, estas suspensiones celulares se inocularon individualmente (1% v/v) en 20 mL de EEH y los tubos se incubaron durante 72 h a 30°C. Las mediciones de pH se realizaron a 0, 4, 8, 24, 48 y 72 h después de la inoculación.

~ 54 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

6.2. Capacidad de degradar el almidón

Considerando que estos granos andinos poseen un elevado contenido de almidón y la importancia que involucra su degradación para el metabolismo de las BL, se evaluó la capacidad de BL de hidrolizar este polímero. Para ello se usó el método descripto por Lee, Gilliland y Carter (2001) con algunas modificaciones. Se utilizó medio MRS (De Man, Rogosa, and Sharpe, 1960) modificado donde la glucosa se sustituyó por almidón soluble al 1% (p/v, BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA). Con este medio se prepararon placas de Petri con medio agarizado (MRS-almidón) que fueron inoculadas con 5 μL de los cultivos overnight (ON) de BL e incubadas a 30°C durante 72h. La verificación de los halos de hidrólisis se realizó colocando 5 mL de solución de Lugol (5 mM de

I2 y 5 mM de KI) sobre las placas, se dejó 2 min y se retiró el excedente. Aquellas colonias que mostraron halos se las calificó como bacterias lácticas amilolíticas (BLA). Como control positivo se utilizó la cepa de L. amylovorus CRL 887 previamente descrita por tener una elevada actividad amilolítica (Laiño y col., 2014).

6.3. Producción de filancia y/o polisacárido capsular (CPS)

Para evaluar esta propiedad se usaron cultivos ON crecidos en MRS, 5 μL de estos cultivos se colocaron en placas de MRS agar y se incubaron a 30°C durante 48 h. La capacidad de formar colonias filantes se determinó observando la apariencia mucoide al tocar las colonias con un palillo estéril (Ruas-Madiedo y De Los Reyes-Gavilán, 2005). La formación de CPS se determinó mediante la técnica de tinción negativa con tinta china a partir de un cultivo activo cultivado en MRS líquido durante aproximadamente 16-24 h (Mozzi y col., 2001). Estos cultivos activos fueron lavados dos veces con SSE y colocados en porta objeto (5 μL) junto con una igual cantidad de tinta china, luego se observaron al microscopio óptico, empleando una lente de inmersión de 100X (Leica DM500).

~ 55 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

6.4. Capacidad de degradar fitato

La capacidad de degradar fitato por las cepas de BL fue determinada de acuerdo al protocolo descripto por Anastasio y col., (2010) con algunas modificaciones. La determinación de actividad fitasa de las BL se realizó en extractos libres de células (ELC) preparados de la siguiente manera: a partir de cultivo ON en medio de cultivo MRS, se hicieron tres pases en caldo Chalmers modificado (CCM) y se incubó a 30°C durante 24h. Entre cada pase se realizó el lavado de las células con SSE. La DO600nm inicial = 0,1 fue ajustada para hacer el tercer pase. Luego se incubó a 30°C midiendo DO600 nm hasta que las BL llegaron a fase exponencial de crecimiento (8-10h de incubación, aproximadamente). Las células se recolectaron por centrifugación (10.000 x g, 4°C, 5 min). Luego de dos lavados sucesivos con SSE, se añadieron perlas de vidrio (150-212 µm diámetro, Sigma- Aldrich Co; St. Louis, MO) y tampón acetato de sodio 0.2M, pH 5 (en una relación 1:1:2, células:perlas:tampón). A continuación, las células se rompieron con un disruptor celular BeadBeater Mini-8 (Biospec Products Inc., Bartlesville, OK, EE.UU.) a velocidad completa con 10 ciclos de 1 min cada uno, con intervalos de 1 min en hielo entre ciclo y ciclo. Para eliminar los residuos celulares y las perlas de vidrio, las muestras se centrifugaron (15.600 x g, 5 min, 4°C), los sobrenadantes obtenidos (ELC) se usaron inmediatamente para ensayos enzimáticos.

La actividad fitasa se determinó midiendo la cantidad de fosfato inorgánico liberado a partir de fitato sódico (Shimizu, 1992). Brevemente, se incubó la mezcla de reacción conteniendo 150 μL de ELC y 600 μL de sustrato (3 mM de Na-fitato en tampón acetato 0,2 M, pH 5,0) a 45°C durante 15 min. Se detuvo la reacción añadiendo 750 μL de ácido tricloroacético (TCA) al 5% (p/v). El fosfato inorgánico liberado se midió añadiendo 750 μL de reactivo de color preparado diariamente mezclando 4 vol de molibdato de amónio al 1,5% (p/v) en una solución de ácido sulfúrico al 5,5% (v/v) y 1 vol de sulfato ferroso 2,7% (P/v).

~ 56 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

Luego de 20 min se midió la absorbancia (DO700nm) usando un lector de microplaca VERSAmax TM (Sunnyvale, CA, EEUU). Los resultados se compararon con una curva estándar preparada con fosfato inorgánico (K2HPO4).

Una unidad de actividad fitasa (U) se definió como la cantidad de enzima que libera 1 nmol mL-1 de fosfato inorgánico por minuto a partir de una solución de Na-fitato 3 mM a pH 5,0 y a 45°C. La actividad fitasa volumétrica se determinó por el método descripto por Nuobariene y col. (2011).

Actividad fitasa volumétrica =

Donde Vt es el volumen total de muestra; V es el volumen de ELC; Δt es el tiempo de reacción y ΔC PO4 es el cambio de la concentración de fosfato en el tiempo.

La actividad fitasa especıfica se definió como unidades de actividad fitasa por mg de proteína (U/mg proteína). La concentración de proteína del ELC se determinó por el método de Bradford (1976), utilizando albúmina de suero bovino como patrón.

6.5. Capacidad de producir vitaminas del grupo B: riboflavina (B2) y folatos (B9)

6.5.1. Capacidad de BL de producir riboflavina

6.5.1.1. Selección de cepas

Las cepas fueron activadas en caldo MRS a incubadas 30°C durante 16h, luego las células fueron colectadas por centrifugación y lavadas 3 veces con SSE y resuspendidas a su volumen original. Esta suspensión se inoculó al 4% (v/v) en caldo Riboflavin Assay Medium (RAM, Difco, Becton, Dickinson, and Co., Sparks, Maryland), e incubadas a 30°C, 16 h sin agitación. El desarrollo bacteriano se determinó por medición de la absorvancia (DO600nm). A los cultivos que

~ 57 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

evidenciaron crecimiento, se les repitió 4 veces el procedimiento anterior inoculando la suspensión celular al 2% en medio RAM fresco. Posteriormente, se tomaron muestras (500 µL) de cada cultivo para determinar la concentración de riboflavina total, intracelular y extracelular, realizando previamente la preparación de las muestras.

6.5.1.2. Preparación de las muestras

Una alícuota de cultivo fue mezclada con el mismo volumen de ácido acético 1% (v/v), y centrifugada a 5.000 x g, 5 min. Se colectó el sobrenadante (muestra de riboflavina extracelular, RE) y el pellet se resuspendió al volumen original con ácido acético 1% (v/v) (muestra de riboflavina intracelular, RI). Las muestras de RE y RI fueron calentadas a 100°C, 5 min, centrifugadas (10.000 x g, 6 min) y conservadas a -70°C hasta la determinación de riboflavina. Para la determinación de riboflavina total (RT), una alícuota de cultivo fue mezclada con el mismo volumen de ácido acético 1% (v/v). La mezcla resultante (1 mL) fue calentada a 100°C, 5 min y centrifugada a 10.000 x g, 6 min. El sobrenadante fue recolectado y conservado a –70°C. Todas las muestras fueron procesadas en oscuridad.

6.5.1.3. Medida de la concentración de riboflavina

La determinación de riboflavina se realizó usando el método microbiológico de Golbach y col. (2007) modificado, usando L. casei subsp. rhamnosus ATCC 7469 como cepa indicadora. Esta cepa, conservada a -70°C, fue activada en caldo MRS e incubada a 37°C, 24 h. El cultivo (1 mL) fue lavado 3 veces con SSE y resuspendido al volumen original. Esta suspensión fue inoculada al 2% (v/v) en el caldo RAM e incubada a 37°C, 24 h. Para la determinación de riboflavina, se usó la cepa inoculada al 4% (v/v) en 12 mL de RAM.

Las muestras (RI, RE y RT) conservadas a –70°C, se descongelaron a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego se colocaron 100 µL de cada muestra y 100 µL

~ 58 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

de la cepa de referencia inoculada al 4% en 12 mL de RAM, en cada pocillo de una microplaca estéril de 96 pocillos (Deltalab, Argentina). Las placas se incubaron a 37°C, 48 h sin agitación, midiéndose la densidad óptica (DO580 nm) usando un lector de microplaca VERSAmax TM (Sunnyvale, CA, USA).

Una curva estándar fue realizada en cada microplaca usando riboflavina, grado HPLC (Fluka Biochemica, Sigma-Aldrich, Switzerland) como estándar. La concentración de riboflavina se expresó como nanogramos por mililitro (ng/mL), a partir del valor de riboflavina obtenido de la curva estándar, corregido por el factor de dilución.

Los resultados fueron comprobados mediante la técnica de HPLC, realizando el protocolo descripto por Juárez del Valle y col., (2014). La determinación fue llevada a cabo usando un equipo de HPLC con detector de fluorescencia (Shimadzu, Fluorescence detector RF-10 AXL, Prominence Line, Japan) usando una longitud de excitación de 445 nm y de emisión de 530 nm. Se utilizó una columna C18 Pursuit (XRs 5 C18, 150 mm x 4.6 mm, Varian). La riboflavina fue eluida en condiciones isocráticas usando, como fase móvil, acetato de sodio 0,05 M / metanol (30:70, v/v). Se realizó una curva estándar utilizando diferentes diluciones de riboflavina comercial (Fluka, Biochemika, Germany).

6.5.2. Capacidad de BL para producir folatos

6.5.2.1. Selección de cepas

Se evaluó la capacidad de las 73 cepas de BL de producir folatos. Las cepas fueron activadas en caldo MRS e incubadas a 30°C durante 16h, luego las células fueron colectadas por centrifugación y lavadas 3 veces con SSE y resuspendidas a su volumen original. Esta suspensión se inoculó al 4% (v/v) en el caldo FACM (Folic Acid Casei Medium, Difco, Becton, Dickinson, and Co., Sparks, Maryland) e incubadas a 30°C, 18 h sin agitación. Luego, se repitió el procedimiento anterior, y la suspensión celular se inoculó al 2% en caldo FACM. Los cultivos que

~ 59 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

desarrollaron bien (visualizado por incremento de la DO600nm) fueron lavados e inoculados al 2% en caldo FACM fresco. Este procedimiento fue repetido 4 veces. Se seleccionaron aquellas cepas que mostraron crecimiento hasta el quinto pase sucesivo en caldo FACM. Posteriormente, se tomaron muestras (500 µL) de cada cultivo para determinar la concentración de folatos total, intracelular y extracelular.

6.5.2.2. Preparación de las muestras

Un alícuota de cultivo fue mezclada con el mismo volumen de tampón protector [tampón fosfato 0,1M (pH 6,8)], con la adición de ácido ascórbico 1,5% (p/v) para evitar la oxidación de los folatos, y centrifugado (5000 x g, 5 min). Se colectó el sobrenadante (muestra de folato extracelular, FE) y las células se resuspendieron al volumen original con tampón protector (muestra de folato intracelular, FI). Las muestras de FE y FI fueron calentadas a 100°C, 5 min, centrifugadas (10.000 x g, 6 min) y almacenadas a -70°C hasta la determinación de folatos. Para la determinación de folato total (FT), una alícuota de cultivo fue mezclada con el mismo volumen de tampón protector. La mezcla resultante (1 mL) fue calentada a 100°C, 5 min y centrifugada a 10.000 x g, 6 min. El sobrenadante fue recolectado y almacenado a –70°C.

6.5.2.3. Medida de la concentración de folatos

La determinación de folatos se realizó empleando el método microbiológico de Horne y col. (1988) modificado usando L. casei subsp. rhamnosus NCIMB10463 como cepa de referencia (O'Broin y col., 1992), la cual es naturalmente resistente a cloranfenicol (>500 µg/mL). La cepa, conservada a -70°C, fue activada en caldo MRS e incubada a 37°C, 24 h. Un mililitro del cultivo fue centrifugado, lavado 3 veces con SSE y resuspendido al volumen original. Esta suspensión fue inoculada al 2% (v/v) en el caldo FACM e incubada a 37°C, 24 h. Este paso se repitió para disminuir el contenido de folatos en la cepa. Para la

~ 60 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

determinación de folatos, se usó la cepa inoculada al 4% (v/v) en 10 mL de FACM conteniendo 20 µg/mL de cloranfenicol (disminución del riesgo de contaminación microbiana).

Las muestras FT, FI y FE conservadas a -70°C, se descongelaron a temperatura ambiente en la oscuridad, para ser luego diluidas con tampón protector (1/40 y 1/80). Luego, en cada pocillo de una microplaca estéril de 96 pocillos (Deltalab, Argentina), se colocaron 100 µL de cada muestra diluida y 100 µL de la cepa de referencia inoculada al 4% (v/v) en 10 mL de FACM conteniendo 20 µg/mL de cloranfenicol. Las placas se incubaron a 37°C, 48 h sin agitación, midiéndose la densidad óptica (DO580nm) en un lector de microplaca VERSAmax TM (Sunnyvale, CA, EEUU). En cada microplaca, se realizó una curva estándar usando ácido fólico, grado HPLC (Fluka Biochemica, Sigma-Aldrich, Switzerland) como estándar. La concentración de folatos se expresó como nanogramos por mililitros (ng/mL), a partir del valor de folato obtenido de la curva estándar, corregido por el factor de dilución.

Ensayos in situ en masa de quínoa. Formulación del alimento prototipo

7. Muestras utilizadas

7.1. Harina

Tanto las masas ácidas como las pastas de quínoa fueron elaboradas con harina de quínoa comercial (Sturla lote N° H02 H17).

8. Pruebas realizadas en masa

8.1. Preparación del inóculo

Cultivos (ON) en medio MRS fueron repicados en el mismo medio (2% v/v) e incubados a 30°C durante 16 h hasta alcanzar la fase exponencial de ~ 61 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

crecimiento. Se cosecharon las células por centrifugación (5000 x g) durante 5 minutos, se lavaron dos veces con SSE y se estandarizó el inóculo a una densidad celular de aproximadamente 108 UFC/mL, resuspendiendo las células en agua corriente. En el caso de utilizar cultivos mixtos, se preparó una suspensión celular considerando la relación de 1/1 (cepa/cepa), llegando a una concentración final en la suspensión de 108 UFC/mL.

8.2. Preparación de las masas

Se prepararon masas ácidas o “sourdough” en recipientes estériles con harina de quínoa [Rendimiento de masa DY= (peso masa x 100 / peso harina) = 160]. Para ello se mezclaron 6,25 g de harina de quínoa con 3,75 mL de suspensión celular (108 UFC/mL), a fin de obtener un recuento en la masa de 7 aproximadamente 10 UFC/g de masa. Se tomó una alícuota (T0) para determinación de UFC/g de masa inicial y pH inicial utilizando un pHmetro introductor portátil (Sartorius PT-10, Alemania). El resto de las masas se incubaron a 30°C y al cabo de 24 h se determinaron recuento celular (UFC/g masa) y valores de pH.

Como controles se prepararon: un control negativo (masa inoculada con la cepa

E. gallinarum CRL 1989 por ser una cepa que no produce B2 y B9 y no tiene actividad fitasa), y un control de inóculo donde se reemplazó el volumen de inóculo para la formulación de la masa con agua corriente (sin inóculo).

Las distintas muestras de masas ácidas y controles, después de 24 h de fermentación, se colocaron en desecador y secaron en estufa a 50°C hasta peso constante. Posteriormente se molieron hasta obtener la consistencia de un polvo fino usando mortero de porcelana y se guardaron a -20°C para estudios posteriores.

Se determinó la humedad de las masas como la diferencia entre el peso húmedo y el peso seco de las masas que se secaron hasta peso constante.

~ 62 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

8.3. Determinación de riboflavina y folatos en masas

8.3.1. Preparación de las muestras

La extracción de vitaminas se realizó sometiendo las muestras de las distintas masas ácidas y controles (muestras secas y pulverizadas, conservadas a -20° C) a un tratamiento tri-enzimático descripto por DeVries y col., (2005) con algunas modificaciones. En el diagrama de flujo de la Figura 1 se muestran los pasos realizados. Se usó como tampón protector [tampón fosfato 0,1M (pH 6,8)], con la adición de ácido ascórbico 1 % (p/v) para evitar la oxidación de los folatos. Las enzimas [α-amilasa de Aspergilus oryzae (Cat. Nº 10065) y proteasa de Streptomyces griseus (Cat. Nº P5147) obtenidas de Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA] fueron disueltas en agua destilada a una concentración de 4 mg/mL y esterilizadas por filtración (0,22 µm). La enzima deconjugasa de folatos se obtuvo de plasma de ratas Wistar (INSIBIO-CONICET-UNT) de acuerdo a lo descripto por Aiso et al. (1998). Se realizó un control de enzimas tomando 1mL de tampón protector y realizando el mismo procedimiento que las muestras

(diagrama de flujo). El valor de B2 y B9 de este control se restó al valor de estas vitaminas obtenidas en las muestras. Todas las muestras fueron procesadas en oscuridad.

~ 63 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

0,5 g de muestra + 5 mL de tampón protector, con ácido ascórbico 1 % (p/v)

Mezclar vigorosamente

1 mL de la mezcla + 200 µL de α-amilasa

Incubar 2h a 37°C

Calentar a 100ºC para inactivar enzima

Agregar 200 µL de proteasa

Incubar 2,5 h a 37°C

Calentar a 100°C para inactivar enzima

La muestra resultante se dividió en dos partes:

600 µL de muestra + 60 µL de 800 µL de muestra + 100 µL de ácido acético glacial deconjugasa

Incubar 12 h a 37°C 10000 x g, 10 min

El sobrenadante fue recolectado y Calentar a 100°C almacenado a –70°C para para inactivar enzima determinación de B2. 10000 x g, 10 min

El sobrenadante fue recolectado y almacenado a -70°C para determinación de B9.

Figura 1: Diagrama de flujo que muestra los pasos seguidos para la extracción de vitaminas.

~ 64 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

8.3.2. Determinación de folatos (B9)

La determinación de folatos se realizó usando el método microbiológico detallado en el apartado 6.5.2.3. En este caso las muestras fueron diluidas en tampón protector con una dilución 1/100 y 1/200.

8.3.3. Determinación de riboflavina (B2)

La determinación de riboflavina en las distintas muestras de masas ácidas y en controles, luego del tratamiento tri-enzimatico, fue realizada por HPLC según el protocolo descripto en el apartado 6.5.1.3. Las muestras fueron desproteinizadas con ácido tricloroacético 0,75 M (proporción 3:1).

8.4. Determinación de fitato residual

La determinación del fitato residual en las distintas muestras de masas ácidas y controles se realizó por un método colorimétrico descripto por Gao y col., (2007). El fundamento del método se basa en la decoloración del complejo rosa de Fe+3--sulfosalicilato (reactivo Wade) por el fitato. El color rosa del reactivo Wade se debe a la reacción entre el ion férrico y el ácido sulfosalicílico con un máximo de absorbancia de 500 nm. En presencia de fitato, el hierro se une al éster de fosfato y no está disponible para reaccionar con el ácido sulfosalicílico, lo que resulta en una disminución de la intensidad del color rosado.

Preparación de las muestras: Se preparó un extracto crudo en tubos Falcón de 15 mL, para lo cual se pesó 0,5 g de muestras de masa, se agregó 10 mL de HCl 2,4% y se agitaron durante 16 h a velocidad moderada (220 rpm) en agitador orbital (Decalab, Argentina). Posteriormente se centrifugó a 1000 x g a 10°C durante 20 min, se recogieron los sobrenadantes a los cuales se los rotuló “extractos crudos.” A continuación, a fin de eliminar las interferencias de los componentes de la matriz que podrían interferir con la reacción colorimétrica en la determinación del fitato, se agregó 1 g de NaCl a los extractos crudos, se

~ 65 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

agitó a velocidad moderada en agitador orbital durante 20 min para disolver la sal y se dejó sedimentar a -20°C por 20 min. Luego, las mezclas se centrifugaron a 1000 x g a 10° C durante 20 min, se recogieron los sobrenadantes a los cuales se los rotuló “extractos limpios.”

Determinación del fitato residual: Se realizó una dilución 1/25 de los extractos limpios con agua destilada desionizada. Luego, en un tubo Falcón de 15 mL, se mezclaron 3 mL de estas muestras diluidas con 1 mL de reactivo de Wade

(0,03% de FeCl3 ∙ 6H2O + ácido sulfosalicílico al 0,3%), se mezclaron en agitador y se centrifugaron a 1000 x g a 10° C por 10 min. El blanco de reacción se preparó con 3 mL de agua destilada desionizada + 1 mL de reactivo de Wade.

La absorbancia (DO 500nm) de 200 μl de las muestras se determinó en un lector de microplaca VERSAmax TM (Sunnyvale, CA, EEUU). Los resultados se compararon con una curva estándar (1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 25, 50 y 100 mg/mL) preparada con fitato de sodio (Sigma, St. Louis, MO). La concentración de fitato se calculó a partir de la diferencia entre la absorbancia del blanco y el de las muestras ensayadas.

9. Compatibilidad entre cepas

A fin de poder utilizar cultivos iniciadores compuestos por más de una cepa, se realizó la verificación de compatibilidad entre cepas de BL, para lo cual se empleó el método de difusión en agar de acuerdo a Parente y col., (1995). Un resultado positivo se revela por la presencia de un halo de inhibición de la cepa testigo debido a la producción de sustancias antimicrobianas, indicando que hay incompatibilidad entre las cepas. A partir de cultivos de BL crecidas en MRS, las células fueron centrifugadas a 5000 x g durante 5 min, lavadas dos veces con

SSE y resuspendidas en SSE a una DO600nm = 1,00, medida en espectrofotómetro (Spectronic 20, Bausch y Lomb, Nueva York, EE.UU.) que corresponde, aproximadamente a 108 - 109 UFC/mL.

~ 66 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

Se prepararon cajas de Petri con 15 mL de MRS agar duro (1,5% agar) y se dejó solidificar. Posteriormente, se adicionó una segunda capa (10 mL) de MRS agar blando (0,7%) fundido y enfriado a 45°C conteniendo 50 µL de suspensión celular de la cepa “indicadora”. Una vez solidificada la segunda capa, se efectuaron orificios de 5 mm de diámetro con cilindros de plástico estériles en los cuales se colocaron 20 μl de las suspensiones celulares del resto de las cepas de interés con el objeto de detectar la producción de alguna sustancia que actúe como inhibidora del crecimiento de la cepa utilizada como indicadora. Las placas fueron luego incubadas a 30°C durante 24 h y se evaluó la presencia de halos de inhibición (≥2 mm). Todas las BL se utilizaron como cepas potencialmente productoras de compuestos inhibidores e indicadoras. 10. Formulación de un alimento a base de harina de quínoa bio- enriquecido en vitaminas y minerales: “ñoquis de quínoa.”

10.1. Elaboración de pasta de quínoa

Una vez seleccionada la cepa o la combinación de cepas que produjeron la mayor concentración de vitaminas (B2 y B9) y degradaron la mayor cantidad de fitato en las masas realizadas con harina de quínoa, se procedió a la elaboración del alimento bio-fortificado en vitaminas y minerales.

Para la elaboración de la pasta de quínoa, primeramente, se probaron cuatro protocolos a fin de obtener una masa con buenas características reológicas. Los protocolos probados fueron (Tabla 1):

 Protocolos 1 y 2: Se siguió el protocolo descripto por Chillo y col, (2009) usado para la elaboración de pastas con harinas no-convencionales, al cual se le realizó algunas modificaciones. Brevemente, se realizó una pasta fresca con un contenido de agua del 30% (p/p). Esta cantidad de agua se separó en dos partes iguales, una mitad para preparar almidón pre-gelatinizado (AP-G) y la otra mitad para realizar una masa ácida con un rendimiento de masa DY=160. Esta masa

~ 67 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

ácida se preparó de igual manera que en el apartado 8.2 del presente capítulo. El AP-G se obtiene mezclando una porción de harina de quínoa, 10 o 20% (p/p en base a la harina) con agua, esta mezcla luego se calienta a 80°C para inducir la gelatinización del almidón. Posteriormente se enfría a 40°C y se mezcla con la masa ácida fermentada (24 h de fermentación) para formar la pasta (ñoquis de quínoa).  Protocolos 3 y 4: fueron similares a los protocolos 1 y 2 pero el AP-G se realizó partir de fécula de mandioca. Como control en cada protocolo se realizó una pasta sin el agregado de AP-G. Tabla 1: Formulación de los diferentes protocolos realizados para la elaboración de pasta de quínoa.

% Harina de % AP-G % Agua Protocolos quínoa (p/p) (p/p) (p/p) 1 60 10 30 2 50 20 30 3 60 10* 30 4 50 20* 30 *: Almidón pre-gelatinizado obtenido a partir de fécula de mandioca. AP-G: almidón pre-gelatinizado

A partir de los resultados, se eligió el protocolo 4 para realizar los estudios posteriores. Se prepararon los diferentes grupos de pastas de quínoa:

• Grupo 1: masa control de pH [masa de quínoa sin fermentar, acidificada químicamente (pH 4) con una solución molar 4:1 de ácido acético: ácido láctico].

• Grupo 2: masa control (-) [masa de quínoa fermentada con la cepa E. gallinarum CRL 1989 no productora de riboflavina, folatos ni fitasa].

• Grupo 3: masa control Ribo+Fólico [masa de quínoa sin fermentar, acidificada químicamente (pH 4) con una solución molar 4:1 de ácido acético: ácido láctico, suplementada con riboflavina comercial (5,1µg/g masa) * y con ácido fólico comercial (1,6 µg/g masa) *].

~ 68 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

• Grupo 4: masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales [masa de quínoa fermentada con C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964)].

* Concentración de vitaminas B2 y B9 producidas por C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) en masa de quínoa.

Se determinó el pH inicial y final (24 h de fermentación) de todas las pastas evaluadas, como así también las UFC/g masa en las pastas que fueron inoculadas con el cultivo mixto y con la cepa no productora. Además, se preparó una pasta sin inóculo y sin ajustar el pH. Las muestras de los diferentes grupos de pastas se colocaron en desecador y secaron en estufa a 50°C hasta peso constante. Posteriormente se molió hasta obtener la consistencia de un polvo fino usando un mortero de porcelana y se conservaron a -20°C para estudios posteriores.

10.2. Determinación de riboflavina, folatos, minerales y fitato en pasta de quínoa

Las concentraciones de B2, B9 y fitato residual se determinaron en las diferentes pastas elaboradas como se detalló en los apartados 8.3 y 8.4 como así también la concentración de minerales solubles (Ca+2, Fe+2, Mg+2 y Pi) determinada según el protocolo descripto por Anastasio y col., (2010) con algunas modificaciones.

Extracción de minerales: Extractos con 5 g de muestra (muestras pulverizada, conservada a – 20°C) y 40 mL de HCl 0,65 M fueron preparados en tubos Falcón de 50 mL, luego se agitaron a 220 rpm durante 4 h en agitador orbital. Posteriormente se centrifugó a 4500 x g y se recuperaron los sobrenadantes a los cuales se les realizó una dilución 1/5 con agua destilada desionizada.

Determinación de minerales: La concentración de minerales solubles (Ca+2, Fe+2, Mg+2) de los extractos diluidos se determinó por espectrometría de absorción atómica. Las muestras fueron digeridas previamente con ácido nítrico concentrado. El proceso fundamental consiste en la atomización del metal a

~ 69 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

analizar en una llama de aire – acetileno y la absorción de la radiación emitida por una lámpara de cátodo hueco, previa realización de la curva de calibración donde se establece la relación absorbancia-concentración. Los estándares que se emplean son trazables a NIST (National Institute of Standars and Technology). El equipo que se usó es un espectrómetro de absorción atómica marca Perkin Elmer modelo AAnalyst 100. En todos los casos se emplea lámpara de cátodo hueco, para calcio (λ=422,7 nm), para hierro (λ=248,3 nm) y para magnesio (λ=285,2nm).

El fosforo fue determinado por método colorimétrico basado en el protocolo descripto por Correa y col., (2017). El método se basa en la formación de un complejo coloreado en presencia de fosforo (fosfomolibdato,

(MoO24MoO3)2H3PO4) que en presencia de ácido ascórbico se reduce a azul de molibdeno y cuya absorbancia se lee a una longitud de onda de 660 nm. Se realizaron curvas de calibración a diferentes concentraciones empleando un estándar, fosfato monobásico de potasio KH2PO4.

Evaluación de la funcionalidad de pasta fermentada bio- enriquecida en vitaminas y minerales en un modelo animal

11. Animales de experimentación

Se emplearon ratones BALB/c (hembras de 3 semanas de edad) criados y mantenidos en colonia cerrada en el bioterio del Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA, San Miguel de Tucumán, Argentina). Los mismos fueron colocados en cajas individuales, mantenidos en condiciones ambientales controladas (temperatura 20 ± 2°C; humedad 55% ± 2%) con ciclos de 12 h de luz/oscuridad. Durante todo el período de experimentación, los animales tuvieron libre acceso a agua y alimento sólido. Para llevar a cabo los ensayos se utilizó un alimento para roedores de composición definida libre en riboflavina y folatos (Dyets, Bethlehem, USA) cuya composición se detalla en la Tabla 2, a la

~ 70 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

que se denominó Dieta Deficiente (DD). Una dieta convencional completa (DC) cuya composición es idéntica a la DD, pero suplementada con 7 mg de riboflavina/Kg de alimento y 2 mg de ácido folico/Kg de alimento, fue utilizada para alimentar a los animales de los grupos control. Los protocolos experimentales fueron previamente aprobados por el Comité de Ética para el Cuidado Animal de CERELA (CRL-BIOT-LT-2014-1A).

Tabla 2: Composición de las dietas (Dyets, Bethlehem, USA).

Dieta Control* Dieta Deficiente** Ingredientes Concentración g/kg de dieta L-Alanina 3,5 3,5 L- Arginina (base libre) 11,2 11,2 L- Asparagina.H2O 6,82 6,82 L- Acido Aspártico 3,5 3,5 L- Cisteína 3 3 L-Acido Glutámico 35 35 Glicina 23,3 23,3 L-Histidina 3,3 3,3 L-Isoleucina 8,2 8,2 L-Leucina 11,1 11,1 L-Lisina-HCl 18 18 L- Metionina 8,2 8,2 L-Fenilalanina 11,6 11,6 L-Prolina 3,5 3,5 L-Serina 3,5 3,5 L- treonina 8,2 8,2 L- Triptofano 1,74 1,74 L-Tirosina 3,5 3,5 L-Valina 8,2 8,2 Dextrina 397 397 Sucrosa 100 100 Celulosa 50 50 Aceite de soja 70 70 Mix de minerales #210025 35 35 Acetato de Sodio 8,1 8,1 Mix de vitaminas #317759 (libre de ácido fólico y riboflavina) 10 10 Riboflavina Premix (1mg/g) 7 -- Premezcla Ácido Fólico/Sucrosa 2 - Cloridrato de Colina 2 2 * Dieta para roedores de composición L-aminoácido definida con riboflavina (7mg/Kg) y con 2 mg/kg de ácido fólico agregado. ** Dieta para roedores de composición L-aminoácido definida sin riboflavina y ácido fólico agregado

~ 71 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

12. Protocolo de prevención de deficiencia nutricional en riboflavina y folatos

Con el objeto de evaluar la eficiencia biológica de folatos y riboflavina, producidos por L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964 en masa de quínoa, en prevenir el desarrollo de la deficiencia nutricional en ambas vitaminas, los ratones destetados fueron divididos en 6 grupos, los cuales fueron alimentados durante 42 días consecutivos, con:

Grupo 1: DD + masa control de pH [masa de quínoa sin fermentar, acidificada hasta pH 4 con ácido láctico/acético (4/1)].

Grupo 2: DD + masa control cepa no productora (masa de quínoa fermentada con una cepa no productora de riboflavina, folatos ni fitas).

Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico [masa de quínoa sin fermentar, acidificada hasta pH 4 con ácido láctico/acético (4:1), suplementada con riboflavina comercial (3.034 ng/g masa) * y con ácido fólico comercial (962 ng/g masa) *].

Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales (masa de quínoa fermentada con C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964)).

Grupo control (GC): Dieta convencional Completa, comercial (DC)

Grupo deficiente (GD): Dieta deficiente en ambas vitaminas, comercial (DD)

* Concentración de vitaminas B2 y B9 producidas por C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) en masa de quínoa.

Todos los grupos de ratones tuvieron libre acceso al agua de bebida y al alimento correspondiente durante el experimento (Figura 2).

Al final de este período (42 d), se realizó el sacrificio de los animales (8 por grupo mediante sangrado bajo anestesia) para la toma de muestras.

~ 72 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

BALB/c hembras infantes (3 semanas de edad)

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo C Grupo D (n=8) (n=8) (n=8) (n=8) (n=8) (n=8)

Periodode alimentación días) (42 Grupo Grupo Grupo experimental control Deficiente Figura 2: Protocolo experimental de prevención de deficiencia nutricional en riboflavina y folatos usando un modelo de ratón. Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD masa+ control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales; Grupo control: Dieta convencional Completa, comercial (DC); Grupo deficiente: Dieta deficiente en ambas vitaminas, comercial (DD).

13. Obtención y procesamiento de muestras

13.1. Muestras de sangre periférica

Las muestras de sangre fueron obtenidas por punción cardíaca de animales previamente anestesiados con pentobarbital sódico.

13.1.1. Muestras de sangre periférica para hemograma

Las muestras se obtuvieron empleando EDTA como anticoagulante en la concentración de 1,5 mg/mL de sangre, manteniendo la relación sangre:anticoagulante (9:1) recomendada por el Comité Internacional para la Estandarización en Hematología (ICSH) (ICSH, 1977).

13.1.2. Muestras de sangre entera y plasma

Las muestras se obtuvieron en tubos plásticos empleando EDTA como anticoagulante en la concentración de 1,5 mg/mL de sangre, manteniendo la relación sangre:anticoagulante (9:1) recomendada por el ICSH (ICSH, 1977).

Se tomó una alícuota (100 μL) de la sangre entera y se almacenó a -70°C hasta su análisis. El resto de sangre entera se centrifugó (3000 x g, 10 min) y se

~ 73 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

trasvasó el plasma a otro tubo. Las muestras de plasma fueron fraccionadas en alícuotas y almacenadas a -70°C (Dacie y col.,2008). Las células sedimentadas (eritrocitos) se lavaron 3 veces con solución fisiológica fría (NaCl 0,15 M, 4°C). Los eritrocitos (0,05 mL) se hemolizaron mediante el agregado de agua destilada (0,95 mL) y se conservaron a -70°C.

13.1.3. Muestras de suero

Las muestras de sangre entera se obtuvieron en tubos de plástico, sin anticoagulante, se las dejo a 37°C durante 30 min para que coagulen, luego se centrifugó a 1000 x g 10 min y se separó el sobrenadante. Estas muestras fueron utilizadas para la determinación de minerales.

13.2. Muestras de órganos (hígado, bazo y riñón) para dosaje de folatos

El hígado, bazo y riñones fueron extraídos y colocados en tubos Eppendorf. Los órganos se pesaron inmediatamente después de ser obtenidos empleando una balanza electrónica. El peso final resultó del promedio de los valores obtenidos en tres pesadas diferentes realizadas en forma alternada.

13.3. Obtención de las muestras histológicas de los animales de experimentación

Los intestinos fueron lavados dos o tres veces con PBS para posterior estudio histológico. Porciones de intestino delgado fueron cortadas y fijadas en solución de formaldehido al 10% en PBS durante 24 h a temperatura ambiente. Posteriormente, los tejidos fueron enviados a laboratorio bioquímico para tinción y corte histológico de los mismos.

~ 74 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

13.4. Procesamiento de sangre entera y plasma para la determinación de folatos

Las muestras de sangre entera se procesaron de acuerdo al siguiente protocolo: se descongeló la alícuota de sangre entera a temperatura ambiente, se colocó en tubo de plástico 50 μL más 950 μL de agua destilada estéril (dilución 1/20), a fin de lisar los glóbulos rojos y liberar el folato. Luego se hizo una dilución 1/50 con tampón protector estéril (tampón fosfato 0,1 M conteniendo 1% de ác. ascórbico). Se incubó a 37°C durante 3 h para activar la conjugasa presente en el suero y que ésta convierta los folipoliglutamatos de los eritrocitos en folilmonoglutamatos que luego serán determinados por el dosaje microbiológico. Luego, la muestra se calentó a 100°C, 5 min, se centrifugó a 13000 x g, 10 min. Se separó el sobrenadante, se fraccionó en alícuotas y se conservó a -70°C.

Las muestras de plasma se procesaron de acuerdo al siguiente protocolo: una alícuota (100 μL) de plasma se colocó en 900 μL de tampón protector estéril

(dilución 1/10), a fin de lisar los glóbulos rojos y liberar el folato. Se incubó a 37° C, 3 h para activar la conjugasa. Luego, la muestra se calentó a 100°C, 5 min; se centrifugó 13000 x g, 10 min. Se separó el sobrenadante y se fraccionó en alícuotas las cuales fueron conservadas a -70°C.

13.5. Procesamiento de órganos para la determinación de folatos

Las muestras de órganos se procesaron siguiendo este protocolo: se colocó cada órgano, previamente pesado, en 5 mL de tampón protector y se disgregó empleando un homogeneizador. El homogenato se incubó a 37°C para activar conjugasa, luego se calentó el homogenato a 100°C 5 min, se centrifugó a 13000 x g, 10 min, se trasvasó el sobrenadante y se fraccionó en alícuotas y se conservó a -70°C.

~ 75 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

14. Evaluación de las muestras

14.1. Determinación de la concentración de folatos en sangre entera, plasma y órganos

La determinación de folatos se realizó usando el método microbiológico (Horne y col., 1988) modificado usando L. casei subsp. rhamnosus NCIMB10463 como cepa de referencia (O'Broin y col., 1992), la cual es naturalmente resistente a cloranfenicol (>500 μg/mL). Las muestras fueron diluidas en tampón protector en la siguiente relación: a) Sangre entera = dilución 1/100, b) Plasma de animales deficientes = dilución 1/10 y Plasma de los demás grupos = dilución 1/20, y c) Órganos = dilución 1/500.

Para el cálculo final de la concentración de folatos en sangre entera y plasma se consideró la dilución inicial 1/20 y 1/10 respectivamente, realizada durante el procesamiento de la muestra, mientras que, en el caso de los órganos, se tuvo en cuenta el peso de los órganos y el volumen de tampón empleado en la disgregación de los mismos.

14.2. Determinación del estado de riboflavina

El coeficiente de activación de la glutatión reductasa eritrocitaria o EGRAC por sus siglas en inglés es un método para determinar el estado funcional de la riboflavina. El EGRAC es un método funcional que consiste en la reducción de la glutatión oxidada (GSSG) a su forma reducida (GSH) mediante la glutatión reductasa que tiene FAD como cofactor. El NADPH se oxida a NADP+ y se monitoriza a 340 nm. El EGRAC calcula el coeficiente del índice de la variación de la absorbancia por unidad de tiempo en presencia y ausencia del FAD (Ecuación 1.1).

Para determinar EGRAC se utilizó la técnica descripta por Adelekan y Thurnham (1986) con modificaciones. La sangre hemolizada fue descongelada a

~ 76 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

temperatura ambiente (21°C) en la oscuridad. Muestras de sangre hemolizada (31,3 μL) se adicionaron a 1 mL de tampón fosfato (PBS 0,1 M, pH 7,4) conteniendo 2,3 mM de ácido etilen diamino tetracético (EDTA) y 0,89 mM de glutatión oxidado (GSSG) con o sin FAD (1 mM). La mezcla fue preincubada a 37°C 30 min; luego, 200 μL se colocaron en cada pocillo de una microplaca estéril de 96 pocillos (Deltalab, Argentina) a los cuales se agregó 2 mM de

NAPDH (8 μL) para comenzar la reacción. Se midió la DO340nm cada 5 min durante una hora a 37° C usando un lector de microplaca VERSAmaxTM (Sunnyvale, CA, USA). La determinación del EGRAC fue realizada, en cada muestra, por triplicado.

Ecuación 1.1 EGRAC= (ΔA340 con FAD/ ΔA340 sin FAD)

Un valor de EGRAC inferior a 1,3 se considera normal; valores iguales o mayores a 1,3 indican deficiencia de riboflavina.

14.3. Evaluación histológica del intestino delgado

Los cortes histológicos teñidos con hematoxilina y eosina se observaron mediante un microscopio trinocular (Carl Zeiss, modelo Primo Star, Alemania). Las imágenes se capturaron con un ocular WF 10x/ 20, objetivos de 10X y 40X, que tiene adicionado una cámara digital (Canon Powershot G9, 12 megapixels, Japón). Las imágenes capturadas fueron procesadas y analizadas usando el programa AxioVision Rel. 4.8, que permite hacer mediciones microscópicas.

14.4. Peso corporal

El peso de los animales vivos fue determinado cada 2 días durante todo el periodo de alimentación, y el día de toma de muestra. Se utilizó una balanza electrónica (ACCULAB, USA) con una sensibilidad de 0,01 g y el peso final resultó

~ 77 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

del promedio de los valores obtenidos en tres pesadas diferentes realizadas en forma alternada.

15. Determinación de minerales en suero

La cuantificación de los minerales (Ca+2, Fe+2, Mg+2 y Pi) en suero se realizó con el equipo cobas c system (Roche/Hitachi, USA), mediante un Test in vitro, basado en metodos colorimétricos. El fosfato inorgánico (Pi) fue determinado por un método fotométrico con molibdato de amonio. El principio del método es el siguiente: en presencia de ác. sulfúrico, el Pi forma un complejo de fosfomolibdato de amonio con el molibdato de amonio.

Pi + molibdato de amonio H2SO4 fosfomolibdato de amonio

La concentración de fosfomolibdato formado es directamente proporcional a la concentración de Pi y se mide fotométricamente.

El calcio (Ca+2) también fue determinado por un método fotométrico el cual consiste primeramente en una reacción, bajo condiciones alcalinas, de los iones calcio con el 5-nitro-5-metil-BAPTA para formar un complejo. En un segundo paso, el complejo formado reacciona con EDTA.

Ca+2 + NM-BAPTA pH alcalino Complejo de Calcio-NM-BAPTA

Complejo de Calcio-NM-BAPTA NM-BAPTA + + EDTA Complejo calcio-EDTA

El cambio de absorbancia es directamente proporcional a la concentración de calcio.

El hierro (Fe+2) fue determinado por el método FerroZine sin desproteinización. pH ˂2 Complejo transferrina-Fe apotransferrina + Fe+3

ascorbato Fe+3 Fe+2

Fe+2 + Ferrozine complejo cromático

~ 78 ~

MATERIALES Y MÉTODOS

En medio ácido, el Fe+3 se libera de la transferrina, luego el ascorbato reduce los iones de Fe+3 a Fe+2 que reaccionan con FerroZine para formar un complejo cromático. La intensidad cromática es directamente proporcianal a la concentración de hierro y puede medirse fotométricamente.

El magnesio (Mg+2) fue determinado por un método colorimétrico con determinación del punto final. Principio del test: se basa en la reacción del Mg+2 con el azul de xilidil en una solución alcalina, el Mg+2 forma complejo purpúreo con azul de xilidil. La concentración de Mg+2 se mide fotométricamente por la disminución de la bsorbancia del azul de xilidil.

16. Análisis estadístico

Los resultados fueron obtenidos de 3 experimentos independientes y cada punto fue medido en triplicado. Todos los valores fueron expresados como la media ± desvío estándar (DE). Los análisis estadísticos fueron realizados con el paquete de software Infostat versión 2016e, utilizando ANOVA GLM seguido de una prueba post-hoc de Tukey, y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p ≤ 0,05.

~ 79 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Capítulo I: Aislamiento e identificación de bacterias lácticas de quínoa y amaranto

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

1.1. Introducción

Las masas ácidas o ‘‘sourdoughs’’ son ecosistemas biológicos complejos, donde las BL son los microrganismos dominantes, que en muchos casos coexisten con levaduras que pueden estar presentes en números elevados.

Contrariamente a otras fermentaciones de alimentos y bebidas, los estudios que describen el ecosistema de masa fermentada datan de hace casi cincuenta años. El grupo español coordinado por Benedito de Barber fue uno de los primeros que estudiaron consistentemente el mundo de la masa ácida (Barber y col., 1989, 1991). Posteriormente, se describieron los principales rasgos metabólicos y funcionales de las levaduras de masa fermentada y, especialmente, las BL (De Vuyst y col., 2009, 2014; Gobbetti y col., 2014; Minervini y col., 2014). El incremento del empleo de la masa fermentada a niveles industriales y artesanales llevó a un intensivo trabajo de investigación en este tema. La literatura reciente se ha enfocado marcadamente en los factores que afectan el establecimiento y, especialmente, la composición de la biota de masa fermentada. Una interpretación más completa de dichos factores es fundamental para estandarizar el rendimiento de masa fermentada y para permitir la propagación y el uso de este iniciador natural más manejable y seguro. Entre estos determinantes, las características de los microorganismos involucrados, el medio ambiente, el tipo de harina, los parámetros de fermentación y la modalidad de propagación de masa fermentada son de gran importancia. Se demostró ampliamente que, para explotar el potencial de las harinas no convencionles, es necesaria la selección de cultivos iniciadore adecuados (Coda y col., 2014). En comparación con los iniciadores alóctonos o comerciales o adaptados para la fermentación de harina de trigo, la selección de cepas dentro de la microbiota de la matriz no triguera es un requisito previo para la adaptación rápida la cual podría tener una influencia positiva en las

~ 84 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

propiedades nutricionales, funcionales y tecnológicas (Coda y col., 2010; Corbo y col., 2017).

Existen tres tipos de masas ácidas:

 Masa ácida tipo I o tradicionales, representa procesos espontáneos de fermentación de masa ácida, basados en backslopping, es decir, re- inoculación cíclica repetida de un nuevo lote de harina y agua con uno previo, derivado de la llamada masa madura. Tradicionalmente este proceso se lleva a cabo a temperatura ambiente (30°C) (De Vuyst y col, 2014).  Masa ácida Tipo II o industrial, sirve principalmente como acidificante de la masa. Estas masas ácidas son preparaciones semifluidas que se fermentan durante largos períodos de tiempo (de 2 a 5 días) a temperaturas, en ocasiones mayores a 30°C para acelerar el proceso (Harth y col., 2016).  Masas ácidas Tipo III, son preparaciones secas de masas industriales que se utilizan como suplementos acidificantes y portadores de aroma. Estas son preparadas por fermentación de la masa ácida (tradicional) con una subsecuente evaporación de agua por liofilización, secado por spray o secado en un reactor de lecho fluidizado (Corsetti y col. 1998; Messens y De Vuyst 2002).

El número de especies de BL aisladas de masas ácidas en todo el mundo abarca más de 80 especies bacterianas, incluyendo principalmente a los géneros de Lactobacillus y Leuconostoc, pero también Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus y Weissella. (Gobbetti y col., 2016). En la actualidad, la masa ácida se emplea en la fabricación de diferentes productos tales como panes, pasteles y galletas (De Vuyst y Neysens, 2005), aplicándose a una gran variedad de harinas de cereales en todo el mundo (Corsetti y Settanni 2007).

~ 85 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

Los Valles Calchaquíes del NOA, a pesar de su clima hostil por la altura, albergan gran diversidad de plantas y microorganismos constituyendo un ecosistema único. Durante siglos, los nativos sobrevivieron gracias a su alimentación basada en plantas indígenas como la quínoa y el amaranto. Si bien se conocen los constituyentes de estos cultivos, no se registran antecedentes de su biodiversidad microbiana. En base a todos estos antecedentes el primer objetivo de este trabajo de Tesis fue el aislamiento e identificación de la microbiota láctica de granos y harinas de quínoa y amaranto.

1.2. Resultados

1.2.1. Aislamiento e identificación de BL

La microbiota láctica presente en granos (QCH, QRC y QRH) y masas ácidas de quínoa (QS y QC) y granos (A1 y A2) y masas ácidas (AS) de amaranto fue determinada durante la fermentación. El recuento microbiano en la masa QS fermentada en los diferentes medios evaluados estuvo en el orden 109 UFC/g masa a las 24 h, manteniéndose sin mayores variaciones hasta el final de la fermentación (día 10). Sin embargo, en la masa QC, al mismo tiempo de fermentación, los valores estuvieron comprendidos entre 108 y 1010 UFC/g masa manteniéndose constante después del día 6 de fermentación. En la masa de AS se observaron valores entre 109 y 1010 UFC/g masa.

Los recuentos de BL de QS en medio MRS-5 estuvieron en el orden de 109-1010 UFC/g de masa a las 24 h. Estos valores fueron aproximadamente constantes hasta el final de la fermentación. No hubo diferencias significativas en los recuentos de células obtenidos para las masas de quínoa de QC y QS (Figura 1.1).

~ 86 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

Figura 1.1. Crecimiento de BL [UFC/g masa (- - - -)] y valores de pH (____) durante la fermentación de masa ácida QS (₀) y QC (•). Los resultados se expresan como la media ± DE.

Respecto a los valores de pH de QC y QS, éstos disminuyeron de 6,3 ± 0,3 a 4,2 ± 0,1 y 6,0 ± 0,2 a 3,9 ± 0,2, respectivamente, después de 5 días. Estos valores permanecieron constantes hasta el final de la fermentación (Figura 1.1).

Los recuentos de BL de granos de quínoa, estuvieron en el orden de 103 y 105 UFC/mL antes de la incubación (T0). El número de BL varió de 5 x 104 a 8,4 x 104 CFU/mL, 5,3 x 103 a 3,8 x 107 CFU/mL y 4,1 x 102 a 1,7 x 108 UFC/mL después de 2 días para QCH, QRC y QRH, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre los días 7 y 10 (Figura 1.2). Los valores de pH para QCH, QRC y QRH fueron 5,0 ± 0,2, 5,4 ± 0,3 y 4,5 ± 0,2, respectivamente al final de la fermentación (Figura 1.2).

~ 87 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

Figura 1.2: Crecimiento de BL [UFC/mL (- - - -)] y valores de pH (____) durante la incubación de granos de quínoa: QCH (•), QRC (₀) y QRH (▼). Los resultados se expresan como la media ± DE.

El análisis de la microbiota láctica de la masa ácida de amaranto (AS) mostró un incremento de 2 x 103 a 5 x 109 UFC/g de masa a las 24 h de incubación que

permaneció constante hasta el final de la fermentación (Figura 1.3).

logUFC/g masa

Tiempo (días)

Figura 1.3: Crecimiento de BL [UFC/g masa (▪)] y valores de pH (•) durante la fermentación de masa ácida de amaranto (AS). Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 88 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

El recuento de BL en granos de amaranto fue de 3,0 x 104 a 6,8 x 108 UFC/mL para A1, mientras que en A2 fue de 4,6 x 102 a 2,8 x 108 UFC/mL a las 48 h de incubación (Figura 1.4).

Figura 1.4: Crecimiento de BL [UFC/mL (▪)] y valores de pH (•) durante la incubación de granos de amaranto, A1 (____) y A2 (- - -). Los resultados se expresan como la media ± DE.

En base a la caracterización preliminar realizada con tinción de Gram y actividad de catalasa, se seleccionaron 63 aislamientos de masas ácidas de quínoa (48% cocos y 52% bacilos) y 54 aislamientos de granos de quínoa (100% cocos) como presuntivas BL. La identificación molecular de estos aislamientos reveló 44 patrones diferentes o tipos RAPD-perfiles, que luego de la secuenciación del gen que codifica para el ARN ribosomal 16S se identificaron las siguientes especies: Lactobacillus (L.) plantarum (7); L. rhamnosus (5); L. sakei (1), Pediococcus (P.) pentosaceus (9), Leuconostoc (Lc.) mesenteroides (1), Enterococcus (E.) casseliflavus (2), E. mundtii (3), E. hirae (1), E. gallinarum (12) Enterococcus sp. (1), y E. hermanniensis (2).

Del total de los aislamientos de masa ácida de amaranto (30) y de granos (60), 70 fueron considerados putativas BL (Gram-positivo y catalasa-negativo). El

~ 89 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

análisis microscópico mostró la presencia de cocos (59%) y bacilos (41%). El análisis molecular reveló 29 patrones diferentes o RAPD-perfiles los cuales, luego de la secuenciación del gen que codifica para el ARN ribosomal 16S, correspondieron a diferentes cepas de L. plantarum (8), L. rhamnosus (6), E. mundtii (4), E. hermanniensis (3), E. durans (1), Enterococcus sp. (1), Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides (3) y Lc. mesenteroides (3).

En la Figura 1.5 se muestra de manera representativa los diferentes patrones obtenidos tanto con el primer M13b como con el XD9 para cepas aisladas de masa ácida de quínoa QC.

a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

b 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 4 15 16 17 18 19

Figura 1.5: Figura representativa de un gel de agarosa con los patrones RAPD-perfiles de las BL aisladas de masa ácida de quínoa QC obtenidos con los primer a) XD9 y b) M13. 1: Marcador de peso molecular; 2: aislamiento 1(QC A 2); 3: aislamiento 2(QC A 3); 4: aislamiento 3 (QC A 4); 5: aislamiento 4 (QC A 5); 6: aislamiento 5 (QC B 1); 7: aislamiento 6 (QC B 2); 8: aislamiento 7 (QC B 3); 9: aislamiento 8 (QC B 4); 10: aislamiento 9 (QC B 5); 11: aislamiento 10 (QC M1 1); 12: aislamiento 11 (QC M1 2); 13: aislamiento 12 (QC M1 3); 14: aislamiento 13 (QC M1 4); 15: aislamiento 14 (QC M3 1); 16: aislamiento 15 (QC M3 2); 17: aislamiento 16 (QC M3 4); 18: aislamiento 17 (QC M3 5); 19: Marcador de peso molecular.

~ 90 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

Todas las cepas de BL aisladas e identificadas de quínoa y amaranto se depositaron en la Colección de Cultivos CERELA (CRL).

Tabla 1.1: Bacterias lácticas aisladas de masa ácida y granos de quínoa

BL Origen BL Origen L. rhamnosus CRL 1963 QS E. gallinarum CRL 1991 QCH L. plantarum CRL 1964 QS E. gallinarum CRL 1992 QCH L. rhamnosus CRL 1965 QS E. gallinarum CRL 1989 QCH L. plantarum CRL 1966 QS E. gallinarum CRL 1990 QCH E. mundtii CRL 1971 QS E. hirae CRL 1993 QCH L. plantarum CRL 1967 QS E. gallinarum CRL 1999 QRC L. plantarum CRL 1968 QS E. gallinarum CRL 2000 QRC L. plantarum CRL 1969 QS Enterococcus sp. CRL 2001 QRC L. rhamnosus CRL 1983 QS E. gallinarum CRL 2002 QRC L. rhamnosus CRL 1984 QS E. gallinarum CRL 2003 QRC E. casseliflavus CRL 1988 QC E. gallinarum CRL 2004 QRC L. plantarum CRL 1970 QC E. gallinarum CRL 2005 QRC L. rhamnosus CRL 1972 QC E. mundtii CRL 2006 QRC L. plantarum CRL 1973 QC E. mundtii CRL 2007 QRC E. hermanniensis CRL1976 QC Lc. mesenteroides CRL 2012 QRH E. hermanniensis CRL1977 QC E. gallinarum CRL 2014 QRH L. sakei CRL 1978 QC E. gallinarum CRL 2015 QRH P. pentosaceus CRL 1979 QC E. casseliflavus CRL 2016 QRH P. pentosaceus CRL 1974 QC P. pentosaceus CRL 1975 QC P. pentosaceus CRL 1980 QC P. pentosaceus CRL 1981 QC P. pentosaceus CRL 1982 QC P. pentosaceus CRL1985 QC P. pentosaceus CRL1986 QC P. pentosaceus CRL1987 QC QS: masa ácida de harina de quínoa comercial Sturla; QC: masa ácida de harina de quínoa Cica Hornillos, Coop. Cauqueva, Jujuy; QCH: granos de quínoa Cica de INTA Hornillos, Jujuy; QRC: granos de quínoa Real de Coop. Cauqueva, Jujuy; QRH: granos de quínoa Real de INTA Hornillos, Jujuy.

En la masa ácida de QC se observó mayor diversidad de BL: L. plantarum, L. rhamnosus, E. mundtii, P. pentosaceus y E. casseliflavus, donde el mayor número de cepas aisladas pertenece a P. pentosaceus. Mientras que en QS el mayor número de cepas identificadas corresponde a L. plantarum (Tabla 1.1).

Por otra parte, las BL aisladas de las tres fuentes de granos de quínoa fueron principalmente, E. gallinarum (Tabla 1.1). También se observaron diferencias en la microbiota de BL al comparar los granos de quínoa con los de amaranto, por ~ 91 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

ejemplo, en amaranto se determinó E. hermanniensis y E. durans que no fueron encontradas en granos de quínoa y E. casseliflavus, E. hirae y E. gallinarum que estuvieron presentes en quínoa, pero no en amaranto (Tablas 1.1 y 1.2). Estos resultados demuestran que la microbiota láctica fue variable según sean de harina o grano y, a su vez, dependiente de la harina, de la variedad y del origen de los granos.

Tabla 1.2: Bacterias lácticas aisladas de masa ácida y granos de amaranto.

BL Origen BL Origen

L. plantarum CRL 2079 AS Lc. mesenteroides CRL 2121 A1 L. plantarum CRL 2080 AS E. durans CRL 2122 A1 Lc. mesenteroides subsp. L. plantarum CRL 2082 AS A1 mesenteroides CRL 2123 L. rhamnosus CRL 2081 AS Lc. mesenteroides CRL 2124 A1 L. rhamnosus CRL 2139 AS E. hermanniensis CRL 2125 A1 Lc. mesenteroides subsp. L. rhamnosus CRL 2090 AS A1 mesenteroides CRL 2131 L. rhamnosus CRL 2091 AS Lc. mesenteroides CRL 2132 A1 L. plantarum CRL 2092 AS E. hermanniensis CRL 2133 A1 L. rhamnosus CRL 2093 AS E. hermanniensis CRL 2134 A1 L. rhamnosus CRL 2104 AS E. mundtii CRL 2135 A1 L. plantarum CRL 2105 AS E. mundtii CRL 2136 A1 L. plantarum CRL 2106 AS E. mundtii CRL 2137 A1 Lc. mesenteroides subsp. L. plantarum CRL 2107 AS A1 mesenteroides CRL 2140 E. mundtii CRL 2094 AS Enterococcus sp. CRL 2138 A2 L. plantarum CRL 2108 AS AS: masa ácida de harina de amaranto comercial Sturla; A1: granos de amaranto de INTA Hornillos; A2: granos de amaranto comercial ``El peoncito``.

~ 92 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

1.3. Discusión

En este trabajo de tesis se prepararon masas ácidas con harinas de quínoa y amaranto las cuales fueron propagadas cada 24 h durante 10 días mediante “backslopping”. Se tomaron muestras a diferentes tiempos para evaluar la microbiota presente. Se obtuvieron recuentos de BL en medio MRS-5 en el orden de 109-1010 UFC/g de masa a las 24 h de incubación, manteniéndose constantes hasta el final de la fermentación.

Respecto a los valores de pH, se observó entre el tercer y el quinto día de fermentación un descenso de dos unidades aproximadamente (pH=6 a pH=4) en las tres masas evaluadas. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otros autores que evaluaron la microbiota láctica en masas ácidas realizadas con distintos tipos de harinas. Nionelli y col. (2014) reportaron recuentos de 109 UFC/g de masa y valores de pH alrededor de 4 durante la fermentación de masas ácidas de trigo. Similares resultados fueron informados para masas ácidas preparadas con harina de centeno (Viiard y col., 2016), harina de buckwheat (trigo sarraceno) y teff (Moroni y col., 2011).

Para la identificación de los microorganismos presentes, tanto en los granos como en las masas ácidas, se procedió a la amplificación mediante PCR de la región variable (V1) del gen que codifica para el ARN ribosomal 16S. Se eligió un aislamiento representativo de cada uno de los tipos de perfiles RAPD observado. Los amplicones fueron luego purificados, secuenciados, y las secuencias analizadas “on line”. Los diferentes microorganismos identificados fueron L. plantarum, L. rhamnosus, L. sakei, P. pentosaceus, E. casseliflavus, E. mundtii, E. hermaniensis, E. hirae, E. gallinarum, Enterococcus sp., Lc. mesenteroides, Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides, E. durans.

Más de 60 especies diferentes de lactobacilos se asociaron a masas ácidas a través del tiempo, lo cual es ciertamente representativo de la gran diversidad, la

~ 93 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

cual depende de la harina y del origen de las mismas usadas en la preparación de la masa ácida y de los métodos de análisis dependientes o independientes de cultivo (Gobbetti y col., 2016).

El análisis de nuestros resultados demuestra la presencia de una microbiota láctica variable según el sustrato (harina o grano) y a su vez fue dependiente del origen de los mismos. Observamos que la diversidad de géneros y especies de BL en los aislamientos a partir de las masas ácidas fue mayor que la determinada en los aislamientos a partir de granos.

En la microbiota láctica aislada de las tres fuentes de granos de quínoa predominó principalmente, E. gallinarum, mientras que en los granos de amaranto fue Leu. mesenteroides. También se observaron diferencias entre la microbiota de BL presente en granos de quínoa y de amaranto, por ejemplo, en amaranto se determinó E. hermanniensis y E. durans que no fueron encontradas en granos de quínoa y E. casseliflavus, E. hirae y E. gallinarum que estuvieron presentes en quínoa, pero no en amaranto.

En la masa ácida de QC se observó una mayor diversidad de BL: L. plantarum, L. rhamnosus, E. mundtii, P. pentosaceus y E. casseliflavus, siendo P. pentosaceus el que se encontró con mayor frecuencia. Mientras que en masa ácida QS hubo poca diversidad bacteriana (L. plantarum, L. rhamnosus, E. mundtii) al igual que en la masa ácida de amaranto (AS).

Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otros autores, donde se identificaron diferentes cepas de Lactobacillus en masas ácidas realizadas con distintas harinas provenientes de diferentes orígenes, como por ejemplo L. sakei fue aislado de masa ácida preparada con harina de espelta de Bélgica ( Weckx y col., 2010b), de salvado de centeno de Finlandia (Katina y col., 2007), de alforfón de Irlanda (Moroni y col., 2011), de amaranto de India-Perú-México- Alemania (Sterr y col., 2009), de trigo de Italia (Minervini y col., 2011, 2012). Por otro lado, L. plantarum es la especie más frecuentemente aislada de estos

~ 94 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

hábitats. La adaptabilidad ecológica de L. plantarum podría explicarse por su metabolismo de carbohidratos, altamente adaptado a este tipo de ecosistemas y, además su dominio durante la fermentación estaría relacionado a su metabolismo versátil (Molenaar y col., 2005; Coda y col., 2010). Esta especie fue aislada de masas ácidas realizadas con harina de espelta proveniente de Bélgica (Weckx y col., 2010b), de centeno de Italia (Ercolini y col., 2013), de Estonia (Bessmeltseva y col., 2014), de trigo de Italia (Di Cagno y col., 2014), de amaranto de origen India-Perú-México-Alemania (Sterr y col., 2009), entre otras. L. plantarum, Lc. mesenteroides también se determinaron en otros sustratos libres de gluten como buckwheat (trigo sarraceno) y teff (Moroni y col., 20011).

Por otra parte, Pediococcus pentosaceus es una especie de BL frecuente en los alimentos fermentados tradicionales de Etiopía. También se la identificó en harina de centeno de Suecia, Marruecos, Francia y Bélgica y masas de trigo alemanas. Asi también en la fermentación espontánea de harina de sorgo y otros granos africanos (Coda y col., 2014); en masas ácidas de amaranto y buckwheat (Sterr y col., 2009; Moroni y col., 2010, 2012).

La microbiota presente en los granos, y en consecuencia en las harinas, podría estar influenciada por el clima particular de cada región agronómica donde se cultivan (temperatura y humedad), las condiciones de almacenamiento, afecciones causadas por insectos y la aplicación de fungicidas (De Vuyst y Neysens 2005; Sterr y col., 2009) y por los diferentes tratamientos que sufren las harinas durante su procesamiento.

El uso de cultivos iniciadores autóctonos es más adecuado cuando se requiere un rendimiento funcional, ya que tienen menos competencia con la microbiota presente y están mejor adaptados a la matriz alimentaria durante la fermentación (Leroy y De Vuyst 2004; Minervini y col., 2010).

~ 95 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I :

1.4. Conclusiones parciales

Los resultados obtenidos en esta etapa del trabajo de Tesis indican que:

 Los granos andinos, quínoa y amaranto albergan una variada microbiota láctica.  Se aislaron e identificaron 73 cepas pertenecientes a diferentes géneros y especies: Lactobacillus (L). plantarum, L. rhamnosus, L. sakei, Pediococcus (P.) pentosaceus, Enterococcus (E.) casseliflavus, E. mundtii, E. hermaniensis, E. hirae, E. gallinarum, Enterococcus sp., Leuconostoc (Lc.) mesenteroides, E. durans.  Se identificaron 26 y 18 cepas de BL en masas y granos de quínoa, respectivamente y 15 y 14 cepas de BL en masas y granos de amaranto, respectivamente.  La diversidad de BL depende del sustrato usado para el aislamiento (harina o grano) como asi también el origen de los mismos.

~ 96 ~

Capítulo II Caracterización y selección de cepas de bacterias lácticas aisladas de quínoa y amaranto

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

2.1. Introducción

La fermentación es un proceso dependiente de la actividad biológica de los microorganismos para la producción de diferentes metabolitos (Ross y col., 2002). Las BL son los microorganismos más importantes que se usan en las fermentaciones alimenticias. Además de las demandas generales para los cultivos iniciadores desde la perspectiva de la seguridad, la efectividad tecnológica y la economía, se deben tener en cuenta numerosos aspectos específicos al seleccionar las cepas para las diferentes fermentaciones alimentarias. Por lo tanto, los criterios de selección para BL dependen del tipo y las características deseadas del producto final, las actividades metabólicas deseadas, las características de las materias primas y la tecnología aplicada. En este capítulo se evaluaron in vitro ciertas propiedades de las BL aisladas de quínoa y amaranto de interés (capacidad de acidificación, producción de CPS, filancia, vitaminas B2 y B9 y actividad fitasa y amilolítica).

2.2. Resultados

2.2.1. Capacidad de acidificación

La capacidad de acidificación evaluada durante 72 h de incubación en extracto estéril de harina (EEH) de las 44 cepas de BL aisladas de masas ácidas y granos de quínoa, se muestran en las Figuras 2.1 a y b. Las cepas L. plantarum CRL 1966, 1967 y 1969 aisladas de masa ácida QS y L. plantarum CRL 1993 aislada de granos de quínoa QCH, disminuyeron el pH por debajo de 4,0 y 5,0 respectivamente después de 8 h de incubación. Por el contrario, las cepas restantes alcanzaron estos valores de pH después de 24 h de fermentación.

En cuanto a las cepas aisladas de masa ácida y granos de amaranto (29) los resultados de la capacidad de acidificación se muestran en las Figuras 2.2 a y b. Las cepas L. rhamnosus CRL 2139, L. plantarum CRL 2079, 2092, 2107 y 2108

~ 100 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

aisladas de masa ácida AS y Lc. mesenteroides CRL 2132 y E. durans CRL 2122 aisladas de granos de amaranto disminuyeron el valor del pH del EEH por debajo de 5.0 después de 8 h de incubación, mientras que las cepas restantes alcanzaron este valor de pH después de las 24 h de fermentación.

a

BL

b

BL

Figura 2.1: Acidificación después de 72 h fermentación de EEH por BL aisladas de a) masa ácida de quínoa; b) granos de quínoa

~ 101 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

a

BL

b

BL

Figura 2.2: Acidificación después de 72 h fermentación de EEH por BL aisladas de a) masa ácida de amaranto; b) granos de amaranto

~ 102 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

2.2.2. Capacidad de degradar el almidón

Considerenado que el almidón es uno de los principales carbohidratos presentes en las semillas de quínoa y amaranto (32%-69%) (Wright y col., 2002), determinar y seleccionar BL con capacidad de degradarlo es muy importante. Los resultados mostraron que del total de cepas (73) evaluadas, sólo 20 cepas mostraron actividad amilolitica: 4 cepas aisladas de masa ácida QS (L. rhamnosus CRL 1963 y CRL 1984, L .plantarum CRL 1964 y CRL 1968) (Tabla 2.1), 8 cepas aisladas de granos de quínoa (E. gallinarum CRL 1989, CRL 1990, CRL 1991, CRL 1992, CRL 1999, CRL 2004, CRL 2005 y CRL 2014) (Tabla 2.2), 4 cepas aisladas de masa ácida AS (L. plantarum CRL 2079, 2080, 2092, 2106) (Tabla 2.3) y 4 cepas aisladas de granos de amaranto (E. hermanniensis CRL 2134, 2136, E. mundtii CRL 2137, Enterococcus sp. CRL 2138) (Tabla 2.4).

2.2.3. Capacidad de producir filancia y polisacárido capsular (CPS)

La producción de CPS y filancia por BL es de suma importancia ya que permitiría mejorar las características reológicas de alimentos fermentados evitando el agregado de espesantes químicos.

En este estudio, se evaluó la capacidad de las BL de producir filancia y/o CPS. Los resultados mostraron que estas propiedades son cepa dependiente (Tabla 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4). Algunas cepas producen CPS y filancia como, por ejemplo, L. rhamnosus CRL 1964 y 1984, L. plantarum CRL 1966, 1967, 1968, 1969 y 1973. Otras producen CPS, pero no producen filancia como, por ejemplo, L. rhamnosus CRL1963, 1965 y 1983, mientras que otras como L. plantarum CRL 1970 y L. rhamnosus CRL 1972 no producen CPS pero si mostraron filancia (Tabla 2.1).

~ 103 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

2.2.4. Capacidad de degradar fitato

La quínoa y el amaranto contienen altas concentraciones de minerales (K+, Mg2+, Fe2+ y Zn2+), pero su biodisponibilidad puede estar limitada debido a la presencia de factores anti-nutricionales como el ácido fítico (AF) o fitato, el cual actúa como agente quelante. Ciertas BL son capaces de degradar AF presente en sustratos vegetales, principalmente en harinas integrales. Dada la importancia de esta propiedad en BL, evaluamos la capacidad de las BL aisladas de quínoa y amaranto de hidrolizar el fitato presente en estos granos andinos.

En este trabajo de Tesis se cuantificó la actividad fitasa en ELC de las 73 cepas de BL aisladas de los granos andinos. E. casseliflavus CRL 1988, L. rhamnosus CRL 1983, 1963, E. mundtti CRL 2007, 2012, y E. hirae CRL 1993, cepas aisladas masas ácidas y granos de quínoa, fueron las que mostraron mayor actividad fitasa (684 ± 38; 606 ± 79; 584 ± 48; 957 ± 25; 617 ± 38; 579 ± 30 U/mL, respectivamente). El resto de las cepas expresaron actividad fitasa entre 7-579 U/mL (Tablas 2.1y 2.2).

L. plantarum CRL 2079, 2080, 2105, 2106, E. durans CRL 2122, E. mundtti CRL 2135, 2136 y 2137, cepas aisladas de masa ácidas y de granos de amaranto, son las que mostraron mayores valores de actividad fitasa (699 ± 47; 636 ± 48; 648 ± 9; 730 ± 25; 1041 ± 48; 685 ± 8; 588 ± 30; 598 ±8 U/mL respectivamente). El resto de las cepas manifestaron actividad fitasa en un rango de 136-530 U/mL (Tablas 2.3 y 2.4).

~ 104 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

Tabla 2.1: Propiedades de BL aisladas de masas ácidas de quínoa

Actividad Actividad fitasa Actividad BL CPS Filancia fitasa especifica amilolítica (U/mL) (U/mg proteína) L. rhamnosus CRL 1963 + - + 584 ± 48 77,7 ± 3,8 L. plantarum CRL 1964 + + + 114 ± 30 74,5 ± 3,3 L. rhamnosus CRL 1965 + - - 284 ± 63 48,1 ± 2,3 L. plantarum CRL 1966 + + - 80 ± 21 34,2 ± 2 E. mundtii CRL 1971 - - - 448 ± 82 98,9 ± 8,5 L. plantarum CRL 1967 + + - 140 ± 69 74,5 ± 3,9 L. plantarum CRL 1968 + + + 156 ± 38 83,0 ± 9,3 L. plantarum CRL 1969 + + - 214 ± 25 117,6 ± 9,5 L. rhamnosus CRL 1983 + - - 606 ± 79 99,3 ± 8,7 L. rhamnosus CRL 1984 + + + 60 ± 16 17,8 ± 1,6 E. casseliflavus CRL 1988 - - - 684 ± 38 96,3 ± 8,3 L. plantarum CRL 1970 - + - 294 ± 53 75,0 ± 3,3 L. rhamnosus CRL 1972 - + - 314 ± 67 65,4 ± 2,7 L. plantarum CRL 1973 + + - 105 ± 35 40,9 ± 2,5 E. hermanniensis CRL 1976 - - - 272 ± 25 62,7 ± 2,5 E. hermanniensis CRL 1977 + - - 250 ± 34 97,3 ± 8,4 L. sakei CRL 1978 + - - 336 ± 67 80,6 ± 8,7 P. pentosaceus CRL 1979 + + - 177 ± 50 98,9 ± 8,5 P. pentosaceus CRL 1974 + + - 189 ± 46 62,4 ± 2,6 P. pentosaceus CRL 1975 + + - 179 ± 54 45,7 ± 2,4 P. pentosaceus CRL 1980 + + - 223 ± 49 104,7 ± 9,4 P. pentosaceus CRL 1981 + + - 152 ± 41 53,5 ± 2,5 P. pentosaceus CRL 1982 + + - 221 ± 33 149,3 ± 9,3 P. pentosaceus CRL1985 + + - 270 ± 33 197,1 ± 9,6 P. pentosaceus CRL1986 + + - 7 ± 2 6,3 ± 0,2 P. pentosaceus CRL 1987 + + - 44 ± 15 17,9 ± 1,5 CPS: Polisacárido capsular. Los simbolos (+) y (-) indican la presencia o ausencia de la propiedad. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 105 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

Tabla 2.2: Propiedades de BL aisladas de granos de quínoa

Actividad Actividad fitasa Actividad BL CPS Filancia fitasa especifica amilolítica (U/mL) (U/mg proteína) E. gallinarum CRL 1991 - - + 62 ± 10 25,3 ± 1,5 E. gallinarum CRL 1992 - - + 0 0 E. gallinarum CRL 1989 - - + 0 0 E. gallinarum CRL 1990 - - + 30 ± 10 14,8 ± 1 E. hirae CRL 1993 - - - 579 ± 30 60,4 ± 2,3 E. gallinarum CRL 1999 - - + 0 0 E. gallinarum CRL 2000 - - - 116 ± 30 48,5 ± 2,3 Enterococcus spp. CRL 2001 - - - 9 ± 1 3,3 ± 0,1 E. gallinarum CRL 2002 - - - 0 0 E. gallinarum CRL 2003 - - - 234 ± 45 83,0 ± 7,4 E. gallinarum CRL 2004 - - + 0 0 E. gallinarum CRL 2005 - - + 0 0 E. mundtii CRL 2006 - - - 441 ± 67 129,3 ± 8,6 E. mundtii CRL 2007 - - - 957 ± 25 145,0 ± 9,3 Lc. mesenteroides CRL 2012 - - - 617 ± 38 180,9 ± 8,8 E. gallinarum CRL 2014 + - + 172 ± 35 50,4 ±2,4 E. gallinarum CRL 2015 - - - 91 ± 30 35,8 ± 2,3 E. casseliflavus CRL 2016 - - - 70 ± 35 28,3 ± 6,3 CPS: Polisacárido capsular. Los simbolos (+) y (-) indican la presencia o ausencia de cierta propiedad. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 106 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

Tabla 2.3: Propiedades de cepas de BL aisladas de masas ácidas de amaranto

Actividad fitasa Activida Actividad BL CPS Filancia especifica amilolítica fitasa (U/mL) (U/mg proteína) L. plantarum CRL 2079 + + + 699 ± 47 136,3 ± 9,4

L. plantarum CRL 2080 + + + 636 ± 48 108,7 ± 8,8

L. plantarum CRL 2082 - + - 333 ± 49 58,5 ± 2,9

L. rhamnosus CRL 2081 - - - 234 ± 1 84,2 ± 8,1

L. rhamnosus CRL 2139 - + - 135 ± 41 15,8 ± 1,4

L. rhamnosus CRL 2090 - + - 300 ± 3 87,5 ± 8,3

L. rhamnosus CRL 2091 - + - 291 ± 13 46,7 ± 2,3

L. plantarum CRL 2092 + + + 577 ± 65 106,7 ± 8,6

L. rhamnosus CRL 2093 - - - 355 ± 25 55,0 ± 2,4

L. rhamnosus CRL 2104 - - - 0 0

L. plantarum CRL 2105 - + - 648 ± 9 102,0 ± 7,9

L. plantarum CRL 2106 + + + 730 ± 25 133,7 ± 9,5

L. plantarum CRL 2107 + + - 530 ± 42 83,5 ± 7,4

E. mundtii CRL 2094 + - - 287 ± 47 59,3 ± 2,7

L. plantarum CRL 2108 + + - 136 ± 7 20,5 ± 9,4 CPS: Polisacárido capsular. Los simbolos (+) y (-) indican la presencia o ausencia de cierta propiedad. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 107 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

Tabla 2.4: Propiedades de BL aisladas de granos de amaranto

Actividad Actividad fitasa Actividad BL CPS Filancia fitasa especifica amilolítica (U/mL) (U/mg proteína) Lc. mesenteroides CRL 2121 - - - 373 ± 61 149,2 ± 10,0 E. durans CRL 2122 + - - 1041 ± 48 125,7 ± 9,4 Lc. mesenteroides subsp. - - - 358 ± 25 165,0 ± 10,2 mesenteroides CRL 2123 Lc. mesenteroides CRL 2124 + - - 370 ± 5 66,7 ± 3,5 E. hermanniensis CRL 2125 - - - 387 ± 14 95,6 ± 9,1 Lc. mesenteroides subsp. + - - 406 ± 18 148,2 ± 9,9 mesenteroides CRL 2131 Lc. mesenteroides CRL 2132 + - - 338 ± 37 108,3 ± 8,7 E. hermanniensis CRL 2133 + - - 255 ± 53 65,7 ± 3,3 E. hermanniensis CRL 2134 + - + 156 ± 17 37,3 ± 2,1 E. mundtii CRL 2135 + - - 685 ± 8 106,5 ± 8,8 E. mundtii CRL 2136 + - + 588 ± 30 76,1 ± 4,3 E. mundtii CRL 2137 + - + 598 ± 8 71,6 ± 3,8 Lc. mesenteroides subsp. + - - 0 0 mesenteroides CRL 2140 Enterococcus sp. CRL 2138 - - + 167 ± 7 40,9 ± 2,7 CPS: Polisacárido capsular. Los simbolos (+) y (-) indican la presencia o ausencia de cierta propiedad. Los resultados se expresan como la media ± DE.

2.2.5. Produccion de vitaminas del grupo B: riboflavina (B2) y folatos (B9) por BL

La capacidad de producir vitaminas B2 y B9 en todas las cepas de BL aisladas de quínoa y amaranto fue evaluada. Las cepas capaces de crecer en ausencia de las vitaminas fueron seleccionadas para cuantificar la concentración de las vitaminas producidas (intracelular, extracelular y total).

Catorce de las 26 cepas evaluadas aisladas de masas ácidas de quínoa producen folatos, de las cuales 4 (L. plantarum CRL 1973 y CRL 1970, L. rhamnosus CRL

1972 y L. sakei CRL 1978) producen elevada concentración de B9 total (> 100 ng/mL), siendo L. plantarum CRL 1973 la cepa que mayor cantidad produce (143

~ 108 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

± 6 ng/mL) (Figura 2.3a). De las cepas aisladas de granos de quínoa, E. hirae CRL 1993 fue la única que produce folatos (9,0 ± 0,5 ng/mL) (Figura 2.3b).

La excreción de los folatos producidos al medio de cultivo fue cepa- dependiente. Aproximadamente 36% de las cepas mostraron secreción de los folatos producidos (> 70 ng/mL, concentración extracelular), mientras que 29% de las cepas mostraron acumulación del folato en el interior celular (> 20 ng/mL, concentración intracelular).

De las cepas aisladas de masas ácidas de quínoa, L. rhamnosus, fue la especie que produjo mayor concentración de riboflavina total (> 270 ng/mL), mientras que siete cepas no producen esta vitamina y las demás producen una concentración variable (6 - 360 ng/mL) (Figura 2.3 a).

L. rhamnosus CRL 1963 produce la mayor concentración de B2 extracelular (360 ± 10 ng/mL). Con respecto a la concentración de riboflavina intracelular L. plantarum CRL 1964 retiene la mayor cantidad de esta vitamina.

Entre las cepas aisladas de granos de quínoa (18), E. hirae CRL 1993, E. casseliflavus CRL 2016, E. gallinarum CRL 1992 y CRL 2005 produjeron las mayores concentraciones de B2 total (> 20 ng/mL). Las cepas restantes produjeron entre 13 - 20 ng/mL, excepto E. mundtii CRL 2006 y CRL 2007, que no produjeron esta vitamina (Figura 2.3 b).

~ 109 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

a

BL

Vitaminas (ng/mL)

b

BL

Vitaminas (ng/mL)

Figura 2.3: Producción total de riboflavina (B2) y folato (B9) (ng/mL) por BL aisladas de a) masas ácidas de quínoa; b) granos de quínoa. Los resultados se expresan como la media ± DE. a-j Letras distintas indican diferencia significativa (p< 0.05). ~ 110 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

El 86% de las cepas aisladas de masas ácidas y de granos de amaranto fueron capaces de crecer en el medio sin folatos. L. plantarum CRL 2106 aislado de masa ácida de amaranto y Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131, Lc. mesenteroides CRL 2132 y Enterococcus sp. CRL 2138, aislados de granos producen la mayor concentración de folatos totales (> 130 ng/mL); siendo Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131, la cepaque mayor concentración de esta vitamina produce (142 ± 2 ng/mL). El resto de las cepas producen B en un rango comprendido entre (9 -130 ng/mL) (Figura 2.4 a y b).

La concentración de folato intracelular en Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131, Lc. mesenteroides CRL 2132 E. hermanniensis CRL 2133, aisladas de amaranto, fue mayor (entre 60-70 ng/mL) que el de las cepas aisladas de quínoa.

La producción de riboflavina extracelular en las cepas aisladas de masa ácida de amaranto fue mayor que la intracelular. L. plantarum fue la especie que mayor concentración de B2 total produjo de las cepas aisladas de masas ácidas de amaranto, siendo L. plantarum CRL 2106 y L. plantarum CRL 2107, (126 ± 11 y 164 ± 18 ng/mL respectivamente) las cepas que produjeron la concentración más elevada de esta vitamina. Las demás cepas sintetizaron niveles variables, excepto L. rhamnosus CRL 2093 que no produce B2 (Figura 2.4 a).

De las cepas aisladas de granos de amaranto, Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131 y E. durans CRL 2122 producen la mayor concentración de riboflavina total (268 ± 24 y 259 ± 14 ng/mL, respectivamente) (Figura 2.4 b).

~ 111 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

a

BL

Vitaminas (ng/mL)

b

BL

Vitaminas (ng/mL)

Figura 2.4: Producción total de riboflavina (B2) y folato (B9) (ng/mL) por BL aisladas de a) masa ácida de amaranto; b) granos de amaranto. Los resultados se expresan como la media ± DE. a-e Letras distintas indican diferencia significativa (p< 0.05). ~ 112 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

De acuerdo a todas las propiedades evaluadas (producción de vitaminas B2 y B9, actividad fitasa y amilolítica, capacidad de acidificación y producción de CPS), se seleccionaron 11 cepas de BL aisladas de quínoa y 7 de amaranto para realizar estudios in situ en masas realizadas con harina de quínoa.

 Cepas seleccionadas de BL aisladas de quínoa

Activ. Activ. B B BL 2 9 fitasa amilolític Acidificación CPS Filancia (ng/mL) (ng/mL) (U/mL) a L. rhamnosus 360 ± 10 34 ± 5 584 ± 48 + + + - CRL 1963 L. rhamnosus 298 ± 30 18 ± 1 606 ± 79 - + + - CRL 1983 L. rhamnosus - 128 ± 11 314 ± 67 - + - + CRL 1972 L. sakei - 107 ± 2 336 ± 67 - + + - CRL 1978 L. plantarum 17 ± 2 105 ± 5 294 ± 53 - + - + CRL 1970 L. rhamnosus 274 ± 12 63 ± 4 60 ± 16 + + + + CRL 1984 L. plantarum 213 ± 13 58 ± 2 140 ± 69 - ++ + + CRL 1967 L. plantarum 178 ± 8 46 ± 2 80 ± 21 - ++ + + CRL 1966 L. plantarum 64 ± 5 143 ± 6 105 ± 35 - + + + CRL 1973 L. plantarum 52 ± 2 46 ± 2 114 ± 30 + + + + CRL 1964 L. plantarum 22 ± 1 75 ± 2 156 ± 38 + + + + CRL 1968 CPS: Polisacárido capsular. Los simbolos (+) y (-) indican la presencia o ausencia de cierta propiedad. (++) acidificación rapida entre las 4-5 h de incubación en EEH. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 113 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

 Cepas de BL aisladas de amaranto seleccionadas

Activ. B B Activ. BL 2 9 fitasa Acidificación CPS Filancia (ng/mL) (ng/mL) amilolítica (U/mL) L. plantarum 126 ± 11 138 ± 7 730 ± 25 + + + + CRL 2106 L. plantarum 164 ± 18 91 ± 5 530 ± 42 - ++ + + CRL 2107 L. plantarum 46 ± 2 107 ± 9 136 ± 7 - ++ + + CRL 2108 Lc. mesenteroides subsp. 268 ± 24 142 ± 2 406 ± 18 - + + - mesenteroides CRL 2131 L. plantarum 45 ± 1 41 ± 5 699 ± 47 + ++ + + CRL 2079 L. rhamnosus 41± 1 46 ± 2 636 ± 48 + + + + CRL 2080 L. plantarum 40 ± 2 50 ± 1 577 ± 65 + ++ + + CRL 2092 CPS: Polisacárido capsular. Los simbolos (+) y (-) indican la presencia o ausencia de cierta propiedad. (++) acidificación rapida entre las 4-5 h de incubación en EEH. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 114 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

2.3. Discusión

Ciertas características tecnológicas y funcionales de interés de las BL aisladas de masas ácidas y granos de quínoa y amaranto fueron evaluadas en este trabajo de Tesis: capacidad de acidificación, de degradar almidón, producir filancia y polisacárido capsular (CPS), hidrolizar fitato y producir vitaminas (riboflavina y folatos).

Las BL productoras de exopolisacáridos son microrganismos de importancia industrial en la producción de alimentos funcionales y son frecuentemente utilizados como cultivos iniciadores o coadyuvantes para la elaboración de alimentos fermentados como yogur, queso y productos a base de cereales (Patel y Prajapat, 2013). Esto se debe a su propiedad de aumentar la viscosidad y mejorar las características reológicas del producto fermentado (Zannini y col., 2016).

Los panes y otros productos de panificación elaborados con harinas libres de gluten, se caracterizan por presentar bajo volumen y características reológicas poco aceptables debido a la falta de la red que forman las proteínas del gluten (Gallagher y col., 2003). Los exopolisacáridos, polímeros de carbohidratos de alto peso molecular, son producidos por ciertas cepas BL durante la fermentación de la masa ácida y tienen el potencial para remplazar a los hidrocoloides en las masas sin gluten (Schwab y col., 2008). En base a esto, en este trabajo de Tesis, evaluamos la capacidad de las BL aisladas de granos andinos de producir filancia y/o formar CPS. Los resultados obtenidos mostraron que estas características son cepa dependiente.

Los polisacáridos constituyen la parte principal de las semillas de quínoa y amaranto, siendo el almidón el componente principal (67,3%). La mayoría de las BL son incapaces de degradar el almidón debido a la falta de la enzima amilasa. Sin embargo, algunas cepas presentan esta actividad enzimática y son calificadas como BL amilolíticas (BLA). Esta característica es muy importante a ~ 115 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

considerar en la selección de BL para su uso como cultivo iniciador en la fermentación de sustratos amiláceos como los granos andinos estudiados en este trabajo de Tesis.

De acuerdo a la bibliografía, sólo algunas cepas de lactobacilos exhiben actividad amilasa (Gänzle y Follador, 2012), Ciertas BLA han sido reportadas de diferentes alimentos tropicales fermentados con almidón, hechos especialmente de raíces como mandioca y camote o granos como maíz, sorgo y arroz (Ramos y col., 2015; Smerilli y col., 2015). En este estudio, se demostró que ciertas cepas de BL, la mayoría pertenecientes a L. plantarum, aisladas de masas ácidas de amaranto, y a E. gallinarum, de granos de quínoa, tienen la capacidad de degradar el almidón.

El contenido de ácido fitico (AF) o fitato en las harinas y alimentos libres de gluten (LG) es un factor antinutricional importante a considerar, especialmente para los pacientes celíacos que sufren de deficiencias de micronutrientes. Las harinas/ingredientes LG muestran concentraciones variables de fitato: 0,12% en arroz, 0,25% en mijo perla, 0,47% en amaranto, 0,70% en teff, 0,92% en maíz, 1,13% en avena, 1,18% en quínoa, 1,33% en soja (Arendt y col., 2011). El AF puede ser hidrolizado por la enzima fitasa que se encuentra en plantas y granos, pero su actividad es insuficiente para hidrolizar todo el AF. Se considera que la fuente microbiana es la fuente más importante ya que los mismos microorganismos que participan en la fermentación pueden hidrolizar este compuesto. Existen antecedentes que ciertas BL son capaces de degradar fitatos presentes en sustratos vegetales, principalmente en harinas integrales.

Se ha reportado que cepas de BL seleccionadas de masas ácidas de cereales son capaces de degradar el AF (López y col., 2000; De Angelis y col., 2003; Songré- Ouattara y col., 2008; Rizzello y col., 2010). En este trabajo de Tesis evaluamos la capacidad de las BL aisladas de quínoa y amaranto de hidrolizar el fitato presente en estos sustratos. Los resultados mostraron que la mayoría de las BL

~ 116 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

aisladas de estos granos poseen actividad fitasa, evidenciándose las mayores actividades enzimáticas en las cepas: L. plantarum CRL 2106 (730 ± 25 U/mL), aislada de masa ácida de amaranto; E. durans CRL 2122 (1041 ± 48 U/mL), aislada de granos de amaranto; E. mundtii CRL 2007 (957 ± 25 U/mL) y Lc. mesenteroides CRL 2012 (617 ± 38 U/mL), aisladas de granos de quínoa; E. casseliflavus CRL 1988 (684 ± 38 U/mL) y L. rhamnosus CRL 1983 (606 ± 79 U/mL) aisladas de masas ácidas de quínoa. Estas actividades son similares a las reportadas por Anastasio y col., (2010) para L. plantarum H5 (710 U/mL). Sin embargo, menores actividades fitasa, fueron determinadas en P. pentosaceus KTU05-8 (32 U/mL) y KTU05-9 (54 U/mL), aislados de masa ácida de centeno (Cizeikiene y col., 2015).

Asimismo, las actividades fitasa, proteolítica y amilolítica están influenciadas por el pH del medio. Cambios en los valores de pH, debido a la acidificación biológica durante el período de fermentación, producen valores de pH óptimos a los de las enzimas presentes en el sustrato (Komlenić y col, 2102). La actividad óptima de estas enzimas, que juegan un importante papel en los cambios de los constituyentes de la masa, se logra a valores de pH de 5,0-6,0; pH 4,0-5,0; y pH 3,6-6,2; para las enzimas fitasa, proteolíticas y amilolíticas, respectivamente (Poutanen y col., 2009; Gänzle, 2014). Como se demostró en este estudio, ciertas cepas de BL pueden reducir el pH a valores por debajo de 6,0 al comienzo de la fermentación, lo que proporcionaría un valor de pH óptimo para las actividades enzimáticas de interés.

El contenido de riboflavina en harina de quínoa y amaranto se encuentra en el rango de 0,29-0,32 mg/100 g. Mientras que el contenido de folatos totales en estas harinas es de 0,13-0,18 mg/100 g en quínoa y de 0,07 mg/100 g en amaranto (Mburu y col., 2011; Dini y col., 2012). Sin embargo, en general, se producen reducciones significativas de todas las vitaminas durante el periodo de almacenamiento de los granos o harinas y durante el procesamiento de los

~ 117 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

granos, lo que afecta el valor nutricional de los productos (Mburu y col., 2011;

Dini y col., 2012;). Schoenlechner y col., (2010a) determinaron una pérdida de folatos totales de 33,5 ± 10,4% en promedio, después de 3 meses de almacenamiento de la harina de quínoa y amaranto a una temperatura de 20°C y una humedad relitava del 50%. La producción de alimentos fermentados con elevados niveles de vitamina B incrementa su valor comercial y nutricional y elimina la necesidad de fortificación (Burgess y col., 2009).

A pesar de que la mayoría de BL son auxotróficas para varias vitaminas, se sabe que ciertas cepas tienen la capacidad de sintetizar vitaminas del grupo B (LeBlanc y col., 2011).

En este trabajo de Tesis se determinó que BL aisladas de quínoa y amaranto tienen capacidad de producir vitaminas B2 y B9, siendo una característica cepa dependiente y algunas de las cuales fueron capaces de producir ambas vitaminas. Esta propiedad de las BL es muy importante en el diseño de nuevos alimentos fermentados derivados de quínoa o amaranto biofortificados en folatos y riboflavina. De las cepas aisladas de quínoa, L. plantarum CRL 1973 produce la mayor concentración de folatos (143 ± 6 ng/mL) y L. rhamnosus CRL 1963 produce la mayor concentración de riboflavina extracelular (360 ± 10 ng/mL). Mientras que, de las cepas aisladas de amaranto, Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131 fue la que mayor concentración de folatos y riboflavina produce, 142 ± 2 y 268 ± 24 ng/mL, respectivamente. Estos valores son mayores a los reportados en un estudio en el que 40 cepas aisladas de trigo produjeron folatos entre 30 y 70 ng/mL (Salvucci y col., 2016). Por otra parte, L. plantarum CRL 2106 y 2107 producen mayores concentraciones de folato que los valores reportados por cepas de esta especie (Laiño y col., 2014).

Cepas de BL productoras de vitaminas del grupo B de otros nichos ecológicos, como productos lácteos, salvado de avena (Juárez del Valle y col., 2014; Kariluoto y col., 2014), masas ácidas (Russo y col., 2014) fueron identificadas.

~ 118 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

Sin embargo, este estudio constituye el primero que muestra que cepas de BL aisladas de quínoa y amaranto, cultivos ancestrales andinos, son capaces de producir riboflavina y folatos.

2.4. Conclusiones parciales

 Las cepas L. plantarum CRL 1966, 1967 y 1969 aisladas de masa ácida y L. plantarum CRL 1993 aislada de granos de quínoa, L. rhamnosus CRL 2139, L. plantarum CRL 2079, 2092, 2107 y 2108 aisladas de masa ácida y Lc. mesenteroides CRL 2132 y E. durans CRL 2122 aisladas de granos de amaranto, disminuyeron el pH del EEH por debajo de 5 a las 8 h de fermentación.  Las cepas que presentaron actividad amilolítica fueron: L. rhamnosus CRL 1963 y CRL 1984, L. plantarum CRL 1964 y CRL 1968 (aisladas de masa ácida de quínoa), E. gallinarum CRL 1989, CRL 1990, CRL 1991, CRL 1992, CRL 1999, CRL 2004, CRL 2005 y CRL 2014 (aisladas de granos de quínoa), L. plantarum CRL 2079, 2080, 2092, 2106 (aisladas de masa ácida de amaranto) y E. hermanniensis CRL 2134, 2136, E. mundtii CRL 2137, Enterococcus sp. CRL 21383 (aisladas de granos de amaranto).  Ciertas cepas de BL aisladas de quínoa y amaranto tienen capacidad de producir filancia y/o formar CPS, siendo esta propiedad cepa dependiente.  L. plantarum CRL 1973 y L. rhamnosus CRL 1963, aisladas de quínoa son las BL que mayor concentración de B2 y B9 producen, respectivamente (360 ± 10 y 143 ± 6 ng/mL). Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131, aislada de amaranto fue la que mayor concentración de folatos y riboflavina produce, 142 ± 2 y 268 ± 24 ng/mL, respectivamente.

 Las cepas que mostraron mayor actividad fitasa fueron:

 E. casseliflavus CRL 1988 (684 ± 38 U/mL) y L. rhamnosus CRL 1983 (606 ± 79 U/mL) aisladas de masas ácidas de quínoa,

~ 119 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

 E. mundtii CRL 2007 (957 ± 25 U/mL) y Lc. mesenteroides CRL 2012 (617 ± 38 U/mL), aisladas de granos de quínoa,

 L. plantarum CRL 2106 (730 ± 25 U/mL), aislada de masa ácida de amaranto,

 E. durans CRL 2122 (1041 ± 48 U/mL), aislada de granos de amaranto.

 De acuerdo a todas las propiedades evaluadas, se seleccionaron 11 cepas aisladas de quínoa (L. rhamnosus CRL 1963, CRL 1983, CRL 1972 y CRL 1984; L. sakei CRL 1978; L. plantarum CRL 1970, CRL 1967, CRL 1966, CRL 1973, CRL 1964 y CRL 1968) y 7 cepas aisladas de amaranto (L. plantarum CRL 2106, CRL 2107, CRL 2108, CRL 2079, CRL 2080 y CRL 2092 y Lc. mesenteroides CRL 2131) para continuar y cumplir los objetivos planteados.

~ 120 ~

Capítulo III: Ensayos in situ en masa de quínoa. Formulación del alimento prototipo

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

3.1. Introducción

En el complejo sistema de las masas madres, la síntesis de diferentes metabolitos estaría regulada tanto por las interacciones complejas entre los microorganismos iniciadores, entre el iniciador y la microbiota contaminante de la masa ácida, asi como por la interacción entre los microorganismos y los sustratos presentes en el medio (Corsetti y col., 1996). De allí surge la importancia de evaluar y corroborar las propiedades de las BL determinadas en los estudios in vitro en el Capítulo II con estudios in situ. En ciencia, in situ designa el análisis de un fenómeno exactamente en el lugar y condiciones donde el mismo se desarrolla (sin desplazamiento a un medio o lugar especial, y sin modificación de las condicionantes usuales o naturales).

En base a lo mencionado, en este Capítulo se evaluaron la capacidad de crecimiento, acidificación, producción de vitaminas (B2 y B9) y degradación de fitato en masas elaboradas con harina de quínoa. Asimismo, se formuló un alimento prototipo a base de harina de quínoa bio-enriquecido en vitaminas y minerales al que se denominó “ñoquis de quínoa.”

3.2. Resultados

3.2.1. Crecimiento de cepas de bacterias lácticas en masas de quínoa

Masas con harina de quínoa (DY= 160) fueron preparadas e inoculadas individualmente con las distintas cepas de BL seleccionadas según las propiedades evaluadas en la sección anterior (producción de vitaminas B2 y B9, capacidad de hidrolizar fitato, degradar almidón, capacidad de acidificación y producción de CPS). Los resultados demostraron que las 18 cepas evaluadas fueron capaces de crecer en las masas de quínoa, observándose recuentos de 109 UFC/g masa a las 24 h de fermentación. Se determinaron valores de pH finales en las masas alrededor de 4 para todas las cepas evaluadas (Tabla 3.1).

~ 124 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

Tabla 3.1: Crecimiento de BL y valores de pH en masas de quínoa

pH pH log UFC/g masa log UFC/g masa BL inicial final inicial final L. rhamnosus CRL 1963 6,1 ± 0,1 4,1 ± 0,1 7,3 ± 0,2 9,5 ± 0,2 L. plantarum CRL 1964 5,9 ± 0,1 4,0 ± 0,1 7,9 ± 0,3 9,8 ± 0,3 L. sakei CRL 1978 6,2 ± 0,2 4,2 ± 0,1 7,5 ± 0,2 9,1 ± 0,1 L. plantarum CRL 1967 6,1 ± 0,2 4,0 ± 0,2 7,5 ± 0,2 9,4 ± 0,1 L. plantarum CRL 2107 6,1 ± 0,1 4,1 ± 0,1 8,1 ± 0,3 9,6 ± 0,2 L. plantarum CRL 2106 6,1 ± 0,1 4,1 ± 0,1 8,1 ± 0,3 9,5 ± 0,2 L. plantarum CRL 1968 6,1 ± 0,2 4,1 ± 0,2 8,3 ± 0,3 9,5 ± 0,1 L. plantarum CRL 1966 6,1 ± 0,2 4,1 ± 0,1 7,9 ± 0,3 9,5 ± 0,1 L. plantarum CRL 1973 6,1 ± 0,1 4,1 ± 0,1 7,9 ± 0,2 9,4 ± 0,1 L. plantarum CRL 2108 6,1 ± 0,2 3,9 ± 0,2 7,7 ± 0,2 9,6 ± 0,2 L. plantarum CRL 2092 6,1 ± 0,2 3,9 ± 0,2 8,0 ± 0,3 9,8 ± 0,3 Lc. mesenteroides subsp. 6,1 ± 0,1 4,3 ± 0,1 7,8 ± 0,2 9,2 ± 0,1 mesenteroides CRL 2131 L. plantarum CRL 2079 6,0 ± 0,1 4,0 ± 0,2 7,9 ± 0,3 9,9 ± 0,3 L. plantarum CRL 2080 6,0 ± 0,1 3,9 ± 0,2 8,0 ± 0,3 9,8 ± 0,3 L. plantarum CRL 1970 6,3 ± 0,1 4,1 ± 0,1 8,0 ± 0,3 9,7 ± 0,2 L. rhamnosus CRL 1984 6,0 ± 0,1 4,1 ± 0,1 7,6 ± 0,2 9,8 ± 0,3 L. rhamnosus CRL 1983 6,2 ± 0,2 4,2 ± 0,1 7,4 ± 0,2 9,1 ± 0,1 L. rhamnosus CRL 1972 6,1 ± 0,2 4,0 ± 0,2 7,7 ± 0,2 9,8 ± 0,3

Control inóculo 6,0 ± 0,1 6,0 ± 0,2 7,3 ± 0,2 9,5 ± 0,1 Los resultados se expresan como la media ± DE.

3.2.2. Determinación de riboflavina y folatos en masas de quínoa

Las masas ácidas que presentaron mayor concentración de B2 fueron las fermentadas por las cepas L. plantarum CRL 1973, 2107 y 1967, L. rhamnosus CRL 1963 y 1983 y Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131 (6,6 ± 0,5; 6,0 ± 0,4; 6,6 ± 0,4; 5,7 ± 0,3; 5,8 ± 0,2; 6,4 ± 0,4 µg/g masa, respectivamente) respecto a la masa control, sin inóculo (4,0 ± 0,4 µg/g masa) (Figura 3.1a).

En cuanto a la concentración de folatos, las masas ácidas fermentadas por las cepas L. plantarum CRL 1973 (3,1 ± 0,1 µg/g masa), 1964 (3,3 ± 0,7 µg/g masa) y L. rhamnosus CRL 1984 (3,4 ± 0,3 µg/g masa) fueron las que mostraron mayor concentración de B9 en comparación a la masa control, sin inóculo (2,2 ± 0,1 µg/g masa) (Figura 3.1b).

~ 125 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

a 8.0 7.0

6.0 5.0

4.0

g /g /g g masa) μ 3.0 2.0

1.0 Riboflavina Riboflavina (

0.0

b 4.0

3.5

3.0 masa) masa)

2.5 g /g /g g

μ 2.0 1.5

1.0

olatos ( F 0.5 0.0

Figura 3.1: Concentración de vitaminas (µg/g masa) en masas de quínoa fermentadas por BL, a) riboflavina; b) folatos. Los resultados se expresan como la media ± DE.

3.2.3. Evaluación de cultivos mixtos en la producción de vitaminas y degradación de fitato en masa de quínoa

En base a resultados obtenidos (producción de vitaminas en masas de quínoa, capacidad de degradar fitatos, hidrolizar almidón, acidificación y producción de CPS y filancia) (Tabla 3.3) se seleccionaron 6 cepas de BL (Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131, L. plantarum CRL 1964, L. rhamnosus CRL 1963, L. rhamnosus CRL 1984, L. rhamnosus CRL 1983, L. plantarum CRL 2107) para preparar cultivos mixtos (C.M) a fin de evaluarlos y determinar cuáles de ellos producen mayor concentración de vitaminas y menor cantidad de fitato residual en masas ácidas de quínoa. Previamente se realizaron ensayos de compatibilidad entre las cepas seleccionadas. Los resultados no mostraron halos

~ 126 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

de inhibición de crecimiento en las placas agarizadas demostrando que todas las cepas fueron compatibles entre sí (Tabla 3.2).

Tabla 3.2: Compatibilidad de BL seleccionadas

CRL CRL CRL CRL CRL CRL BL 1983 1963 1984 1964 2107 2131 L. rhamnosus X - - - - - CRL 1983 L. rhamnosus - X - - - - CRL 1963 L. rhamnosus - - X - - - CRL 1984 L. plantarum - - - X - - CRL 1964 L. plantarum - - - - X - CRL 2107 Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides - - - - - X CRL 2131 (-) indican la ausencia de halos de inhibición de crecimiento

Tabla 3.3: Selección de BL para preparar cultivos mixtos

B B 2 9 Activ. BL seleccionada (µg/g (µg/g Activ. Fitasa Acidificación CPS Filancia masa) masa) amilolítica (U/mL)

L. rhamnosus 1,8 - 606 ± 79 - + + - CRL 1983 L. rhamnosus - 1,2 60 ± 16 + + + + CRL 1984 L. rhamnosus 1,7 - 584 ± 48 + + + - CRL 1963 Lc. mesenteroides subsp. 2,4 0,3 358 ± 25 - + + - mesenteroides CRL 2131 L. plantarum 1,3 1,1 114 ± 30 + + + + CRL 1964 L. plantarum 2,1 - 530 ± 42 - + + + CRL 2107 CPS: Polisacárido capsular. Los simbolos (+) y (-) indican la presencia o ausencia de cierta propiedad. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 127 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

Se seleccionaron las siguientes combinaciones de cultivos mixto: i) C.M.1: Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131+ L. plantarum CRL 1964, ii) C.M.2: L. rhamnosus CRL 1963 + L. rhamnosus CRL 1984, iii) C.M.3: L. rhamnosus CRL 1983 + L. rhamnosus CRL 1984, iv) C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964. Los cultivos mixtos (cepa/cepa: 1/1), inóculo inicial: 107 UFC/g masa, se emplearon para la preparación de masas ácidas con harina de quínoa (DY= 160). Después de 24 h de incubación a 30°C, se realizó la extracción de vitaminas y fitato. Como control negativo (C.N) se usó la cepa de E. gallinarum CRL 1989 por ser una cepa que no produce B2 y B9 y no tiene actividad fitasa.

En la Tabla 3.4 y Figura 3.2 se muestran los resultados obtenidos respecto a la producción de vitaminas y contenido de fitato residual respectivamente, en las distintas masas ácidas fermentadas con las diferentes combinaciones de C.M de BL.

Tabla 3.4: Producción de vitaminas por cultivos mixtos de BL en masas de quínoa

Masa ácida con cultivo *B2 (µg/g masa) *B9 (µg/g masa) mixto C.M.1 5,9 ± 0,1 1,1 ± 0,1 C.M.2 3,8 ± 0,3 0,4 ± 0,1 C.M.3 6, 1± 0,1 1,0 ± 0,1 C.M.4 5,1 ± 0,4 1,6 ± 0,2 C.N 2,2 ± 0,1 0,05 ± 0,01

*Los valores obtenidos de B2 o B9 resultan de la diferencia entre la concentración de vitamina obtenida en la masa ácida con cutivo mixto y el control sin inóculo (C.S.I). C.M.1: Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131 + L. plantarum CRL 1964; C.M.2: L. rhamnosus CRL 1963 + L. rhamnosus CRL 1984; C.M.3: L. rhamnosus CRL 1983 + L. rhamnosus CRL 1984; C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964; C.N: (control negativo), E. gallinarum CRL 1989. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 128 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

Figura 3.2: Contenido de fitato residual (mg/g masa) en masas ácidas realizadas con cultivos mixtos de BL. C.S.I: control sin inóculo. C.M.1: Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131 + L. plantarum CRL 1964; C.M.2: L. rhamnosus CRL 1963 + L. rhamnosus CRL 1984; C.M.3: L. rhamnosus CRL 1983 + L. rhamnosus CRL 1984; C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964; C.N: (control negativo), E. gallinarum CRL 1989. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-C Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

A partir de los resultados obtenidos, se seleccionó el cultivo mixto 4 (C.M.4) formado por L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964, por ser la masa fermentada en la que se obtuvo una elevada concentración de riboflavina y folatos (5,1 ± 0,4 y 1,6 ± 0,2 µg/g masa, respectivamente) y menor concentración de fitato residual (17,4 ± 1,3 mg/g masa).

3.2.4. Formulación de un alimento prototipo a base de harina de quínoa bio-enriquecido en vitaminas y minerales: “ñoquis de quínoa.”

En la preparación de muchos alimentos se utiliza almidón pre-gelatinizado (A- PG) para mejorar la textura a temperatura ambiente y refrigerada; entre estos se encuentran los postres instantáneos, mezclas de salsa, rellenos de tartas y glaseados (Moore y col., 1984). El A-PG está compuesto de pequeñas partículas de gel, que cuando se disuelven, producen soluciones de alta viscosidad (BeMiller y Whistler, 1996) (Figura 3.3). Debido a esta característica, para la elaboración de la pasta a base de harina de quínoa (ñoquis), usamos A-PG. Se probaron 4 protocolos distintos con el fin de obtener una masa con buenas características reológicas.

~ 129 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

Figura 3.3: imagen representativa de la consistencia del almidón de mandioca pre-gelatinizado (20%)

El empleo de los protocolos 1 y 2 (10% y 20% de A-PG de quínoa, respectivamente) dió como resultado una masa quebradiza que no permitió el buen armado de los ñoquis. Al emplear el protocolo 3 (10% A-PG de mandioca) y para obtener una pasta con óptimas características, se tuvo que agregar más harina a la masa, con lo cual se estaría diluyendo la cantidad de vitaminas por gramo de masa; mientras que con el protocolo 4 (20% A-PG de mandioca) se obtuvo una masa más elástica con mejores características que permitió el buen armado de los ñoquis (Figura 3.4). En base a estos resultados se seleccionó el protocolo 4 para preparar la pasta de quínoa y evaluar las propiedades de las BL.

a b

Figura 3.4: Imagen representativa de las pastas realizadas a: con 20% de A-PG de mandioca, b: realizada sin el agregado de A-PG.

Definido el protocolo a usar, se prepararon diferentes grupos de pastas:

~ 130 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

• Grupo 1: masa control de pH [masa de quínoa sin fermentar, acidificada químicamente (pH 4) con una solución molar 4:1 de ácido acético: ácido láctico].

• Grupo 2: masa control (-) [masa de quínoa fermentada con la cepa E. gallinarum CRL 1989 no productora de riboflavina, folatos ni fitasa].

• Grupo 3: masa control Ribo+Fólico [masa de quínoa sin fermentar, acidificada químicamente (pH 4) con una solución molar 4:1 de ácido acético: ácido láctico, suplementada con riboflavina comercial (5,1µg/g masa) * y con ácido fólico comercial (1,6 µg/g masa) *].

• Grupo 4: masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales [masa de quínoa fermentada con C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964)].

* Concentración de vitaminas B2 y B9 producidas por C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) en masa de quínoa.

Luego se determinó concentración de vitaminas (B2 y B9) y fitato residual en las distintas pastas. La concentración de B2 y B9 en la pasta del G4 (fermentada con el C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) fue de 5,0 ± 0,5 y 1,3 ± 0,1 µg/g masa, respectivamente, siendo estos valores mayores a los obtenidos en la pasta G2 control (-) (1,7 ± 0,1 y 0,1 ± 0,01 µg/g masa, respectivamente) (Figura 3.5). La concentración de fitato residual en la pasta elaborada con el cultivo mixto (17,3 ± 0,2 mg / g masa) fue menor a la pasta G2 (21,8 ± 0,2 mg/g masa) (Figura 3.5 c).

~ 131 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

a

Riboflavina(µg/g masa)

Grupos de pastas

b

) Folatos(µg/g masa

c Grupos de pastas

c

)

masa

tatoresidual (mg/g Fi

Grupos de pastas Figura 3.5: Concentración de vitaminas (µg/g masa) a) Riboflavina; b) Folatos y c) Fitato residual (mg/g masa) en diferentes pastas realizadas. Grupo 2: masa control (-) cepa no productora; Grupo 3: masa control Ribo+Folico; Grupo 4: masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. G1: pasta control sin inóculo. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-C Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05). ~ 132 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

Asimismo, se evaluó la concentración de minerales solubles obtenidos en las pastas como resultado de la actividad fitasa del C.M de BL empleado. La pasta elaborada con masa ácida fermentada con el C.M.4 (G4) mostró mayor contenido de minerales solubles (Ca+2: 96,0 ± 2,1 mg/L; Fe+2: 6,8 ± 1,0 mg/L; Mg+2: 244,3 ± 29,3 mg/L; P: 260,0 ± 30,0 mg/L) que la pasta G2 (Ca: 88,8 ± 1,8 mg/l; Fe: 6,1 ± 0,6 mg/L; Mg: 225,5 ± 31,1 mg/L; P: 180,0 ± 15,0 m/L) (Figura 3.7).

Si bien ambas pastas (G2 y G4) presentaron un pH final alrededor de 4, el efecto estaría dado por la actividad fitasa del C.M y no por el efecto del pH en sí, dado a que en la masa control pH (G1) (pasta sin inóculo y acidificada químicamente, pH = 4) los valores de minerales solubles fueron similares a la pasta G2 (Ca+2: 90 ± 0,7; Fe+2: 6,5 ± 0,7; Mg+2: 215 ± 4,2 y Pi: 195 ± 15 mg/L) (Figura 3.7). Esto se debería a que en la pasta del G1, hubo una leve actividad fitasa dada por las fitasas endógenas de la harina que se activaron como consecuencia del efecto del pH, mientras que en la pasta G4, realizada con el C.M se debería a la acción combinada de la actividad fitasa de las BL y activación de las fitasas endógenas de la harina.

Figura 3.7: Contenido de minerales solubles (mg/L) en pastas de quínoa. Grupo 2: masa control (-) cepa no productora; Grupo 4: masa bio- enriquecida en vitaminas y minerales G1: pasta control pH, sin inóculo. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-C Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

~ 133 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

3.3. Discusión

El empleo de BL como cultivos iniciadores permite, a través de sus actividades metabólicas tales como acidificación, producción de exopolisacáridos y compuestos antimicrobianos, actividad proteolítica, amilolítica y fitasa, mejorar no sólo la calidad de los productos libres de gluten (LG), sino también su valor nutricional, al incrementar el contenido de ciertas vitaminas (Arend y col., 2011; LeBlanc y col., 2015).

Se ha demostrado que ciertos alimentos fermentados con BL contienen altos niveles de riboflavina y folatos como resultado de la biosíntesis microbiana (Ewe y col., 2010; Capozzi y col., 2011; Laiño y col., 2013, 2014; Juarez del Valle y col., 2014; Russo y col., 2014).

Sin embargo, no existen antecedentes sobre la producción de vitaminas por BL en granos andinos. La quínoa es un grano andino con elevado valor nutricional y además no contiene gluten pudiendo ser utilizada en la elaboración de alimentos para pacientes celíacos. Es por ello que nos planteamos evaluar la producción de B2 y B9 por BL usando como sustrato harina de quínoa.

La producción de vitaminas por microorganismos en sustratos alimenticios depende de la cepa empleada, de la composición del sustrato como así también de las condiciones de fermentación (Kariluoto y col., 2014). Nuestros resultados demostraron que la masa ácida elaborada con harina de quínoa es un sustrato adecuado para el crecimiento de las BL seleccionadas y la producción de riboflavina y folatos por parte de estas bacterias. La mayor concentración de vitamina B2 fue obtenida en masas ácidas de quínoa fermentadas por las cepas L. plantarum CRL 1973, 2107 y 1967, L. rhamnosus CRL 1963 y 1983 y Leuc. mesenteroides CRL 2131 que produjeron 6,6 ± 0,5; 6,0 ± 0,4; 6,6 ± 0,4; 5,7 ± 0,3;

5,8 ± 0,2; 6,4 ± 0,4 µg de B2/g masa, respectivamente. Mientras que las masas ácidas fermentadas por las cepas L. plantarum CRL 1973, 1964 y L. rhamnosus

~ 134 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

CRL 1984 mostraron mayor concentración de folatos: 3,1 ± 0,4; 3,3 ± 0,7; 3,4 ±

0,3 µg de B9/g masa, respectivamente.

Kariluoto y col., (2006) determinaron que BL empleadas para la fermentación de masa ácida de centeno no produjeron folatos, sino que, por el contrario, lo consumieron disminuyendo la concentración de 6.5 µg/100 g (concentración presente en la masa) a 2.9 µg/100 g después de 19 h de fermentación.

El ácido fítico es un eficiente quelante de minerales (Ca+2, Mg+2, Fe+2 y Zn+2) y asimismo acompleja grupos básicos de aminoácidos de las proteínas, disminuyendo la biodisponibilidad dietética de estos nutrientes, es por ello que es considerado un factor anti-nutricional. Esta característica es importante a considerar, en especial en alimentos destinados a pacientes celiacos que padecen deficiencias de micronutrientes (Arendt y col., 2011).

El fitato puede ser hidrolizado por la enzima fitasa, lo cual incrementaría la biodisponibilidad de los oligoelementos. Existen varias estrategias para incrementar la actividad fitasa presente en las materias primas empleadas en la elaboración de alimentos. Los cereales y seudocereales poseen fitasas endógenas, las cuales serían activadas durante el proceso de fermentación por BL debido al descenso de pH, proporcionando un pH óptimo para la actividad de la enzima (Sanz-Penella y col., 2012).

Otra alternativa es la adición de fitasa exógena, generalmente de origen microbiano. Esta estrategia se utiliza ampliamente en la producción de piensos para animales monogástricos, y también se ha investigado en la producción de alimentos con cereales y legumbres para el consumo humano (Maenz, 2001). La actividad fitasa ha sido descripta en cepas de grado alimentario del género Bifidobacterium, las cuales se han aplicado en procesos de panificación directos e indirectos demostrando su eficiencia en la reducción de fitatos y el incremento de la disponibilidad de hierro (Sanz-Penella y col., 2009, 2012a). Sin embargo, las exigencias nutricionales y la necesidad de anaerobiosis estricta

~ 135 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

limitan su uso en la fermentación de alimentos; debido a esto, otros autores emplearon directamente la fitasa obtenida de Bifidobacterium para la elaboración de alimentos con el fin de reducir el efecto negativo del fitato (Sanz-Penella y col., 2012b; Tamayo-Ramos y col., 2012; García-Mantrana y col., 2014; Iglesias-Puig y col., 2015). La desventaja de esta estrategia es el costoso y tedioso proceso de purificación de la enzima.

Ciertas BL poseen la capacidad de degradar fitato, aumentando así la disponibilidad de minerales. En un trabajo realizado por Rizzello y col. (2010), se demostró que la fermentación de masa ácida de gérmen de trigo con dos cepas de BL (L. plantarum LB1 y L. rossiae LB5) aumentó aproximadamente 3.6 veces la actividad de fitasa y mejoró la biodisponibilidad de minerales (Ca+2, Fe+2, Mn+2 y Zn+2). Anastasio y col. (2010) evaluaron el efecto de la fermentación de masas de trigo con un cultivo mixto de BL fitasa positivas (L. plantarum H5 y L3, Leuconostoc gelidum A16 y E. faecium A86) sobre la concentración de minerales solubles (Fe+2, Mg+2 y Zn+2) usando como control un cultivo mixto de BL fitasas negativas (L. gelidum LM249, L. plantarum H19 y L. plantarum L8). Los resultados demostraron que después de 24 h de fermentación se produjo un incremento en la concentración de minerales solubles con respecto a la masa control.

García-Mantrana y col. (2016), usaron una cepa de L. casei modificada genéticamente, la cual expresa actividad fitasa proveniente de Bifidobacterium. Después de evaluar la actividad enzimática en medio de cultivo donde observaron la degradación completa del ácido fítico, emplearon esta cepa como cultivo iniciador en la elaboración de pan con harina integral. La cepa tuvo capacidad para fermentar la masa, pero la hidrólisis del fitato fue muy baja.

Nuobariene y col. (2015) demostraron una disminución del contenido de fitato durante la fermentación de una masa de trigo integral fermentada con L. panis (90 %) o L. fermentum (70%).

~ 136 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis demostraron que el cultivo mixto seleccionado (C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) presenta una elevada actividad fitasa que produjo un menor contenido de fitato residual (17,4 ± 1,3 mg/g masa) en comparación al control sin inóculo (34,3 ± 0,2 mg/g masa).

En este trabajo de Tesis se investigó el efecto de cepas naturalmente productoras de fitasas, riboflavina y folatos durante la fermentación de un alimento a base de quínoa. Esta estrategia de biofortificación proporciona una gran ventaja sobre otras; no origina costos extra dado que los mismos cultivos iniciadores son los microorganismos que sintetizan las vitaminas y la enzima fitasa. Con este proceso se logra mayor biodisponibilidad de minerales y mayor concentración de vitaminas.

La pasta fue uno de los primeros alimentos autorizados por la FDA (Food and Drug Administration) para el enriquecimiento con hierro y vitaminas en 1949. La OMS (Organización Mundial de la Salud) y la FDA consideran a este alimento como un buen vehículo para la adición de nutrientes (Chillo y col., 2008). La pasta no es un producto fermentado, sin embargo, el presente estudio de Tesis ofrece nuevos puntos de vista interesantes sobre el potencial biotecnológico de las BL en la fabricación de pasta, como una estrategia para la fortificación in situ de alimentos. Existen antecedentes del empleo de BL en la elaboración de pastas con harina o sémola de trigo (Di Cagno y col., 2005; De Angelis y col.,

2010; Cappozzi y col., 2011; Curiel y col., 2014). En otros estudios se elaboraron pastas con harina de granos andinos (quínoa, amaranto o buckwheat), pero sin un proceso de fermentación previo usando BL (Chillo y col., 2009, 2010; Schoenlechner y col., 2010, Mastromatteo y col., 2012). Este trabajo de Tesis constituye el primer estudio realizado en la elaboración de pasta bio- enriquecida en riboflavina, folatos y minerales usando BL y harina de quínoa. La concentración de B2 y B9 en la pasta preparada y fermentada con el cultivo

~ 137 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

mixto fue de 5,0 ± 0,5 y 1,3 ± 0,1 µg / g masa, respectivamente, siendo estos valores mayores a los obtenidos en la pasta preparada con la cepa no productora, control (-) (1,7 ± 0,1 y 0,1 ± 0,01 µg / g masa, respectivamente). La concentración de fitato residual fué menor (30 %) en la masa fermentada con el cultivo mixto respecto a la masa control (sin inóculo).

Según el Código Alimentario Argentino (CAA), la ingesta diaria recomendada (IDR) de riboflavina es de 1,3 mg de vitamina y 400 µg de ácido fólico. El Art. 1363 del CAA define a los alimentos fortificados como “aquellos alimentos en los cuales la proporción de proteínas y/o aminoácidos y/o vitaminas y/o ácidos grasos esenciales es superior a la del contenido natural medido del alimento corriente, por haber sido suplementado significativamente”. Dice además que “La porción del alimento fortificado deberá aportar entre 20% y 50% para vitaminas liposolubles y minerales, y 20% y 100% para vitaminas hidrosolubles, de los Requerimientos Diarios Recomendados”. De acuerdo con nuestros resultados, una porción (80 g) de pasta fermentada con cultivo mixto de BL seleccionadas (G4), aportaría 31% de la IDR para riboflavina, y 26% de folatos, por lo tanto, el producto podría considerarse como un alimento bio-fortificado.

La pasta elaborada con trigo tiene mejores parámetros de calidad (estructura de pasta firme, adhesividad reducida, etc.) que la pasta no convencional. La harina de trigo, gracias al gluten, componente proteico cohesivo, es la única harina de cereal que puede formar una masa viscoelástica tridimensional cuando se mezcla con agua (Mastromatteo y col., 2012). Para mejorar la calidad (estructura, textura, aceptabilidad y vida útil) de la pasta no convencional, entre ellas a base de harinas sin gluten, se llevaron a cabo varios estudios que incluyeron el uso de almidones, hidrocoloides, productos lácteos, gomas y otras proteínas y sus combinaciones como alternativa al gluten (Huang y col., 2001; Singh col., 2004; Chillo y col., 2007, 2009; Schoenlechner y col., 2010). En estos trabajos, la adición de agentes estructurantes (carboximetilcelulosa y almidón

~ 138 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

pre-gelatinizado) fue necesaria para la preparación de pastas elaboradas con harinas no convencionales con buenas características sensoriales.

En este trabajo de Tesis se probaron distintos protocolos a fin de mejorar las características reológicas de la pasta elaborada con harina de quínoa. El agregado de 20% de almidón pre-gelatinizado proveniente de fécula de mandioca dió lugar a una masa mucho más suave, elástica y con mejores características reológicas.

Los estudios in vitro e in situ realizados en esta Tesis constituyen la primera fase en el proceso de elaboración de un alimento funcional. En este este trabajo de Tesis se desarrolló un alimento prototipo, el cual consiste en una pasta fermentada utilizando harina de quínoa como matriz alimentaria y cepas lácticas seleccionadas productoras de riboflavina, folatos y fitasa. La próxima etapa consiste en la valoración de la funcionalidad de la pasta de quínoa fermentada bio-fortificada, mediante ensayos in vivo, adecuadamente diseñados utilizando un modelo animal desarrollado en este trabajo de Tesis.

~ 139 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

3.4. Conclusiones parciales

 Las 18 cepas de BL seleccionadass previamente, de acuerdo a las propiedades evaluadas, fueron capaces de crecer en masas realizadas

con harina de quínoa y producir vitaminas B2 y B9.  De acuerdo a la producción de vitaminas en masas acidas de quínoa y a las propiedades evaluadas (capacidad de degradar fitatos, hidrolizar almidón, acidificación y producción de CPS y filancia), se seleccionaron 6

cepas de BL para realizar cultivos mixtos y evaluar la producción de B2, B9 y degradación de fitatos en masas realizadas con harinas de quínoa. Las cepas fueron todas compatibles entre si.  En base a los resultados obtenidos se seleccionó el cultivo mixto 4 (C.M.4) con la combinación de las cepas L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964, por ser la masa fermentada en la que se obtuvo alta concentración de riboflavina y folatos (5,1 ± 0,4 y 1,6 ± 0,2 µg/g masa, respectivamente) y menor concentración de fitato residual (17,4 ± 1,3 mg/g masa).  El cultivo mixto C.M.4 fue utilizado para la fermentación de una masa elaborada con harina de quínoa y empleada en la preparación de pastas

naturalmente bioenriquecidas en vitaminas (B2 y B9) y minerales (G4). Como control (-) se preparó una pasta (G2) fermentada con E. gallinarum CRL 1989 por ser una cepa no productora de vitaminas ni fitasa.  La pasta bioenriquecida (G4) presentó mayor concentración de riboflavina, folatos, fitato residual y minerales solubles respecto a la pasta control (G2).

~ 140 ~

Capítulo IV: Evaluación de la funcionalidad de pasta fermentada bio-enriquecida en vitaminas y minerales en un modelo animal de experimentación deficiente en vitaminas

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

4.1. Introducción

Los efectos in vivo de las vitaminas y minerales presentes en masas de quínoa fermentadas por BL seleccionadas están fuertemente influenciados por su biodisponibilidad. En general, la biodisponibilidad es la fracción de un nutriente o compuesto ingerido que alcanza la circulación sistémica y puede ser utilizado. Por lo tanto, es multifactorial ya que incluye la digestión gastrointestinal, la absorción, el metabolismo, la distribución tisular y la bioactividad del nutriente / compuesto. Sin embargo, debido a la dificultad de investigar la bioactividad, la biodisponibilidad se considera comúnmente tanto como la fracción de un compuesto como el metabolito (s) de ese compuesto que alcanza la circulación sistémica (Holst y Williamson, 2008). La biodisponibilidad puede verse afectada por una amplia gama de factores, no solo relacionados con los alimentos (por ejemplo, forma química del compuesto, características de la matriz alimentaria), sino también con el individuo (por ejemplo, vaciamiento gástrico, tiempo de tránsito intestinal), lo que resulta en variabilidad interindividual. Comenzando con la ingestión y la digestión de un alimento, la matriz alimentaria puede influir en la bioaccesibilidad de las vitaminas y minerales porque la cantidad que se libera desde dentro de la matriz influirá en la fracción que está disponible para la absorción intestinal. Los efectos sobre la bioaccesibilidad pueden evaluarse in vitro mediante la simulación de la digestión gástrica y del intestino delgado. Los métodos in vitro son formas rápidas y económicas de estimar la bioaccesibilidad de un compuesto bioactivo, incluidos los cambios resultantes de las variaciones en la matriz de alimentos y el procesamiento de alimentos (Angelino y col., 2017). Sin embargo, estos métodos no pueden medir completamente la biodisponibilidad de los bioactivos, ya que esto requiere metodologías in vivo.

Con el fin de evaluar la funcionalidad y biodisponibilidad de los nutrientes (minerales y vitaminas) del alimento prototipo diseñado en esta Tesis (pasta fermentada utilizando harina de quínoa como matriz alimentaria y cepas

~ 144 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

lácticas seleccionadas productoras de riboflavina, folatos y fitasa), se utilizó un modelo animal de deficiencia vitamínica. Se determinó si el alimento fermentado con las cepas seleccionadas es efectivo en prevenir la deficiencia de vitaminas (riboflavina y folatos) e incrementar la biodisponibilidad de minerales.

4.2. Resultados

4.2.1. Evaluación de la funcionalidad de la pasta de quínoa (tipo ñoquis) fermentada, naturalmente fortificada con riboflavina y folatos para prevenir la deficiencia de ambas vitaminas en un modelo animal

A fin de evaluar si el producto bio-fortificado en riboflavina y folatos, producidos por C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) en masa de quínoa, era capaz de prevenir la deficiencia nutricional de estas vitaminas se usó un modelo de ratón deficiente en B2 y B9. El producto bio-fortificado fue administrado en forma conjunta con una dieta balanceada libre de ambas vitaminas desde el inicio de la depleción.

En este modelo, los ratones hembras de 3 semanas de edad destetados, fueron divididos en 6 grupos sometidos a diferentes dietas (Grupo 1 al 4 y grupos control y deficientes). El ensayo se realizó 42 días, durante el cual, cada 2 días, se examinó el peso de los animales y consumo del alimento. Al final del ensayo, se realizó la extracción de órganos y muestras de sangre para determinar el estado de riboflavina, folatos, minerales y los valores hematológicos.

4.2.1.1. Peso corporal y consumo de alimento

La Figura 4.1 muestra los valores del peso corporal de los animales durante el período de experimentación (42 días). La ganancia de peso corporal de los ratones de los grupos experimentales (G1 al G4) fue superior a la ganancia obtenida en los animales del grupo deficiente (GD) durante todo el periodo de experimentación. Al final del ensayo, el peso corporal registrado entre los

~ 145 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

grupos G1, G2, y GC, fueron similares entre sí (aproximadamente 24 g); los animales del grupo GD, mostraron valores de peso corporal menores (18 ± 0,9 g) mientras que el peso corporal de los grupos G3 y G4 fueron mayores al resto de los grupos (31,2 ± 0,8 g y 28,3 ± 0,9 g, respectivamente). Cabe destacar que no se observaron diferencias en el volumen de alimento consumido entre los grupos experimentales y los grupos control y deficiente durante el periodo ensayado (Figura 4.2).

Figura 4.1: Peso corporal. El peso corporal se expresa en g, GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-C Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

~ 146 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

Figura 4.2: Consumo promedio de alimento expresado en gramos/día/ratón (g/d/r). GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-B Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

4.2.1.2. Peso relativo de órganos internos

Se observó un pequeño aumento en el peso relativo de hígado (5,4 ± 0,2 g) y una disminución en el bazo (0,32 ± 0,04 g) de los animales deficientes cuando se compara con el grupo control (4,6 ± 0,5 g; 0,38 ± 0,01 g, respectivamente). También en el grupo G4 se observó un pequeño incremento en el peso relativo del bazo (0,48 ± 0,02 g) comparado con el resto de los grupos (Figura 4.3).

~ 147 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

Figura 4.3: Peso relativo de los órganos (*: peso del órgano /peso animal x 100). GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-B Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

4.2.1.3. Parámetros bioquímicos

En los animales alimentados con la pasta bio-fortificada (G4) se observó mayores valores de Hemoglobina (14,4 g/dL), de hematocrito (47%), de hemoglobina corpuscular media (20,6 pg) y menor valor de concentración de hemoglobina corpuscular media (30 g/dL) al comprar dichos parámetros con el grupo deficiente (Hb: 12,6 g/dL, Hto: 39,9%, HCM: 15,1 pg, CHCM: 31,6 g/dL).

Se observó hipocromía en los GR y mayor tamaño al igual que en los GB, los cuales además presentaron neutrófilos más segmentados en el grupo deficiente (GD) en relación con el grupo control (GC) y el grupo experimental G4 (Figura 4.4).

~ 148 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

Tabla 4.1: Evaluación de la serie roja al final del período de experimentación

Grupo GR Hb Hto VCM HCM CHCM Plaquetas (células/L) (g/dL) (%) (fL) (pg) (g/dL) (células/µL) GD 8.360.000 12,6 39,9 49,2 15,1 31,6 172000 G1 8.210.000 13,9 42,0 51,8 16,7 33,1 387000 G2 7.490.000 13,7 40,0 53,4 16,6 31,8 256000 G3 8.910.000 14,0 47,0 52,7 15,7 29,8 292000 G4 8.400.000 14,4 47,0 49,6 20,6 30,0 324000 GC 8.980.000 14,1 45,0 50,0 15,8 31,1 278000 GR: glóbulos rojos; Hb: hemoglobina; Hto: hematocrito; VCM: volumen corpuscular medio; HCM: hemoglobina corpuscular media; CHCM: concentración de hemoglobina corpuscular media; GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales.

GD GC G4 a

b

c

Figura 4.4: Fotografías representativas de frotis de sangre de ratón pertenecientes a los siguientes grupos: GD: grupo deficiente; GC: grupo control normal; G4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. a) glóbulos rojos, b) linfocitos, c) neutrófilos. La flecha muestra neutrófilo hipersegmentado.

~ 149 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

4.2.1.4. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera

El grupo alimentado con la pasta fermentada bio-enriquecida (G4) mostró la mayor concentración de folatos en sangre entera (716 ± 74 ng/mL) respecto a todos los grupos evaluados (Figura 4.5 a), siendo mucho mayor que el grupo control (GC) (511 ± 26 ng/mL) y que el grupo que fue alimentado con la masa a la cual se la suplementó con las vitaminas sintéticas (B2 y B9) en la misma concentración que la producida por el C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964 en la masa de quínoa) (G3)(429 ± 53 ng/mL).

Con respecto a la concentración de folatos plasmáticos, no se observaron diferencias significativas entre los animales pertenecientes al G4 (41 ± 4 ng/mL) con respecto al GC (37 ± 4 ng/mL) (Figura 4.5 b).

El grupo deficiente (GD) mostró las menores concentraciones de folatos tanto en sangre entera (219 ± 10 ng/mL) como en plasma (12,9 ± 0,9 ng/mL).

De esta manera se demostró que la pasta fermentada por BL bio-enriquecida en vitaminas fue efectiva en prevenir la deficiencia de folatos cuando se lo administra simultáneamente con una dieta libre de folatos.

~ 150 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

a

(ng/mL)

sangre entera Folatos en

b

Folatos en plasma(ng/mL)

Figura 4.5: Concentración de folatos en sangre entera (a) y plasma (b) en ng/mL. GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-D Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05). 4.2.1.5. Dosaje de folatos en órganos

Los resultados demostraron que los niveles de folatos en hígado de los animales pertenecientes al G4 (3,4 ± 0,4 ug/g órgano) fueron significativamente mayores que todos los grupos experimentales (Figura 4.6 a). En riñón la concentración de folatos de los animales del grupo G4 (2,9 ± 0,3 ug/g órgano) fue similar al de los animales del G3 y al de los del GC (3,3 ± 0,6 y 2,5 ± 0,1 ug/g órgano, respectivamente) (Figura 4.6 b), mientras que en el bazo el nivel de folatos (1,5± 0,4 ug/g órgano) fue mayor que el GC (0,7 ± 0,05 ug/g órgano) (Figura 4.6 c). En

~ 151 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

el GD se observaron niveles de folatos en todos los órganos evaluados significativamente menores que el GC y que el resto de los grupos, salvo en el bazo donde el valor fue similar al GC.

a

(µg/g órgano) (µg/g Folatos en hígado Folatoshígado en Grupos

b

(µg/g órgano) (µg/g

riñón Folatos en

Grupos

c

(µg/g órgano) (µg/g

bazo Folatos en

Grupos

Figura 4.6: Concentración de folatos en órganos, Hígado (a), Riñon (b) y Bazo (c) en µg/g de órgano. GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio- enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-D Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

~ 152 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

4.2.1.6. Evaluación histológica de intestino

Los cortes histológicos del intestino delgado mostraron cambios en la morfología de las vellosidades intestinales (Figura 4.7). Los ratones deficientes en riboflavina y folatos (grupos: GD, G1, G2) exhibieron una atrofia significativa, es decir una disminución en la longitud de las vellosidades (211 ± 76; 299 ± 53; 284 ± 57 μm respectivamente), en relación a los animales de los grupos G3 y G4, cuyas vellosidades fueron del mismo tamaño (363 ± 47; 401 ± 46 μm respectivamente) y comparables al grupo control (334 ± 74) (Figura 4.8).

G GD D GC

G4 G3 G4

Figura 4.7: Fotografías representativas de cortes histológicos de intestino delgado de ratón pertenecientes a los siguientes grupos: GD: grupo deficiente; GC: grupo control normal; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales.

~ 153 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

G4 G3 GC G1 G2 GD Grupos

Figura 4.8: Longitud de las vellosidades (μm) registrada en los grupos ensayados. GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-D Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

4.2.1.7. Determinación de riboflavina

El coeficiente de activación de la glutatión reductasa eritrocitaria o EGRAC es un método para determinar el estado funcional en riboflavina. El EGRAC es un método funcional que consiste en la reducción de la glutatión oxidada (GSSG) a su forma reducida (GSH) mediante la glutatión reductasa que tiene FAD como cofactor. El NADPH se oxida a NADP+ y se monitoriza a 340 nm.

El EGRAC se calcula como la actividad de la glutatión reductasa estimulada con su grupo prostético FAD (actividad estimulada) dividida por la actividad sin FAD exógeno (actividad basal).

Si el valor de EGRAC es 1 significa que la enzima está saturada y valores mayores de EGRAC implican que es necesario FAD exógeno para saturar la misma. Un

~ 154 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

valor de EGRAC inferior a 1,3 se considera normal; valores iguales o mayores a 1,3 indican deficiencia de riboflavina (del Valle y col., 2016).

Los ratones alimentados con la dieta deficiente (DD) más la pasta fermentada con las cepas seleccionadas (G4) al igual que el grupo que recibió la DD más la pasta a la cual se le agregó las vitaminas sintéticas (G3), mostraron valores de EGRAC menores a 1,3, valor similar al grupo control (Figura 4.9)

Por el contrario, los ratones alimentados con la DD mas la pasta control de pH (G1) y los ratones que fueron alimentados con la DD mas la pasta fermentada con la cepa no productora de vitaminas (G2) evidenciaron valores de EGRAC iguales o mayores a 1,3, al igual que el grupo deficiente (GD), lo que estaría indicando que hay una deficiencia de riboflavina en estos grupos (Figura 4.9).

EGRAC

2.00 1.80 1.60

1.40

1.20 1.00 0.80 0.60

0.40 0.20

0.00 GD G1 G2 G3 G4 GC

Figura 4.9: Estado de riboflavina (EGRAC) en los animales luego de 42 días de alimentación. GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 3: DD + masa control Ribo+Folico; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE.

~ 155 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

4.2.2. Determinación de minerales en sangre

Con el fin de evaluar la actividad fitasa in situ en la pasta realizada con harina de quínoa fermentada con C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) y su efecto sobre la disponibilidad de minerales, se determinaron los valores de Ca+2, Fe+2, Mg+2 y Pi en suero de los animales pertenecientes a todos los grupos experimentales. Los resultados mostraron que el contenido de Mg+2 en suero de los ratones pertenecientes al G4 fue significativamente mayor (4,85 ± 0,24 mg/dL) respecto al GC y GD (3,5 ± 0,1 y 3,3 ± 0,4 mg/dL, respectivamente). No se observaron diferencias significativas en el contenido de fósforo, hierro y calcio en ninguno de los grupos evaluados (Figura 4.10).

Figura 4.10: Concentración de minerales en suero, en mg/dl. GC: grupo control normal; GD: grupo deficiente; Grupo 1: DD + masa control de pH; Grupo 2: DD + masa control cepa no productora; Grupo 4: DD + masa bio-enriquecida en vitaminas y minerales. Los resultados se expresan como la media ± DE. A-B Letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

~ 156 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

4.3. Discusión

En este trabajo de Tesis se evaluó el efecto que produce una pasta elaborada con harina de quínoa fermentada con BL productoras de riboflavina y folatos sobre el contenido de estas vitaminas al administrarla simultáneamente a una dieta libre de B2 y B9, desde el primer día de depleción. Para ello se realizaron ensayos in vivo usando un modelo animal de prevención de deficiencia en riboflavina y folatos (el cual pusimos a punto), usando ratones BALB/c.

En este modelo se determinó peso de los animales, consumo de alimento, concentración de folatos en sangre entera, plasma, órganos, peso relativo de los órganos. Se evaluó histológicamente el intestino delgado, parámetros hematológicos y el estado de riboflavina mediante la determinación de EGRAC.

La deficiencia de riboflavina se estudió en diversas especies animales sobre las que ejerce varios efectos nocivos, el más importante de los cuales es el retraso del crecimiento. Las ratas deficientes en riboflavina necesitan, tal vez debido a la disfunción mitocondrial, de 15 a 20% más aporte calórico que los animales testigo para mantener un peso corporal similar (Bowman y Russell, 2004). En este trabajo de Tesis se determinó que los animales pertenecientes al grupo deficiente presentaron un menor peso corporal (18,0 ± 0,9 g) al final del periodo de experimentación (42 días) comparado con el grupo control (24,0 ± 0,8) y al grupo que recibió la pasta bioeriquecida en B2 y B9 (G4) (28,3 ± 0,9 g). Resultados similares fueron obtenidos por del Valle y col., (2016) quienes evaluaron una leche de soja fermentada con cepas de BL productoras de B2 en la prevención de deficiencia de esta vitamina y obtuvieron como resultado que los animales alimentados con la leche de soja fermentada con las BL como así también los alimentados con la leche a la cual se le aguego B2 sintética (29 ± 1 g y 26 ± 1g, respectivamente), mostraron un peso similar al grupo control (28 ± 1g). Mientras que los animales pertenientes al grupo deficiente evidenciaron

~ 157 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

valores de peso corporal menores (36%) respecto a los valores obtenido en el grupo control. Además, la riboflavina participa en el desarrollo del tracto gastrointestinal (TGI). Esto se evidenció en ratas destetadas que después de sólo 4 días de ser alimentados con una dieta deficiente en riboflavina se registraron los primeros cambios morfológicos en el tracto gastrointestinal, con un aumento significativo en el tamaño y profundidad de las criptas y una menor incidencia de bifurcación (Yates y col., 2001). Una semana de agotamiento de riboflavina llevaron a la reducción de vellosidades por unidad de superficie de la mucosa en comparación con los controles bien nutridos, lo que sugiere una menor superficie de absorción. Luego de un agotamiento prolongado (5 semanas) se observó una hipertrofia en las vellosidades intestinales (Williams y col., 1995). Resultados similares fueron obtenidos en este trabajo de Tesis doctoral donde observamos que hubo una atrofia significativa de las vellocidaddes intestinales en los ratones deficientes en riboflavina y folatos (grupos: GD, G1, G2) en relación a los animales de los grupos G3 y G4, cuyas vellosidades evidenciaron una tendencia a la normalización del tamaño de las mismas comparables al grupo control. En los modelos de deficiencia, la medición del EGRAC constituye una prueba que permite determinar el estado de suficiencia en vitamina B2. Así, valores de EGRAC superiores o iguales a 1,3 indican deficiencia de riboflavina. Los resultados de nuestros estudios mostraron que la administración de la masa de quínoa bio-enriquecida en vitaminas a los animales del grupo G4 conjuntamente con una dieta deficiente, fue capaz de prevenir la deficiencia de las vitaminas, este hecho fue evidenciado por valores de EGRAC menores a 1.3, similares a aquellos animales que recibieron pasta de quínoa, suplementada con riboflavina sintética (5,1µg/g masa) y con ácido fólico comercial (1,6 µg/g masa) (G3). Estos resultados sugieren que la riboflavina producida por las BL posee una biodisponibilidad similar a la riboflavina sintética. Similares resultados fueron

~ 158 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

obtenidos por del Valle y col., 2016 que demostraron que la riboflavina producida por BL tiene la misma biodisponibilidad que la vitamina sintética en un modelo de deficiencia usando ratones, donde los animales alimentados con la leche de soja fermentada con BL productora de B2 presentaron valores de EGRAC menores a 1,3 al igual que los animales alimentados con la leche de soja a la que se le agregó B2 sintética. Mientras que los animales alimentados con la leche de soja fermentada con la BL no productora de B2 y los animales del grupo deficiente evidenciaron valores de EGRAC ≥ 1,3. Esto concuerda con nuestros resultados, donde, el producto fermentado por E. gallinarum CRL 1989 (cepa no productora de riboflavina y folatos) no fue capaz de reducir los valores de EGRAC en los animales alimentados con esta pasta (G2), siendo los valores de EGRAC (superior a 1,3) similares al grupo deficiente (GD).

Una deficiencia clínica de folato conlleva a una anemia megaloblástica, la cual es reversible con un tratamiento con ácido fólico. Esta patología ocurre por una falla en la síntesis del ADN como consecuencia de insuficiente cantidad de folato plasmático. Esta falta de síntesis de ADN lleva a una menor producción de hemoglobina y alteración de la maduración celular durante la eritropoyesis con glóbulos rojos (GR) de gran tamaño (megalocitos) y disminución de la concentración de hemoglobina. También, incremento en el volumen corpuscular medio (VCM) y en la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), hipersegmentación de los neutrófilos, entre otras alteraciones hematológicas. Asimismo, se produce disminución de la concentración de folatos en plasma y glóbulos rojos (Mattson y col., 2003). En nuestro trabajo observamos que en los animales alimentados con la pasta bio-fortificada (G4) se observó un incremento en el valor de la hemoglobina, hematocrito, hemoglobina corpuscular media y menor valor de concentración de hemoglobina corpuscular media al comprar dichos parámetros con el grupo deficiente, quienes además mostraron al observar los frotis de sangre entera una hipocromía en los GR, un mayor tamaño al igual que en los globulos blanco

~ 159 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

(GB) los cuales, además presentaron neutrófilos más segmentados al compararlo con el grupo control (GC) y el grupo que recibió la pasta bio- enriquecida (G4). Un comportamiento similar fue observado por Leblanc y col. (2010), quienes evaluaron la biodisponiblidad de diferentes folatos producidos por una cepa de Lactococcus lactis modificada genéticamente mediante un modelo de depleción-repleción usando ratas. Observaron en frotis de sangre que, después del período de depleción, los glóbulos rojos eran ligeramente hipocrómicos y algunos granulocitos presentaban neutrófilos multisegmentados. Además, se evidenció que, en los animales deficientes, el número de eritrocitos (glóbulos rojos) y glóbulos blancos fue más bajo, al igual que las concentraciones de hemoglobina y hematocrito, mientras que el volumen corpuscular medio y los niveles medios de hemoglobina corpuscular fueron mayores en comparación con los observados en el grupo sin depleción (grupo control).

Con respecto a los valores de folatos observamos que, los animales pertenecientes al GD tuvieron valores más bajos de folatos tanto en sangre entera como en plasma y también en todos los órganos evaluados (bazo, riñón e hígado) al compararlos con el control (GC). Mientras que los animales pertenecientes al grupo G4 presentaron una concentración de folatos igual o mayor que los animales del GC y que el grupo que recibió la pasta a la cual se le agregó el ácido fólico (G3). Estos resultados ponen en evidencia que los folatos producidos por el cultivo mixto seleccionado (C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) poseen una biodisponibilidad similar al ácido fólico. Estos resultados concuerdan con los publicados por otros autores (LeBlanc y col., 2010a Laiño y col., 2015).

~ 160 ~

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

4.4. Conclusiones parciales

 Se puso a punto un modelo animal de prevención de deficiencia en riboflavina y folatos, usando ratones BALB/c que permitió evaluar la biodiponibilidad de B2 y B9 producidas por una combinación de BL (C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) en un alimento fermentado a base de harina de quínoa (ñoquis de quínoa).

 La pasta de quínoa bio-enriquecida en B2 y B9 administrada junto a una dieta deficiente en estas vitaminas, fue capaz de prevenir la deficiencia nutricional de B2 y B9 puesto en evidencia por la presencia de valores normales de folatos en sangre entera, plasma y órganos y por valores de EGRAC menores a 1,3.

 La pasta de quínoa fermentada con BL bio-enriquecida en B2 y B9 puede ser considerada como una estrategia efectiva, útil y viable a la fortificación con vitaminas sintéticas.

~ 161 ~

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES

Conclusiones Generales de este Trabajo de Tesis:

Aislamiento e identificación de BL

Quínoa Amaranto

Masa ácida (26) Granos (18) Masa ácida (15) Granos (14)

L. plantarum (7) E. mundtii (2) L. plantarum (8) E. mundtii (3) E. casseliflavus (1) E. hermanniensis (3) L. rhamnosus (5) L. rhamnosus (6) L. sakei (1) E. hirae (1) E. mundtii (1) E. durans (1) P. pentosaceus (9) E. gallinarum (12) Enterococcus sp. (1) E. casseliflavus (1) Enterococcus sp. (1) Lc. mesenteroides (6) E. mundtii (1) Lc. mesenteroides (1) E. hermanniensis (2)

Propiedades evaluadas in vitro

Amilolítica Acidificación CPS Filancia

20 cepas 11 cepas evidenciaron 39 cepas 29 cepas rápida acidificación (˂ 5 a 8h) Vitaminas Fitasa

E. casseliflavus CRL 1988 (684 ± 38 U/mL) L. rhamnosus CRL 1983 (606 ± 79 U/mL) L. rhamnosus CRL 1963 (584 ± 48 U/mL) B 9 B2 E. mundtti CRL 2007 (957 ± 25 U/mL) L. plantarum CRL 1973 L. plantarum CRL 1963 E. mundtti CRL 2012 (617 ± 38 U/mL) (143 ± 6 ng/mL) (360 ± 10 ng/mL) L. plantarum CRL 2079 (699 ± 47 U/mL) Lc. mesenteroides subsp. Lc. mesenteroides subsp. L. plantarum CRL 2080 (636 ± 48 (U/mL) mesenteroides CRL 2131 mesenteroides CRL 2131 L. plantarum CRL 2105 (648 ± 9 U/mL) (142 ± 2 ng/mL) (268 ± 24 ng/mL) L. plantarum CRL 2106 (730 ± 25 U/mL) E. durans CRL 2122 (1041 ± 48 U/mL) E. mundtti CRL 2135 (685 ± 8 U/mL)

~ 164 ~

CONCLUSIONES

Selección de cepas

En base a las propiedades evaluadas se seleccionaron las siguientes cepas de BL:

 11 cepas de BL aisladas de quínoa (L. rhamnosus CRL 1963, CRL 1983, CRL 1972 y CRL 1984, L. sakei CRL 1978, L. plantarum CRL 1970, CRL 1967, CRL 1966, CRL 1973, CRL 1964 y CRL 1968) y

 7 aisladas de amaranto (L. plantarum CRL 2106, CRL 2107, CRL 2108, CRL 2079, CRL 2080 y CRL 2092 y Leuc. mesenteroides CRL 2131). Pruebas in situ

De estas 18 cepas de BL, se seleccionaron 6 con las cuales se realizaron 4 cultivos

mixtos (C.M) para realizar estudios in situ (producción de B2 y B9 y contenido de fitato residual) en masas realizadas con harina de quínoa.

 C.M.1: Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides CRL 2131 + L. plantarum CRL 1964;

 C.M.2: L. rhamnosus CRL 1963 + L. rhamnosus CRL 1984;  C.M.3: L. rhamnosus CRL 1983 + L. rhamnosus CRL 1984;  C.M.4: L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964;

En base a los resultados obtenidos se seleccionó el C.M.4 (L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964) por ser la masa fermentada en la que se obtuvo alta concentración de riboflavina (5,1 ± 0,4 µg/g masa) y folatos (1,6 ± 0,2 µg/g masa) y menor concentración de fitato residual (17,4 ± 1,3 mg/g masa).

Pruebas in vivo

Los estudios revelaron que los animales alimentados con la pasta fermentada con el cultivo mixto 4 (G4) tuvieron:

 Mayor peso  Mayor concentración de folatos en sangre y órganos  Mayor concentración de minerales en sangre  Valores de EGRAC ˂ a 1,3

La pasta de quínoa bio-enriquecida en B2 y B9 administrada junto a una dieta deficiente en estas vitaminas, fue capaz de prevenir la deficiencia

nutricional de B2 y B9.

De esta manera, se concluye que este trabajo de Tesis evidencia nuevas perspectivas de aplicación de BL autóctonas y su aplicación en el diseño de alimentos funcionales derivados de granos andinos, bio-enriquecidos en vitaminas y minerales.

~ 165 ~

PROYECCIONES

PROYECCIONES

De los resultados obtenidos en este trabajo de tesis doctoral, surgen las siguientes proyecciones:

 Evaluar las características organolépticas y reológicas del producto bio- fortificado y realizar el análisis sensorial del mismo.

 Evaluar la funcionalidad del alimento luego de ser sometido a procesos

de cocción.

 Diseñar nuevos alimentos utilizando las cepas L. plantarum CRL 2107 + L. plantarum CRL 1964 con importantes características puestas en evidencia

en este Trabajo de Tesis.

 Profundizar estudios de la actividad fitasa, puesta en evidencia en este Trabajo, durante la fermentación de la masa de seudocereales a fin de optimizar parámetros de fermentación: pH, tiempo y temperatura de incubación, cofactores, a fin de lograr mayor degradación del fitato.

~ 168 ~

BIBLIOGRAFÍA

BIBLIOGRAFÍA

Adelekan, D. A., & Thurnham, D. I. (1986). The influence of riboflavin deficiency on absorption and liver storage of iron in the growing rat. British journal of nutrition, 56(1), 171-179.

Aiso, K., & Tamura, T. (1998). Trienzyme treatment for food folate analysis: Optimal pH and incubation time for α-amylase and protease treatments. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 44(3), 361-370.

Aleixandre, A., & Miguel, M. (2008). Dietary fiber in the prevention and treatment of metabolic syndrome: a review. Critical reviews in food science and nutrition, 48(10), 905-912.

Alfonzo, A., Ventimiglia, G., Corona, O., Di Gerlando, R., Gaglio, R., Francesca, N., ... & Settanni, L. (2013). Diversity and technological potential of lactic acid bacteria of wheat flours. Food microbiology, 36(2), 343-354.

Allen, L. H., De Benoist, B., Dary, O., Hurrell, R., & World Health Organization. (2006). Guidelines on food fortification with micronutrients.

Alvarez-Jubete, L., Arendt, E. K., & Gallagher, E. (2009). Nutritive value and chemical composition of pseudocereals as gluten-free ingredients. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 60(sup4), 240-257.

Alvarez-Jubete, L., Arendt, E. K., & Gallagher, E. (2010). Nutritive value of pseudocereals and their increasing use as functional gluten-free ingredients. Trends in Food Science & Technology, 21(2), 106-113.

Anastasio, M., Pepe, O., Cirillo, T., Palomba, S., Blaiotta, G., & Villani, F. (2010). Selection and use of phytate‐degrading LAB to improve cereal‐based products by mineral solubilization during dough fermentation. Journal of food science, 75(1), 28-35.

Andlid, T. A., Veide, J., & Sandberg, A. S. (2004). Metabolism of extracellular inositol hexaphosphate (phytate) by Saccharomyces cerevisiae. International journal of food microbiology, 97(2), 157-169.

Andreassi, J. L., & Moran, R. G. (2002). Mouse folylpoly-γ-glutamate synthetase isoforms respond differently to feedback inhibition by folylpolyglutamate cofactors. Biochemistry, 41(1), 226-235.

Angelino, D., Cossu, M., Marti, A., Zanoletti, M., Chiavaroli, L., Brighenti, F., ... & Martini, D. (2017). Bioaccessibility and bioavailability of phenolic compounds in bread: a review. Food & function, 8(7), 2368-2393.

~ 172 ~

BIBLIOGRAFÍA

ANMAT, 2002. Ley 25.630 prevención de anemias y malformaciones del tubo neural, http://www.anmat.gov.ar/Legislacion/Alimentos/Ley_25630.pdf.

Arendt, E. K., Moroni, A., & Zannini, E. (2011). Medical nutrition therapy: use of sourdough lactic acid bacteria as a cell factory for delivering functional biomolecules and food ingredients in gluten free bread. Microbial cell factories, 10(1), S15.

Axelsson L. (2004). Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. En: Lactic Acid Bacteria. Microbiological and Functional Aspects Third Edition, Revised and Expanded. Eds. Slaminen, S.; von Wright, A. y Ouwehand, A. Marcel Dekker, Inc. New York, Estados Unidos. Cap. 1, pp. 12.

Azizi-Namini, P., Ahmed, M., Yan, A. T., & Keith, M. (2012). The role of B vitamins in the management of heart failure. Nutrition in Clinical Practice, 27(3), 363-374.

Bailey, L. B., Rampersaud, G. C., & Kauwell, G. P. (2003). Folic acid supplements and fortification affect the risk for neural tube defects, vascular disease and cancer: evolving science. The Journal of Nutrition, 133(6), 1961S-1968S.

Bailey, S. W., & Ayling, J. E. (2009). The extremely slow and variable activity of dihydrofolate reductase in human liver and its implications for high folic acid intake. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(36), 15424-15429.

Banka, S., Blom, H. J., Walter, J., Aziz, M., Urquhart, J., Clouthier, C. M., & Will, A. (2011). Identification and characterization of an inborn error of metabolism caused by dihydrofolate reductase deficiency. The American Journal of Human Genetics, 88(2), 216-225.

Barber, S., Torner, M. J., Martínez-Anaya, M. A., & de Barber, C. B. (1989). Microflora of the sour dough of wheat flour bread IX. Biochemical characteristics and baking performance of wheat doughs elaborated with mixtures of pure microorganismsBiochemische Merkmale und Leistungsfahigkeit der mit Mischungen reiner Mikroorganismen hergestellten Weizenbackteige. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung, 189(1), 6-11.

Barber, S., Báguena, R., de Barber, C. B., & Martínez-Anaya, M. A. (1991). Evolution of biochemical and rheological characteristics and breadmaking quality during a multistage wheat sour dough processEntwicklung biochemischer und rheologischer Eigenschaften und des Backverhaltens während einer mehrstufigen Weizensauerteigführung. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung, 192(1), 46-52.

~ 173 ~

BIBLIOGRAFÍA

Basset, G. J., Quinlivan, E. P., Gregory, J. F., & Hanson, A. D. (2005). Folate synthesis and metabolism in plants and prospects for biofortification. Crop Science, 45(2), 449-453.

Belton, P. S., & Taylor, J. R. (Eds.). (2002). Pseudocereals and less common cereals: grain properties and utilization potential. Springer Science & Business Media. 93-122.

BeMiller, J., Whistler, R., 1996. Carbohydrates. In: Fennema (Ed.), Food Chemistry, third ed. Marcel Dekker, New York, pp. 157–223.

Bessmeltseva, M., Viiard, E., Simm, J., Paalme, T., & Sarand, I. (2014). Evolution of bacterial consortia in spontaneously started rye sourdoughs during two months of daily propagation. PloS one, 9(4), e95449.

Bhargava, A., Shukla, S., & Ohri, D. (2006). Chenopodium quinoa—an Indian perspective. Industrial crops and products, 23(1), 73-87.

Blakley, R. L., & Benkovic, S. J. (1984). Folates and pterins. Wiley. Volume 1, Chemistry and Biochemistry of Folates. John Wiley & Sons, Inc., New York.

BLANCO, A. (2006). Química Biológica; Editorial El Ateneo, 8 va., 231-236.

BOWMAN, B. A., & RUSSELL, R. M. (2004). Conocimientos actuales sobre nutrición. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 46, 72-72.

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72(1-2), 248-254.

Brosnan, B., Coffey, A., Arendt, E. K., & Furey, A. (2012). Rapid identification, by use of the LTQ Orbitrap hybrid FT mass spectrometer, of antifungal compounds produced by lactic acid bacteria. Analytical and bioanalytical chemistry, 403(10), 2983-2995.

Burgess, C. M., Smid, E. J., & van Sinderen, D. (2009). Bacterial vitamin B2, B11 and B12 overproduction: an overview. International journal of food microbiology, 133(1-2), 1-7.

Capozzi, V., Menga, V., Digesu, A. M., De Vita, P., van Sinderen, D., Cattivelli, L., ... & Spano, G. (2011). Biotechnological production of vitamin B2-enriched bread and pasta. Journal of agricultural and food chemistry, 59(14), 8013-8020.

Carr, F. J., Chill, D., & Maida, N. (2002). The lactic acid bacteria: a literature survey. Critical reviews in microbiology, 28(4), 281-370. ~ 174 ~

BIBLIOGRAFÍA

Caselato‐Sousa, V. M., & Amaya‐Farfán, J. (2012). State of knowledge on amaranth grain: a comprehensive review. Journal of Food Science, 77(4).

Chauhan, G. S., Eskin, N. A. M., & Tkachuk, R. (1992). Nutrients and antinutrients in quinoa seed. Cereal Chem, 69(1), 85-88.

Cheryan, M., & Rackis, J. J. (1980). Phytic acid interactions in food systems. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 13(4), 297-335.

Chillo, S., Laverse, J., Falcone, P. M., & Del Nobile, M. A. (2007). Effect of carboxymethylcellulose and pregelatinized corn starch on the quality of amaranthus spaghetti. Journal of Food Engineering, 83(4), 492-500.

Chillo, S., Laverse, J., Falcone, P. M., Protopapa, A., & Del Nobile, M. A. (2008). Influence of the addition of buckwheat flour and durum wheat bran on spaghetti quality. Journal of Cereal Science, 47(2), 144-152.

Chillo, S., Suriano, N., Lamacchia, C., & Del Nobile, M. A. (2009). Effects of additives on the rheological and mechanical properties of non-conventional fresh handmade tagliatelle. Journal of cereal science, 49(2), 163-170.

Chillo, S., Civica, V., Iannetti, M., Mastromatteo, M., Suriano, N., & Del Nobile, M. A. (2010). Influence of repeated extrusions on some properties of non- conventional spaghetti. Journal of food engineering, 100(2), 329-335.

Cizeikiene, D., Juodeikiene, G., Bartkiene, E., Damasius, J., & Paskevicius, A. (2015). Phytase activity of lactic acid bacteria and their impact on the solubility of minerals from wholemeal wheat bread. International journal of food sciences and nutrition, 66(7), 736-742.

Coda, R., Nionelli, L., Rizzello, C. G., De Angelis, M., Tossut, P., & Gobbetti, M. (2010). Spelt and emmer flours: characterization of the lactic acid bacteria microbiota and selection of mixed starters for bread making. Journal of applied microbiology, 108(3), 925-935.

Coda, R., Di Cagno, R., Rizzello, C. G., Nionelli, L., Edema, M. O., & Gobbetti, M. (2011a). Utilization of African grains for sourdough bread making. Journal of food science, 76(6), 329-335.

Coda, R., Cassone, A., Rizzello, C. G., Nionelli, L., Cardinali, G., & Gobbetti, M. (2011b). Antifungal activity of Wickerhamomyces anomalus and Lactobacillus plantarum during sourdough fermentation: identification of novel compounds and long-term effect during storage of wheat bread. Applied and environmental microbiology, 77(10), 3484-3492.

~ 175 ~

BIBLIOGRAFÍA

Coda, R., Rizzello, C. G., Trani, A., & Gobbetti, M. (2011c). Manufacture and characterization of functional emmer beverages fermented by selected lactic acid bacteria. Food microbiology, 28(3), 526-536.

Coda, R., Rizzello, C. G., Pinto, D., & Gobbetti, M. (2012). Selected lactic acid bacteria synthesize antioxidant peptides during sourdough fermentation of cereal flours. Applied and Environmental Microbiology, 78(4), 1087-1096.

Coda, R., Di Cagno, R., Gobbetti, M., & Rizzello, C. G. (2014). Sourdough lactic acid bacteria: exploration of non-wheat cereal-based fermentation. Food microbiology, 37, 51-58.

Corbo, M. R., Racioppo, A., Monacis, N., & Speranza, B. (2017). Commercial starters or autochtonous strains? That is the question. Starter Cultures in Food Production, 174-198.

Correa, A., & Oviedo, A. (2017). Estudio de un método para determinar fósforo en leguminosas mediante espectroscopía ultravioleta visible. InfoANALÍTICA, (5), 53-66.

Corsetti, A., Gobbetti, M., & Smacchi, E. (1996). Antibacterial activity of sourdough lactic acid bacteria: isolation of a bacteriocin-like inhibitory substance from Lactobacillus sanfranciscoC57. Food microbiology, 13(6), 447- 456.

Corsetti, A., Gobbetti, M., Rossi, J., & Damiani, P. (1998). Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfranciscensis CB1. Applied Microbiology and Biotechnology, 50(2), 253-256.

Corsetti, A., & Settanni, L. (2007). Lactobacilli in sourdough fermentation. Food Research International, 40(5), 539-558.

Crowley, S., Mahony, J., & van Sinderen, D. (2013). Broad-spectrum antifungal- producing lactic acid bacteria and their application in fruit models. Folia microbiologica, 58(4), 291-299.

Curiel, J. A., Coda, R., Limitone, A., Katina, K., Raulio, M., Giuliani, G., ... & Gobbetti, M. (2014). Manufacture and characterization of pasta made with wheat flour rendered gluten-free using fungal proteases and selected sourdough lactic acid bacteria. Journal of Cereal Science, 59(1), 79-87.

Dacie, J., Lewis, S., 2008. Dacie y Lewis. Hematología Práctica, 10a ed. Elsevier España.

~ 176 ~

BIBLIOGRAFÍA

De Angelis, M., Gallo, G., Corbo, M. R., McSweeney, P. L., Faccia, M., Giovine, M., & Gobbetti, M. (2003). Phytase activity in sourdough lactic acid bacteria: purification and characterization of a phytase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1. International journal of food microbiology, 87(3), 259-270.

De Angelis, M., Cassone, A., Rizzello, C. G., Gagliardi, F., Minervini, F., Calasso, M., & Gobbetti, M. (2010). Mechanism of degradation of immunogenic gluten epitopes from Triticum turgidum L. var. durum by sourdough lactobacilli and fungal proteases. Applied and environmental microbiology, 76(2), 508-518.

De Man, J. C., Rogosa, D., & Sharpe, M. E. (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. Journal of Applied Microbiology, 23(1), 130-135.

De Simone, F., Dini, A., Pizza, C., Saturnino, P., & Schettino, O. (1990). Two flavonol glycosides from Chenopodium quinoa. Phytochemistry, 29(11), 3690- 3692.

De Vuyst, L., & Neysens, P. (2005). The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions. Trends in Food Science & Technology, 16(1), 43-56.

De Vuyst, L., Van Kerrebroeck, S., Harth, H., Huys, G., Daniel, H. M., & Weckx, S. (2014). Microbial ecology of sourdough fermentations: diverse or uniform? Food microbiology, 37, 11-29.

De Vuyst, L., Vrancken, G., Ravyts, F., Rimaux, T., & Weckx, S. (2009). Biodiversity, ecological determinants, and metabolic exploitation of sourdough microbiota. Food Microbiology, 26(7), 666-675. del Valle, M. J., Laiño, J. E., de Giori, G. S., & LeBlanc, J. G. (2014). Riboflavin producing lactic acid bacteria as a biotechnological strategy to obtain bio- enriched soymilk. Food research international, 62, 1015-1019.

Delavenne, E., Ismail, R., Pawtowski, A., Mounier, J., Barbier, G., & Le Blay, G. (2013). Assessment of lactobacilli strains as yogurt bioprotective cultures. Food Control, 30(1), 206-213.

Delgado, M. C. O., Galleano, M., Añón, M. C., & Tironi, V. A. (2015). Amaranth peptides from simulated gastrointestinal digestion: antioxidant activity against reactive species. Plant foods for human nutrition, 70(1), 27-34.

Deshpande, S. S., & CHERYAN, M. (1984). Effects of Phytic Acid, Divalent Cations, and Their Interactions on α‐Amylase Activity. Journal of food science, 49(2), 516-519.

~ 177 ~

BIBLIOGRAFÍA

DeVries, J. W., Rader, J. I., Keagy, P. M., & Hudson, C. A. (2005). Microbiological assay-trienzyme procedure for total folates in cereals and cereal foods: collaborative study. Journal of AOAC International, 88(1), 5-15.

Di Cagno, R., De Angelis, M., Alfonsi, G., de Vincenzi, M., Silano, M., Vincentini, O., & Gobbetti, M. (2005). Pasta made from durum wheat semolina fermented with selected lactobacilli as a tool for a potential decrease of the gluten intolerance. Journal of agricultural and food chemistry, 53(11), 4393-4402.

Di Cagno, R., Pontonio, E., Buchin, S., De Angelis, M., Lattanzi, A., Valerio, F., & Calasso, M. (2014). Diversity of the lactic acid bacteria and yeast microbiota switching from firm to liquid sourdough fermentation. Applied and environmental microbiology, AEM-00309.

Di Cagno, R.; Filannino, P. and Gobbetti, M. (2016). Vegetable and fruit fermentation by BAL. En: Biotechnoloy of Lactic Acid Bacteria, second edithion. Eds: Mozzi, F.; Raya, R.R. and Vignolo, G., Wiley Blackwell, 216-229.

Di Sabatino, A., & Corazza, G. R. (2009). Coeliac disease. The Lancet, 373(9673), 1480-1493.

Dini, I., Tenore, G. C., & Dini, A. (2004). Phenolic constituents of Kancolla seeds. Food chemistry, 84(2), 163-168.

Dini, I., Tenore, G. C., & Dini, A. (2005). Nutritional and antinutritional composition of Kancolla seeds: an interesting and underexploited andine food plant. Food Chemistry, 92(1), 125-132.

Dini, I., Tenore, G. C., & Dini, A. (2010). Antioxidant compound contents and antioxidant activity before and after cooking in sweet and bitter Chenopodium quinoa seeds. LWT-Food Science and Technology, 43(3), 447-451.

Dini, C., García, M. A., & Vina, S. Z. (2012). Non-traditional flours: frontiers between ancestral heritage and innovation. Food & function, 3(6), 606-620.

Ekinci, R., & Kadakal, C. (2005). Determination of seven water-soluble vitamins in tarhana, a traditional Turkish cereal food, by high-performance liquid chromatography. ACTA chromatographica, 15, 289.

Ercolini, D., Pontonio, E., De Filippis, F., Minervini, F., La Storia, A., Gobbetti, M., & Di Cagno, R. (2013). Microbial ecology dynamics during rye and wheat sourdough preparation. Applied and environmental microbiology, 79(24), 7827- 7836.

~ 178 ~

BIBLIOGRAFÍA

Ewe, J. A., Wan-Abdullah, W. N., & Liong, M. T. (2010). Viability and growth characteristics of Lactobacillus in soymilk supplemented with B- vitamins. International journal of food sciences and nutrition, 61(1), 87-107.

Febles, C. I., Arias, A., Hardisson, A., Rodrıguez-Alvarez, C., & Sierra, A. (2002). Phytic acid level in wheat flours. Journal of Cereal Science, 36(1), 19-23.

Felis, G. E., Salvetti, S., & Torriani, S. (2015). Systematics of Lactic Acid Bacteria: Current Status. Biotechnology of Lactic Acid Bacteria: Novel Applications, 2nd Edition. Eds. Mozzi, F, 25-31.

Fischer, M., & Bacher, A. (2005). Biosynthesis of flavocoenzymes. Natural product reports, 22(3), 324-350.

Fontana, C., Cocconcelli, P. S., & Vignolo, G. (2005). Monitoring the bacterial population dynamics during fermentation of artisanal Argentinean sausages. International Journal of Food Microbiology, 103(2), 131-142.

Fontana, L., Bermudez-Brito, M., Plaza-Diaz, J., Munoz-Quezada, S., & Gil, A. (2013). Sources, isolation, characterisation and evaluation of probiotics. British journal of nutrition, 109(S2), S35-S50.

Food and Nutrition Board (1998) Riboflavin. Dietary Reference Intakes: Thiamin, Riboflavin, Niacin, Vitamin B6, Vitamin B12, Pantothenic Acid, Biotin, Folate and Choline. Washington DC, USA: National Academies Press, pp. 87–122.

Food and Nutrition Board (2000) Recommended dietary allowances. National Academy of Sciences. Washington, DC, USA.

Fox, B. A., & Cameron, A. G. (2004). Ciencia de los alimentos, Nutrición y Salud. Limusa. pp. 271-285.

Frontela, C., Haro, J. F., Ros, G., & Martínez, C. (2008). Effect of dephytinization and follow-on formula addition on in vitro iron, calcium, and zinc availability from infant cereals. Journal of agricultural and food chemistry, 56(10), 3805- 3811.

Frontela, C., Ros, G., & Martínez, C. (2009). Iron and calcium availability from digestion of infant cereals by Caco-2 cells. European Food Research and Technology, 228(5), 789-797.

Frye, R. E., Sequeira, J. M., Quadros, E. V., James, S. J., & Rossignol, D. A. (2013). Cerebral folate receptor autoantibodies in autism spectrum disorder. Molecular psychiatry, 18(3), 369-381.

~ 179 ~

BIBLIOGRAFÍA

Fuentes, F., & Bhargava, A. (2011). Morphological analysis of quinoa germplasm grown under lowland desert conditions. Journal of agronomy and crop science, 197(2), 124-134.

Fuller, R. (1989). Probiotics in man and animals. Journal of Applied Microbiology, 66(5), 365-378.

Gaggiano, M., Di Cagno, R., De Angelis, M., Arnault, P., Tossut, P., Fox, P. F., & Gobbetti, M. (2007). Defined multi-species semi-liquid ready-to-use sourdough starter. Food microbiology, 24(1), 15-24.

Gallagher, E., Gormley, T. R., & Arendt, E. K. (2003). Crust and crumb characteristics of gluten free breads. Journal of Food Engineering, 56(2), 153- 161.

Gänzle, M. G., & Follador, R. (2012). Metabolism of oligosaccharides and starch in lactobacilli: a review. Frontiers in microbiology, 3, 1-15.

Gänzle, M. G. (2014). Enzymatic and bacterial conversions during sourdough fermentation. Food microbiology, 37, 2-10.

Gänzle, M. G. (2015). Lactic metabolism revisited: metabolism of lactic acid bacteria in food fermentations and food spoilage. Current Opinion in Food Science, 2, 106-117.

Gänzle, M., & Ripari, V. (2016). Composition and function of sourdough microbiota: From ecological theory to bread quality. International journal of food microbiology, 239, 19-25.

Gao, Y., Shang, C., Maroof, M. S., Biyashev, R. M., Grabau, E. A., Kwanyuen, P., & Buss, G. R. (2007). A modified colorimetric method for phytic acid analysis in soybean. Crop science, 47(5), 1797.

García-Mantrana, I., Monedero, V., & Haros, M. (2014). Application of phytases from bifidobacteria in the development of cereal-based products with amaranth. European Food Research and Technology, 238(5), 853-862.

García-Mantrana, I., Yebra, M. J., Haros, M., & Monedero, V. (2016). Expression of bifidobacterial phytases in Lactobacillus casei and their application in a food model of whole-grain sourdough bread. International journal of food microbiology, 216, 18-24.

Gobbetti, M. (1998). Interactions between lactic acid bacteria and yeasts in sourdoughs. Trends Food Sci. Technol, 9, 267-274.

~ 180 ~

BIBLIOGRAFÍA

Gobbetti, M., De Angelis, M., Corsetti, A., & Di Cagno, R. (2005). Biochemistry and physiology of sourdough lactic acid bacteria. Trends in Food Science & Technology, 16(1), 57-69.

Gobbetti, M., Rizzello, C. G., Di Cagno, R., & De Angelis, M. (2014). How the sourdough may affect the functional features of leavened baked goods. Food microbiology, 37, 30-40.

Gobbetti, M., Minervini, F., Pontonio, E., Di Cagno, R., & De Angelis, M. (2016). Drivers for the establishment and composition of the sourdough lactic acid bacteria biota. International journal of food microbiology, 239, 3-18.

Goh, Y. I., & Koren, G. (2008). Folic acid in pregnancy and fetal outcomes. Journal of Obstetrics and Gynaecology, 28(1), 3-13.

Golbach, J. L., Chalova, V. I., Woodward, C. L., & Ricke, S. C. (2007). Adaptation of Lactobacillus rhamnosus riboflavin assay to microtiter plates. Journal of food composition and analysis, 20(7), 568-574.

Grapp, M., Just, I. A., Linnankivi, T., Wolf, P., Lücke, T., Häusler, M., & Steinfeld, R. (2012). Molecular characterization of folate receptor 1 mutations delineates cerebral folate transport deficiency. Brain, 135(7), 2022-2031.

Greiner, R., Konietzny, U., & Jany, K. D. (1998). Purification and properties of a phytase from rye. Journal of Food Biochemistry, 22(2), 143-161.

Greiner, R., & Konietzny, U. (2006). Phytase for food application. Food Technology & Biotechnology, 44(2).

Guerra-Matias, A. C., & Arêas, J. A. (2005). Glycemic and insulinemic responses in women consuming extruded amaranth (Amaranthus cruentus L). Nutrition research, 25(9), 815-822.

Halsted, C. H., Villanueva, J. A., Devlin, A. M., & Chandler, C. J. (2002). Metabolic interactions of alcohol and folate. The Journal of nutrition, 132(8), 2367S-2372S.

Hanson, A. D., & Roje, S. (2001). One-carbon metabolism in higher plants. Annual review of plant biology, 52(1), 119-137.

Haros, M., Rosell, C. M., & Benedito, C. (2001a). Use of fungal phytase to improve breadmaking performance of whole wheat bread. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(11), 5450-5454.

~ 181 ~

BIBLIOGRAFÍA

Haros, M., Rosell, C. M., & Benedito, C. (2001b). Fungal phytase as a potential breadmaking additive. European Food Research and Technology, 213(4), 317- 322.

Haros, M., Bielecka, M., Honke, J., & Sanz, Y. (2007). Myo-inositol hexakisphosphate degradation by Bifidobacterium infantis ATCC 15697. International journal of food microbiology, 117(1), 76-84.

Haros, M., Carlsson, N. G., Almgren, A., Larsson-Alminger, M., Sandberg, A. S., & Andlid, T. (2009). Phytate degradation by human gut isolated Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC27919 and its probiotic potential. International journal of food microbiology, 135(1), 7-14.

Harrison, R. (2002). Structure and function of xanthine oxidoreductase: where are we now? Free Radical Biology and Medicine, 33(6), 774-797.

Harth, H., Van Kerrebroeck, S., & De Vuyst, L. (2016). Community dynamics and metabolite target analysis of spontaneous, backslopped barley sourdough fermentations under laboratory and bakery conditions. International journal of food microbiology, 228, 22-32.

Hébert, E. M., Raya, R. R., Tailliez, P., & de Giori, G. S. (2000). Characterization of natural isolates of Lactobacillus strains to be used as starter cultures in dairy fermentation. International journal of food microbiology, 59(1), 19-27.

Herbert V (1996). Vitamin B-12. In: Ziegler EE, Filer LJ, eds. Present Knowledge in Nutrition. 7th ed. Washington D.C.: ILSI Press, 191-205.

Hille, R. (2005). Molybdenum-containing hydroxylases. Archives of biochemistry and biophysics, 433(1), 107-116.

Hirose, Y., Fujita, T., Ishii, T., & Ueno, N. (2010). Antioxidative properties and flavonoid composition of Chenopodium quinoa seeds cultivated in Japan. Food Chemistry, 119(4), 1300-1306.

Hoey, L., McNulty, H., & Strain, J. J. (2009). Studies of biomarker responses to intervention with riboflavin: a systematic review. The American journal of clinical nutrition, ajcn-27230B.

Holst, B., & Williamson, G. (2008). Nutrients and phytochemicals: from bioavailability to bioefficacy beyond antioxidants. Current opinion in biotechnology, 19(2), 73-82.

~ 182 ~

BIBLIOGRAFÍA

Horne, D. W., & Patterson, D. (1988). Lactobacillus casei microbiological assay of folic acid derivatives in 96-well microtiter plates. Clinical chemistry, 34(11), 2357-2359.

Huang, J. C., Knight, S., & Goad, C. (2001). Model prediction for sensory attributes of nongluten pasta. Journal of Food Quality, 24(6), 495-511.

Hugenholtz, J. (2008). The lactic acid bacterium as a cell factory for food ingredient production. International Dairy Journal, 18(5), 466-475.

ICSH, 1977. Recommendation of measurement of erythrocyte sedimentation rate of human blood (International Committee for Standardization in Hematology) Am J Clin Pathol 68(4): 505-507.

Iglesias-Puig, E., Monedero, V., & Haros, M. (2015). Bread with whole quinoa flour and bifidobacterial phytases increases dietary mineral intake and bioavailability. LWT-Food Science and Technology, 60(1), 71-77

Inagawa, J., Kiyosawa, I., & Nagasawa, T. (1987). Effects of phytic acid on the digestion of casein and soybean protein with trypsin, pancreatin or pepsin. Journal of Japanese Society of Nutrition and Food Science (Japan).

Jacobsen, S. E., Mujica, A., & Jensen, C. R. (2003). The resistance of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) to adverse abiotic factors. Food Reviews International, 19(1-2), 99-109.

James, L. E. A. (2009). Quinoa (Chenopodium quinoa Willd.): composition, chemistry, nutritional, and functional properties. Advances in food and nutrition research, 58, 1-31.

Jancurová, M., Minarovicová, L., & Dandar, A. (2009). Quinoa-a review. Czech Journal of Food Sciences, 27(2), 71-79.

Kariluoto, S., Aittamaa, M., Korhola, M., Salovaara, H., Vahteristo, L., & Piironen, V. (2006). Effects of yeasts and bacteria on the levels of folates in rye sourdoughs. International journal of food microbiology, 106(2), 137-143.

Kariluoto, S., Edelmann, M., Nyström, L., Sontag-Strohm, T., Salovaara, H., Kivelä, R., & Piironen, V. (2014). In situ enrichment of folate by microorganisms in beta-glucan rich oat and barley matrices. International journal of food microbiology, 176, 38-48.

Katina, K., Arendt, E., Liukkonen, K. H., Autio, K., Flander, L., & Poutanen, K. (2005). Potential of sourdough for healthier cereal products. Trends in Food Science & Technology, 16(1), 104-112. ~ 183 ~

BIBLIOGRAFÍA

Katina, K., Laitila, A., Juvonen, R., Liukkonen, K. H., Kariluoto, S., Piironen, V., ... & Poutanen, K. (2007). Bran fermentation as a means to enhance technological properties and bioactivity of rye. Food Microbiology, 24(2), 175-186.

Kim, Y. I. (1999). Folate and carcinogenesis: evidence, mechanisms, and implications. The Journal of nutritional biochemistry, 10(2), 66-88.

Knuckles, B. E., & Betschart, A. A. (1987). Effect of phytate and other myo‐ inositol phosphate esters on α‐amylase digestion of starch. Journal of Food Science, 52(3), 719-721.

Knuckles, B. E. (1988). Effect of Phytate and Other Myo‐Inositol Phosphate Esters on Lipase Activity. Journal of Food Science, 53(1), 250-252.

Komlenić, D. K., Slačanac, V., & Jukić, M. (2012). Influence of acidification on dough rheological properties. In Rheology. InTech.

Konietzny, U., & Greiner, R. (2003). PHYTIC ACID: nutritional impact. Encyclopeaia of food science and nutrition. Elsevier, London, 4555-4563.

Kumar, V., Sinha, A. K., Makkar, H. P., & Becker, K. (2010). Dietary roles of phytate and phytase in human nutrition: A review. Food Chemistry, 120(4), 945- 959.

Laiño, J. E., LeBlanc, J. G., & Savoy de Giori, G. (2012). Production of natural folates by lactic acid bacteria starter cultures isolated from artisanal Argentinean yogurts. Canadian journal of microbiology, 58(5), 581-588.

Laiño, J. E., del Valle, M. J., de Giori, G. S., & LeBlanc, J. G. J. (2013). Development of a high folate concentration yogurt naturally bio-enriched using selected lactic acid bacteria. LWT-Food Science and Technology, 54(1), 1-5.

Laiño, J. E., del Valle, M. J., de Giori, G. S., & LeBlanc, J. G. J. (2014). Applicability of a Lactobacillus amylovorus strain as co-culture for natural folate bio- enrichment of fermented milk. International journal of food microbiology, 191, 10-16.

Laiño, J. E., Zelaya, H., del Valle, M. J., de Giori, G. S., & LeBlanc, J. G. (2015). Milk fermented with selected strains of lactic acid bacteria is able to improve folate status of deficient rodents and also prevent folate deficiency. Journal of Functional Foods, 17, 22-32.

Lamothe, L. M., Srichuwong, S., Reuhs, B. L., & Hamaker, B. R. (2015). Quinoa (Chenopodium quinoa W.) and amaranth (Amaranthus caudatus L.) provide

~ 184 ~

BIBLIOGRAFÍA

dietary fibres high in pectic substances and xyloglucans. Food chemistry, 167, 490-496.

LeBlanc, J. G., Burgess, C., Sesma, F., de Giori, G. S., & van Sinderen, D. (2005). Lactococcus lactis is capable of improving the riboflavin status in deficient rats. British journal of nutrition, 94(2), 262-267.

LeBlanc, J. G., Taranto, M. P., Molina, V., & Sesma, F. (2010). B-group vitamins production by probiotic lactic acid bacteria. Biotechnology of lactic acid bacteria: Novel applications, 211-232.

LeBlanc, J. G., Sybesma, W., Starrenburg, M., Sesma, F., De Vos, W. M., De Giori, G. S., & Hugenholtz, J. (2010a). Supplementation with engineered Lactococcus lactis improves the folate status in deficient rats. Nutrition, 26(7), 835-841.

LeBlanc, J. G., Laiño, J. E., del Valle, M. J., Vannini, V., Van Sinderen, D., Taranto, M. P., ... & Sesma, F. (2011). B‐Group vitamin production by lactic acid bacteria– current knowledge and potential applications. Journal of Applied Microbiology, 111(6), 1297-1309.

LeBlanc, J. G., Laiño, J. E., del Valle, M. J., de Giori, G. S., Sesma, F., & Taranto, M. P. (2015). B‐Group Vitamins Production by Probiotic Lactic Acid Bacteria. Biotechnology of Lactic Acid Bacteria: Novel Applications, 279-296.

Lee, H. S., Gilliland, S. E., & Carter, S. (2001). Amylolytic cultures of Lactobacillus acidophilus: potential probiotics to improve dietary starch utilization. Journal of Food science, 66(2), 338-344.

Leroy, F., & De Vuyst, L. (2004). Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends in Food Science & Technology, 15(2), 67-78.

Lewis, G. P., & Rowe, P. B. (1979). Oxidative and reductive cleavage of folates— a critical appraisal. Analytical biochemistry, 93, 91-97.

Li, D., Pickell, L., Liu, Y., Wu, Q., Cohn, J. S., & Rozen, R. (2005). Maternal methylenetetrahydrofolate reductase deficiency and low dietary folate lead to adverse reproductive outcomes and congenital heart defects in mice. The American journal of clinical nutrition, 82(1), 188-195.

Liévin-Le Moal, V., & Servin, A. L. (2014). Anti-infective activities of lactobacillus strains in the human intestinal microbiota: from probiotics to gastrointestinal anti-infectious biotherapeutic agents. Clinical microbiology reviews, 27(2), 167- 199.

~ 185 ~

BIBLIOGRAFÍA

Liu, B. L., Rafiq, A., Tzeng, Y. M., & Rob, A. (1998). The induction and characterization of phytase and beyond. Enzyme and Microbial Technology, 22(5), 415-424.

Lopez, H. W., Ouvry, A., Bervas, E., Guy, C., Messager, A., Demigne, C., & Remesy, C. (2000). Strains of lactic acid bacteria isolated from sour doughs degrade phytic acid and improve calcium and magnesium solubility from whole wheat flour. Journal of agricultural and food chemistry, 48(6), 2281-2285.

Lopez, H. W., Leenhardt, F., Coudray, C., & Remesy, C. (2002). Minerals and phytic acid interactions: is it a real problem for human nutrition? International journal of food science & technology, 37(7), 727-739.

Lucock, M. (2000). Folic acid: nutritional biochemistry, molecular biology, and role in disease processes. Molecular genetics and metabolism, 71(1), 121-138.

Makarova, K., Slesarev, A., Wolf, Y., Sorokin, A., Mirkin, B., Koonin, E., & Shakhova, V. (2006). Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(42), 15611- 15616.

Maruyama, T., Shiota, T., & Krumdieck, C. L. (1978). The oxidative cleavage of folates: a critical study. Analytical biochemistry, 84(1), 277-295.

Massey, V. (2000) The chemical and biological versatility of riboflavin. 283–296.

Mastromatteo, M., Chillo, S., Civica, V., Iannetti, M., Suriano, N., & Del Nobile, M. A. (2012). A multistep optimization approach for the production of healthful pasta based on nonconventional flours. Journal of Food Process Engineering, 35(4), 601-621.

Mattarelli, P., Holzapfel, W., Franz, C. M., Endo, A., Felis, G. E., Hammes, W., ... & Dellaglio, F. (2014). Recommended minimal standards for description of new taxa of the genera Bifidobacterium, Lactobacillus and related genera. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 64(4), 1434-1451.

Mattson, M. P., & Shea, T. B. (2003). Folate and homocysteine metabolism in neural plasticity and neurodegenerative disorders. Trends in neurosciences, 26(3), 137-146.

Mburu, M. W., Gikonyo, N. K., Kenji, G. M., & Mwasaru, A. M. (2011). Properties of a complementary food based on amaranth grain (Amaranthus cruentus) grown in Kenya. Journal of Agriculture and Food Technology, 1(9), 153-178.

~ 186 ~

BIBLIOGRAFÍA

McGuire, J. J., & Coward, J. K. (1984). Pteroylpolyglutamates: biosynthesis, degradation, and function. En: Folates and pterins. Blakley, R.L., Bencovic, S.J. (Eds.), John Wiley & Sons, New York, N.Y., pp. 135-190.

McNulty, H., & Pentieva, K. (2004). Folate bioavailability. Proceedings of the Nutrition Society, 63(4), 529-536.

Meroth, C. B., Walter, J., Hertel, C., Brandt, M. J., & Hammes, W. P. (2003). Monitoring the bacterial population dynamics in sourdough fermentation processes by using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, 69(1), 475-482.

Messens, W., & De Vuyst, L. (2002). Inhibitory substances produced by Lactobacilli isolated from sourdoughs—a review. International journal of food microbiology, 72(1), 31-43.

Minervini, F., De Angelis, M., Di Cagno, R., Pinto, D., Siragusa, S., Rizzello, C. G., & Gobbetti, M. (2010). Robustness of Lactobacillus plantarum starters during daily propagation of wheat flour sourdough type I. Food microbiology, 27(7), 897-908.

Minervini, F., Di Cagno, R., Lattanzi, A., De Angelis, M., Antonielli, L., Cardinali, G., ... & Gobbetti, M. (2011). The lactic acid bacteria and yeast microbiota of nineteen sourdoughs used for the manufacture of traditional/typical Italian breads: interactions between ingredients and microbial species diversity. Applied and environmental microbiology, AEM-07721.

Minervini, F., Lattanzi, A., De Angelis, M., Di Cagno, R., & Gobbetti, M. (2012). Influence of artisan bakery-or laboratory-propagated sourdoughs on the diversity of lactic acid bacterium and yeast microbiotas. Applied and environmental microbiology, 78(15), 5328-5340.

Minervini, F., De Angelis, M., Di Cagno, R., & Gobbetti, M. (2014). Ecological parameters influencing microbial diversity and stability of traditional sourdough. International journal of food microbiology, 171, 136-146.

Miranda, M., Vega-Gálvez, A., Quispe-Fuentes, I., Rodríguez, M. J., Maureira, H., & Martínez, E. A. (2012). Nutritional aspects of six quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) ecotypes from three geographical areas of Chile. Chilean journal of agricultural research, 72(2), 175.

Molenaar, D., Bringel, F., Schuren, F. H., De Vos, W. M., Siezen, R. J., & Kleerebezem, M. (2005). Exploring Lactobacillus plantarum genome diversity by using microarrays. Journal of Bacteriology, 187(17), 6119-6127.

~ 187 ~

BIBLIOGRAFÍA

Moore, C. O., Tuschhoff, J. V., Hastings, C. W., & Schanefelt, R. V. (1984). Applications of starches in foods. In Starch: Chemistry and Technology (Second Edition) (pp. 575-591).

Moroni, A. V., Iametti, S., Bonomi, F., Arendt, E. K., & Dal Bello, F. (2010). Solubility of proteins from non-gluten cereals: A comparative study on combinations of solubilising agents. Food chemistry, 121(4), 1225-1230.

Moroni, A. V., Arendt, E. K., & Dal Bello, F. (2011). Biodiversity of lactic acid bacteria and yeasts in spontaneously-fermented buckwheat and teff sourdoughs. Food Microbiology, 28(3), 497-502.

Moroni, A. V., Zannini, E., Sensidoni, G., & Arendt, E. K. (2012). Exploitation of buckwheat sourdough for the production of wheat bread. European Food Research and Technology, 235(4), 659-668.

Mozzi, F., Torino, M. I., & de Valdez, G. F. (2001). Identification of exopolysaccharide-producing lactic acid bacteria: a method for the isolation of polysaccharides in milk cultures. Food microbiology protocols, 183-190.

Nachman, F., del Campo, M. P., González, A., Corzo, L., Vázquez, H., Sfoggia, C., ... & Mauriño, E. (2010). Long-term deterioration of quality of life in adult patients with celiac disease is associated with treatment noncompliance. Digestive and Liver Disease, 42(10), 685-691.

Nionelli, L., Curri, N., Curiel, J. A., Di Cagno, R., Pontonio, E., Cavoski, I., ... & Rizzello, C. G. (2014). Exploitation of Albanian wheat cultivars: characterization of the flours and lactic acid bacteria microbiota, and selection of starters for sourdough fermentation. Food microbiology, 44, 96-107.

Novakovic, P., Stempak, J. M., Sohn, K. J., & Kim, Y. I. (2005). Effects of folate deficiency on gene expression in the apoptosis and cancer pathways in colon cancer cells. Carcinogenesis, 27(5), 916-924.

Nowak, V., Du, J., & Charrondière, U. R. (2016). Assessment of the nutritional composition of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.). Food chemistry, 193, 47- 54.

Nuobariene, L., Hansen, A. S., Jespersen, L., & Arneborg, N. (2011). Phytase‐ active yeasts from grain‐based food and beer. Journal of applied microbiology, 110(6), 1370-1380.

Nuobariene, L., Cizeikiene, D., Gradzeviciute, E., Hansen, Å. S., Rasmussen, S. K., Juodeikiene, G., & Vogensen, F. K. (2015). Phytase-active lactic acid bacteria

~ 188 ~

BIBLIOGRAFÍA

from sourdoughs: Isolation and identification. LWT-Food Science and Technology, 63(1), 766-772.

O'broin, S., & Kelleher, B. (1992). Microbiological assay on microtitre plates of folate in serum and red cells. Journal of Clinical Pathology, 45(4), 344-347.

Oh, B. C., Choi, W. C., Park, S., Kim, Y. O., & Oh, T. K. (2004). Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytases. Applied Microbiology and Biotechnology, 63(4), 362-372.

Ohio State University, 2005. Extension Fact Sheet - Folate (Folacin, Folic acid). HYG 5553-05, 1-3.

Parente, E., Brienza, C., Moles, M., & Ricciardi, A. (1995). A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity. Journal of microbiological methods, 22(1), 95-108.

Patel, A., & Prajapat, J. B. (2013). Food and health applications of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Advances in Dairy Research, 1-8.

Pérez Ríos, M., & Ruano, A. (2004). Vitaminas y salud: aportación vitamínica al organismo. Offarm: Farmacia y Sociedad, 23(8), 96-106.

Pfeiffer, C. M., Sternberg, M. R., Schleicher, R. L., & Rybak, M. E. (2013). Dietary supplement use and smoking are important correlates of biomarkers of water- soluble vitamin status after adjusting for sociodemographic and lifestyle variables in a representative sample of US adults. The Journal of nutrition, jn- 112.

Porres, J. M., Etcheverry, P., Miller, D. D., & Lei, X. G. (2001). phytase and citric acid supplementation in whole‐wheat bread improves phytate‐phosphorus release and iron dialyzability. Journal of food science, 66(4), 614-619.

Pospiech, A., & Neumann, B. (1995). A versatile quick-prep of genomic DNA from gram-positive bacteria. Trends in Genetics, 11(6), 217-218.

Pothakos, V., Devlieghere, F., Villani, F., Björkroth, J., & Ercolini, D. (2015). Lactic acid bacteria and their controversial role in fresh meat spoilage. Meat science, 109, 66-74.

Poutanen, K., Flander, L., & Katina, K. (2009). Sourdough and cereal fermentation in a nutritional perspective. Food microbiology, 26(7), 693-699.

~ 189 ~

BIBLIOGRAFÍA

Powers, H. J. (1999). Current knowledge concerning optimum nutritional status of riboflavin, niacin and pyridoxine. Proceedings of the Nutrition Society, 58(2), 435-440.

Powers, H. J. (2003). Riboflavin (vitamin B-2) and health. The American journal of clinical nutrition, 77(6), 1352-1360.

Quinlivan, E. P., Hanson, A. D., & Gregory, J. F. (2006). The analysis of folate and its metabolic precursors in biological samples. Analytical biochemistry, 348(2), 163-184.

Quiroga, A. V., Barrio, D. A., & Añón, M. C. (2015). Amaranth lectin presents potential antitumor properties. LWT-Food Science and Technology, 60(1), 478- 485.

Ramos, C. L., de Sousa, E. S., Ribeiro, J., Almeida, T. M., Santos, C. C. A. D. A., Abegg, M. A., & Schwan, R. F. (2015). Microbiological and chemical characteristics of tarubá, an indigenous beverage produced from solid cassava fermentation. Food microbiology, 49, 182-188.

Repo-Carrasco, R., Espinoza, C., & Jacobsen, S. E. (2003). Nutritional value and use of the Andean crops quinoa (Chenopodium quinoa) and kañiwa (Chenopodium pallidicaule). Food reviews international, 19(1-2), 179-189.

Repo-Carrasco-Valencia, R. A. M., & Serna, L. A. (2011). Quinoa (Chenopodium quinoa, Willd.) as a source of dietary fiber and other functional components. Food Science and Technology (Campinas), 31(1), 225-230.

Rizzello, C. G., Nionelli, L., Coda, R., De Angelis, M., & Gobbetti, M. (2010). Effect of sourdough fermentation on stabilisation, and chemical and nutritional characteristics of wheat germ. Food Chemistry, 119(3), 1079-1089.

Rizzello, C. G., Nionelli, L., Coda, R., & Gobbetti, M. (2012). Synthesis of the cancer preventive peptide lunasin by lactic acid bacteria during sourdough fermentation. Nutrition and cancer, 64(1), 111-120.

Rizzello, C. G., Lorusso, A., Montemurro, M., & Gobbetti, M. (2016). Use of sourdough made with quinoa (Chenopodium quinoa) flour and autochthonous selected lactic acid bacteria for enhancing the nutritional, textural and sensory features of white bread. Food microbiology, 56, 1-13.

Rosell, C. M., Cortez, G., & Repo‐Carrasco, R. (2009a). Breadmaking use of Andean crops quinoa, kaniwa, kiwicha, and tarwi. Cereal chemistry, 86(4), 386- 392.

~ 190 ~

BIBLIOGRAFÍA

Rosell, C. M., Santos, E., Penella, J. M. S., & Haros, M. (2009b). Wholemeal wheat bread: A comparison of different breadmaking processes and fungal phytase addition. Journal of cereal science, 50(2), 272-277.

Ross, R. P., Morgan, S., & Hill, C. (2002). Preservation and fermentation: past, present and future. International journal of food microbiology, 79(1-2), 3-16.

Ruales, J., & Nair, B. M. (1993a). Content of fat, vitamins and minerals in quinoa (Chenopodium quinoa, Willd) seeds. Food Chemistry, 48(2), 131-136.

Ruales, J., & Nair, B. M. (1993b). Saponins, phytic acid, tannins and protease inhibitors in quinoa (Chenopodium quinoa, Willd) seeds. Food Chemistry, 48(2), 137-143.

Ruas-Madiedo, P., & De Los Reyes-Gavilán, C. G. (2005). Invited review: methods for the screening, isolation, and characterization of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Journal of Dairy Science, 88(3), 843-856.

Ruas‐Madiedo, P., Salazar, N., de los Reyes‐Gavilan, C.G. (2009). Biosyntesis and Chemical Composition of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria. En: Bacterial Polysaccharides: Current Innovations and Future Trends. Ed. Ullrich, M. pp. 279‐310.

Russo, P., Capozzi, V., Arena, M. P., Spadaccino, G., Dueñas, M. T., López, P., & Spano, G. (2014). Riboflavin-overproducing strains of Lactobacillus fermentum for riboflavin-enriched bread. Applied microbiology and biotechnology, 98(8), 3691-3700.

Said, H. M., Chatterjee, N., Haq, R. U., Subramanian, V. S., Ortiz, A., Matherly, L. H., & Rubin, S. A. (2000). Adaptive regulation of intestinal folate uptake: effect of dietary folate deficiency. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 279(6), C1889-C1895.

Salvucci, E., LeBlanc, J. G., & Pérez, G. (2016). Technological properties of lactic acid bacteria isolated from raw cereal material. LWT-Food Science and Technology, 70, 185-191.

Sandberg, A. S., Hulthen, L. R., & Turk, M. (1996). Dietary Aspergillus niger phytase increases iron absorption in humans. The Journal of nutrition, 126(2), 476-480.

Sanz-Penella, J. M., Tamayo-Ramos, J. A., Sanz, Y., & Haros, M. (2009). Phytate reduction in bran-enriched bread by phytase-producing bifidobacteria. Journal of agricultural and food chemistry, 57(21), 10239-10244.

~ 191 ~

BIBLIOGRAFÍA

Sanz-Penella, J. M., Laparra, J. M., Sanz, Y., & Haros, M. (2012). Bread supplemented with amaranth (Amaranthus cruentus): effect of phytates on in vitro iron absorption. Plant foods for human nutrition, 67(1), 50-56.

Sanz-Penella, J. M., Tamayo-Ramos, J. A., & Haros, M. (2012a). Application of bifidobacteria as starter culture in whole wheat sourdough breadmaking. Food and Bioprocess Technology, 5(6), 2370-2380.

Sanz-Penella, J. M., Frontela, C., Ros, G., Martinez, C., Monedero, V., & Haros, M. (2012b). Application of bifidobacterial phytases in infant cereals: Effect on phytate contents and mineral dialyzability. Journal of agricultural and food chemistry, 60(47), 11787-11792.

Schoenlechner, R., Drausinger, J., Ottenschlaeger, V., Jurackova, K., & Berghofer, E. (2010). Functional properties of gluten-free pasta produced from amaranth, quinoa and buckwheat. Plant foods for human nutrition, 65(4), 339-349.

Schoenlechner, R., Wendner, M., Siebenhandl-Ehn, S., & Berghofer, E. (2010a). Pseudocereals as alternative sources for high folate content in staple foods. Journal of Cereal Science, 52(3), 475-479.

Scholl, T. O., & Johnson, W. G. (2000). Folic acid: influence on the outcome of pregnancy. The American journal of clinical nutrition, 71(5), 1295s-1303s.

Schuppan, D., Junker, Y., & Barisani, D. (2009). Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterology, 137(6), 1912-1933.

Schwab, C., Mastrangelo, M., Corsetti, A., & Gänzle, M. (2008). Formation of oligosaccharides and polysaccharides by Lactobacillus reuteri LTH5448 and Weissella cibaria 10M in sorghum sourdoughs. Cereal Chemistry, 85(5), 679-684.

Scott, J. M. (1999). Folate and vitamin B12. Proceedings of the Nutrition Society, 58(2), 441-448.

Scott, J., Rébeillé, F., & Fletcher, J. (2000). Folic acid and folates: the feasibility for nutritional enhancement in plant foods. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80(7), 795-824.

See, J. A., Kaukinen, K., Makharia, G. K., Gibson, P. R., & Murray, J. A. (2015). Practical insights into gluten-free diets. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 12(10), 580-591.

Shane B. (2000). Folic acid, vitamin B-12, and vitamin B-6. In: Stipanuk M, ed. Biochemical and Physiological Aspects of Human Nutrition. Philadelphia: W.B. Saunders Co. 483-518. ~ 192 ~

BIBLIOGRAFÍA

Shimizu, M. (1992). Purification and Characterization of Phytase from Bacillus suhtilis (natto) N–77. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 56(8), 1266- 1269.

Silva Jr, L. S., Trevisan, M. G., Rath, S., Poppi, R. J., & Reyes, F. G. (2005). Chromatographic determination of riboflavin in the presence of tetracyclines in skimmed and full cream milk using fluorescence detection. Journal of the Brazilian Chemical Society, 16(6A), 1174-1178.

Singh, M., & Krikorian, A. D. (1982). Inhibition of trypsin activity in vitro by phytate. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 30(4), 799-800.

Singh, S., Raina, C. S., Bawa, A. S., & Saxena, D. C. (2004). Sweet potato‐based pasta product: optimization of ingredient levels using response surface methodology. International journal of food science & technology, 39(2), 191- 200.

Slavin, J. (2004). Whole grains and human health. Nutrition research reviews, 17(1), 99-110.

Smerilli, M., Neureiter, M., Wurz, S., Haas, C., Frühauf, S., & Fuchs, W. (2015). Direct fermentation of potato starch and potato residues to lactic acid by Geobacillus stearothermophilus under non‐sterile conditions. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 90(4), 648-657.

Smulders, Y. M., & Stehouwer, C. D. (2005, May). Folate metabolism and cardiovascular disease. In Seminars in vascular medicine (Vol. 5, No. 02, pp. 87- 97).

Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E., Holt, J.G. (1986). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Eds. Williams y Wilkins. Edición 1ª. Volumen 2.

Songré-Ouattara, L. T., Mouquet-Rivier, C., Icard-Vernière, C., Humblot, C., Diawara, B., & Guyot, J. P. (2008). Enzyme activities of lactic acid bacteria from a pearl millet fermented gruel (ben-saalga) of functional interest in nutrition. International journal of food microbiology, 128(2), 395-400.

Srichuwong, S., Curti, D., Austin, S., King, R., Lamothe, L., & Gloria-Hernandez, H. (2017). Physicochemical properties and starch digestibility of whole grain sorghums, millet, quinoa and amaranth flours, as affected by starch and non- starch constituents. Food Chemistry, 233, 1-10.

~ 193 ~

BIBLIOGRAFÍA

Stabler, S.P. (2010). Clinical folate deficiency. In: Bailey LB, ed. Folate in Health and Disease. 2nd edition ed. Boca Raton, FL: CRC press, Taylor & Francis Group: 409-428.

Stahmann, K. P., Revuelta, J. L., & Seulberger, H. (2000). Three biotechnical processes using Ashbya gossypii, Candida famata, or Bacillus subtilis compete with chemical riboflavin production. Applied Microbiology and Biotechnology, 53(5), 509-516.

Sterr, Y., Weiss, A., & Schmidt, H. (2009). Evaluation of lactic acid bacteria for sourdough fermentation of amaranth. International journal of food microbiology, 136(1), 75-82.

Sweeney, M. R., McPartlin, J., & Scott, J. (2007). Folic acid fortification and public health: report on threshold doses above which unmetabolised folic acid appear in serum. BMC public health, 7(1), 41.

Tamayo-Ramos, J. A., Sanz-Penella, J. M., Yebra, M. J., Monedero, V., & Haros, M. (2012). Novel phytases from Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC 27919 and Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697. Applied and environmental microbiology, 78(14), 5013-5015.

Tamura, T., & Picciano, M. F. (2006). Folate and human reproduction. The American Journal of Clinical Nutrition, 83(5), 993-1016.

Tang, Y., & Tsao, R. (2017). Phytochemicals in quinoa and amaranth grains and their antioxidant, anti‐inflammatory and potential health beneficial effects: a review. Molecular Nutrition & Food Research.

Taylor, J. R., Belton, P. S., Beta, T., & Duodu, K. G. (2014). Increasing the utilisation of sorghum, millets and pseudocereals: Developments in the science of their phenolic phytochemicals, biofortification and protein functionality. Journal of Cereal Science, 59(3), 257-275.

Thakur, K., & Tomar, S. K. (2015). Exploring indigenous Lactobacillus species from diverse niches for riboflavin production. Journal of Young Pharmacists, 7(2), 126.

Thapa, N., & Tamang, J. P. (2015). Functionality and therapeutic values of fermented foods. Health benefits of fermented foods, 111-168.

Tjon, J. M. L., van Bergen, J., & Koning, F. (2010). Celiac disease: how complicated can it get? Immunogenetics, 62(10), 641-651.

~ 194 ~

BIBLIOGRAFÍA

Türk, M., & Sandberg, A. S. (1992). Phytate degradation during breadmaking: effect of phytase addition. Journal of Cereal Science, 15(3), 281-294.

Valcárcel-Yamani, B., & da Silva Lannes, S. C. (2012). Applications of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) and amaranth (Amaranthus Spp.) and their influence in the nutritional value of cereal based foods. Food and Public Health, 2(6), 265-275.

Vanos, V., & Cox, L. (1986). Rapid routine method for the detection of lactic acid bacteria among competitive flora. Food Microbiology, 3(3), 223-234.

Vásquez, S. M., Suárez, H., & Zapata, S. (2009). Utilización de sustancias antimicrobianas producidas por bacterias acido lácticas en la conservación de la carne. Revista chilena de nutrición, 36(1), 64-71.

Vega‐Gálvez, A., Miranda, M., Vergara, J., Uribe, E., Puente, L., & Martínez, E. A. (2010). Nutrition facts and functional potential of quinoa (Chenopodium quinoa willd.), an ancient Andean grain: a review. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90(15), 2541-2547.

Viiard, E., Bessmeltseva, M., Simm, J., Talve, T., Aaspõllu, A., Paalme, T., & Sarand, I. (2016). Diversity and stability of lactic acid bacteria in rye sourdoughs of four bakeries with different propagation parameters. PloS one, 11(2), e0148325.

Weckx, S., Van der Meulen, R., Allemeersch, J., Huys, G., Vandamme, P., Van Hummelen, P., & De Vuyst, L. (2010). Community dynamics of bacteria in sourdough fermentations as revealed by their metatranscriptome. Applied and environmental microbiology, 76(16), 5402-5408.

West, J., Logan, R. F., Smith, C. J., Hubbard, R. B., & Card, T. R. (2004). Malignancy and mortality in people with coeliac disease: population based cohort study. Bmj, 329(7468), 716-719.

Wijngaard, H. H., & Arendt, E. K. (2006). Buckwheat. Cereal Chemistry, 83(4), 391-401.

Williams, J. G., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., & Tingey, S. V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic acids research, 18(22), 6531-6535.

Williams, E. A., Powers, H. J., & Rumsey, R. D. E. (1995). Morphological changes in the rat small intestine in response to riboflavin depletion. British Journal of Nutrition, 73(1), 141-146.

~ 195 ~

BIBLIOGRAFÍA

Winkels, R. M., Brouwer, I. A., Siebelink, E., Katan, M. B., & Verhoef, P. (2007). Bioavailability of food folates is 80% of that of folic acid. The American journal of clinical nutrition, 85(2), 465-473.

Wood, S. G., Lawson, L. D., Fairbanks, D. J., Robison, L. R., & Andersen, W. R. (1993). Seed lipid content and fatty acid composition of three quinoa cultivars. Journal of Food Composition and Analysis, 6(1), 41-44.

Wright, K. H., Pike, O. A., Fairbanks, D. J., & Huber, C. S. (2002). Composition of Atriplex hortensis, sweet and bitter Chenopodium quinoa seeds. Journal of food science, 67(4), 1383-1385.

Xu, X., & Chen, J. (2009). One-carbon metabolism and breast cancer: an epidemiological perspective. Journal of Genetics and Genomics, 36(4), 203-214.

Yang, E. J., & Chang, H. C. (2010). Purification of a new antifungal compound produced by Lactobacillus plantarum AF1 isolated from kimchi. International journal of food microbiology, 139(1), 56-63.

Yates, C. A., Evans, G. S., & Powers, H. J. (2001). Riboflavin deficiency: early effects on post-weaning development of the duodenum in rats. British Journal of Nutrition, 86(5), 593-599.

Zannini, E., Waters, D. M., Coffey, A., & Arendt, E. K. (2016). Production, properties, and industrial food application of lactic acid bacteria-derived exopolysaccharides. Applied microbiology and biotechnology, 100(3), 1121- 1135.

Zhang, R., Daroczy, K., Xiao, B., Yu, L., Chen, R., & Liao, Q. (2012). Qualitative and semiquantitative analysis of Lactobacillus species in the vaginas of healthy fertile and postmenopausal Chinese women. Journal of medical microbiology, 61(5), 729-739.

Zhao, R., Min, S. H., Qiu, A., Sakaris, A., Goldberg, G. L., Sandoval, C., & Goldman, I. D. (2007). The spectrum of mutations in the PCFT gene, coding for an intestinal folate transporter, that are the basis for hereditary folate malabsorption. Blood, 110(4), 1147-1152.

Ziegler, E. E., & Filer Jr, L. J. (1996). Rivlin RS. Riboflavin. Present knowledge in nutrition. 7th ed. Washington D.C.: ILSI Press; 1996:167-173.

~ 196 ~

ABREVIATURAS Y SIGLAS

ABREVIATURAS Y SIGLAS

Abreviaturas y Siglas A1 Granos de amaranto (Amaranthus caudatus) de INTA Hornillos A2 Granos de amaranto comercial “El peoncito” ác. Ácido ADN Ácido desoxirribonucleico AF Ácido fítico ANMAT Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica APG Ácido pteroilglutámico AP-G Almidón pre-gelatinizado ARN Ácido ribonucleico AS Masa realizada con harina de amaranto comercial Sturla ATCC Colección Americana de Cultivos Tipo, del inglés American Type Culture Collection atm Atmósfera

B1 Tiamina

B12 Cobalamina

B2 Riboflavina

B3 Niacina

B5 Ácido pantoténico

B6 Piridoxina

B8 Biotina

B9 Folatos BHI Medio de cultivo, del inglés Brain heart infusión BL Bacterias lácticas BLA Bacteria láctica amilolíticas C.M Cultivo mixto C.N Control negativo c.s.p. Cantidad suficiente para CAA Código Alimentario Argentino Cat. Catálogo CCM Caldo Chalmers modificado CERELA Centro de Referencia para Lactobacilos CHCM Concentración de hemoglobina corpuscular media CoA Coenzima A CPS polisacárido capsular, del inglés capsular polysaccharide CRL CERELA DC Dieta convencional completa DD Dieta deficiente DE Desvío estándar DHF Dihidrofolato DHFR Dihidrofolato reductasa DLG Dieta libre de gluten DO Densidad óptica DTN Defectos del tubo neural DY Rendimiento de masa, del inglés dough yield

~ 200 ~

ABREVIATURAS Y SIGLAS

EC Enfermedad celíaca EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EEH Extracto estéril de harina Coeficiente de Activación de la Glutatión Reductasa Eritrocitaria, del inglés EGRAC Erythrocyte Glutathione Reductase Activation Coefficient ELC Extractos libres de células EMP Embden-Meyerhof-Parnas Medio para dosaje microbiológico de ácido fólico para L. casei, del inglés Folic Acid FACM Casei Medium FAD Flavín adenín dinucleótido Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, del inglés FAO Food and Agriculture Organization Administración de drogas y alimentos de Estados Unidos, del inglés Food and Drug FDA Administration FDP- fructosa‐1,6‐bifosfato aldolasa aldolasa FE Folatos extracelulares FI Folatos intracelulares FMN Flavín mononucleótido FT Folatos totales GC Grupo control GD Grupo deficiente GR Glóbulos rojos GRAS Reconocido generalmente como seguro, del inglés Generally recognized as safe GSH Glutatión reducido GSSG Glutatión oxidado GTP Guanosina-5’-trifosfato H y L Medio de cultivo para hongo y levaduras HAP fitasa ácida de histidina, del inglés histidine acid phytase Hb Hemoglobina HCM Hemoglobina corpuscular media Cromatografía líquida de alta resolución, del inglés High performance liquid HPLC chromatography Hto Hematocrito Comité Internacional para la Estandarización en Hematología, del inglés ICSH International Committee for Standardization in Hematology IDR Ingesta diaria recomendada InsP1 mio-inositol monofosfato InsP2 mio-inositol difosfato InsP3 mio-inositol trifosfato InsP4 mio-inositol tetrafosfato InsP5 mio-inositol pentafosfato InsP6 mio-inositol hexafosfato KDa Kilo Dalton LEL Leche extracto de levadura LG Libre de gluten

~ 201 ~

ABREVIATURAS Y SIGLAS

MRS Medio de cultivo Man Rogosa Sharpe MTHFR Metilentetrahidrofolato reductasa NADH Nicotinamida adenina dinucleótido reducido NADP+ Nicotinamida adenina dinucleótido Centro Nacional para la Información Biotecnológica, del inglés National Center for NCBI Biotechnology Information nd No determinado NOA Noroeste argentino OMS Organización Mundial de la Salud ON Overnight pABA Ácido p-aminobenzoico PBS Tampón fosfato salino, del inglés Phosphate-buffered saline PCA Medio de cultivo para recuento en placa agar, del inglés Plate count agar PCR Reacción en cadena de la polimerasa, del inglés Polymerase Chain Reaction PEG polietilenglicol pH Potencial de Hidrógeno Pi Fosfato inorgánico PK Fosfocetolasa, del inglés phosphoketolase QC Masa realizada con harina de quínoa Cica Hornillos QCH Granos de quínoa Cica de INTA Hornillos QRC Granos de quínoa Real de Coop. Cauqueva QRH Granos de quínoa Real de INTA Hornillos QS Masa realizada con harina de quínoa comercial Sturla r Ratón Medio para dosaje microbiológico de riboflavina, del inglés Riboflavin Assay RAM Medium Amplificación aleatoria de ADN polimórfico, del inglés Random Amplification of RAPD Polymorphic DNA RE Riboflavina extracelular RI Riboflavina intracelular RT Riboflavina total SAM S-adenosilmetionina SDS Dodecil sulfato sódico SHA S-adenosilhomocisteína SSE Solución salina estéril TAE Tampón Tris-acetato-EDTA TE Tampón Tris-EDTA TGI Tracto gastrointestinal THF Tetrahidrofolato VCM Volumen corpuscular medio Unidades y símbolos % Porciento µL Microlitros d Días g Aceleración de la gravedad g Gramos

~ 202 ~

ABREVIATURAS Y SIGLAS

h Hora kg kilogramos L Litros log logaritmo M Molar mg Miligramos min Minutos mL Mililitros mm Milímetros mM Milimolar N Normal ng Nanogramos nm Nanómetros °C Temperatura en grados centígrados p/p Peso en peso p/v Peso en volumen rpm Revoluciones por minuto Seg segundos U unidad de actividad fitasa UFC Unidades formadoras de colonias V voltios v/v Volumen en volumen vol Volumen µg Microgramos μm Micrómetros μM Micromolar Microorganismos A. Aspergillus E. Enterococcus L. Lactobacillus Lc. Leuconostoc P. Pediococcus

~ 203 ~

ABREVIATURAS Y SIGLAS

~ 204 ~