MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

TAXONOMIE, EKOLOGIE A VÝZNAM ČELEDI ENTEROCOCCACEAE Bakalářská práce Lucie Zátopková

Vedoucí práce: RNDr. Pavel Švec, Ph.D. Brno 2012

Bibliografický záznam

Autor: Lucie Zátopková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Název práce: Taxonomie, ekologie a význam čeledi Enterococcaceae

Studijní program: Biologie

Studijní obor: Obecná biologie – zaměření Mikrobiologie

Vedoucí práce: RNDr. Pavel Švec, Ph.D.

Akademický rok: 2011/2012

Počet stran: 53 Klíčová slova: taxonomie, čeleď Enterococcaceae, Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Catellicoccus, Pilibacter

Bibliographic Entry

Author: Lucie Zátopková Faculty of Science, Masaryk University Department of experimental biology Department of microbiology Taxonomy, ecology and significance of the family Title of Thesis: Enterococcaceae

Degree programme: Biology

Field of Study: General biology – specialization Microbiology

Supervisor: RNDr. Pavel Švec, Ph.D.

Academic Year: 2011/2012

Number of Pages: 53 Keyword: taxonomy, family Enterococcaceae, Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Catellicoccus, Pilibacter

Abstrakt

Čeleď Enterococcaceae byla v roce 2009 navrţena pro fylogenticky blízce příbuzné rody Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus a Vagococcus. Rody Catellicoccus a Pilibacter, které byly popsány v pozdějších letech, se do této čeledě zahrnují na základě podobnosti sekvence genu pro 16S rRNA. Zástupci zmíněných rodů se vyskytují převáţně u ţivočichů včetně člověka, ale také na rostlinách, v prostředí a v potravinách. Některé druhy hrají důleţitou roli v humánní klinické mikrobiologii.

Abstract The family Enterococcaceae was designed for the phylogenetically closely related genera Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus and Vagococcus in 2009. Genera Catellicoccus and Pilibacter, which were described in later years, are included in this family on the basis of sequence similarity of 16S rRNA gene. Representatives of these genera are found mostly in animals including humans, but also on plants, in the environment and in food. Some species are playing an important role in human clinical microbiology.

Poděkování Za odborné vedení, cenné rady, ochotu a čas, který mi věnoval, bych ráda poděkovala RNDr. Pavlu Švecovi, Ph.D, pod jehoţ vedením jsem svou bakalářskou práci vypracovala na půdě České sbírky mikroorganismů.

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 11. května 2012 ……………………………… Lucie Zátopková

Obsah

1. Úvod ...... 10 2. Cíl práce ...... 10 3. Taxonomie a charakteristika čeledě Enterococcaceae ...... 11 3.1. Taxonomie ...... 11 3.2. Charakteristika ...... 13 4. Rody čeledě Enterococcaceae ...... 14 4.1. Rod Enterococcus ...... 14 4.1.1. Historie ...... 14 4.1.2. Fenotypové vlastnosti ...... 14 4.1.3. Metabolismus ...... 16 4.1.4. Genom ...... 16 4.2. Rod Melissococcus ...... 17 4.2.1. Historie ...... 17 4.2.2. Fenotypové vlastnosti ...... 17 4.2.3. Metabolismus ...... 18 4.2.4. Genom ...... 19 4.3. Rod Tetragenococcus ...... 19 4.3.1. Historie ...... 19 4.3.2. Fenotypové vlastnosti ...... 19 4.3.3. Metabolismus ...... 20 4.3.4. Genom ...... 20 4.4. Rod Vagococcus ...... 21 4.4.1. Historie ...... 21 4.4.2. Fenotypové vlastnosti ...... 21 4.4.3. Metabolismus ...... 22 4.4.4. Genom ...... 22 4.5. Rod Catellicoccus ...... 22 4.5.1. Historie ...... 22 4.5.2. Fenotypové vlastnosti ...... 22 4.5.3. Metabolismus ...... 23 4.5.4. Genom ...... 23

7 4.6. Rod Pilibacter ...... 23 4.6.1. Historie ...... 23 4.6.2. Fenotypové vlastnosti ...... 24 4.6.3. Metabolismus ...... 24 4.6.4. Genom ...... 25 5. Ekologie a výskyt ...... 26 5.1. Rod Enterococcus ...... 26 5.1.1. Enterokoky u ţivočichů ...... 26 5.1.2. Enterokoky u člověka ...... 27 5.1.3. Enterokoky na rostlinách ...... 27 5.1.4. Enterokoky v půdě ...... 27 5.1.5. Enterokoky ve vodách ...... 28 5.1.6. Enterokoky v potravinách ...... 28 5.1.7. Dělení enterokoků ...... 28 5.2. Rod Melissococcus ...... 29 5.3. Rod Tetragenococcus ...... 30 5.4. Rod Vagococcus ...... 31 5.5. Rod Catellicoccus ...... 32 5.6. Rod Pilibacter ...... 32 6. Význam ...... 32 6.1. Klinický význam ...... 33 6.1.1. Onemocnění ...... 33 6.1.2. Faktory virulence ...... 34 6.1.3. Rezistence k antibiotikům...... 34 6.2. Potravinářství ...... 35 6.3. Probiotika ...... 36 7. Izolace a identifikace ...... 38 7.1. Rod Enterococcus ...... 38 7.1.1. Izolace ...... 38 7.1.2. Identifikace ...... 38 7.2. Rod Melissococcus ...... 39 7.2.1.I zolace ...... 39 7.2.2. Identifikace ...... 40

8 7.3. Rod Tetragenococcus ...... 40 7.3.1. Izolace ...... 40 7.3.2. Identifikace ...... 41 7.4. Rod Vagococcus ...... 41 7.4.1. Izolace ...... 41 7.4.2. Identifikace ...... 41 7.5. Rod Catellicoccus ...... 42 7.5.1. Izolace ...... 42 7.5.2. Identifikace ...... 42 7.6. Rod Pilibacter ...... 42 7.6.1. Izolace ...... 42 7.6.2. Identifikace ...... 43 8. Závěr ...... 44 9. Seznam literatury ...... 45

9 1. Úvod

Čeleď Enterococcaceae, patřící do domény Bacteria, zahrnuje druhy bakterií významné v humánní a veterinární klinické mikrobiologii, ale také druhy, které jsou z pohledu člověka vcelku bezvýznamné, protoţe nemají ţádné praktické vyuţití ani negativní působení na své okolí. Tyto bakterie lze nalézt v rozmanitých prostředích. Najdeme zde druhy vyskytující se ve vodě, v půdě a na rostlinách, ale i běţné zástupce mikroflóry ţivočichů včetně člověka. Jsou také součástí mléčných výrobků a jiných potravin. Stejně tak sem patří bakterie, které mohou způsobovat různá onemocnění zvířat i člověka, nebo naopak jiné, které lze díky jejich pozitivním účinkům vyuţít například jako probiotika. Na základě fylogenetické příbuznosti je nyní do čeledě Enterococcaceae zařazeno celkem 6 rodů – Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Catellicoccus a Pilibacter.

2. Cíl práce

Cílem této bakalářské práce je přehledné zpracování dosud získaných a aktuálních poznatků o jednotlivých rodech čeledě Enterococcaceae, s ohledem na taxonomické změny, které v rámci této čeledě proběhly v posledních letech.

10 3. Taxonomie a charakteristika čeledě Enterococcaceae

3.1. Taxonomie

V roce 2009 byla navrţena čeleď Enterococcaceae (Ludwig a kol. 2009), která dnes pojímá celkem šest rodů. Jsou to rody Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Catellicoccus a Pilibacter (Obr. 1). Poslední dva zmíněné rody jsou do této čeledě řazeny pouze na základě blízké fylogenetické příbuznosti.

Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Enterococcaceae Rody: Enterococcus Melissococcus Tetragenococcus Vagococcus Catellicoccus Pilibacter

11

Obr. 1: Fylogenetický strom čeledě Enterococcaceae zaloţený na analýze genu pro 16S rRNA (zdroj Švec a Franz, v tisku)

12 3.2. Charakteristika

Zástupci čeledě Enterococcaceae jsou grampozitivní bakterie mléčného kvašení s nízkým procentuálním obsahem guaninu a cytosinu (dále jen G+C) v genomové DNA patřící do řádu Lactobacillales (Sedláček 2007). Čeleď byla vyčleněna na základě vysoké fylogenetické příbuznosti rodů zjištěné sekvenací genu pro 16S rRNA, jehoţ sekvence můţe být na úrovni jednotlivých druhů velmi konzervativní (Ludwig a kol. 2009). Jednotlivé rody čeledě Enterococcaceae jsou vzájemně dost heterogenní a existuje mezi nimi jen málo společných vlastností. Buňky jsou nejčastěji ve formě sférických nebo ovoidních koků, ale nalezneme zde však i buňky ve tvaru tyček, nikdy netvoří endospory a jsou kataláza negativní (Ludwig a kol. 2009). Mikroorganismy této čeledě se vykazují chemoorganotrofním růstem. Mohou to být anaerobové, fakultativní anaerobové či mikroaerofilové. Někteří zástupci melisokoků a katelikoků dokonce vyţadují určitou koncentraci CO2 nebo vyšší koncentrace CO2 podporuje jejich růst, v tom případě jde o tzv. kapnofilní organismy. Většina druhů z rodu Enterococcus a Tetragenococcus je schopná růstu i při vyšších koncentracích soli (Ludwig a kol. 2009).

13 4. Rody čeledě Enterococcaceae

4.1. Rod Enterococcus

4.1.1. Historie

Termín „entérocoque“ prvně pouţil francouzský vědec Thiercelin v roce 1899 při popisu nového grampozitivního diplokoka intestinálního původu. O čtyři roky později Thiercelin a Jouhaud společně navrhli rodové jméno Enterococcus. V roce 1906 však Andrewes a Horder tuto bakterii přejmenovali na „Streptococcus faecalis“, kdyţ ji na základě schopnosti tvořit krátké či dlouhé řetízky zařadili do rodu Streptococcus a k rodovému jménu připojili specifický přídomek „faecalis“ odkazující na původ izolátu (Kalina 1970). Druhým enterokokálním druhem byl „Streptococcus faecium“ popsaný Orla-Jensenem roku 1919. V pozdějších letech začalo být uţíváno rozdělení streptokoků do čtyř skupin, z nichţ skupina označovaná jako „skupina enterokoků“ nebo „streptokoky fekálního původu“ zahrnovala právě druhy, které dnes nesou rodové jméno Enterococcus. Toto rozdělení zavedl Sherman, který spolu s Wingem popsal třetí druh skupiny enterokoků – „Streptococcus durans“ (Facklam a kol. 2002). V roce 1970 byl podán návrh o přeřazení fekálních streptokoků do samostatného rodu Enterococcus. Podnětem k tomu byla studie morfologie, buněčného uspořádání a antigenní struktury (Kalina 1970). Rod Enterococcus byl však validně uznán aţ v roce 1984, kdy Schleifer a Kilpper-Bälz navrhli přesun druhů „Streptococcus faecalis“ a „Streptococcus faecium“ do rodu Enterococcus na základě DNA-DNA a DNA-rRNA hybridizace (Schleifer a Kilpper-Bälz 1984). Název rodu Enterococcus je odvozen ze dvou slov řeckého původu – slovo „enteron“ znamená střevo, coţ poukazuje na prvotní izolaci této bakterie z intestinálního traktu, a slovo „kokkos“, tedy jádro či obilka, vypovídá o tvaru buněk enterokoků (Švec a Devriese 2009).

4.1.2. Fenotypové vlastnosti

Enterokoky jsou grampozitivní ovoidní buňky vyskytující se jednotlivě, v párech nebo v krátkých řetízcích, často prodlouţené ve směru řetízku (viz obr. 2). Netvoří endospory a některé kmeny mohou být pohyblivé. Ve vztahu ke kyslíku jsou to fakultativní

14 anaerobové, kteří spíše upřednostňují anaerobní podmínky před aerobním prostředím (Schleifer a Kilpper-Bälz 1984). Katalázový test je negativní, ale určité kmeny mohou při kultivaci na krevním agaru produkovat pseudokatalázu (Švec a Devriese 2009). Jednotlivé kolonie jsou vţdy pravidelné a kruhové s průměrem aţ 5 mm a hladkým povrchem. Jisté druhy enterokoků jsou ţlutě pigmentované díky přítomnosti karotenoidního pigmentu. V závislosti na druhu lze někdy na krevním agaru pozorovat hemolýzu (Švec a Devriese 2009). Optimální růstová teplota se udává 35-37°C, kdy většina druhů roste i při 10 °C a 45 °C (Devriese a Pot 1995). Zástupci rodu Enterococcus jsou schopní růstu v prostředí s pH 9,6 a při 6,5 % koncentraci NaCl, čehoţ lze vyuţít při jejich odlišení od příbuzných streptokoků (Schleifer a Kilpper-Bälz 1984). Vyznačují se také schopností růstu v médiu se 40 % ţluči, ke které jsou rezistentní (Švec a Devriese 2009). Peptidoglykan v buněčné stěně je typu lysin-D-kyselina asparagová nebo lysin-alanin2-3. Mastné kyseliny s dlouhým řetězcem v cytoplazmatické membráně jsou převáţně nasycené s rovným řetězcem či mononenasycené. Některé druhy mohou tvořit i mastné kyseliny s cyklopropanovými kruhy (Schleifer a Kilpper-Bälz 1984). Mezi buněčnou stěnou a membránou je umístěn antigen, který je u enterokoků antigenem skupiny D podle Lancefieldové (Smith a Shattock 1964).

Obr. 2: Enterococcus faecium – fotografie ze skenovacího elektronového mikroskopu (upraveno podle http://www.jgi.doe.gov/News/Efacium_overvw.htm).

15 4.1.3. Metabolismus

Enterokoky jsou chemoorganotrofové s fermentativním metabolismem, přesněji s homofermentativním mléčným kvašením, kdy hlavním produktem při fermentaci glukózy je L(+) enantiomer kyseliny mléčné. Kromě glukózy mohou dále tvořit kyselinu z různých substrátů. Většina druhů okyseluje N-acetylglukosamin, D-fruktózu, galaktózu, laktózu, maltózu, D-mannózu, ribózu, trehalózu, arbutin či amygdalin, zatímco z fukózy, erytritolu, D-arabinózy nebo L-xylózy kyselinu netvoří. Za aerobních podmínek je glukóza přeměňována na kyselinu octovou, acetoin a CO2 (Švec a Devriese 2009). Embden-Meyerhof-Parnasova dráha je hlavní metabolická cesta pro zisk energie fermentací. Energie však můţe být také získávána rozkladem některých aminokyselin jako je arginin, tyrosin, serin, agmatin, fenylalanin či kanavanin (Deibel 1964). Enterokoky hydrolyzují hipurát v místě peptidové vazby za vzniku glycinu a kyseliny benzoové (Deibel 1964). Hydrolyzován je také eskulin. Výsledky Voges-Proskauerova testu (produkce acetoinu) jsou s výjimkou jednoho druhu (Enterococcus saccharolyticus) pozitivní, naopak test pro enzym ureázu je většinou negativní (Devriese a kol. 2006). Některé druhy enterokoků produkují proteázu, ţelatinázu, hyaluronidázu, lipázu či DNázu, které lze povaţovat za faktory virulence (Elsner a kol. 2000).

4.1.4. Genom

Procentuální obsah G+C v genomové DNA se pohybuje od 32,5 do 44,9 mol% v závislosti na druhu (Švec a Devriese 2009). Velikost samotného genomu je v rozpětí 2 500 aţ 3 500 kb. Přesná velikost se můţe lišit nejen druhově, ale také v závislosti na přítomnosti extrachromozomálních elementů začleněných v chromozomu (Oana a kol. 2002). Enterokoky mohou obsahovat širokou škálu plazmidů a transpozonů, které mohou být příčinou nabytí a přenosu nových vlastností jako je rezistence k určitým antibiotikům nebo vedou k získání nových faktorů virulence (Weaver 2000). U tohoto rodu byly popsány tři typy plazmidů – feromonové plazmidy (pheromone responsive), RCR plazmidy (Rolling Circle Replicating) a Inc18 plazmidy (Weaver a kol. 2002). Pro druh Enterococcus faecalis jsou typické feromonové plazmidy kódující povrchový adhesin neboli agregační substanci, která se váţe na vazebný ligand na povrchu donorové i recipientní buňky. To vede k vytvoření seskupení buněk. Následně dojde k jejich přímému kontaktu a umoţní se tak přenos samotného plazmidu (Weaver 2000). Dalším typem plazmidů jsou RCR plazmidy, tedy plazmidy, které se replikují otáčející se kruţnicí. RCR

16 plazmidy bývají v buňkách přítomné ve vysokém počtu kopií a jejich velikost je menší neţ 10 kb. Naopak plazmidy Inc18 jsou velké přibliţně 25-30 kb a počet jejich kopií nepřesahuje 10 na buňku (Weaver a kol. 2002). Dalšími mimochromozomálními elementy, které lze u enterokoků najít, jsou transpozony, ostrovy patogenity, bakteriofágy ve formě profágů nebo inzerční sekvence. Transpozony můţeme rozdělit na konjugativní, sloţené a transpozony rodiny Tn3 (Tendolkar a kol. 2003). Za zmínku jistě stojí transpozony, které jsou odpovědné za rezistenci k antibiotikům, především k vankomycinu (Paulsen 2003). Rezistence k antibiotikům je v dnešní době všeobecným problémem nejen u enterokoků a tomuto tématu bude věnována větší pozornost v kapitole 6.1.3. Rezistence k antibiotikům.

4.2. Rod Melissococcus

4.2.1. Historie

Roku 1912 popsal White „Bacillus pluton“ coby původce onemocnění hniloby včelího plodu. Později, v roce 1982, Bailey a Collins pro tento druh navrhli název „Streptococcus pluton“, ale návrh nebyl podpořen biochemickou analýzou, coţ téhoţ roku přispělo ke vzniku zcela nového rodu Melissococcus s druhem Melissococcus pluton následně roku 1998 modifikovaným na Melissococcus plutonius (Forsgren 2010). Jméno rodu Melissococcus je vytvořené ze dvou slov řeckého původu. První část rodového názvu je od slova „melissa“, včela, a naráţí na výskyt této bakterie. Druhá část jména je odvozena ze slova „kokkos“, obilka, coţ odpovídá tvaru buněk melisokoků (Dicks a Holzapfel 2009).

4.2.2. Fenotypové vlastnosti

Jedná se o kopinaté, někdy aţ tyčkovité nebo pleomorfní buňky vyskytující se jednotlivě, v párech nebo řetízcích o různé délce (viz obr. 3). Gramovým barvením se barví pozitivně, ale snadno se odbarvují. Melisokoky jsou nepohyblivé, kataláza negativní a netvoří endospory. Jsou to anaerobové či mikroaerofilové, přičemţ nejlepší růst je při

1-5 % koncentraci CO2. Melisokoky nejsou schopné aerobního růstu (Dicks a Holzapfel 2009).

17 Tvar kolonií se můţe lišit v závislosti na zdroji izolátu. Obvykle jsou však kolonie neprůhledné, bílé, vyklenuté o velikosti do 1 mm. Avšak byly pozorovány i kolonie malé, průhledné, ploché s jasným středem a zrnitými okraji (Dicks a Holzapfel 2009). Teplotní optimum pro růst je 35 °C (Sedláček 2007). Optimální růstová hodnota pH se udává 6,5 aţ 6,6 (Dicks a Holzapfel 2009).

V buněčné stěně je přítomen murein (peptidoglykan) typ L-lysin-alaninn. Z mastných kyselin s dlouhým řetězcem podobně jako u enterokoků převaţují řetězce rovné, mononenasycené a mastné kyseliny s cyklopropanovými kruhy. Rody Enterococcus a Melissococcus dříve oba patřily ke streptokokům a jejich dalším společným rysem i typ antigenu podle Lancefieldové, tedy antigen typu D (Dicks a Holzapfel 2009).

Obr. 3: Melissococcus plutonius – fotografie ze skenovacího elektronového mikroskopu, přímka představuje měřítko 1 μm (upraveno podle Forsgren 2010).

4.2.3. Metabolismus

Melisokoky patří mezi bakterie s chemoorganotrofním růstem. Z cukrů však vyuţívají jen glukózu a fruktózu, jiné cukerné látky jsou okyselovány zřídka, i kdyţ některé kmeny mohou fermentovat sacharózu, maltózu, melezitózu nebo salicin. Hlavním produktem fermentace je kyselina mléčná s malým mnoţstvím kyseliny octové, isomáselné a jantarové (Dicks a Holzapfel 2009). Některé kmeny melisokoků dokáţí hydrolyzovat eskulin a mohou produkovat β-glukozidázu. Mezi další enzymy, které jsou produkovány, patří fosfatáza a β-galaktozidáza (Arai a kol. 2012).

18 4.2.4. Genom

Rod Melissococcus zahrnuje jediný druh Melissococcus plutonius a pro sekvenaci jeho genomu byl vybrán kmen, který byl původně uloţen do sbírky při prvotním popisu rodu, respektive druhu, Baileym a Collinsem. Genom se skládá z jedné kruţnicové molekuly DNA s obsahem G+C párů 29-30 mol% a velikosti necelých 1 900 kb a plazmidu velkého téměř 178 kb (Okumura 2011). Plazmid kóduje různé transportní proteiny, dále enzymy, které se účastní metabolismu cukrů, a dokonce NADH dehydrogenázu. V chromozomu byl také zaznamenán profágový element, přestoţe byla zjištěna přítomnost krátkých palindromatických sekvencí, tzv. CRISPR, které poskytují odolnost vůči infekci bakteriofágy (Okumura 2011).

4.3. Rod Tetragenococcus

4.3.1. Historie

V roce 1934 holandský vědec Mees izoloval, a ve své práci popsal, druh „Pediococcus halophilus“ (Yong a Wood 1974), který byl později přejmenován na Tetragenococcus halophilus a přiřazen k fylogeneticky bliţším enterokokům coby nový rod (Collins a kol. 1990). Tato změna však byla uznána aţ v roce 1993. Pojmenování rodu Tetragenococcus vzniklo ze tří slov řeckého původu. Byla to slova „tetra“ – čtyři, „genes“ – tvořit a „kokkos“ – obilka. Rodové jméno tedy poukazuje na schopnost těchto mikrobů tvořit tetrády (Dicks a kol. 2009).

4.3.2. Fenotypové vlastnosti

Tetragenokoky jsou grampozitivní sférické nebo ovoidní buňky, které lze pozorovat jednotlivě, v párech a díky dělení ve dvou rovinách také v tetrádách. Zástupci tohoto rodu jsou nepohybliví, kataláza i oxidáza negativní a netvoří endospory. Jedná se o fakultativní anaeroby (Dicks a kol. 2009). Optimální podmínky pro růst jsou při teplotě 25-35 °C a koncentraci 5-10 % NaCl. Tetragenokoky nejsou schopné růstu při 10 ani 45 °C, ale v závislosti na druhu dokáţí růst v médiu s 1 % aţ 25 % NaCl. Jsou to tedy halofilní bakterie a jejich růst při 10 % NaCl lze vyuţít k odlišení od příbuzných pediokoků (Dicks a kol. 2009). Jeden druh, Tetragenococcus muriaticus, dokonce NaCl k růstu přímo vyţaduje (Satomi a kol. 1997)

19 Tyto mikroorganismy lze také povaţovat za mírně alkalifilní, kdy optimální pH je 7,0-8,0, naopak nerostou při pH niţším neţ 4,5 (Dicks a kol. 2009). Peptidoglykan, který je přítomen v buněčné stěně, je typu lysin-D-kyselina asparagová (Holzapfel a kol. 2006). Mastné kyseliny mohou být nasycené, mononenasycené nebo s cyklopropanovými kruhy (Dicks a kol. 2009).

4.3.3. Metabolismus

Růst je chemoorganotrofní. Metabolismus bakterií tohoto rodu je homofermentativní, kdy fermentací glukózy vzniká jako hlavní produkt L(+)-kyselina mléčná a zároveň nedochází k tvorbě plynu. Někdy můţe docházet ke vzniku stopového mnoţství D(-)-kyseliny mléčné, ale tato schopnost je druhově specifická (Dicks a kol. 2009). Tetragenokoky dokáţí vyuţívat široké spektrum cukerných substrátů, avšak utilizace určitých cukrů závisí také na daném druhu (Holzapfel a kol. 2006). Fermentace, která je zdrojem energie, probíhá Embden-Meyerhofovou drahou (Holzapfel a kol. 2006). Tetragenokoky nedokáţí redukovat nitráty ani nehydrolyzují arginin (Dicks a kol. 2009). Jako halofilní bakterie mohou produkovat aminopeptidázy, a proto hrají důleţitou roli např. při fermentaci rybích omáček (Udomsil a kol. 2010).

4.3.4. Genom

Dosud je znám pouze obsah G+C párů v genomové DNA, který činí 34-38,3 mol%, nikoli velikost genomu (Dicks a kol. 2009). U druhu Tetragenococcus halophilus byl vyizolován plazmid pUCL287 o velikosti 8,7 kb, který má mechanismus replikace tzv. théta-typu, tedy ţe replikace má dvě replikační vidlice a probíhá obousměrně. Jedná se o plazmid kryptický, protoţe jeho funkce není stále objasněna (Benachour a kol. 1997). Přibliţně 22 kb velký plazmid pD1, který kóduje dekarboxylaci kyseliny asparagové na alanin, byl popsán u T. halophilus kmene D10 (Higuchi a kol. 1998). U kmenů T. halophilus získaných z rybí omáčky byl izolován plazmid pHDC, jehoţ mechanismus replikace je stejný jako u výše zmiňovaného kryptického plazmidu. Tento plazmid o velikosti 30 kb kóduje především gen hdc pro histidin dekarboxylázu. Dále také kóduje proteiny, které se zřejmě podílí na metabolismu cukrů (Satomi a kol. 2008).

20 Někteří zástupci rodu Tetragenococcus mohou obsahovat i jiné extrachromozomální elementy neţ jsou plazmidy. V případě jejich citlivosti k určitým bakteriofágům lze u tetragenokoků pozorovat tyto bakteriální viry ve formě profágů (Hanagata a kol. 2003).

4.4. Rod Vagococcus

4.4.1. Historie

Rod Vagococcus, další rod čeledě Enterococcaceae, byl popsán roku 1989 po izolaci z kuřecích výkalů a říční vody (Collins a kol. 1989a). Validně uznán byl ale aţ v následujícím roce. Název rodu byl vytvořen na základě latinského slova „vagus“, které znamená putování, a slova řeckého původu „kokkos“, tedy obilka. Ve volném překladu označuje jméno Vagococcus ovoidní či kokovité bakterie schopné pohybu (Collins 2009).

4.4.2. Fenotypové vlastnosti

Grampozitivní vagokoky ovoidního tvaru se vyskytují jednotlivě, v párech nebo krátkých řetízcích. Netvoří endospory, jsou kataláza negativní. Některé druhy, popřípadě kmeny, můţou být pohyblivé peritrichálními bičíky. Na agaru s přídavkem koňské nebo ovčí krve mohou opět určité druhy poskytovat α-hemolýzu. Ve vztahu ke kyslíku jsou to fakultativní anaerobové (Collins 2009). Většina kmenů můţe růst při teplotě 10°C, někdy i niţší, avšak pouze některé jsou schopny růstu i při 40 °C. Optimální teplota se odvíjí od daného druhu a prostředí, ve kterém se nachází. Obecně se udává, ţe vagokoky nerostou při 6,5 % koncentraci NaCl v médiu (Collins 2009), i kdyţ existují zprávy, ţe u jistých kmenů byl růst při této koncentraci NaCl pozorován (Teixeira a kol. 1997, Shewmaker a kol. 2004). Určité kmeny dokáţí růst při pH 9,6, ale rozmezí i optimum je druhově závislé (Collins 2009). Například druh Vagococcus acidifermentans roste při pH 4,0 aţ 9,0, od čehoţ je také odvozen druhový název (Wang a kol. 2011). U vagokoků je buněčná stěna typu L-lysin-D-kyselina asparagová (Collins a kol. 1989a). Z mastných kyselin přítomných v membránách jsou nejčastější mastné kyseliny nasycené s přímým řetězcem či kyseliny mononenasycené (Wallbanks a kol. 1990). Tyto bakterie můţeme také zařadit do sérologických skupin podle Lancefieldové. Nejčastěji

21 vystavují antigen skupiny N (Sedláček 2007), ale některé kmeny mohou slabě reagovat i s antisérem skupiny D (Teixeira a kol. 1997).

4.4.3. Metabolismus

Stejně jako předchozí rody čeledě Enterococcaceae jsou vagokoky chemoorganotrofní. Růst je homofermentativní, při fermentaci glukózy tedy vzniká L(+)-kyselina mléčná jako hlavní produkt a přitom se netvoří plyn. Jako zdroj energie slouţí i další rozmanité cukry a cukerné alkoholy, ale schopnost vyuţití určitých sacharidů je dána druhově (Collins 2009). Vagokoky nehydrolyzují ţelatinu, hipurát ani arginin, neredukují nitráty na nitrity. Některé kmeny produkují acetoin. V médiu s přídavkem ţluče můţou poskytovat pozitivní reakci pro hydrolýzu eskulinu (Collins 2009).

4.4.4. Genom

Obsah G+C párů v gemomu se pohybuje od 34 mol% u druhu Vagococcus carniphilus (Shewmaker a kol. 2004) aţ po 44,5 mol% v genomu Vagococcus elongatus (Lawson a kol. 2007).

4.5. Rod Catellicoccus

4.5.1. Historie

Rod Catellicoccus byl popsán poměrně nedávno v roce 2006, kdy jej vědci izolovali z mořských savců tuleně Halichoerius grypus a sviňuchy Phocoena phocoena (Lawson a kol. 2006). Stejně jako u ostatních zmíněných rodů i název rodu Catellicoccus poukazuje na některé vlastnosti tohoto mikroba. Původem je ze slov „catella“, coţ je latinský pojem pro řetízek, a slova řeckého původu „kokkos“, které znamená obilka. Jedná se tedy o koky schopné tvořit řetízky (Lawson a kol. 2006).

4.5.2. Fenotypové vlastnosti

Buňky jsou ve tvaru koků, které se vyskytují v párech nebo řetízcích. Tyto nepohyblivé grampozitivní bakterie netvoří endospory, jsou kataláza negativní a fakultativně anaerobní, kdy zvýšený obsah CO2 pozitivně ovlivňuje jejich růst (Lawson a kol. 2006).

22 Po jednodenní kultivaci na krevním agaru vytváří poloprůsvitné kulaté, celistvé kolonie o průměru 0,25 aţ 0,55 mm. Na agaru obohaceném ovčí krví netvoří hemolýzu (Lawson a kol. 2006). Rostou při teplotě 37 °C, ale nejsou schopny růstu v 10 °C. Dokáţí však růst v médiu s přídavkem 10 % ţluče (Lawson a kol. 2006). Murein v buněčné stěně, který je zaloţený na lysinu, je typu L-lysin-glycin-D-kyselina asparagová, coţ je u grampozitivních, kataláza negativních bakterií celkem vzácné. Pod buněčnou stěnou je umístěn antigen schopný reagovat s antisérem skupiny D podle Lancefieldové (Lawson a kol. 2006).

4.5.3. Metabolismus

Růst katelikoků je chemoorganotrofní s moţností fermentace trehalózy. Kyselinu netvoří z L-arabinózy, D-arabitolu, glykogenu, inulinu, laktózy, maltózy, mannitolu, ribózy, sacharózy, škrobu, tagatózy a některých dalších cukrů (Lawson a kol. 2006). Eskulin ani hipurát není těmito bakteriemi hydrolyzován. Produkují arginin dihydrolázu a leucin arylamidázu. Naopak netvoří alkalickou fosfatázu. Voges-Proskauerova reakce, tedy tvorba acetoinu, je negativní. Nitráty nejsou redukovány na nitrity. V závislosti na daném kmenu je moţná tvorba glycyl tryptofan arylaminázy a ureázy (Lawson a kol. 2006).

4.5.4. Genom

Rod Catellicoccus byl popsán poměrně nedávno a je zatím rodem s jediným druhem Catellicoccus marimammalium, jehoţ genom nebyl dosud sekvenován. Je však znám obsah G+C v genomové DNA, který činí 38 mol% (Lawson a kol. 2006).

4.6. Rod Pilibacter

4.6.1. Historie

Rod Pilibacter byl izolován v roce 2006 ze střeva termita Coptotermes formosanus (Higashiguchi a kol. 2006). Název rodu Pilibacter je odvozen ze slova latinského původu „pilum“, coţ znamená oštěp, a slova „bacter“, které pochází z řeckého „bacteron“, tedy tyč. Rodové jméno tak vypovídá o tvaru bakteriální buňky (Higashiguchi a kol. 2006).

23 4.6.2. Fenotypové vlastnosti

Na rozdíl od ostatních rodů čeledě Enterococcaceae mají bakterie rodu Pilibacter tvar nepravidelných tyček s typicky zúţenými konci (viz obr. 4). Nejčastěji se vyskytují jednotlivě, v párech nebo tvoří palisády. Jsou grampozitivní, avšak starší kultury mají sklon se odbarvovat. Jde o bakterie anaerobní, kataláza i oxidáza negativní, netvořící endospory (Higashiguchi a kol. 2006). Pilibaktery tvoří krémově zbarvené kolonie, které mohou být na krevním agaru α-hemolytické (Higashiguchi a kol. 2006). Růst byl zaznamenán při 20 °C, ale ne při 42 °C. Bakterie tohoto rodu nejsou schopné růstu v médiu s přídavkem NaCl o koncentraci 6,5 % (Higashiguchi a kol. 2006). Typ peptidoglykanu v buněčné stěně nebyl dosud popsán. Hlavními mastnými kyselinami s dlouhým řetězcem jsou mastné kyseliny typu nasyceného či mononenasyceného (Higashiguchi a kol. 2006).

Obr. 4: Pilibacter termitis – snímek ze skenovacího elektronového mikroskopu, měřítko 2 μm (upraveno podle Higashiguchi a kol. 2006).

4.6.3. Metabolismus

Pilibaktery patří k bakteriím mléčného kvašení. Jsou to tedy chemoorganotrofové s heterofermentací, kdy spolu s kyselinou mléčnou je tvořen ve větší míře také etanol. Na kyselinu jsou přeměňovány cukry jako je D-xylóza, D-galaktóza, D-fruktóza, D-manóza, D-sorbitol, N-acetyglukosamin, salicin, D-celobióza, D-maltóza, D-laktóza nebo

24 D-trehalóza, zatímco z glycerolu, erytritolu, arabinózy, D-ribózy, L-xylózy, D-manitolu, sacharózy, inulinu a některých dalších cukerných substrátů se kyselina netvoří (Higashiguchi a kol. 2006). Zástupci tohoto rodu nehydrolyzují ţelatinu, DNA, hipurát ani škrob. Neprodukují ureázu či arginin dehydrolázu. Voges-Proskauerova reakce na tvorbu acetoinu je negativní. Nitráty nejsou redukovány na nitrity (Higashiguchi a kol. 2006).

4.6.4. Genom

Podobně jako fylogeneticky příbuzný rod Catellicoccus je i rod Pilibacter relativně mladým rodem pouze s jedním druhem Pilibacter termitis. Dosud nebyla provedena sekvenace celého genomu, je pouze známo, ţe obsah G+C v genomové DNA je 37,8 mol% (Higashiguchi a kol. 2006).

25 5. Ekologie a výskyt

5.1. Rod Enterococcus

Enterokoky jsou bakterie široce rozšířené v nejrůznějších habitatech. Dodnes bylo popsáno celkem 43 druhů. Spousta zástupců tohoto rodu byla izolována ze zvířat nebo z člověka. Nejčastěji se vyskytují v intestinálním traktu teplokrevných ţivočichů, méně četné jsou v jejich pohlavním traktu a ústní dutině. Jsou však také získávány z plazů, ptáků i hmyzu. Některé enterokoky působí jako běţní komenzálové, jiné však mohou svému hostiteli způsobovat zdravotní potíţe jako septikémie, endokarditidy a další. Velký význam mají tyto bakterie zvláště z pohledu humánní klinické mikrobiologie, protoţe se jedná o časté původce nozokominálních infekcí (Švec a Devriese 2009). Enterokokům coby bakteriím způsobujícím infekce je věnována kapitola 6.1. Klinický význam.

5.1.1. Enterokoky u živočichů

Jak jiţ bylo zmíněno, enterokoky jsou obvyklou mikroflórou trávícího traktu teplokrevných zvířat. Zřejmě nejčastějšími druhy jsou E. faecium a E. faecalis. Druh Enterococcus villorum byl izolován ze střeva selat (Vancanneyt a kol. 2001), Enterococcus ratti ze střeva krysy (Teixeira a kol. 2001) a Enterococcus asini ze střeva osla (de Vaux a kol. 1998). Z análních výtěrů a chronických otitid psů byl získán Enterococcus canis (De Graef a kol. 2003), zatímco ze střev zdravých psů Enterococcus canintestini (Naser a kol. 2005a). Enterococcus hermanniensis byl izolován také ze psů, konkrétně z jejich mandlí (Koort a kol. 2004). U skotu byl objeven Enterococcus devriesei (Švec a kol. 2005b). Ze stěv a podestýlky skotu byl získán Enterococcus saccharolyticus (Rodrigues a Collins 1990). Enterococcus pseudoavium byl izolován z mastitid krav (Collins a kol. 1989b). U drůbeţe se vyskytují druhy Enterococcus avium, Enterococcus gallinarum (Collins a kol. 1984) a Enterococcus hirae (Farrow a Collins 1985), ale E. avium a E. gallinarum bývají častěji neţ z ptáků izolovány z feces savců včetně člověka (Švec a Devriese 2009). Enterococcus cecorum byl izolován ze slepého střeva kuřat (Williams a kol. 1989). Z dudkovce stromového (Phoeniculus purpureus) byl získán Enterococcus phoeniculicola (Law-Brown a Meyers 2003). Ve střevech holubů byl nalezen Enterococcus columbae (Devriese a kol. 1990).

26 Enterococcus casseliflavus byl dokonce izlován z hlemýţdě jihoevropského (Helix aspersa) (Švec a kol. 2002). Enterokoky tvoří mikroflóru i u hmyzu, který saje nektar jako jsou včely a čmeláci, ale jsou přítomné také u slunéček a dalších brouků. Z těchto bezobratlých byly izolovány druhy E. faecalis, E. faecium či E. casseliflavus. Hmyz můţe slouţit jako zimní útočiště pro enterokoky vyskytující se také na rostlinách, na které se na počátku vegetačního období díky hmyzu opět přenesou (Martin a Mundt 1972). Ze střev termitů byl získán Enterococcus termitis (Švec a kol. 2006).

5.1.2. Enterokoky u člověka

Převaţujícími druhy v trávícím traktu člověka jsou E. faecalis a E. faecium. Z humánního klinického materiálu (vagina, ţluč, feces) byly dále získány druhy Enterococcus raffinosus (Collins a kol. 1989b), Enterococcus gilvus, Enterococcus pallens (Tyrrell a kol. 2002), Enterococcus caccae (Carvalho a kol. 2006) a Enterococcus dispar (Collins a kol. 1991). Mimo tyto enterokoky, které se nacházejí převáţně u člověka, lze z humánních vzorků vyizolovat i Enterococcus durans, E. avium, E. cecorum, E. gallinarum, E. hirae nebo Enterococcus mundtii (Švec a Devriese 2009).

5.1.3. Enterokoky na rostlinách

Enterokoky jsou přítomny i na rostlinách. Mundt ve své studii uvádí, ţe tyto bakterie zde jsou jen dočasnou mikroflórou, protoţe kaţdé vegetační období musí enterokoky rostlinu znovu osídlit. Častěji se vyskytují na květech neţ na listech či pupenech a na jejich šíření se podílí hmyz a vítr (Mundt 1961). Z rostlin byly dosud izolovány druhy E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. casseliflavus, E. mundtii, Enterococcus sulfureus (Ott a kol. 2001), Enterococcus camelliae (Sukontasing a kol. 2007), Enterococcus plantarum (Švec a kol., v tisku), Enterococcus ureilyticus a Enterococcus rotai (Sedláček a kol., v tisku).

5.1.4. Enterokoky v půdě

Výskyt enterokoků v půdě je velmi nízký a zřejmě je způsoben kontaminací z ţivočichů nebo z rostlin pomocí větru a deště (Mundt 1961). Hypotézu, ţe půda není pro tyto mikroby vyloţeně přirozeným prostředím, dokazuje i studie, při které byly enterokoky vyizolovány pouze z 8 vzorků půdy z celkových 369 a byly identifikovány jako E. feacalis (Medrek a Litsky 1960). Dalšími druhy, které byly izolovány z půdního prostředí, jsou E. mundtii (Collins a kol. 1986) a E. casseliflavus (Collins a kol. 1984).

27 5.1.5. Enterokoky ve vodách

Enterokoky jsou přítomny také ve vodách. Můţe se jednat o vody sladké i slané. Z povrchových sladkých vod byly izolovány druhy Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus moraviensis (Švec a kol. 2001), Enterococcus ureasiticus, Enterococcus quebecensis (Sistek a kol., v tisku), Enterococcus silesiacus (Švec a kol. 2006) a Enterococcus rivorum (Niemi a kol., v tisku). Z mořské vody byl získán Enterococcus aquimarinus (Švec a kol. 2005a). Podobně jako do půdy se však mohou enterokoky dostat do vody z vyšších organismů, zvláště z výkalů ţivočichů, coţ se obecně povaţuje za fekální znečištění. Nějčastěji bývají z kontaminovaných vod izolovány druhy E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, méně častěji E. avium, E. gallinarum, E. cecorum a E. columbae. Tyto bakterie jsou schopné ve vodě dlouho přeţívat a lze je tedy vyuţít jako indikátory znečištění i při kontaminaci vodního zdroje ve větší vzdálenosti od místa testování (Švec a Devriese 2009).

5.1.6. Enterokoky v potravinách

Význam mají enterokoky také v potravinářství. Mohou být příčinou kontaminace a kaţení potravin, ale na druhé straně se některé kmeny vyuţívají jako startéry pro výrobu fermentovaných sýrů či uzenin (Franz a kol. 2003). Druhové zastoupení závisí na typu potraviny. Z mléčných produktů bývají nejčastěji izolovány druhy E. faecium a E. faecalis (Franz a kol. 2003). Z italských sýrů, vyráběných ze syrového mléka, byly získány druhy E. lactis (Morandi a kol., v tisku) a E. italicus (Grazia Fortina a kol. 2004), z holandského sýru „Gouda“ druh Enterococcus malodoratus (Collins a kol. 1984). Mastné produkty nejčastěji obsahují E. faecium a E. faecalis, méně často E. durans a E. hirae. Z krůtího masa můţe být získán E. gallinarum, z masa brojlerů byl izolován E. hermanniensis (Koort a kol. 2004). Výskyt Enterococcus viikkiensis byl zjištěn v produktech vyráběných z brojlerů (Rahkila a kol. 2011). Enterococcus thailandicus byl izolován z fermentované uzeniny thajského původu zvané „mum“ (Tanasupawat a kol. 2008). Tématem významu enterokoků v potravinách se podrobněji zabývá kapitola 6.2. Potravinářství.

5.1.7. Dělení enterokoků

Enterokoky lze na základě fylogenetické příbuznosti, tedy podobnosti genu pro 16S rRNA, dělit do sedmi skupin (Tabulka 1) (Franz a kol. 2011).

28 Tabulka 1. Zařazení jednotlivých druhů enterokoků do skupin (upraveno podle Franz a kol. 2011; Morandi a kol., v tisku; Niemi a kol., v tisku; Sedláček a kol., v tisku; Švec a kol., v tisku; Rahkila a kol. 2011).

Druhová skupina založená na Druhy podobnosti genu pro 16S rRNA Skupina druhu E. avium E. avium, E. devriesei, E. gilvus, E. malodoratus, E. pseudoavium, E. raffinossus, E. viikkiensis Skupina druhu E. cecorum E. cecorum, E. columbae Skupina druhu E. dispar E. dispar, E. asini, E. canintestini, E. hermanniensis, E. pallens Skupina druhu E. faecalis E. faecalis, E. caccae, E. haemoperoxidus, E. moraviensis, E. plantarum, E. rivorum, E. rotai, E. silesiacus, E. termitis, E. ureasiticus, E. ureilyticus, E. quebecensis Skupina druhu E. faecium E. faecium, E. canis, E. durans, E. hirae, E. lactis, E. mundtii, E. phoeniculicola, E. ratti, E. villorum, E. thailandicus Skupina druhu E. gallinarum E. gallinarum, E. casseliflavus Skupina druhu E. saccharolyticus E. saccharolyticus, E. aquimarinus, E. camelliae, E. italicus, E. sulfureus

5.2. Rod Melissococcus

Jediný druh tohoto rodu Melissococcus plutonius je významným patogenem včel, který má za následek nemoc zvanou hniloba včelího plodu. Bakterie je celosvětově rozšířená a byla izolována nejen ze včely medonosné (Apis mellifera), ale i z dalších druhů včel jako je včela východní (Apis carana) a včela skalní (Apis laboriosa). Podobným onemocněním je také mor včelího plodu, který je způsoben bakterií Paenibacillus larvae (Forsgren 2010). Melissococcus plutonius napadá larvy ve špatně utěsněných komůrkách a zabíjí je ve stáří 4-5 dnů. Do larev se dostává skrze kontaminovanou potravu. Infikovaná larva se pohybuje po komůrce, na rozdíl od zdravé není stočená, a často umírá mimo komůrku. Barva larev se při napadení chorobou mění z normální bílé přes ţlutou a hnědou aţ na šedočernou v době rozkladu (Forsgren 2010). Melisokok se v přírodě mnoţí pouze ve střevě včelích larev. Šíření v kolonii včel je zřejmě závislé na přeţivších infikovaných jedincích, kteří bakterii rozšiřují přes své výkaly. Melisococcus plutonius je odolný proti dlouhodobějšímu vysušování, takţe ve fekáliích přeţívá a můţe opět napadat další larvy. Všichni jedinci v koloniích však nemusí být infikováni. Mezi jednotlivými včelstvy nesou za šíření nemoci na delší vzdálenosti odpovědnost dospělé infikované dělnice, které přeţily larvální stádium, v němţ byly

29 napadeny. Melisokok je citlivý na antibiotikum oxytetracyklin hydrochlorid, které brání této bakterii v mnoţení, čehoţ se vyuţívá k prevenci a léčbě hniloby včelího plodu. Kolonie včel těţce postiţené infekcí je však potřeba zcela zničit (Forsgren 2010).

5.3. Rod Tetragenococcus

Tetragenokoků je k nyní 5 druhů, kdy druh Tetragenococcus halophilus se nově dělí na dva poddruhy (Justé a kol. 2012). Tyto bakterie nejsou patogenní pro rostliny či zvířata a nejčastěji bývají izolovány z potravin, především se zvýšeným obsahem soli, ale druh Tetragenococcus solitarius byl původně získán z humánního klinického materiálu (Dicks a kol. 2009). Zřejmě největší význam mají zástupci tohoto rodu v potravinářství, protoţe jsou přítomní při fermentacích některých omáček, kde produkty těchto mléčných bakterií působí jako konzervace a ochrana před neţádoucími mikroorganismy (Kobayashi a kol. 2004). Snad nejčastějším mléčným kokem přítomným v potravinách o vysoké koncentraci soli je Tetragenococcus halophilus, dříve „Pediococcus halophilus“, který byl vyizolován z nakládaných i solených ančoviček, z rybí omáčky a také z omáčky sójové, při jejíţ výrobě se dokonce tento tetragenokok pouţívá jako startovací kultura (Dicks a kol. 2009). Některé kmeny této bakterie byly nově získány z husté cukerné šťávy (meziproduktu při rafinaci řepného cukru), kde způsobovaly degradaci cukru. Tyto kmeny se v určitých vlastnostech lišily od ostatních kmenů druhu T. halophilus, a proto byl druh T. halophilus rozdělen na dva poddruhy – T. halophilus subsp. halophilus pro kmeny ze slaného prostředí a T. halophilus subsp. flandriensis pro kmeny z cukerné šťávy (Justé a kol. 2012). Další druhy tetragenokoků byly také vyizolovány z potravin. Tetragenococcus muriaticus byl získán z fermentované omáčky z jater olihní (Satomi a kol. 1997), Tetragenococcus koreensis z tradičního korejského jídla jménem „kimchi“, které obsahuje různé druhy zeleniny, koření a dalších ingrediencí a zraje v anaerobních podmínkách za pomoci bakterií přítomných v surovém materiálu (Lee a kol. 2005). Tetragenococcus osmophilus byl stejně jako T. halophilus subsp. flandriensis vyizolován z husté cukerné šťávy (Justé a kol. 2012). Výjimku tvoří druh T. solitarius, který byl prvotně popsán ve vzorcích humánního klinického materiálu a jeho výskyt v potravinách nebyl dosud zaznamenán. Tento druh dříve patřil do rodu Enterococcus, ale sekvenací genu pro 16S rRNA byla zjištěna jeho větší příbuznost s tetragenokoky neţ s enterokoky (Ennahar a Cai 2005).

30 5.4. Rod Vagococcus

Rod Vagococcus má dnes 8 druhů, které se vyskytují v prostředí, ale také v ţivočiších včetně člověka, kde mohou vystupovat jako běţná mikroflóra či jako oportunní patogeny (Collins 2009). Prvním vyizolovaným druhem je Vagococcus fluvialis (Collins a kol. 1989). Je moţné jej najít v rozmanitých zdrojích jako jsou domestikovaná zvířata (Pot a kol. 1994), ale i v humánních klinických vzorcích (Teixeira a kol. 1997). V. fluvialis lze pro některé ţivočichy povaţovat za oportunního patogena (Collins 2009). Naproti tomu byla u ryby mořčáka evropského (Dicentrarchus labrax) zjištěna probiotická aktivita kmene V. fluvialis působící proti vibrióze způsobené bakterií Vibrio anguillarum. Tato aktivita byla dosud prokázána in vitro a předurčuje tedy V. fluvialis do budoucna jako potencionální probiotikum k léčbě a prevenci vibriózy ve vodohospodářství (Sorroza a kol. 2012). Vagococcus salmoninarum byl vyizolován v USA z nemocného pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) (Wallbanks a kol. 1990), ale následně byl objeven i u některých dalších lososovitých ryb v jiných částech světa (Collins 2009). V. salmoninarum je původcem nemoci lososovitých ryb, která se projevuje různými příznaky (např. letargie či anorexie) a ty způsobují problémy při tření. Tato nemoc má za následek zvýšený úhyn ryb, coţ můţe způsobovat velké ekonomické ztráty v chovech ryb. Šíření choroby je stále na vzestupu a problémem je i rezistence vagokoků k antibiotikům, které jsou pro vodohospodářství povolené (Ruiz-Zarzuela a kol. 2005). Další druh Vagococcus lutrae by získán z vydry říční (Lutra lutra), která uhynula při autonehodě. Na základě pitvy bylo zjištěno, ţe vydra byla před smrtí v dobrém zdravotním stavu, a proto nelze říci jakou úlohu hraje V. lutrae z pohledu svého hostitele (Lawson a kol. 1999). U druhu Vagococcus fessus, který byl vyizolován z mršin tuleně a sviňuchy, také není jeho patologický význam znám (Hoyles a kol. 2000). Vagococcus carniphilus byl objeven v mletém hovězím mase. Jeho role v infekcích či kontaminaci potravin není dosud prozkoumána, ale předpokládá se, ţe můţe být spojen s oportunními infekcemi podobně jako V. fluvialis (Shewmaker a kol. 2004). Ze skladovací jámy na prasečí hnůj byl získán V. elongatus, jehoţ přirozený výskyt nebyl zjištěn (Lawson a kol. 2007). Další vagokok izolovaný z potraviny, přesněji jiţ zkaţených vařených krevet bílých (Penaeus vannamei), je Vagococcus penaei (Jaffres a kol. 2010). Dosud poslední popsaný druh je V. acidifermentans, který byl izolován z bioreaktoru s acidogenním kvašením slouţícímu k ošetření odpadních vod z potravinářství (Wang a kol. 2011).

31 5.5. Rod Catellicoccus

Rod Catellicoccus obsahuje v současné době pouze jeden druh a to Catellicoccus marimammalium, jehoţ dva kmeny byly vyizolovány z mršin mořských savců. (Lawson a kol. 2006). Kromě primární izolace nejsou dosud zprávy o jiném výskytu těchto bakterií. Také není jasný vztah tohoto mikroorganismu ke svým hostitelům, tedy zda vystupuje jako bakterie běţné mikroflóry či jestli má patogenní vlastnosti. První a také typový kmen pocházel z mrtvé sviňuchy obecné (Phocoena phocoena), která byla nalezena na východním pobřeţí Skotska. Příčinou smrti zvířete byla těţká enteritida (zánět střeva) a peritonitida (zánět pobřišnice). Katelikok byl získán pro identifikaci z různých tkání v břišní dutině, přesněji z mesenteria, ledvin, tenkého střeva, perikardiální a peritoneální tekutiny (Lawson a kol. 2006). Druhým kmenem je bakterie izolovaná z tenkého střeva tuleně kuţelozubého (Halichoerius grypus), jehoţ mršina pocházela z jiţního pobřeţí Skotska. Smrt tohoto jedince však nezpůsobila ţádná nemoc či infekce (Lawson a kol. 2006).

5.6. Rod Pilibacter

Rod Pilibacter je dnes tvořen pouze jedním druhovým zástupce Pilibacter termitis, který byl vyizolován z termita pocházejícího z kolonií na Havaji. Přesněji se jednalo o zadní střevo termita Coptotermes formosanus Shiraki, který patří do třídy Insecta (hmyz), řádu Dictyoptera, podřádu Isoptera (všekazi) a čeledě Rhinotermitidae (Higashiguchi a kol. 2006). Jiţ v dřívějších studiích bylo prokázáno, ţe střevo různých druhů termitů je místem výskytu značného mnoţství rozmanitých bakterií patřících do kmenů Proteobacteria, Spirochaetes, Bacteroidetes, Firmicutes a dalších (Ohkuma a Kudo 1996). Častými mikroorganismy, které jsou přítomné v intestinálním traktu termitů, jsou zástupci řádu Lactobacillales, kam se řadí i Pilibacter. Pravý význam mléčných bakterií není dosud objasněn, ale předpokládá se, ţe hrají důleţitou roli při udrţování homeostáze v bakteriálním společenstvu přítomném v termitím střevu (Higashiguchi a kol. 2006).

32 6. Význam

6.1. Klinický význam

Někteří zástupci čeledě Enterococcaceae mohou být pro své hostitele patogenní či oportunně patogenní a způsobovat tak různá onemocnění. O patogenitě druhů M. plutonius a V. fluvialis či V. salmoninarum byla zmínka jiţ v kapitole 5. Ekologie a výskyt. Tato kapitola se proto zaměří pouze na klinický význam rodu Enterococcus, jehoţ někteří zástupci jsou pro člověka důleţití z pohledu humánní klinické mikrobiologie.

6.1.1. Onemocnění

Enterokoky bývaly dříve známé jen jako bakterie způsobující endokarditidy, vzácněji meningitidy. Dnes jsou tyto oportunní patogeny povaţovány za jednu z nejčastějších příčin nozokomiálních infekcí, tedy infekcí získaných při pobytu v nemocnici (Devriese a kol. 2006). U člověka způsobují enterokoky bakterémie, infekce ran, meningitidy, peritonitidy, osteomyelitidy, infekce ţlučových i močových cest a gynekologické záněty (Černohorská 2003). Účastní se i infekcí respiračního traktu a centrálního nervového systému, otitid, sinusitid (zánět dutin), septických artritid či infekcí popálenin (Švec a Devriese 2009). Enterokokální infekce jsou velmi časté u dlouhodobě hospitalizovaných pacientů, kteří mají zavedený močový či intravaskulární katetr, dále u pacientů léčených širokospektrými antibiotiky, na něţ bývají enterokoky většinou rezistentní (Černohorská 2003), či u lidí se sníţenou imunitou (Franz a kol. 2003). Kmeny způsobující nozokomiální infekce bývají často rezistentní ke konvenčním antibiotikům (Černohorská 2003). Infekce zapříčiněné enterokoky jsou aţ z 90 % způsobené E. faecalis, asi ze 7 % E. faecium (Černohorská 2003) a zbytek tvoří ostatní druhy jako například E. gallinarum, který byl izolován z endokarditidy (Dargere a kol. 2002), či E. raffinosus způsobující vaginální infekce (Savini a kol. 2008). Enterokoky tvoří podstatnou sloţku infikující mikroflóry v případě břišních infekcí, které bývají většinou polymikrobní. Účastní se také peritonitid spojených s chronickou ambulantí peritoneální dialýzou, salpingitid (tedy zánětů vejcovodů) a pánevních abscesů (Devriese a kol. 2006). Enterokokální endokarditidy jsou časté u uţivatelů drog pomocí injekčních stříkaček, ale také u starších lidí. V obou těchto případech můţe být mortalita poměrně vysoká (Černohorská 2003).

33 6.1.2. Faktory virulence

Faktory virulence hrají v patogenitě enterokoků důleţitou roli podobně jako rezistence k antibiotikům. Jsou odpovědné převáţně za adherenci, kolonizaci a invazi do tkání hostitele. V posledních letech byly některé faktory virulence enterokoků podrobněji popsány, jiné jsou však teprve zkoumány a jejich princip účasti na infekcích je dosud neznámý (Franz a kol. 2011). Hlavním faktorem virulence je agragační substance (dále jen AS), coţ je adhezin, který je kódován feromonovým plazmidem. AS indukuje shlukování enterokokálních buněk a to vede k efektivnímu přenosu samotného plazmidu (Franz a kol. 2003). Takto vytvořené shluky enterokoků jsou dokonce určitou dobu po infekci mnohem odolnější k lidským makrofágům (Süßmuth a kol. 2000). Kromě vazby na buněčné receptory bakterií, ale také lidských makrofágů a epiteliálních buněk, se AS můţe vázat i na proteiny extracelulární matrix jako je fibronektin, trombospondin či kolagen typu I. To vše přispívá ke vzniku infekcí ran a bakteriálních endokarditid (Franz a kol. 2003). Mezi další adheziny patří chromozomálně kódovaný enterokokální povrchový protein nebo kolagen vázající protein tzv. adhezin kolagenu z E. faecalis, jeţ se váţe nejen na kolagen typu I a IV, ale i na laminin a je spojen s tvorbou biofilmu u tohoto enterokoka (Franz a kol. 2003). Tyto adheziny jsou odpovědné za přichycení bakteriální buňky ke stěně střeva či pochvy (Černohorská 2003). Za potencionální virulentní determinantu je moţné povaţovat také adhezinům podobné antigeny endokarditidy druhů E. faecalis a E. faecium (Franz a kol. 2011). Některými enterokoky produkovaný bakteriocin β-hemolyzin, nazýván téţ cytolyzin, inhibuje růst ostatních grampozitivních bakterií a tím usnadňuje enterokokům kolonizaci sliznice (Černohorská 2003). Další faktory virulence jsou enzym hyaluronidáza či proteolytický enzym želatináza narušující tkáně. Jako faktor virulence lze také povaţovat bakteriální pili, které se podílejí na vazbě enterokokoků k epiteliálním buňkám hostitele a úlohu mají i při endokarditidách (Franz a kol. 2011).

6.1.3. Rezistence k antibiotikům

Enterokoky jsou svou vlastní podstatou rezistentní k mnoha β-laktamům, fluorochinolonům, linkosamidům a také k nízké koncentraci aminoglykosidů. Rezistence k antibiotikům můţe být přirozená, kdy geny pro rezistenci jsou kódovány chromozomálně, nebo získaná, tedy zprostředkovaná extrachromozomálními DNA elementy jako jsou plazmidy či transpozony. Získané geny mohou kódovat rezistenci k chloramfenikolu,

34 tetracyklinům, makrolidům, linkosamidům, streptograminům, chinolonům a kódují zvláště vysokou úroveň rezistence k aminoglykosidům, β-laktamům a glykopeptidům (Švec a Devriese 2009). Vysoký stupeň rezistence k aminoglykosidům můţe být zprostředkován více způsoby. Můţe se jednat o jedinou mutací v proteinu ribozomální podjednotky 30S pro rezistenci ke streptomycinu nebo mohou enterokoky produkovat enzymy modifikující aminoglykosidy (Shepard a Gilmore 2002). Odolnost vůči β-laktamovým antibiotikům je charakteristická hlavně pro druhy E. faecalis a E. faecium. Principem rezistence je produkce specifického penicilin vázajícího proteinu PBP5. Míra produkce proteinu PBP5 koreluje se stupněm rezistence k penicilinu. Při ztrátě schopnosti produkovat protein PBP5 se původně rezistentní kmen stává citlivým. Produkce samotných β-laktamáz je u zmíněných druhů vzácná (Cetinkaya a kol. 2000). Váţným problémem jsou enterokoky rezistentní k vankomycinu. Právě za tento typ rezistence můţe být odpovědných šest fenotypů. Jedná se o fenotypy značené VanA, VanB, VanC, VanD, VanE a VanG. Jediný VanC je kódován chromozomálně a není tedy moţný jeho přenos. Ostatní fenotypy jsou určené přenosnými elementy (Švec a Devriese 2009). Fenotyp VanA se projevuje vysokým stupněm rezistence k vankomycinu a teikoplaninu (obě zmíněné antibiotika jsou ze skupiny glykopeptidů), VanB mírnou rezistencí k vankomycinu. Fenotypy VanA a VanB se vyskytují převáţně u E. faecalis a E. faecium. Odolnost můţe být vyvolána nejden glykopeptidy, ale i neglykopeptidickými látkami jako je například bacitracin. Fenotyp VanC charakterizuje přirozenou mírnou rezistenci k vankomycinu typickou pro druhy E. gallinarum a E. casseliflavus (Cetinkaya a kol. 2000). Fenotyp VanD kóduje mírnou rezistenci k vankomycinu i k teikoplaninu a byl nalezen u E. faecium. Fenotyp VanE se vykazuje nízkým stupněm a VanG mírným stupněm rezistence k vankomycinu (Švec a Devriese 2009).

6.2. Potravinářství

Enterokoky jsou běţnou mikroflórou potravin převáţně pocházejících ze zvířat jako je mléko, mléčné či masné výrobky (Švec a Devriese 2009). Tyto mléčné bakterie hrají důleţitou roli ve výrobě tradičních fermentovaných potravin zvláště v evropských státech kolem Středozemního moře. Jejich přítomnost v některých sýrech a uzeninách vede k jedinečným organoleptickým vlastnostem jako je chuť a aroma, ale také k podpoře zrání těchto produktů (Franz a kol. 2003).

35 Zdrojem enterokoků v mléce a mléčných produktech jsou zřejmě výkaly dojných krav, kontaminovaná voda, pracovní vybavení či nehygienické podmínky při výrobě (Garg a Mital 1991). Díky schopnosti růstu při zvýšeném pH i vysoké salinitě a moţnosti přeţívat při zvýšené teplotě zůstávají enterokoky v materiálu přítomné i během procesu jako je pasterizace (Giraffa 2002). Enterokoky se svými proteolytickými a esterolytickými vlastnostmi podílí na zrání sýru a napomáhají rozvíjení aroma, chuti, barvy a struktury. Právě pro tyto ţádoucí schopnosti se některé kmeny enterokoků pouţívají při výrobě tradičních sýrů jako startovací kultury. Nejčastěji se jedná o kmeny druhu E. faecium, které nesou menší riziko přítomnosti faktorů virulence či rezistence k antibiotikům neţ E. faecalis (Franz a kol. 2003). Další výhodou přítomnosti enterokoků v sýrech je produkce různých bakteriocinů, které mohou poskytovat ochranu výrobku před kontaminací neţádoucími bakteriemi jako je např. Listeria monocytogenes (Franz a kol. 2003). Enterokoky jsou často přítomné na mase, kam se mohou dostat při poráţce zvířete, ale také během jeho zpracování. V tomto případě se většinou jedná o kontaminaci a enterokoky odolné vůči vysoké teplotě, které jsou při zpracování masa vystaveny, působí jako původci kaţení produktu. Nejčastějšími druhy odpovědnými za znehodnocení potravin jsou E. faecium a E. faecalis (Franz a kol. 2003). Zástupci rodu Enterococcus se však ve fermentovaných mastných výrobcích vyskytují i jako ţádoucí mikroorganismy. Většinou se opět jedná o kmeny E. faecium a E. faecalis. Enterokoky byly izolovány například ze španělských sušených salámů „chorizo“ a „espetec“, kde mohou působit díky produkci bakteriocinů jako ochranné kultury před listeriemi. Nelze je však vyuţít jako startovací kultury, protoţe bakteriální růst i tvorba bakteriocinů je během zrání salámu inhibována nízkou teplotou a kořenícími přísadami (Franz a kol. 2003).

6.3. Probiotika

Některé kmeny enterokoků se vyuţívají jako probiotika k podpoře nebo zlepšení dobrého zdravotního stavu člověka či zvířat. Podle nejnovější definice Světové zdravotnické organizace z roku 2002 jsou probiotika „ţivé organismy, které, jsou-li podávány v dostatečném mnoţství, poskytují zdravotní prospěch svému hostiteli“ (Franz a kol. 2011).

36 Probiotika většinou bývají ve formě farmaceutických přípravků jako doplněk stravy, díky čemuţ jsou bakterie poţívány ve velkém mnoţství, které je potřebné k dosaţení pozitivních účinků. V samotných potravinách se vyskytují nejčastěji v mléčných produktech. Při podávání zvířatům jsou přidávány do krmiva jako aditiva (Franz a kol. 2011). Probiotika mohou být tvořeny jednou kulturou, respektive kmenem jistého druhu, nebo se můţe jednat o směs tvořenou více druhy různých rodů. Nejčastěji jsou takto vyuţívány laktobacily a bifidobakterie, mnohem méně streptokoky a enterokoky (Franz a kol. 2003). Hlavním problémem bakterií rodu Enterococcus je riziko nositelství různých faktorů virulence a rezistence k antibiotikům, coţ oprávněně vyvolává obavy z moţného přenosu těchto vlastností i na probiotické kmeny (Franz a kol. 2003). Z enterokoků se jako probiotika pouţívají kmeny E. faecium SF68 a E. faecalis Symbioflor 1 (Franz a kol. 2011). Cílovým místem působení probiotik je gastrointestinální systém. Pomocí probiotik se mohou léčit některé nemoci jako jsou průjmy, akutní enteritidy, průjmy spojené s antibiotiky nebo syndrom dráţdivého tračníku. Enterokokální probiotika dokonce díky své hydroláze ţlučových kyselin sniţují hladinu cholesterolu v séru. Fungují téţ jako podpora imuntiního systému střeva (Franz a kol. 2011). Principem účinnosti probiotických kmenů enterokoků je jejich interakce s mikrobiální populací, včetně případných patogenů, a s imunitním systémem střeva. Patogeny jsou konkurenčními enterokoky vyloučeny ze střev a dochází ke stabilizaci původní mikrobiální populace, která byla podráţděním střev či léčbou antibiotiky oslabena (Franz a kol. 2011). Pro léčbu průjmů se většinou vyuţívá kmene E. faecium SF68. Tento kmen je v intestinálním traktu komenzálem, a proto má velmi krátkou lag fázi a generační dobu (asi 20 min za optimálních podmínek). In vitro vykazuje schopnost inhibovat růst E. coli, sérovarů salmonely či enterobakterů, je také schopný tolerovat ţluč a nízké hodnoty pH. Všechny tyto vlastnosti jsou pravděpodobně důvodem účinnosti léčby střevních onemocnění (Franz a kol. 2011).

37 7. Izolace a identifikace

7.1. Rod Enterococcus

7.1.1. Izolace

Bakterie rodu Enterococcus vyţadují komplexní nutriční média, proto nemohou dobře růst na médiích syntetických. Růst je značný pouze na bohatých médiích jako jsou BHI agar (z angl. Brain Heart Infusion), Todd-Hewitt bujón, TSA agar (z angl. Tryptone Soya Agar) nebo krevní agary. Některé druhy rostou velmi špatně na de Man-Rogosa-Sharpe agaru (MRS) pro stanovení mléčných bakterií (Švec a Devriese 2009). Pro izolaci enterokoků bylo vyvinuto více neţ 60 různých selektivních médií, avšak i ty dovolují růst jiným bakteriím a také ne všechny enterokoky mohou na určitých selektivních médiích růst (Švec a Devriese 2009). Zřejmě nejčastějším selektivním činitelem je azid sodný (NaN3). Podobně mohou média obsahovat ţlučové kyseliny, eskulin nebo antibiotika o nízké účinnosti na enterokoky (Devriese a kol. 2006). Jedním z nejpouţívanějších médií pro izolaci enterokoků je Slanetz-Bartely agar, také nazýván M-Enterococcus agar (Devriese a kol. 2006). Mezi další selektivní média patří Bile Easculin Agar (BEA), Kanamycin Easculin Azid agar (KEA) a další (Weiss a kol. 2005). Obvyklá teplota pro kultivaci enterokoků je 35-37 °C (Devriese a Pot 1995).

7.1.2. Identifikace

Samotná izolace na selektivních médiích pro určení rodu Enterococcus není často dostačující. Proto se vyuţívá různých fyziologických a biochemických testů, které mohou jiţ také vypovídat o příslušném enterokokálním druhu. Rychlejšími a téţ přesnějšími metodami pro určování jednotlivých druhů jsou metody molekulárně biologické. Pro enterokoky bylo takových metod navrţeno jiţ několik. Běţně pouţívanou metodou je sekvenace genu pro 16S rRNA, která však kvůli velké podobnosti tohoto genu mezi některými druhy není zcela spolehlivá (Švec a Devriese 2009). Analýza mezerníků tRNA pomocí PCR (z angl. Polymerase Chain Reaction) se pro druhovou identifikaci enterokoků ukázala jako mnohem přesnější (Beale a kol. 2000). Podobnou metodou je PCR amplifikace ribozomálních mezerníků (Tyrrell a kol. 1997).

Analýza mezerníkových oblastí mezi repeticemi (rep-PCR) s primerem (GTG)5 (Švec a kol.

38 2005c) a náhodně amplifikovaná PCR jsou další druhově specifické metody (Descheemaeker a kol. 1997). Rychlým způsobem identifikace druhů je také metoda MLSA (z angl. multilocus sequence analysis) (Naser a kol. 2005b). Pro identifikaci enterokoků se dále vyuţívají metody biochemické a fyzikální jako je analýza celobuněčných proteinů pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE), analýza mastných kyselin či denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE) a teplotní gradientová gelová elektroforéza (TGGE) variabilních oblastní na 16S rDNA (Švec a Devriese 2009).

7.2. Rod Melissococcus

7.2.1. Izolace

Melisokoky rostou pouze v anaerobních nebo mikroaerofilních podmínkách, nejlépe v přítomnosti 1-5 % CO2 a jejich růst je téţ stimulován autolyzovaným kvasničným extraktem (Dick a kol. 2009). Kultivace kmenů M. plutonius je moţná jen na komplexních médiích. Ty obvykle obsahují fermentovatelný cukr, škrob, pepton, cystein nebo cystin a draslík. Pro růst melisokoky vyţadují poměr sodíku ku draslíku (Na:K) roven 1 či menší (Dicks a Holzapfel 2009). Bailey v roce 1984 navrhnul dvě chemicky definovaná média, která se liší v solích, karbohydrátech a bazích. Mnohem nepatrnější rozdíl mají ve sloţení aminokyselin. V médiu musí být přítomny některé látky, které jsou pro melisokoky esenciální, tedy nezbytné. Jedná se o glukózu, metionin, tymin, xantin, pyridoxal hydrochlorid a některé vitamíny. Glukóza můţe být pro některé kmeny nahrazena sacharózou nebo melezitózou, také škrob nemusí být vţdy vyţadován (Dick a kol. 2009). Při izolaci melisokoka z infikovaných včelích larev se většinou larvy rozmělní a homogenizují v destilované vodě. Následně se provede kříţový roztěr na definované médium, které obsahuje příslušné mnoţství kvasničného extraktu, glukózy, rozpustného

škrobu, dihydrogenfosforečnanu draselného (KH2PO4) a agaru, a jehoţ pH bylo upraveno na 6.6. Po anaerobní kultivaci o délce devíti dnů při 37 °C se odečítají bílé kolonie melisokoka (Dick a kol. 2009).

39 7.2.2. Identifikace

Jedním z důvodů, které vedly ke zdokonalení a zvýšení spolehlivosti metod pro identifikace druhu M. plutonius, byl malý počet fenotypových znaků, pomocí něhoţ lze melisokoka odlišit od ostatních bakterií (Dick a kol. 2009). První moţností rychlé a citlivé detekce M. plutonius je metoda ELISA (z anglického Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (Pinncock a Featherstone 1984). K identifikaci lze také vyuţít sérologických testů s polyklonálními antiséry (Allen a Ball 1990). Další rychlou metodou detekce je metoda PCR, s primery navrţenými podle sekvence 16S rRNA, která umoţňuje vysoce specifickou identifikaci M. plutonius (Govan a kol. 1998). Variantou klasické PCR analýzy je jednokroková odstupňovavá neboli uhnízděná PCR (hemi-nested PCR) (Djordjevic a kol. 1998). V roce 2000 byla navrţena další metoda pro detekci M. plutonius. Původně se jednalo o analýzu pro identifikaci druhů enterokoků, ale v obsáhlé sadě oligonukleotidových sond pro druhově specifickou hybridizaci s rRNA byla nalezena sekvence specifická i pro melisokoka (Behr a kol. 2000).

7.3. Rod Tetragenococcus

7.3.1. Izolace

Tetragenokoky jsou halofilní a mírně alkalifilní bakterie, proto se pro jejich izolaci pouţívá médium s vysokým obsahem NaCl a glukózou coby zdrojem uhlíku, pH média se upravuje na hodnotu 7,0-8,0. Tetragenokoky dříve patřily k pediokokům a jejich růstové poţadavky jsou vcelku podobné, proto lze k izolaci zástupců rodu Tetragenococcus pouţít média pro pediokoky jako je selektivní SL médium nebo MRS s přídavkem 4-6 % NaCl a pH 7,0. Také lze pouţít GYP médium (z anglického Glucose Yeast extract Phosphate) obohacené o 0,3 % CaCO3, 1 % MgSO4, 0,1 % KCl a upraveným pH na 7,0. Na těchto médiích tvoří tetragenokoky kolonie s jasnou zónou vzniklou v důsledku produkce kyseliny mléčné. Pediokoky však na rozdíl od tetragenokoků nesnesou vysoké koncentrace NaCl, zatímco například T. muriaticus chlorid sodný přímo vyţaduje. Tato schopnost pomáhá k odlišení zmíněných dvou rodů (Dick a kol. 2009). Všechny tetragenokoky rostou dobře v GYP bujónu obohaceném o 5 % NaCl. Růst při kultivaci ve 30 °C můţe být aerobní i anaerobní (Dick a kol. 2009).

40 7.3.2. Identifikace

Halofilní, acidofilní a fakultativně anaerobní růst tetragenokoky odlišuje od příbuzných pediokoků. Od aerokoků, které tvoří tetrády stejně jako zástupci rodu Tetragenococcus, je liší schopností růstu při pH 5,0, ţádným růstem při hodnotě pH 9,0 a jejich fakultativně anaerobním nikoli mikroaerofilním růstem (Dick a kol. 2009). Kromě fyziologických a biochemických testů se pro rychlejší identifikaci nejen tetragenokoků vyuţívají molekulární metody včetně různých obměn metody PCR. Při popisu některých druhů byly pouţity analýzy jako je DNA-DNA hybridizace, částečná či kompletní sekvenace genu pro 16S rRNA, repetitivní PCR (rep-PCR), náhodně amplifikovaná polymorfní DNA (RAPD – z angl. random amplifield polymorphic DNA) nebo analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP – z angl. restriction fragment lenght polymorphism) (Huys a kol. 2011; Justé a kol. 2012; Lee a kol. 2005; Satomi a kol. 1997). Analýza mastných kyselin bývá prováděna kapilární plynovou chromatografií (Satomi a kol. 1997).

7.4. Rod Vagococcus

7.4.1. Izolace

Vagokoky mohou být izolovány na krví obohacených agarech jako je BHI nebo Columbia agar obsahující 5 % kravské, koňské či ovčí krve. Kultivace se provádí při 37°C v běţné atmosféře nebo v 5-10 % CO2 (Collins 2009). Vagokoky rostou také v Todd-Hewitt bujónu (Shewmaker a kol. 2004). Pro izolaci druhu Vagococcus salmoninarum byl pouţit krevní agar obohacený 7 % ovčí krve, který byl kvůli neschopnosti tohoto druhu růst při vysokých teplotách inkubován v běţné atmosféře při 25 °C (Schmidtke a Carson 1994).

7.4.2. Identifikace

Od laktokoků či enterokoků lze většinu zástupců rodu Vagococcus odlišit díky jejich pohyblivosti, neschopností růstu v médiu s 6,5 % NaCl nebo produkcí kyseliny z různých cukerných substrátů. Přesto pro jednotlivé testy mohou v rámci rodů existovat výjimky a spolehlivost rozlišení příbuzných mikroorganismů nemusí být vysoká (Collins 2009).

41 Mimo biochemické a fyziologické testy se k odlišení rodu či jednotlivých druhů vagokoků pouţívají spolehlivější molekulárně biologické metody. Vyuţívá se sekvenace genu pro 16S rRNA (Hoyles a kol. 2000), pro analýzu chromozomální DNA bývá pouţívána metoda pulzní gelové elektroforézy (PFGE – z angl. pulsed-field gel electrophoresis) (Teixeira a kol. 1997). Také se provádí analýza celobuněčných proteinů pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE) (Shewmaker a kol. 2004) nebo analýza mastných kyselin metodou kapilární plynové chromatografie (Wallbanks a kol. 1990).

7.5. Rod Catellicoccus

7.5.1. Izolace

Prvotní a dosud jediná izolace kmenů rodu Catellicoccus byla provedena na Columbia krevním agaru obohaceném 5 % ovčí krve za kapnofilních podmínek a při teplotě 37 °C (Lawson a kol. 2006). Katelikoky naopak nerostou v tekutých médiích obvykle pouţívaných pro grampozitivní, kataláza negativní koky jako jsou BHI bujón, Todd-Hewitt bujón a další, dokonce ani při obohacení médií koňským sérem (Lawson a kol. 2006).

7.5.2. Identifikace

Při primární identifikaci byly pro biochemickou charakterizaci vyuţity komerční mikrotesty. Dále byla provedena sekvenace genu pro 16S rRNA a pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC – z angl. High Performance Liquid Chromatography) byl zjištěn obsah G+C párů v genomové DNA (Lawson a kol. 2006). Ţádné další zprávy o izolaci nebo identifikaci katelikoků kromě popisu tohoto rodu nebyly publikovány.

7.6. Rod Pilibacter

7.6.1. Izolace

Kmeny pilibaktera byly při prvotní izolaci kultivovány na Todd-Hewitt agaru při teplotě 30 °C za anaerobních podmínek po dobu 3 dní. Tyto bakterie dále snadno rostou na

42 standartních na ţiviny bohatých médiích jako je TSA či TSA obohacený 5 % ovčí krve (Higashiguchi a kol. 2006).

7.6.2. Identifikace

K identifikaci pilibaktera byly pouţity komerční testy, ale i klasické plotnové testy pro hydrolýzu DNA na DNáza agaru nebo hydrolýzu škrobu na TSA agaru s přídavkem rozpustného škrobu a mnohé další (Higashiguchi a kol. 2006). Pro určení fylogenetického vztahu k jiným bakteriím a popisu rodu byly provedeny metody DNA-DNA hybridizace a sekvenace genu pro 16S rRNA. Obsah G+C párů v genomové DNA byl zjištěn pomocí HPLC (Higashiguchi a kol. 2006). Podobně jako u katelikoků nebyly dosud publikovány jiné práce o izolaci či identifikaci pilibakterů mimo publikaci popisující rod, respektive druh.

43 8. Závěr

Čeleď Enterococcaceae navrţená v roce 2009 pojímá dnes celkem šest rodů bakterií mléčného kvašení – Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Catellicoccus a Pilibacter. Zástupci těchto rodů osídlují rozmanitá prostředí a mohou v nich zaujímat důleţité postavení. Bezpochyby nejvýraznějším rodem čeledě je rod Enterococcus, který je velmi významným taxonem z mnoha hledisek. Výskyt enterokoků je přirozený na rostlinách či ve vodě, vyuţívají se také v potravinářství i ve farmacii. Největší podíl druhů se vyskytuje u ţivočichů včetně člověka, kde tvoří přirozenou mikroflóru. Zřejmě nejznámější jsou však enterokoky díky své patogenitě, protoţe se jedná o velmi časté původce nozokomiálních infekcí. Za patogenitu jsou odpovědné mnohé faktory virulence a také rezistence k antibiotikům, coţ je v dnešní době velmi diskutovaný problém. Na tato témata byl publikován nespočet prací a zájem o ně stále neopadává. Poznání mechanismů patogenity totiţ můţe vést k prevenci či účinnější léčbě nemocí, ale téţ k zamezení neustálého rozšiřování rezistence k antibiotikům na jiné patogení kmeny stejně jako na kmeny environmentální a kmeny vyuţívané jako probiotika či startéty. Rody Melissococcus, Tetragenococcus a Vagococus hrají roli především ve veterinární mikrobiologii, jelikoţ jisté druhy jsou pro některé ţivočichy patogenní. Na druhou stranu jsou zde také druhy běţné v prostředí či v případě tetragenokoků kmeny vyuţívané v potravinářství. Rody Catellicoccus a Pilibacter byly popsány teprve nedávno a jsou do čeledě řazeny pouze na základě fylogenetické příbuznosti. Jejich ekologický význam není znám, proto je také nutné věnovat jim pozornost.

44 9. Seznam literatury

Allen M.F., Ball B.V. (1993): The cultural characteristics and serological relationships of isolates of Melissococcus pluton. J. Apic. Res. 32: 80-88.

Arai R., Tominaga K., Wu M., Okura M., Ito K., Okamura N., Onishi H., Osaki M., Sugimura Y., Yoshiyama M., Takamatsu D. (2012): Diversity of Melissococcus plutonius from Honeybee Larvae in Japan and Experimental Reproduction of European Foulbrood with Cultured Atypical Isolates. PLoS ONE. 7: e33708.

Beale M., Beale P., Vaneechoutte M., Storms V., Butaye P., Devriese L.A., Verschraegen G., Gillis M., Haesebrouck F. (2000): Application of tRNA intergenic spacer PCR for identification of Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 38: 4201-4207.

Benachour A., Frere J., Flahaut S., Novel G., Auffray Y. (1997): Molecular analysis of the replication region of the theta-replicating plasmid pUCL287 from Tetragenococcus (Pediococcus) halophilus ATCC33315. Mol. Gen. Genet. 255: 504-513.

Behr T., Koob C., Schedl M., Mehlen A., Meier H., Knopp D., Frahm E., Obst U., Schleifer K.H., Niessnes R., Ludwig W. (2000): A Nested Array of rRNA Targeted Probes for the Detection and Identification od Enterococci by Reverse Hybridization. Syst. Appl. Microbiol. 23: 563-572.

Carvalho M.S., Shewmaker P.L., Streigerwalt A.G., Morey R.E., Sampson A.J., Joyce K., Barrett T.J., Teixeira L.M., Facklam R.R. (2006): Enterococus caccae sp. nov., isolated from human stools. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 1505-1508.

Cetinkaya Y., Falk P., Mayhall C.G.(2000): Vancomycin-Resistant Enteorococci. Clin. Microbiol. Rev. 13: 686-707.

Collins M.D. (2009): Genus IV. Vagococcus Collins, Ash, Farrow, Walbanks and Williams 1990a, 212VP. In: De Vos P., Garrity G.M., Jones D., Krieg N.R., Ludwig W., Rainey F.A., Schleifer K.H., Whitman W.B. (eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 616-618, Springer, New York.

Collins M.D., Ash C., Farrow J.A.E., Wallbanks S., Williams A.M. (1989a): 16S Ribosomal ribonucleic acid sequence analyses of lactococci and related taxa. Description of Vagococcus fluvialis gen. nov., sp. nov. J. Appl. Microbiol. 67: 453-460.

Collins M.D., Facklam R.R., Farrow J.A., Williamson R. (1989b): Enterococcus raffinosus sp. nov., Enterococcus solitarius sp. nov. and Enterococcus pseudoavium sp. nov. FEMS Microbiol. Lett. 48: 283-288.

Collins M.D., Farrow J.A.E., Jones D. (1986): Enterococcus mundtii sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 36: 8-12.

Collins M.D., Jones D., Farrow J.A.E., Kilpper-Bälz R., Schleifer K.H. (1984): Enterococcus avium nom. rev., comb. nov.; E. casseliflavus nom. rev., comb. nov.;

45 E. durans nom. rev., comb. nov.; E. gallinarum comb. nov.; and E. malodoratus sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 220-223.

Collins M.D., Rodrigues U.M. Pigott N.E., Facklam R.R. (1991): Enterococcus dispar sp. nov. a new Enterococcus species from human sources. Lett. Appl. Microbiol. 12: 95-98.

Collins M.D., Williams A.M., Wallbanks S. (1990): The phylogeny of Aerococcus and Pediococcus as determined by 16S rRNA sequence analysis: description of Tetragenococcus gen. nov. FEMS Microbiol. Lett. 70: 255-262.

Černohorská L. (2003): Rod Enterococcus. In: Votava M. (eds.), Lékařská mikrobiologie speciální. 127-128. Neptun, Brno.

Dargere S., Vergnaud M., Verdon R., Saloux E., Le Page O., Leclercq R., Bazin C. (2002): Enterococcus gallinarum Endocarditis Occurring on Native Heart Valves. J. Clin. Microbiol. 40: 2308-2310.

Descheemaeker P., Lammens C., Pot B., Vandamme P., Goossens H. (1997): Evaluation of Arbitrarily Primed PCR Analysis and Pulsed-Field Gel Electrophoresis of Large Genomic DNA Fragments for Identification of Enterococci Importatnt in Human Medicine. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 555-561.

Devriese L.A., Baele M., Butaye P. (2006): The Genus Enterococcus: Taxonomy. In: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt (eds.), The Prokaryotes: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria, 163-174, Springer, New York.

Devriese L.A., Ceyssens K., Rodrigues U.M., Collins M.D. (1990): Enterococcus columbae, a species from pigeon intestines. FEMS Microbiol. Lett. 59: 247-251.

Devriese L.A., Pot B. (1995): The genus Enterococcus. In: Wood B.J.B., Holzapfel W.H. (eds.), The Lactic Acid Bacteria: The genera of lactic acid bacteria, 327-367, St. Edmundsbury Press, Bury St. Edmunds.

Dicks L.M.T., Holzapfel W.H. (2009): Genus II. Melissococcus Bailey and Collins 1983, 672 VP. In: De Vos P., Garrity G.M., Jones D., Krieg N.R., Ludwig W., Rainey F.A., Schleifer K.H., Whitman W.B. (eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 611- 616, Springer, New York.

Dicks L.M.T., Holzapfel W.H., Satomi M., Kimura B., Fujii T. (2009): Genus III. Tetragenococcus Collins, Williams and Wallbanks 1993, 188VP. In: De Vos P., Garrity G.M., Jones D., Krieg N.R., Ludwig W., Rainey F.A., Schleifer K.H., Whitman W.B. (eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 607-611, Springer, New York.

Diebel R.H. (1964): The Group D streptococci. Bacteriol. Rev. 28: 330-366.

Djordjevic S.P., Noone K., Smith L., Hornitzky M.A.Z. (1998): Developement of a hemi-nested PCR assay for the specific detection of Melissococcus pluton. J. Apic. Res. 37: 165-174.

46 Elsner H.-A., Sobottka I., Mack D., Claussen M., Laufs R., Wirth R. (2000): Virulence Factors od Enterococcus feacalis and Enterococcus faecium Blood Culture Isolates. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 19: 39-42.

Ennahar S., Cai Y. (2005): Biochemical and genetic evidence for the transfer of Enterococcus solitarius Collins et al. 1989 to the genus Tetragenococcus as Tetragenococcus solitarius comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 589-592.

Facklam R.R., Carvalho M.S., Teixeira L.M. (2002): History, Taxonomy, Biochemical Charakteristics, and Antibiotic Susceptibility Testing of Enterococci. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 1-54, ASM Press, Washington, D.C.

Farrow J.A.E., Collins M.D. (1985): Enterococcus hirae, a New Species That Includes Amino Acid Assay Strain NCDO 1258 and Strains Causing Growth Depression in Young Chickens. Int. J. Syst. Bacteriol. 35: 73-75.

Forsgren E. (2010): European foulbrood in honey bees. J. Invertebr. Pathol. 103: 5-9.

Franz C.M.A.P., Huch M., Abriouel H., Holzapfel W., Gálvez A. (2011): Enterococci as probiotics and their implications in food safety. Int. J. Food Microbiol. 151: 125-140.

Franz C.M.A.P, Stiles M.E., Schleifer K.H., Holzapfel W.H. (2003): Enterococci in foods – a conundrum for food safety. Int. J. Food Microbiol. 88: 105-122.

Garg S.K., Mital B.K. (1991): Enterococci in milk and milk products. Crit. Rev. Microbiol. 18:15-45.

Giraffa G. (2002): Enterococci from food. FEMS Microbiol. Rev. 26: 163-171.

Govan V.A., Brözel V., Allsopp M.H., Davison S. (1998): A PCR Detection Method for Rapid Identification of Melissococcus pluton in Honeybee Larvae. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1983-1985.

De Graef E.M., Devriese L.A., Vancanneyt M., Baele M., Collins M.D., Lefebvre K., Swings J., Haesebrouck F. (2003): Description od Enterococcus canis sp. nov. from dogs and reclassification of Enterococcus porcinus Teixeira et al. 2001 as a junior synonym of Enterococcus villorum Vancanneyt et al. 2001. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1069-1074.

Grazia Fortina M., Ricci G., Mora D., Manachini P.L. (2004): Molecular analysis of artisanal Italian cheeses reveals Enterococcus italicus sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1717-1721.

Hanagata H., Shida O., Takagi H. (2003): Taxonomic homogeneity of a salt-tolerant lactic acid bacteria isolated from shoyu mash. J. Gen. Appl. Microbiol. 49: 95-100.

Higashiguchi D.T., Husseneder C., Grace J.K., Berestecky J.M. (2006): Pilibacter termitis gen. nov., sp. nov., a lactic acid bacterium from the hindgut of the Formosan subterranean termite (Coptotermes formosanus). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 15-20.

47

Higuchi T., Uchida K., Abe K.(1998): Aspartate decarboxylation encoded on the plasmid in the soy sauce lactic acid bacterium, Tetragenococcus halophila D10. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 1601-1603.

Holzapfel W.H., Franz C.M.A.P., Ludwig W., Back W., Dicks L.M.T. (2006): The Genera Pediococcus and Tetragenococcus. In: In: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt (eds.), The Prokaryotes: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria, 229-266, Springer, New York.

Hoyles L., Lawson P.A., Foster G., Falsen E., Ohlén M., Grainger J.M., Collins M.D. (2000): Vagococcus fessus sp. nov., isolated from a seal and a harbour porpoise. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1151-1154.

Huys G., Leisner J., Björkroth J. (2011): The Lesse LAB Gods: Pediococcus, Leuconostoc, Weissella, Carnobacterium and Affiliated Genera. In: Lahtinen S., Ouwehand A.C., Salminen S., Von Wright A. (eds.), Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects. -121, CRC Press, New York.

Jaffres E., Prévost H., Rossero A., Joffraud J.-J., Dousset X. (2011): Vagococcus penaei sp. nov., isolated from spoilage microbiota of cooked shrimp (Penaeus vannamei). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 2159-2164.

Justé A., Van Trappen S., Verreth C., Cleenwerck I., De Vos P., Lievens B., Willems K.A. (2012): Characterization of Tetragenococcus strains from sugar thick juice reveals a novel species, Tetragenococcus osmophilus sp. nov., and divides Tetragenococcus halophilus into two subspecies, T.halophilus subsp. halophilus subsp. nov. and T.halophilus subsp. flandriensis subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62:129-137.

Kalina A.P. (1970): The taxonomy and nomenclature of enterococci. Int. J. Syst. Bacteriol. 20: 185-189.

Kobayashi T., Kajiwara M., Wahyuni M., Hamada-Sato N., Imada C., Watanabe E. (2004): Effect of culture conditions on lactic acid production of Tetragenococcus species. J. Appl. Microbiol. 96: 1215-1221.

Koort J., Coenye T., Vandamme P., Sukura A., Björkroth J. (2004): Enterococcus hermanniensis sp. nov., from modified-armosphere-packaged broiler meat and canine tonsils. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1823-1827.

Law-Brown J., Meyers P.R. (2003): Enterococcus phoeniculicola sp. nov., a novel member of the enterococci isolated from the uropygial gland of the Red-billed Woodhoopoe, Phoeniculus purpureus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 683-685.

Lawson P.A, Collins M.D., Falsen E. (2006): Catellicoccus marimammalium gen. nov., sp. nov., a novel Gram-positive, catalase-negative, coccus-shaped bacterium from porpoise and grey seal. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 429-432.

Lawson P.A., Falsen E., Cotta M.A., Whitehead T.R. (2007): Vagococcus elongatus sp. nov., isolated from a swine-manure storage pit. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 751-754.

48 Lawson P.A., Foster G., Falsen E., Ohlén M., Collins M.D. (1999): Vagococcus lutrae sp. nov., isolated from the common otter (Lutra lutra). Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 1251-1254.

Lee M., Kim M.K., Vancanneyt M., Swings J., Kim S.-H., Kang M.S., Lee S.-T. (2005): Tetragenococcus koreensis sp. nov., a novel rhamnolipid-producing bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1409-1431.

Ludwig W., Schleifer K.-H., Whitman W. B. (2009): Family IV. Enterococcaceae fam. nov. In: De Vos P., Garrity G.M., Jones D., Krieg N.R., Ludwig W., Rainey F.A., Schleifer K.H., Whitman W.B. (eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 594, Springer, New York.

Martin J.D., Mundt J.O. (1972): Enterococci in Insects. Appl. Microbiol. 24: 575-580.

Medrek T.F., Litsky W. (1960): Comparative Incidence of Coliform Bacteria and Enterococci in Undisturbed Soil. Appl. Microbiol. 8: 60-63.

Morandi S., Cremonesi P., Povolo M., Brasca M. (v tisku): Enterococcus lactis sp. nov. from Italian raw milk cheeses. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (v tisku). http://ijs.sgmjournals.org/content/early/2011/10/13/ijs.0.030825-0.abstract.

Mundt J.O. (1961): Occurrence of Enterococci: Bud, Blossom, and Soil Studies. Appl. Microbiol. 9: 541-544.

Naser S.M., Thompson F.L., Hoste B., Gevers D., Dawyndt P., Vancanneyt M., Swings J. (2005b): Application of multilocus sequence analysis (MLSA) for rapid identification of Enterococcus species based on rpoA and pheS genes. Microbiology+. 151: 2141-2150.

Naser S.M., Vancanneyt M., De Graef E., Devriese L.A., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Švec P., Decostere A., Haesebrouck F., Swings J. (2005a): Enterococcus canintestini sp. nov., from faecal samples of healthy dogs. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 2177-2182.

Niemi R.M., Olinkangas T., Paulin L., Švec P., Vandamme P., Karkman A., Kosina M., Lindström K. (v tisku): Description of Enterococcus rivorum sp. nov. from pristine brooks. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (v tisku). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22058322.

Oana K., Okimura Y., Kawakami Y., Hayashida N., Shimosaka M., Okazaki M., Hayashi T., Ohnishi M. (2002): Physical and genetic map of Enterococcus faecium ATCC19434 and demonstration of intra- and interspecific genomic diversity in enterococci. FEMS Misrobiol. Lett. 207: 133-139.

Ohkumu M., Kudo T. (1996): Phylogenetic diversity of the intestinal bacterial community in the termite Reticulitermes speratus. Appl. Environ. Microbiol. 62: 461-468.

Okumura K., Arai R., Okura M., Kirikae T., Takamatsu D., Osaki M., Miyoshi-Akiyama T. (2011): Complete Genome Sequence of Melissococcus plutonius ATCC 35311. J. Bacteriol. 193: 4029-4030.

49 Ott E.-M., Müller T. Müller M., Franz C.M.A.P., Ulrich A., Gabel M., Seyfarth W. (2001): Population dynamics and antagonistic potential of enterococci colonizing the phyllosphere od grasses. J. Appl. Microbiol. 91: 54-66.

Paulsen I.T., Banerjei L., Myers G.S.A., Nelson K.E., Seshardi R., Read T.D., Fouts D.E., Eisen J.A., Gill S.R., Heidelberg J.F., Tettelin H., Dodson R.J., Umayam L., Brinkac L., Beanan M., Daugherty S., DeBoy R.T., Durkin S., Kolonay J., Madupu R., Nelson W., Vamathevan J., Tran B., Upton J., Hansen T., Shetty J., Khouri H., Utterback T., Radune D., Ketchum K.A., Dougherty B.A., Fraser C.M. (2003): Role of mobile DNA in the evolution of vancomycin-resistant Enterococcus faecalis. Science. 299: 2071-2074.

Pinncock D.E., Featherstone N.E. (1984): Detection and quantification of Melissococcus pluton infection in honey bee colonies by means of enzyme-linked immunosorbent assay. J. Apic. Res. 23: 168-170.

Pot B., Devriese L.A., Hommez J., Miry C., Vandemeulebroecke K., Kersters K., Haesebrouck F., (1994): Characterization and identification of Vagococcus fluvialis strains isolated from domestic animals. J. Appl. Bacteriol. 77: 362-369.

Rahkila R., Johansson P., Säde E., Björkroth J. (2011): Identification of Enterococci from Broiler Products and a Broiler Processing Plant and Description of Enterococcus viikkiensis sp. nov. Appl. Environ. Microbiol.

Rodrigues U., Collins M.D. (1990): Phylogenetic analysis of Streptococcus saccharolyticus based on 16S rRNA sequencing. FEMS Microbiol. Lett. 71: 231-234.

Ruiz-Zarzuela I., de Blas I., Gironés O., Ghittino C., Múzquiz J.L. (2005): Isolation of Vagococcus salmoninarum in Rainbow Trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), Broodstocks: Characterization of the Pathogen. Vet. Res. Commun. 29: 553-562.

Satomi M., Furushita M., Oikawa H., Yoshikawa-Takahashi M., Yano Y. (2008): Analysis of a 30 kbp plasmid enconding histidine decarboxylase gene in Tetragenococcus halophilus isolated from fish sauce. Int. J. Food Microbiol. 126: 202-209.

Satomi M., Kimura B., Mizoi M., Sato T., Fujii T. (1997): Tetragenococcus muriaticus sp. nov., a New Moderately Halophilic Lactic Acid Bacterium Isolated from Fermented Squid Liver Souce. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 832-836.

Savini V., Manna A., D`Antonio F., Talia M., Catavitello C., Balbinot A., Febbo F., Carlino D., Fioritoni F., Di Bonaventura G., D`Antonio D. (2008): First report of vaginal infection caused by Enterococcus raffinosus. J. Med. Microbiol. 57: 672-673.

Sedláček I. (2007): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Brno, 270s.

Sedláček I., Holochová P., Mašlaňová I., Kosina M., Spröer C., Bryndová H., Vandamme P., Rudolf I., Hubálek Z., Švec P. (v tisku): Enterococcus ureilyticus sp. nov. and Enterococcus rotai sp. nov., two novel urease producing enterococci from environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (v tisku). http://ijs.sgmjournals.org/content/early/2012/04/16/ijs.0.041152-0.abstract.

50 Shepard B.D., Gilmore M.S. (2002): Antibiotic-resistant enterococci: the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance. Microb. Infect. 4: 215-224.

Shewmaker P.L., Steigerwalt A.G., Morey R.E., Carvalho M.S., Elliott J.A., Joyce K., Barrett T.J., Teixeira L.M., Facklam R.R. (2004): Vagococcus carniphilus sp. nov., isolated from ground beef. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1505-1510.

Schleifer K.H., Klipper-Bälz R. (1984): Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. no. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 31-34.

Schmidtke L.M., Carson J. (1994): Characteristics of Vacococcus salmoninarum isolated from diseased salmonid fish. J. Appl. Bacteriol. 77: 229-236.

Sistek V., Maheux A.F., Boissinot M., Bernard K.A., Cantin P., Cleenwerck I., de Vos P., Bergeron M.G. (v tisku). Two novel species, Enterococcus ureasiticus sp. nov. and Enterococcus quebecensis sp. nov., isolated from water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (v tisku). http://ijs.sgmjournals.org/content/early/2011/08/01/ijs.0.029033-0.

Smith D.G., Shattock P.M.F. (1964): The Cellular Location of Antigens in Streptococci of Groups D, N and Q. J. Gen. Microbiol. 34: 165-175.

Sorroza L., Padilla D., Acosta F., Román L., Grasso V., Vega J., Real F. (2012): Characterization of the probiotic strain Vagococcus fluvialis in the protection of European sea bass (Dicentrarchus labrax) against vibriosis by Vibrio anguillarum. Vet. Microbiol. 155: 369-373.

Sukontasing S., Tanasupawat S., Moonmangmee S., Lee J.-S., Suzuki K. (2007): Enterococcus camelliae sp. nov., isolated from fermented tea leaves in Thailand. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 2151-2154.

Süßmuth S.D., Muscholl-Silberhorn A., Wirth R., Susa M., Marre R., Rozdzinski E. (2000): Aggregation Substance Promotes Adherence, Phagocytosis, and Intracellular Survival of Enterococcus faecalis within Human Macrophages and Suppresses Respiratory Burst. Infect. Immun. 68: 4900-4906.

Švec P., Devriese L.A. (2009): Genus I. Enterococcus (ex Thiercelin and Jouhaud 1903) Schleifer and Kilpper-Bälz 1984, 32VP. In: De Vos P., Garrity G.M., Jones D., Krieg N.R., Ludwig W., Rainey F.A., Schleifer K.H., Whitman W.B. (eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 594-607, Springer, New York.

Švec P., Devriese L.A., Sedláček I., Baele M., Vancanneyt M., Haesebrouck F., Swings J., Doškař J. (2001): Enterococcus haemoperoxidus sp. nov. and Enterococcus moraviensis sp. nov., isolated from water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1567-1574.

Švec P., Devriese L.A., Sedláček I., Baele M., Vancanneyt M., Haesebrouck F., Swings J., Doškař J. (2002): Characterization of yellow-pigmented and motile enterococci isolated from intestines of the garden snail Helix aspersa. J. Appl. Microbiol. 92: 951-957.

51 Švec P., Franz C.M.A.P. (v tisku): Section IV: The family Enterococcaceae. In: Wood B.J.B., Holzapfel W.H. (eds.), The Lactic Acid Bacteria: Biodiversity and Taxonomy, Wiley-Blackwell, England.

Švec P., Vancanneyt M., Devriese L.A., Naser S.M., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Swings J. (2005a): Enteococcus aquamarinus sp. nov., isolated from sea water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 2183-2187.

Švec P., Vancanneyt M., Koort J., Naser S.M., Hoste B., Vihavainen E., Vandamme P., Swings J., Björkroth J. (2005b): Enterococcus devriesei sp. nov., associated with animal sources. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 2479-2484.

Švec P., Vancanneyt M., Seman M., Snauwaert C., Lefebvre K., Sedláček I., Swings J. (2005c): Evaluation of (GTG)5-PCR for identification of Enterococcus spp. FEMS Microbiol. Lett. 247: 59-63.

Švec P., Vancanneyt M., Sedláček I., Naser S.M., Snauwaert C., Lefebvre K., Hoste B., Swings J. (2006): Enterococcus silesiacus sp. nov. and Enterococcus termitis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 577-581.

Švec P., Vandamme P.A., Bryndová H., Holochová P., Kosina M., Mašlaňová I., Sedláček I. (v tisku): Enterococcus plantarum sp. nov., isolated from plants. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (v tisku). http://ijs.sgmjournals.org/content/early/2011/08/19/ijs.0.033357-0.

Tanasupawat S. Sukontasing S., Lee J.-S. (2008): Enterococcus thailandicus sp. nov., isolated from fermented sausage (‘mum’) in Thailand. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 1630-1634.

Teixeira L.M., Carvalho M.S., Espinola M.M.B., Steigerwalt A.G., Douglas M.P., Brenner D.J., Facklam R.R. (2001): Enterococcus porcinus sp. nov. and Enterococcus ratti sp. nov., associated with enteric disorders in animals. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1737-1743.

Teixeira L.M., Carvalho M.S., Merquior V.C., Steigerwalt A.G., Brenner D.J., Facklam R.R. (1997): Phenotypic and Genotypic Characterization of Vagococcus fluvialis, Including Strains Isolated from Human Sources. J. Clin. Microbiol. 35: 2778-2781.

Tendolkar P.M., Baghdayan A.S., Shankar N. (2003): Pathogenic enterococci: new developments in the 21st centrury.Cell. Mol. Life Sci. 60: 2622-2636.

Tyrrell G.J., Bethune R.N., Willey B., Low D.E. (1997): Species Identification of Enterococci via Intergenic Ribosomal PCR. J. Clin. Microbiol. 35: 1054-1060.

Tyrrell G.J., Turnbull L., Teixeira L.M., Lefebvre J., Carvalho M.S., Facklam R.R., Lovgren M. (2002): Enterococcus gilvus sp. nov. and Enterococcus pallens sp. nov. Isolated from Human Clinical Specimens. J. Clin. Microbiol. 40: 1140-1145.

Udomsil N., Rodtong S., Tanasupawat S., Yongsawatdigul J. (2010): Proteinase-producing halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to produce volatile compounds. Int. J. Food Microbiol. 141: 186-194.

52 Vancanneyt M., Snauwaert C., Cleenwerck I., Baele M., Descheemaeker P., Goossens H., Pot B., Vandamme P., Swings J., Haesebrouck F., Devriese L.A. (2001): Enterococcus villorum sp. nov., an enteroadherent bacterium associated with diarrhoea in piglets. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 393-400. de Vaux Albane, Laguerre G., Divies C., Prévost H. (1998): Enterococcus asini sp. nov. isolated from the caecum of donkeys (Equus asinus). Int. J. Syst. Microbiol. 48: 383-387.

Wallbanks S., Martinez-Murcia A.J., Fryer J.L., Phillips B.A., Collins M.D. (1990): 16S rRNA Sequence Determination for Members of Genus Carnobacterium and Related Lactic Acid Bacteria and Description of Vagococcus salmoninanrum sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 224-230.

Wang L., Cui Y.-S., Kwon C.S., Lee S.-T., Lee J.-S., Im W.-T. (2011): Vagococcus acidifermentans sp. nov., isolated from an acidogenic fermentation bioreactor. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61: 1123-1126.

Weaver K.E. (2000): Enterococcal genetics. In: Fishetti V.A., Novick R.P., Ferretti J.J., Portnoy D.A., Rood J.I. (eds.), Gram-Positive Pathogens, 259-271, ASM Press, Washington D.C.

Weaver K.E., Rice L.B., Churchward G. (2002): Plasmids and transposons. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Courvalin P., Dunny G.M., Murray B.E., Rice L.B. (eds.), The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotic Resistance, 219-263, ASM Press, Washington, D.C.

Weiss A., Doming K.J., Kneifel W. (2005): Selective Media for Enumeration of Probiotic Enterococci, Food Technol. Biotechnol. 43:147–155.

Williams A.M., Farrow J.A.E., Collins M.D. (1989): Reverse transcriptase sequencing of 16S ribosomal RNA from Streptococcus cecorum. Lett. Appl. Microbiol. 8: 185-189.

Yong F.M., Wood B.J.B. (1974): Mircobiology and Biochemictry of Soy Sauce Fermentation. Adv. Appl. Microbiol. 17: 157-194.

Elektronické zdroje: http://www.jgi.doe.gov/News/Efacium_overvw.htm

53