Identificación, Caracterización Y

INIA VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL CAPÍTULO III IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y PATOGENICIDAD DEL HONGO ENTOMOPATÓGENO Paecilomyces cateniannulatus AISLADO DE Thaumastocoris peregrinus (HEMIPTERA: THAUMASTOCORIDAE) EN EL ESTADO DE RÍO GRANDE DEL SUR - BRASIL

María L. San Román1; Carlos F. Wilcken1; Ana C. Firmino1; Edson L. Furtado1

1. INTRODUCCIÓN dientes activos registrados y las restriccio- nes de uso de plaguicidas no permitidos El área de plantación de eucalipto en Bra- por las certificadoras nacionales e interna- sil ha alcanzado las 5.102.103 ha en 2012 cionales. Dentro del control biológico con según la Asociación Brasilera de Foresta- enemigos naturales, fue reportada la ocu- dores (ABRAF, 2013). En los últimos años, rrencia de Cleruchoides noackae Lin & Hu- nuevas plagas han sido detectadas, ame- ber (Hymenoptera: Mymaridae) parasitando nazando la productividad de las plantacio- huevos de este insecto, en Sydney (Austra- nes. Entre éstas se encuentra la chinche lia) (Lin et al., 2007). Cleruchoides noackae del eucalipto Thaumastocoris peregrinus fue introducido por primera vez en Brasil (Hemiptera: Thaumastocoridae). Esta plaga en noviembre de 2011. Otra alternativa es es considerada especie invasora en varios el control microbiano utilizando organismos países, estando presente en África (Sudáfri- entomopatógenos. En Brasil fue reportada ca y Zimbawe), América del Sur (Argentina, la ocurrencia del hongo Zoophthora radi- Uruguay, Brasil, Chile y Paraguay) y Europa cans (Entomophthorales) afectando ninfas 17 (Italia) (Jacobs y Neser, 2005; Carpintero y y adultos de T. peregrinus en plantaciones Dellapé, 2006; Wilcken et al., 2010; Mar- clonales de eucalipto en el estado de San tínez y Bianchi, 2010; Laudonia y Sasso, Pablo en 2009 (Mascarin et al., 2012). Más 2012). allá del hallazgo, este grupo de hongos re- sulta difícil de multiplicar a escala comercial En Brasil T. peregrinus fue detectado por para su uso a campo (Alves, 1998). Entre primera vez en el 2008 y rápidamente se los principales hongos entomopatógenos transformó en un problema. Este insecto empleados para el control de insectos se cuando ataca plantas de eucalipto reduce encuentran los hongos pertenecientes su productividad, disminuyendo el área fo- a la subdivisión Deuteromycotina, clase liar. Las ninfas y adultos se alimentan suc- Hyphomycetes, con géneros tales como cionando savia, provocando el plateado de Paecilomyces, Beauveria, Metarhizium y las hojas, que evoluciona a clorosis o bron- Lecanicillium (Alves, 1998). Los hongos del ceado, llevando finalmente a la defoliación género Paecilomyces penetran normalmen- de los árboles. Entre las estrategias para su te vía tegumento, usando la presión física y control se encuentra el control químico, ge- la acción química a través del apresorio de neralmente utilizado cuando ocurren brotes penetración. Han sido observados afectan- poblacionales de esta plaga. Sin embargo do lepidópteros, coleópteros, hemípteros y su uso es limitado, no siendo recomenda- ortópteros. Existen reportes de aislamientos do por el riesgo ambiental, la falta de ingre- de Paecilomyces spp. en Stenoma decora

1 Departamento de Producción Vegetal / Defensa Fitosanitaria, Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad Estadual de San Pablo (UNESP), Botucatu, SP, Brasil. VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL INIA

(Lepidoptera: Stenomidae) en Bahía, Eup- 2. MATERIALES Y MÉTODOS seudosoma spp. (Lepidoptera: Arctiidae) en San Pablo y en adultos de Lagria villo- Colecta de insectos y aislamiento del sa (Coleoptera: Lagriidae), en Mato Grosso hongo (Alves, 1998). El estudio fue realizado en el Laboratorio de En estudios realizados en áreas afectadas Control Biológico de Plagas Florestales de por T. peregrinus fueron observadas ocu- la Facultad de Ciencias Agronómicas (FCA), rrencias epizoóticas en plantaciones de eu- Universidad Estadual Paulista - Campus de caliptos en la región de Alegrete, Rio Grande Botucatu. Fueron colectados individuos de T. do Sul. A partir de insectos muertos en esa peregrinus muertos en epizootia en las plan- epizootia, se aislaron algunos hongos po- taciones de eucaliptos de la empresa Stora tencialmente entomopatógenos, siendo uno Enso, en la región de Alegrete, Río Grande de ellos identificado como del género Paeci- do Sul. La colecta de insectos fue realizada lomyces, todavía no registrado como patóge- en noviembre de 2011, directamente de la no de T. peregrinus. Este trabajo tuvo como copa de los árboles. Se colectaron individuos objetivo realizar la caracterización morfoló- muertos y moribundos con presencia de mi- gica, biológica, patogénica y molecular de celio sobre el cuerpo, siendo ésta la princi- Paecilomyces spp. aislado de T. peregrinus. pal característica para la selección de las También se realizó un estudio de infección muestras (Figuras 1 y 2). Para determinar el del insecto, visualizado por medio del uso de agente patógeno causante de mortalidad en microscopía electrónica de barrido. los insectos se siguió la metodología basada

2 18

1 A B FiguraFigura 1. 1.A. A.T. peregrinusT. peregrinus sobre sobre hoja de hoja eucalipto de eucalipto en el campo. en el B campo.. T. peregrinus B. T. peregrinus enfermos (1) y sanos (2), colectadosenfermos en (1) epizootias y sanos a (2), campo. colectados en epizootias a campo.

0,5 mm

Figura 2. T. peregrinusFigura con 2. extrusión T. peregrinus de micelio con de extrusión Paecilomyces de micelio sp. por de las articulaciones y Paecilomyces sp. por las articulaciones y orificio anal. orificio anal.

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en los postulados de Koch. Los insectos co- El hongo fue pulverizado con una Torre de lectados fueron acondicionados en cámaras Potter con un volumen de 3 mL de sus- húmedas para propiciar la esporulación de pensión de esporas para cada aislamiento los hongos. Después de 24 horas los insec- aplicada a 15 lb/pul2 de presión y con una tos fueron sometidos a esterilización con so- concentración de 106 esporas/mL (diluido lución de hipoclorito de sodio al 2%, alcohol con agua estéril y coadyuvante Tween 20 al 70%, agua esterilizada y posteriormente al 0,02%). Para el testigo fue realizada la colocados en medio agar-agua en placas de aspersión utilizando agua destilada es- Petri. Después de la observación del creci- téril con Tween al 0,02%. Después de la miento de la colonia, ésta fue repicada en inoculación las placas fueron colocadas medio PDA (papa-dextrosa-agar) para su en cámara BOD a 25°C y un fotoperíodo posterior identificación. de 12 horas de luz/oscuridad. Se realiza- ron evaluaciones diarias del experimento Obtención de cultivos monospóricos contando y retirando los insectos muertos hasta 6 días o hasta alcanzar la mortali- Para la obtención de cultivos monospóricos, dad total en el tratamiento. Los insectos las colonias obtenidas de los aislamientos muertos fueron colocados en cámara hú- fueron lavadas con agua destilada esterili- meda para reaislar el hongo causante de zada y la concentración de las suspensio- la mortalidad y para confirmar que se trató nes de esporas fue estandarizada en 102 del aislamiento inicialmente aplicado. esporas/mL. Se colocaron 100 µl de la sus- pensión de esporas en placas conteniendo Proceso de colonización del hongo medio agua/agar enriquecido con 0,005% en el insecto de oxitetraciclina. Las esporas fueron indi- vidualizadas y visualizadas en microscopio Para complementar los estudios de pa- óptico, utilizando cámara de Neubauer para togenicidad se realizó un seguimiento de el conteo y posterior dilución a la concen- la colonización del hongo sobre el cuerpo tración padrón (102 esporas/mL). Poste- del insecto. Para esto fue pulverizada una riormente, las esporas individuales fueron suspensión conteniendo 106 esporas/mL di- 19 transferidas a medio PDA para la formación rectamente sobre los insectos vivos. Como de las colonias. testigo la pulverización fue hecha con agua destilada estéril. Test de patogenicidad en T. peregrinus Después de la inoculación, conforme a la metodología descripta para el test de pa- El objetivo del test fue evaluar el potencial togenicidad, los insectos tratados fueron entomopatogénico de los hongos aislados. colectados en intervalos de tiempo prede- Para la realización de los bioensayos se terminados (2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 utilizaron insectos sanos de T. peregrinus, horas) y fijados en solución de Karnovs- obtenidos de la cría en laboratorio. A partir ky (glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído del aislamiento puro del hongo, obtenido a 2,0%, tampón fosfato 0,05M, pH 7,2), por partir de los insectos, se escogieron algu- un período mínimo de 24 horas a partir nas placas para hacer los test de patoge- de la muerte de los insectos. Posterior- nicidad. Se utilizó un diseño experimental mente, las muestras fueron preparadas y enteramente al azar con dos tratamientos analizadas en un microscopio electrónico (patógeno y testigo) y 4 repeticiones. Cada de barrido LEO435-VP. Se evaluaron cin- repetición estaba compuesta por una placa co insectos para cada intervalo de tiempo de Petri conteniendo gel estéril y un disco predeterminado. La preparación y obser- de hoja de Eucalyptus camaldulensis, en vación de las muestras fue realizada en el el cual se colocaban 10 insectos (ninfas y Centro de Microscopía Electrónica, locali- adultos) de T. peregrinus. zada en la ESALQ/USP. VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL INIA

Caracterización biológica del ITS 1 e ITS 4 que generan un fragmento crecimiento de aproximadamente 750 pares de bases. Para la PCR, se emplearon 3 μl del ADN La caracterización cultural de los aisla- total extraído (30 ng), tampón 1X de la en- mientos se basó en la velocidad de creci- zima GoTaq ADN polimerasa (Promega®), miento micelial, color de la colonia y es- 2mM MgCl2, 0,2 mM DNTP, 0,2 μM de cada tructuras producidas en medio de cultivo primer y 1,25 U de GoTaq DNA polimera- PDA. A partir de los cultivos, se obtuvieron sa (Promega®), ajustando el volumen de la discos de 6 mm de diámetro de los bordes reacción para 50 μl con agua tratada con de la colonia cultivada por 10 días en me- dietilpirocarbonato (DEPC). En el caso del dio PDA y los mismos fueron transferidos al PCR relacionado con el factor de elonga- centro de nuevas placas de Petri utilizando ción fue usado el primer EF1, que genera el mismo medio. Posteriormente al repi- un fragmento de aproximadamente 1300 que, las cepas aisladas fueron incubadas a pares de bases. Para el PCR se emplearon 25±1ºC y un fotoperíodo de 12 h luz/oscu- 3 μl de ADN total extraído (30 ng), tampón ridad. La evaluación del crecimiento de la 1X de la enzima GoTaq DNA polimerasa colonia fue realizada a diario, midiendo el (Promega®), 2mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 1 diámetro de la misma en la placa Petri con μM del primer y 1,25 U de GoTaq DNA poli- regla milimetrada. La velocidad media de merasa (Promega®), ajustando el volumen crecimiento micelial fue utilizada para los de reacción para 50 μl con agua tratada con análisis estadísticos. El experimento fue DEPC. conducido siguiendo un diseño al azar con cinco repeticiones por tratamiento, donde Los fragmentos de ADN amplificados fueron cada unidad experimental comprendía una visualizados en gel de agarosa coloreado placa. con bromuro de etidio y observados bajo luz UV. Previo a su secuenciación los frag- Caracterización morfológica mentos amplificados fueron purificados utilizando 100 μl del producto de SV Gel y PCR 20 Se determinó el tamaño de las esporas Clean Up Sistem (Promega®). Las secuen- producidas por los aislamientos mediante cias obtenidas fueron alineadas y procesa- el sistema de video cámara Opton, modelo das con el programa Mega 5.05 para poste- TA-0124XS, instalada en microscopio ópti- riormente construir árboles filogenéticos de co. La imagen fue trasmitida a un compu- los aislamientos de Paecilomyces, utilizan- tador y analizada por medio del programa do el método “p-distance” (Tamura, 1992). EDN-2. Para la calibración del equipamien- En cada caso fue realizado un “bootstrap” to se utilizó una lámina micrografiada (Carl con 10.000 réplicas. Zeiss®). Se evaluaron 30 esporas de cada aislamiento. Los resultados de PCR fueron comparados con las secuencias depositadas en el Gen- Caracterización molecular Bank, códigos de acceso BankIt1525016 Paecilomyces JQ957848 (región ITS); La extracción de ADN del aislamiento selec- BankIt1525018 Paecilomyces JQ957849 cionado en el experimento de patogenicidad (α-elongase). se realizó conforme a una adaptación del método desarrollado por Murray y Thomp- 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN son (1980). Para la caracterización molecular se estudió la región ITS del ADN riboso- A partir de los insectos colectados se ob- mal y parte del gen del factor de elongación tuvo una colonia con características típicas (EF-1α). La amplificación de la región ITS de Paecilomyces spp., que al ser inocula- del ADN ribosomal del hongo seleccionado da en insectos sanos se mostró altamente se realizó utilizando los pares de primers patogénica a la chinche del eucalipto. En INIA VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL

los bioensayos realizados en los test de sión de esporas usadas para la inoculación patogenicidad se verificó su capacidad de se basa en fragmentos de hifas, conidios causar mortalidad por encima del 50% de germinados y conidios no germinados, los insectos en dos días posteriormente a existen diferencias en el número de insec- la inoculación, en tanto que a partir de los tos muertos, ya que las inoculaciones con tres días fue observada la mortalidad del esporas germinadas y con hifas del hongo 100% de los insectos inoculados (Figura 3). fueron más agresivas que con conidios no A pesar de observarse mortalidad de insec- germinados. Comparando la bioactividad tos 24 horas después de la inoculación, la de blastosporas de P. fumosoroseus y co- observación en microscopio electrónico de nidios de Beauveria bassiana, Fragues et barrido permitió comprobar que las esporas al. (1994) mostraron que las blastosporas del hongo inician su germinación y pene- fueron 4 veces más eficaces en infectar y tración sobre el cuerpo del insecto a las 4 matar ninfas de la mosca blanca Bemisia horas después de la inoculación (Figura 4). argentifolli (Hemiptera: Aleyrodidae). En A las 24 horas de la inoculación, fue posible base a estos resultados se podría asumir observar la colonización del cuerpo del in- que la cantidad de individuos de T. peregri- secto en casi su totalidad, corroborando los nus muertos a las 24 h podría ser mayor si datos de los bioensayos de patogenicidad éstos fueran inoculados con esporas ger- (Figura 4). minadas e hifas del hongo.

Según la literatura, la patogenicidad de En base a las características biológicas y mor- algunas especies de Paecilomyces puede fológicas de los cultivos y a las secuencias variar conforme a la forma de propágu- de ADN extraídas del hongo, éste fue iden- lo usada en la inoculación de este hon- tificado como Paecilomyces cateniannulatus go (Fragues et al., 1994). Estos autores, Liang. El hongo estudiado mostró un creci- estudiando la capacidad de infección de miento micelial de 10,7 mm/día. La colonia los propágulos de P. fumosoroseus sobre tenía coloración blanca en la parte superior Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noc- y levemente rosada en la cara posterior de la tuidae) observaron que cuando la suspen- placa en medio de cultura PDA (Figura 5). El 21

Figura 3. Mortalidad de ninfas y adultos de T. peregrinus a lo largo del tiempo después de la inoculación con esporas de Paecilomyces spp. en laboratorio (temperatura 25 ± 1 oC, fotoperíodo de 12 h luz/oscuridad). VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL INIA

FiguraFigura 4 .4. Evolución Evolución de lade colonización la colonización del hongo del hongo Paecilomyces Paecilomyces cateniannulatus cateniannulatus en el cuerpo en elde T. peregrinuscuerpo (A = 2 hs,de T.B =peregrinus 4 hs, C = 8 (A hs, = D2 =hs, 12 B hs, = 4E hs,= 24 C h =s, 8F hs,= 48 D hs, = 12 G hs,= 72 E hs, = 24 H =hs, 96 hs). F = 48 hs, G = 72 hs, H = 96 hs).

hongo presentó fiálides agrupadas y globosas (Figura 5). Los conidios son pequeños y ova- en posición basal, comprimidas y alargadas al les con dimensiones de 2,6 (2,0-3,5 µm) x 1,6 final, donde se pudieron observar los conidios (0,8-2,5 µm) largo y ancho respectivamente.

A B Figura 5. Fiálides y conidios de P. cateniannulatus Figura 5. Fiálides y conidios de P.(A) cateniannulatus y colonia de P.(A) cateniannulatus y colonia de P. cateniannulatus (B). (B).

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Liang et al. (2005), en un trabajo realizado de 12 especies de Paecilomyces por RAPD en China donde caracterizaron morfológica- (Random Amplified Polymorphic DNA) ha mente y molecularmente especies de Paeci- sido relatada por Huang et al. (2002). Los lomyces, describen a P. cateniannulatus con resultados experimentales muestran que características similares a las obtenidas en las semejanzas entre P. cateniannulatus este trabajo, donde las colonias típicas tie- y P. farinosus son apenas de 26 a 38%. nen coloración blanca e hifas aéreas. Las Los test de laboratorio apuntan a la exis- fiálides poseen una porción basal globosa o tencia de algunas razas de P. cateniannu- elipsoidal y una proyección fina y larga. Pre- latus que tienen alta patogenicidad cuando senta así mismo conidios pequeños, ovales fueron inoculadas en pulgones, nematodos a elipsoidales de 2 a 3,5 μm × 1-2,5 μm. En y especies de lepidópteros (Liang et al., ese estudio los autores reportan además a 2005). P. cateniannulatus como entomopatogénico para algunos lepidópteros. En base a las secuencias de ADN (Figu- ra 6) el aislamiento de P. cateniannulatus El presente trabajo constituye el primer re- (ISO 39) obtenido de T. peregrinus presentó porte de P. cateniannulatus para Brasil como 99% de homología de la región ITS de su entomopatógeno de T. peregrinus. ADN ribosomal con el de Isaria catenian- nulata (= P. cateniannulatus) GZUIFR-xs.4 Paecilomyces cateniannulatus puede ser (GI170774134) reportado en China. Así mis- fácilmente distinguido de especies es- mo la secuenciación de la región del factor trechamente relacionadas, tales como P. de elongación de este mismo aislamiento fumosoroseus y P. farinosus, por la colo- presentó 99% de homología con Isaria cate- ración blanca de la colonia y cadenas de niannulata (= P. cateniannulatus) raza IP 218 conidios imbricados. La variación genética (GI323145657) de Brasil.

47 iso39 94 gi170774134GZUIFR-xs.4 gi170774135GZUIFR-xs.6 23 100 70 gi164652064GZUIFR-xsxy4 gi299891110GZU-BCECWC113 lsariafumosoroseaGZU-BCECWC1 lsariacicadaeMRCIF45 lsariatenuipesNHJ12337 69 99 lsariatenuipesMY01724 A 50 iso39 100 lsariacateniannulatalP218

lsariacateniannulatalP154

lsariacateniannulataARSEF6242

100 lsariacateniannulataARSEF6240

100 Beauveriabrongniartii2753 Beauveriabrongniartii384

100 Beauveriabassiana2643 B 100 Beauveriabassiana2590 Figura 6. A) Árbol filogenético de P. cateniannulatus basado en la región ITS- 5.8S rDNA. B) Árbol filogenético de P. cateniannulatus basado en el factor de elongación. VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL INIA

Los análisis filogenéticos apuntan valores de INGLIS, P.W.; TIGANO, M.S. 2006. Identifi- “bootstrap” significativos, encima del 50%, cation and taxonomy of some entomopatho- que confirman la identidad de este hongo, genic Paecilomyces spp. (Ascomycota) iso- separando de manera clara P. cateniannula- lates using rDNA-ITS Sequences. Genetics tus de otras especies de Paecilomyces (Fi- and Molecular Biology 29: 132-136. gura 6). Como se observa en el árbol filoge- nético montado en base a las secuencias del JACOBS, D.H.; NESER, S. 2005. Thaumas- factor de elongación, los aislamientos brasi- tocoris australicus Kirkaldy (Heteroptera: leros (IP) formaron un grupo bien definido y Thaumastocoridae): a new insect arrival in diferente de los aislamientos de P. catenian- South Africa, damaging to Eucalyptus trees: nulatus de China (ARSEF). research in action. South African Journal of Science 101: 233-236. 4. CONCLUSIONES LAUDONIA, S.; SASSO, R. 2012. The bron- • Fue identificada la especie de Paecilomy- ze bug Thaumastocoris peregrinus: a new in- ces cateniannulatus infectando T. peregri- sect recorded in Italy, damaging to Eucalyptus nus, siendo ésta la primera ocurrencia de trees. Bulletin of Insectology 65(1): 89-93. este hongo entomopatógeno sobre esta plaga forestal exótica en Brasil. LIN, N.Q.; HUBER, J.T.; LA SALLE, J. 2007. The Australian genera of Mymaridae (Hy- • P. cateniannulatus es capaz de penetrar el menoptera: Chalcidoidea). Zootaxa 1596: cuerpo del insecto a partir de las 4 horas 1-111. posteriores a la inoculación, principalmen- te por las aberturas naturales del insecto. LIANG, Z.Q.; HAN, Y.F.; CHU, H.L.; LIU, A.Y. 2005. Studies on genus Paecilomyces 5. BIBLIOGRAFÍA in China I. Fungal Diversity 20: 83-101.

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