INIA VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL CAPÍTULO III IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y PATOGENICIDAD DEL HONGO ENTOMOPATÓGENO Paecilomyces cateniannulatus AISLADO DE Thaumastocoris peregrinus (HEMIPTERA: THAUMASTOCORIDAE) EN EL ESTADO DE RÍO GRANDE DEL SUR - BRASIL María L. San Román1; Carlos F. Wilcken1; Ana C. Firmino1; Edson L. Furtado1 1. INTRODUCCIÓN dientes activos registrados y las restriccio- nes de uso de plaguicidas no permitidos El área de plantación de eucalipto en Bra- por las certificadoras nacionales e interna- sil ha alcanzado las 5.102.103 ha en 2012 cionales. Dentro del control biológico con según la Asociación Brasilera de Foresta- enemigos naturales, fue reportada la ocu- dores (ABRAF, 2013). En los últimos años, rrencia de Cleruchoides noackae Lin & Hu- nuevas plagas han sido detectadas, ame- ber (Hymenoptera: Mymaridae) parasitando nazando la productividad de las plantacio- huevos de este insecto, en Sydney (Austra- nes. Entre éstas se encuentra la chinche lia) (Lin et al., 2007). Cleruchoides noackae del eucalipto Thaumastocoris peregrinus fue introducido por primera vez en Brasil (Hemiptera: Thaumastocoridae). Esta plaga en noviembre de 2011. Otra alternativa es es considerada especie invasora en varios el control microbiano utilizando organismos países, estando presente en África (Sudáfri- entomopatógenos. En Brasil fue reportada ca y Zimbawe), América del Sur (Argentina, la ocurrencia del hongo Zoophthora radi- Uruguay, Brasil, Chile y Paraguay) y Europa cans (Entomophthorales) afectando ninfas 17 (Italia) (Jacobs y Neser, 2005; Carpintero y y adultos de T. peregrinus en plantaciones Dellapé, 2006; Wilcken et al., 2010; Mar- clonales de eucalipto en el estado de San tínez y Bianchi, 2010; Laudonia y Sasso, Pablo en 2009 (Mascarin et al., 2012). Más 2012). allá del hallazgo, este grupo de hongos re- sulta difícil de multiplicar a escala comercial En Brasil T. peregrinus fue detectado por para su uso a campo (Alves, 1998). Entre primera vez en el 2008 y rápidamente se los principales hongos entomopatógenos transformó en un problema. Este insecto empleados para el control de insectos se cuando ataca plantas de eucalipto reduce encuentran los hongos pertenecientes su productividad, disminuyendo el área fo- a la subdivisión Deuteromycotina, clase liar. Las ninfas y adultos se alimentan suc- Hyphomycetes, con géneros tales como cionando savia, provocando el plateado de Paecilomyces, Beauveria, Metarhizium y las hojas, que evoluciona a clorosis o bron- Lecanicillium (Alves, 1998). Los hongos del ceado, llevando finalmente a la defoliación género Paecilomyces penetran normalmen- de los árboles. Entre las estrategias para su te vía tegumento, usando la presión física y control se encuentra el control químico, ge- la acción química a través del apresorio de neralmente utilizado cuando ocurren brotes penetración. Han sido observados afectan- poblacionales de esta plaga. Sin embargo do lepidópteros, coleópteros, hemípteros y su uso es limitado, no siendo recomenda- ortópteros. Existen reportes de aislamientos do por el riesgo ambiental, la falta de ingre- de Paecilomyces spp. en Stenoma decora 1 Departamento de Producción Vegetal / Defensa Fitosanitaria, Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad Estadual de San Pablo (UNESP), Botucatu, SP, Brasil. VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL INIA (Lepidoptera: Stenomidae) en Bahía, Eup- 2. MATERIALES Y MÉTODOS seudosoma spp. (Lepidoptera: Arctiidae) en San Pablo y en adultos de Lagria villo- Colecta de insectos y aislamiento del sa (Coleoptera: Lagriidae), en Mato Grosso hongo (Alves, 1998). El estudio fue realizado en el Laboratorio de En estudios realizados en áreas afectadas Control Biológico de Plagas Florestales de por T. peregrinus fueron observadas ocu- la Facultad de Ciencias Agronómicas (FCA), rrencias epizoóticas en plantaciones de eu- Universidad Estadual Paulista - Campus de caliptos en la región de Alegrete, Rio Grande Botucatu. Fueron colectados individuos de T. do Sul. A partir de insectos muertos en esa peregrinus muertos en epizootia en las plan- epizootia, se aislaron algunos hongos po- taciones de eucaliptos de la empresa Stora tencialmente entomopatógenos, siendo uno Enso, en la región de Alegrete, Río Grande de ellos identificado como del género Paeci- do Sul. La colecta de insectos fue realizada lomyces, todavía no registrado como patóge- en noviembre de 2011, directamente de la no de T. peregrinus. Este trabajo tuvo como copa de los árboles. Se colectaron individuos objetivo realizar la caracterización morfoló- muertos y moribundos con presencia de mi- gica, biológica, patogénica y molecular de celio sobre el cuerpo, siendo ésta la princi- Paecilomyces spp. aislado de T. peregrinus. pal característica para la selección de las También se realizó un estudio de infección muestras (Figuras 1 y 2). Para determinar el del insecto, visualizado por medio del uso de agente patógeno causante de mortalidad en microscopía electrónica de barrido. los insectos se siguió la metodología basada 2 18 1 A B FiguraFigura 1. 1.A. A.T. peregrinusT. peregrinus sobre sobre hoja dehoja eucalipto de eucalipto en el campo. en el Bcampo.. T. peregrinus B. T. peregrinus enfermos (1) y sanos (2), colectadosenfermos en (1) epizootias y sanos a (2), campo. colectados en epizootias a campo. 0,5 mm Figura 2. T. peregrinusFigura con 2. extrusión T. peregrinus de micelio con deextrusión Paecilomyces de micelio sp. por de las articulaciones y Paecilomyces sp. por las articulaciones y orificio anal. orificio anal. INIA VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL en los postulados de Koch. Los insectos co- El hongo fue pulverizado con una Torre de lectados fueron acondicionados en cámaras Potter con un volumen de 3 mL de sus- húmedas para propiciar la esporulación de pensión de esporas para cada aislamiento los hongos. Después de 24 horas los insec- aplicada a 15 lb/pul2 de presión y con una tos fueron sometidos a esterilización con so- concentración de 106 esporas/mL (diluido lución de hipoclorito de sodio al 2%, alcohol con agua estéril y coadyuvante Tween 20 al 70%, agua esterilizada y posteriormente al 0,02%). Para el testigo fue realizada la colocados en medio agar-agua en placas de aspersión utilizando agua destilada es- Petri. Después de la observación del creci- téril con Tween al 0,02%. Después de la miento de la colonia, ésta fue repicada en inoculación las placas fueron colocadas medio PDA (papa-dextrosa-agar) para su en cámara BOD a 25°C y un fotoperíodo posterior identificación. de 12 horas de luz/oscuridad. Se realiza- ron evaluaciones diarias del experimento Obtención de cultivos monospóricos contando y retirando los insectos muertos hasta 6 días o hasta alcanzar la mortali- Para la obtención de cultivos monospóricos, dad total en el tratamiento. Los insectos las colonias obtenidas de los aislamientos muertos fueron colocados en cámara hú- fueron lavadas con agua destilada esterili- meda para reaislar el hongo causante de zada y la concentración de las suspensio- la mortalidad y para confirmar que se trató nes de esporas fue estandarizada en 102 del aislamiento inicialmente aplicado. esporas/mL. Se colocaron 100 µl de la sus- pensión de esporas en placas conteniendo Proceso de colonización del hongo medio agua/agar enriquecido con 0,005% en el insecto de oxitetraciclina. Las esporas fueron indi- vidualizadas y visualizadas en microscopio Para complementar los estudios de pa- óptico, utilizando cámara de Neubauer para togenicidad se realizó un seguimiento de el conteo y posterior dilución a la concen- la colonización del hongo sobre el cuerpo tración padrón (102 esporas/mL). Poste- del insecto. Para esto fue pulverizada una riormente, las esporas individuales fueron suspensión conteniendo 106 esporas/mL di- 19 transferidas a medio PDA para la formación rectamente sobre los insectos vivos. Como de las colonias. testigo la pulverización fue hecha con agua destilada estéril. Test de patogenicidad en T. peregrinus Después de la inoculación, conforme a la metodología descripta para el test de pa- El objetivo del test fue evaluar el potencial togenicidad, los insectos tratados fueron entomopatogénico de los hongos aislados. colectados en intervalos de tiempo prede- Para la realización de los bioensayos se terminados (2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 utilizaron insectos sanos de T. peregrinus, horas) y fijados en solución de Karnovs- obtenidos de la cría en laboratorio. A partir ky (glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído del aislamiento puro del hongo, obtenido a 2,0%, tampón fosfato 0,05M, pH 7,2), por partir de los insectos, se escogieron algu- un período mínimo de 24 horas a partir nas placas para hacer los test de patoge- de la muerte de los insectos. Posterior- nicidad. Se utilizó un diseño experimental mente, las muestras fueron preparadas y enteramente al azar con dos tratamientos analizadas en un microscopio electrónico (patógeno y testigo) y 4 repeticiones. Cada de barrido LEO435-VP. Se evaluaron cin- repetición estaba compuesta por una placa co insectos para cada intervalo de tiempo de Petri conteniendo gel estéril y un disco predeterminado. La preparación y obser- de hoja de Eucalyptus camaldulensis, en vación de las muestras fue realizada en el el cual se colocaban 10 insectos (ninfas y Centro de Microscopía Electrónica, locali- adultos) de T. peregrinus. zada en la ESALQ/USP. VI JORNADA TÉCNICA DE PROTECCIÓN FORESTAL INIA Caracterización biológica del ITS 1 e ITS 4 que generan un fragmento crecimiento de aproximadamente 750 pares de bases. Para la PCR, se emplearon 3 μl del ADN La caracterización cultural de los aisla- total extraído (30 ng), tampón 1X de la en- mientos se basó en la velocidad de creci- zima GoTaq ADN polimerasa (Promega®), miento micelial, color de la colonia y es- 2mM MgCl2, 0,2 mM DNTP, 0,2 μM de cada tructuras producidas en medio de cultivo primer y 1,25 U de GoTaq DNA polimera- PDA. A partir de los cultivos, se obtuvieron sa (Promega®), ajustando el volumen de la discos de 6 mm de diámetro de los bordes reacción para 50 μl con agua tratada con de la colonia cultivada por 10 días en me- dietilpirocarbonato (DEPC).