Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro De

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

Victor Anastácio Duarte Holanda

Papel do sistema peptidérgico da nociceptina/orfanina FQ no comportamento depressivo em camundongos

Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Doutor em Psicobiologia.

Natal/RN

2018

VICTOR ANASTÁCIO DUARTE HOLANDA

PAPEL DO SISTEMA PEPTIDÉRGICO DA NOCICEPTINA/ORFANINA FQ NO COMPORTAMENTO DEPRESSIVO EM CAMUNDONGOS

Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Doutor em Psicobiologia.

Orientadora: Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli

Natal/RN

2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Sistema de Bibliotecas – SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Holanda, Victor Anastácio Duarte. Papel do sistema peptidérgico da nociceptina/orfanina FQ no comportamento depressivo em camundongos / Victor Anastácio Duarte Holanda. - 2019. 160 f.: il.

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro De Biociências, Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia. Natal, RN, 2019. Orientadora: Profª. Drª. Elaine Cristina Gavioli.

1. Nociceptina/orfanina FQ - Tese. 2. Receptor NOP - Tese. 3. Ligantes NOP - Tese. 4. Antidepressivo - Tese. 5. Estresse - Tese. 6. Camundongo - Tese. I. Gavioli, Elaine Cristina. II. Título.

RN/UF/BCZM CDU 519.513

Elaborado por Ana Cristina Cavalcanti Tinôco - CRB-15/262

Título: Papel do sistema peptidérgico da nociceptina/orfanina FQ no comportamento depressivo em camundongos

Autor: Victor Anastácio Duarte Holanda

Data da defesa: 23/11/2018

Banca Examinadora

Profa. Dra. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos

Universidade Federal do Ceará

Profa. Dra. Mariana Ferreira Pereira de Araújo Instituto Internacional de Neurociências Edmond e Lily Safra

Prof. Dr. Hindiael Aeraf Belchior Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Profa. Dra. Janine Inez Rossato Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Dedico esse trabalho aos meus pais, Antonio Carlos e Ozana, por sempre acreditarem em mim e nunca desistirem dos meus sonhos. Obrigado por tudo!

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar eu agradeço a Deus, por ter me colocado nesse caminho e ter me mantido firme durante todas as tempestades, por ser meu guia e me permitir crescer a cada dia.

Agradeço de forma muito especial à minha orientadora, Profa. Dra. Elaine Gavioli. Não só pela orientação, mas sim por ter acreditado no meu potencial, por sempre ter me incentivado a seguir em busca dos meus objetivos, por sempre apresentar aquela palavra acolhedora nos momentos mais difíceis durante todo esse período. Agradeço por ter confiado em mim, e contribuído no meu amadurecimento, transformação e formação. Certamente, o seu apoio, preocupação e carinho foram indispensáveis para que eu pudesse chegar ate aqui.

Ao Prof. Dr. Girolamo Calo’ e a Dra. Chiara Ruzza pelo acolhimento, orientação e sugestões fundamentais para a construção desse trabalho. Em especial a Dra Federica Ferrari, Joaquim Azevedo, Sofia Simioni e Nunzia Guarino pela amizade e por me acolher, tornando o período na cidade de Ferrara mais ameno.

Aos professores Dra. Silvânia Vasconcelos, Dra. Mariana Araújo, Dr, HindiaelBelchiore Dra Janine Rossatopor terem aceitado fazer parte dessa banca de doutorado. Obrigado pela disponibilidade e pela contribuição.

A todos meus amigos queridos do Laboratório de Farmacologia Comportamental, Fernanda, Clarissa, Iris, Laila, Mara, Wilton, Layze, Pamela, Epifanio, Ingrid, Marlon, Mirella, Decio, Adriana, Lisiane e Julia. Obrigado por cada experiência compartilhada e pelos momentos de descontração, que tornaram o trabalho no laboratório ainda mais prazeroso.

Aos amigos mais que especiais que me acompanham durantes todos esses anos de tanto crescimento. À Luana, pela sua amizade sincera desde o

início! Obrigado por ser meu ponto de equilíbrio e por preencher esses anos com a sua alegria, seu carinho, sua força, sua disponibilidade. Serie eternamente grato por sua amizade!

À Marina, Fernanda, Diana e Luiz Eduardo. Obrigado por se fazer presente em todos os momentos de dificuldade, de alegria, de crescimento, enfim, sempre!

À Samila, Mariana, Maria Luiza, Mateus, Iago e Lúcia que aqui representam tantos outros amigos que não cabem nesta página, mas que deixaram uma parte de si na minha vida.

Ao Caio, por todo o amor e entrega! Pela paciência e incentivo nesses anos desafiadores e por ir sempre em frente comigo. Muito obrigado pelas inúmeras vezes que você me exergou melhor do que eu sou.

Aos meus pais, Antonio Carlos e Ozana, que sempre acreditaram em mim mesmo quando nem eu acreditava. Muito obrigado pelas inúmeras vezes que vocês abriram mão dos seus sonhos em prol dos meus, em escolher o meu sorriso em detrimento dos seus. Ao meu irmão, Vinicius, pelo companheirismo incondicional desde sempre e para sempre. À cada pessoa dessa família, que a seu modo se fez presente e confortou esse coração saudoso.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

A todas as pessoas não mencionadas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

RESUMO

Introdução: A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é o ligante endógeno de um receptor acoplado a proteína Gi, denominado receptor NOP. Tanto a N/OFQ quanto o receptor NOP são amplamente expressos em áreas envolvidas no processamento das emoções. Evidências clínicas e pré-clínicas sugerem efeito antidepressivo decorrente do bloqueio do receptor NOP. Este estudo tem como objetivo investigar o papel do sistema peptidérgico da N/OFQ-receptor NOP na modulação do comportamento depressivo em camundongos. Metodos: Camundongos machos Swiss e CD-1 e camundongos knockout para o receptor NOP (NOP(-/-)) foram empregados neste estudo. Para avaliar o comportamento do tipo depressivo dos animais foram utilizados o teste da natação forçada (TNF) e o modelo do desamparo aprendido (DA). Na primeira etapa deste estudo, os efeitos de agonistas, antagonistas e fenótipo de camundongos NOP(-/-) foram investigados no desenvolvimento do comportamento desamparado. Em seguida, foi avaliado o efeito da co-administração de agonistas NOP e fármacos antidepressivos clássicos no TNF e DA. Resultados: Os agonistas NOP, Ro 65- 6570 (0,01-1 mg/kg, ip) e MCOPPB (0,1-10 mg/kg, ip), pré-sessões de indução, aumentaram a porcentagem de camundongos que desenvolvem o comportamento de desamparo. Em contraste, o bloqueio do receptor NOP com o antagonista SB-612111 (1-10 mg/kg, ip) reduziu a porcentagem de camundongos exibindo comportamento desamparado e resultados semelhantes foram observados em camundongos NOP(-/-). Porém, sob a mesma condição experimental, a nortriptilina (20 mg/Kg, ip) não alterou a aquisição de comportamento desamparado. Na segunda parte desse estudo, a administração de fluoxetina, nortriptilina, R-ketamina e SB-612111 induziu efeito semelhante ao antidepressivo no TNF. A administração aguda dos agonistas NOP, N/OFQ e Ro 65-6570, não induziu nenhuma alteração comportamental. No entanto, a co- administração de N/OFQ e Ro 65-6570 bloqueou a expressão do comportamento do tipo antidepressivo de SB-612111, fluoxetina e nortriptilina, mas não R-ketamina, no TNF. Da mesma forma, a injeção sistêmica de SB- 612111, nortriptilina e R-ketamina reverteu o comportamento desamparado dos camundongos expostos ao DA. A co-administração de Ro 65-6570 bloqueou o efeito antidepressivo do SB-612111 e nortriptilina, mas não R-ketamina. Conclusão: A ativação da sinalização do receptor NOP facilita, enquanto o seu bloqueio impede a aquisição do comportamento desamparado. Ainda, a ativação do receptor NOP interfere no efeito antidepressivo de fármacos monoaminérgicos, como a nortriptilina e fluoxetina, mas não R-ketamina. Em última análise, esses achados indicam um perfil pró-depressivo induzido pela ativação da sinalização do receptor NOP durante um evento estressante, bem como contribuem para investigar o papel exercido pelo sistema N/OFQ-receptor NOP na regulação dos estados de humor.

Palavras-chave: Nociceptina/orfanina FQ; receptor NOP; agonista NOP; antagonista NOP; antidepressivo; estresse; teste da natação forçada; desamparo aprendido; camundongo.

ABSTRACT

Introduction: Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) is the endogenous ligand of a receptor coupled to Gi protein named NOP receptor. Both N/OFQ and NOP receptor are widely expressed in brain areas involved in emotional processing. Clinical and preclinical evidence suggests antidepressant effects due to the blockade of the NOP receptor. This study aimed to investigate the role of the N/OFQ-NOP receptor system in the modulation of depressive-like behaviors in mice. Methods: Male Swiss and CD-1 mice and mice knockout for the NOP receptor (NOP (-/-)) were used in this study. The forced swimming test (FST) and the learned helplessness model (LH) were used to evaluate the depressive-like behavior of mice. Firstly, the effects of NOP agonists, antagonists and NOP(-/-) phenotype were investigated in the acquisition of the helpless behavior. The effects of co-administration of NOP agonists and classical antidepressant drugs on FST and LH were also investigated. Results: The NOP agonists, Ro 65-6570 (0.01-1 mg/kg, ip) and MCOPPB (0.1-10 mg/kg, ip), pre-induction sessions, increased percentage of mice developing the helpless phenotype. In contrast, blockade of NOP receptor with the antagonist SB-612111 (1-10 mg/kg, ip) reduced the percentage of mice exhibiting helpless behavior, and similar results were observed in NOP(-/-) mice. Interesting enough, under the same experimental condition, administration of nortriptyline (20 mg/kg, ip) did not alter the acquisition of helpless behavior. In the second part of this study, fluoxetine, nortriptyline, R-ketamine and SB-612111 induced similar antidepressant-like effects in the FST. Acute administration of NOP agonists, N/OFQ and Ro 65- 6570, did not induce any behavioral change. However, co-administration of N/OFQ and Ro 65-6570 blocked the antidepressant effects of SB-612111, fluoxetine and nortriptyline, but not R-ketamine, in FST. Likewise, the systemic injection of SB-612111, nortriptyline, but not R-ketamine, reversed the helpless behavior of mice. Co-administration of Ro 65-6570 blocked the antidepressant effects of SB-612111 and nortriptyline, but not R-ketamine. Conclusion: The activation of NOP receptor signaling facilitates, while its blockade, prevents the acquisition of helpless behavior. Furthermore, NOP receptor activation interferes with the antidepressant effects of monoaminergic drugs, including nortriptyline and fluoxetine, but not R-ketamine. Ultimately, these findings indicate a pro- depressive profile due to the activation of the NOP receptor signaling during a stressful event, as well as contribute to the investigation about the role played by the N/OFQ-NOP receptor in the regulation of mood states.

Key words: Nociceptin/orphanin FQ; NOP receptor; NOP agonists; NOP antagonists; antidepressant; stress; forced swimming test; learned helplessness; mouse.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática das respostas intracelulares decorrentes da ativação do receptor NOP 33

Figura 2: Desenho experimental para indução do comportamento de desamparo em camundongos 48

Figura 3: Desenho experimental para indução do comportamento de desamparo em camundongos (protocolo experimental 2) 49

Figura 4: Desenho experimental para avaliação do componente cognitivo do desamparo aprendido. 48

Figura 5: Fluxograma ilustrativo da etapa I – padronização da condição experimental do desamparo aprendido 51

Figura 6: Fluxograma ilustrativo da etapa I – efeito de fármacos antidepressivos na condição experimental definida na série experimental anterior 51

Figura 7: Fluxograma ilustrativo da etapa II – administração de agonistas NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado 52

Figura 8: Fluxograma ilustrativo da etapa III – administração de antagonistas NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado41 53

Figura 9: Fluxograma ilustrativo da etapa III - fenótipo de camundongos NOP(-/- ) no modelo do desamparo aprendido 53

Figura 10: Fluxograma ilustrativo da etapa IV – administração de agonistas NOP na performance cognitiva de camundongos 54

Figura 11: Fluxograma ilustrativo da etapa IV – performance cognitivade camundongos NOP(-/-) na condição de estresse escapável 55

Figura 12: Fluxograma ilustrativo da etapa V – administração de antidepressivos convencionais no teste da natação forçada 56

Figura 13: Fluxograma ilustrativo da etapa VI – administração de ligantes NOP de origem peptídica no teste da natação forçada 56

Figura 14: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 da etapa VII – co- administração de N/OFQ e fluoxetina no teste da natação forçada 57

Figura 15: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa VII - co- administração de N/OFQ e nortriptilina no teste da natação forçada 57

Figura 16: Fluxograma ilustrativo do experimento 3 da etapa VII - co- administração de N/OFQ e R-ketamina no teste da natação forçada 58

Figura 17: Fluxograma ilustrativo da etapa VIII – administração de ligantes NOP no teste da natação forçada 58

Figura 18: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 - etapa IX - co-administração de Ro 65-6570 e fluoxetina no teste da natação forçada 59

Figura 19: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa IX - co- administração de Ro 65-6570 e nortriptilina no teste da natação forçada 59

Figura 20: Fluxograma ilustrativo do experimento 3 da etapa IX - co- administração de Ro 65-6570 e R-ketamina no teste da natação forçada 60

Figura 21: Fluxograma ilustrativo da etapa X - administração de antidepressivos convencionais no modelo do desamparo aprendido 61

Figura 22: Fluxograma ilustrativo da etapa XI – administração de ligantes NOP no modelo do desamparo aprendido. 62

Figura 23: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 da etapa XII – co- administração de Ro 65-6570 e nortriptilina no modelo do desamparo aprendido 62

Figura 24: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa XII - co- administração de Ro 65-6570 e R-ketamina no modelo do desamparo aprendido 63

Figura 25: Padronização das condições experimentais para realizar o teste de DA em camundongos CD-1 66

Figura 26: Efeito dos agonistas NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado em camundongos CD-1 67

Figura 27: Efeitos de nortriptilina, SB-612111 e fenótipo de camundongos NOP(- /-)no teste do desaparo aprendido 68

Figura 28: Efeito de agonistas NOP, Ro 65-6570 e MCOPPB, e fenótipo de camundongos NOP(-/-)no componente cognitivo do modelo desaparo aprendido 70

Figura 29: Efeito da administração de fluoxetina (20 mg/Kg; ip) e nortriptilina (20 mg/Kg; ip) e R-ketamina (10 m/Kg; ip) no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao teste da natação forçada 71

Figura 30 Efeito da co-administração de N/OFQ (1 nmol; icv) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip) e UFP-101 (10 nmol; icv) ou SB-61211 (10 mg/Kg; ip) no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao TNF ‘ 72

Figura 32: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip) e fluoxetina (20 mg/Kg; ip), nortriptilina (20 mg/Kg; ip) e R-ketamina (10 mg/Kg; ip) no tempo

de imobilidade dos camundongos expostos ao teste da natação forçada 74

Figura 33: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip) e fluoxetina (20 mg/Kg; ip), nortriptilina (20 mg/Kg; ip) e R-ketamina (10 mg/Kg; ip) no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao teste da natação forçada 76

Figura 34: Efeitos do pré-tratamento com Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg, ip) e SB- 612111 (10 mg/Kg, ip) nas latências de escape e número de escapes em camundongos desamparados 77

Figura 35: Efeito do pré-tratamento com Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg, ip) e nortriptilina (20 mg/Kg, ip) ou R-ketamina (10 mg/Kg, ip) na latência de escape e número de escapes em camundongos desamparados 78

Figura 36: Influência de eventos estressores sobre a neurotransmissão N/OFQnérgica 89

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT - Serotonina

ACTH - Hormônio adenocorticotropico

AMPc - Monofosfato cíclico de denosina

ANOVA - Análise de variância

BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro

CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais

CPF – córtex pré-frontal

CRF - Hormônio liberador de corticotrofina

DA – Desamparo aprendido

DALY - Disability-Adjusted Life Year / Anos de vida ajustados pela doença

DSM-V - Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders / Manual de Diagnóstico e Estatístico dos Transtornos Mentais, edição

GPCR - Receptor acoplado a proteína G

HPA - Eixo hipotálamo-pituitária-adrenal

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

Icv – Intracerebroventricular

Ip – Intraperitoneal

ISRS - Inibidores seletivos da recaptação de serotonina

LCE - Labirinto em cruz elevado

LPS – Lipopolisacarídeo bacteriano

MAO - Enzima monoaminooxidase

N/OFQ - Nociceptina/orfanina FQ

NA - Noradrenalina

NDR – núcleo dorsal da raphe

NMDA - O N-metil-D-aspartato

NOP - Receptor do peptídeo N/OFQ

NOP(-/-)- Animais knockoutpara o receptor NOP

OMS - Organização Mundial da Saúde

POMC - Pró-opiomelanocortina

PVN - Núcleo paraventricular do hipotálamo

RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro

SNC - Sistema nervoso central

TDM - Transtorno depressivo maior

TNF - Teste da natação forçada

TSC - Teste de suspensão pela cauda

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ...... 19

1.1. Transtornos mentais...... 19

1.2. Transtorno depressivo maior ...... 19

1.3. Neurobiologia do transtorno depressivo ...... 20

1.4. Modelo animal de depressão: Testes de desespero comportamental e modelo do desamparo aprendido ...... 27

1.5. Tratamento farmacológico da depressão ...... 30

1.5 Sistema Nociceptina/orfanina FQ – receptor NOP ...... 31

1.6 Sistema N/OFQ – receptor NOP e depressão ...... 37

2. OBJETIVOS ...... 41

2.1 Objetivo geral ...... 41

2.2 Objetivos específicos ...... 41

3. MATERIAIS E MÉTODOS...... 42

3.1 Animais ...... 42

3.2 Drogas e tratamentos ...... 43

3.3 Cirurgia estereotáxica para implantação de uma cânula intracerebroventricular ...... 44

3.4 Teste da natação forçada (TNF) ...... 45

3.5 Desamparo aprendido ...... 45

3.6 Análises para avaliação do posicionamento da cânula ...... 48

3.7 Delineamento experimental ...... 49

Etapa I: Avaliação do papel do sistema da N/OFQ – receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado ...... 49

Experimento 1: Padronização do DA em camundongos CD-1 ...... 49

Experimento 2: Efeito da administração de agonista NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado ...... 50

Experimento 3: Efeito do bloqueio farmacológico e genético do receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado ...... 51

Experimento 4: Efeito da administração de agonistas NOP e do fenótipo NOP (-/-) sobre o componente cognitivo do DA ...... 53

Etapa II: Investigação do efeito da co-administração de agonistas NOP e antidepressivos em condição de desespero comportamental e em situação de estresse incontrolável ...... 54

Experimento 1: Padronização das condições experimentais para a realização do TNF ...... 54

Experimento 2: Efeito da co-administração de agonistas NOP, N/OFQ ou Ro-65-6570, e antagonistas NOP, UFP-101 ou SB-612111, no TNF ...... 55

Experimento 3 Efeito da co-administração de N/OFQ e antidepressivos clássicos em camundongos no TNF ...... 56

Experimento 4: Efeito da co-administração de Ro 65-6570e antidepressivos clássicos no TNF ...... 57

Experimento 5: Avaliação do efeito da administração de nortriptilina e R- ketamina em animais que desenvolveram o fenótipo desamparado: ...... 59

Experimento 6: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e SB-612111 no desamparo aprendido ...... 60

Experimento 7: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e antidepressivos clássicos no desamparo aprendido ...... 60

3.8 Análise estatística ...... 62

4. RESULTADOS ...... 63

Padronização do DA em camundongos CD-1 ...... 63

Efeito da administração de agonista NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado ...... 64

Efeito do bloqueio farmacológico e genético do receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado ...... 65

Efeito da administração de agonistas NOP e do fenótipo NOP(-/-) sobre o componente cognitivo do DA ...... 67

Padronização das condições experimentais para a realização do TNF ...... 68

Efeito da co-administração de N/OFQ e antidepressivos clássicos em camundongos no TNF ...... 70

Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e antidepressivos clássicos no TNF ...... 71

Avaliação do efeito da administração de nortriptilina e ketamina em animais que desenvolveram o fenótipo desamparado ...... 73

Efeito da co-administração de Ro 65-6570e antidepressivos clássicos no desamparo aprendido ...... 75

5. DISCUSSÃO ...... 78

6. CONCLUSÕES ...... 93

7. PERSPECTIVAS FUTURAS ...... 95

8. REFERÊNCIAS ...... 96

9. ANEXOS ...... 129

Parecer Comissão de Ética ...... 129

Artigo publicado na revista Psychopharmacology ...... 132

1. INTRODUÇÃO

1.1. Transtornos mentais

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), através da publicação “Mental Health: New Understanding, New Hope” (Brundtland, 2001), os transtornos mentais e comportamentais são compreendidos como condições clínicas caracterizadas por alterações do pensamento, do humor ou de comportamento e representam um sério problema de saúde pública em todo o mundo. Estudos epidemiológicos recentes realizados em 63 países mostram que 29% das pessoas já apresentaram algum transtorno mental ao longo de sua vida (Steel et al., 2014). Os pacientes diagnosticados com algum transtorno mental sofrem com ampla redução na qualidade de vida, em virtude das alterações de cunho afetivos, cognitivos, comportamentais e físicos (Birnbaum et al., 2010; Kessler et al., 2005).

1.2. Transtorno depressivo maior

O transtorno depressivo maior (TDM) é um dos transtornos depressivos mais prevalentes na população, causando perturbações cognitivas e afetivas, afetando de forma negativa a qualidade de vida dos pacientes. Nos Estados Unidos da América(EUA), estes transtornos apresentam incidência ao longo da vida de 20% em mulheres e 12% em homens (Goodier, 2014), com taxas de prevalências de 12 meses em torno de 6 a 8% (Murphy et al., 2012). Geralmente, observa-se que a depressão acomete cerca de 2 vezes mais as mulheres que os homens (Van de Velde et al., 2010). No entanto, recentemente questionou-se essa clássica proporção 2:1 entre mulheres e homens, visto que foi demonstrado que homenssão menos propensos a relatar sintomas depressivos quando questionados sobre depressão, porém acabam relatando um número maior de sintomas depressivos quando questionados sobre bem-estar (Goodier, 2014). No Brasil, dados do IBGE (2013) estimam que 7,6% das pessoas com 18 anos 19

ou mais de idade receberam diagnóstico de depressão por profissional de saúde mental. Verificou-se que há maior prevalência desta doença em mulheres (10,9 %) do que em homens (3,9 %) e na área urbana do que rural. O TDM pode surgir em qualquer idade, porém as chances aumentam com o início da puberdade, observandotaxas de incidências de TDM: 0,9% em crianças em idade pré- escolar, 1,9% em crianças em idade escolar e 4,7% em adolescentes (Kashani e Sherman, 1988).

De acordo com o DSM-V (2013), a depressão maior é um transtorno psiquiátrico caracterizado por cinco ou mais dos sintomas,sendo pelo menos um dos sintomas o humor deprimido ou a perda de interesse ou prazerem atividades cotidianas. Estes sintomas precisam estar presentes por, pelo menos, duas semanas e necessariamente representam mudanças no funcionamento prévio do indivíduo. Os demais sintomas apresentados pelos pacientes depressivos incluem alterações no apetite ou peso, sono e atividade psicomotora, diminuição da energia, sentimentos de desvalorização pessoal ou culpa, dificuldades em pensar, concentrar-se ou tomar decisões, pensamentos recorrentes de morte, planos ou tentativas suicidas.Oaparecimento crônico dos sintomas, sejam eles emocionais e/ou somáticos,faz com que o indivíduo se torne incapaz de exercer sua atividade no trabalho,bem como, causa prejuízo substancial na vida social e pessoal (Enns e Cox,1999; Greco et al., 2004; Muñoz et al., 2005).

1.3. Neurobiologia do transtorno depressivo

Existem várias hipóteses que são utilizadas para explicar as alterações morfofuncionais que justificam o desenvolvimento do fenótipo depressivo nos pacientes. A primeira teoria e mais bem estudada é a teoria monoaminérgica, que defende que o surgimento do fenótipo depressivo é causado por uma redução na concentração de monaminas, principalmente serotonina (5-HT) e noradrenalina (NA), no sistema nervoso central (SNC) (Schildkraute Kety, 1967). As primeiras evidências acerca dessa teoria surgiram de pesquisas clínicas com agentes que atuavam em condição não psiquiátrica, como a iproniazida e a

imipramina, que promoveram efeito antidepressivo, porém foram iniciamente testados para tratamento da tuberculose e da esquizofrenia, respectivamente, e mais tarde relacionados ao aumento da concentração sináptica de 5-HT e NA (Berton e Nestler, 2006; Pittenger e Duman, 2007). Além disso, pesquisas com pacientes (hipertensos) que faziam uso de reserpina, fármaco que bloqueia o envesiculamento das monaminas, deplentando as concentrações dessas na fenda sináptica, relacionaram o uso desse fármaco com o surgimento de sintomas depressivos (Cleare, 2004). Estudos clínicos mais recentes, usando a técnica de Tomografia por Emissão de Prótons (PET), mostrou aumento em cerca de 30% na atividade da enzima monoamina oxidase (MAO) em pacientes depressivos (Meyer et al., 2006). Ainda, identificou-se redução na disponibilidade de metabólitos de NA no sangue arterial e venoso em pacientes depressivos quando comparados aos controles (Lambert et al., 2000).

Apesar dos antidepressivos promoverem elevação na concentração de monoaminas a partir das primeiras administrações (Trivedi, 2006), o aparecimento dos efeitos terapêuticos ocorre após algumas semanas de tratamento, mostrando que existem outros fatores, além da diminuição de monoaminas, envolvidos no desenvolvimento do fenótipo depressivo. De fato, foi demonstrado que depletar monoaminas em pacientes depressivos intensifica os sintomas depressivos, porém ao depletar monoaminas em pacientes saudáveis não contribui para o surgimento do estado depressivo (Ruhe et al., 2007). Dados semelhantes foram relatados em estudos com animais. De fato, a depleção de 5-HT e NA inibe a ação dos inibidores seletivos da receptação de serotonina (ISRSs) e inibidores seletivos da receptação de noradrenalina em modelos animais de depressão, porém por si a depleção de monoaminas não induz fenótipo depressivo (Lucki e O’Leary, 2004; Cryan et al., 2004; Yalcin et al., 2008).

A partir dessas observações clínicas e pré-clínicas contraditórias, a teoria monoaminérgica vem sendo editada a fim de contemplar esse retardo no início do efeito terapêutico, e neste contexto, foram incluídos que no âmbito de suas ações, os fármacos antidepressivos, para produzirem o efeito terapêutico

demandam regulação negativa e desenssibilização pré- e pós-sináptica de receptores de NA e 5-HT (Ferrari e Villa, 2016). Um dos exemplos mais estudados é o de que a administração de diversos antidepressivos, em longo prazo, mas não agudamente, diminui os sítios de ligação ao ligante do receptor ß-adrenérgico (ßAR) no hipocampo e córtex cerebral (Duman et al., 1997), bem como, a capacidade dos ßARs de estimular a formação de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)(Duman et a., 1997). Utilizando agonistas do receptor 5-HT1A, estudos de imagem (PET) evidenciaram alterações na expressão desse receptor em pacientes depressivos (Pitchot et al., 2005, Savitz, 2013) e a exposição de longa duração a antidepressivos restaura a expressão do receptor 5-HT1A no hipocampo (Blier e Montigny, 1994). Estudos de eletrofisiologia mostram que administração aguda e de curta duração, de agonistas do receptor 5-HT1A produz supressão no desparo de neurônios serotoninérgicos. Entretanto, durante o tratamento prolongado, a atividade de neurônios serotoninérgicos retorna progressivamente ao normal como resultado de um desensibilização de autoreceptores somatodendriticos (para revisão: Blier e Montigny, 1994).Ainda, um estudo post-mortemmostrou níveis reduzidos da p11, uma proteína que aumenta a eficiência do receptor 5-HT1B, receptor pré- sináptico, em pacientes depressivos (Carhart-Harris et al., 2016).

Além da disfunção na neurotransmissão monoaminérgica, existe uma vertente de pensamento que associa o desenvolvimento do fenótipo depressivo com alterações na funcionalidade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e elevação permanente nos níveis de glicocorticoides circulante (Nemeroff, 1996). O mecanismo fisiológico que ocorre em resposta a eventos estressores é a ativação do eixo HPA. Os neurônios do núcleo paraventricular (PVN) do hipotálamo respondem ao estresse, induzindo a síntese e secreção do hormônio liberador de corticotrofina (CRF) que, por sua vez, atua na pituitária anterior, induzindo a síntese e liberação do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), este estimula o córtex da adrenal, induzindo síntese e liberação de glicocorticoides (Herman et al., 2003). Os glicocorticóides promovem alterações metabólicas e comportamentais que capacitam o organismo a responder eficientemente aos eventos estressores (para revisão: Nestler et al., 2002). A ativação desse eixo é

controlada por algumas vias centrais, como por exemplo, o hipocampo exerce influência inibitória sobre a ativação do eixo HPA, respondendo a elevação na concentração de glicocorticoides, enquanto que a amígdala exerce influência positiva sobre a ativação dos neurônios do PVN (Nestler et al., 2002).

Os glicocorticoides são de extrema importância para o controle da ativação do eixo HPA. Em níveis normais de glicocorticoides, ocorre melhora na função do hipocampo, inibindo a ativação do eixo e favorecendo as habilidades cognitivas. Já em condições de estresse prologado e/ou severo, nos quais nota- se persistente elevação dos níveis de glicocorticoides, percebe-se dano nos neurônios hipocampais, principalmente na camada CA3. Estudos sugerem que esse dano envolve redução na arborização dendítrica, diminuição no número de espinhas dendítricas (McEwen, 2000; Sapolsky, 2000) e redução do nascimento de novos neurônios granulares no giro denteado de adultos (Fuchs e Gould, 2000). Sendo assim, esse dano ao hipocampo geraria redução no feedback negativo sobre a ativação do eixo, resultando em elevação persistente de glicocorticoides que intensificaria os danos neuronais. Portanto, postula-se que esse ciclo vicioso, com consequente dano hipocampal, está mediando o desenvolvimento da TDM (Nestler et al., 2002).

Corroborando essa corrente de pensamento, estudos apontam que cerca de metade dos pacientes diagnosticados com depressão apresentam eixo HPA disfuncional e essa característica é corrigida com o uso crônico de antidepressivos (Sachar e Baron, 1979; De Kloet et al., 1988; Arborelius et al., 1999; Holsboer, 2001). Foi demonstrado também hipersecreção de CRF em pacientes depressivos (Arborelius et al., 1999; Holboer, 2001; Kasckow et al., 2001). Ainda, em concordância com estudos clínicos, experimentos com animais submetidos ao modelo da separação materno fetal mostram alteração na ativação do eixo HPA, que persiste até a vida adulta e é corrigida com o uso de antidepressivos (De Kloet et al., 1988; Francis e Meaney, 1999; Heim e Nemeroff, 2001). Já foi relatado na literatura que o fenótipo depressivo pode estar ligado a alterações na liberação de CRF. De fato, antagonistas do receptor

CRF1promovem ações do tipo antidepressiva em animais expostos a diferentes modelos animais de depressão (para revisão: Paez-Pereda et al., 2011).

O dano hipocampal, resultante da elevação permanente de glicocorticoides no sangue é a observação mais replicada em estudos pré- clínicos e em observações post-mortem, que fornece base para a hipótese que correlaciona o desenvolvimento do TDM com a diminuição dos fatores neurotróficos (Monteggia et al., 2004; Duman e Monteggia, 2006). Muitos estudos ressaltam o papel do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) nessa hipótese. Observações pré-clínicas têm mostrado que situações de estresse reduzem a expressão de BDNF no hipocampo e o uso crônico de antidepressivos reestabelece esta sinalização (Duman e Monteggia, 2006). Além disso, estudos post-mortem mostram que o hipocampo de pacientes deprimidos apresenta redução no seu volume e na expressão de BDNF e do seu receptor (Karege et al., 2005). Ainda, a infusão direta de BDNF no hipocampo evoca efeito do tipo antidepressivo em roedores e esse efeito foi bloqueado em animais knockout para o gene do receptor do BDNF (Shirayama et al., 2002; Monteggia, 2007). Porém, evidências na literatura se contrapõem a hipótese de redução dos níveis de fatores neurotróficos na depressão: (1) muitos estudos têm falhado em evidenciar as alterações na expressão de BNDF e outros fatores neurotróficos causadas pelo estresse e pela terapia antidepressiva ou têm relatado resultados que contrapõem essa teoria (Groves, 2007; Martinowich et al., 2007); (2) a depleção de BDNF ou o bloqueio do seu receptor no prosencéfalo não induz fenótipo do tipo depressivo (Monteggia, 2007); (3) em algumas áreas, como por exemplo, área tegumentar ventral (ATV) ou núcleo accubens (NAc), a injeção de BDNF induz efeito do tipo pró-depressivo (Berton, 2006).

Contudo, um efeito marcante de praticamente todos os antidepressivos usados na clínica é a indução de neurogênese no hipocampo, processo no qual novos neurônios são formados a partir de progenitores neurais da zona subgranular hipocampal, que após se diferenciarem migram até o giro denteado (Sahay e Hen, 2007; Pittenger e Duman, 2008). O bloqueio da neurogênese impede o aparecimento do efeito do tipo antidepressivo em vários modelos

animais de depressão (Santarelli et al., 2003; Pittenger e Duman, 2008). Além disso, o tratamento com antidepressivos, através da ativação de fatores de transcrição, como o CREB, aumenta os níveis dos fatores de crescimento (Sahay e Hen, 2007), como o BDNF.

Já existe uma gama de evidências que correlacionam a neurotransmissão glutamatérgica como tendo papel importante na neurobiologia do TDM. O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC, estima-se que 50% dos neurônios do cérebro são neurônios glutamatéricos (McGeer et al., 1987). Este neurotransmissor atua sobre receptores ionotrópicos e metabotrópicos. O N-metil-D-aspartato (NMDA) é um dos principais receptores ionotrópicos glutamatérgicos expressos no cérebro (Monaghan et al., 1989). Inúmeras evidências sugerem que a neurotransmissão glutamatérgica esteja alterada na fisiopatologia da depressão: (1) pacientes deprimidos apresentam níveis elevados de glutamato no plasma e em áreas límbicas (Sanacora et al., 2004; Kendell et al., 2005); (2) foi demonstrado que o tratamento crônico com antidepressivos, por diferentes mecanismos, reduz a liberação de glutamato no complexo hipocampal e no córtex pré-frontal em ratos (Golembiowska e Dziubina, 2000; Bonanno et al., 2005); (3) estudos in vitro mostraram que alguns antidepressivos tricíclicos, desmetilimipramina e imipramina, ligam-se ao receptor NMDA e competem com o glutamato pela ligação neste receptor (Reynolds e Miller, 1988; Sills e Loo, 1988).

Além disso, estudos correlacionam o bloqueio do receptor NMDA com o efeito do tipo antidepressivo. Trullas e Skolnick (1990) mostraram que o uso de antagonistas do receptor NMDA evoca efeito do tipo antidepressivo em teste pré- clínicos de screening, como o teste do nado forçado (TNF) e teste de suspensão pela cauda (TSC). O tratamento crônico com antagonistas do receptor NMDA induz efeitos comportamentais semelhantes aos antidepressivos nos modelos animais de estresse crônico moderado (Papp e Morly,1994), desamparo aprendido (Meloni et al., 1993) e bulbectomia olfatória (Kelly et al., 1997).Ylmaz e seus colaboradores (2002) mostraram que uma única dose de ketamina, antagonista NMDA, promove efeito duradouro do tipo antidepressivo em testes

de desespero comportamental, TNF e TSC. Estudos clínicos também mostraram que a administração aguda de ketamina promove efeito do tipo antidepressivo duradouro (Berman et al., 2000; Zarate et al., 2006).

As evidências acerca da hiperfunção glutamatérgica no fenótipo depressivo também atingem os receptores metabotrópicos. Inicialmente,Pilc e Legotku (1995) mostraram que a terapia prolongada com antidepressivos reduz a estimulação da adenilil ciclase, a partir da ativação de receptor metabotrópico do grupo I (mGluR1 e mGluR5) e, posteriormente, foi descrito que o tratamento crônico com antidepressivos reduz a produção de fosfatidilinositol a partir de mGluR1na camada CA1 do hipocampo (Palucha et al., 1997; Plic et al., 1998). Isso mostra que o tratamento crônico com antidepressivos reduz a sensibilidade dos receptores glutamatérgicos. Além disso, o bloqueio do receptor mGluR5,com antagonistas seletivos induz um fenótipo do tipo antidepressivo em TSC (Tatarczynska et al., 2001), enquanto que camundongos knockout para o gene do receptor mGluR5apresenta fenótipo do tipo antidepressivo em teste de desespero comportamental (para revisão: Palucha e Plic, 2007).

Estudos mostram existir uma relação entre as teorias glutamatérgicas e a hipótese monoaminérgicada da depressão, bem como com o papel dos fatores neurotróficos no desenvolvimento do fenótipo depressivo. De fato, os neurônios glutamatérgicos estabelecem ativação tônica sobre o locus coeruleus(LC) (Aston-Jones et al., 1986) e em uma situação de estresse (estresse de contenção ou estresse por barulho) ocorre aumento da liberação de glutamato no LC (Singewald et al., 1995; Timmerman et al., 1999) que aumenta a liberação de noradrenalina. Porém, o estresse crônico ou repetido que levaria ao aumento persistente da liberação de glutamato,exauriria posteriormenteos estoques de noradrenalina (Paul e Skolnick, 2003). Além disso, a sinalização glutamatérgica inibe indiretamente os núcleos da rafe, através de interneurônios gabaérgicos (Kalen et al., 1986; Tao e Auerbach, 2000). Com relação à hipótese dos fatores neurotróficos, foi demonstrado que a sinalização intracelular a partir de receptores NMDA, culmina com a fosforilação de CREB que, por sua vez, induziria aumento na síntese de BDNF (para revisão: Paul e Skolnick, 2003).

Esse achado levanta uma contradição, pois ao se bloquear a ativação de NMDA, gera-se efeito antidepressivo. Esse evento pode ser explicado, pois receptores NMDA extra-sinápticos induzem sinalização intracelular que culmina na desfosforilação de CREB, que paraliza a sinalização, sendo assim postula-se que o efeito antidepressivo dos antagonistas NMDA seja resultante do bloqueio de receptores NMDA extra-sinápticos (Paul e Skolnick, 2003).

Sendo assim, percebe-se que as hipóteses que visam explicar a etiologia do transtorno depressivo estão interconectadas, contribuindo simultaneamente para o desenvolvimento do fenótipo depressivo. Ainda, evidenciam a necessidade de entender como os antidepressivos promovem seus efeitos terapêuticos que vão além do aumento da concentração de monoaminas na sinapse. Por fim, o amplo conhecimento dessas teorias abre um leque grande de oportunidades na busca por novos agentes com potencial antidepressivo.

1.4. Modelo animal de depressão: testes de desespero comportamental e modelo do desamparo aprendido

Um modelo animal da depressão humana apropriado deve cumprir os seguintes critérios, tanto quanto possível: semelhança entre os comportamentos apresentados pelo animal e os sintomas da doença (validade analógica), as bases neuorbiológicas e etiológicas das alterações vistas em animais se assemelham à doença em humanos (validade teórica) e modificações completa ou abrandamento do comportamento após o tratamento com fármacos usados clinicamente e ausência de efeito com outras classes de fármacos (validade preditiva) (Willner e Mitchell, 2002; Vollmayr et al., 2007). Tentando alcançar essas exigências, foi descrito os testes de desespero comportramental, inicialmente o desenvolveram o teste da natação forçada (TNF) (Porsolt et al., 1977) e posteriormente o teste de suspensão da cauda (TST) (Steru et al., 1985), sendo atualmente uma das ferramentas mais utilizadas para screening de novas moléculas com potencial antidepressivo (Nestler et al., 2002; Petit-Demouliere et al., 2005). Esse amplo uso, em sua grande maioria, é devido a sua fácil execução e ampla replicabilidade dos resultados (Borsini e Meli, 1988). Esses testes são baseados na observação de ratos, que após os movimentos orientados de fuga

iniciais tende a assumir uma postura imóvel, quando colocados em um cilindro com água de forma que não consigam escapar ou após serem suspensos pela cauda exibem certa agitação ou comportamentos do tipo fuga, com o tempo desenvolvem uma postura imóvel (Cryan et al., 2005). Alguns autores sugerem que estes comportamentos refletem uma falha na persistência do comportamento de escape direcionado ou, em outras palavras, o animal desenvolve um comportamento passivo que o capacita a enfrentar o evento estressor (Lucki, 1997). Uma grande desvantagem da TNF e TSC (como acontece com muitos paradigmas sensíveis aos antidepressivos) está no fato de que os tratamentos agudos com antidepressivos revertem a imobilidade, enquanto que na clínica pode demorar semanas para os mesmos antidepressivos mostrarem eficácia terapêutica (Detke et al.,1997).

Apesar de largamente utilizado para prever os efeitos de antidepressivos, os testes acima citados são considerados por alguns autores como um conjunto muito específico de comportamentos induzidos por estresse que não têm nenhuma relação direta empírica com os sintomas depressivos nos seres humanos (Holmes, 2003; Petit-Demouliere et al., 2005). Deficiências na validade analógica (semelhanças fenomenológicas entre o modelo e a depressão) e validade etiológica (uma justificativa teórica do modelo) são as principais desvantagens destes ensaios (Petit-Demouliere et al., 2005).

Como alternativa aos testes mencionados acima, apresenta-se o modelo do desamparo aprendido, um dos primeiros paradigmas utilizados como modelo animal de depressão, que emprega eletrochoques, incontroláveis e imprevisíveis, como evento estressor para induzir um fenótipo tipo depressivo (Overmier e Seligman, 1967; O’Neil e Moore, 2003; Vollmayr e Gass, 2013). Overmier e Seligman (1967), perceberam que após exposição a eletrochoques incontroláveis, os animais desenvolvem déficits no comportamento de escape e denominou esse comportamento de desamparo aprendido (DA) que é revertido com uso de agentes antidepressivos (Weiss e Kilts, 1998). Maier e Seligman (1976) mostraram que além do déficit no comportamento de escape desenvolvido após a exposição ao modelo do desamparo aprendido, os animais

apresentam outras alterações comportamentais, como por exemplo: um aumento das emoções negativas, inferidas a partir de alterações no repertório comportamental e no estado físico dos animais, tanto no momento do teste como na gaiola. Estas alterações incluem: aumento da estereotipia, diminuição da discriminação apetitiva, alteração no comportamento alimentar, aumento da ulceração e frequência cardíaca. Outros exemplos de alterações comportamentais que também são observadas nos animais desamparados destacam-se: modificações nos padrões de sono REM (Adrien et al., 1991), redução do peso corporal, alterações no comportamento sexual (Dess et al., 1988) e níveis elevados de fator de liberação de corticotrofina (CRF) e corticosterona (Greenberg et al., 1989). Mudanças motivacionais e cognitivas, além das emocionais, também são observadas nos animais que desenvolveram o fenótipo desamparado. De fato, observa-se que os animais apresentam motivação reduzida para escapar do local onde recebeu o choque, observado durante a sessão teste, haja visto que a resposta motora neste momento é reduzida, e pode indicar um déficit na motivação para escapar deste ponto da gaiola. Ainda, em nível cognitivo, os animais apresentam capacidade reduzida para detectar uma associação entre uma resposta comportamental adaptativa e as consequências dessa resposta, inferido a partir de resultados em que os animais que desenvolveram o comportamento do desamparo aprendido exibem algumas poucas vezes respostas de fuga do lado da gaiola onde receberam o choque, mas estes não são capazes de apresentar uma curva de aprendizagem, ou seja, respostas de fuga não se tornam mais frequentes (são sempre exceção e aparecem ao acaso) (Pryce et al., 2011).

O DA apresenta validade translacional de acordo com os critérios propostos para modelos animais de depressão, esse modelo apresenta validade teórica, visto que o DA foi baseado nas evidências de que a depressão é um transtorno com forte relação entre eventos de vida estressantes (Fava e Kendler, 2000) e, ainda, a incontrolabilidade sobre um evento aversivo é um fator causal inequívoco em roedores e humanos (Willner, 1984; Markou et al., 2009). Além do defict no comportamento de escape, é possível visualizar nos animais desamparados diminuição da sensibilidade e responsividade para a preferência

a ingestão de sacarose e diminuição da auto-estimulação intracraniana, inidicadores de anedonia em analogia à perda de prazer e interesse durante a depressão (Sanchis-Segura et al., 2005; Vollmayr et al., 2004; Zacharko et al., 1983). Ainda, o DA espelha as alterações vegetativas e neuroendócrinas durante a depressão, tais como alterações associadas ao sono REM, aumento dos níveis basais de corticosterona e não-supressão de dexametasona (Adrien et al., 1991; Henn e Vollmayr, 2005), mostrando assim forte validade analógica. Esse modelo apresenta forte validade preditiva, pois tais alterações comportamentais (sofridas por animais e humanos) podem ser revertidas com a administração de antidepressivos (Takamori et al., 2001). Sherman e colaborades (1982) mostraram que doses repetidas de antidepressivos (antidepressivos tricíclicos, inibidores seletivos da recaptação de 5HT e inibidores da MAO) ou terapia eletroconvulsiva (McKinney, 1986) são capazes de reduzir a latência de escape do compartimento eletrificado e diminuir o número de animais que apresentam o comportamento do desamparo aprendido. Este efeito é bastante robusto como evidenciado na literatura, onde nenhum composto eficaz e em uso na clínica falhou em reverter o DA (Vollmayr e Henn, 2003). Em contraste, uma vasta gama de compostos (incluindo benzodiazepínicos ansiolíticos, antipsicóticos, como a clorpromazina, psicoestimulantes, tais como cafeína e anfetaminas, e sedativos, como fenobarbital e etanol) não são eficazes em reverter o comportamento de desamparo (Pryce et al., 2011; Vollmayr e Gass, 2013). Dessa forma, o modelo do DA se apresenta como uma forte alternativa para o estudo das alterações encontradas nos pacientes com depressão e ainda tem grande utilizada na busca por novos potenciais alvos para o tratamento da depressão.

1.5. Tratamento farmacológico da depressão

Os fármacos utilizados no tratamento do TDM atuam basicamente aumentando a concentração de monoaminas na fenda sináptica, principalmente serotonina e noradrenalina. Eles são classificados em quatro grupos, segundo o seu mecanismo de ação, são eles: inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS), antidepressivos tricíclicos, que inibem a recaptação de serotonina e noradrenalina, os inibidores seletivos da enzima monoaminooxidase (MAO) e, mais recentemente aprovado para uso clínico, os

agonistas melatoninérgicos (Lanni et al., 2009; Cupri et al., 2011;Catena- Dell’Osso et al., 2012). De maneira geral, os antidepressivos restauram os níveis sinápticos de monoaminas, principalmente a serotonina e a noradrenalina e, em longo prazo, induzem plasticidade sináptica nos circuitos neurais. Vale ressaltar que os efeitos terapêuticos só são observados após cerca de 3 ou 4 semanas de uso da terapia, ficando restrito nas primeiras semanas somente os efeitos adversos, que como exemplo podemos citar: náuseas, agitação, problemas sexuais, doresde cabeça, insônia, anorexia, diarreia ou constipação (Duman e Monteggia, 2006; Tardito et al., 2006). Esse retardo no surgimento dos efeitos terapêuticos é responsável por uma taxa de desistência em torno de 30%, no primeiro ano de terapia farmacológica. Ainda, desses pacientes relatados, cerca de 80% apresentaram recidiva do TDM (Paykel et al., 2013). Além disso, apenas metade dos pacientes tratados apresenta remissão completa após a terapia com um único fármaco antidepressivo (Berton e Nestler, 2006).

Sendo assim, é de extrema importância que novas moléculas com potencial antidepressivo sejam identificadas para que sejam produzidos novos antidepressivos mais eficazes e bem tolerados (Berton e Nestler, 2006). A pesquisa focada em sistemas peptidérgicos tem se mostrado bastante promissora com esse objetivo, já que evidências bem consistentes têm mostrado que esses sistemas também atuam como mensageiros no SNC (Uppal et al., 2010). Logo, o uso de moduladores da atividade de sistemas peptidérgicos apresenta-se de grande valia para o melhor entendimento da função exercida por esses sistemas sobre as mais diversas funções biológicas (Hökfelt et al., 2000; Paéz et al., 2003).

1.5 Sistema Nociceptina/Orfanina FQ – receptor NOP

A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo (FGGFTGARKSARKLANQ) que foi isolado por dois grupos distintos, em 1995, em cérebros de ratos e porcos. Meunier e colaboradores (1995), denominaram o composto de nociceptina, devido ao efeito hiperalgésico evocado pela administração supraespinal em camundongos expostos ao teste de placa quente e ao teste de retirada da cauda. Já, Reinscheid e colaboradores (1995)

denominaram o composto de orfanina FQ, devido ser o ligante endógeno de um receptor anteriormente órfão e conter os aminoácidos fenilalanina e glicina nas suas extremidades amino e carboxi terminal, respectivamente. Apesar da estreita semelhança com os peptídeos opióides, a N/OFQ não apresenta afinidade por nenhum receptor opióide clássico, pois apresenta o aminoácido fenilalanina no lugar do aminoácido tirosina. Além disso, os opióides endógenos não apresentam afinidade pelo receptor da N/OFQ, denominado de receptor NOP (Cox et al., 2000). Recentemente, Thompson e colaboradores (2012) explicaram a diferença de afinidade da N/OFQ com os receptores opióides após a cristalização do receptor NOP e observação das diferenças estruturais na região de ligação dos ligantes entre o receptor NOP e os receptores opióides clássicos. A N/OFQ é resultante de um processo de clivagens consecutivas do peptídeo pré-pró-N/OFQ (ppN/OFQ), que apresenta sequência de aminoácidos muito conservada entre as espécies, principalmente no domínio C terminal (Sundström et al., 2010). Além da N/OFQ, o processo de clivagem da pré-pró- N/OFQ, dá origem a outros dois peptídeos bioativos, a N/OFQ II e a nocistatina (Florin et al., 1997; Okuda-Ashitaka et al., 1998).

O receptor NOP é um receptor acoplado a proteína G (GPCR), do tipo Gi/o, sendo assim, a sua ativação (Fig. 1) ocasiona redução da formação de AMPc (Wu et al., 1997), bloqueia canais de Ca2+(Connor et al., 1996b) e estimula a condutância do K+(Vaughan e Christie, 1996). Portanto, a sinalização do receptor NOP induz efeitos inibitórios, causando redução da neurotransmissão (Schlicker e Morari, 2000) e/ou inibição do disparo neuronal (Heinricher, 2003), dependendo do sítio (pré ou pós-sináptico) de expressão.

Figura 1: Representação esquemática das respostas intracelulares decorrentes da ativação do receptor NOP (Adaptado de Molinari et al., 2001).

O RNAm da ppN/OFQ e N/OFQ são amplamente expressos nosistema nervoso central, sendo particularmente abundantes em áreas corticais elímbicas (hipocampo, giro denteado, áreas septais e amígdala), em núcleoshipotalâmicos e tronco encefálico, nos cornos dorsal e ventral da medulaespinhal e nos corpos celulares dos gânglios da raiz dorsal (Boom et al., 1999; Neal et al., 1999b). O receptor NOP apresenta sua estrutura primária bastante conservada entre as espécies de mamíferos (Stevens, 2009) e está expresso no sistema nervoso central e em órgãos periféricos, bem como no sistema imune. Especificamente no sistemanervoso central, pode-se encontrar o receptor NOP expresso no córtex, em regiões límbicas, hipotálamo, tronco encefálico, em ambos os cornos da medulaespinhal e nos corpos celulares dos gânglios da raiz dorsal (Neal et al., 1999a). O receptor NOP também se encontra expresso em núcleos serotoninérgicos, noradrenérgicos e dopaminérgicos, tais como no complexo da

rafe, no locus ceruleus, no núcleo do trato solitário, na área tegmental ventral e na substância negra (Mollereau e Mouledous, 2000). Baseado nesse padrão de expressão pode-se postular que a ativação do sistema N/OFQ–receptor NOP é capaz de modular o processamento nociceptivo, de aprendizado e memória, do estado emocional, do controle neuroendócrino, da ingestão de alimentos, do controle motor e das vias de recompensa e prazer (Lambert, 2008).

Devido às semelhanças estruturais entre o sistema N/OFQ–receptor NOP com o sistema opióide clássico, a primeira ação biológica investigada acerca do novo sistema foi sua ação sobre a nocicepção e os resultados mostram que essas ações dependem da dose e da via de administração. Os resultados sugerem que a injeção intracerebroventricular (icv) de N/OFQ induz efeito pró- nociceptivo e reversão do efeito antinociceptivo da morfina, bem como de outros agonistas opióides (Grisel et al., 1996; Mogil et al., 1996; Calò et al., 1998; Bertorelli et al., 1999; Wang et al., 1999). Essa ação é resultante da interação da N/OFQ com o receptor NOP, visto que o uso de antagonistas do receptor NOP (Calo et al.,2000b; Calo' et al., 2002) e de animais NOP(-/-) (Nishi et al.,1997; Noda et al., 1998) bloqueiam ou desaparecem com o referido efeito, respectivamente. Contudo, quando administrada por via intratecal (it), a N/OFQ induz efeito antinociceptivo (Erb et al., 1997; King et al., 1997; Hao et al., 1998; Kamei et al., 1999; Yamamoto et al., 1997).

Além da ação sobre o comportamento nociceptivo, outra observação inicial foi que a N/OFQ causa prejuízos sobre a atividade locomotora espontânea em roedores (Reinscheid et al., 1995; Devine et al., 1996; Noble e Roques, 1997), efeito este que é revertido pelos antagonistas do receptor NOP (Rizzi et al., 2001; Calo et al., 2005) o que desaparece em animais NOP(-/-) (Nishi et al., 1997; Carrà et al., 2005). Já os antagonistas do receptor NOP facilitam a coordenação motora no teste do rota-rod (Marti et al., 2004a), nos quais camundongos NOP(-/-) apresentam desempenho motor superior aos camundongos NOP(+/+), enquanto que não há diferença de comportamento no teste campo aberto (Rizzi et al., 2011). Sendo assim, postula-se que a modulação do sistema N/OFQ – receptor NOP seja mais relevante no momento

da realização de atividade motora forçada do que na atividade motora espontânea. Também foi observado que os antagonistas do receptor NOP atenuam déficits motores em modelos de Parkinson em roedores e primatas não humanos (Marti et al., 2004a; Marti et al., 2005; Viaro et al., 2008; Mabrouk et al., 2010; Volta et al., 2010), e que os níveis de N/OFQ estão 3,5 vezes mais elevados no liquido cerebroespinhal de pacientes diagnosticados com Parkinson do que nos controles (Marti et al., 2010). Coletivamente, esses dados sugerem que os antagonistas do receptor NOP podem representar uma nova estratégia no tratamento de distúrbios hipocinéticos.

Também já foi descrito que o sistema N/OFQ–receptor NOP pode modular as vias de recompensas e o abuso de drogas. De fato, existe alta expressão do receptor NOP na circutaria mesolímbica envolvida no processo de recompensa, como córtex pré-frontal, área tegumentar ventral, núcleoaccubens e núcleo central da amígdala (Neal et al., 1999a). Em concordância, foi relatado que a administração de N/OFQ não induz recompensa nem aversão (Devine et al., 1996), e consegue bloquear aquisição de preferência por lugar induzida pela morfina em ratos (Murphy et al., 1999) e em camundongos (Sakoori e Murphy, 2004). Vale ressaltar que a administração de N/OFQ central também diminui a auto-administração de álcool (Ciccocioppo et al., 2004). Todos esses relatos podem ser justificados pelo prejuízo causado na liberação de dopamina nas vias de recompensa decorrente da ativação do receptor NOP (Witkin et al., 2014; Toll et al., 2016).

Além desses efeitos, foi demonstrado que a administração icv de N/OFQ, agonista peptídico do NOP, promove efeito do tipo ansiolítico em diversos modelos animais, a citar, caixa claro-escuro, teste do conflito operante (Jenck et al., 1997), bem como reduziu a ansiedade em camundongos quando diretamente confrotados com uma ameça natural (um rato) na bateria de teste de defesa(Griebel et al. 1999) Posteriormente o efeito do tipo ansiolítico foi confirmado na tarefa do labirinto em cruz elevado – LCE, (Jenck et al., 1997; Gavioli et al., 2002; Gavioli e Calo', 2006; Asth et al., 2016), hole –board (Kamei et al., 2004) e labirinto em T (Asth et al., 2015).

Nas buscas por novas moléculas com potencial ansiolítico, muitos esforços foram implicados na identificação de pequenas moléculas ligantes do receptor NOP (para revisão:Mustazza e Bastanzio, 2011; Toll et al., 2016). O composto mais bem estudado nessa situação é o Ro 64-6198, que induz, após administração periférica, efeitos do tipo ansiolítico em ratos, camundongos e porquinhos-da-índia submetidos a uma variedade de modelos animais de ansiedade (Jenck et al., 2000; Varty et al., 2005; Nicolas et al., 2006; Nicolas et al., 2007; Chang et al., 2015). Ainda, o Ro 64-6198 produziu intenso efeito ansiolítico em resposta a uma variedade de estímulos ansiogênicos de leves a fortes, como no teste de conflito Vogel em ratos Sprague Dawley, no teste de aproximação-evitação social em ratos Lewis, na hipofagia induzida por novidade em camundongos C57BL/6J e hipertermia induzida por estresse em camundongos NMRI (Goeldner et al., 2012). Esta ação ansiolítica do Ro 64-6198 é dependente da ativação do receptor NOP, uma vez que este efeito não é presente em camundongos knockout para receptor de NOP (NOP(-/-)) (Varty et al., 2005). Além disso, a administração de Ro 64-6198 não teve responsabilidade de abuso em um paradigma de autoestimulação (Le Pen et al., 2002), e nenhum sinal de tolerância aos efeitos semelhantes a ansiolíticos foi detectado após 15 dias de injeções (Dautzenberg et al., 2001)

Recentemente, Asth e colaboradores, 2016, mostraram que a administração de AT-090, agonista parcial NOP, promoveu efeito do tipo ansiolítico em animais expostos ao LCE. Ainda, animais transgênicos para o gene da ppN/OFQ (ppN/OFQ(-/-)) e NOP(-/-) apresentaram fenótipo ansiogênico no LCE e caixa do claro-escuro quando comparados aos animais controles. Em contraste, não foram observadas diferenças nocomportamento de camundongos NOP(-/-)em alguns modelosclássicos de ansiedade, como campo aberto, hole- board, marble burying e noteste de Geller-Seifter (Gavioli et al., 2007; Varty et al., 2005). Ainda foi visualizado que os animais NOP(-/-) apresentam fenótipo do tipo ansiolítico no modelo de supressão alimentar induzida pela novidade e no labirinto emT elevado quando comparado com os NOP(+/+) (Gavioli et al., 2007). Assim, sugere-se que o sistema da N/OFQ-receptor NOP exerça papel relevante, porém complexo, na modulação dos estados de ansiedade.

1.6 Sistema N/OFQ – receptor NOP e depressão

Diversos estudos têm relacionado o sistema daN/OFQ - receptor NOP com o transtorno de humor depressivo. Dados da literatura mostram que em roedores, aadministração aguda de antagonistas do receptor NOP, tanto peptídicos (UFP-101 e [Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2), quanto não peptídicos (J- 113397, SB-612111 e LY2940094) reduziram o tempo de imobilidade na tarefa da natação forçada e dasuspensão pela cauda, sugerindo um efeito do tipo antidepressivo (Gavioli et al., 2003; Gavioli et al., 2004; Rizzi et al., 2007; Post et al., 2015). Somado a esses achados, Redrobe e seus colegas, 2002, mostraram que a N/OFQ foi inativa nestes testes, não induzindo quaisquer efeitos comportamentais, porém a co-administração de N/OFQ com antagonistas doreceptor NOP, como UFP-101, J-113397 e SB-612111, reverteu os efeitosdo tipo antidepressivo dos antagonistas NOP (Gavioli et al., 2003; Gavioli et al., 2004; Gavioli e Calo', 2006; Rizzi et al., 2007). Vitale e colaboradores (2009; 2017) demonstraram que, a administração de UFP-101, via i.c.v. produziuatividade do tipo antidepressiva, em tratamento repetido por 21 dias, no modelode estresse crônico variável. Neste contexto, os pesquisadores mostraram que o estresse crônico variável induz nos animais perda na preferência por ingestão de sacarose, que é restaurada com a administração repetida de UFP-101. Essa administração crônica de UFP-101 foi capaz de reverter as alterações na concentração de 5-HT no córtexfrontal e o nível de cortisol sérico, que foram alteradas devido a exposição ao estresse (Vitale et al., 2009).

Recentemente, Medeiros e colaboradores (2015) mostraram que o bloqueio do receptor NOP, com antagonistas de origem peptídica e não- peptídica, reverteu o fenótipo do tipo depressivo induzido pela ativação do sistema imunológico quando desafiado pela administração de LPS. Ainda, foi observado que UFP-101 e SB-612111 são eficientes em reverter o déficit no comportamento de escape gerado após os animais serem submetidos ao modelo do desamparo aprendido (Holanda et al., 2016), reforçando a ação do tipo antidepressiva induzida pelo bloqueio do receptor NOP, ação esta que foi vastamente replicada em animais em modelos e espécies distintas.

Complementar aos achados farmacológicos, camundongos knockout para o gene do receptor NOP apresentam redução no tempo deimobilidade em testes de desespero comportamental ao se comparar com os animais selvagens (Gavioli et al., 2003; Gavioli et al., 2004). Também foi mostrado que ratos knockout para o receptor NOP também apresentam um fenótipo do tipo antidepressivo quando avaliados noteste da natação forçada (Rizzi et al., 2011). Através dessas observações pode-se concluir que o efeito do tipo antidepressivo produzido por antagonistas do receptor NOP é dependente da interação dos compostos com o receptor NOP. De fato, otratamento com antagonistas do receptor NOP, J-113397, UFP-101 e SB-612111, reduziu o tempo de imobilidade dos camundongos controles, porém não alterou o comportamento dos animais knockout para o receptor NOP (Gavioli et al., 2003; Gavioli e Calo’, 2006; Rizzi et al., 2007).

Recentemente, um estudo clínico utilizando LY2940094, um antagonista não peptídico do receptor NOP, disponível por via oral, reforçou os resultados obtidos em estudos com modelos animais acerca do efeito antidepressivo de antagonistas do receptor NOP. De fato, o tratamento por 8 semanas com LY2940094 foi eficaz em aliviar os sintomas depressivos em pacientes diagnosticados com transtorno depressivo maior (Post et al., 2016).

A literatura traz uma série de evidências sugerindo um possível mecanismo de ação para o efeito antidepressivo dos antagonistas NOP (Gavioli e Calo’, 2013). Assim como a maioria dos antidepressivos, o efeito antidepressivo evocado pelo bloqueio do receptor NOP parece estar correlacionado com o aumento na concentração encefálica de monoaminas, principalmente 5-HT. De fato, já foi demonstrado haver a expressão de receptores NOP em neurônios serotoninérgicos no núcleo dorsal da rafe (Lê Maître et al., 2005). Além disso, a administração crônica de um inibidor seletivo da recaptação de serotonina (ISRS), paroxetina, aumenta os sítios de ligação a N/OFQ em neurônios do núcleo dorsal da rafe (Vilpoux et al., 2002). Ainda, estudos mostraram que a infusão de N/OFQ diminui a liberação de 5-HT em sinaptossomas cérebro-corticais (Mela et al., 2004) e que esse efeito é

bloqueado por diversos antagonistas do receptor NOP, de diferente natureza (peptídico e não peptídico) (Fantin et al., 2007). Nazzaro e colaboradores (2010) mostraram que a infusão de N/OFQ no núcleo dorsal da rafe diminui a taxa de disparo dos neurônios serotoninérgicos do núcleo dorsal da rafe e essa inibição é revertida pela administração de UFP-101, tanto in vivo como in vitro. Vitale e colaboradores (2009) mostraram que a exposição ao estresse crônico variável causa um desequilíbrio na sinalização serotoninérgica, reduzindo os níveis desse transmissor no córtex pré-frontal, enquanto que a administração crônica de UFP-101 é capaz de reestabelecer esses parâmetros. Ainda, a redução de 5- HT in vivo previne o efeito do tipo antidepressivo induzido pela administração de UFP-101 em animais expostos à natação forçada (Gavioli et al., 2004). Tao e colaboradores (2007), utilizando a técnica de microdiálise, mostraram que a infusão de N/OFQ no núcleo dorsal da rafe (NDR) e no núcleo accubens reduz os níveis de 5-HT extracelular no NDR e essa redução é dependente da ativação do receptor NOP, visto que a infusão de um antagonista NOP bloqueou a ação da N/OFQ no NDR. Recentemente, Post e colaboradores, (2016), também utilizando a técnica de microdiálise, observaram um pequeno, porém significativo aumento nos níveis extracelulares de 5-HT no córtex pré-frontal medial de ratos uma hora após a administração deLY2940094, um antagonista NOP. Em conjunto, esses achados sugerem que o efeito do tipo antidepressivo induzido pelos antagonistas NOP pode ser mediado através da potencialização da neurotransmissão serotoninérgica.

Além da modulação sob a neurotransmissão serotoninérgica, já foi demonstrado que o sistema N/OFQ - receptor NOP exerce efeito modulatório sobre o sistema noradrenérgico. Estudos mostram que há expressão tanto de N/OFQ como de receptor NOP no locus coeruleus (Neal et al., 1999a; Florin et al., 2000). Ainda, estudos utilizando métodos de eletrofisiologia em tecido ex- vivo mostraram que a N/OFQ reduziu o disparo no locus coeruleus (Connor et al., 1996a), sendo este efeito prevenido pela ação do UFP-101 (Gavioli et al., 2004). Evidências adicionais mostram que a administração de N/OFQ no núcleo basolateral da amígdalareduz os níveis noradrenérgicose esse efeito é revertido com a infusão de J-113397, que promove per seaumento na liberação de

noradrenalina extracelular em cerca de 200% dos níveis basais (Kawahara et al., 2004). Estudos in vitro mostram que a infusão de N/OFQ exerce influência inibitória sobre a liberação de noradrenalina no córtex cerebral, tanto de roedores como de humanos (Okawa et al., 2001; Rominger et al., 2002; Siniscalchi et al., 2002). Corroborando esses achados, mostrou-se que a infusão de N/OFQ no córtex medial frontal, reduz os níveis de noradrenalina e AMPc no córtex pré- frontal de ratos (Yoshitake et al., 2013). Além disso, um estudo de microdiálise revelou que a ativação do receptor NOP no locus coeruleos reduz a liberação de noradrenalina no córtex pré-frontal (Okawa et al., 2001).

Apesar do notório efeito do tipo antidepressivo induzido pela administração de antagonistas NOP em diferentes testes comportamentais e modelos animais de depressão, ainda pouco se conhece sobre o papel endógeno desempenhado pela ativação do receptor NOP em condições de estresse. Diversas evidências sugerem efeito inibitório da N/OFQ sobre a neurotransmissão monoaminérgica, o que contribuiria, em última análise, para um efeito do tipo pró-depressivo decorrente da ativação do receptor NOP. Porém, pouco se sabe sobre o papel endógeno desse sistema, especialmente diante de uma condição estressora. Dessa forma, mostra-se necessário a realização de estudos que contribuam para o entendimento do papel endógeno do sistema N/OFQ-receptor NOP sobre a resposta comportamental e neuroquímica frente a eventos estressores.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O presente estudo tem como objetivo avaliar o envolvimento do sistema peptidérgico da N/OFQ-receptor NOP no comportamento depressivo em camundongos.

2.2 Objetivos específicos

1. Investigar as ações de ligantes do receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado em camundongos expostos à situação de estresse inescapável; 2. Avaliar o fenótipo de camundongos NOP(-/-) quando expostos à situação de estresse inescapável; 3. Estudar os efeitos da co-administração de agonistas NOP e antidepressivos no comportamento de camundongos submetidos ao estresse inescapável e à situação de desespero comportamental.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos (30-40 g, provenientes do biotério do FarmacoLab, vinculado ao Departamento de Biofísica e Farmacologia, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte), camundongos CD-1 (ENVIGO, Udine, Italia) e camundongos NOP(+/+) e NOP(-/-).Os detalhes da geração dos animais NOP(+/+) e NOP(-/-) foram descritos anteriormente (Bertorelli et al., 2002; Nishi et al., 1997). Os camundongos NOP(-/-) utilizados neste estudo foram cruzados com camundongos CD-1 nos laboratórios do Professor Calo’, University of Ferrara (Itália) por várias gerações, portanto, prevalecendo o background genético da linhagem CD-1. Na UFRN, os animais foram alojados em, no máximo, 13 por caixa (41 x 34 x 16 cm), já na UNIFE os animais foram alojados em 6 por caixa (43 x 27 x 15 cm). Os animais tiveram livre acesso a ração e água e foram mantidos em um ciclo de 12 horas claro- escuro (luzes acessas às 6:00h) com uma temperatura de 22°C ± 1oC. Um número total de 515 animais foi utilizado para o desenvolvimento desse estudo, sendo 259 camundongos Swiss testados no teste da natação forçada, 100 camundongos Swiss foram expostos no modelo do desamparo aprendido (somente 84 animais desenvolveram o comportamento desamparado, e foram efetivamente utilizados no tratamento farmacológico). Ainda, foram utilizados 126 camundongos CD-1 e 30 camundongos NOP(+/+) e NOP(-/-) no modelo do desamparo aprendido.

Todos os procedimentos experimentais foram feitos de acordo com as recomendações da Lei n. 11.794 de 08/10/2008 (Lei Arouca) e cumprem as diretrizes do Conselho das Comunidades Européias (2010/63/E) e os regulamentos italianos (D.Lgs, 26/2014). Todos os procedimentos foramaprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (N° 059/2015; N º 010.015/2017) e pelo Órgão de Bem-Estar Animal da Universidade de Ferrara e pelo Ministério da Saúde italiano (Protocolo nº 302/2017). 42

Os animais NOP(+/+) e NOP(-/-) foram obtidos por acasalamento de camundongos NOP(+/-). Todos os camundongos foram genotipados usando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Os DNAs foram preparados a partir de biópsias de orelha. A extração e amplificação do DNA foram realizadas utilizando o KAPA Mouse Genotyping Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, Massachusetts, EUA). Os primes utilizados foram: primer 1 (5 ’GCCCATCGAGGTGTTCATGTGCCTGT-3’), primer 7 (5’- GACCCGCCTACCTGAGGATGACATAC-3’) e primer 4 (5’- CAATATCGCGGCTCAGTTCGAGGTGC-3’). O primer 1 e 7 amplificam um fragmento de 372 pb dos alelos do tipo selvagem, enquanto o primer 1 e 4 amplificam um fragmento de 384 pb dos alelos mutantes. Os produtos da reação foram separados em gel de agarose a 2% MetaPhror® (Lonza, Rockland, ME, EUA) por eletroforese horizontal em tampão Tris-Borato-EDTA por 5 ha 95 mV.

3.2 Drogas e tratamentos

Para a realização deste estudo foi utilizado nortriptilina (20 mg/Kg, ip, 60 minutos antes do teste, diluído em salina), fluoxetina (20 mg/Kg, ip, 60 minutos antes do teste, diluído em salina) e R-ketamina (10 mg/Kg, ip, 30 min antes do teste, diluído em salina), um antidepressivo tricíclico, um antidepressivo inibidor seletivo da receptação de serotonina e um antagonista seletivo de receptores NMDA, respectivamente. Também foram utilizados N/OFQ (1 nmol, icv, 5 min antes do teste, diluído em salina), Ro 65-6570 (0,01, 0,1, 0,3 e 1 mg/Kg; ip; 30 ou 60 min, diluído em 1 % DMSO) e MCOPPB (0,1, 1, 10 mg/Kg, 30 min, diluído em 1 % DMSO - Sigma Aldrich, St Louis, USA) agonista peptídico e não- peptídicos do receptor NOP, respectivamente. Além disso, foram testados os antagonistas NOP de natureza peptídica, UFP-101 (10 nmol, icv, 5 min antes do teste, diluído em salina) e não peptídica, SB-612111 (0,1, 1 e 10 mg/kg, ip, 30 ou 60 min antes do teste, diluído em 1 % DMSO - Tocris Bioscience, Bristol, UK). N/OFQ e Ro 65-6570 foram doados pelo Prof. R. Guerrini (Dept. de Biotecnologia e Química Farmacêutica, University of Ferrara, Itália). As doses dos compostos agonistas e antagonistas NOP testadas foram previamente descritas na literatura como indutoras de efeito ansiolítico para os agonistas e antidepressivo para o antagonista NOP (Para revisão: Gavioli e Calo’, 2006; Gavioli e Calo’, 2013).

3.3 Cirurgia estereotáxica para implantação de uma cânula intracerebroventricular

Para testar a ação do agonista e antagonista peptídicos do receptor NOP, N/OFQ e UFP-101, os animais foram submetidos a uma cirurgia esteriotáxica para implantação de uma cânula guia no ventrículo lateral dos camundongos. Para as coordenadas da implantação da cânula foi consultado o atlas do cérebro de camundongos (Paxinos e Franklin, 2001), de onde foram retiradas as seguintes coordenadas: ântero-posterior -0,6 mm, meso-lateral +1,1 mm e dorso-ventral - 1,0 mm. As medidas ântero-posterior e meso-lateral foram obtidas considerando o bregma como ponto zero enquanto que a medida dorso-ventral foi considerada a partir das membranas meninges. Dessa forma, a cânula foi implantada 1 mm acima do ventrículo lateral. Antes de iniciar a cirurgia, cada camundongo foi anestesiado com ketamina (100 mg/kg, intraperitonealmente - ip) e xilazina (10 mg/kg, ip). Com os animais já anestesiados, foi realizada a tricotomia e posterior imobilização em um aparelho estereotáxico, por meio da inserção de pinos no conduto auditivo externo e de uma presilha nos dentes incisivos, resultando na fixação da cabeça do animal durante todo o processo. Os camundongos foram submetidos a uma incisão longitudinal na pele, na linha média da região superior do crânio, expondo o periósteo. As medidas para definição do local de implantação da cânula foram tomadas e o local foi perfurado com broca de aço manual. A cânula-guia, com 0,7 mm de diâmetro e 8 mm de comprimento, foi então introduzida verticalmente de acordo com as coordenadas descritas acima e, em seguida, fixada ao crânio por meio de polímero sintético (acrílico odontológico). Ao final, cada cânula foi selada com um mandril (fio de aço inoxidável) para impedir sua obstrução até o momento do experimento. Durante o processo cirúrgico os animais receberam antibiótico profilático ampicilina (100 mg/Kg, sc) e o anti-inflamatório cetoprofeno (5 mg/Kg, sc). O cetoprofeno também foi administrado nos dois dias seguintes, ou seja, 24 e 48 h após a implantação da cânula, uma vez ao dia. Todo o procedimento foi executado sob condições de assepsia o local da incisão tratado com o agente antisséptico iodo-povidine, a fim de prevenir inflamação e infecção bacteriana decorrente do procedimento cirúrgico. Após um período de cinco dias os animais foram submetidos à avaliação comportamental. 44

Para a administração icv, o camundongo foi imobilizado manualmente, o mandril foi retirado e foi introduzida a agulha de injeção, medindo 0,3 mm de diâmetro e 9 mm de comprimento, através da cânula-guia. A solução contendo a droga foi injetada no volume de 2 µl, durante um período de um minuto, utilizando uma seringa Hamilton de 10 µl que estava conectada através de um tubo de polietileno PE-10 à cânula de injeção.

3.4 Teste da natação forçada

O TNF foi realizado em camundongos Swiss, como previamente descrito por Porsolt e colaboradores (1977) e modificado por Gavioli et al. (2003). Resumidamente, consiste em colocar os camundongos individualmente em cilindros de vidro (18 cm de altura, 17 cm de diâmetro) contendo água a 12 cm de altura (24 °C ± 1 °C) para duas sessões de natação: uma sessão treino de 15 min, a qual foi seguida, após 24 h, por uma sessão teste de 5 min. Ao final de cada sessão de natação, o animal foi removido do cilindro com água, a fim de evitar hipotermia, o animal foi colocado em uma caixa forrada com papel por 15 min e, então, retornou para a gaiola de origem. A água do cilindro foi trocada para cada animal. O tempo de imobilidade (tempo no qual o animal permanece flutuando, fazendo apenas os movimentos necessários para manter sua cabeça acima da água), é um parâmetro previamente validado para detectar o efeito do tipo antidepressivo dos fármacos nesta tarefa e foi registrado cumulativamente somente durante a sessão teste.

3.5 Desamparo aprendido

O DA foi realizado, em camundongos Swiss machos, CD-1, NOP(+/+) e NOP(-/-). Nos camundongos Swiss, o DA foi realizado como descrito anteriormente por Maeng et al. (2008) e modificado por Oz Malkesman et al. (2011). O teste do DA ocorreu em uma shutlle box, composta por dois compartimentos (50 x 30 x 30 cm) separados por uma porta-guilhotina (12 x 25 cm). A shuttle box foi confeccionada em acrílico preto, enquanto no piso existem barras de aço inoxidável (0,3 cm de largura e 1 cm de distância), local onde são disparados os choques elétricos. A sessão de indução do desamparo, realizada no dia 1, onde os animais receberam 180 sessões de choques elétricos 45

inescapáveis na pata [1,0 mA, 20 s de duração com intervalos médios entre as tentativas de 15 s (variando de 10-20 s)], acompanhados por uma luz fraca, 3 s antes da liberação do choque.

A sessão de screening aconteceu 24 h após a sessão de indução (dia 2), sendo composta de 30 ciclos de 20 s cada. Cada ciclo é dividido em dois blocos de 10 s, no primeiro bloco o animal recebe aleatoriamente, dentro desse intervalo, 3 s de uma luz fraca (estímulo condicionado) mais um eletrochoque, com duração variável de 1 a 10 s. O segundo bloco é o período de descanso para o animal com duração de 10 s. Na sessão de screening, a porta que conecta os dois compartimentos da shuttle box permanece aberta e são considerados em desamparo aprendido os camundongos que falharem em mais de 20 tentativas em sair do compartimento onde receberam o choque elétrico. Os animais que não entraram em desamparo foram descartados do estudo. Na última fase do teste (dia 3), 24 h depois da sessão de screening, realizou-se a avaliação do efeito de fármacos. Nesta etapa, os animais em desamparo foram divididos em grupos, nos quais receberam um dos tratamentos, nortriptilina, R- ketamina, N/OFQ, Ro 65-6570 ou veículo. Nesta fase, os animais em desamparo foram novamente submetidos a um dos compartimentos da shuttle box e a porta que conecta os compartimentos permaneceu aberta. No dia do teste, os animais foram submetidos a 30 sessões de choques (antecipados por uma luz) e os parâmetros mensurados foram: latência de escape do compartimento onde recebeu o choque (medida em segundos) e a frequência de falhas na fuga do compartimento onde o choque foi acionado. O procedimento acima descrito encontra-se ilustrado na figura 2. Esse protocolo, em nossas condições experimentais apresenta uma eficácia média em induzir o fenótipo desamparado em cerca de 70 a 80% dos animais submetidos ao modelo, dado esse que está de acordo com a literatura (Pryce et al., 2011).

Figura 2: Desenho experimental para indução do comportamento de desamparo em camundongos.

Os camundongos CD-1, NOP(+/+) e NOP(-/-) foram expostos a um protocolo de DA diferente, realizado nos laboratórios do Professor Dr Calo’ (Departamento de Ciências Médicas, Secção de Farmacologia, Unversity of Ferrara, Itália). O modelo do DA foi conduzido modificando nosso protocolo relatado anteriormente. Os animais foram colocados individualmente em uma caixa de Plexiglas com um piso de grade de aço inoxidável (0,3 x 1 cm) acoplado a um gerador de choque elétrico (Ugo Basile, Itália). O aparelho é dividido em dois compartimentos (47 x 18 x 25 cm) por uma porta de guilhotina (12 x 25 cm). Os camundongos foram submetidos a choques elétricos durante três dias consecutivos. Durante a primeira e a segunda sessão (sessões 1 e 2 - indução), os camundongos foram expostos a 180 ciclos de choques elétricos, imprevisíveis e inescapáveis nas patas (0,5 mA, 1–10 s duração do choque, 10 s de intervalo médio). Durante a terceira sessão (sessão 3 - teste), os camundongos foram expostos a 30 ciclos de choques elétricos com escape (0,5 mA, 1-10 s duração do choque, intervalo médio de 20 s). Durante a sessão de teste, os animais podem escapar dos choques elétricos, movendo-se para o outro lado da caixa. A duração das sessões de indução é de cerca de 45 - 50 min, enquanto a sessão de teste dura cerca de 15 min. Os camundongos que falharam em mais de 20 tentativas de fuga na sessão de testes foram considerados desamparados. O número de fugas durante a sessão de teste foi gravado automaticamente. Nesta condição experimental (Fig. 3), o modelo apresentado induz o fenótipo desamparado com uma eficiência em torno de 50 - 60% nos camundongos.

Figura 3: Desenho experimental para indução do comportamento de desamparo em camundongos (protocolo experimental 2).

Também foi avaliado o protocolo cognitivo/memória do desamparo aprendido em animais CD-1 e NOP(+/+) e NOP(-/-). Neste protocolo (fig. 4), os animais foram expostos a 3 dias de experimento, com os dois primeiros dias destinados a indução e no terceiro dia foi realizado o screening. Neste protocolo, a programação de ciclos segue a mesma (indução 1 e 2 com 180 ciclos de choques e screening com 30 ciclos de choques), porém desde o primeiro dia existe a possibilidade de escape (a porta em guilhotina permanece aberta) do compartimento eletrificado. Na sessão de screening é contabilizado o número de escapes.

Figura 4: Desenho experimental para avaliação do componente cognitivo do desamparo aprendido.

3.6 Análises para avaliação do posicionamento da cânula

Ao terminar todos os testes, os animais que foram submetidos à cirurgia esteriotáxica para implantação da cânula guia no ventrículo lateral foram 48

eutanasiados com uma injeção intraperitoneal de tiopental sódico (superdose > 100 mg/Kg). Foi infundida uma solução de corante azul de metileno (2 µl) no ventrículo lateral, a fim de determinar a localização da cânula. A análise do posicionamento da cânula foi feita a olho nu, com o tecido in natura, de acordo com a presença do corante nos ventrículos dos cérebros dos animais. Os animais que apresentarem danos cerebrais visíveis e/ou cânula localizada fora do ventrículo lateral foram desconsiderados da análise estatística

3.7 Delineamento experimental

Etapa I: Avaliação do papel do sistema da N/OFQ – receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado

Experimento 1: Padronização do DA em camundongos CD-1

Esse procedimento serviu para estabelecer e padronizar a condição ideal para a realização do DA, em camundongos CD-1, de forma que o protocolo escolhido ao final apresentasse uma eficiência de indução mediana para que se pudesse realizar manipulações farmacológicas tanto para elevação quanto para redução da percentagem de indução do comportamento desamparado. Para isso, escolheu-se 3 protocolos diferentes, com 1, 2 e 3 dias de indução (Fig. 5). Passadas 24 h da sessão de screening, os animais considerados desamparados foram tratados com nortriptilina (20 mg/kg; ip; 30 min antes do teste), SB- 612111(10 mg/kg; ip; 30 min antes do teste) ou veículo e submetidos à sessão de teste do DA (Fig. 6).

Figura 5: Fluxograma ilustrativo da etapa I – padronização da condição experimental do DA.

Figura 6: Fluxograma ilustrativo da etapa I – efeito de fármacos antidepressivos na condição experimental definida na série experimental anterior.

Experimento 2: Efeito da administração de agonista NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado.

Nesta etapa experimental, avaliou-se o efeito da administração de agonistas NOP, Ro 65-6570 (0,01-1 mg/Kg; ip; 30 min antes das sessões de indução) e MCOPPB (0,1-10 mg/Kg; ip; 30 min antes das sessões de indução) pré-sessão de indução do DA em camundongos CD-1. Para isso, os agonistas NOP foram testados em diversas doses, antes de cada sessão de indução, e a porcentagem de indução do fenótipo desampardo ao final da sessão de screening foi registrada (Fig. 7).

Figura 7: Fluxograma ilustrativo da etapa II – administração de agonistas NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado.

Experimento 3: Efeito do bloqueio farmacológico e genético do receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado

Experimento 3.1: Efeito do bloqueio farmacológico do receptor NOP sobre o desenvolvimento do fenótipo desamparado.

Durante essa etapa, buscou-se avaliar o efeito induzido pelo bloqueio farmacológico e genético do receptor NOP durante o desenvolvimento do fenótipo desamparado em camundongos CD-1 e NOP(+/+) e NOP(-/-). Para avaliar o efeito do bloqueio farmacológico, testou-se o efeito da administração de SB-612111 (0,1 – 10 mg/Kg; ip; 30 min antes das sessões de indução) pré- indução, comparando com o efeito da administração de nortriptilina (20 mg/Kg; ip; 30 min antes das sessões de indução), pré-indução (Fig. 8).

Figura 8: Fluxograma ilustrativo da etapa III - administração de antagonistas NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado.

Experimento 3.2: Efeito do bloqueio genético do receptor NOP sobre o desenvolvimento do fenótipo desamparado.

Visando avaliar o efeito do bloqueio genético da sinalização do receptor NOP, avaliou-se o fenótipo dos camundongos NOP(+/+) e NOP(-/-) quando submetidos ao protocolo do desamparo aprendido (Fig. 9).

Figura 9: Fluxograma ilustrativo da etapa III - fenótipo de camundongos NOP(-/- ) no modelo do desamparo aprendido.

Experimento 4: Efeito da administração de agonistas NOP e do fenótipo NOP (- /-) sobre o componente cognitivo do DA

A fim de eliminar possíveis viéses de interpretação é necessário avaliar o efeito das administrações de Ro 65-6570 (1 mg/kg; ip; 30 min antes da sessão de indução) e MCOPPB (10 mg/Kg; ip; 30 min antes da sessão de indução), bem como o fenótipo de camundongos NOP(-/-) sobre a performance cognitiva no DA. Para isso, os camundongos CD-1 tratados com os agonistas NOP (Fig. 10) e camundongos NOP(-/-) (Fig. 11) foram expostos a três sessões com choques elétricos nas patas, no qual desde a primeira sessão (indução), o animal tem a possibilidade de escapar do lado eletrificado da caixa, pois a porta em guilhotina permaneceu aberta.

Figura 10: Fluxograma ilustrativo da etapa IV – administração de agonistas NOP na performance cognitiva de camundongos.

Figura 11: Fluxograma ilustrativo da etapa IV – performance cognitiva de camundongos NOP(-/-) na condição de estresse escapável.

Etapa II: Investigação do efeito da co-administração de agonistas NOP e antidepressivos em condição de desespero comportamental e em situação de estresse incontrolável Experimento 1: Padronização das condições experimentais para a realização do TNF

Esta etapa experimental serviu para avaliar o efeito da administração de fluoxetina (20 mg/Kg; ip; 60 min antes do teste), nortriptilina (20 mg/Kg; ip; 60 min antes do teste) e R-ketamina (10 mg/Kg; 30 min antes do teste) emcamundongos submetidos ao TNF (Fig. 12). Nesta etapa experimental buscou-se investigar se a magnitude do efeito antidepressivo induzido pelos fármacos supracitados será equivalente e, portanto, comparável. Caso esta etapa seja desconsiderada, pode-se causar um viés ou até inviabilizar as etapas posteriores, se a magnitude do efeito antidepressivo de um dos fármacos supracitados for muito superior ou inferior aos demais.

Figura 12: Fluxograma ilustrativo da etapa V – administração de antidepressivos convencionais no teste da natação forçada.

Experimento 2: Efeito da co-administração de agonistas NOP, N/OFQ ou Ro-65- 6570, e antagonistas NOP, UFP-101 ou SB-612111, no TNF

Para a realização de experimentos futuros desse projeto, foi necessário determinar se N/OFQ (1 nmol, icv, 10 min antes do teste) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg, ip, 30 min antes do teste) bloqueia o efeito do tipo antidepressivo induzido pela administração de UFP-101 (10 nmol, icv, 5 min antes do teste) ou SB- 612111 (10 mg/Kg, ip, 30 min antes do teste), (Fig. 13 e 14). Esta etapa experimental é de grande relevância, uma vez que, foi possível observar se a N/OFQ e o Ro 65-6570, agonista NOP de origem peptídica e não peptídica, respectivamente, são capazes de impedir a expressão do comportamento do tipo antidepressivo induzido pelo UFP-101 e SB-612111, antagonistas peptídico e não peptídico, respectivamente. Caso esta dose dos agonistas seja suficiente para afetar o efeito dos antagonistas, utilizaremos tal dose em experimentos subsequentes. Os animais que receberam N/OFQ e UFP-101 foram submetidos a uma cirurgia estereotáxica para implantação de uma cânula icv e, 5 dias após o procedimento, foram submetidos à análise comportamental no TNF.

Figura 13: Fluxograma ilustrativo da etapa VI – administração de ligantes NOP de origem peptídica no teste da natação forçada.

Figura 14: Fluxograma ilustrativo da etapa VIII – administração de ligantes NOP no teste da natação forçada.

Experimento 3: Efeito da co-administração de N/OFQ e antidepressivos clássicos em camundongos no TNF

Experimento 3.1: Efeito da co-administração de N/OFQ e fluoxetina no TNF

Nesta etapa, verificou-se o efeito da administração de N/OFQ em animais tratados com um antidepressivo inibidor da recaptação de 5-HT, a fluoxetina. Para desenvolver esta etapa, os animais foram submetidos a uma cirurgia estereotáxica para a implantação de uma cânula guia no ventrículo lateral, após 5 dias de recuperação os animais foram submetidos ao teste comportamental. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou fluoxetina (20 mg/Kg; ip), e após 55 min, receberam salina (icv) ou N/OFQ (1 nmol, icv); cinco min depois foram expostos ao TNF (Fig. 15).

Figura 15: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 da etapa VII – co- administração de N/OFQ e fluoxetina no teste da natação forçada.

Experimento 3.2: Efeito da co-administração de N/OFQ e nortriptilina no TNF

Nesta etapa, investigou-se o efeito da administração de N/OFQ em animais tratados com um antidepressivo tricíclico, a nortriptilina. Para 56

desenvolver esta etapa, os animais foram submetidos a uma cirurgia estereotáxica para a implantação de uma cânula-guia no ventrículo lateral, após cinco dias de recuperação os animais foram submetidos ao teste comportamental. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou nortriptilina (20 mg/Kg; ip), e após 55 min, receberam salina (icv) ou N/OFQ (1 nmol, icv); 5 min depois foram expostos ao TNF (Fig. 16).

Figura 16: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa VII - co- administração de N/OFQ e nortriptilina no teste da natação forçada.

Experimento 3.3: Efeito da co-administração de N/OFQ e R-ketamina no TNF

Nesta etapa, avaliou-se o efeito da administração de N/OFQ em animais tratados com um antidepressivo antagonista de receptor NMDA, a R-ketamina. Para desenvolver esta etapa, os animais foram submetidos a uma cirurgia esteriotáxica para a implantação de uma cânula guia no ventrículo lateral, após 5 dias de recuperação os animais foram submetidos ao teste comportamental. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou R-ketamina (10 mg/Kg; ip), e após 25 min, receberam salina (icv) ou N/OFQ (1 nmol, icv); 5 min depois foram expostos ao TNF (Fig. 17).

Figura 17: Fluxograma ilustrativo do experimento 3 da etapa VII - co- administração de N/OFQ e R-ketamina no teste da natação forçada.

Experimento 4: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e antidepressivos clássicos no TNF

Experimento 4.1: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e fluoxetina no TNF

Nesta etapa, estudou-se o efeito da administração de Ro 65-6570 em animais tratados com um antidepressivo inibidor da recaptação de 5-HT, a fluoxetina. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip), 5 min depois, receberam salina (ip) oufluoxetina (20 mg/Kg; ip) e 60 min depois foram expostos ao TNF (Fig. 18).

Figura 18: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 - etapa IX – co-administração de Ro 65-6570 e fluoxetina no teste da natação forçada.

Experimento 4.2: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e nortriptilina no TNF

Nesta etapa, avaliou-se o efeito da administração de Ro 65-6570 em animais tratados com um antidepressivo tricíclico, a nortriptilina. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip), 5 min depois, receberam salina (ip) ounortriptilina (20 mg/Kg; ip) e 60 min depois foram expostos ao TNF (Fig. 19).

Figura 19: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa IX - co- administração de Ro 65-6570 e nortriptilina no teste da natação forçada.

Experimento 4.3: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e R-ketamina no TNF

Nesta etapa, investigou-se o efeito da administração de Ro 65-6570 em animais tratados com um antidepressivo antagonista NMDA, R- ketamina. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip), 5 min depois, receberam salina (ip) ou R-ketamina (10 mg/Kg; ip) e 30 min depois foram expostos ao TNF (Fig. 20).

Figura 20: Fluxograma ilustrativo do experimento 3 da etapa IX - co- administração de Ro 65-6570 e R-ketamina no teste da natação forçada.

Experimento 5: Avaliação do efeito da administração de nortriptilina e R- ketamina em animais que desenvolveram o fenótipo desamparado:

Esta fase do estudotem por objetivo estabelecer o protocolo experimental, onde os animais desenvolvem a condição de desamparo aprendido. O teste do DA foi executado em camundongos Swiss, conforme proposto acima. Uma vez encontrada a condiçãoexperimental com eficiência máximaem induzir a condição de desamparo, os mesmos foram divididos em quatro grupos: de acordo com os tratamentos a seguir: nortriptilina (30 mg/Kg; ip; 60 min antes do teste), R- ketamina (10 mg/Kg; ip; 30 min antes do teste) (Fig. 21).

Figura 21: Fluxograma ilustrativo da etapa X - administração de antidepressivos convencionais no modelo do desamparo aprendido.

Experimento 6: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e SB-612111 no desamparo aprendido

Para experimentos subsequentes desse projeto foi-se necessário determinar se o agonista NOP, Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg, ip), bloqueia o efeito tipo antidepressivo induzido pela administração de SB-612111 (10 mg/Kg, ip), um antagonista NOP, em camundongos Swiss que desenvolveram o fenótipo desamparado. Esta etapa experimental é de grande relevância, uma vez que permite observar se o Ro 65-6570, um agonista NOP de origem não-peptídica, é capaz de impedir a expressão do comportamento do tipo antidepressivo induzido pelo SB-612111, um antagonista NOP não-peptídico. Como esta dose de Ro 65-6570 foi suficiente para afetar o efeito do SB-612111, tal dose de Ro 65-6570 foi utilizada no experimento da Etapa XII. Os animais que foram submetidos a esta etapa experimental foram pré-tratados com Ro 65-6570, 5 min antes de administração do SB-612111. O SB-612111 foi administrado 60 min antes da avaliação comportamental no TNF (Fig. 22).

Figura 22: Fluxograma ilustrativo da etapa XI – administração de ligantes NOP no modelo do desamparo aprendido.

Experimento 7: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e antidepressivos clássicos no desamparo aprendido

Experimento 7.1: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e nortriptilina no desamparo aprendido

Nesta etapa, verificou-se o efeito da administração de Ro 65-6570em animais tratados com um antidepressivo tricíclico, a nortriptilina, em

camundongos Swiss que desenvolveram o fenótipo desamparado após serem submetidos ao desamparo aprendido. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip), 5 min depois, receberam salina (ip) ou nortriptilina (20 mg/Kg; ip) e 60 min depois foram expostos a sessão teste do desamparo aprendido (Fig. 23).

Figura 23: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 da etapa XII – co- administração de Ro 65-6570 e nortriptilina no modelo do desamparo aprendido.

Experimento 7.2: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e R-ketamina no desamparo aprendido

Nesta etapa, verificamos o efeito da administração de Ro 65-6570 em animais tratados com um antidepressivo antagonista NMDA, a R-ketamina, em animais que desenvolveram o fenótipo desamparado após serem submetidos ao desamparo aprendido. No dia do teste, os animais receberam salina (ip) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip), 5 min depois, receberam salina (ip) ou R-ketamina (10 mg/Kg; ip) e 30 min depois serão expostos ao desamparo aprendido (Fig. 24).

Figura 24: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa XII - co- administração de Ro 65-6570 e R-ketamina no modelo do desamparo aprendido.

3.8 Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média do número de escapes (etapas I e IV), percentagem de indução do fenótipo desamparado (etapas II e III), média ± erro padrão da média do tempo de imobilidade (etapas V a X) e média ± erro padrão da média da área sob a curva (calculada a partir da latência de escape e o número de escapes; etapasXI e XII). A percentagem de indução do fenótipo desamparado foi analisada estatisticamente empregando o teste de chi-quadrado, seguindo do post hoc de Bonferroni. Os demais dados foram inicialmente submetidos ao teste de Kolmogorov-Sminorv para avaliar a normalidade e ao teste de Levene para avaliar a homogeneidade de variância. Uma vez que os dados apresentaram distribuição normal, as comparações entre os grupos tratados e controle foram feitas através do teste t (para comparação entre 2 grupos), por meio do teste ANOVA de uma via (para comparação de 3 grupos ou mais), seguida pelo teste post hoc de Tukey, ou por meio do teste ANOVA de duas vias (para comparação entre grupos onde dois fatores independentes estão presentes), seguida pelo teste post hoc de Tukey, a depender do delineamento experimental. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes. As análises foram realizadas nos programas, SPSS (versão 22) e Prisma Graph Pad (versão 6).

4. RESULTADOS

Etapa I: Avaliação do papel do sistema da N/OFQ – receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado

Padronização do DA em camundongos CD-1

O primeiro passo foi estabelecer as condições experimentais ótimas para realizar experimentos do DA em camundongos CD-1. Foram testados três diferentes protocolos de DA, com 1, 2 e 3 sessões de indução. Como mostrado na figura 25A, apenas 1 sessão de indução não foi eficiente na indução do fenótipo desamparado. Com 2 sessões de indução, 55% dos animais desenvolveram o fenótipo desamparado, enquanto que com 3 sessões de indução, 100% dos camundongos desenvolveram o fenótipo desamparado. Assim, o protocolo de 2 sessões de indução foi escolhido para investigar o efeito dos ligandos NOP e o fenótipo de camundongos NOP(-/-).

É importante observar que, sob essas condições experimentais (Fig. 25B), nortriptilina (20 mg/kg; 60 min; ip) e SB-612111 (10 mg/kg; 30 min; ip) foram capazes de reverter o déficit no comportamento de escape gerado pelo DA em camundongos (Fig. 25B: F(2,4) = 12,19, P<0,05, one-way ANOVA, teste de Tukey).

A B

1 0 0 3 0 R e silie n te

8 0 D e s a m p a ra d o 2 5 *

o *

ã 2 0 ç

6 0 s

p n

a 1 5

c e

4 0 s

d E

1 0 % 2 0 5

0 0 1 2 3 V e íc u lo N o rtrip tilin a S B -6 1 2 1 1 1 (2 0 m g /k g ) (1 0 m g /k g ) S e s s õ e s d e in d u ç ã o

Figura 25: Padronização das condições experimentais para realizar o teste de DA em camundongos CD-1. (A) Efeito do número de sessões de indução e (B) da administração aguda de nortriptilina (20 mg/Kg; ip; 30 min antes do teste) e SB-612111 (10 mg/Kg; ip; 30 min antes do teste) em camundongos desamparados. Os dados são apresentados como porcentagem de camundongos desamparados (A) e como a média ± erro padrão da médiade escapesdurante a sessão de teste de 2-4 camundongos/grupo (B). *P<0,05 vs. veículo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey).

Efeito da administração de agonista NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado

Na presente condição experimental, 50-60% dos camundongos controlesdesenvolveram o fenótipo desamparado. Como mostrado na figura 26, a administração de agonistas de NOP [Ro 65-6570 (0,01, 0,1, 0,3 e 1 mg/kg) e MCOPPB (0,1, 1 e 10 mg/kg) ] antes das sessões de indução, favoreceuaumento significativo e dose-dependente da percentagem de camundongos desamparados (Fig. 26A: x2=118,7;df=4; Fig 26B: x2=45,3; df=3; P<0,05 para ambos os agonistas NOP).

A B

R e silie n te * * R e silie n te * 1 0 0 D e s a m p a ra d o 1 0 0 D e s a m p a ra d o *

8 0 8 0

o ã

6 0 ã 6 0

4 0 4 0

% 2 0 % 2 0

0 0 0 0 ,0 1 0 ,1 0 ,3 1 0 0 0 ,1 1 1 0

R o 6 5 -6 5 7 0 (m g /K g ) M C O P P B (m g /K g )

Figura 26: Efeito dos agonistas NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado em camundongos CD-1. Ro 65-6570 (0,01, 0,1, 0,3 e 1 mg/kg, ip,30 min antes da sessão de indução) e MCOPPB (0,1, 1 e 10 mg/kg, ip, 30 min antes da sessão de indução) foram administrados antes das sessões de indução e o comportamento avaliado na sessão de screening. Os dados são apresentados como percentagem de camundongos que exibem comportamento desamparado de 6-10 camundongos/grupo. *P<0,05 vs. veículo (teste de chi- quadrado, seguido do teste post hoc de Bonferroni).

Efeito do bloqueio farmacológico e genético do receptor NOP no desenvolvimento do fenótipo desamparado

Nesta etapa experimental, investigou-se os efeitos do bloqueio da sinalização do receptor NOP, através de ferramentas farmacológicas (SB- 612111) e genéticas (NOP (-/-)), no desenvolvimento do fenótipo desamparado. Como ilustrado na figura 27A, a administração de nortriptilina não alterou a porcentagem de camundongos desamparados comparados ao controle, mas o SB-612111 (3 e 10 mg/kg) reduziu significativamente a porcentagem de camundongos desamparados comparados ao controle (Fig. 27B; x2 = 64,7; df=3; P<0,05).

Semelhante aos camundongos CD-1, quase 50% dos camundongos NOP(+/+) desenvolveram o fenótipo desamparado após 2 sessões de indução. Em contraste, os animais que não possuíam o receptor NOP apresentaram uma resistência significativa ao desenvolvimento do fenótipo desamparado e, nenhum camundongo testado nessas condições experimentais desenvolveu o comportamento desamparado (Fig. 27C; x2=100,7; df=1; P<0,05).

A B

R e silie n te 1 0 0 R e silie n te 1 0 0 D e s a m p a ra d o D e s a m p a ra d o

8 0 8 0

o ã

ã 6 0 6 0

4 0 4 0

% % 2 0 2 0 * *

0 0 V e íc u lo N o rtrip tilin a 0 1 3 1 0 (2 0 m g /k g ) S B -6 1 2 1 1 1 (m g /K g )

1 0 0 R e silie n te

8 0 D e s a m p a ra d o o

ã 6 0

n i

4 0

% 2 0 * 0 N O P (+ /+ ) N O P (-/-)

Figura 27: Efeitos de nortriptilina (A), SB-612111 (B) e fenótipo de camundongos NOP(-/-) (C) no teste do DA. Nortriptilina (20 mg/kg, 30 min, pré-tratamento, ip) e SB-612111 (1, 3 e 10 mg/kg, 30 min, pré-tratamento, ip) foram administrados antes das sessões de indução. Os dados são apresentados como a porcentagem de camundongos exibindo comportamento desamparado, número total 6-10

camundongos/grupo. *P<0,05 vs. veículo ou NOP(+/+) (teste chi-quadrado, seguido do teste post hoc de Bonferroni).

Efeito da administração de agonistas NOP e do fenótipo NOP(-/-) sobre o componente cognitivo do DA

Aqui foi investigado o efeito da administração de Ro 65-6570(1 mg/kg, 30 min antes da sessão de indução, ip) e MCOPPB (10 mg/kg, 30 min antes da sessão de indução, ip), bem como fenótipo de camundongos NOP(-/-)no componente cognitivo do modelo DA. Como mostrado na figura 28A, o grupo controle foi capaz de aprender a tarefa (apresentando um aumento no número de escapes com o passar dos dias, tornando o escape do comportamento eletrificado mais eficiente). A administração de MCOPPB não alterou o número de escapes do compartimento eletrificado quando comparado com o grupo controle (Fig, 28A). Porém, a administração de Ro 65-6570 antes das sessões de indução prejudicou aprendizado da tarefa, resultando em reduzido número de escapesem todos os dias de experimentos (Fig.28A: F (2,15)=10,02, P<0,05). Os camundongos NOP(+/+) apresentaram uma média de escape de 22 escapes no dia do teste,comportamento de escape semelhante aos camunodngos CD-1. No entanto, aumento significativo no número de escapes foi observado em camundongos NOP(-/-) comparado com NOP(+/+), sugerindo melhor performance cognitiva desses animais(Fig. 28B: t(10)=3,02, P<0,05).

A B * 3 0 3 0

2 5 2 5

2 0 2 0

e p

p 1 5 1 5

s E E 1 0 * 1 0

5 5

0 0 V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 M O C P P B N O P (+ /+ ) N O P (-/-) (1 m g /k g ) (1 0 m g /k g )

Figura 28: Efeito de agonistas NOP, Ro 65-6570e MCOPPB (A), e fenótipo de camundongos NOP(-/-) (B) no componente cognitivo do modelo DA. Ro 65-6570 e MCOPPB (1 e 10 mg/kg, respectivamente, 30 min, pré-tratamento ip) foram administrados antes das sessões de indução. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da médiado número de escapesde 6 camundongos/grupo. *P<0,05 vs. veículo ou NOP(+/+), (ANOVA uma via seguido do teste post hoc da Tukey (A) e teste T de Student (B)).

Etapa II: Investigação do efeito da co-administração de agonistas NOP e antidepressivos em condição de desespero comportamental e em situação de estresse incontrolável

Padronização das condições experimentais para a realização do TNF

Inicialmente avaliou-se o efeito induzido pela administração de antidepressivos clássicos, a citar fluoxetina, nortriptilina e ketamina no TNF. Buscou-se por empregar doses destes fármacos que produzissem efeito equivalente a fim de estabelecer uma futura comparação; de fato, testou-se o efeito da administração de nortriptilina (20 mg/Kg; ip; 60 min), fluoxetina (20 mg/Kg; ip; 60 min) e R-ketamina (10 mg/Kg; ip; 30 min). Como pode-se visualizar na figura 29A, a administração de nortriptilina e fluoxetina reduziu o tempo de imobilidade no TNF (Fig. 29A; F (2,17)= 37,07; P< 0,05). A administração de R- 68

ketamina, também reduziu o tempo de imobilidade dos animais expostos ao TNF quando comparado ao grupo controle (Fig. 29B; t(8)=12,82; P<0,05).

A B

2 5 0 2 5 0 )

) 2 0 0

2 0 0 s

(

d a

a 1 5 0 1 5 0

d d

i *

b o o 1 0 0 * 1 0 0

* m

5 0 5 0

m e

e 0 0

T T F lu o xe tin a N o rtrip tilin a S a lin a S a lin a K e ta m in a (2 0 m g /K g ) (2 0 m g /K g ) (1 0 m g /K g )

Figura 29: Efeito da administração de fluoxetina (20 mg/Kg; ip) e nortriptilina (20 mg/Kg; ip) (A) e R-ketamina (10 m/Kg; ip) (B) no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao TNF. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. n(A) = 6-7; n(B) = 4-6. *P<0,05 vs. salina (ANOVA de uma via, teste de Tukey e teste t independente, respectivamente).

Efeito da co-administração de N/OFQ e UFP-101 no TNF

Um importante passo na construção desse trabalho foi determinar qual dose de N/OFQ e Ro 65-6570, agonistas peptídico e não peptídico, respectivamente, do receptor NOP, são eficazesem bloquear a redução do tempo de imobilidade evocado pela administração de UFP-101 e SB-612111, respectivamente, antagonista do receptor NOP, no TNF, visto que a referida dose será empregada nas fases subsequentes deste estudo. Como ilustra a figura 30A, a administração de UFP-101 (10 nmol; icv), reduziu o tempo de imobilidade dos animais quando se comparadoao controle e a co-administração de N/OFQ (1 nmol; icv) com UFP-101 (10 nmol; icv) bloqueou esse efeito (F(2,9)=20,09; P<0,05). A administração de SB-612111 (10 mg/Kg; ip; 60 min)

reduziu o tempo de imobilidade desses animais, enquanto que a associação entre Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip; 60 min) e SB-612111 bloqueou o efeito do tipo antidepressivo evocado pela administração do antagonista do receptor NOP (F(2,9)=30,38; P<0,05) (Fig. 30B)

A B # # 2 5 0 S a lin a 2 5 0 V e íc u lo 2 0 0

) U F P -1 0 1 (1 0 n m o l)

s 2 0 0 S B -6 1 2 1 1 1 (1 0 m g /k g )

)

(

1 5 0 e a

d 1 5 0

d i

* i

l i

b * b o 1 0 0

o 1 0 0

5 0 d

5 0

m e 0 e

T 0 T S a lin a N /O F Q (1 n m o l) V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 (0 ,3 m g /k g )

Figura 30: Efeito da co-administração de N/OFQ (1 nmol; icv) ou Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg; ip) e UFP-101 (10 nmol; icv) ou SB-61211 (10 mg/Kg; ip) no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao TNF. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. n = 4/grupo. *P<0,05 vs. salina; #P<0,05 vs. UFP-101 (ANOVA de uma via, teste de Tukey).

Efeito da co-administração de N/OFQ e antidepressivos clássicos em camundongos no TNF

Nesta etapa experimental avaliou-se o efeito do pré-tratamento com agonista NOP, N/OFQ, sobre a redução no tempo de imobilidade, evocado pela administração de nortriptilina, fluoxetina e R-ketamina, em camundongos Swiss expostos ao TNF. Como ilustrado na figura 31A e 31B, a administração de fluoxetina (20 mg/Kg; ip; 60 min) e nortriptlina (20 mg/Kg; ip; 60 min) reduz o tempo de imobilidade no TNF e a pré-administração de N/OFQ (1 nmol; icv; 5 min) preveniu a ação induzida pela administração de fluoxetina e nortriptilina, reestabelecendo o tempo de imobilidade desses animais para níveis semelhantes ao do grupo controle. ANOVA de duas vias identificou efeito significativo para a interação entre o pré-tratamento e o tratamento (A=

F(1,29)=108,0; B= (F(1,28)=83,87, P<0,05 para ambos). Já a administração de R-ketamina reduziu o tempo de imobilidade dos animais no TNF, porém a co- administração de N/OFQ e R-ketamina não promove nenhuma alteração estatisticamente significante sobre o efeito da R-ketamina (fig. 31C). ANOVA de duas vias revelou somente o efeito do tratamento com R-ketamina (F(1,16)=176,8; P<0,05).

A B

) # # )

s 2 5 0

(

S a lin a S a lin a

e d 2 0 0 d a F lu o x e tin a (2 0 m g /k g ) 2 0 0

a N o rtrip tilin a (2 0 m g /k g )

i b

1 5 0 b 1 5 0 o

o *

1 0 0 * 1 0 0

5 0 o 5 0

m e

e 0 0

T T S a lin a N/OFQ (1 nmol) Salina N/OFQ (1 nmol)

C )

s 2 5 0 (

S a lin a e

d 2 0 0

a K e ta m in a (1 0 m g /K g )

l i

b 1 5 0

o * *

m i

1 0 0

o 5 0

p m

e 0 T Salina N/OFQ (1 nmol)

Figura 31: Efeito da co-administração de N/OFQ (1 nmol; icv) e fluoxetina (20 mg/Kg; ip), nortriptilina (20 mg/Kg; ip) e R-ketamina (10 mg/Kg; ip) no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao TNF. Os dados são apresentados como média ± erro padrão média. n = 4-9/grupo. *P<0,05 vs. salina; #P<0,05 vs. fluoxetina, nortriptilina ou R-ketamina (ANOVA de duas vias, teste de Tukey).

Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e antidepressivos clássicos no TNF

Nesta etapa experimental avaliou-se o efeito do pré-tratamento com agonista NOP, Ro 65-6570, sobre o tempo de imobilidade evocado pela administração de nortriptilina, fluoxetina e R-ketamina em camundongos expostos ao TNF. Como ilustra a figura 32A e 32B, a administração de fluoxetina

e nortriptilina reduzem o tempo de imobilidade dos animais, enquanto que a associação entre Ro 65-6570 e os antidepressivos preveniu a redução da imobilidade evocada pela fluoxetina e nortriptilina. A ANOVA de duas vias identificou um efeito significativo da interação entre o pré-tramento com Ro 65- 6570 e o tratamento com fluoxetina (F(1,20)=73,14, P<0,05) e nortriptilina (F(1,16)=101,5, P<0,05). A administração de R-ketamina reduziu o tempo de imobilidade dos animais expostos ao TNF e a associação entre Ro 65-6570 e R- ketamina não promoveu alterações estatisticamente significativas quando comparado ao grupo tratado com R-ketamina. ANOVA de duas vias identificou somente efeito significativo para o tratamento com R-ketamina (Fig. 32C;F(1,16)=386,2; P<0,05).

A B

2 5 0 # # V e íc u lo 2 5 0 V e íc u lo

) 2 0 0 F lu o x e tin a (2 0 m g /k g )

( )

2 0 0 N o rtrip tilin a (2 0 m g /k g )

(

d e

a 1 5 0

d a

i 1 5 0

l b

* i

o *

1 0 0 b o

m 1 0 0

5 0 d o

5 0

m e

0 e T 0 V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 T V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 (0 ,3 m g /K g ) (0 ,3 m g /K g )

2 5 0 V e íc u lo

) 2 0 0 K e ta m in a (1 0 m g /K g )

(

e d

a 1 5 0

l i

b * *

o 1 0 0

e d

5 0

p m

e 0 T V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 (0 ,3 m g /K g )

Figura 32: Efeito da co-administração de Ro 65-6570 (0,3mg/Kg; ip) e fluoxetina (20 mg/Kg; ip), nortriptilina (20 mg/Kg; ip) e R-ketamina (10 mg/Kg; ip) no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao TNF. Os dados são apresentados

como média ± erro padrão da média. n = 4-6/grupo. *P<0,05 vs. salina; #P<0,05 vs. fluoxetina, nortriptilina ou R-ketamina (ANOVA de duas vias, teste de Tukey).

Avaliação do efeito da administração de nortriptilina e R-ketamina em animais que desenvolveram o fenótipo desamparado

Visiando estabelecer as condições experimentais ideais para as próximas etapas, foi avaliado o efeito da administração de nortriptilina (20 mg/Kg, ip, 60 min) e R-ketamina (10 mg/Kg, ip, 30 min) em camundongos desamparados após submetidos ao modelo DA. Como ilustrado na figura 33A e 33C, a administração de nortriptilina e R-ketamina, reverteu o déficit no comportamento de escape, reduzindo a latência de escape quando comparado com os animais controles (A= t(9)=19,27, P<0,05; C= t(11)=6,758, p<0,01). As administrações de nortriptilina e R-ketamina também induziram aumento siginificativo no número de escapes quando comparado ao grupo controle (Figura 33B, 33D) (B= t(9)=24,73, P<0,05; D= t(11)=10,19, P<0,05).

A B

e 8 0 0 3 0

a c

s 2 5 e

6 0 0

e 2 0

a *

i a

c 4 0 0 1 5

ê t

E 1 0

a l

2 0 0 a

d 5

U 0 0 A V e íc u lo N o rtrip tilin a (2 0 m g /K g ) S a lin a N o rtrip tilin a (2 0 m g /K g )

C D

e 8 0 0 3 0 *

a c

s 2 5 e

6 0 0

e 2 0 s

d *

i a

c 4 0 0 1 5

ê t

E 1 0

a l

2 0 0 a

d 5

U 0 0 A V e íc u lo K e ta m in a (1 0 m g /k g ) S a lin a K e ta m in a (1 0 m g /K g )

Figura 33: Efeito da administração de nortriptilina e R-ketamina sobre a latência de escape (A,C) e número de escapes (B,D) em camundongos desamparados após submetidos ao modelo do DA. Dados são apresentados com média ± erro padrão da área sobre a curva da latência de escape (A,C) e o número de escapes (B,D) de 5-6 animais/grupo. *P<0,05 vs. salina (Student teste T independente).

Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e SB-612111 no desamparo aprendido

O efeito da administração aguda com o antagonista de NOP, SB-612111, eo agonista de NOP, Ro 65-6570, foramavaliados no modelo doDA (Fig. 34). SB- 612111 reduziu a latências de escape (Fig. 34A,P<0,05) e aumentou o número de escapes (Fig. 34B, P<0,05). Em contraste, Ro 65-6570 não induziu qualquer mudança significativa no comportamento animais desamparados no modelo do DA (Fig. 34,P>0,05). No entanto, o pré-tratamento com Ro 65-6570 preveniu 74

totalmente os efeitos do SB-612111, reduzindo as latências de escape (Fig. 34A) e aumentando o número de escapes (Fig. 34B). ANOVA de duas vias detectou efeito da interação entre os dois fatores independentes (agonista e antagonista de NOP) nas latências de escape (Fig. 34A, F(1,24)=99,6, P<0,05) e número de escapes (Fig. 34B,F(1,24)=190,1, P<0,05).

A B

8 0 0 3 0 V e íc u lo V e íc u lo e #

p 2 5 * a S B -6 1 2 1 1 1 S B -6 1 2 1 1 1

c 6 0 0 s

e 2 0

e e

d *

a 4 0 0 1 5

n E

ê 1 0

t a

l 2 0 0

a 5 #

U 0 0 A V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0

Figura 34: Efeitos do pré-tratamento com Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg, ip) e SB- 612111 (10 mg/Kg, ip) nas latências de escape (A) e número de escapes (B) em camundongos desamparados. Os dados são apresentados como media ± erro padrão da média da área sob a curva das latências de escape e número de escapes de 7 camundongos/grupo. *P<0,05 vs. veículo; #P<0,05 vs. controle (ANOVA de duas vias, teste post hocde Dunnett).

Efeito da co-administração de Ro 65-6570 e antidepressivos clássicos no desamparo aprendido

Como ilustrado na figura 35, a administração do agonista NOP, Ro 65- 6570, impediu a reversão do comportamento desamparado, induzida pela administração de nortriptilinaem camundongos. A ANOVA de duas vias identificou um efeito de interação entre Ro 65-6570 e nortriptilina nas latências de escape e número de escapes (Fig. 35A, F(1,13)=13,0;Fig. 35B, F(1,13)=12,2, P<0,05 para ambos). Os efeitos de Ro 65-6570 em camundongos tratados com R-ketamina também foram avaliados no modelo DA (Fig. 35C, 35D). Quando o

Ro 65-6570 foi co-administrado com R-ketamina, não foram observadas alterações significativas nas latências de escape (Fig. 35C) e na frequência de escapes (Fig. 35D) quando comparados com camundongos tratados apenas com R-ketamina. A ANOVA de duas viasdetectou apenas efeito significativo para o fator independente R-ketamina (Fig. 35C, F(1,12)=109,4; Fig. 35D, F(1,12)=205,6).

A B

8 0 0 3 0 V e íc u lo V e íc u lo # 2 5 * N o rtrip tilin a (2 0 m g /k g ) N o rtrip tilin a

6 0 0 e

p 2 0

a *

p 1 5

e 4 0 0

i E

c 1 0 n

ê #

t 2 0 0

a l

C 0

U 0 A V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0

C D

8 0 0 3 0 V e íc u lo V e íc u lo 2 5 K e ta m in a * k e ta m in a 6 0 0

e * p

a 2 0 c

s * s

e *

e e

4 0 0 p 1 5

s c

E 1 0

n ê

t 2 0 0

a l

U 0 0 A V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0 V e íc u lo R o 6 5 -6 5 7 0

Figura 35: Efeito do pré-tratamento com Ro 65-6570 (0,3 mg/Kg, ip) e nortriptilina (20 mg/Kg, ip) ou R-ketamina (10 mg/Kg, ip) na latência de escape (A,C) e número de escapes (B,D) em camundongos desamparados. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média da área sob a curva para latências de escape e número de escapes de 4-5 camundongos/grupo. *P<0,05

vs. veículo, #P<0,05 vs. veículo + nortriptilina (ANOVA de duas vias, teste de Dunnett).

5. DISCUSSÃO

Na primeira etapa desse estudo, objetivando investigar o papel do sistema da N/OFQ–receptor NOP na aquisição do comportamento desemparado, avaliou-se o efeito da ativação do receptor NOP, usando agonistas deste receptor (Ro 65-6570 e MCOPPB), e o bloqueio do receptor NOP, farmacológico (SB-612111) e genético (camundongos NOP (-/-)), sobre o desenvolvimento do fenótipo desamparado. Pode-se notar que a administração de antagonista NOP (SB-612111), antes das sessões de indução, e o bloqueio genético do receptor NOP mostraram-se eficientes em prevenir o desenvolvimento do fenótipo desamparado. Já a ativação do receptor NOP (Ro 65-6570 e MCOPPB), antes das sessões de indução, facilitou a aquisição de um fenótipo desamparado, sugerindo que o sistema da N/OFQ-receptor NOP encontra-se ativo endogenamente diante de um evento estressor.

A fim de estabelecer uma condição ideal para estudo da aquisição do comportamento desamparado, o primeiro passo foi padronizar a condição experimental. Ao avaliar o efeito da manipulação farmacológica e genética no desenvolvimento do fenótipo desamparado em camundongos CD-1 e NOP(+/+) e NOP(-/-) buscou-se determinar um protocolo que atingisse uma eficiência de indução do fenótipo desamparado mediana, para que pudesse identificar tanto alterações na porcentagem de indução para mais (fenótipo pró-depressivo), como para menos, através da prevenção do desenvolvimento do fenótipo desamparado. O melhor protocolo para essa situação foi o que empregou dois dias de sessão de indução, atingindo uma eficiência em torno de 50-60% de expressão do comportamento desamparado. Nesta condição experimental, nortriptilina e SB-612111, quando administrados pré-teste, induziram efeito do tipo antidepressivo, revertendo o déficit no comportamento de escape e aumentando o número de escapes em comparação ao grupo veículo. Esse dado está em consonância com a literatura tanto para o antidepressivo tricíclico nortriptilina (Telner et al.,1981; Kametani et al., 1983) quanto o antagonista NOP SB-612111 (Holanda et al., 2016). Dessa forma, o protocolo escolhido permite, além da possibilidade de manipulação tanto para um efeito pró-depressivo como um efeito preventivo, replicar os dados da literatura em que o déficit no 78

comportamento de escape é revertido pela administração de drogas com potencial antidepressivo.

No presente estudo, pela primeira vez, fazendo uso de ferramentas farmacológicas e genéticas foi evidenciado o envolvimento da sinalização do receptor NOP na aquisição do fenótipo desamparado. Dois diferentes agonistas NOP, Ro 65-6570 e MCOPPB, aumentaram a porcentagem de animais desamparados de maneira dose-dependente. Enquanto que o bloqueio farmacológico e genético do receptor NOP, através do antagonista NOP SB- 612111 e de animais que não expressam esse receptor, diminuiu a porcentagem de animais que adquire o fenótipo do tipo depressivo. Vale salientar que a administração de nortriptilina, antidepressivo amplamente usado na clínica, quando administrada antes da sessão de indução, não foi capaz de alterar significativamente a porcentagem de animais que desenvolveram o fenótipo desamparado. Resultado similar ao que se observou para a nortriptilina já foi descrito na literatura para outro antidepressivo tricíclico, imipramina (10 e 30 mg/Kg), injetada antes da sessão de indução em ratossubmetidos ao modelo do DA (Takamori et al., 2001). Em conjunto, esses dados mostram que o sistema da N/OFQ–receptor NOP é tonicamente ativo e está diretamente relacionado com a aquisição do fenótipo desamparado. Apesar da literatura associar o fenótipo desamparado com uma intensa redução dos níveis de monoaminas em diferentes áreas cerebrais (Maynert e Levi, 1964; Weiss et al., 1975; Zigmond e Harvey, 1970; Bliss e Zwanziger, 1966; Thierry et al., 1968), o aumento dos níveis de monoaminas centralmente, evocado pela administração de antidepressivos tricíclicos não é suficiente para prevenir o desenvolvimento do fenótipo desamparado. Sendo assim, essas observações sugerem que os ligantes NOP induzem algumas alterações neuroquímicas capazes de afetar o comportamento desamparado que vão além do aumento na concentração de monoaminas.

Pode-se explicar esse perfil de ação dos ligantes NOP baseando-se na estreita relação entre o sistema da N/OFQ receptor NOP com o estresse. De fato, existe uma gama de evidências que correlaciona a ativação do receptor

NOP com um aumento nos níveis séricos de corticosterona e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e ativação do eixo HPA (Devine et al., 2001; Leggett et al., 2006). Ainda, o estresse agudo altera a expressão de N/OFQ e receptor NOP em áreas críticas para a modulação do humor, como hipocampo, hipotálamo e amígdala. De fato, o estresse de contenção agudo (30 min) em ratos diminuiu os níveis de N/OFQ no prosencéfalo basal imediatamente após o estresse, enquanto que os níveis de N/OFQ retornaram à condição basal 24 h depois do evento estressor (Devine et al. 2003). Por outro lado, observou-se que 4h após o estresse de contenção agudo (120 min) ocorre aumentoda expressão de N/OFQ no giro denteado, CA1 e CA3 do hipocampo, aparentemente mediado por hormônios glicocorticoides endógenos, visto que em animais adrenocorticomizados essas alterações não foram vizualisadas (Nativio et al., 2012). Enquanto que reduzida expressão do RNAm ppN/OFQ foi detectado no hipocampo, córtex pré-frontal e amígdala central 4 h após os animais serem submetidos à estresse de conteção (Delaney et al., 2012). Com base nesses achados, N/OFQ possivelmente foi liberada durante o estresse agudo, justificando, assim, a redução dos níveis de N/OFQ no cérebro imediatamente após um estresse de contenção de 30 min (Devine et al., 2003). No entanto, após a liberação do peptídeo, ocorre adaptação fisiológica deste sistema voltada na restauração dos níveis de N/OFQ. Já em relação ao receptor NOP, observou- se que o estresse de contenção agudo aumenta a expressão de RNAm do receptor NOP na amígdala e no núcleo paraventricular do hipotálamo (Ciccocioppo et al., 2014; Green et al., 2009). Essas alterações na expressão do sistema da N/OFQ–receptor NOP durante o estresse agudo, poderia em último caso, resultar em um aumento na sinalização do receptor NOP.

Com base na literatura que correlaciona estresse e o sistema da N/OFQ, os dados desse estudo sugerem que a administração de agonistas NOP somado a ativação do eixo HPA (induzida pelo estresse inescapável), aumentariam a sinalização gerada por um evento estressor, potencializando as consequências do estresse. Por outro lado, os eventos estressores promovem aumento na transmissão N/OFQnérgica no encéfalo e o bloqueio do receptor NOP em associação ao evento estressor poderia atenuar as consequências do estresse.

Vale salientar que as alterações neuroplásticas na sinalização do sistema da N/OFQ-receptorNOP promovidas pelo estresse podem ser justificadas pela existência de elementos responsivos aos glicocorticoides no gene que codifica a expressão de N/OFQ em humanos (Xie et al., 1999). Ainda, corroborando essa hipótese, Báez e colaboradores (1996) demonstraram que a administração de glicorticóide antes da sessão de indução facilita a aquisição do fenótipo desamparado. No entanto, estudos futuros fazem-se necessários a fim de avaliar a participação do eixo HPA, mediada pelo receptor NOP, na aquisição do fenótipo desamparado.

Cabe salientar que tanto o efeito pró-depressivo como o efeito preventivo para o desenvolvimento do fenótipo desamparado evocado pela administração de Ro 65-6570, MCOPPB e SB-612111, não são causados por alterações nos componentes motivacionais/locomotor do DA, pois todas as doses utilizadas nesse estudo são doses em que a literatura mostra não induzir alterações na locomoção no modelo DA e em outros testes, como por exemplo campo aberto (Silva et al., 2018).

Com relação ao componente cognitivo do DA, o nosso grupo já mostrou que SB-612111 (10 mg/Kg, ip, 30 min) não altera a capacidade do animal em aprender a tarefa de se esquivar do eletrochoque, quando existe a possibilidade de escape (Holanda et al., 2016). Porém, devido a ausência de informação sobre o efeito de agonistas NOP no componente cognitivo do DA, e a fim de eliminar qualquer viés de interpretação, investigou-se o efeito da administração de Ro 65- 6570 e MCOPPB, ambos na maior dose testada no DA, administrado antes das sessões de indução, sobre o componente cognitivo do DA (protocolo que permite a possibilidade de escape durante a fase de indução), e pode-se notar que a administração de Ro 65-6570 causou redução significativa no número de escapes em comparação ao grupo controle, indicando prejuízo na aprendizagem da tarefa. Esse dado está em acordo com a literatura que relaciona a ativação do receptor NOP com um efeito bifásico sobre os processos de aprendizagem e memória, facilitando os processos em baixas dosagens e causando prejuízo nos mesmos nas doses mais altas (para revisão: Andero et al., 2015).

Vale mencionar que apesar do prejuízo cognitivo ser um viés na interpretação do efeito pró-depressor do Ro 65-6570, pode-se supor que durante o protocolo inescapável sob efeito do Ro 65-6570 o animal teria prejuízo na aquisição da informação de que essa é uma condição inescapável e quando fosse dado a possibilidade de escape, durante a sessão de screening, esse animal buscaria o escape ativamente, aumentando o número de escapes quando comparado ao controle, o que o levaria a ser classificado como resiliente. Porém, o resultado aqui observado é justamente o oposto, ou seja, pode-se observar redução significativa na frequência de escape. É interessante notar que a administração de MCOPPB não causou nenhum prejuízo sobre o componente cognitivo do teste em comparação ao grupo controle. Anteriormente, já havia sido relatado que a administração de MCOPPB não induz prejuízo cognitivo em roedores (Hirao et al., 2008).

Um cenário oposto foi visualizado quando os camundongos NOP(-/-) foram avaliados quanto ao componente cognitivo do DA. Nesta situação, animais que não expressam o receptor NOP apresentaram um desempenho melhor que os animais NOP(+/+), revelando aumento significativo no número de escapes, mostrando que os animais NOP(-/-) aprenderam melhor a tarefa. Esse fato também não causa nenhum viés na interpretação dos dados que revelam que os animais NOP(-/-) são resistentes ao desenvolvimento do fenótipo desamparado, visto que no protocolo tradicional (estresse inescapável), os camundongos NOP(-/-) tem a oportunidade de compreender que nasessão de indução não existe possibilidade de escape e na sessão de screening, quando há a possibilidade de escape do choque, os animais NOP(-/-) buscam ativamente o escape, aumentando significativamente a porcentagem deanimais que não desenvolvem o fenótipo desamparado,ou seja, o oposto do que poderia ser considerado um viés promovido pela melhor performance cognitiva desses animais. Portanto, apesar da sinalização do receptor NOP afetar a cognição dos animais, esse efeito não parece interferir na interpretação da aquisição do comportamento desamparado modulado pela sinalização do receptor NOP. Parece que ambos os eventos (desamparo x cognição) não estão conectados e que o perfil pró-depressivo de agonistas NOP é legítimo.

A locomoção espontânea e a nocicepção podem ser fatores interferentes na interpretação dos resultados aqui relatados pelo ligante NOP do comportamento desamparado. Em relação à atividade locomotora, foi demonstrado que Ro 65-6570 e MCOPPB não modificaram a locomoção espontânea nas doses capazes de modificar o comportamento animal no modelo de desamparo aprendido (Silva et al., 2018; Holanda et al., 2018). Além disso, dados da literatura demonstraram que o bloqueio farmacológico, SB-612111, e genético, NOP(+/+) e NOP(-/-), não afetam a locomoção espontânea do camundongo (Nishi et al., 1997; Marti et al., 2004; Rizzi et al., 2007; Silva et al., 2018). Em relação aos efeitos dos ligantes NOP na nocicepção, uma série de evidências recentemente revisadas por Toll et al. (2016) demonstraram que agonistas e antagonistas seletivos de NOP não modificam a transmissão da dor nociceptiva aguda. Isto foi confirmado no teste de retirada da cauda tanto para Ro 65-6570 (Rizzi et al., 2016) como para o SB-612111 (Rizzi et al., 2007). Por outro lado, até a presente data, não há relatos na literatura sobre os efeitos de MCOPPB em ensaios analgesiométricos. Por fim, os camundongos NOP(-/-) exibem um limiar nociceptivo agudo semelhante ao dos camundongos controles (Nissi et al., 1997; Di Giannuario et al., 2001). Assim, propõe-se que as ações dos ligantes NOP na aquisição do comportamento desamparado são genuínas e não enviesadas por viéses como memória, locomoção e nocicepção e o mesmo pode ser dito para o fenótipo apresentado peloscamundongos NOP(-/-).

Neste estudo observou-se que os fármacos antidepressivos e os antagonistas NOP mostraram-se eficientes em induzir um efeito do tipo antidepressivo em camundongos, reduzindo o tempo de imobilidade dos animais no TNF, bem como, revertendo o déficit no comportamento de escape dos animais submetidos ao DA. Além disso, a administração de antagonista NOP (SB-612111), antes das sessões de indução, e o bloqueio genético do receptor NOP mostraram-se eficientes em prevenir o desenvolvimento do fenótipo desamparado. Já a ativação do receptor NOP (Ro 65-6570 e MCOPPB), antes das sessões de indução, facilitou o desenvolvimento de um fenótipo pró- depressor nos camundongos expostos ao DA. Conforme demonstrado na segunda etapa desse estudo, a N/OFQ e o Ro 65-6570 quando administrados

per se não alteraram o tempo de imobilidade no TNF e o déficit no comportamento de escape de camundongos no DA, porém foram capazes de bloquear o efeito antidepressivo evocado pela administração de UFP-101 e SB- 612111. A co-administração de agonistas NOP, N/OFQ e Ro 65-6570 com fluoxetina e nortriptilina promoveu bloqueio do efeito antidepressivo, induzido pela administração dos antidepressivos per se no TNF e no DA. Já a co- administração de N/OFQ ou Ro 65-6570 e R-ketamina não alterou o comportamento do tipo antidepressivo induzido pela R-ketamina em ambos os testes.

Baseado nas evidências aqui apresentadas que sugerem que o sistema N/OFQ–receptor NOP modula a aquisição do fenótipo desamparado, bem como, dados que apóiam a ação ansiolítica, analgésica, antitussígena e anti- hipertensiva de agonistas NOP, além de candidatá-los para o tratamento de incontinência urinária devido à bexiga hiperativa (Toll et al., 2016), faz-se necessário a investigação das possíveis interações medicamentosas entre os agonistas NOP e na presente situação fármacos antidepressivos. Cabe comentar que neste estudo foram realizados dois testes comportamentais, a nomear: teste de natação forçada e modelo de desamparo aprendido, que apesar de serem amplamente utilizados para identificar um potencial antidepressivo, os resultados desses testes são bastante distintos em termos de significância. No TNF, o animal quando submetido a um evento estressante inescapável (natação) assume uma postura imóvel. O tratamento com antidepressivos reduz o comportamento imóvel passivo. Acredita-se que o comportamento imóvel reflita a incapacidade de persistir no comportamento dirigido ao escape após o estresse (ou seja, o desespero comportamental) ou o desenvolvimento de uma estratégia passiva que desengate as formas ativas de enfrentamento do estresse (Slattery e Cryan, 2012). No modelo de desamparo aprendido, os animais são submetidos a uma situação estressante incontrolável, imprevisível e inescapável, e durante uma segunda exposição a essa tarefa, é apresentado aos animais uma possibilidade de escapar do evento desagradável (isto é, a porta em guilhotina dentro da caixa é aberta), mas a maioria deles não consegue escapar do choque elétrico (esses animais são chamados de

desamparados). Os antidepressivos podem reverter de forma significativa e seletiva esse comportamento desamparado (Pryce et al., 2011).

Neste estudo, pode-se notar que a administração pré-teste de fluoxetina, nortriptilina, R-ketamina, UFP-101 e SB-612111 foram igualmente efetivos em reduzir o tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao TNF, dado este já descrito na literatura (Lucki, 1997; Gavioli 2003, 2004; Kos et al., 2006; Rizzi et al., 2007; Antony et al., 2014; Fukumoto et al., 2017). Ainda, a administração aguda de nortriptilina, R-ketamina e SB-612111, também no pré-teste, reverteu o déficit no comportamento de escape de animais desamparados, como reportado anteriormente (Telner et al., 1981; Kemetani et al., 1983; Maeng et al., 2008; Holanda et al., 2016). No que se refere aos agonistas NOP, os resultados desse estudo mostram que a administração de N/OFQ e Ro 65-6570, não promoveu alteração no tempo de imobilidade dos camundongos expostos ao TNF, mas bloqueou o efeito do tipo antidepressivo induzido pela administração de antagonistas NOP, UFP-101 e SB-612111, respectivamente. Ainda foi mostrado que o pré-tratamento com Ro 65-6570 bloqueou o efeito antidepressivo induzido pelo SB-612111 quando administrado antes da sessão teste do TNF e do DA, sugerindo que esse efeito é resultante da interação da molécula do antagonista com o receptor NOP. Especula-se que esse bloqueio de efeito possa ser explicado por uma competição dos ligantes pelo receptor NOP. De fato, estudos de binding usando células expressando o receptor recombinante de NOP humano mostraram que ambos Ro 65-6570 e SB-612111 foram capazes de deslocar a ligação [3H]N/OFQ (Hashiba et al., 2000; Spagnolo et al., 2007). Ainda, um tipo competitivo de um antagonismo foi descrito para o SB-612111, que foi avaliado contra N/OFQ (Spagnolo et al. 2007) e Ro 65-6570 (Ferrari et al., 2017). Dado esse de acordo com a literatura que mostra que a administração de diferentes doses de N/OFQ (0,01- 1 nmol, icv, 5 min antes do teste) não promove alteração no comportamento de camundongos e ratos submetidos ao TNF e em camundongos submetidos ao TSC, mas na maior dose (1 nmol), a injeção de N/OFQ bloqueou o efeito do tipo antidepressivo do UFP- 101 10 nmol (Gavioli et al., 2003; Gavioli et al., 2004) e SB-612111 10 mg/Kg (Rizzi et al., 2007).

Alguns estudos avaliaram o efeito da administração do agonista do receptor NOP em testes de desespero comportamental e nenhum deles evidenciou nenhuma alteração significantiva em relação ao grupo controle, porém a co-administração de agonista com antagonista NOP é capaz de bloquear o efeito antidepressivo evocado pela administração do antagonista NOP (Redrobe et al., 2002; Gavioli et al., 2003; Gavioli et al., 2004; Rizzi et al., 2007; Witkin et al., 2016). Essa falta de efeito dos agonistas NOP observadaem testes de desespero comportamental pode ser explicada pela possível existência de efeito teto que impossibilitaria a detecçãode um aumento no tempo de imobilidade (Gavioli e Calo’, 2013)

Quando se avaliou o efeito da co-administração de N/OFQ e Ro 65-6570 com fluoxetina, nortriptilina e R-ketamina pode-se notar que os agonistas NOP bloquearam o efeito antidepressivo evocado pela fluoxetina e nortriptilina, porém quando se associou os agonistas NOP com R-ketamina, o efeito antidepressivo da R-ketamina foi mantido tanto no TNF quanto no DA. Até o presente momento, um único estudo testou o efeito da co-administração de antidepressivo clássico e agonista NOP. Witkin e colaboradores (2014), em um artigo de revisão na qual os autores apresentam dados próprios, mostrou que o agonista NOP Ro 64-6198 (0,3 mg/Kg; vo.; 30 min de pré-tratamento) não promoveu alteração sobre o tempo de imobilidade de camundongos no TNF, enquanto que o antagonista NOP, SB-612111(30 mg/Kg; vo; 30 min de pré-tratamento) induziu efeito do tipo antidepressivo. Quando co-administrados, o agonista NOP Ro 64-6198 bloqueou o efeito antidepressivo do SB-612111. No entanto, a administração de Ro 64- 6198 (nas mesmas condições descritas acima) não preveniu o efeito antidepressivo da imipramina (15 mg/Kg, i.p.; 30 min antes do teste). Sugerem- se algumas diferenças metodológicas para explicar a discordância nos resultados. Apesar de discreta, existe diferença farmacodinâmica entre os agonistas NOP, Ro 64-6198 (Witkin et al., 2014) e Ro 65-6570 (presente estudo) e também nos fármacos antidepressivos utilizados, imipramina (Witkin et al., 2014) e fluoxetina e nortriptilina (presente estudo). São encontradas ainda diferenças nos protocolos utilizados para no TNF. De fato, Witkin e colaboradores empregaram apenas uma sessão de teste, enquanto que no

presente estudo foram utilizadas duas sessões: teste e reteste. Vale ressaltar que o presente trabalho traz evidências robustas, pois testou dois diferentes tipos de agonistas NOP (peptídico e não-peptídico) e três antidepressivos de classes distintas (a citar: um ISRS, um antidepressivo tricíclico e um antagonista de receptores NMDA). Este protocolo, utilizando teste e reteste, causa estresse adicional ao animal que pode acarretar em alterações na expressão encefálica de N/OFQ e/ou do receptor NOP (Witkin et al., 2014), como já comentado anteriormente, favorecendo de antemão um aumento da sinalização do receptor NOP, o que deixaria os animais submetidos a esse protocolo mais sensíveis à ação de agonistas NOP.

Figura 36: Influência de eventos estressores sobre a neurotransmissão N/OFQnérgica. Eventos estressores agudos, como por exemplo: natação forçada (TNF), estresse de contenção (EC) e estresse social (ES) ou estresse de aglomeração social, desencadeiam uma séria de eventos mediados pela ativação do eixo HPA, que culmina no aumento da concentração de glicocorticoides. Por sua vez, além de capacitar o organismo para desenvolver uma resposta adaptativa para esses eventos, esses mediadores atuam em elementos responsivos a glicocorticoides no gene que codifica a ppN/OFQ e

dessa forma altera a expressão de N/OFQ e outros peptídeos em diversas áreas, principalmente em estruturas límbicas envolvidas na mediação das emoções.

Ao avaliar a co-administração entre os agonistas NOP e os antidepressivos utilizados na clínica, notou-se que tanto a N/OFQ quanto o Ro 65-6570 conseguiram prevenir o efeito antidepressivo evocado pela administração de fluoxetina e nortriptilina, porém não alteram o efeito da administração de R-ketamina. Uma das possíveis explicação é a diferença no mecanismo de ação desses antidepressivos e a interação deles com a sinalização N/OFQnérgicas. De fato, é de amplo conhecimento que os antidepressivos clássicos promovem seus efeitos terapêuticos por aumentar a disponibilidade de monoaminas na fenda sináptica, logo após a primeira administração, seja por inibir a receptação de 5-HT e noradrenalina (antidepressivos tricíclicos – nortriptilina) ou inibir a recaptação seletiva de 5-HT (ISRS – fluoxetina) (para revisão: Manji et al., 2001; Morilak e Frazer, 2004; Berton e Nestler, 2006).

Uma série de evidências correlaciona o sistema da N/OFQ–receptor NOP com alterações na disponibilidade de monoaminas no sistema nervoso central. Inúmeros estudos retratam um robusto efeito do tipo antidepressivo resultante do bloqueio do receptor NOP e esse efeito parece ser mediado por um aumento na neurotransmissão monoaminérgica (para revisão: Gavioli e Calo’, 2013). Ainda foi demonstrado que o antagonista NOP, LY2940094, além de induzir efeito do tipo antidepressivo em camundongos expostos ao TNF, também incrementou o efeito da fluoxetina nesse teste (Witkin et al., 2016). De fato, ao associar o antagonista NOP com a fluoxetina, ambos em doses inativas no TNF, observou-se potencialização do efeito da fluoxetina, que reduziu o tempo de imobilidade dos animais no TNF. Este aumento na ação antidepressiva da fluoxetina quando associada ao antagonista NOP deve-seprincipalmente por mecanismos farmacodinâmicos entre o antagonista NOP e a fluoxetina, visto que não foi observado aumento na ocupação entre os sítios receptoriais das drogas em questão, bem como não foram observadas alterações nas concentrações

plasmáticas e encefálicas das drogas quando administradas em concomitância (Witkin et al., 2016).

Os efeitos do estresse sobre a sinalização N/OFQnérgica parecem estar relacionados com a neurotransmissão serotoninérgica. De fato, já foi demonstrado que a N/OFQ inibe a liberação de 5-HT a partir do NDR (núcleo dorsal da raphe) em animais sob condições basais e após exposição à natação forçada (Nazzaro et al., 2009). Ainda, Nazzaro e colaboradores (2010) mostraram que após a exposição à natação forçada, ocorre potencialização da inibição de neurônios do NDR, tanto in vitro quanto in vivo, induzida pela N/OFQ, sugerindo aumento da sensibilidade a sinalização decorrente da ativação deste sistema. Coletivamente, esses achados sugerem que a exposição a eventos estressores agudos induz adaptações na neurotransmissão N/OFQnérgica em estruturas límbicas, possivelmente, devido ao controle que os glicocorticoides exercem sob a expressão de N/OFQ (Nativio et al., 2012) (Fig. 36). Essas adaptações decorrentes da resposta ao evento estressor poderiam estar relacionadas a indução de um quadro hiposserotoninérgico.

Observações moleculares também contribuem para a ligação da neurotransmissão N/OFQnérgica com um estado hiposserotoninérgico. De fato, usando a abordagem de deleção de gene condicional, foi gerado um animal knockout para o gene da p38 MAPK, depletado seletivamente em neurônios serotoninérgicos (Bruchas et al., 2011). Nesse estudo os pesquisadores mostraram que o evento estressor inicia uma cascata de sinalização intracelular na qual a p38 MAPK induz um estado hiposserotoninérgico, que poderia estar mediando o comportamento do tipo pró-depressivo (Bruchas et al., 2011). É interessante notar que Zhang e colaboradores (1999), usando células tumorais, mostraram que a estimulação do receptor NOP pela N/OFQ resultou na ativação de p38 MAPK. Sendo assim, tais evidências moleculares sugerem que a sinalização N/OFQnérgica contribui para uma resposta mal adaptativa a eventos estressores e isso parece ter ligação com um estado hiposserotoninérgico, que por sua vez, ao associar fármacos antidepressivos, como fluoxetina e nortriptilina, com agonistas NOP, impossibilitaria a ação dos antidepressivos

clássicos em restaurar os níveis de monoaminas, o que por sua vez, resultaria na neutralização da ação desses fármacos.

A ketamina, por sua vez, atua como antagonista NMDA e promove efeito do tipo antidepressivo de início rápido e persistente associado a um aumento da disponibilidade de glutamato no córtex pré-frontal (CPF). Acredita-se que esse aumento de glutamato ocorra devido ao bloqueio do receptor NMDA, em interneurônios gabaérgicos, que por sua vez deixariam de inibir a sinalização glutamatérgica no CPF, aumentando a disponibilidade deste neurotransmissor na fenda sináptica (Duman et al., 2016). Esse aumento da concentração de glutamato ativa receptor AMPA (Homayoun e Moghaddam, 2007; Maeng et al., 2008; Feyissa et al., 2009; Stone et al., 2012), induzindo despolarização da membrana e influxo de Ca2+, por ativar canais de Ca2+-dependente de voltagem, liberando BDNF, que ativa TrkB e Akt que, então, ativa a sinalização de mTORC1 (do inglês: mammalian target of rapamycin complex 1- complexo alvo da rapamicina de mamíferos 1), induzindo a síntese de proteínas necessárias para a formação e maturação das sinapses no CPF, restaurando e a funcionalidade dessa região encefálica e, consequentemente, produzindo os efeitos terapêuticos da ketamina (Li et al., 2010; Miller et al., 2014; Zhou et al., 2014). De fato, o emprego de camundongos knockinpara o alelo BDNFVal66Met, que promove bloqueio da sinalização de BDNF, ou a infusão de bloqueadores da cascata de mTORC1 no CPF, como rapamicina, aboliram os efeitos antidepressivos induzidos pela administração de ketamina (Autry et al., 2011; Liu et al., 2012; Duman et al., 2016), mostrando que essa sinalização intracelular é necessária para o rápido e persistente efeito antidepressivo deste fármaco.

Ainda cabe mencionar que existem estudos que relacionam o efeito agudo da ketamina com elevação dos níveis de 5-HT, porém não há um consenso acerca desse tópico na literatura. De fato, neste estudo, usamos a R-ketamina, que mostrou induzir efeito antidepressivo agudo não relacionado a neurotransmissão serotoninérgica, como demonstrado em camundongos tratados previamente com P-clorofenilalanina (PCPA), um inibidor da síntese de 5-HT (Zhang et al., 2018). Anteriormente, Fukumoto e seus colaboradores, 2016,

mostraram que o pré-tratamento com PCPA atenuava os efeitos antidepressivos agudos da R,S-ketamina (30 mg/kg, 30 min antes do TNF) em camundongos C57Bl/6J. Em contraste com esses achados, Gigliucci et al. (2013) mostraram que os efeitos antidepressivos agudos de R,S-ketamina (25 mg/kg, 1 h antes do TNF) em ratos não foram alterados pela PCPA. Recentemente, du Jardin et al. (2018) mostraram que os efeitos depressores da S-ketamina (15 mg/kg, 1 h antes do TNF) em ratos FSL foram abolidos pela depleção de 5-HT com PCPA. Embora as razões para essas discrepâncias ainda sejam desconhecidas, a estereoseletividade da ketamina poderia explicar aação antidepressiva dependente de 5-HT.

Dados da literatura sugerem que a sinalização N/OFQérgica pode alterar a disponibilidade glutamato em várias áreas do SNC. De fato, já foi demonstrado a presença de receptor NOP em áreas predominantemente glutamatérgicas, como córtex pré-frontal, cerebelo e tronco encefálico (Okawa et al., 1998). Já foi demonstrado também que a N/OFQ diminui a liberação de glutamato em fatias cerebrocorticais de ratos (Nicol et al., 1996), bem como a N/OFQ inibe a isquemia induzida por glutamato nessa mesma preparação (Nelson et al., 2000). Ainda foi demonstrado que a N/OFQ diminui a liberação de glutamato e a excitabilidade neuronal em culturas de neurônios corticais primários de ratos (Bianchi et al., 2004). Também já foi demonstrado, utilizando a técnica de patch- clamp, que a administração de N/OFQ diminui a liberação de glutamato na amígdala lateral, possivelmente atuando em sítios de liberação pré-sinápticos (Meis e Pape, 2001). Dessa forma, percebe-se que a sinalização N/OFQnérgica diminui a disponibilidade e a sinalização de glutamato em várias áreas do SNC. Sendo assim, apesar da inibição exercida pela N/OFQ sobre a sinalização gutamatérgica, não existe dados descritos na literatura relacionando a sinalização N/OFQnérgica com os mecanismos intracelulares necessários para o efeito antidepressivo agudo da ketamina. Assim, a ineficácia dos agonistas NOP em neutralizar os efeitos antidepressivos da R-ketamina podem ser explicados pelo fato de que a R-ketamina promove seu efeito antidepressivo por mecanismos que dependem do aumento na liberação de BDNF e ativação da sinalização de mTORC1 no CPF, cujas ações não apresentam relação com os

efeitos inibitórios induzidos pela N/OFQ na sinalização glutamatérgica no córtex pré-frontal, cerebelo, tronco encefálico e amígdala.

Considerando que (1) eventos estressores agudos promovem aumento na ativação do eixo HPA e, consequentemente, nos níveis de glicocorticoides, o que poderia causar potencialização da neurotransmissão N/OFQnérgica, (2) a N/OFQ, quando ativa o receptor NOP, gera inibição sobre a neurotransmissão monoaminérgica, por reduzir os disparos neuronais e a liberação de monoaminas na fenda sináptica, (3) os antagonistas NOP induzem efeito do tipo antidepressivo, possivelmente por contrabalancear os efeitos inibitórios da N/OFQ sobre a disponibilidade de monoaminas. As ações de eventos estressores na ativação do eixo HPA e, consequentemente, elevação da sinalização do receptor NOP contribuiriam para explicar tanto o efeito pró- depressor dos agonistas NOP durante o desenvolvimento do fenótipo desamparado, quanto o efeito preventivo para o desenvolvimento do fenótipo desamparado, evocado pela administração de antagonistas NOP e pelo bloqueio genético do receptor NOP. Além disso, a neutralização do efeito antidepressivo induzido pela fluoxetina e nortriptilina quando co-administrados com agonistas NOP dar-se-ia possivelmente devido ao efeito hipomonoaminérgico, principalmente hiposserotoninérgico, decorrente da exposição prévia ao estresse e da sensibilização do sistema N/OFQnérgico diante de eventos estressores. Neste cenário, o uso de antagonistas NOP pode prevenir os efeitos sensibilizadores da N/OFQ endógena sobre o eixo HPA, produzindo efeito preventivo na aquisição de um fenótipo desamparado diante de um evento estressor inescapável. Já o tratamento pós-evento estressor com antagonistas NOP poderia atuar agudamente revertendo o quadro hipomonoaminérgico derivado do aumento da transmissão N/OFQnérgica, promovendo efeito do tipo antidepressivo.

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste estudo indicam que nossas condições experimentais permitem avaliar manipulações tanto para um aumento na aquisição do fenótipo desamparado como uma prevenção desse efeito. Além disso, essa condição permite replicar o efeito antidepressivo evocado pela administração de nortriptilina e SB-612111, administrados antes da sessão teste. Ainda, pode-se concluir que apesar da administração de nortriptilina, antes das sessões de indução, não alterar o desenvolvimento do fenótipo desamparado, a administração de SB-612111 foi capaz de prevenir o desenvolvimento do fenótipo do tipo depressivo, quando administrado antes das sessões de indução os antidepressivos. Ao contrário, a administração antes das sessões de indução de agonistas NOP, Ro 65-6570 e MCOPPB, foi capaz de induzir um efeito pró- depressivo, observado através do aumento no número de animais que desenvolveram o fenótipo desamparado. Esses efeitos parecem estar relacionados com a facilitação da transmissão N/OFQnérgica, evocada pela exposição ao evento estressor agudo, que contribuiria para o aumento da ativação do eixo HPA, como também para os efeitos deletérios decorrentes dessa ativação.

O bloqueio farmacológico e genético do receptor NOP conferiu aos animais resistência na aquisição do fenótipo desamparado. Vale salientar que os animais NOP(-/-) apresentam um desempenho significantemente melhor quando comparado com os animais NOP(+/+) da performance cognitiva do modelo do desamparo aprendido. Porém, visto os resultados aqui apresentados, a melhor performancecognitiva não parecer ser um fator de viés para a interpretação dos dados relacionados ao comportamento desamparado.

Ainda, a administração de fluoxetina, nortriptilina, R-ketamina, UFP-101 e SB-612111 induziu efeito do tipo antidepressivo. A co-administração de agonistas NOP, N/OFQ e Ro 65-6570, com os antagonistas NOP, UFP-101 e SB-612111, resultou em bloqueio do efeito do tipo antidepressivo induzido pelos

antagonistas NOP, sugerindo o que o efeito do tipo antidepressivo induzido pelos antagonistas NOP, depende da interação destas moléculas com o receptor NOP. Ao co-administrar fármacos antidepressivos e agonistas NOP, observou-se que a administração de N/OFQ ou Ro 65-6570 bloqueou o efeito do tipo antidepressivo da fluoxetina e nortriptilina. Esse efeito parece envolver a modulação da neurotransmissão monoaminérgica na fenda sináptica, visto que quando agonistas NOP foram co-administrados com R-ketamina, o efeito antidepressivo da R-ketamina foi preservado. Esses achados somam-se às evidências da literatura que apontam para um efeito hipomonoaminérgico induzido pela ativação do sistema N/OFQ–receptor NOP, visto que em situações estressoras, como por exemplo, no teste da natação forçada e no modelo do desamparo aprendido, ocorre potencialização da neurotransmissão N/OFQnérgica, promovendo consequentemente inibição da neurotransmissão monoaminérgica.

Dessa forma, o uso de agonistas NOP poderia ser um problema caso viessem a ser desenvolvidos futuramente como fármacos, já que se mostraram pró-depressivos e promovem ações que afetam a neurotransmissão monoaminérgica, impactando diretamente a farmacoterapia antidepressiva. Por outro lado, os dados aqui apresentados reforçam o potencial antidepressivo e apontam, pela primeira vez, um papel preventivo dos antagonistas NOP no tratamento da depressão. Já que ao bloquear farmacologicamente esse receptor, houve redução significativa da aquisição do fenótipo desamparado. Estudos futuros são necessários para investigar os mecanismos pelos quais os ligantes NOP modulam a aquisição do comportamento desamparado. Estas informações são de grande significância para o entendimento da participação do sistema da N/OFQ – receptor NOP na fisiopatologia da depressão.

7. PERSPECTIVAS FUTURAS

Os dados apresentados até o momento somados a evidências da literatura corroboram a hipótese de que a sinalização do sistema N/OFQ- receptor NOP modulam a resposta fisiológica a eventos estressores, através do do eixo HPA e da neurotransmissão monoaminérgica, que podem estar na base fisiopatologia de transtornos psiquiátricos, como a depressão maior.

Para o melhor entendimento dessa corrente de pensamento, seria interessante investigar a interação entre a ativação do sistema N/OFQ–receptor NOP e o eixo HPA durante um evento estressor. Sendo assim seria de extrema valia investigar a participação do eixo HPA nos efeitos pró-depressores e preventivos dos agonistas e antagonistas NOP, respectivamente, fazendo o uso de antagonistas do CRF, bem como utilizando animais adrenocorticomizados. Ainda seria interessante determinar os níveis de CRF e ACTH, em condições basais e após a exposição ao DA e se esses níveis sofrem alguma alteração após a administração de ligantes NOP. Apesar da literatura mostrar que os agonistas NOP administrados pré-sessão teste não alteram o tempo de imobilidade no TNF, seria interessante também avaliar o efeito da administração destas drogas antes da sessão de treino, que possibilitaria uma replicação dos dados pró-depressores encontrados utilizando o modelo do DA.

Cabe ainda investigar possíveis alterações neuroquímicas por trás dessa modulação da resposta ao estresse pela ativação do receptor NOP no modelo do desamparo aprendido, como por exemplo, avaliar o dano oxidativo, através da peroxidação lipídica e proteica, como também os níveis de BDNF e possibilidade de morte neuronal e neurogênese, utilizando ferramentas farmacológicas e genéticas.

8. REFERÊNCIAS

Adrien, J., Dugovic, C., Martin, P. (1991) Sleep-wakefulness patterns in the helpless rat. Physiol Behav, 49: 257-262.

Aguilera, G., Pham, Q., Rabadan-Diehl, C. (1994) Regulation of pituitary vasopressina receptors during chronic stress: relationship to corticotroph responsiveness. J Neuroendocrinol 6(3), 299–304.

Alfonso, J., Frasch, A.C., Flugge, G. (2005) Chronic stress, depression and antidepressants: effects on gene transcription in the hippocampus. Rev Neurosci 16(1), 43–56.

Antony, L.J., Paruchuri, V.N., Ramanan, R. (2014) Antidepressant effect of ketamine in sub anaesthetic doses in male albino mice. J Clin Diagn Res. 8(6), 057.

Asth, L., Ruzza, C., Malfacini, D., Medeiros, I., Guerrini, R., Zaveri, N.T., Gavioli, E.C., Calo', G. (2016) Beta-arrestin 2 rather than G protein efficacy determines the anxiolytic-versus antidepressant-like effects of nociceptin/orphanin FQ receptor ligands. Neuropharmacology. 105:434-42.

Aston-Jones, G., Ennis, M., Pieribone, V.A., Nickell, W.T., Shipley, M.T. (1986) The brain nucleus locus coeruleus: restricted afferent control of a broad efferent network.Science. 7;234(4777):734-7.

Autry, A.E., Adachi, M., Nosyreva, E., Na, E.S., Los, M.F., Cheng, P.F., Kavalali, E.T., Monteggia, L.M. (2011) NMDA receptor blockade at rest triggers rapid behavioural antidepressant responses. Nature. Jun 15;475(7354):91-5.

Berman, R.M., Cappiello, A., Anand, A., Oren, D.A., Heninger, G. R., Charney, D.S. (2000) Antidepressant effects of ketamine in depressed patients. Biol Psychiatry 47, 351−354.

Berton, O. (2006) Essential role of BDNF in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science; 311:864–868.

Berton, O., Nestler, E.J. (2006) New approaches to antidepressant drug discovery: beyond monoamines. Nat Rev Neurosci. Feb;7(2):137-51.

Berton, O., Nestler, E.J. (2006) New approaches to antidepressant drug discovery: beyond monoamines. Nat Rev Neurosci; 7(2):137-51.

Bertorelli, R., Bastia, E., Citterio, F., Corradini, L., Forlani, A., Ongini, E. (2002). Lack of the nociceptin receptor does not affect acute or chronic nociception in mice. Peptides 23(9): 1589-1596.

Bertorelli, R., Corradini, L., Rafiq, K., Tupper, J., Calò, G., Ongini, E. (1999) Nociceptin and the ORL-1 ligand [Phe1psi (CH2-NH)Gly2]nociceptin(1-13)NH2 exert anti-opioid effects in the Freund's adjuvant-induced arthritic rat model of chronic pain. Br J Pharmacol. Nov;128(6):1252-8.

Bianchi, C., Marani, L., Barbieri, M., Marino, S., Beani, L., Siniscalchi, A. (2004) Effects of nociceptin/orphanin FQ and endomorphin-1 on glutamate and GABA release, intracellular [Ca2+] and cell excitability in primary cultures of rat cortical neurons. Neuropharmacology. 47(6):873-83.

Birnbaum, H.G., Kessler, R.C., Kelley, D., Ben-Hamadi, R., Joish, V.N. & Greenberg, P.E. (2010) Employer burden of mild, moderate, and severe major depressive disorder: mental health services utilization and costs, and work performance. Depress Anxiety 27(1), 78-89.

Blier, P., de Montigny, C. (1994) Current advances and trends in the treatment of depression. Trends Pharmacol Sci. 15(7):220-6.

Bliss, E., Zwanziger, J. (1966) Brain amines and emotional stress. JPsychiat Res L:189-198.

Bonanno, G., Giambelli, R., Raiteri, L., Tiraboschi, E., Zappettini, S., Musazzi, L. (2005) Chronic antidepressants reduce depolarization-evoked glutamate release and protein interactions favoring formation of SNARE complex in hippocampus. J Neurosci 25, 3270−3279.

Boom, A., Mollereau, C., Meunier, J.C., Vassart, G., Parmentier, M., Vanderhaeghen, J.J. & Schiffmann, S. N. (1999) Distribution of the nociceptin and nocistatin precursor transcript in the mouse central nervous system. Neuroscience, 91(3), 991-1007.

Borsini, F., Meli, A. (1988) Is the forced swimming test a suitable model for revealing antidepressant activity?. Psychopharmacology (Berl.)94, 147–160.

Bruchas, M.R., Schindler, A.G., Shankar, H., Messinger, D.I., Miyatake, M., Land, B.B. (2011) Selective p38α MAPK deletion in serotonergic neurons produces stress resilience in models of depression and addiction. Neuron 71(3), 498–511.

Brundtland, G.H. (2001) From the World Health Organization. Mental health: newunderstanding, new hope. JAMA, 286(19), 2391.

Buwalda, B., Kole, M.H., Veenema, A.H., Huininga, M., de Boer, S.F., Korte, S.M. (2005) Long-term effects of social stress on brain and behavior: a focus on hippocampal functioning. Neurosci Biobehav Rev 29(1), 83–97.

Calo, G., Guerrini, R. (2013) Medicinal Chemistry, Pharmacology, and Biological Actions of Peptide Ligands Selective for the Nociceptin/Orphanin FQ Receptor. In Research and Development of Opioid-Related Ligands. ACS Symposium Series, Vol.1131; pp 275–325.

Calo', G., Bigoni, R., Rizzi, A., Guerrini, R., Salvadori, S. & Regoli, D. (2000a) Nociceptin/orphanin FQ receptor ligands. Peptides, 21(7), 935-47.

Calo', G., Guerrini, R., Bigoni, R., Rizzi, A., Bianchi, C., Regoli, D. & Salvadori, S. (1998) Structure-activity study of the nociceptin(1-13)-NH2 N-terminal

tetrapeptide and discovery of a nociceptin receptor antagonist. J Med Chem, 41(18), 3360-6.115.

Calo', G., Guerrini, R., Rizzi, A., Salvadori, S. & Regoli, D. (2000b) Pharmacology of nociceptin and its receptor: a novel therapeutic target. Br J Pharmacol, 129(7), 1261-83.

Calo, G., Guerrini, R., Rizzi, A., Salvadori, S., Burmeister, M., Kapusta, D.R., Lambert, D.G. & Regoli, D. (2005) UFP-101, a peptide antagonist selective for the nociceptin/orphanin FQ receptor. CNS Drug Rev, 11(2), 97-112.

Calò, G., Rizzi, A., Bogoni, G., Neugebauer, V., Salvadori, S., Guerrini, R., Bianchi, C. & Regoli, D. (1996) The mouse vas deferens: a pharmacological preparation sensitive to nociceptin. Eur J Pharmacol, 311(1), R3-5.

Calò, G., Rizzi, A., Marzola, G., Guerrini, R., Salvadori, S., Beani, L., Regoli, D. & Bianchi, C. (1998) Pharmacological characterization of the nociceptin receptor mediating hyperalgesia in the mouse tail withdrawal assay. Br J Pharmacol, 125(2),373-8.

Calo, G., Rizzi, A., Rizzi, D., Bigoni, R., Guerrini, R., Marzola, G., Marti, M., McDonald, J., Morari, M., Lambert, D.G., Salvadori, S. & Regoli, D. (2002) [Nphe1,Arg14,Lys15]nociceptin-NH2, a novel potent and selective antagonist of the nociceptin/orphanin FQ receptor. Br J Pharmacol, 136(2), 303-11.

Capuron, L., Ravaud, A. (1999) Prediction of the depressive effects of interferon alfa therapy by the patient's initial affective state. N Engl J Med.340(17):1370.

Carrà, G., Rizzi, A., Guerrini, R., Barnes, T.A., McDonald, J., Hebbes, C.P., Mela, F., Kenigs, V.A., Marzola, G., Rizzi, D., Gavioli, E., Zucchini, S., Regoli, D., Morari, M., Salvadori, S., Rowbotham, D.J., Lambert, D.G., Kapusta, D.R. & Calo', G. (2005) [(pF)Phe4,Arg14,Lys15]N/OFQ-NH2 (UFP-102), a highly potent and selective agonist of the nociceptin/orphanin FQ receptor. J Pharmacol Exp Ther, 312(3), 1114-23.

Catena-Dell'Osso, M., Marazziti, D., Rotella, F., Bellantuono, C. (2012) Emerging targets for the pharmacological treatment of depression: focus on melatonergic system. Curr Med Chem.;19(3):428-37.

Chang, S.D., Brieaddy, L.E., Harvey, J.D., Lewin, A.H., Mascarella, S.W., Seltzman, H.H., Reddy, P.A., Decker, A.M., McElhinny, C.J. Jr., Zhong, D., Peterson, E.E., Navarro, H.A., Bruchas, M.R., Carroll, F.I. (2015) Novel Synthesis and Pharmacological Characterization of NOP Receptor Agonist 8-[(1S,3aS)- 2,3,3a,4,5,6-Hexahydro-1H-phenalen-1-yl]-1-phenyl-1,3,8-triazaspiro[4.5]decan- 4-one (Ro 64-6198). ACS Chem Neurosci 6(12):1956-64.

Chaturvedi, H.K., Bapna, J.S., Chandra, D. (2001) Effect of fluvoxamine and N- methyl-D-aspartate receptor antagonists on shock-induced depression in mice. Indian J Physiol Pharmacol, 45:199–207.

Ciccocioppo, R., de Guglielmo, G., Hansson, A.C., Ubaldi, M., Kallupi, M., Cruz, M.T., Oleata, C.S., Heilig, M., Roberto, M. (2014) Restraint stress alters nociceptin/orphanin FQ and CRF systems in the rat central amygdala: significance for anxiety-like behaviors. J Neurosci, 34(2), 363-72.

Ciccocioppo, R., Panocka, I., Polidori, C., Regoli, D. & Massi, M. (1999) Effect of nociceptin on alcohol intake in alcohol-preferring rats. Psychopharmacology (Berl), 141(2), 220-4.

Cleare, A.J. (2004) Biological models of unipolar depression. In: Power M (ed) Mood disorders: a handbook of sicience and practice. John Wiley & Sons, Chichester, pp- 29-46

Connor, M., Vaughan, C.W., Chieng, B., Christie, M.J. (1996a) Nociceptin receptor coupling to a potassium conductance in rat locus coeruleus neurones in vitro. Br J Pharmacol, 119(8), 1614-8.

100

Connor, M., Yeo, A., Henderson, G. (1996b) The effect of nociceptin on Ca2+ channel current and intracellular Ca2+ in the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Br J Pharmacol, 118(2), 205-7.

Cowen, P.J. (2002) Cortisol, serotonin and depression: all stressed out? Br J Psychiatry; 180:99-100.

Cox, B.M, Chavkin, C., Christie, M.J., Civelli, O., Evans, C., Hamon, M.D., Hoellt, V., Kieffer, B., Kitchen, I., McKnight, A.T., Meunier, J.C., Portoghese, P.S. (2000) Opioid receptors. In: Girdlestone D (ed) The IUPHAR compendium of receptor characterization and classification, 2nd edn. IUPHAR Media, London, pp 321– 333.

Crupi, R., Marino, A., Cuzzocrea, S. (2011) New therapeutic strategy for mood disorders. Curr Med Chem.18(28):4284-98.

Cryan, J.F., Markou, A., Lucki, I. (2002) Assessing antidepressant activity in rodents: recent developments and future needs. Trends Pharmacol. Sci., 23, 238–245.

Cryan, J.F., Mombereau, C., Vassout, A. (2005) The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies inmice. Neurosci Biobehav Rev, 29: 571-625.

Dawe, K.L., Wakerley, J.B., & Fulford, A.J. (2010) Nociceptin/orphanin FQ and the regulation of neuronal excitability in the rat bed nucleus of the stria terminalis: interaction with glucocorticoids. Stress 13(6), 516–527.

De Kloet, E.R., Rosenfeld, P., Van Eekelen, J.A., Sutanto, W., and Levine, S. (1988). Stress, glucocorticoids and development. Prog Brain Res. 73, 101–120.

Dess, N.K., Raizer, J., Chapman, C.D., Garcia, J. (1988) Stressors in the learned helplessness paradigm: effects on body weight and conditioned taste aversion in rats. Physiol Behav, 44: 483-490.

101

Detke, M.J. (1997) Acute and chronic antidepressant drug treatment in the rat forced swimming test model of depression. Exp. Clin. Psychopharmacol.5, 107– 112.

Devine, D.P., Hoversten, M.T., Ueda, Y., Akil, H. (2003). Nociceptin/orphanin FQ content is decreased in forebrain neurones during acute stress. J Neuroendocrinol, 15(1), 69–74.

Devine, D.P., Taylor, L., Reinscheid, R.K., Monsma, F.J., Civelli, O. & Akil, H. (1996) Rats rapidly develop tolerance to the locomotor-inhibiting effects of the novel neuropeptide orphanin FQ. Neurochem Res, 21(11), 1387-96.

Devine, D.P., Watson, S.J., Akil, H. (2001). Nociceptin/orphanin FQ regulates neuroendocrine function of the limbic–hypothalamic–pituitary–adrenal axis. Neuroscience102(3), 541–553.

Duman, R.S., Monteggia, L.M. (2006) A neurotrophic model for stress-related mood disorders. Biol Psychiatry, 59(12), 1116-27.

Duman, R.S., Aghajanian, G.K., Sanacora, G., Krystal, J.H. (2016) Synaptic plasticity and depression: new insights from stress and rapid-acting antidepressants.Nat Med, 22(3):238-49.

Duman, R.S., Heninger, G.R., Nestler, E.J. (1997) A molecular and cellular theory of depression. Arch Gen Psychiatry, 54:597-606.

Duman, R.S., Monteggia, L.M. (2006) A neurotrophic model for stress-related mood disorders. Biol Psychiatry, 59:1116–1127.

Dunn, A.J., Swiergiel, A.H. (2005) Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav; 81(3):688-93.

Enns, M.W., Cox, B.J. (1999) Perfectionism and depression symptom severity in major depressive disorder. Behav Res Ther, 37(8), 783-94.

102

Erb, K., Liebel, J.T., Tegeder, I., Zeilhofer, H.U., Brune, K., Geisslinger, G. (1997) Spinally delivered nociceptin/orphanin FQ reduces flinching behaviour in the rat formalin test. Neuroreport, 8(8), 1967-70.

Fantin, M., Fischetti, C., Trapella, C., Morari, M. (2007). Nocistatin inhibits 5- hydroxytryptamine release in the mouse neocortex via presynaptic Gi/o protein linked pathways. Br J Pharmacol 152(4), 549–555.

Fava, M., Kendler, K.S. (2000) Major depressive disorder. Neuron 28:335–341.

Ferrari, F., Villa, R.F. (2016) The neurobiology of depression: an integrated overview from biological theories to clinical evidence. Mol neurobiol. 10.1007.

Feyissa, A.M., Chandran, A., Stockmeier, C.A., Karolewicz, B. (2009) Reduced levelsof NR2A and NR2B subunits of NMDA receptor and PSD-95 in the prefrontalcortex in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 33,70–75.

Florin, S., Meunier, J., Costentin, J. (2000) Autoradiographic localization of [3H] nociceptin binding sites in the rat brain.Brain Res, 880(1–2), 11–16.

Florin, S., Suaudeau, C., Meunier, J.C., Costentin, J. (1997) Orphan neuropeptide NocII, a putative pronociceptin maturation product, stimulates locomotion in mice. Neuroreport, 8(3), 705-7.

Francis, D.D., Meaney, M.J. (1999). Maternal care and the development of stress responses. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 128–134.

Fuchs, E., Gould, E. (2000). Mini-review: in vivo neurogenesis in the adult brain: regulation and functional implications. Eur. J. Neurosci. 12, 2211–2214.

Fukuda, K. (2014) Etiological classification of depression based on the enzymes of tryptophan metabolism. BMC Psychiatry; 14:372.

103

Gavioli, E.C., Calo', G. (2006) Antidepressant- and anxiolytic-like effects of nociceptin/orphanin FQ receptor ligands. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 372(5): 319-330.

Gavioli, E.C., Calo', G. (2013) Nociceptin/orphanin FQ receptor antagonists as innovative antidepressant drugs. Pharmacol Ther, 140(1): 10-25.

Gavioli, E.C., Marzola, G., Guerrini, R., Bertorelli, R., Zucchini, S., De Lima, T.C. (2003) Blockade of nociceptin/orphanin FQ-NOP receptor signalling produces antidepressant-like effects: pharmacological and genetic evidences from the mouse forced swimming test. Eur J Neurosci, 17(9): 1987-1990.

Gavioli, E.C., Vaughan, C.W., Marzola, G., Guerrini, R., Mitchell, V.A., Zucchini, S. (2004) Antidepressant-like effects of the nociceptin/orphanin FQ receptor antagonist UFP-101: new evidence from rats and mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 369(6): 547-553.

Gold, S.M., Irwin, M.R. (2009) Depression and immunity: inflammation and depressive symptoms in multiple sclerosis. Immunol Allergy Clin North Am, 29(2):309-20.

Golembiowska, K., Dziubina, A. (2000) Effect of acute and chronic administration of citalopram on glutamate and aspartate release in the rat prefrontal cortex. Pol J Pharmacol, 52, 441−448.

Greco, T., Eckert, G., Kroenke, K. (2004) The outcome of physical symptoms with treatment of depression. J Gen Intern Med, 19(8), 813-8.

Green, M.K., Barbieri, E.V., Brown, B.D., Chen, K.W., Devine, D.P. (2007) Roles of the bed nucleus of stria terminalis and of the amygdala in N/OFQ-mediated anxiety and HPA axis activation. Neuropeptides, 41(6), 399–410.

Greenberg, L., Edwards, E., Henn, F.A. (1989) Dexamethasone suppression test in helpless rats. Biol Psychiatry, 26: 530-532.

104

Grisel, J.E., Mogil, J.S., Belknap, J.K., Grandy, D.K. (1996) Orphanin FQ acts as a supraspinal, but not a spinal, anti-opioid peptide. Neuroreport, 7(13), 2125-9.

Groves, J.O. (2007) Is it time to reassess the BDNF hypothesis of depression? Mol Psychiatry, 12, 1079–1088.

Hao, J.X., Xu, I.S., Wiesenfeld-Hallin, Z., Xu, X.J. (1998) Anti-hyperalgesic and antiallodynic effects of intrathecal nociceptin/orphanin FQ in rats after spinal cord injury, peripheral nerve injury and inflammation. Pain, 76(3), 385-93.

Heim, C., Nemeroff, C.B. (2001). The role of childhood trauma in the neurobiology of mood and anxiety disorders: preclinical and clinical studies. Biol. Psychiatry, 49, 1023–1039.

Heinricher, M.M. (2003) Orphanin FQ/nociceptin: from neural circuitry to behavior. Life Sci, 73(6), 813-22.

Henn, F.A., Vollmayr, B. (2005) Stress models of depression: forming genetically vulnerable strains. Neurosci Biobehav Rev 29:799–804.

Herbert, T.B., Cohen, S. (1993) Depression and immunity: a meta-analytic review. Psychol Bull, 113(3), 472-86.

Herman, J.P., Cullinan, W.E. (1997) Neurocircuitry of stress: central control of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis. Trends Neurosci 20(2), 78–84.

Herman, J.P., Figueiredo, H., Mueller, N.K., Ulrich-Lai, Y., Ostrander, M.M., Choi, D.C., Cullinan, W.E. (2003). Central mechanisms of stress integration: hierarchical circuitry controlling hypothalamo-pituitary-adrenocortical responsiveness. Front Neuroendocrinol, Jul;24(3):151-80.

Hökfelt, T., Broberger, C., Xu, Z.Q., Sergeyev, V., Ubink, R., Diez, M. (2000) Neuropeptides—na overview. Neuropharmacology, 39(8):1337-56.

105

Holanda, V.A., Medeiros, I.U., Asth, L., Guerrini, R., Calo', G., Gavioli, E.C. (2016) Antidepressant activity of nociceptin/orphanin FQ receptor antagonists in the mouse learned helplessness. Psychopharmacology, Jul;233(13):2525-32.

Holanda, V.A.D., Santos, W.B., Asth, L., Guerrini, R., Calo', G., Ruzza, C., Gavioli, E.C. (2018) NOP agonists prevent the antidepressant-like effects of nortriptyline and fluoxetine but not R-ketamine. Psychopharmacology (Berl). Nov;235(11):3093-3102.

Holmes, P.V. (2003) Rodent models of depression: reexamining validity without anthropomorphic inference. Trends Pharmacol Sci 15, 143–174.

Holsboer, F. (2001). Stress, hypercortisolism and corticosteroid receptors in depression: implications for therapy. J. Affect. Disord 62, 77–91.

Homayoun, H., Moghaddam, B. (2007) NMDA receptor hypofunction produces oppositeeffects on prefrontal cortex interneurons and pyramidal neurons. J. Neurosci. 27,11496–11500.

Inoue, M., Shimohira, I., Yoshida, A., Zimmer, A., Takeshima, H., Sakurada, T., Ueda, H. (1999) Dose-related opposite modulation by nociceptin/orphanin FQ of substance P nociception in the nociceptors and spinal cord. J Pharmacol Exp Ther, 291(1), 308-13.

Jenck, F., Moreau, J.L., Martin, J.R., Kilpatrick, G.J., Reinscheid, R.K., Monsma, F.J., Nothacker, H.P., Civelli, O. (1997) Orphanin FQ acts as an anxiolytic to attenuatebehavioral responses to stress. Proc Natl Acad Sci U S A, 94(26), 14854-8.

Jenck, F., Wichmann, J., Dautzenberg, F.M., Moreau, J.L., Ouagazzal, A.M., Martin, J.R., Lundstrom, K., Cesura, A.M., Poli, S.M., Roever, S., Kolczewski, S., Adam, G., Kilpatrick, G. (2000) A synthetic agonist at the orphanin FQ/nociceptin receptor ORL1: Anxiolytic profile in the rat. Proc Natl Acad Sci U S A 97:4938- 4943.

106

Jenck, F., Wichmann, J., Dautzenberg, F.M., Moreau, J.L., Ouagazzal, A.M., Martin,J.R., Lundstrom, K., Cesura, A.M., Poli, S.M., Roever, S., Kolczewski, S., Adam, G., Kilpatrick, G. (2000) A synthetic agonist at the orphanin FQ/nociceptin receptor ORL1:anxiolytic profile in the rat. Proc Natl Acad Sci U S A, 97(9), 4938- 43.

Kalén, P., Pritzel, M., Nieoullon, A., Wiklund, L. (1986) Further evidence for excitatory amino acid transmission in the lateral habenular projection to the rostral raphe nuclei: lesion-induced decrease of high affinity glutamate uptake. Neurosci Lett, 11;68(1):35-40.

Kamei, J., Matsunawa, Y., Miyata, S., Tanaka, S., Saitoh, A. (2004) Effects of nociceptin on the exploratory behavior of mice in the hole-board test. Eur J Pharmacol, 489(1-2), 77-87.

Kamei, J., Ohsawa, M., Suzuki, T., Saitoh, A., Endoh, T., Narita, M., Tseng, L.F., Nagase, H. (1999) The modulatory effect of (+)-TAN-67 on the antinociceptive effects of the nociceptin/orphanin FQ in mice. Eur J Pharmacol, 383(3), 241-7.

Karege, F., Vaudan, G., Schwald, M., Perroud, N., La Harpe, R. (2005) Neurotrophin levels in postmortem brains of suicide victims and the effects of antemortem diagnosis and psychotropic drugs. Brain Res Mol Brain Res; 136:29–37.

Kasckow, J.W., Baker, D., and Geracioti, T.D., Jr. (2001). Corticotropin-releasing hormine in depression and post-traumatic disorder Peptides 22, 845–851.

Kawahara, Y., Hesselink, M.B., van Scharrenburg, G., Westerink, B.H. (2004) Tonic inhibition by orphanin FQ/nociceptin of noradrenaline neurotransmission in the amygdala. Eur J Pharmacol, 485(1–3), 197–200.

Kelly, J.P., Wrynn, A.S., & Leonard, B.E. (1997) The olfactory bulbectomized rat as a model of depression: an update. Pharmacol Ther, 74, 299−316.

107

Kendell, S.F., Krystal, J.H., Sanacora, G. (2005) GABA and glutamate systems as therapeutic targets in depression and mood disorders. Expert Opin Ther Targets, 9, 153−168.

Kessler, R.C., Chiu, W.T., Demler, O., Merikangas, K.R., Walters, E.E. (2005) Prevalence, severity, and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Arch Gen Psychiatry, 62(6), 617-27.

King, M.A., Rossi, G.C., Chang, A.H., Williams, L., Pasternak, G.W. (1997) Spinal analgesic activity of orphanin FQ/nociceptin and its fragments. Neurosci Lett, 223(2), 113-6.

Kos, T., Legutko, B., Danysz, W., Samoriski, G., Popik, P. (2006) Enhancement of antidepressant-like effects but not brain-derived neurotrophic factor mRNA expression by the novel Nmethyl-D-aspartate receptor antagonist neramexane in mice. J Pharmacol Exp Ther, 318(323):1128–36.

Köster, A., Montkowski, A., Schulz, S., Stübe, E.M., Knaudt, K., Jenck, F. (1999) Targeted disruption of the orphanin FQ/nociceptin gene increases stress susceptibility and impairs stress adaptation in mice. Proc Natl Acad Sci 96(18), 10444–10449.

Kubera, M., Obuchowicz, E., Goehler, L., Brzeszcz, J., Maes, M. (2011) In animal models, psychosocial stress-induced (neuro)inflammation, apoptosis and reduced neurogenesis are associated to the onset of depression. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 35(3):744-59.

Kuhn, R., Pilc, A., Palucha, A., Pilc, A. (2007) Metabotropic receptor ligands as possible anxiolytic and antidepressant agents. Pharmacol Ther, 115:116–47.

Lanni, C., Govoni, S., Lucchelli, A., Boselli, C. (2009) Depression and antidepressants: molecular and cellular aspects. Cell Mol Life Sci, 66(18):2985- 3008.

108

Le Maître E., Vilpoux C., Costentin J., e Leroux-Nicollet I. (2005) Opioid receptor- Like 1 (NOP) receptors in the rat dorsal raphe nucleus: evidence for localization on serotoninergic neurons and functional adaptation after 5,7- dihydroxytryptamine lesion. Journal of Neuroscience Research, 81:488–496.

Le Pen, G., Wichmann, J., Moreau, J.L., Jenck, F. (2002) The orphanin receptor agonist RO 64-6198 does not induce place conditioning in rats. Neuroreport 13(4):451-4.

Leggett, J.D., Dawe, K.L., Jessop, D.S., Fulford, A.J. (2009) Endogenous nociceptin / orphanin FQ system involvement in hypothalamic–pituitary–adrenal axis responses: relevance to models of inflammation. J Neuroendocrinol, 21(11), 888–897.

Leggett, J.D., Harbuz, M.S., Jessop, D.S., Fulford, A.J. (2006). The nociceptin receptor antagonist [Nphe1, Arg14, Lys15]nociceptin/orphanin FQ-NH2 blocks the stimulatory effects of nociceptin/orphanin FQ on the HPA axis in rats. Neuroscience, 141(4), 2051–2057.

Leggett, J.D., Jessop, D.S., Fulford, A.J. (2007). The nociceptin/orphanin FQ antagonista UFP-101 differentially modulates the glucocorticoid response to restraint stress in rats during the peak and nadir phases of the hypothalamo- pituitary-adrenal axis circadian rhythm. Neuroscience, 147(3), 757–764.

Liu, R.J., Lee, F.S., Li, X.Y., Bambico, F., Duman, R.S., Aghajanian, G.K.( 2012) Brain-derived neurotrophic factor Val66Met allele impairs basal and ketamine- stimulated synaptogenesis in prefrontal cortex.Biol Psychiatry.;71(11):996-1005.

Lucki, I. (1997) The forced swimming test as a model for core and component behavioral effects of antidepressant drugs. Behav. Pharmacol., 8, 523–532.

Mabrouk, O.S., Marti, M. Morari, M. (2010) Endogenous nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) contributes to haloperidol-induced changes of nigral amino acid transmission and parkinsonism: a combined microdialysis and behavioral study

109

in naïve and nociceptin/orphanin FQ receptor knockout mice. Neuroscience, 166(1), 40-8.

Maeng, S., Zarate, C.A.Jr., Du, J., Schloesser, R.J, McCammon, J., Chen, G., Manji, H.K. (2008) Cellular mechanisms underlying the antidepressant effects of ketamine: role of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors. Biol Psychiatry, 15;63(4):349-52.

Maes, M. (2011) Depression is an inflammatory disease, but cell-mediated immune activation is the key component of depression. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry; 35(3):664-75.

Maier, S.F., Seligman, M.E.P. (1976) Learned helplessness: theory andevidence. J Exp Psychol,3–46.

Manji, H.K., Drevets, W.C., Charney, D.S. (2001) The cellular neurobiology of depression. Nature Med. 7,541–547.

Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M.A., Tricklebank, M., Steckler, T. (2009) Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacol 34,74–89.

Marti, M., Mela, F., Fantin, M., Zucchini, S., Brown, J.M., Witta, J., Di Benedetto, M., Buzas, B., Reinscheid, R.K., Salvadori, S., Guerrini, R., Romualdi, P., Candeletti, S., Simonato, M., Cox, B.M., Morari, M. (2005) Blockade of nociceptin/orphanin FQ transmission attenuates symptoms and neurodegeneration associated with Parkinson's disease. J Neurosci, 25(42), 9591-601.

Marti, M., Mela, F., Guerrini, R., Calò, G., Bianchi, C., Morari, M. (2004a) Blockade of nociceptin/orphanin FQ transmission in rat substantia nigra reverses haloperidolinduced akinesia and normalizes nigral glutamate release. J Neurochem, 91(6), 1501-4.

110

Marti, M., Mela, F., Veronesi, C., Guerrini, R., Salvadori, S., Federici, M., Mercuri, N.B., Rizzi, A., Franchi, G., Beani, L., Bianchi, C., Morari, M. (2004b) Blockade of nociceptin/orphanin FQ receptor signaling in rat substantia nigra pars reticulata stimulates nigrostriatal dopaminergic transmission and motor behavior. J Neurosci,24(30), 6659-66.

Marti, M., Sarubbo, S., Latini, F., Cavallo, M., Eleopra, R., Biguzzi, S., Lettieri, C., Conti, C., Simonato, M., Zucchini, S., Quatrale, R., Sensi, M., Candeletti, S., Romualdi, P., Morari, M. (2010) Brain interstitial nociceptin/orphanin FQ levels are elevated in Parkinson's disease. Mov Disord, 25(11), 1723-32.

Marti, M., Viaro, R., Guerrini, R., Franchi, G., Morari, M. (2009) Nociceptin/orphanin FQ modulates motor behavior and primary motor cortex output through receptors located in substantia nigra reticulata. Neuropsychopharmacology, 34(2), 341-55.

Martinowich, K., Manji, H., Lu, B. (2007) New insights into BDNF function in depression and anxiety. Nature Neurosci 10:1089–1093.

Mathews, D.C., Henter, I.D., Zarate, C.A. (2012) Targeting the glutamatergic system to treat major depressive disorder: rationale and progress to date. Drugs; 72(10):1313-33.

Maynert, E., Levi, R. (1964) Stress-induced release of brain norepinephrine andits inhibition by drugs. J Pharmacol Exp Ther 143:90-95.

Mc Geer, P.L., Eccles, J.C., Mc Geer, E.G. (1987). Molecular Neurobiology of the Mammalian Brain. New York: Plenum Press.

McEwen, B.S. (2000). Allostasis and allostatic load: implications for neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology 22, 108–124.

McEwen, B.S. (2008) Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol; 583(2-3):174-85 111

McKinney, W.T. (1986) Electroconvulsive therapy and animal models of depression. Ann N Y Acad Sci, 462: 65-69.

Medeiros, I.U., Ruzza, C., Asth, L., Guerrini, R., Romão, P.R.T., Gavioli, E.C., Calo, G. (2015) Blockade of Nociceptin/Orphanin FQ receptor signaling reverses LPS-induced depressive-like behavior in mice. Peptides,15, p.S0196.

Meis, S., Pape, H.C. (2001) Control of glutamate and GABA release by nociceptin/orphanin FQ in the rat lateral amygdala.J Physiol, 1;532(Pt 3):701-12.

Mela, F., Marti, M., Ulazzi, L., Vaccari, E., Zucchini, S., Trapella, C. (2004) Pharmacological profile of nociceptin/orphanin FQ receptors regulating 5- hydroxytryptamine release in the mouse neocortex.Eur J Neurosci, 19(5), 1317– 1324.

Meunier, J.C., Mollereau, C., Toll, L., Suaudeau, C., Moisand, C., Alvinerie, P. (1995). Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature, 377(6549): 532-535.

Miller, O.H., Yang, L., Wang, C.C., Hargroder, E.A., Zhang, Y., Delpire, E., Hall, B.J., (2014) GluN2B-containing NMDA receptors regulate depression-like behavior and are critical for the rapid antidepressant actions of ketamine. Elife. 23;3:e03581.

Mogil, J.S., Grisel, J.E., Reinscheid, R.K., Civelli, O., Belknap, J.K., Grandy, D. K. (1996) Orphanin FQ is a functional anti-opioid peptide. Neuroscience, 75(2), 333-7.

Mollereau, C., Mouledous, L. (2000). Tissue distribution of the opioid receptor- like (ORL1) receptor. Peptides, 21(7): 907-917.

Monaghan, D.T., Bridges, R.J., Cotman, C.W. (1989) The excitatory aminoacid receptors: their classes, pharmacology, and distinct properties in the function of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 29, 365−402.

112

Monteggia, L.M. (2004) Essential role of brain-derived neurotrophic factor in adult hippocampalfunction. Proc Natl Acad Sci; 20;101(29):10827-32.

Monteggia, L.M. (2007) Brain-derived neurotrophic factor conditional knockouts show gender differences in depression-related behaviors. Biol Psychiatry, 61:187–197.

Morilak, D.A., Frazer, A. (2004) Antidepressants and brain monoaminergic systems: a dimensional approach to understanding their behavioral effects in depression and anxiety disorders. Int. J. Neuropsychopharmacol.7, 193–218.

Müller, N., Schwarz, M.J. (2007) The immune-mediated alteration of serotonin and glutamate: towards an integrated view of depression. Mol Psychiatry; 12(11):988-1000.

Muñoz, R.A., McBride, M.E., Brnabic, A.J., López, C.J., Hetem, L.A., Secin, R., Dueñas, H.J. (2005) Major depressive disorder in Latin America: the relationship between depression severity, painful somatic symptoms, and quality of life. J Affect Disord, 86(1), 93-8.

Murphy, N.P., Lee, Y. & Maidment, N.T. (1999) Orphanin FQ/nociceptin blocks acquisition of morphine place preference. Brain Res, 832(1-2), 168-70.

Murray, C.J.L., Lopez, A.D. (1996) The Global Burden of Disease: a comprehensive assessment of mortality and disability from diseases, injuries, and risk factors in 1990 and projected to 2020. Cambridge: Harvard University Press. PMID: 25121335.

Mustazza, C., Bastanzio, G. (2011) Development of nociceptin receptor (NOP) agonists and antagonists.Med Res Rev, 31(4):605-48.

Nazzaro, C., Barbieri, M., Varani, K., Beani, L., Valentino, R.J., Siniscalchi, A. (2010) Swim stress enhances nociceptin/orphanin fqinduced inhibition of rat dorsal raphe nucleus activity in vivo and in vitro: role of corticotropinreleasing factor. Neuropharmacology; 58(2): 457–464. 113

Neal, C.R., Mansour, A., Reinscheid, R., Nothacker, H.P., Civelli, O., Akil, H., Watson, S.J. (1999a) Opioid receptor-like (ORL1) receptor distribution in the rat central nervous system: comparison of ORL1 receptor mRNA expression with (125)I- [(14)Tyr]-orphanin FQ binding. J Comp Neurol, 412(4), 563-605.

Neal, C.R., Mansour, A., Reinscheid, R., Nothacker, H.P., Civelli, O., Watson, S. J. (1999b) Localization of orphanin FQ (nociceptin) peptide and messenger RNA in the central nervous system of the rat. J Comp Neurol, 406(4), 503-47.

Nelson, R.M., Calo’, G., Guerrini, R., Hainsworth, A.H., Green, A.R., Lambert, D.G. (2000) Nociceptin/orphanin FQinhibits ischaemia-induced glutamate efflux from rat cerebrocortical slices, NeuroReport, 11 3689–3692.

Nestler, E.J., Barrot, M.R.J., DiLeone, A.J., Eisch, S.J., Monteggia, L.M. (2002) Neurobiology of Depression Neuron.Cell Press, 34, 13–25.

Nicol, B., Rowbotham, D.J., Lambert, D.G. (2002) Nociceptin/orphanin FQ inhibits glutamate release from rat cerebellar and brain stem slices.Neurosci Lett. 28;326(2):85-8.

Nicolas, L.B., Klein, S., Prinssen, E.P. (2007) Defensive-like behaviours induced by ultrasound: further pharmacological characterization in Lister-hooded rats. Psychopharmacology (Berl), 194(2):243-52.

Nicolas, L.B., Kolb, Y., Prinssen, E.P. (2006) A combined marble burying- locomotor activity test in mice: a practical screening test with sensitivity to different classes of anxiolytics and antidepressants. Eur J Pharmacol, 547(1- 3):106-15.

Nishi, M., Houtani, T., Noda, Y., Mamiya, T., Sato, K., Doi, T. (1997) Unrestrained nociceptive response and disregulation of hearing ability in mice lacking the nociceptin/orphanin FQ receptor. EMBO J,16(8): 1858-1864.

114

Noble, F., Roques, B.P. (1997) Association of aminopeptidase N and endopeptidase 24.15 inhibitors potentiate behavioral effects mediated by nociceptin/orphanin FQ in mice. FEBS Lett, 401(2-3), 227-9.

Noda, Y., Mamiya, T., Nabeshima, T., Nishi, M., Higashioka, M., Takeshima, H. (1998) Loss of antinociception induced by naloxone benzoylhydrazone in nociceptin receptor-knockout mice. J Biol Chem, 273(29), 18047-51.

Okawa, H., Hirst, R.A., Smart, D., McKnight, A.T., Lambert, D.G. (1998) Rat central ORL-1 receptor uncouples from adenylyl cyclase during membrane preparation, Neurosci. Lett., 246 49–52.

Okawa, H., Kudo, M., Kudo, T., Guerrini, R., Lambert, D.G., Kushikata, T. (2001). Effects of nociceptinNH2 and [Nphe1]nociceptin(1–13)NH2 on rat brain noradrenaline release in vivo and in vitro. Neurosci Lett 303(3), 173–176.

Okuda-Ashitaka, E., Minami, T., Tachibana, S., Yoshihara, Y., Nishiuchi, Y., Kimura, T. & Ito, S. (1998) Nocistatin, a peptide that blocks nociceptin action in pain transmission. Nature, 392(6673), 286-9.

O'Neil, M.F., Moore, N.A. (2003) Animal models of depression: are there any? Hum Psychopharmacol. Jun;18(4):239-54.

Ouagazzal, A.M., Moreau, J.L., Pauly-Evers, M., Jenck, F. (2003) Impact of environmental housing conditions on the emotional responses of mice deficient for nociceptin/orphanin FQ peptide precursor gene. Behav Brain Res 144, 111– 117.

Overmier, J.B., Seligman, M.E. (1967) Effects of inescapable shock upon subsequent escape and avoidance responding. J Comp Physiol Psychol 63,28– 33.

Oxenkrug, G.F. (2010) Tryptophan kynurenine metabolism as a common mediator of genetic and environmental impacts in major depressive disorder: the

115

serotonin hypothesis revisited 40 years later. Isr J Psychiatry Relat Sci, 47(1):56- 63.

Páez, X., Hernández, L., Baptista, T. (2003) Advances in the molecular treatment of depression. Rev Neurol, 37(5):459-70.

Paez-Pereda, M., Hausch, F., Holsboer, F. (2011) Corticotropin releasing factor receptor antagonists for major depressive disorder. Expert Opin Investig Drugs. Apr;20(4):519-35.

Palagini, L., Mosca, M., Tani, C., Gemignani, A., Mauri, M., Bombardieri, S. (2013) Depression and systemic lupus erythematosus: a systematic review. Lupus, 22(5):409-16.

Papp, M., Moryl, E. (1994) Antidepressant activity of non-competitive and competitive NMDA receptor antagonists in a chronic mild stress model of depression. Eur J Pharmacol 263, 1−7.

Paul, I.A., Skolnick, P. (2003) Glutamate and depression: clinical and preclinical studies. Ann N Y Acad Sci, 1003:250-72.

Paykel, E.S., Scott, J., Cornwall, P.L., Abbott, R., Crane, C., Pope, M. (2005) Duration of relapse prevention after cognitive therapy in residual depression: follow-up of controlled trial. Psychol Med, 35(1):59-68.

Pessoa Rocha, N., Reis, H.J., Vanden Berghe, P., Cirillo, C. (2014) Depression and cognitive impairment in Parkinson's disease: a role for inflammation and immunomodulation?. Neuroimmunomodulation; 21(2-3):88-94.

Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. (2005) Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.Psychopharmacology (Berl) 177(3), 245–255.

Pilc, A., Branski, P., Palucha, A., Tokarski, K., Bijak, M. (1998) Antidepressant treatment influences group I of glutamate metabotropic receptors in slices from hippocampal CA1 region. Eur J Pharmacol; 349:83–7.

116

Pilc, A., Legutko, B. (1995) The influence of prolonged antidepressant treatment on the changes in cyclic AMP accumulation induced by excitatory amino acids in rat cerebral cortical slices. Neuroreport 7:85–8.

Pittenger, C., Duman, R.S. (2007) Stress, Depression, and Neuroplasticity: A Convergence of Mechanisms Neuropsychopharmacology REVIEWS 33, 88– 109.

Polidori, C., Calo, G., Ciccocioppo, R., Guerrini, R., Regoli, D., Massi, M. (2000a) Pharmacological characterization of the nociceptin receptor mediating hyperphagia: identification of a selective antagonist. Psychopharmacology (Berl), 148(4), 430-7.

Polidori, C., de Caro, G., Massi, M. (2000b) The hyperphagic effect of nociceptin/orphanin FQ in rats. Peptides, 21(7), 1051-62.

Porsolt, R.D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. (1978) Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol, 47(4), 379- 91.

Porsolt, R.D., Le Pichon, M., Jalfre, M. (1977) Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature, 266(5604), 730-2.

Post, A., Smart, T.S., Krikke-Workel, J., Dawson, G.R., Harmer, C.J., Browning, M., Jackson, K., Kakar, R., Mohs, R., Statnick, M., Wafford, K., McCarthy, A., Barth, V., Witkin, J.M. (2015) A Selective Nociceptin Receptor Antagonist to Treat Depression: Evidence from Preclinical and Clinical Studies. Neuropsychopharmacology.

Pryce, C.R., Azzinnari, D., Spinelli, S., Seifritz, E., Tegethoff, M., Meinlschmidt, G. (2011) Helplessness: a systematic translational review of theory and evidence for its relevance to understanding and treating depression. Pharmacol Ther. Dec;132(3):242-67.

117

Redrobe, J.P., Calo', G., Regoli, D., Quirion, R. (2002) Nociceptin receptor antagonists display antidepressantlike properties in the mouse forced swimming test. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 365(2): 164-167.

Reinscheid, R.K, Nothacker, H.P., Bourson, A., Ardati, A., Henningsen, R.A., Bunzow, J.R. (1995) Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor. Science, 270(5237):792-794.

Reinscheid, R.K., Nothacker, H.P., Bourson, A., Ardati, A., Henningsen, R.A., Bunzow, J.R. (1995) Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor. Science, 270(5237):792-794.

Reiss, D., Wolter-Sutter, A., Krezel, W., Ouagazzal, A.M. (2007) Effects of social crowding on emotionality and expression of hippocampal nociceptin/orphanin FQ system transcripts in mice. Behav Brain Res, 184(2), 167–173.

Réus, G.Z., Jansen, K., Titus, S., Carvalho, A.F., Gabbay, V., Quevedo, J. (2015) Kynurenine athway dysfunction in the pathophysiology and treatment of depression: Evidences from animal and human studies. J Psychiatr Res.

Reynolds, I.J., Miller, R.J. (1988) Tricyclic antidepressants block N-methyl-D- aspartate receptors: similarities to the action of zinc. Br J Pharmacol, 95: 95–102.

Rizzi, A., Bigoni, R., Marzola, G., Guerrini, R., Salvadori, S., Regoli, D. Calo', G. (2001) Characterization of the locomotor activity-inhibiting effect of nociceptin/orphanin FQ in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 363(2), 161-5.

Rizzi, A., Gavioli, E.C., Marzola, G., Spagnolo, B., Zucchini, S., Ciccocioppo, R., Trapella, C., Regoli, D., Calò, G. (2007) Pharmacological characterization of the nociceptin/orphanin FQ receptor antagonist SB-612111 [(-)-cis-1-methyl-7-[[4- (2,6- dichlorophenyl)piperidin-1-yl]methyl]-6,7,8,9-tetrahydro-5H- benzocyclohepten-5-ol]: in vivo studies. J Pharmacol Exp Ther, 321(3), 968-74.

118

Rizzi, A., Molinari, S., Marti, M., Marzola, G., Calo', G. (2011) Nociceptin/orphanin FQ receptor knockout rats: in vitro and in vivo studies. Neuropharmacology, 60(4), 572-9.

Rominger, A., Förster, S., Zentner, J., Dooley, D.J., McKnight, A.T., Feuerstein, T.J. (2002) Comparison of the ORL1 receptor-mediated inhibition of noradrenaline release in human and rat neocortical slices. Br J Pharmacol, 135(3), 800–806.

Ruhe, H.G., Mason, N.S., Schene, A.H. (2007) Mood is indirectly related to serotonin, norepinephrine and dopamine levels in humans: a meta-analysis of monoamine depletion studies. Mol Psychiatry, 12:331–359.

Sachar, E.J., Baron, M. (1979). The biology of affective disorders Annu. Rev. Neurosci. 2, 505–517.

Sahay, A., Hen, R. (2007) Adult hippocampal neurogenesis in depression. Nature Neurosci; 10:1110-1115.

Sakoori, K., Murphy, N.P. (2004) Central administration of nociceptin/orphanin FQ blocks the acquisition of conditioned place preference to morphine and cocaine, but not conditioned place aversion to naloxone in mice. Psychopharmacology (Berl), 172(2), 129-36.

Sakurada, T., Katsuyama, S., Sakurada, S., Inoue, M., Tan-No, K., Kisara, K., Sakurada, C., Ueda, H., Sasaki, J. (1999) Nociceptin-induced scratching, biting and licking in mice: involvement of spinal NK1 receptors. Br J Pharmacol, 127(7), 1712-8.

Sałat, K., Siwek, A., Starowicz, G., Librowski, T., Nowak, G., Drabik, U., Gajdosz, R., Popik. P. (2015) Antidepressant-like effects of ketamine, norketamine and dehydronorketamine in forced swim test: Role of activity at NMDA receptor .Neuropharmacology.;99:301-7.

119

Sanacora, G., Gueorguieva, R., Epperson, C.N., Wu, Y.T., Appel, M., Rothman, D.L. (2004) Subtype-specific alterations of gamma-aminobutyric acid and glutamate in patients with major depression. Arch Gen Psychiatry, 61, 705−713.

Sanchis-Segura, C., Spanagel, R., Henn, F.A., Vollmayr, B. (2005) Reduced sensitivity to sucrose in rats bred for helplessness: a study using the matching law. Behav Pharmacol 16:267–270.

Sandin, J., Georgieva, J., Schött, P.A., Ogren, S.O., Terenius, L. (1997) Nociceptin/orphanin FQ microinjected into hippocampus impairs spatial learning in rats. Eur J Neurosci, 9(1), 194-7.

Santarelli, L., Gabrielli, M., Candelli, M., Cremonini, F., Nista, E.C., Cammarota, G., Gasbarrini, G., Gasbarrini, A. (2003) Post-cholecystectomy alkaline reactive gastritis: a randomized trial comparing sucralfate versus rabeprazole or no treatment. Eur J Gastroenterol Hepatol, Sep;15(9):975-

Sapolsky, R.M. (2000). Glucocorticoids and hippocampal atrophy in neuropsychiatric disorders. Arch. Gen. Psychiatry, 57, 925–935.

Schildkraut, J.J., Kety, S.S. (1967) Biogenic amines and emotion. Science, 7;156(3771):21-37.

Schlicker, E., Morari, M. (2000) Nociceptin/orphanin FQ and neurotransmitter release in the central nervous system. Peptides, 21(7), 1023-9.

Schwarcz, R., Bruno, J.P., Muchowski, P.J., Wu, H.Q. (2012) Kynurenines in the mammalian brain: when physiology meets pathology. Nat Rev Neurosci, 13(7):465-77.

Shaw, K., Turner, J., Del Mar, C. (2002) Tryptophan and 5-hydroxytryptophan for depression.Cochrane Database Syst Rev, (1): CD003198.

Sherman, A.D., Sacquitne, J.L., Petty, F. (1982) Specificity of the learned helplessness model of depression. Pharmacol Biochem Behav, 16: 449-454.

120

Shirayama, Y., Chen, A.C., Nakagawa, S., Russell, D.S., Duman, R.S. (2002) Brain-derived neurotrophic fator produces antidepressant effects in behavioral models of depression. J Neurosci, 22:3251–3261.

Shu, Y.S., Zhao, Z.Q., Li, M.Y., Zhou, G.M. (1998) Orphanin FQ/nociceptin modulates glutamate- and kainic acid-induced currents in acutely isolated rat spinal dorsal horn neurons.Neuropeptides, 32(6):567-71.

Silva, E.F., Silva, A.I., Asth, L., Souza, L.S., Zaveri, N.T., Guerrini, R., Calo', G., Ruzza, C., Gavioli, E.C. (2019) Nociceptin/orphanin FQ receptor agonists increase aggressiveness in the mouse resident-intruder test.Behav Brain Res, 1;356:120-126.

Singewald, N., Zhou, G.Y., Schneider, C. (1995) Release of excitatory and inhibitory amino acids from the locus coeruleus of conscious rats by cardiovascular stimuli and various forms of acute stress.Brain Res. 15;704(1):42- 50.

Siniscalchi, A., Rodi, D., Morari, M., Marti, M., Cavallini, S., Marino, S. (2002) Direct and indirect inhibition by nociceptin/orphanin FQ on noradrenaline release from rodent cerebral cortex in vitro.Br J Pharmacol, 136(8), 1178–1184.

Slattery, D.A., Cryan, J.F. (2012) Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents.Nat Protoc, 3;7(6):1009-14.

Smith, R.S. (1991) The macrophage theory of depression. Med Hypotheses. 35(4):298-306.

Soh, N.L., Walter, G. (2011) Tryptophan and depression: can diet alone be the answer? Acta Neuropsychiatrica, 23(1):3-11.

Steel, Z., Marnane, C., Iranpour, C., Chey, T., Jackson, J. W., Patel, V., Silove, D. (2014) The global prevalence of common mental disorders: a systematic review and meta-analysis 1980-2013. Int J Epidemiol, 43(2), 476-93.

121

Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. (1985) The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl), 85: 367-370.

Stevens, C.W. (2009) The evolution of vertebrate opioid receptors. Front Biosci (Landmark Ed), 14, 1247-69.

Stone, J.M., Dietrich, C., Edden, R., Mehta, M.A., De Simoni, S., Reed, L.J., Krystal, J.H., Nutt, D., Barker, G.J. (2012) Ketamine effects on brain GABA and glutamate levels with 1H-MRS: relationship to ketamine-induced psychopathology. Mol Psychiatry, 17(7):664-5.

Sundström, G., Dreborg, S., Larhammar, D. (2010) Concomitant duplications of opioid peptide and receptor genes before the origin of jawed vertebrates. PLoS One, 5(5), e10512.

Svenningsson, P. (2006) Alterations in 5-HT1B receptor function by p11 in depression-like states.Science, 311:77–80.

Tafet, G.E., Bernardini, R. (2003) Psychoneuroendocrinological links between chronic stress and depression. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 27(6), 893–903.

Takamori, K., Yoshida, S., Okuyama, S. (2001) Availability of learned helplessness test as a model of depression compared to a forced swimming test in rats. Pharmacology, 63: 147-153.

Tao, R., Auerbach, S.B. (2000) Regulation of serotonin release by GABA and excitatory amino acids.J Psychopharmacol, 14(2):100-13.

Tao, R., Ma, Z., Thakkar, M.M., McCarley, R.W., Auerbach, S.B. (2007) Nociceptin/ orphanin FQ decreases serotonin efflux in the rat brain but in contrast to a kappa-opioid has no antagonistic effect on mu-opioid-induced increases in serotonin efflux.Neuroscience, 147(1), 106–116.

122

Tardito, D., Perez, J., Tiraboschi, E., Musazzi, L., Racagni, G. Popoli, M. (2006) Signaling pathways regulating gene expression, neuroplasticity, and neurotrophic mechanisms in the action of antidepressants: a critical overview. Pharmacol Rev, 58(1), 115-34.

Tatarczyńska, E., Klodzińska, A., Chojnacka-Wójcik, E., Palucha, A., Gasparini, F. (2001) Potential anxiolytic- and antidepressant-like effects of MPEP, a potent, selective and systemically active mGlu5 receptor antagonist. Br J Pharmacol, 132(7):1423-30.

Thierry, A-M., France, J., Glowinski, J., Seymour, S. (1968) Effects of stress onthe metabolism of norepinephrine, dopamine and serotonin in the centralnervous system of the rat. I. Modifications of norepinephrine turnover. J.Pharmacol. Exp. Ther, 163: 163-171.

Thompson, A.A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., Wu, H., Vardy, E., Huang, X.P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B.L., Cherezov, V., Stevens, R.C. (2012) Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic. Nature, 485(7398), 395-9.

Timmerman, W., Cisci, G., Nap, A., de Vries, J.B., Westerink, B.H. (199) Effects of handling on extracellular levels of glutamate and other amino acids in various areas of the brain measured by microdialysis.Brain Res, 3;833(2):150-60.

Toledo, M.A., Pedregal, C., Lafuente, C., Diaz, N., Martinez-Grau, M.A., Jiménez, A., Benito, A., Torrado, A., Mateos, C., Joshi, E.M., Kahl, S.D., Rash, K.S., Mudra, D.R., Barth, V.N., Shaw, D.B., McKinzie, D., Witkin, J.M., Statnick, M.A. (2014) Discovery of a novel series of orally active nociceptin/orphanin FQ (NOP) receptor antagonists based on a dihydrospiro (piperidine-4,7'-thieno[2,3-c]pyran) scaffold. J MedChem, 57(8), 3418-29.

Toll, L., Bruchas, M.R., Calo', G., Cox, B.M., Zaveri, N.T. (2016) Nociceptin/Orphanin FQ Receptor Structure, Signaling, Ligands, Functions, and Interactions with Opioid Systems.Pharmacol Rev. 68(2):419-57.

123

Trivedi, M.H. (2006) Evaluation of outcomes with citalopram for depression using measurement-based care in STAR*D: implications for clinical practice. Am J Psychiatry, 163:28–40.

Trullas, R., Skolnick, P. (1990) Functional antagonists at the NMDA receptor complex exhibit antidepressant actions. Eur J Pharmacol, 185, 1−10.

Uppal, A., Singh, A., Gahtori, P., Ghosh, S.K., Ahmad, M.Z. (2010) Antidepressants: current strategies and future opportunities. Curr Pharm Des, 16(38):4243-53.

Van de Velde, S., Bracke, P., Levecque, K. (2010). Gender differences in depression in 23 European countries. Cross-national variation in the gender gap in depression. Social Science & Medicine,71, 305-313.

Varty, G.B., Hyde, L.A., Hodgson, R.A., Lu, S.X., McCool, M.F., Kazdoba, T.M., Del Vecchio, R.A., Guthrie, D.H., Pond, A.J., Grzelak, M.E., Xu, X., Korfmacher, W.A., Tulshian, D., Parker, E.M., Higgins, G.A. (2005) Characterization of the nociceptin receptor (ORL-1) agonist, Ro64-6198, in tests of anxiety across multiple species. Psychopharmacology, 15:1-12.

Vaughan, C.W., Christie, M.J. (1996) Increase by the ORL1 receptor (opioid receptor-like1) ligand, nociceptin, of inwardly rectifying K conductance in dorsal raphe nucleus neurones. Br J Pharmacol, 117(8), 1609-11.

Viaro, R., Marti, M., Morari, M. (2010) Dual motor response to l-dopa and nociceptin/orphanin FQ receptor antagonists in 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6- tetrahydropyridine (MPTP) treated mice: Paradoxical inhibition is relieved by D(2)/D(3) receptor blockade. Exp Neurol, 223(2), 473-84.

Viaro, R., Sanchez-Pernaute, R., Marti, M., Trapella, C., Isacson, O. Morari, M. (2008) Nociceptin/orphanin FQ receptor blockade attenuates MPTP-induced parkinsonism. Neurobiol Dis, 30(3), 430-8.

124

Vilpoux, C., Naudon, L., Costentin, J., Leroux-Nicollet, I. (2002) Chronic paroxetine increases [3H]nociceptin binding in rat dorsal raphe nucleus. Neuroreport, 13(1),111–114.

Vitale, G., Ruggieri, V., Filaferro, M., Frigeri, C., Alboni, S., Tascedda, F. (2009) Chronic treatmentwith the selective NOP receptor antagonist [Nphe 1, Arg 14, Lys 15]N/OFQ-NH 2 (UFP-101) reverses the behavioural and biochemical effects of unpredictable chronic mild stress in rats.Psychopharmacology (Berl), 207(2): 173-189.

Vollmayr, B., Bachteler, D., Vengeliene, V., Gass, P., Spanagel, R., Henn, F. (2004) Rats with congenital learned helplessness respond less to sucrose but show no deficits in activity or learning. Behav Brain Res 150:217–221.

Vollmayr, B., Gass, P. (2013) Learned helplessness: unique features and translational value of a cognitive depression model. Cell Tissue Res. Oct;354(1):171-8.

Vollmayr, B., Mahlstedt, M.M., Henn, F.A. (2007) Neurogenesis and depression: what animal models tell us about the link. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 257: 300-303.

Volta, M., Mabrouk, O.S., Bido, S., Marti, M., Morari, M. (2010) Further evidence for an involvement of nociceptin/orphanin FQ in the pathophysiology of Parkinson's disease: a behavioral and neurochemical study in reserpinized mice. J Neurochem, 115(6), 1543-55.

Volta, M., Viaro, R., Trapella, C., Marti, M., Morari, M. (2011) Dopaminenociceptin/orphanin FQ interactions in the substantia nigra reticulata of hemiparkinsonian rats: involvement of D2/D3 receptors and impact on nigro- thalamic neurons and motor activity. Exp Neurol, 228(1), 126-37.

125

Wang, J.L., Zhu, C.B., Cao, X.D., Wu, G.C. (1999) Distinct effect of intracerebroventricular and intrathecal injections of nociceptin/orphanin FQ in the rat formalin test. Regul Pept, 79(2-3), 159-63.

Wang, L.N., Liu, L.F., Zhang, J.X., Zhao, G.F. (2009) [Plasma levels of nociceptin/orphanin FQ in patients with bipolar disorders and health adults]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 89(13), 916-8.

Weiss, J., Glazer, H., Pohorecky, L., Brick, J., Miller, N. (1975) Effects of chronicexposure to stressors on avoidance-escape behavior and on brainnorepinephrine. Psychosomatic Medicine .37,No.6: 522-534.

Whiteford, H.A., Ferrari, A.J., Degenhardt, L., Feigin, V., Vos, T. (2015) The global burden of mental, neurological and substance use disorders: an analysis from the Global Burden of Disease Study 2010. PLoS One, 10(2), e0116820.

Willner, P, (1984) The validity of animal models of depression. Psychopharmacology 83:1–16.

Willner, P., Mitchell, P.J. (2002) The validity of animal models of predisposition to depression. Behav Pharmacol, 13: 169-188.

Witkin, J M., Statnick, M.A., Rorick-Kehn, L.M., Pintar, J.E., Ansonoff, M., Chen, Y., Tucker, R.C., Ciccocioppo, R. (2014) The biology of Nociceptin/Orphanin FQ (N/OFQ) related to obesity, stress, anxiety, mood, and drug dependence. Pharmacol Ther, 141(3), 283-99.

Witkin, J.M., Rorick-Kehn, L.M., Benvenga, M.J., Adams, B.L., Gleason, S.D., Knitowski, K.M., … Statnick, M.A. (2016) Preclinical findings predicting efficacy and side-effect profile of LY2940094, an antagonist of nociceptin receptors. Pharmacology Research & Perspectives, 4(6), e00275. https://doi.org/10.1002/prp2.275.

126

Wu, Y.L., Pu, L., Ling, K., Zhao, J., Cheng, Z.J., Ma, L., Pei, G. (1997) Molecular characterization and functional expression of opioid receptor-like1 receptor. Cell Res,7(1), 69-77.

Xie, G.X., Ito, E., Maruyama, K., Suzuki, Y., Sugano, S., Sharma, M. (1999) The promoter region of human prepro-nociceptin gene and its regulation by cyclic AMP and steroid hormones. Gene, 238(2), 427–436.

Yamamoto, T., Nozaki-Taguchi, N., Kimura, S. (1997) Analgesic effect of intrathecally administered nociceptin, an opioid receptor-like1 receptor agonist, in the rat formalina test. Neuroscience, 81(1), 249-54;

Yilmaz, A., Schulz, D., Aksoy, A., Canbeyli, R. (2002) Prolonged effect of an anesthetic dose of ketamine on behavioral despair. Pharmacol Biochem Behav, 71:349–52.

Yoshitake, S., Ijiri, S., Kehr, J., Yoshitake, T. (2013) Concurrent modulation of extracellular levels of noradrenaline and cAMP during stress and by anxiogenicor anxiolytic-like neuropeptides in the prefrontal cortex of awake rats.Neurochem Int, 62(3), 314–323.

Yu, T.P., Fein, J., Phan, T., Evans, C.J., Xie, C.W. (1997) Orphanin FQ inhibits synaptic transmission and long-term potentiation in rat hippocampus. Hippocampus, 7(1), 88-94.

Zacharko, R.M., Bowers, W.J., Kokkinidis, L., Anisman, H. (1983) Regionspecific reductions of intracranial self-stimulation after uncontrollable stress: possible effects on reward processes. Behav Brain Res 9:129–141.

Zambello, E., Jiménez-Vasquez, P.A., El Khoury, A., Mathé, A.A., Caberlotto, L. (2008) Acute stress differentially affects corticotropin-releasing hormone mRNA expression in the central amygdala of the “depressed” flinders sensitive line and the control flinders resistant line rats. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 32(3), 651–661.

127

Zarate, C.A., Jr., Singh, J.B., Carlson, P.J., Brutsche, N.E., Ameli, R., Luckenbaugh, D.A. (2006) A randomized trial of an N-methyl-Daspartate antagonist in treatment-resistant major depression. Arch Gen Psychiatry 63, 856−864.

Zhang, Z., Xin, S.M., Wu, G.X., Zhang, W.B., Ma, L., Pei, G. (1999) Endogenous delta-opioid and ORL1 receptors couple to phosphorylation and activation of p38 MAPK in NG108-15 cells and this is regulated by protein kinase A and protein kinase C. J Neurochem, 73(4), 1502–1509.

Zhou, W., Wang, N., Yang, C., Li,X.M., Zhou, Z.Q., Yang, J.J. (2014) Ketamine- induced antidepressant effects are associated with AMPA receptors-mediated upregulation of mTOR and BDNF in rat hippocampus and prefrontal cortex. Eur Psychiatry, 29(7):419-23.

Zigmond, M., Harvey, J. (1970) Resistance to central norepinephrine depletionand decreased mortality in rats chronically exposed to electric footshock.JNeuro-Visc Rel, 31:373-381.

128

9. ANEXOS

Parecer Comissão de Ética

129

130

131

Artigo publicado na revista Psychopharmacology

NOP AGONISTS PREVENT THE ANTIDEPRESSANT-LIKE EFFECTS OF NORTRIPTYLINE AND FLUOXETINE BUT NOT R-KETAMINE

Victor A. Duarte Holanda1 , Wilton B. Santos1 , Laila Asth1 , Remo Guerrini2 , Girolamo Calo’3 , Chiara Ruzza3 , Elaine C. Gavioli1

1Behavioral Pharmacology Laboratory, Department of Biophysics and Pharmacology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil;

2Department of Chemistry and Pharmaceutical Sciences, University of Ferrara, Ferrara, Italy;

3Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neuroscience, University of Ferrara, Ferrara, Italy.

Corresponding author:

Elaine C. Gavioli

Behavioral Pharmacology Laboratory,

Department of Biophysics and Pharmacology,

Federal University of Rio Grande do Norte,

Av. Senador Salgado Filho, sn, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, Brazil 59072-970 – Phone: +55 84 3342-2256

Email address: [email protected]

Acknowledgments:

This work was supported by funds from the Brazilian National Council Research (CNPq; Grant N° PVE 401289/2014-1, N° 302302/2015-8 and N° 401837/2016- 5 to ECG). VADH was recipient of PhD scholarship from Capes Foundation. LA held a PDJ fellowship from Brazilian National Research Council.

132

Conflict of interest: none declared.

ABSTRACT

Rationale: Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) is the endogenous ligand of a Gi protein-coupled receptor named NOP. Both N/OFQ and NOP receptor are widely expressed in brain areas involved in the control of emotional processes. Clinical and preclinical studies support antidepressant effects due to the blockade of NOP receptor signaling. By contrast, NOP receptor activation did not evoke any change in behavioral despair tests. Objectives: The present study aimed to investigate the effects of the co-administration of NOP agonists and classic antidepressant drugs in the forced swimming test (FST) and learned helplessness model (LH) in mice. Methods: Male Swiss mice were co- administered with NOP agonists (N/OFQ and Ro 65-6570) and antidepressants (nortriptyline, fluoxetine and R-ketamine) or SB-612111 (NOP antagonist) and the behavioral effects were assessed in the FST and LH tests. Results: Fluoxetine, nortriptyline and R-ketamine and the NOP antagonist SB-612111 displayed antidepressant-like effects in the FST. The administration of the NOP agonists N/OFQ and Ro 65- 6570 did not induce any behavioral change. However, co-administration of NOP agonists blocked the antidepressant effects of SB-612111, fluoxetine and nortriptyline, but not R-ketamine. Similarly, in the LH, the systemic injection of SB-612111, nortriptyline and R-ketamine reversed helplessness. The co-administration of Ro 65-6570 blocked the antidepressant- like effects of SB-612111 and nortriptyline, but not R-ketamine. Conclusions: NOP receptor activation inhibits the acute antidepressant effects of nortriptyline and fluoxetine, but not R-ketamine. The present findings contribute to further understand the role played by the N/OFQ-NOP receptor system in regulating mood states.

Key-words: nociceptin/orphanin FQ; NOP receptor; antidepressants; forced swimming test; learned helplessness; mouse.

133

INTRODUCTION

Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) is a heptadecapeptide acting as the endogenous ligand for the NOP receptor, a member of the G-protein coupled receptor family (Reinscheid et al. 1995; Meunier et al. 1995). The NOP receptor is structurally and functionally related to opioid receptors, and the activation of NOP signaling consequently leads to the reduction of Ca+2 influx and cAMP production and to the increase of K + efflux (Toll et al. 2016). Indeed, N/OFQ has structural similarities with the opioid peptide dynorphin A (Mollereau et al. 1996); however neither N/OFQ has affinity for classic opioid receptors (Reinscheid et al. 1995) nor the endogenous opioids have affinity for the NOP receptor (Cox et al. 2000). In the central nervous system, both N/OFQ and NOP receptor are expressed in limbic structures and brainstem monoaminergic nuclei (Mollereau and Mouledous 2000; Boom et al. 1999; Neal et al. 1999). This evidence supports a regulatory role for the N/OFQ – NOP receptor system in modulating stress- related psychiatric disorders, such as depression, anxiety, drug abuse and food consumption-related disorders (Gavioli and Calo' 2013; Witkin et al. 2014; Toll et al. 2016). A large body of evidence supports the putative antidepressant effects of NOP antagonists in rodents. Peptide or non-peptide NOP antagonists induce antidepressant-like effects in rodents in behavioral despair assays, such as forced swimming and tail suspension test (Redrobe et al. 2002; Gavioli et al. 2003, 2004; Rizzi et al. 2007; Post et al. 2016; Witkin et al. 2016). NOP antagonists were also effective in reversing depressive-like behaviors resulted from the administration of E. coli lipopolysaccharide (LPS; Medeiros et al. 2015), chronic mild stress (Vitale et al. 2009; Vitale et al. 2017), and unpredictable and uncontrollable electric footshocks (Holanda et al. 2016). Importantly, NOP receptor knockout mice and rats display antidepressant-like phenotype in behavioral despair assays (Gavioli et al. 2003; Rizzi et al. 2011); additionally the genetic deletion of the NOP receptor prevents LPS-induced depressive-like behavior in mice (Medeiros et al. 2015). Recently, a clinical study corroborated the preclinical antidepressant-like effects of NOP antagonists. In fact, the NOP

134

receptor antagonist LY2940094 (Toledo et al. 2014) displayed antidepressant efficacy in patients with major depressive disorder (Post et al. 2016). Preclinical studies also investigated the effects of NOP agonists in behavioral despair assays. The NOP agonists N/OFQ and Ro 64-6198 did not induce any change in immobility time of rodents exposed to the forced swimming and tail suspension test (Gavioli et al. 2003, 2004; Rizzi et al. 2007; Goeldner et al. 2012) but they were able to prevent the antidepressant-like effects of NOP antagonists (Gavioli et al. 2003, 2004; Gavioli and Calo’ 2006; Rizzi et al. 2007; Vitale et al. 2009). It is interesting to mention that the agonism and the antagonism of NOP receptors have a rather unique profile, the first inducing anxiolytic effects and the second inducing antidepressant-like actions in rodents (Gavioli and Calo’ 2006). For these reasons, NOP agonists have been proposed as promising anxiolytic drug. Additionally, NOP agonists were also candidate as innovative treatment for urinary incontinence due to overactive bladder, as well as pain, hypertension, and cough (Toll et al. 2016). Consequently, the investigation of the possible drug-drug interactions is now needed. Considering the therapeutic potential of NOP agonists, the present study was aimed to investigate the behavioral effects of the association between mechanistically distinct antidepressant drugs and NOP agonists. To this aim, using the forced swimming test and learned helplessness model, the effects of the co-administration of NOP agonists and classical antidepressants, nortriptyline and fluoxetine, but also R-ketamine, an anesthetic drug with fast, potent and long-lasting antidepressant actions, were evaluated in mice.

METHODS

Animals

Experiments were performed using male Swiss mice breaded at the Federal University of Rio Grande do Norte (Natal, Brazil). Mice were 8-12 weeks old (38- 42 g) and were housed in plastic cages (33 x 40 x 17 cm) in groups of maximum 10 under standard conditions (22±1°C; 12-h light:12-h dark cycle, lights on at 6:00 am) with food and water ad libitum. A total number of 379 mice were used for

135

developing this study, being 259 animals tested in the forced swimming test, 100 mice were exposed to the learned helplessness paradigm (only 84 animals developed the helpless behavior, and then they were effectively subjected to the pharmacological treatments), and 20 were used in the open field test. The experiments were performed during the mornings between 7:00 and 12:00 am. All the experimental series were conducted in accordance with the Brazilian law no. 11.794/2008 for care and use of experimental animals and were approved by the Local Ethics Committee for Animal Use of the Federal University of Rio Grande do Norte (License no. 059/2015 and 010.015/2017). This study is reported following the ARRIVE guidelines (Kilkenny et al. 2010).

Drugs and treatments

Nortriptyline (Pamelor®, NOVARTIS Biociências S.A., São Paulo, Brazil), fluoxetine (Medley Pharmaceutical Industry, Campinas, Brazil), dextroketamine (R-ketamine; Ketamin®, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda, Itapira, Brazil), Ro 65-6570, N/OFQ (both synthesized by Prof. Guerrini, Department of Pharmaceutical Sciences, University of Ferrara, Italy), and SB612111 (Tocris Bioscience, Bristol, UK) were used. Nortriptyline, fluoxetine and R-ketamine were dissolved in saline (NaCl 0.9%) solution. The stock solutions of SB-612111 and Ro 65-6570 were prepared in 100% dimethylsulfoxide (DMSO), while N/OFQ in saline, stored at -20 °C and dissolved in saline solution just before the experiments. The final concentration of DMSO in SB612111 and Ro 65-6570 solutions did not exceed 1 %. Nortriptyline (20 mg/kg; 60 min; ip), fluoxetine (20 mg/kg; 60 min; ip) and R-ketamine (10 mg/kg, 30 min or 24 h prior the test; ip) were acute administrated based on previous studies demonstrating reversal of shock-induced shuttle box escape deficits after acute injections of nortriptyline and ketamine (Holanda et al. 2016; Maeng et al. 2008) and decreased immobility time in the forced swimming test (de Moura et al, 2014; Fukumoto et al., 2017). Additionally, aiming to find an equi-effective dose of R-ketamine compared to nortriptyline and fluoxetine in the forced swimming test, R-ketamine (3 and 10 mg/kg) was tested in a pilot study under our experimental conditions (Fig. 1S). SB-612111 (10 mg/kg; 30 min; ip) was

136

administrated at the dose demonstrated in previous studies to elicit consistent antidepressant-like effects in the learned helplessness (Holanda et al. 2016) and the forced swimming test (Rizzi et al. 2007). N/OFQ (1 nmol; 5 min prior to the test; icv) and Ro 65-6570 (0.3 mg/kg; 5 min prior to antidepressants; ip) was injected at the highest dose that does not affect animal locomotion (Asth et al. 2016). In the long-term effects of R-ketamine, Ro 65-6570 was administered at two distinct time points: (1) 30 min after R-ketamine (24 h before the test) or (2) 30 min prior the test. Control groups were treated with their respective vehicles (saline or DMSO solutions) following the same schedule described for treatment groups. All drugs injected ip were given in a volume of 10 ml/kg. N/OFQ was administered intracerebroventricularly (icv) 5 min before the behavioral test.

Sterotaxic surgery

Mice were anesthetized with ketamine and xylazine (100 and 10 mg/kg, i.p., respectively) and placed in a stereotaxic apparatus. An 8 mm stainless steel guide cannula (25 × 0.7 mm) was implanted into the lateral ventricle and was fixed with dental cement. Coordinates toward the bregma were ML -1.1 mm, AP -0.6 mm, DV -1.0 mm. To prevent occlusion, a dummy cannula was inserted into the guide cannula. After surgery, the animals were allowed to recover for 5 days. For the N/OFQ icv injection, awake mice were gently restrained and the drug solution (2 µl/mouse) was injected (2 µL/min) with a cannula protruding 1 mm from the guide cannula. At the end of behavioral assessment, mice were euthanized, and then icv injected with methylene blue dye (2 µl). Ten min after, brains were removed to verify the placement of the guide cannula. Only the data from those animals with dispersion of the dye throughout the ventricles (>95% of the animals) were used.

Forced swimming test

The forced swimming test was performed as described by Porsolt et al. (1977). Mice were placed individually in glass cylinders (height: 18 cm; diameter: 17 cm) containing 12 cm of water at 24 ± 1 °C, for two swim sessions: an initial 15 min training session on day 1, and, 24 h later (day 2), a 5 min test session. Results

137

were relative to the 5 min test session. The immobility time (i.e. the time spent floating in the water without struggling) was recorded by an experienced observer. Mice were randomly assigned to experimental groups. In the present study, we tested the effects of the co-administration of two distinct NOP agonists, a peptide (N/OFQ) and a non-peptide (Ro 65-6570), and 3 antidepressant drugs (nortriptyline, Rketamine and fluoxetine) administered before the test session (as detailed in the figures) in the forced swimming test.

Learned helplessness model

The learned helplessness was performed as previously described by our research group (Holanda et al. 2016). Mice were individually placed in a shuttle box with a steel grid floor (0.3 x 1 cm) attached to an electric shock generator (AVS Projetos, Ribeirão Preto, SP, Brazil). The box is divided in two chambers (50 x 30 x 30 cm) by a guillotine door (12 x 25 cm). Mice were exposed to electric footshocks during three consecutive days. At the first day (session 1 - induction), mice were subjected to 180 cycles of randomly assigned inescapable electric footshocks (1.0 mA, 1-10 s shock duration, 10-s average interval). At the second (session 2 - screening) and third days (session 3 - test) experimental sessions, mice were exposed to 30 cycles of electric footshocks (1.0 mA, 1-10 s shock duration, 20-s average interval). During these sessions, the guillotine door was open then after the shock, mice could escape by moving to the other side of the shuttle box. Mice that failed in more than 20 trails to escape at the screening session were considered helpless. Those animals that did not developed helpless (approximately 20%) were excluded from this study. At the test session, the following parameters were evaluated: escape latency (s) and number of escapes. The assessment of movement between chamber sides was recorded manually by an experienced observer who was blind to the treatment conditions. In this study, the effects of the co-administration of the NOP agonist Ro 65-6570 and two antidepressant drugs (nortriptyline and R-ketamine) were assessed in the learned helplessness model. Due to the impressive similarity of effects between N/OFQ and Ro 65-6570 in blocking the effects of the antidepressants in the forced swimming test, we chose to continue this study in the learned helplessness

138

model only with Ro 65-6570. Concerning antidepressant drugs, we excluded to test the effects of the co-administration of Ro 65-6570 and fluoxetine in the learned helplessness model essentially because this antidepressant is not acute effective in reversing escape deficits in helpless mice (Holanda et al. 2016).

Data analysis

Data are presented as mean ± SEM (for number of escape and immobility time) of n animals. Escape latency data were converted to the area under the curve (AUC) by plotting the escape latency (s) for each cycle (total of 30 cycles) in the test session. Mean ± SEM of AUC data for each treatment were used for statistical analysis. Data sets were initially checked for normality and homogeneity of variance before using of parametric statistical tests. The differences between escape latencies, number of escapes and immobility time of distinct treatment groups were evaluated through the two-way ANOVA (independent factors: antidepressants and NOP agonists administration) or one- way ANOVA, when appropriated, followed by Tukey’s post hoc test. Differences were considered statistically significant when P < 0.05. For the statistical analysis, the GraphPad Prism software version 6.0 (Graph Pad Software Inc., San Diego, USA) was used.

RESULTS

Effects of pretreatment with NOP agonists and antidepressants in the mouse forced swimming test

In a pilot series of experiments the effects of antidepressants in the forced swimming test were evaluated under the present experimental conditions. Acute administration of nortriptyline (20 mg/kg, ip), fluoxetine (20 mg/kg, ip) and R- ketamine (10 mg/kg, ip) significantly reduced the immobility time of mice with similar efficacy (data not shown). The effects of the co-administration of the NOP antagonist SB-612111 and the NOP agonist Ro 65- 6570 was evaluated in the forced swimming test (Fig. 1). Two-way ANOVA revealed an interaction effect

139

between the two independent factors analyzed (NOP agonist and antagonist) in the immobility time (Fig. 1, Ro 65-6570 + SB-612111: F(1,13)=16.7, P<0.05)

As shown in Fig. 2, the pretreatment with NOP agonists (N/OFQ and Ro 65-6570) prevented the reduction of immobility time evoked by nortriptyline (Fig. 2A, 2B) and fluoxetine (Fig. 2C, 2D), but not R-ketamine (Fig. 2E, 2F). Two-way ANOVA identified an interaction effect between the NOP agonists and nortriptyline and fluoxetine (Fig. 2A, F(1,29)=108.0; Fig. 2B, F(1,28)=48.3; Fig. 2C, F(1,20)=73.14; Fig. 2D, F(1,16)=164.4; P<0.05). On the contrary, two-way ANOVA revealed only significant effects for the independent factor antidepressant in those mice treated with the association between NOP agonists and R-ketamine (Fig. 2E, F(1,16)=176.8; Fig.2F, F(1,26)=108.3; P<0.05).

Aiming to investigate the effects of the NOP agonist in the protracted antidepressant actions of Rketamine (assessed 24 h after the injection of R- ketamine), Ro 65-6570 was injected at two distinct time points: (1) prior the R- ketamine injection (i.e., 30 min before R-ketamine) or (2) 30 min before the test (i.e., 24 h after the R-ketamine injection). As showed in the figure 3S, the administration of R-ketamine significantly reduced immobility time in the forced swimming test. The pretreatment with the NOP agonist Ro 65-6570, at any situation tested, did not affect the protracted antidepressant actions of R- ketamine (Fig. 3S, one-way ANOVA, Tukey’s test, F(3,16)=53.2, P<0.05).

Effects of co-administration of Ro 65-6570 and classic antidepressants in helpless mice

In a pilot set of experiments, the effects of the acute administration of nortriptyline (20 mg/kg, ip) and R-ketamine (10 mg/kg, ip) were assessed in the learned helplessness model. Both nortriptyline and R-ketamine significantly reduced the escape latencies and reversed the escape failures observed in helpless mice (data not shown). In order to further validate experimental conditions, the effects of acute treatment with the NOP antagonist SB-612111 and the NOP agonist Ro 65-6570 were evaluated in the learned helplessness model (Fig. 3). SB-612111 reduced escape latencies (Fig. 3A, P0.05). However, the pretreatment with Ro

140

65-6570 fully prevented the effects of SB-612111 in reducing escape latencies (Fig. 3A) and increasing the number of escapes (Fig. 3B). Two-way ANOVA detected an interaction effect between the two independent factors (NOP agonist and antagonist) in the escape latencies (Fig 3A, F(1,24)=99.6, P<0.05)

As shown in Fig. 4, the administration of Ro 65-6570revented the nortriptyline- induced reversal of helpless behaviorin mice. Two-way ANOVA identified an interactioneffect between Ro 65-6570 and nortriptyline in the escapelatencies and number of escapes (Fig. 4a, F(1,13) = 13.0;Fig. 4b, F(1,13) = 12.2, p < 0.05 for both). The effects of Ro 65-6570in mice treated with R-ketamine were also evaluatedin the helplessness model (Fig. 4c, d). When Ro 65-6570 wasco- administratedwith R-ketamine, no significant alterations inthe escape latencies (Fig. 4c) and the frequency of escapes(Fig. 4d) were observed when compared with R-ketaminetreatedmice. Two-way ANOVA detected only significant effectsfor the independent factor R-ketamine (Fig. 4c,F(1,12) = 109.4; Fig. 4d, F(1,12) = 205.6; p < 0.05 for both).Trying to rule out an eventual bias effect on spontaneouslocomotion of the association between Ro 65-6570 and antidepressants, the actions of the co-administration of these treatments were investigated in the open field test. As presented in Fig. 4S, the co-administration of Ro 65-6570 and nortriptyline or R-ketamine did not significantly affect spontaneous locomotion compared to saline-treated mice (F(2,19) = 2.013, p = 0.16, n = 6–7/group).

DISCUSSION

In this present study, we observed that distinct drugs, such as nortriptyline, fluoxetine, and R-ketamine, and the NOP antagonista SB-612111 induced antidepressant-like effects in mice in the forced swimming test and learned helplessness model. Regarding the NOP agonists, Ro 65-6570 and N/OFQ, they Control Ro 65-6570 did not affect animal behavior when administered alone but were able, when co-administered, to prevent the antidepressant-like effects evoked by SB-612111, nortriptyline, and fluoxetine. By contrast, the

141

antidepressant effects of R-ketamine were unaffected by the co-administration of NOP agonists.

In this study, two behavioral tests were used for assessing the effects of antidepressant drugs, forced swimming test, and learned helplessness model. The main reason for choosing these two tests is the fact that both are sensitive to the acute effects of some antidepressant drugs. It is interesting to mention that the outcomes of these tests are quite distinct in terms of significance. In the forced swimming test, the animal is submitted to an acute inescapable stressful event, and an immobile posture is assumed. Passive immobile behavior is reduced with the treatment with antidepressants. The immobile behavior is believed to reflect either a failure to persist in escape-directed behavior after stress (i.e., behavioral despair) or the development of a passive strategy that disengages the animal from active forms of stress coping (Slattery and Cryan 2012). In the learned helplessness model, animals are subjected to an acute unpredictable and inescapable stressful situation, and during a second exposure to this task, animals are invited to escape from the unpleasant event (i.e., the guillotine door inside the shuttle box is open), but most of them fail to escape from the electric footshock (these animals are named helpless). Antidepressant drugs can significantly and selectively reverse this helpless behavior (Pryce et al. 2011). In the present study independent on the behavioral test used, NOP agonists when co-administered with fluoxetine and nortriptyline, but not R-ketamine, block the antidepressant effects of these drugs. These observations are quite huge since these tests reflect different behaviors which are mediated by distinct neuronal circuits. Thus, this coincidence of results observed in the forced swimming test and learned helplessness model representes that the effects of antidepressants showed in these two tests, despite based on distinct neuronal circuits, are similarly modulated by NOP agonists.

Under the present experimental conditions, the antidepressants, nortriptyline, fluoxetine, and R-ketamine, and the NOP antagonist SB-612111 were equally effective in reducing immobility time in the mouse forced swimming test. The antidepressant-like effects of these compounds in behavioral despair tests have

142

already been described in the literature (Lucki 1997; Gavioli et al. 2003, 2004; Kos et al. 2006; Rizzi et al. 2007; Antony et al. 2014; Fukumoto et al. 2017). Additionally, the present findings showed that one single administration of the antidepressants nortriptyline and R-ketamine and the NOP antagonist SB- 612111 reversed escape deficits in helpless mice; similar results have been reported previously (Telner et al. 1981; Kametani et al. 1983; Maeng et al. 2008; Holanda et al. 2016). As far as the mechanism of action of these drugs is concerned, the worldwide prescribed antidepressants nortriptyline and fluoxetine inhibit the monoamine reuptake protein, with low or high selectivity for the 5-HT transporter, respectively; thus, these drugs promote antidepressant effects increasing monoamine levels in the synaptic cleft (Morilak and Frazer 2004). Ketamine has been reported to evoke rapid-acting and long-lasting antidepressant effects in patients more than one decade ago (Berman et al. 2000; Zarate Jr et al. 2006). In this study, the administration of the NOP agonist Ro 65- 6570 did not affect the protracted antidepressant effects of R-ketamine. In our opinion, these findings do not completely exclude a role played by the NOP receptor system in the long-term effects of R-ketamine, particularly because the lack of pharmacokinetic information for Ro 65-6570. It is widely known that ketamine acts as na antagonist of NMDA receptors, thus acutely increasing BDNF levels. The neurothrophic factor BDNF activates TrkB receptors, which promotes immediate changes in glutamate release during this acute phase of ketamine’s antidepressant effects (Autry et al. 2011). Additionally, the protracted antidepressant actions of ketamine are quite unique, and require a complex orchestration of multiple molecular mediators and neurochemical changes that differ from underlying mediators of the ketamine acute effects (Zanos and Gould 2018\). Finally, the mechanisms underlying the antidepressant effects ofNOP antagonists are not fully understood. However, among different possible mechanisms deeply discussed in Gavioli and Calo’ (2013), the block of the profound inhibitory effect exerted by N/OFQ on monoaminergic transmission (see below) seems to be the best candidate.

Concerning NOP agonists, the present data showed that Ro 65-6570 did not affect the animal behavior in two distinct assays namely forced swimming and

143

learned helplessness; however, the non-peptide NOP agonist completely blocked the antidepressant-like effects of SB-612111 in both assays. This is in line with previous findings demonstrating that N/OFQ counteracts the effects of SB- 612111 in the mouse forced swimming test (Rizzi et al. 2007). Thus, two chemically distinct NOP agonists (the peptide N/OFQ and the nonpeptide Ro 65- 6570) blocked the antidepressant actions of the NOP antagonist SB-612111 most probably by competing for the same target of action, i.e., the NOP receptor. This proposal is supported by evidence obtained in receptor binding and functional studies. In fact, binding studies using cells expressing the recombinant human NOP receptor showed that both Ro 65-6570 and SB-612111 were able to displace [3H]N/OFQ binding (Hashiba et al. 2001; Spagnolo et al. 2007). More importantly, a competitive type of antagonismo has been described for SB- 612111 both when challenged against N/OFQ (Spagnolo et al. 2007) and Ro 65- 6570 (Ferrari et al. 2017).

The present findings also showed that NOP agonists blocked the effects of monoaminergic antidepressants, nortriptyline, and fluoxetine, but not of the R- ketamine. A growing body of evidence suggests that NOP receptor activation promotes a profound inhibition of monoaminergic transmission. In fact, in vitro studies showed that N/OFQ inhibits 5-HTand noradrenaline release from brain preparations (slices and synaptosomes; Schlicker and Morari 2000) and electrophysiological studies demonstrated that N/OFQ decreases the firing rate of locus coeruleus (noradrenergic; Connor et al. 1996) and dorsal raphe (serotonergic; Vaughan and Christie 1996) neurons, via NOP receptor activation (Gavioli et al.2004). Moreover, in vivo microdialysis studies showed that N/OFQ into the dorsal raphe nucleus reduces 5-HT levels in this brain area (Tao et al. 2007), while in the locus coeruleus, N/OFQ decreases noradrenaline efflux in the prefrontal córtex (Okawa et al. 2001). Importantly, these inhibitory effects of N/OFQ on monoamine levels were reversed by NOP antagonists (Okawa et al. 2001; Tao et al. 2007). In addition, stressful conditions have been reported to enhance N/OFQ-induced inhibition of rat dorsal raphe nucleus activity (Nazzaro et al. 2010). In an opposite way, behavioral studies showed that NOP receptor antagonism can increase the antidepressantlike response to fluoxetine (Witkin et

144

al. 2016). Thus, via the above mentioned mechanisms, NOP agonists might elicit such a profound inhibition of the noradrenergic and serotoninergic neurotransmission that neutralizes the antidepressant effects of nortriptyline and fluoxetine.

On the other hand, the lack of effect of NOP agonists on the R-ketamine-induced acute antidepressant actions suggests that the mechanism of action of this drug is not dependent on monoaminergic transmission or less dependent than that of nortriptyline and fluoxetine. In this study, we used R-ketamine which has been showed to evoke acute and protracted antidepressant effects independent on 5- HT neurotransmission, as showed in mice pretreated mice with P- chlorophenylalanine (PCPA), an inhibitor of 5-HT synthesis (Zhang et al. 2018). It should be mentioned that there is not a consensus in the literature about the participation of 5-HT in the acute effects of the ketamine. Previously, the pretreatment with PCPA attenuated the acute antidepressant effects of R,S- ketamine (30 mg/kg, 30 min before the FST) in C57BL/6J mice (Fukumoto et al. 2016). In contrast with these findings, Gigliucci et al. (2013) showed that the acute antidepressant effects of R,S-ketamine (25 mg/kg, 1 h before the FST) in rats were not altered by PCPA. Recently, du Jardin et al. (2018) showed that the acute antidepressant effects of S-ketamine (15 mg/kg, 1 h before the FST) in FSL rats were abolished by 5-HT depletion with PCPA. Although the reasons for these discrepancies are still unknown, the stereoselectivity 5-HTdependent antidepressant actions of ketamine could be one explanation.

To the best of our knowledge, a single published study investigated the effects of the co-administration of antidepressants and NOP agonists. Witkin et al. (2014), in a review article in which the authors present their own data, showed that the NOP agonist Ro 64-6198 (0.3 mg/kg, po) did not affect imipramine (15 mg/kg, ip)-induced antidepressant-like effects in the mouse forced swimming test. Several factorscould explain these discrepant results including antidepressant drugs tested (imipramine versus nortriptyline and fluoxetine as tested in the present study) and differences in the forced swimming protocol (one versus two sessions). The additional swimming session in which our mice were subjected in

145

the forced swimming test could elevate the endogenous NOP receptor signaling into the brain. In fact, electrophysiological studies showed that the N/OFQ- induced inhibitory effects on dorsal raphe nucleus firing rates were 10-fold enhanced in brain slices prepared from rats 24 h previously subjected to swim stress (Nazzaro et al. 2010).

The present study was particularly limited to the observations of the acute effects of the association between antidepressants and NOP agonists. However, future studies aimed to investigate the effects of NOP agonists and antagonists on chronic antidepressant administrations are of clinical relevance to depressed patients under pharmacotherapy. Indeed, chronic treatment with selective 5-HT reuptake inhibitors significantly increases NOP density, particularly in the dorsal raphe nucleus, in which serotonergic cell bodies are located (Le Maître et al. 2013; Vilpoux et al. 2002). Moreover, exposure to acute aversive stimuli and chronic stressful situations can distinctly modulate the expression of NOP receptors (Green and Devine 2009; Nativio et al. 2012).

In conclusion, the present study brings robust evidence for the inhibitory actions of NOP receptor activation on the antidepressant effects of nortriptyline and fluoxetine, but not Rketamine. We hypothesized that NOP agonists impair central monoaminergic transmission under stressful conditions counteracting the antidepressant effects of drugs with monoaminergic-dependent mechanisms of action. Ultimately, the increase of NOP receptor signaling in the CNS, eventually due to stress, would be predicted to modify the antidepressant efficacy of conventional antidepressants.

REFERENCES

Antony LJ, Paruchuri VN, Ramanan R (2014) Antidepressant effect of ketamine in sub anaesthetic doses in male albino mice. J Clin Diagn Res 8(6):HC05-07.

146

Asth L, Ruzza C, Malfacini D, Medeiros I, Guerrini R, Zaveri NT, Gavioli EC, Calo' G (2016) Beta-arrestin 2 rather than G protein efficacy determines the anxiolytic- versus antidepressant-like effects of nociceptin/orphanin FQ receptor ligands. Neuropharmacol 105:434-442.

Autry AE, Adachi M, Nosyreva E, Na ES, Los MF, Cheng PF, Kavalali ET, Monteggia LM (2011) NMDA receptor blockade at rest triggers rapid behavioural antidepressant responses. Nature 475(7354):91-95.

Berman RM, Cappiello A, Anand A, Oren DA, Heninger GR, Charney DS, Krystal JH (2000) Antidepressant effects of ketamine in depressed patients. Biol Psychiatry 47(4):351-354.

Boom A, Mollereau C, Meunier JC, Vassart G, Parmentier M, Vanderhaeghen JJ, Schiffmann SN (1999) Distribution of the nociceptin and nocistatin precursor transcript in the mouse central nervous system. Neuroscience 91(3):991-1007.

Connor M, Vaughan CW, Chieng B, Christie MJ (1996) Nociceptin receptor coupling to a potassium conductance in rat locus coeruleus neurones in vitro. Br J Pharmacol 119(8):1614-1618. Cox BM, Chavkin C, Christie MJ, Civelli O, Evans C, Hamon MD et al (2000). Opioid receptors. In: Girdlestone D (ed) The IUPHAR compendium of receptor characterization and classification, 2nd edn. IUPHAR Media, London, pp 321–333. de Moura JC, Noroes MM, Rachetti Vde P, Soares BL, Preti D, Nassini R, Materazzi S, Marone IM, Minocci D, Geppetti P, Gavioli EC, André E (2014) The blockade of transient receptor potential ankirin 1 (TRPA1) signalling mediates antidepressant- and anxiolytic-like actions in mice. Br J Pharmacol 171(18):4289- 4299. du Jardin KG, Liebenberg N, Cajina M, Müller HK, Elfving B, Sanchez C, Wegener G (2018) SKetamine Mediates Its Acute and Sustained Antidepressant- Like Activity through a 5-HT1B Receptor Dependent Mechanism in a Genetic Rat Model of Depression. Front Pharmacol 8:978.

147

Ferrari F, Malfacini D, Journigan BV, Bird MF, Trapella C, Guerrini R, Lambert DG, Calo' G, Zaveri NT (2017) In vitro pharmacological characterization of a novel unbiased NOP receptorselective nonpeptide agonist AT-403. Pharmacol Res Perspect 5(4):1-17.

Fukumoto K, Iijima M, Chaki S (2016) The Antidepressant Effects of an mGlu2/3 Receptor Antagonist and Ketamine Require AMPA Receptor Stimulation in the mPFC and Subsequent Activation of the 5-HT Neurons in the DRN. Neuropsychopharmacology 41(4):1046-1056.

Fukumoto K, Toki H, Iijima M, Hashihayata T, Yamaguchi JI, Hashimoto K, Chaki S (2017) Antidepressant Potential of (R)-Ketamine in Rodent Models: Comparison with (S)-Ketamine. J Pharmacol Exp Ther 361(1):9-16.

Gavioli EC, Calo' G (2006) Antidepressant- and anxiolytic-like effects of nociceptin/orphanin FQ receptor ligands. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 372(5):319-330.

Gavioli EC, Calo' G (2013) Nociceptin/orphanin FQ receptor antagonists as innovative antidepressant drugs. Pharmacol Ther 140(1):10-25.

Gavioli EC, Marzola G, Guerrini R, Bertorelli R, Zucchini S, De Lima TC (2003) Blockade of nociceptin/orphanin FQ-NOP receptor signalling produces antidepressant-like effects: pharmacological and genetic evidences from the mouse forced swimming test. Eur J Neurosci 17(9):1987-1990.

Gavioli EC, Vaughan CW, Marzola G, Guerrini R, Mitchell VA, Zucchini S (2004) Antidepressantlike effects of the nociceptin/orphanin FQ receptor antagonist UFP-101: new evidence from rats and mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 369(6):547-553.

Gigliucci V, O'Dowd G, Casey S, Egan D, Gibney S, Harkin A (2013) Ketamine elicits sustained antidepressant-like activity via a serotonin-dependent mechanism. Psychopharmacology (Berl) 228(1):157-166.

148

Goeldner C, Spooren W, Wichmann J, Prinssen EP (2012) Further characterization of the prototypical nociceptin/orphanin FQ peptide receptor agonist Ro 64-6198 in rodent models of conflict anxiety and despair. Psychopharmacol (Berl) 222(2):203-214.

Green MK, Devine DP (2009) Nociceptin/orphanin FQ and NOP receptor gene regulation after acute or repeated social defeat stress. Neuropeptides 43(6):507- 514.

Hashiba E, Harrison C, Galo' G, Guerrini R, Rowbotham DJ, Smith G, Lambert DG (2001) Characterisation and comparison of novel ligands for the nociceptin/orphanin FQ receptor. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363(1):28-33.

Holanda VAD, Medeiros IU, Asth L, Guerrini R, Calo' G, Gavioli EC (2016) Antidepressant activity of nociceptin/orphanin FQ receptor antagonists in the mouse learned helplessness. Psychopharmacol (Berl) 233(13):2525-2532.

Kametani H, Nomura S, Shimizu J (1983) The reversal effect of antidepressants on the escape deficit induced by inescapable shock in rats. Psychopharmacol (Berl) 80(3):206-208.

Kilkenny C, Browne W, Cuthill IC, Emerson M, Altman DG (2010) Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol 160:1577-1579.

Kos T, Legutko B, Danysz W, Samoriski G, Popik P (2006) Enhancement of antidepressant-like effects but not brain-derived neurotrophic factor mRNA expression by the novel N methyl-Daspartate receptor antagonist neramexane in mice. J Pharmacol Exp Ther 318(323):1128-1136.

Le Maître E, Dourmap N, Vilpoux C, Leborgne R, Janin F, Bonnet JJ, Costentin J, Leroux-Nicollet I (2013) Acute and subchronic treatments with selective serotonin reuptake inhibitors increase Nociceptin/Orphanin FQ (NOP) receptor

149

density in the rat dorsal raphe nucleus; interactions between nociceptin/NOP system and serotonin. Brain Res 1520:51-60.

Lucki I (1997) The forced swimming test as a model for core and component behavioral effects of antidepressant drugs. Behav Pharmacol 8:523-532. Maeng S, Zarate CAJr, Du J, Schloesser RJ, McCammon J, Chen G, Manji HK (2008) Cellular mechanisms underlying the antidepressant effects of ketamine: role of alpha-amino-3-hydroxy-5- methylisoxazole-4-propionic acid receptors. Biol Psychiatry 63(4):349-352.

Medeiros IU, Ruzza C, Asth L, Guerrini R, Romão PRT, Gavioli EC, Calo G (2015) Blockade of Nociceptin/Orphanin FQ receptor signaling reverses LPS- induced depressive-like behavior in mice. Peptides 72:95-103.

Meunier JC, Mollereau C, Toll L, Suaudeau C, Moisand C, Alvinerie P et al (1995). Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377(6549):532- 535.

Mollereau C, Simons M-J, Soularue P, Liners F, Vassart G, Meunier J-C, Parmentier M (1996) Structure, tissue distribution, and chromosomal localization of the prepronociceptin gene. Proc Natl Acad Sci USA 93:8666-8670.

Mollereau C, Mouledous L (2000) Tissue distribution of the opioid receptor-like (ORL1) receptor. Peptides 21(7):907-917.

Morilak DA, Frazer A (2004) Antidepressants and brain monoaminergic systems: a dimensional approach to understanding their behavioural effects in depression and anxiety disorders. Int J Neuropsychopharmacol 7:193-218.

Nazzaro C, Barbieri M, Varani K, Beani L, Valentino RJ, Siniscalchi A (2010) Swim stress enhances nociceptin/orphanin fq induced inhibition of rat dorsal raphe nucleus activity in vivo and in vitro: role of corticotrophin releasing factor. Neuropharmacol 58(2): 457-464.

150

Nativio P, Pascale E, Maffei A, Scaccianoce S, Passarelli F (2012) Effect of stress on hippocampal nociceptin expression in the rat. Stress 15(4):378-384.

Neal CR, Mansour A, Rinscheid R, Nothacker HP, Civelli O, Watson SJ (1999) Localization of orphanin FQ (nociceptin) peptide and messenger RNA in the central nervous system of the rat. J Comp Neurol 406(4): 503-547.

Okawa H, Kudo M, Kudo T, Guerrini R, Lambert DG, Kushikata T (2001) Effects of nociceptinNH2 and [Nphe1]nociceptin(1–13)NH2 on rat brain noradrenaline release in vivo and in vitro. Neurosci Lett 303(3):173-176.

Porsolt RD, Le Picho M, Jalfre M (1977) Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature 266(5604):730-732.

Post A, Smart TS, Krikke-Workel J, Dawson GR, Harmer CJ, Browning M, Jackson K, Kakar R, Mohs R, Statnick M, Wafford K, McCarthy A, Barth V, Witkin JM (2016) A Selective Nociceptin Receptor Antagonist to Treat Depression: Evidence from Preclinical and Clinical Studies. Neuropsychopharmacol 41(7):1803-1812.

Pryce CR, Azzinnari D, Spinelli S, Seifritz E, Tegethoff M, Meinlschmidt G (2011) Helplessness: a systematic translational review of theory and evidence for its relevance to understanding and treating depression. Pharmacol Ther 132(3):242- 267.

Redrobe JP, Calo' G, Regoli D, Quirion R (2002) Nociceptin receptor antagonists display antidepressantlike properties in the mouse forced swimming test. Naunyn Schmiedebergs ArchPharmacol 365(2):164-167.

Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A, Ardati A, Henningsen RA, Bunzow JR (1995) Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein- coupled receptor. Science 270(5237):792-794.

Rizzi A, Gavioli EC, Marzola G, Spagnolo B, Zucchini S, Ciccocioppo R, Trapella C, Regoli D, Calò, G (2007) Pharmacological characterization of the 151

nociceptin/orphanin FQ receptor antagonista SB-612111 [(-)-cis-1-methyl-7-[[4- (2,6- dichlorophenyl)piperidin-1-yl]methyl]-6,7,8,9-tetrahydro5H- benzocyclohepten-5-ol]:n vivo studies. J Pharmacol Exp Ther 321(3):968-974.

Rizzi A, Molinari S, Marti M, Marzola G, Calo' G (2011) Nociceptin/orphanin FQ receptorknockout rats: in vitro and in vivo studies. Neuropharmacol 60(4):572- 579.

Schlicker E, Morari M (2000) Nociceptin/orphanin FQ and neurotransmitter release in the centralnervous system. Peptides 21(7):1023-1029.

Söderlund J, Lindskog M (2018) Relevance of Rodent Models of Depression in Clinical Practice:Can We Overcome the Obstacles in Translational Neuropsychiatry? Int J Neuropsychopharmacol inpress. doi: 10.1093/ijnp/pyy037.

Spagnolo B, Carrà G, Fantin M, Fischetti C, Hebbes C, McDonald J, Barnes TA, Rizzi A, TrapellaC, Fanton G, Morari M, Lambert DG, Regoli D, Calò G (2007) Pharmacological characterization ofthe nociceptin/orphanin FQ receptor antagonist SB-612111 [(-)-cis-1-methyl-7-[[4-(2,6-dichlorophenyl)piperidin-1- yl]methyl]-6,7,8,9-tetrahydro-5H-benzocyclohepten-5-ol]: in vitrostudies. J Pharmacol Exp Ther 321(3):961-967.

Tao R, Ma Z, Thakkar MM, McCarley RW, Auerbach SB (2007) Nociceptin/orphanin FQdecreases serotonin efflux in the rat brain but in contrast to a kappa-opioid has no antagonisticeffect on mu-opioid-induced increases in serotonin efflux. Neuroscience 147(1):106-116.

Telner JI, Singhal RL, Lapierre YD (1981) Reversal of learned helplessness by nortriptyline. ProgNeuropsychopharmacol 5(5-6):587-590.

Toledo MA, Pedregal C, Lafuente C, Diaz N, Martinez-Grau MA, Jiménez A, Benito A, Torrado A,Mateos C, Joshi EM, Kahl SD, Rash KS, Mudra DR, Barth VN, Shaw DB, McKinzie D, WitkinJM, Statnick MA (2014) Discovery of a novel

152

series of orally active nociceptin/orphanin FQ (NOP)receptor antagonists based on a dihydrospiro (piperidine-4,7'-thieno[2,3-c]pyran) scaffold. JMedChem 57(8):3418-3429.

Toll L, Bruchas MR, Calo’ G, Cox BM, Zaveri NT (2016) Nociceptin/Orphanin FQ ReceptorStructure, Signaling, Ligands, Functions, and Interactions with Opioid Systems. Pharmacol Ver 68(2):419-457.

Vaughan CW, Christie MJ (1996) Increase by the ORL1 receptor (opioid receptor- like1) ligand,nociceptin, of inwardly rectifying K conductance in dorsal raphe nucleus neurones. Br J Pharmacol117(8):1609-1611.

Vilpoux C, Naudon L, Costentin J, Leroux-Nicollet I (2002) Chronic paroxetine increases[3H]nociceptin binding in rat dorsal raphe nucleus. Neuroreport13(1):111-114.

Vitale G, Ruggieri V, Filaferro M, Frigeri C, Alboni S, Tascedda F (2009) Chronic treatment with the selective NOP receptor antagonist [Nphe 1, Arg 14, Lys 15]N/OFQ-NH 2 (UFP-101) reverses the behavioural and biochemical effects of unpredictable chronic mild stress in rats. Psychopharmacol (Berl) 207(2):173- 189.

Vitale G, Filaferro M, Micioni Di Bonaventura MV, Ruggieri V, Cifani C, Guerrini R, Simonato M, Zucchini S (2017) Effects of [Nphe1, Arg14, Lys15] N/OFQ-NH2 (UFP-101), a potent NOP receptor antagonist, on molecular, cellular and behavioural alterations associated with chronic mild stress. J Psychopharmacol 31(6):691-703.

Witkin JM, Rorick-Kehn LM, Benvenga MJ, Adams BL, Gleason SD, Knitowski KM, Li X, Chaney S, Falcone JF, Smith JW, Foss J, Lloyd K, Catlow JT, McKinzie DL, Svensson KA, Barth VN, Toledo MA, Diaz N, Lafuente C, Jiménez A, Benito A, Pedregal C, Martínez-Grau MA, Post A, Ansonoff MA, Pintar JE, Statnick MA (2016) Preclinical findings predicting efficacy and sideeffect profile of LY2940094, an antagonist of nociceptin receptors. Pharmacol Res Perspect 4(6):e00275.

153

Witkin JM, Statnick MA, Rorick-Kehn LM, Pintar JE, Ansonoff M, Chen Y, Tucker RC, Ciccocioppo R (2014) The biology of Nociceptin/Orphanin FQ (N/OFQ) related to obesity, stress, anxiety, mood, and drug dependence. Pharmacol Ther 141(3):283-299.

Zarate CAJr, Singh JB, Carlson PJ, Brutsche NE, Ameli R, Luckenbaugh DA, Charney DS, Manji HK (2006) A randomized trial of an N-methyl-D-aspartate antagonist in treatment-resistant major depression. Arch Gen Psychiatry 63(8):856-864.

Zhang K, Dong C, Fujita Y, Fujita A, Hashimoto K (2018) 5-Hydroxytryptamine- Independent Antidepressant Actions of (R)-Ketamine in a Chronic Social Defeat Stress Model. Int J Neuropsychopharmacol 21(2):157-163.

154

Figure 1 - Effects of co-administration of Ro 65-6570 (0.3 mg/kg, ip) and SB- 612111 (10 mg/kg, ip) on the immobility time of mice in the forced swimming test (FST). Data are presented mean ± SEM of 4-5 mice/group. *P<0.05 vs. vehicle; #P<0.05 vs. control + SB-612111 group, two-way ANOVA, Dunnett’s test.

155

Figure 2 - Effects of pretreatment with N/OFQ (1 nmol; icv) or Ro 65-6570 (0.3 mg/kg, ip) and nortriptyline (20 mg/kg, ip) (A,B), fluoxetine (20 mg/kg, ip) (C,D) and R-ketamine (10 mg/kg, ip) (E,F) in mice in the forced swimming test (FST). Data are presented mean ± SEM of 5-8 mice/group. *P<0.05 vs. vehicle; #P<0.05 vs. control + antidepressant group, two-way ANOVA, Dunnett’s test.

156

Figure 3 - Effects of pretreatment with Ro 65-6570 (0.3 mg/kg, ip) and SB-612111 (10 mg/kg, ip) on the escape latencies (A) and number of escapes (B) in helpless mice. Data are presented as mean ± SEM for escape latencies (after obtain the area under the curve – AUC – for each treatment) and number of escapes of 7 mice/group. *P<0.05 vs. Vehicle; #P<0.05 vs. control + SB-612111 group, two- way ANOVA, Dunnett’s test.

157

Figure 4 - Effects of the pre-treatment with Ro 65-6570 (0.3 mg/kg, ip) and nortriptyline (20 mg/kg, ip) or R-ketamine (10 mg/kg, ip) on the escape latencies (A,C) and number of escapes (B,D) in helpless mice. Data are presented as mean ± SEM for escape latencies (after obtain the area under the curve – AUC – for each treatment) and number of escapes of 4-5 mice/group. *P<0.05 vs. Vehicle; #P<0.05 vs. control + notriptyline group, two-way ANOVA, Dunnett’s test.

158