Ficha Catalográfica Preparada

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

FRANCISCA CHARLIANE CARLOS DA SILVA

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E ENVOLVIMENTO DO ESTRESSE OXIDATIVO PROVOCADAS POR DIFERENTES TRATAMENTOS COM KETAMINA EM CAMUNDONGOS

FORTALEZA 2012

FRANCISCA CHARLIANE CARLOS DA SILVA

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E ENVOLVIMENTO DO ESTRESSE OXIDATIVO PROVOCADAS POR DIFERENTES TRATAMENTOS COM KETAMINA EM CAMUNDONGOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Farmacologia.

Orientador: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa.

FORTALEZA 2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

S58a Silva, Francisca Charliane Carlos da Alterações comportamentais e envolvimento do estresse oxidativo provocadas por diferentes tratamentos com ketamina em camundongos / Francisca Charliane Carlos da Silva. – 2012. 127 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2012. Orientação: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa.

1. Ketamina. 2. Estresse Oxidativo. 3. Depressão. 4. Ansiedade. I. Título.

CDD 616.8527 2

FRANCISCA CHARLIANE CARLOS DA SILVA

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E ENVOLVIMENTO DO ESTRESSE OXIDATIVO PROVOCADAS POR DIFERENTES TRATAMENTOS COM KETAMINA EM CAMUNDONGOS

Aprovada em 27/09/2012

BANCA EXAMINADORA

______Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa (Orientadora) Universidade Federal do Ceará-UFC

______Profa. Dra. Gisela Costa Camarão Universidade Federal do Ceará-UFC

______Prof. Dr. Roberto César Pereira Lima Junior Universidade Federal do Ceará-UFC

A Deus, Nosso Senhor, que me deu saúde e força para chegar a mais uma conquista importante da minha vida.

Aos meus pais, pelo carinho, amor e paciência e por sempre estarem ao meu lado me apoiando.

AGRADECIMENTOS

Aqueles que passam por nós não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós.” Antoine de Saint-Exupéry

À Funcap, pelo apoio financeiro.

À minha amiga e orientadora Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa, pelos conhecimentos passados com dedicação e paciência, pela disponibilidade em me ajudar sempre que necessário. Por acreditar e confiar em mim, pela realização profissional e pessoal. Sendo exemplo de gara, determinação e competência.

Á banca examinadora desta pesquisa, pelas brilhantes considerações que guiaram a confecção final deste trabalho.

Às minhas amigas de pós-graduação Maria do Carmo, Luciana Ximenes, Giuliana Ignácio e Mariana Fernandes pelo estímulo, competência, ensinamentos com o intuito de chegar à excelência.

Ao meu amigo Brinell Arcanjo que esteve ao meu lado realizando os experimentos e me acompanhando durante todo o trabalho.

Aos professores do curso de pós-graduação em Farmacologia da UFC, em especial Dra. Glauce Barroso, Dra. Marta Maria Fonteles, Dra. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos, Dra. Helena Serra Azul, Dr. Carlos Maurício, Dra. Nylane Alencar, pelos conhecimentos transmitidos e apoio fornecido aos alunos da pós graduação.

Aos meus amigos de pós graduação Helvira, Edith, Nayrton, Emiliano e Mariana Feitosa que estiveram presentes em vários momentos, pela dedicação e amizade e por estarem sempre dispostos a ajudar.

À técnica do laboratório Vilani, pela companhia constante.

Aos funcionários do Biotério que forneceram os animais para o estudo.

A todos os funcionários do Departamento de Farmacologia da UFC, em especial Aura e Márcia.

Ao meu noivo Wilson Gouveia, sempre presente e compreensível com relação às minhas angústias.

Enfim agradeço a todos aqueles que dispuseram um pouco do bem mais precioso: o tempo

“(...) Imagine um piano e um pianista; a certa altura tocando, o piano fica desafinado: uma tecla não bate mais e cordas quebram. O pianista obrigatoriamente, apesar de ótimo, tocará mal. O cérebro seria o piano e o pianista a alma, não é? É uma velha comparação...se o cérebro se deteriora, aalma, obrigatoriamente mostra-se atoleimada.”

Luigi Pirandello, em “O finado Mattia Pascal”

RESUMO

A ketamina é usada principalmente como anestésico, produzindo um tipo de anestesia, denominada anestesia dissociativa que se caracteriza por um estado cataléptico. Entretanto, o uso da ketamina não tem sido restrito à prática clínica e pesquisa, uma vez que, atualmente, tem sido utilizada como droga de abuso, visto produzir efeitos tanto alucinógenos quanto estimulantes. O objetivo deste estudo foi avaliar alterações comportamentais tais como ansiedade e depressão em camundongos submetidos a diferentes tratamentos com ketamina (agudo, subcrônico e abstinência de 24h), bem como investigar o envolvimento do estresse oxidativo em córtex pré-frontal de camundongos após tratamento agudo com ketamina. Trata- se de um estudo experimental, onde para avaliar as alterações comportamentais (ansiedade e depressão) os camundongos foram tratados com ketamina agudamente ou subcronicamente (7 dias consecutivos), sendo realizados os modelos experimentais de Campo Aberto (TCA), Labirinto de Cruz Elevado (LCE), Nado Forçado (TNF) e Suspensão da Cauda (TSC). Os animais também foram expostos a abstinência de 24h após o tratamento subcrônico e submetidos aos modelos experimentais supracitados. Para investigar o envolvimento do estresse oxidativo, os animais foram tratados agudamente com ketamina e utilizado o córtex pré-frontal para avaliar atividade da catalase, níveis de glutationa, malonialdeído e nitrito. Os resultados mostraram que no TCA houve aumento da atividade locomotora espontânea em todos os tipos de tratamento e em todas as doses utilizadas. No LCE o tratamento agudo, subcrônico e abstinência de 24h com ketamina reduziu alguns parâmetros nos braços abertos. No TNF e TSC, o tratamento agudo e subcrônico reduziu o tempo de imobilidade em todas as doses utilizadas. Enquanto na abstinência de 24h houve aumento do tempo de imobilidade nas doses de 10 e 20 mg/kg. Quanto ao envolvimento do estresse oxidativo após o tratamento agudo com ketamina em córtex pré-frontal de camundongos notou-se um aumento significativo da atividade da catalase, dos níveis de malonildialdeído e nitrito. Enquanto nos níveis de glutationa reduzida (GSH) observou-se uma diminuição significativa. Conclui-se com o trabalho que o tratamento agudo e subcrônico causou efeito ansiogênico e antidepressivo. Enquanto que a abstinência de 24h após o tratamento subcrônico evidenciou um efeito ansiogênico e depressor. Além das alterações comportamentais, constata-se que o tratamento agudo com ketamina causa aumento do estresse oxidativo, indicando a ocorrência de possíveis lesões neurais em consequência dessas alterações.

Palavras-chaves: Ketamina. Ansiedade. Depressão. Estresse oxidativo.

ABSTRACT

Ketamine is mainly used as an anesthetic, producing a kind of anesthesia, called dissociative anesthesia characterized by a cataleptic. However, the use of ketamine has been restricted to clinical practice and research, since, currently, has been used as a drug of abuse, since both produce hallucinogenic effects as stimulants. The aim of this study was to evaluate behavioral changes such as depression and anxiety in mice subjected to different treatments with ketamine (acute, subchronic and withdrawal of 24), as well as investigate the involvement of oxidative stress in the prefrontal cortex of mice after acute treatment Ketamine. This is an experimental study to evaluate where behavioral changes (depression and anxiety) mice were treated with ketamine acutely or subcronicamente (7 consecutive days), being conducted experimental models of Open Field (TCA), Labyrinth of High Cross (LCE), Forced Swim (TNF) and Tail Suspension (TSC). The animals also were exposed to 24 hours of abstinence after treatment and subjected to subchronic experimental models above. To investigate the involvement of oxidative stress, the animals were treated acutely with ketamine and used the prefrontal cortex to evaluate the activity of catalase, glutathione, and nitrite malonialdeído. The results showed that the TCA increased spontaneous locomotor activity in all types of treatment and at all doses used. In LCE treating acute and subchronic withdrawal 24h with ketamine reduced some parameters in the open arms. In TNF and TSC, acute and subchronic treatment reduced immobility time at all doses used. While the withdrawal of 24h was increased immobility time in doses of 10 and 20 mg/kg. Regarding the involvement of oxidative stress after acute treatment with ketamine in the prefrontal cortex of mice was noted a significant increase in catalase activity, levels of malondialdehyde and nitrite. While the levels of reduced glutathione (GSH) showed a significant decrease. It concludes with the work that the acute and subchronic treatment caused anxiogenic and antidepressant effects. While abstinence from 24h after treatment showed a subchronic effect anxiogenic and depressant. In addition to behavioral changes, it appears that acute treatment with Ketamine causes increased oxidative stress, indicating the possible occurrence of neural injuries as a result of these changes.

Keywords: ketamine. Anxiety.Depression.Oxidative stress.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1.1 Estrutura química Ketamina. 19

FIGURA 1.2 Enantiômeros da Ketamina. 20

FIGURA 1.3 Receptor NMDA. 22

FIGURA 4.1 Representação da região anatômica no camundongo referente ao 47 córtex pré-frontal.

FIGURA 5.1 Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina via 53 intraperitoneal, sobre a atividade locomotora espontânea no teste do campo aberto em camundongos durante 5 minutos de observação.

FIGURA 5.2 Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via 54 intraperitoneal, sobre o tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação.

FIGURA 5.3 Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via 55 intraperitoneal, sobre a porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação.

FIGURA 5.4 Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via 56 intraperitoneal, sobre o número de entradas nos braços abertos (NEBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação.

FIGURA 5.5 Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via 57 intraperitoneal, sobre a porcentagem de entrada nos braços abertos (PEBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação.

FIGURA 5.6 Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via 58 intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste do nado forçado em camundongos.

FIGURA 5.7 Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via 59 intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste da suspensão da cauda em camundongos.

FIGURA 5.8 Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento 60 subcrônico, via intraperitoneal, sobre a atividade locomotora espontânea no teste do campo aberto em camundongos.

FIGURA 5.9 Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento 62 subcrônico, via intraperitoneal, sobre o número de entradas nos braços abertos (NEBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos.

FIGURA 5.10 Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento 62 subcrônico, via intraperitoneal, sobre a porcentagem de entrada nos braços abertos (PEBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos.

FIGURA 5.11 Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento 63 subcrônico, via intraperitoneal, sobre a porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos.

FIGURA 5.12 Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento 64 subcrônico, via intraperitoneal, sobre o tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos.

FIGURA 5.13 Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento 65 subcrônico, via intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste do nado forçado em camundongos.

FIGURA 5.14 Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento 66 subcrônico, via intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste da suspensão da cauda em camundongos.

FIGURA 5.15 Atividade da catalase em córtex pré-frontal de camundongosapós 67 administração de aguda de ketamina.

FIGURA 5.16 Níveis de glutationa reduzida (GSH) em córtex pré-frontal após 68 administração de aguda de ketamina em camundongos.

FIGURA 5.17 Efeito da administração aguda de ketamina sobre a formação de 60 malonildialdeído (MDA) em córtex pré-frontal de camundongos.

FIGURA 5.18 Níveis de nitrito em córtex pré-frontal após administração de 70 aguda de ketamina em camundongos.

LISTA DE QUADROS

QUADRO 4.1 Esquema do Teste do Campo Aberto. 43

QUADRO 4.2 Esquema do Teste do Plus Maze. 44

QUADRO 4.3 Esquema do Teste do Nado Forçado. 45

QUADRO 4.4 Esquema do Teste da Suspensão da Cauda. 46

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

HIV- Human Immunodeficiency Virus LSD- Dietilamida do ácido lisérgico DSM-IV- Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais 4º Ed. PCP- Fenilciclidina DEA- Drug Enforcement Administration pKa- Constante de dissociação FDA- Food and Drug Administration NMDA- N-metil D-Aspartato SNC- Sistema Nervoso Central NO- Óxido Nítrico GMPc- Monofosfato Cíclico de Guanosina NOS- Óxido nítrico Sintase 5-HT- 5-hidroxitriptamina (serotonina) BDNF- Brain-Derived Neurotrophic Factor TCA - Teste do Campo Aberto LCE - Teste do Labirinto em Cruz Elevado TNF - Teste do Nado Forçado TSC - Teste da Suspensão da Cauda TBARs- Thiobarbituric Acid Reactive Substances GSH- Glutathione ALE - Atividade Locomotora Espontânea NEBA- Número de Entradas nos Braços Abertos

TPBA- Tempo de Permanência nos Braços Abertos

PEBA- Percentagem de Entrada nos Braços Abertos

PTBA- Percentagem do Tempo de Permanência nos Braços Abertos

CPF - Córtex Pré-Frontal pH- Potencial de Hidrogénio iónico

HCl- Ácido clorídrico

EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

MDA- Malonildialdeido

TBA- Ácido tiobarbitúrico

NaNO2- Nitrito de sódio

DTNB- Ácido 5,5-ditiobis (2- nitrobenzóico)

ANOVA- Analise de Variância

EPM- Erro Padrão da Média i.p- Intraperitoneal

Ket- Ketamina

Cont- Controle

GABA- Ácido gama-aminobutírico

5HT- 5-hidroxitriptamina

MAO- Monoamina oxidase

AGPI- Ácidos graxos poliinsaturados

ERO- Espécies reativas de oxigênio

ERN- Espécies reativas de nitrogênio

RL- Radicais livres

- O2 - Radical superóxido

HO - Radical hidroxila

L - Radical alquila

LO - Alcoxila

LOO - Peroxila

NADPH- Dinucleotídeo de nicotinamida-adenina-fosfato (forma reduzida)

LPO- Peroxidação lipídica

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 16

1.1 Drogas psicoativas 16 1.2 Ketamina 18 1.3 Química e farmacocinética 19 1.4 Ketamina: mecanismo de ação 21 1.5 Ketamina: efeitos farmacológicos 24 1.6 Ketamina: usos terapêuticos 26 1.7 Ketamina como droga de abuso 29

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA 35

3 OBJETIVOS 38

3.1 Objetivo Geral 38 3.2 Objetivos Específicos 38

4 MATERIAIS E MÉTODOS 40

4.1 Drogas e Reagentes 40 4.2 Equipamentos 40 4.3 Animais 41 4.4 Preparo das drogas 41 4.5 Tratamento dos animais e Procedimento experimental 41 4.6 Protocolo dos experimentos comportamentais 42 4.7 Protocolo dos Experimentos Neuroquímicos 46 4.8. 4.8 Determinação do envolvimento do estresse oxidativo 47 4.9 4.9 Análise estatística 50

5 RESULTADOS 52

5.1 Efeitos da ketamina no tratamento agudo e subcrônico. 52 5.2 Efeitos da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico 59 5.3. 5.3 Efeitos da ketamina no estresse oxidativo 67

6 DISCUSSÃO 73

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS 88

8 CONCLUSÃO 91

REFERÊNCIAS 93

ANEXOS 107

APÊNDICES 109

INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

1.1 DROGAS PSICOATIVAS

O uso de drogas psicoativas não é um evento novo no repertório humano, mas uma prática milenar e universal, não sendo, portanto, fenômeno exclusivo da época em que vivemos. Na antiguidade, drogas originárias de plantas eram usadas como medicação para as mais diversas doenças. Drogas também eram usadas em homenagem aos deuses, em rituais sagrados. A partir do século XVI, o uso de drogas entrou em nova fase: com a Era das Navegações, os europeus entraram em contato com diferentes culturas, sobretudo quando colonizaram o continente americano, entrando pela primeira vez em contato com a cocaína usada pelos nativos do Andes, com o tabaco que já era usado pelas tribos indígenas da América do Norte, com o haxixe quando faziam comércio com os árabes e com o ópio no Extremo Oriente (PRATTA, SANTOS, 2001; FOCCHI, 2004).

A partir de então, a Europa importou essas drogas, que passaram a ser utilizadas por aproximadamente, três séculos como tônicos, fortificantes e remédios, para as mais variadas patologias. Mas foi apenas no século XIX que os problemas decorrentes desse uso indiscriminado começaram a despertar a atenção, e no século XX ocorreram verdadeiras epidemias de abuso e dependência de substâncias psicoativas (FOCCHI, 2004).

Atualmente, o consumo de drogas psicoativas tem se tornado um tema cada vez mais preocupante. Isto se deve ao fato de ser um fenômeno social e constituir-se em uma das principais questões na saúde pública. Os possíveis danos resultantes do consumo dessas substâncias decorrem tanto do próprio uso das substâncias químicas quanto da vivência do processo de dependência. Problemas graves de comportamento e de saúde – como doenças hepáticas, contaminação pelo HIV, acidentes de trânsito são exemplos desses danos (LARANJEIRA, 2001).

As drogas psicoativas podem ser classificadas em três tipos: depressoras, alucinógenas e estimulantes. As depressoras alteram o processamento de captação das informações pelo

cérebro, dificultando e atrasando esse mecanismo, exemplo o álcool, ópio e morfina. As alucinógenas tendem a despersonalizar os usuários, como a maconha, LSD e heroína. Já as estimulantes causam aumento do processamento cerebral, resultando em situações de êxtase e grande agitação, como a cocaína, crack, ecstasy, anfetaminas e cafeína (FOCCHI, 2004).

Entre as drogas psicoativas, algumas possuem propriedades reforçadoras. Reforço ou estímulo reforçador é a capacidade que a droga tem de criar e manter hábitos e comportamentos. Essa característica é considerada fundamental para que a droga seja capaz de induzir dependência. O reforço pode ser positivo ou negativo. Reforço positivo é a capacidade da droga de produzir efeitos agradáveis e sensações prazerosas. Reforço negativo é a capacidade da droga de diminuir sensações desagradáveis. Em muitos casos é difícil separar qual o tipo de reforço predomina em determinada situação (ALMEIDA, 2006).

Essas drogas com propriedade reforçadora, por induzirem a autoadministração, podem levar a estados de uso abusivo, dependência e adição. O termo adição é usado no DSM-IV (APA, 1994) preferencialmente ao termo dependência, para evitar confusão com o termo dependência física. Dependência física se refere às adaptações que levam a sintomas de abstinência na interrupção abrupta do uso de uma droga, que recebe a denominação de Síndrome de Abstinência. Essas adaptações são diferentes das adaptações que ocorrem na adição, na qual a principal característica é a perda de controle sobre o uso da droga, mesmo sob consequências adversas intensas (VOLKOW, LI, 2005). No padrão de comportamento abusivo, existem, de forma recorrente e significativa, consequências negativas do uso da droga, mas ainda não existe a presença de tolerância, síndrome de abstinência perda do controle sobre o uso da droga (KAPLAN, SADOCK, 1995).

A progressão do uso inicial à adição é influenciada por muitos fatores. Entre eles, a droga em si, a personalidade do usuário, e influências de outras pessoas e ambientais. A interação entre esses fatores é complexa e determina por que alguns indivíduos apresentam comportamentos aditivos e outros não.

O uso inicial da droga pode ser voluntário, na busca de prazer, das suas propriedades reforçadoras, mas, para a pessoa que apresenta adição, a escolha pelo uso da droga não é mais voluntária. Ocorre uma neuroadaptação semelhante ao que ocorre no aprendizado de uma tarefa e o indivíduo procura a droga mesmo na evidência de consequências pessoais negativas e graves (CHOU, NARASIMNHAN, 2005). No entanto, os mecanismos neurobiológicos que

determinam essa transição do uso controlado para o descontrolado ainda não estão totalmente esclarecidos. As recaídas no uso das drogas é o fator clínico mais difícil de ser controlado no tratamento da adição. Após longo período de abstinência, o craving (desejo compulsivo) pela droga ou a recaída pode ser iniciado pela presença da droga em si, por pistas ambientais que estejam associadas à droga ou pelo estresse (SHAHAN, HOPE, 2005).

No Brasil e no mundo, o uso de drogas psicoativas é muito alto. Em pesquisa desenvolvida por Carlini et al (2007) foi mostrado que a prevalência de uso na vida de qualquer droga, exceto tabaco e álcool, foi maior na região Nordeste do Brasil, onde alcançou 27,6%. A região com menos uso na vida foi a Norte com 14,4%. Considerando-se o país como um todo, a taxa foi de 22,8% da população. O menor uso na vida de álcool ocorreu na Região Norte (53,9%) e o maior na Sudeste (80,4%). Ainda, são observados mais dependentes de álcool para o sexo masculino..

1.2 KETAMINA

O cloridrato de ketamina produz efeitos tanto alucinógenos quanto estimulantes, sendo sintetizado pela primeira vez em 1962 pelo farmacêutico americano Calvin Stevens no laboratório Parke & Davis por ocasião de pesquisas para substituição dos anestésicos de fenciclidina (PCP), sendo nomeada inicialmente de "CI581" (SMITH, LARIVE, ROMANELLI, 2002). Usada principalmente como anestésico, produz um tipo de anestesia diferente denominada anestesia dissociativa que se caracteriza por um estado cataléptico. Este fenômeno parece resultar da dissociação funcional e eletrofisiológica entre os sistemas tálamo-neocortical e límbico (GARCIA, 2007).

Alguns estudos relatam um potencial antidepressivo da ketamina (BERMAN et al, 2000; ZARATE et al, 2006). Além disso, a ketamina é capaz de restabelecer psicoses em pacientes esquizofrênicos remitentes. Esta substância tem sido usada para avaliar sintomas positivos e negativos da esquizofrenia humana tais como os déficits auditivos e visuais; alterações nas regiões límbicas cortical, formação hipocampal, núcleo accumbens, e amigdala basolateral; aumento cerebral do fluxo sangüíneo no córtex cingulado anterior e redução cerebral do fluxo sanguíneo no hipocampo e córtex visual primário (UMBRICHT et al, 2000; DUNCAN et al, 2001).

Devido a suas ações farmacológicas entre elas, alucinógenas e estimulantes, na metade da década de 90, ela foi acionada ao DEA (Drug Enforcement Administration), órgão que classifica substâncias psicoativas, como uma droga emergente. Atualmente, seu uso é permitido apenas quando administrado por médicos e veterinários, sendo mais utilizada na indução e manutenção da anestesia (SMITH, LARIVE, ROMANELLI, 2002). Entretanto, o uso da ketamina não tem sido restrito à prática clínica e pesquisa, uma vez que, atualmente, tem sido frequentemente utilizada como droga de abuso pelos jovens em festas, denominadas de “club drug”. A associação entre diversas drogas de abuso são comuns nessas festas, podendo causar intoxicações fatais nos usuários (GLABE, 2004).

1.3 QUÍMICA E FARMACOCINÉTICA

A Ketamina, 2-(o-clorofenil)-2-(metilamino)-cicloexanona, é uma arilcicloalquilamina derivada da fenciclidina com peso molecular de 238 daltons e pKa de 7,5 (Figura 1.1). É comercialmente utilizada como uma mistura racêmica de dois isômeros opticamente ativos (enantiômeros), o S(+) e o R(-) associada aos conservantes cloreto de benzetônio e ao clorbutanol (KOHRS, DURIEUX, 1998; LUFT, MENDES, 2005) (Figura 1.2).

Fonte: http://cetamina-ffup.blogspot.com/2009/05/aspectos-estruturais.html. Acesso: 06/07/2012 Figura 1.1- Estrutura química Ketamina

Fonte: http://paginateste123.wordpress.com/caracteristicas-estruturais/. Acesso: 06/07/2012 Figura 1.2- Enantiômeros da Ketamina

Esses isômeros possuem propriedades farmacológicas diferentes. O FDA (Food and Drugs Administration), em 1992 alertou para o fato de que a separação de estereoisômeros não estava recebendo atenção adequada no desenvolvimento comercial de drogas. A despeito das dificuldades técnicas e do alto custo, o foco nesse horizonte poderia abrir novas possibilidades terapêuticas (LUFT, MENDES, 2005). Estudos em animais demonstraram que a S(+) ketamina tem aproximadamente quatro vezes mais afinidade para a área de ligação da fenciclidina no receptor NMDA do que a R(-) ketamina (PLENNINGER, DURIEUX, HIMMELSEHER, 2002). A S(+) ketamina é 2 vezes mais potente que a forma racêmica para prevenir a sensibilização central da medula espinhal (JAKSCH et al, 2002). Devido a S(+) ketamina ter uma maior afinidade pelo receptor e apresentar farmacocinética similar à forma racêmica, esta poderia ser uma droga clinicamente interessante (LAURETTI et al, 2000).

A ketamina é metabolizada através de oxidação pelas enzimas microssomais hepáticas em três metabólitos ativos: norcetamina, 5OH-cetamina e 4OH-cetamina, sendo a norcetamina o principal metabólito ativo, apresentando um terço a um quinto da potência da droga original. Todos os metabólitos são hidroxilados a hidroxinorcetina e em seguida conjugados a derivados glicuronídeos hidrossolúveis e excretados na urina. Além do fígado, o metabolismo ocorre em menor proporção nos rins, intestino e pulmões (DUVAL NETO, 2004; GARCIA, 2007). Apresenta alta lipossolubilidade e fraca ligação as proteínas plas-

máticas (10 a 30%), resultando em grande volume de distribuição (aproximadamente 3l.kg-1), logo a ação do fármaco é mais rápida. Seu clearance de eliminação é relativamente alto (1000 a 1600 mL.min-1), o que confere uma meia-vida curta em torno de 2 a 3 horas (GARCIA, 2007).

A norcetamina, principal metabólito da ketamina, tem um poder avaliado em torno de 20% da molécula inicial, ou seja, 1/3 a 1/4 da potência da droga original e surge no sangue dentro de 2 a 3 minutos após a injeção intravenosa de um bolus de ketamina, atingindo um pico plasmático em 30 minutos. Porém, suas concentrações são persistentes por mais de cinco horas após a administração, gerando uma eliminação lenta e um grande potencial de acúmulo (OLIVEIRA et al, 2004).

1.4 KETAMINA: MECANISMO DE AÇÃO

A neurofarmacologia da ketamina é complexa, uma vez que a mesma interage com vários tipos de receptores em diversos locais de ligação, incluindo os receptores de glutamato, tanto NMDA (N-metil-D-aspartato) quanto não-NMDA; opióides; gabaérgicos; serotonérgicos; além de agir, direta ou indiretamente, sobre as monoaminas (acetilcolina, noradrenalina e dopamina) (GARCIA, 2007).

O mecanismo primário de ação da ketamina dá-se pelo bloqueio dos receptores NMDA por ligação ao sítio da fenciclidina (PCP), localizado no interior do canal iônico (MAENG, ZARATE, 2007).

Os receptores de glutamato NMDA são receptores inotrópicos ativados pelo glutamato, principal neurotransmissor excitatório do SNC (Figura 1.3). O glutamato desempenha um importante papel na regulação da plasticidade sináptica, no aprendizado e memória, sendo encontrado em aproximadamente 80% dos neurônios (BANNERMAN et al, 1995). O canal do receptor é permeável ao cálcio e em menor grau ao sódio e ao potássio. Ligação simultânea do glutamato com a glicina, um co-agonista, é obrigatória para a ativação deste receptor. O magnésio de maneira voltagem-dependente bloqueia o canal em repouso e a abertura ocorre somente mediante despolarização e ligação simultânea dos “agonistas” (RANG et al, 2007).

Os receptores NMDA são áreas pós-sinápticas de ação da ketamina para reduzir a estimulação do SNC. Esta droga liga-se ao receptor da fenciclidina no canal NMDA e inibe a ativação do canal pelo glutamato de maneira não-competitiva. O S(+), seu componente levógiro, tem três a quatro vezes mais afinidade pelo receptor do que o isômero R(-), refletindo as diferenças observadas na sua potência analgésica e anestésica (PLENNINGER, DURIEUX, HIMMELSEHER, 2002).

Fonte: http://www.psiquiatriageral.com.br/cerebro/imagens/receptor_nmda.jpg. Acesso: 29/06/2012 Figura 1.3- Receptor NMDA

Como dito anteriormente, a ketamina exibe ação em diferentes receptores. Durante algum tempo não foi descrita nenhuma interação da ketamina com os receptores de glutamato não-NMDA, entretanto, foi descoberto, por meio de estudos com modelos animais, que esta droga também atua mediante nestes receptores, provavelmente, através do sistema glutamato/NO/GMPc. Existem várias classes de receptores de glutamato não-NMDA que são ativados seletivamente por agonistas dentre eles, quisqualato, AMPA (α-amino-3-hidroxi-5-

hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato) ou cainato. A ativação dos receptores não-NMDA estimula a produção de óxido nítrico (NO), que em seguida aumenta a concentração de GMPc. A ketamina age inibindo estes receptores com conseqüente inibição da óxido nítrico sintase (NOS), enzima necessária à formação de NO (GONZÁLES et al, 1995). A inibição NOS induzida pela ketamina, além de desenvolver um possível papel neuroprotetor e de ativação do sistema simpático, parece estar envolvida também com os efeitos analgésicos desta substância (GORDH, KARLSTEN, KRISTENSEN, 1995).

Foi observada uma interação da ketamina nos receptores opióides acoplados à proteína G, mas essa interação não parece ser responsável pela sua atividade analgésica (HUSTVEIT, MAURSET, OYE, 1995). Visto que, a naloxona, antagonista opióide, não é capaz de reverter o efeito analgésico da ketamina. Isto pode ser explicado por uma afinidade 10 a 20 vezes inferior pelos receptores opióides do que pelo receptor NMDA, sugerindo que essa interação com os receptores opióides não é o principal mecanismo de sua ação analgésica (KOHRS, DURIEUX, 1998).

Entretanto, os efeitos adversos psicomiméticos da ketamina parecem estar relacionados com os receptores opióides kappa, já que os agonistas kappa produzem efeitos similares (KOHRS, DURIEUX, 1998; RAEDER, STENSETH, 2000). A afinidade da ketamina pelos receptores opióides é a seguinte µ > κ > δ (SMITH et al, 1982), sendo que a S(+) ketamina apresenta afinidade duas a quatro vezes superiores pelos receptores µ e κ do que a R(-) ketamina.

Por fim, ainda foi visto que a ketamina tem ação sobre a neurotransmissão colinérgica, noradrenérgica, dopaminérgica e serotonérgica. A ketamina, em concentrações clínicas, inibe a liberação de acetilcolina mediada pelo receptor NMDA. A inibição pós- sináptica do receptor nicotínico não apresenta importância clínica. Nos receptores muscarínicos também ocorre uma inibição, sendo que o isômero levógiro S(+) apresenta duas vezes mais afinidade pelo receptor do que o isômero dextrógiro R(-). A afinidade da ketamina para esse receptor é 10 a 20 vezes menor do que a apresentada para receptores NMDA (LUFT, MENDES, 2005). Os efeitos adversos comportamentais da ketamina podem estar relacionados à inibição da transmissão colinérgica (DUVAL NETO, 2004).

A R(-) ketamina inibe a captação neuronal de noradrenalina e a S(+)-ketamina adicionalmente inibe a captação extra-neuronal, produzindo uma resposta sináptica prolongada e aumento da transferência de noradrenalina para dentro da circulação, que pode ser observada no sistema cardiovascular pelo aumento da pressão arterial, da freqüência cardíaca e do débito cardíaco (GARCIA, 2007).

A captação de dopamina também é inibida pela ketamina, o que pode levar a um aumento da atividade dopaminérgica central que pode estar relacionada com os fenômenos de dependência química. Os sistemas dopaminérgicos, cortical e subcortical, estão funcionalmente relacionados com o sistema glutamatérgico. Por sua vez, a disfunção deste poderia precipitar sintomas psicóticos relacionados à esquizofrenia. Estes sintomas têm sido descritos após o uso da ketamina e a explicação para isso é que o bloqueio dos receptores NMDA interfere com a neurotransmissão dopaminérgica, a qual está envolvida com a esquizofrenia. Essas evidências levaram diversos autores a pesquisarem modelos propícios para maiores estudos na área, despertando, assim, a ketamina como um possível modelo de esquizofrenia (VASCONCELOS et al, 2005).

Estudos demonstram que a captação neuronal de serotonina parece ser inibida pela ketamina, já que a metisergida, um antagonista serotonérgico (5-HT), é capaz de abolir o efeito analgésico da administração intratecal de ketamina. Isto implica que mecanismos serotonérgicos estão envolvidos nos efeitos analgésicos desta droga (MARTIN et al, 1988; CRISP et al, 1991). A inibição da captação de serotonina também está relacionada às propriedades emetisantes da ketamina, visto que, a administração concomitante de ondansetron, um antagonista seletivo dos receptores 5-HT3, inibe o efeito emetisante da ketamina por meio de sua ação nos receptores serotonérgicos (KOHRS, DURIEUX, 1998; TONELLI, ANDREATINI, 2000).

1.5 KETAMINA: EFEITOS FARMACOLÓGICOS

Em relação aos efeitos no sistema cardiovascular, a ketamina provoca aumento da pressão arterial, da frequência cardíaca e do débito cardíaco. A dose equipotente de S(+) ketamina, apesar de ser menor que a da mistura racêmica, causa alteração hemodinâmica semelhante (DOENICKE et al, 1992). No entanto, em contraposição à maioria dos agentes

anestésicos, a ketamina apresenta certa margem de segurança durante seu uso em pacientes com distúrbios cardiovasculares. No sistema respiratório a ketamina causa mínima depressão respiratória, além de ter um efeito broncodilatador e manter o reflexo faríngeo e esofagiano. O laringoespasmo suficiente para necessitar de intubação produzido pela ketamina ocorre apenas em 0,02% dos casos (GREEN, LI, 2000). Quando a ketamina é administrada lentamente, geralmente a respiração é mantida. Entretanto a injeção intravenosa rápida de ketamina pode produzir apnéia transitória. A apnéia é mais freqüente em neonatos (CRAVEN, 2007).

Os efeitos no sistema nervoso central provocados pela ketamina ainda se constituem um grande empecilho ao seu uso clínico abrangente (FISHER, CODERRE, HAGEN, 2000; VASCONCELOS et al, 2005). Em concentrações anestésicas causa efeitos dissociativos que são dependentes da dose e mais comuns em homens jovens e fortes. Os pacientes parecem estar em estado cataléptico, permanecendo com os olhos abertos e mantendo muitos reflexos, apesar de não serem seguramente protetores. Após sua administração, as pupilas dilatam-se moderadamente e ocorre nistagmo, lacrimejamento e salivação. Estes efeitos podem ser atenuados pelo uso concomitante de benzodiazepínicos, porém vale ressaltar que a amnésia promovida pela ketamina é menos pronunciada que por estes (OLIVEIRA et al, 2004).

Devido a sua ação dissociativa, a ketamina produz efeitos psicológicos indesejáveis, principalmente no período pós-operatório, denominados de reações emergenciais. Os mais comuns são: pesadelos, experiências extracorpóreas (sensação de flutuar fora do corpo) e ilusões. A incidência de alucinações varia de 5% a mais de 30% após doses usadas para indução anestésica e é mais comum em mulheres e menos comum em crianças. As pessoas com história de doença psiquiátrica apresentam alterações com maior frequência. A administração de grandes doses de ketamina por via intravenosa; de maneira rápida, causa mais efeitos psicomiméticos (OLIVEIRA et al, 2004). Doses repetidas de ketamina utilizadas para promover sedação ou analgesia, principalmente em pacientes queimados podem causar tolerância, acarretando em aumento significativo da dose para produzir o mesmo efeito. Essa tolerância dura cerca de 3 dias (CRAVEN, 2007).

1.6 KETAMINA: USOS TERAPÊUTICOS

 KETAMINA E ANESTESIA

A ketamina foi introduzida há aproximadamente 30 anos, com o intuito de atuar como uma droga monoanestésica que produzisse analgesia, perda da consciência e imobilidade (KOHRS, DURIEUX, 1998). Em decorrência de importantes efeitos colaterais, como alucinações, distúrbios proprioceptivos e a sensação de flutuar sobre o corpo, não conseguiu ampla aceitação clínica (LUFT, MENDES, 2005).

Entretanto, a ketamina tem importância clínica em algumas situações, como na indução da anestesia em pacientes com choque hemodinâmico; indução da anestesia em pacientes com asma ativa; sedação intramuscular em pacientes não cooperativos, particularmente em crianças; sedação em unidades de tratamento intensivo e na troca de curativos em pacientes queimados (KOHRS, DURIEUX, 1998).

 KETAMINA E ANALGESIA PREEMPTIVA

A cirurgia e a inflamação tecidual desencadeiam aferência nociceptiva que pode desenvolver sensibilização periférica e hiperalgesia primária, aumentando a responsividade medular para estímulos, nocivos ou não, devido ao fenômeno de wind-up, e outros mecanismos, com indução de sensibilização central e potencialização de longa duração. O bloqueio desses mecanismos, antes do seu desenvolvimento, pode prevenir o aparecimento da sensibilização central.

Desta forma, analgesia preemptiva tem como objetivo enfatizar que a sensibilização central é induzida por estímulo nocivo pré e pós-operatório, consistindo em administrar medicação antinociceptiva antes do início da cirurgia. Tem sido usada para reduzir a dor, o consumo de analgésicos, ou ambos durante toda a intervenção (LUFT, MENDES, 2005).

Os neurotransmissores excitatórios atuando através de receptores NMDA têm sido envolvidos no desenvolvimento da sensibilização central e na potencialização de longa duração (SCHULTE, SOLLEVI, SEGERDAHL, 2004). Essa observação estimulou a avaliação de antagonistas dos receptores NMDA em vários modelos de dor. Na prática

clínica, a ketamina representa um dos poucos antagonistas NMDA disponíveis, apresentando ainda propriedade analgésica não relacionada ao receptor NMDA, como a ativação do sistema inibitório descendente monoaminérgico, envolvidos na modulação de processos nociceptivos e geralmente ativados por opióides sistêmicos (PEKOE, SMITH, 1982; LODGE, JOHNSON, 1990).

A ketamina tem sido testada em animais e em humanos através de vários modelos de dor e nocicepção. Foi demonstrado, em um ensaio clínico aleatório, que pacientes ao receberem doses repetidas de ketamina (pré-incisional e no intra-operatório) apresentaram menores escores de dor, menor consumo de analgésicos e melhora do humor (ARGIRIADOU et al, 2004).

 KETAMINA E DEPRESSÃO

A depressão é uma das mais prevalentes e dispendiosas psicopatologias, causando morbidade e mortalidade em todo mundo. A farmacoterapia da depressão é cara e largamente prescrita pelos médicos, porém menos da metade dos pacientes alcançam completa remissão após terapia com um único antidepressivo (GARCIA et al, 2008). É amplamente aceito que pelo menos 20% dos pacientes com depressão não respondem adequadamente ao tratamento com as drogas antidepressivas, sendo necessária a descoberta de novas drogas antidepressivas (CROWN et al, 2002).

Além disso, as drogas utilizadas no tratamento da depressão demoram cerca de semanas a meses para produzir um efeito, resultando em morbidade considerável e risco aumentado para comportamento suicidas, principalmente nos primeiros 9 dias após o inicio do tratamento (JICK, KAYE, JICK, 2004).

Estudos revelam que receptores NMDA têm um importante papel na etiologia das psicopatologias como a ansiedade e a depressão (KRYSTAL et al, 1994; JAVITT, 2004). Diversos estudos pré-clínicos tem demonstrado que antagonistas dos receptores NMDA, como o MK-801, AP7, CPP, neramexane e outros exibem efeitos ansiolíticos e antidepressivos em ratos (TRULLAS, SKOLNICK, 1990; MAJ et al., 1992; SKOLNICK et al., 1996; MATHEUS, GUIMARÃES, 1997; PRZEGALINSKI et al., 1997; ADAMEC et al., 1999; MENARD, TREIT, 2000; MOLCHANOV, KOS et al., 2006a).

Estudos clínicos sugerem que a administração aguda de ketamina reduz os sintomas de depressão em pacientes que sofrem de depressão maior (BERMAN et al, 2000), e que pacientes com este tipo de depressão quando tratados com uma única dose de ketamina apresentaram rápidos efeitos antidepressivos e esses efeitos permaneceram por cerca de 1 semana (ZARATE et al, 2006).

Evidências sugerem que o BDNF (Brain-derived-neurotrophic factor), uma das inúmeras proteínas endógenas envolvidas na manutenção da sobrevida e no crescimento dos neurônios cerebrais e periféricos (LEWIN, BARDE, 1996), pode estar relacionado com diversas psicopatologias. Dentro deste contexto, níveis reduzidos de BDNF foram encontrados em cérebros posmortem de pacientes com depressão (KAREGE et al, 2002) e foi visto que a infusão cerebral de BDNF produz efeitos antidepressivos em ratos SIUCIAK et al, 1997).

Alguns estudos têm demonstrado que o tratamento antidepressivo crônico, mas não o agudo induz um aumento da expressão de BDNF em hipocampo de roedores (NIBUYA, NESTLER, DUMAN, 1996; DE FOUBERT et al, 2004). Interessantemente, um estudo realizado por Garcia e colaboradores (2008), mostrou que o tratamento agudo com altas doses de ketamina (50mg/kg) aumentou os níveis de BDNF em hipocampo de ratos o que pode indicar que esse seria o provável mecanismo pelo qual a ketamina produziria ação antidepressiva rápida.

 KETAMINA E NEUROPROTEÇÃO

A hipóxia e a isquemia cerebral desencadeiam uma cascata fisiopatológica que culmina em destruição e morte celular (KOHRS, DURIEUX, 1998). Neurônios isquêmicos liberam glutamato e causam uma superativação dos receptores NMDA que, por sua vez aumentam os níveis intracelulares de cálcio e resulta em morte celular (LUFT, MENDES, 2005). Dessa forma, os antagonistas dos receptores NMDA têm sido alvo de estudos para a investigação de seus possíveis efeitos neuroprotetores.

Um estudo com animais mostra que a ketamina administrada em grandes doses antes e após a lesão isquêmica reduziu o neurodéfict hipóxico e isquêmico, porém a administração de pequenas doses somente após a lesão não demonstrou efeito (HOFFMAN et al, 1992). Outro

estudo que utilizando modelo de traumatismo cerebral em ratos demonstrou que a administração intraperitoneal de ketamina (180 mg/kg) 2 horas após a lesão reduziu o tamanho do infarto e o déficit neurológico (SHAPIRA et al, 1994).

Há muitas controvérsias a respeito da neuroproteção induzida por ketamina devido a diferenças de modelos experimentais, doses, inicio e duração do tratamento, entre outros fatores. Tem sido observado uma proteção praticamente completa do hipocampo após o tratamento prévio com ketamina (MARCOUX, 1993), porém em outros estudos foi demonstrado que a ketamina pode intensificar a lesão neuronal durante episódios isquêmicos breves e exercer um efeito benéfico após uma isquemia prolongada (CHURCH, ZEMAN, 1991). Já outros autores observaram que a ketamina não exerce efeitos sobre a isquemia global, enquanto outros observaram efeitos positivos (JANTZEN, 1994).

No entanto, a ketamina pode ser neurotóxica. Um estudo evidenciou que neurônios do córtex cerebral de ratos estavam morfologicamente danificados após a aplicação de fenciclidina ou ketamina, porém isto poderia ser evitado pela administração de anticolinérgicos, diazepam ou barbitúricos (KOHRS, DURIEUX, 1998).

Portanto, embora a ketamina pareça ser uma droga promissora para o tratamento de pacientes com isquemia/hipóxia cerebral aguda, novos estudos ainda são necessários para inseri-la na prática clínica.

1.7 KETAMINA COMO DROGA DE ABUSO

O uso da ketamina não está restrito à prática clínica e pesquisa, uma vez que, atualmente, tem sido frequentemente utilizada como droga de abuso em clubes noturnos e festas conhecidas como “raves” (ARDITTI et al, 2002). O primeiro caso de uso deste fármaco como droga de abuso foi descrito ainda no ano de 1971 na costa oeste dos Estados Unidos que, devido aos seus efeitos psicomiméticos, lhe atribuiu a expressão de “anestésico dissociativo” (SIEGEL, 1978). No Reino Unido, no início dos anos 90, o uso recreacional da ketamina disseminou-se largamente (JANSEN, 1993).

Embora a cena contemporânea das “dance drugs” seja um fenômeno global, presente em muitos países, ela é um reflexo da expressão da cultura local. Durante os últimos anos o

termo “club drugs” tem sido utilizado para definir um grupo heterogêneo de substâncias químicas em permanente evolução que é consumida com fins recreacionais. Estas substâncias vêm sendo extensivamente utilizadas, primeiramente pela cultura “rave” e depois pelo então denominado “club culture”. Estes movimentos são caracterizados pela busca de sensações amplificadas, combinando música eletrônica, uma “maratona” de dança e drogas de abuso. Após alguns anos do predomínio do consumo de anfetaminas, atualmente o uso de outras substâncias está aumentando, principalmente drogas com efeitos alucinógenos, como a ketamina (WHO, 2006).

Devido ao aumento de casos do uso abusivo desta droga na década de 1990, o FDA a classificou como droga de abuso. Trata-se de uma substância que age no sistema límbico e córtex cerebral, aumentando a excitação elétrica dessas regiões, além dos gânglios da base e hipocampo, causando elevação do tônus simpático (AGUAVIVA, 2003).

Os usuários recreacionais da ketamina a denominam popularmente de “Special K”, “Vitamina K” ou simplesmente “K” (JANSEN, 2001 DARRACOT-CANKOVIC; DILLON, COPELAND, JANSEN, 2003) e são atraídos pelos efeitos da droga, tais como elevação do humor, euforia, distorções visuais e auditivas, sensações eróticas, empatia, sensação de flutuação sobre o próprio corpo, dentre outros (FREESE, MIOTTO, REBACK, 2002; GLABE, 2004).

O uso recreativo da ketamina nos Estados Unidos, em especial por usuários de drogas injetáveis, vem aumentando em grupos de risco, como homossexuais masculinos, e jovens marginalizados (COPELAND, DILLON, 2005).

Pesquisas com usuários de drogas injetáveis revelaram que a ketamina não é a primeira droga injetável e nem a droga de escolha. Freqüentemente, a primeira injeção de ketamina ocorre no contexto do uso de polidrogas e em idades mais avançadas (média de 19 anos) (LANKENAU et al, 2007). Outro estudo realizado entre usuários de ecstasy mostra que 29,5% destes fizeram uso de polidrogas e que a ketamina era a droga mais comumente associada (60%) (YEN, HSU, CHENG, 2007).

Estudos prévios relatam que a ketamina tem ação semelhante a outras drogas de abuso, tais como cocaína e anfetamina, com capacidade de induzir sensibilização após a

administração repetida (ROBINSON, BERRIDGE, 2003). Considerando que a sensibilização está relacionada com a dependência causada por estas drogas, estudos demonstraram que o uso repetido da ketamina pode, de fato, levar a um padrão compulsivo de seu uso, mesmo após a administração de baixas doses (TRUJILLO, ZAMORA, WARMOTH, 2008). Desta forma, ocorrendo ou não a dependência após o uso repetido desta substância, os dados apresentados pelo referido estudo, mostram alterações comportamentais e psicoativas que podem causar prejuízos aos usuários.

Muitos dos efeitos psicomiméticos dessa droga são transitórios, reversíveis e influenciados pelas condições de tempo, dose e administração (KEILHOFF et al, 2004). Doses baixas de ketamina, utilizadas pelos adictos, produzem melhora no humor e sintomas psiquiátricos como perda da realidade, despersonalização, alucinações visuais, sonhos prazerosos ou não (ZACNY, GALINKIN, 1999), perda de atenção, de habilidade de aprendizado e de memória. Doses mais altas causam vômitos, fala arrastada, amnésia, redução da função motora, delírio com ou sem agitação psicomotora, movimentos tônicos-clônicos, taquicardia ou bradicardia, hipotensão e depressão respiratória (JANSEN, 1993).

Usuários de altas doses reportam experiências como saída do próprio corpo ou proximidade à morte, como também distúrbios visuais ou “flashbacks” que podem durar dias ou semanas após a exposição. Os possíveis efeitos sobre a cognição ou psiquiátricos, produzidos pelo uso da droga em longo prazo, não foram suficientemente estudados em usuários (JANSEN, DARRACOT-CANKOVIC, 2001). Tolerância e dependência foram relatadas (DOTSON, ACKERMAN, WEST, 1995), porém estudos adicionais são necessários para se determinarem os sintomas da retirada e um tratamento eficaz para ela.

Diversas pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de revelar as alterações comportamentais e neuroquímicas causadas pelo uso recreacional da ketamina. Estudo com animais, utilizando-se modelos de depressão e ansiedade revelou que o tratamento agudo com ketamina, nas doses de 30 e 100 mg/kg, no teste do nado forçado induziu um comportamento depressivo. A ketamina em ambas as dosagens causou hiperlocomoção, podendo estar relacionado com ação de agonista dopaminérgico. Entretanto, a ketamina em doses altas causou inicialmente hipolocomoção, sugerindo uma ativação dos neurônios noradrenérgicos e serotonérgicos (HAYASE, YAMAMOTO, YAMAMOTO, 2006).

Em roedores e macacos, doses agudas e subanestésicas de antagonistas do receptor NMDA produzem fenômenos comportamentais, tais como hiperlocomoção, aumento do comportamento estereotipado, déficits cognitivos e sensoriomotores e impedimento da interação social. Antagonistas do receptor NMDA aumentam os níveis extracelulares da dopamina e glutamato bem como os níveis de noradrenalina e acetilcolina no córtex pré- frontal (VERMA, MOGHADDAM, 1996; O’DONNELL, GRACE, 1998).

A ketamina utilizada em doses subanestésicas induz um quadro de esquizofrenia em humanos, incluindo sintomas positivos e negativos e alterações na eletrofisiologia do processo de informação cortical (ORANJE et al, 2000; UHLHAAS et al, 2007). Muitos investigadores sugerem que a exposição repetida do receptor NMDA aos antagonistas pode levar a um quadro de esquizofrenia superior aos efeitos de uma única dose destas drogas. A ketamina e a fenciclidina, antagonistas não-competitivos do receptor de NMDA, exacerbaram sintomas psicóticos em pacientes esquizofrênicos e induziram sintomas positivos e negativos semelhantes a essa doença em indivíduos saudáveis (ADLER et al, 1999).

Estudos também demonstraram que a administração de ketamina (0,1 ou 0,5 mg/kg) em indivíduos saudáveis produziu comportamento semelhante aos sintomas positivos e negativos da esquizofrenia, bem como alterações da percepção, prejuízo na fluência verbal e sintomas similares ao estado dissociativo (KRYSTAL et al, 1994). Desta forma, os usuários recreacionais de ketamina podem desenvolver sintomas semelhantes ao da esquizofrenia, já que fazem uso freqüente desta droga. Estudo recente revelou que usuários recreacionais de ketamina desenvolveram aumento na dissociação e sintomas similares a esquizofrenia na noite em que fizeram uso da droga. Porém, após 3 dias do uso da ketamina estes achados não foram observados (UHLHAAS et al, 2007).

Apesar das ações psicomiméticas serem os principais efeitos adversos decorrentes do uso recreacional de ketamina, outros efeitos tem sido relatados. Estudos mostraram que 10 usuários recreacionais de ketamina por 1 a 4 anos apresentavam diversos sintomas urinários do trato inferior, como disúria, aumento da frequencia, urgência urinária, incontinência e hematúria. Além disto, todos os usuários tiveram uma diminuição da capacidade funcional da bexiga para cerca de 30 a 100 ml diária. A maioria apresentava hidronefrose e cerca da

metade apresentava algum prejuízo renal. Portanto, estes achados sugerem que o uso crônico de ketamina pode acarretar em insuficiência renal crônica (CHU et al, 2007). A etiologia dessas alterações ainda é desconhecida, podendo ser devido a danos cerebrais ou na medula espinhal a causa para essa disfunção. Outra causa sugerida é que ocorram efeitos tóxicos diretos da ketamina e seus metabólitos sobre a mucosa do trato urinário inferior. Além disto, os usuários de ketamina, muitas vezes, usam outras drogas que poderiam colaborar com o aparecimento dessa disfunção (CHU et al, 2007). Novas investigações são necessárias para determinar a exata causa dessa patologia.

RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

O consumo de drogas tem se mostrado um dos mais complexos e inquietantes fenômenos de nossos tempos, exigindo que o governo e a sociedade partilhem a responsabilidade na busca de alternativas que levem à sua melhor compreensão e abordagem. Um dos maiores problemas clínicos enfrentados no combate ao vício das drogas é a recaída. Estudos mostram que usuários são suscetíveis à volta ao consumo de drogas de abuso mesmo após longos períodos de retirada ou abstinência (FOCCHIA; LEITE; SCIVOLETTOC, 2001).

O uso da ketamina como droga de abuso vem aumentando no mundo, inclusive no Brasil. No entanto, os efeitos adversos que esta pode ocasionar quando usada de forma abusiva e indiscriminada ainda não foram suficientemente estudados. Os fenômenos de tolerância e dependência têm sido descritos, mas estudos adicionais são necessários para se determinar os sintomas de abstinência, assim como formas eficazes de tratá-la.

Sintomas de ansiedade e depressão consistem em frequentes manifestações iniciais da síndrome de abstinência ao uso continuado de drogas de abuso (GAWIN, 1991), tendo sido observados tanto em relatos clínicos quanto em experimentos com animais (PAINE; JACKMAN; OLMSTEAD, 2002).

Alguns estudos sugerem que a ketamina, assim como a cocaína e outras drogas de abuso, induz também sensibilização após a administração repetida (ROBINSON, BERRIDGE, 2003), o que pode, de fato, levar a um padrão compulsivo de uso (TRUJILLO; ZAMORA; WARMOTHET, 2008), com consequentes alterações comportamentais e psicoativas prejudiciais aos usuários.

A partir do exposto verifica-se que a pesquisa realizada sobre as alterações comportamentais induzidas pela ketamina utilizam diferentes modelos animais, sendo os resultados contraditórios. Dessa forma, decidiu-se ampliar os conhecimentos dos efeitos da ketamina através da observação das alterações comportamentais nos modelos de ansiedade e depressão provocadas pelo tratamento agudo e subcrônico com ketamina em camundongos.

Como já foi dito anteriormente, os antagonistas NMDA, como a ketamina, são capazes de induzir sintomas similares ao da esquizofrenia. Apesar da patogênese da esquizofrenia permanecer desconhecida, há indícios de que pode haver uma relação entre estresse oxidativo e essa doença (REDDY, YAO, 1996). Dessa forma, decidiu-se avaliar a participação do estresse oxidativo após a administração aguda de ketamina em córtex pré-frontal de camundongos.

OBJETIVOS

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar as alterações comportamentais de ansiedade e depressão em camundongos submetidos a diferentes tratamentos com ketamina (agudo, subcrônico e abstinência de 24h), bem como investigar o envolvimento do estresse oxidativo em córtex pré-frontal de camundongos após tratamento agudo com ketamina.

3.2 ESPECÍFICOS

 Determinar as alterações comportamentais provocadas por diferentes tratamentos com ketamina (agudo, subcrônico e abstinência de 24h) em camundongos, através de modelos experimentais de ansiedade (Campo Aberto, Labirinto em Cruz Elevado) e depressão (Nado Forçado e Suspensão da Cauda).

 Investigar o envolvimento do estresse oxidativo após a administração aguda de ketamina, determinando a atividade da catalase e os níveis de TBARs, nitrito e GSH em córtex pré- frontal de camundongos após o tratamento agudo.

MATERIAIS E MÉTODOS

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 DROGAS E REAGENTES

Drogas/Reagentes Origem Água Destilada Deionizador Álcool etílico P.A. Quimex, Brasil Ketamina Cristália®, Brasil

4.2 EQUIPAMENTOS

Equipamentos Origem Agitador de tubos Modelo 251, FANEN, SP, Brasil

Balança Analítica Modelo H5, Mettler, Suíça Balança para animais Filizola, Brasil Campo Aberto Fabricado no próprio laboratório Centrífuga refrigerada Modelo Marathon 26 KMR, Fisher Scientific

Cronômetro Incoterm, Brasil Cubetas de quartzo Hellma Deionizador USF, Elga, USA Detector eletroquímico L-ECD-6ª, Shimadzu Corp., Japan

Equipamento de Millipore para Millipore Apparatus, Bedford, MA, USA filtração à vácuo Espectrofotômetro Modelo Beckman DU 640B, Fullerton, CA, USA

Freezer a – 70 ºC Modelo ULT 2586-3D14, Revco Scientific, Inc. Asheville, N.C. ,USA Homogeneizadores manuais Bellico, USA

Labirinto em cruz elevado Fabricado no departamento Medidor de pH, modelo B374 Micronal, SP, Brasil Pipetas Automáticas H.E., Dinamarca Recipiente do Nado Forçado Fabricado no próprio laboratório Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc.USA Vidrarias Pirex, Brasil

4.3 ANIMAIS

Em todos os experimentos foram utilizados camundongos albinos da espécie Mus musculus da variedade Swiss, adultos, do sexo masculino, pesando entre 25-35 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, mantidos em ciclo de iluminação ambiental (claro/escuro) de 12 horas, com temperatura em média de 25ºC, recebendo ração padrão tipo Purina e água ad libitum.

Os experimentos realizados estão de acordo com o guia de cuidados e usos de animais de laboratório do Departamento de saúde e serviços humanos dos Estados Unidos da América (EUA) e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas Animais da Universidade Federal do Ceará (UFC), sob protocolo nº: 41/09.

4.4 PREPARO DAS DROGAS

A Ketamina (cloridrato de Ketamina proveniente do laboratório Cristália) foi dissolvida em água destilada momentos antes da administração por via intraperitoneal em um volume final de 0,1 mL para cada 100 g de peso do animal.

4.5 TRATAMENTO DOS ANIMAIS E PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Os animais foram divididos em grupos experimentais com cerca de 8 animais em cada. Em seguida, os animais foram tratados com ketamina (5, 10 e 20mg/kg) agudamente e durante 7 dias consecutivos, por via intraperitoneal. As alterações comportamentais foram avaliadas 10 min após a administração aguda, no sétimo dia após a administração subcrônica e vinte e quatro horas (24h) após a última administração subcrônica de ketamina. Para isto, foram utilizados os testes do “Campo Aberto (TCA)”, “Labirinto em Cruz Elevado (LCE)”, “Nado Forçado” (TNF) e “Suspensão da Cauda” (TSC) para a investigação de possíveis efeitos de ansiedade e depressão provocados pelo tratamento com ketamina.

Após os testes comportamentais, os animais foram sacrificados e a estrutura cerebral córtex pré-frontal foi retirada para os testes neuroquímicos. Posteriormente, foi determinada a atividade da catalase e os níveis de TBARs, nitrito e GSH em córtex pré-frontal, com o intuito de se avaliar a participação do estresse oxidativo nas alterações neuroquímicas.

4.6 PROTOCOLO DOS EXPERIMENTOS COMPORTAMENTAIS

4.6.1 Avaliação da Atividade Ansiolítica

 4.6.1.1 Teste do Campo Aberto (TCA)

Este teste foi realizado para testar a atividade exploratória do animal (ARCHER, 1973). O aparato para camundongos é feito de acrílico (paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x 15 cm) e dividido em 9 quadrantes iguais (Quadro 1). Após 10 min da administração aguda, no sétimo dia após a administração subcrônica e vinte e quatro horas (24h) após a última administração subcrônica de ketamina, os animais, um por vez, foram colocados no centro do campo aberto onde o número de cruzamentos com as quatro patas (atividade locomotora espontânea; ALE) foram registrados durante um tempo de 5 minutos.

Este teste é considerado como um bom modelo animal de ansiedade por sua sensibilidade bidirecional a tratamentos farmacológicos, podendo avaliar o comportamento semelhante à ansiedade em várias espécies, incluindo animais transgênicos e camundongos knockout (CAROLA et al., 2002). Além disso, o TCA pode também ser utilizado para examinar os efeitos de agentes físicos não farmacológicos, como exposição ao predador e/ou procedimentos semelhantes, obtendo-se como resultado uma avaliação etiológica detalhada (CHOLERIS et al., 2001).

QUADRO 4.1 Esquema do Teste do Campo Aberto.

 4.6.1.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)

O modelo LCE (LISTER, 1987) consiste de dois braços abertos opostos (30 x 5 cm) e dois fechados (30 x 5 x 25 cm), também opostos, em forma de cruz (Quadro 2). Os braços abertos e fechados estão conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). A plataforma, as paredes laterais dos braços fechados são confeccionadas em acrílico transparente e o chão em acrílico preto. O aparelho está elevado a uma altura de 45 cm do nível do chão. Após 10 min. da administração aguda, no sétimo dia após a administração subcrônica e vinte e quatro horas (24h) após a última administração subcrônica de ketamina, os animais, um por vez, foram colocados no centro do aparelho com a cabeça voltada para um dos braços fechados e o seu comportamento observado por 5 minutos. As medidas comportamentais registradas no LCE foram: número de entradas e o tempo despendido nos braços abertos e nos fechados. A frequência total de entradas é obtida pela soma simples das frequências de entradas nos braços abertos e nos fechados. Para análise estatística dos dados e confecção dos gráficos a percentagem de entradas nos braços abertos é calculada dividindo-se a frequência de entradas nos braços abertos pela frequência total de entradas, e esse índice multiplicado por 100. De maneira semelhante é calculada a percentagem do tempo em que os animais permanecem nos braços abertos. Dessa forma os parâmetros levados em consideração para

análise estatística são: número de entradas nos braços abertos (NEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA), percentagem de entrada nos braços abertos (PEBA) e percentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA).

QUADRO 4.2 Esquema do Teste do Plus Maze.

Teste Plus Maze

Ketamina (5, 10 e 20mg/kg) ou salina i.p. agudamente ou por 7 dias 5 minutos

10 min ou 24h de abstinência

• Número de entrada no braço aberto (NEBA); • Percentagem de entrada no braço aberto (PEBA); • Percentagem do tempo de permanência braço aberto (PTBA); • Tempo de permanência no braço aberto (TPBA).

•

•Percentagem de permanência no braço aberto (PTBA)

4.6.2 Avaliação da Atividade Antidepressiva

 4.6.2.1 Teste do Nado Forçado (TNF)

Para o experimento (PORSOLT et al., 1977) foram utilizados tanques de 22 cm de diâmetro e 40 cm de altura contendo água fresca a 23±1ºC até a metade do tanque, cerca de 20 cm (Quadro 3). Após 10 min. da administração aguda, no sétimo dia após a administração subcrônica e vinte e quatro horas (24h) após a última administração subcrônica de ketamina, os animais foram colocados, um por vez, no tanque onde o tempo de imobilidade, em segundos, foi contado durante cinco minutos. O animal foi considerado imóvel quando

permaneceu flutuando na água, fazendo apenas movimentos suaves necessários para manter a cabeça acima da água.

QUADRO 4.3 Esquema do Teste do Nado Forçado.

Teste Nado Forçado

Ketamina (5, 10 e 20mg/kg) ou salina i.p. 5 minutos agudamente ou por 7 dias

10 min ou 24h de abstinência

• Tempo de Imobilidade

 4.6.2.2 Teste da Suspensão da Cauda (TSC)

Após 10 min. da administração aguda, no sétimo dia após a administração subcrônica e vinte e quatro horas (24h) após a última administração subcrônica de ketamina, os animais, um por vez, foram suspensos, presos com uma fita adesiva a cerca de 1 cm da ponta da cauda, numa plataforma 58 cm acima da bancada, durante 6 minutos (STERU et al., 1985). O parâmetro observado foi o tempo de imobilidade do animal, em segundos (Quadro 4).

QUADRO 4.4 Esquema do Teste da Suspensão da Cauda.

Teste da Suspensão da Cauda

Ketamina (5, 10 e 5 minutos 20mg/kg) ou salina i.p. agudamente ou por 7 dias

10 min ou 24h de abstinência

• Tempo de Imobilidade

4.7 PROTOCOLO DOS EXPERIMENTOS NEUROQUÍMICOS

4.7.1 Dissecação das Áreas Cerebrais

Para a realização do estudo neuroquímico foi dissecado a área cerebral córtex pré-frontal. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e, em seguida, os encéfalos foram retirados e colocados sobre papel alumínio numa placa de petri com gelo. Para a retirada do córtex pré-frontal (CPF), a porção anterior dos lobos frontais (em torno de 1,5 mm a partir do bulbo olfatório) foi removida e feita uma secção bilateral com o auxílio de uma tesoura de microdissecação (MACHADO, 1985) (Figura 4.1). Como as áreas corticais dos ratos/camundongos são geralmente menos evoluídas, menos diferenciadas e menos segregadas que o córtex cerebral de primatas, existia uma controvérsia na literatura se realmente primatas e roedores possuíam córtex frontal. A conclusão (UYLINGS et al., 2003) é que estes animais possuem um córtex frontal que pode ser definido anatomicamente e funcionalmente como córtex pré-frontal, o qual é subdividido em uma

região orbital-símile e outra região que pode incluir as estruturas dorsolateral e anterior cingulado- símile.

Fonte: UYLINGS et al., 2003 Figura 4.1 Representação da região anatômica no camundongo referente ao córtex pré- frontal. Nos roedores as áreas do cingulado anterior, pré-límbica e infralímbica formam o córtex pré-frontal. PL-área cortical pré-límbica; IL- área infralímbica cortical; MO – áreas cortical orbital medial; ACV- área anterior do cingulado ventral.

4.8 DETERMINAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO ESTRESSE OXIDATIVO

4.8.1 Determinação da enzima catalase

 Método

A atividade da catalase foi medida pelo método que usa o peróxido de hidrogênio para gerar

H2O e O2 (MAEHLY, CHANCE, 1954). Desta forma a atividade da catalase foi medida pelo grau desta reação de transformação.

 Procedimento experimental

Imediatamente após dissecação das áreas cerebrais, estas área foram homogeneizada em tampão fosfato 0,05 M, pH 7,0 a 10 % (peso/volume). O primeiro passo para determinação da atividade da catalase é o preparo do meio de reação que é constituído por 9 mL de peróxido de hidrogênio diluído em água destilada (1/1000) em 0,5 mL de tampão tris-HCl 1 M EDTA 5mM, pH 8 e 0,5 mL de água destilada. A amostra (20 L) após centrifugada a 10.000 Xg por 5 min foi adicionada a 980 L do meio de reação. Após 1 min, a absorbância inicial foi registrada e a final foi lida após 6 min. O comprimento de onda utilizado foi de 230 nm. A curva padrão foi feita utilizando catalase purificada (Sigma, MO, USA) sob condições idênticas às do ensaio. As proteínas foram determinadas utilizando o método de LOWRY et al. (1951).

 Soluções reagentes

 H2O2 diluído 10 L de peridol 30 % foram diluídos em água destilada q.s.p. 10 ml.

 Tampão tris-HCl 1M EDTA 5mM Foram pesados 12,11 g de trizma base e 0,1861 g de EDTA e diluídos para 100 mL de água destilada e o pH foi ajustado para 8,0 com ácido clorídrico.

4.8.2 Determinação da Peroxidação Lipídica

 Método

A peroxidação lipídica é uma das mais importantes expressões orgânicas do estresse oxidativo induzido pela reatividade de radicais livres do oxigênio. O método mais empregado para a determinação do MDA (malonialdeído) em amostras biológicas é baseado na sua reação com o ácido tiobarbitúrico (TBA). Nesta reação, duas moléculas de TBA reagem estequiometricamente com uma molécula de MDA para formar uma solução de cor rosa, que tem absorbância máxima em pH ácido em 532 a 535 nm. O coeficiente de extinção deste cromóforo num comprimento de onda de 535 nm e pH 1,0 é de 1,56 x 105 M-1. O método utilizado neste experimento foi descrito por HUANG et al., (1998), com algumas modificações.  Procedimento Experimental

As áreas cerebrais foram homogeneizadas a 10 % com tampão fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,4. Em seguida, 63µL de cada homogenato foi misturado com 100 µL de ácido perclórico à 35% e, depois foram centrifugada (5000 rpm/10 min). 150 µL das frações dos sobrenadantes foram aspirados e misturados com 50 µL ácido tiobarbitúrico 1,2% e então aquecido em um Banho Maria com água fervente (100 ºC) por 30 min. Após o resfriamento, a leitura foi feita em ELISA com comprimento de onda ajustado para 532 nm. Os resultados foram expressos como mol/mg de proteína.

4.8.2 Determinação de Nitrito

A fim de avaliar os efeitos do tratamento agudo com ketamina na produção de óxido nítrico (NO), os níveis de nitrito–nitrato foram determinados em homogenatos das áreas cerebrais de camundongos, imediatamente após a decapitação em todos os grupos. Após centrifugação (800 × g/10 min), o sobrenadante dos homogenatos foram aspirados e a produção de NO foi determinada com base na reação de Griess (VERDE et al., 1981; RADENOVIC, SELAKOVIC, 2005). Brevemente, foram incubados 100 μL do sobrenadante com 100 μL de reagente de Griess (sulfanilamine em 1% H3PO4/0.1% N-(1-naphthyl)-etilenodiamina dihydrochloride/1%H3PO4/distilled água, 1: 1: 1: 1) à temperatura ambiente por 10 min. A absorbância foi medida em 550 nm através de um leitor de microplate. A curva padrão foi preparada com várias concentrações de NaNO2 (variando de 0,75 a 100 μM) e foi expressa em μM.

4.8.3 Determinação dos Níveis de GSH

Os níveis de GSH foram avaliados para estimar as defesas endógenas contra o estresse oxidativo. O método baseou-se na reação do reagente de Ellman (DTNB) com grupos tiol livre. Os homogenatos à 10% (w/v) em EDTA 0.02 M foram adicionados à solução de tricloroacético à 50%. Após a centrifugação (3000 rpm/15 min), o sobrenadante dos homogenatos foram aspirados e misturados com tampão 0.4 M Tris-HCl, pH 8.9 e 0.01 M DTNB. Os níveis de GSH foi determinado em absorvância de 412 nm através de um leitor de microplate e expressa como ng de GSH/g tecido (SEDLAK, LINDSAY, 1998).

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para comparações múltiplas foi utilizada Análise de variância (ANOVA) e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc, dados não paramétricos foram analisados pelo teste Student t. Em todas as análises estatísticas, os valores foram representados pela Média ± Erro Padrão da Média (EPM) com o número de animais entre parênteses e foi considerado o nível crítico para rejeição da hipótese de nulidade menor que 0,05 (p<0,05). Os asteriscos (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) caracterizam o grau de significância.

RESULTADOS

5 RESULTADOS

5.1 EFEITOS DA KETAMINA NO TRATAMENTO AGUDO E SUBCRÔNICO.

5.1.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA KETAMINA EM MODELOS DE ANSIEDADE.

5.1.1.1 Teste do Campo Aberto

O parâmetro analisado neste teste foi a atividade locomotora espontânea (ALE), e o resultado foi expresso como número de travessias. No tratamento agudo, os animais foram tratados com ketamina 5, 10 e 20mg ou salina por via i.p uma única vez e o experimento foi realizado 10 min após a administração. Enquanto que no tratamento subcrônico, os animais foram tratados por 7 dias consecutivos com ketamina 5, 10 e 20mg ou salina por via i.p. e o experimento foi realizado 10 minutos após a última administração.

No tratamento agudo a ketamina, por via intraperitoneal, aumentou significativamente a atividade locomotora em todas as doses utilizadas [Ket 5mg: 74,88 ± 3,32 (8) ***; Ket 10mg:

109,40 ± 7,21 (8) ***; Ket 20mg: 83,67 ± 5,02 (8)] ***, comparando com o controle [cont.:

52,93 ± 1,85 (16)]. No tratamento subcrônico, a ketamina também aumentou significativamente a atividade locomotora em todas as doses utilizadas [Ket 5mg: 39,67 ±

2,17 (7)*; Ket 10mg: 43,00 ±3 ,77 (7) **; Ket 20mg: 55,57 ± 4,64 (7) ***] quando comparado com o controle [25,40 ± 1,60 (7)] (Figura 5.1).

140

120 ***

100 *** 80 ***

60 *** ** * 40

Número deTravessias 20

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg TRATAMENTO AGUDO TRATAMENTO SUBCRÔNICO

FIGURA 5.1 - Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina via intraperitoneal, sobre a atividade locomotora espontânea no teste do campo aberto em camundongos durante 5 minutos de observação. Controle (veículo), ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p 10 min antes do experimento (tratamento agudo) ou foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 7º dia (tratamento subcrônico). Os valores representam a média±EPM da atividade locomotora espontânea durante 5 minutos de observação. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle.

5.1.1.2. Teste do Labirinto em Cruz Elevado

O tratamento agudo e subcrônico por via i.p. com a ketamina nas doses de 5, 10 e 20 mg/kg, no labirinto em cruz elevado diminuiu significativamente o TPBA em todas as doses utilizadas (Figura 5.2) [AGUDO- ket 5mg: 24,71±6,81 (8)***; Ket 10mg: 73,67±5,61 (8)*;

Ket 20mg: 71,43±11,11 (8)*, SUBCRÔNICO- Ket 5mg: 41,33±8,77 (7) **; Ket 10mg:

80,20±11,38 (7) *; Ket 20mg: 80,80±8,33 (7) *] quando comparado os seus respectivos controles [AGUDO- 95,40±4,51 (16) e SUBCRÔNICO-107,40±5,21 (7) ].

A administração aguda de ketamina diminuiu significativamente o PTBA apenas na dose de 20 mg/kg [Ket 5mg: 30,38±3,69 (8); Ket 10mg: 26,00±2,19 (8); Ket 20mg:

10,88±4,09 (8)***] enquanto que a administração subcrônica de ketamina diminuiu significativamente esse parâmetro em todas as doses utilizadas [Ket 5mg: 14,44±4,29 (7)**;

Ket 10mg: 30,85±4,53 (7) *; Ket 20mg: 27,10±2,37 (7) *] quando comparado os seus respectivos controles [AGUDO- 29,64±2,70 (16) e SUBCRÔNICO- 40,05±2,64 (7) ] (Figura

5.3).

120

100 * * * 80 *

60 **

TPBA(s) 40 ***

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

TRATAMENTO AGUDO TRATAMENTO SUBCRÔNICO

FIGURA 5.2 - Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via intraperitoneal, sobre o tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação. Controle (veículo), ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p 10min antes do experimento (tratamento agudo) ou foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 7º dia (tratamento subcrônico). Os valores representam a média±EPM do tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) durante 5 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle.

40 * 35

30 *

20 **

PTBA(%) *** 15

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg TRATAMENTO AGUDO TRATAMENTO SUBCRÔNICO

FIGURA 5.3 - Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via intraperitoneal, sobre a porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação. Controle (veículo), ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p 10min antes do experimento (tratamento agudo) ou foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 7º dia (tratamento subcrônico). Os valores representam a média±EPM da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) durante 5 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle.

A Figura 5.4 mostra que o tratamento agudo com ketamina diminuiu significativamente o NEBA nas doses de 10 e 20 mg/kg [Ket 5mg: 6,50±0,96 (8); Ket 10mg:

2,43±0,72 (8)*; Ket 20mg: 2,57±0,65 (8)*] comparando com o controle [5,50±0,70 (16) e que o tratamento subcrônico com ketamina não alterou significativamente esse parâmetro em nenhuma das doses utilizadas [controle: 4,43±0,92 (7); Ket 5mg: 4,71±1,44 (7); Ket 10mg:

6,00±0,70 (7); Ket 20mg: 6,20±0,37 (7)].

A ketamina administrada agudamente e subcronicamente não causou alteração significativa no PEBA (Figura 5.5) em nenhuma das doses utilizadas [AGUDO- controle

37,68±2,70 (16); Ket 5mg: 34,37±3,70 (8); Ket 10mg: 29,32±2,44 (8); Ket 20mg: 33,30±2,63

(8) e SUBCRÔNICO- controle: 29,56±4,95 (7); Ket 5mg: 29,96±7,66 (7); Ket 10mg:

43,34±6,27 (7); Ket 20mg: 39,72±3,45 (7)].

4 * *

NEBA 3

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg TRATAMENTO AGUDO TRATAMENTO SUBCRÔNICO

FIGURA 5.4 - Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via intraperitoneal, sobre o número de entradas nos braços abertos (NEBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação. Controle (veículo), ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p 10min antes do experimento (tratamento agudo) ou foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 7º dia (tratamento subcrônico). Os valores representam a média±EPM do número de entradas nos braços abertos (NEBA) durante 5 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05 vs controle.

45 40 35 30

25 20

PEBA (%) PEBA 15 10 5 0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

TRATAMENTO AGUDO TRATAMENTO SUBCRÔNICO

FIGURA 5.5 - Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via intraperitoneal, sobre a porcentagem de entrada nos braços abertos (PEBA) no teste do labirinto em cruz elevado para camundongos durante cinco minutos de observação. Controle (veículo), ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p 10min antes do experimento (tratamento agudo) ou foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 7º dia (tratamento subcrônico). Os valores representam a média±EPM da porcentagem de entrada nos braços abertos (PEBA) durante 5 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc.

5.1.2. AVALIAÇÃO DA KETAMINA EM MODELOS DE DEPRESSÃO

5.1.2.1. Teste do Nado Forçado

No teste do nado forçado, os animais foram tratados agudamente com ketamina 5, 10 e

20mg ou salina por via i.p uma única vez e os experimentos foram realizados 10 min após a administração ou subcrônicamente por 7 dias consecutivos com ketamina 5, 10 e 20mg ou salina por via i.p. e os experimentos foram realizados 10 minutos após a última administração.

A Figura 5.6 mostra que o tratamento agudo e subcrônico com ketamina nas doses de

5, 10 e 20 mg/kg, por via i.p., levou a uma diminuição do tempo de imobilidade em todas as doses utilizadas [AGUDO- Ket 5mg: 84,33± 13,22 (8)*; Ket 10mg: 78,75± 12,73 (8) **; Ket

20mg: 99,67 ± 4,492 (8)* e SUBCRÔNICO- Ket 5mg: 102,60±15,68 (8) *; Ket 10mg:

104,90±15,59 (7) **; Ket 20mg: 40,86± 7,156 (7) ***] quando comparado com os seus respectivos controles [AGUDO - Cont: 139,6 ± 15,61 (8) e SUBCRÔNICO- Cont:

158,9±11,71

180

160

140

120 * ** * * 100 **

60 *** 40

Tempo de Imobilidade (s) Imobilidade de Tempo 20

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg TRATAMENTO AGUDO TRATAMENTO SUBCRÔNICO

FIGURA 5.6- Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste do nado forçado em camundongos. Controle (veículo), ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p 10min antes do experimento (tratamento agudo) ou foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 7º dia (tratamento subcrônico). Os valores representam a média±EPM do tempo de imobilidade (s) durante 5 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle.

5.1.2.2. Teste da Suspensão da Cauda

Neste experimento (Figura 5.7), a administração aguda e subcrônica de ketamina diminuiu o tempo de imobilidade em todas as doses utilizadas [AGUDO- Ket 5mg:

74,83±12,24 (7)**; Ket 10mg: 70,20±18,01 (7) **; Ket 20mg: 85,40±15,13 (7)** e

SUBCRÔNICO- Ket 5mg: 73,00± 11,45 (8) *; Ket 10mg: 58,00± 8,69 (7) **; Ket 20mg:

36,00±10,41 (7) ***] relacionando aos seus respectivos controle [AGUDO- Cont: 129,2± 6,30

(6) e SUBCRÔNICO- Cont: 104,5± 7,75 (7)].

160

140

120 ** 100 ** ** * 80 ** 60 *** 40

Tempode Imobilidade (s) 20

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg TRATAMENTO AGUDO TRATAMENTO SUBCRÔNICO

FIGURA 5.7 - Efeito do tratamento agudo e subcrônico com ketamina, via intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste da suspensão da cauda em camundongos. Controle (veículo), ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p 10min antes do experimento (tratamento agudo) ou foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 7º dia (tratamento subcrônico). Os valores representam a média±EPM do tempo de imobilidade (s) durante 6 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle.

5.2 EFEITOS DA KETAMINA NA ABSTINÊNCIA DE 24H APÓS O TRATAMENTO SUBCRÔNICO

5.2.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA KETAMINA EM MODELOS DE ANSIEDADE NA ABSTINÊNCIA DE 24H APÓS O TRATAMENTO SUBCRÔNICO

5.2.1.1. Teste do Campo Aberto

Neste experimento, os animais foram tratados subcronicamente com ketamina por 7 dias nas doses de 5, 10 e 20mg ou salina por via i.p. e os experimentos foram realizados respectivamente no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h.

O parâmetro analisado neste teste foi a atividade locomotora espontânea (ALE) e o resultado foi expresso como número de travessias. A ketamina, por via intraperitoneal, aumentou significativamente a atividade locomotora (Figura 5.8) em todas as doses utilizadas

[Ket 5mg: 41,27± 3,28 (11) ***; Ket 10mg: 43,82± 2,43 (11) ***; Ket 20mg: 37,50± 2,62 (11)

***], comparando com o controle [cont.: 21,20± 2,21 (10)].

50 *** *** 45 *** 40

Númerode travessias

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.8 - Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, via intraperitoneal, sobre a atividade locomotora espontânea no teste do campo aberto em camundongos. Controle (veículo) e ketamina (ket 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h. Os valores representam a média±EPM da atividade locomotora espontânea durante 5 minutos de observação. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: ***p<0,001 vs controle.

5.2.1.2. Teste do Labirinto em Cruz Elevado

A abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina diminuiu significativamente em todas as doses utilizadas os seguintes parâmetros: NEBA (Figura 5.9)

[Ket 5mg: 5,45±0,59 (11) *; Ket 10mg: 5,40± 0,27 (11) *; Ket 20mg: 4,10±0,46 (10) ***;

PEBA (Figura 5.10) [Ket 5mg: 38,38±2,97 (11)**; Ket 10mg: 34,65±2,22 (11) ***; Ket 20mg:

32,44±3,80 (10) ***] quando comparado com os respectivos controles: NEBA [7,20±0,51

(10)]; PEBA [53,20±3,20 (10)]. Enquanto que o PTBA (Figura 5.11) sofreu redução apenas na dose de 20 mg/kg [Ket 5mg: 36,70±2,69 (11); Ket 10mg: 34,03±2,84 (11); Ket 20mg:

29,08±2,517 (11) *]. O TPBA (Figura 5.12) não sofreu alteração significativa em nenhuma das doses utilizadas [controle: 67,60±7,92 (10); Ket 5mg: 74,80±5,40 (11); Ket 10mg:

69,64±8,80 (11); Ket 20mg: 73,55±8,01 (11)].

7 *

6 *

5 ***

4 NEBA

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.9 - Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, via intraperitoneal, sobre o número de entradas nos braços abertos (NEBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos. Controle (veículo) e ketamina (ket 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h. Os valores representam a média±EPM do número de entradas nos braços abertos (NEBA). Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; ***p<0,001 vs controle.

** 40 *** ***

30 PEBA (%) PEBA 20

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.10 - Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, via intraperitoneal, sobre a porcentagem de entrada nos braços abertos (PEBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos. Controle (veículo) e ketamina (ket 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h. Os valores representam a média±EPM da porcentagem de entrada nos braços abertos (PEBA). Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: **p<0,01; ***p<0,001 vs controle.

20 PTBA (%) PTBA

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.11 - Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, via intraperitoneal, sobre a porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos. Controle (veículo) e ketamina (ket 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h. Os valores representam a média±EPM da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA). Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05 vs controle.

100

50 TPBA (s) TPBA 40

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.12 - Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, via intraperitoneal, sobre o tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos. Controle (veículo) e ketamina (ket 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h. Os valores representam a média±EPM do tempo de permanência nos braços abertos (TPBA). Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc.

5.2.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA KETAMINA EM MODELOS DE DEPRESSÃO NA ABSTINÊNCIA DE 24H APÓS O TRATAMENTO SUBCRÔNICO

5.2.2.1. Teste do Nado Forçado

O grupo de animais tratados submetidos à abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina apresentou um aumento significativo no tempo de imobilidade nas doses de 10 e 20 mg/kg [Ket 5mg: 70,80±4,61; Ket 10mg: 96,88±10,52 (9) *; Ket 20mg:

101,2±12,50 (9) *] (Figura 5.13) comparado com o controle [64,56±3,77 (10)].

120 *

100

Tempo de imobilidade (s) Tempo 20

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.13 - Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, via intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste do nado forçado em camundongos. Controle (veículo) e ketamina (ket 5, 10 e 20 mg/kg) foram foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h.. Os valores representam a média±EPM do tempo de imobilidade (s) durante 5 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05 vs controle.

5.2.2.2. Teste da Suspensão da Cauda

Neste experimento, os animais foram tratados subcronicamente com ketamina por

7dias nas doses de 5, 10 e 20mg ou salina por via i.p. e os experimentos foram realizados respectivamente no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h.

A ketamina causou um aumento significativo no tempo de imobilidade nas doses de

10 e 20 mg/kg [Ket 5mg 69,90±4,31; Ket 10mg: 90,56±10,78 (9) *; Ket 20mg: 115,5± 3,54

(10) ***] comparado com o controle [67,40±4,41 (10)] (Figura 5.14).

140

*** 120

* 100

Tempode imobilidade (s)

0 Controle Ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.14 - Efeito da ketamina na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, via intraperitoneal, sobre o tempo de imobilidade, em segundos, no teste da suspensão da cauda em camundongos. Controle (veículo) e ketamina (ket 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p durante 7 dias consecutivos e o experimento foi realizado no 8º dia, ou seja, com abstinência de 24h.. Os valores representam a média±EPM do tempo de imobilidade (s) durante 5 minutos. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; ***p<0,001 vs controle.

5.3 EFEITOS DA KETAMINA NO ESTRESSE OXIDATIVO

5.3.1 ATIVIDADE DA CATALASE EM CÓRTEX PRÉ-FRONTAL APÓS ADMINISTRAÇÃO DE AGUDA DE KETAMINA DE CAMUNDONGOS.

A atividade da catalase no córtex pré-frontal aumentou apenas nas doses de 10 e 20 mg/kg

* *** [Ket 5mg: 38,41 ± 2,11 (7); Ket 10mg: 51,30 ± 5,85 (6) ; Ket 20mg: 76,48 ± 10,18 (7) ] comparando com o seu respectivo controle [Cont: 25,77 ± 1,76 (7)] como mostrado na Figura 5.15.

100 90 *** 80 70 60 * 50 40 30 20

Atividade catalase catalase Atividade

µM/min/µg de proteína de µM/min/µg 10 0 Controle ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.15 - Atividade da catalase em córtex pré-frontal de camundongos após administração de aguda de ketamina. Diferentes grupos de camundongos foram tratados com: salina (controles) e ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) foram administrados por via i.p e 10min após a administração os animais tiveram o córtex pré-frontal dissecados para determinação da atividade da catalase. A atividade da catalase foi determinada por espectrofotometria.. Os valores representam a média±EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05; ***p<0,001 vs controle.

5.3.2 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA REDUZIDA (GSH) EM

CÓRTEX PRÉ-FRONTAL APÓS ADMINISTRAÇÃO DE AGUDA DE KETAMINA DE CAMUNDONGOS.

Os níveis de glutationa reduzida (GSH) apresentaram uma diminuição significativa no

** córtex pré-frontal (CPF) em todas as doses utilizadas [Ket 5mg: 565,0 ± 58,56 (8) ; Ket 10mg:

*** *** 306,8 ± 64,44 (8) ; Ket 20mg: 236,1 ± 23,1 (8) ) quando comparado com os seus respectivos controles [Cont: 823,6 ± 78,06 (8)] como observado na Figura 5.16.

1000 900 800 700 ** 600 500 GSH 400 ***

ng/g tecido ng/g 300 *** 200 100 0 Controle ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.16 - Níveis de glutationa reduzida (GSH) em córtex pré-frontal após administração de aguda de ketamina em camundongos. Diferentes grupos de camundongos foram tratados com salina (controle) e ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) por via i.p e 10min após a administração os animais tiveram o córtex pré-frontal dissecados para mensuração dos níveis de glutationa reduzida (GSH). Os níveis de glutationa reduzida (GSH) foram determinados por um leitor de microplate. Os valores da representam a média±EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: **p<0,01; ***p<0,001 vs controle.

5.3.3. DETERMINAÇÃO DO EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO AGUDA DE KETAMINA SOBRE A FORMAÇÃO DE MALONILDIALDEÍDO (MDA) EM CÓRTEX PRÉ- FRONTAL DE CAMUNDONGOS.

Os níveis de MDA, como mostra a Figura 5.17 tiveram aumento significativo no córtex pré-

* frontal nas doses de 10 e 20 mg/kg [Ket 5mg: 4,34 ± 0,77 (7); Ket 10mg: 6,51 ± 0,84 (7) ; Ket

* 20mg: 6,65 ± 0,78 (7) ] quando comparado com o controle [Cont: 3,50 ± 0,43 (7)].

8 * * 7

TBARS 3

mmol de MDA/mg de proteína de MDA/mg de mmol 0 Controle ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.17 - Efeito da administração aguda de ketamina sobre a formação de malonildialdeído (MDA) em córtex pré-frontal de camundongos. Diferentes grupos de camundongos foram tratados com salina (controle) e ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) por via i.p e 10min após a administração os animais tiveram o córtex pré-frontal dissecados. Os níveis de malonildialdeído (MDA) foram por um leitor de microplate. Os valores representam a média±EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: *p<0,05 vs controle.

5.3.4. DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE NITRITO EM CÓRTEX PRÉ-FRONTAL

APÓS ADMINISTRAÇÃO DE AGUDA DE KETAMINA DE CAMUNDONGOS.

Os níveis de nitrito, como observado na Figura 5.18 apresentaram aumento significativo no

*** córtex pré-frontal em todas as doses utilizadas [Ket 5mg: 6,82 ± 0,53 (8) ; Ket 10mg: 7,41 ± 0,32

(8) ***; Ket 20mg: 8,03 ± 0,44 (8) *** ) comparando com o seu respectivo controle [Cont: 4,24 ±

0,34 (8)].

9 *** 8 *** *** 7 6 5 4

NITRITO 3

µmol/g tecidoµmol/g 2 1 0 Controle ket 5mg Ket 10mg Ket 20mg

FIGURA 5.18. Níveis de nitrito em córtex pré-frontal após administração de aguda de ketamina em camundongos. Diferentes grupos de camundongos foram tratados com salina (controle) e ketamina (ket; 5, 10 e 20 mg/kg) por via i.p e 10min após a administração os animais tiveram o córtex pré-frontal dissecado para mensuração dos níveis de nitrito. Os níveis de nitrito foram determinados por um leitor de microplate. Os valores representam a média±EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA seguido por Student Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos: ***p<0,001 vs controle.

DISCUSSÃO

6 DISCUSSÃO

6.1 ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS APÓS A ADMINISTRAÇÃO DE KETAMINA EM CAMUNDONGOS.

A ansiedade pode ser caracterizada como a antecipação emocional de uma situação aversiva, de difícil controle e de provável ocorrência. Enquanto que o medo pode ser definido como uma reação a uma situação perigosa real e bem definida e é visto por vários autores como uma entidade independente da ansiedade. Ainda assim, por vezes pode ser difícil uma separação entre as duas.

Alguns modelos animais de ansiedade evocam, pela simples exposição do animal a um novo ambiente ou estímulo, comportamentos de medo ou defensivos, análogos a manifestações ansiosas em indivíduos com transtornos de ansiedade. Por exemplo, animais expostos ao labirinto em cruz elevado apresentam um comportamento denominado de avaliação de risco (risk assessment), o que pode ser relacionado à hipervigilância, apresentada por indivíduos ansiosos. A avaliação de risco representa uma antecipação de um perigo potencial, sendo um comportamento defensivo de grande valor adaptativo; ainda assim, indivíduos ansiosos parecem mais frequentemente tentar antecipar tal ameaça no intuito de lidar melhor com isto, o que acaba por trazer prejuízos para os mesmos (RAMOS et al., 1997; BLANCHARD & BLANCHARD, 1999).

O estudo comportamental relacionado à ansiedade em modelos animais é baseado na afirmativa de que a ansiedade em animais é comparável a ansiedade em humanos. Apesar disso, não pode ser provado que um animal vive a ansiedade da mesma maneira que um ser humano. Por outro lado, é incontestável que diferentes modelos comportamentais em roedores indicam ansiedade, isto é, mudanças comportamentais e periféricas que, presumivelmente podem estar relacionadas com uma alta atividade do sistema nervoso simpático (OHL, 2003).

Vários testes foram desenvolvidos para avaliar parâmetros comportamentais que indicassem ansiedade em roedores, dentre eles temos o teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE), também conhecido como Plus Maze. O LCE é o modelo mais utilizado e aceito pela comunidade científica como um procedimento rápido e simples para detectar efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos de drogas em ratos e camundongos (TREIT, 1985).

Desta forma, no presente estudo foi utilizado o LCE, para investigar as alterações comportamentais após o tratamento agudo e subcrônico com ketamina em camundongos. Nesse mesmo modelo experimental também foram investigadas as alterações comportamentais na abstinência de 24h após o uso subcrônico de ketamina.

Os resultados demonstraram que a administração aguda de ketamina foi capaz de causar ansiedade nos animais ao reduzir o TPBA (em todas as doses), PTBA (apenas na dose de 20 mg/kg) e NEBA (nas doses de 10 e 20 mg/kg).

Alguns trabalhos mostram que os antagonistas dos receptores NMDA não competitivo apresentam um perfil ansiolítico em vários modelos animais de ansiedade (KOEK, COLPAERT, 1991; XIE, COMMISSARIS, 1992; PLAZNIK et al., 1994; WILEY, 1997). Entretanto, os efeitos da ketamina, que é um antagonista NMDA não competitivo, não foram observados de forma consistente. Isso pode ser devido os estudos utilizarem testes comportamentais, doses, vias e duração de administração diferente, resultando em efeitos contraditórios.

É possível encontrar na literatura efeitos ansiolíticos, ansiogênicos ou nenhum efeito após o tratamento com ketamina. O presente estudo evidenciou um efeito ansiogênico da ketamina após o tratamento agudo, corroborando com o estudo realizado por Silvestre et al. (1997) que também demonstrou um perfil ansiogênico da ketamina (7 mg/kg) interpretado pela redução do NEBA e PTBA no teste do LCE. Outros estudos também observaram um aumento da ansiedade nos animais tratados com ketamina (BABAR et al., 2001; BECKER et al., 2003).

Diferente dos nossos resultados, Engi et al. (2009) mostrou um efeito ansiolítico da ketamina em alta dose (50 mg/kg) ao aumentar o NEBA no teste do LCE. Enquanto que um estudo realizado por Hayase et al. (2006) não observou alteração significativa após o tratamento agudo com ketamina (30 mg/kg) no teste do LCE. Assim, podemos constatar que os efeitos da administração aguda de ketamina sobre a ansiedade são controversos e que novos estudos ainda são necessários.

Além disso, observamos que os efeitos ansiogênicos da ketamina são similares aos efeitos de drogas estimulantes como cocaína, anfetamina ou cafeína (FILE, HYDE, 1979; PELLOW et al., 1985; YANG et al., 1992).

Com relação a administração subcrônica de ketamina observa-se uma redução nos parâmetros TPBA e PTBA do Labirinto em Cruz Elevado em todas as doses utilizadas, evidenciando um efeito ansiogênico da ketamina. Ao contrário, dos efeitos agudos da ketamina que são extensamente investigados, os estudos dos efeitos subcrônicos da ketamina na ansiedade ainda são escassos. Um estudo realizado com Fenciclidina, que também é um antagonista NMDA, administrada por sete dias não observou alteração significativa no LCE (MCLEAN, WOOLLEY, NEILL, 2010). Enquanto um estudo realizado por SILVESTRE et al, (2002) observou um efeito ansiolítico com ketamina em ratos evidenciado pelo aumento da PTBA, entretanto esse estudo realizou o tratamento crônico por trinta dias.

O efeito ansiogênico da ketamina observado com o tratamento subcrônico também é similar ao encontrado com outras drogas de abuso como cocaína e anfetamina. Um estudo mostrou que a administração subcrônica de cocaína na dose de 30 mg/kg e anfetamina na dose de 4 mg/kg em camundongos causa ansiedade no LCE (HAYASE, YAMAMOTO, YAMAMOTO, 2006). Yang et al (1992) também evidenciou que a administração de cocaína por 7 ou 14 dias provoca efeitos ansiogênicos em ratos.

Decidimos ainda investigar, nesse mesmo modelo experimental, as alterações comportamentais na abstinência de 24h após o uso subcrônico de ketamina. Os resultados demonstraram um efeito ansiogênico ao reduzir o NEBA e o PEBA em todas as doses utilizadas. Enquanto que o PTBA também sofreu uma diminuição, mas apenas na dose de 20 mg/kg.

Como já dito anteriormente, a existência de uma síndrome de abstinência é incerto, sendo necessários estudos que investiguem sintomas dessa possível abstinência.

A fenciclidina, que compartilha o mesmo mecanismo de ação da ketamina, está sendo extensamente estudada em modelos de abstinência após tratamento subcrônico (TURGEON, LIN, SUBRAMANIAN, 2007; EGERTON et al, 2008). Isso é devido a fenciclidina ser proposta como modelo de esquizofrenia tanto para produção de sintomas positivos quanto negativos (SEILLIER, GIUFFRIDA, 2009).

Um estudo observou que a retirada da fenciclidina após o tratamento subcrônico causou um prejuízo na memória de trabalho e uma redução da interação social e que a retirada do MK-801 em animais tratados subcronicamente apresentou apenas uma ligeira diminuição na interação social

(SEILLIER, GIUFFRIDA, 2009). Esse resultado corrobora com outro estudo realizado que demonstrou que a abstinência após o tratamento subcrônico com fenciclidina causa ansiedade em ratos (AUDET, GOULET, DORÉ, 2006).

Além do Labirinto em Cruz Elevado, outra possibilidade de aumentar a aversão de um roedor contra uma área desprotegida é o teste do campo aberto, sendo empregado para avaliar a atividade exploratória dos animais. A tendência natural do animal em um ambiente novo é a de explorá-lo, apesar do estresse e do conflito provocado por este ambiente (MONTGOMERY, 1958). No presente estudo, a administração aguda e sucbrônica de ketamina aumentaram a Atividade Locomotora Espontânea (ALE) no Campo aberto em todas as doses utilizadas. Esse mesmo efeito foi observado na abstinência de 24 horas após o tratamento subcrônico.

A hiperlocomoção causada por antagonistas NMDA tem sido bem caracterizada por diversos estudos (LEONIBUS et al, 2001; JENTSCH, ROTH, 1999; IRIFUNE et al, 1995). Um estudo observou um aumento da atividade locomotora com baixa dose de ketamina (30 mg/kg) dentro do primeiros 10 minutos, seguida por um rápido declínio. Em contrapartida, doses elevadas de ketamina (150 mg/kg) inibiram a atividade locomotora ao nível do controle durante os primeiros 30 minutos. Posteriormente, a atividade aumentou gradualmente e atingiu um pico em cerca de 2 h (IRIFUNE, SHIMIZU, NOMOTO, 1991). Esses achados também foram encontrados por Hayase, Yamamoto e Yamamoto (2006) onde observaram que a ketamina em baixas doses (30 mg/kg) causa hiperlocomoção e em altas doses (100 mg/kg) provoca inicialmente hipolocomoção, que é revertida para hiperlocomoção após 120 minutos.

Dessa forma, o aumento da atividade locomotora observada no presente trabalho é um resultado corroborado por outros estudos (IMRE et al, 2006; RODVELT, 2008 ; RAZOUX, GARCIA, LENA, 2007). Neuroquimicamente, a hiperlomoção tem sido extensamente associada ao aumento da liberação de dopamina (dopamine turnover) no núcleo accumbens e estriado de roedores (YLITALO, SAARNIVAARA, AHTEE, 1976; IRIFUNE, SHIMIZU, NOMOTO, 1991).

Como relatado previamente a ketamina produz hiperlocomoção dose dependente em camundongos. A alta dose de ketamina (150 mg/kg) induz hiperlocomoção aproximadamente o dobro do que uma dose baixa (30 mg/kg ). No entanto, a maior dose de ketamina também induz anestesia, sendo que a hiperlocomoção só ocorre após a fase anestésica. Portanto, as propriedades neuroquímicas envolvida na hiperlocomoção produzidas por doses anestésicas podem ser diferente

daquelas produzidas por doses mais baixas. A dose mais baixa de ketamina seletivamente aumenta a liberação de dopamina no núcleo accumbens e estriado durante o pico de locomoção, enquanto a dose mais elevada aumenta não apenas dopamina, mas também a liberação de noradrenalina e serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) em muitas regiões do cérebro (IRIFUNE, SHIMIZU, NOMOTO, 1991). Estudos também demonstram que a hiperlocomoção observada com a ketamina pode ser revertida pelo haloperidol, antagonista do receptor dopaminérgico, constatando a ação da dopamina na hiperlocomoção (MOREIRA, GUIMARÃES, 2005; YAMAMOTO et al, 1997; LANNES, 1991).

Com o intuito de fortalecer o envolvimento da dopamina na hiperlocomoção causada por ketamina, um estudo mostrou que a hiperlocomoção causada pela ketamina na dose de 30 mg/kg em camundongos foi inibida pela administração de diazepam (IRIFUNE, 1998). Sabe-se que o Ácido Gama Aminobutírico (GABA) atua no sistema nervoso central podendo alterar a atividade locomotora se suficientemente estimulado ou inibido, pois o GABA interage diretamente com os neurônios de dopamina em uma ação inibitória (FISHMAN, 1983). Os benzodiazepínicos são conhecidamente moduladores da neurotransmissão gabaérgica e consequentemente diminuem a liberação de dopamina no núcleo accumbens e estriado de roedores (ISHIKO, INAGAKI, TAKAORI, 1983).

Além da ansiedade, já discutida anteriormente, investigamos também o efeito da ketamina em modelos animais de depressão. Sabe-se que a depressão é uma condição psiquiátrica extremamente comum, para a qual existem uma gama de teorias neuroquímicas e uma variedade correspondente de diferentes tipos de fármacos usados no tratamento. É um campo no qual o empirismo terapêutico ocorreu antes, com o entendimento do mecanismo, tendendo a ficar para trás, sendo que parte das dificuldades é dos modelos animais, os quais não se aplicam à mudança de humor que define a condição humana (RANG et al., 2007). Numerosos compostos antidepressivos são agora disponíveis e presume-se que agem através de diferentes mecanismos, envolvendo os sistemas noradrenérgico, serotonérgico e/ou dopaminérgico. A heterogeneidade da resposta clínica às drogas antidepressivas e estabilizadoras do humor, e, a susceptibilidade aos efeitos adversos, são os maiores problemas encontrados atualmente na clínica (LERER, MACCIARDI, 2002).

Acredita-se que o estresse e a depressão são fenômenos inter-relacionados. O estresse é tipicamente implicado na etiologia das desordens depressivas ou como uma consequência delas (ANISMAN, ZACHARKO, 1982; BROWN, GERSHON, DIEHL, 1993; SHERRILL et al., 1997;

TURNER, LLOYD, 1999). Os modelos animais de depressão são tipicamente baseados na exposição de animais a condições estressantes (situação ameaçadora), e há vários testes específicos para medir as respostas comportamentais e psicológicas.

Os modelos animais mais amplamente utilizados para screening de novas drogas antidepressivas são os testes do nado forçado e da suspensão da cauda. Esses testes são bastante sensíveis e relativamente específicos para a maioria das classes de drogas antidepressivas, incluindo, os antidepressivos tricíclicos, os inibidores seletivos da recaptação de serotonina, os inibidores da MAO (monoamina oxidase) e os atípicos (DETKE, RICKELS, LUCKI, 1995; PORSOLT, BERTIN, JALFRE, 1977; STERU et al., 1985).

O teste da suspensão da cauda baseia-se no fato de que camundongos, quando suspensos pela cauda demonstram um padrão temporal, alternando entre períodos de atividade (“comportamento de fuga”) e imobilidade (“comportamento de espera”), refletindo um “desespero comportamental” (PORSOLT et al., 1978). Esse comportamento em animais é considerado como uma reprodução semelhante ao comportamento da depressão humana (STERU et al., 1985; WILLNER, 1984). Portanto, uma diminuição no tempo de imobilidade de um grupo submetido à administração de uma droga padrão ou teste, em relação ao grupo controle, sugere uma ação antidepressiva (STERU et al. 1985).

Os resultados deste trabalho mostraram que a ketamina diminuiu o tempo de imobilidade, em todas as doses utilizadas, quando os animais foram tratados agudamente e subcronicamente. Entretanto, resultados diferentes foram encontrados no grupo de animais submetidos à abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina, onde foi observado um aumento significativo no tempo de imobilidade nas doses de 10 e 20 mg/kg.

O teste do nado forçado também é um modelo de desespero comportamental. Neste teste, os animais são forçados a nadar em um recipiente com água de onde é impossível escapar. O fenômeno comportamental observado neste teste parece ser resultado da exposição a uma situação inescapável, na qual o animal divide seu comportamento em períodos de atividade vigorosa (comportamento de procura) e de imobilidade (comportamento de espera) (STERU et al., 1985). Embora a relação entre imobilidade (uma postura mantida que reflete um estado de “desespero comportamental” no qual o animal é rendido pelo desejo de escapar) e depressão, seja controversa (GARDIER et al., 2001), é bem demonstrado que drogas com atividade antidepressiva

antagonizam, ou seja, diminuem o tempo de imobilidade do animal (PORSOLT et al., 1977; FERNANDEZ-TERUEL et al., 1990). No entanto, o teste do nado forçado parece ser mais sensível que o teste da suspensão da cauda em detectar drogas com atividade antidepressiva, visto que, doses menores de drogas como a imipramina são suficientes para apresentar um efeito antidepressivo no nado forçado (PORSOLT et al., 1977).

No teste do nado forçado, a ketamina diminuiu o tempo de imobilidade em todas as doses utilizadas tanto no tratamento agudo quanto no subcrônico. Igualmente ao que foi encontrado no teste da suspensão da cauda, neste teste os animais submetidos à abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina, também apresentaram um aumento significativo no tempo de imobilidade nas doses de 10 e 20 mg/kg.

Como relatado anteriormente, as drogas utilizadas no tratamento da depressão demoram a produzir um efeito antidepressivo, resultando em considerável morbidade. Estudos clínicos sugerem que a administração aguda de ketamina reduz os sintomas de depressão em pacientes que sofrem de depressão maior (BERMAN et al., 2000), e que pacientes com este tipo de depressão quando tratados com uma única dose de ketamina apresentaram rápidos efeitos antidepressivos e esses efeitos permaneceram por cerca de uma semana (ZARATE et al., 2006).

Há mais de 15 anos tem sido relatada uma possível ação antidepressiva dos antagonistas dos receptores NMDA após administração aguda no Teste do Nado Forçado e no Teste da Suspensão da Cauda (TRULLAS, SKOLNICK 1990; LAYER et al. 1995; KOS et al. 2006a). Como os outros antagonistas dos receptores NMDA, a ketamina também tem produzido um provável efeito antidepressivo após o tratamento agudo tanto no TNF quanto no TSC em diferentes doses e espécies de camundongos e ratos.

Efeitos foram observados no TNF em camundongos na dose de 2,5 mg/kg (MAENG et al. 2008), nas doses de 5-10 mg/kg na raça albino (ROSA et al. 2003), na dose de 30 e 100 mg/kg na raça ICR (HAYASE et al. 2006) e em ratos na dose de 10-15 mg/kg (Garcia et al. 2008) como também no TSC em camundongos Swiss na dose de 1 mg/kg (MANTOVANI et al. 2003) e nas doses de 50-66 mg/kg na raça C57BL/6J/Han (KOS et al. 2006b).

Esse resultado também foi observado por outro estudo que demonstrou a redução da imobilidade no Teste do Nado Forçado em ratos após a administração aguda de ketamina nas doses

de 10 e 50 mg/kg (ENGIN, TREIT, DICKSON, 2009). Entretanto, Hayase et al (2006) observou que o tratamento agudo com ketamina não alterou significativamente o tempo de imobilidade na dose de 30 e 100 mg/kg, pelo contrário houve um aumento desse parâmetro, revelando uma tendência a um comportamento depressivo. Em todos estes experimentos foram utilizado a via de administração intraperitoneal.

Um estudo demonstrou que uma única injeção de ketamina (160 mg/kg) foi capaz de reduzir o tempo de imobilidade no teste do nado forçado em ratos 3, 7 ou 10 dias após essa única administração (YILMAZ et al, 2002). Popik et al (2008) realizaram uma série de experimentos, buscando replicar o efeito antidepressivo duradouro da ketamina após a sua administração única observado pelo Yilmaz e ainda investigar sua possível ação antidepressiva após o tratamento repetido. Nesse estudo não foi observado efeito antidepressivo no TNF nem no TSC em ratos no 7º dia após uma única dose de ketamina (160 mg/kg). Ação antidepressiva da ketamina também não foi demonstrada no TNF em camundongos Swiss após duas semanas da administração de ketamina em diversas doses (1-50 mg/kg). Ainda nesse estudo foram investigados os efeitos antidepressivos após o tratamento crônico com ketamina. Nesse experimento os animais foram tratados duas vezes por dia durante 2 semanas e submetidos ao TNF, sendo observado redução do tempo de imobilidade.

Outro estudo também observou que a administração crônica de ketamina nas doses de 5, 10 e 15 mg/kg uma única vez por dia durante 14 dias consecutivos foi capaz de reduzir o tempo de imobilidade em ratos no TNF (GARCIA et al, 2008).

Entretanto é possível encontrar em alguns estudos resultados diferentes. Um estudo realizado por Chindo et al (2012) mostrou que a abstinência de 24h após o tratamento com ketamina em camundongos por 5 dias consecutivos na dose de 30mg/kg aumentou o tempo de imobilidade no TNF e esse efeito persistiu por 21 dias após a retirada da ketamina. Resultado similar foi encontrado por Chatterjee et al (2011) onde o tratamento crônico com ketamina na dose de 100 mg/kg produziu aumento do tempo de imobilidade no TNF, perdurando por 10 dias.

No presente trabalho, os resultados sugerem efeitos ansiogênicos e antidepressivos no tratamento agudo e subcrônico com ketamina. Enquanto na abstinência de 24h observa-se a permanência das ações ansiogênicas, porém foi identificado um efeito depressivo. Esses achados indicam que as alterações comportamentais provocadas pela ketamina são similares aos das drogas

de abuso como a cocaína. Entretanto, novos estudos se fazem necessário para ratificar e propor possíveis mecanismos envolvidos nessas alterações.

6.2 EFEITOS DA KETAMINA NO ESTRESSE OXIDATIVO APÓS A ADMINISTRAÇÃO AGUDA EM CAMUNDONGOS.

Efeitos tóxicos do oxigênio sobre componentes biológicos já eram conhecidos no final de século XIX (LORRAIN-SMITH, 1899), tornado-se objeto de intensa investigação científica nos últimos anos (HALLIWELL, 2000). Estes efeitos são resultantes da oxidação de componentes celulares como tióis, cofatores enzimáticos, proteínas, nucleotídeos e lipídeos, principalmente ácidos graxos poliinsaturados (AGPI), mediados por espécies reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN), conhecidas genericamente como radicais livres (RL) (ROMERO et al., 1998).

Um radical livre é qualquer espécie capaz de existência independente que contenha um ou mais elétrons desemparelhados (HALIWELL, 1987). As ERO incluem todos os radicais do - oxigênio, como o ânion radical superóxido (O2 ), radical hidroxila (HO), radical alquila (L), alcoxila (LO) e peroxila (LOO) (BARBER, BERNHEIM, 1967; CHANGE, SIES, BOVERIS, 1979). Nas ERN estão incluídos além do peroxinitrito (ONOO-), o óxido nítrico (NO) e o radical dióxido de nitrogênio (NO2) (EISERICH, PATEL, O’DONNELL, 1998; HOGG, KALYANARAMAN, 1999).

Em condições normais (organismos saudáveis), a produção de espécies reativas é em sua maior parte balanceada pelos sistemas de defesa antioxidante do organismo. No entanto, em determinadas condições patológicas pode haver um desequilíbrio entre a produção de oxidantes e as defesas antioxidantes, favorecendo a ocorrência de estresse oxidativo.

Para evitar os efeitos danosos das espécies reativas, existem mecanismos eficientes para a detoxificação das mesmas, como a produção endógena de enzimas antioxidantes e alguns antioxidantes não-enzimáticos. Embora diferindo na composição, as defesas antioxidantes estão amplamente distribuídas no organismo e compreendem:

 Agentes que removem cataliticamente os radicais livres, como as enzimas superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, entre outras;  Proteínas que minimizam a disponibilidade de pró-oxidantes (íons de ferro e cobre, por exemplo), ao se ligarem aos mesmos como as transferrinas;  Proteínas que protegem biomoléculas de danos (incluindo dano oxidativo) por outros mecanismos;  Agentes de baixo peso molecular que aprisionam espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, como glutationa, α-tocoferol, ácido ascórbico e a bilirrubina.

Assim, o termo “Estresse Oxidativo” é usado para se referir à situação na qual a geração de espécies reativas ultrapassa a capacidade das defesas antioxidantes disponíveis. Pode resultar tanto de uma diminuição das defesas antioxidantes quanto de uma produção aumentada de oxidantes, bem como da liberação de metais de transição ou a combinação de quaisquer desses fatores (HALLIWELL, 2001).

O estresse oxidativo pode promover adaptação, dano ou morte celular:  Adaptação: as células podem geralmente tolerar um estresse oxidativo moderado, que geralmente resulta em up-regulation da síntese de sistemas de defesa antioxidante a fim de restaurar o balanço oxidante/antioxidante. Apesar disso, nem sempre o estresse oxidativo precisa envolver defesas antioxidantes aumentadas.

 Dano celular: o estresse oxidativo pode danificar todos os alvos moleculares (DNA, proteínas, carboidratos e lipídios) (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999). A resposta à injúria pode ser reversível: a célula entra em steady state alterado temporário ou prolongado que não leva à morte celular.

 Morte celular: pode ocorrer tanto por necrose quanto por apoptose. Na morte celular por necrose, a célula incha e se rompe, liberando seu conteúdo para o meio extracelular. Pode haver a liberação de antioxidantes, como a catalase e a glutationa, e também de pró-oxidantes, como os íons cobre e ferro e proteínas do grupo HEME, agentes esses que podem afetar as células adjacentes, podendo até mesmo impor a elas um estresse oxidativo. Já na apoptose o mecanismo intrínseco de suicídio celular é ativado, e não há a liberação do conteúdo celular. A morte celular por apoptose pode

ser acelerada em certas doenças, como as desordens neurodegenerativas, havendo envolvimento do estresse oxidativo (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

Além da indução de necrose e apoptose, o estresse oxidativo pode levar a um aumento da lipoperoxidação, cujos produtos (malonildialdeído e 4-hidroxinonenal, entre outros) são altamente neurotóxicos, e a um dano oxidativo tanto às proteínas, inibindo a atividade de diversas enzimas e alterando a função celular, quanto ao DNA, causando alteração de bases púricas e pirimídicas (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

Clinicamente, o estresse oxidativo pode causar lesão tecidual relacionado com muitas desordens fisiopatológicas como a hipóxia, a inflamação e a isquemia tecidual e de reperfusão. Outras teorias afirmam que o estresse oxidativo pode estar relacionado com disfunção neurológica associada a doenças incluindo a doença de Parkinson, Alzheimer, epilepsias, dentre outras (BEYER et al., 1998).

Como já foi dito anteriormente, os antagonistas NMDA, como a ketamina, são capazes de induzir sintomas similares ao da esquizofrenia. Apesar da patogênese da esquizofrenia permanecer desconhecida, há indícios que pode haver uma relação entre estresse oxidativo e essa doença (REDDY, YAO, 1996). Dessa forma, decidimos avaliar a participação do estresse oxidativo após a administração aguda de ketamina em córtex pré-frontal de camundongos.

A escolha pelo córtex pré-frontal foi devido estudos demonstrarem que doses subanestésicas de ketamina causa comprometimento da função dessa região cerebral em ratos (MALHOTRA et al, 1996). Além disso, várias linhas de evidência sugerem que a ketamina pode alterar a função do córtex pré-frontal em parte interagindo com a neurotransmissão dopaminérgica nesta região (SEEMAN et al, 1976). Um estudo realizado com usuários recreacionais de ketamina demonstrou um aumento (up regulation) dos receptores D1 de dopamina no córtex pré-frontal dorsolateral (NARENDRAN et al, 2005). Estes dados sugerem que o uso repetido de ketamina para fins recreativos afeta a transmissão pré-frontal dopaminérgica de um sistema criticamente envolvido na memória laboral.

Iniciamos pela investigação da atividade da catalase em córtex pré-frontal (CPF) de camundongos após o tratamento agudo com ketamina nas doses de 5, 10 e 20 mg/kg. A catalase é

uma hemeproteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a H2O e O2. É encontrada no sangue, medula óssea, mucosas, rim e fígado. Sua atividade é dependente de NADPH.

Quadro 1- Reação da catalase

Nosso resultado demonstrou um aumento significativo da atividade da catalase em todas as doses utilizadas. Um estudo observou um aumento da atividade da catalase sanguinea em pacientes com diferentes formas de esquizofrenia. No entanto, resultados diferentes foram observados em ratos, onde ocorreu diminuição da atividade da catalase em diferentes áreas cerebrais após a administração aguda de ketamina (OLIVEIRA et al, 2009).

O segundo parametro estudado para investigar o envolvimento do estresse oxidativo após a adminstração aguda de ketamina foi a peroxidação lipídica (LPO). A LPO pode ser definida como uma cascata de eventos bioquímicos resultante da ação dos RL sobre os lípideos insaturados das membranas celulares, gerando principalmente L•, LO• e LOO•, levando à destruição de sua estrutura, falência dos mecanismos de troca de metabólitos e, numa condição extrema, à morte celular (BENZIE, 1996). A LPO talvez se constitua no evento citotóxico primário que desencadeia seqüência de lesões na célula. Existem diversas metodologias para a avaliação da LPO em sistemas biológicos.

Uma das técnicas mais utilizadas para se avaliar a oxidação de lípidios é o teste do malondialdeído (MDA). O MDA é um dialdeído formado como um produto secundário durante a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados por cisão beta dos AGPI peroxidados, principalmente o ácido araquidônico. A sua condensação com o ácido tiobarbitúrico (TBA) forma produtos, que podem ser determinados por absorção no visível ou por fluorescência (JANERO, 1990).

Nosso estudo verificou que doses subanestésicas de ketamina, 10 e 20 mg/kg elevou os níveis de MDA indicando aumento da peroxidação lipídica. Aumento dos níveis de peroxidação lipídica foi observado em eritrócitos (HERKEN et al.,2001) e no plasma (AKYOL et al., 2002) de pacientes esquizofrênicos. Estudos tem demonstrado que antagonistas NMDA como o MK-801 são capazes de aumentar o MDA em ratos (OZYURT et al, 2007a; OZYURT et al, 2007b). Um estudo encontrou dados similares, onde a ketamina na dose de 4 mg/kg aumentou significativamente os níveis de MDA em cerebelo, córtex pré-frontal, córtex cerebral, hipocampo e corpo estriado de ratos (OLIVEIRA et al, 2009).

Há crescentes indícios de que o óxido nítrico (NO) desempenha um papel importante na fisiopatologia da esquizofrenia. Por exemplo, aumento nos níveis do NO são relatados no plasma (AKYOL et al., 2002), células vermelhas do sangue (HERKEN et al., 2001) e cérebro post-mortem de pacientes portadores de esquizofrenia (YAO, LEONARD, REDDY, 2004). Além disso, foi observado que o hiperfuncionamento dos receptores NMDA levam a geração excessiva de NO por acúmulo de cGMP (ALBRECHT, WEGRZYNOWICZ, 2005).

Dessa forma, decidimos investigar o envolvimento do nitrito no estresse oxidativo após a adminstração aguda de ketamina. Nossos resultados mostraram que a administração aguda de ketamina em camundongos resulta em altos níveis de nitrito no córtex pré-frontal, corroborando com nossos dados, estudos demonstram um aumento dos níveis de NO em pacientes com esquizofrenia crônica. (YAO et al, 1998, YILMAZ et 2007). Resultados contraditórios foram observados por Ramirez et al (2004) que encontraram uma baixa concentração de nitrito no fluído cerebroespinhal de pacientes esquizofrênicos. Um estudo experimental observou que o MK-801, um antagonista NMDA aumentou os níveis de óxido nítrico no córtex pré-frontal de ratos (OZYURT et al, 2007b).

O último parâmetro utilizado para investigar o envolvimento do estresse oxidativo após a adminstração aguda de ketamina foi o GSH, que é um tripeptídeo essencial e um antioxidante endógeno encontrado nas células animais. Ele interage com os radicais livres e pode proteger dos danos produzidos pelo oxigênio singlet, radicais hidróxido e superóxidos (SHI et al, 1994). Em nosso estudo observamos que a administração aguda de ketamina em todas as doses utilizadas foi capaz de reduzir os níveis de glutationa em todas as doses utilizadas. Níveis diminuídos de glutationa reduzida foram encontrados em pacientes com esquizofrenia crônica (ZHANG et al, 2006; RAFFA et al, 2009).

Um estudo experimental em ratos observou que a fenciclidina, um antagonista NMDA utilizado como modelo animal de esquizofrenia, reduziu os níveis de GSH (RADONJIĆ et al, 2010). Entretanto, estudos experimentais verificaram que com o antagonista NMDA, MK-801, aumentou os níveis de GSH reduzida no córtex pré-frontal de ratos (OZYURT et al, 2007a; OZYURT et al, 2007b).

Assim em relação ao estresse oxidativo, os resultados sugerem que o tratamento agudo com ketamina acarreta em efeitos pró-oxidantes, podendo justificar os prejuízos cognitivos ocasionados por usuários recreacionais de ketamina. Os presentes dados também podem explicar, pelo menos em parte, os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da esquizofrenia.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Observando-se conjuntamente todos os resultados alcançados neste estudo, foi possível notar que:

No teste do campo aberto, o tratamento agudo e subcrônico com ketamina causou um aumento significativo da atividade locomotora em todas as doses utilizadas. Resultado similar foi encontrado na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico, onde houve também um aumento da atividade locomotora em todas as doses utilizadas.

No teste do labirinto em cruz elevado, o tratamento agudo e subcrônico com ketamina, pois reduziu alguns parâmetros nos braços abertos, como o TPBA e a PTBA. A abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina também ocasionou redução de alguns parâmetros nos braços abertos, como o NEBA e a PEBA.

Esses resultados observados no teste do campo aberto e no teste do labirinto em cruz elevado sugerem que os tipos de tratamentos com ketamina utilizados no presente estudo provocam efeitos ansiogênicos.

No teste do nado forçado, o tratamento agudo e subcrônico com ketamina, em todas as doses utilizadas, diminuiu o tempo de imobilidade. Enquanto que a abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina nas doses de 10 e 20 mg/kg provocou um aumento significativo no tempo de imobilidade.

No teste da suspensão da cauda, o tratamento agudo e subcrônico com ketamina, em todas as doses utilizadas, diminuiu o tempo de imobilidade. Resultado diferente foi observado na abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina nas doses de 10 e 20 mg/kg, quando ocorreu um aumento significativo no tempo de imobilidade.

Esses resultados encontrados no teste do nado forçado e no teste da suspensão da cauda indicam que o tratamento agudo e subcrônico com ketamina provocam efeitos antidepressivos. Enquanto que a abstinência de 24h após o tratamento subcrônico com ketamina causou efeito depressor.

Através da investigação do envolvimento do estresse oxidativo constatou-se que após o tratamento agudo com ketamina em córtex pré-frontal de camundongos ocorreu um aumento significativo da atividade da catalase, dos níveis de malonildialdeído e nitrito. Enquanto nos níveis de glutationa reduzida (GSH) observou-se uma diminuição significativa, sugerindo uma ação pró-oxidante da ketamina.

CONCLUSÃO

8 CONCLUSÃO

Com o presente trabalho pode-se concluir que os diferentes tipos de tratamento com ketamina são capazes de alterar o comportamento do animal. No tratamento agudo e subcrônico observou-se um efeito ansiogênico e antidepressivo. Enquanto que a abstinência de 24h após o tratamento subcrônico evidenciou um efeito ansiogênico e depressor.

Além das alterações comportamentais, constata-se que o tratamento agudo com ketamina causa aumento do estresse oxidativo, indicando a ocorrência de possíveis lesões neurais em consequência dessas alterações.

Vários estudos descrevem os efeitos comportamentais e neuroquímicos causados pela ketamina. Entretanto, os resultados são contraditórios talvez pela variação dos tratamentos, doses, vias e espécies de animais diferentes. Desta forma, o presente estudo é de suma importância, pois contribui no esclarecimento dos efeitos causados pela ketamina. Estudos posteriores ainda são necessários para esclarecer os mecanismos estão envolvidos nas alterações comportamentais e neuroquímicas provocadas pela ketamina.

Da anestesia ao uso abusivo, a ketamina cada vez mais vem sendo utilizada. O uso como droga de abuso já tem sido largamente relatado, sendo os achados desse estudo relevante para compreender os mecanismos do abuso dessa substância.

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ANEXOS

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APÊNDICES

Brain Research Bulletin 83 (2010) 9–15

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Brain Research Bulletin

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Research report Behavioral alterations and pro-oxidant effect of a single ketamine administration to mice

Francisca Charliane Carlos da Silva a, Maria do Carmo de Oliveira Cito a, Maria Izabel Gomes da Silva a, Brinell Arcanjo Moura a, Manuel Rufino de Aquino Neto a, Mariana Lima Feitosa a, Raquell de Castro Chaves a, Danielle Silveira Macedo a, Silvania Maria Mendes de Vasconcelos a, Marta Maria de Franç a Fonteles b, Francisca Cléa Florenç o de Sousa a,∗ a Laboratory of Neuropharmacology, Department of Physiology and Pharmacology, School of Medicine, Federal University of Ceará, Street Cel. Nunes de Melo 1127, CEP: 60430-270, Fortaleza, Brazil b Department of Pharmacy, School of Pharmacy, Dentistry, and Nursing, Federal University of Ceará, Street Capitão Francisco Pedro 1210, CEP: 60431-327, Fortaleza, Brazil article info abstract

Article history: A growing body of evidence has pointed to the ionotropic glutamate N-methyl-d-aspartate receptor Received 29 October 2009 (NMDA) as an important player in the etiology of psychopathologies, including anxiety and major depres- Received in revised form 13 May 2010 sion. Clinical findings suggest that ketamine may be used for the treatment of major depression. There is Accepted 19 May 2010 evidence that reactive oxygen species also play an important role in the pathogenesis of many diseases, Available online 1 July 2010 particularly those which are neurological and psychiatric in nature. This study examined the behavioral and oxidative stress alterations after a single administration of ketamine (5, 10 and 20 mg/kg i.p.) Keywords: in mice. Ketamine presented a significant anxiogenic effect in the elevated plus-maze model of anxi- Ketamine Anxiety ety, also increasing locomotor activity. In the forced swimming and tail suspension tests, a significant Depression decrease in immobility time after ketamine administration was observed. In addition to the behavioral Behavior changes induced by ketamine, this drug also increased lipid peroxidation, nitrite content and catalase Oxidative stress activity, while decreased GSH levels in mice prefrontal cortex. In conclusion, our results confirm the antidepressant effects of ketamine, also showing a pro-oxidant effect of this drug. © 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.

1. Introduction ing from major depression [67]. In agreement with these clinical findings, some evidence from the literature suggests that ketamine Ketamine has been used clinically as a dissociative anesthetic induces anxiolytic and antidepressant-like effects in rodents sub- since the 1960s and is regarded as a noncompetitive glutamate jected to animal models of anxiety and depression [23]. N-methyl-d-aspartic acid (NMDA) receptor antagonist [35]. Sub- Studies carried out in rats and mice demonstrated neurotoxic- anesthetic doses of NMDA receptor antagonists, like ketamine ity such as structural damage, reversible or irreversible neuronal (30–50 mg/kg), induce behavioral and neurochemical changes alterations, neural disinhibition, and c-fos or heat shock protein associated with symptoms of schizophrenia in humans and animals expression particularly in the posterior cingulate and retrosplenial [26,63]. (PC/RS) cortex during systemic administration of NMDA recep- Recently, clinical studies suggested that acute administration tor antagonists like MK-801, ketamine and phencyclidine (PCP) of ketamine ameliorate depressive symptoms in patients suffer- [27]. However, the mechanism for neurotoxicity of NMDA receptor antagonists and the subsequent degenerative process in the PC/RS cortex have not fully been understood. A study suggested that PCP ∗ induced injury in the PC/RS cortex was associated with increased Corresponding author. Tel.: +55 85 3366 8342; fax: +55 85 3366 8333. E-mail addresses: [email protected] (F.C.C. da Silva), oxidative stress and antioxidants could block this injury [47]. [email protected] (M. do Carmo de Oliveira Cito), [email protected] Oxidative stress refers to an imbalance between the formation (M.I.G. da Silva), [email protected] (B.A. Moura), manuelrufi[email protected] of cellular oxidants and the antioxidative processes and it occurs (M.R. de Aquino Neto), [email protected] (M.L. Feitosa), when the production of reactive oxygen radicals (ROS) (or free rad- [email protected] (R. de Castro Chaves), [email protected] icals) such as the superoxide anion (O −), hydroxyl radical (OH) (D.S. Macedo), silvania [email protected] (S.M.M. de Vasconcelos), 2 [email protected] (M.M. de Franç a Fonteles), and hydrogen peroxide (H2O2) increase beyond the physiological cleafl[email protected] (F.C.F. de Sousa). antioxidant protective mechanisms and is associated with numer-

ous pathological states, including diseases of the nervous system 2.6. Forced swimming test (FST) [14]. In the present study, we attempted to evaluate not only behavioral effects induced by an acute ketamine administration in mice, The forced swimming test [43,44] includes an exposure in the but at the same time to estimate the relationship between the water tank. For these experiments the tank size was 22 cm in oxidative stress data and behavioral effects of the drug. diameter and 40 cm in height. The tank had a rounded lid and contained 20 cm high fresh water at 25 ◦C. During the test session, mice were placed in the tank and left there for 5 min during which 2. Material and methods immobility time was registered. A mouse was considered immobile when it remained floating in the water, without struggling, mak- 2.1. Animals ing only very slight movements necessary to keep its head above water. Male Swiss mice (25–30 g) were used in each experiment and maintained at a controlled temperature (23 ± 1 ◦C) with a 12 h dark/light cycle and free access to water and food. Animals were 2.7. Tail suspension test (TST) treated in accordance with the current law and the NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals. The tail suspension test has been described by Steru et al. [57]. Male Swiss mice were housed in plastic cages in a 12 h light cycle with food and water freely available. Animals were transported 2.2. Drugs and treatments from the housing room to the testing area in their own cages and allowed to adapt to the new environment for 1 h before testing. For Ketamine was obtained from Laboratory Cristália (Brazil). the test, the animals were divided into four groups with 7–10 ani- Different groups of mice (n = 7–16 each) were administered mals per group. They were suspended on the edge of a shelf 58 cm intraperitoneally (i.p.) with saline (control) or different doses of above a table top by adhesive tape placed approximately 1 cm from ketamine (5, 10 and 20 mg/kg) 10 min before the test sessions, i.e. the tip of the tail. The duration of immobility is recorded for a period elevated plus-maze, open-field, forced swimming or tail suspen- of 5 min. sion tests. In order to evaluate oxidative stress alterations, animals were treated with saline or ketamine (5, 10 and 20 mg/kg) and 2.8. Determination of oxidative stress parameters 10 min after, prefrontal cortex (PFC) was dissected for preparation of homogenates 10% (w/v) in 0.05 M phosphate buffer, pH 7.4 or 2.8.1. Measurements of lipid peroxidation EDTA 0.02 M (GSH measurements) for the enzymatic assays. All Lipid peroxides formation was analyzed by measuring the thio- drugs were administered in a volume of 1 mL/kg. The protein con- barbituric acid reacting substances (TBARS) in the homogenates. centration was measured according to the method described by The samples were briefly mixed with 50 mM potassium phosphate Lowry et al. [30]. monobasic buffer pH 7.4, 63 ␮L of the homogenate was mixed to 100 ␮L of 35% perchloric acid, then the samples were centrifuged ␮ 2.3. Experimental protocol (5000 rpm/10 min), 150 L of the supernatants were retrieved and mixed with 50 ␮L of thiobarbituric acid 1.2%, then heated in a boil- The animals were tested during the light period and observed ing water bath for 30 min. After cooling, the lipid peroxidation was in a closed room with constant temperature (23 ± 1 ◦C) and poorly determined by the absorbance at 535 nm and was expressed as ␮ illuminated with a 15-V red light, except in the forced swimming mol of malondialdehyde (MDA)/mg of protein. and tail suspension Tests whose were illuminated with normal light. All tests were performed in different days with distinct groups 2.8.2. Nitrite determination of animals. In order to assess the effects of treatments with respective drug on nitric oxide (NO) production, nitrite levels were determined in the mouse brain homogenates immediately after decapitation 2.4. Elevated plus-maze test (EPM) in all groups. After centrifugation (800 × g/10 min), the supernatant of homogenate was collected and the production of NO The elevated plus maze for mice [29] consisted of two per- was determined based on Griess reaction [13,46]. Briefly, 100 ␮L pendicular open arms (30 cm × 5 cm) and two closed arms of supernatant was incubated with 100 ␮L of Griess reagent (30 cm × 5cm× 25 cm) also in perpendicular position. The (sulfanilamine in 1% H PO /0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine open and closed arms were connected by a central platform 3 4 dihydrochloride/1%H PO /distilled water, 1:1:1:1) at room tem- (5 cm × 5 cm). The platform and the lateral walls of the closed arms 3 4 perature for 10 min. The absorbance was measured at 550 nm via a were made of transparent acrylic and the floor of black acrylic. microplate reader. The standard curve was prepared with several The maze was 45 cm above the floor. After treatment, the animal concentrations of NaNO (ranging from 0.75 to 100 ␮M) and was was placed at the center of the plus-maze facing the enclosed 2 expressed as ␮mol/g of protein. arm, and observed for 5 min. The following parameters were registered: number of entries in the open and closed arms, and time of permanence in each of them. The percentage of entries and 2.8.3. Evaluation of catalase activity time spent in the open arms were calculated. Catalase activity was measured by the method that employs hydrogen peroxide to generate H2O and O2 [31]. The activity was measured by degree of this reaction. The standard assay substrate 2.5. Open-field test (OFT) mixture contained 0.30 mL of hydrogen peroxide in 50 mL of 0.05 M phosphate buffer, pH 7.0. The sample aliquot (20 ␮L) was added The open-field area was made of acrylic (transparent walls and to 980 ␮L of substrate mixture. After 1 min, initial absorbance was black floor, 30 cm × 30 cm × 15 cm) divided into nine squares of recorded and final absorbance was read after 6 min. The reaction equal area. This apparatus was used to evaluate the exploratory was followed at 230 nm. A standard curve was established using activity of the animal [2]. The observed parameter was the number purified catalase (Sigma, MO, USA) under identical conditions. All of squares crossed (with the four paws). samples were diluted with 0.1 mmol/L phosphate buffer (pH 7.0) F.C.C. da Silva et al. / Brain Research Bulletin 83 (2010) 9–15 11 to provoke an inhibition of 50% of diluent rate (i.e., the uninhibited reaction) and results were expressed as ␮M/min/␮g protein.

2.8.4. Determination of GSH levels GSH levels were evaluated to estimate endogenous defenses against oxidative stress. The method was based on Ellman’s reagent (DTNB) reaction with free thiol groups. PFC homogenates 10% (w/v) in EDTA 0.02 M were added to a 50% trichloroacetic acid solu- tion. After centrifugation (3000 rpm/15 min), the supernatant of homogenate was collected and the production levels of GSH were determined as described by Sedlak and Lindsay [50]. Brieﬂy, the samples were mixed with 0.4 M Tris–HCl buffer, pH 8.9 and 0.01 M DTNB. GSH level was determined by the absorbance at 412 nm and was expressed as ng of GSH/g wet tissue.

2.9. Statistical analysis

All results are presented as mean ± S.E.M. Data were analyzed by ANOVA followed by Student–Newman–Keuls’s post hoc test. Results were considered signiﬁcant at P < 0.05.

3. Results

3.1. Behavioral experiments

3.1.1. Elevated plus-maze Effects of ketamine (5, 10 and 20 mg/kg) in the EPM test are presented in Fig. 1. In this test, the groups treated with ketamine modiﬁed the following observed parameters: number of entries in the open arms (NEOA) [control: 5.50 ± 0.70 (16); Ket 5 mg: 7.50 ± 0.96 (8); Ket 10 mg: 2.43 ± 0.72 (8)*; Ket 20 mg: 2.57 ± 0.65 (8) *P < 0.05] and time of permanence in the open arms (TPOA/s) [control: 89.33 ± 6.36 (16); Ket 5 mg: 89.50 ± 10.58 (8); Ket 10 mg: 75.83 ± 6.46 (8); Ket 20 mg: 24.71 ± 11.11 (8) ***P < 0.001], as well as percentage time of permanence in the open arms (PTOA) [control: 29.64 ± 2.70 (16); Ket 5 mg: 30.38 ± 3.69 (8); Ket 10 mg: 26.00 ± 2.19 (8); Ket 20 mg: 10.88 ± 4.09 (8) ***P < 0.001]. Ketamine administration did not modiﬁed percentage the number of entries in the open arms (PEOA) [control: 37.68 ± 2.70 (16); Ket 5 mg: 34.37 ± 3.69 (8); Ket 10 mg: 29.32 ± 2.44 (8); Ket 20 mg: 33.30 ± 2.63 (8)].

3.1.2. Open-ﬁeld test Fig. 2 shows that ketamine (5, 10 and 20 mg/kg) signiﬁcantly increased in all doses tested the number of crossings in the OFT as compared to controls [control: 52.93 ± 1.85 (16); Ket 5 mg: 74.88 ± 3.32 (8)***; Ket 10 mg: 109.4 ± 7.21 (8) ***; Ket 20 mg: 83.67 ± 5.02 (8) ***P < 0.001].

3.1.3. Forced swimming test In the FST, ketamine at all doses (5, 10 and 20 mg/kg) and imipramine 10 mg/kg induced a significant decrease in the immobility time as compared to control [control: 139.60 ± 15.61 (8); Ket 5 mg: 84.33 ± 13.22 (8)**; Ket 10 mg: 78.75 ± 12.73 (8)**; Fig. 1. Plus-maze test of groups of mice which received vehicle or ketamine (5, 10 Ket 20 mg: 99.67 ± 4.49 (8)*, IMP 10: 21.00 ± 2.62 (7) ***P < 0.01, and 20 mg/kg). (A) NEOA: number of entries in the open arms; (B) TPOA(s): time of permanence in the open arms; (C) PTOA: percentage time of permanence in the open P < 0.001] (Fig. 3). arms; (D) PEOA: percentage the number of entries in the open arms. The results are presented as mean ± S.E.M. Significant difference compared with control (*P < 0.05; 3.1.4. Tail suspension test ***P < 0.001). ANOVA and Student–Newman–Keuls’s as the post hoc test. Similar to those results observed in FST, Fig. 4 shows that ketamine (5, 10 and 20 mg/kg) and imipramine 30 mg/kg signifi- 3.2. Oxidative stress parameters cantly decreased the immobility time in animals as compared to the control group in Tail suspension test [control: 149.20 ± 6.30 3.2.1. Lipid peroxidation (6); Ket 5 mg: 74.83 ± 12.24 (7)***; Ket 10 mg: 70.20 ± 18.01 (7)**; The treatment of the animals with ketamine only at of 10 and Ket 20 mg: 85.40 ± 15.13 (7)***; IMP 30: 22.71 ± 1.88 (7) ***P < 0.01, 20 mg/kg resulted in high levels of MDA in PFC when compared P < 0.001, P < 0.01]. with the control group (Fig. 5) [control: 3.79 ± 0.47 (7); Ket 5 mg: 12 F.C.C. da Silva et al. / Brain Research Bulletin 83 (2010) 9–15

Fig. 2. Open-field test of groups of mice which received vehicle or ketamine (5, 10 and 20 mg/kg). The figure shows number of squares crossed measured for 5 min. The Fig. 5. Levels of TBARS (lipid peroxidation level) in prefrontal cortex of adult mice ± results are presented as mean S.E.M. Significant difference compared with control treated with vehicle or ketamine (5, 10 and 20 mg/kg). The results are presented as (***P < 0.001). ANOVA and Student–Newman–Keuls’s as the post hoc test. mean ± S.E.M. Significant difference compared with control (*P < 0.05; ***P < 0.001). Student–Newman–Keuls’s as the post hoc test. Abbreviation: TBARS, thiobarbituric- acid-reacting substances.

Fig. 3. Forced swimming test of groups of mice which received vehicle, ketamine (5, 10 and 20 mg/kg) or imipramine (10 mg/kg). The figure shows immobility time (s). The results are presented as mean ± S.E.M. Significant difference compared with control (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). ANOVA and Student–Newman–Keuls’s as the post hoc test. Fig. 6. Content of nitrite in prefrontal cortex of adult mice treated with vehicle or ketamine (5, 10 and 20 mg/kg). The results are presented as mean ± S.E.M. Significant 4.34 ± 0.77 (7); Ket 10 mg: 6.51 ± 0.84 (7)*; Ket 20 mg: 6.65 ± 0.78 difference compared with control (***P < 0.001). Student–Newman–Keuls’s as the (7)* P < 0.05, ␮mol de MDA/mg of protein]. post hoc test.

3.2.2. Nitrite content Ketamine only at high dose (20 mg/kg) resulted in high levels 3.2.4. GSH levels of nitrite in PFC as compared to the control group (Fig. 6) [con- Ketamine administration in all doses tested resulted in signiﬁ- ± ± trol: 280.8 48.34 (8); Ket 5 mg: 388.6 22.87 (7); Ket 10 mg: cant decrease in GSH levels in PFC when compared to control groups ± ± 399.1 18.55 (7); Ket 20 mg: 557.8 35.59 (8) ***P < 0.05], results (Fig. 8) [control: 823.6 ± 78.06 (8); Ket 5 mg: 565.0 ± 58.56 (8)*; Ket ␮ were expressed in mol/g of tissue. 10 mg: 306.8 ± 64.44 (8)***; Ket 20 mg: 236.1 ± 23.09 (8) ***P < 0.05, ng/g wet tissue]. 3.2.3. Catalase activity An increase in catalase activity was seen in the ketamine group in PFC only at the doses of 10 and 20 mg/kg as compared to the control group (Fig. 7) [control: 25.77 ± 1.76 (7); Ket 5 mg: 38.41 ± 2.11 (7); Ket 10 mg: 51.30 ± 5.85 (7)*; Ket 20 mg: 76.48 ± 10.18 (7) ***P < 0.05, ␮M/min/␮g de protein].

Fig. 4. Tail suspension test of groups of mice which received vehicle, ketamine (5, 10 Fig. 7. Catalase activity in prefrontal cortex of adult mice treated with and 20 mg/kg) or imipramine (30 mg/kg). The figure shows immobility time (s). The vehicle or ketamine (5, 10 and 20 mg/kg). The results are presented as results are presented as mean ± S.E.M. Significant difference compared with control mean ± S.E.M. Significant difference compared with control (*P < 0.05; ***P < 0.001). (**P < 0.01). Student–Newman–Keuls’s as the post hoc test. Student–Newman–Keuls’s as the post hoc test. F.C.C. da Silva et al. / Brain Research Bulletin 83 (2010) 9–15 13

In relation to locomotor activity, studies have demonstrated that acute administration of NMDA receptors antagonists, such as phencyclidine (PCP), increased locomotion [22,36]. In accordance with this previous data, a single dose of ketamine caused hyperlocomotion in a low (30 mg/kg, i.p.) dose group, and hypolocomotion followed by hyperlocomotion in a high (100 mg/kg, i.p.) dose group [15]. Our results confirm the ones cited above, since a hyperlocomotion was observed after ketamine administration in all doses used in our experimental protocol (dose range: 5–20 mg/kg). Previous study correlated the increase in locomotion seen after ketamine administration with a dopaminergic agonist action of this drug in dopaminergic D2-receptors [18,52]. A significant antidepressant effect of ketamine was observed using forced swimming and tail suspension tests, 10 min after Fig. 8. NP-SH levels in prefrontal of adult mice treated with vehicle or Ketamine drug administration. Drugs with established antidepressant activ- (5, 10 and 20 mg/kg). The results are presented as mean ± S.E.M. Significant differ- ity, as imipramine, reduce the time during which the animals ence compared with control (*P < 0.05; ***P < 0.001). Student–Newman–Keuls’s as remain immobile [43,64]. The possible antidepressant effect of the post hoc test. ketamine is not something new. It has been known for more than 15 years that NMDA receptor antagonists produce antidepressant- 4. Discussion like effects after a single administration in screening procedures like the TST and FST [23]. The present study confirms the acute Considerable research has demonstrated that noncompetitive antidepressant-like effects of ketamine in mice observed in other N-methyl-d-aspartate (NMDA) receptor antagonists, such as the studies using different doses and different time withdrawal after dissociative anesthetics ketamine, reproduce the cardinal symp- ketamine administration [7,32,49]. Some clinical reports showed tomatic features of schizophrenia [60]. In humans, ketamine can that ketamine acute administration produce rapid therapeutic produce hallucinations and paranoia similar to the positive symp- effects in seriously depressed humans [5], thus our results corrob- toms of schizophrenia [17]. Ketamine can also produce social orates these ones. withdrawal, poverty of speech, and blunted affect resembling the Several studies have shown that reactive oxygen species (ROS) negative symptoms of the disease [1,24]. In rodents and mon- have an important role in the pathogenesis of many diseases, espe- keys, acute sub-anesthetic doses of NMDA antagonists produce a cially neurological and psychiatric diseases [58]. Oxidative stress schizophrenia-like symptomatology, including hyperlocomotion, may be a common pathogenic mechanism underlying many major enhanced stereotyped behaviors, cognitive and sensorimotor gat- psychiatric disorders, as the brain has comparatively greater vul- ing deficits, and impaired social interactions [6,21,28,42]. Beyond nerability to oxidative damage [38]. In this context, it has already schizophrenia, anxiety and major depression etiology is also related been reported that free radicals are elevated in patients diagnosed to NMDA receptors [20,25]. Several clinical and preclinical stud- with schizophrenia [10,65]. Young et al. [66] reported that there ies have demonstrated that NMDA antagonists produce anxiolytic- was an increase in protein carbonyl groups as well as damage to the and antidepressant-like effects. In this way, chemical compounds DNA in schizophrenic patients, suggesting that an oxidative alter- acting on NMDA receptors could be interesting as pharmacological ation had occurred. Recently, Cumurcu et al. [8] showed that total targets for the treatment of mood disorders [33,37,56]. serum oxidant status is associated with major depressive disor- The anesthetic effects of ketamine have been reported to be der, since there was an elevation of this parameter in patients with closely correlated with its antagonistic effects on NMDA receptors major depressive disorder as compared to healthy volunteers and [19,59], but persistent modifications of other neurons including antidepressant treatment was able to reverse this alteration. dopamine (DA), norepinephrine (NE), and serotonin (5-HT) neu- Based on these previous findings, we decided to investigate rons have also been reported to accompany the behavioral effects oxidative stress in prefrontal cortex of mice treated with ketamine, of ketamine [18,61,62]. since studies have demonstrated that sub-anesthetic doses of this In the present work, the effects of ketamine were studied in drug impair prefrontal cortex function in the rat and produce several behavior animal models, such as EPM, OFT, FST and TST, symptoms in humans similar to those observed in schizophrenia to investigate its possible central activity. These tests are classi- and dissociative states, including impaired performance of frontal cal models for screening central nervous system actions providing lobe-sensitive tests [34,40]. Besides, several lines of evidence sug- information about psychomotor performance, anxiety and depres- gest that ketamine may alter prefrontal cortex function in part by sion. interacting with dopamine neurotransmission in this region [51]. Our results showed that a single injection of ketamine had a Individuals diagnosed with depression present a hypoactivation in significant anxiogenic effect in mice in the EPM test, affecting their the left prefrontal lobe [12,16] suggesting a deficit in this region, locomotor activity (OFT test). In EPM, significant behavioral alter- which has been interpreted as being related to reduction in the ations derived from anxiety-related preference for closed arms ability of depressed individuals to experience pleasure or have (attenuating the number and the percentage of the time spent into appetitive goals. the open arms). Studies investigating the anxiety-related effects The data presented in this study demonstrate that sub- of ketamine in animal models are scarce. Moreover, the results of anesthetic doses of ketamine, 10 and 20 mg/kg increased TBARS, these studies have been haphazard, with reports of anxiolytic [54], indicating an increase in lipid peroxidation. Our data corrobo- anxiogenic [3], and null results [4]. These studies used different rate with a study the showed an elevation in lipid peroxidation behavioral procedures, different doses, different routes of admin- products in rats prefrontal cortex following the administration of istration, and different durations of ketamine administration. A NMDA antagonists as MK-801 [41]. In this line of evidence, the recent study showed that ketamine presented anxiolytic effects study demonstrated that after administration of ketamine (4 and only at high dose (50 mg/kg, i.p.) [9], in our case 5, 10 and 20 mg/kg 10 mg/kg) an increase of TBARS levels in various regions (cerebel- were anxiogenic doses, thus we may conclude that ketamine anx- lum, prefrontal, hippocampus, striatum and cortex) of the rat brain iolytic effects depends on the dose administered. was observed [39]. 14 F.C.C. da Silva et al. / Brain Research Bulletin 83 (2010) 9–15

Researches have focused on the biochemical and molecular [8] B.E. Cumurcu, H. Ozyurt, I. Etikan, S. Demir, R. Karlidag, Total antioxidant actions of nitric oxide (NO) in normal conditions, as well as, its capacity and total oxidant status in patients with major depression: impact of antidepressant treatment, Psychiatry Clin. Neurosci. 63 (5) (2009 Oct) 639–645. potential alteration in pathological conditions like schizophrenia [9] E. Engin, D. Treit, C.T. Dickson, Anxiolytic- and antidepressant-like properties of [68,69] and depression [11]. Based on this, we also decided to inves- ketamine in behavioral and neurophysiological animal models, Neuroscience tigate ketamine effects on nitrite levels. In the present study, high 161 (June (2)) (2009) 359–369. [10] C. Fendri, A. Mechri, G. Khiari, A. Othman, A. Kerkeni, L. Gaha, Oxidative stress levels of nitrite were observed in prefrontal cortex of mice after involvement in schizophrenia pathophysiology: a review, Encephale 32 (2006) 20 mg/kg ketamine administration. According to our results, pre- 244–252. vious studies have demonstrated increased NO levels in patients [11] R. Garg, A. Kumar, Possible role of citalopram and desipramine against sleep with chronic schizophrenia [65]. However, contradictory results deprivation-induced anxiety like-behavior alterations and oxidative damage in mice, Indian J. Exp. Biol. 46 (11) (2008 Nov) 770–776. were observed by Ramirez et al. [48] that demonstrated low con- [12] I.H. Gotlib, C. Ranganath, J.P. Rosenfeld, Frontal EEG alpha asymmetry, depres- centration of nitrite in the cerebrospinal fluid from schizophrenic sion, and cognitive functioning, Cogn. Emotion 12 (1998) 449–478. patients. Nitrite levels were also elevated after sleep deprivation- [13] L.C. Green, S.R. Tannenbaum, P. 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Our data shows enhanced catalase activity and [20] D.C. Javitt, Glutamate as a therapeutic target in psychiatric disorders, Mol. Psychiatry 9 (2004) 979–984. decreased levels of GSH in prefrontal cortex of mice after ketamine [21] G. Keilhoff, A. Becker, G. Grecksch, G. Wolf, H.G. Bernstein, Repeated appli- acute administration, demonstrating an alteration in antioxidative cation of ketamine to rats induces changes in the hippocampal expression of brain defenses. Rachkauskas et al. [45] observed increased blood parvalbumin, neuronal nitric oxide synthase and cFOS similar to those found in human schizophrenia, Neuroscience 126 (2004) 591–598. catalase activity in patients with different forms of schizophrenia. [22] M. Kalinichev, M.J. Robbins, E.M. Hartfield, P.R. Maycox, S.H. Moore, K.M. However, different results were observed in rats, which showed Savage, et al., Comparison between intraperitoneal and subcutaneous phen- decreased CAT enzyme activities [39]. In chronic mild stress model cyclidine administration in Sprague–Dawley rats: a locomotor activity and gene induction study, Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32 (2008) of depression an increase in catalase (cerebellum, hippocampus, 414–422. striatum, cortex) and a decrease in superoxide dismutase activ- [23] T. Kos, P. Popik, M. Pietraszek, D. Schafer, W. Danysz, O. Dravolina, et al., Effect ity (prefrontal, hippocampus, striatum and cortex) was observed of 5-HT3 receptor antagonist MDL 72222 on behaviors induced by ketamine in rats and mice, Eur. Neuropsychopharmacol. 16 (2006) 297–310. in stressed rats, suggesting that an imbalance between superox- [24] J.H. Krystal, L.P. Karper, J.P. Seibyl, G.K. Freeman, R. Delaney, J.D. Brem- ide dismutase and catalase activities contributes to stress-related ner, et al., Subanesthetic effects of the noncompetitive NMDA antagonist, diseases, such as depression. ketamine, in humans. Psychotomimetic, perceptual, cognitive, and neuroendocrine responses, Arch. Gen. Psychiatry. 51 (1994) 199–214. In conclusion, recent findings support the idea of a putative [25] J.H. Krystal, D.C. D’Souza, I.L. Petrakis, A. Belger, R.M. Berman, D.S. Charney, role of NMDA receptors in mood-related symptoms, and rapid and W. Abi-Saab, S. Madonick, NMDA agonists and antagonists as probes of glu- robust effects of ketamine in reverting mainly physiological alter- tamatergic dysfunction and pharmacotherapies in neuropsychiatric disorders, ations induced by chronic mild stressful situations in rats. Our Harv. Rev. Psychiatry 7 (3) (1999) 125–143. [26] A.C. Lahti, M.A. Weiler, B.A. Tamara Michaelidis, A. Parwani, C.A. Tamminga, results also showed antidepressant alterations following a single Effects of ketamine in normal and schizophrenic volunteers, Neuropsychophar- ketamine dose. Additionally, in our study, ketamine in the doses macology 25 (4) (2001) 455–467. related to its antidepressant effect also increased lipid peroxida- [27] Q. Li, S. Clark, D.V. Lewis, W.A. Wilson, NMDA receptor antagonists disinhibit rat posterior cingulate and retrosplenial cortices: a potential mechanism of tion, nitrite content and catalase activity, while decreased GSH neurotoxicity, J. Neurosci. 22 (2002) 3070–3080. levels. Taken together these results indicates that some caution is [28] B.K. Lipska, D.R. Weinberger, To model a psychiatric disorder in animals: needed in relation to ketamine since this drug in spite of its antide- schizophrenia as a reality test, Europsychopharmacology 23 (2000) 223–239. [29] R.G. Lister, The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse, Psycophar- pressant effects is related to pro-oxidant alterations in CNS also macology 92 (1987) 180–185. causing anxiety behavior. [30] H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. 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RESUMO ABSTRACT

Objetivo. Realizar uma revisão bibliográfica sobre a ketamina, en- Objective. To do a bibliographic review about ketamine, focusing focando aspectos químicos e farmacocinéticos, seus mecanismos de chemical and pharmacokinetical aspects, and its mechanisms of ac- ação, efeitos farmacológicos, usos terapêuticos, bem como aborda o tion, pharmacological effects, uses on therapeutic practice and ap- uso da ketamina como droga de abuso. Ketamina. Método. Estudo proach ketamine uses as abuse drug. Method. In the present study, de revisão bibliográfica através das bases de dados Pubmed, SciELO, a literature review on ketamine was performed using the database Lilacs e Medline, na qual foram selecionados estudos clássicos e recen- electronic Pubmed, Medline and Lilacs. Relevant classic and recent tes relevantes para a discussão do tema abordado. Resultados. Após studies related to the ketamine theme were selected. Results. After análise dos artigos selecionados, conclui-se que a ketamina apresenta analysis of the selected studies, promising prospects for ketamine perspectivas promissoras. Alguns estudos demonstraram propriedades were identified. Some studies have demonstrated analgesic proper- analgésicas em relação à dor pós-operatória e outros revelaram uma ties in relation to postoperative pain, while other revealed a rapid ação antidepressiva rápida. Além disto, a ketamina também apre- antidepressant action from ketamine. Furthermore, this drug also sentou efeitos neuroprotetores em vários estudos animais. Embora a showed neuroprotective effects in several animal studies. However, ketamina seja um campo promissor, essas ações precisam ser melhor such actions need to be better investigated. Recently, it has been investigadas. Atualmente, observou-se que o seu uso não se restringe observed that ketamine use is not restricted only to clinical practice apenas à prática clínica ou pesquisa, sendo frequentemente utilizada or research. It has also been often abused for its hallucinogenic como droga de abuso pelos jovens em festas como um potente aluci- properties by teenagers and young adults at dance parties. Conclu- nógeno. Conclusão. Pesquisas sobre o uso recreacional da ketamina sion. So, researches on recreational use of ketamine, as well as data também são necessárias, especialmente no Brasil, assim como dados showing morbidity and mortality from its use as a drug of abuse que mostrem a morbidade e mortalidade pelo uso desta substância are also necessary. como droga de abuso.

Unitermos. Ketamina, Anestesia, Analgesia, Depressão, Drogas de Keywords. Ketamine, Anesthesia, Analgesia, Depression, Drug Abuso. Abuse.

Citação. Silva FCC, Dantas RT, Citó MCO, Silva MIG, Vasconcelos Citation. Silva FCC, Dantas RT, Citó MCO, Silva MIG, Vascon- SMM, Fonteles MMF, Viana GSB, Sousa FCF. Ketamina, da aneste- celos SMM, Fonteles MMF, Viana GSB, Sousa FCF. Ketamina, sia ao uso abusivo: artigo de revisão. da anestesia ao uso abusivo: artigo de revisão.

1. Enfermeiro, Mestrando em Farmacologia – UFC, Fortaleza-CE, Brasil. Trabalho realizado no Departamento de Fisiologia e Far- 2. Enfermeira, Doutoranda em Farmacologia - UFC, Fortaleza-CE, Brasil. macologia da Faculdade de Medicina da Universida- 3. Farmacêutica, Doutora em Farmacologia – UFC, Fortaleza-CE, Brasil. de Federal do Ceará (UFC), Fortaleza-CE, Brasil. 4. Enfermeira, Doutora em Farmacologia, Professora adjunta do Depar- tamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Uni- Endereço para correspondência: versidade Federal do Ceará, Atuação em Neuropsicofarmacologia – UFC, Dra. Francisca CF Sousa Fortaleza-CE, Brasil. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, 5. Farmacêutica, Pós-Doutorado pela University of Auckland, Nova Ze- Faculdade de Medicina, UFC. lândia, Professora adjunta do Departamento de Farmácia da Universidade R Cel. Nunes de Melo,1127 Federal do Ceará. Atuação em Neurofarmacologia – UFC, Fortaleza-CE, CEP 60430-270, Fortaleza-CE, Brasil. Brasil. Tel: (85) 3366-8337 / fax: 3366-8333 6. Farmacêutica, Pós-Doutorado pela University of Maryland System, Pro- E-mail: [email protected] fessora adjunta do Departamento de Farmácia da Universidade Federal do Ceará, Atuação em Neuropsicofarmacologia – UFC, Fortaleza-CE, Brasil. Revisão 7. Farmacêutica, Doutora em Farmacologia e Professora adjunta do Depar- Recebido em: 27/10/08 tamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Univer- Aceito em:13/02/09 sidade Federal do Ceará – UFC, Fortaleza-CE, Brasil. Conflito de interesses: não

Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 227 revisão INTRODUÇÃO de fenciclidina (PCP), sendo nomeada inicialmente O uso de drogas psicoativas não é um evento de ”CI581”4. Usada principalmente como anestésico, novo no repertório humano, mas uma prática milenar produz um tipo de anestesia diferente denominada e universal, não sendo, portanto, fenômeno exclusivo anestesia dissociativa que se caracteriza por um esta- da época em que vivemos. Na antiguidade, drogas ori- do cataléptico. Este fenômeno parece resultar da dis- ginárias de plantas eram usadas como medicação para sociação funcional e eletrofisiológica entre os sistemas as mais diversas doenças. Drogas também eram usa- tálamo-neocortical e límbico5. das em homenagem aos deuses em rituais sagrados. A Alguns estudos relatam ainda um potencial an- partir do século XVI, o uso de drogas entrou em nova tidepressivo da ketamina6,7. Além disso, a ketamina é fase: com a Era das Navegações, os europeus entraram capaz de restabelecer psicoses em pacientes esquizofrê- em contato com diferentes culturas, sobretudo quando nicos remitentes. Esta substância tem sido usada para colonizaram o continente americano, entrando pela avaliar sintomas positivos e negativos da esquizofrenia primeira vez em contato com a cocaína usada pelos humana tais como os déficits auditivos e visuais;- al nativos do Andes, com o tabaco que já era usado pelas terações nas regiões límbico cortical, formação hipo- tribos indígenas da América do Norte, com o haxixe campal, núcleo accumbens, e amigdala basolateral; quando faziam comércio com os árabes e com o ópio aumento cerebral do fluxo sanguíneo no córtex cingu- no Extremo Oriente1,2. lado anterior e redução cerebral do fluxo sanguíneo no A partir de então, a Europa importou essas dro- hipocampo e córtex visual primário8,9. gas, que passaram a ser utilizadas por aproximadamen- Devido a suas ações farmacológicas, na meta- te três séculos como tônicos, fortificantes e remédios, de da década de 90, ela foi acionada ao DEA (Drug para as mais variadas patologias. Mas foi apenas no Enforcement Administration), um órgão que classifica século XIX que os problemas decorrentes desse uso in- substâncias psicoativas, como uma droga emergente. discriminado começaram a despertar a atenção, e no Atualmente, seu uso é permitido apenas quando mi- século XX, ocorreram verdadeiras epidemias de abuso nistrado por médicos e veterinários, sendo mais utili- e dependência de substâncias psicoativas1. zada na indução e manutenção da anestesia4. Entretan- Atualmente, o consumo de drogas psicoativas to, o uso da ketamina não tem sido restrito à prática tem se tornado um tema cada vez mais preocupan- clínica e pesquisa, uma vez que, atualmente, tem sido te. Isto se deve ao fato de ser um fenômeno social e frequentemente utilizada como droga de abuso pelos constituir-se em uma das principais questões na saúde jovens em festas, denominadas então de “club drug”. pública. Os possíveis danos resultantes do consumo A associação entre diversas drogas de abusos é comum dessas substâncias, decorrem tanto do próprio uso das nessas festas, podendo causar intoxicações fatais nos substâncias químicas quanto da vivência do processo usuários10. de dependência. Problemas graves de comportamento O presente trabalho apresenta uma revisão da e de saúde – como doenças hepáticas, contaminação literatura científica sobre a ketamina, enfocando aspec- pelo HIV, acidentes de trânsito são exemplos desses tos químicos e farmacocinéticos, seus mecanismos de danos3. ação, efeitos farmacológicos, usos terapêuticos, bem As drogas psicoativas podem ser classificadas em como aborda o uso da ketamina como droga de abuso. três tipos: depressoras, alucinógenas e estimulantes. As depressoras alteram o processamento de captação das MÉTODO informações pelo cérebro, dificultando e atrasando esse Trata-se de um estudo de revisão bibliográfica de mecanismo, exemplo o álcool, ópio e morfina. As alu- base descritiva realizada no período de setembro a de- cinógenas tendem a despersonalizar os usuários, como zembro de 2008 com o levantamento de dados pesqui- a maconha, LSD e heroína. Já as estimulantes causam sados na literatura com o objetivo de selecionar estudos aumento do processamento cerebral, resultando em si- clássicos e recentes relevantes para a discussão do tema tuações de êxtase e grande agitação, como a cocaína, abordado encontrados em bibliotecas virtuais e base de crack, ecstasy, anfetaminas e cafeína1. dados como Pubmed, SciELO, Lilacs e Medline, uti- O cloridrato de ketamina produz efeitos tanto lizando a combinação dos seguintes descritores: keta- alucinógenos quanto estimulantes, sendo sintetizado mina, anestesia, analgesia, depressão, neuroproteção e pela primeira vez em 1962 pelo farmacêutico ameri- drogas de abuso e suas respectivas traduções nos idiomas cano Calvin Stevens no laboratório Parke & Davis por inglês e espanhol. ocasião de pesquisas para substituição dos anestésicos

228 Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 revisão RESULTADOS lenta e um grande potencial de acúmulo. A biodispo- nibilidade pela via intramuscular é de 93% e atinge QUÍMICA E FARMACOCINÉTICA pico plasmático em cinco minutos. Entretanto, por via A Ketamina, 2-(o-clorofenil)-2-(metilamino)- oral ocorre extenso metabolismo de primeira passagem cicloexanona, é uma arilcicloalquilamina derivada da e a biodisponibildade torna-se limitada, cerca de 20%. fenciclidina com peso molecular de 238 daltons e pKa A ketamina é rapidamente absorvida para a circulação de 7,511. É comercialmente utilizada como uma mistu- sistêmica após injeção peridural com biodisponibilda- ra racêmica de dois isômeros opticamente ativos (enan- de de 77%. A administração de ketamina por via intra- tiômeros), o S(+) e o R(-) associada aos conservantes nasal e retal, apresenta biodisponibildade de 50 e 25%, cloreto de benzetônio e ao clorbutanol12,13. respectivamente5-11. Esses isômeros possuem propriedades farmaco- lógicas diferentes. O FDA (Food and Drugs Adminis- MECANISMO DE AÇÃO tration), em 1992 alertou para o fato de que a separa- A neurofarmacologia da ketamina é complexa, ção de estereoisômeros não estava recebendo atenção uma vez que a mesma interage com vários tipos de adequada no desenvolvimento comercial de drogas. receptores em diversos locais de ligação, incluindo os A despeito das dificuldades técnicas e do alto custo, o receptores de glutamato, tanto NMDA (N-metil-D- foco nesse horizonte poderia abrir novas possibilidades aspartato) quanto não-NMDA; opiódes; gabaérgicos; terapêuticas12. Estudos em animais demonstraram que serotonérgicos; além de agir, direta ou indiretamente, a S(+) ketamina tem aproximadamente quatro vezes sobre as monoaminas (acetilcolina, noradrenalina e mais afinidade para a área de ligação da fenciclidina no dopamina)5. receptor NMDA do que a R(-) ketamina14,15. A S(+) ketamina é 2 vezes mais potente que a forma racêmica Ações nos Receptores de Glutamato NMDA para prevenir a sensibilização central da medula espi- Os receptores de glutamato NMDA são recep- nhal16. Devido a S(+) ketamina ter uma maior afini- tores inotrópicos ativados pelo glutamato, principal dade pelo receptor e apresentar farmacocinética similar neurotransmissor excitatório do SNC. O glutamato à forma racêmica, esta poderia ser uma droga clinica- desempenha um importante papel na regulação da mente interessante13-17. plasticidade sináptica, no aprendizado e memória, sen- A ketamina é metabolizada através de oxidação do encontrado em aproximadamente 80% dos neurô- pelas enzimas microssomais hepáticas em três metabó- nios19. O canal do receptor é permeável ao cálcio e em litos ativos: norcetamina, 5OH-cetamina e 4OH-ceta- menor grau ao sódio e ao potássio. Ligação simultânea mina, sendo a norcetamina o principal metabólito ati- do glutamato com a glicina, um co-agonista, é obri- vo, apresentando um terço a um quinto da potência da gatória para a ativação deste receptor. O magnésio de droga original. Todos os metabólitos são hidroxilados maneira voltagem-dependente bloqueia o canal em re- a hidroxinorcetina e em seguida conjugados a deriva- pouso e a abertura ocorre somente mediante despolari- dos glicuronídeos hidrossolúveis e excretados na urina. zação e ligação simultânea dos “agonistas”20. Além do fígado, o metabolismo ocorre em menor pro- Os receptores NMDA são áreas pós-sinápticas porção nos rins, intestino e pulmões5,14-18. Apresenta de ação da ketamina para reduzir a estimulação do alta lipossolubilidade e fraca ligação as proteínas plas- SNC. Esta droga liga-se ao receptor da fenciclidina no máticas (10 a 30%), resultando em grande volume de canal NMDA e inibe a ativação do canal pelo gluta- distribuição (aproximadamente 3l.kg-1), logo a ação do mato de maneira não-competitiva. O S(+), seu com- fármaco é mais rápida. Seu clearance de eliminação é ponente levógiro, tem três a quatro vezes mais afini- relativamente alto (1000 a 1600 mL.min-1), o que con- dade pelo receptor do que o isômero R(-), refletindo fere uma meia-vida curta em torno de 2 a 3 horas5. as diferenças observadas na sua potência analgésica e A norcetamina, principal metabólito da ketami- anestésica15. na, tem um poder avaliado em torno de 20% da mo- lécula inicial, ou seja, 1/3 a 1/4 da potência da droga Ações nos Receptores de Glutamato Não-NMDA original e surge no sangue dentro de 2 a 3 minutos Existem várias classes de receptores de gluta- após a injeção intravenosa de um bolus de ketamina, mato não-NMDA que são ativados seletivamente por atingindo um pico plasmático em 30 minutos. Porém, agonistas, dentre eles, quisqualato, AMPA (α-amino- suas concentrações são persistentes por mais de cinco 3-hidroxi-5-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato) ou horas após a administração, gerando uma eliminação cainato. Durante algum tempo não foi descrita nenhu-

Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 229 revisão ma interação da ketamina com estes receptores, entre- noradrenalina para dentro da circulação, que pode ser tanto, foi descoberto, por meio de estudos com mo- observada no sistema cardiovascular pelo aumento da delos animais, que esta droga também atua mediante pressão arterial, da frequência cardíaca e do débito car- receptores de glutamato não-NMDA, provavelmente, díaco5. através do sistema glutamato/NO/GMPc. A ativação A captação de dopamina também é inibida pela dos receptores não-NMDA estimula a produção de ketamina, o que pode levar a um aumento da atividade óxido nítrico (NO), que em seguida aumenta a con- dopaminérgica central, sugerindo uma relação com os centração de GMPc. A ketamina age inibindo estes fenômenos de dependência química. Os sistemas do- receptores com consequente inibição da óxido nítri- paminérgicos, cortical e subcortical, estão funcional- co sintase (NOS), enzima necessária à formação de mente relacionados com o sistema glutamatérgico. Por NO21. A inibição NOS induzida pela ketamina, além sua vez, a disfunção deste poderia precipitar sintomas de desenvolver um possível papel neuroprotetor e de psicóticos relacionados à esquizofrenia. Estes sintomas ativação do sistema simpático, parece estar envolvida têm sido descritos após o uso da ketamina e a explica- também com os efeitos analgésicos desta substância22. ção para isso é que o bloqueio dos receptores NMDA interfere com a neurotransmissão dopaminérgica, a Ações nos Receptores Opióides qual está envolvida com a esquizofrenia. Essas evidên- As ações da ketamina sobre os receptores opiói- cias levaram diversos autores a pesquisarem modelos des acoplados à proteína G não parece ser responsável propícios para maiores estudos na área, despertando, pela sua atividade analgésica23. Visto que, a naloxona, assim, a ketamina como um possível modelo de esqui- antagonista opióide, não é capaz de reverter o efeito zofrenia26. analgésico da ketamina. Isto pode ser explicado por Estudos demonstram que a captação neuronal uma afinidade 10 a 20 vezes inferior pelos receptores de serotonina parece ser inibida pela ketamina, já que opióides do que pelo receptor NMDA, sugerindo que a metisergida, um antagonista serotonérgico (5-HT), essa interação com os receptores opióides não é o prin- é capaz de abolir o efeito analgésico da administração cipal mecanismo de sua ação analgésica13. intratecal de ketamina. Isto implica que mecanismos Entretanto, os efeitos adversos psicomiméticos serotonérgicos estão envolvidos nos efeitos analgésicos da ketamina parecem estar relacionados com os recep- desta droga27,28. A inibição da captação de serotonina tores opióides kappa, já que os agonistas kappa produ- também está relacionada às propriedades emetisantes zem efeitos similares23,24. Sua afinidade pelos recepto- da ketamina, visto que, a administração concomitante res opióides é a seguinte µ > κ > δ25. A S(+) ketamina de ondansetron, um antagonista seletivo dos recepto- apresenta afinidade duas a quatro vezes superior pelos res 5-HT3, inibe o efeito emetisante da ketamina por receptores µ e κ do que a R(-) ketamina. meio de sua ação nos receptores serotonérgicos13-29.

Interação com a Neurotransmissão Colinérgica, EFEITOS FARMACOLÓGICOS Noradrenérgica, Dopaminérgica e Serotonérgica Os efeitos no sistema nervoso central provoca- A ketamina, em concentrações clínicas, ini- dos pela ketamina ainda se constituem um grande em- be a liberação de acetilcolina mediada pelo receptor pecilho ao seu uso clínico abrangente24-30. Em concen- NMDA. A inibição pós-sináptica do receptor nicotí- trações anestésicas causa efeitos dissociativos que são nico não apresenta importância clínica. Nos recepto- dependentes da dose e mais comuns em homens jovens res muscarínicos também ocorre uma inibição, sendo e fortes. Os pacientes parecem estar em estado catalép- que o isômero levógiro S(+) apresenta duas vezes mais tico, permanecendo com os olhos abertos e mantendo afinidade pelo receptor do que o isômero dextrógiro muitos reflexos, apesar de não serem seguramente pro- R(-). A afinidade da ketamina para esse receptor é 10 tetores. Após sua administração, as pupilas dilatam-se a 20 vezes menor do que a apresentada para recepto- moderadamente e ocorre nistagmo, lacrimejamento e res NMDA12. Os efeitos adversos comportamentais da salivação. Estes efeitos podem ser atenuados pelo uso ketamina podem estar relacionados à inibição da trans- concomitante de benzodiazepínicos, porém vale ressal- missão colinérgica18. tar que a amnésia promovida pela ketamina é menos A R(-)-ketamina inibe a captação neuronal de pronunciada que por estes11. noradrenalina e a S(+)-ketamina adicionalmente inibe Devido a sua ação dissociativa, a ketamina pro- a captação extra-neuronal, produzindo uma resposta duz efeitos psicológicos indesejáveis, principalmente sináptica prolongada e aumento da transferência de no período pós-operatório, denominados de reações

230 Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 revisão emergenciais. Os mais comuns são: pesadelos, experi- monoanestésica que produzisse analgesia, perda da ências extracorpóreas (sensação de flutuar fora do cor- consciência e imobilidade13. Em decorrência de impor- po) e ilusões. A incidência de alucinações varia de 5% a tantes efeitos colaterais, como alucinações, distúrbios mais de 30% após doses usadas para indução anestésica proprioceptivos e a sensação de flutuar sobre o corpo, e é mais comum em mulheres e menos comum em não conseguiu ampla aceitação clínica12. crianças. As pessoas com história de doença psiquiá- Entretanto, a ketamina tem importância clínica trica apresentam alterações com maior frequência. A em algumas situações, como na indução da anestesia administração de grandes doses de ketamina por via em pacientes com choque hemodinâmico; indução intravenosa, de maneira rápida, causa mais efeitos psi- da anestesia em pacientes com asma ativa; sedação in- comiméticos11. Doses repetidas de ketamina utilizadas tramuscular em pacientes não cooperativos, particu- para promover sedação ou analgesia, principalmen- larmente em crianças; sedação em unidades de trata- te em pacientes queimados podem causar tolerância, mento intensivo e na troca de curativos em pacientes acarretando em aumento significativo da dose para queimados13. produzir o mesmo efeito. Essa tolerância dura cerca de Ainda há muitas controvérsias em relação ao 3 dias31. melhor medicamento para induzir anestesia e que in- Em relação aos efeitos no sistema cardiovascu- terfira o mínimo no estado hemodinâmico dos pacien- lar, a ketamina provoca aumento da pressão arterial, da tes hipovolêmicos após o trauma. Estudos revelam que frequência cardíaca e do débito cardíaco. A dose equi- a ketamina mantém a função cardiovascular, preserva potente de S(+)-ketamina, apesar de ser menor que a o transporte de oxigênio e causa apenas uma depressão da mistura racêmica, causa alteração hemodinâmica respiratória temporária34. Após a indução do anesté- semelhante. No entanto, em contraposição à maioria sico ketamina em cães submetidos a um modelo ex- dos agentes anestésicos, a ketamina apresenta uma cer- perimental de choque hemorrágico, observou-se que ta margem de segurança durante seu uso em pacien- houve aumento significativo da pressão venosa central, tes com distúrbios cardiovasculares. Como a ketamina frequência cardíaca, pressão capilar pulmonar e do ín- preserva a frequência cardíaca e a pressão atrial direita dice de resistência pulmonar vascular após a adminis- através de seus efeitos sobre o sistema nervoso simpáti- tração de ketamina35. Apesar de novas investigações se- co, foi usada para indução anestésica em pacientes com rem necessárias, a ketamina tem demonstrado ser uma tamponamento cardíaco, pericardite restritiva e com droga segura para a indução anestésica em pacientes doença cardíaca congênita com propensão a desvio do hipovolêmicos. fluxo sanguíneo da direita para a esquerda11. Ressalva A ketamina não deve ser utilizada como agente é feita em relação ao seu uso em portadores de mio- anestésico isolado, pois possui ação analgésica visceral cardiopatia isquêmica, nos quais provoca um efeito baixa e também devido à catalepsia, sugerindo assim a cardiodepressor. Esta ação provavelmente é resultante associação com outros produtos que antagonizem seus da redução crônica de catecolaminas observada nesta efeitos estimulantes simpáticos36. Estudos mostram classe de pacientes32. que a administração de ketamina juntamente com a No sistema respiratório a ketamina causa mí- dexmedetomidina na indução da anestesia não foi ide- nima depressão respiratória, além de ter um efeito al, pois o efeito cataléptico da ketamina se sobressaiu. broncodilatador e manter os reflexos faríngeo e esofa- Já ao retirar a ketamina na indução e utilizando a de- giano. O laringoespasmo suficiente para necessitar de xmedetomidina isoladamente, notou-se a ausência do intubação produzido pela ketamina ocorre apenas em efeito cataléptico e ao associar a ketamina apenas na 0,02% dos casos33. Quando a ketamina é administrada manutenção, observaram-se apenas pequenos tremores lentamente, geralmente a respiração é mantida. Entre- musculares37. tanto a injeção intravenosa rápida de ketamina pode Em um estudo com cães, verificou-se os efeitos produzir apnéia transitória. A apnéia é mais frequente cardiorespiratórios e analgésicos em dois grupos com em neonatos31. associação de romifidina ou xilazina com ketamina e verificou-se que ambos os grupos apresentaram hipo- USOS TERAPÊUTICOS termia, bradicardia, hipotensão e redução da frequên- cia respiratória. Na anestesia em equinos verificou-se Ketamina e Anestesia que a combinação de ketamina, éter gliceril guaiaco- A ketamina foi introduzida há aproximadamen- lato e diazepam foi a melhor para induzir a anestesia38. te 30 anos com o intuito de atuar como uma droga

Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 231 revisão Ketamina e Analgesia Preemptiva na redução da quantidade de opióide usada no período A cirurgia e a inflamação tecidual desencadeiam pós-operatório45. Em crianças não foi evidenciado po- aferência nociceptiva que pode desenvolver sensibili- tencialização do efeito de opióides com ketamina por zação periférica e hiperalgesia primária, aumentando via endovenosa em apendicectomia46. a responsividade medular para estímulos, nocivos ou Em pacientes usuários de drogas, o uso da keta- não, devido ao fenômeno de wind-up, e outros meca- mina reduziu a necessidade de opióides para o alívio da nismos, com indução de sensibilização central e poten- dor pós operatória, demonstrando seu potencial para o cialização de longa duração. O bloqueio desses meca- uso na tolerância crônica47. Um estudo observacional nismos, antes do seu desenvolvimento, pode prevenir revelou que a ketamina reduziu a incidência de náuseas o aparecimento da sensibilização central. e vômitos em cirurgia plástica, um menor índice de Desta forma, analgesia preemptiva tem como efeitos adversos e boa aceitação pelo paciente48. objetivo enfatizar que a sensibilização central é induzi- Estudos em animais têm demonstrado que a da por estímulo nocivo pré e pós-operatório, consistin- ketamina usada por via endovenosa diminui a sensi- do em administrar medicação antinociceptiva antes do bilização central causada pela formalina em gatos com início da cirurgia. Tem sido usada para reduzir a dor, medula espinhal seccionada no tronco encefálico, o consumo de analgésicos, ou ambos durante toda a obtendo-se melhores resultados quando administrada intervenção12. antes da formalina. Outro estudo em ratos mostrou Os neurotransmissores excitatórios atuando efeito antinociceptivo da ketamina, assim como outros através de receptores NMDA têm sido envolvidos no verificaram redução acentuada da intensidade da dor desenvolvimento da sensibilização central e na poten- neuropática induzida em ratos49,50. cialização de longa duração39. Essa observação estimu- Apesar dos estudos mostrarem que a ketamina lou a avaliação de antagonistas dos receptores NMDA é capaz de reduzir a sensibilização central, a tolerância em vários modelos de dor. Na prática clínica, a ketami- e a hiperalgesia induzida por opióides, o consumo de na representa um dos poucos antagonistas NMDA dis- anestésicos, o uso de analgésicos, a incidência de efei- poníveis, apresentando ainda propriedade analgésica tos adversos pós-operatórios, a nocicepção e a dor neu- não relacionada ao receptor NMDA, como a ativação ropática, deve-se aguardar maior número de estudos do sistema inibitório descendente monoaminérgico, para avaliar a importância da ketamina na analgesia envolvidos na modulação de processos nociceptivos e preemptiva. geralmente ativados por opióides sistêmicos40,41. A ketamina tem sido testada em animais e em Ketamina e Depressão humanos através de vários modelos de dor e nocicep- A depressão é uma das mais prevalentes e dis- ção. Foi demonstrado, em um ensaio clínico aleatório, pendiosas psicopatologias, sendo causa mundial de que pacientes ao receberam doses repetidas de ketami- morbidade e mortalidade. A farmacoterapia da depres- na (pré-incisional e no intra-operatório) apresentaram são é cara e largamente prescrita pelos médicos, porém menores escores de dor, menor consumo de analgési- menos da metade dos pacientes alcançam completa re- cos e melhora do humor42. missão após terapia com um único antidepressivo51. É Pequenas doses de ketamina peridural, admi- amplamente aceito que pelo menos 20% dos pacientes nistradas antes da incisão, apresentam efeitos analgési- com depressão não respondem adequadamente ao tra- cos mais eficazes do que administração por via venosa. tamento com as drogas antidepressivas, sendo necessá- Este resultado pode relacionar-se a alterações farmaco- ria a descoberta de novas drogas antidepressivas52. cinéticas da administração peridural. Em estudo alea- Além disso, as drogas utilizadas no tratamento tório duplamente cego, a administração sistêmica de da depressão demoram cerca de semanas a meses para pequenas doses de antagonistas de NMDA associada produzir um efeito, resultando em morbidade conside- à analgesia peridural controlada pelo paciente, com rável e risco aumentado para comportamento suicidas, associação de morfina e bupivacaína diminui a dor, a principalmente nos primeiros 9 dias após o início do demanda por analgésicos e a incidência de efeitos ad- tratamento53. versos associados ao uso da morfina peridural, como Estudos revelam que receptores NMDA têm náuseas e prurido43,44. um importante papel na etiologia das psicopatologias Estudos revelam que a ketamina em baixas do- como a ansiedade e a depressão54,55. Diversos estudos ses é segura, agindo como um potente adjuvante dos pré-clínicos têm demonstrado que antagonistas dos opióides, tanto na qualidade do alívio da dor quanto receptores NMDA, como o MK-801, AP7, CPP, ne-

232 Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 revisão ramexane e outros, exibem efeitos ansiolíticos e antide- tratados com S(+) ketamina e que a GAP-43, proteí- pressivos em ratos51. na envolvida no crescimento e regeneração neuronal, Estudos clínicos sugerem que a administração apresentava níveis significativamente maiores quando aguda de ketamina reduz os sintomas de depressão comparados com o grupo controle não tratado63,64. em pacientes que sofrem de depressão maior6, e que Há muitas controvérsias a respeito da neuro- pacientes com este tipo de depressão quando tratados proteção induzida por ketamina devido a diferenças com uma única dose de ketamina apresentaram rápi- de modelos experimentais, doses, início e duração do dos efeitos antidepressivos e esses efeitos permanece- tratamento, entre outros fatores. Tem sido observado ram por cerca de 1 semana7. uma proteção praticamente completa do hipocampo Evidências sugerem que o BDNF (Brain-deri- após o tratamento prévio com ketamina65, porém em ved-neurotrophic factor), uma das inúmeras proteínas outros estudos foi demonstrado que a ketamina pode endógenas envolvidas na manutenção da sobrevida e intensificar a lesão neuronal durante episódios isquê- no crescimento dos neurônios cerebrais e periféricos56, micos breves e exercer um efeito benéfico após uma pode estar relacionado com diversas psicopatologias. isquemia prolongada66. Já outros autores observaram Dentro deste contexto, níveis reduzidos de BDNF fo- que a ketamina não exerce efeitos sobre a isquemia glo- ram encontrados em cérebros posmortem de pacientes bal, enquanto outros observaram efeitos positivos67. com depressão57 e foi visto que a infusão cerebral de No entanto, a ketamina pode ser neurotóxica. BDNF produz efeitos antidepressivos em ratos58. Estudos mostraram que neurônios do córtex cerebral Alguns estudos têm demonstrado que o trata- de ratos estavam morfologicamente danificados após mento antidepressivo crônico, mas não o agudo, induz a aplicação de fenciclidina ou ketamina, porém isto um aumento da expressão de BDNF em hipocampo poderia ser evitado pela administração de anticolinér- de roedores59,60. Interessantemente, um estudo realiza- gicos, diazepam ou barbitúricos13. do mostrou que o tratamento agudo com altas doses de Portanto, embora a ketamina pareça ser uma ketamina (50mg/kg) aumentou os níveis de BDNF em droga promissora para o tratamento de pacientes com hipocampo de ratos, o que pode indicar que esse seria isquemia/hipóxia cerebral aguda, novos estudos ainda o provável mecanismo pelo qual a ketamina produziria são necessários para inseri-la na prática clínica. ação antidepressiva rápida51. Ketamina como Droga de Abuso Ketamina e Neuroproteção O uso da ketamina não está restrito à prática A hipóxia e a isquemia cerebral desencadeiam clínica e pesquisa, uma vez que, atualmente, tem sido uma cascata fisiopatológica que culmina em destrui- frequentemente utilizada como droga de abuso em ção e morte celular13. Neurônios isquêmicos liberam clubes noturnos e festas conhecidas como “raves”68. glutamato e causam uma superativação dos receptores O primeiro caso de uso deste fármaco como droga de NMDA que, por sua vez, aumentam os níveis intra- abuso foi descrito ainda no ano de 1971 na costa oeste celulares de cálcio e resulta em morte celular12. Dessa dos Estados Unidos que, devido aos seus efeitos psi- forma, os antagonistas dos receptores NMDA têm sido comiméticos, lhe atribuiu a expressão de “anestésico alvo de estudos para a investigação de seus possíveis dissociativo”69. No Reino Unido, no início dos anos efeitos neuroprotetores. 90, o uso recreacional da ketamina disseminou-se lar- Estudos em animais mostram que a ketamina gamente70. administrada em grandes doses antes e após a lesão is- Embora a cena contemporânea das “dance quêmica reduziu o neurodéfict hipóxico e isquêmico, drugs” seja um fenômeno global, presente em muitos porém a administração de pequenas doses somente países, ela é um reflexo da expressão da cultura local. após a lesão não demonstrou efeito61. Outro estudo, Durante os últimos anos o termo “club drugs” tem que, utilizando modelo de traumatismo cerebral em sido utilizado para definir um grupo heterogêneo de ratos, demonstrou que a administração intraperitoneal substâncias químicas em permanente evolução que são de ketamina (180 mg/kg) 2 horas após a lesão reduziu consumidas com fins recreacionais. Estas substâncias o tamanho do infarto e o déficit neurológico62. vem sendo extensivamente utilizadas, primeiramente Foi observado que a S(+) ketamina pode ter pro- pela cultura “rave” e depois pelo então denominado priedades neuroregenerativas, já que neurônios lesio- “club culture”. Estes movimentos são caracterizados nados de ratos mostraram um aumento significativo da pela busca de sensações amplificadas, combinando sobrevivência e do crescimento axonal quando foram música eletrônica, uma “maratona” de dança e drogas

Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 233 revisão de abuso. Após alguns anos do predomínio do consu- sam vômitos, fala arrastada, amnésia, redução da fun- mo de anfetaminas, atualmente o uso de outras subs- ção motora, delírio com ou sem agitação psicomotora, tâncias está aumentando, principalmente drogas com movimentos tônicos-clônicos, taquicardia ou bradicar- efeitos alucinógenos, como a ketamina32. dia, hipotensão e depressão respiratória70. Devido ao aumento de casos do uso abusivo Usuários de altas doses reportam experiências desta droga na década de 1990, o FDA a classificou como saída do próprio corpo ou proximidade à mor- como droga de abuso. Trata-se de uma substância que te, como também distúrbios visuais ou flashbacks que age no sistema límbico e córtex cerebral, aumentando podem durar dias ou semanas após a exposição. Os a excitação elétrica dessas regiões, além dos gânglios da possíveis efeitos sobre a cognição ou psiquiátricos, pro- base e hipocampo, causando elevação do tônus simpá- duzidos pelo uso da droga em longo prazo, não foram tico71. suficientemente estudados em usuários73. Tolerância e Os usuários recreacionais da ketamina a deno- dependência foram relatadas82, porém estudos adicio- minam popularmente de “Special K”, “Vitamina K” nais são necessários para se determinarem os sintomas ou simplesmente “K”72,73 e são atraídos pelos efeitos da retirada e um tratamento eficaz para ela. da droga, tais como elevação do humor, euforia, dis- Diversas pesquisas têm sido realizadas com o torções visuais e auditivas, sensações eróticas, empatia, objetivo de revelar as alterações comportamentais e sensação de flutuação sobre o próprio corpo, dentre neuroquímicas causadas pelo uso recreacional da ke- outros10,74. O uso recreativo da ketamina nos Estados tamina. Estudo com animais, utilizando-se modelos Unidos, em especial por usuários de drogas injetáveis, de depressão e ansiedade revelou que o tratamento vem aumentando em grupos de risco, como homosse- agudo com ketamina, nas doses de 30 e 100 mg/kg, xuais masculinos, e jovens marginalizados75. no teste do nado forçado induziu um comportamento Estudos em usuários de drogas injetáveis reve- depressivo. A ketamina em ambas as dosagens causou laram que a ketamina não é a primeira droga injetá- hiperlocomoção, podendo estar relacionado com ação vel e nem a droga de escolha. Frequentemente, a pri- de agonista dopaminérgico. Entretanto, a ketamina em meira injeção de ketamina ocorre no contexto do uso doses altas causou inicialmente hipolocomoção, suge- de polidrogas e em idades mais avançadas (média de rindo uma ativação dos neurônios noradrenérgicos e 19 anos)76. Outro estudo realizado entre usuários de serotonérgicos83. ecstasy mostra que 29,5% destes fizeram uso de poli- Em roedores e macacos, doses agudas e suba- drogas e que a ketamina era a droga mais comumente nestésicas de antagonistas do receptor NMDA produ- associada (60%)77. zem fenômenos comportamentais, tais como hiperlo- Estudos prévios relatam que a ketamina tem comoção, aumento do comportamento estereotipado, ação semelhante a outras drogas de abuso, tais como déficits cognitivos e sensoriomotores e impedimento cocaína e anfetamina, com capacidade de induzir da interação social. Antagonistas do receptor NMDA sensibilização após a administração repetida78. Con- aumentam os níveis extracelulares da dopamina e glu- siderando que a sensibilização está relacionada com tamato bem como os níveis de noradrenalina e acetil- a dependência causada por estas drogas, estudos de- colina no córtex pré-frontal84,85. monstraram que o uso repetido da ketamina pode, de A ketamina utilizada em doses subanestésicas fato, levar a um padrão compulsivo de seu uso, mesmo induz um quadro de esquizofrenia em humanos, in- após a administração de baixas doses79. Desta forma, cluindo sintomas positivos e negativos e alterações na ocorrendo ou não a dependência após o uso repetido eletrofisiologia do processo de informação cortical86-88. desta substância, os dados apresentados pelo referido Muitos investigadores sugerem que a exposição repeti- estudo, mostram alterações comportamentais e psicoa- da do receptor NMDA aos antagonistas pode levar a tivas que podem causar prejuízos aos usuários. um quadro de esquizofrenia superior aos efeitos de uma Muitos dos efeitos psicomiméticos dessa droga única dose destas drogas. A ketamina e a fenciclidina, são transitórios, reversíveis e influenciados pelas condi- antagonistas não-competitivos do receptor de NMDA, ções de tempo, dose e administração80. Doses baixas de exacerbaram sintomas psicóticos em pacientes esqui- ketamina, utilizadas pelos adictos, produzem melhora zofrênicos e induziram sintomas positivos e negativos no humor e sintomas psiquiátricos como perda da re- semelhantes a essa doença em indivíduos saudáveis87. alidade, despersonalização, alucinações visuais, sonhos Estudos também demonstraram que a administração prazerosos ou não81, perda de atenção, de habilidade de ketamina (0,1 ou 0,5 mg/kg) em indivíduos sau- de aprendizado e de memória. Doses mais altas cau- dáveis produziu comportamento semelhante aos sinto-

234 Rev Neurocienc 2010;18(2):227-237 revisão mas positivos e negativos da esquizofrenia, bem como tolerância e dependência têm sido descritos82, mas es- alterações da percepção, prejuízo na fluência verbal e tudos adicionais são necessários para se determinar os sintomas similares ao estado dissociativo55. Desta for- sintomas de abstinência, assim como formas eficazes de ma, os usuários recreacionais de ketamina, podem de- tratá-la. senvolver sintomas semelhantes aos da esquizofrenia, já que fazem uso frequente desta droga. Estudo recente CONCLUSÃO revelou que usuários recreacionais de ketamina desen- A ketamina é uma droga de neurofarmacologia volveram aumento na dissociação e sintomas similares complexa, uma vez que a mesma interage com vários a esquizofrenia na noite em que fizeram uso da droga. tipos de receptores em diversos locais de ligação, in- Porém, após 3 dias do uso da ketamina, estes achados cluindo os receptores de glutamato, tanto NMDA não foram observados88. quanto não-NMDA, opiódes, gabaérgicos, serotonér- Apesar das ações psicomiméticas serem os prin- gicos, além de agir, direta ou indiretamente sobre as cipais efeitos adversos decorrentes do uso recreacional monoaminas (acetilcolina, noradrenalina e dopami- de ketamina, outros efeitos tem sido relatados. Estudos na)5. Foi introduzida inicialmente com o intuito de mostraram que 10 usuários recreacionais de ketamina atuar como uma droga monoanestésica que produzisse por 1 a 4 anos apresentavam diversos sintomas uriná- analgesia, perda da consciência e imobilidade. No en- rios do trato inferior, como disúria, aumento da fre- tanto, não conseguiu ampla aceitação clínica devido quência, urgência urinária, incontinência e hematúria. à ocorrência de importantes efeitos colaterais, como Além disto, todos os usuários tiveram uma diminuição alucinações, distúrbios proprioceptivos e a sensação de da capacidade funcional da bexiga para cerca de 30 flutuar sobre o corpo. a 100 ml diária. A maioria apresentava hidronefrose É possível que seja necessário revisar as indica- e cerca da metade apresentava algum prejuízo renal. ções para o uso da ketamina, tendo em vista o conhe- Portanto, estes achados sugerem que o uso crônico de cimento atual13. A ketamina tem apresentado perspec- ketamina pode acarretar em insufuciência renal crôni- tivas promissoras. Estudos recentes envolvendo seus ca. A etiologia dessas alterações ainda é desconhecida, mecanismos de ação, efeitos neuronais e analgésicos podendo ser devido a danos cerebrais ou na medula motivaram sua reavaliação e ampliação de seu uso. espinhal a causa para essa disfunção. Outra causa suge- Ademais, a disponibilidade do isômero S(+) ketami- rida é que ocorram efeitos tóxicos diretos da ketamina na que poderia causar menos efeitos adversos do que a e seus metabólitos sobre a mucosa do trato urinário mistura racêmica despertou novamente o interesse por inferior. Além disto, os usuários de ketamina, muitas esta droga. Vários estudos têm demonstrado proprie- vezes, usam outras drogas que poderiam colaborar com dades de analgesia preemptiva da ketamina em relação o aparecimento dessa disfunção89. Novas investigações à dor pós-operatória. Outros estudos revelaram uma são necessárias para determinar a exata causa dessa pa- ação antidepressiva rápida da ketamina. Além disto, a tologia. ketamina apresentou efeitos neuroprotetores em estu- Paradoxalmente ao seu uso como droga de abu- dos animais. Embora a ketamina seja um campo pro- so, a ketamina tem sido utilizada no tratamento de missor, essas ações precisam ser melhor estudadas para usuários de drogas. Estudos revelam que o tratamento serem utilizadas na clínica. destes usuários com ketamina aumenta significativa- No entanto, o seu uso não tem sido restrito à mente o tempo de abstinência. Um estudo realizado prática clínica e pesquisa. A ketamina apresenta po- com dependentes de heroína mostrou que após um tentes efeitos alucinógenos que produz nos usuários ano, 50% dos dependentes que fizeram sessões repe- melhora do humor, despersonalização, delírios, sen- tidas com ketamina mantiveram-se em abstinência90. sação de flutuar fora do corpo, depressão respiratória, Outro estudo desta vez realizado com dependentes de podendo levar à morte. Com uma frequência cada vez álcool mostrou que 60% dos pacientes alcoólicos que maior vem sendo encontrada em festas, disseminando- fizeram o tratamento com ketamina permaneceram se como droga de abuso, na maioria das vezes em as- mais de um ano em total abstinência91. sociação com outras substâncias, sempre na busca de O uso da ketamina como droga de abuso vem sensações ampliadas. aumentando no mundo, inclusive no Brasil. No entan- Além disto, há um número de efeitos potenciais to, os efeitos adversos que esta pode ocasionar quando da ketamina que podem ser descritos como adversos usada de forma abusiva e indiscriminada, ainda não ou prejudiciais, com uma crescente evidência de sin- foram suficientemente estudados73. Os fenômenos de tomas de tolerância e dependência entre seus usuários

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