Vanessa Rodrigues Guedes

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO E DOS ÓLEOS VOLÁTEIS DE Acritopappus micropappus

Salvador 2004 ii

VANESSA RODRIGUES GUEDES

ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO E DOS ÓLEOS VOLÁTEIS DE Acritopappus micropappus

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química do Instituto de Química da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Química na área de concentração em Química Orgânica.

Orientador: Prof. Dr. Dirceu Martins

Salvador 2004 iii

Dedico este trabalho àqueles que sempre acreditaram em mim: meus pais, meus queridos irmãos e em especial ao meu marido Alziro. iv

AGRADECIMENTOS

A Deus por estar sempre ao meu lado me guiando.

Ao Prof. Dr. Dirceu Martins pela preciosa orientação, dedicação e por ter acreditado no meu potencial.

Aos professores Frederico Guaré, Jorge David, Leila Aguiar e Nídia Roque pelos conhecimentos transmitidos.

Aos professores do Departamento de Química Orgânica por todo conhecimento adquirido durante minha formação, em especial a professora Anair pela disponibilidade e obtenção de alguns espectros de massa.

À professora Hortensia Pousada Bautista pela identificação botânica e ajuda indispensável.

A todos os funcionários do Instituto de Química que colaboraram na realização desse trabalho.

A Cristovão e a Paulo pelo apoio técnico.

Aos meus colegas de laboratório: Meire, Jaquelina, Suzimone, Luciana, Carla, Marcus, Larissa, Manuela, Débora, Rosane, Vânia, Pedro, e André, pelo companherismo e pelos momentos agradáveis que passamos juntos.

A Martins, Flávia, Rita e Sandra pela troca de conhecimentos e pela amizade que construímos.

A Josanaide pela disponibilidade e apoio constantes.

A Lourdes pela preciosa ajuda durante a conclusão desse trabalho.

A Floricéa pela grande amiga que foi em todos os momentos, pelo grande incentivo e pelas incontáveis contribuições.

Ao CNPq pelo indispensável apoio financeiro.

Aos meus pais pela compreensão e incentivo.

Aos meus queridos irmãos, em especial a Ninho pelo apoio fundamental e carinho.

Aos meus avós, Jolira e Epaminondas sempre presentes.

Ao meu amado marido Alziro pela paciência, incentivo e amor, tão importantes em cada momento da minha vida.

Os meus sinceros agradecimentos v

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS...... vii

LISTA DE FIGURAS...... ix

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS...... xvii

RESUMO...... xix

ABSTRACT...... xx

1.0 INTRODUÇÃO...... 1

1.1 A FAMÍLIA ASTERACEAE...... 1

1.2 A TRIBO EUPATORIEAE...... 2

1.3 O GÊNERO ACRITOPAPPUS...... 5

1.4 A ESPÉCIE Acritopappus micropappus...... 7

1.5 CONSTITUINTES QUÍMICOS ENCONTRADOS NO EXTRATO HEXÂNICO DAS PARTES AÉREAS DE Acritopappus micropappus...... 26

1.6 CONSTITUINTES QUÍMICOS IDENTIFICADOS NOS ÓLEOS VOLÁTEIS DE TRÊS ESPÉCIMENS DE Acritopappus micropappus...... 28

2.0 TERPENOS...... 31

2.1 MONOTERPENOS...... 33 vi

2.2 SESQUITERPENOS...... 35

2.3 TRITERPENOS...... 36

2.4 ESTERÓIDES...... 38

3.0 LIGNANAS...... 39

4.0 PARTE EXPERIMENTAL...... 41

4.1 MATERIAL VEGETAL...... 41

4.2 REAGENTES; MÉTODOS E EQUIPAMENTOS...... 42

4.3 ESTUDO DOS COMPONENTES FIXOS DA ESPÉCIE Acritopappus micropappus.....43

4.3.1 Obtenção dos extratos...... 44

4.3.2 Isolamento dos constituintes químicos do extrato hexânico...... 45

4.4 ESTUDO DOS COMPONENTES VOLÁTEIS DA ESPÉCIE Acritopappus micropappus...... 53

4.4.1 Obtenção dos óleos voláteis...... 53

5.0 IDENTIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS...... 57

5.1 IDENTIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO EXTRATO HEXÂNICO DAS PARTES AÉREAS DA ESPÉCIE Acritopappus micropappus...... 57

SESQUITERPENOS 5.1.1 Identificação da substância I...... 58 vii

5.1.2 Identificação da substância VI...... 72

5.1.3 Identificação da substância VII...... 77

TRITERPENOS 5.1.4 Identificação das substâncias II, III, IV e V...... 85

ESTERÓIDES 5.1.5 Identificação das substâncias VIII e IX...... 93

LIGNANA 5.1.6 Identificação da substância X...... 96

ÓLEOS VOLÁTEIS 5.1.7. Identificação dos constituintes químicos dos óleos voláteis dos três espécimens de Acritopappus micropappus...... 106

6.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 126

7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 128 viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Diferentes metabólitos produzidos na tribo Eupatorieae...... 3

Tabela 02 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus confertus...... 10

Tabela 03 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus heterolepis...... 15

Tabela 04 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus longifolius...... 17

Tabela 05 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus morii...... 19

Tabela 06 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus pintoi...... 20

Tabela 07 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus prunifolius...... 23

Tabela 08 Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus. teixeirae...... 25

Tabela 09 Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Saúde...... 28

Tabela 10 Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Morro do Chapéu...... 29

Tabela 11 Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Jacobina...... 30

Tabela 12 Dados de RMN de 1H, 13C, HETCOR (13C-1H), COLOC (13C-1H), COSY (1H-1H) e NOESY (1H-1H) da substância I...... 71

Tabela 13 Dados de RMN de 1H dos sesquiterpenos I, VI e VII...... 82 ix

Tabela 14 Dados de RMN de 13C dos sesquiterpenos I, VI e VII...... 83

Tabela 15 Dados de RMN de 13C dos triterpenos II, III, IV e V...... 91

Tabela 16 Dados de RMN de 1H, 13C, HETCOR (13C-1H), COLOC (13C-1H), COSY (1H-1H) da substância X...... 105

Tabela 17 Constituintes químicos presentes nos óleos essenciais dos três espécimens de Acritopappu micropappus...... 125 x

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Isótipo de Acritopappus micropappus...... 8

Figura 02 Esquema da origem taxonômica da espécie Acritopappus micropappus...... 9

Figura 03 Rotas biossintéticas para a obtenção do isopentenil difosfato (IPP)...... 32

Figura 04 Isomerização do IPP para DMAPP...... 33

Figura 05 Formação do E-pirofosfato de geranila, precursor geral dos monoterpenos...... 33

Figura 06 Estrutura de alguns monoterpenos com atividades biológicas...... 34

Figura 07 Formação do Pirofosfato de E,E-farnesila, precursor geral dos sesquiterpenos..35

Figura 08 Estruturas de alguns sesquiterpenos com atividades biológicas...... 36

Figura 09 Formação do 2,3-epóxi-esqualeno e do cicloartenol...... 37

Figura 10 Estruturas de alguns triterpenos com atividades biológicas...... 37

Figura 11 Estruturas de alguns esteróides encontrados em plantas...... 38

Figura 12 Esquema biossintético para obtenção de lignanas...... 40

Figura 13 Obtenção dos extratos hexânico e metanólico das partes aéreas de Acritopappus micropappus...... 47

Figura 14 Fracionamento do extrato hexânico das partes aéreas de. Acritopappus micropappus...... 48 xi

Figura 15 Obtenção da substância I e das substâncias II, III, IV e V em mistura...... 49

Figura 16 Isolamento das substâncias VI e VII...... 50

Figura 17 Obtenção das substâncias VIII e IX em mistura...... 51

Figura 18 Isolamento da substância X...... 52

Figura 19 Aparelhagem de Clevenger modificada...... 54

Figura 20 Obtenção dos óleos voláteis dos espécimens coletados nos municípios de Morro do Chapéu, Jacobina e Saúde ...... 56

Figura 21 Estruturas: esqueleto bornano, borneol e isoborneol...... 58

Figura 22 Espectro de RMN de1H da substância I ...... 61

Figura 23 Expansão do espectro de RMN de 1H da substância I na região de 0,01 ppm a 1,75 ppm ...... 62

Figura 24 Expansão do espectro de RMN de 1H da substância I na região de 5,07 ppm a 5,16 ppm ...... 62

Figura 25 Expansão do espectro de RMN de 1H da substância I na região de 4,04 ppm a 4,13 ppm...... 63

Figura 26 Espectro de RMN de 13C da substância I ...... 63

Figura 27 Expansão do espectro de RMN de 13C da substância I na região de 3,35 ppm a 51,29 ppm ...... 64

Figura 28 Espectro DEPT-135º da substância I...... 64 xii

Figura 29 Espectro DEPT-90º da substância I ...... 65

Figura 30 Espectro HETCOR (13C-1H) da substância I ...... 65

Figura 31 Expansão do espectro HETCOR (13C-1H) da substância I ...... 66

Figura 32 Espectro COLOC (13C-1H) da substância I ...... 66

Figura 33 Expansão do Espectro COLOC (13C-1H) da substância I ...... 67

Figura 34 Espectro COSY (1H-1H) da substância I ...... 67

Figura 35 Expansão do espectro COSY (1H-1H) da substância I ...... 68

Figura 36 Espectro NOESY (1H-1H) da substância I...... 68

Figura 37 Expansão espectro NOESY (1H-1H) da substância I ...... 69

Figura 38 Expansão espectro NOESY (1H-1H) da substância I ...... 69

Figura 39 Espectro de massas da substância I ...... 70

Figura 40 Proposta de fragmentação de massas para a substância I...... 70

Figura 41 Espectro de RMN de1H da substância VI...... 74

Figura 42 Expansão do espectro de RMN de1H da substância VI na região de 4,05 ppm a 5,04 ppm...... 74

Figura 43 Espectro de RMN de 13C da substância VI ...... 75

Figura 44 Espectro DEPT-135º da substância VI ...... 75

Figura 45 Espectro DEPT-90º da substância VI ...... 76 xiii

Figura 46 Espectro de RMN de1H da substância de VII ...... 79

Figura 47 Expansão do espectro de RMN de1H da substância VII na região de 4,07 ppm a 5,78 ppm...... 79

Figura 48 Espectro de RMN de 13C da mistura de VI e VII ...... 80

Figura 49 Espectro DEPT-135º da mistura de VI e VII...... 80

Figura 50 Espectro DEPT-90º da mistura de VI e VII...... 81

Figura 51 Tipos de sistemas de anéis para os triterpenos pentacíclicos isolados de A. micropappus...... 84

Figura 52 Espectro de RMN de 1H da mistura de II, III, IV e V...... 88

Figura 53 Expansão do espectro de RMN de 1H da mistura de II, III, IV e V na região de 3,20 ppm e 5,20 ppm...... 88

Figura 54 Espectro de RMN de 13C da mistura de II, III, IV e V...... 89

Figura 55 Expansão do espectro de RMN de 13C da mistura de II, III, IV e V na região de 79,05 ppm e 115,13 ppm...... 89

Figura 56 Espectro DEPT-135º da mistura de II, III, IV e V ...... 90

Figura 57 Espectro DEPT-90º da mistura de II, III, IV e V...... 90

Figura 58 Espectro de RMN de 1H da mistura de VIII e IX...... 94

Figura 59 Esqueleto de lignana do tipo diarilbutanolídeo. (8.8’, 9.0.9’)...... 95

Figura 60 Espectro de RMN de1H da substância X ...... 99 xiv

Figura 61 Expansão do espectro de RMN de1H da substância X na região de 2,30 ppm a 6,80 ppm ...... 99

Figura 62 Expansão do espectro de RMN de1H da substância X...... 100

Figura 63 Expansão do espectro de RMN de1H da substância X na região de 5,88 ppm a 6,69 ppm...... 100

Figura 64 Espectro de RMN de 13C da substância X ...... 101

Figura 65 Espectro de DEPT-135º da substância X ...... 101

Figura 66 Espectro HETCOR (13C-1H) da substância X...... 102

Figura 67 Expansão do espectro HETCOR (13C-1H) da substância X...... 102

Figura 68 Expansão do espectro HETCOR (13C-1H) da substância X...... 103

Figura 69 Espectro COLOC (13C-1H) da substância X...... 103

Figura 70 Espectro COSY (1H-1H) da substância X...... 104

Figura 71 Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus coletado no município de Jacobina obtido no CG/EM...... 108

Figura 72 Espectro de massas do α-pineno ...... 109

Figura 73 Espectro de massas do β-pineno ...... 109

Figura 74 Espectro de massas do β-mirceno ...... 109

Figura 75 Espectro de massas do α-felandreno ...... 110 xv

Figura 76 Espectro de massas do Limoneno ...... 110

Figura 77 Espectro de massas do α-copaeno...... 110

Figura 78 Espectro de massas do Cariofileno ...... 111

Figura 79 Espectro da massas do α-humuleno...... 111

Figura 80 Espectro de massas do Germacreno D ...... 111

Figura 81 Espectro de massas do Biciclogermacreno ...... 112

Figura 82 Espectro de massas do δ-cadineno ...... 112

Figura 83 Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus coletado no município de Morro do Chapéu obtido no GC/EM...... 112

Figura 84 Espectro de massas do 6-metil-5-hepten-2-ona...... 113

Figura 85 Espectro de massas do Limoneno ...... 113

Figura 86 Espectro de massas do β-selineno ...... 113

Figura 87 Espectro de massas do 1,10 epóxi-cariofileno ...... 114

Figura 88 Espectro de massas do (+)-Junenol ...... 114

Figura 89 Espectro de massas do β-acorenol ...... 114

Figura 90 Espectro de massas do α-muurolol...... 115

Figura 91 Espectro de massas do Valerianol ...... 115 xvi

Figura 92 Espectro de massas doβ-eudesmol ...... 115

Figura 93 Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus coletado no município de Saúde no CG/EM...... ……...... 116

Figura 94 Espectro de massas do α-pineno ...... 116

Figura 95 Espectro de massas do β-pineno ...... 116

Figura 96 Espectro de massas do β-mirceno...... 117

Figura 97 Espectro de massas do Limoneno...... 117

Figura 98 Espectro de massas do (E)-β-ocimeno ...... 117

Figura 99 Espectro de massas do δ-elemeno ...... 118

Figura 100 Espectro de massas do α-copaeno ...... 118

Figura 101 Espectro de massas do β-cubebeno ...... 118

Figura 102 Espectro de massas do Cariofileno ...... 119

Figura 103 Espectro de massas do α-santaleno...... 119

Figura 104 Espectro de massas do α-humuleno ...... 119

Figura 105 Espectro de massas do β-santaleno ...... 120

Figura 106 Espectro de massas do Germacreno D ...... 120

Figura 107 Espectro de massas do β-selineno ...... 120 xvii

Figura 108 Espectro de massas do Valenceno ...... 121

Figura 109 Espectro de massas do Biciclogermacreno ...... 121

Figura 110 Espectro de massas do (Z)-α-bisaboleno ...... 121

Figura 111 Espectro de massas do β-bisaboleno ...... 122

Figura 112 Espectro de massas do δ-cadineno ...... 122

Figura 113 Espectro de massas do (E)-γ-bisaboleno ...... 122

Figura 114 Espectro de massas do Germacreno B ...... 123

Figura 115 Espectro de massas do Espatulenol...... 123

Figura 116 Espectro de massas do 1,10-epoxi-cariofileno ...... 123

Figura 117 Espectro de massas do α-muurolol ...... 124

Figura 118 Espectro de massas da Valerianona ...... 124 xviii

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

δ - Deslocamento químico Ang - Angeloil AcOEt – Acetato de etila CC – Cromatografia em coluna CCDC – Cromatografia em camada delgada comparativa CG/EM – Cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas CoA – Coenzima A COLOC – Espectro de correlação heteronuclear (13C-1H) a duas e três ligações d – Dubleto DCM – Diclorometano dd – Duplo dubleto ddd – Duplo duplo dubleto DEPT – Intensificação do sinal sem distorção por transferência de polarização (Distortionless enhancement by polarization tranfer) DMAPP – Pirofosfato de dimetilalila DMSO – Dimetilsulfóxido HETCOR – Espectro de correlação heteronuclear (13C-1H) a uma ligação Hex – Hexano HMG-CoA - β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA HOMOCOSY – Espectro de correlação homonuclear (1H-1H) IPP – Pirofosfato de isopentenila IR – Índice de retenção IV – Infravermelho J – Constante de acoplamento m/z – Relação massa carga MeOH – metanol MVA – Ácido mevalônico MVAPP – Difosfato do ácido mevalônico NOESY – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de carbono 13 xix

RMN de 1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio s – Singleto TPP – Difosfato de tiamina Tr – Tempo de retenção xx

RESUMO

O presente trabalho descreve o estudo fitoquímico das partes aéreas (folhas e galhos) de espécimens de Acritopappus micropappus (Asteraceae) coletados no Morro da Antena, município de Saúde (abril de 2001); no Morro do Cruzeiro, município de Jacobina (abril de 2001) e no município de Morro do Chapéu (agosto de 1999). A espécie Acritopappus micropappus é endêmica da Chapada Diamantina e até o presente momento, nenhum estudo fitoquímico foi relatado para a mesma. As partes aéreas foram submetidas a extrações com hexano e a seguir com metanol. Do extrato hexânico do espécimen coletado no município de Saúde, foram isoladas e identificadas as seguintes substâncias: o sesquiterpeno canferenol, que sofreu decomposição através de fotooxidação, levando aos derivados 10ξ-hidroperoxi- canferen-11-eno e 11-hidroperoxi-canferen-9-eno; a lignana yateína; uma mistura contendo os triterpenos β-amirina, α-amirina, lupeol e pseudotaraxasterol e uma mistura contendo os esteróides sitosterol e estigmasterol. Foram obtidos os óleos voláteis das partes aéreas dos três espécimens coletados, através de hidrodestilação. Estes óleos foram analisados através de cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas, levando à identificação de 31 constituintes, sendo 6 monoterpenos, 24 sesquiterpenos e a cetona 6-metil-5-hepten-2-ona, mostrando variabilidade estrutural entre os constituintes dos três óleos. Os componentes majoritários presentes no óleo volátil obtido do espécimen coletado em Jacobina foram germacreno D, α-pineno e β-pineno, do espécimen coletado no município de Saúde foram α- humuleno, cariofileno e valerianona e do espécimen coletado em Morro do Chapéu foram β- acorenol, 1,10-epoxi-cariofileno, (+)-junenol e 6-metil-5-hepten-2-ona. Os fracionamentos do extrato hexânico e os isolamentos das substâncias foram realizados através de cromatografia em coluna de sílica e sephadex LH-20. As identificações das substâncias foram realizadas através de métodos espectrométricos, tais como RMN de 1H e 13C (incluindo DEPT, COSY, HETCOR, COLOC e NOESY) e espectrometria de massas. O sesquiterpeno canferenol e a lignana yateína são raros na natureza, tendo sido relatados para poucas espécies de plantas. Os extratos dos espécimens coletados nos municípios de M. do Chapéu e Jacobina foram submetidos a bioensaios contra o fungo Cladosporium sphaerospermum utilizando o método bioautográfico e ensaios biológicos preliminares contra Staphylococcus aureus e Candida albicans, respectivamente. Sendo que apenas os extratos hexânicos mostraram-se ativos. Palavras-chaves: Acritopappus micropappus; Asteraceae; canferenol; yateína; triterpenos; óleos voláteis xxi

ABSTRACT

The present work describes the phytochemical study of the aerial parts (leaves and stems) of Acritopappus micropappus specimens (Asteraceae) collected on Morro da Antena in Saúde (April 2001); on Morro do Cruzeiro in Jacobina (April 2001) and in Morro do Chapéu (August 1999). The Acritopappus micropappus species is endemic from Chapada Diamantina and, until this moment, no phytochemical study has been reported on this species. The aerial parts were submitted to extractions with hexane followed by methanol. From the hexane extract of the specimen collected in Saúde, the following substances were extracted: the campherenol sesquiterpene that was decomposed by photooxidation, leading to the derived 10ξ-hidroperoxi-campheren-11-ene and 11-hidroperoxi-campheren-9-ene, the yatein lignan; a mixture with β-amirin, α-amirin, lupeol and pseudotaraxasterol triterpernes; and a mixture with the sitosterol and stigmasterol steroids. Volatile oils were obtained from the aerial parts of the three specimens through hydrodestilation. These oils by analyzed with gas chromatography in association with mass spectrometry leading to the identification of 31 constituents, including 6 monoterpenes, 24 sesquiterpenes and the 6-metil-5-hepten-2-one cetone, showing structural variability among the constituents of the three oils. The major components present in the volatile oil obtained from the specimen collected in Jacobina were germacrene D, α-pinene and β-pinene, from the specimen collected in Saúde were α- humulene, caryophyllene and valerianone, and from the specimen collected from Morro do Chapéu were β-acorenol, 1,10-epoxi-caryophyllene, (+)-junenol and 6-metil-5-hepten-2-one. The fractionations of the hexane extracts and the isolation of the substances were accomplished by using chromatography column over silica and sephadex LH 20. The identification of the substances were made using spectrometrics methods, such as RMN of 1H and 13C (including DEPT, COSY, HETCOR, COLOC and NOESY) and the mass spectrometry. The campherenol sesquiterpene and the yatein lignan are rare in nature; they have been reported in few species of plants. The extracts of the species collected in Morro do Chapéu and Jacobina were submitted to bioassays against the fungus Cladosporium sphaerospermum using the bioauthographic method and preliminary biological assays against Staphylococcus aureus and Candida albicans, respectively. But only the hexane extracts were active. Key words: Acritopappus micropappus; Asteraceae; campherenol; yatein; triterpenes; volatile oils. 1

1.0-Introdução

1.1-A Família Asteraceae

A família Asteraceae (Compositae) é uma das maiores famílias de plantas, representa 10% do total da flora de angiospermas, e compreende cerca de 1.500 gêneros com aproximadamente 25.000 espécies [Bautista, 2000]. A Asteraceae está dividida em quatro subfamílias e dezessete tribos [Alvarenga et al, 2001].

Esta família apresenta ampla distribuição, sendo bem representada nas regiões tropical, subtropical e temperada. São plantas que podem desenvolver-se em localidades ao nível do mar, como atingir os picos das mais altas montanhas, tendo invadido, com sucesso, todos os tipos de habitats, com exceção, talvez, do aquático, visto que poucas espécies são, realmente, aquáticas verdadeiras. São mais abundantes nas regiões áridas do que nas florestas tropicais úmidas [Barroso, 1978].

Na flora brasileira, em particular, as asteráceas encontram sua maior representatividade, respectivamente, nos estados de Minas Gerais e Bahia, onde se localizam exatamente as áreas core da distribuição de Acritopappus [Bautista, 2000].

A subdivisão da família Asteraceae em 17 tribos tem sido bem aceita, estando assim constituída pelas tribos Barnadesieae, Cardueae, Lactuceae, Liabeae, Vernonieae,

Eupatorieae, Astereae, Inuleae, Heliantheae, Helenieae, Anthemideae, Senecioneae,

Calenduleae, Arctoteae, Mutisieae, Plucheeae e Gnafalieaea [Alvarenga et al, 2001]. 2

Das 17 tribos classificadas para a família, Vernonieae, Eupatorieae, Heliantheae,

Helenieae e Mutisieae são predominantemente americanas, com poucas espécies originadas nas regiões tropical e subtropical da África e da Ásia [Barroso, 1978].

Na grande maioria, as Asteraceaes estão representadas por espécies herbáceas, anuais ou perenes, subarbustivas ou arbustivas e raramente por espécies arbóreas. De maneira geral, suas folhas são alternadas ou radicais, folhas opostas surgem em alguns gêneros e espécies, principalmente nas tribos Heliantheae e Eupatorieae [Barroso, 1978].

1.2-A Tribo Eupatorieae

A tribo Eupatorieae constitui a maior parte da família Asteraceae na região

Neotropical e está representada por 16 subtribos, com 170 gêneros, com aproximadamente

2.400 espécies, espalhadas pelo México, América Central, Índias Ocidentais e América do

Sul. Apenas quatro gêneros – Adenostemma J.R. Forst & G. Forst, Austroepatorium R.M.

King & H. Rob., Eupatorium L. e Mikania Willd. – apresentam algumas espécies na África,

Ásia e nas Ilhas do Pacífico, e somente a espécie – Eupatorium cannabinum L. – estende-se pela Europa [Bautista, 2000].

De plantas da tribo Eupatorieae foram isolados uma ampla variedade de metabólitos secundários, tais como, alcalóides pirrolizidínicos [Wiedenfeld & Andrade-Cetto, 2001], que causam danos ao fígado quando ingeridos por mamíferos; flavonóides [El-Sayed et al, 1990], presentes nas flores e capazes de absorverem raios ultravioletas; cumarinas; cromanos e benzofuranos [Sigstad et al, 1996] que são responsáveis por alguns efeitos tóxicos (“doença do leite” ou “tremedeira”); monoterpenos derivados do timol [González et al, 1992]; 3

sesquiterpenos derivados do humuleno [Bohlman et al, 1982 A], bisaboleno [Calderón et al,

1984], cadineno [Cuenca et al, 1992], alguns na forma de ésteres derivados do ácido angélico; lactonas sesquiterpênicas dos tipos germacranolídeos [Sigstad et al, 1991], guaianolídeos

[Hernández et al, 1997] e eudesmanolídeos [Bohlman et al, 1981 A]; diterpenos, como os kaurânicos [Bardón et al, 1996], clerodânicos [Bohlman et al, 1982 B] e labdânicos

[Escamilla et al, 1990]; carotenóides e poliacetilenos, principalmente do tipo pentaineno e seus derivados [King e Robson, 1987]. Algumas substâncias presentes na tribo Eupatorieae estão representadas na tabela 01.

Tabela 01-Diferentes metabólitos produzidos na tribo Eupatorieae

Espécies Substâncias Classe Referências Eupatorium 1 Alcalóide Lang et al, 2001 semialatum pirrolizidínico Graziela 2 Flavonóide Nakashima et al, 1994 mollissima Conocliniopis 3 Cumarina Bolhmann et al, prasiifolia 1980 B Eupatorium 4 Benzofurano Gomez et al, 1982 aschembornianum Stevia 5 Sesquiterpeno Sigstad et al, 1991 grisebachiana germacranolídeo Lasiolaena 6 Sesquiterpeno Bohlmann et al, santosii eudesmanolídeo 1981 B Stevia 7 Sesquiterpeno Sigstad et al, 1991 grisebachiana guaianolídeo Stevia 8 Diterpeno Escamilla et al, 1990 seleriana labdânico Goyazianthus 9 Diterpeno Bohlmann et al, tetrastichus clerodânico 1982 B 4

OH OH O HO O H OCH3 OH O OH HO OCH3 N CH3 O O O O

1 2 3 Tussilagina 3-metoxi- 11-hidroxi- 11,12-diidro obliquina 6,7,3’,4’-tetrahidroxiflavona

OH OH

H CO O OH O O 3 OH O O

4 5 6 6-metoxi-2-[1,2-diidroxi- 3β-hidroxi 8α-hidroxi-11β, 2-propil] benzofurano costunolideo 13-diidroreynosina

H OAc COOH H O AcO H OAc O O H O O

7 8 9 Estafietina Ácido ent-labd-7-en 15 acetil-2α,16-diacetoxi 3-oxo-15-óico 3β, 4β-epoxi-3,4-diidrokolavenol 5

1.3-O Gênero Acritopappus

As plantas do gênero Acritopappus apresentam-se como arbustos eretos moderadamente ramificados, com folhas opostas. O nome Acritopappus refere-se a irregularidade da forma de pappus, uma irregularidade que tem resultado na localização indevida de algumas espécies na classificação tradicional da tribo. O gênero apresenta também folhas coriaceas ou subcoriaceas sem grandes pontuações glandulares, tem a superfície com receptáculos pouco convexos, apresenta flores de coloração lavanda pálida com a cor concentrada em anteras e tem os segmentos pappus totalmente resistente [King e

Robson, 1987].

O gênero Acritopappus ocorre, principalmente, nas zonas montanhosas com um tipo de vegetação próprio denominada campo rupestre. Por causa desses habitats preferentes e sua freqüente inacessibilidade, o gênero tem sido pobremente coletado e é relativamente pouco conhecido [Bautista, 2000].

Todo o gênero é caracterizado por seu alto grau de endemicidade; apenas duas espécies – A. confertus e A. longifolius –possuem uma faixa de distribuição geográfica mais ampla A. confertus é abundante no estado da Bahia, desde o litoral até as serras, mas também ocorre nos estados do Ceará, Pernambuco e Sergipe, em regiões orográficas. Ocorre, ainda, em planícies litorâneas, em vegetação de restiga, a menos de 500 m da linha da praia, situadas logo a norte de Salvador, prolongando-se por cerca de 100 km e ao sul dessa cidade, na região de Valença, situada entre as baías de Todos os Santos e de Camamú [Bautista, 2000].

Cerca de 95% das espécies do gênero Acritopappus localizam-se em zonas serranas situadas na parte central dos estados da Bahia e Minas Gerais [Bautista, 2000].

O gênero Acritopappus é considerado como um pequeno gênero brasileiro e é constituíd 6

por 19 espécies: A. buiquensis A. catolesensis, A. confertus, A. connatifolius, A. diamantinicus, A. harleyi, A. heterolepis, A. irwinii, A. jacobaeus, A. longifolius, A. micropappus, A. morii, A. pereirae, A. pintoi, A. prunifolius, A. santosii, A. stenophyllus, A. subtomentosus e A. teixeira.. Sendo as espécies A. longifolius e A. confertus as primeiras espécies descritas para o gênero.

Antes de o nosso grupo começar a estudar espécies pertencentes ao gênero

Acritopappus já haviam sido estudadas, do ponto de vista fitoquímico, seis espécies (A. heterolepis, A. confertus, A. longifolius, A. morii, A. prunifolius e A. teixeirae) relatadas na literatura. Atualmente duas novas espécies foram estudadas pelo nosso grupo A. pintoi

(Tabela 06, p.20) e A. micropappus, além da espécie A. confertus (Tabela 02, p.10) que já havia sido estudada anteriormente por Bohlmann et al. Comparando os metabólitos secundários isolados e/ou identificados dessas oito espécies foi observado que cinco das espécies (A. heterolepis, A. confertus, A. morii, A. teixeirae, A. longifolius) apresentaram como metabólitos secundários comuns, diterpenos ent-labdânicos e clerodânicos. Foram encontrados também alguns eudesmanos, cadineno e derivados do desidronerolidol. Além disso, muitas dessas espécies contêm humuleno e trideca pentaineno (Tabelas 02 a 08, p.10).

Nenhum diterpeno foi isolado da espécie Acritopappus prunifolius (Tabela 07, p.23). Dos constituintes isolados dessa espécie alguns são comuns a outras espécies, tais como cadineno (A. heterolepsis), germacreno (A. heterolepsis, A. confertus, A. morii, A. teixeirae), humuleno (A. morii, A. confertus) e angelato de desidronerolidol (A. longifolius). 7

1.4-A Espécie Acritopappus micropappus

A espécie Acritopappus micropappus (Figura 01, p.8) apresenta-se com porte arbustivo com altura máxima de 1,75 m, o que corresponde a um dos menores arbustos do gênero. Com ramificação abundante desde próximo à base e intensamente folhoso. Suas folhas são simples, opostas com lâminas inteiras e, freqüentemente, com pilosidade em ambas as faces. As margens são revolutas e a base apresenta-se atenuada. A inflorescência é representada por corimbos com menor número de capítulos. O número de flores por capítulo varia de cinco a cinqüenta. A espécie floresce e frutifica durante todo o ano. O epíteto específico, formado pelo prefixo micro e a desinência pappus, refere-se ao pappus pequeno, coroniforme. Esta espécie que foi classificada como Ageratum micropappum quando descrita para o gênero Ageratum por Baker (1876), representava a única com pappus curto coroniforme, ante todas as demais espécies circunscritas para o gênero Ageratum, que possuem o pappus aristado. Na atualidade, o posicionamento desta espécie na concepção do gênero Acritopappus está coerente com outras espécies do gênero, em que é comum o mesmo tipo de papus, como sejam: A. harleyi, A. jacobaeus, A. santosii e A. subtomentosus [Bautista,

2000].

Os espécimens estudados foram coletados no município de Morro do Chapéu em agosto de 1999, no Morro da Antena, município de Saúde em abril de 2001 e no Morro do

Cruzeiro, município de Jacobina em abril de 2001, todos localizados no Estado da Bahia e foram identificados pela Profa. Dra Hortensia Pousada Bautista, curadora do Herbário

RADAMBRASIL, do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística localizado em Salvador-

BA. As exsicatas encontram-se depositadas no Herbário RADAMBRASIL sob numeração: 8

HRB 41.223 (município de Morro do Chapéu), HRB 49.440 (município de Saúde) e HRB

49.441 (município de Jacobina).

Um esquema sobre a origem taxonômica da espécie está representado na figura

02, p.9.

Figura 01 - Isótipo de Acritopappus micropappus (BAKER) R. M. KING & H. ROBINSON 9

Família Asteraceae

Subfamília Latucoideae

Tribo Eupatorieae

Subtribo Ageratinae

Gênero Acritopappus

Espécie Acritopappus micropappus

Figura 02 - Esquema da origem taxonômica da espécie Acritopappus micropappus [King e Robson, 1987] 10

Tabela 02-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus confertus

Acritopappus confertus Bohlmann et al, 1980 A

CH CCCH=CH 3 5 2

H H OH

CO H 2 CO R H R' 2 H

R" R= H HO R'= CH2OH R"= CH2OH 11

R R' R"

R=CO2H CO2H CO2H CO2H CO2H R'=CH2OH CH2OH CH2OH CH2OAc CH2OH R"=CH3 CH2OH CHO CH2OH CH2OCH3

Tabela 02–Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus confertus (continuação)

Acritopappus confertus Bohlmann et al, 1983

CHO H OH

H H

O H OH

OH OH 12

O H O HO O

OH O H OH OH H H HO O CH3O O

OH O OH O Tabela 02–Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus confertus (continuação)

Acritopappus confertus Bohlmann et al, 1983

OH O

O O R O

H R=H O R=OH H

CO2R' CO2R

R OR" OR'

H H R=CH3 CHO O R'=CH3 CH3 R = CH3 CH3 CH3 R"=H AC R'=Ac CH3 H 13

OH CO2CH3 R CO2CH3 CHO

H O H R= CH2OAc CHO

CO2CH3 CO2H O H O OH

H H O Tabela 02–Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus confertus (continuação)

Acritopappus confertus Bohlmann et al, 1983

CO CH O OHC 2 3 OH

O CO2CH3

H H O 14

CH3O2C CO2CH3 OAc OH CHO OAc

H H R O R=β-OH R =α-OH

CO2R

X OR'

R=CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 R'= Ac Ac Ac H H Ac X=β-CHO β-OCHO β-CO2CH3 β-OH CH2 O α-H α-H α-H α-H

Tabela 02-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus confertus (continuação)

Lopes, 2002

O H OH 15

H OH

CHO O

Tabela 03-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus heterolepis 16

Acritoppapus heterolepis Bohlmann et al, 1980 A

CH CCCH=CH 3 5 2 HO

OH H

R HO H O

O O O R=H R=OH

OH O H HO O O

OCH3 OH O HO 1

Tabela 03- Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus heterolepis (continuação)

Acritoppapus heterolepis Bohlmann et al, 1980 A

R H H X O O

β α R =CO2H CH2OH X= -OH; -H X= O

R R'

R'' O H H H O

H HO R= OH OH R’= OH H R’’= H OH

CO R H R' 2

R" R=H H H H R'=CH2OAc CH2OH CH2OAc CH2OH R"=CH2OH CH2OH CHO CHO 2

Tabela 04-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus longifolius

Acritopappus longifolius Bohlmann et al, 1981 A

HO H OH O

O OAng O O O 3

Tabela 04-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus longifolius (continuação)

Acritopappus longifolius Bohlmann et al, 1981 A

O O O O

H H

R O

HO O OH CHO

H H

R =CH2OH R =CHO

H O H H H O O HO H 4

Tabela 05-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus morii

Acritopappus morii Bohlmann et al, 1980 A

CH3O O O O O O O OH H

O X O

OH H H X=CH2OH

OH CO H CHO 2 OH

OH H H

O O H O

H 5

Tabela 06-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus pintoi

Acritopappus pintoi Sousa et al, 2000

H3CO O

HO H 6

Tabela 06–Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus pintoi (continuação)

Acritopappus pintoi Sousa et al, 2001

O O

H3CO O H CO2H

H HO CO2H

O O

H3CO

O 7

Tabela 06-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus pintoi (continuação)

Acritopappus pintoi Sousa et al, 2002

CO2H

H CO2H

CHO

H CO2H

CO2H 8

Tabela 07-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus prunifolius

Acritopappus prunifolius Bohlmann et al, 1982 A

H HO R=Ac R=Ang

H OH

O H O OAng

H O H

O 9

Tabela 07-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus prunifolius (continuação)

Acritopappus prunifolius Bohlmann et al, 1982 A

OH HO H O O OAng O O O

H HO H

H H HO 10

Tabela 08-Estruturas das substâncias isoladas da espécie Acritopappus teixeirae

Acritopappus teixeirae Bohlmann et al, 1980 A

CO2H H O CHO O

HO OCH3 11

O H O OH

1.5-Constituintes químicos encontrados no extrato hexânico das partes aéreas de Acritopappus micropappus

H HO OH H

I II Canferenol β-amirina 12

H H

H H HO HO H H

III IV α-amirina Lupeol

H OOH H

H HO H OH

V VI Pseudotaraxasterol 10ξ-hidroperoxi-canferen-11-eno

OOH H H H

OH HO

VII VIII 11-hidroperoxi-canferen-9-eno Sitosterol 13

O H H3CO O H CO 3 H OCH3 H H H O HO O

IX X Estigmasterol Yateína

1.6-Constituintes químicos identificados nos óleos voláteis de três

espécimens de Acritopappus micropappus

Tabela 9–Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Saúde (abril/2001)

Município de Saúde

α β -pineno β-pineno -mirceno Limoneno β-ocimeno H

H H H H H H α-copaeno δ-elemeno β-cubeno Cariofileno α-santaleno 14

α -humuleno Germacreno D β-selineno Valenceno β-santaleno

H Biciclo α γ germacreno -bisaboleno β-bisaboleno δ-cadineno -bisaboleno H O HO H H

H HO H H 1,10-epoxi O Espatulenol cariofileno α Valerianona Germacreno B -muurolol

Tabela 10-Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Morro do Chapéu (agosto/1999)

Município de Morro do Chapéu

6-metil-5-hepten-2-ona Limoneno β-selineno O HO H

H H OH β 1,10-epoxi-cariofileno (+)-junenol -acorenol 15

HO H

HOHHO H

α-muurolol α-eudesmol Valerianol

Tabela 11-Substâncias identificadas no óleo volátil do espécimen coletado no Município de Jacobina (abril/2001)

Município de Jacobina

α-pineno β-pineno β-mirceno 16

H H

α-felandreno Limoneno α-copaeno

α Cariofileno -humuleno Germacreno D

Biciclogermacreno δ-cadineno

2.0-Terpenos 17

Os terpenos formam o maior grupo de produtos naturais secundários, com cerca de

29.000 compostos conhecidos, incluindo os esteróides [Adam and Zapp, 1998]. São estruturas que contêm esqueletos carbônicos derivados de unidades de isopreno (C5 ) e são classificados como hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40).

A unidade de isopreno é produzida naturalmente, mas não está envolvida na formação desses compostos. As unidades bioquimicamente ativas foram identificadas como os ésteres difosfatados: dimetilalil difosfato (DMAPP) e isopentenil difosfato (IPP) [Dewick,

1997].

Diversos produtos naturais contêm derivados do isopreno nas suas moléculas, em combinação com esqueletos carbônicos derivados de outras fontes, tais como as rotas do acetato e chiquimato. Um fragmento terpênico comum nesses casos é a unidade C5, normalmente um substituinte dimetilalilico. Essas moléculas são chamadas de meroterpenóides [Dewick, 1997].

Antigamente, a rota do ácido mevalônico era a única rota biossintética conhecida para obtenção do IPP. Recentemente, um novo caminho biossintético foi proposto, através da rota da triose/piruvato [Adam e Zapp, 1998]. As duas rotas estão esquematizadas na figura 03, p.32. No entanto, existe a hipótese de que a rota da triose/piruvato ocorra nos plastídios, estando envolvida na formação dos mono-, di-, e tetraterpenos, enquanto os sesquiterpenos, os triterpenos e os esteróides biologicamente relacionados são formados no citoplasma pela rota do mevalonato [Adam e Zapp, 1998]. 18

H + O + H +N HOOC O S CoA -

- S CoA S TPP Piruvato O H OO O O znES +N S CoA OH O AcetoacetilCoA S

- CO2 OHO + EnzSH + HOOC N HOH S CoA OH HMG-CoA S HO H 2 NADPH PO H H OH Gliceraldeído-3-P HOOC OH + + H MVA N O O H 2 ATP S H OH H O H O - TPP HO H HO H HO P O ADP PO H PO H O OH OH H H H O OPP 1-Desoxi-xilulose-5-P MVAPP ATP -CO2 -H2O HO OPP OP IPP OOH Rota do mevalonato Rota da triose/piruvato

Figura 03-Rotas biossintéticas para a obtenção do isopentenil difosfato (IPP) [Adam e Zapp, 1998 e Dewick, 1997]. O IPP é isomerizado para outra unidade de isopreno, DMAPP, por uma enzima isomerase (Figura 04). O DMAPP possui um bom grupo de saída, o difosfato, e pode gerar via um processo Sn1 um carbocátion alílico que é estabilizado por deslocalização de carga. 19

+ H Isomerase OPP OPP HR HS IPP DMAPP

Figura 04-Isomerização do IPP para DMAPP

2.1-Monoterpenos

Os monoterpenos são compostos que possuem 10 átomos de carbono, derivados da condensação de duas unidades isoprênicas. Um precursor comum dos monoterpenos é o pirofosfato de geranila, o qual é formado a partir da combinação do DMAPP e do IPP envolvendo a ação da enzima prenil transferase (Figura 05).

+ OPP + OPP OPP DMAPP HR HS HR HS

E OPP OPP Geranil PP (GPP)

Figura 05-Formação do E-pirofosfato de geranila, precursor geral dos monoterpenos

Os monoterpenos são compostos de grande interesse comercial que estão presentes nos óleos voláteis que utilizamos na indústria de perfumes e fragrância, na produção de especiarias e de ervas empregadas em culinária, na industria de alimentos e condimentos

[Robbers et al, 1997]. 20

Muitos monoterpenos são utilizados para fins medicinais. A cânfora (Figura 06) é utilizada como auxiliar em analgésicos locais; o ascaridol e o eucaliptol (Figura 06) são utilizados como anti-helmínticos [Seigler, 1998]; o mentol (Figura 06), em pequenas doses orais tem ação carminativa, mas em grandes doses pode exercer ação de depressão cardíaca; o terpinol (Figura 06) é utilizado como expectorante [Robbers et al, 1997].

O O O O

Cânfora Ascaridol Eucaliptol

Mentol Terpinol

Figura 06-Estrutura de alguns monoterpenos com atividades biológicas

2.2-Sesquiterpenos 21

Os sesquiterpenos são o tipo mais numeroso dos terpenos com aproximadamente

5.000 compostos conhecidos, com mais de 200 esqueletos diferentes. Sua distribuição nas plantas basicamente é a mesma dos monoterpenos, sendo que os sesquiterpenos também são comuns em óleos voláteis [Seigler, 1998].

O pirofosfato de E,E-farnesila (FPP) é o precursor biossintético comum dos sesquiterpenos, o qual é formado pela adição de uma unidade de IPP (C5) ao E-pirofosfato de geranila com participação da enzima prenil transferase (Figura 07).

OPP + OPP Geranil PP HR HS IPP

+ OPP OPP HR HS

OPP Pirofosfato de E,E-farnesila

Figura 07-Formação do Pirofosfato de E,E-farnesila, precursor geral dos sesquiterpenos

Muitos sesquiterpenos apresentam atividades biológicas das mais diversas. O β- bisaboleno e o bergamoteno (Figura 08, p.36) são agentes alelopáticos, inibidores do crescimento de raízes; o capsidiol e o hemigossipol (Figura 08, p.36) são fitoalexinas; o debneiol (Figura 08, p.36), possui atividade fungitóxica; o gossipol (Figura 08, p.;36), que é um dímero de sesquiterpeno, apresenta propriedade contraceptiva em mamíferos machos

[Seigler, 1998]. 22

β-bisaboleno Bergamoteno Capsidiol

CHO OH HO

HO OH OH

Hemigossipol Debneiol

CHO OH OH CHO HO OH

HO OH

Gossipol

Figura 08-Estruturas de alguns sesquiterpenos com atividades biológicas

2.3-Triterpenos 23

Triterpenos são compostos que possuem 30 átomos de carbono, sendo formados pela adição de duas moléculas do pirofosfato de farnesila. Os triterpenos possuem esqueleto derivado da ciclização do 2,3-epóxiesqualeno, que leva ao cicloartenol e a outros triterpenos subsequentes (Figura 09, p.37) [Dewick, 1997].

+ OPP OPP Farnesil PP Cátion alílico Farnesil PP

H OPP

Prescaleno PP

Esqualeno

O2 NADPH

HO O H 2,3-epóxido de esqualeno Cicloartenol

Figura 09-Formação do 2,3-epóxi-esqualeno e do cicloartenol

Muitos triterpenos apresentam atividades biológicas, dando-lhes uma importância terapêutica e comercial [Mahato and Sem, 1997]. Como exemplo tem-se o ácido betulínico

[Fujioka et al, 1994] e o ácido morônico [Ito et al, 2001], os quais são utilizados no tratamento anti-HIV (Figura 10). 24

H H

H CO2H CO2H

H H HO O H H

Ácido betulínico Ácido morônico

Figura 10-Estruturas de alguns triterpenos com atividades biológicas

2.4-Esteróides

Os triterpenos são os precursores dos esteróides, os quais são essenciais como constituintes de membranas celulares, pois ajudam a manter sua integridade e o controle da permeabilidade. Os organismos eucariotas são capazes de sintetizar os esteróides ou os adquirem através da dieta. Já os organismos procariotas têm a capacidade de efetuar a ciclização do esqualeno para formar moléculas como os esteróides. Esses compostos têm três carbonos a menos que os triterpenos, devido à perda das metilas ligadas aos carbonos 4 e 14

[Mann, 1994] e geralmente, os que são encontrados em plantas são hidroxilados no C-3

[Kaufman, 1999]. A figura 11 exemplifica alguns esteróides encontrados em plantas. 25

H H

H H H H HO HO

Fucosterol Ergosterol

H H HO

Colesterol

Figura 11-Estruturas de alguns esteróides encontrados em plantas 26

3.0-Lignanas

As lignanas são dímeros encontrados na natureza, obtidas a partir do acoplamento fenólico oxidativo de monômeros derivados do ácido cinâmico, que é o precursor de muitos metabólitos com unidades básicas C6-C3 [Mann, 1994].

Diferentes ciclizações e modificações podem ocorrer gerando lignanas dos mais variados tipos estruturais. A lignana yateína apresenta atividade inseticida contra os insetos

Sitophilus granarius, Tribolium confusum e Trogoderma granarium [Harmatha & Nawrot,

2002], além de participar da rota biossintética da lactona ariltetralina, podofilotoxina, a qual é derivada do álcool coniferílico passando pelas dibenzilbutirolactonas matairesinol e yateína

(Figura 12, p.40). O anel metilenodioxílico, é encontrado em muitos produtos naturais derivados do chiquimato e é formado por uma reação no modelo orto-hidroximetoxi [Dewick,

1997].

A podofilotoxina é um potente inibidor de mitoses (divisão celular), através da inibição da enzima tubulina polimerase, a qual é responsável pela produção da proteína tubulina. Os inibidores de mitoses são utilizados no tratamento de câncer [Mann, 1994]. Um dos derivados semi-sintéticos da podofilotoxina, o etoposideo, é um potente agente anticancerígeno utilizado no tratamento de câncer de pulmão, câncer testicular e linfomas, geralmente em combinação com outras drogas. Outro derivado semi-sintético, o teniposideo, tem similar propriedade anticancerígena, embora não seja usado amplamente como o 27

etoposideo O teniposideo é utilizado no tratamento de neuroblastoma em crianças. A podofilotoxina e as lignanas relacionadas foram encontradas nas raízes das espécies de

Podophyllum (Berberidaceae) [Dewick, 1997].

CO2H CH2OH O OCH3 H H

Acoplamento fenólico H CO oxidativo 3 O

H3CO HO Ácido cinâmico OH (+)-Pinoresinol NADPH Álcool coniferílico

H3CO H3CO O OH O O OH O HO HO O O NAD+

H3CO OCH3 H3CO H3CO

OCH3 OH OH Yateína Matairesinol Secoisolariciresinol

O O O O O O Hidroxilação O O

H3CO OCH3 H3CO OCH3

OCH3 OCH3 Desoxipodofilotoxina Podofilotoxina

Figura 12-Esquema biossintético para obtenção de lignanas 28

4.0-Parte Experimental

4.1-Material Vegetal

Os três espécimens de Acritopappus micropappus estudados foram coletados no estado da Bahia em locais diferentes, no município de Morro do Chapéu em agosto de 1999; no Morro da Antena, município de Saúde em abril de 2001 e no Morro do Cruzeiro, município de Jacobina em abril de 2001.

A identificação botânica foi realizada pela Profª Drª Hortensia Pousada Bautista, curadora do herbário RADAMBRASIL do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, localizado em Salvador-BA. As exsicatas dos três espécimens encontram-se depositadas no mesmo herbário, catalogadas sob os números: HRB 41.223 (Morro do Chapéu), HRB 49.440

(Saúde) e HRB 49.441 (Jacobina). 29

4.2-Reagentes, Métodos e Equipamentos

As partes aéreas do material vegetal depois de secas ao ar a temperatura ambiente foram trituradas no Moinho Thomas Wiley Laboratory Mill-Model 4.

Os solventes utilizados nos procedimentos cromatográficos e na preparação dos extratos foram das marcas Merck, Vetec e Quimex.

A evaporação dos solventes orgânicos utilizados na obtenção dos extratos hexânicos e metanólicos e das frações foi realizada sob pressão reduzida no evaporador rotatório de marca Buchi, modelo R-3000.

Na cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) foi utilizado gel de sílica GF254 da marca Merck como fase estacionária. As cromatoplacas para CCDC foram preparadas espalhando-se a suspensão de sílica em água destilada sobre placas de vidro através do espalhador mecânico Heidelberg, obtendo-se placas com 0,5 mm de espessura.

Foram utilizadas placas de vidro de 2,5 X 7,0 cm, 5,0 X 20,0cm e 20,0 X 20,0 cm. Depois de secas ao ar livre todas as cromatoplacas foram ativadas em estufa a 100º C por um período de aproximadamente uma hora.

Como reveladores foram utilizadas irradiações com lâmpada ultravioleta nos comprimentos de onda de 254 nm e 366 nm, vapores de iodo e sulfato cérico.

O fracionamento através da técnica de cromatografia em coluna foi feito utilizando gel de sílica grau 60 da marca Merck (0,060-0,200 mm); gel de sílica (0,035-0,070 mm) da marca Merck e sephadex LH-20 da Pharmacia.

Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C unidimensionais e bidimensionais foram registrados em espectrômetros Varian Gemini 300 e Brucker DPX 300, operando com freqüências do hidrogênio a 300 MHz e do carbono a 75MHz, utilizando o 30

clorofórmio deuterado como solvente e o pico em 7,27 ppm, da impureza de CHCl3, como referência interna.

Os espectros de massas da substância I e dos óleos voláteis foram obtidos em espectrômetro HP, modelo 5973 MSD, acoplado ao cromatógrafo a gás Hewlett Packard

(HP), modelo 6890, utilizando coluna capilar de sílica fundida HP 5MS (5% difenil e 95% dimetilpolisiloxano), com 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura do filme, com temperatura do injetor a 220º C e programação do forno de 60º C a

240º C, com taxa de aquecimento de 3º C por minuto, permanecendo a 240º C durante 10 minutos, para os óleos; e com temperatura de injetor a 240º C, programação de forno de 60º C a 240º C , com taxa de aquecimento de 3º C por minuto, permanecendo a 280º C durante 15 minutos, para a substância I.

4.3-Estudo dos componentes fixos da espécie Acritopappus micropappus

Os componentes fixos foram estudados utilizando o extrato hexânico das partes aéreas do espécimen coletado no Morro da Antena, no município de Saúde em abril de 2001.

As substâncias obtidas do extrato hexânico, após fracionamento cromatográfico, foram analisadas através da técnica de espectrometria de RMN de 1H, 13C, DEPT-135º,

DEPT-90º, de massas e com o auxílio dos dados descritos na literatura. 31

4.3.1-Obtenção dos extratos

As partes aéreas dos espécimens de Acritopappus micropappus foram inicialmente secas à temperatura ambiente e em seguida moídas, separadamente. O material vegetal obtido para cada espécimen foi submetido a três extrações sucessivas utilizando 2L de hexano e em seguida com 2L de metanol. Após eliminação do solvente em evaporador rotatório, sob pressão reduzida à temperatura de aproximadamente 35º C, foi obtido 7,1g do extrato hexânico e 26,8g do extrato metanólico do espécimen coletado no município de

Saúde; 30,1g do extrato hexânico e 41,6g do extrato metanólico do espécimen coletado no município de Jacobina e 1,4g do extrato hexânico e 4,4g do extrato metanólico do espécimen coletado no município de Morro do Chapéu (Figura 13, p.47).

Os extratos hexânico e metanólico do espécimen coletado no município de Morro do Chapéu foram submetidos a bioensaio para verificação de atividade contra o fungo fitopatogênico Cladosporium sphaerospermum, utilizando o método bioautográfico, onde apenas o extrato hexânico mostrou-se ativo [Silva et al, 1998]. Os extratos hexânico e metanólico do espécimen coletado no município de Jacobina foram submetidos a ensaios preliminares contra Staphylococcus aureus e Candida albicans, sendo apenas o extrato hexânico ativo. 32

4.3.2-Isolamento dos constituintes químicos do extrato hexânico

O extrato hexânico obtido das partes aéreas (7,1g) do espécimen coletado no município de Saúde, foi submetido a uma coluna cromatográfica filtrante em gel de sílica

0,060-0,200 mm, empacotada a seco, utilizando-se como eluentes misturas de

Hex:AcOEt:MeOH, em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100), obtendo-se 16 frações denominadas MSH.

Após a evaporação do solvente, todas as frações da coluna filtrante foram submetidas a CCDC e após análise dos resultados as frações MSH-9 (1088mg), MSH-10

(790mg) e as frações MSH-12 e MSH-13 que foram previamente reunidas (893mg), foram submetidas a fracionamento cromatográfico (Figura 14, p.48).

A fração MSH-9 foi submetida à coluna cromatográfica em gel de sílica 0,035-

0,070 mm, utilizando-se como eluentes misturas de DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 98:2:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100). Foram obtidas 99 frações denominadas MSA. As frações MSA-19 e MSA-23 foram reunidas (150mg), após a análise dos resultados obtidos por CCDC e submetidas a fracionamento em coluna de Sephadex LH-20 utilizando-se como eluentes misturas de Hex:DCM (1:4), DCM:Acetona (3:2) e DCM:Acetona (1:4), obtendo-se

53 frações denominadas MSA(19-23). Após análise dos resultados obtidos por CCDC, algumas frações foram reunidas e das frações MSA(19-23)29-30 e MSA(19-23)20-22 foram isoladas a substância I (30mg) e quatro substâncias em mistura (15mg), respectivamente. As substâncias encontradas em mistura foram denominadas de substância II, III, IV e V (Figura

15, p.49). As frações MSA-13 e MSA-18 também foram reunidas (298mg) e submetidas à 33

coluna cromatográfica em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando como eluentes misturas de

DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100), obtendo-se

115 frações denominadas MSA(13-18). Algumas frações foram agrupadas, após análise dos resultados obtidos por CCDC. As frações MSA(13-18)(96-98) (10mg) e MSA(13-18)(104-

106) (13mg) foram submetidas a fracionamento, separadamente, em coluna de Sephadex LH-

20 utilizando-se como eluentes misturas de Hex:DCM (1:4), DCM:Acetona (3:2) e

DCM:Acetona (1:4). Da fração MSA(13-18)(96-98)27 foi identificada a substância VI (4mg) e da fração MSA(13-18)(104-106)27 foi identificada a substância VII (2mg) (Figura 16, p.50).

A fração MSH-10 (790mg) foi fracionada em coluna cromatográfica em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando-se como eluentes misturas de DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100), onde foram obtidas 97 frações

(MSC-0 a MSC-96). Nas frações MSC-38 e MSC-41, previamente reunidas, foram identificadas as substâncias VIII e IX (94mg) em mistura (Figura 17, p.51).

As frações MSH12-13 reunidas (893mg) foram submetidas a fracionamento cromatográfico através de coluna em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando-se como eluentes misturas de DCM:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes de 0:0:100). Foram obtidas 81 frações denominadas MSE. Todas as frações foram analisadas por CCDC e após a análise, algumas frações foram agrupadas. A fração MSE41-45 (135mg) foi fracionada através de coluna cromatográfica em gel de sílica 0,035-0,070 mm, utilizando- se como eluentes misturas de Hex:AcOEt:MeOH em gradiente crescente de polaridade (com proporção inicial entre os eluentes de 100:0:0 e finalizando com proporção entre os eluentes 34

de 0:0:100), onde foram obtidas 75 frações denominadas MSE(41-45). Algumas frações foram reunidas após análise por CCDC, na fração MSE(41-45)68-72 foi identificada a substância X (88mg) (Figura 18, p.52).

Partes aéreas secas e moídas (408,4g)

Extração com 2L de hexano (3X)

Evaporação do solvente

TORTA Extrato hexânico TORTA (7,14g)(7,1g)

Extração com 2L de metanol (3X)

Evaporação do solvente

TORTA Extrato metanólico TORTA (26,76g)(26,8g) 35

Figura 13–Obtenção dos extratos hexânico e metanólico das partes aéreas da espécie A. micropappus

Extrato Hexânico Hexânico (7,1g)(7,14g)

C.C. filtrante (sílica 0,060-0,200mm) eluente:hex:AcOEt:MeOH (gradiente)

FraFrações:ções: MSHMSH1-16 1-16-

CCDC

MSH 99 MSH 1010 MSH 12-1312--13 (1087,9mg)(1088mg) (789,7mg)(790mg) (892,5mg)(893mg)

C.C. em sílica 0,035-0,070mm C.C. em sílica 0,035-0,070mm C.C. em sílica 0,035-0,070mm eluente:DCM: AcOEt MeOH eluente:DCM: AcOEt MeOH eluente:DCM: AcOEt MeOH (gradiente) (gradiente) (gradiente)

FraFrações:ções: FraFrações:ções: FraFrações:ções: MSA 1-991-99 MSC 0-960-96 MSE 0-800-80 36

Figura 14–Fracionamento do extrato hexânico das partes aéreas de Acritopappus micropapppus

FraFrações:ções: MSA 1-99

CCDC

MSA 13-18 MSA 19-23 (298,0mg) (298mg) (150,2mg) (150mg) C.C. (Sephadex LH 20) eluente: Hex:DCM:Acetona (gradiente)

Frações: MSA(19-23)0-55MSA(19-23)0-52-

CCDC

MSA (19-23) MSA (19-23) 29-30 20-22

I II, III, IV e V ((30mg) 8 mg) ((15,2(15mg) mg) mg) 37

Figura 15–Obtenção da substância I e das substâncias II, III, IV e V em mistura.

MSA 13-18 (298,0mg)(298mg)

C.C. com sílica 0,035-0,070mm eluente :DCM: AcOEt :MeOH (gradiente) Frações: MSA (13-18)0-114

CCDC

MSA (13-18) MSA (13-18) (96-98) (9,9mg)(10mg) (104-106) (13mg)(12,9mg)

C.C. (Sephadex LH 20) C.C. (Sephadex LH 20) eluente: Hex:DCM:Acetona eluente: Hex:DCM:Acetona (gradiente) (gradiente) MSA (13-18) MSA (13-18) (96-98) 0-63 (104-106) 0-39

CCDC CCDC

MSA (13-18) MSA (13-18) (96-98) 27 (104-106) 27

VI VII ( 44mg) mg) ( 2mg)1,4 mg) 38

Figura 16–Isolamento das substâncias VI e VII.

MSH 10 (789,7mg)(7907mg)(790 mg) C.C. em sílica 0.035-0.070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH (gradiente)

Frações: MSC 0-96

CCDC

Fração: MSC 38-41

VIIIIX e IXX (46,0mg)(46mg)(94mg) 39

Figura 17–Obtenção das substâncias VIII e IX em mistura

MSH 12-13 (892,5mg)(893mg)

C.C. em sílica 0,035-0,070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH (gradiente) Frações: MSE 0-80

CCDC

MSE 41-45 (134,7mg)(135mg)

C.C. em sílica 0,035-0,070 mm Eluente: DCM:AcOEt:MeOH (gradiente)

Frações: MSE (41-45) 1-75

CCDC

MSE (41-45) (68-72)

X (87,9mg)(88mg) 40

Figura 18–Isolamento das substâncias X.

4.4-Estudo dos componentes voláteis da espécie Acritopappus

micropappus

O estudo dos constituintes voláteis presentes nas partes aéreas dos três espécimens coletados nos municípios de Saúde (abril de 2001), Jacobina (abril de 2001) e Morro do

Chapéu (agosto de 1999) foi realizado através da obtenção dos óleos por hidrodestilação, utilizando-se um aparelho doseador de óleos voláteis do tipo Clevenger modificado (Figura

19, p.54).

A composição química do óleo assim obtido foi analisada através de cromatografia à gás acoplada a espectrometria de massas (CG/EM) com o auxílio da espectroteca.

A identificação dos constituintes presentes nos óleos voláteis foi realizada através da determinação de seus índices de retenção, além de compará-los com os dados disponíveis na literatura [Adams, 1995]

4.4.1-Obtenção dos óleos voláteis

As partes aéreas dos três espécimens foram previamente secas ao ar à temperatura ambiente e depois moídas, obtendo-se 51,3g; 53,4g e 212,5g de material vegetal coletado nos 41

municípios de Saúde, Jacobina e Morro do Chapéu, respectivamente. Em seguida, foram submetidos a hidrodestilação, por período de quatro horas, separadamente.

Para a técnica de hidrodestilação utilizou-se um aparelho doseador de óleos voláteis do tipo Clevenger modificado (Figura 19). Essa aparelhagem é composta de um balão de destilação no qual o material é colocado com água destilada, um condensador de refluxo e um dispositivo tipo Clevenger para receber a mistura óleo-água, cuja principal função é acumular o óleo condensado, sem retornar para o balão. Esse aparelho permite um ciclo contínuo de vaporização-condensação, dispensando a remoção ou reposição de água, durante o processo.

Através dessa técnica, constituintes pouco polares e insolúveis em água, são co- destilados com vapor d’água. Esse método apresenta como vantagem ser conduzido a temperaturas em torno de 100º C, evitando a decomposição térmica dos constituintes do óleo, além de ser bastante seletivo, uma vez que apenas substâncias insolúveis em água são co- destiladas. 42

Figura 19–Aparelhagem de Clevenger modificada. Concluída a destilação, foram separadas duas porções do óleo. Uma porção com óleo puro, contido na fase superior, que foi retirado sem solvente com o auxílio de uma pipeta de

Pasteur. E uma segunda porção que foi retirada da aparelhagem utilizando a técnica de extração, tendo como solvente o DCM. As duas porções foram analisadas por cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG/EM).

Dos óleos obtidos, apenas o que pertencia ao espécimen coletado no município de

Morro do Chapéu (i) foi obtido puro (2 g), os óleos dos espécimens coletados nos municípios de Jacobina (ii) e Saúde (iii) foram extraídos com DCM, devido ao menor rendimento (Figura

20, p.56). 43

Partes aéreas secas e moídas i (51,3g), ii (53,4g) e iii (212,5g)

Hidrodestilação

Óleo + Água Fase Aquosa Óleo + Água

Separação com pipeta de Pasteur

Óleo i Óleo(20g) Óleo +Água

Extração com DCM

CG/MS

Óleo + DCM Água Óleo ii + DCM Óleo iii + DCM

CG/MS 44

Figura 20-Obtenção dos óleos voláteis dos espécimens coletados nos municípios Morro do Chapéu (i), Jacobina (ii) e Saúde (iii). 45

5.0-Identificação e Determinação Estrutural das Substâncias Isoladas

5.1-Identificação dos constituintes químicos do extrato hexânico das partes aéreas de Acritopappus micropappus

SESQUITERPENOS

As identificações dos sesquiterpenos isolados foram realizadas através das análises de seus espectros de RMN de 1H, 13C, DEPT-135º, DEPT-90º, COSY, HETCOR,

COLOC, NOESY e de massas.

Os sesquiterpenos isolados do extrato hexânico da espécie Acritopappus micropappus apresentaram um esqueleto do tipo bornano (Figura 21, p.58) substituído na posição 8 por um grupo prenílico. Os substituintes bornanos, apresentam sinais de hidrogênio característicos na faixa de 0,5-3,0 ppm no espectro de RMN de 1H, com exceção para o hidrogênio que está ligado ao carbono onde se encontra o grupo substituinte. Os hidrogênios metilênicos apresentam-se como multipletos e os hidrogênios metílicos como singletos [Flautt

& Erman, 1962].

Para determinação da configuração relativa do hidrogênio carbinólico H-4, foram tomados como base no espectro de RMN de 1H, o sinal do hidrogênio carbinólico do borneol

(Figura 21, p.58) que ocorre em 3,91 ppm como duplo duplo dupleto, com constantes de acoplamento de 9,6 Hz, 3,5 Hz e 1,6 Hz, ao passo que no isoborneol (Figura 21, p.58) o sinal 46

correspondente a este hidrogênio ocorre em 3,51 ppm como tripleto, constante de acoplamento de 5,2 Hz [Flautt & Erman, 1962]. Portanto, através da comparação desses dados com os observados nos espectros de RMN de 1H dos sesquiterpenos isolados, foi possível confirmar a presença do hidrogênio carbinólico na posição exo, como ocorre no borneol.

O deslocamento químico observado no espectro de RMN de 13C para o carbono

C-4 em torno de 77,40 ppm foi importante para predizer a substituição no anel por um grupo hidroxílico.

9 8

3 H OH

6 1 5 OH H A B C

Figura 21-Estruturas: esqueleto bornano (A), borneol (B) e isoborneol (C).

5.1.1-Identificação da substância I

A substância I foi identificada através das análises dos espectros de RMN de 1H,

13C, DEPT-135º, DEPT-90º, COSY, HETCOR, COLOC, NOESY e de massas, e por comparação com os dados descritos na literatura para substâncias de estruturas próximas [Ngo

& Brown, 1999; Kato et al, 1996, Orihara & Furuya 1993 e Flautt et al, 1963].

O espectro de RMN de 1H (Figura 22, p.61) da substância I apresentou quatro singletos atribuíveis a hidrogênios metílicos, sendo dois em 1,68 ppm (H-12) e 1,61 ppm (H-

13), atribuíveis aos grupos metílicos sobre dupla ligação (Figura 23, p.62) e os outros dois em

0,85 ppm e 0,89 ppm, atribuíveis aos hidrogênios H-15 e H-14. O triplo hepteto em 5,11 ppm 47

(7,2 Hz e 1,4 Hz) (Figura 24, p.62) característico de hidrogênio olefínico, foi atribuído ao hidrogênio H-10. A configuração endo do substituinte hidroxílico no anel foi atribuída com base na observação de um duplo duplo dubleto em 4,08 ppm (J=1,6 Hz, J=3,2 Hz e 9,9 Hz)

(Figura 25, p.63), atribuível ao hidrogênio H-4.

O espectro COSY 1H-1H (Figura 34, p.67) mostrou acoplamento entre o sinal em

1,80 ppm (H-9) e o sinal em 2,00 ppm (H-9’), definindo o sinal relativo ao hidrogênio 9.

O espectro de RMN de 13C (Figura 26, p.63) apresentou 15 sinais, confirmando que se tratava de um sesquiterpeno. Através da comparação com os espectros DEPT-135º

(Figura 28, p.64) e DEPT-90º (Figura 29, p.65) foi possível identificar quatro sinais referentes a carbonos metílicos, cinco referentes a carbonos metilênicos, três a carbonos metínicos e três a carbonos não hidrogenados. A presença do carbono carbinólico foi confirmada pelo sinal que ocorreu em 77,37 ppm (CH), o qual foi atribuído ao carbono C-4. Dois dos sinais correspondentes as metilas apareceram em 16,57 ppm e 13,35 ppm e foram atribuídos aos carbonos C-14 e C-15, respectivamente. O sinal que ocorreu em 50,37 ppm (C) foi atribuído ao carbono C-7. Esses sinais presentes no espectro de RMN de 13C são característicos do esqueleto bornano, o que confirmou a presença deste na estrutura da substância identificada.

A presença da dupla ligação foi confirmada mais uma vez pelos sinais apresentados em

131,14 ppm (C) e 125,17 ppm (CH) que foram atribuídos aos carbonos C-11 e C-10, respectivamente.

O espectro HETCOR 1H-13C (J=140 Hz) (Figura 30, p.65), dentre as correlações observadas, apresentou correlação entre o sinal em 24,17 ppm (C-9) e o sinal em 1,90 ppm

(H-9), e apresentou também correlação entre o sinal em 32,40 ppm (C-8) e o sinal em 1,15 ppm (H-8). Além dessas correlações mostrou também correlação entre o sinal em 13,35 ppm e o sinal em 0,85 ppm, assim como entre o sinal em 16,57 ppm e o sinal em 0,89 ppm, o que confirmou as atribuições dos deslocamentos químicos desses hidrogênios metílicos. 48

As correlações observadas no espectro COLOC 1H-13C (11 Hz) (Figura 32, p.66) entre o sinal em 32,40 ppm (C-8) e o sinal em 0,89 ppm (H-14), definiu a posição do carbono

C-8.

A posição da cadeia prenílica foi definida através da observação de correlações no espectro NOESY entre os sinais em 4,08 ppm (H-4) e o sinal em 0,85 ppm (H-15) (Figura 37, p.69) e entre o sinal em 0,89 ppm (H-14) com o sinal em 1,60 ppm (H-1, exo) (Figura 38, p.69).

A posição das metilas sobre a ligação dupla foi definida pelo espectro NOESY através da correlação observada entre os sinais em 5,11 ppm (H-10) e em 1,68 ppm (H-12) definindo as posições do sinal em 25,68 ppm (C-12) como cis em relação ao hidrogênio e do sinal em 17,52 ppm (C-13 ) como trans em relação ao hidrogênio (Figura 37, p.69).

A tabela 12 p.71 mostra as atribuições dos sinais dos espectros de RMN de 1H e

13C, assim como as correlações observadas nos espectros HETCOR, COLOC, COSY e

NOESY.

O espectro de massas (Figura 39, p.70) obtido por impacto de elétrons (70 eV), apresentou como pico do íon molecular o sinal m/z 222 (28%), com o pico base ocorrendo em

m/z 69 (100%), confirmando a fórmula molecular C15H26O proposta para a substância I. A figura 40 p.70 mostra propostas de fragmentações de massas para os picos em m/z 69, m/z 161

(23%), m/z 179 (57%) e m/z 207 (7%).

O sesquiterpeno canferenol foi obtido como um óleo e apresentou atividade ótica

25º [α] D -86,48. Este composto já havia sido isolado anteriormente da espécie Cinnamomum camphora (Lauraceae) [Hikino et al, 1967]. 49

8 14 12

15 4 13 6 1 OH

Substância I

1 Figura 22-Espectro de RMN de H da substância I [300 MHz, CDCl3] 50

Figura 23–Expansão do espectro de RMN de1H da substância I na região de 0,01 ppm a 1,75 ppm

Figura 24–Expansão do espectro de RMN de1H da substância I na região de 5,07 ppm a 5,16 ppm 51

Figura 25–Expansão do espectro de RMN de1H da substância I na região de 4,04 ppm a 4,13 ppm

8 14 12

4 13

1 OH

13 Figura 26-Espectro de RMN de C da substância I [75MHz, CDCl3] 52

Figura 27-Expansão espectro de RMN de 13C da substância I na região de 13,35 ppm a 51,29 ppm

8 14 12

4 13 6 1 OH

Figura 28-Espectro de DEPT-135º da substância I [75 MHz, CDCl3] 53

8 14 12

4 13

1 OH

Figura 29-Espectro de DEPT-90º da substância I [75 MHz, CDCl3]

13 1 Figura 30–Espectro HETCOR ( C- H) da substância I [J= 140 Hz, CDCl3] 54

13 1 Figura 31–Expansão do espectro HETCOR ( C- H) da substância I [J= 140 Hz, CDCl3]

13 1 Figura 32–Espectro COLOC ( C- H) da substância I [J=11 Hz, CDCl3] 55

13 1 Figura 33–Expansão do espectro COLOC ( C- H) da substância I [J=11 Hz, CDCl3]

1 1 Figura 34–Espectro COSY ( H- H) da substância I [300 MHz, CDCl3] 56

1 1 Figura 35–Expansão do espectro COSY ( H- H) da substância I [300 MHz, CDCl3]

1 1 Figura 36–Espectro NOESY ( H- H) da substância I [500 MHz, CDCl3] 57

1 1 Figura 37–Expansão espectro NOESY ( H- H) da substância I [500 MHz, CDCl3]

1 1 Figura 38–Expansão espectro NOESY ( H- H) da substância I [500 MHz, CDCl3] 58

Figura 39–Espectro de massas da substância I [I. E., 70 eV]

OH OH m/z 69 m/z 222 (100 %)

CH -H2O 3 H2CCH2 + + OH OH OH m/z 222 m/z 207 m/z 179 m/z 161

Figura 40-Proposta de fragmentação de massas da substância I 59

Tabela 12-Dados de RMN de 1H [300MHz J (Hz)], 13C [75MHz], HETCOR (13C-1H) [140 Hz], COLOC (13C-1H) [11Hz], COSY (1H-1H) [300MHz] e NOESY (1H-1H) [500MHz] δ (ppm) da substância I

CHCOLOC COSY NOESY J (Hz) (13C-1H) (1H-1H) (1H-1H)

128,04 (CH2) 1,22 m (endo) 0,95; 2,20 - 4,08

1’ 1,60 m (exo)

226,13 (CH2) 1,25 m (endo) 0,85; 1,80 0,85; 1,20 -

2’ 1,85 m (exo)

3 51,29 (C) - 0,85; 0,89; -- 1,22; 2,20 4 77,37 (CH) 4,08 ddd 4,08 0,95; 2,20 0,85; 1,22; (9,9; 3,2; 1,6) 2,20 538,82 (CH2) 0,95 m (endo) 1,22; 1,60 1,80 -

5’ 2,20 m (exo)

6 42,04 (CH) 1,80 t 0,85; 0,89; 2,20 - (4,5) 1,80 7 50,37 (C) - 0,85; 0,89; -- 1,80 8 32,40 (CH2) 1,15 m 0,85; 0,89 - - (12,4) 9 24,17 (CH2) 1,80 e 2,00 m - 5,11 - (12,4) 10 125,17 (CH) 5,11 m - 1,61; 1,68; 1,68 (7,2; 1,4) 1,80; 2,00 11 131,14 (C) - 1,61; 1,68 - -

12 25,68 (CH3) 1,68 s 1,61 5,11 -

13 17,52 (CH3) 1,61 s 1,68 5,11 0,85

14 16,57 (CH3) 0,89 s 0,85; 1,15 - 1,22; 1,60

15 13,35 (CH3) 0,85 s 0,85; 0.89; - 1,22; 1,61; 1,15 4,08 60

5.1.2-Identificação da substância VI

A substância VI é um artefato formado a partir da fotooxidação da substância I que foi identificado através das análises dos espectros de RMN de 1H, 13C, DEPT-135º,

DEPT-90º e por comparação com os dados descritos na literatura para as substâncias 10ξ- hidroxi-isocanferen-11-eno [Ngo & Brown, 1999] e 24-hidroperoxicicloart-25-en-3β-ol [Kato et al, 1996].

O espectro de RMN de 1H (Figura 41, p.74) mostrou-se parecido com o da substância I, confirmando a presença do esqueleto bornano. Alguns sinais correspondentes aos hidrogênios presentes na cadeia lateral apresentaram-se diferenciados, como o tripleto em

4,26 ppm (J=6,7 Hz) (Figura 42, p.74), com integração relativa para um hidrogênio, atribuível ao hidrogênio H-10, devido à presença do grupo hidroperoxílico. Os sinais em 5,01 ppm e

5,04 ppm (Figura 42, p.74), com integração relativa para dois hidrogênios, foram atribuídos aos hidrogênios H-12 e H-12’, característicos de hidrogênios vinílicos. Além do sinal em 1,73 ppm (Figura 41, p.74), referente ao hidrogênio H-13, característico de metila sobre dupla.

Comparando com a substância I, observou-se que a substância VI apresentou apenas um sinal correspondente a metila sobre dupla, devido a migração dessa ligação das posições 10 e 11 para as posições 11 e 12 em decorrência da peroxidação sofrida pela substância I na posição

10. A tabela 13 p.82, mostra a atribuição dos dados de RMN de 1H.

O espectro de RMN de 13C (Figura 43, p.75) apresentou 14 sinais atribuíveis aos

15 átomos de carbono, confirmando a presença de um sesquiterpeno. Através da comparação com os espectros DEPT-135º (Figura 44, p.75) e DEPT-90º (Figura 45, p.76) foi possível identificar três sinais referentes a carbonos metílicos, cinco referentes a seis carbonos metilênicos, três a carbonos metínicos e três a carbonos não hidrogenados. Alguns sinais 61

coincidiram com os da substância I, confirmando mais uma vez a presença do anel bornano, diferindo apenas em relação aos deslocamentos químicos dos carbonos da cadeia lateral presente na estrutura. A presença de uma ligação dupla terminal foi confirmada pelos sinais que ocorreram em 143,59 ppm (C), que foi atribuído ao carbono olefínico C-11 e o sinal em

114,51 ppm (CH2) que foi atribuído ao carbono vinílico C-12. Foi observado ainda um sinal em 90,38 ppm (CH), característico de carbono ligado a um grupo hidroperoxílico, que foi atribuído ao carbono C-10. A tabela 14 p.83, mostra a atribuição dos dados de RMN de 13C.

A substância VI foi identificada como 10ξ-hidroperoxi-canferen-11-eno. Até o momento, não foram encontrados dados na literatura sobre esta substância, o que sugere que a mesma seja inédita.

OOH 8 14 13 10

4 12 6 1 OH

Substância VI 62

OOH 8 14 13 10

4 12 6 1 OH

1 Figura 41-Espectro de RMN de H da substância VI [300 MHz, CDCl3] 63

Figura 42–Expansão do espectro de RMN de1H da substância VI na região de 4,05 ppm a 5,04 ppm OOH 8 OOH 14 13 8 14 11 13 15 7 10 6 1 12 4 12 4 OH 6 3 1 OH

13 Figura 43-Espectro de RMN de C da substância VI [75MHz, CDCl3] 64

Figura 44-Espectro de DEPT-135º da substância VI [75 MHz, CDCl3] OOH 8 14 13 10

4 12 6 1 OH

Figura 45-Espectro de DEPT-90º da substância VI [75 MHz, CDCl3] 65

5.1.3-Identificação da substância VII

A substância VII também foi isolada como um artefato formado a partir da fotooxidação da substância I, que foi identificado em mistura com a substância VI, através das análises do seu espectro de RMN de 1H, dos espectros de RMN de 1H, 13C, DEPT-135º ,

DEPT-90º da mistura e com os dados descritos na literatura para substâncias correlacionadas

[Ngo & Brown, 1999 e Kato et al, 1996].

O espectro de RMN de 1H (Figura 46, p.79) mostrou-se parecido com o da substância I. Através da comparação com os espectros das substâncias I e VI foi possível atribuir os sinais dos hidrogênios da substância VII. Os deslocamentos químicos dos hidrogênios diferiram apenas em relação aos hidrogênios presentes no grupo prenílico. Os sinais apresentados em 5,70 ppm (J=14,9 Hz e 7,9 Hz) e em 5,55 ppm (J=14,9 Hz) (Figura 47, p.79) característicos de hidrogênios olefínicos, foram atribuídos aos hidrogênios H-9 e H-10, respectivamente. O sinal de metila em 1,35 ppm que foi atribuído aos hidrogênios metilícos

H-12 e H-13, mostrou que a substância VII não apresenta sinal de metila sobre ligação dupla, como nas substâncias I e VI. Isso ocorre devido a migração da ligação dupla das posições 10 e

11 para as posições 9 e 10, após a peroxidação sofrida pela substância I na posição 11. A tabela 13 p.82, mostra a atribuição dos dados de RMN de 1H.

Dos sinais apresentados no espectro de RMN de 13C (Figura 48, p.80), apenas 14 foram atribuídos aos 15 carbonos da substância VII. Através da comparação com o espectro

DEPT-135º (Figura 49, p.80) e DEPT-90º (Figura 50, p.81) foi possível identificar três sinais referentes a carbonos metílicos, quatro referentes a carbonos metilênicos, quatro a carbonos metínicos e três a carbonos não hidrogenados. A maioria dos sinais dos carbonos coincidiram com os das substâncias I e VI, confirmando a presença do anel bornano e do grupo prenílico. 66

Os sinais que ocorreram em 129,24 ppm (CH) e em 135,18 ppm (CH), característicos de dupla ligação interna, foram atribuídos aos carbonos C-9 e C-10, respectivamente. O sinal em

82,17 ppm (C) atribuível ao carbono C-11, confirmou a presença do grupo hidroperoxílico; e um sinal em 24,35 ppm (CH3) foi atribuído aos carbonos metílicos presentes nas posições C-

12 e C-13. A tabela 14 p.83, mostra a atribuição dos dados de RMN de 13C.

A substância VII foi identificada como 11-hidroperoxi-canferen-9-eno. Até o momento, não foram encontrados dados na literatura sobre esta substância, o que sugere que a mesma seja inédita.

8 14 11 15 OOH 4

6 1 OH

Substância VII 67

8 14 11 15 OOH 4

6 1 OH

1 Figura 46-Espectro de RMN de H da substância VII [300 MHz, CDCl3]

Figura 47-Expansão do espectro de RMN de1H da substância VII na região de 4,07 ppm a 5,78 ppm 68

8 14 11 15 OOH 4

6 1 OH

13 Figura 48-Espectro de RMN de C da mistura de VI e VII [75MHz, CDCl3] 69

Figura 49-Espectro de DEPT-135º da mistura de VI e VII [75 MHz, CDCl3] 8 14 11 15 OOH 4

6 1 OH

º Figura 50-Espectro de DEPT-90 da mistura de VI e VII [75 MHz, CDCl3] 70

Tabela 13 - Dados de RMN de 1H dos sesquiterpenos I, VI e VII

[300MHz, CDCl3, δ (ppm), J (Hz)].

H I VI VII J (Hz) J (Hz) J (Hz) 1 (endo) 1,22 m - - 1’ (exo) 1,60 m - - 2 (endo) 1,25 m - - 2’ (exo) 1,85 m - - 4 4,08 ddd (9,9;3,2;1,6) 4,07 ddd (8,6 e 1,7) 4,08 ddd (9,9;3,3;1,4) 5 (endo) 0,95 m 1,26 m - 5’ (exo) 2,20 m 2,11 m - 6 1,80 t (4,5) 1,92 m - 8 1,15 m (12,4) - - 9 1,90 m (12,4) - 5,70 m (14,9 e 7,9) 10 5,11 m (7,2 e 1,4) 4,26 t (6,7) 5,55 d (14,9) 12 1,68 s 1,73 m 1,34 s 13 1,61 s 5,01 m 1,34 s 13’ - 5,04 m - 14 0,89 s 0,86 s 0,87 s 15 0,85 s 0,87 s 0,88 s -OOH - 7,85 - 71

Tabela 14-Dados de RMN de 13C dos sesquiterpenos I, VI e VII

[75MHz, CDCl3, δ (ppm)]

C I Multi VI Multi VII Multi

1 28,04 CH2 27,97 CH2 28,08 CH2

2 26,13 CH2 26,15 CH2 26,91 CH2

3 51,29 C 51,04 C 51,34 C

4 77,37 CH 77,33 CH 77,36 CH

5 38,82 CH2 38,71 CH2 38,59 CH2

6 42,04 CH 42,01 CH 42,42 CH

7 50,37 C 50,39 C 50,20 C

8 32,40 CH2 26,79 CH2 35,28 CH2

9 24,17 CH2 27,97 CH2 129,24 CH

10 125,17 CH 90,38 CH 135,18 CH

11 131,14 C 143,59 C 82,17 C

12 25,68 CH3 16,57 CH3 24,35 CH3

13 17,52 CH3 114,59 CH2 24,35 CH3

14 16,57 CH3 17,09 CH3 16,72 CH3

15 13,35 CH3 13,37 CH3 13,40 CH3 72 73

TRITERPENOS

Os triterpenos são metabólitos secundários presentes nas floras terrestre e marinha e na fauna, ocorrendo na forma livre assim como, na forma de éter e éster. Embora o uso medicinal dessa classe de compostos tenha sido limitado, trabalhos recentes indicaram o seu grande potencial como medicamento [Mahato e Kundu, 1994].

Os triterpenos são formados por 30 átomos de carbono, sendo a maior parte compostos policíclicos, podendo ser tetra ou pentacíclicos. Esses últimos, apresentam dois sistemas de anéis representados na figura 51.

Nas partes aéreas da espécie Acritopappus micropappus foram encontradas substâncias contendo esses dois tipos de sistemas de anéis.

19 21 19 21

13 17 13 17 22 11 11

1 C 1 C 10 8 16 10 8 16 14 14 AB A B 3 7 3 7 5 5

Figura 51-Tipos de sistemas de anéis para os triterpenos pentacíclicos isolados de A. micropappus. 74

5.1.4-Identificação das substâncias II, III, IV e V

As substâncias II, III, IV e V foram obtidas em mistura e identificadas através das análises dos espectros de RMN de 1H, 13C, DEPT-90o, DEPT-135º da mistura e por comparação com os dados descritos na literatura [Mahato e Kundu, 1994].

O espectro de RMN de 1H (Figura 52, p.88) da mistura apresentou vários sinais correspondentes a hidrogênios metílicos na região entre 0,70 ppm e 1,40 ppm; além de dois sinais em 1,64 ppm e 1,69 ppm atribuíveis aos hidrogênios dos grupos metílicos ligados aos carbonos olefínicos, presentes nas substâncias IV e V, um multipleto em 3,22 ppm, correspondente aos hidrogênios carbinólicos ligados aos carbonos C-3, comuns as substâncias

II, III, IV e V. Apresentou dois sinais em 4,69 ppm e em 4,58 ppm que foram atribuídos aos hidrogênios olefínicos ligados ao carbono C-29 da substância IV e um sinal em 4,61 ppm referente ao hidrogênio olefínico ligados ao carbono C-21 da substância V, além de dois tripleto em 5,13 ppm e em 5,18 ppm, atribuíveis aos hidrogênios olefínicos das substâncias

III e II, respectivamente. Esses sinais podem ser observados na expansão do espectro de

RMN de 1H, figura 53 p.88.

O espectro de RMN de 13C (Figura 54, p.89) apresentou vários sinais, principalmente na região entre 14,00 ppm e 60,00 ppm, indicando uma mistura de triterpenos.

Através da análise dos espectros DEPT-135o (Figura 56, p.90) e DEPT-90o (Figura 57, p.90) foi possível identificar os sinais correspondentes aos carbonos metílicos, metilênicos e metínicos e por comparação com o espectro de RMN de 13C, atribuir os sinais correspondentes aos carbonos não hidrogenados. 75

A partir dos valores dos deslocamentos químicos dos carbonos olefínicos e por comparação com os dados descritos na literatura [Mahato e Kundu, 1994] foi possível identificar os quatro triterpenos presentes na mistura.

Os sinais que ocorreram em 145,18 ppm (C) e 121,71 ppm (CH) foram atribuídos aos carbonos C-13 e C-12 da substância II e os sinais em 139,58 ppm (C) e 124,41 ppm (CH) aos carbonos C-13 e C-12 da substância III, característicos de triterpenos oleananos e ursanos, que possuem insaturação entre os carbonos 12 e 13. Os sinais que apareceram em

150,97 ppm (C) e 109,31 ppm (CH2) são característicos de triterpenos do tipo lupano, que possuem insaturação entre os carbonos 20 e 29 e foram atribuídos aos carbonos C-20 e C-29 da substância IV. Os sinais que ocorreram em 139,58 ppm (C) e 118,87 ppm (CH) são característicos de triterpenos pseudotaraxeranos, que possuem insaturação entre os carbonos

20 e 21. Esses sinais podem ser observados na expansão do espectro de RMN de 13C, figura

55, p.89.

A comparação de todos esses dados com os descritos na literatura permitiu identificar os componentes da mistura como β-amirina (II), α-amirina (III), lupeol (IV) e pseudotaraxasterol (V). A atribuição dos dados de RMN de 13C destas substâncias encontram- se na tabela 15 p.91. 76

30 29 30 29 20 20 12 12 17 17 25 26 25 26 H 28 H 28 1 9 1 9 H 15 H 15 3 27 3 27 7 7 HO HO H H 24 23 24 23

II - β-amirina III - α-amirina

29 30

30 20 29 20 21 21 19 12 H 12 H 17 17 25 26 25 26 H 28 H 28 1 9 1 9 H 15 H 15 3 27 3 27 7 7 HO HO H H 24 23 24 23

IV - Lupeol V – Pseudotaraxasterol 77

1 Figura 52–Espectro de RMN de H da mistura de II, III, IV e V [300 MHz, CDCl3]

Figura 53–Expansão do espectro de RMN de 1H da mistura de II, III, IV e V na região de 3,20 ppm e 5,20 ppm 78

13 Figura 54-Espectro de RMN de C da mistura de II, III, IV e V [75MHz, CDCl3]

Figura 55-Expansão do espectro de RMN de 13C da mistura de II, III, IV e V na região de 79,05 ppm e 115,13 ppm 79

Figura 56-Espectro de DEPT-135º da mistura de II, III, IV e V [75MHz, CDCl3] 80

Figura 57-Espectro de DEPT-90º da mistura de II, III, IV e V [75MHz, CDCl3] Tabela 15-Dados de RMN de 13C dos triterpenos II, III, IV e V

[75MHz, CDCl3, δ (ppm)]

C II III IV V

1 38,58 (CH2) 38,70 (CH2) 38,70 (CH2) 38,70 (CH2) 2 27,26 (CH2) 27,26 (CH2) 27,39 (CH2) 27,39 (CH2) 3 79,05 (CH) 79,05 (CH) 79,05 (CH) 79,05 (CH) 4 38,77* 38,77* 38,77* 38,77* 5 55,29 (CH) 55,17 (CH) 55,29 (CH) 55,29 (CH) 6 18,35 (CH2) 18,35 (CH2) 18,35 (CH2) 18,35 (CH2) 7 32,78 (CH2) 32,93 (CH2) 34,27 (CH2) 34,27 (CH2) 8 38,70* 40,00* 40,82 (C) 41,52* 9 47,71 (CH) 47,71 (CH) 50,43 (CH) 50,43 (CH) 10 37,42* 36,89 (C) 37,14 (C) 37,14 (C) 11 23,52 (CH2) 23,36 (CH2) 20,93 (CH2) 21,61 (CH2) 12 121,71 (CH) 124,41 (CH) 25,13 (CH2) 27,26 (CH2) 13 145,18 (C) 139,58 (C) 38,04 (CH) 39,21 (CH) 14 42,07 (C) 42,07 (C) 42,83 (C) 42,33 (C) 15 26,15 (CH2) 28,74* 27,26 (CH2) 26,93 (CH2) 16 27,03 (CH2) 26,62 (CH2) 35,57 (CH2) 36,70 (CH2) 17 32,49 (C) 33,75 (C) 43,00 (C) 34,72* 18 47,63 (CH) 59,06 (CH) 48,30 (CH) 48,70 (CH) 19 46,82 (CH2) 39,60 (CH) 47,97 (CH) 36,31 (CH) 20 31,08 (C) 39,66 (CH) 150,97 (C) 139,58 (C) 21 34,73 (CH2) 31,25 (CH2) 29,84 (CH2) 118,87 (CH) 22 37,28 (CH2) 41,52 (CH2) 40,00 (CH2) 42,18 (CH2) 23 28,12 (CH3) 28,12 (CH3) 28,09 (CH3) 27,98* 24 15,50 (CH3) 15,68 (CH3) 15,37 (CH3) 15,37 (CH3) 25 15,62 (CH3) 15,62 (CH3) 16,11 (CH3) 16,28 (CH3) 26 16,86 (CH3) 16,86 (CH3) 15,97 (CH3) 16,04 (CH3) 27 26,00 (CH3) 23,26 (CH3) 14,54 (CH3) 14,74 (CH3) 28 28,39 (CH3) 28,10 (CH3) 18,00 (CH3) 17,70 (CH3) 29 33,33 (CH3) 17,47 (CH3) 109,31 (CH2) 22,61 (CH3) 30 23,69 (CH3) 21,40 (CH3) 19,30 (CH3) 21,40 (CH3)

* sinais não observados 81

ESTERÓIDES

Os esteróides constituem uma classe de compostos naturais com ampla distribuição na natureza, sendo encontrados em plantas, microorganismos e animais vertebrados e invertebrados. Nos humanos os esteróides desenvolvem e controlam o sistema reprodutor, como o estradiol (hormônio feminino) e a testosterona (hormônio masculino)

[Heftmann,1975].

Além disso, os esteróides possuem vasta gama de aplicações terapêuticas: funcionam como cardiotônicos (digitoxina), são precursores de vitamina D (ergosterol), anticoncepcionais orais (estrogênios), agentes antiinflamatórios (corticosteróides) e agentes anabolizantes (androgênios) [Robbers et al, 1997].

Os esteróides apresentam esqueletos contendo 27 a 29 átomos de carbono, compostos por estruturas tetracíclicas. Em geral, o carbono C-17 do anel D encontra-se substituído por uma cadeia lateral, que pode conter de 7 a 10 átomos de carbono e a posição 3 do anel A pode estar substituída por grupos funcionais como hidroxílico ou carbonílico. 82

5.1.5-Identificação das substâncias VIII e IX

As substâncias VIII e IX foram obtidas em mistura de difícil separação e identificadas através da análise do espectro de RMN de 1H dessa mistura.

O espectro de 1H (Figura 58, p.94) da mistura foi característico de esteróides, apresentando alguns sinais comuns às duas substâncias. Os sinais entre 0,61 ppm e 1,00 ppm foram atribuídos aos hidrogênios metílicos, um multipleto em torno de 3,51 ppm, foi atribuído aos hidrogênios carbinólicos H-3 e um dubleto largo em 5,35 ppm, foi atribuído aos hidrogênios olefínicos H-6 das duas substâncias. Além desses o espectro mostrou dois multipletos entre 5,03 ppm e 5,14 ppm, que foram atribuídos aos hidrogênios H-22 e H-23 da substância IX.

A comparação desses dados com os descritos na literatura [Núñes, 1996 e Ribeiro,

1999] permitiu identificar os constituintes da mistura como sitosterol e estigmasterol.

29 29

21 21 20 27 20 27 18 25 18 25 23 23 11 26 11 26 13 13 19 19 1 H 1 H

10 8 15 10 8 15 H H H H 3 3 HO HO 6 6

VIII -Sitosterol IX- Estigmasterol 83

1 Figura 58–Espectro de RMN de H da mistura de VIII e IX [300 MHz, CDCl3] 84

LIGNANA

As lignanas são compostos diméricos derivados do ácido cinâmico que é precursor de compostos com esqueleto C6-C3. Cerca de 450 lignanas de no mínimo 55 famílias são conhecidas. Esses compostos podem apresentar atividades antimicrobiana e antifúngica [Seigler, 1998].

Mais de 500 lignóides estão relatados na literatura. Desse total, 90% pertence ao grupo das lignanas e neolignanas e pelo menos 40 esqueletos carbônicos diferentes são conhecidos [Simões et al, 2001]. A figura 59 mostra um dos tipos estruturais de lignanas denominado diarilbutanolídeo (8.8’, 9.0.9’) que foi encontrado nas partes aéreas da espécie

Acritopappus micropappus.

2' 9' 3' 1' 8' O 4' 6' 8 9 5' 1 O 6 2

5 3 4

Figura 59-Esqueleto de lignana do tipo diarilbutanolídeo. (8.8’, 9.0.9’) 85

5.1.6-Identificação da substância X

A substância X foi identificada através das análises dos espectos de RMN de 1H,

13C, DEPT-135º, COLOC, HETCOR e COSY, e por comparação com os dados descritos na literatura [Koul et al, 1983].

O espectro de RMN de 1H (Figura 60, p.99) apresentou um multipleto centrado em 2,50 ppm, com integração relativa a quatro hidrogênios, referente aos hidrogênios benzílicos α’ e aos hidrogênios β e β’; além de dois duplos dubletos em 2,86 ppm (J=14,0 Hz e J=5,8 Hz), com integração relativa para dois hidrogênios, referentes aos hidrogênios α.

Esses sinais são observados quando a estereoquímica dos hidrogênios β e β’ é trans. O singleto em 3,79 ppm (Figura 61, p.99), com integração relativa para nove hidrogênios, foi atribuído aos hidrogênios metoxílicos. Foram observados também dois duplos dubletos centrados em 3,84 ppm (J=11,3 Hz e J=7,3 Hz) e em 4,14 ppm (J=7,3 Hz e J=6,9 Hz) (Figura

62, p.100), com integração relativa para dois hidrogênios, que foram atribuídos aos hidrogênios γ’. Foram observados ainda dois dubletos em 5,90 ppm (J=1,3 Hz) (Figura 63, p.100), com integração relativa para dois hidrogênios, característico de hidrogênios metilenodioxílicos. Entre 6,33 e 6,67 ppm (Figura 63, p.100), o espectro mostrou três sinais característicos de hidrogênios ligados a anel aromático, com integração relativa para cinco hidrogênios. Um singleto em 6,33 ppm que foi atribuído aos hidrogênios H-2 e H-6; um duplo dubleto centrado em 6,43 ppm, que foi atribuído ao hidrogênio H-6’ (J=8,5 Hz e J=1,7 Hz), que apresentou acoplamento orto com o dubleto em 6,65 ppm (J=8,5 Hz) que foi atribuído ao hidrogênio H-5’ e acoplamento em meta com o dubleto em 6,42 ppm, que foi atribuído ao hidrogênio H-2’ (J=1,7 Hz). 86

O espectro de RMN de 13C (Figura 64, p.101) apresentou 19 sinais atribuíveis aos carbonos da lignana. Através da comparação com o espectro DEPT-135º (Figura 65, p.101) foi possível identificar quatro sinais referentes a carbonos metilênicos, dois referentes aos três carbonos metoxílicos, seis sinais referentes a sete carbonos metínicos e sete sinais referentes a oito carbonos não hidrogenados. A presença de um carbono carbonílico de lactona foi confirmada pelo sinal que ocorreu em 178,31 ppm (C) que foi atribuído ao carbono C-γ. Os carbonos metínicos presentes no anel aromático apresentaram os sinais em 121,35 ppm (C-

6’), 108,61 ppm (C-2’), 108,09 ppm (C-5’) e o sinal em 106,17 ppm referente aos carbonos C-

6 e C-2. O sinal em 100,90 ppm confirmou a presença do grupo metilenodioxílico e os sinais em 60,62 ppm e 55,93 ppm confirmaram a presença dos três carbonos metoxílicos. Os sinais em 38,11 ppm e 35,07 ppm foram atribuídos aos carbonos metilênicos C-α’ e C-α, respectivamente.

Através do espectro HETCOR 1H-13C (140 Hz) (Figura 66, p.102) foram confirmadas as ligações entre os hidrogênios e os carbonos. Essas correlações são mostradas na tabela 16, p.105.

O espectro COLOC 1H-13C (11 Hz) (Figura 69, p.103) mostrou acoplamento entre o sinal em 131,44 ppm com os sinais em 2,50 ppm (H-α’) e 6,65 ppm (H-5’), confirmando a atribuição do sinal em 131,44 ppm para o carbono C-1’; ao passo que o sinal em 133,20 ppm foi atribuído ao carbono C-1, devido ao acoplamento deste último com os sinais em 2,86 ppm

(H-α) e 6,33 ppm (H-2 e H-6). Este espectro também apresentou acoplamento entre os sinais em 35,07 (C-α) ppm e 6,33 ppm (H-2) confirmando a atribuição do C-α e acoplamento entre os sinais em 38,11 ppm (C-α’) e 6,43 ppm (H-6’) confirmando atribuição do C-α’. O acoplamento entre os sinais em 178,31 ppm (C-γ) e 2,86 ppm (H-α), foram importantes para definir a posição do carbono carbonílico na molécula.

A tabela 16 p.105 mostra as atribuições dos sinais dos espectros de RMN de 1H e 87

13C, assim como as correlações observadas nos espectros HETCOR, COLOC e COSY.

A tabela 16 p.105 mostra as atribuições dos sinais dos espectros de RMN de 1H e

13C, assim como as correlações observadas nos espectros HETCOR, COLOC e COSY.

A comparação de todos esses dados com os encontrados na literatura confirmou a identificação da substância como yateína. A lignana X, com esqueleto do tipo diarilbutanolídeo (8.8’, 9.0.9’), já havia sido isolada anteriormente da espécie Piper clusii

[Koul et al, 1983].

O α H H3CO 5 1 γ β O

α´ H3CO 3 β´ γ´ H 1´ OCH3

5´ O O

Substância X 88

O α H H CO 3 5 1 γ β O α´ β´ γ´ H3CO 3 H 1´ OCH3

5´ O O

1 Figura 60-Espectro de RMN de H da substância X [300 MHz, CDCl3]

Figura 61-Expansão do espectro de RMN de1H da substância X na região de 2,30 ppm e 6,80 ppm 89

O α H H3CO 5 1 γ β O

α´ H3CO 3 β´ γ´ H 1´ OCH3

5´ O O

1 Figura 62-Expansão do espectro de RMN de H da substância X [300 MHz, CDCl3]

Figura 63-Expansão do espectro de RMN de1H da substância X na região de 5,88 ppm e 6,69 ppm 90

O α H H3CO 5 1 γ β O

α´ H3CO 3 β´ γ´ H 1´ OCH3

5´ O O

13 Figura 64-Espectro de RMN de C da substância I [75MHz, CDCl3]

Figura 65-Espectro de DEPT-135º da substância X [75 MHz, CDCl3] 91

13 1 Figura 66–Espectro HETCOR ( C- H) da substância X [J= 140 Hz, CDCl3]

13 1 Figura 67–Expansão do espectro HETCOR ( C- H) da substância X [J= 140 Hz, CDCl3] 92

13 1 Figura 68–Expansão do espectro HETCOR ( C- H) da substância X [J= 140 Hz, CDCl3] 93

13 1 Figura 69–Espectro COLOC ( C- H) da substância X [J=11 Hz, CDCl3]

1 1 Figura 70-Espectro COSY ( H- H) da substância X [300 MHz, CDCl3] 94

Tabela 16-Dados de RMN de 1H [300MHz J (Hz)], 13C [75MHz], HETCOR (13C-1H) [140 Hz], COLOC (13C-1H) [11Hz] e COSY (1H-1H) 300MHz] δ (ppm) da substância X

CMultHCOLOCCOSY (13C-1H) (1H-1H) α 35,07 (CH2) 2,86 dd 6,33 - (14,0 e 5,8) α’ 38,11 (CH2) 2,50 m 6,43; 3,85; 3,85; 4,14; 2,50 2,86 β 46,24* (CH) 2,50 m 2,50; 2,80 3,85; 4,14; 2,86 β’ 40,88* (CH) 2,50 m 2,50; 2,80 3,85; 4,14; 2,86 γ 178,31 (C) - 2,50; 2,86; - 3,85; 4,14 γ’ 70,98 (CH2) 3,85 dd - 2,50; 6,33 (11,3 e 7,3) 4,14 dd (7,3 e 6,9) 1 133,20 (C) - 2,80; 6,33 - 1’ 131,44 (C) - 2,50; 6,65 - 2 106,17 (CH) 6,33 s 2,86; 6,33 3,85 2’ 108,61 (CH) 6,42 d 2,50; 6,43 - (1,6) 3 153,08 (C) - 3,80; 6,33 - 3’ 147,73* (C) - 6,43 - 4 136,76 (C) - 3,80; 6,33 - 4’ 146,21* (C) - 5,90; 6,43; - 6,65 5 153,08 (C) - 3,80; 6,33 - 5’ 108,09 (CH) 6,65 d 6,43; 6,65 - (8,4) 6 106,17 (CH) 6,33 s 2,86; 6,33 3,85 6’ 121,35 (CH) 6,43 dd 2,50; 6,43; - (8,5 e 1,7) 6,65 -O-CH2-O- 100,90 (CH2) 5,90 d 5,90 - (1,3) -O-CH3 (3) 55,93 (CH3) 3,80 s 3,85; 4,14 6,33 95

-O-CH3 (4) 60,63 (CH3) 3,80 s - 6,33 -O-CH3 (5) 55,93 (CH3) 3,80 s 3,85; 4,14 6,33 * Esses sinais podem está trocados. 96

5.2-Identificação dos constituintes químicos dos óleos voláteis dos três

espécimens de Acritopappus micropappus

A identificação dos constituintes presentes nos óleos voláteis das partes aéreas dos diferentes espécimens foi realizada através das análises dos espectros de massas obtidos por

CG/EM.

Os espectros de massas obtidos foram comparados com os padrões contidos nos bancos de dados da biblioteca de espectros, NIST Mass Spectral Library, utilizando um programa de busca NIST Mass Spectral Search Program 1.6 instalado no equipamento e com os espectros registrados na literatura [Adams, 1995].

Adicionalmente foram comparados os índices de retenção calculados com os tabelados. A determinação dos índices de retenção por interpolação numérica baseia-se no algoritmo proposto por Kóvats, através do qual o índice de retenção de uma substância é calculado em relação uma série homóloga de hidrocarbonetos lineares tomados como padrões, nesse experimento utilizou-se a série C9H20 a C26H54.

O uso da série homóloga baseia-se na propriedade de seus membros serem eluídos em condições isotérmicas, com tempo de retenção variando exponencialmente com o número de átomos de carbono [Castello, 1999]. Como conseqüência o gráfico do logaritmo dos tempos de retenção dos membros da série homóloga, versus os números de átomos de carbono ou os índices de retenção correspondentes, resulta numa linha reta. Hidrocarbonetos lineares são utilizados como padrões de referência pelo fato de serem apolares, quimicamente inertes e serem solúveis na maioria das fases estacionárias de baixa polaridade. Kóvats estabeleceu que o índice de retenção dos hidrocarbonetos lineares, com n átomos de carbono utilizados como 97

referência seria, por definição, igual a cem vezes o número de átomos de carbono do hidrocarboneto em questão [Reis, 2001].

Os índices de retenção dos constituintes dos óleos da espécie Acritopappus micropappus foram determinados através do algoritmo proposto por Kóvats, como mostrado na expressão abaixo,

I=100 m ______log t'Rx - log t'Rz + Z log t'Rz + m - log t'Rz

Onde:

t’Rz < t’Rx < t’Rz + m

t’Rx = tempo de retenção da substância x

t’Rz = tempo de retenção do hidrocarboneto de menor massa molecular

t’Rz + m = tempo de retenção do hidrocarboneto de maior massa molecular

m = diferença entre o número de átomos de carbono do dois hidrocarbonetos envolvidos

Z = número de carbonos do hidrocarboneto com tempo de retenção t’Rz

Através da análise por CG/EM foram identificados 31 constituintes no total, sendo

6 monoterpenos, 24 sesquiterpenos e a cetona alifática 6-metil-5-hepten-2-ona, com grande variabilidade estrutural entre os três óleos. O espécimen coletado no município de Jacobina mostrou-se rico em monoterpenos, enquanto os outros dois mostraram-se ricos em sesquiterpenos. Os componentes majoritários presentes no óleo volátil obtido do espécimen 98

coletado no município de Jacobina foram germacreno-D (22,5%), β-pineno (14,1%) e α- pineno (14,0%) do espécimen coletado no município de Saúde foram α-humuleno (10,4%), cariofileno (8,8%), e valerianona (7,5%), enquanto do espécimen coletado no município de

Morro do Chapéu foram β-acorenol (12,5%), 1,10-epoxicariofileno (10,0%), (+)-junenol

(9,5%) e 6-metil-5-hepten-2-ona (8,8%). A tabela 17 p.125 mostra os dados dos constituintes voláteis presentes nos óleos dos três espécimens com seus respectivos índices de retenção e percentagens.

Abundance

TIC: AMJD.D 5.00 850000 800000 6.08 750000 25.45 700000 650000 600000

550000 6.44 500000 7.59 450000 400000 350000 300000 24.32 22.95 250000 200000 150000 26.05

100000 6.84 27.13 37.34 5.987.468.22 21.21 47.22 4.83 25.85 50000 19.6621.81 25.6226.3927.0229.1429.3530.6531.0831.5332.02 20.8321.5723.7324.6125.3026.2226.7528.3529.9230.1330.3331.7431.83 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 Time-->

Figura 71–Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus coletado no município de Jacobina obtido no CG/EM [I. E., 70 eV] 99

220000 Scan 122 (5.004 min): AMJD.D 93 200000

180000

160000

140000

120000

100000

80000

60000 77 40000

20000 121 105 41 136 0 53 67 3032 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 62 82 87 115

m/z-->

Figura 72-Espectro de massas do α-pineno [I.E., 70 eV]

Abundance

200000 Scan 265 (6.081 min): AMJD.D 93 180000

160000

140000

120000

100000

80000

60000

40000 69 41 79 20000 121 136 0 53 107 3032 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 63 87 102 115

m/z-->

Figura 73-Espectro de massas do β-pineno [I.E., 70 eV]

Abundance

120000 Average of 6.435 to 6.442 min.: AMJD.D 110000 93 100000

90000

80000

70000 69 60000 41 50000

40000

30000

20000

10000 79 53 0 121 32 107 136 30 40 50 6063 70 80 90 100102 110115 120 130 140

m/z--> 100

Figura 74-Espectro de massas do β-mirceno [I.E., 70 eV] Abundance

26000 Scan 366 (6.841 min): AMJD.D 93 24000

22000

20000

18000

16000

14000

12000

10000

8000 77 136 6000

32 4000

2000

39 65 0 51 105 119 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

m/z-->

Figura 75-Espectro de massas do α-felandreno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 465 (7.587 min): AMJD.D 65000 68 60000 93 55000

50000

45000

40000

35000

30000

25000 79

20000 121 107 136 15000

10000 53 39 5000 32 0 30 40 50 6063 70 80 90 100 110 120 130 140 74 102 115 128

m/z-->

Figura 76-Espectro de massas do Limoneno [I.E., 70 eV]

Abundance

22000 Scan2406 (21.200 min): OEAMJN1.D 119 21000 20000 H 105 161 19000

18000

17000

16000

15000

14000

13000

12000

11000 93 10000 H 9000 H 8000

7000

6000

5000 41 81 4000

3000 55 204 2000 133

1000 67 145 189 0 32 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170175 180 190 200 210

m/z--> 101

Figura 77-Espectro de massas do α-copaeno [I.E., 70 eV] Abundance

18000 Scan 2506 (22.953 min): AMJD.D 17000 133

16000 93 15000 14000 H E 13000

12000 79 11000

10000 69 105 41 9000 8000 120 7000 161 6000 5000 148

4000 55 189 3000 2000 175 204 1000 32 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

m/z-->

Figura 78-Espectro de massas do Cariofileno [I.E., 70 eV]

Abundance

55000 Scan 2687 (24.316 min): AMJD.D 93

50000

45000 40000 E 35000 E E 30000

25000

20000

121 15000 80

147 10000 107 5000 41 67 53 204 0 161 32 136 189 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170175 180 190 200 210

m/z-->

Figura 79-Espectro de massas do α-humuleno [I.E., 70 eV]

Abundance

130000 Scan 2837 (25.445 min): AMJD.D 161 120000

110000

100000

90000

80000

70000

60000

50000 105 91 40000 119 30000 81 20000 133 204 41 10000 55 67 147 0 3032 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170175 180189 190 200 210

m/z--> 102

Figura 80-Espectro de massas do Germacreno D [I.E., 70 eV] Abundance

17000 Scan 2917 (26.047 min): AMJD.D 121 16000

15000 14000 13000 12000 93 11000 10000 9000

8000 107 7000 6000

5000 161 79 4000 3000 204 41 136 67 2000 55 1000 189 32 147 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170175 180 190 200 210

m/z-->

Figura 81-Espectro de massas do Biciclogermacreno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 3193 (27.125 min): OEAMJN1.D 28000 161 26000

24000

22000

20000 119 18000 134 16000 105 14000 H 12000 91 10000 204

8000 81 6000 41 4000 189 2000 55 69 145 0 3032 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170176 180 190 200 210

m/z-->

Figura 82-Espectro de massas do δ-cadineno [I.E., 70 eV] 103

Figura 83-Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A micropappus coletado no município de Morro do Chapéu obtido no CG/EM [I.E., 70 eV] Abundance

11500 Scan 372 (6.296 min): MICROPAP.D 11000 43

10500

10000 9500 O 9000

8500

8000

7500

7000

6500

6000

5500

5000

4500

4000 55 3500 108 3000

2500 69 2000

1500

1000 32 500 93 83 0 126 3038 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 m/z-->

Figura 84-Espectro de massas do 6-metil-5-hepten-2-ona [I.E., 70 eV]

Abundance

1800 Scan 582 (7.541 min): MICROPAP.D 68 1600

93 1400 32

1200

1000

800

79 600 40

400 53 107 136 121 200 45 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

m/z-->

Figura 85-Espectro de massas do Limoneno [I.E.,70 eV] 104

Abundance

1150 Scan 3620 (25.553 min): MICROPAP.D 32 1100

1050

1000

950

900 41 69 850

800

750 93 700

650

600 550 105 H 500 133 450 161 55 400 79 350

300 121 250

200 189 150

100

0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

m/z-->

Figura 86-Espectro de massas do β-selineno [I.E., 70 eV] Abundance

2400 Scan 4249 (29.282 min): MICROPAP.D 2300 41 2200

2100 2000 1900 O 1800 1700 1600 1500 H 79 1400 93 1300

1200 32 1100 55 1000 109 900 69 H 800

700 121 600 500

400 136 149 300 159 200

100 187 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

m/z-->

Figura 87-Espectro de massas do 1,10-epóxi-cariofileno [I.E., 70 eV]

34000 Scan 4472 (30.604 min): CONFERT2.D 32000 109 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 H 12000 41 10000 OH 8000 161 55 81 95 6000 135 4000 67 179 204 2000 121 189 0 147 3032 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220222

Figura 88-Espectro de massas do (+)-Junenol [I.E., 70 eV] 105

Abundance

Scan 4573 (31.203 min): MICROPAP.D 4000 119

3500 43 HO

3000

2500 105 161

2000

1500 81

134 32 93 1000 55

71 500 179

204 222 147 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220

m/z-->

Figura 89-Espectro de massas do β-acorenol [I.E., 70 eV] Abundance

1400 Scan 3784 (31.578 min): OEAMD.D 95 1300 HO H 1200

1100

1000 161

900

800 79 121 43

700 107 H 600 32 55

500

400 67

204 300 135

200 145

179 100 189 222

0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220

m/z-->

Figura 90-Espectro de massas do α-muurolol [I.E., 70 eV]

Abundance

1500 Scan 4699 (31.950 min): MICROPAP.D 32

1400

1300

1200

1100 43

1000

900 800 HO 107 700 55 81 121 600 95

500 161 67

400

300

133 147 200 204 175 100 189

0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

m/z-->

Figura 91-Espectro de massas do Valerianol [I.E., 70 eV] 106

Abundance

750 Scan 3818 (31.831 min): OEAMP.D 32 700 59 650

600

550

500 43 450 HOH149 93 400

350

300 164 79 107 250 121

200

150 67 135

100

0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

m/z-->

Figura 92-Espectro de massas do β-eudesmol [I.E., 70 eV] Abundance

TIC: OEAMS2.D 24.33 320000

300000 6.08 22.96 280000

260000

240000

220000 32.58

200000 23.03

180000 25.43 160000 26.05 140000 5.01 120000 7.59 60.32 27.03 19.65 100000 27.14 37.33 31.09 80000 21.20 26.37 24.64 37.26 60000 4.22 6.44 25.85 25.62 26.59

40000 29.33 8.22 27.47 28.34 29.14 31.57 13.99 23.67 32.08 58.98 21.81 25.27 26.23 26.78 29.66 20000 6.84 7.46 10.04 21.89 24.9325.15 26.84 28.72 29.53 30.32 31.8332.02 38.22 18.15 18.96 29.92 36.68 47.22 4.84 5.99 20.14 23.56 30.96 33.20 49.73 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 Time-->

Figura 93-Cromatograma de íons totais do óleo volátil das partes aéreas de A. micropappus coletado no município de Saúde obtido no CG/EM [I.E., 70 eV]

90000 Scan 119 (4.984 min): AMS.D 32 85000

80000

75000

70000

65000

60000

55000

50000

45000

40000

35000 93

30000

25000

20000

15000

10000 77 5000 40 121 105 0 136 53 67 30 40 50 60 62 70 80 82 90 100 110 115 120 130 140

m/z--> 107

Figura 94-Espectro de massas do α-pineno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 262 (6.061 min): AMS.D 32 85000

80000 93 75000

70000

65000

60000

55000

50000

45000

40000

35000

30000

25000

20000 69 79 41 15000 121 10000 136 53 5000 107 63 115 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 m/z-->

Figura 95-Espectro de massas do β-pineno [I.E., 70 eV]

12000 Scan 444 (6.429 min): OEAMS2.D 93 11000

10000

9000 41 69 8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000 79

53 1000

121 0 32 107 136 30 40 50 6063 70 80 90 100 110 120 130 140

Figura 96-Espectro de massas do β-mirceno [I.E., 70 eV]

16000 Scan 598 (7.588 min): OEAMS2.D 15000 68 14000 13000 93 12000 11000 10000 9000 8000 7000 6000 79 5000 4000 53 121 3000 39 107 136 2000 1000 0 3032 40 50 6063 70 80 90 100 110115 120 130 140

m/z > 108

Figura 97-Espectro de massas do Limoneno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 682 (8.221 min): OEAMS2.D 6500 93

6000

5500

5000

4500

4000

3500

3000 79

2500

2000

1500 41 105

1000 121 53 67

500 32 136

0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 m/z-->

Figura 98-Espectro de massas do (E)-β-ocimeno [I.E., 70 eV]

Scan 2200 (19.650 min): OEAMS2.D 17000 121 16000

15000

14000

13000

12000 93 11000

10000

9000

8000 136 7000

6000

5000 161 4000

3000 77 105 41 2000 53 1000 67 0 189 204 3032 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 147150 160 170 180 190 200 210

m/z-->

Figura 99-Espectro de massas do δ-elemeno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan2406 (21.201 min): OEAMS2.D 9500 119 H 105 9000 161 8500

8000

7500

7000

6500

6000

5500

5000 93 4500 H 4000 3500 H 3000

2500 81 41 2000 204 1500 133 55 1000 69

500 32 145 189

0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 m/z--> 109

Figura 100-Espectro de massas do α-copaeno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 2485 (21.795 min): OEAMS2.D 161

3200

3000

2800

2600

2400

2200

2000

1800

1600

1400 H

1200 91

105 1000 H 119

800

41 79 600

55 133 400 204 32 69 147 200

0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 101-Espectro de massas do β-cubebeno [I.E., 70 eV] Abundance

Scan 2502 (22.926 min): AMS.D 32 40000

35000

30000

25000 H E

20000

133 15000 93

10000 79 H 105

120 147161 5000 67 55 189 175 43 204 281 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z-->

Figura 102-Espectro de massas do Cariofileno [I.E., 70 eV] 110

Abundance

40000 Scan 2512 (23.001 min): AMS.D 32

35000

30000

25000

20000

94 15000

10000

5000 107 79 121 189 161 0 55 204 135 148 176 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280281 300 320327

m/z-->

Figura 103-Espectro de massas do α-santaleno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 2684 (24.296 min): AMS.D 52000 93

50000

48000

46000

44000

42000

40000 32

38000

36000

34000

32000 E

30000 28000 E E 26000

24000

22000

20000

18000 121

16000 80

14000

12000 147 10000 107 8000 41 67 6000 204 4000 53 161 136 2000 189 175 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 104-Espectro de massas do α-humuleno [I.E., 70 eV]

Scan 2513 (23.008 min): AMS.D 40000 32

35000

30000

25000

20000

15000 94

10000

5000 107 79 121 189 161 204 0 55 67 133 43 176 40 60 80 100 120 140148 160 180 200 220 240 260 280281

Figura 105-Espectro de massas do β-santaleno [I.E., 70 eV] 111

Abundance

Scan 2967 (25.424 min): OEAMS2.D 23000 161 22000

21000

20000

19000

18000

17000

16000

15000

14000 105 13000 91

12000

11000

10000

9000 119 81 8000

7000 41

6000

5000 133

4000 55 67 3000 204 2000 147 1000 32 189 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 106-Espectro de massas do Germacreno D [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 2992 (25.612 min): OEAMS2.D 93

2800 105

2600 79

2400 121

2200 41

2000

1800

1600 67 161 H 1400 55 133 147 1200

1000 189 204

800 175

600

32 400

200

0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 107-Espectro de massas do β-selineno [I.E., 70 eV] Abundance

Scan 3024 (25.853 min): OEAMS2.D 161 8500

8000

7500

7000

6500

6000

5500

5000

4500

4000 105 91 3500

3000 204 119 189 2500

2000 133

1500 41 77 147 1000 55 67 500 32 175

0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 108-Espectro de massas do Valenceno [I.E., 70 eV] 112

Abundance

16000 Scan 3049 (26.042 min): OEAMS2.D 121 15000 14000 13000 93 12000 11000 10000

9000 107 8000 7000 79 6000 5000 41 4000 3000 67 161 2000 55 136 1000 204 147 189 0 3032 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170175 180 190 200 210

m/z-->

Figura109-Espectro de massas do Biciclogermacreno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 3093 (26.373 min): OEAMS2.D 93 7000

6500

6000 5500 Z 5000

4500

4000

3500 105 119 3000 79 2500 41 67

55 2000 133 204 147 1500 161

1000 189

500 32 175 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 110-Espectro de massas do (Z)-α-bisaboleno [I.E., 70eV] Abundance

Scan 3121 (26.584 min): OEAMS2.D 93 5500 69

5000

41 4500

4000

3500

3000

2500

79 2000 161 119 107

1500

204

1000 53

133

500 32 147 189

0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 111-Espectro de massas do β-bisaboleno [I.E., 70 eV] 113

Abundance

Scan 3194 (27.133 min): OEAMS2.D 11500 161

11000

10500

10000

9500

9000

8500

8000

7500 119 7000

6500

6000 134

5500 105 91 H 5000 204

4500

4000

3500

3000 41 69 2500 81

2000 55 189 1500

1000 147

500 32 176 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 112-Espectro de massas do δ-cadineno [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 3238 (27.464 min): OEAMS2.D 3600 93 3400 3200 107 3000

2800 119 2600 2400 E 2200 2000 1800 1600 1400 41 135 1200 79 1000 161 55 800 69 600 204 400 32 200 147 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z-->

Figura 113-Espectro de massas do (E)-γ-bisaboleno [I.E., 70 eV] Abundance

Scan 3354 (28.338 min): OEAMS2.D 121 2400

93 2200

2000

1800 E 1600 E 1400 105 67

1200 79 41

1000

800 53 161 133 600

147 204 400 189

32 200

0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z--> 114

Figura 114-Espectro de massas do Germacreno B [I.E., 70 eV]

Abundance H

1500 Scan 3460 (29.136 min): OEAMS2.D 43

1400 91 1300

1200

1100 205 119 HO 1000 H

900 107 162 800 79 69 700 147

600 187 55 500 131

400

300 32

200 177

100

0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

m/z-->

Figura 115-Espectro de massas do Espatulenol [I.E., 70 eV]

2400 Scan 3486 (29.332 min): OEAMS2.D 2300 43 2200 2100 O 2000 79 1900 1800 91 1700 H 1600 1500 1400 1300 1200 69 1100 55 1000 107 H 900 800 700 121 600 500 400 133 300 147 159 200 32 177 100 187 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

m/z >

Figura 116-Espectro de massas do 1,10-epóxi-cariofileno [I.E., 70 eV] Abundance HO H Scan 3783 (31.568 min): OEAMS2.D 2200 161 2100 2000 95 1900

1800 43 1700 1600 1500 1400 121 H 1300 204 1200 105 1100 1000 79 900 800 55 700 71 600 500 32 400 133 179 300 145 200 189 100 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210 m/z--> 115

Figura 117-Espectro de massas do α-muurolol [I.E., 70 eV]

Abundance

Scan 3917 (32.577 min): OEAMS2.D 16000 69 15000 95

14000

13000 41 109 12000

11000

10000

9000 137 8000 179 7000 6000 55 O 5000 82

4000 161

3000 123 222 2000 151

1000 207 32 194 0 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220 m/z-->

Figura 118-Espectro de massas da Valerianona [I.E., 70 eV]

Tabela 17- Constituintes químicos presentes nos óleos voláteis dos três

espécimens de Acritopappus micropappus

Substâncias I.R. Saúde M. do Chapéu Jacobina (%) (%) (%) α-pineno 938 2,97% - 14,06 116

β-pineno 980 6,20 - 14,08 6-metil-5- 988 - 8,83 - hepten-2-ona β-mirceno 992 1,22 - 9,19 α-felandreno 1007 - - 1,52 Limoneno 1032 2,34 2,26 9,75 β-ocimeno 1052 0,73 - - δ-elemeno 1349 3,23 - - α-copaeno 1376 2,32 - 1,52 β-cubeno 1390 0,71 - - Cariofileno 1418 8,82 - 7,58 α-santaleno 1420 5,26 - - α-humuleno 1453 10,37 - 8,41 β-santaleno 1461 1,92 - - Germacreno- D 1480 5,58 - 22,52 β-selineno 1485 1,86 3,10 - Valenceno 1490 2,49 - - Biciclogermacre 1495 5,76 - 4,35 mo α-bisaboleno 1503 2,76 - - β-bisaboleno 1509 2,23 - - δ- cadineno 1524 3,62 - 2,34 γ-bisaboleno 1533 1,11 - - Germacreno – B 1556 0,79 - - Espatulenol 1576 1,01 - - 1,10-epóxi- 1581 1,40 9,95 - cariofileno (+)-junenol 1616 - 9,46 - β-acorenol 1635 - 12,45 - α-muurolol 1644 1,52 2,90 - α-eudesmol 1652 - 3,41 - Valerianol 1656 - 6,88 - Valerianona 1673 7,54 - - Total - 83,76 59,24 95,32 117

6.0-Considerações Finais

No estudo fitoquímico do extrato hexânico das partes aéreas da espécie

Acritopappus micropappus foram identificados dez metabólitos secundários, dos quais dois são artefatos; sendo três sesquiterpenos, quatro triterpenos, dois esteróides e uma lignana.

Dos triterpenos obtidos em mistura, apenas o lupeol já havia sido relatado no gênero, na espécie Acritopappus prunifolius. Além desse, foram identificados α-amirina, β- amirina e o pseudotaraxasterol.

Na família Asteraceae, em apenas cinco espécies foram encontradas lignanas:

Phaganalon rupestre (Gnaphalieae) [Gongora et al, 2002], Centaurea americana (Cardueae)

[Cooper et al, 2002], Centaurea scoparia (Cardueae) [Youssef & Frahm, 1995], Arnica mollis

(Heliantheae) [Merfort et al, 1996] e Lychnophora ericoides (Vernonieae) [Borsato et al,

2000], sendo que nenhuma delas pertence à tribo Eupatorieae. Porém, a lignana yateína foi encontrada pela primeira vez nessa família. A lignana yateína, participa da rota biossintética do composto podofilotoxina, o qual apresenta atividade anticancerígena.

Os sesquiterpenos isolados, apresentaram esqueleto do tipo bornano substituído na posição 8 por um grupo prenílico, conhecidos como: canferenol (I), 10ξ-hidroperoxi- canferen-11-eno (VI) e 11-hidroperoxi-canferen-9-eno (VII). Os artefatos VI e VII são inéditos e foram formados a partir da fotooxidação da substância I com oxigênio do ar. 118

As substâncias I e X são raras na natureza, sendo relatadas na família Asteraceae pela primeira vez.

Através do estudo dos constituintes voláteis das partes aéreas dos três espécimens de Acritopappus micropappus coletados em municípios diferentes e em dois períodos, foi possível verificar uma diferença estrutural considerável entre os constituintes químicos destes espécimens, sendo o α-pineno, β-pineno e o germacreno-D os compostos majoritários no óleo do espécimen coletado em Jacobina; α-humuleno, cariofileno e valerianona os constituintes majoritários encontrados no óleo do espécimen coletado em Saúde e β-acorenol, 1,10-epoxi- cariofileno, (+)-junenol e 6-metil-5-hepten-2-ona os principais constituintes encontrados no

óleo do espécimen coletado em Morro do Chapéu.

O extrato hexânico do espécimen coletado no município de Morro do Chapéu foi submetido a ensaio bioautográfico contra o fungo Cladosporium sphaerospermum mostrando- se ativo, enquanto que o extrato hexânico do espécimen coletado no município de Jacobina foi submetido a ensaios biológicos preliminares apresentando atividade contra Staphylococcus aureus e Candida albicans, o que demonstra seu potencial como um provável agente bacteriostático e antifúngico. 119

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