Faculté de Médecine

Laboratoire de Recherche en Orthopédie Traumatologie (LROT)

Etude des effets d’un courant électrique pulsé de basses fréquences sur les kératinocytes humains

Jean-François Collard

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Devant le Jury composé des Professeurs :

Philippe LEBRUN (Président - ULB) Maurice HINSENKAMP (Promoteur - ULB) Carine MAENHAUT (Secrétaire - ULB) Véronique DEL MARMOL (ULB) Marcel ROOZE (ULB) Stéphane SWILLENS (ULB) Isabelle LAGROYE (Université de Bordeaux, France) Année académique Antonio SAROLIC (Université de Split, Croatie) 2015-2016

Faculté de Médecine

Laboratoire de Recherche en Orthopédie Traumatologie (LROT)

Etude des effets d’un courant électrique pulsé de basses fréquences sur les kératinocytes humains

Jean-François Collard

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Devant le Jury composé des Professeurs :

Philippe LEBRUN (Président - ULB) Maurice HINSENKAMP (Promoteur - ULB) Carine MAENHAUT (Secrétaire - ULB) Véronique DEL MARMOL (ULB) Marcel ROOZE (ULB) Stéphane SWILLENS (ULB) Isabelle LAGROYE (Université de Bordeaux, France) Antonio SAROLIC (Université de Split, Croatie) Année académique 2015-2016

Remerciements

Je suis conscient que ce travail a été rendu possible grâce à la confiance que me témoigne le Pr. Hinsenkamp depuis plusieurs années. C'est un réel plaisir de discuter Sciences avec lui et de confronter nos idées. Je suis sincèrement reconnaissant pour l'autonomie et les nombreuses responsabilités qu'il m'a confiées au fil des années. Le terme le plus juste et pourtant si simple que m'offre la langue française pour lui témoigner ma gratitude est le mot "Merci".

Je remercie le Président de mon Comité d'Accompagnement, le Pr. Rooze, ainsi que ses Membres, les Prs. Maenhaut, Verschaeve et Hinsenkamp, pour les conseils et l'intérêt porté à ce travail ainsi que pour le soutien apporté lorsque certaines difficultés se sont présentées.

Il n'est pas possible de parler de cet écrit sans remercier le Pr. Burny pour ses nombreuses lectures, corrections et simplifications. Son œil averti et ses remarques ont été précieux pour améliorer et organiser ce texte. Je remercie également Monique Donkerwolcke, Sylvie Fourez et ma petite maman pour leur aide dans la recherche des coquilles, la correction orthographique et pour leur soutien.

J'ai également une pensée pour le Dr. Mukisi que je revois assis il y a quelques années dans ce bureau surchauffé pour terminer sa thèse avec le Pr. Burny; j'ai souvent songé à lui durant la rédaction pour me donner du courage…

Je remercie les Ingénieurs du Beams et du LISA de l'ULB et tout particulièrement le Dr. Mertens et Nicolas Juliemont pour leur aide précieuse lors des mesures et de l'analyse des paramètres électriques utilisés dans ce travail.

Merci au Pr. Maenhaut de m'avoir ouvert son laboratoire pour y réaliser les PCR et au Dr. Dom pour sa sympathie et ses précieux conseils.

Je souhaite remercier le Pr. de Maertelaer pour ses avis et conseils avisés dans le domaine des statistiques.

Merci au Pr. Soularue pour notre fructueuse collaboration et à son équipe pour leur accueil au sein de PartnerChip (Commissariat à l'Energie Atomique (CEA), Evry France). Je remercie tout particulièrement le Dr. Baulade pour son aide et ses conseils dans l'analyse des échantillons microarrays.

Ce travail a été rendu possible grâce au financement du Belgian BioElectroMagnetics Group (BBEMG). Je remercie les différentes équipes universitaires pour l'intérêt porté à mon travail. Je remercie tout particulièrement le soutien et les encouragements du Pr. Verschaeve, Pr. Geuzaine, Dr. Crasson, Dr. Maes, Dr. De Ridder, Dr. Du Four, Véronique Beauvois, Maryse Ledent, Lyse Mulpas et Jean Hoeffelman.

Résumé Ces dernières décennies, les populations, civiles en général et professionnelles en particulier, ont été soumises à une exposition croissante aux champs électriques (EF) et magnétiques (MF) d'extrêmement basses fréquences (ELF). Différentes réponses biologiques ont été observées sur différents types de cellules et de tissus exposés à des courants et des champs ELF. Ces études permettent une meilleure connaissance de notre environnement électromagnétique mais les mécanismes biologiques précis et les implications des fréquences ELF sur la santé restent peu connus. Il est nécessaire de développer des protocoles de recherche pour répondre à ces questions. La revue exhaustive de la littérature met clairement en avant : - le manque de connaissance des mécanismes cellulaires activés après stimulation ELF; - l'importance de leur étude pour toutes recherches liées à l'utilisation de la stimulation ELF; - l'efficacité des techniques omiques qui permettent l'identification de ces mécanismes cellulaires; - l'importance du choix des modèles expérimentaux utilisés afin de faciliter l'extrapolation des résultats chez l'homme. Pour répondre à ces observations, nous avons recherché les gènes et les mécanismes cellulaires impliqués lors de la stimulation ELF sur un modèle de culture d'explants de kératinocytes humains mis en culture sur support dermique dévitalisé et stimulé par un courant électrique pulsé. Nous pensons que la recherche sur un modèle humain in vitro permet d'obtenir des résultats plus intéressants pouvant être extrapolés plus facilement aux études épidémiologiques ou cliniques. Les résultats préliminaires obtenus sur ce modèle de culture par Hinsenkamp et al. aboutissent à la même conclusion que leurs études des effets des champs sur le tissu osseux. Ils ont observés à partir de différents modèles, une maturation plus rapide de la matrice cartilagineuse associée à une accélération de l'ossification des tissus embryonnaires. Les analyses microarrays ont été réalisées sur 288 explants d'épiderme provenant de 3 cultures cellulaires indépendantes utilisant l'épiderme de 3 sujets différents. La première analyse des résultats montre que, pour un certain nombre de sondes, la valeur du taux d'expression est différente lorsque l'on compare deux à deux les conditions d'échantillonnage. Cette observation est valable pour l'évolution naturelle au cours du temps des cultures témoins (J4T/J1T : 296 sondes; J7T/J1T : 702 sondes; J12T/J1T : 1006 sondes) ou des cultures stimulées (J4S/J1T : 941 sondes; J7S/J1T : 625 sondes; J12S/J1T : 946 sondes) ainsi que pour la comparaison d'un temps stimulé à son temps témoin (J4S/J4T : 304 sondes; J7S/J7T : 220 sondes; J12S/J12T : 496 sondes).

L'analyse de l'évolution des résultats au cours du temps (comparaison de Jx à J1) pour le groupe témoin et stimulé montre que, si la stimulation augmente ou diminue la régulation de certains gènes par rapport à J1 (témoin), la variation n'est généralement pas suffisante pour statistiquement inverser le sens de la régulation naturellement observée dans le temps. Seuls 3 gènes (EPS8, ADAMTS1, NOS1) ne suivent pas cette règle.

De plus, la comparaison des listes de gènes aux 3 temps d'échantillonnage J4, J7 et J12, montre que 3 gènes sont systématiquement exprimés dans les trois groupes stimulés comparés à leur

II Résumé témoin respectif : TXNRD1, ATF3 et MME. Ils sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération, la différenciation et la mitose.

L'analyse du rôle joué par DKK1 et MACF1 au temps J4 montre que la sur-expression de DKK1 et la sous-expression de MACF1 ont pour effet l'inhibition du "pathway Wnt" ce qui provoque une diminution de la prolifération et une augmentation de la différenciation terminale.

Parmi les variations intéressantes, BMP-2 est sur-exprimée au temps J12. Cette protéine est connue pour jouer un rôle important dans l'ostéogenèse, l'angiogenèse et la maturation cellulaire. Une analyse par triangulation montre que la stimulation par un courant ELF pulsé accélère la sur- ou la sous-expression de certains gènes qui, dans des circonstances normales (groupe témoin non stimulé), auraient suivi la même tendance (sur- ou sous-régulation) mais de manière plus lente. Parmi ces gènes, CHEK1, DKK1, NDRG4, SPRR3 sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération et la différenciation; UBE2D3 est actif dans la voie de signalisation de la BMP-2; les autres gènes sont actifs dans la mitose, le développement cellulaire et la réplication de l'ADN. Nous avons ensuite utilisé des outils informatiques qui permettent une analyse sans apriori des résultats : L'analyse du graphe orienté acyclique généré par WebGestalt sur base des données de GO a mis en évidence les processus biologiques impliquant les gènes présents dans nos résultats et dont la régulation a été modifiée. Ces gènes ont des fonctions dans les mécanismes du cycle cellulaire, de la mitose, de la prolifération ou de la différenciation. Ces résultats sont cohérents avec les résultats macroscopiques précédents et les premières observations présentées ci-dessus. Pour mettre en évidence les voies de signalisation actives dans les processus biologiques, nous avons utilisé KEGG qui indique que les voies "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" utilisent un nombre statistiquement significatif de gènes présents dans nos résultats. Le cycle cellulaire et la mitose sont impliqués dans la prolifération cellulaire. La différenciation a également besoin de cette étape proliférative puisque ce sont les cellules filles qui deviendront des cellules matures. La "voie de signalisation p53" est également active dans le cycle cellulaire, la différenciation, l'apoptose et le maintien de l'intégrité cellulaire. L'analyse des voies connexes à "p53" et à "cycle cellulaire", utilisant des gènes présents dans nos résultats, a mis en avant plusieurs cascades dont certaines utilisent des gènes actuellement connus pour n'avoir de rôle que dans une seule cascade. Ces gènes sont des candidats potentiels à la fonction de marqueur de la stimulation ELF. On y retrouve entre autre FoxO : régulé par JNK (membre des MAPK), actif avec TGF-β1 dans la migration cellulaire et la diminution de l'apoptose; Jak/STAT qui active la voie "cytokine-cytokine receptor interaction" utile lors de la prolifération, différenciation, migration, apoptose et survie cellulaire; Wnt qui régule la prolifération, la différenciation ainsi que la mobilité cellulaire. D'autres voies d'intérêt mais n'utilisant pas de gène ayant une fonction unique ont été listées : PI3K/Akt, en partie régulée par la phosphorylation de FoxO, a une fonction dans la prolifération cellulaire. Les différentes analyses réalisées avec Pathway studio confirment qu'une grande majorité des gènes présents dans nos résultats sont actifs dans les processus de prolifération, différenciation, croissance cellulaire, cycle cellulaire, mitose, apoptose, migration et survie cellulaire. Plusieurs gènes et mécanismes discutés précédemment (ADAMTS1, ATF3, BMP-2, DKK1, DUSP4, MACF1, MME, PDGFRA, SFRP1, TXNRD1, WNT) ont été isolés par le programme.

III Résumé

La recherche des mécanismes utilisant les gènes isolés lors de l'analyse par triangulation les relie à la prolifération, la différenciation, l'adhésion cellulaire, la réplication de l'ADN et la mort cellulaire. Pathway Studio nous a permis de localiser dans la cellule les protéines qui devraient finalement être traduites suite à la modification de l'expression de leurs gènes. Cette analyse permet d'étudier les interactions entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule ainsi que rechercher les protéines stimulant un grand nombre d'autres protéines ou recevant un grand nombre de stimuli. La protéine extracellulaire Endothelin 1 (ET-1), codée par le gène EDN1, agit sur 9 protéines membranaires différentes : EGFR par l'intermédiaire de la signalisation des MAPK; PDGFRA; GLUT-3 (exprimé à partir du gène SLC2A3); COX-2 (exprimée à partir du gène PTGS2); EP4 (exprimée à partir du gène PTGER4); PLAUR et les gènes IER3, CD44 et IL6ST qui seront traduits en protéines membranaires. Neuregulin 1, codée par le gène NRG1, est la seconde protéine extracellulaire la plus active vers les protéines membranaires différentes. L'analyse des résultats met en évidence 840 interactions entre une protéine extracellulaire et une protéine nucléaire en incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique. Les protéines membranaires recevant des informations du plus grand nombre de protéines extracellulaires sont EGFR et FAS. C'est également EGFR, une des voies de signalisation les plus importantes de la régulation de la croissance, la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire, qui transmet le plus d'informations aux protéines cytoplasmiques. FAS est capable de réguler l'apoptose et la prolifération en fonction du taux de fixation de son ligand. A l'aide d'un screening par la technique des microarrays de l'expression des gènes réalisé sur des échantillons témoins et stimulés, nous avons : - vérifié la cohérence des résultats avec les études historiques; - mis en évidence les processus biologiques responsables de la réponse cellulaire observée; - isolé une liste de gènes "marqueurs potentiels" impliqués spécifiquement dans ces mécanismes: - vérifié l'hypothèse que la stimulation ELF accélère dans le temps l'apparition de phénomènes qui seraient apparus naturellement mais avec une latence plus longue. Les observations faites dans le cadre de cette étude ont mis en évidence un nombre important d'informations. Plusieurs d'entre elles nécessitent des recherches complémentaires afin de préciser et de confirmer les résultats. Il serait intéressant : - de comparer et de grouper les résultats de la littérature montrant des effets similaires même si la stimulation ou le modèle de culture sont différents; - de développer les techniques de microdosimétrie afin de connaître avec précision la stimulation reçue par la cellule; - de développer l'étude des signaux afin de découvrir la composante active qui déclenche la réaction de la cellule; - de mettre en place un protocole étudiant la voie métabolique Wnt sur des cellules sanguines en incluant un dosage de la β-caténine pour étudier l'effet de la stimulation sur la leucémie infantile. Il faudra vérifier que les gènes exprimés dans nos résultats soient finalement traduits en protéines actives afin de confirmer leur rôle comme marqueurs de la stimulation ELF.

IV

Abstract In recent decades, populations, civil in general and professional in particular, are subjected to increasing exposure of extremely low frequency (ELF) electric (EF) and magnetic (MF) fields. Several biological responses have been observed in different cell types and tissues exposed to currents and ELF fields. These studies contribute to a better knowledge of our electromagnetic environment but the precise biological mechanisms and implications on health of ELF frequencies remain unclear. It is necessary to develop research protocols to answer these questions. The comprehensive review of the literature clearly puts forward: - lack of knowledge of cellular mechanisms activated after ELF stimulation; - importance of their study for all researches related to the use of ELF stimulation; - omic techniques efficiency for identification of cellular mechanisms; - importance in the choice of experimental models used to allow extrapolation in humans. In response to these observations, we looked for genes and cellular mechanisms involved after ELF stimulation on a model of human keratinocyte explants cultured on devitalized dermal support and stimulated by a pulsed electric current. We think that research on in vitro human model provides more interesting results and can be extrapolated easily to epidemiological or clinical studies. Preliminary results of this model of culture obtained by Hinsenkamp et al. arrive at the same conclusion that their studies of the effects of fields on bone tissues where a faster maturation of cartilage matrix associated with the acceleration of the ossification of embryonic tissue models were observed. The first analysis of microarrays results obtained on cell cultures carried out independently with 288 skin explants from three different subjects shows, for some probes, that the expression level value is different when comparing two by two sampling conditions. This is true for the natural evolution during time of the control cultures (D4T/D1T: 296 probes; D7T/D1T: 702 probes; D12T/D1T: 1006 probes) and stimulated cultures (D4S/D1T: 941 probes; D7S/D1T: 625 probes; D12S/D1T: 946 probes) and for comparison of a stimulated sampling time to its control (D4S/D4T: 304 probes; D7S/D7T: 220 probes; D12S/D12T: 496 probes).

Analysis of the results over time (comparison of Dx with D1) for control and stimulated group shows, if the stimulation increases or decreases the regulation of some genes compared to D1 (control), that the variation is usually not sufficient to statistically reverse the direction of the natural regulation observed over time. Only 3 genes (EPS8, ADAMTS1, NOS1) do not follow this rule.

Furthermore, comparison of gene lists at the three sampling time D4, D7 and D12, shows that three genes are consistently expressed in the three stimulated groups compared to their respective control: TXNRD1, ATF3 and MME. They are known to play a role in proliferation, differentiation and mitosis.

Analysis of role of DKK1 and MACF1 at D4 shows that DKK1 over-expression and MACF1 down-regulation result in the inhibition of "Wnt pathway" which causes a decrease in proliferation and increased of terminal differentiation.

V Abstract

Another interesting variation, BMP-2 is over-expressed at D12 sampling time. This protein is known to play an important role in osteogenesis, angiogenesis, and cell maturation. An analysis by triangulation method shows that stimulation by pulsed ELF current accelerates the up- or down-regulation of some genes that, under normal circumstances (unstimulated controls) have followed overtime the same trend (up-or down-regulation) but more slowly. Among these, CHEK1, DKK1, NDRG4, SPRR3 are known to play a role in proliferation and differentiation; UBE2D3 is active in the signaling pathway of BMP-2; the other genes are involved in mitosis, cell growth and DNA replication. Then, we used bio-informatics tools to analyze the results without a priori: Analysis of directed acyclic graph generated by WebGestalt based on GO data showed biological processes involving the genes of our results. These genes have functions in the mechanisms of cell cycle, mitosis, proliferation or differentiation. These results are consistent with previous macroscopic results and the first observations presented above. To highlight the signaling pathways active in biological processes, we used KEGG and the results indicate that "cell cycle" and "p53 signaling pathway" use a significant number of genes present in our results. Cell cycle and mitosis are involved in cell proliferation. Differentiation also needs this proliferative step since these are the sister cells who will become mature cells. "p53 signaling pathway" is also active in cell cycle, differentiation, apoptosis, and the maintenance of cellular integrity. Analysis of related pathways "p53" and "cell cycle", using genes from our results, highlighted several cascades using genes known to have a function only in one cascade. These genes are potential candidates as marker of ELF stimulation. We find FoxO, regulated by JNK (MAPK Member), active with TGF-β1 in cell migration and decreased of apoptosis; Jak/STAT pathway that activates the "cytokine-cytokine receptor interaction" useful in proliferation, differentiation, migration, apoptosis and cell survival; Wnt which regulates proliferation, differentiation and cell motility. Other pathways of interest but not using a gene having a single function were listed: PI3K/Akt pathway, in part regulated by FoxO phosphorylation, has a function in cell proliferation. The various analyzes conducted with Pathway Studio confirm that a great majority of genes of our results are active in the processes of proliferation, differentiation, cell growth, cell cycle, mitosis, apoptosis, migration and cell survival. Several genes and mechanisms discussed above (ADAMTS1, ATF3, BMP-2, DKK1, DUSP4, MACF1, MME, PDGFRA, SFRP1, TXNRD1, WNT) were isolated by the software. Search of mechanisms using genes isolated during triangulation analysis highlight proliferation, differentiation, cell adhesion, DNA replication and cell death. Pathway Studio allows proteins localization in cell that would normally be translated following the modification of the expression of their genes. This analysis is used to study interactions between exterior and interior of the cell and look for proteins stimulating a large number of other proteins or receiving a large number of stimuli. Extracellular protein Endothelin 1 (ET-1), encoded by the EDN1 gene acts on 9 different membrane proteins: EGFR via MAPK signaling, PDGFRA, GLUT-3 (expressed from SLC2A3 gene), COX-2 (expressed from PTGS2 gene), EP4 (expressed from PTGER4 gene), PLAUR and IER3, CD44 and IL6ST genes that are translated

VI Abstract into membrane proteins. Neuregulin 1, encoded by NRG1 gene is the second most active extracellular protein to various membrane proteins. Analysis of the results shows 840 interaction of extracellular proteins to a nuclear protein including a membrane protein and a cytoplasmic protein. Membrane proteins receiving the largest number of extracellular proteins stimulation are EGFR and FAS. It is also EGFR, one of the most important signaling pathways regulating growth, survival, proliferation and cell differentiation, which transmit most information's to cytoplasmic proteins. FAS is able to regulate apoptosis and proliferation depending of its ligand binding rates. Using microarray screening of the genes expression realized on different control and stimulated samples, we have: - verified the consistency of results with historical studies; - highlighted biological processes responsible of the observed cellular response; - isolated a "potential markers" gene list specifically involved in these mechanisms: - verified the hypothesis that the ELF stimulation accelerates in time the occurrence of phenomena naturally appearing but with a longer latency. The observations made in this study showed a significant number of information. Many of them require further research to clarify and confirm the results. It would be interesting: - to compare and group results from the literature showing similar effects even if stimulation or culture model are different; - to develop microdosimetry techniques to know with precision the stimulation received by the cell; - to promote the study of electric signals to discover the active component that triggers the reaction of the cell; - to establish a protocol studying Wnt pathway on blood cells including a dosage of β- catenin to study the effect of the stimulation on childhood leukemia. It will verify that the genes expressed in our results are translated into active proteins to confirm their role as markers of ELF stimulation.

VII

Table des matières

REMERCIEMENTS ...... I RÉSUMÉ ...... II ABSTRACT ...... V TABLE DES MATIÈRES ...... VIII TABLE DES ABRÉVIATIONS ...... XI GLOSSAIRE ...... XIII CHAPITRE 1 - INTRODUCTION ...... 1 1.1 HISTORIQUE ...... 1 1.2 RECOMMANDATIONS DE SANTÉ PUBLIQUE ...... 2 1.3 STIMULATION D'EXTRÊMEMENT BASSES FRÉQUENCCES : EXEMPLES D'APPLICATION ...... 3 1.3.1 En orthopédie ...... 3 1.3.2 Analyse des mécanismes cellulairrees : études antérieures ...... 3 1.3.3 Développements actuels ...... 5 CHAPITRE 2 - REVUE DE LA LITTÉRATURE ...... 6 2.1 INTRODUCTION...... 6 2.2 MÉCANISMES CELLULAIRES IMPLIQUÉS DANS LA PROOLIFÉRATION ET LA DIFFÉRENCIATION DES KÉRATIINOCYTES ...... 6 2.3 ETUDES EXPÉRIMENTALES ...... 10 2.3.1 Expression des gènes et des protéines ...... 10 2.3.2 Modification du développement cellulaire ...... 11 2.3.2.1 Prolifération ...... 11 2.3.2.2 Différenciation ...... 11 2.3.3 Accélération d'un processus physiologique ...... 12 2.3.4 Génotoxicité ...... 12 2.3.5 Effet fenêtre ...... 13 2.3.6 Conclusions ...... 14 2.4 ETUDES ÉPIDÉMIOLOGIQUES ...... 27 2.4.1 Cancer ...... 27 2.4.1.1 Chez les enfants ...... 27 a. Leucémie infantile ...... 27 b. Cancer du cerveau ...... 29 2.4.1.2 Cancer chez les adultes ...... 29 a. Risque carcinogène ...... 29 b. Leucémie chez l'adulte ...... 29 c. Cancer du sein ...... 30 2.4.2 Maladie neurodégénérative ...... 30 2.4.3 Incidence sur la gestation ...... 33 2.4.4 Intolérance environnementale idiioopathique attribuée aux EMFM ...... 33 2.4.5 Conclusions ...... 34 2.5 ETUDES CLINIQUES ...... 35 2.5.1 Effets biologiques positifs ...... 35 2.5.1.1 Réparation tissulaire ...... 35 2.5.1.2 Consolidation osseuse ...... 36 2.5.2 Conclusions ...... 36 2.6 CONCLUSIONS DE LA REVUE DE LA LITTÉRATURE ...... 37 CHAPITRE 3 - OBJECTIFS DE L'ÉTUDE ...... 38

VIII Table des matières

CHAPITRE 4 - MATÉRIEL ET MÉTHODES ...... 39 4.1 MODÈLE DE CULTURE CELLULAIRE ...... 39 4.1.1 Préparation des supports dermiques ...... 39 4.1.2 Préparation des explants épidermiques ...... 39 4.1.3 Fabrication des supports en mousse ...... 40 4.1.4 Préparation des électrodes ...... 41 4.1.5 Préparation du milieu de culture ...... 41 4.1.6 Assemblage du modèle expérimental ...... 41 4.1.7 Mise au point du modèle de culture cellulaire ...... 43 4.1.7.1 Recherche de l'irradiation optimale des supports dermiques ...... 43

4.1.7.2 Vérification du taux de CO2 et de la température de l'incubateur ...... 44 4.1.7.3 Vérification de la composition du milieu de culture ...... 44 4.2 CARACTÉRISTIQUES ÉLECTRIQUES DE LA STIMULATION ...... 45 4.2.1 Caractérisation du signal électrique ...... 45 4.2.1.1 Générateur et modèle expérimmental ...... 45 4.2.1.2 Champs électromagnétiques ...... 46 4.3 PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL ...... 49 4.3.1 Chronologie ...... 49 4.3.2 Prélèvement des explants et extraction de l'ARN ...... 49 4.3.2.1 Procédure ...... 49 4.3.2.2 Mise au point de l'extraction de l'ARN : quantité et qualité des échantillons ...... 50 4.3.3 Analyse de l'expression des gènes ...... 51 4.3.3.1 Microarray ...... 51 a. Intérêt de la technique ...... 51 b. Choix de la puce microarray ...... 51 c. Protocole ...... 51 4.3.3.2 Validation : qRT-PCR ...... 51 a. Technique ...... 51 b. Sélection des amorces ...... 52 c. Choix des gènes de normaliisation ...... 52 4.4 STATISTIQUE DES MICROARRAYS ...... 52 4.4.1 Fold Change et logarithme du Folld Change ...... 52 4.4.1.1 Relative Fold Change ...... 53 4.4.1.2 Fold Change et réplicas biologiques ...... 53 4.4.2 Variation significative de l'expression des gènes ...... 53 4.4.3 Normalisation et analyse statistique des données microarrays ...... 53 4.4.4 Utilisation de LIMMA et analyse par triangulation ...... 54 4.5 ANALYSE DES RÉSULTATS ...... 55 4.5.1 Par la littérature ...... 55 4.5.2 Par la bio-informatique ...... 55 CHAPITRE 5 - RÉSULTATS ET DISCUSSION ...... 57 5.1 ANALYSE MICROARRAY ET VALIDATION PAR QRT-PCR ...... 57 5.1.1 Résultats ...... 57 5.1.2 Validation ...... 57 5.2 ANALYSE MANUELLE DES RÉSULTATS MICROARRAYS ...... 57 5.2.1 Premières observations ...... 57 5.2.1.1 Résultats ...... 57 5.2.1.2 Discussion ...... 59 a. Expression du groupe témoin et stimulé au cours du temps ...... 59 b. Gènes systématiquement régulés ...... 60 c. Gènes codant DKK1 et MACF1 ...... 61 d. Gène codant BMP-2 ...... 62

IX Table des matières

5.2.2 Clustering en k-means...... 63 5.2.2.1 Résultats ...... 63 5.2.2.2 Discussion ...... 63 5.3 ANALYSE PAR TRIANGULATION ...... 66 5.3.1 Résultats ...... 66 5.3.2 Discussion ...... 67 5.4 LES MÉCANISMES CELLULAIRES ...... 70 5.4.1 GeneOntology module du site internet WebGestalt ...... 70 5.4.1.1 Résultats ...... 70 5.4.1.2 Discussion ...... 70 5.4.2 KEGG module du site internet WebGestalt ...... 73 5.4.2.1 Résultats ...... 73 5.4.2.2 Discussion ...... 74 5.4.3 Site internet KEGG : analyse manuelle ...... 74 5.4.3.1 Résultats ...... 74 5.4.3.2 Discussion ...... 77 5.4.3.3 En résumé ...... 80 5.5 PATHWAY STUDIO...... 81 5.5.1 Résultats ...... 81 5.5.2 Discussion ...... 88 5.6 DISCUSSION DU PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL ...... 92 CHAPITRE 6 - CONCLUSIONS ...... 93 6.1 PERSPECTIVES ...... 96 ANNEXES 1 - RÉSULTATS ...... 98 TABLEAU A-1 : "LISTE A" ...... 98 TABLEAUX A-2 A, B, C : LISTES DES SONDES OBTENUES PAR TRIANGULATION ...... 120 TABLEAU A-3 : PROCESSUS CELLULAIRES AYANT PLUS DE 100 CONNEXIONS AVEC LES GÈNNES DE LA "LISTE A" ...... 124 TABLEAUX A-4 A, B, C, D, E : PROCESSUS CELLULAIRES QUI UTILISENT AU MOINS 7 GÈNES DE LA "LISTE A" ...... 129 TABLEAU A-5 : INTERACTIONS ENTRE LES PROTÉINES (EXTRACELLULAIRE VERS NUCLÉAIRE) ...... 136 ANNEXE 2 - LA TECHNIQUE MICROARRAY ...... 146 ANNEXE 3 - LA TECHNIQUE QRT-PCR ...... 150 ANNEXE 4 - LA PEAU ...... 152 ANNEXE 5 - NOTIONS DE PHYSIQUE ÉLECTRIQUE ...... 160 ANNEXE 6 - NORMES D'EXPOSITION AUX ELF ...... 166 ANNEXE 7 - PUBLICATIONS ...... 168 7.1 IN VITRO STUDY OF THE EFFECTS OF ELF ELECTRIC FIELDS ON GENE EXPRESSION IN HUMAN EPIDERMMAL CELLS BIOELECTROMAGNETICS 32:28-36 (2011) ...... 168 7.2 BONE MORPHOGENIC PROTEIN–MRNA UPREGULATION AFTER EXPOSURE TO LOW FREQUENCY ELEECTRIC FIELD INTERNATIONAL ORTHOPAEDICS 35:1577–81 (2011) ...... 177 7.3 STATISTICAL VALIDATION OF THE ACCELERATION OF THE DIFFERENTIATION AT THE EXPENSE OF THE PROLIFERATION IN HUMAN EPIDERMAL CELLS EXPOSED TO EXTREMELY LOW FREEQUENCY ELECTRIC FIELDS PROGRESS IN BIOPHYSICS AND MOLECULAR BIOLOOGY 111:37-45 (2013) ...... 182 7.4 CELLULAR PROCESSES INVOLVED IN HUMAN EPIDERMAL CELLS EXPOSED TO EXTREMELY LOW FREQUEENCY ELECTRIC FIELDS CELLULAR SIGNALLING 27:889–98 (2015) ...... 191 BIBLIOGRAPHIE ...... 201 THÈSE ANNEXE ...... 229 COMMENT VALIDER L’EFFET OSTÉO-INDUCTEUR DE LA POUDRE D’OS DÉMINÉRALISÉE ? ...... 229 CURRICULUM VITAE ...... 230

X

Table des abréviations

A549 Lignée cellulaire dérivée d'un adénocarcinome de cellules épithéliales pulmonaires humaines ADN Acide DésoxyriboNucléique ADNc ADN complémentaire ALL Acute Lymphoblastic Leukemia ou Leucémie Aiguë Lympholastique AML Acute Myeloid Leukemia ou Leucémie Myéloïde Aiguë ARN Acide RiboNucléique ARNm ARN messager Beams Laboratoire Bio, Electro And Mechanical Systems BEMER BioElectroMagnetric Energy Resonance BGC-823 Lignée cellulaire dérivée d'un cancer gastrique humain BMP Bone Morphogenetic Protein BMSCs Bone marrow stem cells ou cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse COST European Cooperation in Science and Technology DAG Directed Acyclic Graph ou graphe orienté acyclique DKK1 Gène Dickkopf Homolog 1 DMEM Dulbecco Modified Eagle's Medium EF Electric Field ou champs électriques EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EHS Electromagnetic hypersensitivity ou hypersensibilité électromagnétique ELF Extremely Low Frequency ou fréquences extrêmement basses ELF-EF Extremely Low Frequency Electric Field ou champs électriques d'extrêmement basses fréquences ELF-MF Extremely Low Frequency Magnetic Field ou champs magnétiques d'extrêmement basses fréquences EMF ElectroMagnetic Field ou champs électromagnétiques F12 Ham's F12 Nutrient Mixture FBS Fetal Bovine Serum ou sérum de veau foetal FC Fold Change FRC Fibroblastic Reticular Cells ou cellules fibroblastiques réticulaires

FCR Relative Fold Change GAG GlycosAminoGlycanes GO GeneOntology HaCaT Lignée cellulaire dérivée de kératinocytes humains hBMSCs Human Bone Marrow Stem Cells ou cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse humaine HepG2 Lignée cellulaire dérivée d'hépatocarcinome humain hFSFs Fibroblastes de la couche sclérale de foetus humains hMSC cellules souches mésenchymateuses humaines HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells ou cellules endothéliales de veine ombilicale humaine HV-HVOL High Voltage - High Voltage Overhead power Lines ou ligne électrique aérienne de haut voltage IARC International Agency for Research on Cancer ICNIRP International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection IEI-EMF Intolérance idiopathique environnementale attribuée aux champs électromagnétiques J Jour de prélèvement JNK c-Jun N-terminal kinase K562 Lignée cellulaire dérivée d'une leucémie myéloïde chronique KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LIMMA Linear Models for MicroArray LISA Laboratories of Image, Signal processing and Acoustics LOVO Lignée cellulaire dérivée d'un adénocarcinome de colon

XI Table des abréviations

Table des abréviations (suite) MACF1 Gène microtubule-actine facteur 1 MAPK Mitogen Activated Protein Kinase Mc3T3-E1 Lignée cellulaire ostéoblastique murine MF Magnetic Field ou champs magnétiques MG63 Lignée cellulaire ostéoblastique dérivée d'un ostéosarcome humain MKN-28 Lignée cellulaire dérivée d'un adénocarcinome gastrique humain MKN-45 Lignée cellulaire dérivée d'un carcinome gastrique humain MSCs Cellules souches mésenchymateuses NB69 Lignée cellulaire neuroblastome humain dérivée d'une tumeur de la glande surrénale NDD NeuroDegenerative Disease ou maladies neurodégénératives NHEK Lignée cellulaire dérivée de kératinocytes épidermiques humains normaux NRPB National Radiological Protection Board NS Non Significatif OMS Organisation Mondiale de la Santé OR Odds Ratio ou risque relatif rapproché PBS Phosphate Buffered Saline ou tampon phosphate salin PC12 Lignée cellulaire dérivée de cellules de phéochromocytome (affection tumorale des cellules chromaffines de la médullo-surrénale) de rat PEMF Pulsed ElectroMagnetic Field ou champs électromagnétiques pulsés qRT-PCR quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RAW264.7 Lignée cellulaire dérivée de macrophages de souris rBMSCs rabbit bone marrow-derived MSCs ou lignée cellulaire dérivée de MSCs de lapin RCA Connecteur Radio Corporation of Amercia, appelé aussi CINCH S Groupe stimulé SaOS-2 Lignée cellulaire dérivée d'ostéosarcome humain SCENIHR Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks SH-SY5Y Lignée cellulaire dérivée de neuroblastome humain SPC-A1 Lignée cellulaire dérivée d'un adénocarcinome pulmonaire humain T Groupe témoin TAMMEF Application thérapeutique des champs électromagnétiques modulés par un signal musical THP-1 Lignée cellulaire monocytaire humaine VHV-HVOL Very High Voltage - High Voltage Overhead power Lines ou ligne électrique aérienne de très haut voltage VSMCs Culture primaire de cellules de muscles lisses vasculaires aortiques WebGestalt WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit

XII

Glossaire Abdominoplastie : Intervention chirurgicale qui consiste à retirer les excédents de graisse abdominale sous-cutanée associée à une ablation de l'excédent de peau. ADN complémentaire (ADNc) : Simple brin d'ADN artificiellement synthétisé à partir d'un ARNm, représentant la partie codante de la région du génome ayant été transcrit en cet ARNm. Amorces ou primers (annexe 3, p. 150) : Petits brins d'ADN d'environ 20 bases (oligonucléotides) capables de s'hybrider de façon spécifique grâce à la complémentarité des bases sur son brin d'ADN complémentaire. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier dans la technique PCR. Buffer RLT (Qiagen®) : Le tampon RLT est un tampon de lyse pour cellules et tissus avant isolation de leurs ARN. Cal osseux : Réaction cicatricielle souvent hypertrophique localisée au foyer de fracture et à proximité aboutissant à la consolidation osseuse. Cellules souches mésenchymateuses : Cellules capables de produire plusieurs types de cellules appartenant aux tissus squelettiques, tels que le cartilage, les os et la graisse. Chitosane : Polyoside composé de D-glucosamine liée et N-acétyl-D-glucosamine. Il est produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine composant l'exosquelette des arthropodes ou de l'endosquelette des céphalopodes. Conductivité électrique (σ) (annexe 5.3, p. 163) : Aptitude d'un matériau ou d'une solution à laisser les charges électriques se déplacer librement, permettant le passage d'un courant électrique. Dermatome de Wagner : Instrument chirurgical utilisé pour couper de très fines tranches de peau. Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) : Milieu de culture utilisé pour l'apport d'éléments nutritifs nécessaires au maintien et à la prolifération de presque tous les types de cellules in vitro. Il est dérivé du Eagle's minimal essential medium (EMEM). ELISA (technique ELISA) : Enzyme-Linked ImmunoAorbent Assay ou dosage d'immunoadsorption par enzyme liée ou dosage immuno-enzymatique sur support solide. Technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes antigène-anticorps et est couplé à une enzyme qui peut émettre un signal grâce à un substrat chromogène ou fluorogène.

XIII Glossaire

FASTA : Format de fichier texte utilisé pour stocker des séquences biologiques de nature nucléique ou protéique. Ces séquences sont représentées par une suite de lettres codant pour des acides nucléiques ou des acides aminés. Ce format, de par son utilisation très répandue, est devenu un standard de facto en bio-informatique. Fetal Bovine Serum (FBS) : Sérum de veau fœtal, issu des fœtus de vache, est le sérum le plus largement utilisé en culture cellulaire. Les protéines globulaires (albumine de sérum bovin) sont le composant majeur de ce sérum. L'importante variété de protéines maintient les cellules en culture dans un milieu favorable à leur survie, croissance et multiplication. Glycosaminoglycanes (GAG) : Macromolécules glucidiques composant la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs. Ham's F12 nutrient mixture (F12) : Milieu de culture développé par Ham. Conçu pour la croissance sans sérum de cellules d'ovaire et de poumon de hamster chinois; il est largement utilisé avec du sérum pour la culture de cellules de mammifères. Omiques (techniques omiques) : Techniques permettant une étude au niveau moléculaire de la réponse des gènes (génomique) des protéines (protéomique) et du métabolisme (métabolomique). Phosphate Buffered Saline (PBS, tampon phosphate salin) : Solution tampon isotonique contenant du chlorure de sodium, du phosphate disodique, du phosphate monopotassique et un peu de chlorure de potassium. Couramment utilisée en biochimie. Ce tampon sert surtout à rincer les cellules lorsqu'il faut enlever toute trace de milieu avant de les traiter. Protéomique : Etude de l'ensemble des protéines d'une cellule, d'un organite, d'un tissu, d'un organe ou d'un organisme à un moment donné et sous des conditions données. Pseudarthrose : Absence de consolidation des fragments osseux après une fracture. QIAshredder (Qiagen®) : Homogénéisateur composé d'un système de "broyage-biopolymère" inclus dans une colonne de microcentrifugation. qRT-PCR (annexe 3, p. 150) : PCR : réaction en chaîne par polymérase; RT : reverse transcriptase; q (ou real-time) : quantitative (ou en temps réel). La qRT-PCR est une réaction de polymérisation en chaine (PCR) c'est-à-dire une méthode de biologie moléculaire d'amplification d'ADN in vitro à partir d'un échantillon d'ARN (RT) capable de mesurer la quantité initiale d'ADN ou ARN (q).

XIV Glossaire

Rétinoïdes : Classe de composés chimiques dérivés de la vitamine A. Ils sont utilisés en médecine pour leur activité de régulation de la croissance et de la différenciation des cellules épithéliales. RNAlater (Qiagen®) : RNA Stabilization Reagent stabilise immédiatement l'ARN des échantillons tissulaires afin de conserver le profil d'expression génique. RNeasy Mini Kit (Qiagen®) : Le kit RNeasy Mini fournit une méthode de purification rapide de l'ARN à partir de cellules, tissus ou levure en utilisant des colonnes à membrane de silice avec une capacité de liaison de 100μg d'ARN. Sonde (ou probe) : En biologie moléculaire, une sonde d'hybridation est un fragment d'ADN ou d'ARN de longueur variable qui est complémentaire à une séquence spécifique d'un gène donné. L'annexe 2 (p. 146) décrit l'utilisation des sondes pour la technique microarray Affymetrix. Sterrad® : Marque déposée d'un appareil de stérilisation (Advanced Sterilization Products). Le procédé repose sur le pouvoir bactéricide du peroxyde d'hydrogène activé sous forme de plasma froid. Un plasma est une phase de la matière constituée de particules chargées; un gaz plasma est un gaz ionisé. Temps de diffusion d'une charge électrique : Dans un milieu donné, temps caractéristique de répartition des charges électriques pour atteindre une position d'équilibre. Temps de propagation de l'onde électromagnétique : Dans un milieu donné, temps mis par une onde électromagnétique pour parcourir une distance donnée (ordre de grandeur de la dimension du problème). Transcriptomique : Etude de l'ensemble des ARN messagers produits lors du processus de transcription d'un génome. Transduction : Mécanisme par lequel une cellule répond à l'information qu'elle reçoit en activant une série de signaux secondaires (internes ou externes à la cellule) ou des processus cellulaires internes (métabolisme, cycle cellulaire, motilité etc...). Translocation : Type de transport correspondant à un passage direct des protéines au travers d'une membrane via des pores. Western blot : Méthode de biologie moléculaire permettant la détection et l'identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique.

XV

Chapitre 1 - Introduction 1.1 Historique Depuis l'origine de la vie, le monde biologique est exposé aux champs électromagnétiques terrestres. En 1952, Schumann découvre les Ondes Transversales Magnétiques Terrestres connues sous le nom d'Ondes de Schumann ou Résonance de Schumann [Schlegel et al., 2002]. Nous référant au travail de Hinsenkamp [1994], les premières études sur ll'électricité et les tissus biologiques datent de la première moitié du 18ème siècle. Gray mesure la conductivité* des tissus biologiques et Franklin réalise des cures d'électrothérapie. A la fin du 18ème siècle, Galvani étudie la relation entre l'électricité et l'innervation motrice des muscles. En 1819, Oerstedt écrit une théorie de l'électromagnétisme qui rassemble les forces électriiques et magnétiques aboutissant à la découverte de l'induction électromagnétique par les frères Faraday. Dès 1812, la stimulation électrique est utilisée en Orthopédie par Birch sur une pseudaarrthrose* de tibia. Il est suivi par Lente, Holl, Garett, Béranger-Féraud qui observent d''autres cas guéris selon eux par le traitement. En 1847, Matteucci publie ses résultats sur l'électricité animale. A Saint-Pétersbourg, Grigor'jev (1881) publie "Metalloscopy and Metallotherapy" où il compile les données de l'action thérapeutique des champs magnétiques. En 1900-1901, Danilevsky publie une monographie intitulée "Research in Physiological Action of Electricity over a Distance" [Zhadin, 2001]. Depuis le début du vingtième siècle, les nouvelles technologies ont multiplié les sources de champs électromagnétiques (ElectroMagnetic Field : EMF) (annexe 5, p.. 160). Ils suscitent un intérêt croissant justifié par les risques potentiels sur la santé des lignes à haute tension et des courants domestiques (basse fréquence) et de la téléphonie mobile (haute fréquence) (tab. A-6, p. 165). Depuis quelques années, la recherche des applications cliniqquues de la stimulation électrique ou électromagnétique se dévelooppe étudiant les bénéfices qu'elle pourrait apporter à la santé. Les "champs à haute fréquence" ne sont pas traités dans cette étude. Les propriétés physiques de ces champs ainsi que leurs actions surr le vivant sont totalement différentes des champs de fréquennces extrêmement basses (Extremeely Low Frequency : ELF) (tab. A-6, p. 165). Ce sont des ondes très énergétiques capables de provoquer un effet thermique et une ionisation pour les plus hautes fréquences [OMS, 1998]. Au cours des dernières décennies, l'étude des effets biologiques des champs électriques (Electric Field : EF) et magnétiques (Magnetic Field : MF) ELF est devenue un sujet de recherche important. De nombreuses études expérimentales et épidémiologiques ontt été réalisées dans des domaines comme le cancer, les maladies neurodégénératives, la réponse immunitaire, l'intolérance environnementale idiopathiique, la grossesse, la réponse cellulaire et tissulaire comme la régulation de la mélatonine, la prolifération, la différenciatiion ou la cicatrisation osseuse. La compréhension de ces effets est d'actualité vu l'augmentation ces dernières années de l'exposition aux EMF tant dans la population générale que professionnelle. La recherche sur les effets de "faible intensité", en particulier à long terme, a été déclarée nécessaire par un document

* Voir Glossaire

1 Chapitre 1 - Introduction de l'Union Européenne [Parlement Européen, 2013]. Ces études contribuent à une meilleure connaissance de notre environnement électromagnétique mais les mécanismes biologiques précis et les implications sur la santé de l'exposition aux ELF restent mal connus. 1.2 Recommandations de santé publique L'International Agency for Research on Cancer (IARC), groupe d'experts scientifiques de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), publie une monographie sur l'évaluation des risques carcinogènes pour l'homme des champs électriques d'extrêmement basses fréquences (ELF-EF) et des champs magnétiques d'extrêmement basses fréquences (ELF-MF) [IARC, 2002]. Les ELF-MF ont la particularité de pénétrer à l’intérieur du corps sans être modifiés et d'y induire la circulation de courant [OMS, 1998]. Les ELF-MF ont été classés dans la catégorie "peut être carcinogène pour l'homme" (Groupe 2B) au même titre que le café. Elle correspond à un facteur de risque carcinogène considéré comme limite ou réfutable et dont la preuve n'a pas été établie de manière certaine sur l'animal. Cette conclusion est basée sur des résultats épidémiologiques indiquant que l'exposition aux champs ELF pourrait être une cause de leucémie infantile sans être expliquée par des mécanismes connus ou confirmée expérimentalement. Les ELF-EF ont quant à eux été classés dans le Groupe 3 c'est-à-dire "non classés quant à leurs effets carcinogènes pour l'homme", les preuves étant jugées insuffisantes chez l'homme et insuffisantes ou limitées en expérimentation animale [IARC, 2002]. Le rapport le plus récent émanant d'une commission officielle d'experts a été publié par le Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks (SCENIHR) et concerne les effets potentiels sur la santé de l'exposition aux EMF [SCENIHR, 2015] : - Le Comité confirme que les nouvelles études épidémiologiques : ▪ sont conformes aux conclusions antérieures indiquant un risque accru de leucémie infantile pour des expositions quotidiennes moyennes supérieures à 0,3-0,4μT; ▪ ne fournissent pas de preuve convaincante d'un risque accru de maladies neurodégénératives, y compris la démence; ▪ concernant la grossesse, ne montrent pas de signes défavorables liés à l'exposition ELF-MF. Les conclusions des études sur la santé de l'enfant suite à l'exposition maternelle durant la grossesse comportent des biais méthodologiques et ne peuvent servir pour l'évaluation du risque; ▪ aucun effet n'a pu être observé concernant la reproduction humaine. - En ce qui concerne les études in vitro les experts constatent que : ▪ la pertinence d'un lien entre l'exposition ELF-MF et la leucémie infantile n'est pas claire et les mécanismes sont toujours inconnus; ▪ les ELF-MF peuvent induire des effets génotoxiques ainsi que d'autres effets biologiques pour des densités de flux magnétique supérieur à 100μT. - Concernant l'hypersensibilité électromagnétique (EHS) (chap. 2.4.4, p. 33), les études existantes ne fournissent aucune preuve convaincante d'un lien causal entre l'exposition ELF-MF et les symptômes dont se plaignent les patients. Néanmoins, deux études expérimentales ont identifié des participants capables de réagir de façon fiable à des

2 Chapitre 1 - Introduction

champs magnétiques. Avant de donner du poids à ces résultats, il faudra renouveler ces études de manière indépendante. Bien que les effets biologiques de l'exposition ELF-EMF, -MF ou -EF soient étudiés depuis de très nombreuses années, les conclusions des Commissions Scientifiques montrent une divergence entre études épidémiologiques et études expérimentales ou présentent des conclusions non définitives. Découvrir les mécanismes cellulaires impliqués et activés par la stimulation ELF est une étape indispensable pour comprendre les réactions du corps face à la stimulation ELF. Ces connaissances permettront de mieux définir les effets bénéfiques des ELF ainsi que leur seuil de de risque pour la santé. Les normes légales d'exposition actuellement en vigueur sont présentées à l'annexe 6 (p. 166). 1.3 Stimulation d'extrêmement basses fréquences : exemples d'application 1.3.1 En orthopédie En plus des caractéristiques électrophysiologiques classiques des tissus vivants (potentiel de membrane, courant de dépolarisation etc…) des variations de potentiels endogènes ont pu être mesurées, notamment au niveau osseux [Yasuda, 1953; Cochran, 1966; Cowin et al., 1995]. Dès 1953, en observant des variations de potentiels électriques apparaissant à la surface de l'os lors des phases dynamiques de mise en charge, Yasuda a ouvert la voie à l'étude de leurs effets sur l'ostéogenèse [Yasuda, 1953]. Pour cet auteur, les variations de potentiels électriques sont responsables de la formation du cal* lors de la consolidation des fractures. Comme Yasuda et al. [1953], Nogushi [1957] montre que dans certaines conditions, des variations de potentiels électriques appliquées à l'os favorisent la formation de tissu osseux. Bassett et al. [1964] implantent une anode et une cathode reliées à un générateur de courant continu au travers d'une corticale de fémur de chien in vivo et observent l'apparition d'os autour de la cathode. Pour Bassett [1971], l'os convertit l'énergie mécanique en un signal électrique qui modifie l'environnement des cellules mésenchymateuses* contrôlant leurs activités fonctionnelles et mitotiques. Ces variations font intervenir des amplitudes d'EMF bien inférieures aux potentiels de membrane. L'application de champs exogènes modifie le métabolisme osseux en accélérant certains processus physiologiques sans entraîner de manifestations pathologiques [Hinsenkamp, 1994; Chang et al., 2003]. La cohérence des résultats de nombreuses études in vivo et in vitro portant sur l'effet des courants électriques sur l'os montrent que l'ostéogenèse peut être stimulée par des variations de potentiel électrique [Hinsenkamp, 1994]. Néanmoins, les mécanismes cellulaires impliqués lors d'une stimulation par un champ électromagnétique ou un courant électrique restent mal connus. 1.3.2 Analyse des mécanismes cellulaires : études antérieures Différentes réponses biologiques ont été observées suite à l'exposition ELF-EMF de faible amplitude sur différents modèles de tissus en croissance ou en réparation :

3 Chapitre 1 - Introduction

- une augmentation de la concentration des glycosaminoglycanes* acides dans la matrice cartilagineuse des rudiments osseux d'embryons de souris in vitro [Hinsenkamp et al., 1982; Rooze et al., 1982; Hinsenkamp, 1994]; - une augmentation significative de la longueur totale des rudiments osseux accompagnée d'une accélération du processus d'ossification primaire sur des tibias et des métatarses d'embryons de poulet in vivo [Rooze et al., 1985; Hinsenkamp, 1994]; - une relation entre l'amplitude du champ électrique local et le taux d'ossification sur des embryons de caille [Hinsenkamp et al., 1985a; Hinsenkamp, 1994]. Les résultats des études in vitro [Hinsenkamp et al., 1982; Rooze et al., 1982; Hinsenkamp, 1994], in vivo [Hinsenkamp et al., 1985a; Rooze et al., 1985; Hinsenkamp, 1994] et cliniques [Hinsenkamp et al., 1984, 1985b, 1993a, 1993b] sont en accord avec une accélération de la différenciation de la matrice cartilagineuse précédant l'ossification. Les modèles osseux étant complexes à mettre en œuvre, le modèle expérimental a été simplifié. Des cultures d'épiderme humain sur support dermique in vitro ont été utilisées (chap. 4.1 p.39). La conductivité électrique de l'os et de la peau est relativement plus faible que celle des autres tissus (annexe 5.3, p. 163). Le modèle de base de la culture des kératinocytes est inspiré du protocole utilisé par Prunieras et al. [1983]. Lors de l'utilisation d'un courant continu, une première étude [Jercinovic et al., 1996] a montré sur ce modèle de culture que la position des explants sur le support dermique avait une incidence sur leur croissance, le courant continu entraînant une polarisation du milieu et une modification du pH autour de l'anode. Par contre, lors de l'utilisation du signal alternatif [Hinsenkamp et al., 1997] aucune incidence de la position de l'explant n'a été observée. Les caractéristiques de la stimulation (forme d'onde, intensité et fréquence du signal, fréquence et durée de la stimulation) se basent sur une revue de la littérature publiée par Vodovnik et al. [1992] sur les applications humaines de la stimulation électrique et électromagnétique dans le traitement des plaies chroniques ainsi que sur une étude clinique de la cicatrisation des blessures chroniques [Jercinovic et al., 1994]. Ce modèle de croissance épidermique, stimulé par un courant électrique pulsé asymétrique à charge nulle de 40Hz, modulé par une fréquence de 0,125Hz et transmis par deux électrodes de platine, offre un protocole simplifié et bien caractérisé pour étudier les effets biologiques des ELF. Les résultats sur les cultures stimulées par un courant pulsé à charge nulle montrent [Hinsenkamp et al., 1997] : - une diminution de la zone de croissance entourant les explants (fig. 1);

A B Figure 1 : zone de croissance entourant un explant épidermique de 3mm de diamètre. La photo de gauche (A) est l'explant témoin après 12 jours de culture, la photo de droite (B) l'explant après 11 jours de stimulation et 12 jours de culture

4 Chapitre 1 - Introduction

- une meilleure stratification avec augmentation du nombre de couches de kératinocytes différenciés; - une diminution de l'incorporation de la thymidine tritiée reflétant la diminution du nombre de mitoses. Ces observations suggèrent qu'une stimulation électrique pulsée ELF influence la différenciation des explants de la culture épidermique. Une meilleure structure et maturation des couches épidermiques dans les zones formées autour de l'explant sont également observées. Ce phénomène se fait au dépend de la prolifération : le nombre de mitoses diminue parallèlement à la taille de la zone de croissance voisine de l'explant. Cela confirme l'accélération de la différenciation observée précédemment in vivo et in vitro sur différentes espèces [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a; Rooze et al., 1982, 1985; Hinsenkamp, 1994]. 1.3.3 Développements actuels Les résultats obtenus par Hinsenkamp et al. [1997] utilisant un courant électrique pulsé ELF appliqué sur des cultures d'épiderme humain sur supports dermiques dévitalisés in vitro aboutissent à la même conclusion que les études des effets des EMF sur le tissu osseux [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a; Rooze et al., 1982, 1985; Hinsenkamp, 1994] où une maturation plus rapide de la matrice cartilagineuse associée à une accélération de l'ossification des modèles de tissus embryonnaires ont été observées. Compte tenu de la réponse cohérente obtenue sur ces modèles biologiques suite à l'application d'un courant électrique ou électromagnétique pulsé, asymétrique, à charge nulle, de basses fréquences et de faible amplitude, nous proposons de rechercher les mécanismes impliqués au niveau cellulaire par screening de l'expression génique. La technique des microarrays (annexe 2, p. 146) permet de comparer la variation de l'expression d'un gène entre un échantillon témoin et un échantillon stimulé, l'intensité de l'expression de ce gène pouvant être modifiée par la stimulation dont nous recherchons les effets. Nous avons utilisé la puce microarray Affymetrix GeneChip® human genome U133 Plus 2.0 qui permet un large screening de l'expression des gènes en analysant l'expression de 38.500 gènes (chap. 4.3.3.1, p. 51). Cette technique est particulièrement appropriée pour révéler les mécanismes cellulaires activés ou inhibés par les ELF ainsi que les éventuels récepteurs. La quantité d'acide ribonucléique (ARN) nécessaire aux prélèvements successifs nécessite une adaptation du protocole de culture de kératinocyte afin d'augmenter significativement le nombre d'explants mis en culture simultanément tant pour le groupe témoin que stimulé.

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Chapitre 2 - Revue de la littérrature 2.1 Introduction Dès 2003, nous nous sommes intéressés à rechercher les mécanismes celllulaires expliquant les résultats obtenus sur des modèles de cultures osseuses ou épidermiques stimulés par des ELF-EMF ou par un courant électrique ELF. L'analyse des modifications de l'expression de l'ensemble du génome, dans le but d'identifier les mécanismes cellulaires activés ou inhibés par la stimulation, nous a paru une méthode ooriginale et particulièrement intérressante. Nous pensons que la recherche sur un modèle humain devrait permettre d'obtenir des résuultats plus intéressants pouvant être reliés aux études épidémiologiques ou cliniques. Le nombre important de thèmes de recherche impliqués par les effets biologiques des ELF-EMF est révélateur de la complexité du sujet. Les mécanismes cellulaires concernés se rapportent rarement à une fonction unique ou à un type cellulaire spécifique et sont souvent interconnectés : il est donc important de réaliser une revue exhaustive de la littérature afin de relever l'ensemble des obsservations expérimentales, épidémiologiques ou cliniques et d'en tirer d'éventuels points communs. Les premiers thèmes abordés par la revue de la littérature ont un lien direct avec l'étude expérimentale réalisée. Dans la mesure du possible, chaque sujet est introduit par des références qui font la synthèse des connaissances et se poursuit par une revue systématique des publications depuis 2008. 2.2 Mécanismes cellulaires impliqués dans la prolifération et la différenciation des kératinocytes Les études antérieures ont mis en évidence le rôle de la prolifération ett de la différenciation cellulaire dans les processus activés après une stimulation ELF (chap. 1.3 p. 3). Dans le cadre de la recherche des mécanismes cellulaires, il est intéressant de relever ddans la littérature les cascades métaboliques classiquement impliquées dans ces deux processsus. Ces informations serviront à vérifier l'adéquation fonctionnelle des pathways mis en évidence par nos résultats et n'ont pas pour but d'orienter notre recherche qui volontairement corresspond à un screening complet et non ciblé de l'expression du génome. Les voies de signalisation MAPK-ERK (extracellular signal-regulated kinase) (fig. 2) et PI3K-mTOR (phosphatidylinositol 3-kinaase - mammalian target of rapamycin) (fig. 3 et 4) font partie des principaux mécanismes de contrôle de la cellule en réponse aux signaux extracellulaires : survie cellulaire, difffférenciation, prolifération, métabolisme et motilité [Mendoza et al., 2011]. La cascade dde signalisation MAPK/ERK esst impliquée dans la régulattion de la différenciation des kératinocytes. Les signauxx circulant à travers ERK-MAPK intègrent et régulent les effets de l'epidermal growth factor receptor (EGFR), de l'intégriine et de la signalisation via le calcium. Les stimuli d'activation sont localisés dans la membrane plasmique où ils régulent la conversion de Ras-GDP en Ras-GTP actif. La transformation en Ras-GTP favorise la signalisation à travers une cascade de kinases qui sont activées par phosphorylation avant de pphosphoryler leurs cibles en aval, en progressant via l'activation de Raf-1, B-Raf, MEK-1/2 et pour terminer ERK-1/2. ERK-1//2 phosphorylé agit sur

6 Chapitre 2 - Revue de la littérature un grand nombre de protéines dont plusieurs facteurs de transcription pour activer l'expression des gènes et initier la réponse cellulaire [Cursons et al., 2015]. Squarize et al. [2010] ont observé que l'activation de la voie PI3K-Akt-mTOR fait partie du processus normal de réparation du tissu cutané. Ils ont montré que l'activation de la voie PI3K-Akt augmente la vitesse de fermeture de la plaie et que ce phénomène dépend de l'activation de mTOR qui est régulé en amont par PTEN et TSC1. Il est également possible que l'activité de mTOR dans les cellules épithéliales régule l'expression de cytokines telles que le TGFβ, TGFα, FGF ou VEGF.

Figure 2 : voie de signalisation MAPK/ERK Source : www.mm.interhealth.info. Copyright Daniele Focosi, 2001-2005

7 Chapitre 2 - Revue de la littérature

Figure 3 : voie de signalisation PI3K-Akt Source : Biocarta : http://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta/h_aktPathway

La voie de signalisation Wnt (fig. 5) joue un rôle important dans l'organogenèse et la morphogenèse de la peau [Widelitz, 2008]. En l'absence de Wnt, la voie de signalisation du même nom est inhibée et le niveau de β-caténine est maintenu bas par un complexe multi-protéines cytoplasmique comprenant les protéines Axine, Adenomatous Polyposis Coli Protein (APC) et glycogène synthase kinase 3 (GSK3). APC et Axine participent à la phosphorylation de la β-caténine par GSK3 qui est ensuite ubiquitinylée et dégradée par un protéasome. L'effet de cette régulation négative de Wnt est une réduction de la prolifération cellulaire [Pasca di Magliano et al., 2007] et une induction de la différenciation cellulaire terminale [Boyden et al., 2002; van der Horst et al., 2005]. DKK1 joue un rôle dans la régulation négative de cette voie de signalisation [van der Horst et al., 2005]. Une voie de signalisation Wnt active nécessite une translocation* de l'axine et de ses protéines associées à travers la membrane cellulaire [Chen et al., 2006], cette translocation est impossible sans la présence de MACF1. Quant à FOXO1, il joue un rôle important dans la transformation des kératinocytes vers un phénotype de cicatrisation. Il active la migration et la sur-expression de la transforming growth factor β1 (TGF-β1) et de ses cibles en aval, integrin-α3 and -β6 and MMP-3 and -9 [Ponugoti et al., 2013; Hameedaldeen et al., 2014].

8 Chapitre 2 - Revue de la littérature

Figure 4 : voie de signalisation Akt-mTOR, Source : Biocarta : http://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta/h_mTORPathway

Figure 5 : voie de signalisation Wnt

Source : Biocarta : http://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta/h_wntPathway

9 Chapitre 2 - Revue de la littérature

2.3 Etudes expérimentales 2.3.1 Expression des gènes et des protéines En 2005, le "World Health Organization’s EMF Project", "l'European Union’s Cost 281 Action", la "Commission K of the International Union of Radioscience", le "Forschungsgemeinschaft Funk", le "VerUm Foundation" et "l'International Committee on Electromagnetic Safety from USA" ont organisé le premier atelier sur la transcriptomique* et la protéomique* dans la recherche sur les EMF. Suite à ce workshop, Leszczynski [2006] conclut dans son Editorial de la revue Proteomics, que l'utilisation des techniques protéomiques et transcriptomiques est une approche utile pour déterminer les cibles moléculaires possibles des EMF au niveau subcellulaire. Il ajoute que ce type de recherche systématique peut générer une importante base de données qui permettrait aux scientifiques de formuler des hypothèses plus précises concernant les mécanismes des effets biologiques des champs électromagnétiques. En 2012, dans le cadre de l'action COST BM0704, il publie avec d'autres spécialistes une revue de la littérature (2005- 2010) sur l'utilisation de ces techniques [Leszczynski et al. 2012]. La conclusion précise qu'aucun résultat convaincant ne révèle d'effet nocif des EMF. Ils indiquent toutefois que la majorité des études examinent les effets aigus. Les modèles biologiques étudiés ont été exposés à une dose unique avant extraction de la protéine ou de l'analyse de l'expression des gènes. La réalité de l'exposition des populations humaines est souvent très différente puisqu'elles sont exposées chroniquement aux ELF durant de nombreuses années. Ils notent qu'à partir des études menées, il est impossible de trouver un gène, un groupe de gènes ou des protéines pouvant être considérés comme marqueurs d'une réponse cellulaire à la stimulation EMF. Ils considèrent que les recherches utilisant la protéomique ou la transcriptomique devraient se poursuivre sur des modèles humains : les expérimentations pourraient fournir ainsi des résultats directement applicables dans l'évaluation des risques sur la santé humaine. Les études animales, nécessaires pour identifier des mécanismes, ne peuvent fournir aucune preuve fiable relative à d'éventuelles conséquences cliniques. Les lignées cellulaires immortalisées devraient être proscrites, les voies de la régulation cellulaire étant modifiées et non physiologique. Ils expliquent l'importance de réaliser des études utilisant différentes approches analytiques validées par leur reproduction systématique et que les changements observés doivent être confirmés par d'autres techniques ARN (qRT-PCR*). Les publications (2008-2015) résumées ci-dessous utilisent une stimulation ELF et analysent l'expression des gènes et des protéines (tab. 1, p. 16). La plupart des études analysent un petit nombre de gènes ou de protéines, seules deux publications [Jennings et al., 2008; Caputo et al., 2014] (1‡, 2) réalisent un screening complet de l'expression des gènes par microarray sur un modèle de lignée cellulaire humaine stimulé par des EF. Les recherches de Sun et al. [2010] (22), Bouwens et al. [2012] (23), Chen et al. [2012] (25), Huwiler et al. [2012] (26), Kirschenlohr et al. [2012] (24) ne montrent aucun effet sur les gènes étudiés. Lisachev et al. [2010] (17) ne révèlent pas d'effet pour la stimulation à 4,4Hz alors que la stimulation à 100Hz modifie l'expression de certains gènes. Les autres publications réalisant un screening microarray présentent toutes une modification de l'expression de certains gènes étudiés [Chung et al., 2010;

‡ Position de la publication dans le tableau 1 (p. 16)

10 Chapitre 2 - Revue de la littérature

Jennings et al., 2008; Caputo et al., 2014] (15, 1, 2), excepté pour une étude sur la levure [Chen et al., 2012] (25) et les bactéries [Huwiler et al., 2012] (26). Quatre équipes [Tsai et al., 2009; Jansen et al., 2010; Wang et al., 2011a; Zhou et al., 2012] (3, 4, 5, 6) ont analysé par PCR l'expression de gènes après une stimulation PEMF sur 3 lignées cellulaires humaines et un modèle de rat. Pour la stimulation EMF, Vianale et al. [2008] (7), Mayer-Wagner et al. [2011] (8), Wang et al. [2013] (10) et Corallo et al. [2014] (11) ont travaillé sur des lignées cellulaires humaines et Selmaoui et al. [2011] (9) sur des échantillons de sang humain avec des analyses ciblées utilisant les PCR, ELISA ou la protéomique. Ces techniques ciblées ont également été utilisées sur des modèles de rats et de souris [Aydin-Abidin et al., 2008; Hu et al., 2008; George et al., 2008; Chung et al., 2010; Cuccurazzu et al., 2010; Lisachev et al., 2010; Reyes-Guerrero et al., 2010; Rodríguez - De la Fuente et al., 2012] (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), sur des insectes [Li et al., 2013a] (20) et sur des champignons [Potenza et al., 2012] (21). Ces études présentent toutes une modification de l'expression des gènes étudiés. 2.3.2 Modification du développement cellulaire 2.3.2.1 Prolifération Les résultats obtenus sur la prolifération cellulaire sont variables. Les études ont été menées sur différents modèles de cultures (cellules humaines, muridées, bovines et porcines) et suivant les protocoles, les résultats montrent une augmentation, une diminution ou une absence d'effet sur la prolifération. Ces résultats varient ou s'inversent en présence de co-facteurs (tab. 2, p. 22). Un effet fenêtre (chap. 2.3.5, p. 13) est observé sur la prolifération des fibroblastes [Binhi et al., 2000]. Liu et al. [2013] soutiennent cette hypothèse en montrant une prolifération accrue pour une stimulation de 10Hz mais aucune différence significative pour les groupes de stimulation à 30Hz ou 50Hz. 2.3.2.2 Différenciation Löschinger et al. [1998], travaillant sur des cultures de fibroblastes humains stimulés à 20Hz, observent une induction de la différenciation terminale après stimulation de 12 heures/jour durant 14 jours. Lisi et al. [2006] constatent qu'une exposition (1h, 2 fois/jour) de kératinocytes normaux à un champ de 7Hz - 100μT EMF augmente la différenciation cellulaire. Manni et al. [2004] ont travaillé sur des cellules primaires de kératinocytes humains buccaux exposés à un champ électromagnétique (50Hz); leurs résultats supportent l'hypothèse que l'exposition aux EMF induit un niveau de différenciation plus élevé. Zhou et al. [2011, 2012] montrent une augmentation significative de la différenciation et de la minéralisation des ostéoblastes associée à un accroissement de la phosphatase alcaline chez les ostéoblastes de rat in vitro exposés à 50Hz - 3,6mT pendant 30min. Hronik-Tupaj et al. [2011] concluent que la stimulation électrique améliore la différenciation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC). Pour Ciombor et al. [2002] la réponse des chondrocytes à des ELF-PEMF (ELF-EMF pulsés) se traduit par une différenciation cellulaire plus rapide et une synthèse accrue de la matrice cartilagineuse (maturation plus rapide). Lors de l'étude de la lignée cellulaire ostéoblastique MG63 (dérivée d’un ostéosarcome humain) stimulée par PEMF, Lohmann et al. [2000] montrent une différenciation accrue objectivée par la diminution de la prolifération, l'augmentation de l'activité de la phosphatase alcaline, la synthèse

11 Chapitre 2 - Revue de la littérature de l'ostéocalcine et la production de collagène. Le traitement avec des PEMF aboutit à un phénotype ostéoblastique mieux différencié et plus mature. Dans leurs expériences, Cho et al. [2012], Kim et al. [2013], Choi et al. [2014], observent une différenciation neuronale accrue par un traitement à 50Hz ELF. 2.3.3 Accélération d'un processus physiologique Pour Callaghan et al. [2008] et Goudarzi et al. [2010] la stimulation PEMF accélère la cicatrisation des plaies des patients normaux ou diabétiques et protège de la nécrose tissulaire. Patruno et al. [2010] observent que la stimulation ELF-EMF 50Hz accélère la cicatrisation des plaies cutanées avec transition plus rapide de la phase inflammatoire vers la différenciation terminale. Une revue de la littérature [Pesce et al., 2013] sur la cicatrisation des plaies confirme cette observation. Comme indiqué dans le chapitre précédent, suite à l'exposition ELF-PEMF la différenciation des chondrocytes est plus rapide [Ciombor et al., 2002]. Les résultats de Cuppen et al. [2007] indiquent que la stimulation ELF-EMF améliore la compétence immunitaire des animaux. Sun et al., [2009] montrent que la prolifération débute plus rapidement dans le groupe stimulé que dans le groupe témoin. 2.3.4 Génotoxicité Vijayalaxmi et al. [2005] observent que 46% des 63 publications recensées ne révèlent aucune augmentation de dommage du matériel génétique, 22% suggèrent une augmentation et 32% sont non concluantes. En 2009, ils analysent 87 publications (1990-2007) et concluent que si les études sont menées sous le seuil de sécurité recommandé par les directives de l'International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection [ICNIRP, 1998] ou du National Radiological Protection Board [NRPB, 2001], les indices de génotoxicité globaux de la méta-analyse (exposition ELF versus témoins) sont similaires à l'indice "spontané" à partir d'une base de données historiques sur les cellules normales [Vijayalaxmi et al., 2009]. Maes et al. [2012] revoient la littérature dans le but de préciser l'intérêt de la cytogénétique pour évaluer une éventuelle relation entre ELF-MF et maladie d'Alzheimer. Leur conclusion indique qu'il est généralement admis que les ELF-MF ne sont pas des agents génotoxiques, mais certaines publications indiquent qu'ils peuvent augmenter les effets d'agents connus pour induire des mutations ou des tumeurs. Trente et une références (1991-2009) sont répertoriées dont trois synthèses qui montrent l'absence d'effet génotoxique dans la majorité des études. Des exceptions existent, certaines données suggérant une induction de l'instabilité chromosomique due à l'exposition aux EMF. Suite aux publications du programme REFLEX [2004] montrant une augmentation de cassures de brins d'ADN ainsi qu'aux commentaires de Vijayalaxmi [2006], Burdak-Rothkamm et al. [2009] ont répété l'étude de manière indépendante. A l'instar de Scarfi et al. [2005], ils n'ont pu confirmer les résultats du groupe REFLEX et n'ont constaté aucun dommage important au niveau des cassures de l'ADN ou d'altérations chromosomiques visibles. Focke et al. [2010], suivant le même protocole, confirment l'augmentation de la fragmentation de l'ADN nucléaire avec, en plus, un effet accru en phase S du cycle cellulaire.

12 Chapitre 2 - Revue de la littérature

Yokus et al. [2008] exposent des rats durant 10 mois à un champ de 50Hz-100μT, 2 heures/jour. Ils obtiennent une modification significative par oxydation des bases ADN alors qu'aucune modification n'est observée avec une exposition de 500μT. Kim et al. [2010] comparent une exposition unique de 60Hz - 6mT MF, 30min à une exposition répétée. Pour l'exposition unique, ils ne constatent pas de variation de viabilité des cellules mais une augmentation des cassures de l'ADN double-brin tant dans les cultures de cellules normales que cancéreuses. Pour une exposition répétitive, ils observent une réduction de la viabilité cellulaire et une augmentation des cassures de l'ADN double-brin dans toutes les cellules. Dans une étude sur des embryons de souris exposées à des ELF-EMF, Borhani et al. [2011] observent que l'exposition au stade préimplantatoire aurait des effets néfastes sur l'embryon en augmentant la fragmentation de son ADN. Mariucci et al. [2010] étudient le dommage de l'ADN cérébral et détectent des atteintes avec un effet réversible dans toutes les zones exposées. Lors d'une stimulation MF de 2,5mT durant 96h sur la souche Saccharomyces cerevisiae, Ruiz-Gómez et al. [2010] observent une déficience dans la réparation des brins d'ADN ainsi qu'une altération de la croissance et de la survie mais aucune altération de l'ADN ou du cycle cellulaire. L'équipe de Wilson [2015] recherche des mutations dans les tissus somatiques et germinaux de souris mâles exposées à un MF de 10, 100 or 300μT à 50Hz durant 2 ou 15h. Leurs résultats suggèrent que, pour les doses utilisées, les effets mutagènes in vivo des ELF-MF sont mineurs voir négligeables. Bułdak et al. [2012] ont combiné du cisplatine, inducteur de réponse oxydative et une stimulation ELF-MF. La stimulation a atténué les effets du stress oxydatif et les dommages de l'ADN causés par le cisplatine alors que la stimulation ELF-MF seule présente un stress oxydatif léger et est inducteur de dommages à l'ADN. Markkanen et al. [2008] observent qu'un prétraitement MF à 100μT diminuait la génotoxicité cellulaire de la ménadione, un agent génotoxique. Ils ne trouvent par contre aucun effet pour : la stimulation MF seule, la combinaison MF et ultraviolet-B, la stimulation MF après exposition à la ménadione. En 2011, la même équipe [Luukkonen et al., 2011] confirme les résultats de 2008 sur l'effet de la ménadione après un prétraitement 100μT MF. L'équipe de Mizuno [2014] n'a trouvé aucun changement important sur la survie des cellules ou le dégât de l'ADN lorsque des cellules sont exposées aux rayons ultraviolets-B suivi par une stimulation EMF 5mT. 2.3.5 Effet fenêtre Bawin et al. [1976] considèrent que la réponse des cellules aux EMF dépend de fréquences spécifiques et proposent l'existence d'un "effet fenêtre". Il existerait pour les signaux des "fenêtres" d'intensités et de fréquences dans lesquelles apparaîtrait une réaction biologique [Adey, 1996]. La délimitation des "fenêtres" restant floue les conclusions sont susceptibles d'évoluer. Robison et al. [2002], Heredia-Rojas et al. [2001] semblent confirmer l'approche de Bawin montrant la non-linéarité des effets en fonction de l'évolution des champs sur des études traitant de prolifération cellulaire ou de cancer. Des publications plus récentes confirment cette non-linéarité. Plusieurs auteurs ont observé que les réponses biologiques dépendent des caractéristiques des signaux : forme d'onde [Pesce et al., 2013; Zhou et al., 2014], stimulation intermittente ou continue [Martinez et al., 2012], durée de stimulation [Kim et al., 2013], intensité et fréquence [Binhi et al., 2000; Xu et al., 2010; Zhang et

13 Chapitre 2 - Revue de la littérature al., 2010, Sadeghipour et al., 2012; Crocetti et al., 2013; Liu, 2013; Martirosyan et al., 2013; Pesce et al., 2013]. L'effet fenêtre fait généralement référence à une zone spécifique du spectre des fréquences, du niveau d'intensité ou relatif à la forme d'onde dans laquelle la cellule réagit. Le concept de fenêtre peut être étendu car le type et le niveau de maturité d'une cellule peuvent la faire réagir spécifiquement à une stimulation ELF. Trillo et al. [2012] ont présenté des résultats montrant l'interaction du co-facteur rétinoïde* ROL (all-trans-retinol) et de la stimulation EMF sur différents types cellulaires. Sur la lignée cellulaire NB69 (neuroblastome humain), la présence du co-facteur induit une synergie additive sur la prolifération alors que pour les cellules HepG2 (hépatocarcinome humain), l'effet prolifératif du ROL est partiellement bloqué par la stimulation. Wang et al. [2011a] ont étudié la prolifération sur six lignées cellulaires cancéreuses stimulées par des PEMF et montrent que MKN-45 (carcinome gastrique humain) et SPC-A1 (adénocarcinome pulmonaire humain) ne réagissent pas, alors que la prolifération est significativement inhibée pour BGC-823 (cancer gastrique), MKN-28 (cancer gastrique), A549 (adénocarcinome de cellules épithéliales pulmonaires humaines) et les cellules Lovo (adénocarcinome du colon). D'Angelo et al. [2015] confirment la dépendance de la réaction à la stimulation au type cellulaire étudié. Wei et al., [2008] observent que les cellules réagissent différemment à la stimulation en fonction de leur stade de différenciation. Huang et al. [2014] ont démontré que deux types de kératinocytes épidermiques (lignée cellulaire "HaCaT human keratinocyte" et lignée cellulaire "NHEK primary normal human epidermal keratinocytes") réagissaient différemment à un même stimulus ELF-EMF. Plus récemment, l'équipe de Tessaro [2015] a montré que le taux de croissance de bactéries sous ELF-EMF était influencé par les caractéristiques cellulaires des différentes espèces. 2.3.6 Conclusions Leszczynski [2006] souligne l'intérêt d'un screening systématique des cellules et des tissus par des techniques omiques* qui permettent d'améliorer la connaissance des mécanismes cellulaires impliqués lors d'une stimulation EMF. Cette recommandation que nous avions anticipée dès 2003 commence à être suivie pour les ELF sans que le screening ne soit systématique (tab. 1, p. 16). Certaines études ont été menées sur des lignées cellulaires humaines, des souris, des bactéries, des levures, des champignons et des insectes alors qu'un screening global sur des modèles les plus proches des conditions physiologiques in vivo chez l'Homme (cultures primaires de fibroblastes humains, chondrocytes, épiderme humain, cellules souches, cellules sanguines, etc...) pourrait fournir des résultats directement applicables à l'homme. Ces études devraient identifier les mécanismes biologiques impliqués dans la stimulation ELF-EMF. Ces nouvelles informations permettraient de développer de nouveaux traitements et de mieux définir les risques éventuels sur la santé. Les choix que nous avons faits ont tenu compte de ces impératifs et seront présentés dans les chapitres suivants. On observe (tab. 2, p. 22) que la stimulation pulsée aurait tendance à augmenter la prolifération cellulaire pour des stimulations allant de quelques heures à 2 ou 3 jours. Les résultats observés sur des tibias et des métatarses d'embryons de poulet in vivo montrent une accélération précoce de la prolifération suivie d'une accélération du processus d'ossification primaire correspondant à la différentiation des cellules [Rooze et al., 1985]. Avec le modèle de culture des kératinocytes

14 Chapitre 2 - Revue de la littérature

(chap. 4.1, p. 39), Hinsenkamp et al. [1997] ont montré une diminution de la prolifération après 11 jours de stimulation. Il est concevable, comme pour le modèle osseux [Rooze et al., 1985], que la prolifération, qui précède normalement la différenciation, soit également accélérée dans les premières heures de la stimulation. Ce déroulement est cohérent avec les résultats de Wei et al. [2008] qui observent, sur des cellules ostéoblastiques primaires stimulées par des EMF pulsés, une promotion de la prolifération et une inhibition de la différenciation au stade de la prolifération et la promotion de la différenciation au stade de la différenciation. L'ensemble de la littérature citée (chap. 2.3.2.2, p. 11) indique une augmentation de la différenciation cellulaire après stimulation ELF. Sur différents modèles biologiques in vitro et in vivo exposés à un champ électromagnétique présentant un train d'impulsion, Hinsenkamp et al. [1982, 1985a], Rooze et al. [1982, 1985], Hinsenkamp [1994] ont montré une accélération de la différenciation de la matrice cartilagineuse précédant l'ossification. Cette accélération de la différenciation cellulaire au détriment de la prolifération a également été montrée sur le modèle de culture de kératinocytes humains exposés à un courant électrique pulsé (chap. 1.3.2, p. 3) [Jercinovic et al., 1996; Hinsenkamp et al., 1997]. Le processus d'accélération sera développé au chapitre 5.3 (p. 66). Les observations sur l'effet "fenêtre" montrent l'intérêt de grouper les résultats des études utilisant un même type de stimulation ou un même type cellulaire et, idéalement, ne faisant varier qu'un seul paramètre à la fois afin de dresser la carte des fenêtres actives de la stimulation ELF. Il est fondamental de pouvoir accéder, dans les publications, à un maximum de détails sur le protocole expérimental, sur le type de stimulation et sur le modèle biologique utilisé. Il semble néanmoins intéressant de ne pas cloisonner systématiquement les résultats en fonction de leurs caractéristiques de stimulation (-EMF, -MF, -EF, -PEMF, fréquence, etc…) vu que l'on peut trouver des effets identiques avec une stimulation EMF et différents modèles de tissus osseux [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a, 1985b, 1993a, 1993b; Rooze et al., 1982, 1985; Hinsenkamp, 1994] ou un courant électrique et une culture d'explants épidermiques [Jercinovic et al., 1996; Hinsenkamp et al., 1997; chap. 5 p. 57]. Il est généralement admis que la majorité des études ne montre pas d'effet génotoxique. Quelques études individuelles montrent une certaine génotoxicité mais elles utilisent souvent des intensités supérieures aux normes prescrites. Ces résultats sont néanmoins intéressants pour établir les seuils de génotoxicité. Les zones "inactives" sont également mises en évidence dans certaines études pour des intensités supérieures aux seuils de sécurité.

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Chapitre 2- Revuedela littérature Tableau 1 : publications (2008-2015) qui utilisent une stimulation ELF et analysent l'expression des gènes et des protéines

Auteurs Modèle de culture Matériel d'étude Stimulation Observations

Humain RT-PCR EF Aucune modification Rat - souris Screening microarray PEMF Insecte Protéines EMF Champignon Levure Bactérie

Culture in vitro de Modification de l'expression des gènes associés à : la cicatrisation (1) Expression des gènes : puce cellules normales de des plaies, la production de matrice, la signalisation cellulaire, la Jennings microarray Affymetrix HG-133 0,1V.mm-1 , EF, 1h fibroblaste dermique croissance et à l'activation de voies de signalisation spécifiques et al., 2008 Plus + RT-PCR adulte (TGF-β, protéines G, l'inhibition de l'apoptose)

60Hz, 24,5V peak to peak 0h et 4h post-exposition : aucune modification

16 (2) Etude de l'expression des gènes Lignée cellulaire osseuse voltage, modulé par une Caputo avec la puce microarray 24h post-exposition : sous-expression de ZNF394, LMOD3, humaine SaOS-2 onde carrée 12,5Hz, EF, HS.544637, TMEM17, LOC100128288, FAM175A, LRRFIP1 et et al., 2014 HumanHT12 v.4.0 + RT-PCR -2 4μA.cm pendant 1h sur-expression de LOC348840, ZNF137, KILLIN

Cellules souches 0,13mT, 2mV.cm-1 Pulse (3) mésenchymateuses Expression de l'ARNm de quasi-rectangulaire, durée de Après 7 jours de stimulation : sur-expression de Runx2/Cbfa1 et Tsai humaines isolées à partir Runx2/Cbfa1, ALP, Col-I et pulse de 300μs, fréquence de ALP suivie d'une sous-expression et al., 2009 de la moelle osseuse de GAPDH par RT-PCR répétition de 7,5Hz, 2h/jour Sous-expression de Col-I après 10 jours patients adultes pendant 3, 7 et 10 jours

Cellules souches Augmentation du taux de BMP-2, TGF-β1, ostéoprotégérine, (4) humaines de moelle 15Hz PEMF, 1 Gauss, 5ms matrix metalloproteinase-1 et -3, ostéocalcine, bone sialoprotéine Jansen RT-PCR osseuse in vitro burst/5μs pulse 14 jours jusqu'au jour 9. La phosphorylation de ERK1/2 n'est pas impactée et al., 2010 (BMSCs) par la stimulation PEMF

Tableau 1 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Matériel d'étude Stimulation Observations

Lignée cellulaire (5) humaine néoplasique Expression de Midkine (MK) par Wang BGC-823, MKN-45, 7,5Hz, 0,4T, PEMF Altération de l'expression de Midkine RT-PCR et al., 2011a MKN-28, A549, SPC-A1, LOVO

PEMF 1 semaine avant (6) Rats Sprague Dawley Expression de Axin2, Wnt3a, Pas de modification de l'expression de Axin2, augmentation de ovariectomie, 8Hz, 3,82mT, Zhou femelle de 33 mois avec LRP5, β-catenin, c-myc, DKK1 et l'expression de Wnt3a, LRP5, β-catenin, c-myc, et Runx2, 40min/jour, 5jours/semaine, et al., 2012 /sans ovariectomie Runx2 par RT-PCR diminution de l'expression de DKK1 12 semaines

Production et expression de La stimulation réduit l'expression de RANTES, MCP-1, MIP-1α et (7) Lignée cellulaire de Chemokine par ELISA et IL-8 17 Vianale kératinocytes humains RT-PCR 50Hz, 1mT durant 72h 17 et al., 2008 (HaCaT) NF-κB devient indétectable après 1h de stimulation NF-κB p65 par ELISA.

Stimulation + facteurs de croissance : améliorent la Cellules souches différenciation chondrogénique (8) mésenchymateuses 15Hz, 5mT, 1.2A RMS, EF Mayer- humaines adultes de induit inférieur à 2mV/m, Stimulation seule : n'induit pas de différenciation chondrogénique RT-PCR Wagner moelle osseuse (MSCs) 45min toutes les 8h, 3 Augmentation de l'expression de COL2A1 et GAG, expression et al., 2011 in vitro différenciées par fois/jour, 21 jours stable de l'aggrécane et SOX9 et diminution de l'expression de FGF-2 et TGF-β 3 COL10A1

50Hz, 10μT, 1h "off", 1h (9) Interleukine 1 beta (IL-1β), 2 (IL- Echantillon de sang "on" avec champ "on-off" Stimulation intermittente : augmentation de Il-6, aucun effet sur Selmaoui 2), 6 (IL-6), 1 receptor antagonist humain in vivo toutes les 15s ou 50Hz, IL-1β, IL-2, IL-1RA, IL-2R et al., 2011 (IL-1RA), 2 receptor (IL-2R) 10μT en continu, durant 9h

Tableau 1 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Matériel d'étude Stimulation Observations Détection par RT-PCR de Fibroblastes de la couche l'expression de TGF-β2 et FGF-2 sclérale de foetus Diminution de la synthèse de collagène I par la régulation de la (10) humains (hFSFs) traités Détection par voie métabolique MAPK, Wang avec un milieu immunofluorescence de COL1A1 50Hz, 0,2mT, 24h Sur-expression de MMP-2, et al., 2013 conditionné à partir de et MMP-2 l'épithélium pigmentaire Augmentation d'activité de ERK1/2 et p38 Mesure de ERK1/2 et p38 par rétinien Western blot*.

Stimulation favorise l'expression de protéines : du noyau, du chondrocytes 100Hz ou ELF modulés cytoplasme et des organelles apparentées au métabolisme arthrosiques primaires (TAMMEF) avec des (11) (glyceraldeyde-3-phosphate-dehydrogenase), de la réponse au isolés de têtes fémorales fréquences, intensités et des Corallo Analyse protéomique stress (Mn-superoxide-dismutase, heat-shock proteins), de la humaines prélevées lors formes d'ondes variables, et al., 2014 régulation du cytosquelette (actine), de l'inhibition de la de prothèse totale de 30min/jour durant 2 18 protéinase (cystatin-B) et de la régulation des fonctions hanche semaines inflammation (S100-A10, S100-A11)

protéine c-Fos : sur-expression dans toutes les aires corticales 1Hz, 10Hz et stimulation testées pour la stimulation 1Hz et 10Hz et uniquement dans le (12) burst-Theta TMS cortex limbique pour la stimulation iTBS et rTMS Aydin- cortex de rat Dark Analyse des protéines c-Fos and intermittent ou repetitive Abidin Agouti zinc finger protein (zif268) protéine zif268 : sur-expression dans toutes les aires corticales transcranial magnetic et al., 2008 pour la stimulation iTBS, dans le cortex moteur primaire et le stimulation (rTMS) cortex sensoriel pour la stimulation 10Hz et aucun effet après la stimulation 1Hz

Culture primaire de Expression d'Osteopontin (OPN): (13) Sous-expression de l'ARNm de OPN. cellules de muscles lisses ARNm par RT-PCR et protéine 20, 40, 60mT Hu vasculaires aortiques de par Western blot + activité de 10, 20 et 30 min L'expression de la protéine OPN et l'activité de MMP-2 sont et al., 2008 rat (VSMCs) Metalloproteinase-2 (MMP-2) dépendants de la dose mais pas du temps de la stimulation

Tableau 1 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Matériel d'étude Stimulation Observations

(14) Taux de HSP70 sanguin et niveau 60Hz, 8μT, 30min avant Sur-expression du gène HSP70 et une augmentation de son taux George Rats Sprague-Dawley tissus cardiaques : ARNm (RT- reperfusion protéique et al., 2008 PCR et protéine (Western blot)

(15) Femelles de souris AKR Puce Affymetrix "Mouse Gene 60Hz, 5μT, 83,3μT, 500μT Modification de l'expression de certains gènes, aucun changement Chung âgées de 4 à 6 semaines 1.0ST assay" 21h/jour durant 40 semaines dans le thymus au stade précoce du cancer et al., 2010

Augmentation de la neurogenèse in vivo, augmentation de la (16) Souris in vivo C57BL/6 Expression de l'ARNm par RT- 50Hz, 1mT, transcription des gènes pro-neuronaux (Mash1, NeuroD2, Hes1) Cuccurazzu adulte mâle + isolation PCR et des protéines par Western 1h à 7h/jour pendant 7 jours et des gènes codant pour Ca 1.2 channel α , augmentation de la et al., 2010 du tissu hippocampal blot v 1c traduction des protéines NeuroD1, NeuroD2 et Ca

Stimulation 100Hz : sur-expression de S100B qui revient ensuite

19 à sa valeur initiale; sur-expression progressive pendant la 100Hz, 4 X 1s avec 30s (17) Tranche in vitro de la première heure de S100A1 et se maintient durant la deuxième Etude de l'expression de l'ARNm interval, Lisachev sous-zone CA1 de heure après stimulation; aucun changement de l'expression de de S100B, S100A1 et S100A6 4,4Hz , 400 stimuli pendant et al., 2010 l'hippocampe de rat S100A6 91s Stimulation 4,4Hz : aucune modification de l'expression de l'ARNm

Rats femelles : la stimulation ELF augmente l'expression de (18) Expression des gènes par RT- 60Hz 1mT pour le groupe OB ERβ durant la phase dioestrus et la diminue durant l'oestrus, Reyes- Rats adultes (mâle et PCR : Olfactory bulb(OB) stimulé, 2μT pour le groupe pas d'effet sur ERα. L'expression de ERα et ERβ fluctue Guerrero femelle) estrogen receptor-α (ERα), -β témoin, 2h/jour durant 9 naturellement durant l'oestrus. et al., 2010 (ERβ) jours Rats mâles : l'expérimentation ne montre aucune variation de l'expression de ERα ou ERβ avec ou sans stimulation

Tableau 1 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Matériel d'étude Stimulation Observations

(19) Vecteur plasmide Expression du gène Luciferase Rodríguez - électrotransféré dans le par activation de la séquence 60Hz, 80μT, 2h/jour pendant Modification de l'expression de la luciferase par activation du de la Fuente quadriceps de souris spécifique de hsp70 par la 7 jours promoteur hsp70 dans le muscle quadriceps de la souris et al., 2012 BALB/c in vivo stimulation EMF

Exposition court terme : 439 gènes sur-exprimés et 874 sous- exprimés 3,03±0,04mT, exposition de (20) 72h après éclosion ou Exposition long terme : 514 gènes sur-exprimés et 1206 sous- Li Drosophila melanogaster Expression des gènes stimulation de l'œuf jusqu'à exprimés et al., 2013a l'âge adulte de 3 jours 238 gènes sur-exprimés et 598 sous-exprimés sont communs aux 2 conditions

20 Etude de l'expression de Cdc42, (21) RhoGdi, S97, S22 et actine par Sur-expression de Cdc42, RhoGdi, S97, S22 et de l'actine ainsi Tuber borchii mycelium Potenza RT-PCR afin d'évaluer la 50Hz, 0,1mT, 1h/3jours que des gènes impliqués dans la croissance des hyphes et de in vitro et al., 2012 croissance des hyphes du l'organisation du cytosquelette champignon

Expression des gènes par RT- (22) Villosité trophoblastique PCR : Les résultats ne montrent aucune modification de l'expression des Sun 50Hz, 0,4mT, 72h humaine in vitro Bcl-2 lié à l'apoptose, bax, gènes après une stimulation de 72h et al., 2010 caspase-3, p53, fas.

Lignée cellulaire de la leucémie monocytaire 50Hz onde sinusoidale 5μT, (23) aiguë humaine THP-1 et 30min ou 4 ondes de 320, Les résultats ne montrent aucune modification de l'expression du Bouwens RT-PCR lignées cellulaires du 730, 880, 2600Hz, 5μT, 30 gène ou de la protéine cytokine et al., 2012 pharynx humain Detroit min 562

Tableau 1 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Matériel d'étude Stimulation Observations

Leucocytes humains in Etude par RT-PCR de l'expression (24) vivo prélevés 2 fois à 2h de 16 gènes de mammifères qui Les résultats ne montrent aucune réponse consistante à Kirschenlohr d'intervalle avant la ont précédemment été publiés 50Hz, 62.0±7,1μT, 2h l'exposition ELF et al., 2012 stimulation et 3 fois comme répondant à la stimulation après ELF-MF

(25) Saccharomyces Puce microarray Affymetrix La stimulation ELF n'altère pas l'expression des gènes de Chen 50Hz, 0,4mT, 6h cerevisiae Yeast Genome S98 + RT-PCR Saccharomyces cerevisiae et al., 2012

50Hz, 1mT, onde sinusoïdale continue ou (26) Echerichia coli K-12 intermittente (2min "on", Les résultats ne montrent aucune modification de l'expression des Huwiler Microarray Affymetrix MG1655 4min "off"), ligne électrique gènes et al., 2012 21 intermittente (2min "on", 4min "off"), 2,5h ou 15h

Chapitre 2- Revuedela littérature Tableau 2 : publications (2008-2015) qui utilisent une stimulation ELF et analysent la prolifération cellulaire

Auteurs Modèle de culture Stimulation Observations

Humain EF

Muridé PEMF

Bovin EMF

Porcin

Résultat en fonction de co-facteurs

Cellules souches 0,13mT, 2mV.cm-1, impulsions quasi- Milieu de culture de base : PEMF n'augmentent pas la prolifération. Tsai mésenchymateuses humaines de rectangulaire de 300μs avec une fréquence et al., 2009 Milieu ostéogénique : PEMF augmentent la durée de la prolifération de 7 moelle osseuse de patients adultes de répétition de 7,5Hz 2h/jour jours à 10 jours 22 Pas de modification de la prolifération cellulaire en l'absence d'agonistes de l'adénosine et de l'adénosine désaminase, Varani Chondrocytes bovins et cultures de 75Hz PEMF, 1,3ms, 1,5mT, 0,07mV.cm-1 Stimulation de la prolifération cellulaire en présence de CGS 21680, et al., 2008 fibroblastes synoviocytes Augmentation de l'inhibition de la prolifération en présence de CI-IB- MECA dans les synoviocytes de type fibroblaste

50Hz, 10μT, intermittent, en présence ou Cid Cellule humaine d'hépatocarcinome absence de mélatonine 10nM La stimulation induit la prolifération et la dédifférenciation cellulaire et al., 2012 HepG2 (physiologique) ou 1μM lorsque la mélatonine exerce des effets cytostatiques et différenciants (pharmacologique)

Stimulation EMF ou 0,5 μM de all-trans-retinol : augmente Lignée cellulaire humaine NB69 de Trillo 50Hz, 100μT, intermittent 42h seul ou en individuellement la prolifération cellulaire dans les deux lignées cellulaires neuroblastome et HepG2 et al., 2012 combinaison avec 0,5μM all-trans-retinol d'hepatocarcinome Stimulation EMF + all-trans-retinol : induisent un effet additif sur la prolifération cellulaire dans la lignée NB69

Tableau 2 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Stimulation Observations

Résultat en fonction du type cellulaire, du stade de différenciation ou du type de stimulation

Lignées cellulaires humaines: cancer gastrique (BGC-823, MKN- La stimulation pourrait inhiber significativement la prolifération de BGC- Wang 45, MKN-28), adénocarcinome 823, MKN28, A549 et des cellules Lovo, 7,5Hz, 0,4T, PEMF et al., 2011a épithélial (A549), adénocarcinome Aucun effet significatif n'a été détecté sur MKN-45 et sur les cellules SPC- poumon (SPC-A1), cancer colon A1 (LOVO)

Cellules endothéliales veineuses de Le milieu de culture ayant contenu des cellules ostéoblastiques stimulées cordon ombilical humain (HUVEC) par un ELF-PEMF augmente54 fois la prolifération des cellules Hopper PEMF 15Hz, impulsion de 4,5ms 1,8mT endothéliales. et al., 2009 durant 8h (EBI Bone Healing Devince) Lignée ostéoblastique de cellules Le milieu de culture ayant contenu des cellules endothéliales stimulées crânienne de fœtus de rat (FRC) par un ELF-PEMF ne modifie pas la prolifération ostéoblastique 23 48Hz, 1,55mT, PEMF, exposé : Aucune modification du nombre de cellules, MC3t3-E1 et cellule primaire 24h en continu Wei d'ostéoblastes provenant de l'os Promotion de la prolifération et inhibition de la différenciation en phase de 24h non exposé suivi de 24h exposé et al., 2008 occipital de rats Sprague Dawley prolifération, 24h exposé suivi de 24h non exposé âgés de deux jours 48h exposé en continu Promotion de la différenciation en phase de différenciation des cellules

Stimulation de la prolifération cellulaire en présence de CGS 21680, Varani Chondrocytes bovins et cultures de 75Hz PEMF, 1,3ms, 1,5mT, 0,07mV.cm-1 et al., 2008 fibroblastes synoviocyte Amplification de e l'inhibition de la prolifération cellulaire provoquée par CI-IB-MECA dans les synoviocytes de type fibroblaste

Stimulation EMF en continu : n'a pas induit de changements significatifs 50Hz, 100μT, intermittent (5min de la prolifération cellulaire. Martinez Lignée cellulaire humaine de On/10min Off ou 3h On/3h Off) ou et al., 2012 neuroblastome NB69 Stimulation intermittente : augmentation significative de la prolifération continu durant 63h via la voie de signalisation MAPK ERK1/2 à chaque exposition intermittente

Lignée cellulaire humaine NB69 de Stimulation EMF + 0.5μM de all-trans-retinol : induisent un effet additif Trillo 50Hz, 100μT, intermittent 42h seul ou en neuroblastome et HepG2 sur la prolifération de la lignée NB69, l'effet prolifératif de all-trans-retinol et al., 2012 combinaison avec 0.5μM all-trans-retinol

d'hepatocarcinome est partiellement bloqué par la stimulation EMF pour la lignée HepG2,

Tableau 2 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Stimulation Observations

Résultat en fonction du type cellulaire, du stade de différenciation ou du type de stimulation (suite)

Cellules souches Kim Une exposition de 6 ou 12 jours diminue le taux de prolifération alors que mésenchymateuses de moelle 50Hz 1mT, pendant 2, 6 ou 12 jours et al., 2013 l'exposition de 2 jours n'a pas d'effet osseuse adulte (hBMSCs)

La stimulation favorise la prolifération des cellules souches neurales Piacentini Cellules souches neurales 50Hz, 1mT, exposition permanente jusque indifférenciées, diminue la prolifération des cellules qui ont déjà et al., 2008 postnatales 0 jour de souris CD-I 12 jours commencé à se différencier

Cellules stromales Stimulation 10Hz : augmentation de la prolifération Liu 10, 30, 50 et 70Hz, 1mT, 2h exposition mésenchymateuses de moelle et al., 2013 suivi par 4h non exposées Stimulation entre 30 et 50 Hz : aucune différence n'a été observée après 2 osseuse (rBMSCs) semaines de stimulation

Stimulation 4Hz : active la prolifération cellulaire 24 Martirosyan Escherichia coli K-12 2, 4, 6, 8, 10Hz, 0,4mT, 30min et al., 2013 Stimulation 8 Hz : inhibition de la prolifération cellulaire

Prolifération accrue

Cellules souches Sun 15Hz, 4,5ms train de 20 impulsions PEMF Accélération de l'apparition de la mitose 12 à 16h après la stimulation ce mésenchymateuses de moelle et al., 2009 8h/jour durant 3 jours qui est plus rapide que dans le groupe témoin osseuse in vitro (hBMSCs)

Cellules souches Lim 10, 30, 100Hz, PEMF, 0,05mT, exposé en mésenchymateuses alvéolaires Augmentation de la prolifération de 15% après 5 jours et al., 2013a continu humaines dérivées de l'os

Cellules tendineuses humaines Girolamo 75Hz, PEMF, 1,5mT, impulsions de La stimulation influence positivement la prolifération de façon dose- récoltées à partir de tendons semi- et al., 2013 1,3ms, EF induit 2mV crète, 4, 8 or 12h dépendante tendineux et gracilis

Lin PEMF (1,8mT-3mT, 75 Hz, 2 h/jour La stimulation améliore la prolifération et la minéralisation des Ostéoblastes murins 7F2 et al., 2010 durant 3 semaines ostéoblastes mis en culture sur une structure de chitosane*

Tableau 2 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature

Auteurs Modèle de culture Stimulation Observations

Prolifération accrue (suite)

Ostéoblastes murins 7F2 cultivés dans des conditions inflammatoires Lin 75Hz, PEMF 1,5mT, EF induit de 2,5mV, sur structure de chitosane en La stimulation renforce la prolifération cellulaire et al., 2011 impulsions de 1,3ms pendant 9h présence de cellules macrophages RAW264.7

Exposition unique : active la prolifération des chondrocytes et l'expression Chondrocytes intégrés dans un gel de certains gènes. Chang 75Hz, 1,8 à 3mT, impulsion de 1,3ms d'atélocollagène provenant de et al., 2010 induisant un EF de 3,5mV, 24h Exposition à court terme (1 semaine) : favorise la production de GAG et la genoux de porcs formation de lacunes. Trois semaines après l'exposition : aucune production de GAG ou de collagène

25 Durant les trois semaines de stimulation, l'évolution de la quantité totale Chang Chondrocytes porcins primaires 75Hz, 1,8-3mT, impulsions de 1,3ms. d'ADN n'est pas différente (p ≥ 0,1) entre le groupe témoin et stimulé. Par et al., 2011 cultivés sur un film de chitosane 2h/jour pendant 3 semaines contre, le taux de prolifération du groupe stimulé à la semaine 3 est supérieur à celui semaine 1 (p ≤ 0,05)

Delle Monache Cellules endothéliales de la veine 50Hz, 1mT 1, 6 et 12h Après 6h d'exposition, la stimulation augmente le taux de prolifération et al., 2008 ombilicale humaine

Vianale Lignée cellulaire de kératinocytes 50Hz, 1mT durant 72h Après 42h d'exposition, la stimulation augmente le taux de prolifération et al., 2008 humains (HaCaT)

Patruno Lignée cellulaire de kératinocytes 50Hz, 1mT durant 3, 18 et 48h La stimulation augmente le taux de prolifération et al., 2010 humains (HaCaT)

Gaetani Cellules souches cardiaques, Combinaison de MF statique 10μT et La stimulation augmente l'activité métabolique et le taux de prolifération. et al., 2009 adultes humains sinusoïdal 7Hz, 2.5μT, 3 ou 5 jours Cette tendance se réduit après 3 jours d'exposition.

Sulpizio Cellule de neuroblastome Augmentation significative du nombre de cellules, de leur viabilité et du 50Hz, 1mT pendant 5, 10 et 15 jours et al., 2011 SH-SY5Y taux de prolifération

Tableau 2 (suite) Chapitre 2- Revuedela littérature Auteurs Modèle de culture Stimulation Observations

Zhang Cellules souches épidermiques L'augmentation de la fréquence de la stimulation renforce de manière 1, 10 ou 50Hz, 5mT, 3, 5 ou 7 jours et al., 2013 humaines proportionnelle la prolifération et le pourcentage de cellules en phase S

Pas de modification de la prolifération

Cellules progénitrices neurales Pas de modification de la prolifération cellulaire Lim 1, 10 ou 50Hz, 1V.cm-1 EF, 4h/jour porcines de foetus de miniporc du et al., 2013b pendant 3, 7 et 14 jours Stimulation avec les fréquences plus élevées : retarde la différenciation des Yucatan à 45 jours de gestation cellules en astrocytes matures

Mannerling Cellules humaines de leucémie On n'observe aucun changement du taux de prolifération après 24h 50Hz, 25μT ou 50μT ou 100μT, 1h et al., 2010 myéloïde chronique K562 in vitro d'exposition à 100μT

Lignée cellulaire PC12 dérivée de Morabito 50Hz, 0,1mT ou 1mT, stimulation aiguë de Exposition EMF longue durée : n'a pas d'incidence sur la prolifération sauf phéochromocytome de la et al., 2010 30min ou de longue durée (7 jours) une légère diminution transitoire après trois jours après l'exposition 1.0mT médullosurrénale rat 26 Prolifération diminuée

Yan Cellules souches Inhibition de la croissance des cellules souches mésenchymateuses 50Hz, 20mT, 12h et al., 2010 mésenchymateuses humaines humaines

Zhou 50Hz, 0,9mT à 4,8mT par palier de 0,3mT, Inhibition de la prolifération des ostéoblastes indépendamment de la dose Ostéoblastes de rats nouveau-nés et al., 2011 30min/jour jusque 15 jours de stimulation

Cellules souches Cho Inhibition de la prolifération des cellules souches mésenchymateuses après mésenchymateuses de moelle 50Hz, 1mT, durant 12 jours et al., 2012 12 jours d'exposition osseuse humaine (hBM-MSCs)

Fibroblastes de la couche sclérale Wang de foetus humains (hFSFs) milieu 50Hz, 0,2mT, 24h Diminution du taux de prolifération et al., 2013 de l'épithélium pigmentaire rétinien

120Hz, 4.5mT, 50min/jour, 32 jours (7 Jiménez- García Rats mâles Fischer-344 avec jours de stimulation + traitement Inhibition de la prolifération des cellules durant l'hépatocarcinogenèse et al., 2010 lésions prénéoplasiques du foie carcinogenic et 25 jours de stimulation)

Chapitre 2 - Revue de la littérature

2.4 Etudes épidémiologiques 2.4.1 Cancer Le premier document rapportant une association entre champs électromagnétiques et cancer a été rapporté par Wertheimer et al. [1979] dans une étude sur la mortalité infantile. Des recherches ultérieures ont conclu à des risques de cancer accrus, en particulier la leucémie, alors que d'autres études ont conclu à l'absence de risque significatif. Ces résultats sont référencés par Lacy- Hulbert et al. [1998], l'ICNIRP [2001] et Elliott et al. [2013]. Lambrozo et al. [2014] se sont posé la question de savoir si, après 30 ans de recherche sur les ELF-EMF, "il n'était pas temps de devenir raisonnable" : les études épidémiologiques actuelles trouvent un facteur de risque de plus en plus faible après exposition aux ELF-EMF principalement dû à la diminution des biais. 2.4.1.1 Chez les enfants a. Leucémie infantile La question d'un lien causal entre les ELF-MF et la leucémie infantile est posée depuis près de 40 ans. L'IARC [2002] a classé les ELF-MF comme "potentiellement carcinogène" (classification 2B), se basant sur des preuves limitées chez l'homme et l'insuffisance de preuve provenant d'études expérimentales sur les animaux. Les observations chez l'homme proviennent d'études épidémiologiques résumées dans deux méta-analyses sur l'étiologie de la leucémie infantile [Ahlbom et al., 2000; Greenland et al., 2000] qui observent une légère association entre ELF-MF et risque de leucémie pour des niveaux d'exposition supérieurs à 0,3 et/ou 0,4μT. Pour Schüz et al. [2007] la relation entre l'ELF-EMF et leucémie infantile manque toujours d'explications plausibles. Certains relèvent des éléments en faveur d'une association [Kroll et al., 2010] et concluent à partir d'études récentes sur l'association des MF et de la leucémie que les MF sont de possibles carcinogènes [Kheifets et al., 2010a]. Malgré l'apparente consistance d'une relation statistique, des questions importantes restent posées en raison du manque de connaissances des mécanismes impliqués et de l'existence de biais dans les études de cas-témoins susceptibles de surévaluer l'estimation du risque [Schüz et al., 2008, Kheifets et al., 2010a]. Les publications de Kroll et al. [2010] et de Kheifets et al. [2010a] sont discutées par Schmiedel et al. [2010] qui sont persuadés que les études épidémiologiques n'ont rien apporté depuis l'étude de Greenland et al. [2000]. Peut-être faut-il accepter les limites de la recherche épidémiologique et attendre de nouvelles approches technologiques (une meilleure caractérisation de l'exposition et des mécanismes biologiques) pour tirer de nouvelles conclusions [Savitz, 2010]. Malgré l'apport controversé des études épidémiologiques les plus récentes, de nouvelles études continuent d'être publiées. Wünsch-Filho et al. [2011] étudient les effets des MF 60Hz sur la leucémie aiguë lympholastique (ALL). Ils n'ont pas observé de risque accru chez les enfants exposés à des champs égaux ou supérieurs à 0,3μT comparés à une exposition inférieure à 0,1μT. Jirik et al. [2012], dans une étude cas-témoins appariés, n'ont trouvé aucune relation entre le niveau d'exposition et la leucémie infantile pour des niveaux d'exposition de 0,2μT à 0,4μT. Schüz et al. [2012] ont étudié plus de 3.000 enfants diagnostiqués avec une ALL dans huit pays, le lien entre l'exposition aux ELF-MF et la survie : aucune association significative ne peut être observée. Sermage-Faure et al. [2013] testent l'hypothèse d'une augmentation de l'incidence ALL chez les enfants vivant à proximité des lignes hautes tensions de 63-150KV (HV-HVOL) et

27 Chapitre 2 - Revue de la littérature

225-400KV (VHV-HVOL). Ils montrent une augmentation de l'indice de risque relatif rapproché (odds ratio, OR) pour l'apparition des ALL chez les enfants vivant à moins de 50 mètres d'une VHV-HVOL mais aucune relation n'a été trouvée au-delà de cette distance ou à moins de 50 mètres d'une HV-HVOL. Pedersen et al. [2014a] ne trouvent pas de risque accru chez les enfants vivant à moins de 200m de lignes aériennes de 132 à 400kV. Leitgeb, [2014] groupant les données épidémiologiques, explique les résultats controversés et critique l’hypothèse d’un lien causal entre exposition aux ELF-MF et leucémie infantile. Il conclut que la classification dans le groupe 2B doit être révisée. Par opposition une méta-analyse reprenant les résultats de 9 études montre que le niveau d'exposition aux EMF peut être associé à la leucémie infantile [Zhao et al., 2014]. Le Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks a conclu [SCENIHR, 2009] que les nouvelles études épidémiologiques et animales qui ont abordé l'exposition aux ELF ne modifiaient pas leur évaluation de 2007 : les ELF-EMF sont potentiellement carcinogènes et peuvent augmenter la fréquence d'apparition de la leucémie infantile mais ils reconnaissent que le hasard et les biais ont pu produire ce résultat. Ce rapport actualisé en 2015 conclut que les résultats actuels ne montrent aucun effet néfaste des EMF sur la santé si l'exposition reste sous les normes [SCENIHR, 2015]. Le huitième rapport du Scientific Council on Electromagnetic Fields of the Swedish Radiation Safety Authority [SSM, 2013] indique que les nouvelles informations sont conformes aux méta-analyses précédentes relevant une augmentation minime du risque de leucémie après une exposition aux lignes électriques haute tension. Aucune étude in vitro ne fournit une explication sur les mécanismes de cette conclusion épidémiologique. Le rapport du SSM [2015] indique que les dernières études ne présentent aucune association consistante et souligne que les nouvelles études conservent toujours les mêmes approches et les mêmes limitations que les études antérieures. Outre l'exposition des enfants, celle des parents, avant ou pendant la grossesse, pourrait jouer un rôle dans le développement du cancer chez l'enfant. Peu d'études ont été menées sur les parents exposés professionnellement à des EMF élevés avec l'idée que l'exposition à des EMF pourrait entraîner une altération génétique et donc augmenter la probabilité d'apparition d'un cancer chez les enfants. Quelques études ont examiné l'exposition maternelle, mais le nombre de femmes enceintes exposées aux EMF est faible. L'IARC [2002] a conclu que les études sur l'exposition professionnelle aux champs magnétiques des parents et le cancer chez les enfants présentent des résultats inconsistants se basant sur un petit nombre de cas. Hug et al. [2010] et Reid et al. [2011] ont analysé l'association entre l'exposition aux champs ELF-EMF des pères et mères et l'ALL chez l'enfant et n'ont montré aucun risque accru chez les enfants de parents professionnellement exposés aux ELF. Une étude considérant le niveau de radon et la pollution de l'air comme cofacteurs a été réalisée : en fonction des méthodes d'analyse, les résultats montrent une interaction significative entre ELF-EMF, radon et leucémie infantile mais cette interaction pourrait être due au hasard [Pedersen et al., 2014b].

28 Chapitre 2 - Revue de la littérature b. Cancer du cerveau Une méta-analyse de ELF-MF groupant 13 études (1979-2007) sur les tumeurs cérébrales de l'enfant ne fournit aucune preuve de l'augmentation du risque chez les enfants exposés aux champs ELF résidentiels [Mezei et al., 2008]. Une augmentation de risque modérée ne peut être exclue pour les niveaux d'exposition les plus élevés (> 0,3 ou 0,4μT). Kheifets et al. [2010b] publient une analyse des données de 10 études (1960-2001) sur ces tumeurs et les champs ELF-MF. Aucun résultat n'est statistiquement significatif. Même si certains indices Odds pour la catégorie d'exposition la plus élevée (> 0,3 ou 0,4μT) sont augmentés, la conclusion indique qu'il y a peu de preuves d'une relation entre ELF-MF et le cancer du cerveau chez l'enfant. Ces études ne traitent qu'un petit nombre de cas dont il est difficile de tirer des conclusions. Les évidences épidémiologiques liant ce cancer à l'exposition résidentielle aux MF sont peu concluantes. 2.4.1.2 Cancer chez les adultes a. Risque carcinogène Elliott et al. [2013] ont mené une étude de cas-témoins à l'aide de données (1974-2008) du Registre National du cancer (Angleterre et Pays de Galles) analysant les risques de cancers chez l'adulte en relation avec la distance des lignes électriques haute tension ou des MF qu'elles produisent. Ils n'ont trouvé aucune augmentation du risque ou une tendance en faveur de la leucémie, du cancer du cerveau ou du système nerveux central, du mélanome malin ou du cancer du sein en relation avec l'éloignement ou l'amplitude des MF. Guxens et al. [2014] ont conduit une étude dans quatre pays nordiques sur une population professionnelle afin d'évaluer l'exposition des ELF-MF ou des chocs électriques durant les heures de travail et le cancer du cerveau, les tumeurs malignes hématopoïétiques et lymphatiques ou le cancer du sein. Dans cette très importante cohorte (68.770 cancers du cerveau, 65.609 lymphomes, 83.088 leucémies, 33.791 myélomes multiples, 1.827 cancers du sein masculin, 297.283 cancers du sein féminin) aucune preuve de risque accru en relation avec l'exposition professionnelle aux ELF-EMF ou chocs électriques n'a pu être trouvée. Concernant les professionnels exposés à des intensités de champs plus importantes, certaines études montrent que les ELF pourraient jouer un rôle dans l'apparition ou la progression des tumeurs cérébrales vers des stades plus avancés [Turner et al., 2014]. b. Leucémie chez l'adulte Marcilio et al. [2011] ont évalué l'association de la distance du domicile à la ligne électrique aérienne la plus proche, de l'amplitude du champ magnétique calculée à partir des lignes électriques et de la mortalité par la leucémie chez l'adulte. Un risque accru de mortalité a été relevé aux distances les plus proches des lignes électriques par rapport aux personnes vivant à plus de 400 mètres; le risque est plus élevé pour les personnes vivant à moins de 50 mètres. Ils ont observé une légère augmentation de la mortalité par leucémie chez les adultes vivant dans des maisons soumises aux champs magnétiques les plus élevés.

29 Chapitre 2 - Revue de la littérature

Concernant l'exposition professionnelle à des intensités de champs plus importantes, une étude souligne la cohérence des résultats indiquant l'absence de relation entre leucémie et PEMF, la démonstration de l'hypothèse inverse reste aléatoire [Sorahan, 2014]. Talibov et al. [2015] ont étudié l'association entre l'exposition professionnelle aux ELF-MF, les chocs électriques et la leucémie myéloïde aiguë (AML). L'étude inclut 5.409 cas d'AML adulte diagnostiqués entre 1961 et 2005 et 27.045 témoins. Les résultats ne montrent pas d'association entre les différents facteurs étudiés. c. Cancer du sein Pour Feychting [2013], commentant Li et al. [2013b], ce type d'étude a été mené depuis les années 1980 sur base de l'hypothèse que les champs ELF suppriment la production de mélatonine qui aurait un effet protecteur contre le cancer du sein. Des études récentes, moins sensibles aux biais, ont été réalisées pour l'exposition résidentielle (matelas chauffants) et l'exposition professionnelle : elles n'ont pas confirmé les quelques résultats positifs initiaux et ne soutiennent pas l'hypothèse que les champs ELF-MF augmentent le risque de cancer du sein. L'IARC [2002] a considéré les preuves insuffisantes et l'OMS [2007a], sur base de nouvelles études, a conclu à l'absence de risque de cancer du sein. L'OMS estime que les preuves sont suffisantes pour affirmer que les champs magnétiques ne causent pas le cancer du sein. 2.4.2 Maladie neurodégénérative La neurodégénérescence est une perte progressive de la structure et de la fonction des neurones. Les maladies neurodégénératives (NeuroDegenerative Disease, NDD) telles la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington (cause génétique) ou la sclérose latérale amyotrophique apparaissent lorsque la régénération fonctionnelle ou structurelle est déficiente. Souvent, les processus NDD impliquent des facteurs environnementaux [Brown et al., 2005; Cannon et al., 2011]. Sobel et al. [1995] furent les premiers à s'intéresser à l'étude des EMF dans les NDD. Utilisant les observations de Sobel et al. [1995, 1996], Feychting et al. [1998] et Savitz et al. [1998], le National Radiological Protection Board (NRPB) publie un rapport sur les ELF et les NDD [NRPB, 2001]. Sur les désordres neurodégénératifs, l'OMS [2007a] rejoint l'avis du NRPB et indique qu'aucune évidence ne montre de lien entre ELF et la maladie de Parkinson. Si le NRPB indique de très faibles éléments montrant une association avec la maladie d'Alzheimer, l'OMS ne trouve aucune association significative pour cette maladie ou la sclérose latérale amyotrophique. Huss et al. [2009] publient la première étude réalisée en Suisse sur le risque des différentes NDD après exposition résidentielle aux lignes à haute tension et, en 2013, une étude danoise comprenant un groupe témoins a analysé l'association possible entre la distance résidentielle par rapport aux lignes à très haute tension et les NDD [Frei et al., 2013]. Ces études n'ont montré aucune relation entre les ELF et la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la maladie du motoneurone, la démence vasculaire ou d'autres types de démence. De plus, l'étude danoise ne montre pas de risque accru de NDD pour les personnes vivant à proximité des lignes électriques et ne confirme pas le risque accru de maladie d'Alzheimer trouvé dans l'étude suisse.

30 Chapitre 2 - Revue de la littérature

Différentes études et méta-analyses ont été menées sur l'exposition professionnelle et les NDD [Håkansson et al., 2003; García et al., 2008; Vergara et al., 2013; Sorahan et al., 2014]. Vergara et al. [2013] notent des erreurs de classification des maladies et des évaluations imprécises de l'exposition déforçant plusieurs études : les connaissances sur les effets ELF-MF sur les NDD nécessitent des améliorations. Sur un modèle de souris, l'équipe de Liebl [2015] a montré que la stimulation MF 50Hz 1mT n'affecte pas les processus cellulaires impliqués dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer et de la sclérose latérale amyotrophique. Zhang et al. [2015] tirent la même conclusion pour la maladie d'Alzheimer après une étude de l'exposition ELF-EMF à court terme (100μT/50Hz) sur un modèle de rat. Le tableau 3 présente les observations réalisées pour les NDD après exposition professionnelle, résidentielle et in vitro : aucune ne relie l'exposition ELF à la maladie de Parkinson, la démence, la sclérose en plaque ou la maladie des motoneurones. Bien que certaines études ne montrent aucune association ou une association non directement liée aux EMF, un risque accru pourrait exister pour la maladie d'Alzheimer et la sclérose latérale amyotrophique [Håkansson et al., 2003; NRPB, 2001; Garcia et al., 2008; Huss et al., 2009; Vergara et al., 2013; Huss et al., 2015]. Mattsson et al. [2012] publient une revue de la littérature sur les expérimentations in vivo et in vitro qui recherchent un mécanisme expliquant le lien de causalité suggéré pas les études épidémiologiques entre la maladie d'Alzheimer et l'exposition aux EMF. Pour Mattson, les études expérimentales revues sont insuffisantes pour répondre à la question. La même année, Maes et al. [2012], évoquent plusieurs voies métaboliques proposées dans la littérature qui pourraient expliquer le risque accru de maladie d'Alzheimer suite à l'exposition aux ELF-EMF : - La production de l'amyloïde-β, responsable de la formation de plaques amyloïdes dans la maladie, est accrue après une exposition à long terme aux ELF-MF. - La mélatonine peut affecter l'initiation et l'évolution de la maladie; différentes études montrent une baisse de sa production après exposition aux EMF. - Le stress oxydatif élevé dans la maladie, l'est également après exposition aux EMF. - Sous couvert de confirmation, que les ELF-EMF puissent augmenter la charge mutationnelle causée par l'aneuploïdie, ils pourraient augmenter son incidence.

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Chapitre 2- Revuedela littérature Tableau 3 : observations réalisées sur les maladies neurodégénératives et l'exposition ELF professionnelle, résidentielle et in vitro

Pathologies et preuve de leurs associations avec les ELF-EMF Type Auteurs d'exposition Sclérose latérale Sclérose en Maladie de Maladie des Alzheimer Démence amyotrophique plaque Parkinson motoneurones

Huss et al., 2009 risque accru NS NS NS NS

Résidentielle Frei et al., 2013 NS NS NS NS NS NS

NRPB, 2001 très faibles preuves risque accru mais NS causé par les chocs électriques

Håkansson et al., 2003 risque accru risque accru NS NS 32 OMS, 2007a association inadéquate NS NS

augmentation Garcia et al., 2008 Professionnelle significative du risque

augmentation augmentation modérée modérée du risque Vergara et al., 2013 du risque mais pas à NS NS NS mais pas à cause cause des MF des MF

Sorahan et al., 2014 NS NS NS NS NS NS

Huss et al., 2015 NS

Liebl et al., 2015 NS in vitro Zhang et al., 2015 NS

Chapitre 2 - Revue de la littérature

2.4.3 Incidence sur la gestation Peu de publications traitent des effets des ELF sur la grossesse et leurs résultats sont souvent contradictoires. Li et al. [2002] concluent à un risque nul de fausse couche pour un niveau moyen d'exposition aux MF; le risque apparaît si l'intensité de l'exposition augmente. En 2013, deux publications s'opposent : pour Mahram et al. [2013], il n'y a pas d'effet des ELF-EMF sur la grossesse humaine, la croissance fœtale et le développement; pour Shamsi Mahmoudabadi et al. [2013], l'exposition est probablement liée à des avortements spontanés précoces. Une étude utilisant des embryons de souris exposés à des ELF-MF a montré de possibles effets néfastes sur la fertilité et sur le développement de l'embryon, diminuant le nombre de blastocystes et augmentant la fragmentation de leur ADN [Borhani et al., 2011]. Plus récemment, une étude sur la proximité résidentielle aux sources EMF et le poids à la naissance conclut que vivre à proximité immédiate de sources ELF-EMF (<100m) est associé à une croissance fœtale sous-optimale [de Vocht et al., 2014]. 2.4.4 Intolérance environnementale idiopathique attribuée aux EMF L'Intolérance Environnementale Idiopathique attribuée aux champs électromagnétiques (IEI- EMF), aussi appelée Hypersensibilité Electromagnétique (EHS) ou électrosensibilité, est caractérisée comme symptômes non spécifiques que les individus concernés attribuent à l'exposition aux EMF [OMS, 2005]. Les symptômes fréquemment mentionnés sont dermatologiques (rougeurs, picotements et sensations de brûlure) ainsi que des symptômes souvent associés à la neurasthénie ou au système nerveux (fatigue, lassitude, difficultés de concentration, étourdissements, nausées, palpitations cardiaques et troubles digestifs). Cette collection de symptômes ne recouvre aucun syndrome reconnu : l'EHS se caractérise par une variété de symptômes non spécifiques qui diffèrent d'un individu à l'autre. Les symptômes sont réellement éprouvés et leur gravité peut varier d'un individu à l'autre mais, quelle qu'en soit sa cause, l'EHS peut être handicapant [OMS, 2005]. Baliatsas et al. [2012] sont demandeurs d'un protocole international permettant une définition claire de l'EHS ainsi que d'outils de dépistage validés. Rubin et al. [2010] publient une revue de 46 études de provocation impliquant 1175 volontaires souffrant d'EHS. Ils concluent que peu d'arguments suggèrent que les EMF déclenchent les symptômes rapportés et que les personnes concernées soient aptes à détecter la présence d'EMF. L'effet nocebo suffirait à expliquer la symptomatologie déclarée. Néanmoins, deux études expérimentales ont identifié des participants capables de réagir de façon fiable à des champs magnétiques [SCENIHR, 2015]. Une étude récente de Porsius et al. [2015] montre que l'installation d'une nouvelle HV-HVOL a un impact négatif sur la perception des riverains sur leur santé et ce, même avant la mise en service de la ligne. Les preuves disponibles suggèrent que l'EHS doit être considérée comme ayant une origine principalement psychogène [Rubin et al., 2010; Köteles et al., 2013] et le traitement basé sur la thérapie cognitive et comportementale peut être utile à certains patients [Rubin et al., 2010].

33 Chapitre 2 - Revue de la littérature

2.4.5 Conclusions L'intérêt de l'épidémiologie dans l'étude des effets physiopathologiques des ELF date de plusieurs décennies. L'équipe de Wertheimer [1979] étudiait déjà l'association des EMF et du cancer chez les enfants. Nombre de thèmes ont été abordés : leucémie infantile, exposition des parents et effets sur la santé de l'enfant, cancer du cerveau chez l'enfant, risque carcinogène chez l'adulte, maladies neurodégénératives etc... . Certaines études ne traitent qu'un petit nombre de cas exposés d'où la difficulté de tirer des conclusions. Aucune statistique ne montre une augmentation significative du risque même si une augmentation modérée ne peut être exclue pour les niveaux d'exposition les plus élevés. Les expositions inférieures aux recommandations sont sans risque. Certaines études montrent un risque accru pour la maladie d'Alzheimer et la sclérose latérale amyotrophique. La question reste posée quant à la leucémie infantile pour laquelle plusieurs études épidémiologiques ont montré un risque accru, sans confirmation expérimentale. Pour l'instant, aucune relation de cause à effet n'a pu être mise en évidence par les experts de l'OMS pour les expositions domestiques. Les résultats sont contradictoires pour les expositions professionnelles montrant dans quelques rares études une relation entre le cancer du cerveau et les EMF [NIEHS/NIH, 2002]. Les études épidémiologiques poolées n'ont relevé aucune relation entre EMF et cancer chez l'adulte (leucémies, cancer du cerveau ou cancer du sein) [NIEHS/NIH, 2002; OMS, 2007a]. Le SCENIHR [2009, 2015] continue de considérer que les ELF-EMF restent un carcinogène potentiel pouvant contribuer à une augmentation de la leucémie infantile ajoutant qu'il est possible que la combinaison du hasard et des biais aient mené à cette conclusion. Nos connaissances actuelles montrent qu'il n'y a pas d'effet néfaste évident des EMF sur la santé si l'exposition reste en dessous des niveaux recommandés et fixés par les normes en vigueur. A l'heure actuelle aucune étude in vitro ne fournit une explication mécanistique justifiant cette conclusion. Les études épidémiologiques actuelles sur la leucémie infantile et l'exposition aux ELF montrent un facteur de risque de plus en plus faible [Lambrozo et al., 2014], n'apportent rien de neuf comme information [Savitz, 2010]. Schmiedel et al. [2010] et Leitgeb et al. [2014] demandent la révision de la classification de l'IARC.

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2.5 Etudes cliniques 2.5.1 Effets biologiques positifs Traditionnellement, les études des effets biologiques des ELF-EMF se focalisent sur les risques sanitaires. Certains résultats thérapeutiques présentent cependant un réel intérêt. Ils ont été observés à des expositions inférieures aux limites recommandées par l'International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection (ICNIRP). Ces interactions potentiellement bénéfiques sont étudiées dans divers contextes et les mécanismes pourraient être exploités et utilisés dans plusieurs applications thérapeutiques : - le traitement des cancers; - l'exposition/stimulation des tissus et cellules excitables impliqués dans les maladies neurologiques, neurodégénératives ou les troubles psychiatriques; - l'exposition/stimulation des tissus non-excitables lors de la cicatrisation, la croissance ou des applications de régénération. L'intérêt de ce type de recherche est confirmé par la création d'une action COST (Cooperation in Science and Technology) supportée par la Commission Européenne portant le nom de "European network for innovative uses of EMFs in biomedical applications (EMF-MED)". L'action vise à soutenir la recherche sur les effets biologiques bénéfiques des ELF et leur utilisation dans des applications biomédicales. Elle a pour objet d'améliorer la compréhension des mécanismes d'interaction physiques et biologiques des effets de la stimulation ELF chez l'Homme. 2.5.1.1 Réparation tissulaire Des études montrent que les blessures guérissent plus vite après exposition aux ELF-MF [Vodovnik et al., 1992; Ottani et al., 1988; Jercinovic et al., 1994; Okano et al., 2006; Callaghan et al., 2008]. Une amélioration de l'angiogenèse a été observée [Cañedo-Dorantes et al., 2002] sur des patients souffrant d'ulcères chroniques aux jambes ne répondant pas aux traitements médicaux ou chirurgicaux. Traitées par un champ EMF 60Hz 120V 3,6mT, 69% des lésions ont montrés une guérison en moins de quatre mois. Suite à la revue de la littérature sur l'implication des cytokines dans la cicatrisation après un traitement avec ELF-EMF, Pesce et al. [2013] concluent que les EMF auraient une application thérapeutique dans les maladies où l'inflammation chronique est présente (ulcères). Rezaei Kanavi et al. [2012] expliquent qu'un traitement à court terme des brûlures alcalines de la cornée par des champs pulsés ELF est un traitement sûr et non invasif; ses effets thérapeutiques sont comparables à un traitement médical classique. Les résultats de Bai et al. [2013] montrent que les cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse peuvent être différenciées en cellules neurales par une stimulation EMF 50Hz. Ils en concluent que le traitement non invasif EMF 50Hz pourrait faciliter la différenciation des cellules stromales en neurones fonctionnels et être associé aux thérapies de transplantation de cellules souches afin de lutter contre les maladies du système nerveux central.

35 Chapitre 2 - Revue de la littérature

2.5.1.2 Consolidation osseuse Yasuda et al. [1953] et Nogushi [1957] ont montré que sous certaines conditions, des modifications du potentiel électrique appliqué à l'os favorisent la formation osseuse. Bassett et al. [1981] ont implanté une anode et une cathode, connectées à un générateur de courant continu, à travers la corticale d'un fémur de chien in vivo et ils ont observé la formation d'os autour de la cathode. Les résultats d'études in vivo et in vitro revues ou réalisées par Hinsenkamp [1994] analysent les effets de la stimulation des EMF sur l'os et montrent que l'ostéogenèse peut être stimulée par des variations de potentiel électrique. Bodamyali et al. [1998], étudiant l'ostéogenèse in vitro, ont utilisé des PEMF de 15Hz sur des ostéoblastes de la voûte crânienne de rats et ont observé la formation de nodules osseux augmentant en taille et en nombre. Ils ont observé par qRT-PCR une augmentation de la transcription de l'ARNm de la Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) et BMP-4. Selvamurugan et al. [2007], combinant les effets de la BMP-2 et de la stimulation PEMF sur la formation osseuse, ont trouvé une synergie lorsque les deux agents se sont combinés. Fu et al. [2014] testent une stimulation composée de 10 à 30 impulsions par jour (Single Pulsed ElectroMagnetic Field" – SPEMF; 1 impulsion toutes les 5 secondes), sur des cellules de moelle osseuse humaine et sur un modèle de souris in vivo intégrant une greffe osseuse nécrotique. Le traitement journalier est inférieur à 3 minutes. Ils concluent que la stimulation SPEMF accélère la différenciation ostéogénique de la culture cellulaire et améliore la consolidation osseuse, la néo-vascularisation et la croissance cellulaire dans les os nécrotiques de souris. 2.5.2 Conclusions On observe ces dernières années une évolution dans la recherche des effets des ELF sur la santé. Au départ d'une recherche liée aux risques, on trouve de plus en plus d'études traitant des effets bénéfiques pour la santé. La Commission Européenne soutient actuellement ce type de recherche dans le cadre d'une action COST.

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2.6 Conclusions de la Revue de la Littérature Vu la variété de conditions d'exposition, de modèles biologiques et de types d'analyses utilisée dans les protocoles expérimentaux, il est difficile de comparer les études et de tirer des conclusions globales. De nombreuses publications mettent en avant le manque de connaissances sur les mécanismes cellulaires et l'intérêt de leurs découvertes [IARC, 2002; Leszczynski, 2006; Schüz et al., 2008; Kheifets et al., 2010a; Savitz, 2010; Leszczynski et al. 2012; SSM, 2013, 2015; SCENIHR, 2015]. La présence de fenêtres, correspondant à certaines caractéristiques du signal, limiterait l'activité des champs [Adey, 1996; Binhi et al., 2000, Liu et al., 2013; Pesce et al., 2013]. La multiplicité des paramètres explique les résultats contradictoires et la nécessité de bien préciser dans les protocoles les caractéristiques électriques de la stimulation (forme d'onde, fréquence, amplitude, intensité). Il semble que lorsque les recherches en laboratoire sont menées en dessous des valeurs recommandées par l'ICNIRP [1998], les quelques effets négatifs observés ont rarement pu être reproduits ou même sont contredits par d'autres équipes. Des effets bénéfiques ont par contre été observés dans plusieurs études. La réaction cellulaire ou tissulaire à la stimulation ELF observée dans ces études montre que la recherche des mécanismes cellulaires impliqués est une voie d'analyse qui mérite d'être approfondie. Concernant les études épidémiologiques, des réserves importantes persistent dues au manque de connaissances des mécanismes biologiques impliqués, mais aussi en raison des biais dans les études de cas-témoins susceptibles d'augmenter l'estimation du risque [Schüz et al., 2008; Kheifets et al., 2010a]. Si ces biais ne peuvent pas être totalement exclus dans des études récentes, ils ont considérablement diminué. Parallèlement, les études les plus récentes présentent aussi un taux de risque inférieur aux études les plus anciennes.

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Chapitre 3 - Objectifs de l'étude Pourquoi étudier les effets du courant et des champs électromagnétiques? Nous sommes de plus en plus exposéss aux courants et champs électromagnétiques et il est important de fixer des normes justifiées par des effets biologiques scientifiiquement démontrés. Il est également fondamental de répondre à toutes les questions qui concernent la santé de la population. Questions : Compte tenu de la réponse cohérente de différents modèles biologiques à l'application d'un courant électrique ou électromagnétique pulsé, asymétrique, à charge nulle, de basses fréquences et de faible amplitude (chap. 1.3.2, p. 3), différentes questions se posent : - Quels sont les récepteurs et les mécanismes sur lesquels agit la stimulation électrique? - Quels sont les processus bioologiques activés par ces récepteurs (prolifération; différenciation; physiologique ou pathologique)? - Quelles sont les caractéristiques de la stimulation déclenchant une réaction cellulaire? La revue de la littérature met clairemeent en évidence : - le manque de connaissance des mécanismes cellulaires activés après stimulation ELF; - l'importance de leur étude dans toute recherche liée à l'utilisation de lla stimulation ELF; - l'efficacité des techniques omiques dans la recherche des mécanismes cellulaires; - l'intérêt du screening et des modèles expérimentaux permettant l'extrapolation des résultats chez l'homme; - la difficulté de prouver expérimentalement les résultats épidémiologiiques positifs; - la difficulté de comparer les résultaats des différentes études; - la présence d'effets similaires avec ddifférents modèles de culture et de stimulation; - l'intérêt croissant pour les effets positifs des champs ELF; - le manque de preuves d'effets pathologiques en dessous des dosees recommandées par l'ICNIRP. Objectifs : Suite à ces questions et au manque flagrant de connaissance sur le sujet,, nous proposons : - de rechercher les mécanismes implliqués au niveau cellulaire par un screening complet et non ciblé de l'expression génique; - de mettre en évidence les processus biologiques actifs dans la réponse cellulaire observée après la stimulation ELF; - d'isoler une liste de gènes "marqueurs" spécifiquement impliqués dans ces mécanismes; - de tester l'hypothèse que la stimulation ELF accélère dans le temps l'apparition de phénomènes qui seraient apparus naturellement mais avec une latence plus longue; - de vérifier la cohérence des nouveaauux résultats avec les résultats des études historiques.

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Chapitre 4 - Matériel et méthodes 4.1 Modèle de Culture cellulaire Notre modèle expérimental est constitué d’explants d'épiderme humains mis en culture sur un support dermique dévitalisé sur lesquels nous étudions l'effet d'un courant électrique pulsé de basse fréquence. La structure de la peau humaine ainsi que les mécanismes de la prolifération, de la différenciation et de la cicatrisation cutanée sont présentés annexe 4 (p. 152). Le derme et l'épiderme sont prélevés lors de procédures d'abdominoplaassties* réalisées par un chirurgien plasticien sur des patients ne présentant aucun antécédent pathoollogique. Le derme sert à préparer les supports de culture pour les kératinocytes qui sont prélevés sous forme d'explants de 3mm de diamètre à partir de l'épiderme. Les dermes et les explants d'épiderme sont prélevés chez dees donneurs différents. Les explannts utilisés lors d'une même expériience sont prélevés sur un même sujet. Les supports dermiques reposent sur des rectangles de mousse imbibée de milieu de culture. La stimulation est appliquée au moyen de 2 électrodes en platine disposées de part et d'autre du support dermique. Elle consiste en un courant électrique pulsé de faible innttensité, à charge nulle, envoyé de manière intermittente 40 minutes par jour durant 3, 6 ou 11 jourss. 4.1.1 Préparation des supports dermiques L'ensemble des opérations se déroule stérilement. Le lambeau de peau prélevé lors d'une abdominoplastie est placé pendant une heure à 4°C afin de faciliter l'hypodermectomie. Un maximum d'adipocytes est reséqué sans entailler le derme. Derme et épiderme sont ensuite placés dans une boîte de Pétri contenant une solution de Phosphate Buffered Saline* (PBS), Fungizone, Penicillin/Streptomycin et Gentamicin. Le tout est déposé dans un incubateur à

37°C/5% CO2 pendant dix à douze jours. Après cette période, l’épiderme est facilement détaché du derme. Nous avons fait fabriquer un emporte-pièce de 60x30mm pouur découper l'ensemble des supports dermiques de manière standardisée. Les rectangles de derme subissent ensuite une série de 20 congélations dans de l’azote liquide suivies de décongélations dans un bain-marie à 37°C pour éliminer les cellules tout en conservant la structure du tissu. La dernière étape consiste en une stérilisation par rayon gamma (cobalt-60) à 7kGy suivie par le stockage à -20°C. Le traitement des peaux obtenues à partir de 46 abdominoplasties aura été nécessaire pour fournir les dermes utilisés dans nos différents protocoles de mise au poinntt (chap. 4.1.7, p. 43 et 4.3.2.2, p. 62) ainsi que pour les quarante-deux supports dermiques nécessaires à la réalisation de l'étude microarray (chap. 4.3.3, p. 50). 4.1.2 Préparation des explants épidermiques L'ensemble de ces opérations se déroulle stérilement. Le lambeau de peau prélevé lors d'une abdominoplastie est placé pendant une heure à 4°C afin de faciliter l''hypodermectomie. Le maximum d'adipocytes est réséqué sans eentailler l'épiderme. Le prélèvemeent dégraissé est placé 1 nuit à 4°C dans une solution de Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMMEM). Le lendemain, l'épiderme est détaché du derme par à un dermatome de Wagner* (fig. 6) et placé 30 minutes

39 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

dans une solution de Trypsine-EDTA (incubateur 37°C/5% CO2) afin de faciliter la migration et l'attachement des cellules sur le support dermique.

Figure 6 : prélèvement au dermatome de Wagner

Pour inhiber la trypsine, l’épiderme est placé 5min dans une solution de DMEM, Ham's F12 Nutrient Mixture* (F12) et Fetal Bovine Serum (FBS). L’épiderme sera ensuite découpé avec un "Punch Biopsy" (Stiefel®) de 3mm de diamètre (fig. 7).

Punch Biopsy

Epiderme Tapis de découpe

Figure 7 : découpe des explants de 3 mm de diamètre à l'aide d'un punch Biopsy

4.1.3 Fabrication des supports en mousse L'utilisation sera précisée au chapitre 4.1.6. Pour la fabrication de 30 supports en mousse : - découper les rectangles de mousse (60mm sur 30mm); - tremper les mousses 30min dans 1.5l d'eau de ville et mélanger à l'aide d'un vortex; - rincer pendant 15min à l'eau distillée courante; - tremper les mousses 30min dans 1.5l d'isopropanol et mélanger à l'aide d'un vortex; - rincer pendant 15min à l'eau distillée courante; - tremper les mousses 30min dans 1.5l d'acétone et mélanger à l'aide d'un vortex; - rincer pendant 15min à l'eau distillée courante; - bouillir les mousses 30min dans 1.5l d'eau distillée;

40 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

- sécher 1 nuit sur papier buvard; - stériliser par autoclave à 120°C. 4.1.4 Préparation des électrodes Un câble électrique est soudé sur une électrode en platine (50mm/2mm/0,5mm) et isolé par un manchon thermorétractable; une paire de câble est soudée à son autre extrémité à un connecteur RCA (Radio Corporation of America, appelé aussi CINCH) (fig. 8). Six paires d'électrodes et six rallonges d'un mètre RCA/RCA sont préparées. L'ensemble est stérilisé au Sterrad®*.

Figure 8 : A : 2 câbles électriques soudés sur 2 électrodes de platine et isolés par un manchon thermorétractable; B : la paire de câble est soudée à son autre A B extrémité à un connecteur RCA

4.1.5 Préparation du milieu de culture Le milieu de culture [Pruniéras et al., 1983; De Dobbeleer et al., 1989] est constitué de : Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) et Ham’s F12 nutrient mixture (F12) (3:1 v/v) additionnés de : - Fetal bovine serum (FBS) (10% v/v); - L-Glutamine 200mM stock (1% v/v); - hydrocortisone 0.50μg/ml stock (1% v/v); - Fungizone 250μg/ml stock (0,25% v/v); - Penicillin/Streptomycin 5000U/ml stock (11,1 v/v); - Gentamicin 50μg/ml stock (0,11 v/v ). Le milieu de culture est changé dans chaque boîte de Pétri toutes les 48h. 4.1.6 Assemblage du modèle expérimental L'ensemble des opérations se déroule stérilement. Le modèle expérimental complet consiste en : - Phase 1 : ▪ placer une grille métallique stérile dans une boîte de Pétri; ▪ déposer sur la grille un support dermique préalablement décongelé dans du PBS; ▪ déposer sur chaque support dermique 6 explants épidermiques de 3mm de diamètre fraîchement découpés au "Punch Biopsy";

41 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

▪ recouvrir la boîte de Pétri de son couvercle et laisser reposer 30 minutes dans un incubateur à 37°C/5% CO2; ▪ remplir la boîte de Pétri du milieu de culture préalablement chauffé au bain marie à 37°C jusqu'à affleurement du sommet de la grille; ▪ placer l'ensemble 3 jours dans un incubateur à 37°C/5% CO2.

- Phase 2 (fig. 9) : ▪ après 72 heures retirer les boîtes de Pétri de l'incubateur; ▪ imbiber un rectangle de mousse de milieu de culture préalablement chauffé au bain marie à 37°C et le placer dans une boîte de Pétri; ▪ déposer sur la mousse un derme et ses 6 explants préparés durant la phase 1; ▪ placer un cadre plastique stérile autour de la mousse et y fixer 2 électrodes; ▪ ajuster le derme afin qu'il se trouve en contact avec les deux électrodes; ▪ ajouter du milieu de culture jusqu'à affleurement du bas du support dermique; ▪ pour les échantillons stimulés, raccorder les électrodes au stimulateur et au générateur électrique (fig. 10).

Explants épidermiques Electrodes

Support dermique Support en mousse

Figure 9: modèle expérimental complet

Figure 10 : générateur et stimulateur

42 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

4.1.7 Mise au point du modèle de culture cellulaire En utilisant le protocole de culture des kératinocytes proposé par Pruniéras et al. [1983], les cultures cellulaires réalisées à petite échelle sous la supervision de l'équipe du Pr. Heenen [De Dobbeleer et al., 1989] ont permis d'obtenir les premiers résultats histologiques et morphométriques des effets des courants sur les kératinocytes [Jercinovic et al., 1996; Hinsenkamp et al., 1997]. Pour l'étude de l'expression des gènes par la technique des microarrays, la quantité d'ARNm nécessaire nous a contraints à augmenter le nombre d'explants de kératinocytes mis en culture simultanément. Nous avons alors observé une dégradation, voire un échec de la croissance des explants lors des cultures à plus grande échelle. Afin de comprendre les raisons de cet échec, nous avons pris contact avec les Auteurs ayant mis au point cette technique de culture [Pruniéras et al., 1983] afin de préciser des points fondamentaux et des détails techniques. Suite à cette enquête, différentes expériences ont été réalisées afin de mettre au point la culture cellulaire à grande échelle. Nous avons porté une attention particulière à certains détails du protocole : - la température du milieu de culture; - la température du local lors des changements de milieu de culture; - la qualité de l'hypodermectomie des supports dermiques; - l'épaisseur finale de la coupe au dermatome; - tension de l'épiderme lors de la découpe au dermatome. 4.1.7.1 Recherche de l'irradiation optimale des supports dermiques La préparation des supports dermiques se déroule comme indiqué chapitre 4.1.1. Initialement [Jercinovic et al., 1996; Hinsenkamp et al., 1997], une irradiation de 20KGy était réalisée mais le vieillissement de la bombe de Cobalt rendait aléatoire le dosage. Finalement un problème mécanique empêcha son utilisation. Les publications sur la mise au point et l'utilisation de ce modèle de culture [De Dobbeleer et al., 1989; Jercinovic et al., 1996] font référence à une exposition de 35Gy. Les avis pris lors de la résolution du problème nous ont décrit cette dose comme extrêmement faible et ne garantissant pas la stérilisation. Cette dose n'a pas été retenue vu les bons résultats obtenus précédemment avec 20KGy. Nous avons réalisé auprès de la société Sterigenics l'irradiation initiale à 25KGy classiquement utilisée pour la stérilisation. Après l'échec des cultures utilisant les dermes stérilisés à 25KGy, différentes doses d'irradiation ont été testées. Six supports dermiques ont été irradiés par rayonnement gamma (cobalt-60) à 1, 5, 10, 15, 20, 25KGy par la Société Stérigenics. La suite du protocole de culture se déroule suivant les conditions standards (chapitre 4.1.6). Le tableau 4 présente les observations macroscopiques des dermes après irradiation et avant la culture. Le tableau 5 présente les observations macroscopiques de l'attachement des explants sur le derme après 15 jours de culture.

43 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

Le tableau 6 présente les observations macroscopiques de la zone de prolifération autour des explants après 15 jours de culture.

Tableau 4 : observations macroscopiques des dermes après irradiation et avant culture

Dose irradiation KGy Observation macroscopique du derme 1 Derme lisse comme avant irradiation 5 Derme lisse comme avant irradiation 10 1 ou 2 légers plis facilement récupérables 15 Plus de plis plus difficilement récupérables 20 Grand nombre de plis non récupérables 25 Grand nombre de plis non récupérables

Tableau 5 : observations macroscopiques de l'attachement des explants sur le derme après 15 jours de culture

Dose irradiation KGy Observation macroscopique : attachement 1 Attachement complet 5 Attachement complet 10 Attachement complet 15 Pas d'attachement 20 Pas d'attachement 25 Pas d'attachement

Tableau 6 : observations macroscopiques de la zone de prolifération autour des explants après 15 jours de culture Dose irradiation KGy Observation macroscopique : prolifération 1 Présente mais plus faible que dans la publication Jercinovic 5 Présente mais plus faible que dans la publication Jercinovic 10 Présente mais plus faible que dans la publication Jercinovic 15 Absente 20 Absente 25 Absente

Conclusion : une irradiation de maximum 10KGy doit être appliquée pour un bon déroulement de la culture cellulaire. Nous réaliserons l'irradiation des supports dermiques à 7KGy.

4.1.7.2 Vérification du taux de CO2 et de la température de l'incubateur

Une mesure du taux de CO2 et de la température de l'incubateur est effectuée deux fois par jour tout au long de la culture utilisant les dermes irradiés afin de vérifier le bon fonctionnement de l'enceinte. Rien de particulier n'a pu être relevé. 4.1.7.3 Vérification de la composition du milieu de culture Les premiers résultats obtenus [Jercinovic et al., 1996; Hinsenkamp et al., 1997] utilisaient la même composition de milieu de culture que Pruniéras et al. [1983]. Certains éléments de ce milieu ont ensuite été retirés de sa composition. Nous avons observé que la culture fonctionnait parfaitement avec le milieu de culture, sans toxine cholérique mais utilisant de l'hydrocortisone.

44 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

4.2 Caractéristiques électriques de la stimulation Les notions de physique traitant du courant électrique, des champs électrique et magnétique ainsi que de la conductivité et de la permittivité sont présentées annexe 5 (p. 160). La stimulation est un courant électrique pulsé à charge nulle de 40Hz (fig. 11). La fréquence fondamentale comporte un train d'impulsion de 4 secondes suivies de 4 secondes de pause. L'amplitude maximale des pulsations est de 20mA à la sortie du générateur. La stimulation est appliquée 40 minutes chaque jour durant 11 jours. Courant électrique (mA) Courant électrique Courant électrique (mA) Courant électrique Temps (ms) Temps (s)

Figure 11 : signal électrique

4.2.1 Caractérisation du signal électrique Afin de préciser les caractéristiques du signal électrique, nous avons reçu l'aide des Ingénieurs du Laboratoire Beams (Bio, Electro And Mechanical Systems) et du LISA (Laboratories of Image, Signal processing and Acoustics) de l'ULB. 4.2.1.1 Générateur et modèle expérimental Le générateur de courant est connecté en série à un condensateur de 2,1μF dont la décharge (en négatif) permet de libérer dans le milieu le nombre exact de charges accumulées (en positif). Le choix se porte sur un générateur de courant afin de libérer dans le circuit une même densité de courant ( ). Le générateur de tension présente le risque de créer une impédance de contact difficile à caractériser, c'est-à-dire une capacité aux bornes des électrodes qui rendrait la valeur du champ électrique ( ) difficile à déterminer. La constante de temps du potentiel électrique (V) mesurée à la sortie du générateur est de 430μs. La formule =. permet de calculer la valeur de la résistance (200Ω, valeur confirmée par une mesure au multimètre électronique). En ajoutant une résistance électronique en série de 200Ω, la constante de temps est doublée. La mesure de la constante de temps du potentiel électrique (V) permet de définir le support dermique comme une résistance pure. La figure 12 présente la valeur du champ électrique calculée à la valeur maximale d'intensité du courant pour le modèle incluant milieu de culture, mousse et support dermique (20mA). Le champ électrique a été mesuré en différents points à l'aide d'une aiguille et les mesures analysées à l'aide du logiciel de simulation COMSOL® Multiphysics. La validation de la simulation a été faite par comparaison aux mesures de potentiel électrique en différents points. La valeur de champ électrique, homogène entre les électrodes, est de 88,1V.m-1. La simulation a montré la

45 Chapitre 4 - Matériel et méthodes répartition uniforme du courant entre le derme et son environnement : la mesure de la résistivité montre que 20% de la densité de courant passe par le derme et 80% par le milieu de culture.

Figure 12 : simulation COMSOL, analyse du champ électrique

4.2.1.2 Champs électromagnétiques Pour notre modèle d'exposition, la fréquence de répétition (f) est de 40Hz et la distance (l) entre les électrodes est de 6cm. Il faut néanmoins noter que le signal est de type pulsé et que l'onde peut être transformée du domaine temporel dans le domaine fréquentiel par l'algorithme de Fourier. L'onde pulsée et sa fréquence de répétition sont transformées en une somme de sinusoïdes de fréquence croissante et d'amplitude variable. Notre signal pulsé présente des fréquences allant jusque ± 3000Hz. Pour déterminer dans quel régime de l'électromagnétisme le modèle se place et connaître les types de champs en présence, les équations de Maxwell (annexe 5.2, p. 160) sont nécessaires. Ces formules utilisent les valeurs de conductivité et de permittivité du milieu étudié. L'annexe 5.3 (p. 163) présente différentes études qui ont déterminé ces valeurs et bien qu'il y ait une certaine cohérence dans les résultats, les valeurs précises de conductivité et de permittivité de chaque type tissulaire restent difficiles à déterminer. Le tableau 7 présente les résultats de Tavernier et al. [1993] sur la conductivité (σ exprimée en S.m-1) du modèle de culture utilisé dans cette étude (notons que ces résultats sont pour le modèle saturé en milieu de culture et qu'il ne s'agit pas de valeurs pour les tissus isolés). Les résultats de la permittivité (ε exprimée en F.m-1) (tab. 8) sont quant à eux variables en fonction de la fréquence [Tavernier et al.,1993].

Tableau 7 : conductivité (S.m-1) du derme et de l’épiderme utilisés dans la culture et saturée en milieu de culture (σ du milieu de culture ≅ 2,05 S.m-1). Les valeurs sont constantes entre 1Hz et 100KHz

Orientation spatiale Derme Epiderme Dans le plan 2,57±0,83 0,95±0,37 Perpendiculaire au plan 1,62±0,33 0,15±0,02

46 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

Tableau 8 : permittivité (F.m-1) du derme et de l’épiderme utilisés dans la culture et saturée en milieu de culture

Derme Epiderme Fréquence Perpendiculaire au Perpendiculaire au Dans le plan Dans le plan Hz plan plan 3 2,14E-3±1.4E-3 2,82E-3±5,3E-3 2,24E-3±1,1E-3 - 30 1,74E-4±9,3E-3 4,57E-4±5,1E-4 2,19E-4±1,1E-4 7,08E-6±6,6E-6 300 3,31E-5±1,0E-5 1,91E-5±1,2E-5 1,05E-3±5,4E-6 1,66E-6±1,1E-6 3000 4,17E-6±2,0E-6 1,20E-6±4,7E-7 1,02E-6±9,7E-7 3,72E-7±7,8E-8

Les équations de Maxwell ont été appliquées au modèle expérimental pour caractériser le domaine électromagnétique de la stimulation utilisée :

8 -1 - : période temporelle, - c : vitesse de la lumière, (≈3.10 m.s ), exprimée en seconde (s) exprimée en mètre par seconde - l : distance fixée par la géométrie du modèle, - : période spatiale, exprimée en mètre (m) exprimée en seconde (s) - : période = , exprimée en seconde (s) - : fréquence, exprimée en Hertz (Hz)

1 1 = = =2,5.10 40

1 1 = = =3,3.10 3000

0,06 ∆ = = =2.10 3. 10

=.=3.10 . 0,025 = 7500

=.=3.10 .3,3.10 = 100

Pour notre modèle ∆ ≪ et ≪ : l'approximation des régimes quasi-statiques est ainsi validée. Une seconde méthode pour déterminer le régime applicable à notre modèle est de vérifier les temps caractéristiques de la stimulation en fonction de la fréquence et de son orientation :

- : temps de diffusion des charges électriques - : perméabilité du matériau, exprimé en seconde (s) exprimée en henrys par mètre (H.m-1) - - : temps de propagation de l'onde EMF, : conductivité du matériau, -1 exprimé en seconde (s) exprimée en henrys par mètre (H.m ) - : permittivité diélectrique du matériau, - : distance fixée par la géométrie du modèle, exprimée en farad par mètre (F.m-1) exprimée en mètre (m)

47 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

Temps de diffusion* des charges électriques dans le plan à 30Hz pour l'épiderme

2,19. 10 = = = 2,31.10 0,95

Temps de diffusion des charges électriques perpendiculaires au plan à 30Hz pour l'épiderme

7,08. 10 = = = 4,72.10 0,15

Temps de diffusion des charges électriques dans le plan à 3000Hz pour l'épiderme

1,02. 10 = = = 1,07.10 0,95

Temps de diffusion des charges électriques perpendiculaires au plan à 3000Hz pour l'épiderme

3,72. 10 = = = 2,48.10 0,15

Temps de diffusion de la densité de courant dans le plan

= =4 .10 . 0,95. 0,06 = 4,30.10

Temps de diffusion de la densité de courant perpendiculaire au plan

= = 4 . 10 . 0,15. 0,06 = 6,79.10

Temps de propagation* de l'onde électromagnétique à 30Hz

= =. = 0,06. 7,08.10. 4 . 10 = 1,79. 10

Temps de propagation de l'onde électromagnétique à 3000Hz

= =. = 0,06. 1,02.10. 4 . 10 = 6,79. 10

On observe également par cette méthode que pour l'ensemble des conditions ≥ ,. Suivant Rapetti et al. [2014] notre modèle se situe dans un régime quasi-statique.

48 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

Si on utilise les valeurs de permittivité et de conductivité de la littérature [Gabriel et al., 2009;

Faes et al., 1999], bien que la valeur de se rapproche de , les conditions de simplification des formules de Maxwell pour le régime quasi-statique peuvent s'appliquer. Il n'y a pas de déphasage temporel entre courant et tension dans ce régime, champ électrique et champ magnétique peuvent être considérés séparément car ils sont découplés dans l'équation de Maxwell. L'importance que prend le terme correspondant aux courants de déplacement dans l'équation de Maxwell-Ampère devient négligeable. Le modèle utilisé présente donc un champ magnétique induit négligeable. 4.3 Protocole expérimental 4.3.1 Chronologie

La culture cellulaire commence par une période de 3 jours de stabilisation dans l'incubateur (J-3 à J1). A J1, les boîtes de Pétri contenant chacune 6 explants comme décrit à la phase 2 (p. 42) sont divisées en un groupe stimulé (S) et un groupe témoin (T). La culture cellulaire se poursuit pendant 12 jours incluant pour le groupe S, 40 minutes de stimulation chaque jour durant 11 jours. Les prélèvements de 12 explants provenant chacun d'une des huit conditions expérimentales ont

été réalisés à cinq temps d'échantillonnage. Le premier à J-3 lors de la découpe des explants à l'aide du Punch Biopsy, le second à J1 juste avant la première stimulation, suivi de trois prélèvements à J4, J7 et J12 pour le groupe témoin et le groupe stimulé. Pour le groupe stimulé, J4S correspond à 3 périodes de stimulation plus 24h, J7S 6 périodes de stimulation plus 24h et J12S 11 périodes de stimulation plus 24h (fig. 13). Le protocole complet de culture cellulaire a été réalisé à 3 reprises à partir de 3 épidermes provenant d'abdominoplastie de sujets distincts et les ARN des explants ont été analysés grâce à 24 puces microarrays Affymetrix GeneChip® human genome U133 Plus 2.0. 4.3.2 Prélèvement des explants et extraction de l'ARN Pour récolter la quantité minimale d'ARN nécessaire à la réalisation de l'analyse microarray, 12 explants placés sur 2 supports dermiques, chacun mis en culture dans une boîte de Pétri, sont nécessaires pour chaque condition d'échantillonnage. Une culture complète nécessite 14 supports dermiques et 96 explants épidermiques. Le protocole microarray réalisé à partir de 3 épidermes différents utilise donc 288 explants et 42 supports dermiques. 4.3.2.1 Procédure Les 12 explants sont détachés stérilement des 2 dermes à l'aide d'une lame de bistouri et d'une pince puis sont immédiatement placés dans une solution de RNAlater* à -20°C. Lorsque l'ensemble des échantillons a été prélevé, les 12 explants de chaque temps d'échantillonnage sont homogénéisés à l'aide d'un homogénéiseur rotor-stator Silent Crusher S Heidolph utilisant une tête 3F pour les volumes de 0,8 à 1 ml (pour microtubes type Eppendorf) en présence de Buffer RLT*. Pour extraire l'ARN des explants, nous avons utilisé la procédure "Animal Tissues Protocol" du RNeasy Mini Kit* (Qiagen®). La procédure est complétée par l'utilisation d'une colonne

49 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

QIAshredder* afin d'améliorer l'homogénéisation et filtrer les débris insolubles. L'étape optionnelle "RNase-Free DNase Set" est intégrée au protocole d'extraction afin d'éliminer toutes traces d'ADN des échantillons.

J4S J7S J12S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Groupe stimulé

--33 -2-2 -1-1

J-3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Groupe témoin

J1T J4T J7T J12T

Echantillonnage Attachement des explants / pas de stimulation

Stimulation : 40 min Groupe témoin / pas de stimulation

Identification des échantillons Groupe stimulé / stimulation J-3, J1T, J4T, J7T, J12T, J4S, J7S, J12S avec J = Jour; T = Témoin; S = Stimulé Unité de temps : 1 jour

Exemple :

ème - J4T : échantillonnage au 4 jour de culture après l'attachement des explants groupe témoin. ème - J7S : échantillonnage au 7 jour de culture après l'attachement des explants et 6 périodes de 40 minutes de stimulation, groupe stimulé. Figure 13 : schéma expérimental

4.3.2.2 Mise au point de l'extraction de l'ARN : quantité et qualité des échantillons Deux supports dermiques avec les épidermes de deux donneurs différents ont servi à déterminer le nombre d'explants à prélever lors de chaque échantillonnage. - Homogénéisation au rotor-stator : ▪ Choix de l'appareil : ▪ deux homogénéiseurs ont été testés afin de déterminer l'appareil "mixant" le mieux les explants. Le choix s'est porté sur le modèle Silent Crusher S Heidolph avec la tête 3F pour les volumes de 0,8 à 1 ml en microtubes. ▪ Utilisation : ▪ sur un lit de glace, les explants prélevés à différents temps de culture sont homogénéisés à l'aide du rotor-stator dans une solution de lyse (Buffer RLT, β-ME). - Extraction de l'ARN : ▪ Suivant la procédure "Protocol Animal Tissues" du kit " RNeasy Mini" (Qiagen®).

50 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

- Mesure de la quantité, qualité et pureté des échantillons :

▪ On peut estimer l'extraction d'ARN à 500ng/explants pour un échantillonnage à J12T. ▪ Une étape de filtration sur colonne QIAshredder est ajoutée au protocole d'extraction afin d'améliorer l'homogénéisation et la purification des échantillons d'ARN. ▪ La migration sur gel de l'échantillon d'ARN montre une contamination par de l'ADN. Lors de l'extraction, une étape de traitement par DNase a été utilisée pour résoudre le problème. 4.3.3 Analyse de l'expression des gènes 4.3.3.1 Microarray a. Intérêt de la technique Les microarrays (puces à ADN) permettent d'analyser le niveau d'expression de gènes, voire du génome complet, d'une cellule ou d'un tissu par rapport à un échantillon de référence. La technique est rappelée à l'annexe 2 (p. 146). b. Choix de la puce microarray Le but est de rechercher les gènes dont l'expression a été modifiée par la stimulation électrique. Nous avons opté pour la puce microarray Affymetrix GeneChip® human genome U133 Plus 2.0 qui permet l'analyse sur 38.500 gènes, soit l'ensemble du génome humain [Affymetrix]. c. Protocole Nous avons réalisé le protocole en collaboration avec PartnerChip (Commissariat à l'Energie Atomique (CEA), Evry France). Les échantillons ont été préparés et hybridés selon le protocole Affymetrix double-cycle prévu pour les échantillons ayant, après extraction, une quantité en ARNtotal comprise entre 10 et 100ng. Il comprend un cycle supplémentaire pour la synthèse des ADN complémentaires* (ADNc) suivi d'une amplification afin d'obtenir des quantités ARNc marqués suffisantes pour une analyse avec les puces microarrays. La fluorescence est détectée à l'aide d'un scanner Affymetrix GeneChip® 3000. Les données d'expression ont été générées en utilisant le logiciel Affymetrix GCOS. Le contrôle qualité des puces a été réalisé sur base du rapport 3'/5' des sondes* contrôles "glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase" et "β-actine". 4.3.3.2 Validation : qRT-PCR Nous avons validé les résultats obtenus avec les puces microarrays en analysant par qRT-PCR l'expression de 5 transcrits à partir d'ARN provenant des 3 cultures épidermiques pour l'ensemble des temps d'échantillonnage (excepté pour un sujet au temps J7 et J12 par manque d'ARN). Les gènes choisis pour cette validation ont été sélectionnés après une première analyse des résultats microarrays (chap. 5.2.1.2, p. 59). a. Technique La PCR, technique d'amplification de l'ADN in vitro, permet de repérer un fragment d'ADN ou de gène défini, même présent en quantité infime, et d'en obtenir un grand nombre de copies. La PCR quantitative en temps réel est une amélioration de la PCR qui permet de suivre "en temps

51 Chapitre 4 - Matériel et méthodes réel" le processus d’amplification PCR en détectant la fluorescence émise par les produits de PCR néo formés et d'ainsi connaître la quantité d'ADN formé à chaque instant. Le fonctionnement de la technique est rappelé à l'annexe 3 (p. 150). b. Sélection des amorces Les amorces* (primers) sont sélectionnées à l'aide du logiciel Primer31 [Koressaar et al., 2007; Untergrasser et al., 2012] utilisant une séquence FASTA* obtenue sur le site du National Center for Biotechnology Information2. Elles ont été vérifiées par le logiciel Standard Nucleotide BLAST3. c. Choix des gènes de normalisation La normalisation de l'expression a été faite avec la beta-2-microglobulin (B2M) et TATA box- binding protein, deux gènes faisant partie d'une liste proposée par Allen et al. [2008] comme référence de normalisation pour les qRT-PCR réalisées sur les kératinocytes humains. Nos résultats microarrays montrent également des taux d'expressions similaires pour ces deux gènes dans les échantillons témoins et stimulés. 4.4 Statistique des microarrays 4.4.1 Fold Change et logarithme du Fold Change Si la condition expérimentale stimulée exprime 4 fois plus la sonde étudiée que la condition témoin, on dit que le gène est sur-exprimé par la stimulation. Le ratio nommé Fold Change (FC) est égal à =4. Pour les gènes sur-exprimés le FC est supérieur à 1. Si la condition expérimentale stimulée exprime 4 fois moins la sonde étudiée que la condition témoin, on dit que le gène est sous-exprimé par la stimulation. Le FC est égal à =0,25. Pour les gènes sous-exprimés le FC se situe entre 0 et 1. Pour obtenir une meilleure symétrie lors de la visualisation des résultats, les valeurs des FC sont transformées en valeurs logarithmiques (base 2). Une transformée logarithmique est symétrique à sa transformée inverse (log2 (X) = -log2 ( )). Lorsque l'on compare l'expression d'un gène entre sa condition A (stimulée) et B (témoin), la valeur obtenue a la même valeur absolue que l'on compare A vs B ou B vs A et le signe indique le sens de l'expression. Exemple (échantillon stimulé par rapport au témoin) :

- gène sur-exprimé 4 fois : FC = = 4 log2 (FC) = log2 ( ) = log2 (4) - log2 (1) = 2 - gène sous-exprimé 4 fois : FC = =0,25 log2 (FC) = log2 ( ) = log2 (1) - log2 (4) = -2

1 http://frodo.wi.mit.edu 2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore 3 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov Dernier accès le 07/09/ 2015

52 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

4.4.1.1 Relative Fold Change Par convention, afin de mieux visualiser la variation de l'expression, il est admis qu'un FC < 1 (sous-exprimé) s'écrive avec sa valeur inverse ( ) précédée d'un signe négatif pour indiquer la sous-expression; c'est le "Relative FC" que nous écrirons FCR [Chen et al., 2003; Ingersoll et al., 2010; Liu et al., 2015]. Les calculs logarithmiques se font exclusivement à partir du FC original (compris entre 0 et 1 pour les gènes sous-exprimés).

Si FC > 1 alors FCR = FC et si FC < 1 alors FCR = - Exemple : si FC = 0,25, par convention, FCR = - = -4 , 4.4.1.2 Fold Change et réplicas biologiques

Trois réplicas biologiques ont été analysés pour chacune des conditions expérimentales (J-3, J1, J4S, J4T, J7S, J7T, J12S ou J12T). Après normalisation, les taux d'expression sont exprimés sous forme logarithmique. Le FC entre la condition expérimentale A et B pour une sonde donnée peut

être obtenu en calculant la différence entre la moyenne arithmétique de l'expression (log2) de la sonde dans les 3 puces microarrays (condition expérimentale A) et celle de la condition expérimentale B.

Calculer le log2 (FC) en réalisant la moyenne arithmétique des log2 (FC) obtenus pour chacun des réplicas donne le même résultat. Si pour une raison quelconque le calcul du FC se fait à partir du taux d'expression réel (non transformé en log2) c'est la moyenne géométrique qui est alors utilisée. 4.4.2 Variation significative de l'expression des gènes

Dans le manuscrit, les FC sont écrits sous la forme FCR ou sous la forme logarithmique avec l'indication log2 (FC). En accord avec les valeurs classiquement admises dans la littérature, nous avons défini une sonde microarray comme présentant une variation significative de son expression si la valeur de p après un test t de Student est inférieure ou égale à 0,05 et si la valeur absolue du FCR est supérieure ou égale à 2 (IFCRI ≥ 2). 4.4.3 Normalisation et analyse statistique des données microarrays La normalisation et l'analyse statistique des puces à ADN ont été effectuées en utilisant le programme ArrayAssist1 Expression (Agilent Technologies-Stratagene Products) pour l'analyse de la variance (ANOVA) et l'analyse des k-means. L'analyse de la variance a été menée sur les résultats des échantillons témoins (J1, J4T, J7T, J12T) et stimulés (J1, J4S, J7S, J12S). Le partitionnement de données (data clustering) est une méthode statistique d'analyse qui divise un ensemble de données en différents "paquets" homogènes (ou clusters). Le partitionnement en k-moyennes (ou k-means) est une méthode de "regroupement des données" couplée à une "optimisation combinatoire" cela consiste à trouver dans un ensemble

53 Chapitre 4 - Matériel et méthodes discret (points épars, isolés les uns des autres) des sous-ensembles partageant des caractéristiques communes. Le nombre de clusters k est fixé et les points de données épars sont répartis en fonction de la valeur d'un point à la moyenne des points de son cluster. 4.4.4 Utilisation de LIMMA et analyse par triangulation Le modèle d'analyse Linear Models for MicroArray (LIMMA) [Smyth, 2004] est une méthode statistique d'analyse de la variance pour les données obtenues à partir d'une analyse de l'expression des gènes par microarray. Il a l'avantage de donner des résultats robustes, même pour les expériences avec petit nombre de puces microarrays. Le modèle est prévu pour analyser la différence d'expression entre deux conditions expérimentales pour une même sonde. LIMMA est particulièrement utile pour déterminer les changements lorsque de nombreuses variables sont présentes (différents génotypes ou différents temps de prélèvement). LIMMA procure une "statistique t modérée" pour les gènes modifiés de manière significative. Plutôt que de considérer chaque gène isolément, la statistique t modérée analyse l'information de variabilité d'autres gènes présents sur la puce et calcule la valeur de t. La méthode LIMMA permet d'améliorer la puissance du test t. Nous avons effectué l'analyse de l'expression des gènes suivant le modèle LIMMA afin d'identifier les listes de gènes exprimés de manière différentielle entre différents groupes de gènes (fig. 14).

1. J4S vs J4T (J7S vs J7T) : avec cette analyse entre groupe stimulé et groupe témoin à un même jour d'échantillonnage, nous pouvons identifier les gènes susceptibles d'être des marqueurs de mécanismes cellulaires activés ou inhibés par stimulation ELF.

2. J7T vs J4T (J12T vs J4T; J12T vs J7T) : par l'analyse des groupes aux différents temps de prélèvements témoins, nous pouvons identifier les gènes présentant une modification naturelle de leur expression au court du temps. Ces gènes devraient être impliqués dans des mécanismes qui évoluent naturellement au cours du temps (prolifération ou différentiation cellulaire).

3. J4S vs J7T (J4S vs J12T; J7S vs J12T) : cette analyse entre un groupe stimulé prélevé à un temps précoce et un des groupes témoins prélevé à un temps plus tardif nous permet d'identifier les gènes qui n'ont pas de différence d'expression. Un gène avec p ≥ 0,05 aura la même expression dans le groupe stimulé et témoin.

Nous avons analysé par triangulation l'expression des gènes aux différents temps de prélèvement. L'échantillonnage au cours du temps permet de comparer à l'évolution naturelle du groupe de témoins l'effet de la stimulation à un temps T. Dans une première étape, nous comparons les profils d'expression des gènes provenant des

échantillons stimulés aux échantillons témoins prélevés au même temps (J4S vs J4T; J7S vs J7T) et avons sélectionné les gènes présentant une différence significative entre les deux groupes (p ≤ 0,05) (fig.14 : ). Dans la seconde étape, nous comparons les profils d'expression des gènes entre les groupes d'échantillons témoins aux différents temps de prélèvement. Le temps le plus précoce est celui

54 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

sélectionné à l'étape 1 (J7T vs J4T ou J12T vs J4T ou J12T vs J7T). Nous avons sélectionné les gènes présentant une différence significative entre les deux groupes (fig.144 : ). Dans la troisième étape, nous comparons les échantillons témoins les plus tardifs sélectionnés à l'étape 2 avec les échantillons stimulés sélectionnés à l'étape 1 (J4S vs J7T ou J4S vs J12T ou J7S vs J12T). Nous conservons la liste des gènes ne présentant aucune différence entre les deux groupes. (fig.14 : ). La dernière étape consiste à rechercher les gènes communs à ces trois listes ce qui permet d'isoler les gènes s'exprimant de la même manière suite à la stimulattion ELF ou par leur évolution naturelle à un temps ultérieur.

Stimulé S Stimulé S

Témoin T Témoin T J4 J7 J12 J4 J7 J12

Stimulé S

Témoin T J J J 4 7 12 Figgure 14 : principe de l'étude par trianguulation

4.5 Analyse des résultats 4.5.1 Par la littérature L'analyse de la littérature permet de rechercher la (les) fonction(s) des gènes ayant une fonction caractérisée. Ce type de recherche peut être orienté par les gènes ayant une forte variation de leur expression ou par les observations de nos premières études (chap. 1..3.2, p. 3) comme la prolifération et la différenciation [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a, 1997; Rooze et al., 1982, 1985; Hinsenkamp, 1994]. Cette analyse peut se faire sur une liste de gènes présentant des singularités telles qu'être présentes à chaque temps d'échantillonnage. 4.5.2 Par la bio-informatique Différents outils informatiques ont été utilisés pour analyser les résultats microarrays : - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [Kanehisa et al., 2000, 2014] est un ensemble de bases de données pouvant être utilisées pour des modélisations et des simulations ou plus simplement pour rechercher des données relatives aux génomes et aux voies métaboliques.

55 Chapitre 4 - Matériel et méthodes

- Le projet GeneOntology (GO) [Ashburner et al., 2000] fournit une représentation structurée d'un ensemble de concepts et de leurs relations à des "termes" définis représentant les propriétés de gènes. L'analyse "Gene-set enrichment" permet de réaliser le profil fonctionnel d'un grand nombre de gènes, de déterminer quel "terme" apparaît statistiquement plus fréquemment. Cette technique permet d'isoler une liste de gènes impliqués dans une fonction commune (pathway), statistiquement surreprésentés dans les résultats. - FatiGO [Al-Shahrour et al., 2004] est un outil Web qui recherche des associations significatives entre un groupe de gènes et les termes de Gene Ontology (GO). Il peut extraire les termes GO qui sont nettement sur- ou sous- représentés dans des résultats microarrays. - WebGestalt (WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit) [Zhang et al., 2005] est utilisé comme interface pour l'analyse fonctionnelle à l'aide des bases de données GO et KEGG lors d'études génétiques générant une quantité importante de données. Un gène peut être visualisé et organisé par une méthode choisie par l'utilisateur (GO, KEGG). Le module GO de WebGestalt permet de générer un "graphe orienté acyclique" (directed acyclic graph, DAG) avec les termes "GO biological processes enriched". La catégorie dite "enrichie" apparaît dans nos résultats statistiquement plus fréquemment qu'elle ne l'aurait été au hasard. - Le logiciel Pathway Studio (Elsevier anciennement Ariadne Genomics) [Nikitin et al., 2003] permet d’intégrer les données issues de la littérature Medline aux données expérimentales et de construire des réseaux d’interaction. Il aide à interpréter les données expérimentales dans le contexte des voies métaboliques et de leurs connections. Il aide à la construction de diagrammes reliant les interactions de gènes, de protéines ou de cascades de signalisation sur bases des résultats microarrays et des connaissances scientifiques référencées.

56

Chapitre 5 - Résultats et Discussion Les techniques d'observation utilisées pour l'analyse des données obtenues lors du protocole microarray ont généré une grande quantité de résultats. Pour facilliter la lecture et la compréhension, nous avons choisi de less présenter en fonction de la méthoode d'analyse et de les discuter directement dans un même chapitre. Vu les différents axes d'analyse, séparer résultats et discussion peut être source de confusion. 5.1 Analyse microarray et validation par qRT-PCR 5.1.1 Résultats L'analyse microarray a généré 8 fichiers de données pour chacun des 3 réplicas de culture cellulaire. Pour chacune des conditions expérimentales (J-3, J1, J4S, J4T, J7S, J7T, J12S ou J12T), constituée de 12 explants épidermiques dans chaque réplica, on calcule la moyenne arithmétique du logarithme en base base2 de l'expresssion d'une sonde à partir des résultats des 3 cultures cellulaires. Le log2 (FC) entre deux moyennes obtenues pour deux conditioons expérimentales est fourni par la différence entre les moyennes. La liste complète des sondes dont l'expression est significativement différente entre les groupes témoins et stimulés au même temps d'échantillonnage (J4S vs J4T, J7S vs J7T et J12S vs J12T) a été nommée "Liste A" (tab. A-1, p. 98). 5.1.2 Validation Bien que la validité des résultats obtenus par une analyse microarray aient été évaluées et confirmées [Canales et al., 2006; Morey et al., 2006] et qu'il ait été démontré que les données obtenues par microarray et par qRT-PCR étaient semblables, nous avons validé les résultats en analysant l'expression de 5 transcrits par PCR sur l'ensemble des temps d'échantillonnage et pour les trois cultures épidermiques. Les gènes choisis pour cette analyse de validation ont été sélectionnés suite à l'analyse des résultats chapitre 5.2.1.2 (p. 59). La comparaison des valeurs obtenues par ces deux techniques montre des variations d'expression des gènes comparables qui permetttent de valider l'analyse microarray [Collard et al., 2011].

La figure 15 compare pour 5 gènes les valeurs des FC (log2 FC) de l'analyyse microarray entre un échantillon stimulé et son échantillon témoin et les mesures par qRT-PPCR réalisées pour les mêmes gènes [Collard et al., 2011]. 5.2 Analyse manuelle des résulltats microarrays 5.2.1 Premières observations 5.2.1.1 Résultats

Une analyse de variance (J4S, J7S, J12S vs J1 et J4T, J7T, J12T vs J1) a été réalisée sur les données stimulées d'une part et non stimulées d'aauutre part. Pour le groupe témoin, 1131 gènes et pour le groupe stimulé, 471 gènes (p ≤ 0,01) présentent une régulation au cours du temps [Collard et al., 2011].

57 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

L'expression des gènes est ensuite comparée aux différents temps d'échantillonnage. Tout d'abord dans les deux groupes par rapport au témoin J1 (tab. 9) et ensuiite au même temps de prélèvement entre les groupes stimulés et témoins (tab. 10) avec IFCRI ≥ 2 et p ≤ 0,05 [Collard et al., 2011].

Figure 15 : comparaison des résultats obtenus par qRT-PCR et par microarray : rapport entre l'expression de 5 gènes stimulés et leurs témoins respectifs. La barre d'erreur, qui correspond à l'erreur standard sur

la moyenne, a été détet rminée à paarrtir des 3 valeurs de log2 (JXS) - log2 (JXT) obtenues pour chacun des réplicas

Tableau 9 : nombre de gènes présentant une modification de leur expression au cours du temps en comparant l’expression aux difféférents temps de prélèvement des gènes du groupe témémoin et le temps initial de prélèvement J1. La même comparaison a été réalisée entre les différents temps de prélèvements stimulés et le témoin J1 (IFCRI ≥ 2; p ≤ 0,05)

Jx Témoin/J1 Jx Stimulé /J1

Jx Sur-exprimé Sous-exprimé Sur-exprimé Sous-exprimé

J4 93 203 315 626

J7 389 313 228 397

J12 397 609 441 505

Tableau 110 : nombre de gènes préssentant une modification de leur expression : comparaison du grroupe stimulé

et du grroupe témoin au même temps de prélèvement (J4S vs J4T ou J7S vs J 7T ou J12S vs J12T) (IFCRI ≥ 2; p ≤ 0,05)

Stimulé/Témoin J4 J7 J12 Sur-exprimé 39 30 237 Sous-exprimé 265 190 259

58 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Si l'on compare la liste des gènes significativement sur- ou sous- régulés (IFCRI ≥ 2; p ≤ 0,05) aux trois temps stimulés avec leurs témoins respectifs, seeuls trois gènes sont systématiquement sur-exprimés à chaquue temps de prélèvement [Collard et al., 2011] :

J4 J7 J12

- Thioredoxin reductase 1 (TXNRD1) : FCR 2.02 3.22 2.34 p 0.05 0.05 0.02 - Activating transcription factor 3 (ATF3) : FCR 2.49 13.41 9.28

p 0.03 0.05 0.03

- Membrane metallo-endopeptidase (MME) : FCR 3.02 5.53 20.28

p 0.005 0.005 0.04

Une analyse rapide de la liste des gènes au temps de prélèvement J4 montrant une expression fortement modifiée entre l'échantillon stimulé et témoin (J4S vs J4T) permeett, grâce à la littérature, de mettre en évidence 2 gènes jouant un rôle complémentaire et bienn caractérisé : le gène

Dickkopf Homolog 1 (DKK1) est sur-exprimé (FCR = 4.42; p = 0.01) ett le gène microtubule- actine facteur 1 (MACF1) est sous-exprimé (FCR = -2,66; p = 0.008) [Collard et al., 2011]. L'analyse microarray du prélèvement

à 12 jours de stimulation (J12S) comparée à son témoin (J12T) montre une augmentation significative de la quantité d'ARNm de la BMP-2 (fig. 16) [Hinsenkamp et al., 2011]. Figure 16 : logarithme (base 2) du FC de l'expression de BMP-2 des échantillons stimulés comparés à leur témoin au même temps de prélèvement. La barre d'erreur, qui correspond à l'erreur standard sur la moyenne, a été déterminée à partir des 3 valeurs de log2 (JXS) - logo 2 (JXT) obtenues pour chacun des réplicas

5.2.1.2 Discussion La variation de l'expression de nombreux gènes (tab. 9 et 10) confirme quue les cellules ont réagi à la stimulation ELF [Collard et al., 2011]. a. Expression du groupe témoin et stimulé au cours du temps

Si on analyse l'expression des gènes dans le temps entre groupe témoin (J4T, J7T, J12T vs J1) et groupe stimulé (J4S, J7S, J12S vs J1), pour la quasi-totalité des sondes régulées (IFCRI ≥ 2; p ≤ 0,05), une même sonde a le même type de régulation (sur- ou sous-régulé) aux autres temps de prélèvement dans les deux grroupes. Seules 3 sondes (EPS8, ADAMTS1 et NOS1), sur-exprimées au temps de prélèvement J4S, sont sous-exprimées au teemps J12T comparé au témoin J1. EPS8 (Epidermal growth factor receptor pathway substrate 8) a été identifié comme

59 Chapitre 5 - Résultats et Discussion substrat du "Epidermal Growth Factor Receptor" (EGFR). Il joue un rôle dans la régulation et l'équilibre entre prolifération et différenciation cellulaire. L'expression de EPS8, augmentée durant la prolifération, est diminuée lors de la différenciation terminale [Gallo et al., 1997]. Lors de la cicatrisation des plaies cutanées, ADAMTS1 (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1) est sur-exprimé lors de la phase de prolifération des cellules non différenciées et régulé à la baisse lorsque les kératinocytes commencent à se différencier [Krampert et al., 2005]. NOS1 (Nitric oxide synthase 1 neuronal) catalyse la production d'oxyde nitrique (NO) importante molécule de signalisation. NO est connu pour son rôle dans l'activation ou l'inhibition de la prolifération et de la différenciation. NOS1 joue également un rôle dans la communication cellulaire au niveau de la membrane plasmique [Napoli et al., 2013].

Si la stimulation augmente ou diminue la régulation de certains gènes par rapport à J1 (témoin), la variation reste statistiquement insuffisante pour inverser la sens de la régulation naturelle: si dans un groupe une sonde montre une variation positive de son expression

(FCR ≥ 2; p ≤ 0,05), elle sera soit sur-exprimée dans les autres groupes (stimulés ou témoins) soit sans effet. Cette observation est également valable pour les sondes sous-exprimées. Si on observe la liste des sondes non régulées au cours du temps dans le groupe témoin, on voit que pour le groupe stimulé, ces sondes sont plus fréquemment sous-exprimées que sur-exprimées. Quantitativement, la stimulation aurait tendance à inhiber un plus grand nombre de gènes. b. Gènes systématiquement régulés

La comparaison des 3 listes de gènes (J4S vs J4T, J7S vs J7T, J12S vs J12T) montre que seuls trois gènes ont systématiquement une modification de leur expression aux trois temps de stimulation comparés à leurs témoins respectifs [Collard et al., 2011]. Ces trois gènes sur-exprimés sont : - TXNRD1 (Thioredoxin reductase 1) : ▪ est impliqué dans la régulation de la prolifération chez l'embryon [Jakupoglu et al., 2005]; ▪ ce gène code pour un membre de la famille des "pyridines nucleotides oxidoreductases". La protéine réduit la thiorédoxine et joue un rôle dans le métabolisme du sélénium ainsi que dans la protection contre le stress oxydatif. L'enzyme fonctionnelle est considérée comme un homodimère qui utilise FAD comme cofacteur. Il est connu pour réguler entre autre TP53, AP-1, NFkB, NADPH, FAS [NCBI handbook, 2012]. - ATF3 (Activating transcription factor 3) : ▪ sa présence est accrue lors de la différenciation des chondrocytes [James et al., 2006]; ▪ ce gène code pour un membre du "mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding (CREB)", protéine de la famille des facteurs de transcription. Cette protéine est impliquée dans le processus de la réponse cellulaire au stress. Il existe différentes variantes de la transcription du gène codant pour différentes isoformes de la protéine. Elle joue un rôle dans le pathway PI3K et est

60 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

connue pour être régulée entre autres par TP53, IFNG, ATF4, P38 MAPK [NCBI handbook, 2012]. - MME (Membrane metallo-endopeptidase : ▪ est connu pour dégrader la substance P qui est impliquée dans la prolifération, l'activation et la motilité des kératinocytes et des fibroblastes [Xie et al., 2011]. ▪ sa protéine se trouve dans une variété de tissus normaux mais est également un marqueur de la leucémie lymphocytaire aiguë humaine. C'est une glycoprotéine qui est particulièrement abondante dans le rein, où elle est présente sur la bordure en brosse des tubules proximaux et sur l'épithélium glomérulaire. Cette enzyme est une endopeptidase qui inactive les hormones peptidiques du glucagon, des enképhalines, de la substance P, de la neurotensine, de l'oxytocine ou de la bradykinine [NCBI handbook, 2012]. c. Gènes codant DKK1 et MACF1

L'analyse de la liste de gènes (J4S vs J4T) montre que le gène DKK1 est significativement sur-exprimé 4,4 fois plus dans le groupe stimulé que dans le groupe témoin. DKK1 joue un rôle dans la régulation négative de la voie de signalisation Wnt [van der Horst et al., 2005]. L'effet de cette régulation négative de Wnt est une réduction de la prolifération cellulaire [Pasca di Magliano et al., 2007] et une induction de la différenciation cellulaire terminale [Boyden et al., 2002; van der Horst et al., 2005]. Beaucoup d'effets de Wnt sont régulés par la β-caténine qui s'accumule dans le cytoplasme et est transloqué* dans le noyau si la voie Wnt est activée. En l'absence de la signalisation Wnt, la β-caténine est phosphorylée par la sérine/thréonine kinase, la caséine kinase et GSK-3 [Nusse, 2005]. DKK1 est régulé par les protéines kinases, (SAPK)/c- Jun amino-terminal kinases (JNK) signaling cascade [Colla et al., 2007]. SAPK/JNK est activé par une variété de stress environnementaux, tels que les UV ou les rayonnements gamma, les cytokines inflammatoires et les facteurs de croissance [Johnson et al., 2007; Weston et al., 2007]. Certains stress environnementaux sont des rayonnements et un récepteur ELF serait donc susceptible de compléter la liste des récepteurs ou des activateurs de la voie de signalisation JNK [Collard et al., 2011]. Microtubule-actin cross-linking factor 1 (MACF1) est quant à lui significativement sous-exprimé 2,7 fois dans le groupe stimulé. Il joue également un rôle dans la voie de signalisation Wnt/β-caténine mais comme inhibiteur en aval [Chen et al., 2006]. Une voie de signalisation Wnt active nécessite une translocation de l'axine et de ses protéines associées à travers la membrane cellulaire [Chen et al., 2006], cette translocation est impossible sans la présence de MACF1. La régulation négative de MACF1 a la même fonction que DKK1 sur la molécule Wnt: une inactivation de la voie Wnt et une diminution de la concentration en β-caténine [Collard et al., 2011]. Dans la littérature, certaines publications ont montré un effet possible des EMF sur la leucémie infantile (chap. 2.4.1.1 a, p. 27). La leucémie la plus fréquente chez l'enfant est la leucémie lymphoblastique aiguë (ALL). Plusieurs documents sur ce sujet indiquent que les ALL présente une activation de la voie de signalisation Wnt [Khan et al., 2007] ainsi qu'une augmentation de la concentration de la β-caténine [Chung et al., 2002]. D'autres ont présenté une inhibition de la

61 Chapitre 5 - Résultats et Discussion voie de signalisation Wnt comme ''une cible d'intérêt pour l'utilisation des thérapies plus spécifiques…'' [Román-Gómez, 2007]. Dans nos résultats, la β-caténine (présente dans la voie de signalisation Wnt) et la voie de signalisation Wnt sont inhibées par l'expression accrue du gène responsable de la synthèse de DKK1 ainsi que la diminution de l'expression du gène responsable de la synthèse de MACF1 [Collard et al., 2011]. d. Gène codant BMP-2

L'analyse microarray du prélèvement à 12 jours de stimulation (J12S) comparé à son témoin (J12T) a montré une augmentation significative de la quantité d'ARNm de la BMP-2 dans les cellules épidermiques humaines stimulées [Hinsenkamp et al., 2011]. Les effets de la BMP-2 sont comparables à ceux observés précédemment sur le même type cellulaire [Hinsenkamp et al., 1997]. Stelnicki et al. [1998] ont montré que la BMP-2 utilisée seule produit un épaississement épidermique marqué et une augmentation de la kératinisation reflétant un effet sur la maturation cellulaire. La sur-expression de l'ARNm de BMP-2 a été observée avec un courant électrique bi-phasique sur les cellules souches mésenchymateuses [Kim et al., 2009], avec un PEMF sur des ostéoblastes de rat [Bodamyali et al., 1998] et avec un couplage capacitif sur les cellules osseuses de souris [Wang et al., 2006]. Les effets synergiques entre la BMP-2 et les PEMF ont été montrés sur les cellules ostéoblastiques de rat [Selvamurugan et al., 2007] et les cellules souches mésenchymateuses [Schwartz et al., 2008]. Les modèles animaux précédemment utilisés ainsi que des études cliniques sur les fractures fraîches exposées aux EMF ont montré une rigidité précoce du cal avec une moindre formation de cal périosté [Hinsenkamp et al., 1978, 1984; Hinsenkamp, 1994] suggérant une accélération de l'ossification membraneuse précoce compatible avec les effets d'une augmentation de la BMP-2 décrits dans la littérature [Bostrom et al., 1995; Ishidou et al., 1995]. Une analyse clinique des résultats de 308 cas de pseudarthrose a montré que les pseudarthroses hypertrophiques ont significativement un meilleur pronostic de guérison après exposition aux ELF (87,8%) comparées aux pseudarthroses atrophiques. L'accélération de la maturation d'un volume important de fibrocartilage préexistant peut expliquer ce résultat et est compatible avec une augmentation de la production de BMP-2 [Hinsenkamp et al., 1985b; Bostrom, 1998; Bostrom et al., 1998]. Le rôle des BMPs, en particulier celui de la BMP-2, dans l'ostéogenèse et la consolidation des fractures est connu [Bishop et al., 2007; Borovecki et al., 2007; McKay et al., 2007; Pecina et al., 2007; Kwong et al., 2009]. Des études antérieures réalisées sur l'exposition de l'os embryonnaire à des EMF montrent une accélération de la maturation du cartilage qui précède immédiatement l'ossification enchondrale [Hinsenkamp et al., 1982; Rooze et al., 1982; Hinsenkamp 1994] ainsi qu'une accélération de l'ossification membraneuse. Ces effets sont connus pour être liés à l'action de la BMP-2 [Hinsenkamp et al., 1985a; Rooze et al., 1985; Hinsenkamp, 1994]. Cette observation a été confirmée par Jansen et al. [2010] qui ont montré, en utilisant des PEMF, une minéralisation accrue de cellules souches dérivées de la moelle osseuse couplée à l'augmentation du taux d'ARNm de la BMP-2. Ils ont également conclu qu'il y avait induction de la différenciation au détriment de la prolifération.

62 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

5.2.2 CClusterinng en k-means 5.2.2.1 Résultats La figure 17 présente les résultats pour le groupe témoin de l'analyse de cclustering en k-means (chap. 4.4.3, p. 53). La figure 18 présente les résultats de l'analyse pour lle groupe stimulé.

1 2 3

J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 4 5 6 A

J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 7 8 9 B C D

J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 Figure 17 : résultats de l'analyse de clustering en k-means, groupe témoin Nous avons utilisé FatiGO (chap. 4.5.2, p. 55) sur les sondes isolées à partir des 4 clusters du groupe témoin montrant une variation de l'expression au cours du temps (fig.17 A, B, C, D). Les processus biologiques mis en évidence sont présentés dans le tableau 11 [Collard et al., 2011]. Pour le groupe stimulé, les sondes ont également été isolées à partir de 4 clusters (fig.18 A, B, C, D) et annotées dans GOO (tab. 12) [Collard et al., 2011]. 5.2.2.2 Discussion L'analyse en k-means regroupe les sondes mises en évidence dans l'anallyse ANOVA en neuf clusters ayant des comportements d'expression similaires. Pour le groupe témoin (fig. 17), 2 profils contenant 19 et 99 sondes présentent une augmentation de la régulation au cours du temps; 2 profils contenant 29 et 76 sondes ont une régulation diminuée. 138 des 223 sondes mises en évidence dans ces 4 profils sont annnnotés au niveau 3 dans les processus biologiques de GO (tab. 11).

63 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

1 2 3

J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 4 5 6

A B

J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 7 8 9

C D

J1 J4 J7 J12 J1 J4 J7 J12 J1 J4 JJ7 J12 Fiigure 18 : résultats de l'analyse de clustering en k-means, groupe stimulé

Pour le groupe stimulé (fig. 18), 2 profils contenant 11 et 41 sondes préésentent également une augmentation de la régulation au cours du temps et 2 profils contenantt 6 et 24 sondes pour lesquelles la régulation est diminuée. L'analyse par GO de ces 82 sondes mises en évidence dans ces 4 profils montre une annotation au niveau 3 pour 51 d'entre eux (tab. 12). 33 sondes isolées des 4 clusters témoins se trouvent également dans les clusters stimulés et présentent une régulation (sur- ou sous-régulée) allant dans le même sens pour les 2 groupes. Au même temps d'échantillonnage, le taux de régulation n'est pas pour autaannt identique entre une sonde du groupe témoin et du groupe stimulé. FatiGO est une interface Web cherchant les associations significatives ennttre la base de données GO et un groupe de gènes. L'analyse des deux tableaux de résultats Fatigoo (tab. 11 et 12) montre que 57% des voies de signalisation biologique mises en avant par GO estt strictement identique entre le groupe stimulé et le groupe témoin. Les processus biologiques communs comme "épidermis development" ou "ectoderm development" sont cohérents avec les premières observations [Hinsenkamp et al., 1997] : l'ectoderme, feuillet externe de l''embryon, joue un rôle dans le développement de l'épiderme, de sa formation à sa structure mature. "G-protein signaling" joue un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Ces processus sont actifs dans le modèle expérimental et sont le reflet d'une physiologie nnormale de la culture cellulaire.

64 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Tableau 11 : résultats obtenus par FatiGO de Gene Ontology Biological Process sur 223 gènes (groupe témoin)

Level GO Biological Process Number of genes level 3 cellular metabolic process (GO:0044237) 63 primary metabolic process (GO:0044238) 58 regulation of biological process (GO:0050789) 54 cell communication (GO:0007154) 48 macromolecule metabolic process (GO:0043170) 43

level 4 signal transduction (GO:0007165) 43 regulation of cellular process (GO:0050794) 39 system development (GO:0048731) 32 anatomical structure morphogenesis (GO:0009653) 30 biopolymer metabolic process (GO:0043283) 29

level 5 organ development (GO:0048513) 28 cell surface receptor linked signal transduction (GO:0007166) 24 cellular protein metabolic process (GO:0044267) 22 cell development (GO:0048468) 19 negative regulation of cellular process (GO:0048523) 17

level 6 tissue development (GO:0009888) 13 regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolic 13 process (GO:0019219) organ morphogenesis (GO:0009887) 12 RNA biosynthetic process (GO:0032774) 12 cell death (GO:0008219) 12

level 7 ectoderm development (GO:0007398) 12 regulation of transcription (GO:0045449) 12 transcription, DNA-dependent (GO:0006351) 12 programmed cell death (GO:0012501) 9 cyclic-nucleotide-mediated signaling (GO:0019935) 7

level 8 epidermis development (GO:0008544) 12 regulation of transcription, DNA-dependent (GO:0006355) 12 apoptosis (GO:0006915) 9 transcription from RNA polymerase II promoter (GO:0006366) 9 regulation of programmed cell death (GO:0043067) 8

level 9 regulation of apoptosis (GO:0042981) 8 regulation of transcription from RNA polymerase II promoter (GO:0006357) 7 angiogenesis (GO:0001525) 6 positive regulation of programmed cell death (GO:0043068) 6 G-protein signaling, coupled to cAMP nucleotide second messenger 6 (GO:0007188)

Des processus biologiques tels que "Sphingoid catabolic process", "Prostanoid" ou "Icosanoid metabolic process", "Osteoblast differentiation" ainsi que le "Transforming growth factor beta receptor signaling pathway" sont uniquement présents dans le groupe stimulé. On sait que les sphingoïdes, à la base de la fabrication de tous les sphingolipides, sont des médiateurs importants des voies de signalisation impliquées dans la prolifération, la différenciation, l'apoptose, la réponse au stress ou l'inflammation. [Hannun et al., 2002; Spiegel et al., 2002; Snider et al., 2010]. Les prostaglandines, les prostacyclines et les thromboxanes font partie de la famille des prostanoïdes, qui sont des eicosanoïdes, et constituent une vaste famille de dérivés d'oxydation d'acides gras polyinsaturés à 20 atomes de carbone. Les prostanoïdes sont connus pour leur effet anti-inflammatoire et leurs rôles dans la cicatrisation. "TGF-β receptor signaling pathway" joue un rôle dans la différenciation cellulaire.

65 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Tableau 12 : résultats obtenus avec l'outil FatiGO de Gene Ontology Biological Process sur 82 gènes (groupe stimulé)

Level GO Biological Process Number of genes level 3 cellular metabolic process (GO:0044237) 30 primary metabolic process (GO:0044238) 28 cell communication (GO:0007154) 18 macromolecule metabolic process (GO:0043170) 17 regulation of biological process (GO:0050789) 16

level 4 signal transduction (GO:0007165) 15 regulation of cellular process (GO:0050794) 13 system development (GO:0048731) 11 protein metabolic process (GO:0019538) 10 biopolymer metabolic process (GO:0043283) 9

level 5 cell surface receptor linked signal transduction (GO:0007166) 9 cellular protein metabolic process (GO:0044267) 8 organ development (GO:0048513) 8 cellular lipid metabolic process (GO:0044255) 8 pregnancy (GO:0007565) 7

level 6 tissue development (GO:0009888) 7 proteolysis (GO:0006508) 5 G-protein coupled receptor protein signaling pathway (GO:0007186) 4 protein modification (GO:0006464) 4 RNA biosynthetic process (GO:0032774) 4

level 7 ectoderm development (GO:0007398) 7 fatty acid metabolic process (GO:0006631) 4 transcription, DNA-dependent (GO:0006351) 4 regulation of transcription (GO:0045449) 3 post-translational protein modification (GO:0043687) 3

level 8 epidermis development (GO:0008544) 7 G-protein signaling, coupled to cyclic nucleotide second messenger (GO:000 3 icosanoid metabolic process (GO:0006690) 3 regulation of transcription, DNA-dependent (GO:0006355) 3 transforming growth factor beta receptor signaling pathway (GO:0007179) 3

level 9 prostanoid metabolic process (GO:0006692) G-protein signaling, coupled to cAMP nucleotide second messenger (GO:000 3 osteoblast differentiation (GO:0001649) 2 positive regulation of programmed cell death (GO:0043068) 1 sphingoid catabolic process (GO:0046521) 1

Les processus de régulation "mort cellulaire programmée" et "régulation de la transcription" sont présents dans les deux groupes mais les processus qui traitent de la régulation de l'apoptose et des mécanismes de la transcription cellulaire sont mieux représentés dans le groupe témoin. 5.3 Analyse par triangulation 5.3.1 Résultats La méthode d'analyse est présentée au chapitre 4.4.4 (p. 53). Pour rappel, nous avons tout d'abord observé une différence significative dans la régulation de l'expression d'un certain nombre de gènes entre le témoin (J4T) et le stimulé (J4S). Nous avons ensuite relevé un autre groupe de gènes ayant une différence significative dans leur expression pour le groupe témoin entre J4T et J7T. Pour terminer, nous avons sélectionné à partir des gènes communs aux deux premières listes, les gènes ne présentant aucune différence (p ≥ 0,05) entre le

66 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

groupe stimulé J4S et le groupe témoin J7T. La même analyse a été réalisée avec J4S-J4T-J12T et J7S-J7T-J12T [Collard et al., 2013].

- Triangle J4S-J4T-J7T

319 sondes de la puce microarray répondent aux trois conditions du triangle J4S-J4T-J7T (p ≤ 0,05 pour J4S/J4T et J7T/J4T; NS pour J4S/J7T). Dans cette liste, 271 sondes sont régulées à la baisse par la stimulation ELF; 48 régulées

à la hausse. La liste des 319 sondes se réduit à 33 si nous appliquons un IFCRI ≥ 2 (tab A-2A, p. 120).

- Triangle J4S-J4T-J12T

183 sondes de la puce microarray répondent aux trois conditions du triangle J4S-J4T- J12T (p ≤ 0,05 pour J4S/J4T et J12T/J4T; NS pour J4S/J12T). Dans cette liste, 159 sondes sont régulées à la baisse par la stimulation; 24 régulées à la

hausse. La liste des 183 sondes se réduit à 25 si nous appliquons un IFCRI ≥ 2 (tab A-2B, p. 121).

- Triangle J7S-J7T-J12T

329 sondes de la puce microarray répondent aux trois conditions du triangle J7S-J7T- J12T (p ≤ 0,05 pour J7S/J7T et J12T/J7T; NS pour J7S/J12T). Dans cette liste, 301 sondes sont régulées à la baisse par la stimulation, 28 régulées à la

hausse. La liste des 329 sondes se réduit à 65 si nous appliquons un IFCRI ≥ 2 (tab. A-2C, p. 122). 5.3.2 Discussion Une analyse statistique par triangulation montre que la stimulation par un courant ELF pulsé accélère la sur- ou la sous-régulation de certains gènes qui, dans des circonstances normales (groupe témoin non stimulé) auraient suivi la même tendance (sur- ou sous-régulation) mais de manière plus lente [Collard et al., 2013].

L'analyse des valeurs de FCR montre que la modification de l'expression génique induite par la stimulation peut être identique ou légèrement inférieure/supérieure à la variation de l'expression du témoin aux différents temps d'échantillonnage : les gènes dont la régulation est modifiée par la stimulation électrique peuvent mettre un temps plus ou moins long pour atteindre le même niveau de régulation dans le groupe témoin. Il est intéressant de noter que la stimulation accélère l'expression d'une majorité de gènes sous-régulés. "Reference Sequence Project" (RefSeq) [NCBI handbook, 2012] donne des informations sur les fonctions de gènes énumérés dans les tableaux A-2 A, B, C (p. 120-123) : - CDC6 joue un rôle dans la régulation des étapes précoces de la réplication de l'ADN; - CDC20 agit comme une protéine de régulation interagissant avec plusieurs autres protéines à différents niveaux du cycle cellulaire; - MCM4, MCM5, MCM6, MCM10 codent des protéines essentielles pour l'initiation de la réplication du génome eucaryote;

67 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

- RRM2 code pour les sous-unités de la ribonucléotide réductase qui catalyse la formation des désoxyribonucléotides à partir des ribonucléotides; - TMPO code une protéine qui joue un rôle dans l'assemblage de la lamina nucléaire et qui aide à maintenir l'organisation structurelle de l'enveloppe nucléaire; - TOP2A est une enzyme nucléaire impliquée dans les processus de condensation chromosomique, de séparation des chromatides, de soulagement du stress de torsion qui se produit durant la transcription de l'ADN ou sa réplication; - TSPAN1 joue un rôle dans la médiation des événements de transduction* des signaux qui jouent un rôle dans la régulation du développement cellulaire, l'activation, la croissance et la motilité; - U2AF1 joue un rôle dans l'épissage de l'ARN et de maturation de l'ARNm; - UHRF1 et CDCA3 jouent un rôle dans le cycle de la division cellulaire; - ZWILCH joue un rôle dans la phase M du cycle mitotique. Nous avons également identifié des gènes jouant un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaire (tab. 13) : - CHEK1 : sa surexpression provoque l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2 [Tapia-Alveal et al., 2009]. Il joue un rôle essentiel mais mal défini dans la prolifération cellulaires des cellules non perturbés [Wilsker et al., 2008]; - DKK1 est clairement identifié comme un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt requise pour l'induction de la différenciation [Boyden et al., 2002;. Van der Horst et al., 2005] ainsi que pour la réduction de la prolifération cellulaire [Pasca di Magliano et al., 2007]; - NDRG4 est un membre de la famille des NDRG (N-Myc downstream-regulated gene) composée de NDRG-1, -2, -3 et -4. Ce groupe de protéines, structurellement liées, a un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaire, l'apoptose, la réponse au stress et la migration cellulaire. L'expression de ces protéines est régulée à la hausse au cours de la différenciation cellulaire et inhibée dans plusieurs types de tumeurs [Qu et al., 2002; Shimono et al., 1999; Zhou et al., 2001]. NDRG4 participe aux processus de régulation qui conduisent à la différenciation cellulaire et la formation des neurites [Ohki et al., 2002]; - SPRR3 est fortement induite au cours de la différenciation des kératinocytes épidermiques humains in vitro et in vivo [Gibbs et al., 1993]. SPRR est exprimé en association étroite avec la différenciation épidermique de la peau normale [Koizumi et al., 1996]. Nous observons que certains gènes sont liés à des voies de signalisation connue : - UBE2D3 joue un rôle dans la voie de signalisation des BMP [Chen et al., 2004]. Le rôle des BMPs dans l'ostéogenèse et la guérison des fractures a été développé au chapitre 5.2.1.2 d (p. 62). Un grand nombre des gènes présentés dans les tableaux A-2 A, B, C, jouent un rôle dans la mitose, le développement cellulaire, la réplication de l'ADN transcription ou la traduction.

68

Cha

p itre 5- Tableau 13 : logarithme (base 2) du FC de gènes jouant un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaire isolés dans l'analyse par triangulation R

J4S/J4T J7S/J7T J7T/J4T J12T/J4T J12T/J7T J4S/J7T J4S/J12T J7S/J12T ésultats etDiscussion

Gene FC FC FC FC FC FC FC FC Triangle Probes 2 2 2 2 2 2 2 2 symbole p-value p-value p-value p-value p-value p-value p-value p-value p-value Log Log Log Log Log Log Log Log

J S-J T-J T 204602_at DKK1 2,14 0,01417 2,65 0,01115 -0,51 0,55390 4 4 7 J S-J T-J T 204602_at DKK1 2,14 0,01417 3,66 0,00236 -1,51 0,10874 4 4 12

J S-J T-J T 205394_at CHEK1 1,10 0,02341 1,42 0,03497 -0,33 0,56374 7 7 12

69 J S-J T-J T 209159_s_at NDRG4 1,21 0,04193 1,22 0,00340 0,01 0,99838 4 4 7 J S-J T-J T 209159_s_at NDRG4 1,21 0,04193 0,98 0,03913 0,24 0,63925 4 4 12

J S-J T-J T 218990_s_at SPRR3 1,06 0,03100 2,10 0,01939 1,05 0,10150 4 4 7 J S-J T-J T 218990_s_at SPRR3 1,06 0,03100 2,42 0,03237 -1,36 0,13035 4 4 12

J S-J T-J T 240383_at UBE2D3 -1,50 0,00537 -0,75 0,04697 -0,75 0,11777 4 4 7 J S-J T-J T 240383_at UBE2D3 -1,50 0,00537 -1,26 0,01850 -0,23 0,63561 4 4 12

Chapitre 5 - Résultats et Discussion

5.4 Les mécanismes cellulaires Nous avons utilisé la liste complète des sondes statistiquement sur- ou sous-exprimées entre les

échantillons témoins et stimulés aux mêmes temps d'échantillonnage (J4S vs J4T et J7S vs J7T et J12S vs J12T) ("Liste A", tab A-1, p. 98). Analyser l'ensemble des résultats aux temps précoces et plus tardifs de la stimulation permet de mettre en évidence un maximum de mécanismes cellulaires activés ou inhibés par la stimulation ELF [Collard et al., 2015].

Les sondes sont définies comme significativement exprimées si le IFCRI ≥ 2 et la valeur p ≤ 0,05 après un test t de Student pour l'un des ratios J(4, 7, ou 12)S vs J(4, 7 ou 12)T. 5.4.1 GeneOntology module du site internet WebGestalt 5.4.1.1 Résultats La base de données GO est conçue comme un "graphe orienté acyclique" (Directed Acyclic Graph DAG). En mathématiques, un DAG est un graphe orienté sans boucle, c'est-à-dire formé par une collection de domaines reliés entre eux suivant un ordre hiérarchique sans possibilité de réaliser un circuit. WebGestalt permet de générer un DAG (fig. 19) présentant les processus biologiques enrichis (processus mis en évidence de manière plus fréquente que ce qui serait attendu par le hasard) dans GO. Les cadres rouges représentent les catégories enrichies et les cadres noirs représentent les processus hiérarchiques non-enrichis. On peut trouver pour les cadres enrichis le nom de la catégorie GO, le nombre de gènes impliqués dans la catégorie et la valeur de p. Sur la version en ligne [Collard et al., 2015], il est possible de visualiser les gènes impliqués dans chaque processus cellulaires enrichis. 5.4.1.2 Discussion Le DAG généré par le site WebGestalt (fig. 19) à partir de la base de données GO [Collard et al., 2013] présente le terme "biological process" à l'origine de l'arborescence avec un premier niveau juste en-dessous comportant six processus. Le premier processus, sous l'origine, est "biological regulation" (non enrichie) reliée au niveau inférieur à la catégorie enrichie "positive (or negative) regulation of biological process" définie comme "tout processus qui active ou augmente (ou arrête, réduit) la fréquence, la vitesse ou l'importance d'un processus biologique" [Binns et al., 2009]. Cette cascade commence au "niveau cellulaire" et se termine par les "processus de division nucléaire". La chaîne de processus biologiques de la première catégorie, assez générale, est essentielle pour les mécanismes cellulaires dans lesquels les cellules activent ou modifient leur expression, fonction ou maturation. Le second processus, sous l'origine, est "cellular process". Cette catégorie, enrichie, joue principalement un rôle dans la division cellulaire. Notons que la "negative regulation of cellular process" suivie par la "negative regulation of cell cycle" sont présents dans l'arborescence, mais pas la régulation positive. Les processus "regulation of cell cycle arrest", "M phase of mitotic cell cycle" ainsi que la "mitosis" sont également présents. Pour cette seconde cascade, l'absence

70 Chapitre 5 - Résultats et Discussion de la "régulation positive du cycle cellulaire" et la présence de "l'arrêt du cycle cellulaire" semblent être en accord avec une diminution de la prolifération cellulaire. Le troisième processus, sous l'origine, est "cell proliferation" (enrichi). Cette catégorie est définie comme "la multiplication ou la reproduction des cellules, ce qui entraîne l'expansion d'une population cellulaire" [Binns et al., 2009]. Elle n'est pas intégrée à la catégorie "Processus cellulaire" parce que c'est un processus actif au niveau de la population cellulaire et les processus cellulaires sont limités aux cellules individuelles. La présence de cette catégorie confirme l'observation faite sur la seconde catégorie concernant la diminution de la prolifération cellulaire. Le quatrième processus, sous l'origine est "death" suivi par "regulation of cell death" et "regulation of programmed cell death" (enrichi). L'apoptose peut avoir été révélée suite à la grande similarité des mécanismes moléculaires impliqués dans l'apoptose et dans la différenciation terminale de l'épiderme [Fernando et al., 2007]. Il est probable que la différenciation terminale des kératinocytes soit incluse dans cette catégorie. Il est aussi concevable que l'apoptose apparaît naturellement au cours d'une culture cellulaire durant 15 jours. Le cinquième processus, "metabolic process", comprend des processus macromoléculaires tels la réplication ou la réparation de l'ADN ainsi que la synthèse ou la dégradation des protéines. Le seul processus enrichi dans cette catégorie est "DNA metabolic process". La présence de ce processus peut s'expliquer par les fonctions activées par les trois premières cascades sous l'origine qui activent la division cellulaire ou la synthèse des protéines. Le tableau 19 (p. 84) indique que le processus "DNA replication" est sous-régulé, ce qui est cohérent avec la diminution de la prolifération mise en évidence dans les deuxièmes et troisièmes catégories. Le dernier processus est "réponse à un stimulus" qui contient les catégories enrichies "response to stress", "response to external stimulus", "response to wounding", "Response to chemical stimulus" suivi de "response to organic cyclic compound". La réponse cellulaire au stress et à la réponse à un stimulus externe peuvent être aisément expliquées par la stimulation ELF. La réponse à la cicatrisation pourrait s'expliquer par les processus impliqués dans la guérison d'une blessure cutanée : la prolifération et la différenciation sont principalement activées, comme dans notre modèle.

71 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Figure 19 : graphe orienté acyclique obtenu sur le module GO du site WebGestalt

7272 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

5.4.2 KEGG module du site internet WebGestalt 5.4.2.1 Résultats WebGestalt utilise la base de données "processus biologique" de KEGG, qui liste les interactions moléculaires dans les cellules, et la connecte aux résultats des analyses omiques. L'étude de la "Liste A" par le module KEGG sur le site internet WebGestalt montre qu'un nombre de gènes statistiquement significatifs présents dans nos résultats jouent un rôle dans les voies de signalisation "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" [Collard et al., 2015]. Les informations fournies par le programme sont les suivantes :

"cycle "voie de signalisation cellulaire" de p53" Nombre de gènes communs à la "Liste A" et présents dans le processus : 16 11 Nombre de gènes référencés dans la catégorie : 122 68 Nombre prévu dans la catégorie : 3 2,13 Rapport de l'enrichissement : 4,19 5,17 Valeur de p du test hypergéométrique : 1,32e-06 7,78e-06 Valeur de p ajustée par le test multiple d'ajustement : 0,0002 0,0005

Les 16 gènes identifiés dans le processus "cycle cellulaire" sont présentés avec leur FCR dans le tableau 14.

Tableau 14 : liste des gènes de la "Liste A" mis en évidence avec le module KEGG de WebGestalt et présents dans la voie de signalisation "cycle cellulaire" Symbole N° sonde Nom du gène FC du gène R 231259_s_at CCND2 cyclin D2 3.1084 222037_at MCM4 minichromosome maintenance complex component 4 -2.0063 203554_x_at PTTG1 pituitary tumor-transforming 1 -2.0485 216237_s_at MCM5 minichromosome maintenance complex component 5 -2.0701 205394_at CHEK1 checkpoint kinase 1 -2.1364 228729_at CCNB1 cyclin B1 -2.1390 202705_at CCNB2 cyclin B2 -2.1935 201930_at MCM6 minichromosome maintenance complex component 6 -2.2974 203213_at CDK1 cyclin-dependent kinase 1 -2.3588 203755_at BUB1B budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (yeast) -2.3623 203968_s_at CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae) -2.4227 236313_at CDKN2B cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (p15, inhibits CDK4) -2.5690 203418_at CCNA2 cyclin A2 -2.8117 204822_at TTK TTK protein kinase -3.0231 209642_at BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (yeast) -3.2352 202870_s_at CDC20 cell division cycle 20 homolog (S. cerevisiae) -3.5709

73 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Les 11 gènes identifiés dans la "voie de signalisation de p53" sont présentés tableau 15 avec leur

FCR.

Tableau 15 : liste des gènes de la "Liste A" mis en évidence avec le module KEGG de WebGestalt et présents dans la voie de signalisation "voie de signalisation de p53" Symbole N° sonde Nom du gène FC du gène R 231259_s_at CCND2 cyclin D2 3.1084 211833_s_at BAX BCL2-associated X protein 2.9361 204780_s_at FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) 2.4535 204493_at BID BH3 interacting domain death agonist 2.2411 233254_x_at PTEN phosphatase and tensin homolog -2.1231 205394_at CHEK1 checkpoint kinase 1 -2.1364 228729_at CCNB1 cyclin B1 -2.1390 202705_at CCNB2 cyclin B2 -2.1935 203213_at CDK1 cyclin-dependent kinase 1 -2.3588 201890_at RRM2 ribonucleotide reductase M2 -2.4525 202627_s_at SERPINE1 serpin peptidase inhibitor, clade E, member 1 -3.0534

5.4.2.2 Discussion Le "cycle cellulaire" est l'ensemble des étapes qui constituent la vie d'une cellule. Il comprend plusieurs phases de croissance dans lesquelles la cellule opère la synthèse et duplique son matériel génétique (interphase) et une phase où elle se divise (mitose ou méiose) pour donner naissance à deux cellules filles identiques (mitose). Les cellules filles reproduiront ce cycle, et ainsi de suite. Le cycle cellulaire et la mitose sont à la base de la prolifération cellulaire. La différenciation a également besoin de cette étape proliférative puisque les cellules filles, à un moment donné, commenceront leur différenciation en une cellule mature. La "voie de signalisation de p53" est associée à de nombreux processus cellulaires tels la différenciation, la réparation de l'ADN, le cycle cellulaire ou l'apoptose. p53 peut initier l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose ou la sénescence afin de maintenir l'intégrité de la cellule [Haupt et al., 2003; Feng, 2010]. Les processus biologiques "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" ont été mis en évidence sur WebGestalt à partir de la liste globale des résultats, sans le moindre paramètre susceptible d'influencer le résultat. Ici également, cette technique d'analyse sans apriori aboutit à la mise en évidence des processus fondamentaux de la prolifération et de la différenciation cellulaire. 5.4.3 Site internet KEGG : analyse manuelle 5.4.3.1 Résultats A partir des processus "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" obtenus lors de l'analyse WebGestalt (chap. 5.4.2, p. 73), nous avons effectué une analyse afin d'identifier d'autres voies connexes incluant des gènes de la "Liste A". Le tableau 16 présente la liste de ces voies métaboliques, le nombre de gènes de la "Liste A" inclus dans la voie et leurs liens avec d'autres voies incluant des gènes présents dans la "Liste A" [Collard et al., 2015].

74 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Tableau 16 : analyse manuelle à partie du site web KEGG. Ce tableau contient les voies métaboliques liées à "Cycle cellulaire" ou "voie de signalisation p53" et incluant des gènes de la "Liste A" Nombre de gènes de KEGG La voie de signalisation est liée la "Liste A" inclus Nom de la voie de signalisation à cette autre voie dans la voie Cell cycle 16 MAPK signaling pathway FoxO signaling pathway 13 Apoptosis Cell cycle MAPK signaling pathway PI3K/Akt signaling pathway TGF- β signaling pathway MAPK signaling pathway 12 Apoptosis Calcium signaling pathway Cell cycle p53 signaling pathway Phosphatidylinositol (PI3K) signaling system Wnt signaling pathway Cytokine-cytokine receptor interaction 12 Adherens junction Apoptosis Focal adhesion Jak-STAT signaling pathway p53 signaling pathway 11 Apoptosis Cell cycle PI3K/Akt signaling pathway 11 Apoptosis B Cell receptor signaling pathway Cell cycle Focal adhesion Jak-STAT signaling pathway MAPK signaling pathway mTOR signaling pathway NF-Kappa B signaling pathway p53 signaling pathway Regulation of Actin cytoskeleton 11 Adherens junction Focal adhesion MAPK signaling pathway Focal adhesion 9 Cell cycle Cytokine-cytokine Receptor Interaction ECM-Receptor Interaction MAPK signaling pathway Phosphatidylinositol signaling system PI3K/Akt signaling pathway Regulation of Actin cytoskeleton Wnt signaling Pathway Wnt signaling pathway 9 Adherens junction Cell cycle Focal adhesion MAPK signaling pathway TGF- β signaling pathway Apoptosis 7 Cell cycle Cytokine-cytokine Receptor Interaction NF-Kappa B signaling pathway p53 signaling pathway PI3K/Akt signaling pathway

75 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Tableau 16 (suite) Nombre de gènes de KEGG La voie de signalisation est liée la "Liste A" inclus Nom de la voie de signalisation à cette autre voie dans la voie

Calcium signaling pathway 6 Apoptosis MAPK signaling pathway Jak-STAT signaling pathway 6 Apoptosis Cell cycle Cytokine-cytokine Receptor Interaction MAPK signaling pathway PI3K/Akt signaling pathway Tight junction 6 Adherens junction Phosphatidylinositol signaling system Regulation of Actin cytoskeleton Complement and coagulation cascades 5 B Cell receptor signaling pathway Adherens junction 4 Cytokine-cytokine Receptor Interaction MAPK signaling pathway TGF- β signaling pathway Tight junction Wnt signaling pathway B Cell receptor signaling pathway 4 Calcium signaling pathway Complement and coagulation cascades MAPK signaling pathway NF-Kappa B signaling Pathway PI3K/Akt signaling pathway Regulation of Actin cytoskeleton ErbB signaling pathway 4 Calcium signaling pathway Cell cycle MAPK signaling pathway mTOR signaling pathway PI3K/Akt signaling pathway T-cell receptor signaling pathway 4 Calcium signaling pathway Cell adhesion molecules MAPK signaling pathway NF-Kappa B signaling pathway PI3K/Akt signaling pathway Regulation of Actin cytoskeleton ECM-Receptor Interaction 3 Focal adhesion mTOR signaling pathway 3 MAPK signaling pathway NF-Kappa B signaling Pathway 3 Apoptosis B Cell receptor signaling pathway Calcium signaling pathway T-cell receptor signaling pathway Phosphatidylinositol signaling system 3 Focal adhesion TGF- β signaling pathway 3 Apoptosis Cell cycle MAPK signaling pathway

76 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Le tableau 17 met en évidence, à partir du tableau 16, les voies de signalisation utilisant dans leurs cascades des gènes présents dans la "Liste A" ayant la particularité de ne jouer un rôle que dans une seule voie de signalisation.

Tableau 17 : liste des voies métaboliques incluant des gènes de la "Liste A". Ces gènes sont connus pour avoir une fonction dans une seule voie métabolique

Nom de la voie de signalisation Symbole du gène FCR EntrezGene Regulation of actin cytoskeleton ARHGEF7 3.5433 8874 SSH1 2.8380 54434 ENAH -2.2322 55740 IQGAP3 -2.2799 128239 Wnt signaling pathway DKK1 4.4211 22943 TBL1XR1 -2.0876 79718 DAAM1 -2.1175 23002 SFRP1 -2.3446 6422 Complement and coagulation cascades F12 -2.3185 2161 KNG1 -2.4975 3827 THBD -2.5906 7056 Cell Cycle CDC6 -2.4227 990 TTK -3.0231 7272 FoxO PRMT1 2.1625 3276 PLK4 -2.1853 10733 MAPK DUSP4 2.9941 1846 MAP4K4 2.0165 9448 Adherens junction SSX2IP -2.6911 117178 Calcium signaling pathway TMEM142B -3.8934 80228 ECM-Receptor Interaction HMMR -2.4871 3161 ErbB signaling pathway NRG1 2.0087 3084 Focal adhesion PARVA 3.1305 55742 Jak-STAT signaling pathway SPRY4 2.2764 81848 TGF-beta signaling pathway FST 2.9464 10468 Tight junction EPB41L3 -2.0545 23136

5.4.3.2 Discussion Le module KEGG du site WebGestalt a permis d'isoler statistiquement la voie "cycle cellulaire" et la "voie de signalisation de p53" de la "Liste A". A partir de ces deux voies de signalisation, nous avons effectué une analyse manuelle sur le site internet KEGG afin d'identifier d'autres voies connexes (tab. 16) incluant des gènes de la "Liste A" afin de rechercher la cascade des voies métaboliques déclenchées par la stimulation ELF. Le tableau 17 présente les voies de signalisation utilisant dans leurs cascades des gènes de la "Liste A" ayant la particularité de jouer un rôle dans une voie de signalisation unique. Si un gène est connu pour être actif exclusivement dans une voie spécifique et si l'expression de ce gène est

77 Chapitre 5 - Résultats et Discussion modifiée par la stimulation ELF, il y a une grande chance que cette voie joue un rôle dans les processus biologiques activés par la stimulation [Collard et al., 2013]. Forkhead box O (FoxO) est un régulateur clé de la croissance cellulaire qui a la capacité de limiter la prolifération cellulaire en favorisant l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose ou la quiescence. Il permet une réponse adaptative au stress et permet de "traduire" les stimuli environnementaux en modifiant l'expression génique afin de réguler la réaction de l'organisme [Greer et al., 2005]. Un mécanisme important de la régulation de FoxO est sa phosphorylation par la sérine-thréonine kinase (Akt) [Yamagata et al., 2008]. Les facteurs FoxO sont impliqués dans la médiation de l'effet de Akt sur la prolifératif, la survie et la croissance cellulaire [Hers et al., 2011]. Greer et al. [2005] ont remarqué que c-Jun N-terminal Kinase (JNK), un membre de la famille des protéines kinases (MAPK) activé par des stimuli de stress, est responsable de la régulation de FoxO dans plusieurs organismes. FoxO est négativement régulé par PKB/Akt et impliqué dans la régulation du cycle et de la mort cellulaire [Essers et al., 2004]. Ponugoti et al. [2013] expliquent que FoxO1 est nécessaire à la transition des kératinocytes vers un phénotype de cicatrisation ce qui implique l'augmentation de la migration cellulaire et la sur-régulation de transforming growth factor β1 (TGF-β1) favorisant ensemble la migration et la diminution de l'apoptose. Les TGF-β sont un type de facteurs de croissance multifonctionnels qui inhibent dans nombre de types cellulaires la progression du cycle. Un médiateur de TGF-β, Smad4 induit l'apoptose à travers la voie JNK [Lee et al., 2002]. La voie de signalisation de p53 a une fonction fondamentale pour les cellules vivantes, associée à de nombreux processus tels la différenciation, la réparation de l'ADN, le cycle cellulaire ou l'apoptose. En réponse à divers signaux de stress, p53 initie l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose ou la sénescence afin de maintenir l'intégrité de la cellule à l'aide des voies Akt et mTOR. [Haupt et al., 2003; Feng, 2010]. Chen et al. [2005] ont démontré la relation entre p53, checkpoint kinase 2 (Chk2) and p38 MAPK dans l'arrêt du cycle cellulaire. Il y a de nombreux parallèles dans le mode de régulation de FoxO et de p53 dans l'arrêt du cycle cellulaire, la mort cellulaire ou le stress oxydatif [Zhang et al., 2011]. En réponse à des stimuli extérieurs, MAPK transduit des signaux comme les facteurs de croissance et le stress de la membrane cellulaire aux facteurs de transcription du noyau [Steelman et al., 2004]. MAPK régule l'expression des gènes de l'apoptose, du cycle cellulaire, de la mitose, de la prolifération, de la différenciation cellulaire ou de la régulation de la mobilité [Wilkinson et al., 2000; Wada et al., 2004]. Il est reconnu que MAPK et la voie de signalisation phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) fonctionnent comme un réseau de signalisation interconnecté actif dans un large éventail de fonctions fondamentales telles que la croissance cellulaire, la survie ou la différenciation [Hao et al., 2010]. p38 MAPK est généralement considéré comme prenant part à la réponse au stress, mais joue aussi un rôle dans la régulation du cycle cellulaire [Chen et al., 2005]. L'équipe de recherche de Chao [1992] a indiqué qu'il existe au moins deux voies de signalisation indépendantes pour l'activation des MAPK : la première dépendante de la mobilisation du calcium intracellulaire, la seconde activée par le récepteur du facteur de croissance épidermique de la tyrosine kinase, calcium indépendant.

78 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

La voie "cytokine-cytokine receptor interaction" utilise également 12 gènes de la "Liste A". Ghoreschi et al. [2009] et Harrison [2012] soulignent que les réponses cellulaires à la majorité des cytokines ou facteurs de croissance sont activées par Janus kinase/signal transducers et l'activateur de transcription Jak/STAT. Les réponses cellulaires comprennent la prolifération, la différenciation, la migration, l'apoptose et la survie cellulaire. Akt apparaît comme un nœud de signalisation important au sein de toutes les cellules et l'une des protéines kinases les plus importantes dans la physiologie ou la pathologie des eucaryotes. Akt est principalement régulé par l'activation de PI3K. La voie de signalisation PI3K/Akt joue un rôle dans la prolifération cellulaire et est en partie régulée par la phosphorylation de FoxO [Zhang et al., 2011]. L'activation de PI3K génère plusieurs phosphoinositols conduisant à l'activation d'Akt, considéré comme un facteur clé de la survie cellulaire, stimulant la prolifération et inhibant l'apoptose [Reif et al., 2003]. L'activation de PI3K est requise pour la progression en phase G1/S et son inhibition conduit en l'arrêt de la phase G1 dans de nombreux types de cellules [Liang et al., 2003]. PI3K/Akt est une voie de transduction des signaux qui est stimulée par différentes cytokines ou facteurs de croissance. Elle régule de nombreuses fonctions biologiques, y compris la survie, la prolifération cellulaire, la progression du cycle cellulaire ou l'apoptose et a des interactions avec Ras, PTEN ou la synthèse de l'ADN. [Lawlor et al., 2001]. Akt active la croissance cellulaire via la voie de signalisation mTOR complex 1 (mTORC1) [Manning et al., 2007], elle-même régulée par la voie de signalisation des facteurs de croissance [Hers et al., 2011]. Les interactions entre PI3K/Akt et MAPK/ERK (également connu sous le nom de Raf/Mek/ERK) sont importantes pour la régulation de la progression du cycle cellulaire et l'apoptose [Chang et al., 2003b]. Il a été montré que les voies "MAPKs", "JNK" et "p38", activées par le stress, étaient inhibées par la voie de signalisation Akt. Par conséquent, un équilibre entre la voie de survie PI3K/Akt, et la voie apoptotique JNK/p38 peut être établi à travers ce type de croisement [Manning et al., 2007]. Un autre régulateur positif d'Akt est focal adhesion kinase (FAK) avec un lien direct entre Akt1 et FAK et une potentialisation de l'activation de l'un par l'autre [Wang et al., 2011b]. Focal adhesion kinase (FAK) joue un rôle dans la régulation coordonnée de la prolifération et la migration cellulaire en réponse à l'adhésion cellulaire médiée par l'intégrine [Zhao et al., 1998]. Lu et al. [2008] ont également observé que l'inhibition d'Akt par un inhibiteur de Pi3k réduisait l'activité de NF-kappaB et l'expression de STAT3, alors que son activation entraîne l'effet inverse. D'autre part, l'inhibition de l'activité STAT3 diminue l'expression d'Akt. Cette observation souligne l'interaction entre PI3K/Akt/NF-kappaB et Jak2/STAT3 avec un effet protecteur contre l'apoptose. Ils soulignent également que PI3K/Akt joue un rôle dans la phosphorylation de STAT grâce à une tyrosine kinase qui relie les récepteurs à cytokines à PI3K par l'intermédiaire de Jak [Lu et al., 2008]. Les cascades de réactions Jak/STAT et Jak/PI3K/Akt/mTORC, avec leur action commune sur la prolifération, ont également été analysées par Yamada et al. [2012]. Le groupe de Dan [2008] a indiqué le rôle de Akt dans l'activation de NF-kappaB par mTOR. PI3K/Akt interagit avec le fonctionnement des jonctions serrées (tight junctions) sans qu'aucune généralisation ne puisse être faite, des effets opposés étant observés [González-Mariscal et al., 2008]. Outre le rôle de la voie de signalisation NF-kappa B dans la réponse immunitaire, il existe des arguments montrant

79 Chapitre 5 - Résultats et Discussion son rôle actif dans le cycle cellulaire, la prolifération [Hinz et al., 1999; Kaltschmidt et al., 1999], ainsi que dans l'apoptose [Kaltschmidt et al., 2000]. Les jonctions serrées et les jonctions d'ancrage (adherens junctions) sont deux complexes de jonction "cellule-cellule" de l'épithélium. La jonction d'ancrage initie et stabilise l'adhérence entre cellules et régule l'actine présente dans le cytosquelette ainsi que la signalisation intracellulaire. Les jonctions serrées ont une fonction "barrière" empêchant le mouvement des protéines membranaires et une fonction "porte" permettant le passage des ions et des molécules entre les cellules. Une jonction serrée peut se lier à une jonction d'ancrage ou à l'actine du cytosquelette via des protéines cytoplasmiques associées [Hartsock et al., 2008; Meng et al., 2009]. p38 MAPK semble interagir avec l'actine du cytosquelette et moduler le réarrangement des filaments d'actine durant la différenciation cellulaire [Khurana et al., 2003]. La voie de signalisation Wnt a été étudiée : elle déstabilise les jonctions d'ancrage et favorise la migration des cellules [Vlad-Fiegen et al., 2012]. Les récepteurs de facteurs de croissance sont actifs dans la phase membraneuse de la voie de signalisation MAP (Mitogen Activated Protein) et leur action se poursuit par l'activation de plusieurs kinases cytoplasmiques appelées MAPK (MAP Kinase). Différents groupes de MAPs existent : un groupe est activé par les facteurs de croissance et régule la prolifération et la différenciation cellulaire par l'intermédiaire de ERKs (extracellular signal-regulated kinases); un autre groupe, JNK et p38, est activé par des stimuli de stress et est impliqué dans la différenciation cellulaire et l'apoptose; une autre voie (ERK5) est activée par des facteurs de croissance, par les stimuli de stress et participe à la prolifération cellulaire [Zhang et al., 2002; González-Mariscal et al., 2008]. La voie de signalisation MAPK joue un rôle dans les jonctions serrées en modulant l'expression de plusieurs protéines présentes dans ces complexes ainsi que par les interactions des protéines intégrales des jonctions serrées avec d'autres protéines nécessaires pour l'activation de la voie de signalisation ERK [González- Mariscal et al., 2008]. La voie de signalisation Wnt régule la prolifération, la différentiation et la mobilité cellulaire [Hadjihannas et al., 2012]. Bikkavilli et al. [2008] ont observé la régulation de la voie "Wnt canonique" par p38 MAPK. L'équipe de Nishita [2000] a proposé un modèle d'interaction entre la cascade Wnt et la cascade TGF-B. Pour Peng et al., [2014], Wnt régule la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses via la voie de signalisation p53. 5.4.3.3 En résumé Cette analyse permet de lister les différentes voies de signalisation qui intègrent dans leurs cascades des gènes ayant réagi à une stimulation ELF. FoxO est un régulateur fondamental de la croissance cellulaire en permettant une réponse adaptative de la cellule au stress, par l'action de régulatrice d'Akt et JNK. FoxO est connu pour participer à la cicatrisation des kératinocytes. Akt, un autre régulateur critique, phosphoryle FoxO est régulé suite à l'activation de PI3K, JNK, FAK ou p38. Les cytokines et les facteurs de croissance ont une fonction importante dans l'activation de Jak/STAT ou de PI3K/Akt. MAPK et PI3K sont des cascades interconnectées jouant un rôle important dans la régulation de la croissance cellulaire et dans la différenciation.

80 Chapitre 5 - Résultats et Discussion p38 MAPK ou la voie p53, avec l'aide d'Akt et sous le contrôle de mTOR et NF-KappaB, participent à la réponse au stress. Les jonctions serrées et d'ancrage sont également associées à la prolifération et à la différenciation. Le cytosquelette d'actine interagit avec p38 MAPK et Wnt afin de déstabiliser les jonctions d'ancrage. Après activation des récepteurs membranaires des facteurs de croissance, les cascades de signalisation des MAPK sont activées. p38 MAPK régule la voie canonique de Wnt permettant le contrôle précis du cycle cellulaire. Une interaction entre Wnt et TGF-B est également possible. p53 et Wnt sont également interconnectés. Certaines de ces voies utilisent des gènes que nous avons mis en évidence et qui ne jouent un rôle que dans une seule voie de signalisation. Si un gène est connu pour être actif exclusivement dans une voie spécifique et si son expression est modifiée par la stimulation ELF, il est probable que cette voie soit active dans le processus biologique activé par la stimulation. Les 25 gènes et les 14 voies de signalisation mis en évidence (tab. 17) représentent des données d'un grand intérêt dans la recherche de marqueurs spécifiques de la stimulation ELF. 5.5 Pathway Studio 5.5.1 Résultats La première analyse a été réalisée avec les gènes de la "Liste A" (tab. A-1, p. 98) afin d'identifier dans quels processus biologiques la majorité des 836 gènes de la liste interagissent. Les processus cellulaires ayant plus de 100 connexions avec des gènes de la "Liste A" sont représentés figure 20. La liste complète des gènes impliqués dans ces connexions est reprise tableau A-3 (p. 124)

La seconde analyse a été réalisée avec les gènes de la "Liste A" ayant un IFCRI ≥ 10. Nous avons recherché les processus biologiques contenant les gènes ayant subi un changement très important dans leur expression. Les colonnes de gauche (A) du tableau 18 présentent la liste des gènes de la "Liste A" avec le IFCRI ≥ 10. Les colonnes centrales (B) de la table listent les gènes accessoires ajoutés par le logiciel lors de la recherche de processus cellulaires et ayant une connectivité locale. Les colonnes de droite (C), les résultats de l'analyse, indiquent les processus biologiques ayant au moins cinq connexions locales avec des gènes de la colonne de gauche. Nous avons développé en détails les résultats pour les processus biologiques ayant au moins sept gènes connectés (avec un IFCRI ≥ 10). Les tableaux A-4 A, B, C, D, E (p. 129-135) présentent ces gènes, leurs FCR, une citation Medline justifiant la connexion et l'ensemble des numéros de référence Medline.

La troisième analyse a été réalisée avec les gènes de la "Liste A" ayant un IFCRI ≥ 4. Pathway Studio a été programmé pour analyser les liens directs entre ces gènes et les liens avec les processus biologiques ayant au moins 10 connexions avec les gènes interagissant entre eux. Le tableau 19 présente les processus cellulaires et les catégories fonctionnelles interagissant avec les protéines connectées ainsi que les protéines interconnectées avec d'autres protéines.

81 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Figure 20 : première analyse Pathway Studio : processus cellulaires ayannt plus de 100 connexions avec des gègènes de la "Liste A"

La quattrième analyse a été réalisée sur une liste de gènes obtenue après analyse par triangulation de J4S, J4T et J7T (tab. A-2A, p. 120). La liste de gènes a été analysée par Pathway Studio afin de rechercher les processus biologiques concernés par l'accélération observée.. La figure 21 présente les liens entre les processus cellulaires et les gènes de la liste montrant une accélération de leur régulation après la stimulation ELF. La cinquième analyse utilisant Pathway Studio recherche la localisation des protéines dans la cellule ainsi que leurs interactions. La "Liste A" contient les résultats de l'expression des gènes mais nous postulons que l'ensemble des ARNm seront traduits en protéines. Le tableau 20 présente les gènes de la "Liste A" classsés suivant la localisation extracellulaire, membranaire, cytoplasmique, nucléaire, mitochondriale, du réticulum ou de l'appareeil de Golgi de leur protéine. L'analyse des liens entre les prootéines du tableau 20 met en évidence 840 interactions d'une protéine extracellulaire vers une protéine nucléaire en incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique (tab. A-5, p. 136).

82

Chapitre 5- RésultatsetDiscussion

Tableau 18 : seconde analyse pathway Studio : liste des processus biologiques ayant au moins 5 connections locales avec des gènes de la "Liste A" ayant un IFCRI ≥ 10 A B C Sonde avec IFC I ≥ 10 présent dans la Sélectionné par Gène ajouté par le programme R Résultats Résultats Résultats "Liste A" le programme et présent dans la "Liste A" Nombre de Numéro de Nombre de Nombre de Processus cellulaire avec une Nom FC Oui/Non Nom FC connectivités sonde R connectivités locales R connectivités locales connectivité locale > 5 locales 204595_s_at STC1 23.3541 Yes 64 PTGER4 7.7085 2 cell proliferation 11 203434_s_at MME 20.2766 Yes 100 BRAF 3.0284 1 apoptosis 11 203131_at PDGFRA 15.0401 Yes 68 BAX 2.9361 1 cell growth 9 202672_s_at ATF3 13.4129 Yes 71 BMP-2 2.8173 1 cell differentiation 9 242809_at IL1RL1 12.6018 Yes 30 CCL22 2.5772 2 wound healing 7 202157_s_at CELF2 10.4316 Yes 24 MDM2 2.5016 1 cell migration 6 225975_at PCDH18 10.2059 Yes 2 HSP90B1 2.4634 1 cell adhesion 6 226084_at MAP1B 10.1488 Yes 45 FAS 2.4535 2 cell death 6 83 215704_at FLG -11.5147 Yes 23 IL6ST 2.0350 1 inflammatory response 6 213933_at PTGER3 -11.8960 Yes 81 CHEK1 -2.1364 1 vascularization 6 220414_at CALML5 -12.4239 Yes 6 CYP2R1 -2.2817 1 endothelial cell function 5 1552544_at SERPINA12 -22.0370 Yes 10 CDK1 -2.3588 1 translation 5 1569410_at RP1-14N1.3 -32.8168 Yes 1 KNG1 -2.4975 1 Cell Cycle 5 207908_at KRT2 -50.0784 Yes 1 KIAA0101 -2.6139 2 regeneration 5 206177_s_at ARG1 -80.3099 Yes 44 CD44 -2.8185 2 cytokine production 5 229733_s_at --- 11.8369 No EGFR -3.0511 4 oxidative stress 5

240248_at C10orf46 -10.1538 No SERPINE1 -3.0534 1 240420_at AADACL2 -11.4116 No LYNX1 -4.3924 1 1553454_at RPTN -15.6725 No 206643_at HAL -17.4474 No 217521_at --- -18.2340 No Résultats obtenus après analyse de Pathway Studio

Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Tableau 19 : troisième analyse utilisant Pathway Studio recherche les gènes (IFCRI ≥ 4) interagissant entre eux et les processus cellulaires ayant au moins 10 connections locales avec ces protéines connectées.

A B C Processus cellulaire Classe fonctionnelle protéine

Nom du Connectivité Connectivité Nom du Connectivité processus FC Nom FC FC R locale R locale gène R locale cellulaire cell differentiation 34 WNT 32 MME 20.2766 24 cell proliferation 33 DKK 4.4211 9 PDGFRA 15.0401 22 apoptosis 29 ATF3 13.4129 23 cell growth 25 TFPI2 9.5950 9 cell migration 20 UCHL1 9.5583 17 vascularization 20 PTGER4 7.7085 25 cell death 19 NOV 5.2515 15 cell adhesion 17 ACTA2 5.0869 14 ADAMTS Cell Cycle 15 4.9705 10 1 pregnancy 15 CTGF 4.6389 32 cell motility 14 DKK1 4.4211 27 cell survival 14 PGF 4.1359 24 embryonal development 14 TXNRD1 3.2171 15 regeneration 14 DUSP4 2.9941 10 contraction 13 BMP-2 2.8173 29 wound healing 13 SFRP1 -2.3446 21 cell invasion 12 PLD1 -2.5277 16 chemotaxis 12 IFNK -4.1843 3 DNA replication -2.0063 12 MACF1 -4.3308 5 inflammatory response 12 LYNX1 -4.3924 3 osteogeneses 12 DLX2 -4.7061 12 oxidative stress 12 MX1 -4.8258 7 morphogenesis 11 HPGD -4.9080 13 cell fate 10 CXCL14 -5.4770 10 immune response 10 IFIT1 -7.1063 5 neurogenesis 10 MMP9 -8.9066 44 ROS generation 10 TCHH -9.6763 3 translation 3.6274 10 FLG -11.5147 10 PTGER3 -11.8960 22 RPTN -15.6725 1 FLG2 -32.8168 1 ARG1 -80.3099 11

84

Chapitre 5- RésultatsetDiscussion

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Figure 21 : quatrième analyse Pathway Studio : liens entre les processus cellulaires et une liste de gènes présentant une accélération de leur régulation après une stimulation ELF. La couleur verte signale une sous-régulation du gène ou du processus et la couleur rouge une sur-régulation

Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Tableau 20 : cinquième analyse Pathway Studio : classement des protéines de la "Liste A" en fonction de leur localisation dans la cellule Protéines extracellulaires AADACL2 CCDC3 CYR61 FUCA2 NOV PSG5 STC1 ADAMTS1 CCL22 DEFB1 IFNK NPNT PSG7 TCN1 ADM CD274 DKK1 IGFL2 NRG1 PTX3 TEX264 ANXA9 CD86 EDN1 IL1F7 PCDH18 RPTN TFPI2 APOD CD99 EFNA5 KNG1 PCSK9 SCG5 TGFBI AZGP1 CNTNAP2 ENDOD1 LGALS7 PCYOX1L SEMA4A TNFSF10 BMP2 COL22A1 ENDOU LYNX1 PGF SERPINA12 BPIL2 COL6A3 F12 MFAP5 PLAC1 SERPINE1 C10orf99 COL8A2 FAM3C MMP28 PRSS23 SFRP1 C5orf13 CTGF FLRT3 MMP9 PSAPL1 SLURP1 C5orf46 CXCL14 FST NMU PSG2 SMPDL3A Protéines membranaire ADAM8 CLEC7A FEZ1 IL1R2 OCA2 RAB8B SPRY4 ANPEP CLIC4 FLVCR2 IL1RL1 ORAI2 RAET1E STXBP1 AP2B1 CMTM7 FNDC3B IL6ST P2RY2 SDCBP SUSD1 ARMCX3 CNTN1 FRAS1 ITPRIPL2 PAQR5 SFTPD SUSD4 ASAP1 CYTH3 FRY ITSN1 PARVA SLC12A7 THBD ASPRV1 DCBLD2 FTL KAL1 PDGFRA SLC15A1 TMEFF1 ATP10B DDR2 GEM KCND3 PHLDB2 SLC19A2 TMEM170B ATP7A DSC1 GNB2L1 KCTD12 PLAUR SLC22A3 TMEM200A ATP8B1 DSG1 GPR115 KCTD4 PLD1 SLC26A9 TMEM231 C19orf28 EGFR GPR27 LY75 PLEKHA3 SLC2A3 TNFRSF10D C20orf30 EMB GPX1 MFAP3L PLTP SLC39A2 TRAF4 C6orf105 EMP1 GULP1 MGC87042 PLXDC2 SLC39A6 TSPAN1 C7orf44 ENAH HMMR MME PROM2 SLC45A4 UNC93A CAMK2N1 EPHA4 IDE MPP7 PTGER3 SLC6A6 CCDC109B EPHB6 IER3 MUC15 PTGER4 SLC7A11 CD44 FAAH2 IFNGR1 NKTR PTGS2 SNX9 CDHR1 FAS IGF2R NPIPL3 RAB27B SPPL3 Protéines cytoplasmiques ABL2 C7orf10 DOCK11 HPGD LOC653602 PROSC SRGAP1 ACSBG1 C9orf21 DUSP4 HSDL2 LOC728153 PSMG4 SSH1 ACTA2 C9orf30 DUT HSP90B1 MAB21L3 PSRC1 SSX2IP ADH1B CALML5 EFS HSPA4 MACF1 PTEN STIL AFAP1L1 CAMK1D EIF3B IFIT1 MALAT1 PTPRG TAGLN3 AHDC1 CAND1 EIF3C INPP4B MAP1B PXMP4 TCHH AKAP2 CCDC50 EIF4A1 IQGAP3 MAP4K4 PYCARD TCP11L2 AKR1C1 CCDC64 EIF5A2 IRS1 MARCH3 RAB7B TICAM2 ALDH3B2 CCDC76 ELMOD1 IRS2 MDM2 RAC2 TK1 AMDHD1 CCDC85C ELOVL6 ITM2C MGC2752 RALGAPA2 TKT ANKHD1 CCNA2 EML1 JOSD1 MIR374AHG RAPGEF4 TRIM4 ANKRD10 CCNB1 ENO1 KANK4 MX1 RASEF TRIM8 ANLN CCNB1IP1 EPB41L3 KBTBD6 MYH10 RASGRP1 TRIP13 AOX1 CCNB2 EPPK1 KIAA0485 MYO5B RASSF1 TTC22 ARG1 CDA ETNK1 KIAA0754 N4BP2L2 RASSF10 TXNIP ARHGEF7 CDC42BPB FAM59A KIAA1826 NANP RBP1 TXNRD1 ARL5A CDC42EP3 FAM72C KIAA1949 NAV1 RDH12 TYRP1 ARMC8 CDCA3 FAM83B KIF14 NBPF1 RHOB UBE2C ATG16L1 CDK1 FAM83D KIF15 NBPF10 RHOC UBE2D3 ATP6V1C2 CDKN2B FAM84A KIF18B NCRNA00275 RNF114 UBE2T ATP6V1H CDKN3 FAM91A2 KIF20A NDRG4 RNF213 UCHL1

86 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Tableau 20 (suite) Protéines cytoplasmiques (suite) AURKA CEP170 FAM98A KLHL24 NEB RPL32P3 UHRF1 AVIL CEP55 FBXL3 KRAS NEBL RRM2 ULK3 BAX CFDP1 FLG KRT18 NOD2 S100A7A USP34 BBOX1 CFLAR FLG2 KRT2 NT5E SACS USP47 BID CHEK1 FLJ13744 KRT9 PANK1 SARS VAV3 BIRC5 COTL1 FNTB LOC100130691 PBK SCRN1 VPS13D BLMH CYP1A1 FTH1 LOC100131015 PDIA5 SERPINB4 VSNL1 BRAF CYP4F12 GATM LOC100132832 PEA15 SERPINB6 WDR1 C12orf29 DAAM1 GCLM LOC100499466 PELI1 SERTAD4 XRCC6BP1 C15orf29 DDX60 GFPT1 LOC100506168 PET112L SGPP2 ZAK C1orf21 DEGS2 GLRX LOC100507025 PLK4 SGTB ZWILCH C1orf68 DENND1B GPD2 LOC100507603 PPIA SLAIN2 C1orf85 DENND2D GPT2 LOC284837 PPP1R15A SOD2 C1orf96 DENR GSR LOC344887 PPP2R2A SPATS2L C5orf32 DIRC3 GSTA4 LOC643008 PPP3CC SPRR3 C6orf114 DNAJC6 HAL LOC645638 PRKRA SPRY2 Protéines nucléaires AFF4 DCLRE1B FUS MCM4 PITPNC1 SH3BGRL2 TWIST1 APITD1 DDIT3 GINS1 MCM5 PLAG1 SMG1 U2AF1 ASPM DEPDC1 GINS2 MCM6 POLE2 SNRNP200 WWC1 ATF3 DHRS2 GTF2H3 MED6 POLQ SNRPA1 ZBTB10 BCL11A DLGAP5 GTF3A MGA POLR2J2 SP110 ZNF131 BUB1 DLX2 HELLS MITF POU2F3 SP3 ZNF160 BUB1B DLX5 HIST1H2BC MKI67 PRMT1 SPC25 ZNF165 CASC5 DNASE1L2 HJURP NCAPG PRPF19 SPEN ZNF207 CASP14 DTL HMG20B NCAPH PSMB7 SQSTM1 ZNF236 CBX6 E2F8 HMGA2 NDC80 PTTG1 SUZ12 ZNF254 CDC20 EGR2 ING3 NEIL3 RAD51 TAF15 ZNF281 CDC6 EID1 KIF11 NHS RAD54B TAF9B ZNF323 CDCA7 ELK3 KIF23 NIPBL RANBP2 TBL1XR1 ZNF451 CDK13 ETS1 KIF4A NR2F2 RBM14 TCEAL3 ZNF542 CELF2 ETV5 LASS5 NUF2 RBM25 TDG ZNF548 CENPA EWSR1 LATS2 NUSAP1 REV3L TMPO ZNF662 CENPF FANCD2 LEF1 PCBP2 RNPC3 TNFAIP3 ZNF738 CENPW FANCI LRPPRC PHC2 RORA TOP2A ZNF846 CFL2 FGD2 LRRFIP1 PHF17 SAV1 TPX2 CHD9 FHL1 MAF PHF19 SCAF11 TREX2 CRABP2 FOXD1 MCM10 PHLDA1 SETBP1 TTK Protéines du réticulum ANKRD13C CYB5A CYP4B1 FKBP14 LPIN1 SEC23IP TMEM173 ASPH CYP2R1 ERP27 IKBIP NQO1 SQLE BFAR CYP39A1 FDFT1 LASS2 PLD3 TM7SF2 Protéines mitochondriales ABHD5 AKR1B1 KIAA0101 NLN STS ACOT8 ATP5S MGLL PLD6 SUPV3L1 AIFM2 DGAT2 NDUFS8 PRDX3 TIMM44 Protéines de l'appareil de Golgi PCSK6 GOLGA4 NUCB1 NSFL1C SLC35B2 ARFGAP3 EXOC6 ST6GALNAC1 HS3ST3A1 GOLM1 GORAB

87 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

5.5.2 Discussion La première analyse faite avec Pathway Studio (fig. 20, p. 82) permet de confirmer les processus cellulaires les plus significatifs obtenus avec le module GO sur le site WebGestalt. Ces résultats sont cohérents avec nos précédentes observations sur la prolifération et la différenciation cellulaire [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a, 1997; Rooze et al., 1985]. La deuxième analyse réalisée avec Pathway Studio utilise les gènes ayant la variation d'expression la plus importante entre le groupe témoin et le groupe stimulé (IFCRI ≥ 10) (tab. 18 A). Les gènes dont l'expression a été très fortement modifiée jouent un rôle dans les processus cellulaires précédemment identifiés : la prolifération cellulaire, l'apoptose, la croissance cellulaire, la différenciation cellulaire, la cicatrisation des plaies, etc… (tab. 18 C). Si nous analysons les citations Medline proposées par le logiciel Pathway Studio pour les 11 gènes ayant une connexion locale avec le processus "prolifération cellulaire" (tab. A-4A, p. 129), nous pouvons lire pour les gènes sur-exprimés : STC1 inhibe la croissance osseuse longitudinale en supprimant la zone proliférative des chondrocytes au niveau de la plaque de croissance [Wu et al., 2006]; MME inhibe la croissance des cellules "hormone-refractory CaP" [Perry et al., 2006]; ATF3 peut altérer la prolifération des fibroblastes [Turchi et al., 2008], etc… et pour les gènes sous-exprimés : la suppression de ARG1 bloque l'augmentation de la prolifération cellulaire [Wei et al., 2000]; la sur-expression de SERPINA12 favorise la prolifération [Nakatsuka et al., 2013], mais nous observons une sous-régulation; la sur-expression du FLG favorise la prolifération [Ridd et al., 2006] mais nous avons une sous-expression de FLG, etc… . Seule la régulation à la hausse de PDGFRA n'est pas totalement cohérente avec l'idée de diminution de la prolifération [Koyama et al., 1994], mais comme il s'agit d'un récepteur, il doit être activé pour promouvoir la prolifération. Le tableau A-4B (p. 131) présente les gènes liés à l'apoptose et montre que l'expression de ces 10 gènes est en faveur de l'apoptose. Il faut toutefois noter que les résultats obtenus par Law et al. [2008] supportent l'idée que STC1 est un facteur pro-apoptotique alors que dans les résultats de Block et al. [2009] STC1 joue un rôle dans les effets anti-apoptotiques des cellules souches mésenchymateuses; MME réduit l'apoptose des cellules ß [Aston-Mourney et al., 2013]; la voie de signalisation PDGFRalpha a un rôle protecteur face à l'apoptose dans les phases précoces du développement [Van Stry et al., 2005]. On voit que les mécanismes de l'apoptose sont complexes et peuvent dépendre du type de cellule ou du niveau de la différenciation. De plus, comme indiqué plus haut, ils peuvent avoir été mis en évidence dans nos résultats par la similitude avec certains mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation terminale épidermique [Fernando et al., 2007]; il est également envisageable que l'apoptose apparaisse naturellement au cours de la culture cellulaire. Les résultats et les informations Medline présentés au tableau A-4C (p. 133) ne permettent pas de définir le sens de la régulation pris par le processus "croissance cellulaire". Ce processus est défini comme un "processus par lequel une cellule augmente de taille au cours du temps de façon irréversible…" [Binns et al., 2009]. Une analyse devrait être réalisée pour chaque temps d'échantillonnage.

88 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

En revanche, il est évident que le processus cellulaire "différenciation" (tab. A-4D, p. 134) est activé : STC1 est exprimé dans les chondrocytes et les ostéoblastes au cours du développement des souris et peut améliorer la différenciation des cellules crâniennes en culture [Johnston et al., 2010]; MME joue un rôle spécifique dans le contrôle de la croissance et la différenciation pour de nombreux types cellulaires [Oishi et al., 2005] et des marqueurs de la lignée myoépithéliale (MME/CD10) sont fortement augmentés pendant la différenciation [Williams et al., 2009]; ATF3 semble faciliter la sortie du cycle cellulaire ainsi que la différenciation terminale des chondrocytes [James et al., 2006], etc… . La sous-expression de la filaggrine peut paraître anormale d'autant plus qu'elle est utilisée comme marqueur de la différenciation cellulaire. Notons que Bernerd et al. [2001] ont publié l'information que certaines protéines de la différenciation comme K10, la loricrine ou la filaggrine ont été altérées dans des cultures in vitro d'épiderme de xeroderma pigmentosum reconstitué. Cette observation pourrait confirmer l'absence de filaggrine dans nos résultats. Cette sous-expression est compatible avec des résultats (non publiés) provenant d'un dosage réalisé sur le modèle de culture d'explants de kératinocyte ne permettant pas de mettre en évidence une augmentation de cette protéine aux temps de prélèvement les plus tardifs.

Pour les gènes et les FCR exprimés dans le processus cellulaire "cicatrisation des plaies" (tab. A-4E, p. 135), nous pensons que ce processus est impliqué de par les caractéristiques intrinsèques de notre modèle de culture présentant les caractéristiques de la réparation d'une blessure de la peau. Des observations précédentes [Hinsenkamp, 1994, 2011] suggèrent que les cellules doivent être en phase de réparation ou de croissance pour être sensibles à une stimulation électrique. Il serait intéressant d'étudier ce processus pour chaque temps d'échantillonnage. Les processus cellulaires mis en évidence lors de la troisième analyse avec des gènes

(IFCRI ≥ 4) ayant des liens communs et au moins 10 liaisons locales avec les gènes interagissant entre eux (tab. 19 A) sont identiques à ceux présentés ci-dessus. Cette analyse met en évidence deux classes fonctionnelles (tab. 19 B): Wnt, non relié directement à une sonde de la puce

Affymetrix et DKK (relié par le logiciel avec la sonde DKK1, FCR = 4,42). Ces voies de signalisation, déjà mises en évidence après l'analyse manuelle, se trouvent ici soulignées par une méthode totalement automatisée. DKK1 joue un rôle dans la régulation négative de la voie de signalisation Wnt en bloquant son récepteur [van der Horst et al., 2005] ce qui a pour effet la réduction de la prolifération cellulaire [Pasca di Magliano et al., 2007] ainsi qu'une induction de la différenciation cellulaire terminale [Boyden et al., 2002; van der Horst et al., 2005]. Il est intéressant de noter que tous les gènes cités dans l'analyse manuelle au chapitre 5.2.1 (p. 57) (DKK1, MACF1, ATF3, MME, TXNRD1, BMP-2) sont présents dans le tableau 19 C (p.84). Le processus cellulaire "réplication de l'ADN" que le logiciel a relié avec le gène sous-exprimé

MCM4 (FCR = -2,0063) (tab. 19 A) est cohérent avec les observations précédentes montrant une diminution de l'incorporation de la thymidine-[H3] dans les échantillons stimulés [Hinsenkamp et al., 1997]. Pour la quatrième analyse, la figure 21 (p. 85) montre que la prolifération et la différenciation cellulaire sont impliquées par des gènes présentant une accélération de leur régulation après la stimulation ELF.

89 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

La cinquième analyse a permis de localiser dans la cellule l'emplacement des protéines qui devraient finalement être traduites à partir des gènes de la "Liste A" (tab. 20). L'analyse de ce tableau et des interactions entre les protéines des différentes localisations permet de révéler les protéines stimulant un grand nombre d'autres protéines ou recevant un grand nombre de stimuli. Elle permet de compléter les cascades décrites dans les chapitres précédents vu que les gènes discutés devraient être transcrits et traduits en protéines actives. C'est la protéine extracellulaire Endothelin 1 (ET-1), codée par le gène EDN1, qui présente le plus grand nombre d'interactions vers des protéines membranaires différentes : - ET-1 transactive EGFR par l'intermédiaire de la signalisation des MAPK ce qui peut contribuer à l'augmentation de la prolifération [Gomez Sandoval et al., 2013]; - la stimulation de ET-1 augmente significativement la régulation de PDGFRA [Sihvola et al., 2002]; - ET-1 régule à la hausse l'expression GLUT-3 (exprimée à partir du gène SLC2A3) dans différents types de cellules [Van den Berghe, 2004]; - ET-1 induit l'expression de COX-2 (exprimée à partir du gène PTGS2) dans des cellules endothéliales vasculaires du cerveau de souris [Lin et al., 2014]; - ET-1 induit une augmentation dose-dépendante de la trasncription du réceteur EP4 (exprimée à partir du gène PTGER4) [Spinella et al., 2004]; - ET-1 induit une augmentation de l'expression de PLAUR [He, 1992]; Pathway Studio relie également ET-1 aux gènes IER3, CD44 et IL6ST qui seront traduits en protéines membranaires. Neuregulin 1, codée par le gène NRG1, est la seconde protéine extracellulaire la plus active vers différentes protéines membranaires. Elle agit sur CD44, EGFR, ENAH, PLAUR, PTGS2, FAS, SLC2A3. Comme pour ET-1, NRG1 augmente l'expression de GLUT-3 (gène SLC2A3) [Suárez et al., 2001]; la voie de signalisation EGFR/neuregulin joue un rôle important dans la régulation de la croissance cellulaire, la différenciation et la prolifération et la vie de la cellule et pour Patel et al. [2000] l'activation du récepteur EGFR augmente la prolifération cellulaire des cellules épithéliales du foie. Comme pour EDN1 et NRG1 présentés ci-dessus, KNG1, codant la protéine extracellulaire bradykinin, joue un rôle sur la protéine membranaire EGFR : la prolifération cellulaire induite par la bradykinine dépend de la transactivation du récepteur EGF [Cheng et al., 2012]. Il en va de même pour PTGS2 où la bradykinin participe à la régulation de la synthèse de COX-2 [Villanueva et al., 2007]. Cette protéine est également en relation avec ANPEP, CD44 et IDE. La protéine membranaire recevant des informations du plus grand nombre de protéines extracellulaires est EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). La protéine transcrite par ce gène est une glycoprétéine transmembranaire membre des protéines kinases qui est un récepteur pour les facteurs de croissance épidermiques [NCBI handbook, 2012]. Liu et al. [2006] indiquent que ADAMTS1 favorise l'activation de EGFR; les autres gènes qui lui sont connectés sont CCL22, CTGF, DEFB1, DKK1, EDN1, F12, KNG1, MMP9, NRG1, SFRP1, TNFSF10.

90 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

En étant connectée à 25 protéines cytoplasmiques, c'est également EGFR qui transmet le plus vers les protéines cytoplasmiques. PTGS2 codant pour la protéine membranaire COX-2 reçoit une stimulation de 11 protéines extracellulaires dont la BMP-2 discutée précédemment. C'est ensuite 16 protéines cytoplasmiques qui sont en relation avec COX-2. L'analyse des liens entre les protéines du tableau 20 (p. 86) met en évidence 840 interactions d'une protéine extracellulaire vers une protéine nucléaire en incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique (tab. A-5, p. 136). Pour l'interaction entre la protéine extracellulaire et membranaire, on observe que : - ADAMTS1, CCL22, DEFB1, F12, SFRP1 sont uniquement liées à EGFR, - DKK1 est principalement liée à EGFR et pour 5 interactions à CD44, - MMP9 est principalement liée à EGFR et pour 2 interactions à PLAUR, - CTGF est principalement liée à EGFR et pour 2 interactions à PLAUR, - EDN1 est principalement liée à EGFR et également à CD44, PDGFRA, PLAUR, PTGER4 et PTGS2 - NRG1 est principalement liée à EGFR et FAS et également à PTGS2 (5 liens), PLAUR (2 liens), - TNFSF10 est principalement liée à EGFR et FAS et également à PTGS2 (3 liens), PLAUR (2 liens), - KNG1 est principalement liée à EGFR, CD44 et PTGS2 et également à ANPEP (2 liens), - CYR61 et FST sont uniquement liées à PTGS2, - PGF et SERPINE1 sont uniquement liées à PLAUR, - TFPI2 est uniquement liée à FAS, - BMP-2 est principalement liée à FAS et également à MME et PTGS2, On observe que c'est la protéine membranaire EGFR qui reçoit le plus de stimulations venant des protéines extracellulaires (519 liens) suivi de FAS avec 196 liens. Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une protéine monomérique transmembranaire. Elle transduit un signal suite à sa liaison à un ligand spécifique (comme le facteur de croissance épidermique ou le Transforming Growth Factor α (TGFα)). EGFR est une des voies de signalisation les plus importantes de la régulation de la croissance, la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire. [Oda et al., 2005]. FAS (TNF receptor superfamily, member 6), une protéine membranaire connue pour jouer un rôle central dans la régulation de l'apoptose, est également impliquée dans la tranduction du signal prolifératif des fibroblastes. Freiberg et al. [1997] ajoutent que le choix entre ces deux voies de signalisation dépend du taux de saturation du récepteur FAS et de son ligand. Cette protéine est connue pour activer NF-kappaB, MAPK3/ERK1 et MAPK8/JNK [NCBI handbook, 2012]. Le récepteur de l'urokinase (PLAUR) est une protéine qui concentre l'activité de sérine-protéase qui est impliquée dans les processus de prolifération cellulaire, migration, remodelage tissulaire, cicatrisation de plaies ou morphogenèse [Zhang et al., 2004].

91 Chapitre 5 - Résultats et Discussion

Les protéines extracellulaires ADAMTS1, BMP-2, DKK1 et membranaires MME, PDGFRA ont déjà été discutées dans les chapitres précédents. 5.6 Discussion du protocole expérimental Comme le soulignent Leszczynski et al. [2012], les expérimentations utilisant des modèles humains offrent des résultats directement exploitables pour améliorer les connaissances sur la santé humaine. La culture in vitro de cellules épidermiques humaines exposées à un courant électrique de basse fréquence permet de mieux comprendre ses effets sur les cellules en général. L'analyse des résultats antérieurs (chap. 1.3.2, p. 3) et une revue de la littérature (chap. 2, p. 6) ne permettent pas d'identifier une réponse spécifique à un type de tissu (os, peau, etc…) mais plutôt à son stade de développement. Sur les cellules épidermiques, les résultats préliminaires ont montré une diminution de la zone de croissance entourant l'explant, une meilleure stratification des kératinocytes et une diminution du pourcentage de cellules marquées à la H3-thymidine. Ces observations confirment les effets observés sur le tissu osseux : une accélération de la maturation au détriment de la prolifération [Hinsenkamp et al., 1997]. Le modèle de culture cellulaire utilisé dans cette étude a l'avantage d'être proche des conditions physiologiques in vivo. Bien que la culture du tissu épidermique en milieu air-liquide soit plus simple que d'autres cultures tissulaires (dont le tissu osseux), le protocole reste contraignant en temps et en manipulations. Une mise au point et une adaptation et du protocole ont été nécessaires afin de réaliser la culture à grande échelle pour l'analyse par microarray. La quantité de peau nécessaire est importante et l'approvisionnement dépendant et limité par le nombre d'abdominoplasties réalisées par le Service de Chirurgie Plastique. Les principales modifications apportées au protocole original [Pruniéras et al., 1983] concernent la procédure d'irradiation des supports dermiques (7KGy), la suppression de la toxine cholérique dans le milieu de culture ainsi que les adaptations permettant la culture des échantillons à grande échelle.

92

Chapitre 6 - Conclusions Les effets biologiques des ELF peuvent sembler de prime abord un sujet siimple à étudier mais la littérature montre que des recherches menées depuis la première moitié du 18ème siècle n'apportent toujours aucune conclusion définitive et que les mécanismes cellulaires impliqués restent très peu connus [IARC, 2002; Leszczynski, 2006; Schüz et al., 2008; Kheifets et al., 2010a; Savitz, 2010; Leszczynski et al. 2012; SSM, 2013, 2015; SCENIHR, 2015]. L'ensemble de la population mondiale est entouré par un nuage d'ondes de plus en plus dense et varié, parallèlement, les applications médicales utilisant une stimulation électrique se développent. Il est important de mieux comprendre la réaction des cellules aux phénomènes électriques. La première difficulté de cette recherche est due à son approche interdissciplinaire. La mise au point et les mesures permettant la caractérisation de la stimulation sont unn défi en soi et le choix d'un modèle biologique autorisant l'extrapolation des résultats à l'homme ne facilite pas la mise en place d'un protocole pertinent. La littérature met également en avant la difficulté de comparer les résultatts de différentes études vu la non-linéarité des effets en fonction de l'évolution des champs. Bawin et al. [1976] définissent cette non-linéarité comme "l'effet fenêtre". Ce concept peut être étendu car une même cellule peut réagir différemment à une sttimulation ELF suivant son niveau de maturité et deux types cellulaires peuvent réagir différemmmment à une même stimulation ELF bien que ce dernier point ne semple pas toujours ce vérifier. Les résultats obtenus par Hinsenkamp ou Rooze montrent qu'il reste néanmoins intéressant de ne pas cloisonner systématiquement les résultats en fonction de leurs caractérriistiques de stimulation (-EMF, -MF, -EF, PEMF, fréquence, etc…) : ils ont montré des effets identiques avec une stimulation électromagnétique pulsée appliquée à différents modèles osseux en phase de croissance ou de réparation (in vitro et in vivo) [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a, 1985b, 1993a, 1993b; Rooze et al., 1982, 1985; Hinsenkamp, 1994] et une stimulation électrique appliquée à une culture d'explants d'épiderme humain [Jercinovic et al., 1996; Hinsenkamp et al., 1997; Collard et al., 2011, 2015]. Compte tenu de la réponse cohérente obtenue sur ces différents modèles, nous avons recherché les mécanismes impliqués au niveau cellulaire par screening de l'expression génique. Comme Leszczynnski [2006] et le groupe d'expertts du COST BM0704 [Leszczynski et al., 2012] nous sommes d'avis que la recherche des mécanismes cellulaires est fondammentale pour comprendre les effets biologiques des EMF. Les modèles osseux étant complexes à mettre en œuvre, nous avons choisi d'utiliser la culture d'explants d'épiderme humain sur support dermique in vitro. Ce modèle stimulé par un courant électrique pulsé asymétrique à charge nulle de 40Hz, modulé par une fréquence de 0,125Hz et transmis par deux électrodes de platine offre un protocole relativement bien caractérisé pour étudier les effets biologiques des ELF. Vu la quantité d'ARN nécessaire pour l'étude par microarray, une mise au point du protocole à partir de la culture originale [Pruniéras et al., 1983] a été nécessaire. La technique microarray permet d'analyser la variation de l'expression des gènes entre un échantillon stimulé et un échantillon témoin. Elle permet d'observer la réaction cellulaire à une stimulation. Pour cette étude, 24 puces microarrays ont été hybridées à l'ARN provenant de trois cultures cellulaires

93 Chapitre 6 - Conclusions réalisées indépendamment à partir de 3 épidermes de donneurs différents. Le prélèvement des 288 explants épidermiques sont répartis sur huit temps d'échantillonnage. Sur ce modèle de culture, Hinsenkamp et al. [1997] ont montré par des analyses planimétriques et histologiques une réaction du tissu à la stimulation ELF pulsée. Ces résultats montrent une symétrie avec les observations des études précédentes sur les PEMF stimulant différents modèles de tissus osseux en croissance ou en réparation. La première observation faite au niveau génique confirme que les cellules réagissent bien à la stimulation ELF puisque l'expression de plusieurs gènes a été modifiée entre les échantillons stimulés et les échantillons témoins.

L'analyse des résultats au cours du temps (comparaison de Jx à J1) pour le groupe témoin et stimulé montre que, si la stimulation augmente ou diminue la régulation de certains gènes par rapport à J1 (témoin), la variation n'est dans la majorité des cas pas suffisante pour statistiquement inverser la sens de la régulation naturelle. Seuls 3 gènes (EPS8, ADAMTS1,

NOS1) ne suivent pas cette règle : ils sont sur-exprimés à J4S et sous-exprimés à J12T. Ces trois gènes sont connus pour jouer un rôle dans les mécanismes de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Comparé à l'évolution naturelle de l'expression des gènes au cours du temps, la stimulation augmente de 12% le nombre des gènes sur-exprimés et de 35% le nombre des gènes sous-exprimés. Toujours lors de l'analyse au cours du temps, FatiGO montre que 57% des voies de signalisation biologique mis en avant par GO sont strictement identiques entre le groupe témoin et le groupe stimulé. Les processus dont l'expression est modifiée dans le groupe stimulé sont impliqués dans la prolifération, la différenciation, l'apoptose, la réponse au stress ou l'inflammation.

La comparaison des listes de gènes aux trois temps d'échantillonnage J4, J7 et J12, montre que seuls 3 gènes sont systématiquement exprimés dans les trois groupes stimulés comparés à leur témoin respectif : TXNRD1, ATF3 et MME. Ils sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération, la différenciation et la mitose. Cette analyse montre également que le nombre des gènes sous-exprimés est 6 à 7 fois plus important que le nombre des gènes sur-exprimés pour la comparaison au temps J4 et J7. On peut aussi voir le rôle joué par DKK1 et MACF1 au temps J4 : la sur-expression de DKK1 et la sous-expression de MACF1 ont pour effet l'inhibition du "pathway Wnt" ce qui provoque une diminution de la prolifération et une augmentation de la différenciation terminale. BMP-2 a, pour sa part, été sur-exprimée au temps J12. Cette protéine est connue pour jouer un rôle important dans l'ostéogenèse, l'angiogenèse et la maturation cellulaire. L'analyse par triangulation montre que la stimulation par un courant ELF pulsé accélère la sur- ou la sous-expression de certains gènes qui, dans des circonstances normales (groupe témoin non stimulé) auraient suivi la même tendance (sur- ou sous-régulation) mais de manière plus lente. CHEK1, DKK1, NDRG4, SPRR3 sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération et la différenciation; UBE2D3 est actif dans la voie de signalisation de la BMP-2 dont la sur-expression et la fonction ont été soulignées plus haut; les autres gènes sont actifs dans la mitose, le développement cellulaire et la réplication de l'ADN. L'analyse du graphe orienté acyclique généré par WebGestalt sur base des données de GO a mis en évidence les processus biologiques impliquant les gènes présents dans nos résultats et dont la régulation a été modifiée. Ces gènes ont des fonctions dans les mécanismes du cycle cellulaire,

94 Chapitre 6 - Conclusions de la mitose, de la prolifération ou de la différenciation. Cette technique d'analyse sans apriori met en évidence des processus biologiques cohérents avec les résultats macroscopiques précédents et les premières observations présentées ci-dessus. Pour mettre en évidence les voies de signalisation actives dans les processus biologiques, nous avons utilisé KEGG qui indique que les voies "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" utilisent un nombre statistiquement significatif de gènes présents dans nos résultats. Le cycle cellulaire et la mitose sont à la base de la prolifération cellulaire. La différenciation a également besoin de cette étape proliférative puisque ce sont les cellules filles qui deviendront des cellules matures. La "voie de signalisation p53" est également active dans le cycle cellulaire, la différenciation, l'apoptose et le maintien de l'intégrité cellulaire. L'analyse des voies connexes à "p53" et à "cycle cellulaire", utilisant des gènes présents dans nos résultats, a mis en avant plusieurs cascades dont certaines utilisent des gènes actuellement connus pour n'avoir de rôle que dans cette dernière. Les gènes et les voies de signalisation présentées au tableau 17 (p.77) sont bien impliqués dans les réactions biologiques activées par une stimulation ELF pulsée. Cette liste contient des candidats potentiels à la fonction de marqueur de la stimulation ELF. On y retrouve entre autre FoxO, régulé par JNK (membre des MAPK), actif avec TGF-β1 dans la migration cellulaire et la diminution de l'apoptose; Jak/STAT qui active la voie "cytokine-cytokine receptor interaction" utile lors de la prolifération, différenciation, migration, apoptose et survie cellulaire; Wnt qui régule la prolifération, la différenciation ainsi que la mobilité cellulaire. D'autres voies d'intérêt mais n'utilisant pas de gène ayant une fonction unique ont été listée : PI3K/Akt, en partie régulée par la phosphorylation de FoxO, a une fonction dans la prolifération cellulaire. Les différentes analyses réalisées avec Pathway studio confirment qu'une grande majorité des gènes présents dans nos résultats sont actifs dans les processus de prolifération, différenciation, croissance cellulaire, cycle cellulaire, mitose, apoptose, migration et survie cellulaire. Plusieurs gènes et mécanismes discutés précédemment (ADAMTS1, ATF3, BMP-2, DKK1, DUSP4, MACF1, MME, PDGFRA, SFRP1, TXNRD1, WNT) ont été isolés par le programme. La recherche des mécanismes utilisant les gènes isolés lors de l'analyse par triangulation a mis en évidence la prolifération, la différenciation, l'adhésion cellulaire, la réplication de l'ADN et la mort cellulaire. La localisation des protéines dans la cellule permet d'étudier les interactions entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule ainsi que de rechercher les protéines stimulant un grand nombre d'autres protéines ou recevant un grand nombre de stimuli. La protéine extracellulaire Endothelin 1 (ET- 1), codée par le gène EDN1, agit sur 9 protéines membranaires différentes : EGFR par l'intermédiaire de la signalisation des MAPK, PDGFRA, GLUT-3 (exprimé à partir du gène SLC2A3), COX-2 (exprimée à partir du gène PTGS2), EP4 (exprimée à partir du gène PTGER4) PLAUR et les gènes IER3, CD44 et IL6ST qui seront traduit en protéines membranaires. Neuregulin 1, codée par le gène NRG1, est la seconde protéine extracellulaire la plus active vers les protéines membranaires différentes. L'analyse de nos résultats montre que l'ensemble des mécanismes cellulaires habituellement actifs dans la prolifération et la différenciation des kératinocytes et qui ont été soulignés dans la revue de la littérature (MAPK-ERK, PI3K-Akt-mTOR, EGFR, RAF/MEK/ERK, PTEN, Wnt,

95 Chapitre 6 - Conclusions

FOXO, TGF-β) ont bien été impliqués dans les réactions cellulaires apparues après l'application d'un courant ELF pulsé. L'analyse des résultats met en évidence 840 interactions d'une protéine extracellulaire vers une protéine nucléaire et incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique. Les protéines membranaires recevant des informations du plus grand nombre de protéines extracellulaires est EGFR et FAS. C'est également EGFR, une des voies de signalisation les plus importantes de la régulation de la croissance, la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire, qui transmet le plus d'informations aux protéines cytoplasmiques. FAS est capable de réguler l'apoptose et la prolifération en fonction du taux de fixation de son ligand. Certaines études épidémiologiques rapportent un effet possible des EMF sur la leucémie lymphoblastique aiguë mais sans jamais avoir été expliqué en laboratoire. Les mécanismes cellulaires de la leucémie activent la voie de signalisation Wnt et augmentent la concentration de β-caténine [Chung et al., 2002; Khan et al., 2007]. A l'opposé, dans nos résultats, DKK1 et MACF1 ne s'expriment pas en faveur d'une activation de la voie de signalisation Wnt, ni d'une augmentation de la concentration de la β-caténine. Par rapport aux objectifs énoncés, nous avons : - montré la cohérence entre la modification de l'expression des gènes et les résultats des études historiques; - isolé et proposé différents processus cellulaires pouvant être à l'origine des observations macroscopiques; - isolé différents gènes connus pour avoir individuellement une fonction dans une voie de signalisation unique ce qui signifie qu'il y a de grandes chances que ces voies et ces gènes soient actifs dans les processus biologiques activés par la stimulation; - montré par une méthode statistique utilisant une technique de triangulation que la stimulation par un courant ELF pulsé accélère la sur- ou la sous-régulation de certains gènes qui, dans des circonstances normales (groupe témoin non stimulé) auraient suivi la même tendance (sur- ou sous-régulation) mais de manière plus lente. 6.1 Perspectives Les observations faites dans le cadre de cette étude ont mis en évidence un nombre conséquent d'informations. Plusieurs d'entre elles vont nécessiter des recherches complémentaires afin de préciser et confirmer les résultats. Nous avons observé des effets similaires suite à la stimulation ELF-PEMF de différents modèles osseux et avec un courant ELF pulsé sur un modèle de culture de kératinocytes. La comparaison de différentes publications met en avant la modification de l'expression de mêmes gènes sous l'effet de différents types de stimulation ELF. Ces observations montrent l'intérêt de croiser les résultats provenant de différents modèles. Il apparaît de plus en plus intéressant de comparer et de grouper des résultats montrant des effets similaires, même si la stimulation ou le modèle de culture sont différents, que de vouloir exclusivement comparer des résultats provenant de stimulations identiques vu que la définition précise des caractéristiques électriques des signaux n'est pas simple à définir. Dans le cadre du COST BM1309 (EMF-MED), nous essayons de

96 Chapitre 6 - Conclusions montrer l'intérêt de globaliser les informations sur les mécanismes. Il faut se servir des connaissances spécifiques de chaque scientifique en physiologie ou pathologie de la prolifération, différenciation, immunité, réparation tissulaire, etc… afin de globaliser la recherche des mécanismes cellulaires impliqués dans la stimulation ELF. Une autre question connexe et tout aussi fondamentale est le développement des techniques de microdosimétrie afin de connaître avec précision la stimulation reçue par la cellule. L'étude des signaux est fondamentale afin de découvrir la composante active qui déclenche la réaction de la cellule. Afin de répondre à la problématique de la leucémie infantile, la connaissance des mécanismes est primordiale. Nos observations montrent que la voie métabolique Wnt, incluant une fonction importante de la β-caténine, semble être inhibée par la stimulation alors qu'elle est activée dans la leucémie ALL. La mise en place d'un protocole étudiant cette voie métabolique sur des cellules sanguines et incluant un dosage de la β-caténine devrait mener à des observations intéressantes. Nous avons posé l'hypothèse que l'ensemble des gènes exprimés dans nos résultats serait traduit en protéines. Il faut s'assurer que les protéines mises en évidence sont actives dans les réactions métaboliques. Afin de confirmer ou non leur rôle comme marqueurs de la stimulation ELF, il est nécessaire de prouver l'activation des protéines extracellulaires et membranaires fortement impliquées dans les réactions et de vérifier la présence des protéines issues des gènes connus pour avoir une fonction dans une voie métabolique unique (tab. 17, p. 77).

97

Annexes 1 - Résultats Tableau A-1 : "Liste A" Liste complète des sondes exprimées de manière différentielle obtenue lors de l'analyse microarray pour la comparaison des temps d'échantillonnage J4S vs J4T, J7S vs J7T et J12S vs J12T (IFCRI ≥ 2, p ≤ 0,05).

Probe Set ID Gene Symbol Gene Title FCR

204595_s_at STC1 stanniocalcin 1 23.3541 membrane metallo-endopeptidase (neutral endopeptidase, 203434_s_at MME 20.2766 enkephalinase, CALLA, CD10) 203131_at PDGFRA platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide 15.0401 202672_s_at ATF3 activating transcription factor 3 13.4129 242809_at IL1RL1 Interleukin 1 receptor-like 1 12.6018 Transcribed locus, strongly similar to NP_055107.3 chromobox 229733_s_at --- 11.8369 homolog 6 [Homo sapiens] 202157_s_at CUGBP2 CUG triplet repeat, RNA binding protein 2 10.4316 225975_at PCDH18 protocadherin 18 10.2059 226084_at MAP1B microtubule-associated protein 1B 10.1488 209278_s_at TFPI2 tissue factor pathway inhibitor 2 9.5950 201387_s_at UCHL1 ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (ubiquitin thiolesterase) 9.5583 204897_at PTGER4 prostaglandin E receptor 4 (subtype EP4) 7.7085 201438_at COL6A3 collagen, type VI, alpha 3 7.4881 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 2 /// pregnancy specific beta- 208134_x_at PSG2 6.1802 1-glycoprotein 2 201596_x_at KRT18 keratin 18 6.1400 206498_at OCA2 oculocutaneous albinism II (pink-eye dilution homolog, mouse) 6.0356 205083_at AOX1 aldehyde oxidase 1 6.0162 234994_at KIAA1913 KIAA1913 5.8534 204011_at SPRY2 sprouty homolog 2 (Drosophila) 5.4524 206157_at PTX3 pentraxin-related gene, rapidly induced by IL-1 beta 5.3981 214321_at NOV nephroblastoma overexpressed gene 5.2515 200974_at ACTA2 actin, alpha 2, smooth muscle, aorta 5.0869 222162_s_at ADAMTS1 ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1 4.9705 227792_at LOC162073 Hypothetical protein LOC162073 4.8992 212188_at KCTD12 potassium channel tetramerisation domain containing 12 4.8056 226145_s_at FRAS1 Fraser syndrome 1 4.6439 209101_at CTGF connective tissue growth factor 4.6389 204602_at DKK1 dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) 4.4211 202047_s_at CBX6 chromobox homolog 6 4.3214 1559449_a_at ZNF539 Zinc finger protein 539 4.2012 1555742_at ------4.1799 placental growth factor, vascular endothelial growth factor-related 209652_s_at PGF 4.1359 protein apoptosis-inducing factor (AIF)-like mitochondrion-associated 224461_s_at AMID inducer of death /// apoptosis-inducing factor (AIF)-like 4.0929 mitochondrion-associated inducer of death

98 Annexes 1 - Résultats

226034_at --- Homo sapiens, clone IMAGE:3881549, mRNA 4.0811 Aldo-keto reductase family 1, member C2 (dihydrodiol 1562102_at AKR1C2 dehydrogenase 2; bile acid binding protein; 3-alpha hydroxysteroid 4.0718 dehydrogenase, type III) 1555854_at ------4.0109 227458_at ------3.9876 plasminogen activator, urokinase receptor /// plasminogen activator, 211924_s_at PLAUR 3.9476 urokinase receptor 227295_at IKIP IKK interacting protein 3.9393 204720_s_at DNAJC6 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 6 3.9200 224583_at COTL1 coactosin-like 1 (Dictyostelium) 3.8309 twist homolog 1 (acrocephalosyndactyly 3; Saethre-Chotzen 213943_at TWIST1 3.7244 syndrome) (Drosophila) 1553861_at TCP11L2 t-complex 11 (mouse) like 2 3.7175 219985_at HS3ST3A1 heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 3A1 3.7072 209286_at CDC42EP3 CDC42 effector protein (Rho GTPase binding) 3 3.6782 1556773_at PTHLH Parathyroid hormone-like hormone 3.6707 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10d, decoy with 227345_at TNFRSF10D 3.6573 truncated death domain 235296_at EIF5A2 eukaryotic translation initiation factor 5A2 3.6274 228562_at --- Transcribed locus 3.5911 alanyl (membrane) aminopeptidase (aminopeptidase N, 202888_s_at ANPEP 3.5880 aminopeptidase M, microsomal aminopeptidase, CD13, p150) 203939_at NT5E 5'-nucleotidase, ecto (CD73) 3.5699 235412_at ARHGEF7 Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 7 3.5433 213187_x_at FTL ferritin, light polypeptide 3.4496 226955_at FLJ36748 hypothetical protein FLJ36748 3.4368 217553_at MGC87042 similar to Six transmembrane epithelial antigen of prostate 3.4358 212099_at RHOB ras homolog gene family, member B 3.3820 207719_x_at CEP170 centrosomal protein 170kDa 3.3662 201028_s_at CD99 CD99 molecule 3.3469 230528_s_at MGC2752 hypothetical protein MGC2752 3.3153 200736_s_at GPX1 glutathione peroxidase 1 3.2702 227534_at C9orf21 chromosome 9 open reading frame 21 3.2272 201289_at CYR61 cysteine-rich, angiogenic inducer, 61 3.2192 205694_at TYRP1 tyrosinase-related protein 1 3.2174 201266_at TXNRD1 thioredoxin reductase 1 3.2171 204830_x_at PSG5 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5 3.2168 235456_at --- CDNA clone IMAGE:4819084 3.1343 202643_s_at TNFAIP3 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3 3.1341 217890_s_at PARVA parvin, alpha 3.1305 231259_s_at --- Transcribed locus 3.1084 AKAP2 /// 202759_s_at PALM2- A kinase (PRKA) anchor protein 2 /// PALM2-AKAP2 protein 3.0924 AKAP2 223132_s_at TRIM8 tripartite motif-containing 8 3.0585

99 Annexes 1 - Résultats

Full-length cDNA clone CS0DB001YB20 of Neuroblastoma Cot 225820_at --- 3.0563 10-normalized of Homo sapiens (human) 208025_s_at HMGA2 high mobility group AT-hook 2 /// high mobility group AT-hook 2 3.0474 217858_s_at ARMCX3 armadillo repeat containing, X-linked 3 3.0447 221985_at KLHL24 kelch-like 24 (Drosophila) 3.0374 236402_at --- CDNA FLJ42263 fis, clone TKIDN2014570 3.0284 202497_x_at SLC2A3 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 3 3.0075 204015_s_at DUSP4 dual specificity phosphatase 4 2.9941 200649_at NUCB1 nucleobindin 1 2.9839 Transcribed locus, strongly similar to NP_061844.1 G protein- 227769_at --- coupled receptor 27; super conserved receptor expressed in brain 1 2.9821 [Homo sapiens] 232434_at DIRC3 disrupted in renal carcinoma 3 2.9809 224911_s_at DCBLD2 discoidin, CUB and LCCL domain containing 2 2.9576 219702_at PLAC1 placenta-specific 1 2.9510 226847_at FST follistatin 2.9464 211833_s_at BAX BCL2-associated X protein 2.9361 224663_s_at CFL2 cofilin 2 (muscle) 2.9125 1564630_at EDN1 endothelin 1 2.9051 226017_at CMTM7 CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 7 2.8889 239250_at ZNF542 zinc finger protein 542 2.8878 209276_s_at GLRX glutaredoxin (thioltransferase) 2.8731 221752_at SSH1 Slingshot homolog 1 (Drosophila) 2.8380 223120_at FUCA2 fucosidase, alpha-L- 2, plasma 2.8303 205290_s_at BMP2 bone morphogenetic protein 2 2.8173 209114_at TSPAN1 tetraspanin 1 2.8135 transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like 205122_at TMEFF1 2.8106 domains 1 218517_at PHF17 PHD finger protein 17 2.8104 220477_s_at C20orf30 chromosome 20 open reading frame 30 2.7949 220178_at C19orf28 chromosome 19 open reading frame 28 2.7908 ADAM metallopeptidase domain 8 /// ADAM metallopeptidase 205180_s_at ADAM8 2.7673 domain 8 201467_s_at NQO1 NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 2.7579 201559_s_at CLIC4 chloride intracellular channel 4 2.7512 205749_at CYP1A1 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 2.7346 203562_at FEZ1 fasciculation and elongation protein zeta 1 (zygin I) 2.7213 209184_s_at IRS2 insulin receptor substrate 2 2.7157 201540_at FHL1 four and a half LIM domains 1 2.6863 205602_x_at PSG7 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 7 2.6778 218066_at SLC12A7 solute carrier family 12 (potassium/chloride transporters), member 7 2.6750 prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase 204748_at PTGS2 2.6594 and cyclooxygenase) 226725_at --- Transcribed locus 2.6433 218309_at CAMK2N1 calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitor 1 2.6407

100 Annexes 1 - Résultats

201325_s_at EMP1 epithelial membrane protein 1 2.6234 209120_at NR2F2 nuclear receptor subfamily 2, group F, member 2 2.6150 224916_at LOC340061 hypothetical protein LOC340061 2.6114 37028_at PPP1R15A protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 15A 2.6056 200919_at PHC2 polyhomeotic-like 2 (Drosophila) 2.5913 228234_at TICAM2 toll-like receptor adaptor molecule 2 2.5910 207861_at CCL22 chemokine (C-C motif) ligand 22 2.5772 203857_s_at PDIA5 protein disulfide isomerase family A, member 5 2.5628 201272_at AKR1B1 aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase) 2.5519 201050_at PLD3 phospholipase D family, member 3 2.5288 Full-length cDNA clone CS0CAP007YJ17 of Thymus of Homo 234986_at --- 2.5196 sapiens (human) 225160_x_at MGC5370 hypothetical protein MGC5370 2.5016 215913_s_at GULP1 GULP, engulfment adaptor PTB domain containing 1 2.4921 200748_s_at FTH1 ferritin, heavy polypeptide 1 2.4905 213112_s_at SQSTM1 sequestosome 1 2.4834 205668_at LY75 lymphocyte antigen 75 2.4798 RNA binding protein S1, serine-rich domain /// RNA binding 224346_at RNPS1 2.4797 protein S1, serine-rich domain 212233_at --- 3'UTR of hypothetical protein (ORF1) 2.4707 216450_x_at HSP90B1 heat shock protein 90kDa beta (Grp94), member 1 2.4634 225442_at --- Clone DPDP-3 dental pulp-derived protein 3, mRNA sequence 2.4551 204780_s_at FAS Fas (TNF receptor superfamily, member 6) 2.4535 221558_s_at LEF1 lymphoid enhancer-binding factor 1 2.4501 224927_at KIAA1949 KIAA1949 2.4450 206307_s_at FOXD1 forkhead box D1 2.4303 213262_at SACS spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay (sacsin) 2.4184 230795_at --- Transcribed locus 2.4125 217771_at GOLPH2 golgi phosphoprotein 2 2.4092 FAM91A2 /// FLJ39739 /// family with sequence similarity 91, member A2 /// FLJ39739 LOC440685 /// protein /// hypothetical gene supported by AK124550 /// 1568609_s_at LOC644642 /// hypothetical protein LOC644642 /// hypothetical protein 2.4065 LOC644677 /// LOC644677 /// similar to poly (ADP-ribose) polymerase family, LOC645052 /// member 8 /// similar to hypothetical gene supported by AK123662 LOC653496 221773_at ELK3 ELK3, ETS-domain protein (SRF accessory protein 2) 2.4040 208814_at HSPA4 Heat shock 70kDa protein 4 2.4028 204743_at TAGLN3 transgelin 3 2.4018 201631_s_at IER3 immediate early response 3 2.3989 219210_s_at RAB8B RAB8B, member RAS oncogene family 2.3789 210719_s_at HMG20B high-mobility group 20B 2.3762 219655_at C7orf10 chromosome 7 open reading frame 10 2.3718 208669_s_at CRI1 CREBBP/EP300 inhibitor 1 2.3706 1552277_a_at C9orf30 chromosome 9 open reading frame 30 2.3643 209298_s_at ITSN1 intersectin 1 (SH3 domain protein) 2.3634

101 Annexes 1 - Résultats

1566342_at SOD2 Superoxide dismutase 2, mitochondrial 2.3579 231907_at --- CDNA FLJ31718 fis, clone NT2RI2006647 2.3559 218056_at BFAR bifunctional apoptosis regulator 2.3461 224707_at ORF1-FL49 putative nuclear protein ORF1-FL49 2.3277 225842_at PHLDA1 pleckstrin homology-like domain, family A, member 1 2.3260 227418_at KIAA1826 KIAA1826 2.3242 1553413_at ------2.3234 209159_s_at NDRG4 NDRG family member 4 2.3176 221004_s_at ITM2C integral membrane protein 2C /// integral membrane protein 2C 2.3143 204346_s_at RASSF1 Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 1 2.3056 226337_at SCYL1BP1 SCY1-like 1 binding protein 1 2.3034 223027_at SNX9 sorting nexin 9 2.2975 209758_s_at MFAP5 microfibrillar associated protein 5 2.2919 SPRY4 /// sprouty homolog 4 (Drosophila) /// similar to sprouty homolog 4 221489_s_at 2.2764 LOC653170 (Drosophila) solute carrier family 7, (cationic amino acid transporter, y+ system) 207528_s_at SLC7A11 2.2741 member 11 228745_at SGTB small glutamine-rich tetratricopeptide repeat (TPR)-containing, beta 2.2681 224716_at SLC35B2 solute carrier family 35, member B2 2.2671 222619_at ZNF281 zinc finger protein 281 2.2638 202211_at ARFGAP3 ADP-ribosylation factor GTPase activating protein 3 2.2603 207233_s_at MITF microphthalmia-associated transcription factor 2.2524 214455_at HIST1H2BC histone 1, H2bc 2.2459 204493_at BID BH3 interacting domain death agonist 2.2411 201462_at SCRN1 secernin 1 2.2341 219390_at FKBP14 FK506 binding protein 14, 22 kDa 2.2293 204472_at GEM GTP binding protein overexpressed in skeletal muscle 2.2266 226773_at --- MRNA (clone ICRFp507I1077) 2.2213 solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), 228754_at SLC6A6 2.2204 member 6 225331_at CCDC50 coiled-coil domain containing 50 2.2147 CHST5 /// carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 5 /// 64900_at 2.2043 ABHD14B abhydrolase domain containing 14B 229865_at FNDC3B fibronectin type III domain containing 3B 2.2016 221900_at COL8A2 collagen, type VIII, alpha 2 2.2006 protein phosphatase 3 (formerly 2B), catalytic subunit, gamma 207000_s_at PPP3CC 2.1972 isoform (calcineurin A gamma) 1555841_at ------2.1965 205372_at PLAG1 pleiomorphic adenoma gene 1 2.1820 HIST1H4H /// 232035_at HIST2H4A /// histone 1, H4h /// histone 2, H4a /// histone H4/o 2.1713 H4/o 242293_at ING3 inhibitor of growth family, member 3 2.1673 225102_at MGLL monoglyceride lipase 2.1658 ITGAV /// integrin, alpha V (vitronectin receptor, alpha polypeptide, antigen 202075_s_at 2.1651 PLTP CD51) /// phospholipid transfer protein

102 Annexes 1 - Résultats

206445_s_at PRMT1 protein arginine methyltransferase 1 2.1625 225688_s_at PHLDB2 pleckstrin homology-like domain, family B, member 2 2.1527 204944_at PTPRG protein tyrosine phosphatase, receptor type, G 2.1514 209383_at DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3 2.1452 226479_at KBTBD6 kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 6 2.1438 203349_s_at ETV5 ets variant gene 5 (ets-related molecule) 2.1394 201525_at APOD apolipoprotein D 2.1354 200885_at RHOC ras homolog gene family, member C 2.1343 208699_x_at TKT transketolase (Wernicke-Korsakoff syndrome) 2.1333 218276_s_at SAV1 salvador homolog 1 (Drosophila) 2.1330 225609_at GSR glutathione reductase 2.1323 203925_at GCLM glutamate-cysteine ligase, modifier subunit 2.1314 200787_s_at PEA15 phosphoprotein enriched in astrocytes 15 2.1308 201393_s_at IGF2R insulin-like growth factor 2 receptor 2.1262 226264_at SUSD1 sushi domain containing 1 2.1256 228073_at NANP N-acetylneuraminic acid phosphatase 2.1246 200958_s_at SDCBP syndecan binding protein (syntenin) 2.1246 219502_at NEIL3 nei endonuclease VIII-like 3 (E. coli) 2.1223 200867_at ZNF313 zinc finger protein 313 2.1201 201889_at FAM3C family with sequence similarity 3, member C 2.1186 225447_at GPD2 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 (mitochondrial) 2.1124 202260_s_at STXBP1 syntaxin binding protein 1 2.1094 202912_at ADM adrenomedullin 2.1088 226886_at --- Clone 114 tumor rejection antigen 2.0984 242979_at --- Transcribed locus 2.0974 242277_at PHACTR2 Phosphatase and actin regulator 2 2.0955 NBPF11 /// neuroblastoma breakpoint family, member 11 /// neuroblastoma 242191_at NBPF9 /// breakpoint family, member 9 /// neuroblastoma breakpoint family, 2.0942 NBPF10 member 10 226893_at --- CDNA FLJ31718 fis, clone NT2RI2006647 2.0921 225598_at SLC45A4 solute carrier family 45, member 4 2.0884 221039_s_at DDEF1 development and differentiation enhancing factor 1 2.0872 227013_at LATS2 LATS, large tumor suppressor, homolog 2 (Drosophila) 2.0872 222212_s_at LASS2 LAG1 longevity assurance homolog 2 (S. cerevisiae) 2.0854 218990_s_at SPRR3 small proline-rich protein 3 2.0839 1558693_s_at C1orf85 chromosome 1 open reading frame 85 2.0780 217988_at CCNB1IP1 cyclin B1 interacting protein 1 2.0765 224833_at ETS1 v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian) 2.0764 225665_at ZAK sterile alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK 2.0745 212274_at LPIN1 lipin 1 2.0738 231576_at ETNK1 Ethanolamine kinase 1 2.0633 227037_at LOC201164 similar to CG12314 gene product 2.0611 233406_at KIAA0256 KIAA0256 gene product 2.0579 217294_s_at ENO1 enolase 1, (alpha) 2.0512

103 Annexes 1 - Résultats

212894_at SUPV3L1 suppressor of var1, 3-like 1 (S. cerevisiae) 2.0509 200615_s_at AP2B1 adaptor-related protein complex 2, beta 1 subunit 2.0480 210896_s_at ASPH aspartate beta-hydroxylase 2.0445 239231_at --- CDNA FLJ41910 fis, clone PEBLM2007834 2.0443 233888_s_at SRGAP1 SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1 2.0443 241418_at --- MRNA; cDNA DKFZp686B14224 (from clone DKFZp686B14224) 2.0433 pleckstrin homology domain containing, family A (phosphoinositide 223370_at PLEKHA3 2.0431 binding specific) member 3 211372_s_at IL1R2 interleukin 1 receptor, type II 2.0403 PRP19/PSO4 pre-mRNA processing factor 19 homolog (S. 203103_s_at PRPF19 2.0379 cerevisiae) 212196_at IL6ST Interleukin 6 signal transducer (gp130, oncostatin M receptor) 2.0350 201751_at JOSD1 Josephin domain containing 1 2.0312 203093_s_at TIMM44 translocase of inner mitochondrial membrane 44 homolog (yeast) 2.0201 224951_at LASS5 LAG1 longevity assurance homolog 5 (S. cerevisiae) 2.0177 227279_at TCEAL3 transcription elongation factor A (SII)-like 3 2.0166 222547_at MAP4K4 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4 2.0165 209385_s_at PROSC proline synthetase co-transcribed homolog (bacterial) 2.0144 228933_at NHS Nance-Horan syndrome (congenital cataracts and dental anomalies) 2.0137 206683_at ZNF165 zinc finger protein 165 2.0131 239804_at CCNI Cyclin I 2.0117 206343_s_at NRG1 neuregulin 1 2.0087 219155_at PITPNC1 phosphatidylinositol transfer protein, cytoplasmic 1 2.0073 201619_at PRDX3 peroxiredoxin 3 2.0066 225055_at AMZ2 Archaemetzincins-2 2.0008 236297_at --- CDNA FLJ45742 fis, clone KIDNE2016327 -2.0020 232931_at ASCC3L1 activating signal cointegrator 1 complex subunit 3-like 1 -2.0025 237232_at UBE2H Ubiquitin-conjugating enzyme E2H (UBC8 homolog, yeast) -2.0035 1559232_a_at SLC33A1 Solute carrier family 33 (acetyl-CoA transporter), member 1 -2.0035 227211_at PHF19 PHD finger protein 19 -2.0058 222037_at MCM4 MCM4 minichromosome maintenance deficient 4 (S. cerevisiae) -2.0063 209512_at HSDL2 hydroxysteroid dehydrogenase like 2 -2.0065 222016_s_at ZNF323 zinc finger protein 323 -2.0080 214807_at --- MRNA; cDNA DKFZp564O0862 (from clone DKFZp564O0862) -2.0088 204033_at TRIP13 thyroid hormone receptor interactor 13 -2.0092 1569157_s_at LOC162993 hypothetical protein LOC162993 -2.0098 240242_at --- Transcribed locus -2.0101 228708_at RAB27B RAB27B, member RAS oncogene family -2.0112 224771_at NAV1 neuron navigator 1 -2.0125 236781_at ANKS1A Ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 1A -2.0138 1565976_at FCHO2 FCH domain only 2 -2.0203 235660_at --- MRNA; cDNA DKFZp667E0114 (from clone DKFZp667E0114) -2.0226 242560_at FANCD2 Fanconi anemia, complementation group D2 -2.0241 1559204_x_at KRAS v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog -2.0242

104 Annexes 1 - Résultats

ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit 213995_at ATP5S -2.0269 s (factor B) 243330_at CTNNA2 Catenin (cadherin-associated protein), alpha 2 -2.0290 ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 (rho family, small GTP 213603_s_at RAC2 -2.0304 binding protein Rac2) Protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase domain 238902_at PCMTD1 -2.0317 containing 1 1568706_s_at AVIL Advillin -2.0333 228032_s_at --- CDNA FLJ36663 fis, clone UTERU2002826 -2.0336 231722_at CASP14 caspase 14, apoptosis-related cysteine peptidase -2.0337 243793_at AHDC1 AT hook, DNA binding motif, containing 1 -2.0341 237238_at WWC1 WW, C2 and coiled-coil domain containing 1 -2.0377 214594_x_at ATP8B1 ATPase, Class I, type 8B, member 1 -2.0386 1560199_x_at FLJ11903 similar to hypothetical protein MGC40405 -2.0386 protein phosphatase 2 (formerly 2A), regulatory subunit B (PR 52), 236492_at PPP2R2A -2.0392 alpha isoform Full-length cDNA clone CS0DI029YM01 of Placenta Cot 25- 235247_at --- -2.0397 normalized of Homo sapiens (human) 227510_x_at PRO1073 PRO1073 protein -2.0404 SLC35E1 /// solute carrier family 35, member E1 /// hypothetical protein 222039_at -2.0425 LOC146909 LOC146909 242932_at FARP2 FERM, RhoGEF and pleckstrin domain protein 2 -2.0429 242146_at SNRPA1 Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A' -2.0429 241832_at FAM98A family with sequence similarity 98, member A -2.0435 244663_at --- Transcribed locus -2.0450 206277_at P2RY2 purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 2 -2.0452 203554_x_at PTTG1 pituitary tumor-transforming 1 -2.0485 230312_at --- Transcribed locus -2.0488 erythrocyte membrane protein band 4.1-like 3 /// erythrocyte 211776_s_at EPB41L3 -2.0545 membrane protein band 4.1-like 3 233867_at --- CDNA FLJ20112 fis, clone COL05405 -2.0562 229457_at ANKHD1 ankyrin repeat and KH domain containing 1 -2.0562 1563130_a_at IREB2 Iron-responsive element binding protein 2 -2.0572 240240_at UBE2J2 Ubiquitin-conjugating enzyme E2, J2 (UBC6 homolog, yeast) -2.0597 232865_at AFF4 AF4/FMR2 family, member 4 -2.0600 232529_at SP3 Sp3 transcription factor -2.0605 215203_at GOLGA4 golgi autoantigen, golgin subfamily a, 4 -2.0620 226259_at EXOC6 exocyst complex component 6 -2.0623 233824_at LPP LIM domain containing preferred translocation partner in lipoma -2.0629 222889_at DCLRE1B DNA cross-link repair 1B (PSO2 homolog, S. cerevisiae) -2.0635 209754_s_at TMPO thymopoietin -2.0637 242476_at --- Transcribed locus -2.0646 239629_at CFLAR CASP8 and FADD-like apoptosis regulator -2.0651 206364_at KIF14 kinesin family member 14 -2.0663

105 Annexes 1 - Résultats

SMG1 /// PI-3-kinase-related kinase SMG-1 /// KIAA0220-like protein /// LOC23117 /// hypothetical protein LOC440345 /// PI-3-kinase-related kinase 244766_at LOC440345 /// -2.0666 SMG-1 pseudogene /// PI-3-kinase-related kinase SMG-1 LOC440354 /// pseudogene LOC595101 205206_at KAL1 Kallmann syndrome 1 sequence -2.0696 MCM5 minichromosome maintenance deficient 5, cell division 216237_s_at MCM5 -2.0701 cycle 46 (S. cerevisiae) 237216_at GARNL1 GTPase activating Rap/RanGAP domain-like 1 -2.0705 204300_at PET112L PET112-like (yeast) -2.0709 239780_at KIF1B Kinesin family member 1B -2.0712 240262_at CTNNA1 Catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa -2.0718 243301_at COL22A1 collagen, type XXII, alpha 1 -2.0751 205339_at STIL SCL/TAL1 interrupting locus -2.0756 Transcribed locus, weakly similar to XP_209041.2 PREDICTED: 240165_at --- -2.0766 similar to KIAA1503 protein [Homo sapiens] 225067_at ULK3 unc-51-like kinase 3 (C. elegans) -2.0772 221666_s_at PYCARD PYD and CARD domain containing -2.0796 215726_s_at CYB5A cytochrome b5 type A (microsomal) -2.0822 213517_at PCBP2 Poly(rC) binding protein 2 -2.0850 219494_at RAD54B RAD54 homolog B (S. cerevisiae) -2.0853 222634_s_at TBL1XR1 transducin (beta)-like 1X-linked receptor 1 -2.0876 205909_at POLE2 polymerase (DNA directed), epsilon 2 (p59 subunit) -2.0887 227955_s_at --- CDNA: FLJ22256 fis, clone HRC02860 -2.0953 237262_at --- Full length insert cDNA clone ZE05E03 -2.0956 231449_at --- Transcribed locus -2.1010 1552619_a_at ANLN anillin, actin binding protein -2.1015 Phosphoribosylglycinamide formyltransferase, 244822_at GART phosphoribosylglycinamide synthetase, -2.1040 phosphoribosylaminoimidazole synthetase DKFZp762E13 218726_at hypothetical protein DKFZp762E1312 -2.1041 12 1558515_at --- CDNA clone IMAGE:4328048 -2.1047 membrane protein, palmitoylated 7 (MAGUK p55 subfamily 1564308_a_at MPP7 -2.1068 member 7) 241768_at BCCIP BRCA2 and CDKN1A interacting protein -2.1083 225239_at --- CDNA FLJ26120 fis, clone SYN00419 -2.1101 202338_at TK1 thymidine kinase 1, soluble -2.1114 232094_at C15orf29 Chromosome 15 open reading frame 29 -2.1115 242642_at NDEL1 NudE nuclear distribution gene E homolog like 1 (A. nidulans) -2.1129 244659_at TRIP12 Thyroid hormone receptor interactor 12 -2.1135 Transcribed locus, strongly similar to NP_005351.2 v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog; Avian 229327_s_at --- musculoaponeurotic fibrosarcoma (MAF) protooncogene; v-maf -2.1137 musculoaponeurotic fibrosarcoma (avian) oncogene homolog [Homo sapiens] TAF15 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)- 227891_s_at TAF15 -2.1139 associated factor, 68kDa

106 Annexes 1 - Résultats

234326_at N4BP1 Nedd4 binding protein 1 -2.1150 226936_at C6orf173 chromosome 6 open reading frame 173 -2.1152 201896_s_at PSRC1 proline/serine-rich coiled-coil 1 -2.1164 201506_at TGFBI transforming growth factor, beta-induced, 68kDa -2.1171 232552_at DAAM1 Dishevelled associated activator of morphogenesis 1 -2.1175 242369_x_at NCOA2 Nuclear receptor coactivator 2 -2.1179 237713_at TACC2 Transforming, acidic coiled-coil containing protein 2 -2.1196 1557963_at CDC42BPB CDC42 binding protein kinase beta (DMPK-like) -2.1200 212570_at ENDOD1 endonuclease domain containing 1 -2.1229 phosphatase and tensin homolog (mutated in multiple advanced 233254_x_at PTEN -2.1231 cancers 1) 205933_at SETBP1 SET binding protein 1 -2.1249 236462_at YEATS2 YEATS domain containing 2 -2.1274 227678_at XRCC6BP1 XRCC6 binding protein 1 -2.1288 235626_at CAMK1D calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID -2.1305 221861_at --- MRNA; cDNA DKFZp762M127 (from clone DKFZp762M127) -2.1309 219250_s_at FLRT3 fibronectin leucine rich transmembrane protein 3 -2.1322 1554486_a_at C6orf114 chromosome 6 open reading frame 114 -2.1346 229070_at C6orf105 chromosome 6 open reading frame 105 -2.1347 205394_at CHEK1 CHK1 checkpoint homolog (S. pombe) -2.1364 236951_at NSFL1C NSFL1 (p97) cofactor (p47) -2.1367 226875_at DOCK11 dedicator of cytokinesis 11 -2.1369 1557586_s_at ATP6V1H ATPase, H+ transporting, lysosomal 50/57kDa, V1 subunit H -2.1382 240282_at WDR1 WD repeat domain 1 -2.1383 228729_at CCNB1 cyclin B1 -2.1390 213454_at APITD1 apoptosis-inducing, TAF9-like domain 1 -2.1395 234762_x_at NLN Neurolysin (metallopeptidase M3 family) -2.1399 226223_at PAWR PRKC, apoptosis, WT1, regulator -2.1407 244610_x_at UBE2E2 Ubiquitin-conjugating enzyme E2E 2 (UBC4/5 homolog, yeast) -2.1421 235716_at --- Transcribed locus -2.1427 1556373_a_at MGC35361 Hypothetical protein MGC35361 -2.1441 233388_at CA12 Carbonic anhydrase XII -2.1478 204092_s_at AURKA aurora kinase A -2.1483 228320_x_at CCDC64 coiled-coil domain containing 64 -2.1501 225904_at C1orf96 chromosome 1 open reading frame 96 -2.1504 ELOVL family member 6, elongation of long chain fatty acids 210868_s_at ELOVL6 -2.1511 (FEN1/Elo2, SUR4/Elo3-like, yeast) 237868_x_at KIAA0674 KIAA0674 -2.1523 213701_at C12orf29 chromosome 12 open reading frame 29 -2.1529 243384_at ------2.1543 234552_at --- CDNA FLJ20083 fis, clone COL03440 -2.1559 1562416_at FLNB Filamin B, beta (actin binding protein 278) -2.1598 243647_at ------2.1613 SMA3 /// 226365_at SMA3 /// Similar to cadherin 12, type 2 preproprotein -2.1619 LOC643998

107 Annexes 1 - Résultats

243004_at --- Transcribed locus -2.1627 243769_at ------2.1647 239536_at C1orf56 Chromosome 1 open reading frame 56 -2.1667 protein kinase, interferon-inducible double stranded RNA dependent 237107_at PRKRA -2.1669 activator 243660_at CHD9 Chromodomain helicase DNA binding protein 9 -2.1768 219428_s_at PXMP4 peroxisomal membrane protein 4, 24kDa -2.1786 DKFZp451M21 231540_at hypothetical protein DKFZp451M2119 -2.1791 19 203178_at GATM glycine amidinotransferase (L-arginine:glycine amidinotransferase) -2.1812 218662_s_at HCAP-G chromosome condensation protein G -2.1829 204887_s_at PLK4 polo-like kinase 4 (Drosophila) -2.1853 206102_at GINS1 GINS complex subunit 1 (Psf1 homolog) -2.1854 213007_at KIAA1794 KIAA1794 -2.1864 201008_s_at TXNIP thioredoxin interacting protein -2.1865 239551_at TMED3 Transmembrane emp24 protein transport domain containing 3 -2.1902 224428_s_at CDCA7 cell division cycle associated 7 /// cell division cycle associated 7 -2.1903 1559023_a_at ------2.1917 225299_at MYO5B myosin VB -2.1924 202705_at CCNB2 cyclin B2 -2.1935 243499_at --- Transcribed locus -2.1939 206642_at DSG1 desmoglein 1 -2.1940 232890_at C14orf135 Chromosome 14 open reading frame 135 -2.1972 LOC645638 /// 229566_at similar to WDNM1 homolog /// similar to WDNM1 homolog -2.2005 LOC650626 47571_at ZNF236 zinc finger protein 236 -2.2009 216392_s_at SEC23IP SEC23 interacting protein -2.2044 240991_at NDRG1 N-myc downstream regulated gene 1 -2.2047 1553718_at ZNF548 zinc finger protein 548 -2.2083 236752_at PKP4 Plakophilin 4 -2.2085 238534_at LRRFIP1 Leucine rich repeat (in FLII) interacting protein 1 -2.2091 244665_at ITGA6 Integrin, alpha 6 -2.2099 219316_s_at C14orf58 chromosome 14 open reading frame 58 -2.2109 229966_at EWSR1 Ewing sarcoma breakpoint region 1 -2.2149 236524_at TM2D1 TM2 domain containing 1 -2.2154 240008_at ARID1B AT rich interactive domain 1B (SWI1-like) -2.2189 216211_at C10orf18 Chromosome 10 open reading frame 18 -2.2222 C-type lectin domain family 7, member A /// C-type lectin domain 221698_s_at CLEC7A -2.2245 family 7, member A 240499_at KIAA1128 KIAA1128 -2.2271 236470_at --- Transcribed locus -2.2276 PAK3 /// p21 (CDKN1A)-activated kinase 3 /// ubiquitin-conjugating enzyme 202954_at -2.2289 UBE2C E2C 239486_at ------2.2294 218349_s_at ZWILCH Zwilch, kinetochore associated, homolog (Drosophila) -2.2301

108 Annexes 1 - Résultats

1553672_at ENAH enabled homolog (Drosophila) -2.2322 243828_at KATNAL1 Katanin p60 subunit A-like 1 -2.2350 205627_at CDA cytidine deaminase -2.2352 1557996_at ------2.2352 202575_at CRABP2 cellular retinoic acid binding protein 2 -2.2381 238774_at KIAA1267 KIAA1267 -2.2381 214199_at SFTPD surfactant, pulmonary-associated protein D -2.2418 213067_at MYH10 myosin, heavy polypeptide 10, non-muscle -2.2443 232511_at --- CDNA clone IMAGE:5310744 -2.2476 223126_s_at C1orf21 chromosome 1 open reading frame 21 -2.2527 1773_at FNTB farnesyltransferase, CAAX box, beta -2.2527 MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide A (myocyte 239571_at MEF2A -2.2600 enhancer factor 2A) 1552621_at POLR2J2 DNA directed RNA polymerase II polypeptide J-related gene -2.2613 1560926_at PPP4R2 Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2 -2.2632 1560680_at EEA1 Early endosome antigen 1, 162kD -2.2646 239954_at ZNF160 zinc finger protein 160 -2.2646 205024_s_at RAD51 RAD51 homolog (RecA homolog, E. coli) (S. cerevisiae) -2.2647 231925_at P2RY1 Purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 1 -2.2659 233674_at FOXO3A Forkhead box O3A -2.2674 232489_at CCDC76 coiled-coil domain containing 76 -2.2678 216858_x_at ------2.2691 220066_at CARD15 caspase recruitment domain family, member 15 -2.2710 1554287_at TRIM4 tripartite motif-containing 4 -2.2718 227209_at CNTN1 Contactin 1 -2.2722 241837_at ARID5B AT rich interactive domain 5B (MRF1-like) -2.2724 1557384_at ZNF131 Zinc finger protein 131 (clone pHZ-10) -2.2738 1557270_at ZNF69 Zinc finger protein 69 -2.2740 1553333_at C1orf161 chromosome 1 open reading frame 161 -2.2748 POLR2J2 /// DNA directed RNA polymerase II polypeptide J-related gene /// 1552622_s_at -2.2780 LOC441259 similar to postmeiotic segregation increased 2-like 2 229538_s_at IQGAP3 IQ motif containing GTPase activating protein 3 -2.2799 227109_at CYP2R1 cytochrome P450, family 2, subfamily R, polypeptide 1 -2.2817 1563900_at FAM83B family with sequence similarity 83, member B -2.2818 242972_at HCG18 HLA complex group 18 -2.2833 Erythrocyte membrane protein band 4.1 (elliptocytosis 1, RH- 236379_at EPB41 -2.2864 linked) 233931_at ELF1 E74-like factor 1 (ets domain transcription factor) -2.2868 201996_s_at SPEN spen homolog, transcriptional regulator (Drosophila) -2.2882 1562378_s_at PROM2 prominin 2 -2.2895 240314_at NCOR1 Nuclear receptor co-repressor 1 -2.2917 butyrobetaine (gamma), 2-oxoglutarate dioxygenase (gamma- 205363_at BBOX1 -2.2929 butyrobetaine hydroxylase) 1 236613_at RBM25 RNA binding motif protein 25 -2.2953 243031_at RTN4 Reticulon 4 -2.2964

109 Annexes 1 - Résultats

207414_s_at PCSK6 proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 -2.2971 215191_at --- CDNA FLJ14085 fis, clone HEMBB1002534 -2.2973 MCM6 minichromosome maintenance deficient 6 (MIS5 homolog, 201930_at MCM6 -2.2974 S. pombe) (S. cerevisiae) 204400_at EFS embryonal Fyn-associated substrate -2.2987 212022_s_at MKI67 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 -2.2992 206023_at NMU neuromedin U -2.3020 227759_at PCSK9 proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 -2.3134 225911_at NPNT nephronectin -2.3176 205774_at F12 coagulation factor XII (Hageman factor) -2.3185 244674_at RBM6 RNA binding motif protein 6 -2.3206 226959_at ------2.3215 218806_s_at VAV3 vav 3 oncogene -2.3234 214753_at PFAAP5 Phosphonoformate immuno-associated protein 5 -2.3318 212949_at BRRN1 barren homolog 1 (Drosophila) -2.3321 1556950_s_at SERPINB6 serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 6 -2.3341 238880_at GTF3A general transcription factor IIIA -2.3378 210397_at DEFB1 defensin, beta 1 -2.3405 209762_x_at SP110 SP110 nuclear body protein -2.3411 237768_x_at ------2.3411 223229_at UBE2T ubiquitin-conjugating enzyme E2T (putative) -2.3441 202037_s_at SFRP1 secreted frizzled-related protein 1 -2.3446 237690_at GPR115 G protein-coupled receptor 115 -2.3450 238982_at DENR density-regulated protein -2.3488 232278_s_at DEPDC1 DEP domain containing 1 -2.3498 217586_x_at ------2.3498 242225_at MON2 MON2 homolog (S. cerevisiae) -2.3569 203213_at CDC2 cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M -2.3588 218802_at CCDC109B coiled-coil domain containing 109B -2.3602 235730_at LOC642351 hypothetical protein LOC642351 -2.3608 BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta 203755_at BUB1B -2.3623 (yeast) 215206_at EXT1 Exostoses (multiple) 1 -2.3639 203742_s_at TDG thymine-DNA glycosylase -2.3664 226877_at RPL32P3 ribosomal protein L32 pseudogene 3 -2.3677 225687_at FAM83D family with sequence similarity 83, member D -2.3699 236474_at ZNF395 Zinc finger protein 395 -2.3722 240636_at --- Transcribed locus -2.3771 Splicing factor proline/glutamine-rich (polypyrimidine tract binding 221768_at SFPQ -2.3887 protein associated) 235493_at ZNF638 Zinc finger protein 638 -2.3926 1556277_a_at PAPD4 PAP associated domain containing 4 -2.3960 238812_at ZA20D3 Zinc finger, A20 domain containing 3 -2.3962 244145_at FYCO1 FYVE and coiled-coil domain containing 1 -2.3975 244801_at PSMB7 Proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 7 -2.3983

110 Annexes 1 - Résultats

solute carrier family 22 (extraneuronal monoamine transporter), 205421_at SLC22A3 -2.3986 member 3 SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of 239238_at SMARCC1 -2.3998 chromatin, subfamily c, member 1 242550_at EIF3S9 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 9 eta, 116kDa -2.4005 222104_x_at GTF2H3 general transcription factor IIH, polypeptide 3, 34kDa -2.4022 232141_at U2AF1 U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1 -2.4025 1555019_at PCDH21 protocadherin 21 -2.4107 242859_at TFCP2 Transcription factor CP2 -2.4212 203968_s_at CDC6 CDC6 cell division cycle 6 homolog (S. cerevisiae) -2.4227 235138_at VPS35 Vacuolar protein sorting 35 (yeast) -2.4239 242413_at ITSN2 Intersectin 2 -2.4260 222348_at ------2.4287 1558714_at ROBO1 Roundabout, axon guidance receptor, homolog 1 (Drosophila) -2.4302 215268_at KIAA0754 hypothetical LOC643314 -2.4320 244185_at METAP2 Methionyl aminopeptidase 2 -2.4351 219510_at POLQ polymerase (DNA directed), theta -2.4362 205442_at MFAP3L microfibrillar-associated protein 3-like -2.4369 1557360_at LRPPRC leucine-rich PPR-motif containing -2.4379 229674_at SERTAD4 SERTA domain containing 4 -2.4389 226663_at ANKRD10 ankyrin repeat domain 10 -2.4405 218953_s_at PCYOX1L prenylcysteine oxidase 1 like -2.4409 1564248_at VIL2 Villin 2 (ezrin) -2.4412 TAF9B RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)- 228483_s_at TAF9B -2.4426 associated factor, 31kDa 223822_at SUSD4 sushi domain containing 4 -2.4458 215252_at DNAJC7 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 7 -2.4469 214079_at DHRS2 dehydrogenase/reductase (SDR family) member 2 -2.4470 207192_at DNASE1L2 deoxyribonuclease I-like 2 -2.4483 239348_at USP31 Ubiquitin specific peptidase 31 -2.4512 239635_at TMEM137 transmembrane protein 137 -2.4520 201890_at RRM2 ribonucleotide reductase M2 polypeptide -2.4525 202871_at TRAF4 TNF receptor-associated factor 4 -2.4546 236907_at PABPC1 Poly(A) binding protein, cytoplasmic 1 -2.4566 ZNF738 /// 240155_x_at zinc finger protein 738 /// zinc finger protein 493 -2.4619 ZNF493 1557352_at SQLE Squalene epoxidase -2.4711 204796_at EML1 echinoderm microtubule associated protein like 1 -2.4752 223701_s_at USP47 ubiquitin specific peptidase 47 -2.4765 240238_at TBC1D22A TBC1 domain family, member 22A -2.4816 1558695_at PLEKHA5 Pleckstrin homology domain containing, family A member 5 -2.4827 231235_at NKTR natural killer-tumor recognition sequence -2.4847 207165_at HMMR hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM) -2.4871 243562_at ------2.4975 223381_at CDCA1 cell division cycle associated 1 -2.4982

111 Annexes 1 - Résultats

223878_at INPP4B inositol polyphosphate-4-phosphatase, type II, 105kDa -2.5029 KIF15 /// 219306_at kinesin family member 15 /// chromosome 7 open reading frame 9 -2.5034 C7orf9 239597_at PAN3 PAN3 polyA specific ribonuclease subunit homolog (S. cerevisiae) -2.5062 236496_at DEGS2 degenerative spermatocyte homolog 2, lipid desaturase (Drosophila) -2.5131 244605_at ------2.5166 214805_at EIF4A1 Eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 1 -2.5181 208955_at DUT dUTP pyrophosphatase -2.5199 242673_at UBE3C Ubiquitin protein ligase E3C -2.5270 215723_s_at PLD1 phospholipase D1, phosphatidylcholine-specific -2.5277 218542_at CEP55 centrosomal protein 55kDa -2.5278 214295_at KIAA0485 KIAA0485 protein -2.5287 240458_at ITPR2 Inositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 2 -2.5311 230792_at AMDD amidase domain containing -2.5332 LOC652689 /// hypothetical protein LOC652689 /// family with sequence similarity FAM72A /// 72, member A /// similar to family with sequence similarity 72, 225834_at -2.5336 LOC653594 /// member A /// similar to family with sequence similarity 72, member LOC653820 A 226279_at PRSS23 protease, serine, 23 -2.5337 NBPF1 /// neuroblastoma breakpoint family, member 1 /// neuroblastoma NBPF3 /// breakpoint family, member 3 /// neuroblastoma breakpoint family, NBPF11 /// member 11 /// neuroblastoma breakpoint family, member 20 /// 1562063_x_at NBPF20 /// -2.5344 neuroblastoma breakpoint family, member 9 /// neuroblastoma NBPF9 /// breakpoint family, member 10 /// neuroblastoma breakpoint family, NBPF10 /// member 8 NBPF8 220521_s_at ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S. cerevisiae) -2.5350 224555_x_at IL1F7 interleukin 1 family, member 7 (zeta) -2.5385 204162_at KNTC2 kinetochore associated 2 -2.5439 225655_at UHRF1 ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1 -2.5545 LOC653468 /// hypothetical protein LOC653468 /// similar to Ribosome biogenesis 217653_x_at -2.5560 LOC653471 protein BMS1 homolog 242055_at C6orf85 Chromosome 6 open reading frame 85 -2.5599 215062_at FMNL2 Formin-like 2 -2.5611 204962_s_at CENPA centromere protein A -2.5650 236313_at CDKN2B cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (p15, inhibits CDK4) -2.5690 226649_at PANK1 pantothenate kinase 1 -2.5702 235575_at LOC440993 Hypothetical gene supported by AK128346 -2.5705 similar to RAN-binding protein 2-like 1 isoform 2 /// similar to Ran- LOC653086 /// binding protein 2 (RanBP2) (Nuclear pore complex protein Nup358) 242712_x_at LOC653489 /// -2.5780 (Nucleoporin Nup358) (358 kDa nucleoporin) (P270) /// similar to LOC653596 RAN-binding protein 2-like 1 isoform 2 242836_at ATP1B3 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 3 polypeptide -2.5786 204072_s_at FRY furry homolog (Drosophila) -2.5825 227450_at C12orf46 chromosome 12 open reading frame 46 -2.5857 CDNA FLJ46881 fis, clone UTERU3015647, moderately similar to 226789_at --- -2.5901 Embigin precursor 242572_at GAB1 GRB2-associated binding protein 1 -2.5903

112 Annexes 1 - Résultats

237252_at THBD thrombomodulin -2.5906 229765_at ZNF207 Zinc finger protein 207 -2.5911 203961_at NEBL nebulette -2.5924 213805_at ABHD5 abhydrolase domain containing 5 -2.5928 229899_s_at HSUP1 Similar to RPE-spondin -2.5929 244780_at SGPP2 sphingosine-1-phosphate phosphotase 2 -2.5951 242271_at SLC26A9 solute carrier family 26, member 9 -2.6001 227062_at TncRNA trophoblast-derived noncoding RNA -2.6018 228323_at CASC5 cancer susceptibility candidate 5 -2.6072 242008_at AGTPBP1 ATP/GTP binding protein 1 -2.6074 203889_at SCG5 secretogranin V (7B2 protein) -2.6091 243583_at TCF7L2 Transcription factor 7-like 2 (T-cell specific, HMG-box) -2.6094 202503_s_at KIAA0101 KIAA0101 -2.6139 211788_s_at TREX2 three prime repair exonuclease 2 -2.6191 Similar to peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase COOH- 238755_at LOC644943 -2.6199 terminal interactor 218585_s_at DTL denticleless homolog (Drosophila) -2.6215 223316_at CCDC3 coiled-coil domain containing 3 -2.6230 220651_s_at MCM10 MCM10 minichromosome maintenance deficient 10 (S. cerevisiae) -2.6242 205651_x_at RAPGEF4 Rap guanine nucleotide exchange factor (GEF) 4 -2.6281 serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 4 /// serpin 211906_s_at SERPINB4 -2.6321 peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 4 205685_at CD86 CD86 molecule -2.6329 232264_at EDD1 E3 ubiquitin protein ligase, HECT domain containing, 1 -2.6340 1558732_at ------2.6428 242829_x_at FBXL3 F-box and leucine-rich repeat protein 3 -2.6469 241339_at C9orf52 Chromosome 9 open reading frame 52 -2.6484 1566191_at SUZ12 Suppressor of zeste 12 homolog (Drosophila) -2.6528 1556551_s_at SLC39A6 solute carrier family 39 (zinc transporter), member 6 -2.6577 226617_at ARL5A ADP-ribosylation factor-like 5A -2.6582 sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain 219259_at SEMA4A -2.6583 (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4A 217602_at PPIA peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A) -2.6587 219918_s_at ASPM asp (abnormal spindle)-like, microcephaly associated (Drosophila) -2.6615 233595_at USP34 ubiquitin specific peptidase 34 -2.6620 1552777_a_at RAET1E retinoic acid early transcript 1E -2.6622 230000_at C17orf27 chromosome 17 open reading frame 27 -2.6631 227276_at PLXDC2 plexin domain containing 2 -2.6636 222809_x_at C14orf65 chromosome 14 open reading frame 65 -2.6665 203767_s_at STS steroid sulfatase (microsomal), arylsulfatase C, isozyme S -2.6681 Cell division cycle 2-like 5 (cholinesterase-related cell division 232266_x_at CDC2L5 -2.6689 controller) 242710_at RSNL2 Restin-like 2 -2.6699 213707_s_at DLX5 distal-less homeobox 5 -2.6712 235592_at ELL2 Elongation factor, RNA polymerase II, 2 -2.6718

113 Annexes 1 - Résultats

242903_at IFNGR1 interferon gamma receptor 1 -2.6784 215012_at ZNF451 zinc finger protein 451 -2.6810 236322_at FLJ31951 Hypothetical protein FLJ31951 -2.6817 238883_at THRAP2 Thyroid hormone receptor associated protein 2 -2.6823 235701_at R3HDM2 R3H domain containing 2 -2.6827 201291_s_at TOP2A topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa -2.6852 221521_s_at GINS2 GINS complex subunit 2 (Psf2 homolog) -2.6875 226999_at RNPC3 RNA-binding region (RNP1, RRM) containing 3 -2.6881 206400_at LGALS7 lectin, galactoside-binding, soluble, 7 (galectin 7) -2.6884 203016_s_at SSX2IP synovial sarcoma, X breakpoint 2 interacting protein -2.6911 240066_at LOC168850 Hypothetical protein LOC168850 -2.6975 DKFZp761P04 240690_at Hypothetical protein DKFZp761P0423 -2.7087 23 238455_at --- CDNA FLJ45742 fis, clone KIDNE2016327 -2.7199 223307_at CDCA3 cell division cycle associated 3 -2.7204 VPS13D /// vacuolar protein sorting 13 homolog D (S. cerevisiae) /// similar to 220221_at -2.7237 LOC654256 vacuolar protein sorting 13D isoform 1 235847_at ZFAND3 Zinc finger, AN1-type domain 3 -2.7426 1559078_at BCL11A B-cell CLL/lymphoma 11A (zinc finger protein) -2.7449 204718_at EPHB6 EPH receptor B6 -2.7475 233350_s_at TEX264 testis expressed sequence 264 -2.7535 238342_at ------2.7538 243752_s_at PSCD3 pleckstrin homology, Sec7 and coiled-coil domains 3 -2.7549 mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 6 homolog (S. 207078_at MED6 -2.7560 cerevisiae) 207828_s_at CENPF centromere protein F, 350/400ka (mitosin) -2.7587 234331_s_at ------2.7689 NBPF1 /// neuroblastoma breakpoint family, member 1 /// neuroblastoma NBPF11 /// breakpoint family, member 11 /// neuroblastoma breakpoint family, NBPF20 /// 1569519_at member 20 /// neuroblastoma breakpoint family, member 9 /// -2.7700 NBPF9 /// neuroblastoma breakpoint family, member 10 /// neuroblastoma NBPF10 /// breakpoint family, member 8 NBPF8 242059_at ETNK1 Ethanolamine kinase 1 -2.7732 242695_at --- Transcribed locus -2.7869 220085_at HELLS helicase, lymphoid-specific -2.7894 218355_at KIF4A kinesin family member 4A -2.7943 1556658_a_at MBNL1 Muscleblind-like (Drosophila) -2.7946 240673_at --- Transcribed locus -2.7955 232170_at S100A7L1 S100 calcium binding protein A7-like 1 -2.7978 209681_at SLC19A2 solute carrier family 19 (thiamine transporter), member 2 -2.8017 218755_at KIF20A kinesin family member 20A -2.8042 Transcribed locus, weakly similar to XP_517454.1 PREDICTED: 228623_at --- -2.8079 similar to hypothetical protein MGC45438 [Pan troglodytes] 203418_at CCNA2 cyclin A2 -2.8117 206539_s_at CYP4F12 cytochrome P450, family 4, subfamily F, polypeptide 12 -2.8173

114 Annexes 1 - Résultats

217523_at endothelin CD44 molecule (Indian blood group) -2.8185 243073_at C6orf153 Chromosome 6 open reading frame 153 -2.8297 202095_s_at BIRC5 baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin) -2.8354 242871_at PAQR5 progestin and adipoQ receptor family member V -2.8419 243993_at PCTK2 PCTAIRE protein kinase 2 -2.8453 219990_at E2F8 E2F transcription factor 8 -2.8464 206363_at MAF v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian) -2.8529 236966_at ARMC8 armadillo repeat containing 8 -2.8586 239660_at C20orf74 chromosome 20 open reading frame 74 -2.8730 Family with sequence similarity 62 (C2 domain containing) member 1564424_at FAM62B -2.8825 B 209891_at SPBC25 spindle pole body component 25 homolog (S. cerevisiae) -2.8870 201310_s_at C5orf13 chromosome 5 open reading frame 13 -2.8923 ATP7A /// ATPase, Cu++ transporting, alpha polypeptide (Menkes syndrome) 205197_s_at -2.8988 LOC644732 /// similar to ATPase, Cu++ transporting, alpha polypeptide 241242_at C9orf10 Chromosome 9 open reading frame 10 -2.9114 236514_at ACOT8 Acyl-CoA thioesterase 8 -2.9157 240046_at ------2.9198 241954_at FDFT1 Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1 -2.9208 213832_at --- MRNA; cDNA DKFZp547P042 (from clone DKFZp547P042) -2.9283 Mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 31 homolog 243319_at MED31 -2.9317 (S. cerevisiae) 243179_at --- CDNA FLJ33993 fis, clone DFNES2007757 -2.9326 1563088_a_at LOC284837 hypothetical protein LOC284837 -2.9336 236201_at --- Transcribed locus -2.9343 231108_at FUS Fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma) -2.9343 240383_at UBE2D3 ubiquitin-conjugating enzyme E2D 3 (UBC4/5 homolog, yeast) -2.9389 NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 8, 23kDa (NADH- 232169_x_at NDUFS8 -2.9405 coenzyme Q reductase) 232344_at RASA1 RAS p21 protein activator (GTPase activating protein) 1 -2.9413 242352_at NIPBL Nipped-B homolog (Drosophila) -2.9489 233405_at FIP1L1 FIP1 like 1 (S. cerevisiae) -2.9678 242074_at PITPNB Phosphatidylinositol transfer protein, beta -2.9705 242732_at MTSS1 Metastasis suppressor 1 -2.9736 203423_at RBP1 retinol binding protein 1, cellular -2.9751 231148_at IGFL2 IGF-like family member 2 -2.9829 236985_at EIF4B Eukaryotic translation initiation factor 4B -3.0014 210701_at CFDP1 craniofacial development protein 1 -3.0070 204709_s_at KIF23 kinesin family member 23 -3.0218 204822_at TTK TTK protein kinase -3.0231 RAB27B /// RAB27B, member RAS oncogene family /// SH3 domain binding 207018_s_at -3.0275 SH3BGR glutamic acid-rich protein 239272_at MMP28 matrix metallopeptidase 28 -3.0362 epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v- 1565483_at EGFR -3.0511 erb-b) oncogene homolog, avian)

115 Annexes 1 - Résultats

serpin peptidase inhibitor, clade E (nexin, plasminogen activator 202627_s_at SERPINE1 -3.0534 inhibitor type 1), member 1 1553982_a_at RAB7B RAB7B, member RAS oncogene family -3.0534 238736_at REV3L REV3-like, catalytic subunit of DNA polymerase zeta (yeast) -3.0566 213624_at SMPDL3A sphingomyelin phosphodiesterase, acid-like 3A -3.0813 219148_at PBK PDZ binding kinase -3.0825 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D (AU-rich element RNA 241702_at HNRPD -3.0885 binding protein 1, 37kDa) 224839_s_at GPT2 glutamic pyruvate transaminase (alanine aminotransferase) 2 -3.0909 207254_at SLC15A1 solute carrier family 15 (oligopeptide transporter), member 1 -3.0949 232597_x_at SFRS2IP Splicing factor, arginine/serine-rich 2, interacting protein -3.0963 238431_at --- Transcribed locus -3.1013 1563468_at ZAK Sterile alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK -3.1025 213256_at MARCH3 membrane-associated ring finger (C3HC4) 3 -3.1043 Phosphorylase, glycogen; liver (Hers disease, glycogen storage 232958_at PYGL -3.1045 disease type VI) 236700_at LOC653352 similar to eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 8 -3.1122 204942_s_at ALDH3B2 aldehyde dehydrogenase 3 family, member B2 -3.1321 210052_s_at TPX2 TPX2, microtubule-associated, homolog (Xenopus laevis) -3.1531 204444_at KIF11 kinesin family member 11 -3.1660 236678_at JAG1 Jagged 1 (Alagille syndrome) -3.1691 235405_at GSTA4 glutathione S-transferase A4 -3.1691 237689_at SARS Seryl-tRNA synthetase -3.1698 1557987_at LOC641298 PI-3-kinase-related kinase SMG-1 - like locus -3.1817 235805_at ACSS2 Acyl-CoA synthetase short-chain family member 2 -3.1999 1559360_at EFNA5 Ephrin-A5 -3.2070 240180_at --- MRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1090207 -3.2081 235409_at MGA MAX gene associated -3.2274 1569312_at ZNF146 Zinc finger protein 146 -3.2288 209642_at BUB1 BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (yeast) -3.2352 240361_at ------3.2594 221081_s_at DENND2D DENN/MADD domain containing 2D -3.2633 215314_at ANK3 Ankyrin 3, node of Ranvier (ankyrin G) -3.2698 234032_at ZCCHC7 Zinc finger, CCHC domain containing 7 -3.2701 203798_s_at VSNL1 visinin-like 1 -3.2776 243206_at CCDC45 Coiled-coil domain containing 45 -3.2914 235798_at ------3.2915 239022_at SDHAL1 Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein-like 1 -3.2919 215029_at ------3.2935 232527_at --- CDNA FLJ13309 fis, clone OVARC1001442 -3.3177 Guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2- 222034_at GNB2L1 -3.3262 like 1 225354_s_at SH3BGRL2 SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 2 -3.3318 207109_at POU2F3 POU domain, class 2, transcription factor 3 -3.3335 235144_at --- CDNA FLJ32320 fis, clone PROST2003537 -3.3382

116 Annexes 1 - Résultats

203764_at DLG7 discs, large homolog 7 (Drosophila) -3.4421 219978_s_at NUSAP1 nucleolar and spindle associated protein 1 -3.4521 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 /// tumor 202687_s_at TNFSF10 -3.4603 necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 1566232_at LOC126917 Hypothetical protein LOC126917 -3.4810 229740_at LOC643008 PP12104 -3.4840 232304_at PELI1 Pellino homolog 1 (Drosophila) -3.4926 243171_at ------3.5052 230053_at --- Transcribed locus -3.5137 1553906_s_at FGD2 FYVE, RhoGEF and PH domain containing 2 -3.5585 202870_s_at CDC20 CDC20 cell division cycle 20 homolog (S. cerevisiae) -3.5709 230599_at RNF19 Ring finger protein 19 -3.5953 218986_s_at FLJ20035 hypothetical protein FLJ20035 -3.5965 235651_at ------3.6240 244597_at DNAPTP6 DNA polymerase-transactivated protein 6 -3.6378 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (non-coding 223940_x_at MALAT1 -3.6857 RNA) 238142_at KCTD13 Potassium channel tetramerisation domain containing 13 -3.7052 1556007_s_at CSNK1A1 Casein kinase 1, alpha 1 -3.7180 1556361_s_at ANKRD13C ankyrin repeat domain 13C -3.7276 229546_at LOC653602 hypothetical LOC653602 -3.7366 206465_at ACSBG1 acyl-CoA synthetase bubblegum family member 1 -3.7543 209446_s_at C7orf44 chromosome 7 open reading frame 44 -3.7589 220413_at SLC39A2 solute carrier family 39 (zinc transporter), member 2 -3.7906 1555773_at BPIL2 bactericidal/permeability-increasing protein-like 2 -3.8309 243544_at ADH1C Alcohol dehydrogenase 1C (class I), gamma polypeptide -3.8425 227238_at MUC15 mucin 15, cell surface associated -3.8625 206605_at P11 26 serine protease -3.8929 1558426_x_at TMEM142B transmembrane protein 142B -3.8934 205249_at EGR2 early growth response 2 (Krox-20 homolog, Drosophila) -3.9374 208188_at KRT9 keratin 9 (epidermolytic palmoplantar keratoderma) -3.9451 233874_at KIAA1458 KIAA1458 -4.0320 232530_at LOC652226 hypothetical protein LOC652226 -4.0428 243740_at --- Transcribed locus -4.1165 243177_at C6orf117 Chromosome 6 open reading frame 117 -4.1290 cyclin-dependent kinase inhibitor 3 (CDK2-associated dual 209714_s_at CDKN3 -4.1583 specificity phosphatase) 226382_at LOC283070 hypothetical protein LOC283070 -4.1647 217014_s_at AZGP1 alpha-2-glycoprotein 1, zinc -4.1651 224093_at IFNK interferon, kappa -4.1843 208246_x_at --- CDNA FLJ20006 fis, clone ADKA02694 -4.2011 1564333_a_at SORCS2 Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 2 -4.2156 219300_s_at CNTNAP2 contactin associated protein-like 2 -4.2502 236350_at --- Transcribed locus -4.2659 236266_at LOC283666 Hypothetical protein LOC283666 -4.2757

117 Annexes 1 - Résultats

229374_at EPHA4 EPH receptor A4 -4.3010 1562529_s_at RORA RAR-related orphan receptor A -4.3122 1553407_at MACF1 microtubule-actin crosslinking factor 1 -4.3308 242998_at RDH12 retinol dehydrogenase 12 (all-trans/9-cis/11-cis) -4.3381 1554179_s_at LYNX1 Ly6/neurotoxin 1 -4.3924 229596_at AMDHD1 amidohydrolase domain containing 1 -4.4176 1553986_at RASEF RAS and EF-hand domain containing -4.4527 1554565_x_at UNQ1887 signal peptide peptidase 3 -4.4724 238827_at SH3RF2 SH3 domain containing ring finger 2 -4.5778 239771_at CAND1 cullin-associated and neddylation-dissociated 1 -4.5790 231930_at ELMOD1 ELMO/CED-12 domain containing 1 -4.6531 207147_at DLX2 distal-less homeobox 2 -4.7061 207730_x_at HDGF2 Hepatoma-derived growth factor-related protein 2 -4.7804 228538_at ZNF662 zinc finger protein 662 -4.7805 203328_x_at IDE insulin-degrading enzyme -4.8145 myxovirus (influenza virus) resistance 1, interferon-inducible 202086_at MX1 protein p78 (mouse) /// myxovirus (influenza virus) resistance 1, -4.8258 interferon-inducible protein p78 (mouse) 203913_s_at HPGD hydroxyprostaglandin dehydrogenase 15-(NAD) -4.9080 ST6 (alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N- 227725_at ST6GALNAC1 -4.9467 acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 211712_s_at ANXA9 annexin A9 /// annexin A9 -4.9757 235514_at FLJ25084 Skin ASpartic Protease -5.0316 210130_s_at TM7SF2 transmembrane 7 superfamily member 2 -5.0340 214070_s_at ATP10B ATPase, Class V, type 10B -5.0435 202179_at BLMH bleomycin hydrolase -5.0938 218002_s_at CXCL14 chemokine (C-X-C motif) ligand 14 -5.4770 205513_at TCN1 transcobalamin I (vitamin B12 binding protein, R binder family) -5.5351 1552532_a_at ATP6V1C2 ATPase, H+ transporting, lysosomal 42kDa, V1 subunit C2 -5.5408 220432_s_at CYP39A1 cytochrome P450, family 39, subfamily A, polypeptide 1 -5.5901 205054_at NEB nebulin -5.7908 1554195_a_at MGC23985 similar to AVLV472 -5.9873 242559_at C20orf38 Chromosome 20 open reading frame 38 -6.2197 239787_at KCTD4 potassium channel tetramerisation domain containing 4 -6.4315 205590_at RASGRP1 RAS guanyl releasing protein 1 (calcium and DAG-regulated) -6.6097 229125_at ANKRD38 ankyrin repeat domain 38 -6.6611 226064_s_at DGAT2 diacylglycerol O-acyltransferase homolog 2 (mouse) -6.8606 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 /// 203153_at IFIT1 -7.1063 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 227736_at C10orf99 chromosome 10 open reading frame 99 -7.3007 215123_at LOC440345 hypothetical protein LOC440345 -7.4296 214382_at UNC93A unc-93 homolog A (C. elegans) -7.5546 210096_at CYP4B1 cytochrome P450, family 4, subfamily B, polypeptide 1 -7.9935 244197_x_at CNOT2 CCR4-NOT transcription complex, subunit 2 -8.7575 207324_s_at DSC1 desmocollin 1 -8.8212

118 Annexes 1 - Résultats

matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa 203936_s_at MMP9 -8.9066 type IV collagenase) 214536_at SLURP1 secreted LY6/PLAUR domain containing 1 -9.4176 217087_at C1orf68 chromosome 1 open reading frame 68 -9.4579 213780_at TCHH trichohyalin -9.6763 240248_at C10orf46 Chromosome 10 open reading frame 46 -10.1538 240420_at AADACL2 arylacetamide deacetylase-like 2 -11.4116 215704_at FLG filaggrin -11.5147 213933_at PTGER3 prostaglandin E receptor 3 (subtype EP3) -11.8960 220414_at CALML5 calmodulin-like 5 -12.4239 1553454_at RPTN repetin -15.6725 206643_at HAL histidine ammonia-lyase -17.4474 217521_at --- Transcribed locus -18.2340 serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, 1552544_at SERPINA12 -22.0370 antitrypsin), member 12 1569410_at RP1-14N1.3 filaggrin 2 -32.8168 207908_at KRT2 keratin 2 (epidermal ichthyosis bullosa of Siemens) -50.0784 206177_s_at ARG1 arginase, liver -80.3099

119 Annexes 1- Résultats

Tableaux A-2 A, B, C : Listes des sondes obtenues par triangulation

Tableau A-2A : liste des 33 sondes obtenues par la triangulation J4S–J4T–J7T

J4S/J4T J4S/J7T J7T/J4T

N° sonde Symbole gène Log2FC p-value Log2FC p-value Log2FC p-value 242074_at --- -1.55 0.04033 -0.79 0.21379 -0.76 0.02683 239243_at ZNF638 -1.63 0.00978 -0.76 0.14384 -0.87 0.02169 226877_at RPL32P3 -1.48 0.00026 -0.31 0.49597 -1.17 0.03693 234032_at --- -1.49 0.00780 -0.67 0.16530 -0.82 0.03070 240383_at UBE2D3 -1.50 0.00537 -0.75 0.11777 -0.75 0.04697 239780_at --- -1.41 0.00569 -0.77 0.07657 -0.65 0.02548 241837_at --- -1.28 0.03474 -0.42 0.36349 -0.86 0.03323 244597_at SPATS2L -1.31 0.03003 -0.63 0.20934 -0.68 0.01144 238706_at PAPD4 -1.34 0.00376 -0.56 0.16872 -0.78 0.02586 240458_at --- -1.34 0.01775 -0.52 0.22680 -0.82 0.02682 229899_s_at C20orf199 -1.15 0.01903 -0.48 0.21348 -0.68 0.00234 232500_at RALGAPA2 -1.16 0.02718 -0.50 0.22275 -0.66 0.02871 228623_at --- -1.18 0.02497 -0.65 0.13185 -0.52 0.03140 242693_at --- -1.21 0.00532 -0.60 0.06221 -0.60 0.04118 1559232_a_at SLC33A1 -1.18 0.00001 -0.03 0.62853 -1.15 0.00001 237107_at PRKRA /// PRKRAP1 -1.20 0.01648 -0.03 0.94163 -1.17 0.00717 35493_at --- -1.11 0.04241 -0.25 0.57701 -0.86 0.00231 235912_at --- -1.12 0.02449 -0.54 0.17930 -0.59 0.01265 1559023_a_at --- -1.13 0.00425 -0.37 0.84660 -0.76 0.04877 238736_at REV3L -1.14 0.03000 -0.16 0.69199 -0.98 0.00644 233595_at USP34 -1.14 0.02496 -0.58 0.18200 -0.56 0.01136 239551_at --- -1.14 0.01728 -0.23 0.52072 -0.91 0.02500 236951_at NSFL1C -1.10 0.04423 0.30 0.43224 -1.40 0.00136 239629_at CFLAR -1.03 0.01617 -0.49 0.19605 -0.54 0.03891 236492_at PPP2R2A -1.03 0.03335 -0.56 0.17362 -0.47 0.00698 202478_at TRIB2 -1.00 0.01523 0.39 0.12578 -1.39 0.00136 218990_s_at SPRR3 1.06 0.03100 -1.05 0.10149 2.10 0.01939 209159_s_at NDRG4 1.21 0.04193 0.00 0.99838 1.21 0.00340 214455_at HIST1H2BC 1.17 0.00453 -0.01 0.96893 1.18 0.00040 209277_at TFPI2 1.26 0.04092 0.12 0.82942 1.14 0.04847 209114_at TSPAN1 1.49 0.00901 0.73 0.08874 0.76 0.02764 205749_at CYP1A1 1.45 0.04264 0.77 0.19367 0.69 0.00534 204602_at DKK1 2.14 0.01417 -0.51 0.55390 2.65 0.01115

120 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-2B : liste des 25 sondes obtenues par la triangulation J4S–J4T–J12T

J4S/J4T J4S/J12T J12T/J4T

N° sonde Symbole gène Log2FC p-value Log2FC p-value Log2FC p-value 204602_at DKK1 2.14 0.01417 -1.51 0.10874 3.66 0.00236 209114_at TSPAN1 1.49 0.00901 0.80 0.06607 0.70 0.02930 205749_at CYP1A1 1.45 0.04264 0.60 0.29570 0.85 0.00165 209159_s_at NDRG4 1.21 0.04193 0.24 0.63925 0.98 0.03913 214455_at HIST1H2BC 1.17 0.00453 -0.95 0.10820 2.12 0.00544 218990_s_at SPRR3 1.06 0.03100 -1.36 0.13035 2.42 0.03237 239629_at CFLAR -1.03 0.01617 -0.41 0.28473 -0.62 0.03155 236951_at NSFL1C -1.10 0.04423 0.32 0.42073 -1.42 0.00181 235493_at --- -1.11 0.04241 -0.43 0.38842 -0.69 0.01811 238736_at REV3L -1.14 0.03000 -0.65 0.13102 -0.49 0.03792 239551_at --- -1.14 0.01728 -0.29 0.37359 -0.85 0.01752 233595_at USP34 -1.14 0.02496 -0.72 0.10799 -0.42 0.00889 229899_s_at C20orf199 -1.15 0.01903 -0.37 0.38673 -0.79 0.01814 1559232_a_at --- -1.18 0.00001 0.05 0.29323 -1.23 0.00000 237107_at PRKRA /// PRKRAP1 -1.20 0.01648 0.19 0.60863 -1.39 0.00074 242693_at --- -1.21 0.00532 -0.28 0.36198 -0.92 0.01618 232141_at U2AF1 -1.27 0.00759 0.04 0.88993 -1.31 0.00299 241837_at --- -1.28 0.03474 -0.32 0.49451 -0.96 0.03005 242859_at --- -1.28 0.00308 -0.09 0.77245 -1.19 0.00681 238706_at PAPD4 -1.34 0.00376 -0.33 0.39005 -1.01 0.01157 226877_at RPL32P3 -1.48 0.00026 0.19 0.34359 -1.67 0.00020 234032_at --- -1.49 0.00780 -0.73 0.10014 -0.76 0.00829 240383_at UBE2D3 -1.50 0.00537 -0.23 0.63561 -1.26 0.01850 242074_at --- -1.55 0.04033 -0.74 0.22901 -0.81 0.00788 239243_at ZNF638 -1.63 0.00978 -0.05 0.89923 -1.58 0.00021

121 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-2C : liste des 65 sondes obtenues par triangulation J7S–J7T–J12T

J7S/J7T J7S/J12T J12T/J7T

N° sonde Symbole gène Log2FC p-value Log2FC p-value Log2FC p-value 235456_at --- 1.65 0.02321 0.56 0.40055 1.09 0.02116 232035_at HIST1H4H 1.12 0.04822 -0.27 0.69756 1.39 0.03794 229351_at --- 1.00 0.02464 0.44 0.23328 0.56 0.02100 227211_at PHF19 -1.00 0.04025 0.20 0.57310 -1.21 0.00963 232958_at --- -1.00 0.02618 0.62 0.10256 -1.62 0.00001 224771_at NAV1 -1.01 0.01307 -0.21 0.40989 -0.80 0.02327 222037_at MCM4 -1.01 0.00784 0.44 0.37986 -1.44 0.02251 213603_s_at RAC2 -1.02 0.00730 -0.16 0.41808 -0.87 0.01009 242560_at FANCD2 -1.02 0.00842 0.07 0.81435 -1.09 0.00384 206277_at P2RY2 -1.03 0.00202 -0.21 0.24363 -0.83 0.01489 222039_at KIF18B -1.03 0.01195 -0.18 0.50955 -0.85 0.00531 222680_s_at DTL -1.04 0.00990 -0.14 0.55578 -0.90 0.00664 214710_s_at CCNB1 -1.04 0.00751 -0.11 0.66819 -0.92 0.02961 203554_x_at PTTG1 -1.04 0.00122 -0.38 0.10563 -0.66 0.00590 216237_s_at MCM5 -1.05 0.00115 0.09 0.75840 -1.14 0.00491 209754_s_at TMPO -1.05 0.01256 0.15 0.20521 -1.20 0.00838 219494_at RAD54B -1.06 0.00639 -0.34 0.17081 -0.72 0.01864 218726_at HJURP -1.07 0.00116 -0.17 0.43677 -0.91 0.00116 201506_at TGFBI -1.08 0.02569 -0.37 0.28894 -0.72 0.01026 201896_s_at PSRC1 -1.08 0.00400 -0.30 0.32473 -0.79 0.04210 226936_at CENPW -1.08 0.00036 -0.28 0.38854 -0.80 0.04884 202338_at TK1 -1.08 0.00131 -0.16 0.50841 -0.92 0.00401 205933_at SETBP1 -1.09 0.01325 -0.40 0.12835 -0.69 0.01774 242890_at --- -1.09 0.00164 -0.30 0.36941 -0.79 0.04970 204092_s_at AURKA -1.10 0.00231 -0.11 0.81412 -1.00 0.04910 213008_at FANCI -1.10 0.01423 0.14 0.35692 -1.24 0.00507 228729_at CCNB1 -1.10 0.00973 -0.15 0.67555 -0.95 0.03528 226875_at DOCK11 -1.10 0.02936 -0.33 0.37737 -0.77 0.02892 205394_at CHEK1 -1.10 0.02341 0.33 0.56374 -1.42 0.03497 218663_at NCAPG -1.12 0.01042 -0.38 0.30761 -0.75 0.02087 224428_s_at CDCA7 -1.13 0.02846 0.43 0.23863 -1.56 0.00100 213007_at FANCI -1.13 0.00022 -0.38 0.24789 -0.75 0.03423 204887_s_at PLK4 -1.13 0.00507 -0.37 0.18491 -0.76 0.03883 218662_s_at NCAPG -1.13 0.00057 -0.42 0.20417 -0.71 0.03897 218349_s_at ZWILCH -1.16 0.02263 -0.03 0.90736 -1.13 0.01839 205024_s_at RAD51 -1.18 0.00337 -0.26 0.54978 -0.92 0.04302 229538_s_at IQGAP3 -1.19 0.00664 0.13 0.60192 -1.31 0.01032

122 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-2C (suite)

J7S/J7T J7S/J12T J12T/J7T

N° sonde Symbole gène Log2FC p-value Log2FC p-value Log2FC p-value 201930_at MCM6 -1.20 0.00107 -0.20 0.45835 -1.00 0.00525 203755_at BUB1B -1.24 0.00351 -0.07 0.82610 -1.17 0.02405 209773_s_at RRM2 -1.26 0.00024 -0.39 0.19351 -0.87 0.01165 218039_at NUSAP1 -1.27 0.00757 -0.31 0.40395 -0.96 0.03510 203968_s_at CDC6 -1.28 0.02246 -0.29 0.32191 -0.99 0.01957 201890_at RRM2 -1.29 0.00016 -0.50 0.12085 -0.79 0.03793 214079_at DHRS2 -1.29 0.03254 -0.11 0.56399 -1.18 0.04970 229674_at SERTAD4 -1.29 0.02296 0.44 0.26281 -1.72 0.00080 202870_s_at CDC20 -1.30 0.00089 -0.02 0.95673 -1.28 0.00860 202094_at BIRC5 -1.31 0.00174 -0.38 0.26229 -0.94 0.02502 232238_at ASPM -1.31 0.00799 0.08 0.71797 -1.39 0.00562 FAM72A /// FAM72B /// 225834_at -1.34 0.02458 -0.05 0.91000 -1.29 0.02075 FAM72C /// FAM72D 225655_at UHRF1 -1.35 0.00046 -0.33 0.23152 -1.02 0.01107 204162_at NDC80 -1.35 0.01855 -0.47 0.34435 -0.87 0.04341 204962_s_at CENPA -1.36 0.00366 -0.29 0.34593 -1.07 0.02966 220651_s_at MCM10 -1.39 0.00985 -0.15 0.55465 -1.24 0.01717 218585_s_at DTL -1.39 0.00054 -0.30 0.24195 -1.09 0.01046 221521_s_at GINS2 -1.43 0.00238 -0.38 0.24930 -1.05 0.00177 201291_s_at TOP2A -1.43 0.00006 -0.20 0.44896 -1.23 0.00406 223307_at CDCA3 -1.44 0.00038 -0.40 0.29179 -1.04 0.03791 218355_at KIF4A -1.48 0.00161 -0.47 0.10761 -1.02 0.01805 220085_at HELLS -1.48 0.00294 0.52 0.11590 -2.00 0.00293 203418_at CCNA2 -1.49 0.01691 -0.13 0.69952 -1.36 0.00939 202095_s_at BIRC5 -1.50 0.01903 -0.03 0.93683 -1.48 0.00495 204822_at TTK -1.60 0.00492 -0.37 0.42681 -1.22 0.03391 209642_at BUB1 -1.69 0.00057 -0.29 0.21780 -1.41 0.00431 219978_s_at NUSAP1 -1.79 0.00229 -0.41 0.19096 -1.38 0.00200 209714_s_at CDKN3 -2.06 0.01192 -1.07 0.11025 -0.99 0.02394

123

A Tableau A-3 : Processus cellulaires ayant plus de 100 connexions avec les gènes de la "Liste A" nnexes 1– Liste des gènes impliqués dans des processus cellulaires ayant plus de 100 connexions avec les gènes de la "Liste A" Nombre de Nom du connections de la processus Nom du gène de la "Liste A" ayant une connexion avec le processus cellulaire R "Liste A" avec le ésultats cellulaire processus cell proliferation 264 ABL2 CCNB2 DCLRE1B EPHB6 HS3ST3A1 LGALS7 NR2F2 PRDX3 SERPINE1 TNFRSF10D ACTA2 CD274 DDIT3 ETS1 HSP90B1 LRRFIP1 NRG1 PRKRA SETBP1 TNFSF10 ADAMTS1 CD44 DDR2 ETV5 HSPA4 LY75 NT5E PRMT1 SFRP1 TOP2A ADM CD86 DEFB1 EWSR1 IDE MACF1 NUF2 PRPF19 SFTPD TPX2 AKR1C1 CD99 DENND2D F12 IER3 MAF NUSAP1 PTEN SLC12A7 TREX2 ANKHD1 CDC20 DKK1 FAM3C IFIT1 MALAT1 P2RY2 PTGER3 SLC7A11 TSPAN1 ANLN CDC6 DLGAP5 FAM59A IFNGR1 MAP1B PARVA PTGER4 SLURP1 TTK ANPEP CDK1 DLX2 FAS IGF2R MAP4K4 PBK PTGS2 SMG1 TWIST1 APOD CDKN2B DLX5 FDFT1 IL1RL1 MCM10 PCBP2 PTPRG SOD2 TXNIP ARG1 CDKN3 DTL FHL1 IL6ST MCM4 PCSK6 PTTG1 SP3 TXNRD1

124 ARHGEF7 CELF2 DUSP4 FLG INPP4B MCM5 PCSK9 PTX3 SPRR3 TYRP1 ASPH CENPA DUT FLRT3 IQGAP3 MCM6 PDGFRA PYCARD SPRY2 U2AF1 ASPM CENPF E2F8 FNDC3B IRS1 MDM2 PEA15 RAC2 SPRY4 UBE2C ATF3 CENPW EDN1 FNTB IRS2 MITF PGF RAD51 ST6GALNAC1 UBE2D3 AURKA CEP55 EFNA5 FST KAL1 MKI67 PHC2 RANBP2 STC1 UCHL1 AZGP1 CFLAR EGFR FTH1 KIAA0101 MME PHF17 RASGRP1 STIL UHRF1 BAX CHEK1 EGR2 FTL KIF11 MMP9 PHLDA1 RASSF1 STS VAV3 BCL11A CLEC7A EIF3B FUS KIF14 MUC15 PLAC1 RBM14 SUZ12 VSNL1 BID CLIC4 EIF3C GFPT1 KIF4A MX1 PLAG1 RBP1 TDG WWC1 BIRC5 CNTN1 EIF4A1 GLRX KLHL24 MYH10 PLAUR RHOB TFPI2 ZAK BMP2 CRABP2 EIF5A2 GNB2L1 KNG1 NDC80 PLD1 RHOC TGFBI ZBTB10 BRAF CTGF EML1 GPX1 KRAS NDRG4 PLK4 RORA THBD BUB1 CXCL14 EMP1 GSTA4 KRT18 NMU PLXDC2 RRM2 TIMM44 CAND1 CYB5A ENAH HELLS KRT9 NOD2 POU2F3 SAV1 TK1 CCL22 CYR61 ENO1 HMGA2 LASS2 NOV PPIA SDCBP TKT CCNA2 DAAM1 EPB41L3 HMMR LATS2 NPNT PPP1R15A SEMA4A TMEFF1 CCNB1 DCBLD2 EPHA4 HPGD LEF1 NQO1 PPP2R2A SERPINA12 TMPO

A

apoptosis 234 ACTA2 CCNA2 CYB5A FANCD2 IFNGR1 MAP1B PBK PTGS2 SLC2A3 TNFAIP3 nnexes 1– ADM CCNB1 CYP1A1 FAS IGF2R MAP4K4 PCBP2 PTTG1 SLC35B2 TNFRSF10D AIFM2 CCNB2 CYR61 FDFT1 IKBIP MCM10 PCSK9 PTX3 SLC39A6 TNFSF10 AKR1C1 CD274 CYTH3 FHL1 IL6ST MCM5 PDGFRA PYCARD SLC6A6 TOP2A

ANPEP CD44 DDIT3 FLG ING3 MDM2 PEA15 RAC2 SLC7A11 TPX2 R APITD1 CD86 DEFB1 FST IRS1 MGLL PGF RAD51 SLURP1 TRAF4 ésultats APOD CD99 DENND2D FTH1 IRS2 MITF PHC2 RANBP2 SMG1 TREX2 ARG1 CDC20 DKK1 FTL ITSN1 MKI67 PHF17 RASGRP1 SOD2 TTK ASPM CDC42BPB DSG1 GCLM KAL1 MME PHLDA1 RASSF1 SP110 TWIST1 ATF3 CDC6 DUSP4 GFPT1 KIF14 MMP9 PLAG1 RBM25 SP3 TXNIP AURKA CDCA7 DUT GLRX KIF23 MX1 PLAUR RBP1 SPRR3 TXNRD1 BAX CDK1 E2F8 GNB2L1 KIF4A MYH10 PLD1 RDH12 SPRY2 U2AF1 BCL11A CDKN2B EDN1 GPD2 KNG1 NDC80 PLK4 REV3L SPRY4 UBE2C BFAR CDKN3 EFNA5 GPX1 KRAS NDRG4 PLTP RHOB SQSTM1 UCHL1 BID CELF2 EGFR GSR KRT18 NOD2 POU2F3 RHOC STC1 UHRF1 BIRC5 CENPA EGR2 GSTA4 LASS2 NOV PPIA RORA STS VAV3 BMP2 CENPF ELOVL6 GULP1 LASS5 NQO1 PPP1R15A RRM2 SUPV3L1 WWC1 125 BRAF CENPW ENO1 HMGA2 LATS2 NR2F2 PRDX3 SAV1 SUZ12 ZAK BUB1 CFLAR EPB41L3 HMMR LEF1 NRG1 PRKRA SERPINA12 TFPI2 BUB1B CHEK1 EPHA4 HPGD LGALS7 NT5E PRMT1 SERPINB4 TGFBI CAMK1D CLEC7A EPHB6 HSP90B1 LY75 NUF2 PROM2 SERPINB6 THBD CAND1 CLIC4 ETNK1 HSPA4 LYNX1 NUSAP1 PTEN SERPINE1 TIMM44 CASP14 CRABP2 ETS1 IDE MAF P2RY2 PTGER3 SFRP1 TK1 CCL22 CTGF EWSR1 IER3 MALAT1 PARVA PTGER4 SFTPD TMEFF1

cell differentiation 208 ABHD5 BRAF CLEC7A EDN1 FST IRS2 NOD2 PPIA RORA SUZ12 ACTA2 BUB1B CLIC4 EGFR FTH1 KAL1 NOV PPP1R15A SEMA4A TCHH ADAM8 CASP14 CNTN1 EGR2 FUS KNG1 NPNT PRDX3 SERPINB6 TDG ADAMTS1 CCDC64 CRABP2 EID1 GLRX KRAS NQO1 PRMT1 SERPINE1 TFPI2 ADM CCL22 CTGF EIF4A1 GNB2L1 KRT18 NR2F2 PRPF19 SETBP1 TGFBI AFF4 CCNA2 CXCL14 EMB GPD2 LEF1 NRG1 PTEN SFRP1 THBD AKR1C1 CCNB1 CYR61 EMP1 GPX1 LGALS7 NT5E PTGER3 SLC15A1 TMPO ANPEP CCNB2 DAAM1 ENO1 HMG20B LPIN1 NUCB1 PTGER4 SLC2A3 TNFSF10 APITD1 CD274 DDIT3 EPHA4 HMGA2 LRPPRC P2RY2 PTGS2 SLC35B2 TRAF4 APOD CD44 DDR2 ETS1 HMMR LY75 PBK PTPRG SLC7A11 TSPAN1 ARHGEF7 CD86 DEFB1 EWSR1 HPGD LYNX1 PCBP2 PTTG1 SLURP1 TWIST1

Annexes 1–Résultats cell differentiation (suite) ASAP1 CD99 DGAT2 FAM3C HSP90B1 MACF1 PCSK6 PTX3 SOD2 TXNIP ASPM CDC20 DKK1 FAS HSPA4 MAF PCSK9 PYCARD SP110 TXNRD1 ATF3 CDC6 DLX2 FEZ1 IDE MAP1B PDGFRA RAB7B SP3 TYRP1 AURKA CDK1 DLX5 FGD2 IER3 MDM2 PGF RAC2 SPEN UCHL1 AZGP1 CDKN2B DNASE1L2 FHL1 IFNGR1 MGLL PHF17 RASGRP1 SPRR3 UHRF1 BAX CELF2 DSC1 FLG IFNK MITF PLAC1 RASSF1 SPRY2 VSNL1 BCL11A CENPF DSG1 FLRT3 IGF2R MME PLAUR RBM14 SPRY4 ZNF281 BID CFLAR DTL FNDC3B IL1RL1 MMP9 PLD1 RBP1 SSH1 ZNF451 BIRC5 CHD9 DUSP4 FOXD1 IL6ST NDRG4 PLTP RHOB STC1 BMP2 CHEK1 E2F8 FRAS1 IRS1 NHS POU2F3 RHOC STXBP1

cell growth 181 ACTA2 BMP2 CLIC4 EIF4A1 GNB2L1 LASS2 NQO1 PTEN SFRP1 TWIST1 ADH1B BRAF CRABP2 EIF5A2 GPX1 LATS2 NRG1 PTGER3 SFTPD TXNIP ADM BUB1 CTGF EMP1 GSR LGALS7 NT5E PTGER4 SOD2 TXNRD1 AKR1B1 CAND1 CXCL14 ENO1 HELLS LY75 NUCB1 PTGS2 SPRY2 UBE2C AKR1C1 CASP14 CYP1A1 EPB41L3 HMGA2 MAF PBK PTPRG SPRY4 UBE2D3 ANLN CCNA2 CYR61 EPHA4 HMMR MALAT1 PDGFRA PTTG1 SQLE UBE2T 126 ANPEP CCNB1 DAAM1 EPHB6 HPGD MAP1B PEA15 PXMP4 STC1 UCHL1 APITD1 CD274 DCBLD2 ETS1 IDE MCM10 PGF PYCARD TAF9B UHRF1 APOD CD44 DDIT3 EXOC6 IER3 MCM4 PHF17 RAC2 TFPI2 USP47 ARG1 CD99 DEFB1 F12 IGF2R MDM2 PHLDA1 RAD51 TGFBI VAV3 ARHGEF7 CDC20 DKK1 FAS IL1RL1 MGLL PLAUR RASGRP1 THBD ASPH CDC6 DLGAP5 FEZ1 IL6ST MITF PLD1 RASSF1 TIMM44 ASPM CDK1 DTL FHL1 ING3 MKI67 PLK4 RBM14 TK1 ATF3 CDKN2B DUSP4 FST IRS1 MME POU2F3 RHOB TMEM173 AURKA CELF2 E2F8 FTH1 IRS2 MMP9 PPIA RHOC TNFRSF10D AZGP1 CENPA EDN1 FTL ITSN1 MUC15 PPP1R15A RORA TNFSF10 BAX CENPF EFNA5 FUS KIAA0101 NDC80 PRDX3 RRM2 TPX2 BCL11A CFLAR EGFR GINS2 KNG1 NMU PRKRA SERPINE1 TRIM8 BIRC5 CHEK1 EGR2 GLRX KRAS NOV PSMG4 SETBP1 TTK

Cell Cycle 168 ACTA2 BUB1B CENPA DUT FST KIF4A MME PLAUR RBM14 TMEFF1 ADM CCL22 CENPF E2F8 FTH1 KNG1 MMP9 PLD1 REV3L TMPO ANKHD1 CCNA2 CFLAR EDN1 GINS2 KRAS NDC80 PLK4 RHOB TNFSF10 ANLN CCNB1 CHEK1 EGFR GNB2L1 KRT18 NDRG4 POLQ RORA TOP2A

Annexes 1–Résultats Cell Cycle (suite) ANPEP CCNB1IP1 CLIC4 EGR2 GPX1 LATS2 NQO1 PPIA RRM2 TPX2 APOD CCNB2 CRABP2 EIF3B HELLS LEF1 NR2F2 PPP1R15A SERPINE1 TTK ARG1 CD274 CTGF EIF4A1 HMGA2 LGALS7 NRG1 PPP2R2A SFRP1 TWIST1 ASPM CD44 CYP1A1 EMP1 HMMR LPIN1 NT5E PRDX3 SFTPD TXNIP ATF3 CD86 CYR61 ENO1 HSP90B1 MAF NUF2 PRMT1 SMG1 TXNRD1 AURKA CD99 DCBLD2 EPB41L3 IER3 MALAT1 NUSAP1 PTEN SOD2 UBE2C BAX CDC20 DDIT3 EPHA4 IFNGR1 MCM10 P2RY2 PTGER4 SP3 UCHL1 BCL11A CDC6 DDR2 ETS1 IL6ST MCM4 PBK PTGS2 SPC25 UHRF1 BID CDCA3 DEPDC1 FANCD2 ING3 MCM5 PCBP2 PTPRG SPRY2 VAV3 BIRC5 CDK1 DHRS2 FAS IRS1 MCM6 PEA15 PTTG1 SPRY4 ZAK BMP2 CDKN2B DKK1 FDFT1 KIAA0101 MDM2 PHF17 RAD51 SSH1 ZBTB10 BRAF CDKN3 DLGAP5 FEZ1 KIF14 MITF PHLDA1 RASSF1 TDG BUB1 CELF2 DTL FLG KIF23 MKI67 PLAG1 RASSF10 TK1

cell death 162 ADM CCNB2 CYR61 ETS1 IL6ST MME PLAUR RASGRP1 SQSTM1 TWIST1 AIFM2 CD274 DDIT3 FANCD2 IRS1 MMP9 PLD1 RASSF1 STC1 TXNIP APITD1 CD44 DEFB1 FAS ITSN1 MX1 PPIA RDH12 STXBP1 TXNRD1 127 ATF3 CD86 DKK1 FDFT1 KIAA0101 NCAPH PPP1R15A RHOB SUPV3L1 TXNRD1 AURKA CD99 DSG1 FTH1 KNG1 NDC80 PRDX3 RHOC TAF9B TYRP1 AURKA CDC20 DUSP4 FTL KRAS NOD2 PRKRA RRM2 TDG UBE2C BAX CDC6 DUT GCLM KRT18 NOV PROM2 SERPINB4 TGFBI UCHL1 BFAR CDK1 EDN1 GLRX LASS5 NQO1 PRPF19 SERPINE1 THBD UHRF1 BID CDKN3 EFNA5 GNB2L1 LATS2 NRG1 PTEN SFRP1 TK1 VSNL1 BIRC5 CELF2 EGFR GPX1 LEF1 NUF2 PTGER4 SFTPD TMEM173 BMP2 CENPF EGR2 GSR LGALS7 PCBP2 PTGS2 SLC39A6 TNFAIP3 BRAF CFLAR EIF5A2 GSTA4 MAP1B PCSK9 PTTG1 SLC7A11 TNFRSF10D BUB1 CFLAR EMP1 GTF3A MCM10 PDGFRA PTX3 SLURP1 TNFSF10 BUB1B CHEK1 ENAH HMGA2 MDM2 PEA15 PYCARD SOD2 TOP2A CCL22 CLIC4 ENDOU HSP90B1 MDM2 PGF RAC2 SP3 TPX2 CCNA2 CTGF ENO1 IDE MITF PHC2 RAD51 SPATS2L TRAF4 CCNB1 CYP1A1 EPHA4 IER3 MKI67 PHLDA1 RANBP2 SPPL3 TTK

cell migration 112 ABL2 BMP2 CDKN2B EMB HMMR MAP4K4 PCDH18 RAC2 SPRY2 UCHL1 ACTA2 BRAF CEP55 ENAH HPGD MDM2 PDGFRA RASGRP1 SPRY4 VAV3 ADAM8 C5orf13 COL8A2 ENO1 IGF2R MME PEA15 RASSF1 SSH1 VSNL1

cell migration (suite) ADAMTS1 CAMK1D CRABP2 EPHA4 IL1R2 MMP9 PGF RHOB STC1 WWC1 Annexes 1–Résultats ADM CCL22 CTGF ETS1 IL6ST MYH10 PLAUR RHOC TFPI2 ANPEP CCNB1 CXCL14 FAM84A IRS1 NOV PLD1 SDCBP TGFBI APOD CCNB1IP1 CYR61 FAS IRS2 NPNT PPIA SEMA4A THBD ARHGEF7 CD44 DAAM1 FHL1 KAL1 NR2F2 PTEN SERPINB4 TK1 ASAP1 CD86 DDR2 FST KNG1 NRG1 PTGER3 SERPINE1 TNFSF10 ATF3 CD99 DKK1 FTH1 KRAS NT5E PTGER4 SFRP1 TRAF4 ATP7A CDC42BPB EDN1 GNB2L1 KRT18 P2RY2 PTGS2 SLURP1 TWIST1 AURKA CDK1 EGFR GPX1 LGALS7 PARVA PTTG1 SOD2 TXNIP

cell survival 103 ADM CD44 E2F8 GLRX KIF4A NDC80 PGF PTGS2 SERPINE1 TWIST1 ATF3 CD86 EDN1 GNB2L1 KNG1 NOD2 PHLDA1 PTTG1 SFRP1 TXNIP AURKA CDC20 EGFR GPD2 KRAS NOV PLAUR PYCARD SMG1 UCHL1 BAX CDK1 EGR2 HMGA2 KRT18 NQO1 PPIA RAC2 SOD2 USP47 BID CFLAR EIF4A1 IER3 LATS2 NRG1 PPP1R15A RAD51 SPRY2 BIRC5 CHEK1 EIF5A2 IGF2R LEF1 NT5E PRKRA RAPGEF4 SQSTM1 BMP2 CTGF EPB41L3 IL6ST MAF PARVA PRMT1 RASSF1 STIL 128 BRAF CYR61 ETS1 IRS1 MDM2 PBK PRPF19 RBP1 TICAM2 BUB1B DDIT3 FAS IRS2 MITF PCBP2 PTEN RHOB TNFRSF10D CCNA2 DKK1 FST ITSN1 MME PDGFRA PTGER3 RHOC TNFSF10 CCNB1 DLGAP5 GFPT1 KIF11 MMP9 PEA15 PTGER4 RORA TPX2

mitosis 100 ADM BUB1 CDKN2B EDN1 HELLS KIF4A MKI67 PGF RANBP2 TK1 ANLN BUB1B CELF2 EGFR HJURP KRAS MX1 PLD1 RASSF1 TMPO APITD1 CCNA2 CENPA EGR2 HMMR LATS2 MYH10 PLK4 RHOB TNFSF10 ARHGEF7 CCNB1 CENPF EWSR1 IRS1 MAP1B MYO5B POLE2 SAV1 TOP2A ASPM CCNB1IP1 CEP55 FANCD2 IRS2 MCM10 NCAPH PRKRA SPC25 TPX2 AURKA CCNB2 CHEK1 FAS KIAA0101 MCM4 NDC80 PTEN SPEN TTK BID CD44 CLIC4 FDFT1 KIF11 MCM5 NRG1 PTGS2 SPRY2 U2AF1 BIRC5 CDC20 CTGF FEZ1 KIF14 MCM6 NUF2 PTTG1 SSH1 UBE2C BMP2 CDC6 DCLRE1B GINS2 KIF20A MDM2 NUSAP1 RAD51 STIL UCHL1 BRAF CDK1 DLGAP5 GNB2L1 KIF23 MITF PBK RAD54B TGFBI VAV3

Annexes 1–Résultats Tableaux A-4 A, B, C, D, E : Processus cellulaires qui utilisent au moins 7 gènes de la "Liste A" Processus cellulaires obtenus dans la seconde analyse réalisée avec Pathway Studio et qui utilisent au moins 7 gènes de la "Liste A". Le tableau contient la liste des gènes utilisés dans ces voies métaboliques ainsi qu'une citation Medline et des références Medline justifiant la présence de ces gènes dans chacune des voies Tableau A-4A : relation des gènes avec la prolifération cellulaire.

Relation avec la Nombre de prolifération FCR Citation Medline références Références Medline cellulaire Medline STC1 ---> 23.3541 STC1 inhibits longitudinal bone growth by suppressing growth plate 2 17909264 16377640 chondrocyte proliferation.

MME ---| 20.2766 Overexpression of NEP (MME) in hormone-refractory CaP cells 25 8631021 1660144 9227412 12056552 19234135 significantly inhibits their growth, while loss of NEP activity stimulates CaP cell proliferation and migration. 8943850 10385588 14704146 7962523 16054017 23381789 1469102 9427606 20957047 11350908 10951272 9337153 15840561 12220742 15637592 129 14500390 17459884 16728568 9861296 18708424

PDGFRA --+> 15.0401 When activated by ligand binding, both PDGF-R alpha and PDGF-R 48 7923614 15811134 17470632 18366137 19654211 beta stimulate proliferation. 17079230 1325456 19366796 17440089 17632543 15342968 12761844 19366798 16538672 15757958 12808148 15837572 10764412 17314398 16258521 20924364 12651897 15677564 19553600 12436445 17604334 19383909 18502897 20817666 15331661 18339881 19126548 18474118 19939260 23383310 8548759 11481486 16030188 16818613 23041331 11557737 16508943 15781583 9488729 16418325 15814780 16331269 11953315

Annexes 1–Résultats Tableau A-4A (suite)

Relation avec la Nombre de prolifération FCR Citation Medline références Références Medline cellulaire Medline ATF3 --+> 13.4129 The c-Jun/ATF-2 target gene atf3 can regulate cell proliferation both 17 11314051 15990869 17764562 16278400 18511933 positively and negatively and its expression is strongly induced by both growth factors and stresses. ATF3 can alters proliferation in fibroblasts. 12832543 16469745 17456735 21129190 16263788 16516039 16079289 12034827 12833146 17095753 11375399 19233874

IL1RL1 --+> 12.6018 TOPK, IL1RL1, and NME1 that are overexpressed in BCR/ABL+ cells 7 11207266 20014349 11714798 18762778 11441076 are thought to play a role in cell proliferation and differentiation. 14991091 12589034

CELF2 ---> 10.4316 CUGBP2 overexpression inhibits proliferation of HCT-116 cells. 3 18258790 18292181 18325984

130 MAP1B ---> 10.1488 Overexpression of HA-Mtap1b-LC1 inhibits proliferation of NIH-3T3 1 17308336 cells.

FLG --+> -11.5147 Filaggrin associated with 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate- 1 16537558 induced proliferation and differentiation.

PTGER3 ---> -11.8960 EP3 receptor stimulation decreases proliferation at low prostaglandin 7 11095474 18321859 19099561 16977324 16051640 E2 concentrations, whereas 10- to 100-fold higher concentrations of prostaglandin E2 stimulate proliferation by activation of the EP2 18634605 18230618 receptor.

SERPINA12 --+> -22.0370 The application of recombinant vaspin and Vaspin-Ad promoted the 1 proliferation and inhibited the apoptosis of human aortic endothelial 23307819 cells.

ARG1 ---> -80.3099 Blockade of arginase I induction by IFN-gamma, H-89, or genistein 17 also blocked the increase in cell proliferation. 10898736 16773651 19508396 12923240 19890055 11470919 11742824 12813022 19703164 15465793 20407034 15342423 18323470 19234205 20711410

12874210 12787129

Annexes 1–Résultats Tableau A-4B : relation des gènes avec l'apoptose

Relation Nombre de avec FCR Citation Medline références Références Medline l'apoptose Medline STC1 ---> 23.3541 Overexpression of STC1 prevented Abeta-induced apoptosis of human 9 18652825 18786506 19656913 19347030 16377640 brain microvascular endothelial cells; STC-1 was both necessary and sufficient to reduce apoptosis of the ischemic lung cells; STC-1 mediates 19267325 19509170 19096036 18199603 the antiapoptotic effects of Multipotent stromal cells.

MME ---> 20.2766 NEP (MME) expression induces apoptosis and cell cycle G1 arrest; 18 15756002 11118039 11307776 10803579 12748254 neprilysin (MME)could prevent possible rescue of keratocytes from apoptosis; enzyme neprilysin (MME) reduces ß-cell apoptosis. 12363040 11350908 17083125 10385588 10666035 12764385 15637592 11186280 11309283 12697667 14734478 11901191 15205682

PDGFRA --- 15.0401 PDGFRalpha signaling has a protective role in preventing apoptosis in 6 15919820 16168125 16818613 17342771 17643098 > early development.

131 15811134

ATF3 --+> 13.4129 We show that ATF3 promotes apoptosis and cell cycle arrest; ATF3 is 60 16469745 18178318 17360647 14718536 15897233 involved in the regulation of cell growth, apoptosis, and stress response, depending on the cell type. 18755691 18644986 12909328 21152039 18487508 18057093 18194435 16109718 16291753 20565867 21205742 20600850 18719024 16079289 9755171 11473362 15674352 17178897 20167600 18922905 21280179 16613840 12386811 21034493 18728164 17764926 20002170 12161427 20137089 16631627 19647793 17952119 15199129 15684420 17898295 16489044 12832543 20571063 21129190 21396734 20140008 15713895 15231818 16044158 20140008 20581861 18511933 15308587 17785797 18178318

12392999 19074148 17575148 18235102 22033410

Annexes 1–Résultats Tableau A-4B (suite) Relation Nombre de avec FCR Citation Medline références Références Medline l'apoptose Medline

CELF2 --+> 10.4316 CUGBP2 (CELF2) overexpression induces apoptosis. 8 18325984 18292181 18258790 15226369 17855367

15033780 16095752 15358864

MAP1B --+> 10.1488 Full-length but not N-terminal truncated form of MAP1B induced 3 apoptosis in cortical neurons; overexpression of N-terminal fragments of 16234245 12376528 18195017 MAP1B has been shown to promote neuronal apoptosis.

FLG ---> -11.5147 Because filaggrin is expressed at a level of the epidermis where 4 keratinocytes are in transition between the nucleated granular and the 10822280 15175023 15737187 11159940 anucleate cornified layers, we hypothesize that filaggrin aids in the

132 terminal differentiation process by facilitating apoptotic machinery.

PTGER3 ---> -11.8960 The mechanisms by which EP3 receptors/Rho kinase affects inflammation 1 20590584 and neuronal apoptosis remain to be identified.

SERPINA12 -22.0370 The application of recombinant vaspin and Vaspin-Ad promoted the 3 23284999 23135225 23307819 ---| proliferation and inhibited the apoptosis of human aortic endothelial cells.

ARG1 --+> -80.3099 The downstream effects of Arginase can inhibit CD8+ T cell proliferation 4 21029397 17016554 17255300 22926702 and activation or trigger T cell apoptosis (v).

Annexes 1–Résultats Tableau A-4C : relation des gènes avec la croissance cellulaire

Relation Nombre de avec la FC Citation Medline références Références Medline croissance R Medline cellulaire STC1 ---> 23.3541 Stanniocalcin 1 and IRS-1 contribute to progesterone receptor mediated 1 19706513 breast cancer cell growth in the absence of progestins.

MME ---| 20.2766 Expression of NEP in androgen-independent prostate cancer cells inhibits 8 9427606 1533518 14704146 10803579 11309283 cell migration, inhibits cell growth and tumorigenicity in the prostate , and induces apoptosis and cell cycle arrest . 11350908 16940054 7635530

PDGFRA -- 15.0401 Inhibition of PDGFR-A by RNA interference, small molecule inhibitor or 5 +> neutralizing antibody, had a dramatic effect on tumor cell growth both in vitro and in vivo, although resistance evolved in one-third of tumors; 18679424 19553600 17079230 16354679 17485528 platelet-derived growth factor receptor (PDGFRA) is a potent activator of cell growth, survival and migration.

133 ATF3 ---| 13.4129 Over-expression of ATF3 protein moderately suppresses cell growth; the 10 transcription factor ATF-3 stimulates cell growth and protein synthesis; 12386811 11481491 18511933 15308587 18497336 ATF3 is involved in the regulation of cell growth, apoptosis, and stress response, depending on the cell type. 18178318 18719024 14633654 16428460 18426833 IL1RL1 ---> 12.6018 ST2 (IL1RL1) gene plays a role in cell growth regulation; IL1RL1 2 promoted cell growth and served as inflammatory cell chemoattractants 10491084 17982090

and inducers of stress response. CELF2 ---> 10.4316 Cells overexpressing CUGBP2 had a lower growth rate, eventually 1 18292181 underwent apoptosis. MAP1B ---| 10.1488 These data strongly suggest that MAP1B cooperates with DAPK-1 to 1 reduce cell growth and that this requires functional DAPK-1 kinase 18195017

activity.

PTGER3 ---> -11.8960 prostaglandin E2 signals through EP2 promote cell growth; A specific 6 15331179 15247185 18230618 19180509 16024629 antagonist against EP3 abrogated the cell growth. 23338277

ARG1 --+> -80.3099 induced arginase I in macrophages can enhance tumor cell growth. 1 15465793

Annexes 1–Résultats Tableau A-4D : relation des gènes avec la différenciation cellulaire Relation avec Nombre de la FC Citation Medline références Références Medline différenciation R Medline cellulaire STC1 --+> 23.3541 STC1 is expressed in chondrocytic and osteoblastic cells during murine 5 development and can enhance differentiation of calvarial cells in 11927399 20174869 11737588 11146507 15367391 culture.

MME ---> 20.2766 CD10(MME) plays a specific role in the control of growth and 12 12649673 16405511 7656459 15756002 15751084 differentiation of many cell types by cleaving growth factors that are 20506111 10385588 8624907 7890699 19426500 able to promote cellular proliferation. 15870909 11340378

PDGFRA ---> 15.0401 Pdgfra is expressed in the mesenchyme of multiple organs during 11 15811134 17440089 19939260 16418325 19654211 embryonic development and Pdgfralpha is involved in cell proliferation, 12761844 15941858 17620431 differentiation, migration, and apoptosis in many tissues. 12651897 16467141 19147501

ATF3 --+> 13.4129 ATF3 induction appears to facilitate cell cycle exit and terminal 8 20304822 21372517 16428460 18922905 18808719

134 differentiation of chondrocytes. 16984628 17102133 19549813

IL1RL1 ---> 12.6018 ST2 (IL1RL1) from fetal liver promotes growth and differentiation of 8 2891538 12589034 19841166 19196821 18802081 early B lineage cells. 1585838 10510079 19196812

CELF2 --+> 10.4316 The neuronal-specific ELAV RNA-binding proteins (CELF2) are 1 necessary and sufficient to induce neuronal differentiation in 16554442 mammalian cells.

MAP1B ---> 10.1488 MAP1B plays an important role in neuronal differentiation. 4 11121433 7769400 9813091 15528209

FLG ---> -11.5147 Filaggrin is involved in the terminal differentiation of epidermis but the 19 18795935 9822682 19554025 7688400 20208004 relative importance of the different functions of filaggrin remains 18717683 6174530 18007582 12230510 12663686 unclear; Only some differentiation proteins (i.e., K10, loricrin, filaggrin) were found to be altered in in vitro reconstructed xeroderma 7829877 8417356 10822280 17439945 19209157 pigmentosum epidermis. 16702271 16537558 17079689 11438733

PTGER3 ---> -11.8960 Prostaglandin E2 receptors of the EP2 and EP4 subtypes regulate 4 activation and differentiation of mouse B lymphocytes to IgE-secreting 8855294 15283844 15140225 18666211 cells.

Annexes 1–Résultats Tableau A-4E : relation des gènes avec la cicatrisation des plaies

Relation Nombre de avec la FC Citation Medline références Références Medline cicatrisation R Medline des plaies STC1 ---> 23.3541 STC1 protein is considered to have roles in many physiological 1 processes, including bone development, reproduction, wound healing, 16287871 angiogenesis, and modulation of inflammatory response.

MME ---| 20.2766 NEP (MME), represent important control factors for the inflammatory 2 response in skin disorders such as psoriasis or allergic inflammation, but 12485446 15507108 may also be capable of affecting pigmentation, cell survival, wound healing and tissue regeneration.

ATF3 ---> 13.4129 ATF3 is involved in homeostasis, wound healing, metastasis and the 1 signaling pathways mediating cellular response to genotoxic stress 12386811

IL1RL1 ---> 12.6018 Epidermal-derived proinflammatory cytokines interleukin-1alpha (IL- 1 1alpha) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) were found to 135 mediate synergistically the secretion of these wound-healing mediators 17971017 (with the exception of sST2) from fibroblasts in dermal substitutes.

PTGER3 --- -11.8960 EP3 receptor the subtype involved in wound healing and angiogenesis. 1 18042549 >

CALML5 --- -12.4239 Clsp/Scarf (CALML5) plays an important role in late epidermal wound 1 > healing, perhaps participating in the change from activated to 17470426 differentiating keratinocyte phenotype.

ARG1 --+> -80.3099 Macrophage-specific expression of Arginase-1 is commonly believed to 2 promote inflammation, fibrosis, and wound healing by enhancing L- 19360123 16556895 proline, polyamine, and Th2 cytokine production.

Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 : Interactions entre les protéines (extracellulaire vers nucléaire)

Liste des 840 interactions trouvées par Pathway Studio entre une protéine extracellulaire vers une protéine nucléaire et incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique. extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire ADAMTS1 EGFR MDM2 ATF3 F12 EGFR CCNA2 TTK ADAMTS1 EGFR AURKA BUB1B F12 EGFR BIRC5 TTK ADAMTS1 EGFR CCNA2 BUB1B FST PTGS2 CCNA2 BUB1B ADAMTS1 EGFR BIRC5 BUB1B FST PTGS2 CCNA2 CDC20 ADAMTS1 EGFR AURKA CDC20 FST PTGS2 CCNA2 CDC6 ADAMTS1 EGFR BAX CDC20 FST PTGS2 CCNA2 CDC6 ADAMTS1 EGFR CCNA2 CDC20 FST PTGS2 CCNA2 MCM4 ADAMTS1 EGFR CHEK1 CDC20 FST PTGS2 CCNA2 MCM5 ADAMTS1 EGFR CCNA2 CDC6 FST PTGS2 CCNA2 MCM6 ADAMTS1 EGFR CCNA2 CDC6 FST PTGS2 CCNA2 MKI67 ADAMTS1 EGFR AURKA CENPA FST PTGS2 CCNA2 TTK ADAMTS1 EGFR AURKA CENPA KNG1 EGFR MDM2 ATF3 ADAMTS1 EGFR BID CYB5A KNG1 CD44 CDK1 BUB1 ADAMTS1 EGFR AURKA DLGAP5 KNG1 PTGS2 CDK1 BUB1 ADAMTS1 EGFR MDM2 EID1 KNG1 CD44 CDK1 BUB1B ADAMTS1 EGFR KRAS ETS1 KNG1 EGFR AURKA BUB1B ADAMTS1 EGFR CHEK1 FANCD2 KNG1 EGFR CCNA2 BUB1B ADAMTS1 EGFR MDM2 HMGA2 KNG1 EGFR BIRC5 BUB1B ADAMTS1 EGFR BIRC5 KIF23 KNG1 PTGS2 CDK1 BUB1B ADAMTS1 EGFR BAX LASS5 KNG1 CD44 CDK1 CDC20 ADAMTS1 EGFR AURKA LATS2 KNG1 CD44 CDK1 CDC20 ADAMTS1 EGFR CCNA2 MCM4 KNG1 EGFR AURKA CDC20 ADAMTS1 EGFR CHEK1 MCM4 KNG1 EGFR BAX CDC20 ADAMTS1 EGFR CCNA2 MCM5 KNG1 EGFR CCNA2 CDC20 ADAMTS1 EGFR CCNA2 MCM6 KNG1 EGFR CHEK1 CDC20 ADAMTS1 EGFR BAX MKI67 KNG1 PTGS2 CDK1 CDC20 ADAMTS1 EGFR CCNA2 MKI67 KNG1 PTGS2 CDK1 CDC20 ADAMTS1 EGFR IRS1 MKI67 KNG1 CD44 CDK1 CDC6 ADAMTS1 EGFR CYP1A1 NQO1 KNG1 EGFR CCNA2 CDC6 ADAMTS1 EGFR AURKA NUSAP1 KNG1 EGFR CCNA2 CDC6 ADAMTS1 EGFR KRAS PHLDA1 KNG1 PTGS2 CDK1 CDC6 ADAMTS1 EGFR BIRC5 PTTG1 KNG1 EGFR AURKA CENPA ADAMTS1 EGFR CHEK1 PTTG1 KNG1 EGFR AURKA CENPA ADAMTS1 EGFR BAX RAD51 KNG1 EGFR BID CYB5A ADAMTS1 EGFR BID RAD51 KNG1 ANPEP SOD2 DDIT3 ADAMTS1 EGFR CHEK1 RAD51 KNG1 CD44 CDK1 DLGAP5 ADAMTS1 EGFR BAX TOP2A KNG1 EGFR AURKA DLGAP5 ADAMTS1 EGFR AURKA TPX2 KNG1 PTGS2 CDK1 DLGAP5 ADAMTS1 EGFR CCNA2 TTK KNG1 EGFR MDM2 EID1 ADAMTS1 EGFR BIRC5 TTK KNG1 ANPEP SOD2 ETS1 BMP2 FAS MDM2 ATF3 KNG1 EGFR KRAS ETS1 BMP2 FAS CCNB1 BUB1 KNG1 EGFR CHEK1 FANCD2 BMP2 FAS CDK1 BUB1 KNG1 CD44 CDK1 HMGA2

136 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire BMP2 FAS BIRC5 BUB1B KNG1 EGFR MDM2 HMGA2 BMP2 FAS CCNA2 BUB1B KNG1 PTGS2 CDK1 HMGA2 BMP2 FAS CCNB1 BUB1B KNG1 CD44 CDK1 KIF23 BMP2 FAS CDK1 BUB1B KNG1 EGFR BIRC5 KIF23 BMP2 CLIC4 BAX CDC20 KNG1 PTGS2 CDK1 KIF23 BMP2 FAS BAX CDC20 KNG1 EGFR BAX LASS5 BMP2 FAS CCNA2 CDC20 KNG1 EGFR AURKA LATS2 BMP2 FAS CDK1 CDC20 KNG1 CD44 CDK1 MCM10 BMP2 FAS CDK1 CDC20 KNG1 PTGS2 CDK1 MCM10 BMP2 FAS RASSF1 CDC20 KNG1 CD44 CDK1 MCM4 BMP2 PTGS2 BAX CDC20 KNG1 EGFR CCNA2 MCM4 BMP2 FAS CCNA2 CDC6 KNG1 EGFR CHEK1 MCM4 BMP2 FAS CCNA2 CDC6 KNG1 PTGS2 CDK1 MCM4 BMP2 FAS CDK1 CDC6 KNG1 CD44 CDK1 MCM5 BMP2 MME PTEN CDC6 KNG1 EGFR CCNA2 MCM5 BMP2 FAS BID CYB5A KNG1 PTGS2 CDK1 MCM5 BMP2 FAS SOD2 DDIT3 KNG1 CD44 CDK1 MCM6 BMP2 MME HSP90B1 DDIT3 KNG1 EGFR CCNA2 MCM6 BMP2 FAS CDK1 DLGAP5 KNG1 PTGS2 CDK1 MCM6 BMP2 MME PTEN EGR2 KNG1 CD44 CDK1 MKI67 BMP2 FAS MDM2 EID1 KNG1 EGFR BAX MKI67 BMP2 FAS SOD2 ETS1 KNG1 EGFR CCNA2 MKI67 BMP2 MME PTEN FDFT1 KNG1 EGFR IRS1 MKI67 BMP2 FAS CDK1 HMGA2 KNG1 PTGS2 CDK1 MKI67 BMP2 FAS MDM2 HMGA2 KNG1 CD44 CDK1 NCAPG BMP2 FAS BIRC5 KIF23 KNG1 PTGS2 CDK1 NCAPG BMP2 FAS CDK1 KIF23 KNG1 EGFR CYP1A1 NQO1 BMP2 MME PTEN LASS2 KNG1 EGFR AURKA NUSAP1 BMP2 CLIC4 BAX LASS5 KNG1 EGFR KRAS PHLDA1 BMP2 FAS BAX LASS5 KNG1 CD44 CDK1 PTTG1 BMP2 PTGS2 BAX LASS5 KNG1 CD44 CDK1 PTTG1 BMP2 MME PTEN LEF1 KNG1 EGFR BIRC5 PTTG1 BMP2 FAS CDK1 MCM10 KNG1 EGFR CHEK1 PTTG1 BMP2 FAS CCNA2 MCM4 KNG1 PTGS2 CDK1 PTTG1 BMP2 FAS CDK1 MCM4 KNG1 PTGS2 CDK1 PTTG1 BMP2 FAS CCNA2 MCM5 KNG1 CD44 CDK1 RAD51 BMP2 FAS CDK1 MCM5 KNG1 EGFR BAX RAD51 BMP2 MME HSP90B1 MCM5 KNG1 EGFR BID RAD51 BMP2 FAS CCNA2 MCM6 KNG1 EGFR CHEK1 RAD51 BMP2 FAS CDK1 MCM6 KNG1 PTGS2 CDK1 RAD51 BMP2 CLIC4 BAX MKI67 KNG1 CD44 CDK1 RANBP2 BMP2 FAS BAX MKI67 KNG1 PTGS2 CDK1 RANBP2 BMP2 FAS CCNA2 MKI67 KNG1 CD44 CDK1 TMPO BMP2 FAS CDK1 MKI67 KNG1 PTGS2 CDK1 TMPO BMP2 MME PTEN MKI67 KNG1 EGFR BAX TOP2A BMP2 PTGS2 BAX MKI67 KNG1 EGFR AURKA TPX2

137 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire BMP2 FAS CDK1 NCAPG KNG1 CD44 CDK1 TTK BMP2 MME PTEN NQO1 KNG1 EGFR CCNA2 TTK BMP2 FAS BIRC5 PTTG1 KNG1 EGFR BIRC5 TTK BMP2 FAS CCNB1 PTTG1 KNG1 PTGS2 CDK1 TTK BMP2 FAS CDK1 PTTG1 MMP9 EGFR MDM2 ATF3 BMP2 FAS CDK1 PTTG1 MMP9 EGFR AURKA BUB1B BMP2 CLIC4 BAX RAD51 MMP9 EGFR CCNA2 BUB1B BMP2 FAS BAX RAD51 MMP9 EGFR BIRC5 BUB1B BMP2 FAS BID RAD51 MMP9 EGFR AURKA CDC20 BMP2 FAS CDK1 RAD51 MMP9 EGFR BAX CDC20 BMP2 MME PTEN RAD51 MMP9 EGFR CCNA2 CDC20 BMP2 PTGS2 BAX RAD51 MMP9 EGFR CHEK1 CDC20 BMP2 FAS CDK1 RANBP2 MMP9 EGFR CCNA2 CDC6 BMP2 FAS CDK1 TMPO MMP9 EGFR CCNA2 CDC6 BMP2 CLIC4 BAX TOP2A MMP9 EGFR AURKA CENPA BMP2 FAS BAX TOP2A MMP9 EGFR AURKA CENPA BMP2 PTGS2 BAX TOP2A MMP9 EGFR BID CYB5A BMP2 FAS BIRC5 TTK MMP9 EGFR AURKA DLGAP5 BMP2 FAS CCNA2 TTK MMP9 EGFR MDM2 EID1 BMP2 FAS CDK1 TTK MMP9 EGFR KRAS ETS1 CCL22 EGFR MDM2 ATF3 MMP9 PLAUR KRAS ETS1 CCL22 EGFR AURKA BUB1B MMP9 EGFR CHEK1 FANCD2 CCL22 EGFR CCNA2 BUB1B MMP9 EGFR MDM2 HMGA2 CCL22 EGFR BIRC5 BUB1B MMP9 EGFR BIRC5 KIF23 CCL22 EGFR AURKA CDC20 MMP9 EGFR BAX LASS5 CCL22 EGFR BAX CDC20 MMP9 EGFR AURKA LATS2 CCL22 EGFR CCNA2 CDC20 MMP9 EGFR CCNA2 MCM4 CCL22 EGFR CHEK1 CDC20 MMP9 EGFR CHEK1 MCM4 CCL22 EGFR CCNA2 CDC6 MMP9 EGFR CCNA2 MCM5 CCL22 EGFR CCNA2 CDC6 MMP9 EGFR CCNA2 MCM6 CCL22 EGFR AURKA CENPA MMP9 EGFR BAX MKI67 CCL22 EGFR AURKA CENPA MMP9 EGFR CCNA2 MKI67 CCL22 EGFR BID CYB5A MMP9 EGFR IRS1 MKI67 CCL22 EGFR AURKA DLGAP5 MMP9 EGFR CYP1A1 NQO1 CCL22 EGFR MDM2 EID1 MMP9 EGFR AURKA NUSAP1 CCL22 EGFR KRAS ETS1 MMP9 EGFR KRAS PHLDA1 CCL22 EGFR CHEK1 FANCD2 MMP9 PLAUR KRAS PHLDA1 CCL22 EGFR MDM2 HMGA2 MMP9 EGFR BIRC5 PTTG1 CCL22 EGFR BIRC5 KIF23 MMP9 EGFR CHEK1 PTTG1 CCL22 EGFR BAX LASS5 MMP9 EGFR BAX RAD51 CCL22 EGFR AURKA LATS2 MMP9 EGFR BID RAD51 CCL22 EGFR CCNA2 MCM4 MMP9 EGFR CHEK1 RAD51 CCL22 EGFR CHEK1 MCM4 MMP9 EGFR BAX TOP2A CCL22 EGFR CCNA2 MCM5 MMP9 EGFR AURKA TPX2 CCL22 EGFR CCNA2 MCM6 MMP9 EGFR CCNA2 TTK CCL22 EGFR BAX MKI67 MMP9 EGFR BIRC5 TTK

138 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire CCL22 EGFR CCNA2 MKI67 NRG1 EGFR MDM2 ATF3 CCL22 EGFR IRS1 MKI67 NRG1 FAS MDM2 ATF3 CCL22 EGFR CYP1A1 NQO1 NRG1 FAS CCNB1 BUB1 CCL22 EGFR AURKA NUSAP1 NRG1 FAS CDK1 BUB1 CCL22 EGFR KRAS PHLDA1 NRG1 EGFR AURKA BUB1B CCL22 EGFR BIRC5 PTTG1 NRG1 EGFR CCNA2 BUB1B CCL22 EGFR CHEK1 PTTG1 NRG1 EGFR BIRC5 BUB1B CCL22 EGFR BAX RAD51 NRG1 FAS BIRC5 BUB1B CCL22 EGFR BID RAD51 NRG1 FAS CCNA2 BUB1B CCL22 EGFR CHEK1 RAD51 NRG1 FAS CCNB1 BUB1B CCL22 EGFR BAX TOP2A NRG1 FAS CDK1 BUB1B CCL22 EGFR AURKA TPX2 NRG1 EGFR AURKA CDC20 CCL22 EGFR CCNA2 TTK NRG1 EGFR BAX CDC20 CCL22 EGFR BIRC5 TTK NRG1 EGFR CCNA2 CDC20 CTGF EGFR MDM2 ATF3 NRG1 EGFR CHEK1 CDC20 CTGF EGFR AURKA BUB1B NRG1 FAS BAX CDC20 CTGF EGFR CCNA2 BUB1B NRG1 FAS CCNA2 CDC20 CTGF EGFR BIRC5 BUB1B NRG1 FAS CDK1 CDC20 CTGF EGFR AURKA CDC20 NRG1 FAS CDK1 CDC20 CTGF EGFR BAX CDC20 NRG1 FAS RASSF1 CDC20 CTGF EGFR CCNA2 CDC20 NRG1 PTGS2 CHEK1 CDC20 CTGF EGFR CHEK1 CDC20 NRG1 EGFR CCNA2 CDC6 CTGF EGFR CCNA2 CDC6 NRG1 EGFR CCNA2 CDC6 CTGF EGFR CCNA2 CDC6 NRG1 FAS CCNA2 CDC6 CTGF EGFR AURKA CENPA NRG1 FAS CCNA2 CDC6 CTGF EGFR AURKA CENPA NRG1 FAS CDK1 CDC6 CTGF EGFR BID CYB5A NRG1 EGFR AURKA CENPA CTGF EGFR AURKA DLGAP5 NRG1 EGFR AURKA CENPA CTGF EGFR MDM2 EID1 NRG1 EGFR BID CYB5A CTGF EGFR KRAS ETS1 NRG1 FAS BID CYB5A CTGF PLAUR KRAS ETS1 NRG1 FAS SOD2 DDIT3 CTGF EGFR CHEK1 FANCD2 NRG1 EGFR AURKA DLGAP5 CTGF EGFR MDM2 HMGA2 NRG1 FAS CDK1 DLGAP5 CTGF EGFR BIRC5 KIF23 NRG1 EGFR MDM2 EID1 CTGF EGFR BAX LASS5 NRG1 FAS MDM2 EID1 CTGF EGFR AURKA LATS2 NRG1 EGFR KRAS ETS1 CTGF EGFR CCNA2 MCM4 NRG1 FAS SOD2 ETS1 CTGF EGFR CHEK1 MCM4 NRG1 PLAUR KRAS ETS1 CTGF EGFR CCNA2 MCM5 NRG1 EGFR CHEK1 FANCD2 CTGF EGFR CCNA2 MCM6 NRG1 PTGS2 CHEK1 FANCD2 CTGF EGFR BAX MKI67 NRG1 EGFR MDM2 HMGA2 CTGF EGFR CCNA2 MKI67 NRG1 FAS CDK1 HMGA2 CTGF EGFR IRS1 MKI67 NRG1 FAS MDM2 HMGA2 CTGF EGFR CYP1A1 NQO1 NRG1 EGFR BIRC5 KIF23 CTGF EGFR AURKA NUSAP1 NRG1 FAS BIRC5 KIF23 CTGF EGFR KRAS PHLDA1 NRG1 FAS CDK1 KIF23

139 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire CTGF PLAUR KRAS PHLDA1 NRG1 EGFR BAX LASS5 CTGF EGFR BIRC5 PTTG1 NRG1 FAS BAX LASS5 CTGF EGFR CHEK1 PTTG1 NRG1 EGFR AURKA LATS2 CTGF EGFR BAX RAD51 NRG1 FAS CDK1 MCM10 CTGF EGFR BID RAD51 NRG1 EGFR CCNA2 MCM4 CTGF EGFR CHEK1 RAD51 NRG1 EGFR CHEK1 MCM4 CTGF EGFR BAX TOP2A NRG1 FAS CCNA2 MCM4 CTGF EGFR AURKA TPX2 NRG1 FAS CDK1 MCM4 CTGF EGFR CCNA2 TTK NRG1 PTGS2 CHEK1 MCM4 CTGF EGFR BIRC5 TTK NRG1 EGFR CCNA2 MCM5 CYR61 PTGS2 BID CYB5A NRG1 FAS CCNA2 MCM5 CYR61 PTGS2 BID RAD51 NRG1 FAS CDK1 MCM5 DEFB1 EGFR MDM2 ATF3 NRG1 EGFR CCNA2 MCM6 DEFB1 EGFR AURKA BUB1B NRG1 FAS CCNA2 MCM6 DEFB1 EGFR CCNA2 BUB1B NRG1 FAS CDK1 MCM6 DEFB1 EGFR BIRC5 BUB1B NRG1 EGFR BAX MKI67 DEFB1 EGFR AURKA BUB1B NRG1 EGFR CCNA2 MKI67 DEFB1 EGFR CCNA2 BUB1B NRG1 EGFR IRS1 MKI67 DEFB1 EGFR BIRC5 BUB1B NRG1 FAS BAX MKI67 DEFB1 EGFR AURKA CDC20 NRG1 FAS CCNA2 MKI67 DEFB1 EGFR BAX CDC20 NRG1 FAS CDK1 MKI67 DEFB1 EGFR CCNA2 CDC20 NRG1 FAS CDK1 NCAPG DEFB1 EGFR CHEK1 CDC20 NRG1 EGFR CYP1A1 NQO1 DEFB1 EGFR AURKA CDC20 NRG1 EGFR AURKA NUSAP1 DEFB1 EGFR BAX CDC20 NRG1 EGFR KRAS PHLDA1 DEFB1 EGFR CCNA2 CDC20 NRG1 PLAUR KRAS PHLDA1 DEFB1 EGFR CHEK1 CDC20 NRG1 EGFR BIRC5 PTTG1 DEFB1 EGFR CCNA2 CDC6 NRG1 EGFR CHEK1 PTTG1 DEFB1 EGFR CCNA2 CDC6 NRG1 FAS BIRC5 PTTG1 DEFB1 EGFR CCNA2 CDC6 NRG1 FAS CCNB1 PTTG1 DEFB1 EGFR CCNA2 CDC6 NRG1 FAS CDK1 PTTG1 DEFB1 EGFR AURKA CENPA NRG1 FAS CDK1 PTTG1 DEFB1 EGFR AURKA CENPA NRG1 PTGS2 CHEK1 PTTG1 DEFB1 EGFR AURKA CENPA NRG1 EGFR BAX RAD51 DEFB1 EGFR AURKA CENPA NRG1 EGFR BID RAD51 DEFB1 EGFR BID CYB5A NRG1 EGFR CHEK1 RAD51 DEFB1 EGFR BID CYB5A NRG1 FAS BAX RAD51 DEFB1 EGFR AURKA DLGAP5 NRG1 FAS BID RAD51 DEFB1 EGFR AURKA DLGAP5 NRG1 FAS CDK1 RAD51 DEFB1 EGFR MDM2 EID1 NRG1 PTGS2 CHEK1 RAD51 DEFB1 EGFR MDM2 EID1 NRG1 FAS CDK1 RANBP2 DEFB1 EGFR KRAS ETS1 NRG1 FAS CDK1 TMPO DEFB1 EGFR KRAS ETS1 NRG1 EGFR BAX TOP2A DEFB1 EGFR CHEK1 FANCD2 NRG1 FAS BAX TOP2A DEFB1 EGFR CHEK1 FANCD2 NRG1 EGFR AURKA TPX2 DEFB1 EGFR MDM2 HMGA2 NRG1 EGFR CCNA2 TTK

140 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire DEFB1 EGFR MDM2 HMGA2 NRG1 EGFR BIRC5 TTK DEFB1 EGFR BIRC5 KIF23 NRG1 FAS BIRC5 TTK DEFB1 EGFR BIRC5 KIF23 NRG1 FAS CCNA2 TTK DEFB1 EGFR BAX LASS5 NRG1 FAS CDK1 TTK DEFB1 EGFR BAX LASS5 PGF PLAUR KRAS ETS1 DEFB1 EGFR AURKA LATS2 PGF PLAUR KRAS PHLDA1 DEFB1 EGFR AURKA LATS2 SERPINE1 PLAUR KRAS ETS1 DEFB1 EGFR CCNA2 MCM4 SERPINE1 PLAUR KRAS ETS1 DEFB1 EGFR CHEK1 MCM4 SERPINE1 PLAUR KRAS PHLDA1 DEFB1 EGFR CCNA2 MCM4 SERPINE1 PLAUR KRAS PHLDA1 DEFB1 EGFR CHEK1 MCM4 SFRP1 EGFR MDM2 ATF3 DEFB1 EGFR CCNA2 MCM5 SFRP1 EGFR AURKA BUB1B DEFB1 EGFR CCNA2 MCM5 SFRP1 EGFR CCNA2 BUB1B DEFB1 EGFR CCNA2 MCM6 SFRP1 EGFR BIRC5 BUB1B DEFB1 EGFR CCNA2 MCM6 SFRP1 EGFR AURKA CDC20 DEFB1 EGFR BAX MKI67 SFRP1 EGFR BAX CDC20 DEFB1 EGFR CCNA2 MKI67 SFRP1 EGFR CCNA2 CDC20 DEFB1 EGFR IRS1 MKI67 SFRP1 EGFR CHEK1 CDC20 DEFB1 EGFR BAX MKI67 SFRP1 EGFR CCNA2 CDC6 DEFB1 EGFR CCNA2 MKI67 SFRP1 EGFR CCNA2 CDC6 DEFB1 EGFR IRS1 MKI67 SFRP1 EGFR AURKA CENPA DEFB1 EGFR CYP1A1 NQO1 SFRP1 EGFR AURKA CENPA DEFB1 EGFR CYP1A1 NQO1 SFRP1 EGFR BID CYB5A DEFB1 EGFR AURKA NUSAP1 SFRP1 EGFR AURKA DLGAP5 DEFB1 EGFR AURKA NUSAP1 SFRP1 EGFR MDM2 EID1 DEFB1 EGFR KRAS PHLDA1 SFRP1 EGFR KRAS ETS1 DEFB1 EGFR KRAS PHLDA1 SFRP1 EGFR CHEK1 FANCD2 DEFB1 EGFR BIRC5 PTTG1 SFRP1 EGFR MDM2 HMGA2 DEFB1 EGFR CHEK1 PTTG1 SFRP1 EGFR BIRC5 KIF23 DEFB1 EGFR BIRC5 PTTG1 SFRP1 EGFR BAX LASS5 DEFB1 EGFR CHEK1 PTTG1 SFRP1 EGFR AURKA LATS2 DEFB1 EGFR BAX RAD51 SFRP1 EGFR CCNA2 MCM4 DEFB1 EGFR BID RAD51 SFRP1 EGFR CHEK1 MCM4 DEFB1 EGFR CHEK1 RAD51 SFRP1 EGFR CCNA2 MCM5 DEFB1 EGFR BAX RAD51 SFRP1 EGFR CCNA2 MCM6 DEFB1 EGFR BID RAD51 SFRP1 EGFR BAX MKI67 DEFB1 EGFR CHEK1 RAD51 SFRP1 EGFR CCNA2 MKI67 DEFB1 EGFR BAX TOP2A SFRP1 EGFR IRS1 MKI67 DEFB1 EGFR BAX TOP2A SFRP1 EGFR CYP1A1 NQO1 DEFB1 EGFR AURKA TPX2 SFRP1 EGFR AURKA NUSAP1 DEFB1 EGFR AURKA TPX2 SFRP1 EGFR KRAS PHLDA1 DEFB1 EGFR CCNA2 TTK SFRP1 EGFR BIRC5 PTTG1 DEFB1 EGFR BIRC5 TTK SFRP1 EGFR CHEK1 PTTG1 DEFB1 EGFR CCNA2 TTK SFRP1 EGFR BAX RAD51 DEFB1 EGFR BIRC5 TTK SFRP1 EGFR BID RAD51 DKK1 EGFR MDM2 ATF3 SFRP1 EGFR CHEK1 RAD51

141 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire DKK1 EGFR AURKA BUB1B SFRP1 EGFR BAX TOP2A DKK1 EGFR CCNA2 BUB1B SFRP1 EGFR AURKA TPX2 DKK1 EGFR BIRC5 BUB1B SFRP1 EGFR CCNA2 TTK DKK1 CD44 BAX CDC20 SFRP1 EGFR BIRC5 TTK DKK1 EGFR AURKA CDC20 TFPI2 FAS MDM2 ATF3 DKK1 EGFR BAX CDC20 TFPI2 FAS CCNB1 BUB1 DKK1 EGFR CCNA2 CDC20 TFPI2 FAS CDK1 BUB1 DKK1 EGFR CHEK1 CDC20 TFPI2 FAS BIRC5 BUB1B DKK1 EGFR CCNA2 CDC6 TFPI2 FAS CCNA2 BUB1B DKK1 EGFR CCNA2 CDC6 TFPI2 FAS CCNB1 BUB1B DKK1 EGFR AURKA CENPA TFPI2 FAS CDK1 BUB1B DKK1 EGFR AURKA CENPA TFPI2 FAS BAX CDC20 DKK1 EGFR BID CYB5A TFPI2 FAS CCNA2 CDC20 DKK1 EGFR AURKA DLGAP5 TFPI2 FAS CDK1 CDC20 DKK1 EGFR MDM2 EID1 TFPI2 FAS CDK1 CDC20 DKK1 EGFR KRAS ETS1 TFPI2 FAS RASSF1 CDC20 DKK1 EGFR CHEK1 FANCD2 TFPI2 FAS CCNA2 CDC6 DKK1 EGFR MDM2 HMGA2 TFPI2 FAS CCNA2 CDC6 DKK1 EGFR BIRC5 KIF23 TFPI2 FAS CDK1 CDC6 DKK1 CD44 BAX LASS5 TFPI2 FAS BID CYB5A DKK1 EGFR BAX LASS5 TFPI2 FAS SOD2 DDIT3 DKK1 EGFR AURKA LATS2 TFPI2 FAS CDK1 DLGAP5 DKK1 EGFR CCNA2 MCM4 TFPI2 FAS MDM2 EID1 DKK1 EGFR CHEK1 MCM4 TFPI2 FAS SOD2 ETS1 DKK1 EGFR CCNA2 MCM5 TFPI2 FAS CDK1 HMGA2 DKK1 EGFR CCNA2 MCM6 TFPI2 FAS MDM2 HMGA2 DKK1 CD44 BAX MKI67 TFPI2 FAS BIRC5 KIF23 DKK1 EGFR BAX MKI67 TFPI2 FAS CDK1 KIF23 DKK1 EGFR CCNA2 MKI67 TFPI2 FAS BAX LASS5 DKK1 EGFR IRS1 MKI67 TFPI2 FAS CDK1 MCM10 DKK1 EGFR CYP1A1 NQO1 TFPI2 FAS CCNA2 MCM4 DKK1 EGFR AURKA NUSAP1 TFPI2 FAS CDK1 MCM4 DKK1 EGFR KRAS PHLDA1 TFPI2 FAS CCNA2 MCM5 DKK1 EGFR BIRC5 PTTG1 TFPI2 FAS CDK1 MCM5 DKK1 EGFR CHEK1 PTTG1 TFPI2 FAS CCNA2 MCM6 DKK1 CD44 BAX RAD51 TFPI2 FAS CDK1 MCM6 DKK1 EGFR BAX RAD51 TFPI2 FAS BAX MKI67 DKK1 EGFR BID RAD51 TFPI2 FAS CCNA2 MKI67 DKK1 EGFR CHEK1 RAD51 TFPI2 FAS CDK1 MKI67 DKK1 CD44 BAX TOP2A TFPI2 FAS CDK1 NCAPG DKK1 EGFR BAX TOP2A TFPI2 FAS BIRC5 PTTG1 DKK1 EGFR AURKA TPX2 TFPI2 FAS CCNB1 PTTG1 DKK1 EGFR CCNA2 TTK TFPI2 FAS CDK1 PTTG1 DKK1 EGFR BIRC5 TTK TFPI2 FAS CDK1 PTTG1 EDN1 EGFR MDM2 ATF3 TFPI2 FAS BAX RAD51 EDN1 CD44 CCNA2 BUB1B TFPI2 FAS BID RAD51

142 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire EDN1 EGFR AURKA BUB1B TFPI2 FAS CDK1 RAD51 EDN1 EGFR CCNA2 BUB1B TFPI2 FAS CDK1 RANBP2 EDN1 EGFR BIRC5 BUB1B TFPI2 FAS CDK1 TMPO EDN1 PTGS2 BIRC5 BUB1B TFPI2 FAS BAX TOP2A EDN1 CD44 CCNA2 CDC20 TFPI2 FAS BIRC5 TTK EDN1 EGFR AURKA CDC20 TFPI2 FAS CCNA2 TTK EDN1 EGFR BAX CDC20 TFPI2 FAS CDK1 TTK EDN1 EGFR CCNA2 CDC20 TNFSF10 EGFR MDM2 ATF3 EDN1 EGFR CHEK1 CDC20 TNFSF10 FAS MDM2 ATF3 EDN1 PDGFRA BAX CDC20 TNFSF10 PTGS2 MDM2 ATF3 EDN1 PTGER4 BAX CDC20 TNFSF10 FAS CCNB1 BUB1 EDN1 CD44 CCNA2 CDC6 TNFSF10 FAS CDK1 BUB1 EDN1 CD44 CCNA2 CDC6 TNFSF10 EGFR AURKA BUB1B EDN1 EGFR CCNA2 CDC6 TNFSF10 EGFR CCNA2 BUB1B EDN1 EGFR CCNA2 CDC6 TNFSF10 EGFR BIRC5 BUB1B EDN1 EGFR AURKA CENPA TNFSF10 FAS BIRC5 BUB1B EDN1 EGFR AURKA CENPA TNFSF10 FAS CCNA2 BUB1B EDN1 EGFR BID CYB5A TNFSF10 FAS CCNB1 BUB1B EDN1 EGFR AURKA DLGAP5 TNFSF10 FAS CDK1 BUB1B EDN1 EGFR MDM2 EID1 TNFSF10 EGFR AURKA CDC20 EDN1 EGFR KRAS ETS1 TNFSF10 EGFR BAX CDC20 EDN1 PLAUR KRAS ETS1 TNFSF10 EGFR CCNA2 CDC20 EDN1 EGFR CHEK1 FANCD2TNFSF10 EGFR CHEK1 CDC20 EDN1 EGFR MDM2 HMGA2 TNFSF10 FAS BAX CDC20 EDN1 EGFR BIRC5 KIF23 TNFSF10 FAS CCNA2 CDC20 EDN1 PTGS2 BIRC5 KIF23 TNFSF10 FAS CDK1 CDC20 EDN1 EGFR BAX LASS5 TNFSF10 FAS CDK1 CDC20 EDN1 PDGFRA BAX LASS5 TNFSF10 FAS RASSF1 CDC20 EDN1 PTGER4 BAX LASS5 TNFSF10 EGFR CCNA2 CDC6 EDN1 EGFR AURKA LATS2 TNFSF10 EGFR CCNA2 CDC6 EDN1 CD44 CCNA2 MCM4 TNFSF10 FAS CCNA2 CDC6 EDN1 EGFR CCNA2 MCM4 TNFSF10 FAS CCNA2 CDC6 EDN1 EGFR CHEK1 MCM4 TNFSF10 FAS CDK1 CDC6 EDN1 CD44 CCNA2 MCM5 TNFSF10 EGFR AURKA CENPA EDN1 EGFR CCNA2 MCM5 TNFSF10 EGFR AURKA CENPA EDN1 CD44 CCNA2 MCM6 TNFSF10 EGFR BID CYB5A EDN1 EGFR CCNA2 MCM6 TNFSF10 FAS BID CYB5A EDN1 CD44 CCNA2 MKI67 TNFSF10 FAS SOD2 DDIT3 EDN1 EGFR BAX MKI67 TNFSF10 EGFR AURKA DLGAP5 EDN1 EGFR CCNA2 MKI67 TNFSF10 FAS CDK1 DLGAP5 EDN1 EGFR IRS1 MKI67 TNFSF10 EGFR MDM2 EID1 EDN1 PDGFRA BAX MKI67 TNFSF10 FAS MDM2 EID1 EDN1 PTGER4 BAX MKI67 TNFSF10 PTGS2 MDM2 EID1 EDN1 EGFR CYP1A1 NQO1 TNFSF10 EGFR KRAS ETS1 EDN1 EGFR AURKA NUSAP1TNFSF10 FAS SOD2 ETS1 EDN1 EGFR KRAS PHLDA1 TNFSF10 PLAUR KRAS ETS1

143 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire EDN1 PLAUR KRAS PHLDA1 TNFSF10 EGFR CHEK1 FANCD2 EDN1 EGFR BIRC5 PTTG1 TNFSF10 EGFR MDM2 HMGA2 EDN1 EGFR CHEK1 PTTG1 TNFSF10 FAS CDK1 HMGA2 EDN1 PTGS2 BIRC5 PTTG1 TNFSF10 FAS MDM2 HMGA2 EDN1 EGFR BAX RAD51 TNFSF10 PTGS2 MDM2 HMGA2 EDN1 EGFR BID RAD51 TNFSF10 EGFR BIRC5 KIF23 EDN1 EGFR CHEK1 RAD51 TNFSF10 FAS BIRC5 KIF23 EDN1 PDGFRA BAX RAD51 TNFSF10 FAS CDK1 KIF23 EDN1 PTGER4 BAX RAD51 TNFSF10 EGFR BAX LASS5 EDN1 EGFR BAX TOP2A TNFSF10 FAS BAX LASS5 EDN1 PDGFRA BAX TOP2A TNFSF10 EGFR AURKA LATS2 EDN1 PTGER4 BAX TOP2A TNFSF10 FAS CDK1 MCM10 EDN1 EGFR AURKA TPX2 TNFSF10 EGFR CCNA2 MCM4 EDN1 CD44 CCNA2 TTK TNFSF10 EGFR CHEK1 MCM4 EDN1 EGFR CCNA2 TTK TNFSF10 FAS CCNA2 MCM4 EDN1 EGFR BIRC5 TTK TNFSF10 FAS CDK1 MCM4 EDN1 PTGS2 BIRC5 TTK TNFSF10 EGFR CCNA2 MCM5 F12 EGFR MDM2 ATF3 TNFSF10 FAS CCNA2 MCM5 F12 EGFR AURKA BUB1B TNFSF10 FAS CDK1 MCM5 F12 EGFR CCNA2 BUB1B TNFSF10 EGFR CCNA2 MCM6 F12 EGFR BIRC5 BUB1B TNFSF10 FAS CCNA2 MCM6 F12 EGFR AURKA CDC20 TNFSF10 FAS CDK1 MCM6 F12 EGFR BAX CDC20 TNFSF10 EGFR BAX MKI67 F12 EGFR CCNA2 CDC20 TNFSF10 EGFR CCNA2 MKI67 F12 EGFR CHEK1 CDC20 TNFSF10 EGFR IRS1 MKI67 F12 EGFR CCNA2 CDC6 TNFSF10 FAS BAX MKI67 F12 EGFR CCNA2 CDC6 TNFSF10 FAS CCNA2 MKI67 F12 EGFR AURKA CENPA TNFSF10 FAS CDK1 MKI67 F12 EGFR AURKA CENPA TNFSF10 FAS CDK1 NCAPG F12 EGFR BID CYB5A TNFSF10 EGFR CYP1A1 NQO1 F12 EGFR AURKA DLGAP5 TNFSF10 EGFR AURKA NUSAP1 F12 EGFR MDM2 EID1 TNFSF10 EGFR KRAS PHLDA1 F12 EGFR KRAS ETS1 TNFSF10 PLAUR KRAS PHLDA1 F12 EGFR CHEK1 FANCD2TNFSF10 EGFR BIRC5 PTTG1 F12 EGFR MDM2 HMGA2 TNFSF10 EGFR CHEK1 PTTG1 F12 EGFR BIRC5 KIF23 TNFSF10 FAS BIRC5 PTTG1 F12 EGFR BAX LASS5 TNFSF10 FAS CCNB1 PTTG1 F12 EGFR AURKA LATS2 TNFSF10 FAS CDK1 PTTG1 F12 EGFR CCNA2 MCM4 TNFSF10 FAS CDK1 PTTG1 F12 EGFR CHEK1 MCM4 TNFSF10 EGFR BAX RAD51 F12 EGFR CCNA2 MCM5 TNFSF10 EGFR BID RAD51 F12 EGFR CCNA2 MCM6 TNFSF10 EGFR CHEK1 RAD51 F12 EGFR BAX MKI67 TNFSF10 FAS BAX RAD51 F12 EGFR CCNA2 MKI67 TNFSF10 FAS BID RAD51 F12 EGFR IRS1 MKI67 TNFSF10 FAS CDK1 RAD51 F12 EGFR CYP1A1 NQO1 TNFSF10 FAS CDK1 RANBP2

144 Annexes 1 - Résultats

Tableau A-5 (suite) extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire extracellulaire membranaire cytoplasmique nucléaire F12 EGFR AURKA NUSAP1TNFSF10 FAS CDK1 TMPO F12 EGFR KRAS PHLDA1 TNFSF10 EGFR BAX TOP2A F12 EGFR BIRC5 PTTG1 TNFSF10 FAS BAX TOP2A F12 EGFR CHEK1 PTTG1 TNFSF10 EGFR AURKA TPX2 F12 EGFR BAX RAD51 TNFSF10 EGFR CCNA2 TTK F12 EGFR BID RAD51 TNFSF10 EGFR BIRC5 TTK F12 EGFR CHEK1 RAD51 TNFSF10 FAS BIRC5 TTK F12 EGFR BAX TOP2A TNFSF10 FAS CCNA2 TTK F12 EGFR AURKA TPX2 TNFSF10 FAS CDK1 TTK

145

Annexe 2 - La technique microarray Une analyse microarray repose sur le principe d'hybridation moléculaire (appariement entre des bases complémentaires de deux brins de la molécule d'ADN). Elle utilise des enzymes clivant l'ADN à certains sites précis de la moolécule double brins. Elle permet de rechercher une séquence d'intérêt dans un fragment d'ADN par l'intermédiaire d'une sonde marquée capable de s'hybrider à la séquence recherchée. Les microarrays sont une adaptation et une miniaturisation de cette technique (fig. A-1). La sonde est fixée sur une surface solide et la miniaturisation permet d'en fixer plusieurs capables de repérer spécifiquement les différenttes séquences d'intérêt. Une puce microarray est une surface solide sur laquelle sont fixées de manière ordonnée et avec une position déterminée des molécules le plus souvent d'acides nucléiques. Il existe également des puces d'anticorps, de protéines, de molécules lipophiles ou glycosylées, etc… . Nous nous intéresserons exclusivement aux puces d'acides nucléiques également appellées "puces à ADN".

Figure A-1 : principe de fonctionnnement d'une puce microarray (Source : Affymetrix website)

Chaque cellule d'un organisme contient le même matériel génétique. En fonction du type cellulaire et de la fonction de la cellule ses gènes sont activés ou réprimés. L'expression d'un gène et l'information codée qu'il contient, aboutit à sa transcription sous forme d'ARN messager. L'expression des gènes est analysée en prréparant par transcription inverse des sondes à partir de l'ADN complémentaire de ces ARN messagers. Pour certaines puces, les sondes déposées sur la lame microarray peuvent représenter la totalité des gènes exprimés par laa cellule. On peut ainsi comparer l'expression des gènes entre deux tissus (sain vs cancéreux) ou entre deux conditions expérimentales pour un même type celllulaire (stimulation chimique ouu physique). Si l'étude porte sur les ARN messagers, la puce mesure l'expression des gènes dont sont issus les messagers et le signal mesuré sera proportionnel au nombre de messagers transcrits.

146 Annexe 2 - La technique microarray

Pour mesurer l'expression de l'ARN dans un échantillon biologique, lla première étape est d'extraire l'ARNm des cellules. Une puce microarray peut mesurer l'expression de n'importe quel gène. La première étape est de construire une sonde (un fragment d'ADN) sur une surface solide. Dans le modèle de puce utilisée, la sonde est composée de 25 bases élémentaires et représente une section d'un gène beaucoup plus long (fig. A-2).

Taaille d'une puce GeneChip®

Des millions de brins d'ADN sont fixés sur chaque emplacement

6,5 millions d'emplacement sur chaque puce GeneChip® 1 brin = 25 bases Figure A-2 : disposition des sondes de 25 bases élémentaires sur une surface solide (Source : Affymetrix website)

Cette sonde est choisie car la suite des 25 bases appartient exclusivement à un gène donné et que seul l'ARN de ce gène pourra s'hybrider à cette sonde. La puce contient des millions de copies de cette sonde unique pour un ARN. Sur la puce Affymetrix GeneChip® human genome U133 Plus 2.0 (fig. A-3), il est possible de mesurer de manière simultanée l'expression de plus de 47.000 ARN [Affymetrix, data sheet U133 array]. ® Figure A-3: puce microarray Afffymetrix Genechip human genome U133 Plus 2.0

147 Annexe 2 - La technique microarray

Le marquage peut être différent en fonction de la technologie utilisée. Affymetrix utilise le marquage unique (fig. A-4). Il n'y a donc qu'une seule condition expérimentale par puce (par exemple une puce pour l'échantillon témoin et une puce pour l'échantillon stimulé) : les données obtenues par les deux puces sont comparées. Le produit à analyser est marqué par de la biotine couplée à de la streptavidine-phycoérythrine qui permet une mesure du signal fluorescent après excitation par laser. Plus le signal est important sur un emplacement donné de la puce, plus l'échantillon contient de l'ARN hybridé aux sondes fixées sur cette position. La seconde technique de marquage hybride les extraits de deux conditions expérimentales sur la même puce, chacun étant marqué par une molécule fluorescente différente (Cy3/Cy5 est souvent utilisé dans cette technique). C'est la différence de densité de couleur qui sera mesurée.

ADN non hybridé

Fragments d'ARN hybridés avec l'ADN de la puce ADN hybridé

Figure A-4 : hybridation des fragments de l'échantillon à analyser préalablement marqué à de la biotine couplée à de la streptavidine- phycoérythrine et mesure du signal fluorescent après excitation par laser (Source : Affymetrix website)

Afin de pouvoir comparer de manière précise les deux échantillons (témoin et stimulé) il est nécessaire de procéder à une normalisation. Cette normalisation peut se faire à partir de la grande proportion des gènes ayant la même expression dans les deux conditions expérimentales, à partir de gènes montrant une expression constante pour tous les tissus ou par l'introduction d'un contrôle interne identique pour les deux conditions expérimentales. Comme indiqué plus haut, il est nécessaire de préparer et de marquer les ARN extraits de la cellule afin qu'ils puissent s'hybrider à leur sonde complémentaire. En fonction de la quantité d'ARN de départ, Affymetrix propose 2 méthodes de préparation des échantillons d'ARN. Pour les échantillons comprenant de 1 à 15μg d'ARNtot, une transformation de l'ARN en ADNc en un cycle et pour les échantillons plus petits (10 à 100ng) une transformation et une amplification par transcription in vitro en deux cycles. Après avoir transformé l'ARN en ADNc, une étape de transcription inverse incorporant des uraciles marqués à la biotine les transforme en ARNc marqués. Après fragmentation des ARNc marqués et l'hybridation avec les sondes fixées sur la puce, cette dernière est lavée afin d'éliminer l'ensemble des ARN qui ne se sont pas hybridés. La mesure du taux d'expression des sondes de la puce est réalisée par l'acquisition par un scanner de la fluorescence des produits hybridés aux sondes (fig. A-5).

148 Annexe 2 - La technique microarray

Figure A-5 : préparation des échantillons d'ARN avant leur introduction dans la puce microarray (Source : Affymetrix website)

149

Annexe 3 - La technique qRT-PCR PCR : Polymerase Chain Reaction ou réaction de polymérase en chaîne ; RT : Reverse Transcriptase; q ou (real-time) : quantitative (ou en temps réel). La PCR est une technique d'amplification de l'ADN in vitro. Elle permet de repérer dans un mélange un fragment d'ADN ou de gène précis, même présent en quantité infime, et d'en obtenir un très grand nombre de copies. Un cycle de PCR comporte trois étapes : - une séparation des deux brins d'ADN par chauffage (dénaturation); - une hybridation des amorces* (primers) aux extrémités de la séquence recherchée; - une élongation grâce à l'action de l'ADN polymérase. Le cycle est répété pour obtenir une multiplication exponentielle de la séquence d'ADN cible. La RT-PCR est une première adaptation de la PCR qui permet de travailler à partir d'échantillon d'ARN. Les ARN extraits des cellules sont transformés en ADNc par la transcriptase inverse des rétrovirus (reverse transcriptase) qui synthétise une chaîne d’ADN à partir d’une matrice d’ARN. La PCR quantitative en temps réel est une application de la PCR. Elle permet de suivre "en temps réel" le processus d’amplification PCR en détectant la fluorescence émise par les produits de PCR néo formés et ainsi connaître la quantité d'ADN formé à chaque instant. La technique utilise deux amorces sens et anti-sens qui sont de petits brins d'ADN d'environ 20 bases (oligonucléotides) capables de s'hybrider de façon spécifique (grâce à la complémentarité des bases) à son brin d'ADNc. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier. Pratiquement (fig. A-6), les ARNm d'un échantillon sont convertis en ADNc double brins par transcription inverse. L'ADNc double brins est dénaturé et les deux amorces ajoutées se lient à l'ADNc, cela révèle la présence de l'ARNm recherché dans l'échantillon original. Une enzyme Taq polymerase vient compléter le brin à partir de l'amorce et des informations fournies par l'ADNc. Après 20 cycles de dénaturation, hybridation des amorces et élongation, la séquence spécifique incluse entre les 2 amorces est amplifiée 220 fois.

150 Annexe 3 - La technique qRT-PCR

Figure A-6 : principe de la qRT-PCR Reproduit avec la permission des Editions Sinauer Associates, Inc [Gilbert , 2013]

151

Annexe 4 - La peau Les informations de ce chapitre sont tirées de l'Atlas d'Histologie Fonctionnelle de Wheater [Burkitt H.G. et al., 1993], d'un Supplément des Annales de Dermatologie et de Vénéréologie [Crickx, 2005] ainsi que de deux publications sur la cicatrisation cutanée [Singer et al.,1999; Borena et al., 2015]. La peau est l'organe de revêtement extérieur du corps de l'homme et des animaux. Elle est constituée de trois tissus superposés, l'épiderme, le derme et l'hypoderme, qui "isolent" les tissus biologiques du monde extérieur. Elle possède de nombreuses fonctions (maintien de l'homéostasie et notamment la thermorégulation, la protection face aux agressions extérieures et aux agents exogènes etc...). Elle joue également un rôle dans les fonctions sensorielles via les mécanorécepteurs, thermorécepteurs et nocicepteurs ainsi que dans le métabolisme par le stockage d'énergie sous forme de triglycérides dans le tissu adipeux sous-cutané ou par la synthèse de vitamine D. 4.1 Structure de la peau humaine La peau (fig. A-7) est constituée en surface par l'épiderme qui est séparé du derme par la jonction dermo-épidermique et ensuite le tissu adipeux ou hypoderme qui est le plus profond.

Figure A-7 : structure de la peau humaine Reproduit avec la permission des Editions John Libbey Eurotext [Burkitt H.G. et al., 1993]

4.1.1 Epiderme L'épiderme (fig. A-8) est la couche la plus superficielle de la peau. C'est un épithélium pavimenteux stratifié kératinisé. Son épaisseur moyenne varie de 60 à 100µm et peut atteindre 600 à 700µm. Il est constitué principalement (90-95%) de kératinocytes, d’autres cellules se retrouvent dans les couches profondes : - des mélanocytes responsables de la pigmentation (couche basale); 152 Annexe 4 - La peau

- les cellules de Merkel dont le rôle est de servir de récepteur sensoriel; - les cellules de Langerhans, dérivées des monocytes, dont la fonction consiste à phagocyter et à présenter les antigènes aux lymphocytes T. L’épiderme ne contient ni vaisseau sanguin ni vaisseau lymphatique mais renferme de nombreuses terminaisons nerveuses libres. Sa fonction primaire est de produire la couche cornée qui forme une couche protectrice semi-perméable. Les kératinocytes se différencient en fabriquant de la kératine, protéine fibreuse à structure α-hélicoïdale. Il existe vingt formes distinctes de kératine dans l'épithélium humain, dix autres dans les cheveux et les ongles [Schweizer et al., 2006]. Les kératinocytes apparaissent au niveau de la couche la plus profonde de l'épiderme et migrent à la surface en se différenciant.

Figure A-8 : structure de l'épiderme : B : couche basale, S : stratum spinosum, G : stratum granulosum, L : stratum lucidum, C : stratum corneum. Reproduit avec la permission des Editions John Libbey Eurotext [Burkitt H.G. et al., 1993]

L'épiderme se compose de 4 ou 5 couches: - la couche germinative ou couche basale ou stratum basale (fig. A-8-B) forme la couche la plus profonde et est composée d'une seule couche cellulaire où naissent les kératinocytes. Elle est composée de cellules cubiques ou prismatiques; les cellules basales sont attachées par des hémidesmosomes à une membrane basale acellulaire qui sépare l’épiderme du derme et forme la jonction dermo-épidermique. C'est uniquement au sein de cette couche que ce produisent les mitoses; - la couche de Malpighi, couche épineuse ou stratum spinosum (fig. A-8-S) se compose de 5 à 15 couches de kératinocytes; les couches inférieures sont composées de cellules polygonales qui s’aplatissent dans les couches supérieures liées les unes aux autres par les desmosomes qui assurent une grande cohésion entre les cellules. De nombreux ribosomes sont impliqués dans la fabrication de la kératine;

153 Annexe 4 - La peau

- la couche granuleuse ou stratum granulosum (fig. A-8-G), composée de 1 à 3 couches de kératinocytes possédant un noyau ovale et dense, est composée de cellules granuleuses aplaties qui contiennent des grains de kératohyaline et des kératinosomes ou corps lamellaires d'Odland; - la couche stratum lucidum (fig. A-8-L) est une couche morte homogène qui ne s'observe que dans la peau épaisse; c'est une zone de transition entre le stratum granulosum et le stratum corneum. Elle est constituée de trois ou quatre assises de cellules jointives; - la couche cornée ou stratum corneum (fig. A-8-C), la plus externe de l’épiderme, est composée de 5 à 15 couches de grandes cellules polyédriques plates complètement kératinisées, les cornéocytes, qui ont perdu leurs organelles et qui sont dites mortes. Cette couche peut être subdivisée en deux sous-couches. Le stratum compactum, qui fait suite à la couche granuleuse et qui est formé de cellules kératinisées étroitement soudées par les cornéodesmosomes. Il assure la fonction de "barrière de l'épiderme" et est surmontée par une couche desquamante ou stratum disjonctum en surface et au niveau de laquelle les cellules cornées subissent la desquamation. L'ensemble des couches épidermiques se renouvelle entièrement au bout de 30 à 45 jours, avec tout d'abord un renouvellement des cellules germinatives, puis une migration des cellules à travers l'épaisseur de l'épiderme. Le temps de transit d'un kératinocyte à travers la couche cornée est d'environ 14 jours. a. Prolifération de l'épiderme Le renouvellement de l'épiderme est assuré par les kératinocytes de la couche basale qui se divisent activement et se différencient. Chaque kératinocyte donne naissance à deux cellules identiques : une reste sur la couche basale et se divisera à son tour, l'autre se différenciera vers les couches supérieures. Chez un individu en bonne santé, il y a un équilibre entre prolifération des cellules basales et desquamation de la couche cornée. b. Différenciation de l'épiderme La différenciation s’observe en microscopie par des changements structuraux au sein des couches épidermiques. Les kératinocytes se différencient et migrent de la couche basale vers la surface où ils desquament. Lors du processus de différenciation, les kératinocytes des couches épineuse et granuleuse ayant perdu leur potentiel prolifératif sont encore vivants et fonctionnels. Le passage des kératinocytes de la couche basale à la couche épineuse est caractérisé par un changement de type de kératine, par la production de l’involucrine, marqueur précoce de la différenciation, et par la production de granules lamellaires dans les couches supérieures. La couche granuleuse est caractérisée par la présence des grains de kératohyaline et par l’expression de marqueurs tardifs de différenciation, la loricrine et la filaggrine. Les cellules granuleuses perdent leur noyau et leurs organites intracellulaires. Le contenu des grains de kératohyaline est dispersé dans le cytoplasme, provoquant la maturation de la profilaggrine en filaggrine qui va induire l’agrégation des filaments de kératine pour former la matrice cytoplasmique des cornéocytes. La filaggrine est ensuite protéolysée en acides aminés polaires libres, en acide urocanique et en acide pyrrolidone carboxylique qui constituent les facteurs hydratants naturels de la couche cornée. La différenciation des cellules granuleuses résulte dans la formation d’une zone de transition qui

154 Annexe 4 - La peau sépare les couches épidermiques vivantes de celles dites "mortes" de la couche cornée. C’est dans cette zone que les constituants de la cellule granuleuse sont remodelés, pour aboutir à la formation des cornéocytes de la couche cornée. La membrane cytoplasmique laisse place à une enveloppe rigide, extrêmement résistante et insoluble : l’enveloppe cornée. Elle est produite par l’action des transglutaminases qui catalysent la formation de liaisons isopeptidiques à partir de différents précurseurs protéiques. A la jonction entre la couche granuleuse et la couche cornée, au niveau du pôle apical des kératinocytes de la couche granuleuse, les corps lamellaires fusionnent avec la membrane plasmique et déversent leur contenu lipidique dans les espaces inter-cornéocytaires. Ces lipides, une fois libérés, fusionnent pour constituer d’amples lamelles qui se superposent parallèlement à la surface des cornéocytes pour former un ciment intercornéocytaire compact qui joue le rôle de "barrière" de l’épiderme. 4.1.2 Jonction dermo-épidermique Région acellulaire qui sépare le derme de l'épiderme, la jonction dermo-épidermique est la membrane basale associée à tout épithélium. Elle provient à la fois des kératinocytes de la couche basale et des fibroblastes du derme. On parlera d'une zone de la membrane basale constituée de plusieurs structures. La jonction dermo-épidermique se compose de deux lames : - la lame basale qui se compose de : ▪ la lamina lucida (20-50 nm), en contact direct avec l'épiderme, provient de l’agencement de protéoglycanes et de glycoprotéines. Elles sont synthétisées par les cellules basales et les ancrent à la lamina densa; ▪ la lamina densa (30-70nm) est principalement composée de collagène de type IV, également de laminine, d'entactine/nidogène et de protéoglycanes, (héparan sulfate, chondroitin sulfate). - la lame réticulaire, en continuité avec le derme, consiste en une matrice dense formée notamment de filaments de collagène (I et III) et de substance fondamentale. Elle assure la fonction de support mécanique pour l’adhésion de l’épiderme au derme, détermine la polarité des kératinocytes basaux, joue le rôle de barrière sélective en contrôlant les échanges moléculaires et cellulaires entre le derme et l'épiderme, sert de support pour l’adhésion et la migration des kératinocytes dans la réépidermisation lors de la cicatrisation cutanée. 4.1.3 Derme Le derme (fig. A-9), situé sous la membrane basale de l’épiderme, est un tissu conjonctif constitué principalement d'une matrice extracellulaire et de fibroblastes. Ceux-ci sécrètent du collagène, de l’élastine, de la fibrilline, de la substance fondamentale, des facteurs de croissance et des enzymes dont des collagénases pour dégrader la matrice, la renouveler et la réorganiser. La substance fondamentale contient entre autres des protéoglycanes et de la fibronectine qui permettent les interactions cellule-matrice, les mouvements cellulaires et le contrôle de l'environnement cellulaire en matière d’hydratation et d’équilibre ionique. Le derme apporte à la peau de la résistance, de l'extensibilité, de l'élasticité et une certaine compressibilité (rôle surtout joué par le tissu adipeux sous-cutané). Il supporte l’épiderme par l’intermédiaire de la membrane basale. Il a une épaisseur moyenne de 1 à 2 mm; il est plus épais au niveau de la paume des mains et de la plante des pieds (3 à 4 mm) et plus fin au niveau des paupières (0,6 mm). Le

155 Annexe 4 - La peau derme héberge des vaisseaux lymphatiques ou sanguins, des nerfs et des terminaisons nerveuses spécialisées qui comprennent les récepteurs nerveux sensitifs de Merkel et les corpuscules de Meissner (pour le toucher), les corpuscules de Pacini (pour la pression), et les corpuscules de Ruffini (récepteurs mécaniques). Le derme abrite également les annexes épidermiques incluant les glandes sudoripares eccrines et apocrines, les follicules pilo-sébacés (sauf au niveau de la paume des mains et de la plante des pieds). Le derme contient également des cellules du système immunitaire : les cellules dendritiques dermiques, des macrophages et des mastocytes.

Figure A-9 : structure du derme : R : couche réticulaire, P : couche papillaire Reproduit avec la permission des Editions John Libbey Eurotext [Burkitt H.G. et al., 1993] Le derme se subdivise en deux régions histologiques : - Le derme papillaire se situe immédiatement sous la lame réticulaire de la jonction dermo-épidermique avec laquelle il est en continuité. Ce nom provient de la présence de nombreuses papilles dermiques qui servent à accroître l'adhésion et les échanges avec l'épiderme. Il est plus vascularisé, innervé et se compose d'un plus grand nombre de cellules que le derme réticulaire. Il se compose de fines fibres de collagène qui s'entrecroisent pour former un réseau irrégulier et peu dense. C’est un tissu conjonctif lâche constitué de fines fibrilles de collagène de type I et III, isolées qui s'entrecroisent pour former un réseau irrégulier et peu dense. - Le derme réticulaire est localisé sous le derme papillaire. Il contient des fibres de collagène et d'élastine de diamètre plus important qui s’orientent parallèlement aux lignes de tension afin d’accroître la résistance mécanique de la peau. Le derme réticulaire constitue la plus grande portion du derme. 4.1.4 Hypoderme L'hypoderme est le tissu graisseux sous-cutané, couche la plus profonde de la peau, prolongeant le derme en profondeur. Il est composé de tissus conjonctifs spongieux richement vascularisés parsemés d'adipocytes groupés en amas. Il protège l'organisme des chocs physiques, des variations de température et sert de réserve adipeuse.

156 Annexe 4 - La peau

4.2 Cicatrisation cutanée Une lésion de la peau enclenche différents mécanismes afin de limiter les dommages et ensuite induire la réparation des tissus. Le processus de cicatrisation comprend trois grandes étapes : - une phase vasculaire durant laquelle se crée un caillot de fibrine qui arrête le saignement suivie d'une phase inflammatoire avec un nettoyage de la plaie par les cellules inflammatoires (fig. A-10); - une seconde phase durant laquelle les tissus dermique et épidermique sont réparés pour ensuite subir un remodelage de la matrice extracellulaire (fig. A-11); - une dernière phase de maturation de la cicatrice. Durant l'étape vasculaire, la mise à nu du sous-endothélium provoque l’agrégation plaquettaire par l’intermédiaire du facteur de Willebrand, de la thrombine et du collagène extravasculaire. L'activation plaquettaire libère les granules contenant la thrombospondine, la fibronectine et le platelet factor-4 (PF-4). D'autres protéines (fibrinogène, fibronectine, thrombospondine, vitronectine, thrombine) sont mises en présence par l’extravasation sanguine aboutissant à la formation du caillot de fibrine. Le réseau de fibrine-fibronectine libère un grand nombre de facteurs de croissance comme le "platelet-derivated growth factor" (PDGF), le "fibroblast growth factor" (FGF), le "epidermal growth factor (EGF), le "insulin-like growth factor" (IGF), le "vascular endothelial growth factor" (VEGF), le "keratinocyte growth factor" (KGF) et le "transforming growth factor α et β" (TGFα, β), responsables de la migration et de l’activation des polynucléaires neutrophiles et des macrophages. La courte phase de vasoconstriction permettant l'hémostase et l'agrégation plaquettaire est suivie par une vasodilatation permettant l’afflux des cellules circulantes sur le site de la plaie qui débute la phase inflammatoire. Les neutrophiles et

Figure A-10 : phase inflammatoire de la cicatrisation cutanée Reproduit avec la permission de Singer et al. [1999], Copyright Massachusetts Medical Society 157 Annexe 4 - La peau les monocytes sont attirés dans la plaie par les facteurs plaquettaires, des peptides bactériens, des facteurs du complément et des produits de dégradation de la fibrine. Les polynucléaires neutrophiles, premiers leucocytes présents dans la plaie, libèrent des enzymes protéolytiques (élastase, collagénases, etc…) qui assurent le nettoyage de la plaie. Une fois sur site, les monocytes se différencient en macrophages et jouent un rôle antiinfectieux, de détersion locale et de remodelage matriciel grâce à leurs capacités de phagocytose. Ils amplifient la réponse inflammatoire, stimulent la prolifération des fibroblastes et la production de collagène par la libération de plusieurs cytokines dont "l'insulin growth factor 1" (IGF1), le "transforming growth factor β" (TGFβ), le "tumor necrosis factor α" (TNFα) et le "platelet-derivated growth factor" (PDGF). Les cellules inflammatoires persistent jusqu'au 5ème-7ème jour. La phase de réparation tissulaire (10 à 15 jours) correspond à la prolifération des fibroblastes, à l’angiogenèse et à la synthèse de la matrice extracellulaire (fig. A-11). La migration et la prolifération des fibroblastes dépend des cytokines produites par les plaquettes, les macrophages et également par les fibroblastes eux-mêmes qui synthétisent une nouvelle matrice extracellulaire composée au début principalement de collagène III, puis de collagène I, de fibronectine, de protéoglycanes (acide hyaluronique, chondroïtine sulfate, dermatane sulfate, héparane sulfate). Ils participent au remodelage matriciel en produisant des enzymes protéolytiques dont les métalloproteinases (collagénase ou MMP-1, gelatinase ou MMP-2), favorisant la migration cellulaire dans la matrice. La réépithélialisation (fig. A-11) se déroule en plusieurs phases : la migration des cellules épithéliales, leur multiplication, puis la différenciation de l’épiderme ainsi reformé. Lorsque la plaie est fermée par une monocouche de kératinocytes, ils arrêtent leur migration, se multiplient et se différencient. Ensuite seulement se produit la colonisation de l’épiderme par les cellules de Langerhans et les mélanocytes. Cette phase proliférative peut durer jusqu'à deux mois après fermeture de la plaie.

Figure A-11 : phase de réépithélialisation et de néovascularisation de la cicatrisation cutanée Reproduit avec la permission de Singer et al. [1999], Copyright Massachusetts Medical Society

158 Annexe 4 - La peau

Vient alors la formation de nouveaux vaisseaux sanguins (fig. A-11) qui est initialement attribuée à "l'acidic" ou "basic fibroblast growth factor". D'autres molécules angiogénique arrivent ensuite : le "vascular endothelial growth factor", le "transforming growth factor β", "l'angiogenin", "l'angiotropin" et la "thrombospondin". En plus des facteurs angiogéniques, une matrice extracellulaire et des récepteurs endothéliaux sont nécessaires pour permettre l'angiogenèse. Durant la phase de maturation se déroule le remodelage de la matrice extracellulaire qui va accroître considérablement la résistance de la cicatrice. La fibronectine et l’acide hyaluronique sont progressivement remplacés par les collagènes, les fibres élastiques et les glycoaminoglycanes (dermatane sulfate, chondroïtine 4 sulfate). Les collagénases (métalloprotéinases) et leurs inhibiteurs ("tissue inhibitors of metalloproteinases" ou TIMP), les protéases synthétisées par les fibroblastes, les polynucléaires et les macrophages principalement, interviennent de façon importante dans les phénomènes de remodelage matriciel.

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Annexe 5 - Notions de physique électrique Les informations de ce chapitre sont tirées du 2ème volume de "The Feynman Lectures on Physics" [Feynman et al., 1977] et du Cours de Physique Berkeley, 2ème volume [Purcel, 1998]. 5.1 Courant électrique Un courant électrique est un déplacement au sein d'un matériau conducteur d'un ensemble de porteurs de charges électriques, des électrons ou des ions. Ces déplacements sont imposés par l'action de la force d'interaction électrique entre deux particules chargées. L'intensité du courant électrique (i) est un nombre décrivant le débit de charge électrique (q) à travers une surface donnée (d) et se mesure en ampère (A) : Avec : () - i : intensité du courant électrique, () = () exprimée en ampère (A) - q : charge électrique qui passe à travers une surface donnée - t : temps, exprimé en seconde (s)

5.2 Champs électromagnétiques

Une onde électromagnétique est la combinaison d'un champ magnétique () exprimé en ampère par mètre (A.m-1) et un champ électrique () exprimé en volt par mètre (V.m-1). Lorsque des charges s'accumulent sur des objets, elles ont tendance à se repousser si elles sont de même signe et à s'attirer si elles sont de signe contraire. Cette tendance est caractérisée par la tension électrique (U) et se mesure en volts (V).

Un champ électrique () est présent chaque fois qu'il existe une charge électrique. Il s'agit d'un champ vectoriel défini pour une charge ponctuelle, son origine, sa direction et son sens en chaque point de l'espace. L'intensité du champ électrique est mesurée en volts par mètre (V.m-1). Plus la tension est élevée plus son intensité est forte. Il représente la force par unité de charge. Tout appareil branché sur une prise de courant électrique, même s'il n'est pas en fonctionnement, possède un champ électrique associé, proportionnel à la tension de la source à laquelle il est relié. L'intensité du champ est maximale à proximité de l'appareil et diminue rapidement avec la distance. Certains matériaux comme le métal font écran aux champs électriques.

Pour la composante magnétique, on utilise également le terme induction magnétique (). et

sont liés par la perméabilité magnétique (μ) qui dépend du matériau dans lequel on se trouve : Avec :

=. - : induction magnétique, exprimée en tesla (T) - : perméabilité magnétique, exprimée en henrys par mètre (H.m-1) - : champ magnétique, exprimé en ampère par mètre (A.m-1)

160 Annexe 5 - Notions de physique électrique

La perméabilité magnétique (μ) de la plupart des tissus biologiques est pratiquement égale à la perméabilité du vide (4 . 10 . ). Les principales caractéristiques d'une onde électromagnétique sont sa fréquence (f) exprimée en hertz (Hz), sa période (T) (T=1/f) exprimée en seconde (s) et sa longueur l'onde exprimée en mètre (m). Selon le théorème d'Ampère tout courant parcourant un circuit, soit un déplacement de charges électriques, crée un champ magnétique () à travers la section qu'il entoure. Plus l'intensité du courant est élevée plus le champ est grand. Ces champs sont mesurés en ampères par mètre (A.m-1) et ils sont généralement caractérisés par l'induction magnétique () correspondante qui s'exprime en teslas (T) ou en gauss (G) (10000 G = 1T). Jusqu'à un certain niveau de fréquence, les champs magnétiques ne sont pas arrêtés par la plupart des matériaux et en particulier par les tissus vivants. Par abus de langage, l'induction magnétique est communément appelée "champ magnétique". L'inductance (L) exprimée en Henry (H) est la propriété d'un fil conducteur dans lequel une variation de courant circulant induit une tension qui s'oppose à la variation de courant. L'inductance est le quotient du flux du champ magnétique capté par le circuit par l’intensité du courant traversant le circuit. En 1864, Maxwell décrit ces phénomènes ainsi que la formulation mathématique. Elle se compose de quatre équations basées sur la loi de Gauss, la loi de Gauss sur le magnétisme, la loi d'induction de Faraday et la loi d'Ampère. La loi de Gauss décrit la relation entre un champ électrique statique et les charges électriques qui la provoquent. Cette loi lie le flux du champ électrique à travers une surface fermée à la quantité de charge présente à l’intérieure de cette surface. L'équation de Maxwell-Thomson énonce qu'il n'existe aucune "charge magnétique" analogue à une charge électrique. L'équation de Maxwell-Faraday dérivée de la loi d'induction de Faraday décrit comment un champ magnétique variable peut induire un champ électrique. Ce champ électrique induit possède des lignes de champs fermées comme le champ magnétique. La loi d'Ampère-Maxwell indique que les champs magnétiques peuvent être générés par un courant électrique (loi d'Ampère) ou par la variation des champs électriques. Ces deux dernières lois montrent qu'un champ magnétique variable induit un champ électrique et qu'un champ électrique variable induit un champ magnétique. C’est ce qui permet d’expliquer l’existence d’ondes électromagnétiques. Les équations de Maxwell sont fondamentales pour la description des phénomènes électromagnétiques. Sous certaines conditions, il est possible de simplifier ces équations complexes lorsque certains termes deviennent négligeables. Il existe trois domaines : le domaine statique, le quasi stationnaire et le régime à haute fréquence. Le domaine quasi statique peut être considéré lorsque la distance parcourue par l’onde en une période est beaucoup plus grande que

les dimensions caractéristiques du problème.

161 Annexe 5 - Notions de physique électrique

Avec : =. - : période spatiale, exprimée en mètre (m) - : période temporelle, exprimée en seconde (s) 8 -1 ∆ = - c : vitesse de la lumière (≈3.10 m.s ) - l : distance émetteur-récepteur, exprimée en mètre (m)

Et si ≪ ou ∆ ≪ l'approximation des régimes quasi-statiques est valide et la loi de Maxwell peut être simplifiée. La simplification de l'équation de Maxwell peut également se faire par l'étude des trois temps caractéristiques d'un phénomène électromagnétique présent dans l'analyse dimensionnelle de l'équation. Temps de diffusion de la charge électrique :

=

Temps de diffusion de la densité de courant : Avec : - : permittivité du matériau,

exprimée en farad par mètre (F.m-1)

- : perméabilité du matériau, -1 exprimée en henrys par mètre (H.m ) = - : conductivité du matériau, exprimée en siemens par mètre (S.m-1) - : vitesse de l'onde électromagnétique dans le matériau << vitesse de la lumière dans le vide - : distance fixée par la géométrie du modèle exprimée en mètre (m)

Temps de propagation de l'onde électromagnétique : = =

Dans le domaine correspondant à cette situation, à savoir un spectre de fréquence ne dépassant pas le kHz et une dimension caractéristique réduite du problème, on peut considérer que la vitesse de propagation est instantanée. Ceci correspond à l’approximation quasi-statique. Parmi les différentes situations quasi-statiques, il existe différentes situations qui peuvent permettre de faire des simplifications. La comparaison des constantes de temps du problème, entre elles, et par rapport à la période de la fréquence appliquée permet de déterminer que nous nous trouvons en régime de conduction quasi-stationnaire.

162 Annexe 5 - Notions de physique électrique

1 1 1 Avec : < < < - =2 Dans cette situation, le champ électrique et le champ magnétique peuvent être considérés séparément car ils sont découplés. L'importance que prend le terme correspondant aux courants de déplacement dans l'équation de Maxwell-Ampère devient négligeable. Le modèle utilisé présente donc un champ magnétique induit négligeable.

5.3 Conductivité et Permittivité La conductivité électrique (σ) est l'aptitude d'un matériau ou d'une solution à laisser les charges électriques se déplacer librement, donc à permettre le passage d'un courant électrique. La conductance (G) est une représentation de cette capacité à laisser passer le courant; elle s'exprime en siemens (S). Elle est l'inverse de la résistance (R) :

1 =

et par la loi d'Ohm = . , on peut déduire que la conductance se définit également comme le rapport entre l'intensité du courant électrique (I) et la tension électrique (U) :

=

La conductivité électrique () est l'inverse de la résistivité (). Elle correspond à la conductance (G) d'une portion de matériau de 1m de longueur et de 1m2 de section; elle se mesure en siemens par mètre (S.m-1) et se définit également comme le rapport de la densité de courant ()̅ par l'intensité du champ électrique (E) (loi d'Ohm locale) : Avec : -1 ̅ = - σ : siemens par mètre (S.m ) - ̅ : ampère par mètre carré (A.m-2) - : volt par mètre (V.m-1)

Ce qui peut également se décrire comme un courant (I) constant qui parcourt un cylindre conducteur de section (a) et de longueur (l) soumis à une différence de potentiel (U) appliquée à ces deux bases : Avec : -1 . - σ : siemens par mètre (S.m ) = - I : ampère (A) . - l : mètre (m) - U : volt (V) - a : mètre carré (m2)

163 Annexe 5 - Notions de physique électrique et par la loi d'Ohm = . : = .

La résistivité (ρ) est l'inverse de la conductivité; elle s'exprime en ohm mètre (Ωm) :

Avec : . - ρ : ohm mètre (Ωm) = - R : ohm (Ω) - a : mètre carré (m2) - l : mètre (m)

La permittivité, plus précisément permittivité diélectrique (ε), est une propriété physique qui décrit la réponse d'un milieu donné à un champ électrique qui lui est appliqué : Avec : - : champ d'induction électrique, exprimé en tesla (T) = - : champ électrique, exprimé en volt par mètre (V.m-1) - : permittivité diélectrique, exprimée en farad par mètre (F.m-1)

La permittivité diélectrique est une mesure de la capacité d'un matériau à être polarisé en présence d'un champ électrique. Le rapport entre la permittivité diélectrique d'un matériau (ε) à -12 -1 celle du vide (εo = 8,85.10 F.m ) est défini comme la constante diélectrique (εr) :

Faes et al. [1999] réalisent une revue de la littérature sur la résistivité des tissus biologiques et montrent que pour un même type tissulaire les résultats sont très variables. On peut néanmoins noter qu'à 100Hz la majorité des tissus se trouvent entre 10-1 et 10 Ω.m alors que les tissus repris dans la catégorie "Os" (106 Ω.m), "Os cortical" (102 Ω.m) et "tissus adipeux (10-102 Ω.m)" ont une résistivité plus élevée. La peau fait également exception dans deux études sur trois en indiquant une résistivité de 103-104 Ω.m pour la peau et 104-105 Ω.m pour le stratum corneum. On voit donc que la résistivité des 2 principaux modèles tissulaires utilisés dans les études réalisées par notre laboratoire est plus élevée que celle des autres tissus. Les études ne tiennent en général pas compte de la direction alors que ce paramètre est une variable importante. Gabriel [2009] rapporte des valeurs équivalentes avec une conductivité à 100Hz pour la peau de 10-4 S.m-1.

164 Annexe 5 - Notions de physique électrique

5.4 Spectre des fréquences La classification du spectre des fréquences est définie par l'International Telecommunication Union (tab. A-6) [ITU, 2000]. Alors que les champs de très basse fréquence concernent principalement le transport de l'électricité, les fréquences supérieures concernent les écrans d'ordinateur (50kHz), les ondes radios (100MHz) et des phénomènes de société de ces dernières années: le GSM (850-900-1800-1900Mhz) et le WiFi (2,4 et 5GHz). Tableau A-6 : classification du spectre des fréquences comme définie par l'Union Internationale des Télécommunications dans la recommandation UIT-R V.431-7

Longueur Bandes Fréquences Usages d’onde 3Hz 1 000 km Ondes électromagnétiques naturelles, résonance terrestre de Ondes ELF à à Schumann, ondes physiologiques humaines, ondes des lignes (Extremely Low Frequency) 300Hz ∞ électriques, usages inductifs industriels, ondes électriques 300Hz 100 km Ondes électromagnétiques naturelles notamment des orages Ondes ULF à à solaires, ondes physiologiques humaines, ondes électriques (Ultra Low Frequency) 3kHz 1 000 km des réseaux téléphoniques 3kHz 10 km Ondes électromagnétiques naturelles, radiocommunications Ondes VLF à à submaritimes militaires, transmissions par CPL, systèmes de (Very Low Frequency) 30kHz 100 km radionavigation, émetteurs de signaux horaires Ondes électromagnétiques naturelles des orages terrestres, Ondes LF 30kHz 1 km radiocommunications maritimes et submaritimes, (Low Frequency) à à transmissions par CPL, radiodiffusion en OL, émetteurs de ou ondes kilométriques 300kHz 10 km signaux horaires, systèmes de radionavigation Ondes MF 300kHz 100 m Radiodiffusion en OM, radiocommunications maritimes et (Medium Frequency) à à aéronautiques, radioamateurs, signaux horaires et ADSL ou ondes hectométriques 3MHz 1 km Radiodiffusion internationale, radioamateurs, Ondes HF 3MHz 10 m radiocommunications maritimes, aéronautiques, militaires et (High Frequency) à à d’ambassades, aide humanitaire, transmissions ou ondes décamétriques 30MHz 100 m gouvernementales, applications inductives autorisées, transmissions par CPL, signaux horaires, CB en 27MHz, radar Radiodiffusion et télédiffusion, radiocommunications Ondes VHF 30MHz 1 m professionnelles, transmissions militaires, liaisons des secours (Very High Frequency) à à publics, radionavigation et radiocommunications ou ondes métriques 300MHz 10 m aéronautiques, radioamateurs, satellites météo, radioastronomie, recherches spatiales Télédiffusion, radiodiffusion numérique, radioamateurs, radiocommunications professionnelles, transmissions Ondes UHF 300MHz 10 cm militaires, liaisons gouvernementales, liaisons satellites, FH (Ultra High Frequency) à à terrestres, radiolocalisation et radionavigation, usages ou ondes décimétriques 3GHz 1 m spatiaux, satellites météo, téléphonie GSM, UMTS et DECT, Wi-Fi et Bluetooth, systèmes radar, fours à micro-ondes FH terrestres et par satellite, systèmes radar, liaisons et FH Ondes SHF 3GHz 1 cm militaires divers, systèmes BLR, radioastronomie et usages (Super High Frequency) à à spatiaux, radiodiffusion et télédiffusion par satellite, ou ondes centimétriques 30GHz 10 cm liaisons Wi-Fi FH terrestres et par satellite, recherches Ondes EHF 30GHz 1 mm spatiales, radioastronomie, satellites divers, liaisons et FH (Extremely High Frequency) à à militaires, radioamateurs, systèmes radar, raies spectrales ou ondes millimétriques 300GHz 1 cm moléculaires, expérimentations et recherches scientifiques

165

Annexe 6 - Normes d'exposition aux ELF Les champs électrique et magnétique terrestres, extrêmement faibles, sont respectivement de l'ordre de 10-4V.m-1 et 10-5µT. L'exposition humaine la plus importante aux champs ELF est associée principalement à la production, au transport et à l'utilisation de l'énergie électrique. Les champs électriques et magnétique en-dessous des lignes électriques aériennes peuvent atteindre respectivement 12kV.m-1 et 30µT. A proximité des centrales et des sous-stations, les champs électriques peuvent atteindre 16kV.m-1 et les champs magnétiques 270µT. Les travailleurs chargés de l'entretien des lignes de transport et de distribution de courant peuvent donc être exposés à des champs très importants. Les champs électriques au voisinage de la plupart des appareils domestiques ne dépassent pas 500V.m-1 et le champ magnétique est généralement inférieur à 150µT. Dans les deux cas, le champ peut être nettement plus élevé à proximité immédiate de l'appareil, mais il diminue rapidement avec la distance [OMS, 2007b; Classic K, 2014]. L'International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection (ICNIRP), commission reconnue par l'OMS, a pour objectif d'établir des recommandations limitant l'exposition visant à protéger les personnes des effets des EF et MF 50Hz sur la santé. Un facteur de réduction est appliqué au niveau des recommandations et permet de prendre en compte l'hétérogénéité du grand public. Les restrictions de base des EF internes considérées comme acceptables dans le cerveau et la rétine sont 10-1V.m-1 pour l'exposition professionnelle et 2.10-2V.m-1 pour l'exposition du grand public. Les valeurs des champs électriques induits sont traduites en grandeurs électriques directement mesurables. Les niveaux de référence sont obtenus par modélisation mathématique à partir des restrictions de base et utilisent un facteur de réduction additionnel de 3 de manière à tenir compte des incertitudes dosimétriques. Les niveaux de référence de l'exposition aux EF et MF 50Hz sont [ICNIRP, 2010] : - pour l'exposition professionnelle: 10kV.m-1 - 800A.m-1 - 1000µT; - pour la population générale: 5kV.m-1 - 160A.m-1 - 200µT.

L'Union Européenne a également émis des recommandations et des directives. Pour l'exposition du grand public, le Conseil de l'Union Européenne [1999] a adopté la recommandation 1999/519/CE relative à la limitation de l'exposition du public aux EMF. Pour l'exposition professionnelle, le Conseil de l'Union Européenne et le Parlement Européen ont arrêté la directive 2013/35/EU [2013] définissant les prescriptions minimales de sécurité et de santé relatives à l'exposition des travailleurs aux risques dus aux agents physiques (EMF). Les valeurs limites d'exposition de cette recommandation sont basées sur les directives de l'ICNIRP [2010]. La terminologie sur les "valeurs déclenchant l’action" (VA) utilisée dans la directive reprend la terminologie "VA basses" et "VA hautes". Pour les EF, ce sont les niveaux en lien avec les mesures de protection ou de prévention spécifiques établies dans la directive; et pour les MF, les "VA basses" sont les niveaux en lien avec les "valeurs limites d’exposition" (VLE) relatives aux effets sensoriels et les "VA hautes" sont les niveaux en lien avec les VLE relatives aux effets sur la santé.

166 Annexe 6 - Normes d'exposition aux ELF

Les niveaux de référence de l'exposition aux EF et MF 50Hz sont : - valeurs pour l'exposition professionnelle 50Hz : ▪ Champ électrique : VA basse de 10kV.m-1 rms et VA haute de 20kV.m-1 rms. ▪ Induction magnétique : VA basse de 1000µT rms, VA haute de 6000µT rms et de 18mT rms pour une exposition des membres à un MF localisé. - valeurs pour la population générale 50Hz : ▪ Champ électrique : 5kV.m-1 rms. ▪ Induction magnétique : 100µT rms.

Les directives européennes doivent être transposées dans la législation des Etats membres. En Belgique, pour le grand public, la valeur du champ électrique généré par une installation de transport de l'électricité doit rester inférieure aux valeurs suivantes mesurées à 1,5m du sol ou des habitations : - dans les zones habitées ou destinées à l'habitat sur les plans de secteur: 5kV.m-1; - lors des surplombs de routes: 7kV.m-1; - dans les autres lieux: 10kV.m-1.

Il n'existe pas à ce jour une législation belge particulière au sujet de l'exposition à des champs d'induction magnétique. Au niveau de l'exposition professionnelle, la directive européenne 2013/35/UE devra être transposée par la Belgique avant le 1er juillet 2016.

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Thèse annexe : Comment valider l’effet ostéo-inducteur de la poudre d’os déminéralisée ? Ces dernières années, le recours aux allogreffes osseuses s’est imposé lors de reprises de prothèses, de reconstructions de pertes de substances d’origine traumatique dégénérative, infectieuse ou après résections tumorales. En plus des différentes greffes congelées ou cryopréservées, les banques de tissus ont développé des greffes lyophilisées avec entre autres les blocs et copeaux d'os spongieux, les baguettes d'os cortical et la poudre d'os cortical déminéralisée (DBM, Demineralized Bone Matrix). La DBM est proposée dans la réparation du tissu osseux depuis la fin du 19ème siècle [Gruskin et al., 2012]. Elle représente un réservoir naturel en mesure de délivrer diverses protéines et facteurs de croissance sur un site de fracture. Elle contient entre autres des Bone SialoProtein (BSP), de l'Osteopontin (OPN), de l'Insulin-like Growth Factor (IGF-I), de la Transforming Growth Factor-β (TGF-β), de l'acidic Fibroblast Growth Factor (FGF-α), du Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), du Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) ainsi que des Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) [Holt et al., 2012] qui sont connues pour être essentielles à la croissance et à la régénération osseuse. Ces facteurs de croissance modulent la différenciation des cellules responsables de la formation osseuse et cartilagineuse. L'ostéo-induction est le processus par lequel l'élaboration de la matrice osseuse (ostéogenèse) est induite par la différenciation de cellules non différenciées en ostéoblastes. Différents paramètres peuvent influencer l'effet ostéo-inducteur de la DBM : l'effet de l'âge du donneur est controversé, le traitement physique et chimique habituellement utilisé lors de l'étape de sécurisation et de lyophilisation des greffes osseuses ne semble pas avoir d'influence. La déminéralisation osseuse favorise l'exposition des BMPs [Urist, 1965] mais sa durée et la concentration du HCl semblent une étape critique. La taille des grains semble être optimale entre 420 et 840μm. La qualité de la lyophilisation et le choix de la stérilisation finale sont fondamentaux pour conserver l'effet ostéo-inducteur de la DBM. L'effet ostéo-inducteur pouvant varier d'un lot à l'autre, nous proposons de valider l'activité de la poudre d'os déminéralisée en trois étapes par : - le dosage de l'ensemble des protéines présentes dans la poudre d'os. Bien que les BMP-2, -4 et -7 soient les plus fréquemment citées et choisies comme protéines recombinantes dans les préparations à but ostéo-inducteur, nous nous attendons à retrouver une série d'autres protéines naturellement présentes dans la matrice osseuse. La première étape de cette recherche sera l'extraction des protéines de la matrice osseuse qu'il faudra isoler du collagène présent en très grande quantité. Ensuite, une séparation des peptides par chromatographie liquide suivie d'une analyse par spectrographie de masse qui permettra de dresser la liste des protéines présentes. - une recherche in vitro de l'effet des grains de DBM sur des cellules souches mésenchymateuses. Les cellules sont prélevées lors d'une arthroplastie de hanche et mise en culture dans un gel 3D incluant des grains de DBM (choix déjà validé). Des techniques comme le dosage de l'activité de la phosphatase alcaline, l'utilisation de colorations histologiques spécifiques ou la recherche des marqueurs moléculaires spécifiques des stades de la différenciation cellulaire permettront d'analyser l'effet de la DBM sur la différenciation cellulaire. - une analyse de l'effet de la DBM lors d'une utilisation clinique en Stomatologie. Lors de la pose d'un implant, suite à l'enlèvement de la dent et avant mise en place de l'implant, de l'os néoformé doit combler l'espace laissé par la racine dentaire. Pour permettre la formation de la matrice osseuse dans cette cavité, un matériau ostéo-conducteur comme la DBM doit y être déposé. Nous proposons d'étudier la variabilité de l'ostéogenèse : entre différents lots de DBM provenant de donneurs différents; avec ou sans ajout de facteurs de croissance comme le culot plaquettaire; en comparant l'effet de la DBM avec un autre matériau ostéo-conducteur non ostéo-inducteur comme le carbonate de calcium. L'analyse histomorphométrique d'une carotte d'os néoformé nécessairement retirée lors de la mise en place de l'implant permettra de mesurer et comparer la qualité osseuse entre les différents échantillons. Les résultats de ces trois études devraient permettre de valider l'effet ostéo-inducteur de la poudre d'os déminéralisée.

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Curriculum Vitae Au 01 janvier 2016

Nom : COLLARD Prénom : Jean-François Nationalité : Belge Etat Civil : Célibataire Lieu de naissance : Dinant, Belgique DDN : 25 février 1976

Téléphone: + 32 (2) 555.37.23 E-Mail : [email protected] 1. TITRES ET CERTIFICATS COMPLEMENTAIRES • Gradué en biologie médicale - Institut Couvreur Bruxelles - 2000 • Licencié en Sciences Biomédicales, Ingénierie Faculté de Médecine - Université Libre de Bruxelles (ULB) - 2003 • Diplôme d’Etudes Approfondies (DEA) en Sciences Biomédicales Faculté de Médecine - Université Libre de Bruxelles (ULB) - 2004 • Certificat complémentaire en Science des Animaux de Laboratoire Faculté de Médecine - Université Libre de Bruxelles (ULB) - 2004 • Certificate of Training Partek Genomics Suite - 2012 • Certificate of Training Pathway Studio 9, Desktop Edition - 2012 • Certificate of Training Affymetrix University Expression Data Analysis - 2012 2. FONCTIONS 2.1 Actuelles - Directeur Technique - Banque de Tissus de l'Hôpital Erasme (BTE) Depuis 01/2014 - Assistant de Recherche - Université Libre de Bruxelles (ULB) Depuis 11/2003 Laboratoire de Recherche en Orthopédie Traumatologie (LROT) - Sujet de recherche : - Effets des champs électromagnétiques sur les cellules - Les substituts osseux de la Banque de Tissus Erasme - La mesure des contraintes mécaniques de l’os - La maladie de Kashin-Beck • European Cooperation in Science and Technology (COST) – Action BM1309 Depuis 11/2013 European network for innovative uses of EMFs in biomedical applications (EMF-MED) - Fonction : - Délégué national au sein du Management Committee - Membre du Working Group 2 (Non-cancer EMF interactions and applications) 2.2 Antérieures • Recherche, assistance technique et secrétariat - Banque de Tissus de l'Hôpital Erasme (BTE) 09/2011-01/2014 • European Cooperation in Science and Technology (COST) – Action BM0704 Emerging EMF Technologies and Health Risk Management. 05/2008-04/2012 - Fonction : - Délégué national substitut au sein du Management Committee - Membre du Working Group 4 (Biology) 3. PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS • Articles dans des revues scientifiques internationales avec comité de lecture (IF: 2014) 1. Balestra C., Germonpré P., Poortmans J., Schietecatte J., Collard J-F., Ben Salem F., Snoeck T., Vann R.D. Marroni A. Evidence for a non-hypoxic stimulus on EPO production in healthy humans. European Journal of Underwater and Hyperbaric Medicine. 3(3), 32, 2002. 2. Hinsenkamp M., Mathieu F., Claus W., J.-F. Collard, de Maertelaere V. Effects of physical environment on the evolution of Kashin-Beck disease in Tibet. International Orthopaedics, 33 (5): 1085-1088, 2009. IF : 2.110 3. Collard J.-F., Mertens B., Hinsenkamp M. In vitro study of the effects of ELF electric fields on gene expression in human epidermal cells. Bioelectromagnetics. 32(1):28-36. 2011. IF : 1.705

230 Curriculum Vitae 4. Hinsenkamp M., Collard J.-F. Bone Morphogenic Protein--mRNA upregulation after exposure to low frequency electric field. International Orthopaedics. 35(10):1577-81. 2011. IF : 2.110 5. Collard J.-F., Lazar C., Nowé A., Hinsenkamp M. Statistical validation of the acceleration of the differentiation at the expense of the proliferation in human epidermal cells exposed to extremely low frequency electric fields Progress in Biophysics and Molecular Biology, 111(1):37-45. 2013 IF : 2.274 6. Collard J.-F., Hinsenkamp M. Cellular processes involved in human epidermal cells exposed to extremely low frequency electric fields. Cell Signal. 27(5):889-98, 2015. IF : 4.315 7. Hinsenkamp M., Collard J.-F. Growth factors in orthopaedic surgery: demineralized bone matrix versus recombinant bone morphogenetic proteins. Int Orthop. 39(1):137-47, 2015. IF : 2.110 • Articles dans des revues scientifiques nationales avec comité de lecture : 2 • Communications écrites lors de congrès ou colloques nationaux et internationaux : 7 • Communications orales lors de congrès ou colloques internationaux : 14 • Communications orales lors de congrès ou colloques nationaux : 30 • Evaluation et correction d'articles pour des revues scientifiques internationales Invité par le Journal : Bioelectromagnetics, Biological Trace Element Research, Medical Research Archives, PLOS ONE, Research in Biomedical Engineering (RBE), Scandinavian Journal of Rheumatology. Avis demandé par un reviewer : International Journal of Molecular Sciences, International Orthopaedics, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Modern Rheumatology, Nature Review Rheumatology, Osteoarthritis and Cartilage. 4. APPARTENANCE A DES SOCIETES SAVANTES • Belgian BioElectroMagnetics Group (BBEMG) http://www.bbemg.ulg.ac.be/ • European BioElectromagnetics Association (EBEA) http://www.ebea.org/ • The BioElectroMagnetics Society (BEMS) https://www.bems.org/ • Association Belge de Banques de Tissus et Cellules (ABBT) http://www.bvwb-abbt.be/ • European Cooperation in Science and Technology (COST) - Action BM0704. Emerging EMF Technologies and Health Risk Management http://www.cost.eu/domains_actions/bmbs/Actions/BM0704 • European Cooperation in Science and Technology (COST) – Action BM1309 European network for innovative uses of EMFs in biomedical applications (EMF-MED) http://www.cost.eu/domains_actions/bmbs/Actions/BM1309 • Kashin-Beck Disease Fund ASBL http://www.kbdfund.be/ 5. ENSEIGNEMENT • Accompagnement de 10 travaux et projets de 2ème et 3ème cycles :

- Modélisation 3D d'une diaphyse de tibia et analyse par éléments finis du modèle. - Contribution à l'étude des contraintes mécaniques dans l'os générées par différents exercices. - Mise au point d'un système d'instrumentation en vue de l'étude des sollicitations mécaniques d'une diaphyse tibiale. - Caractérisation du signal électrique au travers d'un derme. - Treatment of tibia fracture treated by external fixation. - Redesign d’un système d’instrumentation en vue de l’étude des sollicitations mécaniques de la diaphyse tibiale pour la prévention de l’ostéoporose de décharge chez les astronautes. - Fabrication et validation d'un système d'instrumentation en vue de l'étude des sollicitations mécaniques de la diaphyse tibiale pour la prévention de l'ostéoporose de décharge chez les astronautes. - Comparaison de l’effet de différents types de mobilisations sur la sollicitation osseuse; Intérêt dans l’ostéoporose de décharge. - Mesure expérimentale d’impédance de peau. - Simulation du comportement électrique de la peau humaine.

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