INSTITUTO EVANDRO CHAGAS
IVY TSUYA ESSASHIKA PRAZERES
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO VÍRUS JURUAÇÁ ISOLADO DE MORCEGO NO ESTADO DO PARÁ
ANANINDEUA
2016
IVY TSUYA ESSASHIKA PRAZERES
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO VÍRUS JURUAÇÁ ISOLADO DE MORCEGO NO ESTADO DO PARÁ
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Virologia.
Orientadora: Dra. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros
ANANINDEUA
2016
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto Evandro Chagas
Prazeres, Ivy Tsuya Essashika. Caracterização genotípica do vírus juruaçá isolado de morcego no Estado do Pará. / Ivy Tsuya Essashika. – Ananindeua, 2016. 76 f.: il.; 30 cm
Orientador: Dra. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros Dissertação (Mestrado em Virologia) – Instituto Evandro Chagas, Programa de Pós-Graduação em Virologia, 2016.
1. Vírus Juruaçá. 2. Caracterização genética. 3. Sequenciamento next generation. 4. RNAss. 5. Tombusviridae I. Medeiros, Daniele Barbosa de Almeida, orient. II. Instituto Evandro Chagas. IV. Título.
CDD: 579.2562
IVY TSUYA ESSASHIKA PRAZERES
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO VÍRUS JURUAÇÁ ISOLADO DE MORCEGO NO ESTADO DO PARÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas, para obtenção do título de mestre em Virologia
Orientador (a): Dr.a Daniele Barbosa de Almeida Medeiros
Aprovado em: 27/04/2016
BANCA EXAMINADORA
Dr.a Adriana Ribeiro Carneiro Centro de Genômica e Biologia de Sistemas, Universidade Federal do Pará
Dr.a Ana Cecília Ribeiro Cruz Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas
Dr. João Lídio da Silva Gonçalves Vianez Júnior Centro de Inovações Tecnológicas, Instituto Evandro Chagas
Ao meu avô, Osamu Esashika. À minha avó, Julieta Prazeres. Que sempre seguirão comigo.
AGRADECIMENTOS
À Deus, que sempre esteve presente em minha vida, guiando meus passos e me mostrando o caminho, sempre me dando muita saúde para seguir em frente.
Aos meus amados pais, Elizabete e Aroldo, por terem me ensinado o significado de uma família, e sempre me apoiarem em todas minhas decisões. Não há nada mais importante na vida do que a nossa base, é ela que nos apoia em momentos difíceis e é ela que nos levanta nas conquistas.
Aos meus irmãos, Catarina, Italo, Ianie e Iasmin, pelo companheirismo e amor sempre presentes, obrigada apenas por vocês serem quem vocês são, minha vida não seria a mesma se não fossem essas quatro pessoinhas que sempre estiveram do meu lado.
Ao meu namorado, Breno, por estar sempre comigo, dando apoio e solidariedade em todos os momentos da minha vida.
Ao Programa de Pós Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas por me habilitar para que esse projeto de mestrado fosse concluído.
Ao Instituto Evandro Chagas, em especial a Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, por permitirem que esse projeto fosse executado em suas dependências com todas as suas técnicas e materiais necessários.
À minha querida mentora, educadora, orientadora, Dra. Daniele Barbosa, por todos os ensinamentos, todas as conversas, todas as explicações que foram dedicadas a mim durante a execução desse projeto, obrigada por me trazer de volta para a área da pesquisa, terei sempre em você um exemplo e um modelo de ser humano íntegro e que luta atrás dos seus sonhos.
Ao Laboratório de Clonagem e Expressão de Proteínas, onde parte da pesquisa foi conduzida e executada, em especial à doutoranda Maria Helena e mestre Adriana pela amizade e pelos ensinamentos das técnicas essenciais para o projeto.
Ao Laboratório de Biologia Molecular, Laboratório de Sorologia I e Laboratório de Cultura de Células pela disponibilidade do espaço, das técnicas e dos materiais utilizados durante a pesquisa, e obrigada também pela amizade e atenção de todos seus integrantes que sempre estavam dispostos a transmitir a informação e contribuir para o correto desenvolvimento deste projeto.
Ao Centro de Inovações Tecnológicas pelo auxílio e desenvolvimentos das técnicas de bioinformática.
A todos os funcionários, servidores e estagiários da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas que direta ou indiretamente estiveram envolvidos com o estudo, o meu muito obrigada à toda essa família do arbovírus que desde meus tempos de faculdade abrem os braços para me ajudar a percorrer esse caminho.
“ A persistência é o menor caminho do êxito”.
(Charles Chaplin)
RESUMO
Introdução: O vírus Juruaçá (VJUR) foi isolado em camundongos albinos suíços recém-nascidos a partir de fragmentos de vísceras de um morcego capturado na região de Porto de Trombetas, município de Oriximiná, Estado do Pará. Com base nas propriedades antigênicas, o VJUR é considerado como vírus não agrupado. Estudos iniciais mostraram que o VJUR apresenta morfologia semelhante aos integrantes da família Picornaviridae, no entanto são necessários estudos adicionais para confirmar tal classificação taxonômica. Ademais, o VJUR causa infecção persistente em cultivos primários de astrócitos e microglias e as alterações anatomopatológicas e reações imunohistoquímicas indicam como principal alvo da infecção o sistema nervoso central de camundongos albinos suíços, caracterizando uma patogenia imune inflamatória. Portanto, torna-se importante o desenvolvimento de um estudo de caracterização genética que proporcionará o melhor entendimento a respeito da organização genômica do vírus e sua posterior definição taxonômica. Objetivo: O objetivo do estudo é caracterizar geneticamente o VJUR. Material e Métodos: Para tentar o isolamento em cultivos celulares, foi utilizada linhagem derivadas de vertebrados: Vero E6. Foi realizado o sequenciamento completo do genoma do VJUR pela plataforma Ion Torrent. Posteriormente, foi feita a montagem do genoma utilizando os programas Newbler e Mira, definição das cadeias de leitura abertas (CALs) pelo programa ORFfinder, a análise de identidade pelo Blast, e análises de domínios protéicos utilizando o banco de dados INTERPRO, para a descrição da organização e características do genoma. As análises filogenéticas foram realizadas utilizando os métodos de Agrupamento de Vizinhos. Resultados: O vírus foi isolado com sucesso no cultivo celular de Vero E6, com resultado confirmado pela técnica de imunofluorescência direta. Seu genoma foi sequenciado, obtendo-se um total de 5.020 nt, no qual, preliminarmente, são reconhecidas três cadeias abertas de leituras. Apenas uma CAL foi reconhecida no Blastx apresentando 33% de identidade com o vírus Pelargonium line pattern, membro da família Tombusviridae, comumente associado a vírus que infectam plantas. A análise filogenética demonstrou uma relação do VJUR com os membros da família Tombusviridae (bootstrap 100%), porém em um ramo distinto. Conclusão: O VJUR pertence à uma nova família dentro dos vírus de RNAss. Palavras-Chave: Vírus Juruaçá; caracterização genética; sequenciamento next generation; RNAss, Tombusviridae.
ABSTRAT
Introduction: Vírus Juruaçá (VJUR) was isolated in newborn Swiss albino mice from viscera fragments of a bat captured in the region of Porto de Trombetas, municipality of Oriximiná, State of Pará. Based on the antigenic properties, VJUR it is considered as non-clustered virus. Initial studies showed that VJUR has similar morphology to the Picornaviridae family members, however additional studies are needed to confirm this taxonomic classification. Furthermore, VJUR cause persistent infection in primary cultures of astrocytes and microglia and pathological and immunohistochemical reactions show how the main target of central nervous system infection in Swiss albino mice characterized by an inflammatory autoimmune disease. Therefore, it becomes important to develop a study of genetic characterization will provide a better understanding about the genomic organization of the virus and its subsequent setting Taxonomy. Objective: The objective of the study is to characterize genetically the VJUR. Methods: To try isolation in cell culture, lines derived from vertebrates were used: Vero E6. Was performed the complete sequencing of the genome VJUR by Ion Torrent platforms. Subsequently, the genome assembly was made using the Newbler and Mira programs, definition of open reading frames (ORF) by ORFfinder program analysis identity by Blast, and analysis of protein domains using the InterPro database, to the description the organization and characteristics of the genome. Phylogenetic analyzes were performed using the Neighbor joing methods. Results: The virus was successfully isolated in cell culture Vero E6, with results confirmed by the technique of direct immunofluorescence. Its genome was sequenced, obtaining a genome of 5020 nt, in which, initially, are recognized three ORF’s. Only one ORF was recognized in Blastx presenting 33% identity with the Pelargonium line pattern virus, Tombusviridae family member, commonly associated with viruses that infect plants. Phylogenetic analysis showed a VJUR relationship with the members of the family Tombusviridae (bootstrap 100%), but in a different branch. Conclusion: VJUR belongs to a new family within the virus RNAss. Keywords: Juruaçá virus; genetic characterization; next generation sequencing; RNAss, Tombusviridae.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...... 12
2 OBJETIVOS...... 13
2.1 OBJETIVO GERAL...... 13
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...... 13
3 JUSTIFICATIVA...... 14
4 REVISÃO DE LITERATURA...... 15
4.1 VÍRUS...... 15
4.2 CLASSIFICAÇÃO VIRAL...... 16
4.3 NOMENCLATURA VIRAL...... 18
4.4 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO VIRAL...... 18
4.5 MORCEGOS: HOSPEDEIROS – RESERVATÓRIOS...... 19
4.6 MORCEGOS AMAZÔNICOS...... 20
4.7 VÍRUS ISOLADOS DE MORCEGOS...... 21
4.7.1 Família Rhabdoviridae...... 21
4.7.2 Família Paramyxoviridae...... 22
4.7.3 Família Filoviridae...... 23
4.7.4 Família Poxviridae...... 23
4.7.5 Família Bunyaviridae...... 24
4.7.6 Família Adenoviridae...... 25
4.7.7 Família Orthomyxoviridae...... 26
4.7.8 Família Herpesviridae...... 27
4.8 VÍRUS JURUAÇÁ...... 27
4.9 SEQUENCIMENTO DE ÚLTIMA GERAÇÃO E METAGENÔMICA VIRAL...... 29
5 MATERIAL E MÉTODOS...... 32
5.1 AMOSTRA VIRAL...... 32
5.2 ISOLAMENTO E PRODUÇÃO DE ESTOQUE VIRAL...... 32
5.3 PRODUÇÃO DO SORO HOMÓLOGO...... 33
5.4.SUSCETIBILIDADE DE CULTIVOS CELULARES À INFECÇÃO VIRAL...... 33
5.4.1 Infecção das Culturas Celulares pelo Vírus Juruaçá...... 33
5.5 SEQUENCIAMENTO GENÔMICO...... 35
5.5.1 Sequenciamento pelo Ion torrent ...... 35
5.5.2 Preparação biblioteca genômica...... 35
5.5.3 Amplificação clonal da biblioteca genômica (PCR de Emulsão)...... 36
5.6 MONTAGEM DO GENOMA...... 36
5.7 DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DE SIMILARIDADE...... 36
5.8 IDENTIFICAÇÃO DOS MOTIVOS CONSERVADOS, SÍTIOS DE CLIVAGEM E SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃO...... 37
5.9 ANÁLISE FILOGENÉTICA...... 38
5.10 DETECÇÃO DO GENOMA...... 38
5.10.1 Extração do RNA viral...... 38
5.10.2 Transcrição Reversa seguida da reação em cadeia mediada pela polimerase (RT-PCR)...... 39
5.11 CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS VIRAIS...... 40
5.11.1 Pré preparo da amostra...... 40
5.11.2 Enriquecimento da proteína alvo...... 41
5.11.3 Eletroforese em gel de acrilamida (SDS-PAGE)...... 42
5.11.4 Western Blot...... 43
6 RESULTADOS...... 44
6.1 INFECÇÃO NA CULTURA CELULAR...... 44
6.2 DADOS DO SEQUENCIAMENTO...... 44
6.3 DESCRIÇÃO DO GENOMA...... 45
6.4 SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃO, MOTIVOS CONSERVADOS E SÍTIOS DE CISTEÍNAS...... 46
6.5 ANÁLISE DE SIMILARIDADE...... 48
6.6 ANÁLISE FILOGENÉTICA...... 49
6.7 RT-PCR...... 54
6.8 GEL DE ACRILAMIDA...... 56
6.9 WESTERN BLOT...... 57
7 DISCUSSÃO...... 58
8 CONCLUSÃO...... 65
REFERÊNCIAS...... 66
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1 INTRODUÇÃO
A região Amazônica inclui cerca de 60% do território brasileiro, apresenta um clima tropical úmido e possui uma das maiores bacias hidrográficas do mundo, além de deter uma enorme biodiversidade de fauna e flora ainda pouco conhecida (CAUSEY et al., 1961). Portando, nesse vasto ecossistema é possível encontrar uma diversidade de dípteros hematófagos e vertebrados silvestres proporcionando condições ambientais favoráveis para a manutenção de diversos vírus na natureza (TRAVASSOS DA ROSA et al.,1997).
Diante desse cenário de diversidade, a população Amazônica ficou susceptível à ação desses agentes virais, surgindo o aparecimento de doenças em casos isolados, surtos epidêmicos e grandes endemias (CAUSEY et al., 1961). Isso tudo ocasionou um grande movimento de investigação na região, que teve início em 1954 a partir do programa de coleta de dados sorológicos e virológicos estabelecido pelo acordo feito entre o Serviço Especial de Saúde Pública do Brasil - hoje Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) - e a Fundação Rockefeller (FR), com a criação do laboratório de arbovírus do Instituto Evandro Chagas (IEC), sediado em Belém-Pará (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1998).
Nas décadas de 50 a 90 foram isolados aproximadamente 190 tipos diferentes de arbovírus, com 157 descritos pela primeira vez no Brasil e com 36 associados à infecção humana, sendo que 13 são considerados endêmicos na região amazônica (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1998; VASCONCELOS et al., 2003).
Embora existam diversos projetos de pesquisa na região, ainda existem alguns vírus que permanecem sem uma classificação taxonômica definida, representando uma significativa parcela do número de vírus isolados no IEC, sendo considerados vírus não grupado e não classificado (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1998), entre eles, o vírus Juruaçá (VJUR).
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do estudo é caracterizar geneticamente o vírus Juruaçá (VJUR) isolado de morcego no município de Oriximiná, Pará, Brasil.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Verificar novas linhagens celulares susceptíveis à infecção viral;
- Caracterizar geneticamente e determinar a organização do genoma do VJUR ;
- Realizar a análise filogenética das sequências nucleotídicas obtidas do VJUR com outros vírus;
- Definir a classificação viral em família, gênero e espécie do VJUR.
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3 JUSTIFICATIVA
Os morcegos possuem características biológicas e ecológicas que os definem como grande reservatório de inúmeros vírus, de diferentes famílias. Esses aspectos fazem com que se tornem de grande importância na pesquisa científica, assim, a vigilância e a descoberta de novos vírus circulantes entre esses animais são essenciais para a saúde pública (BREDT; UIEDA; PEDRO, 2012).
A análise de aspectos morfológicos são, por muitas vezes, falhos para a definição taxonômica dos vírus, gerando alguns erros para sua correta classificação. Recentemente, o vírus Trinity, que era classificado na família Togaviridae com base na sua microscopia eletrônica (EL MEKKI et al., 1981), está sendo reclassificado com membro da família Bunyaviridae, de acordo com o sequenciamento do seu genoma (LIMA, 2014). Portanto, com o sequenciamento completo do genoma, é possível conhecer a organização genômica e a predição das funções das proteínas virais, que, aliado à análise filogenética, promovem uma classificação mais precisa em família, gênero, espécie viral e subespécies (genótipos, cepas, linhagens, etc.).
Ademais, o VJUR é caracterizado por uma patogenia imune inflamatória responsável por alterações anatomopatológicas e reações imunohistoquímicas no sistema nervoso central de camundongos albinos suíços e infecção persistente em cultivos primários de astrócitos e microglias (FERREIRA, 2012).
Portanto, torna-se importante o desenvolvimento de um estudo de caracterização genética que proporcionará o melhor entendimento a respeito da organização genômica desse vírus e sua posterior definição taxonômica.
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4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 VÍRUS
Os vírus são pequenos segmentos de ácidos nucléicos (RNA ou DNA) envoltos por uma cápsula protéica, não possuem metabolismo próprio e são considerados parasitas obrigatórios devido utilizarem a maquinaria celular para sua sobrevivência. Por serem organismos de alta complexidade e singularidades, desafiam a compreensão e descrição de todos os aspectos relacionados à sua apresentação (CONDIT, 2007).
Os vírus podem se apresentar de diferentes formas e tamanhos e para determinar a morfologia de uma estrutura viral o método mais utilizado é a microscopia eletrônica, que conta com várias técnicas para gerar uma imagem detalhada de uma partícula viral. Uma das classificações virais mais adotadas é a distinção de vírus envelopado e não envelopado, sendo diferenciado pela presença ou ausência da bicamada lipídica (HARRISON, 2007).
Para sua sobrevivência, as partículas virais precisam transportar seu genoma viral para uma célula hospedeira não infectada e processar várias fases necessárias para sua replicação (Figura 1). O vírus precisa realizar a ligação aos receptores celulares, passar por todos os processos intracelulares de sinalização e alcançar o núcleo da célula infectada para que seu genoma dê inicio ao processo de transcrição e replicação viral (HELENIUS, 2007).
O organismo de um hospedeiro animal pode apresentar várias alterações fisiopatológicas que indiquem a presença de um vírus, como: lesões de pele e mucosas digestivas, distúrbios neurológicos, distúrbios respiratórios, disfunção imune, falência de órgãos específicos e até a morte. A presença viral pode ser comprovada também através da análise de efeito citopático em cultura de células susceptíveis a determinados agentes virais. O isolamento pode ocorrer a partir da coleta de material biológico diretamente do hospedeiro original ou indução da patologia em algum hospedeiro substituto ou em cultura de célula (CONDIT, 2007). Vários animais podem ser úteis na investigação laboratorial, como camundongos, hamsters, coelhos, primatas não humanos, (KUCHLER, 1977; STORCH, 2005), 16
embora a maioria dos métodos estão sendo substituídos por culturas de células (MAHY; KANGRO, 1996; HARRISON, 2007).
Figura 1 – Esquema da replicação de vírus de RNA.
Vírus
1
2 7
Receptor celular
Genoma viral RNA
3 6
RNA m 4 5
Fonte: (MEDEIROS, D. B. A., 2004). Legenda: (1) Adsorção do vírus a receptores celulares; (2) entrada do vírus por endocitose; (3) desnudamento viral; (4) síntese de ARN replicação e transcrição do genoma viral; (5) tradução do RNA mensageiro viral; (6) montagem viral; (7) Liberação da partícula viral por brotamento.
4.2 CLASSIFICAÇÃO VIRAL
Os virologistas, de forma geral, concordam que os vírus devem ser considerados um grupo de organismos distintos, independentemente do hospedeiro, pois vários vírus, agora classificados na mesma família, podem infectar hospedeiros de diferentes reinos. A taxonomia viral é supervisionada pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV) que usa parte da nomenclatura da taxonomia tradicional para identificar as espécies de vírus e agrupá-los em gêneros, famílias e ordens, identificando também suas características biológicas, morfológicas, estrutura do genoma e propriedades antigênicas (MURPHY et al., 1995).
Vírus da mesma estrutura e morfologia são isolados de uma variedade de hospedeiros que incluem bactérias, fungos, plantas, insetos e vertebrados. Com o objetivo de classificar os vírus, os estudos destacaram diferentes aspectos 17 singulares à partícula viral para obter um sistema de classificação aceitável a todos os virologistas (VAN REGENMORTEL et al., 2000).
Para classificação de vírus devem-se utilizar os níveis hierárquicos de Ordem, Família, Subfamília, Gênero e Espécie. Mas isso não obriga a utilização total de todos os níveis, por exemplo, um vírus tem sua primeira classificação em espécie, a maioria das espécies é classificada em gênero e a maioria dos gêneros é classificado em família, no entanto, existem espécies que não conseguem se adequar em nenhum gênero assim como existem gêneros que não se unem em famílias, sendo classificados portanto como não grupados (KING et al., 2012).
O ICTV adota um esquema de classificação universal, que emprega os níveis hierárquicos de ordem, família, subfamília, gênero e espécie, no entanto, no que diz respeito à classificação viral, os níveis mais elevados do que a ordem não são atualmente utilizados, e os níveis mais baixos que espécies, tais como cepas e variantes, não são consideradas oficialmente pelo ICTV (KNIPE; HOWLEY, 2005). A biologia de um vírus, incluindo propriedades como a variedade de hospedeiros, a patogênese, transmissão e habitat, são componentes fundamentais para a caracterização viral (VAN-REGENMORTEL, 1990). Alguns critérios importantes são:
a) Morfologia viral: tamanho, forma, simetria do capsídeo, presença ou ausência de envelope; b) Propriedades físico-químicas: estrutura do genoma, tipo de ácido nucléico (DNA ou RNA), tipo de cadeia (fita simples ou dupla), sentido (positivo, negativo ou ambisenso), sensibilidade a agentes físicos ou químicos, características lipídicas, presença de proteínas estruturais ou não estruturais; c) Propriedades antigênicas: relação sorológica; d) Propriedades biológicas: estratégia de replicação, hospedeiros, modo de transmissão, patogenicidade, distribuição geográfica (MURPHY et al., 1995; MURPHY, 1996).
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4.3 NOMENCLATURA VIRAL
O ICTV utiliza uma nomenclatura para vírus especificando sufixos para cada táxon. Nomes para gêneros, subfamílias, famílias e ordens devem ter uma palavra terminando com os sufixos -virus, -virinae, -viridae e –virales, respectivamente e devem ser escritas em itálico com a sua primeira letra do nome em maiúsculo. Os nomes referentes a espécie podem ter mais de uma palavra e não possuem um sufixo específico e devem ser escrito em itálico e também com a primeira letra do nome em maiúsculo. Os membros pertencentes a cada táxon devem compartilhar características em comum que permitam que sejam agrupados em um mesmo gênero, ou família ou ordem (MAYO, 1996; MAYO; HORZINEK, 1998; VAN REGENMORTEL; MAHY, 2004; KING et al., 2012).
4.4 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO VIRAL
O estudo viral utiliza algumas técnicas que são comuns para vários ramos da ciência, e suas características particulares permitem analisar e compreender os resultados em cada ferramenta utilizada. A presença de um vírus pode ser evidenciada por efeitos no organismo de seu hospedeiro ou em culturas de células, no caso de alguns vírus que infectam animais. Os efeitos sobre os hospedeiros incluem uma variedade de sintomas, como: lesões de pele e mucosas, distúrbios neurológicos, disfunção imune, falência de órgãos, podendo levar até a morte (CONDIT, 2007). Muitos animais podem fazer o papel de hospedeiros substituto, onde o vírus pode ser excretado e isolado de materiais biológicos. Historicamente, cães, gatos, coelhos, ratos, hamsters podem ser úteis nas investigações laboratoriais (KUCHLER, 1977). Mas a maioria dos métodos que envolvem animais está sendo substituído por métodos de cultura de células. E nas células podem surgir alterações morfológicas, que são denominados de efeitos citopáticos (ECP). (MAHY, 1996). Algumas características dos ECP são importantes para a identificação ou a suspeita da presença do vírus, como que tipo de cultura de célula é afetada, a taxa de progressão e a distribuição do efeito e a natureza das alterações morfológicas (STORCH, 2005). 19
A presença viral também pode ser confirmada por técnicas de detecção antigênica, como a fluorescência com anticorpos específicos ou detecção de ácido nucléico utilizando técnicas de PCR com primers e sondas específicas.
O material de cultura celular também pode ser analisado pela técnica de microscopia eletrônica, que permite a visualização e descrição das partículas virais, podendo proporcionar uma indicação sobre qual família compartilha das mesmas características daquele vírus em estudo. Essa técnica foi utilizada na descoberta de coronavírus durante um surto de síndrome respiratória aguda grave em Hong Kong em 2003 (KSIAZEK et al., 2003; PEIRIS et al., 2003).
4.5 MORCEGOS: HOSPEDEIROS – RESERVATÓRIOS
Das mais de 4.600 espécies reconhecidas de mamíferos, 925 (cerca de 20%) são de morcegos (TEELING et al., 2005). Estão agrupadas em duas subordens: Megachiroptera, contendo uma única família, Pteropodidae (42 gêneros, 166 espécies), e Microchiroptera, contendo 16 famílias de morcegos (135 gêneros, 759 espécies) (SIMMONS, 2005).
Os morcegos são considerados mamíferos abundantes, diversificados, e geograficamente dispersos. Embora muito se saiba sobre eles, informações mais detalhadas são necessárias para explicar as mudanças anatômicas, seus estilos de vida, os seus papéis nos ecossistemas e seu significado como hospedeiros de vírus de importância para o ser humano (CALISHER, 2006).
Das 1.116 espécies de morcegos, pelo menos 75% são insetívoras, contribuindo para o controle das populações de insetos noturnos (SIMMONS, 2005; REIS et al., 2007; CLEVELAND et al., 2006); 25% são fitófagas, alimentando-se de produtos vegetais; um número menor é carnívoro-piscívora ou sanguívora e outras espécies são onívoras, limitando-se a um determinado tipo de alimento (KUNZ; FENTON, 2003).
Suas asas variam em extensão de 130 milímetros a 2 metros, e várias espécies alimentam-se de insetos, mamíferos, peixes, sangue, frutas e pólen. Os morcegos são encontrados em todos os continentes, exceto na Antártida e estão sendo cada vez mais reconhecido como reservatório hospedeiro de vírus que podem 20 atravessar barreiras de interespécies para infectar os seres humanos e outros mamíferos domésticos e selvagens. No entanto, os estudos sobre as histórias naturais de morcegos e sua importância como hospedeiros de vírus zoonóticos tem sido subestimado, com exceção de seu papel na manutenção e transmissão de vírus da raiva. Ainda possuem várias características importantes para a manutenção do equilíbirio biótico, ajudam o controle insetos, replantam florestas cortadas, e polinizam plantas que fornecem alimentos para seres humanos e outras espécies (CAMPBELL, 1925; HILL; SMITH,1984; KUNZ; FENTON, 2003).
A estruturação espacial e demográfica das populações de morcegos propicia a manutenção de vírus causadores de infecções agudas e persistentes. Além disso, dentro de determinadas regiões, as populações de morcegos podem existir como metapopulações, com o potencial de transmissão viral de forma sazonal e surtos anuais, bem como o potencial para surtos periódicos entre as populações distintas (CALISHER, 2006).
4.6 MORCEGOS AMAZÔNICOS
A Amazônia compõe cerca de 1/3 do território brasileiro, e essa vasta área geográfica indica a ocorrência de pelo menos 172 espécies de morcegos, distribuídas em 64 gêneros diferentes, presentes nas nove famílias conhecidas na região: Phyllostomidae (com 89 espécies), Molossidae (24 espécies), Vespertilionidae (22 espécies), Emballonuridae (15 espécies), Mormoopidae (3 espécies), Thyropteridae (3 espécies), Noctilionidae (2 espécies), Natalidae e Furipteridae, com apenas uma espécie cada (PERRACCHI et al., 2011). O Pará é o estado com maior número de espécies registradas (120), seguido pelo Amazonas (110), Amapá (79), Mato Grosso (74), Acre (59), Rondônia (50) e Roraima (42), e a porção Amazônia do Maranhão com 21 espécies. Nove espécies de morcego são amplamente distribuídas, com registro em todos os estados amazônicos: Saccopteryx bilineata, e S. leptura, Micronycteris megalotis, Phyllostomus hastatus, Glossophaga soricina, Carollia perspicillata, Artibeus planirostris, Desmodus rotundus e Molossus molossus. E nove espécies têm registro conhecido apenas no Estado do Pará: Cyttarops alecto, Peropteryx trinitatis, Saccopteryx gymnura, Micronycteris homezi, Choeroniscus godmani, Lonchophylla mordax, Thyroptera 21 lavali, Lasiurus egregius, Molossops neglectus e Molossus barnesi (BERNARD; TAVARES; SAMPAIO, 2011).
4.7 VÍRUS ISOLADOS DE MORCEGOS
Os morcegos apresentam muitos aspectos que possibilitam serem o reservatório perfeito para patógenos emergentes e zoonóticos. Características como: viver em grandes colônias, realizar viagens de grandes distâncias através do vôo e proporcionar a disseminação viral, e poder se manter vivos por grandes períodos de tempo, e outras propriedades que proporcionam a esses animais conviver com inúmeros agentes virais (WYNNE; WANG, 2013).
Mais de 200 vírus já foram isolados ou detectados em morcegos, representando 11 famílias e 37 gêneros desses animais. Os vírus são pertencentes a 27 famílias distintas, demostrando a diversidade viral encontrada nesses mamíferos (CALISHER, 2006). Abaixo relacionamos algumas espécies virais que já foram isoladas de morcegos:
4.7.1 Família Rhabdoviridae
A família Rhabdoviridae é subdividida em 11 gêneros distintos, e os membros pertencentes ao gênero Lyssavirus são classificados em 14 espécies diferentes, entre elas, estão o vírus da Raiva (VRAB), responsável por importante encefatile fatal tanto em animais quanto em humanos (TAKAOKA, 2003; WARRELL; WARRELL, 2004). Esses virions possuem uma organização genômica de ácido ribonucléico de fita única, sentido negativo, não segmentado, e sua morfologia lembra o formato de bala de revólver com duas unidades estruturais: um nucleocapsídeo helicoidal e um envelope lipídico derivado da membrana citoplasmática do hospedeiro durante o processo de brotamento (KING et al., 2012).
Os membros do gênero Lyssavirus apresentam como principais hospedeiros reservatórios, os morcegos da ordem Chiroptera (SODRE; GAMA; DE ALMEIDA, 2010; SCHNEIDER et al., 2009; BANYARD et al., 2011). O vírus mais conhecido, dada a sua importância médica, é o VRAB, que causa a uma panencefalite com 22 letalidade em torno de 100%. A Raiva é uma doença zoonótica transmitida através da mordedura, arranhadura ou contaminação das mucosas com saliva de vetebrados infectados para indivíduos suscetíveis. São reconhecidos quatro ciclos biológicos de trasmissão da Raiva, cujo morcego tem participação em dois deles: rural (animais de produção) e silvestre aéreo (exclusivamente por morcegos). Os outros dois são transmitidos por carnívorus domésticos (ciclo Urbano) e canideos silvestres (silvestre terreste) (TAKAOKA et al., 2003; WADA et al., 2004; KOTAIT; CARRIERI; TAKAOKA, 2009). Nas últimas decadas, há registros de Raiva humana transmitida por morcegos ocorridos em Trinidad, Brasil, Peru, Equador, Colômbia e Venezuela (TRAVASSOS DA ROSA et al., 2006; BARBOSA et al., 2007; HURST; PAWAN, 1932, 1936). No Brasil, o Desmodus rotundus é o morcego hematófago mais importante na transmissão da doença em herbívoros (UIEDA, 1998; REZENDE et al., 1997; FERNANDES, 2001).
4.7.2 Família Paramyxoviridae
A família Paramyxoviridae possui duas subfamílias: a Paramyxovirinae, subdividida em sete gêneros distintos, e a Pneumovirinae com dois gêneros distintos. Os membros pertencentes ao gênero Henipavirus são classificados em duas espécies: Hendra virus e Nipah virus. Esses virions possuem uma organização genômica de ácido ribonucléico de fita única, sentido negativo, linear Os henipavirus possuem uma ampla e diversificada gama de hospedeiros: morcegos, porcos, cavalos, seres humanos, característica que pode ser explicada pela presença do receptor altamente conservado encontrado em células de vertebrados, justificando a ampla variedade de hospedeiros. Estão associados à doença severa e frequentemente fatal nos seres humanos e nos cavalos (KING et al., 2012).
Os vírus Hendra e Nipah são paramixovirus altamente patogênicos e têm sido detectados em morcegos da família Pteropodidae, nas últimas décadas (MARSH et al., 2012). Em 1994 na Austrália, aproximadamanente 24 cavalos morreram de causa não diagnosticada apresentando alguns sintomas semelhantes, e dois homens que trabalhavam com esses animais também apresentaram a doença após contato com os cavalos. O paramixovírus foi isolado no sangue de todos, tanto os animais quanto os serem humanos, detectando-se como agente etiológico o vírus Hendra (SELVEY et al., 1995). Mais de um quinto dos morcegos no norte da 23
Austrália apresentaram articopos neutralizantes ao vírus Hendra, assim como algumas outras espécies na Nova Guiné, e em 1996 o vírus foi isolado de um Pteropodidae (HALPIN et al., 2000).
Em 1998, o vírus Nipah foi reconhecido como o agente etiológico de uma doença fatal que acometia humanos e porcos na Malásia e em Cingapura. Anticorpos neutralizantes para o vírus Nipah foram detectados em cinco espéscies de morcegos na Malásia, sugerindo infecção generalizada nessa área. O vírus também foi detectado em urina e em frutas deixadas por esses morcegos o que possibilitou a confirmação desses animais como hospedeiros naturais do vírus (CHUA et al., 2000).
4.7.3 Família Filoviridae
A família Filoviridae é subdividida em três gêneros distintos, e os membros pertencentes ao gênero Ebolavirus são classificados em cinco espécies diferentes, entre elas, estão os vírus da espécie Zaire ebolavirus. Esses vírus possuem uma organização genômica de ácido ribonucléico linear de fita única, sentido negativo, não segmentado. Os virions são compostos por um nucleocapsideo central e um envelope lipídico oriundo da membrana plasmática da célula hospedeira (KING et al., 2012).
Em 1976, uma série de casos fatais de febres hemorrágicas aconteceu tanto no sul do Sudão quanto em Zaire, separados por cerca de 1000 km. O vírus denominado Ebola-virus, da família Filoviridae foi isolado e parcialmente caracterizado em pacientes no Zaire e no Sudão, mas os estudos de campo não conseguiram demonstrar a sua origem (JOHNSON et al., 1977). O vírus foi, então, detectado em morcegos, coletados na fronteira de Gabão e a República do Congo, que possuiam RNA viral muito semelhante ao surto de 1976 em humanos, ficando evidenciado então que esses mamíferos seriam o possível hospedeiro reservatório do Ebola-virus (LEROY et al., 2005).
4.7.4 Família Poxviridae
A família Poxviridae é subdividida em 2 subfamílias: Chordopoxvirinae, com 10 gêneros, entre eles as espécies Vaccinia virus e Variola virus do gênero Orthopoxvirus; e a subfamília Entomopoxvirinae subdivididos em três gêneros 24 distintos. Esses virions possuem uma organização genômica de ácido desoxirribonucléico linear de fita dupla, e sua morfologia é do tipo pleomórfica, com uma membrana lipoprotéica, com unidades tubulares ou globulares, mas tamblém podem ser ovóides com a membrana possuindo um filamento em espiral (KING et al., 2012).
Em três continentes diferentes foram detectados poxvírus em morcegos: na África, na América do norte e na Oceania. Durante a vigilância ativa de morcegos africanos frugívoros Eidolon helvum, foram detectadas altas prevalências de sequências genéticas de poxvirus através da análise metagenômica de swabs coletados desses animais (BAKER et al., 2013). Entre 2009 e 2011, outro poxvirus associado a patologia foi detectado em seis morcegos Eptescicus fuscus em um centro de animais selvagens localizado ao norte do Estados Unidos. A doença clínica identificada nesses animais foi progressiva até levar a eutanásia. O vírus foi identificado através de microscopia eletrônica e isolado em cultura de células (EMERSON, et al., 2013). Um outro poxvírus foi detectado em 2009 , no sul da Austrália, quando os morcegos apresentavam lesão nodular e o vírus também foi identificado por meio de microscopia eletrônica (McLELLAND et al., 2013). Nenhuma outra caracterização viral foi relatada, e tanto a epidemiologia como as implicações para a conservação do poxvirus no morcego permancem deconhecidas.
4.7.5 Família Bunyaviridae A família Bunyaviridae é subdividida em 5 gêneros distintos: Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus, Phlebovirus e Tospovirus. Esses virions possuem uma organização genômica de ácido ribonucléico de fita única, sentido negativo, com três segmentos: L (grande), M (médio) e S (pequeno) (KING et al., 2012). Os hantavírus são vírus zoonóticos associados a roedores e causadores da Sindrome Cardiopulmonar por hantavirus, nas Américas, e pela Febre Hemorrágica com sídrome renal, na Europa e Ásia (TRAVASSOS DA ROSA, 2008).
Recentemente, os hantavírus vem sendo identificados em aproximadamente 100 espécies de morcegos insetívoros, destacando os vírus: Mouyassué virus encontrada no Neoromicia nanus, uma espécie de morcego capturado na Costa do Marfim (SUMIBCLAY et al., 2012); Magboi virus em Nycteris hispidai de Serra Leoa (WEISS et al., 2012); Xuan Son virus em Hipposideros pomona do Vietnã (ARAI et 25 al., 2013) e Hunagpi virus nos morcegos Pipistrellus abramus, Rhinolophus sinicus, Rhinolophus monoceros e Rhinolophus affinis da China (GUO et al., 2013). O RNA de hantavírus ainda não foi detectado em morcegos do tipo frugívoros e nem foram associados casos de hantaviroses em humanos associados aos hantavírus identificados em morcegos (ECKERLE; LENK; ULRICH, 2014).
Com a combinação de métodos de isolamento viral e o avanço da tecnologia de sequenciamento de nova geração foi possível o isolamento de um novo nairovírus em morcegos da espécie Hipposideros gigas na Zambia e o estudo in vivo para investigar características clínicas e patológicas da doença demonstrou que algumas cepas isoladas desse vírus produzem uma profunda doença hemorrágica em camundongos que pode ser similar à febre hemorrágica Crimea do Congo em humanos, doença de alta letalidade caracterizada por febre baixa, mialgia astenia e discreta artralgia, e o paciente também pode evoluir com hemorragias e alterações do sistema nervoso central compatível com encefalite (ISHII et al., 2014; WHITEHOUSE, 2004).
Em 2010, foi isolado um phlebovírus na espécie de morcego Rousettus leschenaultii na Índia. Após a coleta do sobrenadante de cultura de célula Vero E6 infectada, esse material foi submetido à microscopia eletrônica de transmissão, RT- PCR, e posterior sequenciamento para confirmação de que o isolado era o vírus Malsoor. Esse vírus possui um parentesco genético com outros dois phlebovirus altamente patogêncios em humanos: vírus da síndrome da febre severa com trombocitopenia e o vírus heartland, daí a importância de pesquisas sobre os possíveis hospedeiros desse virus, exposição à humanos e outras características ecoepidemiológicas relacionadas à esse novo Phlebovirus (MOURYA et al., 2014; BASU et al., 2015).
4.7.6 Família Adenoviridae
A família Adenoviridae é subdividida em cinco gêneros distintos: Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovrus, Mastadenovirus e Siadenovirus. Esses virions possuem uma organização genômica de ácido desoxirribonucléico linear de fita dupla, não segmentado, não possuem o envelope lipídico e são altamente resistentes. Possuem mais de 40 sorotipos distintos e podem causar gastroenterites, infecção de trato respiratório e conjutivite em humanos (KING et al., 2012). 26
Em quatro amostras fecais de morcegos do Quênia, das espécies Chaerephon sp. e Otomops martiensseni foram detectados DNA de adenovirus. A análise filogenética dessas quatro amostras baseada no sequênciamento parcial do gene hexon e sequências representativas de 47 adenovirus conhecidos, demonstraram o agrupamento desses virus no gênero Mastadenovirus e foram mais estreitamente relacionados com os vírus de adenovirus caninos e de morcego, demonstrando que provavelmente esses adenovirus compartilharam um ancestral comum. É importante ressaltar que esses animais detectados com adenovirus são muito frequentes na caverna Suswa, a maior colônia de morcegos Otomops martiensseni, com extenso histórico de atividade humanas, como mineração, visitas turísticas nas cavernas, caças e consumo de morcegos, o que possivelmente aumenta a chance de infeccção zoonótica spillover desses morcegos. Portanto, o estudo da diversidade viral nesses animais ajudará na compreensão de possíveis vírus emergentes (CONRARDY, 2014; SMITH, 2013; SIMONS, 1998).
4.7.7 Família Orthomyxoviridae
A família Orthomyxoviridae é subdividida em seis gêneros distintos: Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Isavirus, Quaranjavirus e Thogotovirus. Esses virions possuem uma organização genômica de ácido ribonucléico de fita simples, sentido negativo e simetria helicoidal. Os influenzavirus são responsáveis por causar doença respiratória em humanos (KING et al., 2012).
Duas linhagens de Influenzavirus A foram recentemente detectadas em morcegos Sturnira lilium na Guatemala e Artibeus jamaicensis planirostris no Peru. Esses vírus, até então, tinham como hospedeiro reservatório uma ampla gama de animais, como: cachorros, cavalos, gatos, primatas não humanos, gado, baleias, pandas, tamanduás, camelos e pinguins (CHAMBERS et al., 2013; MANZ et al., 2013; TAUBENBERGER; KASH, 2010). A detecção em morcegos, que reprensenta 20% dos mamíferos, expande dramaticamente o leque de hospedeiros deste vírus (MEHLE, 2014).
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4.7.8 Família Herpesviridae
Herpesviridae é uma grande família de vírus de DNA que causam doenças em animais, incluindo seres humanos é dividida em três subfamílias: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Os betaherpesvirus e os gammaherpesvirus vem sendo frequentemente isolados em morcegos africanos e sul-americanos, bem como em morcegos insetívoros na Europa (RAZAFINDRATSIMANDRESY et al., 2009). Na amazônia, o hepesvírus Parixá, isolado de morcego, apresentou uma importante hepatite em camundongos e com visualização, até então indêntica, de partículas virais no núcleo dos hepatócitos (MACHADO, 1998).
4.8 VÍRUS JURUAÇÁ
Em 1982, foi obtido o isolamento do VJUR em camundongos albinos suíços recém-nascidos, a partir de vísceras de morcego capturado no distrito de Porto de Trombetas, no município de Oriximiná, na zona do Baixo Amazonas, no Estado do Pará. O porto surgiu nos anos 80, em função da exploração da bauxita, mineral responsável pela remoção da cobertura vegetal e das camadas superficiais do solo daquela região (Figura 2) (BRASIL, 2015).
Após um estudo experimental do vírus para estudar sua susceptibilidade em cultivos celulares de linhagens contínuas e cultivos primários de células do sistema nervoso central encontrou-se que: as células VERO CCL-81 e células Aedes albopictus clone C6/36, usadas rotineiramente no isolamento de arbovírus e outro vírus vertebrados, não foram sensíveis à infecção pelo VJUR. A ausência de efeito citopático (ECP) e a não detecção de antígenos virais pelas técnicas de imunofluorescência e fixação do complemento, sugeriram que essas linhagens não apresentam receptores capazes de mediar a adsorção com este vírus. O VJUR também apresenta tropismo por neurônios e células gliais em camundongos albinos suíços recém-nascidos. A infecção é caracterizada por uma patogenia imune inflamatória, com alterações anatomopatológicas e reações imunohistoquímicas no Sistema Nervoso Central de camundongos infectados (ARAÚJO, 2006).
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Figura 2 – Localização do Porto de Trombetas (à direita). Local onde foi capturado o morcego.
ORIXIMINÁ ORIXIMINÁ
PARÁ PARÁ
Fonte: Google Earth e IBGE, adaptado.
A análise por microscopia eletrônica de transmissão de cortes de cérebro de camundongo infectado com o vírus, mostrou partículas virais visíveis a partir do 4º dia pós inoculação, apresentando morfologia esférica, medindo de 23-30nm de diâmetro localizadas no citoplasma celular, não sendo observada a presença de envelope viral (Figura 3). O estudo de caracterização antigênica, ultraestrutural e moleculares básicos realizados por Araújo (2006), sugeriu uma classificação taxonômica do VJUR na família Picornaviridae, no entanto, até o presente momento não há informações genéticas relevantes capazes de confirmar tal classificação.
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Figura 3 – Micrografia eletrônica do vírus Juruaçá em cortes ultrafinos de cérebro de camundongo albino suíço (8 dias p.i.).
Fonte: (ARAUJO, 2006). Nota: Partículas virais desprovidas de envelope agrupadas no citoplasma celular (seta).
4.9 SEQUENCIMENTO DE ÚLTIMA GERAÇÃO E METAGENÔMICA VIRAL
Com o advento do sequenciamento genômico de última geração, em princípio com a aplicação do método de pirossequenciamento e posteriormente com a segunda geração utilizando os métodos de sequenciamento paralelo e semicondução iônica, um grande número de genomas virais tem sido descobertos, principalmente referente a agentes virais não cultiváveis (BIBBY, 2013).
Estudos com base na metagenômica viral em animais são vastos. Em 2004, Bengis et al. (2004), descreveram dois diferentes padrões de transmissão de doenças infecciosas de animais ao homem. O primeiro padrão é representado por doenças virais oriundas de animais de vida selvagem. Conforme este padrão, apesar de tais doenças serem raramente transmitidas ao homem, uma vez que o vírus se adapta ao hospedeiro humano, pode manter seu ciclo ativo mediante transmissão horizontal. O maior exemplo deste fato ocorreu com o HIV oriundo do Vírus da Imunodeficiência Adquirida (SIV) (HAHN et al., 2000). O segundo padrão envolve múltiplos eventos de transmissão animal-homem. Eventos estes, possivelmente mediados por artrópodes. A infecção pelo Vírus do Oeste de Nilo 30
(VWN) é uma evidência clara disso, englobando aves, mosquitos, cavalos e o ser humano.
O papel de morcegos frutívoros, insetívoros ou hematófagos como reservatórios de agentes infecciosos é estudado no mundo todo. Isto se deve ao fato de que muitos vírus isolados em morcegos são capazes de ignorar as barreiras entre espécies e infectar o homem, normalmente causando doenças graves (SARS, Raiva, Nipah). Esta realidade não poderia ser ignorada pela metagenômica viral e as investigações envolvendo morcegos são bastante frequentes (CALISHE et al., 2006; WONG et al., 2007; LUIS et al., 2013; SMITH; WANG, 2013).
Devido ao contato direto e constante com o homem e por serem reservatórios de agentes infecciosos pertencentes a diversas famílias virais, roedores também podem transmitir zoonoses. As principais fontes de transmissão de patógenos de roedores ao homem são as fezes e a urina provenientes de animais infectados. Para descrever a diversidade viral presente nas fezes de roedores de vida selvagem, Phan et al. (2011), realizaram análise metagenômica de 105 amostras fecais de camundongos, ratazanas e ratos selvagens, sequenciando vírus de vegetais (Nanoviridae, Geminiviridae) e de insetos (Densovirinae, Iridoviridae), assim como alguns vírus de mamíferos, incluindo: sapelovírus, astrovírus, papilomavírus e picornavírus. Apesar de a maioria dos vírus de vegetais estarem pouco associados a patologias humanas, estudos anteriores detectaram RNA de vírus que infectam vegetais no corpo humano, principalmente nas amostras provenientes do trato respiratório de indivíduos fumantes (BALIQUE; COLSON; RAOULT, 2012).
A participação de animais domésticos como reservatórios de determinados vírus zoonóticos também está sendo investigada pela metagenômica. Já se evidenciou, por exemplo, que suínos são reservatórios do genótipo 3 do vírus da Hepatite E e humanos podem ser infectados mediante consumo de carne contaminada e mal cozida (MENG, 2011). Shan et al. (2011), analisaram as fezes de 24 suínos diarreicos e 12 saudáveis em uma fazenda de criação destes animais. Seus resultados mostraram que 98% do viroma presente nas amostras era composto por vírus de RNA pertencentes às famílias Picornaviridae, Astroviridae, Caliciviridae, e Coronaviridae, tanto em animais saudáveis como em doentes. Adicionalmente, os autores concluíram que as coinfecções verificadas poderiam 31 promover recombinação e rearranjo entre cepas virais e resultar na emergência de novos vírus patogênicos ao homem.
Seguindo esta mesma linha de raciocínio, Masembe et al. (2012) conduziram estudo metagenômico em soros de porcos domésticos e foram capazes de detectar vírus responsáveis por arboviroses zoonóticas, como o Vírus ndumu (NDUV), um Alphavirus transmitido por mosquito que pode infectar bovinos e humanos (KOKERNOT; MCINTOSH; WORTH, 1961). Ficando bem evidenciada a relevância da metagenômica como metodologia útil para a vigilância de arboviroses que afetam a saúde humana.
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5 MATERIAL E MÉTODOS
Todas as técnicas foram desenvolvidas observando as normas e critérios exigidos pelo comitê Internacional de Biossegurança. Essa dissertação não foi submetida ao Comitê de Ética em Uso de Animais porque não foi necessária a inoculação em nenhum camundongo, haja vista que todos os experimentos seguintes utilizaram estoques que já estavam previamente disponíveis no acervo da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas (SAARB).
5.1 AMOSTRA VIRAL
A amostra do vírus Juruaçá (AN 401933) pertence ao acervo da SAARB do Instituto Evandro Chagas (IEC) e foi isolada de um morcego (espécie não identificada) capturado em 03 de maio de 1982 na região de Porto Trombetas, município de Oriximiná, localizado no Estado do Pará. Este vírus foi isolado de camundongos albinos suíços recém nascidos, sendo considerado como vírus não grupado e não classificado (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1998).
5.2 ISOLAMENTO E PRODUÇÃO DE ESTOQUE VIRAL
O estoque viral utilizado estava disponível no acervo da seção, e foi produzido a partir de suspensões de cérebro de camundongo infectado com o VJUR procedente do acervo da SAARB/IEC. As suspensões virais foram preparadas a partir da maceração de um cérebro infectado, em 1,8 mL de solução borato-salina tamponada (PBS) pH 7,2, contendo 0,75% de albumina bovina e antibióticos (100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina).
Os camundongos recém-nascidos em grupos de seis, com dois a três dias de vida, apresentando perfeitas condições de saúde, foram inoculados via intracerebral com 0,02 mL da suspensão. Os animais foram observados diariamente e, ao manifestarem os sinais de doença, foram colhidos e conservados a – 70ºC ou submetidos aos procedimentos laboratoriais.
33
5.3 PRODUÇÃO DO SORO HOMÓLOGO
O soro homólogo do isolado viral já estava disponível no acervo, e foi produzido em camundongos jovens (três a quatro semanas de vida). Quatro inoculações semanais foram administradas via intraperitoneal (i.p.), com um volume de 0,2 mL de suspensão de cérebro de camundongo infectado, preparada na proporção de 1:10 em uma solução salina fisiológica (NaCl a 0,85%). Uma semana após a última vacinação, os animais foram anestesiados e o sangue coletado por punção cardíaca, sem o uso de anticoagulante. O sangue obtido foi centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos. O soro coletado foi armazenado em freezer a temperatura de - 20ºC. A especificidade do soro foi comprovada por testes de FC e IFI.
5.4 SUSCETIBILIDADE DE CULTIVOS CELULARES À INFECÇÃO VIRAL
Para tentar o isolamento em cultivos celulares, foi utilizada a linhagem derivada de vertebrado: Vero C1008, clone E6 (rim de macaco Chlorocebus aethiops).
Os cultivos celulares de Vero C1008, clone E6 foram mantidos em estufa a 37ºC e semanalmente tripsinizados, com a troca de meio de cultivo a cada quatro dias. As células foram mantidas com o meio D-MEM/F12 acrescido de glicose (0,06%), glutamina (200mM), penicilina/estreptomicina (100 UI/mL) e fugizon (2,5 µg/mL).
5.4.1 Infecção das Culturas Celulares pelo vírus Juruaça
A partir dos cérebros de camundongos recém-nascidos infectados obtidos foi preparada a suspensão viral, macerando-se os cérebros de camundongos com auxílio de gral e pistilo, e diluindo-se em 1,8 mL de PBS contendo streptomicina e penicilina (diluído 1:5). A suspensão viral foi centrifugada em centrífuga refrigerada (ThermoScientific) por 10 minutos à 12.000 rpm e, em seguida, filtrada com auxilio de filtro de 0,22 μm acoplado em seringa. 34
Cada suspensão foi inoculada em garrafa de 25 cm2 contendo células VERO C1008, clone E6 (RHIM et al., 1969). Para isso, o meio de crescimento (meio 199 com 5% de soro bovino fetal-SBF) das garrafas foi retirado e substituído por 1mL da suspensão viral filtrada seguida da adsorção em estufa a 37 ºC com 5% de CO2 durante 1 hora e realizando homogeneização manual das garrafas de 15 em 15 minutos. Posteriormente, acrescentou-se nas garrafas 10mL de meio de manutenção (meio 199 com 2% de soro bovino fetal-SBF), seguida de incubação a 37ºC. As culturas celulares infectadas foram observadas diariamente em microscópio invertido (Zeiss) para visualização de efeito citopático (ECP). sendo estas células coletadas (congeladas a -70ºC) quando obtiver-se aproximadamente 70 % de ECP.
A confirmação da replicação viral nos cultivos celulares infectados foi confirmada pela técnica de RT-PCR (item 5.10.2) bem como por imnofluorescência indireta (IFI) segundo Gubler, Kuno e Sather (1984), tendo como base o seguinte protocolo:
1)Fixar as lâminas por 10 minutos em Paraformaldeído a 4% em tampão fosfato, pH 7,4, 0,02M;
2) Esperar de 3 a 5 minutos para a lâmina secar;
3)Incubar com 25µL do soro homólogo (primeiro anticorpo) na proporção de 1:20 e 1:40 em PBS pH 7,4 durante 30 minutos a 37 ºC em câmara úmida;
4)Lavar duas vezes em PBS, a primeira para retirar o excesso, e a segunda aguardar por 10 minutos;
5) Lavar rapidamente com água destilada;
6)Incubar com anti-anticorpo (segundo anticorpo) de camundongo conjugado a isotiocianato de fluoresceína, a 37 ºC por 30 minutos em câmara úmida;
7) Lavar duas vezes em PBS, a primeira para retirar o excesso, e a segunda aguardar por 10 minutos;
8) Lavar rapidamente com água destilada;
9)Montar a lâmina-lamínula com glicerol tamponado pH 8,4; 35
10)Observar ao microscópio de fluorescência (Zeiss, Axiophot).
Como controle negativo do teste foi utilizado: (i) células não infectadas incubadas com o soro homólogo dos vírus em estudo; e (ii) células infectadas incubadas com soros de outros vírus, que não apresentavam cruzamento sorológico em testes de FC.
5.5 SEQUENCIAMENTO GENÔMICO
Para a obtenção das sequências nucleotídicas completas foi utilizada a plataforma de sequenciamento: IonTorrent (Life Technologies, AppliedBiosystems).
5.5.1 Sequenciamento pelo IonTorrent
No sequenciamento utiliza-se de um chip semicondutor capaz de traduzir sinais químicos em informações digitais. Normalmente, quando um nucleotídeo é incorporado pela molécula de DNA polimerase um próton é liberado resultando numa modificação de pH. Cada poço do chip semicondutor contém aproximadamente um milhão de cópias de molécula de DNA. O sequenciador inunda o chip com um nucleotídeo após o outro, e, se esse nucleotídeo complementa a sequência da molécula de DNA, uma molécula de hidrogênio será liberada resultando na mudança de pH que será detectada pelo sensor, transformando assim informação química em informação digital. Assim, cada nucleotídeo incorporado é medido em segundos, permitindo tempos de execução curtos.
5.5.2 Preparação biblioteca genômica
O IonTorrent requer a geração de uma biblioteca de fragmentos de DNA acompanhados de adaptadores. Isso pode ser feito ligando esses adaptadores aos produtos da PCR ou adicionando as sequências adaptadoras aos primers da PCR na região da extremidade 5’. Partindo-se de um genoma de RNA, o primeiro passo será a preparação de uma biblioteca de cDNA (DNA complementar) cuja 36 fragmentação do genoma foi realizada por fragmentação em Cloreto de Zinco que irá gerar fragmentos com tamanho médio de 400 pb. Em seguida as bibliotecas foram construídas empregando o kit de preparação de bibliotecas genômicas (fragmentcDNAlibrary kit, Roche). As enzimas contidas no kit promoveram a ligação de adaptadores (A e B) aos fragmentos de cDNA que foram amplificados e sequenciados com primers complementares.
5.5.3 Amplificação clonal da biblioteca genômica (PCR de Emulsão)
A biblioteca de cDNA contendo os fragmentos genômicos foram postas em contato com esferas de captura requeridas durante a etapa de sequenciamento. Este processo foi realizado pelo kit emPCR (Roche) em aproximadamente onze horas de duração. Brevemente, na fase inicial do processo de amplificação, os fragmentos da biblioteca de DNA juntamente com as enzimas e esferas de captura embebidas em solução aquosa, foram injetadas no interior de pequenos containers cilíndricos contendo óleo sintético. A combinação destes reagentes e a vigorosa agitação dos mesmos produzirão a emulsão (pequenas gotas nas quais as esferas estarão presentes). Usualmente, o que se espera é que cada gotícula contenha apenas um fragmento de DNA que será isoladamente amplificado por PCR, clonalmente ao redor da micro-esfera de captura. Ao final da reação de PCR, as esferas que não apresentarem fragmentos de DNA foram eliminadas, ao passo que as que apresentarem DNA amplificado foram retidas e utilizadas para a etapa de processamento e leitura do sinal de sequenciamento.
5.6 MONTAGEM DO GENOMA
Para montagem do genoma obtido pelo sistema de sequenciamento foi utilizado um pré-processo nas leituras que foram confrontadas contra um banco de dados contendo sequências de hospedeiros para que, desta forma, fosse feita uma triagem inicial e a retirada de possíveis contaminantes, objetivando aumentar a confiabilidade. Ademais, este pré-processo torna a etapa subsequente mais rápida e efetiva computacionalmente. 37
Posteriormente, o algoritmo “GS De Novo Assembler” (http://www.454.com /products-solutions/analysis-tools/gs-de-novo-assembler.asp), foi usado para a montagem propriamente dita, tendo a função de realizar a montagem de genomas baseando-se na sobreposição das leituras, avaliando ainda, a qualidade de cada uma delas.
Utilizou-se para montagem o programa MIRA 3 e o programa “Newbler” (http://www.chevreux.org/projects_mira.html), respeitando o mesmo pré- processamento supracitado. Foi utilizado um valor de qualidade de 20 (escala
Phred), definida por q=10log10e (EWING; GREEN, 1998).
A validação do genoma foi feita mediante alinhamento dos contigs montados pelos algoritmos empregados gerando uma sequência consenso (scaffold) e, sobretudo considerando a maior incorporação de leituras e cobertura.
Independente do programa usado para montagem, os contigs foram visualizados pelo programa Tablet (MILNE et al., 2010) e posteriormente confrontados contra o banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), utilizando o programa BLAST search (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).
5.7 DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DE SIMILARIDADE
As regiões codificantes dos vírus foram identificadas utilizando o programa ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/) e Geneious R7 .
5.8 IDENTIFICAÇÃO DOS MOTIVOS CONSERVADOS, SÍTIOS DE CLIVAGEM E SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃO
Para a descrição da organização e características do genoma, foram realizadas análises de domínios protéicos utilizando o banco de dados INTERPRO através da ferramenta Interproscan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/). O INTERPRO alberga vários bancos de dados de domínios, motivos e famílias protéicas, tais como: ProDom, SMART, TIGRFAMS, Pfam, SUPERFAMILY, 38
PANTHER e SignalPHMM. Os sítios potenciais de glicosilação foi predito pelo programa NetNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/).
5.9. ANÁLISE FILOGENÉTICA
O programa PROMALS foi utilizado para o alinhamento das sequências selecionadas. O programa constrói alinhamentos de alta qualidade consistentes com suas sequências e estruturas das proteínas (PEI; KIM; GRISHIN, 2008).
As árvores filogenéticas foram construídas usando o método de Agrupamento de Vizinhos (neighbor-joining) (SAITOU; NEI, 1987), implementado pelo programa computacional Mega v.6, utilizando modelo/método p-distance, que após seleção prévia foi identificado sendo o melhor método para avaliação (TAMURA et al., 2013).
5.10. DETECÇÃO DO GENOMA
5.10.1 Extração do RNA viral
A extração do RNA viral foi realizada a partir do estoque viral em cérebro de camundongos e cultivo celular infectados. Para tal, o protocolo foi desenvolvido em duas etapas: a primeira etapa utilizando o reagente Trizol ® Reagent (Invitrogen) e a segunda etapa utilizando o Pure link® RNA kit (Life Technologies). Foi realizada também uma extração de cérebro de camundongo e de cultura de células não infectados para serem utilizadas como controle negativo na realização do RT-PCR. Todos os produtos foram armazenados no -70C até o momento de uso. O procedimento descrito abaixo foi adaptado das instruções dos dois produtos utilizados:
1) Adicionar 1mL de Trizol ® Reagent para cada 50-100mg de tecido e macerar bem até homogeneizar completamente a amostra. Em caso de cultura celular, adicionar 0,75mL de Trizol ® Reagent para cada 0,25mL de amostra;
2) Manter o homogenato por 5 minutos a temperatura ambiente; 39
3) Adicionar 0,2mL de clorofórmio para cada 1mL de Trizol ® Reagent. Agitar por 15 segundos e manter 3 minutos a temperatura ambiente;
4) Centrifugar a amostra por 15 minutos a 12.000 rpm a 4ºC ;
5) Retirar a fase aquosa e transferir para um novo tubo;
6) Adicionar 0,6mL de etanol a 70% e homogeneizar por 15 segundos;
7) Transferir até 0,7mL de amostra para a coluna e centrifugar a 12.000 rpm por 15 segundos a temperatura ambiente, repetir até que toda amostra tenha sido processada;
8) Adicionar 0,7mL de Tampão de Lavagem I (Wash Buffer I) à coluna e centrifugar a 12.000 rpm por 15 segundos a temperatura ambiente;
9) Adicionar 0,5mL do Tampão de Lavagem II (Wash Buffer II) à coluna e centrifugar a 12.000 rpm por 15 segundos a temperatura ambiente, repetir o passo mais uma vez;
10) Centrifugar a 14.000 rpm por 1 minutos a temperatura ambiente para secar a coluna;
11) Adicionar 50µL de água livre de nucleases;
12) Descartar a coluna e estocar o tubo contendo o RNA a -80ºC para posterior uso.
5.10.2 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia mediada pela polimerase (RT-PCR)
O RNA extraído foi submetido a um protocolo de RT-PCR em dois passos para a obtenção dos fragmentos de DNA viral relacionados às três regiões do genoma. O design dos iniciadores foi feito pelo programa Geneious R7 após a análise do sequenciamento.
A primeira etapa consistiu na desnaturação do RNA viral utilizando 5µL do RNA total em termociclador (Applied Biosystems) usando o ciclo: 90ºC por 2 40 minutos. Em seguida, iniciou-se transcrição reversa (RT), no qual foi preparado uma reação cujo volume final foi de 20 µL, contendo: 6µL de água livre de RNAse e
DNAse (H2O free), 4µL de tampão 5x, 1µL de dNTPs 0,2mM, 1µL de DTT, 1µL de RT SuperScript III 100U (Invitrogen), 1µL RNAse 0.4U/ µL, 1µL iniciadores reverso 0,2µM e 5µL do produto da desnaturação, submetidos a uma temperatura de 45ºC por 65 minutos. Para verificar a quantidade a ser utilizado na etapa de reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR), foi realizado três diluição do produto da RT, nas proporções de 1:1, 1:10 e 1:100.
Na etapa de PCR, preparou-se uma reação com volume final de 50µL, contendo: 38µL H2O free, 5µL de tampão 10x, 1,5µL de MgCl2 1,5mM, 1µL de dNTPs 0.2mM, 1µL iniciadores reverso 0,2µM, 1µL iniciadores senso 0,2µM, 0,5µL de TaqPlatinum 2,5U (Invitrogen), e 2µL do cDNA produto da etapa de RT. No termociclado, a PCR foi submetida a 40 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 55ºC por 2 minutos e 72ºC por 3 minutos, finalizando coma extensão final à 72ºC por 10 minutos.
Após a realização do teste de RT-PCR, a amplificação do material genético foi visualizada em gel de agarose à 1,2%, corado com syber green (concentração 0,5µL para cada 10mL de gel) (invitrogen). O peso molecular utilizado foi o 100bp DNA Ladder (Invitrogen).
5.11 CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEÍNA VIRAIS
5.11.1 Pré preparo da amostra
A cultura celular de VERO C1008, clone E6 infectada com o JURV foi submetida a um pré-tratamento que teve como objetivo clarificar a amostra para melhor desempenho nos testes seguintes. A amostra foi centrifugada por 1 hora a 4ºC a 15.000 rpm, o sobrenadante foi, então, transferido por um filtro de seringa de 0,22 µm e depois por uma coluna de Amicon Ultra 100kDA.
41
5.11.2 Enriquecimento da proteína alvo
Para enriquecimento da proteína alvo, foi utilizado o kit Protein A HP SpinTrap (GE Healthcare). Utilizou-se o protocolo de cross-link onde a proteína A é responsável pela captura de anticorpos que são covalentemente ligados à ela e esses anticorpos utilizam um agente cross-link para realizar a ligação à proteína de interesse. A proteína de interesse, então, é enriquecida, purificada através de lavagens consecutivas e eluída da coluna sem os anticorpos, que estão ligados a matriz. Todo o protocolo é dividido em várias etapas:
-Etapa 1: Remover a solução armazenada na coluna;
-Etapa 2: Equilibrar a coluna;
-Etapa 3: Ligar o anticorpo à coluna contendo a Proteína A;
-Etapa 4: Adicionar tampão de ligação;
-Etapa 5: Adicionar o tampão cross-link A;
-Etapa 6: Adicionar tampão contendo Dimethyl pimelimidate dihydrochloride;
-Etapa 7: Lavar a coluna com tampão cross-link A;
-Etapa 8: Bloquear a membrana com tampão cross-link B;
-Etapa 9: Adicionar tampão de eluição para remoção de anticorpos não ligados;
-Etapa 10: Adicionar tampão de ligação;
-Etapa 11: Adicionar a amostra viral e, após incubação de 60 minutos, centrifugar para retirar todas as proteínas não ligadas. Nessa etapa coleta-se a primeira amostra.
- Etapa 12: Adicionar tampão de lavagem e centrifugar por 1 minuto. Esse procedimento é realizado 5 vezes, e é coletado uma amostra depois de cada centrifugação, gerando 5 amostras, no total. 42
-Etapa 13: Adicionar solução de eluição e proceder para a centrifugação. Esse procedimento é realizado 2 vezes, e é coletado uma amostra após cada centrifugação, gerando 2 amostras, no total.
Todas as instruções foram realizadas segundo o manual do fabricante. Um resumo esquemático é demonstrado na Figura 4.
Figura 4 – Resumo esquemático do kit Protein A HP SpinTrap (GE Healthcare).
Fonte: GE Healthcare (adaptado).
5.11.3 Eletroforese em gel de acrilamida (SDS-PAGE)
Após o enriquecimento da proteína alvo, as proteínas foram verificadas através da eletroforese de acrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A amostra foi inserida nos poços do gel de separação (Acrilamida 30%, 1,5M TrisHcl pH 8.8, H2O milli-Q, SDS 10%, APS 10%, TEMED ultra puro) e do gel de empilhamento (Acrilamida 30%, 1M TrisHcl pH 6.8, H2O milli-Q, SDS 10%, APS 10%, TEMED ultra puro), e submetida a uma corrente de 30mA por 40 minutos em cuba vertical de eletroforese contendo tampão de corrida para a passagem de corrente elétrica.
A coloração do gel foi feita com coomassie blue R250 (VETEC), metanol,
ácido acético e H2O milli-Q. O gel foi retirado da cuba de eletroforese e mergulhado 43 na solução de coloração por uma hora e depois na solução descorante contendo metanol, ácido acético e H2O milli-Q. O peso de proteína utilizado foi o Benchmark Protein Ladder (Invitrogen).
5.11.4 Western Blot
Foi feito um gel de acrilamida em SDS-PAGE descontínuo a 10%, para realizar a separação eletroforética das proteínas da amostra. O gel correu em cuba de eletroforese vertical a 30mA por 40 minutos.
O gel de acrilamida foi transferido para a membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences poro de 0,45µm) em sistema semi seco Trans-blot SD Semi-dry transfer cell (BIORAD), utilizando tampão de transferência (48mM Tris
Base, 39mM Glicina, 1,3mM SDS, 20% Metanol e H2O milli-q). A transferência durou 30 minutos com a fonte com voltagem à 20V. A membrana foi bloqueada com solução de bloqueio PBS-Tween 0,05% (Na2HPO4 0,05M, NaCl 0,15M, 0,05% de Tween-20, pH 7.4 contendo 5% de lectina de leite), por duas horas sob agitação.
Após o bloqueio, a membrana foi lavada três vezes com PBS tween 0,01% pH 7.5 em agitador automático. O soro foi diluído 1:500 (PBS Tween 0,01% + lectina 1%), e incubado com a membrana durante uma hora a temperatura ambiente em agitador automático. Após esse tempo, a membrana foi incubada com o conjugado anti-mouse associado com a peroxidase por 1 hora em agitador automático. Após nova lavagem, a membrana foi revelada com solução de revelação (6mg diaminobenzidina diluída em 50 mL de PBS e 1 mL de H2O2 30%), incubada até aparecer alguma banda e depois lavada em H2O destilada.
44
6 RESULTADOS
6.1 INFECÇÃO NA CULTURA CELULAR
As células VERO C1008 clone E6 na primeira passagem, após 3 dias de pós inoculação (p.i) do VJUR, apresentaram 70% de ECP caracterizado pela intensa destruição da monocamada celular e acúmulo de células refringentes no sobrenadante. Para cada inoculação foi utilizado controle da cultura utilizando células de VERO C1008 clone E6 não inoculadas (Figura 5). A replicação viral nas células infectadas foi confirmada por IFI (dados não mostrados) e por RT-PCR (item 6.2).
Figura 5 – Células VERO C1008 clone E6 não infectadas (esquerda), e células VERO C1008 clone E6 após três dias da infecção (direita), mostrando o ECP caracterizado por destruição da monocamada celular.
Fonte: Próprio autor.
6. 2 DADOS DO SEQUENCIAMENTO
Foram realizadas duas corridas da amostra de cérebro de camundongo infectado. A primeira corrida obteve-se um total de 406.963 leituras (reads) e 1.671.628 reads na segunda corrida. Após a montagem, foram gerados 89.562 reads, contendo um total de 13.615 contigs, cujo maior contig foi de 6.753 nucleotídeos (nt). A cobertura de sequencia foi superior a 3.000 vezes (cobertura = tamanho do genoma/número de leituras). 45
Paralelamente ao sequenciamento do isolado de cérebro de camundongo infectado no Centro de Inovações Tecnológicas no Instituto Evandro Chagas (CIT/IEC), o VJUR também foi processado (através do sequenciador Illumina) e analisado na University of Texas Medical Branch (UTMB), em Galveston, Texas, pela equipe do Dr Nikkos Vasislaski., obtendo-se duas sequências consensos derivadas de uma de cultura de célula VERO C1008, clone E6 infectada com o vírus, e a outra de cérebro de camundongo infectado. Não foi possível disponibilizar os dados gerados no sequenciamento na UTMB.
6.3 DESCRIÇÃO DO GENOMA
Após a montagem das sequências obtidas no CIT/IEC, obteve-se um genoma de ácido ribonucleico (RNA) de 5.020nt, dividido em: três cadeia aberta de Leitura (Open Reed Frame - ORF), duas regiões inter gênicas (RIG), uma região 5’ não traduzida (5' untranslate region - 5’UTR), e uma região 3’ não traduzida (3’UTR) (Tabela 1). As predições do tamanho da proteína e do ponto isoelétrico foram feitas através do programa Geneious. O esquema do genoma do VJUR é mostrado na Figura 6.
Tabela 1 – Descrição das características do genoma do vírus após as análises das sequências.
Componentes Ponto nt Posição aa Tamanho proteína do genoma isoelétrico 5’ UTR 49 1 a 49 - - - ORF 1 1.143 50 a 1.192 380 41.47 kDa 9.93 RIG 1 48 1.193 a 1.240 - - - ORF 2 1.443 1.241 a 2.683 480 55.02 kDa 9.76 RIG 2 35 2.684 a 2.718 - - - ORF 3 1.812 2.719 a 4.530 603 66.16 kDa 8.48
3’ UTR 490 4.531 a 5.020 - - -
Fonte: próprio autor. Legendas: nt: nucleotídeos ; aa: aminoácidos.
46
Figura 6 – Figura representativa do genoma descritivo do vírus Juruaçá.
Fonte: próprio autor
6.4 SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃO, MOTIVOS CONSERVADOS E SÍTIOS DE CISTEÍNAS
A análise da sequência referente à proteína da ORF1 (380 aa) e da ORF3 (603), através do software InterproScan, não encontrou homologia com os bancos de dados de proteínas. A análise dos 480 aa referentes à ORF2 encontrou um domínio relacionado á proteína RNA polimerase dependente de RNA (RpdR), entre as posições 201 à 317 (Figura 7).
Figura 7 – Resultado obtido após a análise através do InterproScan referente à sequência de aminoácidos da ORF 2.
Fonte: InterproScan.
As sequências de aminoácidos analisadas com o uso da ferramenta NetNGlyc (motivo Asn-X-Ser/Thr) mostraram um sítio potencial para N-glicosilação na sequência da proteína relacionada à ORF1 na posição 158 (Figura 8). Foram encontrados também cinco resíduos de cisteínas na referida proteína.
A análise da sequência de aminoácidos referente à ORF 2 mostrou quatro sítios potenciais para N-glicosilação nas posições: 89, 216, 320 e 336, e também foram encontrados 17 resíduos de cisteínas (Figura 9). 47
Figura 8 – Resultado da análise da sequência de aminoácidos referente à ORF 1 pelo software NetNGlyc.
MAHQGAAPPPGNRGGPAAPPRGWLPGQPAPGAPQPPAVAVNNQPVGFGQVAAPVAHGQAVNRGPNNGQQQ GLNLHVVNNNAPNLAEPPDDALAMHWYIPWRTPATRRQAPHWKTSFSVTTGIIIARSAVPKLVESLVDITRPVGFW QHTKQMAWDFLNLTAALASPHIALAQIYGYESTGHMIGNIKATAIAIWEGSHQCAAHEFWKLVQRTMPMFRRITGV LALASASWCAYRYVTYVTRGPPPFEPEGFAGPTTCVEVTQERALASPTHFACPAGLRALITEKAMMLERTPQLIQ KMKGIAGRWCDEHGINPMERPAFIAGAVAAAMTVPRLELDLVAYQRRWEVQYAQRQIAHAAMQGDPAPPHELF WRWLTNPGRR
Fonte: NetNGlyc. Nota: Abaixo do gráfico está a sequência com a predição do sítio em vermelho e a probabilidade da predição.
Figura 9 – Resultado da análise da sequência de aminoácidos referente à ORF 2 pelo software NetNGlyc.
MRQGAVIRVPTSYEHVERVHRILWQPSRHKEVSVHNACLCNEVISLRNRVLFDTPVPDRSFVEHAKRVAHRIALY VGKHQPADGDWIRNYTGKKRTIYENAREDLITVPFCKGKDRYVKSFIKMEKVFDPEKDPRMIQARNPRFNYLLGN YLKPIEHIIYNMKGKRQLRKIFPPTRCIAKCLDLRTRAQLLKRKFESIPNAICYSLDASRFDAHVNPSLLNLEHSIYKY CYSNDRLLQQLLSCQLLNRGVTSNGVRYRCPGGRMSGDMNTALGNCLLMCIIVATCMRIMGFRAGEWEMFCDG DDTLVIINANRSQLFEQNFSNLFNRAGMNMKLENKSNKISGIKFCQGCVINTADGAKFVSDPDRTLSRALISTRHFQ HPKSIGPLLRQIGLCELAIHCGVPILQEFALAMLRNAGNAQIHKIQPSGRLIKAKRELYAHGGKIDPLPITMDARLDFE EAFGIETWEQHQLEAELRGAVF
Fonte: NetNGlyc. Nota: Abaixo do gráfico está a sequência com a predição do sítio em vermelho e a probabilidade da predição. 48
A análise da sequência de aminoácidos referente à ORF 3 mostrou dois sítios potenciais para N-glicosilação nas posições: 128 e 412, e também foram encontrados três resíduos de cisteínas (Figura 10 ).
Figura 10 – Resultado da análise da sequência de aminoácidos referente à ORF 3 pelo software NetNGlyc.
MTPDRPRGLNFGIMASRRRRRTGAAARAPVPSPSPSQNNQQQNAVNRVIGYAAGQPILLAGGRRRRRRQPPVQ RTRRRLVPRTQAAEQGWWFLGNFHIDEHSEIGLLDATFLHPSNFPNTPYSAANLNFSHRTEYRWSLEIHVTSAVT TGARVAVLAIPNPEWNPVEVPLSLIWGATQNGMGTMVTATGINGRQAGFSITTSTLRLSNSRPTLGSWVGHSAGL LVVYLLDPPRGTTGPAPMTVTVLAKVNQRVHNPIPGFLNWADEDMPGPKPQSAVLQQAVSDITSQIPVNSHTATA WLAGGMYWKLVDGSSWSTGLTGELWVYAVYTASHHPYDWQNNDSQLRDPKYLVTWHEPASGVIQMVGFEDY ATAQAQASGTTAKIPHGAELCIQYRDDATFRRWEGKFQGLTNNVSIILTLIWKSPQAYLLKKSGFRQPRDLPHPGA TSLRMGITPSLLPHQPRGVEASHATSTTVSQQVIHLGQRLDNLEQLLRRSLHVSHHQETMLPEENCSMRSESSVA STRLSGENLSPSETSTSSTMIGLFRRATSWLASSNESVPSLQLSAATSSERLTISPDSSDTSFEIVGPLPTPDQLHP PCDDPLCDICFEDDNESAV
Fonte: NetNGlyc. Nota: Abaixo do gráfico está a sequência com a predição do sítio em vermelho e a probabilidade da predição.
6.5 ANÁLISE DE SIMILARIDADE
A análise com o software Blast-X das sequências da ORF 1 e ORF 3 não demonstrou nenhum resultado de similaridade. A análise referente à ORF 2 mostrou uma similaridade de 33% com o domínio da RpdR do vírus Pelargonium line pattern vírus, pertencente à família Tombusviridae.
49
6.6 ANÁLISE FILOGENÉTICA
Para a construção da árvore filogenética pelo método de Agrupamento de vizinhos foram utilizados vírus de RNAss pertencentes à famílias cuja morfologia apresentada é icosaédrica com diâmetro aproximado de 30nm, dos quais têm-se: Alphatetraviridae, Alvernaviridae, Arteriviridae, Astroviridae, Caliciviridae, Dicistroviridae, Hepeviridae, Leviviridae, Luteoviridae, Nodaviridae, Permutotetraviridae, Picornaviridae, Secoviridae, Tombusviridae e Tymoviridae. A região utilizada do VJUR foi a ORF 2, devido ser, provavelmente, a polimerase viral e portanto a mais conservada. O vírus Juruaça agrupou próximo aos vírus da família Tombusviridae (bootstrap 100%), porém em um ramo distinto (Figura 11, Figura 12).
50
Figura 11 – Árvore filogenética do VJUR pelo método de Agrupamento de vizinhos utilizando vírus de RNAss.
Família Tombusviridae
Juruaça-BEAN401933 Família Tymoviridae Família Alphatetraviridae Família Hepeviridae Família Luteoviridae Família Não Classificado Família Alvernaviridae Família Nodaviridae Família Leviviridae Família Astroviridae Família Permototetraviridae Família Caliciviridae Família Arteriviridae
Família Secoviridae
Família Dicistroviridae Legenda de hospedeiros:
PLANTAS
INVERTEBRADOS
HUMANO E VERTEBRADOS Família Picornaviridae NÃO HUMANOS
MICROORGANISMOS EUCARIOTOS
BACTÉRIAS
51
Legenda da árvore filogenética: TCV/NC_003821: Turnip crinkle vírus; CCFV/NC_001600/Australia: Cardamine chlorotic fleck vírus; HCRSV/NC_003608/ ElSalvado: Hibiscus chlorotic ringspot vírus; JINRV/NC_002187: Japanese iris necrotic ring vírus; MNSP/NC_001504: Melon necrotic spot vírus; PSNV/NC_004995/Japao/2002: Pea stem necrosis vírus; SoYMMV/NC_011643/Coreiado: Soybean yellow mottle mosaic virus; CPMoV/NC_003535/Nigeria: Cowpea mottle vírus; NLVCV/NC_009017/Alaska/20: Nootka lupine vein-clearing vírus; SCV/NC_001780: Saguaro cactus vírus; CbMV/NC_021926/USA/2002: Calibrachoa mottle vírus; AnFBV/NC_007733/USA/2006: Angelonia flower break vírus; CarMV/NC_001265: Carnation mottle vírus; PFBV/NC_005286 /Espanha/20: Pelargonium flower break vírus; HnRSV/NC_014967/USA/2011: Honeysuckle ringspot vírus; PelRSV/NC_026240: Pelargonium ringspot vírus; ELV/NC_026239: Elderberry latent vírus; PCRPV/NC_005985: Pelargonium chlorotic ring pattern virus; RrLDV/NC_020415/USA/2009: Rosa rugosa leaf distortion vírus; MCMV/NC_003627: Maize chlorotic mottle vírus; PLPV/NC_007017/Alemanha/2: Pelargonium line pattern vírus; CMMV/NC_0111108/ReinoUnid: Cocksfoot mild mosaic vírus; TPAV/NC_021705/USA/2005: Thin paspalum asymptomatic vírus; PMV/NC_002598/USA/1957: Panicum mosaic vírus; GaMV/NC_001818: Galinsoga mosaic vírus; FNSV/NC_020469/Colombia/2: Furcraea necrotic streak vírus; TNVA/NC_001777: Tobacco necrosis virus A; OMMV/NC_006939/Portugal/2: Olive mild mosaic vírus; OLV1/NC_001721/Italia: Olive latent virus 1; TLeV1/NC_015227/USA/2006: Trailing lespedeza virus 1; CLSV/NC_007816/Canada/200: Cucumber leaf spot vírus; YSV/NC_022895/Nigeria/199: Yam spherical vírus; PoLV/NC_000939: Pothos latent virus genes; MWLMV/NC_009533/USA/2007: Maize white line mosaic vírus; JCSMV/NC_005287/Ira/2006: Johnsongrass chlorotic stripe mosaic vírus: BBSV/NC_004452/ China/1980: Beet black scorch vírus; TNVD/NC_003487/Hungria/19: Tobacco necrosis virus D; LWSV/NC_001822/Franca/199: Leek white stripe vírus; MNeSV/NC_007729: Maize necrotic streak vírus; CBLV/NC_004725/Bulgaria/2: Cucumber Bulgarian latent vírus; EMCV/NC_023339/Israel/200: Eggplant mottled crinkle vírus; PLV/AY100482: Pear latent vírus; LNV/DQ011234/Taiwan: Lisianthus necrosis vírus; LNSV/JN700748/USA/1998: Lettuce necrotic stunt vírus; MPV/NC_020073/Marrocos /19: Moroccan pepper vírus; CNV/NC_001469: Cucumber necrosis vírus; CyRSV/NC_003532: Cymbidium ringspot virus; PeNSV/NC_005285: Pelargonium necrotic spot vírus; PNSV/AJ607402: Pelargonium necrotic spot vírus; AMCV/NC_001339: Artichoke mottled crinkle vírus; CIRV/GQ259480/Italia/2009: Carnation Italian ringspot vírus; CIRV/NC_003500: Carnation Italian ringspot vírus; GALV/NC_011535/Japao: Grapevine Algerian latent virus; TBSV/NC_001554: Tomato bushy stunt vírus; PEMV2/NC_003853: Pea enation mosaic virus-2; CMoV/KF533713/ReinoUnido: Carrot mottle vírus; CMoV/NC_011515/Alemanha/2: Carrot mottle vírus; CMoMV/NC_001726 /Australia: Carrot mottle mimic vírus; GRV/NC_003603/AfricadoSul: Groundnut rosette vírus; ETBTP/NC_024808/Ethiopian: Ethiopian tobacco bushy top vírus; TBTV/NC_004366/China/2001: Tobacco bushy top vírus; OPMV/NC_027710/NovaZeland: Opium poppy mosaic vírus; OCST/NC_003633: Oat chlorotic stunt vírus; BYDVGAV/NC_004666: Barley yellow dwarf virus-GAV; DRVX1/AB033715: Dianthovirus RVX1; CRV/NC_003530: Carnation ringspot vírus; RCNMV/NC_003756: Red clover necrotic mosaic vírus; SCNMV/NC_003806: Sweet clover necrotic mosaic vírus; Juruaca_BEAN401933: Vírus Juruaçá; OBDV/NC_001793: Oat blue dwarf vírus; 52
GFkV/NC_003347/Italia/199: Grapevine fleck vírus; APLV/NC_020470/Colombia/1: Andean potato latent vírus; NCBV/NC_001990/AfricadoSu: Nudaurelia capensis beta vírus; DpTV/NC_005898/China/2005: Dendrolimus punctatus tetravirus; HEV/KR872417: Hepatitis E vírus; CuTV/NC_015521/USA/1988: Cutthroat trout vírus; PLRV/NC_001747: Potato leafroll vírus; PEMV1/NC_003629: Pea enation mosaic virus-1; SCPMV/NC_001625: Southern cowpea mosaic vírus; HcRNAV/NC_007518: Heterocapsa circularisquama RNA vírus; NV/NC_002690: Nodamura vírus; SJNNV/NC_003448: Striped Jack nervous necrosis vírus; EPMS2/NC_001417: Enterobacterio phage MS2; EPQB/NC_001890: Enterobacteria phage Qbeta; TAstV1/NC_005790/USA/2000: Turkey astrovirus 2; RA/NC_025346/USA/2010: Rabbit astrovirus; TaV/AF282930: Thosea asigna vírus; WAC/NC_004541: Walrus calicivirus; SaV/NC_010624/Tailandia/2: Sapovirus Mc10; NAV1/NC_007916/ReinoUnido: Newbury agent 1 virus; RHDV/NC_001543/China/1991: Rabbit hemorrhagic disease vírus; PRRSV/NC_001961/Americado: Porcine respiratory and reproductive syndrome vírus; ToTV/NC_009013/Espanha/20: Rice tungro spherical vírus; CRLVpot/NC_006271/USA/200: Broad bean wilt virus 2; RTSV/NC_001632: Bean pod mottle vírus; PYFV/NC_003628: Parsnip yellow fleck vírus; SDV/NC_003785/Japao/1979: Satsuma dwarf vírus; TomRSV/NC_003840: Tomato ringspot vírus; BPMV/NC_003496: Cherry rasp leaf vírus; BBWV2/NC_002690: Tomato torrado vírus; IAPV/NC_009025/Israel/200: Cricket paralysis vírus; CrPV/NC_003924/Australia: Israel acute paralysis virus of bees; ssRNAV/NC_007522/Japao/20: Schizochytrium single-stranded RNA vírus; RsRNAV1/NC_018613/Japao: Rhizosolenia setigera RNA virus 01; PnPV/NC_003113/Taiwan/199: Perina nuda vírus; ChPV2/NC_024766/HongKong: Chicken picornavirus 2; DHV1/NC_008250/USA/1949: Duck hepatitis A virus 1; HPeV/NC_001897: Human parechovirus; SPaV1/NC_018226/Franca/20: Swine pasivirus 1; SePV1/NC_009891/Canada/20: Seal picornavirus type 1; KuV/KC935379/Hungria/2011: Kunsagivirus 1; HAV/NC_001489: Hepatitis A vírus; AEV/NC_003990: Avian encephalomyelitis vírus; PSV1/NC/003987: Porcine sapelovirus 1; EVC96/KF495604/China/2011: Human enterovirus C96; SVV001/NC_011349/USA/2002: Seneca valley vírus; EMCV/NC_001479: Encephalomyocarditis vírus; MSP1/JQ814851/China/2010: Miniopterus schreibersii picornavirus 1; ERAV/NC_003982: Equine rhinitis A vírus; HCoV/NC_023984/Holanda/19: Human cosavirus; ERBV1/NC_003983: Equine rhinitis B virus 1; PTV1/NC_003985: Porcine teschovirus 1; BHuV1/NC_018668/Hungria/2: Bovine hungarovirus 1; >MoVA2/NC_023987/Hungria/2: Mosavirus A2; RoV2/NC_024070/Gambia/200: Rosavirus 2; CPDV/NC_021178/HongKong/2: Canine picodicistrovirus; TVH/NC_021201/USA/2008-20: Turkey hepatitis virus 2993D; SaliV-FHB/NC_025114/China: Salivirus FHB; TV3/NC_014413/China/2006: Turdivirus 3; SakoVA/NC_022802/Portugal: Feline sakobuvirus A; AV/NC_001918/Paquistao/19: Aichi vírus; TuGV/NC_018400/Hungra/201: Turkey gallivirus; TV1/NC_014411/China/2007: Turdivirus 1; JSY/NC_028380/China/2015: Chicken sicinivirus JSY.
53
Figura 12 – Amplificação do primeiro ramo da árvore filogenética. Em destaque, o vírus Juruaçá.
Família Tombusviridae
Juruaça-BEAN401933 54
6.7 RT-PCR
Para verificar a detecção do genoma viral a partir das três ORFs identificadas, foram desenhados três conjuntos de iniciadores para realização do teste de RT-PCR (Tabela 2).
Tabela 2 - Iniciadores desenhados para utilização no protocolo de RT-PCR do VJUR.
Primer Descrição Tamanho senso ATCATTATAGCGAGATCGGC ORF 1 575pb reverso TTGATTCCATGCTCATCACA senso GAGGATAATGGGCTTCAGAG ORF 2 463pb reverso ATGCGCGTATAGTTCTCTTT senso TTCACATTGATGAGCACTCA ORF 3 702pb reverso CTGTGTAGACAGCATAGACC
Fonte: próprio autor.
Os testes de RT-PCR foram feitos tanto com a cultura celular de VERO C1008 clone E6 infectada, quanto em cérebro de camundongo infectado. Observou- se a amplificação do material genético da ORF1, ORF2 e ORF3 nos dois tipos de amostras infectadas, cujos tamanhos de fragmentos foram de 575pb, 463pb e 702pb respectivamente (Figura 13).
55
Figura 13 – Gel de agarose 1,2% mostrando a amplificação do material genético, utilizando os iniciadores relacionados à ORF 1 (A), ORF 2 (B), ORF 3 (C) em amostras de cultivos celulares e de camundongos infectados .
A B
Legenda (A): 1- Peso molecular; 2- Legenda (B): 1- Peso molecular; 2- Cérebro de camundongo infectado pelo Cérebro de camundongo infectado pelo VJUR na diluição 1:1; 3- Cérebro de VJUR; 3- Cultura celular infectada pelo camundongo infectado pelo VJUR na VJUR na diluição 1:1; 4- Cultura celular diluição 1:10; 4- Cultura celular infectada infectada pelo VJUR na diluição 1:10; 5- pelo VJUR na diluição 1:1; 5- Cultura Cultura celular infectada pelo VJUR na celular infectada pelo VJUR na diluição diluição 1:100; 6- Controle negativo. 1:10; 6- Controle negativo.
C Legenda (C): 1- Cultura celular infectada pelo VJUR na diluição 1:1; 2- Cultura celular infectada pelo VJUR na diluição 1:10; 3- Cultura celular infectada pelo VJUR na diluição 1:100; 4- Controle negativo; 5- Peso molecular.
Fonte: Próprio autor.
56
6.8 GEL DE ACRILAMIDA
Foi feito um gel descontínuo de acrilamida com os produtos do kit Protein A HP SpinTrap (GE Healthcare): proteínas não ligadas, primeira lavagem, segunda lavagem, terceira lavagem, quarta lavagem, quinta lavagem, 1º eluído e 2º eluído (produtos das etapas 11, 12 e 13 – item 5.11.2). De acordo com o peso molecular, observamos quatro bandas correspondente a proteínas de 120kDa, 70kDa, 60 kDa e 30 kDa aproximadamente. Este experimento foi repetido e o mesmo resultado foi observado. (Figura 14).
Figura 14 – Gel descontínuo de proteínas dos produtos do kit Protein A HJ SpinTrap. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Fonte: Próprio autor. Legenda: 1- Peso molecular; 2- Proteínas não-ligadas; 3- Primeira lavagem; 4- Segunda lavagem; 5- Terceira lavagem; 6- Quarta lavagem; 7- Quinta lavagem; 8- Primeiro eluído; 9 - Segundo eluído. Destaque em vermelho para as alturas das bandas nos eluídos finais.
57
6.9 WESTERN BLOT
As amostras do kit Protein A HP SpinTrap referente à: proteínas não ligadas, eluído 1 e eluído 2 foram submetidas ao western blot e após a revelação da membrana apareceram duas bandas nas amostras eluídas que foram correspondentes aos tamanhos de 60kDa e 30kDa, aproximadamente (Figura 15).
Figura 15 – Resultado do western blot das 3 amostras.
A B C
Fonte: Próprio autor. Legenda: A - proteínas não ligadas; B – eluído 1; C – eluído 2. Destaque em vermelho para as alturas das bandas nos eluídos finais.
58
7 DISCUSSÃO
Os morcegos são considerados os mamíferos vertebrados mais abundantes, diversificados e geograficamente dispersos no mundo. Devido suas características anatômicas e estilos de vida próprios, são importantes vetores e reservatório dos mais diversos vírus (CALISHER et al., 2006). Diversas famílias virais já foram isoladas a partir de morcegos, tais como: Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Togaviridae, Flaviviridae e alguns desses vírus podem ser transmitidos de morcegos para humanos (TURNER, 1975; MURRAY et al., 1995; LAU et al., 2005; LEROY et al., 2005; TONG et al., 2012; THOMPSON et al., 2015).
Muitas espécies de morcegos possuem a capacidade de executar o voo à longas distâncias a procura de alimento durante a migração sazonal, o que aumenta a probabilidade de dispersão viral entre esses animais e para outros animais susceptíveis. Por exemplo, algumas variantes do RABV, identificadas em morcegos de vários locais, foram associadas a casos da doença em indígenas nos Estados Unidos da América e no Canadá (MONDUL; KREBS; CHILDS, 2003; ROHDE, 2004; RUPPRECHT; GIBBONS, 2004).
No Brasil, um estudo de surto realizado por Travassos da Rosa e colaboradores (2006) nas áreas rurais dos municípios de Portel e Viseu no Estado do Pará, isolou o vírus da Raiva antigenicamente caracterizado como Desmodus rotundus variante 3 (AgV3) em doze pacientes que relataram terem recebido mordidas de morcegos antes da manifestação dos sintomas encefálicos. Esse foi o primeiro surto no Brasil no qual o vírus da Raiva foi isolado tanto de humanos como de morcegos, sendo os isolados caracterizados geneticamente e antigenicamente. O número de casos de raiva urbana reduziu-se devido ao êxito de programas de vigilância e vacinação em cães e gatos. O que se tem observado na região Sul e Sudeste do país é o registro de raiva nesses animais causada pela variante relacionada ao morcego (AgV3) (BARBOSA et al., 2008; MENEZES et al., 2008; OVIEDO-PASTRANA et al., 2015).
Os vírus são muito bem adaptados ao seu hospedeiro, sendo capazes de demonstrar tanta estabilidade dentro do seu ambiente que podem provocar pouca ou nenhuma doença clínica nas espécies infectadas. Entretanto, quando um vírus 59 transpõe a barreira de espécies e chegam aos humanos os efeitos podem ser diversos. O vírus Hendra surgiu em um surto de doença respiratória em 1994 que infectou 20 cavalos e dois humanos, resultando na morte de todos os cavalos e de um humano. Em humanos, a taxa de mortalidade é de 57% (MURRAY et al., 1995b; SELVEY et al., 1995 ).
Após as análises do genoma do VJUR não foi verificada relação com nenhuma família viral anteriormente associada a morcego e esse resultado é discordante da conclusão relatada por Araújo (2006), no qual classificou o VJUR como membro da família Picornaviridae. Os critérios dessa classificação preliminar foram baseadas nas características biológicas, por meio da susceptibilidade celular e de camundongos albinos suíços recém-nascidos; características morfológicas observadas por microscopia eletrônica; por testes de sensibilidade ao Desoxicolato de Sódio (DCA) demonstrando a ausência de envelope viral; e finalmente, pela amplificação de genoma viral utilizando iniciadores genéricos para os Picornavírus, no qual esse foi o critério crucial para a determinação taxonômica na referida família. Entretanto, a utilização de iniciadores genéricos podem ser suscetíveis à amplificação inespecíficas e somente o sequenciamento genômico poderia confirmar a relação do VJUR com a família Picornaviridae e este foi o objetivo principal deste estudo.
As células VERO CCL-81 e C6/36 usadas no estudo de Araújo (2006) não foram susceptíveis à infecção pelo VJUR, ao passo que nos cultivos primários de células nervosas de camundongos foram confirmados a replicação viral. As células VERO C1008 clone E6 utilizadas no presente estudo são diferentes das células VERO CCL-81 utilizada por Araújo (2006). Possivelmente, as alterações genéticas que diferem as duas linhagens de células VERO possibilitou a replicação do VJUR na VERO E6 utilizada no presente estudo, mas não viabilizou a infecção viral da linhagem CCL-81 utilizadas anteriormente. Por esse motivo, a susceptibilidade à infecção viral foi diferente nas duas situações.
A cobertura adquirida após o sequenciamento do genoma do VJUR foi de 3.000x, sendo considerada alta, e demonstrando uma alta confiabilidade na recuperação dos dados. Ademais, o sequenciamento completo do seu genoma foi realizado em dois locais diferentes de pesquisa, e tanto no IEC quanto na UTMB, 60 foram obtidos resultados iguais. Portanto, essa reprodutibilidade dos dados em locais distintos, aliado a alta confiabilidade dos dados assegura a relação do VJUR à família Tombusviridae.
Por outro lado, os achados de Araújo (2006) quanto a morfologia viral - partículas virais esféricas medindo em torno de 30 nm de diâmetro - e a resistência ao DCA corroboram com as características tanto dos picornavírus quanto aos tombusvírus. De fato, a análise apenas das características morfológicas de um vírus pode gerar dúvidas quanto a classificação viral, tal como pôde ser comprovado no caso do vírus Trinitti primeiramente classificado como membro da família Togaviridae com base nas análises de microscopia eletrônicas (EL MEKKI et al., 1981), mas que após análise molecular do genoma observou-se que este vírus na verdade pertence à família Bunyaviridae (LIMA, 2015).
Os integrantes da família Tombusviridae possuem o genoma de RNA fita simples e polaridade positiva, linear com um ou dois segmentos, morfologia icosaédrica com a partícula viral medindo de 28 a 35nm de diâmetro, e tem como principal hospedeiros as plantas (KING et al., 2012). Entretanto, dois pontos precisam ser analisados antes de afirmar que o VJUR seja classificado na família Tombusviridae: a organização genômica do VJUR e o espectro de hospedeiros da família Tombusviridae.
A organização genômica do VJUR não foi relacionada a nenhum vírus de RNA de fita simples polaridade positiva (RNAss+) conhecido nem mesmo com os Tombusvírus. Das três ORF’s analisadas apenas a ORF2 foi reconhecida nos bancos de dados do InterproScan e Blast-X, tendo maior identidade (33%) com o vírus Pelargonium line pattern (família Tombusviridae), sendo relacionada ao domínio da RNA polimerase dependente de RNA (RpdR).
Quanto ao espectro de hospedeiros da família Tombusviridae, seus integrantes infectam comumente plantas e o VJUR foi isolado de morcegos e replica bem tanto em camundongos quanto em células de origem animal (VERO E6). Ademais, não há informações sobre a espécie do morcego no qual o VJUR foi isolado, nem o hábito alimentar desse morcego. Então, Será que um vírus de plantas seria capaz de infectar ou mesmo causar doença em animais? Para responder essa pergunta é necessário analisar algumas características do VJUR. 61
A metodologia de RT-PCR em dois passos utilizando o iniciador reverso na RT sugere que o VJUR apresente o genoma de RNAss+ e é possível encontrar entre vírus das famílias de vírus de RNAss+ diferentes tipos de hospedeiros, dos quais compreendem: homem, animais vertebrados, microorganimos eucarióticos, invertebrados, plantas, arqueobactérias e bactérias (KING et al., 2012). Para confirmação da polaridade positiva do genoma é necessário submete-lo á um gel bidimensional para certificar essa sugestão.
A RpdR é um componente catalítico importante no processo de transcrição e replicação no ciclo de vida dos vírus de RNA (STEITZ, 1998). Possui seis motivos estruturais altamente conservados dispostos na ordem Pre-A, A, B, C, D e E. A única exceção à essa ordem é encontrada em polimerases das famílias Birnaviridae e Permutatetraviridae (GARRIGA et al., 2007; FERRERO et al., 2012; ). Por apresentar alta conservação em seus motivos, o domínio da polimerase é utilizado para comparar, de forma evolutiva, vírus de diferentes famílias (POCH et al., 1989). O percentual de 33% de similaridade com a RpdR do vírus Pelargonium line pattern sugere que o VJUR é relacionado à família Tombusviridae, mas não necessariamente membro da referida família, devido ao fato de um único gene foi relacionado à RpdR e os dois outros genes virais não foram relacionadas a nenhum vírus no banco de dados.
Com relação a análise do genoma e das proteínas virais, os tamanhos das três proteínas virais preditas in silico corroboram com os tamanhos encontrados nos gel de proteínas: A proteína viral codificada pela ORF1 foi predita com peso de 41.7 KDa, sendo relacionada a banda no gel desnaturante na altura aproximada entre 25 a 30KDa; a proteína viral relacionadas à ORF2, com peso molecular predito de 55 KDa, foi relacionado à banda do gel desnaturante na altura de 60 kDa; e a ORF3, cujo peso molecular predito foi de 67.6 kDa, no gel desnaturante foi associada a banda protéica na altura de 70 KDa. A única proteína viral que o valor predito foi um pouco maior ao observado no gel foi a proteína da ORF1, mas é comum que algumas proteínas virais possam sofrer clivagem pós traducional e se apresente com tamanho menor ao serem identificadas no gel desnaturante de proteína (ALBERTS, 1998). 62
O resultados do Westen Blot sugerem que as proteínas das ORF1 e ORF3 apresentam características antigênicas e que, provavelmente, façam parte da estrutura do capsídeo.
A proteína ORF2 não foi detectada no teste de Western Blot, sugerindo que essa proteína não seja imunogênica. Muito embora algumas polimerase virais, tal como NS5 dos Flavivírus (RIVINO et al., 2013), seja imunogênica, é comum que proteínas não estruturais não induzam a resposta imune, por serem expressas apenas durante ciclo replicativo no interior das células (ALBERTS, 1998).
Através da análise da PCR foi possível verificar a presença do vírus tanto em culturas de células infectadas quanto em cérebros de camundongos infectados. O gel de polimerase referente à ORF1 demonstrou que o isolado obteve a altura esperada de 575pb, a amplificação referente à ORF2 demonstrou uma altura de 463pb e a ORF3 de 702pb, mostrando que os iniciadores específicos para as três ORF's, desenhados com base no sequenciamento obtido, foram eficientes para a amplificação do genoma. Portanto, o protocolo de RT-PCR estabelecido neste estudo pode ser usado para confirmação de infecções pelo VJUR em casos de investigação eco-epidemiológica em projetos futuros, por exemplo.
As análises no NetNGlyc demonstraram que, possivelmente, a proteína referentes à ORF3 é glicosilada. Entretanto, os vírus não envelopados, tais como Reoviridae, Picornaviridae e Tombusviridae, não possuem sítios de glicosilação (KING et al., 2012). Apesar desse resultado, a análise in silico é sugestiva e não comprovativa, para isso seria necessário testes bioquímicos adicionais para comprovar a presença ou não da glicosilação das proteínas virais, tal como a utilização do kit Pierce Glycoprotein Staining Kit (Thermo Scientific).
Apesar de ter sido isolado de um morcego de espécie não identificada, o VJUR foi mais relacionado com um vírus que pode ser isolado em plantas, mas que infectou camundongo e linhagens contínuas de células de células animais. Em camundongos neonatos causou uma reação inflamatória intensa, que levou ao óbito 100% dos animais infectados após sete dias da inoculação, devido à exacerbação da resposta imune no sistema nervoso central desses animais (ARAÚJO, 2006; FERREIRA, 2013). 63
Não há dados na literatura que relate um vírus capaz de transpor barreiras à nível de Reino, tal como sugere ter ocorrido com o VJUR. Há relatos de RABV ultrapassando barreiras evolutivas de gênero, família e Ordem. Baby e colaboradores (2015) relataram a detecção de RABV isolado em uma ave doméstica da espécie Gallus domesticus (galinhas) que foi, um mês antes, atacada e ferida por um cachorro de rua na Índia em um local onde existe uma população abundante de cachorros na rua e alta endemia de VRAB entre eles. Os testes moleculares realizados com a carcaça da ave, que faleceu após um mês do ataque do cachorro, mostraram positividade para o VRAB (BABY et al., 2015).
É possível encontrar casos de spillover de vírus que podem ter sido originados de morcegos, mas que são encontrados em humanos, como alguns paramixovírus, como o vírus Mumps, vírus do sarampo, vírus Parainfluenxa, vírus Canine distemper e vírus hepatite C (DREXLER et al., 2012). No presente estudo não foi possível detectar por metagenômica o material genético do morcego capturado, devido o esgotamento da amostra original de 1982, mas devido à estreita relação do VJUR com os vírus de plantas, especula-se que o morcego fosse do tipo frugívoro, mas não há dados suficientes para confirmar essa suposição. Sugere-se um estudo envolvendo a captura de morcegos na mesma área que foi capturado o morcego isolado com o VJUR para investigar, através de técnicas de biologia molecular a possível circulação do vírus entre esses animais na área de Trombetas, em Oriximiná.
Por outro lado, vários vírus relacionados à planta têm sido descritos na literatura durante os últimos anos, e atualmente estão classificados em 22 famílias, 108 gêneros e 1.019 espécies (KING et al., 2012). Entretanto, diversos estudos de metagenômica e sequenciamento de última geração indicam que a diversidade existente desse tipo de vírus vem sendo subestimada (WREN et al., 2006; GIAMPETRUZZI et al., 2012). Balique e colaboradores (2015) descreveram alguns achados que podem suportar a hipótese de que vírus de planta pode ultrapassar a barreira dos invertebrados e chegar aos vertebrados.
Os humanos, provavelmente, convivem com vírus de planta a milhares de anos através do plantio de alimentos e uso de fontes naturais para sua sobrevivência, e isso sustenta a hipótese de que esse tipo de vírus é inofensivo para 64 os seres humanos. Entretanto, se um vírus como esse conseguir quebrar a barreira de especificidade do hospedeiro e se tornar capaz de multiplicar em vertebrados, talvez essa multiplicação pode passar despercebida se não estiver associada com alguma sintomatologia e, então, não se adapta ao novo hospedeiro vertebrado, sendo incapaz de ser transmitidos para outros indivíduos. Não há nenhuma evidência que indique vírus de planta como agente causador de doença em humano e animais. Deve ser mais estudada a possível interação de vírus de planta com células de origem humana, que pode não ser necessariamente associado com a replicação viral em células hospedeiras, mas pode envolver a modulação a expressão de genes em células humanas por meio de mecanismos de interferência do RNA (REBOLLEDO-MENDEZ et al., 2013; BALIQUE et al., 2015).
O resultado da análise filogenética corroborou com o resultado do BlastX, mostrando que o VJUR é relacionado, mas não pertencente à família Tombusviridae.
Portanto, sugere-se que o VJUR seja um vírus novo, pertencente à uma nova família, mais relacionado com os vírus de RNAss+, segundo a classificação de Baltimore, não sorologicamente relacionado a nenhum outro grupo viral.
65
8 CONCLUSÃO
-O VJUR é susceptível à linhagem celular VERO C1008 clone E6;
-O genoma do VJUR é de RNA fita simples, polaridade positiva com 5020 nt;
-O VJUR foi relacionado filogeneticamente com os membros da família Tombusviridae;
-Sugere-se que o VJUR pertence á uma nova família dentro dos vírus de RNAss.
66
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