Evolución Del Nicho Climático Y De Rasgos Funcionales En El Género Neotropical Disyunto Azara Ruiz & Pav

EVOLUCIÓN DEL NICHO CLIMÁTICO Y DE RASGOS FUNCIONALES EN EL GÉNERO NEOTROPICAL DISYUNTO AZARA RUIZ & PAV.

Tesis Entregada A La Universidad De Chile En Cumplimiento Parcial De Los Requisitos Para Optar Al Grado De

Doctor en Ciencias Biológicas, mención Ecología y Biología Evolutiva.

Facultad De Ciencias

Por

Paz Nicole Montenegro Urbina

Noviembre, 2018

Director de Tesis Dr: Luis Felipe Hinojosa Opazo

Co-Director de Tesis Dra: María Fernanda Pérez Trautmann.

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD DE CHILE

INFORME DE APROBACION

TESIS DE DOCTORADO

Se informa a la Escuela de Postgrado de la Facultad de Ciencias que la Tesis de Doctorado presentada por la candidata.

Paz Nicole Montenegro Urbina

Ha sido aprobada por la comisión de Evaluación de la tesis como requisito para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas Ecología y Biología Evolutiva, en el examen de Defensa Privada de Tesis rendido el día 1 de Octubre, 2018.

Director de Tesis: D r. Luis Felipe Hinojosa Opazo......

Co- Director de Tesis Dra. Ma Fernanda Pérez Trautmann......

Comisión de Evaluación de la Tesis

Dr. Marco Méndez ......

Dr. Ramiro Bustamante ......

Dr. Lohengrin Cavieres ......

A mis hijos Florencia y Leonardo: Nunca pierdan la curiosidad

RESUMEN BIOGRÁFICO

Soy Paz Nicole Montenegro Urbina. Nací el 3 de Abril, 1985 en la VI Región, Chile, donde también recibí mis estudios Básicos y de Educación Media. Pregrado de mi educación superior lo realicé en la Facultad de Ciencias en Universidad de Chile, obteniendo el grado de Licenciado en Ciencias, mención en Biología. Realicé un Magíster en Ciencias, mención Ecología y Biología Evolutiva, en la misma Universidad, donde comencé a interesarme por la respuesta de la biota frente al cambio climático. Mi intención es continuar esta línea de investigación una vez terminado el Doctorado.

iii

AGRADECIMIENTOS

Esta tesis fue financiada por CONICYT a través de la beca de estudios doctorado nacional y beca de apoyo de realización de tesis doctoral n° 21110794, por IEB proyectos ICM P05-002 y PBF-23 e IEB AFB170008 (PIA, CONICYT), al proyecto Anillo ACT172099 (PIA, CONICYT) y a los proyectos FONDECYT N° 1150690-1171369-1141047. A CONAF por permitir la colecta de muestras en áreas protegidas gracias a la autorización n° 002/2014. Quisiera agradecer a mis tutores, Felipe Hinojosa y Fernanda Pérez por el apoyo, empuje y la ayuda material e intelectual que permitieron llevar a cabo este estudio. A la comisión revisora de la Tesis: Marco Méndez, Ramiro Bustamante y Lohengrin Caviedes por sus valiosas observaciones que hicieron de éste un mejor trabajo. A quienes me ayudaron y acompañaron en las campañas de colecta: Carmen Gloria Ossa, Maureen Murúa, Benito Rosende, Felipe Vera, Nicolás Lavandero, Gabriela Jolochin, Andrés González y Mauricio Cisternas. A Gioconda Peralta y Loreto Carrasco por su invaluable ayuda en el Laboratorio de Diversidad Molecular. Por enseñarme a utilizar los equipos y permitirme utilizar espacio para obtener secuencias de ADN y, por sobre todo, la disposición a enseñar y a ayudar frente a cualquier problema. Agradezco nuevamente a Carmencha por enseñarme a obtener los datos de los rasgos funcionales y en especial por su amistad y su contención emocional que me ayudó a seguir y no abandonar. A quienes me ayudaron con el análisis de los datos y me ofrecieron ayuda desinteresadamente: Darko Cotoras, Paulina Ossa, Nataly Glade, Alejandra Vidal, Federico Haretche, Hugo Ayarde y María José Dibán. A Juan Pablo Pino por guiarme entre los fósiles foliares del Sur de Sudamérica. Agradezco a Verónica Levín por su incalculable ayuda y trabajo, siendo un salvavidas de organización en un mar de muestras y datos. A Javiera Chinga, Nicolás Venegas, Nicolás Sáez, Isabel Mujica, Paula Núñez, Isidora Sepúlveda y Daniela Aros por su amistad e interesantes conversaciones de ciencia y la vida. A Alexandra Elbakyan, por su incalculable ayuda en el desarrollo de este y otros trabajos. A mi familia extendida y amigos, por todo el apoyo y cariño. A mi compañero de la vida, Ignacio Energici, por su apoyo ilimitado frente a cualquier problema y por ser el ayudante de terreno incondicional. Finalmente, agradezco a mi hija Florencia Energici, por enseñarme a ser eficiente en el uso del tiempo. Y a ti, hijo(a) que vienes en camino, junto con tu hermana, por ser las razones más grandes para sonreír y trabajar por un futuro mejor.

INDICE DE MATERIAS

Lista de abreviaturas VIII

Resumen/Abstract XI

Introducción General 1

Hipótesis 6

Objetivos 7

Modelo de Estudio 8

Referencias 10

Tablas 14

Figuras 16

Capítulo I 19

Hipótesis Filogenética de Azara y reconstrucción de área ancestral

Introducción 20

Materiales y métodos 24

Resultados 31

Discusión 35

Referencias 38

Tablas 46

Figuras 48

Capítulo II 55

Reconstrucción y evolución del nicho climático de Azara

Introducción 56

Materiales y métodos 60

Resultados 64

Discusión 66

Referencias 70

Tablas 78

Figuras 82

Capítulo III 85

Evolución y correlación de rasgos funcionales según variables climáticas

Introducción 86

Materiales y métodos 91

Resultados 97

Discusión 102

Referencias 105

Tablas 112

Figuras 120

Conclusiones Generales 127

Conclusiones 127

Anexo I 131

Descripción de las especies de Azara

Azara alpina 132

Azara celastrina 133

Azara dentata 134

Azara integrifolia 135

Azara lanceolata 136

Azara microphylla 137

Azara petiolaris 138

Azara salicifolia 139

Azara serrata 140

Azara uruguayensis 141

Anexo II 142

Protocolo de extracción y purificación de ADN genómico

Extracción 143

Purificación 144

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LISTA ABREVIATURAS

CNF: Conservatismo de Nicho Filético Ma: millones de años m: metros cm: centímetros mm: milímetros Km: kilómetros gr: gramos Kg: kilogramos ng: nanogramos pb: pares de bases

L: microlitros MPa: mega pascales ° C: grados Celsius ADN: ácido desoxirribonucleico InDel: Inserción-Deleción CTAB: Bromuro de Cetil-trimetilamonio UV: luz ultravioleta cpADN: ADN cloroplastidial nADN: ADN nuclear MP: Máxima Parsimonia MV: Máxima Verosimilitud IB: Inferencia Bayesiana AIC: Criterio de Información de Akaike

AICw: Criterio de Akaike ponderado MCC: credibilidad de clado máxima

viii

MRCA: ancestro común más reciente ENM: Modelo de nicho climático AUC: curva característica del receptor Bio1: Temperatura media anual Bio2: Promedio rango diurno Bio3: Isotermalidad Bio4: Estacionalidad de a temperatura Bio5: Temperatura máxima del mes más cálido Bio6: Temperatura mínima del mes más frío Bio7: Rango anual de temperatura Bio8: Promedio de temperatura del cuarto más húmedo Bio9: Promedio de temperatura del cuarto más seco Bio10: Promedio de temperatura del cuarto más cálido Bio11: Promedio de temperatura del cuarto más frío Bio12: Precipitación anual Bio13: Precipitación del mes más húmedo Bio14: Precipitación del mes más seco Bio15: Estacionalidad de la precipitación Bio16: Precipitación del cuarto más húmedo Bio17: Precipitación del cuarto más seco Bio18: Precipitación del cuarto más cálido Bio19: Precipitación del cuarto más frío PNO: Ocupación de nicho predicho.

Wmean: medias ponderadas de PNO

: Lambda, señal filogenética de Pagel MDI: índice de disparidad morfológica BM: Movimiento Browniano OU: Ornstein-Uhlenbeck WN: Ruido blanco

TLP: Potencial hídrico al punto de pérdida de turgor

0: Potencial osmótico en máximo turgor

: módulo de elasticidad

RWCTLP: contenido relativo de agua al punto de pérdida de turgor

LMA: relación peso seco/área foliar

MLA: promedio tamaño foliar

SD: densidad estomática kh: conductividad hidráulica

KS: conductividad hidráulica específica

LSC: conductividad foliar específica

WD: densidad de la madera

VDi: densidad de los vasos

VD: diámetro promedio de los vasos

HV: Valor Huber

CCA: Análisis de correlación canónica

RESUMEN

Estudios filogenéticos sugieren que los nichos climáticos de los linajes se conservan más de lo esperado, implicando que adaptaciones a condiciones climáticas novedosas no pueden ser alcanzadas por todos los linajes debido a restricciones morfológicas, fisiológicas o de desarrollo de los rasgos que permiten adaptación local a condiciones climáticas cambiantes (rasgos funcionales). Se ha propuesto que es más fácil moverse que cambiar, es decir, si existen corredores, las especies tenderán a conservar su nicho climático ocupando áreas para las cuales ya poseen los rasgos funcionales que le permiten sobrevivir. Por otro lado, si no existen estos corredores, los linajes locales aislados sufren fuertes presiones selectivas a desarrollar adaptaciones in situ, o de lo contrario, extinguirse.

Sudamérica ha sido escenario de fuertes cambios geológicos y climáticos los últimos 70 Ma. Se ha propuesto que, desde el Cretácico, el continente pasó de condiciones climáticas macrotermales con altas precipitaciones a desarrollar condiciones meso/microtermales en latitudes medias y altas, presentando estacionalidad de precipitación en algunas zonas a partir del Mioceno debido a al levantamiento de los Andes y el establecimiento de la Diagonal Árida.

En esta tesis se evaluó la labilidad del nicho climático del género neotropical de distribución disyunta Azara. Las 10 especies del género habitan en un macroclima mesotermal, donde algunas de ellas están sometidas a fuerte estrés hídrico. Se construyó una hipótesis filogenética del género para determinar la evolución del nicho climático a través de modelos computacionales y analizó la labilidad de rasgos funcionales como expresión fenotípica de la evolución del nicho climático de las distintas especies dentro del género.

Los resultados indican que este género tiene 48 Ma de antigüedad y el ancestro común habría habitado en latitudes medias, bajo condiciones micro/mesotermales. La hipótesis filogenética sugiere una especiación mediante diversificación por adaptación local y se propone que las especies en aislamiento tendría un origen por procesos vicariantes y dispersión a larga distancia. Según los análisis de la evolución del nicho climático, las especies de Azara no presentan señal filogenética de las variables ambientales, sugiriendo una rápida evolución de nicho. Los rasgos funcionales de Azara presentaron una alta labilidad según tolerancia y respuesta a distintas condiciones climáticas, consistente con desarrollo de adaptaciones in situ a condiciones climáticas locales en un contexto de clima cambiante.

ABSTRACT

Phylogenetic studies suggest that the climatic niche of lineages are preserved more than expected, implying that adaptations to novel climatic conditions cannot be reached by all lineages due to morphological, physiological or developmental restrictions of traits that allow local adaptation to changing climatic conditions (functional traits). It has been proposed that it is easier to move than to change, that is, if there are corridors, the species will tend to conserve their climatic niche by tracking areas for which they already possess the functional traits that allow them to survive. On the other hand, if these corridors do not exist, the isolated local lineages suffer strong selective pressures to develop in situ adaptations, or else they will become extinct.

South America has been the scene of strong geological and climatic changes in the last 90 Ma. It has been proposed that, since the Cretaceous, the continent went from macrothermal climatic conditions with high rainfall to developing meso/microthermal conditions in medium and high latitudes, presenting rainfall seasonality in some areas from the Miocene due to the uplift of the Andes and the establishment of the Arid Diagonal.

In this thesis the lability of the climatic niche of the Neotropical species of disjunct distribution Azara was evaluated. The 10 species of the genus inhabit a mesothermal macroclimate, where some of them are subjected to strong water stress. A phylogenetic hypothesis of the genus was constructed to determine the evolution of the climatic niche through computational models and analyzed the lability of functional traits as the phenotypic expression for climatic niche evolution of the different species within the genus.

The results indicate that this genus is 47 Ma old and the common ancestor would have inhabited medium latitudes, with micro/mesothermal conditions. The phylogenetic hypothesis suggests a speciation by diversification by local adaptation and it is proposed that the species in isolation would have an origin by vicariant and long-distance dispersal processes. According to the analysis of climatic niche evolution, Azara species do not present phylogenetic signals of environmental variables, suggesting a rapid niche evolution. Azara´s functional traits showed high lability according to tolerance and response to different climatic conditions, consistent with the development of in situ adaptations to local climatic conditions in a changing environment scenario.

xii

INTRODUCCION GENERAL

- Conservatismo de Nicho Filético

Los rasgos funcionales, es decir “las características morfo-fisio-fenológicas que influyen directa o indirectamente en la adecuación biológica a través de sus efectos sobre el crecimiento, reproducción y supervivencia” (Violle et al., 2007) tienen directa relación de cómo se relacionan las distintas especies vegetales con su medio ambiente, es decir, con su distribución en distintos gradientes ambientales y de cómo interactúan y sobreviven frente a distintas condiciones abióticas.

Estudios filogenéticos recientes sugieren que los nichos climáticos, es decir, el conjunto de condiciones de temperatura y precipitación donde una especie puede ocurrir (Grinnell, 1917;

Bonetti and Wiens, 2014) , se conservarían a través de los linajes de plantas vasculares (Pearson and Dawson, 2003), lo que estaría basado en la observación de la tendencia de los miembros de un clado a ocupar ambientes similares (Donoghue, 2008). Esta tendencia a la retención de requerimientos climáticos a través del tiempo se ha denominado “conservatismo de nicho filético” (CNF) (Peterson, Soberon, and Sanchez-Cordero, 1999; Wiens, 2004; Cooper, Jetz, and

Freckleton, 2010). El patrón de CNF ha sido explicado a través de restricciones a la modificación de rasgos funcionales relacionados a distintas tolerancias climáticas (Ackerly, 2004; Violle et al.,

2007; Crisp and Cook, 2012). Estas inferencias contrastan con numerosos estudios de linajes de plantas vasculares que presentan una amplia variabilidad en sus rasgos funcionales,

1 observándose diferencias fundamentales en su morfología y fisiología, los cuales estarían relacionados a las diferentes condiciones climáticas en las cuales habitan (Liu, Peterson, and Ge,

2011; Chang et al., 2012; Liu et al., 2012; Zhu, Xia, and Chen, 2012). Por ejemplo, en el caso de plantas leñosas de un mismo clado, entre la transición desde ambientes húmedos a secos se observa una reducción del tamaño foliar y la densidad estomática, adaptaciones que se asocian a disminución de evapotranspiración (Ackerly, 2004; Wright et al., 2004; Lambers, Chapin, and

Pons, 2008). En el caso de la temperatura, la transición hacia ambientes fríos o cálidos en un grupo monofilético generalmente está acompañada con la reducción del diámetro de los vasos y de un incremento en el número ellos, lo que estaría relacionado con la prevención de embolismo en condiciones de sequía o en ciclos de congelamiento-deshielo, sin que ocurra una importante reducción en la conductancia xilemática (Sperry, Donnelly, and Tyree, 1988; Sperry and Sullivan, 1992; Körner, 2003; Lambers, Chapin, and Pons, 2008). Se ha propuesto para explicar los marcados patrones de CNF y la presencia de distintas tolerancias ambientales dentro de los linajes el principio que es más fácil para las especies migrar a un área en la que puedan sobrevivir con los rasgos funcionales que ya poseen en vez de que cambiarlos y evolucionar in situ nuevas tolerancias (Donoghue, 2008; Donoghue and Edwards, 2014). Esto implica que en la evolución de los rasgos funcionales depende del grado de conectividad, es decir, producto de cambios climáticos y en áreas geográficas conectadas, las especies tenderían a seguir el hábitat para el cual están adaptados evitando la evolución local de tolerancias. Por otro lado, en un área geográfica aislada, frente a una fuerte presión selectiva, es probable que los rasgos funcionales evolucionen en los linajes residentes (Donoghue, 2008).

Debido a que las tolerancias ecofisiológicas de pocos organismos han sido estudiadas, propiedades más fáciles de obtener son utilizadas como aproximación a las tolerancias climáticas

2 de los organismos, asumiendo que representan sus rasgos funcionales (Crisp and Cook, 2012).

Por ejemplo, rasgos asociados a tolerancias climáticas generalmente se estiman mediante modelamientos de nicho climático, enfocándose en características macroecológicas como bioma y distribución altitudinal y latitudinal (Evans et al., 2009; Angulo, Ruiz-Sanchez, and Sosa, 2012).

Es muy interesante indagar si el patrón de CNF representa conservatismo en rasgos funcionales ya que algunos de estos rasgos serían poco proclives a modificarse, lo que implicaría que es necesario describir y detallar de forma más precisa la gama existente en la labilidad evolutiva de rasgos funcionales si se desea dilucidar las causas subyacentes al CNF (Donoghue,

2008).

- CNF en Sudamérica

Sudamérica presenta una composición y distribución de su biota que refleja su compleja historia biogeográfica. El continente presenta actualmente bosques distribuidos disyuntamente, separados física y climáticamente por la Cordillera de los Andes y la Diagonal Árida, una franja desértica que cruza el continente de Noroeste a Sureste (Villagran and Hinojosa, 1997) y actualmente se ha tratado de explicar este este patrón de distribución disyunta mediante procesos vicariantes y de dispersión a larga distancia. En el caso de géneros como Myrceugenia,

Bomarea, Escallonia, Azara, y en general taxa con distribución Neotropical, se ha propuesto que durante el Cenozoico tuvieron una distribución continua que se vio interrumpida debido al levantamiento de la Cordillera de los Andes, lo que ocasionó fragmentación y aislamiento mediante una barrera física a la dispersión, reforzado por drásticos cambios climáticos al establecerse definitivamente la Diagonal Árida (Hinojosa and Villagran, 1997), lo que habría

3 abierto nuevas oportunidades para diversificar mediante adaptación, particularmente a condiciones de sequía en zonas áridas y a la alta variabilidad interanual de precipitación

(Armesto, Kalin Arroyo, and Hinojosa, 2007; Gerold, 2008; Luebert and Pliscoff, 2017).

Se estima que Sudamérica enfrentó fuertes cambios climáticos y geomorfológicos durante el Terciario. Según antecedentes paleobotánicos de tafofloras terciarias de Sudamérica,

Hinojosa & Villagrán (1997) propusieron un modelo de evolución vegetacional según la sucesión de tipos de paleofloras (Neotropical, Antártica y Mixta) en un contexto de cambios geoclimáticos.

Este modelo propone que entre el Cretácico y el Paleoceno (95-57 Ma), cuando Sudamérica,

Antártica y Australia aún se encontraban unidas en Gondwana, lo que es hoy el cono sur de

Sudamérica presentaban Paleofloras Gondwánicas, con elementos fitogeográficos

Australasianos, Neotropicales y Pantropicales, elementos distribuidos actualmente en regiones cálidas y húmedas (Figura IA). Posteriormente durante el Paleoceno/Eoceno a Eoceno medio (57-

40 Ma) se habría mantenido una flora de tipo Gondwánica en lo que hoy corresponde al Noroeste

Argentino, pero en el cono sur de Sudamérica, se habría producido un reemplazo de la flora de tipo Gondwánica (Hinojosa, 2005) por una Mixta (mezcla de taxa subtropicales, subantárticos y endémicos), indicando descenso de temperaturas en esta zona (Figura IB). Posteriormente, durante el Eoceno superior al Oligoceno (40-24.7 Ma) ocurre la fragmentación de Australia y la glaciación de Antártica Este, lo cual implicó un importante descenso de temperatura y el reemplazo de flora Mixta en el cono sur de Sudamérica por flora de tipo Antártica, comprimiendo los cinturones de flora de tipo Mixta y Gondwánica hacia el norte (Figura IC). Durante el Mioceno inferior (24.7-15.3), Sudamérica se separa de la Antártica y una importante extensión continental se encuentra bajo transgresiones marinas, arrasando con una importante extensión de bosques

(Figura ID). Durante el Mioceno medio a Mioceno superior (15.3-5.1 Ma), comienza la surgencia

4 de la corriente de Humboldt y las trasgresiones marinas retroceden y se estima que la cordillera de los Andes habría alcanzado una altura suficiente para intervenir en la circulación atmosférica y la distribución de las precipitaciones (Le Roux, 2012b). Es en esta época que se sugiere comenzó a formarse el desierto de Atacama y a establecerse la Diagonal Árida, además de un incremento del contraste Invierno-Verano en las precipitaciones de la costa Oeste del Sur de Sudamérica.

Estos cambios climáticos tuvieron por consecuencia un nuevo tipo de paleoflora habría ocupado la zona central de Argentina y el sur de Bolivia: Paleoflora subtropical mésica (Figura IE).

Posteriormente, durante el Plioceno (5.1-1.63 Ma), el continente habría alcanzado la configuración geológica-climática actual y la flora subtropical mésica habría sido reemplazada por flora de tipo subtropical xérica alrededor de los 30°S al este de la Cordillera de los Andes

(Figura IF).

En el proceso de diversificación por especiación alopátrica en Sudamérica es interesante indagar si la biota ancestral poseía los rasgos morfológicos, fisiológicos y bioquímicos necesarios para soportar las nuevas condiciones climáticas que se establecerían en el continente durante el

Mioceno o, por otro lado, modificaron in situ sus rasgos funcionales, permitiéndoles sobrevivir en condiciones de aislamiento sujeto a cambios climáticos drásticos. En este sentido es de particular interés el género Azara (Salicaceae; Ruiz and Pavón, 1794), el cual consta de 10 especies que se distribuyen disyuntamente en el Cono Sur: A. serrata, A. integrifolia, A. dentata,

A. alpina y A. celastrina en Chile, A. lanceolata, A. microphylla y A. petiolaris en Chile-Argentina,

A. salicifolia en Argentina-Bolivia y finalmente A. uruguayensis en Brasil-Uruguay (Figura II).

Debido a que este género presenta su centro de diversidad en un área geográfica que ha sido sometida a fuertes cambios climáticos desde el Mioceno, además de cambios geomorfológicos del paisaje, surgen las siguientes preguntas e hipótesis:

1) ¿Las disyunciones presentes en Azara pueden explicarse mediante dispersión o

vicarianza?

Si el género Azara diversificó debido al efecto vicariante (barrera) de la Cordillera de los

Andes y/o Diagonal Árida, se espera que la diversificación del género que dio origen a la distribución disyunta coincida temporalmente con el establecimiento de estas barreras durante el Terciario.

2) ¿Se puede identificar conservatismo o labilidad en la evolución del nicho climático de

Azara?

Dado que Azara diversificó durante una época de fuertes cambios climáticos y geomorfológicos que resultaron en el desarrollo y establecimiento de barreras, entonces se espera que el género haya sufrido grandes presiones selectivas que derivaron en adaptaciones locales in situ a climas y microclimas que se fueron generando durante el Terciario.

3) ¿Los rasgos funcionales en Azara responden acorde a la evolución del nicho climático?

Si el género Azara presenta labilidad de nicho climático producto de adaptaciones in situ frente a un cambio climático en condiciones de aislamiento, entonces se espera que los rasgos funcionales las especies hermanas disyuntas del género no presenten similitudes y respondan sin restricciones filogenéticas a las condiciones climáticas locales.

OBJETIVOS

Objetivo General:

Reconstruir la evolución del nicho climático y de rasgos funcionales en el género Neotropical disyunto de Sudamérica Azara.

Objetivos específicos:

1. Reconstruir la historia biogeográfica del género Azara.

2. Determinar el tipo de evolución del nicho climático.

3. Determinar el modelo de evolución de los rasgos funcionales.

4. Determinar si Azara presenta un patrón de evolución de nicho climático y rasgos funcionales consistente con adaptaciones climáticas in situ.

- Modelo de estudio

Azara es un género neotropical de Angiospermas perteneciente a la familia Salicaceae, Orden

Malpighiales que consta de 10 especies. Son arbustos o árboles pequeños que alcanzan 1-8 m de altura. Las hojas son simples, alternas, en algunas especies pareadas, simples de 1-9 cm longitud y 0.5-5 cm de ancho. Las flores son pequeñas, sépalos verdes, libres; corola ausente, androceo con estambres numerosos, filamentos de color amarillo, gineceo de ovario súpero, con un cáliz

4-5 lobulado agrupadas en inflorescencias en cimas corimbiformes o racemiformes. Sus flores presentan un fuerte aroma y su síndrome de polinización es entomofilia. El fruto es una baya blanquecina, negruzca, roja o naranja de 3-10 mm de diámetro y varias especies se cultivan como planta ornamental para los jardines debido a su follaje y agradable olor, siendo su síndrome de dispersión por endozoocoría (Anexo I).

Actualmente, las especies de Azara son nativas de regiones subtropicales y templadas de Sudamérica, habitando zonas que presentan climas tipo B y, en su mayoría, C en la clasificación climática de Köppen (Tabla I, Figura III) (Kottek et al., 2006; Peel, Finlayson, and

McMahon, 2007). Los climas tipo B se caracterizan por una precipitación anual escasa y poseen un valor menor al umbral establecido de la evapotranspiración potencial; la segunda letra indica el grado de aridez (S = semiárido y W = desértico/árido) y la tercera letra el comportamiento de las temperaturas (h = cálido y k = frío). Los climas de tipo C se caracterizan por ser mesotermales/templados, es decir la temperatura media del mes más frío se encuentra entre -

3 y 18°C y la del mes más cálido supera los 10°C , con precipitaciones que exceden a la evaporación; la segunda letra explica el régimen de lluvias (f = precipitaciones constantes durante el año, w = invierno seco y s = verano seco) y la tercera letra el patrón de temperaturas

(a = subtropical, el verano supera 22°C media mes más cálido; b = Templado; verano no supera

22°C media mes más cálido y temperaturas medias superan 10°C al menos 4 meses al año y c =

Subpolar; verano no supera 22°C media mes más cálido y temperaturas medias de meses que superan 10°C son menos de 4 al año; Figura III). Mayores detalles de características morfológicas y distribución de Azara se encuentran en el Anexo I.

Para realizar esta tesis sobre la evolución del nicho climático de Azara, se colectó material vegetal fresco de distintas localidades (Tabla II) durante los meses Diciembre-Mayo

(2014-2015) para las especies que se pueden encontrar en Chile y durante los meses Abril- Mayo

2016 se realizó la colecta para las especies A. salicifolia y A. uruguayensis.

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Tabla I. Clima actual en los cuales ocurren las epecies de Azara según la clasificación Köppen. En negrita se destaca el clima en el cual habitan la mayoría de los individuos de cada especie.

Climas Especies B C Azara alpina Csb Azara celastrina BWk, BSk Csa, Csb Azara dentata Csb Azara integrifolia Csb, Cfb Azara lanceolata Csb, Cfb, Cfc Azara microphylla BWk Csb, Cfb Azara petiolaris BSk Csb Azara salicifolia BSk, BSh Cwa, Cwb Azara serrata Csb, Cfb Azara uruguayensis Cfa, Cfb

Tabla II. Localidades de colecta de las especies de Azara. Especie Localidad Latitud Longitud Laguna Maule 35°56'11.8''S 70°36'18.94''O A. alpina Lircay 35°36'1.75"S 71°3'20.27"O Siete Tazas 35°26'17.33"S 70°57'2.11"O El Canelo 33°22'2.69"S 71°41'31.24"O A. celastrina Peñuelas 33°9'20.70"S 71°32'59.04"O La Campana 32°58'50.70"S 71°10'20.61"O Peñuelas 33°9'20.70"S 71°32'59.04"O A. dentata Sn Carlos de Apoquindo 33°24'1.16"S 70°30'6.09"O Termas de Cauquenes 34°15'39.34"S 70°36'16.57"O Antuco 37°23'48.00"S 71°27'6.00"O A. integrifolia Lircay 35°36'1.75"S 71°3'20.27"O Nahuelbuta 37°48'7.92"S 73°0'40.72"O Contulmo 38°0'56.38"S 73°10'52.00"O A. lanceolata Huillinlebu 38°14'54.00"S 72°18'23.00"O Nahuelbuta 37°48'7.92"S 73°0'40.72"O Rariruca 38°21'18.00"S 38°21'18.00"S A. microphylla Nahuelbuta 37°48'7.92"S 73°0'40.72"O Huillinlebu 38°14'54.00"S 72°18'23.00"O Antuco 37°23'48.00"S 71°27'6.00"O A. petiolaris Lircay 35°36'1.75"S 71°3'20.27"O La Campana 32°58'50.70"S 71°10'20.61"O Culebrillas (1) 27°42'59''S 65°54'09''O A. salicifolia Culebrillas (2) 27°43'02''S 65°54'15''O Tafi del Valle 27°00'39''S 65°39'27''O Antuco 37°23'48.00"S 71°27'6.00"O A. serrata Lircay 35°36'1.75"S 71°3'20.27"O Nahuelbuta 37°48'7.92"S 73°0'40.72"O Cerro Pan de Azúcar 34°48'48''S 55°15'07''O A. uruguayensis Piriapolis 34°51'48.92"S 55°13'9.23"O Bellavista 34°46'42.00"S 55°20'50.00"O

Figura I. Evolución de las tafofloras del sur de Sudamérica durante el Terciario. A: Cretácico superior a Paleoceno, B: Paleoceno/Eoceno a Eoceno inferior-Eoceno medio, C: Eoceno superior a Oligoceno, D: Mioceno inferior, E: Mioceno medio a Mioceno superior y F: Plioceno. Clave de símbolos y achurados: 1: Corriente de Humboldt; 2: Cordillera de los Andes; 3: Transgresiones; 4: Desierto de Atacama; PALEOFLORAS: 5: Tropical; 6: Antártica; 7: Mixta; 8: Subtropical mésica; 9: Subtropical xérica; SA: Sudamérica, AN: Antártida; AU: Australia; => <= conexión; <= => desconexión; GAE: Glaciación de Antártida este; GAW: Glaciación de Antártida oeste. (Figura obtenida de Hinojosa & Villagrán, 1997)

Figura II. Distribución de las especies pertenecientes al género Azara.

Figura III: Clasificación climática de Köppen para el área de distribución de Azara.

Capítulo I: Hipótesis Filogenética de Azara y reconstrucción de área ancestral.

INTRODUCCION

Los cambios geológicos y climáticos ya sean a escala global o local, tienen una profunda influencia en la sobrevivencia, diversificación y extinción de la biota (Donoghue and Edwards, 2014).

Durante el Terciario, Sudamérica sufrió profundos cambios climáticos y geológicos que tuvieron un gran impacto en los organismos (Le Roux, 2012b). Periodos de calentamiento y enfriamiento, junto procesos pulsátiles de actividad tectónica, caracterizan los últimos 60 Ma (Villagran and

Hinojosa, 1997; Gregory-Wodzicki, 2000; Hinojosa, 2005; Hinojosa and Villagran, 2005; Graham,

2009; Ramos, 2009; Garreaud, Molina, and Farias, 2010; Le Roux, 2012b).

Producto de estos cambios, la composición y distribución de la biota de Sudamérica presenta patrones que reflejan su compleja historia biogeográfica. El continente presenta actualmente bosques distribuidos disyuntamente, separados física y climáticamente por la

Cordillera de los Andes y la Diagonal Árida (Figura 1.1), una franja desértica que cruza el continente de Noroeste a Sureste (Villagran and Hinojosa, 1997). Estos bosques disyuntos presentan además similitudes florísticas en su composición, compartiendo numerosos géneros como Alstroemeria, Drymis, Araucaria, Lithrea, Myrceugenia y Crinodendron, entre otros, que estarían sugiriendo una historia en común (Villagran and Hinojosa, 1997; Quiroga, 2010).

Para explicar este patrón, se han propuesto hipótesis de diversificación mediante vicarianza y dispersión a larga distancia. Según la hipótesis de vicarianza, durante el Cenozoico, estos géneros habrían presentado una distribución continua que se habría interrumpido debido al levantamiento de la Cordillera de los Andes, proceso que se ha propuesto como uno de los

20 eventos más importantes en el desarrollo actual de la flora de Sudamérica (Hoorn et al., 2010), generando una separación de clados Este-Oeste datados en el Mioceno medio.

Alternativamente, según la hipótesis de dispersión a larga distancia, el origen de los géneros neotropicales de distribución disyunta puede explicarse mediante expansión desde un centro de origen incluso cruzando importantes barreras geográficas o climáticas, como cadenas montañosas o desiertos, a través de vectores de dispersión con posterior asentamiento en áreas geográficas con ambiente apropiado para la sobrevivencia (Christenhusz and Chase, 2013; Harris,

Ickert‐Bond, and Rodríguez, 2018). Según esta hipótesis, el patrón disyunto podría haberse generado posterior al establecimiento de Los Andes y la Diagonal Árida.

Para determinar la contribución relativa de los procesos geográficos en la diversificación de los linajes, se han construido y utilizado filogenias moleculares datadas. Los árboles construidos a partir de secuencias de ADN nos permiten establecer relaciones de parentesco entre las especies dentro de los géneros y así proponer un escenario plausible de diversificación relacionado al contexto histórico biogeográfico.

En el sur de Sudamérica, distintos estudios filogenéticos se han llevado a cabo en diversos géneros, en los cuales se observan distintos patrones de diversificación relacionados a la orogénesis andina. Se ha propuesto que los Andes tiene cuatro tipos de efectos en la diversificación de los linajes: a) fuente de nuevos hábitats de altura, b) corredor Norte ↔ Sur, c) generador de nuevas condiciones ambientales y d) barrera vicariante (Luebert and Weigend,

2014).

Los linajes que habrían diversificado en Los Andes como fuente de nuevos hábitats de altura se habrían diversificado a partir del Mioceno, siendo los de alturas bajas a medias los más antiguos y los de mayor altura presentan diversificación reciente. Por ejemplo, Schizanthus se

21 habría diversificado durante el Pleistoceno, como consecuencia de cambios de interacciones biológicas en ambientes de altura novedosos (Perez et al., 2006). Otros géneros como Azorella,

Laretia y Mulinum presentan una diversificación en Los Andes que podría explicarse mediante un origen andino patagónico durante el Mioceno (aproximadamente 12 Ma), con posterior colonización hacia el trópico a través de Los Andes (Nicolas and Plunkett, 2012). El levantamiento andino también provocó profundos cambios ambientales, principalmente en la distribución y periodicidad de las precipitaciones (Garreaud, Molina, and Farias, 2010), lo que generó fuertes presiones selectivas durante el Mioceno medio, que derivó en el origen y diversificación de taxa de ambientes áridos como Gypothamnium en el Desierto de Atacama (Luebert, Wen, and Dillon,

2009). El efecto de los Andes como barrera vicariante se puede observar en el género Drimys, el cual presenta un clado Nororiental de especies distribuidas en Brasil y un clado Suroccidental de especies distribuidas en Chile con una separación de 13-16 Ma (Marquinez et al., 2009); caso similar, pero de topología distinta, es Myrceugenia y Alstroemeria, géneros que presentan un clado de especies distribuidas en Brasil que se encuentran anidadas dentro del clado de especies que agrupa a las especies chilenas, cuya separación también estaría datada también durante el

Mioceno (Chacon et al., 2012; Murillo, Stuessy, and Ruiz, 2013; Murillo-A, Stuessy, and Ruiz,

2016).

En este capítulo se propone construir una hipótesis filogenética completa del género

Azara analizando secuencias de ADN cloroplastidial y nuclear. Azara es un género reducido de especies que se encuentran disjuntas en Chile, en bosque Tucumano-Boliviano (Yungas),

Uruguay y el sur de Brasil. Se propone estimar sus tiempos de divergencia y patrón de diversificación, con el fin de relacionar la topología del árbol en un contexto geológico para así proponer un escenario plausible que explique su diversificación y distribución.

Si el género Azara diversificó debido al efecto vicariante de la Cordillera de los Andes, se espera observar un patrón de diversificación donde los tiempos de especiación coincidan con los eventos de levantamiento durante la orogénesis andina. Para lograr esto, se construyó un árbol filogenético mediante secuencias de ADN cloroplastidial y nuclear y se calibraron sus nodos utilizando hojas fósiles pertenecientes a afloramientos del Terciario. También se realizó una reconstrucción de distribución de área ancestral para determinar el origen y distribución probable de los ancestros de Azara.

MATERIALES Y METODOS

- Modelo de estudio

En la zona Mediterránea de Chile, entre 30-38° S, habitan 6 especies: A. alpina, A. serrata, A. integrifolia, A. celastrina A. dentata y A. petiolaris, donde dos de ellas, A. petiolaris y A. alpina son capaces de habitar zonas de alturas en los faldeos de la Cordillera de los Andes. El clima del mediterráneo en Chile corresponde a Csb de la clasificación Köppen (Kottek et al., 2006; Peel,

Finlayson, and McMahon, 2007) y se caracteriza por un periodo prolongado de sequía en verano e inviernos lluviosos (Armesto, Kalin Arroyo, and Hinojosa, 2007). Más al sur de Chile, en la ecorregión del clima Templado lluvioso, entre los 38-55° S habitan principalmente dos especies:

A. lanceolata y A. microphylla, aunque esta última especie presenta una reducida población disjunta a los 31°S (Villagrán et al., 2004; Armesto, Kalin Arroyo, and Hinojosa, 2007). Esta zona se caracteriza por tener un tipo de clima Cfb, donde llueve durante todo el año, aunque las precipitaciones se concentran principalmente en invierno.

En los faldeos orientales andinos al norte de Argentina y sur de Bolivia, en las Yungas, entre 15-30° S, habita la especie A. salicifolia. El Bosque Tucumano-Boliviano, presenta un clima

Cwa, que se caracteriza por precipitaciones estacionales, pero a diferencia del clima mediterráneo, las precipitaciones se concentran en el verano y el periodo seco es durante el invierno (Quiroga, 2010).

Finalmente, A. uruguayensis se encuentra presente en Uruguay y el Sureste de Brasil entre

28-35°S en un clima Cfa, donde las precipitaciones se distribuyen homogéneamente durante el año (Figura 1.3).

- Colecta y extracción de ADN

Se colectaron hojas de un total de 30 individuos correspondientes a las 10 especies de Azara en distintas localidades. Se seleccionaron individuos con características morfológicas claras según la descripción taxonómica para evitar individuos que parecían híbridos (Montenegro, P., obs. per.). Como grupo externo se colectó material vegetal fresco de Xylosma tweedianum (Clos)

Eichler en Uruguay, una especie cercana a Azara según filogenia de Salicaceae que se encuentra presente en el área de colecta (Chase et al., 2002). El tejido de cada uno de ellos se almacenó en bolsas herméticas con sílica gel. El tejido seco (0,5 gr) fue molido en TissueLyser de Qiagen y el

DNA fue extraído utilizando un protocolo CTAB modificado (Doyle, 1991). Finalmente, las extracciones fueron verificadas en gel de agarosa al 2% bajo luz UV y la concentración y pureza de la extracción del ADN genómico se evaluó en el espectrómetro NanoDropTM 1000

(Thermoscientific).

- Selección de partidores

Se realizó una prueba de partidores universales de cpADN (Taberlet et al., 1991; Demesure,

Sodzi, and Petit, 1995; DumolinLapegue, Pemonge, and Petit, 1997; Sang, Crawford, and Stuessy,

1997; Small et al., 1998; Grivet and Petit, 2003; Tate and Simpson, 2003; Shaw et al., 2005; Shaw et al., 2007) y secuencias nucleares (Frohlich and Meyerowitz, 1997; Baldwin and Markos, 1998;

Emshwiller and Doyle, 1999; Larena et al., 1999). Se escogió utilizar de entre estos partidores el par trnS-trnG y MatK (Shaw et al., 2007; Yu, Xue, and Zhou, 2011) de cpADN no codificante y los partidores ITS (3-4), ITS (5-2) (White et al., 1990) y ETS para nADN (Tabla 1.1).

Para obtener el partidor género específico de la región ETS, se utilizó una librería genómica de A.celastrina. Para construir la librería, se extrajo DNA genómico de un individuo colectado en la localidad El Canelo (33°22’04’’S 71°41’32’’O) con el protocolo CTAB modificado (Anexo II). El

ADN fue enviado a OMICS Solutions (Centro Nacional de Genómica y Bioinformática, Santiago,

Chile, http://omics-solutions.cl) para realizar pirosecuenciación en el secuenciador genómico

454 Jr (454 Life Sciences, Roche, Branford, CT, USA). La concentración de ADN se cuantificó mediante un Fluorómetro Qubit 2.0 (LifeTechnologies), y se cortaron 100 ng de ADN a 400 pb.

Se preparó una biblioteca de fragmentos de ADN utilizando un kit de biblioteca de fragmentos

Ion Xpress Plus y posteriormente se secuenció con un chip Ion 314 siguiendo el protocolo del fabricante (Thermo Scientific, P.N MAN0007218, MAN0007242 2.0). Posteriormente se buscó dentro de la librería genómica de A. celastrina la secuencia ETS disponible para una especie cercana a Azara dentro de la filogenia (Chase et al., 2002), Dovyalis hebecarpa, disponible en

NCBI (ID: KC415433.1) utilizando el programa BLAST+ v2.2.29 (Camacho et al., 2009). Se obtuvieron 18 lecturas dentro de la librería genómica que fueron alineadas y concatenadas utilizando como templado la secuencia de D. hebecarpa para reconstruir la secuencia original de

A. celastrina. Para realizar la concatenación y alineamiento se utilizó el algoritmo ClustalW implementado en el programa BioEdit v7.2.5 (Hall, 1999). Una vez reconstruida la secuencia, se utilizó el servicio Primer3 (http://primer3.ut.ee) para diseñar los mejores partidores.

- Amplificación

La reacción de amplificación (PCR) se preparó con las soluciones de GoTaq® Flexi de Promega en un volumen final de 30 L; 6 L de buffer GoTaq® Flexi, MgCl2 2.5mM, dNTP 2.5 mM, 1.6 ng de cada partidor, 0.5 L de DNA Polimerasa GoTaq® y 7.5 ng de ADN y agua ultra pura (Promega).

El protocolo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para las regiones nucleares (ITS y ETS) es la siguiente: denaturación inicial a 94° C por 5 minutos seguido de 35 ciclos de denaturación a 94° C por 45 segundos, annealing a 56° C por 1 minuto y extensión a 72° C por 1:30 minutos. Al finalizar los ciclos se permite una extensión final a 72° C por 7 minutos y luego se enfría a 4° C y se mantiene a esa temperatura hasta enviar a secuenciar.

Para las regiones cloroplastidiales se utilizaron dos protocolos distintos. Para MatK

(472F-1248R) denaturación inicial a 94° C por 3 minutos seguido de 40 ciclos de denaturación a

94° C por 30 segundos, annealing a 51° C por 40 segundos y extensión a 72° C por 1 minuto. Al finalizar los ciclos se permite una extensión final a 72° C por 10 minutos y luego se enfría a 4° C y se mantiene a esa temperatura hasta enviar a secuenciar. Para trnS-trnG la amplificación fue realizada con una denaturación inicial de 80° C y 30 ciclos de denaturación a 95° C por 1 minuto, annealing de partidores a 50° C por 1 minuto, seguido por una rampa de 0.38° C/s hasta alcanzar

65° C, y mantener temperatura de extensión de 65° C por 4 minutos; seguido de un paso de extensión final de 5 minutos a 65° C.

El producto de amplificación fue verificado en gel de agarosa al 1% preparado con

GelRedTM de Biotium, en electroforesis bajo el buffer 1X TAE (0.04M Tris-Acetato, 0.001 M

EDTA, pH 8.0) y visualizado bajo luz UV. Purificación y secuenciación por ambos lados de

27 producto de PCR se realizaron en MACROGEN Inc y en el servicio de secuenciación de la Pontificia

Universidad Católica de Chile.

- Alineamiento

El alineamiento y edición de las secuencias de DNA se realizó con el programa BioEdit v7.2.5

(Hall, 1999) a través de el algoritmo ClustalW (Larkin et al., 2007). Se alineó cada marcador por separado y posterior a una inspección visual, las secuencias que mostraban inserciones/deleciones (InDels) en el alineamiento se codificaron como un evento binario.

Se concatenaron como dos sets de datos distintos los marcadores correspondientes a secuencias nucleares y cloroplastidiales. Posteriormente, ambos sets se concatenaron para reconstruir una hipótesis filogenética. La concatenación de matrices se realizó en el programa

Mesquite v3.2 (Drummond and Rambaut, 2007).

- Hipótesis Filogenéticas

Máxima Parsimonia (MP) y Máxima Verosimilitud (MV): Se buscó el mejor modelo de sustitución nucleotídica con criterio AIC para las matrices correspondientes a las secuencias nucleares, a las cloroplastidiales y al set correspondiente a la concatenación de ambas con el programa

JModelTest2 (Darriba et al., 2012): TPM1uf+I para secuencias nucleares, TrN para secuencias cloroplastidiales y GTR+G para las secuencias concatenadas. Posteriormente se realizó una búsqueda exhaustiva con los criterios MP y MV usando un algoritmo de optimización ACCTRAN

28 en el programa PAUP*(Swofford, 2002), se calculó bootstrap no paramétrico de las mejores hipótesis filogenéticas para los distintos sets de matrices y se guardó el largo de las ramas.

Inferencia Bayesiana (IB): Se utilizó el mejor modelo de sustitución nucleotídica obtenido mediante JModelTest2 (Darriba et al., 2012) y las especificaciones de la búsqueda bayesiana se implementaron en el programa BEAUti v1.8.4. Se especificó un árbol al azar para comenzar el análisis y se definió el proceso Yule como modelo de especiación. Se estableció una distribución gamma con un valor inicial de 1, forma 0.001 a escala 1000, sin offset. Para la corrida, se estableció un largo de 60000000 para cuatro cadenas MCMC con un log cada 5000.

En el programa TRACER v1.6 (Drummond and Rambaut, 2007) se exploró el resultado del análisis en BEAST y se desechó el 10% de los árboles correspondientes al inicio de la cadena. Con el programa TreeAnnotator (Drummond & Rambaut, 2007) se construyó el árbol de credibilidad de clado máxima (MCC) y fue graficado en el programa FigTree v1.4.3

(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).

- Datación

Para datar el árbol obtenido mediante IB utilizando todas las secuencias concatenadas, se calculó las edades de los nodos en MrBayes utilizando la topología obtenida a través de BEAST. Para esto se especificó una edad para el nodo de A.celastrina-A. dentata, utilizando un fósil foliar de Azara celastriniformis, encontrado en la flora Terciaria del río Pichileufú, Argentina (Berry, 1938; Wilf et al., 2005), cuya datación la ubica temporalmente entre Paleoceno tardío y Eoceno medio

(48.6-37 Ma). A posteriori, se incorporó una segunda datación por fósil foliar, Azara sp., encontrado en la tafoflora de Quinamávida, Chile, perteneciente al Eoceno inferior (56-41.43

Ma) como datación mínima para el primer nodo de diversificación de Azara (Troncoso, 1992).

Finalmente, para incorporar incerteza topológica y de largo de ramas en el estimado de tiempo,

1000 árboles fueron muestreados y datados al azar dentro de la distribución estacionaria del análisis bayesiano para obtener valores de edad promedio e intervalos de credibilidad de 95% de edad para cada uno de los nodos.

- Análisis Biogeográfico

Para la reconstrucción de las áreas ancestrales de Azara, se utilizó el árbol MCC y datos georreferenciados de las 10 especies. Se clasificaron las ocurrencias según 4 regiones operacionales: Chile Central (A), Bosque templado (B), Yungas y Este de Sudamérica (D) (Figura

1.2, Tabla 1.2).

Se utilizaron 3 modelos biogeográficos probabilísticos para modelar la evolución de rangos geográficos ancestrales mediante máxima verosimilitud: DEC (Dispersión-Extinción-

Cladogénesis; (Ree and Smith, 2008), DIVA-Like (Dispersión, Análisis Vicariante; (Ronquist, 1997) y BayArea-like (Landis et al., 2013), donde cada uno de los modelos evalúa 3 procesos biogeográficos: Dispersión, Vicarianza y Cladogénesis, respectivamente.

Se calcularon las tasas de dispersión (d), extinción (e) y dispersión a larga distancia (j) para cada uno de los modelos y se seleccionó el mejor modelo de ajuste el criterio de información de Akaike ponderado (AICW).

Los análisis se realizaron mediante el paquete BioGeoBEARS implementado en R

(Matzke, 2013).

RESULTADOS

- Amplificación de PCR y alineamiento:

Nucleares: La amplificación del fragmento nuclear ITS34 resultó en una sola banda de tamaño aproximado de 300 pb, con 30 loci informativos y 13 sitios en el alineamiento correspondientes a InDels. De la misma manera, el fragmento ITS52 amplificó con una sola banda de tamaño aproximado de 300 pb, de los cuales 45 son sitios polimórficos y 25 sitios corresponden a InDels.

Finalmente, el fragmento ETS amplificó una sola banda de aproximadamente 400 pb de peso, de los cuales 72 sitios resultaron polimórficos y 50 sitios corresponden a InDels.

Al codificar los InDels como eventos binarios y al concatenar las secuencias nucleares se obtuvo un alineamiento de 929 pb, con 176 sitios polimórficos.

Cloroplastidiales: La amplificación del fragmento MatK resultó en una sola banda de aproximadamente 650 pb de tamaño, de los cuales 24 sitios son polimórficos y 7 sitios corresponden a InDels. De forma similar, el fragmento trnS-trnG amplificó en una sola banda de tamaño aproximado de 700 pb con 126 sitios polimórficos y 60 corresponden a InDels.

Al concatenar las secuencias cloroplastidiales y codificar los InDels como eventos binarios, se obtuvo una secuencia de 1277 pb de tamaño con 52 sitios polimórficos.

- Análisis filogenético:

Se calcularon los árboles filogenéticos correspondientes a secuencias de cloroplasto, nucleares y de ADN total para cada uno de los criterios de Máxima Parsimonia (MP), Máxima

Verosimilitud (MV) e Inferencia Bayesiana (IB), obteniendo en total 9 árboles. Los árboles que resultaron de los análisis mostraron congruencias topológicas para cada tipo de secuencia, tanto en organización de nodos y largo de las ramas, sin existir conflicto entre los resultados para los distintos criterios, salvo nodos no resueltos o con muy bajo soporte. Debido a esto, los resultados son informados de acuerdo con la topología obtenida a través de IB.

Se observó que, para los árboles obtenidos a partir de secuencias nucleares y cloroplastidiales, el género Azara corresponde a un grupo monofilético. Las secuencias nucleares sirvieron para resolver la topología terminal de los árboles propuestos, pero presentan bajo soporte para resolver nodos más antiguos. De forma complementaria, los árboles obtenidos a través de secuencias cloroplastidiales presentaron buena resolución y soporte en nodos más antiguos, pero son débiles al resolver nodos más recientes (Figura 1.4).

Entre los árboles nucleares y cloroplastidiales se encontraron algunas incongruencias topológicas, las cuales en general corresponden a nodos con bajo soporte estadístico. La mayor excepción a este caso es la posición de los nodos A. serrata/A. lanceolata, ubicado en posición terminal según secuencias nucleares y basal según secuencias cloroplastidiales, y A. microphylla/A. integrifolia, el cual fue ubicado de forma basal según secuencias nucleares y de forma terminal según secuencias cloroplastidiales. A pesar de estas incongruencias, el árbol construido a partir del ADN total secuenciado resultó ser consistente entre los tres criterios de reconstrucción y tener buen soporte estadístico para sus nodos (Figura 1.5). Si bien hay que tener en consideración que la genealogía de distintos genes puede que no se corresponda con la genealogía del género (Shaw, 2002; Shaffer and Thomson, 2007; Pleines, Jakob, and Blattner,

2009), los árboles obtenidos a partir de ADN cloroplastidial y nuclear al ser coherentes apuntan

32 que la topología obtenida a través de ellos podría ser una herramienta útil para sugerir un escenario plausible sobre la historia y evolución de este género.

- Edad de los Nodos

Según las calibraciones utilizadas, el género Azara tiene una edad mínima de 48 Ma, donde habría ocurrido el primer evento de diversificación, separándose en la rama que daría origen al clado de A. integrifolia/A.microphylla del ancestro común del resto de las especies (Figura 1.6,

Tabla 1.3).

El ancestro común de A. integrifolia/A.microphylla sólo presenta esas dos especies actuales como descendientes, sugiriendo un largo periodo de estasis o baja tasa de diversificación/alta tasa de extinción para este linaje.

Luego de un periodo de aproximadamente 10 Ma desde la primera diversificación (nodo

I), entre 37 y 22 Ma ocurren varios eventos de especiación (nodos III, IV, V y VII). Los nodos III y

IV se habrían originado de forma cercana temporalmente, alrededor de los 37 Ma. Luego, desde una de las ramas que se originan desde el nodo III, alrededor de 34 Ma ocurre una nueva diversificación (nodo V). Posteriormente, desde una de las ramas originadas desde el nodo V ocurre una nueva diversificación a los 28 Ma.

Luego de este primer pulso de diversificación, se observa un segundo pulso (nodos II, VI

VIII y IX), que daría origen a otras especies entre 10 y 1 Ma. La primera diversificación de este grupo ocurre en el clado que da origen a las especies A. alpina y A. salicifolia, en el nodo VI, alrededor de los 9 Ma. Le siguen la diversificación que da origen a los nodos II y VIII, alrededor de los 4 y 5 Ma, respectivamente. Finalmente, las diversificaciones más recientes son las correspondientes al nodo II y al nodo IX, aproximadamente a los 7 y 4 Ma, respectivamente. El

33 nodo II corresponde a la diversificación que dio origen a A. integrifolia y A. microphylla, el ancestro común de estas especies se habría originado hace aproximadamente 49 Ma, sin existir otras especies de este linaje en la actualidad, ya sea por estasis o extinción de especies ligadas a esta rama. Por último, a partir del nodo IX alrededor de 4 Ma ocurre la última diversificación de este género, dando origen a las especies A. petiolaris y A. uruguayensis.

- Reconstrucción del rango de distribución ancestral

Según los análisis de reconstrucción de distribución de área ancestral, el modelo de mejor ajuste corresponde a BayArea-like +J (AICW=1; Tabla 1.4). Mediante este modelo, se calcularon las tasas de dispersión, extinción y dispersión a larga distancia: d=1E-7, e=0.0033 y j=0.082 individuos/Ma, respectivamente (Figura 1.7, Tabla 1.4).

Este modelo considera que el ancestro común del género habría habitado las zonas que actualmente corresponden al Bosque templado y Chile central (Figura 1.2).

Alrededor de los 10 Ma, el ancestro común de A. salicifolia y A. alpina probablemente habría habitado en el área geográfica que hoy corresponde a Los Andes de Sur. A partir de los

9.7 Ma y mediante aislamiento, se habría originado la especie A. salicifolia en la zona de las

Yungas. Distinto es el caso del ancestro común de las especies A. uruguayensis y A. petiolaris, que habría habitado en la zona Bosque templado y Centro de Chile, y habría colonizado mediante dispersión a larga distancia la zona Este de Sudamérica. El resto de las especies habrían diversificado en simpatría y alguna de ellas, como A. alpina y A. lanceolata, habrían reducido su ocupación de áreas (Figura 1.7).

DISCUSION

Los árboles obtenidos mediante secuencias nucleares y cloroplastidiales son congruentes al agrupar a las especies de Azara como un grupo monofilético y los resultados indican que la edad mínima calculada para el ancestro común más reciente corresponde a una edad promedio de 47

Ma (Figura 1.6, Tabla 1.3), durante el Eoceno medio. Debido a la escasa presencia de fósiles foliares de Azara, sugiere complementar los árboles obtenidos con la secuenciación de una especie de un género más cercano, como especies del género Abatia (Chase et al., 2002), el cual no pudo ser obtenido durante la realización de este estudio para poder mejorar la datación del ancestro común más reciente para Azara.

Clásicamente, los patrones de distribución disyunta en Sudamérica se han explicado como resultado del aislamiento geográfico y climático, consecuencia de la orogénesis andina

(Hinojosa and Villagran, 1997; Villagran and Hinojosa, 1997), sin embargo, los tiempos de diversificación calculados para el MCC y la reconstrucción del área de distribución ancestral sólo apoyan la hipótesis de especiación por vicarianza para las Yungas y se estima que la distribución disyunta en el Este de Sudamérica se habría originado mediante dispersión a larga distancia.

Las especies que se encuentran actualmente aisladas, A. salicifolia en las Yungas en el

Noroeste Argentino y Sur de Bolivia, y A. uruguayensis en Uruguay y el Sureste de Brasil, se encuentran en clados distintos, cada una de ellas con una especie endémica de Chile como especie hermana (A. salicifolia en nodo VI y A. uruguayensis en nodo IX, Figura 1.6).

Para las especies hermanas A. salicifolia y A. alpina, se sugiere que durante el Mioceno medio el ancestro común de ambas se distribuía probablemente en las zonas de Chile Central,

Bosque Templado y Yungas, en una Cordillera de Los Andes en proceso de levantamiento y que habría alcanzado la mitad de su altura alrededor de los 15 Ma (Hartley, 2003). Los cambios climáticos y altitudinales de los Andes habrían permitido la diversificación de estas dos especies de altura, en aislamiento por efecto vicariante de Los Andes, alrededor de 10 Ma: una en el límite arbóreo del Bosque templado en altitudes medias (A. alpina) y la otra en las Yungas (A. salicifolia)

(Figura 1.7).

Un proceso diferente habría originado la especie Azara uruguayensis, actualmente en aislamiento en el este de Sudamérica. Las especies de Azara tienen frutos carnosos que corresponden a bayas rojas, naranjas, azules y negras (Anexo I) que resultan muy atractivas a vectores de dispersión como aves migratorias. Actualmente, La dieta de Elaenia albiceps chilensis incluye frutos de Azara (Amico and Aizen, 2005; Reid and Armesto, 2011) y se ha documentado que individuos de esta especie recorren largas distancias, cruzando la Cordillera de los Andes para llegar al Este de Brasil, tomando una ruta que contempla un paso por la zona de Uruguay

(Bravo, Cueto, and Gorosito, 2017). Se propone que la dispersión de semillas a través de aves migratorias (Elaenia albiceps chilensis como análogo moderno) podría haber superado las barreras de la Diagonal Árida como barrera climática y los Andes como barrera geográfica permitiendo el establecimiento y diversificación de Azara en el Este de Sudamérica a partir de los 5 Ma en áreas geográficas que presentaron condiciones apropiadas para la sobrevivencia y permanencia de individuos a través del tiempo, dando origen así al patrón de distribución disyunta que presenta el género Azara actualmente en el Sur de Sudamérica.

Según los resultados, el resto de las especies de Azara que no presentan especies hermanas en aislamiento (A. celastrina, A. dentata, A.integrifolia, A. lanceolata, A.microphylla y

A. serrata) habrían diversificado simpátricamente los últimos 10 Ma, probablemente como

36 consecuencia de los cambios climáticos y los microambientes generados a medida que la

Cordillera de los Andes alcanzaba altura suficiente para intervenir en la circulación atmosférica y por lo tanto en la distribución temporal y espacial de lluvias.

Finalmente, según la evidencia obtenida en este estudio, se sugiere que Azara es un linaje que se habría originado en el sur de Sudamérica en el Bosque Templado y Chile Central, y habría colonizado hacia el Norte y al Este, en contraposición de la hipótesis de Conservatismo de

Nicho Tropical (TNH), la cual estipula que el origen y diversificación de Angiospermas se originaron en zonas tropicales y algunos pocos linajes lograron hacer la transición a zonas

Subtropicales y Templadas (Wiens, 2004; Donoghue, 2008). Este patrón direccional Sur-Norte lo presentan también géneros como Alstroemeria, Nothofagus y Myrceugenia (Chacon et al., 2012;

Hinojosa et al., 2016; Murillo-A, Stuessy, and Ruiz, 2016), contradiciendo el supuesto del Trópico como origen y fuente de la biodiversidad vegetal. La diversificación de este género a partir del

Eoceno medio estaría impulsada fuertemente por el efecto de Los Andes como modificador climático, y la presencia de especies disyuntas (que clásicamente se atribuía al efecto vicariante de los Andes) se podría explicar también por colonización de nuevas áreas mediante dispersión a larga distancia.

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Tabla 1.1. Partidores utilizados para reconstrucción filogenética del género Azara.

Partidor Secuencia Referencia trnS: AACTCGTACAACGGATTAGCAATC trnS-trnG Shaw et al., 2007 trnG: GAATCGAACCCGCATCGTTAG 472f: CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC matK Yu et al., 2011 1248r: GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC ITS5: GGAGTAAAAGTCGTAACAAGG ITS5-2 White et al., 1990 ITS2: GCTGCGTTCTTCATCGAT ITS3: GCATCGATGAACGCAGC ITS3-4 White et al., 1990 ITS4: TCCTCCGCTTATTGATAT ETS-F: GGGWTCYTGTGYTGYRTACC ETS Este estudio ETS-R: TCATACTTACACATCGATGGCT

Tabla 1.2. Distribución de las especies actuales de Azara en zonas terrestres de Sudamérica. A) Chile Central, B) Bosque Templado, C) Yungas y D) Este Sudamérica. Presencia de las especies en cada una de las áreas se representa con 1 y la ausencia, 0. Especie Ecorregión A B C D A. alpina 1 0 0 0 A. celastrina 1 1 0 0 A. dentata 1 1 0 0 A. integrifolia 1 1 0 0 A. lanceolata 1 0 0 0 A. microphylla 1 1 0 0 A. petiolaris 1 1 0 0 A. salicifolia 0 0 1 0 A. serrata 1 1 0 0 A. uruguayensis 0 0 0 1

Tabla 1.3. Tabla resumen de edad calculada para los nodos del filograma de Azara. La identificación de los nodos se corresponde a la numeración dada en la Figura 1.6. Calibración por fósiles se indican con un asterisco (*)

Filograma Consenso Estimaciones basadas en 1000 árboles bayesianos Intervalo de credibilidad 95%

Edad Mediana NODO Edad (Ma) Edad Inferior (Ma) Edad Superior (Ma) (Ma)

I* 47.8 47.6 47.0 49.4 II 4.4 4.1 0.8 8.8 III 38.7 38.4 37.0 40.9 IV* 37.7 37.5 37.0 39.0 V 34.4 34.7 28.7 39.4 VI 9.7 9.4 4.2 16.0 VII 28.1 28.1 22.2 34.0 VIII 7.1 6.9 3.5 10.9 IX 3.8 3.6 0.9 7.1

Tabla 1.4: Parámetros obtenidos mediante el análisis de distribución de área ancestral para la filogenia de Azara. Los modelos corresponden a DEC (dispersión), DIVA-like (vicarianza) y BayArea-like (Cladogénesis). Se informan valores de tasa de dispersión (d), extinción (e) y dispersión a larga distancia (j) para cada uno de los modelos. AICW (Criterio de Akaike ponderado) corresponde a criterio de selección de los modelos según el ajuste de los datos. El valor destacado con negrita indica el modelo de mejor ajuste.

Modelo d e j AICW DEC 0.0089 1.00E-12 0 0.0003 DEC+J 0.008 1.00E-12 0.048 0.0001 DIVALIKE 0.01 1.00E-12 0 0.0002 DIVALIKE+J 0.01 1.00E-12 1.00E-5 7.40E-05 BAYAREALIKE 0.0034 0.015 0 8.40E-06 BAYAREALIKE+J 1.00E-07 0.0033 0.082 1

a b ) )

Figura 1.1. Barreras climáticas (1a; disponibilidad hídrica) y geográficas (1b; altura de la Cordillera de los Andes) que explicarían el aislamiento actual de formaciones boscosas en el sur de Sudamérica.

Figura 1.2: Regiones terrestres en los que habitan las especies actuales de Azara. A) Chile Central, B) Bosque Templado, C) Yungas y E) Este Sudamérica.

Figura 1.3: Distribución actual del género Azara. Triángulos representan a las especies que habitan en climas con precipitaciones concentradas en una estación; cuadrados representan especies de clima templado y figuras con punto central representan especies en aislamiento.

a) b)

98.9/97.9 0.61 1

100/100 80.4/56.1 1 1 0.85 0.6

89/84.9 1

99.5/95.7 96.7/94.5 1 1

61.1/62.8 1 1

79.2/72.8 62.1/64.1 1 1

96.6/67.3 1

Figura 1.4: Comparación de los árboles de credibilidad de clado máxima (MCC) obtenidos a través del criterio IB para las secuencias de núcleo (A) y cloroplasto (B) de Azara. En cada nodo se informan los valores de soporte obtenidos según los criterios de MP (en negrita, sobre la rama), MV (cursiva, sobre la rama) e IB (bajo la rama). Valores de soporte inferiores a 50 para MP y MV y 0.5 para IB no son informados.

0.7

68/57 75/60 1 1

0.9 100/98 1 72/66 1 1 100/100 1

99/82 1

Figura 1.5: Árbol de credibilidad de clado máxima (MCC) obtenido a través del criterio IB para las secuencias concatenadas (nuclear y cloroplastidial) de Azara, proyectado en un mapa según coordenadas geográficas. Al lado izquierdo de cada nodo se informan los valores de soporte obtenidos según los criterios de MP (en negrita, sobre la rama), MV (cursiva, sobre la rama) e IB (bajo la rama). Valores de soporte inferiores a 50 para MP y MV y 0.5 para IB no son informados.

idad

construído a partir de ADN nuclear y cloroplastidial. Asteriscos (*) representan nodos nodos representan (*) Asteriscos cloroplastidial. y nuclear ADN de partir a construído

Azara

La escala indica el tiempo (Ma) eltiempo indica escala La

Figura 6: Cronograma del género género delCronograma 6: Figura credibil de 95% de elintervalo indican horizontales Barras edades las calculadas. son nodos los a frente Números calibrados. divergencia. de tiempos los para

Figura 1.7: Reconstrucción de la distribución ancestral de mayor probabilidad para cada nodo de la filogenia de Azara representado mediante el modelo BayArea-like +J. Cajas terminales y colores representan a distribución actual de las especies de Azara. En la figura, las áreas corresponden a A) Bosque Templado; B) Chile Central; C) Yungas y D) Este de Sudamérica. Líneas verticales representan edades de hitos biogeográficos especificados en el análisis.

Capítulo II:

Reconstrucción y evolución del nicho climático de Azara

INTRODUCCION

Determinar los procesos detrás de la diversificación y el mantenimiento de la biodiversidad es uno de los principales objetivos en Ecología y Biología Evolutiva. Frente al escenario actual de cambio climático, estudios relacionados con diversificación y especiación en un entorno cambiante se ha convertido en uno de los principales objetivos de estudio (Evans et al., 2009).

El principal concepto para abordar las predicciones sobre los cambios en la distribución geográfica en relación con el cambio climático es el nicho climático (Bellard et al., 2012).

Actualmente, la definición más aceptada para el nicho es la propuesta por Hutchinson, que corresponde a un hipervolumen abstracto de n variables sobre las cuales las especies pueden persistir en el tiempo (Hutchinson, 1957b; Hutchinson, 1957a). Este concepto abstracto de nicho puede acotarse para definir el nicho climático (símil al concepto de nicho grinnelliano), que hace referencia a las condiciones climáticas que permiten que una especie sobreviva y se reproduzca

(Grinnell, 1917; Broennimann et al., 2007; Broennimann et al., 2012; Guisan et al., 2014).

Los datos de ocurrencia georreferenciados en combinación con conjuntos de datos climáticos de alta resolución se pueden usar para generar modelos de nicho climático de especies

(Warren, Glor, and Turelli, 2008, 2010, 2011). Estos modelos pueden evaluar la idoneidad de los hábitats en todo el paisaje, que pueden tener diversas aplicaciones, incluidas las predicciones de ocupación de especies invasoras y estudios evolutivos relacionados con la trayectoria evolutiva del nicho climático en los linajes (Peterson, Soberon, and Sanchez-Cordero, 1999; Patterson and

Givnish, 2002; Ackerly, 2003, 2004; Wiens, 2004; Broennimann et al., 2007; Donoghue, 2008;

Evans et al., 2011; Peterson, 2011; Broennimann et al., 2012; Peterson and Soberon, 2012;

Donoghue and Edwards, 2014; Guisan et al., 2014; Hinojosa et al., 2015).

Para evaluar la trayectoria evolutiva de los linajes, es necesario contar con un árbol filogenético. Actualmente, mediante modelos de reloj molecular y calibraciones de nodos a través de fósiles, se puede inferir al construir los árboles filogenéticos tiempos estimados de diversificación (Drummond et al., 2006; Ho and Larson, 2006; Bell, Soltis, and Soltis, 2010), los cuales pueden ser relacionados con la historia biogeográfica de los linajes y sus requerimientos climáticos a través del tiempo.

Durante la última década, estudios filogenéticos han sugerido que los nichos climáticos no son tan lábiles como se ha descrito, sino que se conservan a través del linaje de plantas vasculares (Pearson and Dawson, 2003), los cuales se basarían en la observación de la tendencia de los miembros de un clado al ocupar entornos similares, más de lo que se esperaría por diversificación ecológica sin restricciones. (Donoghue, 2008; Losos, 2008; Donoghue and

Edwards, 2014). Esta tendencia a la retención del nicho climático, a lo largo del tiempo en especies pertenecientes al mismo clado se ha denominado "conservatismo de nicho filético"

(Peterson, Soberon, and Sanchez-Cordero, 1999; Wiens, 2004; Cooper, Jetz, and Freckleton,

2010). El patrón de CNF se ha explicado a través de restricciones en la modificación de rasgos ecofisiológicos relacionados con diferentes tolerancias climáticas, aunque se ha abordado principalmente a través de modelos informáticos (Ackerly, 2004; Violle et al., 2007; Crisp and

Cook, 2012).

Para explicar los patrones marcados CNF se ha propuesto que es más fácil para las especies migrar a un área donde pueden sobrevivir preservando su nicho climático en vez de cambiar y desarrollar características fisonómicas al adaptarse a un nuevo entorno. Esto implica

57 que la conservación o evolución del nicho climático depende del grado de conectividad, es decir, cuando hay corredores en un área geográfica sometida a cambios climáticos, si las condiciones geográficas son adecuadas, las especies tienden a seguir el hábitat a través del paisaje para el que están adaptadas. Por otro lado, en una zona geográfica aislada que sufre cambios climáticos, se ejerce una fuerte presión selectiva sobre la biota local, que se ve obligada a evolucionar para resistir las nuevas condiciones ambientales, o en el caso de no logarlo, extinguirse (Donoghue,

2008).

Para abordar preguntas paleoecológicas relacionadas al CNF, recientemente se ha implementado el uso de modelos de nichos climáticos (ENM) relacionados con filogenias (Losos,

2008; Evans et al., 2009). Esta integración ha permitido abordar hipótesis sobre diversificación ecológica, es decir, el papel de las variables abióticas en el origen de los taxa.

Actualmente, el género Azara habita principalmente en el macroclima

Templado/Mesotérmico (C, en la clasificación Köppen) (Kottek et al., 2006; Peel, Finlayson, and

McMahon, 2007; Luebert and Pliscoff, 2017), diferendo entre si principalmente en la cantidad y distribución de las precipitaciones durante el año. Por ejemplo, A. uruguayensis habita en el clima

Cfa, donde las precipitaciones son abundantes y homogéneas durante todo el año; A. alpina, A. serrata, A. integrifolia, A. celastrina A. dentata y A. petiolaris habitan en el clima Cfb, donde las precipitaciones se encuentran concentradas en los meses de invierno y existe una fuerte evaporación de agua durante los meses de verano; A. salicifolia habita en un Cwa, que se caracteriza por precipitaciones estacionales, pero a diferencia del clima Csb, las precipitaciones se concentran en el verano y el periodo seco es durante el invierno; y finalmente, A. lanceolata y A. microphylla habitan principalmente bajo un clima Cfb, si bien las precipitaciones aumentan durante el invierno, existen precipitaciones durante todo el año. Estas diferencias en la

58 disponibilidad hídrica son fundamentales en la determinación del nicho climático de especies vegetales, ya que significa que las especies de climas con alta variabilidad en la disponibilidad de agua debieron desarrollar adaptaciones que les permitan tolerar condiciones de sequía.

Debido que la morfología y las relaciones bióticas (Anexo I) de las especies de Azara son muy similares, se propone que la diversificación de Azara depende principalmente de factores abióticos. Azara diversificó en un contexto de cambio climático, además del desarrollo y establecimiento de barreras geográficas y climáticas, por lo tanto, se estima que el género desarrolló adaptaciones locales in situ a climas y microclimas que se fueron generando durante el Terciario (Hinojosa and Villagran, 1997).

En este contexto, para el género neotropical de distribución disjunta Azara se propone que la labilidad del nicho climático fue fundamental en la adaptación local frente a los profundos cambios climáticos y geomorfológicos que ocurrieron es Sudamérica durante el Terciario. Se espera observar que las variables climáticas en las que se desarrollan las especies actuales de

Azara no posean señal filogenética, es decir, no exista CNF, especialmente en las variables relacionadas a la disponibilidad hídrica.

MATERIALES Y METODOS

- Modelamiento de Nicho Climático de las especies actuales de Azara

Dos tipos de datos son necesarios para construir modelos de nicho climático (ENM) y la posible distribución geográfica de las especies según sus requerimientos climáticos: ocurrencias válidas georreferenciadas y matrices de datos climáticos para el área geográfica de interés. Se utilizaron

833 ocurrencias de las especies de Azara, las cuales fueron obtenidas desde del conjunto de datos global en línea GBIF (Global Biodiversity Information Facility; www.gbif.org), Herbario

Virtual Austral Americano (herbariovaa.org), herbario de la Universidad Católica de Concepción,

Herbario del Laboratorio de Paleoecología de Universidad de Chile, Herbarios MVFA, MVJB y

MVM en Montevideo, Uruguay y mediante observaciones de campo (comunicación personal con

Federico Haretche). Los datos ambientales utilizados corresponden a la base de datos WorldClim de 19 variables bioclimáticas actuales (Hijmans et al., 2005) con una resolución de 30’’

(aproximadamente 1 Km2 en el Ecuador). Mediante un Análisis de Componentes Principales

(PCA) se determinaron las variables de temperatura y precipitación de mayor contribución en la explicación de la varianza (Tabla 2.1, Figura 2.1). De las 19 variables climáticas se seleccionaron

10 que representan las de mayor contribución y menor índice de correlación entre ellas para el análisis de modelación de nicho y se obtuvo 2 componentes principales que explicaron el 67.5% de la varianza (PC1 = 38.4% y PC2 = 29.1%). Para PC1, las variables con mayor ponderación corresponden a las de temperatura (Bio1, 6, 8, 10 y 11) y las de PC2 son variables de precipitación

(Bio 12, 14, 15, 17 y 18).

Para modelar los nichos climáticos de las especies de Azara se utilizó un método de máxima entropía implementado en MaxEnt v3.3.3 (Phillips, Anderson, and Schapire, 2006; Phillips and

Dudik, 2008). Para estimar cómo cada ENM difería del azar, se evaluó el área bajo la curva característica del receptor (AUC) para cada especie. Se usaron 50 repeticiones, 25% de los datos como entrenamiento. Para el resto del análisis, se utilizó el promedio de los modelos (50 repeticiones) para cada especie.

- Sobreposición de Nicho

Se calculó la sobreposición de nicho en el promedio de los modelos de nicho climático mediante los índices D (Schoener, 1992) e I (Warren, Glor, and Turelli, 2008). Ambos índices están entre el rango de valores 0 y 1, donde 0 indica que no existe sobreposición de nicho y 1 indica completa sobreposición de nicho y se diferencian principalmente en que el índice D calcula el rango apropiado para una especie basado en la distribución de probabilidad para cada celda, calculando la superposición de nicho según la abundancia de la especie en esas localidades y el I se basa solamente en distribuciones de probabilidad (Yousefkhani, Rastegar-Pouyani, and

Aliabadian, 2016). Este cálculo se realizó mediante el paquete Phyloclim en R.

- Predicción de Ocupación de Nicho (PNO) y Medias Ponderadas de las Variables Climáticas

Para generar los perfiles PNO (Evans et al., 2009), cada capa bioclimática utilizada en el modelamiento de nicho climático es integrada a cada una de las distribuciones de probabilidad de cada especie calculadas en MaxEnt. La distribución resultante agrupa los perfiles PNO en histogramas de área de unidad de idoneidad para la ocupación pronosticada de cada especie de cada variable bioclimática. El enfoque utilizado para obtener perfiles PNO fue utilizar los valores

61 de salida RAW de las distribuciones de probabilidad obtenidas mediante MaxEnt de cada especie y dividirlos en 50 secciones espaciadas equitativamente que abarcan el rango de parámetros de cada variable bioclimática. Se calculó los perfiles de PNO para las 10 variables bioclimáticas seleccionadas utilizando PCA y, finalmente, se estimó la media ponderada (Wmean) para cada una de ellas. Los cálculos se realizaron mediante los paquetes de R (RCoreTeam, 2012) Acepack,

Ape, Ade4 y Phyloclim.

- Evolución del nicho climático y métodos comparativos

Para reconstruir la evolución del nicho climático en Azara, se utilizó el árbol MCC obtenido en este estudio. Se evaluó CNF de las medias ponderadas de PNO mediante tres métodos comparativos: 1) Señal filogenética  (Pagel, 1999), la cual evalúa el grado de covarianza de las variables entre las especies, donde =0 significa que los caracteres no poseen señal filogenética y =1 significa que si posee señal filogenética; 2) Mediante el Índice de Disparidad Morfológica

(MDI), el cual compara la disparidad observada a la disparidad esperada bajo un modelo evolutivo mediante Movimiento Browniano (BM) sin restricciones (Harmon et al., 2003). Valores positivos de MDI indicarían evolución de nicho y valores negativos indicarían conservatismo de nicho en los clados (Evans et al., 2009) y; 3) Utilizando el criterio de información de Akaike ponderado (AICW) para comparar el ajuste de 3 modelos evolutivos: Movimiento Browniano (BM) el cual asume que la estructura de correlación entre los valores del rasgo a evaluar es proporcional al grado de ascendencia compartida entre pares de especies (Felsenstein, 1973),

Ornstein-Uhlenbeck (OU), Modelo de evolución estabilizadora con un óptimo (Butler and King,

2004) y un modelo de Ruido Blanco (WN), modelo no filogenético que asume que los datos provienen de una única distribución normal sin estructura de covarianza entre las especies. La suma de los valores de AICW es igual a 1, donde el modelo con mayor ajuste es el de mayor valor.

Los análisis se realizaron mediante el paquete GEIGER (Harmon et al., 2008) implementado en R (RCoreTeam, 2012).

RESULTADOS

- Nicho climático y sobreposición de Nicho

Los modelos de nicho climático realizados obtenidos mediante MaxEnt resultaron consistentes.

El área bajo la curva característica del receptor (AUC) del promedio de 50 modelos para cada especie tuvo valores entre 0.992 y 0.997, con un SD entre 0 y 0.001.

Para todas las comparaciones pareadas mediante el índice D, el valor más alto es para la comparación A. serrata-A. integrifolia (D=0.8) y los valores más bajos corresponden a las comparaciones pareadas de A. salicifolia y A. uruguayensis con el resto de las especies. Para el

índice I, se encuentran mayores niveles de sobreposición de nicho, siendo la comparación A. serrata-A. integrifolia el índice I de mayor valor (I=0.95) y las comparaciones de A. salicifolia con

A. alpina y A. lanceolata los valores más bajos (I=0.05) (Tabla 2.2).

Los valores obtenidos mediante las medias ponderadas de PNO (Wmean), indican que las especies actuales de Azara se desarrollan en condiciones microtermales y mesotermales, habitando en condiciones de temperatura de Bio1 <12° C y Bio1 =14-20° C, respectivamente

(Wing, 2003) con una Wmean de precipitación anual (Bio12) entre 390-1750 mm (Tabla 2.3).

- Nicho Climático Filogenético

De acuerdo con las reconstrucciones de las condiciones climáticas en las que habría vivido el ancestro común más reciente (MRCA) del género Azara habría habitado en condiciones climáticas microtermales (Bio1= 13.1° C, CI95%= ± 7.6° C) y con precipitación anual Bio12=1216 mm, CI95%= ± 718.8 (Tabla 2.4, Figura 2.3). Los valores de la reconstrucción ancestral del resto de las variables se detallan en la Tabla 2.4 y en la Figura 2.4.

Al evaluar la evolución del nicho climático, se observa una tendencia de rápida evolución relacionada a la adaptación local. Al calcular la señal filogenética mediante  de Pagel en todas las variables, los valores obtenidos fueron cercanos a cero y no significativos, indicando que no se puede distinguir señal filogenética para ninguna de las variables climáticas (Tabla 2.5). Valores de MDI, al igual que los valores de , no pueden ser distinguidos de evolución de nicho mediante movimiento browniano (p-valor >0.05) (Tabla 2.5).

Al comparar los modelos de evolución OU, BM y WN, se observó que el modelo que más se ajusta para explicar la evolución de nicho según los datos disponibles en Azara es el modelo

WN, donde la variabilidad que se observa en las variables de nicho climático de las especies de

Azara es independiente de la filogenia (Tabla 2.5).

DISCUSION

En términos generales, la evidencia de la evolución del nicho climático del género Azara sugiere una rápida evolución del nicho a medida que el género se diversificaba durante el Terciario.

De acuerdo con los análisis se observó que las variables de mayor contribución al modelo promedio ENM son las variables relacionadas principalmente a la temperatura, sin embargo, ninguna de estas variables presentó señal filogenética, sugiriendo así que las distintas especies de Azara fueron capaces de adaptarse a nuevas condiciones ambientales en vez de seguir un ambiente específico a medida que el clima cambiaba durante el Terciario.

Según los análisis de sobreposición de nicho de las especies actuales de Azara, los índices calculados difieren en su interpretación. En general, el índice D de Schöener para cada par de especies indica una muy baja sobreposición de nicho entre ellas, con la excepción del par A. integrifolia-A. serrata, especies que según filogenia no son hermanas, por lo que su sobreposición de nicho es probable que sus rangos de distribución se superponen. De forma alternativa, mediante el índice I se observan valores más altos correspondientes a un patrón de sobreposición de nicho en varias comparaciones pareadas de especies, sin embargo, éstas no corresponden a especies hermanas según filogenia (excepto I=0.9 para el par A.integrifolia-A. microphylla) (Tabla 2.2). En las especies hermanas disyuntas, se observa que no existe conservación de nicho, ya que las especies A. alpina/salicifolia y A. petiolaris/uruguayensis presentan índices de sobreposición de nicho muy bajos (D=0 e I=0.1)

Según el análisis de los diferentes modelos de evolución del nicho climático de Azara, el género presenta una alta labilidad frente a cambios en las condiciones climáticas. El modelo de evolución de mejor ajuste a los valores de las variables climáticas es el de ruido blanco (WN), lo cual se puede interpretar como la evolución de nicho ha sido tan rápida dentro del género que la evidencia de compartir ancestro común se pierde (Boucher et al., 2014; Munkemuller et al.,

2015). Esta conclusión también es apoyada por no poder distinguir los valores de MDI observados a los esperados bajo evolución según MB y los valores obtenidos de , cuyos indicadores apuntan a que no existe covarianza entre la topología del árbol y las variables climáticas en las que las especies habitan (Tabla 2.5).

Según la reconstrucción de los estados ancestrales de los nodos internos dentro de la filogenia de Azara, los ancestros representados en cada uno de los nodos habitaron en condiciones entre microtermales y mesotermales, esto producto de la gran amplitud del intervalo de confianza del 95% calculado para la temperatura media anual (Bio1). Esta amplitud del intervalo de confianza de 95% se puede apreciar en todas las variables calculadas (Tabla 2.4,

Figura 2.4), lo cual no permitiría establecer de forma acotada los valores de las variables climáticas de los ancestros mediante este tipo de reconstrucción. Esto podría deberse a que las reconstrucciones ancestrales obtenidas mediante los nichos climáticos de las especies actuales tengan diferencias importantes en comparación a los requerimientos de los ancestros (Meseguer et al., 2015), ya que una separación de millones de años haría improbable que los requerimientos climáticos de los ancestros y las especies actuales sean las mismas (Peterson, 2011), como también la limitante misma del análisis que sólo considera una valor medio de temperatura e ignora la amplitud de rango de las variables ambientales. Es por eso que reconstrucciones paleoclimáticas utilizando fisonomía foliar de tafofloras son fundamentales para poder obtener

67 una aproximación más precisa al paleoclima donde habitaron especies ancestrales (Hinojosa and

Villagran, 1997; Wiemann et al., 1998; Hinojosa, 2005; Hinojosa and Villagran, 2005; Wilf et al.,

2005; Hinojosa, Armesto, and Villagran, 2006; Hinojosa et al., 2011; Hinojosa et al., 2015 ). Este es el caso para el nodo IV de la filogenia de Azara, correspondiente al fósil Azara celastriniforma, encontrado en la tafoflora del río Pichileufú (Berry, 1938), perteneciente al Eoceno Medio (Wilf et al., 2005): según reconstrucciones climáticas utilizando fisonomía foliar, la temperatura del ancestro común del nodo IV de la filogenia de Azara se encontraría entre 23-16° C (Hinojosa,

2005; Hinojosa et al., 2006), temperatura superior a la obtenida en la reconstrucción mediante modelos de nicho climático (17-10° C).

- Clima y diversificación

Según el árbol filogenético obtenido, la diversificación de Azara ocurrió durante los últimos 50

Ma, un periodo marcado por fuertes cambios geológicos y climáticos (Hinojosa and Villagran,

1997; Hinojosa, 2005; Le Roux, 2012b, a). El primer evento de diversificación de Azara corresponde en edad al Cenozoico temprano. Basado en reconstrucciones paleoclimáticas de temperatura utilizando fisonomía foliar (Hinojosa, 2005), entre los 50-40 Ma la biota de

Sudamérica se habría desarrollado en un ambiente cálido y húmedo (Hinojosa and Villagran,

1997; Hinojosa et al., 2006).

El inicio del segundo periodo importante de diversificación correspondiente a los nodos

III, IV, V, y VII, se sitúan durante el Eoceno-Oligoceno, en el periodo del enfriamiento Bartoniano-

Rupeliano (Lyle et al., 2007; Le Roux, 2012a, b). Durante este periodo las temperaturas habrían oscilado entre 14-19° C (Zachos et al., 2001; Hinojosa, 2005), la tafoflora que caracteriza a esta

época es de tipo mixto (Hinojosa and Villagran, 1997) y la diversificación habría sido

68 contemporánea al establecimiento de la Corriente Circumpolar Antártica (Barker, 2001; Le Roux,

2012a).

Antes del Mioceno medio, la altura de los Andes permitía el paso de lluvias de verano en

Chile Norte y Centro, pero a partir de 14 Ma, la altura de los Andes alcanza la mitad de su elevación, interfiriendo con la circulación atmosférica y la distribución de las lluvias. También, en esta época se establece la Corriente de Humboldt y junto el efecto de la altura de los Andes, inició el desarrollo de la Diagonal Árida del sur de Sudamérica desde el desierto de Atacama hasta las estepas de Patagonia. Su establecimiento significó el retiro de bosque subtropical que previamente ocupaba el área y su reemplazo por flora antártica, mixta y subtropical mésica

(Hinojosa and Villagran, 1997). Al mismo tiempo, la altura de los Andes comenzó a interceptar lluvia desde el Noreste, intensificando los efectos de las lluvias estivales en el Noroeste Argentino y el Sur de Bolivia, donde actualmente comunidades de bosques se desarrollan (Hinojosa and

Villagran, 1997; Le Roux, 2012b).

Finalmente, entre 10-3 Ma, el género presenta su último pulso de diversificación (nodos

II, VI, VIII y IX), el cual se desarrolla en un contexto de enfriamiento (Zachos et al., 2001; Hinojosa,

2005).

Según la reconstrucción del área ancestral (Capítulo 1), se sitúa al MRCA del género Azara en latitudes medias de Sudamérica y las reconstrucciones de los estados ancestrales del nicho climático apuntan a una diversificación bajo condiciones micro/mesotermales. Un patrón similar se observa en los géneros Nothofagus (Hinojosa et al., 2016) y Myrceugenia (Perez et al., 2014;

Murillo-A, Stuessy, and Ruiz, 2016), donde especies templadas diversifican y dan origen a especies en zonas tropicales y subtropicales.

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Tabla 2.1. Eigenvalues y varianza explicada para cada uno de los componentes principales utilizando las 19 variables de Bioclim. En negrita se destacan las variables que se seleccionaron para construir los ENM para cada especie.

Variables Climáticas Eigenvectors scores PC1 PC2 Variable (38.4%) (29.1%) Bio1 Temperatura media anual 0.36 0.07 Promedio rango diurno (media mensual (max T° - Bio2 min T°)) -0.11 -0.26

Bio3 Isotermalidad (BIO2/BIO7) (* 100) -0.07 -0.24 Estacionalidad de a temperatura (desviación estandar Bio4 *100) -0.04 -0.05 Bio5 Temperatura máxima del mes más cálido 0.27 -0.01 Bio6 Temperatura mínima del mes más frío 0.32 0.14 Bio7 Rango anual de temperatura (BIO5-BIO6) -0.08 -0.16 Temperatura (°C) Temperatura Bio8 Promedio de temperatura del cuarto más húmedo 0.33 0.11 Bio9 Promedio de temperatura del cuarto más seco 0.28 -0.01 Bio10 Promedio de temperatura del cuarto más cálido 0.34 0.06

Bio11 Promedio de temperatura del cuarto más frío 0.34 0.08

Bio12 Precipitación anual -0.20 0.34

Bio13 Precipitación del mes más húmedo -0.26 0.19 Bio14 Precipitación del mes más seco 0.00 0.40 Estacionalidad de la precipitación (Coeficiente de Bio15 variación) -0.01 -0.36 Bio16 Precipitación del cuarto más húmedo -0.26 0.20 Bio17 Precipitación del cuarto más seco -0.01 0.40 Precipitación (mm) Precipitación Bio18 Precipitación del cuarto más cálido 0.03 0.36 Bio19 Precipitación del cuarto más frío -0.27 0.19

0.01

0.02

0.01

A.uruguayensis

0.1

0.02

0.45

0.62

0.32

0.78

0.54

0.21

0.38

A.serrata

0.07

0.09

0.02

0.01

A.salicifolia

0.1

0.06

0.78

0.27

0.15

0.33

0.46

0.27

0.45

. El triángulo superior contiene los valores los contiene superior triángulo El .

A.petiolaris

Azara

0.1

0.6

0.88

0.06

0.49

0.61

0.24

0.08

0.43

A.microphylla

0.8

0.3

0.09

0.58

0.05

0.38

0.11

0.03

0.28

A.lanceolata

0.12

0.95

0.07

0.65

0.87

0.57

0.45

0.12

0.32

A.integrifolia

valores correspondientes a I. a correspondientes valores

0.09

0.84

0.09

0.78

0.54

0.28

0.75

0.43

0.18

A.dentata

0.07

0.51

0.08

0.55

0.29

0.13

0.39

0.72

0.04

A.celastrina

0.06

0.69

0.05

0.72

0.74

0.59

0.62

0.45

0.15

A.alpina

Tabla 2.2. Valores pareados de los índices de sobreposición de nicho para las especies de de especies paralas nicho de sobreposición de índices los de pareados Valores 2.2. Tabla del índice D y bajo la diagonal se encuentran los encuentran diagonal se la bajo y D índice del

A.uruguayensis

A.serrata

A.salicifolia

A.petiolaris

A.microphylla

A.lanceolata

A.integrifolia

A.dentata

A.celastrina A.alpina 79

Tabla 2.3. Medias ponderadas (wmean) de los perfiles de ocupancia del nicho climático predicho (PNO) de variables climáticas de las especies actuales de Azara.

Temperatura (°C) Precipitación (mm) Azara species Bio1 Bio6 Bio8 Bio10 Bio11 Bio12 Bio14 Bio15 Bio17 Bio18 A. alpina 7.4 -2.5 2.9 12.7 2.3 1203.8 23.8 73.6 90.1 90.4 A. celastrina 14.2 4.6 10.3 18.5 9.9 391.8 1.3 105.7 5.1 6.4 A. integrifolia 11.5 2.5 7.7 16.3 7.0 1372.5 26.4 76.8 97.5 102.6 A. lanceolata 8.4 0.0 4.4 12.9 3.9 1741.3 55.1 54.5 198.3 202.8 A.microphylla 10.0 1.2 6.1 14.7 5.5 1617.0 37.4 69.2 137.6 142.3 A. dentata 13.2 3.2 8.9 18.3 8.3 821.0 8.5 93.4 32.9 36.2 A. serrata 11.3 2.0 7.3 16.1 6.7 1277.3 23.0 79.9 86.0 89.9 A. petiolaris 9.8 -0.8 5.2 15.1 4.6 833.3 11.7 86.7 44.2 45.1 A. salicifolia 14.9 2.4 17.8 18.3 10.9 687.5 6.0 84.1 25.9 312.6 A. uruguayensis 16.8 6.4 16.2 22.0 11.8 1286.6 84.0 12.6 279.1 313.5

Tabla 2.4. Reconstrucción de los estados ancestrales e intervalo de confianza de 95% para las 10 variables bioclimáticas para los nodos de Azara.

Nodes Variable I II III IV V VI VII VIII IX Temperature

(°C) 13.6 ± 11.3 ± 13.1 ± 7.6 10.9 ± 3.5 12.7 ± 6.7 12.0 ± 5.9 11.7 ± 5.0 10.2 ± 3.3 13.0 ± 3.3 Bio1 3.4 3.4 Bio6 3.2 ± 6.4 1.9 ± 2.9 2.7 ± 5.6 3.8 ± 2.9 1.9 ± 5.0 0.1 ± 2.9 1.9 ± 4.2 1.2 ± 2.8 2.6 ± 2.8 10.8 ± 10.1 ± 10.2 ± 7.1 ± 6.0 9.6 ± 5.9 9.6 ± 10.2 8.8 ± 8.5 6.4 ± 5.7 10.3 ± 5.7 Bio8 13.1 11.5 5.8 18.3 ± 15.6 ± 17.5 ± 6.7 15.6 ± 3.1 17.3 ± 5.9 16.7 ± 5.2 16.6 ± 4.4 14.9 ± 2.9 18.2 ± 2.9 Bio10 3.1 3.0 Bio11 8.6 ± 8.1 6.4 ± 3.7 8.1 ± 7.2 9.0 ± 3.7 7.4 ± 6.3 6.7 ± 3.6 7.0 ± 5.3 5.7 ± 3.6 7.9 ± 3.6 Precipitation

(mm) 1216.2 ± 1478.4 ± 1092.4 ± 643.8 ± 1118.2 ± 964.8 ± 1220.6 ± 1451.6 ± 1092.1 ± Bio12 718.8 327.7 633.9 325.4 559.0 321.8 467.8 313.8 313.8 35.4 ± 32.1 ± 29.2 ± 6.8 ± 30.4 ± 16.6 ± 38.4 ± 38.9 ± 45.9 ± Bio14 57.6 26.2 50.8 26.1 44.8 25.8 37.5 25.1 25.1 67.8 ± 72.7 ± 73.0 ± 97.5 ± 69.9 ± 77.8 ± 62.8 ± 66.4 ± 52.3 ± Bio15 56.3 25.7 49.7 25.5 43.8 25.2 36.7 24.6 24.6 125.1 ± 118.0 ± 103.6 ± 25.5 ± 108.2 ± 63.6 ± 135.1 ± 140.7 ± 156.3 ± Bio17 190.9 87.0 168.4 86.4 148.5 85.5 124.2 83.3 83.3 200.5 ± 127.0 ± 164.2 ± 32.3 ± 171.8 ± 198.2 ± 166.3 ± 150.4 ± 176.7 ± Bio18 268.6 122.4 236.8 121.6 208.9 120.2 174.8 117.3 117.3

Tabla 2.5. Resultado de los análisis de Conservatismo de Nicho para las 1 variables bioclimáticas.  señal filogenética de Pagel, donde LogL es la probabilidad Log-

Likelihood de  observado, LogL0 es la probabilidad Log-Likelihood de =0; MDI, índice de disparidad morfológica, donde Avg.sq es el promedio de las distancias euclidianas entre los pares de puntos y AICW es el criterio de información de Akaike ponderado que indica la calidad relativa de ajuste de los modelos evolutivos Orstein-Uhlenbeck (OU), Movimiento Browniano (BM) y Ruido Blanco (WN).

 MDI AICw

Variable  logL logL0 P Avg. sq P BM OU WN Bio1 7.35E-05 -5.40E+01 -5.40E+01 1.00 0.42 0.82 0.01 0.03 0.96 Bio6 5.69E-05 -5.27E+01 -5.27E+01 1.00 0.29 0.82 0.02 0.04 0.95 Bio8 7.35E-05 -5.96E+01 -5.96E+01 1.00 0.48 0.82 0.01 0.02 0.97 Bio10 7.35E-05 -5.29E+01 -5.29E+01 1.00 0.36 0.73 0.01 0.03 0.95 Bio11 7.35E-05 -5.46E+01 -5.46E+01 1.00 0.45 0.91 0.01 0.02 0.97 Bio12 4.81E-01 -8.15E+01 -8.16E+01 0.56 0.24 0.82 0.14 0.14 0.72 Bio14 6.93E-05 -5.17E+01 -5.17E+01 1.00 0.21 0.82 0.02 0.05 0.93 Bio15 5.46E-05 -5.14E+01 -5.14E+01 1.00 0.22 0.73 0.02 0.05 0.94 Bio17 4.20E-05 -6.50E+01 -6.50E+01 1.00 0.22 0.82 0.02 0.05 0.93 Bio18 7.35E-05 -5.40E+01 -5.40E+01 1.00 0.11 0.73 0.01 0.03 0.96

Figura 2.1. Análisis de Componentes Principales con las 19 variables bioclimáticas con todos los registros de las 10 especies de Azara.

Figura 2.2. Filogenia (MCC) del género Azara. En los recuadros se identifican los nodos internos.

47.6 35.7 23.8 11.9 0.0 47.6 35.7 23.8 11.9 0.0 Time (Ma) Time (Ma) Figura 2.3. Fenogramas del estado ancestral de las variables climáticas. Líneas blancas corresponden a la proyección del árbol filogenético en un espacio definido por la variable climática (eje y) y tiempo (eje x) y las líneas azules representan el intervalo de confianza CI95%.

Capítulo III:

Evolución y correlación de rasgos funcionales según variables climáticas

INTRODUCCION

La adecuación biológica (fitness) en plantas, al tratarse principalmente de organismos sésiles, depende principalmente de los rasgos funcionales. Tallos, hojas y raíces exhiben una gran variabilidad física que tiene directa relación con el ambiente en el que habitan y su capacidad de crecimiento y supervivencia (Ackerly et al., 2000). Los rasgos funcionales, es decir “las características morfo-fisio-fenológicas que influyen directa o indirectamente en la adecuación biológica la planta al ambiente a través de sus efectos sobre el crecimiento, la reproducción y la supervivencia” (Violle et al., 2007) están directamente relacionados con el medio ambiente donde habitan, es decir, con su distribución en distintos gradientes ambientales y de cómo interactúan y sobreviven frente a distintas condiciones abióticas.

Sin embargo, la capacidad de adaptación mediante variabilidad de los rasgos funcionales cuenta con limitaciones. Una fracción de la variación de los rasgos funcionales dentro de un linaje está sujeta a restricciones de carácter evolutivo, es decir, parte ellos conservan características producto de una herencia filogenética compartida. Estas restricciones comprenden limitaciones morfológicas, fisiológicas, fenológicas o de desarrollo (Gould and Lewontin, 1979; Davis et al.,

2010), por lo tanto, el estudio de la variabilidad y restricciones de estos rasgos funcionales dentro de un linaje nos permite evaluar el grado de labilidad o conservatismo, dependiendo de cuán restringidos por filogenia sean los rasgos funcionales a la evolución por presiones selectivas a condiciones abióticas (Pearson and Dawson, 2003).

La restricción a la modificación de rasgos funcionales dentro de un clado tiene por consecuencia la presencia de limitaciones en la modificación del nicho climático del linaje (rango de condiciones climáticas donde los organismos pueden persistir y reproducirse), lo cual se traduce directamente en la capacidad de habitar distintos tipos de ambientes (Ackerly, 2003).

Por ejemplo, si las restricciones a las modificaciones de los rasgos funcionales están fuertemente limitadas, en las especies que componen este linaje se observará una tendencia a ocupar ambientes similares (Donoghue, 2008). Este patrón se ha denominado “Conservatismo de Nicho

Filético” (Peterson, Soberon, and Sanchez-Cordero, 1999; Wiens, 2004; Cooper, Jetz, and

Freckleton, 2010). Por otro lado, si la capacidad de modificación de los rasgos funcionales no presenta restricciones por filogenia, las especies cercanamente emparentadas podrán ocupar distintos tipos de ambientes (Liu, Peterson, and Ge, 2011; Clark et al., 2012; Liu et al., 2012).

- Rasgos funcionales y clima

En un sentido amplio, la capacidad de distintas plantas dentro de un clado de habitar distintas condiciones ambientales se alcanza mediante distintos tipos de estrategias. Éstas incluyen ajustes fenológicos como también cambios en los rasgos funcionales desde nivel de bioquímica celular hasta arquitectura de raíces, tallos y hojas (Mart, Veneklaas, and Bramley,

2016). Entre los factores abióticos, existen dos factores de estrés climático que las plantas terrestres enfrentan: disponibilidad de agua y variaciones en la temperatura (Lambers, Chapin, and Pons, 2008).

Las plantas vasculares terrestres son considerados organismos homohídricos y poiquilotermos, es decir, se mantienen turgentes y cercanas al 100% de humedad relativa, aunque se encuentren

87 expuestas a ambientes de menor humedad relativa; y no son capaces de aumentar temperatura en condiciones de frío, pero sí pueden enfriar las hojas bajo condiciones de altas temperaturas mediante evapotranspiración, por lo que la disponibilidad de agua es crucial frente al estrés de altas temperaturas (Levitt, 1980).

Frente al estrés, las plantas presentan dos tipos de estrategias en la modificación de rasgos funcionales: resistentes o tolerantes. La estrategia de tolerancia consiste en conservar procesos fisiológicos fundamentales bajo condiciones leves a moderadas de estrés y la resistencia consiste en mantener el metabolismo bajo condiciones de estrés severos (Levitt,

1980; Basu et al., 2016).

A nivel celular, la respuesta frente a la sequía y altas temperaturas consiste en mantener el turgor (Hsiao et al., 1976). Para mantener el turgor, la respuesta celular consiste en disminuir el potencial hídrico al punto de pérdida de turgor (TLP; MPa), el cual se define en el momento que el volumen celular comienza a disminuir por falta de agua poniendo en riesgo la integridad citoplasmática (Lambers, Chapin, and Pons, 2008). Para disminuir el TLP, las células pueden: a) aumentar la concentración intracelular de solutos para disminuir el potencial osmótico en máximo turgor (0; MPa), b) Aumentar la elasticidad de la pared celular mediante la disminución del módulo de elasticidad (; MPa) y c) aumentar el agua apoplástica mediante la redistribución de agua simplástica (Bartlett et al., 2014). También se ha descrito que la capacidad de perder mayor volumen de agua antes de alcanzar el punto de pérdida de turgor (RWCTLP; %) significa que son células que pueden proteger el citoplasma frente a condiciones de escases hídrica

(Lambers, Chapin, and Pons, 2008; Bartlett et al., 2014). En el caso de la resistencia al frío, ésta se alcanza mediante la disminución de la viscosidad de la membrana celular y en la acumulación

88 de solutos (disminución de 0), los cuales evitan la formación de cristales de hielo en bajas temperaturas (Lambers, Chapin, and Pons, 2008).

A nivel foliar, se observa una reducción del tamaño foliar (Peppe et al., 2011; Perez et al., 2014), aumento de la relación masa foliar/área foliar (LMA) (Niinemets, 2001; Centritto,

2002; Westoby et al., 2002; Wright et al., 2004; Wright et al., 2005; Poorter et al., 2009; Puglielli et al., 2015); disminución densidad y tamaño estomático (Franks and Farquhar, 2007) frente a condiciones de sequía y temperaturas extremas (Ackerly, 2004; Wright et al., 2004; Lambers,

Chapin, and Pons, 2008; Perez et al., 2014).

En el xilema, en condiciones de sequía y temperaturas extremas se observa reducción del diámetro de los vasos y de un incremento en el número ellos, lo que estaría relacionado con la prevención y disolución de embolismos, sin que ocurra una interrupción en la conductancia xilemática hacia el follaje (Sperry and Sullivan, 1992; Körner, 2003; Lambers, Chapin, and Pons,

2008; Hernández-Fuentes, Bravo, and Cavieres, 2015; Rosell, Olson, and Anfodillo, 2017). Esta reducción del tamaño de los vasos tiene por consecuencia un compromiso en el transporte hídrico, presentándose una disminución de la conductividad hidráulica específica (Ks) y en la conductividad foliar específica (LSC) (Tyree and Ewers, 1991; Ladjal, Huc, and Ducrey, 2005).

Finalmente, en la anatomía de la madera, estas adaptaciones a estrés hídrico y temperaturas extremas se ven reflejadas en valores de Huber mayores (Preston and Ackerly,

2003; Yoshimura, 2011) y mayor densidad de la madera (WD), ya que una alta densidad de madera significa que gran parte de la biomasa es ocupada por pared celular en vez de tejido conductivo (Searson et al., 2004).

Según filogenia y análisis de nicho climático del género Azara (ver capítulos I y II), el género Azara habría diversificado principalmente mediante adaptación y aislamiento a partir del

Eoceno (50 Ma). El análisis de reconstrucción del nicho climático y evaluación de la señal filogenética de las variables ambientales indican que el nicho climático de Azara es completamente lábil, sin lograr detectarse restricciones filogenéticas a la evolución del nicho climático en las especies que lo componen. Por esto, es interesante indagar si esta labilidad tiene un sustento fenotípico coherente en rasgos funcionales relacionados a las diferentes condiciones de disponibilidad hídrica y variabilidad térmica en la que habitan las especies del clado.

Si el género Azara presenta labilidad de nicho climático producto de adaptaciones in situ frente a un cambio climático en condiciones de aislamiento, entonces se espera que los rasgos funcionales las especies hermanas disyuntas de género no presenten similitudes y respondan sin restricciones filogenéticas a las condiciones climáticas locales.

MATERIALES Y METODOS

- Obtención de datos de rasgos funcionales

Rasgos Foliares - Se midieron los rasgos foliares de 3 individuos por especie por sitio de colecta, de cada individuo se seleccionaron hojas maduras, completamente expandidas sin daño foliar producto de herbivoría.

Se cortaron hojas a nivel de peciolo o rama terminal y se hidrataron durante 24 horas en bolsas selladas con agua destilada, en oscuridad y a 18° C hasta alcanzar máximo turgor para asegurar una apropiada construcción de la curva presión volumen (Koide et al., 2000). Se midió el potencial hídrico (MD, MPa) de las hojas a medida que se iban deshidratando para obtener una curva presión-volumen siguiendo el protocolo disponible en http://prometheuswiki.org/tiki-index.php?page=Leaf+pressure-volume+curve+parameters

(Sack et al., 2003). La presión hidráulica fue medida con una cámara de presión Scholander (PMS

Instrument Company, Model 1000) y las hojas fueron pesadas después de cada medición en una balanza analítica (Precisa Gravimetrics AG Series 320XB, Dietikon, Switzerland). El tejido foliar se deshidrató ligeramente a temperatura ambiente y se volvió a medir potencial hídrico y masa; esto fue repetido hasta alcanzar una masa constante. Una vez alcanzada una masa constante, las hojas fueron secadas por 48 horas a 70°C. Una vez obtenido el peso seco, se calcularon los siguientes rasgos fisiológicos: potencial osmótico a máximo turgor (0; MPa), potencial osmótico

91 en el punto de pérdida de turgor (TLP; MPa), contenido relativo de agua al punto de pérdida de turgor (RWCTLP; %) y el módulo de elasticidad (ɛ; MPa) (Lambers, Chapin, and Pons, 2008).

Las hojas secas fueron escaneadas (Deskjet Ink Advantage 1515, All-in-One series,

Hewlett Packard) y analizadas utilizando el programa ImageJ (Schindelin et al., 2015) para determinar el área de la hoja (LA). Finalmente, utilizando el peso seco (g), se calculó la razón de masa foliar por área (LMA; g cm-2) para cada uno de los individuos (Poorter et al., 2009).

Se utilizaron dos métodos para extraer la cutícula de las hojas, 20 láminas para cada especie (excepto A dentata, cuya extracción sólo fue posible en 10 láminas). Se eligió la técnica adecuada para cada especie según dificultad de extracción.

La primera técnica consiste en barnizar la cara abaxial de cada hoja con una fina capa de laca transparente de uñas. Una vez seca se aplicó cinta adhesiva sobre la laca y se removió mecánicamente la epidermis, montándola cuidadosamente sobre un portaobjetos para posterior observación (Zeng, 2008).

La segunda técnica se utilizó en hojas cuya extracción no fue posible mediante el método anterior. Consiste en diafanizar las hojas, utilizando un protocolo modificado de Johansen

(Johansen, 1940): las hojas se sumergieron en una solución al 100% de HCl, hasta alcanzar su completa decoloración. Luego las muestras se colocaron en agua destilada para proceder a separar ambas epidermis con ayuda de agujas de disección. Posteriormente las muestras se tiñeron en una solución de azul de metileno y se montaron en portaobjetos provistos de una gota de Entellan (Merk), cubriéndolos con un cubreobjetos para su posterior observación.

Cada una de las placas fue fotografiada bajo microscopio con un aumento de 40x. Las fotografías obtenidas se analizaron mediante el programa ImageJ (Schindelin et al., 2015) para obtener el rasgo densidad estomática (SD; estomas/mm2).

Tamaño máximo de los vasos – Para cada individuo se cortó una rama recta de aproximadamente 1 cm de diámetro y 20 cm de largo, sin ramificaciones ni hojas. Se estimó el largo máximo de los vasos aplicando presión con aire con una jeringa en la región que originalmente estaba más cerca de la raíz (Ewers and Fisher, 1989). La región distal fue cortada cada 0.5 cm aproximadamente hasta que burbujas emergen. El largo de la rama restante se estimó como el largo máximo de los vasos (MVL; cm) y esta medida se utilizó posteriormente para mediciones de conectividad hidráulica.

Conductividad hidráulica – Una segunda colecta de ramas de los mismos individuos por especie se colectó para medir conductividad hidráulica (kh), la cual consiste en la razón entre el flujo de agua (F; 푘푔 s-1) a través de una sección de rama y un gradiente de presión (푑푃/푑푥, 푀P푎

푚-1) que causa el flujo (Sperry, Donnelly, and Tyree, 1988).

Al momento de la colecta, las ramas recientemente colectadas fueron cortadas bajo agua para evitar generar nuevos embolismos. Posteriormente, en la estación de medición se cortaron ambos extremos bajo el agua, dejando una rama de largo similar al largo máximo de los vasos determinado para cada especie (aproximadamente 15 cm). Manteniendo a rama bajo el agua, se removió aproximadamente 1cm de madera de ambos extremos de la rama y se envolvieron con Parafilm. Se conectó la rama, manteniendo la dirección del flujo de agua, a una columna de una solución de KCl elevada aproximadamente a 3 metros (~29.5 KPa) y se dejó conectada 10-15 min (midiendo el flujo de agua cada 15 segundos), de manera que se removieran la mayor

93 cantidad de émbolos. Posteriormente la solución se dejó a 1 m (la cual aporta una presión constante de fluido de 9.8 KPa) y se midió el flujo de salida de la solución de KCl mediante una balanza analítica (Precisa Gravimetrics AG Series 320XB, Dietikon, Switzerland) cada 15 segundos durante 10 minutos. Se dividió la conductividad hidráulica de cada rama por el diámetro de albura, para obtener la conductividad específica (Ks) y así hacer comparables las medidas de

-1 -1 -1 ramas de distinto diámetro (Ks; kg MPa m s ).

Anatomía de la madera – Las mismas ramas utilizadas para la medición de conductividad se perfundieron con safranina para visualizar las secciones de xilema conductivo. Una sección transversal de la región distal a las hojas de la rama fue cortada con micrótomo, fue montado en un portaobjetos y fotografiado bajo microscopio con un aumento de 40x. La fotografía obtenida se analizó mediante el programa ImageJ (Schindelin et al., 2015) para obtener los rasgos de promedio del diámetro de los vasos (VD; μm) y densidad de los vasos (VDi; vasos mm-2). También para cada una de las especies, los diámetros de los vasos fueron categorizados cada 10 m para construir histogramas de frecuencia. Según la ley de Hagen-Poiseuille (Tyree and Ewers, 1991), se elevaron los diámetros a la cuarta potencia y se sumaron en cada categoría con el fin de determinar la contribución relativa de cada clase de tamaño de vasos a la conductividad total.

Se obtuvo para cada rama el valor de Huber (HV; sección transversal de albura dividido por el área foliar soportada por esa rama) calculando el área del follaje utilizando el valor LMA calculado para cada especie y el peso seco del follaje de cada rama. (Huber, 1928; Vinya et al.,

2012). También se calculó la conductividad específica de la hoja (Ks dividida por área de hojas alimentada por la rama, LSC; kg MPa-1 m-3 s-1) y la densidad de la madera (WD; g cm-3) (Tyree and

Ewers, 1991).

- Análisis de datos de rasgos funcionales

Las diferencias en los rasgos funcionales entre las 10 especies de Azara se contrastaron mediante un análisis de componentes principales (PCA). Posteriormente, para evaluar diferencias entre las especies para cada rasgo funcional, se realizaron una serie de análisis de ANOVA de una vía, y cuando éstos resultaron significativos, se realizaron pruebas a posteriori de Tukey (IC= 95%) para identificar diferencias entre los rasgos funcionales de cada especie. Para realizar estos análisis se utilizaron los paquetes stats y agricolae implementados en R (RCoreTeam, 2012).

- Señal Filogenética

Para detectar señal filogenética en Azara, se utilizó el árbol MCC obtenido en el capítulo 1. Se evaluó conservatismo de rasgos funcionales mediante tres métodos comparativos: 1) Señal filogenética  (Pagel, 1999), la cual evalúa el grado de covarianza de las variables entre las especies, donde =0 significa que los caracteres no poseen señal filogenética y =1 significa que si posee señal filogenética; 2) Mediante el Índice de Disparidad Morfológica (MDI), el cual compara la disparidad observada a la disparidad esperada bajo un modelo evolutivo mediante

Movimiento Browniano (BM) sin restricciones (Harmon et al., 2003). Valores positivos de MDI indicarían evolución de nicho y valores negativos indicarían conservatismo de nicho en los clados

(Evans et al., 2009) y; 3) Utilizando el criterio de información de Akaike ponderado (AICW) para comparar el ajuste de 3 modelos evolutivos: Movimiento Browniano (BM) el cual asume que la estructura de correlación entre los valores del rasgo a evaluar es proporcional al grado de ascendencia compartida entre pares de especies (Felsenstein, 1973), Ornstein-Uhlenbeck (OU),

Modelo de evolución estabilizadora con un óptimo (Butler and King, 2004) y un modelo de Ruido

Blanco (WN), modelo no filogenético que asume que los datos provienen de una única

95 distribución normal sin estructura de covarianza entre las especies. La suma de los valores de

AICW es igual a 1, donde el modelo con mayor ajuste es el de mayor valor.

Los análisis se realizaron mediante el paquete GEIGER (Harmon et al., 2008) implementado en R (RCoreTeam, 2012).

- Correlación Variables Climáticas y Rasgos Funcionales

La correlación entre variables ambientales y los rasgos funcionales obtenidos se evaluó mediante un análisis de correlación canónica (CCA; Hotelling, 1936) una vez verificados que las variables ambientales y rasgos funcionales no presentan señal filogenética.

Para seleccionar las variables climáticas, se calculó el índice de correlación de Pearson entre los valores de PNO de las 19 variables climáticas (Tabla 3.1) y el valor de cada especie en el PC1 del análisis de PCA para rasgos funcionales y se seleccionaron 5 variables climáticas con un módulo de índice de Pearson mayor a 0.5 que representan estrés climático térmico (Bio5,

Bio6 y Bio11) y de precipitación (Bio15 y Bio17). Para seleccionar los rasgos funcionales, se eligió un rasgo de potencial hídrico (módulo de 0), un rasgo de elasticidad de pared celular (), un rasgo de conductividad hidráulica (KS) y un rasgo de anatomía de madera (VD).

El análisis de CCA se realizó mediante el paquete vegan implementado en R (RCoreTeam,

2012).

RESULTADOS

- Análisis de Componentes principales de rasgos funcionales

Se observó diferenciación de las respuestas de los rasgos funcionales analizados entre especies mediante el análisis de PCA. El primer componente (PC1), que explica el 23.8% de la varianza, mostró alta contribución de los rasgos fisiológicos celulares (Tabla 3.2): los rasgos de mayor ponderación en este componente principal son los rasgos de elasticidad de la pared celular y porcentaje de agua al punto de pérdida de turgor ( y RWCTLP, respectivamente) separando en los cuadrantes negativos a las especies con mayor elasticidad de la pared celular y menor porcentaje de agua en el punto de pérdida de turgor y los cuadrantes positivos aquellas con menor elasticidad y mayor porcentaje de agua en el punto de pérdida de turgor (Figura 3.1,

Tabla 3.2).

El segundo componente principal (PC2) explica un 19.7% adicional de la varianza y dominan los rasgos de anatomía de la madera relacionados al tamaño y número de vasos (Tabla 3.2). En los cuadrantes positivos se encuentran las especies con vasos de mayor tamaño y menor número; y en los cuadrantes negativos se encuentran las especies que presentan vasos de menor diámetro y mayor densidad, es decir, a través del PC2 se pueden observar las especies que presentan adaptaciones relacionadas a la prevención de embolismos en el cuadrante negativo y

97 en el cuadrante positivo aquellas que son capaces de una mayor conductividad hídrica (Figura

3.1, Tabla 3.2).

- Rasgos funcionales

Frente a condiciones de estrés hídrico y de temperatura, el potencial hídrico en el punto de pérdida de turgor (TLP; MPa) disminuye como respuesta al estrés abiótico climático. En las especies de Azara, no se encontraron diferencias significativas entre los valores de TLP (ANOVA;

F=1.41, p=0.21), con valores promedio entre -1.6 y -0.9 MPa (Tabla 3.3, Figura 3.2a). Entre los rasgos funcionales que influyen en TLP (0 y RWCTLP), se encontraron diferencias significativas entre las especies de Azara para el ajuste osmótico (0; Mpa) (ANOVA; F=4.59, p<0.01), donde

A. petiolaris presenta mayor ajuste osmótico (Tabla 3.3, Figura 3.2b). En el módulo de elasticidad de la pared celular (), existen diferencias significativas entre A. salicifolia y el resto de las especies de Azara (ANOVA; F=5.10, p<0.01), especie que presenta la mayor elasticidad, lo que también le permite perder una mayor cantidad de volumen de agua antes de alcanzar el punto de pérdida de turgor (RWCTLP; %) (Tabla 3.3, Figura 3.2c y 3.2d). Concordantemente, se encontraron diferencias significativas entre las especies de Azara (F=21.8, p<0.001) para el rasgo

RWCTLP.

En los rasgos de morfología foliar, se encontraron diferencias significativas de los valores de LMA (F=6.86, p<0.01), MLA (F=16.64, p<0.01) y SD (F=23.49, p<0.01) obtenidos para cada especie según los análisis de ANOVA de una vía. Las especies de Azara que presenta una mayor protección del aparato fotosintético e inversión en biomasa (mayor LMA) frente a condiciones de estrés abiótico son A. alpina, A.dentata, A. integrifolia, A. petiolaris y A. salicifolia (Tabla 3.4,

Figura 3.3a). En el caso del tamaño foliar promedio, las especie que presentan láminas de menor tamaño (MLA) son A. microphylla, A. lanceolata, A.dentata y A. alpina (Tabla 3.4, Figura 3.3b) y finalmente, las especies con menor densidad estomática promedio en el género (SD; estomas/mm2) son A. celastrina, A. uruguayensis, A. salicifolia y A. petiolaris (Tabla 3.4, Figura

3.c).

Frente a condiciones de altas y bajas temperaturas y estrés hídrico, la conductividad hidráulica específica (Ks; kg MPa-1 m-1 s-1) y la conductividad foliar específica (LSC; kg MPa-1 m-3 s-

1) se espera que disminuyan como respuesta al estrés abiótico climático. En las especies de Azara no se logró identificar diferencias significativas de KS (ANOVA; F=1.8, p=0.09), cuyos valores promedio se encuentran entre 0.26 y 1.34 kg MPa-1 m-1 s-1 y LSC, cuyos valores promedio se encuentran entre 11-61 kg MPa-1 m-3 s-1 (ANOVA; F=1.23, p=0.3) entre las especies de Azara

(Tabla 3.5, Figura 3.4).

En los rasgos de anatomía de la madera, no se encontraron diferencias significativas entre las especies de Azara en los valores de HV (ANOVA; F=0.72, p=0.69), es decir, área de albura en relación con el área de follajea mantenido por ese tallo, tampoco en densidad de la madera (WD; g cm3) (ANOVA; F=1.56, p=0.19) (Tabla 3.6, Figura 3.5).

Finalmente, una alta densidad (VDi; vasos mm-2) y un tamaño pequeño (VD; m) de vasos del xilema se asocian a adaptaciones frente a la prevención y disolución de embolismos frente a estrés abiótico de temperatura y baja disponibilidad hídrica, y en el caso de Azara, para ambos rasgos se encontraron diferencias significativas entre las especies (ANOVA VD; F=3.34, p=0.009 y ANOVA VDi; F=2.96, p=0.016), pero la prueba a posteriori de Tukey no tuvo el poder suficiente para resolver las diferencias entre las especies. En Azara, los valores de VDi se encuentran entre

18-43 vasos/mm-2 en promedio; en el caso de VD, los valores promedios obtenidos en Azara se encuentran entre 33-48 m de diámetro (Tabla 3.6, Figura 3.5c)

Al analizar la frecuencia de los distintos tamaños de vasos y su contribución relativa a la conductividad hidráulica, se observa una alta frecuencia (>40%) de vasos de la clase de menor diámetro (10-20 m) en todas las especies de Azara, siendo A. celastrina la especie con mayor frecuencia de vasos (61%) en esta clase de tamaño (Tabla 3.7, Figura 3.6a). Sin embargo, en A. celastrina se observa una mayor contribución de conductividad hídrica en la clase de diámetro de mayor tamaño (80-90 m) de entre las especies de Azara, cuyas clases de mayor contribución se encuentran entre los 50 y 80 m de diámetro (Tabla 3.7, Figura 3.6b).

- Señal Filogenética

Al calcular la señal filogenética mediante  de Pagel de los rasgos funcionales, los valores obtenidos fueron cercanos a cero para los rasgos celulares, foliares y de conductividad y se obtuvo valores cercanos a 1 para los rasgos de anatomía de madera (Tabla 3.8). Valores de MDI, tanto en variables de temperatura como en variables de precipitación, tuvieron un resultado positivo, es decir, se sugiere que la disparidad se distribuye principalmente dentro de los subclados debido a la evolución de nicho dentro de los subclados. Sin embargo, los valores de

MDI, al igual que los valores de , no pueden ser distinguidos de evolución de nicho mediante movimiento browniano (p-valor >0.05) (Tabla 3.8).

Al comparar los modelos de evolución OU, BM y WN, se observó que el modelo que más se ajusta para explicar la evolución de la mayoría de los rasgos funcionales medidos en Azara es el modelo WN, donde la variabilidad que se observa en las variables de nicho climático de las

100 especies de Azara es independiente de la filogenia. Sólo en el rasgo WD el modelo evolutivo de mejor ajuste corresponde a BM (Tabla 3.8).

- Análisis de correlación canónica

Según el análisis de CCA, existe una correlación significativa entre los rasgos funcionales y las variables climáticas seleccionadas (Pillai=3.64; p=0.044).

Las variables climáticas de estrés térmico (temperatura máxima del mes más cálido, temperatura mínima del mes más frío y temperatura promedio del cuarto más frío; Bio5, Bio6 y

Bio11, respectivamente) presentan una mayor correlación negativa con el eje canónico 2 (CA2).

Las variables de precipitación Bio15 (Estacionalidad de la precipitación) y Bio17 (Precipitación del cuarto más seco) también se correlacionan con el CA2, pero Bio15 de forma negativa y Bio17 de forma positiva. Con respecto a CA1, las variables de precipitación se localizan en los cuadrantes negativos y los de temperatura, en el cuadrante positivo (Figura 3.7a).

Los rasgos funcionales seleccionados mostraron principalmente una separación en el

CA2: LMA, VD y KS en los cuadrantes negativos y 0 y  en los positivos. En el CA1, las variables ubicadas en los cuadrantes positivos son KS y VD, y en los negativos 0,  y LMA (Figura 3.7a).

En los cuadrantes positivos de CA2 en el análisis de CCA, las especies A. lanceolata, A. microphylla se encuentran en el cuadrante positivo de CA1 y las especies A. alpina y A. uruguayensis en el negativo de CA1. En los cuadrantes negativos de CA2, las especies A.petiolaris,

A. salicifolia y A. dentata se encuentran en el cuadrante positivo de CA1 y, finalmente, las especies A. serrata, A.integrifolia y A. celastrina se ubican en el cuadrante negativo de CA1

(Figura 3.7b).

101

DISCUSION

Los rasgos funcionales analizados presentaron alta labilidad según tolerancia a distintas condiciones climáticas, además de presentar correlaciones significativas entre los rasgos y las condiciones ambientales donde cada especie habita. Coherentemente, el modelo de evolución de mejor ajuste para la mayoría de los rasgos analizados es el de ruido blanco (WN), lo cual se puede interpretar como la evolución de los rasgos funcionales ha sido tan rápida dentro del género que la evidencia de compartir ancestro común se pierde (Boucher et al., 2014;

Munkemuller et al., 2015). También, la conclusión de una alta labilidad de rasgos funcionales es apoyada por no poder distinguir los valores de MDI observados a los esperados bajo evolución según MB y los valores obtenidos de , cuyos indicadores apuntan a que no existe covarianza entre la topología del árbol y los rasgos funcionales.

En los rasgos fisiológicos foliares, la resistencia frente a la sequía y bajas temperaturas se alcanza disminuyendo los valores de 0 hacia valores más negativos, rasgo que se encuentra correlacionado con la precipitación del cuarto más seco (a menor precipitación, valores más negativos de 0) y con la temperatura mínima del mes más frío (a menor temperatura, valores más negativos).

Mantener la conductividad hidráulica es crucial en la resistencia al estrés hídrico y frente a los ciclos de hielo-deshielo, y en el caso de Azara, un rasgo que contribuye para lograr la

102 continuidad de la columna de agua frente al estrés hídrico y de bajas temperaturas es la disminución del tamaño de los vasos (VD). Una consecuencia de tener vasos de tamaño reducido es el compromiso que existe con la conductividad hidráulica, problema que es compensado aumentando el número de vasos (VDi). En Azara, VD responde principalmente a la estacionalidad de la precipitación (Bio15): a mayor estacionalidad, vasos de menor diámetro y mayor densidad.

Dentro de la distribución de clases de tamaños de los vasos en Azara, también se puede observar una adaptación frente a la estacionalidad de las precipitaciones: gran proporción de vasos pequeños (10-20 m) y una baja densidad de vasos de mayor tamaño. Los vasos de menor tamaño se encargan de mantener la conductividad hidráulica frente a condiciones de estrés hídrico y los vasos de mayor tamaño se encargan de mantener un flujo mayor de agua si éstos no se encuentran embolizados durante un periodo de disponibilidad hídrica. Esta compensación es particularmente clara con A. celastrina, ya que esta especie presenta la mayor proporción de vasos de menor diámetro (61%), pero los vasos que presentan la mayor contribución a la conductividad hidráulica son las de mayor tamaño dentro de las especies del género.

Además de influir la disponibilidad hídrica en KS, el análisis de correlación también indica que el promedio de temperatura invernal influye en la conductividad hidráulica: a menor temperatura promedio, menor conductividad hidráulica. Esto tiene sentido en la disminución de

KS producto de cavitación (formación de embolismos por frío) de los vasos producto de los ciclos hielo-deshielo.

103

Usualmente las plantas frente a condiciones de estrés hídrico muestran cambios en su densidad estomática o son más densas y rígidas (mayor LMA); ambas estrategias tienen por resultado neto la disminución de la superficie disponible para evapotranspiración (Poorter et al.,

2009). En el caso de Azara, no se logró definir una correlación clara entre las variables climáticas de estrés climáticas seleccionadas para el análisis de CCA y el rasgo LMA.

Finalmente, según los resultados obtenidos en este trabajo, se determinó que la diversidad de especies de Azara responde a la labilidad de sus rasgos funcionales, ya que permitió al clado sobrevivir y adaptarse in situ a los fuertes cambios climáticos en términos de disponibilidad hídrica y variabilidad térmica. Esta labilidad es la causa directa de la baja conservación del nicho climático dentro del linaje y así sobrevivir y adaptarse a los profundos cambios geológicos y climáticos que caracterizaron los últimos 50 Ma en Sudamérica.

104

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111

6.4

4.9

12.6

84.0

11.8

22.0

18.2

16.2

22.8

29.3

40.3

11.1

16.8

317.5

313.5

279.1

357.9

130.0 1286.6

A. uruguayensis

6.0

2.4

6.1

31.0

25.9

84.1

10.9

18.3

11.3

17.8

23.2

25.5

29.2

14.0

14.9

312.6

374.3

139.6

687.5

A. salicifolia

4.6

5.2

5.5

9.8

-0.8

45.1

44.2

86.7

11.7

15.1

14.8

25.2

24.4

41.0

14.0

441.8

471.5

174.9

833.3

A. petiolaris

6.7

7.3

2.0

5.4

89.9

86.0

79.9

23.0

16.1

15.9

23.0

25.0

36.6

12.6

11.3

637.6

682.4

247.1

1277.3

A. serrata

8.5

8.3

8.9

3.2

5.4

1.3

36.2

32.9

93.4

18.3

17.9

23.8

27.0

38.8

13.2

451.3

486.1

184.6

821.0

A. dentata

5.5

6.1

1.2

5.4

69.2

37.4

14.7

14.5

22.2

23.4

35.5

12.2

10.0

756.9

142.3

137.6

805.8

285.7

1617.0

A.microphylla

3.9

4.4

0.0

5.2

8.4

54.5

55.1

12.9

12.7

20.7

20.6

35.0

11.0

746.0

202.8

198.3

775.2

278.1

1741.3

A. lanceolata

7.0

7.7

2.5

5.4

97.5

76.8

26.4

16.3

16.0

22.3

24.9

35.7

12.2

11.5

675.2

102.6

723.6

261.7

1372.5

A. integrifolia

predicción de ocupación de nicho climático (PNO) de las 19 variables 19 las de (PNO) climático nicho de ocupación de predicción

6.4

5.1

1.3

9.9

4.6

5.6

99.2

18.5

18.2

10.3

21.3

25.9

33.4

12.1

14.2

238.2

251.6

105.7

391.8

A. celastrina

2.3

2.9

5.5

7.4

-2.5

90.4

90.1

73.6

23.8

12.7

12.5

24.9

22.4

40.5

13.9

592.9

629.3

226.3

1203.8

A. alpina

mean) de los perfiles de de perfiles los de mean)

Variable

Precipitation

Temperature

1. Promedios ponderados ( ponderados Promedios 1.

Precipitaciónfrío más del cuarto

Precipitacióncálido más del cuarto

Precipitaciónseco más del cuarto

Precipitaciónhúmedo más del cuarto

Estacionalidaddeprecipitaciónla (Coeficiente devariación)

Precipitacióndel seco mes más

Precipitacióndel húmedomes más

Precipitaciónanual

Promedio de temperatura del cuarto más frío Promedio más dedel temperatura cuarto

Promedio de temperatura del cuarto más cálidoPromedio más dedel temperatura cuarto

Promedio de temperatura del cuarto más secoPromedio más dedel temperatura cuarto

Promedio de temperatura del cuarto más húmedoPromedio más dedel temperatura cuarto

Rango anual de(BIO5-BIO6) anualtemperatura Rango

Temperatura mínima del frío mínima mes Temperatura más

Temperatura máximadel Temperatura cálidomes más

Estacionalidad de a temperatura (desviacióntemperaturaEstacionalidad dea *100) estandar

Isotermalidad100) (* (BIO2/BIO7)

Promediodiurno(media rango mensualmin- T°)) (max T°

Temperatura media Temperatura anual

climáticas de Bioclim. de climáticas Tabla Tabla

Bio19

Bio18

Bio17

Bio16

Bio15

Bio14

Bio13

Bio12

Bio11

Bio10

Bio9

Bio8

Bio7

Bio6

Bio5

Bio4

Bio3

Bio2 Bio1

112

Tabla 3.2. Ponderación de los variables rasgos funcionales en los dos primeros componentes principales (PC1 y PC2). Valor en paréntesis indican el porcentaje explicado por cada eje. Las variables son clasificadas en rasgos celulares (TLP = Potencial hídrico al punto de pérdida de turgor, 0 = Potencial osmótico a máximo turgor,  = módulo de elasticidad y RWCTLP = Contenido relativo de agua al punto de pérdida de turgor), foliares (LMA = razón peso seco y área foliar,

MLA = área foliar promedio y SD = densidad estomática), conductividad (KS = conductividad hidráulica específica y LSC = conductividad foliar específica) y rasgos de anatomía de madera (WD = densidad de la madera, VDi = densidad de los vasos, VD = tamaño de los vasos y HV = valor Huber) Rasgos Funcionales Vectores propios

Tipo Variables PC1 (23.8%) PC2 (19.7%)

TLP -0.12 -0.26

0 -0.33 -0.32 Celulares  0.37 0.24

RWCTLP 0.43 0.12

LMA -0.08 0.27

Foliares MLA -0.30 -0.34

SD 0.25 -0.27

Ks -0.33 -0.14 Conductividad LSC 0.22 -0.20

WD -0.23 0.05

VDi 0.27 -0.47 Anatomía VD -0.32 0.42

HV -0.09 0.18

113

Tabla 3.3. Valores promedio, mediana y desviación estándar (SD) de los rasgos funcionales celulares obtenidos de las especies de Azara. Potencial hídrico en punto pérdida de turgor (TLP;

MPa), potencial osmótico a máximo turgor (0;MPa), módulo de elasticidad () y contenido relativo de agua en el punto de pérdida de turgor (RWCTLP; %).

TLP 0  RWCTLP Especie Promedio Mediana SD Promedio Mediana SD Promedio Mediana SD Promedio Mediana SD A. alpina -1.2 -1.2 0.1 -0.8 -0.8 0.1 25.6 29.1 9.7 96.8 97.1 1.0 A. celastrina -1.3 -1.3 0.2 -0.9 -0.9 0.1 20.1 17.0 5.2 96.3 97.1 1.7 A. dentata -1.4 -1.2 0.4 -1.0 -1.0 0.2 23.0 24.3 5.3 95.7 96.4 1.4 A. integrifolia -1.2 -1.3 0.2 -0.9 -1.0 0.2 28.5 25.6 5.7 96.8 96.2 0.9 A. lanceolata -1.4 -1.4 0.1 -1.0 -1.0 0.1 25.5 21.8 8.4 95.7 95.5 0.7 A. microphylla -1.6 -1.6 0.4 -1.1 -1.2 0.3 17.2 16.8 4.2 93.6 94.8 1.7 A. petiolaris -1.4 -1.4 0.3 -1.1 -1.1 0.2 19.8 23.5 9.1 97.1 96.0 2.4 A. salicifolia -1.2 -1.2 0.3 -0.6 -0.6 0.1 1.7 1.7 0.7 78.2 79.3 5.4 A. serrata -0.9 -0.8 0.2 -0.6 -0.6 0.0 14.4 19.0 7.0 94.9 97.1 3.2 A. uruguayensis -1.1 -1.1 0.3 -0.7 -0.7 0.2 16.3 13.9 6.1 95.7 96.3 1.4

114

Tabla 3.4. Valores promedio, mediana y desviación estándar (SD) de los rasgos funcionales foliares obtenidos de las especies de Azara. Razón peso seco/área (LMA; g/mm2), área foliar promedio (MLA; mm2) y c) densidad estomática (SD; estomas/mm2).

LMA (g/mm2) MLA (mm2) SD (estomas/mm2) Especie Promedio Mediana SD Promedio Mediana SD Promedio Mediana SD A. alpina 1.93E-04 2.20E-04 4.64E-05 288.50 325.68 155.01 3.94 4.08 0.88 A. celastrina 1.28E-04 1.15E-04 2.64E-05 545.34 573.42 154.81 2.63 2.64 0.52 A. dentata 1.70E-04 1.62E-04 1.39E-05 318.24 327.56 60.76 2.88 2.64 0.67 A. integrifolia 1.62E-04 1.62E-04 1.62E-05 596.06 459.98 309.16 2.82 2.64 0.83 A. lanceolata 7.43E-05 7.46E-05 7.62E-06 347.78 302.86 100.25 4.26 4.27 1.11 A. microphylla 1.12E-04 1.15E-04 7.76E-06 102.64 111.5 18.05 3.40 3.26 0.80 A. petiolaris 1.42E-04 1.19E-04 4.39E-05 1044.68 1076.18 361.81 2.36 2.26 0.47 A. salicifolia 1.33E-04 1.40E-04 1.38E-05 1674.54 1596.78 292.08 2.45 2.39 0.47 A. serrata 1.09E-04 1.18E-04 2.67E-05 926.31 790.14 274.49 4.31 4.65 1.16 A. uruguayensis 1.15E-04 1.06E-04 2.56E-05 1227.58 1043.58 381.93 2.61 2.51 0.37

115

Tabla 3.5. Valores promedio, mediana y desviación estándar (SD) de los rasgos funcionales de conductividad obtenidos de las especies de Azara: Conductividad hidráulica específica (KS; kg MPa-1 m-1 s-1) y Conductividad foliar específica (LSC; kg MPa-1 m-3 s-1). Ks LSC Especie Promedio Mediana SD Promedio Mediana SD A. alpina 0.43 0.39 0.21 10.77 11.27 5.30 A. celastrina 1.34 1.27 0.43 61.09 56.11 31.71 A. dentata 0.73 0.78 0.25 15.09 14.47 2.78 A. integrifolia 0.61 0.59 0.14 18.06 18.86 6.29 A. lanceolata 0.26 0.30 0.10 15.24 14.11 9.02 A. microphylla 0.52 0.44 0.32 35.86 33.25 25.30 A. petiolaris 0.72 0.67 0.36 16.82 14.76 8.86 A. salicifolia 1.25 1.15 0.58 22.82 22.45 15.61 A. serrata 1.14 1.14 0.76 13.94 14.74 7.71 A. uruguayensis 0.97 0.84 0.73 20.87 22.01 16.90

116

2.49

2.98

1.02

3.88

3.57

6.13

1.86

0.39

5.85

3.65

37.21

33.21

44.53

32.93

35.53

42.50

41.27

42.33

48.18

40.46

Mediana

) y diámetro promedio promedio diámetro y )

36.70

33.16

44.89

32.69

33.40

37.76

40.31

42.35

44.04

41.66

Promedio

0.07

7.74

1.81

2.79

2.25

5.40

12.86

11.88

10.57

11.23

22.77

40.83

20.89

45.25

33.70

27.37

21.81

17.66

18.88

26.66

VDi

Mediana

31.06

42.97

20.86

42.64

31.17

33.51

21.14

17.62

20.34

22.95

funcionales funcionales de anatomía de madera obtenidos de las

Promedio

0.06

0.09

0.06

0.11

0.06

0.01

0.02

0.05

0.07

), densidad de los vasos (VDi; vasos mm vasos (VDi; vasos los de ),densidad

0.25

0.26

0.39

0.28

0.15

0.20

0.23

0.21

0.24

0.39

) ) de los rasgos

Mediana

0.29

0.36

0.27

0.22

0.23

0.22

0.21

0.28

0.36

Promedio

1.44E-03

3.10E-03

1.79E-03

2.12E-03

5.08E-04

1.41E-03

2.40E-04

4.35E-04

1.59E-03

1.92E-03

1.41E-03

6.61E-03

1.16E-03

2.90E-03

6.60E-04

1.72E-03

9.90E-04

8.53E-04

1.11E-03

1.26E-03

Mediana

1.70E-03

3.96E-03

1.83E-03

3.14E-03

8.97E-04

1.88E-03

1.05E-03

9.67E-04

1.83E-03

2.35E-03

Promedio

m).



6. Valores promedio, mediana y desviación estándar (

A.uruguayensis

A.serrata

A.salicifolia

A.petiolaris

A.microphylla

A.lanceolata

A.integrifolia

A.dentata

A.celastrina

A.alpina Especie

de los vasos (VD; (VD; vasos los de Tabla Tabla cm g (WD; madera la de densidad (HV), Huber Valor Azara: de especies

117

0.00

1.12

4.31

6.43

4.09

0.99

19.61

25.81

24.20

13.44 C(%)

0.00

0.03

0.19

1.46

3.41

6.23

7.73

10.10

24.68

46.17 F (%)F

uruguayensis

3.83

0.00

4.93

6.78

6.04

3.05

0.99

C(%)

15.34

20.39

24.63

14.02

serrata

0.02

0.00

0.15

0.33

1.23

2.90

6.84

8.69

10.22

19.83

49.78

F (%)F

0.00

2.16

7.23

7.46

2.69

1.15

0.36

C(%)

17.14

22.19

23.61

16.00

0.00

0.10

0.50

1.83

3.91

7.38

9.75

salicifolia

10.15

10.00

16.49

39.90

F (%)F

0.00

2.82

0.00

2.80

2.82

9.03

5.04

2.50

0.91

C(%)

21.53

24.09

16.89

11.59

0.00

0.03

0.00

0.07

0.10

0.50

1.97

3.90

5.33

8.17

9.70

petiolaris

18.50

51.73

F (%)F

0.00

1.44

4.62

4.08

1.20

C(%)

12.87

20.84

25.57

19.22

10.16

0.00

0.04

0.18

0.81

2.33

5.57

9.34

13.50

20.84

47.39

F (%)F

microphylla

0.00

4.39

4.06

6.03

3.16

2.49

0.89

C(%)

17.70

14.40

23.01

17.01

10.25

0.00

0.08

0.11

0.70

0.89

2.35

3.08

3.62

4.76

6.81

lanceolata

20.64

56.96

F (%)F

0.00

3.36

7.89

4.80

1.67

0.63

C(%)

15.65

29.42

25.26

11.32

0.00

0.15

0.54

1.77

5.91

9.91

integrifolia

11.48

15.33

45.00

F (%)F

0.00

1.20

4.60

4.76

1.32

0.66

C(%)

18.58

28.82

26.59

13.48

vasos (F%) y contribución (%) de cada clase de tamaño a la conductividad hídrica para cada cada para hídrica a conductividad la tamaño de clase cada de (%) contribución y (F%) vasos

dentata

0.00

0.05

0.31

2.08

5.73

10.32

11.67

11.26

11.99

46.59

F (%)F

0.00

2.16

8.68

4.55

1.73

1.47

0.74

C(%)

11.42

11.13

21.41

20.54

16.17

0.00

0.07

0.40

0.57

1.72

2.73

3.81

3.99

4.67

4.85

celastrina

15.85

61.34

F (%)F

Azara.

0.00

1.51

5.07

9.75

6.82

2.27

0.62

C(%)

18.51

21.33

20.85

13.27

alpina

0.00

0.04

0.21

0.62

1.94

3.96

7.54

10.71

15.04

19.20

40.75

F (%)F

Frecuencia de diámetro de los de diámetro de Frecuencia

. .

3.7



Tabla Tabla de especies las de una

140-150

130-140

120-130

110-120

100-110

90-100

80-90

70-80

60-70

50-60

40-50

30-40

20-30

10-20 Rango ( Rango

118

Tabla 3.8. Resultado de los análisis de señal filogenética para los rasgos funcionales analizados.  señal filogenética de Pagel, donde LogL es la probabilidad Log-Likelihood de  observado, LogL0 es la probabilidad Log-Likelihood de =0; MDI, índice de disparidad morfológica, donde

Avg.sq es el promedio de las distancias euclidianas entre los pares de puntos y AICW es el criterio de información de Akaike ponderado que indica la calidad relativa de ajuste de los modelos evolutivos Orstein-Uhlenbeck (OU), Movimiento Browniano (BM) y Ruido Blanco (WN).

Variable  MDI AICw

 logL logL0 p Avg. sq P BM OU WN

TLP 7.44E-05 3.3 3.3 1.00 0.75 1.00 0.01 0.02 0.97

0 7.44E-05 1.2 1.2 1.00 0.85 1.00 0.01 0.02 0.98

 7.44E-05 -34.0 -34.0 1.00 0.79 1.00 0.00 0.01 0.98

RWCTLP 7.44E-05 -31.0 -31.0 1.00 0.53 0.90 0.01 0.03 0.96

LMA 7.44E-05 89.1 89.1 1.00 0.55 0.90 0.04 0.10 0.86

MLA 7.44E-05 -75.8 -75.8 1.00 0.53 0.90 0.03 0.12 0.85

SD 7.44E-05 -10.7 -10.7 1.00 0.32 0.90 0.13 0.11 0.76

Ks 7.44E-05 -3.6 -3.6 1.00 0.78 1.00 0.00 0.01 0.98

LSC 7.44E-05 -40.8 -40.8 1.00 1.01 1.00 0.01 0.02 0.96

WD 0.82 16.6 15.3 0.11 0.12 0.80 0.59 0.14 0.27

VDi 0.71 -35.1 -35.9 0.19 0.17 0.60 0.40 0.16 0.44

VD 0.63 -28.6 -28.9 0.40 0.28 0.90 0.26 0.14 0.60

HV 0.29 55.9 55.6 0.50 0.19 0.90 0.06 0.07 0.87

119

Figura 3.1: Análisis de componentes principales (PCA) de los rasgos funcionales obtenidos para las especies de Azara. La ponderación de los valores de los rasgos funcionales en los dos primeros componentes principales (PC1 y PC2) se detallan en la Tabla 2.

120

(MPa)

TLP 

b) a ab b a c b c a ab b b ab b c c c c

(MPa) c

0 

a c) a a a a a a a

b  a b b

a a a a a a a a a

d) (%)

TLP RWC

Figura 3.2. Diagrama de cajas representando los rasgos funcionales de nivel celular para cada una de las especies de Azara: a) Potencial hídrico en punto pérdida de turgor (TLP; MPa), b) potencial osmótico a máximo turgor (0; MPa), c) módulo de elasticidad () y e) contenido relativo de agua en el punto de pérdida de turgor (RWCTLP; %). Letras sobre los diagramas de caja representan diferencias significativas entra las especies para cada rasgo según ANOVA de una vía y test de Tukey a posteriori (IC=95%).

121

a) a ab bc ab bc ab abc bc bc

b) d bc cd

bc ab ab a a a a

ab cd a cd a d d d bc d

Figura 3.3. Diagrama de cajas representando los rasgos funcionales de foliar para cada una de las especies de Azara: a) Razón peso seco/área (LMA; g/mm2), b) área foliar promedio (MLA; mm2) y c) densidad estomática (SD; estomas/mm2). Letras sobre los diagramas de caja representan diferencias significativas entra las especies para cada rasgo según ANOVA de una vía y test de Tukey a posteriori (IC=95%).

122

Figura 3.4. Diagrama de cajas representando los rasgos funcionales de conductividad hidráulica -1 -1 para cada una de las especies de Azara: a) Conductividad hidráulica específica (KS; kg MPa m s-1) y b) Conductividad foliar específica (LSC; kg MPa-1 m-3 s-1).

123

Figura 3.5. Diagrama de cajas representando los valores obtenidos para rasgos funcionales de anatomía de la madera para cada una de las especies de Azara: a) Valor Huber, b) densidad de la madera (WD; g cm-3), c) densidad de vasos (VDi; Vasos mm-2) y d) diámetro promedio de los vasos (VD; m).

124

Figura 3.6. Distribución de frecuencia de los diámetros de los vasos xilemáticos de las especies de Azara en secciones transversales de rama. Los gráficos muestran a) porcentaje de número de vasos que se distribuyen en cada clase de tamaño y b) Porcentaje de contribución de cada clase de tamaño de vasos a la conductividad hidráulica teórica según la ley de Hagen-Poiseuille.

125

Variables climáticas Rasgos funcionales

CA2 CA2

CA1 CA1

CA2 CA2

CA1 CA1

Figura 3.7. Correlación canónica entre variables de estrés climáticas (rojo) y rasgos funcionales (azul). a) Vectores de las variables climáticas y rasgo funcionales respecto a los ejes canónicos 1 y 2 (CA1 y CA2) y b) Distribución de las especies de Azara en los ejes canónicos CA1 y CA2.

126

Conclusiones Generales

Los cambios climáticos y geomorfológicos que sufrió Sudamérica durante el Terciario moldearon los patrones actuales de distribución y tolerancias climáticas de la biota. Se sugiere que los numerosos géneros sudamericanos que poseen distribución disyunta se habrían originado en un contexto de aislamiento y adaptación al generarse barreras físicas y climáticas para la dispersión y descenso global de la temperatura.

En el primer capítulo de la tesis se construyó una hipótesis filogenética a través de ADN nuclear y cloroplastidial de las especies del género Azara. Los principales resultados indican que el género es un grupo monofilético de al menos 47 Ma de antigüedad, que se habría originado en latitudes medias de Sudamérica, donde la evidencia de fósiles foliares indica una presencia de paleoflora de tipo mixta y, según reconstrucciones paleoclimáticas utilizando morfología foliar, en condiciones climáticas mesotermales y según reconstrucciones de nicho climático, condiciones microtermales. La datación de la hipótesis filogenética, además de reconstrucciones de área ancestral, sugiere una especiación mediante diversificación simpátrica por adaptación local y se propone que las especies que actualmente se encuentran en aislamiento se habrían originado por vicarianza para el clado andino y por dispersión a larga distancia, colonizando el este de Sudamérica.

En el segundo capítulo se analizó la evolución del nicho climático de Azara utilizando datos georreferenciados de presencia de cada especie y datos climáticos a través de su distribución, generando modelos de nicho climático para cada especie. Al analizar la evolución del nicho climático, se observó que las especies de Azara no presentan señal filogenética en las variables ambientales y también se obtuvo sobreposición de los nichos climáticos, descartando

127 conservación de nicho por causas filéticas. Al evaluar el modelo de evolución de nicho, se encontró que el modelo de mejor ajuste a los datos corresponde al ruido blanco (WN), lo cual indica que la variabilidad observada en el nicho climático de las especies de Azara es independiente de la filogenia, sugiriendo que no existe restricciones filogenéticas a la modificación del nicho climático.

Finalmente, en el tercer capítulo se analizaron rasgos funcionales de fisiología y morfología foliar y de anatomía de la madera como expresión fenotípica del nicho climático. Se evaluó si los rasgos funcionales presentaban restricciones por filogenia a la variación fenotípica y si efectivamente las especies alteraban sus rasgos funcionales en respuesta a variables climáticas. Se observó que los rasgos funcionales analizados efectivamente responden a distintas condiciones climáticas y esta variación no tendría restricciones filéticas a la modificación de los rasgos funcionales, permitiendo una modificación del nicho climático consistente con desarrollo de adaptaciones in situ a condiciones climáticas locales en un contexto de cambio climático.

Dentro de la diversificación de Azara, se observan dos pulsos importantes de diversificación: el primero de ellos entre el Eoceno-Oligoceno (50-27 Ma), en un contexto global de fuerte descenso de la temperatura, es decir, adaptaciones morfo-fisio-fenológicas al frío permitieron a este género diversificar durante el Paleógeno. Posteriormente, se observa un periodo de estasis durante el Mioceno inferior a medio, cuando empiezan a ocurrir grandes cambios geomorfológicos: durante esta época comienzan los pulsos de levantamiento de la Cordillera de los Andes y grandes extensiones continentales se encuentran bajo introgresiones marinas atlánticas, arrasando con extensas áreas de bosques. El segundo pulso de diversificación de Azara ocurre entre el Mioceno medio y Plioceno, en un contexto de cambios en la abundancia, distribución espacial y temporal de las precipitaciones, además de establecerse la Cordillera de los Andes como una característica fisonómica importante en el continente, actuando como barrera vicariante para las especies andinas del Azara de la zona central de Chile y las Yungas. En esta época fue crucial desarrollar adaptaciones frente al estrés hídrico en estas zonas, lo que le permitió al género sobrevivir y diversificar a medida que se establecía la Diagonal Árida en el continente, con un importante descenso en las precipitaciones, las cuales además presentan una marcada estacionalidad anual. Entre las adaptaciones al estrés hídrico encontramos rasgos morfológicos y fisiológicos, como el tamaño reducido de vasos y el ajuste osmótico, entre otros.

128

La disyunción de Azara presente con Este de Sudamérica es posterior a la formación de la barrera vicariante andina, por lo que los análisis sugieren dispersión a larga distancia sincrónica con el establecimiento de la Diagonal Árida.

La dispersión a larga distancia representa un “salto” a través de una barrera, como alguna característica topográfica o una zona climáticamente inhóspita, la cual puede producirse efectivamente por saltos, o ser resultado de una dispersión por etapas (stepping stone) que se vio interrumpida en algún momento de la historia. Se propone que es lo segundo lo que podría explicar la diversificación de Azara en el Este de Sudamérica.

Durante el Plioceno, flora subtropical mésica podría haber mantenido continuidad de distribución entre la costa Pacífica y Atlántica de Sudamérica a través de la dispersión de aves migratorias (análogo moderno: Elaenia albiceps chilensis), pero a medida que la paleoflora subtropical mésica era reemplazada por paleoflora subtropical xérica durante el establecimiento de la Diagonal Árida, esta continuidad se interrumpió aislando efectivamente a las especies del Oeste y Este de Sudamérica. Se propone realizar una revisión de paleofloras subtropicales mésicas del Plioceno en el centro de Argentina y verificar si efectivamente se pueden encontrar registros fósiles de Azara.

En el desarrollo de esta tesis surgieron algunas observaciones que sería interesante responder en una investigación posterior:

El género Azara corresponde a un género Neotropical cuya diversificación se habría dado en un contexto micro/mesotérmico, pero de bajo estrés hídrico. Según esta tesis, Azara tuvo que desarrollar adaptaciones morfo-feno-fisiológicas para poder sobrevivir en un continente que, durante el Mioceno debido a profundos cambios geológicos y climáticos, sometió a grandes extensiones de bosques a condiciones de estrés hídrico, desarrollándose nuevas formaciones vegetales y especies capaces de tolerar la sequía. Sería interesante evaluar nodos más profundos dentro de la familia Salicaceae y analizar la evolución del nicho climático con respecto a la adaptación a cambios climáticos relacionados principalmente desde la transición de condiciones macrotermales a mesotermales entre el Cretácico y Paleoceno.

Dentro de la misma línea, se ha observado que las Familias más antiguas de angiospermas tienden a distribuirse en latitudes bajas, compartiendo un nicho climático tropical.

129

Estas observaciones dieron origen a la hipótesis de nicho tropical, la cual sugiere que el origen y diversificación de angiospermas se habría dado bajo condiciones megatermales estables y el origen de las Familias que habitan zonas templadas se podría explicar mediante el descenso de temperatura y posterior adaptación in situ, permitiéndoles una posterior habilidad de colonización desde el trópico a latitudes más altas. Sin embargo, los géneros Nothofagus, Escallonia y Myrceugenia presentan un patrón distinto, sugiriendo que el nicho climático del ancestro común se habría originado en condiciones mesotermales, con una posterior colonización hacia el trópico. El género Myrceugenia tiene las especies actuales tropicales anidadas dentro de clados con nicho climático templado, sugiriendo que las especies tropicales serían derivadas de aquellas con nicho climático mesotérmico. Además, hay antecedentes que en este género existe tolerancia al frío en especies que actualmente no habitan zonas templadas, sugiriendo una conservación de nicho templado.

Se propone analizar el patrón de diversificación de otros taxa con distribución Templada- Tropical de Sudamérica para poner a prueba la hipótesis de nicho tropical y así ampliar el entendimiento de la diversificación de la biota bajo un mundo climáticamente cambiante.

130

Anexo I:

Descripción de las especies de Azara

131

Azara alpina Poepp. & Endl.

Distribución y Hábitat: A. alpina crece en la Cordillera de los Andes, entre Lircay y Valdivia (Figura A1.1). Habita sobre suelos de origen volcánico, generalmente a pleno sol. Tipo de Clima: Csb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Arbusto siempreverde, totalmente glabro, de ramas ascendentes que alcanza una altura de hasta 1,5m. Hojas alternas, de borde dentado hacia el ápice, de forma lanceolado- cuneadas, con estípulas foliosas. Láminas 2-4 x 1- 2cm (Fig A1.2).

a) b)

Figura A1.2: detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. alpina

Flores hermafroditas, de color amarillo, reunidas en inflorescencias corimbosas axilares. 4 tépalos, 20-30 estambres (Figura A1.2b). El fruto es una baya esférica de color rojo (Figura A1.3).

Figura A1.3: Frutos de A. alpina

Figura A1.1: Distribución de A. alpina

según nicho climático realizado (ver capítulo 2). Escala de grises representa probabilidad de ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

132

Azara celastrina D.Don

Sinónimos: Azara lilen Bert.; A. sparsiflora Steud.

Distribución y Hábitat: Lilén es endémico de Chile y crece en ambas cordilleras desde Limarí a Biobío (Figura A1.4). Crece entre 0 y/o 1000 msnm. Tipo Clima: BWk, BSk y Csb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Arbusto o árbol pequeño, siempreverde, que alcanza una altura de hasta 6m, corteza rugosa de color gris cenicienta. Hojas alternas, borde ligeramente aserrado, de forma ovalada con estípulas foliosas. Láminas de color verde oscuro lustroso de 2,5-4cm de longitud (Figura A1.5).

a) b)

Figura A1.5: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. celastrina

Flores hermafroditas, de color amarillo, reunidas en inflorescencias corimbosas. Estambres numerosos (Figura A1.5b). El fruto es una baya esférica de color blanquecino a negrusco de 5mm de diámetro (Figura A1.6).

Figura A1.4: Distribución de A. celastrina según nicho climático realizado (ver capítulo 2).Escala de grises representa probabilidad de ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad Figura A1.6: Detalle de frutos de A. celastrina. cero de ocurrencia.

133

Azara dentata Ruiz & Pav.

Sinónimos: Azara celastrina D.Don var. tomentosa (Steud.) Reiche; A. tomentosa Bert. ex Steud.

Distribución y Hábitat: Corcolén Blanco es endémico de Chile y crece entre Santiago y Valdivia (Figura A1.7). Crece entre 500 y/o 1500 msnm y habita principalmente en laderas asoleadas de la precordillera andina. Tipo Clima: Csb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Arbusto pubescente, siempreverde, que alcanza una altura de hasta 2,5m. Follaje de color cenicienta. Hojas alternas, borde dentado, de forma elíptica con estípulas foliosas. Láminas de color verde claro, densamente pubescentes de 1-4 x 1-2cm (Figura A1.8a).

a) b)

Figura A1.8: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. dentata.

Flores hermafroditas, de color amarillo, reunidas en inflorescencias corimbosas. Estambres numerosos (Figura A1.8b). El fruto es una baya esférica de color anaranjado de 4-5mm de diámetro (Figura A1.9).

Figura A1.7: Distribución de A. dentata según nicho climático Figura A1.9: Detalle de realizado (ver capítulo 2). Escala frutos de A. dentata. de grises representa probabilidad de ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

134

Azara integrifolia Ruiz & Pavon

Sinónimos: Azara berteroniana Steud.; A. browneae Phil.; A. hirtella Miq.; A. integrifolia Ruiz & Pav. var. browneae (Phil.) Reiche; A. integrifolia Ruiz & Pav. var. pycnophylla (Phil.) Reiche; A. intermedia Gay; A. lechleriana Steud.; A. pycniphylla Phil.

Distribución y Hábitat: Es endémico de Chile y crece entre Valparaíso y Osorno (Figura A1.10) entre 200 y/o 2000 msnm. Tipo Clima: Csb y Cfb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Arbusto siempreverde, que alcanza una altura de hasta 3m. Hojas alternas, de borde entero o con algunos dientes, de forma aovada a elíptica, con estípulas foliosas. Láminas 2,5-4 x 1-3cm.

a) b)

Figura A1.11: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. integrifolia.

Flores hermafroditas, de color amarillo, reunidas en inflorescencias corimbosas. 4 tépalos, 15-20 estambres. El fruto es una baya esférica de color gris verdosa con numerosas semillas en su interior.

Figura A1.12: Detalle de frutos Figura A1.10: Distribución de A. de A. integrifolia. integrifolia según nicho climático realizado (ver capítulo 2). Escala de grises representa probabilidad de ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

135

Azara lanceolata Hook

Sinónimos: Azara brumalis Gand.; A. chiloensis Hook.f.; A. lanceolata Hook.f. var. chiloensis (Hook.f.) Reiche; A. serrata Ruiz & Pav. var. chiloensis (Hook.f.) Reiche.

Distribución y Hábitat: Crece en ambas cordilleras desde Arauco a Magallanes (Figura A1.13), también en Argentina y crece entre 0 y/o 1000 msnm. Habita lugares húmedos o a plenos sol. Tipo Clima: Csb, Cfb y Cfc. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Arbusto siempreverde, que alcanza una altura de hasta 4m, ramas delgadas, largas y flexibles. Hojas alternas, de borde aserrado, de forma lanceolada a elíptica con estípulas foliosas. Láminas de color verde lustroso de 3,5-7 x 0,7-1,5cm, nervio medio muy notorio (Figura A1.14a).

a) b)

Figura A1.14: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. lanceolata.

Flores hermafroditas, de color amarillo, reunidas en inflorescencias corimbosas axilares. 4-5 tépalos vellosos, estambres numerosos y estilo terminado en estigma de 4 lóbulos (Figura A1.14b). El fruto es una baya esférica de color blanquecino a rosada de 6- 7mm de diámetro, en su interior muchas semillas de Figura A1.13: Distribución de A. 1,5-2mm de largo (Figura A1.15). integrifolia según nicho climático realizado (ver capítulo 2). Escala de Figura A1.15: Detalle de frutos grises representa probabilidad de de A. lanceolata. ocurrencia, donde negro representa

mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

136

Azara microphylla Hook Sinónimos: Azara borealis Phil.; A. valdiviae Lechler ex Steud.; Myrtophyllum chilense Turcz.

Distribución y Hábitat: tiene una distribución discontinua con poblaciones en Fray Jorge y luego desde Ñuble a Chiloé (Figura A1.16), también en Argentina. Crece entre 0 y/o 1500 msnm. Tipo Clima: BWk (Fray Jorge), Csb y Cfb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Arbusto o pequeño árbol siempreverde, que alcanza una altura de hasta 5m. Los brotes nuevos están cubiertos de vellos. Hojas alternas, de borde entero o con algunos dientes, de forma aovadas con estípulas foliosas. Láminas coriáceas, de color verde lustroso de 0,8-2,5cm de largo (Figura A1.17a).

a) b)

Figura A1.17: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. microphylla.

Flores hermafroditas, de color amarillo, solitarias o reunidas en inflorescencias corimbosas. 5 tépalos, 5 estambres y estilo terminado en estigma de 3 lóbulos (Figura A.17b). El fruto es una baya esférica de color anaranjado con numerosas semillas en su interior (Figura 18). Figura A1.16: Distribución de A. Figura A1.18: Detalle de microphylla según nicho climático frutos de A. microphylla. realizado (ver capítulo 2). Escala de grises representa probabilidad de ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

137

Azara petiolaris (D. Don) Johnst

Sinónimos: Azara crassifolia Hort.; A. gilliesii Hook. & Arn.; A. lilen Bert.; Quillaia petiolaris D.Don.

Distribución y Hábitat: Es endémico de Chile y crece en ambas cordilleras entre Limarí y Ñuble (Figura A1.19) entre 600 y/o 1500 msnm. Tipo Clima: BSk y Csb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Árbol siempreverde, que alcanza una altura de hasta 10m. Hojas alternas, de borde dentado, de forma ovalada con estípulas foliosas. Láminas de color verde lustroso de 3-5cm de largo, nervadura muy notoria (Figura A1.20a).

a) b)

Figura A1.20: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. petiolaris.

Flores hermafroditas, de color amarillo, de 5- 6mm, reunidas en inflorescencias corimbosas. 5 tépalos, estambres numerosos (Figura A1.20b). El fruto es una baya esférica de color blanco azulado con numerosas semillas en su interior (Figura A1.21).

Figura A1.21: Detalle de frutos de A. petiolaris

Figura A1.19: Distribución de A. petiolaris según nicho climático realizado (ver capítulo 2). Escala de grises representa probabilidad de

ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

138

Azara salicifolia Griseb.

Distribución: Es endémica de Argentina y Bolivia (Figura A1.22) en laderas húmedas de cerros con bosques deciduos y pastizales de la Provincia de Las Yungas de Bolivia y noroeste argentino, de Jujuy a Catamarca, entre los 1.500 y 2.000 m s.m. Tipo Clima: BSh, BSk, Cwa, Cwb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Arbolito de hasta 8 m. Lámina foliar angosta y elíptica con ápice y base atenuados, glabra, márgenes aserrados con dientes glanduloso, verde en el haz, verde claro en el envés, de 4-10 cm de largo y 4 cm ancho; pecíolo glabro, de 8-15 mm de largo; estípulas prontamente caducas (Figura A1.22a). a) b)

Figura A1.22: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. salicifolia.

Corimbos axilares 4-5-floros. Flores perfectas con 4- 5 sépalos libres, dorso tomentoso, de 1,5-2,0 mm largo y hasta 2 mm ancho. Estambres numerosos y gineceo 4-5 mm de largo. Ovario glabro, globoso- cónico, atenuado en un estilo columnar, estigma trilobado (Figura A1.22b). Baya globosa, de 5-7 mm de diámetro, con cáliz, filamentos estaminales y estigma persistentes numerosas semillas en su interior. Figura A1.22: Distribución de A. salicifolia según nicho climático Figura A1.23: Detalle de realizado (ver capítulo 2). Escala de frutos de A. salicifolia. grises representa probabilidad de

ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

139

Azara serrata R. et P.

Sinónimos: Azara bergii Phil.; A. dubia Steud.; A. subandina Phil.; A. umbellata Phil.

Distribución: Ambas cordilleras desde Aconcagua hasta Chiloé, del litoral a la precordillera andina, en lugares húmedos (Figura A1.24). Crece entre 200 y/o 2000 msnm. Tipo Clima: Csb y Cfb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: arbusto pubescente, de 1 a 1.8 m de altura. Hojas perennes, alternas pecioladas, con borde serrado, de 2 a 4 cm de longitud; estípulas semejantes a hojas, redondeadas, miden 1 a 1.5 cm de largo (Figura A1.25).

a) b)

Figura A1.25: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. serrata.

Flores unidas en inflorescencias corimbosas largamente pedunculadas. Cáliz con 5 a 6 divisiones, corola nula y numerosos estambres. El fruto es una baya azul blancuzca de 4 a 5 mm de diámetro con numerosas semillas en su interior (Figura A1.26).

Figura A1.24: Distribución de A. Figura A1.26: serrata según nicho climático Detalle de frutos de realizado (ver capítulo 2). Escala de A. serrata. grises representa probabilidad de

ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

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Azara uruguayensis Sleumer Sinónimo: Arechavaletaia uruguayensis

Distribución: Es endémica de Brasil, Argentina, Uruguay. Crece en condiciones de humedad y alta exposición solar (Figura A1.27). Está amenazada por pérdida de hábitat. Tipo Clima: Cfa y Cfb. Síndrome de polinización: Entomofilia; Síndrome de dispersión: endozoocoría.

Descripción: Es un arbusto de 2-3 m de altura (raramente 6 m), ramifica disparejo; tronco delgado, inerme, corteza canela, lisa, follaje siempreverde, persistente, verdoso oscuro; hojas simples, alternas, glabras, haz más oscuro, envés claro, elípticas lanceloadas, y algunos dientes en el ápice, coriáceas, de 5-11 cm de largo, y en la base de cada hoja hay estípulas reniformes, grandes, enteras o dentadas (Figura A1.28a).

a) b)

Figura A1.28: Detalle de Hojas (a) y flores (b) de A. uruguayensis.

Flores apétalas, amarillentas, en racimos axilares. Florece en primavera. Su fruto es una baya globosa, de 4-7 mm de diámetro, rojizo, y varias semillas internamente (Figura A1.29). Figura A1.27: Distribución de A. uruguayensis según nicho climático realizado (ver capítulo 2). Escala de Figura A1.29: Detalle de frutos grises representa probabilidad de de A. uruguayensis. ocurrencia, donde negro representa mayor probabilidad de ocurrencia según condiciones climáticas y blanco probabilidad cero de ocurrencia.

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Anexo II:

Protocolo de extracción y purificación de ADN genómico

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Extracción ADN

1. Moler tejido (40-80 mg) hasta tener polvo fino en la moledora. Usar tubos de 2 ml junto con una bolita de acero.

2. Agregar una punta de espátula pequeña de PVP (polivinilpirrolidona) en polvo y homogeneizar con 2 minutos más de moledora.

3. Añadir 0.8 ml de solución TVBGi a los polvos, vórtex 30 segundos.

4. Incubar a 65°C por 2 horas. Invertir tubos cada 3 min.

5. Dejar enfriar 15 minutos y añadir 20 ng de RNAsa y mantener a 37° C por 15 minutos.

6. Agregar un volumen similar de cloroformo (~0.7 ml), cerrar bien el tubo y mezclar fuertemente (vórtex) por dos minutos hasta alcanzar una emulsión lechosa.

7. Dejar que separar las fases (± 3 minutos) y volver a mezclar en vórtex.

8. Repetir el paso siete 4 veces

9. Centrifugar los tubos a máxima velocidad (15000 rpm) por 15 min y remover cuidadosamente la fase sobrenadante sin tocar la interfase ni las paredes del

tubo (~500 L)

10. Colocar el sobrenadante en un nuevo tubo de 2 ml y volver a extraer con 1 volumen de cloroformo emulsionando con vórtex (repetir paso 6 y 7 tres veces o las veces que sea necesario hasta que el pellet no salga oscuro). Se obtiene

~400 L

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Purificación ADN

11. Añadir 1/10 de volumen de acetato de Amonio 7.5 M y 1 volumen de isopropanol, y mezclar vigorosamente. Dejar reposar 5 minutos y centrifugar por 15 minutos a 15000 rpm. Botar sobrenadante conservando el pellet.

12. Agregar 1 mL de Etanol 95%, centrifugar a 15000 rpm y botar el líquido, cuidando de no botar el pellet. Invertir los tubos sobre papel absorbente y dejar secar (el pellet podría verse oscuro) por 30 minutos como máximo, no hay que dejar secar completamente.

13. Disolver el pellet en 20 L de H2O miliQ o agua libre de nucleasas.

i Solución TVBG - 25 mL D H2O - 10 mL 1m TRIS-HCL pH 7.5 - 28 mL 5M NaCl - 20 mL 10% CTAB - 4 mL 500 mM EDTA pH 8.0 - 3 mL 10% SDS o Tween 20

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