POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW

Kwartalnik Tom 52 Zeszyt 2•2013 KWIECIE¡ – CZERWIEC

CODEN: PMKMAV 52 (2) Advances in Microbiology 2013

POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW

Kwartalnik Tom 52 Zeszyt 3•2013 LIPIEC – WRZESIE¡

CODEN: PMKMAV 52 (3) Advances in Microbiology 2013

POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW

Kwartalnik Tom 52 Zeszyt 4•2013 PAèDZIERNIK – GRUDZIE¡

CODEN: PMKMAV 52 (4) AdvancesIndex Copernicus in ICV Microbiology = 9,52 (2012) 2013 Impact Factor ISI = 0,151 (2012) Punktacja MNiSW = 15,00 (2012)

http://www.pm.microbiology.pl RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), DANUTA DZIERŻANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański), ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii), STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Państwowy Zakład Higieny), GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski)

REDAKCJA JACEK BIELECKI (redaktor naczelny), JERZY HREBENDA (zastępca), BOHDAN STAROŚCIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich)

ADRESY REDAKCJI Redaktorzy: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 04, fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected]; [email protected]

Sekretarz Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (22) 628 08 22, (22) 621 13 51 e-mail: [email protected]

PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie)

Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardy Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej, Al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin, tel./fax: (91) 46 616 51, 52, lub fax: (91) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected]

Stali recenzenci: JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), JÓZEF KUR (Politechnika Gdańska), EUGENIUSZ MAŁAFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wrocławiu)

CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOWĄ POMOCĄ MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO

ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1

Informacja o zdjęciu na okładce: Fonsecaea monophora – szczegóły morfologii (widoczny konidiofor i układ konidiów). SEM, pow. 4 000 x. Autor zdjęcia: dr n. med. Tomasz Jagielski; Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego ul. I. Miecznikowa 1; 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected].

Szanowni Państwo! Autorzy i Czytelnicy Postępów Mikrobiologii: Informujemy Państwa, że uległ zmianie numer konta bankowego Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. Aktualny numer konta: BGŻ SA 57 2030 0045 1110 0000 0261 2550

POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW Nakład 1150, Objętość 15 arkuszy wyd., Papier offset 80 g Skład i druk: Zakład Wydawniczy Letter Quality, tel. 22 115 38 10, 607 217 879 e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz POST. MIKROBIOL., EPIDEMIOLOGIA ZAKAŻEŃ STREPTOCOCCUS PYOGENES, 2013, 52, 3, 223–232 http://www.pm.microbiology.pl STRUKTURA KLONALNA POPULACJI I ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ

Katarzyna Szczypa1, Joanna Wilemska2, Waleria Hryniewicz3, Izabela Sitkiewicz3*

1 ALAB Laboratoria, ul Stępińska 22/30, 00-739 Warszawa 2 Zakład Cytologii Klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, ul Marymoncka 99/103, 01-813 Warszawa 3 Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, Narodowy Instytut Leków, Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa

Wpłynęło w marcu 2013 r.

Spis treści: 1. Wstęp. 2. Zakażenia wywoływane przez S. pyogenes. 3. Nosicielstwo i drogi szerzenia się zakażeń S. pyogenes. 4. Ustalanie pokrewieństwa genetycznego pomiędzy szczepami S. pyogenes. 5. Oporność S. pyogenes na antybiotyki. 6. Profilaktyka zakażeń S. pyogenes. 7. Podsumowanie Epidemiology of Streptococcus pyogenes infections, clonal structure population and antibiotic resistance Abstract: Streptococcus pyogenes (GAS) is one of the major human pathogens responsible for infections worldwide. It may cause mild infections of the skin and mucosal surfaces, as well as severe invasive infections. It has been estimated that S. pyogenes is responsible for half a million deaths a year, and is considered as one of the most important pathogens. Many clinical investigations on S. pyogenes focus on characterization of pathogenic strains, heterogeneity/homogeneity of the population clonal spread, transfer between patients and tracing sources of antibiotic resistance. Advanced studies on vaccines that prevent GAS infections are in progress. Contents: 1. Introduction. 2. S. pyogenes infections. 3. Carrier state and epidemiology of infections. 4. S. pyogenes strains genetic affinity. 5. S. pyogenes resistance to antibiotics. 6. The prophylactics ofS. pyogenes infections. 7. Summary

Słowa kluczowe: Streptococcus pyogenes, GAS, oporność na antybiotyki, erm, struktura klonalna Key words: Streptococcus pyogenes, GAS, antibiotic resistance, erm, clonal structure

1. Wstęp S. pyogenes pośród dziesięciu najważniejszych pato- genów człowieka [15]. Globalny charakter zakażeń, Streptococcus pyogenes (paciorkowiec β-hemolizujący oporność na niektóre klasy antybiotyków czy obecność grupy A, ang. group A Streptococcus, GAS) jest Gram- wysoce zjadliwych klonów wśród szczepów inwazyjnych -dodatnim, katalazo-ujemnym ziarniakiem, należącym powoduje, że S. pyogenes jest przedmiotem ciągłego zain­ do liczącego ponad 50 gatunków rodzaju Streptococcus. teresowania lekarzy, mikrobiologów i epidemiologów. Rodzaj ten skupia bakterie, które powodują infekcje sze- Jednym z głównych celów prowadzonych nad tym rokiej grupy gospodarzy, począwszy od człowieka po drobnoustrojem badań jest śledzenie zmian w patogen- wiele gatunków zwierząt domowych i dzikich. Pacior- ności i we wrażliwości na stosowane w terapii zakażeń kowce kolonizują różne tkanki gospodarza stanowiąc leki. Podejmowane są również próby badań epidemio- tzw. „normalną florę bakteryjną”, są też przyczyną logicznych wyjaśniających podłoże genetyczno-popu- wielu infekcji [30]. S. pyogenes jest ścisłym patogenem lacyjne obserwowanej różnorodności lub klonalności człowieka, charakteryzuje się zdolnością do całkowitej pomiędzy szczepami GAS i związek pomiędzy grupami hemolizy typu β krwinek czerwonych na podłożu sta- szczepów o określonych cechach a typami wywoływa- łym i występowaniem na powierzchni komórki grupo- nych zakażeń i ich ciężkością [11]. wego wielocukru A (grupowanie wg Lancefield) [23]. GAS jest odpowiedzialny za szeroki wachlarz zaka- żeń o różnym stopniu ciężkości. Niektóre z nich, choć 2. Zakażenia wywoływane przez S. pyogenes występują stosunkowo rzadko mają charakter inwazyjny tzn. rozwijają się w fizjologicznie jałowych miejscach Pomimo ogromnego postępu medycyny i możli­ organizmu i, pomimo leczenia, obarczone są wysoką wości stosowania ciągle skutecznego wobec S. pyogenes śmiertelnością. Według Światowej Organizacji Zdrowia antybiotyku – penicyliny (patrz rozdział 5), nadal notuje (WHO) szacunkowa liczba zgonów w wyniku inwazyj- się na całym świecie wysoką zapadalność na infekcje nych infekcji GAS i powikłań po zakażeniach wynosi S. pyogenes. Są to przede wszystkim zakażenia poza­ ponad 500 000 przypadków rocznie, co umiejscawia szpi­talne w większości o charakterze sporadycznym.

* Autor korespondencyjny: Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, Narodowy Instytut Leków, Chełmska 30/34, 00-725 War­szawa; e-mail: [email protected] 224 KATARZYNA SZCZYPA, JOANNA WILEMSKA, WALERIA HRYNIEWICZ, IZABELA SITKIEWICZ

Ich przeważająca liczba to zapalenie gardła i migdałków Niektórzy badacze również sugerują związek pomię- podniebiennych (angina paciorkowcowa) pojawiające dzy zaburzeniami autoimmunologicznymi i neuropsy- się szczególnie w krajach o klimacie umiarkowanym chiatrycznymi u dzieci powiązane z zakażeniem GAS oraz powierzchowne zapalenia skóry (liszajec) występu- i polegające na zaostrzeniu przez zakażenie GAS zabu- jące częściej w klimacie ciepłym i wilgotnym. Szacuje się, rzeń obsesyjno-kompulsywnych lub tików, tzw. zespół że globalnie w skali roku GAS jest przyczyną 616 milio- PANDAS [42, 51]. nów przypadków infekcji gardła a także 111 milionów Zakażenia GAS nie ograniczają się jednak tylko do przypadków infekcji skórnych (głównie liszajca) [15]. zapaleń gardła i powierzchownych infekcji skóry. Dro­ Obie postacie zakażeń mają stosunkowo łagodny cha- bnoustrój ten odpowiedzialny jest również za głębokie rakter, ale nieleczone lub leczone nieprawidłowo, mogą infekcje zagrażające życiu wymagające natychmiastowej prowadzić do wystąpienia powikłań zarówno o charak- interwencji lekarza. Należą do nich poważne choroby terze ropnym, jak i nieropnym. W przypadku anginy układowe (inwazyjne) takie jak posocznica i paciorkowco- paciorkowcowej bezpośrednie ropne powikłania po wy zespół wstrząsu toksycznego (streptococcal toxic shock zakażeniu mogą przyjmować postać ropnia około- syndrome, STSS), często jako następstwo martwiczego migdałkowego, zapalenia tkanek około migdałkowych zapalenia powięzi (necrotizing fasciitis, NF) [23, 74, 75]. (cellulitis), ropnego zapalenie wyrostka sutkowatego, Częstość zachorowań na ciężkie zakażenia GAS zapalenia węzłów chłonnych, ucha środkowego, zatok zaczęła wzrastać w drugiej połowie lat 80. XX wieku. i znacznie rzadziej bakteriemii, zapalenia płuc, zapalenia W wielu krajach, między innymi w Stanach Zjedno- opon mózgowo-rdzeniowych i ropni mózgu [46]. Może czonych, Kanadzie i Wielkiej Brytanii od wczesnych także dojść do rozwoju martwiczego zapalenia powięzi lat 90-tych gromadzone są dane na temat epidemio­logii (patrz niżej). W przypadku zakażeń skóry najczęstszą, inwazyjnej choroby paciorkowcowej. Według danych ale łagodną postacią jest liszajec. Natomiast znacznie przedstawionych przez Centers for Disease Control and cięższymi formami infekcji obejmującymi tkankę pod- Prevention (CDC, Atlanta), co roku w Stanach Zjedno- skórną i powierzchowne naczynia limfatyczne jest róża czonych występuje od 10 do 15 tysięcy zakażeń inwazyj- (łac. erysipelas) a także tzw. cellulitis dotyczący głębszej nych GAS, które są przyczyną około 2000 zgonów [65]. warstwy podskórnej i tkanki tłuszczowej; nieleczone W Polsce prowadzony jest rejestr zachorowań wy- mogą bezpośrednio prowadzić do ciężkich postaci zaka- wołanych­ przez S. pyogenes na podstawie zgłoszeń nad- żenia (patrz niżej) prowadzących do zgonu. syłanych do Wojewódzkich Stacji Sanitarno-Epidemio­ W 2–3 tygodniu po przebytym paciorkowcowym logicznych a następnie do Zakładu Epidemiologii Naro- zapaleniu gardła, najczęściej u młodych nieleczonych dowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego osób, może rozwinąć się ciężkie nieropne powikłanie Zakładu Higieny (NIZP-PZH) (http://www.pzh.gov.pl/ pod postacią gorączki reumatycznej. Choroba ta cha- oldpage/epimeld/2011/index_mp.html). Według rejestru, rakteryzuje się wielonarządowym procesem zapalnym w Polsce w 2011 r., wystąpiły zaledwie cztery przypadki o podłożu autoimmunologicznym i ujawnia się głównie STSS. Wszystkie pozostałe zakażenia zakwalifikowane jako zapalenie mięśnia sercowego oraz zapalenie sta- jako inwazyjne (3 399 przypadków) to przypadki wystą- wów, które szybko mija; rzadziej jako pląsawica, rumień pienia róży. Raporty dotyczące zakażeń inwazyjnych brzeżny. Gorączka reumatyczna jest najczęstszą przy- w Polsce nie świadczą niestety o braku występowania czyną nabytych wad serca. Kolejnym nieropnym powi- inwazyjnych zakażeń w naszym kraju, a jedynie o braku kłaniem może być ostre kłębuszkowe zapalenie nerek, ich rozpoznawalności przez lekarzy i precyzyjnego sys- które może poprzedzać nie tylko angina paciorkowcowa, temu raportowania. W ramach działania krajowych ale również wywoływane przez GAS zakażenia skóry. ośrodków referencyjnych ds. Zakażeń Ośrodkowego Jest to choroba również o podłożu immunologicznym, Układu Nerwowego (KOROUN, www.koroun.edu.pl) i ds. w przebiegu której obserwuje się uszkodzenia kłębusz- Leko­wrażliwości Drobnoustrojów (KORLD, www.korld. ków nerkowych na skutek odkładania się w nich kom- edu.pl), oraz programów monitorowania inwazyjnych pleksów immunologicznych. Obecnie liczba zachoro- zakażeń (sieć BiNET, http://www.koroun.edu.pl/binet_ wań na gorączkę reumatyczną i kłębuszkowe zapalenie info01.php) corocznie gromadzonych jest kilkadzie- nerek jest niska w krajach o wysokim statusie ekono- siąt izolatów z inwazyjnych zakażeń GAS nadesłanych micznym, jednak w krajach rozwijających się stanowi z terenu całego kraju. Pierwsze dane o molekularnych nadal poważny problem [15]. W krajach takich jak Boli- cechach szczepów wywołujących inwazyjne zakażenia wia, Indie, Sudan czy Zambia aż 10% dzieci w wieku GAS w Polsce są wynikiem pracy tych ośrodków [74]. szkolnym może cierpieć z powodu popaciorkowco- Uważa się powszechnie, że GAS jest patogenem wego zapalenia serca i wynikających z niego wad serca. odpowiedzialnym przede wszystkim za zakażenia W Indiach choroba ta odpowiada za połowę schorzeń pozaszpitalne. Jednak ta bakteria, wprawdzie znacznie serowo-naczyniowych będących przyczyną śmierci rzadziej, jest również odpowiedzialna za zakażenia zwią- wielu młodych osób do 40 roku życia [15]. zane z opieką zdrowotną, w tym szpitalne. Prezentowane EPIDEMIOLOGIA ZAKAŻEŃ S. PYOGENES, STRUKTURA KLONALNA POPULACJI I ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ 225 w latach 1965–2004 doniesienia opisują 61 epidemicz- 4. Ustalanie pokrewieństwa pomiędzy nych ognisk szpitalnych zakażeń GAS, obejmujących szczepami GAS liczbę od 2 do 56 przypadków. Były to głównie zakażenia miejsca operowanego oraz zakażenia okołoporodowe. Ze względu na poważne konsekwencje zdrowotne Szacuje się, że odsetek szpitalnych zakażenia GAS może i społeczne, jakie niosą za sobą opisywane zakażenia sięgać nawet 14% [25, 26]. Również w Polsce obserwuje S. pyogenes, oprócz rozpoznania czynnika etiologicz- się pojedyncze szpitalne ogniska epidemiczne wywołane nego w konkretnym przypadku zachorowania, niezwy- przez GAS [70] (S i t k i e w i c z i H r y n i e w i c z, kle ważne jest prowadzenie ciągłego monitorowania KORLD, dane niepublikowane). tych infekcji dla celów terapeutycznych i epidemio­ logicznych. W dochodzeniu epidemiologicznym do ustalenia 3. Nosicielstwo i drogi szerzenia się zakażeń pokrewieństwa pomiędzy izolatami należącymi do S. pyogenes tego samego gatunku, lub udowodnienia jego braku, wykorzystuje się klasyczne metody mikrobiologiczne GAS jest drobnoustrojem, dla którego człowiek jest oparte na ocenie cech fenotypowych mikroorganizmu jedynym gospodarzem. Pomimo, że nosicielstwo S. pyo- oraz nowoczesne metody biologii molekularnej analizu- genes występuje głównie w górnych drogach oddecho- jące materiał genetyczny mikroorganizmu. Opis cech wych (błona śluzowa gardła) i na skórze człowieka to danego izolatu powstaje w tzw. procesie typowania. bakterie te mogą również kolonizować narządy moczo- Przydatność systemu typowania oceniana jest na pod- płciowe (pochwę) i okolice odbytu. Stopień nosicielstwa stawie jego rozdzielczości, łatwości interpretacji wyni- jest zależny od wieku człowieka. Najczęściej nosicielami ków, ich powtarzalności, wiarygodności, szybkiego są dzieci w wieku szkolnym, których odsetek waha się w wyko­na­nia i kosztów. zakresie od 12 do 23%. Odsetek nosicieli pośród osób W powiązaniu z danymi demograficznymi, klinicz- dorosłych jest niższy i wynosi około 5% [47]. Zakażenie nymi i klasyczną analizą epidemiologiczną, typowanie GAS szerzy się drogą kropelkową lub poprzez bezpo- drobnoustrojów umożliwia ustalanie potencjalnych średni kontakt z wydzieliną z błon śluzowych nosogardła rezerwuarów drobnoustrojów patogennych i możli- osoby chorej lub nosiciela. Przenoszenie drobnoustroju wości ich rozprzestrzeniania, a w efekcie weryfikację może też odbywać się na drodze kontaktu z zakażoną odpowiednich schematów postępowania w przypadku raną lub zmienioną chorobowo skórą. Okres wylęgania wystąpienia infekcji. Oprócz znaczenia w dochodzeniu choroby jest różny, dla zapalenia gardła i migdałków epidemiologicznym, typowanie szczepów jest niezwy- wynosi 2 do 5 dni, dla zakażeń skóry czas ten jest nieco kle istotne w immuno- i chemioprofilaktyce, ma ważny dłuższy i obejmuje 5–7 dni. W przypadku inwazyjnej aspekt poznawczy oraz przyczynia się do badania ewo- postaci zakażenia jest on zróżnicowany, i wynosi średnio lucji bakterii [16]. 1–3 dni. Występowanie zakażeń GAS ma w większości Określanie cech fenotypowych (np. biochemicznych, charakter sporadyczny, aczkolwiek może przyjmować antybiotykowrażliwości) nie jest wystarczające a jedynie również postać ognisk epidemicznych, gdyż zapalenie przydatne na wstępnym etapie typowania drobnoustro- gardła i liszajec potrafią rozprzestrzeniać się w dużych jów i musi być wzbogacone molekularnymi technikami skupiskach ludzkich. Szacuje się, że ryzyko przeniesie- typowania. nia zakażenia w kontakcie domowym wynosi ok. 25%. W typowaniu epidemiologicznym S. pyogenes naj- Badania sugerują, że źródłem zakażenia i rozprzestrze- ważniejszą metodą jest określenie typu (dawniej sero- niania się GAS w środowisku domowym mogą być typu) białka M. Białko M jest głównym powierzchnio- dzieci w wieku szkolnym ze względu na wysoką zacho- wym, zmiennym antygenem S. pyogenes, jego warianty rowalność i nosicielstwo. Ta grupa dzieci często choruje odpowiedzialne są za powstawanie różnych serotypów na wirusowe zakażenia górnych dróg oddechowych, a to GAS [75]. Wprowadzona w latach 60. XX wieku fenoty- zwiększa rozsiew S. pyogenes i innych gatunków bytu- powa metoda identyfikacji typów serologicznych białka jących w nosogardle. Wykazano również, że więcej niż M oparta jest na reakcji pomiędzy specyficznym, N-koń- troje dzieci mieszkających w jednym gospodarstwie cowym fragmentem białka M a swoistymi przeciwcia- domowym ułatwia międzyosobnicze rozprzestrzenianie łami w teście precypitacji [40]. Pomimo długoletniego się GAS [23, 28]. W środowisku szpitalnym źrόdła sze- używania metoda serologiczna ma szereg ograniczeń rzenia się zakażeń GAS są różne. Mogą to być endogenne i była stosowana przez nieliczną grupę laboratoriów szczepy własne skolonizowanego pacjenta oraz szczepy referencyjnych. Ograniczenia wynikały głównie z dużej egzogenne pochodzące od nosicieli, którymi mogą być pracochłonności metody i kosztów oznaczenia, np. inni pacjenci w szpitalu lub pracownicy opieki medycz- uzyskanie szerokiego wachlarza wzorcowych surowic nej. Bardzo rzadko źródłem GAS w szpitalu są przed- odpornościowych, czy związane z tym utrzymywanie mioty z otoczenia pacjenta lub sprzęt medyczny [72]. zwierząt laboratoryjnych okazało się bardzo drogie. 226 KATARZYNA SZCZYPA, JOANNA WILEMSKA, WALERIA HRYNIEWICZ, IZABELA SITKIEWICZ

Aby uniknąć niedoskonałości metody serologicznej, Wraz z coraz powszechniejszym wykorzystaniem około roku 1995 wprowadzona została metoda moleku- sekwencjonowania w typowaniu bakterii, coraz częściej larna typowania białka M, tzw. typowanie emm (emm stosowaną metodą ustalania pokrewieństwa pomiędzy typing). Typowanie emm uważane jest dzisiaj za „złoty szczepami GAS jest tzw. Multi Locus Sequence Typing standard”, gdyż opierając się na sekwencjonowaniu frag- (MLST) [29]. Metoda polega na ustaleniu sekwencji mentu DNA wykazuje nawet najmniejsze różnice w budo- nukleotydowej siedmiu (u innych gatunków ta liczba wie białka M. Metoda polega na amplifikacji fragmentu może być zmienna) alleli konserwowanych genów meta- genu emm kodującego N-koniec białka M przy użyciu bolizmu podstawowego. Każdy znany do tej pory allel reakcji PCR, a następnie ustaleniu sekwencji 180 nukle- ma swój unikatowy numer w bazie danych, na podsta- otydów kodujących pierwsze 50 aminokwasów dojrza- wie kodu składającego się z siedmiu liczb odpowiadają- łego białka wraz z 10 aminokwasami sekwencji sygna- cych numerom alleli ustalany jest tzw. typ sekwencyjny łowej. Uzyskane sekwencje porównuje się z dostępną izolatu (sequence type, ST). ST izolatów z całego świata na stronie internetowej CDC bazą danych, w której mogą być ze sobą porównywane i łączone w grupy znajduje się ponad 200 typów emm. Porównanie z sekwen- podobnych klonów, czyli tzw. kompleksy klonalne (clo- cją referencyjną pozwala na okreś­lenie nie tylko typu, ale nal complex, CC). Informacja na temat znalezionych i allelicznych wariantów określonego typu białka M. Jeśli do tej pory wariantów genόw ST oraz szczepów, u któ- sekwencja nukleotydowa 5’ genu emm jednego szczepu rych zostały opisane, zdeponowana jest w internetowej jest identyczna w > 95% z sekwencją innego szczepu, to bazie danych pod adresem http://www.spyogenes.mlst. określa się, że szczepy te prezentują te same typy emm. net. Obecnie baza danych MLST dla S. pyogenes zawiera Tylko w nielicznych przypadkach typy emm określone około 500 typów ST, które zostały wyodrębnione spo- metodami genetycznymi nie odpowiadają typom sero- śród przesłanych kilku tysięcy szczepów [33, 48]. logicznym białka M [6, 31, 32]. Metoda molekularnego Pomimo wielu zalet metody MLST, jakimi są wysoka typowania emm jest zgodna z konwencjonalnym typo- czułość i powtarzalność, stosowanie jej jest ograniczone, waniem serologicznym wg L a n c e f i e l d, eliminuje głównie ze względu na koszt sekwencjonowania. jednak ograniczenia związane z ciągłym pojawianiem Aby usprawnić typowanie GAS, zmniejszyć nakłady się nowych wariantów białka M, ograniczoną dostęp- finansowe i ułatwić analizę ciągle wprowadzane są nowe nością surowicy a także trudnoś­ciami w interpretacji metody, które powstają dzięki rozwojowi technologii wyniku. Jej zaletą jest czułość, prostota wykonania oraz sekwencjonowania i metod PCR. Przykładem takiej oszczędność czasowa, jedynym zaś ograniczeniem może nowej metody może być wersja MLST niewymagająca być dostępność specjalistycznego sprzętu. Dodatkowo, sekwencjonowania, zwana MeltTs. Metoda, podobnie nie wykrywalna na drodze serologicznej zmienność jak sekwencjonowanie DNA wykrywa polimorfizmy sekwencji emm w obrębie typu, może być przesłanką w sekwencji DNA, oparta jest jednak na porównaniu w śledzeniu ognisk epidemii oraz transmisji specyficz- krzywych topnienia (high resolution melting curves, nych klonów w populacji S. pyogenes. W większości przy- HRM) dziesięciu krótkich fragmentów o długości od padków w genomie występuje tylko jeden gen emm, choć 59 do 119 par zasad powielonych w reakcji PCR. Każdy możliwe jest występowanie do trzech odrębnych genów fragment zawiera polimorficzne miejsca (SNPs), a frag- emm i emm-like, których aranżacja warunkuje wystąpie- menty w zależności od liczby par G+C różnią się od sie- nie tzw. wzorów emm (od A do E) [48]. bie temperaturą topnienia DNA. Porównanie liczby par W związku z rozwojem technik molekularnych, G+C określonych na podstawie temperatury topnienia coraz rzadziej używa się również innych, stosowanych cząsteczki w 10 fragmentach DNA daje unikalny profil przez lata, metod serologicznych takich jak typowanie MeltTs. Wadą tej metody może być konieczność posia- oparte na różnicach antygenowych białka T lub wykry- dania urządzenia zdolnego przeprowadzić analizę krzy- wanie enzymu OF (opacity factor) [42, 54]. wych topnienia. Metoda ta jest w ponad 99% zgodna Standardową metodą używaną przez wiele laborato- z analizą MLST, a wykryte różnice pomiędzy badanymi riów referencyjnych do porównywania izolatów bakte- szczepami odzwierciedlają strukturę populacji [59]. ryjnych, nie tylko GAS, jest analiza makrorestrykcyjna Oprócz metod bazujących na ustalaniu sekwen- wraz z rozdziałem fragmentów w zmiennym polu cji konserwowanych (MLST) lub zmiennych (emm elektrycznym (PFGE). Analizy PFGE są jednak trudne typing) genów, do typowania można zastosować metody w wykonaniu i niełatwe do porównania pomiędzy róż- wykrywające określone konfiguracje genów lub mobil- nymi ośrodkami. Metoda ta daje znakomite rezultaty nych elementów genetycznych w badanych szczepach. w przypadku analizy niezbyt dużej liczby szczepów GAS wytwarza szereg charakterystycznych czynni- pochodzących z lokalnych epidemii. Ze względu na ków wirulencji, głównie tzw. superantygenów, których ograniczenia PFGE, od dłuższego czasu poszukiwano występowanie lub współwystępowanie może świadczyć metod, które dałyby bardziej jednoznaczne i łatwiejsze o pokrewieństwie izolatów [13, 14]. Również obecność w interpretacji wyniki. zintegrowanych z genomem mobilnych elementów EPIDEMIOLOGIA ZAKAŻEŃ S. PYOGENES, STRUKTURA KLONALNA POPULACJI I ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ 227 genetycznych jest cechą diagnostyczną i dwa szczepy teza mówiąca o tym, że koszt energetyczny ponoszony o takim samym położeniu elementów w genomie są przez komórkę bakteryjną GAS w zmniejszeniu powi- ze sobą blisko spokrewnione. Na podstawie sekwencji nowactwa PBP do molekuł antybiotyku jest zbyt wysoki, genomowych GAS ustalono 21 stałych miejsc integracji aby mógł ulec utrwaleniu. Wyhodowane bowiem w labo- mobilnych czynników genetycznych takich jak fagi lub ratorium niewrażliwe na penicylinę mutanty S. pyogenes elementy ICE (integrative conjugative elements) w okreś­ produkujące zmienione białka PBP charakteryzowały się lonych miejscach genomu, których położenie może obniżoną żywotnością i szybko ginęły [37]. Mimo to ist- zostać użyte do projektowania systemów typowania [9]. nieje obawa, że wśród paciorkowców grupy A, podobnie Przykładem metod typowania opartych o wykrywanie jak u wielu ziarenkowców Gram-dodatnich dzielących określonych genów lub elementów genetycznych mogą z nimi tę samą niszę ekologiczną, może pojawić się nie- by metody oparte o szereg reakcji multiplex PCR opra- wrażliwość na ten antybiotyk [3, 15]. cowane ostatnio w naszym laboratorium [13, 14]. Wydaje się więc niezwykle istotnym, aby stale moni- Na podstawie analizy sekwencji genomowych, nasz torować wrażliwość S. pyogenes zarówno na penicylinę, zespół opracował również metodę MLVA/MLVF (Multi jak i na antybiotyki innych grup stosowane w leczeniu Locus VNTR Analysis/ Multi Locus VNTR Fingerprin- zakażeń tym drobnoustrojem (www.antybiotyki.edu.pl). ting) opartą na analizie sekwencji tandemowo powtó- Należy również podkreślić fakt, że sama penicylina rzonych w genomie S. pyogenes tzw. VNTR (Variable nie jest w pełni skuteczna w przypadku rozwijających Number Tandem Repeats) [54, 55]. W szeregu genów się głęboko w tkankach inwazyjnych zakażeń. W takich GAS występują powtórzenia nukleotydowe o długości przypadkach konieczne jest zastosowanie innych terapii od kilkunastu do kilkuset par zasad. W reakcji multiplex antybiotykowych. Od wielu lat antybiotyki makrolidowe PCR namnażane są fragmenty DNA o zróżnicowanej stanowią ważną alternatywę dla penicyliny, zwłaszcza wielkości, która zależna jest od liczby powtórzeń wystę- w leczeniu zakażeń u osób z nadwrażliwością na peni- pujących w danym fragmencie DNA. Im mniej różnic cylinę. Wzrost ich znaczenia wiąże się ze zwiększającym w wielkości produktów PCR zostanie wykrytych, tym się udziałem w zakażeniach człowieka bakterii atypo- bliżej badane szczepy są ze sobą spokrewnione. wych i z wykrytą stosunkowo niedawno unikatową Przyszłość metod ustalania pokrewieństwa między cechą preparatów makrolidowych, tzn. ich działaniem izolatami bakteryjnymi i badań nad ewolucją bakterii, przeciwzapalnym [57]. Antybiotyki makrolidowe nie na razie niestety ograniczona przez zbyt wysokie koszty, mogą jednak zastąpić w terapii antybiotyków beta-lak- leży w całościowych analizach genomów bakteryjnych. tamowych ze względu na coraz częściej pojawiającą się Przykładem wykorzystania do analizy epidemii wywoła- oporność na tę grupę leków. Wśród szczepów opornych nych przez S. pyogenes technik sekwencjonowania nowej na makrolidy często występuje krzyżowa oporność na generacji jest analiza kilkuset szczepów serotypu M3 izo- linkozamidy, mające to samo miejsce i często wspólny lowanych z inwazyjnych zakażeń wywołanych GAS [8]. mechanizm oporności. Bakterie wykazujące taką krzy- Analiza porównawcza całych genomów pozwoliła nie żowa oporność są izolowane w wielu krajach na świe- tylko prześledzić dynamikę rozwoju epidemii w nastę- cie, a problem został dostrzeżony w latach 90. XX wieku pujących po sobie falach zachorowań, ale również przy- [21]. W Europie pierwsze paciorkowce grupy A oporne czyniła się do wykazania wpływu pojedynczych mutacji na erytromycynę zanotowano już w roku 1959 w Wiel- w genomie na wirulencję GAS. Przykładem może być kiej Brytanii [44]. Wzmożone zużycie antybiotyków tej pojedyncza mutacja w genie mtsR odpowiedzialnym za klasy, obserwowane w przeciągu ostatnich dwudziestu regulację transportu jonów metali na aktywację głównej lat, spowodowało niekorzystny z perspektywy terapii, proteazy GAS-SpeB [56]. drastyczny wzrost oporności wśród GAS. Dane pocho- dzące z różnych regionów świata, jednogłośnie podno- 5. Oporność S. pyogenes na antybiotyki szą ten problem, szacując odsetek opornych szczepów na poziomie od 2,7% aż do 40% [2, 10, 39, 43, 50, 53, 58, Podstawowym antybiotykiem stosowanym w lecze- 60, 67, 73, 78]. W Polsce poziom oporności GAS na ery- niu zakażeń S. pyogenes jest penicylina. Jak dotąd wszyst- tromycynę szacuje się w granicach 12%, z tendencją do kie szczepy GAS są w pełni wrażliwe na ten antybiotyk, systematycznego wzrostu [73]. W badaniach populacyj- a wrażliwość na penicylinę oznacza również wrażliwość nych obserwuje się klonalne rozprzestrzenianie okreś­ na inne antybiotyki beta-laktamowe [45]. Od ponad lonych serotypów GAS takich jak M4, M28, M75 i M77 70 lat nie uległo zmianie minimalne stężenie penicyliny wykazujących oporność na antybiotyki makrolidowe hamujące wzrost S. pyogenes (MIC). Fenomen ciągłej [34, 64], (Bo r e k, O b s z a ń s k a i Si t k i e w i c z, wrażliwości GAS na beta-laktamy tłumaczy się z jednej dane niepublikowane). strony brakiem odpowiednich mechanizmów umożli- Oporność bakterii na makrolidy jest związana trzema wiających wniknięcie do komórki bakterii plazmidu nio- podstawowymi mechanizmami: (i) modyfikacją celu sącego gen beta-laktamazy, jak również słabej zdolności działania antybiotyku, (ii) aktywnym jego wypompo- GAS do transformacji [35, 45]. Dodatkowo istnieje hipo- wywaniem z komórki bakteryjnej oraz (iii) modyfikacją 228 KATARZYNA SZCZYPA, JOANNA WILEMSKA, WALERIA HRYNIEWICZ, IZABELA SITKIEWICZ enzymatyczną antybiotyku. Wśród paciorkowców grupy niem antybiotyku z komórki na zewnątrz do środowiska A powszechnym mechanizmem opor­ności na makrolidy oraz wytwarzaniem białek chroniących rybosomy (ribo- jest modyfikacja celu działania leku, czyli potranskryp- somal protection proteins, RPPs). Pierwszy z wymienio- cyjna modyfikacja podjednostki 23S rybosomowego nych mechanizmów występuje przede wszystkim u bak- RNA. Enzymy modyfikujące RNA są kodowane przez terii Gram-ujemnych [17, 18]. Drugi rodzaj oporności geny erm (erythromycin resistance methylase) nale- jest charakterystyczny dla S. pyogenes a białka RPPs żące do dużej grupy ermAM z dwoma wystepujacymi kodowane są przez geny tetM i tetO [20]. u S. pyogenes genami ermTR/A i ermB. Działanie tych Zaobserwowano częste współwystępowanie genów enzymów wpływa hamująco na wiązanie do podjed- oporności na makrolidy i tetracykliny, korelacja najczęś­ nostki 50S rybosomu nie tylko makrolidόw, lecz rów- ciej dotyczy występowania genów ermB z tetM oraz nież linkozamidόw (klindamycyny) i strepto­gramin ermTR/A z tetM i tetO. Zjawisko to wiąże się z wystę- typu B. W wyniku aktywności produktów genów erm powaniem horyzontalnego transferu wśród szczepów występuje wspomniane zjawisko oporności krzyżowej GAS. Zidentyfikowano sekwencje transpozonów zin- zwane MLSB (macrolides lincosamides streptogramins B), tegrowanych z genomami GAS zawierających wymie- a ekspresja oporności MLSB może mieć charakter induk- nione geny oporności [62]. Wykazano również, że cyjny (iMLSB) lub konstytutywny (cMLSB). Oporność w przypadku fenotypu M oraz fenotypu iMLSB determi- typu MLSB ma poważne konsekwencje terapeutyczne nantom oporności na erytromycynę często towarzyszy w odniesieniu do zakażeń inwazyjnych wywoływanych gen tetO, w przeciwieństwie do związanego najczęściej przez GAS, bowiem uniemożliwia zastosowanie naj- z fenotypem cMLSB genu tetM. Szczególnie użyteczne bardziej skutecznego schematu leczenia tj. penicyliny jest poszukiwanie kodującego tetracyklinę genu tetM, z klindamycyną. będącego markerem silnie rozprzestrzenionych w geno- Paciorkowce grupy A są również w stanie aktyw- mach bakteryjnych, integracyjnych elementów koniuga- nie usuwać antybiotyk z komórki bakteryjnej (efflux). cyjnych ICE z rodziny Tn916 [61]. W przypadku feno- Mechanizm ten jest uwarunkowany obecnością trans- typu cMLS, występowanie wspomnianej funkcjonalnej porterów MSF (major facilitator superfamily) kodo- lub wyciszonej determinanty oporności na tetracyklinę, wanych przez geny mef. Aktywność tego mechanizmu świadczy właśnie o zaistniałym włączeniu genu ermB warunkuje jedynie oporność na makrolidy 14- i 15-czło- do pochodnych Tn916 – Tn1545, Tn3703, Tn1116 czy nowe (erytromycyna, klarytromycyna, roksytromycyna Tn3872 [77]. Innym unikatowym elementem, przeno- i azytromycyna), a wynikający z tego fenotyp oporności szącym informację o oporności na tetracyklinę i ery- określa się, jako oporność typu M. tromycynę jest tetO-mefA. Powstał on poprzez insercję Oporność na makrolidy w wielu przypadkach ko­re- genu tetO, a także transpozonu Tn1207.1 zawierającego luje z opornością na tetracykliny – antybiotyki, których gen mefA, do profaga włączonego w chromosom bak- bakteriostatyczne działanie polega, podobnie jak w przy- teryjny [36]. Z kolei oporność na antybiotyki inne niż padku makrolidów, na hamowaniu biosyntezy białka. tetracyklina, jest markerem elementu ICE 10750-RD.2, Mają one zdolność wiązania się z białkami podjednostki zawierającego gen ermA, flankowany przez geny opor- 30S rybosomu, blokując przyłączanie się aminoacylo- ności na tetronazynę i spektynomycynę [9, 77]. -tRNA do miejsca akceptorowego A w kompleksie W ciągu minionej dekady, intensywnie badano oto­ mRNA-rybosom [20]. Antybiotyki te wprowadzono do czenie genów mef/erm oraz mechanizmy ich ekspansji. lecznictwa w latach 50-tych XX wieku, kiedy niewiele Scharakteryzowano w ten sposób szereg elementów było na rynku tego typu leków, więc stanowiły ważną transpozycyjnych związanych z opornością na erytro­ alternatywę dla penicylin. To zaowocowało ich szero- mycynę, o charakterze profagów, ICE, transpozonów kim stosowaniem i to nie tylko w medycynie, ale także a nawet plazmidów. Często obserwowana różnica w weterynarii, i produkcji roślinnej [38]. Po raz pierwszy w orga­nizacji genetycznej poszczególnych ICEs wzglę- szczepy S. pyogenes oporne na tetracyklinę pojawiły się dem reszty chromosomu, może wskazywać, że przeno- niedługo po wprowadzeniu leku w roku 1954 w Wielkiej szący informację o oporności element wywodzi się od Brytanii [1]. W latach 70-tych XX wieku w wielu kra- donora niespokrewnionego z GAS [9]. Pozwala to na jach poziom oporności GAS na tetracyklinę był bardzo rozprzestrzenianie się lekooporności nie tylko w obrębie wysoki i wynosił nawet 80% [52]. W badaniach pro- populacji GAS, lecz także pomiędzy przedstawicielami wadzonych w Polsce poziom oporności na tetracyklinę różnych patogennych gatunków z rodzajów Streptococ- wśród izolatów GAS pochodzących z różnych zakażeń cus, Enterococcus, Staphylococcus a nawet Clostridium był wysoki i wynosił ponad 40%. Od tego czasu obser- [4, 77, 79]. Inne gatunki bakteryjne zajmujące typowe wowano dramatyczne narastanie oporności na tę grupę dla S. pyogenes nisze mogą być jednocześnie rezerwu- antybiotyków, która rozprzestrzeniała się głównie przy arami nowych determinantów oporności. Jak do tej udziale mobilnych elementów genetycznych [68]. pory, w genomach GAS wykazano występowanie sze- Oporność na tetracykliny jest związana przede regu mobilnych elementów genetycznych przenoszą- wszystkim z dwoma mechanizmami: aktywnym usuwa- cych oporność na makrolidy takich jak Tn917, Tn3872, EPIDEMIOLOGIA ZAKAŻEŃ S. PYOGENES, STRUKTURA KLONALNA POPULACJI I ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ 229

Tn6002, Tn1116 z ermB; ICE10750-RD.2, pRW35 Wybór składu i produkcja szczepionki jest procesem z ermA; Tn1207.3, Φ10394.4, Φm46.1, oraz chime- złożonym i długoletnim, toteż niezwykle istotną kwestią ryczny element szczepu M6 (transpozon wbudowany jest odpowiedni dobór białek o właściwościach immu- w profaga) niosący mefA [4, 77]. nogennych. W przypadku GAS, od wielu lat promowana O dynamice horyzontalnego transferu genów może jest strategia wykorzystania w tym celu białka M ze również świadczyć izolacja inwazyjnego szczepu S. pyo­ względu na ochronne właściwości przeciwciał przeciwko genes, którego indukowana oporność na erytromycynę temu białku [12, 24]. Ze względu na istnienie bardzo warunkowana była zlokalizowanym na plazmidzie wielu antygenowo odmiennych białek M proponuje się pRW35 genem ermT, typowym dla chromosomu pacior- wykorzystanie w szczepionce najczęściej występujących kowców grupy D, izolowanych na Tajwanie i USA [27, serotypów S. pyogenes, odpowiedzialnymi za zapalenie 80]. Odkrycie to dobitnie pokazuje, że analizując ekspan- gardła i migdałków podniebiennych oraz infekcje inwa- sję lekooporności GAS nie można wykluczać żadnego zyjne. W badaniu II fazy szczepionki StreptAvax (ID rodzaju mobilnych elementów genetycznych uczestni- Biomedical) po roku obserwacji klinicznej oceniono, czących w potencjalnym horyzontalnym transferze. że szczepionka ta wywołuje swoistą odpowiedź immu- Narastanie oporności na makrolidy i linkozamidy, nologiczną u zdrowych osób dorosłych nie powodując wśród szczepów GAS nakazuje poszukiwanie alterna- przy tym poważnych objawów niepożądanych [38, 49]. tywnych terapii, które mogłyby znaleźć zastosowanie Stworzenie szczepionki wykorzystującej fragmenty w leczeniu zakażeń, zwłaszcza tych o charakterze inwa­ białka M jest jednak zadaniem nieco kontrowersyj- zyj­nym. Grupą antybiotyków o aktywności głównie nym ze względu na dwa główne problemy. Pierwszym wobec ziarenkowców Gram-dodatnich są oksazolidy- problemem jest ciągła ewolucja i powstawanie nowych nony. Ich jedyny przedstawiciel linezolid, jest zalecany typów białka M, przeciwko którym szczepionka o ściśle w leczeniu ciężkich zakażeń opornymi na metycylinę ustalonym składzie będzie nieskuteczna. Ważniejszym S. aureus czy opornymi na penicylinę S. pneumoniae. jednak problemem jest geograficznie zróżnicowana Antybiotyk ten posiada unikatowy mechanizm działa- i nierównomierna dystrybucja szczepów [15]. Oszaco- nia zaburzający biosyntezę białka bakterii. Blokuje on wano, że opracowana 26 walentna szczepionka zapew- powstanie kompleksu inicjacyjnego, składającego się niłaby odporność przeciwko większości chorobotwór- z podjednostek 50S i 30S oraz tRNA. W terapii zakażeń czych izolatów w krajach wysoko rozwiniętych (Europa, S. pyogenes istotny jest fakt, iż linezolid hamuje produk- Ameryka Północna, Australia, Nowa Zelandia, Japonia cję toksyn pirogennych w podobnym stopniu do klin- i Hong Kong), średni poziom odporności w Azji i na damycyny [22]. Środkowym Wschodzie oraz niski poziom w Afryce i na Innymi antybiotykami stosowanymi w leczeniu zaka- wyspach Pacyfiku [69]. Różnice w strukturze warian- żeń powodowanych przez ziarenkowce Gram-dodatnie tów w różnych regionach geograficznych wskazują na są nowe fluorochinolony (IV generacja), których przed- konieczność produkcji kilku rodzajów szczepionek, stawicielami są lewofloksacyna i moksifloksacyna. Jest to które będą przystosowane do użycia na konkretnym jedyna grupa chemioterapeutyków, których mechanizm kontynencie. Alternatywą może być opracowanie szcze- działania polega na hamowaniu syntezy DNA. Punktem pionki zawierającej antygeny o niewielkiej zmienności uchwytu dla fluorochinolonów są dwa enzymy bakte- wspólne dla wszystkich szczepów i powodujące powsta- ryjne, regulujące przestrzenne ukształtowanie DNA: wanie przeciwciał ochronnych, gyraza DNA i topoizomeraza IV. Wymienione fluoro- Do czasów poznania sekwencji pierwszego genomu chinolony, lewofloksacyna i moksifloksacyna znalazły GAS, wybór czynników mogących stanowić poten- zastosowanie w leczeniu zakażeń układu oddechowego cjalny antygen szczepionkowy odbywał się głównie na wywołanych przez paciorkowce [3]. W badaniach pro- drodze analiz serologicznych. Pulę wybranych w taki wadzonych w Polsce wartości MIC linezolidu i fluoro- sposób czynników znacznie wzbogaciły dopiero bada- chinolonów dla izolatów GAS zarówno opornych na nia molekularne GAS, analizujące szereg nowopozna- makrolidy, jak i pochodzących z inwazyjnych infekcji nych białek zewnątrzkomórkowych i powierzchniowych wskazywały na ich wrażliwość na wymienione powyżej lipoprotein [41, 63]. W wyniku systematycznych badań chemioterapeutyki [73, 74]. wykryto cząsteczki, których właściwości sugerują ich potencjalne wykorzystanie w składzie szczepionki. Przy- 6. Profilaktyka zakażeń S. pyogenes kładowo, 23 nowo zidentyfikowane białka mogące być potencjalnymi składnikami szczepionki reagują z suro- Mimo wieloletnich badań ukierunkowanych na wicą osób, które przeszły infekcję GAS – co oznacza, opracowanie metod efektywnego zapobiegania zakaże- że są wytwarzane podczas infekcji. Białka te znajdują niom powodowanym przez GAS, wciąż brakuje komer- się na powierzchni ściany komórkowej co czyni je bar- cyjnie dostępnej szczepionki, mogącej uchronić przed dziej dostępnymi dla przeciwciał i dobrymi celami dla zakażeniem. szczepionki [19] 230 KATARZYNA SZCZYPA, JOANNA WILEMSKA, WALERIA HRYNIEWICZ, IZABELA SITKIEWICZ

Przykładem badanego białka jako składnika poten- cin- and miocamycin-susceptible (M phenotype) Streptococcus cjalnej szczepionki przeciwko GAS jest zewnątrzkomór- pyogenes in Spain. J. Antimicrob. Chemother. 51, 333–337 (2003) 3. Amabile-Cuevas C.F., Hermida-Escobedo C., Vivar R.: Com- kowa proteaza SpyCEP. Eksperymenty prowadzone na parative in vitro activity of moxifloxacin by E-test against Strep- modelach zwierzęcych dają pozytywne efekty, zarówno tococcus pyogenes. Clin. Infect. Dis. 32 Suppl. 1, S30–32 (2001) w przypadku iniekcji domięśniowej, jak i donosowej. 4. Banks D.J., Porcella S.F., Barbian K.D., Martin J.M., Musser J.M.: Dodatkową zaletą wykorzystania SpyCEP jest fakt, Structure and distribution of an unusual chimeric genetic ele- że jego homologi zidentyfikowano również w innych ment encoding macrolide resistance in phylogenetically diverse gatunkach paciorkowców, w tym S. equi (SeCEP), a także clones of group A Streptococcus. J. Infect. Dis. 188, 1898–1908 (2003) będącego przyczyną zoonoz, S. iniae (CepI) [71, 76, 81]. 5. Batzloff M.R., Hayman W.A., Davies M.R., Zeng M., Pruk- Innymi składnikami szczepionek mogą być np: pepty- sakorn S., Brandt E.R., Good M.F.: Protection against group daza C5a [66], czy konserwatywny peptyd J8 białka M A streptococcus by immunization with J8-diphtheria toxoid: [5]. Ostatnio przy użyciu metod proteomicznych contribution of J8- and diphtheria toxoid-specific antibodies zidentyfikowane kolejne 40 białek, które mogą zostać to protection. J. Infect. Dis. 187, 1598–1608 (2003) 6. Beall B., Facklam R., Thompson T.: Sequencing emm-specific użyte w konstrukcji szczepionki przeciw GAS. Do sil- PCR products for routine and accurate typing of group A strep- nych immunogenów zakwalifikowano streptolizynę O, tococci. J. Clin. Microbiol. 34, 953–958 (1996) białko powierzchniowe (SPy0269 w szczepie SF370), 7. Bensi G., Mora M., Tuscano G., Biagini M., Chiarot E., białko zewnątrzkomórkowe (SPy0019 w szczepie SF370) Bombaci M., Capo S., Falugi F., Manetti A.G., Donato P., i białko należące do rodziny internalin A (SPy1361 Swennen E., Gallotta M., Garibaldi M., Pinto V., Chiappini N., Musser J.M., Janulczyk R., Mariani M., Scarselli M., Telford J.L., w szczepie SF370) [7]. Grifantini R., Norais N., Margarit I., Grandi G.: Multi high- throughput approach for highly selective identification of vaccine candidates: the group a streptococcus case. Mol. Cell. 7. Podsumowanie Proteomics, 11, M111 015693 (2012) 8. Beres S.B., Carroll R.K., Shea P.R., Sitkiewicz I., Martinez- Narastająca oporność na antybiotyki wśród szcze- Gutierrez J.C., Low D.E., McGeer A., Willey B.M., Green K., pów S. pyogenes uwydatnia konieczność prowadzenia Tyrrell G.J., Goldman T.D., Feldgarden M., Birren B.W., Fofanov Y., Boos J., Wheaton W.D., Honisch C., Musser J.M.: aktywnego monitorowania lekowrażliwości, w oparciu Molecular complexity of successive bacterial epidemics decon- zarówno o metody fenotypowe, jak i genetyczne w celu voluted by comparative pathogenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. identyfikacji rezerwuarów opornych drobnoustrojów. USA, 107, 4371–4376 (2010) Zastosowanie molekularnych technik takich jak MLST, 9. Beres S.B., Musser J.M.: Contribution of exogenous genetic ele- MLVA czy PFGE do ustalania pokrewieństwa między ments to the group A Streptococcus metagenome. PLoS One, 2, e800 (2007) szczepami, badanie występowania genów oporności na 10. Bergman M., Huikko S., Pihlajamaki M., Laippala P., Palva E., różne antybiotyki, ich lokalizacji oraz dróg przenoszenia Huovinen P., Seppala H.: Effect of macrolide consumption on jest ważnym kierunkiem badań w mikrobiologii. erythromycin resistance in Streptococcus pyogenes in Finland Wysoka różnorodność i zmienność szczepów GAS in 1997–2001. Clin. Infect. Dis. 38, 1251–1256 (2004) wskazuje na możliwość szybkiej selekcji coraz to now- 11. Bessen D.E.: Population biology of the human restricted patho­ gen, Streptococcus pyogenes. Infect. Genet. Evol. 9, 581–593 szych klonów o podwyższonej wirulencji. Złożoność (2009) procesów wiodących do umiejscowienia genów warun- 12. Bisno A.L., Rubin F.A., Cleary P.P., Dale J.B.: Prospects for kujących oporność na chemioterapeutyki i dalszej a group A streptococcal vaccine: rationale, feasibility, and wędrówki tychże genów jest jeszcze jednym dowodem obstacles-report of a National Institute of Allergy and Infec- na niezwykłą plastyczność genetyczną S. pyogenes. tious Diseases workshop. Clin. Infect. Dis. 41, 1150–1156 (2005) 13. Borek A.L., Obszanska K., Hryniewicz W., Sitkiewicz I.: Detec- Od wielu lat podejmowane są próby opracowa- tion of Streptococcus pyogenes virulence factors by multiplex nia swoistej wysoce immunogennej i bezpiecznej PCR. Virulence, 3, (2012) szczepionki przeciwko szczepom GAS. Obecnie dużą 14. Borek A.L., Wilemska J., Izdebski R., Hryniewicz W., Sitkie- nadzieję w zwalczaniu rozprzestrzeniania infekcji GAS wicz I.: A new rapid and cost-effective method for detection of budzi wykorzystanie, zidentyfikowanych za pomocą phages, ICEs and virulence factors encoded by Streptococcus pyogenes. Pol. J. Microbiol. 60, 187–201 (2011) tzw. „reverse vaccinology”, nowych cząsteczki białek 15. Carapetis J.R., Steer A.C., Mulholland E.K., Weber M.: The zewnątrzkomórkowych S. pyogenes jako potencjalnych global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect. składników szczepionki. Dis. 5, 685–694 (2005) 16. Carrico J.A., Silva-Costa C., Melo-Cristino J., Pinto F.R., de Lencastre H., Almeida J.S., Ramirez M.: Illustration of a com- Piśmiennictwo mon framework for relating multiple typing methods by appli- cation to macrolide-resistant Streptococcus pyogenes. J. Clin. 1. Akiba T., Koyama K., Ishiki Y., Kimura S., Fukushima T.: On Microbiol. 44, 2524–2532 (2006) the mechanism of the development of multiple-drug-resistant 17. Chopra I., Roberts M.: Tetracycline antibiotics: mode of action, clones of Shigella. Jpn. J. Microbiol. 4, 219–227 (1960) applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial 2. Alos J.I., Aracil B., Oteo J., Gomez-Garces J.L.: Significant resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65, 232–260; second page, increase in the prevalence of erythromycin-resistant, clindamy- table of contents (2001) EPIDEMIOLOGIA ZAKAŻEŃ S. PYOGENES, STRUKTURA KLONALNA POPULACJI I ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ 231

18. Clermont D., Chesneau O., De Cespedes G., Horaud T.: New 34. Feng L., Lin H., Ma Y., Yang Y., Zheng Y., Fu Z., Yu S., Yao K., tetracycline resistance determinants coding for ribosomal pro- Shen X.: Macrolide-resistant Streptococcus pyogenes from Chi- tection in streptococci and nucleotide sequence of tet(T) iso- nese pediatric patients in association with Tn916 transposons lated from Streptococcus pyogenes A498. Antimicrob. Agents family over a 16-year period. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 67, Chemother. 41, 112–116 (1997) 369–375 (2010) 19. Cole J.N., Ramirez R.D., Currie B.J., Cordwell S.J., Djordje- 35. Gillespie S.H.: Failure of penicillin in Streptococcus pyogenes vic S.P., Walker M.J.: Surface analyses and immune reactivities pharyngeal infection. Lancet, 352, 1954–1956 (1998) of major cell wall-associated proteins of group a streptococcus. 36. Giovanetti E., Brenciani A., Vecchi M., Manzin A., Varaldo P.E.: Infect. Immun. 73, 3137–3146 (2005) Prophage association of mef(A) elements encoding efflux- 20. Connell S.R., Tracz D.M., Nierhaus K.H., Taylor D.E.: Riboso- mediated erythromycin resistance in Streptococcus pyogenes. mal protection proteins and their mechanism of tetracycline J. Antimicrob. Chemother. 55, 445–451 (2005) resistance. Antimicrob. Agents. Chemother. 47, 3675–3681 (2003) 37. Horn D.L., Zabriskie J.B., Austrian R., Cleary P.P., Ferretti 21. Cornaglia G., Ligozzi M., Mazzariol A., Valentini M., Orefici G., J.J., Fischetti V.A., Gotschlich E., Kaplan E.L., McCarty M., Fontana R.: Rapid increase of resistance to erythromycin and Opal S.M., Roberts R.B., Tomasz A., Wachtfogel Y.: Why have clindamycin in Streptococcus pyogenes in Italy, 1993–1995. The group A streptococci remained susceptible to penicillin? Report Italian Surveillance Group for Antimicrobial Resistance. Emerg. on a symposium. Clin. Infect. Dis. 26, 1341–1345 (1998) Infect. Dis. 2, 339–342 (1996) 38. Hu M.C., Walls M.A., Stroop S.D., Reddish M.A., Beall B., 22. Coyle E.A., Cha R., Rybak M.J.: Influences of linezolid, penicil- Dale J.B.: Immunogenicity of a 26-valent group A streptococ- lin, and clindamycin, alone and in combination, on streptococ- cal vaccine. Infect. Immun. 70, 2171–2177 (2002) cal pyrogenic exotoxin a release. Antimicrob. Agents Chemother. 39. Jacob S.E., Lloyd C.A., Menon T.: cMLS and M phenotypes 47, 1752–1755 (2003) among Streptococcus pyogenes isolates in Chennai. Indian. 23. Cunningham M.W.: Pathogenesis of group A streptococcal J. Med. Microbiol. 24, 147–148 (2006) infections. Clin. Microbiol. Rev. 13, 470–511 (2000) 40. Lancefield R.C.: Current knowledge of type-specific M antigens 24. Dale J.B., Penfound T., Chiang E. Y., Long V., Shulman S.T., of group A streptococci. J. Immunol. 89, 307–313 (1962) Beall B.: Multivalent group A streptococcal vaccine elicits bac- 41. Lei B., Liu M., Chesney G.L., Musser J.M.: Identification of new tericidal antibodies against variant M subtypes. Clin. Diagn. candidate vaccine antigens made by Streptococcus pyogenes: Lab. Immunol. 12, 833–836 (2005) purification and characterization of 16 putative extracellular 25. Daneman N., Green K.A., Low D.E., Simor A.E., Willey B., lipoproteins. J. Infect. Dis. 189, 79–89 (2004) Schwartz B., Toye B., Jessamine P., Tyrrell G.J., Krajden S., 42. Lewin A.B., Storch E.A., Mutch P.J., Murphy T.K.: Neurocogni- Ramage L., Rose D., Schertzberg R., Bragg D., McGeer A.: Sur- tive functioning in youth with pediatric autoimmune neuropsy- veillance for hospital outbreaks of invasive group a streptococ- chiatric disorders associated with streptococcus. J. Neuropsy- cal infections in Ontario, Canada, 1992 to 2000. Ann. Intern. chiatry Clin. Neurosci. 23, 391–398 (2011) Med. 147, 234–241 (2007) 43. Littauer P., Caugant D.A., Sangvik M., Hoiby E.A., Sundsf- 26. Davies H.D., McGeer A., Schwartz B., Green K., Cann D., jord A., Simonsen G.S.: Macrolide-resistant Streptococcus Simor A.E., Low D.E.: Invasive group A streptococcal infec- pyogenes in Norway: population structure and resistance deter- tions in Ontario, Canada. Ontario Group A Streptococcal Study minants. Antimicrob. Agents. Chemother. 50, 1896–1899 (2006) Group. N. Engl. J. Med. 335, 547–554 (1996) 44. Lowbury E.J., Hurst L.: The sensitivity of staphylococci and 27. DiPersio L.P., DiPersio J.R., Frey K.C. i Beach J.A.: Prevalence other wound bacteria to erythromycin, oleandomycin, and of the erm(T) gene in clinical isolates of erythromycin-resistant spiramycin. J. Clin. Pathol. 12, 163–169 (1959) group D Streptococcus and Enterococcus. Antimicrob. Agents. 45. Macris M.H., Hartman N., Murray B., Klein R.F., Roberts R.B., Chemother. 52, 1567–1569 (2008) Kaplan E.L., Horn D., Zabriskie J.B.: Studies of the continuing 28. Efstratiou A.: Group A streptococci in the 1990s. J. Antimicrob. susceptibility of group A streptococcal strains to penicillin dur- Chemother. 45 Suppl., 3–12 (2000) ing eight decades. Pediatr. Infect. Dis. J. 17, 377–381 (1998) 29. Enright M.C., Spratt B.G., Kalia A., Cross J.H., Bessen D.E.: 46. Martin J.M., Green M.: Group A streptococcus. Semin. Pediatr. Multilocus sequence typing of Streptococcus pyogenes and the Infect. Dis. 17, 140–148 (2006) relationships between emm type and clone. Infect Immun 69, 47. Martin J.M., Green M., Barbadora K.A., Wald E.R.: Group A 2416–2427 (2001) streptococci among school-aged children: clinical characteris- 30. Facklam R.: What happened to the streptococci: overview of tics and the carrier state. Pediatrics, 114, 1212–1219 (2004) taxonomic and nomenclature changes. Clin. Microbiol. Rev. 15, 48. McGregor K.F., Spratt B.G., Kalia A., Bennett A., Bilek N., 613–630 (2002) Beall B., Bessen D.E.: Multilocus sequence typing of Strepto- 31. Facklam R., Beall B., Efstratiou A., Fischetti V., Johnson D., coccus pyogenes representing most known emm types and dis- Kaplan E., Kriz P., Lovgren M., Martin D., Schwartz B., Toto- tinctions among subpopulation genetic structures. J. Bacteriol. lian A., Bessen D., Hollingshead S., Rubin F., Scott J., Tyrrell G.: 186, 4285–4294 (2004) emm typing and validation of provisional M types for group A 49. McNeil S.A., Halperin S.A., Langley J.M., Smith B., War- streptococci. Emerg. Infect. Dis. 5, 247–253 (1999) ren A., Sharratt G.P., Baxendale D.M., Reddish M.A., Hu M.C., 32. Facklam R.F., Martin D.R., Lovgren M., Johnson D.R., Efstra- Stroop S.D., Linden J., Fries L.F., Vink P.E., Dale J.B.: Safety and tiou A., Thompson T.A., Gowan S., Kriz P., Tyrrell G.J., immunogenicity of 26-valent group a streptococcus vaccine in Kaplan E., Beall B.: Extension of the Lancefield classification healthy adult volunteers. Clin. Infect. Dis. 41, 1114–1122 (2005) for group A streptococci by addition of 22 new M protein gene 50. Michos A.G., Bakoula C.G., Braoudaki M., Koutouzi F.I., sequence types from clinical isolates: emm103 to emm124. Clin. Roma E.S., Pangalis A., Nikolopoulou G., Kirikou E., Syrio- Infect. Dis. 34, 28–38 (2002) poulou V.P.: Macrolide resistance in Streptococcus pyogenes: 33. Feil E.J., Li B.C., Aanensen D.M., Hanage W.P., Spratt B.G.: prevalence, resistance determinants, and emm types. Diagn. eBURST: inferring patterns of evolutionary descent among Microbiol. Infect. Dis. 64, 295–299 (2009) clusters of related bacterial genotypes from multilocus sequence 51. Murphy T.K., Storch E.A., Lewin A.B., Edge P.J., Goodman typing data. J. Bacteriol. 186, 1518–1530 (2004) W.K.: Clinical factors associated with pediatric autoimmune 232 KATARZYNA SZCZYPA, JOANNA WILEMSKA, WALERIA HRYNIEWICZ, IZABELA SITKIEWICZ

neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infec- 67. Silva-Costa C., Ramirez M., Melo-Cristino J.: Rapid inversion of tions. J. Pediatr. 160, 314–319 (2012) the prevalences of macrolide resistance phenotypes paralleled 52. Nakae M., Murai T., Kaneko Y., Mitsuhashi S.: Drug resistance by a diversification of T and emm types among Streptococ- in Streptococcus pyogenes isolated in Japan. Antimicrob. Agents cus pyogenes in Portugal. Antimicrob. Agents Chemother. 49, Chemother. 12, 427–428 (1977) 2109–2111 (2005) 53. Nielsen H.U., Hammerum A.M., Ekelund K., Bang D., 68. Skoczynska A., Kadlubowski M., Wasko I., Fiett J., Hrynie- Pallesen L.V., Frimodt-Moller N.: Tetracycline and macrolide wicz W.: Resistance patterns of selected respiratory tract patho- co-resistance in Streptococcus pyogenes: co-selection as a rea- gens in Poland. Clin. Microbiol. Infect. 13, 377–383 (2007) son for increase in macrolide-resistant S. pyogenes? Microb. 69. Steer A.C., Batzloff M.R., Mulholland K., Carapetis J.R.: Drug. Resist. 10, 231–238 (2004) Group A streptococcal vaccines: facts versus fantasy. Curr. 54. Obszanska K., Borek A.L., Hryniewicz W., Sitkiewicz I.: Multi- Opin. Infect. Dis. 22, 544–552 (2009) ple locus VNTR fingerprinting (MLVF) of Streptococcus pyo- 70. Strus M., Drzewiecki A., Chmielarczyk A., Tomusiak A., genes. Virulence, 3, (2012) Romanek P., Kosowski K., Kochan P., van der Linden M., 55. Obszanska K., Borek A. L., Izdebski R., Hryniewicz W., Sit­ Lutticken R., Heczko P.B.: Microbiological investigation of kie­wicz I.: Multilocus variable number tandem repeat analysis a hospital outbreak of invasive group A streptococcal disease (MLVA) of Streptococcus pyogenes. J. Microbiol. Methods. 87, in Krakow, Poland. Clin. Microbiol. Infec.t 16, 1442–1447 (2010) 143–149 (2011) 71. Sumby P., Zhang S., Whitney A.R., Falugi F., Grandi G., 56. Olsen R.J., Sitkiewicz I., Ayeras A.A., Gonulal V.E., Cantu C., Graviss E.A., Deleo F.R., Musser J.M.: A chemokine-degrading Beres S.B., Green N.M., Lei B., Humbird T., Greaver J., Chang E., extracellular protease made by group A Streptococcus alters Ragasa W.P., Montgomery C.A., Cartwright J., Jr., McGeer A., pathogenesis by enhancing evasion of the innate immune Low D.E., Whitney A.R., Cagle P.T., Blasdel T.L., DeLeo F.R., response. Infect. Immun. 76, 978–985 (2008) Musser J.M.: Decreased necrotizing fasciitis capacity caused by 72. Szczypa K., Hryniewicz W.: Zakażenia Streptococcus pyogenes a single nucleotide mutation that alters a multiple gene viru- nabyte w szpitalu. Nowa Klinika, 16, 717 (2009) lence axis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 888–893 (2010) 73. Szczypa K., Sadowy E., Izdebski R., Hryniewicz W.: A rapid 57. Pechere J.C.: New perspectives on macrolide antibiotics. Int. increase in macrolide resistance in Streptococcus pyogenes iso- J. Antimicrob. Agents. 18, Suppl. 1, S93–97 (2001) lated in Poland during 1996–2002. J. Antimicrob. Chemother. 58. Reinert R.R., Lutticken R., Sutcliffe J.A., Tait-Kamradt A., 54, 828–831 (2004) Cil M.Y., Schorn H.M., Bryskier A., Al-Lahham A.: Clonal 74. Szczypa K., Sadowy E., Izdebski R., Strakova L., Hryniewicz W.: relatedness of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes Group A streptococci from invasive-disease episodes in Poland isolates in Germany. Antimicrob. Agents. Chemother. 48, 1369– are remarkably divergent at the molecular level. J. Clin. Micro- 1373 (2004) biol. 44, 3975–3979 (2006) 59. Richardson L.J., Tong S.Y., Towers R.J., Huygens F., McGregor K., 75. Szczypa K., Wilemska J., Hryniewicz W., Sitkiewicz I.: Mecha- Fagan P.K., Currie B.J., Carapetis J.R., Giffard P.M.: Preliminary nizmy wirulencji Streptococcus pyogenes. Post. Mikrobiol. 51, validation of a novel high-resolution melt-based typing method 3–15 (2012) based on the multilocus sequence typing scheme of Strepto- 76. Turner C.E., Kurupati P., Wiles S., Edwards R.J., Sriskandan S.: coccus pyogenes. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1426–1436 (2011) Impact of immunization against SpyCEP during invasive dis- 60. Richter S.S., Heilmann K.P., Dohrn C.L., Beekmann S.E., Riahi F., ease with two streptococcal species: Streptococcus pyogenes Garcia-de-Lomas J., Ferech M., Goossens H., Doern G.V.: and Streptococcus equi. Vaccine, 27, 4923–4929 (2009) Increasing telithromycin resistance among Streptococcus pyo- 77. Varaldo P. E., Montanari M.P., Giovanetti E.: Genetic elements genes in Europe. J. Antimicrob. Chemother. 61, 603–611 (2008) responsible for erythromycin resistance in streptococci. Anti- 61. Roberts A.P., Mullany P.: A modular master on the move: the microb Agents Chemother 53, 343–353 (2009) Tn916 family of mobile genetic elements. Trends Microbiol. 17, 78. Weiss K., De Azavedo J., Restieri C., Galarneau L.A., Gour- 251–258 (2009) deau M., Harvey P., Paradis J.F., Salim K., Low D.E.: Phenotypic 62. Robinson D.A., Sutcliffe J.A., Tewodros W., Manoharan A., and genotypic characterization of macrolide-resistant group A Bessen D.E.: Evolution and global dissemination of macrolide- Streptococcus strains in the province of Quebec, Canada. resistant group A streptococci. Antimicrob. Agents Chemother. J. Antimicrob. Chemother. 47, 345–348 (2001) 50, 2903–11 (2006) 79. Wondrack L., Massa M., Yang B.V., Sutcliffe J.: Clinical strain 63. Rodriguez-Ortega M.J., Norais N., Bensi G., Liberatori S., of Staphylococcus aureus inactivates and causes efflux of mac- Capo S., Mora M., Scarselli M., Doro F., Ferrari G., Gara- rolides. Antimicrob. Agents. Chemother. 40, 992–998 (1996) guso I., Maggi T., Neumann A., Covre A., Telford J.L., Grandi 80. Woodbury R.L., Klammer K.A., Xiong Y., Bailiff T., Glennen A., G.: Characterization and identification of vaccine candidate Bartkus J.M., Lynfield R., Van Beneden C., Beall B.W.: Plasmid- proteins through analysis of the group A Streptococcus surface Borne erm(T) from invasive, macrolide-resistant Streptococcus proteome. Nat. Biotechnol. 24, 191–197 (2006) pyogenes strains. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1140–1143 64. Rubio V., Valdezate S., Alvarez D., Villalon P., Medina M.J., (2008) Salcedo C., Saez-Nieto J.A.: Molecular epidemiology, antimi- 81. Zinkernagel A.S., Timmer A.M., Pence M.A., Locke J.B., crobial susceptibilities and resistance mechanisms of Streptococ- Buchanan J.T., Turner C.E., Mishalian I., Sriskandan S., Han- cus pyogenes isolates resistant to erythromycin and tetracycline ski E., Nizet V.: The IL-8 protease SpyCEP/ScpC of group A in Spain (1994–2006). BMC Microbiol. 12, 215 (2012) Streptococcus promotes resistance to neutrophil killing. Cell 65. Schuchat A., Hilger T., Zell E., Farley M.M., Reingold A., Harri- Host Microbe, 4, 170–178 (2008) son L., Lefkowitz L., Danila R., Stefonek K., Barrett N., Morse D., Pinner R.: Active bacterial core surveillance of the emerging Podziękowania infections program network. Emerg. Infect. Dis. 7, 92–99 (2001) Artykuł powstał dzięki finansowemu wsparciu z grantu NCN 66. Shet A., Kaplan E., Johnson D., Cleary P. P.: Human immu- N N401 536140, działalności statutowej NIL (DS.5.82 i DS 5.67), nogenicity studies on group A streptococcal C5a peptidase sieci monitorowania pozaszpitalnych zakażeń inwazyjnych BiNet, (SCPA) as a potential vaccine against group A streptococcal oraz Narodowemu Programowi Ochrony Antybiotyków (NPOA- infections. Indian. J. Med. Res. 119, Suppl., 95–98 (2004) Moduł1) POST. MIKROBIOL., IMMOBILIZACJA KOMÓREK – ZNACZENIE BIOMEDYCZNE 2013, 52, 3, 233–245 http://www.pm.microbiology.pl

Zofia Bakuła1*, Radosław Stachowiak1, Jarosław Wiśniewski1, Ludomira Granicka2 i Jacek Bielecki1

1 Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa 2 Instytut Biocybernetyki i Inżynierii Biomedycznej im. Macieja Nałęcza, ul. Ks. Trojdena 4, 02-109 Warszawa

Wpłynęło w czerwcu 2013 r.

Spis treści: 1. Wprowadzenie. 2. Metody immobilizacji komórek. 2.1. Unieruchomienie bez nośnika. 2.2. Unieruchomienie na powierzchni nośnika. 2.3. Unieruchomienie wewnątrz nośnika. 2.3.1. Pułapkowanie. 2.3.2. Kapsułkowanie. 2.3.3. Nanoopłaszczanie. 3. Historia zastosowania nośników do immobilizacji materiału biologicznego. 4. Immobilizacja w zastosowaniach biomedycznych. 4.1. Drogi podawania terapeutyków przy użyciu unieruchomionych komórek. 4.2. Właściwości kapsułek wykorzystywanych we wszczepieniach. 4.2.1. Struktura materiału nośnika. 4.2.2. Biozgodność. 4.2.3. Wytrzymałość. 4.2.4. Właściwości chemiczne. 4.3. Właściwości kapsułek wykorzystywanych w terapii doustnej. 4.4. Immobilizowany materiał biologiczny. 4.5. Biomedyczne zastosowania immobilizowanych komórek. 4.5.1. Wykorzystanie unieruchomionych komórek eukariotycznych. 4.5.2. Wykorzystanie unieruchomionych drobnoustrojów. 5. Podsumowanie Cell immobilization – biomedical significance Abstract: Cell encapsulation, which aims to entrap viable cells within the confines of semi-permeable membranes, represents one of the current leading methodologies aimed at the delivery of biological factors to patients for the treatment of multiple diseases. The pores of the membrane are suitably sized to allow the entry of small molecules such as oxygen, nutrients and electrolytes into the capsule and egress of metabolites and small bioactive molecules from the capsule. Entrapment of cells in physical membranes has been practiced since the early 1930s. Numerous encapsulation techniques have been developed over the years and they are classified as entrapment, microencapsulation (usually small spherical devices), macroencapsulation (hollow fiber membranes) and nanocoating. Cell encapsulation technologies were initially directed towards the transplantation of cells across an immunological barrier without the use of immunosuppressant drugs. Some encapsulated microorganisms may carry a transfected human gene, and thus become a source of valuable regulatory factors or anti-tumor factors. Such factors released in strategic locations may direct or modify the biological processes in the eukaryotic organism in biomedical applications. Membranes with immobilized cells can be also used as a novel method for oral drug delivery. Contents: 1. Introduction. 2. Methods of cell immobilization. 2.1. Immobilization without carrier. 2.2. Immobilization on carrier. 2.3. Immobilization in carrier. 2.3.1. Entrapment. 2.3.2. Encapsulation. 2.3.3. Nanocoating. 3. The history of using membranes for immobilization. 4. Encapsulation in biomedical applications. 4.1. Methods of drug delivery using encapsulated cells. 4.2. Membrane properties important for implantation. 4.2.1. Structure of carrier material. 4.2.2. Biocompatibility. 4.2.3. Durability. 4.2.4. Chemical properties. 4.3. Membrane properties for oral drug delivery. 4.4. Immobilized biological material. 4.5. Biomedical applications of encapsulated cells. 4.5.1. Use of encapsulated eukaryotic cells. 4.5.2. Use of encapsulated microorganisms. 5. Summary

Słowa kluczowe: immobilizacja, pułapkowanie, kapsułkowanie, nanoopłaszczanie, terapia biohybrydowa Key words: immobilization, entrapment, encapsulation, nanocoating, biohybrid therapy

1. Wprowadzenie nie redukując niezbędną dawkę podawanych leków immunosupresyjnych, minimalizując skutki uboczne Znanych jest wiele chorób wywołanych nieprawi- i poprawiając jakość życia pacjentów [53]. Immobiliza- dłowym metabolizmem cząsteczek w organizmie bądź cja komórek ma wiele zalet w porównaniu z immobiliza- ich nieodpowiednim stężeniem [77]. Skuteczne lecze- cją białek. Jest mniej kosztowna, pozwala na długotrwałe nie tego typu schorzeń wymaga dostarczenia biologicz- i kontrolowane dostarczanie cząsteczek produkowanych nie aktywnych cząstek terapeutycznych do właściwego de novo, a gdy implant ulegnie uszkodzeniu, toksyczność miejsca w organizmie i ich uwalniania, najkorzystniej, spowodowana wysokim stężeniem leku jest znacznie w kontrolowany sposób. Systemy opierające się na mniejsza. Unieruchamianie materiału biologicznego immobilizowanych komórkach w półprzepuszczalnych może być także wykorzystywane, jako nowa metoda nośnikach mających postać implantu dają medycynie doustnego podawania leków i szczepionek [62]. Jest ona nowe możliwości i pozwalają na produkcję substancji, szczególnie korzystna w porównaniu z doustnym poda- których organizm sam produkować nie może. Unieru- waniem immobilizowanych białek, które często ulegają chamiać można szerokie spektrum komórek, jednocześ­ uszkodzeniu podczas wędrówki przez układ trawienny.

* Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego; ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected] 234 ZOFIA BAKUŁA, RADOSŁAW STACHOWIAK, JAROSŁAW WIŚNIEWSKI, LUDOMIRA GRANICKA, JACEK BIELECKI

2. Metody immobilizacji komórek ich metabolizmu i cech środowiska [6]. Wadą tej metody jest uzyskiwanie stosunkowo niskiego stężenia biomasy Immobilizacja drobnoustrojów jak i komórek euka- na jednostkę objętości bioreaktora. riotycznych polega na częściowym lub całkowitym ogra- Wiązanie kowalencyjne polega na utworzeniu wią- niczeniu ich swobodnego ruchu przy jednoczesnym zań chemicznych takich jak wiązania estrowe czy pep- zapewnieniu im dostępu do składników odżywczych tydowe między grupami funkcyjnymi składników osłon i odpływu produktów przemiany. Istnieje wiele kla­ komórek a nośnikiem (siła przyczepu jest tu wyższa niż syfikacji metod unieruchamiania, a najpopularniejsza w przypadku adsorpcji i adhezji). W metodzie tej stosuje wyróżnia: (i) unieruchomienie bez nośnika, (ii) unie- się czynnik wiążący (np. aldehyd glutarowy) i nośnik ruchomienie na powierzchni nośnika, (iii) unierucho- (np. ziemię okrzemkową, szkło porowate, pochodne mienie wewnątrz nośnika [74]. celulozy, akrylany, skały wulkaniczne, bawełnę) [6]. Aby poprawić efektywność immobilizacji sugeruje się 2.1. Unieruchomienie bez nośnika obniżenie siły elektrostatycznego odpychania komórka – nośnik, bądź nadaje się powierzchni komórki lub Unieruchomienie bez nośnika wykorzystuje natu- nośnika odpowiedni ładunek (np. poprzez zastosowa- ralną (samoagregacja) bądź indukowaną zdolność nie polietylenoiminy). Zarówno czynniki wiążące jak komórek do tworzenia skupisk (indukowana flokulacja i stosowane modyfikacje nośnika muszą być indywidu- komórek i sieciowanie przestrzenne). alnie dobierane, gdyż mogą one redukować żywotność Samoagregacja możliwa jest dzięki wydzielaniu komórek oraz powodować opory dyfuzyjne. przez komórki związków, które umożliwiają im wzrost W metodach wykorzystujących wiązanie do po-­ w postaci kłaczków czy granulek (np. polimukosacha- wierzchni nośnika należy zwracać szczególną uwagę na rydów), a tworzeniu skupisk sprzyja duża koncentracja zmiany środowiska (np. spadek pH może powodować biomasy. Zdolność komórek do wzajemnego łączenia odklejanie się komórek). Ponadto obserwuje się częś­ się może być zwiększana np. poprzez stosowanie odpo- ciowe uwalnianie materiału biologicznego związane wiednich podłoży, regulację pH, temperatury czy stę- z autolizą komórek z niższych warstw, turbulencjami żenia tlenu, a także poprzez dodawanie polielektroli- czy przepływem fazy ciekłej. tów. Manipulowanie wyżej wymienionymi czynnikami w celu umożliwienia tworzenia skupień i konglome- 2.3. Unieruchomienie wewnątrz nośnika ratów nazywane jest indukowaną flokulacją. Materiał biologiczny otrzymany zarówno w procesach samo- Unieruchomienie materiału wewnątrz nośnika polega agregacji jak i flokulacji charakteryzuje się jednak małą na fizycznym zamknięciu komórek w matrycy. Dro­ wytrzymałością mechaniczną, co ogranicza możliwości bnoustroje zamknąć można wewnątrz półprzepuszczal- jego zastosowania. nej membrany w postaci kapsułki (nanokapsułkowanie Sieciowanie przestrzenne to wiązanie komórek róż- i mikrokapsułkowanie) bądź kapilary (makrokapsułko- nymi substancjami mogącymi reagować z grupami wanie) lub pułapkować w porowatym nośniku [75]. funkcyjnymi osłon komórkowych np. aldehydem gluta- rowym, chlorkiem cyjanurowym bądź heksametylocy- 2.3.1. Pułapkowanie janiną. Wzajemne sieciowanie daje zwykle dosyć trwały biomateriał, jednak może prowadzić do częściowej utraty Pułapkowanie (inkluzja) polega na uwięzieniu ko- aktywności komórek i utrudniać dyfuzję substratów. mórek w trójwymiarowej matrycy, której rozmiar jest istotnie większy od rozmiarów komórek (najczęściej są 2.2. Unieruchomienie na powierzchni nośnika to kuleczki o średnicy 0,3–3 mm) [6]. Materiał biolo- giczny można wymieszać z roztworem nośnika (mono- W obrębie metod unieruchamiania na powierzchni merem bądź nieusieciowanym polimerem) i środka nośnika wyróżnia się adsorpcję i adhezję oraz wiązanie sieciującego, a następnie układ taki poddać polimery- kowalencyjne. zacji. Do produkcji matryc pełnożelowych wykorzystuje Adsorpcja i adhezja oparte są na wiązaniach jono- się związki chemiczne pochodzenia naturalnego bądź wych, wodorowych, hydrofobowych, siłach elektro- syntetyczne, które żelują poprzez wytworzenie między statycznych, siłach van der Waalsa lub kombinacjach cząsteczkami wiązań wodorowych, hydrofobowych, tych sił. Nośnik (np. celulozę, drewno, szkło porowate, kowalencyjnych lub oddziaływań jonowych. Muszą one tlenki metali, syntetyczne polimery) wprowadza się do spełniać pewne wymagania: nie być toksyczne względem roztworu z materiałem biologicznym i pozostawia na unieruchamianych komórek, tworzyć żel w łagodnych pewien czas, bez mieszania lub z mieszaniem, w celu osa- warunkach (temperatura, pH, nietoksyczne odczynniki) dzenia się komórek. Skuteczność unieruchamiania za- oraz mieć odpowiednie właściwości mechaniczne [34]. leży od rodzaju matrycy, typu zastosowanych komórek, W biotechnologii materiałem najczęściej stosowanym IMMOBILIZACJA KOMÓREK – ZNACZENIE BIOMEDYCZNE 235 do pułapkowania jest alginian sodu (jednowartoś­ nianu i dodatnio naładowanej poli-L-lizyny prowa- ciowa sól kwasu alginianowego) – liniowy kopolimer dziła do powstania membrany koacerwacyjnej. Następ- zbudowany z dwóch typów monomerów: kwasu β-D- nie kapsułki pokrywano roztworem polietylenoiminy mannurowego (M) i α-L-guluronowego (G), pozyski- (ładunek ujemny), a rdzeń alginianowy upłynniano wany z morskich brunatnic. przy użyciu cytrynianu sodu [46]. Modyfikacja doko- nana przez O’ S h e a i wsp., polegała na zastąpieniu 2.3.2. Kapsułkowanie polietylenoiminy kolejną warstwą alginianu w celu zwiększenia biokompatybilności kapsułek (w literatu- Kapsułkowanie polega na otaczaniu rdzenia ścian- rze kapsułki uzyskane tą metodą, z upłynnionym bądź kami uformowanymi z jednej lub kilku substancji nieupłynnionym rdzeniem nazywane są kapsułkami okrywających [2]. Rdzeń stanowi zwykle od 10 do 90% APA – alginate-poly-L-lysine-alginate) [52]. Kapsułki ogólnej masy kapsułki. Może nim być substancja lub APA zastosowane zostały między innymi do produkcji mieszanina substancji w postaci stałej, ciekłej lub gazo- przeciwciał monoklonalnych na skalę przemysłową [55]. wej. Materiałem ścianek mogą być związki naturalne Przeszkodą w masowej produkcji okazała się jednak bądź syntetyczne [17]. Technikami wykorzystywanymi wysoka cena odczynników oraz skomplikowana metoda do formowania kapsułek są: odparowanie rozpuszczal- wytwarzania kapsułek (w procesie przemysłowym wiele nika, żelowanie za pomocą jonów, suszenie rozpyłowe, kapsułek zostało uszkodzonych podczas upłynniania powlekanie, ekstruzja, koacerwacja, denaturacja ter- alginianowego rdzenia cytrynianem sodu) [53]. Inne miczna i suszenie sublimacyjne [56]. Kapsułki zwykle modyfikacje polegały na zastępowaniu poli-L-lizyny zapobiegają ucieczce komórek z nośnika, jednocześnie innymi związkami np. chitozanem, bądź zwiększa- nie zaburzając przepływu małocząsteczkowych produk- niu liczby kolejnych warstw (np. kapsułki APAPA tów i substratów [17]. – alginian/poli-L-lizyna/alginian/poli-L-izyna/alginian; Makrokapsułki zwane też membranami kapilar- APPPP – alginian/poli-L-lizyna/pektyna/poli-L-lizyna/ nymi mają cylindryczny kształt, średnice wewnętrzną pektyna; APCPA – alginian/poli-L-lizyna/chitozan/poli- od 0,5 do 1,5 mm i długość od 1 do 10 cm [37]. Mem- -L-lizyna/alginian) [54, 61, 64]. Mniej skomplikowane brany kapilarne wytwarzane są między innymi z poli- metody polegają na pokrywaniu kulek tłuszczami np. propylenu, polimeru z grupy poliolefin, zbudowanego olejem palmowym [19]. Kulki takie miały być wyko- z merów o wzorze: –(CH2CH(CH3))–. Polimer ten rzystywane do terapii doustnych, a dodatkowe pokrycie występuje w trzech podstawowych formach stereoizo- miało chronić immobilizowane bakterie przed szko- merycznych: ataktycznej, izotaktycznej i syndiotaktycz- dliwym działaniem soku żołądkowego. H u n k e l e r nej. Polipropylen izotaktyczny, w którym konfiguracja opisał metodę polegającą na koacerwacji anionowego wszystkich centrów chiralności jest jednakowa, posiada siarczanu celulozy z kationowym chlorkiem polimety- najlepsze własności mechaniczne i jest najczęściej wyko- loamonowym lub alginianu, siarczanu celulozy, chlorku rzystywaną formą. Polipropylen jest termoplastyczny, wapnia polimetylenoguanidyny [35]. wykazuje dużą odporność chemiczną na działanie soli, zasad, kwasów i rozpuszczalników organicznych. Cha- 2.3.3. Nanoopłaszczanie rakteryzuje się także dobrą przepuszczalnością powie- trza. Jest materiałem palnym, bezbarwnym, bezwonnym Nanokapsułki to zwykle warstwy otaczające poje- i niewrażliwym na działanie wody (absorpcja wody dynczą komórkę bakteryjną, a ich średnica nie przekra- wynosi od 0,01 do 0,03%). Polipropylen charakteryzuje cza 0,2 µm [17]. Metoda ta eliminuje niewykorzystaną się wysoką biozgodnością i nie jest biodegradowalny przestrzeń w rdzeniu kapsuły, co może korzystnie [41]. Innymi materiałami stosowanymi do makro­ wpływać na transport cząsteczek między otoczeniem kapsułkowania jest m.in. polichlorek winylu, poliuretan kapsułki a masą komórkową, jednocześnie zmniej- czy polisulfon. szając rozmiary wszczepu. Sposobem wytwarzania Mikrokapsułki są kuliste, a ich średnica zawiera się takiego nośnika jest odwirowanie materiału komórko- w przedziale 0,2–5000 µm. Metodami najczęściej sto- wego w gradiencie gęstości z polimerem np. z kopo- sowanymi do ich wytwarzania są metody polegające limerem metakrylanu hydroksylowego i metarkrylanu na modyfikacji pełnych kapsułek żelowych. Mody- metylowego [70] lub z roztworem alginianu i czynnika fikacje te miały głównie na celu stworzenie dodatko- sieciującego. Można także zastosować metodę warstwa wych warstw pokrywających, dzięki którym komórki po warstwie (LbL – layer by layer) wykorzystując elek- wydostające się z żelu zatrzymują się w wolnej warstwie trostatyczne oddziaływania poszczególnych warstw. między kapsułką a płaszczem. Jedna z nich wykorzy- W technice tej używa się głównie polielektrolitów, czyli stywała pełne alginianowe kulki żelowe, które umiesz- polimerów z ugrupowaniami jonowymi lub ulegają- czane były w roztworze poli-L-lizyny. Koacerwacja cymi jonizacji np. poli-L-lizyny wraz z polietylenoiminą dwóch polielektrolitów, ujemnie naładowanego algi- bądź poli-L-lizyny wraz z sulfonianiem polistyrenu 236 ZOFIA BAKUŁA, RADOSŁAW STACHOWIAK, JAROSŁAW WIŚNIEWSKI, LUDOMIRA GRANICKA, JACEK BIELECKI sodu. Koacerwacja dwóch polielektrolitów dodat- 4. Immobilizacja w zastosowaniach biomedycznych nio naładowanej poli-L-lizyny i ujemnie naładowanej polietylenoiminy bądź sulfonianu polistyrenu prowa- 4.1. Drogi podawania terapeutyków przy użyciu dzi do powstania membrany koacerwacyjnej. Kilka unieruchomionych komórek prac wykazało, że zastosowanie tego typu związków jest przydatne w opłaszczaniu komórek eukariotycz- Istnieją dwie podstawowe metody podawania terapeu­ nych i drobnoustrojów (np. nanoopłaszczone drożdże tyków w postaci enkapsulowanych komórek – wszcze- zachowały swoją żywotność i zdolności wydzielnicze) pienie lub terapia doustna. Wszczepienie polega na [18]. Polietylenoimina może występować w formie umieszczeniu urządzenia wydzielającego lek w określo- liniowej bądź rozgałęzionej. Forma liniowa zawiera nym miejscu w organizmie. W zależności od ukrwienia jedynie aminy drugorzędowe i w temperaturze poko- tego miejsca, możemy osiągać wysokie stężenie czyn- jowej występuje w stałym stanie skupienia, dlatego nika terapeutycznego w osoczu, bądź jedynie w oko- do immobilizacji wykorzystywana jest forma rozga- licach implantu. W terapii doustnej substancja może łęziona, która zawiera pierwszo, drugo i trzeciorzę- wchłaniać się w żołądku i jelicie, bądź tylko w jelicie. dowe grupy aminowe. Jednak jak pokazują badania, Preparaty wchłaniane z żołądka i jelit dostają się do polietylenoimina może charakteryzować się wysoką układu krwionośnego, osiągając wysokie stężenie we toksycznością [76]. Sulfonian polistyrenu (sól sodowa krwi przez określony czas. sulfonianu polistyrenu, PSS) jest dobrze rozpuszczalny w wodzie, a w medycynie wykorzystywany może być do 4.2. Właściwości kapsułek wykorzystywanych zmniejszania stężenia jonów potasu we krwi. Doustne we wszczepieniach podawanie PSS może jednak wywołać utratę apetytu, wymioty, nudności, a nawet doprowadzić do martwicy Implantacja immobilizowanych komórek wiąże się jelita grubego [67]. z szeregiem trudności związanych ze strukturą, biozgod- nością, wytrzymałością i właściwościami chemicznymi. W celu rozwiązania możliwych problemów optymaliza- 3. Historia zastosowania nośników cja systemu dotyczy następujących sfer: do immobilizacji materiału biologicznego 4.2.1. Struktura materiału nośnika Naukowcy badają problem transplantacji nośni- ków zawierających materiał biologiczny od początku Interakcja między tkankami gospodarza a implan- XX wieku. W 1933 B i s c e g e l i e zamknęła komórki tem zależy zarówno od struktury zewnętrznej jak rakowe w polimerowej matrycy i wszczepiła je do jamy i kształtu urządzenia. Wykazano, że implanty z ostrymi brzusznej świni [4]. Wyniki tego badania pokazały, że rogami wywołują silniejszą odpowiedź organizmu komórki nie zostały zniszczone przez system immu- gospodarza (powstaje więcej komórek stanu zapalnego nologiczny gospodarza. Około trzydzieści lat później, i wyższa jest aktywność enzymów komórkowych wokół C h a n g wprowadził pomysł wykorzystywania tzw. implantu). Badania wykazały także różnice w zdolności „sztucznych komórek”, czyli układów, które naśladują do utrzymania przy życiu immobilizowanych komórek funkcje biologiczne komórek własnych [9]. Idea ta w implantach różniących się zewnętrzną strukturą [43]. została wdrożona w latach 70- i 80-tych XX wieku do Powierzchnia gładka stymuluje częściej reakcję fibro- immobilizacji komórek wysp trzustkowych wydziela- tyczną, podczas gdy powierzchnia szorstka indukuje jących insulinę, jako ksenoprzeszczepu (przeszczepy wrastanie komórek gospodarza w struktury ściany. ksenogeniczne to przeszczepy międzygatunkowe, allo- Uważa się, iż bioimplanty w postaci kapilar zapewniają geniczne – wewnątrzgatunkowe) [11, 46]. Od tego bardziej powtarzalny kształt oraz wyższą gładkość czasu bardzo wiele wysiłku zostało włożone w lepsze powierzchni w porównaniu do mikrokapsułek [80]. zrozumienie tego typu układów. Trwają badania nad Struktura porów w nośniku determinuje zasięg inter- zastosowaniem enkapsulowanych komórek celem ­akcji między immobilizowanymi komórkami a środowi- wspomagania chorej tkanki lub narządów. Taki układ skiem zewnętrznym. Określana jest przez ich wielkość, może służyć do podawania leków, a także znaleźć zasto- rozmieszczenie oraz głębokość. Nośniki porowe, zgod- sowanie biotechnologiczne np. przy produkcji rożnego nie z klasyfikacją IUPAC definiowane są jako mikropo- typu związków na skalę przemysłową. Z immobilizacją rowate (średnica porów niższa niż 2 nm), mezoporowate materiału biologicznego wewnątrz nośnika można spot­ (średnica między 2 a 50 nm) i makroporowate (średnica kać się przy zastosowaniach w oczyszczaniu środowiska powyżej 50 nm). Tylko niewielkie cząsteczki jak np. tlen – biodegradacji [50], badaniach biozgodności – badaniu mogą penetrować materiały mikroporowate. Materiały cytotoksyczności [27], a także w inżynierii tkankowej mezoporowate pozwalają na przepływ większych cząste- w klonalnej selekcji pożądanych fenotypów [63]. czek jak np. małych białek. Implanty zawierające makro- IMMOBILIZACJA KOMÓREK – ZNACZENIE BIOMEDYCZNE 237 pory pozwalają na przepływ dużych białek, czasem cować system, który zagwarantuje pełną ochronę immo- nawet całych komórek. Strukturę porów określa także bilizowanego materiału biologicznego. Indukcja odpo- Masa Cząsteczkowa Progu Odcięcia (MWCO – Molecu- wiedzi może zacząć się wraz z dyfuzją przez matrycę lar Weight Cut Off), czyli masa najmniejszej cząsteczki antygenów powierzchniowych lub białek wydzielanych (wyrażona w kDa) która pozostaje w nośniku. Wiele przez komórki żywe, a także białek uwolnionych z mar- z wykorzystywanych materiałów posiada jednak niere- twych komórek. Rozpoznawanie i prezentowanie anty- gularną strukturę i wielkość porów, a dodatkowo ich genów przez komórki prezentujące antygen inicjuje właś­ciwości mogą ulegać zmianie w środowisku poim- komórkową i humoralną odpowiedź immunologiczną. plantacyjnym (np. poprzez wchłanianie wody przez poli- Pierwszy z tych szlaków prowadzi do aktywacji między mer bądź jego degradację). Pory powinny umożliwiać innymi komórek cytotoksycznych i makrofagów. Ele- swobodny przepływ substancji odżywczych, tlenu i pro- menty te nie powinny przenikać do kapsułek, i jest to duktów przemiany, ale nie samych komórek. Transport dość łatwo osiągane dzięki regulacji wielkości porów. substancji wzdłuż matrycy możliwy jest dzięki gradien- Znacznie trudniejsze jest hamowanie wnikania do towi stężeń. Badania wykazały, że głównym czynnikiem nośnika składników odpowiedzi humoralnej. Należy limitującym przeżywalność komórek w kapsułkach jest dodatkowo pamiętać, że samo przeciwciało może nie dostępność tlenu [69]. Komórki o większych wymaga- wpływać niszcząco na obcą komórkę, np. patogennego niach pokarmowych powinny znajdować się w mate- drobnoustroju, ale może uruchomić dopełniacz, który riałach o bardzo dobrej przepuszczalności, komórki tego dokona. Dla cytokin, limfokin i przeciwciał kap- ksenogeniczne w przeciwieństwie do allogenicznych suła okazuje się często niewystarczającą barierą. Waż- wymagają bardziej restrykcyjnej immunoizolacji [44]. nym problemem jest także wydzielanie przez makrofagi Immunoizolacja to ochrona implantowanego mate- tlenku azotu, a także reaktywnych metabolitów tlenu riału biologicznego przed reakcją immunologiczną [13]. Możliwe szlaki odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Efektywność immunoizolacji związana jest względem immobilizowanych komórek wszczepionych bezpośrednio z wielkością porów w kapsule. Ważne jest, do organizmu przedstawiono na Rysunku 1. żeby aktywne składniki układu immunologicznego nie Kilku autorów w swych pracach wykazało, że wszczep były w stanie oddziaływać z antygenami na powierzchni może powodować niespecyficzną odpowiedź immu- izolowanych komórek. Ponieważ kapsułki nie są barie- nologiczną przeciwko implantowanym komórkom rami absolutnymi, a system immunologiczny zawiera [5]. Dodatkowym problemem jest implantowanie ko- cały szereg ścieżek obronnych, bardzo ciężko jest opra- mórek mających wydzielać fibrynogen, histaminę czy

Rys. 1. Oddziaływanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza z komórkami znajdującymi się w implancie 238 ZOFIA BAKUŁA, RADOSŁAW STACHOWIAK, JAROSŁAW WIŚNIEWSKI, LUDOMIRA GRANICKA, JACEK BIELECKI fibronektynę. Czynniki te powodują napływ granulo- 4.2.4. Właściwości chemiczne cytów, bazofili i makrofagów w pierwszych dniach po implantacji. Makrofagi produkują czynniki takie jak Nośnik powinien być nierozpuszczalny w środo- TNF-α, TGF-β i histamina, stymulując komórki umiesz- wisku, w którym drobnoustroje będą unierucha- czone w implancie [3]. miane. Ważna jest odporność na degradację chemiczną i mikrobiologiczną. Właściwości chemiczne deter- 4.2.2. Biozgodność minują także możliwości sterylizacji i oczyszczania implantu. Dodatkowo obecność odpowiednich grup Biozgodność jest niezbędną cechą materiału warun- funkcyjnych może wpływać na przyleganie komórek kującą jego prawidłowe działanie w żywym organizmie. lub białek do powierzchni nośnika. Pokrywanie matrycy Nośnik w pełni biozgodny powoduje minimalną odpo- przez białka może zatykać pory i znacząco obniżać jej wiedź organizmu, do którego jest wszczepiany [75]. przepuszczalność. Materiał powinien być chroniony przed pokryciem Na przydatność materiału wpływa także jego cena, przez fibroblasty (przerost tkanki włóknistej zaburza dostępność, możliwości regeneracji i zastosowania przepuszczalność matrycy) [20]. Nośnik nie może w skali przemysłowej, prostota i parametry biologiczne oddziaływać negatywnie na biorcę implantu, prowa- podczas unieruchamiania. Przykładowe materiały dzić do reakcji alergicznych lub toksycznych, wywo- wykorzystywane do unieruchamiania dla zastosowań ływać stanu zapalnego, zmian nowotworowych, być biomedycznych znajdują się w Tabeli I. mutagenny lub teratogenny. W kontakcie z krwią nie powinien wywoływać zmian w jej składzie, wpływać na 4.3. Właściwości kapsułek wykorzystywanych krzepliwość krwi, a także zmieniać konfiguracji, morfo- w terapii doustnej logii i trwałości komórek immobilizowanych i komórek gospodarza. Przewód pokarmowy jest doskonałym miejscem do dostarczania substancji terapeutycznych. Odpo- 4.2.3. Wytrzymałość wiednio dobrane komórki mogą produkować enzymy, białka, przeciwciała czy leki. Tego typu układy mogą Materiał musi być tak wytrzymały, aby przetrwać także zostać wykorzystane przy produkcji szczepionek proces implantacji w formie nienaruszonej. Już bardzo jadalnych. Obecnie tylko nieliczne mogą być podawane niewielkie uszkodzenia mogą powodować ucieczkę doustnie, ponieważ często antygen zostaje uszkodzony immobilizowanego materiału biologicznego. Dodat- podczas wędrówki przez układ trawienny, i nie może kowo nośnik musi charakteryzować się elastycznością on indukować odpowiedniej reakcji ze strony układu i odpornością na rozciąganie. Wiele urządzeń immun- immunologicznego. Immobilizowane komórki dostar- moizolacyjnych zawiodło z powodu zbyt malej wytrzy- czane do jelita i produkujące antygen mogą rozwiązać małości mechanicznej – układy pękały uwalniając unie- ten problem. Ze względu na nieprzyjazne środowisko ruchomione komórki do organizmu gospodarza. do doustnej terapii komórek wykorzystuje się głównie

Tabela I Materiały wykorzystywane do immobilizacji materiału biologicznego

Piśmien- Zastosowany materiał Komórki immobilizowane Gospodarz nictwo Polipropylen Komórki trzustki chomika Szczur [36] Komórki wątroby płodowej świni Szczur [73] Escherichia coli Mysz [28] Poliuretan Szczurze komórki trzustki Szczur [78] Komórki trzustki świni Szczur [82] Poliaryloeterosulfon Szczurze mioblasty Mysz [10] Polisulfon Szczurze hepatocyty Szczur [80] Makrokapsułkowanie Poliakrylonitryl Szczurze komórki nowotworowe nadnerczy Małpa [1] Alginiano-L-lizyno-alginian Escherichia coli Szczur [58] Silikon Szczurze komórki trzustki Szczur [7] Alginian Ludzkie hepatocyty Badania in vitro [16] Bakterie kwasu mlekowego [68] Glikol polietylenowy Komórki trzustki świni Szczur [15] i pułapkowanie

Makrokapsułkowanie Amylopektyna Szczurze komórki nadnerczy Badania in vitro [49] IMMOBILIZACJA KOMÓREK – ZNACZENIE BIOMEDYCZNE 239 drobnoustroje. Bakterie wykorzystywane tu są jako małe Tabela II bioreaktory. Dodatkowo charakterystyka wzrostu, krótki Przykładowe typy komórek wykorzystywanych do immobilizacji czas replikacji i wysoka odporność niektórych szczepów i ich zastosowania na warunki środowiska czyni je idealnymi kandydatami Piśmien- Typ komórek Zastosowanie do produkcji substancji terapeutycznych w jelicie. nictwo W terapii doustnej szerokie zastosowanie znajdują Mioblasty Choroba Parkinsona [1] hydrożelowe kapsułki (np. których podstawę stanowi Choroba afektywna [45] alginian, karagen, agaroza). Różnorodność wykorzy- Nowotwory [12] stywanych nośników sprawia, że mogą być one odpo- Hemofilia [33] wiednio dobierane, zależnie od tego jak zaplanujemy Komórki macierzyste Regeneracja kości [22] terapię. Po doustnym podaniu kapsułki narażone są Escherichia coli Usuwanie mocznika [58] na nieprzyjazne czynniki takie jak: aktywność różnego Hepatocyty Transplantacja wątroby [31] rodzaju enzymów, zachodzące w organizmie reakcje Komórki wysepek Cukrzyca [11] chemiczne, zmieniające się pH [24]. Ważne jest odpo- trzustkowych wiednie dobranie wielkości porów. Immunoizolacja nie Komórki przytarczyc Sztuczne narządy [32] musi być aż tak restrykcyjna jak w przypadku kapsułek Komórki jajnika Choroba Fabry’ego [51] implantowanych. Nośnik musi być biozgodny, ale nie Oxalobacter formigenes Kamienie nerkowe [21] musi być chroniony przed pokryciem przez fibroblasty. Erwinia herbicola Fenyloketonuria [47] Dalej należy rozważyć czy immobilizowane komórki mogą być potencjalnie niebezpieczne dla człowieka. W przypadku pracy z genetycznie modyfikowanymi wraz z ich zastosowaniem zaprezentowano w Tabeli II. organizmami, kapsułki nie powinny rozpuszczać się Przy wyborze odpowiedniego materiału biologicznego w środowisku kwaśnym, ani po długiej ekspozycji na należy zwrócić uwagę na jego wymagania pokarmowe, środowisko zasadowe. Gdy unieruchomione komórki odporność na stres oraz zmienność morfologiczną mają dotrzeć do jelita (aby terapeutyk uwalniany był (ewentualne zmiany w rozmiarze komórek mogłyby jedynie w jelicie, np. przez wzgląd na jego drażniące na umożliwiać im wydostawanie się z kapsuł). Ważne jest żołądek działanie), należy upewnić się, że przetrwają upewnienie się czy komórki, których używamy nie są nieuszkodzone przejście przez żołądek. Podczas dojeli- zakażone wirusami, grzybami, a także zbadanie reakcji towego dostarczania probiotyków przy użyciu kapsułek, organizmu na inne poza pożądaną przez nas cząsteczką wykorzystywany materiał powinien być nierozpusz- produkty wydzielane przez dany typ komórek. Bakte- czalny w środowisku kwaśnym, natomiast rozpuszczalny rie posiadają przewagę nad eukariotycznymi liniami po odpowiedniej ekspozycji na środowisko zasadowe. komórkowymi. Są zazwyczaj tańsze w hodowli, bar- Kapsułki warto dodatkowo powlekać substancjami dziej oporne na stres, mniej wymagające, jeśli chodzi wielkocząsteczkowymi, tak, aby ułatwić pobranie ich o warunki zewnętrzne, mogą być aktywne przez dłuż- odpowiedniej ilości na raz, a jednocześnie stworzyć szy czas. Są także prostszymi­ modelami do modyfikacji. dodatkową barierę ochronną. Droga doustna podawa- Genetycznie modyfikowane drobnoustroje, zaprojekto- nia terapeutyków ma wiele zalet. Do pobrania nie jest wane w celu wydzielania pożądanych czynników mogą wymagany żaden specjalistyczny sprzęt ani personel, stać się przyszłością terapii biohybrydowej. Przy pew- a w razie przedawkowania lek w łatwy sposób można nego typu terapiach niezastąpione mogą także okazać usunąć. Jest też relatywnie tania, a podawane kap- się bakteriofagi. Bardzo ważnym aspektem jest bezpie- sułki nie muszą być sterylne. By zaprojektować nośnik czeństwo biologiczne. W przypadku organizmów mody- w terapii doustnej należy wziąć pod uwagę koniecz- fikowanych genetycznie ekspresja genów powinna być ność maksymalizowania przeżywalności bakterii i ma­- regulowana wielopoziomowo, a same szczepy powinny ksymalizowania zdolności do dostarczania substancji być wysoce stabilne genetycznie. terapeutycznej. 4.5. Biomedyczne zastosowania 4.4. Immobilizowany materiał biologiczny immobilizowanych komórek

Jako materiał biologiczny stosowany w immobi- Znanych jest wiele chorób wywołanych niewystar- lizacji nadają się odpowiednie szczepy bakterii bądź czającym stężeniem odpowiednich cząstek w orga- linie komórkowe, które wydzielają cząstki terapeu- nizmie (Rys. 2), bądź ich nieprawidłowym metaboli- tyczne przez długi okres czasu, bądź są w stanie pełnić zmem. Terapia biohybrydowa umożliwia dostarczanie określone funkcje przy ciągłej terapii doustnej. Można substancji terapeutycznych przez długi okres czasu. korzystać z linii pierwotnych, stabilnych, allogenicz- Implanty produkujące pożądane cząstki mogłyby wypeł- nych, ksenogenicznych. Przykładowe typy komórek niać liczne defekty enzymatyczne. Drugim obszarem 240 ZOFIA BAKUŁA, RADOSŁAW STACHOWIAK, JAROSŁAW WIŚNIEWSKI, LUDOMIRA GRANICKA, JACEK BIELECKI

modyfikowane komórki mogą wytwarzać każdą pożą- daną cząstkę in vivo bez modyfikacji genomu gospo- darza. Układy te pozwalają także na zmniejszenie lub całkowite wycofanie podawania leków immunosupresyj- nych. Immobilizacja komórek ma wiele zalet w porów- naniu z immobilizacją białek, ponieważ pozwala na długotrwałe i kontrolowane dostarczanie cząsteczek produkowanych de novo. Poza tym, jeżeli implant ule- gnie uszkodzeniu, toksyczność spowodowana wysokim stężeniem leku będzie znacznie mniejsza. Problemem jest ewentualne uwolnienie komórek z kapsułek i wywo- łanie reakcji immunologicznej. Enkapsulacja może być także wykorzystywane przy dojelitowym dostarczaniu terapeutyków, a enkapsulo- wane bakteriofagi, mogą usuwać patogeny jelitowe takie jak Salmonella czy Clostridium [23, 38].

4.5.1. Wykorzystanie unieruchomionych komórek eukariotycznych

Przeprowadzono badania dotyczące leczenia meta- chromatycznej leukodystrofii przy użyciu membran immobilizacyjnych [14]. Ta neurodegeneracyjna cho- roba wywołana jest niskim poziomem arylosulfatazy A w organizmie. Zmodyfikowana genetycznie linia komór- kowa mysich mioblastów C2C12 stała się zdolna do pro- dukcji artylosulfatazy A. Komórki zamykano w kapila- rach z poliaryloeterosulfonu. Wykazano, że badania linia Rys. 2. Wybrane choroby wywołane niezdolnością organizmu do produkuje pożądany enzym, jednocześnie­ przeżywając produkcji odpowiedniej ilości cząstek biologicznych nawet 4 tygodnie po implantacji do allogenicznej myszy. Inny eksperyment dotyczył leczenia cukrzycy za wykorzystującym unieruchomione komórki jest dostar- pomocą kapsułkowanych komórek [44]. Nośniki wyko- czanie leków. Medycyna ciągle poszukuje skutecznej nane zostały z polimeru akrylowego i posłużyły do metody ukierunkowanego podawania terapeutyków. transplantacji szczurzych wysepek trzustkowych my- Implanty wszczepiane w pobliżu chorobowo zmienio- szom chorych na tę chorobę. Matryca okazała się bio- nego miejsca umożliwiałyby osiąganie lokalnie wyso- kom­patybilna, implant nie był odrzucany i umożliwiał kich stężeń leków i jednocześnie zmniejszałyby wywo- utrzymanie poziomu cukru we krwi w normie nawet ływane przez nie skutki uboczne. przez 60 dni. W terapiach biohybrydowych wykorzystywanych Stworzono także system umożliwiający kontrolo- może być wiele typów związków: enzymy, inhibitory, wane wydzielanie erytropoetyny przez immobilizowany aktywatory, przeciwciała. Uwalnianie cząstek terapeu- materiał biologiczny [71]. Zmodyfikowane fibroblasty tycznych może być konstytutywne bądź stymulowane. wydzielały hormon peptydowy w obecności doksycy- Uwalnianie konstytutywne jest najprostszym syste- kliny bądź mifepristonu. Kapilary implantowane były mem i umożliwia otrzymanie stałych porcji substancji do jamy otrzewnej myszy. U zwierząt, którym poda- z kapsuły do zewnętrznej tkanki. Uwalnianie kontrolo- wano doksycyklinę lub mifepriston obserwowano pod- wane umożliwia odpowiedź komórek znajdujących się wyższone stężenie erytropoetyny w surowicy podczas wewnątrz kapsułek na pewne sygnały z wnętrza orga- 6-miesięcznej obserwacji (podwyższonego poziomu nie nizmu (produkcja cząstek tylko wtedy, kiedy organizm obserwowano u myszy nieotrzymujących antybiotyków). tego wymaga), może też być indukowane podaniem Wykorzystano także genetycznie zmodyfikowane pacjentowi odpowiedniej substancji. Dodatkową kon- mioblasty do produkcji VEGF i FGF-2 (czynniki angio- trolę uwalniania mogą stanowić mechanizmy dyfuzji. genezy) [66]. Komórki zamykano w polimerowych Jeżeli stężenie cząstek terapeutycznych na zewnątrz nośnikach z polieterosulfonu i implantowano szczu- kapsułki będzie wysokie, produkty te nie będą dalej rom. Tylko komórki produkujące FGF-2 okazały się dyfundowały na zewnątrz matrycy. Zaletą terapii bio- skutecznie redukować nekrozę tkanki. Terapia ta może hybrydowych jest to, że immobilizowane, genetycznie być wykorzystywana przy chorobach niedokrwiennych. IMMOBILIZACJA KOMÓREK – ZNACZENIE BIOMEDYCZNE 241

Systemy oparte na komórkach modyfikowanych Zbadano możliwość usuwania mocznika przez do- genetycznie zamkniętych w kapilarach mogą także ustne podawanie mikrokapsułek zawierających gene- dostarczać czynniki neurotropowe [45]. Produkcja tego tycznie zmodyfikowaną E. coli (plazmid pAKU17 zawie- typu cząstek mogłaby skutecznie leczyć choroby neuro­ rający geny ureazy ureaDABCEFG z Klebsiella aerogenes degeneracyjne. Odpowiednio zmodyfikowana gene- został wtransformowany do E. coli DH5) [60]. Doustna tycznie linia komórkowa C2C12 efektywnie wydzielała dawka kapsułek APA zawierających zmodyfikowany rzęskowy czynnik neurotropowy. Wykazano także, że szczep skutkowała spadkiem wysokiego poziomu mocz- żywotność komórek a także efektywność produkcji nika u szczurów chorych na mocznicę. Metoda ta oka- czynnika może zależeć od wykorzystanej do kapsułko- zała się skuteczna podczas 21 dniowej terapii. Szczury wania matrycy. leczone przeżywały okres eksperymentalny, jednocześ­nie Inne badania wskazały na obiecujące wyniki w zakre- 50% nieleczonych szczurów w tym czasie umierało [58]. sie leczenia kapsułkowanymi komórkami choroby Par- W badaniach in vitro zmodyfikowaną E. coli DH5 kinsona [81]. Układy tego typu mogą także znaleźć zamknięto w kapsułkach zbudowanych z poli(alkoholu zastosowanie w leczeniu raka. Obiecujące wyniki w tej winylowego) (PVA – polyvinyl alcohol). PVA charakte- sferze dały badania z dostarczaniem do nowotworowo ryzuje się znacznie wyższą wytrzymałością mechaniczną zmienionych miejsc czynników takich jak cytochrom niż APA. W ten sposób rozwiązany może zostać wcześ­ P-450 i IL-2 a także inhibitorów angiogenezy [12, 39, niej napotkany problem łamliwości kapsułek zbudowa- 65]. Trwają badania nad leczeniem tą metodą stward- nych z APA. Badania in vitro wykazały, że 100 mg kap- nienia zanikowego bocznego [83]. sułkowanej hodowli bakteryjnej może usunąć 18,4 mg Pojawiają się pojedyncze doniesienia o zastosowa- mocznika w 4 godziny [24]. niu terapii immobilizowanymi komórkami u pacjentów. P r a k a s h i C h a n g zbadali rozkład innych niż G u n z b u r g i wsp. przeprowadzili terapię nowotworu mocznik metabolitów przy użyciu mikrokapsułek zawie- trzustki, polegającą na wszczepieniu w miejscu nowo- rających zmodyfikowane komórki E. coli DH5 (bada- tworu, enkapsulowanych komórek L293 modyfikowa- nia in vitro) [59]. Zaobserwowano spadek w osoczu nych genetycznie do produkcji enzymu aktywującego stężenia potasu, magnezu, fosforu, sodu, chloru, chole- czynnik przeciwnowotworowy podawany pacjentom. sterolu, bilirubiny, kreatyniny i kwasu moczowego, co Stwierdzono u 10 pacjentów zatrzymanie wzrostu nowo- może mieć ogromne znaczenie terapeutyczne między tworu w ciągu 20- tygodniowej obserwacji [30]. Jednak innymi przy niewydolności nerek. W eksperymentach unieruchamianie materiału biologicznego nie jest dotąd tych bakterie zamykane były w kapsułkach APA. Wyka- stosowane w klinicznej praktyce, głównie z powodu zano, że kapsułki te nie wpływają w sposób zauważalny ograniczonej żywotności wszczepów [29]. na metabolizm immobilizowanych komórek E. coli. Pro- Jak widać, cały czas prowadzone są prace nad zasto- fil białkowy komórek kapsułkowanych w APA nie różnił sowaniem immobilizowanego materiału komórkowego się znacząco od profilu białkowego komórek będących dla celów terapeutycznych, uwieńczone pojedynczymi w stanie wolnym [57]. zastosowaniami klinicznymi, pomimo konkurencyjnych G a r o f a l o i C h a n g w swoich badaniach wyka- dla tych metod badań prowadzonych nad możliwością zali, że Pseudomonas pictorum jest w stanie usuwać generowania zastępczych narządów z własnych komórek nadmiar cholesterolu z surowicy. Drobnoustrój ten macierzystych pacjentów. immobilizowany był w kapsułkach alginianowych, poli- lizynowo-alginianowych, a także kapsułkach agarowych. 4.5.2. Wykorzystanie unieruchomionych Tylko w przypadku kapsułek agarowych zaobserwowano drobnoustrojów spadek poziomu cholesterolu porównywalny z tym, który uzyskiwano dla komórek w stanie wolnym. Jednocześnie, G r a n i c k a i wsp., przeprowadzili badania doty- nie obserwowano wydostawania się komórek z nośnika. czące uwalniania zielonego białka fluoryzującego (GFP Pory w mikrokapsułkach alginianowych i alginianowo- – green fluorescent protein) przez makrokapsułko- -polilizynowych były zbyt małe, i stanowiły barierę dla wane w polipropylenowych membranach kapilarnych przepływu lipoprotein [26]. Dalsze badania z użyciem komórki E. coli. Wydzielane białko miało posłużyć matryc agarowych wykazały, że znacznie skuteczniejsze jako model substancji terapeutycznej. Membrany kapi- w usuwaniu cholesterolu są mikrokapsułki o średnicy larne implantowano myszom. Wykazano, że użyta 0,5 mm – 1,6 mm niż te o średnicy powyżej 2,5 mm [25]. matryca jest szczelna względem immobilizowanego B o r k o w s k a i wsp. zastosowali enkapsulowane szczepu, a produkowane GFP jest w stanie przekraczać w modyfikowanych powłokach polilizynowo-poliety- barierę, jaką jest membrana [28]. Naturalnie, w lite- lenoiminowych bakterie B. subtilis, szczepy zrekombi- raturze nie brak przykładów bardziej bezpośrednio nowane wydzielające toksyny, wykazując cytotoksyczny demonstrujących przydatność immobilizowanych drob- wpływ na komórki białaczkowe pacjentów z ostrą bia- noustrojów in vivo. łaczką limfatyczną [8]. 242 ZOFIA BAKUŁA, RADOSŁAW STACHOWIAK, JAROSŁAW WIŚNIEWSKI, LUDOMIRA GRANICKA, JACEK BIELECKI

L l o y d - G e o r g e i C h a n g umieścili w kapsu- Wykazano, że immobilizowane w ten sposób bakterie łach komórki Erwinia herbicola wykazujące aktywność przeżywają w warunkach zbliżonych do tych, panują- fenolo-liazy tyrozynowej (TPL – tyrosine phenol-lyase). cych w żołądku i jelicie, a także zachowują w nich swoją Podczas trwania eksperymentu badano reakcję enzy- aktywność (badania in vitro). Matryca hydrożelowa matyczną amoniaku i pirogronianiu wraz z fenolem czy jest rozpuszczalna w 37°C, w zasadowym pH (warunki katecholem odpowiednio w L-tyrozynę bądź L-3,4-di- panujące w jelicie cienkim), uwalniając bakterie do śro- hydroksyfenyloalaninę (badania in vitro). Wykorzystany dowiska. Metoda ta, może być bardzo efektywna przy szczep kapsułkowany był w matrycy APA. Nie wykazano dostarczaniu różnego rodzaju probiotyków takich jak różnic w aktywności TPL między szczepem kapsułko- Lactobacillus czy Bifidobacterium, a także wykorzysty- wanym a szczepem w stanie wolnym. Aktywność TPL wana do dostarczania różnego rodzaju związków aktyw- mikrokapsułkowanych komórek E. herbicola mogłaby nych do jelita [23]. znaleźć zastosowanie w usuwaniu amoniaku czy fenolu Enkapsulacja materiału biologicznego może także przy niewydolności wątroby [47]. zostać wykorzystana w terapii fagowej. Bakteriofag Doustne dostarczanie kapsułkowanych bakterii może Felix O1 okazał się bardzo skuteczny w walce z zakaże- także stać się skuteczną metodą w leczeniu kamieni niami Salmonella [79]. Jednak, aby fag podawany doust- nerkowych. Oxalobacter formigenes produkuje enzymy nie okazał się skuteczny w leczeniu patogenów jelito- degradujące szczawiany, niszcząc ich nadmiar, główny wych, musi przetrwać nieprzyjazne warunki panujące czynnik ryzyka powstawania i wzrostu kamieni nerko- w układzie pokarmowym zwierząt czy człowieka (a bez wych u pacjentów z kamicą nerkową [21]. ochrony nie jest w stanie tego zrobić) [38]. Niezbędne Terapia oparta na kapsułkowanych drobnoustro- więc okazuje się jego kapsułkowanie. Badania wykazały, jach wpływających na stężenia aminokwasów w osoczu że Felix O1 immobilizowany w mikrokapsułkach chi- mogłaby okazać się skuteczna np. przy leczeniu feny- tozanowo-alginianowych jest odzyskiwany przy dłu- loketonurii [47]. Bakterie mogłyby także wpływać na gotrwałej ekspozycji na stymulowane warunki układu poziom wodoru i azotu cząsteczkowego we krwi. Żywe pokarmowego (liczba cząstek fagowych po godzinnej komórki dostarczane doustnie metabolizujące wodór ekspozycji na pH 2,4 spadła o 2,58 jednostki logaryt- czy azot do związków takich jak metan czy woda zapo- miczne (fag w stanie wolnym nie był wykrywalny już biegałyby chorobie dekompresyjnej bądź zmniejszały po 5 minutach ekspozycji na pH poniżej 3,7). Kapsułki czas dekompresji. Bakterie mające potencjalne zastoso- rozpuszczały się po 6 godzinach w pH 6,8. wanie w tej terapii to metabolizujący wodór Methano- Podobne badania przeprowadził S t a n f o r d i wsp. brevibacter smithii czy azot – bakterie z rodziny Entero- Autorzy wykorzystali cztery fagi: wV8, rV5, wV7 i wV11 bacteriaceae [42]. (bakteriofagi E. coli O157:H7 – enterohemolityczny Mikrokapsułkowane drobnoustroje mogłyby także szczep wywołujący choroby układu pokarmowego radzić sobie z chorobami jelita związanymi z podnie- i moczowego) zamknięte w polimerowych kapsułkach. sionym poziomem kwasów żółciowych. Lactobacillus Po 20 minutowej ekspozycji na pH 3,0 odzyskiwano reuterii jest zdolny do wiązania kwasów żółciowych 13,6% cząstek fagowych (po uwolnieniu w pH 7,2). Dla i mógłby łagodzić problem związany z nadmiernym porównania, w tych warunkach fagi niekapsułkowane wydzielaniem elektrolitów, towarzyszącej mu biegunce całkowicie traciły swoją aktywność [72]. i odwodnieniu [40]. Poza kapsułkowaniem szczepów zdolnych do wy- dzielania substancji mogących wypełniać defekty enzy- 5. Podsumowanie matyczne czy cząstek, których organizm produkować nie może, kolejnym zastosowaniem jest kapsułkowanie Pierwsze badania z wykorzystaniem enkapsulowa- probiotyków. Żywe komórki, jako uzupełnienie diety nych komórek eukariotycznych pochodzą z lat 30-tych pozytywnie mogą wpłynąć na bakteryjną florę jelitową. XX wieku. Od tego czasu wprowadzono wiele technik Analizy jedzenia wzbogacanego w probiotyki oraz nie- immobilizacji, a najprostszy podział wyróżnia pułapko- których preparatów farmaceutycznych wykazały, że wanie, kapsułkowanie i nanoopłaszczanie. Bardzo ważne podawane w ten sposób szczepy mają niską przeżywal- jest odpowiednie dobranie materiału, z którego kap- ność i zdolność do zasiedlania jelita [48]. Bakterie muszą sułki będą wykonane, a optymalizacja systemu dotyczy przejść takie biologiczne bariery jak kwaśne środowi- struktury, biozgodności, wytrzymałości i właści­wości sko żołądka, czy żółć w jelicie. Jak wykazano, probiotyki chemicznych. Unieruchomione, immunoizolowane obniżają poziom cholesterolu, wzmagają tolerancję lak- komórki, wydzielające czynniki terapeutyczne, wszcze- tozy, a także mogą zapobiegać nowotworom, biegunkom pione do organizmu, pozwalają na regulację lub mody- i modulują aktywność układu odpornościowego. Enkap- fikację procesów biologicznych, a tym samym leczenie sulacja bakterii w alginianie wapnia jest często używana różnych zaburzeń. Nośniki stosowane są z powodze- do immobilizacji szczepów ze względu na nietoksycz- niem do immunoizolacji komórek eukariotycznych, ność nośnika, łatwość metody oraz jej niski koszt. jednak kapsułkowanie drobnoustrojów do zastosowań IMMOBILIZACJA KOMÓREK – ZNACZENIE BIOMEDYCZNE 243 biomedycznych budzi ciągle wątpliwości przez wzgląd 10. Cheung S., Tai J., Tze W.: Effect of molecular weight of polysul- na bezpieczeństwo. fone fibres on macroencapsulated pigislet xenograft function W przyszłości unieruchamianie materiału biologicz- in diabetic mice. Cell Transplant. 29, 2144–2145 (1997) 11. Chick W.L.: Beta cell culture on synthetic capillaries: an artifi- nego prawdopodobnie zajmie ważne miejsce w medy- cial endocrine pancreas. Science, 187, 847–848 (1975) cynie. Wiele aspektów tej metody wymaga jeszcze 12. Citrone P., Bourgeois M., Chang P.L.: Antiangiogenic cancer opracowania. Przedmiotem badań są w dalszym ciągu: therapy with microencapsulated cells. Hum. Gene Ther. 14, zastosowanie allogenicznych i ksenogenicznych ko- 1065–1077 (2003) mórek, ich przeżywalność, immunoprotekcja, biokom- 13. Colton C.K.: Engineering challenges in cell encapsulation tech- patybilność nośników, długoterminowa skuteczność nology. Trends Biotechnol. 14, 158–162 (1996) 14. Consiglio A., Bordignon C. i wsp.: Metabolic correction in układów, ściśle kontrolowane wydzielanie cząstek tera- oligodendrocytes derived from metachromatic leukodystrophy peutycznych, kontrola proliferacji (przepełnienie kap- mouse model by using encapsulated recombinant myoblasts. sułek komórkami może obniżać żywotność immobili- J. Neurol. Sci. 255, 7–16 (2007) zowanych komórek) i wytrzymałość układów. Gdy już 15. Cruise G.M., Hegre O.D., Lamberti F.V., Hager S.R., Hill R., powyższe kwestie zostaną dokładnie zbadane, można Scharp D.S., Hubbell J.A.: In vitro and in vivo performance of będzie oczekiwać bardziej powszechnych zastosowań porcine islets encapsulated in interfacially photopolymerized poly(ethylene glycol) diacrylate membranes. Cell Transplant. 8, klinicznych układów z immobilizowanym materiałem 293–306 (1999) biologicznym. 16. David B., Dufresne M., Nagel M.D., Legallais C.: In vitro assess- ment of encapsulated C3A hepatocytes functions in a fluidized * * * bed bioreactor. Biotechnol. Prog. 20, 1204–1212 (2004) 17. Dembczyński R., Jankowski T.: Unieruchamianie komórek Badania nad immobilizacją i jej zastosowaniami bio- drobnoustrojów metodą kapsułkowania – stan obecny i możli­ wości rozwoju tej metody. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, medycznymi prowadzone przez autorów były dofinan- 41, 5–17 (2004) sowane przez MNiSW grant nr: N N401 015936 oraz 18. Diaspro A., Silvano D., Cavalleri O., Gliozzi A.: Single Living NCN grant nr N N401 592840. Cell Encapsulation in Nano-organized Polyelectrolyte Shells. Pracę dedykujemy pamięci Jarosława Wiśniew- Lanmuir. 18, 5047–5050 (2002) skiego, który zapoczątkował badania nad immobilizacją 19. Ding W.K., Shah N.P.: An improved method of microencapsu- w Zakładzie Mikrobiologii Stosowanej UW. lation of probiotic bacteria for their stability in acidic and bile conditions during storage. J. Food Sci. 74, 53–61 (2009) 20. Dulong J.L., Legallis C.: Contribution of a finite element model for the geometric optimization of an implantable bioartificial Piśmiennictwo pancreas. J. Biomed. Mater. Res. 52, 183–192 (2000) 21. Duncan S.H., Richardson A.J., Kaul P., Holmes R.P., Allison M.J., 1. Aebischer P., Goddard M., Signore A., Timpson R.: Functional Stewart C.S.: Oxalobacter formigenes and its potential role in recovery in hemiparkinsonian primates transplanted with poly- human health. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3841–3847 (2002) mer-encapsulated PC12 cells. Experiment. Neurol. 126, 151–158 22. Endres, M., Wenda N., Woehlecke H., Neumann K., Ringe J., (1994) Erggelet C., Lerche D., Kaps C.: Microencapsulation and chon- 2. Arshady R.: Microcapsules for foods. J. Microencapsul. 10, drogenic differentiation of human mesenchymal progenitor 413–435 (1993) cells from subchondral bone marrow in Ca-alginate for cell 3. Babensee, J.E., Anderson, J.M., McIntire, L.V Mikos, A.G.: Host injection. Acta Biomater. 6, 436–444 (2010) response to tissue engineered device. Adv. Drug. Deliv. Rev. 33, 23. Favaro-Trindade C.S., Grosso C.R.: Microencapsulation of 111–139 (1998) L. acidophilus (La-05) and B. lactis (Bb-12) and evaluation 4. Bisceglie V.: Uber die antineoplastische immunitat; heterologe of their survival at the pH values of the stomach and in bile. Einpflnzung von Tumoren in Huhner-embryonen. Zeit. Krebs­ J. Microencapsul. 19, 485–494 (2002) forsch. 40, 122–140 (1933) 24. Gao H., Yu Y., Cai B., Wang M.: Preparation and properties of 5. Blasi P., Giovagnoli S., Schoubeen A., Ricci M., Rossi C., microencapsulated genetically engineered bacteria cells for oral Luca G., Basta G., Calafiore R.: Preparation and in vitro and therapy of uremia. Chin. Sci. Bull. 49, 1117–1121 (2004) in vivo characterization of composite microcapsules for cell 25. Garofalo F.A., Chang T.M.: Effects of mass transfer and reac- encapsulation. Int. J. Pharm. 324, 27–36 (2006) tion kinetics on serum cholesterol depletion rates of free and 6. Bonin S.: Mikroorganizmy immobilizowane. Agro Przemysł, 6, immobilized Pseudomonas pictorum. Appl. Biochem. Biotechnol. 20–23 (2008) 27, 75–91 (1990) 7. Boninsegna S., Bosetti P., Carturan G., Dellagiacoma G., Dal- 26. Garofalo F.A., Chang T.M.: Immobilization of P. pictorum in Monte R., Rossi M.: Encapsulation of individual pancreatic open pore agar, alginate and polylysine-alginate microcapsules islets by sol-gel SiO2: a novel procedure for perspective cellular for serum cholesterol depletion. Biomater. Artif. Cells Artif. grafts. J. Biotechnol. 100, 277–286 (2003) Organs, 17, 271–89 (1989) 8. Borkowska M., Łyżniak M., Grzeczkowicz A., Stachowiak R., 27. Goguen B., Kedersha N.: Clonogenic cytotoxicity testing by Kawiak J., Bielecki J., Budziszewska B., Granicka L.: The Cyto- microdrop encapsulation. Nature, 363, 189–190 (1993) toxic effect of polyelectrolyte shells coated bacterial cells on 28. Granicka L.H., Żołnierowicz J., Wasilewska D., Weryński A., human leukemia cells. Nanomed. Nanotech. (2012), http://www. Kawiak J.: Induced Death of Escherichia coli encapsulated omicsonline.org/2157-7439/2157-7439-3-152.pdf in a hollow fiber membrane as observed in vitro or after sub- 9. Chang T.M.S.: Semipermeable microcapsules. Science, 146, cutaneous implantation. J. Microbiol. Biotechnol. 20, 224–228 524–525 (1964) (2010) 244 ZOFIA BAKUŁA, RADOSŁAW STACHOWIAK, JAROSŁAW WIŚNIEWSKI, LUDOMIRA GRANICKA, JACEK BIELECKI

29. Groot M., T.A. Schuurs, R. van Schilfgaarde: Causes of limited method for encapsulation of living cells: preliminary results survival of microencapsulated pancreatic islet grafts. J. Surg. with PC12 cell line. J. Microencaps. 18, 323–334 (2001) Res. 121, 141–150, (2004) 50. Moslemy P., Neufeld R.J., Guiot S.R.: Biodegradation of gasoline 30. Gunzburg W.H, Salmons B: Use of cell therapy as a means of by gellan gum-encapsulated bacterial cells. Biotech. Bioeng. 80, targeting chemotherapy to inoperable pancreatic cancer. Acta 175–184 (2002) Biochim. Polon. 52, 601–607 (2005) 51. Naganawa Y., Ohsugi K., Kase R., Date I., Sakuraba H., Sakur- 31. Hai-Ying G., Zhong C., Rong-Xiao S., Su-Su Y., Hong-Yuan C., agawa N.: In vitro study of encapsulation therapy for Fabry Yi-Tao D., Ai-Min Y.: The immobilization of hepatocytes on disease using genetically engineered CHO cell line. Cell Trans- 24 nm-sized gold colloid for enhanced hepatocytes prolifera- plant. 11, 325–9 (2002) tion. Biomaterials, 25, 3445–3451 (2004) 52. O’Shea G. M., Goosen M.F.A., Sun A.M.: Prolonged survival 32. Hasse, C., Klöck G., Schlosser A., Zimmermann U., Roth- of transplanted islets of langerhans encapsulated in a bio- mund M.: Parathyroid allotransplantation without immuno- compatible membrane. Biochim. Biophys. Acta, 804, 133–135 suppression. Lancet, 350, 1296–1297 (1997) (1984) 33. Hortelano G., AI-Hendy A., Frederick A., Chang P.L.: Deliv- 53. Orive G., Hernandez R.M., Gascon A., Pedraz J.L.: Biomedical ery of human factor IX in mice by encapsulated recombinant application of immobilized cells. Methods Biotech. 22, 427–437 myoblasts: a novel approach towards allogeneic gene therapy (2006) of hemophilia B. Blood, 87, 5095–5103 (1996) 54. Ouyang W, Chen H., Jones M.L., T. Haque, Martoni C., 34. Hunkeler D., Prokop A., Powers A., Haralson M., Di Mari Afkhami F., Prakash S.: Novel multi-layer APPPA microcap- S., Wang T.A.: Screening of polymers as biomaterials for cell sules for oral delivery: preparation condition, stability and encapsulation. Polymers News, 22, 232–240 (1997) permeability. Indian J. Biochem Biophys. 46, 491–497 (2009) 35. Hunkeler D.: Polymers for bioartificial organs. Trends Polymers 55. Posillico E. G.: Microencapsulation technology for large-scale Sci. 5, 286–293 (1997) antibody production. Biotechnol. 4, 114–117 (1986) 36. Imai M., Kawabata N., Kato K., Kawahara T., Nakazawa F., 56. Pothakamury U.R., Barbosa-Cánovas G.V.: Fundamental Sawa M., Kasai S., Mito M.: Successful xenograft in strepto- aspects of controlled release in foods. Trends Food Sci. Tech. 6, zotocin induced diabetic rat using dispersed hamster islet tis- 397–406 (1995) sue within microporous polypropylene bag. Cell Transplant. 5, 57. Prakash S., Chang T.M.S.: Growth kinetics of genetically engi- 51–65 (1996) neered E. coli DH 5 cells in artificial cell APA membrane micro- 37. Jasiński A., Słomski R., Szalata M., Lipiński D.: Transplantacja capsules: preliminary report. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. narządów – wyzwanie dla biotechnologii. Biotechnologia, 72, Biotechnol. 27, 291–301 (1999) 7–28 (2006) 58. Prakash S., Chang T.M.S.: Microencapsulated genetically engi- 38. Joerger R.D.: Alternatives to antibiotics: bacteriocins, antimi- neered live E. coli DH5 cells administered orally to maintain crobial peptides and bacteriophages. Poult. Sci. 82, 640–647 normal plasma urea level in uremic rats. Nat. Med. 2, 883–887 (2003) (1996) 39. Joki T., Machluf M., Atala A., Zhu J., Seyfried N.T., Dunn I.F., 59. Prakash S., Chang, T.M.S.: Artificial cell microcapsules con- Abe T., Carroll R.S., Black P.: Continuous release of endostatin taining genetically engineered E. coli DH5 cells for in-vitro low- from microencapsulated engineered cells for tumor therapy. ering of plasma potassium, phosphate, magnesium, sodium, Nat. Biotech. 19, 35–39 (2001) chloride, uric acid, cholesterol, and creatinine: a preliminary 40. Jones M.L., Chen H., Ouyang W., Metz T., Prakash S.: Micro- report. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 27, 475– encapsulated genetically engineered Lactobacillus plantarum 481 (1999) 80 (pCBH1) for bile acid deconjugation and its implication in 60. Prakash S., Chang, T.M.S.: Preparation and in-vitro analysis of lowering cholesterol. J. Biomed. Biotechnol. 27, 61–69 (2004) genetically engineered E. coli DH5 cells, microencapsulated in 41. Karger-Kocsis J.: Polypropylene, structure and morphology, artificial cells for urea and ammonia removal. Biotech. Bioeng. str. 1–30, Chapman and Hall, Londyn 1995 46, 621–626 (1995) 42. Kayar S.R., Axley M.J.: Accelerated gas removal from divers 61. Prakash S., Jones M.L.: Artificial Cell Therapy: New Strategies tissues utilizing gas metabolizing bacteria. US Patent 5 922 317 for the Therapeutic Delivery of Live Bacteria.J. Biomed. Bio- (1997) technol. 1, 44–56 (2005) 43. Lacy P.E., Hegre O.D, Gerasimidi-Vazeou A., Gentile F.T, 62. Prakash S., Urbanska A.M.: Colon-targeted delivery of live Dionne K.E.: Maintenance of normoglycemia in diabetic bacterial cell biotherapeutics including microencapsulated live Lysaght mice by subcutaneous xenografts of encapsulated islets. bacterial cells. Biologics Targ. Ther. 2, 355–378 (2008) Science, 254, 1782–1784 (1991) 63. Pueyo M.E., Darquy S., Arbet-Engels C., Poitout V., Di Maria S., 44. Lanza R.P., Jackson R., Sullivan A., Ringeling J., McGrath C., Gangnerau M.N., Reach G.: A method for obtaining mono­ Kuhtreiber W., Chick W.L.: Xenotransplantation of cells using dispersed cells from isolated porcine islets of Langerhans. Int. biodegradable microcapsules. Transplant. 67, 1105–1111 (1999) J. Artif. Org. 18, 34–38 (1995) 45. Li R.H., Williams S., Burkstrand M., Roos E.: Encapsulation 64. Rabanel J.M., Banquy X., Zouaoui H., Mokhtar M.: Progress matrices for neutrophic factor-secreting myoblast cells. Tissue Technology in Microencapsulation Methods for Cell Therapy. Eng. 6, 151–163 (2000) Biotechnol. Prog. 25, 946–963 (2009) 46. Lim F., Sun A.M.: Microencapsulated islets as bioartificial 65. Read T.A., Sorensen D.R., Mahesparan R., Enger P.R., Timpl R., endocrine pancreas. Science, 210, 908–909 (1980) Olsen B.R., Hjelstuen H.B., Haraldseth O., Bjerkvig R.: Local 47. Lloyd-George I., Chang T.M.: Free and microencapsulated endostatin treatment of gliomas administered bymicroencap- Erwinia herbicola for the production of tyrosine. Biomater. sulated producer cells. Nat. Biotech. 19, 29–34 (2001) Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 21, 323–333 (1993) 66. Rinsch, C., Quinodoz P., Pittet B., Alizadeh N., Baetens D., 48. Matsuzaki T., Chin J.: Modulating immune responses with pro- Montandon D., Aebischer P., Pepper M.S.: Delivery of FGF-2 biotic bacteria. Immunol. Cell Biol. 78, 67–73 (2000) but not VEGF by encapsulated genetically engineered myo- 49. Mercier P., Fernandez F., Tortosa F., Bagheri H., Duplan H., blasts improves survival and vascularization in a model of acute Tafani M., Bes J.C., Bastide R., Lazorthes Y., Sallerin B.: A new skin flap ischemia.Gene Ther. 8, 523–533 (2001) IMMOBILIZACJA KOMÓREK – ZNACZENIE BIOMEDYCZNE 245

67. Rogers F.B., Li S.C.: Acute colonic necrosis associated with 76. Vancha A.R., Govindaraju S., Parsa K., Jasti M., González- sodium polystyrene sulfonate (Kayexalate) enemas in a critically García M., Ballestero R.: Use of polyethyleneimine polymer in ill patient: case report and review of the literature. J. Trauma. 51, cell culture as attachment factor and lipofection enhancer. BMC 395–397 (2001) Biotechnol. 4, 23 (2004) 68. Ross G.R., Gullis C., Gonzalez N.S.: Microencapsulation 77. Wang T.G., Cell encapsulation technology and therapeutics (w) of probiotic strains for swine feeding. Biol. Pharm. Bull. 31, Birkhäuser, red. W. M. Kühtreiber, R.P. Lanza, W.L. Chick., Bos- 2121–2125 (2008) ton, 1999, s. 29–30. 69. Schrezenmeir, J., Kirchgessner J.: Effect of microencapsulation 78. Ward R.S., White K.A., Wolcott C.A., Wang A.Y., Kuhn R.W., on oxygen distribution in islet organs. Transplant. 57, 1308– Taylor J.E., John J.K.: Development of a hybrid artificial pan- 1314 (1994) creas with a dense polyurethane membrane. ASAIO J. 39, 70. Sefton M.V., May M.H., Lahooti S., Babensee J.E.: Making 261–267 (1993) microencapsulation work: conformal coating, immobilization 79. Whichard J.M., Sriranganathan N., Pierson F.W.: Suppression gels and in vivo performance. J. Contr. Release, 65, 173–186. of Salmonella growth by wild-type and large-plaque variants of (2000) bacteriophage Felix O1 in liquid culture and on chicken frank- 71. Serguera C., Bohl, D., Rolland E., Prevost P., Heard J.M.: Con- furters. J. Food Prot. 66, 220–225 (2003) trol of erythropoietin secretion by doxycyline of mifepristone 80. Yang M.B., Vacanti J.P, Ingber D.E.: Hollow fibers for hepato- in mice bearing polymer encapsulated engineered cells. Hum. cyte encapsulation and transplantation: studies of survival and Gene Ther. 10, 375–383 (1999) function in rats. Cell Transplant. 3, 373–385 (1994) 72. Stanford K., McAllister M.A., Niu Y.D., Stephens T.P., Maz- 81. Yasuhara T., Date I.: Intracerebral transplantation of genetically zocco A, Waddell T.E., Johnson R.P.: Oral Delivery Systems engineered cells for Parkinson’s disease: toward clinical applica- for Encapsulated Bacteriophages Targeted at Escherichia coli tion. Cell Transplant. 16, 125–132 (2007) O157:H7 in Feedlot Cattle. J. Food Prot. 73, 1304–12 (2010) 82. Zondervan G.J., Hoppen H.J, Pennings A.J., Fritschy W., 73. Takebe K., Shimura T., Munkhbat B., Hagihara M., Nakani- Wolters G.: Design of a polyurethane membrane for the encap- shi H., Tsuji K.: Xenogeneic (pig to rat) fetal liver fragment sulation of islets of Langerhans. Biomaterials, 13, 136–144 transplantation using macrocapsules for immunosolation. Cell (1992) Transplant. 5, 31–33 (1996) 83. Zurn A.D., Henry H., Schelup M., Aubert V., Winkel L., 74. Tuszyński T. Immobilizacja droboustrojów. Możliwości ich Eilers B., Bauchmann C., Aebischer P.: Evaluation of an intra­ przemysłowego wykorzystania. Laboratorium, 10, 34–39 (2008) thecal immune response in amyotrophic lateral sclerosis 75. Uludag H., de Vos P., Tresco P.A.: Technology of mammalian patients implanted with encapsulated genetically engineered cell encapsulation, Adv. Drug Deliv. 42, 29–64 (2000) xenogenic cells. Cell Transplant. 9, 471–484 (2000)

POST. MIKROBIOL., CHOROBA NIEDOKRWIENNA SERCA 2013, 52, 3, 247–260 http://www.pm.microbiology.pl A ZAKAŻENIA BAKTERYJNE HELICOBACTER PYLORI I CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE – ROLA BIAŁEK SZOKU CIEPLNEGO I ZJAWISKO MIMIKRY ANTYGENOWEJ

Agnieszka Matusiak1*, Magdalena Chmiela1

1 Pracownia Gastroimmunologii, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki, 90-237 Łódź, ul. Banacha 12/16

Wpłynęło w lutym 2013 r.

Spis treści: 1. Patogeneza choroby niedokrwiennej serca. 2. Choroba niedokrwienna serca jako proces zapalny. 3. Markery reakcji zapalnej w chorobie niedokrwiennej serca. 4. Czynniki bakteryjne a choroba niedokrwienna serca. 5. Podłoże autoimmunizacyjne choroby niedokrwiennej serca. 6. Białka szoku cieplnego (Hsp) – bodźce i tarcze w procesach z autoimmunizacji w chorobie niedokrwiennej serca. 7. Prozapalne działanie białek Hsp w chorobie niedokrwiennej serca. 8. Hipoteza cytotoksycznego działania przeciwciał przeciwko bakteryjnym białkom szoku cieplnego o masie cząsteczkowej 60 i 65 kDa w chorobie niedokrwiennej serca. 9. Podsumowanie Coronary heart disease versus Helicobacter pylori and Chlamydophila pneumoniae bacterial infections – the role of heat shock proteins and the phenomenon of antigenic mimicry Abstract: The end of the previous century brought new findings concerning the role of inflammation and the infectious agents in the development of atherosclerosis. However, it is still not clear whether and how the infectious agents participate in the formation and the development of the atherosclerotic plaque. This article discusses the findings which to confirm the hypothesis that the bacterial Hsp proteins are factors promoting the autoimmune reactions and pathological processes leading to coronary heart disease. The involvement of bacterial Hsp proteins in the atherosclerotic processes is probably based on the upregulation of anti-Hsp60 autoantibodies produced in response to infection with a pathogen which produces Hsp60. Since the Hsp proteins are very conservative, the antibodies produced in response to bacterial Hsp60 may react with the human analogue Hsp60 exposed on the surface of endothelium. The complexes of autoantibodies and human Hsp60 proteins may induce the complement dependent cytotoxicity and promote inflammatory damage of the vessels. Contents: 1. Pathogenesis of coronary heart disease. 2. Coronary heart disease as an inflammatory process. 3. Markers of inflammation in coronary heart disease. 4. Bacterial factors and coronary heart disease. 5. Autoimmune background of coronary heart disease. 6. Heat shock proteins (Hsp) – the stimuli and the targets of autoimmune processes in coronary heart disease 7. Proinflammatory action of Hsp proteins in coronary heart disease. 8. The hypothesis of the cytotoxic effect of antibodies against bacterial Hsp60 and Hsp65 proteins in coronary heart disease. 9. Summary

Słowa kluczowe: białka szoku cieplnego (Hsp), Chlamydophila pneumoniae, choroba niedokrwienna serca, Helicobacter pylori Key words: Chlamydophila pneumoniae, coronary heart disease, heat shock protein (Hsp), Helicobacter pylori

1. Patogeneza choroby niedokrwiennej serca usposabiające: otyłość, brak aktywności fizycznej, cho- roba wieńcowa w wywiadzie rodzinnym, płeć, czyn- Choroba niedokrwienna serca (ChNS) stanowi ze- niki socjoekonomiczne, etniczne i behawioralne. Płeć spół dolegliwości będących następstwem przewlekłego może stanowić czynnik ryzyka w grupie osób zdro- stanu niedotlenienia i niedożywienia komórek mięśnia wych, szczególnie w związku z wiekiem. Przyjmuje się, sercowego. ChNS objawia się uciskiem, pieczeniem, że zachorowania na choroby wieńcowe mogą wystąpić uczuciem ciężaru, dyskomfortu oraz dławienia w klatce w znacznie młodszym wieku u mężczyzn niż u kobiet. piersiowej [59, 69]. W grupie ryzyka obciążonej dodatnim wywiadem Ze względu na rolę danego czynnika w patogenezie rodzinnym ryzyko wystąpienia wyżej wymienionych choroby wieńcowej wyodrębnia się następujące czynniki zmian dotyczy mężczyzn poniżej 45 roku życia i kobiet przyczynowe: palenie papierosów, nadciśnienie tętnicze, poniżej 55 [74, 79]. podwyższone stężenie cholesterolu całkowitego i frak- cji lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL – low density lipoprotein), a obniżone stężenie frakcji lipoproteiny 2. Choroba niedokrwienna serca jako proces zapalny o wysokiej gęstości (HDL – high density lipoprotein) oraz cukrzyca; warunkowe: podwyższone stężenie Na przełomie XX i XXI wieku badania prowadzone trójglicerydów, nieprawidłowe stężenie lipoprotein, nad chorobą niedokrwienną serca wkroczyły w nową fazę. homocysteiny i czynników krzepnięcia, oraz czynniki Zwrócono uwagę na rolę procesu zapalnego w rozwoju

* Autor korespondencyjny: Pracownia Gastroimmunologii, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, 90-237 Łódź, ul. Banacha 12/16; tel. 42 635 45 25; e-mail: [email protected] 248 AGNIESZKA MATUSIAK, MAGDALENA CHMIELA miażdżycy wskazując, iż jedną z głównych jej przyczyn lesterolu tworzą pokrywę lipidową blaszki miażdżycowej jest miejscowa i uogólniona reakcja zapalna z udziałem [54]. Potwierdzeniem, iż zmiany miażdżycowe są zwią- komórek układu odpornościowego [30]. zane z reaktywnością komórek odpornościowych jest Trudno jest jednoznacznie wskazać czynniki inicju- zwiększona ich liczba we wszystkich stadiach rozwoju jące powstawanie ogniska zapalnego i tworzenie blaszki ognisk miażdżycowych. Wykazano, iż główną populacją miażdżycowej. Jednakże wiadomo, że dysfunkcja śród- komórek w świeżo tworzących się zmianach miażdżyco- błonka i wysoki poziom cholesterolu odgrywają zna- wych są limfocyty T, natomiast w ogniskach przetrwa- czącą rolę w procesie zapalnym, który cechuje napływ łych proporcja ta zostaje odwrócona na korzyść makro- makrofagów do przestrzeni śródbłonkowej, wskutek fagów. Gromadzące się w zmianach miażdżycowych zwiększonej migracji monocytów krwi obwodowej [54]. makrofagi inicjują procesy odpornościowe poprzez Monocyty przekształcają się w makrofagi, które roz- prezentację antygenów limfocytom T oraz produkcję poznają i fagocytują utlenione cząsteczki lipoproteiny cytokin i chemokin [40, 73], rys. 1. o niskiej gęstości – oxLDL (oxidise low-density lipopro- teins). Białkowe składniki cząsteczek LDL są przetwa- rzane i prezentowane limfocytom T przez makrofagi, 3. Markery reakcji zapalnej w chorobie jak również przez komórki dendrytyczne w powiązaniu niedokrwiennej serca z cząsteczkami układu zgodności tkankowej – MHC (major histocompatibility complex) klasy II. Aktywo- Na liście wskaźników stanu zapalnego, które korelują wane w środowisku reakcji zapalnej makrofagi i lim- z ryzykiem powstania zmian miażdżycowych znajdują focyty uwalniają chemokiny, które stymulują migrację się m.in.: mieloperoksydaza i metaloproteinazy zmaga- komórek mięśni gładkich z mięśniówki, tworzących zynowane w ziarnistościach neutrofilów i makrofagów. wraz z komórkami piankowatymi włóknistą pokrywę. Mieloperoksydaza przyczynia się do wędrówki leuko- Proces ten ułatwiają interferon gamma – IFN-γ i czyn- cytów oraz akumulacji komórek piankowatych i przez nik martwicy guzów – TNF-α (tumor necrosis factor α), to pośrednio do dysfunkcji śródbłonka, indukując ich wydzielane przez limfocyty pomocnicze Th1 (T helper), apoptozę, co skutkuje pęknięciem blaszki miażdżyco- jak również interleukina 12 (IL-12) produkowana przez wej i jej destabilizacją. Efektem powstających uszko- makrofagi i komórki piankowate. Te ostatnie ulegają dzeń jest uwalnianie czynnika tkankowego oraz akty- apoptozie, a powstałe nierozpuszczalne kryształy cho- wacja kaskady krzepnięcia krwi. Mieloperoksydaza,

Rys. 1. Powstawanie blaszki miażdżycowej w aspekcie procesu zapalnego (LDL – lipoproteina o niskiej gęstości, oxLDL – utlenione cząsteczki LDL, limfocyty Th – limfocyty T pomocnicze, IFN-γ – interferon gamma, TNF-α – czynnik martwicy guzów α, IL-12 – interleukina 12) CHOROBA NIEDOKRWIENNA SERCA A ZAKAŻENIA BAKTERYJNE H. PYLORI I C. PNEUMONIAE 249 zużywając śródbłonkowy tlenek azotu zmniejsza jego metaboliczną, potwierdzoną przez brak zdolności synte- dostępność w śródbłonku oraz hamuje jego czynność tyzowania przez nie ATP. Na własne potrzeby bakterie te rozkurczową i przeciwzapalną. Ponadto bierze udział wykorzystują ATP pochodzące z zakażonych komórek. w oksydacyjnej modyfikacji LDL do form aterogennych, W ich ścianie komórkowej występuje lipopolisacharyd rozpoznawanych przez receptory makrofagów [61]. (LPS), brak jest natomiast peptydoglikanu [38]. For- Istotnymi markerami reakcji zapalnej, aktywowanymi mami zakażającymi komórki gospodarza są, posiadające przez mieloperoksydazę są wydzielane przez makrofagi nukleoid, ciałka elementarne (EB – elementary body), metaloproteinazy, niszczące składniki macierzy zewną- które wewnątrz komórek docelowych przekształcają trzkomórkowej m.in. elastynę i kolagen. Rozkład tych się w metabolicznie aktywne ciałka siateczkowate (RB białek prowadzi do destabilizacji blaszki miażdżycowej. – reticulate body), nie zawierające nukleoidu [7]. Z nie- Metaloproteinazy uczestniczą także w procesie peroksy- jasnych przyczyn ciałka siateczkowate mogą przekształ- dacji lipidów i przyspieszaniu zużycia tlenku azotu [73]. cać się w ciałka przetrwalne (PB – persistent body), Również białko C-reaktywne – CRP (C reactive cechujące się zdolnością długotrwałego pozostawania protein) należące do białek fazy ostrej, którego stęże- w komórce gospodarza. Formy takie najprawdopodob- nie w osoczu rośnie w odpowiedzi na zakażenie lub niej odpowiedzialne są za rozwój zakażeń przewlekłych uszkodzenie tkanek, stanowi ważny marker procesu [7, 38]. Charakterystyczną dla C. pneumoniae cechą jest zapalnego i jest uznawane za wskaźnik wystąpienia zdolność namnażania się w różnego rodzaju komórkach, incydentu wieńcowego powiązanego z uszkodzeniem między innymi w makrofagach lub w komórkach mięśni komórek śródbłonka. Stężenie CRP jest skorelowane gładkich ścian naczyń krwionośnych [2]. z podwyższonym stężeniem IL-6, TNF-α, otyłością C. pneumoniae powoduje zakażenia wyłącznie u ludzi i insulinoopornością, co może wskazywać na związek pod postacią zapalenia płuc, astmy oskrzelowej i prze- pomiędzy przewlekłym zapaleniem a dysfunkcją śród- wlekłej obturacyjnej choroby płuc [7, 38]. błonka naczyniowego [13]. Wykazano, że CRP jest lep- Wśród czynników chorobotwórczości C. pneumo- szym wskaźnikiem wystąpienia incydentu wieńcowego niae wyróżnia się antygeny grupowo swoiste (kom- niż frakcja LDL cholesterolu, gdyż kobiety z wysokim pleks lipopolisacharydowy wspólny dla wszystkich stężeniem CRP i niskim LDL były bardziej narażone na przedstawicieli rodzaju Chlamydophila) oraz antygeny ostrą niewydolność wieńcową w porównaniu z tymi, gatunkowo swoiste (białko błony zewnętrznej – omp1, które charakteryzowały się wysokim stężeniem LDL odgrywające istotną rolę w utrzymaniu integralności a niskim CRP [67]. ściany komórkowej ciałek elementarnych oraz białko szoku cieplnego – cHsp o wysokim stopniu homologii z ludzkim białkiem Hsp60) [27, 65]. 4. Czynniki bakteryjne a choroba niedokrwienna serca S a i k k u, w 1988 roku, jako pierwszy zwrócił uwagę na rolę zakażeń C. pneumoniae w rozwoju choroby nie- Przewlekły stan zapalny towarzyszy również wielu dokrwiennej serca wykazując, że u osób z zawałem chorobom zakaźnym, stąd rozpatruje się wpływ zakażeń mięśnia sercowego aż 65% badanych posiadało prze- wirusem Herpes simplex, a także zakażeń bakteryjnych, ciwciała przeciwko C. pneumoniae [70]. W późniejszych najczęściej Chlamydophila pneumoniae, Helicobacter py- badaniach T h o m i wsp. dowiedli, że podwyższony lori i Mycoplasma pneumoniae na rozwój choroby niedo- poziom takich przeciwciał blisko trzykrotnie zwięk- krwiennej. Reakcja zapalna inicjowana wskutek takich sza prawdopo­dobieństwo wystąpienia choroby niedo- zakażeń jest powiązana z nasileniem ekspresji czynnika krwiennej serca [80]. W badaniach własnych wykazano transkrypcyjnego NF-κB (nuclear factor) [9, 13]. istotnie wyższą częstość zakażeń C. pneumoniae, zwłasz- Różne mechanizmy związane z chorobami zakaźnymi cza zakażeń o charakterze przewlekłym, u pacjentów mogą mieć wpływ na rozwój choroby niedokrwiennej z objawową chorobą wieńcową w porównaniu do osób serca. Niektóre z nich wynikają z obecności czynnika zdrowych [50]. zakaźnego w ścianie naczynia i wiążą się z lokalną reak- Do chwili obecnej nie wiadomo w jaki sposób zaka- cją zapalną oraz nasiloną proliferacją komórek mięśni żenie C. pneumoniae wpływa na powstawanie blaszek gładkich. Częściej jednak procesy patologiczne towa- miażdżycowych. Przypuszcza się, że bakterie mogą rzyszące chorobie wieńcowej są wynikiem przewlekłej rozwijać się w obrębie tych struktur. Przemawia za reakcji zapalnej, reakcji o charakterze autoimmuno- tym sposób przenoszenia zakażenia tymi drobnoustro- logicznym oraz modyfikacji klasycznych czynników jami z człowieka na człowieka drogą kropelkową, ich ryzyka choroby niedokrwiennej serca przez czynniki transport za pośrednictwem makrofagów, jak również zakaźne [9]. potwierdzone występowanie i namnażanie się w śród- Chlamydophila pneumoniae. Gatunek błonku naczyniowym. C. pneumoniae obecne w makro- C. pneumoniae należy do patogenów wewnątrzkomórko- fagach aktywują wytwarzanie metaloproteinaz, które, wych charakteryzujących się ograniczoną aktywnoś­cią jak już zaznaczono, uszkadzają tkankę łączną w obszarze 250 AGNIESZKA MATUSIAK, MAGDALENA CHMIELA blaszki miażdżycowej. Udowodniono także, iż rozwój w blaszkach miażdżycowych, czemu towarzyszyła nasi- C. pneumoniae w śródbłonku nasila procesy zakrzepowe lona ekspresja cząsteczek ICAM-1 (intercellular adhe- [15, 38]. Przewlekłym lub nawracającym infekcjom sion molecule) [1]. C. pneumoniae towarzyszy wzrost stężenia fibrynogenu, W wielu badaniach wykazano, że u osób zakażo- czynnika von Willebranda, cholesterolu LDL i białka nych H. pylori, podobnie jak u pacjentów z chorobą CRP w surowicy krwi [6]. Potwierdzono również, że niedokrwienną serca, występuje podwyższony poziom C. pneumoniae w zakażonych komórkach aktywuje cholesterolu całkowitego i trójglicerydów, przy jed- wytwarzanie wielu cytokin, m.in. TNF-α, IL-1β, IL-6, noczesnym obniżeniu frakcji HDL w surowicy krwi. IL-8 i MCP-1 (macrophage chemotactic protein) [34]. Wskazuje to na możliwy wpływ przewlekłej infekcji na Związek zakażenia C. pneumoniae z chorobą nie- metabolizm lipidów, co jest związane ze zwiększonym dokrwienną serca może mieć podłoże autoimmunolo- ryzykiem choroby wieńcowej [42, 56]. W surowicach giczne, spowodowane reakcjami krzyżowymi pomiędzy osób zakażonych H. pylori występuje podwyższone stę- białkami szoku cieplnego tych bakterii oraz komórek żenie cytokin zapalnych, głównie IL-6, IL-8 i TNF-α, jak gospodarza i skierowanymi przeciwko nim przeciw- również fibrynogenu, inhibitora tkankowego aktywatora ciałami. Zakażenie C. pneumoniae wzbudza zarówno plazminogenu typu 1 oraz czynnika von Willebranda, komórkową, jak i humoralną odpowiedź immunolo- który stanowi czuły wskaźnik jawnej klinicznie miaż- giczną gospodarza. Kluczową rolę w eliminacji zakaże- dżycy i jest czynnikiem prognostycznym wystąpienia nia odgrywa odpowiedź typu komórkowego z udziałem ostrego zespołu wieńcowego [17]. Nasila się także pro- limfocytów T CD8+, które do pełnej aktywacji wyma- dukcja białka C-reaktywnego [85] oraz agregacja płytek gają IFN-γ, wytwarzanego przez limfocyty T pomocni- krwi, co sprzyja tworzeniu mikrozakrzepów. Natomiast cze pobudzone przez antygeny C. pneumoniae [21, 27]. alkalizacja środowiska żołądka związana z zakaże- Gdy odpowiedź komórkowa adaptacyjna swoista niem H. pylori sprzyja wzrostowi stężenia homocyste- zawodzi wówczas zakażenie przybiera postać przewle- iny w surowicy krwi, co z kolei ogranicza wchłanianie kłą i taki jest też charakter towarzyszącej mu reakcji kwasu foliowego i witaminy B12 [17]. zapalnej, która może doprowadzić do rozwoju procesów W nasilaniu procesu zapalnego towarzyszącego patologicznych [78]. miażdżycy nie wyklucza się udziału lipopolisacharydu Helicobacter pylori. Od chwili odkrycia pałeczek H. pylori, który stymuluje wydzielanie przez pałeczek H. pylori przez Wa r r e n a i M a r s h a l l a makrofagi TNF-α, o działaniu hamującym aktyw- w 1982 roku i wykazania ich roli w rozwoju choroby ność lipazy lipoproteinowej. Pociąga to za sobą wzrost wrzodowej żołądka i dwunastnicy powszechnie przyj- poziomu trójglicerydów i obniżenie stężenia choleste- muje się, że choroba ta ma charakter zakaźny i jest rolu frakcji HDL w surowicy. W badaniach, w których wynikiem kolonizacji nabłonka żołądka przez te bak- podawano myszom LPS H. pylori przez 10 dni, utrzymu- terie. Późną konsekwencją takich zakażeń może być jąc warunki przewlekłej infekcji, zaobserwowano nasi- rozwój zmian nowotworowych o charakterze chłoniaka lenie zmian miażdżycowych i znacznie wyższy poziom MALT (mucosa associated lymphoid tissue) lub gru­ przeciwciał przeciwko oxLDL w porównaniu do zwierząt czolakoraka [47]. kontrolnych [58]. Dowiedziono również, że w blaszce Do czynników ryzyka zakażeń H. pylori należy miażdżycowej pod wpływem oxLDL, nasila się ekspre- niski status socjo-ekonomiczny, gęstość zaludnienia, sja receptora TLR4 (toll-like receptor 4) wiążącego LPS złe warunki sanitarne oraz predyspozycje genetyczne. [93]. U n k e l b a c h i wsp. nie wykluczyli, iż polimor- W trakcie rozwoju zakażenia różne czynniki H. pylori, fizm genów kodujących receptory CD14 i TLR4, pośred- między innymi ureaza, toksyna wakuolizująca – VacA niczących w aktywacji komórek odpornościowych przez (vacuolating cytotoxin A), białko CagA związane z cyto- LPS, może determinować rozwój choroby wieńcowej toksyną (cytotoxin associated gene A antigen), inicjują [12, 84]. Z kolei H a j r a i wsp. wykazali nasilenie ostrą reakcję zapalną, która z czasem przybiera charak- aktywacji NF-κB oraz ekspresji E-selektyny i VCAM-1 ter przewlekły. Najważniejszym czynnikiem chorobo- (vascular cell adhesion molecule) w komórkach śród- twórczości pałeczek H. pylori jest ureaza, która neutra­ błonka naczyń myszy transgenicznych pozbawionych lizuje kwaśny odczyn soku żołądkowego, stwarzając receptora dla LDL, stymulowanych lipopolisacharydem tym bakteriom warunki do wzrostu. Ureaza jest także [20]. Przewlekłe zakażenie H. pylori sprzyja tworzeniu ważnym czynnikiem prozapalnym [45]. się kompleksów LPS-LDL, ze współudziałem białka Po raz pierwszy na możliwą rolę zakażenia H. pylori wiążącego lipopolisacharyd – LBP (lipopolisaccharide w rozwoju choroby niedokrwiennej serca uwagę zwrócił binding protein). Kompleksy takie, deponowane w śród- M e n d a l l i wsp. w 1994 roku, wykazując podwyż- błonku naczyniowym, mogą nasilać procesy miażdży- szony poziom przeciwciał przeciwko antygenom cowe związane z reakcją zapalną [88]. D u z e n d o r f e r H. pylori u większości pacjentów z chorobą wieńcową i wsp. wykazali, że białko LBP jest niezbędne do aktywa- [53]. Z kolei A m e r i s o i wsp. wykryli DNA H. pylori cji przez LPS komórek śródbłonka tętnic wieńcowych, CHOROBA NIEDOKRWIENNA SERCA A ZAKAŻENIA BAKTERYJNE H. PYLORI I C. PNEUMONIAE 251 które posiadają wewnątrzkomórkowy receptor TLR4, gospodarza zidentyfikowano u wielu patogenów bak- a białko LBP spełnia funkcję katalizatora przenoszą- teryjnych m.in. C. pneumoniae, Treponema pallidum, cego kompleks utworzony z surowiczego białka sCD14 Borrelia burgdorferi, Mycoplasma pneumoniae, H. pylori, i LPS do wnętrza komórek [11]. Wobec tego niezwykle Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, a także ważna wydaje się informacja o wzroście stężenia LBP u wirusów i grzybów [94]. w surowicy wraz z nasileniem objawów choroby wień- Mimikra antygenowa jest też podstawą „hipotezy cowej i podczas zakażenia H. pylori [19]. Nie wyklucza zakaźnej”, która zakłada, że powszechne w populacji się, iż LPS H. pylori może sprzyjać rozwojowi choroby ludzkiej choroby, m.in choroby neurodegeneracyjne, niedokrwiennej serca również poprzez zdolność obni- choroby tkanki łącznej, a także choroba niedokrwienna żania aktywności fagocytarnej komórek żernych [77], serca są następstwem chorób zakaźnych. a także osłabianie aktywności cytotoksycznej komórek Na modelu mysim wykazano, że skutkiem zakaże- NK [68] i proliferacyjnej limfocytów [18]. nia Chlamydiophila jest zapalenie mięśnia sercowego, Intensywność reakcji zapalnej towarzyszącej zaka- w którego rozwoju kluczową rolę odgrywają przeciw- żeniom H. pylori jest skorelowana z ekspresją białek bakteryjne przeciwciała przyczyniające się do uszko- CagA i VacA u szczepów typu I (CagA+VacA+). Zaka- dzenia mięśnia sercowego. Przeciwciała takie mogą żeniom takim towarzyszy wzrost poziomu trombiny być inicjowane przez białko błony zewnętrznej, którego – czynnika VII C oraz fragmentów F 1+2 protrombiny sekwencja aminokwasowa jest podobna do sekwencji [17]. Podczas reakcji zapalnej rozwijającej się wskutek łańcucha ciężkiego alfa miozyny, występującej w mięś­ takich zakażeń odsłaniają się prawdopodobnie antygeny niu sercowym ludzi. Przypuszcza się, że zarówno komórek śródbłonka i mięśni gładkich w blaszkach Chlamydophila, jak i pałeczki H. pylori mogą nasilać miażdżycowych eksponowane na działanie przeciwciał u osób zakażonych objawy choroby niedokrwiennej anty-CagA. Powstawanie takich kompleksów immu- serca poprzez indukowanie reakcji autoimmunolo- nologicznych wiąże się z ryzykiem dalszych uszkodzeń gicznych, inicjowanych przez białka szoku cieplnego śródbłonka zależnych od kompleksu litycznego białek [43]. Wykazano między innymi wpływ białka HspB dopełniacza [14]. H. pylori o masie cząsteczkowej 60 kDa na produkcję Zależność między zakażeniami H. pylori a podatnoś­ cytokin i adhezyn komórkowych, a także metaloprote- cią na rozwój choroby wieńcowej potwierdzają badania inaz pochodzenia makrofagowego, których znaczenie prowadzone na materiale pochodzącym od osób pod- w rozwoju choroby niedokrwiennej serca jest dobrze danych leczeniu w celu eliminacji pałeczek H. pylori udokumentowane [51]. M a t s u u r a i wsp. sugerują, z organizmu, u których stężenie trójglicerydów, IL-1, że białko HspB H. pylori może sprzyjać rozwojowi cho- IL-8 oraz TNF-α znacznie obniżało się. Po zakończe- roby niedokrwiennej serca poprzez nasilanie wytwarza- niu ukierunkowanego leczenia przeciwko H. pylori, nia IFN-γ i IL-12 przez limfocyty pomocnicze Th1 [48]. z zastosowaniem antybiotyków, średnica światła naczyń Wielu autorów odnosi mimikrę antygenową, będącą krwionośnych była większa niż u chorych, u których nie podłożem reakcji zapalnej w przebiegu choroby nie- wdrożono antybiotykoterapii [37]. dokrwiennej serca, do determinantów antygenowych Lewis (Le). Determinanty takie obecne na komórkach ludzkich stanowią ligandy dla cząsteczek adhezyjnych, 5. Podłoże autoimmunizacyjne choroby ulegających ekspresji w śródbłonku naczyń krwiono- niedokrwiennej serca śnych (E i P-selektyna) oraz na leukocytach (L-selek- tyna) [16]. Wiązanie selektyn z determinantami Le Rola patogenów bakteryjnych w chorobie niedo- kieruje migracją limfocytów do ogniska zapalenia krwiennej serca jest coraz częściej rozpatrywana jako i odgrywa ważną rolę w skupianiu komórek odpornoś­ proces autoimmunizacyjny związany z podobień- ciowych w obwodowych węzłach chłonnych. Wyka- stwem antygenowym struktur gospodarza i czynników zano, iż pałeczki H. pylori posiadające antygeny Le zakaźnych, które mogą inicjować krzyżową aktywność w łańcuchach o-swoistych LPS, wiążą E i L-selektyny, autoreaktywnych limfocytów T i B. Zjawisko to jest co może wskazywać na rolę takich interakcji w prze- definiowane jako mimikra antygenowa. Mechanizmy wlekłym procesie zapalnym poprzez rekrutację komó- efektorowe odpowiedzi immunologicznej rozwijającej rek zapalnych, a także przetrwanie pałeczek H. pylori się z udziałem komórek odpornościowych gospodarza w śródbłonku [16]. Aktywność LPS H. pylori wyraża mogą być kierowane zarówno przeciwko strukturom się także pobudzeniem monocytów i makrofagów do występującym u drobnoustrojów, jak i tym zlokalizo- wydzielania cytokin prozapalnych, tj. IL-1, IL-6 czy IL-8 wanym w komórkach gospodarza. Różne białka, które [18]. Szczepy z ekspresją determinantów LeX lub LeA posiadają zbliżoną strukturę trzeciorzędową mogą indu- przyciągają krążące limfocyty poprzez L-selektynę [16], kować podobną odpowiedź serologiczną. Struktury o czym świadczy dodatnia korelacja pomiędzy ekspresją identyczne lub podobne do komponentów komórek determinantów Le u H. pylori a nasileniem kolonizacji 252 AGNIESZKA MATUSIAK, MAGDALENA CHMIELA oraz napływem neutrofilów i limfocytów do błony ślu- zowej żołądka u pacjentów zakażonych H. pylori. Także u pacjentów z owrzodzeniem żołądka, zakażonych H. pylori z ekspresją LeX, obserwowano silny naciek neutrofilów [24].

6. Białka szoku cieplnego (Hsp) – bodźce i tarcze w procesach z autoimmunizacji w chorobie niedokrwiennej serca

Wysoce konserwatywne białka szoku cieplnego (heat shock proteins – hsp) mogą stanowić zarówno bodziec, jak i struktury docelowe w procesach patologicznych wynikających z autoimmunizacji. Są homogenną grupą około 20 białek występujących we wszystkich poznanych organizmach, zarówno prokariotycznych, jak i eukario- tycznych [66]. Po raz pierwszy zostały opisane przez Ritossa u Drosophila melanogaster w 1962 roku. Roz- Rys. 2. Czynniki indukujące ekspresję genów kodujących mieszczenie tych cząstek w komórkach uwarunkowane białka szoku cieplnego – Hsp i rola tych białek jest ich powinowactwem do określonych organelli lub na poziomie komórkowym występowaniem właściwych dla nich substratów. W pra- widłowo funkcjonującej komórce białka Hsp gromadzą nych organelli komórkowych. Hsp uczestniczą również się w siateczce śródplazmatycznej, gdzie zachodzi bio- w procesie naprawy uszkodzonych białek, umożliwia- synteza białka, jak również w mitochondriach i lizoso- jąc im powrót do postaci natywnej. Jeśli jednak defekty mach. Natomiast podczas podziału komórki związane są na tyle duże, że nie jest to możliwe, to pośredniczą są z cytoszkieletem, stabilizując i chroniąc go przed w usuwaniu uszkodzonych cząsteczek z udziałem pro- reorganizacją w niekorzystnych warunkach. Podczas teasomów [33, 41]. stresu poziom Hsp w cytoplazmie wzrasta, następnie Hsp o aktywności opiekuńczej stabilizują lub przy- białka te są transportowane do jądra komórkowego, wracają natywną formę chronionym białkom dzięki gdzie chronią DNA, pre-mRNA, prerybosomy i białka powinowactwu do regionów hydrofobowych polipep- jądrowe przed uszkodzeniem i degradacją, aktywują tydów lub częściowo rozwiniętego białka. W wyniku także różne geny. Ekspresja genów kodujących białka nieprecyzyjnego działania systemu ochrony komórki, szoku cieplnego jest indukowana przez wiele czynników mogą powstawać nierozpuszczalne agregaty białkowe, szkodliwych, m.in. temperaturę, trucizny metaboliczne, usuwane w wyniku hydrolizy stymulowanej przez Hsp analogi aminokwasów, niedobór glukozy, cytokiny, alko- lub też dzięki ich aktywności proteolitycznej. Białka hole, metale ciężkie, wolne rodniki, różne typy promie- opiekuńcze odgrywają także istotną rolę w transporcie niowania, zakażenia wirusowe i bakteryjne, a także nie- wewnątrzkomórkowym innych białek, a także w sygna- steroidowe leki przeciwzapalne [33, 82], rys. 2. lizacji komórkowej oraz regulacji ekspresji genów [82]. Na podstawie mas cząsteczkowych i różnic w struk- Do grupy Hsp60 należy zarówno białko mitochon- turze pierwszorzędowej polipeptydów, wśród białek drialne (mt-Hsp), jak i cytoplazmatyczne. Białko mito- szoku cieplnego wyróżniono następujące podgrupy: chondrialne funkcjonuje w dynamicznej równowadze Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 i Hsp niskoczą- pomiędzy monomerami, heptamerami i tetradekame- steczkowe o masie cząsteczkowej w zakresie od 8,5 do rami. Ich dysocjacji do monomerów następuje przy 40 kDa. Nazewnictwo takie przyjęto wtrakcie konferen- niskim stężeniu tego białka, natomiast do tworzenia cji w Cold Spring Harbor w 1996 roku [81, 82]. Białka tetradekamerów w obecności ATP i mitochondrialnego Hsp stanowią 5–10% wszystkich białek organizmu, Hsp10, jako kofaktora mt-Hsp60. Cytoplazmatyczne chronią komórki przed działaniem czynników streso- białko Hsp60 tworzone jest przez formy heterooligo- wych, zarówno zewnątrzkomórkowych, jak i wewnątrz- meryczne i bierze udział w łączeniu białek cytoszkieletu komórkowych (metabolity), pełniąc jednocześnie ważne tj. aktyny i tubuliny [81]. funkcje w procesach fizjologicznych. Plejotropowa Białka szoku cieplnego mogą stawać się immuno- aktywność białek Hsp związana jest z tworzeniem przez genne wskutek zmian strukturalnych lub potranslacyj- nie przejściowo kompleksów z innymi białkami. Może nej modyfikacji autogennych Hsp w wyniku zaburzeń to powodować zmianę ich konformacji, co pozwala na metabolicznych lub procesów oksydacyjnych. Zakłada ich przemieszczanie się przez błony biologiczne do róż- się również możliwość tworzenia kompleksów białek CHOROBA NIEDOKRWIENNA SERCA A ZAKAŻENIA BAKTERYJNE H. PYLORI I C. PNEUMONIAE 253

Hsp z własnymi lub obcymi antygenami, które mogłyby adhezyjnych i wytwarzaniem białka CRP, fibrynogenu stymulować limfocyty B do wytwarzania przeciwciał oraz amyloidu A [3]. rozpoznających białka Hsp [66]. Stwierdzono, że Hsp wytwarzane przez C. pneumo- Mimo, iż samo białko Hsp60 nie aktywuje dopeł- niae regulują ekspresję metaloproteinaz i sekrecję TNF-α niacza, to w kompleksie z przeciwciałami nabywa taką w komórkach gospodarza. Przypuszcza się, że ma to właściwość [64]. Powstanie aktywnych białek dopełnia- związek z wykorzystywaniem przez te drobnoustroje cza w procesie kaskadowej aktywacji inicjowanej przez składników pokarmowych pochodzących z zasiedlanych kompleksy immunologiczne może ostatecznie doprowa- komórek. Do wzrostu stężenia Hsp we krwi gospoda- dzić do uszkodzenia tkanek własnych i rozwoju zmian rza dochodzi prawdopodobnie w momencie wysiewu patologicznych. Tradycyjne czynniki rozwoju miaż- bakterii, po zakończeniu fazy wewnątrzkomórkowego dżycy, tj. nadciśnienie tętnicze, hiperlipidemia, oxLDL, namnażania [6]. palenie tytoniu, uszkadzając komórki śródbłonka, Również odpowiedź Th1, będąca reakcją na zaka- doprowadzają do wzrostu ekspresji Hsp [65], przez co żenie H. pylori, może przyczyniać się do wystąpienia ryzyko powikłań wynikających z tworzenia komplek- zmian miażdżycowych. Z powodu znacznej homologii sów immunologicznych wzrasta u pacjentów z chorobą sekwencji aminokwasowych ludzkiego Hsp60 i białka niedokrwienną serca. Hsp60 H. pylori (Hp-Hsp60) limfocyty Th1 o swois­ tości wobec bakteryjnego Hsp napływające do błony śluzowej żołądka, mogą być aktywowane i przycią- 7. Prozapalne działanie białek Hsp w chorobie gane przez endogenne cząsteczki Hsp60 kumulowane niedokrwiennej serca na powierzchni śródbłonka, w odpowiedzi na czyn- niki stresogenne, tj. nadciśnienie tętnicze, hipercho- Jedną z możliwości udziału białek szoku cieplnego, lesterolemię czy cytokiny. Niektóre peptydy ludzkiego zarówno ludzkich, jak i bakteryjnych, w rozwoju cho- białka Hsp60 zostały wykryte w strukturze limfocy- roby niedokrwiennej serca, jest stymulacja przez nie tów T CD4+, co może generować autoimmunolo- komórek śródbłonka naczyniowego za pośrednictwem giczne zmiany miażdżycowe. Wykazano, że modulacja receptora CD14 i kinazy białkowej p38 do wydziela- równowagi Th1/Th2 w kierunku redukcji odpowiedzi nia cytokin prozapalnych, m.in. IL-6 i TNF-α [36, 54]. Th1, w trakcie immunizacji białkiem Hsp60H. pylori, W doświadczeniach z użyciem przeciwciał blokujących skutkuje zmniejszeniem rozmiaru blaszek miażdżyco- receptory TLR-2 i TLR-4, wykazano zahamowanie pro- wych. Również terapia eradykacyjna H. pylori prowa- liferacji limfocytów T w odpowiedzi na bakteryjne lub dzi do ograniczenia takich zmian, ponieważ eliminacja ludzkie białko Hsp, w grupie pacjentów z przewlekłym czynnika zakaźnego przywraca równowagę Th1/Th2. zapaleniem przyzębia i z chorobą wieńcową [22]. Można zatem przypuszczać, iż redukcja limfocytów Silnym działaniem prozapalnym cechuje się białko Th1 (CD4+) swoistych wobec Hsp60H. pylori może Hsp60 występujące w strukturach powierzchniowych przyczynić się do ograniczenia rozwoju zmian miaż- pałeczek H. pylori. Wykazano, że stymuluje ono komórki dżycowych. W badaniach in vitro wykazano, iż lim- linii monocytów ludzkich THP-1 do wytwarzania focyty Th1 aktywowane Hp-Hsp60, pochodzące od IL-1β, IL-8, TNF-α i IL-8 [44]. Jego stężenie jest wyższe myszy zakażonych H. pylori, przenikały przez barierę w plazmie pacjentów z chorobą niedokrwienną serca, komórek śródbłonka. Natomiast nieaktywowane takim w porównaniu do zdrowych dawców. Stwierdzono także, białkiem limfocyty izolowane od myszy zakażonych że u osób palących tytoń, z nadciśnieniem tętniczym H. pylori nie przekraczały bariery śródbłonka. Kiedy i cukrzycą, z podwyższonym stężeniem białka Hsp60 komórki śródbłonka poddano działaniu przeciwciał i swoistych wobec niego przeciwciał, częściej pojawiają IgG przeciwko Hsp60 H. pylori aktywowane Hp-Hsp60 się objawy choroby wieńcowej, niż u osób, u których limfocyty Th1 traciły zdolność wnikania pomiędzy wymienione wskaźniki pozostają w normie. Z h a n g komórki śródbłonka [4]. i wsp. wykazali wzrost stężenia Hsp60 w plazmie pacjen- Rozpuszczalne białka Hsp (sHsp) mogą być uwal- tów na dzień przed i dzień po wystąpieniu ostrego incy- niane z komórek ludzkich lub bakteryjnych podczas dentu wieńcowego i stopniowe jego obniżanie po sied- stresu fizycznego, chemicznego i biologicznego. Mogą miu dobach [97]. być także produkowane przez komórki zapalne poddane Sugeruje się, że zarówno egzogenne, jak i endogenne działaniu cytokin. Źródłem rozpuszczalnych białek sHsp białka Hsp mogą przyczyniać się do rozwoju reak- mogą być również komórki apoptotyczne i uszkodzone cji zapalnej w ścianach naczyń krwionośnych, a także mechanicznie [46]. Stwierdzono wzrost stężenia sHsp powodować destabilizację blaszki miażdżycowej. Ludz- u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i z miażdżycą kie i bakteryjne Hsp aktywują komórki śródbłonka tętnicy szyjnej oraz jego związek z grubością ścian tęt- naczyniowego, makrofagi, a także komórki mięśni nic. U niektórych pacjentów poziom tego białka prze- gładkich, co wyraża się nasileniem ekspresji cząsteczek kraczał 1 mg/l [63, 90]. 254 AGNIESZKA MATUSIAK, MAGDALENA CHMIELA

Choć większość badaczy wskazuje na wzrost stężenia wyższym niż 1000 ng/ml, podczas gdy u osób z geno- białka Hsp60 w surowicy osób z chorobą niedokrwienną typem CC lub CG odsetek ten wynosił odpowiednio serca, to Z h a n g i wsp. nie potwierdzili związku mię- 26% i 23,3% [72]. dzy poziomem tego białka a czynnikami ryzyka tej choroby tj. paleniem tytoniu, nadciśnieniem tętniczym, hipercholesterolemią, cukrzycą oraz płcią w grupie 8. Hipoteza cytotoksycznego działania przeciwciał osób zdrowych. Wykazali natomiast, iż stężenie tego przeciwko bakteryjnym białkom szoku cieplnego białka zwiększa się w surowicach osób zdrowych wraz o masie cząsteczkowej 60 i 65 kDa w chorobie z wiekiem. U osób z podwyższonym stężeniem Hsp60 niedokrwiennej serca częstość choroby niedokrwiennej serca była pięciokrot- nie wyższa niż u osób z niskim stężeniem tego białka Pierwsze przypuszczenia o udziale przeciwciał anty- w surowicy [97]. -Hsp60 i anty-Hsp65 w patogenezie choroby niedo- W 2009 roku Z h a n g i wsp. zasugerowali udział krwiennej serca wywodzą się z badań opublikowanych białek Hsp60, Hsp70 i Hsp90α w patogenezie raka jelita przez M a y r’a i wsp. w 1999 roku [51]. Rok później grubego, natomiast nie potwierdzili ich związku z nasi- Pockley i wsp. wykazali podwyższone stężenie białka leniem choroby nowotworowej [95]. Hsp60 i przeciwciał przeciwko Hsp65 w surowicach W kontekście choroby niedokrwiennej serca, zain- pacjentów z nadciśnieniem tętniczym, co pozostawało teresowanie wzbudzają: białko Hsp22, ponieważ jest w związku z przyspieszonym tworzeniem się zmian produkowane wyłącznie w kardiomiocytach oraz białko miażdżycowych u osób z taką dolegliwością [63]. Hsp27 produkowane zarówno przez kardiomiocyty, jak Rola białek szoku cieplnego w procesie aterogenezy i komórki śródbłonka naczyniowego [5, 52, 75]. Obiecu- jest prawdopodobnie ściśle związana z podwyższo- jące wydają się wyniki badań J ó z e f o w i c z - O k o n - nym poziomem przeciwciał przeciwko białkom Hsp60 k w o i wsp., którzy wykazali istotną statystycznie róż- i Hsp65 [65]. Ich powstawanie mogą indukować bak- nicę w stężeniu surowiczego białka Hsp27 u pacjentów teryjne białka szoku cieplnego zwłaszcza te, które mają z objawami stabilnej dusznicy bolesnej ze zwężeniem charakter antygenów powierzchniowych. Duży kon- tętnicy wieńcowej, w odniesieniu do osób zdrowych. serwatyzm struktury tych białek może być przyczyną Rozważa się znaczenie tego białka jako markera diag­ wystąpienia immunologicznych reakcji krzyżowych nostycznego w chorobie niedokrwiennej serca. Zwraca między bakteryjnymi białkami Hsp a ich ludzkimi uwagę fakt, iż stężenie Hsp27 jest wprost proporcjo- homologami, np. białkiem o masie 60 kDa (hHsp60). nalne do masy niedokrwionego mięśnia sercowego, jak W związku z tym mechanizm ochrony komórki przed również stopnia zwężenia naczyń krwionośnych [31]. szkodliwymi warunkami środowiskowymi może dopro- K u c h sugeruje, że oznaczanie stężenia tego białka wadzić do inicjacji procesów autoimmunologicznych, może być przydatne w diagnozowaniu form pośrednich stanowiących przyczynę uszkodzeń komórek śród- choroby niedokrwiennej serca, pomiędzy względnie błonka, stanowiących niszę do tworzenia blaszki miaż- wczesnym stadium a niestabilnością wieńcową. Bada- dżycowej. Zatem ludzkie białka szoku cieplnego mogą nia udziału niskocząsteczkowych białek szoku cieplnego stać się celem krzyżowej reakcji odpornościowej zaini- w rozwoju choroby wieńcowej są nieliczne i pozostają cjowanej przez antygeny często występujących u ludzi jak dotąd w fazie wstępnej [39]. patogenów bakteryjnych, do których zalicza się m.in. Nie wyklucza się znaczenia haplotypów genu hsp60 H. pylori i C. pneumoniae. Wykazano, iż z powodu wyso- jako czynników sprzyjających wystąpieniu choroby kiego stopnia homologii białek z tej rodziny przeciw- niedokrwiennej serca. W badaniach 4 wariantów poli- ciała i limfocyty T skierowane przeciwko Hsp60 i Hsp65 morficznych genu hsp60, wynikających z podstawie- C. pneumoniae reagują krzyżowo z ludzkim białkiem nia pojedynczych nukleotydów: rs2340690, rs788016, Hsp60 [8, 55, 65]. Jednak J a s t r z ę b s k i i wsp. nie rs2305560 i rs2565163, przeprowadzonych z udziałem potwierdzili w swoich badaniach zależności pomiędzy ponad tysiąca uczestników wykazano, iż w przypadku zakażeniem C. pneumoniae a poziomem przeciwciał osób z haplotypem GCTC istnieje dwukrotnie wyż- anty-Hsp60 u osób z chorobą niedokrwienną serca. sze ryzyko wystąpienia choroby wieńcowej niż u osób Wykazali oni, że mimo zwiększonej ekspresji białka z haplotypem GTTC (OR = 1,91, 95% CI: 1,26–2,89, Hsp60 u osób z nadciśnieniem tętniczym i wysokiego p = 0,002). Wyniki te mogą sugerować związek haplo- stopnia homologii pomiędzy strukturą ludzkiego i bak- typu GCTC hsp60 z podwyższonym ryzykiem wystą- teryjnego białka Hsp60, reakcja immunologiczna prze- pienia chorób układu krążenia [23]. Zamiana C na G ciwko ludzkiemu Hsp60 nie miała związku z takimi w regionie promotorowym Hsp60/Hsp10 (3054–3712), zakażeniami [28, 29]. Jest wysoce prawdopodobne, że w pozycji 3175, jest związana z podwyższonym stęże- procesy zapalne zachodzące u pacjentów z chorobą niem Hsp60 w surowicach u ludzi. U 40% pacjentów wieńcową w śródbłonku naczyniowym mogą być nasi- z genotypem GG wykrywano białko Hsp60 w stężeniu lane przez przeciwciała anty-Hsp powstające w odpo- CHOROBA NIEDOKRWIENNA SERCA A ZAKAŻENIA BAKTERYJNE H. PYLORI I C. PNEUMONIAE 255

Rys. 3. Hipoteza cytotoksycznego działania przeciwciał przeciwko białkom szoku cieplnego – Hsp60 wobec komórek śródbłonka naczyniowego (C – dopełniacz, MAC – kompleks atakujący błonę) wiedzi na zakażenia C. pneumoniae [6, 29, 34], jakkol- Hsp60 H. pylori (Glu141-Leu160) rozpoznają sekwencje wiek już sama obecność C. pneumoniae w komórkach aminokwasowe w ludzkim białku Hsp60. W badaniach mięśni gładkich nasila ekspresję białka Hsp60, które prowadzonych na myszach zespół ten potwierdził zależ- może stać się tarczą dla przeciwciał, ale jest również ność pomiędzy podwyższonym poziomem przeciwciał jednym z bodźców stymulujących proliferację tych IgG2a anty-Hsp60 H. pylori a nasileniem zmian miaż- komórek [34]. dżycowych w śródbłonku [4]. W 1993 roku X u i wsp. wskazali na korelację Wykazano również wiązanie bakteryjnego białka pomiędzy grubością warstwy wewnętrznej ściany tęt- Hsp60 z ludzkimi przeciwciałami IgG1, IgG3 i IgM, ale nicy szyjnej a poziomem przeciwciał przeciwko białku nie IgA, za pośrednictwem fragmentu Fab [10]. Hsp65 mykobakterii [92]. Zwrócono również uwagę W badaniach własnych wykazano istotnie częst- na związek pomiędzy wysokim poziomem przeciwciał szą produkcję przeciwciał IgG anty-HspB H. pylori anty-Hsp65 a śmiertelnością wśród pacjentów z chorobą u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca zaka- wieńcową [89]. żonych niż u osób niezakażonych tymi bakteriami. Choć hipoteza cytotoksycznego działania przeciwciał Takiej zależności nie zaobserwowano w odniesieniu do anty-Hsp60 i anty-Hsp65, wobec komórek śródbłonka przeciwciał przeciwko ludzkiemu białku Hsp60, które naczyniowego została zasugerowana przez M a y r’a wykrywano z podobną częstością zarówno u osób i wsp. w 1999 roku [51], to już wcześniej wiele badań in z wykluczonym, jak i z potwierdzonym zakażeniem vitro wskazało, że cząsteczki Hsp60 są eksponowane na H. pylori [49]. Wyniki badań O k a d y i wsp. wska- komórkach śródbłonka. Przeciwciała anty-Hsp60, two- zują, że u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca rząc z nimi kompleksy immunologiczne aktywują cyto- podwyższony jest zarówno poziom przeciwciał prze- toksyczność zależną od dopełniacza, skutkiem czego jest ciwko ludzkiemu białku Hsp60, jak i przeciwko jego uszkodzenie komórek śródbłonka [71, 76, 91], rys. 3. odpowiednikowi występującemu u pałeczek H. pylori Jednakże nie wszystkie badania potwierdzają występo- [57]. Na podwyższony poziom przeciwciał przeciwko wanie zjawiska cytotoksyczności wobec komórek śród- ludzkiemu białku Hsp60 w surowicach pacjentów z cho- błonka. Może to wskazywać na znaczenie podklasy prze- robą niedokrwienną serca wskazują również badania ciwciał, które reagują z wspólnym epitopem ludzkiego P r o h á s z k i i wsp. [64]. Natomiast Z h u i wsp. nie i bakteryjnego białka Hsp60 oraz możliwością aktywacji tylko potwierdzili obecność przeciwciał przeciwko biał- dopełniacza. Z badań A y a d y i wsp. wynika, że prze- ku Hsp60 u 75% pacjentów z chorobą niedokrwienną ciwciała IgG2 przeciwko specyficznym peptydom białka serca, ale zwrócili także uwagę, iż przeciwciała takie 256 AGNIESZKA MATUSIAK, MAGDALENA CHMIELA występowały istotnie częściej u osób seropozytywnych ludzkiego białka CRP. Wspólne determinanty zlokalizo- (65%) niż seronegatywnych (49%) [98]. wane we wszystkich tych białkach były rozpoznawane Wykazano także, iż poziom IgG anty-Hsp60 był istot- przez IgG anty-CRP [83]. nie wyższy u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca P e r s h i n k a i wsp. wykazali, że przeciwciała prze- zakażonych szczepami H. pylori typu I (CagA+VacA+), ciwko białkom Hsp65 M. tuberculosis oraz Escherichia niż u osób z grupy kontrolnej zakażonych tym samym coli rozpoznawały 17 epitopów, natomiast przeciwciała typem pałeczek H. pylori. Nie stwierdzono jednak róż- anty-Hsp60 Chlamydia trachomatis reagowały z 18 epi- nicy istotnej statystycznie w poziomie IgG anty-Hsp60 topami ludzkiego Hsp60. Wykazano, że 8 epitopów ludz- porównując pacjentów z chorobą wieńcową z zakaże- kiego białka Hsp było rozpoznawanych przez wszystkie niem H. pylori typu I lub typu II (CagA-VacA-) oraz oceniane przeciwciała przeciwko bakteryjnym białkom pacjentów niezakażonych tymi drobnoustrojami. Ana- Hsp60. W badaniach histochemicznych wykazano, że lizując intensywność produkcji przeciwciał anty-Hsp60 niektóre z tych epitopów są eksponowane w komórkach wśród osób bez zmian wieńcowych autorzy wykazali, że śródbłonka ścian naczyń krwionośnych [62]. poziom takich przeciwciał był istotnie wyższy u osób Aktywność przeciwciał, indukowanych przez bak- zakażonych H. pylori niezależnie od typu szczepu wywo- teryjne białka Hsp, może być błędnie kierowana prze- łującego zakażenie, w porównaniu do osób zdrowych ciwko ludzkiemu białku Hsp60, którego ekspresja nasila niezakażonych tymi pałeczkami [43]. się w śródbłonku naczyniowym w przebiegu choroby H o p p i c h l e r i wsp. zwrócili uwagę na progno- niedokrwiennej serca. styczną wartość oznaczania przeciwciał anty-Hsp60 Niektórzy badacze sugerują, iż ocena wytwarzania i anty-Hsp65 u pacjentów z chorobą niedokrwienną. przeciwciał anty-Hsp60 może stanowić dodatkowy W pierwotnie utworzonej grupie doświadczalnej osób marker pomocny w diagnozowaniu choroby wieńcowej z podwyższonym mianem takich przeciwciał, stwier- [57]. Va r b i r o i wsp. badając stabilność przeciwciał dzono występowanie epizodów sercowo-naczyniowych, IgG anty-Hsp60 u pacjentów z chorobą wieńcową nie pod postacią niestabilnej dławicy piersiowej, zawału wykazali zmian w poziomie takich immunoglobulin serca, udaru mózgu, a nawet zgonu sercowego [25, 87]. w ciągu pięciu lat, co świadczy o wysokiej stabilności Wykazano, iż zwłaszcza przeciwciała IgA skierowane przeciwciał skierowanych przeciwko konserwatywnym przeciwko ludzkiemu białku Hsp60 mogą przyczyniać białkom szoku cieplnego [86]. się do wystąpienia zdarzeń sercowo-naczyniowych [26]. W pracy przeglądowej dotyczącej związku białek Te spostrzeżenia po raz kolejny rzucają światło na rolę szoku cieplnego z chlamydiozami i chlamydofilozami przeciwciał tej klasy w patogenezie choroby wieńco- P a w l i k o w s k a i D e p t u ł a zwracają uwagę na wej. U zdrowych ochotników wyższe stężenie takich wartość diagnostyczną oznaczania poziomu przeciw- przeciwciał oznaczano u dawców, u których stwier- ciał przeciwko białkom Hsp C. pneumoniae w choro- dzono nadciśnienie tętnicze lub cukrzycę. Wykazany bach układu krążenia, z towarzyszącym zakażeniem przez innych badaczy spadek poziomu przeciwciał C. pneumoniae, ze względu na możliwe interakcje takich anty-Hsp60 u pacjentów poddanych leczeniu aspiryną przeciwciał z ludzkim białkiem Hsp60 eksponowanym i/lub statynami wydaje się potwierdzać, iż przeciwciała na makrofagach. Autorzy podkreślają, iż konsekwencją anty-Hsp pojawiają się u pacjentów z aktywną chorobą takiej interakcji może być aktywacja makrofagów skut- wieńcową [96]. kująca wytwarzaniem cytokin nasilających przebieg Obecnie wiele uwagi poświęca się ustaleniu po- reakcji zapalnej, która odgrywa kluczową rolę w pato- tencjalnego mechanizmu działania przeciwciał prze-­ genezie choroby niedokrwiennej serca [60]. ciwko bakteryjnym białkom Hsp w chorobie niedo- Z kolei K i m u r a i wsp. na podstawie przeprowa- krwiennej serca. dzonych oznaczeń poziomu przeciwciał anty-Hsp60 Krzyżowe wiązanie białka HspB H. pylori przez prze- w surowicach i analizy stanu istoty białej mózgu zasuge- ciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu białku rowali, że podwyższony poziom takich przeciwciał może Hsp60 wykazali K a w a h a r a i wsp. [32], a O k a d a stanowić czynnik ryzyka dla choroby małych naczyń i wsp. potwierdzili, że przeciwciała IgG przeciwko okreś­ krwionośnych w mózgu [35]. lo­nym sekwencjom aminokwasowym białka Hsp60 H. pylori rozpoznawały determinanty antygenowe ludzkiego białka Hsp60 w teście ELISA. Wiadomo, 9. Podsumowanie iż dwudziesto aminokwasowy fragment tego białka (Glu141-Leu160) jest dominującym epitopem wiązanym W ostatnich latach ubiegłego stulecia rozpoczęto z patogenezą choroby wieńcowej [57]. badania nad rolą procesu zapalnego w rozwoju miaż- Występowanie pewnych determinantów antygeno- dżycy. Zwrócono także uwagę na udział czynników wych wspólnych dla ludzkiego Hsp60 i Hsp65 Myco- zakaźnych, m.in. C. pneumoniae i H. pylori w patogene- bacterium tuberculosis stwierdzono także w cząsteczce zie choroby niedokrwiennej serca, a także na rolę pro- CHOROBA NIEDOKRWIENNA SERCA A ZAKAŻENIA BAKTERYJNE H. PYLORI I C. PNEUMONIAE 257 cesów autoimmunologicznych. Mimo licznych badań of hypo-responsive Toll-like receptor 4 variants with risk of nie ma ostatecznej odpowiedzi na pytanie, w jaki spo- myocardial infarction. Eur. Heart. J. 25, 1447–1453 (2004) sób zakażenia mogą wpływać na powstawanie i rozwój 13. Filipiak K.J., Opolski G.: Choroby układu sercowo-naczynio- wego i ich czynniki ryzyka – teoria continuum. Terapia, 9, 5–9 blaszki miażdżycowej. Przedstawione wyniki badań (2001) wydają się potwierdzać hipotezę o roli bakteryjnych 14. Franceschi F., Sepulveda A.R., Gasbarrini A., Pola P., Sil- białek Hsp, jako czynników stymulujących reakcje veri N.G., Gasbarrini G., Graham D.Y., Genta R.M.: Cross- autoimmunologiczne i wynikające z nich procesy pato- reactivity of anti-CagA antibodies with vascular wall antigens: logiczne w chorobie niedokrwiennej serca. Rola tych possible pathogenic link between Helicobacter pylori infection and atherosclerosis. Circulation, 106, 430–434 (2002) białek w procesie miażdżycowym jest prawdopodobnie 15. Fryer R.H., Schwobe E.P., Woods M.L. Rodgers G.M.: Chla- powiązana z podwyższonym mianem przeciwciał anty- mydia species infect human vascular endothelial cells and -Hsp, które mogą być indukowane przez bakteryjne induce procoagulant activity. J. Investig. Med. 45, 168–174 (1997) powierzchniowe białka szoku cieplnego, o wysokim 16. Galustian Ch., Elviss N., Chart H., Owen R., Feizi T.: Inter- stopniu podobieństwa do białek gospodarza ekspo- actions of gastrotropic bacterium Helicobacter pylori with the leukocyte-endothelium adhesion molecules, the selectins nowanych w komórkach śródbłonka naczyniowego. – a preliminary report. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 36, Powstawanie kompleksów immunologicznych, w skład 127–134 (2003) których wchodzą białka Hsp i przeciwciała anty-Hsp 17. Grąbczewska Z., Nartowicz E., Szymaniak L., Wiśniewska E., może być przyczyną uszkodzenia naczyń wskutek cyto- Przybył R., Polak G., Kubica J., Dymek G., Giedrys-Kalemba G., toksyczności zależnej od białek dopełniacza. To pociąga Kotschy M., Odrowąż-Sypniewska G.: Endothelial dysfunction za sobą nasilenie procesów zapalnych i ich utrwalenie. in acute coronary syndrome without ST segment elevation in the presence of Helicobacter pylori infection. Kardiol. Pol. 57, 533–536, (2002) 18. Grębowska A., Moran A.P., Bielański W., Matusiak A., Piśmiennictwo Rechciński T., Rudnicka K., Baranowska A., Rudnicka W., Chmiela M.: Helicobacter pylori lipopolisaccharide activity 1. Ameriso S.F., Fridman E.A., Leiguarda R.C., Sevlever G.E.: in human peripheral blood mononuclear leukocyte cultures. Detection of Helicobacter pylori in human carotid atheroscle- J. Physiol. Pharmacol. 61, 437–442 (2010) rotic plaques. Stroke, 32, 385–391 (2001) 19. Grębowska A., Moran A.P., Matusiak A., Bąk-Romaniszyn L., 2. Andersen P.: Pathogenesis of lower respiratory tract infections Czkwianianc E., Rechciński T., Walencka M., Płaneta- due to Chlamydia, Mycoplasma, Legionella and viruses. Thorax, Małecka I., Rudnicka W., Chmiela M.: Anti-phagocytic activ- 53, 302–307 (1998) ity of Helicobacter pylori lipopolisaccharide (LPS) – possible 3. Andrié R.P., Bauriedel G., Braun P., Höpp H.W., Nickenig G., modulation of the innate immune response to these bacteria. Skowasch D.: Prevalence of intimal heat shock protein 60 homo­ Pol. J. Microbiol. 57, 185–192 (2008) logues in unstable angina and correlation with anti-heat shock 20. Hajra L., Evans A.I., Chen M., Hyduk S.J., Collins T., protein antibody titers. Basic. Res. Cardiol. 106, 657–665 (2011) Cybylsky M.I.: The NF-κB signal transduction pathway in aor- 4. Ayada K., Yokota K., Kobayashi K., Shoenfeld Y., Matsuura E., tic endothelial cells is primed for activation in regions predis- Oguma K.: Chronic infections and atherosclerosis. Clin. Rev. posed to atherosclerotic lesion formation. Proc. Natl. Acad. Sci. Allergy Immunol. 37, 44–48 (2009) USA, 97, 9052–9057 (2000) 5. Benjamin I.J., McMillan D.R.: Stress (heat shock) proteins: 21. Halme S., Latvala J., Karttunen R., Palatsi I., Saikku P., Surcel molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. H.M.: Cell-mediated immune response during primary Chlamy- Circ. Res. 83, 117–132 (1998) dia pneumoniae infection. Infect. Immun. 68, 7156–7158 (2000) 6. Brykczyński M., Wiechowski S., Naruszewicz M.: Chlamydia 22. Hasan A., Sadoh D., Palmer R., Foo M., Marber M., Lehner T.: pneumoniae w progresji wielonaczyniowej choroby wieńcowej. The immune responses to human and microbial heat shock Terapia, 112, 20–24 (2001) proteins in periodontal disease with and without coronary 7. Choroszy-Król I., Ruczkowska J.: Laboratoryjna diagnostyka heart disease. Clin. Exp. Immunol. 142, 585–594 (2005) chlamydioz. Akademia Medyczna we Wrocławiu, 2004, s. 53–57 23. He M.A., Zhang X., Wang J., Cheng L., Zhou L., Zeng H., 8. Ciervo A., Visca P., Petrucca A., Biasucci L.M., Maseri A., Wang F., Chen Y., Xu Z., Wei Q., Hu F.B., Wu T.: Genetic varia- Cassone A.: Antibodies to 60-kilodalton heat shock protein tion in heat shock protein 60 gene and coronary heart disease in and outer membrane protein 2 of Chlamydia pneumoniae in China: tagging-SNP haplotype analysis in a case-control study. patients with coronary heart disease. Clin. Diagn. Lab. Immu- Cell. Stress Chaperones, 13, 231–238 (2008) nol. 9, 66–74 (2002) 24. Heneghan M.A., McCarthy C.F., Moran A.P.: Relationship of 9. Danesh J., Collins R., Peto R.: Chronic infection and coronary blood group determinants on Helicobacter pylori lipopolysac- heart disease: is there any link? Lancet, 350, 430–436 (1997) charide with host Lewis phenotype and inflammatory response. 10. Dubreuil J.D., Giudice G.D. Rappuoli R.: Helicobacter pylori Infect. Immun. 68, 937–941 (2000) interactions with host serum and extracellular matrix proteins: 25. Hoppichler F., Koch T., Dzien A., Gschwandtner G., Lechleit- potential role in the infectious process. Microbiol. Mol. Biol. ner M.: Prognostic value of antibody titre to heat-shock protein Rev. 66, 617–629 (2002) 65 on cardiovascular events. Cardiology, 94, 220–223 (2000) 11. Dunzendorfer S., Lee H., Soldau K., Tobias P.S.: Toll-like 26. Huittinen T., Leinonen M., Tenkanen L., Mänttäri M., Virk- receptor 4 functions intracellularly in human coronary artery kunen H., Pitkänen T., Wahlström E., Palosuo T., Manninen V., endothelial cells: roles of LBP and sCD14 in mediating LPS- Saikku P.: Autoimmunity to human heat shock protein 60, responses. FASEB J. 18, 1117–1119 (2004) Chlamydia­ pneumoniae infection, and inflammation in predict- 12. Edfeldt K., Bennet A.M., Eriksson P., Frostegard J., Wiman B., ing coronary risk. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 431–437 Hamsten A., Hansson G.K., de Faire U., Yan Z.Q.: Association (2002) 258 AGNIESZKA MATUSIAK, MAGDALENA CHMIELA

27. Jama-Kmiecik A., Choroszy-Król I.: Rola Chlamydophila Mao S.J., Tsai N.M. Antibodies against Helicobacter pylori heat pneumoniae w astmie oskrzelowej i przewlekłej obturacyjnej shock protein 60 aggravate HSP60-mediated proinflammatory chorobie płuc – mechanizmy odpowiedzi immunologicznej. responses. Cytokine, 55, 174–180 (2011) Adv. Clin. Exp. Med. 16, 113–121 (2007) 45. Malfertheiner P. Helicobacter pylori – od podstaw do leczenia. 28. Jastrzębski M., Czarnecka D., Rajzer M., Kawecka-Jaszcz K.: Wyd. Medyczne Sanmedica, Warszawa, 1997, s. 11–32 Increased levels of inflammatory markers in hypertensives with 46. Mallat Z., Tedgui A.: Current perspective on the role of apopto- target organ damage. Kardiol. Pol. 64, 802–811 (2006) sis in atherothrombotic disease. Circ. Res. 88, 998–1003 (2001) 29. Jastrzębski M., Czarnecka D., Rajzer M., Marcinkowski M., 47. Marshall B.J., Warren J.R.: Unidentified curved bacilli in the Kawecka-Jaszcz K.: Infekcja Chlamydia pneumoniae oraz stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet, wirusem cytomegalii a przebudowa naczyń i serca w samoist- 1, 1311–1315 (1984) nym nadciśnieniu tętniczym. Nadciśnienie Tętnicze, 9, 266–275 48. Matsuura E., Kobayashi K., Matsunami Y., Shen L., Quan N., (2005) Makarova M., Suchkov S.V., Ayada K., Oguma K., Lopez L.R.: 30. Jawień J.: New insights into immunological aspects of athero- Autoimmunity, infectious immunity and atherosclerosis. J. Clin. sclerosis. Pol. Arch. Med. Wewn. 118, 127–131 (2008) Immunol. 29, 714–721 (2009) 31. Józefowicz-Okonkwo G., Wierzbowska-Drabik K., Kasielski M., 49. Matusiak A., Rechciński T., Rudnicka K., Bąk-Romaniszyn L., Trzos E., Goraca A., Nowak D., Kasprzak J., Krzemińska- Czkwianianc E., Rudnicka W., Krzemińska-Pakuła M., Pakuła M.: Is Hsp27 a marker of myocardial ischaemia? Kardiol. Chmiela M.: The reactivity of serum IgG from the patient with Pol. 67, 947–952 (2009) coronary heart disease and healthy subjects with heat shock 32. Kawahara Y., Yokota K., Mizuno M., Yunoki N., Uesu T., proteins (Hsp): HspB of Helicobacter pylori, Mycobacterium Okada H., Kobayashi K., Hirai Y., Oguma K., Tsuji T.: Anti- bovis Hsp65 and human recombinant Hsp60. Wyd. SGGW, bodies to human gastric epithelial cells and heat shock protein Warszawa, 2009, s. 116–119 60 in Helicobacter pylori positive mucosa associated lymphoid 50. Matusiak A., Rechciński T., Rudnicka K., Walencka M., Rud- tissue lymphoma. Gut, 45, 20–23 (1999) nicka W., Chmiela M.: Helicobacter pylori and Chlamydophila 33. Kaźmierczuk A., Kiliańska Z.M.: Plejotropowa aktywność pneumoniae infections – potential risk factors for the develop- białek szoku cieplnego. Post. Hig. Med. Dosw. 63, 502–521 ment of coronary heart disease. Sepsis, 4, 221–227 (2010) (2009) 51. Mayr M., Metzler B., Kiechl S., Willeit J., Schett G., Xu Q., 34. Kern J.M., Maass V., Maass M.: Chlamydia pneumoniae-induced Wick G.: Endothelial cytotoxicity mediated by serum antibod- pathological signaling in the vasculature. FEMS Immunol. Med. ies to heat shock proteins of Escherichia coli and Chlamydia Microbiol. 55, 131–139 (2009) pneumonia. Immune reactions to heat shock proteins as a pos- 35. Kimura A., Sakurai T., Yamada M., Koumura A., Hayashi Y., sible link between infection and atherosclerosis. Cicrulation, 99, Tanaka Y., Hozumi I., Takemura M., Seishima M., Inuzuka T.: 1560–1566 (1999) Elevated Anti-Heat Shock Protein 60 Antibody Titer is Related 52. Mehta T.A., Greenman J., Ettelaie C., Venkatasubramaniam A., to White Matter Hyperintensities. J. Stroke Cerebrovasc. Dis. Chetter I.C., McCollum P.T.: Heat shock proteins in vascular dis- 21, 305–309 (2012) ease- a review. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 29, 395–402 (2005) 36. Kol A., Lichtman A.H., Finberg R.W., Libby P., Kurt-Jones E.A.: 53. Mendall M.A., Goggin P.M., Mollinneaux N., Srachan D., Cutting edge: heat shock protein (HSP) 60 activates the innate Camm A.: Relation of Helicobacter pylori infection and coro- immune response: CD14 is an essential receptor for HSP60 nary heart disease. Heart. J. 71, 437–439 (1994) activation of mononuclear cells. J. Immunol. 164, 13–17 (2000) 54. Milioti N., Bermudez-Fajardo A., Penichet M.L., Oviedo- 37. Kowalski M., Konturek P.C., Pieniazek P., Karczewska E., Orta E.: Antigen-induced immunomodulation in the pathogen- Kluczka A., Grove R., Krakig W., Nasseri R., Thale J., Hahn E.G., esis of atherosclerosis. Clin. Dev. Immunol. ID 723539 (2008) Konturek S.J.: Prevalence of Helicobacter pylori infection in 55. Moen R.J., La Voi K.P., Zhang M., Blake M.J.: Clonidine- coronary lumen reduction after percutaneous coronary angio- Induced Heat-Shock Protein Expression in Rat Aorta. J. Car- plasty. Dig. Liver. Dis. 33, 222–229 (2001) diovasc. Pharmacol. Ther. 3, 171–184 (1998) 38. Krenke R.: Zakażenia górnych dróg oddechowych – wywołane 56. Niemiela S., Karttunen T., Korhonen T., Laara E., Karttunen R., przez drobnoustroje atypowe. Magazyn Otorynolaryngologiczny­ , Ikaheimo M., Kesaniemi Y.A.: Could Helicobacter pylori infec- XII (wydanie specjalne), 3–15 (2006) tion increase the risk of coronary heart disease by modifying 39. Kuch M.: Białka szoku cieplnego – czy mamy już do czynienia serum lipid concentration? Heart, 75, 573–575 (1996) z nowym markerem niedokrwienia? Kardiol. Pol. 67, 953–954 57. Okada T., Ayada K., Usui S., Yokota K., Cui J., Kawahara Y., (2009) Inaba T., Hirohata S., Mizuno M., Yamamoto D., Kusachi S., 40. Kutuk O., Basaga H.: Inflammation meets oxidation: NF-κB Matsuura E., Oguma K.: Antibodies against heat shock protein as mediator of initial lesion development in atherosclerosis. 60 derived from Helicobacter pylori: diagnostic implications in Trends Mol. Med. 9, 549–557 (2003) cardiovascular disease. J. Autoimmun. 29, 106–115 (2007) 41. Lanneau D., Brunet M., Frisan E., Solary E., Fontenay M., 58. Ostos M.A. Recalde D., Zakin M.M. Scott-Ajgara D.: Impli- Garrido C.: Heat shock proteins: essential proteins for apoptosis cation of natural killer T cell in atherosclerosis development regulation. J. Cell. Mol. Med. 12, 743–761 (2008) during a LPS-induced chronic inflammation. FEBS Lett. 519, 42. Laurila A., Bloigu A., Nayha S., Hassi J., Leinonen M., Saikku P.: 23–29 (2002) Association of Helicobacter pylori infection with elevated serum 59. Pająk A.: Zwalczanie choroby niedokrwiennej serca poprzez lipids. Atherosclerosis, 142, 207–210 (1999) modyfikację czynników ryzyka. Acta Angiol. 2, 111–122 (1996) 43. Lenzi C., Palazzuoli A., Giordano N., Alegente G., Gonnelli C., 60. Pawlikowska M., Deptuła W.: Białka szoku termicznego (HSPs Campagna M.S., Santucci A., Sozzi M., Papakostas P., Rollo F., – Heat Shock Proteins), a chlamydiozy i chlamydofilozy. Post. Nuti R., Figura N.: H. pylori infection and systemic antibodies Mikrobiol. 48, 213–219 (2009) to CagA and heat shock protein 60 in patients with coronary 61. Pawlus J., Rusak M., Chociej-Stypułkowska J., Dąbrowska M.: heart disease. World J. Gastroenterol. 12, 7815–7820 (2006) Parametry aktywacji płytek krwi i stężenie mieloperoksydazy, 44. Liao K.W., Lin C.S., Chen W.L., Yang C.T., Lin C.M., Hsu W.T., jako markery choroby niedokrwiennej serca. Pol. Merk. Lek. Lin Y.Y., Chiu Y.H., Huang K.C., Wu H.Y., Wu M.S., Wu C.J., 172, 259–262 (2010) CHOROBA NIEDOKRWIENNA SERCA A ZAKAŻENIA BAKTERYJNE H. PYLORI I C. PNEUMONIAE 259

62. Perschinka H., Mayr M., Millonig G., Mayerl C., van der Zee R., regulates phagocytosis of Helicobacter pylori. Pol. J. Microbiol. Morrison S.G., Morrison R.P., Xu Q., Wick G.: Cross-reactive 55, 95–101 (2006) B-cell epitopes of microbial and human heat shock protein 78. Svanholm C., Bandholtz L., Castanos-Velez E., Wigzell H.: 60/65 in atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23, Protective DNA immunization against Chlamydia pneumoniae. 1060–1065 (2003) Scand. J. Immunol. 51, 345–353 (2000) 63. Pockley A.G., Wu R., Lemne C., Kiessling R., de Faire U., 79. Szostak W.B., Cybulska B.: Otyłość wisceralna jako czynnik Frostegård J.: Circulating heat shock protein 60 is associated miażdżycy. Medycyna po Dyplomie, wyd. specjalne, 2–8 (1996) with early cardiovascular disease. Hypertension, 36, 303–307 80. Thom D.H., Grayston J.T., Siscovick D.S., Wang S.P., Weiss N.S., (2000) Daling J.R.: Association of prior infection with Chlamydia 64. Prohászka Z., Duba J., Lakos G., Kiss E., Varga L., Jánoskuti L., pneumoniae and angiographically demonstrated coronary Császár A., Karádi I., Nagy K., Singh M., Romics L., Füst G.: artery disease. JAMA, 268, 68–72 (1992) Antibodies against human heat-shock protein (hsp) 60 and 81. Tsan M.F., Gao B.: Heat shock protein and innate immunity. mycobacterial hsp65 differ in their antigen specificity and com- Cell. Mol. Immunol. 1, 274–279 (2004) plement-activating ability. Int. Immunol. 11, 1363–1370 (1999) 82. Tukaj S., Lipińska B.: Białka szoku termicznego w reumatoi- 65. Rabczyński M., Adamiec R.: Rola przewlekłego zakażenia i bia- dalnym zapaleniu stawów: przyjaciel czy wróg? Post. Hig. Med. łek HSP60/65 w miażdżycy zarostowej. Przegl. Lek. 64, 419–422 Dosw. 65, 427–436 (2011) (2007) 83. Udvarnoki K., Cervenak L., Uray K., Hudecz F., Kacskovics I., 66. Rabczyński M., Adamiec R., Olszewska-Roczniak J.: Przeciw­ Spallek R., Singh M., Füst G., Prohászka Z.: Antibodies against ciała anty-HSP 60/65 – rola w patogenezie miażdżycy, czynnik C-reactive protein cross-react with 60-kilodalton heat shock ryzyka rozwoju blaszki miażdżycowej. Adv. Clin. Exp. Med. 15, proteins. Clin. Vaccine Immunol. 14, 335–341 (2007) 933–939 (2006) 84. Unkelbach K., Gardemann A., Kostrzewa M., Philipp M., 67. Ridker P.M., Rifai N., Rose L., Buring J.E., Cook N.R.: Com- Tillmanns H., Haberbosch W.: A new promoter polymorphism parison of C-reactive protein and low-density lipoprotein cho- in the gene of lipopolysaccharide receptor CD14 is associated lesterol levels in the prediction of first cardiovascular events. with expired myocardial infarction in patients with low ath- N. Engl. J. Med. 347, 1557–1565 (2002) erosclerotic risk profile. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19, 68. Rudnicka K., Włodarczyk M., Moran A.P., Rechciński T., 932–938 (1999) Miszczyk E., Matusiak A., Szczęsna E., Walencka M., Rud- 85. Vahdat K., Jafari S. M., Pazoki R., Nabipour I.: Concurrent nicka W., Chmiela M.: Helicobacter pylori antigens as poten- increased high sensitivity C-reactive protein and chronic infec- tial modulators of lymphocytes’ cytotoxic activity. Microbiol. tions are associated with coronary artery disease: a population- Immunol. 56, 62–75 (2012) based study. Indian J. Med. Sci. 61, 124–126 (2007) 69. Rywik S., Broda G., Piotrowski W., Wągrowska H., Pola- 86. Varbiro S., Biro A., Cervenak J., Cervenak L., Singh M., kowska M., Pardo B.: Epidemiologia chorób układu krążenia Banhidy F., Sebestyen A., Füst G., Prohászka Z.: Human anti- – Program Pol-MONICA Warszawa, Kardiol. Pol. 44 (supl. II), 60 kD heat shock protein autoantibodies are characterized by 7–35 (1995) basic features of natural autoantibodies. Acta Physiol. Hung. 70. Saikku P., Leinonen M., Mattila K., Ekman M.R., Nieminen M.S., 97, 1–10 (2010) Mäkelä P.H., Huttunen J.K, Valtonan V.: Serological evidence 87. Veres A., Füst G., Smieja M., McQueen M., Horváth A., Yi Q., of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic Bíró A., Pogue J., Romics L., Karádi I., Singh M., Gnarpe J., coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet, Prohászka Z., Yusuf S.: Heart Outcomes Prevention Evaluation 2, 983–986 (1988) (HOPE) Study Investigators. Relationship of anti-60 kDa heat 71. Schett G., Xu Q., Amberger A., Van der Zee R., Recheis H., shock protein and anti-cholesterol antibodies to cardiovascular Willeit J., Wick G.: Autoantibodies against heat shock protein events. Circulation, 106, 2775–2780 (2002) 60 mediate endothelial cytotoxicity. J. Clin. Invest. 96, 2569– 88. Vreugdenhil A.C., Snoek A.M., van’t Veer C., Greve J.W., 2577 (1995) Buurman W.A.: LPS – binding protein circulates an association 72. Shamaei-Tousi A., Steptoe A., O’Donnell K., Palmen J., with apoB – containing lipoproteins and enhances endotoxin Stephens J. W., Hurel S.J., Marmot M., Homer K., D’Aiuto F., – LDL-VLDL interaction. J. Clin. Invest. 107, 225–234 (2001) Coates A.R., Humphries S.E., Henderson B.: Plasma heat shock 89. Xu Q., Kiechl S., Mayr M., Metzler B., Egger G., Oberhollen- protein 60 and cardiovascular disease risk: the role of psycho- zer F., Willeit J., Wick G.: Association of serum antibodies to social, genetic, and biological factors. Cell Stress Chaperones, heat-shock protein 65 with carotid atherosclerosis: clinical sig- 12, 384–392 (2007) nificance determined in a follow-up study. Circulation, 100, 73. Sheikine Y., Hansson G.K.: Chemokines and atherosclerosis. 1169–1174 (1999) Ann. Med. 36, 98–118 (2004) 90. Xu Q., Schett G., Perschinka H., Mayr M., Egger G., Oberhol- 74. Smith S.C., Greenland Ph., Grundy S.M.: Prevention Confer- lenzer F., Willeit J., Kiechl S., Wick G.: Serum soluble heat shock ence V. Beyond Secondary Preventio: Identifying the High-Risk protein 60 is elevated in subjects with atherosclerosis in a gen- Patient for primary prevention. Executive Summary. Circula- eral population. Circulation, 102, 14–20 (2000) tion, 4, 111–115 (2000) 91. Xu Q., Schett G., Seitz C. S., Hu Y., Gupta R. S., Wick G.: 75. Snoeckx L.H., Cornelussen R.N., Van Nieuwenhoven F.A., Surface staining and cytotoxic activity of heat-shock protein Reneman R.S., Van Der Vusse G.J.: Heat shock proteins and 60 antibody in stressed aortic endothelial cells. Circ. Res. 75, cardiovascular pathophysiology. Physiol. Rev. 81, 1461–1497 1078–1085 (1994) (2001) 92. Xu Q., Willeit J., Marosi M., Kleindienst R., Oberhollenzer F., 76. Soltys B.J., Gupta R.S.: Cell surface localization of the 60 kDa Kiechl S., Stulnig T., Luef G., Wick G.: Association of serum heat shock chaperonin protein (hsp60) in mammalian cells. antibodies to heat-shock protein 65 with carotid atherosclero- Cell. Biol. Int. 21, 315–320 (1997) sis. Lancet, 341, 255–259 (1993) 77. Strapagiel D., Grębowska A., Różalska B., Bąk-Romaniszyn L., 93. Xu X.H., Shah P.K., Faure E., Equils O., Thomas L., Fish- Czkwianianc E., Płaneta-Małecka I., Rechciński T., Rudnicka W., bein M.C., Luthinger D., Xu X.P., Rajavashisth T.B., Yano J., Chmiela M.: Natural mannose-binding lectin (MBL) down- Kaul S., Arditi M.: Toll-like receptor-4 is expressed by mac- 260 AGNIESZKA MATUSIAK, MAGDALENA CHMIELA

rophages in Marine and human lipid-rich atherosclerotic heat shock protein 60, hypertension, and diabetes on risk of plaques and upregulated by oxidized LDL. Circulation, 104, coronary heart disease in Chinese. Clin. Chem. 54, 1046–1052 3103–3108 (2001) (2008) 94. Ząbek J.: Rola antygenów bakteryjnych w indukcji procesów 97. Zhang X., He M., Cheng L., Chen Y., Zhou L., Zeng H., autoimmunizacyjnych związanych z patogenezą reaktywnego Pockley A.G., Hu F.B., Wu T.: Elevated heat shock protein 60 zapalenia stawów. Alergia Astma Immunologia, 4, 41–44 (1999) levels are associated with higher risk of coronary heart disease 95. Zhang W.L., Gao X.Q., Han J.X., Wang G.Q., Yue L.T.: Expres- in Chinese. Circulation, 118, 2687–2693 (2008) sions of heat shock protein (HSP) family HSP 60, 70 and 98. Zhu J., Quyyumi A.A., Rott D., Csako G., Wu H., Halcox J., 90alpha in colorectal cancer tissues and their correlations to Epstein S.E.: Antibodies to human heat-shock protein 60 are pathohistological characteristics. Ai Zheng, 28, 612–618 (2009) associated with the presence and severity of coronary artery 96. Zhang X., He M.A., Cheng L., Zhou L., Zeng H., Wang J., disease: evidence for an autoimmune component of athero- Wang F., Chen Y., Hu F.B., Wu T.: Joint effects of antibody to genesis. Circulation, 103, 1071–1075 (2001) POST. MIKROBIOL., OPORNOŚĆ BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE 2013, 52, 3, 261–271 http://www.pm.microbiology.pl NA ANTYBIOTYKI β-LAKTAMOWE WYNIKAJĄCA Z WYTWARZANIA β-LAKTAMAZ

Ewa Nikonorow1, Anna Baraniak1*, Marek Gniadkowski1

1 Zakład Mikrobiologii Molekularnej, Narodowy Instytut Leków, ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa Wpłynęło w grudniu 2012 r.

Spis treści: 1. Wprowadzenie. 2. Mechanizmy oporności bakterii na antybiotyki β-laktamowe. 3. Klasyfikacja β-laktamaz. 4. β-Laktamazy gatunkowo-specyficzne. 5. β-Laktamazy nabyte. 6. Ekspresja β-laktamaz. 7. Najważniejsze grupy β-laktamaz nabytych. 7.1. β-Laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym, ESBL. 7.2. Cefalosporynazy AmpC. 7.3. Karbapenemazy. 7.3.1. Karbapenemazy klasy A 7.3.2. Karbapenemazy klasy B. 7.3.3. Karbapenemazy klasy D. 8. Podsumowanie β-Lactamase-mediated resistance in Enterobacteriaceae Abstract: Production is β-Lactamase the major mechanism of resistance to β-lactams in Gram-negative bacteria. In recent years, resistance due to production of β-lactamases has been increasing at on alarming rate. It refers mostly to extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) that are the main problem in microorganisms of the family Enterobacteriaceae, conferring resistance to all penicillins, cephalosporins (except for cephamycins) and monobactams. Acquired cephalosporinases of the AmpC type also have become a significant factor of enterobacterial resistance to newer generation of β-lactams. The effect of AmpCs is largely strengthened by this mutational overexpression in such pathogens as Enterobacter spp. or Citrobacter freundii. β-Lactamase-mediated resistance to carbapenems in the members of the family Enterobacteriaceae has become a matter of highest concern over the last decade. It has been associated with various carbapenem- hydrolyzing enzymes, including the so-called KPC, MBL or OXA-48 types. Antimicrobial resistance in bacteria has been a key issue in public health, requiring constant monitoring at the hospital, country and global level. Contents: 1. Introduction. 2. Mechanisms of resistance to β-lactam antibiotics. 3. Classification of β-lactamases. 4. Natural β-lactamases. 5. Acquired β-lactamases. 6. Expression of β-lactamases. 7. Main groups of the acquired β-lactamases. 7.1. Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs. 7.2. AmpC-type cephalosporinases. 7.3. Carbapenemases. 7.3.1. Class A carbapenemases. 7.3.2. Class B carbapenemases. 7.3.3. Class D carbapenemases. 8. Conclusions

Słowa kluczowe: AmpC, β-laktamaza, Enterobacteriaceae, ESBL, karbapenemaza Key words: AmpC, β-lactamase, carbapenemase, Enterobacteriaceae, ESBL

1. Wprowadzenie oprócz podwyższenia ekspresji naturalnych genów oporności, mogą prowadzić też do modyfikacji miej- Szybki wzrost oporności bakterii na antybiotyki sca docelowego antybiotyku lub zamknięcia dróg jego stosowane w lecznictwie stanowi jeden z najpoważ- penetracji. Ponadto, efektywny horyzontalny transfer niejszych problemów współczesnej medycyny. Opor- genów powoduje pojawianie się w komórkach nowych ność bakterii może być naturalna (charakterystyczna genów oporności (kodujących różnorodne efektory), dla danego gatunku) lub nabyta (charakterystyczna dla przenoszonych na ruchomych elementach genetycz- danego szczepu drobnoustroju) i jest warunkowana róż- nych (elementy transpozycyjne, plazmidy, bakteriofagi). norodnymi mechanizmami. Oporność naturalna może Szczepy dysponujące opornością nabytą mają przewagę wynikać z braku w komórkach danego gatunku miejsca selekcyjną w warunkach silnej presji antybiotykowej. docelowego dla leku, obecności struktur ograniczają- Równoczesna ekspozycja na różne rodzaje antybiotyków cych możliwość jego dotarcia do celu lub funkcjono- prowadzi do selekcji tzw. szczepów wieloopornych, czyli wania konkretnych mechanizmów oporności, których dysponujących opornością na kilka grup terapeutycz- efektory (np. pompy, enzymy) kodowane są przez gatun- nych. Jednoczesna obecność różnych genów oporności kowo-specyficzne geny chromosomalne. Nie stanowi na tych samych elementach ruchomych ułatwia poja- ona poważnego problemu klinicznego, gdyż zazwyczaj wianie się takich szczepów [39, 43, 76, 78]. dotyczy jedynie niewielkich stężeń leków. Problem wzra- Istnieje pięć podstawowych strategii oporności bak- sta, gdy dzięki zjawiskom genetycznym dochodzi np. terii na antybiotyki, takich jak: do podwyższenia poziomu ekspresji naturalnych genów 1. inaktywacja enzymatyczna antybiotyków (hydro- oporności i powstania szczepów opornych na leczenie, liza, modyfikacje chemiczne, np. acetylacja); przy czym wówczas mamy już do czynienia z opornością 2. zmiany strukturalne miejsca działania leku (zmiany nabytą. Ten rodzaj oporności stanowi znacznie większe sekwencji aminokwasowej białka, modyfikacje, wyzwanie. Zmiany w chromosomalnym DNA komórki, np. metylacja);

* Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Molekularnej, Narodowy Instytut Leków, ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa; tel.: 22 851 43 88; fax: 22 841 33 67; e-mail: [email protected] 262 EWA NIKONOROW, ANNA BARANIAK, MAREK GNIADKOWSKI

3. zastąpienie oryginalnego miejsca docelowego nową w błonie zewnętrznej tych bakterii, przez co cząsteczki cząsteczką, pozbawioną powinowactwa do leku; β-laktamów wnikają w niższych stężeniach do prze- 4. zmniejszenie przepuszczalności osłon komórko- strzeni periplazmatycznej komórki. Druga strategia wych dla antybiotyku (błony zewnętrznej bakterii polega na aktywnym wypompowywaniu leku z komórki Gram-ujemnych); bakteryjnej, która może ulegać intensyfikacji wskutek 5. aktywne wypompowywanie leku z komórki [43, podwyższania ekspresji tzw. systemów pompowo-pory- 76, 78]. nowych, odpowiedzialnych za ten proces [43, 51]. Ostatnim z omawianych typów mechanizmów, o największym znaczeniu dla oporności na antybiotyki 2. Mechanizmy oporności bakterii β-laktamowe u pałeczek Gram-ujemnych, jest wytwa- na antybiotyki β-laktamowe rzanie β-laktamaz [44]. Enzymy te prawdopodobnie pochodzą od prekursorowych białek PBP; przypuszcza Antybiotyki β-laktamowe są największą i najbardziej się, że niektóre z nich mogą nadal pełnić bliżej nie- zróżnicowaną grupą antybiotyków, używaną do leczenia określoną rolę w procesie biosyntezy peptydoglikanu niemal wszystkich rodzajów zakażeń o rozległej etiolo- [49, 51]. Jednak podstawową funkcją β-laktamaz jest gii. W użyciu jest obecnie pięć typów β-laktamów, tj. ochrona bakterii przed działaniem β-laktamów, zarówno penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, karbapenemy tych, które są naturalnie produkowane i uwalniane do oraz inhibitory β-laktamaz, przy czym te ostatnie nie środowiska przez grzyby i inne bakterie (β-laktamazy są antybiotykami i stosowane są w lekach łączonych naturalne), jak i tych, które stosowane są przez czło- z penicylinami lub cefalosporynami. Mechanizm dzia- wieka w medycynie i innych obszarach aktywności łania β-laktamów polega na inhibicji kluczowych enzy- (β-laktamazy naturalne i nabyte) [39]. mów biosyntezy ściany komórkowej bakterii (peptydo- glikanu), tzw. białek PBP (Penicillin-Binding Proteins). Komórki bakterii o osłabionej strukturze ściany ulegają 3. Klasyfikacja β-laktamaz lizie, przez co β-laktamy zaliczane są do antybiotyków o działaniu bakteriobójczym [39, 43]. Oporność bakterii Zdecydowana większość β-laktamaz posiada serynę na β-laktamy jest warunkowana różnorodnymi mecha- w centrum aktywnym (β-laktamazy serynowe), a kata- nizmami, które klasyfikuje się w obrębie czterech zasad- lizowana przez nie hydroliza β-laktamów przebiega niczych strategii: dwuetapowo: najpierw w reakcji acylacji wytwarzany 1. wytwarzanie białek PBP o niskim powinowactwie jest ester serynowy, a następnie w wyniku jego hydrolizy do β-laktamów; (deacylacji) uwolniony zostaje produkt bez pierścienia 2. zmniejszanie przepuszczalności osłon komórko- β-laktamowego [39, 49, 51]. Drugi, mniej powszechny wych bakterii; mechanizm otwierania pierścienia β-laktamowego 3. wypompowywanie leków z komórki bakteryjnej; wykorzystywany jest przez tzw. metalo-β-laktamazy 4. wytwarzanie β-laktamaz – enzymów hydrolizują- i opiera się na interakcji antybiotyku z kationem cynku cych cząsteczki β-laktamów. w centrum aktywnym enzymu. Wytwarzanie β-laktamaz Pierwsza grupa mechanizmów, obecna zarówno jest jednym z intensywniej i najdłużej badanych mecha- u bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych, zwią- nizmów oporności bakterii na leki [9, 39]. zana jest z białkami PBP. Mechanizmy oporności zależne Zasadniczy zrąb różnorodności β-laktamaz, obej­ od tych białek są dwojakiego rodzaju. Pierwszy polega mujący wszystkie znane dzisiaj ich klasy i rodziny na modyfikacji naturalnych PBP tak, aby nie miały one powstał dawno przed wprowadzeniem do lecznictwa powinowactwa do β-laktamów, ale jednocześnie pełniły antybiotyków. Niezwykle krótki z ewolucyjnego punktu funkcje katalityczne w procesie wytwarzania peptydo- widzenia okres po wprowadzeniu antybiotyków do tera- glikanu. Modyfikacje te następują wskutek gromadzenia pii i innych dziedzin aktywności człowieka zaowoco- mutacji w genach pbp lub nabywania ich zmutowanych wał dalszym, bardzo przyspieszonym różnicowaniem fragmentów od innych organizmów i zastępowania nimi się tych enzymów. Obecnie w użyciu są dwa systemy homologicznych odcinków genów własnych. Drugi ro- klasyfikacji β-laktamaz, tzw. system funkcjonalny oraz dzaj związany jest z pozyskiwaniem obcego, komplet- system strukturalny [2, 9, 11,39]. Pierwszy, autorstwa nego genu kodującego białko PBP, które nie oddziałuje B u s h i J a c o b y’e g o, opiera się na porównaniu z cząsteczkami β-laktamów [43]. szybkości reakcji hydrolizy różnych β-laktamów (peni- Dwie kolejne strategie, typowe dla bakterii Gram- cylin, cefalosporyn, monobaktamów i karbapenemów) -ujemnych, polegają na ograniczeniu możliwości pene- oraz podatności β-laktamaz na inhibicję przez nie- tracji komórki bakteryjnej przez antybiotyk β-lak- które β-laktamy (typowe inhibitory β-laktamaz – kwas tamowy. Pierwsza z nich związana jest z likwidacją klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam, a także aztreo­ lub zmniejszeniem liczby tzw. kanałów porynowych nam i kloksacylinę) oraz EDTA i NaCl. Wyodrębnia OPORNOŚĆ BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE NA ANTYBIOTYKI Β-LAKTAMOWE 263 on cztery zasadnicze grupy funkcjonalne, oznaczone mów i grupuje β-laktamazy ze względu na ich pokre- cyframi od 1 do 4: wieństwo ewolucyjne. Analiza porównawcza sekwen- • Grupa 1 obejmuje β-laktamazy preferujące cefalospo- cji aminokwasowych β-laktamaz pozwoliła wyróżnić ryny, ale aktywne też względem penicylin i monobak- cztery klasy enzymów, oznaczone od A do D. Klasy A, tamów, słabo podatne na inhibicję kwasem klawulano- C i D to β-laktamazy serynowe, natomiast w klasie B wym, ale hamowane przez kloksacylinę. Tradycyjnie znalazły się MBL. Oba podziały β-laktamaz dobrze ze określa się je terminem „cefalosporynazy AmpC”. sobą korelują. Wszystkie enzymy tworzące funkcjonalną • Grupa 2 jest najliczniejsza, bardzo zróżnicowana grupę 1 stanowią strukturalną klasę C. Grupa 2 zawiera strukturalnie i funkcjonalnie, przez to podzielona na β-laktamazy klas A i D, natomiast grupa 3 odpowiada 12 podgrup. Są tu zarówno penicylinazy, jak i cefa- klasie B. Enzymy należące do funkcjonalnej grupy 4 nie losporynazy, o wąskim, szerokim, rozszerzonym lub zostały scharakteryzowane pod względem struktury. ekstremalnie szerokim spektrum substratowym, obej- mującym praktycznie wszystkie β-laktamy. Wspólną cechą tych enzymów jest podatność na hamowanie 4. β-Laktamazy gatunkowo-specyficzne przez inhibitory β-laktamowe (kwas klawulanowy, tazobaktam, sulbaktam), która może też ulegać reduk- Jak wspomniano wcześniej, β-laktamazy pojawiły cji w drodze mutacji. się na wczesnych etapach ewolucji bakterii. Wspólnymi • Grupa 3 obejmuje metalo-β-laktamazy (MBL), hydro- przodkami dzisiejszych β-laktamaz oraz białek PBP były lizujące penicyliny, cefalosporyny oraz karbapenemy. pierwotne PBP. W 1998 r. M a s s o v a i M o b a s h e r y MBL są hamowane przez EDTA, natomiast nie są zaproponowali hipotezę, w myśl której wszystkie klasy hamowane przez inhibitory β-laktamowe. β-laktamaz (A-D) wyewoluowały niezależnie od siebie z • Grupa 4 to zaledwie kilka enzymów stosunkowo innych prekursorów PBP, wraz z odpowiednimi klasami dawno zidentyfikowanych i słabo zbadanych; w naj- współczesnych białek PBP [49]. Zdecydowana więk- nowszej wersji systemu klasyfikacji funkcjonalnej szość pałeczek Gram-ujemnych posiada własne, typowe grupa ta została pominięta [39]. dla danego gatunku β-laktamazy, których geny zloka- Drugi system zaproponował A m b l e r [1]. Jest on lizowane są w chromosomalnym DNA. Wiele gatun- oparty na analizie sekwencji aminokwasowych enzy- ków bakterii Gram-ujemnych, m.in. Acinetobacter spp.,

Tabela I Wybrane elementy klasyfikacji funkcjonalnej i strukturalnej β-laktamaz (na podstawie Jacoby i Bush [32])

Grupa Klasa Wrażliwość na inhibitory funkcjo- struktu- Wybrane substraty klawulanian Wybrane enzymy EDTA nalna ralna tazobaktam 1 1 C cefalosporyny (I, II, III)* NIE NIE Cefalosporynazy AmpC E. coli i P. areuginosa, CMY-2, FOX-I, MIR-1, P99 le cefalosporyny (I, II, III, IV) NIE NIE GCl,CMY-37 2 2a A penicyliny z wyjątkiem izoksazolilowych TAK NIE PCI 2b penicyliny i cefalosporyny (I) TAK NIE SHV-1,TEM-1, TEM-2, TLE-1 (TEM-90) 2be penicyliny, cefalosporyny (I, II, III, IV), TAK NIE CTX-M-15, CTX-M-44 (TOHO-1), PER-1, monobaktamy SFO-1, SHV-5, TEM-10, TEM-26, VEB-1 2br penicyliny i cefalosporyny (I) NIE NIE TEM-30, TEM-76, TEM-103, SHV-10, SHV-26 2ber penicyliny, cefalosporyny (I, II, III, IV) NIE NIE TEM-50, TEM-68, TEM-89 i monobaktamy 2c karboksypenicyliny TAK NIE PSE-l,CARB-3 2d D penicyliny izoksazolilowe Słaba NIE OXA-1,OXA-10 2de penicyliny, cefalosporyny (I, II, III, IV) Słaba NIE OXA-ll,OXA-15 2df penicyliny, karbapenemy Słaba NIE OXA-23, OXA-48 2e A cefalosporyny (I, II, III, IV) TAK NIE CepA 2f karbapenemy TAK NIE IMI-1, KPC-2, KPC-3, SME-1, GES-1 3 3a B penicyliny, cefalosporyny (I, II, III, IV), NIE TAK IMP-1, LI, NDM-1, VIM-1 karbapenemy 3b karbapenemy NIE TAK CphA, Sfh-1

* liczbami rzymskimi oznaczono generacje cefalosporyn 264 EWA NIKONOROW, ANNA BARANIAK, MAREK GNIADKOWSKI

Pseudomonas spp. oraz pałeczki z rodziny Enterobac- ustrojów chorobotwórczych. W przypadku bakterii teriaceae, takie jak Escherichia coli, Enterobacter spp., Gram-ujemnych jest to przełom lat 1950 i 1960, kiedy Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella to wprowadzono pierwsze β-laktamy skierowane prze- morganii, Providencia stuartii i Providencia rettgeri, ciwko pałeczkom jelitowym (aminopenicyliny i cefalo- posiada gatunkowo-specyficzne cefalosporynazy AmpC. sporyny I generacji). Masowe stosowanie β-laktamów, Pomimo pewnych różnic gatunkowych, enzymy te cha- a także opracowywanie co pewien czas nowych ich rakteryzują się bardzo szerokim zakresem preferencji rodzajów i generacji (cefamycyny, oksyimino-cefalo- substratowych, obejmującym przede wszystkim więk- sporyny II, III i IV generacji, monobaktamy, inhibitory szość cefalosporyn (z wyjątkiem leków IV generacji), ale β-laktamaz, karbapenemy) były powodami wręcz lawi- też penicyliny i monobaktamy [10, 39, 43, 51]. Ekspresja nowego narastania oporności u pałeczek Gram-ujem- tych β-laktamaz najczęściej ma charakter indukowalny, nych od przełomu lat 1970. i 1980. Kolejne „kamie- ale u E. coli i Acinetobacter spp. zachodzi ona konstytu- nie milowe” tego procesu odzwierciedlają sekwencję tywnie na bardzo niskim poziomie i nie nadaje dzikim wprowadzania coraz to nowych β-laktamów [39, 51]. szczepom oporności na antybiotyki β-laktamowe [39, Uzyskanie samej oporności na te leki jest głównym kie- 43]. Różne zjawiska genetyczne (mutacje w genach regu- runkiem tej ewolucji (pojawianie się kolejnych warian- latorowych, mutacje i insercje elementów ruchomych tów β-laktamaz), ale ważne są także jej efektywność w obrębie promotorów) prowadzą do ekspresji konsty- (podnoszenie ekspresji lub parametrów kinetycznych tutywnej enzymów AmpC na zdecydowanie podwyż- β-laktamaz, sprzyjające tło genetyczne), ekonomika szonym poziomie. (poszerzanie spektrów substratowych) oraz rozprze- Niektóre pałeczki Gram-ujemne: Klebsiella spp., strzenianie w populacjach bakterii. Istnieje szereg Citrobacter koseri, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Kluy- mechanizmów wpływających na ewolucję β-laktamaz, vera spp., Chryseobacterium meningosepticum, Steno- a przez to i wytwarzających je szczepów, z których trophomonas maltophilia i inne wytwarzają charaktery- najważniejszymi są: mobilizacja naturalnych genów styczne enzymy należące do klasy A. Profile substra- β-laktamaz, mutacje strukturalne w genach β-laktamaz, towe tych β-laktamaz są bardzo zróżnicowane. Niektóre mutacyjne i rekombinacyjne zmiany regulatorowe pro- z nich głównie hydrolizują różnego rodzaju penicyliny wadzące do wzrostu ich ekspresji, koniugacyjny trans- i są to tzw. β-laktamazy o szerokim spektrum substra- fer genów β-laktamaz, wreszcie mutacyjne zmiany tła towym (np. enzymy typu SHV-1, LEN lub OKP Kleb- genetycznego podnoszące poziom oporności (defekty siella pneumoniae), a inne posiadają bardzo rozległy poryn, zwiększanie aktywności pomp) [24, 25, 48, 51]. zakres działania tzw. β-laktamaz o rozszerzonym spek- trum substratowym, ESBL (np. β-laktamazy K-OXY Klebsiella oxytoca lub KLU Kluyvera spp.), lub do nich 6. Ekspresja β-laktamaz zbliżony [39, 43]. U szeregu wymienionych gatunków naturalny poziom wytwarzania tych enzymów jest bar- Zakres i stopień oporności bakterii na antybiotyki dzo niski i nie nadają one drobnoustrojom oporności β-laktamowe, wywołanej wytwarzaniem β-laktamazy, na β-laktamy. Podobnie jednak jak w przypadku natu- wynikają z właściwości samego enzymu oraz ze sposobu ralnych cefalosporynaz AmpC, możliwe są modyfikacje i poziomu jego ekspresji. Bardzo duże znaczenie ma też genetyczne, prowadzące do istotnego podwyższenia ich tło genetyczne, czyli obecność innych mechanizmów ekspresji. U niektórych gatunków naturalne β-laktamazy oporności na β-laktamy w danym szczepie. Wytwarzanie klasy A wytwarzane są w sposób indukowalny [39]. β-laktamazy przez komórkę bakteryjną może odbywać Inną grupę enzymów kodowanych chromosomal- się stale na tym samym poziomie (ekspresja konstytu- nie stanowią MBL. Występują one np. u S. maltophilia, tywna) lub w sposób regulowany (ekspresja induko- Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila, C. meningosep- wana), zależny od obecności w środowisku bakterii ticum, Legionella gormanii, Caulobacter crescentus, Jan- odpowiednich dla danego gatunku i rodzaju enzymu thinobacterium lividum, czy Flavobacterium johnsoniae, induktorów β-laktamowych. Poziom ekspresji, zarówno i wykazują aktywność wobec penicylin, cefalosporyn konstytutywnej, jak i w stanie indukcji, może być bardzo i karbapenemów, przez co ich spektrum substratowe różny i wynika on przede wszystkim z wydajności trans- należy także określić jako bardzo szerokie [10, 43]. krypcji genu kodującego daną β-laktamazę. Transkryp- cja genu zależy głównie od siły promotora, a niekiedy też obecności pewnych elementów regulacyjnych, np. 5. β-Laktamazy nabyte attenuatorów transkrypcji. Ponadto, w niektórych szcze- pach bakterii dochodzi do zwiększenia liczby kopii genu Od momentu wprowadzenia β-laktamów do terapii β-laktamazy. Dlatego też ta sama β-laktamaza, nawet zakażeń, obserwuje się gwałtowne przyspieszenie ewo- w szczepach tego samego gatunku, może być wytwa- lucji oporności na te antybiotyki w populacjach drobno­ rzana na różnym poziomie [32, 39, 43]. OPORNOŚĆ BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE NA ANTYBIOTYKI Β-LAKTAMOWE 265

Jak wspomniano wyżej, przykładami enzymów ule- β-laktamaz, ESBL zostały zaklasyfikowane do dwóch gających ekspresji konstytutywnej na bardzo niskim podgrup grupy 2: podgrupy 2be („β-laktamazy o roz- poziomie są naturalne β-laktamazy AmpC E. coli i Aci- szerzonym spektrum substratowym hamowane przez netobacter spp. Dzikie szczepy tych drobnoustrojów są kwas klawulanowy”) oraz podgrupy 2de („β-laktamazy wrażliwe na wszystkie β-laktamy aktywne wobec pałe- o rozszerzonym spektrum substratowym hydrolizu- czek Gram-ujemnych. Z kolei K. pneumoniae wytwa- jące kloksacylinę”). Według podziału strukturalnego rza gatunkowo-specyficzne β-laktamazy o szerokim β-laktamaz należą one do klas A (podgrupa 2be) i D spektrum substratowym klasy A (typu SHV-1, LEN lub (podgrupa 2de). Są to enzymy o masie cząsteczkowej OKP) na poziomie wystarczającym do nadania szcze- około 30 kDa, w ich miejscu aktywnym znajduje się pom dzikim oporności na amino- i karboksypenicyliny. reszta serynowa [10]. Charakter indukowany ma natomiast ekspresja cefalo- Enzymy ESBL występują głównie jako nabyte, kodo- sporynaz AmpC charakterystycznych dla Enterobacter wane plazmidowo β-laktamazy. Geny kodujące ESBL spp., C. freundii, S. marcescens, M. morganii, P. stuartii zlokalizowane są często na plazmidach koniugacyj- i P. rettgeri, a także P. aeruginosa. Dzikie szczepy tych nych (np. IncFII, IncI), w tym także o szerokim zakre- gatunków są oporne na te β-laktamy, które są induk- sie gospodarza (np. IncA/C, IncL/M), przez co ule- torami i jednocześnie substratami AmpC, głównie gają szybkiemu rozprzestrzenianiu, również pomiędzy aminopenicyliny oraz cefalosporyny I i II generacji. szczepami należącymi do różnych gatunków [15, 29, 47, Dodatkowo, wskutek mutacji w genach regulatorowych, 59]. Ponadto, występują one w obrębie specyficznych ww. gatunki mogą wytwarzać β-laktamazy AmpC stale elementów genetycznych (transpozonów, modułów na wysokim poziomie, bez względu na obecność lub transpozycyjnych, kaset integronowych), co zapew- brak induktora. Stan trwałego odblokowania produk- nia im przenoszenie pomiędzy różnymi cząsteczkami cji AmpC określa się mianem „derepresji”. Zmutowane DNA, a często też wysoki poziom ekspresji [32, 39, 67]. szczepy z derepresją AmpC stają się oporne na wszystkie Jak zaznaczono wyżej, także niektóre gatunkowo-spe- β-laktamy, które są choćby „słabymi” substratami tych cyficzne β-laktamazy klasy A posiadają cechy ESBL. cefalosporynaz, czyli wszystkie penicyliny, cefalospo- Wytwarzane są one m.in. przez K. oxytoca (β-laktamazy ryny (z wyjątkiem leków IV generacji) oraz monobak- K2 lub K-OXY) [22, 26], Kluyvera spp. (KLU) [18, 30, tamy i jest to oporność niehamowana lub w niewielkim 65, 74], Serratia fonticola (SFO) [50], C. meningosepti- stopniu hamowana przez inhibitory β-laktamaz – kwas cum (CME) [6, 75] lub Rahnella aquatilis (RAHN) [5]. klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam. Częstość dere- Nabyte ESBL, zidentyfikowane po raz pierwszy presji i poziom wytwarzania enzymu w tym stanie zależy w 1983 r. [35, 36], są obecnie źródłem poważnych pro- od gatunku bakterii. Derepresja β-laktamaz AmpC, blemów klinicznych i epidemiologicznych na całym związana z bardzo wysokim poziomem produkcji tych świecie. Wytwarzane są przede wszystkim przez szpi- enzymów, najczęściej spotykana jest u Enterobacter talne szczepy pałeczek różnych gatunków z rodziny cloacae i C. freundii [32, 39, 43]. Enterobacteriaceae, choć w ostatnim okresie obserwuje Zdecydowana większość β-laktamaz nabytych, w tym się je także coraz częściej w szczepach wywołujących β-laktamaz o szerokim spektrum substratowym, ESBL, zakażenia pozaszpitalne, głównie u E. coli, ale także AmpC i MBL, których geny obecne są na plazmidach, u Salmonella i Shigella [12, 61]. Identyfikowane są rów- ulega ekspresji konstytutywnej [39, 43]. Jak już wcześ­ nież u niektórych pałeczek niefermentujących, zwłasz- niej wspomniano, poziom tej ekspresji zależy głównie cza P. aeruginosa i Acinetobacter baumannii [39]. od siły promotora genu kodującego β-laktamazę oraz Duża i stale rosnąca częstość występowania ESBL liczby kopii genu w komórce bakteryjnej. wśród izolatów klinicznych K. pneumoniae, która w skali pojedynczego oddziału lub szpitala, a nawet regionu lub kraju może osiągać 40–60% i więcej [21, 61], kon- 7. Najważniejsze grupy β-laktamaz nabytych sekwentnie zawęża możliwości terapeutyczne anty- biotyków β-laktamowych. Ponadto, brak skutecznego 7.1. β-Laktamazy o rozszerzonym spektrum leczenia wynika z faktu, że wiele izolatów ESBL+ substratowym, ESBL przejawiało w badaniach in vitro wrażliwość na szereg antybiotyków należących do spektrum substratowego ESBL to enzymy zdolne do hydrolizy wszystkich ESBL (zwłaszcza oksyimino-β-laktamów) ze względu penicylin, cefalosporyn (oprócz cefamycyn) i mono- na specyficzne cechy enzymu lub niższy poziom jego baktamów. Hydrolizują oksyimino-β-laktamy z szyb- ekspresji [39, 77]. Zastosowanie takich leków w terapii kością nie mniejszą niż 10% szybkości hydrolizy ben- kończyło się jednak często niepowodzeniem. Pierwsze zylopenicyliny. Aktywność większości tych β-laktamaz takie przypadki odnotowywano już w latach 1980. [7], hamowana jest przez kwas klawulanowy, sulbaktam przeprowadzona zaś pod koniec lat 1990. metaanaliza i tazobaktam [10, 39]. W systemie funkcjonalnym wykazała, że ryzyko niepowodzenia wynosi ok. 50% 266 EWA NIKONOROW, ANNA BARANIAK, MAREK GNIADKOWSKI w przypadku zastosowania cefalosporyny III generacji przepuszczalności błony zewnętrznej, wypompowywa- (np. ceftazydymu, cefotaksymu, ceftriaksonu) w lecze- nie leku). Niektóre z tych mechanizmów, np. wysoka niu zakażenia szczepem ESBL+, na którą ten szczep ekspresja cefalosporynazy AmpC, MBL, lub poważne wykazywał wrażliwość in vitro [62]. Ryzyko to zależało obniżenie przepuszczalności błony zewnętrznej, ze od wartości MIC (minimalnego stężenia hamującego) względu na niepodatność na działanie inhibitorów danej cefalosporyny i wzrastało jeszcze bardziej w przy- β-laktamaz, mogą maskować obecność ESBL [20]. padku szczepów, dla których wartość MIC znajdowała Innym poważnym problemem w zwalczaniu szczepów się bezpośrednio poniżej wartości granicznej dla szcze- o fenotypie ESBL+ jest też fakt, że są one często oporne pów wrażliwych i średniowrażliwych [61, 62]. Zjawisko również na antybiotyki z innych grup terapeutycznych, to związane jest z tzw. efektem inokulum, czyli wzrostu przez co jeszcze łatwiej mogą ulegać pozytywnej selekcji wartości MIC leku wraz ze wzrostem gęstości zawiesiny i utrzymywać się we florze szpitalnej oraz wywoływać bakterii (badania lekowrażliwości in vitro prowadzi się epidemie. Geny kodujące ESBL zlokalizowane są na przy stosunkowo niskiej gęstości zawiesiny bakterii). plazmidach, na których z reguły znajdują się też geny Ponadto, może dojść do selekcji mutantów o podwyż- warunkujące oporność np. na aminoglikozydy, ko-tri- szonej aktywności enzymatycznej ESBL lub zwiększo- moksazol, tetracykliny lub chloramfenikol [32]. nym poziomie ekspresji β-laktamazy. W związku z tym, potrzeby kliniczne i epidemiologiczne, spowodowały 7.2. Cefalosporynazy AmpC konieczność precyzyjnej identyfikacji fenotypu ESBL+ we wszystkich izolatach Enterobacteriaceae w ramach Aktywność cefalosporynaz AmpC, w tym ich bar- rutynowej diagnostyki laboratoryjnej. Zalecano więc, dzo rozległe spektrum substratowe, omówiono w części aby wszystkie izolaty kliniczne, u których stwierdzano poświęconej β-laktamazom gatunkowo-specyficznym. obecność ESBL, bez względu na szczegółowy obraz Od roku 1988r. obserwuje się również nabyte warianty antybiogramu, interpretować jako oporne na wszyst- tych enzymów i są one wytwarzane głównie przez kie substraty ESBL (z wyjątkiem izolatów pochodzą- K. pneumoniae, E. coli i P. mirabilis [31, 39, 63]. Za prze- cych z zakażeń dróg moczowych). W ostatnich latach niesienie naturalnych genów ampC odpowiedzialne są główne ośrodki zajmujące się standaryzacją metod elementy ISEcp1, ISCR1 oraz IS26. Ich źród­łem były diagnostyki mikrobiologicznej (European Committee chromosomy C. freundii, Enterobacter spp., M. morganii for Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST, oraz i innych bakterii, które dały początek kilku rodzinom Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI) dokonały nabytych AmpC, takim jak np. MIR, CMY-2, DHA, istotnych zmian w zakresie diagnostyki ESBL. Poprzez ACC, MOX, czy FOX [17, 31, 63]. Najbardziej rozpo- zaostrzenie kryteriów oceny wrażliwości pałeczek wszechnione są β-laktamazy z rodziny CMY-2, pocho- Enterobacteriaceae na oksyimino-cefalosporyny, nie- dzące od AmpC C. freundii [4, 9, 33]. W odróżnieniu mal wszystkie szczepy ESBL+ są oporne na tę grupę od swoich indukowanych prekursorów, większość leków i w związku z tym nie ma już potrzeby ich rekla- cefalosporynaz nabytych wytwarzana jest w sposób syfikacji w razie wykrycia tego mechanizmu oporno- konstytutywny, ponieważ mobilizacji najczęściej ulegał ści. Obecnie wykrywanie ESBL prowadzi się wyłącznie jedynie gen ampC, bez towarzyszącego mu na chro- do celów epidemiologicznych oraz kontroli zakażeń, mosomie genu regulatorowego ampR. Nabyte AmpC i służą temu różne metody (np. test dwóch krążków, nadają szczepom oporność na penicyliny, cefalosporyny DDST – double-disc synergy test; E-test), wszystkie jed- (z wyjątkiem IV generacji), monobaktamy i połączenia nak sprowadzające się do stwierdzenia znaczącego obni- β-laktamów z inhibitorami [31, 63]. Jak w przypadku żenia wrażliwości badanego szczepu na przynajmniej innych β-laktamaz, poziom oporności szczepów zależy jeden z markerowych oksyimino-β-laktamów (ceftazy- od poziomu ekspresji enzymu [63, 17]. W sensie kli- dym, cefotaksym, ceftriakson, cefpodoksym, cefepim, nicznym szczepy wytwarzające nabyte AmpC są równie aztreonam) i wykazania wpływu inhibitora β-laktamaz groźne, jak szczepy ESBL+, jednak w sensie epidemiolo- (kwasu klawulanowego) na ten efekt [20]. Diagnostykę gicznym stanowią one mniejsze zagrożenie ze względu ESBL utrudnia różnorodność fenotypów oporności na znacznie mniejszą częstość występowania [31, 63]. szczepów ESBL+ na β-laktamy, której jedynie wycinkiem jest wspomniana wyżej bardzo niska oporność in vitro 7.3. Karbapenemazy części szczepów na wybrane substraty ESBL. Fenotypy oporności szczepów wytwarzających ESBL zależą od W ciągu ostatnich dziesięciu lat największy niepo- wielu czynników, m.in. szczegółowych preferencji sub- kój budzą β-laktamazy zdolne do hydrolizy karbapene- stratowych konkretnych wariantów ESBL, stopnia ich mów. Karbapenemy to jedna z najnowszych generacji podatności na działanie inhibitorów, poziomu aktyw- β-laktamów, wprowadzona do lecznictwa w połowie ności enzymatycznej i ekspresji oraz obecności innych lat 1980, o najszerszym zakresie działania spośród mechanizmów oporności (inne β-laktamazy, obniżenie wszystkich antybiotyków, dobrych parametrach farma- OPORNOŚĆ BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE NA ANTYBIOTYKI Β-LAKTAMOWE 267 kologicznych i – co szczególnie ważne – niehydrolizo- w obrębie transpozonu Tn4401 z grupy Tn3 [54], a wraz wana przez ESBL i AmpC. Szybkie rozprzestrzenianie z nim na plazmidach różnych typów (np. IncFIIK). Wiele się szczepów wytwarzających ESBL spowodowało, że z tych plazmidów ma zdolność do koniugacji, jednak karbapenemy stały się lekami „ostatniej szansy” w lecze- jej wydajność jest stosunkowo niewielka [3, 16, 38]. niu ciężkich zakażeń wywoływanych przez pałeczki Drobnoustroje KPC+ swój „sukces” epidemiologiczny Gram-ujemne, zwłaszcza na oddziałach intensywnej zawdzięczają przede wszystkim rozprzestrzenianiu klo- terapii [43]. Nieuzasadnione ich stosowanie przyniosło nalnemu i związane jest to z tzw. hiperepidemicznym negatywne skutki w postaci selekcji szczepów opornych, (o wysokim potencjale epidemicznym) klonem K. pneu- najpierw dzięki mechanizmom ograniczającym trans- moniae ST258, który najpierw pojawił się w USA, potem port leków, a od 1988 r. także wytwarzaniu β-laktamaz został przeniesiony do Izraela, Grecji, a wreszcie dotarł hydrolizujących karbapenemy. Oba rodzaje oporności do wielu miejsc na całym niemal świecie [55, 57]. początkowo pojawiły się u niefermentujących pałeczek W wymienionych krajach, a także w Polsce, klon ten P. aeruginosa [39, 51, 41], ale w latach 1990. zaczęto jest zdecydowanie dominujący [3]. Wszystkie wymie- obserwować także szczepy Enterobacteriaceae z naby- nione czynniki powodują, że szczepy KPC+ uważa się tymi karbapenemazami klasy B, tzw. MBL [44, 58, 42]. dziś powszechnie za jedno z największych wyzwań dla W latach 2000. lawinowy wzrost izolacji szczepów zdrowia publicznego w dziedzinie zakażeń bakteryjnych, wytwarzających karbapenemazy w niektórych regio- medycyny (terapia), epidemiologii (zapobieganie, era- nach świata, coraz częstsze przypadki przenoszenia wraz dykacja) oraz mikrobiologii (wykrywanie, interpretacja z pacjentami do innych krajów, wreszcie pojawianie się wyniku) [8, 40, 55, 57]. Niewątpliwie są one od 2008 r. coraz to nowych typów tych enzymów spowodowało, że największym problemem w tym zakresie w Polsce, kiedy jest to obecnie najważniejszy temat w dziedzinie leko- to po raz pierwszy zidentyfikowano szczep KPC+ [3]. oporności drobnoustrojów. Narastanie wielooporności drobnoustrojów wytwarzających karbapenemazy pro- 7.3.2. Karbapenemazy klasy B wokuje do stawiania pytań o przyszłość terapii zaka- żeń [14, 40]. Karbapenemazy to enzymy o szerokich, Wspominane już wcześniej enzymy klasy B (grupy 3), a nawet możliwie najszerszych spektrach substratowych, czyli metalo-β-laktamazy (metallo-β-lactamases; MBL) przez co ta często używana nazwa w pewnym sensie są specyficzną grupą β-laktamaz, które nie posiadają jest myląca; oddaje ona jednak to, co w ich aktywno- reszty serynowej w centrum aktywnym, wymagają nato- ści jest najważniejsze [8, 19, 40, 53, 55–57, 68, 72, 80]. miast jonów cynku jako kofaktorów reakcji hydrolizy Zdumiewająca jest różnorodność strukturalno-ewo- pierścienia β-laktamowego. Z tego powodu są hamo- lucyjna karbapenemaz, obejmująca wszystkie cztery wane przez EDTA i inne chelatory jonów dwuwartoś­ klasy strukturalne β-laktamaz, przede wszystkim jednak ciowych, pozostają natomiast niewrażliwe na inhibitory klasy A, B i D. β-laktamowe. Są to najbardziej wyspecjalizowane i naj- aktywniejsze karbapenemazy, ponadto, jest to jedyna 7.3.1. Karbapenemazy klasy A klasa β-laktamaz, której wszyscy przedstawiciele wyka- zują zdolność do hydrolizy karbapenemów. Spektrum Najważniejsze karbapenemazy klasy A (podgrupa 2f) substratowe tych enzymów obejmuje również wszystkie to enzymy z rodziny KPC (Klebsiella pneumoniae car- penicyliny i cefalosporyny, a MBL nie rozkładają tylko bapenemase), izolowane od 1996 r. w USA. Pochodze- monobaktamów [11, 42, 68, 72, 80]. U bakterii środo- nie ewolucyjne tych β-laktamaz nie jest znane, nato- wiskowych odkryto wiele gatunkowo-specyficznych miast, zgodnie z nazwą, najczęściej obserwuje się je MBL, jednak żadna z nich nie mogła być prekursorem w szczepach K. pneumoniae, choć do chwili obecnej obserwowanych nabytych enzymów tej grupy. Pierwsze zidentyfikowano je również w wielu innych gatunkach nabyte MBL pojawiły się u Gram-ujemnych pałeczek Enterobacteriaceae, a nawet Pseudomonas spp. i innych niefermentujących P. aeruginosa (1988 r. w Japonii) i do pałeczkach niefermentujących. Enzymy z tej rodziny, dzisiaj są one najczęściej wytwarzane przez ten gatunek których dzisiaj znamy już 12, posiadają najszersze spek- bakterii. Od połowy lat 1990. na Dalekim Wschodzie trum substratowe ze wszystkich β-laktamaz: hydrolizują (np. Japonii, Korei, Tajwanie, Chinach), a od 2001 r. one wszystkie stosowane klinicznie β-laktamy, choć w Europie obserwuje się też szczepy Enterobacteriaceae nie zawsze z taką samą wydajnością (najaktywniejsze MBL+. Najważniejszymi rodzinami nabytych MBL są są względem penicylin i cefalosporyn I generacji) [11, enzymy IMP i VIM, występujące zarówno u pałeczek

55, 57, 72]. Duże znaczenie dla wysokiej oporności niefermentujących, jak i jelitowych. Geny blaIMP i blaVIM szczepów ma obecność dodatkowych mechanizmów istnieją zawsze w postaci kaset włączonych w obręb inte- (defekty poryn, wytwarzanie dodatkowo ESBL), co jest gronów, głównie klasy 1. Integrony te mogą być z kolei zjawiskiem równie częstym, jak oporność na inne grupy zlokalizowane w transpozonach (np. Tn21) i wraz z nimi leków (wielooporność) [16, 34]. Geny blaKPC lokują się przenosić się między cząsteczkami DNA [68, 72, 80]. 268 EWA NIKONOROW, ANNA BARANIAK, MAREK GNIADKOWSKI

W Europie problem Enterobacteriaceae MBL+ szybko nia 2010]. Warto nadmienić, że w 2011 r. pierwszy szczep przybrał zatrważające rozmiary w Grecji, gdzie w ciągu E. coli NDM+ wyizolowano w Polsce u pacjenta przenie- pięciu lat szczepy K. pneumoniae wytwarzające enzym sionego ze szpitala w jednym z krajów środkowo-afry- VIM-1 stanowiły ok. 50% populacji tego gatunku w śro- kańskich [M. Gn i a d k o w s k i, J. F i e t t, A. B a r a - dowiskach oddziałów intensywnej terapii [79]. U pod- n i a k, R. I z d e b s k i, D. Ż a b i c k a, K. Fi l c z a k, łoża tego procesu było rozprzestrzenianie się kilku W. Hr y n i e w i c z; dane niepublikowane]. klonów K. pneumoniae, ale też intensywny transfer plazmidów (typu IncN) [23, 52]. Sytuacja ta uwidocz- 7.3.3. Karbapenemazy klasy D niła, jak wielkie zagrożenie niesie narastanie lekoopor- ności bakterii chorobotwórczych, w przypadku gdy nie β-Laktamazy hydrolizujące karbapenemy klasy D zostaną przedsięwzięte energiczne działania zapobie- (podgrupa 2df), czyli tzw. enzymy CHDL (carbape- gawcze na poziomach lokalnym i państwowym. Drob- nem-hydrolyzing class D β-lactamases) spotykane są noustroje wytwarzające MBL z rodziny VIM pojawiły się od początku lat 1980. u przedstawicieli rodzaju niefer- później w Hiszpanii i innych krajach Europy, niekiedy w mentujących pałeczek Acinetobacter i u tych drobno- wyniku przeniesienia pacjenta ze szpitala w Grecji [27]. ustrojów stanowią główne źródło oporności na karba- W 2010 r. wielki rozgłos zyskała sprawa identyfi­ka­ penemy [66]. W 2001 r. pojawił się w Turcji ich nowy cji nowego rodzaju MBL – enzymu NDM-1, wykrytego rodzaj, OXA-48, związany wyłącznie z Enterobacteria- w wieloopornym szczepie K. pneumoniae w Szwecji ceae, zwłaszcza K. pneumoniae, ale też E. coli, E. cloacae u pacjenta, który wcześniej hospitalizowany był w In- i innymi gatunkami [57]. CHDL mają stosunkowo diach. W ślad za pierwszym doniesieniem pojawiły się słabą aktywność wobec karbapenemów, a poza nimi kolejne prace ukazujące niezwykłe rozprzestrzenienie hydrolizują jeszcze tylko penicyliny i cefalosporyny szczepów NDM-1+ różnych gatunków Enterobacteria- I generacji [11, 66]. Niemniej, wysoka ekspresja i czę- ceae w Indiach, Pakistanie i Bangladeszu (także w środo- sta obecność licznych innych mechanizmów oporności wisku pozaszpitalnym) oraz wskazujących wymienione (w tym wytwarzanie ESBL) powoduje, że szczepy OXA- kraje jako źródło tych szczepów przeniesionych do Wiel- 48+ są, podobnie do KPC+ i MBL+, wysoce oporne na kiej Brytanii i szeregu różnych państw europejskich, wszystkie β-laktamy i wiele innych grup leków [13]. Gen

USA, Australii, krajów Zatoki Perskiej i Afryki [37, 56, blaOXA-48 leży w transpozonie Tn1999, utworzonym przez 82]. Szczepy NDM+ są z reguły wysoce oporne i – tak dwie sekwencje IS1999, ale blisko z nim spokrewniony jak KPC+ – wielooporne [56]. Geny blaNDM, tworzące gen blaOXA-181 jest położony w bezpośrednim pobliżu operon wraz z genem opor­ności na bleomycynę (bleMBL), ISEcp1 [13, 70]. Koniugacyjny transfer specyficznej położone są obok elementu ISAba125, który prawdopo- grupy plazmidów uważany jest za główny mechanizm dobnie odpowiedzialny był za ich mobilizację z chromo- rozprzestrzeniania się OXA-48 w populacjach Entero- somu nieznanego gatunku. Charakter sekwencji ISAba1 bacteriaceae [13]. Szczepy z β-laktamazami typu OXA-48 oraz kilka innych przesłanek sugerują, że niefermentu- są kolejnym przykładem szybkiego przenikania do jąca pałeczka A. baumannii mogła być pierwszym gatun- Europy niebezpiecznych drobnoustrojów z regionów kiem, który nabył geny blaNDM i stąd dopiero nastąpiło endemicznych, którymi są w tym przypadku głównie przeniesienie do rodziny Enterobacteriaceae (szczepy kraje wschodniej i południowej części basenu Morza A. baumannii NDM+ są stosunkowo często izolowane Śródziemnego. Szczepy OXA-48+ z Turcji i północnej w niektórych krajach). Obecność blaNDM w plazmidach Afryki (Egipt, Maroko) napływają do Europy i wywo- o wysokim potencjale koniugacyjnym (IncN, IncL/M, łują epidemie szpitalne we Francji, Holandii, Niem- IncA/C, IncFII) sprawia, że transfer horyzontalny jest czech, Hiszpanii i innych krajach. Ostatnio również głównym sposobem rozprzestrzeniania się karbapene- stwierdzono pojawienie się szczepów Enterobacteriaceae maz NDM wśród bakterii, przy czym wielkie znacze- wytwarzających bardzo podobne enzymy: OXA-181 nie ma tu również wysoka aktywność transpozycyjna w Indiach i OXA-204 w Tunezji [27, 56, 69]. elementów zawierających blaNDM („epidemia transpo- zonu”) [64]. W ramach wspomnianego wcześniej roz- głosu medialnego, w którym K. pneumoniae NDM-1+ 8. Podsumowanie nazwano „superbakterią”, po raz pierwszy powszechniej uświadomiono sobie wymiar ekonomiczny i nawet spo- Problematyka oporności bakterii chorobotwórczych łeczno-polityczny narastania oporności bakterii na anty- na antybiotyki stała się jednym z najbardziej palących biotyki w dzisiejszym świecie. Wspomniane doniesienia wyzwań dla medycyny zakażeń i zdrowia publicznego uderzyły bowiem w intensywnie rozwijającą się, nową w ostatnich dekadach. Szacuje się, że krajach Unii Euro- gałąź gospodarki niektórych krajów, czyli rynek tanich pejskiej lekooporność drobnoustrojów jest przyczyną usług medycznych [60, 81] [R o b e r t s M.: New ‘super- śmierci ok. 25 000 osób rocznie, ponadto, zwiększa ona bug’ found in UK hospitals. BBC News Health, 11 sierp- też znacznie koszty opieki zdrowotnej i koszty społeczne OPORNOŚĆ BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE NA ANTYBIOTYKI Β-LAKTAMOWE 269

[73]. Wytwarzanie β-laktamaz hydrolizujących antybio- third-generation cephalosporins during nosocomial outbreak of tyki β-laktamowe nowych generacji niewątpliwie należy multiresistant Klebsiella pneumoniae. Lancet, 2, 302–306 (1987) obecnie do najgroźniejszych mechanizmów oporności 8. Bush K.: Alarming β-lactamase-mediated resistance in multi­ drug-resistant Enterobacteriaceae. Curr. Opin. Microbiol. 13, bakterii na leki. Głównym problemem jest pojawianie 558–564 (2010) się i rozprzestrzenianie szczepów pałeczek Gram-ujem- 9. Bush K., Fisher J.F.: Epidemiological expansion, structural stu­ nych, zarówno jelitowych z rodziny Enterobacteria- dies, and clinical challenges of new β-lactamases from gram- ceae jak i niefermentujących, wytwarzających enzymy negative bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 65, 455–478 (2011) nabyte, takie jak ESBL, AmpC i karbapenemazy. Szczepy 10. Bush K., Jacoby G.A., Medeiros A.A.: A functional classifica- tion scheme for β-lactamases and its correlation with molecular te wykazują oporność także na leki nie β-laktamowe. structure. Antimicrob Agents Chemother. 39, 1211–1233 (1995) Europejskie Centrum Kontroli Chorób, ECDC (Euro- 11. Bush K., Jacoby G.A.: Updated functional classification of β-lac- pean Centre for Disease Control), wyróżnia wśród nich tamases. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 969–976 (2010) szczepy wielooporne, czyli niewrażliwe na co najmniej 12. Canton R., Novais A., Valverde A., Machado E., Peixe L., trzy grupy leków (multi-drug resistant, MDR), szczepy Baquero F., Coque T.M.: Prevalence and spread of extended- spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in Europe. o rozszerzonej wielooporności (extensively drug-resi- Clin. Microbiol. Infect. 14 (Suppl. 1), 144–153 (2008) stant, XDR) oraz szczepy całkowicie oporne (pandrug- 13. Carrër A., Poirel L., Yilmaz M., Akan O.A., Feriha C., Cuzon G., -resistant, PDR) [46]. Zaliczane one są do tzw. „pato- Matar G., Honderlick P., Nordmann P.: Spread of OXA-48-en- genów alarmowych”, których pojawienie się powinno coding plasmid in Turkey and beyond. Antimicrob. Agents prowadzić do wdrażania zaostrzonych procedur kontroli Chemother. 54, 1369–1373 (2010) zakażeń. Niezwykle ważna jest ich niezwłoczna i wia- 14. Cohen M. L.: Epidemiology of drug resistance: implications for a post-antimicrobial era. Science, 257, 1050–1055 (1992) rygodna identyfikacja w laboratoriach mikrobiologicz- 15. Coque T. M., Novais A., Carattoli A., Poirel L., Pitout J., Peixe L., nych. Znaczące ograniczenie lub – niekiedy – całkowity Baquero F., Canton R., Nordmann P.: Dissemination of clonally brak opcji terapeutycznych wobec tak istotnych czynni- related Escherichia coli strains expressing extended-spectrum ków zakażeń stanowi z oczywistych względów wielkie β-lactamase CTX-M-15. Emerg. Infect. Dis. 14, 195–200 (2008) zagrożenie dla zdrowia publicznego. 16. Cuzon G., Naas T., Truong H., Villegas M.V., Wisell K., Carmeli Y., Gales A.C., Navon-Venezia S., Quinn J.P., Nord- mann P.: Worldwide diversity of Klebsiella pneumoniae that Podziękowania produces β-lactamase bla gene. Emerg. Infect. Dis. 16, Powstanie tej publikacji było możliwe dzięki częściowemu KPC-2 1349–1356 (2010) wsparciu z funduszu programu zdrowotnego Ministerstwa Zdrowia 17. D’Andrea M. M., Literacka E., Zioga A., Giani T., Baraniak A., „Narodowy Program Ochrony Antybiotyków” (NPOA). Fiett J., Sadowy E., Tassios P. T., Rossolini G. M., Gniad- kowski M., Miriagou V.: Evolution of a multi-drug-resistant Proteus mirabilis clone with chromosomal AmpC-type cephalo- Piśmiennictwo sporinases spreading in Europe. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 2735–2742 (2011) 1. Ambler R. P., Coulson A. F., Frere J. M., Ghuysen J. M., Joris B., 18. Decousser J.W., Poirel L., Nordmann P.: Characterization Forsman M., Levesque R. C., Tiraby G., Waley S. G.: A stand- of a chromosomally encoded extended-spectrum class A ard numbering scheme for the class A β-lactamases. Biochem. β-lactamase from Kluyvera cryocrescens. Antimicrob. Agents J. 276, 269–270 (1991) Chemother. 45, 3595–3598 (2001) 2. Ambler R. P.: The structure of β-lactamases.Philos. Trans. R. Soc. 19. Deshpande P., Shetty A., Kapadia F., Hedge A., Soman R., Lond. B, 289, 321–331 (1980) Rodrigues C.: New Delhi metallo 1: have carbapenems met 3. Baraniak A., Grabowska A., Izdebski R., Fiett J., Herda M., their doom? Clin. Infect. Dis. 51, 1222 (2010) Bojarska K., Zabicka D., Kania-Pudlo M., Mlynarczyk G., 20. Drieux L., Brossier F., Sougakoff W., Jarlier V.: Phenotypic Zak-Pulawska Z., Hryniewicz W., Gniadkowski M., the detection of extended-spectrum β-lactamase production in KPC-PL Study Group: Molecular characteristics of KPC-pro- Enterobacteriaceae: review and bench guide. Clin. Microbiol. ducing Enterobacteriaceae at the early stage of their dissemina- Infect. 14 (Suppl. 1), 90–103 (2008) tion in Poland, 2008–2009. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 21. Empel, J., Baraniak A., Literacka E., Mrówka A., Fiett J., 5493–5499 (2011) Sadowy E., Hryniewicz W., Gniadkowski M.: Molecular survey 4. Barlow M., Hall B.G.: Origin and evolution of the AmpC of β-lactamases conferring resistance to newer β-lactams in β-lactamases of Citrobacter freundii. Antimicrob. Agents Chem- Enterobacteriaceae isolates from Polish hospitals. Antimicrob. other. 46, 1190–1198 (2002) Agents Chemother. 52, 2449–2454 (2008) 5. Bellais S., Poirel L., Fortineau N., Decousser, J.W., Nordmann P.: 22. Fournier B., Roy P.H.: Variability of chromosomally encoded Biochemical-genetic characterization of the chromosomally β-lactamases from Klebsiella oxytoca. Antimicrob. Agents Chem- encoded extended-spectrum class A β-lactamase from Rahnella other. 41, 1641–1648 (1997) aquatilis. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2965–2968 (2001) 23. Giakkoupi P., Xanthaki A., Kanelopoulou M., Vlahaki A., 6. Bellais S., Poirel L., Naas T., Girlich D., Nordmann P.: Genetic- Miriagou V., Kontou S., Papafraggas E., Malamou-Lada H., biochemical analysis and distribution of the Ambler class A Tzouvelekis L.S., Legakis N.J., Vatopoulos A.C.: VIM-1 Metallo- β-lactamase CME-2, responsible for extended-spectrum cepha­ β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae strains in Greek losporin resistance in Chryseobacterium (Flavobacterium) hospitals. J. Clin. Microbiol. 41, 3893–3896 (2003) meningosepticum. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1–9 (2000) 24. Gniadkowski M.: Evolution and epidemiology of extended- 7. Brun-Buisson C., Legrand P., Philippon A., Montravers F., spectrum β-lactamases (ESBLs) and ESBL-producing micro- Ansquer M., Duval J.: Transferable enzymatic resistance to organisms. Clin. Microbiol. Infect. 7, 597–608 (2001) 270 EWA NIKONOROW, ANNA BARANIAK, MAREK GNIADKOWSKI

25. Gniadkowski M.: Evolution of extended-spectrum β-lactamases tory Medicine, wyd. 4, red. V. Lorian, Williams & Wilkins, USA, (ESBLs) by mutation. Clin. Microbiol. Infect. 14 (Suppl. 1), 2000, s. 502 11–32 (2008) 44. Livermore D.M., Woodford N.: The β-lactamase threat in 26. Granier S.A., Leflon-Guibout V., Goldstein F.W., Nicolas- Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter. Trends Chanoine M.H.: New Klebsiella oxytoca β-lactamase genes Microbiol. 14, 413–420 (2006) bla(OXY-3) and bla(OXY-4) and a third genetic group of 45. Luzzaro F., Mezzatesta M., Mugnaioli C., Perilli M., Stefani S., K. oxytoca based on bla(OXY-3). Antimicrob. Agents Chemother. Amicosante G., Rossolini G.M., Toniolo A.: Trends in produc- 47, 2922–2928 (2003) tion of extended-spectrum β-lactamases among enterobacteria 27. Grundmann H., Carmeli Y. i wsp.: Carbapenem-non-suscep­ of medical interest: report of the second Italian nationawide tible Enterobacteriaceae in Europe: conclusions from a meeting survey. J. Clin. Microbiol. 44, 1659–1664 (2006) of national experts. Euro. Surveill. 15, 19711 (2010) 46. Magiorakos A.P., Monnet D.L. i wsp.: Multidrug-resistant, exten- 28. Hernández J.R., Martínez-Martínez L., Cantón R., Coque T.M., sively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an inter- Pascual A., the Spanish Group for Nosocomial Infections national export proposal for interim standard definitions for (GEIH): Nationwide study of Escherichia coli and Klebsiella acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect. 18, 268–281 (2012) pneumoniae producing extended-spectrum β-lactamases in 47. Marcade G., Deschamps C., Boyd A., Gautier V., Picard B., Spain. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 2122–2125 (2005) Branger C., Denamur E., Arlet G.: Replicon typing of plasmids 29. Hopkins K.L., Liebana E., Villa L., Batchelor M., Threlfall E.J., in Escherichia coli producing extended-spectrum β-lactamases. Carattoli A.: Replicon typing of plasmids carrying CTX-M or J. Antimicrob. Chemother. 63, 67–71 (2009) CMY β-lactamases circulating among Salmonella and Escheri- 48. Martínez-Martínez L.: Extended-spectrum β-lactamases and chia coli isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 3203–3206 the permeability barrier. Clin. Microbiol. Infect. 14 (Suppl. 1), (2006) 82–89 (2008) 30. Humeniuk C., Arlet G., Gautier V., Grimont P., Labia R., Philip- 49. Massova I., Mobashery S.: Kinship and diversification of bacte- pon A.: β-lactamases of Kluyvera ascorbata, probable progeni- rial penicillin-binding proteins and β-lactamases. Antimicrob. tors of some plasmidencoded CTX-M types. Antimicrob Agents Agents Chemother. 42, 1–17 (1998) Chemother. 46, 3045–3049 (2002) 50. Matsumoto Y., Inoue M.: Characterization of SFO-1, a plasmid- 31. Jacoby G.A.: AmpC β-lactamases. Clin. Microbiol. Rev. 22, mediated inducible class A β-lactamase from Enterobacter cloa- 161–182 (2009) cae. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 307–313 (1999) 32. Jacoby G.A., Bush K.: β-Lactam Resistance in the 21st Century 51. Medeiros A.A.: Evolution and dissemination of β-lactamases (w) Frontiers in Antimicrobials Resistance. red. D.G White, accelerated by generations of β-lactam antibiotics. Clin. Infect. M.N. Alekshun, P.F. Mcdermott, S.B. Levy, ASM Press, USA, Dis. 24 (Suppl. 1), 19–45 (1997) 2005, 53–65 52. Miriagou V., Papagiannitsis C.C., Kotsakis S.D., Loli A., 33. Jacoby G.A., Griffin C.M., Hooper D.C.: Citrobacter spp. as Tzelepi E. , Legakis N.J., Tzouvelekis L.S.: Sequence of pNL194,

a source of qnrB alleles. Antimicrob. Agents Chemother. 55, a 79.3-kilobase IncN plasmid carrying the blaVIM-1 metallo-β- 4979–4984 (2011) lactamase gene in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents 34. Kitchel B., Rasheed J.K., Endimiani A., Hujer A.M., Anderson Chemother. 54, 4497–4500 (2010) K.F., Bonomo R.A., Patel J.B.: Genetic factors associated with ele- 53. Moellering R.C. Jr.: NDM-1 – a cause for worldwide concern. vated carbapenem resistance in KPC-producing Klebsiella pneu- N. Engl. J. Med. 363, 25 (2010) moniae. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4201–4207 (2010) 54. Naas T., Cuzon G., Villegas M.V., Lartigue M.F., Quinn J.P., 35. Kliebe C., Nies B.A., Meyer J.F., Tolxdorff-Neutzling R.M., Nordmann P.: Genetic structures at the origin of acquisition of

Wiedemann B.: Evolution of plasmid-coded resistance to the beta-lactamase bla KPC gene. Antimicrob. Agents Chemother. broad-spectrum cephalosporins. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1257–1263 (2008) 28, 302–307 (1985) 55. Nordmann P., Cuzon G., Naas T.: The real threat of Klebsiella 36. Knothe H., Shah P., Krcmery V., Antal M., Mitsuhashi S.: pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet Infect. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole Dis. 9, 228–236 (2009) and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and 56. Nordmann P., Poirel L., Toleman M.A., Walsh T.R.: Does broad- Serratia marcescens. Infection, 11, 315–317 (1983) spectrum β-lactam resistance due to NDM-1 herald the end of 37. Kumarasamy K.K., Woodford N.I wsp.: Emergence of a new the antibiotic era for treatment of infections caused by Gram- antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: negative bacteria? J. Antimicrob. Chemother. 66, 689–692 (2011) a molecular, biological, and epidemiological study. The Lancet 57. Nordmann P., Naas T., Poirel L.: Global spread of carbapen- Infect. Dis. 10, 597–602 (2010) emase-producing Enterobacteriaceae. Emerg. Infect. Dis. 17, 38. Leavitt A., Chmelnitsky I., Carmeli Y., Navon-Venezia S.: Com- 1791–1798 (2011) plete nucleotide sequence of KPC-3-encoding plasmid pKpQIL 58. Nordmann P.: Trends in β-lactam resistance among Enterobac- in the epidemic Klebsiella pneumoniae sequence type 258. Anti- teriaceae. Clin. Infect. Dis. 27 (Suppl. 1), 100–106 (1998) microb. Agents Chemother. 54, 4493–4496 (2010) 59. Novais A., Canton R., Moreira R., Peixe L., Baquero F., 39. Livermore D.M.: Beta-Lactamases in laboratory and clinical Coque T.M.: Emergence and dissemination of Enterobacte- resistance. Clin. Microbiol. Rev. 8, 557–584 (1995) riaceae isolates producing CTX-M-1- like enzymes in Spain 40. Livermore D.M.: Has the era of untreatable infections arrived? are associated with IncFII (CTX-M-15) and broad-host-range J. Antimicrob. Chemother. 64 (Suppl. 1), 29–36 (2009) (CTX-M-1, -3, and -32) plasmids. Antimicrob. Agents Chemo­ 41. Livermore D.M.: Of Pseudomonas, porins, pumps and car­ ther. 51, 796–799 (2007) bapenems. J. Antimicrob. Chemother. 47, 247–250 (2001) 60. Palmer R.: A disease – or gene – by any other name would cause 42. Livermore D.M.: The impact of carbapenemases on antimicro- a stink. Nature Medicine, 16, 1059 (2010) bial development and therapy. Curr. Opin. Investig. Drugs, 3, 61. Paterson D.L., Bonomo R.A.: Extended-spectrum β-lactamases: 218–224 (2002) a clinical update. Clin. Microbiol. Rev. 18, 657–686 (2005) 43. Livermore D.M., Williams J.D.: β-Lactams: Mode of Action and 62. Paterson D.L., Ko W.C., Von Gottberg A., Casellas J.M., Mechanism of Bacterial Resistance (w) Antibiotics in Labora- Mulazimoglu L., Klugman K.P., Bonomo R.A., Rice L.B., OPORNOŚĆ BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE NA ANTYBIOTYKI Β-LAKTAMOWE 271

McCormack J.G., Yu V.L.: Outcome of cephalosporin treatment 73. Rezolucja Parlamentu Europejskiego z dn. 27 października for serious infections due to apparently susceptible organisms 2011 r. w sprawie zagrożenia zdrowia publicznego w wyniku producing extended-spectrum β-lactamases: implications for oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (nr B7 0538/2011) the clinical microbiology laboratory. J. Clin. Microbiol. 39, 74. Rodriguez M.M., Power P., Radice M., Vay C., Famiglietti A., 2206–2212 (2001) Galleni M., Ayala J.A., Gutkind G.: Chromosome-encoded 63. Philippon A., Arlet G., Jacoby G.A.: Plasmid-determined CTX-M-3 from Kluyvera ascorbata: a possible origin of plas- AmpC-type β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 46, mid-borne CTX-M-1-derived cefotaximases. Antimicrob. Agents 1–11 (2002) Chemother. 48, 4895–4897 (2004) 64. Poirel L., Dortet L., Bernabeu S., Nordmann P.: Genetic fea- 75. Rossolini G.M., Franceschini N., Lauretti L., Caravelli B.,

tures of blaNDM-1-positive Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Riccio M.L., Galleni M., Frere J.M., Amicosante G.: Cloning of Chemother. 55, 5403–5407 (2011) a Chryseobacterium (Flavobacterium) meningosepticum chro- 65. Poirel L., Kampfer P., Nordmann P.: Chromosome-encoded mosomal gene (blaA(CME)) encoding an extended-spectrum Ambler class A β-lactamase of Kluyvera georgiana, a probable class A β-lactamase related to the Bacteroides cephalosporinases progenitor of a subgroup of CTX-M extended-spectrum β-lac- and the VEB-1 and PER β-lactamases. Antimicrob. Agents tamases. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 4038–4040 (2002) Chemother. 43, 2193–2199 (1999) 66. Poirel L., Naas T., Nordmann P.: Diversity, epidemiology and 76. Rozenberg-Arska M., Visser M.R.: Enterobacteriaceae (w) Infec- genetics of class D β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. tious diseases, Wyd. 2, red. J. Cohen, W.G. Powderly i wsp., 54, 24–38. (2010) Mosby, USA, 2004, s. 2189 67. Poirel L., Naas T., Nordmann P.: Genetic support of extended- 77. Sanders C.C., Thomson K.S., Bradford P.A.: Problems with spectrum β-lactamases. Clin. Microbiol. Infect. 14 (Suppl. 1), detection of β-lactam resistance among nonfastidious gram- 75–81 (2008) negative bacilli. Infect. Dis. Clin. North Am. 7, 411–424 (1993) 68. Poirel L., Pitout J.D., Nordmann P.: Carbapenemases: molecu- 78. Schmitz F.J., Fluit A.C.: Mechanizms of antybacterial resistance lar diversity and clinical consequences. Future Microbiol. 2, (w) Infectious diseases, Wyd. 2, red. J. Cohen, W.G. Powderly 501–512 (2007) i wsp., Mosby, USA, 2004, s. 1733 69. Poirel L., Potron A., Nordmann P.: OXA-48-like carbapen- 79. Vatopoulos A.: High rates of metallo-β-lactamase-producing emases: the phantom menace. J. Antimicrob. Chemother. 67, Klebsiella pneumoniae in Greece – a review of the current evi- 1597–1606 (2012) dence. Euro. Surveill. 13, 8023 (2008) 70. Potron A., Nordmann P., Lafeuille E., Al Maskari Z., Al 80. Walsh T.R., Toleman M.A., Poirel L., Nordmann P.: Metallo-β- Rashdi F., Poirel L.: Characterization of OXA-181, a carbap- lactamases: the quiet before the storm? Clin. Microbiol. Rev. 18, enem-hydrolyzing class D β-lactamase from Klebsiella pneu- 306–325 (2005) moniae. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 4896–4899 (2011) 81. Walsh T.R., Toleman M.A.: The emergence of pan-resistant 71. Pulcini C., Bush K., Craig W.A., Frimodt-Møller N., Gray- Gram-negative pathogens merits a rapid global political son M.L., Mouton J.W., Turnidge J., Harbarth S., Gyssens I.C., response. J. Antimicrob. Chemother. 67, 1–3 (2012) ESCMID Study Group for Antibiotic Policies: Forgotten anti- 82. Walsh T.R., Weeks J., Livermore D.M., Toleman M.A.: Disse- biotics: an inventory in Europe, the United States, Canada, and mination of NDM-1-positive bacteria in the New Delhi envi- Australia. Clin. Infect. Dis. 54, 268–274 (2012) ronment and its implications for human health: an environ- 72. Qenan A.M, Bush K.: Carbapenemases: the versatile beta-lac- mental point prevalence study. Lancet Infect. Dis. 11, 355–362 tamases. Clin. Microbiol. Rev. 20, 440–458 (2007) (2011)

POST. MIKROBIOL., IMMUNOPROFILAKTYKA ZAKAŻEŃ CAMPYLOBACTER 2013, 52, 3, 273–289 http://www.pm.microbiology.pl

Paweł Łaniewski1, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka*1

1 Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa

Wpłynęło w grudniu 2012 r.

Spis treści: 1. Charakterystyka patogenu i epidemiologia zakażeń. 2. Objawy chorobowe i źródła zakażeń. 3. Szczepionki anty-Campylobacter. 4. Podjednostkowe szczepionki anty-Campylobacter skonstruowane z użyciem atenuowanych szczepów S. enterica. 5. Podsumowanie Anti-Campylobacter immunoprophylaxis Abstract: Campylobacter jejuni is currently recognized as a major cause of food-borne human gastroenteritis worldwide. In developed countries the majority of Campylobacter infections are associated with the consumption of undercooked poultry meat. Although a isease lasts only several days and is very often self-limiting, campylobacteriosis constitutes a serious medical and socioeconomic problem. In patients, especially from developed countries, who have not encountered the pathogen before the infection can result in severe gastroenteritis accompanied with long-lasting bloody or mucus diarrhea. Moreover, C. jejuni can cause septicemia in immunocompromised individuals or induce autoimmune neurological disorders. Rapidly increasing antibiotic resistance of Campylobacter strains compels us to develop alternative therapeutic strategies. Implementation of immunoprophylaxis for humans or chickens seems to be the most effective strategy to decrease the number of human infections. Subunit vaccines are the safest, but mildly immunogenic, prophylactic method therefore, heterologous antigens are frequently delivered to a host by special delivery vectors i.e. attenuated Salmonella strains, to induce protective immune response. Avirulent Salmonella strains were also successfully used as a carrier to construct anti-Campylobacter subunit vaccines. Up till now, only several Campylobacter genes encoding immunogenic proteins: Peb1A, CjaA, Pal, Cj0420 and bacterioferritin, were cloned in Salmonella cells and the immune response and protection efficiency of constructed vaccine were determined on animal models. Here, we discuss the recent developments in the field of Salmonella-based anti-Campylobacter vaccines. Contents: 1. Pathogen characteristics and infection epidemiology. 2. The symptoms and source of infections. 3. Anti-Campylobacter vaccines. 4. Anti-Campylobacter subunit vaccines constructed with attenuated S. enterica cells. 5. Conclusions

Słowa kluczowe: antygen, Campylobacter, Salmonella, szczepionka podjednostkowa Key words: antigen, Campylobacter, Salmonella, subunit vaccine

1. Charakterystyka patogenu i epidemiologia zakażeń (http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/diseases/ campylobacter/technical.html# incidence). W UE liczba Bakterie z rodzaju Campylobacter to Gram-ujemne, przypadków kampylobakteriozy szacowana jest na przy- mikroaerofilne, spiralne, ruchliwe pałeczki należące do najmniej 2 miliony, a może sięgać nawet 20 milionów klasy ε-Proteobacteria. Aktualnie mikroorganizmy te rocznie [7]. Wg raportów EFSA w UE od 2005 do 2010 r. są najczęściej izolowanym czynnikiem etiologicznym kampylobakterioza była nieprzerwanie najczęściej wystę- stanów zapalnych przewodu pokarmowego u ludzi pującą chorobą odzwierzęcą. We wszystkich krajach zarówno w krajach rozwiniętych jak i rozwijających się członkowskich w 2010 r. odnotowano 212 064 przy- [3,33]. Infekcje wywoływane są głównie przez dwa nie- padków zakażeń Campylobacter­ sp. [6]. W porównaniu rozróżnialne pod względem klinicznym gatunki: Cam- do roku poprzedniego był to wzrost o 6,7%. W tym sa- pylobacter jejuni i Campylobacter coli. Wg raportu EFSA mym czasie odnotowano 99 020 przypadków salmonel- (Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności, Euro- lozy, drugiej najczęściej występującej zoonozy. Jednakże pean Food Safety Agency) i ECDC (Europejskie Centrum w przypadku zakażeń pałeczkami Salmonella ich liczba Zapobiegania i Kontroli Chorób, European Center for od 5 lat systematycznie się obniża (w 2010 r. spadek Disease Control and Prevention) odpowiadają one za o 8,8% w porównaniu do roku poprzedniego) (Rys. 1). 35,7% i 2,3% odnotowanych przypadków kampylobak- Liczba zdiagnozowanych przypadków kampylobak­ teriozy w Unii Europejskiej (UE) w 2010 r. [6]. teriozy w poszczególnych krajach UE ze względu na Dane epidemiologiczne wskazują, iż liczba przypad- odmienne systemy monitorowania zakażeń bakteryjnych ków kampylobakteriozy w skali światowej sięga aż 400 mi- znacznie się różniła i wynosiła od 0,04 do 200,58 przy- lionów rocznie (48). Wg danych CDC (Centrum Zwal- padków zachorowań na 100 000 mieszkańców. W Polsce czania i Zapobiegania Chorób, Center for Disease Control w 2010 r. potwierdzono jedynie 367 przypadków kam- and Prevention) każdego roku infekcje Campylobacter po- pylobakteriozy (0,96 zachorowań na 100 000 osób). wodują ok. 2–3 miliona przypadków zachorowań w USA Tak niski poziom wynika prawdopodobnie z faktu, iż

* Autor korespondencyjny: Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecz- nikowa 1, 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected] 274 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

wczesnym okresie życia. Potwierdza to ostatni raport EFSA i ECDC, który wskazuje, że w 2010 r. w UE aż 2/3 (17 z 27) ognisk epidemiologicznych (outbreak) kam- pylobakteriozy o udokumentowanym źródle powiąza- nych było z zanieczyszczonym Campylobacter mięsem drobiowym [6]. Mechanizm zapoczątkowania infekcji kurcząt na fermach pozostaje niewyjaśniony, lecz nie- zależnie od źródła zakażenia Campylobacter rozprze- strzenia się w stadach kurcząt bardzo szybko doprowa- dzając do zakażenia nawet 100% ptaków [30]. Chociaż poziom kolonizacji jelit kurcząt jest bardzo wysoki (nawet 1010 CFU na gram zawartości jelit), nie wywo- łuje to u ptaków objawów chorobowych. Fakt ten unie- Rys. 1. Kinetyka zachorowań na kampylobakteriozę i salmonellozę możliwia eliminację ze stad osobników zainfekowanych w Unii Europejskiej w latach 2006–2010 wg [6] [17]. Do dalszego zanieczyszczenia mięsa drobiowego dochodzi w rzeźniach, stąd wysoki procent tusz kur- w Polsce dopiero od niedawna rejestruje się przypadki cząt znajdujących się na rynku zawiera duże liczby ko­- kampylobakteriozy jako wyodrębnionej jednostki cho- mórek tego drobnoustroju. Podczas przetwarzania mięsa robowej. Co więcej szacuje się, że tylko co dziesiąty komórki patogenu przedostają na skórę tusz drobiowych przypadek kampylobakteriozy jest odnotowywany, poprzez zanieczyszczenie zawartością przewodu pokar- reszta zakażonych osób ze względu na łagodny prze- mowego. Specyficzne mikrośrodowisko na powierzchni bieg infekcji prawdopodobnie nie zgłasza się do lekarza. tusz sprzyja przetrwaniu pałeczek w temperaturze 4°C, a nawet po zamrożeniu. Dodatkowo wykazano, iż pato- gen w przypadku nieodpowiedniego przechowywania 2. Objawy chorobowe i źródła zakażeń mięsa może ulec w tymże środowisku namnożeniu [41]. Wg danych EFSA i ECDC w 2010 r. 29,6% tusz drobio- Kliniczna manifestacja zakażeń Campylobacter spp. wych w UE było zanieczyszczonych pałeczkami Campy- bywa bardzo różnorodna i waha się od przypadków lobacter [6]. W poszczególnych krajach członkowskich asymptomatycznych do ostrych stanów zapalnych jelit, udział zakażonego świeżego mięsa wynosił od 3,1% aż którym towarzyszy długotrwała, krwawa lub śluzowata do 90,0%. Ponieważ dawka infekcyjna dla człowieka jest biegunka [1]. Te ostatnie symptomy chorobowe charak- względnie niska (102 CFU), do zakażeń człowieka może terystyczne są dla osób zakażonych z krajów rozwinię- dochodzić stosunkowo łatwo i często [20]. tych, które w przeszłości nie zetknęły się z patogenem. Dodatkowym problemem z medycznego punktu W większości przypadków stan chorobowy trwa kilka widzenia jest zjawisko nasilającej się antybiotykoopor- dni, a infekcje mają tendencję do samowyleczenia. Jed- ności bakterii z rodzaju Campylobacter wynikające nakże u ludzi z obniżoną odpornością (dzieci w wieku z nadmiernego i często nieuzasadnionego stosowania poniżej 2 lat, osoby starsze, osoby po przebytych cho- antybiotyków w praktyce weterynaryjnej jak i terapii robach nowotworowych czy zakażeni wirusem HIV) ludzi. Jak wcześniej wspomniano w większości przy- infekcje Campylobacter są często przyczyną zakażeń padków zakażenia Campylobacter przebiegają w łagodny ogólnoustrojowych oraz posocznicy [20]. Dodatkowo sposób i wymagają jedynie leczenia objawowego (obser- udokumentowano, że infekcje Campylobacter mogą wacja, uzupełnienie płynów i elektrolitów). Antybio- prowadzić do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych tykoterapię stosuje się jedynie w przypadku ciężkiego i neurologicznych: reaktywnego artretyzmu i neuro- przebiegu choroby. Badania epidemiologiczne pokazują patii obwodowego układu nerwowego tj. zespół Guil- jednak gwałtowny wzrost oporności na powszechnie laina-Barrégo (GBS) czy chorób zapalnych jelit (IBD, stosowane terapeutyki (tj. makrolidy, fluorochinolony inflammatory bowel diseases, tj. choroba Leśniowskiego- i tetracyklinę) zarówno wśród klinicznych szczepów -Crohna [18, 22, 29]. Campylobacter jest także drugą C. jejuni/coli jak i szczepów izolowanych z pożywienia po zakażeniach enterotoksycznymi szczepami E. coli [10, 26, 27]. Wykazano także rosnącą liczbę szczepów (ETEC) przyczyną biegunek podróżnych [8]. wieloopornych, co niewątpliwie utrudnia zwalczanie W krajach rozwiniętych do zakażeń pałeczkami przypadków kampylobakteriozy, wydłużając okres Campylobacter u ludzi dochodzi najczęściej przez spo- leczenia lub powodując całkowitą nieskuteczność stoso- życie zanieczyszczonego pałeczkami patogenu mleka, wanej terapii. W przypadku ogólnoustrojowych infekcji wody lub mięsa, zwłaszcza nieodpowiednio przygo- spowodowanej przez szczepy Campylobacter oporne na towanego drobiu [17]. Niewątpliwie głównym źród­ makrolidy i fluorochinolony jedyną alternatywą wydaje łem patogenu są kurczęta ulegające kolonizacji we się zastosowanie gentamycyny [31, 41]. IMMUNOPROFILAKTYKA ZAKAŻEŃ CAMPYLOBACTER 275

3. Szczepionki anty-Campylobacter Badane prototypy szczepionek anty-Campylobacter przeznaczone zarówno dla ludzi jak i kurcząt ogólnie Ograniczenie liczby przypadków kampylobakteriozy można podzielić na szczepionki skonstruowane w opar- u ludzi można osiągnąć na drodze obniżenia poziomu ciu o zabite komórki drobnoustroju tzw. CWC (Cam- zakażeń stad drobiu. W ramach multidyscyplinarnego pylobacter whole-cell vacinnes) oraz szczepionki podjed- programu CARMA (Campylobacter Risk Manage- nostkowe zawierające jedynie wybrane antygeny Cam- ment and Assesment) badano wprowadzanie różnego pylobacter [5, 19]. Charakterystykę ostatnio badanych rodzaju interwencji w procesie produkcji, przetwarza- szczepionek anty-Campylobacter przedstawiono w Tab. I. nia i spożycia mięsa drobiowego (from farm to fork) tj. Szczepionki anty-Campylobacter zawierające całe ko- podniesienie poziomu higieny na fermach, rzeźniach mórki patogenu mają kilka ograniczeń. Najważniej- i przedsiębiorstwach procesujących żywność czy edu- szym z nich jest wysoki poziom zmienności genetycz- kacja społeczeństwa [14]. Metody te okazały się jednak nej C. jejuni [11, 34]. Mikroorganizmy te posiadają nieskuteczne, stąd wprowadzenie do powszechnego sto- się tzw. „otwarty” pangenom (pula wszystkich genów sowania szczepień ochronnych ludzi lub kurcząt wydaje obecna w genomach przedstawicieli danego gatunku się najwłaściwszą strategią zapobiegania ludzkim przy- lub rodzaju). Oznacza to, że poznanie materiału gene- padkom kampylobakteriozy. tycznego kolejnych szczepów C. jejuni wzbogaca pan- Jak dotąd na świecie nie ma dostępnej na rynku sku- genom gatunku o kolejne unikatowe geny. Porównanie tecznej szczepionki anty-Campylobacter, pomimo iż od materiału genetycznego 13 szczepów C. jejuni wyka- kilkunastu lat europejskie i amerykańskie ośrodki nau- zało, że jedynie 2/3 genów stanowią tzw. geny podsta- kowe wraz z firmami biotechnologicznymi prowadzą wowe (core genes), występujące w genomach wszystkich intensywne badania w tym kierunku. Szczepionka anty- przedstawicieli gatunku. Reszta genów była specyficzna -Campylobacter dla ludzi przeznaczona będzie prawdo- dla poszczególnych szczepów lub kilku przedstawicieli podobnie tylko dla osób z grupy podwyższonego ryzyka gatunku (dispensable/auxillary genes). Przykładowo tj. personelu medycznego, osób podróżujących do regio- genom C. jejuni M1 składa się z 1080 genów podstawo- nów świata, gdzie kampylobakterioza jest chorobą ende- wych i aż 547 genów dodatkowych [9]. Analiza mate- miczną lub osób zagrożonych rozwojem chorób autoim- riału genetycznego 5 blisko spokrewnionych szczepów munizacyjnych [46]. Ze względu na występujące zjawisko ST-21 wyizolowanych z różnych źródeł (tj. klinicznych mimikry molekularnej pomiędzy lipooligosacharydem i środowiskowych) i scharakteryzowanych za pomocą (LOS) C. jejuni a ludzkimi gangliozydami badania kli- techniki MLST (multi locus sequence typing) wykazała niczne prototypów szczepionek na ludzkich ochotnikach ich wysoką zmienność fenotypową i genetyczną, co wiązały się z ryzykiem wystąpienie u pacjentów chorób niewątpliwie warunkuje ich zdolność przystosowaw- autoimmunizacyjnych. Identyfikacja szczepu C. jejuni czą do różnych środowisk [13]. Ostatnio przeprowa- CG8421, niewywołującego u ludzi GBS, niewątpliwie dzone analizy transkryptomów oraz proteomów ułatwi testowanie tego rodzaju szczepionek [45]. C. jejuni wykazały także olbrzymią zmienność profilu

Tabela I Prototypy podjednostkowych szczepionek anty-Campylobacter skonstruowanych z wykorzystaniem atenuowanych szczepów S. enterica

Badany Lokalizacja Model Rodzaj atenuacji Efekt szczepienia Piśmiennictwo antygen transgenu zwierzęcy Peb1A ΔphoPQ plazmid myszy indukcja specyficznych przeciwciał klasy IgG; [42] brak protekcji CjaA Δcrp Δcya plazmid kurczęta indukcja specyficznych przeciwciał klasy IgY i IgA; [50] obniżenie kolonizacji o 6 log ΔaroA plazmid kurczęta indukcja specyficznych przeciwciał; [2] obniżenie poziomu kolonizacji o 1,4 log ΔaroA Δhtr chromosom kurczęta indukcja specyficznych przeciwciał klasy IgY i IgA; [23] obniżenie poziomu kolonizacji o 2 log Pal ΔaroA Δhtr chromosom kurczęta indukcja specyficznych przeciwciał klasy IgY i IgA; [23] obniżenie poziomu kolonizacji o 4 log Δcrp Δcya plazmid kurczęta indukcja specyficznych przeciwciał klasy IgY i IgA; (Łaniewski i wsp. brak protekcji dane niepublikowane) Cj0420 ΔaroA Δhtr chromosom kurczęta indukcja specyficznych przeciwciał klasy IgY i IgA; [23] obniżenie poziomu kolonizacji o 1 log

Cj1534c ΔPfur33::TT araC PBAD fur plazmid kurczęta obniżenie poziomu kolonizacji o 3,6 log [21]

Δpmi Δ(gmd-fcl) ΔasdA 276 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA białkowego mikroorganizmu w zależności od warunków odpowiedź immunologiczną szczepionego gospodarza i fazy wzrostu [25, 49]. Dodatkowo badania wykazały, i zapewnić efekt ochronny. W celu dostarczenia antyge- iż kurczęta w trakcie swojego życia wielokrotnie ulegają nów C. jejuni do komórek układu immunologicznego kolonizacji przez różne szczepy Campylobacter spp. [43], stosowano zarówno szczepy S. enterica sv. Typhimurium stąd skonstruowanie skutecznej szczepionki CWC dla jak i Enteritidis zmutowane w genach kodujących białka kurcząt wydaje się bardzo trudne. W przypadku ludzi regulatorowe (ΔphoPQ, Δcrp Δcya), białka szlaków syn- użycie takiej szczepionki, bez dokładnego poznania tezy związków aromatycznych (ΔaroA) czy białka szoku mechanizmów patogenezy pałeczek C. jejuni jest dość cieplnego (Δhtr). Do konstrukcji tego rodzaju proto- ryzykowne, gdyż może prowadzić do rozwoju chorób typów szczepionek podjednostkowych wykorzystano autoimmunizacyjnych. następujące białka Campylobacter: Peb1A (Cj0921c), Szczepionki podjednostkowe uważane są za najbez- CjaA (Cj0982c), Pal (Cj0113), Cj0420 i bakterioferry- pieczniejsze, lecz ich immunogenność w porównaniu do tynę (Cj1534c) (Tab. II). szczepionek zawierających żywe atenuowane komórki Białko Peb1A jest jednym z ważnych czynników jest dużo niższa. W procesie konstrukcji tego typu wirulencji C. jejuni. Początkowo zostało zidentyfiko- szczepionek krytyczny jest wybór antygenów. Pałeczki wano jako adhezyna. Inaktywacja kodującego go genu C. jejuni posiadają wiele białek o właściwościach immu- cj0921c powodowała ok. 100-krotne obniżenie poziomu nogennych, jednakże niewiele z nich posiada odpo- adhezji zmutowanego szczepu C. jejuni do komórek wiedni potencjał ochronny. Rozwój badań z dziedziny eukariotycznych i wpływała na kolonizację jelita myszy genomiki, transkryptomiki i proteomiki w ostatnich [36]. Białko Peb1A pełni w komórce C. jeju­ ni­ także inną latach niewątpliwie przyczynił się do dużego postępu funkcję. L e o n - K e m p i s M d e l i wsp. [24] wyka- w identyfikacji nowych antygenów. Jednakże do tej pory zali, że Peb1A bierze udział w transporcie do wnętrza na zwierzętach laboratoryjnych testowano tylko kilka komórki bakteryjnej dwóch aminokwasów: glutami- potencjalnych kandydatów do konstrukcji szczepionki nianu i asparaginianu. Badania wykazały, że białko to – głównie w postaci oczyszczonych rekombinowanych stanowi składnik wiążący ligand systemu transportu białek lub produkowanych w żywych atenuowanych typu ABC i jest niezbędne dla C. jejuni do wykorzy- szczepach bakteryjnych [19]. stania tychże aminokwasów jako źródła węgla. Warto podkreślić, że transport aminokwasów jest niezwykle 4. Podjednostkowe szczepionki anty-Campylobacter ważny w fizjologii komórek C. jejuni. Mikroorganizm skonstruowane z użyciem atenuowanych ten nie posiada genu kodującego 6-fosfofruktokinazę szczepów S. enterica – enzymu niezbędnego w katabolizmie glukozy, stąd aminokwasy in vivo stanowią dla C. jejuni główne źródło Jako nośnik genów C. jejuni z powodzeniem wyko- węgla i energii [15, 44, 47]. Białko Peb1A w komórkach rzystano m.in. atenuowane szczepy S. enterica. Zastoso- C. jejuni zlokalizowane jest głównie w peryplazmie, jed- wana strategia powinna podwyższyć lub/i ukierunkować nakże odnajdywane było także na powierzchni komórki

Tabela II Rodzaje testowanych szczepionek anty-Campylobacter [19]

Droga Rodzaj szczepionki Skład Model Efekt szczepienia podania Szczepionki CWC C. jejuni 81–176 komórki inaktywowane formaliną doustna fretki protekcja 40–89% C. jejuni FIMCB komórki inaktywowane formaliną doustna kurczęta protekcja 16–93% Campyvax® komórki przygotowane doustna ludzcy III faza kliniczna wg Nutriment Signal Technology ochotnicy (wyniki niedostępne) Szczepionki podjednostkowe rekombinowane białka oczyszczone z komórek E. coli rekombinowane donosowa myszy redukcja kolonizacji; białka tj. FlaA-MBP, LivK, Cj1643, Cj0092, lub protekcja w zależności od Cj0420, FlaC, FspA1, FspA2 podskórna użytego białka: 17–89% koniugaty CPS-CRM: polisacharyd otoczkowy C. jejuni podskórna myszy; małpy brak objawów chorobowych polisacharydowe 81–176 skoniugowany z inaktywowaną (Aotus nancymae) przy jednoczesnej kolonizacji toksyną błoniczą szczepy S. enterica jako białka Peb1A, Pal, CjaA, Cj420 produkowane doustna myszy; kurczęta redukcja kolonizacji nośniki antygenów w atenuowanych komórkach S. enterica Campylobacter IMMUNOPROFILAKTYKA ZAKAŻEŃ CAMPYLOBACTER 277

[4, 24]. Ze względu na różną lokalizację Peb1A może Skuteczność zastosowania antygenu CjaA potwier- pełnić w komórce podwójną rolę tj. adhezyny i białka dziły też eksperymenty z użyciem innego atenuowanego wiążącego ligand. szczepu S. Typhimurium uszkodzonego w szlakach syn- Szczepy S. Typhimurium produkujące antygen Peb1A tezy aminokwasów aromatycznych [2]. W tychże bada- zostały skonstruowane przez amerykańską firmę biotech- niach gen cjaA sklonowano na plazmidzie pod kontrolą nologiczną AVANT Immunotherapeutics [42]. W tym indukowalnego in vivo promotora nirB w fuzji trans- celu fragmenty genu cj0921c (kodujące białko Peb1A bez lacyjnej z fragmentem DNA kodującym C-terminalny sekwencji sygnalnej) sklonowano w trzech różnych pla- fragment toksyny tężca. Plazmid zawierający gen cjaA zmidach serii Asd+ i wprowadzono do komórek S. Typhi- wprowadzono do komórek S. Typhimurium ΔaroA, po murium ΔphoPQ. W dwóch pierwszych przypadkach czym dwukrotnie szczepiono nim kurczęta. Ekspery- użyte wektory zapewniały wewnątrzkomórkową produk- ment ochronny wykazał obniżenie poziomu kolonizacji cję białka. Plazmidy te różniły się jedynie liczbą kopii. ptaków o 1,4 rzędu wielkości w 3. i 4. tygodniu od zaka- Pierwszy posiadał ori replikacji pBR, drugi zaś dwa sys- żenia pałeczkami C. jejuni. Analiza odpowiedzi immu- temy replikacji: pSC101 i indukowalny in vivo system nologicznej wykazała, iż protekcja związana jest ściśle replikacji pUC. Trzeci z użytych wektorów zapewniał z indukcją specyficznych przeciwciał zarówno klasy IgY zaś sekrecję antygenu do środowiska za pomocą sys- jak i IgA rozpoznających białko CjaA. Plazmid zawie- temu transportu hemolizyny. Skonstruowanymi pro- rający gen cjaA wprowadzono także do innych atenu- totypami szczepionek produkującymi antygen Peb1A owanych szczepów S. Typhimurium tj. ΔspaS i ΔssaU. immunizowano doustnie myszy BALB/c. Pomimo, iż Zmiana rodzaju atenuacji komórek nośnika przyczy- analizy Western blot w surowicy szczepionych zwierząt, niła się do zwiększenia efektu protekcyjnego, co praw- wykazały indukcję produkcji specyficznych przeciwciał dopodobnie wynikało z ich dłuższej przeżywalności anty-Peb1A klasy IgG, immunizacja nie chroniła myszy w organizmie ptaków w porównaniu do stosowanego przed zakażeniem pałeczkami C. jejuni. wcześniej szczepu ΔaroA. Antygen CjaA (Cj0982c) został zidentyfikowany W identyczny sposób badano także potencjał och­ przez naszą grupę badawczą jako białko silnie reagujące ronny innych antygenów C. jejuni tj. Peb1A, GlnH z przeciwciałami anty-Campylobacter [35]. CjaA, podob- i ChuA. Jedynie zastosowanie szczepu S. Typhimurium nie jak Peb1A, jest zewnątrzkomórkowym białkiem ΔaroA produkującego białko Peb1A obniżało poziomu C. jejuni, będącym składnikiem systemu transportu typu kolonizacji przewodu pokarmowego kurcząt do poziomu ABC, niezbędne w transporcie aminokwasów. Analiza obserwowanego w przypadku użycia antygenu CjaA. krystalograficzna białka wykazała, że posiada ono silne Kolejnym antygenem C. jejuni zidentyfikowanym powinowactwo do cysteiny [28]. Ze względu na fakt, iż i testowanym przez naszą grupę badawczą było białko ekspresja genu cjaA wrasta w warunkach obniżonego Pal (peptidoglycan-associated lipoprotein). Lipopro- dostępu żelaza a także na podłożu stałym, jego produkt teina ta zwana także CjaD lub Omp18 zakotwiczona może brać udział w procesach kolonizacji i wirulencji jest w błonie zewnętrznej komórek C. jejuni. Poprzez [16,38]. Dodatkowo wykazano, iż białko CjaA występuję oddziaływanie z kompleksem białek Tol odpowiada w większej ilości w komórkach świeżych klinicznych za utrzymanie integralności osłon komórkowych [12]. izolatów niż w komórkach wielokrotnie pasażowanych Prawdopodobnie białko Pal jest niezbędne do przeżycia szczepów laboratoryjnych (4). Białko CjaA zostało także komórek C. jejuni – wielokrotne próby skonstruowania zidentyfikowane jako rozpoznawane przez przeciwciała w naszym laboratorium mutanta delecyjnego w kodują- matczyne, chroniące kurczęta przez pierwsze tygodnie cym je genie cj0113 kończyły się niepowodzeniem (dane życia przed zakażeniem C. jejuni [40]. niepublikowane). W celu oceny właściwości ochronnych W celu oceny potencjału protekcyjnych białka CjaA antygenu gen cj0113 sklonowano na wysokokopijnym w Zakładzie Genetyki Bakterii UW skonstruowano plazmidzie Asd+ i wprowadzono do komórek S. Typhi- szczep S. Typhimurium Δcrp Δcya produkujący anty- murium Δcrp Δcya Δasd. Białko w komórkach hete- gen [50]. Gen cjaA sklonowano do wysokokopijnego rologicznego gospodarza lokalizowało się w osłonach plazmidu Asd+ i wprowadzono do komórek nośnika komórkowych (głównie w błonie zewnętrznej). Bada- zawierającego dodatkowo chromosomową delecję genu nia na modelu kurzym wykazały, iż pomimo indukcji asd. Skonstruowanym prototypem szczepionki immu- humoralnej odpowiedzi odpornościowej anty-Cam- nizowano kurczęta dwukrotnie w 1-szym i 14-tym dniu pylobacter, immunizacja nie prowadziła do obniżenia życia. Przeprowadzone eksperymenty wykazały induk- poziomu kolonizacji przewodu pokarmowego kurcząt cję przeciwciał anty-Campylobacter klasy IgY (IgG) przez pałeczki C. jejuni (dane niepublikowane). w surowicy oraz sIgA w śluzie jelitowym szczepionych Analizowano także przydatność do konstrukcji kurcząt. Uodpornianie kurcząt skonstruowanym pro- szczepionki białka Cj0420 (ACE393) zidentyfikowa- totypem szczepionki prowadziło także do obniżenia nego technikami proteomicznymi przez duńską firmę poziomu kolonizacji jelita ptaków przez heterologiczny farmaceutyczną ACE BioSciences jako silny immunogen szczep C. jejuni aż o 6 rzędów wielkości. zlokalizowany na powierzchni komórek C. jejuni [37]. 278 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

Analiza siewstwa przeprowadzona na modelu mysim Podziękowania potwierdziła potencjał ochronny białka Cj0420. Zwie- Artykuł został sfinansowany ze środków grantu MNiSW N N302 236838, decyzja 2368/B/P01/2010/38. rzęta szczepione podskórnie oczyszczonym rekombi- nowanym białkiem były kolonizowane przez pałeczki C. jejuni znacznie rzadziej w stosunku do kontroli [39]. Piśmiennictwo L a y t o n i wsp. [23] zastosowali odmienną strategię 1. Blaser M.J., Wells J.G., Feldman R.A., Pollard R.A., Allen J.R.: immunizacji, produkując w komórkach nośnika jedynie Campylobacter enteritis in the United States. A multicenter wybrane epitopy białek Pal, CjaA i Cj0420. W badaniach study. Ann. Intern. Med. 98, 360–365 (1983) jako nośnika heterologicznych genów użyto szczepu 2. Buckley A.M., Wang J., Hudson D.L., Grant A.J., Jones M.A., S. Enteritidis ΔaroA Δhtr. DNA kodujący wybrane Maskell D.J., Stevens M.P.: Evaluation of live-attenuated Salmo- fragmenty białek Pal, CjaA i Cj0420 wprowadzono do nella vaccines expressing Campylobacter antigens for control of C. jejuni in poultry. Vaccine, 28, 1094–1105 (2010) chromosomu szczepu nośnikowego w obręb genu lamB, 3. Coker A.O., Isokpehi R.D., Thomas B.N., Amisu K.O., Obi C.L.: kodującego zewnątrzkomórkową porynę. Dzięki inte- Human campylobacteriosis in developing countries. Emerg. gracji DNA i uzyskanym fuzjom epitopy wybranych Infect. Dis. 8, 237–244 (2002) białek były prezentowane na powierzchni komórek 4. Cordwell S.J., Len A.C., Touma R.G., Scott N.E., Falconer L., S. Enteritidis. Użyty szczep nośnikowy oprócz anty- Jones D., Connolly A., Crossett B., Djordjevic S.P.: Identifica- tion of membrane-associated proteins from Campylobacter genu w celu stymulacji komórkowej odpowiedzi odpor- jejuni strains using complementary proteomics technologies. nościowej produkował także peptyd CD154 (CD40L), Pro­teomics, 8, 122–139 (2008) będące ligandem czynnika TNF (tumor necrosis factor) 5. de Zoete M.R., van Putten J.P., Wagenaar J.A.: Vaccination of [32]. Skonstruowane w powyższy sposób prototypy chickens against Campylobacter. Vaccine, 25, 5548–5557 (2007) szczepionek podano per os kurczętom w dniu wyklu- 6. EFSA: The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Out- cia. Ptaki zakażano pałeczkami C. jejuni 3 tygodnie breaks in 2010. EFSA J. 10, 2597 (2012) później. Analiza odpowiedzi odpornościowej wykazały 7. EFSA: Scientific opinion on quantification of the risk posed by we wszystkich przypadkach indukcję w surowicy specy- broiler meat to human campylobacteriosis in the EU. EFSA J. ficznych przeciwciał klasy IgY (IgG). Najwyższe miano 8, 1437–1526 (2010) przeciwciał anty-Campylobacter uzyskano po immu- 8. Ekdahl K., Giesecke J.: Travellers returning to Sweden as sen- nizacji kurcząt szczepem produkującym epitop biała tinels for comparative disease incidence in other European countries, campylobacter and giardia infection as examples. Pal. W tym przypadku widoczna była także indukcja Euro. Surveill. 9, 6–9 (2004) wydzielniczych przeciwciał klasy IgA. Eksperyment 9. Friis C., Ussery D.W. i wsp.: Genomic characterization of ochronny na modelu kurzym wykazał, że szczepionka Campylobacter jejuni strain M1. PLoS One, 5, e12253 (2010) zawierająca epitop Pal obniża poziom kolonizacji kur- 10. Gallay A., Megraud F. i wsp.: Campylobacter antimicrobial drug cząt przez C. jejuni aż o 4 rzędy wielkości tj. poniżej resistance among humans, broiler chickens, and pigs, France. Emerg. Infect. Dis. 13, 259–266 (2007) poziomu kolonizacji wykrywalnego za pomocą stoso- 11. Gilbreath J.J., Cody W.L., Merrell D.S., Hendrixson D.R.: wanej techniki qPCR – ilościowej reakcji PCR w czasie Change is good: variations in common biological mechanisms rzeczywistym (quantitive real-time PCR). Produkcja in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Heli- w komórkach S. Enteritidis epitopów białek Cj0420 cobacter. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75, 84–132 (2011) i CjaA także przyczyniła się do obniżenia poziomu kolo- 12. Godlewska R., Wisniewska K., Pietras Z., Jagusztyn-Kryni­ cka E.K.: Peptidoglycan-associated lipoprotein (Pal) of Gram- nizacji kurcząt odpowiednio o ok. 1 i 2 rzędy wielkości. negative bacteria: function, structure, role in pathogenesis and potential application in immunoprophylaxis. FEMS Microbiol. Lett. 298, 1–11 (2009) 5. Podsumowanie 13. Gripp E. i wsp.: Closely related Campylobacter jejuni strains from different sources reveal a generalist rather than a specialist lifestyle. BMC Genomics, 12, 584 (2011) Podsumowując, przeprowadzone eksperymenty na 14. Havelaar A.H. i wsp.: Effectiveness and efficiency of controlling modelach zwierzęcych sugerują, iż z badanych dotąd Campylobacter on broiler chicken meat. Risk Anal. 27, 831–844 antygenów Campylobacter białka CjaA i Peb1A mają (2007) największy potencjał ochronny, który powinien być 15. Hofreuter D., Novik V., Galan J.E.: Metabolic diversity in wykorzystany w konstrukcji szczepionki anty-Cam- Campylobacter jejuni enhances specific tissue colonization. Cell Host Microbe, 4, 425–433 (2008) pylobacter przeznaczonej dla drobiu. Niezbędne jest 16. Holmes K., Mulholland F., Pearson B.M., Pin C., McNicholl- jednak kontynuowanie badań mających na celu iden- Kennedy J., Ketley J.M., Wells J.M.: Campylobacter jejuni gene tyfikację nowych skutecznych antygenów – białek kon- expression in response to iron limitation and the role of Fur. serwowanych w obrębie wielu serotypów, występujących Microbiology, 151, 243–257 (2005) w komórce w dużej ilości i indukujących silną odpo- 17. Humphrey T., O’Brien S., Madsen M.: Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective. Int. J. Food wiedź odpornościową. Jednocześnie powinno się opra- Microbiol. 117, 237–257 (2007) cowywać nowe rodzaje strategii mające na celu wzmoc- 18. Jacobs B.C., van Belkum A., Endtz H.P.: Guillain-Barré syn- nienie/modulację odpowiedzi odpornościowej kurcząt. drome and Campylobacter infection (w) Campylobacter, red. IMMUNOPROFILAKTYKA ZAKAŻEŃ CAMPYLOBACTER 279

Nachamkin I., Szymanski C.M., Blaser M.J., Washington, D.C., gene encoding a 30 kDa immunopositive protein, component 2008, s. 168–189 of the ABC transport system; expression of the gene in avirulent 19. Jagusztyn-Krynicka E.K., Laniewski P., Wyszynska A.: Update Salmonella typhimurium. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 19, on Campylobacter jejuni vaccine development for preventing 137–150 (1997) human campylobacteriosis. Expert Rev. Vaccines, 8, 625–645 36. Pei Z., Burucoa C., Grignon B., Baqar S., Huang X.Z., (2009) Kopecko D.J., Bourgeois A.L., Fauchere J.L., Blaser M.J.: Muta- 20. Janssen R., Krogfelt K.A., Cawthraw S.A., van Pelt W., Wage- tion in the peb1A locus of Campylobacter jejuni reduces inter­ naar J.A., Owen R.J.: Host-pathogen interactions in Campylo- actions with epithelial cells and intestinal colonization of mice. bacter infections: the host perspective. Clin. Microbiol. Rev. 21, Infect. Immun. 66, 938–943 (1998) 505–518 (2008) 37. Prokhorova T.A., Nielsen P.N., Petersen J., Kofoed T., Craw- 21. Joens L.A.: Reduction of Campylobacter jejuni in poultry using ford J.S., Morsczeck C., Boysen A., Schrotz-King P.: Novel sur- Cj1534 in an attenuated Salmonella vaccine. Med-Vet-Net face polypeptides of Campylobacter jejuni as traveller’s diar- Workpackage 34: Workshop on immunity to and vaccination rhoea vaccine candidates discovered by proteomics. Vaccine, against Campylobacter jejuni in chickens, Surrey, Wielka Bryta- 24, 6446–6455 (2006) nia, 2009 38. Sampathkumar B., Napper S., Carrillo C.D., Willson P., 22. Kalischuk L.D., Inglis G.D., Buret A.G.: Campylobacter jejuni Taboada E., Nash J.H., Potter A.A., Babiuk L.A., Allan B.J.: induces transcellular translocation of commensal bacteria via Transcriptional and translational expression patterns associated lipid rafts.Gut Pathog. 1, 2 (2009) with immobilized growth of Campylobacter jejuni. Microbio­ 23. Layton S.L., Morgan M.J., Cole K., Kwon Y.M., Donoghue D.J., logy, 152, 567–577 (2006) Hargis B.M., Pumford N.R.: Evaluation of Salmonella-vectored 39. Schrotz-King P., Prokhorova T.A., Nielsen P.N., Crawford J.S., Campylobacter peptide epitopes for reduction of Campylobacter Morsczeck C.: Campylobacter jejuni proteomics for new trav- jejuni in broiler chickens. Clin. Vaccine Immunol. 18, 449–454 ellers’ diarrhoea vaccines. Travel. Med. Infect. Dis. 5, 106–109 (2011) (2007) 24. Leon-Kempis Mdel R., Guccione E., Mulholland F., Williamson 40. Shoaf-Sweeney K.D., Larson C.L., Tang X., Konkel M.E.: M.P., Kelly D.J.: TheCampylobacter jejuni PEB1a adhesin is Identification of Campylobacter jejuni proteins recognized by an aspartate/glutamate-binding protein of an ABC transporter maternal antibodies of chickens. Appl. Environ. Microbiol. 74, essential for microaerobic growth on dicarboxylic amino acids. 6867–6875 (2008) Mol. Microbiol. 60, 1262–1275 (2006) 41. Silva J., Leite D., Fernandes M., Mena C., Gibbs P.A., Teixeira P.: 25. Liu X., Gao B., Novik V., Galan J.E.: Quantitative proteomics of Campylobacter spp. as a foodborne pathogen: a review. Front. intracellular Campylobacter jejuni reveals metabolic reprogram- Microbiol. 2, 200 (2011) ming. PLoS Pathog. 8, e1002562 (2012) 42. Sizemore D.R., Warner B., Lawrence J., Jones A., Killeen K.P.: 26. Mazi W., Senok A., Al-Mahmeed A., Arzese A., Bindayna K., Live, attenuated Salmonella typhimurium vectoring Campylo- Botta G.: Trends in antibiotic sensitivity pattern and molecular bacter antigens. Vaccine, 24, 3793–3803 (2006) detection of tet(O)-mediated tetracycline resistance in Campy- 43. Skanseng B., Trosvik P., Zimonja M., Johnsen G., Bjerrum L., lobacter jejuni isolates from human and poultry sources. Jpn. J. Pedersen K., Wallin N., Rudi K.: Co-infection dynamics of Infect. Dis. 61, 82–84 (2008) a major food-borne zoonotic pathogen in chicken. PLoS Pathog. 27. Moore J.E. i wsp.: The epidemiology of antibiotic resistance in 3, e175 (2007) Campylobacter. Microbes Infect. 8, 1955–1966 (2006) 44. Thompson S.A., Gaynor E.C.:Campylobacter jejuni host tis- 28. Muller A., Thomas G.H., Horler R., Brannigan J.A., Blagova E., sue tropism: a consequence of its low-carb lifestyle? Cell Host Levdikov V.M., Fogg M.J., Wilson K.S., Wilkinson A.J.: An Microbe, 4, 409–410 (2008) ATP-binding cassette-type cysteine transporter in Campylo- 45. Tribble D.R. i wsp.: Campylobacter jejuni strain CG8421: bacter jejuni inferred from the structure of an extracytoplasmic a refined model for the study of campylobacteriosis and evalu- solute receptor protein. Mol. Microbiol. 57, 143–155 (2005) ation of Campylobacter vaccines in human subjects. Clin. Infect. 29. Nachamkin I., Allos B.M., Ho T.: Campylobacter species and Dis. 49, 1512–1519 (2009) Guillain-Barre syndrome. Clin. Microbiol. Rev. 11, 555–567 46. Tribble D.R. i wsp.: Diagnostic approach to acute diarrheal ill- (1998) ness in a military population on training exercises in Thailand, 30. Newell D.G., Fearnley C.: Sources of Campylobacter coloniza- a region of campylobacter hyperendemicity. J. Clin. Microbiol. tion in broiler chickens. Appl. Environ. Microbiol. 69, 4343– 46, 1418–1425 (2008) 4351 (2003) 47. Velayudhan J., Kelly D.J.: Analysis of gluconeogenic and ana- 31. Newell D.G., Kruse H. i wsp.: Food-borne diseases – the chal- plerotic enzymes in Campylobacter jejuni: an essential role lenges of 20 years ago still persist while new ones continue to for phosphoenolpyruvate carboxykinase. Microbiology, 148, emerge. Int. J. Food Microbiol. 139, Suppl. 1, S3–15 (2010) 685–694 (2002) 32. O’Meara K.M., Kremer C.J., Layton S.L., Berghman L.R., Har- 48. Walker R.I.: Considerations for development of whole cell gis B.M., Cole K.: Evaluation of recombinant Salmonella express- bacterial vaccines to prevent diarrheal diseases in children in ing CD154 for persistence and enhanced antibody response in developing countries. Vaccine, 23, 3369–3385 (2005) commercial turkeys. Poult. Sci. 89, 1399–1405 (2010) 49. Wright J.A., Grant A.J., Hurd D., Harrison M., Guccione E.J., 33. Olson C.K., Ethelberg S., van Pelt W., Tauxe R.V.: Epidemio­ Kelly D.J., Maskell D.J.: Metabolite and transcriptome analysis logy of Campylobacter jejuni infections in industrialized nations of Campylobacter jejuni in vitro growth reveals a stationary- (w) Campylobacter, red. Nachamkin I., Szymanski C.M., phase physiological switch. Microbiology, 155, 80–94 (2009) Blaser M.J., AMS, Washington, D.C., 2008, s. 163–189 50. Wyszynska A., Raczko A., Lis M., Jagusztyn-Krynicka E.K.: 34. Parkhill J., Barrell B.G. i wsp.: The genome sequence of the Oral immunization of chickens with avirulent Salmonella food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervari- vaccine strain carrying C. jejuni 72Dz/92 cjaA gene elicits spe- able sequences. Nature, 403, 665–668 (2000) cific humoral immune response associated with protection 35. Pawelec D., Rozynek E., Popowski J., Jagusztyn-Krynicka E.K.: against challenge with wild-type Campylobacter. Vaccine, 22, Cloning and characterization of a Campylobacter jejuni 72Dz/92 1379–1389 (2004)

POST. MIKROBIOL., KONSTRUKCJA SZCZEPIONEK PODJEDNOSTKOWYCH 2013, 52, 3, 281–294 http://www.pm.microbiology.pl Z WYKORZYSTANIEM KOMÓREK SALMONELLA ENTERICA JAKO NOŚNIKA HETEROLOGICZNYCH GENÓW

Paweł Łaniewski1, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka1*

1 Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa

Wpłynęło w grudniu 2012 r.

Spis treści: 1. Salmonella jako idealny nośnik heterologicznych antygenów. 2. Atenuacja komórek S. enterica. 3. Stabilność utrzymania transgenu. 4. Poziom ekspresji transgenu. 5. Lokalizacja antygenu a typ odpowiedzi immunologicznej. 6. Podsumowanie Subunit vaccine construction using Salmonella enterica cells as a carrier of heterologous genes Abstract: Salmonella enterica strains are widely employed as a live delivery vector for subunit vaccine construction. Vaccine strains must be safe but still immunogenic; therefore, it is crucial to obtain a proper balance between the attenuation and the reactogenicity of the constructed strains. Salmonella strains used in immunoprophylaxis are mainly constitutively disrupted in genes involved in auxotrophy, virulence or regulation. A novel promising concept of the Salmonella-based vaccine design is a regulated delayed attenuation in vivo combined with a delayed antigen expression system. Using this approach bacteria display features of a wild-type strain at the time of oral vaccination to effectively colonize the lymphoid tissue and the fully attenuated phenotype after host tissue colonization. Expression of heterelogous genes in Salmonella cells is mainly achieved by introducing recombinant plasmids harboring gene of interest. Alternatively, a transgene can be integrated into a chromosomal DNA. Diverse strategies were developed to control plasmid maintenance and foreign gene expression. Among them the most frequently used are the balanced-lethal and toxin-antidote systems or operator-repressor titration technology. Overproduction of a recombinant protein often causes a metabolic burden in vaccine cells resulting in the loss of their viability. To overwhelm the problem, the transgene expression is kept under control of an in vivo inducible promoter or a promoter which activity is regulated by appropriate small molecules. Alternatively, plasmids with a regulated copy number or a delayed antigen synthesis system have been employed by various research groups. Localization of an antigen in a carrier cell is also critical for the strength and type of immune response. A programmed lysis of carrier cells is used to deliver the antigen to host immune cells. Moreover, Salmonella is used to carry DNA vaccines. Here, we review the latest strategies in the design of Salmonella-based subunit vaccines. Contents: 1. Salmonella as a perfect carrier of heterologous antigens. 2. Attenuation of S. enterica cells. 3. Transgene stability. 4. Transgene expression level. 5. Antigen localization and the type of immune response. 6. Conclusions

Słowa kluczowe: atenuacja, nośnik, Salmonella, szczepionka podjednostkowa Key words: attenuation, carrier, Salmonella, subunit vaccine

1. Salmonella jako idealny nośnik ciu o atenuowane szczepy Salmonella silnie stymulują heterologicznych antygenów zarówno odpowiedź humoralną jak i komórkową. Dodatkowo podane drogą doustną lub donosową indu- Bakterie Salmonella enterica posiadają wiele cech kują mechanizmy odpornościowe w błonach śluzowych. predysponujących je do użycia jako nośnik heterologicz- Ten łatwy i nie wymagający użycia strzykawek sposób nych antygenów w konstrukcji szczepionek podjednost- podania szczepionki umożliwia w przypadku zwierząt kowych. Mikroorganizmy tego gatunku w zależności jednoczesną immunizację całych stad poprzez rozpyle- od serotypu wywołują u ludzi różne choroby. S. ente- nie bakterii lub dodanie ich do wody pitnej. Kluczową rica sv. Typhi (S. Typhi) jest czynnikiem etiologicznym kwestią są też niskie koszty produkcji tego typu szcze- duru brzusznego, natomiast infekcje ludzi S. enterica sv. pionek, a także możliwość liofilizacji i przechowywania Typhimurium (S. Typhimurium) oraz S. enterica sv. preparatu w temperaturze pokojowej, co jest niesłycha- Enteritidis (S. Enteritidis) są często przyczyną tzw. nie istotną zaletą szczepionki w przypadku użycia jej zatruć pokarmowych [53]. Pomimo, iż szczepy S. ente- w krajach rozwijających się. rica są wysoce wirulentne, wystarczy inaktywacja kilka genów aby uzyskać wystarczająco bezpieczny poziom atenuacji komórek patogenu. Większość narzędzi gene- 2. Atenuacja komórek S. enterica tycznych używanych do badań na modelowym organi- zmie jakim jest Escherichia coli, ze względu na bliskie Obecnie na rynku znajdują się dwa licencjowane pokrewieństwo obu bakterii, można zastosować także rodzaje szczepionek przeciwko durowi brzusznemu. do manipulacji genetycznych komórek Salmonella. Tylko jedna z nich – o nazwie handlowej Vivotif ® (Berna Szczepionki podjednostkowe skonstruowane w opar- Biotech AG) – zawiera żywe komórki S. Typhi Ty21a.

* Autor korespondencyjny: Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecz- nikowa 1, 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected] 282 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

Szczep ten został otrzymany w latach 70. ubiegłego Rozwój technik inżynierii genetycznej oraz dokładne wieku w wyniku niespecyficznej chemicznej muta- poznanie mechanizmów patogenezy S. enterica pozwo- genezy wirulentnych komórek szczepu S. Typhi Ty2 liło na skonstruowanie wielu awirulentnych szczepów przy użyciu nitrozoguanidyny [27]. Początkowo został zawierających w przeciwieństwie do S. Typhi Ty21a kilka scharakteryzowany jako mutant w genie galE, kodu- zdefiniowanych mutacji. Najważniejsze prototypy szcze- jącym 4-epimerazę UDP-galaktozową – enzym odpo- pionek przeciwko durowi brzusznemu będące obec- wiedzialny za wytwarzanie pełnego lipopolisacharydu nie w fazie badań klinicznych przedstawiono w Tab. I. (LPS). Dalsze badania wykazały, że nie produkuje on Jednocześnie szczepy te są wykorzystywane jako noś- także antygenu Vi i posiada w genomie ponad 30 innych niki heterologicznych antygenów m.in. ureazy Helico- mutacji odróżniających jego materiał genetyczny od bacter pylori (Ty800) [15], C-terminalnego fragmentu wyjściowego szczepu Ty2 [28, 48]. Szczepionka ta jest toksyny tężca [69], podjednostki PA83 toksyny wąglika dobrze tolerowana i bezpieczna w użyciu. W ciągu 25 lat (CVD 908-htrA) [21] czy antygenów wirusa HPV zaszczepiono nią ponad 200 milionów ludzi i obserwo- (human papilloma virus) (Ty21a, CVD 908-htrA, Ty800 wano stosunkowo niedużą liczbę odczynów poszcze- [18] w celu konstrukcji biwalentnych szczepionek. piennych. Jednakże nie jest ona całkowicie skuteczna Najczęściej wprowadzanymi zmianami w chromo- i w celu zapewnienia długotrwałego efektu ochronnego somie powodującymi utratę wirulencji przez komórki musi być podawana doustnie co najmniej w 3 dawkach. S. enterica, zarówno S. Typhi jak i S. Typhimurium, były Druga dostępna szczepionka – Typhim Vi® (Sanofi delecje następujących genów: Pasteur) – zawiera oczyszczony polisacharyd otoczkowy • pur, aro, gua – kodujących białka niezbędne w biosyn- Vi, który jest charakterystyczny dla serowarów Typhi, tezie puryn, aminokwasów aromatycznych i guani- Paratyphi C i Dublin [30]. Szczepionka ta podawana dyny (mutacje auksotroficzne); jest domięśniowa jednokrotnie, gdyż dawki przypomi- • htrA – kodującym peryplazmatyczną proteazę sery- nające, tak jak w przypadku stosowania innych szcze- no­wą, indukowaną w warunkach stresowych i nie- pionek polisacharydowych, nie wzmacniały odpowiedzi zbędną dla komórek S. enterica do przetrwania w ma- immunologicznej. Podobnie jak Vivotif ® szczepionka ta krofagach; charakteryzuje się tylko 55–70% skutecznością. Dodat- • ssaV, cdt – kodujących czynniki wirulencji (ssaV ko- kowo nie wykazuje efektu ochronnego u dzieci poniżej duje białko strukturalne budujące aparat sekrecyjny 2 roku życia [42,50]. Ta jej wada zostanie prawdopo- typu III wyspy patogenności SPI-2 a cdt białko warun- dobnie w najbliższym czasie przezwyciężona poprzez kujące kolonizację głębiej położonych tkanek); wprowadzenie na rynek szczepionek zawierających • phoPQ, cya, crp, fur, rpoS, rhoE, rfaH, dam – kodu- polisacharyd Vi skoniugowany z białkiem nośnikowym jących białka regulatorowe, alternatywne czynniki σ, tj. nietoksyczną rekombinowaną egzotoksyną A Pseu- antyterminatory transkrypcji lub metylazy DNA; domonas aeruginosa (szczepionka Vi-rEPA) lub nie­ • galE, pmi, rfaH, rfc – kodujących białka niezbędne aktywną toksyną błoniczą CRM197 (cross reacting mate- w biogenezie lipopolisacharydu. rial). Szczepionka Vi-CRM197, opracowana przez firmę Wprowadzenie wyżej wymienionych mutacji w szcze-

Novartis, zawiera jako białko nośnikowe CRM197, aktual- pach S. enterica używanych jako nośniki heterologicz- nie już licencjonowany do stosowania w szczepionkach nych genów powinno zapewniać odpowiedni poziom dla ludzi preparat, oraz polisacharyd Vi otrzymany ze atenuacji komórek. Ważne jest, aby skonstruowany szczepu Citrobacter freundii WR7011. Polisacharyd Vi szczep Salmonella był jednocześnie bezpieczny w uży- C. freundii jest strukturalnie zbliżony i immunologicznie ciu tzn. nie wywoływał objawów poszczepiennych nawet nierozróżnialny od Vi S. Typhi [54, 63, 71, 76]. u osób z osłabionym układem immunologicznym a jed-

Tabela I Obecnie badane szczepionki nowej generacji przeciwko durowi brzusznemu

Nazwa Genotyp Faza badań Piśmiennictwo CVD 908-htrA S. Typhi Ty2 ΔaroC ΔaroD ΔhtrA II [70]

CVD 909 (HolaVax-Typhoid®) S. Typhi Ty2 ΔaroC ΔaroD ΔhtrA Ptac viaB (produkujący konstytutywnie antygen Vi)* II [70] M01ZH09 S. Typhi Ty2 ΔaroC ΔssaV II [44, 75] Ty800 S. Typhi Ty2 ΔphoPQ I [31]

* Geny kodujące antygen Vi znajdują pod kontrolą ściśle regulowanego promotora. Ich ekspresja jest indukowana jedynie w środowisku zewnątrzkomórkowym, natomiast gdy komórki Salmonella znajdują się wewnątrz makrofagów i komórek dendrytycznych geny kodujące białka niezbędne do produkcji antygenu Vi nie są wyrażane. W celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej wobec antygenu Vi, w szczepie CVD 909 viaB sklonowano pod kontrolą konstytutywnego promotora tac. KONSTRUKCJA SZCZEPIONEK PODJEDNOSTKOWYCH Z WYKORZYSTANIEM KOMÓREK SALMONELLA ENTERICA 283 nocześnie był silnie immunogenny w celu zapewnienia pamiętać, że u ludzi te dwa serotypy charakteryzują się długotrwałego efektu ochronnego (najlepiej po zażyciu innym przebiegiem infekcji, zakażenie S. Typhi wywo- już jednej dawki preparatu). Przykładem nieprawidło- łuje ogólnoustrojową infekcję, a zakażenie S. Typhi- wego zbalansowania poziomu atenuacji i immunogen- murium infekcję lokalną ze stanem zapalnym. Jednym ności jest aktualnie używany jako szczepionka przeciwko z przykładów są podane wyżej badania dotyczące serii durowi brzusznemu szczep S. Typhi Ty21. Jego niska szczepów S. Typhi CVD, innym badania mające na celu skuteczność prawdopodobnie wynika z nadatenuacji, skonstruowanie szczepów S. Typhi RASTyV (recombi- braku aktywnego genu rpoS kodującego jeden z alterna- nant attenuated S. Typhi vaccine). W tym drugim przy- tywnych czynników σ polimerazy RNA. Z drugiej strony padku wprowadzenie na plazmidzie genu rpoS, który szczepy zawierające unieczynnione pojedyncze geny był nieaktywny w wyjściowym szczepie S. Typhi Ty2 lub szlaki metaboliczne niezbędne do infekcji komó- w znaczący sposób zwiększyło skuteczność immuniza- rek gospodarza mogą wykazywać nadal zbyt wysoki cji [66]. Należy też wnikliwie przeanalizować fenotypy poziom wirulencji. Szczep CVD 908 skonstruowano szczepów wyjściowych stosowanych do otrzymania mutując wirulentne komórki S. Typhi Ty2 w genach wersji atenuowanych. Znaczące różnice w genomach aroC i aroD, których produkty są niezbędne do biosyn- występujące nie tylko pomiędzy różnymi serotypami, tezy aminokwasów aromatycznych [70]. W rezultacie ale także pomiędzy szczepami tych samych serotypów szczep ten nie namnaża się wewnątrz komórek euka- Salmonella, skutkują różnym rodzajem i różnym pozio- riotycznych, jednak jest w stanie przetrwać wewnątrz mem odpowiedzi immunologicznej [10, 66]. ich na tyle długo, aby zaindukować silną odpowiedź Optymalnie atenuowane szczepy S. Typhi lub S. Ty-­ immunologiczną. Badania kliniczne na ludzkich ochot- phi­murium wykorzystane jako nośniki heterologicznych nikach wykazały, że szczep CVD 908 rzeczywiście indu- antygenów mogą nie funkcjonować idealnie z powodu kuje wysoki poziom przeciwciał anty-LPS klasy IgG zaburzenia metabolizmu komórek nośnika związanego w surowicy jak i stymuluje powstawanie limfocytów B z ekspresją transgenu. W wyniku nadprodukcji hetero- produkujących przeciwciała anty-LPS klasy IgA już po logicznego białka komórki Salmonella stają się często zażyciu pojedynczej dawki. Jednak szczepionka była nadatenuowane i zbył słabo immunogenne. Nowator- dobrze tolerowana przez pacjentów tylko w przypadku skim rozwiązaniem tego problemu jest wykorzystanie doustnego podania pojedynczej dawki zawierającej strategii „regulowanej opóźnionej atenuacji in vivo” 5 × 104 lub 5 × 105 CFU. Podanie wyższych dawek powo- (regulated delayed attenuation in vivo) [12]. Klasyczna dowało u pacjentów asymptomatyczną poszczepienną konstrukcja awirulentnych szczepów Salmonella pole- bakteriemię. Okazało się, że dopiero wprowadzenie gała na ich konstytutywnej atenuacji, nowa metoda dodatkowej mutacji w genie htrA, zwiększającej wrażli- opiera się zaś na warunkowej atenuacji. Szczep skon- wość komórek Salmonella na stres oksydacyjny, pozwo- struowany według tej metody w momencie przygotowa- liło na osiągnięcie odpowiedniego poziomu atenuacji. nia preparatu i szczepienia posiada dziki fenotyp, dzięki Badania wykazały, że w ten sposób skonstruowany czemu nie ma obniżonego potencjału kolonizacyjnego szczep CVD 908-htrA w porównaniu do poprzedniego i potrafi spenetrować głębokie warstwy tkanki GALT nadal jest silnie immunogenny i nie jest odnajdywany oraz odpowiednie narządy limfatyczne immunizowa- we krwi pacjentów, nawet przy zastosowaniu wysokich nego gospodarza. Dopiero w momencie oddziaływania dawek preparatu (tj. 5 × 109 CFU). Przykład ten ilustruje z komórkami prezentującymi antygen (tj. makrofagami jak ważne jest w konstrukcji awirulentnych szczepów czy komórkami dendrytycznymi) komórki Salmonella Salmonella odpowiednie zbilansowanie poziomu ate- ulegają atenuacji. nuacji i immunogenności komórek. Jedną z przyczyn Konstrukcję szczepu o opóźnionej atenuacji można utrudniających otrzymanie odpowiednio atenuowa- osiągnąć na kilka sposobów. Jednym z nich jest delecja nych i wysoce immunogennych szczepów S. Typhi jest genu pmi, kodującego izomerazę mannozo-6-fosfora- brak modelu zwierzęcego do badań, ze względu na silny nową [13]. Enzym ten, katalizujący reakcję konwersji tropizm gatunkowy S. Typhi. S. Typhi jest patogenem fruktozo-6-fosforanu do mannozo-5-fosforanu, jest wyłącznie ludzi. Początkowe badania oceniające atenu- niezbędny do syntezy pełnego antygenu O lipopoli- ację i immunogenność zmienionych genetycznie szcze- sacharydu. Komórki mutanta w genie pmi hodowane pów Salmonella przeprowadzane są z wykorzystaniem w obecności mannozy syntetyzują pełen LPS (smooth S. Typhimurium na modelu mysim. Infekcja myszy LPS), jednak po skolonizowaniu tkanek gospodarza S. Typhimurium wywołuje u tych zwierząt objawy cho- po 7–8 podziałach tracą antygen O, stając się bardziej robowe podobne do ludzkiego duru brzusznego. Jednak podatne na fagocytozę i działanie układu dopełniacza. w większości przypadków wprowadzenie identycznych W celu zapewnienia wykorzystania mannozy przez mutacji do genomu S. Typhi skutkuje niecałkowitą ich komórki podczas hodowli in vitro tylko do syntezy LPS atenuacją i niemożliwym do zaakceptowania pozio- dodatkowo zinaktywowano geny gmd-fcl. Produkty mem reaktogenności lub też ich nadatenuacją. Trzeba tych genów umożliwiają przekształcenie GDP-mannozy 284 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA w GDP-fukozę i syntezę polisacharydowego kwasu kolo- cji szczepionek przeznaczonych dla ludzi lub zwierząt. ­nowego (colanic acid). Wykazano, że mutacja obniża Dodatkowo stosowane do konstrukcji szczepów szcze- także zdolność do tworzenie biofilmu i koloniza- pionkowych rekombinowane plazmidy powinny być cję powierzchni kamieni żółciowych, jednak nie ma niekoniugacyjne, niemobilizowane i charakteryzować wpływu na immunogenność szczepu. się wąskim zakresem gospodarza. Uniemożliwia to Inną strategią uzyskania opóźnionej atenuacji jest przeniesienie transgenu do innych bakterii na drodze konstrukcja warunkowych mutantów z użyciem kasety horyzontalnego transferu genów. araC PBAD zawierającej regulator i promotor arabino- W celu stabilnego utrzymywania plazmidów w ko- zowy [12]. Delecja w chromosomie nukleotydowej mór­ kach­ Salmonella bez konieczności stosowania anty- sekwencji promotorowej wybranego genu lub genów biotykowej presji selekcyjnej skonstruowano tzw. „balan- i zastąpienie jej kasetą arabinozową skutkuje transkryp- ced-lethal host-vector system” lub „conditional-lethal sys- cją genu/ów tylko w obecności arabinozy. Po skoloni- tem”. W układach tych szczep nośnikowy zawiera chro- zowaniu tkanek gospodarza, ekspresja tychże genów ze mosomową delecję genu metabolizmu podstawowego względu na brak induktora, zostaje zahamowana. (house-keeping gene). Mutacja (najczęściej warunkująca Badania z użyciem szczepu S. Typhimurium o opóź- auksotrofizm) jest komplementowana przez funkcjo- nionej atenuacji produkującego antygen PspA Strep- nalny allel genu zlokalizowany na rekombinowanym tococcus pneumoniae na modelu mysim wykazały, że plazmidzie; tak więc, do przeżycia komórek niezbędne kolonizuje on wątrobę i śledzionę z 10-krotnie wyższą jest posiadanie plazmidowej kopii genu. Komórki, który częstością niż szczepy atenuowane w standardowy spo- utracą plazmid są eliminowane z populacji w wyniku sób [51]. Użyty w tych badaniach szczep zawierał wiele zaburzenia prawidłowego metabolizmu. Jednym z genów zmian w chromosomie, a jego opóźniona atenuacja wykorzystanych z powodzeniem w konstrukcji takiego wynikała z delecji genu pmi oraz wprowadzeniu kaset układu jest gen asd, kodujący dehydrogenazę semial- arabinozowych powyżej genów fur lub/i crp, kodujące dehydu asparaginianowego – enzymu niezbędnego do istotne dla wirulencji białka regulatorowe. Immuniza- biosyntezy m.in. kwasu diaminopimelinowego, skład- cja myszy szczepem o opóźnionej atenuacji indukowała nika peptydoglikanu [11]. Plazmidy zawierające sklono- wyższy poziom specyficznych przeciwciał anty-PspA wany i zoptymalizowany pod kątem poziomu ekspresji klasy IgG oraz wyższy poziom cytokin charakterystycz- gen asd wykorzystano z powodzeniem do produkcji nych zarówno dla odpowiedzi immunologicznej typu w komórkach S. Typhimurium m.in. antygenów PspA Th1 jak i Th2 tj. IFN-γ i IL-4. Co więcej jego zastoso- i PsaA S. pneumoniae [40, 80], PsaA i LcrV Yersinia wanie prowadziło do podwyższenia skuteczności szcze- pestis [4, 72, 73], CjaA Campylobacter jejuni [84] czy pionki z 21% aż do 71–86% (odsetek przeżycia myszy też ESAT-6 i CFP-10 Mycobacterium tuberculosis [38]. zakażanych wirulentnym szczepem S. pneumoniae). Inne geny wykorzystane do konstrukcji tego typu Wyniki eksperymentu potwierdziły, że rodzaj atenuacji systemu to m.in. dadB i murA kodujące także enzymy szczepu nośnikowego ma ogromny wpływ na immuno- niezbędne do syntezy peptydoglikanu, odpowiednio genność heterologicznego antygenu. racemazę alaninową i transferazę enoilopirogronianową [78], thyA, kodujący syntezę tymidylanową niezbędną w biosyntezie tymidyny [3] czy też ssb (single-stranded 3. Stabilność utrzymania transgenu binding protein) kodujący białko biorące udział w proce- sach replikacji, rekombinacji i naprawy DNA [22]. Najczęstszym narzędziem wykorzystywanym do eks­ Inną strategią mającą na celu zapobieganie utracie presji heterologicznych genów w komórkach bakteryj- plazmidów jest wykorzystanie występującego naturalnie nych są rekombinowane plazmidy. W celu zapewnienia w komórkach bakteryjnych mechanizmu posegregacyj- ich stabilnego utrzymania w komórce w warunkach nej eliminacji bezplazmidowych komórek (post-segre- in vitro stosuje się antybiotykową presję selekcyjną. gational killing system) hok-sok [20]. Ten system addyk- Jednakże w trakcie immunizacji w warunkach in vivo cyjny zwany systemem „trucizna-antidotum” składa się plazmid może być spontaniczne tracony, ponieważ z trzech genów: hok (host killing), mok (mediation of ekspresja heterologicznego genu zlokalizowanego na killing) i sok (suppresion of killing). W komórkach zawie- plazmidzie stanowi spore obciążenie metaboliczne dla rających plazmid transkrypcji ulegają gen hok, kodujący komórek nośnikowych. Komórki w środowisku pozba- białko o toksycznych dla komórki właściwościach (tru- wionym presji selekcyjnej mogą utracić plazmid i zdo- cizna) jak i gen sok, kodujący krótki antysensowny RNA być przewagę w populacji, co niewątpliwie drastycznie (antidotum). Oddziaływanie RNA sok z transkryptem obniżałoby efektywność immunizacji. Ze względów mRNA zachodzących na siebie genów mok-hok pro- bezpieczeństwa odpowiednie agencje wprowadziły wadzi do degradacji powstałej dwuniciowej struktury także regulacje zabraniające używania kaset niosących przez RNazę III, co uniemożliwią produkcję toksyny. geny warunkujące antybiotykooporność w konstruk- W przypadku utraty przez komórkę plazmidu zawiera KONSTRUKCJA SZCZEPIONEK PODJEDNOSTKOWYCH Z WYKORZYSTANIEM KOMÓREK SALMONELLA ENTERICA 285 ona otrzymane w wyniku podziału zarówno cząsteczki zintegrowany z chromosomem heterologiczny DNA mRNA trucizny jak i antidotum. Antysensowny RNA [35]. System z użyciem fagowej rekombinazy pozwala sok w przeciwieństwie do mRNA mok-hok jest mniej na efektywniejsze i bardziej precyzyjne manipulowa- stabilny i szybciej ulega degradacji. W ten sposób nie materiałem genetycznym Salmonella. W przeci- w komórce gen hok ulega transkrypcji, syntetyzowana wieństwie do bakteryjnego systemu rekombinacji Rec toksyna depolaryzuje błonę cytoplazmatyczną, co pro- wymaga on jedynie krótkich nukleotydowych sekwencji wadzi do śmierci komórki [26]. System ten wykorzy- homologicznych (30–50 pz). Daje też możliwość usunię- stano m.in. w badaniach przedklinicznych do stabilnego cia kasety „antybiotykooporności” po selekcji mutan- utrzymywania przez komórki S. Typhi CVD 908-htrA tów, co jest istotnym elementem w konstrukcji szczepów plazmidu kodującego podjednostkę toksyny wąglika szczepionkowych. Usunięcie niepożądanej nukleotydo- PA83 w fuzji z białkiem ClyA [19]. wej sekwencji DNA jest możliwe, dzięki wykorzystaniu Ciekawym rozwiązaniem jest także strategia utrzy- aktywności enzymatycznej rekombinazy specyficznej mywania plazmidów opierająca się na oddziaływaniu co do miejsca FLP (tzw. flipazy) wycinającej dowolną sekwencji operatorowych lacO z represorem LacI tzw. nukleotydową sekwencję położoną między dwoma ORT („operator-repressor titration technology”) [24]. sekwencjami FRT (FLP recombinase target) o zgodnej W celu jej zastosowania niezbędna była konstrukcja orientacji. Użycie w konstrukcji mutanta kasety „anty- szczepu S. Typhimurium zawierającego zlokalizowany biotykoopornościowej” oflankowanej sekwencjami FRT na chromosomie gen metabolizmu podstawowego tj. pozwala na jej skuteczne usunięcia za pomocą rekom- dapD, kodujący enzym niezbędny do syntezy lizyny, binazy FLP. Poszczególne etapy opisanej wyżej metody pod kontrolą promotora laktozowego. Wprowadzenie integracji transgenu do chromosomowego DNA przed- do komórek rekombinowanego plazmidu zawierającego stawia Rys. 1. sekwencje operatora lacO powoduje wysycenie represora LacI, co umożliwia syntezę białka niezbędnego do prze- życia komórek. W przypadku utraty plazmidu, nadmiar produkowanego represora LacI blokuję syntezę białka DapD, co prowadzi do śmierci komórki. System ten został wykorzystany do konstrukcji szczepu S. Typhimu- rium produkującego antygen F1 Y. pestis [25]. Badanie na modelu mysim wykazało stabilne utrzymanie pla- zmidu, co przyczyniło się do uzyskania efekt protekcyj- nego po jednokrotnym szczepieniu zwierząt. Ostatnio technologię tą z powodzeniem wykorzystano także do konstrukcji prototypu szczepionki DNA przeciwko prąt- kom gruźlicy [33]. Za pomocą mikroskopii immuno- fluorescencyjnej wykazano skuteczność systemu ORT w dostarczaniu heterologicznego DNA (tj. genu mpt64 M. tuberculosis) do wnętrza mysich makrofagów. Alternatywnym sposobem utrzymywania transgenu w komórkach Salmonella jest integracja heterologicz- nego DNA do chromosomu szczepu nośnikowego. Niewątpliwą zaletą tej strategii jest możliwość jedno- czesnej inaktywacji genu prowadzącej do atenuacji szczepu nośnikowego wraz z wprowadzeniem kasety ekspresyjnej. Integracja do DNA zapewnia wysoką stabilność utrzymania transgenu, gdyż geny zlokalizo­ ­ wane na chromosomie bardzo rzadko ulegają sponta- nicznym delecjom. Do niedawna ta genetycznie skomplikowana metoda, opierająca się głównie na rekombinacji homologicznej Rec, wymagała przeprowadzenia wielu manipulacji in vitro oraz stosowania kaset niosących geny warunkujące antybiotykooporność. Opracowanie nowego narzędzia Rys. 1. Mechanizm integracji heterologicznego DNA do chromo- somu Salmonella za pomocą systemu rekombinacji Red faga λ. do konstrukcji mutantów wykorzystującego rekom- Opis w tekście. Objaśnienia: IVIP – promotor indukowalny in vivo; binazę Red faga λ (recombineering) niewątpliwie uła- FLP – rekombinaza specyficzna co do miejsca (flipaza); FRT – sekwencja twi i przyspieszy konstrukcję szczepów zawierających rozpoznawana przez flipazę;aph – gen oporności na kanamycynę. 286 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

Ze względu na fakt, iż w ten sposób wprowadzony rate nitrate reduction) promotory nirB i dmsA użyte do gen posiada tylko jedną kopię w komórce ważne jest ekspresji DNA kodującego C-fragment toksyny tężca zapewnienie optymalnej produkcji heterologicznego [56]; promotor nirB i htrA zastosowane do ekspresji białka w celu uzyskania odpowiedniej immunogen­ DNA kodującego C-fragment toksyny tężca [62]; pro- ności [34]. motor nirB ze sztucznie skonstruowanym podwójnym promotorem nirB-T7 użytym do ekspresji fuzji anty- genu Streptococcus mutans z podjednostką B toksyny 4. Poziom ekspresji transgenu LT E. coli [64]; promotory pagC i nirB zastosowane do ekspresji epitopów białek wirusa TGEV (transmissible Jak wspomniano wcześniej konstytutywna produk- gastroenteritis virus) [9]. W większości przypadków cja antygenu najczęściej z wysoko­kopijnego plazmidu ich zastosowanie zwiększa poziom odpowiedzi immu- powoduje zaburzenie metabolizmu komórki nośnika, nologicznej w stosunku do zastosowania promotorów co wpływa na infekcyjność szczepu in vivo i może pro- aktywnych konstytutywnie, choć decyzja wyboru IVIP wadzić do obniżenia skuteczności immunizacji. do kontroli konkretnego antygenu w konkretnym szcze- Jedną ze strategii ograniczającą ekspresję heterolo- pie nośnikowym winna być dobrana eksperymentalnie. gicznych genów jest użycie promotorów indukowalnych Synteza owoalbuminy przez komórki S. Typhimu- in vivo – IVIP (in vivo inducible promoter) (Rys. 2). rium ΔsseC (SseC – składnik kompleksu aparatu sekre- W tym przypadku antygen jest syntetyzowany przez cyjnego typu III SPI-2) w warunkach in vivo, wynikająca komórki nośnika tylko w momencie oddziaływania ze sklonowania heterologicznego genu na plazmidzie z komórkami APC układu immunologicznego gospoda- pod kontrolą promotora sseA (SseA – białko opiekuń- rza. Do tej pory zastosowano promotory następujących cze systemu sekrecji typu III SPI-2), w porównaniu do genów S. enterica tj. nirB, dmsA, pagC, spv, dps, phoP, konstytutywnej syntezy białka indukowała u myszy wyż- ompC, htrA, groE, katG, sseA czy ssaG [7]. szy poziom specyficznych przeciwciał zarówno klasy Jednymi z najczęściej używanymi w konstrukcji IgG jak i IgA, ale także silniej stymulowała odpowiedź szczepionek są promotory genów pagC i ssaG. Gen komórkową. Zastosowanie analogicznej produkcji anty- pagC koduje białko zlokalizowane w błonie zewnętrznej genu p60 Listeria monocytogenes w tychże komórkach istotne dla komórek S. enterica do przetrwania wewnątrz zapewniała wyższy poziom protekcji [35]. makrofagów [55]. Natomiast białko SsaG stanowi skład- B u m a n n (2001) [cyt. wg. 7] wykazał zaś, że nik aparatu transportu typu III, kodowanego przez geny zarówno konstytutywna jak i regulowana (za pomocą zlokalizowane na wyspie patogenności SPI-2. Promo- promotora genu pagC) produkcja owoalbuminy przez tory pagC i ssaG z powodzeniem wykorzystano do eks- komórki S. Typhimurium ΔaroA stymuluje u myszy presji heterologicznych genów, gdyż ulegają one indukcji podobny poziom odpowiedzi immunologicznej zwią- w makrofagach, a w warunkach in vitro wykazują niski zany z limfocytami Th CD4+. Jednakże w przypadku poziom ekspresji. produkcji białka z wykorzystaniem IVIP do stymu- Wpływ indukcji produkcji antygenu tylko w warun- lacji podobnego poziomu odpowiedzi komórkowej kach in vivo na efektywność immunizacji badano potrzebna była 1000-krotnie niższa dawka bakterii. z udziałem różnych promotorów wielokrotnie. Porów- W przypadku transgenów zlokalizowanych na chro- nywano m.in. dwa regulowane przez białko FNR (fuma- mosomie zastosowanie konstytutywnych silnych pro-

Rys. 2. Strategie indukcji ekspresji heterologicznych genów w warunkach in vivo poprzez zastosowanie promotorów indukowalnych in vivo, zmiany kopijności plazmidu in vivo lub użycie odpowiedniego induktora ekspresji genu KONSTRUKCJA SZCZEPIONEK PODJEDNOSTKOWYCH Z WYKORZYSTANIEM KOMÓREK SALMONELLA ENTERICA 287 motorów ma na celu zapewnienie wystarczającej ilości gen kodujący białko regulatorowe oraz promotor (araC antygenu do stymulacji reakcji odpornościowej. Badania PBAD) powyżej heterologicznego genu pozwala na kon- wykazały jednak, że i w tym przypadku zastosowanie trolowanie produkcji antygenu za pomocą induktora tj. promotorów indukowanych in vivo prowadzi do uzyska- arabinozy. W identyczny sposób można także sterować nia lepszych rezultatów [32]. Pod kontrolą promotora liczbą kopii cząsteczek plazmidu. genu ssaG sklonowano gen eltB, kodujący podjednostkę Alternatywną strategią do stosowania indukowal- B toksyny LT enterotoksycznego szczepu E. coli (ETEC) nych in vivo promotorów genów Salmonella jest zasto- [68]. Kasetę ekspresyjną wprowadzono do chromosomu sowaniem systemu RDAS (regulated delayed antigen syn- szczepu S. Typhi M01ZH09. Wykazano, że ekspresja thesis) polegającego na opóźnionej produkcji antygenu genu eltB w komórkach nośnika, które uległy fagocyto- [79]. W układzie tym heterologiczny gen zlokalizowany zie przez ludzkie komórki U937 wzrasta aż 500-krotnie na plazmidzie klonowany jest pod kontrolą promotora w porównaniu do poziomu jego ekspresji w komórkach trc. Promotor ten zapewnia wysoki poziom ekspresji S. Typhi hodowanych na sztucznej pożywce. Badanie i jest ściśle regulowany przez represor LacI. Gen kodu- poziomu odpowiedzi immunologicznej myszy immu- jący białko regulatorowe zlokalizowany na chromosomie nizowanych donosowo pojedynczą dawką szczepionki znajduje się poniżej kasety arabinozowej (araC PBAD). wykazało indukcję specyficznych przeciwciał IgG jedy- W warunkach in vitro bakterie hodowane w obecności nie w przypadku antygenu produkowanego in vivo. Jako arabinozy produkują represor LacI, który hamuje eks- kontrolę użyto szczepu produkującego antygen w spo- presję heterologicznego genu. Natomiast w warunkach sób konstytutywny (gen eltB pod kontrolą promotora in vivo, w uodparnianym organizmie, gdzie bakterie nie tac). Eksperyment ten dowodzi słuszności hipotezy mają dostępu do arabinozy, ekspresja genu lacI zostaje mówiącej, że nie ilość produkowanego antygenu a odpo- zablokowana. Stężenie represora w komórkach zmniej- wiedni czas jego produkcji i lokalizacja jest czynnikiem sza się z każdym podziałem, co powoduje stopniową krytycznym w uzyskaniu odpowiedzi immunologicznej. indukcję syntezy heterologicznego antygenu. Schemat Indukcję ekspresji heterologicznego genu można działania systemu RDAS przedstawia Rys. 3. W celu także osiągnąć poprzez zastosowanie strategii opierającej poprawy kontroli produkcji antygenu w komórkach się na kontrolowaniu liczby kopii cząsteczek plazmidu nośnika, natywny gen lacI poddano różnym modyfika- w komórce nośnika [52]. W tym celu stosuje się wektor cjom genetycznym m.in. zmieniono jego kodon inicja- ekspresyjny posiadający dwa różne systemy replikacji cyjny, sekwencję RBS oraz zoptymalizowano niektóre zapewniające różną liczbę jego kopii. W warunkach in kodony biorąc pod uwagę ich używalność w komórkach vitro plazmid replikuje się dzięki konstytutywnemu sys- rodzaju Salmonella. Zmiany te przyczyniły się do ściślej- temowi replikacji warunkującemu jedną lub niewielką szej represji heterologicznego genu w warunkach in vitro liczbę kopii w komórce. Sklonowanie genu kodującego i wyższej indukcji jego ekspresji w warunkach in vivo. białko inicjacyjne drugiego systemu replikacji pod Badanie na modelu mysim przy użyciu antygenu PspA kontrolą indukowalnego in vivo promotora umożliwia S. pneumoniae wykazały wyższą skuteczność szczepu zwiększenie liczby kopii plazmidu, co skutkuje nadpro- S. Typhimurium produkującej antygen z opóźnieniem dukcją heterologicznego białka w warunkach in vivo od szczepu produkującego go w sposób konstytutywny. (Rys. 2). Dodatkowo sklonowanie heterologicznego Ostatnio porównano także skuteczność działania sys- genu na plazmidzie także pod kontrolą indukowalnego temu RDAS z układami stosującymi promotory induko- in vivo promotora może spotęgować zamierzony efekt. walne in vivo [81]. W tym celu skonstruowane zostały Podobną strategię zwaną także „runaway-like replica- trzy plazmidy zawierające gen pspA S. pneumoniae pod tion”, opartą na bardziej skomplikowanym mechanizmie kontrolą różnych promotorów: trc, pagC i ssaG. Wektory regulacji kopijności plazmidu, zastosowano do nadpro- wprowadzono do komórek S. Typhimurium produku- dukcji przez komórki S. Typhimurium w warunkach in jących i nieprodukujących represor LacI, a następnie vivo antygenu LcrV Y. pestis [74]. Immunizacja myszy immunizowano nimi myszy. Przeprowadzona analiza skonstruowanym szczepem indukowała u zwierząt silną wykazała, że szczep S. Typhimurium z systemem RDAS odpowiedź odpornościową zarówno typu Th1 jak i Th2, indukuje u szczepionych zwierząt najwyższy poziom co chroniło je w eksperymencie protekcyjnym przed specyficznych przeciwciał klasy IgA i IgG rozpoznają- letalną dawką Y. pestis. cych antygen PspA. Uzyskana po immunizacji zwierząt Inną metodą mającą na celu indukcję ekspresji hete- odpowiedź humoralna była aż 100-krotnie wyższa od rologicznych genów w komórkach Salmonella w odpo- odpowiedzi immunologicznej uzyskanej w przypadku wiednim momencie infekcji jest zastosowanie promo- zastosowania do ekspresji genu pspA promotora ssaG. torów ściśle regulowanych przez drobnocząsteczkowe Poziom protekcji uodparnianych myszy po zakażeniu substancje (Rys. 2) [52]. Jednym z promotorów, który wirulentnym szczepem S. pneumoniae był porówny- umożliwia „zdalne sterowanie” ekspresją genów jest pro- walny w przypadku użycia jako nośnika genu pspA motor arabinozowy. Wprowadzenie kasety zawierającej S. Typhimurium RDAS i S. Typhimurium wyrażającej 288 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

Rys. 3. Schemat działania systemu opóźnionej produkcji antygenu (RDAS) w komórkach Salmonella. W warunkach in vitro w podłożu uzupełnionym arabinozą gen lacI, sklonowany pod kontrolą promotora BAD ulega ekspresji a produkowany represor LacI blokuje transkrypcję genu x sklonowanego pod kontrolą promotora trc. W warunkach in vivo przy braku arabinozy dimer białka regulatorowego AraC uniemożliwia produkcję represora LacI co skutkuje ekspresją genu kodującego antygen.

PspA z promotora genu pagC w przeciwieństwie do dla komórek nośnikowych lub też mogą przyczynić się użycia do ekspresji transgenu promotora genu ssaG. do obniżenia ich immunogenności. Białko o lokalizacji Zaobserwowane w tym eksperymencie różnice w pro- cytoplazmatycznej będzie dostępne dla komórek układu dukcji heterologicznego antygenu z dwóch różnych immunologicznego gospodarza dopiero po lizie ko­- indukowalnych in vivo promotorów mogą być spowo- mórek nośnika. Heterologiczne białka wybrane do kon- dowane różnymi mechanizmami regulacyjnymi. Aktyw- strukcji szczepionek podjednostkowych to często białka ność obu promotorów PpagC i PssaG jest regulowana przez zewnątrzkomórkowe, stąd ich lokalizacja w redukują- układ dwuskładnikowy PhoP-PhoQ, tak więc żaden z cym środowisku cytozolu może prowadzić do uzyska- tych promotorów nie może być zastosowany do ekspresji nia nieprawidłowej konformacji. Ze względu na fakt, że heterologicznego genu w zczepie atenuowanym przez wiele determinant antygenowych to epitopy konforma- unieczynnienie genów kodujących białka tego układu cyjne, może się to przyczynić do braku indukcji specy- dwuskładnikowego. Promotor PssaG jest dodatkowo regu- ficznych przeciwciał. Dodatkowo udokumentowano, że lowany przez mechanizmy warunkujące ekspresję genów za pomocą różnych lokalizacji antygenu w komórkach wyspy patogenności SPI-2 jak np. układ dwuskładni- Salmonella możliwe jest wzmocnienie i odpowiednie kowy SsrA-SsrB, co może wpływać na skuteczność dzia- ukierunkowanie odpowiedzi immunologiczną gospo- łania prototypu szczepionki. W tych eksperymentach darza. Do tej pory opracowano bardzo wiele technologii wykazano, że system RDAS może być alternatywnym, mających na celu „wysyłanie” heterologicznych białek do zastosowania promotorów indukowalnych in vivo, do peryplazmy, na powierzchnię komórek nośnika lub sposobem wzmocnienia immunogenności szczepio- do otaczającego środowiska. nek opartych na żywych komórkach Salmonella. Jego K a n g i wsp. [40] wykorzystali do sekrecji antygenu zaletą jest zastosowanie mechanizmów regulatorowych PspA S. pneumoniae sekwencję sygnalną β-laktamazy

„obcych” dla komórek rodzaju Salmonella i niezależnych (Bla) E. coli. Badania wykazały że fuzyjne białko BlaSS- od metodyki użytej do atenuacji szczepu nośnikowego. -PspA wydzielane do peryplazmy i na zewnątrz komórek S. Typhimurium indukuje aż 10 000-krotnie wyższą spe- cyficzną odpowiedź humoralną w porównaniu do białka 5. Lokalizacja antygenu a typ odpowiedzi produkowanego na terenie cytoplazmy [39]. Immuniza- immunologicznej cji myszy skonstruowanym szczepem S. Typhimurium o opóźnionej atenuacji, wydzielającym antygen PspA Odpowiednia lokalizacja antygenu produkowanego przy użyciu sekwencji sygnalnej Bla, efektywnie chroniła w komórkach nośnikowych Salmonella jest istotna zwierzęta przed zakażeniem S. pneumoniae [51]. z kilku powodów. Heterologiczne białka w cytoplazmie, Do sekrecji heterologicznych białek do pery­plaz- zwłaszcza ulegające nadprodukcji, mogą być toksyczne my komórek Salmonella używano także sekwencji syg- KONSTRUKCJA SZCZEPIONEK PODJEDNOSTKOWYCH Z WYKORZYSTANIEM KOMÓREK SALMONELLA ENTERICA 289 nalnych białek MalE i PhoA, a do ich prezentacji na Interesującą niedawno opracowaną strategią mającą powierzchni komórek nośnika fuzji translacyjnych na celu uwolnienie z komórek nośnika produkowanego z białkami OmpA, Lpp, LamB, a także fimbrii i auto- antygenu jest programowana liza komórek nośnika [45]. transporterów AIDA i MisL [7]. Produkowane w komór- System ten jest dość skomplikowany i składa się z części kach szczepu nośnikowego antygeny pobudzają głównie kodowanej chromosomowo oraz wprowadzonej in trans odpowiedź humoralną poprzez prezentację antygenów na plazmidzie (Rys. 4). Szczep S. Typhimurium posiada limfocytom CD4+ przez MHC klasy II. w chromosomie m.in. gen murA pod kontrolą kasety

W konstrukcji szczepionek podjednostkowych wyko­ arabinozowej (araC PBAD) oraz delecję genu asd. Jak już rzystywane są także pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wcześniej wspomniano produkty tych genów są nie- OMV (outer membrane vesicle). OMV, będące natural- zbędne w syntezie peptydoglikanu. Na chromosomie nymi proteoliposomami, produkowane są przez wiele pod kontrolą promotorów arabinozowych znajdują się gatunków mikroorganizmów, głównie gramujemnych, także geny kodujące białka regulatorowe LacI (repre- w różnych fazach wzrostu. Ich liczba wzrasta znacząco sor promotora trc) i C2 (represor promotora P22R). w warunkach stresowych. Zawierają głównie białka Na plazmidzie zaś znajdują się kopie genów asd oraz osłon komórkowych i białka peryplazmatyczne, w tym murA pod kontrolą promotora arabinozowego oraz także czynniki wirulencji. Mechanizm segregacji białek pokrywającą się z nimi otwarta ramkę odczytu kodu- do OMV nie został jak dotąd dokładnie wyjaśniony [16]. jący antysensowny RNA pod kontrolą promotora P22R. OMV mają zdolność do interakcji zarówno z komór- Plazmid zawiera także gen kodujący heterologiczny kami prokariotycznymi jak i eukariotycznymi, są więc antygen pod kontrolą promotora trc. W warunkach in wykorzystywane do produkcji szczepionek podjednost- vitro w obecności arabinozy ekspresji ulegają geny asd, kowych jako nośniki antygenów. Wchodzą m.in. w skład murA, c2 i lacI, co zapewnia normalny wzrost komórek wieloskładnikowej podjednostkowej szczepionki anty- oraz blokuje ekspresję heterologicznego genu. W środo- -Neisseria meningitidis typu B (MenB) opracowanej wisku pozbawionym arabinozy, ekspresja wyżej wymie- przez firmę Novartis i będącej aktualnie w III fazie nionych genów ulega zahamowaniu. Odblokowana badań klinicznych [61]. zostaje zaś ekspresja genów kodujących antygen oraz Nietypową metodą mającą na celu sekrecję hetero- antysensowny RNA asd-murA. Blokuje to całkowicie logicznych białek przez komórki Salmonella jest użycie produkcję białek Asd i MurA w komórce, co w kon- fuzji z cytolizyną A (ClyA), nazywaną również SheA sekwencji prowadzi do jej lizy i uwolnienia antygenu. lub HlyE [23]. Nieznany jest mechanizm transportu tej Metodę to wykorzystano m.in. w konstrukcji prototypów toksyny przez błonę cytoplazmatyczną, udowodniono szczepionek przeciwko S. pneumoniae [45], M. tuber- jednak, że w jej wydzielaniu poza komórkę bakteryjną culosis [38] czy wirusowi grypy [2]. biorą udział OMV [77]. Fuzje translacyjne heterolo- Dla wzmocnienia odpowiedzi komórkowej skon- gicznych antygenów z ClyA również wydajnie segregują struowano szczepy Salmonella wydzielające hetero- do OMV, co umożliwia ich wydzielanie na zewnątrz logiczne antygeny na zewnątrz komórki, do cytozolu komórki nośnika. Dodatkową zaletą tej specyficznej komórek eukariotycznych. W tym celu wykorzystano sekrecji antygenów może być pobudzenie wrodzonej systemy transportu typu III S. enterica kodowane przez odpowiedzi immunologicznej przez LPS znajdujący się geny zlokalizowane na SPI-1 i SPI-2. Te systemy sekrecji na powierzchni OMV [8, 43]. aktywne są na różnych etapach infekcji. SPI-1 warun- Strategię tą wykorzystano m.in. w konstrukcji szcze- kuje inwazję do komórek eukariotycznych, SPI-2 jest ­pionki przeciwko wąglikowi. Badania wykazały, że aktywny podczas wzrostu Salmonella wewnątrz ko- immunizacja myszy szczepem S. Typhimurium produ- mórek eukariotycznych i warunkuje biogenezę wakuoli kującym fuzyjne białko ClyA-PA83 chroni zwierzęta (SCV – Salmonella containing vacuole). Oba przekazują przed zakażaniem sporami B. anthracis [67]. Podob- do komórek eukariotycznych wiele białek efektorowych nego efekty protekcyjnego nie uzyskano w przypadku modulujących ich metabolizm [1, 60, 82]. Stworze- zastosowania do sekrecji antygenu systemu sekrecji nie fuzji translacyjnych heterologicznych antygenów Hly (jednoetapowy system sekrecji typu I). Ekspery- z N-fragmentami białek efektorowych SPI-1 tj. SopE czy ment przeprowadzony na małpach z wykorzystaniem SptP przyczyniało się do zwiększenia prezentacji anty- szczepu szczepionkowego S. Typhi CVD 908-htrA jako genu cytotoksycznym limfocytów T CD8+ z udziałem nośnika potwierdził skuteczność immunizacji przy cząsteczek MHC klasy I. Skuteczność działania tego typu użyciu fuzyjnego białka ClyA-PA83 [19]. Efekt ten uzy- fuzji efektorów SPI-1 udokumentowano w stosunku do skano niewątpliwie dzięki sekrecji antygenu na zewnątrz kilku antygenów Eimeria (czynnik etiologiczny kokcy- komórek Salmonella, którą potwierdzono za pomocą diozy drobiu) [46,47] oraz w immunizacji myszy anty- techniki mikroskopii elektronowej z użyciem prze- genami (ESAT- 6 i CFP-10) M. tuberculosis [37]. Nie ciwciał znakowanych koloidalnym złotem (immuno- we wszystkich eksperymentach uzyskano efekty pozytyw- gold staining). ne. Immunizacja ochotników atenuowanym szczepem 290 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

Rys. 4. Schemat „programowanej lizy” komórek Salmonella w warunkach in vivo. W warunkach in vitro w podłożu uzupełnionym arabinozą ekspresji ulegają geny sklonowane pod kontrolą promotora BAD tj. murA i asd, kodujące enzymy niezbędne do syntezy sciany komórkowej oraz c2 i lacI, kodujące represory blokujące syntezę antysensownego mRNA murA-asd oraz hetero- logicznego antygenu. W warunkach in vivo przy braku arabinozy zablokowana zostaje ekspresja genów murA, asd, których produkty są niezbędne do przeżycia komórek. Jednocześnie w komórce zahamowaniu ulega produkcja represorów C2 i LacI, co umożliwia ekspresję sklonowanego pod kontrolą promotora P22R antysensowny RNA murA-asd oraz sklonowanego pod kontrolą promotora trc genu kodujący antygen. W konsekwencji prowadzi to do lizy komórek i uwolnienia dużej ilości antygenu.

Salmonella niosącym fuzje białka Gag wirusa HIV [29, 36]. Prezentowane dane wskazują, jak wnikliwie i SopE Salmonella nie skutkowała indukcją odpowiedzi musi być dobierany system transportu heterologicznych immunologicznej skierowanej przeciwko antygenowi antygenów. Poznanie mechanizmów indukcji odpowie- Gag [49]. Różnice w efektach eksperymentów mogą dzi immunologicznej związanej z prezentacją antyge- wynikać zarówno z użytego modelu doświadczalnego nów za pomocą MHC klasy I przez komórki Salmonella (immunizacja kurcząt, myszy lub ludzi) jak i innych będące nośnikami antygenów zapoczątkowało badania szczepów nośnikowych. Skuteczność działania fuzji nad ich wykorzystaniem jako szczepionek antynowo- translacyjnych domen translokacyjnych pięciu bia- tworowych [57]. łek efektorowych SPI-2 (SiFA, SteC, SseL, SceJ i SseF) Ciekawym rozwiązaniem pozwalającym na prezen- z modelowymi antygenami (owoalbumina i listerioli- tację antygenów za pomocą MHC klasy I oraz jedno- zyna) wykazała, że choć in vitro wszystkie fuzje ule- cześnie uniknięcie niedogodnień związanych z nadpro- gały translokacji do cytozolu komórek gospodarza to dukcją heterologicznych antygenów na terenie komórki w eksperymentach in vivo na modelu mysim tylko dwie nośnikowej tj. zaburzeń metabolizmu, toksyczności indukowały znaczący poziom odpowiedzi komórkowej czy zmniejszenia immunogenności, jest zastosowanie KONSTRUKCJA SZCZEPIONEK PODJEDNOSTKOWYCH Z WYKORZYSTANIEM KOMÓREK SALMONELLA ENTERICA 291

modulację odpowiedzi odpornościowej immunizowa- nego gospodarza. Jednakże należy podkreślić, iż wybór odpowiedniej strategii nie jest prosty, a efekt immuni- zacji jest często trudny do przewidzenia. W konstrukcji tego typu szczepionek musi być brane pod uwagę wiele elementów: od wyboru odpowiedniego zestawu anty- genów protekcyjnych, przez genotyp i właściwości ate- nuowanego szczepu nośnikowego, rodzaj stosowanych promotorów do wyrażania heterologicznych genów, strategię prezentacji antygenu komórkom prezentu- jącym antygen, po dobranie odpowiedniego modelu zwierzęcego.

Podziękowania Artykuł został sfinansowany ze środków grantu MNiSW N N302 236838, decyzja 2368/B/P01/2010/38. Rys. 5. Schemat działania szczepionki DNA skonstruowanej z użyciem komórek Salmonella jako nośnika. Opis w tekście. Piśmiennictwo układu pozwalającego na ekspresję antygenów na terenie komórek eukariotycznych. Do tej pory komórki Salmo- 1. Agbor T.A., McCormick B.A.: Salmonella effectors: important nella zostały z powodzeniem wykorzystane jako nośnik players modulating host cell function during infection. Cell szczepionek DNA przeciwko wielu patogenom zarówno Microbiol. 13, 1858–1869 (2011) wirusowym tj. HIV [41], wirusy odry [59], opryszczki 2. Ameiss K., Ashraf S., Kong W., Pekosz A., Wu W.H., Milich D., rd [17] czy zapalenia wątroby typu B i C [6,83] jak i bakte- Billaud J.N., Curtiss R., 3 : Delivery of woodchuck hepatitis virus-like particle presented influenza M2e by recombinant ryjnym tj. Chlamydia trachomatis [5], Clostridium tetani attenuated Salmonella displaying a delayed lysis phenotype. [58], L. monocytogenes [14] czy M. tuberculosis [33]. Vaccine, 28, 6704–6713 (2010) W przypadku konstrukcji tego typu szczepionek 3. Attridge S.R., Davies R., LaBrooy J.T.: Oral delivery of foreign heterologiczny gen musi znajdować się na plazmidzie antigens by attenuated Salmonella: consequences of prior expo- pod kontrolą promotora funkcjonalnego w komórkach sure to the vector strain. Vaccine, 15, 155–162 (1997) eukariotycznych – najczęściej promotora CMV (wirusa 4. Branger C.G., Sun W., Torres-Escobar A., Perry R., Roland K.L., Fetherston J., Curtiss R., 3rd: Evaluation of Psn, HmuR and cytomegalii) lub SV40 (simian virus 40), a rolą Salmo- a modified LcrV protein delivered to mice by live attenuated nella jest jedynie dostarczenie DNA plazmidowego do Salmonella as a vaccine against bubonic and pneumonic Yer­ komórek prezentujących antygen (APC). Po lizie bakte- sinia pestis challenge. Vaccine, 29, 274–282 (2011) rii w fagosomie cząsteczki wektora zawierający hetero- 5. Brunham R.C., Zhang D.: Transgene as vaccine for chlamydia. logiczny gen są transportowane do jądra komórkowego Am. Heart J. 138, S519–522 (1999) 6. Cao J., Chen Z., Ren Y., Luo Y., Cao M., Lu W., Zhao P., Qi Z.: (Rys. 5). Mechanizm tego procesu pozostaje nadal nie- Oral immunization with attenuated Salmonella carrying a co- znany, co niewątpliwie utrudnia prace nad optymaliza- expression plasmid encoding the core and E2 proteins of hepa- cją szczepionek DNA. Na terenie jądra komórkowego titis C virus capable of inducing cellular immune responses and heterologiczny gen ulega ekspresji. Syntetyzowany neutralizing antibodies in mice. Vaccine, 29, 3714–3723 (2011) antygen traktowany jest jako endogenne białko i pre- 7. Cheminay C., Hensel M.: Rational design of Salmonella recom- zentowany przez komórki prezentujące antygen z udzia- binant vaccines. Int. J. Med. Microbiol. 298, 87–98 (2008) 8. Chen D.J., Osterrieder N., Metzger S.M., Buckles E., łem cząsteczek MHC klasy I, co stymuluje odpowiedź Doody A.M., DeLisa M.P., Putnam D.: Delivery of foreign komórkową związaną z limfocytami T CD8+. Wykazano antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proc. jednak, że szczepionki DNA stymulują także odpowiedź Natl. Acad. Sci. USA, 107, 3099–3104 (2010) humoralną i komórkową związaną z limfocytami Th, 9. Chen H., Schifferli D.M.: Enhanced immune responses to co wynika ze zjawiska krzyżowej prezentacji antygenów viral epitopes by combining macrophage-inducible expression with multimeric display on a Salmonella vector. Vaccine, 19, (cross-presentation) [65]. 3009–3018 (2001) 10. Covone M.G., Brocchi M., Palla E., Dias da Silveira W., Rap­ puoli R., Galeotti C.L.: Levels of expression and immunogenic- 6. Podsumowanie ity of attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium strains expressing Escherichia coli mutant heat-labile entero- toxin. Infect. Immun. 66, 224–231 (1998) Opisane powyżej strategie używane w konstrukcji 11. Curtiss R., 3rd, Galan J.E., Nakayama K., Kelly S.M.: Stabili- szczepionek podjednostkowych opartych na awirulent- zation of recombinant avirulent vaccine strains in vivo. Res. nych szczepach Salmonella pozwalają na zróżnicowaną Microbiol. 141, 797–805 (1990) 292 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

12. Curtiss R., 3rd, Wanda S.Y., Gunn B.M., Zhang X., Tinge S.A., 27. Germanier R., Fuer E.: Isolation and characterization of Gal E Ananthnarayan V., Mo H., Wang S., Kong W.: Salmonella mutant Ty 21a of Salmonella typhi: a candidate strain for a live, enterica serovar typhimurium strains with regulated delayed oral typhoid vaccine. J. Infect. Dis. 131, 553–558 (1975) attenuation in vivo. Infect. Immun. 77, 1071–1082 (2009) 28. Germanier R., Furer E.: Characteristics of the attenuated oral 13. Curtiss R., 3rd, Lee I.S. i wsp.: Induction of host immune vaccine strain “S. typhi” Ty 21a. Dev. Biol. Stand. 53, 3–7 (1983) responses using Salmonella-vectored vaccines (w) Virulence 29. Hegazy W.A., Xu X., Metelitsa L., Hensel M.: Evaluation of Sal- Mechanisms of Bacterial Pathogens, red. Brogden K.A., monella enterica type III secretion system effector proteins as Minion F.C., Cornick N., ASM Press, Washington, D.C., 2007, carriers for heterologous vaccine antigens. Infect. Immun. 80, s. 297–313 1193–1202 (2012) 14. Darji A., zur Lage S., Garbe A.I., Chakraborty T., Weiss S.: Oral 30. Hessel L., Debois H., Fletcher M., Dumas R.: Experience with delivery of DNA vaccines using attenuated Salmonella typhimu- Salmonella typhi Vi capsular polysaccharide vaccine. Eur. rium as carrier. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27, 341–349 J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18, 609–620 (1999) (2000) 31. Hohmann E.L., Oletta C.A., Killeen K.P., Miller S.I.: phoP/ 15. DiPetrillo M.D., Tibbetts T., Kleanthous H., Killeen K.P., phoQ-deleted Salmonella typhi (Ty800) is a safe and immuno- Hohmann E.L.: Safety and immunogenicity of phoP/phoQ- genic single-dose typhoid fever vaccine in volunteers. J. Infect. deleted Salmonella typhi expressing Helicobacter pylori urease Dis. 173, 1408–1414 (1996) in adult volunteers. Vaccine, 18, 449–459 (1999) 32. Hohmann E.L., Oletta C.A., Loomis W.P., Miller S.I.: Macro­ 16. Ellis T.N., Kuehn M.J.: Virulence and immunomodulatory roles phage-inducible expression of a model antigen in Salmonella of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. typhimurium enhances immunogenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 81–94 (2010) USA, 92, 2904–2908 (1995) 17. Flo J., Tisminetzky S., Baralle F.: Oral transgene vaccination 33. Huang J.M., Sali M., Leckenby M.W., Radford D.S., Huynh H.A., mediated by attenuated Salmonellae is an effective method to Delogu G., Cranenburgh R.M., Cutting S.M.: Oral delivery of prevent Herpes simplex virus-2 induced disease in mice. Vac- a DNA vaccine against tuberculosis using operator-repressor cine, 19, 1772–1782 (2001) titration in a Salmonella enterica vector. Vaccine, 28, 7523–7528 18. Fraillery D., Baud D., Pang S.Y., Schiller J., Bobst M., Zosso N., (2010) Ponci F., Nardelli-Haefliger D.: Salmonella enterica serovar 34. Husseiny M.I., Hensel M.: Evaluation of Salmonella live vac- Typhi Ty21a expressing human papillomavirus type 16 L1 as cines with chromosomal expression cassettes for translocated a potential live vaccine against cervical cancer and typhoid fusion proteins. Vaccine, 27, 3780–3787 (2009) fever. Clin. Vaccine Immunol. 14, 1285–1295 (2007) 35. Husseiny M.I., Hensel M.: Rapid method for the construction 19. Galen J.E., Chinchilla M., Pasetti M.F., Wang J.Y., Zhao L., of Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine carrier Arciniega-Martinez I., Silverman D.J., Levine M.M.: Mucosal strains. Infect. Immun. 73, 1598–1605 (2005) immunization with attenuated Salmonella enterica serovar 36. Husseiny M.I., Wartha F., Hensel M.: Recombinant vaccines Typhi expressing protective antigen of anthrax toxin (PA83) based on translocated effector proteins ofSalmonella Patho- primes monkeys for accelerated serum antibody responses to genicity Island 2. Vaccine, 25, 185–193 (2007) parenteral PA83 vaccine. J. Infect. Dis. 199, 326–335 (2009) 37. Juarez-Rodriguez M.D., Arteaga-Cortes L.T., Kader R., Cur- 20. Galen J.E., Nair J., Wang J.Y., Wasserman S.S., Tanner M.K., tiss R., 3rd, Clark-Curtiss J.E.: Live attenuated Salmonella vac- Sztein M.B., Levine M.M.: Optimization of plasmid mainte- cines against Mycobacterium tuberculosis with antigen delivery nance in the attenuated live vector vaccine strain Salmonella via the type III secretion system. Infect. Immun. 80, 798–814 typhi CVD 908-htrA. Infect. Immun. 67, 6424–6433 (1999) (2012) 21. Galen J.E., Pasetti M.F., Tennant S., Ruiz-Olvera P., Sztein M.B., 38. Juarez-Rodriguez M.D., Yang J., Kader R., Alamuri P., Cur- Levine M.M.: Salmonella enterica serovar Typhi live vector vac- tiss R., 3rd, Clark-Curtiss J.E.: Live attenuated Salmonella vac- cines finally come of age. Immunol. Cell Biol. 87, 400–412 (2009) cines displaying regulated delayed lysis and delayed antigen 22. Galen J.E., Wang J.Y., Chinchilla M., Vindurampulle C., synthesis to confer protection against Mycobacterium tubercu- Vogel J.E., Levy H., Blackwelder W.C., Pasetti M.F., Levine losis. Infect. Immun. 80, 815–831 (2012) M.M.: A new generation of stable, nonantibiotic, low-copy- 39. Kang H.Y., Curtiss R., 3rd: Immune responses dependent on number plasmids improves immune responses to foreign anti- antigen location in recombinant attenuated Salmonella typhi­ gens in Salmonella enterica serovar Typhi live vectors. Infect. murium vaccines following oral immunization. FEMS Immunol. Immun. 78, 337–347 (2010) Med. Microbiol. 37, 99–104 (2003) 23. Galen J.E., Zhao L., Chinchilla M., Wang J.Y., Pasetti M.F., 40. Kang H.Y., Srinivasan J., Curtiss R., 3rd: Immune responses Green J., Levine M.M.: Adaptation of the endogenous Salmo- to recombinant pneumococcal PspA antigen delivered by live nella enterica serovar Typhi clyA-encoded hemolysin for anti- attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium vaccine. gen export enhances the immunogenicity of anthrax protective Infect. Immun. 70, 1739–1749 (2002) antigen domain 4 expressed by the attenuated live-vector vac- 41. Karpenko L.I., Danilenko A.V., Bazhan S.I., Danilenko E.D., cine strain CVD 908-htrA. Infect. Immun. 72, 7096–7106 (2004) Sysoeva G.M., Kaplina O.N., Volkova O.Y., Oreshkova S.F., 24. Garmory H.S., Brown K.A., Titball R.W.: Salmonella vaccines Ilyichev A.A.: Attenuated Salmonella enteritidis E23 as a vehicle for use in humans: present and future perspectives. FEMS for the rectal delivery of DNA vaccine coding for HIV-1 poly- Microbiol. Rev. 26, 339–353 (2002) epitope CTL immunogen. Microb. Biotechnol. 5, 241–250 (2012) 25. Garmory H.S., Leckenby M.W., Griffin K.F., Elvin S.J., 42. Keitel W.A., Bond N.L., Zahradnik J.M., Cramton T.A., Rob- Taylor R.R., Hartley M.G., Hanak J.A., Williamson E.D., bins J.B.: Clinical and serological responses following primary Cranenburgh R.M.: Antibiotic-free plasmid stabilization by and booster immunization with Salmonella typhi Vi capsular operator-repressor titration for vaccine delivery by using live polysaccharide vaccines. Vaccine, 12, 195–199 (1994) Salmonella enterica Serovar typhimurium. Infect. Immun. 73, 43. Kim J.Y., Doody A.M., Chen D.J., Cremona G.H., Shuler M.L., 2005–2011 (2005) Putnam D., DeLisa M.P.: Engineered bacterial outer membrane 26. Gerdes K., Wagner E.G.: RNA antitoxins. Curr. Opin. Microbiol. vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51–66 10, 117–124 (2007) (2008) KONSTRUKCJA SZCZEPIONEK PODJEDNOSTKOWYCH Z WYKORZYSTANIEM KOMÓREK SALMONELLA ENTERICA 293

44. Kirkpatrick B.D., Taylor D.N. i wsp.: Evaluation of Salmonella ing specific immune responses and protection in cotton rats. enterica serovar Typhi (Ty2 aroC-ssaV-) M01ZH09, with J. Virol. 77, 5209–5217 (2003) a defined mutation in the Salmonella pathogenicity island 2, 60. Patel J.C., Galan J.E.: Manipulation of the host actin cytoskel- as a live, oral typhoid vaccine in human volunteers. Vaccine, eton by Salmonella – all in the name of entry. Curr. Opin. Micro- 24, 116–123 (2006) biol. 8, 10–15 (2005) 45. Kong W., Wanda S.Y., Zhang X., Bollen W., Tinge S.A., 61. Rinaudo C.D., Telford J.L., Rappuoli R., Seib K.L.: Vaccinology Roland K.L., Curtiss R., 3rd: Regulated programmed lysis of in the genome era. J. Clin. Invest. 119, 2515–2525 (2009) recombinant Salmonella in host tissues to release protective 62. Roberts M., Li J., Bacon A., Chatfield S.: Oral vaccination antigens and confer biological containment. Proc. Natl. Acad. against tetanus: comparison of the immunogenicities of Sal- Sci. USA, 105, 9361–9366 (2008) monella strains expressing fragment C from the nirB and htrA 46. Konjufca V., Jenkins M., Wang S., Juarez-Rodriguez M.D., promoters. Infect. Immun. 66, 3080–3087 (1998) Curtiss R., 3rd: Immunogenicity of recombinant attenuated 63. Rondini S., Micoli F., Lanzilao L., Hale C., Saul A.J., Martin L.B.: Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine strains car- Evaluation of the immunogenicity and biological activity of rying a gene that encodes Eimeria tenella antigen SO7. Infect. the Citrobacter freundii Vi-CRM197 conjugate as a vaccine for Immun. 76, 5745–5753 (2008) Salmonella enterica serovar Typhi. Clin. Vaccine. Immunol. 18, 47. Konjufca V., Wanda S.Y., Jenkins M.C., Curtiss R., 3rd: A recom- 460–468 (2011) binant attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium 64. Salam M.A., Katz J., Zhang P., Hajishengallis G., Michalek S.M.: vaccine encoding Eimeria acervulina antigen offers protection Immunogenicity of Salmonella vector vaccines expressing SBR against E. acervulina challenge. Infect. Immun. 74, 6785–6796 of Streptococcus mutans under the control of a T7-nirB (dual) (2006) promoter system. Vaccine, 24, 5003–5015 (2006) 48. Kopecko D.J., Dietrich G. i wsp.: Genetic stability of vaccine 65. Schoen C., Stritzker J., Goebel W., Pilgrim S.: Bacteria as DNA strain Salmonella Typhi Ty21a over 25 years. Int. J. Med. Micro- vaccine carriers for genetic immunization. Int. J. Med. Micro- biol. 299, 233–246 (2009) biol. 294, 319–335 (2004) 49. Kotton C.N., Hohmann E.L. i wsp.: Safety and immunogenicity 66. Shi H., Santander J., Brenneman K.E., Wanda S.Y., Wang S., of attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium deliver- Senechal P., Sun W., Roland K.L., Curtiss R.: Live recombinant ing an HIV-1 Gag antigen via the Salmonella Type III secretion Salmonella Typhi vaccines constructed to investigate the role system. Vaccine, 24, 6216–6224 (2006) of rpoS in eliciting immunity to a heterologous antigen. PLoS 50. Levine M.M., Ferreccio C., Abrego P., Martin O.S., Ortiz E., One, 5, e11142 (2010) Cryz S.: Duration of efficacy of Ty21a, attenuated Salmonella 67. Stokes M.G., Atkins H.S. i wsp.: Oral administration of a Sal- typhi live oral vaccine. Vaccine, 17, Suppl. 2, S22–27 (1999) monella enterica-based vaccine expressing Bacillus anthra- 51. Li Y., Wang S., Scarpellini G., Gunn B., Xin W., Wanda S.Y., cis protective antigen confers protection against aerosolized Roland K.L., Curtiss R., 3rd: Evaluation of new generation Sal- B. anthracis. Infect. Immun. 75, 1827–1834 (2007) monella enterica serovar Typhimurium vaccines with regulated 68. Stratford R., Khan S.A. i wsp.: Optimization of Salmonella delayed attenuation to induce immune responses against PspA. enterica serovar typhi DeltaaroC DeltassaV derivatives as Pro.c Natl. Acad. Sci. USA, 106, 593–598 (2009) vehicles for delivering heterologous antigens by chromosomal 52. Loessner H., Endmann A., Leschner S., Bauer H., Zelmer A., integration and in vivo inducible promoters. Infect. Immun. 73, zur Lage S., Westphal K., Weiss S.: Improving live attenuated 362–368 (2005) bacterial carriers for vaccination and therapy. Int. J. Med. Micro- 69. Tacket C.O., Levine M.M. i wsp.: Safety and immune responses biol. 298, 21–26 (2008) to attenuated Salmonella enterica serovar typhi oral live vector 53. Mastroeni P., Grant A.J.: Spread of Salmonella enterica in the vaccines expressing tetanus toxin fragment C. Clin. Immunol. body during systemic infection: unravelling host and pathogen 97, 146–153 (2000) determinants. Expert Rev. Mol. Med. 13, e12 (2011) 70. Tacket C.O., Levine M.M.: CVD 908, CVD 908-htrA, and CVD 54. Micoli F., Martin L.B. i wsp.: Vi-CRM 197 as a new conjugate 909 live oral typhoid vaccines: a logical progression. Clin. Infect. vaccine against Salmonella Typhi. Vaccine, 29, 712–720 (2011) Dis. 45, Suppl. 1, S20–23 (2007) 55. Miller V.L., Beer K.B., Loomis W.P., Olson J.A., Miller S.I.: An 71. Thiem V.D., Szu S.C. i wsp.: The Vi conjugate typhoid vaccine unusual pagC::TnphoA mutation leads to an invasion- and is safe, elicits protective levels of IgG anti-Vi, and is compat- virulence-defective phenotype in Salmonellae. Infect. Immun. ible with routine infant vaccines. Clin. Vaccine Immunol. 18, 60, 3763–3770 (1992) 730–735 (2011) 56. Orr N., Galen J.E., Levine M.M.: Novel use of anaerobically 72. Torres-Escobar A., Juarez-Rodriguez M.D., Branger C.G., induced promoter, dmsA, for controlled expression of fragment Curtiss R., 3rd: Evaluation of the humoral immune response in C of tetanus toxin in live attenuated Salmonella enterica serovar mice orally vaccinated with live recombinant attenuated Salmo- Typhi strain CVD 908-htrA. Vaccine, 19, 1694–1700 (2001) nella enterica delivering a secreted form of Yersinia pestis PsaA. 57. Panthel K., Meinel K.M., Sevil Domenech V.E., Trulzsch K., Vaccine, 28, 5810–5816 (2010) Russmann H.: Salmonella type III-mediated heterologous 73. Torres-Escobar A., Juarez-Rodriguez M.D., Curtiss R., 3rd: antigen delivery: a versatile oral vaccination strategy to induce Biogenesis of Yersinia pestis PsaA in recombinant attenuated cellular immunity against infectious agents and tumors. Int. Salmonella Typhimurium vaccine (RASV) strain. FEMS Micro- J. Med. Microbiol. 298, 99–103 (2008) biol. Lett. 302, 106–113 (2010) 58. Pasetti M.F., Anderson R.J., Noriega F.R., Levine M.M., 74. Torres-Escobar A., Juarez-Rodriguez M.D., Gunn B.M., Bran- Sztein M.B.: Attenuated deltaguaBA Salmonella typhi vaccine ger C.G., Tinge S.A., Curtiss R., 3rd: Fine-tuning synthesis of strain CVD 915 as a live vector utilizing prokaryotic or eukaryo­ Yersinia pestis LcrV from runaway-like replication balanced- tic expression systems to deliver foreign antigens and elicit lethal plasmid in a Salmonella enterica serovar Typhimurium immune responses. Clin. Immunol. 92, 76–89 (1999) vaccine induces protection against a lethal Y. pestis challenge 59. Pasetti M.F., Levine M.M. i wsp.: Attenuated Salmonella enterica in mice. Infect. Immun. 78, 2529–2543 (2010) serovar Typhi and Shigella flexneri 2a strains mucosally deliver 75. Tran T.H., Dolecek C. i wsp.: A randomised trial evaluating the DNA vaccines encoding measles virus hemagglutinin, induc- safety and immunogenicity of the novel single oral dose typhoid 294 PAWEŁ ŁANIEWSKI, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

vaccine M01ZH09 in healthy Vietnamese children. PLoS One, nant pneumococcal PsaA antigen delivered by a live attenuated 5, e11778 (2010) Salmonella vaccine. Infect Immun 78, 3258–3271 (2010) 76. van Damme P., Podda A. i wsp.: Safety, immunogenicity and 81. Wang S., Li Y., Shi H., Sun W., Roland K.L., Curtiss R., 3rd: Com- dose ranging of a new Vi-CRM conjugate vaccine against parison of a regulated delayed antigen synthesis system with in typhoid fever: randomized clinical testing in healthy adults. vivo-inducible promoters for antigen delivery by live attenuated PLoS One, 6, e25398 (2011) Salmonella vaccines. Infect. Immun. 79, 937–949 (2011) 77. Wai S.N., Uhlin B.E. i wsp.: Vesicle-mediated export and assem- 82. Waterman S.R., Holden D.W.: Functions and effectors of the bly of pore-forming oligomers of the enterobacterial ClyA cyto- Salmonella pathogenicity island 2 type III secretion system. Cell toxin. Cell, 115, 25–35 (2003) Microbiol. 5, 501–511 (2003) 78. Wanda S.Y., Konjufca V., Curtiss R., 3rd: Stability of protective 83. Woo P.C., Wong L.P., Zheng B.J., Yuen K.Y.: Unique immunoge­ antigen expression in vivo is essential for recombinant vaccine nicity of hepatitis B virus DNA vaccine presented by live-atten- efficacy. ASM 107th General Meeting, Toronto, Kanada, 2007 uated Salmonella typhimurium. Vaccine, 19, 2945–2954 (2001) 79. Wang S., Curtiss R., 3rd i wsp.: Salmonella vaccine vectors dis- 84. Wyszynska A., Raczko A., Lis M., Jagusztyn-Krynicka E.K.: Oral playing delayed antigen synthesis in vivo to enhance immuno- immunization of chickens with avirulent Salmonella vaccine stra- genicity. Infect. Immun. 78, 3969–3980 (2010) in carrying C. jejuni 72Dz/92 cjaA gene elicits specific humoral 80. Wang S., Li Y., Shi H., Scarpellini G., Torres-Escobar A., immune response associated with protection against challenge Roland K.L., Curtiss R., 3rd: Immune responses to recombi- with wild-type Campylobacter. Vaccine, 22, 1379–1389 (2004) POST. MIKROBIOL., CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA 2013, 52, 3, 295–305 http://www.pm.microbiology.pl I. ASPEKTY MIKROBIOLOGICZNE I IMMUNOLOGICZNE

Tomasz Jagielski1*†, Elżbieta Rup2†, Anna B. Macura2, Jacek Bielecki1

1 Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski 2 Zakład Mykologii, Katedra Mikrobiologii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie

Wpłynęło w styczniu 2013 r.

Spis treści: 1. Wprowadzenie. 2..Taksonomia i klasyfikacja grzybów z rodzaju Malassezia. 3. Mikrobiologia grzybów z rodzaju Malassezia. 3.1. Charakterystyka ogólna. 3.2. Metabolizm. 3.3. Aktywność enzymatyczna. 4. Interakcje grzybów Malassezia sp. z nnymi mikro- organizmami. 5. Interakcje grzybów Malassezia sp. z układem immunologicznym. 5.1. Serologia i budowa antygenowa. 5.2. Interakcje z układem dopełniacza. 5.3. Wpływ grzybów Malassezia sp. na różne populacje komórek w skórze. 6. Podsumowanie Characterization of fungi of the Malassezia genus. I. Microbiological and immunological aspects Abstract: The yeasts of the Malassezia genus, first described over a century ago, belong to the physiological microflora of the human skin. However, they may occasionally act as opportunistic pathogens resulting in different dermatological pathologies, of which pityriasis versicolor is most frequently diagnosed. Two principle features of the genus Malassezia are distinctive morphology and requirement for external lipid source for growth. To date, the genus accommodates 14 species, all but one being lipid-dependent species. The very recently completed sequencing of the M. globosa genome disclosed the presence of multiple secreted lipases to help the yeasts to utilize cutaneous lipids. Very little is known about interactions between Malassezia organisms and the human host. It is clear however that Malassezia fungi display two phenotypes within the skin, one – immunostimulatory, and the other immunosuppressive, which are responsible for commensal and pathogenic behavior of the fungi, respectively. This article provides a concise and up-to-date description of the Malassezia genus, with particular attention to the microbiology of the fungi and their interactions with the immune system of the human host. Content: 1. Introduction. 2. Taxonomy and classification of Malassezia fungi. 3. Microbiology of Malassezia fungi. 3.1. General characteristics. 3.2. Metabolism. 3.3. Enzymatic activity. 4. Interactions of Malassezia fungi with oher microorganisms. 5. Interactions of Malassezia fungi with the immune system. 5.1. Serology and antigenic structure. 5.2. Interactions with the complement system. 5.3. Influence ofMalassezia fungi on different cel populations within the skin. 6. Conclusions

Słowa kluczowe: atopowe zapalenie skóry (AZS), grzybice, łuszczyca, Malassezia sp., zakażenia skóry Key words: atopic dermatitis (AD), Malassezia sp., mycoses, psoriasis, skin infections

1. Wprowadzenie od wielu różnorodnych czynników, w tym od warunków socjoekonomicznych, klimatycznych czy geograficz- Grzyby z rodzaju Malassezia należą do patogenów nych. Dzięki badaniom z zakresu biologii molekular- oportunistycznych o istotnym znaczeniu klinicznym nej zidentyfikowano obecnie 14 gatunków Malasse- dla ludzi i niektórych zwierząt. Mogą być izolowane zia, w tym 13 lipidozależnych (M. furfur, M. globosa, ze zdrowej skóry oraz powodować pewne choroby M. obtusa, M. sympodialis, M. slooffiae, M. nana, M. der- dermatologiczne, a w przypadku znacznego obniżenia matis, M. restricta, M. equina, M. japonica, M. yamato­ odporności, mogą także przyczyniać się do wystąpienia ensis, M. caprae i M. cuniculi) oraz jeden gatunek lipido- zakażeń ogólnoustrojowych. Do najczęściej występują- niezależny (M. pachydermatis) [17, 38, 39, 60, 61]. cych dermatoz związanych z infekcją grzybami z rodzaju Łuszczyca (psoriasis) jest jedną z najczęściej występu- Malassezia u ludzi należą łupież pstry (pityriasis versi- jących przewlekłych zapalnych chorób skóry. Szacuje się, color) oraz zapalenie mieszków włosowych (Malassezia że około 1–5% populacji europejskiej choruje na łusz- folliculitis). Grzyby z rodzaju Malassezia mogą również czycę. Patogeneza łuszczycy nie jest do końca poznana. nasilać zmiany chorobowe w schorzeniach, takich jak Istnieje wiele czynników predysponujących do wystą- łojotokowe zapalenie skóry (dermatitis seborrhoica) pienia choroby, wśród których ważne miejsce zajmują oraz zaostrzać przebieg łuszczycy (psoriasis) i atopo- czynniki genetyczne. Zakażenia zarówno systemowe jak wego zapalenia skóry (dermatitis atopica) [3, 9, 17, 28, i miejscowe wywołane przez paciorkowce beta-hemo- 37, 38]. Częstość powierzchownych zakażeń grzybiczych lizujące, czy grzyby z rodzaju Candida stanowią znany wywołanych przez grzyby z rodzaju Malassezia zależy czynnik inicjujący epizod łuszczycy wysiewnej czy

* Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski; ul. I. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel.: +48 (0) 22 55-41-312; fax: +48 (0) 22 55-41-402; e-mail: [email protected]. † Autorzy w równym stopniu przyczynili się do powstania pracy. 296 TOMASZ JAGIELSKI, ELŻBIETA RUP, ANNA B. MACURA, JACEK BIELECKI zaostrzający przebieg łuszczycy plackowatej. W wielu może nastąpić również na drodze aktywacji procesów badaniach wykazano, że stymulacja leukocytów jed- zapalnych poprzez uwalniane przez grzyby Malassezia nojądrzastych krwi obwodowej pacjentów z łuszczycą sp. enzymy hydrolityczne [1, 58]. przez superantygeny paciorkowców grupy A wiązała Dokładne poznanie mechanizmów immunomodu- się ze znacznie zwiększoną odpowiedzią proliferacyjną lacyjnych u grzybów z rodzaju Malassezia wymaga dal- oraz uwalnianiem cytokin prozapalnych przez leukocyty szych badań. Dostępne obecnie dane sugerują, że u osób [6, 13, 41]. Wiele badań klinicznych i przedklinicznych ze zdrową skórą (z prawidłową barierą skórno-naskór- potwierdza udział grzybów z rodzaju Malassezia w roz- kową) grzyby Malassezia sp. wywierają efekt immuno- woju zmian łuszczycowych, zwłaszcza w przypadku supresyjny, co pozwala im przetrwać w roli komensala, łuszczycy owłosionej skóry głowy oraz okolicy narzą- natomiast w przypadku pacjentów z łuszczycą lub ato- dów płciowych [49, 63]. Obecnie uważa się, że grzyby powym zapaleniem skóry grzyby stymulują odpowiedź z rodzaju Malassezia mogą nasilać przebieg łuszczycy zapalną, która nasila przebieg choroby podstawowej poprzez uwalnianie cytokin prozapalnych, aktywację i przyczynia się do podtrzymywania zmian skórnych [3]. czynników przyspieszających proliferację keratyno­ cytów oraz wydzielanie enzymów hydrolitycznych [3]. Atopowe zapalenie skóry (atopic dermatitis, AD, 2. Taksonomia i klasyfikacja grzybów AZS) jest przewlekłą, nawrotową dermatozą świądową z rodzaju Malassezia dotyczącą głównie wieku dziecięcego. AZS może prze- biegać jako izolowane schorzenie lub stanowić mani- Grzyby z rodzaju Malassezia są uznawane za składnik festację ogólnoustrojowych zaburzeń o podłożu aler- mikroflory skóry u ludzi i niektórych zwierząt od ponad gicznym wraz z katarem siennym, astmą oskrzelową 150 lat. Malassezia sp. należą do grzybów dimorficz- czy alergiami pokarmowymi. Wśród osób dorosłych nych, występujących zarówno w fazie mycelialnej, jak AZS obserwuje się u 1–3% populacji. Choroba może i drożdżowej. Przez wiele lat obie formy morfologiczne pojawić się po raz pierwszy w wieku dorosłym, utrzy- uznawano za odrębne gatunki. Związek pomiędzy mywać się od okresu dziecięcego lub nawrócić po wie- występowaniem Malassezia sp. a zmianami skórnymi po loletniej remisji [42, 64]. Grzyby z rodzaju Malassezia raz pierwszy zaobserwował E i c h s t e d t w 1846 roku. wydają się stanowić istotny czynnik w patogenezie Uczony ten w łuskach pobranych ze skóry chorobowo AZS u osób dorosłych, zwłaszcza ze zmianami skór- zmienionej pacjenta z łupieżem pstrym zaobserwował nymi zlokalizowanymi na głowie i szyi [24]. Częstość strzępki grzybni. Następnie, w 1874 roku M a l a s s e z występowania grzybów z rodzaju Malassezia na skórze zaobserwował i opisał obecność komórek o kształ- dorosłych pacjentów z AZS oraz w populacji zdrowej cie owalnym i okrągłym w zeskrobinach naskórka od jest podobna i wynosi między 50% a 80%, w zależności pacjentów z łupieżem. Nazwę Malassezia zaproponował od zastosowanej metody badawczej. Natomiast w przy- w 1889 roku B a i l l o n na cześć wspomnianego wcześ­ padku pacjentów z AZS znacząco częściej obserwuje się niej badacza. W warunkach in vitro grzyby z rodzaju dodatnie testy skórne z alergenami Malassezia sp. oraz Malassezia wyhodowali po raz pierwszy C a s t e l l a n i wysokie miana swoistych przeciwciał w klasie IgE prze- i C h a l m e r s w 1913 roku. Badacze ci scharaktery- ciwko Malassezia sp. w surowicy chorych w porównaniu zowali ich właściwości wzrostowe oraz wprowadzili do grup kontrolnych [5, 45, 56]. Stąd, obecnie uważa nazwę Pityrosporum ovale. W 1925 roku We i d m a n n się, że grzyby Malassezia sp. stanowią raczej czynnik wyodrębnił w hodowli gatunek – Malassezia pachyder- alergizujący niż infekcyjny w przypadku pacjentów matis. (Gatunek ten nie należy do fizjologicznej flory z AZS. Nasilenie zmian skórnych u pacjentów z AZS skóry człowieka; izolowany jets natomiast ze skóry

Tabela I Pozycja taksonomiczna grzybów z rodzaju Malassezia

Królestwo: Fungi Typ: Basidiomycota Klasa: Ustilagomycetes Podklasa: Exobasidiomycetidae Rząd: Malasseziales Rodzaj: Malassezia Gatunki: M. furfur M. restricta M. pachydermatis M. nana M. sympodialis M. globosa M. japonica M. yamatoensis M. sloofiae M. obtusa M. dermatis M. equine M. caprae CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. I. ASPEKTY MIKROBIOLOGICZNE I IMMUNOLOGICZNE 297 ptaków i ssaków, w tym często – zwierząt domowych). Kształt i wielkość komórek różnią się między W 1951 roku G o r d o n wyizolował ze zmian skórnych poszczególnymi gatunkami. Rozmiar komórek waha u chorych z łupieżem pstrym, a także ze zdrowej ludz- się od ok. 1,5 do 8 μm. Również w wyglądzie kolonii kiej skóry – komórki przypominające drożdże – ku­li- są wyraźne różnice międzygatunkowe. Cechy morfo- ste lub owalne, otoczone podwójną otoczką i nadał logii kolonii i komórek grzybów Malassezia sp. stano- im nazwę Pityrosporum­ orbiculare [33, 69]. Dopiero wią kryteria diagnostyczne w identyfikacji gatunkowej w 1977 roku udało się w warunkach in vitro wykazać (Rys. 1–2) (Tabela II). konwersję z fazy drożdżopodobnej do mycelialnej, Na poziomie ultrastrukturalnym, kluczową cechą przy czym okazało się, że zarówno komórki okrągłe charakteryzującą wszystkie podstawczaki (Basidiomy- jak i owalne mogą wytwarzać grzybnię. Odkrycie to cota) jest wielowarstwowa ściana komórkowa. Ściana umożliwiło zatwierdzenie jednego gatunku – Malassezia grzybów Malassezia sp. jest jednak unikalna w króle- furfur w 1984 roku, zawierającego wcześ­niej opisywane stwie grzybów. Jest znacznie grubsza (około 0,12 µm) stadia: P. ovale, P. orbiculare i M. furfur [68]. Kolejnym niż ściana innych drożdży i zawiera znacząco większy przełomem w taksonomii grzybów z rodzaju Malas­ odsetek tłuszczów w porównaniu na przykład z grzy­ sezia były badania G u i l l o t i G u e h o w 1995 roku, bami z rodzaju Saccharomyces (15–20% vs 1–2%). Ściana które umożliwiły wyodrębnienie 7 gatunków Malassezia­ : M. furfur, M. pachydermatis, M. sympodialis, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M. slooffiae [36]. W wyniku dalszych badań opisano kolejne gatunki: M. dermatis (S u g i t a i wsp. 2002) [62], M. equine (N e l l i wsp. 2002) [52], M. japonica (S u g i t a i wsp. 2003) [61], M. nana (Hi r a i i wsp. 2003) [40], M. yamotoensis (Sugita i wsp. 2004) [60], M. caprae (C a b a ñ e s i wsp. 2007) [18] oraz M. cuniculi (Ca b a ñ e s i wsp. 2011) [19]. Obecnie obowiązującą pozycję taksonomiczną grzybów z rodzaju Malassezia przedstawiono w tabeli I.

3. Mikrobiologia grzybów z rodzaju Malassezia

3.1. Charakterystyka ogólna

Malassezia sp. jako grzyby dimorficzne mogą wystę- pować w warunkach naturalnych zarówno w fazie myce- lialnej jak i drożdżowej. W warunkach hodowlanych dominuje postać drożdżowa, przy czym opisywano Ryc. 1. Kolonie Malassezia sp. na podłożu Dixona również spontaniczne tworzenie formy mycelialnej po 10 dniach hodowli przez niektóre gatunki Malassezia także w warunkach in vitro [23, 30, 51]. Zaobserwowano, że niektóre składniki podłoży mogą stymulować tworzenie grzybni przez Malassezia sp. Dorn i R o e h n e r t [30] obserwowali wzrost formy mycelialnej Malassezia sp. po dodaniu do podłoża glicyny, natomiast N a z z a r o i wsp. [51] uzy- skali ten sam efekt wykorzystując cholesterol i estry cho- lesterolu. Rozmnażanie bezpłciowe grzybów z rodzaju Malassezia zachodzi przez pączkowanie drożdżowej komórki macierzystej. Ze względu na znaczne trudności w hodowli Malasse- zia sp., grzyby te w warunkach in vitro łatwo giną. (Jako, że grzyby z rodzaju Malassezia wymagają do wzrostu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, do hodowli używa się specjalnych podłóż agarowych, wg formuły Dixona lub Leeminga-Notmana, suplemento- wanych żółcią bydlęcą oraz oksyetylenowanymi estrami Ryc. 2. Pączkujące komórki Malassezia sp. sorbitolu i kwasów tłuszczowych (tzw. Tween-y) [34]). Preparat mikroskopowy z hodowli 298 TOMASZ JAGIELSKI, ELŻBIETA RUP, ANNA B. MACURA, JACEK BIELECKI

Tabela II Charakterystyka wybranych gatunków grzybów z rodzaju Malassezia

M. sympo- M. pachyder- Cecha M. furfur M. globosa M. slooffiae M. restricta M. obtusa dialis matis Morfologia kolonii gładkie, gładkie, szorstkie, pofałdowane, gładkie, gładkie, gładkie, miękkie, miękkie, serowate, kruche nieregularne miękkie, kruche płaskie kruche kruche kruche, wypukłe Barwa kremowa kremowa / kremowa / kremowa / kremowa kremowa kremowa beżowa beżowa beżowa Kształt, wielkość komórki owalne, kuliste, kuliste, cylindryczne kuliste, cylindryczne cylindryczne kuliste, elipsoidalne, średnica: długość: owalne, długość: długość: średnica: średnica: 6–8 µm 1,5–3,5 µm średnica: 4–6 µm 2,5–5 µm 6 µm 2,5–5 µm 2–4 µm Typ pączkowania szeroka sympodialne wąska szeroka wąska szeroka szeroka podstawa podstawa podstawa podstawa podstawa podstawa Wytwarzanie katalazy + + + + + – zmienne Wytwarzanie ureazy + + + + + + + Wzrost w temp. 37°C dobry dobry słaby dobry słaby słaby dobry Max. temp. wzrostu [°C] 40–41 40–41 38 40–41 38 38 40–41 Asymilacja Tween 20 + – – + – – + Asymilacja Tween 40 lub 60 + + – + – – + Asymilacja Tween 80 + + – – – – + Rozdział eskuliny – + – – – + zmienny

Malassezia sp. ma wielowarstwową strukturę, w obrę- Ogólnie, genom grzybów Malassezia sp. należy do bie której wyróżnia się zewnętrzną powłokę o budowie najmniejszych spotykanych u grzybów wolno żyjących. lamelarnej, właściwą ścianę komórkową oraz błonę Jego wielkość waha się między 6,4 a 14 Mpz. Liczba cytoplazmatyczną (nie należy do ściany komórkowej chromosomów wynosi od 5 w szczepach M. pachy- sensu stricto) o charakterystycznym pofałdowanym dermatis do 11 w szczepach M. furfur. Różna jest też wzorze, widocznym w mikroskopie elektronowym. zawartość par G+C rozpięta między 53,5% (M. globosa) Głównymi składnikami ściany komórkowej Malasse- a 68,7% (M. slooffiae). zia sp. są wielocukry – 70%, tłuszcze – 15–20% i białka Spośród 14 gatunków Malassezia, pełną sekwencję – 10%. Struktura ściany komórkowej Malassezia sp. oraz nukleotydową genomu ustalono jedynie dla M. globosa wysoka odsetkowa zawartość lipidów odpowiadają naj- (szczep referencyjny CBS 7877) [67]. Genom M. glo- prawdopodobniej za znaczącą odporność Malassezia sp. bosa (8,9 Mpz) zawiera tylko 4.285 sekwencji kodują- na warunki zewnętrzne, w tym czynniki mechaniczne cych białka, czyli mniej niż jakikolwiek inny poznany czy osmotyczne [4, 35, 59] oraz stanowią istotny czyn- genom grzybów wolno żyjących. W genomie M. globosa nik wirulencji grzyba. Lipofilność ściany komórkowej stwierdza się także niewielką liczbę intronów (obecnych Malassezia sp. ułatwia adhezję komórek grzyba do w 27% genów) oraz sekwencji repetytywnych (< 0.8% komórek gospodarza, utrudnia fagocytozę patogenu wielkości genomu). Niewielki genom M. globosa, podob- oraz hamuje odpowiedź zapalną [43, 50]. Liczba i kształt mitochondriów w każdej komórce Tabela III Wybrane właściwości genomu Malassezia sp. Malassezia sp. wykazuje dużą zmienność. Jądro komór- kowe posiada wyraźnie zaznaczoną błonę jądrową, ota- Liczba chro- Wielkość Zawartość Gatunek czającą ziarna homogennej nukleoplazmy [59]. mosomów genomu [Mpz] par G+C [%] M. pachydermatis 5 6,7–9,3 55,6 3.2. Genetyka M. furfur 7–11 8,5–14 66,4 M. globosa 8 8,5–8,9 53,5 Badanie chromosomowego DNA grzybów z rodzaju M. obtusa 6 7,4 60,7 Malassezia techniką pulsacyjnej elektroforezy żelowej (PFGE, pulsed field gel electrophoresis) wykazało istotne M. sympodialis 7 6,4–7,8 62,2 różnice międzygatunkowe zarówno w zakresie kario- M. slooffae 7 8,6 68,7 typu, jaki i wielkości genomu (Tabela III) [11, 12]. M. restricta 9 8,0 59,9 CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. I. ASPEKTY MIKROBIOLOGICZNE I IMMUNOLOGICZNE 299 nie jak innych gatunków z rodzaju Malassezia, traktuje najczęściej wykorzystują trójglicerydy, wolne kwasy się jako przejaw adaptacji tych grzybów do wzrostu tłuszczowe oraz estry kwasów tłuszczowych. Opisy- w bardzo wąskiej niszy ekologicznej, tj. na skórze zwie- wano również asymilację fosfolipidów oraz cholesterolu rząt ciepłokrwistych [22]. i estrów cholesterolu [25]. Cechą charakterystyczną genomu M. globosa jest Wiedza na temat metabolizmu grzybów z rodzaju nieobecność wielu genów związanych z metabolizmem Malassezia, z wyjątkiem metabolizmu lipidów, jest ogra- kwasów tłuszczowych, w tym genów kodująych syn- niczona. Z uwagi na lipidozależność większości gatun- tazę kwasów tłuszczowych (FAS), Δ9-desaturazę, czy ków, wyniki testów asymilacji węglowodanów znane są izomerazę Δ2,3-enoilo CoA. Braki te kompensowane wyłącznie dla M. pachydermatis. Wykazano, że gatunek są obecnością, występujących w wielu kopiach, genów ten ma zdolność wykorzystywania jako źródło węgla kodujących sekrecyjne lipazy i fosfolipazy, umożli- mannitolu, sorbitolu i glicerolu. Żaden z gatunków wiające asymilację kwasów tłuszczowych z zewnętrz- Malassezia nie fermentuje cukrów. Wzrost tych grzyby nych źródeł. nie zależy również od obecności w podłożu witamin Analiza genomiczna (i proteomiczna) wykazała, że [10, 48]. Jako źródło siarki Malassezia sp. najczęściej genom M. globosa niesie geny kodujące białka podobne wykorzystują metioninę, rzadziej cystynę i cysteinę, wszystkim dotąd opisanym białkom alergizującym M. fur- natomiast źródło azotu mogą stanowić zarówno orga- ­fur (Mala f2-4) i M. sympodialis (Mala s1, s5-13) [67]. niczne (różne aminokwasy) jak i nieorganiczne związki, W genomie M. globosa wykryto geny homologiczne przy czym Malassezia nie asymilują azotanu potasu [48]. do genów TAM1 i SIR1, opisanych wcześniej dla głowni W warunkach naturalnych i standardowej hodowli kukurydzy (Ustilago maydis), fitopatogennego grzyba, Malassezia sp. rosną tlenowo. Mogą jednak tolerować z którym – jak wykazała analiza porównawcza sekwencji również warunki mikroaerofilne lub nawet beztle- genomowych – M. globosa dzieli wysokie pokrewieństwo nowe [31]. filogenetyczne. Gen TAM1 koduje aminotransferazę tryptofanową, enzym odpowiedzialny za przekształcenie 3.4. Aktywność enzymatyczna tryptofanu do pirogronianu indolu, którego pochodne wykrywa się w szczepach M. furfur. Te barwne związki Brak zdolności syntetyzowania własnych kwa- (pigmenty, m. in. pityriarubiny, pityrialakton, malasse- sów tłuszczowych przez Malassezia sp. i konieczność zyna) wykazują różne działanie biologiczne, które wiąże wykorzystywania zewnątrzpochodnych źródeł lipidów się ze zmianami zabarwienia skóry w przebiegu łupieżu znajduje swoje odzwierciedlenie w produkcji licznych pstrego. W powstawaniu barwnych pochodnych indo- zewnątrzkomórkowych enzymów hydrolitycznych, lowych uczestniczy też enzym reduktaza siarczynowa. w tym lipaz oraz fosfolipaz. Mutacje w kodującym ją genie SIR1 znacząco ograniczją Badania dotyczące właściwości lipolitycznych grzy- tworzenie się tych związków [70]. bów z rodzaju Malassezia są prowadzone od wielu lat. W końcu, mimo, że grzyby Malassezia sp. znane Już w 1978 roku C a t t e r a l l i wsp. wykazali obecność są wyłącznie jako formy anamorficzne (haploidalne, zewnątrzkomórkowej lipazy w warunkach in vitro [21]. rozmanażające się bezpłciowo), analiza sekwencyjna W badaniach przeprowadzonych w latach 90. ubiegłego genomu M. globosa pozwoliła zidentyfikować region wieku M a y s e r i wsp. zaobserwowali istotne różnice genetyczny (MAT, mating type locus) związany z roz- w aktywności lipolitycznej między poszczególnymi mnażaniem płciowym tych grzybów. W obrębie oma- gatunkami Malassezia oraz zróżnicowanie w asymilacji wianego locus wykryto geny kodujące feromony, ich odmiennych kwasów tłuszczowych [46, 47]. W bada- błonowe receptory oraz homeodomenowe czynniki niu wykazano znacząco szybszy wzrost Malassezia sp. transkrypcyjne [67]. po dodaniu do podłoża nienasyconych kwasów tłusz- czowych w porównaniu z nasyconymi kwasami tłusz- 3.3. Metabolizm czowymi. Różnice w aktywności lipolitycznej grzybów z rodzaju Malassezia wykorzystane zostały do opraco- Z wyjątkiem M. pachydermatis, wszystkie poznane wania testów diagnostycznych (testy asymilacji „Twe- gatunki Malassezia są lipidozależne, tj. wymagają en’ów”, czy kremoforu EL), które stanowią obecnie zewnętrznych źródeł lipidów do wzrostu. Zapotrzebo- ważne kryterium klasyfikacji gatunkowej Malassezia sp. wanie Malassezia sp. na tłuszcze zaobserwowano po raz (Tabela II) [47]. pierwszy już w 1939 roku [10]. Obecnie wiadomo, że W 2006 roku B r u n k e i H u b e po raz pierw- lipidozależność Malassezia sp. wynika z braku zdolności szy sklonowali i w pełni scharakteryzowali gen lipazy syntezy kwasu mirystynowego, który stanowi prekursor M. furfur i opisali go jako MfLIP1 [14]. MfLIP1 składa długołańcuchowych kwasów tłuszczowych [57]. Skład się 1464 par zasad i koduje enzym o masie cząsteczko- lipidowy Malassezia sp. jest zmienny i w dużej mierze wej 54,3 kDa. Maksymalną aktywność lipazy obserwo- zależy od źródła dostępnych tłuszczów. Malassezia sp. wano w temperaturze 40°C, a optymalne dla niej pH 300 TOMASZ JAGIELSKI, ELŻBIETA RUP, ANNA B. MACURA, JACEK BIELECKI wynosiło 5,8. Badany enzym hydrolizował Tween’y, 4. Interakcje grzybów Malassezia sp. a także wykazywał nieznaczną aktywność fosfolipazy. z innymi mikroorganizmami W niedługim czasie po MfLIP1 wykryto geny dwóch kolejnych lipaz: gen lipazy sekrecyjnej M. pachyder- Grzyby z rodzaju Malassezia uwalniają różne meta- matis, kodujący enzym o aktywności esterazy i masie bolity o działaniu sprzyjającym lub hamującym kolo­ cząsteczkowej 48,1 kDa oraz optymalnym pH 7,5 [54] nizację innymi mikroorganizmami, przy czym antago- oraz gen LIP1 kodujący lipazę M. globosa – enzym nistyczna aktywność szczepów Malassezia sp. wykazuje o masie cząsteczkowej 32 kDa i optymalnym pH 5,5 dużą zmienność gatunkową. W badaniach rosyjskich [27]. W warunkach in vitro, oczyszczona, rekombino- autorów najbardziej aktywnym antagonistycznie gatun- wana lipaza M. globosa hydrolizowała monogliceridy kiem i równocześnie najmniej wrażliwym na działanie i dwuglicerydy, a nie rozkładała trójglicerydów, nato- metabolitów innych szczepów był gatunek M. furfur. miast w badaniach enzymatycznych z wykorzystaniem Związki uwalniane przez M. furfur znacząco hamo- hodowli M. globosa wykazano równiez hydrolizę trój- wały wzrost grzybów należących do klasy Ascomycetes glicerydów, co wskazywało na obecność dodatkowych (Geotrichum sp., Candida albicans) i w mniejszym lipaz u M. globosa. Jak już wspomniano, analiza sekwen- stopniu drożdży należących do klasy Basidiomycetes cyjna genomu M. globosa wykazała obecność wielu kopii (Cryptococcus albidus, Rhodotorula mucilaginosa, Rho- genów kodujących zewnątrzkomórkowe hydrolazy, dotorula aurantica, Trichosporon cutaneum, Trichospo- w tym 14 lipaz, 9 fosfolipaz, 2 oksydoreduktaz choli- ron ovoides) [2]. nowych, sfingomielinaz i licznych proteaz, ulegających ekspresji w momencie kolonizacji tkanek gospodarza przez grzyb [67]. Według wielu badaczy aktywność 5. Interakcje grzybów Malassezia sp. lipolityczna Malassezia sp. jest jednym z podstawowych z układem immunologicznym czynników prowadzących do rozwoju łupieżu i łojotoko- wego zapalenia skóry. Hydrolizując trójglicerydy grzyby 5.1. Serologia i budowa antygenowa Malassezia sp. uwalniają wolne kwasy tłuszczowe, które stanowią istotny czynnik drażniący i nasilający reakcję Grzyby z rodzaju Malassezia mają złożoną budowę zapalną w tkankach gospodarza [55]. antygenową. Obecnie, za pomocą technik immunoelek- Zdolność produkcji fosfolipaz i aktywacja kaskady troforetycznych wykazano obecność ponad 80 antyge- kwasu arachidonowego może stanowić dodatkowy nów o budowie białkowej i cukrowej u poszczególnych czynnik prowadzący do uszkodzenia tkanek gospo- gatunków Malassezia sp. Antygeny białkowe są w więk- darza w przebiegu infekcji Malassezia sp. Wytwa- szości składnikami ściany komórkowej lub cytoplazmy rzanie fosfolipaz przez grzyby z rodzaju Malassezia i ulegają ekspresji we wczesnych fazach wzrostu grzyba. zaobserwowano zarówno w warunkach in vivo jak i in Antygeny wielocukrowe (głównie mannany) oraz czą- vitro w hodowlach linii komórkowych Hep-2, przy steczki o budowie glikoprotein (głównie mannoprote- czym stwierdzono, że szczepy patogenne Malassezia iny), są trudniejsze do wykrycia i występują podczas sp. wykazują znacząco większą aktywność fosfolipazy całego cyklu rozwojowego komórki [3, 4]. [53]. C a f a r c h i a i O n t r a n t o w badaniach nad Pierwszy antygen Malassezia – Mala f1 – został opi- szczepami M. pachydermatis izolowanymi od psów ze sany i zsekwencjonowany w 1997 roku. Mala f1 to białko zmianami grzybiczymi i zdrowych zaobserwowali, że o masie 36 kDa, zawierające 22 aminokwasy i wystę­ szczepy M. pachydermatis pochodzące ze zmian skór- pujące na powierzchni komórki grzyba. Reaktywność nych znacząco częściej wykazywały aktywność fosfoli- rekombinowanego Mala f1 była porównywalna z natu- pazy od szczepów izolowanych ze skóry psów zdrowych ralnie występującym antygenem [4]. Kolejne opisane (94% versus 10,6%) [20]. antygeny: Mala f2 i Mala f3 to cząsteczki o masie, odpo- Grzyby Malassezia sp. produkują również enzymy wiednio 21 kDa i 20 kDa, wykazujące około 50% homo- o właściwościach lipooksygenazy i lipoperoksydazy. logii sekwencji aminokwasowych. Zaobserwowano Zwiększony poziom nadtlenków lipidowych i ich również homologię między Mala f2 i Mala f3 a biał- pochodnych obserwowano w skórze chorobowo zmie- kami błonowymi Candida boidinii i jednym z alerge- nionej u pacjentów z łupieżem pstrym oraz w warun- nów Aspergillus fumigatus [4]. Antygen Mala f4 stanowi kach in vitro po dodaniu do podłoża hodowlanego istotny alergen dla pacjentów z atopowym zapaleniem dla Malassezia sp. wielonienasyconych kwasów tłusz- skóry, u których występuje kolonizacja Malassezia sp. czowych. Badacze sugerują, że depigmentacja skóry Surowica pacjentów z AZS wykazuje swoistą reakcję u pacjentów z łupieżem pstrym może wynikać z uszko- z Mala f4 w 80% przypadków. Białko Mala f4 ma masę dzenia błon komórkowych melanocytów przez nad- 35 kDa i wykazuje 57% homologii z mitochondrialną tlenki lipidowe. Lipoperoksydaza Malassezia sp. dotych- dehydrogenazą maleinową Saccharomyces cerevisiae. czas nie została wyizolowana [26]. Kolejne antygeny białkowe: Mala f6, Mala f7, Mala f8 CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. I. ASPEKTY MIKROBIOLOGICZNE I IMMUNOLOGICZNE 301 i Mala f9 oraz glikoproteinowy antygen M. globosa rów- 5.3. Wpływ grzybów Malassezia sp. na różne nież reagują swoiście z surowicą pacjentów z atopowym populacje komórek w skórze zapaleniem skóry, co sugeruje ich rolę jako czynników alergizujących. Produkowane obecnie zestawy rekom- Interakcje między komórkami Malassezia sp. a ukła- binowanych antygenów Malassezia sp. są najczęściej dem odpornościowym człowieka są przedmiotem badań wykorzystywane w punktowych testach skórnych (skin od wielu lat. W latach 90. ubiegłego wieku oceniano prick test, SPT). W badaniach klinicznych zaobserwo- głównie swoistą odpowiedź humoralną i komórkową wano, że znacząco większy odsetek pacjentów z AZS na podstawie zmian we krwi obwodowej u pacjentów ma pozytywne wyniki SPT z antygenami Malassezia z chorobami związanymi z obecnością grzybów z rodzaju sp. w porównaniu z pacjentami zdrowymi lub osobami Malassezia. Wyniki przeprowadzonych badań były często z innymi chorobami dermatologicznymi związanymi rozbieżne. Od kilku lat badacze skupiają się głównie na z obecnością grzybów z rodzaju Malassezia, przy czym ocenie interakcji między komórkami Malassezia sp. i róż- najwięcej dodatnich wyników testów obserwuje się nymi populacjami komórek obecnych w skórze (Rys. 3). w grupie pacjentów z AZS ze zmianami skórnymi zlo- Wa t a n a b e i wsp. jako pierwsi badali relacje kalizowanymi na głowie i szyi [3, 4]. między grzybami z rodzaju Malassezia i keratynocy- Zróżnicowanie opisywanych przez poszczególnych tami, stanowiącymi naliczniejszą populację komórek badaczy antygenów jest bardzo duże – od drobnych w naskórku i pełniącymi funkcję zarówno strukturalną białek do wielkocząsteczkowych glikoprotein. Nie- jak i immunologiczną [65]. W badaniu wykorzystano które z nich, o podobnej masie cząsteczkowej mogą, komórki M. furfur, M. pachydermatis, M. slooffiae oraz w wyniku dalszych badań, okazać się identyczne. Eks- M. sympodialis. W supernatancie z hodowli komórkowej presja poszczególnych antygenów Malassezia sp. zależy składającej się z keratynocytów i komórek grzybiczych w dużej mierze od czasu hodowli grzyba. Zaobser- w proporcji 1:1 oceniano stężenie IL1β, IL6, IL8, TNFα wowano również, że wiele antygenów wiążących IgE oraz białka chemotaktycznego monocytów (MCP1). jest labilnych w temperaturze pokojowej lub wyż- Hodowlę komórkową prowadzono przez 24 godziny, szej i ulega degradacji po około miesiącu przecho­ przy czym poziom badanych cytokin oceniano w odstę- wywania [3, 4]. pach jednogodzinnych od pierwszej do 24 godziny. Przeciwciała w klasie IgE swoiste dla Malassezia sp. Poziom MCP1 w przypadku wszystkich badanych obserwowano w przypadku 20–100% pacjentów z AZS, gatunków był niski lub niewykrywalny. W supernatancie jednak jak dotąd nie stwierdzono większej korelacji z hodowli M. furfur również nie stwierdzono obecności pomiędzy poziomem przeciwciał i stopniem nasilenia pozostałych cytokin, lub poziom ich był bardzo niski. objawów klinicznych [4, 37, 56]. Najwyższe stężenie cytokin obserwowano w superna- tancie z hodowli M. pachydermatis, co może tłuma- czyć większe nasilenie reakcji zapalnej w przebiegu 5.2. Interakcje grzybów z rodzaju Malassezia sp. infekcji M. pachydermatis u zwierząt w porównaniu z układem dopełniacza z objawami u ludzi. W kolejnym badaniu, przeprowa- dzonym w 2001 roku, B a r o n i i wsp. zaobserwowali Grzyby z rodzaju Malassezia mają zdolność aktywacji zmniejszenie produkcji IL1α oraz zwiększenie wydzie- kaskady dopełniacza zarówno na drodze klasycznej, jak lania IL10 i TGFβ1 przez keratynocyty pod wpływem i alternatywnej. Alternatywna droga aktywacji dopeł- M. furfur, co prowadziło do zahamowania wydzielania niacza zależy od stężenia komórek grzybiczych i czasu IL6 i TNFα [8]. Komórki Malassezia były wchłaniane stymulacji. Cząsteczką najprawdopodobniej odpowie- przez keratynocyty, ale zabijane tylko w niewielkim dzialną za aktywację drogi alternatywnej jest β-glukan odsetku. Badacze postulowali, że supresja wydzielania ściany komórkowej Malassezia sp. Stymulacja klasycz- IL1α, IL6 i TNFα przez Malassezia sp. pozwala prze- nej drogi aktywacji dopełniacza również zależy od czasu trwać komórkom grzyba w komórkach gospodarza bez i stężenia komórek grzybiczych, przy czym większe zna- wywoływania reakcji zapalnej. Zahamowanie wydzie- czenie mają komórki martwe niż żywe. Zdolność akty- lania IL1β, IL6 i TNFα przez jednojądrzaste leukocyty wacji dopełniacza przez Malassezia sp. może stanowić krwi obwodowej (PBMNC) w hodowli z komórkami jeden z mechanizmów powstawania stanu zapalnego Malassezia sp. wykazał K e s a v a n w 1998 roku [44]. u pacjentów z łojotokowym zapaleniem skóry (SD). Również w tym badaniu zaobserwowano, że supre- W badaniach immunohistochemicznych wycinków sja produkcji cytokin prozapalnych zależała od IL10. pobieranych ze zmian skórnych w przebiegu SD wyka- Immunosupresyjny wpływ grzybów z rodzaju Malasse- zano odkładanie się fragmentów C3 dopełniacza wokół zia na keratynocyty w warunkach in vitro potwierdzono komórek Malassezia sp. W wycinkach ze skóry niezmie- w kolejnym badaniu przeprowadzonym w 2004 roku nionej nie stwierdzano obecności białka C3 [4]. [29]. D o n n a r u m m a i wsp. po inkubacji komórek 302 TOMASZ JAGIELSKI, ELŻBIETA RUP, ANNA B. MACURA, JACEK BIELECKI

Ryc. 3. Interakcje grzybów Malassezia sp. z komórkami skóry gospodarza

M. furfur z keratynocytami w proporcji 30:1 zaobser- Interakcje pomiędzy grzybami z rodzaju Malassezia wowali zwiększoną ekspresję genów dla IL10, TGFβ1 i komórkami dendrytycznymi były przedmiotem licz- oraz genu ludzkiej β defensyny (HBD2) w keratynocy- nych badań od 2000 roku. Większość badaczy oceniała tach. Obecnie sugeruje się, że immunosupresyjny wpływ wpływ Malassezia sp. na komórki Langerhansa w zmia- Malassezia sp. na keratynocyty tłumaczy ich występo- nach skórnych u pacjentów z atopowym zapaleniem wanie na skórze jako komensali oraz może stanowić skóry. B u e n t k e i wsp. w badaniu przeprowadzonym przyczynę niewielkiego odczynu zapalnego w przebiegu w 2000 roku badali zdolność komórek dendrytycznych łupieżu pstrego, mimo masywnej kolonizacji skóry przez CD 1a (+) izolowanych z krwi obwodowej do wychwytu Malassezia sp. [66]. Immunosupresyjny efekt wywoły- całych komórek M. furfur, różnych fragmentów komó- wany przez Malassezia sp. na PBMNC udało się odwró- rek grzyba oraz rekombinowanego antygenu Mala f5 cić pozbawiając komórki grzyba lipidowej otoczki, stąd [16]. W badaniu wykazano, że niedojrzałe komórki wydaje się, że to właśnie lipidy odpowiadają za immu- dendrytyczne znacząco efektywniej niż komórki doj- nomodulujący wpływ Malassezia sp. [3]. rzałe wychwytywały komórki Malassezia sp., głównie W badaniu przeprowadzonym w 2004 roku B a r o n i na drodze endocytozy zależnej od receptora manno- i wsp. oceniali wpływ Malassezia sp. na keratynocyty zowego. Endocytoza antygenów grzybiczych induko- u pacjentów z łuszczycą zwyczajną [7]. Badacze zaob- wała dojrzewanie komórek dendrytycznych skutkując serwowali znaczący wzrost ekspresji cząsteczek zaan- również wzmożoną produkcją TNFα, IL1β oraz IL18. gażowanych w hyperproliferację i migrację komórek Dojrzałe komórki dendrytyczne stymulowały następnie (HSP 70, integryna, TGFβ1) w keratynocytach pobra- proliferację autologicznych limfocytów T. W kolejnym nych z wycinków skórnych ze zmian łuszczycowych po badaniu, ci sami autorzy oceniali interakcje pomiędzy inkubacji z komórkami Malassezia sp. w porównaniu komórkami dendrytycznymi i komórkami NK (natu- z keratynocytami ze skóry osób zdrowych. W przy- ral killer) w obecności grzybów z rodzaju Malassezia padku, gdy zmiany łuszczycowe były dodatkowo skolo- [15]. B u e n t k e i wsp. zaobserwowali, że w wycin- nizowane przez Malassezia sp. ekspresja badanych białek kach pobranych ze zmian skórnych u pacjentów z AZS była większa. Nasilenie hyperproliferacji keratynocytów liczba komórek NK jest znacznie większa, niż w skórze przez Malassezia sp. u pacjentów z łuszczycą może przy- pacjentów zdrowych. Badacze inkubowali komórki den- czyniać się do zaostrzenia choroby podstawowej i powo- drytyczne z grzybami Malassezia sp. przez 46 godzin, dować utrzymywanie się zmian skórnych [3, 7]. a następnie oceniali stopień lizy komórek dendrytycz- CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. I. ASPEKTY MIKROBIOLOGICZNE I IMMUNOLOGICZNE 303 nych zależnej od komórek NK. Badanie wykazało, że other clinically significant yeast genera. Bull. Exp. Biol. Med. inkubacja komórek dendrytycznych z komórkami 148, 410–415 (2009) Malassezia sp. ma działanie protekcyjne znacząco 3. Ashbee H.R.: Recent developments in the immunology and biology of Malassezia species. FEMS Immunol. Med. Microbiol. zmniejszając podatność na lizę komórek dendrytycz- 47, 14–23 (2006) nych i dodatkowo stymuluje produkcję IL8, IL6 czy 4. Ashbee H.R., Evans V.: Immunology of diseases associated with IFNγ. Autorzy sugerują, że dojrzałe komórki dendry- Malassezia species. Clin. Microbiol. Rev. 15, 21–57 (2002) tyczne prezentujące antygeny Malassezia sp. limfocytom 5. Back O., Scheynius A., Johansson S.G.: Ketoconazole in atopic T, oporne na lizę przez komórki NK mogą przyczyniać dermatitis: therapeutic response is correlated with decrease in serum IgE. Arch. Dermatol. Res. 287, 448–451 (1995) się do podtrzymania reakcji zapalnej w zmianach skór- 6. Baker B.S., Bokth S., Powles A., Garioch J.J., Lewis H., nych pacjentów z AZS, co dodatkowo jest jeszcze nasi- Valdimarsson H., Fry L.: Group A streptococcal antigen-spe- lane przez produkowane przez komórki dendrytyczne cific T lymphocytes in guttae psoriatics lesion. Br. J. Dermatol. cytokiny prozapalne [15]. G a b r i e l s s o n i wsp. 128, 493–499 (1993) wykazali, że komórki dendrytyczne pobrane od pacjen- 7. Baroni A., Paoletti I., Ruocco E., Agozzino M., Tufano M.A., Donnarumma G.: Possible role of Malassezia furfur in psoria- tów z AZS reagują odmiennie na inkubację z komórkami sis: modulation of TGF-beta1, integrin, and HSP70 expression Malassezia sp. niż komórki dendrytyczne pacjentów in human keratinocytes and in the skin of psoriasis-affected zdrowych [32]. W badaniu zaobserwowano pięcio- patients. J. Cutan. Pathol. 31, 35–42 (2004) krotny wzrost ekspresji genów dla IL8, CD54, CD83, 8. Baroni A., Perfetto B., Paoletti I., Ruocco E., Canozo N., receptora IL1, BTG1 (B-cell translocation gene 1) i MDC Orlando M., Buommino E.: Malassezia furfur invasiveness in (monocyte derived chemokine) w komórkach dendry- a keratinocyte cell line (HaCat): effects on cytoskeleton and on adhesion molecule and cytokine expression. Arch. Dermatol. tycznych pacjentów z AZS po inkubacji z M. sympodialis Res. 293, 414–419 (2001) w porównaniu z ekspresją genów w komórkach dendry- 9. Batra R., Boekhout T., Guého E. Cabañes F.J., Dawson T.L. Jr, tycznych osób z grupy kontrolnej, co może tłumaczyć Gupta A.K.: Malassezia Baillon, emerging clinical yeasts. FEMS odmienną rolę Malassezia sp. w tych grupach [32]. Yeast Res. 5, 1101–1113 (2005) 10. Benham R.W.: The cultural characteristics ofPityrosporum ovale – a lipophilic fungus. J. Invest. Dermatol. 2, 187–203 (1939) 11. Boekhout T., Bosboom R.: Karyotyping of Malassezia yeasts: 6. Podsumowanie taxonomic and epidemiological implications. Syst. Appl. Micro- biol. 17, 146–153 (1994) Dokładne poznanie mechanizmów immunomodu- 12. Boekhout T., Kamp M., Guého E.: Molecular typing of Malassezia lacyjnych grzybów z rodzaju Malssezia wymaga jeszcze species with PFGE and RAPD. Med. Mycol. 36, 365–372 (1998) wielu badań. Dane dostępne obecnie sugerują, że u osób 13. Braun-Falco O., Plewig G., Wolff H., Burgdorf W.: Erythemato- papulo-squamous diseases. [w:] Dermatology. Springer Verlag, ze zdrową skórą (z prawidłową barierą skórno-naskór- Berlin, 2000, s. 585–608. kową) grzyby Malassezia sp. wywierają efekt immuno- 14. Brunke S., Hube B.: MfLIP1, a gene encoding an extracellular supresyjny, co pozwala im przetrwać w roli rganizmów lipase of the lipid-dependent fungus Malassezia furfur. Micro- komensalnych, natomiast w przypadku pacjentów biology, 152, 547–554 (2006) z łuszczycą lub atopowym zapaleniem skóry grzyby sty- 15. Buentke E., Heffler L.C., Wilson J.L., Wallin R.P., Löfman C., Chambers B.J., Ljunggren H.G., Scheynius A.: Natural killer mulują odpowiedź zapalną, która nasila przebieg cho- and dendritic cell contact in lesional atopic dermatitis skin roby podstawowej i przyczynia się do podtrzymywania – Malassezia-influenced cell interaction. J. Invest. Dermatol. zmian skórnych [3]. 119, 850–857 (2002) 16. Buentke E., Zargari A., Heffler L.C., Avila-Cariño J., Savolai­ nen J., Scheynius A.: Uptake of the yeast Malassezia furfur and Podziękowania its allergenic components by human immature CD1a+ den- Autorzy składają podziękowania Panu dr. Pawłowi Krzy- dritic cells. Clin. Exp. Allergy, 30, 1759–1770 (2000) ściakowi z Zakładu Mykologii Katedry Mikrobiologii Collegium 17. Cabañes F.J., Theelen B., Castellá G., Boekhout T.: Two new Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego za użyczenie zdjęć hodowli lipid-dependent Malassezia species from domestic animals. Malassezia sp., a także Panu Jakubowi Pawłotowi za udostępnienie FEMS Yeast Res. 7, 1064–1076 (2007) ryciny ilustrującej oddziaływania międzykomórkowe w przebiegu 18. Cabañes F.J., Theelen B., Castellá G., Boekhout T.: Two new zakażanie grzybami Malassezia sp. lipid-dependent Malassezia species from domestic animals. FEMS Yeast Res. 7, 1064–1076 (2007) 19. Cabañes, F.J., Vega S., Castellá G.: Malassezia cuniculi sp. nov., a novel yeast species isolated from rabbit skin. Med. Mycol. 49, Piśmiennictwo 40–48 (2011) 20. Cafarchia C., Otranto D.: Association between phospholipase 1. Adamski Z.: Badania nad rolą drożdżaków lipofilnych Malasse- production by Malassezia pachydermatis and skin lesions. zia furfur (Pityrosporum ovale, Pityrosporum orbiculare) w róż­ J. Clin. Microbiol. 42, 4868–4869 (2004) 53 nych dermatozach. Rozprawa habilitacyjna, AM w Poznaniu, 21. Catterall M.D., Ward M.E., Jacobs P.: A reappraisal of the role 1995, s. 1–102. of Pityrosporum orbiculare in pityriasis versicolor and the 2. Arzumanian V.G., Sergeev A.Y., Shelemekh O.V., Ojovan I.M., significance of extracellular lipase. J. Invest. Dermatol. 71, Serdiuk O.A.: Antagonistic activity of Malassezia spp. towards 398–401 (1978) 304 TOMASZ JAGIELSKI, ELŻBIETA RUP, ANNA B. MACURA, JACEK BIELECKI

22. Chen T.-A., Hill P.B.: The biology ofMalassezia organisms and 41. Jabłońska S., Majewski S.: Choroby skóry i choroby przeno- their ability to induce immune responses and skin disease. Vet. szone drogą płciową. Wyd. Lekarskie PZWL, Warszawa, 2005, Dermatol. 16, 4–26 (2005) s. 1–528. 23. Civilia E.S., Vignale R., Sanjines A., Conti-Diaz I.A.: Hyphal 42. Katsarou A., Armenaka M.C.: Atopic dermatitis in older production by Pityrosporum ovale. Int. J. Dermatol. 17, 74–77 patients: particular points. JEADV, 25, 12–18 (2011) (1978) 43. Kesavan S., Holland K., Cunliffe W., Ingham E.: The effects of 24. Clemmensen O., Hjorth N.: Treatment of dermatitis of the head de-lipidisation on the immunomodulatory activity of Malasse- and neck with ketoconazole in patients with type I sensitivity zia species. J. Invest. Dermatol. 108, 389A (1997) to Pityrosporum orbiculare. Sem. Dermatol. 2, 26–29 (1983) 44. Kesavan S.: Immunomodulation by Malassezia spp. PhD thesis. 25. Dawson T.L. Jr.: Malassezia globosa and restricta: Breakthrough University of Leeds, Leeds, 1998. understanding of the etiology and treatment of dandruff and 45. Lindgren L., Wahlgren C.F., Johansson S.G., Wiklund I., seborrheic dermatitis through whole-genome analysis. J. Invest. Nordvall S.L. Occurrence and clinical features of sensitization Dermatol. Symp. Proc. 12, 15–19 (2007) to Pityrosporum orbiculare and other allergens in children with 26. De Luca C., Picardo M., Breathnach A., Passi S.: Lipoperoxidase atopic dermatitis. Acta Dermatol. Venereol. 75, 300–304 (1995) activity of Pityrosporum: characterisation of by-products and pos- 46. Mayser P., Fuhrer D., Schmidt R., Grunder K.: Hydrolysis sible role in pityriasis versicolor. Exp. Dermatol. 5, 49–56 (1996) of fatty acid esters by Malassezia furfur: different utilization 27. DeAngelis Y.M., Dawson T.L. Jr i wsp.: Isolation and expression depending on alcohol moiety. Acta Dermatol. Venereol. 75, of a Malassezia globosa lipase gene, LIP1. J. Invest. Dermatol. 105–109 (1995) 127, 2138–2146 (2007) 47. Mayser P., Haze P., Papavassilis C., Pickel M., Gruender K., 28. Diaz M.R., Boekhout T., Theelen B., Bovers M., Cabañes F.J., Gueho E.: Differentiation of Malassezia species: selectivity of Fell J.W.: Microcoding and flow cytometry as a high-through- Cremophor EL, castor oil and ricinoleic acid for M. furfur. Br. put fungal identification system for Malassezia species. J. Med. J. Dermatol. 137, 208–213 (1997) Microbiol. 55, 1197–1209 (2006) 48. Mayser P., Imkampe A., Winkeler M., Papvassilis C.: Growth 29. Donnarumma G., Paoletti I., Buommino E., Orlando M., requirements and nitrogen metabolism of Malassezia furfur. Tufano M.A., Baroni A.: Malassezia furfur induces the expres- Arch. Dermatol. Res. 290, 277–282 (1998) sion of beta-defensin-2 in human keratinocytes in a protein 49. Mayser P., Schutz M., Schuppe H.C., Jung A., Schill W.B.: kinase C-dependent manner. Arch. Dermatol. Res. 295, 474–481 Frequency and spectrum of Malassezia yeasts in the area of (2004) prepuce and glans penis. BJU Int. 88, 554–558 (2001) 30. Dorn M., Roehnert K.: Dimorphism of Pityrosporum orbiculare 50. Mittag H.: Fine structural investigations of Malassezia furfur. in a defined culture medium. J. Invest. Dermatol. 69, 244–248 II. The envelope of the yeast cells.Mycoses , 38, 13–21 (1995) (1977) 51. Nazzaro P.M., Passi S., Caprilli F., Mercantini R.: Induction of 31. Faergemann J., Bernander S.: Micro-aerophilic and anaerobic hyphae in cultures of Pityrosporum by cholesteroland choles- growth of Pityrosporum species. Sabouradia, 19, 117–121 (1981) terol estres. J. Invest. Dermatol. 69, 531–534 (1977) 32. Gabrielsson S., Buentke E., Liedén A., Schmidt M., D’Amato M., 52. Nell A., James S.A., Bond C.J., Hunt B., Herrtage M.E.: Identi- Tengvall-Linder M., Scheynius A. Malassezia sympodialis stimu­ fication and distribution of a novel Malassezia species yeast on lation differently affects gene expression in dendritic cells from normal equine skin. Vet. Rec. 150, 395–398 (2002) atopic dermatitis patients and healthy individuals. Acta Derma- 53. Plotkin L.I., Mathov I., Squiquera L., Leoni J.: Arachidonic acid tol. Venereol. 84, 339–345 (2004) released from epithelial cells by Malassezia furfur phospholi- 33. Gueho E., Midgley G., Guillot J.: The genusMalassezia with pase A₂: A potential pathophysiologic mechanism. Mycology, description of four new species. Antonie van Leeuwenhoek, 69, 90, 163–169 (1998) 337–55 (1996) 54. Plotkin L.I., Squiquera L., Mathov I., Galimberti, R. Leoni J.: 34. Guého-Kellermann E., Boekhout T., Begerow D.: Biodiversity, Characterization of the lipase activity of Malassezia furfur. phylogeny and ultrastructure. [w:] Boekhout T., Guého E., J. Med. Vet. Mycol. 34, 43–48 (1996) Mayser P., Velegraki A. (red.) Malassezia and the skin. Berlin 55. Ro B.I., Dawson T.L. Jr: The role of sebaceous gland activity Heidelberg: Springer-Verlag. str. 17–64. and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic 35. Guillot J., Gueho E., Prevost M.C.: The ultrastructure of dimor- dermatitis and dandruff.J. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 10, phic yeast Malassezia furfur. J. Mycol. Méd. 5, 86–91 (1995) 194–197 (2005) 36. Guillot J., Gueho E.: The diversity of Malassezia yeasts con- 56. Savolainen J., Lintu P., Kosonen J., Kortekangas-Savolainen firmed by rRNA sequence and nuclear DNA comparisons. O., Viander M., Pène J., Kalimo K., Terho E.O., Bousquet J.: Antonie van Leeuvenhoek, 67, 297–314 (1995) Pityrosporum and Candida specific and non-specific humoral, 37. Gupta A.K., Batra R., Bluhm R., Boekhout T., Dawson T.L. Jr: cellular and cytokine responses in atopic dermatitis patients. Skin diseases associated with Malassezia species. J. Am. Acad. Clin. Exp. Allergy, 31, 125–134 (2001) Dermatol. 51, 785–798 (2004) 57. Shifrine M., Marr A.G.: The requirement of fatty acids by 38. Hay R.J., Midgley G.: Introduction: Malassezia yeasts from P. ovale. J. Gen. Microbiol. 32, 263–70 (1963) a historical perspective. [w:] Boekhout T., Guého E., Mayser P., 58. Silny W., Czarnecka-Operacz M.: Atopowe zapalenie skóry Velegraki A. (red.) Malassezia and the skin. Springer-Verlag, – udział limfocytów T i komórek Langerhansa w rozwoju zmian Berlin Heidelberg, 2010 s. 1–16. skórnych. Alerg. Astm. Immunol. 5, 15–20 (2000) 39. Hirai A, Kano R, Makimura K., Duarte E.R., Hamdan J.S., 59. Simmons R.B., Ahearn D.G.: Cell wall ultrastructure and dia- Lachance M.A., Yamaguchi H., Hasegawa A.: Malassezia nana monium blue B reaction of Sporopachyderma quercuum, Bullera sp. nov., a novel lipid-dependent yeast species isolated from tsugae and Malassezia spp. Mycologia, 79, 38–43 (1987) animals. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 623–627 (2004) 60. Sugita T, Tajima M, Takashima M., Amaya M., Saito M., 40. Hirai A., Kano R., Makimura K., Duarte E.R., Hamdan J.S., Tsuboi R., Nishikawa A.: A new yeast, Malassezia yamatoensis, Lachance M.A., Yamaguchi H., Hasegawa A.: Malassezia nana isolated from a patient with seborrheic dermatitis, and its dis- sp. nov., a novel lipid-dependent yeast species isolated from tribution in patients and healthy subjects. Microbiol. Immunol. animals. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 623–627 (2004) 48, 579–583 (2004) CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. I. ASPEKTY MIKROBIOLOGICZNE I IMMUNOLOGICZNE 305

61. Sugita T., Takashima M., Kodama M., Tsuboi R., Nishikawa A.: 66. Wroblewski N., Bär S., Mayser P.: Missing granulocytic infiltrate Description of a new yeast species, Malasseziajaponica, and its in pityriasis versicolor – indication of specific anti-inflamma- detection in patients with atopic dermatitis and healthy sub- tory activity of the pathogen? Mycoses, 48, 66–71 (2005) jects. J. Clin. Microbiol. 41, 4695–4699 (2003) 67. Xu J., Dawson T.L. Jr i wsp.: Dandruff-associated Malassezia 62. Sugita T., Takashima M., Shinoda T., Suto H., Unno T., Tsuboi R., genomes reveal convergent and divergent virulence traits Ogawa H., Nishikawa A.: New yeast species, Malassezia der- shared with plant and human fungal pathogens. Proc. Natl. matis, isolated from patients with atopic dermatitis. J. Clin. Acad. Sci. USA, 104, 18730–18735 (2007) Microbiol. 40, 1363–1367 (2002) 68. Yarrow D., Ahearn D.G. Malassezia Baillon. [w:] The yeasts. 63. Van de Kerkhof P.C., Franssen M.E.: Psoriasis of the scalp: A taxonomic study. Wyd. 3. NJW Kroger van Rij (red.), North diagnosis and management. Am. J. Clin. Dermatol. 2, 159–165 Holland Publ. Co., Amsterdam, 1984, s. 882–885. (2001) 69. Zawirska A.: Grzyby z rodzaju Malassezia. Nowe informacje. 64. Wanat-Krzak M., Kurzawa R.: Atopowe zapalenie skóry – etio­ Post. Derm. Alergol. 2, 97–103 (2004) patogeneza, diagnostyka i leczenie. Alergologia i pulmonologia 70. Zuther K., Mayser P., Hettwer U., Wu W., Spiteller P., Kin- wieku dziecięcego. Klin. Pediatr. 10, 237–244 (2002) dler B.L., Karlovsky P., Basse C.W., Schirawski J.: The trypto- 65. Watanabe S., Kano R., Sato H., Nakamura Y., Hasegawa A.: The phan aminotransferase Tam1 catalyses the single biosynthetic effects ofMalassezia yeasts on cytokine production by human step for tryptophan-dependent pigment synthesis in Ustilago keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 116, 769–773 (2001) maydis. Mol. Microbiol. 68, 152–172 (2008)

POST. MIKROBIOL., CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. 2013, 52, 3, 307–314 http://www.pm.microbiology.pl II. ASPEKTY KLINICZNE

Elżbieta Rup2†, Tomasz Jagielski1*†, Anna Macura2, Jacek Bielecki1

1 Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski 2 Zakład Mykologii, Katedra Mikrobiologii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie

Wpłynęło w styczniu 2013 r.

Spis treści: 1. Występowanie i chorobotwórczość grzybów z rodzaju Malassezia. 1.1. Dystrybucja grzybów z rodzaju Malassezia. 1.2. Chorobotwórczość grzybów Malassezia sp. 1.2.1. Łupież pstry (Pityriasis versicolor, PV). 1.2.2. Zapalenie mieszków włosowych (Malassezia folliculitis). 1.2.3. Łojotokowe zapalenie skóry i łupież (Seborrhoeic dermatitis/Dandruff; SD/D). 1.2.4. Atopowe zapalenie skóry. 1.2.5. Łuszczyca. 2. Wrażliwość na leki grzybów z rodzaju Malassezia. 3. Przyszłość badań nad grzybami z rodzaju Malassezia Characterization of fungi of the Malassezia genus. II. Clinical aspects Piśmiennictwo: Lipophilic yeasts of the genus Malassezia have been associated with a number of diseases affecting human skin. Clinically, pityriasis versicolor is the most important, ranking the first among all cutaneous mycoses in human population worldwide. Malassezia fungi may also aggravate the symptoms of other skin disorders, such as seborrheic dermatitis or exacerbate the course of psoriasis and atopic dermatitis. This review briefly outlines the epidemiology, risk factors, pathogenesis, clinical manifestations, and treatment of various skin diseases related to the Malassezia species. Content: 1. Prevalence and pathogenicity of Malassezia fungi. 1.1. Distribution of Malassezia fungi. 1.2. Pathogenicity of Malassezia sp. 1.2.1. Pityriasis versicolor (PV). 1.2.2. Malassezia folliculitis. 1.2.3. Seborrhoeic dermatitis/Dandruff (SD/D). 1.2.4. Atopic dermatitits. 1.2.5. Psoriasis. 2. Drug susceptibility of Malassezia fungi. 3. Future of the research on Malassezia fungi

Słowa kluczowe: atopowe zapalenie skóry (AZS), grzybice, lekowrażliwość, łupież pstry (PV), łuszczyca, Malassezia sp., zakażenia skóry Key words: atopic dermatitis (AD), drug susceptibility, Malassezia sp., mycoses, pityriasis versiccolor (PV), psoriasis, skin infections

1. Występowanie i chorobotwórczość grzybów przeprowadzonym w 1987 roku w grupie 60 zdrowych z rodzaju Malassezia dzieci w wieku od 2 miesięcy do 14 lat nie stwierdzili kolonizacji skóry dzieci przez szczepy Malassezia sp. [1]. 1.1. Dystrybucja grzybów z rodzaju Malassezia Odkrycie nowych gatunków grzybów z rodzaju Malas- sezia i zastosowanie metod molekularnych w ocenie Grzyby z rodzaju Malassezia mogą być izolowane ich występowania znacznie zwiększyło czułość metod z całej skóry ludzkiej. Miejsca, w których występują badawczych, stąd w badaniach przeprowadzonych najczęściej to okolice bogate w gruczoły łojowe takie w kolejnych latach szczepy Malassezia sp. izolowano ze jak: okolica mostkowa, okolica międzyłopatkowa (tzw. skóry nawet u 98% badanych dzieci [5, 10, 12]. Częstość rynny łojotokowe przednia i tylna), skóra owłosiona kolonizacji skóry przez Malassezia sp. u zdrowych dzieci głowy, czoło, policzki oraz małżowiny uszne. Najwięk- wzrasta wraz z wiekiem. Opisywane przypadki funge- sze nasilenie kolonizacji Malassezia sp. obserwuje się po mii wywołanej przez Malassezia sp. u cewnikowanych okresie dojrzewania u młodych dorosłych. Wraz z wie- wcześniaków spowodowały wzrost badań dotyczących kiem, prawdopodobnie w związku ze zmniejszającą się częstości występowania tych grzybów u noworodków. aktywnością gruczołów łojowych i zawartością lipidów Szczepy Malassezia sp. izolowano ze skóry 34–100% w skórze, spada częstość izolacji Malassezia sp. Pewne hospitalizowanych noworodków, w zależności od cyto- różnice w występowaniu tych grzybów na skórze zaob- wanego badania. Do czynników ułatwiających koloni- serwowano u kobiet i mężczyzn – u mężczyzn częściej zację należały: wcześniactwo, niska masa urodzeniowa izolowano je z dolnych części tułowia i górnych części oraz wydłużający się okres hospitalizacji i żywienia ud w porównaniu z kobietami [13, 31]. pozajelitowego [30, 40, 62]. Wyniki badań dotyczących kolonizacji skóry dzie- Badania dotyczące dystrybucji grzybów z rodzaju cięcej przez grzyby Malassezia sp. są bardzo rozbieżne. Malassezia na skórze ludzkiej opisują głównie wystę- Różnice w ocenie częstości występowania tych grzy- powanie poszczególnych gatunków Malassezia. W oko- bów u dzieci wydają się wynikać głównie z zastosowa- licy międzyłopatkowej stwierdzono głównie gatunki nej metody badawczej. A b r a h a m i wsp. w badaniu M. globosa i M. sympodialis, na skórze klatki piersiowej

* Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski; ul. I. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel.: +48 (0) 22 55-41-312; fax: +48 (0) 22 55-41-402; e-mail: [email protected] † Autorzy w równym stopniu przyczynili się do powstania pracy 308 ELŻBIETA RUP, TOMASZ JAGIELSKI, ANNA MACURA, JACEK BIELECKI

– M. globosa, M. sympodialis oraz M. restricta. Skórę owłosioną głowy kolonizuje najwięcej różnych gatun- ków: M. globosa, M. sympodialis, M. restricta oraz M. slo- offiae i M. furfur, natomiast na twarzy i przedramionach najczęściej stwierdza się obecność M. globosa, M. sym- podialis i M. furfur. Również szczepy typowo zoofilne M. pachydermatis okazjonalnie są izolowane od ludzi, choć nie uznaje się ich za składnik normalnej ludzkiej flory [13, 31]. W wielu badaniach klinicznych próbowano wyod- rębnić poszczególne gatunki Malassezia związane z różnymi chorobami dermatologicznymi. Wyniki tych badań nie przyniosły jednak konsensusu [3, 13, 31].

1.2. Chorobotwórczość grzybów Malassezia sp.

Grzyby z rodzaju Malassezia związane są z występo- waniem wielu schorzeń dermatologicznych zarówno jako czynnik etiologiczny infekcji grzybiczej, jak i patogen nasilający zmiany skórne powstałe na drodze różnych mechanizmów. Do pierwszej grupy zalicza się łupież pstry oraz zapalenie mieszków włosowych, w których zmiany skórne są bezpośrednio związane ze wzrostem grzyba, natomiast do drugiej: łojotokowe zapalenie skóry, atopowe zapalenie skóry oraz łuszczycę [58]. U pacjentów z immunosupresją lub w przypadku zaist- nienia szczególnych okoliczności (żywienie pozajelitowe u wcześniaków) grzyby z rodzaju Malassezia mogą być też przyczyną zakażeń ogólnoustrojowych [13, 31].

1.2.1. Łupież pstry (Pityriasis versicolor, PV)

Łupież pstry jest przewlekłą, powierzchowną grzy- bicą charakteryzującą się występowaniem okrągłych i owalnych plam ze złuszczaniem naskórka zlokalizowa- nych głównie na skórze tułowia, szyi i ramion, Rys. 1, 2. Zmiany skórne mogą być odbarwione, przebarwione, czasem nieznacznie zaczerwienione, a w zaawanso- wanych przypadkach wykazują tendencję do zlewania Rys. 1, 2. Łupież pstry się. Rozpoznanie ułatwia żółtawo-złota fluorescencja w świetle lampy Wooda, obserwowana w około 30% w ludzkich melanocytach, prowadząc do depigmentacji przypadków PV. Wyniki ostatnich badań sugerują, że skóry [39]. Efekt depigmentujący przypisuje się również jedynie M. furfur, spośród wszystkich odkrytych gatun- działaniu kwasu azelainowego (C9 kwas dwukarbok- ków Malassezia, wytwarza związki indolowe, pochodne sylowy), który, jak wykazano, odpowiada za inhibicję tryptofanu, odpowiedzialne za fluorescencję w lampie kompetencyjną tyrozynazy, kluczowego enzymu w pro- Wooda, stąd dodatni wynik badania fluorescencji jedy- cesie melanogenezy [52]. nie w niewielkim odsetku pacjentów. Wspomniane W bezpośrednim badaniu mikroskopowym uwi- związki indolowe (w grupie tej m.in. pityriarubiny, daczniają się zarodniki i strzępki Malassezia sp. Obecnie pityrialakton, malassezyna) wiąże się z patogenezą PV, postuluje się, że do rozwoju PV dochodzi w chwili, gdy w szczególności zaś z powstawaniem charakterystycz- postać drożdżowa Malassezia sp. przechodzi w postać nych zmian zabarwienia skóry. Na przykład malasse- mycelialną zajmującą warstwę rogową naskórka. Stąd zyna, reprezentujaca nową klasę agonistów receptora w badaniu mikroskopowym materiałów pobranych ze węglowodorów arylowych (AhR) indukuje apoptozę zmian skórnych w PV widoczne są właśnie strzępki CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. II. ASPEKTY KLINICZNE 309 grzybni. Choroba ma charakter nawrotowy. Większość 1.2.3. Łojotokowe zapalenie skóry i łupież pacjentów z PV nie zgłasza dolegliwości subiektywnych, (Seborrhoeic dermatitis/Dandruff; SD/D) rzadko zmianom skórnym może towarzyszyć świąd [31]. Łupież pstry występuje u ludzi na całym świecie. Łojotokowe zapalenie skóry jest powszechnie wystę- Częściej spotykany jest na obszarach charakteryzujących pującą dermatozą. Szacuje się, że choroba dotyczy 1–3% się wysoką temperaturą i dużą wilgotnością powietrza populacji ogólnej, a w grupie osób młodych choruje na (choruje tam nawet do 40% populacji). W klimacie nią nawet do 5% populacji [41, 51]. Częstość występo- umiarkowanym występuje rzadziej; w Szwecji dotyka wania SD/D jest znacznie wyższa u pacjentów z immu- 1,1% ludności, a we Włoszech – 3,7%. Dermatoza ta nosupresją, szczególnie z AIDS (30–33% pacjentów) dotyczy głównie młodych osób dorosłych po okresie [24, 26]. Choroba ma charakterystyczny obraz kliniczny. dojrzewania, u których aktywność gruczołów łojowych Najczęściej rozpoczyna się w okresie dojrzewania, jest największa. Opisywano również pojedyncze przy- a zmiany o największym nasileniu obserwuje się u mło- padki PV u dzieci i noworodków [31]. Do czynników dych osób dorosłych. Ogniska rumieniowe pokryte tłu- endogennych zwiększających ryzyko PV należą: niedo- stymi łuskami występują na owłosionej skórze głowy, żywienie [53], stosowanie doustnej hormonalnej anty- w fałdach nosowo-wargowych, na policzkach, powie- koncepcji [14], systemowe stosowanie glikokortykoste- kach, w obrębie brwi, rzadziej zajmują małżowiny uszne, roidów i leków immunosupresyjnych oraz zwiększona skórę klatki piersiowej i okolicę międzyłopatkową. potliwość [17, 21]. W przypadkach o dużym nasileniu może dojść do zaję- Ze skóry pacjentów z PV najczęściej izolowano cia skóry całego ciała. Choroba ma przewlekły przebieg szczepy M. globosa [20, 45] i M. sympodialis [32, 33], z okresowymi zaostrzeniami, głównie w porze jesienno- rzadziej szczepy M. slooffiae i M. furfur. Różnice w czę- -zimowej. Wielu badaczy uważa, że łupież tłusty głowy stości izolowanych gatunków mogą wynikać z uwa- to łagodna odmiana łojotokowego zapalenia skóry. runkowań geograficznych, konieczne są jednak dalsze Rola grzybów z rodzaju Malassezia w rozwoju SD/D badania, aby potwierdzić tę hipotezę [31]. jest badana od wielu lat. Już w 1975 roku M c G i n l e y i wsp. zaobserwowali większą kolonizację skóry przez Malassezia sp. u pacjentów z SD/D w porównaniu 1.2.2. Zapalenie mieszków włosowych z osobami zdrowymi [44]. W wielu badaniach wyka- (Malassezia folliculitis) zano dodatnią korelację pomiędzy stopniem koloniza- cji skóry przez gryzby Malassezia sp. i nasileniem obja- Podobnie jak w łupieżu pstrym, w przebiegu zapa- wów klinicznych w przebiegu SD/D [46] oraz znaczną lenia mieszków włosowych zmiany skórne związane poprawę stanu klinicznego po zastosowaniu leków prze- są bezpośrednio ze wzrostem grzybów Malassezia sp. ciwgrzybiczych u pacjentów z SD/D. Obecnie sugeruje w tkance skórnej. Zajęcie struktur mieszków włosowych się, że zmiany w przebiegu SD/D są związane nie tyle przez drożdżową postać Malassezia sp. skutkuje powsta- z nadmierną kolonizacją skóry przez grzyby Malassezia niem rumieniowych grudek i krost głównie na skórze sp., ile z nieprawidłową odpowiedzią immunologiczną tułowia i proksymalnych części ramion. W rejonach komórek gospodarza na obecność komórek grzyba [11]. geograficznych o gorącym i wilgotnym klimacie choroba Podobnie jak w przypadku PV, prowadzone obecnie może mieć duże nasilenie i przebiegać z zajęciem twa- badania dotyczą głównie występowania poszczególnych rzy. Zmianom skórnym może towarzyszyć świąd. Obok gatunków Malassezia u pacjentów z SD/D. Wyniki nie- komórek Malassezia sp., niektórzy badacze stwierdzali których badań są bardzo rozbieżne, jednak z dostęp- w obrębie mieszków włosowych również gronkowce nych obecnie danych wydaje się, że gatunki najbardziej oraz Propionibacterium acne, jednak w bezpośrednim związane z SD/D to M. globosa i M. restricta. Rzadziej badaniu mikroskopowym najczęściej obserwowano izolowano ze zmian skórnych szczepy M. furfur, M. sym- jedynie Malassezia sp. [31]. podialis, M. obtusa i M. slooffiae [3, 31]. Do czynników predysponujących do wystąpie- nia Malassezia folliculitis zalicza się immunosupresję, cukrzycę oraz stosowanie antybiotyków o szerokim 1.2.4. Atopowe zapalenie skóry spektrum. W badaniach przeprowadzonych w grupie pacjentów z eozynofilowym zapaleniem mieszków wło- Atopowe zapalenie skóry (atopic dermatitis, AD, AZS) sowych w przebiegu zakażenia HIV i AIDS zaobserwo- jest przewlekłą, zapalną dermatozą świądową dotyczącą wano również wysoki odsetek kolonizacji mieszków głównie wieku dziecięcego. AZS może przebiegać jako włosowych przez grzyby Malassezia sp. [25, 26]. izolowane schorzenie lub stanowić manifestację ogól­ W piśmiennictwie brak jest badań dotyczących no­ustrojowych zaburzeń o podłożu alergicznym wraz występowania poszczególnych gatunków Malassezia z zapaleniem błony śluzowej nosa i spojówek, astmą u pacjentów z Malassezia folliculitis [31]. oskrzelową czy alergiami pokarmowymi. Częstość 310 ELŻBIETA RUP, TOMASZ JAGIELSKI, ANNA MACURA, JACEK BIELECKI

Tabela I Odkrycia potwierdzające udział Malassezia sp. w patogenezie AZS

Wnioski z badań klinicznych Piśmiennictwo 1. Leczenie przeciwgrzybicze przyczynia się do poprawy klinicznej u pacjentów z AZS, Clemmensen i Hjorth, 1983 [19] ze zmianami na skórze głowy i szyi. 2. Zwiększona częstość występowania nadwrażliwości typu I na antygeny Malassezia sp. Young i wsp., 1989 [64] u pacjentów z AZS. 3. Pacjenci z AZS mają dodatnie testy płatkowe z ekstraktem Malassezia sp. Rokugo i wsp., 1990 [49] 4. Leczenie przeciwgrzybicze przyczynia się do poprawy klinicznej u pacjentów z AZS, Back i wsp., 1995 [6] ze zmianami na skórze całego ciała. 5. Pacjenci z AZS, ze zmianami na skórze głowy i szyi mają znacząco częściej IgE swoiste Lindgren i wsp., 1995 [41] dla Malassezia sp. w porównaiu z IgE swoistymi dla antygenów innych grzybów. 6. Pacjenci z AZS mają limfocyty Th2 swoiste dla antygenówMalassezia sp. Tengvall Linder i wsp., 1996 [57] 7. W surowicy pacjentów z AZS występują IgE swoiste dla antygenów różnych gatunków Zargari i wsp., 2003 [65] Malassezia sp. występowania AZS znacząco wzrosła w ostatnich deka- ciwgrzybiczych [19]. Istotne odkrycia potwierdzające dach. Obecnie szacuje się, że AZS dotyczy około 10–20% udział gryzbów Malassezia sp. w patogenezie AZS populacji pediatrycznej. U ponad połowy pacjentów zestawiono w tabeli I. Częstość występowania grzybów pierwsze objawy choroby występują w okresie niemow- z rodzaju Malassezia na skórze dorosłych pacjentów lęcym, a u 90% przed ukończeniem 5. r.ż. Wśród osób z AZS oraz w populacji zdrowej jest podobna i wynosi dorosłych AZS obserwuje się u 1–3% populacji [38, między 50% a 80%, w zależności od zastosowanej 61]. Przyczyny powstania AZS są nadal niejasne. Kla- metody badawczej. Natomiast w przypadku pacjentów syczne badania genetyczne wykazały związek pomiędzy z AZS znacząco częściej obserwuje się wysokie miana AZS i innymi chorobami atopowymi. Odsetek chorych swoistych przeciwciał w klasie IgE przeciwko antyge- z dodatnim wywiadem rodzinnym w kierunku ato- nom Malassezia sp. w surowicy oraz pozytywne wyniki pii wynosi 60–70%. Badania kliniczne w grupie bliź- punktowych i płatkowych testów skórnych z antyge- niąt dowiodły, że w przypadku bliźniąt jednojajowych nami Malassezia sp. w porównaniu do grup kontrolnych zgodność zachorowania na AZS jest znacząco wyższa [6, 41, 49, 51, 64]. Stąd, obecnie uważa się, ze grzyby niż u dwujajowych (85% versus 30%). Istotną rolę czyn- Malassezia sp. stanowią raczej czynnik alergizujący niż ników genetycznych potwierdzają również obserwacje infekcyjny w przypadku pacjentów z AZS. Zwiększona rodzinne – stwierdzono, że ryzyko wystąpienia AZS wrażliwość na antygeny Malassezia sp. u pacjentów u dziecka w przypadku, gdy oboje rodzice są chorzy z AZS jest mediowana zarówno na drodze humoral- wynosi 60–80%. Obecnie uważa się, że AZS jest dzie- nej jak i komórkowej. Odpowiedź komórkowa wydaje dziczone wielogenowo, stwierdzono również wystę- się być głównie typu Th2 [57]. W surowicy pacjentów powanie zjawiska piętnowania genetycznego, gdzie z AZS stwierdzono znacząco wyższe poziomy IL4 i IL5 wpływ genów matczynych przewyższa wpływ genów w porównaniu do grup kontrolnych [56]. Cytokiny te są ojcowskich. W 2006 roku odkryto, że mutacja w obrę- związane z reakcjami immunologicznymi mediowanymi bie genu filagryny, jednego z białek odpowiadających przez IgE i ich wysoki poziom może stymulować nad- za tworzenie bariery naskórkowej, znacząco zwiększa mierną produkcję IgE [63]. Jak dotąd nie stwierdzono ryzyko zachorowania na AZS, zwłaszcza na postać korelacji pomiędzy objawami klinicznymi u pacjentów o wczesnym początku i trwałej nadwrażliwości. Odkry- z AZS a poziomem swoistych przeciwciał IgE przeciwko cie to potwierdza istotną rolę bariery skórnej, jako czyn- antygenom Malassezia sp. w surowicy. Sugeruje się, że nika zapobiegającego odpowiedzi alergicznej. Obecnie obecność swoistych przeciwciał IgE na mastocytach, uważa się, że jednym z głównych defektów u pacjentów poprzez uwalnianie histaminy nasila świąd skóry, który z AZS jest upośledzone funkcjonowanie bariery skórnej, prowokuje drażnienie mechaniczne, doprowadzając co prowadzi do nieprawidłowej, zwiększonej prezentacji w ten sposób do dalszego uszkodzenia bariery skórnej antygenów komórkom układu immunologicznego [15]. i zwiększonej ekspozycji na alergeny [3]. Grzyby z rodzaju Malassezia wydają się stanowić Przedmiotem licznych badań u pacjentów z AZS są istotny czynnik w patogenezie AZS u osób dorosłych, również interakcje pomiędzy komórkami Malassezia sp. zwłaszcza ze zmianami skórnymi zlokalizowanymi na i komórkami dendrytycznymi w skórze. Autorzy badań głowie i szyi. Już w latach 80. ub. w. zaobserwowano sugerują, że dojrzałe komórki dendrytyczne prezen- ustępowanie zmian skórnych u pacjentów z AZS po tujące antygeny Malssezia sp. limfocytom T, oporne zastosowaniu miejscowych i systemowych leków prze- na lizę przez komórki NK, mogą przyczyniać się do CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. II. ASPEKTY KLINICZNE 311 podtrzymania reakcji zapalnej w zmianach skórnych [9]. Do innych mechanizmów, mogących uczestniczyć pacjentów z AZS, co dodatkowo jest jeszcze nasilane w indukcji zmian skórnych należą: aktywacja układu przez produkowane przez komórki dendrytyczne cyto- dopełniacza, chemotaksja neutrofilów oraz zwiększona kiny prozapalne, takie jak: IL8, IL6 czy IFNγ [16, 28]. migracja innych komórek immunologicznych do skóry Nasilenie zmian skórnych u pacjentów z AZS może pod wpływem kolonizacji przez grzyby Malassezia sp. nastąpić również na drodze aktywacji procesów zapal- [3, 4, 31]. Wysoka aktywność enzymatyczna grzybów nych poprzez uwalniane przez Malassezia sp. enzymy z rodzaju Malassezia, a w szczególności produkcja lipaz hydrolityczne [13, 31]. może stanowić mechanizm spustowy inicjujący proces Liczne badania dotyczące występowania poszczegól- zapalny w skórze pod wpływem aktywacji kaskady nych gatunków Malassezia u pacjentów z AZS nie przy- kwasu arachidonowego. Do innych istotnych w akty- niosły konsensusu. Ze zmian skórnych izolowano różne wacji stanu zapalnego enzymów produkowanych przez gatunki Malassezia, najczęściej: M. globosa, M. restricta Malassezia sp. należą lipooksygenaza oraz lipoperoksy- [55], M. sympodialis [22, 33] i M. furfur [45]. daza. Utlenianie wolnych i zestryfikowanych kwasów tłuszczowych błon komórkowych przez wymienione enzymy powoduje uszkodzenie komórek i rozwój pro- 1.2.5. Łuszczyca cesu zapalnego [3, 4, 31]. Częstość kolonizacji skóry przez grzyby Malassezia Łuszczyca (psoriasis) jest jedną z najczęściej wystę- sp. u pacjentów z łuszczycą waha się między 50–90%. pujących przewlekłych zapalnych chorób skóry. Sza- Najczęściej izolowanym gatunkiem jest M. globosa, rza- cuje się, że około 1–5% populacji europejskiej choruje dziej izoluje się szczepy M. slooffiae i M. restricta [33, 47]. z powodu łuszczycy. Patogeneza łuszczycy nie jest do końca poznana. Istnieje wiele czynników predysponu- jących do wystąpienia choroby. Zalicza się do nich czyn- 2. Wrażliwość na leki grzybów z rodzaju Malassezia niki genetyczne (antygeny układu HLA: HLA-A2, -B13, -B17, -B27, -Bw57, -Cw2, -Cw6, DR7), immunologiczne W leczeniu zakażeń wywołanych przez grzyby oraz środowiskowe (uraz, światło, infekcje) [15, 37]. z rodzaju Malassezia najczęściej wykorzystywane są Zakażenia zarówno systemowe jak i miejscowe wywo- pochodne imidazolowe (ketokonazol, mikonazol, eko- łane przez paciorkowce beta-hemolizujące, czy grzyby nazol), triazole (flukonazol, itrakonazol) oraz cyklo- z rodzaju Candida stanowią znany czynnik inicjujący piroksolamina. Azole (pochodne imidazolowe oraz epizod łuszczycy wysiewnej czy zaostrzający przebieg triazole) stanowią obecnie największą grupę chemiote- łuszczycy plackowatej. W wielu badaniach wykazano, że rapeutyków przeciwgrzybiczych. Główny mechanizm stymulacja leukocytów jednojądrzastych krwi obwodo- działania tej grupy leków polega na blokowaniu syntezy wej pacjentów z łuszczycą przez superantygeny pacior- ergosterolu, koniecznego do budowy ściany komórko- kowców grupy A wiązała się ze znacznie zwiększoną wej grzyba poprzez hamowanie demetylacji węgla C14 odpowiedzią proliferacyjną oraz uwalnianiem cytokin w cząsteczce lanosterolu, prekursora ergosterolu. Azole prozapalnych przez leukocyty [7]. wiążą się z cytochromem P-450, wypierając z wiązania Wiele badań klinicznych i przedklinicznych potwier- tlen, co hamuje proces demetylacji C14 [29, 34, 35]. dza udział grzybów z rodzaju Malassezia w rozwoju Azole są obecnie szeroko stosowane w leczeniu zarówno zmian łuszczycowych, zwłaszcza w przypadku łuszczycy grzybic powierzchownych jak i systemowych. owłosionej skóry głowy oraz okolicy narządów płcio- Innym chemioterapeutykiem przeznaczonym do wych [43, 60]. Wysiew grudek łuszczycowych w miejs­ stosowania miejscowego jest cyklopiroksolamina. Jest cach aplikacji ekstraktów zawierających komórki Malas- to hydroksylowa pochodna pirydynonu o szerokim sezia sp. obserwowano zarówno w przypadku ludzi działaniu przeciwgrzybiczym (grzybobójcze i grzybo- jak i w badaniach przeprowadzonych na zwierzętach statyczne w odniesieniu do licznych gatunków grzybów [42, 50]. W badaniach klinicznych wykazano również chorobotwórczych), przeciwbakteryjnym i przeciwza- zmniejszenie nasilenia łuszczycy po zastosowaniu doust- palnym. Mechanizm działania przeciwgrzybiczego leku nych i miejscowych leków przeciwgrzybiczych (bifona- polega na chelatowaniu jonów żelaza i glinu (Fe3+ i Al3+), zol, ketokonazol) [2, 23]. Obecnie uważa się, że grzyby co zmniejsza aktywność enzymów metalowrażliwych, z rodzaju Malassezia mogą zaostrzać przebieg łuszczycy głównie cytochromów, katalaz i peroksydaz i w następ- poprzez uwalnianie cytokin prozapalnych, zwłaszcza stwie prowadzi do utrudnienia transportu jonów przez interleukiny 8, dzięki aktywacji tzw. receptorów żeto- błony cytoplazmatyczne drobnoustrojów oraz dezorga- nowych (Toll-like receptors) typu II [8]. W następstwie nizacji ich struktur wewnątrzkomórkowych. Cyklopi- inkubacji keratynocytów z grzybami z rodzaju Malasse- roksolamina hamuje również cykl komórkowy w fazie zia obserwowano również zwiększoną ekspresję TGF-β1 G1/S. Przeciwzapalne działanie cyklopiroksolaminy oraz białek szoku cieplnego – HSP70 w keratynocytach polega na blokowaniu syntezy prostaglandyn (PGE2) 312 ELŻBIETA RUP, TOMASZ JAGIELSKI, ANNA MACURA, JACEK BIELECKI

i leukotrienów (LTB4) w granulocytach wielojądrza- W dostępnym piśmiennictwie brak jest badań opisu- stych (siła działania przeciwzapalnego cyklopirokso- jących możliwe mechanizmy oporności na cyklopiro­ laminy przewyższa siłę działania hydrokortyzonu). ksolaminę [54]. Oprócz efektu przeciwgrzybiczego i przeciwzapalnego cyklopiroksolamina wykazuje działanie przeciwbak- teryjne zarówno względem bakterii Gram-dodatnich, 3. Przyszłość badań nad grzybami jak i Gram-ujemnych, w tym Proteus sp. i Pseudomonas z rodzaju Malassezia aeruginosa [36]. Mechanizmy oporności na leki grzybów z rodzaju Zakażenia grzybami z rodzaju Malassezia są proble- Malassezia nie zostały dotychczas dokładnie poznane. mem klinicznym na całym świecie. Duże zróżnicowanie Jedynie U c h i d a i wsp., w pracy opublikowanej gatunków Malassezia pozwala przypuszczać, ze prawdo- w 1994 roku opisali możliwe mechanizmy oporno- podobnie istnieją także indywidualne różnice w pato- ści M. pachydermatis na antybiotyki polienowe [59]. mechanizmie chorób wywoływanych przez poszcze- W dostępnym obecnie piśmiennictwie brak jest danych gólne genotypy tych grzybów. W przebiegu infekcji dotyczących mechanizmów oporności na leki przeciw- grzybami z rodzaju Malassezia istotną rolę odgrywają grzybicze z innych grup a także innych gatunków Malas- również predyspozycje samego gospodarza. sezia. Wielu autorów opisywało natomiast mechanizmy W 2007 roku na kongresie w Turynie, międzynaro- lekooporności innych drożdży, np. grzybów z rodzaju dowa grupa badaczy określiła nadrzędne cele w dalszych Candida. Wydaje się, że mechanizmy te w przypadku badaniach nad Malassezia sp. Należą do nich: grzybów z rodzaju Malassezia będą podobne [48]. • standaryzacja metod pobierania materiału do badań, Badania dotyczące oporności na leki przeciwgrzybi- hodowli i identyfikacji gatunkowej Malassezia sp., cze z grupy pochodnych azolowych wykazały, że naby- oceniania lekowrażliwości oraz potencjalnego ryzyka wanie oporności odbywa się stopniowo, najczęściej zakażenia szczepami zoofilnymi M. pachydermatis, w wyniku ekspozycji na subterapeutyczne dawki leków. • stworzenie internetowej bazy szczepów referencyjnych, Autorzy badań sugerują, że wiele różnych mechanizmów • kontynuacja badań dotyczących epidemiologii zaka- równocześnie przyczynia się do powstania ostatecznego żeń Malassezia sp., z uwzględnieniem identyfikacji lekoopornego fenotypu, szczególnie w przypadku szcze- gatunkowej grzybów oraz ocena występowania zaka- pów o wysokiej oporności na leki azolowe. W jednym żeń mieszanych na skórze osób zdrowych i chorych, z badań dotyczących oporności C. albicans wykazano, • określenie czynników warunkujących swoistość dys- że aż w przypadku 75% badanych szczepów oporność trybucji szczepów Malassezia sp. w zależności od na leki azolowe była uwarunkowana wieloczynnikowo gatunku gospodarza zwierzęcego, a także czynników [18]. Do możliwych opisywanych mechanizmów opor- wpływających na indywidualne predyspozycje do ności należą: zakażeń u ludzi i zwierząt. • zmniejszenie wewnątrzkomórkowego stężenia leku, związane ze zwiększoną ekspresją genów dla wielole- kowych transporterów błonowych (upregulation mul- Piśmiennictwo tidrugs efflux transporter genes) [29], • zmniejszenie powinowactwa do docelowego substratu: 1. Abraham Z., Berderly A., Lefler E.: Pityrosporum orbiculare in enzymu 14-α-demetylazy lanosterolu w nastepstwie children. Mykosen, 30, 581–583 (1987) 2. Alford R.H., Vice C.G., Cartwright B.B., King L.E.: Ketocona- mutacji kodującego go genu ERG11 [27], zole’s inhibition of fungal antigen-induced thymidine uptake • zmiana składu steroli w błonie komórkowej grzyba by lymphocytes from patients with psoriasis. Am. J. Med. Sci. i w następstwie zmniejszenie stężenia toksycznych 291, 75 (1986) związków powstałych w wyniku zahamowania aktyw- 3. Ashbee H.R.: Recent developments in the immunology and ności 14-α-demetylazy lanosterolu [27], biology of Malassezia species. FEMS Immunol. Med. Microbiol. • zmniejszenie przepuszczalności błony komórkowej 47, 14–23 (2006) 4. Ashbee H.R., Evans V.: Immunology of diseases associated with grzyba dla leku w następstwie zmniejszenia stężenia Malassezia species. Clin. Microbiol. Rev. 15, 21–57 (2002) ergosterolu oraz zmniejszenia stosunku fosfatydylo- 5. Ashbee H.R., Leck A.K., Puntis J.W., Parsons W.J., Evans E.G.: choliny do fosfatydyloetanolaminy w błonie komór- Skin colonization by Malassezia in neonates and infants. Infect. kowej [27], Control Hosp. Epidemiol. 23, 212–216 (2002) • zwiększenie ekspresji genu dla 14-α-demetylazy lano- 6. Back O., Scheynius A., Johansson S.G.: Ketoconazole in atopic dermatitis: therapeutic response is correlated with decrease in sterolu [29]. serum IgE. Arch. Dermatol. Res. 287, 448–451 (1995) Oporność grzybów z rodzaju Malassezia oraz innych 7. Baker B.S., Bokth S., Powles A., Garioch J.J., Lewis H., drożdży i dermatofitów na cyklopiroks występuje nie- Valdimarsson H., Fry L.: Group A streptococcal antigen – spe- zmiernie rzadko pomimo częstego stosowania cyklo- cific T lymphocytes in guttae psoriatics lesion. Br. J. Dermatol. piroksolaminy w leczeniu grzybic powierzchniowych. 128, 493–499 (1993) CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW Z RODZAJU MALASSEZIA. II. ASPEKTY KLINICZNE 313

8. Baroni A., Orlando M., Donnarumma G. i wsp.: Toll-like 27. Francois I.E.G.A., Aerts A.M., Commue B.P.A., Thevissen K.: receptor 2 (TLR2) mediates intracellular signaling in human Currently used antimycotics: spectrum, mode of action and keratinocytes in response to Malassezia furfur. Arch. Dermatol. resistance occurrence. Current Drug Targets, 6, 895–907 (2005) Res. 297, 280 (2006) 28. Gabrielsson S., Buentke E., Liedén A., Schmidt M., D’Amato 9. Baroni A., Paoletti I., Ruocco E., Agozzino M., Tufano M.A., M., Tengvall-Linder M., Scheynius A.: Malassezia sympodialis Donnarumma G.: Possible role of Malassezia furfur in psoria- stimulation differently affects gene expression in dendritic cells sis: modulation of TGF-beta1, integrin, and HSP70 expression from atopic dermatitis patients and healthy individuals. Acta. in human keratinocytes and in the skin of psoriasis-affected Dermatol. Venerol. 84, 339–345 (2004) patients. J. Cutan. Pathol. 31, 35–42 (2004) 29. Ghannoum M.A., Rice L.B.: Antifungal agents: mode of action, 10. Bergbrant I.M., Broberg A.: Pityrosporum ovale culture from mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms the forehead of healthy children. Acta Dermatol. Venereol. 74, with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12, 501–517 260–261 (1994) (1999) 11. Bergbrant I.M., Faergemann J.: Seborrhoeic dermatitis and 30. Gueho E., Simmons R.B., Pruitt W.R., Meyer S.A., Ahearn D.G.: Pityrosporum ovale: a cultural and immunological study. Acta Association of Malassezia pachydermatis with systemic infec- Dermatol. Venereol. 69, 332–335 (1989) tions of humans. J. Clin. Microbiol. 25, 1789–1790 (1987) 12. Bernier V., Weill F.X., Hirigoyen V., Elleau C., Feyler A., 31. Gupta A.K., Batra R., Bluhm R., Boekhout T., Dawson T.L. Jr: Labrèze C., Sarlangue J., Chène G., Couprie B., Taïeb A.: Skin Skin diseases associated with Malassezia species. J. Am. Acad. colonization by Malassezia species in neonates: a prospective Dermatol. 51, 785–798 (2004) study and relationship with neonatal cephalic pustulosis. Arch. 32. Gupta A.K., Kohli Y., Faergemann J.: Epidemiology of Malas­ Dermatol. 138, 215–228 (2002) sezia yeasts associated with pityriasis versicolor in Ontario, 13. Boekhout T., Guého-Kellermann E., Mayser P., Velegraki A. Canada. Med. Mycol. 39, 199–206 (2001) (red.). Malassezia and the Skin: Science and Clinical Practice, 33. Gupta A.K., Kohli Y., Summerbell R.C., Faergemann J.: Quan- Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2010, s. 1–319. titative culture of Malassezia species from different body sites 14. Borelli D., Jacobs P.H., Nall L.: Tinea versicolor: epidemiologic, of individuals with or without dermatoses. Med. Mycol. 39, clinical, and therapeutic aspects. J. Am. Acad. Dermatol. 25, 243–251 (2001) 300–305 (1991) 34. Hitchcock C., Whittle P.T.: Chemistry and mode of action of 15. Braun-Falco O., Plewig G., Wolff H., Burgdorf W.: Erythemato- fluconazole. [w:] Rippon J.W., Fromtling R.A. (red.) Cutaneous papulo-squamous diseases. [w:] Dermatology. Springer Verlag, antifungal agents: selected compounds in clinical practice and Berlin, 2000, s. 585–608. development. Marcel Dekker, Inc., New York, 1993, s. 183–197. 16. Buentke E., Heffler L.C., Wilson J.L., Wallin R.P., Löfman C., 35. Holt R.J.: The imidazoles. [w:] Speller DCE (red), Antifungal Chambers B.J., Ljunggren H.G., Scheynius A.: Natural killer chemotherapy. John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England, and dendritic cell contact in lesional atopic dermatitis skin 1980, s. 107–148. – Malassezia-influenced cell interaction. J. Invest. Dermatol. 36. http://www.drugs.com/monograph/ciclopirox-olamine.html 119, 850–857 (2002) 37. Jabłońska S., Majewski S.: Choroby skóry i choroby przeno- 17. Burke R.C.: Tinea versicolor: susceptibility factors and experi- szone drogą płciową. Wyd. Lekarskie PZWL, Warszawa, 2005, mental infection in human beings. J. Invest. Dermatol. 36, s. 1–528. 389–402 (1961) 38. Katsarou A., Armenaka M.C.: Atopic dermatitis in older 18. Canuto M.M., Rodero F.G.: Antifungal drug resistance to azoles patients: particular points. JEADV, 25, 12–18 (2011) and polyenes. Lancet Infect. Dis. 2, 550–563 (2002) 39. Krämer, H.J., Podobinska M., Bartsch A., Battmann A., 19. Clemmensen O., Hjorth N.: Treatment of dermatitis of the head Thoma W., Bernd A., Kummer W., Irlinger B., Steglich W., and neck with ketoconazole in patients with type I sensitivity Mayser P.: Malassezin, a novel agonist of the aryl hydrocarbon to Pityrosporum orbiculare. Sem. Dermatol. 2, 26–29 (1983) receptor from the yeast Malassezia furfur, induces apoptosis in 20. Crespo E.V., Ojeda M.A., Vera C.A., Crespo E.A., Sanchez F.F.: primary human melanocytes. Chembiochem. 6, 860–865 (2005) Malassezia globosa as the causative agent of pityriasis versicolor. 40. Larocco M., Dorenbaum A., Robinson A., Pickering L.K.: Br. J. Dermatol. 143, 799–803 (2000) Recovery of Malassezia pachydermatis from eight infants in 21. Faergemann J., Bernander S.: Tinea versicolor and Pityrospo- a neonatal intensive care nursery: clinical and laboratory fea- rum orbiculare: a mycological investigation. Sabouraudia, 17, tures. Pediatr. Infect. Dis. J. 7, 398–401 (1988) 171–179 (1979) 41. Lindgren L., Wahlgren C.F., Johansson S.G., Wiklund I., Nor- 22. Faergemann J.: Atopic dermatitis and fungi. Clin. Microbiol. dvall S.L.: Occurrence and clinical features of sensitization to Rev. 15, 545–563 (2002) Pityrosporum orbiculare and other allergens in children with 23. Farr P.M., Krause L.B., Marks J.M., Shuster S.: Response of scalp atopic dermatitis. Acta Derm. Venereol. 75, 300–304 (1995) psoriasis to oral ketoconazole. Lancet, 2, 921 (1985) 42. Lober C.W., Belew P.W., Rosenberg E.W., Bale G.: Patch test 24. Farthing C.F., Staughton R.C., Rowland Payne C.M.: Skin with killed sonicated microflora in patients with psoriasis.Arch. disease in homosexual patients with acquired immune defi- Dermatol. 118, 322 (1982) ciency syndrome (AIDS) and lesser forms of human T cell 43. Mayser P., Schutz M., Schuppe H.C., Jung A., Schill W.B.: Fre- leukaemia virus (HTLV III) disease. Clin. Exp. Dermatol. 10, quency and spectrum of Malassezia yeasts in the area of pre- 3–12 (1985) puce and glans penis. BJU Int. 88, 554–558 (2001) 25. Fearfield L.A., Rowe A., Francis N., Bunker C.B., Staughton R.C.: 44. McGinley K.J., Leyden J.J., Marples R.R., Kligman A.M.: Quan- Itchy folliculitis and human immunodeficiency virus infection: titative microbiology of the scalp in non-dandruff, dandruff, clinicopathological and immunological features, pathogenesis and seborrheic dermatitis. J. Invest. Dermatol. 64, 401–405 and treatment. Br. J. Dermatol. 141, 3–11 (1999) (1975) 26. Ferrándiz C., Ribera M., Barranco J.C., Clotet B., Lorenzo J.C.: 45. Nakabayashi A., Sei Y., Guillot J.: Identification of Malassezia Eosinophilic pustular folliculitis in patients with acquired species isolated from patients with seborrhoeic dermatitis, immunodeficiency syndrome. Int. J. Dermatol. 31, 193–195 atopic dermatitis, pityriasis versicolor and normal subjects. (1992) Med. Mycol. 38, 337–341 (2000) 314 ELŻBIETA RUP, TOMASZ JAGIELSKI, ANNA MACURA, JACEK BIELECKI

46. Pierard G.E., Arrese J.E., Pierard-Franchimont C., Doncker P. : 56. Tengvall Linder M., Johansson C., Bengtsson A., Holm L., Prolonged effects of antidandruff shampoos – time to recur- Härfast B., Scheynius A.: Pityrosporum orbiculare-reactive rence of Malassezia ovalis colonization of skin. Int. J. Cosmet. T-cell lines in atopic dermatitis patients and healthy individu- Sci. 19, 111–117 (1997) als. Scand. J. Immunol. 47, 152–158 (1998) 47. Prohic A.: Identification of Malassezia species from scalp skin 57. Tengvall Linder M., Johansson C., Zargari A., Bengtsson A., of patients with psoriasis and healthy subjects. Acta Dermatol- van der Ploeg I., Jones I., Harfäst B., Scheynius A.: Detection of venerol. Croat. 11, 10–16 (2003) Pityrosporum orbiculare reactive T cells from skin and blood in 48. Robson D. Malassezia: Mechanisms of possible drug resistance. atopic dermatitis and characterization of their cytokine profiles. Australia College of Veterinary Scientists Dermatology Chap- Clin. Exp. Allergy, 26, 1286–1297 (1996) ter Science Week Proceedings, Gold Coast, 6–7th July 2007, 58. Terui T., Kudo K., Tagami H.: Cutaneous immune and inflam- s. 63–67 (http://dermatology.acvsc.org.au). matory reactions to Malassezia furfur. Nippon Ishinkin Gakkai, 49. Rokugo M., Tagami H., Usuba Y., Tomita Y.: Contact sensitivity 40, 63–71 (1999) to Pityrosporum ovale in patients with atopic dermatitis. Arch. 59. Uchida Y., Onodera S., Nakade T., Otomo K.: Sterol compo­ Dermatol. 126, 627–632 (1990) sition in polyene antibiotic – sensitive and resistant strains of 50. Rosenberg E.W., Belew P.W., Bale G.: Effect of topical applica- Malassezia pachydermatis. Vet. Res. Commun. 18, 183–187 tions of heavy suspensions of killed Malassezia ovalis on rabbit (1994) skin. Mycopathologia, 72, 147 (1980) 60. Van de Kerkhof P.C., Franssen M.E.: Psoriasis of the scalp: 51. Savolainen J., Lintu P., Kosonen J., Kortekangas-Savolainen O., diagnosis and management. Am. J. Clin. Dermatol. 2, 159–165 Viander M., Pène J., Kalimo K., Terho E.O., Bousquet J.: Pity- (2001) rosporum and Candida specific and non-specific humoral, cel- 61. Wanat-Krzak M., Kurzawa R.: Atopowe zapalenie skóry – etio­ lular and cytokine responses in atopic dermatitis patients. Clin. patogeneza, diagnostyka i leczenie. Alergologia i pulmonologia Exp. Allergy, 31, 125–134 (2001) wieku dziecięcego. Klin. Pediatr. 10, 237–244 (2002) 52. Schallreuter K.U., Wood J.W.: A possible mechanism of action 62. Welbel S.F., McNeil M.M., Pramanik A., Silberman R., for azelaic acid in the human epidermis. Arch. Dermatol. Res., Oberle A.D., Midgley G., Crow S., Jarvis W.R.: Nosocomial 282, 168–171 (1990) Malassezia pachydermatis bloodstream infections in a neonatal 53. Stein D.H.: Superficial fungal infections. Pediatr. Clin. North intensive care unit. Pediatr. Infect. Dis. J. 13, 104–108 (1994) Am. 30, 545–561 (1983) 63. Wollenberg A., Bieber T.: Atopic dermatitis: from the genes to 54. Subissi A., Monti D., Togni G., Mailland F.: Ciclopirox: recent skin lesions. Allergy, 55, 205–213 (2000) nonclinical and clinical data relevant to its use as a topical anti- 64. Young E., Koers W.J., Berrens L.: Intracutaneous tests with pity- mycotic agent. Drugs, 70, 2133–2152 (2010) rosporon extract in atopic dermatitis. Acta Derm. Venereol. 144, 55. Sugita T., Suto H., Unno T., Tsuboi R., Ogawa H., Shinoda T., 122–124 (1989) Nishikawa A. Molecular analysis of Malassezia microflora on 65. Zargari A., Midgley G., Bäck O., Johansson S.G., Scheynius A.: the skin of atopic dermatitis patients and healthy subjects. IgE-reactivity to seven Malassezia species. Allergy, 58, 306–311 J. Clin. Microbiol. 39, 3486–90 (2001) (2003) POST. MIKROBIOL., CHARAKTERYSTYKA GENOTOKSYN CDT 2013, 52, 3, 315–324 http://www.pm.microbiology.pl (CYTOLETHAL DISTENDING TOXIN)

Patrycja Kobierecka1, Agnieszka Wyszyńska1, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka1*

1 Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego, Zakład Genetyki Bakterii, ul. Miecznikowa 1, 02-096, Warszawa

Wpłynęło w grudniu 2012 r.

Spis treści: 1. Wstęp. 2. Ogólna charakterystyka CDT – operon cdt. 3. Rola podjednostek toksyny. 4. Mechanizm składania dojrzałej toksyny, struktura CDT. 5. Losy CDT w komórkach docelowych. 6. Mechanizm intoksykacji komórki przez toksyny CDT. 7. Nietypowa toksyna CDT wytwarzana przez Salmonella enterica sv. Typhimurium. 8. Podsumowanie Characterization of CDT (cytolethal distending toxin) genotoxins Abstract: The cytolethal distending toxins (CDTs) comprise a family of intracellulary acting bacterial protein genotoxins, produced by a variety of Gram-negative pathogenic bacteria, which cause DNA damage in the target cells. The DNA damage-response in the initiated cell results in the characteristic and irreversible cell cycle arrest and apoptosis in a broad range of mammalian cell cultures.

Most of CDTs are AB2 toxins composed of three different subunits: CdtA and CdtC, both exhibiting a lectin-type fold, and CdtB, which is the active component of the complex, with DNase I and phosphatase activity. Although it is generally accepted that CdtA and CdtC, required for full activity of the CdtB, mediate its delivery into host cells, their precise role in the process remains poorly understood. Also the mechanism of toxin secretion and the mechanisms of cell surface binding, uptake and trafficking require further investigation. Some bacteria utilize OMVs to secrete CDTs. After internalization by dynamin-dependent endocytosis which requires the intact lipid rafts, toxin is retrograde transported through Golgi complex and the endoplasmic reticulum into the cell nuclear compartment, where CdtB exerts its toxic activity. CDTs are virulence determinants playing an important role in the pathogenesis of several bacterial diseases associated, for example, with human infections by Campylobacter jejuni, Escherichia coli and Aggregatibacter actinomycetemcomitans. This review encompasses recent work on CDTs and focuses on the CDTs structure as well as on the molecular mechanisms of toxin uptake and cell’s intoxication. We also discuss some controversial issues and indicate questions which still remain unanswered. Contents: 1. Introduction. 2. General characterization of CDT – cdt operon. 3. Role of CDT toxin subunits. 4. Mechanisms of mature toxin assembly, CDT tertiary structure. 5. CDT uptake into host cells. 6. Mechanism of CDT cellular intoxication. 7. Untypical CDT toxin producting by Salmonella enterica sv. Typhimurium. 8. Summary

Słowa kluczowe: genotoksyna, CDT, aktywność DNazy, aktywność fosfatazy, apoptoza Key words: genotoxin, CDT, DNase activity, phosphatase activity, apoptosis

1. Wstęp toksyny A wydzielanej przez Pseudomonas aeruginosa. Niektóre toksyny posiadają kilka wymiennie stosowa- Patogenne mikroorganizmy podczas koewolucji nych nazw i tak np. toksyna E. coli podobna do toksyny z orga­nizmem gospodarza wykształciły różnorodne czerwonki zwana jest też werotoksyną, od nazwy linii strategie inwazji i przeżycia. Jednym z tych mechaniz­ małpich komórek (Vero) wrażliwych na jej działanie. mów jest wydzielanie związków, głównie białek zwanych Egzotoksyny wydzielane są przez błonę zewnętrzną egzotoksynami, które modyfikują funkcje komórkowe. bakterii gramujemnych za pomocą różnych systemów Najczęściej ich aktywność jest letalna dla komórek sekrecji (I, II, V, OMVs – outer membrane vesicles) [13, gospodarza. Egzotoksyny wytwarzane są zarówno przez 33]. Do grupy toksyn zaliczane są także przez niektórych bakterie Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne, zarówno badaczy tzw. białka efektorowe przekazywane z cyto- przez bakterie tlenowe jak i beztlenowe. Różnią się one zolu bakterii do docelowej komórki za pomocą systemu mechanizmami działania oraz docelowymi komórkami sekrecji typu III (TTSS – type three secretion system) lub wobec których ujawniają swoją aktywność, a ich nomen- IV (TFSS – type four secretion system). Białka te mody- klatura nie jest jednoznacznie usystematyzowana. Nazwy fikują procesy fizjologiczne komórek eukariotycznych, mogą pochodzić od rodzaju atakowanych ko­mórek tak by stworzyć dogodne dla mikroorganizmu warunki (neurotoksyny, leukotoksyny), od szczepów, przez które do życia i replikacji [12, 70]. są produkowane (Shigella sp. – toksyna Shiga), wywoły- Przyjmując za kryterium podziału egzotoksyn wanych chorób (Clostridium tetani – toksyna tężca) czy mechanizm ich działania można wyróżnić trzy główne też posiadanej aktywności (Bordetella pertussis – cyklaza ich typy: a) toksyny internalizowane przez komórki adenylowa). Zdarza się, że nadawane jest im mało gospodarza i wpływające na ich strukturę/metabolizm, informacyjne oznaczenie literowe, tak jak w przypadku b) toksyny oddziałujące z receptorami na powierzchni

* Autor korespondencyjny: Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, UW; ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; e-mail: kjkryn@ biol.uw.edu.pl 316 PATRYCJA KOBIERECKA, AGNIESZKA WYSZYŃSKA, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA komórek ssaczych i wywołujące wielopoziomową odpo- m.in. CHO (chinese hamster ovary), HeLa (human cervi- wiedź tzw. superantygeny oraz c) toksyny uszkadzające cal adenocarcinoma epithelial cells) [15] i Hep-2 (human błonę cytoplazmatyczną, poprzez tworzenie w niej epithelial type 2) [51]. Na jej działanie nie są natomiast porów lub aktywność enzymatyczną [65]. wrażliwe fibroblasty 3T3 (mouse embroynic fibroblasts Przedstawiony niżej artykuł przeglądowy ma na celu cell line) [8], jak również komórki linii Caco-2 (human zapoznanie czytelnika z danymi eksperymentalnymi colonic carcinoma cell line) [15] i ludzkie limfocyty [62]. opisującymi strukturę oraz mechanizm działania tok- Locus CDT składa się z trzech zlokalizowanych syny CDT (cytolethal distending toxin). Jest to pierw- przeważnie na chromosomie, wspólnie, konstytutyw- sza opisana genotoksyna, która wywołuje uszkodzenie nie transkrybowanych otwartych ramek odczytu (ORF): materiału genetycznego wrażliwych komórek eukario- cdtA, cdtB i cdtC [40, 51, 68]. Unikalny locus cdt, składa- tycznych, co skutkuje zatrzymaniem ich cyklu komórko- jący sie z pięciu ORFs: orf1, orf2, cdtA, cdtB, cdtC, wystę- wego i w efekcie śmierć komórek. Z tego powodu zwana puje w genomie A. actinomycetemcomitans. Dwie krót- jest także cyklomoduliną. Toksyna CDT jest produko- kie otwarte ramki odczytu (orf1 i orf2) zlokalizowane są wana przez wiele gatunków Gram-ujemnych bakterii powyżej genu cdtA i prawdopodobnie transkrybowane patogennych dla ludzi i/lub zwierząt, kolonizujących razem z trzema genami cdt. Nie wiadomo jednak czy różne nisze ekologiczne, należących do klas Gamma- mRNA orf1 i orf2 ulegają translacji in vivo, a delecja tego i Epsilonproteobacteria. Aktualnie w bazach danych fragmentu DNA nie wpływa na aktywność toksyny [61]. znajduje się ponad 500 sekwencji aminokwasowych Patogenne szczepy E. coli nietypowo wytwarzają pięć białek adnotowanych jako sekwencje aminokwasowe typów toksyn CDT (oznaczane EcCDT I–V zgodnie z odpowiednich podjednostek toksyn CDT [21]. Najdo- chronologią ich opisania), z których jedynie EcCDT- kładniej pod względem biochemicznym, strukturalnym -III kodowana jest przez geny zlokalizowane na plazmi- oraz fizjologicznym przebadane zostały toksyny CDT dzie Vir [1, 52, 68, 69]. Chromosomowe geny kodujące produkowane przez: Escherichia coli (EcCDT), Haemo- pozostałe typy toksyn E. coli otoczone są przez nukle- philus ducreyi (HdCDT), Shigella dysenteriae (SdCDT), otydowe sekwencje lambdoidalnych fagów wskazujące Salmonella enterica sv. Typhi (SeCDT), Helicobacter na ich przeniesienie na drodze transdukcji, co suge- hepaticus (HhCDT), Aggregatibacter (dawniej Actino- ruje, że operon cdt został nabyty na drodze horyzon- bacillus) actinomycetemcomitans (AaCDT) i Campylo- talnego transferu genów i stanowi wyspę patogen­ności bacter spp (CjCDT) [3, 14, 23, 25, 40, 53, 64]. niedużych rozmiarów [37]. Z trzech genów, których Najczęściej zalecana nomenklatura toksyn CDT pro- produkty tworzą toksynę CDT, najwyższy poziom kon- dukowanych przez różne gatunki mikroorganizmów, serwacji wykazuje sekwencja nukleotydowa genu cdtB podana wyżej, zakłada poprzedzenie skrótu CDT dużą [71]. Poziom identyczności sekwencji aminokwasowych literą odpowiadającą pierwszej literze nazwy rodzajo- CdtB zależy od porównywanych gatunków bakterii. Tak wej i małą literą odpowiadającą pierwszej literze nazwy np. sekwencja aminokwasowa HdCdtB jest identyczna gatunkowej produkującego toksynę mikroorganizmu. w 95,8% z AaCdtB, podczas gdy z EcCdtB-I wykazuje Wraz z szybkim wzrostem liczby mikroorganizmów jedynie 51,1% identyczności [7, 62]. Niezależnie jednak o zsekwencjonowanych genomach ten system już nie- od stopnia identyczności sekwencji aminokwasowych długo może okazać się niejednoznaczny. Ostatnio zapro- podjednostek CdtB zachowują one elementy struktu- ponowano więc zastąpienie jednej litery nazwy gatunko- ralne warunkujące podobny mechanizm ich działania. wej jej trzema pierwszymi literami. I tak zamiast CjCDT CDT należy do grupy toksyn AB, które wnikając niektórzy autorzy proponują stosowanie oznaczenia do wnętrza komórek gospodarza modulują w różno- CjejCDT [30]. rodny sposób ich strukturę i/lub metabolizm. General- nie toksyny AB składają się z podjednostki A (activity) posiadającej aktywność enzymatyczną i z podjed- 2. Ogólna charakterystyka CDT – operon cdt nostki/ek B (binding), które poprzez wiązanie się do swoistych receptorów na powierzchni komórki doce- Toksyna CDT została po raz pierwszy opisana lowej pośredniczy/ą w transporcie podjednostki A do w 1987 roku, kiedy to J o h n s o n i L i o r wykazali, miejsca działania. Wyróżnianych jest kilka podklas tok- że supernatant znad hodowli komórek E. coli powoduje syn AB w zależności od budowy i mechanizmu skła- charakterystyczne postępujące, powolne pęcznienie dania dojrzałej toksyny. Toksyna A P. aeruginosa lub komórek eukariotycznych (2–5 dni) prowadząc osta- toksyna dyfterytu składają się z jednej podjednostki A tecznie do ich śmierci [7, 32]. W 1988 roku udokumen- i jednej podjednostki B syntetyzowanych jako poje- towano, że niektóre kliniczne izolaty C. jejuni powodują dynczy łańcuch białkowy, który przechodzi następnie podobne zmiany [7, 31]. Wrażliwa na działanie tem- potranslacyjne modyfikacje. Toksyna cholery oraz tok- peratury i trypsyny toksyna wykazuje cytotoksyczność syna LT enterotoksycznych szczepów E. coli to przykłady w stosunku do komórek większości linii komórkowych, toksyn podklasy AB5. Toksyna wąglika należy do trzeciej CHARAKTERYSTYKA GENOTOKSYN CDT (CYTOLETHAL DISTENDING TOXIN) 317 podklasy, ponieważ jej podjednostki transportowane funkcję nukleolityczną potwierdzono doświadczalnie. są niezależnie na zewnątrz komórki bakteryjnej i skła- Stwierdzono, że preparat zawierające EcCDT, AaCDT dane do dojrzałej holotoksyny dopiero na powierzchni bądź HdCDT w warunkach in vitro, wykazuje aktyw- komórki eukariotycznej. CDT należy do nowej pod- ność DNazy wobec plazmidowego DNA [5, 14, 15, 48]. klasy toksyn AB – podtyp AB2. Spośród trzech budu- Także wprowadzenie oczyszczonej podjednostki CdtB jących ją podjednostek: CdtA, CdtB i CdtC aktywność na drodze elektroporacji lub bezpośredniej iniekcji do enzymatyczną posiada CdtB, natomiast CdtA i CdtC komórek eukariotycznych stymuluje zmiany w chro- odpowiadają raczej za rozpoznanie docelowej komórki matynie transfekowanych komórek [18, 36]. Zmiana i pośredniczą w transporcie podjednostki B do jej wnę- aminokwasów uwikłanych w proces katalityczny bądź trza, choć ich dokładna rola w procesie intoksykacji wiązanie Mg2+ wykazała, że zmutowane białka nie posia- komórek docelowych nie jest do końca wyjaśniona. dają aktywności nukleazy w warunkach in vitro i nie Masy cząsteczkowe poszczególnych podjednostek w wywołują w komórkach typowych dla działania opisy- zależności od gatunku wytwarzającego je mikroorgani- wanej toksyny zmian [15, 24, 26, 35]. zmu wynoszą odpowiednio: 23–30, 28–29, i 19–21 kDa CdtB, w zależności od pochodzenia, może wykazy- dla CdtA, CdtB i CdtC [27; 58; 61]. Trzy podjednostki wać różny poziom aktywności nukleolitycznej. E l w e l l toksyny są syntetyzowane konstytutywnie, składane w i D r e y f u s za pomocą reakcji „nacinania plazmi- kompleks na terenie peryplazmy po usunięciu sekwencji dowego DNA”, umożliwiającej ilościowe oszacowanie sygnalnych i translokowane na zewnątrz komórki bak- superzwiniętej (supercoiled) formy DNA, udokumen- teryjnej. Przypisanie funkcji określonej podjednostce towali, że EcCdtII-B posiada tylko 0,01% aktywności możliwe było dopiero po sklonowaniu kodujących je ludzkiej lub bydlęcej DNazy I [14]. Jednocześnie wyka- genów w komórkach E. coli i oczyszczeniu rekombino- zano, że zagęszczony supernatant znad komórek E. coli wanych białek. Wcześniej uzyskiwano niespójne wyniki zawierających HdCdtB wykazuje aktywność na poziomie badań, co prawdopodobnie było wynikiem zanieczysz- podobnym do trzustkowej DNazy I [20]. Niska nukle- czenia preparatu badanej podjednostki pozostałymi azowa aktywność CdtB obserwowana in vitro może składnikami kompleksu. Ostatnio uzyskane dane ekspe- sugerować, że białko to wymaga do osiągnięcia pełnej rymentalne sugerują, że obecność trzech podjednostek aktywności obecności komórkowego kofaktora lub spe- jest konieczna dla zachowania pełnej aktywności przez cyficznej struktury chromatyny. Jednakże wiadomo, że toksynę CDT wydzielaną przez H. ducrei, Aggregatibac- jedno dwuniciowe pęknięcie nici DNA jest wystarczające ter actinomycetemcomitans oraz Camylobacter jejuni do zatrzymania cyklu komórkowego. Możliwe jest zatem, [5, 36, 46, 47, 54, 55, 58, 71], choć kontrowersje nadal że nawet niska aktywność nukleazy in vivo jest wystar- dotyczą roli podjednostki CdtA. Jej obecność w kom- czająca do wywołania efektu cytotoksycznego [37]. pleksie nie wydaje się być absolutnie wymagana, choć Kontrowersyjne wnioski z przeprowadzonych ekspe- podwyższa poziom indukowanych zmian w komórkach rymentów wysnuli S h e n k e r i wsp, którzy sugerują, eukariotycznych [4, 5, 38]. Nietypową strukturę posiada że zmiany wywoływane przez CDT związane są raczej toksyna CDT produkowana przez komórki Salmonella z aktywnością fosfatazową białka [60]. Wykazali oni, że enterica sv. Typhi, co opisano w dalszej części tej pracy podjednostka AaCdtB oprócz aktywności nukleolitycz- przeglądowej. nej przeprowadza hydrolizę 3,4,5-trifosforanu fosfaty- dyloinozytolu (PI-3-4-5-P3; PIP3) do 3,4-difosforanu fosfatydyloinozytolu (PI-3,4-P2). Porównanie sekwencji 3. Funkcje podjednostek toksyny aminokwasowych AaCdtB, i 5-fosfatazy inozytolopoli- fosfatydylowej pozwoliło wskazać konserwowane regiony Podjednostka CdtB wykazuje strukturalne podobień- odpowiedzialne za aktywność fosfatazową białka. W stwo do nukleaz eukariotycznych. Charakterystyczne dla celu dokładniejszego zbadania powiązań pomiędzy ssaczej DNazy I reszty aminokwasowe zaangażowane strukturą i funkcją białka stworzono kilka punktowych w hydrolizę wiązań fosfodiestrowych (His134 i His252), mutantów CdtB, w których zmieniono aminokwasy peł- reszty aminokwasowe biorące udział w tworzeniu wią- niące funkcje katalityczne (CdtB H160Q, CdtB H274Q, zań wodorowych (Glu78 i Asp212), jak również wysoko CdtB D199S, CdtB R117A). We wszystkich przypad- konserwowane reszty aminokwasowe oddziałujące kach zaobserwowano zredukowaną aktywność fosfatazy z DNA (Arg111, Asn170, Arg41) mają swoje odpowied- w porównaniu do aktywności CdtB dzikiego typu. Zmu- niki w sekwencji aminokwasowej CdtB. Podjednostka towane białka wykazywały również obniżoną aktywność CdtB zawiera także odnajdywany we wszystkich DNa- DNazy I, choć w przypadku CdtB H274Q aktywność zach pentapeptydowy motyw (Ser-Asp-His-Tyr-Pro), nukleazowa nie uległa zmianie. Według autorów głów- w którym dwie reszty aminokwasowe (Asp251 i His252) nym celem działania CdtB jest PI-3,4,5-P3. Badania są kluczowe w przebiegu procesu enzymatycznego S h e n k e r a i wsp. nie wykluczają jednak możliwości, [15, 51]. Przewidywaną na podstawie analizy in silico że CdtB pełni podwójną funkcję. Aktywność DNazy 318 PATRYCJA KOBIERECKA, AGNIESZKA WYSZYŃSKA, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA warunkuje toksyczność CdtB w niektórych typach Z badań E s h r a g h i i wsp. wynika, że również wią- komórek, podczas gdy aktywność fosfatazy istotna jest zanie AaCDT, HdCDT oraz EcCDT-III, ale nie CjCDT dla oddziaływania z innymi rodzajami komórek [60]. zależy od obecności cholesterolu w błonie komórek Podobne doświadczenie wykonali R a b i n i wsp. rów- docelowych [16]. Ostatnio zidentyfikowano dwa geny nież udowadniając, że CdtB posiada dwie aktywności, (SGMS1i TMEM181), których unieczynnienie sprawia, DNazy i fosfatazy PIP3, oraz, że aktywności te można że komórki eukariotyczne stają się oporne na działa- od siebie odróżnić stosując mutacje specyficzne co do nie EcCDT. Mutacje w genie SGMS1 obniżają poziom miejsca [53]. AaCdtB, do której sekwencji aminokwaso- sfingomieliny, kluczowego składnika mikrodomen bło- wej wprowadzono specyficzne wobec miejsca mutacje nowych, przez co prawdopodobnie obniżają poziom hamujące aktywność fosfatazową a nie wpływające na oddziaływania toksyny z powierzchnią komórek euka- aktywność nukleolityczną, indukuje zatrzymanie cyklu riotycznych. Zlokalizowany na powierzchni komórek komórkowego i proces apoptozy proliferujących mono- produkt drugiego genu, TMEM181, może także pełnić cytów U937 [53]. Mechanizm działania AaCDT anali- funkcję receptora. Nie można jednak wykluczyć, że zowano również z wykorzystaniem komórek Saccharo- białko to uwikłane jest jedynie w transport kompleksu myces cerevisiae, które nie syntetyzują 3,4,5-trifosforanu toksyna-receptor przez błonę komórkową [6]. Pozna- fosfatydyloinozytolu. W tych eksperymentach aktyw- nie receptora toksyny wymaga dalszych badań. Ostat- ność nukleolityczna była wystarczająca do wywołania nio opublikowane dane eksperymentów, w których przez białko CdtB efektu cytotoksycznego [41]. Obser- z wykorzystaniem fluorescencji analizowano lokaliza- wowane różnice w aktywnościach enzymatycznych róż- cję poszczególnych podjednostek AaCDT w komórkach nych zmutowanych form CdtB mogą wynikać między linii CHO-K1. CdtA odnajdywana była na powierzchni innymi z odmiennej wrażliwości stosowanych w bada- komórek docelowych niezależnie od obecności w ich niach komórek eukariotycznych. błonach cholesterolu, podczas gdy CdtC była obecna Główną funkcją podjednostek B toksyn AB jest w cytozolu komórek docelowych. Pozwoliło to autorom rozpoznanie odpowiednich receptorów i zapewnie- na postawienie hipotezy, że podjednostka CdtC pełni nie transportu podjednostki A do cytozolu komórki rolę białka opiekuńczego dla CdtB i jego rola w procesie docelowej. Różnorodność uzyskanych wyników eks- rozpoznania receptorów jest tylko pomocnicza [11]. perymentów, których celem było ustalenie receptora dla CDT sugeruje, że toksyny CDT, w zależności od pochodzenia, mogą wykazywać różną specyficz- 4. Mechanizm składania dojrzałej toksyny, ność receptorową. Udokumentowano, że EcCdtA-II, struktura CDT podobnie jak podjednostka C, wiąże na docelowych komórkach N-glikoproteiny zawierające fukozę [43], Składanie dojrzałej toksyny, będącej heterotrime- a toksyna AaCDT wiąże się z powierzchniowymi gli- rowym białkiem, ma miejsce na terenie peryplazmy. kosfingolipidami (GM1, GM2, GM3 i Gb4 w przy- Sekwencje sygnałowe podjednostek są odcinane przez padku CdtA; GM1 i GM2 w przypadku CdtC) [44]. specyficzne proteazy podczas transportu przez błonę Prezentowane wyżej dane zgodne są ze strukturalnymi wewnętrzną komórki. Podjednostki CdtB i CdtC zaopa- analizami CtdA i CtdC. Występowanie w podjednost- trzone są w klasyczne sekwencje sygnałowe, podczas gdy kach CdtA i CdtC domen lektynowych, podobnych do CdtA ma charakterystyczną dla lipoprotein sekwencję siebie nawzajem i do domeny roślinnej toksyny rycy- sygnalną rozpoznawaną przez sygnalną peptydazę II nowej, sugeruje ich powinowactwo do węglowodano- [27]. CdtA unikalne procesowanie podczas składa- wych receptorów [29, 46]. Odmienne dane zaprezento- nia całego kompleksu i prawdopodobnie jest odpo- wali E s h r a g h i i wsp. Udokumentowali, że komórki wiedzialna za transport dojrzałej toksyny przez błonę linii CHO niezdolne do produkcji N-glikoprotein zewnętrzną komórki bakteryjnej [58]. Plazmid pUCA- oraz glikosfingolipidów bądź niezdolne do biosyntezy acdtA zawierający gen cdtA warunkuje wytwarzanie fukozy są równie wrażliwe na działanie toksyn CDT dwóch immunopozytywnych białek o masie 25 kDa pochodzących z H. ducreyi, A. actinomycetemcomitans, i 18 kDa [58]. Tylko CdtA o masie cząsteczkowej 18 kDa E. coli i C. jejuni jak komórki CHO o niezmienionym wchodzi w skład dojrzałej toksyny. Podobne procesowa- fenotypie [16]. Dodatkowo dane przedstawione przez nie HdCdtA w E. coli zaobserwowali F r i s k i wsp. [20]. B o e s z e - B a t t a g l i a i wsp. sugerują, że AaCDT Rozwiązanie struktur HdCDT, AaCDT oraz EcCdtB- oddziałuje z mikrodomenami błonowymi bogatymi -II potwierdziło wcześniejsze dane otrzymane na drodze w cholesterol. MβCD (methyl beta-cyclodextrin), zwią- modelowania strukturalnego w oparciu o podobieństwo zek powodujący obniżenie poziomu cholesterolu, redu- tych białek do eukariotycznej DNazyI oraz pozwoliło kuje zdolność AaCDT i HdCDT do wiązania się odpo- na częściowe wyjaśnienie mechanizmu składania kom- wiednio z komórkami linii Jurkat i HeLa oraz chroni pleksu [28, 46, 72]. Wykazano m.in., że końce CdtA oraz te komórki przed toksyczną aktywnością CDT [3]. CdtC o strukturze nieglobularnej stabilizują ostateczny CHARAKTERYSTYKA GENOTOKSYN CDT (CYTOLETHAL DISTENDING TOXIN) 319 kompleks. N e s i c i S t e b b i n s skonstruowali trzy się za pomocą szlaku ERAD (ER associated degradation). mutanty wytwarzające toksynę z CdtA z jedną z delecji Jednak w przypadku HdCDT transport zachodzi nieza- na N-końcu (Δ18–56, Δ18–67 lub Δ18–75). Skutkiem leżnie od ERAD lub znacznie się różni od mechanizmu tych zmian nie było obniżenie aktywności enzymatycz- używanego przez inne znane toksyny [23]. Wielu zwo- nej, ale destabilizacja toksyny. Usunięcie większej liczby lenników ma teoria wskazująca na bezpośredni transport niż 75 aminokwasów z N-końca dawało podobny efekt. HdCdtB z ER do jądra komórkowego [37], tym bardziej, Tak więc ten fragment białka nie ma istotnego znacze- że metodami biochemicznymi nie udało się stwierdzić nia dla aktywności ostatecznego kompleksu. Natomiast występowania omawianej toksyny w cytozolu zainfe- C koniec CdtA oddziałuje z CdtC. W wyniku usunię- kowanych komórek eukariotycznych. Trzeba jednak cia 8 aminokwasów CdtA (Δ215–223) odnotowano zwrócić uwagę, że wyniki eksperymentów nie są jedno- brak zdolności do prawidłowego zwinięcia kompleksu. znaczne i zależą od użytej strategii doświadczalnej [11]. Dodatkowo analiza mutantów delecyjnych w genie cdtC Dotychczas dwie grupy badawcze wskazały na istnienie wykazała, że oddziaływanie CdtC z innymi podjed- w obrębie AaCdtB i EcCdtB-II specyficznych sekwencji nostkami jest bardzo istotne w montażu, stabilności aminokwasowych NLS warunkujących kierowanie białka i aktywności kompleksu. Delecja aminokwasów od do jądra komórkowego. NLS w białku AaCdtB znajduje 21 do 35 z N-końca CdtC nie wpływała na stabilność się na N-końcu i obejmuje aminokwasy 48–124. Delecja kompleksu, ale już brak 4 dodatkowych aminokwasów zaledwie 11 aminokwasów (Δ114–124 aa) wystarczy do (Δ21–39) prowadził do znaczącej destabilizacji holo- zaburzenia transportu AaCdtB do jądra komórki doce- toksyny i spadku jej aktywności. Aminokwasy pod- lowej/zniesienia cytotoksyczności CDT [49]. W białku jednostki CdtC w pozycji od 169 do 178 uwikłane są EcCdtB-II zidentyfikowano dwie sekwencje aminokwa- w proces oddziaływania zarówno z CdtB jak i z CdtA. sowe decydujące o jego lokalizacji jądrowej nazwane: Struktura czwartorzędowa kompleksu wykazuje, że NLS1 i NLS2. Interesujące jest to, że delecja każdej z tych CdtA i CdtC uczestniczą w formowaniu dwóch istot- sekwencji aminokwasowych powoduje odmienną lokali- nych powierzchniowych elementów dojrzałej toksyny: zację podjednostki toksyny [42]. Przeprowadzone bada- grupy wysoko konserwowanych aromatycznych reszt nia sugerują, że NLS2 może działać jako sygnał uniemoż- aminokwasowych i głębokiego rowka w miejscu styku liwiający „ucieczkę” CdtB do cytozolu, natomiast NLS1 tych podjednostek. Stosując mutagenezę specyficzną co odpowiadałaby za translokację z ER do jądra komórko- do miejsca, udokumentowano istotny udział tych ele- wego. Interesujący aspekt biologii toksyny CDT stanowi mentów strukturalnych w wiązaniu CDT do komórek kwestia obecności podjednostek A i C na którymkol- docelowych i ich rolę w aktywności enzymatycznej osta- wiek z etapów transportu. Model zaproponowany przez tecznego kompleksu [47]. D a m e k - P o p r a w a i wsp. zakłada, że podjednostka CdtC wzmacniająca wiązanie z tratwami lipidowymi poprzez odpowiedni motyw wiążący cholesterol (CRAC 5. Losy CDT w komórkach docelowych domena) jest także transportowana w formie dimeru z CdtB do wnętrza komórki i przechodzi drogę trans- Wyjaśnienie mechanizmu wnikania CDT do ko­- portu wtórnego. Zgodnie z tym modelem oddysocjowuje mórek eukariotycznych wymaga dalszych badań ponie- ona od dimeru w ER i podlega degradacji a uwolniona waż wyniki ostatnio wykonanych eksperymentów wska- podjednostka B jest dostarczana do jądra [11]. zują, że jest ona wydzielana do środowiska zewnętrznego za pomocą pęcherzyków błony zewnętrznej (OMVs – outer membrane vesicles), a nasza wiedza o uwalnianiu 6. Mechanizm intoksykacji komórki zawartości OMV do cytozolu komórek eukariotycznych przez toksyny CDT jest jak dotąd bardzo ograniczona [40]. Dane dotyczące procesu wnikania CDT do komórek eukariotycznych Uszkodzenia materiału genetycznego przez czynniki pochodzą głównie z eksperymentów wykonanych in endogenne lub egzogenne indukuje aktywność mecha- vitro z wykorzystaniem oczyszczonych białek. Po zwią- nizmów zwanych odpowiedzią na uszkodzenia DNA zaniu do odpowiednich receptorów, toksyna CDT jest (DDR – DNA damage response), których celem jest zmi- pobierana na drodze endocytozy zależnej od dynaminy nimalizowanie niekorzystnych efektów. Mechanizmy te [9]. Następnie jest transportowana poprzez aparat Gol- obejmują szlaki naprawy DNA i modulację aktywno- giego do retikulum endoplazmatycznego (ER) na drodze ści punktów kontrolnych cyklu komórkowego głównie tzw. wtórnego transportu. Uszkodzenie aparatu Golgiego przez dwa szlaki sygnalizacyjne: zależny od kinazy ATM przez traktowane komórek brefeldyną A lub zablokowa- (Ataxia telangiectasia mutated) i zależny od czynnika nie endocytozy hamuje ich intoksykację [9]. Translokacja ATR (ATM and Rad3 related). Aktywność odpowied- podjednostki enzymatycznej toksyn z grupy AB z reti- nich białek gwarantuje zachowanie prawidłowej repli- kulum endoplazmatycznego do cytozolu zwykle odbywa kacji DNA i rozdzielenia chromosomów. 320 PATRYCJA KOBIERECKA, AGNIESZKA WYSZYŃSKA, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

CdtB mająca aktywność DNazy I indukuje powsta- nia komórek UV, co sugeruje, że aktywacja kompleksu wanie dwuniciowych pęknięć w DNA (DSB – double związana jest z DSB [39]. W większości komórek (linie strand breaks), czego konsekwencją jest uruchomienia komórkowe CHO, Hep-2, HeLa) zainfekowanych CDT odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Komórki są nieod- obserwuje się także montaż włókien stresowych aktyny wracalnie zatrzymane w fazie G1 lub G2 i nie prze- [18; 74] odpowiedzialnych są za kształt komórki oraz chodzą mitozy [7]. Faza, w której zatrzyma się cykl zaangażowanych w jej mobilność. Przebudowa szkie- komórkowy zależy od typu komórek. I tak np. HdCDT letu aktynowego po dodaniu CDT wymaga aktywacji blokuje cykl podziałowy nabłonkowych linii komórko- GTPazy RhoA zależnej od defosforylacji regulującego wych (HeLa, Hep-2) i keratynocytów w fazie G2 [7, 74] jej aktywność czynnika Net1 [22]. Białko RhoA wpływa a ludzkie fibroblasty blokowane są w fazie G1 oraz G2 na formowanie ognisk adhezji, co promuje przyczepia- [10, 62]. Limfocyty T mające kontakt z lizatem Campy- nie się komórek do podłoża, reguluje ekspresję genów lobacter upsaliensis, blokowane są w fazie G2 i ostatecz- kodujących czynniki transkrypcji oraz stymuluje proces nie przechodzą apoptozę [45]. Mechanizm zatrzymania proliferacji komórek [50]. Opisane zmiany cytoszkieletu cyklu komórkowego indukowany w wyniku działania aktynowego zachodzące w odpowiedzi na stres geno- CDT jest podobny do tego indukowanego przez promie- toksyczny są prawdopodobnie niezbędne do przeżycia niowanie jonizujące [37]. W blokowanie cyklu komór- komórki [18, 22, 56, 73]. W przedstawionym wyżej kowego zaangażowana jest kinaza ATM, która ulega mechanizmie działania CDT zmiany indukowane autofosforylacji w odpowiedzi na powstanie DSB [7]. przez DSB skutkują zatrzymaniem cyklu komórko- L i i wsp. sugerują, że w ten proces zaangażowany jest wego i apoptozą komórek. Niektórzy autorzy sugerują także czynnik ATR [39]. Natomiast S h i l o h uważa, odwrotny mechanizm, w którym fragmentacja DNA jest że dwuniciowe pęknięcia w DNA prowadzą do akty- konsekwencją zatrzymania cyklu komórkowego i induk- wacji ATM, podczas gdy ATR jest aktywowany przez cji apoptozy oraz podkreślają rolę jednoniciowych pęk- uszkodzenia DNA pojawiające się w wyniku działa- nięć DNA w tym procesie. Obserwowane różnice mogą nia promieniowania jonizującego [63]. Autofosfory- być zależne od rodzaju komórek oraz dawki toksyny lacja ATM prowadzi do fosforylacji Chk2 (checkpoint użytych w eksperymentach [17, 19, 59]. S h e n k e r kinase 2), która przeprowadza fosforylację CDC25C i wsp. udokumentowali, jak wspomniano wyżej, że (fosfataza) w pozycji 216, co skutkuje utratą aktywno- AaCDT wykazuje aktywność fosfatazy 3,4,5-trifosforanu ści tego białka [7]. W niezaburzonym cyklu komórko- fosfatydyloinozytolu (PIP3). Autorzy uważają, że bloko- wym ufosforylowane w pozycji treoniny 14 i tyrozyny 15 wanie cyklu komórkowego przez toksynę głównie spo- białko Cdc2 (cell division cycle 2) jest nieaktywne. Roz- wodowane jest aktywnością fosfatazy, a tylko czasami poczęcie przez komórkę mitozy jest wynikiem aktywa- jej aktywnością DNazy [60], co zgodne jest to z wcześ­ cji cykliny B/Cdc2, która zachodzi wskutek działania niejszą sugestią S e r t a i wsp., że zablokowanie cyklu fosfatazy CDC25C. Konsekwencją utraty aktywności w punkcie kontrolnym G2/M nie zależy od powstawania przez CDC25C jest brak defosforylacji cykliny B/Cdc2, DSB [57]. Dane eksperymentalne przedstawione przez co prowadzi do zatrzymania cyklu w G2/M lub przej- Rabin i wsp., którzy stworzyli serię mutantów AaCdtB, ścia komórek w stan starzenia [2, 7, 10, 57]. ATM akty- zaprzeczają jednak tej hipotezie. Warianty CdtB H160G wuje także czynnik transkrypcyjny p53. P53, którego (zredukowana aktywność DNazy, a utrzymana aktyw- poziom reguluje onkoproteina MDM2 (mourine double ność fosfatazy PIP3) i CdtB D199G (obniżona aktyw- minute 2), bezpośrednio aktywuje p21 (inhibitor kinaz ność DNazy i fosfatazy PIP3) nie powodują zablokowa- zależnych od cyklin). W fibroblastach lub keratynocy- nia cyklu komórkowego i apoptozy w proliferujących tach zainfekowanych CDT fosforylacja p53 przez kinazę komórkach. Nie można jednak wykluczyć, że indukcja Chk2 prowadzi do oddysocjowania MDM2 i w efekcie apoptozy w proliferujących komórkach U937 przez do zwiększonej liczby cząsteczek p21 i wzrostu poziomu CDT wymaga aktywności zarówno DNazy jak i fosfatazy p27. Kompleks cdk2/cyklina E jest inaktywowany przez [53]. W przeciwieństwie do proliferujących komórek, p21, czego konsekwencją jest zatrzymanie cyklu komór- apoptoza w nieproliferujących komórkach U937 nie kowego w fazie G1. Możliwe, że przewaga wstrzymania wymaga aktywacji kaskady kaspaz i mobilizacji AIF cyklu w G2/M obserwowana w większości doświadczeń (apoptosis-inducing factor). W dodatku w tych komór- może być związana z nieobecnością p53 w stosowanych kach apoptoza występuje w wyniku działania CdtB do badań liniach komórkowych. ATM fosforyluje także D199G, CdtB H160G, niezmutowanej cząsteczki CdtB, histon H2AX prowadząc do aktywacji Mre11, kompleksu oraz w obecności CdtB dzikiego typu z dodatkiem inhi- białek Rad50/NBS1/Mre11 związanych z naprawą DNA bitora fosfatazy PIP3 – bpV(pic) (bisperoxo (picolinato) [39]. Fosforylacja H2AX wykrywana jest już godzinę oxo-vanadate). Sugeruje to, że apoptoza w nieproliferu- po traktowaniu komórek DC (dendritic cells) HdCDT, jących komórkach występuje niezależnie od aktywności a 2–3 godziny później następuje relokalizacja Mre11. fosfatazy PIP3 lub od aktywności DNazy [53]. Czy CDT Relokalizacja ta nie ma miejsca w przypadku traktowa- pełni dwojaką funkcję i czy hydroliza PI-3,4,5-P3 do CHARAKTERYSTYKA GENOTOKSYN CDT (CYTOLETHAL DISTENDING TOXIN) 321

PI-3,4-P2 prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego cytozolu komórek eukariotycznych [25]. S p a n o i wsp. wymaga dalszego wyjaśnienia. Istnieją także inne bardzo wykazali, że w komórkach Salmonella aktywną tok- kontrowersyjne hipotezy dotyczące mechanizmu dzia- synę CDT tworzą oprócz CdtB, dwa białka, PltA i PltB, łania CDT. S c h e n k e r i wsp. w 2004 zasugerowali, kodowane przez tą samą wyspę genomową co CdtB i że zatrucie komórki może być spowodowane kaskadą podobnie jak CdtB produkowane jedynie wewnątrz sygnałów pochodzącą z błony komórkowej docelowej zainfekowanej przez patogen komórki. PltA (pertussis- komórki [58]. Jednak G u e r r a i wsp. udowodnili, -like toxin A) jest ortologiem ADP-rybozylującej pod- że ingerencja w prawdopodobną drogę transportu tej jednostki A toksyny Bordetella pertussis, podczas gdy toksyny, między innymi w funkcjonowanie aparatu PltB (pertussis-like toxin B) wykazuje podobieństwo Golgiego, chroni komórkę przed zablokowaniem cyklu sekwencji aminokwasowej do jednego z pięciu skład- komórkowego, jak również przed powstawaniem DSB ników podjednostki B tej toksyny. Transport CdtB na w DNA komórek HeLa [23]. zewnątrz komórek eukariotycznych zainfekowanych przez Salmonella, odbywa się więc prawdopodobnie z udziałem białek PltA i PltB. Kompleks CdtB/PltA/PltB 7. Nietypowa toksyna CDT wytwarzana wydzielany jest na zewnątrz komórek eukariotycz- przez Salmonella enterica serovar Typhi nych, po czym wykazuje toksyczne działanie zarówno w odniesieniu do komórek wcześniej zainfekowanych Toksynę CDT produkuje również wewnątrzkomór- (droga autokrynna) jak i niezainfekowanych (droga kowy patogen Salmonella enterica sv. Typhi. W genomie parakrynna), choć efekt cytotoksyczny jest szybciej tego mikroorganizmu nie odnaleziono genów kodują- widoczny w tym drugim przypadku. Dodanie do śro- cych białka wykazujące podobieństwo do sekwencji dowiska przeciwciał rozpoznających CdtB zapobiega aminokwasowych podjednostek CdtA i CdtC, co było intoksykacji komórek eukariotycznych, zarówno zain- dość zaskakujące, bowiem wyniki przeprowadzonych fekowanych jak i niezainfekowanych [66, 67]. Zapropo- wcześniej analiz wskazują, że obecność tych białek jest nowano o hipotezę, według której komórki nie posia- niezbędna do budowy aktywnego kompleksu toksyny. dające receptora dla toksyny CDT, a więc oporne na Składnik toksyny o aktywności enzymatycznej, homolog autokrynną ścieżkę transporu toksyny, mogą stanowić podjednostki CdtB, kodowany jest przez jeden z genów „bezpieczne schronienie” dla komórek Salmonella i jed- małej wyspy genomowej Salmonella. Białko to posiada nocześnie stanowić źródło toksyny CDT oddziałującej Sec-zależny sygnał sekrecji i wszystkie reszty aminokwa- na komórki posiadające na swej powierzchni właś­ sowe istotne dla katalitycznej aktywności CdtB. Zaob- ciwe receptory. Powyższy stan mógłby odpowiadać za serwowano, że ekstrakt zawierający jedynie SeCdtB, powstawanie chronicznej infekcji, typowej dla serowaru podobnie do CdtB produkowanych przez inne gatunki Typhi. Ocena wiary­godności tego modelu wymaga prze- bakterii, nie wykazuje aktywności cytotoksycznej wobec prowadzenia jeszcze wielu badań. komórek eukariotycznych. Natomiast aktywność kom- pleksu złożonego z CdtB S. Typhi oraz z podjednostek CdtA i CdtC pochodzących z komórek C. jejuni była 8. Podsumowanie porównywalna z aktywnością toksyny CDT wydzielanej przez pałeczki Campylobacter. Ponadto stwierdzono, że CDT jest powszechnie występującą genotoksyną pomimo braku homologów podjednostek CdtA i CdtC bakterii gramujemnych składającą się z trzech jedno- w proteomie S. Typhi, w komórkach nabłonka jelita stek: CdtA, CdtB i CdtC. Podjednostka CdtB wykazuje zainfekowanych przez ten mikroorganizm dochodzi do aktywność DNazy oraz fosfatazy podczas gdy CdtA zatrzymania cyklu komórkowego i charakterystycznych i CdtC oddziałują z błoną komórkową komórek docelo- zmian powodowanych obecnością toksyny CDT [25]. wych i dostarczają podjednostkę katalityczną do wnętrza Oznacza to, że w komórkach S. enterica sv. Typhi pod- komórki. Dokładna rola CdtA i CdtC w procesie intok- jednostka CdtB jest transportowana bez udziału białek sykacji komórek, podobnie jak rola aktywności CdtB CdtC i CdtA. Kolejne obserwacje wykazały, że produk- (nukleaza vs fosfataza) w modulacji cyklu komórkowego cja toksyny jest ściśle uzależniona od procesu interna- nadal wymagają wyjaśnienia. Translokacja CdtB do jądra lizacji bakterii. Białko to powstaje jedynie wtedy, gdy powoduje uszkodzenie materiału genetycznego gospo- patogen znajduje się wewnątrz zainfekowanej komórki. darza, uruchamiając kaskadę sygnałów prowadzącą mię- CdtB musi więc mieć możliwość przedostawania się dzy innymi do aktywacji mechanizmów naprawy mate- przez błonę wakuoli, w której Salmonella przebywa na riału genetycznego, zatrzymania cyklu komórkowego pierwszym etapie infekcji (SCV, Salmonella-containing na poziomie G1/S lub G2/M oraz indukcji procesów vacuole). Genom Salmonella koduje dwa systemy sekre- starzenia lub apoptozy komórek. Mechanizm działania cji typu trzeciego (TTSS SPI-1 oraz TTSS SPI-2), żaden CDT sugeruje, że tworzenie DSB może być strategią z nich nie uczestniczy jednak w transporcie CdtB do bakterii pozwalającą na modulowanie funkcji życiowych 322 PATRYCJA KOBIERECKA, AGNIESZKA WYSZYŃSKA, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA gospodarza. Dotychczasowe badania skupiały się szcze- 8. Cortes-Bratti X., Chaves-Olarte E., Lagergard T., Thelestam M.: gólnie na analizach aktywności CDT in vitro, badaniach The cytolethal distending toxin from the chancroid bacterium biochemicznych a ostatnio strukturalnych. Stosunkowo Haemophilus ducreyi induces cell-cycle arrest in the G2 phase. J. Clin. Invest. 103, 107–115 (1999) mało jest dostępnych danych na temat roli toksyn CDT 9. Cortes-Bratti X., Chaves-Olarte E., Lagergard T., Thelestam M.: w procesach wirulencji in vivo. Potencjalnym mecha- Cellular internalization of cytolethal distending toxin from nizmem działaniem tej genotoksyny jest inhibicja pro- Haemophilus ducreyi. Infect. Immun. 68, 6903–6911 (2000) liferacji komórek nabłonka i indukcja ich apoptozy, co 10. Cortes-Bratti X., Karlsson C., Lagergard T., Thelestam M., umożliwia inwazję bakterii oraz zahamowanie prolifera- Frisan T.: TheHaemophilus ducreyi cytolethal distending toxin induces cell cycle arrest and apoptosis via the DNA damage cji komórek odpowiedzi immunologicznej, czego efek- checkpoint pathways. J. Biol. Chem. 276, 5296–5302 (2001) tem jest lokalna immunosupresja. Wywoływane objawy 11. Damek-Poprawa M., Jang J.Y., Volgina A., Korostoff J., chorobowe uwarunkowane aktywnością CDT są różne DiRienzo J.M.: Localization of Aggregatibacter actinomycetem- i zależne od gatunku patogenu i kolonizowanej niszy comitans cytolethal distending toxin subunits during intoxica- ekologicznej. I tak np. CDT A. actinomycetemcomitans tion of live cells. Infect. Immun. 80, 2761–2770 (2012) 12. Dean P.: Functional domains and motifs of bacterial type III przyczynia się do zapalenia ozębnej powodując zanik effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiol. tkanki kostnej, podczas gdy CDT H. ducreyi opóźnia Rev. 35, 1100–1125 (2011) gojenie się ran po przez wpływ na poziom indukowa- 13. Delepelaire P.: Type I secretion in gram-negative bacteria. nej odpowiedzi immunologicznej. Coraz więcej danych Biochim. Biophys. Acta, 1694, 149–161 (2004) eksperymentalnych wskazuje na fakt, ze w wypadku 14. Elwell C., Chao K., Patel K., Dreyfus L.: Escherichia coli CdtB chronicznych infekcji powodowanych np. przez H. hepa- mediates cytolethal distending toxin cell cycle arrest. Infect. Immun. 69, 3418–3422 (2001) ticus czy C. jejuni wytwarzanie CDT przez patogenne 15. Elwell C.A., Dreyfus L.A.: DNase I homologous residues in mikroorganizmy może być przyczyną indukcji procesu CdtB are critical for cytolethal distending toxin-mediated cell nowotworzenia [34]. cycle arrest. Mol. Microbiol. 37, 952–963 (2000) 16. Eshraghi A., Maldonado-Arocho F.J., Gargi A., Cardwell M.M., Prouty M.G., Blanke S.R., Bradley K.A.: Cytolethal distending toxin family members are differentially affected by alterations Piśmiennictwo in host glycans and membrane cholesterol. J. Biol. Chem. 285, 18199–18207 (2010) Ze względu na dużą liczbę opublikowanych prac dotyczących 17. Fedor Y., Vignard J., Nicolau-Travers M.L., Boutet-Robinet E., genotoksyny CDT cytowana literatura nie jest wyczerpująca acz- Watrin C., Salles B., Mirey G.: From single-strand breaks to kolwiek w opinii autorów jest reprezentatywna. double-strand breaks during S-phase: a new mode of action of the Escherichia coli Cytolethal Distending Toxin. Cell Microbiol. 1. Bielaszewska M., Sinha B., Kuczius T., Karch H.: Cytolethal 15, 1–15 (2013) distending toxin from Shiga toxin-producing Escherichia coli 18. Frisan T., Cortes-Bratti X., Chaves-Olarte E., Stenerlow B., O157 causes irreversible G2/M arrest, inhibition of prolifera- Thelestam M.: TheHaemophilus ducreyi cytolethal distending tion, and death of human endothelial cells. Infect. Immun. 73, toxin induces DNA double-strand breaks and promotes ATM- 552–562 (2005) dependent activation of RhoA. Cell Microbiol. 5, 695–707 (2003) 2. Blazkova H., Krejcikova K., Moudry P., Frisan T., Hodny Z., 19. Frisan T., Cortes-Bratti X., Thelestam M.: Cytolethal distending Bartek J.: Bacterial intoxication evokes cellular senescence with toxins and activation of DNA damage-dependent checkpoint persistent DNA damage and cytokine signalling. J. Cell. Mol. responses. Int. J. Med. Microbiol. 291, 495–499 (2002) Med. 14, 357–367 (2010) 20. Frisk A., Lebens M., Johansson C., Ahmed H., Svensson L., 3. Boesze-Battaglia K., Besack D., McKay T., Zekavat A., Otis L., Ahlman K., Lagergard T.: The role of different protein compo- Jordan-Sciutto K., Shenker B.J.: Cholesterol-rich membrane nents from the Haemophilus ducreyi cytolethal distending toxin microdomains mediate cell cycle arrest induced by Actinoba- in the generation of cell toxicity. Microb. Pathog. 30, 313–324 cillus actinomycetemcomitans cytolethal-distending toxin. Cell (2001) Microbiol. 8, 823–836 (2006) 21. Gargi A., Reno M., Blanke S.R.: Bacterial toxin modulation of 4. Cao L., Bandelac G., Volgina A., Korostoff J., DiRienzo J.M.: the eukaryotic cell cycle: are all cytolethal distending toxins Role of aromatic amino acids in receptor binding activity and created equally? Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 124 (2012) subunit assembly of the cytolethal distending toxin of Aggregat- 22. Guerra L., Carr H.S., Richter-Dahlfors A., Masucci M.G., ibacter actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 76, 2812–2821 Thelestam M., Frost J.A., Frisan T.: A bacterial cytotoxin iden- (2008) tifies the RhoA exchange factor Net1 as a key effector in the 5. Cao L., Volgina A., Huang C.M., Korostoff J., DiRienzo J.M.: response to DNA damage. PLoS One, 3, e2254 (2008) Characterization of point mutations in the cdtA gene of the 23. Guerra L., Nemec K.N., Massey S., Tatulian S.A., Thelestam M., cytolethal distending toxin of Actinobacillus actinomycetem- Frisan T., Teter K.: A novel mode of translocation for cytolethal comitans. Mol. Microbiol. 58, 1303–1321 (2005) distending toxin. Biochim. Biophys. Acta, 1793, 489–495 (2009) 6. Carette J.E., Brummelkamp T.R. i wsp.: Haploid genetic screens 24. Guerra L., Frisan T. i wsp.: Cellular internalization of cytolethal in human cells identify host factors used by pathogens. Science, distending toxin: a new end to a known pathway. Cell Microbiol. 326, 1231–1235 (2009) 7, 921–934 (2005) 7. Ceelen L.M., Decostere A., Ducatelle R., Haesebrouck F.: 25. Haghjoo E., Galan J.E.: Salmonella typhi encodes a functional ytolethal distending toxin generates cell death by inducing cytolethal distending toxin that is delivered into host cells by a bottleneck in the cell cycle. Microbiol. Res. 161, 109–120 a bacterial-internalization pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2006) 101, 4614–4619 (2004) CHARAKTERYSTYKA GENOTOKSYN CDT (CYTOLETHAL DISTENDING TOXIN) 323

26. Hassane D.C., Lee R.B., Mendenhall M.D., Pickett C.L.: Cyto­ 45. Mooney A., Clyne M., Curran T., Doherty D., Kilmartin B., lethal distending toxin demonstrates genotoxic activity in Bourke B.: Campylobacter upsaliensis exerts a cytolethal dis- a yeast model. Infect. Immun. 69, 5752–5759 (2001) tending toxin effect on HeLa cells and T lymphocytes.Micro - 27. Heywood W., Henderson B., Nair S.P.: Cytolethal distending biology, 147, 735–743 (2001) toxin: creating a gap in the cell cycle. J. Med. Microbiol. 54, 46. Nesic D., Hsu Y., Stebbins C.E.: Assembly and function of 207–216 (2005) a bacterial genotoxin. Nature, 429, 429–433 (2004) 28. Hontz J.S., Villar-Lecumberri M.T., Dreyfus L.A., Yoder M.D.: 47. Nesic D., Stebbins C.E.: Mechanisms of assembly and cellular Crystallization of Escherichia coli CdtB, the biologically active interactions for the bacterial genotoxin CDT. PLoS Pathog. 1, subunit of cytolethal distending toxin. Acta Crystallogr. Sect. e28 (2005) F Struct. Biol. Cryst. Commun. 62, 192–195 (2006) 48. Nishikubo S., Sugai M. i wsp.: Single nucleotide polymorphism 29. Hu X., Stebbins C.E.: Dynamics and assembly of the cytolethal in the cytolethal distending toxin B gene confers heterogene- distending toxin. Proteins, 65, 843–855 (2006) ity in the cytotoxicity of Actinobacillus actinomycetemcomitans. 30. Jinadasa R.N., Bloom S.E., Weiss R.S., Duhamel G.E.: Cytolethal Infect. Immun. 74, 7014–7020 (2006) distending toxin: a conserved bacterial genotoxin that blocks 49. Nishikubo S., Sugai M. i wsp.: An N-terminal segment of the cell cycle progression, leading to apoptosis of a broad range of active component of the bacterial genotoxin cytolethal distend- mammalian cell lineages. Microbiology, 157, 1851–1875 (2011) ing toxin B (CDTB) directs CDTB into the nucleus. J. Biol. 31. Johnson W.M., Lior H.: A new heat-labile cytolethal distending Chem. 278, 50671–50681 (2003) toxin (CLDT) produced by Campylobacter spp. Microb. Pathog. 50. Nowak J.M., Grzanka A., Zuryn A., Stepien A.: The Rho protein 4, 115–126 (1988) family and its role in the cellular cytoskeleton. Post. Hig. Med. 32. Johnson W.M., Lior H.: A new heat-labile cytolethal distending Dośw. 62, 110–117 (2008) toxin (CLDT) produced by Escherichia coli isolates from clinical 51. Ohara M., Oswald E., Sugai M.: Cytolethal distending toxin: a material. Microb. Pathog. 4, 103–113 (1988) bacterial bullet targeted to nucleus. J. Biochem. 136, 409–413 33. Korotkov K.V., Sandkvist M., Hol W.G.: The type II secretion (2004) system: biogenesis, molecular architecture and mechanism. 52. Peres S.Y., Oswald E. i wsp.: A new cytolethal distending toxin Nat. Rev. Microbiol. 10, 336–351 (2012) (CDT) from Escherichia coli producing CNF2 blocks HeLa cell 34. Lagergård T., Keith J.: Cytolethal distending toxin as virulence division in G2/M phase. Mol. Microbiol. 24, 1095–1107 (1997) factor, protective antigen, and target for vaccine development. 53. Rabin S.D., Flitton J.G., Demuth D.R.: Aggregatibacter actino- Vaccine: Develop. Therapy, 2, 51–60 (2012) mycetemcomitans cytolethal distending toxin induces apoptosis 35. Lara-Tejero M., Galan J.E.: A bacterial toxin that controls cell in nonproliferating macrophages by a phosphatase-independ- cycle progression as a deoxyribonuclease I-like protein. Science, ent mechanism. Infect. Immun. 77, 3161–3169 (2009) 290, 354–357 (2000) 54. Saiki K., Gomi T., Konishi K.: Deletion and purification studies 36. Lara-Tejero M., Galan J.E.: CdtA, CdtB, and CdtC form a tri- to elucidate the structure of the Actinobacillus actinomycetem- partite complex that is required for cytolethal distending toxin comitans cytolethal distending toxin. J. Biochem. 136, 335–342 activity. Infect. Immun. 69, 4358–4365 (2001) (2004) 37. Lara-Tejero M., Galan J.E.: Cytolethal distending toxin: limited 55. Saiki K., Konishi K., Gomi T., Nishihara T., Yoshikawa M.: damage as a strategy to modulate cellular functions. Trends Reconstitution and purification of cytolethal distending toxin Microbiol. 10, 147–152 (2002) of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Microbiol.Immunol. 38. Lee R.B., Hassane D.C., Cottle D.L., Pickett C.L.: Interactions of 45, 497–506 (2001) Campylobacter jejuni cytolethal distending toxin subunits CdtA 56. Sato T., Nishihara T. i wsp.: p53-independent expression of and CdtC with HeLa cells. Infect. Immun. 71, 4883–4890 (2003) p21(CIP1/WAF1) in plasmacytic cells during G(2) cell cycle 39. Li L., Sharipo A., Chaves-Olarte E., Masucci M.G., Levitsky V., arrest induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans cyto- Thelestam M., Frisan T.: The Haemophilus ducreyi cytolethal lethal distending toxin. Infect. Immun. 70, 528–534 (2002) distending toxin activates sensors of DNA damage and repair 57. Sert V., Cans C., Tasca C., Bret-Bennis L., Oswald E., Ducom- complexes in proliferating and non-proliferating cells. Cell mun B., De Rycke J.: The bacterial cytolethal distending toxin Microbiol. 4, 87–99 (2002) (CDT) triggers a G2 cell cycle checkpoint in mammalian cells 40. Lindmark B., Wai S.N. i wsp.: Outer membrane vesicle-medi- without preliminary induction of DNA strand breaks. Onco- ated release of cytolethal distending toxin (CDT) from Campy- gene, 18, 6296–6304 (1999) lobacter jejuni. BMC Microbiol. 9, 220 (2009) 58. Shenker B.J., Besack D., McKay T., Pankoski L., Zekavat A., 41. Matangkasombut O., Wattanawaraporn R., Tsuruda K., Demuth D.R.: Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal Ohara M., Sugai M., Mongkolsuk S.: Cytolethal distending distending toxin (Cdt): evidence that the holotoxin is composed toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans induces of three subunits: CdtA, CdtB, and CdtC. J. Immunol. 172, DNA damage, S/G2 cell cycle arrest, and caspase-independent 410–417 (2004) death in a Saccharomyces cerevisiae model. Infect. Immun. 78, 59. Shenker B.J., Demuth D.R., Zekavat A.: Exposure of lympho- 783–792 (2010) cytes to high doses of Actinobacillus actinomycetemcomitans 42. McSweeney L.A., Dreyfus L.A.: Nuclear localization of the cytolethal distending toxin induces rapid onset of apoptosis- Escherichia coli cytolethal distending toxin CdtB subunit. Cell mediated DNA fragmentation. Infect. Immun. 74, 2080–2092 Microbiol. 6, 447–458 (2004) (2006) 43. McSweeney L.A., Dreyfus L.A.: Carbohydrate-binding specific- 60. Shenker B.J., Dlakic M., Walker L.P., Besack D., Jaffe E., LaBelle ity of the Escherichia coli cytolethal distending toxin CdtA-II E., Boesze-Battaglia K.: A novel mode of action for a microbial- and CdtC-II subunits. Infect. Immun. 73, 2051–2060 (2005) derived immunotoxin: the cytolethal distending toxin subunit 44. Mise K., Akifusa S., Watarai S., Ansai T., Nishihara T., B exhibits phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate phosphatase Takehara T.: Involvement of ganglioside GM3 in G(2)/M cell activity. J. Immunol. 178, 5099–5108 (2007) cycle arrest of human monocytic cells induced by Actinobacil- 61. Shenker B.J., Hoffmaster R.H., McKay T.L., Demuth D.R.: lus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin. Infect. Expression of the cytolethal distending toxin (Cdt) operon in Immun. 73, 4846–4852 (2005) Actinobacillus actinomycetemcomitans: evidence that the CdtB 324 PATRYCJA KOBIERECKA, AGNIESZKA WYSZYŃSKA, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

protein is responsible for G2 arrest of the cell cycle in human existence of a new cdt variant (Type IV). J. Clin. Microbiol. 41, T cells. J. Immunol. 165, 2612–2618 (2000) 4285–4291 (2003) 62. Shenker B.J., McKay T., Datar S., Miller M., Chowhan R., 69. Toth I., Nougayrede J.P., Dobrindt U., Ledger T.N., Boury M., Demuth D.: Actinobacillus actinomycetemcomitans immuno- Morabito S., Oswald E.: Cytolethal distending toxin type I and suppressive protein is a member of the family of cytolethal type IV genes are framed with lambdoid prophage genes in distending toxins capable of causing a G2 arrest in human T extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 77, cells. J. Immunol. 162, 4773–4780 (1999) 492–500 (2009) 63. Shiloh Y.: ATM and ATR: networking cellular responses to 70. Voth D.E., Broederdorf L.J., Graham J.G.: Bacterial Type IV DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 71–77 (2001) secretion systems: versatile virulence machines. Future Micro- 64. Smith J.L., Bayles D.O.: The contribution of cytolethal distend- biol. 7, 241–257 (2012) ing toxin to bacterial pathogenesis. Crit. Rev. Microbiol. 32, 71. Wising C., Lagergard T. i wsp.: Toxicity and immunogenicity 227–248 (2006) of purified Haemophilus ducreyi cytolethal distending toxin in 65. Solyers A.A., Whitt D.D., Bacterial Exotoxins: Important a rabbit model. Microb. Pathog. 33, 49–62 (2002) but still a mystery (w) Bacterial Pathogenesis. A molecular 72. Yamada T., Komoto J., Saiki K., Konishi K., Takusagawa F.: Vari- approach. Second edition, Washington D. C., 2002, s. 131–149 ation of loop sequence alters stability of cytolethal distending 66. Spano S., Galan J.E.: A novel pathway for exotoxin delivery toxin (CDT): crystal structure of CDT from Actinobacillus by an intracellular pathogen. Curr. Opin. Microbiol. 11, 15–20 actinomycetemcomitans. Protein Sci. 15, 362–372 (2006) (2008) 73. Yamamoto K., Tominaga K., Sukedai M., Okinaga T., Iwanaga K., 67. Spano S., Ugalde J.E., Galan J.E.: Delivery of a Salmonella Typhi Nishihara T., Fukuda J.: Delivery of cytolethal distending toxin exotoxin from a host intracellular compartment. Cell Host B induces cell cycle arrest and apoptosis in gingival squamous Microbe, 3, 30–38 (2008) cell carcinoma in vitro. Eur. J. Oral Sci. 112, 445–451 (2004) 68. Toth I., Herault F., Beutin L., Oswald E.: Production of cyto- 74. Young V.B., Knox K.A., Schauer D.B.: Cytolethal distending lethal distending toxins by pathogenic Escherichia coli strains toxin sequence and activity in the enterohepatic pathogen Heli- isolated from human and animal sources: establishment of the cobacter hepaticus. Infect. Immun. 68, 184–191 (2000) SPIS TREŚCI

K. Szczypa, J. W i l e m s k a, W. Hr y n i e w i c z, I. S i t k i e w i c z – Epidemiologia zakażeń Streptococcus pyogenes, struktura klonalna populacji i antybiotykooporność ...... 223 Z. B a k u ł a, R. S t a c h o w i a k, J. W i ś n i e w s k i, L. G r a n i c k a, J. B i e l e c k i – Immobili- zacja komórek – znaczenie biomedyczne ...... 233 A. M a t u s i a k, M. C h m i e l a – Choroba niedokrwienna serca a zakażenia bakteryjne Helicobacter pylori i Chlamydophila pneumoniae – rola białek szoku cieplnego i zjawisko mimikry antygenowej 247 E. N i k o n o r o w, A. B a r a n i a k, M. G n i a d k o w s k i – Oporność bakterii z rodziny Enterobac- teriaceae na antybiotyki β-laktamowe wynikająca z wytwarzania β-laktamaz ...... 261 P. Ł a n i e w s k i, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Immunoprofilaktyka zakażeń Campylobacter 273 P. Ł a n i e w s k i, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Konstrukcja szczepionek podjednostkowych z wykorzystaniem komórek Salmonella enterica jako nośnika heterologicznych genów ...... 281 T. J a g i e l s k i, E. R u p, A. B. M a c u r a, J. B i e l e c k i – Charakterystyka grzybów z rodzaju Malassezia. I. Aspekty mikrobiologiczne i immunologiczne ...... 295 T. J a g i e l s k i, E. R u p, A. B. M a c u r a, J. B i e l e c k i – Charakterystyka grzybów z rodzaju Malassezia. II. Aspekty kliniczne ...... 307 P. Ko b i e r e c k a, A. Wy s z y ń s k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Charakterystyka geno- toksyn CDT (cytolethal distending toxin) ...... 315

CONTENTS

K. Szczypa, J. W i l e m s k a, W. Hr y n i e w i c z, I. S i t k i e w i c z – Epidemiology of Streptococcus pyogenes infections, clonal structure population and antibiotic resistance ...... 223 Z. B a k u ł a, R. S t a c h o w i a k, J. W i ś n i e w s k i, L. Gr a n i c k a, J. B i e l e c k i – Cell immo- bilization – biomedical significance ...... 233 A. M a t u s i a k, M. C h m i e l a – Coronary heart disease versus Helicobacter pylori and Chlamydo- phila pneumoniae bacterial infections – the role of heat shock proteins and the phenomenon of antigenic mimicry ...... 247 E. N i k o n o r o w, A. B a r a n i a k, M. G n i a d k o w s k i – β-Lactamase-mediated resistance in Enterobacteriaceae ...... 261 P. Łaniewski, E. K. Jagusztyn-Krynicka – Anti-Campylobacter immunoprophylaxis ..... 273 P. Ł a n i e w s k i, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Subunit vaccine construction using Salmonella enterica cells as a carrier of heterologous genes ...... 281 T. J a g i e l s k i, E. R u p, A. B. M a c u r a, J. B i e l e c k i – Characterization of fungi of the Malassezia genus. I. Microbiological and immunological aspects ...... 295 T. J a g i e l s k i, E. R u p, A. B. M a c u r a, J. B i e l e c k i – Characterization of fungi of the Malassezia genus. II. Clinical aspects ...... 307 P. Ko b i e r e c k a, A. Wy s z y ń s k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Characterization of CDT (cytolethal distending toxin) genotoxins ...... 315