Filogenia E Diversificação Do Gênero Bionia Mart. Ex. Benth

ADELINA VITORIA FERREIRA LIMA

FILOGENIA E DIVERSIFICAÇÃO DO GÊNERO BIONIA MART. EX BENTH. (LEGUMINOSAE: PAPILONOIDEAE)

FEIRA DE SANTANA – BAHIA

2014

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA

FILOGENIA E DIVERSIFICAÇÃO DO GÊNERO BIONIA MART. EX BENTH. (LEGUMINOSAE: PAPILONOIDEAE)

Adelina Vitoria Ferreira Lima

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Botânica da Universidade Estadual de Feira de Santana como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Botânica.

ORIENTADOR: PROF. DR. LUCIANO PAGANUCCI DE QUEIROZ (UEFS) CO-ORIENTADORA: DRA. ÉLVIA RODRIGUES DE SOUZA

FEIRA DE SANTANA – BAHIA

2014

BANCA EXAMINADORA

______

Profa. Dr. Alessandra Selbach Schnadelbach

______

Profa. Dr. Marla Ibrahim Uebe

______

Prof. Dr. Orientador Luciano Paganucci de Queiroz

Orientador e Presidente da Banca

Feira de Santana – BA

2014

A minha mãe com amor.

Jamais perca seu equilíbrio, por mais forte que seja o vento da tempestade.

(Hélio Bentes / André Sampaio)

AGRADECIMENTOS

A minha mãe pelo amor incondicional;

A todos os meus familiares, especialmente ao meu irmão (Neto), sobrinha (Júlia) e primas-irmãs (Bia, Tchukão e Nai), que sempre estiveram presentes nessa jornada de mais de dois anos do mestrado, dando apoio psicológico necessário;

Aos meus amigos de todas as horas, Lamarck, Yuri, Geraldo (Gerá), Fabio (Tabebuia), Tarciso (Tatá), Fernando (Beira), Anderson (Bojão), Elkiaer (Elk), Gérson (Limão), Pétala (Pel), Tércia (Tersalina), Mariana, Renata, Margarete e Lorena, os quais tornaram esses últimos anos mais leves e repletos de momentos inesquecíveis;

Ao meu orientador Luciano Paganucci de Queiroz pela orientação e confiança em entregar-me suas filhotas incompreendidas;

A Élvia e a Patrícia Luz pela orientação e amizade. Meninas vocês são show, só tenho a agradecer a vocês!!

As minhas sofredoras queridas Priscilla e Daniele que foram as melhores companheiras de prorrogação;

Aos meus colegas do PPGBot em especial a minha turma ESPECIAL;

Aos irmãos científicos, Pétala, Kamila, Daiane, Janaina, Ariane, Leilton, Jeffersson, Moab, Cris Snack, Maria Cristina, Laura e Eloína pelos socorros, cafés, risadas, aventuras e aos devaneios (sempre tão necessários para o progresso da ciência, kkk);

A todos do LAMOL que me ajudaram de alguma forma no desenvolvimento dessa dissertação, especialmente ao Cássio e ao Ricardo;

Ao pessoal do HUEFS, Teó, Zezé, Elaine, Mariana e Silvia, pela ajuda e atenção.

SUMÁRIO

RESUMO

INTRODUÇÃO GERAL ...... 11

Referências ...... 16

CAPÍTULO 1: Three new species of Bionia Mart. ex Benth. (Leguminosae: Papilionoideae: Phaseoleae)

ABSTRACT ...... 19

INTRODUCTION ...... 19

MATERIAL AND METHODS ...... 20

RESULTS ...... 22

REFERENCES ...... 32

APPENDIX ...... 36

FIGURE LEGENDS ...... 37

FIGURES· ...... 38

CAPÍTULO 2: Filogenia e padrões biogeográficos de Bionia (Papilionoideae: Phaseoleae – Diocleinae)

RESUMO ...... 45

INTRODUÇÃO ...... 46

MATERIAIS E MÉTODOS Amostragem, Extração, Amplificação e Sequenciamento do DNA...... 49

Análises filogenéticas ...... 51

Análises de evolução reticulada...... 52

Datação molecular ...... 53

Análises biogeográficas ...... 54

RESULTADOS Dados moleculares e análises filogenéticas ...... 55

Evolução reticulada ...... 57

Análises biogeográficas espaço-temporais ...... 57

DISCUSSÃO ...... 58

AGRADECIMENTOS ...... 66

LITERATURA CITADA ...... 66

APÊNDICE ...... 76

TABELAS ...... 77

FIGURAS ...... 81

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 87

Resumo

FILOGENIA E DIVERSIFICAÇÃO DO GÊNERO BIONIA MART.EX BENTH. (LEGUMINOSAE: PAPILONOIDEAE).

Bionia Mart.ex Benth. (Papilionoideae: Phaseoleae – Diocleinae) possui cinco espécies todas endêmicas do Brasil. O gênero concentra-se nas cadeias montanhosas do centro- leste do Brasil, tendo seu centro de diversidade na Cadeia do Espinhaço. Bionia foi criado por Bentham e posteriormente considerado sinônimo de Camptosema até ser segregado e restabelecido por Queiroz com base em estudos filogenéticos inferidos por dados micro e macro morfolológicos. Entretanto, filogenias moleculares realizadas em Diocleinae não corroboram o monofiletismo de Bionia proposto por Queiroz, mostrando B. bella Mart. ex Benth. mais relacionado ao gênero Galactia. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos: Capítulo 1, no qual três espécies novas de Bionia foram propostas, B. canescens, B. grao-mogolensis e B. rugosa, todas endêmicas da Cadeia do Espinhaço. As relações filogenéticas das espécies novas foram avaliadas com as outras espécies do gênero através de análise de Máxima Parcimônia e Inferência Bayesiana. A análise filogenética foi conduzida por uma matriz composta pelos gêneros Bionia, Cratylia e Galactia, totalizando 11 táxons e 55 sequências de cinco regiões do genoma nuclear e plastidial (ITS, ETS, rpl32-trnL, matK, trnL-F). As relações filogenéticas de Bionia foram estruturadas geograficamente entre Chapada Diamantina (Bahia) e Serra do Espinhaço (Minas Gerais) e as folhas simples foram consideras um caráter homoplástico para o gênero. Os relacionamentos interespecíficos das espécies novas foram dados pelas relações de B. grao-mogolensis ao clado das espécies de Minas Gerais formado por B.coccinea Mart. ex Benth. e B. tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz, enquanto que as espécies novas da Bahia foram relacionadas com B. canescens emergindo como táxon irmão do clado formado por B. rugosa e B. pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz. Capítulo 2 – teve por objetivo investigar as relações filogenéticas de Bionia, produzindo uma hipótese filogenética para explicar as relações entre as espécies do gênero e seu processo de diversificação. Para tanto, a história biogeográfica de Bionia foi investigada através de análises de evolução reticulada, datação molecular, reconstrução de áreas ancestrais com base em dados moleculares nucleares (ITS e ETS) e plastidiais (rpl32-trnL, trnQ-rps16, matK, trnL-F), buscando elucidar possíveis eventos de hibridação responsáveis pela ampliação da distribuição do gênero. Os táxons utilizados no estudo foram espécies dos gêneros Bionia, Cratylia e Galactia que juntas

somaram 243 sequências, representadas por 16 táxons distintos e 42 espécimes. A matriz de dados com as sequências foi analisada sob os critérios de optimalidade de Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana através de análises individuais e combinadas. Foram verificadas incongruências entre os dados nucleares, plastidiais e nucleares+plastidiais. Os conflitos no sinal filogenético foram tratados como indícios de evolução reticulada e fixação incompleta de alelos. Palavras-chave: Cadeia do Espinhaço. Diversificação. Evolução Reticulada. Filogenia. Hibridação.

INTRODUÇÃO GERAL

Leguminosae é a terceira maior família de plantas, com 730 gêneros e mais de 19.300 espécies que ocupam a maioria dos habitats terrestres, a exceção das regiões polares, e apresentam grande diversidade e endemismo nas regiões temperadas e tropicas (Lewis et al., 2005; Schire et al., 2005). Atualmente, para a família são reconhecidas 42 tribos distribuídas em três subfamílias: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae (Lewis et al., 2005). O monofiletismo das Leguminosae tem sido sustentado em diferentes estudos filogenéticos baseados tanto em dados morfológicos (Chappil, 1995; Tucker & Douglas, 1994) quanto em dados moleculares (Chase et al., 1993; Käss & Wink, 1996; Doyle et al., 1997, 2000; Soltis et al., 2000; Kajita et al., 2001; Persson, 2001; Wojciechowski et al., 2004; Judd & Olmstead, 2004). Entretanto, essas relações filogenéticas se apresentam desatualizadas, inferindo relações evolutivas enganosas dentro da família, por isso um novo esboço começa a ser estruturado, buscando um novo sistema de classificação para as leguminosas (LPWG, 2013).

Papilionoideae é a subfamília mais diversa e amplamente distribuída, apresentando aproximadamente 13.800 espécies em 483 gêneros e 28 tribos (Queiroz, 2009; Wojciechowski, 2003, 2004). Os caracteres diagnósticos que diferenciam Papilionoideae das demais subfamílias são a presença de folhas geralmente pinadas, na maioria trifolioladas, flores papilionóides, exceto alguns grupos basais, com simetria zigomorfa, corola com perfloração imbricada vexilar, semente com região do hilo bem delimitada e radícula com eixo infletido (Queiroz, 2009). A história taxonômica da subfamília remete aos trabalhos clássicos de De Candolle (1825) e Bentham (1837) que proporcionaram os primeiros sistemas de classificação, subdividindo o grupo em tribos e subtribos, respectivamente. Atualmente, Papilonoideae tem seu monofiletismo reconhecido por diferentes regiões plastidiais (Doyle, 1995; Käss & Wink, 1995, 1996, 1997; Doyle et al., 1997, 2000; Kajita et al., 2001; Wojciechowski et al., 2004; Lavin et al., 2005).

Phaseoleae é a maior tribo de Papilionoideae com total de 84 gêneros e 1.493 espécies, apresentando grande diversidade e importância econômica dentro da subfamília (Wojciechowski, 2003; Varela et al., 2004; Lewis et al., 2005). Pela circunscrição atual, a tribo pode ser caracterizada por plantas trepadeiras com folhas trifolioladas e estipuladas, sendo frequentemente dividida em oito subtribos: Cajaninae, 11

Phaseolinae, Clitoriinae, Ophrestiinae, Kennediinae, Erythrininae, Diocleinae e Glycininae (Polhill & Raven, 1981; Polhill, 1994).

Diocleinae, uma das subtribos proposta originalmente por Bentham (1837) como Diocleae, é caracterizada pelo hábito de lianas volúveis e inflorescência em pseudoracemos nodosos. As plantas do grupo estão localizadas, na sua maior parte, no Novo Mundo e possuem algumas características consideradas “primitivas” da tribo. Essas características como o hábito lenhoso, flores grandes, discos proeminentes ao redor do ovário, hilo geralmente longo e presença de aminoácido não proteico canavanina são consideradas de grande importância para o entendimento das relações filogenéticas no grupo, uma vez que esta é mais relacionada à tribo Millettieae do que aos demais membros da tribo Phaseoleae (Lackey, 1981; Polhill, 1981).

A delimitação tradicional de Diocleinae proposta por Lackey (1981) reconhece 13 gêneros: Camptosema Hook & Arn., Canavalia DC., Cleobulia Mart.ex Benth, Collaea DC., Colopogonium Desv., Cratylia Mart.ex Benth, Cymbosema Benth, Dioclea kunth, Galactia P. Browne, Herpyza Ch. Wright, Luzonia Elmer, Macropsychanthus Harms e Pachyrhizus DC. Posteriormente, Fortunato et al. (1996) descreveram o gênero monotípico Lackeya Fortunato L.P. Queiroz & G.P. Lewis e Queiroz (2008) restabeleceu o gênero Bionia Mart.ex Benth., considerado anteriormente sinônimo de Camptosema.

Entretanto, estudos baseados em caracteres moleculares (Doyle & Doyle, 1993; Bruneau et al., 1995; Doyle et al., 1997; Hu et al., 2000; Kajita et al., 2001, Stefanović et al. 2009; Cardoso et al. 2013) indicam o não monofiletismo de Diocleinae (sensu Lackey, 1981), uma vez que gêneros como Calopogonium e Pachyrhizus apresentam-se mais relacionados a subtribo Glycininae e Herpyza mais relacionado a outras subtribos de Phaseolae, além da inclusão de Rhodopis Urb. (Erytrininae) e Lonchocarpus Kunth. (Millettieae) a subtribo.

Camptosema, um dos gêneros de Diocleinae com delimitação taxonômica problemática, teve sua história marcada por erros sucessivos que levaram a transferência para o gênero de espécies tadicionalmente descritas em Bionia, Cratylia, Colleae e Galactia. Essa tendência em Camptosema de incluir espécies caracterizadas pelas flores grandes com pétalas vermelha (Bentham, 1840; Bentham, 1862; Bentham, 1865;

Taubert 1894; Bukart, 1952, 1970) tornou imprecisos os limites do gênero devido ao peso exagerado dado, por diferentes autores, a caracteres relacionados à adaptação das espécies de diferentes linhagens de Diocleinae à polinização por aves (Queiroz, 1999).

O gênero Bionia foi criado por Bentham (1837) baseado nos manuscritos de Martius e incluído na subtribo Diocleinae (como Diocleae), sendo sinonimizado pelo mesmo autor em 1840 em Camptosema. Nesse gênero baseado em uma só espécie, Camptosema rubicundum Hooker & Arnott (1833), as espécies incluídas em Bionia chegaram a denominar uma das suas seções (Bentham, 1862) e se mantiveram nela por quase 170 anos.

Análises filogenéticas realizadas por Queiroz et al. (2003), baseado em dados morfológicos, mostrou o polifiletismo de Camptosema e o relacionamento do clado Bionia ao clado Cymbosema Benth. e Dioclea Kunth sect. Dioclea. A partir desse trabalho foram embasados os critérios para o restabelecimento de Bionia por Queiroz (2008) que descreveu cinco espécies: B. bella Mart. ex Benth., B. coccinea Mart.ex Benth., B. coriacea (Ness & Mart.) Benth., B. pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz e B. tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz.

Filogenias moleculares, no entanto, indicam o não monofiletismo de Bionia (sensu Queiroz, 2008), devido ao posicionamento de B. bella, única espécie do gênero associada a formações florestais pluviais que ocorrem exclusivamente em um pequeno trecho da Serra da Mantiqueira no limite de Minas Gerais com o Espírito Santo (Queiroz, 1999). Dois tabalhos (Jesus, 2009; Pastore et al., 2013) apontam diferentes relacionamentos para B. bella, o primeiro baseado apenas em sequências do espaçador interno transcrito (ITS) do DNA ribossomal nuclear (rDNA) relaciona o táxon à Galactia, enquanto o segundo baseados em dados nucleares e plastidiais combinados o relaciona à Cratylia, respectivamente.

Queiroz (2008) caracteriza morfologicamente o gênero Bionia pelo hábito arbustivo, apresentando a combinação de folhas pinadas trifolioladas e pecioladas ou simples e sésseis, sendo os folíolos diversos no tamanho, forma e indumentação. A inflorescência é típica da tribo (pseudoracemos nodosos) com flores características do gênero pelo estandarte reto, não reflexo, que as deixam tubulosas; e as pétalas glabras vermelhas com presença de nectários, estandarte estreito, presença de aurículas basais e

ovário longamente estipitado. O fruto é um legume com deiscência elástica e as valvas longitudinalmente espiraladas. A semente é compressa, leticular, suborbicular, testa coriácea e hilo oblongo subterminal.

Queiroz (1999) cita a dificuldade de identificação de espécimes de Bionia devido à existência de indivíduos com caracteres intermediários. O exemplo de B. coriacea, que tem sinonimizações propostas por Bentham (1859) e Lewis (1987), é bem marcante, pois a espécie apresenta o maior polimorfismo do gênero. Esses indivíduos com morfologia intermediária, segundo o mesmo autor, podem estar relacionados à ocorrência de possíveis híbridos naturais em algumas populações simpátricas de diferentes espécies em localidades da Chapada Diamantina, Serra do Espinhaço e Planalto Central Brasileiro. Essa hipótese ajudaria a explicar os limites interespecíficos imprecisos do gênero, todavia, essa sustentação é pequena devido a pouca informação sobre biologia reprodutiva em Bionia. Bionia (sensu Pastore et al., 2013) ocorre exclusivamente em Campos Rupestres e Cerrado, em altitudes acima de 900 m, apresentando uma distribuição neotropical disjunta de altitude (Queiroz, 1999). O gênero tem na Cadeia do Espinhaço seu centro de diversidade e endemismo, onde ocorrem quatro das cinco espécies do gênero, sendo propostas mais três espécies todas endêmicas para essa região (ver Capítulo 1). Os Campos Rupestres são as formações vegetacionais típicas das altitudes superiores a 800m da Cadeia do Espinhaço (Conceição, 2008), sendo caracterizados pela elevada diversidade florística e altos níveis de endemismo (Harley & Simmons, 1986; Harley 1988, 1995; Giulietti et al., 1997; Rapini et al. 2008).

Os Campos Rupestres e Cerrado se assemelham pelos climas sazonalmente secos e ecologia marcada pela presença do fogo. Entretanto, os Campos Rupestres são tidos como mais seletivos do que o Cerrado, em geral, pelas características heterogêneas macroespaciais (altitude, topografia e latitude) e microespaciais (edáficas e microclimáticas) (Ribeiro, 2011). Essa composição de fatores extrínsecos resulta em um laboratório evolutivo, abrigando uma flora com níveis de endemismo maiores que os do Cerrado e uma marcada estruturação filogenética geográfica entre as serras disjuntas (Trovó et al., 2012; Hughes et al., 2013), diferenciando assim do Cerrado que apresentou limites porosos para a penetração e recrutamento de linhagens (Simon et al., 2009)

As principais hipóteses biogeográficas usadas para os Campos Rupestres inferem processos históricos e geográficos pretéritos como fatores importantes para a diversificação dos seus grupos. Autores como Haley & Simons (1986) já questionavam a cerca da origem da grande diversidade dos Campos Rupestres, sendo esta relacionada a uma possível origem recente. Essa abordagem espaço-temporal para os Campos Rupestres tem como marco o trabalho clássico de Harley (1988), o qual foi centrado nas variações climáticas ocorridas no Quaternário, utilizando como modelo biológico o gênero Eriope (Labiatae). Esse modelo de especiação relaciona processos evolutivos de especiação alopátrica oportunizadas por retrações geográfica nos períodos interglaciais (quentes e úmidos) e eventos hibridação por expansões geográficas que permitiriam fluxo gênico entre populações disjuntas nos períodos glaciais (frios e secos), refletindo assim os padrões geográficos atuais das espécies.

Análises de diversificação realizadas com os grupos Calliandra Benth. (Leguminosae), Chamaecrista Moench (Leguminosae), Marcetia DC. (Melastomataceae), Mimosa L. (Leguminosae), Minaria (Apocynaceae) e Croton L. (Euphorbiaceae), todos com diversificação nos Campos Rupestres e/ou Cerrado, indicam que a maior parte das espécies resultou de diversificação relativamente recente (menos de 10 milhões de anos) podendo as mesmas estarem associadas à adaptação ao fogo (Queiroz et al., 2009; Simon et al., 2009; Ribeiro, 2011; Souza et al., 2013). Porém estudos futuros devem discutir melhor como as espécies responderam diferentemente as variações ambientais nesses ambientes.

Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivos gerais propor três espécies novas para Bionia e avaliar as relações filogenéticas destas com as outras espécies do gênero (Capítulo 1), bem como investigar as relações filogenéticas interespecíficas e padrões biogeográficos do gênero (Capítulo 2). Esse estudo permitirá ampliar os conhecimentos das suas relações interespecíficas, além de produzir hipóteses filogenéticas e biogeográficas que ajudem a explicar os processos evolutivos responsáveis pela diversificação, surgimento de novas espécies e efeitos dos eventos históricos que refletiriam nos padrões geográficos de Bionia.

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Capítulo 1

Three new species of Bionia Mart. ex Benth. (Leguminosae: Papilionoideae: Phaseoleae)

(Manuscristo formatado conforme normas da revista Phytotaxa)

Three new species of Bionia Mart. ex Benth. (Leguminosae: Papilionoideae: Phaseoleae) from Espinhaço Range, Brazil

ADELINA VITORIA FERREIRA LIMA1, ÉLVIA RODRIGUES DE SOUZA1 & LUCIANO PAGANUCCI DE QUEIROZ1

1 Universidade Estadual de Feira de Santana, Departamento de Ciências Biológicas – Feira de Santana, Bahia, Brazil. email: [email protected]; [email protected]; [email protected]

ABSTRACT Bionia Mart.ex Benth. (Papilionoideae: Phaseoleae) has five species endemic to Brazil. The genus is concentrated in the eastern Brazil and it is strongly associated to high elevation areas in the Espinhaço mountain range. The genus was proposed by Bentham in 1837 and synonymized to Camptosema Hook. & Arn. The genus was reinstated by Queiroz based on the results of phylogenetic analyses of morphological data that showed that genus is not closely related to Camptosema. However, phylogenetic analyses of Pastore et. al., based on combined data of plastid and nuclear genome, indicating the polyphyletic genus with B. bella more related to Galactia than to Bionia. This paper proposes three new species of the genus Bionia in the region of the Espinhaço, in which a phylogenetic study of the Bionia was conducted based on five molecular markers to assess the relationship of these new taxa.

Key words: Chapada Diamantina. Diocleinae. Endemic. Phylogenetic analyses. Taxonomy.

Introduction

Bionia Mart.ex Benth. (Leguminosae, Papilionoideae) has five species endemic to Brazil (Queiroz 2008). The genus was created by Bentham (1837: 96), based on Martius handwrite. Later, Bentham (1840, 1859) merged Bionia and Camptosema Hook.& Arn., a genus proposed by Hooker and Arnott (1833: 129) including only C. rubicundum Hooker and Arnott (1833: 129), and included it in the tribo Phaseoleae subtribe Diocleinae (as Diocleae).

The taxonomic history of Bionia is entangled with that of Camptosema, since they were considered synonymous for almost 170 years because of the similar floral traits (Bentham 1859, 1865). This condition was accepted by other authors who transferred to Camptosema species formerly decribed in Galactia P.Br., Collaea DC. and Cratylia Mart.ex Benth (Taubert 1894, Hassler 1919, Bukart 1957, 1970). Camptosema, so circumscribed, is diagnosed only by red petals but became heterogeneous in several other vegetative and floral traits.

Queiroz (2008) re-established Bionia, recognizing it as distinct of Camptosema. This decision was based on the results of a phylogenetic analyses based on morphological data which indicated that the similarity between Bionia and Camptosema resulted from convergence of different lineages to bird pollination (Queiroz et al. 2003). This reasoning is also supported by the distinct pollen morphology in these two genera (Kavanagh & Ferguson 1981, Queiroz 1999). In this new circumscription, Bionia includes B. bella Mart.ex Benth. (2008:17), B. coccinea Mart.ex Benth. (2008:17), B. coriacea (Nees & Mart.) Benth. (2008:17), B. pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz (2008:17) and B. tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz (2008:18). However, a phylogenetic study based on nuclear and plastid molecular markers demonstrated that B. bella is more related to Galactia P.Browne than to Bionia (Pastore et al. 2013).

The distribution range of Bionia is concentrated in the eastern portion of Brazil, mostly on the Espinhaço mountain range in the Bahia and Minas Gerais states, where four species occur. In an unpublished revision of the genus Camptosema, Queiroz (1999) proposed four new species and two new varieties but highlighted the need of more data to corroborate their taxonomic status. We carried out a phylogenetic study of Bionia based on five molecular markers aimed to evaluate the relationship of these putative new taxa and three new species are being described here.

Materials and Methods

Sampling – Phylogenetic studies (Pastore et al. 2013) showed that Bionia forms a highly supported clade with Cratylia and that this Bionia-Cratylia clade is related to Galactia s.l. Thus, species of these genera were used as outgroups (Appendix 1). The sample of Bionia included four species, B. coccinea, B. coriacea, B. pedicellata and B. tomentosa, as well as the putative new species proposed in this study (Appendix 1).

Most samples were collected in the ﬁeld (silica-dried leaves), but herbarium specimens were also used. Accessions with taxon names, voucher specimens, locations, and GenBank accession numbers are listed in Appendix 1.

Extraction and Amplification of DNA – Total DNA was extracted from silica-dried leaves or herbarium material was isolated using the protocol Doyle & Doyle (1987) using 2 × CTAB (cetilmetil ammonium bromide) and purification with chloroform/isoamyl alcohol (24:1), adapted to microtubs. Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed in thermocycler (GeneAmp.PCR System 9700), using the pairs of primers specific to each region and TopTaq amplification kit (Quiagen, Hilden, Germany). After initial screening were selected five molecular markers as the most variable and informative for Bionia.

The parameters of the amplification reactions nuclear markers, ITS, primers 17SE and 26SE (Sun et al. 1994) e ETS, primers Dioc3 (Pastore et al. 2013) and 18S (Baldwin & Markos 1998) had PCR conditions 94 °C for 3 min; 28 cycles of 1 min at 94 °C, 1 min at 53 °C e 3 min at 72 ° C; followed by a ﬁnal extension of 7 min for 72 ° C. The plastids markers had some different amplifications conditions, intergenic spacer rpl32-trnL (Shaw et al. 2007), primers rpl32 and trnL, and matk gene (Wojciechowski et al. 2004), primers matK685F, matK1100L, matK1932R and trnK2R, were conditions at program: 80 °C for 5 min; 30 cycles of 1 min at 94 °C, 1 min at 50 °C and 3 min at 65 ° C; followed by a ﬁnal extension of 5 min for 65 ° C. The trnL-trnF (Taberlet et al., 1991), primers C, D, E and F, had your reaction conditions described in Sede et al. (2009).

The PCR products were quantified using electrophoresis on 1% agarose gel. The gels were photographed with Kodak equipment EDA290 and analyzed with Kodak 3D 1.6 software. These analyses were separated from PCR products of those that failed to be cleansed followed by treatment with PEG 8000 solution (Polietileno glicol). After this stage, PCR products were quantitated and photographed.

The sequencing reactions were performed using Big Dye Terminator Kit version 3.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, California) using the same primers used in amplification reactions, with the exception of ITS, ITS92 (Desfeaux et al. 1996) and ITS4 (White et al. 1990). The sequences were obtained by electrophoresis on

ABI3130XL model automatic sequencer (Applied Biosystems/Life Technologies Corporation, Carlsbad, California) following the manufacturer's instructions.

Editing sequences and alignment matrices – Complementary strands were combined and base-calling verified with the edited in the program Package Staden (Staden et al. 2003). Alignment was performed manually in PAUP* v.4.0b10 (Swofford, 2002) using the similarity criterion of Kelchner (2000).

Phylogenetic analyses of the data – The Maximum Parsimony analyses (MP) were carried out in PAUP* v.4.0 b10 (Swofford 2002). Because previous analyses of the individual matrices for each of the DNA regions that showed no significant topological disagreements, only the combined data matrix was analyzed. This matrix was constructed using five regions of DNA, two nuclear (ITS and ETS) and three plastid (rpl32 -trnL, matK and trnL-F) from 11 taxa, amounting to 55 sequences. The search for the most parsimonious trees (MPTs) was carried out using a heuristic search, 1.000 random taxon-addition, and tree bisection-reconnection (TBR) branch swapping, saving 15 trees per replicate. Trees saved in this first round were used as starting trees in a second search using the same parameters, but saving a maximum of 10,000 trees. Clade support was estimated with non-parametric bootstrapping (Felsenstein, 1985) with 1.000 pseudoreplications, simple taxon-addition and TBR branch swapping, saving 15 trees per pseudoreplicate.

Bayesian analyses were initially estimated the evolutionary model using MrModeltest v.2.3 (Nylander 2004) from the datasets. The best-ﬁtting nucleotide substitution model for each partition was selected via the Akaike information criterion (AIC) (Akaike 1974) as implemented in the program ModelTest version 3.7 (Posada & Crandall, 1998). The bayesian analyses were performed in the program MrBayes v.3.2 (Ronquist & Huelsenbeck 2003) using Cipres Science Gateway v.3.3 (Miller et al. 2010). Two simultaneous Monte Carlo Markov Chains (MCMC) were run for 3 x 107 generations sampling one tree each 1.000 generations. From of the stability, the remaining trees (8,400) were used to compute a 50% majority-rule consensus tree in PAUP* v.4.0b10 (Swofford 2002), and the frequencies of clades were taken as estimates of posterior probabilities (PP).

Results

This study resulted in an aligned array with 4,913 characters of which 4.2 % were variable and 2.4 % these were informative for parsimony, only one tree was retained with 387 steps, consistency index (CI) 0.8992 and index retention (RI) 0.7771. The clades with posterior probabilities (PP) equal to or higher than 0.95 and/or bootstrap values equal to or higher than 0.75 (BS) are indicated in the 50% majority- rule consensus tree from the Bayesian analysis of the combined data (Fig. 1).

The monophyly of the Bionia (clade B) was supported by our analyses with Cratylia as your sister group (clade A). Our studies showed three well-supported relationships in Bionia (clade B) in all analyses: 1) Clade C, B. coccinea as sister group of B. tomentosa; 2) Clade D, grouping B. coriacea, B. canescens, B. pedicellata and B. rugosa, 3) Clade E, B. pedicellata as sister group of B. rugosa. However, only the MP placement of B. grao-mogolensis as sister group the other species of the genus was supported. But the morphological characters analyzed showed homoplasy. Geographic structure was found across Chapada Diamantina (Bahia) and Espinhaço Range (Minas Gerais), with species from the same area tending to group together in the phylogeny.

Taxonomic treatment

Bionia canescens L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, sp. nov. (Fig. 2)

Bionia canescens resembles B. pedicellata by simple and sessile leaves, but differing by leaves with deeply cordate base, indumentum of branches, lower surface of the leaves and outer surface of the calyx densely woolly and silvery.

Type:— BRAZIL, Bahia, Abaíra, caminho Boa Vista para Bicota, 1200–1600 m elevation, 9 July 1995, F. França, E. Melo, L.P. de Queiroz, W. Ganev 1289 (holotype HUEFS, isotypes K, NY, RB).

Spindly shrub, few ramified, 0.6–1.5 m high; young branches woody, densely lanate, trichomes erect, intertwined, long (ca. 2 mm long), and canescent. Stipules 3.5–4 × 1–

1.5 mm, linear-lanceolate, slendery acuminate, outer surface lanate, inner surface glabrous. Leaves simple, sessile, petiole absent, pulvine 2–3 mm long or absent, stipels

absent; lamina 5.1–7.5 × 4–6 cm, stiff, coriaceus, widely elliptic to suborbiculate; apex rounded or emarginated; base deeply cordate; margin highlighting the indumenta; venation pinnate, brochidodromous, 6–7 pairs of secondary veins diverging from the main vein at an angle of ca. 45–60°, upper surface rugose, tomentose, under surface densely lanate, trichomes canescent, long, intertwined. Pseudoracemes axillary, (2.5–)

6–9 (–11.5) cm long, about equaling the subtending leaf, axis densely lanate, flowered from the basal 1/3th, brachyblasts 15–20, capitate, 5–6–flore; pedicels 3–4 mm long; first order bracts 3–4 × 1 mm, caducous, linear-lanceolate to lanceolate, slendery acuminate, outer surface lanate, inner surface glabrous; second order bracts ca. 2 × 0.8 mm, lanceolate, slendery acuminate, outer surface lanate, inner surface glabrous; bracteoles 3–4 × 1–1.5 mm, persistent, lanceolate, acuminate, outer surface lanate, inner surface glabrous. Flowers 3–3.3 cm long; calyx fleshy, cartaceous, cylindrical, outer surface lanate, canescent, inner surface densely sericeous at the distal half, tube 10–12 mm long, ca. 7 mm wide at the rim, upper lobe 10–12 × 7 mm, entire, ovate, apex acuminate or obtuse, lateral lobes 5–6 × 4 mm, ovate, oblique, acute, lower lobe 8–9 × 4 mm, lanceolate, acuminate. Petals red; standard lamina 2.2–2.4 × 1.7–1.8 cm, elliptic, apex rounded, base truncate provided with two membranous, inflect auricles, ca. 2 × 2–

3 mm, claw ca. 9 mm long; wing petals lamina 1.6–1.8 × 0.5–0.6 cm, oblong-linear, apex rounded, base asymmetric, sagittate at the upper side, sometimes slightly denticulate at the lower margin, claw 12–14 mm long; keel petals lamina 1.8–1.9 × 0.6 cm, elliptic-linear, straight, joined along the lower margin from the basal 1/2th, claw

12–13 mm long; staminal tube 1.9–2.2 cm, membranous, straight, vexillary stamen free at the base by ca. 2 mm, filaments free at the apex by 6–7 mm; anthers ca. 2 × 1 mm, narrowly elliptic; disc 1–1.5 × 1.5 mm, conic, rim truncate, laterally smooth; stipite 6–8 mm long, ovary 6–8 mm long, linear, densely canescent lanate, straight, 7–8–ovulate,

style 10–12 mm long, glabrous. Legume ca. 7 × 4 cm, 5–7–seeded, linear, apex truncate, rostrate, base cuneate, margins straight, stipite ca. 8 mm long; valves woody, densely canescent lanate, slightly constrict between the seeds, endocarp forming membranous translucent packages around the seeds. Seeds oblong-ovate, laterally compressed; testa smooth, coriaceous, dark purple; hilum oblong, subterminal.

Paratypes:— BRAZIL. Bahia: Abaíra, caminho Capão-Serrinha-Bicota, 1220–

1450 m.s.n.m., 26 April 1994 (fl), W. Ganev 3128 (HUEFS, K, SPF); Guarda-Mor,

Capão de Quinca, 1300 m.s.n.m., 19 July 1993 (fl), W. Ganev 1898 (HUEFS, K, SPF); caminho Boa Vista para Bicota, 1200–1600 m.s.n.m., 9 July 1995 (fl), F. França et al.

1289 (HUEFS, K, SPF); estrada para Serrinha e Bicota, 20 April 1998 (fl), L.P. de

Queiroz et al. 5046 (HUEFS); platô da Serra da Tromba, próximo à nascente do rio de

Contas, 20 April 1998 (fl), L.P. de Queiroz et al. 5079 (HUEFS); Serra da Tromba: platô da serra, 29 April 2011 (fl, fr), E.R. de Souza et al. 684 (HUEFS); Piatã, sopé da serra de Santana, a E da cidade de Piatã no caminho para a Capela, 1180 m.s.n.m., 2

November 1996 (fl, fr), L.P.de Queiroz et al. 4718 (HUEFS).

Distribution and habitat:— Bionia canescens is possibly endemic to the mountains near the Catolés village (Bahia) in southern slopes of the Chapada

Diamantina mountain range. It occurs in Campos Rupestres vegetation above 1,300 m elevation. Flowering in April, July and September.

Etymology:— the epithet alludes the densely canescent lanate indument of leafs.

Relationships and DNA Sequence:— Bionia canescens is more similar to B. pedicellata, both sharing the simple, sessile and densely indumented leaves, this is also supported by molecular data that showed geographic structure where species of

Chapada Diamantina (Bahia) grouped in a same clade. This clade relates B. canescens

to the clade formed by B. pedicellata and B. rugosa. Bionia canescens and B. pedicellata could be differentiated by leaves with deeply cordate base of the leaves (vs. rounded to truncate in B. pedicellata) and densely canescent lanate indument of leaf undersurface, young branches and calyx (vs. puberulous and gray indument). Whereas

B. rugosa showed leaves pinnately trifoliolate and petiolate differing of B. canescens and B. pedicellata.

Bionia grao-mogolensis L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, sp. nov. (Figs. 2A–B and 4).

Type:— BRAZIL, Minas Gerais: Grão Mogol, Serra de Grão Mogol, 8 January 2003, L.P. de Queiroz E.R. de Souza, J. Costa, A.S. Conceição, M.A. dos Santos.7535 (holotype HUEFS, isotypes BHCB, HUEFS, K, MO, NY, RB, SPF).

Similar to Bionia tomentosa by the trifoliolate leaves with indumented leaflets but differing by the shape (ovate in B. grao-mogolensis vs. oblong to elliptic in B. tomentosa) and indument of the leaflets (silvery and sericeous vs. tomentose and tan, respectively) and the relative length of the petiole (equal or longer vs. shorter than the distal leaflet).

Spindly shrub, 1–2 m high; young branches densely sericeous, trichomes adpresse, long, canescent or silvery. Stipules 1.5–2 × 0.8–1.2 mm, ovate, acuminate, base swollen.

Leaves pinnately trifoliolate, petiole 2.5–6.5 (–7.3) cm long, ca. 4–5 mm belonging to the pulvine, ca. 2x longer (rarely equaling) than the leaflets, sulcate at the upper side, sericeous; rachis 4–13 mm long; pulvinules 2–3 mm; stipels 1.5–2 mm, stiff, subulate; leaflets coriaceous, ovate; apex abruptly acuminate, base cordate, venation pinnate, brochidodromous, 6–7 pairs of secondary veins diverging from the main vein at an angle of ca. 45–60°; distal leaflet 3.7–5.7 × 1.8–3 cm, lateral leaflets 3.5–5.1 × 1.8–2.6 cm, asymmetric, strongly discolor, upper surface sparsely velutinous, lower surface densely silvery sericeous to lanate. Pseudoracemes axillary, 4.5–9 cm long, slightly

longer or slightly shorter than the subtending leaf, flowered by ca. 1/3 of the total length, brachyblasts ca. 7, capitate or cylindrical, 6–8-flore; pedicels 5–6 mm; first order bract caducous; second order bract ca. 0.8 × 0.8 mm, caducous, widely ovate, outer surface pubescent, inner surface glabrous; bracteoles ca. 1.2 × 1 mm, semipersistent, ovate, apex obtuse, outer surface pubescent, inner surface glabrous. Flowers 3–3,5 cm long; calyx fleshy, cylindrical, outer surface adpresse pubescent, inner surface adpresse pubescent at the distal third, tube ca. 9 mm long, 5 mm wide at the rim, upper lobe 7 × 6 mm, entire, widely ovate, apex acuminate, lateral lobes 6 × 2,5 mm, lanceolate, acuminate, lower lobe 6.5 × 1.5 mm, lanceolate, acuminate. Petals red, standard lamina

2.2–2.4 × 1.2–1.3 cm, elliptic-obovate, apex rounded, base truncate provided with two membranous, inflect auricles, ca. 2.5 × 1.5 mm, claw ca. 5 mm long; wing petals lamina

1.7–1.9 × 0.4–0.5 cm, linear-oblong, apex rounded, base asymmetric, sagittate at the upper side, claw ca. 12 mm; keel petals lamina 1.8–2 × 0.4–0.5 cm, linear-elliptic, straight, joined along the lower margin at the distal half, claw ca. 12 mm; staminal tube

19–21 mm long, membranous, straight, vexillary stamen free at the base by ca. 1.5 mm, filaments free at the apex by 7–8 mm, anthers ca. 1 mm long., narrowly elliptic; disc ca.

1.5 × 0.8 mm, conic, rim truncate, laterally smooth; stipite 9–10 mm long, ovary 10–11 mm long., linear, densely brownish sericeous, straight, 10–ovulate, style 9–10 mm long, glabrous. Legume 8–8.7 × 0.8–1.2 cm, 5–7–seeded, linear, apex rostrate, base cuneate, margins straight, stipite ; valves woody, sparsely adpresse puberulous, slightly constrict between the seeds, endocarp forming membranous translucent packages around the seeds. Seeds (immature) oblong, laterally compressed; testa smooth, coriaceous, dark purple; hilum oblong, subterminal.

Paratypes:— BRAZIL, Minas Gerais: Grão-Mogol, margem direita do rio

Itacambiruçu, entre a ponte para Cristália e a Fazenda Jambeiro, 650 m.s.n.m., A. Bidá

et al. in CFCR 12056 (K, SPF); vale do rio Itacambiruçu, 5 September 1990 (fl),

M.T.V.A. Campos et al. in CFCR 13251 (SPF); vale do riacho Ribeirão, 3 September

1986, I. Cordeiro & R. Mello-Silva in CFCR 10078 (K, SPF); ao norte de Grão-Mogol,

27 November 1984 (fl), R.M. Harley el al. in CFCR 6488 (SPF); ca. 5–15 km ao norte da cidade, 16 October 1988 (fl), R.M. Harley et al. 25097 (K, SPF); rio Itacambiruçu,

21 October 1978 (fl.), G. Hatschbach 41543 (MBM, MU, NY); 5 km N Grão-Mogol,

1.000 m.s.n.m., 18 February 1969 (fr.), H.S. Irwin et al. 23495 (F, NY, UB, US); próximo à saída na estrada para Francisco Sá, 07 January 1986 (fl, fr), R. Mello-Silva et al. in CFCR 8982 (SPF); beira do riacho Ribeirão, 21 May 1987 (fl), J.R. Pirani & R.

Mello-Silva in CFCR 10776 (SPF); Balneário do Corrégo- estrada antiga dos escravos, aprox. 16º 34’S, 42º 53ºW, 19 April 2012 (fl), E.R. de Souza & A.V.F. Lima 845

(HUEFS); Francisco Sá:30Km antes da cidade, aprox. 16º25’S, 42º18’W, 19 April 2012

(fl,fr), E.R. de Souza & A.V.F. Lima 855 (HUEFS).

Distribution and habitat:— It is known only from northern Minas Gerais, at the Grão Mogol and Francisco Sá municipalities. It occurs in Campo Rupestre vegetation, on sandy soil, between 900 and 1000 m of elevation. Flowering between

September and November (one record in April); fruiting in January to February.

Etymology:— the epithet should be the location of the species restricted to Grão

Mogol and nearby.

Relationships and DNA Sequence:— Bionia grao-mogolensis could be distinguished by the combination of the ovate leaflets with lower surface silvery due to a dense cover of sericeous-lanate indument, in which the silvery indumentum contrast with the brown coloration of the ribs attach to the leaflets discolor aspect, and petiole longer or equal to the length of the distal leaflet. It was related only to the MP clade formed by other species Bionia and occurs sympatrically with B. coccinea, B. coriacea

and B. tomentosa. Bionia grao-mogolensis is easily distinguished from B. coccinea by its trifoliolate (vs. simple) leaves and from B. coriacea by its sericeous-lanate (vs. glabrous) leaflets. It is differentiated from B. tomentosa by the shape (ovate in B. grao- mogolensis vs. oblong in B. tomentosa) and color of the indument of the leaflets (silvery vs. ferrugineous).

Bionia rugosa L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, sp. nov. (Fig. 2C–D and 5).

Bionia rugosa is similar to B. tomentosa which differs by more narrow leaves with rough upper surface, stipules, and bracts lacínios the narrower and elongated along the axis of the cup and slender and longer than the adjacent sheets inflorescence.

Type:— BRAZIL, Bahia: Catolés, Estrada para Abaíra, 13º17’S 41º48’W, 1059 m elevation, 7 September 1996, R.M. Harley, L.P. de Queiroz, A.M. Giulietti, M.A. Mayworn 28353 (Holotype HUEFS, isotypes CEPEC, K, RB, SPF).

Spindly shrub, few ramified, 0.7–2.5 m high; young branches woody, densely villous, trichomes ferrugineous. Stipules 5–8 × 0.7–1.5 mm, setiform, outer surface pubescent, inner surface glabrous. Leaves pinnately trifoliolate, petiole 0.9–2.7cm long, ca. 3–5 mm belonging to the pulvine, shorter than leaflets, sulcate at the upper side, densely villous; rachis 4–11 mm; pulvinules 1.5–4 mm; basal stipels 2.5–5 mm, distal stipels shorter, 1–4 mm, pilose, stiff, subulate; leaflets stiff, coriaceus, conduplicate lengthwise along the main vein, margin revolute, oblong-linear, 3.5–5 × longer than wider, apex acute or obtuse, mucronate, base rounded or truncate, venation pinnate, brochidodromous, 7–9 pairs of secondary veins diverging from the main vein at an angle of ca. 45°, strongly impressed at the upper surface, raised and reticulate at the lower surface, distal leaflet 7.1–8.5 × 1.5–2.7 cm, lateral leaflets 5.5–8.2 × 1.3–2.4 cm, symmetric, upper surface rugose to almost bullate, glabrescent or densely pilose, under surface reticulate, densely villous, veins discolor, brown. Pseudoracemes axillary, 12–

18.5 cm, twice or longer than the subtending leaf, axis villous, ferrugineous, flowered by the 3/4th to 1/2th end, brachyblasts (8–)12–24, capitate, 5–6 flore; pedicels 2–5 mm; first order bracts 7–9 mm, caducous, linear-lanceolate, long acuminate, outer surface pubescent, inner surface glabrous; second order bracts 6–7 mm, linear-lanceolate, acuminate, outer surface pubescent, inner surface glabrous; bracteoles 4–6 mm, semipersistent, linear-lanceolate, outer surface pubescent, inner surface glabrous; pedicels 2–4 mm. Flowers 3.5–4.5 cm long; calyx fleshy, cartaceous, cylindrical, outer surface densely velutinous, ferrugineous, inner surface sericeous at the distal half, tube

9–11 mm long, 6–7 mm wide at the rim, upper lobe 9–11 × 7–9 mm, entire, ovate, apex obtuse or abruptly acuminate, lateral lobes 4–6 × 2–3 mm, obliquely ovate, oblique, acute or acuminate, lower lobe 9–11 × 3–4 mm, lanceolate, acuminate. Petals red; standard lamina 2.3–2.7 × 1.7–1.8 cm, elliptic, apex rounded, base truncate provided with two membranous, inflect auricles, ca. 1.5 × 2 mm, claw 7–9 mm long; wing petals lamina 1.6–1.9 × 0.5 cm, oblong-linear, apex rounded, base asymmetric, sagittate at the upper side, claw 12–16 mm long; keel petals lamina 1.7–2.1 × 0.5–0.6 cm, elliptic- linear, straight, joined along the lower margin from the basal 1/3th, claw 10–16 mm long; staminal tube 2–2.5 cm, membranous, straight, vexillary stamen free at the base by 1–3 mm, filaments free at the apex by 8–11 mm; anthers 1.8–2 × 0.8 mm, narrowly elliptic; disc 0.5–1 × 1.5–2 mm, conic, rim truncate, laterally smooth; stipite 11–12 mm long, ovary 11–12 mm long, linear, densely canescent wooly, straight, 11–12 ovulate, style 9–11mm long, glabrous. Legume ca. 8.5 × 1.2 cm, 8-10–seeded, linear, apex obtuse, rostrate, base cuneate, margins straight, stipite ca. 12 mm; valves woody, densely puberulous, slightly constrict between the seeds, endocarp forming membranous translucent packages around the seeds. Seeds 7–8 × 4–5 × 2 mm, oblong, laterally compressed; testa smooth, coriaceous, tan; hilum oblong, subterminal.

Paratypes:— BRAZIL, Bahia: Abaíra, distrito de Catolés, ca. 1 km de Catolés,

Fonte do Meio, estrada Catolés-Furnas, 1050–1100 m.s.n.m., 9 July 1995 (fl), F.

França et al. 1245 (HUEFS); estrada Catolés-Abaíra, 4–5 km de Catolés, Engenho de

Baixo, 1050 m.s.n.m., 19 May 1992 (bt), W. Ganev 315 (HUEFS, K, SPF); estrada

Catolés-Abaíra, ca. 3 km do entroncamento, próximo ao rio Tomboro, 1100 m.s.n.m.,

25 June 1992 (fl), W. Ganev 581 (HUEFS, K, SPF); estrada Catolés-Inúbia, serra em frente à Samambaia, ca. 6 Km de Catolés, 1200 m.s.n.m., 28 July 1992 (fl), W. Ganev

762 (HUEFS, K, SPF); 1100 m.s.n.m., 14 July 1993 (fl.), W. Ganev 1840 (HUEFS, K,

SPF); 1000 m.s.n.m., 21 February 1994 (fl), W. Ganev 3030 (HUEFS, K, SPF); 1150-

1300 m.s.n.m., 5 May 1994 (fl), W. Ganev 3218 (HUEFS, K, SPF); 930 m.s.n.m., 12

April 1994, (bt), W. Ganev 3246 (HUEFS, K, SPF); estrada Catolés-Inúbia, Engenho dos Vieiras, 1100 m.s.n.m., 9 July 1994 (fl), W.Ganev 3479 (HUEFS, K, SPF); ca. 1 km de Catolés, Fonte do Meio, estrada Catolés-Furnas, 1050–1100 m.s.n.m., 9 July 1995

(fl), L.P. de Queiroz 4342 (HUEFS, K, MBM, NY, SPF); estrada para Serrinha e

Bicota, 20 April 1998 (fl., fr.), L.P. de Queiroz et al. 5044 (HUEFS); encosta da serra do Atalho, subida pela Boca do Leão, 20 April 1998 (bt), L.P. de Queiroz et al. 5072

(HUEFS); Abaíra: Serra da Tromba, 29 April 2011 (fl), E.R. de Souza et al.683

(HUEFS); estrada Catolés-Abaíra, 2km de Catolés, 1 May 2011 (fl), E.R. de Souza et al.

692 (HUEFS).

Distribution and habitat:— This new specie is recorded only from a small area near the Catolés village in the southern slopes of the Chapada Diamantina mountain range (Bahia), locally known as Serra do Atalho and Serra da Tromba. It grows in

Campos Rupestres and open grasslands on sandy soil, between 930 to 1300 m elevation.

Flowering between May and July; fruiting in July.

Etymology:— the epithet alludes to the leaflets with upper surface strongly rugose.

Relationships and DNA Sequence:— Bionia rugosa is more similar to B. tomentosa because of the similar ferrugineous indument of the leaflets and young branches. It could be differentiated from B. rugosa by the narrower (oblong-linear, ca.

4–5 × long than wide vs. oblong, ca. 2.5–3 × long than wide) and revolute (vs. plane) leaflets with upper surface strongly rugose (vs. plane) and longer and slender inflorescences. It occurs together with B. coriacea, B. canescens and B. pedicellata, which was also the molecular data related (Clade D). It is differentiated from B. coriacea by the indumented and rugose (vs. glabrous and plane) leaflets and from B. canescens and B.pedicellata by the trifoliate (vs. simple) leaves. Bionia pedicellata was sister taxon of B. rugosa (Clade E) showed simple leaves as a homoplastic morphological character in the opposite of analyses morphological by Queiroz (1999) that reconstruction a clade of simple leaves species.

Acknowledgements

We thank Alessandra Schnadelbach, Lamarck Rocha and Marla Ibrahim for help suggestions for improving this manuscript; the staff at HUEFS herbarium, especially

T.S. Nunes, the Programa de Pós-Graduação em Botânica (PPGBot - UEFS), and

LAMOL. We also thank the “Programa de Pesquisa em Biodiversidade do Semiárido”

(PPBio Semiárido - MCT/CNPq) and “Sistema Nacional de Pesquisa em

Biodiversidade” (SISBIOTA, CNPq 563084/2010-3 and FAPESB PES0053/2011) for financial support. AVFL was supported by the “Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior” (CAPES/PNADB) and “Sistema Nacional de Pesquisa em

Biodiversidade” (CNPq/ SISBIOTA nº 384289/2013-4). ERS and LPQ were supported by CAPES/PNPD nº 02697/09-2 and CNPq/PQ nº 301308/2007-1, respectively.

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Appendix 1. Species used in phylogenetic study were identified in the following order: name of taxon, voucher, country, state and Genbank accession number (ITS, ETS, rpl32-trnL, matK and trnL-F).

Bionia canescens L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, E.R. Souza 684, Abaíra, BA; Bionia coccinea Mart. ex Benth, E.R. Souza 875, Diamantina, MG, KJ402381, KJ402370, KJ402403, -, KJ402392; Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth, K.R.B. Leite 423, Palmeiras, BA, KJ402382, KJ402371, KJ402404, -, KJ402393; Bionia grao- mogolensis L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, E.R. Souza 844, Grão Mogol, MG, KJ402383, KJ402372, KJ402405, -, KJ402394; Bionia pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz, L.P. Queiroz 14851, Umburanas, BA, KJ402384, KJ402373, KJ402406, -, KJ402395; Bionia rugosa L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, E.R. Souza 692, Abaíra, BA, KJ402385, KJ402374, KJ402407, -, KJ402396; Bionia tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz, E.R. Souza 888, Diamantina, MG, KJ402386, KJ402375, KJ402408, -, KJ402397; Cratylia mollis Mart. ex Benth, J.G. Rando 1257, Feira de Santana*, BA, KJ402376, KJ402376, KJ402365, KJ402398, -, KJ402387; Cratylia spectabilis Tul, L.P. Queiroz 5087, Piracicaba*, SP, KJ402377, KJ402366, KJ402399, -, KJ402388; Galactia glausescens Kunth, L.P. Queiroz 14060, Nova Roma, GO, KJ402378, KJ402367, KJ402400, -, KJ402389; Galactia remosoana Harms, L.P. Queiroz 14659, Barra, BA, KJ402379, KJ402368, KJ402401, -, KJ402390.

Figure legends

FIGURE 1. Majority-rule (50%) consensus tree of 8,400 trees sampled at stationarity from the Bayesian analysis based on nuclear (ITS and ETS) and plastids (rpl32-trnL, matk and trnL-F) molecular markers. Numbers on the branches indicate posterior probabilities (PP) ≥ 0.95 and bootstrap values (BS) ≥ 0.75 of the maximum parsimony (MP) analyses, respectively.

FIGURE 2. Bionia canescens: A. Flowering branch [scale bar = 2 cm]. B. Detail of the lower face of the leaf [= 1 cm]. C. Detail of leaf margin highlighting the indument [= 5.9 mm]. D. Flower bud [= 10.2 mm]. E. Flower [= 10.2 mm]. F. Open calyx, inner view [= 11.2 mm]. G. Standard petal [= 12.8 mm]. H. Wing petal [= 12.8 mm]. I Keel petal [= 12.8 mm]. J. Pistil [= 10.3 mm]. K. Detail of the floral nectary around the base of the stipite [= 1.6 mm]. Drawn from by Ivan Castro.

FIGURE 3. Bionia grao-mogolensis: A. Flowering branch [scale bar = 2 cm]. B. Part of the leaf showing the tip of the petiole, leaf rachis, stipels and distal leaflet [= 1.6 cm]. C. Detail of lower surface of the leaflet highlighting the indument [= 6.4 mm]. D. Flower [= 1 cm]. E. Open calyx, inner view [= 6.5 mm]. F. Standard petal [= 6.5 mm]. G. Wing petal [= 6.5 mm]. H. Keel petal [= 6.5 mm]. I. Pistil [= 6.5 mm]. Drawn from by Ivan Castro.

FIGURE 4. Bionia rugosa: A. Flowering branch [scale bar = 3.7 cm]. B. detail of the branch at the petiole attachment highlighting the long stipule [= 2.6 mm]. C. Detail of the stipels of the lateral (C1) and distal (C2) leaflets [= 3.4 mm]. D. Distal leaflet, upper surface [= 2 cm]. E. Detail of the leaflet highlighting the rugose upper surface (E1) and and villous lower surface (E2) [= 3.1 mm]. F. Flower bud [= 1 cm]. G. Flower [= 1 cm]. H. Open calyx, inner view [= 1 cm]. I. Standard petal [= 1 cm]. J. Wing petal [= 1 cm]. K. Keel petal [= 1 cm]. L. Pistil [= 1 cm]. M. Detail of the floral nectary around the base of the stipite [= 2.7 mm]. Drawn from by Ivan Castro.

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

Figure 5 43

CAPÍTULO 2

FILOGENIA E PADRÕES BIOGEOGRÁFICOS DE BIONIA (PAPILIONOIDEAE: PHASEOLEAE –

DIOCLEINAE)

(Manuscrito formatado conforme normas da revista Taxon)

Filogenia e padrões biogeográficos de Bionia (Papilionoideae: Phaseoleae – Diocleinae)

Adelina V.F. Lima¹; Élvia R. de Souza¹; Patrícia L. Ribeiro¹, Luciano P. de Queiroz¹.

¹Programa de Pós-graduação em Botânica, Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, Novo Horizonte, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil Autor para correspondência: Adelina Lima, [email protected]

Resumo Bionia Mart. ex Benth. (Papilionoideae: Phaseoleae – Diocleinae) possui cinco espécies endêmicas do Brasil. O gênero concentra-se nas principais serras e planaltos da parte centro-leste do país com centro de diversidade na Cadeia do Espinhaço. Bionia foi criado por Bentham em 1837 e considerado sinônimo de Camptosema W.J. Hook. & Arn. pelo mesmo autor em 1840, onde se manteve até ser segregado e restabelecido por Queiroz, baseado nos resultados das análises filogenéticas que indicaram o polifiletismo de Camptosema. Bionia pode ser caracterizado morfologicamente, principalmente, pelo hábito arbustivo, combinação de folhas pinadas trifolioladas e pecioladas ou simples e sésseis; flores com estandarte reto, não reflexo, que as deixam tubulosas; e as pétalas glabras vermelhas. Todavia, a identificação de espécimes de Bionia tornasse difícil devido à existência de indivíduos com caracteres intermediários. A fim de avaliar o padrão de evolução de Bionia algumas hipóteses foram testadas como (1) Bionia é um gênero de origem recente como é a maioria das linhagens de Cerrado (Simon & al., 2009) e Campos Rupestres (Queiroz & al. 2009)? (2) a filogenia do gênero está estruturada geograficamente entre os principais núcleos de Campos Rupestres na Cadeia do Espinhaço (Bahia e Minas Gerais)? (3) a taxonomia complexa do gênero, com vários intermediários, pode ser explicada pela diversificação recente do gênero? As relações filogenéticas entre as espécies de Bionia foram investigadas através de análises de Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Bayesiana com base em sequências de DNA dos genomas nuclear e plastidial (ITS, ETS, rpl32- trnL, trnQ-rps16, matK, trnL-trnF) para múltiplos acessos. Estas análises indicaram que a incongruência entre dados moleculares e morfológicos e a estruturação geográfica podem ser resultado da diversificação recente, bem como da evolução reticulada das espécies das diferentes áreas de Campos Rupestres e Cerrado.

Palavras-chave: Biogeografia. Cadeia do Espinhaço. Campos Rupestres. Cerrado. Diversificação. Hibridação.

Abstract Bionia Mart. ex Benth. (Papilionoideae: Phaseoleae - Diocleinae) has five species endemic to Brazil. The genus is concentrated in the main ridges and plateaus of the east-central part of the country with the center of diversity in the Espinhaço Range. Bionia was created by Bentham in 1837 and considered synonymous with Camptosema W.J. Hook. & Arn. by the same author in 1840, where he remained until being secreted and re-established by Queiroz, based on the results of phylogenetic analyses indicated

that the polifiletic Camptosema. Bionia can be morphologically characterized mainly by a shrub, combination of leaves pinnate trifoliate and petiolate or simple and sessile; flowers with no reflection, straight tubular banner that leave; and red petals glabrous . However, identification of specimens of Bionia become difficult due to the existence of individuals with intermediate characters. The historical relationships among species of Bionia were assessed using Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian DNA based in sequences of nuclear and plastid genomes (ITS , ETS , rpl32 - trnL, rps16 - trnQ, matK, trnL - trnF) to multiple accessions. These analyses indicate that the incongruence between molecular and morphological data and the geographic structure may be the result of recent diversification and reticulate evolution of species from different areas of Campos Rupestres and Cerrado. In order to evaluate the pattern of evolution of Bionia some hypotheses were tested as: (1) the phylogenetic incongruities of the group are related to the recent diversification; (2) geographic patterns of Bionia is congruent with the history of other groups in “Campos Rupestres” and “Cerrado”; and (3) the biogeographic history of the Bionia may be related to hybridization events. Key words: Biogeography. Campos Rupestres. Cerrado. Diversification. Espinhaço Range. Hybridization.

Introdução

Bionia Mart. ex Benth. é um pequeno gênero de Leguminosae-Papilionoideae classificado na tribo Phaseoleae subtribo Diocleinae (Queiroz, 2008). A atual circunscrição do gênero compreende cinco espécies distribuídas no centro-leste do Brasil (Queiroz, 2008). O gênero é caracterizado pelo hábito arbustivo, folhas trifolioladas e pecioladas ou simples e sésseis e flores vermelhas com estandarte reto não reflexo o que confere à corola um aspecto tubuloso (Queiroz, 2008). Na mesma obra em que criou o gênero Bionia, Bentham (1837) reconheceu Camptosema como um gênero distinto. Em trabalhos subsequentes, o autor considerou Bionia como sinônimo de Camptosema (Bentham 1859, 1865), posição mantida por Burkart (1970), que adicionou a Camptosema espécies então classificadas de Cratylia Mart. ex Benth., Collaea DC. e Galactia P. Browne.

Estudos de filogenia da subtribo Diocleinae baseados em dados morfológicos (Queiroz & al., 2003) demonstraram o polifiletismo de Camptosema (sensu Burkart, 1970), uma vez que as espécies deste gênero agruparam-se em três linhagens distintas. As espécies de Bionia formaram um clado irmão do clado que agrupa as espécies de Cymbosema Benth. e Dioclea Kunth sect. Dioclea. Baseado nesses resultados, Queiroz (2008) restabeleceu o gênero Bionia no qual incluiu cinco espécies segregadas de

Camptosema: B. bella Mart. ex Benth., B. coccinea Mart. ex Benth., B. coriacea (Nees & Mart.) Benth., B. pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz e B. tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz. Trabalhos posteriores baseados em marcadores moleculares nucleares e plastidiais (ITS e trnL-F, Jesus 2009; ITS, ETS, matK e trnTY, Pastore & al., 2013) confirmaram o polifiletismo de Camptosema, mas, diferentemente do encontrado por Queiroz & al. (2003), indicaram que B. bella não relacionado ao núcleo de espécies do gênero Bionia.

A taxonomia das espécies de Bionia foi estudada (como Camptosema) por Queiroz (1999). Esse estudo revelou um padrão complexo, no qual a variação morfológica dos caracteres vegetativos (principalmente indumento e número de folíolos) consegue estabelecer a distinção entre as espécies. Essa caracterização baseada em caracteres vegetativos, historicamente, gera dificuldade na identificação de espécimes de Bionia devido à existência indivíduos com caracteres intermediários. O exemplo de B. coriacea, que tem sinonimizações propostas por Bentham (1859) e Lewis (1987), é bem marcante, pois a espécie apresenta o maior polimorfismo do gênero o que lhe conferiu vários nomes. Esses indivíduos com morfologia intermediaria, segundo Queiroz (1999), pode estar relacionados à ocorrência de possíveis híbridos naturais em algumas populações simpátricas de diferentes espécies em localidades da Chapada Diamantina, Serra do Espinhaço e Planalto Central Brasileiro.

A exclusão de B. bella, uma espécie de floresta ombrófila submontana, indica que Bionia é um gênero restrito a áreas montanhosas em vegetação de Campos Rupestres e Cerrado. O centro de diversidade e endemismo de Bionia (sensu Pastore & al., 2013) concentra-se na Cadeia do Espinhaço (Queiroz, 1999). Essa cordilheira localiza-se no leste do Brasil e se apresenta disposta em uma série de montanhas e planaltos descontínuos, interrompidos por vales e grandes depressões. Ocupa uma área de, aproximadamente, 120.000 km2 (Giulietti & al., 1997) em dois núcleos principais separados por cerca de 300 km: um no estado da Bahia, ao norte, (Chapada Diamantina, cerca de 10ºS); o outro no estado de Minas Gerais (Serra do Espinhaço, 20º35’S). Esses dois núcleos são diferenciados no sentido norte-sul com o núcleo da Bahia mais seco e circundado pela Caatinga (Seasonally Dry Tropical Forest) e o núcleo de Minas Gerais

mais úmido e com influencia da Mata Atlântica (Ombrophilous Forest), a sudeste, e do Cerrado (Savanna), a sudoeste (Rapini & al., 2008).

Os Campos Rupestres são formações típicas das áreas mais elevadas da Cadeia do Espinhaço, geralmente associados a altitudes superiores a 800 m em afloramentos de quartzitos e solos arenosos, bem drenados, rasos, ácidos e pobres em nutrientes (Harley, 1995; Benites & al. 2003, 2007; Alves & al., 2007; Conceição, 2008; Alves & Kolbek, 2010). Os Campos Rupestres apresentam padrões de diversidade muito particulares, destacando-se alta diversidade florística local e elevados níveis de endemismo de espécies, sendo cerca de 30% destas consideradas raras (Harley & Simmons, 1986; Harley, 1988, 1995; Giulietti & al., 1997, 2009; Rapini & al., 2008). Esses ambientes incluem, sobretudo, formações herbáceo-arbustivas, frequentemente entremeadas por áreas de transição com outros tipos vegetacionais, formando um mosaico de vegetações com diferentes fitofisionomias.

A área core dos Campos Rupestres ocorre na Cadeia do Espinhaço, mas outras áreas importantes podem ser encontradas encravadas em outros Domínios Vegetacionais da América do Sul. No Domínio Amazônico encontra-se um núcleo importante na região dos Tepuis, no escudo das Guianas (Steyermark, 1979; Anderson, 1981; Pires & Prance, 1985; Steyermark & al., 1995; Romero, 2002) e no norte da Serra dos Carajás, estado do Pará (de Secco & Mesquita, 1983; de Secco & Lobo, 1988; Silva & al., 1996). Dentro do Domínio do Cerrado, além da parte sul da Cadeia do Espinhaço, existem áreas de Campos Rupestres associadas a montanhas no sul de Minas Gerais e na Serra Dourada e Serra dos Pirineus, no estado de Goiás (Romero, 2002; Rapini & al., 2008; Alves & Kolbek, 2010). No Domínio da Caatinga, além da parte norte da Cadeia do Espinhaço, são encontrados Campos Rupestres na Serra da Capivara, estado do Piauí (Alves & Kolbek 2010).

Harley (1988) propôs uma hipótese sobre a origem da flora atual dos Campos Rupestres que correlaciona à elevada diversidade e os endemismos restritos a flutuações climáticas ocorridas durante os ciclos de glaciação do Quaternário. De acordo com essa hipótese, os campos rupestres teriam sofrido processos de contração nos períodos interglaciais mais quentes e úmidos, quando teriam ficado restritos ao topo das montanhas mais elevadas com a consequente diferenciação de populações e especiação.

Nos períodos glaciais, mais frios e secos, essa vegetação se expandiria para altitudes mais baixas e permitiria o contato entre espécies próximas recém-diferenciadas, propiciando eventos de hibridação e formação de novas espécies. Trabalhos mais recentes baseados em filogenias datadas indicam uma diversificação relativamente recente da flora dos Campos Rupestres no Plioceno-Pleistoceno (Queiroz & al. 2009) e que pelo menos alguns grupos encontram-se em processo de retração (Ribeiro 2011).

O presente trabalho apresenta um estudo filogenético de Bionia baseado em dados moleculares nucleares e plastidiais, incluindo as espécies novas propostas para o gênero por Lima & al. (submetido). Além disso, objetiva desenvolver hipóteses de diversificação e biogeografia para o gênero, buscando responder as seguintes questões (1) Bionia é um gênero de origem recente como é a maioria das linhagens de Cerrado (Simon & al., 2009) e Campos Rupestres (Queiroz & al. 2009)? (2) a filogenia do gênero está estruturada geograficamente entre os principais núcleos de Campos Rupestres na Cadeia do Espinhaço (Bahia e Minas Gerais)? (3) a taxonomia complexa do gênero, com vários intermediários, pode ser explicada pela diversificação recente do gênero? (4) Bionia coriacea é uma espécie amplamente distribuída ou um complexo polifilético de espécies crípticas apresentando convergência morfológica?

Material e Métodos Amostragem, Extração, Amplificação e Sequenciamento do DNA

Estudos filogenéticos (Pastore & al., 2013) demonstram relação bem sustentada entre os gêneros irmãos Cratylia e Bionia, formando um clado relacionado a um grande clado que inclui os gêneros Galactia, Camptosema, Lackeya e Collaea. Dessa maneira, os gêneros Galactia e Cratylia foram utilizados para avaliar as relações filogenéticas de Bionia (Apêndice 1). As espécies de Bionia foram selecionadas seguindo a delimitação de Pastore & al. (2013) que excluiu B. bella (Pastore & al., 2013). A estratégia de amostragem para Bionia foi principalmente taxonômico e secundariamente geográfico, sendo adicionadas à amostragem as espécies novas propostas por Lima & al.(Capítulo 1) e uma provável espécie nova já tratada no trabalho de Queiroz (1999) como Camptosema ovalifolium, aqui referida como Bionia sp. nov. (Apêndice 1). Além disso,

foram usados múltiplos acessos nas análises para caracterizar o padrão biogeográfico da filogenia do gênero.

O DNA genômico total de cada amostra foi extraído de folhas desidratadas tanto de material fresco quanto de herbário conforme protocolo Doyle & Doyle (1987), utilizando 2 × CTAB (brometo de cetilmetil amônio) e purificação com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), adaptado para microtubos. Todas as amostras de DNA das espécies deste estudo encontram-se armazenadas em Biofreezer a -85°C no Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL) da UEFS.

A amplificação do DNA foi realizada através de reação em cadeia de polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) em termociclador (GeneAmp. PCR System 9700), utilizando os pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos para cada região. Para amplificação dos fragmentos foi realizada uma reação de 10 µL de volume, utilizando aprox. 5 – 20 ng de DNA, 0.5 µ mol/L de cada primer e o Kit de amplificação TopTaq (Quiagen, Hilden, Germany). Foram testadas 12 regiões (waxy, ITS, ETS, agt1, Rpb2, rpoC1, matK, trnL-trnF, rpl32-trnL, trnD-trnT, trnQ-rps16, trnS- G), entretanto, apenas seis delas foram selecionadas, duas regiões nucleares (ETS e ITS) e quatro regiões plastidiais (rpl32-trnL, trnQ-rps16, matK e trnL-trnF), por apresentaram sucesso na amplificação e sequenciamento. Os primers selecionados e parâmetros das reações de amplicação estão sumarizados na Tabela 1.

Os produtos das PCRs foram quantificados através de eletroforese em gel de agarose 1%. Os géis foram fotografados com equipamento Kodak EDA290 e analisados com software Kodak 3D 1.6. Os produtos das PCRs amplificados foram purificados através de tratamento com solução de PEG 8000 (Polietileno glicol). Após a limpeza com PEG os produtos das PCRs foram quantificados na presença de marcador Mass Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) e fotografados.

As reações de sequenciamento foram realizadas com o kit Big-Dye Terminator versão 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, California, U.S.A.) com os mesmos iniciadores utilizados nas reações de amplificação, exceto para o ITS, o qual foi usado os primers ITS 92 e ITS 4. As sequências foram obtidas no sequenciador automático modelo ABI3130XL (Applied Biosystem/Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, E.U.A.) seguindo as instruções do fabricante.

Análises filogenéticas

Os eletroferogramas obtidos foram editados no pacote Staden (Staden & al., 2003) e alinhadas manualmente no PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) versão 4.0b10 (Swofford, 2002) sob os critérios de Kelcher (2000), sendo os gaps tratados como dados faltantes. A matriz Comb1 (nuclear) incluiu 41 terminais e as análises Comb2 (plastídios) e Combinados (nuclear + plastídios) incluíram 42 terminais. As sequências utilizadas nesse estudo serão depositadas no GenBank. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

A identificação de possíveis incongruências foi realizada a partir dos testes de incongruência de comprimento de partições (Incongruence-lenght difference test- ILD, Farris & al., 1995) no PAUP v. 4.0b10 (Swofford, 2002), após a exclusão dos caracteres invariáveis no Mesquite v. 2.71 (Maddison & Maddison, 2010). Alternativamente, testes de ILD também foram realizados com a matriz completa, sem retirar os caracteres constantes. As análises de ILD foram realizadas através de buscas heurísticas com 500 replicações e 10 adições randômicas de sequências, considerando resultados com probabilidades p < 0,01 significativamente incongruentes (Cunningham, 1997). Estes testes em ambos os tratamentos (com e sem indels) foram analisados em particões entre as regiões nucleares, plastídios aos pares, plastídios e ITS, plastídios e ETS e nucleares com os plastidiais, a fim de detectar conflitos entre o conjunto de dados.

As análises filogenéticas foram realizadas através dos critérios de optimalidade de Máxima Parcimônia (MP) e Máxima Verossimilhança (ML) e de Inferência Bayesiana (IB). A análise de Máxima Parcimônia (MP) foi executada no PAUP v.4.0b10 (Swofford, 2002), utilizando buscas heurísticas, parcimônia de Fitch (1971) e o algorítimo TBR (tree-bisection and reconnection) com 1.000 replicações e adição aleatória de táxons, salvando até 15 árvores por replicação para prevenir buscas extensivas em ilhas subótimas. As árvores salvas nesta primeira rodada foram utilizadas como ponto de partida em uma segunda pesquisa, utilizando os mesmos parâmetros, salvando um máximo de 10.000 árvores. Os caracteres receberam pesos iguais, os estados de caracteres foram especificados como não ordenados e o critério de otimização dos estados de caráter foi o ACCTRAN (Accelerated transformation). A sustentação dos clados foi avaliada através de bootstrap no PAUP v. 4.0b10 (Swofford,

2002), com busca heurística, 1.000 pseudo-replicações com adição simples de táxons, TBR como algorítimo de reamostragem e limite de 15 árvores por replicação.

As análises baseadas em modelos evolutivos foram iniciados com a escolha entre os 24 modelos de substituição nucleotídica, testados no MrModeltest 2.3 (Nylander, 2004) individualmente para cada região, sendo o ITS particionado nas regiões ITS1, ITS2 e 5.8S, e o trnL-trnF nas regiões do íntron e do espaçador, de modo a se aplicar a cada um deles o modelo evolutivo mais adequado. As análises de Máxima Verossimilhança (ML) conduzidas no RAxML (Randomized Axelerated Maximum Likelihood; Stamatakis, 2006) e implementadas no Cipres Science Gateway v.3.3 (Miller & al., 2010). O modelo GTR + CAT, permitindo assim uma busca mais rápida entre as árvores mais bem suportadas, sendo aplicado nas oito partições idependentemente. Para o suporte foram feitas 1.000 replicações e selecionada a opção de bootstrap rápido, sendo o consenso de maioria das replicações obtido através do PAUP v. 4.0b10 (Swofford, 2002). No programa MrBayes (Huelsenbeck & Ronquist, 2001; Ronquist & Huelsenbeck, 2003) foi conduzida as análises bayesianas com 2 × 107 gerações para as análises combinadas nuclear (Comb1) e de plastídio (Comb2) e 107 gerações para as análises dos dados combinados totais, salvando em ambas uma árvore a cada 103 gerações, em duas corridas simultâneas, com quatro cadeias cada, três quentes e uma fria. Todas as corridas alcançaram a estabilidade (desvio padrão < 0,001), sendo eliminadas as árvores anteriores à estabilização (burn-in) e realizado o consenso de maioria das árvores restantes nas duas corridas com auxílio do PAUP v. 4.0b10 (Swofford, 2002). O suporte dos clados foi avaliado pela probabilidade posterior (PP).

Análises de evolução reticulada

A rede de consenso (consensus network) foi construída com o software Dendroscope 2.3 (Huson & al., 2007), com o algoritmo galled network, usando o conjunto de 1.000 árvores amostradas na estacionalidade das análises combinadas Comb1 e Comb2, adotando como limite de sustentação da possibilidade de reticulação de 30%. As diferenças em amostragem de táxons nos diferentes conjuntos de dados

foram corrigidas com o uso do algoritmo Z-closure no Dendroscope, o qual considera os táxons ausentes como dados faltantes (Huson & al., 2004). Dados fenológicos de floração foram obtidos de materiais de herbário e utilizados para identificar possíveis sobreposições dos períodos de floração entre espécies distintas de Bionia em áreas de simpatria. Essa sobreposição foi tomada como evidência de potencial fluxo gênico interespecífico.

Datação molecular

O tempo de divergência foi estimado no programa Beast v.1.6.1 (Drummond & Rambaut, 2007) usando a matriz de dados combinados, excluindo os táxons com dados faltantes. A região do espaçador trnL-trnF foi excluída da análise devido ao elevado número de táxons faltantes. A matriz totalizou 32 sequências, sendo quatro destas pertencentes ao grupo externo. Foi utilizado um modelo lognormal não correlacionado de relógio molecular (uncorrelated relaxed molecular clock), modelo de substituição nucleotídica GTR com distribuição gama e sítios invariantes (GTR+I+G) e o modelo de especiação de Yule. Foi estabelecido um total de 107 gerações, amostrando uma árvore a cada 103 gerações, até as cadeias atingirem a estacionalidade e convergência e o tamanho estimado da amostra (ESS) ser superior a 200 para todos os parâmetros da análise. Os resultados das corridas foram avaliados no programa Tracer v.1.5 (Rambaut & Drummond, 2003) e a árvore de máxima credibilidade de clados foi calculada no TreeAnnotator v.1.6.1. O cronograma foi visualizado e editado no FigTree v.1.3.1 (Rambaut, 2009).

Foi realizada uma calibração secundária para o stem node do ancestral comum mais recente (MRCA) do clado [Galactia + (Cratylia+Bionia)] (Média ± StDev = 17,4 ± 3,7 Ma) e para o stem node do MRCA de Cratylia + Bionia (10,1 ± 3,2 Ma). As idades para calibração da análise de datação em Bionia foram obtidas a partir de uma análise mais ampla de datação em Diocleinae, com base em dados de ITS, ETS, matK e trnS-G (sequências disponíveis em Pastore & al., in press.). Foram utilizadas as mesmas estratégias de busca descritas acima, modelo de substituição GTR+I+G para todas as partições e calibração com distribuição normal no stem node de Diocleinae em 45,2 ± 1,7 Ma, baseado nas idades calculadas por Lavin & al. (2005).

Análises biogeográficas

Os dados de distribuição geográfica das espécies foram retirados de Queiroz (1999) complementado com informações de materiais dos herbários ALCB, BHCB, BM, CEN, CEPEC, CTES, E, ESA, GFJP, HEPH, HRB, HRCB, HUEFS, IAC, ICN, IPA, K, MBM, MG, R, RB, SP, SPF, UB, UEC, e SI. Apenas materiais com localizações precisas foram considerados, ou seja, aqueles com as coordenadas geográficas informadas.

As espécies de Bionia ocorrem predominantemente acima de 800m, apresentando um padrão disjunto neotropical de altitude (Queiroz, 1999). A distribuição do gênero foi plotada em um mapa da região centro-leste do Brasil, ressaltando a distribuição de altitudes e a descontinuidade do relevo montanhoso. A partir da distribuição de cada espécie foram criadas oito áreas biogeográficas representativas para Bionia, considerando a conectividade geográfica e a presença de endemismos (Fig. 5 e Tabela 2).

Área A (Cerrado do Nordeste) – Cerrado disjunto cercado pela Caatinga, localizados na Serra do Catimbau (estado de Pernambuco) e na Chapada do Araripe (estado do Ceará), onde se encontra B. pedicellata var. pedicellata (inédita).

Área B (Bahia – Chapada Diamantina Norte) – áreas no bloco norte da Chapada Diamantina, com pequenas serras separadas por extensas áreas de Caatinga na região do Médio São Francisco, a Serra do Tombador e a Serra de Jacobina. Os táxons de Bionia nessa área são B. pedicellata var. pedicellata, B. pedicellata var. leptobotrys (inédita) e B. coriacea.

Área C (Bahia – Chapada Diamantina Leste) – porção sul da Chapada Diamantina oriental que abrange a Serra do Sincorá, um bloco mais ou menos contínuo com índices pluviométricos mais elevados e alta taxa de evapotranspiração, levando as condições metereológicas mais amenas dentro da Chapada Diamantina (Jesus, 1985; Grillo, 2008). Nessa área encontram-se duas variedades de B. pedicellata var. paternum (inédita), B. pedicellata var. pedicellata e B. coriacea.

Área D (Bahia – Chapada Diamantina Oeste) – porção sul ocidental Chapada Diamantina estendendo-se até os limites entre os estado da Bahia e Minas Gerais. Essa área é formada por um complexo de serras com altitudes alcançando perto de 2.000 m s.n.m. (Serra do Rio de Contas, Serra das Almas, Serra da Tromba e Serra do Salto) com grande diversidade e endemismo de espécies na Serra das Almas e Serra da Tromba (Queiroz, 1999). Bionia canescens L.P. Queiroz & A.V.F. Lima e B. rugosa

L.P. Queiroz & A.V.F. Lima são endêmicas dessa área que ainda tem B. pedicellata var. leptobotrys (inédita), B. pedicellata var. pedicellata e B. coriacea.

Área E (Minas Gerais – Serra do Espinhaço Norte) – setor norte da Serra do Espinhaço com montanhas isoladas e separadas por áreas de Caatinga e Cerrado, incluindo a Serra de Grão-Mogol em posição intermediária e disjunta entre as serras de Minas Gerais e Bahia (Pirani & al., 2003). Bionia graomogolensis é restrita a essa área que também inclui B. coccinea var coccinea (inédita), B. coccinea var. nitens (Benth.) L.P.Queiroz, B. coriacea, B. tomentosa.

Área F (Minas Gerais – Serra do Espinhaço Central) – abrange o Planalto de Diamantina, a leste, e a Serra do Cabral, a oeste. Nessa área encontram-se B. coccinea var coccinea, B. coccinea var nitens, B. coriacea e B. tomentosa.

Área G (Minas Gerais – Serra do Espinhaço Sul) – corresponde à Serra do Cipó, localizada na porção sul da Serra do Espinhaço, onde ocorrem B. coccinea var coccinea, B. coccinea var. nitens e B. tomentosa.

Área H (Cerrado Core) – corresponde à área core do Cerrado, abrangendo os estados de Goiás, oeste da Bahia, sul do Piauí e Maranhão. Esse ambiente é considerado um hotspot de biodiversidade, podendo ser caracterizado pelas baixas precipitações, solos pobres, presença de gramíneas e susceptividade ao fogo. Nessa área ocorrem B. coriacea e B. sp. nov. (= “Camptosema ovalifolium”).

A biogeografia histórica espacial de Bionia foi investigada a partir de uma análise estatística de dispersão-vicariância (S-DIVA) no RASP v. 1.107 (Yu & al., 2010, 2011). Utilizou-se uma matriz de presença/ausência de espécies de Bionia nas oito unidades biogeográficas. Estabeleceu-se o máximo de quatro áreas ancestrais que representa o número máximo das áreas das espécies atuais, à exceção de B. coriacea que ocorre em sete das oito áreas. Para considerar as incertezas filogenéticas foi considerado o conjunto de árvores resultantes da IB realizada no Beast. As probabilidades (P) consideradas para reconstrução das áreas ancestrais foram acima de 15%.

Resultados

Dados Moleculares e Análises Filogenéticas

Todas as sequências de DNA utilizadas nas análises totalizaram 318, destas 263 são inéditas. O teste de congruência (ILD) entre os genomas de mesma origem foram 55

congruentes entre si, porém, a concatenação entre os dados entre genomas distintos mostrou-se incongruente.

Foram realizadas análises de MP para os conjuntos de dados individuais e para as três combinações diferentes (Comb1, Comb2 e Combinados). A matriz completa (Combinados) com todos os dados das seis regiões utilizadas totalizou 6.504 caracteres. Destes, 4,5% são variáveis e apenas 3,3% são informativos para a parcimônia. Os dados referentes ao tamanho das matrizes alinhadas, número de terminais, número de sítios variáveis, número de passos evolutivos das árvores geradas, número de árvores salvas, bem como os índices consistência (CI) e de retenção (RI) são apresentados na Tabela 3.

Dos 24 modelos de substituição nucleotídica testados no MrModeltest 2.3, o modelo evolutivo selecionado para a IB de cada conjunto de dados foram o K80 para o ITS1 e ITS2 e JC para os dados do 5.8S; o HKY+G foi escolhido para os dados de ETS e trnL; o F81+G para os dados de para os dados de trnQ-rps16; e o GTR+I+G para os dados do matK e trnL-trnF. As árvores Comb1 e Comb2 apresentaram pouca resolução entre os táxons terminais e os dados plastidiais (Comb2) não sustentaram o monofiletismo de Bionia. A atração de ramos longos foi descartada com a análise dos filogramas (árvores não apresentadas) que evidenciaram apenas ramos curtos.

O consenso maioria de 4.000 árvores da IB do conjunto de dados Combinados apresentou maior resolução do que as árvores obtidas para os outros conjuntos de dados e foi usada para apresentação e discussão dos resultados (Fig. 1). Os clados sustentados (PP  0,95 e/ou bootstrap  0,75 para as análises MP e ML) são indicados na árvore do consenso maioria. Bionia foi sustentado como monofilético e irmão de um clado que reúne as espécies de Cratylia.

Em Bionia (clado B) foram recuperados dois clados principais (C e D). Alguns acessos de Bionia da Serra do Espinhaço/Cerrado, B. grao-mogolensis, Bionia sp. nov. e B. tomentosa, não coalesceram com as outras espécies da Serra do Espinhaço/Cerrado (clado C), formando um grado. O clado C foi sustentado com alto suporte apenas pela ML (BS 0.92), agrupando apenas espécies que ocorrem na Serra do Espinhaço e Cerrado: B. coriacea, B. coccinea var. coccinea, B. coccinea var. nitens, B. tomentosa e Bionia sp. nov. O clado D foi bem sustentado apenas pela IB (PP 1.0) e incluiu as espécie da Chapada Diamantina: B. coriacea, B. pedicellata var. pedicellata, B. 56

pedicellata var. paterna, B. pedicellata var. leptobotrys, B. rugosa e B. canescens. A única espécie cujos acessos coalesceram tanto no clado C quanto no clado D foi B. coriacea.

Evolução reticulada

Os conflitos no sinal filogenético entre as topologias na IB dos dados nucleares (Comb1) e plastidiais (Comb2) foram representados por regiões interligadas no filtro da super-rede (Fig. 3). Incongruências foram identificadas em ambos os clados de Bionia, na qual se observa eventos de reticulação filogenética entre os acessos de áreas da Chapada Diamantina, Serra do Espinhaço e Cerrado. Os dados fenológicos obtidos através de levantamento de herbário (Fig. 2) mostraram florações do tipo contínua nas espécies com maiores distribuição geográfica no gênero, B. coriacea e B. pedicellata, e sobreposição delas com as florações das espécies que ocorrem em simpatria.

Análises biogeográficas espaço-temporais

A origem de Bionia (stem node, nó I) deve ter ocorrido em uma área que compreende a porção oeste da Chapada Diamantina (área D) e a porção norte da Serra do Espinhaço (área E), há cerca de 10 Ma (Fig. 5). A idade estimada para o crown node de Bionia data do final do Mioceno (6,3 ± 0,02 Ma). A diversificação inicial do gênero foi marcada por um evento de vicariância (nó II), resultando em uma linhagem (C1) relacionada ao oeste Chapada Diamantina (nó III; área D, média = 4,3 Ma), e a linhagem C2, relacionada ao norte da Serra do Espinhaço em Minas Gerais (nó IV; área E; média = 5,8 Ma).

A linhagem relacionada ao clado da Chapada Diamantina originou duas outras linhagens predominantes da porção oeste da Chapada Diamantina (área D). A primeira linhagem a se diversificar nessa área (nó VI) data do Plioceno (média = 3,3 Ma) e apresentou expansões de área pouco frequentes para o leste da Chapada Diamantina (área CD; nó VII) no Pleistoceno (média = 2,1 Ma). A segunda linhagem a divergir no Pleistoceno (nó V) ficou restrita à área de origem, mas, assim como a primeira linhagem, apresenta táxons terminais com distribuições mais amplas do que a área

ancestral. Áreas disjuntas de cerrado do nordeste do Brasil (área A) foram colonizadas por dispersões de B. pedicellata var. pedicellata, provavelmente, no Pleistoceno (nó V).

A diversificação inicial da linhagem relacionada ao clado da Serra do Espinhaço e Cerrado ocorreu na área norte da Serra do Espinhaço (área E), dando origem a duas linhagens (nós VIII e X) com dispersões para áreas mais ao sul na Serra do Espinhaço (áreas F e G). A primeira linhagem (nó VIII) a divergir dessa área, no Plioceno, retrata a provável dispersão para áreas de Cerrado (nó XI; área EH; P=16,5), no qual diversificaram duas linhagens: uma na Serra do Espinhaço (nó XII) e outra no Cerrado (nó XIII). A linhagem relacionada ao Cerrado (nó XIII) apresenta um evento de vicariância no Pleistoceno entre Serra do Espinhaço e Cerrado e a outra linhagem se relaciona ao norte da Serra do Espinhaço (nó XIV). Por fim, a segunda linhagem a divergir do clado da Serra do Espinhaço (nó X) apresentou diversificação recente, há menos de 2 Ma (Pleistoceno), concentrada na área de origem (área E).

Discussão

Filogenia de Bionia

As resoluções internas em Bionia nas análises com marcadores individuais apresentaram baixa resolução, mesmo tendo sido empregada uma matriz com 6,5 kbases e espaçadores intergênicos, como rpl32-trnL e trnQ-rps16, avaliados como mais adequados para resolução de filogenias em nível de espécies, pelos seu alto grau de variação (Shaw & al., 2012). O conjunto de dados Combinados (nuclear + plastidial) reconstruiu Bionia como monofilético (Fig. 1) com alto suporte nas três análises (MP, ML e IB). As relações intergenéricas recuperam Cratylia e Bionia como grupos irmãos e reciprocamente monofiléticos.

Cratylia e Bionia (Clado A) são gêneros com flores grandes e distribuição neotropical extra-amazônica que apresentam pequena diferenciação morfológica (Queiroz, 1991, 1999). Essas características, associadas aos comprimentos de ramos curtos da filogenia, sugerem uma diversificação recente dos clados com diferenciação morfológica ainda incipiente, o que explicaria as topologias pouco resolvidas e reticulação entre os dados plastidiais. As principais diferenças morfológicas entre 58

Cratylia e Bionia são a estrutura floral, que em Cratylia apresenta pétalas tomentosas (vs. glabras), estandarte reflexo (vs. estandarte reto, não reflexo), o qual não confere à flor um aspecto tubuloso, corola lilás a margenta ou vermelha (vs. vermelha) e ovário curtamente estipitado (vs. longamente estipitado). Os resultados obtidos por Jesus (2009) e Pastore & al. (2013) também recuperaram relacionamento entre Bionia e Cratylia com suporte elevado.

Bionia foi restabelecido por Queiroz (2008) baseado nos caracteres florais do estandarte reto, não reflexo. A delimitação interespecífica pode ser feita a partir de combinações de caracteres vegetativos e distribuição geográfica (Queiroz, 1999), o que reforça a hipótese de diversificação recente do gênero. As relações filogenéticas interespecíficas de Bionia (Clado B) apresentaram um padrão complexo, com forte incongruência entre os padrões filogenéticos derivados de dados moleculares e a morfologia das espécies. Por outro lado, os padrões filogenéticos observados em Bionia mostraram que diversos clados apresentaram coalescência de acessos de espécies distintas agrupados por áreas geográficas. Além disso, mostra eventos de especiação separados por ramos mais curtos. Esses padrões podem ser resultado de processos históricos e geográficos recentes, envolvendo hibridações e introgressões (ver discussão abaixo), visualizadas, na filogenia, aparecem como acessos de uma mesma espécie que não coalescem como espécies monofiléticas e, portanto, não equivalendo à árvore de genes com a árvore de espécies (Maddison, 1997).

As espécies de Bionia apresentam grande semelhança, sendo a evolução morfológica expressa, principalmente, nas folhas, onde variações quanto ao tamanho, forma, número de folíolos (trifolioladas e pecioladas ou simples e sésseis) e indumento (glabro e indumentado) são usados como critérios taxonômicos para delimitação das espécies do gênero (Queiroz, 1999). As folhas da maioria das espécies são pinadas e trifolioladas, sendo folhas simples um estado homoplástico no gênero, ocorrendo em B. pedicellata e B. canescens no clado da Chapada Diamantina e em B. coccinea no clado da Serra do Espinhaço e Cerrado, o que contraria o resultado obtido na análise morfológica realizada por Queiroz (1999), na qual as espécies coalesceram em um clado comum. Outro caráter relacionado à evolução morfológica das folhas em Bionia refere- se ao indumento, cuja variação da face abaxial da lâmina foliar fornece bons caracteres para a taxonomia. Essa variação no indumento das folhas também é observada em

outras espécies de Campos Rupestres, mas sendo relacionado a convergências morfológicas, que podem surgir em reposta a condições adversas como tipo solo, déficit hídrico, vento e presença do fogo (Giulietti & al., 1997; Queiroz & al., 2008).

Os acessos de B. coriacea chamam a atenção na filogenia por relacionar-se aos principais clados do gênero, apresentando um padrão polifilético na filogenia. Bionia coriacea é identificada pelo caráter glabro de suas partes vegetativas. Entretanto, a complexa diversidade morfológica apresentada pela espécie com ampla distribuição geográfica e de habitats, conferiu a B. coriacea vários nomes na sua história taxonômica (Bentham, 1859; Lewis, 1987), tendo sido reconhecidos como co-espécies por Queiroz (1999, 2008). Queiroz (1999) já questionava se o polimorfismo dessa espécie seria dado pela sua plasticidade fenotípica (isto é, uma espécie morfologicamente polimórfica) ou por diferentes genótipos (manutenção de polimorfismos ancestrais). Nesse sentido, a estruturação da presente filogenia (Fig. 1) associada ao padrão de floração contínuo da espécie (Fig. 2) levam a supor que eventos de evolução reticulada podem responder as incongruências da filogenia.

A especiação ecológica de Bionia nos Campos Rupestres pode ter gerado esse padrão topológico complexo resumido em baixa resolução filogenética, presença de ramos curtos e estruturação geográfica. Essa topologia pode ser relacionada à conservação filogenética do nicho de Bionia nos Campos Rupestres, habitats que envolvem uma história biogeográfica relativamente recente (Hughes & al., 2013), envolvendo eventos de evolução reticulada e convergências morfológicas (Antonelli & al., 2010; Koenen & al., 2013). Mimosa (Leguminosae; Simon & al., 2011), Paepalanthus (Eriocaulaceae; Trovó & al., 2012) e Calliandra (Leguminosae; Souza & al., 2013), grupos com diversificação intensa nos mesmos ambientes de Bionia, também apresentaram em suas filogenias estruturação geográfica, refletindo na pouca relação entre os dados morfológicos e moleculares.

Evolução reticulada e especiação em Bionia

Incongruências entre filogenias derivadas de diferentes conjuntos de dados (e.g., nuclear × plastidial, molecular × morfológicos) podem ser causados por vários

processos como transferência horizontal de genes, fixação incompleta de alelos (incomplete lineage sorting), duplicação de genes e extinção (Madison, 1997). No entanto, a hibridação e a fixação incompleta de alelos são vistos como os principais responsáveis pelos conflitos no sinal filogenético (Madison, 1997; Arnold, 2006).

Os padrões fenológicos da floração das espécies mais amplamente distribuídas de Bionia foram caracterizados por florações contínuas ao longo do ano. Mais importante para o entendimento dos padrões filogenéticos, os períodos de floração de espécies diferentes são fortemente sobrepostos em áreas de simpatria (Fig. 2). Além disso, a morfologia floral muito conservada em todas as espécies do gênero (Fig. 4) sugere que elas compartilham o mesmo tipo de polinizador, como é o caso de B. coriacea e B. pedicellata cujas flores são visitadas por espécies comuns de beija-flores, como Chlorostilbon lucidus (Shaw, 1812) e Phaethornis pretrei (Lesson & Delattre, 1839) (Machado & al. 2007; Demetrio & Machado 2012; Moura 2012). Além disso, dados de biologia reprodutiva de B. pedicellata indicam que esta espécie é auto- incompatível e, portanto, depende de polinizadores bióticos para manter o fluxo de pólen (Demétrio & Machado 2012).

Queiroz (1999), ao analisar os padrões complexos de variação morfológica no gênero, considerou que eles podem ter surgido de eventos de hibridação em algumas áreas de simpatria. Os dados aqui levantados, relacionando o padrão de floração, o sistema reprodutivo e o compartilhamento de polinizadores, reforçam essa hipótese. Além disso, a análise de reticulação (Fig. 3) corrobora a hipótese de evolução reticulada em alguns clados de Bionia e sua estruturação geográfica, especialmente em algumas áreas de simpatria como é o caso do oeste da Chapada Diamantina (área D), o norte da Serra do Espinhaço (área E) e a área core do Cerrado (área H; Fig. 3). A superação de barreiras temporais e espaciais relacionadas às contínuas expansões geográficas de algumas espécies do gênero, promovendo contato entre populações de espécies distintas, daria condições para a ocorrência de hibridações no gênero, que teriam promovido o padrão da estruturação geográfica filogenética.

Grupos com especiação recente são considerados de difícil resolução e nem sempre esta é alcançada com esforço de coleta de dados (Rokas & al., 2003; Pelsen & al., 2010). Por esse lado, a especiação relativamente recente no gênero poderia ser

responsável por barreiras reprodutivas incipientes. Esse fato, associado à expansão das áreas de distribuição de algumas espécies (ver discussão abaixo), poderia promover o fluxo gênico entre elas, a formação de enxames de híbridos e a consequente perda de sinal filogenético. Este é, possivelmente, o principal fator responsável pela baixa resolução, incongruências entre diferentes conjuntos de marcadores moleculares entre si e destes com os padrões morfológicos (Small, 2004; Okuyama & al., 2005). Hibridação natural é um evento comum em plantas, sendo apontada como promotora de diversidade através do estabelecimento de novas espécies (McKinnon, 2005). Por isso, eventos desse tipo poderiam explicar, em Bionia, a redução do sinal filogenético e a estruturação geográfica dos dados moleculares (Small, 2004; Okuyama & al., 2005).

Eventos de hibridação já foram investigados na diversificação de outros grupos neotropicais como Orchidaceae (Cattleya; Santos, 2011; Epidendrum; Pinheiro & al., 2010), Cactaceae (Melocactus, Lambert & al., 2006) e Bromeliaceae (Pitcairnia, Palma-Silva & al., 2011). Em alguns casos, eventos de hibridações têm sido apontados como causas de genomas porosos em grupos de áreas de montanhas do leste do Brasil, produzindo padrões filogenéticos semelhantes ao encontrados em Bionia, como os reportados para o gênero Hoffmansegella (Orchidaceae; Antonelli & al., 2010) e Pitcarnia (Bromeliaceae; Palma-Silva & al., 2011). No caso de Pitcairnia, além de hibridação e introgressão, a fixação incompleta de alelos é um aspecto integrante da radiação adaptativa nos inselbergs neotropicais (Palma-Silva & al., 2011), ambientes em que o isolamento geográfico entre populações assemelha-se ao de Bionia.

Diversificação de Bionia e implicações para o entendimento da biogeografia dos Campos Rupestres

A diversificação de Bionia na Cadeia do Espinhaço ocorreu a partir final do Mioceno (Fig. 5 e Tabela 4). Esse fato foi observado em diversos estudos temporais de diversificação que incluíram grupos de Campos Rupestres como Calliandra (Souza & al. 2013), Mimosa (Simon & al., 2009), Marcetia, Croton (Queiroz & al., 2009), Paepalanthus (Trovó & al., 2012) e Minaria (Ribeiro, 2011). O final do Mioceno foi um período com mudanças globais para climas sazonalmente mais frios e secos. Em consequência, esse período favoreceu a expansão de habitats abertos e a diversificação

de várias linhagens adaptadas a climas mais secos e a habitats sujeitos à ação do fogo (Simon & al. 2009, Antonelli & al. 2010, Edwards & Smith, 2010, Nagilungum & al., 2011, Hughes & al., 2013).

A principal cladogênese de Bionia é marcada pela vicariância entre as áreas de Campos Rupestres dos dois principais núcleos da Cadeia do Espinhaço, formando duas linhagens vicariantes principais associadas aos Campos Rupestres da Bahia (clado da Chapada Diamantina) e Minas Gerais (clado da Serra do Espinhaço e Cerrado). Esse isolamento resultou na origem de espécies distintas nas duas porções da Cadeia do Espinhaço, sendo B. coriacea a única espécie a se dispersar entre os dois núcleos. Essa estruturação geográfica da filogenia entre os dois principais núcleos de campos rupestres é um padrão recorrente em diferentes táxons especialistas desse tipo de vegetação, tendo sido observado em Minaria T.U.P.Konno & Rapini (Apocynaceae; Ribeiro, 2011), Paepalanthus Mart. (Eriocaulaceae; Trovó & al. 2012) e Calliandra (Leguminosae; Souza & al. 2013).

Linhagens distantemente relacionadas compartilhando o mesmo padrão pode indicar que a filogenia de grupos de Campos Rupestres pode estar estruturada por uma forte conservação filogenética do nicho e especiação in situ em um ambiente onde parece haver dispersão fortemente limitada entre os principais núcleos de Campos Rupestres. Essa conservação filogenética do nicho é demonstrada por linhagens praticamente endêmicas dos Campos Rupestres. Esses ambientes são semelhantes ao Cerrado pela sua ecologia associada ao fogo e fitofisionomias. Por causa dessas semelhanças e pela geografia interdigitada, Hughes & al. (2013) predizeram que linhagens de Cerrado e de Campos Rupestres teriam padrões filogenéticos entremeados. No entanto, em todos os casos estudados (citados acima), a evolução de nicho de Campos Rupestres para Cerrado é representada por eventos raros.

Nesse sentido, os padrões biogeográficos espaciais observados em Campos Rupestres assemelham-se mais aos de florestas secas do que aos de Cerrado. Para as florestas secas (STDFs), há um acúmulo crescente de dados indicando que as filogenias são estruturadas por forte conservação do nicho e dispersão limitada (Pennington & al., 2009; Queiroz & Lavin, 2011), enquanto no caso das linhagens de Cerrado parecem apresentar menor conservação do nicho e maior capacidade de dispersão produzindo

filogenias fracamente estruturadas geograficamente. Essa semelhança maior entre os padrões biogeográficos encontrados em linhagens de campos rupestres com o de SDTFs do que com os de Cerrado é surpreendente uma vez que a vegetação dos campos rupestres apresenta semelhança fisionômica com a de cerrado e, como esta, está sujeita à ação periódica do fogo, além de apresentar diversificação relativamente recente (Simon & al., 2009), ao contrário das SDTFs que são formações não sujeitas à ação do fogo e possuem diversificação muito mais antiga (Pennington & al., 2004; Hughes & al., 2013).

Essa coincidência de padrões em biomas tão distintos como os Campos Rupestres e as SDTFs pode refletir o isolamento geográfico entre os seus principais núcleos ao contrário do Cerrado (Savanna) que apresenta uma maior continuidade das suas áreas. Assim, predominaria nos Campos Rupestres um modelo semelhante ao de ilhas, onde a geografia disjunta entre as serras da Cadeia do Espinhaço permitira o isolamento espacial e promoveria subestruturação entre as populações vicariantes (Giulietti & al., 1997; Lambert & al., 2006; Ribeiro & al., 2008; Barbosa & al., 2012). Essa distribuição em ilhas associada à diversificação recente explicaria a estruturação geográfica na filogenia de Bionia nos dois principais núcleos da Cadeia do Espinhaço e poderia ter promovido especiação alopátrica em alguns dos principais topos de serras. A especiação recente explicaria a baixa taxa de substituição de nucleotídeos e a incongruência entre as topologias de diferentes dados (morfológico, plastidiais e nucleares), produzindo a baixa resolução observada dentro dos principais clados de Bionia. Essa falta de resolução interna dos clados também pode ser observada em outros grupos de campos rupestres como Minaria (Ribeiro, 2011), Paepalanthus (Trovó & al., 2012) e Calliandra (Souza & al., 2013).

As análises estatísticas de dispersão e vicariância sugerem que o gênero Bionia encontra-se em processo de expansão dentro dos principais núcleos de Campos Rupestres, com um caso de transição para Cerrado. A expansão em Bionia ocorre principalmente pela dispersão de B. coriacea para quase toda a área de distribuição do gênero e pela dispersão dentro de cada um dos dois núcleos de Campos Rupestres a partir das áreas ancestrais dos clados Chapada Diamantina e Serra do Espinhaço/Cerrado. Outro estudo semelhante, realizado com o gênero Minaria (Apocynaceae; Ribeiro, 2011) obteve resultado diferente, demonstrando que o mesmo

encontra-se em retração. Essa diferença pode ser consequência dos habitats preferenciais dos dois grupos, enquanto Minaria é predominantemente rupícola, crescendo quase que diretamente sobre as rochas (Ribeiro, 2011), as espécies de Bionia crescem em solos mais profundos que se acumulam entre rochas. Assim, é possível que plantas com preferências ecológicas distintas tenham respondido de forma diferente a mudanças nas condições ambientais ocorridas em escala regional ou global. Isso ressalta a necessidade de estudos de fina escala de ecologia dos grupos para melhor compreensão dos padrões biogeográficos observados.

A especiação de Bionia ainda carece de mais estudos experimentais e pontuais que venham a elucidar os possíveis processos de evolução no grupo (hibridações/introgressões). A biologia reprodutiva das espécies do gênero pode ser um bom começo na investigação de barreiras reprodutivas insipientes, associados a estudos filogeográficos, podendo corroborar as hipóteses especuladas nesse trabalho, ajudando a melhor circunscrever as espécies de Bionia.

Agradecimentos

Agradecemos ao Leilton Damascena e ao Tarciso Maia pelas contribuições dadas para o aperfeiçoamento desse manuscrito. Ao Programa de Pós Graduação em Botânica da UEFS (PPGBot), ao Herbário HUEFS e ao Laboratório Molecular de Sistemática de Plantas (LAMOL) pela infraestrutura. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/PNADB) e CNPq (nº 384289/2013-4) pelas bolsas estudo e ao “Programa de Pesquisa em Biodiversidade do Semiárido” (PPBio Semiárido - MCT/CNPq) pelo financiamento das coletas. ERS and LPQ agradecem a CAPES (PNPD nº 02697/09-2) e ao CNPq (PQ nº 301308/2007-1), respectivamente.

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Apêndice 1. Espécies utilizadas no presente estudo foram identificadas na seguinte ordem: nome do taxon, país e estado, voucher (herbário). Bionia canescens L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, Brazil, BA, Abaíra, E.R. Souza 684 (HUEFS); Bionia coccinea var. coccinea Mart. ex Benth., Brazil, MG, Diamantina, E.R. Souza 882 (HUEFS); Bionia coccinea var. coccinea Mart. ex Benth., Brazil, MG, Diamantina, E.R. Souza 875 (HUEFS); Bionia coccinea var. nitens (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, MG, Cardeal Mota, E.R. Souza 909 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Umburanas, E.R. Souza 617 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Rio de Contas, E.R. Souza 657 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Rio de Contas, A.M. Giulietti 2238 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Palmeiras, K.R.B. Leite 423 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Mucugê, L.P. Queiroz 13611 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Barra da Estiva, L.P. Queiroz 13632 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Abaíra, E.R. Souza 700 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, MG, Diamantina, E.R. Souza 886 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, MG, Caraí, E.R. Souza 931 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, BA, Andaraí, L.P. Queiroz 15524 (HUEFS); Bionia coriacea (Nees & Mart.) Benth., Brazil, GO, Planaltina, L.P. Queiroz 14036 (HUEFS); Bionia graomogolensis L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, Brazil, MG, Grão Mogol, L.P. Queiroz 7525 (HUEFS); Bionia graomogolensis L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, Brazil, MG, Grão Mogol, E.R. Souza 844 (HUEFS); Bionia graomogolensis L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, Brazil, MG, Grão Mogol, E.R. Souza 845 (HUEFS); Bionia graomogolensis L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, Brazil, MG, Francisco Sá, E.R. Souza 855 (HUEFS); Bionia sp. nov. (ovalifolia), Brazil, BA, Barreiras, L.P. Queiroz 10242 (HUEFS); Bionia sp. nov. (ovalifolia), Brazil, BA, São Desidério, L.P. Queiroz 10259 (HUEFS); Bionia sp. nov. (ovalifolia), Brazil, BA, Pilão Arcado, L.P. Queiroz 14712 (HUEFS); Bionia sp. nov. (ovalifolia), Brazil, PI, Guariba, Martineli 16136 (HUEFS); Bionia pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, BA, Morro do Chapéu, E.R. Souza 792 (HUEFS); Bionia pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, BA, Morro do Chapéu, E.R. Souza 806 (HUEFS); Bionia pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, BA, Umburanas, L.P. Queiroz 14851 (HUEFS); Bionia pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, BA, Mucugê, L.P. Queiroz 15576 (HUEFS); Bionia pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, BA, Rio de Contas, L.P. Queiroz 13648 (HUEFS); Bionia pedicellata (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, BA, Rio de Contas, E.R. Souza 661 (HUEFS); Bionia rugosa L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, Brazil, BA, Abaíra, E.R. Souza 683(HUEFS); Bionia rugosa L.P. Queiroz & A.V.F. Lima, Brazil, BA, Abaíra, E.R. Souza 692 (HUEFS); Bionia tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, MG, Francisco Sá, E.R. Souza 852 (HUEFS); Bionia tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, MG, Itacambira, E.R. Souza 860 (HUEFS); Bionia tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, MG, Diamantina, E.R. Souza 888 (HUEFS); Bionia tomentosa (Benth.) L.P. Queiroz, Brazil, MG, Grão Mogol, E.R. Souza 843 (HUEFS); Cratylia argentea (Desv.) Kuntze, Brazil, GO, Posse, L.P. Queiroz 10281 (HUEFS); Cratylia mollis Mart. ex Benth., Cultivada (Campos UEFS), J.G. Rando 1257 (HUEFS); Cratylia spectabilis Tul., Cultivada (Campos Esalq), L.P. Queiroz 5087 (HUEFS); Galactia glausescens Kunth., Brazil, GO, Nova Roma, L.P. Queiroz 14060 (HUEFS); Galactia neesii DC., Brazil, GO, Planaltina, L.P. Queiroz 10299 (HUEFS); Galactia remosoana Harms, Brazil, BA, Barra, L.P. Queiroz 14659 (HUEFS).

Tabela 1. Primers e programas usados para amplificação das regiões usadas nesse estudo: 1-Pastore & al. (2013); 2- Baldwin & Markos (1998); 3- Sun & al. (1994); 4- Desfeaux & al. (1996); 5-White & al. (1990); 6-Shaw & al. (2007); 7-Wojciechowski & al. (2004); 8-Taberlet & al. (1991). Desnat= Desnaturação; Amplif. = Amplificação; N.C. = Número de Ciclos; E.F.= Extensão Final; # = primer usado no sequenciamento; * = valor alternativo no programa.

Primers Desnat. Amplif. N.C. E.F. Nuclear ETS* ETS- Dioc3¹ forward (GCTTGTGCATCGAACGGTTGG) 94ºC 94ºC (1min) + 55ºC (1min) + 72ºC 18S-IGG² reverse (CACATGCATGGCTTAATCTTTG ) (3min) 72ºC (2min) 30 (7min)

ITS 17SE³ forward (ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG) 94ºC 94ºC (1min) + 53ºC (1min) + 72ºC 26SE³ reverse (TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC) (3min) 72ºC (3min) 28 (7min)

924 # forward (AAGGTTTCCGTAGGTGAAC) 45 # reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) Sequenciamento Plastidial TrnQ-rps166 trnQ (UUG) forward (GCGTGGCCAAGYGGTAAGGC) 80ºC 94ºC (1min) + 50ºC/54ºC* 65ºC rps16 reverse (GTTGCTTTYTACCACATCGTTT) (5min) (1min) +65ºC (3min) 30 (4min)

rpl32-trnL6 rpl32 forward (CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC) 80ºC 94ºC (1min) + 50ºC/54ºC* 65ºC trnL(UAG) reverse (CTGCTTCCTAAGAGCGT) (5min) (1min) +65ºC (3min) 30 (4min) 77

Primers Desnat. Amplif. N.C. E.F. matK7 matK685F forward(GTATCGCACTATGTATCATTTGA) 80ºC 94ºC (1min) + 50ºC/54ºC* 65ºC matK1932R reverse(CCAGACCGGCTTACTAATGGG) (5min) (1min) +65ºC (3min) 30 (4min) matK1100L forward (TTCAGTGGTACGGAGTCAAATG) 94ºC 94ºC (500seg) + 51ºC (50seg) 72ºC trnK2R reverse (CCCGGAACTAGTCGGATGG) (2min) +72ºC (1,15min) 35 (7min) trnL-trnF8 C forward(CGAAATCGGTAGACGCTACG) D reverse (GGGGATAGAGGGACTTGAAC) 94ºC 94ºC (1min) + 56ºC/54ºC* 72ºC 35 E forward (GGTTCAAGTCCCTCTATCCC) (5min) (1min) +72ºC (2min) (10min) F reverse (ATTTGAACTGGTGACACGAG) Desnat= Desnaturação; Amplif. = Amplificação; N.C. = Número de Ciclos; E.F.= Extensão Final; # = primer usado apenas no seqüenciamento. * = valor alternativo no programa.

Tabela 2. Relação das espécies de Bionia por área, hábitat e estados de ocorrência das espécies.

Espécies Área Habitat Estados B. canescens L.P. Queiroz D campos rupestres BA & A.V.F. Lima B. coccinea Mart. ex Benth E, F, G campos rupestres/ cerrado BA, MG, GO

B.coriacea (Nees & Mart.) B, C, D, E, F, G, H campos rupestres/ cerrado BA, MG, GO, Benth. MA, PI B. grao-mogolensis L.P. E campos rupestres MG Queiroz & A.V.F. Lima

B. pedicellata (Benth.) L.P. A, B, C, D campos rupestres/cerrado BA, CE, PE Queiroz

B. rugosa L.P. Queiroz & D campos rupestres BA A.V.F. Lima

B. tomentosa (Benth.) L.P. E, F, G campos rupestres MG Queiroz B. sp. nov. H cerrado BA, GO, PI

Tabela 3. Características das matrizes e das árvores mais parcimoniosas nas análises de máxima parcimônia individuais e combinada.

N° de N° de N° de N° de Caracteres caracteres passos Nº de Regiões caracteres CI RI táxons analisados inf. p/ da árvores variáveis parcimônia árvore

ETS 41 476 55 (11.7%) 44 (9.2%) 118 10.000 0.9576 0.951 ITS 40 877 73 (8.3%) 48 (5.5%) 132 10.000 0.9621 0.958 trnQ-rps16 41 1408 50 (3.6%) 25 (1.8%) 84 10.000 0.9286 0.9032 rpl32-trnL 41 871 24 (2.8 %) 35 (4%) 91 10.000 0.6703 0.7143 matk 41 1882 51 (2.7 %) 22 (1.7%) 83 10.000 0.8705 0.9038 trnL-F 40 985 77 (7.8%) 106 (10.8%) 237 10.000 0.8059 0.7956 Combinados 42 6499 330 (5%) 280 (4.3%) 822 10.000 0.9164 0.9288

Tabela 4. Estimativa do tempo de divergência molecular (para o nome dos nós ver Fig. 5). tmrca I II III IV V VI IX X XI XII XIII

Mean 9.99 6.33 4.37 5.87 2.75 3.33 2.05 1.99 2.98 2.79 1.93 Stdev 0.02 0.02 0.02 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.01 Lower 95% 7.61 4.71 3.10 4.17 1.62 2.26 1.24 0.94 1.92 1.53 1.12 HPD Upper 95% 12.67 7.99 5.74 7.71 3.93 4.56 2.93 3.38 4.26 4.28 2.77 HPD

Figura 1. Consenso de maioria (50%) das 4.000 árvores da estacionalidade da análise da Bayesiana dos dados combinados (ITS, ETS, rpl32-trnL, trnQ-rps16, matK, trnL- trnF) de Bionia e gêneros relacionados. Apenas os valores de bootstrap (BS) ≥ 0,75 da Máxima Parcimônia (MP) e Máxima Verossimilhança (ML) e Probabilidades Posteriores (PP) ≥ 0,95 foram plotados na figura. As espécies foram diferenciadas por cores. Abreviações das localidades: Abaíra (Ab), Andaraí (And), Barra da estiva (BE), Barreiras (Bar), Cardeal Mota (CM), Caraí (Car), Diamantina (Diam), Francisco Sá (FrS), Grão Mongol (GM), Guarari (Guar), Itacambira (Itac), Morro do Chapeú (MC), Mucugê (Muc), Palmeiras (Palm), Pilão Arcado (PA), Rio de Contas (RC), São Desidério (SD), Umburanas (Umb)

Figura 2. Fenologia da floração das espécies de Bionia por área de ocorrência através de dados de herbário.

Figura 3. Rede de consenso não enraizado (30% de limite para construção da rede) sumarizando as incongruências existentes entre as topologias dos dois conjuntos de dados (Comb1 e Comb2) usando árvores de consenso de maioria com >50% de bootstrap. Na figura apenas a topologia é apresentada, pois os ramos não são escalonados com comprimento de ramo. As linhas em vermelho representam as possíveis reticulações. As áreas biogeográficas (ver Fig. 1) recuperadas pela análise foram destacadas em verde e azul.

Figura 4. Fotos das espécies de Bionia: B. rugosa: A; B. coccinea: B-C; B. pedicellata: D; B. coriacea: E e G; B. tomentosa: F; B. sp. nov. (ovalifolia): H; B. grao-mogolensis: I. (Fotos A, C, E-G: A.V.F. Lima; B: E. Ataíde; D, I: E.R. de Souza; H: L.P. Queiroz).

Figura 5. Árvore de reconstrução da área ancestral, utilizando o consenso das árvores resultantes da Bayesiana realizada no Beast (à direita). As áreas ancestrais foram reconstruídas com probabilidade acima de 15%, sendo estas representadas espacialmente no mapa (à esquerda).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nesse trabalho foram desenvolvidos estudos taxonômicos, filogenéticos e biogeográficos em Bionia a fim de propor três espécies novas para o gênero (Capítulo 1) e investigar a correlação das hipóteses filogenéticas e biogeográficas aos padrões das espécies atuais (Capítulo 2).

O estudo taxonômico (Capítulo 1) propôs mais três espécies novas para o gênero, B. canescens, B. grao-mogolensis e B. tomentosa. Todas as espécies foram consideradas endêmicas da Cadeia do Espinhaço, onde está localizado o centro de diversidade e endemismo do gênero, aumentando assim para essa região o número de espécies de quatro para sete.

As relações filogenéticas interespecíficas no Capítulo 1 apresentaram estruturação geográfica entre as espécies e o caráter das folhas simples foi considerado homoplástico, diferindo das análises morfológicas de Queiroz (1999), no qual as espécies com folhas simples coalesceram todas em um clado bem sustentado.

No estudo filogenético mais robusto, apresentado no Capítulo 2, a amostragem foi considerada adequada para a problemática em nível de espécie, amostrando bem os táxons assim como número de regiões para inferir a filogenia, sendo este o primeiro trabalho em Diocleinae a utilizar os espaçadores de Shaw (2007), rpl32-trnL e trnQ- rps16. De modo geral, os dados apresentaram baixa variação nucleotídica, mas na análise Combinada alguns clados foram reconhecidos e fortemente sustentados, dividindo os acessos do gênero por áreas geográficas, sendo os caracteres morfológicos pouco relacionados à filogenia molecular.

A presença de conflitos no sinal filogenético entre os dados plastidiais e nucleares, conjuntamente com a estruturação filogenética geográfica levaram a formulação de algumas hipóteses sobre o grupo como a diversificação recente e a especiação híbrida, sustentadas por inferências filogenéticas do DNA nuclear e dos cloroplastos, redes, datação molecular, reconstrução de áreas ancestrais, além dos dados morfológicos e fenológicos.

A especiação de Bionia ainda carece de mais estudos experimentais que venham a elucidar os possíveis processos de evolução no grupo (hibridações/introgressões). A 88

biologia reprodutiva das espécies do gênero pode ser um bom começo na investigação de barreiras reprodutivas insipientes, associados a estudos filogeográficos e a modelagens paleoclimática e paleovegetacionais, podendo corroborar com as hipóteses especuladas nesse trabalho, ajudando a melhor circunscrever e explicar os padrões das espécies de Bionia.