UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto De Biologia

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Biologia

CAMILA RABELO OLIVEIRA LEAL

ESPECIALIZAÇÃO TRÓFICA E ESTRUTURA GENÉTICA EM INSETOS

FITÓFAGOS

TROPHIC SPECIALIZATION AND GENETIC STRUCTURE IN PHYTOPHAGOUS

INSECTS

CAMPINAS

2020

CAMILA RABELO OLIVEIRA LEAL

ESPECIALIZAÇÃO TRÓFICA E ESTRUTURA GENÉTICA EM INSETOS

FITÓFAGOS

TROPHIC SPECIALIZATION AND GENETIC STRUCTURE IN PHYTOPHAGOUS

INSECTS

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Ecologia

Thesis presented to the Insttute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment on the requirements for the degree of Doctor in Ecology

Orientador: THOMAS MICHAEL LEWINSOHN

Co-orientadora: KARINA LUCAS SILVA-BRANDÃO

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDEÀ VERSÃO DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAMILA RABELO OLIVEIRA LEAL E ORIENTADA PELO PROF. DR. THOMAS MICHAEL LEWINSOHN

CAMPINAS

2020

Agência(s) de fomento e n°(s) de processo: FAPESP, 2015/10236-7 e 2016/24821-1; CAPES

Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Leal, Camila Rabelo Oliveira, 1989- L473e Especialização trófica e estrutura genética em insetos fitófagos / Camila Rabelo Oliveira Leal. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.

Orientador: Thomas Michael Lewinsohn. Coorientador: Karina Lucas Silva Brandão. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

1. Campos rupestres. 2. Tephritidae. 3. Microssatélites (Genética). 4. Asteraceae. 5. Estrutura genética. I. Lewinsohn, Thomas Michael, 1952-. II. Silva Brandão, Karina Lucas. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Trophic specialization and genetic structure in phytophagous insects Palavras-chave em inglês: Rupestrian fields Asteraceae Microsatellites (Genetics) Vernonieae Genetic structure Área de concentração: Ecologia Titulação: Doutora em Ecologia Banca examinadora: Thomas Michael Lewinsohn [Orientador] Paulo Inácio Prado Elen Arroyo Peres Maria Imaculada Zucchi Vera Nisaka Solferini Data de defesa: 27-01-2020 Programa de Pós-Graduação: Ecologia

Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-8313-3911 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/4598717848368985

Campinas, 27 de janeiro de 2020

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Thomas Michael Lewinsohn (Orientador)

Profa. Dra. Maria Imaculada Zucchi

Prof. Dr. Paulo Inácio de Knegt López de Prado

Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini

Profa. Dra. Elen Arroyo Peres

O membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós Graduação em Ecologia do Instituto de Biologia.

Aos meus amados pais, Ione e Vicente

AGRADECIMENTOS

Esta tese é fruto de um trabalho intenso e coletivo. Desde o início, muitas pessoas contribuíram em diferentes etapas para finalização desta tese e para o meu doutorado. Assim, sou extremamente grata por todas pessoas que conheci e situações que vivenciei nos últimos anos

(principalmente).

Agradeço aos meus pais, Ione e Vicente, pelo amor, carinho e cuidado. Por cuidarem da nossa família, por se preocuparem em me receber tão bem todas as vezes que voltei à nossa casa, por entenderem a minha ausência. Por serem exemplos de humildade e coragem e por terem me ensinado desde cedo que sacrifícios são necessários para alcançar os sonhos. Por me ensinarem a tratar bem e respeitar a todos. Agradeço especialmente por todas as vezes que colocaram os próprios sonhos de lado para realizarem os meus sonhos e os sonhos das minhas irmãs.

Agradeço às minhas irmãs, Lorenna e Fernanda, minhas grandes companheiras e amigas, por todo amor, apoio e interesse. Por todo incentivo e palavras de conforto. Obrigada por serem exemplos de coragem e determinação. Ao meu cunhado Pedro, por todo apoio e amizade.

Sou imensamente grata ao meu orientador Dr. Thomas Michael Lewinsohn, pela dedicação com a qual me orientou e pela contribuição para meu crescimento pessoal e profissional. Agradeço pelo entusiasmo ao me apresentar as interações dos herbívoros endófagos com as compostas e por dividir a direção em milhares de km nas expedições para coleta no

Espinhaço.

À minha co-orientadora, Dra. Karina Lucas Silva Brandão, pela contribuição expressiva para minha formação e crescimento pessoal e profissional. Sou imensamente grata por sua dedicação em diferentes etapas deste trabalho.

À Dra. Marina Reiter Braun, por me ensinar a distinguir espécies de Tomoplagia a partir da dissecção da genitália; ao Dr. Thomas Lewinsohn e ao Dr. Paulo Inácio Prado, por me ajudarem a reconhecer as espécies de compostas e moscas Tomoplagia e por terem me ajudado com as coletas no Espinhaço; ao Dr. Leonardo Ré Jorge, pela ajuda na correção do meu projeto de doutorado e nas coletas no Espinhaço; ao MSc. Joselândio Santos, MSc. Daniel Garcia, Msc.

Tandara Gomes e Dr. Antônio Queiroz pela ajuda nas coletas que realizei no Espinhaço; ao querido Ricardinho, por toda ajuda e dedicação nos momentos de triagem; ao Dr. Marcelo

Monge, pela disponibilidade com a qual me ajudou na identificação de algumas espécies de compostas.

Durante as viagens a Minas Gerais, fomos recebidos por várias pessoas que abriram seus lares para nós. Dessa forma, agradeço aos queridos Maraisa Braga e André Rech, ao Sr. e Sra.

Francisco Prado, Claudia Rabelo e Allan Santos. Muito obrigada pela recepção calorosa e pelo interesse no meu trabalho.

À Dra. Anete Pereira de Souza, pelo interesse e entusiasmo ao discutir meu projeto. Pela oportunidade de obter os marcadores durante o curso de microssatélites (e fora dele) e por todo apoio no LAGM. Ao Dr. Danilo Augusto Sforça, pela ajuda crucial na obtenção dos microssatélites para Tomoplagia bicolor e por me ensinar a genotipar na temida acrilamida. À

Patrícia Zambon, pela ajuda nas genotipagens no sequenciador automático. A todos os colegas e amigos do LAGM, os quais tornaram os dias de vencer as PCRs (ou mesmo perder) mais divertidos e doces. Em especial, agradeço à Dra. Fernanda Ancelmo, Dra. Thamiris Deo, Dra.

Prianda Laborda, Dra. Carla Silva e Dr. Alessandro Pereira, pela disponibilidade em discutir melhorias no trabalho de bancada e/ou análises estatísticas.

Aos integrantes do comitê de acompanhamento de tese, Dr. Paulo Inácio Prado, Dr.

André Victor Lucci Freitas e Dr. Leonardo Ré Jorge, por incentivarem o desenvolvimento deste projeto.

Sou grata aos professores Dr. Paulo Prado, Dr. André Freitas e Dra. Elen Arroyo Peres, por realizarem a análise prévia desta tese.

Agradeço ao Instituto Estadual de Florestas de Minas Gerais (IEF-MG), pela concessão de licença de coleta em diferentes parques estaduais, além de fornecer suporte logístico para realização das coletas. Agradeço aos técnicos que nos acompanharam e disponibilizaram seu conhecimento acerca da distribuição das espécies de compostas nas áreas dos parques.

Ao prof. Martin Pareja, por todo apoio e incentivo para a conclusão desta tese.

Aos amigos de longa data que acompanharam e apoiaram essa trajetória, em especial

Josef, Bets e Luiz Falcão, Polly, Tonho, Claudinha, Thays, Deisy e Gê.

Aos colegas e amigos que Campinas me propiciou. Agradeço especialmente aos queridos da Ecologia: Paula Omena, Mabel, Fátima, Laura, João Suzigan, Micael, Luis Salles, André,

Estrela e Dan Garcia; aos queridos da Genética: Thami, Fer, Mari, Ramir, Mitchi e Chico; e às queridas da Biologia Animal, Paty Avelino e Julia Pablos. Agradeço a amizade fiel do Luiz

Rezende, que desde o início do doutorado esteve ao meu lado e foi fundamental para o feliz encerramento desta etapa. No mesmo sentido, agradeço a amizade da Janaína Cortinoz, que me mostrou outra realidade de Campinas e sempre me inspirou profissional e pessoalmente com seu entusiasmo e alegria. Agradeço à Karoline Ceron, por todo carinho, cuidado e apoio; muito obrigada por sua contribuição fundamental para o encerramento desta jornada.

Agradeço a todos os funcionários do Instituto de Biologia da Unicamp.

Este estudo de doutorado foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo/FAPESP - Bolsa de doutorado regular (processo 2015/10236-7) e também pelo Auxílio

Regular concedido ao Dr. Thomas Michael Lewinsohn (processo 2016/24821-1). O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.

“É preciso que eu suporte duas ou três lagartas se eu quiser conhecer as borboletas…”

Antoine de Saint-Exupéry

Resumo

Pressões seletivas relacionadas ao uso de plantas fazem com que todos os insetos herbívoros apresentem algum nível de especialização ecológica. A distribuição geográfica das plantas influencia tanto a distribuição como a especialização ecológica dos insetos herbívoros; consequentemente, interações herbívoro-planta estabelecidas em escala local podem influenciar a conexão de populações coespecíficas nas escalas local e regional. Neste estudo, investigamos a variabilidade e diferenciação genética de espécies de Tomoplagia (Diptera: Tephritidae), cujas larvas se desenvolvem em capítulos de Asteraceae, principalmente da tribo Vernonieae. A partir do conhecimento de suas associações em diferentes campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais, essa interação foi usada para avaliar a diferenciação genética em Tomoplagia nas escalas local (entre plantas hospedeiras) e regional (dentro e/ou entre plantas hospedeiras de localidades distintas). A variabilidade genética das moscas foi mensurada com marcadores microssatélites espécie-específicos que isolamos e caracterizamos para espécies com diferentes níveis de especialização ecológica: T. grandis (monófaga) e T. bicolor e T. incompleta (oligófagas). As três espécies não estão estruturadas geneticamente entre plantas hospedeiras ou localidades. T. grandis evidenciou diferenciação genética fraca a moderada entre localidades, mas sem correlação com seu distanciamento geográfico. Em T. bicolor e T. incompleta encontramos indícios de diferenciação genética tanto na escala local como na regional; esta diferenciação foi correlacionada com distância apenas em T. bicolor, cujas plantas hospedeiras têm diversidade beta maior que a das hospedeiras de T. incompleta. Esses resultados ajudam a compreender os mecanismos envolvidos na diferenciação genética de insetos herbívoros e fornecem uma primeira aproximação dos padrões de diferenciação genética nesse grupo de insetos herbívoros.

Palavras-chave: campos rupestres, Tephritidae, microssatélites, Vernonieae, estrutura genética

Abstract

Selective pressures related to plant use determine that all herbivorous insects present some level of ecological specialization. The geographical distribution of plants influences the distribution as well as the ecological specialization of herbivorous insects; consequently, herbivore-plant interactions established at the local scale may influence conspecific population connections at local and regional scales. In this study, we investigated the variability and genetic differentiation of Tomoplagia (Diptera: Tephritidae) species, whose larvae develop in capitula of Asteraceae, mainly of the tribe Vernonieae. Based on previous surveys of their associations in different campos rupestres of the Espinhaço Mountain Range in Minas Gerais, this interaction was used to evaluate genetic differentiation in Tomoplagia both at local (among host plants) and at regional (within and/or among host plants from different localities) scales. Genetic variability of flies was measured with species-specific microsatellite markers which were isolated and characterized for species with different levels of ecological specialization: T. grandis (monophagous), and T. bicolor and T. incompleta (both oligophagous). The three species are not genetically structured between host plants or localities. Tomoplagia grandis showed weak to moderate genetic differentiation among localities, with no correlation with their parwise geographical distance. In contrast, T. bicolor and T. incompleta showed evidence of genetic differentiation at both local and regional scales; this differentiation was correlated with distance only in T. bicolor, whose host plants have greater beta diversity than hosts of T. incompleta. These results help to clarify mechanisms involved in genetic differentiation of herbivorous insects and provide the first approximation of the patterns of genetic differentiation in this group of herbivorous insects.

Keywords: campos rupestres, Tephritidae, microsatellites, Vernonieae, genetic structure

SUMÁRIO Capítulo 1: Introdução geral ...... 14 Especialização ecológica e diferenciação associada ao hospedeiro ...... 15 Marcadores genéticos na investigação da história evolutiva de insetos fitófagos ...... 20 As interações Tomoplagia-Asteraceae como sistema de estudo...... 23 Objetivo geral da tese...... 27 Referências bibliográficas ...... 28

Capítulo 2: Caracterização e ausência de transferibilidade de locos microssatélites entre espécies de Tomoplagia (Diptera: Tephritidae) ...... 38 Resumo ...... 38 Introdução ...... 39 Material e Métodos ...... 42 Resultados ...... 46 Discussão ...... 47 Referências bibliográficas ...... 51

Capítulo 3: A diferenciação genética de insetos herbívoros é codeterminada por especialização em plantas hospedeiras e pela distribuição geográfica ...... 58 Resumo ...... 58 Introdução ...... 59 Material e Métodos ...... 65 Resultados ...... 70 Discussão ...... 76 Conclusão ...... 87 Referências bibliográficas ...... 89 Material suplementar ...... 107

Conclusões ...... 110

Referências bibliográficas ...... 113

Apêndices ...... 125 Apêndice 1...... 125 Apêndice 2...... 126 Apêndice 3...... 127 Apêndice 4...... 133 Apêndice 5...... 135

Anexos ...... 137 Anexo 1 ...... 137 Anexo 2 ...... 138

Capítulo 1: Introdução geral

Reconhecer a amplitude das associações entre animais e plantas e avaliar fatores que interferem no fluxo gênico de populações coespecíficas representam questões fundamentais para compreender os mecanismos que originam a biodiversidade (Lewinsohn et al., 2005). Para isso, a delimitação de escala é essencial para a investigação das interações ecológicas, uma vez que resultados contrastantes podem ser detectados em diferentes escalas (Poulin 1997). Nas interações inseto-planta, Fox & Morrow (1981) destacaram a importância da escala espacial e mostraram uma nova perspectiva para a compreensão da especialização ecológica, que pode ser entendida como a variedade de recursos utilizados por uma espécie dados os recursos disponíveis

(Jorge et al. 2014). Nessa perspectiva, o número de espécies de plantas hospedeiras com as quais os insetos herbívoros interagem pode variar entre populações coespecíficas dos insetos ao longo de sua distribuição geográfica, de acordo com as características de comunidades locais (Strong et al. 1984, Thompson 2005). Diversos fatores limitam a amplitude de espécies de plantas com as quais os insetos herbívoros interagem, como restrições filogenéticas (Ehrlich & Raven 1964,

Weiblen et al. 2006, Rasmann & Agrawal 2011), restrições químicas, estruturais e/ou fenológicas das plantas hospedeiros (Feder et al. 1993, Filchak et al. 2000, Scriber 2002), co- ocorrência do inseto herbívoro com a espécie de planta (Prado 1999, Agrawal 2000), pressão do terceiro nível trófico (predadores e parasitoides; Grosman et al. 2017) e até mesmo a presença de microorganismos endosimbiontes no trato digestivo dos insetos herbívoros (Simon et al. 2003,

Medina et al. 2011). Como resultado dessas pressões seletivas, os insetos herbívoros geralmente exibem algum grau de especialização ecológica nas plantas existentes (Dyer et al. 2007, Forister et al. 2012).

A detecção de interações entre insetos e plantas em ambientes naturais é limitada principalmente por dificuldades em: (a) observar e confirmar a utilização do recurso, no caso de insetos exófagos (que se alimentam externamente) de livre movimentação entre plantas, tais como ortópteros; e (b) de encontrar espécies endófagas (que se alimentam internamente) e, como são geralmente imaturos, em criá-los até a fase adulta para identificação. Além dessas dificuldades, a amplitude das interações reconhecidas geralmente está ligada ao esforço amostral empregado. Testes de consumo e preferência alimentar já foram realizados para avaliar a variedade de recursos utilizados por insetos herbívoros exófagos, especialmente lepidópteros com larvas folívoras mastigadoras ou hemípteros sugadores (Bernays & Minkenberg 1997,

Novotny et al. 2006). No entanto, muitos vieses surgem na avaliação do consumo de plantas por insetos fora das condições naturais da interação, principalmente respostas induzidas por condições às quais as plantas e os insetos foram expostos (por exemplo, Cogni et al. 2011).

Especialização ecológica e diferenciação associada ao hospedeiro

As comunidades vegetais diferem drasticamente ao longo dos ecossistemas terrestres, devido a vários fatores, tais como variações na composição químico-física dos solos, topografia e condições climáticas (Barbour et al. 1980). Como resultado, mesmo comunidades espacialmente próximas podem diferir em relação à estrutura física, riqueza e composição das espécies, com possíveis descontinuidades na distribuição regional das espécies de plantas e níveis distintos de substituição de espécies entre comunidades locais. A distribuição das plantas influencia fortemente a distribuição geográfica dos organismos que as utilizam como alimento, abrigo e/ou sítio reprodutivo, especialmente insetos herbívoros (Strong et al. 1984, Lewinsohn et al. 2005,

Novotny 2006, Leal et al. 2016). Na maioria dos casos, insetos herbívoros se associam a um grupo restrito de espécies de plantas, geralmente relacionadas filogeneticamente (Ehrlich &

Raven 1964, Lewinsohn & Roslin 2008, Novotny et al. 2010). Um fator primordial para o estabelecimento de interações é a co-ocorrência, passada e atual, de plantas hospedeiras potenciais com os seus consumidores, que é moldada pela combinação de processos em escalas regional e local (Thompson 2005).

Em escala regional, processos históricos e biogeográficos, como colonização, extinção e especiação, influenciam a montagem de comunidades de plantas e insetos herbívoros (Thompson

2005). Em escala local, características intrínsecas a cada comunidade, como condições ambientais e interações bióticas, determinam o estabelecimento e a permanência das espécies ao longo do tempo. No entanto, nem mesmo a co-ocorrência de insetos herbívoros e plantas hospedeiras garantirá a interação entre eles, devido a fatores intrínsecos à planta, como a presença de defesas e fenologia, a presença de competidores e o risco de predação por inimigos naturais. Assim, as interações estabelecidas em escala local são dependentes das características locais das espécies e do ambiente (Strong et al. 1984, Thompson 2005), e raramente são contínuas ao longo da distribuição geográfica de insetos herbívoros e suas hospedeiras potenciais. Por exemplo, pressões seletivas locais podem exigir adaptações para o estabelecimento e permanência de determinada espécie de planta, o que pode levar a alterações na sua morfologia e fisiologia e torná-la localmente indisponível para o inseto herbívoro. Além disso, tais adaptações podem envolver mudanças fenológicas, que pode afetar a sincronia do desenvolvimento de insetos com o recurso utilizado (por exemplo, flores, frutos, folhas novas) e causar uma incompatibilidade alocrônica (Feder et al. 1993, Filchak et al. 2000). Em um tempo relativamente curto (poucas gerações), modificações nas interações dos insetos herbívoros com as plantas hospedeiras ou com outros herbívoros podem causar a extinção local desses insetos, perda de diversidade genética ou originar especiação, com a possibilidade de raças ou

17 subespécies surgirem devido à associação com diferentes espécies de plantas hospedeiras (Strong et al. 1984).

Uma vez que populações coespecíficas de insetos herbívoros podem divergir geneticamente em função de sua associação com plantas hospedeiras (Mitter et al. 1988, Mopper

1996), é necessário destacar o papel fundamental da imigração na viabilidade demográfica e genética das populações. Por um lado, a conexão entre populações permite o aumento da diversidade genética, com a disseminação de ganhos adaptativos entre populações e fortalecimento da base genética para lidar com mudanças ambientais estocásticas que podem causar extinção (Felsenstein 1976). Por outro lado, o isolamento pode causar uma diferenciação genética gradual em populações isoladas, por causas neutras (deriva genética) ou adaptativas

(seleção divergente), e pode culminar no surgimento de novas espécies (Bush 1975, Via 1999,

Drès & Mallet 2002, Feder & Forbes 2010, Heard 2012, Hardy et al. 2016). A diferenciação genética nos insetos herbívoros em simpatria pode ocorrer devido ao surgimento de uma oportunidade ecológica de interagir com uma nova espécie de planta e, caso não haja perda na aptidão associada ao uso da nova planta hospedeira, mudanças comportamentais, fisiológicas e genéticas poderão originar barreiras reprodutivas entre indivíduos associados às diferentes espécies hospedeiras (Bush 1969). Já em escala regional, a diferenciação genética nestes insetos pode estar relacionada com a capacidade de dispersão da espécie, a amplitude de distribuição das diversas espécies hospedeiras, além de variações adaptativas nas plantas hospedeiras que poderão restringir o uso da planta pelo inseto herbívoro em escala local. Ao considerar que as interações dos insetos herbívoros com as espécies de plantas variam entre as localidades e que diferentes associações podem ser localmente estabelecidas (Fox & Morrow 1981, Strong et al.

1984) e, portanto, regionalmente, o reconhecimento das interações herbívoros-plantas em

18 diferentes localidades e a avaliação da variabilidade genética entre populações coespecíficas associadas a diferentes plantas hospedeiras é muito relevante para o entendimento dos processos que geram diversidade e especiação.

Algumas características dos insetos herbívoros são fundamentais para o estudo de sua especialização ecológica, de modo que eles podem ser agrupados de acordo com a parte da planta mais utilizada (folívoros, florívoros, granívoros), o modo como se alimentam

(mastigadores, sugadores) e como ocorre o consumo na planta (interno, externo) (Schoonhoven et al. 2005). Entre os consumidores internos, os insetos galhadores, minadores e endófagos de inflorescências possuem uma conexão mais íntima por um período determinado com suas plantas hospedeiras, pois se desenvolvem no interior da planta até a emergência de um indivíduo adulto

(Lewinsohn et al 2005). Para esses grupos, a planta hospedeira pode ser vista como um habitat completo (Southwood 1973), que, além de recursos alimentares, fornece local de acasalamento, abrigo contra inimigos naturais e condições ambientais desfavoráveis. Além disso, como os insetos herbívoros adultos muitas vezes apresentam alguma fidelidade à planta hospedeira, eventos reprodutivos podem ocorrer preferencialmente na mesma espécie de planta da qual o indivíduo se alimentou quando imaturo (Bush 1969, Gaston et al. 1992, Feder et al. 1994). Nesse caso, as espécies hospedeiras podem ser reconhecidas pelos insetos quimicamente e as interações com espécies de plantas quimicamente relacionadas se mantêm por muitas gerações, o que dificulta o estabelecimento de novas associações (Schoonhoven et al. 2005). Alguns aspectos tornam os herbívoros endófagos grupos de grande interesse para estudar padrões de diferenciação genética associada a hospedeiros em condições naturais, tais como (1) o momento adequado de coletar os insetos em campo é determinado pelo monitoramento da fenologia do hospedeiro; (2) a amplitude de plantas hospedeiras utilizadas pode ser confirmada pela

19 emergência de insetos coespecíficos de diferentes plantas hospedeiras; (3) o fluxo gênico entre populações associadas a diferentes espécies de plantas hospedeiras pode ser avaliado com segurança da origem dos insetos.

Algumas características ecológicas são desejáveis na escolha de sistemas para investigar a diferenciação genética associada ao hospedeiro. Primeiro, é útil abranger conjuntos de espécies com diferentes níveis de especialização ecológica, uma vez que particularidades das interações podem influenciar os mecanismos capazes de gerar diferenciação genética. Segundo, os estudos empíricos mais extensos e de longo prazo tratam de espécies herbívoras associadas a hospedeiros cuja distribuição foi e é fortemente influenciada por atividades humanas, espécies cultivadas ou pragas de importância econômica. Por este motivo, é de grande relevância investigar a diferenciação genética associada ao hospedeiro em insetos herbívoros naturalmente distribuídos entre comunidades, a fim de detectar padrões de ocorrência dessa diferenciação na natureza.

Terceiro, é muito importante garantir a associação herbívoro-hospedeiro, o que reforça a importância de utilizar insetos endófagos nesses estudos.

A diferenciação genética associada ao hospedeiro já foi investigada em diversos insetos herbívoros que consomem plantas tanto interna quanto externamente e, em alguns casos, a formação de raças relacionadas aos hospedeiros ou mesmo espécies crípticas foram encontradas em populações que se alimentam em diferentes plantas hospedeiras (Bush 1969, Abrahamson et al. 2001, Novotny et al. 2010, Antwi et al. 2015, Danon et al. 2017, Driscoe et al. 2019, Moffat et al. 2019). Esse conhecimento foi estabelecido em escala genética e genômica para algumas espécies de insetos herbívoros, principalmente aquelas com importância econômica na agricultura, como mariposas (Bethenod et al. 2005, Dumas et al. 2015, Silva-Brandão et al.

2018) e moscas (Bush 1969, Filchak et al. 2000, Oroño et al. 2013, Rodriguez et al. 2019), e

20 espécies-modelo como Drosophila (Alvarez et al. 2002, Schug et al. 2007). Nesse sentido, é necessário reconhecer sistemas parasita-hospedeiro (no sentido amplo de parasita, incluindo a maioria de insetos herbívoros; Price 1980) para explorar diferentes padrões de diversificação devido a adaptações evolutivas, cujo conhecimento ajudará a melhorar modelos teóricos para prever processos de especiação e extinção diante de mudanças antropogênicas no uso da terra e alterações climáticas advindas do aquecimento global. O desenvolvimento e uso de ferramentas moleculares adequadas para tais estudos ecológicos e evolutivos é um dos fatores limitantes para o avanço da pesquisa nessa área.

Marcadores genéticos na investigação da história evolutiva de insetos fitófagos

Diversos marcadores moleculares, como microssatélites, alozimas, marcadores AFLP

(polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado) e regiões do DNA mitocondrial já foram empregados na investigação da diferenciação genética associada ao hospedeiro. Esses marcadores podem mostrar retratos distintos do processo de diferenciação populacional. Por exemplo, o isolamento ou conexão de populações podem ser detectados medindo o fluxo gênico ou a rota evolutiva feita por linhagens intraespecíficas entre os hospedeiros pode ser rastreada.

Para sistemas estudados a longo prazo, os primeiros estudos avaliaram a estrutura genética de insetos herbívoros entre os hospedeiros e, em seguida, o percurso dos insetos foi registrado entre hospedeiros e localidades na escala regional (Moffat et al. 2019).

O surgimento de oportunidades ecológicas, como a interação com uma nova espécie de planta, ou o isolamento de uma população de espécie generalista (associada a hospedeiras taxonomicamente e/ou filogeneticamente distintas; usualmente tidas como diferentes famílias ou ordens de plantas, mas veja Jorge et al. 2014) representam diferentes processos pelos quais populações coespecíficas de insetos herbívoros podem divergir geneticamente (Bush 1969, 1975,

Via 1999, Abrahamson et al. 2001, Drès & Mallet 2002, Funk et al. 2002). Uma predição decorrente destas novas interações é que pares de populações de insetos herbívoros que utilizem recursos diferentes serão mais isolados reprodutivamente do que aqueles usando o mesmo hospedeiro, porque a divergência ecológica é um indicativo da presença de seleção divergente

(Funk 1998, Nosil et al., 2009). Tais resultados só foram obtidos devido à combinação do conhecimento ecológico dos sistemas estudados com a aplicação de ferramentas moleculares para avaliar os padrões de variabilidade genética entre populações. O surgimento de novas tecnologias de sequenciamento permitiu o acesso e montagem de genomas e transcriptomas de espécies não-modelo, e a redução dos custos associados a essas técnicas tem permitido estudos que enfocam diferentes aspectos das interações planta-inseto (Schlötterer 2004, Roslin et al.

2019), como o surgimento de duplicações gênicas envolvidas em adaptações (Simon et al. 2015,

Dalla & Dobler 2016), a resposta diferencial das plantas ao ataque de insetos na perspectiva transcriptômica (Crava et al. 2016) e novos avanços no entendimento da formação de redes tróficas (Wirta et al. 2014, Roslin & Majaneva 2016). Embora todas essas tecnologias estejam disponíveis, a maior parte dos estudos as aplica em sistemas que compreendem espécies com algum interesse econômico ou espécies-modelo.

Nos estudos focados em espécies nativas, o uso de sequências de cloroplastos (ITS, nadhF, rpl_32) e mitocôndrias (COI e COII, 16S e 18S) tem fornecido informações relevantes sobre a origem evolutiva e padrões de diversificação para espécies de plantas e insetos, respectivamente. Além disso, os pesquisadores têm usado o alto polimorfismo dos Simple

Sequence Repeats (SSR), ou microssatélites, para obter padrões de diversidade e distribuição de espécies em escala fina (Borém & Caixeta 2009, Allendorf 2017). Os dados genéticos adicionam muita informação aos estudos ecológicos que investigam padrões de migração, reprodução de

22 espécies com diferentes capacidades de dispersão e delimitação de espécies. A união de dados ambientais, fenotípicos e genéticos tem originado resultados surpreendentes e mudado a maneira como entendemos a natureza das interações.

Microssatélites são repetições em cadeia de motivos de DNA nuclear, representados por sequências perfeitas (sem interrupções) ou imperfeitas (interrompidas por bases não repetidas) de um a seis nucleotídeos em genomas de organismos eucariotos (Borém & Caixeta 2009, Hodel et al. 2016). O polimorfismo observado reflete a variação no número de repetições de motivos por alelo em um loco, a qual se deve ao crossing-over desigual, ou erros durante a replicação ou retrotransposição (Kalia et al. 2011). Os microssatélites são marcadores co-dominantes, multilocos e multialélicos, portanto, são bastante informativos. Após isolados, eles podem ser acessados por um par específico de iniciadores desenhados na região flanqueadora de cada marcador. Em alguns casos, os iniciadores desenhados para uma espécie podem ser transferidos para outra do mesmo gênero ou mesmo família, embora o sucesso da amplificação varie entre os organismos (Borém & Caixeta 2009). Algumas vantagens adicionais dos microssatélites incluem sua alta reprodutibilidade entre indivíduos; simplicidade técnica; necessidade de baixa quantidade de DNA para desenvolver a biblioteca de marcadores; baixo custo em comparação a técnicas com o mesmo potencial de informação; alta resolução e polimorfismo com ampla cobertura no genoma (Borém & Caixeta 2009, Kalia et al. 2011, Hodel et al. 2016).

A maioria dos estudos ecológicos usa marcadores genéticos para estabelecer relações filogenéticas entre indivíduos dentro ou entre espécies, e para medir a diversidade genética e caracterizar a estrutura genética de populações. Embora as características dos microssatélites não permitam investigar as relações de ancestralidade entre indivíduos, uma vez que não fornecem informações sobre homologias x homoplasias, o alto polimorfismo detectado pelos

23 microssatélites os torna apropriados para comparações de multipopulações, com tanta informação encontrada em menos de 15 locos multialélicos de microssatélites quanto aquelas encontradas em pelo menos 2.000 SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) bialélicos

(Schlötterer 2004). Assim, os microssatélites têm o potencial de mostrar em escala fina a troca de alelos dentro e entre populações, detectando padrões de diversidade genética e estrutura entre os hospedeiros em várias escalas. A resolução dos microssatélites torna esse marcador adequado para investigar muitos problemas ecológicos, como a diferenciação associada ao hospedeiro tratada neste estudo, com alto nível de informação e orçamento mais baixo.

As interações Tomoplagia-Asteraceae como sistema de estudo

A íntima relação entre insetos endófagos e suas plantas hospedeiras torna estas interações especialmente informativas para elucidar mecanismos genéticos envolvidos no processo de especialização ecológica. Alguns gêneros de moscas da fruta da família Tephritidae (Insecta:

Diptera), como Ceratitis e Bactrocera (Dacinae) e Rhagoletis e Anastrepha (Trypetinae), têm sido estudados sob diferentes aspetos ecológicos e evolutivos (Steck 2008) devido a sua grande importância econômica e potenciais prejuízos para a agricultura. O exemplo clássico de estudo de especialização ecológica simpátrica (Bush 1969; Drès & Mallet 2002) é o da mosca

Rhagoletis pomonella (Walsh), que apresenta raças relacionadas à utilização do seu hospedeiro nativo (espinheiro, Crataegus sp.) e alternativo (maçã, Malus sp., introduzida nos USA no século

19). A maioria das larvas das espécies de Tephritidae é herbívora e pode se desenvolver em diferentes tecidos vegetais, como caules, inflorescências e frutos. Nosso interesse está em um gênero menos estudado e sem importância econômica, Tomoplagia Coquillett (Tephritinae).

Existem 59 espécies descritas dentro do gênero Tomoplagia no novo mundo, das quais 57 estão restritas às Américas Central e do Sul (Norrbom et al. 1999, Prado et al. 2004, 2005). Um

24 intenso levantamento das associações de espécies de Tephritidae com suas plantas hospedeiras da família Asteraceae no sudeste e sul do Brasil foi iniciado em 1985 (Apêndice 1; Lewinsohn

1988, 1991, Prado 1999, Prado et al. 2002). Esses estudos correspondem ao maior conjunto de dados de organismos endófagos criados a partir de capítulos de Asteraceae no Brasil, nos quais

Tomoplagia foi reconhecido como o gênero de insetos endófagos mais diverso e abundante em capítulos de Asteráceas brasileiras (Prado et al. 2002). É relevante destacar que a associação com

Asteraceae é considerada um dos principais fatores de diversificação de Tephritidae e também contribuiu para a distribuição cosmopolita de Tephritinae (Zwölfer 1987, Prado 1999).

Asteraceae é a segunda família mais rica em espécies entre as angiospermas e sua maior diversidade ocorre em habitats não florestais (Funk 2009). Os capítulos de Asteraceae são microhabitats complexos e previsíveis, que fornecem alimento e proteção para uma variedade de insetos herbívoros e também para os inimigos naturais desses insetos. As fêmeas de Tomoplagia depositam seus ovos nos capítulos (Fig. 1), nos quais as larvas se alimentarão de flores, óvulos e frutos (Goeden & Headrick 1991). Essa relação íntima requer adaptações específicas ao uso de capítulos, pois (1) o desenvolvimento de um indivíduo adulto ocorre dentro da planta, e por este motivo os endófagos estão direta e continuamente expostos às defesas da planta hospedeira; (2) a maturidade sexual de machos e fêmeas necessita de sincronia com a fenologia das plantas, a fim de garantir o acasalamento e oviposição no momento adequado; (3) é necessária a compatibilidade estrutural entre o tamanho do inseto endófago e o tamanho do capítulo para a associação com a espécie de planta. Devido a isso, insetos herbívoros endófagos apresentam maior especialização ecológica nas suas plantas hospedeiras se comparados com insetos que utilizam as plantas apenas externamente (Gaston et al. 1992).

As principais plantas hospedeiras das espécies de Tomoplagia pertencem à tribo

Vernonieae (Fig. 2), com associações menos frequentes com espécies das tribos Eupatorieae e

Mutisieae (Prado 1999, Prado et al. 2002, 2004). A diversidade de espécies de Vernonieae é particularmente alta nos campos rupestres brasileiros (Campos et al. 2019), um complexo de fisionomias herbáceas em altitude aproximada de 1000 m, com plantas adaptadas a solos pobres e rasos e afloramentos rochosos (Giulietti & Pirani 1988, Silveira et al. 2015, Morellato &

Silveira 2018). Uma das principais subtribos de plantas hospedeiras de Tomoplagia,

Lychnophorinae, é especialmente diversa em toda a Cadeia do Espinhaço, com muitas espécies endêmicas (Campos et al. 2019, Loeuille et al. 2019). Até o momento, a maior diversidade de

Tomoplagia também foi registrada nas serras da Cadeia do Espinhaço, onde a especialização ecológica em plantas hospedeiras varia entre espécies desde as estritamente monófagas (por exemplo, T. argentiniensis, T. pseudopenicillata, T. grandis, T. rudolphi) àquelas associadas a espécies de plantas hospedeiras pertencentes a diferentes gêneros ou subtribos (como T. bicolor,

T. incompleta, T. reimoseri; Fig. 3; Apêndice 2).

Entre as espécies monófagas do gênero Tomoplagia, a interação de indivíduos de T. grandis com sua única planta hospedeira Lessingianthus buddleiifolius representa um caso interessante, pois T. grandis é uma das maiores moscas dentro do gênero Tomoplagia (Prado et al. 2004). Os adultos, que se desenvolvem L. buddleiifolius são maiores ou possuem o mesmo tamanho corporal que a maioria de capítulos das outras espécies de Vernonieae. Assim, restrições adicionais relacionadas à incompatibilidade de tamanho podem influenciar a especialização de T. grandis. As espécies T. argentiniensis e T. pseudopenicillata são monófagas estritas em Cyrtocymura scorpioides. Além de localidades na Cadeia do Espinhaço, essa interação foi registrada em áreas de Mata Atlântica, como a Serra do Japi, no estado de São

Paulo. Os capítulos de C. scorpioides em janeiro e fevereiro, seguida da criação dos indivíduos de Tomoplagia, indicou que Fêmeas de T. argentiniensis e T. pseudopenicillata depositam seus ovos em mesmas populações e até nos mesmos indivíduos de C. scorpioides (Lewinsohn 1991).

No entanto, não há emergência simultânea de indivíduos das duas espécies. A emergência de adultos de T. pseudopenicillata foi de capítulos das primeiras coletas e a de T. argentiniensis foi de capítulos de coletas posteriores (Lewinsohn 1991).

Entre as espécies generalistas, padrões distintos de associações de Tomoplagia com suas plantas hospedeiras são observados ao longo de sua distribuição, refletindo variação em sua especialização ecológica da escala local para a regional. Na Cadeia do Espinhaço, a distribuição geográfica das espécies de Tomoplagia é geralmente mais ampla que a das espécies de plantas, um fator que limita a ocorrência de interações somente às localidades nas quais as plantas ocorrem (Prado 1999). Por exemplo, T. bicolor e T. rupestris ocorrem em muitas localidades na porção meridional da Cadeia do Espinhaço, no entanto, parte das espécies de plantas utilizadas como hospedeiras possui distribuição restrita. Dessa forma, a distribuição das plantas interfere no conjunto de plantas às quais essas espécies de Tomoplagia se associam em comunidades locais e muitas vezes elas interagem com espécies congenéricas em diferentes localidades. Por outro lado, T. incompleta, que também é amplamente distribuída na Cadeia do Espinhaço meridional, é a espécie de Tomoplagia com maior número de plantas hospedeiras conhecidas (Prado et al.

2002) e diversas dessas hospedeiras também são amplamente distribuídas.

O conhecimento das áreas de ocorrência das espécies de plantas hospedeiras de

Tomoplagia, acumulado ao longo de décadas de coletas sistematizadas e concretizado no maior banco de dados de interações de insetos endófagos-Asteraceae do Sul e Sudeste do Brasil,

27 direcionam as coletas para os locais nos quais uma maior diversidade de espécies de plantas e, consequentemente, Tomoplagia ocorrem.

Objetivo geral da tese

As interações entre Tomoplagia e suas plantas hospedeiras fornecem um sistema único para avaliar e contrastar padrões de variabilidade genética em espécies com diferentes níveis de especialização ecológica em ecossistemas naturais, o que fortalecerá a teoria sobre diferenciação associada ao hospedeiro e especiação como um todo, uma vez que a maioria dos estudos é direcionada para uma espécie, sem considerar causas de variação na amplitude dieta das espécies herbívoras e seus efeitos na variabilidade genética dos herbívoros.

Os dois outros capítulos que compõem essa tese apresentam os resultados da investigação da variabilidade e estrutura genética de três espécies de Tomoplagia (T. grandis, T. bicolor e T. incompleta) em relação à associação com espécies de plantas hospedeiras em escala local e regional. No Capítulo 2, descrevo os procedimentos realizados para isolar e caracterizar marcadores microssatélites para as três espécies de Tomoplagia e discuto o potencial informativo e o papel da relação filogenética na transferibilidade dos marcadores microssatélites entre espécies. No capítulo 3, apresento o padrão de variabilidade e estruturação genética para as populações das três espécies de Tomoplagia obtido com os marcadores microssatélites, e discuto esses resultados de acordo com a especialização trófica de cada espécie, que está diretamente ligada ao padrão de distribuição das plantas hospedeiras.

Referências bibliográficas

ABRAHAMSON, W. G., M. D. EUBANKS, C. P. BLAIR, and A. V. WHIPPLE. 2001. Gall flies,

inquilines, and goldenrods: a model for host-race formation and sympatric speciation. Am.

Zool. 41: 928–938.

AGRAWAL, A. A. 2000. Host-range evolution: adaptation and trade-offs in fitness of mites on alternative hosts. Ecology 81: 500–508.

ALLENDORF, F. W. 2017. Genetics and the conservation of natural populations: allozymes to genomes. Mol. Ecol. 26: 420–430.

ANTWI, J. B., G. A. SWORD, and R. F. MEDINA. 2015. Host-associated differentiation in a highly polyphagous, sexually reproducing insect herbivore. Ecol. Evol. 5: 2533–2543.

BARBOUR, M.G., J. H. BURK, and W. D. PITTS. 1980. Terrestrial plant ecology. Benjamin/Cummings, MenloPark, California.

BERNAYS, E. A., and O. MINKENBERG. 1997. Insect herbivores: different reasons for being a generalist. Ecology 78: 1157–1169.

BETHENOD, M.-T., Y. THOMAS, F. ROUSSET, B. FRÉROT, L. PÉLOZUELO, G. GENESTIER, and D. BOURGUET. 2005. Genetic isolation between two sympatric host plant races of the European corn borer, Ostrinia nubilalis Hübner. II: assortative mating and host-plant preferences for oviposition. Heredity 94: 264–270.

BORÉM, A. AND E. CAIXETA 2009. Marcadores moleculares. 2a. Edição. Editora UFV, Viçosa.

BUSH, G. L. 1969. Sympatric host race formation and speciation in frugivorous flies of the genus Rhagoletis (Diptera, Tephritidae). Evolution 23: 237–251.

BUSH, G. L. 1975. Modes of animal speciation. Annu. Rev. Ecol. Syst. 6: 339–364.

CAMPOS, L., M. FREIRE MORO, V. A. FUNK, and N. ROQUE. 2019. Biogeographical review of Asteraceae in the Espinhaço Mountain Range, Brazil. Bot. Rev. Available at: http://link.springer.com/10.1007/s12229-019-09216-9 [Accessed November 21, 2019].

CRAVA, C. M., C. BRÜTTING, and I. T. BALDWIN. 2016. Transcriptome profiling reveals differential gene expression of detoxification enzymes in a hemimetabolous tobacco pest after feeding on jasmonate-silenced Nicotiana attenuata plants. BMC Genomics 17. Available at: http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-016-3348-0 [Accessed December 1, 2019].

DALLA, S., and S. DOBLER. 2016. Insect adaptation to toxic host plants: gene duplications circumvent functional trade-offs. Evolution 70: 2767–2777.

DANON, G., R. BEN-SHLOMO, N. KEIDAR, and N. DORCHIN. 2017. Geographic and behavioural isolation promote the differentiation of parapatric host-associated forms in bud-galling midges (Diptera: Cecidomyiidae). Biol. J. Linn. Soc. 121: 163–173.

DRÈS, M., and J. MALLET. 2002. Host races in plant-feeding insects and their importance in sympatric speciation. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 357: 471–492.

DRISCOE, A. L., C. C. NICE, R. W. BUSBEE, G. R. HOOD, S. P. EGAN, and J. R. OTT. 2019. Host plant associations and geography interact to shape diversification in a specialist insect herbivore. Mol. Ecol. 28: 4197–4211.

DUMAS, P., F. LEGEAI, C. LEMAITRE, E. SCAON, M. ORSUCCI, K. LABADIE, S. GIMENEZ, A.-L. CLAMENS, H. HENRI, F. VAVRE, J.-M. AURY, P. FOURNIER, G. J. KERGOAT, and E. D’ALENÇON. 2015. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) host-plant variants: two host strains or two distinct species? Genetica 143: 305–316.

DYER, L. A., M. S. SINGER, J. T. LILL, J. O. STIREMAN, G. L. GENTRY, R. J. MARQUIS, R. E. RICKLEFS, H. F. GREENEY, D. L. WAGNER, H. C. MORAIS, I. R. DINIZ, T. A. KURSAR, and P. D. COLEY. 2007. Host specificity of Lepidoptera in tropical and temperate forests. Nature 448: 696–699.

EHRLICH, P. R., and P. H. RAVEN. 1964. Butterflies and plants: a study in coevolution. Evolution 18: 586.

FEDER, J. L., and A. A. FORBES. 2010. Sequential speciation and the diversity of parasitic insects. Ecol. Entomol. 35: 67–76.

FEDER, J. L., T. A. HUNT, and L. BUSH. 1993. The effects of climate, host plant phenology and host fidelity on the genetics of apple and hawthorn infesting races of Rhagoletis pomonella. Entomol. Exp. Appl. 69: 117–135.

FEDER, J. L., S. B. OPP, B. WLAZLO, K. REYNOLDS, W. GO, and S. SPISAK. 1994. Host fidelity is an effective premating barrier between sympatric races of the apple maggot fly. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7990–7994.

FELSENSTEIN, J. 1976. The theoretical population genetics of variable selection and migration. Annu. Rev. Genet. 10: 253–280.

FILCHAK, K. E., J. B. ROETHELE, and J. L. FEDER. 2000. Natural selection and sympatric divergence in the apple maggot Rhagoletis pomonella. Nature 407: 739–742.

FORISTER, M. L., L. A. DYER, M. S. SINGER, J. O. STIREMAN III, and J. T. LILL. 2012. Revisiting the evolution of ecological specialization, with emphasis on insect–plant interactions. Ecology 93: 981–991.

FOX, L., and P. MORROW. 1981. Specialization - species property or local phenomenon. Science 211: 887–893.

FUNK, D. J. 1998. Isolating a role for natural selection in speciation: host adaptation and sexual isolation in Neochlamisus bebbianae leaf beetles. Evolution 52:1744-1759.

FUNK, D. J., K. E. FILCHAK, and J. L. FEDER. 2002. Herbivorous insects: model systems for the comparative study of speciation ecology. Genetica 116: 251–267.

FUNK, V.A. (ed.) 2009. Systematics, evolution, and biogeography of Compositae. International Association for Plant Taxonomy, Viena.

GASTON, K. J., D. REAVEY, and G. R. VALLADARES. 1992. Intimacy and fidelity: internal and external feeding by the British microlepidoptera. Ecol. Entomol. 17: 86–88.

GIULIETTI, A. M., and J. R. PIRANI. 1988. Patterns of geographic distribution of some plant species from the Espinhaço Range, Minas Gerais and Bahia, Brazil. In Proceedings of a Workshop on Neotropical Distribution Patterns, pp. 39–69, W.R. Heyer & P.E. Vanzolini (eds), Rio de Janeiro.

GOEDEN, R., and D. HEADRICK. 1991. Notes on the biology, hosts, and immature stages of Tomoplagia cressoni Aczel in southern California (Diptera: Tephritidae). Proc. Entomol. Soc. Wash. USA.

HARDY, N. B., D. A. PETERSON, and B. B. NORMARK. 2016. Nonadaptive radiation: Pervasive diet specialization by drift in scale insects? Evolution 70: 2421–2428.

HEARD, S. B. 2012. Use of host-plant trait space by phytophagous insects during host-associated differentiation: the gape-and-pinch model. Int. J. Ecol. 2012: 1–15.

HODEL, R. G. J., M. C. SEGOVIA-SALCEDO, J. B. LANDIS, A. A. CROWL, M. SUN, X. LIU, M. A. GITZENDANNER, N. A. DOUGLAS, C. C. GERMAIN-AUBREY, S. CHEN, D. E. SOLTIS, and P. S. SOLTIS. 2016. The report of my death was an exaggeration: a review for researchers using microsatellites in the 21st Century. Appl. Plant Sci. 4: 1600025.

JORGE, L. R., P. I. PRADO, M. ALMEIDA-NETO, and T. M. LEWINSOHN. 2014. An integrated framework to improve the concept of resource specialisation. Ecol. Lett. 17: 1341–1350.

KALIA, R. K., M. K. RAI, S. KALIA, R. SINGH, and A. K. DHAWAN. 2011. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants. Euphytica 177: 309–334.

LEAL, C. R. O., J. OLIVEIRA SILVA, L. SOUSA-SOUTO, and F. DE SIQUEIRA NEVES. 2016. Vegetation structure determines insect herbivore diversity in seasonally dry tropical forests. J. Insect Conserv. 20: 979–988.

LEWINSOHN, T. M. 1988. Composição e tamanho de faunas associadas a capítulos de compostas. Tese de Doutoramento. Universidade Estadual de Campinas.

LEWINSOHN, T. M. 1991. Insects in flower heads of Asteraceae in Southeast Brazil: a tropical case study on species richness. In Plant-Animal Interactions: Evolutionary Ecology in Tropical and Temperate Regions. pp. 525–560, P.W. Price et . (eds.) Wiley, New York.

LEWINSOHN, T. M., V. NOVOTNY, and Y. BASSET. 2005. Insects on plants: diversity of herbivore assemblages revisited. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 36: 597–620.

LEWINSOHN, T. M., and T. ROSLIN. 2008. Four ways towards tropical herbivore megadiversity. Ecol. Lett. 11: 398–416.

LOEUILLE, B., J. SEMIR, AND J. R. PIRANI. 2019. A synopsis of Lychnophorinae (Asteraceae: Vernonieae). Phytotaxa 398: 1–139. Available at: . Date accessed: 21 Nov. 2019

MEDINA, R. F., P. NACHAPPA, and C. TAMBORINDEGUY. 2011. Differences in bacterial diversity of host-associated populations of Phylloxera notabilis Pergande (Hemiptera: Phylloxeridae) in pecan and water hickory: HAD and insect-associated bacteria. J. Evol. Biol. 24: 761–771.

MITTER, C., B. FARRELL, and B. WIEGMANN. 1988. The phylogenetic study of adaptive zones: Has phytophagy promoted insect diversification? American Naturalist 132:107-128.

MOPPER, S. 1996. Adaptive genetic structure in phytophagous insect populations. Trends in Ecology & Evolution 11:235-238.

MOFFAT, C. E., M. K. TAKAHASHI, S. L. PEASE, J. M. BROWN, S. B. HEARD, and W. G. ABRAHAMSON. 2019. Are Eurosta solidaginis on Solidago rugosa a divergent host- associated race? Evol. Ecol. 33: 369–384.

MORELLATO, L. P. C., and F. A. O. SILVEIRA. 2018. Plant life in campo rupestre: New lessons from an ancient biodiversity hotspot. Flora 238: 1–10.

NORRBOM, A. L., L. E. CARROLL, F. C. THOMPSON, I. WHITE, and A. FREIDBERG. 1999. Systematic database of names. Fruit Fly Expert Identification System and Systematic Information Database. Myia 9: 65-251. Nosil, P., L. J. Harmon, O. Seehausen. 2009. Ecological explanations for (incomplete) speciation. Trends in Ecology & Evolution 24:145-156.

NOVOTNY, V., P. DROZD, S. E. MILLER, M. KULFAN, M. JANDA, Y. BASSET, and G. D. WEIBLEN. 2006. Why are there so many species of herbivorous insects in tropical rainforests? Science 313: 1115–1118.

NOVOTNY, V., S. E. MILLER, L. BAJE, S. BALAGAWI, Y. BASSET, L. CIZEK, K. J. CRAFT, F. DEM, R. A. I. DREW, J. HULCR, J. LEPS, O. T. LEWIS, R. POKON, A. J. A. STEWART, G. ALLAN SAMUELSON, and G. D. WEIBLEN. 2010. Guild-specific patterns of species richness and host specialization in plant-herbivore food webs from a tropical forest: Plant-herbivore food webs in tropical forest. J. Anim. Ecol. 79: 1193–1203.

OROÑO, L., L. PAULIN, A. C. ALBERTI, M. HILAL, S. OVRUSKI, J. C. VILARDI, J. RULL, and M. ALUJA. 2013. Effect of host plant chemistry on genetic differentiation and reduction of

gene flow among Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) populations exploiting sympatric, synchronic hosts. Environ. Entomol. 42: 790–798.

POULIN, R. 1997. Species richness of parasite assemblages: evolution and patterns. Annu. Rev. Ecol. Syst. 28: 341–358.

PRADO, P., A. ABREU, V. SOLFERINI, and A. NORRBOM. 2005. Genetic and morphological diagnosis and description of two cryptic species of flower head-infesting Tephritidae (Diptera). Insect Syst. Evol. 36: 361–370.

PRADO, P. I. 1999. Determinantes de ampla escala das associações entre insetos e plantas: tefritídeos (Diptera) endófagos de capítulos de Asteraceae. Tese de Doutoramento. Universidade Estadual de Campinas.

PRADO, P. I., T. M. LEWINSOHN, A. M. ALMEIDA, A. L. NORRBOM, B. D. BUYS, A. C. MACEDO, and M. B. LOPES. 2002. The fauna of Tephritidae (Diptera) from capitula of Asteraceae in Brazil. Proc. Entomol. Soc. Wash. 104: 1007–1028.

PRADO, P. I., A. L. NORRBOM, and T. M. LEWINSOHN. 2004. New species of Tomoplagia Coquillett (Diptera: Tephritidae) from capitula of Asteraceae in Brazil. Neotrop. Entomol. 33: 189–211.

PRICE, P.W., 1980. Evolutionary biology of parasites. Princeton University Press, Princeton.

RASMANN, S., and A. A. AGRAWAL. 2011. Evolution of specialization: a phylogenetic study of host range in the red milkweed beetle (Tetraopes tetraophthalmus). Am. Nat. 177: 728– 737.

RODRIGUEZ, A. I., L. I. FERREYRA, S. B. LANZAVECCHIA, P. V. GOMEZ CENDRA, and J. C. VILARDI. 2019. Cryptic genetic structure in an Argentinian population of Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) evidenced by SSR markers and quantitative traits. Eur. J. Entomol. 116: 109–122.

ROSLIN, T., and S. MAJANEVA. 2016. The use of DNA barcodes in food web construction— terrestrial and aquatic ecologists unite! Genome 59: 603–628.

ROSLIN, T., M. TRAUGOTT, M. JONSSON, G. N. STONE, S. CREER, and W. O. C. SYMONDSON. 2019. Introduction: Special issue on species interactions, ecological networks and community dynamics – Untangling the entangled bank using molecular techniques. Mol. Ecol. 28: 157–164.

SCHLÖTTERER, C. 2004. The evolution of molecular markers — just a matter of fashion? Nat. Rev. Genet. 5: 63–69.

SCHOONHOVEN, L. M., B. VAN LOON, J. J. VAN LOON, and M. DICKE. 2005. Insect-plant biology. Oxford University Press, Oxford.

SCRIBER, J. M. 2002. Evolution of insect-plant relationships: chemical constraints, coadaptation, and concordance of insect/plant traits. Entomol. Exp. Appl. 104: 217–235.

SILVA-BRANDÃO, K. L., A. PERUCHI, N. SERAPHIM, N. F. MURAD, R. A. CARVALHO, J. R. FARIAS, C. OMOTO, F. L. CÔNSOLI, A. FIGUEIRA, and M. M. BRANDÃO. 2018. Loci under selection and markers associated with host plant and host-related strains shape the genetic structure of Brazilian populations of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) J. L. PLOS ONE 13: e0197378.

SILVEIRA, F. A. O. ET AL. 2015. Ecology and evolution of plant diversity in the endangered campo rupestre: a neglected conservation priority. Plant Soil. Available at: http://link.springer.com/10.1007/s11104-015-2637-8 [Accessed September 8, 2015].

SIMON, J.-C., E. D’ALENCON, E. GUY, E. JACQUIN-JOLY, J. JAQUIERY, P. NOUHAUD, J. PECCOUD, A. SUGIO, and R. STREIFF. 2015. Genomics of adaptation to host-plants in herbivorous insects. Funct. Genomics 14: 413–423.

SIMON, J.-C., S. CARRÉ, M. BOUTIN, N. PRUNIER–LETERME, B. SABATER–MUÑOZ, A. LATORRE, and R. BOURNOVILLE. 2003. Host–based divergence in populations of the pea aphid: insights from nuclear markers and the prevalence of facultative symbionts. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 270: 1703–1712.

STECK G. J. 2008. Fruit Flies (Diptera: Tephritidae). In: Capinera J.L. (ed) Encyclopedia of Entomology. Springer, Dordrecht.

STRONG, D. R., J. H. LAWTON, and S. R. SOUTHWOOD. 1984. Insects on plants: community patterns and mechanisms. Harvard University Press, Cambridge, MA.

THOMPSON, J. N. 2005. The geographic mosaic of coevolution. University of Chicago Press, Chicago.

VIA, S. 1999. Reproductive isolation between sympatric races of pea aphids. I. Gene flow restriction and habitat choice. Evolution 53: 1446–1457.

WEIBLEN, G. D., C. O. WEBB, V. NOVOTNY, Y. BASSET, and S. E. MILLER. 2006. Phylogenetic dispersion of host use in a tropical insect herbivore community. Ecology 87: S62–S75.

WIRTA, H. K., P. D. N. HEBERT, R. KAARTINEN, S. W. PROSSER, G. VÁRKONYI, and T. ROSLIN. 2014. Complementary molecular information changes our perception of food web structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 111: 1885–1890.

YOTOKO, K.S.C., P.I. PRADO, C. A. M. RUSSO, AND V. N. SOLFERINI. 2005. Testing the trend towards specialization in herbivore-host plant associations using a molecular phylogeny of Tomoplagia (Diptera: Tephritidae). Mol. Phylogenet. Evol. 35: 701–711.

Figura 1. Fêmea de Tomoplagia bicolor ovipositando em capítulo de Minasia alpestris. As marcas presentes no tórax e abdômen (pontos pretos) e o padrão das bandas presentes nas asas são importantes caracteres utilizados na identificação das espécies de Tomoplagia. Foto: Leonardo Ré Jorge.

A B

C D

E F

G H

Figura 2. Espécies de Vernonieae coletadas nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. Essas espécies são importantes plantas hospedeiras de Tomoplagia bicolor e T. incompleta. (A) Minasia alpestris, (B) M. scapigera, (C) Lychnophora tomentosa, (D) Lychnophoriopsis candelabrum, (E) Lepidaploa rufogrisea, (F) Echinocoryne

schwenkiifolia, (G) Chresta sphaerocephala e (H) Eremanthus elaeagnus. Fotos: (A-C;E-H) Leonardo Re Jorge; (C) Camila Leal.

Figura 3. Interações entre Tomoplagia-Asteraceae nos campos rupestris da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. A figura mostra a interação das espécies de Tomoplagia com os gêneros de Asteraceae; o número de interações específicas varia entre os gêneros. Os gêneros de Asteraceae que não estão em negrito pertencem a tribo Vernonieae; os gêneros em negrito pertencem a tribos diversas de Asteraceae.

Capítulo 2: Caracterização e ausência de transferibilidade de locos microssatélites entre espécies de Tomoplagia (Diptera: Tephritidae)

Camila Rabelo Oliveira Leal, Leonardo Ré Jorge, Anete Pereira de Souza, Thomas Michael Lewinsohn & Karina Lucas Silva-Brandão

Resumo

Marcadores microssatélites são ferramentas genéticas com alto poder de detecção de polimorfismo por loco, comparados a outros marcadores moleculares e, devido a isso, são muito informativos e adequados para estudos populacionais com foco na detecção de variabilidade genética. Neste estudo, isolamos e caracterizamos conjuntos de microssatélites para três espécies de Tomoplagia (Diptera: Tephritidae), moscas endófagas de capítulos de Asteraceae com diferentes níveis de especialização no uso de plantas hospedeiras, e testamos a amplificação heteróloga dos microssatélites caracterizados. Utilizamos dois protocolos para construir as bibliotecas enriquecidas em microssatélites, e caracterizamos 12 locos polimórficos para cada espécie de mosca. As amostras de T. grandis, espécie de hábito monófago, apresentaram menor número de alelos do que as amostras das espécies oligófagas T. incompleta e T. bicolor. A heterozigosidade média observada não variou entre as três espécies, e os altos valores de conteúdo informativo de polimorfismo indicam que os locos microssatélites que caracterizamos são bastante efetivos. Os iniciadores desenvolvidos para cada uma das espécies de Tomoplagia não amplificaram os locos microssatélites para as outras duas espécies, e o teste de amplificação heteróloga indicou uma baixa conservação das sequências de nucleotídeos que flanqueiam as regiões microssatélites nas três espécies avaliadas. Os conjuntos de microssatélites polimórficos caracterizados para três espécies de Tomoplagia poderão ser utilizados em diversos estudos ecológicos e evolutivos que visam detectar padrões de diversidade em fina escala.

Palavras-chave: amplificação heteróloga, Asteraceae, campos rupestres, insetos endófagos, SSR

Introdução

Nas últimas décadas, o uso de ferramentas moleculares para investigar padrões de variação e estruturação da diversidade genética, e os processos responsáveis por tais padrões, em diferentes escalas espaciais e temporais, se tornou mais frequente (Seehausen et al. 2014, Creer et al. 2016, Allendorf 2017). Nesse período, os custos associados às técnicas de sequenciamento e genotipagem diminuíram, permitindo a obtenção de dados genéticos e genômicos, enquanto programas e pacotes mais poderosos para visualização e análise desses dados se tornaram amplamente disponíveis (Allendorf 2017). Dentre os marcadores moleculares, os microssatélites, ou Simple Sequence Repeats (SSR), são bastante eficazes para a avaliação da diversidade genética dentro e entre populações, por diversos motivos: são altamente informativos, principalmente devido a sua natureza codominante e multialélica, têm ampla cobertura no genoma, além de apresentarem ampla reprodutibilidade, baixo custo e simplicidade técnica para seu desenvolvimento (Borém & Caixeta 2016). A genotipagem de locos microssatélites requer uma pequena quantidade de DNA, por ser uma técnica baseada em PCR (reação em cadeia da polimerase). Isso permite amostragens menos invasivas ou destrutivas, especialmente importantes para preservar espécimes de coleções biológicas (Borém & Caixeta 2016, Allendorf

2017). Outra vantagem dos microssatélites é a possibilidade de utilizar a ortologia entre grupos aparentados e realizar a transferibilidade de pares de iniciadores (primers) entre espécies próximas (Gupta et al. 2003, Barbará et al. 2007, Augustinos et al. 2008).

Neste estudo, isolamos e caracterizamos marcadores microssatélites para diferentes espécies de Tomoplagia Coquilett (Tephritidae). O gênero Tomoplagia abrange o principal grupo

40 de insetos herbívoros endófagos de capítulos de Asteraceae no Brasil (Lewinsohn 1991, Prado

1999, Prado et al. 2002, 2004). Na maioria das espécies de Tomoplagia cuja biologia é conhecida, as fêmeas depositam ovos em capítulos das suas plantas hospedeiras, nos quais as larvas se alimentam das flores e das cipselas (apesar de amplamente designados como aquênios, a denominação cipsela é anatomicamente mais apropriada para o fruto de Asteráceas; Marzinek

2008). As larvas empupam dentro do capítulo, do emergem como adultos. Dessa forma, a planta hospedeira representa um habitat completo no qual as moscas de Tomoplagia se abrigam e se desenvolvem. As 59 espécies descritas para o gênero possuem uma distribuição predominante na região Neotropical, com maior diversidade de espécies encontrada até o presente nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço no estado de Minas Gerais, Brasil (Prado et al. 2002, 2004,

2005). Ressalte-se, entretanto, que a fauna associada às Asteráceas de campos rupestres ou alto- montanos é praticamente desconhecida em outras regiões brasileiras. Em vista da alta diversidade e endemismo de plantas potencialmente hospedeiras de Tomoplagia em regiões como a Chapada Diamantina (Ogasawara & Roque 2015, Roque et al. 2016, Campos et al.

2019), podemos prever a ampliação da distribuição atualmente conhecida de diversas espécies, bem como o encontro de novas espécies desse gênero de Tefritídeos, após a prospecção de insetos associados a Asteráceas nessas áreas.

Diversos estudos foram desenvolvidos para elucidar os padrões de associação de

Tomoplagia com suas plantas hospedeiras, tanto em escala local como regional (Lewinsohn

1991, Prado 1999, Prado et al. 2002, 2004), os quais evidenciaram grande variação de especialização ecológica entre as espécies de Tomoplagia. As características ecológicas conhecidas para o gênero, tais como amplitude no grau de especialização ao hospedeiro, certeza da associação devido ao desenvolvimento no interior dos capítulos e distribuição geográfica bem

41 conhecida, tornam a interação Tomoplagia-Asteraceae um excelente modelo para o desenvolvimento de estudos ecológico-evolutivos, tais como aqueles relacionados a padrões de diversidade genética e processos por trás da evolução da especialização ecológica (Devictor et al.

2010, Forister et al. 2012).

Neste estudo, caracterizamos marcadores microssatélites para três espécies de

Tomoplagia associadas a Asteráceas na região Sudeste do Brasil. Tomoplagia grandis Prado,

Norrbom & Lewinsohn, 2004 é uma espécie estritamente monófaga; sua única planta hospedeira conhecida é Lessingianthus buddleiifolius (Mart. ex DC.) H.Rob. T. bicolor Prado, Norrbom &

Lewinsohn, 2004 é uma espécie oligófaga com pelo menos 17 espécies hospedeiras registradas, quase todas pertencentes a cinco gêneros da tribo Lychnophorinae (Prado et al. 2004). T. incompleta (Williston, 1896), espécie oligófaga, tem mais de 20 hospedeiras conhecidas, principalmente nos gêneros Lessingianthus e Lepidaploa, da subtribo Vernoniinae (Prado &

Lewinsohn 2004). Testamos a amplificação heteróloga dos conjuntos de marcadores desenvolvidos para cada uma das três espécies de Tomoplagia, embora elas estejam distantes filogeneticamente na única hipótese filogenética proposta para o gênero (Yotoko et al. 2005; Fig.

1). O desenvolvimento e caracterização desses marcadores microssatélites fornecerá novas ferramentas para a investigação da variabilidade genética no gênero Tomoplagia, com grande potencial de aplicação em estudos de filogeografia e conservação.

Material e Métodos

Construção das bibliotecas e desenho dos iniciadores

Construímos bibliotecas enriquecidas em microssatélites para cada uma das três espécies de Tomoplagia. Para T. incompleta, o isolamento dos microssatélites foi desenvolvido pela

Genetic Marker Services (Brighton, UK; https://geneticmarkerservices.com) e a biblioteca foi construída de acordo com o protocolo de Edwards et al. (1996) a partir do material genético de cinco indivíduos. O DNA genômico total dos indivíduos inteiros de T. incompleta foi obtido com um protocolo de extração salina (Aljanabi & Martinez 1997). A enzima RsaI (New England

Biolabs) foi utilizada para digerir o DNA genômico total e o enriquecimento foi realizado usando as sondas (AG)17, (AC)17, (AAC)10, (CCG)10, (CTG)10 e (AAT)10 (González et al. 2015)., e posteriormente foram clonados.

Construímos as bibliotecas para as espécies T. grandis e T. bicolor de acordo com o protocolo de Billotte et al. (1999), a partir do material genético de um e cinco indivíduos, respectivamente. O DNA genômico total dos indivíduos inteiros de T. grandis e T. bicolor foi extraído com o protocolo de brometo cetiltrimetilamônio (CTAB; Doyle & Doyle 1987). A enzima AfaI (Invitrogen), isosquizômera de RsaI, foi utilizada para digerir o DNA genômico de

T. grandis e T. bicolor, e os fragmentos obtidos foram ligados aos adaptadores de fita dupla 5'-

CTCTTGCTTACGCGTGGACTA-3' e 5'-TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA-3'. Como encontramos elementos transponíveis (transposons) ao usar a enzima AfaI na construção da biblioteca de microssatélites para T. bicolor, construímos outras duas bibliotecas para essa espécie utilizando as enzimas BsuRI e AluI (Invitrogen). Para ambas as espécies, a captura de fragmentos que continham microssatélites foi feita por meio da hibridização das sondas (CT)8 e

(GT)8 ligadas à biotina por esferas magnéticas revestidas por estreptavidina (MagneSphere

Magnetic Separation Products, Promega). Os fragmentos de DNA enriquecidos com microssatélites de cada espécie foram amplificados separadamente via PCR, clonados em pGEM-T Easy Vector (Promega) e inseridos via eletroporação em células competentes de

Escherichia coli XL1-Blue (Promega). Os clones positivos foram selecionados e cultivados em meio de ágar acrescido de 100 μg/mL de ampicilina e 50 μg/mL de X-galactosidase. Após incubação de 16 horas a 37°C, as colônias obtidas para cada espécie foram transferidas para microplacas e armazenadas em freezer a -70°C.

Sequenciamos 25, 48 e 48 clones positivos para T. incompleta, T. grandis e T. bicolor, respectivamente, em sequenciador automático ABI 3500xL (Life Technologies) com o kit Big

Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems). Utilizamos o programa SSRIT

(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool) para identificar a presença de repetições de microssatélites nas sequências geradas. Utilizamos o software Primer3Plus (Untergasser et al.

2012) para desenhar os pares de iniciadores para os locos microssatélites caracterizados para cada espécie de Tomoplagia. Os parâmetros estabelecidos foram: tamanho do iniciador entre 18-

22 pb; tamanho final dos produtos de amplificação de 100–280 pb; temperatura de melting (Tm) entre 52°C - 65°C e máxima diferença de Tm entre pares de iniciadores de 3°C; porcentagem mínima de GC nos iniciadores de 40% e máxima de 60%; ausência de complementaridade na mesma sequência ou nos pares de iniciadores.

PCR e polimorfismo dos locos

A validação dos locos microssatélites foi feita em seis indivíduos da espécie para qual cada conjunto de locos foi isolado, e o teste de amplificação heteróloga foi realizado em seis indivíduos das outras duas espécies. As condições da PCR foram: 1,5 μL do DNA genômico na

concentração padronizada de 5 ng/μL, 2 μL de tampão 5X, 2 μL de DMSO 5%, 1,6 μL de MgCl2 a 25nM, 0,3 μL de dNTPs a 10 nM, 0,3 μL de cada iniciador direto e reverso a 10 nM, 0,3 μL de

Taq DNA polimerase caseira, e H2O deionizada autoclavada em quantidade suficiente para 20

μL de reação. O programa de PCR utilizado foi: desnaturação inicial a 94°C (5 min); 30 ciclos de desnaturação a 94°C (30 s), anelamento à temperatura específica (45 s) (Tabelas 1, 2 e 3), e extensão a 72°C (45 s); extensão final a 72°C (10 min). Avaliamos o polimorfismo dos locos microssatélites em gel de poliacrilamida 6% corado com prata (Creste et al. 2001).

Genotipagem

Os locos que apresentaram polimorfismo no teste inicial em gel de poliacrilamida foram escolhidos para caracterizar o perfil genotípico de 30 indivíduos de cada uma das espécies de

Tomoplagia investigadas, todos oriundos de campos rupestres da Cadeia do Espinhaço meridional. Os indivíduos de cada espécie de Tomoplagia eram provenientes da mesma espécie de planta hospedeira, de diferentes localidades. Assim, os indivíduos analisados de T. bicolor foram criados de Eremanthus elaeagnus; indivíduos de T. grandis foram criados de

Lessingianthus buddleiifolius; e os indivíduos de T. incompleta foram criados de Echinocoryne schwenkiifolia. Os pares de iniciadores que não geraram produtos de amplificação ou que amplificaram vários fragmentos inespecíficos na amplitude de temperatura testada (53°C – 65°C) foram descartados. Os iniciadores diretos usados na amplificação de todos os locos foram sintetizados com a adição de uma cauda M13 (TGTAAAACGACGGCCAGT) na extremidade

5’, para o anelamento dos fluoróforos FAM, VIC, PET e NED (Life Technologies, Carlsbad,

CA, USA; Schuelke 2000), para leitura posterior simultânea de quatro fluoróforos em sequenciador automático; a cada loco foi designada uma fluorescência. As amostras amplificadas

45 foram submetidas a corrida em gel de agarose 1,5 % com tampão Tris-acetato (TAE) 50 mM (pH

7,5 - 7,8) para testar a amplificação. As reações de PCR foram refeitas com a adição de 0,1 μL de cada um dos fluoróforos e a adição de uma segunda etapa no programa de PCR para o anelamento do fluoróforo à cauda. Essa etapa consistiu em 8 ciclos de desnaturação a 94°C (30 s), anelamento a 53°C (45 s) e extensão a 72°C (45 s). Os produtos das PCRs foram diluídos

(10-20%) e em seguida combinados em um multiplex com quatro locos marcados pelas diferentes fluorescências para a genotipagem no sequenciador ABI 3500xL. O marcador Liz

GeneScan 600 (Life Technologies) foi utilizado como padrão de peso molecular para as genotipagens.

A leitura dos eletroferogramas foi realizada com o plugin para análise de microssatélites no programa Geneious Prime v. 2019.0.4 (Kearse et al. 2012). Os alelos foram determinados de acordo com o tamanho (peak calling) e bins foram sobrepostos aos picos de fluorescência para a identificação e padronização dos alelos.

Análises descritivas dos locos microssatélites

Caracterizamos os locos polimórficos de cada conjunto de microssatélites em relação ao número total de alelos por loco e às heterozigosidades observada (HO) e esperada (HE) usando o pacote hierfstat (Goudet 2005) no R (R Core Team 2014). O conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) foi calculado com o pacote PopGenKit (Paquette 2012). O teste exato de

Fisher foi utilizado para detectar desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) por loco e foi executado com o pacote pegas (Paradis 2010).

Resultados

Encontramos sequências microssatélites em 42% das sequências obtidas para Tomoplagia grandis, e em 76% e 36% das sequências obtidas para T. bicolor e T. incompleta, respectivamente. Desenhamos pares de iniciadores para 20, 19 e 17 locos microssatélites para

Tomoplagia grandis, T. bicolor e T. incompleta, respectivamente. Dos 20 pares de iniciadores desenvolvidos para T. grandis, validamos 14, dos quais 12 foram polimórficos e dois monomórficos (Tabela 1). O número de alelos por loco variou de quatro a 13 ( x = 9). Desvios significativos do EHW foram observados nos 12 locos, sempre com valores observados menores do que os esperados, exceto para o loco Tgr12, que apresentou maior valor observado. A HO variou de 0,172 a 0,744 (valor médio = 0,38) e a HE variou de 0,355 a 0,904 (valor médio =

0,76). Dez locos apresentaram alto conteúdo informativo (PIC > 0,5; Tabela 1), com valores de

PIC entre 0,32 (loco Tgr01) e 0,86 (loco Tgr07).

Para os 19 pares de iniciadores desenvolvidos para T. bicolor, validamos 15, com 12 polimórficos e três monomórficos (Tabela 2). O número de alelos por loco variou de seis a 14 (

= 10,2). Desvios significativos do EHW foram observados nos 12 locos, com valores observados menores que o esperado exceto para o loco Tbi02. A HO variou de 0,109 a 0,943 (valor médio =

0,33) e a HE variou de 0,591 a 0,930 (valor médio = 0,72). Os 12 marcadores apresentaram alto

PIC (Tabela 2) e o valor de PIC variou de 0,53 a 0,87.

Para T. incompleta, dos 17 pares de iniciadores desenvolvidos, 14 foram validados, dos quais 12 foram polimórficos e dois monomórficos (Tabela 3). O número de alelos por loco variou de oito a 19 ( = 13,8). Desvios significativos do EHW foram observados nos 12 locos, com valores observados menores que o esperado em todos os locos. A HO variou de 0,052 a

0,638 (valor médio = 0,34) e a HE variou de 0,285 a 0,992 (valor médio = 0,78). Onze

47 marcadores apresentaram alto PIC (Tabela 3), com exceção do loco Tin08 (PIC = 0,33), e o valor de PIC variou de 0,33 a 0,89.

Os três conjuntos de marcadores microssatélites caracterizados neste estudo não são transferíveis entre as espécies de Tomoplagia estudadas. Observamos tanto a ausência de produtos de amplificação como a amplificação de regiões inespecíficas.

Discussão

Encontramos predominantemente motivos de repetição AC/GT nos conjuntos de locos microssatélites que desenvolvemos para Tomoplagia grandis, T. bicolor e T. incompleta. Essa combinação é também a mais frequente no genoma de outros tefritídeos (Bonizzoni et al. 2000,

Shearman et al. 2006, Augustinos et al. 2008) e de artrópodes em geral (Tóth et al. 2000).

Utilizamos um número suficiente de indivíduos (n = 30 por espécie) para estimar as frequências alélicas (Hale et al. 2012) e nossos resultados refletem o alto potencial informativo dos locos que caracterizamos.

Observamos um número maior de alelos nos locos caracterizados para T. incompleta ( x

= 13,9), seguido por T. bicolor ( = 10,1) e T. grandis ( = 9). Os valores médios de HO não variaram entre os 12 locos avaliados nas três espécies de Tomoplagia (HO médio entre 0,33 -

0,38) e revelaram baixos níveis de heterozigosidade observada em relação aos valores esperados

(HE médio entre 0,72 - 0,78). Encontramos o menor valor de HO no loco Tin06 (0,052 – T. incompleta) e o maior valor no loco Tbi02 (0,943 – T. bicolor). O número de alelos que encontramos para as espécies de Tomoplagia são consistentes com aqueles encontrados para espécies em outros gêneros de Tephritidae, como Anastrepha fraterculus (7 a 18 alelos por loco, valor médio = 12,9; Manni et al. 2015) e Ceratitis capitata (8 a 22 alelos por loco, valor médio =

13,6; Bonizzoni et al. 2000), e maiores que o encontrado para Anastrepha suspensa (2 a 12 alelos por locos, valor médio = 6,1; Fritz & Schable 2004) e Bactrocera tau (2 a 9 alelos por locos, valor médio = 4,5; Yan et al. 2015). Yan et al. (2015) também encontraram um loco com baixa heterozigosidade observada para Bactrocera tau (HO = 0,069), assim como encontramos para T. incompleta (loco Tin06). No entanto, os valores de heterozigosidade observada que encontramos para as espécies de Tomoplagia foram inferiores aos encontrados para as espécies acima referidas de Anastrepha, Ceratitis e Bractocera.

O déficit de heterozigotos que observamos em relação ao esperado no EHW pode decorrer, entre outros fatores, da presença de alelos nulos ou mesmo devido ao efeito Wahlund

(Meeûs 2018). Alelos nulos ocorrem devido a mudanças nas bases na região flanqueadora do loco microssatélite, as quais comprometem o anelamento do iniciador e o sucesso da amplificação da sequência na PCR. Já o efeito Wahlund reflete a combinação de indivíduos pertencentes a diferentes populações em uma mesma população. Neste estudo, agrupamos indivíduos provenientes de diferentes localidades a fim de obter o número mínimo necessário (n

= 30) para caracterizar os locos desenvolvidos para T. grandis. A fim de padronizar a caracterização para as três espécies, também utilizamos indivíduos pertencentes a diferentes populações para T. bicolor e T. incompleta. É possível apontar o efeito Wahlund como um dos fatores que determinam a baixa heterozigosidade observada nos nossos resultados. No entanto, como será mostrado no capítulo seguinte, desvios do EHW foram observados para as três espécies, tanto por população como no agrupamento de todas populações. Dessa forma, devemos considerar outros fatores que podem influenciar o déficit de heterozigotos que encontramos, como o parentesco dos indivíduos avaliados e também a ocorrência de endogamia nas populações das três espécies de Tomoplagia.

Os microssatélites espécie-específicos que isolamos e caracterizamos neste estudo não são transferíveis entre as três espécies de Tomoplagia que avaliamos. Augustinos et al. (2008) conseguiram amplificar 26 de 29 locos microssatélites desenvolvidos para Bactrocera oleae entre outras 11 espécies de Tephritidae, dentre elas quatro congenéricas e sete espécies dos gêneros Anastrepha (4), Ceratitis (2) e Rhagoletis (1). O sucesso da transferibilidade de locos microssatélites é bastante variável entre táxons e pode refletir diferentes níveis de conservação da sequência de nucleotídeos flanqueadores entre espécies menos aparentadas (Barbará et al.

2007). De acordo com a única hipótese filogenética disponível para 19 espécies do gênero

Tomoplagia (Yotoko et al. 2005), T. grandis, T. bicolor e T. incompleta são filogeneticamente distantes, o que justifica a baixa conservação das sequências de nucleotídeos flanqueadores de microssatélites entre essas três espécies. Embora coocorram amplamente na região principal de estudo (os campos rupestres da cadeia do Espinhaço em Minas Gerais), as três espécies são ecologicamente diferenciadas, uma vez que estão troficamente associadas a subconjuntos distintos de Asteráceas (respectivamente, os compartimentos ou módulos 3, 4 e 6 de insetos e plantas identificados por (Prado & Lewinsohn 2004).

Os marcadores microssatélites que desenvolvemos para as espécies Tomoplagia são os primeiros para o gênero e contribuirão para o conhecimento da biologia e ecologia do grupo.

Diferente dos microssatélites isolados para espécies de outros gêneros de Tephritidae, os que desenvolvemos não foram transferíveis entre espécies congenéricas, o que reforça a importância do desenvolvimento de marcadores espécie-específicos em Tomoplagia. Além disso, esses marcadores permitirão o desenvolvimento de estudos ecológicos e evolutivos que visam elucidar mecanismos geradores de diversidade e possibilitarão contrastar padrões de diversificação com outros organismos. Os marcadores espécie-específicos não foram amplificados entre as três

50 espécies deste estudo, o que sugere que caraterísticas ecológicas dessas espécies são importantes barreiras para a hibridização. Novos testes poderão ser realizados para verificar a transferência para outras espécies do gênero, o que fornecerá variações do processo de evolução do grupo.

Referências bibliográficas

ALJANABI, S. M., AND I. MARTINEZ. 1997. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Res. 25: 4692–4693.

ALLENDORF, F. W. 2017. Genetics and the conservation of natural populations: allozymes to genomes. Mol. Ecol. 26: 420–430.

AUGUSTINOS, A. A., E. E. STRATIKOPOULOS, E. DROSOPOULOU, E. G. KAKANI, P. MAVRAGANI- TSIPIDOU, A. ZACHAROPOULOU, AND K. D. MATHIOPOULOS. 2008. Isolation and characterization of microsatellite markers from the olive fly, Bactrocera oleae, and their cross-species amplification in the Tephritidae family. BMC Genomics 9: 618.

BARBARÁ, T., C. PALMA-SILVA, G. M. PAGGI, F. BERED, M. F. FAY, AND C. LEXER. 2007. Cross- species transfer of nuclear microsatellite markers: potential and limitations. Mol. Ecol. 16: 3759–3767.

BONIZZONI, M., A. R. MALACRIDA, C. R. GUGLIELMINO, L. M. GOMULSKI, G. GASPERI, AND L. ZHENG. 2000. Microsatellite polymorphism in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Insect Mol. Biol. 9: 251–261.

BORÉM, A. AND E. CAIXETA 2009. Marcadores moleculares. 2a. Edição. Editora UFV, Viçosa.

CAMPOS, L., M. FREIRE MORO, V. A. FUNK, AND N. ROQUE. 2019. Biogeographical Review of Asteraceae in the Espinhaço Mountain Range, Brazil. Bot. Rev. Available at: http://link.springer.com/10.1007/s12229-019-09216-9 [Accessed November 21, 2019].

CREER, S., K. DEINER, S. FREY, D. PORAZINSKA, P. TABERLET, W. K. THOMAS, C. POTTER, AND H. M. BIK. 2016. The ecologist’s field guide to sequence-based identification of biodiversity R. Methods Ecol. Evol. 7: 1008–1018.

CRESTE, S., A. T. NETO, AND A. FIGUEIRA. 2001. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Mol. Biol. Report. 19: 299–306.

DEVICTOR, V., J. CLAVEL, R. JULLIARD, S. LAVERGNE, D. MOUILLOT, W. THUILLER, P. VENAIL, S. VILLÉGER, AND N. MOUQUET. 2010. Defining and measuring ecological specialization. J. Appl. Ecol. 47: 15–25.

FORISTER, M. L., L. A. DYER, M. S. SINGER, J. O. STIREMAN III, AND J. T. LILL. 2012. Revisiting the evolution of ecological specialization, with emphasis on insect–plant interactions. Ecology 93: 981–991.

GOUDET, J. 2005. hierfstat, a package for r to compute and test hierarchical F-statistics. Mol. Ecol. Notes 5: 184–186.

GUPTA, P. K., S. RUSTGI, S. SHARMA, R. SINGH, N. KUMAR, AND H. S. BALYAN. 2003. Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat. Mol. Genet. Genomics 270: 315–323.

HALE, M. L., T. M. BURG, AND T. E. STEEVES. 2012. Sampling for microsatellite-based population genetic studies: 25 to 30 individuals per population is enough to accurately estimate allele frequencies A. F. Y. Poon (Ed.). Plos One 7: e45170.

KEARSE, M., R. MOIR, A. WILSON, S. STONES-HAVAS, M. CHEUNG, S. STURROCK, S. BUXTON, A. COOPER, S. MARKOWITZ, C. DURAN, T. THIERER, B. ASHTON, P. MEINTJES, AND A. DRUMMOND. 2012. Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics 28: 1647– 1649.

MEEÛS, T. 2018. Revisiting FIS, FST, Wahlund effects, and null alleles. J. hered. 109: 446-456.

OGASAWARA, H. A., AND N. ROQUE. 2015. Flora da Bahia: Asteraceae–Subtribo Vernoniinae. Sitientibus Sér. Ciênc. Biológicas 15.

PAQUETTE, S. R. 2012. PopGenKit: useful functions for (batch) file conversion and data resampling in microsatellite datasets. R Package Version 1.

PARADIS, E. 2010. pegas: an R package for population genetics with an integrated-modular approach. Bioinformatics 26: 419–420.

PRADO, P., A. ABREU, V. SOLFERINI, AND A. NORRBOM. 2005. Genetic and morphological diagnosis and description of two cryptic species of flower head-infesting Tephritidae (Diptera). Insect Syst. Evol. 36: 361–370.

PRADO, P. I. 1999. Determinantes de ampla escala das associações entre insetos e plantas: tefritídeos (Diptera) endófagos de capítulos de Asteraceae. Universidade Estadual de Campinas.

PRADO, P. I., AND T. M. LEWINSOHN. 2004. Compartments in insect–plant associations and their consequences for community structure. J. Anim. Ecol. 73: 1168–1178.

PRADO, P. I., T. M. LEWINSOHN, A. M. ALMEIDA, A. L. NORRBOM, B. D. BUYS, A. C. MACEDO, AND M. B. LOPES. 2002. The fauna of Tephritidae (Diptera) from capitula of Asteraceae in Brazil. Proc. Entomol. Soc. Wash. 104: 1007–1028.

PRADO, P. I., A. L. NORRBOM, AND T. M. LEWINSOHN. 2004. New species of Tomoplagia Coquillett (Diptera: Tephritidae) from capitula of Asteraceae in Brazil. Neotrop. Entomol. 33: 189–211.

R CORE TEAM. 2014. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.

ROQUE, N., E. C. DE OLIVEIRA, L. MOURA, A. S. QUARESMA, H. A. OGASAWARA, M. ALVES, F. A. SANTANA, G. HEIDEN, T. A. CAIRES, N. G. BASTOS, G. M. LIMA, AND H. P. BAUTISTA. 2016. Asteraceae no Município de Mucugê, Chapada Diamantina, Bahia, Brasil. Rodriguésia 67: 125–202.

SEEHAUSEN, O. ET AL. 2014. Genomics and the origin of species. Nat. Rev. Genet. 15: 176–192.

SHEARMAN, D. C. A., A. S. GILCHRIST, D. CRISAFULLI, G. GRAHAM, C. LANGE, AND M. FROMMER. 2006. Microsatellite markers for the pest fruit fly, Bactrocera papayae (Diptera: Tephritidae) and other Bactrocera species. Mol. Ecol. Notes 6: 4–7.

TÓTH, G., Z. GÁSPÁRI, AND J. JURKA. 2000. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Res. 10: 967–981.

UNTERGASSER, A., I. CUTCUTACHE, T. KORESSAAR, J. YE, B. C. FAIRCLOTH, M. REMM, AND S. G. ROZEN. 2012. Primer3—new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40: e115– e115.

Tabela 1. Caracterização de 12 locos microssatélites desenvolvidos para Tomoplagia grandis. Temperatura de anelamento (Ta), número de alelos (NA), heterozigosidade observada (HO), heterozigosidade esperada (HE) e conteúdo de informação polimórfica (PIC) ‘ Loco Sequência de Oligonucleotídeo (5'-3') Motivo Ta Tamanho NA HO HE P PIC (°C) (pb)

Tgr01 F: TCAAAGGAAAAACGTCAGTCA (GT)8 53 92-118 6 0,222 0,355 0,03 0,32 R: AATGTCAGTTTACAACGCCG

Tgr02 F: GCTGCCTTGAACTCTCTCTA (TG)10 59 172-184 4 0,172 0,882 < 0,01 0,85 R: TGCTAACACAGTTAGTTTTGC

Tgr03 F: GCAGTGGAGAACAATTGCAT (CA)36 53 132-238 12 0,333 0,788 < 0,01 0,86 R: TGTCCATTTATCTGGGGAATCA

Tgr04 F: AGACACCTATACGAGCGTTC (ACA)7 53 189-243 10 0,378 0,787 < 0,01 0,77 R: ATTGTCGGATCTCATCGGTC

Tgr05 F: TTTTCCACCTGTTAACGGGA (TG)10 59 252-286 12 0,744 0,881 < 0,01 0,85 R: GCCTACATTACGCTGTGTAAC

Tgr06 F: CCATTGAAAGCAAACGCAAA (AC)8 61 238-270 11 0,556 0,873 < 0,01 0,85 R: CAGTGTCTCTGGCAGTGTTA

Tgr07 F: CACACGCTTCTTCTCAAGTG (TG)10 59 196-220 10 0,207 0,904 < 0,01 0,86 R: CTACGCAACTACATGCACAC

Tgr08 F: TCCATTCGCAGTGACACTTA (CA)7 59 206-286 8 0,402 0,799 < 0,01 0,72 R: CGGTTAAAACTTTCCGCTACA

Tgr09 F: GGGAAGAGTGGACTTAGTGG (AC)7 61 194-220 13 0,462 0,849 < 0,01 0,79 R: GCAACTTTACAAGCCAAGCT

Tgr10 F: GCAGTGAGTTGTAATGATATGAAC (GT)7 61 118-166 6 0,222 0,607 < 0,01 0,55 R: CGAGACGCCCAAAAATAGAC

Tgr11 F: ACCGCAAATAAAAAGGGCTC (CA)8 61 216-256 12 0,245 0,904 < 0,01 0,85 R: TCAGCCATTGTGGTTTTGAC

Tgr12 F: CGCCAATTAACTTTCGGTGT (CA)8 61 246-256 4 0,631 0,590 < 0,01 0,49 R: ACAACAACAAGCAAGTGCAT

Tabela 2. Caracterização de 12 locos microssatélites desenvolvidos para Tomoplagia bicolor. Temperatura de anelamento (Ta), número de alelos (NA), heterozigosidade observada (HO), heterozigosidade esperada (HE) e conteúdo de informação polimórfica (PIC)

Loco Sequência de Oligonucleotídeo (5’-3') Motivo Ta Tamanho NA HO HE P PIC (°C) (pb)

Tbi01 F: TTCACATCTCATCGCTTGGA (GA)8 63 128-170 9 0,323 0,631 <0,001 0,66 R: CCGGAATGAAGAAAGCACTG

Tbi02 F: ACGCTTTGCTTTGTTTACCA (TG)8 63 148-204 6 0,943 0,591 <0,001 0,53 R: TAACCTGTGTCTGCAACCTT

Tbi03 F: TCAAACGCCAACACTTGATG (AC)8 63 92-130 11 0,464 0,770 <0,001 0,87 R: TTACCTTGCGCTATCTTCGT

Tbi04 F: GCTTTTGTTAAGTTTGGCGC (AC)9 61 128-146 8 0,109 0,683 <0,001 0,63 R: TGGACTTGCCATATGCCATA

Tbi05 F: CATTGACGCCGTGAAATAGG (AG)8 63 128-144 9 0,192 0,772 <0,001 0,82 R: CCCGAAATCTTAAGTGTGGC

Tbi06 F: TGCTGTTGGGCAAATTCTTT (AC)8 63 176-194 14 0,164 0,630 <0,001 0,81 R: GCCAAATTCCAACTGAATGC

Tbi07 F: AGTTGAGCAAAATGGCGAGA (GT)6 59 152-200 10 0,372 0,689 <0,001 0,70 R: CACAAAAGTGCCCTCACACG

Tbi08 F: CCTCAAAAGGGTACATCATATATGT (TG)9 63 146-186 11 0,442 0,783 <0,001 0,76 R: GCATCGTTGAAAGCCCTAAG

Tbi09 F: AGGACAAAGGTGTGTGGAAA (AC)10 61 162-202 12 0,167 0,930 <0,001 0,79 R: GCTTTTTCACAACTCCCTCC

Tbi10 F: ACATGCATGCGAAACCTTAC (AC)9 63 146-188 12 0,224 0,738 <0,001 0,84 R: AAGTGGTAAGTGGTATGCGT

Tbi11 F: CGTCTGCTGAACATTCAAT (TG)6 63 158-182 9 0,449 0,761 <0,001 0,74 R: AGATGTGCAGTTTGGCAAAG

Tbi12 F: AATATTGCCGATTGAGGGGA (TACA)7 61 212-264 11 0,138 0,711 <0,001 0,64 R: ATTAGTCACCAGCCGATTGT

Tabela 3. Caracterização de 12 locos microssatélites desenvolvidos para Tomoplagia incompleta. Temperatura de anelamento (Ta), número de alelos (NA), heterozigosidade observada (HO), heterozigosidade esperada (HE) e conteúdo de informação polimórfica (PIC)

Locos Sequência de Oligonucleotídeo (5'-3') Motivo Ta Tamanho NA HO HE P PIC (°C) (pb)

Tin01 F: TTTTCCAATGTAGAATGGGTTTT (TG)8 59 208-228 12 0,458 0,847 < 0,01 0,70 R: TCCATTCGTATGTGCTTCTTG

Tin02 F: AATGTTCGTGGCGGAGTAT (TG)8 59 158-200 17 0,408 0,841 < 0,01 0,88 R: TGCAAAGAAAGGTCAGTGAA

Tin03 F: GGCAATCATCGAAGCAAAGT (TTG)8 57 162-201 13 0,281 0,772 < 0,01 0,89 R: TGACAATGAGTGCAGATATGAAAA

Tin04 F: TGAGCTACCAAACGCTGCTA (TG)9 63,3 140-172 14 0,208 0,897 < 0,01 0,87 R: GAACGATTGAAAGGCGAAAA

Tin05 F: CCGTCAACAATCGAGGAAAA (TG)9 59 96-160 19 0,588 0,816 < 0,01 0,88 R: CGCTTTAATACTTCGCACACA

Tin06 F: TGAGTTTGCTCTTGCACTTGA (AC)9 59 120-144 12 0,052 0,784 < 0,01 0,83 R: CCAGCTTGACACCGACTCTC

Tin07 F: GCAGCAAAAGAAGGAAGCAC (GT)13 57 148-202 17 0,638 0,992 < 0,01 0,88 R: AACACACTCCACGCACAAAC

Tin08 F: GTATTTGTGGGAATGCCTTG (AC)11 63 88-150 6 0,219 0,285 < 0,01 0,33 R: GTACACATGTGCGTGATTATGG

Tin09 F: CCGGCTTTTGTTTTATGCAA (TG)9 59 80-120 13 0,165 0,767 < 0,01 0,82 R: TTCTTTGCCACACTTTTGGTT

Tin10 F: TGGCGCTCCTAAAATCACTT (AC)9 59 86-120 9 0,217 0,694 < 0,01 0,61 R: GTGCCACAGACCAGTTTGAA

Tin11 F: TCGCAGCAACGATGATTTAG (TG)8 57 116-174 14 0,402 0,743 < 0,01 0,88 R: TTCCGAGTCTAGATATCCAACCA

Tin12 F: CTTGACGTTGATTACGACACAA (AC)9 63,3 114-156 19 0,492 0,942 < 0,01 0,89 R: CGCTTTTTGTCATTGCATGT

Figura 1. Hipótese filogenética obtida por máxima verossimilhança para 19 espécies de Tomoplagia (Diptera: Tephritidae) baseadas em sequências das regiões COII e 16S. Bibliotecas enriquecidas em microssatélites foram construídas para as espécies apontadas pelas setas vermelhas. Modificada de Yotoko et al. (2005).

Capítulo 3: A diferenciação genética de insetos herbívoros é codeterminada por especialização em plantas hospedeiras e pela distribuição geográfica

Camila Rabelo Oliveira Leal, Karina Lucas Silva-Brandão & Thomas Michael Lewinsohn

Resumo

O surgimento de diferentes linhagens intraespecíficas decorrente da associação com novas plantas hospedeiras tem sido foco de vários estudos que visam compreender mecanismos que promovem diversificação e especiação em insetos herbívoros. Teorias explicativas têm sido elaboradas principalmente para espécies com importância econômica ou espécies modelo, cujas plantas hospedeiras geralmente têm sua distribuição geográfica determinada por atividade antrópica. Assim, é importante identificar diferentes sistemas naturais de associação herbívoros- hospedeiros nos quais processos relevantes possam ser avaliados sem o efeito prevalente da intervenção humana. Neste estudo, avaliamos a amplitude de associação de espécies de

Tomoplagia (Diptera: Tephritidae), insetos endófagos de capítulos, com suas principais plantas hospedeiras (Asteraceae: Vernonieae) em diferentes campos rupestres da Serra do Espinhaço em

Minas Gerais. Esta íntima interação foi usada para investigarmos a diferenciação genética em

Tomoplagia associada ao hospedeiro nas escalas local (entre hospedeiras) e regional (dentro e/ou entre hospedeiras de localidades distintas). Encontramos diferenciação genética não correlacionada com isolamento geográfico para populações de T. grandis, espécie monófaga estrita, na escala regional. Em duas espécies oligófagas, T. bicolor e T. incompleta, encontramos indícios de diferenciação genética tanto na escala local como na regional. T. bicolor está associada a diferentes espécies congenéricas ao longo de sua ocorrência, provavelmente devido à distribuição restrita de suas plantas hospedeiras; T. incompleta, cujas plantas hospedeiras têm

59 distribuição geográfica mais ampla, mantém associações constantes ao longo de sua distribuição.

Encontramos padrão de isolamento por distância apenas para T. bicolor, provavelmente devido à dispersão dos indivíduos para diferentes localidades ser acompanhada de transferência para outras plantas hospedeiras, conforme sua disponibilidade local. Neste estudo, mostramos que mecanismos distintos podem promover a diferenciação genética de insetos herbívoros congenéricos com diferentes níveis de especialização ecológica e destacamos a importância da amplitude e sobreposição de distribuição das plantas hospedeiras para essa diversificação.

Palavras-chave: campos rupestres, diferenciação associada ao hospedeiro, estrutura genética, insetos endófagos, marcadores microssatélites, Vernonieae, Tephritidae

Introdução

A capacidade dos insetos de se alimentar de diferentes plantas é reconhecidamente um gatilho importante no processo de diversificação e de especiação em insetos herbívoros (Mitter et al. 1988, Mopper 1996). Grande parte do ciclo de vida dos insetos herbívoros está ligado à planta hospedeira, a qual lhes fornece, além de recurso alimentar, um sítio de oviposição e abrigo contra inimigos naturais (Strong et al. 1984, Lewinsohn et al. 2005). Dada a elevada diversidade atual, tanto de plantas fanerógamas como dos insetos que delas se alimentam, mudanças de associação de insetos herbívoros com plantas têm sido consideradas explicações potenciais para a origem de aproximadamente metade da biodiversidade terrestre (Ehrlich & Raven 1964, Bernays &

Graham 1988, Drès & Mallet 2002). O estudo de Bush (1969), que documentou a formação simpátrica de uma nova linhagem genética na mosca de frutas Rhagoletis pomonella (Walsh,

1867) (Diptera: Tephritidae) a partir da colonização de uma nova espécie hospedeira,

60 revolucionou o entendimento do processo de especiação ecológica (Rundle & Nosil 2005,

Matsubayashi et al. 2010), ou seja, a divergência devido a fatores ecológicos (Nosil et al. 2009).

Esta proposta mudou o conceito dominante de especiação alopátrica, segundo o qual uma barreira geográfica seria indispensável para que se iniciasse o processo de divergência de linhagens intraespecíficas (Mayr 1947). Desde então, vários estudos, especialmente em espécies de importância econômica ou espécies modelo, demonstraram que populações de insetos herbívoros podem sofrer subdivisão em escala local a partir de sua associação com uma nova planta hospedeira e que tais eventos são mais comuns do que se pensava (Via 1999, Abrahamson et al. 2001, Hawthorne & Via 2001, Berlocher & Feder 2002, Drès & Mallet 2002, Bush &

Butlin 2004, Janz et al. 2006, Feder & Forbes 2007, Peccoud et al. 2009, Feder et al. 2012,

Silva-Brandão et al. 2018, Moffat et al. 2019).

Vários mecanismos diferentes foram propostos para explicar a evolução do uso preferencial de hospedeiros por insetos herbívoros. A adoção de uma nova planta poderia promover acasalamento e oviposição preferenciais por filopatria (Craig et al. 1993, Via 1999,

Funk et al. 2002) e, por consequência, possibilitaria a seleção de genótipos melhor adaptados a cada uma das plantas hospedeiras alternativas. Se estas preferências forem mantidas ao longo do tempo ecológico, o fluxo gênico entre as populações associadas às diferentes plantas hospedeiras poderia ser reduzido e as populações se tornariam isoladas reprodutivamente até o surgimento de duas linhagens especializadas, que podem evoluir para raças relacionadas ao hospedeiro (“host races”), subespécies ou mesmo para espécies distintas (Via 1999, Abrahamson et al. 2001, Heard

2012; mas veja Feder et al. 2012). As plantas, por sua vez, teriam desenvolvido defesas, tanto químicas como morfológicas ou mecânicas, para fugir da herbivoria e restringir a expansão da dieta dos insetos herbívoros (Ehrlich & Raven 1964, Oguro & Sakai 2015). Desta forma,

61 adaptações particulares para determinadas plantas influenciariam a especialização dos insetos herbívoros em um subconjunto do espectro total das espécies hospedeiras coexistentes (Jaenike

1990, Prado 1999, Bernays 1998, Agosta et al. 2010, Jorge et al. 2014). Além disso, as defesas das plantas poderiam impor um trade-off entre preferência e desempenho dos herbívoros associados (Cogni et al. 2011), e restringiriam a incorporação de novas espécies de planta ao conjunto de plantas hospedeiras potenciais para cada grupo de herbívoro.

Um mecanismo evolutivo complementar considera que alguns insetos herbívoros são capazes de se associar a uma gama filogeneticamente ampla de plantas hospedeiras graças à plasticidade fenotípica que, mesmo sem diferenciação genética, pode ser suficiente para manter a polifagia de determinados herbívoros (Mooney & Agrawal 2008). No entanto, uma maior plasticidade fenotípica pode resultar de maior variabilidade genética e, nesse caso, a maior especialização poderia acarretar uma perda de variabilidade genética (Jaenike 1990, Hawthorne

& Via 2001, Gloss et al. 2013). Alternativamente, as características distintas das plantas hospedeiras de espécies polífagas poderiam impor pressões seletivas diferenciais – portanto disruptivas – para seu uso; consequentemente, a seleção de diferentes características adaptativas poderia ser potencializada por isolamento reprodutivo entre populações associadas a diferentes plantas hospedeiras (Via 1999, Berlocher & Feder 2002, Funk et al. 2002, Funk 2010).

Dentro destes diferentes cenários evolutivos, os insetos herbívoros variam drasticamente no grau de especialização ecológica, desde espécies que se alimentam unicamente de uma dada espécie de planta hospedeira (denominados monófagos ou monófagos estritos), até as polífagas, cujas plantas hospedeiras pertencem a táxons superiores distintos - usualmente, em famílias ou ordens diferentes (Bernays 1998, Prado & Lewinsohn 2004, Novotny et al. 2010, Forister et al.

2014). A preferência por plantas hospedeiras pode variar geograficamente entre populações de

62 uma mesma espécie de herbívoro (Fox & Morrow 1981, Thompson 2005), devido a mudanças adaptativas das plantas que podem afetar negativamente a aptidão dos herbívoros em determinados locais (Agrawal 2001, Nosil et al. 2002, Thompson 2005). O desencontro espaço- temporal entre o herbívoro e a espécie de planta hospedeira preferencial, originado pela distribuição restrita da planta (Prado 1999, Thompson 2005) ou pela separação fenológica entre plantas hospedeiras potenciais (Smith 1988, Craig et al. 1993, Saldamando-Benjumea et al.

2014), também podem levar a diferenças geográficas no uso de recursos.

No entanto, nem todos os insetos herbívoros apresentam este padrão de preferência geográfica. Insetos endófagos, cujas larvas se abrigam e se desenvolvem dentro de órgãos das plantas (folhas, caules e flores) têm alto grau de afinidade com suas plantas hospedeiras

(Lewinsohn 1991, Prado 1999, Gaston et al. 1992, Pires & Guimarães 2013) e, consequentemente, se associam a um número restrito de espécies de plantas (Jaenike 1990).

Como resultado, geralmente as plantas hospedeiras potenciais desses herbívoros são filogeneticamente e/ou quimicamente próximas, e a história evolutiva dos herbívoros poderá ser alterada devido a associação com uma nova espécie de planta (Janz et al. 2006, Agosta et al.

2010), principalmente se os atributos dessa planta forem muito diferentes em relação às plantas comumente utilizadas (Berlocher & Feder 2002, Funk et al. 2002, Nosil et al. 2002, Funk 2010).

No entanto, há muito a ser compreendido acerca da diferenciação genética associada ao hospedeiro em sistemas com associações naturalmente distribuídas e os resultados obtidos a partir desses sistemas forneceriam bases mais realísticas do processo de especiação ecológica na natureza. Assim, identificar novos sistemas e investigar a diferenciação genética dos insetos herbívoros decorrente da associação com as plantas hospedeiras pode contribuir em diferentes

63 vertentes da ecologia evolutiva e teórica, bem como ser aplicada para outras áreas de investigação de interações parasitas-hospedeiros.

Um sistema muito adequado ao estudo da evolução da interação entre herbívoros e suas plantas hospedeiras e de suas consequências nos padrões de diferenciação genética associada ao hospedeiro, reúne moscas endófagas de capítulos do gênero Tomoplagia Coquillett (Diptera:

Tephritidae) e suas plantas hospedeiras na família Asteraceae (Lewinsohn 1991, Prado et al.

2002, 2004). Tomoplagia é o gênero mais diverso e abundante de insetos com desenvolvimento da fase larval associado a capítulos de Asteraceae no Brasil (Prado et al. 2002), hábito prevalente entre as espécies do gênero cuja ecologia é conhecida, embora haja ao menos uma espécie formadora de galhas de caule (T. rudolphi, Aczél 1955). Estudos precedentes revelaram que as espécies de Tomoplagia apresentam uma grande variação no grau de especialização em suas plantas hospedeiras, desde espécies monófagas até aquelas com múltiplas hospedeiras dentro de uma ou mais subtribos (Lewinsohn 1991, Prado et al. 2002, 2004, Prado & Lewinsohn 2004).

Mesmo as espécies de Tomoplagia associadas a maior número de plantas hospedeiras são comumente classificadas como especialistas de acordo com as definições usuais, em que a polifagia designa espécies cujas hospedeiras pertencem a famílias ou ordens distintas de plantas

(Lewinsohn 1991, Bernays 1998, Prado & Lewinsohn 2004, Novotny et al. 2010, Forister et al.

2014). Por essa razão, tais espécies podem ser designadas como herbívoros associados a múltiplas hospedeiras, ou ainda como oligófagas, quando suas plantas hospedeiras pertencem a um só gênero ou subtribo (Schoonhoven et al. 2005). Na escala relativa desse sistema em especial, em nossos estudos designamos como espécie polífaga dentro do gênero Tomoplagia qualquer espécie que tenha plantas hospedeiras pertencentes a diferentes tribos ou subfamílias de

Asteráceas, já que nenhuma delas tem hospedeiras confirmadas fora dessa família (Lewinsohn

1991).

Neste trabalho nós investigamos as associações entre espécies de Tomoplagia com suas principais hospedeiras pertencentes à tribo Vernonieae (Asteraceae), para estimar a diferenciação genética de populações coespecíficas de insetos herbívoros associadas a plantas hospedeiras distintas, em sua distribuição natural em diferentes localidades na Cadeia do Espinhaço meridional, em Minas Gerais. Muitas espécies de plantas são endêmicas da Cadeia do Espinhaço e variam em amplitude de distribuição geográfica desde espécies restritas a poucas manchas isoladas até aquelas amplamente distribuídas em toda a região (Collevatti et al. 2009, Jesus et al.

2009, Silveira et al. 2015, Morellato & Silveira 2018). Estudos anteriores dimensionaram a amplitude de plantas hospedeiras utilizadas por espécies de Tomoplagia na região de maior diversidade conhecida dessas associações (Lewinsohn 1991, Prado 1999, Prado et al. 2002,

2004). No presente estudo, investigamos se populações coespecíficas apresentam diferenciação genética entre plantas hospedeiras na mesma localidade (escala local) e entre localidades (escala regional). Dada a grande variação de especialização ecológica das espécies de Tomoplagia, esperamos que (i) insetos herbívoros monófagos apresentem baixa diferenciação genética dentro

(escala local) e entre populações (escala regional) se comparados aos herbívoros oligófagos, uma vez que estão associados à mesma planta hospedeira em localidades com condições ambientais similares. Para as espécies oligófagas, se a associação com a planta hospedeira for mais importante para a diferenciação genética dos insetos herbívoros, esperamos que (ii) populações coespecíficas apresentem diferenciação genética moderada a forte entre plantas hospedeiras tanto em escala local como em escala regional. Por outro lado, como as comunidades locais de plantas têm distribuição descontínua e apresentam alta reposição de espécies (diversidade beta) na

65 extensão da Cadeia do Espinhaço (Prado 1999, Collevatti et al. 2009, Silveira et al. 2015), dessa forma, se a distribuição geográfica das associações for mais importante para a diferenciação genética de populações coespecíficas de Tomoplagia, esperamos que (iii) a maior diferenciação genética ocorra entre populações oriundas de diferentes localidades e que exista sinais de isolamento por distância.

Material e Métodos

Desenho amostral

Para definir as localidades e os períodos do ano mais adequados para uma ampla amostragem de espécies de plantas hospedeiras e, consequentemente, de espécies de Tomoplagia associadas, avaliamos a distribuição geográfica das interações entre Tomoplagia e suas plantas hospedeiras, bem como os períodos de floração das plantas, na base de dados do Laboratório de

Interações Insetos-Plantas (Departamento de Biologia Animal, Universidade Estadual de

Campinas). Amostramos as plantas hospedeiras potenciais em diferentes localidades da Cadeia do Espinhaço situadas no estado de Minas Gerais (Apêndice 1), nas quais a ocorrência das interações era conhecida. Essas localidades compreendem unidades de conservação (Parques

Estaduais da Serra do Cabral, da Serra Negra, do Biribiri e do Rio Preto) e áreas particulares localizadas na Serra do Cipó e nos distritos de Guinda e Conselheiro Mata. As áreas dos parques do Biribiri e do Rio Preto não haviam sido amostradas anteriormente e, portanto, representam novos registros de ocorrência de interações de Tomoplagia e Asteraceae. As amostragens foram realizadas em maio e agosto de 2016 e de junho a setembro de 2017, com um total aproximado de 850 horas de percurso das áreas e de coleta de amostras de populações de plantas hospedeiras em flor. Com exceção da Serra do Cipó e do Parque Estadual da Serra Negra, que foram

66 excluídas do estudo após as visitas iniciais, todas as localidades foram visitadas ao menos seis vezes.

Coletamos amostras populacionais de capítulos de todas as espécies de Asteraceae pertencentes à tribo Vernonieae presentes em cada localidade e os armazenamos em potes plásticos (com volume de 0,5 L ou de 3 L) com uma tampa ventilada por malha fina de nylon, seguindo procedimentos estabelecidos por Lewinsohn (1991). Dessa forma, cada amostra foi composta por capítulos de vários indivíduos de uma população da mesma espécie de planta.

Sempre que possível, as plantas foram amostradas em pelo menos três áreas na mesma localidade, distantes ao menos um quilômetro um do outro; todas as coletas locais foram mantidas separadas. Os capítulos foram coletados na fase de antese até o início de senescência, e sua quantidade variou conforme a disponibilidade local das espécies e o tamanho de seus capítulos. Para todas as populações coletadas, foram prensadas exsicatas como testemunho. As plantas hospedeiras foram identificadas por comparação na coleção de referência do Laboratório de Interações Inseto-Planta e por chaves de identificação (Keeley et al. 2007, Funk et al. 2009).

Espécies incertas foram designadas como morfoespécies em seus respectivos gêneros, porém, todas as espécies que são hospedeiras importantes e abundantes para Tomoplagia foram identificadas até espécie.

As amostras de capítulos foram mantidas em laboratório e examinadas a cada 48 horas para separar e contar os indivíduos adultos de Tomoplagia. A duração mínima do período de triagem foi de 30 dias e somente foi encerrada após 15 dias sem emergência de Tomoplagia na amostra. Os espécimes adultos foram identificados até espécie com auxílio das chaves de identificação de Aczél (1955) e Prado et al. (2004) e confirmados quando necessário por Paulo

Inácio Prado (Departamento de Ecologia, Universidade de São Paulo). Todos espécimes foram

67 conservados em álcool PA 99,6% em congelador a -20° C. Como frequentemente observado para espécies tropicais, a maioria das espécies de Tomoplagia ocorre em baixa frequência nas populações locais. Por este motivo, somente para as espécies T. grandis Prado, Norrbom &

Lewinsohn, 2004, T. bicolor Prado, Norrbom & Lewinsohn, 2004 e T. incompleta (Williston,

1896) foram obtidos números amostrais suficientes em diferentes plantas hospedeiras e localidades (Apêndice 2) e, por esse motivo, essas espécies foram investigadas quanto à sua diferenciação genética local e regional.

Extração de DNA

Ao todo, 40, 178 e 154 indivíduos foram incluídos nas análises genéticas de T. grandis,

T. bicolor e T. incompleta, respectivamente (Tabela 1). O DNA genômico de todos os indivíduos foi extraído de acordo com o procedimento padrão do kit de extração DNeasy Blood and Tissue

(Qiagen AG) e armazenado como solução estoque (100 µL) a -20°C. A concentração de DNA foi estimada com um espectrofotômetro UV NanoDrop (Techno Scientific) e padronizada para 5

ηg/µL para os procedimentos de genotipagem.

Amplificação e genotipagem dos locos microssatélites

Os indivíduos pertencentes às três espécies de Tomoplagia foram genotipados em doze locos microssatélites nucleares, obtidos de bibliotecas construídas especificamente para cada espécie, os quais foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) em acordo com os protocolos descritos em Leal et al. (em preparação; cap. 2). Os oligonucleotídeos iniciadores diretos de todos os locos foram sintetizados com a adição de uma cauda M13

(TGTAAAACGACGGCCAGT) na extremidade 5’, para anelamento dos fluoróforos FAM, VIC,

PET e NED (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) nas PCRs (Schuelke 2000). A cada loco

68 foi designada uma fluorescência. As amostras amplificadas foram submetidas a corrida em gel de agarose 1,5 % com tampão Tris-acetato (TAE) 50 mM (pH 7,5 - 7,8).

As reações de PCR foram diluídas (10-20%) e em seguida combinadas em um multiplex com quatro locos marcados pelas diferentes fluorescências para a genotipagem em um sequenciador automático ABI 3500xL (Life Technologies). O marcador Liz GeneScan 600 (Life

Technologies) foi utilizado como padrão de peso molecular para as genotipagens. A leitura dos eletroferogramas foi realizada com o plugin para análise de microssatélites no programa

Geneious Prime v. 2019.0.4 (Kearse et al. 2012). Os alelos foram determinados de acordo com o tamanho (peak calling), e bins foram sobrepostos aos picos de fluorescência para a identificação e padronização dos alelos. A presença de alelos nulos e outros erros de genotipagem foram conferidos no programa Micro-Checker (Van Oosterhout et al. 2004).

Análises de diversidade e estruturação genética Para avaliar a diversidade e a diferenciação genética devido à associação com as plantas hospedeiras e à distribuição geográfica, definimos as populações avaliadas como conjuntos de indivíduos de mesma espécie de Tomoplagia obtidos de cada planta hospedeira em uma dada localidade, ou seja, populações locais associadas às plantas hospedeiras (“host-associated populations”, Craig et al. 1993, Driscoe et al. 2019). Dessa forma, três populações foram analisadas para a espécie monófaga T. grandis (uma planta hospedeira em três localidades), nove para T. bicolor (sete plantas hospedeiras em três localidades) e nove para T. incompleta (três plantas hospedeiras em quatro localidades; Tabela 1).

Para avaliar a variabilidade genética nestas populações, estimamos as heterozigosidades observada e esperada com o pacote hierfstat (Goudet 2005), o número de alelos por população e por loco, o número médio de alelos por loco, o número de alelos exclusivos e o número de alelos

69 raros por locos (frequência ≤ 0,05) no R (R Core Team 2014). O teste exato de Fisher foi aplicado para detectar desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) para cada espécie e foi executado com o pacote pegas (Paradis 2010). O coeficiente de endogamia de Wright (FIS) e o intervalo de confiança de 95% baseado em 10.000 iterações de bootstrap foram estimados com o pacote hierfstat. Quanto mais alto o valor do FIS, maior a perda de variabilidade genética devido ao pequeno tamanho populacional e à endogamia. Os valores de FIS foram calculados para cada população das três espécies e o valor médio foi obtido por espécie.

Estimamos o índice de fixação (FST) de acordo com Weir & Cockerham (1984) para avaliar a estrutura genética entre pares de populações na mesma localidade e em localidades distintas. A estimativa do FST e o teste de significância baseado em 10.000 iterações bootstrap foram calculados com o pacote diveRsity (Keenan et al. 2013). Construímos um heat map, com o pacote ggplot2, para representar graficamente as estimativas de FST pareado para as três espécies.

A distribuição hierárquica da variação dentro e entre populações de mesma espécie foi avaliada por análise de variância molecular (AMOVA; Excoffier et al. 1992) e a significância da divergência foi testada com 20.000 permutações realizadas com o pacote poppr (Kamvar et al.

2014). Para T. grandis, os agrupamentos testados foram (1) indivíduos de mesma planta hospedeira em escala local e (2) indivíduos de mesma planta hospedeira em diferentes localidades. Para T. bicolor e T. incompleta, os agrupamentos testados foram (1) indivíduos de mesma planta hospedeira em escala local, (2) indivíduos de plantas hospedeiras diferentes em escala local, e (3) indivíduos de plantas hospedeiras diferentes em escala regional.

Também avaliamos a estrutura genética populacional de cada espécie de Tomoplagia a partir de uma análise discriminante de componentes principais (DAPC; Jombart et al. 2010), com o pacote adegenet (Jombart & Ahmed 2011). A DAPC combina a análise de componentes

70 principais com a análise discriminante e não pressupõe o equilíbrio de Hardy-Weinberg nem desequilíbrio de ligações (Jombart et al. 2010). Na DAPC é realizada uma busca por funções discriminantes, a partir da combinação linear dos alelos, que maximizem a variação entre grupos e minimizem a variação dentro dos grupos. O número de agrupamentos de indivíduos deve ser fornecido a priori na DAPC, e foi obtido sem informações prévia pela função find.cluster.

Diferentes números de agrupamentos (K) são testados sequencialmente; os valores de Critério de

Informação Bayesiano (BIC) para cada valor de K são comparados e o K com menor valor de

BIC indica o melhor número de grupos genéticos, com menor divergência dos dados em relação ao modelo. Com a DAPC, os indivíduos de cada espécie de Tomoplagia foram atribuídos aos grupos genéticos (diferentemente da estrutura genética obtida pela estimativa de FST, na qual assumimos que os indivíduos criados de cada espécie de planta hospedeira em cada localidade é uma população); subsequentemente, avaliamos a similaridade genética de populações coespecíficas associadas a diferentes plantas hospedeiras e localidades.

Por fim, avaliamos o padrão de isolamento genético por distância a partir da correlação de duas matrizes de distância genética (Nei 1972) e distância geográfica entre pares de populações via teste de Mantel (10.000 permutações; Mantel 1967) com o pacote ade4.

Resultados

Associações Tomoplagia-Asteraceae

Nossa amostragem incluiu grande parte das espécies hospedeiras de Tomoplagia e confirmou que T. grandis, T. bicolor e T. incompleta possuem diferentes padrões de associação com as plantas hospedeiras em escala local e regional (Apêndice 2). T. grandis é uma espécie monófaga estrita, sempre associada a Lessingianthus buddleiifolius. Dentre as localidades nas

71 quais essa espécie foi amostrada, encontramos menos indivíduos em Biribiri (n = 8) e mais indivíduos em Rio Preto (n = 17). No P.E. Biribiri encontramos uma grande mancha de L. buddleiifolius, mas não obtivemos nenhum adulto de Tomoplagia.

Tomoplagia bicolor e T. incompleta estão associadas a múltiplas plantas hospedeiras em escala local, mas diferem na amplitude de associação em escala regional. T. bicolor foi encontrada principalmente em plantas dos gêneros Minasia e Lychnophora e em Eremanthus elaeagnus, todas da subtribo Lychnophorinae, e mantém associação com diferentes espécies dentro desses gêneros em diferentes localidades (Apêndice 2). A população com maior número de indivíduos de T. bicolor foi proveniente de plantas hospedeiras do gênero Minasia e, entre as populações utilizadas no estudo genético, encontramos um número semelhante de indivíduos entre as demais espécies hospedeiras e localidades.

T. incompleta mantém associações com as mesmas espécies hospedeiras locais no âmbito regional, Echinocoryne schwenkiifolia, Lepidaploa rufogrisea e L. spixiana, todas da subtribo

Lepidaploinae e amplamente distribuídas nas localidades que amostramos. O número de indivíduos de T. incompleta foi maior em E. schwenkiifolia e L. rufogrisea e menor em L. spixiana; entre as localidades, a Serra da Guiné apresentou o menor número de indivíduos

(Apêndice 2). Na Tabela 1 mostramos as populações que foram utilizadas nas análises genéticas.

Genotipagem dos locos microssatélites e análises de diversidade e estruturação genética

O teste para estimar erros de genotipagem com o programa Micro-Checker revelou a presença de alelos nulos em todas as populações avaliadas de T. grandis, T. bicolor e T. incompleta, mas não em todos os locos. Uma parte dos alelos nulos ocorreu devido a erros na marcação do motivo do microssatélite e foi corrigida manualmente no programa Geneious. No

72 entanto, poucos locos permaneceram com alelos nulos mesmo sem a detecção de erros de genotipagem. Além disso, o programa Micro-Checker indicou um excesso de indivíduos homozigotos em alguns locos também nas três espécies.

O número de locos analisados para as três espécies foi o mesmo (n = 12), no entanto, o número de indivíduos avaliados de T. grandis foi menor se comparado ao número de T. bicolor e

T. incompleta. As variáveis utilizadas para avaliar a diversidade genética intrapopulacional das três espécies de Tomoplagia estão resumidas por população na Tabela 2 e por loco no Apêndice

3. A riqueza total e a riqueza média de alelos por loco variaram entre as espécies de Tomoplagia, sendo maior nas populações de T. incompleta (total de 54 a 124 alelos, média de 4,5 a 10 alelos por loco), seguido pelas populações de T. bicolor (total de 47 a 114 alelos, 4 a 9,5 alelos por loco) e menor número nas populações de T. grandis (total de 64 a 83 alelos, média de 5 a 7 alelos por loco). O número de alelos raros variou entre 23 a 36 nas populações de T. grandis, entre 8 a

43 nas populações de T. incompleta e entre 9 a 43 nas populações de T. bicolor. Encontramos um desvio das frequências alélicas observadas em relação às esperadas no equilíbrio de Hardy-

Weinberg para as três espécies (T. grandis: t = 5,31, p < 0,001; T. bicolor: t = 3,84, p = 0,001; T. incompleta: t = 12,19, p < 0,001), sempre com valores observados inferiores aos esperados.

Também encontramos altos valores do coeficiente de endogamia (FIS) nas três espécies (T. grandis: 0,47, T. bicolor: 0,51, T. incompleta: 0,59), o que indica excesso de homozigotos, como revelado no Micro-Checker para alguns locos. Os valores do FIS são mostrados por população de cada espécie, com os respectivos intervalos de confiança (Tabela 2), e por loco para cada população avaliada (Apêndice 3).

Na espécie monófaga T. grandis encontramos estrutura genética fraca entre as populações do Rio Preto e Serra do Cabral (FST = 0,03) e estrutura genética moderada entre as populações do

Biribiri e Serra do Cabral (FST = 0,05) e do Biribiri e Rio Preto (FST = 0.05; Fig. 1A). Os intervalos de confiança do FST pareado entre populações são mostrados no Apêndice 4. O FST global entre as três populações de T. grandis foi de 0,02. Na partição hierárquica da variância genética estimada por meio de uma AMOVA, 95% da variação genética está presente dentro das populações, com baixa variação entre populações diferentes (Tabela 3).

Conforme o Critério de Informação Bayesiano (BIC) dos valores testados de K (1 a 8) na análise de DAPC, inferimos a existência de dois grupos genéticos entre os indivíduos de T. grandis obtidos das três populações (Fig. 2A), e a DAPC foi realizada com esse número de grupos. Na análise de componentes principais (PCA) 12 eixos corresponderam a um total de

69% da variância, com 38% no primeiro eixo; no entanto, com n = 41, no máximo 5 eixos poderiam ser mantidos. Na análise discriminante foi retido um eixo com autovalor de 221,7. A atribuição dos indivíduos das três populações de T. grandis aos dois grupos genéticos demonstrou uma ausência de estrutura genética geográfica entre as populações avaliadas (Fig. 3).

A correlação entre as matrizes de distância genética e distância geográfica estimada com um teste de Mantel não indicou isolamento por distância para T. grandis (r = 0,55, p = 0,35,

Apêndice 5). Portanto, a diferenciação genética entre populações não pode ser explicada pela distância geográfica entre elas.

Em T. bicolor, espécie associada a diferentes espécies de plantas hospedeiras em localidades distintas, encontramos estrutura genética fraca a moderada entre as populações estudadas (Fig. 1B). Na escala local, houve estrutura genética moderada entre as populações associadas a Minasia pereirae e Eremanthus elaeagnus em Conselheiro Mata (FST = 0,07; Fig.

1B). Em escala regional, encontramos estrutura genética moderada entre populações oriundas de hospedeiras congenéricas: M. pereirae em Conselheiro Mata e M. scapigera, respectivamente,

no Biribiri (FST = 0,07) e na Serra do Cabral (FST = 0,05; Fig. 1B). Também em escala regional, encontramos estrutura genética moderada entre a população oriunda de M. pereirae em

Conselheiro Mata em relação às populações associadas a outras espécies de plantas hospedeiras em localidades diferentes, com valores de FST entre 0,05-0,08 (Fig. 1B). Os intervalos de confiança do FST pareado entre populações são mostrados no Apêndice 4. O FST global entre as nove populações de T. bicolor foi de 0,02. De acordo com a AMOVA (Tabela 3), a maior parte da variância (94%) corresponde a variação genética entre indivíduos dentro das populações, quase sem diferenciação entre indivíduos de diferentes hospedeiras na mesma localidade, e pouca variação (5,7% da variância total) entre diferentes hospedeiras encontradas em localidades distintas.

A comparação do BIC dos valores testados de K (1 a 15) indicou a presença de três grupos genéticos nos indivíduos amostrados de T. bicolor (Fig. 2B) e a DAPC foi realizada com esse número de grupos. Na PCA foram retidos 30 eixos que corresponderam a um total de 77% da variância, 38%. Na análise discriminante foram retidos dois eixos com autovalores correspondentes a 748,2 e 290,1. A atribuição dos indivíduos das nove populações de T. bicolor aos três grupos genéticos indica ausência de estruturação genética ligada a plantas hospedeiras nas escalas local e regional (Fig. 4). Na Serra do Cabral, a proporção de indivíduos por grupo genético foi equitativa entre as espécies de plantas hospedeiras. No entanto, no Biribiri e em

Conselheiro Mata indivíduos foram atribuídos aos três grupos genéticos em proporções diferentes entre as plantas hospedeiras. A correlação de Mantel entre as matrizes de distância genética e distância geográfica indica um papel significativo de distância geográfica na diferenciação genética em T. bicolor (r = 0,21, p = 0,03, Suplemento 1, Apêndice 5).

Para T. incompleta, espécie associada às mesmas plantas hospedeiras em localidades distintas, encontramos estrutura genética fraca a moderada nas duas escalas do estudo. Na escala local, observamos estrutura genética moderada entre populações associadas a Lepidaploa spixiana e Echinocoryne schwenkiifolia na Serra da Guiné (FST = 0,09, Fig. 1C). Na escala regional, detectamos estrutura genética moderada entre populações associadas à mesma hospedeira, L. spixiana, em Conselheiro Mata e na Serra da Guiné (FST = 0,07, Fig. 1C).

Também encontramos estrutura genética moderada entre populações associadas a espécies congenéricas, L. spixiana e L. rufogrisea, em diferentes localidades, respectivamente na Serra da

Guiné e em Conselheiro Mata (FST = 0,06, Fig. 1C). Existe uma estrutura genética igualmente moderada entre populações de diferentes hospedeiras e localidades (Fig. 1C). Os intervalos de confiança do FST pareado entre populações são mostrados no Apêndice 4. O FST global entre as nove populações de T. incompleta foi de 0,02. A AMOVA indicou uma partição de variância semelhante à encontrada para T. bicolor, com a maior parte (95% do total) correspondendo à variação genética intrapopulacional, baixa variação (3,61%) entre herbívoros de diferentes hospedeiras na mesma localidade ou entre indivíduos da mesma hospedeira em diferentes localidades (Tabela 3).

A comparação do BIC dos valores testados de K (1-15) indicou a existência de três grupos genéticos para os indivíduos de T. incompleta amostrados (Fig. 2C). Na PCA foram retidos 30 eixos que corresponderam a um total de 72% da variância. Na análise discriminante os dois primeiros eixos tiveram autovalores correspondentes a 606,6 e 302,0. A atribuição dos indivíduos das nove populações de T. incompleta aos três grupos genéticos não evidenciou forte estrutura genética entre plantas hospedeiras nas escalas local e regional (Fig. 5). Na Serra do

Cabral, a proporção de indivíduos por grupo genético foi similar entre as espécies de plantas

76 hospedeiras. No Biribiri e em Conselheiro Mata, a proporção de indivíduos atribuídos aos três grupos genéticos variou entre as espécies de plantas hospedeiras. Os indivíduos obtidos da Serra da Guiné foram atribuídos a apenas dois grupos genéticos, com 87,5% dos indivíduos amostrados atribuídos a um único grupo genético (Fig. 5). Não identificamos isolamento por distância para T. incompleta (teste de Mantel, r = 0,0007, p = 0,45, Apêndice 5).

Discussão

A avaliação do padrão de distribuição da variabilidade genética dentro e entre populações de diferentes espécies de Tomoplagia endófagas de capítulos de plantas da família Asteraceae indicou diferenças na diversidade genética entre espécies de insetos herbívoros com diferentes níveis de especialização ecológica e a existência de estrutura genética moderada associada a diferentes plantas hospedeiras utilizadas por espécies oligófagas, tanto na escala local quanto regional. A distância geográfica entre populações, por outro lado, explica parcialmente parte da variabilidade genética de uma das espécies oligófagas estudadas, T. bicolor.

A amostragem do presente estudo, agregada aos extensos levantamentos anteriores na mesma região (Prado et al. 2002, 2004), representam um rol abrangente de hospedeiras das espécies de Tomoplagia na tribo Vernonieae, o que permite reconhecer plantas hospedeiras usuais e outras espécies hospedeiras utilizadas apenas ocasionalmente. As interações que acrescentamos no presente estudo são consistentes com as registradas por Prado et al. (2002,

2004), no entanto, criamos poucos indivíduos de T. incompleta de plantas do gênero

Lessingianthus, até então registrado como principal gênero de plantas hospedeiras de T. incompleta.

Lewinsohn (1991) já havia destacado como a amplitude de distribuição das plantas hospedeiras é co-determinante das interações herbívoros-hospedeiros em diferentes comunidades locais. É importante salientar que os resultados que apresentamos mostram um retrato das interações em um período curto, ao passo que investigações de mais longo prazo podem elucidar mudanças em curso nas interações herbívoros-hospedeiros e, consequentemente, seus efeitos na diferenciação genética dos herbívoros em diferentes escalas espaciais. O reconhecimento de associações realizadas e potenciais dos herbívoros com plantas hospedeiras é essencial para avaliar diferenciação genética associada a plantas hospedeiras. Por exemplo, Peccoud et al.

(2009), em um estudo abrangente de plantas hospedeiras do afídeo Acyrthosiphon pisum, mostraram que a estrutura genética desse herbívoro está associada a outras plantas hospedeiras além das anteriormente conhecidas (veja Via 1999, Ferrari et al. 2006).

Neste estudo, avaliamos a diversidade genética intrapopulacional e a estrutura genética em populações de três espécies congenéricas de moscas endófagas do gênero Tomoplagia entre plantas hospedeiras naturalmente distribuídas em diferentes campos rupestres na Cadeia do

Espinhaço Meridional. Como as espécies diferem no grau de especialização trófica, esperávamos encontrar maior diversidade genética nas espécies de insetos herbívoros oligófagas em relação à espécie monófaga (Gloss et al. 2013). De fato, o número de alelos total e o número médio de alelos por loco foi maior nas espécies oligófagas, no entanto, a amplitude desses valores foi maior nas espécies oligófagas. Dessa forma, a diferença no esforço amostral entre as três espécies (tanto do número de indivíduos como de populações avaliadas) pode ser responsável pela variação observada no número de alelos, sendo um equívoco atribuir essa variação somente ao nível de especialização trófica do herbívoro. Além disso, o número de alelos exclusivos foi

78 maior nas populações de T. grandis, o que reitera que a diferença amostral pode ter efeito nos padrões de diversidade genética intraespecífica que observamos.

Encontramos diferenças nos padrões de diferenciação genética nas espécies com graus distintos de especialização trófica, mas um resultado comum às três espécies foi a maior variação genética dentro de populações do que entre populações. Nossos resultados indicam que diferentes mecanismos podem levar à estrutura genética em populações naturais de espécies congenéricas, com importante papel da amplitude e sobreposição de distribuição de plantas hospedeiras no padrão de diferenciação genética. Todas as populações avaliadas de Tomoplagia grandis, T. bicolor e T. incompleta apresentaram altos valores de FIS, mas observamos excesso de heterozigotos em alguns locos de cada espécie de Tomoplagia (Apêndice 3, valores negativos). Esse resultado dá indícios possíveis da biologia desse grupo, ainda pouco conhecida, pois é provável que alguns indivíduos irmãos tenham sido criados dos mesmos indivíduos hospedeiros e utilizados nas análises, o que justificaria os altos valores de FIS. Por outro lado, esse resultado pode refletir a existência de endogamia apreciável nas populações de Tomoplagia.

Para o herbívoro monófago Tomoplagia grandis, encontramos estrutura genética moderada e significativa, de acordo com os valores de FST, entre as populações da Serra do

Cabral e do Rio Preto em relação à população do Biribiri, mas a DAPC não indicou estruturação geográfica entre os indivíduos. Não detectamos correlação de distância geográfica com diferenciação genética nessas populações; ao contrário, os indivíduos da população do Biribiri, localizada entre as duas outras localidades, são geneticamente mais distantes em relação às outras duas populações do que essas entre si, embora estejam mais afastadas. Isso pode indicar algum grau de continuidade na única espécie hospedeira conhecida desse herbívoro,

Lessingianthus buddleiifolius. Por outro lado, a avaliação da estruturação espacial é limitada por

79 contar somente com três localidades amostradas. É possível que o acréscimo de outras localidades evidencie um efeito da distância geográfica na diferenciação genética de T. grandis.

Por exemplo, em um estudo que abrangeu uma maior extensão geográfica, Prado et al. (2005) separaram genética e morfologicamente Tomoplagia reticulata e T. pallens, antes espécies crípticas associadas principalmente a Eremanthus glomerulatus. No estudo populacional dessas espécies, Abreu & Solferini (2008) encontraram estrutura genética entre populações de T. reticulata e T. pallens associadas a manchas de E. glomerulatus, e identificaram uma zona híbrida na localidade na qual essas espécies co-ocorrem. Como Yotoko et al. (2005) mostraram que a especialização ecológica em Tomoplagia não representa um fim de linha evolutivo, Prado et al. (2005) levantam a possibilidade de duas espécies de Tomoplagia surgirem a partir de uma espécie especializada.

A ausência estrutura geográfica entre as populações de T. grandis pode indicar continuidade de dispersão das moscas entre as localidades, que diluiria qualquer diferenciação genética decorrente de respostas adaptativas locais. No entanto, a estrutura genética moderada da população do Biribiri em relação às outras duas populações é um indício de que algum fator tenha potencial de limitar o fluxo de indivíduos nessa localidade. A distribuição das plantas hospedeiras age como um limitante absoluto para a dispersão e sobrevivência de espécies monófagas (Jaenike 1990, Prado 1999, Hardy et al. 2016). A frequência de L. buddleiifolius nas diferentes localidades ou mesmo as correntes de vento das serras da Cadeia do Espinhaço podem estar envolvidos na diferenciação genética que observamos para T. grandis, pela capacidade de influenciar a direção de dispersão de indivíduos entre populações, a colonização de novos ambientes e até mesmo a associação com uma nova planta hospedeira (Dobzhansky 1973, Pasek

1988, Hardy et al. 2016). Por exemplo, a direção mais frequente dos ventos para as três

80 localidades é nordeste (https://globalwindatlas.info/), o que pode interferir no fluxo de indivíduos entre as populações da Serra do Cabral e do Rio Preto em relação ao Biribiri, de modo que a população do Biribiri poderia se diferenciar geneticamente por meio de processos neutros como deriva genética (Coyne & Orr 2004). Além disso, como o Biribiri atualmente é cercado por áreas urbanizadas e pastagens, pode estar mais isolado do que as outras duas áreas. Um levantamento mais extenso e completo da distribuição geográfica de L. buddleiifolius permitirá aferir descontinuidades que possam levar à diferenciação genética, além de oferecer possibilidade de analisar a composição genética de outras populações de T. grandis.

A diferenciação genética entre populações associadas a hospedeiros tem sido investigada em vários sistemas de interação parasita-hospedeiro, principalmente para espécies especializadas. Quanto mais íntima a relação dos organismos que interagem, maior a chance de que a associação com um novo hospedeiro em escala local altere a história evolutiva do parasita

(Bush 1969, Abrahamson et al. 2001, Berlocher & Feder 2002, Drès & Mallet 2002, Feder &

Forbes 2010, Heard 2012). No entanto, as particularidades dos sistemas estudados devem ser consideradas, pois restrições preexistentes podem interferir na associação com uma nova espécie de planta e, consequentemente, na diversificação de linhagens intraespecíficas. Nesse sentido, uma das bases da monofagia de T. grandis em L. buddleiifolius pode ser estrutural, pois as pupas possuem tamanho igual ou superior ao dos capítulos da maioria de espécies de Vernonieae, o que as exclui como hospedeiras (“interações proibidas”, no sentido de Jordano et al. 2003, Olesen et al. 2011). Observamos a ocorrência de Lessingianthus coriaceus, espécie com capítulos de tamanho similar aos de L. buddleiifolius, nas três localidades nas quais T. grandis foi coletada, mas não registramos interação com essa hospedeira. Portanto, restrições filogenéticas e/ou químicas somadas à restrição estrutural do tamanho do capítulo podem dificultar a expansão de

T. grandis para outras espécies hospedeiras (Oguro & Sakai 2015). Consequentemente, como toda espécie monófaga, a vulnerabilidade de T. grandis frente a perturbações naturais e/ou antrópicas está hoje completamente atrelada à resiliência de sua única planta hospedeira

(Fonseca 2009).

As duas outras espécies estudadas, Tomoplagia bicolor e T. incompleta, possuem menor tamanho corporal e utilizam conjuntos mais variados de espécies de plantas como hospedeiras.

Poucos indivíduos de T. bicolor e de T. incompleta foram criados de outras espécies hospedeiras além das principais e esses não foram incorporados nas análises genéticas. Houve conservação filogenética na associação com hospedeiros alternativos aceitáveis, respectivamente de T. bicolor com hospedeiras da subtribo Lychnophorinae e de T. incompleta com hospedeiras da subtribo

Lepidaploinae (Apêndice 2). Nossos resultados sugerem que as fêmeas dessas duas espécies oligófagas, dentro de seus conjuntos de hospedeiras, apresentam baixa fidelidade às espécies hospedeiras. Dessa forma, eventos de acasalamento e oviposição de uma mesma fêmea poderiam ocorrer em diferentes espécies dentro do espectro aceitável para o herbívoro, ou então fêmeas distintas poderiam se associar a hospedeiros localmente e temporalmente mais disponíveis

(Lewinsohn et al. 2006). Essa menor fidelidade pode ser facilitada pelo conservadorismo químico a nível de gênero ou subtribo observado em muitos grupos de Asteraceae (Funk et al.

2009, Lusa et al. 2016, Gallon et al. 2018), que poderia facultar a esses herbívoros a plasticidade de utilizar diferentes espécies de plantas filogenética e quimicamente próximas (Bernays 1999,

Ueno et al. 2003). Dessa forma, o fluxo gênico decorrente do uso não preferencial de plantas hospedeiras por indivíduos da mesma população impediria a diferenciação genética das populações associadas a espécies hospedeiras diferentes.

Algumas espécies de Minasia e Lychnophora, principais hospedeiras de T. bicolor, possuem distribuição restrita na cadeia do Espinhaço, caracterizada como distribuição micro- endêmica (Collevatti et al. 2009, Jesus et al. 2009, Campos et al. 2019). A diversidade beta de plantas entre os campos rupestres estudados pode ser o principal fator que determina a especialização trófica de T. bicolor em diferentes locais de sua ocorrência. Encontramos estrutura genética moderada e significativa entre populações de T. bicolor associadas a diferentes plantas hospedeiras nas escalas local e regional. A principal diferenciação genética ocorreu entre a população associada a M. pereirae com populações associadas a espécies congenéricas ou de diferentes gêneros, evidenciada na comparação pareada de FST. Na DAPC encontramos indícios de estruturação genética das populações de T. bicolor. Observamos que os indivíduos de M. pereirae pertencem quase exclusivamente a um dos três grupos genéticos reconhecidos na

DAPC. Esse resultado deve ser interpretado com cautela, visto que poucos indivíduos foram analisados, e esses podem ser estreitamente aparentados ou mesmo pertencerem à mesma ninhada. Ainda assim, essa diferenciação genética sugere que essa população possa estar em processo de especialização local em M. pereirae (Hardy et al. 2016) e, devido a isso, o fluxo gênico com indivíduos de populações associados a outras espécies hospedeiras seja de fato reduzido. Os indivíduos criados de Lychnophora tomentosa também foram atribuídos majoritariamente a um dos grupos genéticos da DAPC, mas no geral observamos fraca diferenciação genética nas comparações pareadas com as demais populações, em escala tanto local como regional.

Nossos resultados para T. bicolor sugerem que a associação com múltiplas hospedeiras de amplitude geográfica restrita pode representar um importante mecanismo para diversificação de insetos herbívoros oligófagos. A dispersão de T. bicolor entre localidades não segue a

83 distribuição das mesmas espécies hospedeiras, mas seria marcada por comutações comportamentais de busca e seleção para oviposição entre plantas hospedeiras potenciais em cada localidade. Essa forma descontínua de associação com espécies hospedeiras pode reduzir a dispersão de indivíduos e promover algum nível de especialização local por deriva em insetos herbívoros oligófagos (Hardy et al. 2016), o que pode gerar diferenciação genética associada a hospedeiros em espécies com algum grau de isolamento geográfico (Goyer et al. 1995,

Thompson 2005, Craft et al. 2010). Provavelmente, a distribuição das plantas hospedeiras e o padrão de associação das moscas com as plantas hospedeiras em escala regional têm um efeito importante no padrão de isolamento por distância que encontramos em T. bicolor. Em

Hyphantria cunea (Lepidoptera: Erebidae) nos Estados Unidos, Vidal et al. (2019) demonstraram que a distância geográfica foi mais importante do que mudança de plantas hospedeiras para a diferenciação genética. Entretanto, essa mariposa é um dos casos mais extremos de polifagia conhecidos, com mais de 600 hospedeiros registrados; portanto, nesse caso particular, o inseto herbívoro deve ter grande plasticidade no uso de plantas hospedeiras (García-

Robledo & Horvitz 2012) e a diferenciação genética entre hospedeiras não é esperada.

As plantas da cadeia do Espinhaço diferem em amplitude de distribuição geográfica, desde espécies endêmicas e micro-endêmicas até outras amplamente distribuídas (Collevatti et al. 2009, Silveira et al. 2015, Campos et al. 2019). Vários estudos relacionam a distribuição restrita e disjunta de parte das plantas do Espinhaço a variações climáticas que ocorreram no

Pleistoceno, com expansão dos campos rupestres nos períodos secos e quentes e retração a locais propícios nos períodos úmidos e frios (Collevatti et al. 2009, Silveira et al. 2015, Morellato &

Silveira 2018). Ao discutir a distribuição geográfica das interações de tefritídeos com plantas da tribo Vernonieae na cadeia do Espinhaço, Prado (1991) destacou que a ausência da planta

84 hospedeira é o principal fator que determina a falta da associação em escala local, mas que plantas hospedeiras alternativas possibilitam estender a amplitude geográfica dos herbívoros endófagos. Isso significa que a distribuição de muitos tefritídeos é mais ampla que a de cada uma das espécies de plantas que os hospedam (Lewinsohn 1991, Lewinsohn et al. 2005), o que afeta a especialização trófica dos insetos em escala local e regional e, como mostramos para T. bicolor, pode atuar como mecanismo de isolamento e diferenciação genética de insetos herbívoros em escala regional.

Tomoplagia incompleta também está associada a múltiplas plantas hospedeiras pertencentes principalmente à subtribo Lepidaploinae. As hospedeiras de T. incompleta são mais amplamente distribuídas que as hospedeiras de T. bicolor; assim, o fluxo de indivíduos de T. incompleta entre populações de localidades distintas pode ser favorecido pela continuidade geográfica de suas hospedeiras. Esse fator provavelmente restringe o isolamento por distância em T. incompleta, e corrobora a importância do distanciamento geográfico na diversificação de herbívoros associados a plantas hospedeiras geograficamente restritas. Populações coespecíficas de herbívoros oriundas das mesmas espécies hospedeiras em diferentes localidades permitem avaliar a diferenciação genética associada ao hospedeiro. No entanto, tais comparações retratam a história evolutiva de apenas parte dos diversos grupos herbívoros existentes.

Encontramos estrutura genética moderada entre populações de T. incompleta associadas a diferentes espécies hospedeiras coocorrentes, como também entre hospedeiras congenéricas e coespecíficas em escala regional. No entanto, as populações de T. incompleta não estão estruturadas geneticamente, visto que os três grupos genéticos evidenciados na DAPC estão distribuídos em todas as localidades estudadas; no entanto, observamos atribuição nos três grupos em diferentes proporções. Por exemplo, os indivíduos criados de duas espécies

85 hospedeiras na Serra da Guiné pertencem quase exclusivamente a um dos três grupos genéticos da DAPC; também encontramos estrutura genética moderada e significativa entre essas duas populações com base nos valores de FST. Apesar de poucos indivíduos terem sido analisados dessas duas populações, esses resultados sugerem que algumas populações de T. incompleta possam se especializar localmente, ou mesmo que existam outros fatores, além do isolamento geográfico, que possuem a capacidade de reduzir o fluxo gênico entre populações. Dessa forma, variações adaptativas relacionadas ao uso das plantas hospedeiras podem ser relevantes para a diferenciação genética de insetos herbívoros associados a plantas hospedeiras amplamente distribuídas (Ehrlich & Raven 1964, Janz et al. 2006, Heard 2012).

A origem de raças associadas a diferentes espécies hospedeiras tem sido estudada em vários aspectos para duas espécies de tefritídeos. Dessas, a raciação de Eurosta solidaginis está ligada ao uso de duas espécies de Asteraceae nativas, Solidago altissima e S. gigantea

(Abrahamson & Weis 1997, Craig et al. 1997, Abrahamson et al. 2001, Moffat et al. 2019). O outro caso demonstra a diferenciação genética de Rhagoletis pomonella, cuja hospedeira nativa é

Crataegus mollis, ao associar-se com uma planta hospedeira introduzida, a maçã, Malus pumila

(Bush 1969, 1975, Feder et al. 1993, 1994, 2003). Para esses dois sistemas, cuja diferenciação genética tem sido estudada há décadas, a origem e manutenção do isolamento reprodutivo das populações associadas a diferentes espécies hospedeiras estão relacionadas ao acasalamento e oviposição preferenciais na espécie hospedeira da qual houve emergência do herbívoro (Bush

1969, Feder et al. 1994, Abrahamson 2001), à aptidão e adaptação fisiológica da prole (Heard

2012), e ao desencontro temporal devido a diferenças no período de emergência dos adultos associados a diferentes espécies com fenologias não-sincronizadas (Feder et al. 1993,

Abrahamson & Weis 1997).

Para posicionar nossos resultados em relação a estudos semelhantes, realizamos uma busca simplificada por artigos publicados até novembro de 2019 que continham o termo “host associated differentiation” no banco de dados Web of Science. Encontramos 84 artigos, dentre os quais selecionamos, aqueles que investigaram a diferenciação genética em insetos devido tanto à planta hospedeira como à distribuição geográfica. Os resultados são resumidos no Suplemento

S2. Os grupos de herbívoros com diferentes hábitos (exófagos, sugadores folívoros mastigadores, e endófagos) foram avaliados tanto em ambientes terrestres como aquáticos (associados a macroalgas), e o efeito cascata foi avaliado em parasitoides de espécies de insetos herbívoros com raças já identificadas em diferentes espécies de plantas hospedeiras. Em herbívoros aquáticos não foi encontrada nenhuma diferenciação genética, provavelmente devido às ondas e correntes marinhas influenciarem a colonização das macroalgas ou também que não haja preferência desses herbívoros por hospedeiras (Johnston et al., 2012, Peres et al. 2019). Para galhadores e afídeos (e outros hemípteros), a diferenciação genética é mais frequente entre espécies de plantas hospedeiras. O estudo de Craft et al. (2010), assim como o presente estudo, avaliou a diferenciação genética em insetos herbívoros naturalmente distribuídos entre suas plantas hospedeiras; os resultados mostraram que a diferenciação entre plantas hospedeiras teve peso variável em relação a distância geográfica na diferenciação genética em 28 espécies de

Lepidoptera com diferentes níveis de especialização trófica (Suplemento S2). A diversidade beta de plantas hospedeiras também influenciou o padrão de isolamento por distância para insetos herbívoros oligófagos a polífagos em Craft et al. (2010).

Neste estudo, nossa expectativa de que a diversidade genética intrapopulacional e a diferenciação genética em insetos herbívoros monófagos fosse menor em comparação a espécies oligófagas foi parcialmente corroborada, visto que o número limitado de indivíduos e populações

87 avaliadas da espécie monófaga pode ter influenciado os nossos resultados. Mostramos indícios de estruturação genética moderada associada à planta hospedeira para herbívoros oligófagos em escala local e regional, resultados que fortalecem a importância da associação com plantas hospedeiras na diversificação de insetos herbívoros. Sugerimos a proximidade química das plantas hospedeiras como um dos fatores para a possível falta de fidelidade filopátrica, ou plasticidade na escolha para oviposição, o que ajudaria a dar conta da estruturação genética fraca a moderada entre populações coespecíficas que observamos. Além disso, corroboramos a predição que a diversidade beta, junto com a distribuição restrita de espécies de plantas hospedeiras, podem ter papel relevante nos padrões de isolamento por distância em insetos herbívoros oligófagos. Por fim, ressaltamos que a avaliação do efeito de outros organismos nas interações herbívoros-hospedeiros, como inimigos naturais ou mesmo bactérias simbióticas dos herbívoros (Medina et al. 2011), pode agregar novas perspectivas aos estudos de diversificação em insetos herbívoros.

Conclusão

Mostramos que a relevância de diferentes mecanismos que determinam a diferenciação genética varia entre insetos herbívoros de mesmo gênero com níveis distintos de especialização em plantas hospedeiras. Diferenças de amplitude de distribuição geográfica das espécies de plantas afetam a especialização de insetos herbívoros associados a múltiplas plantas hospedeiras em escala regional; esse talvez seja o mecanismo responsável pelo padrão de diferenciação por distância encontrado apenas em Tomoplagia bicolor. Dessa forma, quanto maior a substituição de plantas hospedeiras utilizadas entre as localidades de uma região, mais os insetos herbívoros estarão sujeitos a processos de diversificação devido ao isolamento geográfico por distância

(Craft et al. 2010, Hardy et al. 2016, Vidal et al. 2019). Já a diversificação de herbívoros

88 associados a um mesmo conjunto de plantas hospedeiras dentro de uma região provavelmente estará sujeita a processos adaptativos locais. Reforçamos a importância de considerar variações ecológicas de sistemas hospedeiro-parasita (aí incluídos herbívoros) naturalmente distribuídos para elucidar como diferentes histórias evolutivas podem influenciar o surgimento de novas raças ou espécies. Essa importância é reforçada pelos diferentes padrões de diferenciação genética que encontramos de acordo com o grau de especialização ecológica de insetos herbívoros aparentados. Por fim, as características ecológicas das interações Tomoplagia-Vernonieae demonstram que a expansão das interações com novas plantas é possível e tornam esse sistema promissor para aprofundar o entendimento de processos capazes de originar diversidade.

Referências bibliográficas

ABRAHAMSON, W. G., M. D. EUBANKS, C. P. BLAIR, AND A. V. WHIPPLE. 2001. Gall flies, inquilines, and goldenrods: a model for host-race formation and sympatric speciation. Am. Zool. 41: 928–938. ABRAHAMSON, W. G., AND A. E. WEIS. 1997. Evolutionary Ecology Across Three Trophic Levels: Goldenrods, Gallmakers, and Natural Enemies. Princeton University Press, Princeton, NJ. ABREU, A. G., AND V. N. SOLFERINI. 2008. Genetic population structure and hybridization in two sibling species, Tomoplagia reticulata and Tomoplagia pallens (Diptera: Tephritidae). Genet. Mol. Res. 7: 1298–1311. ACZÉL, M. L. 1955. Fruit flies of the genus Tomoplagia Coquillet (Diptera: Tephritidae). Proc. U. S. Natl. Mus. 104: 321–411. AGOSTA, S. J., N. JANZ, AND D. R. BROOKS. 2010. How specialists can be generalists: resolving the “parasite paradox” and implications for emerging infectious disease. Zool. Curitiba 27: 151–162. AGRAWAL, A. A. 2001. Phenotypic plasticity in the interactions and evolution of species. Science 294: 321–326. ALTHOFF, D. M. 2008. A test of host-associated differentiation across the ‘parasite continuum’ in the tri-trophic interaction among yuccas, bogus yucca moths, and parasitoids. Mol. Ecol. 17: 3917–3927. ANTWI, J. B., G. A. SWORD, AND R. F. MEDINA. 2015. Host-associated differentiation in a highly polyphagous, sexually reproducing insect herbivore. Ecol. Evol. 5: 2533–2543. BARMAN, A. K., M. N. PARAJULEE, C. G. SANSONE, C. P. C. SUH, AND R. F. MEDINA. 2012. Geographic pattern of host-associated differentiation in the cotton fleahopper, Pseudatomoscelis seriatus: Genetic population structure of Pseudatomoscelis seriatus. Entomol. Exp. Appl. 143: 31–41. BERLOCHER, S. H., AND J. L. FEDER. 2002. Sympatric speciation in phytophagous insects: moving beyond controversy? Annu. Rev. Entomol. 47: 773–815. BERNAYS, E. A. 1998. Evolution of feeding behavior in insect herbivores. Bioscience 35–44. BERNAYS, E. A. 1999. Plasticity and the problem of choice in food selection. Ann. Entomol. Soc. Am. 92: 944–951. BERNAYS, E., AND M. GRAHAM. 1988. On the evolution of host specificity in phytophagous arthropods. Ecology 69: 886–892. BOOTH, W., O. BALVÍN, E. L. VARGO, J. VILÍMOVÁ, AND C. SCHAL. 2015. Host association drives genetic divergence in the bed bug, Cimex lectularius. Mol. Ecol. 24: 980–992. BUSH, G. L. 1969. Sympatric host race formation and speciation in frugivorous flies of the genus Rhagoletis (Diptera, Tephritidae). Evolution 23: 237–251.

BUSH, G. L. 1975. Modes of animal speciation. Annu. Rev. Ecol. Syst. 6: 339–364. CAMPOS, L., M. FREIRE MORO, V. A. FUNK, AND N. ROQUE. 2019. Biogeographical review of Asteraceae in the Espinhaço Mountain Range, Brazil. Bot. Rev. COGNI, R., J. R. TRIGO, AND D. J. FUTUYMA. 2011. Varying herbivore population structure correlates with lack of local adaptation in a geographic variable plant-herbivore interaction. Plos One 6: e29220. COLLEVATTI, R. G., S. G. RABELO, AND R. F. VIEIRA. 2009. Phylogeography and disjunct distribution in Lychnophora ericoides (Asteraceae), an endangered cerrado shrub species. Ann. Bot. 104: 655–664. CRAFT, K. J., S. U. PAULS, K. DARROW, S. E. MILLER, P. D. N. HEBERT, L. E. HELGEN, V. NOVOTNY, AND G. D. WEIBLEN. 2010. Population genetics of ecological communities with DNA barcodes: An example from New Guinea Lepidoptera. Proc. Natl. Acad. Sci. 107: 5041–5046. CRAIG, T. P., J. D. HORNER, AND J. K. ITAMI. 1997. Hybridization studies on the host races of Eurosta solidaginis: implications for sympatric speciation. Evolution 51: 1552–1560. CRAIG, T. P., J. K. ITAMI, I. W. G. ABRAHAMSON, AND J. D. HORNER. 1993. Behavioral evidence for host-race formation in Eurosta solidaginis. 47: 1696–1710. DANON, G., R. BEN-SHLOMO, N. KEIDAR, AND N. DORCHIN. 2017. Geographic and behavioural isolation promote the differentiation of parapatric host-associated forms in bud-galling midges (Diptera: Cecidomyiidae). Biol. J. Linn. Soc. 121: 163–173. DICKEY, A. M., AND R. F. MEDINA. 2010. Testing host-associated differentiation in a quasi- endophage and a parthenogen on native trees. J. Evol. Biol. 23: 945–956. DOBZHANSKY, T. 1973. Active dispersal and passive transport in Drosophila. Evolution 27: 565–575. DOWNEY, M. H., AND C. C. NICE. 2013. A role for both ecology and geography as mechanisms of genetic differentiation in specialized butterflies. Evol. Ecol. 27: 565–578. DRÈS, M., AND J. MALLET. 2002. Host races in plant-feeding insects and their importance in sympatric speciation. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 357: 471–492. DRISCOE, A. L., C. C. NICE, R. W. BUSBEE, G. R. HOOD, S. P. EGAN, AND J. R. OTT. 2019. Host plant associations and geography interact to shape diversification in a specialist insect herbivore. Mol. Ecol. 28: 4197–4211. EHRLICH, P. R., AND P. H. RAVEN. 1964. Butterflies and plants: a study in coevolution. Evolution 18: 586. FEDER, J. L., S. H. BERLOCHER, J. B. ROETHELE, H. DAMBROSKI, J. J. SMITH, W. L. PERRY, V. GAVRILOVIC, K. E. FILCHAK, J. RULL, AND M. ALUJA. 2003. Allopatric genetic origins for sympatric host-plant shifts and race formation in Rhagoletis. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 10314–10319. FEDER, J. L., S. P. EGAN, AND P. NOSIL. 2012. The genomics of speciation-with-gene-flow. Trends Genet. 28: 342–350.

FEDER, J. L., AND A. A. FORBES. 2007. Habitat avoidance and speciation for phytophagous insect specialists. Funct. Ecol. 21: 585–597. FEDER, J. L., AND A. A. FORBES. 2010. Sequential speciation and the diversity of parasitic insects. Ecol. Entomol. 35: 67–76. FEDER, J. L., T. A. HUNT, AND L. BUSH. 1993. The effects of climate, host plant phenology and host fidelity on the genetics of apple and hawthorn infesting races of Rhagoletis pomonella. Entomol. Exp. Appl. 69: 117–135. FEDER, J. L., S. B. OPP, B. WLAZLO, K. REYNOLDS, W. GO, AND S. SPISAK. 1994. Host fidelity is an effective premating barrier between sympatric races of the apple maggot fly. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7990–7994. FERRARI, J., H. C. J. GODFRAY, A. S. FAULCONBRIDGE, K. PRIOR, AND S. VIA. 2006. Population differentiation and genetic variation in host choice among pea aphids from eight host plant genera. Evolution 60: 1574–1584. FONSECA, C. R. 2009. The silent mass extinction of insect herbivores in biodiversity hotspots. Conserv. Biol. 23: 1507–1515. FORISTER, M. L., V. NOVOTNY, A. K. PANORSKA, L. BAJE, Y. BASSET, P. T. BUTTERILL, L. CIZEK, P. D. COLEY, F. DEM, I. R. DINIZ, et al. 2014. The global distribution of diet breadth in insect herbivores. Proc. Natl. Acad. Sci. 112: 442–447. FOX, L., AND P. MORROW. 1981. Specialization - species property or local phenomenon. Science 211: 887–893. FUNK, D. J. 2010. Does strong selection promote host specialisation and ecological speciation in insect herbivores? Evidence from Neochlamisus leaf beetles. Ecol. Entomol. 35: 41–53. FUNK, D. J., K. E. FILCHAK, AND J. L. FEDER. 2002. Herbivorous insects: model systems for the comparative study of speciation ecology. Genetica 116: 251–267. FUNK, V. A., T. S. SUSANNA, T. F. STUESSY, AND R. J. BAYER. 2009. Systematics, Evolution, and Biogeography of Compositae. International Association For Plant Taxonomy, Vienna, Austria. GALLON, M. E., M. MONGE, R. CASOTI, F. B. DA COSTA, J. SEMIR, AND L. GOBBO- NETO. 2018. Metabolomic analysis applied to chemosystematics and evolution of megadiverse Brazilian Vernonieae (Asteraceae). Phytochemistry 150: 93–105. GARCÍA-ROBLEDO, C., AND C. C. HORVITZ. 2012. Jack of all trades masters novel host plants: positive genetic correlations in specialist and generalist insect herbivores expanding their diets to novel hosts: Quantitative genetics of diet expansion. J. Evol. Biol. 25: 38–53. GASTON, K. J., D. REAVEY, AND G. R. VALLADARES. 1992. Intimacy and fidelity: internal and external feeding by the British microlepidoptera. Ecol. Entomol. 17: 86–88. GLOSS, A. D., A. C. NELSON DITTRICH, B. GOLDMAN-HUERTAS, AND N. K. WHITEMAN. 2013. Maintenance of genetic diversity through plant–herbivore interactions. Curr. Opin. Plant Biol. 16: 443–450. GOUDET, J. 2005. hierfstat, a package for r to compute and test hierarchical F-statistics. Mol. Ecol. Notes 5: 184–186.

GOYER, R. A., T. D. PAINE, D. P. PASHLEY, G. J. LENHARD, J. R. MEEKER, AND C. C. HANLON. 1995. Geographic and host-associated differentiation in the fruittree leafroller (Lepidoptera: Tortricidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 88: 391–396. HARDY, N. B., D. A. PETERSON, AND B. B. NORMARK. 2016. Nonadaptive radiation: Pervasive diet specialization by drift in scale insects? BRIEF COMMUNICATION. Evolution 70: 2421–2428. HAWTHORNE, D. J., AND S. VIA. 2001. Genetic linkage of ecological specialization and reproductive isolation in pea aphids. Nature 412: 904–907. HEARD, S. B. 2012. Use of host-plant trait space by phytophagous insects during host- associated differentiation: the gape-and-pinch model. Int. J. Ecol. 2012: 1–15. JAENIKE, J. 1990. Host specialization in phytophagous insects. Annu. Rev. Ecol. Syst. 243– 273. JANZ, N., S. NYLIN, AND N. WAHLBERG. 2006. Diversity begets diversity: host expansions and the diversification of plant-feeding insects. BMC Evol. Biol. 6: 4. JESUS, F. F., A. G. ABREU, J. SEMIR, AND V. N. SOLFERINI. 2009. Low genetic diversity but local genetic differentiation in endemic Minasia (Asteraceae) species from Brazil. Plant Syst. Evol. 277: 187–196. JOHNSTON, L., M. W. MILLER, AND I. B. BAUMS. 2012. Assessment of host-associated genetic differentiation among phenotypically divergent populations of a coral-eating gastropod across the Caribbean. Plos One 7: e47630. JOMBART, T., AND I. AHMED. 2011. adegenet 1.3-1: new tools for the analysis of genome- wide SNP data. Bioinformatics 27: 3070–3071. JOMBART, T., S. DEVILLARD, AND F. BALLOUX. 2010. Discriminant analysis of principal components: a new method for the analysis of genetically structured populations. BMC Genet. 11: 94. JORDANO, P., J. BASCOMPTE, AND J. OLESEN. 2003. Invariant properties in coevolutionary networks of plant-animal interactions. Ecol. Lett. 6: 69–81. JORGE, L. R., P. I. PRADO, M. ALMEIDA-NETO, AND T. M. LEWINSOHN. 2014. An integrated framework to improve the concept of resource specialisation. Ecol. Lett. 17: 1341–1350. JUÁREZ, M. L., G. SCHÖFL, M. T. VERA, J. C. VILARDI, M. G. MURÚA, E. WILLINK, S. HÄNNIGER, D. G. HECKEL, AND A. T. GROOT. 2014. Population structure of Spodoptera frugiperda maize and rice host forms in South America: are they host strains? Entomol. Exp. Appl. 152: 182–199. KAMVAR, Z. N., J. F. TABIMA, AND N. J. GRÜNWALD. 2014. Poppr: an R package for genetic analysis of populations with clonal, partially clonal, and/or sexual reproduction. PeerJ 2: e281. KEARSE, M., R. MOIR, A. WILSON, S. STONES-HAVAS, M. CHEUNG, S. STURROCK, S. BUXTON, A. COOPER, S. MARKOWITZ, C. DURAN, T. THIERER, B. ASHTON, P. MEINTJES, AND A. DRUMMOND. 2012. Geneious Basic: An integrated and extendable

desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics 28: 1647–1649. KEELEY, S. C., Z. H. FORSMAN, AND R. CHAN. 2007. A phylogeny of the “evil tribe” (Vernonieae: Compositae) reveals Old/New World long distance dispersal: Support from separate and combined congruent datasets (trnL-F, ndhF, ITS). Mol. Phylogenet. Evol. 44: 89–103. KEENAN, K., P. MCGINNITY, T. F. CROSS, W. W. CROZIER, AND P. A. PRODÖHL. 2013. diveRsity: An R package for the estimation and exploration of population genetics parameters and their associated errors. Methods Ecol. Evol. 4: 782–788. KOLBEK, J., and R. J. V. ALVES. 2008. Impacts of cattle, fire and wind in rocky savannas, Southeastern Brazil. Acta Univ. Carol. Environ. 22: 111–130. LEPPÄNEN, S. A., T. MALM, K. VÄRRI, AND T. NYMAN. 2014. A comparative analysis of genetic differentiation across six shared willow host species in leaf- and bud-galling sawflies. Plos One 9: e116286. LEWINSOHN, T. M. 1991. Insects in flower heads of Asteraceae in Southeast Brazil: a tropical case study on species richness. In Plant-Animal Interactions: Evolutionary Ecology in Tropical and Temperate Regions. pp. 525–560, P.W. Price et al. (eds.) Wiley, New York.

LEWINSOHN, T. M., V. NOVOTNY, AND Y. BASSET. 2005. Insects on plants: diversity of herbivore assemblages revisited. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 36: 597–620. LEWINSOHN, T. M. P. I. PRADO, P. JORDANO, J. BASCOMPTE, AND J. M. OLESEN. 2006. Structure in plant-animal interaction assemblages. Oikos 113: 174–184. LOZIER, J. D., G. K. RODERICK, AND N. J. MILLS. 2007. Genetic evidence from mitochondrial, nuclear, and endosymbiont markers for the evolution of host plant associated species in the aphid genus Hyalopterus (Hemiptera: Aphididae). Evolution 61: 1353–1367. LOZIER, J. D., G. K. RODERICK, AND N. J. MILLS. 2009. Molecular markers reveal strong geographic, but not host associated, genetic differentiation in Aphidius transcaspicus, a parasitoid of the aphid genus Hyalopterus. Bull. Entomol. Res. 99: 83–96. LUSA, M. G., M. E. P. MARTUCCI, B. F. P. LOEUILLE, L. GOBBO-NETO, B. APPEZZATO-DA-GLÓRIA, AND F. B. DA COSTA. 2016. Characterization and evolution of secondary metabolites in Brazilian Vernonieae (Asteraceae) assessed by LC-MS fingerprinting. Bot. J. Linn. Soc. 182: 594–611. MANTEL, N. 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Res. 27: 209–220. MAYR, E. 1947. Ecological factors in speciation. Evolution 1: 263–288. MEDINA, R. F., S. J. ARMSTRONG, AND K. HARRISON. 2017. Genetic population structure of sugarcane aphid, Melanaphis sacchari, in sorghum, sugarcane, and Johnsongrass in the continental USA. Entomol. Exp. Appl. 162: 358–365. MEDINA, R. F., P. NACHAPPA, AND C. TAMBORINDEGUY. 2011. Differences in bacterial diversity of host-associated populations of Phylloxera notabilis Pergande (Hemiptera:

Phylloxeridae) in pecan and water hickory: HAD and insect-associated bacteria. J. Evol. Biol. 24: 761–771. MOFFAT, C. E., M. K. TAKAHASHI, S. L. PEASE, J. M. BROWN, S. B. HEARD, AND W. G. ABRAHAMSON. 2019. Are Eurosta solidaginis on Solidago rugosa a divergent host- associated race? Evol. Ecol. 33: 369–384.

MOONEY, K. A., AND A. A. AGRAWAL. 2008. Plant genotype shapes ant‐ aphid interactions: implications for community structure and indirect plant defense. Am. Nat. 171: E195– E205. MORELLATO, L. P. C., AND F. A. O. SILVEIRA. 2018. Plant life in campo rupestre: New lessons from an ancient biodiversity hotspot. Flora 238: 1–10. NASON, J. D., S. B. HEARD, and F. R. WILLIAMS. 2002. Host-associated genetic differentiation in the goldenrod elliptical-gall moth, Gnorimoschema gallaesolidaginis (Lepidoptera: Gelechiidae). Evolution 56: 1475–1488. NEI, M. 1972. Genetic distance between populations. Am. Nat. 106: 283–292. NOSIL, P., B. J. CRESPI, AND C. P. SANDOVAL. 2002. Host-plant adaptation drives the parallel evolution of reproductive isolation. Nature 417: 440–443. NOSIL, P., L. J. HARMON, AND O. SEEHAUSEN. 2009. Ecological explanations for (incomplete) speciation. Trends Ecol. Evol. 24: 145–156. NOVOTNY, V., S. E. MILLER, L. BAJE, S. BALAGAWI, Y. BASSET, L. CIZEK, K. J. CRAFT, F. DEM, R. A. I. DREW, J. HULCR, J. LEPS, O. T. LEWIS, R. POKON, A. J. A. STEWART, G. ALLAN SAMUELSON, AND G. D. WEIBLEN. 2010. Guild-specific patterns of species richness and host specialization in plant-herbivore food webs from a tropical forest: Plant-herbivore food webs in tropical forest. J. Anim. Ecol. 79: 1193–1203. OGURO, M., AND S. SAKAI. 2015. Relation between flower head traits and florivory in Asteraceae: A phylogenetically controlled approach. Am. J. Bot. 102: 407–416. OLESEN, J. M., J. BASCOMPTE, Y. L. DUPONT, H. ELBERLING, C. RASMUSSEN, AND P. JORDANO. 2011. Missing and forbidden links in mutualistic networks. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 278: 725–732. PARADIS, E. 2010. pegas: an R package for population genetics with an integrated-modular approach. Bioinformatics 26: 419–420. PASEK, J. E. 1988. Influence of wind and windbreaks on local dispersal of insects. Agric. Ecosyst. Environ. 22: 539–554. PECCOUD, J., A. OLLIVIER, M. PLANTEGENEST, AND J.C. SIMON. 2009. A continuum of genetic divergence from sympatric host races to species in the pea aphid complex. Proc. Natl. Acad. Sci. 106: 7495–7500. PERES, P. A., M. AZEVEDO-SILVA, S. C. S. ANDRADE, AND F. P. P. LEITE. 2019. Is there host-associated differentiation in marine herbivorous amphipods? Biol. J. Linn. Soc. XX:1- 14. PÉREZ-ALQUICIRA, J., E. VAN DER KNAAP, K. MERCER, L. MCHALE, T. MITCHELL, J. LUNA-RUIZ, E. TEXOCOTITLA-VÁZQUEZ, O. VARGAS-PONCE, AND A.

MICHEL. 2019. Genetic structure of Liriomyza trifolii (Diptera: Agromyzidae) associated with host plants from Southeastern Mexico. Environ. Entomol. 48: 253–262. PIRES, M. M., AND P. R. GUIMARÃES. 2013. Interaction intimacy organizes networks of antagonistic interactions in different ways. J. R. Soc. Interface 10: 20120649. PRADO, P., A. ABREU, V. SOLFERINI, AND A. NORRBOM. 2005. Genetic and morphological diagnosis and description of two cryptic species of flower head-infesting Tephritidae (Diptera). Insect Syst. Evol. 36: 361–370. PRADO, P. I. 1999. Determinantes de ampla escala das associações entre insetos e plantas: tefritídeos (Diptera) endófagos de capítulos de Asteraceae. Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Campinas. PRADO, P. I., AND T. M. LEWINSOHN. 2004. Compartments in insect–plant associations and their consequences for community structure. J. Anim. Ecol. 73: 1168–1178. PRADO, P. I., T. M. LEWINSOHN, A. M. ALMEIDA, A. L. NORRBOM, B. D. BUYS, A. C. MACEDO, AND M. B. LOPES. 2002. The fauna of Tephritidae (Diptera) from capitula of Asteraceae in Brazil. Proc. Entomol. Soc. Wash. 104: 1007–1028. PRADO, P. I., A. L. NORRBOM, AND T. M. LEWINSOHN. 2004. New species of Tomoplagia Coquillett (Diptera: Tephritidae) from capitula of Asteraceae in Brazil. Neotrop. Entomol. 33: 189–211. R CORE TEAM. 2014. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. SALDAMANDO-BENJUMEA, C. I., K. ESTRADA-PIEDRAHÍTA, M. I. VELÁSQUEZ- VÉLEZ, AND R. I. BAILEY. 2014. Assortative mating and lack of temporality between corn and rice strains of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) from Central Colombia. J. Insect Behav. 27: 555–566. SCHOONHOVEN, L. M., B. VAN LOON, J. J. VAN LOON, AND M. DICKE. 2005. Insect- Plant Biology. Oxford University Press, Oxford. SCHUELKE, M. 2000. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nat. Biotechnol. 18: 233–234. SILVEIRA, F. A. O. et al. 2015. Ecology and evolution of plant diversity in the endangered campo rupestre: a neglected conservation priority. Plant Soil 403: 129-152. SMITH, D. C. 1988. Heritable divergence of Rhagoletis pomonella host races by seasonal asynchrony. Nature 336: 66–67. STRONG, D. R., J. H. LAWTON, AND S. R. SOUTHWOOD. 1984. Insects on Plants: Community Patterns and Mechanisms. Harvard University Press, Cambridge, MA. THOMPSON, J. N. 2005. The Geographic Mosaic of Coevolution. University of Chicago Press, Chicago. UENO, H., N. FUJIYAMA, I. YAO, Y. SATO, AND H. KATAKURA. 2003. Genetic architecture for normal and novel host-plant use in two local populations of the herbivorous ladybird beetle, Epilachna pustulosa. J. Evol. Biol. 16: 883–895.

VAN OOSTERHOUT, C., W. F. HUTCHINSON, D. P. M. WILLS, AND P. SHIPLEY. 2004. MICRO-CHECKER: Software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Mol. Ecol. Notes 4: 535–538. VIA, S. 1999. Reproductive isolation between sympatric races of pea aphids. I. Gene flow restriction and habitat choice. Evolution 53: 1446–1457. VIDAL, M. C., T. W. QUINN, J. O. STIREMAN, R. M. TINGHITELLA, AND S. M. MURPHY. 2019. Geography is more important than host plant use for the population genetic structure of a generalist insect herbivore. Mol. Ecol. Available at: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/mec.15218 [Accessed October 3, 2019]. WANG, Y.Z., B.Y. LI, A. A. HOFFMANN, L.J. CAO, Y.J. GONG, W. SONG, J.Y. ZHU, AND S.J. WEI. 2017. Patterns of genetic variation among geographic and host-plant associated populations of the peach fruit moth Carposina sasakii (Lepidoptera: Carposinidae). BMC Evol. Biol. 17. WEIR, B. S., AND C. C. COCKERHAM. 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38: 1358–1370. YOTOKO, K. S. C., P. I. PRADO, C. A. M. RUSSO, AND V. N. SOLFERINI. 2005. Testing the trend towards specialization in herbivore-host plant associations using a molecular phylogeny of Tomoplagia (Diptera: Tephritidae). Mol. Phylogenet. Evol. 35: 701–711. ZEPEDA-PAULO, F., B. LAVANDERO, F. MAHÉO, E. DION, Y. OUTREMAN, J. C. SIMON, AND C. C. FIGUEROA. 2015. Does sex-biased dispersal account for the lack of geographic and host-associated differentiation in introduced populations of an aphid parasitoid? Ecol. Evol. 5: 2149–2161.

Tabela 1. Número de indivíduos de três espécies de Tomoplagia amostradas. As populações deste estudo consistiram de indivíduos criados por espécie de planta hospedeira e por localidade. O número de indivíduos avaliados é mostrado por planta hospedeira e por localidade. (CM) Conselheiro Mata, (BB) Biribiri, RP (Rio Preto), (SC) Serra do Cabral e (SG) Serra da Guiné.

Herbívoros Plantas hospedeiras Localidades Total Espécies Subtribo CM BB RP SC SG T. bicolor Eremanthus elaeagnus (Mart. ex DC.) Sch.Bip. Lychnophorinae 21 25 46 Lychnophora markgravii G.M.Barroso 25 25 Lychnophora tomentosa (Mart. ex DC.) Sch.Bip. 16 16 Lychnophoriopsis candelabrum (Sch.Bip.) H.Rob. 9 9 Minasia alpestris (Gardner) H.Rob. 25 25 Minasia pereirae H.Rob. 8 8 Minasia scapigera H.Rob. 25 25 50 T. grandis Lessingianthus buddleiifolius (Mart. ex DC.) H.Rob. Lepidaploinae 8 17 15 40 T. incompleta Echinocoryne schwenkiifolia (Mart. ex DC.) H. Rob. Lepidaploinae 24 15 25 8 86 Lepidaploa rufogrisea (A. St.-Hil.) H.Rob. 10 18 25 53 Lepidaploa spixiana (Mart. ex DC.) H.Rob. 14 7 21

Tabela 2. Estimativas de diversidade alélica de populações de três espécies de Tomoplagia (Tephritidae) criadas de plantas hospedeiras (Asteraceae: Vernonieae) na Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais.

Espécie Local Planta hospedeira N LA A RA AE AR FIS ll hl

T. grandis Biribiri Lessingianthus buddleiifolius 8 12 64 5,33 12 23 0,46 0,32 0,60 Rio Preto Lessingianthus buddleiifolius 17 12 77 6,41 18 35 0,35 0,22 0,53 Serra do Cabral Lessingianthus buddleiifolius 15 12 83 6,91 18 36 0,47 0,26 0,67

T. bicolor Biribiri Lychnophora tomentosa 15 12 73 6,08 1 15 0,53 0,32 0,71 Biribiri Minasia scapigera 25 12 103 8,58 13 33 0,50 0,30 0,64 Conselheiro Mata Eremanthus elaeagnus 21 12 86 7,17 6 25 0,49 0,30 0,67 Conselheiro Mata Minasia alpestris 25 12 92 7,67 7 25 0,50 0,30 0,69 Conselheiro Mata Minasia pereirae 8 12 47 3,92 0 8 0,51 0,23 0,70 Serra do Cabral Eremanthus elaeagnus 25 12 114 9,50 13 43 0,49 0,31 0,68 Lychnophoriopsis Serra do Cabral candelabrum 9 12 67 5,58 5 24 0,49 0,25 0,75 Serra do Cabral Lychnophora markgravii 25 12 101 8,41 8 35 0,57 0,35 0,73 Serra do Cabral Minasia scapigera 25 12 100 8,33 9 33 0,43 0,25 0,60

T. incompleta Biribiri Echinocoryne schwenkiifolia 15 12 86 7,17 1 18 0,54 0,50 0,67 Biribiri Lepidaploa rufogrisea 22 12 99 8,25 9 26 0,62 0,52 0,74 Conselheiro Mata Echinocoryne schwenkiifolia 24 12 114 9,5 11 34 0,61 0,51 0,74 Conselheiro Mata Lepidaploa rufogrisea 12 12 78 6,5 3 21 0,59 0,52 0,71 Conselheiro Mata Lepidaploa spixiana 14 12 90 7,5 7 28 0,57 0,47 0,70 Serra do Cabral Echinocoryne schwenkiifolia 26 12 115 9,58 13 39 0,68 0,61 0,76 Serra do Cabral Lepidaploa rufogrisea 26 12 124 10,33 12 43 0,58 0,49 0,67 Serra da Guiné Echinocoryne schwenkiifolia 8 12 54 4,5 1 9 0,52 0,35 0,75 Serra da Guiné Lepidaploa spixiana 7 12 54 4,5 1 13 0,47 0,41 0,62

N = número de indivíduos.

Diversidade alélica: LA = locos analisados, A = número de alelos, RA = riqueza média de alelos por loco, AE = alelos exclusivos, AR = alelos raros (frequência ≤ 5%), FIS = coeficiente de endogamia de Wright, ll = valores inferiores do intervalo de confiança (0,025) e hl = valores superiores do intervalo de confiança (0,975).

Tabela 3. Análise Molecular de Variância (AMOVA) baseada na diversidade nuclear de marcadores microssatélites para três espécies do gênero Tomoplagia. A diversidade genética de T. grandis foi avaliada entre populações criadas de sua única hospedeira, Lessingianthus buddleiifolius, em diferentes localidades. A diversidade genética de T. bicolor foi avaliada entre populações criadas de diferentes espécies hospedeiras em localidades distintas. Já a diversidade genética de T. incompleta foi avaliada entre populações de mesmas espécies hospedeiras em localidades distintas.

Espécie Fonte de variação Componentes da % variação variância T. grandis Entre populações de diferentes localidades 0.123 4.57 Dentro de populações por localidade 2.564 95.43

T. bicolor Diferentes hospedeiras entre localidades 0.002 0.30 Diferentes hospedeiras na mesma localidade 0.036 5.69 Indivíduos de mesma localidade e hospedeira 0.597 94.01

T. incompleta Diferentes hospedeiras entre localidades 0.017 0.98 Diferentes hospedeiras na mesma localidade 0.066 3.61 Indivíduos de mesma localidade e hospedeira 1.743 95.41

100

Figura 1. Estimativas de FST pareado (Weir & Cockerham 1984, triângulo superior) e heat map dos valores de FST (triângulo inferior) entre populações de insetos endófagos de capítulos de Asteraceae na Cadeia do Espinhaço localizada no estado de Minas Gerais. (A) Tomoplagia grandis, monófaga em Lessingianthus buddleiifolius (B) T. bicolor, oligófaga associada a diferentes plantas em localidades distintas e (C) T. incompleta, oligófaga associada às mesmas plantas em localidades distintas. Valores em negrito são significativos baseados em 10.000

101 iterações bootstrap. Cores escuras representam maior diferenciação genética entre pares de populações.

102

103

Figura 2. Distribuição de indivíduos, baseada em 12 locos microssatélites, entre os grupos genéticos estabelecidos na Análise Discriminante de Componentes Principais (DAPC) para três espécies de Tomoplagia (Tephritidae) criadas de suas plantas hospedeiras (Asteraceae: Vernonieae) na Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. As diferentes cores em cada gráfico representam os grupos genéticos identificados na DAPC. (A) T. grandis, monófaga em Lessingianthus buddleiifolius, (B) T. bicolor, herbívoro oligófago especializado em espécies de poucos gêneros da subtribo Lychnophorinae e (C) T. incompleta, herbívoro oligófago especializado em espécies de diferentes gêneros da subtribo Lepidaploinae. Os grupos não correspondem a localidades distintas (A) nem a localidades e/ou plantas hospedeiras distintas (B e C); veja Figuras 3 a 5.

104

Figura 3. Proporção de indivíduos de Tomoplagia grandis em cada localidade de coleta atribuídos a cada grupo genético obtido na Análise Discriminante de Componentes Principais (DAPC, K = 2). Cada cor representa um grupo genético e as localidades são campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. (SC) Parque Estadual da Serra do Cabral, (BB) P.E. do Biribiri e (RP) P.E. do Rio Preto.

105

Figura 4. Proporção de indivíduos de Tomoplagia bicolor, mosca herbívora associada a múltiplas plantas hospedeiras da subtribo Lychnophorinae, atribuídos a cada grupo genético obtido na Análise Discriminante de Componentes Principais (DAPC, K = 3). Cada cor representa um grupo genético e as localidades são campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. (SC) Parque Estadual da Serra do Cabral, (BB) P.E. do Biribiri e (CM) Conselheiro Mata. A proporção de indivíduos em cada grupo genético também é mostrada por espécie de planta hospedeira em cada localidade: (Ee) Eremanthus elaeagnus, (Ms) Minasia scapigera, (Lc) Lychnophoriopsis candelabrum, (Lm) Lychnophora markgravii, (Lt) L. tomentosa, (Mp) M. pereirae e (Ma) M. alpestris.

106

Figura 5 Proporção de indivíduos de Tomoplagia incompleta, mosca herbívora associada a múltiplas plantas hospedeiras da subtribo Lepidaploinae, atribuídos a cada grupo genético obtido na Análise Discriminante de Componentes Principais (DAPC, K = 3). Cada cor representa um grupo genético e as localidades são campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. (SC) Parque Estadual da Serra do Cabral, (SG) Serra da Guiné, (BB) P.E. do Biribiri e (CM) Conselheiro Mata. A proporção de indivíduos em cada grupo genético também é mostrada por espécie de planta hospedeira em cada localidade: (Es) Echinocoryne schwenkiifolia, (Lr) Lepidaploa rufogrisea e (Ls) L. spixiana.

107

Material suplementar

S1 Efeito da distância geográfica na distância genética entre populações de Tomoplagia bicolor criados de diferentes espécies hospedeiras da tribo Vernonieae na Cadeia do Espinhaço meridional. A regressão linear mostrada é apenas indicativa, pois os pontos (que representam pares de populações hospedeiras) não são todos independentes. Os valores de r e p mostrados são do teste de Mantel entre as matrizes de distância geográfica e distância genética.

108

S2 Síntese da literatura publicada até novembro de 2019 que investigou a diferenciação genética associada ao hospedeiro e à distribuição geográfica para diferentes grupos de herbívoros. Os estudos foram selecionados pela busca do termo “Host associated differentiation” na base de dados Web of Science. E (espécie), G (gêneros), F (famílias), AU (ausente), PH (planta hospedeira), GE (geográfico).

Referência Ordem Herbívoro Associação Hospedeiros Estrutura genética Marcador E G F AU PH GE Antwi et al. 2015 Hemiptera Pseudatomoscelis seriatus sugador 13 11 7 x AFLP Barman et al. 2012 Hemiptera Pseudatomoscelis seriatus sugador 3 3 3 x x AFLP Craft et al. 2010* Lepidoptera Spp (monófagos) folívoro - - - x x COI Lepidoptera Spp (oligófagos) folívoro - - - x x x Lepidoptera Spp (polífagos) folívoro - - - x x x Danon et al. 2017 Diptera Dasyneuriola sp. galhador 2 1 1 x x COI, AFLP Dickey & Medina 2010 Hemiptera Monelliopsis pecanis sugador 2 1 1 x AFLP Lepidoptera Gretchena bolliana broca de meristema 2 1 1 x AFLP COI e II, folívoro Downey & Nice 2013 Lepidoptera Mitoura gryneus 3 1 1 x AFLP Driscoe et al. 2019 Hymenoptera Belonocnema treatae galhador 3 1 1 x x GBS/SNP Goyer et al. 1995 Lepidoptera Archips argyrospila folívoro 4 3 3 x x Eletroforese Johnston et al. 2012 Neogastropoda Coralliophila abbreviata coralívoro 3 3 3 x SSR, cyt b Juárez et al. 2014 Lepidoptera Spodoptera frugiperda folívoro 2 2 2 x AFLP Leppänen et al. 2014 Hymenoptera Pontania galhador 9 1 1 x COI, ITS2 Hymenoptera Euura galhador 6 1 1 x Medina et al. 2011 Hemiptera Dalbulus maidis sugador 3 1 1 x AFLP Medina et al. 2017 Hemiptera Melanaphis sacchari sugador 3 2 1 x AFLP Nason et al. 2002 Lepidoptera Gnorimoschema gallaesolidaginis galhador 2 1 1 x Aloenzima Peres et al. 2019 Amphipoda Cymadusa filosa consumidor de alga 3 3 3 x SSR Pérez-Alquicira et al. 2019 Diptera Liriomyza trifolii minador 7 5 3 x x COI Wang et al. 2017 Lepidoptera Carposina sasakii folívoro 7 6 2 x COI, SSR

109

Althoff 2008 Hymenoptera Eusandalum parasitóide 6 1 1 x COI, AFLP COI, SSR, parasitoide Lozier et al. 2007 Hemiptera Hyalopterus 1 1 1 x 16S Lozier et al. 2009 Hymenoptera Aphidius transcaspicus parasitóide 4 1 1 x COI, SSR Zepeda-Paulo et al. 2015 Hymenoptera Aphidius ervi parasitóide 5 3 1 x SSR Booth et al. 2015 Hemiptera Cimex lectularius parasita 2 2 2 x COI, SSR

* Estudo feito com 28 espécies de lepidópteros que foram agrupados aqui de acordo com classificação proposta pelos próprios autores. No estudo de Craft et al. 2010, a diferenciação genética para cada espécie de inseto herbívoro foi medida entre um número variável de plantas hospedeiras, portanto não foram incluídas na tabela.

110

Conclusões

Esta tese teve como tema central o papel da especialização ecológica na diferenciação genética associada a plantas hospedeiras em insetos herbívoros. Não há dúvida de que a enorme diversidade de insetos e plantas intriga naturalistas e ecólogos há séculos. Um reflexo disso é a variedade de aspectos investigados para compreender os mecanismos envolvidos na diversificação desses grupos, ou seja, como essa diversidade surge e se mantém. Para estudar a especialização ecológica como um dos fatores que impulsiona o processo de diversificação e, consequentemente, especiação, integrei o conhecimento de grandes áreas das Ciências

Biológicas, como Ecologia, Botânica, Zoologia e Genética. Isso permitiu acumular diferentes conhecimentos teóricos e práticos em cada etapa desta tese e culminou com os resultados que apresentei no formato de três capítulos. A seguir, destaco algumas etapas deste trabalho e finalizo com as perspectivas surgidas a partir deste estudo.

O uso do sistema Tomoplagia-Vernonieae para investigar a questão proposta nesta tese foi viabilizado pelo conhecimento prévio da distribuição dessas interações. A parte meridional da

Cadeia do Espinhaço foi o foco de vários estudos precedentes a este, desenvolvidos pelo grupo científico do Laboratório de Interações Inseto-Planta, que demonstraram a excepcional riqueza de espécies de Vernonieae nessa região. Além disso, a metodologia desenvolvida pelo prof.

Thomas Lewinsohn para criação dos insetos endófagos foi efetiva para assegurar a coleta de material concomitante com a criação das moscas. Com isso, foi possível estender um amplo levantamento das plantas potencialmente hospedeiras de Tomoplagia nas escalas local e regional e registrar as interações com Tomoplagia nas mesmas escalas. Seria de extrema relevância avaliar essas interações em escalas geográficas maiores, no entanto, essa investigação não seria viável no tempo disponível para realização deste estudo.

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Para as análises moleculares, contávamos com iniciadores, desenvolvidos no doutorado de Leonardo Jorge, para 17 locos microssatélites isolados de T. incompleta; esse foi o primeiro motivador do uso de microssatélites para avaliar a variabilidade genética das moscas

Tomoplagia. No entanto, como mostramos no Capítulo 2, não foi possível amplificar esses 17 locos nas outras espécies de Tomoplagia. Isso exigiu a dedicação de um período de tempo para o isolamento e caracterização de microssatélites para duas e três espécies, respectivamente. A falta de transferência dos microssatélites entre as espécies de Tomoplagia é um resultado importante, pois indica a baixa conservação das sequências de nucleotídeos no DNA entre as espécies investigadas e também mostra as dificuldades associadas ao uso dessa ferramenta para estudos futuros. Os microssatélites foram adequados para mostrar um retrato atual dos padrões de variabilidade genética das populações coespecíficas de Tomoplagia. O uso de outros marcadores moleculares, como os mitocondriais ou baseados em genotipagem por sequenciamento, possibilita que processos evolutivos distintos que influenciam a variabilidade genética de espécies sejam explorados e permitirão o contraste com as informações fornecidas pelos microssatélites; além disso, marcadores do tipo SNP possibilitam investigar o papel de forças evolutivas não neutras, como a seleção natural, e assim será possível refinar as questões investigadas.

Nossos resultados corroboram os estudos precedentes que reconheceram para herbívoros endófagos, como Tomoplagia, que diferenças na especialização trófica são diretamente afetadas pela amplitude geográfica da planta hospedeira. Os resultados indicam que mecanismos distintos influenciam a diferenciação genética de insetos herbívoros e atuam de acordo com a especialização ecológica da espécie. Reconhecemos a susceptibilidade do herbívoro monófago

Tomoplagia grandis, visto a diferenciação genética fraca a moderada entre populações de

112 diferentes localidades, mas sobretudo à dependência desse inseto herbívoro de sua planta hospedeira; no entanto, a exploração desse padrão em escala geográfica maior poderá evidenciar diferenciação dependente de distância que não encontramos nas localidades estudadas. A diversidade beta de plantas hospedeiras (ou a baixa amplitude geográfica de cada hospedeira) pode ser o principal determinante do isolamento por distância que observamos em T. bicolor.

Para T. bicolor e T. incompleta, a associação com a planta hospedeira tem o potencial de causar diferenciação genética, como encontrada em níveis fracos a moderados neste estudo.

Nossos resultados sugerem que as interações de Tomoplagia com suas plantas hospedeiras são promissoras para a investigação de diversos processos evolutivos que promovem a especiação. Amostrar mais localidades na região que avaliamos preencheria lacunas da distribuição das plantas hospedeiras e refinaria os padrões de diferenciação genética que encontramos. Por outro lado, ampliar a extensão geográfica deste estudo - por exemplo, avaliar as interações ao longo de toda a Cadeia do Espinhaço - e contrastar informações genéticas obtidas de diferentes marcadores moleculares permitirá inferir eventos relacionados à radiação de Tomoplagia e datar sua ocorrência, aprofundando o conhecimento da importância relativa da dispersão, adaptação e deriva na diversificação de Tomoplagia e de insetos herbívoros no geral.

113

Referências bibliográficas

ABRAHAMSON, W. G., M. D. EUBANKS, C. P. BLAIR, and A. V. WHIPPLE. 2001. Gall flies, inquilines, and goldenrods: a model for host-race formation and sympatric speciation. Am. Zool. 41: 928–938.

ABRAHAMSON, W. G., and A. E. WEIS. 1997. Evolutionary Ecology Across Three Trophic Levels: Goldenrods, Gallmakers, and Natural Enemies. Princeton University Press, Princeton, NJ. ABREU, A. G., and V. N. SOLFERINI. 2008. Genetic population structure and hybridization in two sibling species, Tomoplagia reticulata and Tomoplagia pallens (Diptera: Tephritidae). Genet. Mol. Res. 7: 1298–1311. ACZÉL, M. L. 1955. Fruit flies of the genus Tomoplagia Coquillet (Diptera: Tephritidae). Proc. U. S. Natl. Mus. 104: 321–411. AGOSTA, S. J., N. JANZ, and D. R. BROOKS. 2010. How specialists can be generalists: resolving the “parasite paradox” and implications for emerging infectious disease. Zool. Curitiba 27: 151–162. AGRAWAL, A. A. 2000. Host-range evolution: adaptation and trade-offs in fitness of mites on alternative hosts. Ecology 81: 500–508.

AGRAWAL, A. A. 2001. Phenotypic plasticity in the interactions and evolution of species. Science 294: 321–326. ALJANABI, S. M., and I. MARTINEZ. 1997. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Res. 25: 4692–4693.

ALLENDORF, F. W. 2017. Genetics and the conservation of natural populations: allozymes to genomes. Mol. Ecol. 26: 420–430.

ALTHOFF, D. M. 2008. A test of host-associated differentiation across the ‘parasite continuum’ in the tri-trophic interaction among yuccas, bogus yucca moths, and parasitoids. Mol. Ecol. 17: 3917–3927. ANTWI, J. B., G. A. SWORD, and R. F. MEDINA. 2015. Host-associated differentiation in a highly polyphagous, sexually reproducing insect herbivore. Ecol. Evol. 5: 2533–2543.

AUGUSTINOS, A. A., E. E. STRATIKOPOULOS, E. DROSOPOULOU, E. G. KAKANI, P. MAVRAGANI- TSIPIDOU, A. ZACHAROPOULOU, and K. D. MATHIOPOULOS. 2008. Isolation and characterization of microsatellite markers from the olive fly, Bactrocera oleae, and their cross-species amplification in the Tephritidae family. BMC Genomics 9: 618.

BARBARÁ, T., C. PALMA-SILVA, G. M. PAGGI, F. BERED, M. F. FAY, and C. LEXER. 2007. Cross- species transfer of nuclear microsatellite markers: potential and limitations. Mol. Ecol. 16: 3759–3767.

BARBOUR, M.G., J. H. BURK, and W. D. PITTS. 1980. Terrestrial plant ecology. Benjamin/Cummings, MenloPark, California.

114

BARMAN, A. K., M. N. PARAJULEE, C. G. SANSONE, C. P. C. SUH, and R. F. MEDINA. 2012. Geographic pattern of host-associated differentiation in the cotton fleahopper, Pseudatomoscelis seriatus: Genetic population structure of Pseudatomoscelis seriatus. Entomol. Exp. Appl. 143: 31–41. BERLOCHER, S. H., and J. L. FEDER. 2002. Sympatric speciation in phytophagous insects: moving beyond controversy? Annu. Rev. Entomol. 47: 773–815. BERNAYS, E. A. 1998. Evolution of feeding behavior in insect herbivores. Bioscience 35–44. BERNAYS, E. A. 1999. Plasticity and the problem of choice in food selection. Ann. Entomol. Soc. Am. 92: 944–951. BERNAYS, E., and M. GRAHAM. 1988. On the evolution of host specificity in phytophagous arthropods. Ecology 69: 886–892. BERNAYS, E. A., and O. MINKENBERG. 1997. Insect herbivores: different reasons for being a generalist. Ecology 78: 1157–1169.

BONIZZONI, M., A. R. MALACRIDA, C. R. GUGLIELMINO, L. M. GOMULSKI, G. GASPERI, and L. ZHENG. 2000. Microsatellite polymorphism in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Insect Mol. Biol. 9: 251–261.

BOOTH, W., O. BALVÍN, E. L. VARGO, J. VILÍMOVÁ, and C. SCHAL. 2015. Host association drives genetic divergence in the bed bug, Cimex lectularius. Mol. Ecol. 24: 980–992. BORÉM, A. and E. CAIXETA 2009. Marcadores moleculares. 2a. Edição. Editora UFV, Viçosa.

BUSH, G. L. 1969. Sympatric host race formation and speciation in frugivorous flies of the genus Rhagoletis (Diptera, Tephritidae). Evolution 23: 237–251.

BUSH, G. L. 1975. Modes of animal speciation. Annu. Rev. Ecol. Syst. 6: 339–364.

CAMPOS, L., M. FREIRE MORO, V. A. FUNK, and N. ROQUE. 2019. Biogeographical Review of Asteraceae in the Espinhaço Mountain Range, Brazil. Bot. Rev. Available at: http://link.springer.com/10.1007/s12229-019-09216-9 [Accessed November 21, 2019].

COGNI, R., J. R. TRIGO, and D. J. FUTUYMA. 2011. Varying herbivore population structure correlates with lack of local adaptation in a geographic variable plant-herbivore interaction. Plos One 6: e29220. COLLEVATTI, R. G., S. G. RABELO, and R. F. VIEIRA. 2009. Phylogeography and disjunct distribution in Lychnophora ericoides (Asteraceae), an endangered cerrado shrub species. Ann. Bot. 104: 655–664. CRAFT, K. J., S. U. PAULS, K. DARROW et al. 2010. Population genetics of ecological communities with DNA barcodes: An example from New Guinea Lepidoptera. Proc. Natl. Acad. Sci. 107: 5041–5046.

115

CRAIG, T. P., J. D. HORNER, and J. K. ITAMI. 1997. Hybridization studies on the host races of Eurosta solidaginis: implications for sympatric speciation. Evolution 51: 1552–1560. CRAIG, T. P., J. K. ITAMI, I. W. G. ABRAHAMSON, and J. D. HORNER. 1993. Behavioral evidence for host-race formation in Eurosta solidaginis. 47: 1696–1710. CRAVA, C. M., C. BRÜTTING, and I. T. BALDWIN. 2016. Transcriptome profiling reveals differential gene expression of detoxification enzymes in a hemimetabolous tobacco pest after feeding on jasmonate-silenced Nicotiana attenuata plants. BMC Genomics 17. Available at: http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-016-3348-0 [Accessed December 1, 2019].

CREER, S., K. DEINER, S. FREY, D. PORAZINSKA, P. TABERLET, W. K. THOMAS, C. POTTER, and H. M. BIK. 2016. The ecologist’s field guide to sequence-based identification of biodiversity R. Methods Ecol. Evol. 7: 1008–1018.

CRESTE, S., A. T. NETO, and A. FIGUEIRA. 2001. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Mol. Biol. Report. 19: 299–306.

DALLA, S., and S. DOBLER. 2016. Insect adaptation to toxic host plants: gene duplications circumvent functional trade-offs. Evolution 70: 2767–2777.

DEVICTOR, V., J. CLAVEL, R. JULLIARD, S. LAVERGNE, D. MOUILLOT, W. THUILLER, P. VENAIL, S. VILLÉGER, and N. MOUQUET. 2010. Defining and measuring ecological specialization. J. Appl. Ecol. 47: 15–25.

DICKEY, A. M., and R. F. MEDINA. 2010. Testing host-associated differentiation in a quasi- endophage and a parthenogen on native trees. J. Evol. Biol. 23: 945–956. DOBZHANSKY, T. 1973. Active dispersal and passive transport in Drosophila. Evolution 27: 565– 575. DOWNEY, M. H., AND C. C. NICE. 2013. A role for both ecology and geography as mechanisms of genetic differentiation in specialized butterflies. Evol. Ecol. 27: 565–578. DRÈS, M., and J. MALLET. 2002. Host races in plant-feeding insects and their importance in sympatric speciation. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 357: 471–492.

116

EHRLICH, P. R., and P. H. RAVEN. 1964. Butterflies and plants: a study in coevolution. Evolution 18: 586.

FEDER, J. L., and A. A. FORBES. 2007. Habitat avoidance and speciation for phytophagous insect specialists. Funct. Ecol. 21: 585–597. FEDER, J. L., and A. A. FORBES. 2010. Sequential speciation and the diversity of parasitic insects. Ecol. Entomol. 35: 67–76.

FEDER, J. L., S. P. EGAN, and P. NOSIL. 2012. The genomics of speciation-with-gene-flow. Trends Genet. 28: 342–350. FEDER, J. L., T. A. HUNT, and L. BUSH. 1993. The effects of climate, host plant phenology and host fidelity on the genetics of apple and hawthorn infesting races of Rhagoletis pomonella. Entomol. Exp. Appl. 69: 117–135.

FEDER, J. L., S. H. BERLOCHER, J. B. ROETHELE et al. 2003. Allopatric genetic origins for sympatric host-plant shifts and race formation in Rhagoletis. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 10314–10319. FELSENSTEIN, J. 1976. The theoretical population genetics of variable selection and migration. Annu. Rev. Genet. 10: 253–280.

FERRARI, J., H. C. J. GODFRAY, A. S. FAULCONBRIDGE, K. PRIOR, and S. VIA 2006. Population differentiation and genetic variation in host choice among pea aphids from eight host plant genera. Evolution 60: 1574–1584. FILCHAK, K. E., J. B. ROETHELE, and J. L. FEDER. 2000. Natural selection and sympatric divergence in the apple maggot Rhagoletis pomonella. Nature 407: 739–742.

FONSECA, C. R. 2009. The silent mass extinction of insect herbivores in biodiversity hotspots. Conserv. Biol. 23: 1507–1515.

FOX, L., and P. MORROW. 1981. Specialization - species property or local phenomenon. Science 211: 887–893.

FUNK, D. J. 1998. Isolating a role for natural selection in speciation: host adaptation and sexual isolation in Neochlamisus bebbianae leaf beetles. Evolution 52:1744-1759.

117

FUNK, D. J. 2010. Does strong selection promote host specialisation and ecological speciation in insect herbivores? Evidence from Neochlamisus leaf beetles. Ecol. Entomol. 35: 41–53. FUNK, D. J., K. E. FILCHAK, and J. L. FEDER. 2002. Herbivorous insects: model systems for the comparative study of speciation ecology. Genetica 116: 251–267.

FUNK, V. A., T. S. SUSANNA, T. F. STUESSY, and R. J. BAYER. 2009. Systematics, Evolution, and Biogeography of Compositae. International Association For Plant Taxonomy, Vienna, Austria. GALLON, M. E., M. MONGE, R. CASOTI, F. B. COSTA, J. SEMIR, AND L. GOBBO-NETO. 2018. Metabolomic analysis applied to chemosystematics and evolution of megadiverse Brazilian Vernonieae (Asteraceae). Phytochemistry 150: 93–105. GARCÍA-ROBLEDO, C., and C. C. HORVITZ. 2012. Jack of all trades masters novel host plants: positive genetic correlations in specialist and generalist insect herbivores expanding their diets to novel hosts: Quantitative genetics of diet expansion. J. Evol. Biol. 25: 38–53. GASTON, K. J., D. REAVEY, and G. R. VALLADARES. 1992. Intimacy and fidelity: internal and external feeding by the British microlepidoptera. Ecol. Entomol. 17: 86–88.

GLOSS, A. D., A. C. NELSON-DITTRICH, B. GOLDAN-HUERTAS, and N. K. WHITEMAN. 2013. Maintenance of genetic diversity through plant–herbivore interactions. Curr. Opin. Plant Biol. 16: 443–450. GOEDEN, R., and D. HEADRICK. 1991. Notes on the biology, hosts, and immature stages of Tomoplagia cressoni Aczel in southern California (Diptera: Tephritidae). Proc. Entomol. Soc. Wash. USA.

GOUDET, J. 2005. hierfstat, a package for r to compute and test hierarchical F-statistics. Mol. Ecol. Notes 5: 184–186.

GOYER, R. A., T. D. PAINE, D. P. PASHLEY, G. J. LENHARD, J. R. MEEKER, and C. C. HANLON. 1995. Geographic and host-associated differentiation in the fruittree leafroller (Lepidoptera: Tortricidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 88: 391–396. GUPTA, P. K., S. RUSTGI, S. SHARMA, R. SINGH, N. KUMAR, and H. S. BALYAN. 2003. Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat. Mol. Genet. Genomics 270: 315–323.

HALE, M. L., T. M. BURG, and T. E. STEEVES. 2012. Sampling for microsatellite-based population genetic studies: 25 to 30 individuals per population is enough to accurately estimate allele frequencies A. F. Y. Poon (Ed.). Plos One 7: e45170.

HARDY, N. B., D. A. PETERSON, and B. B. NORMARK. 2016. Nonadaptive radiation: Pervasive diet specialization by drift in scale insects? Evolution 70: 2421–2428.

118

HAWTHORNE, D. J., and S. VIA. 2001. Genetic linkage of ecological specialization and reproductive isolation in pea aphids. Nature 412: 904–907. HEARD, S. B. 2012. Use of host-plant trait space by phytophagous insects during host-associated differentiation: the gape-and-pinch model. Int. J. Ecol. 2012: 1–15.

JAENIKE, J. 1990. Host specialization in phytophagous insects. Annu. Rev. Ecol. Syst. 243–273. JANZ, N., S. NYLIN, and N. WAHLBERG. 2006. Diversity begets diversity: host expansions and the diversification of plant-feeding insects. BMC Evol. Biol. 6: 4. JESUS, F. F., A. G. ABREU, J. SEMIR, and V. N. SOLFERINI. 2009. Low genetic diversity but local genetic differentiation in endemic Minasia (Asteraceae) species from Brazil. Plant Syst. Evol. 277: 187–196. JOHNSTON, L., M. W. MILLER, and I. B. BAUMS. 2012. Assessment of host-associated genetic differentiation among phenotypically divergent populations of a coral-eating gastropod across the Caribbean. Plos One 7: e47630. JOMBART, T., and I. AHMED. 2011. adegenet 1.3-1: new tools for the analysis of genome-wide SNP data. Bioinformatics 27: 3070–3071. JOMBART, T., S. DEVILLARD, and F. BALLOUX. 2010. Discriminant analysis of principal components: a new method for the analysis of genetically structured populations. BMC Genet. 11: 94. JORDANO, P., J. BASCOMPT, and J. OLESEN. 2003. Invariant properties in coevolutionary networks of plant-animal interactions. Ecol. Lett. 6: 69–81. JORGE, L. R., P. I. PRADO, M. ALMEIDA-NETO, and T. M. LEWINSOHN. 2014. An integrated framework to improve the concept of resource specialisation. Ecol. Lett. 17: 1341–1350.

JUÁREZ, M. L., G. SCHÖFL, M. T. VERA et al. 2014. Population structure of Spodoptera frugiperda maize and rice host forms in South America: are they host strains? Entomol. Exp. Appl. 152: 182–199. KALIA, R. K., M. K. RAI, S. KALIA, R. SINGH, and A. K. DHAWAN. 2011. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants. Euphytica 177: 309–334.

KAMVAR, Z. N., J. F. TABIMA, and N. J. GRÜMLAND. 2014. Poppr: an R package for genetic analysis of populations with clonal, partially clonal, and/or sexual reproduction. PeerJ 2: e281. KEARSE, M., R. MOIR, A. WILSON, S. STONES-HAVAS, M. CHEUNG, S. STURROCK, S. BUXTON, A. COOPER, S. MARKOWITZ, C. DURAN, T. THIERER, B. ASHTON, P. MEINTJES, and A. DRUMMOND. 2012. Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics 28: 1647– 1649.

119

KEELEY, S. C., Z. H. FORSMAN, and R. CHAN. 2007. A phylogeny of the “evil tribe” (Vernonieae: Compositae) reveals Old/New World long distance dispersal: Support from separate and combined congruent datasets (trnL-F, ndhF, ITS). Mol. Phylogenet. Evol. 44: 89–103. KEENAN, K., P. MCGINITTY, T. F. CROSS, W. W. CROZIER, and P. A. PRODÖHL. 2013. diveRsity: An R package for the estimation and exploration of population genetics parameters and their associated errors. Methods Ecol. Evol. 4: 782–788. KOLBEK, J., and R. J. V. ALVES. 2008. Impacts of cattle, fire and wind in rocky savannas, Southeastern Brazil. Acta Univ. Carol. Environ. 22: 111–130. LEAL, C. R. O., J. OLIVEIRA SILVA, L. SOUSA-SOUTO, and F. DE SIQUEIRA NEVES. 2016. Vegetation structure determines insect herbivore diversity in seasonally dry tropical forests. J. Insect Conserv. 20: 979–988.

LEPPÄNEN, S. A., T. MALM, K. VÄRRI, and T. NYMAN. 2014. A comparative analysis of genetic differentiation across six shared willow host species in leaf- and bud-galling sawflies. Plos One 9: e116286. LEWINSOHN, T. M. 1988. Composição e tamanho de faunas associadas a capítulos de compostas. Tese de Doutoramento. Universidade Estadual de Campinas.

LEWINSOHN, T. M., V. NOVOTNY, and Y. BASSET. 2005. Insects on plants: diversity of herbivore assemblages revisited. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 36: 597–620.

LEWINSOHN, T. M., and T. ROSLIN. 2008. Four ways towards tropical herbivore megadiversity. Ecol. Lett. 11: 398–416.

LOEUILLE, B., J. SEMIR, and J. R. PIRANI. 2019. A synopsis of Lychnophorinae (Asteraceae: Vernonieae). Phytotaxa 398: 1–139. Available at: . Date accessed: 21 Nov. 2019

LOZIER, J. D., G. K. RODERICK, and N. J. MILLS. 2007. Genetic evidence from mitochondrial, nuclear, and endosymbiont markers for the evolution of host plant associated species in the aphid genus Hyalopterus (Hemiptera: Aphididae). Evolution 61: 1353–1367. LOZIER, J. D., G. K. RODERICK, and N. J. MILLS. 2009. Molecular markers reveal strong geographic, but not host associated, genetic differentiation in Aphidius transcaspicus, a parasitoid of the aphid genus Hyalopterus. Bull. Entomol. Res. 99: 83–96. LUSA, M. G., M. E. P. MARTUCCI, B. F. P. LOEUILLEet al. 2016. Characterization and evolution of secondary metabolites in Brazilian Vernonieae (Asteraceae) assessed by LC-MS fingerprinting. Bot. J. Linn. Soc. 182: 594–611. MANTEL, N. 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Res. 27: 209–220.

120

MAYR, E. 1947. Ecological factors in speciation. Evolution 1: 263–288. MEDINA, R. F., S. J. ARMSTRONG, and K. HARRISON. 2017. Genetic population structure of sugarcane aphid, Melanaphis sacchari, in sorghum, sugarcane, and Johnsongrass in the continental USA. Entomol. Exp. Appl. 162: 358–365. MEDINA, R. F., P. NACHAPPA, and C. TAMBORINDEGUY. 2011. Differences in bacterial diversity of host-associated populations of Phylloxera notabilis Pergande (Hemiptera: Phylloxeridae) in pecan and water hickory: HAD and insect-associated bacteria. J. Evol. Biol. 24: 761–771.

MEEÛS, T. 2018. Revisiting FIS, FST, Wahlund effects, and null alleles. J. hered. 109: 446-456.

MITTER, C., B. FARRELL, and B. WIEGMANN. 1988. The phylogenetic study of adaptive zones: Has phytophagy promoted insect diversification? American Naturalist 132:107-128.

MOONEY, K. A., and A. A. AGRAWAL. 2008. Plant genotype shapes ant‐aphid interactions: implications for community structure and indirect plant defense. Am. Nat. 171: E195– E205. MOPPER, S. 1996. Adaptive genetic structure in phytophagous insect populations. Trends in Ecology & Evolution 11:235-238.

MORELLATO, L. P. C., and F. A. O. SILVEIRA. 2018. Plant life in campo rupestre: New lessons from an ancient biodiversity hotspot. Flora 238: 1–10.

NASON, J. D., S. B. HEARD, and F. R. WILLIAMS. 2002. Host-associated genetic differentiation in the goldenrod elliptical-gall moth, Gnorimoschema gallaesolidaginis (Lepidoptera: Gelechiidae). Evolution 56: 1475–1488. NEI, M. 1972. Genetic distance between populations. Am. Nat. 106: 283–292. NORRBOM, A. L., L. E. CARROLL, F. C. THOMPSON, I. WHITE, and A. FREIDBERG. 1999. Systematic database of names. Fruit Fly Expert Identification System and Systematic Information Database. Myia 9: 65-251.

NOSIL, P., B. J. CRESPI, and C. P. SANDOVAL. 2002. Host-plant adaptation drives the parallel evolution of reproductive isolation. Nature 417: 440–443. NOSIL, P., L. J. HARMON, and O. SEEHAUSEN. 2009. Ecological explanations for (incomplete) speciation. Trends in Ecology & Evolution 24:145-156.

NOVOTNY, V., P. DROZD, S. E. MILLER, M. KULFAN, M. JANDA, Y. BASSET, and G. D. WEIBLEN. 2006. Why are there so many species of herbivorous insects in tropical rainforests? Science 313: 1115–1118.

NOVOTNY, V., S. E. MILLER, L. BAJE, S. BALAGAWI, Y. BASSET, L. CIZEK, K. J. CRAFT, F. DEM, R. A. I. DREW, J. HULCR, J. LEPS, O. T. LEWIS, R. POKON, A. J. A. STEWART, G. ALLAN

121

SAMUELSON, and G. D. WEIBLEN. 2010. Guild-specific patterns of species richness and host specialization in plant-herbivore food webs from a tropical forest: Plant-herbivore food webs in tropical forest. J. Anim. Ecol. 79: 1193–1203.

OGASAWARA, H. A., and N. ROQUE. 2015. Flora da Bahia: Asteraceae–Subtribo Vernoniinae. Sitientibus Sér. Ciênc. Biológicas 15.

OGURO, M., and S. SAKAI. 2015. Relation between flower head traits and florivory in Asteraceae: A phylogenetically controlled approach. Am. J. Bot. 102: 407–416. OLESEN, J. M., J. BASCOMPTE, Y. L. DUPONT et al. 2011. Missing and forbidden links in mutualistic networks. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 278: 725–732. OROÑO, L., L. PAULIN, A. C. ALBERTI, M. HILAL, S. OVRUSKI, J. C. VILARDI, J. RULL, and M. ALUJA. 2013. Effect of host plant chemistry on genetic differentiation and reduction of gene flow among Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) populations exploiting sympatric, synchronic hosts. Environ. Entomol. 42: 790–798.

PAQUETTE, S. R. 2012. PopGenKit: useful functions for (batch) file conversion and data resampling in microsatellite datasets. R Package Version 1.

PARADIS, E. 2010. pegas: an R package for population genetics with an integrated-modular approach. Bioinformatics 26: 419–420.

PASEK, J. E. 1988. Influence of wind and windbreaks on local dispersal of insects. Agric. Ecosyst. Environ. 22: 539–554. PECCOUD, J., A. OLLIVIER, M. PLANTEGENEST, and J.C. SIMON. 2009. A continuum of genetic divergence from sympatric host races to species in the pea aphid complex. Proc. Natl. Acad. Sci. 106: 7495–7500. PERES, P. A., M. AZEVEDO-SILVA, S. C. S. ANDRADE, and F. P. P. LEITE. 2019. Is there host- associated differentiation in marine herbivorous amphipods? Biol. J. Linn. Soc. XX:1-14. PÉREZ-ALQUICIRA, J., E. VAN-DER-KNAAP, K. MERCER et al. 2019. Genetic structure of Liriomyza trifolii (Diptera: Agromyzidae) associated with host plants from Southeastern Mexico. Environ. Entomol. 48: 253–262. PIRES, M. M., and P. R. GUIMARÃES. 2013. Interaction intimacy organizes networks of antagonistic interactions in different ways. J. R. Soc. Interface 10: 20120649. POULIN, R. 1997. Species richness of parasite assemblages: evolution and patterns. Annu. Rev. Ecol. Syst. 28: 341–358.

PRADO, P. I. 1999. Determinantes de ampla escala das associações entre insetos e plantas: tefritídeos (Diptera) endófagos de capítulos de Asteraceae. Universidade Estadual de Campinas.

122

PRADO, P. I., AND T. M. LEWINSOHN. 2004. Compartments in insect–plant associations and their consequences for community structure. J. Anim. Ecol. 73: 1168–1178.

PRADO, P. I., A. L. NORRBOM, and T. M. LEWINSOHN. 2004. New species of Tomoplagia Coquillett (Diptera: Tephritidae) from capitula of Asteraceae in Brazil. Neotrop. Entomol. 33: 189–211.

PRICE, P.W. 1980. Evolutionary biology of parasites. Princeton University Press, Princeton.

R CORE TEAM. 2014. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.

RASMANN, S., and A. A. AGRAWAL. 2011. Evolution of specialization: a phylogenetic study of host range in the red milkweed beetle (Tetraopes tetraophthalmus). Am. Nat. 177: 728– 737.

ROSLIN, T., and S. MAJANEVA. 2016. The use of DNA barcodes in food web construction— terrestrial and aquatic ecologists unite! Genome 59: 603–628.

ROQUE, N., E. C. DE OLIVEIRA, L. MOURA, A. S. QUARESMA, H. A. OGASAWARA, M. ALVES, F. A. SANTANA, G. HEIDEN, T. A. CAIRES, N. G. BASTOS, G. M. LIMA, and H. P. BAUTISTA. 2016. Asteraceae no Município de Mucugê, Chapada Diamantina, Bahia, Brasil. Rodriguésia 67: 125–202.

SALDAMANDO-BENJUMEA, C. I., K. ESTRADA-PIEDRAHÍTA, M. I. VELÁSQUEZ-VÉLEZ, and R. I. BAILEY. 2014. Assortative mating and lack of temporality between corn and rice strains of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) from Central Colombia. J. Insect Behav. 27: 555–566. SCHLÖTTERER, C. 2004. The evolution of molecular markers — just a matter of fashion? Nat. Rev. Genet. 5: 63–69.

SCHOONHOVEN, L. M., B. VAN LOON, J. J. VAN LOON, and M. DICKE. 2005. Insect-plant biology. Oxford University Press, Oxford.

123

SCHUELKE, M. 2000. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nat. Biotechnol. 18: 233–234. SCRIBER, J. M. 2002. Evolution of insect-plant relationships: chemical constraints, coadaptation, and concordance of insect/plant traits. Entomol. Exp. Appl. 104: 217–235.

SEEHAUSEN, O. et al. 2014. Genomics and the origin of species. Nat. Rev. Genet. 15: 176–192.

SHEARMAN, D. C. A., A. S. GILCHRIST, D. CRISAFULLI, G. GRAHAM, C. LANGE, and M. FROMMER. 2006. Microsatellite markers for the pest fruit fly, Bactrocera papayae (Diptera: Tephritidae) and other Bactrocera species. Mol. Ecol. Notes 6: 4–7.

SILVEIRA, F. A. O. et al. 2015. Ecology and evolution of plant diversity in the endangered campo rupestre: a neglected conservation priority. Plant Soil. Available at: http://link.springer.com/10.1007/s11104-015-2637-8 [Accessed September 8, 2015].

SMITH, D. C. 1988. Heritable divergence of Rhagoletis pomonella host races by seasonal asynchrony. Nature 336: 66–67. STECK G. J. 2008. Fruit Flies (Diptera: Tephritidae). In: Capinera J.L. (ed) Encyclopedia of Entomology. Springer, Dordrecht.

STRONG, D. R., J. H. LAWTON, and S. R. SOUTHWOOD. 1984. Insects on plants: community patterns and mechanisms. Harvard University Press, Cambridge, MA.

THOMPSON, J. N. 2005. The geographic mosaic of coevolution. University of Chicago Press, Chicago.

TÓTH, G., Z. GÁSPÁRI, and J. JURKA. 2000. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Res. 10: 967–981.

UENO, H., N. FUJIYAMA, I. YAO, Y. SATO, and H. KATAKURA. 2003. Genetic architecture for normal and novel host-plant use in two local populations of the herbivorous ladybird beetle, Epilachna pustulosa. J. Evol. Biol. 16: 883–895.

124

UNTERGASSER, A., I. CUTCUTACHE, T. KORESSAAR, J. YE, B. C. FAIRCLOTH, M. REMM, and S. G. ROZEN. 2012. Primer3—new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40: e115– e115.

VAN-OOSTERHOUT, C., W. F. HUTCHINSON, D. P. M. WILLS, and P. SHIPLEY. 2004. MICRO- CHECKER: Software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Mol. Ecol. Notes 4: 535–538. VIA, S. 1999. Reproductive isolation between sympatric races of pea aphids. I. Gene flow restriction and habitat choice. Evolution 53: 1446–1457.

VIDAL, M. C., T. W. QUINN, J. O. STIREMAN, R. M. TINGHITELLA, and S. M. MURPHY. 2019. Geography is more important than host plant use for the population genetic structure of a generalist insect herbivore. Mol. Ecol. Available at: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/mec.15218 [Accessed October 3, 2019]. WANG, Y.Z., B.Y. LI, A. A. HOFFMANN, L.J. CAO, Y.J. GONG, W. SONG, J.Y. ZHU, and S.J. WEI. 2017. Patterns of genetic variation among geographic and host-plant associated populations of the peach fruit moth Carposina sasakii (Lepidoptera: Carposinidae). BMC Evol. Biol. 17. WEIBLEN, G. D., C. O. WEBB, V. NOVOTNY, Y. BASSET, and S. E. MILLER. 2006. Phylogenetic dispersion of host use in a tropical insect herbivore community. Ecology 87: S62–S75.

WEIR, B. S., and C. C. COCKERHAM. 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38: 1358–1370. WIRTA, H. K., P. D. N. HEBERT, R. KAARTINEN, S. W. PROSSER, G. VÁRKONYI, and T. ROSLIN. 2014. Complementary molecular information changes our perception of food web structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 111: 1885–1890.

YOTOKO, K.S.C., P.I. PRADO, C. A. M. RUSSO, and V. N. SOLFERINI. 2005. Testing the trend towards specialization in herbivore-host plant associations using a molecular phylogeny of Tomoplagia (Diptera: Tephritidae). Mol. Phylogenet. Evol. 35: 701–711.

ZEPEDA-PAULO, F., B. LAVANDEROI, F. MAHÉO, E. DION, Y. OUTREMAN, J. C. SIMON, and C. C. FIGUEROA. 2015. Does sex-biased dispersal account for the lack of geographic and host- associated differentiation in introduced populations of an aphid parasitoid? Ecol. Evol. 5: 2149–2161.

125

Apêndices

Apêndice 1. Localidades de amostragem de plantas hospedeiras de Tomoplagia na Cadeia do

Espinhaço no Estado de Minas Gerais; as áreas em cinza têm altitude acima de 1000 m.

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Apêndice 2. Associação de Tomoplagia com plantas hospedeiras da tribo Vernonieae (Asteraceae) em cinco localidades na Cadeia do Espinhaço meridional. O número de indivíduos adultos criados de cada hospedeira entre 2016 e 2017 é mostrado por localidade: Conselheiro Mata (CM), Parques Estaduais do Biribiri (BB), do Rio Preto (RP) e da Serra do Cabral (SC) e Serra da Guiné (SG). Em negrito, as espécies investigadas no presente estudo.

Herbívoros Plantas hospedeiras Localidades Total Espécies Subtribo CM BB RP SC SG T. aczeli Paralychnophora bicolor (DC.) MacLeish Lychnophorinae 43 43 T. bicolor Eremanthus elaeagnus (Mart. ex DC.) Sch.Bip. Lychnophorinae 21 36 1 58 Lessingianthus vepretorum (Mart. ex DC.) H.Rob. Lepidaploinae 3 3 Lychnophora markgravii G.M.Barroso Lychnophorinae 53 53 Lychnophora tomentosa (Mart. ex DC.) Sch.Bip. 16 16 Lychnophoriopsis candelabrum (Sch.Bip.) H.Rob. 9 9 Minasia alpestris (Gardner) H.Rob. 94 94 Minasia pereirae H.Rob. 8 8 Minasia scapigera H.Rob. 95 208 303 Proteopsis argentea Mart. & Zucc. ex Sch.Bip. 2 2 T. dimorphica Lessingianthus coriaceus (Less.) H.Rob. Lepidaploinae 1 1 Lessingianthus hoveaefolius (Gardner) H.Rob. 6 6 Lessingianthus laevigatus (Mart. ex DC.) H.Rob. 4 4 T. grandis Lessingianthus buddleiifolius (Mart. ex DC.) H.Rob. Lepidaploinae 8 18 15 41 T. incompleta Echinocoryne schwenkiifolia (Mart. ex DC.) H. Rob. Lepidaploinae 24 15 14 43 8 104 Eremanthus incanus (Less.) Less. Lychnophorinae 1 1 Lepidaploa rufogrisea (A. St.-Hil.) H.Rob. Lepidaploinae 10 18 87 3 118 Lepidaploa spixiana (Mart. ex DC.) H.Rob. 14 7 21 Lessingianthus linearis (Spreng.) H.Rob. 1 1 Vernonanthura laxa (Gardner) H.Rob. Vernoniinae 2 2 T. reimoseri Vernonanthura laxa (Gardner) H.Rob. Vernoniinae 10 10 T. rupestris Eremanthus elaeagnus (Mart. ex DC.) Sch.Bip. Lychnophorinae 6 7 2 1 16 Eremanthus incanus (Less.) Less. 4 4 Lychnophora diamantiniana Coile & S.B.Jones 4 4 Lychnophora ramosissima Gardner 1 1 Lychnophora salicifolia Mart. 9 9 Lychnophora villosissima Mart. 20 20 Lychnophora pseudovillosissima Semir & Leitão 6 6 T. tripunctata Lessingianthus carduoides (Baker) H.Rob. Lepidaploinae 4 4 8 T. variabilis Lessingianthus hoveaefolius (Gardner) H.Rob. Lepidaploinae 16 16

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Apêndice 3. Estimativas de diversidade alélica por loco de populações de três espécies de Tomoplagia (Tephritidae) criadas de plantas hospedeiras (Asteraceae: Vernonieae) coletadas em campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. Diversidade alélica: A = número de alelos, RA = riqueza média de alelos por loco, AE = alelos exclusivos, AR = alelos raros (frequência ≤ 5%), FIS = coeficiente de endogamia de Wright.

A) Tomoplagia grandis

Locos Biribiri Rio preto Serra do cabral A AE AR FIS A AE AR FIS A AE AR FIS TGR1 4 0 3 0,30 4 0 3 -0,09 4 0 3 0,35 TGR2 4 0 1 0,58 3 0 0 0,93 5 0 1 0,84 TGR3 6 2 4 0,29 8 3 6 0,30 8 4 5 0,77 TGR4 6 2 3 0,57 6 2 3 0,26 4 1 2 0,58 TGR5 10 1 4 -0,07 6 0 2 0,61 13 1 5 -0,02 TGR6 6 1 2 0,21 11 2 5 0,07 10 2 5 0,53 TGR7 6 1 0 0,68 9 1 2 0,76 7 0 1 0,74 TGR8 6 2 2 0,71 6 1 2 0,34 9 4 4 0,55 TGR9 4 0 1 0,65 7 0 3 0,63 10 2 6 0,20 TGR10 4 0 1 0,84 6 2 3 0,38 3 0 0 0,88 TGR11 5 3 2 0,64 9 7 6 0,63 5 2 2 0,75 TGR12 3 0 0 0,40 2 0 0 -0,28 5 2 2 -0,24

128

B) Tomoplagia bicolor

Locos Local Plantas hospedeiras Biribiri Lychnophora tomentosa Minasia scapigera A AE AR FIS A AE AR FIS TBIC1 8 0 1 0,47 11 1 4 0,50 TBIC2 3 0 0 -0,71 4 0 1 -0,59 TBIC3 5 1 2 0,79 6 1 2 0,62 TBIC4 7 0 2 0,81 7 3 4 0,56 TBIC5 7 0 1 0,92 6 0 0 0,74 TBIC6 8 0 1 0,77 11 0 2 0,80 TBIC7 4 0 0 0,59 7 1 4 0,57 TBIC8 6 0 3 0,43 8 0 1 0,56 TBIC9 7 0 3 0,53 10 3 4 0,60 TBIC10 7 0 1 0,51 12 2 5 0,53 TBIC11 4 0 0 0,50 9 1 2 0,50 TBIC12 7 0 1 0,70 12 1 4 0,58

Conselheiro Eremanthus elaeagnus Minasia alpestris Minasia pereirae Mata A AE AR FIS A AE AR FIS A AE AR FIS TBIC1 8 0 0 0,63 8 0 1 0,61 4 0 0 0,43 TBIC2 6 2 3 -0,62 3 0 0 -0,80 3 0 0 -0,78 TBIC3 4 1 1 0,52 5 0 1 0,50 4 0 0 0,41 TBIC4 4 0 3 0,69 5 0 0 0,94 2 0 1 0,86 TBIC5 5 0 0 0,87 9 1 2 0,75 3 0 1 0,78 TBIC6 11 2 4 0,59 11 1 3 0,77 8 0 2 0,72 TBIC7 5 0 1 0,54 6 2 3 0,45 5 0 2 0,66 TBIC8 9 0 4 0,24 9 1 4 0,33 4 0 1 0,59

129

TBIC9 10 1 4 0,32 8 0 3 0,50 3 0 1 0,43 TBIC10 9 0 2 0,76 7 0 2 0,80 3 0 0 0,69 TBIC11 6 0 0 0,56 8 1 1 0,45 4 0 0 0,27 TBIC12 9 0 3 0,74 13 1 5 0,66 4 0 0 0,64

Serra do Cabral Eremanthus elaeagnus Lychnophora candelabrum Lychnophora markgravii Minasia scapigera A AE AR FIS A AE AR FIS A AE AR FIS A AE AR FIS TBIC1 11 0 1 0,49 7 2 3 -0,16 8 0 1 0,42 8 0 2 0,49 TBIC2 6 1 3 -0,61 4 0 1 -0,44 4 0 1 -0,60 4 0 1 -0,58 TBIC3 6 0 3 0,47 2 0 0 0,80 2 0 0 0,90 4 0 1 0,42 TBIC4 8 0 3 0,87 7 1 3 0,76 8 1 3 0,66 8 2 2 0,72 TBIC5 6 0 1 0,88 3 0 0 0,90 6 0 0 0,88 10 2 4 0,48 TBIC6 12 2 3 0,56 7 1 2 0,88 9 0 3 0,80 12 1 3 0,85 TBIC7 6 0 3 0,46 5 0 2 0,72 9 3 5 0,70 5 1 2 0,47 TBIC8 10 0 6 0,48 6 0 4 0,19 12 0 6 0,51 12 2 6 0,38 TBIC9 13 4 6 0,49 6 0 2 0,52 15 2 7 0,50 9 1 4 0,52 TBIC10 13 1 5 0,69 10 1 5 0,08 12 1 6 0,67 9 0 3 0,60 TBIC11 10 3 3 0,32 5 0 1 0,49 7 0 0 0,55 8 0 1 0,31 TBIC12 13 2 6 0,79 5 0 1 0,90 9 1 3 0,71 11 0 4 0,49

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C) Tomoplagia incompleta

Locos Local Plantas hospedeiras Biribiri Echinocoryne schwenkiifolia Lepidaploa rufogrisea A AE AR FIS A AE AR FIS TINC1 8 0 3 0,65 10 2 5 0,68 TINC2 8 0 1 0,59 6 0 2 0,65 TINC3 7 0 0 0,42 9 1 1 0,58 TINC4 8 0 3 0,57 6 1 1 0,77 TINC5 7 0 0 0,34 9 1 3 0,28 TINC6 5 0 1 0,64 7 1 2 0,87 TINC7 10 0 2 0,38 12 1 3 0,45 TINC8 6 0 3 0,44 3 0 0 0,89 TINC9 5 0 0 0,74 6 0 1 0,76 TINC10 5 0 0 0,78 7 1 1 0,76 TINC11 9 1 3 0,44 10 0 4 0,27 TINC12 8 0 2 0,59 14 1 3 0,45

Conselheiro Mata Echinocoryne schwenkiifolia Lepidaploa rufogrisea Lepidaploa spixiana A AE AR FIS A AE AR FIS A AE AR FIS TINC1 9 0 3 0,50 6 0 1 0,46 9 1 4 0,41 TINC2 7 0 3 0,72 9 2 4 0,28 6 1 1 0,68 TINC3 8 1 1 0,43 6 0 0 0,75 7 0 0 0,75 TINC4 6 0 1 0,83 6 0 2 0,73 7 0 3 0,53 TINC5 12 1 3 0,62 6 0 2 0,43 9 1 4 0,55 TINC6 10 3 5 0,90 6 0 1 0,87 7 1 3 0,80 TINC7 14 2 4 0,67 8 0 2 0,45 12 0 4 0,59 TINC8 8 3 3 0,35 5 0 1 0,55 6 0 2 0,39 TINC9 5 0 1 0,74 5 1 1 0,67 4 0 0 0,88

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TINC10 6 0 1 0,86 5 0 1 0,79 3 0 0 0,60 TINC11 10 0 2 0,65 6 0 1 0,70 7 1 2 0,43 TINC12 19 1 7 0,11 10 0 5 0,41 13 2 5 0,18

Serra do Cabral Echinocoryne schwenkiifolia Lepidaploa rufogrisea A AE AR FIS A AE AR FIS TINC1 12 0 4 0,55 14 1 7 0,39 TINC2 12 3 7 0,74 10 1 3 0,82 TINC3 7 1 1 0,74 9 0 0 0,84 TINC4 8 2 4 0,84 14 3 10 0,49 TINC5 11 1 3 0,50 14 1 7 0,54 TINC6 7 1 2 0,95 5 0 1 0,77 TINC7 14 1 4 0,58 16 3 4 0,35 TINC8 7 1 3 0,51 5 0 1 0,41 TINC9 8 1 3 0,69 7 1 3 0,59 TINC10 8 1 2 0,84 8 2 2 0,65 TINC11 10 1 3 0,76 9 0 1 0,74 TINC12 11 0 3 0,50 13 0 4 0,40

Serra da Guiné Echinocoryne schwenkiifolia Lepidaploa spixiana A AE AR FIS A AE AR FIS TINC1 6 0 2 0,09 5 0 2 0,64 TINC2 4 1 1 0,45 4 0 0 0,81 TINC3 5 0 0 0,49 3 0 0 0,50 TINC4 3 0 0 0,90 4 0 1 0,79 TINC5 6 0 2 0,08 5 0 2 0,27 TINC6 3 0 0 0,90 4 0 2 0,80 TINC7 7 0 0 0,29 5 0 1 0,16 TINC8 1 0 0 0,90 3 0 1 0,24

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TINC9 3 0 0 0,90 4 1 1 0,29 TINC10 4 0 1 0,61 5 0 1 0,32 TINC11 5 0 1 0,41 6 0 0 0,51 TINC12 7 0 2 0,29 6 0 2 0,32

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Apêndice 4. Intervalo de confiança (95%, triângulo inferior: 0,025, triângulo superior: 0,975) para estimativas de FST de Weir & Cockerham (1984) apresentadas na Fig. 1 (Capítulo 3) para três espécies de Tomoplagia coletadas nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. A) Tomoplagia grandis

1 2 3 1 Biribiri 0,067 0,084 2 Serra do Cabral 0,024 0,045 3 Rio Preto -0,003 0,001

B) Tomoplagia bicolor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Biribiri - Lychnophora tomentosa 0,055 0,031 0,050 0,199 0,021 0,025 0,032 0,033 2 Biribiri - Minasia scapigera -0,010 0,021 0,044 0,251 0,018 0,058 0,016 0,039 3 Conselheiro Mata - Eremanthus elaeagnus 0,013 0,003 0,051 0,245 0,033 0,063 0,026 0,048 4 Conselheiro Mata - Minasia alpestris 0,011 0,009 0,007 0,121 0,007 0,042 0,022 0,009 5 Conselheiro Mata - Minasia pereirae 0,054 0,027 0,036 0,028 0,151 0,140 0,154 0,143 6 Serra do Cabral - Eremanthus elaeagnus 0,012 0,009 0,000 0,008 0,031 0,047 0,013 0,011 7 Serra do Cabral - Lychnophora candelabrum 0,029 0,016 0,007 0,006 0,010 -0,014 0,006 0,012 8 Serra do Cabral - Lychnophora markgravii 0,004 0,010 0,005 0,004 0,025 0,008 -0,030 0,014 9 Serra do Cabral - Minasia scapigera 0,009 0,007 0,006 0,014 0,032 0,007 -0,017 0,006

134

C) Tomoplagia incompleta

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Biribiri - Echinocoryne schwenkiifolia 0,067 0,020 0,019 0,029 0,040 0,059 0,090 0,145 2 Biribiri - Lepidapola rufogrisea 0,004 0,018 0,006 0,008 0,017 0,037 0,063 0,134 3 Conselheiro Mata - Echinocoryne schwenkiifolia 0,017 -0,008 0,004 0,022 0,017 0,027 0,070 0,121 4 Conselheiro Mata - Lepidapola rufogrisea 0,027 0,013 -0,024 0,011 0,023 0,022 0,051 0,085 5 Conselheiro Mata - Lepidaploa spixiana 0,008 0,011 0,014 -0,025 0,017 0,050 0,051 0,143 6 Serra do Cabral - Echinocoryne schwenkiifolia 0,001 0,000 0,004 0,021 -0,007 0,016 0,043 0,071 7 Serra do Cabral - Lepidapola rufogrisea 0,002 0,003 -0,003 0,009 0,000 0,000 0,063 0,070 8 Serra da Guiné - Echinocoryne schwenkiifolia 0,002 -0,007 0,000 0,021 -0,010 0,004 0,008 0,126 9 Serra da Guiné - Lepidaploa spixiana 0,004 0,001 -0,003 0,023 0,010 0,019 0,003 0,004

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Apêndice 5. Matrizes de distância genética (triângulo inferior) e distância geográfica (triângulo superior) utilizadas no teste de Mantel para avaliar os efeitos de isolamento genético por distância para três espécies de Tomoplagia em diferentes campos rupestres da Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais. A) Tomoplagia grandis

1 2 3 1 Biribiri 67,4 40,63 2 Serra do cabral 0,4 99,81 3 Rio preto 0,4 0,2

B) Tomoplagia bicolor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Biribiri - Lychnophora tomentosa 5,75 18,74 18,74 18,74 67,4 67,4 67,4 67,4 2 Biribiri - Minasia scapigera 0,17 18,74 18,74 18,74 67,4 67,4 67,4 67,4 3 Conselheiro Mata - Eremanthus elaeagnus 0,16 0,12 5,75 5,75 74,28 74,28 74,28 74,28 4 Conselheiro Mata - Minasia alpestris 0,18 0,12 0,16 5,75 74,28 74,28 74,28 74,28 5 Conselheiro Mata - Minasia pereirae 0,30 0,28 0,36 0,30 74,28 74,28 74,28 74,28 6 Serra do Cabral - Eremanthus elaeagnus 0,16 0,11 0,17 0,10 0,39 5,75 5,75 5,75 7 Serra do Cabral - Lychnophora candelabrum 0,25 0,23 0,28 0,49 0,39 0,28 5,75 5,75 8 Serra do Cabral - Lychnophora markgravii 0,18 0,10 0,14 0,13 0,48 0,12 0,17 5,75 9 Serra do Cabral - Minasia scapigera 0,17 0,12 0,17 0,09 0,35 0,11 0,20 0,12

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C) Tomoplagia incompleta

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Biribiri - Echinocoryne schwenkiifolia 5,75 18,74 18,74 18,74 67,40 67,40 10,00 10,00 2 Biribiri - Lepidapola rufogrisea 0,26 18,74 18,74 18,74 67,40 67,40 10,00 10,00 3 Conselheiro Mata - Echinocoryne schwenkiifolia 0,16 0,20 5,75 5,75 74,28 74,28 23,71 23,71 4 Conselheiro Mata - Lepidapola rufogrisea 0,25 0,29 0,26 5,75 74,28 74,28 23,71 23,71 5 Conselheiro Mata - Lepidaploa spixiana 0,28 0,27 0,25 0,36 74,28 74,28 23,71 23,71 6 Serra do Cabral - Echinocoryne schwenkiifolia 0,33 0,33 0,27 0,43 0,35 5,75 62,91 62,91 7 Serra do Cabral - Lepidapola rufogrisea 0,28 0,27 0,26 0,36 0,31 0,25 62,91 62,91 8 Serra da Guiné - Echinocoryne schwenkiifolia 0,28 0,28 0,26 0,34 0,34 0,30 0,28 2,00 9 Serra da Guiné - Lepidaploa spixiana 0,50 0,47 0,50 0,48 0,64 0,47 0,41 0,50

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Anexos

Anexo 1

138

Anexo 2

Declaração

As cópias de artigos de minha autoria ou de minha co-autoria, já publicados ou submetidos para publicação em revistas científicas ou anais de congressos sujeitos a arbitragem, que constam da minha Dissertação/Tese de Mestrado/Doutorado, intitulada Especialização trófica e estrutura genética em insetos fitófagos, não infringem os dispositivos da Lei n.° 9.610/98, nem o direito autoral de qualquer editora.

Campinas, 27 de janeiro de 2020.

Assinatura : ______Nome do(a) autor(a): Camila Rabelo Oliveira Leal RG n.° 13323096

Assinatura : ______Nome do(a) orientador(a): Thomas Michael Lewinsohn RG n.° 11979687