Virus De La Marchitez Del Tomate (Tomarv) En El Noroeste De México E Identificación De Hospedantes Alternos” TESIS

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL

UNIDAD SINALOA

“Presencia del Virus de la marchitez del tomate (ToMarV) en el Noroeste de México e identificación de hospedantes alternos” TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN

RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

ROGELIO ARMENTA CHÁVEZ

GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE, 2012

Agradecimientos a proyectos

El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado económicamente por el IPN y recursos autogenerados. El alumno Rogelio Armenta Chávez fue apoyado con una beca CONACYT con clave 366650 y por el IPN a través de la beca PIFI dentro del proyecto Determinación de la importancia de hospedantes alternos en la dispersión de Ca. Liberibacter sp. en el Norte de México (Con número de registro 20120507).

DEDICATORIA

A mis padres A ellos por haberme dado la vida y haberse preocupado día a día por mi bienestar y futuro, a ellos les dedicó esta tesis, mi vida y mi ser. Gracias por ser mis padres.

A mi novia A mi novia Karen quien siempre me ha apoyado en todo, sin condición alguna; por darme su amor y cariño, por eso gracias.

A mi tía Soledad Armenta Por estar a mi lado en los momentos difíciles y haberme dado su apoyo y fuerza para salir adelante día con día. Gracias por eso y por todo lo que venga.

A mi hermana Quien ha estado conmigo en las buenas y en las malas a lo largo de mi vida; gracias hermana por ese apoyo tan peculiar que me das.

A mi tutora Gracias a Erika, quien a pesar de sus regaños y su risa de nervios, estuvo conmigo durante los éxitos y altibajos de este trabajo.

AGRADECIMIENTOS

A mis padres quienes sin escatimar esfuerzo alguno, han sacrificado gran parte de su vida, para formarme y educarme. A quienes la ilusión de su existencia ha sido verme convertido en una persona de provecho. A ustedes padres GRACIAS.

Agradezco a mi familia por su cariño, paciencia, comprensión y apoyo desde siempre, inculcándome que todo lo que sueñe es posible realizarlo.

A CONACYT por el apoyo económico brindado durante la realización de este proyecto.

A COECYT por el apoyo económico brindado para la finalización de este proyecto.

Al CIIDIR-IPN unidad Sinaloa, una institución de enorme calidad, y con un enorme potencial de crecimiento, que me brindó todo el apoyo durante la realización de mi trabajo de investigación.

A mi director de tesis, Dr. Jesús Méndez Lozano, por darme la oportunidad de ser parte de su grupo de trabajo. Sus consejos, paciencia, algunas veces regaños y opiniones sirvieron para que me sienta satisfecho de mi participación dentro de este proyecto de investigación.

A mi Co-directora, M. en C. Erika Camacho Beltrán, por toda su comprensión, nobleza y dedicación que en todo momento mostro hacia mí, por las enseñanzas, sugerencias y apoyo para que juntos pudiéramos llevar de la mano la realización de este trabajo de investigación, por enseñarme que no importa que tan difícil sea el problema, siempre existe una salida o al menos una risa de nervios, gracias jefa por su gran apoyo, y porque creo que mas que una maestra asociada e investigadora adjunta, encontré una amiga

A los miembros del Comité de asesores, Dra. Norma Elena Leyva López, M. en C. Ana Elsi Ulloa Pérez y Dr. Miguel Ángel Apodaca Sánchez por las valiosas contribuciones que hicieron durante la realización de esta investigación, así como por el tiempo que dedicaron para revisar el trabajo final.

A mis compañeros del Laboratorio de Virología: Lucy, Natalie, Norma Macías, Tavo, JuanJo, Emanuel, Emmanuel, Betty, Hugo, Marielos, Miriam, Lalo (por un tiempo) que de alguna forma fueron parte de este trabajo. A todos ustedes gracias por ser parte de esto.

Agradezco a cada uno de los profesores, quienes participaron en mi desarrollo profesional; sin su ayuda y conocimientos no estaría donde hoy me encuentro.

A mis compañeros de generación: Libia Armenta, Meymer, JC, Arely, Luis, Miguel, Elizeth, Magnolia, Lorena, Nachuuu, al Señoron Carlos Eduardo, Héctor Leyva, Wendy, Betito (que estuvo poco pero es un tipaso), Sheila, Alicia, KrlaKo, Roció, Camila. A los compañeros de generaciones pasadas: Nadia, Chaparra, Ale, Alex, Gallo, Abraham, Gerardo, Damián. De igual forma a los nuevos compañeros gracias a todos por su apoyo.

INDICE

GLOSARIO ...... I INDICE DE FIGURAS ...... IV INDICE DE CUADROS ...... VII RESUMEN ...... VIII I. INTRODUCCIÓN ...... 1 II. ANTECEDENTES ...... 3 2.1 Generalidades del tomate (Solanum lycopersicum) ...... 3 2.2 Factores que afectan el cultivo de tomate ...... 4 2.3 Los virus de plantas ...... 8 2.4 Virus que infectan el cultivo de tomate ...... 14 2.5 Factores que inducen la emergencia de enfermedades virales transmitidas por mosca blanca ...... 15 2.6 Familia Secoviridae ...... 16 2.6.1 Género Torradovirus ...... 17 2.6.1.1 Virus torrado del tomate (ToTV) ...... 17 2.6.2 Virus de la necrosis apical del tomate (ToANV) o Virus de la marchitez del tomate (ToMarV) ...... 19 2.6.3 Virus de la mancha del chocolate del tomate (ToChSV) o Virus del chocolate (ToChV) ...... 22 III. JUSTIFICACIÓN ...... 24 IV. HIPÓTESIS ...... 25 V. OBJETIVOS ...... 25 VI. MATERIALES Y METODOS ...... 26 6.1 Área de estudio ...... 26 6.2 Colecta de muestras ...... 26 6.3 Extracción de RNA de tejido foliar ...... 27 6.4 Detección molecular del Virus de la marchitez del tomate (ToMarV) por RT- PCR y PCR anidado...... 28 6.4.1 Síntesis del cDNA de ToMarV ...... 28 6.4.2 Detección de ToMarV y Control Interno por RT-PCR ...... 28 6.4.3 Detección de ToMarV por RT-PCR anidado ...... 29

6.4.4 Electroforesis ...... 31 6.4.5 Purificación del producto de RT-PCR anidado ...... 31 6.4.6 Ligación del producto de RT-PCR anidado ...... 32 6.4.7 Transformación ...... 32 6.4.8 Extracción del DNA plasmídico (Miniprep) ...... 33 6.4.9 Restricción del DNA plasmídico ...... 34 6.4.10 Purificación del DNA plasmídico para secuenciación ...... 34 6.4.12 Secuenciación y análisis de la secuencia ...... 36 6.5 Infectividad del aislado de ToMarV-Guasave en híbridos de tomate y chile36 6.5.1 Obtención del inóculo de ToMarV-Guasave y transmisión mecánica en plantas de tomate y chile...... 37 6.5.2 Detección de ToMarV en plantas de tomate y chile inoculadas ...... 37 6.5.3 Sintomatología inducida por ToMarV ...... 38 6.5.4 Infectividad ...... 38 VII. RESULTADOS ...... 39 7.1 Presencia del Virus de la marchitez del tomate en el Noroeste de México 39 7.1.1 Colecta de muestras de plantas de tomate ...... 39 7.1.3 Extracción de RNA ...... 47 7.1.4 Detección molecular de ToMarV mediante RT-PCR y RT-PCR anidado en muestras de tomate del Noroeste de México...... 48 7.1.5 Identificación molecular de ToMarV en muestras de tomate en el Noroeste de México...... 51 7.2 Identificación de hospedantes alternos a ToMarV en el estado de Sinaloa 53 7.2.1 Colecta de muestras ...... 53 7.2.2 Detección molecular de ToMarV en hospedantes alternos ...... 54 7.2.3 Identificación molecular de ToMarV en muestras de hospedantes alternos en el estado de Sinaloa...... 58 7.3 Análisis de la infectividad del aislado de ToMarV-Guasave en híbridos de tomate y chile...... 60 VIII. DISCUSIÓN...... 66 IX. CONCLUSIONES ...... 72 X. BIBLIOGRAFÍA ...... 74

GLOSARIO Ácido Nucleico. Molécula polimérica compuesta de unidades nucleotídicas unidas entre sí por enlaces fosfodiéster. Las cadenas de DNA (ácido desoxirribonucleico) y de RNA (ácido ribonucleico) difieren en que contienen desoxirribosa y ribosa, respectivamente.

Amplificación. Aumento del número de copias de un gen o de una secuencia de

DNA.

Cancros. Lesión necrótica y con frecuencia profunda que se produce en el tallo, ramas o ramitas de una planta.

Cápside. Cubierta proteica de un virus.

Ciclo agrícola. Recibe los nombres de las estaciones en que se realizan las siembra de un cultivo (otoño-invierno y primavera verano).

Clonación. Transferencia de un fragmento de ADN de interés de un organismo a un elemento genético auto replicante, tales como un plásmido bacteriano.

Desnaturalización de ácidos nucleicos. Se refiere a la conversión de secuencias de DNA doble hebra o RNA doble hebra a secuencias de hebra simple. Generalmente ocurre por calentamiento.

DNA (ácido desoxirribonucleico). Polímeros compuestos de cuatro unidades moleculares diferentes, denominadas desoxirribonucleótidos (abreviados A, G, C y T) que contienen el azúcar desoxirribosa. Los genes son parte de las moléculas de DNA y su codificación viene dada por la secuencia de los desoxirribonucleótidos.

DNA Complementario (cDNA). Cadena complementaria de DNA copiada a partir de una de RNA por la enzima transcriptasa reversa.

DNA Ligasa. Enzima que une extremos de las cadenas de DNA, mediante la formación de enlaces fosfodiéster entre ellos.

DNA Polimerasa. Enzima que agrega nucleótidos a una cadena de DNA en sentido de 5´ - 3´, durante su replicación.

Eco RI. Enzima de restricción obtenida de Escherichia coli, la cual reconoce la secuencia palíndrome GAATTC y produce cortes de tipo escalonados entre G y A.

Electroforesis. Método de separación de moléculas consistente en someter la mezcla a un campo eléctrico, de tal manera que las moléculas migren de acuerdo a su tamaño y su carga eléctrica. Se puede utilizar para separar o purificar proteínas o fragmentos de RNA o DNA.

Enfermedad. Cualquier mal funcionamiento de las células y tejidos del hospedante, que resulta de la irritación continua por un agente patogénico o factor ambiental y que lleva al desarrollo de síntomas.

Fitoplasmas. Son organismos pleomórficos, sin pared celular, y están rodeados de una membrana.

Gen. Fragmento de DNA en el que se contiene el código necesario para la síntesis de una determinada proteína.

Genoma. Toda la información genética contenida en una célula, incluyendo a los genes y a otras secuencias de DNA o RNA.

Gomosis. Es una reacción de defensa, que se manifiesta como una exudación de goma, una materia viscosa de color ámbar que al principio es blanda pero que en muchas ocasiones se endurece con el contacto del aire y que nos indica que la planta está sufriendo alguna alteración de carácter fisiológico, muchas veces provocado por la presencia de hongos, bacterias e incluso insectos.

Hortaliza. Las hortalizas son un conjunto de plantas cultivadas, generalmente, en huerta o regadíos, que se consumen como alimento, ya sea de forma cruda o cocida. El término hortaliza incluye a las verduras y a las legumbres verdes.

Kilobase (Kb). Unidad de longitud de ácidos nucleicos correspondiente a 1000 nucleótidos.

Nucleótidos. Unidades o eslabones moleculares elementales, que enlazados uno a continuación de otro, constituyen los ácidos nucleicos. Químicamente están formados por un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada.

Pares de bases (pb). Pares de bases (nucleótidos) complementarias en una molécula de DNA o RNA.

Primer (oligonucleótido, cebador o iniciador). Secuencia corta de nucleótidos que proporciona el punto de iniciación para que las DNA polimerasas copien una secuencia de nucleótidos y elaboren una cadena complementaria.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Sistema de amplificación genética que permite obtener millones de copias de un determinado fragmento de DNA o RNA, del que se conozcan dos secuencias que lo flanqueen.

RNA (ácido ribonucleico). Polímero compuesto de cuatro unidades moleculares diferentes denominadas ribonucleótidos (abreviados A, G, C y U), que contienen el azúcar ribosa.

RT-PCR. Reacción de transcriptasa reversa y reacción en cadena de la polimerasa.

Secuencia. Forma en que se ordenan los nucleótidos a lo largo de las cadenas de DNA o RNA (o los aminoácidos en las cadenas proteínicas).

Termociclador. Instrumento que permite ejecutar en forma automatizada la técnica de PCR. Al aplicar ciclos térmicos secuenciales, ocurre la desnaturalización, hibridación y síntesis de DNA.

Transcripción-Reversa. Proceso por el cual un modelo de DNA se copia en RNA por la acción de la enzima RNA polimerasa.

Vector. Molécula de DNA que puede unirse a un segmento de DNA de distinto origen y que puede introducirse después en una célula en la que es capaz de replicarse.

Virus. Parásito obligado y submicroscópico compuesto por ácido nucleico y proteínas.

Vortex. Aparato que sirve para agitar vigorosamente.

III

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estabilidad de la producción nacional del cultivo de tomate en México 4 Figura 2. Producción de tomate en México. Número de hectáreas sembradas sobre el número de hectáreas cosechadas de tomate de 1990 al 2010 ...... 4 Figura 3. Principales especies de insectos vectores de los órdenes Hemíptera y Thizanoptera ...... 5 Figura 4. Sintomatología observada en el cultivo de tomate causada por fitopatógenos ...... 6 Figura 5. Sintomatología de marchitez y necrosis causada por diferentes fitopatógenos presentes en el cultivo del tomate ...... 8 Figura 6. Estructura y formas proteicas de virus ...... 10 Figura 7. Informe de hectáreas siniestradas del cultivo de tomate durante los años agrícolas 2000-2010 en México ...... 15 Figura 8. Sintomatología reportada para el Virus del torrado del tomate ...... 18 Figura 9. Organización genómica del Virus de la marchitez del tomate ...... 20 Figura 10. Sintomatología reportada en hojas y fruto infectados con ToMarV ... 21 Figura 11. Sintomatología del Virus de la mancha de chocolate reportada durante 2010 ...... 23 Figura 12. RNA2 del genoma del Virus de la marchitez del tomate ...... 28 Figura 13. Región de la Vp24 y 3’UTR de ToMarV ...... 30 Figura 14. Municipios muestreados en el Noroeste de México ...... 39 Figura 15. Sintomatología de marchitez en plantaciones de tomate en el Norte de Sinaloa ...... 40 Figura 16. Frutos observados en plantas de tomate en campo en el Norte de Sinaloa ...... 41 Figura 17. Sintomatología observada en plantas de tomate en el municipio de Elota ...... 42 Figura 18. Sintomatología observada en fruto de tomate en el municipio de Culiacán ...... 43 Figura 19. Sintomatología de marchitez y/o necrosis presente en plantas de tomate en el municipio de Huatabampo, Sonora...... 44

Figura 20. Sintomatología observada en fruto de tomate en Tepic, Nayarit ...... 45 Figura 21. Sintomatología observada en plantas de tomate en el municipio de Ensenada, Baja California ...... 46 Figura 22. Sintomatología asociada a géneros de virus transmitidos por mosca blanca presente en plantas de tomate en el Noroeste de México ...... 47 Figura 23. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% de RNA total de tejido de tomate ...... 48 Figura 24. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en muestras de tomate en el Norte de Sinaloa ...... 49 Figura 25. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en muestras de tomate en el Noroeste de México ...... 50 Figura 26. Análisis filogenético de las secuencias del ToMarV procedentes de aislados de tomate del Noroeste de México comparadas con otras secuencias disponibles en el Gen Bank ...... 52 Figura 27. Principales hospedantes alternos colectados en Sinaloa ...... 53 Figura 28. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en hospedantes alternos en el estado de Sinaloa ...... 55 Figura 29. Sintomatología de muestras de chile colectadas en Sinaloa ...... 56 Figura 30. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en muestras de chile en el estado de Sinaloa ...... 57 Figura 31. Árbol filogenético de las secuencias de ToMarV aisladas a partir de malezas comparadas con otras secuencias disponibles en el Gen Bank ...... 59 Figura 32. Árbol filogenético de las secuencias de ToMarV aisladas a partir del cultivo de chile comparadas con otras secuencias disponibles en el Gen Bank .. 59 Figura 33. Sintomatología observada durante el bioensayo de infectividad de ToMarV en plantas de tomate ...... 61 Figura 34. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV mediante PCR anidado en híbridos de tomate inoculados mecánicamente ...... 62 Figura 35. Sintomatología observada en chile inoculado con ToMarV ...... 64 Figura 36. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en híbridos de chile mediante PCR anidado ...... 65

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Familias y géneros de virus de plantas ...... 10

Cuadro 2. Primers utilizados para la detección de Virus de la marchitez del tomate y gen ndhB ...... 30 Cuadro 3. Muestras de tomate procedentes del Noroeste de México analizadas durante 2011-2012 ...... 51

Cuadro 4. Análisis de la detección molecular de ToMarV en hospedantes alternos ...... 55 Cuadro 5. Muestras de plantas de chile colectadas en Sinaloa, a partir de la cuales se logró detectar a ToMarV, mediante PCR anidado en 2010-2011 ...... 58 Cuadro 6. Análisis de infectividad de ToMarV en híbridos de tomate ...... 63

VII

RESUMEN En 2008, se reportó en Culiacán la presencia de una nueva especie viral conocida por la ICTV como Virus de la marchitez del tomate (ToMarV) sin embargo, a la fecha, existe poca información acerca de factores epidemiológicos de esta especie. Es por ello que el objetivo del presente estudio, fue determinar la presencia de ToMarV en las principales áreas productoras de tomate en el Noroeste de México, y determinar sus hospedantes alternos. Para llevar a cabo este trabajo se colectaron muestras de follaje y fruto con síntomas relacionados a ToMarV en tomate durante las temporadas agrícolas 2010-2011 y 2011-2012. Los resultados de la detección e identificación molecular mediante RT-PCR y PCR anidado indicaron la presencia de ToMarV en los municipios de Ahome, Guasave y Elota del Estado de Sinaloa, así como en Huatabampo, Sonora. Sin embargo, no se detectó a ToMarV en ninguna muestra de tomate de los estados de Nayarit y Baja California. El análisis filogenético mostró homologías de 89 a 93% con la secuencia reportada de un aislado de Culiacán. Los datos sugieren que hasta el 2012 la dispersión del virus ToMarV se ha limitado a Sinaloa y Sonora. Adicionalmente, se realizó un bioensayo de infectividad mediante inoculación mecánica en seis híbridos utilizados en Sinaloa, inoculándose el aislado de ToMarV obtenido en Guasave, el cual mostró una mayor infectividad en el híbrido Brigade. No se detecto a ToMarV en el hibrido Tisey, lo cual sugiere que este material fue capaz de tolerar la infección de ToMarV-Guasave. Para el caso de hospedantes alternos, logramos detectar la presencia de ToMarV en especies importantes de malezas, tales como Solanum nigrum, Chenopodium spp., Amaranthus spp., Rumex crispus., Parthenium histeroporhus, Portulaca oleracea. También se detecto como hospedante alterno de ToMarV al cultivo de chile colectado en Sinaloa, confirmándose su infectividad mediante un bioensayo, donde el aislado ToMarv- Guasave fue capaz de infectar los tres materiales de chile evaluados (Anaheim, orange y M10). La detección de ToMarV en plantas de chile de manera comercial representa el primer reporte de este virus en otro cultivo de importancia agrícola.

VIII

ABSTRACT In 2008, was reported in Culiacan the presence of a new viral species known by the ICTV as Tomato marchitez virus (ToMarV) however, to date, exist little information about the epidemiological factors of this viral species. Our objective of this research were to determine the occurrence of ToMarV in major tomato producing areas in the Northwest of Mexico, and determined which plants serve as alternate hosts in the absence of tomato crop. To perform this work, samples were collected from leaf tissue and tomato fruits with ToMarV related symptomatology during the 2010-2011 and 2011-2012 growing seasons. Molecular identification of ToMarV indicates the presence of ToMarV in three of the four municipalities sampled in Sinaloa (Ahome, Guasave, Elota) and in Huatabampo, Sonora. However, any sample of tomato was not detected in states of Nayarit and Baja California. Phylogenetic analysis showed homologies of 89 to 93% with the sequence reported in 2008 of an isolate of ToMarV from Culiacán. Our data suggest that until 2012 the spread of ToMarV is only in Sinaloa and Sonora. Additionally, we performed a bioassay of infectivity in six hybrids from agricultural Sinaloense, where ToMarV-Guasave isolate showed greater infectivity in the hybrid Brigade, on the other hand, we could not detect the presence of ToMarV in the hybrid Tisey. This fact suggests to Tisey as a tolerant material that can support ToMarV-Guasave infection. In the case of alternative hosts, we detect the presence of ToMarV in important weed species such as Solanum nigrum, Chenopodium spp., Amaranthus spp. Rumex spp. Parthenium, spp. Portulaca spp. Once this point was over and analyzing that some pepper samples were positive to ToMarV throughout the state of Sinaloa, was performed a bioassay of infectivity in pepper, where the isolated ToMarv-Guasave was able to infect the three materials of pepper (Anaheim, orange and M10) evaluated. ToMarV detection in pepper plants as commercial way represents the first report of ToMarV in other agricultural important crops.

I. INTRODUCCIÓN

La horticultura es una de las actividades de primordial importancia por su valor económico y el alto número de empleos que genera en el país (Martínez-Huerta, 2007). La República Mexicana ocupa el décimo lugar en el mundo en producción del cultivo de tomate con aproximadamente 2,997,640 de toneladas anuales (FAOSTATIC, 2011). La producción nacional de tomate en el 2011 alcanzó un valor de $10,336,853.07 mil millones de pesos. En este sentido, los Estados del Noroeste del país, Baja California, Sonora, Sinaloa y Nayarit aportaron 720,713.84 ton con un valor de producción de $3,708,409.29 mil millones de pesos. En donde Sinaloa se ubicó como líder, aportando alrededor del 50% de la producción de tomate en el Noroeste de México (SIAP, 2012).

El desarrollo del cultivo de tomate puede verse afectado por enfermedades virales, entre ellas se encuentran las inducidas por el Virus de la marchitez manchada (TSWV, género Tospovirus); Virus mosaico del pepino (PepMV, género Potexvirus), Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV, género Begomovirus), Virus de la clorosis infecciosa del tomate (TICV, género Crinivirus), Virus de la clorosis del tomate (ToCV, Crinivirus) y recientemente por un nuevo grupo de virus transmitidos por mosca blanca del género Torradovirus (Popieszny et al., 2007; Turina et al., 2007; Amari et al., 2008; Safanςon et al., 2009; Hanssen 2010; Gámez-Jiménez et al., 2009; Méndez-Lozano et al., 2012)

Los torradovirus pertenecen a la familia Secoviridae y poseen RNA bipartita de forma isométrica (Safanςon et al., 2009). El género Torradovirus se reportó por primera vez en España en 2007, afectando al cultivo del tomate. Las especies de este género atacan las partes apicales de la planta e inducen una necrosis en frutos (cribado o torrado, en España) dejándolo comercialmente inviable (Alfaro- Fernández et al., 2006; Verbeek et al., 2007a; Turina et al., 2007; Alfaro- Fernández et al., 2009a). Desde entonces, este género se ha reportado en

distintas partes del mundo, incluidas Polonia (Popieszny et al., 2007), Francia (Verdín et al., 2009), Hungría (Alfaro-Fernández et al., 2009b), Italia (Davino et al., 2010) y Australia (Gambley et al., 2010). En América, se reportaron por primera vez en Culiacán, Sinaloa, México, durante la temporada agrícola Otoño-Invierno 2006-2007 tanto en sistemas de cultivos protegidos como a campo abierto, a éste agente causal se le nombró Virus de la necrosis apical del tomate (ToANV, Turina, et al., 2007) y Virus de la marchitez del tomate (ToMarV, Verbeek, et al., 2008). En 2010 se reportaron en Guatemala dos nuevas especies de torradovirus causando infección en tomate ToChSV (Virus de la mancha de chocolate del tomate) y ToChV (Virus chocolate del tomate) (Batuman et al., 2010; Verbeek et al., 2010).

Hasta el año 2010 el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) solo reconocía a ToMarV y ToTV como especies de este nuevo género y a ToANV como un aislado de ToMarV (Carstens, 2010). En México los torradovirus han sido asociados a daños puntuales en el estado de Sinaloa; sin embargo, se han seguido observando daños de necrosis en fruto en ciclos agrícolas posteriores a su primera detección. Desde el primer reporte de ToMarV en Culiacán, Sinaloa se desconoce su distribución en el resto del estado y su posible dispersión en áreas productoras de tomate del Noroeste del país.

II. ANTECEDENTES 2.1 Generalidades del tomate (Solanum lycopersicum)

El tomate rojo o jitomate es originario de las tierras altas de la costa occidental de Sudamérica, considerando a México como centro de su domesticación (Smith y Andrew, 1994).

En la actualidad el sector hortícola tiene una importancia particular en la agricultura, y solo la papa y el tomate contribuyen con el 50% de la producción de hortalizas en el mundo. El alto valor del cultivo del tomate no es solo en el comercio, sino también en el sistema alimentario mundial y social. El tomate durante su cultivo, cosecha y comercialización, genera 72 mil empleos directos y 10.7 millones de empleos indirectos (SIAP, 2009).

En los últimos años la producción nacional de tomate se ha mantenido estable, con un promedio anual de 3 millones de toneladas (Figura 1). Según datos de la FAOSTATIC (2010) los principales países productores de tomate son: China, Estados Unidos, Turquía, India, Egipto e Italia, países que conjuntamente han producido durante los últimos 10 años el 60% de la producción mundial.

En México, el tomate se cultiva de manera intensiva en los 32 estados del país y en el 2011 tuvo una producción de aproximadamente 1.87 millones de toneladas de fruta, generando un valor de divisas alrededor de $10,336,853.07 miles de millones de pesos. En este sentido, los Estados del Noroeste del país; Baja California, Sonora, Sinaloa y Nayarit aportaron 720,713.84 toneladas; el valor de la producción fue de $3,708,409.29 miles de millones de pesos; de esta producción Sinaloa aportó alrededor del 50% (SIAP, 2012).

En Sinaloa, el tomate es la especie hortícola más importante debido al valor de su producción y a la demanda en el mercado, seguido por la papa y el tomatillo

(SIAP, 2010). Así mismo, el cultivo de tomate representó en los últimos diez años poco más del 50% de la producción total de hortalizas producidas en el Estado. Actualmente se destina una superficie superior a las 15mil hectáreas para este cultivo, hecho que ha consolidado a Sinaloa como el mayor productor en el país (Martínez-Huerta, 2007).

Figura 1. Estabilidad de la producción nacional del cultivo de tomate en México (SIAP, 2011).

2.2 Factores que afectan el cultivo de tomate El rendimiento y la calidad del tomate puede ser fuertemente afectada tanto por factores abióticos (heladas, sequias, entre otras) como bióticos (plagas y enfermedades). Según datos del Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) esta información se ve reflejada en las pérdidas o números de hectáreas siniestradas reportadas por este organismo (SIAP, 2011) (Figura 2).

100,000.00

80,000.00

60,000.00 Sembradas 40,000.00 hectareas Cosechadas 20,000.00

0.00

Figura 2. Producción de tomate en México. Número de hectáreas sembradas y cosechadas de tomate en México de 1990 al 2010.

Los insectos plaga más destacados por su daño son hemípteros (Bemisia tabaci, Bactericera cockerelli), thizanopteros (Frankliniella occidentales), dípteros (Liriomyza trifolii), lepidópteros (Spodoptera exigua); así mismo, se presentan daños al cultivo por otros artrópodos, como la araña roja (Tetranychus urticae) y el ácaro del bronceado (Aculops lycopersici). Cabe señalar que algunas especies de los ordenes Hemíptera y Thizanoptera son de gran importancia por la capacidad de transmitir fitopatógenos como virus y fitoplasmas (Figura 3; Bautista et al., 2010).

Figura 3. Principales especies de insectos vectores de los órdenes Hemíptera y Thizanoptera. Panel a, (Frankliniella occidentalis : Thizanoptera); Panel b, (Bemisia tabaci : Hemíptera); Panel c, (Myzus persicae : Hemíptera); Panel d, (Bactericella cockerelli : Hemíptera).

Adicionalmente, el cultivo de tomate puede ser afectado por una diversidad de especies fitopatógenas como fitoplasmas (Santos-Cervantes et al. 2008), nematodos (Pratylechus spp., Globodera spp., Meoloidogyne spp.) (Franco, 2010), hongos (Rhizoctonia solani, Pythium spp., Fusarium spp.), bacterias (Xanthomonas axonopodis, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum)

(Tlapal, 2010) y virus (Begomovirus, Crinivirus, Tobamovirus) (Álvarez-Ruiz et al. 2007; Gámez-Jímenez, et al., 2009; Ochoa, 2010; Méndez-Lozano, et al., 2012), causando sintomatologías que van desde necrosis, marchitez, gomosis, amarillamientos, cancros, rugosis, mosaicos, manchas foliares, entre otros (Figura 4).

Figura 4. Sintomatología observada en el cultivo de tomate causada por fitopatógenos. Panel a, Mosaico del foliolo; Panel b, Necrosis de tallo y fruto; Panel c, Marchitez de la planta; Panel d, amarillamiento intervenal.

La sintomatología causada por fitopatógenos puede confundirse debido a que éstas dependen del patógeno, las condiciones climáticas y la tolerancia del

hospedante (Schuman y D’Arcy, 2010). Un ejemplo común de confusión entre sintomatologías, se presenta en aquellas como los amarillamientos del foliolo, la cual puede ser causada por diferentes fitopatógenos; como nematodos, diferentes especies de virus o simplemente deficiencias nutricionales. La marchitez o necrosis en ocasiones puede llegar a confundirse si no se tiene la experiencia y el conocimiento adecuado para discernir entre diversos fitopatógenos, ya que se ha reportado que esta es ocasionada por patógenos como hongos, bacterias y virus. Estas sintomatologías están envueltas en muerte de tejidos, es decir, los síntomas que conocemos como marchitez, necrosis o tizones presentes en las hojas son solo una acumulación de células muertas. Es importante señalar que en ocasiones la necrosis se puede expandir y provocar: aborto de flores, marchitez, atizonamiento, cancros (Schuman y D’Arcy, 2010). En México, existen diversos fitopatógenos como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Clavibacter michiganesis subsp. michiganensis, Virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV), Phytophthora infestans capaces de provocar necrosis o marchitez (Figura 5) (Ramírez-Villapudúa y Sáinz-Rodríguez, 2006). En Sinaloa a mediados de los 90’s se observó una enfermedad de marchitez en el cultivo del tomate que implicaba necrosis en fruto y en la parte apical de la planta, dicha sintomatología fué asociada al Virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV), en ese entonces se creía que el daño estaba asociado a nuevas variantes de este virus debido a la sintomatología distintiva que éste causaba (Cabanillas, 1999).

Figura 5. Sintomatología de marchitez y necrosis causada por diferentes fitopatógenos presentes en el cultivo del tomate. Panel a, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici; Panel b, Clavibacter michiganesis subsp. michiganensis; Panel c, Virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV); Panel d, Phytophthora infestans.

2.3 Los virus de plantas

El genoma de los virus consiste básicamente de una o varias moléculas de ácido nucleico, DNA ó RNA (Figura 6a), las cadena pueden ser sencillas o dobles, lineales o circulares y puede estar contenida en una molécula (genoma monopartita) o en varias (genoma bipartita). El genoma está protegido con una cubierta proteica o cápside, que está constituida por proteínas múltiples llamadas capsómeros; una de sus funciones es conferir la forma del virus (Figura 6b).

Los virus actúan como parásitos celulares sobre su huésped, se adueñan de los mecanismos moleculares de la célula y tienen la capacidad de inducir

enfermedades en casi todos los grupos de organismos vivientes, multicelulares o unicelulares (plantas, animales, hongos, protozoarios y bacterias).

En plantas existe alrededor de 80 géneros clasificados en 17 familias, las especies ubicadas dentro de estos géneros causan cuantiosos daños a los cultivos. El 86.25% de los géneros virales que infectan plantas tienen genoma de RNA; de los que el 4.34% son virus de cadena negativa, el 8.69% son virus de doble cadena, el 40.57% son virus de cadena sencilla positiva y el 47.8% restante son virus de cadena sencilla negativa.

Así mismo, se cuenta con nueve géneros de virus fitopatógenos con genomas de DNA, mismos que equivalen al 13.75% restante de los géneros virales que infectan plantas. Los genomas de DNA pueden ser de cadena sencilla o cadena doble, en este caso se conoce que alrededor del 55% son géneros con genomas de doble cadena, mientras el 45% restante son de cadena sencilla (Agrios, 2005; Hull, 2002).

A lo largo de la historia de la virología vegetal, han aparecidos nuevos géneros o especies capaces de causar fuertes enfermedades y algunas de ellas han sido asignadas a familias o géneros ya existentes, mediante la fusión de familias o géneros o en su defecto creando familias y géneros nuevos a partir de sus características (Carstens, 2009) (Cuadro 1).

Figura 6. Estructura y formas proteicas de virus. (a) Estructura (b) Formas (Varilla rígida, Varilla flexible, baciliforme, baliforme, poliédrica, isométrica)

Cuadro 1. Familias y géneros de virus de plantas.

Tipo de Familia Géneros (especie tipo) genóma

Caulomovirus (Cauliflower mosaic virus)

Cassava vein mosaic virus-like (Cassava mosaic virus)

BDNAavirus (Commelia yellow mottle virus)

DNA Soybean chlorotic mottle virus-like (Soybean chlorotic Caulimoviridae mottle virus) (Doble cadena) Petunia vein clearing virus-like (Petunia vein clearing virus)

Rice tungro baciliform virus-like (Rice tungro baciliform virus)

Begomovirus (Bean golden mosaic virus) DNA Curtovirus (Beet curly top virus) (Cadena Geminiviridae sencilla) Mastrevirus (Maize streak virus)

Topocuvirus (Tomato pseudo-curly top virus)

Circoviridae Nanovirus (Subterranean clover stunt virus)

Fijivirus (Fiji disease virus)

Reoviridae Oryzavirus (Rice ragged stun virus)

RNA Phytoreovirus (Wound tumor virus)

(Doble cadena) Alphacryptovirus (White clover cryptic virus) Partitiviridae Betacryptovirus (White clover cryptic virus 2)

- Varicosavirus (Lettuce big-vein virus)

Tospovirus (Tomato spot wilt virus) Bunyaviridae RNA Ophiovirus (Citrus psorosis virus) (Cadena Relacionado a negativa) Tenuivirus (Rice stripe virus) Bunyaviridae

Bromovirus (Brome mosaic virus)

Alfamovirus (Alfalfa mosaic virus)

Bromoviridae Oleavirus (Olive latent virus)

Cucumovirus (Cucumber mosaic virus)

Ilarvirus (Tobacco streak virus)

Waikavirus (Rice tungro spherical virus) RNA Cheravirus (Cherry rasp left virus) (Cadena

sencilla) Torradovirus (Tomato torrado virus) Secoviridae Sequivirus (Parsnip yellow fleck virus)

Sadwavirus (Satsuma dwarf virus)

Subfamilia Comovirus (Cowpea mosaic virus)

Comovirinae Fabavirus (Broad bean wilt virus)

Nepovirus (Tobacco ring spot virus)

Potyvirus (Potato virus Y)

Macluravirus (Maclura mosaic virus)

Tritimovirus (Wheat streak mosaic virus)

Potyviridae Brabyvirus (Blackberry virus Y)

Bymovirus (Barley yellow mosaic virus)

Ipomovirus (Sweet potato mild mottle virus)

Rymovirus(Ryegrass mosaic virus)

Tombusvirus (Tomato bushy stunt virus)

Aureusvirus (Pothos latent virus)

Avenavirus (Oat chlorotic stunt virus)

Carmovirus (Carnation mottle virus) Tombusviridae Machlomovirus (Maize chlorotic mottle virus)

Necrovirus (Tobacco necrosis virus)

Panicovirus (Panicum mosaic virus)

Dianthovirus (Carnation ring spot virus)

Closterovirus (Beet yellows virus)

Closteroviridae Crinivirus (Lettuce infectious yellow virus)

Ampelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 3)

Luteovirus (Barley yellow dwarf virus-PAV)

Luteoviridae Poleovirus (Potato leafroll virus)

Enamovirus (Pea enation mosaic virus 1)

Tobamovirus (Tobacco mosaic virus)

Tobramovirus (Tobacco rattle virus) RNA Furovirus (Soil-borne wheat mosaic virus) Virgaviridae (Cadena Hordeivirus (Barley strip mosaic virus) sencilla Pecluvirus (Peanut clump virus) con sentido Pomovirus(potato mop-top virus) positivo) Allexivirus (Shallot virus X) Alphaflexiviridae Lolavirus (Lolium latent virus)

Potexvirus (Potato virus X)

Botrexvirus (Botrytis virus x)

Mandarivirus (Indian citrus ringspot virus)

Sclerodarnavirus (Sclerotinia sclerotiorum debilitation- associated RNA virus)

Capillovirus (Apple stem grooving virus)

Carlavirus (Carnation latent virus)

Citrivirus (Citrus left blotch virus) Betaflexiviridae Foveavirus (Apple stem pitting virus)

Trichovirus (Apple chlorotic leaf spot virus)

Vitivirus (Grape vine virus A)

Gammaflexiviridae Mycoflevirus (Botritis virus F)

Maculavirus (Grapevine fleck virus)

Tymoviridae Marafiviru (Maize rayado fino virus)

Tymovirus (Turnip yellow mosaic virus)

Benyvirus (Beet necrotic yellow vein virus)

Ourmiavirus (Ourmia melon virus)

No asignados Idaeovirus (Raspberry bushy dwarf virus)

Sobemovirus (Southern bean mosaic virus)

Umbravirus (Carrot mottle virus)

Nota: Cuadro realizado mediante la revisión obtenida a partir del libro Hull (2002) y actualizado con la ultima propuesta taxonómica aceptada por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (Cartens, 2010).

2.4 Virus que infectan el cultivo de tomate

Las enfermedades virales son un factor limitante en cualquier sistema de producción del cultivo de tomate (Solanum lycopsersicum) y su control químico o antiviral no existe a la fecha. Actualmente, existen diversos virus que infectan a este cultivo. Algunas de las enfermedades importantes son ocasionadas por la infección de especies virales, tales como, el Virus de la marchitez manchada (TSWV; género Tospovirus); Virus mosaico del pepino (PepMV; género Potexvirus) y Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV; género Begomovirus). Los daños que estas enfermedades presentan varían desde amarillamiento de foliolos, lesiones necróticas en tallo o fruto y enanismos que pueden provocar pérdidas completas del cultivo por muerte de la planta. Innumerables son los acontecimientos que envuelven a los virus de plantas con pérdidas económicas. En este sentido, cabe mencionar que durante 1996 y 1998 se describieron dos nuevas enfermedades virales en tomate la cuales fueron asociadas al Virus de la clorosis infecciosa del tomate (TICV; Crinivirus) y al Virus de la clorosis del tomate (ToCV). Este género se reportó causando daños en plantas de tomate en Estados Unidos (Duffus et al., 1994, Wisler et al., 1998). Sin embargo ToCV y TICV han incrementado su distribución, ya que han sido reportadas en 2006 y 2012 infectado al cultivo de tomate en México (Álvarez-Ruiz et al., 2006, Méndez-Lozano et al., 2012). Por su parte, en Sinaloa, México, durante la temporadas agrícolas del 2004 al 2007, se observó una alta población de mosca blanca y daños en el cultivo de tomate asociados a infección por Begomovirus. Este hecho repercutió en la cantidad y calidad de la producción de cultivos hortícolas, observándose disminución en la producción (SIAP, 2011) (Figura 7). En general la distribución geográfica de los virus conocidos se incrementa y nuevos virus continúan apareciendo, tal es el caso del género Torradovirus (Hanssen, 2010).

Figura 7. Informe de hectáreas siniestradas del cultivo de tomate durante los años agrícolas 2000-2010 en México (SIAP, 2011).

2.5 Factores que inducen la emergencia de enfermedades virales transmitidas por mosca blanca

La mosca blanca juega un papel importante en la aparición de nuevas enfermedades virales. Hace más de 35 años que se conoce esta relación virus- vector, solo que en aquellos años se desconocía quien era el actor principal que causaba la sintomatología y la relación se hacía correlacionando la presencia de síntomas tales como amarillamiento, enchinamiento, achaparramiento de plantas con las altas poblaciones de mosca blanca. Hoy día se sabe el rol que juega este insecto y también que especies o géneros de virus están relacionados con las enfermedades. Los factores relacionados a la aparición de nuevas enfermedades virales en el cultivo del tomate, se pueden relacionar al movimiento a larga distancia de material vegetal; es decir que la exportación de plántulas, o la introducción de plantas exóticas a nuevas regiones, lo que propicia la aparición de nuevas enfermedades virales. Otro factor a considerar son las mutaciones o cambios en el genoma viral, los cuales le permiten al virus que diferentes especies de mosca blanca puedan transmitirlos; o bien con la ayuda de éstas pueda llegar a nuevos hospederos e infectarlos. Otro punto importante son los cambios en las poblaciones de vectores, lo cuales pueden perjudicar o ayudar a la emergencia de

nuevos virus. A la fecha se conocen alrededor de 1500 especies de mosca blanca, pero las especies más importantes son Bemisia tabaci Biotipo B y Trialeurodes vaporariorum; estas dos especies son capaces de transmitir todos los géneros virales que se encuentran asociados a mosca blanca, tales como Begomovirus, Crinivirus, Carlavirus, Ipomovirus y recientemente un nuevo género llamado Torradovirus que pertenece a la familia Secoviridae (Navas-Castillo et al., 2011). Este último género se detectó por primera vez a principios del siglo XXI. Las especies de este género atacan el fruto de tomate dejándolo comercialmente inviable. Este género ha sido asignado a la nueva familia Secoviridae propuesta por Safanςon et al. 2009 y aceptada por la ICTV en el 2010 (Alfaro-Fernández et. al., 2006; Verbeek et al., 2007a; Turina et al., 2007; Verbeek et al., 2007b; Carstens, 2010).

2.6 Familia Secoviridae

Los miembros de esta familia infectan a las plantas usando proteínas de movimiento y/o proteínas de la cápside, adaptadas para cumplir con esa función. La estructura común de la partícula es de forma isométrica, su composición nucleica es de RNA de cadena positiva; cuentan con una poli proteína como estrategia de expresión; la replicación común es en bloques e incluye a las enzimas helicasa del tipo III, cistina proteinasa de forma 3C y a la polimerasa tipo I. Esta familia cuenta con ocho géneros los cuales comparten las características anteriormente mencionadas: Comovirus, Fabavirus, Nepovirus, Cheravirus, Sadwavirus, Sequivirus, Waikavirus y Torradovirus (Safanςon, et al., 2009; Carstens, 2009).

2.6.1 Género Torradovirus

El nombre torradovirus deriva de su especie tipo el Virus torrado del tomate (ToTV). En España, “torrado” se refiere a la necrosis severa que se observaba en la enfermedad inducida por ToTV. La organización genómica bipartita de este género se encuentra constituida por una poli proteína, tres proteínas de la cápside y una de movimiento. Las especies de este género son transmitidas por mosca blanca (Trialeurodes vaporariorum y Bemisia tabaci). Las características que definen las especies de este género son: 75% de identidad de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de la cápside entre especies; 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos en la región de la proteinasa-polimerasa; el tipo de vector y el rango de hospedante (Safanςon, et al., 2009; Carstens, 2009).

Al 2010 se han reportado cinco especies alrededor del mundo, las cuales han sido nombradas según la sintomatología que éstas inducen en el cultivo de tomate. Durante la última ratificación del Comité Internacional de Taxonomía de Virus o ICTV, solo se reconocieron dos especies de este género: el Virus torrado del tomate (ToTV) y al Virus de la marchitez del tomate (ToMarV). En ésta ratificación dicho comité consideró al Virus de la necrosis apical del tomate (ToANV) como un aislado de ToMarV (Safanςon et al., 2009; Carstens, 2009).

2.6.1.1 Virus torrado del tomate (ToTV)

En Murcia, España, durante la primavera de 2001, se observó una nueva enfermedad en el cultivo de tomate asociado a una sintomatología descrita como “cribado” o “torrado” (Alfaro-Fernández, 2006). La caracterización morfológica y molecular mostró que el agente causal de esta enfermedad es una partícula viral isométrica con un diámetro aproximado de 28 nm y un genoma viral consistente de dos moléculas de RNA de cadena simple positiva de 7793 (RNA1) y 5389 nucleótidos (RNA2), cubiertas por tres proteínas de la cápside con pesos

estimados de 35, 26 y 23 kDa. Esta especie fue nombrada como Virus torrado del tomate (ToTV) (Verbeek, et al., 2007). La sintomatología producida por esta especie consistía de manchas necróticas, rodeadas por un área verde claro o amarillo que empieza en la base de los foliolos. La infección evoluciona en una severa necrosis de hojas y frutos; en estos últimos se presenta la sintomatología de torrado o cribado, lo cual puede desencadenar en serios problemas económicos (Verbeek, et al., 2007) (Figura 8).

Figura 8. Sintomatología reportada para el Virus del torrado del tomate. Paneles a, b, d, necrosis basal de foliolos; Panel c, necrosis severa conocida como torrado en fruto.

Los hospedantes reportados actualmente para el virus ToTV son cultivos comerciales como Solanum lycopersicum, Petunia hibrida, Capsicum annuum, Solanum tuberosum y Solanum melongena. Así mismo se han reportado malezas como hospedantes alternos, tales como: Nicotiana spp., Physalis floridana, Amaranthus spp., Spergularia spp., Atriplex spp., Chenopodium ambrosioides, Chenopodium spp., Halogetum sativus, Senebiera didyma, Malva spp., Polygonum 18

spp., Solanum nigrum, (Verbeek et al., 2007a; Popieszny et al., 2007; Alfaro- Fernández et al., 2008; Amari et al., 2008).

A la fecha este virus se halla distribuido ampliamente por las principales zonas productoras de España, tales como Islas Canarias, Tenerife, Murcia, Gran Canaria, Mallorca, Almería, Alicante y Barcelona; las cuales cubren el 40% de la producción total de tomate del país (Alfaro-Fernández et al., 2006; Alfaro- Fernández et al., 2007a; Alfaro-Fernández et al., 2007b; Alfaro-Fernández et al., 2009a; Alfaro-Fernández et al., 2009b). Así mismo, se ha distribuido a otros países, como Hungría, Polonia (Popieszny et al., 2007), Francia (Verdín et al., 2009), Panamá (Herrera-Vásquez et al., 2009), Italia (Davino et al., 2010), Australia (Gambley et al., 2010) y Colombia (Verbeek y Dulleman, 2012). En este sentido, estudios recientes señalan a este virus en infecciones mixtas con el Virus mosaico de las cucurbitáceas (CMV) en Panamá, en donde la producción fue severamente dañada (Herrera-Vásquez et al., 2009). En España, se ha reportado a ToTV en infecciones mixtas con el Virus de la clorosis del tomate (ToCV) y el Virus mosaico del pepino (PepMV), sin detectar diferencias entre la sintomatología en coinfección con estos virus o la sintomatología mostrada solo por la infección con ToTV (Gómez et al., 2010).

2.6.2 Virus de la necrosis apical del tomate (ToANV) o Virus de la marchitez del tomate (ToMarV)

Durante los ciclos agrícolas 2003 y 2005, los productores de Sinaloa y Sonora creían haber observado la presencia de una nueva variante de TSWV, la cual infectaba plantas de tomate que contenían el gen de resistencia a TSWV Sw5. Sin embargo, durante el estudio realizado por Turina et al. (2007), no fue detectado TSWV, sino un diferente agente causal denominado ToANV. En esa misma época, Verbeek et al. (2007b) encontraron en áreas productoras de tomate de Sinaloa tanto en campo abierto como en invernaderos, síntomas de una

presunta virosis conocida por los productores como “marchitez”. Los investigadores mencionados demostraron que ese síndrome se debía al virus hoy conocido como ToMarV. Estudios realizados por Safanςon, et al. (2009) confirmaron que ambos virus ToANV y ToMarV pudieran pertenecer a la misma especie debido a que presentan homologías del 99%. Este virus presenta una partícula isométrica con un diámetro aproximado entre 28 y 30 nm. El genoma viral consiste de dos moléculas ssRNA de 7221 nts (RNA1) y 4898 nts (RNA2). Este virus contiene tres proteínas de la cápside de 35, 26 y 24 kDa, respectivamente (Figura 9) (Verbeek et al., 2007b; Turina et al., 2007).

Figura 9. Organización genómica del Virus de la marchitez del tomate. Posiciones relativas que contienen motivos de Helicasa (HEL), Proteasa (Pro), RNA dependiente de la RNA polimerasa (RdRP) en el RNA1 y una putativa proteína de movimiento (MP), tres proteínas de la cápside (Vp35, Vp26, Vp24) codificadas en el RNA2.

Los síntomas típicos causados por este virus son necrosis de las hojas, manchas necróticas oscuras en los frutos, casi siempre se presenta en frutos que no han completado la etapa de maduración. Las plantas severamente infectadas muestran necrosis y malformación en la parte apical, es por ello que el síntoma más distintivo de esta enfermedad es la necrosis en los puntos de crecimiento. Estos síntomas traen consigo pérdidas económicas, debido a que inhiben el crecimiento de las plantas de tomate, además que dejan los frutos incomerciables (Verbeek et al., 2008; Turina et al., 2007) (Figura 10).

Figura 10. Sintomatología reportada en hojas y frutos infectados con ToMarV. Paneles a y c, Necrosis apical de la planta; Panel b, Necrosis basal de foliolos; Paneles d, e, necrosis en frutos.

Existen pocos reportes sobre este virus. Hasta la fecha se reportan como hospedantes a cultivos comerciales tales como Solanum lycopersicum en campo. De manera experimental también se reportan a algunas malezas, tales como Physalis floridana, Chenopodium quínoa, Nicotiana occidentalis, N. benthamiana,

N. clevelandii, N. megalosiphon, N. glutinosa, N. tabacum (Verbeek et al., 2007; Turina et al., 2007).

Durante los ciclos agrícolas 2003 y 2005, este virus fue detectado en Culiacán, Sinaloa y se presume que en el estado de Sonora así como en Baja California se presenta una sintomatología muy similar, hasta la fecha no existen reportes de su presencia en los demás estados del país, así como en otros países del mundo (Verbeek et al., 2008; Turina et al., 2007).

2.6.3 Virus de la mancha del chocolate del tomate (ToChSV) o Virus del chocolate (ToChV)

En el ciclo agrícola 1999, los productores del valle de Salamá y otras áreas productoras de tomate en Guatemala, observaron una nueva enfermedad transmitida por mosca blanca la que localmente conocían como mancha de chocolate.

Las características particulares de este virus como sintomatología, morfología e insecto vector, lo clasifican como un miembro más del género Torradovirus (Batuman et al., 2010a;). Al momento de su caracterización se propuso el acrónimo de ToCSV para este virus, pero ITCV ya había aprobado este acrónimo para el Begomovirus Tomato curly stunt virus, por ello actualmente a este Torradovirus se le conoce como ToChSV (Batuman et al., 2010b). Este virus presenta una partícula isométrica con un diámetro aproximado entre 28 y 30 nm; y su genoma consiste de dos cadenas simples de RNAs, de las cuales una esta compuesta de 7500 nucleótidos, mientras que la segunda es de 5100 nucleótidos (Batuman et al., 2010a).

Los síntomas típicos causados por ToChSV en las hojas, ramas y peciolos son unas distintivas manchas necróticas, que eventualmente se expanden hasta el

tejido apical y ocasionan la muerte de estos. Las hojas infectadas inicialmente muestran epinastía y moteado, luego desarrollan manchas necróticas, especialmente en la porción basal de las nuevas hojas emergentes. Los frutos crecen relativamente pequeños, los cuales muestran unas pequeñas manchas de color café en el fruto (Batuman, et al., 2010a) (Figura 11).

Figura 11. Sintomatología del Virus de la mancha de chocolate reportada durante 2010. Panel a, Necrosis apical en la planta de tomate; Paneles b, d, e, f, Necrosis basal de foliolos en hojas de tomate; Panel c, Necrosis en fruto de tomate.

Existen pocos reportes sobre ToChSV, hasta la fecha solo se ha reportado atacando Solanum lycopersicum. El rango de hospedantes parcial, experimental de este virus, incluye a N. benthamiana, Capsicum annuum, Chenopodium quínoa, C. amaranticolor, Cucúrbita pepo, Datura stramonium, N. tabacum y Phaseolus vulgaris (Batuman et al., 2010a).

III. JUSTIFICACIÓN

El Estado de Sinaloa ocupa el primer en lugar en producción y exportación de hortalizas de invierno en el país, tan sólo en uno de sus productos, el tomate, contribuye con 32% de la producción nacional con un aproximado de 668,302.7 toneladas. El 80% de la fruta se exporta a Estados Unidos y Canadá (Martínez- Huerta, 2007; SIAP, 2012). Sin embargo, el cultivo de tomate es atacado por diversos agentes virales, los cuales son de suma importancia debido a que son responsables por pérdidas en el rendimiento y la calidad de los cultivos en todas partes del mundo, lo que da lugar a que los productores se vean obligados a cambiar los híbridos convencionales por otros tolerantes a dichas enfermedades, lo cual a futuro pudiese provocar a la aparición y/o infección de nuevos virus (Méndez-Lozano, comunicación personal). El género Torradovirus, se ha reportado infectando al cultivo de tomate alrededor del mundo, una de las sintomatologías mas criticas de este genero es la causada en fruto lo cual deja este comercialmente inviable. Actualmente no se han reportado pérdidas importantes por el Virus de la marchitez del tomate (ToMarV), sin embargo, se ha observado infectando severamente ciertos híbridos en Sinaloa. Así mismo se desconoce su distribución en las principales áreas productoras de tomate en el Noroeste de México, así como los reservorios naturales que este pueda tener en ausencia de cultivos, por lo que será de gran importancia la realización de la presente investigación para el desarrollo de estrategias de manejo o de prevención de dicha enfermedad en el cultivo de tomate.

IV. HIPÓTESIS

El Virus de la marchitez del tomate esta presente en cultivos de tomate y hospedantes alternos en las principales zonas productoras del Noroeste de México.

V. OBJETIVOS

Objetivo general

Detectar la presencia del Virus de la marchitez del tomate (ToMarV) en el Noroeste de México e identificar hospedantes alternos.

Objetivos específicos

 Determinar la presencia de ToMarV en el cultivo de tomate en las principales áreas productoras de los Estados de Baja California, Sonora, Sinaloa y Nayarit.

 Identificar hospedantes alternos de ToMarV en los Municipios de Ahome, Guasave, Culiacán y Cruz de Elota, Sinaloa.

 Analizar la infectividad del aislado ToMarV-Guasave en híbridos de tomate y chile.

VI. MATERIALES Y METODOS 6.1 Área de estudio

El presente estudio se realizó en los principales municipios productores de tomate del estado de Sinaloa, tales como Cruz de Elota, Guasave, Ahome, y Culiacán; así como, en el municipio con mayor producción de tomate en los estados localizados en el Noroeste de México: Ensenada en Baja California, Santiago Ixcuintla en Nayarit y Huatabampo en Sonora.

6.2 Colecta de muestras

En el presente trabajo se realizaron muestreos dirigidos preferentemente en aquellas plantas que se observó la sintomatología característica de marchitez. El número total de muestras por localidad, se tomó con base a un 2% del número total de hectáreas sembradas, considerando una muestra por hectárea. La colecta se realizó preferentemente en la etapa del cultivo de floración y fructificación, debido a que en esta etapa se presentan los síntomas representativos descritos para torradovirus.

Las muestras colectadas se depositaron en bolsas de polietileno, se etiquetaron y se trasladaron en una hielera provista de material refrigerante al Laboratorio de Virología del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Sinaloa. Cabe mencionar que al material vegetal de cada muestra colectada se le tomo una fotografía del síntoma utilizando una cámara fotográfica digital. Además con el objeto de contar con la posición exacta del área analizada, cada punto fue georeferenciado con la ayuda de un aparato de geoposición (GPS Marca Garmin).

En el Laboratorio de Virología, se procedió de inmediato a realizar los análisis moleculares correspondientes, o en su caso se almacenó suficiente tejido en un tubo eppendorf de 1.5 ml a -70ºC para análisis posteriores.

6.3 Extracción de RNA de tejido foliar

La extracción del RNA se realizó según el protocolo descrito por Singh (2002) modificado con sulfito de sodio. En un tubo eppendorf de 1.5 ml, se colocaron de 4-5 discos de tejido foliar de tomate sintomático de 9 mm de diámetro (0.05 a 0.1gr) y se agregaron 450 μL de buffer de extracción (0.1M Tris-HCl pH 7.4, 25mM MgCl2, 0.65% Na2SO4), se maceró con un pistilo estéril y posteriormente se incubó en hielo por 10 minutos. Inmediatamente después se adicionó 450 μL de la mezcla fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) y se homogenizó por 10 segundos utilizando un vortex (Fisher Vortex, Serie 158885). Una vez homogenizada la muestra, esta se centrifugó a 13,000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Se recuperó de 250-300 μL del sobrenadante por muestra en un tubo eppendorf de 1.5 μL, luego se adicionaron 50 μL de acetato de sodio 3M y 400 μL de alcohol isopropílico, se homogenizó 5 veces por inversión. Una vez homogenizadas las muestras, se incubó durante 1 hora o toda la noche a -20ºC y posteriormente se centrifugó a 13,000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se decantó y se lavó la pastilla obtenida con 1mL de alcohol etílico al 70% homogenizando 5 veces por inversión para centrifugarlo a 9,000 rpm por 5 minutos a 4ºC. Posteriormente el sobrenadante se decantó nuevamente y se dejó secar la pastilla entre 15 a 20 minutos, una vez que el alcohol etílico se volatizó la pastilla se resuspendió en 30 o 50 μL de agua ultra pura libre de RNAsa. Del total del material extraído, se tomaron 2 μL del RNA extraído se visualizó por electrofóresis en un gel de agarosa al 0.8% (apartado 6.4.4.). Finalmente, el RNA extraído se almacenó a -70ºC en un ultracongelador (REVCO, modelo: ULT1386-3-A39).

6.4 Detección molecular del Virus de la marchitez del tomate (ToMarV) por RT-PCR y PCR anidado. 6.4.1 Síntesis del cDNA de ToMarV

El RNA total extraído de las muestras colectadas se utilizó para la síntesis de cDNA mediante la técnica de RT-PCR. Para la síntesis de cDNA se utilizó una Transcriptasa Reversa (RT) de acuerdo a las recomendaciones del proveedor (Invitrogen corporation, Alameda, CA). Se utilizaron dos juegos de primers específicos (Cuadro 2). La reacción de RT consistió primeramente en mezclar 4.0 μL de RNA total con 0.66 pmol/μL de cada primer y se incubó esta reacción a 72ºC por 10 minutos; posteriormente se realizó un choque térmico colocando los tubos en hielo durante 3 minutos. Enseguida se adicionaron 9.0 μL de la mezcla de RT, la cual estuvo integrada por la solución amortiguadora (1X), 5.7 μL de agua ultra pura libre de RNAasa, 10 mM DTT, 0.2 mM dNTP’s y 1.33 U/μL de la enzima transcriptasa reversa M-ΜLV. Luego se incubó a 37ºC durante 60 minutos, para finalizar la actividad de la enzima se incubó a 70ºC por 10 minutos.

Figura 12. RNA2 del Genoma del Virus de la marchitez del tomate. La región delimitada por las flechas representa la amplificación de los primers reportados por Verbeek et al. (2008).

6.4.2 Detección de ToMarV y Control Interno por RT-PCR

El cDNA obtenido de cada muestra se sometió a amplificación por PCR de acuerdo a las recomendaciones del proveedor (Invitrogen corporation, Brasil) utilizando los primers anteriormente mencionados. La mezcla final de reacción consistió de una solución amortiguadora de PCR (1X), 2.0 mM de MgCl , 0.2 2

pmol/μL de cada uno de los primers (Cuadro 2), 0.2 mM de dNTP’s, 0.04 U/μL de Taq DNA polimerasa, 16.75 μL de agua ultrapura y 2.0 μL del producto del RT (cDNA). TM La mezcla de reacción se incubó en un termociclador Cicycler therma cycler (BIORAD, E.U.A.) con una temperatura inicial de desnaturalización de 95°C por 3 minutos. Cada ciclo se programó de la siguiente manera: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 48°C y 36 segundos a 72°C; durante 39 ciclos, con una extensión final a 72°C por 5 minutos. Para el caso de la detección del gen interno la temperaturas fueron las siguientes: temperatura inicial de desnaturalización de 95°C por 3 minutos. Cada ciclo se programó de la siguiente manera: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C y 3o segundos a 72°C; durante 35 ciclos, con una extensión final a 72°C por 5 minutos. 8 μL del producto de PCR se visualizó por electroforesis en gel de agarosa (apartado 6.4.4.).

6.4.3 Detección de ToMarV por RT-PCR anidado

Para incrementar la sensibilidad en la detección de ToMarV se realizó un PCR anidado utilizando los primers pJER-1123 y pJER-1124, diseñados para este trabajo, los cuales amplificaron un fragmente de 332pb (Cuadro 2) (Figura 13) utilizando como templado o molde el DNA obtenido durante el primer PCR. Para obtener la mezcla final, se utilizó lo siguiente: solución amortiguadora de PCR (1X), 2.0 mM de MgCl , 0.2 pmol/μL de cada primer (pJER-1123 y pJER-1124), 2 0.2 mM de dNTP’s, 0.04 U/μL de taq DNA polimerasa, 15.75 μL de agua ultrapura y 1.0 μL del producto del primer PCR. La mezcla de reacción se incubó en el termociclador, con una temperatura inicial de desnaturalización de 95°C por 3 minuto seguido de 34 ciclos de la siguiente manera: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 59.3°C y 1 minuto a 72°C; al finalizar los ciclos, se realizó una extensión de 72°C por 3 minutos. 8 μL del producto de PCR anidado se visualizó por electroforesis en gel de agarosa (apartado 6.4.4.).

Figura 13. Región de la Vp24 y 3’UTR de ToMarV. Región de amplificación de los primers pJER-1123/pJER-1124 diseñados para incrementar la sensibilidad en la detección de ToMarV mediante PCR anidado amplificando un fragmento de 332 pb.

Cuadro 2. Primers utilizados para la detección de Virus de la marchitez del tomate y gen ndhB

Fragmento Primer Secuencia (5’-3’) Posición Detección amplificado Reacción (nt)

AtropadNad2-1a GGACTCCTGACGTATACGAAGGATC ndhB Control Interno 188 RT-PCR

AtropadNad2-2b AGCAATGAGATTCCCCAATATCAT Especifico ToMarV-F AGTGAGTTCCATTGAGATA RNA2 ToMarV 511 RT-PCR Especifico ToMarV-R TAAAGGAAATTATCGAGTTCC ToMarV Anidado de pJER-1123 CCCAACCTCCTTCTGCCAACCAT RNA2 ToMarV-F PCR Anidado de 332 anidado pJER-1124 TCTAACCAAGCAGGGCACACG ToMarV-R La secuencias de los primers fueron derivadas de las secuencias depositadas en el GenBank: ToMarV = EF681765 (RNA2) (Verbeek, et al., 2008)

6.4.4 Electroforesis

Para visualizar la calidad del RNA y productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 0.8% y 1% respectivamente. La agarosa se disolvió en 100 mL de una solución de buffer TAE 0.5X (40 mM Tris acetato pH 8.0, 1mM EDTA) aplicando calor utilizando un horno de microondas (Turntable Microwave Oven. Serie RXZ015). Posteriormente se agregó 0.8 μl de Bromuro de Etidio (10 mg/μL) y se vertió en la base de la cámara de electroforesis colocando los peines para formar los pozos, se dejó enfriar. Una vez gelificada la agarosa, se depositó la base dentro de la cámara de electroforesis conteniendo buffer TAE 0.5X. Para cargar el RNA total en el gel de agarosa, se mezcló 3 μL de RNA con 2 μL de colorante naranja G (Glicerol 30%, 25 mM EDTA pH 8.0, 0.025% de colorante naranja G). Por otro lado, para cargar el producto del PCR y PCR anidado, se mezcló 8 μL de producto de PCR con 2 μL del colorante naranja G. Para la electroforesis se utilizaron 4 μL de marcador de peso molecular 1Kb (Invitrogen, USA) para el PCR y PCR anidado. Se utilizó una fuente de poder (Termo EC EC4000P, Serie 02E200016-1B) a 75 V, durante 45 minutos para el caso del RNA total; 85 V durante 60 minutos para los productos de PCR y PCR anidado. Finalmente, el gel se visualizó en un fotodocumentador de imágenes CHEMIC DOC (BIORAD, E.U., Serie 76S/07029).

6.4.5 Purificación del producto de RT-PCR anidado

Una vez amplificado el fragmento de interés, éste se purificó de acuerdo a las especificaciones del proveedor mediante el kit de purificación “Wizard sv Gel” y “PCR clean-up system”, en donde se añadió un volumen igual de la solución “Membrane Binding2 a la reacción, al mismo tiempo se insertó la columna (SV Minicolumna) en el tubo colector. Una vez realizado el paso anterior, se procedió a transferir el producto de PCR a la minicolumna ensamblada, incubando por 1 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 14,000 rpm. Se descartó el

sobrenadante y se colocó la columna, se añadió 700 µl de la solución (Membrane Wash), se centrifugó nuevamente a 14,000 rpm por 1 min, se descartó el sobrenadante y se colocó la minicolumna en el tubo colector. Posteriormente se realizó otro lavado añadiendo solo 500 µl de la solución Membrane Wash y se centrifugó por 5 minutos. Nuevamente se decantó lo colectado y se centrifugó la columna ensamblada por 1 minuto; se dejó secando aproximadamente por un lapso de 10 minutos, posteriormente se transfirió cuidadosamente la columna a un tubo nuevo de 1.5 ml, en donde se le añadió 30 µl de agua libre de nucleasas a la minicolumna. Se incubó a temperatura ambiente por un minuto; se centrifugó nuevamente a 14,000 rpm durante 1 minuto, finalmente se descartó la minicolumna y se almacenó el DNA a -20ºC.

6.4.6 Ligación del producto de RT-PCR anidado

Los productos de PCR fueron ligados en el vector de clonación pGEM-T Easy Vector System (Promega Madison, WI, USA), realizando la siguiente metodología: en un tubo eppendorf de 1.5mL, se agregó 5 μL del buffer de ligación 2X, 1 μL del vector pGEM-T (50ng), 3 μL de producto de PCR limpio y 1 μL de la enzima T4 ligasa (3 U). La reacción de ligación se mezcló cuidadosamente y se incubó a 4°C durante toda la noche.

6.4.7 Transformación

Para ello se agregaron 2 μL de producto de la ligación a 30-50 μL de células competentes (JM109), posteriormente se incubó en hielo durante 30 minutos e inmediatamente recibieron un choque térmico a 42°C por 50 segundos. Posteriormente se incubó en hielo por 2 minutos; después se agregó 950 μL de medio SOC (97 mL de agua destilada, bactotriptona 2 g, extracto de levadura 0.55 g, 1 mL deNaCl 1M y 0.25 mL de KCl 1M, disolver, esterilizar y enfriar). Se

2+ adicionó 1 mL de Mg 2M (MgCl 1M, MgSO 1M) y 1 mL de glucosa 2M, pH 7.0); 2 4 después se incubó 1.5 horas a 37°C con agitación constante (250 rpm). Posteriormente, en la campana de flujo laminar, se agregó 100 μL de células transformadas a placas con medio LB sólido la cual contenía ampicilina con una concentración de 100 ng/ml, además de los componentes de selección por color (10 μL de IPTG 0.1M y 20 mg/μL de X-GAL) los cuales se adicionaron 30 minutos antes de transferir las células en el medio sólido. El resto de las células transformadas se centrifugó a 10,000 rpm por 1 minuto para obtener un concentrado de las células. Se decantó aproximadamente 800 μL del sobrenadante y la pastilla se resuspendió en 50 μL. La placa se incubó a 37°C durante 14-16 horas.

6.4.8 Extracción del DNA plasmídico (Miniprep)

La extracción de DNA plasmídico (Miniprep) se realizó con base al método descrito por Birboin and Doly, (1979). Se seleccionaron colonias de las células transformadas (colonias blancas) y se sembraron en 5 mL de medio LB líquido, el cual contenía ampicilina a una concentración de 100 ng/μL. Las células seleccionadas se incubaron a 37°C por 16 horas con agitación (250 rpm), posteriormente se tomaron 1.5 μL del cultivo en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se centrifugó a 10,000 rpm por un minuto, paso que se repitió dos veces, se eliminó el sobrenadante e inmediatamente se agregaron 100 μL de solución I (50 mM Glucosa, 10 mM EDTA, 25 mM Tris HCl pH 8.0 y 1mg/μL de RNAsa), se resuspendió virtiendo el tubo 5 veces, se agregaron 200 μL de solución II (75 μL de agua, 20 μL de 1N NaOH y 5 μL de 20% SDS) (este reactivo se preparó justo antes de ser usado) y se mezcló por inversión. Posteriormente se agregaron 150 μL de la solución III (24.6 g. de acetato de sodio, 40 μL de agua, pH 8.0 ajustado con ácido acético glacial y aforado a 100 μL con agua), mezclándose por inversión y se centrifugó a 10,000 rpm por 8 minutos. Se tomó el sobrenadante y se transfirió a un tubo nuevo. Se precipitó el DNA agregando 800 μL de etanol

absoluto (a temperatura ambiente); se mezcló por inversión, se centrifugó a 10,000 rpm por 8 minutos y se decantó el sobrenadante. Se lavó la pastilla agregando 1μL de alcohol etílico al 70 % y se centrifugó nuevamente a 10,000 rpm por 3 minutos, posteriormente se decantó el sobrenadante y se dejó secar la pastilla. Finalmente, se resuspendió la pastilla en 30-50 μL de agua ultra pura.

6.4.9 Restricción del DNA plasmídico

Con el objeto de corroborar la inserción del fragmento de PCR en el vector de clonación, se realizó una reacción de restricción con la enzima Eco RI. Con este fin en un tubo se mezclaron 5.5 μL de agua ultra pura, 1 μL del Buffer 10X, 0.5 μL de la enzima Eco RI (40 U/μL) y 3 μL de DNA plasmídico (1 μg), se incubó la reacción por dos horas a 37°C. Luego la reacción se visualizó por electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 0.8 % teñido con Bromuro de Etidio, utilizando un marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen, USA).

6.4.10 Purificación del DNA plasmídico para secuenciación

Para confirmar la identidad del fragmento clonado, se realizó la purificación de DNA plasmídico para su posterior secuenciación de acuerdo a las recomendaciones del proveedor del Kit Wizard. Primeramente se crecieron las células transformadas en medio LB líquido con ampicilina, posteriormente se centrifugó a 13,000 rpm durante un minuto y se decantó el sobrenadante. Se adicionaron 250 µl de la solución CRA y se homogenizó en vortex, se adicionó 250 µl de la solución CLA y se homogenizó por inversión. Posteriormente se adicionaron 10 µl de la proteasa alcalina y se agitó por inversión, se dejó incubando a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después se adicionaron 350 µl de la solución NSB y se centrifugó por 10 minutos a 13,000 rpm. El sobrenadante se colocó en la columna y se centrifugó durante un minuto a 13,000 rpm. Se decantó lo colectado y se le adicionaron 750 µl de la solución de lavado

(CWA), se centrifugó durante un minuto a 13,000 rpm, se decantó el líquido que paso por la columna, se adicionó 250 µl de la solución de lavado. Posteriormente se centrifugó por 2 minutos a 13,000 rpm, se decantó el sobrenadante y se centrifugó durante un minuto a 13,000 rpm. Finalmente se colocó la columna en un tubo nuevo de 1.5 ml y se adicionaron 20 µl de agua libre de DNAsas y se centrifugó durante un minuto a 13,000 rpm; posteriormente se almacenó el DNA a -20ºC.

6.4.11 Cuantificación del DNA plasmídico

La cuantificación de DNA plasmídico se realizó con el Kit comercial Quant-it dsDNA HS (Invitrogen). En un tubo falcón se preparó la solución de trabajo diluyendo el fluoróforo (“picogreen”) en el buffer (1:200). Para los estándares, en tubos Eppendorf de 600 μl (lisos), se adicionaron 190 μl de la solución de trabajo y 10 μl de cada estándar, agitándose por dos a tres segundos. Para las muestras de DNA a evaluar, se adicionaron 199 μl de la solución de trabajo y 1 μl de DNA plasmídico (diluido 10 veces). Los tubos se incubaron a temperatura ambiente por dos minutos. Posteriormente, se procedió a la calibración del fluorómetro (Qubit, Invitrogen, Turner Biosystems) con los dos estándares y se tomó la lectura para cada muestra. Los valores dados por el fluorómetro se dan en ng/ml. Para calcular la concentración de las muestras se utilizó la siguiente ecuación:

Concentración de DNA = (F) (200/X) Donde: F = Valor dado por el fluorómetro (ng/ml) X= N° de microlitros de DNA adicionados a cada tubo Eppendorf

6.4.12 Secuenciación y análisis de la secuencia

La secuenciación de los fragmentos amplificados y clonados se realizó en el laboratorio de Química de DNA del CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato, empleando el Kit Terminator Cycle Sequencing, Ready Reaction, en un secuenciador ABI PRISM 377 PERKIN-ELMER (Cetus, Norwalk, CT). Las secuencias se compararon con otras secuencias del género Torradovirus, depositadas en el GenBank del National Center for Biological Information (NCBI) (http://www.ncbi.nml.nhi.gov/), utilizando el programa BLAST. Finalmente se realizó el análisis filogenético con la ayuda del paquete MegAlign del programa de software DNASTAR (version 2.0 Madison, Wisconsin, USA). Para el análisis, se utilizaron las siguientes secuencias de Torradovirus: Virus torrado del tomate (ToTV:NC_009032), Virus de la necrosis apical del tomate (ToANV: VE434/EF063642), Virus de la marchitez del tomate (ToMarV: EF681765 ), Virus del chocolate del tomate (ToChV: ToChV-G01/FJ560490.1), Virus de la mancha de chocolate (ToChSV: GQ305132.1) y el Virus del mosaico de la calabaza (NC_003800).

6.5 Infectividad del aislado de ToMarV-Guasave en híbridos de tomate y chile

Se realizaron dos bioensayos de infectividad en seis genotipos de tomate y tres de chile. Los materiales de tomate evaluados fueron: Brigade, Maya, Tisey, Aptx, y Sun 6200. Los de chile fueron: dos materiales del tipo morron (M10 y Orange) y uno de Anaheim. Los genotipos se arreglaron en un diseño completamente al azar con 8 repeticiones, la unidad experimental consistió de una planta inoculada con ToMarV-Guasave. Las semillas de los genotipos fueron germinados en petmoss húmedo y las plántulas se transfirieron a vasos de poliestireno de ¼ de kg conteniendo sustrato peatmoss. Se mantuvieron en condiciones controladas a temperatura de 25°C y con un fotoperiodo de 16 horas luz/ 8 de oscuridad.

6.5.1 Obtención del inóculo de ToMarV-Guasave y transmisión mecánica en plantas de tomate y chile.

Se obtuvo un aislado de ToMarV-Guasave proveniente de plantas colectadas en campos de tomate. La presencia del virus en los tejidos sintomáticos se confirmo mediante RT PCR anidado. Se inocularon mecánicamente ocho plántulas por cada genotipo de tomate y chile respectivamente, las cuales presentaban de 4 a 5 hojas verdaderas. En cada genotipo se dejaron dos plántulas adicionales sin inocular como testigos sanos (control negativo). El inóculo consistió de fruto de tomate y follaje de chile. El inóculo se maceró en Buffer 0.03M de fosfato/sodio pH 7.7 a 6 °C (Verbeek et al., 2008) utilizando 4 mL por cada gramo de tejido infectado. A cada planta se le agregó carborúndum de 600 mallas pulg2 en la hoja (Quintero-Benitez, 2002). Las plántulas de los genotipos evaluados se inocularon en sus dos primeras hojas apicales, frotándolas con un hisopo de algodón impregnado con el inóculo. Posteriormente se lavaron las hojas inoculadas con agua destilada y las plántulas se mantuvieron en un cuarto de crecimiento, con fotoperiodos 16 horas luz 8 obscuridad.

6.5.2 Detección de ToMarV en plantas de tomate y chile inoculadas

La presencia o ausencia de ToMarV en las plantas inoculadas, se confirmó a los 30 días después de la inoculación en tomate y a los 15 días en chile. Se tomaron dos muestras de 1.0 g de tejido foliar en todas las plantas inoculadas (tanto sintomáticas como asintomáticas) para someterlas a la prueba de RT-PCR anidado (Apartado 6.4).

6.5.3 Sintomatología inducida por ToMarV

En este ensayo se observaron y registraron los síntomas presentes en las plantas inoculadas cada 3 días, durante 30 días en tomate y 15 días en chile.

6.5.4 Infectividad

Al final del ensayo para cada genotipo se analizó la incidencia de plantas infectadas por el virus y la severidad de la enfermedad. Se consideró cómo planta infectada a aquella que mostró síntomas y/o que resultó positiva para ToMarV en la prueba de RT-PCR anidado.

VII. RESULTADOS

7.1 Presencia del Virus de la marchitez del tomate en el Noroeste de México

7.1.1 Colecta de muestras de plantas de tomate

Durante los años agrícolas 2011-2012 se colectaron un total de 302 muestras de tomate cultivadas a campo abierto e invernadero, procedentes de los siete municipios con mayor producción de tomate, en los Estados de Baja California, Sonora, Sinaloa y Nayarit (Figura 14). Los muestreos se realizaron preferentemente en plantas con sintomatología de necrosis y/o marchitez en follaje y frutos.

Figura 14. Municipios muestreados en el Noroeste de México. 1, Guasave (Sinaloa); 2, Ahome (Sinaloa); 3, Huatabampo (Sonora); 4, Tepic (Nayarit); 5, Ensenada (Baja California); 6, Elota (Sinaloa); 7, Culiacán (Sinaloa).

En los recorridos de los predios de Guasave y Ahome (Norte de Sinaloa) se observó sintomatología en plantas de tomate durante la etapa de desarrollo vegetativo que varió de necrosis basal de foliolos a necrosis apical (Figura 15)

Figura 15. Sintomatología de marchitez en plantaciones de tomate en el Norte de Sinaloa. Paneles a, b, d, necrosis apical de las plantas; Paneles c, e, f,) necrosis basal de foliolos.

Sin embargo, al visitar los predios de cultivos de tomate en etapa de producción, la necrosis en frutos fue severa, con efecto importante en la calidad de la cosecha (Figura 16).

Figura 16. Frutos observados en plantas de tomate en campo en el Norte de Sinaloa. Panel a, fruto asintomático; Paneles b, c, necrosis en fruto colectados en Ahome; Paneles d, e, f, necrosis en fruto colectados en Guasave.

Durante los recorridos de campo en La Cruz de Elota (Centro-Sur de Sinaloa) se observó sintomatología típica de necrosis en foliolos y fruto (Figura 17).

Figura 17. Sintomatología observada en plantas de tomate en el municipio de Elota. Paneles a, b, necrosis basal y apical de foliolos, respectivamente; Paneles c, d, Necrosis presente en fruto.

En el municipio de Culiacán se observó necrosis solamente en los frutos, pero no en follaje. La sintomatología de necrosis no fue similar a la reportada por Veerbek et al., 2008; sin embargo, se analizaron estas muestras debido a que en 2008 el virus de ToMarV ya había sido reportado en ese mismo Municipio (Verbeek et al., 2008) (Figura 18).

Figura 18. Sintomatología observada en fruto de tomate en el municipio de Culiacán. Paneles a, b, c, d, Necrosis en fruto.

Durante el recorrido en Huatabampo, Sonora, se observó sintomatología similar a la observada en Guasave, Ahome y Elota del estado de Sinaloa (Figura 19).

Figura 19. Sintomatología de marchitez y/o necrosis presente en plantas de tomate en el municipio de Huatabampo, Sonora: Paneles a, b, necrosis basal y apical de foliolos, respectivamente; Paneles c, d, necrosis en fruto.

Con respecto al muestreo realizado en Tepic, Nayarit, las muestras colectadas en campo presentaron sintomatología de necrosis en fruto, sin embargo, la necrosis observada se asoció con la inducida por el Virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV, Tospovirus). Con la finalidad de descartar si la necrosis estaba asociada a ToMarV se analizaron dichas muestras (Figura 20).

Figura 20. Sintomatología observada en fruto de tomate en Tepic, Nayarit. Paneles a, b, c, d, necrosis presente en fruto de plantas de tomate.

Finalmente se colectaron muestras en Ensenada, Baja California observándose sintomatología de necrosis y poco desarrollo del fruto con baja incidencia. Así mismo, se observó plantas con daño de marchitez púrpura similar a la reportada para una nueva especie del género Torradovirus reportada en Guatemala por Batuman et al., 2010 (Figura 21).

Figura 21. Sintomatología observada en plantas de tomate en el Municipio de Ensenada, Baja California. Panel a, fruto con maduración temprana; Panel b, necrosis en fruto; Panel c, necrosis púrpura putativa a ToCSV:Torradovirus; Panel d) amarillamiento de foliolos.

En las plantaciones de los cuatro Estados se colectaron un total de 302 muestras. Es importante señalar que 145 presentaron sintomatología de marchitez y/o necrosis en plantas o frutos, mientras que 157 manifestaron síntomas asociados a otros géneros virales transmitidos por mosca blanca (Figura 22).

Figura 22. Sintomatología asociada a géneros de virus transmitidos por mosca blanca presente en plantas de tomate en el Noroeste de México: Panel a, enanismo; Panel b y e, enrrollamiento de foliolos; Panel c, moteados; Panel d, amarillamiento intervenal; Panel f, deformación de foliolos.

7.1.3 Extracción de RNA En el Laboratorio de Virología del CIIDIR Unidad Sinaloa, se realizó la extracción de RNA de tejido foliar, según el protocolo de Singh descrito anteriormente. En el análisis electroforético se observó que en la mayoría de las extracciones de las muestras se obtuvo RNA total de buena calidad (Figura 23) lo cual es de vital importancia para una buena detección de virus por PCR.

8 9 Figura 23. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% de RNA total de tejido de tomate. Carriles 1-20, RNA total de muestras de tomate. 10 7.1.4 Detección molecular de ToMarV mediante RT-PCR y RT-PCR anidado en muestras de tomate del Noroeste de México.

Una vez que se obtuvo el RNA total íntegro se realizó la detección mediante RT-PCR utilizando los oligos ToMarV-F y ToMarV-R reportados por Verbeek et al., 2008, amplificando un fragmento de 511 pb. Los resultados iniciales fueron poco favorables debido a que se detecto al virus en solamente en seis de 26 muestras colectadas en el Norte de Sinaloa (Figura 24a). Esto a pesar de observarse sintomatología típica de marchitez en las muestras analizadas. Razón por la que se determinó el diseño de los primers pJER1123/pJER1124 para modificar el análisis mediante PCR anidado e incrementar la sensibilidad de la técnica y evitar falsos negativos. Los resultados obtenidos con esta ultima técnica fueron favorables, pues se detecto a ToMarV en la mayoría de las muestras anteriormente analizadas en las que se habían obtenido resultados negativos mediante RT-PCR (Figura 24b).

Figura 24. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en muestras de tomate en el Norte de Sinaloa. Panel a, RT-PCR utilizando los oligos ToMarV-R y ToMarV-F; Panel b, PCR anidado con los primers pJER-1124 y pJER-1125. Carril 1-4 y 10-26, muestras de tomate de Ahome; Carril 5-8, muestras de tomate de Guasave.

Adicionalmente se analizaron muestras representativas de cada localidad con la finalidad de corroborar una detección apropiada y descartar posibles errores, pues el hecho de no detectar al virus puede deberse a su ausencia, pero también, a un posible inhibidor de la reacción presente en el RNA total extraído. Para ello se realizó un RT-PCR de las muestras utilizando como control interno un mRNA de la planta (gen ndhB) para validar la calidad del RNA. Los resultados de detección indicaron la amplificación por PCR anidado del fragmento de 332 pb correspondiente al virus de ToMarV en plantas colectadas en Cruz de Elota, Guasave, Ahome y Huatabampo (Figura 25b). En Baja California y Nayarit no se detectó el virus en las muestras colectadas (Figura 25a y b). Sin embargo, el hecho de amplificar el gen constitutivo en todas las muestras en el análisis, sugirió un RNA integro para la detección por RT-PCR y aunado al PCR anidado se logró

establecer una apropiada detección de ToMarV en plantas con baja carga viral (Figura 25c)

Figura 25. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en muestras de tomate del Noroeste de México. Panel a) RT-PCR utilizando primers ToMarV-R y ToMarV-F, Panel b) RT-PCR anidado utilizando los primers pJER1123 y pJER1124. Panel c) PCR de control interno utilizando los primers AtropadNad2-1a y AtropadNad2-2b; carril 1-2, control negativo; carril 3, marcador de peso molecular (1kb); carril 4, control (+) RNA de planta con baja carga viral; carriles 5, 6, muestras de tomate de Tepic; carriles 7, 8, muestras de tomate de Elota; carriles 9,10, muestras de tomate de Culiacán; Carriles11, 12, muestras de tomate de Guasave; carriles13, 14, muestras de tomate de Ahome; carriles15, 16, muestra de tomate de Huatabampo; carriles 17, 18, muestras de tomate de Ensenada.

Una vez estandarizada la técnica de detección se procedió analizar el resto de las muestras colectadas en el Noroeste de México. Se logró detectar por PCR anidado la presencia de ToMarV en 86 muestras. De las 86 muestras positivas para ToMarV 15 fueron de Huatabampo, 37 de Ahome, 22 de Guasave y 12 de Elota. Sin embargo, en los estados de Nayarit y Baja California no se logró detectar a ToMarV en ninguna de las muestras analizadas por lo que no podemos asociar la sintomatología observada en campo al virus ToMarV (Cuadro 3).

Cuadro 3. Muestras de tomate procedentes del Noroeste de México analizadas durante 2011-2012. Detección de Sintomatología ToMarV N. Campos Muestras RT- RT-PCR Año Estado Municipio Necrosis Otros mapa analizados colectadas PCR anidado 1a Ahome 5 70 54 16 10 37 Sinaloa 2 a Guasave 4 52 22 30 8 22 3 a Sonora Huatabampo 4 43 30 13 2 15 2011 4 a Nayarit Tepic 6 30 6 24 0 0 Baja 5 a Ensenada 3 50 4 46 0 0 California 6 a Elota 3 30 19 11 2 12 Sinaloa 2012 7 a Culiacán 5 27 10 17 0 0 Total 30 302 145 157 22 86 aEl número indica la localidad correspondiente en figura 11.

7.1.5 Identificación molecular de ToMarV en muestras de tomate en el Noroeste de México.

Para realizar la identificación molecular, los fragmentos amplificados por PCR, procedentes de los estados de Sinaloa y Sonora se clonaron en el vector pGEM®-T Easy. Para determinar la identidad de las fragmentos se enviaron a secuenciar cuatro clonas obtenidas de muestras de Sinaloa (Ahome2010a, Ahome2010b, Guasave2010a, Guasave2010b) y dos de Sonora (Sonora2010a y Sonora2010b). Las secuencias nucleotídicas obtenidas (Apéndice 1) se compararon con otras secuencias de Torradovirus depositadas en el “GenBank del National Center for Biological Information” (NCBI) (http://www.ncbi.nml.nhi.gov/)

utilizando el programa BLAST. Posteriormente se realizó un análisis basado en la alineación de la región que codificada en el RNA 2, utilizando el método joining neirbord (W Clúster) (Figura 26). Con este análisis se confirmó que los fragmentos amplificados pertenecieron a la especie ToMarV del nuevo género Torradovirus, ya que poseen porcentajes de identidad del 89 al 93% con el Virus de la marchitez del tomate.

Figura 26. Análisis filogenético de las secuencias del ToMarV procedentes de aislados de tomate del Noroeste de México comparadas con otras secuencias disponibles en el Gen Bank.

7.2 Identificación de hospedantes alternos a ToMarV en el estado de Sinaloa

7.2.1 Colecta de muestras

Para la identificación de ToMarV en hospedantes alternos en Sinaloa, se colectaron malezas en los municipios de Ahome, Guasave y Elota. Las muestras colectadas se ubicaron en los linderos de cultivos de tomate que presentaban la sintomatología de marchitez asociada a ToMarV. En total se colectaron 42 muestras de los cuales 23 procedieron del municipio de Ahome, 6 de Guasave y 13 de Elota (Cuadro 4). La mayoría de las malezas colectadas en este trabajo no mostraron síntomas (Figura 27).

Figura 27. Principales hospedantes alternos colectados en Sinaloa. a, Rynchosia minima: amarillamiento ligero; b, Rumex crispus: asintomática; c, Portulaca oleraceae: asintomática; d, Solanum nigrum: asintomática; e, Amaranthus spp: asintomática; f) Physalis acutifolia: leve amarillamiento.

7.2.2 Detección molecular de ToMarV en hospedantes alternos

Existen reportes de la importancia que juegan las malezas en la epidemiología de los virus fitopatógenos, es por ello que en este trabajo se realizó la detección molecular en especies de malezas ampliamente distribuidas en Sinaloa. La detección molecular se realizó mediante la técnica de RT-PCR anidado, obteniéndose un total de 12 muestras que amplificaron el fragmento de 332 pb para ToMarV de 42 colectadas (Cuadro 4) (Figura 28).

Cuadro 4. Análisis de la detección molecular de ToMarV en hospedantes alternos.

Positivas para ToMarV/ Municipio Familia Nombre científico Nombre Común No. muestras colectadas Solanaceae Solanum nigrescens Chiquelite 0/2 Chenopodiaceae Chenopodiumambrosioides Chual 1/1 Asteraceae Taraxacum officinaiis Diente de león 0/1 Asteraceae Heliathus annus Girasol 0/1 Amarantaceae Amaranthus spp. Bledo 2/3 Asteraceae Parthenium hysteroporus Estafiate 0/2 Ahome Malvaceae Sida spp. Malvita 0/6 Convolvulaceae Convolvus spp. Correhuela 0/1 Portulacaceae Portulaca oleraceae Verdolaga 1/1 Solanaceae Physalis acutifolia Tomatillo 1/1 Fabaceae Rynchonsia minima Frijolillo 0/1 - Maleza No identificada* - 1/1 Polygonaceae Rumex crispus Lengua de vaca 1/1 Solanaceae Tomate voluntario - 0/1 Chenopodiaceae Chenopodium ambrosinoides Chual 1/1 Guasave Fabaceae Trifolium spp. Trebolillo 1/1 Asteraceae Tagetes erecta Cempasúchil 1/1 Solanaceae Solanum nigrescens Chiquelite 2/2 - Maleza no identificada* - 0/3 Amarantaceae Amaranthus spp. Bledo 0/6 Solanaceae Solanum nigrescens Chiquelite 1/2 Elota Solanaceae Physalis acutifolia Tomatillo 0/2 Portulacaceae Portulaca oleraceae Verdolaga 0/1 - Maleza no identificada* - 0/1 Total 12/42

Figura 28. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en hospedantes alternos en el estado de Sinaloa. Panel a: PCR utilizando los primers ToMarV-R y ToMarV-F, Panel b: PCR anidado con los primer pJER1123 y pJER1124, Panel c: PCR de control interno mediante los primers AtropadNad2-1a y AtropadNad2-2b, (-C): control negativo, (1kb): marcador de peso molecular, (+) control positivo, Carriles 1-15: hospedantes alternos.

Por otra parte, durante el desarrollo de la presente investigación se detecto una enfermedad en el cultivo de chile de invernadero en la región Norte de Sinaloa. Las muestras presentaban moteado, amarillamiento, ampollamiento y acucharamiento de los foliolos (Figura 29).

Figura 29. Sintomatología de muestras de chile colectadas en Sinaloa. a) Moteado; b) Amarillamiento; c) Ampollamiento; d y e) Acucharamiento de las hojas.

En una primera instancia en el laboratorio de Virología se realizó un análisis de detección molecular por PCR de las muestras de chile para los virus del género Begomovirus y Crinivirus previamente reportados en el Estado y que se transmiten por mosca blanca. Los resultados de las muestras no indicaron la presencia de ninguno de los dos virus descritos previamente.

Tomando en cuenta que el género Torradovirus también se transmite por mosca blanca y siendo ToMarV una de las especies que pertenece a éste género se analizaron dichas muestras y se colectaron muestras adicionales de chile en predios cercanos a sembradíos de tomate con sintomatología de necrosis en cultivos encontrados en Guasave y Cruz de Elota durante el mismo ciclo agrícola. La detección molecular mostró una amplificación de un fragmento de 322 pb sugiriendo la presencia de ToMarV en el cultivo de chile en los materiales colectados tipo Mini Bell, Bell Pepper y Anaheim (Figura 30b carriles, 3, 5, 6, 7, 9, 11 y 12).

Figura 30. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV en muestras de chile en el estado de Sinaloa. Panel a: RT-PCR utilizando los primers ToMarV-R y ToMarV-F, Panel b: PCR anidado utilizando los primer pJER1124 y pJER1125, Panel c: PCR de control interno utilizando los primers AtropadNad2-1a y AtropadNad2-2b, (-C): control negativo, (1kb): marcador de peso molecular, (+): control positivo de ToMarV, Carriles 1-5: muestras de chile de tipo Mini Bell del Municipio de Guasave, Carriles 6-10: muestras de chile de tipo Bell Pepper del Municipio de Elota, Carriles 11-15: muestras de chile de tipo Anaheim del Municipio de Guasave.

En total se logró detectar a ToMarV en siete muestras de chile de 12 colectadas en el municipio de Guasave y cuatro de seis muestras de chile colectadas en Cruz de Elota (Cuadro 5).

Cuadro 5. Muestras de plantas de chile colectadas en Sinaloa, a partir de las cuales se logró detectar a ToMarV, mediante PCR anidado en 2010-2011.

Año Muestras infectadas/ Municipio Nombre científico Material Agrícola muestras colectadas Guasave Capsicum annuum Mini Bellpepper 5/7 2010- Guasave Capsicum annuum Anaheim 2/5 2011 Elota Capsicum annuum Bell pepper 4/6 Total 11/18

7.2.3 Identificación molecular de ToMarV en muestras de hospedantes alternos en el estado de Sinaloa.

La identificación molecular de los fragmentos amplificados por PCR anidado de muestras de malezas y chile se clonaron en el vector pGEM®-T Easy. Posteriormente se enviaron a secuenciar 10 clonas de malezas (ChenopodiumAHO2011a, ChenopodiumAHO2011b, TriboliumGVE2011a, TriboliumGVE2011b, TagetesGVE2011a, TagetesGVE2011b, ChenopodiumGVE2011a, ChenopodiumGVE2011b, SolanumGVE2011a y SolanumGVE2011b) y 4 de chile (CapsicumGVE2011a, CapsicumGVE2011b, CapsicumGVE2011c y CapsicumGVE2011d). El análisis se realizó basado en la alineación de la región que codificada en el RNA 2, utilizando el método joining neirbord (W Clúster). Se realizó la filogenia de las clonas secuenciadas de muestras de malezas y chiles secuenciadas (Figura 31 y 32, respectivamente). Los resultados del análisis nos indicaron que los fragmentos amplificados pertenecieron a la especie ToMarV del género Torradovirus. Durante el análisis se obtuvieron porcentajes de identidad de 93.2% con ToMarV, 85% con ToANV,

77% con TCSV, 68% con TChV y 67% con ToTV, aislados de Torradovirus previamente reportados.

Figura 31. Árbol filogenético de las secuencias de ToMarV aisladas a partir de malezas comparadas con otras secuencias disponibles en el Gen Bank.

Figura 32. Árbol filogenético de las secuencias de ToMarV aisladas a partir del cultivo de chile comparadas con otras secuencias disponibles en el Gen Bank.

7.3 Análisis de la infectividad del aislado de ToMarV-Guasave en híbridos de tomate y chile.

En este bioensayo los híbridos Brigade y APTX-271 a los 15 días posteriores a la inoculación (dpi) se observó una reducción de su tasa de crecimiento (Figura 33 d, y e) mientras que el híbrido Tisey no mostró disminución tan marcada (Figura 33a). Cabe mencionar que otras de las sintomatologías observadas durante este análisis fue el aborto de inflorescencias (Figura 33b), mientras que algunas plantas del híbrido Brigade a los 60 dpi presentaron necrosis basal de foliolos (Figura 33c).

a) b) c)

d) e)

f) g)

Figura 33. Sintomatología observada durante el bioensayo de infectividad de ToMarV en plantas de tomate. Paneles a, d, e, f, g: reducción de la tasa de crecimiento, Panel b: aborto de flor, Panel c: ligera necrosis basal de foliolos.

Para determinar que la sintomatología observada en dichos híbridos fue ocasionada por el aislado ToMarV- Guasave, se realizó la detección a los 30 dpi mediante RT-PCR y PCR anidado (Figura 34). Los resultados mostraron la amplificación de una banda del tamaño esperado de 322 pb para ToMarV en los materiales APTX (Figura 34a, carril 7 y 11), Sun 6600 (Figura 34b, carril 30), B rigade (Figura 34b, carriles 35-40 y Maya (Figura 34c, carriles 47-50). 61

Figura 34. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la detección molecular de ToMarV mediante RT-PCR y PCR anidado en híbridos de tomate inoculados mecánicamente.

Los resultados concuerdan con lo observado en los muestreos realizados en campo, es decir mostraron la misma tendencia de tolerancia a ToMarV en los materiales de tomate analizados. El ToMarV-Guasave mostró mayor infectividad en el híbrido Brigade, causando infección en cinco plantas de seis inoculadas. Así mismo, se observó que en el material Tisey no se detectó a ToMarV en las plantas inoculadas. Este hecho, sugirió a Tisey como un material capaz de tolerar la infección de ToMarV-Guasave (Cuadro 6).

Cuadro 6. Análisis de infectividad de ToMarV en híbridos de tomate Muestras positivas a ToMarV/ Híbrido % de Infectividad Muestras inoculadas APTX 2/6 33.3% Tisey 0/6 0% Sun 6600 1/6 16.6% Brigade 5/6 83.3% Maya 4/6 66.6%

Ante el hecho que se detectó a ToMarV en plantas de chile colectadas en campo, se decidió realizar un bioensayo de infectividad con tres materiales de chile (M10, Anaheim y Orange). Se inocularon mecánicamente como se describió anteriormente para el caso de tomate. La sintomatología observada fue reducción de la tasa de crecimiento y ligeros ampollamientos en foliolos (Figura 35).

Figura 35. Sintomatología observada en chile inoculado con ToMarV. Paneles a, c: Ampollamiento, Paneles b, d: planta control asintomática, Panel e: reducción de la tasa de crecimiento.

Para determinar que la sintomatología observada en híbridos fuera ocasionada por ToMarV-Guasave, se realizó una detección a los 15 dpi mediante RT-PCR anidado (Figura 36). La detección del virus en híbridos de chile indicó que ToMarV-Guasave fué capaz de transmitirse mecánicamente en dos muestras del tipo Anaheim, dos del tipo Orange y cinco del tipo M10, mostrando una sintomatología similar a la observada en campo.

Figura 36. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de ToMarV en híbridos de chile mediante PCR anidado: Panel a: Var. Anaheim, Panel b: Var. Orange, Panel c: Var. M10.

VIII. DISCUSIÓN

En 2003, se reportó una enfermedad agresiva con síntomas de “Marchitez” afectando al cultivo de tomate en Sinaloa (Verbeek et al., 2008). Sin embargo, esta sintomatología había sido observada previamente entre 1995-1997 en Culiacán, la cual era asociada al Virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) (Cabanillas, 1996). Actualmente esta sintomatología se asocia a ToMarV (Verbeek et al., 2008). Después del primer reporte de ToMarV y/o ToANV en Culiacán (Turina et al., 2007), no existía información de la distribución de éste virus perteneciente al nuevo género Torradovirus en otras regiones de México. Sin embargo, en este trabajo logramos detectar molecularmente la presencia de ToMarV en dos de las principales regiones productoras de tomate en Sinaloa, ubicadas en la Zona Norte (Ahome y Guasave) y Zona Sur (La Cruz de Elota). Caso similar fue lo ocurrido con el género Crinivirus reportado en Sinaloa por primera vez en el 2006 en tres importantes municipios productores de tomate en el estado de Sinaloa ubicados en la Zona Centro (Culiacán) y Norte (Guasave y Ahome) (Álvarez-Ruiz, et al., 2007) y recientemente reportado en Baja California (Méndez-Lozano et al., 2012). Cabe señalar que tanto el género Torradovirus y Crinivirus pertenecen al grupo de virus de RNA trasmitidos por mosca blanca. Magallanes-Tapia, 2008 concluye que la distribución del género Crinivirus en Sinaloa, se debe a que en el estado existe la presencia de cuatro importantes especies de mosca blanca que actúan como insecto vector de estos virus. En la presente investigación también se logró detectar molecularmente la presencia de ToMarV en el estado de Sonora, mientras que Magallanes-Tapia, en 2008, no logró detectar la presencia de Crinivirus en este mismo estado a pesar de la presencia del insecto vector, concluyendo que para el caso de Crinivirus, esto se debe a las diferencia entre poblaciones y/o especies del insecto vector que pueda existir entre los estados. Sin embargo, durante los estudios con respecto a especies de mosca blanca realizados durante 1993-1994 por investigadores del INIFAP, reportaron que se encontraron las mismas especies de este vector en el

Valle del Mayo en Sonora y Valle del Fuerte en Sinaloa (López-Carbajal, 1993; López-Ahumada, 1993; López-Carbajal, 1994; Armenta-Cárdenas, 1994; López- Ahumada, 1994), por lo cual no se puede asociar solamente al insecto vector como responsable absoluto de la dispersión de una enfermedad viral. Además existen reportes que uno de los factores importantes para la dispersión o aparición de un nuevo género viral en nuevas áreas de cultivo se deba al movimiento global de plantas, frutas, semillas u otras formas de propagación vegetal, todo esto a través de los humanos (Jones, 2009). En nuestro país un claro ejemplo de esto, fue con dos especies del género Begomovirus, donde plántulas infectadas en el lugar nativo de la caracterización del virus fueron desplazadas a diferentes regiones de nuestro país, dispersando así este género viral (Torres-Pacheco, et al 1996). En conclusión, cualquiera de estas dos opciones como es el movimiento de plantas y/o vectores pudiera ser considera como la fuente de dispersión de ToMarV en Sonora y Sinaloa.

Por otra parte, el estudio de hospedantes alternos es de suma importancia debido a que estos juegan un papel muy importante como fuente de inóculo primario en la propagación y dispersión de los virus fitopatógenos (Duffus, 1971). Estos cumplen tres papeles importantes no excluyentes, en la epidemiología de enfermedades virales; servir como reservorio del virus, como reservorio del vector o ambos. Durante 1981 se reportó que para catalogar una maleza como fuente de infección primaria de un virus, sus poblaciones deben de constituir una proporción relevante de la flora silvestre de dicha área y ser abundantemente infectada por el virus (Bos, 1981), tal es el caso de Rynchonsia minima para el Virus rynchonsia golden mosaic virus (Méndez-Lozano, 2006). Sin embargo, algunos autores mencionan que se deben considerar importantes aquellas malezas portadoras asintomáticas del virus, mismas que no pueden reconocerse en el campo a pesar de tener importancia epidemiológica. Ejemplos de lo anterior son Solanum gracile, asociada a la ocurrencia del Peper veinbanding mosaic virus (PVMV); Solanum nigrum, hospedante asintomático del Virus jaspeado de tabaco (TEV) y del Potato Virus Y

(PVY); y Asclepcia syriaca, maleza perenne portadora del Virus mosaico de las cucurbitaceas (CMV) (Walker, 1925). En nuestro estudio encontramos malezas asintomáticas portadoras del Virus de la marchitez de tomate, entre las que destacaron Solanum nigrum, Chenopodium ambrosinoides, Physalis acutifolia, Amaranthus spp., Rumex crispus, Parthenium, histerophorus y Portulaca oleraceae, por estar ampliamente distribuidas y ser éstas una posible fuente de inóculo primario. Así mismo existen reportes de que estas son también hospedantes de mosca blanca y en algunos de los casos son ampliamente infestadas por este insecto (Fu, 1997), lo que conlleva a un alto riesgo en la presencia y epidemiologia de ToMarV.

En México existen pocos trabajos de identificación de virus en malezas, sin embargo el grupo de trabajo del Dr. Méndez-Lozano, ha reportado la presencia de Begomovirus en especies del mismo género de malezas en las que se detectó en esta investigación la presencia de ToMarV. Cabe señalar que existen diversas referencias, que indican que las malezas hospedantes de virus fitopatógenos dentro o alrededor de cultivos comerciales, pueden estar cumpliendo un papel epidemiológico importante (Bruckart y Lorbeer, 1976; Rist y Lorbeer, 1989).

Para el caso de miembros del género Torradovirus, solo existen reportes de la infección de estos virus en plantas hospedantes de manera experimental al igual que en el cultivo de chile (Amari et al., 2008), es por ello que la detección de ToMarV en el cultivo comercial de chile (Capsicum annuum) en la presente investigación, así como en plantas del genero Physalis, Chenopodium , Solanum y Amaranthus implican el primer reporte de manera natural de una especie viral del nuevo género Torradovirus (ToMarV) a nivel mundial.

El análisis de infectividad del aislado ToMarV-Guasave de manera experimental indicó que aun si el hibrido en campo no muestra sintomatología éste puede estar infectado por el virus y fungir como una problable fuente de

inóculo primario. Durante este trabajo se logró detectar a ToMarV en los híbridos Brigade, APTX, Sun 6600 y Maya, observándose a los 15 dpi disminución en la tasa de crecimiento, aborto de inflorescencias y a los 60 dpi, se observó una ligera necrosis basal de foliolos. Se ha reportado que la severidad de la sintomatología varía según el híbrido, título viral, factores abióticos o incluso a la interacción que existe con otros virus (García-Cano et al. 2006). Se han realizado estudios donde la especie ToTV en infecciones simples, induce la alteración de las células del floema; sin embargo, cuando se encuentra en infecciones mixtas, ya sea con dos (ToTV: Torradovirus con ToCV: Crinivirus o PepMV: Potexvirus) o tres especies virales (ToTV: Torradovirus con TSWV: Tospovirus y PepMV: Potexvirus), se produce una sintomatología más severa en la planta infectada, tanto a nivel floema como en algunos otros tejidos vegetales (Alfaro-Fernández et al., 2010).

Actualmente en nuestro Estado se tienen reportes de la presencia de géneros virales trasmitidos por mosca blanca tales como Begomovirus y Crinivirus (Ascencio-Ibáñez et al., 1999; Méndez-Lozano et al., 2006; Álvarez-Ruiz et al., 2006, Gámez-Jímenez et al., 2009; Méndez-Lozano et al., 2012). Debido a la presencia de estos, podrían ocurrir infecciones mixtas, en donde podría existir un riesgo de sinergismo, o incluso algún evento de recombinación, lo cual pueda permitir en un futuro nuevas enfermedades virales (Hanssen et al., 2010).

ToMarV fue originalmente aislado e identificado de plantas de tomate cultivadas a campo abierto con síntomas como marchitez basal de foliolos, necrosis apical de la planta así como una necrosis en fruto en etapas tardías (Verbeek et al., 2008). Cabe mencionar que este virus nunca ha sido reportado infectando otros cultivos de importancia agrícola de manera natural.

Experimentalmente se ha reportado que ToMarV es capaz de infectar especies de Nicotiana spp., Physalis floridana y Chenopodium quínoa (Verbeek et al., 2008), al igual que la especie tipo (ToTV) reportada en España causando la

misma sintomatología en las especies de Nicotiana (Verbeek et al., 2006). Sin embargo, la sintomatología causada en dos plantas indicadoras difiere. Es decir en P. floridana, ToMarV induce un moteado sistémico y ocasionalmente necrosis en las hojas infectadas localmente, mientras que ToTV causa necrosis severa, que puede llegar hasta la muerte de la planta. Para el caso de Chenopodium quinoa, ToMarV causa pequeñas manchas necróticas en la hojas inoculadas, mientras que cuando esta planta es inoculadas con ToTV, estas permanecen asintomáticas (Verbeek et al., 2008).

Existen reportes que la especie Tipo (ToTV) es capaz de infectar especies de importancia agrícola, tal es el caso de los cultivos de berenjena (Solanum melongena), papa (Solanum tuberosum), y chile (Capsicum annuum); este ultimo mostró mosaicos marcados y achaparramiento una vez inoculado con ToTV (Amari et al., 2008); sin embargo, se desconocía, si ToMarV es capaz de causar la misma sintomatología o esta difiere como se ha presentado en algunas especies de plantas.

Por lo anterior, con el fin de conocer la sintomatología ocasionada por ToMarV en plantas de chile, se inocularon mecánicamente tres materiales de este cultivo, esperando observar sintomatología asociada a la previamente reportada para ToTV por Amari, et al., 2008. Algunas plántulas mostraron achaparramiento (Figura 35e) al igual que para ToTV; sin embargo, no se observaron moteados marcados. Por otra parte, algunas plantas mostraron sintomatología similar (Figura 35a, 35c) a la observada en campo (Figura 29a, 29c) como arrugamientos en muestras positivas para ToMarV.

Tomando en cuenta lo anterior, existen reportes de virus que son aislados a partir de algún género de plantas y son capaces de infectar otros géneros vegetales. Esta capacidad sugiere que poseen potencial de limitar la producción de cultivos alternos o al menos fungir como reservorios; entre estos se puede

mencionar al Virus mosaico del pepino (PepMV: Potexvirus), el cual fue aislado de pepino a mediados de los 70’s en Perú y en la última década se ha convertido en una limitante de producción de tomate en el mundo (Hanssen et al., 2010). Un ejemplo mas reciente es el Virus de la clorosis del tomate (ToCV: Crinivirus) el cual actualmente se encuentra reduciendo severamente la calidad y producción del cultivo de chile en España (Fortes et al., 2012).

Los resultados obtenidos en el presente trabajo indicaron que ToMarV fue capaz de infectar de manera natural y experimental al cultivo de chile, ocasionando achaparramiento, síntoma que también se ha reportado para el caso de la especie ToTV en España (Amari, et al., 2008). Sin embargo, se desconoce el impacto que pueda tener este virus en plantaciones comerciales de chile, o el riesgo potencial que existe en la interacción de este con otros virus nativos de este ultimo. Ante la importancia socioeconómica que ha tomado el cultivo del chile en los últimos años, es necesario realizar futuras investigaciones enfocadas en este sentido.

IX. CONCLUSIONES

 El Virus de la marchitez del tomate (ToMarV) se asocio a la sintomatología de necrosis en foliolos y frutos en plantas de híbridos de tomate en los estados de Sinaloa y Sonora.

 No se detectó a ToMarV en plantas con síntomas de necrosis en los estados de Baja California y Nayarit, lo que indica que hasta el 2012 la distribución del virus se limita a los estados de Sinaloa y Sonora.

 Se detectó como nuevos hospedantes de ToMarV a las especies de maleza: Solanum nigrum, Chenopodium abrosinoides, Amaranthus spp., Rumex crispus, Parthenium, histerophorus, Portulaca oleraceae. Esto indica nuevos hospedantes naturales para este virus y un riesgo en la dispersión de la enfermedad.

 La detección de ToMarV en plantas de chile es el primer reporte de este virus en otro cultivo de importancia agrícola en México.

 Los ensayos de infectividad indicaron que un aislado del Virus de la marchitez del tomate (ToMarV-Guasave) fue capaz de causar una infección en los híbridos Brigade, Maya y APTX y se asoció a una disminución en su tasa de crecimiento y aborto de flor.

 El aislado ToMarv-Guasave se mostró más infectivo en plantas de tomate del híbrido Brigade, siendo el único material en que se observó una necrosis basal de foliolos típico de la enfermedad en campo.

 El aislado ToMarv-Guasave fue capaz de infectar los tres materiales de chile evaluados (Anaheim, orange y M10), observándose síntomas de clorosis y arrugamiento de los foliolos.

X. BIBLIOGRAFíA

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