RENATO ASSIS MACHADO

“ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS NOS GENES HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 E TIMP3 COM FISSURAS DE LÁBIO E/OU PALATO NÃO-SINDRÔMICA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA”

PIRACICABA 2015

i

ii UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

RENATO ASSIS MACHADO

“ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS NOS GENES HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 E TIMP3 COM FISSURAS DE LÁBIO E/OU PALATO NÃO-SINDRÔMICA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA”

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do título de Mestre em Estomatopatologia, na Área de Patologia.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Della Coletta Coorientador: Prof. Dr. Hercilio Martelli Junior

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação defendida por Renato Assis

Machado e orientada pelo Prof. Dr. Ricardo Della Coletta.

______Assinatura do orientador PIRACICABA 2015

iii Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159

Machado, Renato Assis, 1989- M18a MacAssociação dos polimorfismos nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 com fissuras de lábio e/ou palato não- sindrômica em uma população brasileira / Renato Assis Machado. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2015.

MacOrientador: Ricardo Della Coletta. MacCoorientador: Hercilio Martelli Junior. MacDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

Mac1. Fenda labial. 2. Polimorfismo genético. I. Della Coletta, Ricardo,1972-. II. Martelli Junior, Hercilio. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Association of polymorphisms in genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 and TIMP3 with nonsyndromic cleft lip and/or palate in a Brazilian population Palavras-chave em inglês: Cleft lip Polymorphism, genetic Área de concentração: Patologia Titulação: Mestre em Estomatopatologia Banca examinadora: Ricardo Della Coletta [Orientador] Mário Sérgio Oliveira Swerts Edgard Graner Data de defesa: 26-02-2015 Programa de Pós-Graduação: Estomatopatologia

iv

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) v

vi

RESUMO O desenvolvimento craniofacial envolve uma série de eventos altamente coordenados e variações polimórficas nos genes que controlam estes eventos podem afetar a morfogênese labial e palatina, resultando nas fissuras do lábio e/ou palato não-sindrômicas (FL/PNS). O objetivo do presente estudo foi verificar a associação dos polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento craniofacial, HOXD1 (rs1374326), TNP1 (rs748044), MSX1 (rs1106514), TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062), FGFR1 (rs7829058), COL2A1 (rs1793949), WNT3 (rs11653738) e TIMP3 (rs242082), na susceptibilidade das FL/PNS em uma população brasileira. Para verificar a associação destes polimorfismos, este estudo associou o teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) com a análise caso-controle com correção de variações genéticas de ancestralidade em uma amostra composta de 189 trios com fissura labial com ou sem fissura palatina não-sindrômica (FL±PNS), 107 trios com fissura palatina não-sindrômica (FPNS), 318 amostras isoladas de pacientes com FL±PNS, 189 amostras isoladas de pacientes com FPNS e 599 controles. Todos os polimorfismos foram inicialmente analisados por TDT e as associações significantes foram confirmadas na análise caso-controle. Os polimorfismos rs28372960 e rs7829058 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS (p=0,04), assim como os polimorfismos rs1374326 e rs11653738 nos trios com FPNS (p=0,04). Contudo, o estudo caso-controle não confirmou tais associações. O haplótipo T-C-C formado pelos polimorfismos rs28372960, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1 foi significantemente mais comum nos pacientes com FL±PNS em comparação com o grupo controle (p=0,01). Frente as modestas associações, nossos resultados não suportam a hipótese de que variantes estudadas nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 são fatores de risco para FL/PNS em uma população brasileira.

Palavras chaves: fissura de lábio e/ou palato não-sindrômica, genes do desenvolvimento craniofacial, polimorfismo genético.

vii

viii ABSTRACT

The craniofacial development involves a series of highly coordinated events, and polymorphic variations in genes that control these events can affect the morphogenesis of the lip and palate, resulting in the non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P). The aim of present study was to verify the association of polymorphisms in genes related to craniofacial development, HOXD1 (rs1374326), TNP1 (rs748044), MSX1 (rs1106514), TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062), FGFR1 (rs7829058), COL2A1 (rs1793949), WNT3 (rs11653738) and TIMP3 (rs242082), in the susceptibility of NSCL/P in a Brazilian population. To verify the association of those polymorphisms, the study associated the transmission disequilibrium test (TDT) and a structured case-control analysis based on the individual ancestry proportions in a sample composed of 189 case-parent trios of non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL±P), 107 case-parent trios of non-syndromic cleft palate (NSCP), 318 isolated samples of NSCL±P, 189 isolated samples of NSCP and 599 healthy controls. All polymorphisms were initially evaluated by TDT, and significant associations were valitaded in a case-control analysis. A significant overtransmission of rs28372960 and rs7829058 polymorphisms in NSCL±P trios was observed (p=0.04), as well as the rs1374326 and rs11653738 polymorphisms in NSCP trios (p=0.04). However, the structured case-control analysis did not confirm those associations. The haplotype T-C-C formed by rs28372960, rs15251 and rs2569062 polymorphisms in TCOF1 gene was significantly more frequent in patients with NSCL±P in comparison with the control group (p=0.01). With the modest associations, our results do not support the hypothesis that HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 and TIMP3 variants are risk factors for NSCL/P in a Brazilian population.

Keywords: nonsyndromic cleft lip and/or palate, craniofacial development genes, genetic polymorphism.

ix

x SUMÁRIO DEDICATÓRIA xiii

AGRADECIMENTOS xv

LISTA DE FIGURAS xix

LISTA DE TABELAS xxi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS xxiii

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DE LITERATURA 5

2.1 Fissuras do lábio e/ou palato não-sindrômicas (FL/PNS) 5

2.2 Embriologia do lábio e palato e a associação com FL/PNS 6

2.3 Epidemiologia das FL/PNS 11

2.4 Etiologia das FL/PNS 12

2.4.1 Fatores ambientais 12

2.4.2 Fatores genéticos 17

2.4.2.1 HOXD1 19

2.4.2.2 TNP1 20

2.4.2.3 MSX1 21

2.4.2.4 TCOF1 23

2.4.2.5 FGFR1 24

2.4.2.6 COL2A1 25

xi 2.4.2.7 WNT3 26

2.4.2.8 TIMP3 27

2.5 Delineamento experimental 28

3 PROPOSIÇÃO 31

4 MATERIAL E MÉTODOS 32

4.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa 32

4.2 Desenho do estudo 32

4.3 Amostra 32

4.4 Coleta das amostras de células bucais 33

4.5 Isolamento do DNA 33

4.6 Seleção dos polimorfismos genéticos 34

4.7 Genotipagem pelo método de discriminação alélica com sondas fluorescentes 34

4.8 Análises estatísticas 35

5 RESULTADOS 37

6 DISCUSSÃO 45

7 CONCLUSÃO 51

REFERÊNCIAS 52

ANEXO 76

xii DEDICATÓRIA

Aos pacientes com FL/PNS e suas famílias, razão de nosso estudo, que gentilmente colaboraram, confiaram e se prontificaram em participar desta pesquisa. Pacientes que nos ensinaram o valor do nosso trabalho e depositaram em nós suas esperanças em busca de uma melhor qualidade de vida. Que este estudo, em sua pequena contribuição e buscando reduzir o universo de desconhecimento sobre o assunto, possa ajudar-nos a oferecer-lhes uma melhor qualidade em suas jornadas diárias.

xiii

xiv AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por me dar força para superar as dificuldades e mostrar os caminhos certos nas horas difíceis.

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa de seu diretor, Professor Doutor Guilherme Elias Pessanha Henriques.

Ao Professor Doutor Alan Roger dos Santos Silva, coordenador do Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas.

Ao meu orientador Professor Doutor Ricardo Della Coletta, pela transmissão de ensinamentos diários, mostrou sempre importante na minha formação pessoal e profissional, pelo exemplo de seriedade, paciência, persistência e bondade em tudo que se envolve. Registro aqui minha profunda admiração pela sua capacidade de construir novos caminhos e por me ensinar principalmente pelo exemplo.

Ao meu coorientador Professor Doutor Hercílio Martelli Júnior, pelo incentivo aos trabalhos científicos desde a graduação e por compartilhar seus conhecimentos com tranquilidade e sabedoria.

Aos Professores Doutores do Departamento de Diagnóstico Oral, áreas de Patologia e Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Ricardo Della Coletta, Alan Roger dos Santos Silva, Jacks Jorge Júnior, Pablo Vargas, Márcio Ajudarte Lopes, Edgard Graner e Oslei Paes de Almeida. Obrigado pelos ensinamentos repassados durante a realização dos créditos.

xv À coordenadora do comitê de ética da FOP Lívia Maria Andaló Tenuta pelo auxílio prestado durante o processo de submissão do trabalho, pela sua disposição, solidariedade e auxílio mostrando em tudo dedicação e responsabilidade.

Aos funcionários da FOP-UNICAMP Geovania Almeida, Emílio Salles, João Carlos Gomes, Adriano Luis Martins e Fabiana Facco Cassarotti pela amabilidade e paciência, e ao Fábio Haach Téo pelo apoio, amizade e valiosa ajuda no laboratório de biologia molecular.

À amiga Sibele Nascimento de Aquino, pelo acolhimento e treinamento no laboratório no início do mestrado e por esclarecer as minhas frequentes dúvidas.

Aos centros de colaboração e parceria neste estudo: Centro Pró-Sorriso da Universidade José do Rosário Vellano – Unifenas, Alfenas, Minas Gerais, na pessoa do Prof. Dr. Mário Sérgio Oliveira Swerts; Centrinho do Hospital Santo Antônio das Obras Assistenciais Irmã Dulce, Salvador, Bahia, na pessoa da Profª. Drª. Sílvia Reis; Associação Portadores de Fissura Labial localizada na cidade de Cascavel, Paraná (APOFILAB), na pessoa da Profª. Drª. Ana Lúcia Carrinho Ayroza Rangel; e o Hospital Universitário Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba- UFPB, João Pessoa, Paraíba, na pessoa da Profª. Drª. Darlene Camati Persuhn, que foram de fundamental importância para a concretização deste trabalho.

À todos os amigos e colegas do programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia: Camila Concha, Carolina Carneiro, Celeste Romero, Débora Lima, Diego Tetzner, Leonardo Reis, Mariana Paglioni, Marisol Galvis, Raiza Vieira, Alicia Rumayor, Ana Camila Messetti, Ana Carolina Pellicioli, César Rivera, Elizabete Bagordakis, Felipe Paiva, Harim Tavares, José Laurentino Filho, Juscelino de Freitas, Marco Aurélio Andrade, Marcondes Sena, Maurício Dourado, Priscilla Diniz, Rodrigo Neves, Thaís Brandão, especialmente aos colegas do Laboratório de Biologia Celular e Molecular Estêvão Azevedo, Fernanda Moreira, Florence Cuadra e Luciana Yamamoto pela amizade, conselhos e ensinamentos transmitidos.

xvi

Aos amigos do Orocentro Camila Borges, Karina Morais, Renata Markman, Vinícius Rabelo, Wagner Gomes, Aparecida Campion, Daniele Morelli e Rogério Elias, pelos ensinamentos compartilhados.

Aos meus pais Carlos Roberto Machado e Lucimar Aparecida de Assis Machado por me apoiarem sempre em todas as minhas escolhas. Obrigado pelo amor, dedicação e exemplo de vida que sempre foram pra mim. Não tenho palavras para agradecer! Ao meu querido irmão Roberto Assis Machado pelo companheirismo de sempre e exemplo de pessoa a seguir. Obrigado a toda família, cada um de vocês é especial pra mim.

À todos que colaboraram direta ou indiretamente durante a realização deste trabalho.

xvii

xviii LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Desenvolvimento do lábio e palato 7

Figura 2 - Fissura de lábio e/ou palato não-sindrômica 7

xix

xx LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Origem das amostras deste estudo 33

Tabela 2 - Características dos polimorfismos genéticos nos genes incluídos neste estudo 35

Tabela 3 - Distribuição dos pacientes com FL±PNS e FPNS analisados no TDT em relação ao gênero 37

Tabela 4 - Cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg para os 10 polimorfismos deste estudo baseado nos genitores (pais

e mães normais) dos 189 núcleos familiares com FL±PNS e 107 com FPNS 38

Tabela 5 - Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os

polimorfismos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062, rs7829058,

rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 189 trios de FL±PNS 39

Tabela 6 - Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os

polimorfismos genéticos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062,

rs7829058, rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 107 trios de FPNS 40

Tabela 7 - Distribuição dos haplótipos no gene TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062) por tipo de fissura analisados no TDT 41

Tabela 8 - Distribuição dos pacientes analisados no grupo caso- controle em relação ao gênero 42

Tabela 9 - Distribuição ancestral dos pacientes do grupo caso (FL±PNS e FPNS) e controle 42

xxi Tabela 10 - Frequência dos polimorfismos rs28372960 do gene TCOF1 e rs7829058 do gene FGFR1 em pacientes com FL±PNS e nos indivíduos do grupo controle 43

Tabela 11 - Distribuição dos polimorfismos rs1374326 do gene HOXD1 e rs11653738 do gene WNT3 nos grupos controle e FPNS 44

xxii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABCA4 - ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 4 APOFILAB - Associação dos Portadores de Fissura Labial BCL - B-cell CLL/lymphoma BMP - Bone morphogenetic proteins BMPR1A - Bone morphogenetic protein receptor, type IA CAD6B - Cadherin6b CK2 - Casein kinase 2 COL10A1 - Collagen, type X, alpha 1 COL2A1 - Collagen, type II, alpha 1 DNA - Deoxyribonucleic acid / Ácido desoxirribonucléico EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid / Ácido etilenodiamino tetra-acético EPH - Ephrin FADD - Fas-Associated protein with Death Domain FBAT - Family Based Association Test FGF - Fibroblast growth factors FGF10 - Fibroblast growth factor 10 FGFR1 - Fibroblast growth factor receptor 1 FGFR2 - Fibroblast growth factor receptor 2 FGFR3 - Fibroblast growth factor receptor 3 FL - Fissura labial FL/P - Fissura de lábio e/ou palato FL/PNS - Fissura lábio e/ou palato não-sindrômica FL±P - Fissura labial com ou sem fissura palatina FLP - Fissura lábio-palatina FOXE1 - Forkhead box E1 FP - Fissura palatina

xxiii GSTM1 - Glutathione S-transferase mu 1 GSTT1 - Glutathione S-transferase theta 1 GWAS - Genome-wide association study /Estudos de associação de larga escala genômica

HCl - Ácido clorídrico HOXD1 - Homeobox D1 HULW - Hospital Universitário Lauro Wanderley

HWE - Hardy-Weinberg equilibrium / Equilíbrio de Hardy-Weinberg IC - Intervalo de confiança IHH - Indian hedgehog IRF6 - Interferon regulatory factor 6 M - Molar MAF - Minor allele frequency / Frequência do alelo menor MAFB - V-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B mL - Mililitros mM - Milimolar MMPs - Matrix metalloproteinases / Metaloproteinases de matriz MSX1 - Muscle segment homeobox 1 MTHFR - Methylenetetrahydrofolate reductase NaCl - Cloreto de sódio nm - nanômetro Nop56p - NOP56 ribonucleoprotein NRP - Neuropilin OAID - Obras Assistenciais Irmã Dulce OR - Odds ratio PAX7 - Paired box 7 PDGF - Platelet-derived growth factor beta

xxiv PTCH - Patched RARA - Retinoic acid receptor, alpha rDNA - DNA ribossômico RNA - Ribonucleic acid / Ácido ribonucleico Robo - Roundabout rpm - rotação por minuto rRNA - RNA ribossômico RUNX2 - Runt-related transcription factor 2 SDS - Sodium dodecil sulfate / dodecil sulfato de sódio SHH - Sonic hedgehog SHOX2 - Short stature homeobox 2 SMAD - Mothers against decapentaplegic homolog SMO - Smoothened SNAIL2 - Snail family zinc finger 2 STOM - Stomatin TCOF1 - Treacher-Collins-Franceschetti syndrome 1 TDT - Transmission disequilibrium test / Teste de desequilíbrio de transmissão TGF- β - Transforming growth factor beta TIMP - Tissue inhibitor of metallopeptidase TIMP3 - Tissue inhibitor of metallopeptidase 3 TNFR - Tumor necrosis factor receptor TNP1 - Transition nuclear protein 1 TRADD - Tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein Tris - Tris-(hidroximetil)-aminometano UBF - Upstream binding fator μg - Microgramas

xxv VAX1 - Ventral anterior homeobox 1 WNT - Wingless WNT3 - Wingless-type MMTV integration site family, member 3 µl - Microlitros

xxvi

1 INTRODUÇÃO As fissuras do lábio e/ou palato (FL/P) representam o defeito craniofacial congênito mais comum em humanos, podendo apresentar-se de forma isolada, não- sindrômica (FL/PNS), ou estar acompanhada por outras alterações, caracterizando uma síndrome (Dixon et al., 2011; Leslie e Marazita, 2013). As FL/Ps são classificadas com base na região anatômica envolvida e se divide em fissuras pré- forame incisivo (fissuras labiais-FL), fissuras pós-forame incisivo (fissuras palatinas- FP) e fissuras transforme incisivo (fissuras lábio-palatinas-FLP). Baseando-se em evidências embriológicas e epidemiológicas, a FL é considerada uma variante menos intensa da FLP e ambas são classificadas juntas no grupo das fissuras labiais com ou sem fissura palatina (FL±P) (Harville et al., 2005; Grosen et al., 2010). A prevalência das FL/PNS entre os nascidos vivos pode variar com a origem étnica, gênero do indivíduo e fatores ambientais (Dixon et al., 2011). Mundialmente a prevalência das FL/PNS é alta, variando de 1:500 a 1:2500 nascidos vivos (Marazita et al., 2002a; Dixon et al., 2011). No Brasil a prevalência é da ordem de 1:685 a 1:2800 nascidos vivos (Martelli-Junior et al., 2007; Rodrigues et al., 2009). As FL/PNS podem apresentar um grande impacto na saúde, qualidade de vida e bem-estar socioeconômico dos indivíduos afetados e de seus familiares. Adicionalmente, problemas de ordenação e hierarquização do sistema público de saúde, bem como de equidade de acesso aos serviços disponíveis, torna a assistência fora do alcance de muitos pacientes e familiares (Marazita et al., 2002a). Por outro lado, o ônus do não tratamento ou tratamento ineficiente, em termos de morbidade, incidência de distúrbios emocionais, estigmatização, exclusão social quanto às oportunidades educacionais e profissionais e de não inserção no mercado de trabalho, recai sobre o afetado, uma vez que as FL/PNS podem afetar além da estética, a sucção, alimentação, fala, audição e apresentar maior suscetibilidade a infecções e a distúrbios psicológicos, requerendo assim assistência multiprofissional por períodos prolongados (Trindade et al., 2007). Desta forma, entender o impacto das fissuras orofaciais é importante para identificar as necessidades não atendidas e desenvolver políticas públicas para reduzir o impacto das fissuras orofaciais no indivíduo e em sua família. Somando a isso, estudos de

1

sua etiologia têm sido amplamente realizados na tentativa de compreender os fatores de risco e projetar estratégias de prevenção (Dixon et al., 2011; Mangold et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012). Uma origem multifatorial, atribuída à ação de fatores genéticos e ambientais, recai na etiologia das FL/PNS, tendo sido sugerido uma íntima associação com exposição materna aos fatores de risco do meio ambiente, incluindo medicamentos, álcool, tabagismo e deficiência de ácido fólico e vitaminas durante o primeiro trimestre da gravidez (Jianyan et al., 2010; Wehby e Murray, 2010). Em relação à participação genética nas FL/PNS, muitos estudos com diferentes estratégias estão sendo realizados, incluindo estudos de ligação, sequenciamento direto do DNA e estudos de associação de larga escala genômica (GWAS), que são baseados na comparação de vários polimorfismos genéticos comuns entre casos e controles (Dixon et al., 2011; Stuppia et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Rahimov et al., 2012). Visto que o desenvolvimento embrionário do lábio e do palato envolve uma série de eventos altamente coordenados, dos quais incluem proliferação, apoptose, migração e transição epitélio-mesênquima (Mossey et al., 2009), sugere que alterações nestes eventos podem também afetar a morfogênese das estruturas faciais resultando nas fissuras (Butali et al., 2011). Desta forma, a busca por variantes genéticas em genes com participação nestes eventos durante a morfogênese normal do lábio e palato também tem sido objeto de intensa investigação (Dixon et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Rahimov et al., 2012; Butali et al., 2014). A estratégia de avaliar o papel de variantes polimórficas em genes associados à embriogênese labial e palatina revelou a possível participação dos genes HOXD1 (homeobox D1), TNP1 (transition nuclear protein 1), MSX1 (muscle segment homeobox 1), TCOF1 (Treacher-Collins-Franceschetti syndrome 1), FGFR1 (fibroblast growth factor receptor 1), COL2A1 (collagen, type II, alpha 1), WNT3 (wingless-type MMTV integration site family, member 3) e TIMP3 (tissue inhibitor of metallopeptidase 3) no desenvolvimento de FL/PNS (Fallin et al., 2003; Juriloff et al., 2004; Beaty et al., 2006; Chiquet et al., 2008; Sull et al., 2008; Jagomagi et al., 2010; Menezes et al., 2010; Nikopensius et al., 2010; Butali et al.,

2

2011; Lace et al., 2011; Nikopensius et al., 2011; Yao et al., 2011; Letra et al., 2012; Mostowska et al., 2012; Smane et al., 2013; Souza et al., 2013; Letra et al., 2014). O gene HOXD1 codifica um fator de transcrição que se faz importante no desenvolvimento craniofacial e alterações são associadas à ocorrência de FL/PNS (Beaty et al., 2006). Estudo in vivo demonstrou que o desenvolvimento ósseo ocorre pela regulação de genes da família HOX expressos pelas células da crista neural (Couly et al., 2002), e que a ação sinérgica dos genes HOXs é fundamental para o desenvolvimento craniofacial (Minoux et al., 2009). TNP1 é associado à morfogênese tecidual durante o desenvolvimento craniofacial (Sarmah e Wente, 2010). A proteína TNP1 é essencial na adesão celular focal à matriz extracelular (Jankowski e Gumucio, 1995) e alterações na sua expressão podem alterar o processo de migração das células da crista neural, favorecendo a formação das FL/PNS (Beaty et al., 2006). MSX1, um membro da família de genes homeobox, codifica um fator de transcrição que é altamente expresso durante a embriogênese e o desenvolvimento ósseo (Nassif et al., 2014). Estudo realizado com camundongos “knockout” para MSX1 revelou que MSX1 controla uma hierarquia genética envolvendo a sinalização controlada por BMPs (bone morphogenetic proteins) e SHH (sonic hedgehog), que regulam o crescimento e proliferação das células mesenquimais localizadas anteriormente no palato, sendo uma causa de desenvolvimento de FP (Zhang et al., 2002). TCOF1 codifica a proteína chamada “treacle”, que se mostra fundamental para a biogênese ribossomal específica para os tecidos da crista neural e ectoderma neural (Sakai e Trainor, 2009). Alterações neste gene são associadas com a síndrome de Treacher-Collins (Masotti et al., 2005) e na ocorrência de FL/PNS (Sull et al., 2008). “Treacle” é essencial para o recrutamento do complexo de transcrição nucleolar e níveis alterados desta proteína resultam na estabilização de p53 e na parada do ciclo celular na fase G1 (Jones et al., 2008). O gene FGFR1 codifica um receptor de tirosino-quinase fundamental para o desenvolvimento craniofacial (Rice et al., 2004). Camundongos “knockout” para FGFR1 apresentaram redução na proliferação das células epiteliais e mesenquimais na área frontal da face, impedido a completa elevação dos processos palatinos e o processo de fusão (Wang et al., 2013). COL2A1 é

3

responsável pela produção da cadeia α1 do colágeno do tipo II. Barbieri et al. (2003) demonstraram que COL2A1 controla a expressão de vários marcadores de diferenciação celular, incluindo FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3), IHH (indian hedgehog), RUNX2 (runt-related transcription factor 2) e COL10A1 (collagen, type X, alpha 1). Estudos realizados com camundongos deficientes para COL2A1 relataram uma formação óssea incompleta durante o processo de desenvolvimento palatino (Savontaus et al., 2004; Aberg et al., 2005). Em humanos, polimorfismos no gene COL2A1 são descritos como fatores de risco para o desenvolvimento das FL±PNS (Nikopensius et al., 2010). A expressão de WNT3 é encontrada na maxila e região média do nariz durante o desenvolvimento craniofacial (Lan et al., 2006). Em adição, WNT3 demonstram um padrão de expressão muito similar a BMPs durante a fusão labial, sugerindo um controle mútuo entre estas proteínas (Liu et al., 2005). TIMP3 são inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz (MMPs), controlando, entre outros fatores, a degradação da matriz extracelular (Baranger et al., 2014). Estudo realizado por Morris-Wiman et al. (2000) revelaram que TIMPs e MMPs são reguladas durante o desenvolvimento do palato e que a suas distribuições correlacionam com a remodelação dos componentes da matriz extracelular. Se o equilíbrio é rompido, malformações, como as FL/PNS podem ocorrer (Blavier et al., 2001). Como variantes polimórficas em genes associados ao desenvolvimento facial podem contribuir para etiologia das FL/PNS, o presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de caracterizar a participação dos polimorfismos nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 na suscetibilidade para o desenvolvimento das FL/PNS em uma população brasileira.

4

2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Fissuras do lábio e/ou palato não-sindrômicas (FL/PNS) As FL/PNS representam mundialmente as malformações congênitas mais frequentes da região craniofacial (World Health Organization, 2014). Aproximadamente 70% das FL±Ps e 50% das FP isoladas se manifestam de forma não-sindrômica, ou seja, sem malformações ou alterações adicionais (Jones, 1988; Marazita et al., 2002b). Os demais casos representam a forma sindrômica, composto por mais de 500 síndromes relatadas (Dixon et al., 2011). A classificação das FL/Ps depende da região anatômica envolvida e se divide basicamente em 3 grupos: fissuras pré-forame incisivo ou FLs, fissuras pós-forame incisivo ou FP e fissuras transforme incisivo ou FLP. A FL é o resultado da não fusão das proeminências nasais e maxilares, a FP ocorre quando os processos palatinos deixam de se fundir e quando surge à falha nos dois processos ocorre a FLP (Shkoukani et al., 2013). Além de ser uma causa importante de mortalidade, chegando até 30% em países subdesenvolvidos e em áreas pontuais em países desenvolvidos, as FL/PNS são associadas também à significativa morbidade (Wehby et al., 2011). Efeitos sobre a fala, audição e estética geram resultados adversos sobre a saúde e integração social (Nopoulos et al., 2007; Mossey et al., 2009). Entre as primeiras complicações está à dificuldade no aleitamento materno, resultando em dificuldades no ganho de peso e no desenvolvimento da criança (Montagnoli et al., 2005). Pesquisas com pacientes fissurados em fase escolar registram alterações cognitivas que em sua maioria foram associadas a micro-alterações na trajetória do crescimento e desenvolvimento das estruturas cerebrais (Broder et al., 1998; Weinberg et al., 2013). A literatura também tem sido categórica em reportar um maior risco na incidência de alguns tipos de câncer nos indivíduos afetados por FL/PNS, possivelmente devido a variações comuns nos genes que regulam o crescimento e o desenvolvimento tecidual (Bille et al., 2005; Frebourg et al., 2006; Taioli et al., 2010; Zhou et al., 2011; Kuchler et al., 2014). No que diz respeito às alterações no desenvolvimento da dentição, as anomalias dentais também têm sido cada vez mais investigadas e detectadas com maior frequência em indivíduos com

5

FL/PNS (Paranaiba, et al., 2013b). Além da saúde física, já se tem apontado o alto impacto das FL/PNS na saúde mental dos afetados, uma vez que estes podem apresentar um maior risco em desenvolver distúrbios psiquiátricos que interferem na vida social (Trindade et al., 2007; Lima et al., 2015). Todas estas complicações, vastamente estudadas, reforçam o impacto negativo que as FL/PNS podem acarretar ao indivíduo, trazendo inúmeras consequências, diretas e indiretas na sua qualidade de vida, tanto nos aspectos individuais quanto familiares e sociais (Wehby e Cassell, 2010). Devido à complexidade das manifestações clínicas, os indivíduos afetados por FL/PNS necessitam de acompanhamento especializado e assistência integral a longo prazo em centros de referência de alta complexidade (Wehby e Cassell, 2010). Embora a reabilitação seja possível com o atendimento de boa qualidade, as FL/PNS inevitavelmente constituem um ônus para o indivíduo, para a família e para a sociedade, com um custo substancial em termos de saúde e serviços relacionados (Dixon et al., 2011).

2.2 Embriologia do lábio e palato e a associação com FL/PNS O desenvolvimento normal do lábio ocorre entre a 4a e 8a semana de gestação. Até o final da 4a semana, as células da crista neural, oriundas do tubo neural anterior, migram para formar o primórdio da face, surgindo dela o processo nasal medial e lateral, que se fundem ao processo maxilar, para formar a parte central do lábio superior, o palato primário e o nariz (Marazita e Mooney, 2004). O palato primário aloja os dentes incisivos da maxila, dando origem à parte anterior do forame incisivo e também contribuindo para a formação do lábio e a porção anterior da maxila (Rice, 2005). O palato secundário se desenvolve após o palato primário durante a 6a e a 12a semanas. Os processos palatinos se elevam acima da língua, fundindo medialmente na linha média, anteriormente com o palato primário e superiormente com o septo nasal. O forame incisivo marca a extensão anterior do palato secundário. A formação dos palatos primário e secundário completa a separação das cavidades nasal e oral, permitindo a respiração simultaneamente à mastigação (Dixon et al., 2011).

6

A B C

D E F

Figura 1 - Desenvolvimento do lábio e palato. (A) Desenvolvimento da proeminência frontonasal, processos maxilares e mandibulares delimitando a cavidade oral primitiva na quarta semana do desenvolvimento embrionário. (B) Na quinta semana, as fossetas nasais foram desenvolvidas com a formação dos processos nasais mediais e laterais. (C) Os processos nasais mediais se fundem com o processo maxilar para formar a parte central do lábio superior e palato primário até o final da sexta semana. O processo lateral forma a asa do nariz. Da mesma forma, os processos mandibulares se fundem para formar o mandíbula. (D) Durante a sexta semana de embriogênese, o palato secundário desenvolve com crescimento bilateral dos processos maxilares, que crescem verticalmente para baixo do lado da língua. (E) Posteriormente, os processos palatinos elevam a uma posição horizontal acima da língua unindo na linha média. (F) Fusão dos processos palatinos, separando o espaço oronasal em cavidade oral e nasal. Modificado a partir de Dixon et al., 2011.

A B C D E

Figura 2 - Fissura de lábio e/ou palato não-sindrômica. (A) Fissura labial. (B) Fissura palatina. (C) Fissura lábio-palatina unilateral incompleta. (D) Fissura lábio-palatina unilateral completa. (E) Fissura lábio-palatina bilateral completa. Modificado a partir de Mossey et al., 2009.

7

O acometimento da FL pode ou não estar associado com a FP, assim como a FP pode surgir independentemente da FL, onde é explicado pela diferença na etiologia dentre as duas manifestações (Dixon et al., 2011). A gravidade da extensão da FL/P é associada ao tempo, gravidade e quantidade de interrupção do desenvolvimento (Economou et al., 2012). Um período crítico é imediatamente antes da formação do palato primário e do lábio, visto que ocorre uma explosão de crescimento mitótico. Durante este período, o desenvolvimento é altamente vulnerável a efeitos genéticos e teratogênicos (Seelan et al., 2012). Neste contexto é relatado o envolvimento de uma série complexa de eventos que exigem uma estreita relação entre proliferação, apoptose, migração e transição epitélio-mesênquima (Stanier e Moore, 2004; Mossey et al., 2009). A proliferação celular é regulada por diversas proteínas, chamadas de fatores de crescimento. Após a ligação ao seu receptor de superfície celular, estas moléculas sinalizadoras iniciam uma cadeia de eventos moleculares que ativam fatores de transcrição. Estes fatores de transcrição ligam-se às regiões reguladoras do genoma e permitem que haja uma ligação entre a enzima RNA-polimerase e o DNA, ocorrendo assim à transcrição e a futura tradução. Estudos sobre o desenvolvimento orofacial têm identificado uma série de moléculas chaves, incluindo os membros das famílias dos fatores de crescimento fibroblástico (FGF), sonic hedgehog (SHH), wingless (WNT) e dos fatores de crescimento transformante beta (TGF-β), o qual incluem as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) e ativinas (Wurdak et al., 2005; Kouskoura et al., 2011). Defeitos nos fatores de crescimento ou nos seus receptores têm sido associados com o surgimento das fissuras orais (Lidral et al., 1998; Riley et al., 2007a). Durante a palatogênese, por exemplo, é descrito a expressão de SHH no epitélio oral que se liga ao seu receptor PTCH (patched) (Rice et al., 2005) no mesênquima subjacente para ativar o receptor SMO (smoothened) e permitir a proliferação celular, visto que a expressão de SMO regula ciclina D1 e D2 no ciclo celular (Lan e Jiang, 2009). Simultaneamente, FGF10 (fibroblast growth factor 10) é expresso no mesênquima e se liga ao seu receptor FGFR2 no epitélio palatino para também regular a proliferação celular (Rice et al., 2004). A sinalização da proteína BMP via o receptor de BMPR1A (bone morphogenetic protein receptor,

8

type IA) no mesênquima regula o crescimento do palato e a expressão de MSX1, SHOX2 (short stature homeobox 2) e de SHH no epitélio do palato (Baek et al., 2011), que serão importantes no processo de proliferação celular e na transição epitélio mesênquima (Finnerty et al., 2009). Apoptose é um processo que desempenha papel central no desenvolvimento embrionário e na morfogênese tecidual (Wei et al., 2008). A apoptose pode ser desencadeada por duas vias: extrínseca e intrínseca. A via extrínseca é ativada por ligantes que se acoplam em receptores da membrana celular. Esses receptores pertencem à família dos receptores do fator de necrose tumoral (TNFR - tumor necrosis factor receptor) que possuem domínios de morte celular onde ativam proteínas adaptadoras (FADD - Fas-associated protein with death domain e TRADD - Tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein), que por sua vez ativam pró-caspases iniciadoras do processo apoptótico. A ativação da cascata das caspases que além de clivar substratos na célula, podem também ativar a via intrínseca mitocondrial por meio da interação com membros da família BCL2 (B-cell CLL/lymphoma 2) (Cory e Adams, 2002). Desta forma a apoptose é um processo complexo e o seu controle se faz essencial para a formação correta do lábio e palato (Dudas et al., 2007). A proteína “treacle”, codificada pelo gene TCOF1, é um precursor da morte celular das células da crista neural durante o desenvolvimento craniofacial devido a ativação e estabilização de p53 (Marszalek et al., 2002), visto que p53 se faz importante no processo de checagem do DNA no ciclo celular e um dando grave na sequência de DNA promove a morte celular (Polyak et al., 1997). A migração celular é um evento importante no processo morfogênico, deste a gastrulação até o desenvolvimento dos múltiplos órgãos (Hu et al., 2014). O início do processo de migração das células da crista neural ainda não é totalmente conhecido. Sabe-se que uma série de fatores de transcrição são estimulados, como SNAIL2 (snail family zinc finger 2), responsável por promover alterações no citoesqueleto da célula durante o processo migratório (Khudyakov e Bronner- Fraser, 2009). As células alteraram as junções celulares, suas propriedades de adesão e a morfologia para adquirir motilidade, o que permite migrar para seus

9

destinos finais (Strobl-Mazzulla e Bronner, 2012; Rogers et al., 2013). Durante a migração, as células da crista neural interagem uma com as outras e com o meio ambiente através de receptores de sinalização, tais como os receptores NRP (neuropilin), Robo (roundabout) e EPH (ephrin), que orientam para destinos específicos de cada célula (Sauka-Spengler e Bronner-Fraser, 2006; Betancur et al., 2010). Defeitos no processo de migração celular têm sido associados ao desenvolvimento das fissuras orais (Nikopensius et al., 2010). Durante o desenvolvimento craniano, é descrito que “knockdown” de SNAIL2 impede o desligamento da transcrição da molécula de adesão CAD6B (cadherin 6b), inibindo assim a migração das células da crista neural (Strobl-Mazzulla e Bronner, 2012). Outro fator importante durante a migração celular é a matriz extracelular. Estudos relacionando capacidade de proliferação celular e metabolismo de matriz extracelular é descrito como fator causal no desenvolvimento de FL/P, assim como de genes relacionados à inibição da degradação da matriz extracelular (Enomoto et al., 2010; Nikopensius et al., 2011; Baranger et al., 2014), visto que, este processo é necessário para o crescimento e posicionamento adequado das proeminências faciais e lâminas palatinas durante a morfogênese orofacial (Kerrigan et al., 2000; Dhulipala et al., 2006; Meng et al., 2009). O processo de transição epitélio-mesênquima é caracterizado pela mudança no fenótipo epitelial para mesenquimal que leva a perda ou expressão reduzida dos marcadores de células epiteliais, como E-caderina, e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais, como N-caderina e vimentina, regulado pelo aumento da expressão dos fatores de transcrição, como TWIST e SNAIL2 (Strobl-Mazzulla e Bronner, 2012). Várias vias de sinalização são descritas na indução da transcrição epitélio-mesênquima, como BMP, FGF (fibroblast growth factors), endotelina e SHH, durante o desenvolvimento craniofacial (Chen et al., 1996; Kettunen e Thesleff, 1998). Na formação do palato, por exemplo, é relatado que a perda de expressão de TGFβ (transforming growth factor beta) nas células epiteliais compromete a ativação da via de sinalização WNT e a expressão dos receptores SMAD2 e SMAD3 (Iwata et al., 2014). Assim, o complexo SMAD combina com os fatores de transcrição em sequência de genes de regulação para ativar ou reprimir

10

a transcrição (Massague, 2012). Defeito nesta via pode alterar o desenvolvimento craniofacial (Kang e Svoboda, 2005) e promover a ocorrência das FL/PNS (Iwata et al., 2014).

2.3 Epidemiologia das FL/PNS As FL/PNS afetam aproximadamente 1 em cada 500 a 2.500 nascidos vivos, com ampla variabilidade de acordo com a etnicidade e exposição a fatores ambientais de risco. Em geral, as populações asiáticas e ameríndias possuem uma alta prevalência (1:500), as populações europeias possuem prevalência intermediária (1:1.000) e as menores taxas de prevalência são observadas em africanos e descendentes de africanos (1:2.500) (Mossey e Little, 2002; Mossey et al., 2009; Murthy e Bhaskar, 2009). Levantamentos epidemiológicos realizados no Brasil mostraram prevalência entre 0,36 a 1,46 casos de FL/PNS para cada 1.000 nascidos vivos, com uma maior frequência no gênero masculino (Martelli-Júnior et al., 2006; Rodrigues et al., 2009). Os diferentes tipos de fissuras apresentaram distribuições distintas e a incidência varia entre os diferentes grupos populacionais (Moosey e Little, 2002; Vieira, 2008; Mossey et al., 2009). A frequência de FLP foi maior em algumas regiões da América Latina e Ásia (China e Japão) e menor em Israel, África do Sul e sul da Europa (Mossey e Little, 2002). A FP isolada apresentou frequência elevada no Canadá e em partes do norte europeu, porém menores em algumas regiões da América Latina e África do Sul (Mossey e Little, 2002; Matthews et al., 2015). No Brasil observa maior frequência de FLP (39,7%), seguida por FL (38,1%) e pela FP (22,2%) (Martelli-Junior et al., 2007). Uma variabilidade interessante pode ser observada na incidência das FL/PNS em relação ao gênero. As FL±P tem uma prevalência maior em indivíduos do gênero masculino, enquanto as FPs são mais frequentes no gênero feminino (Mossey et al., 2009; Martelli et al., 2012). Aproximadamente 75% das fissuras que envolvem o lábio são unilaterais. Entre as fissuras unilaterais, o lado esquerdo é duas vezes mais afetado que o lado direito (Gundlach e Maus, 2006). O risco de FL em relação à FP foi 2,19 vezes maior em homens quando comparados às mulheres

11

e o risco de FLP em relação à FP foi 2,78 vezes maior em homens quando comparado às mulheres (Martelli et al., 2012). Mesmo alguns estudos apontando que o fator socioeconômico pode interferir no aparecimento das fissuras, a sua influência na prevalência não foi conclusivamente confirmada (Carmichael et al., 2003; Yang et al., 2008). Possíveis explicações para as diferenças na prevalência entre origens geográficas e status socioeconômico incluem a influência dos fatores ambientais, tais como os hábitos maternos na gravidez, nutrição e acesso à saúde (Leslie e Marazita, 2013).

2.4 Etiologia das FL/PNS As FL/PNS são etiologicamente heterogêneas. Estudos genéticos e epidemiológicos indicam que há participação de fatores genéticos e ambientais na etiologia desta anomalia congênita, embora sua etiopatogenia permaneça incerta (Dixon et al., 2011; Mangold et al., 2011). Nos últimos anos tem ocorrido uma evolução no entendimento dos fatores causais, com a identificação de novas variantes genéticas, de fatores de risco ambientais e de como os fatores de risco ambientais interagem com os fatores genéticos. Este conhecimento deve, eventualmente, resultar em melhor prevenção, tratamento e prognóstico para os indivíduos afetados (Dixon et al., 2011; Mangold et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012).

2.4.1 Fatores ambientais Há uma enorme variedade de agentes teratogênicos externos que podem influenciar o desenvolvimento do lábio e do palato, embora poucos deles estejam comprovados. Tem sido sugerido que a exposição materna a alguns fatores teratogênicos como medicamentos, álcool e tabaco e as deficiências vitamínicas, principalmente ácido fólico, durante o primeiro trimestre de gestação está intimamente associada com a ocorrência das FL/PNS (Jianyan et al., 2010; Wehby e Murray, 2010). As complexidades dos mecanismos envolvidos se diferem quanto ao tipo, frequência e gravidade, resultando na diversidade das manifestações clínicas das fissuras (Economou et al., 2012).

12

Um dos fatores que podem influenciar na ocorrência de malformações congênitas é a desnutrição materna durante a gestação, pois pode reduzir a capacidade de produção de hormônios e nutrientes indispensáveis ao feto, sendo considerado um elemento agravante no aparecimento das FL/PNS (Krapels et al., 2006). A ingestão adequada de zinco, niacina, ácido ascórbico, ferro e magnésio supridos por meio dos alimentos ou da suplementação vitamínica pode reduzir o risco de malformações (Krapels et al., 2006; Johnson e Little, 2008). Além destes, a ingestão do ácido fólico também tem sido amplamente estudada na prevenção das FL/PNS (Loffredo et al., 2001; Johnson e Little, 2008; Boyles et al., 2011; Figueiredo et al., 2015). A suplementação com ácido fólico tem sido proposta na prevenção de defeitos no tubo neural e de FL/PNS, isto explicado devido sua ação na síntese de nucleotídeos, de aminoácidos e na metilação do DNA, onde se faz necessária na dinâmica da cromatina e na expressão gênica subsequente (Wilcox et al., 2007; Bufalino et al., 2010; Arruda et al., 2013). No entanto, estudos com suplementação de ácido fólico não encontraram uma diminuição na ocorrência de FL/PNS (Ray et al., 2003; Lopez-Camelo et al., 2010; Wehby e Murray, 2010), o que sugere o envolvimento de variantes polimórficas em genes como MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase), que codificam proteínas relacionadas ao metabolismo do ácido fólico, ao risco aumentado para o surgimento de FL/PNS (Bufalino et al., 2010; Bezerra et al., 2014; Aquino et al., 2014a). O tabagismo materno é considerado um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento das FL/PNS (Wyszynski et al., 1997; Little et al., 2004; Honein et al., 2007). Contudo, existem divergências nos resultados sobre o papel do tabagismo no surgimento das FL/PNS. Entre as pesquisas que não constataram associação entre FL/PNS e tabagismo destacam-se um estudo caso-controle realizado por Loffredo et al. (1994) e outro por Coutinho (2009). A associação entre o hábito materno de fumar na gestação e o desenvolvimento das FL/PNS também foi considerado inconsistente de acordo com Chevrier et al. (2008). Entre os registros que confirmam a associação de tabaco com FL/PNS, destaca-se o estudo de Wyszynski et al. (1997), que no período de três décadas (de 1966 a 1996), em um total de 11 estudos analisados, registrou que o risco atribuível ao fumo é de 11%

13

para FL/P e 12% para FP. Outro estudo de meta-analise, que incluiu 22 trabalhos publicados no período de 1966 a 2002, também evidenciou o risco de FL/PNS e o hábito de tabagismo (Little et al., 2004). O estudo de Zhang et al. (2011) com 304 pacientes com FL/PNS de origem Chinesa também evidenciou uma forte associação entre tabagismo e FL/PNS. A dificuldade destes estudos é que a suscetibilidade ao cigarro depende da biotransformação dos compostos tóxicos na mãe e no embrião que muitas vezes não são facilmente tangíveis ou mensuráveis. Interessante observar que o tabagismo durante a gravidez é também associado com malformações dos membros, espinha bífida, recém-nascido com peso e estatura menor, se comparados com os filhos de mães não fumantes e ainda com o aumento elevado no risco de prematuridade (Wang et al., 2014). Alguns estudos demonstraram evidências de interações entre tabagismo e polimorfismos genéticos, bem como a influência de determinados genes que atuam nas vias de desintoxicação metabólicas no desenvolvimento das FL/PNS (Chevrier et al., 2008; Van Den Boogaard et al., 2008; Jianyan et al., 2010; Li et al., 2011; Wu T et al., 2012). Registros demonstram associações significantes entre variações polimórficas nos genes GSTM1 (glutathione S-transferase mu 1) e GSTT1 (glutathione S-transferase theta 1) e tabaco em FL/PNS (Lammer et al., 2005; Shi et al., 2007; Chevrier et al., 2008). Outro gene em associação com o tabagismo materno que apresentou risco aumento no desenvolvimento de FL/PNS foi o RUNX2 (Wu T et al., 2012). O estudo mais recente, visando correlacionar as variáveis genéticas e ambientais, revelou uma forte interação entre tabagismo na gravidez e os polimorfismos nos genes SLC2A9 (solute carrier family 2) e WDR1 (WD repeat domain 1), localizados no cromossomo 4p16.1 em pacientes com FL/PNS (Wu et al., 2014). O álcool é considerado o teratógeno mais consumido mundialmente e o seu uso durante os períodos iniciais da gestação pode contribuir significantemente para o aparecimento de várias alterações congênitas (Leite et al., 2002). Alguns trabalhos consideram que a contribuição do álcool para o desenvolvimento de FL/PNS é significativa (Romitti et al., 1999; Lorente et al., 2000b; Chevrier et al., 2005; Deroo et al., 2008). No entanto, outros consideram os resultados da associação

14

inconsistentes (Meyer et al., 2003; Romitti et al., 2007b). Estes resultados podem ser justificáveis pela dificuldade em mensurar a quantidade, a frequência e o tempo do consumo do álcool em gestantes. Também nem sempre a bebida alcóolica é consumida exclusivamente, havendo frequentemente a associação deste agente teratogênico com outros, como tabaco, drogas ilícitas e ainda aspectos nutricionais (Krapels et al., 2006). Já em pesquisas abordando a suscetibilidade genética e consumo de álcool, Romitti et al. (2007b) observaram que a presença do alelo variante no gene MSX1 (gene que é intensamente expresso durante a embriogênese facial) e o consumo de apenas 1 dose semanal de bebida alcóolica pela mãe pode ser responsável por um aumento no risco de desenvolvimento de FL/PNS. Um trabalho recente desenvolvido por Bezerra et al. (2014) relata um risco aumentado para o desenvolvimento de FL/PNS em mulheres que consumiram bebidas alcoólicas juntamente com a falta de suplementação com ácido fólico e polimorfismos do gene MTHFR. Além do tabaco e do álcool, uma variedade de drogas ilícitas como a maconha, cocaína e o craque, entre outras, já foram descritas como teratogênicas (Lorente et al., 2000b; Lammer et al., 2004; Yang et al., 2014). O uso de alguns medicamentos também pode aumentar o risco de malformações congênitas, entre eles a talidomida, os hormônios androgênicos, os anticonvulsivantes, os anticoagulantes, os antibióticos e os anti-inflamatórios, os quais podem atuar nas diversas fases da morfogênese (Abdo e Machado, 2005). Diferentes atividades de trabalho e diversos compostos químicos utilizados nos processos produtivos têm sido associados com o aumento de risco de defeitos ao nascimento, entretanto, muitas destas associações não são facilmente confirmadas (Garlantezec et al., 2009). Na gravidez ocorrem mudanças importantes no que tange os aspectos fisiológicos e a composição corporal da mulher, estas adaptações são necessárias para o sucesso da gestação, crescimento e desenvolvimento fetal (Desrosiers et al., 2012). A literatura reúne evidências da associação entre malformações congênitas e a exposição ocupacional a agentes químicos, comumente encontrados em áreas industriais, como solventes e metais pesados, e os pesticidas nas áreas agrícolas (Chevrier et al., 2007). Entre as

15

substâncias químicas que produzem risco ao feto, além dos pesticidas de uso agrícola, listam também o sanitário e o doméstico. Segundo sua atividade, os defensivos agrícolas são classificados em inseticidas, acaricidas, fungicidas, raticidas, herbicidas, nematocidas e moluscocidas. Sua entrada no organismo pode ser por via inalatória ou por absorção através das mucosas e pele (Rojas-Martinez et al., 2010). Diversos estudos têm apontado que a exposição ocupacional das mães a agrotóxicos pode favorecer e aumentar o risco no aparecimento das FL/PNS (Lorente et al., 2000a; Romitti et al., 2007a; Gonzalez et al., 2008; Jia et al., 2011). Tendo em vista os fatores apresentados, Garcia (2000) levantou a hipótese de que em áreas agrícolas em períodos de pico do uso de agrotóxicos, a gestante poderia demonstrar um aumento no risco de ter um filho com defeitos congênitos como a FL/PNS. Mesmo apresentando limitações neste estudo, principalmente pela dificuldade em quantificar a exposição ao agrotóxico durante a gestação nestas regiões, outros estudos também afirmam esta associação (Shaw e Gold, 1988; Chevrier et al., 2006; Yang et al., 2014). Adicionalmente, Vieira e Orioli (2002) destacaram que doenças infecciosas parecem ter uma ação danosa sobre o andamento da gravidez, uma vez que o embrião pode ser atingido por certas bactérias, protozoários, vírus, micoplasmas, espiroquetas, fungos ou pseudomonas, responsáveis por enfermidades na mãe. Além dos fatores ambientais classicamente descritos, já foi observado em alguns estudos a possível influência de enfermidades crônicas, como obesidade e diabetes, no aparecimento das FL/PNS (Beaty et al., 2001; Vieira et al., 2002; Leite et al., 2005). Mães diabéticas com filhos fissurados demonstraram a presença de um fator anti-insulina, ligado a albumina, que altera a mobilização proteica e diminui a nutrição das células, alterando seu comportamento e determinando alterações na morfogênese (Abdo e Machado, 2005). O estresse materno tem cada vez mais sido objeto de investigação para intercorrências fetais e foi considerado fator de risco para a FL/PNS (Carmichael et al., 2007). Em estudo recente, Carmichael et al. (2014), avaliando um grupo de 1.100 pacientes com FL/PNS, confirmaram que o estresse nos períodos iniciais da gravidez pode aumentar o risco para o

16

aparecimento de FL/PNS. Entretanto, em vista das interações complexas da sua ação na patogenia da maioria das malformações é difícil estabelecer o exato papel de cada um destes teratogênicos na etiologia das FL/PNS.

2.4.2 Fatores genéticos Fogh-Andersen (1942) foi o primeiro a observar, em um estudo populacional, a existência de um componente hereditário associado ao desenvolvimento das FL/PNS. Nas últimas décadas alguns estudos tem indicado recorrência familial no desenvolvimento de FL/PNS (Sivertsen et al., 2008; Grosen et al., 2010), embora um padrão clássico de herança mendeliana não seja identificado (Natsume et al., 2000; Vieira, 2008). Curtis et al. (1961) demonstraram que o risco de uma segunda ocorrência de FL/PNS em uma mesma família é de 4% se a criança for afetada, 4% se os pais forem afetados, 9% se existirem duas crianças afetadas e 17% se os pais e uma criança forem afetados. Interessantemente nota-se que famílias afetadas por um tipo de fissura não apresentam risco aumentado para outro tipo de fissura, refletindo assim as origens distintas de desenvolvimento de cada forma da anomalia (Jugessur e Murray, 2005). No entanto, ocasionalmente, as FL±P e FP isoladas podem ocorrer dentro de uma mesma família, sugerindo que existe, pelo menos, alguma sobreposição na etiologia destes 2 tipos de fissuras (Leslie e Marazita, 2013). O estudo de Martelli et al. (2010) avaliou a incidência familial de FL/PNS em 185 pacientes e identificou que 35,13% dos indivíduos apresentaram histórico familial de FL/PNS, sendo os primos (54,37%) e os irmãos (21,05%) os mais afetados, independentemente do tipo de fissura. Em estudos com gêmeos, a taxa de concordância observada de 40 a 60% em gêmeos monozigóticos é muito maior do que a concordância de 3 a 5% identificada em gêmeos dizigóticos (Jugessur et al., 2009). A alta taxa de concordância entre gêmeos monozigóticos fornece evidências convincentes para um componente genético forte para as fissuras orofaciais.

17

Estudos recentes com abordagens diferenciadas têm sido realizados com o objetivo de identificar os genes envolvidos com a etiologia das FL/PNS. As abordagens mais recentes são baseadas em estudos de associação de larga escala genômica (GWAS), no qual polimorfismos distribuídos pelo genoma são analisados simultaneamente em pacientes afetados ou não pelas FL/PNS. Estes estudos identificaram a maior parte dos genes e regiões cromossômicas associadas a etiologia das FL/PNS conhecidas até o momento (Dixon et al., 2011; Stuppia et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Ludwig et al., 2012; Rahimov et al., 2012; Bohmer et al., 2013). Dentre as diferentes regiões cromossômicas, destacam-se a 17p13.1 (Wyszynski et al., 2003), 2p13, 3q27-28, 14q21-24, 16q24 (Marazita e Mooney, 2004), 8p11-23 (Riley et al., 2007b), 19p13.12, 19q12, 2q22.3 (Vieira et al., 2002), 9q21, 1p32, 1q32 (Marazita et al., 2009), 8q24.21, 18q22 (Birnbaum et al., 2009; Grant et al., 2009), 9q22 (Moreno et al., 2009; Letra et al., 2010b) 10q25.3, 17q22, 2p21 (Mangold et al., 2010), 1p22, 20q12, 1p36 (Beaty et al., 2010), 6q14.2-14.3 (Letra et al., 2010a) e 3p11 (Ludwig et al., 2012). No entanto, apenas 2 marcadores foram reproduzidos em diferentes populações, os quais estão localizados no gene IRF6 (interferon regulatory factor 6) e em uma região intergênica na região 8q24 (Mostowska et al., 2010; Rojas-Martinez et al., 2010; Murray et al., 2012). Estudos confirmaram a associação do lócus 8q24 na população brasileira (Brito et al., 2012; Bagordakis et al., 2013), mas a participação do gene IRF6 é discutida (Paranaiba et al., 2010; Brito et al., 2012). Outras abordagens que são frequentemente utilizadas para a descoberta de genes e regiões de suscetibilidade as FL/PNS incluem estudos com genes associados a síndromes mendelianas que apresentam a fissura no espectro fenotípico (Kondo et al., 2002), modelos animais (Juriloff e Harris, 2008), análises citogenéticas (Brewer et al., 1999; Higgins et al., 2008), análises de expressão gênica (Yu et al., 1999; Mukhopadhyay et al., 2004; Gong et al., 2005; Zhu, et al., 2009) e estudos de ligação do genoma (Birnbaum et al., 2009; Marazita et al., 2009). A análise de variantes polimórficas em genes envolvidos com a embriogênese normal do lábio e palato também tem sido frequentemente realizada e revelado a participação de inúmeros genes, incluindo WNT (Mostowska et al., 2012), TGFβ3

18

(Saleem et al., 2012), SHH (Orioli et al., 2002), MSX (Jagomagi et al., 2010; Butali et al., 2011), PDGF (platelet-derived growth factor beta) (Wu D et al., 2012), RARA (retinoic acid receptor, alpha) (Maestri et al., 1997), BCL3 (B-cell CLL/lymphoma 3) (Gaspar et al., 2002), MMP, TIMP2 (Letra et al., 2007; Letra et al., 2012; Letra et al., 2014), FOXE1 (forkhead box E1), PTCH, STOM (stomatin)(Letra et al., 2010b), MAFB (v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B), PAX7 (paired box 7), VAX1 (ventral anterior homeobox 1) e ABCA4 (ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 4) (Fontoura et al., 2012; Butali et al., 2014). A diversidade de eventos embriológicos que contribuem para a formação das estruturas faciais reflete no grande número de genes conhecidos ou suspeitos de estarem envolvidos na formação das FL/PNS (Jugessur et al., 2009; Rojas-Martinez et al., 2010). Diante da complexidade destes processos descritos, pode-se perceber o significado biológico dos mecanismos de desenvolvimento embrionário e a sua importância, pelo fato da ocorrência de alguma falha neste processo, poder contribuir para possíveis alterações congênitas. A seguir serão descritos os polimorfismos genéticos nos genes de desenvolvimento embrionário analisados neste estudo, bem como a participação desses genes nos diferentes mecanismos de formação craniofacial.

2.4.2.1 HOXD1 O gene HOXD1 está localizado no cromossomo 2q31.1, possui 3 éxons e codifica uma proteína com 161 aminoácidos com a função de fator de transcrição envolvido na diferenciação e desenvolvimento tecidual. HOXD1 está relacionado no desenvolvimento craniofacial, especificamente no desenvolvimento a partir do primeiro arco faríngeo (Couly et al., 2002; Vieux-Rochas et al., 2013). Interessantemente, sua repressão é necessária para o desenvolvimento do osso nasal, maxila e mandíbula, enquanto que sua expressão é necessária para a formação do osso hióide (Couly et al., 2002). Além disto, HOXD1 está relacionado ao desenvolvimento vascular e nervoso (Guo et al., 2011; Park et al., 2011). O “knockdown” de HOXD1 em células endoteliais inibi a migração, adesão e a formação de estruturas vasculares. Estes eventos foram correlacionados com a

19

redução da expressão de integrina β1, importante na sinalização da angiogênese (Park et al., 2011). Vários estudos têm relacionado HOXD1 com alguns tipos de câncer, como o de ovário (Goode et al., 2010), colorretal (Jacinto et al., 2007; Pussila et al., 2013) e mama (Jeschke et al., 2012). Além disso, também tem sido estudado em outras condições como no autismo (Bacchelli et al., 2003). O gene HOXD1 emergiu como um forte candidato para FL/PNS a partir de estudos de associação realizados em populações de origens étnicas diferentes (Beaty et al., 2006). No entanto, há poucos estudos relacionados a variações genética no gene HOXD1 como fator de risco para FL/PNS. O presente estudo avaliou o polimorfismo rs1374326, localizado na posição 177058316 do gene HOXD1, onde resulta uma transição de um alelo C para um T. O estudo realizado por Beaty et al. (2006) avaliaram 47 polimorfismos identificados no gene HOXD1, em regiões funcionalmente importantes. Destes, apenas o polimorfismo rs1374326 localizado em região intrônica mostrou associação significante com FPNS, sugerindo assim a participação do gene HOXD1 na etiologia da fissura oral.

2.4.2.2 TNP1 A família TNP é representada por 2 genes (TNP1 e TNP2), que foram associados ao desenvolvimento craniofacial e morfogênese tecidual (Sarmah e Wente, 2010). TNP1 está localizado no cromossomo 2q35-q36, possui 2 éxons e codifica uma proteína chamada “spermatid nuclear transition protein 1” de 54 aminoácidos. Sugere a relação de polimorfismos no gene TNP1 com o desenvolvimento de FL/PNS, baseado em observações em estudos de associação (Beaty et al., 2006). TNP1, foi recentemente identificado como um parceiro de ligação da subunidade α da proteína kinase (CK2- casein kinase 2) (Mannowetz et al., 2010), que está envolvida no crescimento, proliferação e apoptose celular (Ortega et al., 2014). Defeito nesta via pode desenvolver alterações importantes na embriogênese (Dominguez et al., 2011), assim como na formação óssea pela inativação da via BMP (Bragdon et al., 2011). Vários estudos têm relacionado TNP1 com o câncer de mama (Long et al., 2013; Han et al., 2014). Além disso, o gene TNP1 também tem sido recentemente

20

estudado em outras condições como a infertilidade masculina e obesidade (Okada et al., 2010; Heidari et al., 2014). Este estudo analisou o polimorfismo rs748044, localizado na posição 218154042, onde resulta uma transição de um C para um T. Um estudo recente mostrou a participação do gene TNP1 na ocorrência FL/PNS através de mapeamento de 962 polimorfismos em 104 genes no cromossomo 2 em 172 trios de FL±P e 60 trios de FP provenientes de Maryland, Singapura e Taiwan. Por meio da análise do teste de desequilíbrio de transmissão e haplótipo, revelou uma associação do polimorfismo rs748044 com FPNS, sendo que o alelo T estaria associado a um risco maior (Beaty et al., 2006).

2.4.2.3 MSX1 MSX1 é um membro da família de genes homeobox com uma participação fundamental no desenvolvimento craniofacial (Zhang et al., 1999; Nassif et al., 2014). O gene MSX1 está localizado no cromossomo 4p16, é composto por 2 éxons, codifica uma proteína de 297 aminoácidos e possui regiões altamente conservadas entre as espécies, o que sugere um papel importante no desenvolvimento (Coudert et al., 2005). Múltiplas linhas de evidências sugerem que o gene MSX1 está envolvido na promoção do crescimento e inibição da diferenciação celular (Blin- Wakkach et al., 2001; Nassif et al., 2014). Este gene possui um papel importante na indução da interação epitélio-mesênquima e, consequentemente, na organogênese de vertebrados (Alappat et al., 2003; Finnerty et al., 2009). As proteínas codificadas pelos genes homeobox possuem em comum um homeodomínio altamente conservado entre as espécies, cuja função é reconhecer sequências específicas de DNA nos genes alvo, visando controlar a expressão destes por meio de ativação ou repressão gênica (Ivens et al., 1990). Mutações no gene MSX1 em humanos estão associados com FP e/ou agenesia dentária (Vastardis et al., 1996; Cobourne, 2007), assim como a síndrome de Wolf-Hirschhorn, que apresenta como característica comum a FL/P (Paradowska-Stolarz, 2014). Um fenótipo semelhante é observado em camundongos “knockout” para o gene MSX1 (Vastardis et al., 1996). No entanto, pouco se sabe sobre a função do MSX1 na diferenciação dos osteoblastos e na mineralização óssea in vivo. Nassif et al. (2014) relatam que camundongos

21

deficientes em MSX1 apresentaram alterações craniofaciais relacionadas à mineralização óssea, no número de osteoblastos, proliferação celular e apoptose, com diferenças na localização óssea que poderiam ser responsáveis por alterações no formato ósseo. A primeira evidência da participação de MSX1 na etiologia das FL/P foi quando uma geração de camundongos “knockouts” apresentou FP e outras anomalias craniofaciais, como hipoplasia de maxila e oligodontia (Satokata e Maas, 1994). Em humanos, mutações em MSX1 foram, inicialmente, identificadas causando uma forma autossômica dominante de agenesia dental (Vastardis et al., 1996). Subsequentemente, Van Den Boogaard et al. (2000) identificaram uma mutação em MSX1 sendo a causa de um padrão familiar de agenesia dental associada à FLP e FP. O sequenciamento completo do gene MSX1 demonstrou que mutações pontuais contribuem com cerca de 2% de todos os casos de FL/PNS (Jezewski et al., 2003). Os estudos de associação de FL±P (Lidral et al., 1998; Beaty et al., 2002; Vieira et al., 2003; Suazo et al., 2004; Park et al., 2007; Jagomagi et al., 2010; Butali et al., 2011; Cardoso et al., 2013; Souza et al., 2013) e FP (Lidral et al., 1998; Butali et al., 2011) têm mostrado um papel para MSX1 em FL/PNS em diferentes populações, e outros, sem nenhuma correlação com ambas as formas de fissuras (Mitchell et al., 2001). Sugere-se que o motivo de divergências entre os resultados verificados na literatura se deva a etnicidade variada das populações investigadas. Um estudo sugeriu que o risco de desenvolvimento de FL/PNS aumenta quando existe exposição materna ao fumo e ao álcool em associação com a presença de variantes polimórficas específicas no gene MSX1 (Romitti et al., 1999; Beaty et al., 2002; Fallin et al., 2003) e que mutações nesse gene parecem estar envolvidas com casos de FL/PNS com história familial (Van Den Boogaard et al., 2000). Nikopensius et al. (2010), com o objetivo de identificar genes relacionados a FPNS nas populações da Estônia, Letônia e Lituânia, avaliaram 591 polimorfismos em 40 genes e identificaram a associação do polimorfismo rs1106514, assim como o haplótipo formado pelos polimorfismos rs1106514 e rs12501827, no gene MSX1

22

com o risco de desenvolver FPNS. Este estudo analisou o polimorfismo rs1106514, localizado na posição 4875926, onde resulta de uma transição de um G para um C.

2.4.2.4 TCOF1 O gene TCOF1 está localizado no cromossomo 5q31.3-32, possui 26 éxons e codifica uma proteína nomeada “treacle”, que desempenha um papel importante na biogênese ribossomal atuando tanto na transcrição do DNA ribossomal (rDNA) quanto no pré-processamento do transcrito de RNA ribossomal (rRNA) (Kadakia et al., 2014). Foi revelado que “treacle” interage com Nop56p (NOP56 ribonucleoprotein) no complexo ribonucleoproteico pré-ribossomal (pré-rRNPs), o qual é importante na metilação da região 2-O da ribose do pré-rRNA (Valdez et al., 2004). No processo de transcrição do rDNA, a parte central de “treacle” se liga com o RNA polimerase I e a porção C-terminal reconhece a região promotora do rDNA e recruta a UBF (upstream binding factor) (Lin e Yeh, 2009). Em estudos in vitro e in vivo indicam que a haploinsuficiência de TCOF1 resulta na dispersão de UBF e da RNA polimerase I no nucléolo, enquanto que as interações de “treacle” com a região promotora do rDNA não são interrompidas (Hayano et al., 2003; Lin e Yeh, 2009). A inibição da função da “treacle”, desta forma, reduz a quantidade de ribossomos maduros, especificamente a subunidade 28S, que, subsequentemente, prejudica a capacidade de síntese proteica das células da crista neural (Trainor et al., 2009). Assim, como as necessidades metabólicas das células dessa linhagem altamente proliferativa não são cumpridas, ocorre à ativação e estabilização do gene p53, o que tem por consequência a ativação de genes apoptóticos, resultando, em última instância na morte das células da crista neural e ectoderma neural (Marszalek et al., 2002). Mais de 118 diferentes mutações foram relatadas na região codificante de TCOF1, onde a maioria são deleções ou duplicações, causando um códon de parada prematuro (Splendore et al., 2005). Mutações em TCOF1 resultam na síndrome Treacher-Collins, a qual é caracterizada por hipoplasia dos ossos faciais, FP e defeitos de ouvido médio e externo (Dixon et al., 2006). Masotti et al. (2005) revelaram que o polimorfismo rs28372960 no gene TCOF1 diminui a atividade

23

promotora do gene em 38% por alterar o fator de transcrição de DNA YY1. Desta forma, os autores concluíram que polimorfismos no gene TCOF1 podem impedir o desenvolvimento e proliferação das células da crista neural e, consequentemente, induzir alterações craniofaciais como as que envolvem o lábio e palato. No entanto, há poucos estudos relacionando polimorfismos do gene TCOF1 e o risco para a ocorrência de FL/PNS. O estudo de Sull et al. (2008), utilizando nove polimorfismos no gene TCOF1 em 81 trios com o afetado apresentando FPNS, revelou que os alelos variantes dos polimorfismos rs15251, rs2569062 e rs2255796 apresentaram um risco maior de desenvolvimento de FPNS. O presente estudo analisou 3 polimorfismos no gene TCOF1. O polimorfismo rs28372960, localizado no códon 4763 em região intrônica do éxon 1, caracterizado por uma transição de um C para um T. O polimorfismo rs15251, localizado no códon 1351 do éxon 23, resulta na transição de um C para um T, promovendo a substituição de um aminoácido alanina por uma valina na posição 1351 da cadeia proteica (Ala1351Val), e rs2569062, localizado no códon 46163 do éxon 24, resulta na transição de um C para um G.

2.4.2.5 FGFR1 A família FGFR é representada por 18 receptores de tirosina quinase que são importantes na regulação de diversas atividades celulares (McKeehan et al., 2009). FGFR1, o protótipo desta família, está localizado no cromossomo 8p11.2-p11.1, possui 22 éxons e codifica uma proteína com 822 aminoácidos. Mutações neste gene resultam na síndrome de Kallmann (Dode et al., 2007; Hero et al., 2015) e na síndrome de Pfeiffer (Bessenyei et al., 2014; Cerrato et al., 2014; Martelli-Júnior et al., 2015). Um importante papel na indução da interação epitélio-mesenquimal e, consequentemente, na organogênese de vertebrados é relacionado ao gene FGFR1 (Rice et al., 2004). A participação de FGFR1 no desenvolvimento craniofacial é bem relatada. A primeira evidência da participação da via FGFR1 na palatogênese foi observada por Wang et al. (2013), que relataram a influência deste gene no desenvolvimento, elevação e fusão dos processos palatinos. Outros estudos em animais também

24

demonstraram a associação deste gene com a palatogênese (Lee et al., 2001; Kanda et al., 2003; Crisera et al., 2008). O sequenciamento demonstrou que as mutações no gene FGFR1 podem contribuir com cerca de 3% de todos os casos de FL±P (Riley et al., 2007a). Os estudos de associação de FL±P têm mostrado um papel para FGFR1 em FL±PNS em diferentes populações (Riley et al., 2007a; Menezes et al., 2008; Lace et al., 2011) e outros, sem nenhuma correlação a FL±PNS (Butali et al., 2011). Sugere-se que o motivo de divergências entre os resultados verificados na literatura se deva a etnicidade variada das populações investigadas. Este estudo analisou o polimorfismo rs7829058, localizado na posição 38332095, onde resulta uma transição de um G para um C. Nikopensius et al. (2010) conduziram um estudo avaliando 11 polimorfismos em FGFR1 em uma amostra de 104 pacientes afetados por FPNS e 606 controles, da região oriental da Europa e mostrou uma associação altamente significativa para os polimorfismos rs7829058 e rs2978083. A avaliação de haplótipos revelou que uma combinação de polimorfismos (rs7012413, rs6996321 e rs7829058) estava associada de forma significante às FPNS e não revelou associação os haplótipos com rs2978083. Os autores concluíram que há o potencial envolvimento de FGFR1 na etiologia das FPNS, mas o seu papel patogenético precisa ser mais investigado.

2.4.2.6 COL2A1 COL2A1 está localizado no cromossomo 12q13.11, possui 54 éxons e codifica uma proteína responsável pela produção da cadeia α do colágeno do tipo II. Mutações neste gene estão relacionadas frequentemente com a sequência de Pierre-Robin, mas sugere que possíveis variações na sequência deste gene podem também causar ou predispor a condições não sindrômicas de FP e micrognatia (Melkoniemi et al., 2003). Além da sequência de Pierre-Robin, a síndrome de Stickler (Faber et al., 2000; Hoornaert et al., 2010), caracterizada por alterações no desenvolvimento craniofacial e em osso longos (Li et al., 1995), também está relacionada à mutação neste gene. Variações genéticas no COL2A1 estão relacionadas à FL/PNS em animais (Ricks et al., 2002; Barbieri et al., 2003).

25

Mutações em COL2A1 resultam em um pró-colágeno malformado que acumula no retículo endoplasmático de condrócitos e ativa a cascata apoptótica, podendo causar defeitos no desenvolvimento ósseo pelo defeito na via de crescimento ósseo endocondral (Liang et al., 2014). Estudo em camundongos com deficiência de COL2A1 relatou o retardo no crescimento de cartilagem de Meckel, importante no desenvolvimento da mandíbula e o arqueamento da língua no interior da cavidade oro-nasal, que impede a elevação e fusão dos processos palatinos (Ricks et al., 2002). Além disto, vários marcadores de diferenciação celular são controlados pelo COL2A1, dentre eles RUNX2 que se mostra importante no processo de desenvolvimento do palato pela diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos (Maeno et al., 2011). Adicionalmente, o potencial condrogênico está presente no periósteo cobrindo os ossos intramembranosos e é observado que camundongos com mutação em COL2A1 apresentam ossificação tardia dos ossos intramembranosos (Savontaus et al., 2004). Para avaliar se COL2A1 desempenha algum papel na etiologia das FPNS, um estudo caso-controle utilizando marcadores de nucleotídeo único foi proposto por Nikopensius et al. (2010). Seis polimorfismos, rs1793949, rs6823, rs12228854, rs12368284, rs10875713 e rs1168359, foram associados às FPNS, indicando que o gene COL2A1 pode ser um fator predisponente. Além disto, a associação de polimorfismos em COL2A1 com outros genes, também foi verificado, sendo que a associação mais forte para FP foi observada entre o polimorfismo rs2288696 do gene FGFR1 e o polimorfismo rs1793949 do gene COL2A1. Este estudo analisou o polimorfismo rs1793949, localizado na posição 48371595, onde resulta uma transição de um C para um T.

2.4.2.7 WNT3 O gene WNT3 localiza-se no cromossomo 17q21.31, possui 5 éxons e codifica uma proteína de 355 resíduos. Mutações neste gene causam a síndrome Tetra-Amélia, que apresenta ausência dos quatro membros e anomalias craniofaciais como características fenotípicas comuns (Niemann, 1993). Um papel importante na indução da interação epitélio-mesênquima e, consequentemente, na

26

diferenciação celular é relacionado ao WNT3 (Song et al., 2014). Estudos em embriões de camundongos “knockout” sugerem que o gene WNT3 desempenha um papel importante no desenvolvimento craniofacial (Carroll et al., 2005; Liu e Millar, 2010) e na FL±PNS (Juriloff et al., 2004). Além disto, é relatado que a via de sinalização WNT-β catenina regula uma série de processos no desenvolvimento e na homeostasia tecidual (Freese et al., 2010; Yang, 2012), visto que β catenina tem a função de adesão às junções celulares e na sinalização nucleolar induzida por WNT (Pellon-Cardenas et al., 2013). Mutações nesta via estão associados a ocorrência de cânceres e agenesia dentária (Lammi et al., 2004; Andrade Filho et al., 2011). Estudos em modelos animais revelaram que a sinalização de WNT é fundamental para o desenvolvimento do crânio e da face (Mani et al., 2010; Sasaki et al., 2014) e a ativação da via de sinalização WNT-β catenina por WNT3, como sua expressão na ectoderme dos processos nasais mediais e distais dos processos maxilar e mandibular, regulam o desenvolvimento facial e fusão do lábio (Lan et al., 2006). Investigações em humanos têm mostrado que polimorfismos na família WNT podem estar correlacionados com anomalias congênita, incluindo FL/PNS (Liu e Millar, 2010). Estudos em diversas populações identificaram polimorfismos em WNT3 associado à FL±PNS (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Lace et al., 2011; Yao et al., 2011; Mostowska et al., 2012) e outros, sem nenhuma correlação com FL±PNS (Fontoura et al., 2015). Nikopensius et al. (2010) avaliaram 16 polimorfismos presentes em WNT3 em 104 casos de FPNS e 606 controles e descreveram a participação do alelo T do polimorfismo rs11653738 como um fator de suscetibilidade para a ocorrência das FPNS. Desta forma, no presente estudo, avaliou-se o polimorfismo rs11653738, localizado no códon 13965, onde resulta uma transição de um C para um T.

2.4.2.8 TIMP3 O gene TIMP3 está localizado no cromossomo 22q12.3, possui 5 éxons e codifica uma proteína com 188 aminoácidos que é responsável pela remodelação tecidual durante o desenvolvimento embrionário (Verstappen e Von Den Hoff,

27

2006). TIMPs apresentam a função primária de controlar a composição da matriz extracelular via inibição de MMPs, mas outras funções não canônicas são atribuídas a este grupo de proteínas (Baranger et al., 2014). Vários estudos têm relacionado TIMP3 com alguns tipos de câncer, como o de fígado (Defamie et al., 2014), carcinoma espinocelular de orofaringe (Van Kempen et al., 2014), de mama (Celebiler Cavusoglu et al., 2009; Gan et al., 2014), de ovário (Januchowski et al., 2014), melanomas (Van Der Velden et al., 2003; Das et al., 2014; Jacomasso et al., 2014), colorretal (Bai et al., 2007; Lin et al., 2012; Qin et al., 2014), bexiga (Hoque et al., 2008; Wieczorek et al., 2013) e pulmão (Kallio et al., 2011; Xu et al., 2013). TIMPs foram associados com FL/PNS com base nas observações de sua expressão espacial e temporal em roedores (Morris-Wiman et al., 2000; Blavier et al., 2001; Brown et al., 2002; Shi et al., 2008; Oliveira Demarchi et al., 2010). Polimorfismos em TIMP3 podem gerar desregulação na remodelação da matriz extracelular durante o desenvolvimento craniofacial (Smane et al., 2013). No entanto, poucos estudos relacionaram variações no gene TIMP3 e o risco para FL/PNS (Nikopensius et al., 2010; Lace et al., 2011). Este estudo analisou o polimorfismo rs242082, localizado na posição 33224439, onde resulta em uma transição de um G para um A. Recentemente, Nikopensius et al. (2010) testaram associações entre 36 polimorfismos no gene TIMP3 para FPNS em um estudo caso- controle (104 pacientes, 606 controles) e a associação significativa foi encontrada no polimorfismos rs242082, onde concluíram que os indivíduos homozigotos para o alelo variante apresentam maior risco de ocorrência de FPNS.

2.5 Delineamento experimental Genes de suscetibilidade às FL/PNS têm sido identificados em várias populações (Dixon et al., 2011). No Brasil, a grande diversidade da população em termos de ancestralidade, torna-o particularmente adequado para estudos genéticos com base em mapeamento por miscigenação (Wehby, 2013), sendo que a análise genética em diversas regiões do país se faz importante devido à variação na ancestralidade entre estas regiões (Pena et al., 2011). Para tanto, as abordagens de mapeamento genético mais utilizadas têm sido os estudos de ligação e

28

associação. A análise de ligação pode ser usada em uma ampla análise por todo o genoma pela existência do lócus responsável pelo fenótipo, por intermédio de sua localização cromossômica, enquanto que a análise de associação é mais útil para a confirmação de suspeita da participação de um determinado alelo na manifestação da doença ou de um alelo existente em um lócus próximo a região genética responsável pela doença (Feitosa e Krieger, 2002). Dois tipos de desenhos de estudo são frequentemente utilizados nos estudos de associação e são classificados como estudos caso-controle e núcleo familiar. Pode-se definir o estudo caso-controle como uma forma de pesquisa na qual são comparados dois grupos, onde o primeiro grupo de indivíduos apresenta o fenótipo (caso) e o segundo grupo não apresenta tal condição (controle). Este tipo de estudo é muito utilizado por permitir um recrutamento de um grande número de indivíduos afetados, sem a necessidade de incluir seus familiares (Risch, 2000). Por outro lado, os estudos caso-controle apresentam a desvantagem de se basearem na diferença entre a frequência dos alelos entre os grupos, que pode ser influenciada pela heterogeneidade populacional (Letra et al., 2007). Visto que a população brasileira resulta da mistura genética de 3 populações ancestrais (Europeia, Africana e Ameríndia) e exibe níveis muito altos de diversidade genômica (Pena et al., 2011), é possível que os marcadores de risco identificados em populações geneticamente homogêneas não são fundamentados na população brasileira. Assim, para evitar resultados tendenciosos e incorretos, os marcadores polimórficos devem ser analisados em um estudo caso-controle, levando em consideração a variação genética da ascendência de cada indivíduo (Pena et al., 2009). No estudo do núcleo familiar (pai, mãe e filho afetado), a ideia é coletar uma amostra de indivíduos afetados juntamente com seus pais (não afetados), ou seja; a base da análise e o estudo da segregação de alelos nos trios, com o intuito de selecionar casos e controles de uma mesma população genética (o núcleo familiar). Para este tipo de estudo de associação de marcadores genético, o genótipo do filho afetado é considerado como um ponto amostral do grupo “caso” e os dois alelos (um materno e um paterno) que não foram transmitidos para o filho afetado são

29

considerados um ponto amostral do grupo “controle”. Desta maneira, têm-se as amostras de casos e de controles de uma mesma população genética (Purcell et al., 2005). A principal vantagem do estudo de núcleos familiares é o controle de possíveis efeitos da estratificação populacional (Sebro e Rogus, 2010). Para a análise utiliza-se o teste de desequilíbrio de transmissão (TDT), avaliando-se a transmissão dos alelos do polimorfismo. O TDT usa um teste x2 de Mc Nermar (1947) para verificar a hipótese nula em que o alelo tido como associado à característica é transmitido em 50% das vezes pelo progenitor heterozigoto (Feitosa e Krieger, 2002).

30

3 PROPOSIÇÃO Determinar a associação dos polimorfismos rs1374326 no gene HOXD1, rs748044 no gene TNP1, rs1106514 no gene MSX1, rs28372960, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1, rs7829058 no gene FGFR1, rs1793949 no gene COL2A1, rs11653738 no gene WNT3 e rs242082 no gene TIMP3 com a suscetibilidade para o desenvolvimento de FL/PNS em uma população brasileira.

31

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Este estudo incorporou os aspectos éticos recomendados pela Comissão Nacional de Ética e Pesquisa-CONEP, incluindo entre outros a obtenção do consentimento livre e esclarecido dos indivíduos, e não apresentou atividades que pudessem causar danos à dimensão física, psíquica, moral, intelectual, social, cultural ou espiritual dos envolvidos. O estudo desenvolvido junto a crianças e adolescentes foi obtido não só a concordância dos mesmos, mas também, e fundamentalmente, o consentimento dos seus responsáveis legais. Este projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da FOP-UNICAMP (protocolo 152/2009; Anexo1).

4.2 Desenho do estudo Este estudo utilizou inicialmente a abordagem de TDT com trios de pacientes com FL±PNS e com FPNS. Os marcadores polimórficos que demonstraram uma transmissão preferencial com um valor de p<0,05 foram selecionados para a abordagem caso-controle com correção para diferenças de ancestralidade.

4.3 Amostras Todas as amostras de pacientes com FL/PNS foram obtidas de 4 Centros de atendimento de pacientes com fissuras orofaciais: o Centro de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais da Universidade José do Rosário Vellano (Centro Pró- Sorriso), localizado em Alfenas, Minas Gerais; a Associação Portadores de Fissura Labial localizada na cidade de Cascavel, Paraná (APOFILAB); o Hospital Santo Antônio das Obras Assistenciais Irmã Dulce (OAID), Salvador, Bahia e o Hospital Universitário Lauro Wanderley (HULW), Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba. Todos os pacientes com FL/PNS foram examinados pelas equipes multidisciplinares de cada centro e apenas pacientes com a forma não- sindrômica de FL/P foram incluídos. Os pacientes com história de consanguinidade ou com história familiar de fissura oral também não foram incluídos neste estudo (Tabela 1).

32

As amostras do grupo controle foram obtidas nas mesmas regiões supracitadas e apenas pacientes sem alterações congênitas ou história familiar de FL/P foram incluídos. A proporção dos pacientes do grupo controle de acordo com a idade e cor de pele/raça foi selecionada, sendo considerado leucoderma os indivíduos caucasianos, feoderma os de origem africana e melanoderma os de origem asiática.

Tabela 1. Origem das amostras deste estudo. Centro Pró- Hospital APOFILAB, HULW, TOTAL Sorriso, OAID, Cascavel- João Alfenas-MG Salvador-BA PR Pessoa-PB

TDT FL±PNS 93 22 74 189

FPNS 22 29 32 24 107

Caso-controle FL±PNS 68 132 69 49 318

FPNS 88 101 189

Controle 209 270 74 46 599

OIAD: Obras Assistenciais Irmã Dulce, APOFILAB: Associação dos Portadores de Fissura Labial, HULW: Hospital Universitário Lauro Wanderley, TDT: Teste de desequilíbrio de transmissão.

4.4 Coleta das amostras de células bucais As amostras de células bucais foram coletadas por meio de um bochecho, por 60 segundos com 5 mL de uma solução aquosa de sacarose a 3%. O conteúdo resultante do bochecho foi transferido para um tubo de 15 mL, o qual continha o volume de 3 mL de uma solução 66% alcoólica contendo 17 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM NaCl e 7 mM EDTA.

4.5 Isolamento do DNA A cada tubo foi adicionado água destilada e deionizada autoclavada q.s.p. 15 mL. Após centrifugação e descarte do sobrenadante, o precipitado foi lavado e

33

centrifugado em solução aquosa, contendo 17 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl e 7 mM EDTA. Novamente o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 1 mL de solução de lise contendo 10 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% dodecil sulfato de sódio (SDS), 5 mM EDTA, incubado a 50ºC por 1 hora, após este tempo foi adicionado 10 μl de proteinase K (Invitrogen, USA) e encubado em movimento contínuo semicircular. Após 16 horas de incubação, foram adicionados 470 μl de uma solução aquosa de 8M de acetato de amônio. A mistura foi centrifugada por 10 min a 14.000 rpm a 4ºC. O precipitado de DNA foi adquirido após adição de 540 μl isopropanol ao sobrenadante e centrifugado (14.000 rpm por 5 min a 4°C). Para o término da purificação foi adicionado 1mL de etanol 70% gelado e centrifugado (14.000 rpm por 5 min a 4°C), removido o sobrenadante, seco e ressuspendido em tampão Tris-EDTA (TE Buffer). A determinação da concentração e pureza das amostras foram determinadas por espectrofotometria utilizando a razão 260/280 nm. Onde valores inferiores a 1,7 indica contaminação com proteína e valor superior a 2 indica contaminação com RNA.

4.6 Seleção dos polimorfismos genéticos Os polimorfismos foram selecionados levando em consideração: 1) apresentarem efeito funcional na proteína e 2) apresentarem distribuição diferencial dos alelos em diferentes populações (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov). Além disso, foram selecionados genes que representam diferentes eventos relacionados a formação do lábio e palato. As características gerais dos polimorfismos estão descritas na Tabela 2.

4.7 Genotipagem pelo método de discriminação alélica com sondas fluorescentes As reações de genotipagem foram realizadas utilizando o sistema de discriminação alélica com sondas fluorescentes. Todos os polimorfismos apresentaram primers e sondas, sistema TaqMan® da Applied Biosystems (USA). A sonda é constituída de fluoróforo que ligado na extremidade 5’ (Reporter) é responsável pela emissão da fluorescência e um composto que bloqueia a emissão

34

desta fluorescência durante a extensão a partir do primer sense. As reações foram realizadas no equipamento Step One Plus (Applied Biosystems, USA) em uma reação de 8 μl contendo 4 μl de 2x Genotyping Master Mix, 0,2 μl da mistura de primers e sondas e 2 ng DNA, os quais foram diluídos em 3,8 μl de água livre de DNase e RNase. Os parâmetros de amplificação foram: 1 ciclo de 30 s a 60°C e 10 min a 95°C (desnaturação inicial) e 40 ciclos de 15 s a 92°C e 1 min a 60°C (estágio de amplificação), os quais foram seguidos por 1 ciclo de 30 s a 60°C.

Tabela 2. Características dos polimorfismos genéticos nos genes incluídos neste estudo. Polimorfismo Gene Cromossomo Localização Alelos MAF

rs1374326 HOXD1 2 176193588 C/t 0,239

rs748044 TNP1 2 217289319 C/t 0,322

rs1106514 MSX1 4 4874199 G/c 0,384

rs28372960 TCOF1 5 150357401 C/t 0,039

rs15251 TCOF1 5 150396669 C/t 0,214

rs2569062 TCOF1 5 150398801 C/g 0,467

rs7829058 FGFR1 8 38474577 G/c 0,168

rs1793949 COL2A1 12 47977812 C/t 0,341

rs11653738 WNT3 17 46809587 T/c 0,276

rs242082 TIMP3 22 32828453 G/a 0,399

MAF: Frequência do alelo menor. Alelo variante em letra minúscula. Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

4.8 Análises estatísticas O teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) foi realizado com o auxílio do software FBAT (Family Based Association Test). Este teste tem o objetivo de

35

verificar a associação genótipo-fenótipo a partir da transmissão diferencial dos alelos dos pais ao afetado. E para a análise dos haplótipos dos polimorfismos rs28372960, rs15251 e rs2569062 do gene TCOF1 foi realizada a função HBAT do software FBAT, onde determina a transmissão diferencial dos haplótipos. Ambas as análises tem o critério de utilizar no mínimo um dos pais normais heterozigotos e, pelo menos, um filho afetado. A existência de equilíbrio de Hardy-Weinberg foi avaliada como descrito por Rodrigues et al. (2009). Para avaliação da ancestralidade genômica, cada indivíduo do grupo caso-controle foi genotipado com 40 polimorfismos curtos bialélicos de inserção/deleção (Indels), segundo os métodos de Bastos-Rodrigues et al., (2006). Para determinar o ancestralidade genômica de cada indivíduo, o software Structure 2.3.4 foi utilizado num modelo assumindo três populações parentais com base na origem tri-híbrida da população brasileira. Após a avaliação da ascendência, o programa STRAT foi usado para analisar a associação dos marcadores polimórficos rs1374326 (HOXD1), rs28372960 (TCOF1), rs7829058 (FGFR1) e rs11653738 (WNT3) condicionado nas proporções de ascendência individuais. O odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% associados (IC 95%) também foram calculados. Em todas as comparações, p≤0,05 foi indicativo de diferença estatisticamente significante.

36

5 RESULTADOS A análise dos polimorfismos genéticos nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 foi inicialmente realizada em 189 trios com FL±PNS e 107 trios com FPNS (Tabela 3). Neste grupo, a prevalência do gênero masculino foi observada nos pacientes com FL±PNS (n=114, 60,3%, Tabela 3) e do gênero feminino nos pacientes com FPNS (n=57, 53,3%, Tabela 3).

Tabela 3. Distribuição dos pacientes com FL±PNS e FPNS analisados no TDT em relação ao gênero. FL±PNS FPNS n (%) n (%) Masculino 114 (60,3) 50 (46,7) Feminino 75 (39,7) 57 (53,3) Total 189 107

O equilíbrio de Hardy-Weinberg entre os genitores (indivíduos normais) não foi observado para o polimorfismo rs15251 no núcleo familiar com FL±PNS, assim como nos polimorfismos rs28372960 e rs242082 com FPNS (Tabela 4). Como por princípio o TDT corrige para possíveis erros na estratificação étnica da população estudada, visto que sua análise ocorre em núcleos familiares, manteve-se nesta análise os polimorfismos que não respeitaram os preceitos do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Contudo, é de conhecimento que nestas circunstâncias o poder de detecção do teste reduz (Sebro e Rogus, 2010).

37

Tabela 4. Cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg para os 10 polimorfismos deste estudo baseado nos genitores (pais e mães normais) dos 189 núcleos familiares com FL±PNS e 107 com FPNS.

Polimorfismo FL±PNS FPNS Valor de p Valor de p rs1374326 0,14 0,39 rs748044 0,19 0,78 rs1106514 0,80 0,37 rs28372960 0,92 0,02 rs15251 0,04 0,52 rs2569062 0,64 0,64 rs7829058 0,05 0,60 rs1793949 0,67 0,17 rs11653738 0,96 0,09 rs242082 0,06 0,03

Tabelas 5 e 6 demonstram os resultados do TDT nos 10 polimorfismos genéticos deste estudo em relação ao tipo de fissura. Com exceção do polimorfismo rs28372960, a frequência do alelo menor (MAF) foi superior a 14% no estudo em trios com FL±PNS (Tabela 5) e superior a 12% no estudo em trios com FPNS (Tabela 6). No estudo utilizando trios com FL±PNS observou-se que o alelo T do polimorfismo rs28372960 e o alelo C do polimorfismo rs7829058 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS (ambos p=0,04, Tabela 5), sendo que a transmissão ocorreu em 20 núcleos familiares no polimorfismo rs28372960 e em 42 famílias no polimorfismo rs7829058 (Tabela 5). No estudo utilizando trios com FPNS observou-se que o alelo T do polimorfismo rs1374326 e o alelo C do polimorfismo rs11653738 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FPNS (ambos p=0,04, Tabela 6), sendo que a transmissão ocorreu em 43 famílias no polimorfismo rs1374326 e em 34 núcleos familiares no polimorfismo rs11653738 (Tabela 6).

38

Tabela 5. Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os polimorfismos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062, rs7829058, rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 189 trios de FL±PNS.

rs1374326 rs748044 rs1106514 rs28372960 rs15251 rs2569062 rs7829058 rs1793949 rs11653738 rs242082

MAF 0,335 0,275 0,447 0,054 0,263 0,461 0,146 0,388 0,271 0,353

Genótipo CC/CT/TT CC/CT/TT GG/GC/CC CC/CT/TT CC/CT/TT CC/CG/GG GG/GC/CC CC/CT/TT TT/TC/CC GG/GA/AA

Afetado (%) 43,1/45,7/11,2 50,8/44,4/4,8 38,0/38,5/23,5 87,7/11,8/0,5 52,4/41,2/6,4 33,0/43,1/23,9 75,0/23,4/1,6 37,2/45,8/17,0 56,9/34,6/8,5 44,1/41,5/14,4

Pai (%) 46,8/38,3/14,9 50,8/40,7/8,5 26,2/55,1/18,7 88,8/11,2/0,0 53,2/41,5/5,3 26,6/53,2/20,2 70,2/28,2/1,6 35,1/46,8/18,1 52,6/39,4/8,0 39,4/48,9/11,7

Mãe (%) 45,5/43,8/10,7 50,8/44,9/4,3 32,1/45,5/22,4 92,0/7,5/0,5 52,1/43,6/4,3 32,1/43,8/24,1 70,6/28,9/0,5 40,1/49,7/10,2 51,9/40,6/7,5 39,6/51,3/9,1

T/NT 77/44 77/39 90/43 20/10 72/52 83/46 42/41 111/23 64/47 79/56

Valor de p 0,74 1,00 0,13 0,04 0,87 0,25 0,04 0,59 0,08 0,41 MAF: frequência do alelo menor (minor allele frequency), T/NT: transmissão/não transmissão.

39

Tabela 6. Teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) para os polimorfismos genéticos rs1374326, rs748044, rs1106514, rs28372960, rs15251, rs2569062, rs7829058, rs1793949, rs11653738 e rs242082 em 107 trios de FPNS.

rs1374326 rs748044 rs1106514 rs28372960 rs15251 rs2569062 rs7829058 rs1793949 rs11653738 rs242082

MAF 0,308 0,254 0,469 0,045 0,250 0,445 0,123 0,385 0,232 0,349

Genótipo CC/CT/TT CC/CT/TT GG/GC/CC CC/CT/TT CC/CT/TT CC/CG/GG GG/GC/CC CC/CT/TT TT/TC/CC GG/GA/AA

Afetado (%) 44,4/44,3/11,3 56,6/39,6/3,8 33,0/39,6/27,4 91,5/8,5/0,0 56,6/38,7/4,7 32,1/46,2/21,7 78,3/18,9/2,8 37,8/48,1/14,1 62,3/33,0/4,7 44,3/42,5/13,2

Pai (%) 49,0/40,6/10,4 52,8/40,6/6,6 29,2/51,9/18,9 90,6/8,5/0,9 57,6/39,6/2,8 34,9/45,3/19,8 72,6/25,5/1,9 38,7/50,9/10,4 61,3/34,0/4,7 37,7/55,7/6,6

Mãe (%) 52,8/37,7/9,5 54,7/38,7/6,6 24,5/53,8/21,7 92,5/6,6/0,9 51,9/39,6/8,5 25,5/56,6/17,9 82,1/16,0/1,9 32,1/52,8/15,1 49,1/48,1/2,8 39,6/49,1/11,3

T/NT 43/18 35/28 57/25 6/9 36/26 56/23 19/22 55/25 34/30 52/31

Valor de p 0,04 0,15 0,77 0,61 0,38 0,69 0,76 0,84 0,04 0,77 MAF: frequência do alelo menor (minor allele frequency), T/NT: transmissão/não transmissão.

40

Os haplótipos dos 3 polimorfismos no gene TCOF1 (rs28372960, rs15251 e rs2569062) foram determinados. O haplótipo formado pelos alelos T-C-C demonstrou associação significante com FL±PNS (p=0,01, Tabela 7). Nenhuma associação significante foi observada para os demais haplótipos nos pacientes com FL±PNS e nos pacientes com FPNS (Tabela 7).

Tabela 7. Distribuição dos haplótipos no gene TCOF1 (rs28372960, rs15251, rs2569062) por tipo de fissura analisados no TDT.

FL±PNS FPNS Frequência/ Frequência/ valor de p valor de p TCOF1 (rs28372960-rs15251-rs2569062) C-C-G 0,451/0,73 0,429/0,70 C-C-C 0,249/0,64 0,272/0,43 C-T-C 0,238/0,77 0,245/0,27 T-C-C 0,037/0,01 0,045/0,46 C-T-G 0,015/0,15 0,008/0,54

Baseado nestes resultados que revelaram uma possível participação dos polimorfismos rs28372960 (TCOF1) e rs7829058 (FGFR1) como fatores de risco de FL±PNS e dos polimorfismos rs1374326 (HOXD1) e rs11653738 (WNT3) como fatores de risco de FPNS, decidiu-se confirmar estes resultados em uma amostra maior baseada na estratégia caso-controle com correção para diferenças de ancestralidade. A distribuição ancestral dos grupos controle, FL±PNS e FPNS foram estimados, tendo predominância europeia, seguida de africana e ameríndia em todos os grupos (Tabela 8). A prevalência do gênero masculino foi observada nos pacientes com FL±PNS (n=177, 55,7%, Tabela 9) e do gênero feminino nos pacientes com FPNS (n=121, 64,0%, Tabela 9) e no grupo controle (n=370, 61,8%, Tabela 9). Contudo, estas diferenças não foram estatisticamente significantes. De modo similar, a análise desses polimorfismos com as FLNS, FLPNS e FPNS separadas foram realizadas no estudo caso- controle e também não apresentaram associação.

41

O equilíbrio de Hardy-Weinberg no grupo controle foi observado para os 4 polimorfismos (rs1374326, rs28372960, rs7829058, e rs11653738) (Tabelas 10 e 11). Não houve diferenças nas distribuições de alelos e genótipos entre os pacientes com FL±PNS e FPNS e os controles analisados (Tabelas 10 e 11).

Tabela 8. Distribuição ancestral dos pacientes do grupo caso (FL±PNS e FPNS) e controle. Europeu Africano Ameríndio (%) (%) (%) Controle 85,6 12,4 1,9 FL±PNS 83,3 15,1 1,6 FPNS 78,9 18,7 2,4

Tabela 9. Distribuição dos pacientes analisados no grupo caso-controle em relação ao gênero.

FL±PNS FPNS Controle n (%) n (%) n (%) Masculino 177 (55,7) 68 (36,0) 229 (38,2) Feminino 141 (44,3) 121 (64,0) 370 (61,8) Total 318 189 599

42

Tabela 10. Frequência dos polimorfismos rs28372960 do gene TCOF1 e rs7829058 do gene FGFR1 em pacientes com FL±PNS e nos indivíduos do grupo controle.

HWE Grupo Controle Grupo FL/PNS OR alelo (95% IC) OR Het (95% IC) OR Hom (95% IC) OR Dom (95% IC) OR Rec (95% IC)

(valor de p) (%) (%) Valor de p Valor de p Valor de p Valor de p Valor de p rs28372960 (TCOF1)

Alelo (C/T) 0,36 93,4/6,6 94,0/6,0 0,89 (0,60-1,33) 0,88 (0,57-1,36) 0,92 (0,17-5,07) 0,88 (0,58-1,35) 0,94 (0,17-5,14)

Genótipo (CC/CT/TT) 87,4/11,9/0,7 88,7/10,7/0,6 0,62 0,57 1,00 0,59 1,00 rs7829058 (FGFR1)

Alelo (G/C) 0,07 84,9/15,1 86,9/13,1 0,84 (0,63-1,2) 0,76 (0,55-1,05) 1,32 (0,45-3,86) 0,79 (0,57-1,08) 1,42 (0,48-4,11)

Genótipo (GG/GC/CC) 71,2/27,5/1,3 75,8/22,3/1,9 0,26 0,09 0,59 0,14 0,57

43

Tabela 11. Distribuição dos polimorfismos rs1374326 do gene HOXD1 e rs11653738 do gene WNT3 nos grupos controle e FPNS.

HWE Grupo Grupo FPNS OR alelo (95% IC) OR Het (95% IC) OR Hom (95% IC) OR Dom (95% IC) OR Rec (95% IC) Controle (valor de p) Valor de p Valor de p Valor de p Valor de p Valor de p rs1374326 (HOXD1)

Alelo (C/T) 0,64 66,4/33,6 63,3/36,7 1,15 (0,89-1,46) 1,39 (0,97-1,98) 1,11 (0,63-1,96) 1,33 (0,94-1,87) 0,93 (0,55-1,58)

Genótipo (CC/CT/TT) 44,5/43,8/11,7 37,6/51,4/11 0,28 0,07 0,71 0,10 0,79 rs11653738 (WNT3)

Alelo (T/C) 0,49 72,4/27,6 71,4/28,6 1,05 (0,81-1,36) 1,00 (0,71-1,43) 1,15 (0,63-2,09) 1,03 (0,74-1,44) 1,15 (0,64 -2,05)

Genótipo (TT/TC/CC) 52,9/38,9/8,2 52,2/38,5/9,3 0,73 0,98 0,64 0,86 0,63

44

6 DISCUSSÃO A frequência elevada em associação à significante morbidade motivou nos últimos anos vários estudos genéticos na busca de um melhor conhecimento dos fatores de risco para o desenvolvimento das FL/PNS (Dixon et al., 2011; Stuppia et al., 2011; Kohli e Kohli, 2012; Rahimov et al., 2012). Atualmente muitos genes e regiões cromossômicas são associados às FL/PNS, mas ainda estamos distantes de uma completa compreensão da etiologia das FL/PNS. A distribuição dos polimorfismos e haplótipos, assim como suas correlações com as FL/PNS, variam amplamente entre as diferentes populações, fazendo com que estudos de validação de suscetibilidade e associação de polimorfismos genéticos sejam essenciais para aumentar a compreensão da complexidade desta anomalia de origem multifatorial (Paranaiba et al., 2013a; Aquino et al., 2014b). Em relação ao tipo de fissura, a prevalência de FL±PNS foi confirmada neste estudo em concordância com estudos internacionais (Clark et al., 2003; Forrester e Merz, 2004; Vallino-Napoli et al., 2006; Nopoulos et al., 2007; Butali et al., 2014) e nacionais (Freitas et al., 2004; Martelli et al., 2010; Martelli et al., 2012). No entanto, em alguns países como na Finlândia (Lithovius et al., 2014), Polônia (Antoszewski e Fijalkowska, 2013) e Israel (Silberstein et al., 2012), a prevalência de FPNS foi observada. Em relação a extensão da fissura e o gênero, a literatura mundial aponta para uma prevalência no gênero masculino de FL±PNS e de FPNS no gênero feminino (Mossey et al., 2009; Martelli et al., 2012). Nossos resultados confirmaram tal observação. No Brasil, estudos prévios também descreveram uma maior frequência de FL±PNS nos indivíduos do gênero masculino, assim como a prevalência de FPNS em mulheres (Freitas et al., 2004; Martelli-Junior et al., 2007; Mossey et al., 2009; Martelli et al., 2012). Segundo Lary et al. (2001) a explicação para isso reside no fato de que o palato do feto feminino demora em média 1 semana a mais para fusionar do que o palato do feto masculino, aumentando a predisposição à ação de fatores nocivos na formação da FP. A suscetibilidade do gênero masculino para a FL±PNS parece ser, ao menos em parte, uma consequência de variações no gene MSX1 que são mais comuns em homens com FL±PNS (Blanco et al., 2001). Embora não seja confirmado, também sugere a hipótese de que genes localizados no

45

cromossomo X tenham um papel importante na etiologia das fissuras (Jugessur et al., 2012; Patel et al., 2013). A morfogênese da região craniofacial requer uma coordenação precisa dos eventos celulares, incluindo proliferação, migração, transição epitélio- mesênquima e apoptose (Mossey et al., 2009). A diversidade dos mecanismos nos principais eventos para a formação das estruturas faciais reflete no grande número de genes conhecidos ou suspeitos de estarem envolvidos na formação do lábio e palato (Maestri et al., 1997; Gaspar et al., 2002; Orioli et al., 2002; Letra et al., 2007; Jagomagi et al., 2010; Letra et al., 2010b; Butali et al., 2011; Fontoura et al., 2012; Letra et al., 2012; Mostowska et al., 2012; Saleem et al., 2012; Wu D et al., 2012; Butali et al., 2014; Letra et al., 2014). Em função da importância genética na embriogênese, os polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento craniofacial, incluindo os genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3, são fortes candidatos para o desenvolvimento de FL/PNS (Fallin et al., 2003; Juriloff et al., 2004; Beaty et al., 2006; Chiquet et al., 2008; Sull et al., 2008; Jagomagi et al., 2010; Menezes et al., 2010; Nikopensius et al., 2010; Butali et al., 2011; Lace et al., 2011; Nikopensius et al., 2011; Yao et al., 2011; Letra et al., 2012; Mostowska et al., 2012; Smane et al., 2013; Souza et al., 2013; Letra et al., 2014). Desta forma, o objetivo deste estudo foi compreender a participação dos polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento craniofacial na etiopatogenia das FL/PNS. Com a finalidade de evitar possível estratificação populacional na amostra, este estudo foi realizado com amostras de quatro regiões diferentes do país e a variabilidade da ancestralidade de cada indivíduo foi levada em consideração no estudo caso-controle, visto que no estudo com trios (TDT) ocorre intrinsicamente o controle da estratificação populacional (Sebro e Rogus, 2010). A prevalência europeia seguida da africana e ameríndia foi obtida tanto no grupo caso quanto no grupo controle, confirmando outros estudos com a população Brasileira (Pena et al., 2011; Filezio et al., 2013; Aquino et al., 2014b). O presente estudo avaliou o polimorfismo rs1374326 do gene HOXD1. Como salientado anteriormente, esse gene é muito importante na formação craniofacial por meio do controle de sua expressão no primeiro arco faríngeo (Couly et al., 2002; Vieux-Rochas et al., 2013). Embora não existam estudos demonstrando a funcionalidade desse polimorfismo, a presença do nucleotídeo

46

variante é preditiva de uma alteração proteica funcional. Baseado nesse contexto, Beaty et al. (2006) propuseram investigar uma possível associação de HOXD1 em 232 casos de FL/PNS provenientes de Maryland, Singapura e Taiwan. Para isso, avaliaram 47 polimorfismos escolhidos por se encontrarem em exons e/ou por uma possível alteração na função proteica. Apenas o polimorfismo rs1374326 mostrou associação significante com FPNS, revelando assim a participação do gene HOXD1 na etiologia das fissuras orais, porém nenhum outro estudo foi realizado com este polimorfismo. Na população brasileira avaliada neste estudo, observou-se que o alelo T do polimorfismo rs1374326 foi preferencialmente transmitido dos pais aos filhos afetados com FPNS, mas a associação deste polimorfismo não foi confirmada na abordagem caso-controle que continha uma amostra mais robusta. Os motivos desta divergência entre os resultados podem ser atribuídos às variações na etnicidade das populações investigadas e ao tamanho amostral. O gene TCOF1 foi também avaliado neste estudo frente a sua importância no desenvolvimento craniofacial. No TDT, entre os 3 polimorfismos no gene TCOF1, apenas o polimorfismo rs28372960 foi transmitido de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS, entretanto não foi confirmado esta associação utilizando a amostra caso-controle. Em relação ao haplótipo T-C-C formado pelos três polimorfismos (rs28372960, rs15251 e rs2569062) no gene TCOF1, observamos uma significante associação com FL±PNS. O estudo de Masotti et al. (2005) revelou que o polimorfismo rs28372960 no gene TCOF1 altera o sítio de ligação do fator de transcrição YY1, diminuindo assim a atividade promotora do gene em 38%. Desta forma, este polimorfismo apresenta grande potencial como fator de risco para o desenvolvimento de FL/PNS, no entanto nenhum outro estudo havia sido realizado com este polimorfismo previamente. Outro estudo realizado com polimorfismos no gene TCOF1 relatou um risco aumentado dos polimorfismos rs15251 e rs2569062 (OR=2,88 e OR= 2,43, respectivamente) para o desenvolvimento de FPNS na população de Maryland, Singapura e Taiwan (Sull et al., 2008). Todavia, indícios definitivos do envolvimento do gene TCOF1 no desenvolvimento das fissuras em humanos permanecem inconclusivos, uma vez que, apesar dos relatos positivos, há falta de estudos do gene TCOF1 em diferentes populações de FL/PNS.

47

Outro gene avaliado neste estudo foi o FGFR1, que emergiu como um forte candidato para FL/PNS a partir de estudos de associação realizados em populações de diferentes origens étnicas (Riley et al., 2007a; Menezes et al., 2008; Lace et al., 2011). Em um estudo de sequenciamento do gene FGFR1 diversas mutações foram identificadas e estima-se que cerca de 3% dos pacientes com FL±PNS apresentam mutações em FGFR1 (Riley et al., 2007a). No presente estudo foi avaliado o polimorfismo rs7829058, localizado na posição 38332095, onde resulta uma transição de um G para um C. Estudo prévio realizado por Lace et al. (2011) na população Letã revelou que o polimorfismo rs7829058 mostrou a significante associação com FL±PNS. De maneira similar, Nikopensius et al. (2010) avaliaram 14 polimorfismos no gene FGFR1 em 104 casos de FPNS nas populações Estoniana, Letoniana e Lituana e demonstraram que o polimorfismo rs7829058 aumenta significantemente o risco de ocorrência das FPs (OR=1,79; IC=1,19–2,72). No presente estudo, a transmissão do alelo polimórfico foi associada com a ocorrência de FL±PNS, contudo, ao validar em uma amostra ampla no estudo caso-controle, não confirmamos a associação. É importante destacar que a ausência de relação entre o polimorfismo rs7829058 em nosso estudo pode estar associada ao tamanho da amostra ou à diferença étnica encontrada na população brasileira. O gene WNT3 foi também alvo de interesse neste estudo em virtude de sua função na indução da interação epitélio-mesênquima e, consequentemente, na diferenciação celular na embriogênese (Song et al., 2014). Além disto, alguns estudos indicam o gene WNT3 como um fator de risco para FL/PNS baseados em modelos animais (Carroll et al., 2005; Liu e Millar, 2010) e estudos de associação (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Lace et al., 2011; Yao et al., 2011; Mostowska et al., 2012). O polimorfismo rs11653738 foi apontado como um fator de risco para o desenvolvimento de FPNS na população da Letônia, Lituânia e Estônia (Nikopensius et al., 2010), porém nenhum outro estudo na literatura confirmou tal associação com outras populações. Neste estudo, embora o polimorfismo rs11653738 foi transmitido de maneira significante dos genitores aos pacientes com FPNS, a análise caso-controle não confirmou a associação. Um dos grandes problemas em estudos genéticos de doenças complexas é avaliar a real significância dos resultados obtidos. Os resultados deste estudo

48

foram avaliados estatisticamente pelo teste de desequilíbrio de transmissão utilizando-se o programa FBAT e o nível de significância foi estabelecido em 0,05. Uma desvantagem do TDT consiste na natureza restritiva da análise, uma vez que utiliza apenas uma parcela da amostra, considerada informativa. Sendo assim, é possível que algumas associações sejam falso-positivas. Desta forma, com o objetivo de validação de nossos resultados foi realizado um estudo caso- controle com uma amostra maior (318 FL±PNS, 189 FPNS e 599 controles), com correção ancestral de cada indivíduo. No estudo caso-controle com os polimorfismos que mostraram associação (rs1374326 do gene HOXD1, rs28372960 do gene TCOF1, rs7829058 do gene FGFR1, e rs11653738 do gene WNT3), nenhum apresentou diferenças nas distribuições de alelos e genótipos entre os pacientes analisados. A falta de associação entre os polimorfismos gênicos na ocorrência de FL/PNS observada neste estudo pode ser justificada pelo tamanho dos grupos e a intensa miscigenação étnica encontrada na população brasileira, mas é importante ressaltar que uma real interação entre estas variantes polimórficas analisadas e o risco para FL/PNS não está bem estabelecida e os resultados permanecem inconclusivos. Os outros 6 polimorfismos avaliados não foram confirmados na população brasileira estudada. Estes resultados não são inesperados, visto que estes polimorfismos (rs748044 no gene TNP1, rs1106514 no gene MSX1, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1, rs1793949 no gene COL2A1 e rs242082 no gene TIMP3) nunca foram estudados na população brasileira, além de que os resultados obtidos nas investigações de polimorfismos genéticos são escassos e apresentam resultados bastante controversos. O tamanho amostral é também outro fator a ser ponderado na interpretação destes resultados negativos. Em resumo, analisando conjuntamente os modestos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que os polimorfismos estudados nos genes HOXD1, TNP1, MSX1, TCOF1, FGFR1, COL2A1, WNT3 e TIMP3 não são fatores de risco para a ocorrência de FL/PNS na população brasileira. Porém, a identificação de novas regiões polimórficas em genes candidatos às FL/PNS é de fundamental importância para o entendimento dessa anomalia. A complexidade e a diversidade dos aspectos clínicos e mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento craniofacial proporcionam inúmeras oportunidades para investigações futuras da etiologia da FL/PNS. Desta forma,

49

nossos resultados devem incentivar outros estudos, principalmente com amostras maiores, para aumentar a nossa compreensão e conhecimento dos eventos genéticos que contribuem para esta complexa alteração de desenvolvimento.

50

7 CONCLUSÃO 1. O alelo T do polimorfismo rs28372960 no gene TCOF1 e o alelo C do polimorfismo rs7829058 no gene FGFR1 foram transmitidos de maneira significante dos genitores para os pacientes com FL±PNS, assim como o alelo T do polimorfismo rs1374326 no gene HOXD1 e alelo C do polimorfismo rs11653738 no gene WNT3 para os pacientes com FPNS.

2. Embora a significância no TDT com os polimorfismos rs1374326 (HOXD1), rs28372960 (TCOF1), rs7829058 (FGFR1), e rs11653738 (WNT3) tenha sido observada, não houve diferença nas distribuições de alelos e genótipos no estudo caso-controle.

3. O haplótipo T-C-C formado pelos polimorfismos rs28372960, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1 demonstrou associação significante com FL±PNS.

4. Os polimorfismos rs748044 no gene TNP1, rs1106514 no gene MSX1, rs15251 e rs2569062 no gene TCOF1, rs1793949 no gene COL2A1 e rs242082 no gene TIMP3 não demonstraram nenhuma associação significante com FL/PNS na população brasileira.

51

REFERÊNCIAS Abdo R, Machado M. Odontopediatria nas fissuras labiopalatais. São Paulo: Santos; 2005. Aberg T, Rice R, Rice D, Thesleff I, Waltimo-Siren J. Chondrogenic potential of mouse calvarial mesenchyme. J Histochem Cytochem. 2005; 53(5): 653-63. Alappat S, Zhang ZY, Chen YP. Msx homeobox gene family and craniofacial development. Cell Res. 2003; 13(6): 429-42. Andrade Filho PA, Letra A, Cramer A, Prasad JL, Garlet GP, Vieira AR, et al. Insights from studies with oral cleft genes suggest associations between WNT- pathway genes and risk of oral cancer. J Dent Res. 2011; 90(6): 740-6. Antoszewski B, Fijalkowska M. The prevalence of cleft lip and/or palate in children from Lodz in years 2001-2010. Pol Przegl Chir. 2013; 85(6): 329-32. Aquino SN, Hoshi R, Bagordakis E, Pucciarelli MG, Messetti AC, Moreira H, et al. MTHFR rs2274976 polymorphism is a risk marker for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the Brazilian population. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2014a; 100(1): 30-5. Aquino SN, Messetti AC, Hoshi R, Borges A, Viena CS, Reis SR, et al. Analysis of susceptibility polymorphisms for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the Brazilian population. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2014b; 100(1): 36-42. Arruda IT, Persuhn DC, de Oliveira NF. The MTHFR C677T polymorphism and global DNA methylation in oral epithelial cells. Genet Mol Biol. 2013; 36(4): 490- 3. Bacchelli E, Blasi F, Biondolillo M, Lamb JA, Bonora E, Barnby G, et al. Screening of nine candidate genes for autism on chromosome 2q reveals rare nonsynonymous variants in the cAMP-GEFII gene. Mol Psychiatry. 2003; 8(11): 916-24. Baek JA, Lan Y, Liu H, Maltby KM, Mishina Y, Jiang R. Bmpr1a signaling plays critical roles in palatal shelf growth and palatal bone formation. Dev Biol. 2011; 350(2): 520-31. Bagordakis E, Paranaiba LM, Brito LA, de Aquino SN, Messetti AC, Martelli- Junior H, et al. Polymorphisms at regions 1p22.1 (rs560426) and 8q24 (rs1530300) are risk markers for nonsyndromic cleft lip and/or palate in the Brazilian population. Am J Med Genet A. 2013; 161a(5): 1177-80. Bai YX, Yi JL, Li JF, Sui H. Clinicopathologic significance of BAG1 and TIMP3 expression in colon carcinoma. World J Gastroenterol. 2007; 13(28): 3883-5. Baranger K, Rivera S, Liechti FD, Grandgirard D, Bigas J, Seco J, et al. Endogenous and synthetic MMP inhibitors in CNS physiopathology. Prog Brain Res. 2014; 214: 313-51.

52

Barbieri O, Astigiano S, Morini M, Tavella S, Schito A, Corsi A, et al. Depletion of cartilage collagen fibrils in mice carrying a dominant negative Col2a1 transgene affects chondrocyte differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 2003; 285(6): C1504-12. Bastos-Rodrigues L, Pimenta JR, Pena SD. The genetic structure of human populations studied through short insertion-deletion polymorphisms. Ann Hum Genet. 2006; 70(5): 658-65. Beaty TH, Hetmanski JB, Fallin MD, Park JW, Sull JW, McIntosh I, et al. Analysis of candidate genes on chromosome 2 in oral cleft case-parent trios from three populations. Hum Genet. 2006; 120(4): 501-18. Beaty TH, Hetmanski JB, Zeiger JS, Fan YT, Liang KY, VanderKolk CA, et al. Testing candidate genes for non-syndromic oral clefts using a case-parent trio design. Genet Epidemiol. 2002; 22(1): 1-11. Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, Munger RG, Ruczinski I, Hetmanski JB, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4. Nat Genet. 2010; 42(6): 525-9. Beaty TH, Wang H, Hetmanski JB, Fan YT, Zeiger JS, Liang KY, et al. A case- control study of nonsyndromic oral clefts in Maryland. Ann Epidemiol. 2001; 11(6): 434-42. Bessenyei B, Tihanyi M, Hartwig M, Szakszon K, Olah E. Variable expressivity of pfeiffer syndrome in a family with FGFR1 p.Pro252Arg mutation. Am J Med Genet A. 2014; 164(12): 3176-9. Betancur P, Bronner-Fraser M, Sauka-Spengler T. Assembling neural crest regulatory circuits into a gene regulatory network. Annu Rev Cell Dev Biol. 2010; 26: 581-603. Bezerra J, Oliveira G, Soares C, Cardoso M, Ururahy M, Neto F, et al. Genetic and non-genetic factors that increase the risk of non-syndromic cleft lip and/or palate development. Oral Dis. 2014; 1-7. Bille C, Winther JF, Bautz A, Murray JC, Olsen J, Christensen K. Cancer risk in persons with oral cleft--a population-based study of 8,093 cases. Am J Epidemiol. 2005; 161(11): 1047-55. Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, Herms S, Steffens M, Rubini M, et al. Key susceptibility locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24. Nat Genet. 2009; 41(4): 473-7. Blanco R, Chakraborty R, Barton SA, Carreno H, Paredes M, Jara L, et al. Evidence of a sex-dependent association between the MSX1 locus and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the Chilean population. Hum Biol. 2001; 73(1): 81-9.

53

Blavier L, Lazaryev A, Groffen J, Heisterkamp N, DeClerck YA, Kaartinen V. TGF- beta3-induced palatogenesis requires matrix metalloproteinases. Mol Biol Cell. 2001;12(5):1457-66. Blin-Wakkach C, Lezot F, Ghoul-Mazgar S, Hotton D, Monteiro S, Teillaud C, et al. Endogenous Msx1 antisense transcript: in vivo and in vitro evidences, structure, and potential involvement in skeleton development in mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(13): 7336-41. Bohmer AC, Mangold E, Tessmann P, Mossey PA, Steegers-Theunissen RP, Lindemans J, et al. Analysis of susceptibility loci for nonsyndromic orofacial clefting in a European trio sample. Am J Med Genet A. 2013; 161a(10): 2545-9. Boyles AL, Ballard JL, Gorman EB, McConnaughey DR, Cabrera RM, Wilcox AJ, et al. Association between inhibited binding of folic acid to folate receptor alpha in maternal serum and folate-related birth defects in Norway. Hum Reprod. 2011; 26(8): 2232-8. Bragdon B, Thinakaran S, Moseychuk O, Gurski L, Bonor J, Price C, et al. Casein kinase 2 regulates in vivo bone formation through its interaction with bone morphogenetic protein receptor type Ia. Bone. 2011; 49(5): 944-54. Brewer C, Holloway S, Zawalnyski P, Schinzel A, FitzPatrick D. A chromosomal duplication map of malformations: regions of suspected haplo- and triplolethality- -and tolerance of segmental aneuploidy--in humans. Am J Hum Genet. 1999; 64(6):1702-8. Brito LA, Paranaiba LM, Bassi CF, Masotti C, Malcher C, Schlesinger D, et al. Region 8q24 is a susceptibility locus for nonsyndromic oral clefting in Brazil. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2012; 94(6): 464-8. Broder HL, Richman LC, Matheson PB. Learning disability, school achievement, and grade retention among children with cleft: a two-center study. Cleft Palate Craniofac J. 1998; 35(2): 127-31. Brown NL, Yarram SJ, Mansell JP, Sandy JR. Matrix metalloproteinases have a role in palatogenesis. J Dent Res. 2002; 81(12): 826-30. Bufalino A, Ribeiro Paranaiba LM, Nascimento de Aquino S, Martelli-Junior H, Oliveira Swerts MS, Coletta RD. Maternal polymorphisms in folic acid metabolic genes are associated with nonsyndromic cleft lip and/or palate in the Brazilian population. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010; 88(11): 980-6. Butali A, Mossey P, Adeyemo W, Eshete M, Gaines L, Braimah R, et al. Rare functional variants in genome-wide association identified candidate genes for nonsyndromic clefts in the African population. Am J Med Genet A. 2014; 164a(10): 2567-71. Butali A, Mossey PA, Adeyemo WL, Jezewski PA, Onwuamah CK, Ogunlewe MO, et al. Genetic studies in the Nigerian population implicate an MSX1 mutation in complex oral facial clefting disorders. Cleft Palate Craniofac J. 2011; 48(6): 646-53.

54

Cardoso ML, Bezerra JF, Oliveira GH, Soares CD, Oliveira SR, de Souza KS, et al. MSX1 gene polymorphisms in non-syndromic cleft lip and/or palate. Oral Dis. 2013; 19(5): 507-12. Carmichael SL, Ma C, Tinker S, Rasmussen SA, Shaw GM. Maternal stressors and social support as risks for delivering babies with structural birth defects. Paediatr Perinat Epidemiol. 2014; 28(4): 338-44. Carmichael SL, Nelson V, Shaw GM, Wasserman CR, Croen LA. Socio- economic status and risk of conotruncal heart defects and orofacial clefts. Paediatr Perinat Epidemiol. 2003; 17(3): 264-71. Carmichael SL, Shaw GM, Yang W, Abrams B, Lammer EJ. Maternal stressful life events and risks of birth defects. Epidemiology. 2007; 18(3): 356-61. Carroll TJ, Park JS, Hayashi S, Majumdar A, McMahon AP. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 2005; 9(2): 283- 92. Celebiler Cavusoglu A, Kilic Y, Saydam S, Canda T, Baskan Z, Sevinc AI, et al. Predicting invasive phenotype with CDH1, CDH13, CD44, and TIMP3 gene expression in primary breast cancer. Cancer Sci. 2009; 100(12): 2341-5. Cerrato FE, Nuzzi LC, Theman TA, Taghinia A, Upton J, Labow BI. Upper extremity anomalies in Pfeiffer syndrome and mutational correlations. Plast Reconstr Surg. 2014; 133(5): 654e-61e. Chen Y, Bei M, Woo I, Satokata I, Maas R. Msx1 controls inductive signaling in mammalian tooth morphogenesis. Development. 1996; 122(10): 3035-44. Chevrier C, Bahuau M, Perret C, Iovannisci DM, Nelva A, Herman C, et al. Genetic susceptibilities in the association between maternal exposure to tobacco smoke and the risk of nonsyndromic oral cleft. Am J Med Genet A. 2008; 146a(18): 2396-406. Chevrier C, Dananche B, Bahuau M, Nelva A, Herman C, Francannet C, et al. Occupational exposure to organic solvent mixtures during pregnancy and the risk of non-syndromic oral clefts. Occup Environ Med. 2006; 63(9): 617-23. Chevrier C, Perret C, Bahuau M, Nelva A, Herman C, Francannet C, et al. Interaction between the ADH1C polymorphism and maternal alcohol intake in the risk of nonsyndromic oral clefts: an evaluation of the contribution of child and maternal genotypes. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2005; 73(2): 114-22. Chevrier C, Perret C, Bahuau M, Nelva A, Herman C, Francannet C, et al. Fetal and maternal CYP2E1 genotypes and the risk of nonsyndromic oral clefts. Am J Med Genet A. 2007; 143a(12): 1382-5. Chiquet BT, Blanton SH, Burt A, Ma D, Stal S, Mulliken JB, et al. Variation in WNT genes is associated with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate. Hum Mol Genet. 2008; 17(14): 2212-8.

55

Clark JD, Mossey PA, Sharp L, Little J. Socioeconomic status and orofacial clefts in Scotland, 1989 to 1998. Cleft Palate Craniofac J. 2003; 40(5): 481-5. Cobourne MT. Familial human hypodontia--is it all in the genes? Br Dent J. 2007; 203(4): 203-8. Cory S, Adams JM. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2002; 2(9): 647-56. Coudert AE, Pibouin L, Vi-Fane B, Thomas BL, Macdougall M, Choudhury A, et al. Expression and regulation of the Msx1 natural antisense transcript during development. Nucleic Acids Res. 2005; 33(16): 5208-18. Couly G, Creuzet S, Bennaceur S, Vincent C, Le Douarin NM. Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development. 2002; 129(4): 1061-73. Coutinho ALF. Lima MC, Kitamura MAP, Neto JF.Pereira RM. Perfil epidemiológico dos portadores de fissuras orofaciais em um Centro de Referência do Nordeste do Brasil. Rev Bras Matern Infant. 2009; Recife 9(2): 149-56. Crisera C, Teng E, Wasson KL, Heller J, Gabbay JS, Sedrak MF, et al. Formation of in vitro murine cleft palate by abrogation of fibroblast growth factor signaling. Plast Reconstr Surg. 2008; 121(1): 218-24. Cunha EM, Fontana R, Fontana T, Silva WR, Moreira QVP, Garcias GL, et al. Antropometria e fatores de risco em recem-nascidos com fendas faciais. Rev Bras Epidemiol. 2004; 7(4): 417-22. Curtis EJ, Fraser FC, Warburton D. Congenital cleft lip and palate. Am J Dis Child 1961: 102: 853-857. Das AM, Seynhaeve AL, Rens JA, Vermeulen CE, Koning GA, Eggermont AM, et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 2014; 17(1): 163-77. Defamie V, Sanchez O, Murthy A, Khokha R. TIMP3 controls cell fate to confer hepatocellular carcinoma resistance. Oncogene. 2014; 1-11. DeRoo LA, Wilcox AJ, Drevon CA, Lie RT. First-trimester maternal alcohol consumption and the risk of infant oral clefts in Norway: a population-based case- control study. Am J Epidemiol. 2008; 168(6): 638-46. Desrosiers TA, Lawson CC, Meyer RE, Richardson DB, Daniels JL, Waters MA, et al. Maternal occupational exposure to organic solvents during early pregnancy and risks of neural tube defects and orofacial clefts. Occup Environ Med. 2012; 69(7): 493-9.

56

Dhulipala VC, Welshons WV, Reddy CS. Cell cycle proteins in normal and chemically induced abnormal secondary palate development: a review. Hum Exp Toxicol. 2006; 25(11): 675-82. Dixon J, Jones NC, Sandell LL, Jayasinghe SM, Crane J, Rey JP, et al. Tcof1/Treacle is required for neural crest cell formation and proliferation deficiencies that cause craniofacial abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(36): 13403-8. Dixon MJ, Marazita ML, Beaty TH, Murray JC. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 2011; 12(3): 167-78. Dode C, Fouveaut C, Mortier G, Janssens S, Bertherat J, Mahoudeau J, et al. Novel FGFR1 sequence variants in Kallmann syndrome, and genetic evidence that the FGFR1c isoform is required in olfactory bulb and palate morphogenesis. Hum Mutat. 2007; 28(1): 97-8. Dominguez I, Degano IR, Chea K, Cha J, Toselli P, Seldin DC. CK2alpha is essential for embryonic morphogenesis. Mol Cell Biochem. 2011; 356(1-2): 209- 16. Dudas M, Li WY, Kim J, Yang A, Kaartinen V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 2007; 109(1): 1-14. Economou AD, Ohazama A, Porntaveetus T, Sharpe PT, Kondo S, Basson MA, et al. Periodic stripe formation by a Turing mechanism operating at growth zones in the mammalian palate. Nat Genet. 2012; 44(3): 348-51. Enomoto H, Nelson CM, Somerville RP, Mielke K, Dixon LJ, Powell K, et al. Cooperation of two ADAMTS metalloproteases in closure of the mouse palate identifies a requirement for versican proteolysis in regulating palatal mesenchyme proliferation. Development. 2010; 137(23): 4029-38. Faber J, Winterpacht A, Zabel B, Gnoinski W, Schinzel A, Steinmann B, et al. Clinical variability of Stickler syndrome with a COL2A1 haploinsufficiency mutation: implications for genetic counselling. J Med Genet. 2000; 37(4): 318-20. Fallin MD, Hetmanski JB, Park J, Scott AF, Ingersoll R, Fuernkranz HA, et al. Family-based analysis of MSX1 haplotypes for association with oral clefts. Genet Epidemiol. 2003; 25(2): 168-75. Feitosa MF, Krieger H. Future of genetic epidemiology in complex traits. Ciência & Saude Coletiva. 2002; 7(1): 73-83. Figueiredo R, Figueiredo N, Feguri A, Bieski I, Mello R, Espinosa M, et al. The role of the folic acid to the prevention of orofacial cleft: an epidemiological study. Oral Dis. 2015; 21(2): 240-7. Filezio MR, Bagordakis E, de Aquino SN, Pereira Messetti AC, Martelli-Junior H, Swerts MS, et al. Polymorphisms in GABRB3 and oral clefting in the Brazilian population. DNA Cell Biol. 2013; 32(3): 125-9.

57

Finnerty JR, Mazza ME, Jezewski PA. Domain duplication, divergence, and loss events in vertebrate Msx paralogs reveal phylogenomically informed disease markers. BMC Evol Biol. 2009; 9:18. Fontoura C, Silva RM, Granjeiro JM, Letra A. Association of WNT9B Gene Polymorphisms With Nonsyndromic Cleft Lip With or Without Cleft Palate in Brazilian Nuclear Families. Cleft Palate Craniofac J. 2015; 52(1):44-8. Fontoura C, Silva RM, Granjeiro JM, Letra A. Further evidence of association of the ABCA4 gene with cleft lip/palate. Eur J Oral Sci. 2012; 120(6): 553-7. Forrester MB, Merz RD. Descriptive epidemiology of oral clefts in a multiethnic population, Hawaii, 1986-2000. Cleft Palate Craniofac J. 2004; 41(6): 622-8. Frebourg T, Oliveira C, Hochain P, Karam R, Manouvrier S, Graziadio C, et al. Cleft lip/palate and CDH1/E-cadherin mutations in families with hereditary diffuse gastric cancer. J Med Genet. 2006; 43(2): 138-42. Freese JL, Pino D, Pleasure SJ. Wnt signaling in development and disease. Neurobiol Dis. 2010; 38(2): 148-53. Freitas JA, Dalben Gda S, Santamaria M, Jr., Freitas PZ. Current data on the characterization of oral clefts in Brazil. Braz Oral Res. 2004; 18(2): 128-33. Gan R, Yang Y, Yang X, Zhao L, Lu J, Meng QH. Downregulation of miR-221/222 enhances sensitivity of breast cancer cells to tamoxifen through upregulation of TIMP3. Cancer Gene Ther. 2014; 21(7): 290-6. Garcia AM, Fletcher T, Maternal occupation in the leather industry and selected congenital malformation. Occup Environ Med.1998; 55(2): 284-6. Garcia AM. Occupational Exposures and Congenital Malformations: A Critical Review. Frontiers in Fetal Health. 2000; 2(9): 11-12. Garlantezec R, Monfort C, Rouget F, Cordier S. Maternal occupational exposure to solvents and congenital malformations: a prospective study in the general population. Occup Environ Med. 2009; 66(7): 456-63. Gaspar DA, Matioli SR, Pavanello RC, Araujo BC, Andre M, Steman S, et al. Evidence that BCL3 plays a role in the etiology of nonsyndromic oral clefts in Brazilian families. Genet Epidemiol. 2002; 23(4): 364-74. Gong SG, Gong TW, Shum L. Identification of markers of the midface. J Dent Res. 2005; 84(1): 69-72. Gonzalez BS, Lopez ML, Rico MA, Garduno F. Oral clefts: a retrospective study of prevalence and predisposal factors in the State of Mexico. J Oral Sci. 2008; 50(2): 123-9. Goode EL, Chenevix-Trench G, Song H, Ramus SJ, Notaridou M, Lawrenson K, et al. A genome-wide association study identifies susceptibility loci for ovarian cancer at 2q31 and 8q24. Nat Genet. 2010; 42(10): 874-9.

58

Grant SF, Wang K, Zhang H, Glaberson W, Annaiah K, Kim CE, et al. A genome- wide association study identifies a locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on 8q24. J Pediatr. 2009; 155(6): 909-13. Grosen D, Chevrier C, Skytthe A, Bille C, Molsted K, Sivertsen A, et al. A cohort study of recurrence patterns among more than 54,000 relatives of oral cleft cases in Denmark: support for the multifactorial threshold model of inheritance. J Med Genet. 2010; 47(3): 162-8. Gundlach KK, Maus C. Epidemiological studies on the frequency of clefts in Europe and world-wide. J Craniomaxillofac Surg. 2006; 34 Suppl 2:1-2. Guo T, Mandai K, Condie BG, Wickramasinghe SR, Capecchi MR, Ginty DD. An evolving NGF-Hoxd1 signaling pathway mediates development of divergent neural circuits in vertebrates. Nat Neurosci. 2011; 14(1): 31-6. Han MR, Deming-Halverson S, Cai Q, Wen W, Shrubsole MJ, Shu XO, et al. Evaluating 17 breast cancer susceptibility loci in the Nashville breast health study. Breast Cancer. 2014. Harville EW, Wilcox AJ, Lie RT, Vindenes H, Abyholm F. Cleft lip and palate versus cleft lip only: are they distinct defects? Am J Epidemiol. 2005; 162(5): 448- 53. Hayano T, Yanagida M, Yamauchi Y, Shinkawa T, Isobe T, Takahashi N. Proteomic analysis of human Nop56p-associated pre-ribosomal ribonucleoprotein complexes. Possible link between Nop56p and the nucleolar protein treacle responsible for Treacher Collins syndrome. J Biol Chem. 2003; 278(36): 34309-19. Heidari MM, Khatami M, Talebi AR, Moezzi F. Mutation analysis of TNP1 gene in infertile men with varicocele. Iran J Reprod Med. 2014; 12(4): 257-62. Hero M, Laitinen EM, Varimo T, Vaaralahti K, Tommiska J, Raivio T. Childhood growth of females with Kallmann syndrome and FGFR1 mutations. Clin Endocrinol (Oxf). 2015; 82(1):122-6. Higgins AW, Alkuraya FS, Bosco AF, Brown KK, Bruns GA, Donovan DJ, et al. Characterization of apparently balanced chromosomal rearrangements from the developmental genome anatomy project. Am J Hum Genet. 2008; 82(3): 712-22. Honein MA, Rasmussen SA, Reefhuis J, Romitti PA, Lammer EJ, Sun L, et al. Maternal smoking and environmental tobacco smoke exposure and the risk of orofacial clefts. Epidemiology. 2007; 18(2): 226-33. Hoornaert KP, Vereecke I, Dewinter C, Rosenberg T, Beemer FA, Leroy JG, et al. Stickler syndrome caused by COL2A1 mutations: genotype-phenotype correlation in a series of 100 patients. Eur J Hum Genet. 2010; 18(8): 872-80. Hoque MO, Begum S, Brait M, Jeronimo C, Zahurak M, Ostrow KL, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 promoter methylation is an independent prognostic factor for bladder cancer. J Urol. 2008; 179(2): 743-7.

59

Hu N, Strobl-Mazzulla PH, Bronner ME. Epigenetic regulation in neural crest development. Dev Biol. 2014; 396(2): 159-68. Ivens A, Flavin N, Williamson R, Dixon M, Bates G, Buckingham M, et al. The human homeobox gene HOX7 maps to chromosome 4p16.1 and may be implicated in Wolf-Hirschhorn syndrome. Hum Genet. 1990; 84(5): 473-6. Iwata J, Suzuki A, Yokota T, Ho TV, Pelikan R, Urata M, et al. TGFbeta regulates epithelial-mesenchymal interactions through WNT signaling activity to control muscle development in the soft palate. Development. 2014; 141(4): 909-17. Jacinto FV, Ballestar E, Ropero S, Esteller M. Discovery of epigenetically silenced genes by methylated DNA immunoprecipitation in colon cancer cells. Cancer Res. 2007; 67(24): 11481-6. Jacomasso T, Trombetta-Lima M, Sogayar MC, Winnischofer SM. Downregulation of reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs in malignant melanoma: inverse correlation with membrane-type 1-matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase 2. Melanoma Res. 2014; 24(1): 32-9. Jagomagi T, Nikopensius T, Krjutskov K, Tammekivi V, Viltrop T, Saag M, et al. MTHFR and MSX1 contribute to the risk of nonsyndromic cleft lip/palate. Eur J Oral Sci. 2010; 118(3): 213-20. Jankowski SA, Gumucio DL. Genes for tensin, villin and desmin are linked on mouse chromosome 1. Mamm Genome. 1995; 6(10): 744-5. Januchowski R, Zawierucha P, Rucinski M, Nowicki M, Zabel M. Extracellular matrix proteins expression profiling in chemoresistant variants of the A2780 ovarian cancer cell line. Biomed Res Int. 2014; 2014: 365867. Jeschke J, Van Neste L, Glockner SC, Dhir M, Calmon MF, Deregowski V, et al. Biomarkers for detection and prognosis of breast cancer identified by a functional hypermethylome screen. Epigenetics. 2012; 7(7): 701-9. Jezewski PA, Vieira AR, Nishimura C, Ludwig B, Johnson M, O'Brien SE, et al. Complete sequencing shows a role for MSX1 in non-syndromic cleft lip and palate. J Med Genet. 2003; 40(6): 399-407. Jia ZL, Shi B, Chen CH, Shi JY, Wu J, Xu X. Maternal malnutrition, environmental exposure during pregnancy and the risk of non-syndromic orofacial clefts. Oral Dis. 2011; 17(6): 584-9. Jianyan L, Zeqiang G, Yongjuan C, Kaihong D, Bing D, Rongsheng L. Analysis of interactions between genetic variants of BMP4 and environmental factors with nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate susceptibility. Int J Oral Maxillofac Surg. 2010; 39(1): 50-6. Johnson CY, Little J. Folate intake, markers of folate status and oral clefts: is the evidence converging? Int J Epidemiol. 2008; 37(5): 1041-58.

60

Jones MC. Etiology of facial clefts: prospective evaluation of 428 patients. Cleft Palate J. 1988; 25(1): 16-20. Jones NC, Lynn ML, Gaudenz K, Sakai D, Aoto K, Rey JP, et al. Prevention of the neurocristopathy Treacher Collins syndrome through inhibition of p53 function. Nat Med. 2008; 14(2): 125-33. Jugessur A, Murray JC. Orofacial clefting: recent insights into a complex trait. Curr Opin Genet Dev. 2005; 15(3): 270-8. Jugessur A, Shi M, Gjessing HK, Lie RT, Wilcox AJ, Weinberg CR, et al. Genetic determinants of facial clefting: analysis of 357 candidate genes using two national cleft studies from Scandinavia. PLoS One. 2009; 4(4): e5385. Jugessur A, Skare O, Lie RT, Wilcox AJ, Christensen K, Christiansen L, et al. X- linked genes and risk of orofacial clefts: evidence from two population-based studies in Scandinavia. PLoS One. 2012; 7(6): e39240. Juriloff DM, Harris MJ, Dewell SL. A digenic cause of cleft lip in A-strain mice and definition of candidate genes for the two loci. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2004; 70(8): 509-18. Juriloff DM, Harris MJ. Mouse genetic models of cleft lip with or without cleft palate. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2008; 82(2): 63-77. Kadakia S, Helman SN, Badhey AK, Saman M, Ducic Y. Treacher Collins Syndrome: the genetics of a craniofacial disease. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2014; 78(6): 893-8. Kallio JP, Hopkins-Donaldson S, Baker AH, Kahari VM. TIMP-3 promotes apoptosis in nonadherent small cell lung carcinoma cells lacking functional death receptor pathway. Int J Cancer. 2011; 128(4): 991-6. Kanda T, Funato N, Baba Y, Kuroda T. Evidence for fibroblast growth factor receptors in myofibroblasts during palatal mucoperiosteal repair. Arch Oral Biol. 2003; 48(3): 213-21. Kang P, Svoboda KK. Epithelial-mesenchymal transformation during craniofacial development. J Dent Res. 2005;84(8):678-90. Kerrigan JJ, Mansell JP, Sengupta A, Brown N, Sandy JR. Palatogenesis and potential mechanisms for clefting. J R Coll Surg Edinb. 2000; 45(6): 351-8. Kettunen P, Thesleff I. Expression and function of FGFs-4, -8, and -9 suggest functional redundancy and repetitive use as epithelial signals during tooth morphogenesis. Dev Dyn. 1998; 211(3): 256-68. Khudyakov J, Bronner-Fraser M. Comprehensive spatiotemporal analysis of early chick neural crest network genes. Dev Dyn. 2009; 238(3): 716-23. Kinoshita H, Natsume N, Hara Y, Miura S, Hattori T, Kawai T. The incidence of cleft lip and/or palate in families. POMS. 1992; 2(1): 41-7.

61

Kohli SS, Kohli VS. A comprehensive review of the genetic basis of cleft lip and palate. J Oral Maxillofac Pathol. 2012; 16(1): 64-72. Kondo S, Schutte BC, Richardson RJ, Bjork BC, Knight AS, Watanabe Y, et al. Mutations in IRF6 cause Van der Woude and popliteal pterygium syndromes. Nat Genet. 2002; 32(2): 285-9. Kouskoura T, Fragou N, Alexiou M, John N, Sommer L, Graf D, et al. The genetic basis of craniofacial and dental abnormalities. Schweiz Monatsschr Zahnmed. 2011; 121(7-8): 636-46. Krapels IP, Vermeij-Keers C, Muller M, de Klein A, Steegers-Theunissen RP. Nutrition and genes in the development of orofacial clefting. Nutr Rev. 2006; 64(6): 280-8. Kuchler EC, Saboia TM, Vieira TC, Lips A, Tannure PN, Deeley K, et al. Studies of genes involved in craniofacial development and tumorigenesis: FGF3 contributes to isolated oral clefts and may interact with PAX9. Acta Odontol Scand. 2014; 72(8): 1070-8. Lace B, Kempa I, Piekuse L, Grinfelde I, Klovins J, Pliss L, et al. Association studies of candidate genes and cleft lip and palate taking into consideration geographical origin. Eur J Oral Sci. 2011; 119(6): 413-7. Lammer EJ, Shaw GM, Iovannisci DM, Finnell RH. Maternal smoking, genetic variation of glutathione s-transferases, and risk for orofacial clefts. Epidemiology. 2005; 16(5): 698-701. Lammer EJ, Shaw GM, Iovannisci DM, Van Waes J, Finnell RH. Maternal smoking and the risk of orofacial clefts: Susceptibility with NAT1 and NAT2 polymorphisms. Epidemiology. 2004; 15(2): 150-6. Lammi L, Arte S, Somer M, Jarvinen H, Lahermo P, Thesleff I, et al. Mutations in AXIN2 cause familial tooth agenesis and predispose to colorectal cancer. Am J Hum Genet. 2004; 74(5): 1043-50. Lan Y, Jiang R. Sonic hedgehog signaling regulates reciprocal epithelial- mesenchymal interactions controlling palatal outgrowth. Development. 2009; 136(8): 1387-96. Lan Y, Ryan RC, Zhang Z, Bullard SA, Bush JO, Maltby KM, et al. Expression of Wnt9b and activation of canonical Wnt signaling during midfacial morphogenesis in mice. Dev Dyn. 2006; 235(5): 1448-54. Lee S, Crisera CA, Erfani S, Maldonado TS, Lee JJ, Alkasab SL, et al. Immunolocalization of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in mouse palate development. Plast Reconstr Surg. 2001; 107(7): 1776-84. Leite IC, Paumgartten FJ, Koifman S. Chemical exposure during pregnancy and oral clefts in newborns. Cad Saude Publica. 2002; 18(1): 17-31. Leite IC, Paumgartten FJR, Koifman S. Fendas orofaciais no recem-nascido e o uso de medicamentos e condicoes de saude materna: estudo caso-controle na

62

cidade do Rio de Janeiro, Brasil. Rev Bras. Saude Matern. Infant. Recife 2005; 5(1): 35-43. Leslie EJ, Marazita ML. Genetics of cleft lip and cleft palate. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2013; 163c(4): 246-58. Letra A, Menezes R, Fonseca RF, Govil M, McHenry T, Murphy MJ, et al. Novel cleft susceptibility genes in chromosome 6q. J Dent Res. 2010a; 89(9): 927-32. Letra A, Menezes R, Govil M, Fonseca RF, McHenry T, Granjeiro JM, et al. Follow-up association studies of chromosome region 9q and nonsyndromic cleft lip/palate. Am J Med Genet A. 2010b; 152a(7): 1701-10. Letra A, Silva RA, Menezes R, Astolfi CM, Shinohara A, de Souza AP, et al. MMP gene polymorphisms as contributors for cleft lip/palate: association with MMP3 but not MMP1. Arch Oral Biol. 2007; 52(10): 954-60. Letra A, Silva RM, Motta LG, Blanton SH, Hecht JT, Granjeirol JM, et al. Association of MMP3 and TIMP2 promoter polymorphisms with nonsyndromic oral clefts. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2012; 94(7): 540-8. Letra A, Zhao M, Silva RM, Vieira AR, Hecht JT. Functional Significance of MMP3 and TIMP2 Polymorphisms in Cleft Lip/Palate. J Dent Res. 2014; 93(7): 651-6. Li L, Zhu GQ, Meng T, Shi JY, Wu J, Xu X, et al. Biological and epidemiological evidence of interaction of infant genotypes at Rs7205289 and maternal passive smoking in cleft palate. Am J Med Genet A. 2011; 155a(12): 2940-8. Li SW, Prockop DJ, Helminen H, Fassler R, Lapvetelainen T, Kiraly K, et al. Transgenic mice with targeted inactivation of the Col2 alpha 1 gene for collagen II develop a skeleton with membranous and periosteal bone but no endochondral bone. Genes Dev. 1995; 9(22): 2821-30. Liang G, Lian C, Huang D, Gao W, Liang A, Peng Y, et al. Endoplasmic reticulum stress-unfolding protein response-apoptosis cascade causes chondrodysplasia in a col2a1 p.Gly1170Ser mutated mouse model. PLoS One. 2014; 9(1): e86894. Lidral AC, Romitti PA, Basart AM, Doetschman T, Leysens NJ, Daack-Hirsch S, et al. Association of MSX1 and TGFB3 with nonsyndromic clefting in humans. Am J Hum Genet. 1998; 63(2): 557-68. Lima LS, Ribeiro GS, de Aquino SN, Volpe FM, Martelli DR, Swerts MS, et al. Prevalence of depressive symptoms in patients with cleft lip and palate. Braz J Otorhinolaryngol. 2015. Lin CI, Yeh NH. Treacle recruits RNA polymerase I complex to the nucleolus that is independent of UBF. Biochem Biophys Res Commun. 2009; 386(2): 396-401. Lin H, Zhang Y, Wang H, Xu D, Meng X, Shao Y, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 transfer suppresses malignant behaviors of colorectal cancer cells. Cancer Gene Ther. 2012; 19(12): 845-51.

63

Lithovius RH, Ylikontiola LP, Harila V, Sandor GK. A descriptive epidemiology study of cleft lip and palate in Northern Finland. Acta Odontol Scand. 2014; 72(5): 372-5. Little J, Cardy A, Munger RG. Tobacco smoking and oral clefts: a meta-analysis. Bull World Health Organ. 2004; 82(3): 213-8. Liu F, Millar SE. Wnt/beta-catenin signaling in oral tissue development and disease. J Dent Res. 2010; 89(4): 318-30. Liu W, Sun X, Braut A, Mishina Y, Behringer RR, Mina M, et al. Distinct functions for Bmp signaling in lip and palate fusion in mice. Development. 2005; 132(6): 1453-61. Loffredo LC, Souza JM, Freitas JA, Mossey PA. Oral clefts and vitamin supplementation. Cleft Palate Craniofac J. 2001; 38(1): 76-83. Loffredo Lde C, de Souza JM, Yunes J, Freitas JA, Spiri WC. [Cleft lip and palate: case-control study]. Rev Saude Publica. 1994; 28(3): 213-7. Long J, Zhang B, Signorello LB, Cai Q, Deming-Halverson S, Shrubsole MJ, et al. Evaluating genome-wide association study-identified breast cancer risk variants in African-American women. PLoS One. 2013; 8(4): e58350. Lopez-Camelo JS, Castilla EE, Orioli IM. Folic acid flour fortification: impact on the frequencies of 52 congenital anomaly types in three South American countries. Am J Med Genet A. 2010; 152a(10): 2444-58. Lorente C, Cordier S, Bergeret A, De Walle HE, Goujard J, Ayme S, et al. Maternal occupational risk factors for oral clefts. Occupational Exposure and Congenital Malformation Working Group. Scand J Work Environ Health. 2000a; 26(2): 137-45. Lorente C, Cordier S, Goujard J, Ayme S, Bianchi F, Calzolari E, et al. Tobacco and alcohol use during pregnancy and risk of oral clefts. Occupational Exposure and Congenital Malformation Working Group. Am J Public Health. 2000b; 90(3): 415-9. Ludwig KU, Mangold E, Herms S, Nowak S, Reutter H, Paul A, et al. Genome- wide meta-analyses of nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate identify six new risk loci. Nat Genet. 2012; 44(9): 968-71. Maeno T, Moriishi T, Yoshida CA, Komori H, Kanatani N, Izumi S, et al. Early onset of Runx2 expression caused craniosynostosis, ectopic bone formation, and limb defects. Bone. 2011; 49(4): 673-82. Maestri NE, Beaty TH, Hetmanski J, Smith EA, McIntosh I, Wyszynski DF, et al. Application of transmission disequilibrium tests to nonsyndromic oral clefts: including candidate genes and environmental exposures in the models. Am J Med Genet. 1997; 73(3): 337-44.

64

Mangold E, Ludwig KU, Birnbaum S, Baluardo C, Ferrian M, Herms S, et al. Genome-wide association study identifies two susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate. Nat Genet. 2010; 42: 24-6. Mangold E, Ludwig KU, Nothen MM. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol Med. 2011; 17(12): 725-33. Mani P, Jarrell A, Myers J, Atit R. Visualizing canonical Wnt signaling during mouse craniofacial development. Dev Dyn. 2010; 239(1): 354-63. Mannowetz N, Kartarius S, Wennemuth G, Montenarh M. Protein kinase CK2 and new binding partners during spermatogenesis. Cell Mol Life Sci. 2010; 67(22): 3905-13. Marazita ML, Field LL, Cooper ME, Tobias R, Maher BS, Peanchitlertkajorn S, et al. Genome scan for loci involved in cleft lip with or without cleft palate, in Chinese multiplex families. Am J Hum Genet. 2002a; 71(2): 349-64. Marazita ML, Field LL, Cooper ME, Tobias R, Maher BS, Peanchitlertkajorn S, et al. Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in China: assessment of candidate regions. Cleft Palate Craniofac J. 2002b; 39(2): 149-56. Marazita ML, Lidral AC, Murray JC, Field LL, Maher BS, Goldstein McHenry T, et al. Genome scan, fine-mapping, and candidate gene analysis of non-syndromic cleft lip with or without cleft palate reveals phenotype-specific differences in linkage and association results. Hum Hered. 2009; 68(3): 151-70. Marazita ML, Mooney MP. Current concepts in the embryology and genetics of cleft lip and cleft palate. Clin Plast Surg. 2004; 31(2): 125-40. Marszalek B, Wojcicki P, Kobus K, Trzeciak WH. Clinical features, treatment and genetic background of Treacher Collins syndrome. J Appl Genet. 2002; 43(2): 223-33. Martelli DR, Bonan PR, Soares MC, Paranaiba LR, Martelli-Junior H. Analysis of familial incidence of non-syndromic cleft lip and palate in a Brazilian population. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2010; 15(6): e898-901. Martelli DR, Machado RA, Swerts MS, Rodrigues LA, Aquino SN, Martelli Junior H. Non syndromic cleft lip and palate: relationship between sex and clinical extension. Braz J Otorhinolaryngol. 2012; 78(5): 116-20. Martelli-Júnior H, de Aquino SN, Machado RA, Leao LL, Coletta RD, Burle-Aguiar MJ. Pfeiffer syndrome: Clinical and genetic findings in five Brazilian families. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2015; 20(1):e52-8. Martelli-Júnior H, Orsi Júnior J, Chaves MR, Barros LM, Bonan PRF, Freitas JA. Estudo epidemiológico das fissuras labiais e palatais em Alfenas - Minas Gerais - de 1986 a 1998. RPG. 2006; 13(1):31-35. Martelli-Junior H, Porto LV, Martelli DR, Bonan PR, Freitas AB, Della Coletta R. Prevalence of nonsyndromic oral clefts in a reference hospital in the state of Minas Gerais, Brazil, between 2000-2005. Braz Oral Res. 2007; 21(4): 314-7.

65

Masotti C, Armelin-Correa LM, Splendore A, Lin CJ, Barbosa A, Sogayar MC, et al. A functional SNP in the promoter region of TCOF1 is associated with reduced gene expression and YY1 DNA-protein interaction. Gene. 2005; 359: 44-52. Massague J. TGFbeta signalling in context. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13(10): 616-30. Matthews JL, Oddone-Paolucci E, Harrop RA. The Epidemiology of Cleft Lip and Palate in Canada, 1998 to 2007. Cleft Palate Craniofac J. 2015; 52(1). McKeehan WL, Wang F, Luo Y. Handbook of Cell Signaling. Academic/Elsevier Press. 2009; 2: 253-259. Melkoniemi M, Koillinen H, Mannikko M, Warman ML, Pihlajamaa T, Kaariainen H, et al. Collagen XI sequence variations in nonsyndromic cleft palate, Robin sequence and micrognathia. Eur J Hum Genet. 2003; 11(3): 265-70. Mendes R, Waissmann W. Aspectos Historicos da Patologia do Trabalho/Patologia do Trabalho Atualizada e Ampliada. Sao Paulo: Atheneu, 2003; 3-46. Menezes R, Letra A, Kim AH, Kuchler EC, Day A, Tannure PN, et al. Studies with Wnt genes and nonsyndromic cleft lip and palate. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010; 88(11): 995-1000. Menezes R, Letra A, Ruff J, Granjeiro JM, Vieira AR. Studies of genes in the FGF signaling pathway and oral clefts with or without dental anomalies. Am J Med Genet A. 2008; 146a(12): 1614-7. Meng L, Bian Z, Torensma R, Von den Hoff JW. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. J Dent Res. 2009; 88(1): 22-33. Meyer KA, Werler MM, Hayes C, Mitchell AA. Low maternal alcohol consumption during pregnancy and oral clefts in offspring: the Slone Birth Defects Study. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2003; 67(7): 509-14. Minoux M, Antonarakis GS, Kmita M, Duboule D, Rijli FM. Rostral and caudal pharyngeal arches share a common neural crest ground pattern. Development. 2009; 136(4): 637-45. Mitchell LE, Murray JC, O'Brien S, Christensen K. Evaluation of two putative susceptibility loci for oral clefts in the Danish population. Am J Epidemiol. 2001; 153(10): 1007-15. Montagnoli LC, Barbieri MA, Bettiol H, Marques IL, de Souza L. Growth impairment of children with different types of lip and palate clefts in the first 2 years of life: a cross-sectional study. J Pediatr (Rio J). 2005; 81(6): 461-5. Moreno LM, Mansilla MA, Bullard SA, Cooper ME, Busch TD, Machida J, et al. FOXE1 association with both isolated cleft lip with or without cleft palate, and isolated cleft palate. Hum Mol Genet. 2009; 18(24): 4879-96.

66

Morris-Wiman J, Burch H, Basco E. Temporospatial distribution of matrix metalloproteinase and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases during murine secondary palate morphogenesis. Anat Embryol (Berl). 2000; 202(2): 129-41. Mossey PA, Little J, Munger RG, Dixon MJ, Shaw WC. Cleft lip and palate. Lancet. 2009; 374(9703): 1773-85. Mossey PA, Little J. Epidemiology of oral clefts: an international perspective. In: Wyszynski DF, ed. Cleft lip and palate: from origins to treatment. New York: Oxford University Press. 2002: 127-158. Mostowska A, Hozyasz KK, Biedziak B, Wojcicki P, Lianeri M, Jagodzinski PP. Genotype and haplotype analysis of WNT genes in non-syndromic cleft lip with or without cleft palate. Eur J Oral Sci. 2012; 120(1): 1-8. Mostowska A, Hozyasz KK, Wojcicki P, Biedziak B, Paradowska P, Jagodzinski PP. Association between genetic variants of reported candidate genes or regions and risk of cleft lip with or without cleft palate in the polish population. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010; 88(7): 538-45. Mukhopadhyay P, Greene RM, Zacharias W, Weinrich MC, Singh S, Young WW, Jr., et al. Developmental gene expression profiling of mammalian, fetal orofacial tissue. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2004; 70(12): 912-26. Murray T, Taub MA, Ruczinski I, Scott AF, Hetmanski JB, Schwender H, et al. Examining markers in 8q24 to explain differences in evidence for association with cleft lip with/without cleft palate between Asians and Europeans. Genet Epidemiol. 2012; 36(4): 392-9. Murthy J, Bhaskar L. Current concepts in genetics of nonsyndromic clefts. Indian J Plast Surg. 2009; 42(1): 68-81. Nassif A, Senussi I, Meary F, Loiodice S, Hotton D, Robert B, et al. Msx1 role in craniofacial bone morphogenesis. Bone. 2014; 66: 96-104. Natsume N, Kawai T, Kohama G, Teshima T, Kochi S, Ohashi Y, et al. Incidence of cleft lip or palate in 303738 Japanese babies born between 1994 and 1995. Br J Oral Maxillofac Surg. 2000; 38(6): 605-7. Niemann S. Tetra-Amelia Syndrome. In: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH, Bird TD, Dolan CR, Fong CT, et al., editors. GeneReviews(R). Seattle (WA): University of Washington, Seattle. All rights reserved; 1993. Nikopensius T, Jagomagi T, Krjutskov K, Tammekivi V, Saag M, Prane I, et al. Genetic variants in COL2A1, COL11A2, and IRF6 contribute risk to nonsyndromic cleft palate. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010; 88(9): 748- 56. Nikopensius T, Kempa I, Ambrozaityte L, Jagomagi T, Saag M, Matuleviciene A, et al. Variation in FGF1, FOXE1, and TIMP2 genes is associated with

67

nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2011; 91(4): 218-25. Nopoulos P, Langbehn DR, Canady J, Magnotta V, Richman L. Abnormal brain structure in children with isolated clefts of the lip or palate. Arch Pediatr Adolesc Med. 2007; 161(8): 753-8. Okada Y, Tateishi K, Zhang Y. Histone demethylase JHDM2A is involved in male infertility and obesity. J Androl. 2010; 31(1): 75-8. Oliveira Demarchi AC, Zambuzzi WF, Paiva KB, da Silva-Valenzuela M, Nunes FD, de Cassia Savio Figueira R, et al. Development of secondary palate requires strict regulation of ECM remodeling: sequential distribution of RECK, MMP-2, MMP-3, and MMP-9. Cell Tissue Res. 2010; 340(1): 61-9. Orioli IM, Vieira AR, Castilla EE, Ming JE, Muenke M. Mutational analysis of the Sonic Hedgehog gene in 220 newborns with oral clefts in a South American (ECLAMC) population. Am J Med Genet. 2002; 108(1): 12-5. Ortega CE, Seidner Y, Dominguez I. Mining CK2 in cancer. PLoS One. 2014; 9(12): e115609. Paradowska-Stolarz AM. Wolf-Hirschhorn syndrome (WHS) - literature review on the features of the syndrome. Adv Clin Exp Med. 2014; 23(3): 485-9. Paranaiba LM, Aquino SN, Bufalino A, Martelli-Junior H, Graner E, Brito LA, et al. Contribution of polymorphisms in genes associated with craniofacial development to the risk of nonsyndromic cleft lip and/or palate in the Brazilian population. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2013a; 18(3): e414-20. Paranaiba LM, Bufalino A, Martelli-Junior H, de Barros LM, Graner E, Coletta RD. Lack of association between IRF6 polymorphisms (rs2235371 and rs642961) and non-syndromic cleft lip and/or palate in a Brazilian population. Oral Dis. 2010; 16(2): 193-7. Paranaiba LM, Coletta RD, Swerts MS, Quintino RP, de Barros LM, Martelli- Junior H. Prevalence of Dental Anomalies in Patients With Nonsyndromic Cleft Lip and/or Palate in a Brazilian Population. Cleft Palate Craniofac J. 2013b; 50(4): 400-5. Park H, Choi HJ, Kim J, Kim M, Rho SS, Hwang D, et al. Homeobox D1 regulates angiogenic functions of endothelial cells via integrin beta1 expression. Biochem Biophys Res Commun. 2011; 408(1): 186-92. Park J, Park BY, Kim HS, Lee JE, Suh I, Nam CM, et al. MSX1 polymorphism associated with risk of oral cleft in Korea: evidence from case-parent trio and case-control studies. Yonsei Med J. 2007; 48(1): 101-8. Patel PJ, Beaty TH, Ruczinski I, Murray JC, Marazita ML, Munger RG, et al. X- linked markers in the Duchenne muscular dystrophy gene associated with oral clefts. Eur J Oral Sci. 2013; 121(2): 63-8.

68

Pellon-Cardenas O, Clancy J, Uwimpuhwe H, D'Souza-Schorey C. ARF6- regulated endocytosis of growth factor receptors links cadherin-based adhesion to canonical Wnt signaling in epithelia. Mol Cell Biol. 2013; 33(15): 2963-75. Pena SD, Bastos-Rodrigues L, Pimenta JR, Bydlowski SP. DNA tests probe the genomic ancestry of Brazilians. Braz J Med Biol Res. 2009; 42(10): 870-6. Pena SD, Di Pietro G, Fuchshuber-Moraes M, Genro JP, Hutz MH, Kehdy Fde S, et al. The genomic ancestry of individuals from different geographical regions of Brazil is more uniform than expected. PLoS One. 2011; 6(2): e17063. Polyak K, Xia Y, Zweier JL, Kinzler KW, Vogelstein B. A model for p53-induced apoptosis. Nature. 1997; 389(6648): 300-5. Purcell S, Sham P, Daly MJ. Parental phenotypes in family-based association analysis. Am J Hum Genet. 2005; 76(2): 249-59. Pussila M, Sarantaus L, Dermadi Bebek D, Valo S, Reyhani N, Ollila S, et al. Cancer-predicting gene expression changes in colonic mucosa of Western diet fed Mlh1+/- mice. PLoS One. 2013; 8(10): e76865. Qin S, Zhu Y, Ai F, Li Y, Bai B, Yao W, et al. MicroRNA-191 correlates with poor prognosis of colorectal carcinoma and plays multiple roles by targeting tissue inhibitor of metalloprotease 3. Neoplasma. 2014; 61(1): 27-34. Rahimov F, Jugessur A, Murray JC. Genetics of nonsyndromic orofacial clefts. Cleft Palate Craniofac J. 2012; 49(1): 73-91. Ray JG, Meier C, Vermeulen MJ, Wyatt PR, Cole DE. Association between folic acid food fortification and congenital orofacial clefts. J Pediatr. 2003; 143(6): 805- 7. Rice DP. Craniofacial anomalies: from development to molecular pathogenesis. Curr Mol Med. 2005; 5(7): 699-722. Rice R, Spencer-Dene B, Connor EC, Gritli-Linde A, McMahon AP, Dickson C, et al. Disruption of Fgf10/Fgfr2b-coordinated epithelial-mesenchymal interactions causes cleft palate. J Clin Invest. 2004; 113(12): 1692-700. Ricks JE, Ryder VM, Bridgewater LC, Schaalje B, Seegmiller RE. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 2002; 65(3): 116-20. Riley BM, Mansilla MA, Ma J, Daack-Hirsch S, Maher BS, Raffensperger LM, et al. Impaired FGF signaling contributes to cleft lip and palate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007a; 104(11): 4512-7. Riley BM, Schultz RE, Cooper ME, Goldstein-McHenry T, Daack-Hirsch S, Lee KT, et al. A genome-wide linkage scan for cleft lip and cleft palate identifies a novel locus on 8p11-23. Am J Med Genet A. 2007b; 143a(8): 846-52.

69

Risch NJ. Searching for genetic determinants in the new millennium. Nature. 2000; 405(6788): 847-56. Rodrigues K, Sena MF, Roncalli AG, Ferreira MA. Prevalence of orofacial clefts and social factors in Brazil. Braz Oral Res. 2009; 23(1): 38-42. Rogers CD, Saxena A, Bronner ME. Sip1 mediates an E-cadherin-to-N-cadherin switch during cranial neural crest EMT. J Cell Biol. 2013; 203(5): 835-47. Rojas-Martinez A, Reutter H, Chacon-Camacho O, Leon-Cachon RB, Munoz- Jimenez SG, Nowak S, et al. Genetic risk factors for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in a Mesoamerican population: Evidence for IRF6 and variants at 8q24 and 10q25. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010; 88(7): 535-7. Romitti PA, Herring AM, Dennis LK, Wong-Gibbons DL. Meta-analysis: pesticides and orofacial clefts. Cleft Palate Craniofac J. 2007a; 44(4): 358-65. Romitti PA, Lidral AC, Munger RG, Daack-Hirsch S, Burns TL, Murray JC. Candidate genes for nonsyndromic cleft lip and palate and maternal cigarette smoking and alcohol consumption: evaluation of genotype-environment interactions from a population-based case-control study of orofacial clefts. Teratology. 1999; 59(1): 39-50. Romitti PA, Sun L, Honein MA, Reefhuis J, Correa A, Rasmussen SA. Maternal periconceptional alcohol consumption and risk of orofacial clefts. Am J Epidemiol. 2007b; 166(7): 775-85. Sakai D, Trainor PA. Treacher Collins syndrome: unmasking the role of Tcof1/treacle. Int J Biochem Cell Biol. 2009; 41(6): 1229-32. Saleem S, Rajendran R, Moinak B, Anna J, Pramod BJ. Evidence for transforming growth factor-beta 3 gene polymorphism in non-syndromic cleft lip and palate patients from Indian sub-continent. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2012; 17(2): e197-200. Sarmah B, Wente SR. Inositol hexakisphosphate kinase-2 acts as an effector of the vertebrate Hedgehog pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010; 107(46): 19921-6. Sasaki Y, Taya Y, Saito K, Fujita K, Aoba T, Fujiwara T. Molecular contribution to cleft palate production in cleft lip mice. Congenit Anom (Kyoto). 2014; 54(2): 94-9. Satokata I, Maas R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 1994; 6(4): 348-56. Sauka-Spengler T, Bronner-Fraser M. Development and evolution of the migratory neural crest: a gene regulatory perspective. Curr Opin Genet Dev. 2006; 16(4): 360-6. Savontaus M, Rintala-Jamsa M, Morko J, Ronning O, Metsaranta M, Vuorio E. Abnormal craniofacial development and expression patterns of extracellular

70

matrix components in transgenic Del1 mice harboring a deletion mutation in the type II collagen gene. Orthod Craniofac Res. 2004; 7(4): 216-26. Sebro R, Rogus JJ. The power of the Transmission Disequilibrium Test in the presence of population stratification. Eur J Hum Genet. 2010; 18(9): 1032-8. Seelan RS, Mukhopadhyay P, Pisano MM, Greene RM. Developmental epigenetics of the murine secondary palate. Ilar j. 2012; 53(3-4): 240-52. Shaw GM, Gold EB. Methodological considerations in the study of parental occupational exposures and congenital malformations in offspring. Scand J Work Environ Health. 1988; 14(6): 344-55. Shi J, Son MY, Yamada S, Szabova L, Kahan S, Chrysovergis K, et al. Membrane-type MMPs enable extracellular matrix permissiveness and mesenchymal cell proliferation during embryogenesis. Dev Biol. 2008; 313(1): 196-209. Shi M, Christensen K, Weinberg CR, Romitti P, Bathum L, Lozada A, et al. Orofacial cleft risk is increased with maternal smoking and specific detoxification- gene variants. Am J Hum Genet. 2007; 80(1): 76-90. Shkoukani MA, Chen M, Vong A. Cleft lip - a comprehensive review. Front Pediatr. 2013; 1: 53. Silberstein E, Silberstein T, Elhanan E, Bar-Droma E, Bogdanov-Berezovsky A, Rosenberg L. Epidemiology of cleft lip and palate among Jews and Bedouins in the Negev. Isr Med Assoc J. 2012; 14(6): 378-81. Sivertsen A, Wilcox AJ, Skjaerven R, Vindenes HA, Abyholm F, Harville E, et al. Familial risk of oral clefts by morphological type and severity: population based cohort study of first degree relatives. Bmj. 2008; 336(7641): 432-4. Smane L, Pilmane M, Akota I. Apoptosis and MMP-2, TIMP-2 expression in cleft lip and palate. Stomatologija. 2013; 15(4): 129-34. Song J, McColl J, Camp E, Kennerley N, Mok GF, McCormick D, et al. Smad1 transcription factor integrates BMP2 and Wnt3a signals in migrating cardiac progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014; 111(20): 7337-42. Souza LT, Kowalski TW, Collares MV, Felix TM. MSX1 gene and nonsyndromic oral clefts in a Southern Brazilian population. Braz J Med Biol Res. 2013; 46(7): 555-8. Splendore A, Fanganiello RD, Masotti C, Morganti LS, Passos-Bueno MR. TCOF1 mutation database: novel mutation in the alternatively spliced exon 6A and update in mutation nomenclature. Hum Mutat. 2005; 25(5): 429-34. Stanier P, Moore GE. Genetics of cleft lip and palate: syndromic genes contribute to the incidence of non-syndromic clefts. Hum Mol Genet. 2004; 13 Spec No 1: R73-81.

71

Strobl-Mazzulla PH, Bronner ME. A PHD12-Snail2 repressive complex epigenetically mediates neural crest epithelial-to-mesenchymal transition. J Cell Biol. 2012; 198(6): 999-1010. Stuppia L, Capogreco M, Marzo G, La Rovere D, Antonucci I, Gatta V, et al. Genetics of syndromic and nonsyndromic cleft lip and palate. J Craniofac Surg. 2011;22(5):1722-6. Suazo J, Santos JL, Carreno H, Jara L, Blanco R. Linkage disequilibrium between MSX1 and non-syndromic cleft lip/palate in the Chilean population. J Dent Res. 2004; 83(10): 782-5. Sull JW, Liang KY, Hetmanski JB, Fallin MD, Ingersoll RG, Park JW, et al. Excess maternal transmission of markers in TCOF1 among cleft palate case-parent trios from three populations. Am J Med Genet A. 2008; 146a(18): 2327-31. Taioli E, Ragin C, Robertson L, Linkov F, Thurman NE, Vieira AR. Cleft lip and palate in family members of cancer survivors. Cancer Invest. 2010; 28(9): 958- 62. Trainor PA, Dixon J, Dixon MJ. Treacher Collins syndrome: etiology, pathogenesis and prevention. Eur J Hum Genet. 2009; 17(3): 275-83. Trindade L, Gonzales RM, Beck CL, Lautert L. [Workloads in communitarian health agents]. Rev Gaucha Enferm. 2007; 28(4): 473-9. Valdez BC, Henning D, So RB, Dixon J, Dixon MJ. The Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product is involved in ribosomal DNA gene transcription by interacting with upstream binding factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101(29): 10709-14. Vallino-Napoli LD, Riley MM, Halliday JL. An epidemiologic study of orofacial clefts with other birth defects in Victoria, Australia. Cleft Palate Craniofac J. 2006; 43(5): 571-6. Van den Boogaard MJ, de Costa D, Krapels IP, Liu F, van Duijn C, Sinke RJ, et al. The MSX1 allele 4 homozygous child exposed to smoking at periconception is most sensitive in developing nonsyndromic orofacial clefts. Hum Genet. 2008; 124(5): 525-34. Van den Boogaard MJ, Dorland M, Beemer FA, van Amstel HK. MSX1 mutation is associated with orofacial clefting and tooth agenesis in humans. Nat Genet. 2000; 24(4): 342-3. Van der Velden PA, Zuidervaart W, Hurks MH, Pavey S, Ksander BR, Krijgsman E, et al. Expression profiling reveals that methylation of TIMP3 is involved in uveal melanoma development. Int J Cancer. 2003; 106(4): 472-9. Van Kempen PM, van Bockel L, Braunius WW, Moelans CB, van Olst M, de Jong R, et al. HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma is associated with TIMP3 and CADM1 promoter hypermethylation. Cancer Med. 2014; 3(5): 1185- 96.

72

Vastardis H, Karimbux N, Guthua SW, Seidman JG, Seidman CE. A human MSX1 homeodomain missense mutation causes selective tooth agenesis. Nat Genet. 1996; 13(4): 417-21. Verstappen J, Von den Hoff JW. Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): their biological functions and involvement in oral disease. J Dent Res. 2006; 85(12): 1074-84. Vieira AR, Orioli IM, Castilla EE, Cooper ME, Marazita ML, Murray JC. MSX1 and TGFB3 contribute to clefting in South America. J Dent Res. 2003; 82(4): 289-92. Vieira AR, Orioli IM, Murray JC. Maternal age and oral clefts: a reappraisal. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2002; 94(5): 530-5. Vieira AR, Orioli IM. Birth order and oral clefts: a meta analysis. Teratology. 2002;66(5):209-16. Vieira AR. Unraveling human cleft lip and palate research. J Dent Res. 2008; 87(2): 119-25. Vieux-Rochas M, Mascrez B, Krumlauf R, Duboule D. Combined function of HoxA and HoxB clusters in neural crest cells. Dev Biol. 2013; 382(1): 293-301. Wang C, Chang JY, Yang C, Huang Y, Liu J, You P, et al. Type 1 fibroblast growth factor receptor in cranial neural crest cell-derived mesenchyme is required for palatogenesis. J Biol Chem. 2013; 288(30): 22174-83. Wang M, Wang ZP, Gong R, Zhao ZT. Maternal smoking during pregnancy and neural tube defects in offspring: a meta-analysis. Childs Nerv Syst. 2014; 30(1): 83-9. Wehby GL, Cassell CH. The impact of orofacial clefts on quality of life and healthcare use and costs. Oral Dis. 2010; 16(1): 3-10. Wehby GL, Castilla EE, Goco N, Rittler M, Cosentino V, Javois L, et al. The effect of systematic pediatric care on neonatal mortality and hospitalizations of infants born with oral clefts. BMC Pediatr. 2011; 11: 121. Wehby GL, Murray JC. Folic acid and orofacial clefts: a review of the evidence. Oral Dis. 2010; 16(1): 11-9. Wehby GL. Advancing and prioritizing research on oral clefts in Brazil. J Pediatr (Rio J). 2013; 89(2): 112-5. Wei Y, Fan T, Yu M. Inhibitor of apoptosis proteins and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2008; 40(4): 278-88. Weinberg SM, Parsons TE, Fogel MR, Walter CP, Conrad AL, Nopoulos P. Corpus callosum shape is altered in individuals with nonsyndromic cleft lip and palate. Am J Med Genet A. 2013; 161a(5): 1002-7. Wieczorek E, Reszka E, Jablonowski Z, Jablonska E, Beata Krol M, Grzegorczyk A, et al. Genetic polymorphisms in matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue

73

inhibitors of MPs (TIMPs), and bladder cancer susceptibility. BJU Int. 2013; 112(8): 1207-14. Wilcox AJ, Lie RT, Solvoll K, Taylor J, McConnaughey DR, Abyholm F, et al. Folic acid supplements and risk of facial clefts: national population based case-control study. Bmj. 2007; 334(7591): 464. World Health Organization. International Collaborative Research on Craniofacial Anomalies. [internet]. 2014 [acesso 2014 dez 19]. Disponível em: http://www.who.int/genomics/anomalies/en/. Wu D, Wang M, Wang X, Yin N, Song T, Li H, et al. Maternal transmission effect of a PDGF-C SNP on nonsyndromic cleft lip with or without palate from a Chinese population. PLoS One. 2012; 7(9): e46477. Wu T, Fallin MD, Shi M, Ruczinski I, Liang KY, Hetmanski JB, et al. Evidence of gene-environment interaction for the RUNX2 gene and environmental tobacco smoke in controlling the risk of cleft lip with/without cleft palate. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2012; 94(2): 76-83. Wu T, Schwender H, Ruczinski I, Murray JC, Marazita ML, Munger RG, et al. Evidence of gene-environment interaction for two genes on chromosome 4 and environmental tobacco smoke in controlling the risk of nonsyndromic cleft palate. PLoS One. 2014; 9(2): e88088. Wurdak H, Ittner LM, Lang KS, Leveen P, Suter U, Fischer JA, et al. Inactivation of TGFbeta signaling in neural crest stem cells leads to multiple defects reminiscent of DiGeorge syndrome. Genes Dev. 2005; 19(5): 530-5. Wyszynski DF, Albacha-Hejazi H, Aldirani M, Hammod M, Shkair H, Karam A, et al. A genome-wide scan for loci predisposing to non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in two large Syrian families. Am J Med Genet A. 2003; 123a(2): 140-7. Wyszynski DF, Duffy DL, Beaty TH. Maternal cigarette smoking and oral clefts: a meta-analysis. Cleft Palate Craniofac J. 1997; 34(3): 206-10. Xu C, Hou Z, Zhan P, Zhao W, Chang C, Zou J, et al. EZH2 regulates cancer cell migration through repressing TIMP-3 in non-small cell lung cancer. Med Oncol. 2013; 30(4): 713. Yang J, Carmichael SL, Canfield M, Song J, Shaw GM. Socioeconomic status in relation to selected birth defects in a large multicentered US case-control study. Am J Epidemiol. 2008; 167(2): 145-54. Yang W, Carmichael SL, Roberts EM, Kegley SE, Padula AM, English PB, et al. Residential agricultural pesticide exposures and risk of neural tube defects and orofacial clefts among offspring in the San Joaquin Valley of California. Am J Epidemiol. 2014; 179(6): 740-8. Yang Y. Wnt signaling in development and disease. Cell Biosci. 2012; 2(1): 14.

74

Yao T, Yang L, Li PQ, Wu H, Xie HB, Shen X, et al. Association of Wnt3A gene variants with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in Chinese population. Arch Oral Biol. 2011; 56(1): 73-8. Yu Z, Chen J, Ford BN, Brackley ME, Glickman BW. Human DNA repair systems: an overview. Environ Mol Mutagen. 1999; 33(1): 3-20. Zhang B, Jiao X, Mao L, Xue J. Maternal cigarette smoking and the associated risk of having a child with orofacial clefts in China: a case-control study. J Craniomaxillofac Surg. 2011; 39(5): 313-8. Zhang Y, Zhao X, Hu Y, St Amand T, Zhang M, Ramamurthy R, et al. Msx1 is required for the induction of Patched by Sonic hedgehog in the mammalian tooth germ. Dev Dyn. 1999; 215(1): 45-53. Zhang Z, Song Y, Zhao X, Zhang X, Fermin C, Chen Y. Rescue of cleft palate in Msx1-deficient mice by transgenic Bmp4 reveals a network of BMP and Shh signaling in the regulation of mammalian palatogenesis. Development. 2002; 129(17): 4135-46. Zhou B, Shan H, Su Y, Xia K, Shao X, Mao W, et al. The association of APE1 - 656T > G and 1349 T > G polymorphisms and cancer risk: a meta-analysis based on 37 case-control studies. BMC Cancer. 2011; 11: 521. Zhu H, Kartiko S, Finnell RH. Importance of gene-environment interactions in the etiology of selected birth defects. Clin Genet. 2009; 75(5): 409-23.

75

ANEXO Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa

COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

CERTIFICADO

O Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP certifica que o projeto de pesquisa "Avaliação de polimorfismos gênicos em pacientes com fissuras lábio-palatinas não-sindrômicas", protocolo nº 152/2009, dos pesquisadores Ricardo Della Coletta, Lívia Máris Ribeiro Paranaíba, Natália Dias Florentino, Renato Assis Machado e Sibele Nascimento de Aquino, satisfaz as exigências do Conselho Nacional de Saúde - Ministério da Saúde para as pesquisas em seres humanos e foi aprovado por este comitê em 09/12/2009, com alterações em 28/06/2010 e 17/07/2014.

The Ethics Committee in Research of the Piracicaba Dental School - University of Campinas, certify that the project"Polymorphisms in patients with nonsyndromic cleft lip and palate", register number 152/2009, of Ricardo Della Coletta, Lívia Máris Ribeiro Paranaíba, Natália Dias Florentino, Renato Assis Machado and Sibele Nascimento de Aquino, comply with the recommendations of the National Health Council - Ministry of Health of Brazil for research in human subjects and therefore was approved by this committee on Dec 09, 2009; with alterations on Jun 28, 2010 and Jul 17, 2014.

Prof. Dr. Felippe Bevilacqua Prado Profa. Dra. Lívia Maria Andaló Tenuta Secretário Coordenadora CEP/FOP/UNICAMP CEP/FOP/UNICAMP

Nota: O título do protocolo aparece como fornecido pelos pesquisadores, sem qualquer edição. Notice: The title of the project appears as provided by the authors, without editing.

76