Glycoproteomic Characterization of Bladder Cancer Chemoresistant Cells
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Glycoproteomic Characterization of Bladder Cancer Chemoresistant Cells Diogo André Teixeira Neves Mestrado em Bioquímica Departamento de Química e Bioquímica 2015 Orientador José Alexandre Ferreira, Professor Doutor, IPO-Porto Coorientador André Silva, Doutor, Investigador Auxiliar, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________ “Success consists of going from failure to failure without loss of enthusiasm.” Winston Churchill Dava tudo para te ter aqui, meu querido avô! 1937-2014 FCUP i Glycoproteomic Characterization of Bladder Cancer Chemoresistant Cells Agradecimentos Foi, sem dúvida, um ano de grande aprendizagem. Não só da aprendizagem do método (sabe sempre a pouco), mas sobretudo da aprendizagem que nos faz crescer enquanto seres íntegros e completos. Um ano que se tornou curto face a tudo aquilo que ainda queria aprender com os melhores. Ao Professor Doutor José Alexandre Ferreira pela orientação, por toda a disponibilidade e paciência. Muita paciência. Sinto que muitas das vezes o tempo faz com que tenhamos que nos desdobrar em vários campos. No campo possível partilhado por nós, pude perceber que estive perante um grande senhor da Ciência. Fez-me perceber também que o pensamento simples faz mover montanhas e que o complexo não se alcança sem uma boa dose de simplicidade. Vejo-o como um exemplo a seguir, como uma figura de proa no panorama científico. Muito obrigado! Ao Professor Doutor Luís Lima por toda a ajuda, conhecimento técnico, pela forma didáctica e simples como aborda as situações. Fez-me perceber a simplicidade dos processos, como podemos ser metodológicos e organizados. É fácil trabalhar com pessoas como o Luís! Devo-lhe também um enorme agradecimento! Ao Doutor André Silva pela co-orientação deste trabalho, pela disponibilidade com que me acolheu e pela interpretação dos espectros de massa. A todos os meus colegas do Grupo de Patologia e Terapêutica Experimental. Pude aprender um pouco de tudo convosco, pude desfrutar da vossa boa disposição incessante. De todos, não consigo deixar de destacar a Elisabete Fernandes por me ter ao seu cuidado em muitos dos momentos. Obrigada por toda a paciência, consegui aprender muito contigo. Surpreendeste-me muito, vais muito longe! Ao Professor Doutor Lúcio Lara Santos, coordenador do grupo, por me ter concedido a oportunidade de pertencer ao GPTE e ter lidado com os melhores! À minha família. Não somos nada sem a nossa família e, felizmente, eu tenho a minha sempre do meu lado independentemente das minhas opções. Queria destacar a minha mãe Glória por ser a minha lutadora e querer sempre o melhor para mim. Obrigado por funcionares como mãe e como pai ao mesmo tempo e por me permitires ser o que sou hoje. Á minha avó Fernanda por estar tão perto de mim, por ser a minha segunda mãe, por estar comigo nos momentos mais importantes da minha vida. Queria destacar também três das mais importantes pessoas da minha vida. Posso nunca ter tido um pai verdadeiramente, mas posso dizer que tive várias figuras que ii FCUP Glycoproteomic Characterization of Bladder Cancer Chemoresistant Cells funcionaram como tal. Ao meu tio Rui por acreditar muito em mim e por estar sempre presente quando preciso. Quando ao longe me vires a tombar, sei que virás a correr segurar-me. Se isto não for dogmático, não acredito em nada. Queria também agradecer ao Vítor, meu padrasto, por ter uma palavra a dizer na minha educação. Também me orgulho muito de te ter presente na minha vida. Finalmente, queria agradecer ao meu avô Álvaro que já partiu. Sei que, do local onde me estás a ver, sorris. Sorris por me veres a cumprir esta etapa. Sorris porque sempre sorriste, mesmo quando não havia razões para sorrir. Nunca te esquecerei, és um exemplo. Quero ser como tu foste! À minha namorada Cíntia. Quanto te conheço, conheço-me. E quando não me conheço, sei que te conhecendo, reconheço-me. E, o resto, digo-te todos os dias e espero continuar a dizer durante muitos mais. Uma palavra de apreço à comunidade bioquímica da UP por também ter aprendido e gozado a vida convosco. Em especial, gostaria de destacar o André, a Joana, a Jessica e a Ana. Espero que os nossos caminhos nunca se descruzem! Por último, a quatro dos melhores do mundo, à minha irmandade. Ao Pedro, ao Rui, ao Fábio e ao Nuno por serem os quatro de sempre, para sempre. A nossa união prevalecerá sempre, nunca se esqueçam disso! FCUP iii Glycoproteomic Characterization of Bladder Cancer Chemoresistant Cells Resumo O cancro de bexiga musculo-invasor (CBMI, estadio >T2) constitui a segunda maior causa de morte entre os tumores geniturinários e variações significativas no prognóstico clinico são observadas para tumores com histopatologia similar devido à heterogeneidade molecular. Mais ainda, tratamentos convencionais baseados em cirurgia e regimes de cisplatina falham em evitar recidivas e disseminação da doença. Assim, a introdução de biomarcadores para a estratificação precisa dos doentes, prognosticação e desenvolvimento de terapia guiada são necessários para melhorar o tratamento destes. Estudos preliminares do nosso grupo sugerem que tumores de bexiga avançados expressam o antigénio Sialil-Tn (STn) que advém da paragem prematura da O-glicosilação das proteínas da superfície celular. Mais importante ainda, este antigénio não foi detetado no urotélio normal denotando uma natureza cancro- específica. Este antigénio demonstrou ser promotor da motilidade celular, invasão, transição epitelial para mesenquimal e evasão do sistema imune. Em adição, o STn foi encontrado em zonas quiescentes do tumor, sugerindo o seu envolvimento na resistência à quimioterapia. Este trabalho demonstrou que a sobre-expressão do STn esteve significativamente associada com tumores de bexiga avançados e sobrevida livre de cancro diminuída independentemente do estadio do tumor. Mais ainda, o STn foi encontrado na metástase de todos os tumores STn positivos. De forma a melhorar a prognosticação do CBMI, a expressão de STn foi incluída no modelo molecular baseado na expressão de queratinas que foi introduzido numa tentativa de reduzir o viés resultante da classificação histopatológica. Conformemente, tumores basal-like (KRT14+ e/ou KRT5+ KRT20-) menos diferenciados apresentaram pior sobrevida livre de cancro e sobrevivência livre de doença do que tumores luminais (KRT14-KRT5- KRT20+) bem diferenciados. A introdução do STn melhorou a capacidade de discriminação deste modelo através da separação de casos com pior sobrevida livre de cancro dentro da população luminal e basal-like. No contexto da resposta à quimioterapia, o STn encontrava-se presente na metástase de 70% dos pacientes que progrediram na doença após quimioterapia adjuvante, sugerindo a sua associação com fenótipos quimioresistentes. Suportando estas observações, doentes positivos para STn que foram submetidos a quimioterapia neo-adjuvante mantiveram a mesma iv FCUP Glycoproteomic Characterization of Bladder Cancer Chemoresistant Cells positividade para STn assim como um fenótipo basal-like após o tratamento, independentemente do estado de diferenciação inicial do tumor. Para confirmar estes resultados, duas linhas celulares tumorais de bexiga (T24 e HT1376) foram submetidas a tratamento com cisplatina, tendo sido observado que a expressão de STn se mantém inalterada após o tratamento, assim como um enriquecimento no fenótipo basal-like entre os clones quimioresistentes. Concomitantemente, uma análise dos transcriptos das células quimioresistentes revelou a activação de programas EMT, associados com a promoção da capacidade de migração e disseminação, assim como programas envolvidos na evasão da apoptose em resposta ao dano no DNA. Em suma, estas observações reforçam a noção de que o STn é um biomarcador de agressividade e quimioresistência e a sua importância no desenvolvimento de terapias guiadas baseadas neste antigénio. Seguidamente, uma abordagem glicoproteómica foi realizada para identificar glicoproteínas que expressem STn em tumores basal-like que conservaram a expressão de STn após quimioterapia neo-adjuvante. Esta abordagem usando nanoLC-ESI-MS/MS permitiu identificar mais de 400 locais O-glicosilados e 143 glicoproteínas de membrana que expressam STn que poderão ser potenciais alvos para terapêutica guiada. Uma das glicoproteínas identificada foi a MUC-16, uma glicoproteína já reportada noutros tumores assim como no soro de doentes com cancro de bexiga, mas não ainda nos tumores de bexiga. Também foram encontradas evidências de alteração da glicosilação no CD44, uma glicoproteína associada ao fenótipo de célula estaminal cancerígena em cancro de bexiga, tendo um papel na mediação da invasão e disseminação da doença. A expressão destas glicoproteínas foi seguidamente validada em tumores primários e na metástase e conservada após quimioterapia neo-adjuvante. Estes resultados não só validam observações anteriores por imunohistoquímica em relação à expressão de STn em tumores de bexiga mas também fornecem um painel de proteínas da superfície celular anormalmente O- glicosiladas que poderão ser usadas para seleccionar tumores de bexiga mais agressivos e melhorar o tratamento da doença. Mais estudos serão necessários para revelar a significância clínica e biológica destas alterações no cancro de bexiga. Palavras-chave Cancro de bexiga | Sialil-Tn | Glicosilação de proteínas | Quimioresistência | Células Estaminais Cancerígenas FCUP v Glycoproteomic Characterization of Bladder Cancer Chemoresistant