Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zum Auftreten verschiedener bakterieller Zoonoseerreger und zu den Risikofaktoren in norddeutschen Schweinemastbeständen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin oder eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Susanne Döhne Marburg/Lahn

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. L. Kreienbrock, Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung

Prof. Dr. K.-H. Waldmann, Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik

1. Gutachter: Prof. Dr. L. Kreienbrock, Prof. Dr. K.-H. Waldmann 2. Gutachter: Prof. Dr. T. Blaha

Tag der mündlichen Prüfung: 03.11.2010

Diese Dissertation wurde gefördert durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Projektes FBI-Zoo

Veröffentlichungen

Erste Ergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

DÖHNE, S., A. VON ALTROCK, R. MERLE, K.-H. WALDMANN u. L. KREIENBROCK (2009):

Incidence and antimicrobial susceptibility of Salmonella in fattening pig herds in Northern Germany. In: 14 th ISAH Congress Vechta, 19.-23. Juli 2009, Proceedings Vol.2

DÖHNE, S., A. VON ALTROCK, R. MERLE, K.-H. WALDMANN u. L. KREIENBROCK (2009):

Resistenzen von Salmonella spp. in norddeutschen Schweinemastbetrieben. In: DVG-Fachgruppentagung Epidemiologie und Dokumentation: „Krankheitsdynamik in Populationen – Bedeutung von Surveillance und Impfprogrammen“, Gießen, 2.-4. September 2009

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 13

2 Literaturübersicht 15

2.1 Lebensmittelbedingte Zoonosen 15

2.2 Salmonella enterica ssp. enterica 16

2.2.1 Erregereigenschaften ...... 16

2.2.2 Nachweis von Salmonella spp...... 18

2.2.3 Epidemiologie ...... 24

2.3 Campylobacter spp. 33

2.3.1 Erregereigenschaften ...... 33

2.3.2 Nachweis von Campylobacter spp...... 35

2.3.3 Epidemiologie ...... 38

2.4 Y. enterocolitica 44

2.4.1 Erregereigenschaften ...... 44

2.4.2 Nachweis von Y. enterocolitica ...... 46

2.4.3 Epidemiologie ...... 49

2.5 Antibiotikaresistenzen 54

2.5.1 Allgemeines ...... 54

2.5.2 Resistenzen bei Salmonella spp...... 58

2.5.3 Resistenzen bei Campylobacter spp...... 59

2.5.4 Mikrodilutionstest und MHK-Wert ...... 62 3 Material und Methoden 65

3.1 Aufbau und Ziel der Studie 65

3.2 Art und Herkunft der untersuchten Proben 66

3.3 Kulturelle Untersuchung 67

3.3.1 Salmonella spp...... 67

3.3.2 Campylobacter spp...... 68

3.3.3 Y. enterocolitica...... 69

3.4 Serologische Untersuchung 70

3.4.1 Salmonella spp...... 70

3.4.2 Campylobacter spp...... 71

3.4.3 Y. enterocolitica...... 71

3.5 Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung 72

3.5.1 Empfindlichkeitstestung der Salmonella spp.-Isolate...... 72

3.5.2 Empfindlichkeitstestung der Campylobacter spp.-Isolate ...... 73

3.6 Fragebogen 75

3.7 Statistische Auswertung 75

4 Ergebnisse 81

4.1 Serologische und kulturelle Untersuchung auf Einzeltierebene 81

4.2 Serologische und kulturelle Untersuchung auf Betriebsebene 85

4.3 Vergleich der serologischen und kulturellen Ergebnisse 87

4.4 Auftreten mehrerer Erreger 89

4.4.1 Erregerkombinationen auf Einzeltierebene ...... 89

4.4.2 Erregerkombinationen auf Bestandsebene...... 89

4.5 Risikofaktoren für das Auftreten der Erreger 93

4.5.1 Dichotome Risikovariablen ...... 93

4.5.2 Stetige Risikovariablen ...... 95

4.5.3 Risikofaktoren für das Auftreten von einem oder mehreren Erregern...... 96

4.6 Auswertung der Resistenzen 100

4.6.1 Resistenzen bei Salmonella spp...... 100

4.6.2 Resistenzen bei Campylobacter spp...... 102

4.6.3 Vergleich der Resistenzen bei Salmonella spp. und Campylobacter spp. 106

4.6.4 Risikofaktorenanalyse für das Auftreten von Antibiotikaresistenzen...... 107

5 Diskussion 111

5.1 Serologische und kulturelle Prävalenzen 112

5.2 Auftreten von Erregerkombinationen 122

5.3 Erregerbekämpfung 124

5.4 Analyse der Risikofaktoren 126

5.5 Einflussfaktoren für das Auftreten mehrerer Erreger 132

5.6 Empfindlichkeitstestung von Salmonella spp. und Campylobacter spp. 134

6 Zusammenfassung 141

7 Summary 145

8 Literaturverzeichnis 147

Abkürzungsverzeichnis

In dieser Arbeit wurden neben den allgemein üblichen Abkürzungen folgende spezielle Kurzformen verwendet:

ACSSuT Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamid, Tetrazyklin ACSSuT+Nx ACSSuT + Nalidixinsäure Ak Antikörper AMP Ampicillin ATCC American Type Culture Collection BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BLE Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung BPLS Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose BPW Buffered-Pepton-Water C. Campylobacter CFU Colony forming unit CHL Chloramphenicol CIN Cefsulidin-Irgascin-Novobiocin CIP Ciprofloxacin CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute, früher NCCLS COL Colistin DANMAP Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Programme DNA Desoxysribonukleinsäure DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen dt. Phagentyp definitiver Phagentyp ECOFF epidemiologischer Cutoff ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ERY Erythromycin EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FARM French Antimicrobial Resistance Monitoring in Bacteria of animal origin FBI-Zoo “Food-borne zoonotic infections of humans” FFN Florfenicol FOT Cefotaxim GEN Gentamicin GERMAP Bericht über Antibiotikaverbrauch und Verbreitung von Antibiotikaresistenzen in Deutschland ITC Irgasan-Ticarcilin- Kaliumchlorat IfsG Infektionsschutzgesetz ITAVARM Italian Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring Қ-Wert Kappa-Wert KAN Kanamycin KBE Koloniebildende Einheiten Kbp Kilobasenpaar Ln. Lymphknoten MARAN Monitoring of antimicrobial resistance and antibiotic usage in Animals in the Netherlands MHK-Wert minimale Hemmstoffkonzentration MHB Müller-Hinton-Bouillon MKTTn Müller-Kaufmann-Tetrathionat-Novobiocin NAL Nalidixinsäure NORM-VET Usage of Antimicrobial Agents an Occurrence of Antimicrobial Resistance in Norway p.i. post infectionem RVS Rappaport-Vassiliadis -Medium RDNC reagiert mit Phagen, aber passt zu keinem bekannten Phagentyp (reacts, but does not not conform) S. Salmonella SAM Ampicillin / Sulbactam SMX Sulfamethoxazol SPF spezifisch pathogenfrei spp. mehrere, nicht im Einzelnen zu nennende Spezies eines Genus ssp. Subspezies STR Streptomycin SVARM Swedish Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring SULF Sulfonamid SXT Sulfamethoxazol / Trimethoprim TAZ Ceftazidim TET Tetrazyklin TMP Trimethoprim VAV Veterinary Monitoring of Antimicrobial resistance in Spain WHO World Health Organisation XLD Xylose-Lysin-Desoxycholat Y. Yersinia Yop Yersinia outer protein ZIPP „Zoonoses in Pork Production / Kontrolle von aus der Produktionskette Schweinefleisch hervorgehenden Zoonosen“

Einleitung 13

1 Einleitung

Verbraucher stellen in der gegenwärtigen Zeit besonders hohe Ansprüche an gesundheitlich unbedenkliche Lebensmittel. Der Lebensmittelsicherheit von Schweinefleisch kommt in diesem Zusammenhang eine herausragende Bedeutung zu, da es in Europa das am häufigsten verzehrte Fleisch ist. Schweine können die bakteriellen Zoonoseerreger Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica asymptomatisch im Magen-Darm-Trakt beherbergen. Diese Krankheitserreger kontaminieren unter bestimmten Umständen das Schweinefleisch während der Schlachtung. Durch den Verzehr des erregerbelasteten Schweinefleisches ist eine orale Infektion des Menschen möglich. Die durch Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica ausgelösten humanen Erkrankungen äußern sich meist in einer selbstlimitierenden Gastroenteritis, jedoch können in seltenen Fällen Komplikationen auftreten. In der europäischen Union wurden im Jahr 2008 offiziell 190.820 humane Infektionen mit Campylobacter spp., 133.258 mit Salmonella spp. und 8354 mit Y. enterocolitica gemeldet. Diese waren somit die drei am häufigsten gemeldeten Zoonosen (EFSA 2010). Die Dunkelziffer der Fälle liegt aber vermutlich viel höher, so dass diese Zoonosen eine sehr hohe Bedeutung für die öffentliche Gesundheit haben. Besorgniserregend ist das zunehmende Auftreten von Antibiotikaresistenzen der bakteriellen Zoonoseerreger. Es ist bekannt, dass der unkontrollierte Einsatz von antibiotischen Wirkstoffen am Tier den selektiven Druck auf die Keime erhöht und dadurch eine Resistenzentwicklung fördert. Es besteht die Möglichkeit einer Übertragung resistenter Zoonoseerreger vom Tier auf den Menschen. Die Resistenz limitiert die therapeutischen Möglichkeiten; antibiotikaresistente Keime bei Schweinen können somit im veterinärmedizinischen und auch im humanmedizinischen Bereich ein großes Problem darstellen. Die EG-Verordnung 178/2002 sieht vor, bereits auf Stufe der Pimärproduktion die Basis für ein sicheres Lebensmittel zu legen, welches frei von Zoonoseerregern ist.

Die vorgelegte Arbeit dient dazu, das Vorkommen von Zoonoseerregern auf Bestandsebene zu beurteilen und durch die Ermittlung von Risikofaktoren einen Beitrag zur Bekämpfung dieser Zoonosen zu leisten. Die serologischen und kulturellen Prävalenzen der bakteriellen Zoonoseerreger Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica in 27 nordeutschen Einleitung 14

Schweinemastbetrieben wurden beschrieben. Anhand eines Fragebogens wurden betriebliche Managementdaten erfasst und mittels statistischer Methoden Zusammenhänge zwischen diesen und dem Auftreten der Erreger ermittelt. Einen dritten Schwerpunkt stellte die Empfindlichkeitstestung der isolierten Bakterien mittels Mikrodilutionsmethode dar. Die Dissertation wurde im Rahmen des FBI-Zoo-Projektes (Projektträger: BMBF, Bundesministerium für Bildung und Forschung) und in enger Kooperation mit dem Projekt ZIPP II der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover (Projektträger: BLE, Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung) erstellt.

Literaturübersicht 15

2 Literaturübersicht

2.1 Lebensmittelbedingte Zoonosen

Als Zoonosen werden laut WHO-Definition diejenigen Infektionskrankheiten bezeichnet, welche auf natürlichem Wege zwischen Tier und Mensch übertragen werden können. Je nach Übertragungsrichtung spricht man von Anthropozoonose (Tier auf Mensch), Zooanthroponose (Mensch auf Tier) oder Amphixenosen (in beide Richtungen) (WIESNER et al. 2000). Als Zoonoseerreger kommen grundsätzlich Bakterien, Viren, Parasiten, Pilze und sonstige biologische Einheiten in Betracht (WIESNER et al. 2000; UNION 2003). Bei lebensmittelbedingten Zoonosen („foodborne zoonoses“) erfolgt die Erregerübertragung durch Lebensmittel. Lebensmittelbedingte Zoonosen treten in den letzten Jahrzehnten vermehrt auf (THORNS 2000). Laut einer Studie (MEAD et al. 1999) sind 95 % der humanen nichttyphoidalen Salmonellosen, 80 % der Campylobacteriosen und 90 % der Yersiniosen lebensmittelbedingt. Die häufigsten durch Lebensmittel übertragenen Krankheiten in der Europäischen Union sind auf Bakterien wie Campylobacter spp. und Salmonella spp., aber auch auf Viren zurückzuführen. Campylobacter spp. sind, gefolgt von Salmonella spp., aktuell die häufigste identifizierte bakterielle Ursache von Durchfallerkrankungen in der EU (EFSA 2010).

Literaturübersicht 16

2.2 Salmonella enterica ssp. enterica

2.2.1 Erregereigenschaften

Salmonella spp. sind gram-negative, fakultativ anaerob wachsende Stäbchenbakterien mit einer Größe von 0,7-1,5 x 2-5 μm (ROLLE et al. 2007). Aufgrund ihrer peritrichen Begeißelung sind alle Salmonellen außer S. Gallinarum und S. Pullorum beweglich (RZEDZICKI et al. 2004). Charakteristische Stoffwechseleigenschaften bestehen in der Nitratreduktion, Gasbildung aus Glukose (ausgenommen S. Typhi), Schwefelwasserstoffbildung auf Dreizuckereisenagar (ausgenommen S. Choleraesuis und S. Paratyphi A), negativer Indol-Reaktion, Nutzung von Citrat als alleinige Kohlenstoffquelle (ausgenommen S. Typhi und S. Paratyphi A), Lysin- (ausgenommen S. Paratyphi A) und Ornithin-Dekarboxylierung (ausgenommen S. Typhi) und einer negativen Urease-Reaktion (HOLDT et al. 1994). Bis auf wenige Ausnahmen (S. ssp. arizonae und diarizonae) sind Salmonellen nicht fähig, Laktose zu fermentieren (LE MINOR 1984; ROLLE et al.). Salmonellen sind mesophile Keime, sie sind im Temperaturbereich von 5 bis 47 °C (Optimum: 37 °C) vermehrungsfähig (BÖHM 1993). Salmonellen benötigen ein minimales Nährstoffangebot zum Wachstum und gelten als anspruchslos in der Anzucht. Sie besitzen eine hohe Tenazität und sind daher außerhalb des Wirtsorganismus lange lebensfähig (D'AOUST 1991). Die Widerstandsfähigkeit steigt in trockener Umgebung, beispielsweise überleben Salmonellen in Staub bei Raumtemperatur bis zu 4 Jahre (SELBITZ 2002). Salmonellen sind empfindlich gegenüber Erhitzen, eine Temperatur von 70 °C tötet den Erreger innerhalb von Sekunden ab (DEDIE et al. 1993). Die serologischen Eigenschaften von Salmonellen nutzt das KAUFFMANN-WHITE-Schema zur Einteilung in verschiedene Salmonellenserovare. Salmonellen besitzen somatische (O-), Geißel-(H-), Kapsel-(K-) und Fimbrien-(F-) Antigene (ROLLE et al.). Die O- und H-Antigene werden im KAUFFMANN-WHITE-Schema in Antigenformeln zusammengefasst. Salmonellen mit identischen O- und H-Gruppen werden dabei dem selben Serotyp/Serovar zugeordnet (YOSHIKAWA et al. 1980). Das erste serologisch basierte Schema zur Salmonellen- Klassifikation veröffentlichte der britische Bakteriologe White im Jahr 1926. Der dänische Bakteriologe KAUFFMANN erweiterte dieses Schema dieses von 1933 bis 1978 sukzessive (KAUFFMANN 1978). Heutzutage kommen jährlich bis zu 20 neu entdeckte Serotypen hinzu, Literaturübersicht 17

die nötigen Erweiterungen und Aktualisierungen des KAUFFMANN-WHITE-Schemas werden durch den Franzosen POPOFF weitergeführt (POPOFF et al. 2004).

Geschichte

1880 wurde S. Typhi, der Erreger des Typhus abdominalis beim Menschen, von Robert KOCH und Karl Joseph EBERTH entdeckt. Vier Jahre später gelang Georg GAFFKY die Anzüchtung dieses Erregers in Reinkultur. Der amerikanische Tierarzt Daniel SALMON isolierte 1885 den Erreger der damals sogenannten „Schweinecholera“ S. Choleraesuis. Der Gattungsname Salmonella wurde 15 Jahre später, im Jahre 1900, durch LIGNIERES zu Ehren SALMONs eingeführt. GÄRTNER entdeckte 1888 den humanmedizinisch bedeutenden Stamm S. Enteritidis (GÄRTNER 1888). LÖFFLER beschrieb 1891 erstmals den ebenfalls humanmedizinisch relevanten Stamm S. Typhimurium. Er nannte den neuartigen Erreger „Bacillus typhi murium“, weil zahlreiche Labormäuse des Hygieneinstituts Greifswald (heutiges FLI) an einer typhusähnlichen Erkrankung verendet waren. In seiner Entdeckung sah der Forscher in erster Linie eine effiziente Möglichkeit zur Feldmausbekämpfung (LOEFFLER 1892). Die Bedeutung von Salmonella spp. als Erreger von „Lebensmittelvergiftungen“ wurde relativ früh erkannt, so dass in Schweden, Norwegen und Finnland schon vor über 50 Jahren Bekämpfungsprogramme implementiert wurden (Anonymous 2006).

Taxonomie und Nomenklatur

Im Laufe der Jahre hat sich die komplexe Taxonomie und Nomenklatur der Bakteriengattung Salmonella immer wieder gewandelt und ist auch heutzutage nicht endgültig (EUZEBY 1999). Anfangs erfolgte die Nomenklatur der Salmonellen nach dem vermuteten Wirt. So entstanden Namen wie S. Cholerasuis (Cholera, Schwein) und S. Typhimurium (Typhus, Maus). Weil Salmonellen aber häufig nicht wirtsspezifisch sind, ging man später zur Verwendung des Entdeckungsortes als Namen über (z.B. S. Brandenburg, S. Dublin). Ursprünglich galt nach dem Serotypisierungsschema KAUFMANNs von 1955 jede neu entdeckte Salmonelle als eigenständige Spezies. Dieses von KAUFFMANN vertretene „Ein-Serotyp-eine-Spezies- Literaturübersicht 18

Konzept“ wurde später widerlegt: So stellten LE MINOR und POPOFF aufgrund molekularbiologischer Erkenntnisse zunächst die Hypothese auf, die Gattung Salmonella bestehe nur aus einer einzigen Spezies, nämlich der Spezies S. enterica (LE MINOR et al. 1987). Neben Salmonella enterica ssp. enterica (Subspezies I) existieren noch fünf weitere Subspezies der Spezies S. enterica (Subspezies II-VI), namentlich S. arizonae, S. diarizonae, S. houtenae, S. indica und S. salamae. Im Jahre 1989 führten REEVES et al. die zweite Salmonella-Spezies S. bongori ein (REEVES et al. 1989). SHELOBOLINA et al. beschrieben schließlich die dritte und bis dato letzte entdeckte Salmonella-Spezies S. subterranea (SHELOBOLINA et al. 2004). Die Subspezies I (Salmonella enterica subspezies enterica) umfasst diejenigen Salmonella- Serovare, die überwiegend bei warmblütigen Wirbeltieren inklusive dem Menschen gefunden werden. Die Subspezies II -VI der Spezies enterica, sowie die Spezies S. bongori können in erster Linie bei poikilothermen und kalblütigen Vertebraten gefunden werden und galten zeitweilig als niedrigpathogen bzw. apathogen für Warmblüter. Jedoch sind auch sie ohne Zweifel als humanpathogene Keime einzustufen, da sie als sporadischer Auslöser schwerer Infektionen bei Menschen beschrieben wurden (WIELER et al. 2000). Bisher wurden im gesamten Genus Salmonella insgesamt über 2.500 Salmonella-Serovare entdeckt, von denen über 1.500 Serovare zu S. enterica ssp. enterica gehören (GRIMONT et al. 2007). Die moderne und allgemein anerkannte Schreibweise für Serovare von Salmonella enterica ssp. enterica nennt hinter dem Genus Salmonella nur das betreffende Serovar. So schreibt man beispielsweise S. Typhimurium stellvertretend für Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhimurium oder auch S. Brandenburg anstatt Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Brandenburg.

2.2.2 Nachweis von Salmonella spp.

Direkter Nachweis mittels kultureller Anzucht

Direkte Verfahren weisen immer den Erreger selbst bzw. Erregerteile nach. Der kulturelle Nachweis von Salmonella spp. umfasst in der Regel eine nicht-selektive Voranreicherung, gefolgt von einer Selektivanreicherung in einer Nährbouillon mit anschließender Literaturübersicht 19

Subkultivierung auf feste Selektivnährböden und nachfolgend einer vorläufigen biochemischen und serologischen Bestätigung. Diese nicht-selektive Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser (BPW) bewirkt eine Regeneration vorgeschädigter Bakterien und erhöht somit die Isolationsquote (SELBITZ 1992). Speziell für die Salmonellendiagnostik steht eine große Vielzahl an Anreicherungsmedien und Selektivnährböden zur Verfügung (DAVIES et al. 2000). Die festen Selektiv- und Differenzierungsnährböden indizieren durch Farbumschlag oder Schwarzfärbung salmonellaverdächtige Kolonien an. Die Voranreicherung ist in der Salmonella-Diagnostik gängig, obwohl es Studien gibt, welche sie bei stark kontaminiertem Material nicht empfehlen (DAVIES et al. 2000). Die beiden häufig verwendeten Voranreicherungen MKTTn (Müller- Kauffmann-Tetrathionat)- und RV (Rappaport- Vassiliadis)-Bouillon wurden in einigen Studien miteinander verglichen: VASSILIADIS et al. (VASSILIADIS et al. 1987) und BAGER et al. (BAGER et al. 1991) berichteten von einer besseren Ausbeute bei Einsatz des RV-Mediums. Die Selektivanreicherung bewirkt die Repression des Wachstums der Begleitflora bei gleichzeitiger Selektion der Salmonellen. In der Rappaport-Vassiliadis-Bouillon hemmen Malachitgrün und Magnesiumchlorid das Wachstum der Begleitflora weitgehend. Im Falle der Müller-Kauffmann-Tetrathionat-Novobiocin-Bouillon werden coliforme Keime und anderer Darmbakterien durch Tetrathionat und die grampositive Flora durch Novobiocin unterdrückt. Die Anreicherungskulturen werden anschließend im Allgemeinen auf mindestens zwei feste Nährböden unterschiedlicher Selektivität ausgestrichen. Die festen Selektiv- und Differenzierungsmedien zeigen durch Farbumschlag (Vergärung bestimmter Kohlehydrate) bzw. Schwarzfärbung (Sulfidbildung) Salmonella-verdächtige Kolonien an. Auf dem XLD-Agar hemmt das Gallensalz Desoxycholat die unerwünschte Begleitflora. Xylose-, Lactose- und Saccharoseabbau würden zu einer pH-Wert-Senkung und somit zu einem Farbumschlag von Phenolrot ins Gelbe führen. Da Salmonellen jedoch Citrat als alleinige Kohlehydratquelle nutzen, kommt es hier nicht zur Gelbfärbung. Salmonellen decarboxylieren Lysin zu Cadaverin, daher bildet sich um Kolonien aufgrund pH-Wert-Erhöhung ein purpurroter Hof. Thiosulfat und Eisen(III)-salz zeigen H2S-Bildung an, indem in den Kolonien schwarzes Eisensulfid ausfällt. Salmonella bilden auf XLD-Agar folglich rote Kolonien mit schwarzem Zentrum. BPLS-Agar dient der Abgrenzung von Lactosespaltern innerhalb der Enterobacteriaceae. Salmonellen wachsen als Nicht-Laktosespalter rot, während Literaturübersicht 20

lactosespaltende Bakterien gelbgrün wachsen. Brilliantgrün führt zur Hemmung der grampositiven Begleitflora. Ein positiver bakteriologischer Befund weist eindeutig das Vorhandensein des Erregers im Bestand nach. Die Bakterienkultur bietet außerdem die Möglichkeit, an den gewonnenen Isolaten weiterführende Untersuchungen, wie Serovarbestimmung, Resistenztestung, Phagentypisierung oder molekulare Untersuchungen, durchzuführen. Hoher Zeit- und Kostenaufwand gehören zu den Nachteilen der kulturellen Diagnostik (FARZAN et al. 2007). Das Ergebnis des bakteriologischen Nachweises wird stark von der durchgeführten Kulturmethode beeinflusst (BAGER et al. 1991). Die Spezifität der kulturellen Methode ist sehr hoch, hingegen ist die Sensitivität der kulturellen Isolierung 20 % niedriger als bei der serologischen Untersuchung. BAGGESEN et al. (1996) bezifferten die Sensitivität bei der Verwendung von Kotproben auf weniger als 50 %. Falschnegative Ergebnisse können besonders bei geringen Keimmengen zustande kommen (DAVIES et al. 2000). Erfolgt der Nachweis der Salmonellen aus Kotproben, so ist er nur im beschränkten Zeitfenster des Ausscheidens positiv (LO FO WONG et al. 2003). Die Haupterregerausscheidung findet bei Salmonella spp. in der ersten Woche post infectionem statt, sie fällt dann rapide ab und geht schließlich ab dem 52. Tag p.i. gegen Null (NIELSEN et al. 1995). Falschnegative Ergebnisse können bei Verwendung von Kot als Untersuchungsmaterial entstehen, wenn die intermittierende Ausscheidung zum Beprobungszeitpunkt sistiert (HURD et al. 1999; DAVIES et al. 2000).

Weiterführende Differenzierungsmethoden

Die Anzucht des Erregers ist die Vorraussetzung für eine Reihe von Folgeuntersuchungen wie Sero- und Phagentypisierung. Die Serotypisierung erfolgt über kommerziell erhältliche spezifische, omni- und polivalente O- und H-Antiseren mittels Objektträgerschnellagglutination. Im KAUFFMANN-WHITE-Schema werden die Serotypen geordnet und durch bestimmte O-Antigene zu Serogruppen zusammengefasst (ROLLE et al. 2007). Die Phagentypisierung nach ANDERSON ermöglicht eine weiterführende Feindifferenzierung von Salmonellastämmen und beruht auf der lytischen Wirkung der Phagenvermehrung Literaturübersicht 21

(ANDERSON et al. 1977). Anhand der entstehenden Lysotypiemuster werden die Isolate einem definitiven (DT) Phagentyp zugeordnet (WIESNER et al. 2000).

Sonstige Nachweismethoden

Neben der klassischen Erregeranzucht mit anschließender Sero- und Phagentypisierung, welche in der vorliegenden Studie angewandt wurden, kommen heutzutage auch modernere Verfahren, wie beispielsweise die PCR (Polymerase-Chain-Reaction) (ARNOLD 2002), und Verfahren zur molekularen Feintypisierung, wie Plasmidprofilbestimmung, Ribotyping oder PFGE (Pulsfeldgelelektrophorese), zum Einsatz (LIESEGANG et al. 2002; DORN et al. 2006). Diese sollen aber an dieser Stelle nicht näher erläutert werden, da sie nicht in den Rahmen dieser Arbeit fallen.

Indirekter Nachweis mittels ELISA

Indirekte Verfahren des Infektionsnachweises detektieren Antikörper (Ak) im Wirt und zeigen somit einen vergangenen Erregerkontakt an. In diesem Kapitel wird ausschließlich auf den ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) eingegangen, da dieser als Untersuchungsmethode eingesetzt wurde. Die Erstentwicklung eines ELISA für den Salmonella-Ak-Nachweis beim Schwein beschrieben NIELSEN et al. (NIELSEN et al. 1995), es handelte sich um einen LPS-mixed-ELISA mit aufgereinigtem LPS von S. Typhimurium and S. Choleraesuis (O:6,7) als Testantigen. Mittlerweile sind mehrere kommerzielle ELISAs auf dem Markt erhältlich. Die gängigen Systeme beruhen auf zwei prinzipiell verschiedenen Testantigenen. LPS-basierte ELISAs verwenden Lipopolysaccharide aus der Zellmembran als Testantigen. Hierzu gehören der in der vorliegenden Arbeit verwendete Salmotype® Pig ScreenTMELISA, außerdem der HerdCheck® Swine Salmonella™ ELISA und das Enterisol® Salmonella-Diagnostikum. Der Salmotype® Pig ScreenTM und der HerdCheck® Swine Salmonella™ basieren auf der Verwendung der O- Antigene 1, 4, 5, 6, 7 und 12 von S. Choleraesuis und S. Typhimurium (FARZAN et al. 2007). Ein weiterer kommerzieller ELISA Salmonella-Ab Svanovir® Salmonella Covalent Mix-ELISA nutzt Polysaccharide der gleichen O-Antigene ohne Lipidanteil (MEJIA et al. 2005). Bei dem Literaturübersicht 22

auf (Lipo-) Polysaccharid basierenden Testprinzip ist eine Feststellung des Infektionsstadiums (akut vs. chronisch) nicht möglich, da es ausschließlich gegen spezifische IgG-Ak gerichtet ist. Im Gegensatz zu diesen drei Tests basiert der Salmotype® Pig STM-WCE™ auf S. Typhimurium Vollzelllysat und detektiert IgA, IgM und IgG-Ak. In einer deutschen Studie differierten die Sensitivitäten je nach Testsystem, was auch auf die unterschiedlichen von den Herstellern empfohlenen Cutoffs zurückgeführt wurde. Die Studie ergab, dass sich die Zeitpunkte im Infektionsgeschehen für die maximale Sensitivität der einzelnen Tests unterscheiden (zwischen 39 und 67 Tagen p.i.). Aufgrund seiner Potenz, IgM-Ak zu detektieren, zeigte der auf Vollzelllysat basierte Test insgesamt die größte Sensitivität (SZABO et al. 2008). IgM ist das erste nach Salmonellainfektion auftretende Immunglobulin (BELOEIL et al. 2004), dadurch kann der vollzelllysatbasierte Salmotype® Pig STM-WCE™ die Infektion in einem früheren Infektionsstadium detektieren als die anderen ELISAs. Eine Bindung der Antikörper in der Testflüssigkeit an die auf der Mikrotiterplatte gebundenen Antigene ist Grundlage einer positiven Reaktion. In der Regel handelt es sich um eine limitierte Selektion an Antigenen aus dem Gesamtantigenpool aller Serovare. Eine Abstimmung auf die Antigene der regional prominentesten Serovare sichert eine gute Sensitivität des Testes (Anonymous 2000b). Mit dem SALMOTYPE® Pig Screen ELISA lassen sich Antikörper gegen über 90 % der in Deutschland am häufigsten auftretenden Salmonella-Serovare nachweisen (BLAHA 1999), diese Abstimmung des Tests auf europäische Serovare kann in anderen Ländern zu falschnegativen Tests aufgrund erniedrigter Sensitivität führen. So forderten FARZAN et al. (2007) beispielsweise eine Anpassung der oben genannten kommerziellen Tests an die Salmonella-Serovare Ontarios. Ein erster internationaler Ringversuch zur Bewertung von verschiedenen in-house und kommerziellen Salmonellen-ELISAs im Jahre 2001 zeigte eine zufriedenstellende Spezifität aber starke Differenzen in der Sensitivität (VAN DER HEIJDEN 2001). In einer spanischen Studie von MEJIA et al. (MEJIA et al. 2005) wurde der Salmotype® Pig ScreenTMELISA mit dem Salmonella-Ab Svanovir® Salmonella Covalent Mix-ELISA verglichen, welcher als Antigen Polysaccharid und nicht wie der Salmotype® Lipopolysaccharid verwendet. Diese beiden Tests zeigten bei manchen Betrieben, aus für die Autoren nicht erkennbaren Gründen, wenig Übereinstimmung (MEJIA et al. 2005). Die meisten Salmonellenkontrollprogramme basieren auf serologischen Tests (NOLLET et al. 2005). Dies bietet bezüglich Kosten- und Zeitaufwand erhebliche Vorteile und eignet sich daher Literaturübersicht 23

auch zum Screening großer Tierzahlen in der Routinediagnostik (FARZAN et al. 2007). Der ELISA ist im Gegensatz zur kulturellen Diagnostik nicht an die Phase des Ausscheidens gebunden, und ein positiver Befund ist als Indikator für eine vorangegangene Salmonellenexposition anzusehen (LO FO WONG et al. 2003). Infektionsversuche mit S. Cholerasuis zeigten, dass die Antikörpertiter 12 Wochen nach erfolgter Infektion immer noch erhöht waren (GRAY et al. 1996). Problematisch ist beim serologischen Nachweis die „diagnostische Lücke“, in der es zu falschnegativem Testergebnis kommt: Zwischen Infektion und Serokonversion liegt bei Salmonella spp. ein Zeitfenster von 6 bis 37 Tagen (NIELSEN et al. 1995). Auch können die Ergebnisse der Serologie in Abhängigkeit verschiedener Faktoren Schwankungen unterworfen sein. Beispielsweise kann der Hydratationszustand der Tiere einen entscheidenden Einfluss auf die OD%-Werte der Schweine haben: Denn je höher der Hämatokrit, desto konzentrierter liegen die Antikörper im Serum vor (DAVIES et al. 2003). Einige Studien wiesen auf eine deutlich niedrigere Sensitivität bei Verwendung von Fleischsaft als Probenmaterial im Vergleich zu Serum hin (RÖSLER 2007; WILHELM et al. 2007). Andere Autoren widerum stellten keine Unterschiede zwischen beiden Probentypen fest (STEINBACH et al. 2003; SZABO et al. 2008). Als Probenmaterial für den ELISA kann grundsätzlich entweder Serum oder Fleischsaft dienen. Die Testung im Rahmen der „Schweinesalmonellenverordnung“ (Anonymous) beruht meist auf unkomplizierter und kostengünstiger zu gewinnenden Fleischsaftproben. Der willkürlich festgelegte Cutoff beeinflusst entscheident die ermittelte Prävalenz (NOLLET et al. 2005). Laut Deutscher Schweinesalmonellenverordnung wird der Cutoff 40 OD% eingesetzt (Anonymous), welcher zunächst auch in Dänemark genutzt wurde, bevor dort eine Absenkung auf die (auch vom Testhersteller LDL) empfohlenen 20 OD% erfolgte (NIELSEN et al. 2001). Während der Testhersteller des Salmoporc Pigtype ELISAs 20 OD% angibt, empfiehlt der Fabrikant des HerdCheck® Swine Salmonella™ 10 OD%. Die von FARZAN et al. (2007) ermittelten Schnittpunkte der maximalen Sensitivität und Spezifität dieser Tests liegen nahe an diesen Werten (25 OD% bzw. 9 OD%).

Literaturübersicht 24

2.2.3 Epidemiologie

Salmonella-Infektionen spielen weltweit eine große Rolle als Ursache humaner Gastroenteritiden (WEGENER et al. 2003). Sie sind klassische Lebensmittelinfektionen, die Erkrankung wird meist durch den Verzehr tierischer Lebensmittel ausgelöst (THORNS 2000). Salmonellen sind im Magen-Darmtrakt von Warm- und Kaltblütern zu finden, beispielsweise bei Hühnern, Truthühnern, Enten, Kühen, Schweinen, Schafen, Möwen, Eseln, Hunden, Katzen, Schildkröten, Meerschweinchen, Schlangen und Echsen (YOSHIKAWA et al. 1980). Durch die geringe Wirtsspezifität entstehen unübersichtliche Infektketten zwischen Heim-, landwirtschaftlichen Nutz-, und Wildtierreservoiren, was die Bekämpfung von Salmonelleninfektionen erschwert (BLAHA 1993a). Latent infizierte lebensmittelliefernde Tiere können den Erreger beim Schlachtvorgang in die Lebensmittelkette eintragen (ALBAN et al. 2005). Die wichtigste Infektionsquelle für den Menschen sind Eier und Geflügelfleisch (THORNS 2000). An nächster Stelle steht der Verzehr von Schweinefleisch. Kontaminiertes Schweinefleisch wird für ungefähr 20 % der humanen Salmonellosen verantwortlich gemacht (STEINBACH et al. 1999). Außerdem wurden Salmonella-Infektionen nach dem Genuss von Salmonella-kontaminierter Schokolade (WERBER et al. 2005), Tomaten (Anonymous 2007b) oder Kräutertee (RKI 2003) beschrieben. Neben Einzelerkrankungen treten Salmonellainfektionen häufig als Gruppenerkrankung, beispielsweise in Kindertagesstätten oder Seniorenheimen, auf. So wurde im Jahre 2007 allein von 1.844 verschiedenen Salmonella- Ausbruchsgeschehen in Deutschland berichtet (RKI 2008).

Epidemiologische Einteilung der Salmonellen

Nach SELBITZ (1992) werden die Salmonellenserovare anhand ihrer Wirtsadaptation und Bedeutung als Krankheitserreger in folgende epidemiologischen Gruppen eingeteilt: Die Erreger der epidemiologischen Gruppe 1 (S. Typhi, S. Paratyphi) sind streng an den Menschen adaptiert und haben als Krankheitserreger für Tiere keine Bedeutung. Erreger der Gruppe 2 können hingegen trotz der Adaptation an bestimmte Tierarten [S. Choleasuis (Schwein), S. Dublin (Rind), S. Gallinarum (Huhn), S. Abortusequi (Pferd), S. Abortusovis (Schaf)] in seltenen Fällen auch beim Menschen schwere Erkrankungen verursachen, welche zu Literaturübersicht 25

besonderer Invasivität mit Septikämie neigen. Erreger der Gruppe 3 führen bei Tieren meist zu latenten, selten zu schweren Krankheitsverläufen und sind beim Menschen Haupterreger von gastroenteralen Zoonosen (SELBITZ 1992). Diese Gruppe umfasst neben S. Enteritidis und S. Typhimurium noch über 2000 weitere Serovare. Eine weitere Einteilung nach BLAHA (BLAHA 1993b) fasst Gruppe 1 und 2 zu den speziesadaptierten, epidemisch vorkommenden Salmonellen zusammen. Gruppe 3 gliedert BLAHA in die „sporadisch vorkommenden, nicht speziesadaptierten Serovare“, wie S. agona und S. infantis ,einerseits sowie andererseits in die „endemisch vorkommenden, nicht speziesadaptierten“ Serovare S. Typhimurium und S. Enteritidis, welche wegen des hohen Eintrages in die Lebensmittelkette eine große Relevanz für die Gefährdung der menschlichen Gesundheit haben .

2.2.3.1 Salmonella spp. beim Menschen

Generell unterscheidet man in Bezug auf die menschliche Salmonellose zwischen typhoidalen und nichttyphoidalen Salmonellen. Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhi und Serovar Parathyphi repräsentieren die typhoidalen Salmonellen und rufen Typhus bzw. Paratyphus hervor, dies sind schwere zyklische systemische Infektionen mit Darmbeteiligung. In Deutschland sind Typhus und Paratyphus weitgehend zurückgedrängt, während sie in Ländern mit schlechten Hygienebedingungen verbreitet sind (PARRY et al. 2008). Die typhoidalen Salmonellen stellen keine Zoonoseerreger dar und werden in den folgenden Ausführungen nicht mehr erläutert. Alle anderen humanpathogenen Salmonellenserovare gehören zu den nichttyphoidalen Salmonellen, welche Gastroenteritiden auslösen können (YOSHIKAWA et al. 1980). Im Jahr 2007 wurden in Deutschland insgesamt 55.400 humane Salmonellen-Enteritiden nach

Infektionsschutzgesetz übermittelt. Bei 71 % der Nennungen handelte es sich um das Serovar

S. Enteritidis und bei 23 % der Fälle um S. Typhimurium. In sehr weitem Abstand folgten S. Infantis (0,8 %) und S. Virchow (0,4 %), sowie S. Derby, S. Newport und S. Bovismorbificans mit 0,3 %. Alle anderen übermittelten Serovare machten zusammen lediglich 4 % aus (RKI 2008). In Deutschland gipfelte die Anzahl gemeldeter Fälle humaner Salmonellosen im Jahre 1992 mit 195.378 gemeldeten Fällen, seither ist ein rückläufiger Trend Literaturübersicht 26

zu beobachten. Im Verhältnis zu S. Enteritidis nahm der Anteil von S. Typhimurium in der Vergangenheit zu (RKI 2008).

Infektionsverlauf

Die Infektion des Menschen erfolgt oral in erster Linie über den Verzehr kontaminierter Nahrung (WEGENER et al. 2003), aber auch über direkten Kontakt zu infizierten Personen (LINTZ et al. 1976) und zu infizierten Heimtieren (GUARDABASSI et al. 2004). Die Infektionsdosis für den erwachsenen Menschen liegt bei 104–106 Keimen (RKI 2009), bei alten, jungen, kranken oder immungeschwächten Menschen (sog. YOPIs: young, old, pregnant, immunosuppressed) kann sie wesentlich niedriger liegen (D'AOUST 1991). Die Salmonellose manifestiert sich meist als akute Enteritis mit den Symptomen einer plötzlich einsetzender Diarrhoe, Cephalgie, abdominalem Schmerz, Unwohlsein und manchmal Vomitus. Häufig tritt leichtes Fieber auf, und die Symptome halten über einige Tage hinweg an (YOSHIKAWA et al. 1980). In seltenen Fällen kann die initiale Darmentzündung in einen septischen Verlauf mit zum Teil hohem Fieber übergehen (SELBITZ 1995).

Therapie

Normalerweise ist die Salmonellose selbstlimitierend. An Stelle einer antibiotischen Behandlung steht die Volumensubstitution zur Verhinderung einer Dehydratation im Vordergrund (D'AOUST 1991). Die Symptome dauern normalerweise nur Stunden oder Tage an (YOSHIKAWA et al. 1980). Bei schwerer Enteritis und vor allem bei systemischen Verläufen ist jedoch eine adäquate Antibiose unbedingt erforderlich (HOHMANN 2001). Früher galten bei einer Salmonellose Ampicillin, Chloramphenicol und Trimethoprim- Sulfamethoxazol als Mittel der Wahl (YOSHIKAWA et al. 1980). In den letzten 20 Jahren haben sich Resistenzen gegen diese drei Antibiotika bei Salmonellen stark verbreitet (D'AOUST 1991; THRELFALL et al. 1997), sodass nun Fluorchinolone und Cephalosporine der 3. Generation die wichtigsten Alternativen zur Therapie schwerer Salmonellosen darstellen (HOHMANN 2001). Da Fluorchinolone im Tierversuch bei Jungtieren Arthropathien auslösen (PATTERSON 1991), ist bei der Anwendung bei Kindern Vorsicht angebracht. Literaturübersicht 27

2.2.3.2 Salmonella spp. beim Schwein

Infektionen der Schweine mit nicht-speziesadaptierten Salmonella-Serovaren bleiben meist latent. Die Erreger können daher unerkannt während der Schlachtung in die Lebensmittelkette gelangen und eine bedeutende Infektionsquelle für den Menschen darstellen (BLAHA 1993a). In Deutschland (BFR 2008b) und den meisten europäischen Ländern (EFSA) ist S. Typhimurium der am weitesten verbreitete Serotyp bei Schweinen. S. Typhimurium ist zweithäufigstes identifiziertes Serovar bei humanen Salmonellosen sowohl in Deutschland (BFR 2008a) als auch EU-weit (EFSA 2010). Geschätzte 20 % der humanen Salmonellosen in Deutschland werden auf Schweinefleischverzehr zurückgeführt (STEINBACH et al. 1999). Wie zahlreiche Studien zeigen, sind Salmonellen in Schweinebeständen relativ weit verbreitet. Eine großangelegte Studie des BfR an 2.569 deutschen Mastschweinen ergab eine bakteriologische Prävalenz von 12,7 % in den Intestinallymphknoten und eine serologische Prävalenz von 32,3 % bei einem Cutoff von ≥ 20 OD% (BFR 2008b). Weitere deutsche Studien ergaben folgende Anteile kulturell Salmonella-positiver Tiere: In Darmlymphknoten entdeckten GAREIS et al. bei 3 % (GAREIS et al. 1996), GANTER et al. bei 3,5 % (GANTER et al. 1997) und FRIES et al. bei 18,3 % (FRIES et al. 2002) der Tiere Salmonella spp.. In den USA entdeckten BAHNSON et al. mittels Untersuchung von Mesenteriallymphknoten 13,3 % (BAHNSON et al. 2001) und CARLSON et al. bei der Untersuchung der Ileocaecallymphknoten 3,69 % (CARLSON et al. 2001) positive Tiere. In Australien detektierten MOO et al. bei 18 % (MOO et al. 1980) der Tiere den Erreger in den Jejunal- und Ileocaecallymphknoten. Die festgestellten serologischen Prävalenzen in Deutschland lagen in anderen Studien mit Mastschweinen z.B. bei 1,6 % (CZERNY et al. 2001) oder 7,3 % (VON ALTROCK et al. 2000) bei Verwendung des Cutoffs 40 OD%.

Infektionsverlauf

Obwohl bei Schweinen experimentell nasale Infektionen nachgewiesen wurden (FEDORKA- CRAY et al. 1995), geschieht in Natura der überwiegende Anteil von Salmonella-Infektionen fäkal-oral (ROLLE et al. 2007). Die latent infizierten Schweine tragen Salmonella asymptomatisch in Tonsillen, Darm und darmassoziiertem lymphatischem Gewebe (WOOD et Literaturübersicht 28

al. 1989; FEDORKA-CRAY 2000). Vom latenten Trägertum abzugrenzen ist die klinische Salmonellose des Schweines (WALDMANN et al. 2004). Sie äußert sich meist in akuten Enteritiden aber auch Pneumonien und kann schwere septikämische Verläufe annehmen (ROLLE et al. 2007). Klinische Verläufe beruhen vorwiegend auf dem schweineadaptierten Serovar S. Choleraesuis, welches in den USA und Kanada im Gegensatz zu Europa eine sehr bedeutende Rolle spielt (GRAY et al. 2001). Während Saugferkel und erwachsene Tiere meist subklinisch infiziert sind, kommt es bei Absetzern und Jungschweinen bis 60 kg öfter zu klinischen Verläufen (WALDMANN et al. 2004). Auch nicht schweineadaptierte Serovare können bei Schweinen zu Erkrankungen führen, besonders wenn das Immunsystem der Tiere durch weitere Faktoren, wie Futterumstellung oder Umstallung, überfordert wird. In einem Infektionsversuch (SCHERER et al. 2008) mit S. Typhimurium zeigten fünf von 16 Tieren klinische Durchfallsymptomatik.

Infektionsquellen im Bestand

Die Ausbreitung der Salmonellen innerhalb eines Schweinebestandes findet horizontal und vertikal statt. Von einem Bestand zum anderen erfolgt die Weiterverbreitung vermutlich in absteigender Bedeutung durch 1.) Einstallung latent infizierter Tiere, 2.) kontaminierte Futtermittel sowie 3.) belebte und unbelebte Vektoren, wie z.B. Schadnager, Hunde und Katzen oder kontaminierte Gegenstände (BLAHA 1993a). Symptomlos ausscheidende Carrier wurden schon in den 70er Jahren als bedeutende Infektionsquelle für Schweinebestände identifiziert (ISHIGURO et al. 1979). Die Studie von LO FO WONG et al. zeigten, dass Ferkelzukauf von mehr als drei Händlern mit erhöhter Seroprävalenz einherging (LO FO WONG et al. 2004). NOWAK et al. (2007) beschrieben die Zulieferung von einem einzelnen Salmonella-freien Ferkelzulieferbertrieb als protektiv. BAGER bezeichnete einerseits das Einstallen infizierter Carrierschweine als Hauptrisikofaktor für die Infektion mit S. Typhimurium und andererseits Futter als Hauptrisikofaktor für die Infektion mit Nicht-Typhimurium Serovaren (BAGER 1994). Die Salmonella-Kontamination von sowohl pelletiertem und als auch nicht-pelletiertem Futter sowie von Nass- und Trockenfutter wurde beschrieben (Anonymous 2000b). Die Beprobung von Fertigfuttermitteln für Schweine ergab in den europäischen Ländern 0-3,3 % positive Proben. Die Belastung der Literaturübersicht 29

Futtermittel mit S. Enteritidis und S. Typhimurium war jedoch generell niedrig (EFSA 2007). Erhitztes Futter war zum Zeitpunkt der Herstellung in der Mühle selten kontaminiert, während Transport und Lagerung des Futters sind Kontaminationen möglich (Anonymous 2000b; DAVIES et al. 2004). VAN DER WOLF et al. (1999) beschrieben automatisierte Flüssigfütterung als protektiven Faktor bezüglich Salmonella-Infektionen und Trogfütterung als risikoerhöhenden Faktor. In anderen Studien identifizierte man die Tränkeaufnahme aus dem Trog statt aus der Nippeltränke sowie die alleinige Trockenfutteraufnahme gegenüber der Aufnahme einer Mischung aus Trocken- und Nassfutter als Risikofaktoren (BAHNSON et al. 2006). Auch FABLET et al. (2003) nannten Trockenfutter als Risikofaktor und gaben als mögliche Erklärung die ausbleibende Säuerung des Magen-Darm-Inhalts im Gegensatz zu Nassfuttereinsatz an. Eine Studie von LO FO WONG et al. (2004) beschrieb pelletiertes Futter als Risikofaktor für hohe Salmonella-Seroprävalenz, als protektive Faktoren werden Molkefütterung und gute hygienische Verhältnisse, wie gute Händehygiene des Stallpersonals und komplett abgetrennte Buchten, genannt. Unvollständige Abtrennungen stellen einen Risikofaktor dar, weil der Nasenkontakt zwischen den Tieren die Erregerübertragung ermöglicht (LO FO WONG et al. 2004; OLIVEIRA et al. 2007). VAN DER WOLF et al. (2001) und BELOEIL et al. (2007) beschrieben einen Zusammenhang zwischen dem Einsatz antibiotischer Wachstumspromotoren bzw. einer antibiotischen Pro- und Metaphylaxe und einem erhöhtem Salmonella-Aufkommen. Beide Autoren unterstreichen durch ihre Funde die Notwendigkeit der Stallhygiene: Die Stallhochdruckreingung und Desinfektion in Kombination mit dem Rein-Raus-System waren protektive Faktoren (VAN DER WOLF et al. 2001), ebenso das Tragen von Schutzkleidung und die Isolation der Produktionsstätte (BELOEIL et al. 2007). Andererseits stellten laut BELOEIL et al. (2007) eine residuale Salmonellenbelastung im Maststall vor dem Aufstallen, das Auftreten des PRRS- Virus und eine große Gruppengröße Risikofaktoren für eine Salmonella-Serokonversion dar. Die Bedeutung einer sorgfältigen Reinigung und Desinfektion für die Salmonella-Bekämpfung wurde bereits von BERENDS et al. (1996) herausgestellt. Hohe Salmonellenraten in der Tierumgebung wurden trotz vorangegangener Reinigung und Desinfektion isoliert (FUNK et al. 2001). CLARK et al. betonten die Wichtigkeit des Alles-Rein-Alles-Raus-Prinzips in der Schweinemast, um Krankheiten zu verhindern (CLARK et al. 1991). Allerdings existiert auch Literaturübersicht 30

eine Studie von CZERNY et al. (CZERNY et al. 2001), die beim Rein-Raus-System einen höheren Anteil seropositiver Tiere als bei kontinuirlicher Einstallung ausmachte. Vollspaltenboden wurde in mehreren Studien als protektiver Faktor und Teilspaltenboden als Risikofaktor für Salmonella-Infektion beschrieben, da dort aufgrund des Kontakts zum Kot eine fäkal-orale Kontamination begünstigt wird (VONNAHME 2005). Von Nagetieren in Schweinebeständen werden nicht selten Salmonella isoliert (LE MOINE et al. 1987; LETELLIER et al. 1999), somit stellen diese ein Infektionsrisiko dar. MEIJA et al. (2006) identifizierten fehlende Nagerbekämpfung als Risikofaktor für erhöhte Salmonella- Ausscheidung bei Sauen. In einer englischen Studie zur Salmonellaprävalenz bei Ratten und Hausmäusen erwiesen sich >10 % der Tiere als positiv (HEALING 1991). In der Vergangenheit wurde eine Nagerbekämpfung auf Basis Salmonella-haltiger Rodentizide durchgeführt, möglicherweise hatte dies die Erhöhung der Salmonella-Prävalenz bei Nagern zu Folge (HEALING 1991). Auch der Eintrag von Salmonellen über Wildvögel, insbesondere durch die Verschmutzung des Futters mit dem salmonellenkontaminierten Kot der Wildvögel, stellt einen Risikofaktor dar (DANIELS et al. 2003). Die Haltung von zusätzlichen anderen Tierspezies neben Schweinen war in der Studie von MEIJA et al. (2006) verbunden mit einer erhöhten Salmonella-Exkretion durch die Mastschweine. Dieses Phänomen wurde auch von FUNK et al. (2001) beschrieben. MEIJA et al. (2006) stellte bei einer Herdengröße über 1600 Tiere eine höhere bakteriologische Salmonella-Prävalenz fest, während VAN DER WOLF et al. (2001) eine kleine Herdengröße (unter 800 Tiere) als Risikofaktor nannte. In einer Risikostudie von LEYK et al. (2002) konnten keine Unterschiede der epidemiologischen Daten von serologisch Salmonella-positiven und -negativen Beständen festgestellt werden. Eine Metastudie von FOSSE et al. (2009) ergab, dass bisher für Salmonella spp. deutlich mehr Risikofaktoren als für Campylobacter spp. und Y. enterocolitica veröffentlicht wurden.

Literaturübersicht 31

Bekämpfung

Das Ziel der Bekämpfung von Salmonella in Schweinemastbeständen ist aufgrund der ubiquitären Verbreitung nicht die vollständige Eradikation, sondern lediglich die Reduktion der Erregerübertragung (ERDMAN et al. 2005). Eine wichtige Grundlage für die Salmonellenreduzierung in Schweinebeständen stellt die Einhaltung allgemeiner Hygienemaßnahmen dar. Die Fütterung von grobvermahlenem und angesäuertem Futter scheint eine weitere wirksame Strategie gegen Salmonella spp. in den Beständen zu sein (VISSCHER 2006). Es besteht die Möglichkeit, die Salmonella-Belastung der Bestände mittels Impfung zu senken. Besonders Lebendimpstoffe sind empfehlenswert, da sie neben der humoralen auch die zelluläre Immunantwort induzieren (SELBITZ 1995).

Überwachungsprogramme

In Schweden, Norwegen und Finnland wurden schon vor über 50 Jahren Salmonellenüberwachungsprogramme (auf bakteriologischer Basis) eingeführt. Als Resultat wurden diese Länder durch die EU als „low prevalence countries“ eingestuft. Dänemark betreibt seit 1995 ein Salmonellenüberwachungsprogramm, welches auf serologischen Ergebnissen basiert (MOUSING et al. 1997). Dänemark gilt als „medium prevalence country“, während alle anderen Europäischen Länder unter die “high prevalence countries“ fallen (BLAHA 2007). Die EU-Gesetzgebung zu Zoonosen (RL 2003/99/EG und VO 2061/2003/EG) gaben der Forderung nach der Reduzierung des Eintrags und der Vermehrung von Salmonellen entlang der Lebensmittelkette eine neue Dimension. In Deutschland trat am 13. März 2007 die Schweine-Salmonellen-Verordnung „Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine“ in Kraft, mit ihr wurde nach einer mehrjährigen nationalen Erhebungsphase ein bundesweites Salmonellenüberwachungsprogramm eingeführt. Diese Verordnung betrifft Betriebe mit über 50 Mastplätzen, welche auf der Basis regelmäßiger serologischer Untersuchungen auf Salmonella-Antikörper in drei Kategorien eingeteilt werden. Die Betriebskategorisierung beruht auf dem Cutoff 40 OD %. Die Kategorie I umfasst Betriebe mit bis zu 20 % positiven Literaturübersicht 32

Befunden, Kategorie II erstreckt sich über den Bereich 20 % bis 40 % positiver Befunde und Kategorie III weist einen Anteil von mehr als 40 % positiven Tieren auf. Betriebe, welche in die Kategorie III fallen, müssen sich einer speziellen Beratung durch den betreuenden Tierarzt unterziehen. So ist „sicherzustellen, dass unverzüglich bakteriologische und epidemiologische Untersuchungen auf Salmonellen durchgeführt werden, um die Ursache des Eintrags zu ermitteln“, und Maßnahmen zur Verminderung der seropositiven Anteils der Tiere eingeleitet werden, „insbesondere eine Reinigung und Desinfektion der frei werdenden Buchten .. sowie eine Schadnagerbekämpfung durchgeführt werden“.

Literaturübersicht 33

2.3 Campylobacter spp.

2.3.1 Erregereigenschaften

Die Erreger der Gattung Campylobacter sind gramnegative, sporenlose, meist gebogene Stäbchen von 0,2-0,9 x 0,5-5 μm Größe. Durch uni- oder bipolare monotriche Begeißelung erlangen sie die charakteristische korkenzieherartige Beweglichkeit (URSING et al. 1994). Campylobacter spp. gelten als empfindliche und anspruchsvoll zu züchtende Bakterien, da sie hohe Anforderungen an die Wachstumsbedingungen stellen (PARK 2002). Wachstum erfolgt bei den thermophilen Campylobactern (C. coli, C. jejuni, C. lari und C. upsaliensis) ausschließlich im engen Temperaturbereich von 30-42 °C, wobei 42 °C als Optimaltemperatur für thermophile Campylobacter spp. angegeben wird (SKIRROW et al. 1980; PARK 2002). So können sich Campylobacter spp. in gekühlten Lebensmitteln nicht mehr vermehren (OOSTEROM et al. 1985). Campylobacter spp. benötigen zum Wachstum eine mikroaerophile

Atmosphäre zusammengesetzt aus 85 % N2, 5 % O2 und 10 % CO2 (BOLTON et al. 1983). Der Erreger ist in der Umwelt unter geeigneten Bedingungen einige Zeit überlebensfähig, aber kann sich nicht außerhalb des Wirtsorganismus vermehren (BORCH et al. 1996). Gegenüber Austrocknung und Hitze reagiert er sehr empfindlich (PARK 2002), die Überlebenschancen in der Umwelt sind daher bei kühlen Temperaturen in feuchter Umgebung erhöht. Ebenfalls äußerst sensibel reagiert der Keim gegenüber oxidativem Stress (HUMPHREY et al. 2007). Nach anhaltenden Mangelzuständen in der Kultur kann ein Übergang in ein „viable but nonculturable“ (VBNC)-Stadium erfolgen, erkennbar an kokkoiden unbeweglichen Zellen (ROLLINS et al. 1986). In diesem VBNC-Stadium ist der Keim zwar lebens- nicht aber vermehrungsfähig (THOLOZAN et al. 1999).

Geschichte

Die erstmalige mikroskopische Entdeckung des Erregers gelang dem österreichischen Kinderarzt ESCHERICH schon 1886 (KIST 1986). Anfang des 20. Jahrhunderts wurde das Bakterium aufgrund der gebogenen Form der Spezies Vibrio zugeordnet und zunächst vorwiegend als Aborterreger eingeordnet. Die Bedeutung als Gastroenteritiserreger kam erst zu Literaturübersicht 34

Tage, als JONES 1931 den Zusammenhang mit der Winterdysenterie des Kalbes aufzeigte und den Erreger als „Vibrio jejuni“ bezeichnete (JONES et al. 1931). 1944 beschrieb DOYLE „Vibrio coli“ und dessen Beziehung zur Dysenterie des Schweines (DOYLE 1944). Schließlich beschrieb LEVY die mögliche Kausalität von Vibrio für humane Gastoenteritiden (LEVY 1946). Einem Meilenstein glich die Differenzierung zweier verschiedener Typen Vibrios durch Elisabeth King (KING 1957). Sie unterschied den Aborterreger V. fetus von den „related vibrios“, welche sie durch Wachstum bei 42 °C und der Beteiligung an humanen Gastroenteritiden abgrenzte. Der Gattungsname Campylobacter wurde 1963 von SEBALD und VERON eingeführt und so die Abtrennung von den Vibrio offiziell vollzogen (SEBALD et al. 1963). Erst gegen Ende der 70er Jahre wurde die Bedeutung von Campylobacter spp. als Gastroenteriserreger des Menschen erkannt (MOORE et al. 2005). Diese Wandlung war begründet in Verbesserungen der Kultivierungsmethode und dem Einsatz neu entwickelter Selektivnährmedien (SKIRROW 1977).

Taxonomie

Die Gattung Campylobacter wurde 1963 aufgrund ihrer Mikroaerophilie, der Differenz im Guanin- und Cytosingehalt und der Unfähigkeit zur Kohlehydratfermentation aus der Gattung Vibrio abgetrennt. Die Gattung Campylobacter gehört zusammen mit der Gattung Arcobacter zur Familie der Campylobacteriaceae, welche zur Klasse Epsilonproteobacteria gehört. Das Genus Campylobacter umfasst eine Vielzahl von apathogenen und pathogenen Spezies (ON 2001) wie C. fetus (ssp. fetus, ssp. venerealis), C. jejuni (ssp. doylei, ssp. jejuni), C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C. hyointestinalis (ssp. hyointestinalis, ssp. lawsonii), C. sputorum, C. mucosalis, C. concisus, C. curvus, C. rectus, C. gracilis, C. showae, C. helveticus. C. lanienae und C. hominis. Die bedeutensten humanpathogenen Spezies sind die thermophilen Spezies C. jejuni, C. coli und C. lari (RKI 2005). Diese zeichnen sich durch ein enges Temperaturspektrum (30 - ca. 46 °C) aus, in welchem Wachstum möglich ist (HUMPHREY et al. 2007). Die Spezies C. lari wurde in 1983 begründet und wurde anhand ihrer Nalidixinsäureresistenz definiert (LIOR 1984).

Literaturübersicht 35

2.3.2 Nachweis von Campylobacter spp.

Kultureller Nachweis

Der kulturelle Campylobacter-Nachweis wurde erst in den 70er Jahren etabliert, da Campylobacter sehr anspruchsvoll in der Anzucht ist (MOORE et al. 2005). Er erfolgt entweder durch direktes Ausplattieren des Probenmaterials auf dem Nährboden oder durch eine vorgeschaltete Selektivanreicherung in einem Flüssigmedium (JACOBS-REITSMA 2008). Dem direkten Ausplattieren kann die Filtrationsmethode vorgeschaltet werden (BUTZLER et al. 1973). Hierbei ermöglicht die geringe Größe des Erregers die Passage durch einen Membranfilter, beispielsweise aus Cellulose-Acetat (GOOSSENS et al. 1986). In den meisten Fällen ist die Voranreicherung der Proben in Anreicherungsbouillons angebracht, um die Wiederfindungsrate bei vorgeschädigten Erregern oder geringer Keimzahl zu verbessern (FITZGERALD et al. 2008). Es stehen verschiedene selektive Anreicherungsmedien (Preston- Boullion, Bolton-Anreicherung, usw.) und Nähragars (Karmali-Agar, Thioglyklolat-Agar, Skirrow-Agar) zur Verfügung. Die Spezial-Nährböden zur Campylobacter-Isolierung beinhalten häufig selektierende Antibiotika sowie Zusätze von Blut oder Kohle, um die Wirkung toxischer Sauerstoffverbindungen auf die empfindlichen Campylobacter spp. abzuschwächen. Im Allgemeinen ergibt sich durch Kombination mehrerer Anzuchtmedien eine größere Isolationsquote als bei Verwendung eines einzigen Mediums (ENDTZ et al. 1991b). Beim kulturellen Nachweis thermophiler Campylobacter spp. sind die besonderen Erregereigenschaften Mikroaerophilie und Thermophilie zu berücksichtigten. Zur Schaffung dieser Atmosphäre werden Anaerobierbrutschränke oder Anaerobiertöpfe verwendet (BOLTON et al. 1983). Die Bebrütung thermophiler Campylobacter spp. bei 42 °C bringt den Vorteil einer gewissen Selektion gegenüber meso- und psychrophilen Keimen mit sich. Auf den meisten Nährböden wachsen Campylobacter als flache graue unregelmäßige Kolonien. Sie zeigen keine Hämolyse auf Blutagar. Um das typische Schwärmen beobachten zu können, ist der Einsatz frischer, nicht ausgetrockneter Nährböden nötig (FITZGERALD et al. 2008). Zu Verwechslungen führen könnte die ähnliche Koloniemorphologie von Arcobacter (VANDAMME et al. 1992). Von präsumptiven Campylobacter-Kolonien wird eine gram- Literaturübersicht 36

Färbung angefertigt und außerdem die drehende Beweglichkeit der Bakterien im hängenden Tropfen beurteilt.

Weiterführende Differenzierungsmethoden

Zur weiterführenden Diagnostik zwecks Speziesdifferenzierung isolierter Campylobacter spp. können phänotypische Methoden, wie die biochemische Feindifferenzierung, Serotypisierung, oder Resistenztestung, eingesetzt werden. Die biochemische Differenzierung der einzelnen Campylobacter-Spezies voneinander ist schwierig, da eine vergleichsweise geringe biochemische Aktivität vorliegt und kaum Variationen im Verhalten auftreten (FITZGERALD et al. 2008). Die positive Chromoxidasereaktion ist typisch für alle Vertreter der Gattung, während die Katalasereaktion je nach Spezies unterschiedlich ausfällt. C. coli, C. jejuni und C. lari reagieren Katalase-positiv, während beispielsweise C. upsaliensis Katalase-negativ reagiert. Mittels Hippurat- Hydrolysetest lassen sich C. coli von C. jejuni unterscheiden, da hier C. jejuni als einzige Campylobacter-Spezies positiv reagiert (VANDAMME et al. 1992; ON 2001). Doch kann es dabei durch abweichende Reaktionen zu einer Überbewertung des C. jejuni-Anteils kommen (STEINHAUSEROVA et al. 2001), sodass ergänzend eine PCR zur Detektion des Hippurikasegens angewendet werden sollte. Die früher einmal mögliche Speziesdifferenzierung mithilfe der Bestimmung der Antibiotikaresistenz wird mittlerweile durch erworbene Resitenzen erschwert. So eignet sich die Nalidixinsäureresistenz nicht mehr zur Abgrenzung von C. lari gegenüber C. coli und C. jejuni, da sich auch bei diesen Spezies Nalidixinsäureresistenzen entwickelt haben (ENDTZ et al. 1991a). Es sind zwei verschiedene Serotypisierungsmethoden beschrieben worden: das Penner-System nutzt die Typisierung von hitzestabilen Oberflächenantigenen (HS-System) mit Hilfe passiver Hämagglutination (PENNER et al. 1980), das Lior-System basiert auf dem Nachweis wenig charakterisierter, hitzelabiler Oberflächenantigene (HL-System) mittels Objektträgeragglutination (LIOR et al. 1982). Da aber viele Stämme mittels Serotypisierung nicht näher zu differenzieren sind, ist die ergänzende Differenzierung mit einer genotypischen Methode angebracht (WASSENAAR et al. 2000). Literaturübersicht 37

Sonstige Nachweismethoden

Campylobacter spp. sind langsamwachsende und besonders anspruchsvolle Bakterien. Daher hat neben dem klassischen kulturellen Nachweis auch die Polymerase Chain Reaction (PCR) als molekularbiologische Methode Bedeutung (GONZALEZ et al. 1997; MARSHALL et al. 1999). Je nach verwendetem Primer kann so die Zugehörigkeit zur Gattung Campylobacter, zu den einzelnen Spezies, wie C. coli oder C. jejuni, oder die Stammdifferenzierung innerhalb einer Spezies mittels Amplifizierung bestimmter Genabschnitte identifiziert werden (GAULL 2003). Eine moderne Multiplex-Realtime-PCR bietet den Vorteil, dass Mischinfektionen mit C. coli und C. jejuni erkannt werden. Eine neuetablierte Kolonieblothybridisierung dient dem Nachweis von Kolonien verschiedener Spezies auf einer Agarplatte und verfeinert damit die kulturelle Diagnostik (HÄNEL et al. 2008). In der Humanmedizin spielt seit einigen Jahren der Antigennachweis im Kot mittels ELISA eine Rolle (HÄNEL et al. 2008). An genotypischen Methoden sind außerdem Ribotyping, Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), Flagellin-Typing (fla typing) (WASSENAAR et al. 2000) und Multilocus-Sequenz-Typing (MLST) (DINGLE et al. 2005) im Einsatz.

Serologischer Nachweis

Für die Detektion von Campylobacter-Antikörpern beim Schwein wurden bisher einzelne serologische Untersuchungen beschrieben. Beispielsweise beruht die Studie von VON ALTROCK et al. (VON ALTROCK et al. 2006) auf der Immunoblot-Methode. Der von VON ALTROCK et al. eingesetzte Immunoblot war IgG-isotypspezifisch und beruhte auf dem Einsatz eines Vollzell-Mischantigens dreier Stämme C. coli und C. jejuni. KRAMER et al. (2001) stellten anlässlich eines Kongresses erste Ergebnisse der Entwicklung eines LPS (Lipopolysaccharid)-Mix-ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen C. coli und C. jejuni beim Schwein vor. Sie berichteten von einer guten Sensitivität und Spezifität dieses ELISAs. KLEY (2003) entwickelte in ihrem Dissertationsvorhaben einen ELISA zum Nachweis von C. coli und C. jejuni. Dieser war in der Lage, Infektionen der Schweine mit Untersuchung von Serum und Fleischsaft zu detektieren. Die Autorin berichtet allerdings von Schwierigkeiten bei der Beurteilung der Probenergebnisse, da aufgrund fehlender Negativ-Seren ein Cutoff nicht Literaturübersicht 38

festzulegen war. Für die Humanmedizin ist ein kommerzieller ELISA (recomWell®Campylobacter) erhältlich, welcher sowohl IgA als auch IgG-Ak gegen C. coli und C. jejuni detektiert und auf rekombinanten, Campylobacter-spezifischen Antigenen basiert. Hier zeigte eine Testphase, dass zur Beurteilung des Campylobacter-Immunstatus immer die Ergebnisse des IgG- und IgA-Nachweises gemeinsam und zusätzlich klinische Hinweise hinzugezogen werden müssen (HÄNEL et al. 2008).

2.3.3 Epidemiologie

Campylobacter spp. sind die häufigste gemeldete Ursache akuter Gastroenteritis in den Industrieländern (MOORE et al. 2005). Dennoch bestehen bezüglich der Epidemiologie viele Unklarheiten und die Übertragungswege sind weit weniger bekannt als beispielsweise bei Salmonella spp. (EKDAHL et al. 2005). Die thermophilen Campylobacter spp., in erster Linie C. coli und C. jejuni und seltener C. lari, sind Auslöser der Campylobacter-Enteritis beim Menschen. Campylobacter spp. sind weitverbreitet und kolonisieren als enterale Kommensalen im Gastrointestinaltrakt von landwirtschaftlichen Nutztieren (Geflügel (JORGENSEN et al. 2002), Schweine (GÖRGEN et al. 1983), Schafe und Rinder (STANLEY et al. 2003)) und Haustieren (Hunde und Katzen (HALD et al. 1997)). Diese stellen Reservoire von Campylobacter spp. dar und sind in der Regel asymptomatische Träger (HUMPHREY et al. 2007). Allgemein ist Campylobacter streng an seine enterale ökologische Nische adaptiert und kann nicht in der Umwelt replizieren. Jedoch kann der Keim in Biofilmen und Wasser einige Zeit in der VBNC-Form (viable but not culturable) überleben (ALTEKRUSE et al. 2003). In diesem Stadium überlebt das Bakterium zwar, ist jedoch nicht kultivierbar. Die genauen prozentualen Anteile der einzelnen auslösenden Ursachen humaner Campylobacteriosen sind unklar (JACOBS-REITSMA 2008). Die größte ätiologische Bedeutung wird dem Konsum nicht ausreichend erhitzten Geflügelfleisches beigemessen (THORNS 2000; BFR 2009). In Deutschland sind die Campylobacter-Funde in Geflügelfleisch seit Jahren unverändert hoch, so waren im Jahr 2005 31,1 % und im Jahr 2007 32,67 % der Geflügelfleischproben positiv (RKI 2006; BFR 2009). Nachdem in Belgien aufgrund eines Dioxinskandals Geflügelfleischprodukte vom Markt genommen wurden, sank die Infektionsrate der humanen Campylobacteriose um geschätzte 40 % (VELLINGA et al. Literaturübersicht 39

2002). Auch in Deutschland lässt sich eine Parallele zwischen dem Vorkommen von Campylobacter in Geflügelfleisch und humanen Campylobacteriosen aufzeigen (BFR 2008a). Als weitere Ursachen sind der Konsum von Rohmilch (FAHEY et al. 1995), aber auch von rohem, beziehungsweise nicht durchgegartem, Fleisch vom Schwein, Rind und Schaf beschrieben. Generell ist die Kontaminationsrate von rohem Schweinefleisch mit unter 1,5% (BFR 2009) sehr niedrig, weshalb der Genuss für den Verbraucher ein eher geringeres Risiko darstellt (HÄNEL et al. 2008). Auch der enge Kontakt zu infizierten Haustieren kann eine mögliche Infektionsquelle darstellen, da Hunde und Katzen häufig Träger des Erregers sind (MORENO et al. 1993). In nordischen Ländern führt der Genuss von unbehandeltem kontaminiertem Oberflächengewässer regelmäßig zu humanen Infektionsausbrüchen (MOORE et al. 2005). Auch das Schwimmen in kontaminierten Seen ist als Risikofaktor für humane Campylobacter-Enteritis bekannt (SCHONBERG-NORIO et al. 2004).

2.3.3.1 Campylobacter spp. beim Menschen

Seit dem Jahr 2005 übersteigt die Zahl der humanen Campylobacteriosen die der Salmonellosen. Campylobacter-Gastroenteritiden waren 2007 in Deutschland mit 66.107 Erkrankungen gemäß Meldung nach Infektionsschutzgesetz die häufigsten bakteriellen Durchfallerkrankungen. Auch EU-weit sind Campylobacter-Infektionen die meistberichtetste Gastroenteritisursache (EFSA 2010). Laut TAM et al. (2003) sind 90 % aller humanen Campylobacteriosen durch die Spezies C. jejuni bedingt. Auch in Deutschland wird bei erkrankten Menschen hauptsächlich die Spezies C. jejuni (71,1 %) isoliert, gefolgt von C. coli (6,3%) und C. lari (1%). Bei 20,8 % der humanen Isolate erfolgte keine Weiterdifferenzierung zwischen C. coli und C. jejuni (RKI 2008). Auffällig ist eine ausgeprägte Saisonalität des Auftretens humaner Campylobacter-Enteritis, sie tritt in Europa vermehrt in der warmen Jahreszeit auf (NYLEN et al. 2002).

Literaturübersicht 40

Infektionsverlauf

Viele Campylobacter-Infektionen verlaufen asymptomatisch, bei Manifestation der Infektion tritt gewöhnlich eine akute Enteritis auf. Die häufigsten Symptome sind (hämorrhagische) Diarrhoe, Abdominalkrämpfe, Fieber und Müdigkeit (WITTENBRINK 2002). Bemerkenswert ist die sehr geringe Infektionsdosis (ca. 800 Keime) im Vergleich zu anderen lebensmittelassoziierten Krankheitserregern (BLACK et al. 1988). In der Regel ist die Krankheit bei immunkompetenten Personen selbstlimitierend und die Symptome verschwinden nach ca. einer Woche. Als seltene postinfektiöse Komplikation tritt das Guillain-Barré-Syndrom (GBS) auf, welches eine immunvermittelte Polyradikuloneuropathie des peripheren Nervensystems darstellt und (NACHAMKIN 2002). Ätiologisch bedeutsam sind für das GBS außer Campylobacter auch andere Bakterien bzw. Viren (Anonymous 1998).

Therapie

Eine symptomatische Therapie mit Volumen- und Elektrolytsubstitution ist bei enteralen Verläufen meist ausreichend (RKI 2005). Bei hohem Fieber, septikämischer Streuung und schweren klinischen Verläufen ist eine antibiotische Therapie mit Erythromycin oder Fluorchinolonen angezeigt. Der Einsatz von ß-Lactamen empfiehlt sich aufgrund weit verbreiteter Resistenzen weniger (ENGBERG et al. 2001). Gegen Fluorchinolone wird eine stärkere Resistenzentwicklung als gegen Erythromycin beobachtet, weshalb bevorzugt Erythromycin zur Therapie gewählt werden sollte (ALTEKRUSE et al. 2003; VLIEGHE et al. 2008).

2.3.3.2 Campylobacter spp. beim Schwein

Schweine stellen ein bedeutendes Campylobacter-Reservoir dar (YOUNG et al. 2000), da sie den Erreger sehr oft in der Faezes ausscheiden (WEIJTENS et al. 1999). Verschiedene Autoren beschreiben C. coli beim Schwein als Kommensalen, da die Prävalenz bei Schweinen sehr hoch ist und keinerlei Erkrankungen auslöst (GÖRGEN et al. 1983; WEBER 1985; GAULL 2003). Schweine sind von Geburt an hochempfänglich gegenüber der Literaturübersicht 41

Campylobacter-Kolonisation (YOUNG et al. 2000); die Erregerübertragung geschieht in der Regel von der Muttersau auf die Ferkel (WEIJTENS et al. 1997). Mit zunehmendem Alter sinkt die Ausscheidungsrate im Kot (WEIJTENS et al. 1993; YOUNG et al. 2000). In einer Untersuchung in den Niederlanden waren über 85 % der Schlachtschweine positiv (WEIJTENS et al. 1993), deutsche (GÖRGEN et al. 1983), französische (FOSSE et al. 2008a), kanadische (MAFU et al. 1989) und schweizer (SCHUPPERS et al. 2005) Studien ergaben Prävalenzen im Kot von nahezu 100 %. Eine Metastudie von FOSSE et al. (2009) beschreibt 69,7 % Prävalenz in Faezes oder Rektuminhalt als Median aus elf verschiedenen Studien. Generell gibt es zum Vorkommen von Campylobacter im Lymphknoten weniger wissenschaftliche Studien als zum Vorkommen im Kot, aber die vorliegenden Studien lassen niedrigere Raten in den Lymphknoten als im Kot erahnen. So fand man beispielsweise in den Jejunallymphknoten bei deutschen Schweinen eine Prävalenz von 45,8 % (FRIES et al. 2002) bzw. 45,6 % (LEUE 2005) und bei norwegischen Schweinen von 29,2 % (NESBAKKEN et al. 2003). In frischen Schweinefleischproben lagen die Isolationsraten 2006 in Deutschland bei 0,7 %, in anderen europäischen Ländern waren sie auf vergleichbar niedrigem Niveau (EFSA 2007). Im Allgemeinen herrscht die Meinung vor, dass Geflügel vornehmlich C. jejuni und Schweine eher C. coli beherbergen (MANSER et al. 1985). Eine Wirtspreferenz von C. coli liegt bezüglich des Schweines vor (LEBLANC MARIDOR et al. 2008). Laut EFSA wird bei Schweinen fast immer C. coli isoliert und nur in Ausnahmefällen C. jejuni (2007), was auch durch das Speziesverhältnis in zahlreichen Studien, beispielsweise von VARELA et al. (2007) mit 0,2 % C. jejuni vs. 99,2 % C. coli oder von SCHUPPERS et al. (2005) mit 1,2 % C. jejuni vs. 96,3 % C. coli bestätigt wird. Allerdings zeigten im Gegensatz dazu Studien von YOUNG et al. (2000) und FINLAY et al. (1986) erstaunlich hohe C. jejuni-Prävalenzen (bis 82 %) beim Schwein. Coinfektionen mit beiden Spezies kommen vor, C. jejuni beherbergende Schweine tragen häufig auch C. coli (BOES et al. 2005). WEITJENS et al. (WEIJTENS et al. 1999) stellte bei wiederholter Beprobung starke Schwankungen in der Keimauscheidung im Kot fest. Die Ursachen für die intermittierende Erregerausscheidung könnten beispielsweise in einer mukusassoziierten Akkumulation von Campylobacter in der Tiefe der Darmkrypten oder einer inhomogenen Kolonisation verschiedener Darmabschnitte begründet sein (LEE et al. 1986). Literaturübersicht 42

Risikofaktoren

Insgesamt liegen bisher vergleichsweise wenig Studien zu Risikofaktoren bezüglich Campylobacter-Prävalenzen in Schweinemastbetrieben vor (FOSSE et al. 2009). WEIJTENS et al. (2000) zeigten den Einfluss der Umweltkontamination mit Campylobacter als Risikofaktor für eine Reinfektion des Bestandes auf. Nach einer Grundreinigung und -desinfektion der Stallgebäude wurden SPF-Schweine wiedereingestallt, diese Maßnahme der Dekontamination führte 20 Monate lang zur Senkung der Campylobacter-Infektionen. Die Campylobacter- Pävalenz betrug in dem grundgereinigten Betrieb nur 22 %, während sie in einem Kontrollbetrieb bei 98 % lag (WEIJTENS et al. 2000). Somit scheint Reinigung und Desinfektion des Stalles den Keimdruck zu senken und die Campylobacter-Prävalenzen deutlich zu beeinflussen. Auch ALTER et al. vermuten, dass unzureichend gereinigte Abteile eine kontinuierliche Infektionsquelle mit Campylobacter spp. darstellen könnten, da die Campylobacter-Funde in der Umgebung nach Reinigung und Desinfektion der Buchten zwar deutlich weniger (1,6 % statt 9,2 %), doch immer noch Erreger vorhanden waren (ALTER et al. 2005b). In Umgebungsproben werden regelmäßig Campylobacter spp. isoliert, obwohl das Bakterium eine relativ geringe Tenazität gegenüber Umwelteinflüssen besitzt. VON ALTROCK et al. (2006) isolierten Campylobacter spp. von Tränken, Trögen, Stiefeln und Wasserhähnen der untersuchten Schweinebestände. KASIMIR (2005) gelang die Isolation des Erregers auf Fliegen, einer Nippeltränke und einem Wassertrog. ALTER et al. (2005b) fanden 0,7 % positive Umgebungsproben, unter anderem in einem Trog, einer Ratte und zwei Fliegen. GAULL (2003) fand in 4,2 % der Umgebungsproben Campylobacter vor. Auch WEITJENS et al. vermuteten den möglichen Eintrag in die Bestände über Schadnager, Wildvögel bzw. den Landwirt selbst (WEIJTENS et al. 1997). Eine Unterdrucklüftung des Stallgebäudes scheint einen protektiven Effekt zu erzeugen (WEIJTENS et al. 2000). WEHEBRINK (2007) führte als Risikofaktoren für eine höhere Campylobacter-Prävalenz eine kleine Bestandsgröße (unter 1.000 Tieren) und anthelminthische Behandlung auf, während in ihrer Studie die Aufstallung in getrennten Ställen und antibiotische Behandlung zu Anfang der Mastperiode protektive Faktoren darstellen. FOSSE et al. (2009) vermuteten, dass kleinere Betriebe möglicherweise generell ein weniger gutes Hygienemanagement praktizierten und dadurch die Campylobacter-Prävalenzen höher als in größeren Betrieben lagen. Obwohl es im Literaturübersicht 43

Geflügelbereich in zahlreichen Studien gelang, kontaminiertes Wasser und Futter als Risikofaktor zu identifizierten (PEARSON et al. 1993), wurde jener Zusammenhang im Schweinebereich noch nicht nachgewiesen (FOSSE et al. 2009). In einer Studie von ALTER et al. (ALTER et al. 2005a) waren Futter- und Tränkewasserproben erregerfrei und scheinen auch laut WEIJTJENS et al. (2000) und JACOBS-REIMTSMA et al. (1995) keine Rolle für den Erregereintrag zu spielen. WEITJENS et al. (1993) ermittelten keinen Unterschied zwischen Trocken- und Flüssigfütterung, jedoch wurde vom gleichen Autor eine protektive Wirkung bei manueller Fütterung der Mastschweine ausgemacht (2000). WEHEBRINK (2007) entdeckte signifikant höhere bakteriologische Campylobacter-Prävalenzen, wenn Futter zugekauft wurde. WELLS et al. (2010) beschreiben die Reduzierung des Vorkommens enteraler Campylobacter spp. durch Zusatz von Kupfersulfat und Carbadox zum Futter, zweier in den USA eingesetzter Wachstumspromotoren. Bezüglich der Stallumgebung beschrieb WEHEBRINK Teilspaltenböden als Risikofaktoren (2007), welche im Vergleich zu Vollspaltenböden mit höheren Campylobacter-Funden korreliert waren.

Bekämpfung

WEIJTENS et al. (2000) halten die Campylobacter-Bekämpfung in Schweinbeständen für praktikabel. Da sich die Saugferkel sehr früh über den Kontakt zur Muttersau infizieren (WEIJTENS et al. 1993), müsste die Bekämpfung unter Miteinbeziehung der Muttersauen erfolgen. Die frühe Trennung der Ferkel von der Sau und nachfolgend mutterlose Aufzucht wurde hierfür in Betracht gezogen. NESBAKKEN et al. (2007) nahmen hingegen aufgrund der hohen Prävalenz von bis zu 100 % an, dass die Schaffung Campylobacter-freier Betriebe nicht machbar ist.

Literaturübersicht 44

2.4 Y. enterocolitica

2.4.1 Erregereigenschaften

Bei Y. enterocolitica handelt es sich um ein gramnegatives, pleomorphes, peritrich begeißeltes und fakultativ anaerobes Stäbchenbakterium der Größe 0,5 x 0,8 x 1,3 μm (BERCOVIER et al. 1984). Das Bakterium besitzt keine Kapsel und bildet keine Sporen. Ein wichtiges Merkmal der Yersinia-Arten (ausgenommen Y. pestis) ist ihre Beweglichkeit bei 22-28 °C, jedoch nicht bei 35-37 °C (ALEKSIC et al. 1990). Y. enterocolitica ist ein psychrotrophes Bakterium und kann in Lebensmitteln selbst bei Kühlschranktemperaturen überleben und wachsen, dies nutzt man bei der sogenannten „Kälteanreicherung“. Die optimale Bebrütungstemperatur liegt bei 30- 37 °C, generell ist das Wachstum aber im weiten Temperaturspektrum von 0-44 °C möglich (HANNA et al. 1977). Yersinien reagieren Oxidase-negativ, Katalase-positiv und zeigen Nitratreduktion (ALEKSIC et al. 1990). Humanpathogen sind Y. pestis, der Erreger der schwarzen Pest, Y. pseudotuberculosis, der Erreger der Pseudotuberkulose und bestimmte Serovare von Y. enterocolitica, dem Erreger der humanen Yersiniose (ROLLE et al.). Da nicht alle Vertreter von Y. enterocolitica humanpathogen sind, ist die diagnostische Abgrenzung der zahlreichen apathogenen Umweltisolate in diesem Zusammenhang wichtig (NEUBAUER et al. 2001b).

Geschichte und Taxonomie

Die Erstbeschreibung erfolgte durch MC IVER und PIKE (MC IVER et al. 1934) nach Isolation aus einem Gesichtsabszess einer Farmbewohnerin. Sie tauften den Erreger damals Flavobacterium pseudomallei. 1939 isolierten SCHLEIFSTEIN und COLEMAN den gleichen Erreger aus dem Darm und nannten ihn daher in Bacterium enterocoliticum um. Zu Ehren von YERSIN, dem Entdecker der Pesterregers, gründete VAN LOGHEM 1944 das Genus Yersinia, in welches der Erreger im Jahre 1964 schließlich unter seinem neuen Namen Yersinia enterocolitica überführt wurde (FREDRIKSEN 1964). Das Genus Yersinia gehört zur Familie der Enterobacteriaceae. Das Genus Yersinia beinhaltet heutzutage 14 Spezies: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Literaturübersicht 45

Y. bercovieri, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. aldovae, die fischpathogene Art Y. ruckeri (BOTTONE 1997) und Y. aleksiciae (SPRAGUE et al. 2005). Die Spezies Y. enterocolitica wurde aufgrund von Differenzen im 16-S-rRNA-Gen in die beiden Subspezies Y. enterocolitica ssp. Enterocolitica (amerikanische Isolate) und ssp. Palearctica (europäische Isolate) geteilt (NEUBAUER et al. 2000). WAUTERS et al. unterteilten Y. enterocolitica anhand verschiedener Substratverwertungsmuster bei biochemischen Reaktionen in 6 Biovaren (1A, 1B, 2-5). Biovar 1A besteht überwiegend aus apathogenen Stämmen; Biovar 1B umfasst die pathogenen amerikanischen Stämme und die Biovaren 2, 3, 4 und 5 beinhalten die pathogenen europäischen Stämme (WAUTERS et al. 1987). Jedoch ließen Isolierungen des Biovars 1A im Zusammenhang mit humanen Gastroenteritiden Zweifel an der bisher angenommenen Apathogenität dieses Biovars aufkommen (BISSETT et al. 1990). Anhand eines Antigenschemas werden die Biovare weiter in Serovare unterteilt. Das angewandte Antigenschema beinhaltet auch apathogene Yersinien (ROLLE et al. 2007). Diagnostische Bedeutung haben die O-Antigene (Oberflächenantigene) und die H-Antigene (Geißelantigene). Die O-Antigene werden mit Zahlen, die H-Antigene mit Buchstaben bezeichnet (SCHIEMANN 1989). O-Antigene sind nicht speziesspezifisch, so kommt zum Beispiel O:3 bei Y. enterocolitica, Y. intermedia und anderen Yersinia-Spezies vor. H-Antigene jedoch können zur direkten Identifizierung der Spezies herangezogen werden. Es sind ca. 28 O- Antigene und bisher 18 H-Antigene für Y. enterocolitica entdeckt worden (ALEKSIC et al. 1990). Aussagen über die Pathogenität können anhand der Kombination der H-Antigene getroffen werden. Die pathogenen Serotypen O:3, O:9 und O:5,27 sind beispielsweise stets mit den H-Antigenen a,b; abc, abcv;a,c; c oder b,c kombiniert (ALEKSIC et al. 1990). Die virulenzplasmid-codierten Yop’s sind gemeinsame Virulenzfaktoren aller pathogenen Yersinia- Spezies (Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis). Als Effektorproteine des Typ III- Sekretionssystems induzieren sie erst nach erfolgter Adhäsion, Kolonisierung und Infektion eine spezifische Antikörperantwort und sind somit hochspezifisch für eine Yersiniose (CORNELIS et al. 1998).

Literaturübersicht 46

2.4.2 Nachweis von Y. enterocolitica

Kultureller Nachweis

Die kulturelle Anzucht ist die Grundlage für die weitere Differenzierung der Yersina-Stämme (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2003). Der direkte Ausstrich von Untersuchungsmaterial auf feste Nährböden ist im Falle von asymptomatischen Yersinia-Infektionen selten erfolgreich, weshalb zeitaufwändige Voranreicherungsschritte in Flüssigmedien nötig sind (DE BOER 1995). Grundsätzlich unterscheidet man zwischen der Kälteanreicherung und der Selektivanreicherung mittels verschiedenster Anzuchtmedien. Die Kälteanreicherung bei 4°C ist eine Methode, welche sich die Psychrophilie von Y. enterocolitica zu Nutze macht und laut LAUKKANEN et al. (LAUKKANEN et al. 2010) eine höhere Sensitivität als andere kulturelle Anreicherungsmethoden aufweist. Diese Methode wurde in verschiedenen Studien bei der Untersuchung von klinischen Materialien, Lebensmittel- und Umweltproben unter Verwendung von PBS (Phospat buffered saline) als Anzuchtbouillon eingesetzt (DE BOER et al. 1991; LETELLIER 1999). Die lange Inkubationszeit von 7 bis 21 Tagen ist ein Nachteil der Kälteanreicherung, außerdem werden apathogene Yersinien und andere psychrophile Keime nicht unterdrückt und können die Probe überwuchern (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2003). Mittels KOH-Behandlung besteht die Möglichkeit die Begleitflora während der Kälteanreicherung zu unterdrücken (SCHIEMANN 1983) Für die Selektivanreicherung bei wärmeren Temperaturen („Warmanreicherung“) stehen verschiedene Flüssig- und Festmedien zur Verfügung. Kein Nährmedium ist in der Lage, alle pathogenen Yersinia-Serotypen gleichzeitig zu selektieren (DE BOER 1995). Eines der populärsten Flüssig-Selektivmedien für Yersinien ist die ITC-Bouillon (Irgasan-Ticarcilin- Kaliumchlorat). Sie wurde von WAUTERS et al. (1988) durch Weiterentwicklung der modifiizierten Rappaport-Boullion entwickelt. Die ITC-Bouillon ist gut geeignet, um pathogene Yersinien aus kontaminiertem Material zu selektieren. Als fester Nährboden wird der CIN-Agar nach SCHIEMANN (1979) häufig eingesetzt. Er wirkt hoch selektiv, insbesondere gegenüber Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Proteus mirabilis, und Literaturübersicht 47

weist im Vergleich zum MacConkey- und Salmonella-Shigella-Agar eine höhere Nachweisrate auf (SCHIEMANN 1979). Besonders bei der Erregerisolation aus Tonsillen und Mesenteriallymphknoten zeigte sich die Selektivanreicherung gegenüber der Kälteanreicherung überlegen (DE BOER et al. 1991; FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 1999). Bei der Erregerisolation aus Lebensmitteln liegt die minimale Nachweisgrenze für das Gelingen des kulturellen Nachweises bei 103-106 CFU, bei geringerer Keimkonzentration kann es zu falschnegativen Ergebnissen kommen (VISHNUBHATLA et al. 2001). Generell sind zum kulturellen Yersinia-enterocolitica-Nachweis beim Schwein am besten die Tonsillen geeignet, da sich der Erreger dort absiedelt. In den Tonsillen ergaben sich in vielen Studien deutlich höhere Nachweisquoten als in Darminhalt bzw. Lymphknoten (PEDERSEN 1979; WAUTERS 1979; SCHIEMANN 1980; FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2001a; NESBAKKEN et al. 2003).

Weiterführende Differenzierungsmethoden

Die weitere Differenzierung der präsumptiven Yersinia-Kolonien erfolgt biochemisch mittels Eisen-III-Zucker-Schrägagar (Kligler-Agarmedium), wobei verdächtige Stämme

Glukosepositiv, Laktose-negativ, H2S-negativ sind und keine Gasbildung zeigen. Das kommerziell erhältliche API®-20E-Testsystem (Fa. Biomerial) für Enterobacteriaceae kann ebenfalls zur biochemischen Differenzierung genutzt werden (ARCHER et al. 1987).

Sonstige Nachweismethoden

Generell haben heutzutage DNA-basierte Methoden (PCR, DNA-Hybridisierung) für den Yersinia-Nachweis eine große Bedeutung gewonnen, da sie eine höhere Sensitivität und einen niedrigeren Zeitaufwand mit sich bringen (JAGOW et al. 1986). Auch bei der phänotypischen Differenzierung auftretende Probleme bezüglich der Speziesidentifizierung und der Differenzierungsmöglichkeit zwischen pathogenen und apathogenen Stämmen führten zu vermehrtem Einsatz PCR-basierter Methoden. So ist bei Differenzierung anhand biochemischer Reaktionen z.B. leicht eine Verwechslung zwischen apathogenen Yersinia spp. und Y. enterocolitica möglich (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2006a). Niedrige Isolationsraten für Yersinia spp. stellen mitunter ein methodisches Problem bei der Erregeranzucht dar, denn die Literaturübersicht 48

PCR zeigt höhere Nachweisraten als die kulturelle Erregeranzucht und ist durch hohe Spezifität und Sensitivität gekennzeichnet (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2003). Das Virulenzplasmid (pYV), das hitzestabile Enterotoxin-Gen yst und die an der Invasion beteiligten Gene ail und inv sind Zielstrukturen für einen spezifischen Nachweis von Yersinia mittels PCR (ARNOLD 2002). Die PCR erwies sich laut NOWAK et al. (2006) in vielen Untersuchungen als sensitiver im Vergleich zum kulturellen Yersinia-Nachweis. NESBAKKEN et al. (2003) konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Ergebnissen der Yersinia- Kultur und der PCR feststellen. Sie gaben aber zu bedenken, dass die von ihnen angewandte PCR-Methode nicht zwischen Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis und Y. pestis differenzieren kann (NESBAKKEN et al. 2003). Andere molekularbiologische Methoden, wie Ribotyping mittels Restriktionsenzymen und Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), verfeinern die epidemiologischen Untersuchungen (BOTTONE 1999). Laut FREDERIKSSON-AHOMAA (2006A) ist die molekularbiologische Subtypisierung aufgrund ihres diskriminatorischen Vermögens den phänotypischen Methoden (Serotypisierung, Biotypisierung, Phagentypisierung, Antibiogrammtypisierung) überlegen, wobei die Pulsfeldgelelektrophorese den Goldstandart der Subtypisierung repräsentiert.

Serologischer Nachweis

Die Detektion von Yersinia-Infektionen beim Schwein kann anhand der Antikörperbildung erfolgen, wobei nach einer Infektion der Großteil der Herde seropositiv reagiert (SKJERVE et al. 1998; NESBAKKEN et al. 2006). Die Entwicklung des ersten ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen Y. enterocolitica O:3 wurde in einer dänischen Studie beschrieben (NIELSEN et al. 1996). Man präsentierte eine zeitsparende, günstige Alternative zum kulturellen Yersinia-Nachweis. Die Serokonversion war mit diesem LPS-basierten ELISA 19 Tage p.i. nachweisbar und bis zum Versuchsende (70. Tag) anhaltend. Der LPS-ELISA nach THIBODEAU et al. detektiert gleichzeitig Antikörper gegen die Yersinia-Serotypen O:3, O:9 und O:5,27, welche die meistvorkommenden bei Humaninfektionen sind (THIBODEAU et al. 2001). Literaturübersicht 49

Der neueste kommerzielle ELISA „PIGTYPE® YOPSCREEN Pig“ basiert auf der Verwendung rekombinanter Yop-Antigene (Yersinia-outer-Proteins), welche von allen Serotypen der pathogenen plasmidtragenden Stämme gebildet werden. Er ermöglicht den Nachweis von Antikörpern gegen die virulenten Yersinia-Stämme O:3, O:8 und O:9. Mittels des Yop-Antigen basierten Tests lässt sich die Serokonversion bereits nach wenigen Tagen darstellen (HASSEL 2008). Da auch Y. pseudotuberculosis und Y. pestis Yop-Antigene tragen, ist die Differenzierung durch diesen ELISA nicht gegeben. Neben der ELISA-Technik wurde für das Schwein auch ein aus der Humanmedizin stammender Westernblot entwickelt, welcher fünf Yersinia-outer-Proteine (YopD, YopE, YopH, YopM, V-antigen) als Testantigene verwendet (HENSEL et al. 2004). In der Humanmedizin wird zum serologischen Nachweis der Infektion ein Immunoblot auf Basis der Yops durchgeführt , welcher IgG und IgA detektiert (HEESEMANN et al. 1995).

2.4.3 Epidemiologie

Die Epidemiologie von Y. enterocolitica-Infektionen ist komplex und immer noch vergleichsweise unverstanden (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2006a; LAUKKANEN et al. 2009). Mittels PCR wurden genotypisch von humanpathogenen Isolaten nicht unterscheidbare Stämme bei verschiedenen Tierarten, wie Schweinen, Hunden, Katzen, Schafen oder Nagern, entdeckt (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2006a). In erster Linie wird rohes Schweinefleisch als Auslöser verdächtigt (TAUXE et al. 1987; DE BOER et al. 1991). Es gibt laut FREDRIKSSON-AHOMAA et al. (2006b) zwar keine eindeutigen Beweise für die Infektionsroute über das Schweinefleisch, jedoch deuten auch ihre Untersuchungen stark darauf hin. Y. enterocolitica zeigt eine hohe Toleranz gegen Hitze und Kälte und wurde neben rohem Schweinefleisch auch in gekochtem und in gefrorenem Schweinefleisch nachgewiesen. Beispielsweise wurden im Jahre 2007 in Deutschland bei 9,3 % der Schweinefleischproben Y. enterocolitica festgestellt. In arabischen Ländern tritt die humane Yersiniose laut NIMRI et al. wesentlich seltener auf, weil dort vielfach aus religiösen Gründen kein Schweinefleisch verzehrt wird (NIMRI et al. 2004). Da beim Schwein pathogene Isolate vorkommen, die identisch zu den humanen Bioserotypen sind, sollte die Rolle des Schweinefleisches genau untersucht werden (GÜRTLER et al. 2005). Literaturübersicht 50

Auch die Infektion mittels verkeimten Trinkwassers scheint beim Menschen eine Rolle zu spielen (NESBAKKEN et al. 2007). Weiterhin wurden indirekte Infektionen von Mensch zu Mensch via Bluttransfusionen (BOTTONE 1999) beschrieben. Auch Infektionen infolge engen Kontaktes zu infizierten Haustieren, wie Hund und Katze, scheinen möglich (FREDRIKSSON- AHOMAA et al. 2006a). Meist treten humane Infektionen sporadisch ohne unmittelbar erkennbaren Auslöser auf (BOTTONE 1997, 1999). Enterale Yersiniosen treten weltweit auf, doch in Europa ist das Vorkommen besonders häufig. Die an humaner Yersiniose beteiligten Bioserotypen gehören meist zu 1B/O:8; 2/O:5,27; 2/O:9; 3/O:3 und 4/O:3., wobei Bioserotyp 4/O:3 der häufigste Auslöser in Europa, USA, Kanada und Japan ist (BOTTONE 1999). Klassischerweise überwiegen in Europa die Serovare O:3, O:9 und O:5,27, und in Nordamerika herrschen O:8, O:13, O:20 und O:21 des Biovars 1B vor (ROLLE et al.). Jedoch gibt es einerseits in den USA in letzter Zeit eine Zunahme von O:3 Serovaren gegenüber Serovaren aus der Biovar 1B (HEESEMANN 1994), während in Deutschland 2001 der erste Fall einer Humanerkrankung durch O:8 auftrat (RKI 2002).

2.4.3.1 Y. enterocolitica beim Menschen

Im Jahr 2007 wurden 4.987 humane Yersiniosen in Deutschland gemeldet, wobei sich seit Jahren ein leicht rückläufiger Trend andeutet. 90 % der humanen Yersiniosen entfielen auf Serotyp O:3, 6 % auf O:9 und 0,2 % auf O:5,27 (RKI 2008). Bei gesunden deutschen Blutspendern wurde mittels ELISA eine Yersinia-Seroprävalenz von 33 % festgestellt, was auf häufige subklinische Yersinien-Infektion hinweisen könnte (MAKI-IKOLA et al. 1997).

Infektionsverlauf

Das häufigste Symptom einer Y.-enterocolitica-Infektion ist Diarrhoe (BOTTONE 1999). Neben dem klinischen Bild einer Enteritis kann die Infektion auch als terminale Ileitis mit mesenterialer Lymphadenitis (teilweise mit Pseudoappendicitis) oder als septikämische Form in Erscheinung treten (BOCKEMÜHL et al. 2003). Bis zu 30 % aller Fälle von Appendicitis werden auf Y.-enterocolitica-Infektionen zurückgeführt. Meist ist die Infektion selbstlimitierend, aber auch Komplikationen und Todesfälle kommen vor (BOTTONE 1997). Literaturübersicht 51

So kann es unter Umständen zur Abszessbildung an inneren Organen, Erythema nodosum, reaktiver Arthritis, Uveitis oder Thyreoiditis kommen (NEUBAUER et al. 2001b). Im Falle einer enteralen Yersiniose wird eine Antibiotika-Therapie, wie auch im Falle einer extraintestinalen Form, zwecks Verhinderung von Komplikationen in jedem Falle angeraten (STILLE 2005). Zum Einsatz kommen hierbei Chinolone oder Tetrazykline (Anonymous 1998). Gegenüber ß-Lactamen sind Yersinia spp. häufig resistent, so dass dieser Wirkstoffklasse therapeutisch von vorneherein wenig Bedeutung beigemessen wird (NAVARRO et al. 1993).

2.4.3.2 Y. enterocolitica beim Schwein

Schweine stellen vermutlich das wichtigste Reservoir für humanpathogene Yersinien dar (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2001b), und eine lebenslange Erregerpersistenz wird vermutet (ROLLE et al.). Schweinefleischverzehr steht laut DE BOER in Verdacht der Hauptverursacher von humanen Yersiniosen zu sein (DE BOER et al. 1991). Auch FREDRIKSSON-AHOMAAs Untersuchungen zum molekularen Vergleich humaner und porciner Stämme deuteten darauf hin, dass Schweine eine bedeutende Ursache für humane Infektionen sein könnten (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2006b). Beim Schwein sind Yersinien bereits drei Stunden nach experimenteller Infektion während transienter Bakteriämie im Initialstadium in den Tonsillen nachweisbar (THIBODEAU et al. 1999), welche neben dem Verdauungstrakt das Haupterregerreservoir darstellen (TAUXE et al. 1987). Der Erreger kann monatelang in den Tonsillen persistieren, ohne dass eine Erregerausscheidung im Kot erfolgt (KAPPERUD 1991). So war in einer dänischen Studie eine bakterielle Isolierung der Erreger nach 30-70 Tagen p.i. nur noch aus den Tonsillen möglich, während Darm und Darmlymphknoten zu diesem Untersuchungszeitpunkt bereits wieder negative Ergebnisse lieferten (NIELSEN et al. 1996). Die Yersinia-Nachweisraten aus Tonsillen liegen etwa zehnfach höher als die aus Faezes (PEDERSEN 1979; WAUTERS 1979; SCHIEMANN 1980). In der Studie von GÜRTLER et al. (2005) lag das Verhältnis der Isolationshäufigkeit aus Tonsillen gegenüber der aus Ileocaecallymphknoten ebenfalls bei 10:1 (38,4 % zu 3,8 %), in anderen Studien (NESBAKKEN et al. 2003) lag die Isolationsrate aus den Mesenteriallymphknoten unter der Isolationsrate aus Faeces (8,3 % zu 12,5 % ). Klinisch Literaturübersicht 52

apparente Erkrankungen durch Yersinien können laut NEUBAUER et al. (2001a) bei Jungtieren auftreten, während bei erwachsenen Schweinen asymptomatisches Carriertum überwiegt. In Untersuchungen erwiesen sich 1,6 % der untersuchten deutschen Schweineherden und 3,18 % der Einzeltiere als positiv (BFR 2008a). BOWMAN et al. entdeckten mit zunehmendem Alter der Schweine ansteigende Prävalenzen: Positiv waren <1 % der Saugferkel, 1,4 % der Läufer und 10,7 % der Mastschweine. Interessanterweise wurde bei tragenden Sauen die zweithöchste Rate (9,1 %) entdeckt und die abgeferkelten Sauen waren alle negativ (BOWMAN et al. 2007).

Risikofaktoren

Zwischen den Schweinen ist laut SKERVJE et al. (1998) eine fäkal-orale Übertragung bei Y. enterocolitica anzunehmen. Sowohl von Ratten (KAPPERUD 1975) als auch Fliegen (FUKUSHIMA et al. 1979) konnten Yersinien isoliert werden. In Umgebungsproben liegt die Nachweisrate von Y. enterocolitica in der Regel niedrig (PILON et al.: 0,6 % (2000), VON ALTROCK et al.: 3,4 % (2006)). SKERVJE et al. (1998) identifizierten als Risikofaktoren für erhöhte Yersinia-Seroprävalenz die Benutzung eines betriebseigenen Transportfahrzeugs für die Schlachthoftransporte, die regelmäßige Anwesenheit von Katzen und Stroheinstreu. Eine Unterdruckventilation und manuelle Fütterung der Mastschweine wirkten sich protektiv aus. Sowohl SKERVJE et al. (1998) als auch WINGSTRAND (2001) stellten fest, dass kleinere Betriebe und auch geschlossene Produktionssysteme ein niedrigeres Risiko für einen positiven Yersinia- Herdenstatus hatten als größere Betriebe und Betriebe mit Ferkelzukauf. Dieses Phänomen wird auf Yersinia-Eintragungen durch infizierte zugekaufte Tiere zurückgeführt. NOWAK et al. (2006) beschrieben geringere Yersinia-Prävalenzen bei Schlachtschweinen aus alternativen Haltungssystemen im Vergleich zu Tieren aus konventionellen Systemen und sahen als Risikofaktoren den Ferkelzukauf von mehreren fremden Zulieferern, die Verfütterung zugekauften Futters und den gemeinsamen Schlachthoftransport mit betriebsfremden Tieren an. Im Gegensatz dazu schreibt eine kanadische Studie dem Erregereintrag von außen keine Bedeutung zu, weil sich herausstellte, dass wenige Yersinia-Stämme endemisch monatelang in einem Bestand persistierten (PILON et al. 2000). Literaturübersicht 53

NESBAKKEN et al. (2007) hielten die Schaffung Yersinia-freier Bestände durch Bekämpfung des Erregers in Basiszuchtbetrieben für möglich. SKERVJE et al. (SKJERVE et al. 1998) waren der Meinung, dass die Verhinderung des Kontakts zwischen Yersinia-infizierten und nicht- infizierten Schweineherden die Verringerung der Herdenprävalenzen ermöglicht.

Literaturübersicht 54

2.5 Antibiotikaresistenzen

2.5.1 Allgemeines

Die Resistenz einer Bakterienart oder -gattung gegenüber bestimmten Antibiotika kann entweder inhärent sein (intrinsische bzw. natürliche Resistenz) oder aber erworben werden (erworbene Resistenz). Intrinsische Resistenz beruht auf dem Fehlen der passenden Zielstrukturen des Bakteriums (SCHWARZ et al. 2001). Der Resistenzerwerb erfolgt durch Übertragung genetischen Materials von anderen Bakterien oder aber durch Mutation eigener Gene. Die Probleme in der Human- und Veterinärmedizin sind vorwiegend durch erworbene Resistenzen gegen Antibiotika bedingt. Es gibt grundsätzlich zwei Entstehungswege: Zum einen den Erwerb exogener mobiler Elemente (Integrons, Plasmide und Transposons) per horizontalem Gentransfer und zum andern die Mutation von chromosomal codierten Elementen. Single-Step- und Multi-Step-Mutationen können einerseits zur Modifikation der Zielstrukturen am Bakterium führen, andererseits können durch schrittweise Mutation Proteine des physiologischen Zellmetabolismus zu antibiotikaabbauenden Enzymen verändert werden (SCHWARZ et al. 2001). Die molekularen Mechanismen der Bakterienresistenz sind mannigfaltig: Reduzierte Affinät zur Zielstruktur des Antibiotikums, enzymatische Inaktivierung und reduzierte intrazelluläre Akkumulation (durch reduzierte Permeabilität der Zellmembran und/oder erhöhten Drug-Efflux) kommen in Frage. Pro Antibiotikum wurden bis zu sechs verschiedene Resistenzmechanismen beschrieben (ROBERTS 1996). Die schnelle Ausbreitung antimikrobieller Resistenzgene zwischen Bakterien der gleichen und anderen Spezies erfolgt hauptsächlich durch den horizontalen Gentransfer. Ein oder mehrere Resistenzgene werden hierbei vor allem durch Plasmide, Transposons und Integrons/Genkasseten übrtragen. Diesen Elementen ist der Aufbau aus Doppelstrang-DNA gemeinsam, sie unterscheiden sich jedoch in Größe, Struktur, biologischen Eigenschaften (z.B. Autoreplikation, Autotransposition) und dem Übertragungsweg. Plasmide haben eine erheblich variable Größe von 2-100 kbp und sind ringförmige, extrachromosomale DNA. Sie sind zur Autoreplikation befähigt und codieren zusätzliche, für das Bakterium nützliche Eigenschaften, wie beispielsweise Resistenzen. DNA-Transposons betreiben hingegen keine Autoreplikation, Literaturübersicht 55

ihre Größe beträgt <1-60 kbp. Über ein Transpositionssystem können sie mittels des Enzyms Transposase ihren Locus im Genom verändern. Genkassetten sind kleine Elemente unter 2 kbp, welche weder Autoreplikation noch Transposition vollziehen und bisher ausschließlich für gramnegative Bakterien nachgewiesen wurden (BENNETT 1995). Der horizontale Gentransfer dieser Elemente erfolgt auf dem Wege der Konjugation (Mobilisation), Transduktion oder Transformation (SCHWARZ et al. 2001). Konjugation beschreibt den Selbsttransfer von Plasmiden oder Transposons von einer Donorzelle auf eine Empfängerzelle. Es besteht die Annahme, dass die Konjugation den Hauptweg für die Verbreitung von Resistenzgenen zwischen verschiedenen Bakterienspezies darstellt. Beispielsweise geschieht die Verbreitung der wichtigen ß-Lactam-Resistenzen mittels Konjugation (DAVIES 1994). Transduktion ist bakteriophagenvermittelt, daher ist die Größe der übertragenen Resistenzgene limitiert. Transduktion erfolgt vorwiegend bei Bakterien gleicher Spezies aufgrund der für die Phagenanheftung benötigten spezifischen Zielstrukturen. Transformation beschreibt die Aufnahme von isolierter DNA in eine kompetente Empfängerzelle ohne Zellkontakt zur Donorzelle und spielt vermutlich keine große Rolle für die Verbreitung von Resistenzgenen (SCHWARZ et al. 2001) . Nach dem Transfer persistieren die Elemente entweder extrachromosomal oder werden als sogenannte Pathogenitätsinseln (Blöcke mit mobilen genetischen Elementen) integriert (MC DERMOTT 2006). Man unterscheidet somit plasmidgebundene von chromosomalen Resistenzen, wobei erstere zwischen Bakterien übertragbar sind und sich entsprechend rascher ausbreiten. Ein Resistenzmechanismus kann häufig mehrere chemisch verwandte Substanzen inaktivieren (Kreuzresistenz). In diesen Fällen kann das Ergebnis der Resistenztestung einer prototypischen Substanz auf die Gruppe übertragen werden.

Gefahren der Antibiotikaresistenzen

Resistenzen werden generell bei fast allen Bakterien und allen verfügbaren Wirkstoffen beobachtet, seitdem in den späten 1940ern antimikrobielle Substanzen in großem Umfang eingesetzt werden. Literaturübersicht 56

Mit Beginn der antibiotischen Ära wurde ein Selektionsdruck gegen die Krankheitserreger aufgebaut. Dieser führt zur Begünstigung von Bakterien, welche die genetische Potenz besitzen, diesem Selektionsdruck zu wiederstehen (MATEU et al. 2001). Einmal im Bakterium vorhanden, weisen Resistenzgene eine gewisse Stabilität auf, und existieren somit noch lange nachdem ein Antibiotikum vom Markt genommen wird im Genpool (SALYERS et al. 1997). Der Einführung einer neuen antimikrobiellen Substanz folgte bisher ausnahmslos die Resistenzentwicklung (LEVY 1982). Besonders resistenzfördernd ist ein inadäquater Antibiotikaeinsatz, wie beispielsweise der Einsatz subtherapeutischer Dosen, verfrühtes Absetzen der Medikation, unspezifische Massenmedikation, Einsatz von Stoffen mit zu breitem Wirkspektrum sowie der pro- und metaphylaktische Einsatz von Antibiotika ohne mikrobiologische Abklärung (HELMUTH et al. 2004). Eine Studie von EMBORG et al. zeigte, dass eine Erhöhung des Tetrazyklineinsatzes bei dänischen Schweinen zur Selektion von tetrazyklinresistenten S.-Typhimurium-Phagentypen und folglich zu einer Verschiebung in der Phagentypverteilung führten (EMBORG et al. 2007). Dieses Beispiel unterstützt die Annahme, dass durch Antibiotikaeinsatz multiresistente Klone selektiert werden und dies der Antrieb für Veränderungen der Antibiotikaresistenzraten innerhalb eines Serovars sein könnte. Heutzutage stellt Antibiotikaresistenz ein großes Problem in der Human- und Veterinärmedizin dar. Der weltweite Austausch von Zuchttieren spielt für die Verbreitung von resistenten Isolaten eine große Rolle (MC DERMOTT 2006), daher sind Resistenzprobleme immer von länderübergreifender Bedeutung (AARESTRUP 2004). Wenn resistente Keime in den Tierbeständen vorkommen, so ergibt sich aus veterinärmedizinischer Sicht in erster Linie das Problem des Therapieversagens. Aus dem Vorhandensein resistenter zoonotischer Bakterien innerhalb der Tierpopulation entstehen grundsätzlich zwei Risiken für die menschliche Gesundheit: Zum einen können resistente Tierisolate im Fall von zoonotischen Erregern den Menschen entweder direkt durch Tierkontakt oder indirekt via Lebensmittel infizieren (HELMUTH 2000). Zum anderen besteht die Gefahr der Übertragung von Resistenzgenen per horizontalem Gentransfer auf andere humanpathogene Keime oder auch Kommensalen. Infektionen mit resistenten Erregern führen wegen des Therapieversagens vermehrt zu Komplikationen. Diese können zu schwereren Verläufen und daraus resultierender Hospitalisierung, verlängerter Krankheitsdauer, bis hin zu Todesfällen führen (VARMA et al. 2005). In vergleichenden Untersuchungen an dänischen Patienten betrug die Mortalitätsrate bei Literaturübersicht 57

Infektion mit sensiblen Salmonella-Stämmen 2,3 %; bei ACSSuT-resistenten (= Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamid, Tetrazyklin) Stämmen erhöhte sie sich auf 4,8 %; bei Nx-resistenten (= Nalidixinsäure) auf 10,3 % und bei ACSSuT/Nx-resistenten Isolaten sogar auf 13,1 % (HELMS et al. 2002). Für Campylobacter spp. wurden ähnliche Tendenzen beobachtet (HELMS et al. 2005b). Die Einhaltung der in den „Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antimikrobiell wirksamen Tierarzneimitteln“ beschriebenen Grundregeln sollten beim Antibiotikaeinsatz befolgt werden, um die Resistenzbildung zu minimieren (Anonymous 2000a). Generell sollte der Antibiotikaeinsatz auf das Notwendigste beschränkt werden, um den allgemeinen Selektionsdruck zu senken. Kontinuierliches Monitoring von Antibiotikaeinsatz bei Tieren und von Resistenzentwicklungen ist wichtig, um sicherzustellen, dass der Antibiotikaeinsatz in der Veterinärmedizin die menschliche Gesundheit nicht beeinträchtigt (AARESTRUP et al. 2008a). Der limitierte Einsatz von Fluorchinolonen und Cephalosporinen der 3. und 4. Generation in der Tiermedizin und das Verhindern von Neuzulassungen weiterer Cephalosporine der 4. Generation für die Veterinärmedizin wurde von HENSEL et al. (2004) gefordert. In mehren europäischen Ländern wurden bereits Resistenz-Monitoringprogramme eingeführt, welche Isolate von lebensmittelliefernden Tieren mit einschließen, beispielsweise DANMAP in Dänemark, FARM in Frankreich, ITAVARM in Italien, MARAN in den Niederlanden, NORM-VET in Norwegen, SVARM in Schweden und VAV in Spanien. In Deutschland wurde 2008 erstmals der GERMAP-Bericht über Antibiotikaverbrauch und -resistenzen veröffentlicht (Anonymous 2008). Die Ergebnisse dieser verschiedenen Berichte sind jedoch aufgrund von Differenzen in der Probennahme und -anzahl sowie der Labormethoden schwer vergleichbar (DE JONG et al. 2009). Häufig werden die Daten von den Ländern auch abweichend gruppiert; und es erfolgt eine - in Bezug auf Tierarten, Serovare sowie Phagentypen - anders aufgeschlüsselte Darstellung. Einen entscheidenden Einfluss hat auch die Verwendung unterschiedlicher Grenzwerte zur Interpretation der im Mikrodilutionsverfahren ermittelten minimalen Hemmkonzentrationen (MHK). Eine weitere Vereinheitlichung der Methodik und der Ergebnispräsentation ist daher sinnvoll, um eine Vergleichbarkeit verschiedener Studien zu ermöglichen.

Literaturübersicht 58

2.5.2 Resistenzen bei Salmonella spp.

Seit Anfang der 90er Jahre haben bei Salmonella spp. Resistenzenraten gegen Antibiotika, insbesondere die Multiresistenzen, dramatisch zugenommen (THRELFALL 2000). Mittlerweile sind an 20 % bis 40 % der humanen Salmonella-Infektionen resistente Keime beteiligt (MCDERMOTT). Einen großen Anteil daran hatte die epidemische Verbreitung des Phagentyps S. Typhimurium DT 104 (THRELFALL 2000). DT 104 trägt regelmäßig die typische ACSSuT-Pentaresistenz gegen die Antibiotika Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfamethoxazol und Tetrazyklin (HELMS et al. 2005a). Zusätzlich zur Pentaresistenz kommen bei DT 104 mittlerweile Resistenzen gegen Trimethoprim, Kanamycin sowie gegen die Reserveantibiotika Nalidixinsäure, Ciprofloxacin und der Cephalosporin- Gruppe vor. DT 104 wurde zunächst 1984 in Großbritannien isoliert und hat mittlerweile eine weltweite Verbreitung erfahren. Vermutlich wurde dieser Phagentyp mit exotischen Vögeln aus Hong Kong und Indonesien eingeschleppt. In manchen Ländern ist DT 104 der dominierende Phagentyp, in anderen bleibt er selten (MC DERMOTT 2006). Die höchsten Resistenzraten sind bei Salmonella spp. gegen ältere Wirkstoffgruppen, wie Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfamethoxazol oder Tetrazyklin, zu verzeichnen. Es gibt bei Salmonella spp. eine besorgniserregende Resistenzentwicklung gegen die Stoffklassen der Cephalosporine neuerer Generation sowie Fluorchinolone, dies sind Reserveantibiotika zur Therapie schwerer systemischer Infektionen (HOHMANN 2001). Die Cephalosporinresistenz ist noch nicht so weit verbreitet wie die Resistenz gegen Fluorchinolone und stellt somit in manchen Gebieten die einzige effektive Therapie der Salmonellose dar.

Literaturübersicht 59

Tabelle 1 Vergleich von Antibiotikaresistenzraten bei S. Typhimurium

EFSA GERMVET DANMAP Autor Schwein Schweine mit Enteritis Schwein Tierart Methode k.A. Dilution CLSI Dilution Länder D DK NL E D DK n 302 737 85 26 575 Serovar S. Typhimurium S. Typhimurium S. Typhimurium Jahr 2005 2004/2005 2007 Anteil resistenter Isolate in % : AMP 78,2 26,9 60 - 76,9 36,0 CHL 51,3 10,6 40 25 57,7 11 SULF 86,4 38,9 63,5 65 - 47 TET 52 40,7 70,6 90 80,8 47 TMP 27,2 8,3 31,8 15 19,2 - GEN 3,6 1,4 0 7,5 23,1 1 NAL 3,6 1,2 0 7,5 3,8 1

2.5.3 Resistenzen bei Campylobacter spp.

Von besonderer Bedeutung sind bei thermophilen Campylobacter Resistenzen gegen Fluorchinolone und Makrolide, da diese Wirkstoffklassen die Therapeutika der Wahl bei einer schweren Campylobacteriose darstellen (AARESTRUP et al. 2008a). Außer gegen Penicilline und viele Cephalosporine sind C. coli und C. jejuni oft gegen Trimethoprim, Sulfamethoxazol, Rifampicin und Vancomycin resistent. Ursprünglich galten Campylobacter spp. als hoch empfindlich gegenüber Erythromycin, Fluorchinolonen, Tetrazyklinen, Aminoglykosiden und Clindamycin. Doch mittlerweile treten vermehrt Resistenzen gegen diese Antibiotika auf (FITZGERALD et al. 2008). In den 1990ern kam es sowohl bei Campylobacter als auch bei anderen Enterobacteriaceae zur Zunahme von Fluorchinolonresistenzen. In Deutschland wiesen 30 % - 40 % der humanen Campylobacter-Isolate eine Fluorchinolonresistenz auf, während in Südeuropa bis 70 % und Thailand bis 80 % der Isolate resistent gegenüber Fluorchinolonen waren (HÄNEL et al. 2008). Der Zusammenhang zwischen beginnendem Fluorchinoloneinsatz in der Human- und Veterinärmedizin auf der einen und zunehmenden Resistenzraten bei Campylobacter-Isolaten humaner und aviärer Herkunft auf der anderen Seite wurde bereits durch ENDTZ et al. (1991a) dargelegt. Eine Studie in Spanien beschrieb Literaturübersicht 60

Fluorchinolonresistenzen bei 100 % der untersuchten porcinen und aviären Isolate. Auch in anderen europäischen Ländern, wie Finland, England, Niederlande und Kanada, traten Fluorchinolonresistenzen auf (SAENZ et al. 2000). Kreuzresistenzen zwischen Nalidixinsäure und Ciprofloxacin sind üblich und wurden von REINA et al. (1994) bei 89,1 % der Stämme gefunden, während 10,9 % der Stämme resistent gegenüber Nalidixinsäure und sensibel gegenüber Ciprofloxacin waren. Weniger selten treten Ciprofloxacin-resistente Stämme auf, welche gegenüber Nalidixinsäure sensibel sind (FITZGERALD et al. 2008). Vor 30 Jahren beschrieb SKIRROW (1977) C. coli und C. jejuni als hochempfindlich gegenüber Erythromycin. Mittlerweile werden in der Literatur speziesabhängige Ausprägungen der Makrolidresistenz beschrieben, und zwar treten wesentlich höhere Erythromycin- Resistenzraten bei C. coli im Vergleich zu C. jejuni auf (FITZGERALD et al. 2008). Bei C. jejuni liegen die Resistenzraten humaner Isolate weltweit bei 0-11 % und bei C. coli bei 0- 68 % (HÄNEL et al. 2008). Die Ursache für diese speziesabhängigen Differenzen sind bislang noch unklar (AARESTRUP et al. 2008a). SAENZ et al. berichteten in einer spanischen Studie von der Abwesenheit von Erythromycin-Resistenzen bei C. jejuni aus Geflügel, jedoch hohen Resistenzraten (81,1 %) bei C. coli aus Schweinen (SAENZ et al. 2000). In Quebec wiesen porcine C.-coli-Isolate ebenfalls wesentlich höhere Resistenzraten (61 %) auf als aviäre C.-coli- Isolate (0 %) (GUEVREMONT et al. 2006). In den meisten Regionen liegen die Resistenzraten von Campylobacter gegen Erythromycin unter 5 %, mit Ausnahme von Thailand, wo Resistenzraten von über 50 % beschrieben wurden (NACHAMKIN 2000). Bezüglich Aminoglykosiden wird in der Literatur regelmäßig von Diskrepanzen zwischen niedriger Gentamicinresistenz und hoher Streptomycinresistenz berichtet (VARELA et al. 2007). Die völlige Abwesenheit von Gentamicinresistenz wurde in mehreren Studien beschrieben (AARESTRUP et al. 1997; SCHUPPERS et al. 2005; GUEVREMONT et al. 2006). Daher wurde dieser Wirkstoff auch bereits als Alternativantibiotikum vorgeschlagen (FERNANDEZ et al. 2000).

Tabelle 2 Literaturübersicht 61 spp. Campylobacter biotikaresistenzraten bei Tabelle 2 Vergleich von Anti

Literaturübersicht 62

2.5.4 Mikrodilutionstest und MHK-Wert

Der Mikrodilutionstest gilt mittlerweile als der goldene Standard zur Resistenzbestimmung (AARESTRUP et al. 2008a). Die Erstbeschreibung des Dilutionstests stammt bereits von Alexander FLEMING (1929). Die ursprünglich verwendete Makrodilutionsmethode wurde in den 1960ern zur heutigen Mikrodilutionsmethode weiterentwickelt (TURNIDGE et al. 2007). Der in der Mikrodilutionsmethode bestimmte MHK-Wert entspricht der minimalen Schwelle, bei der unter definierten Bedingungen durch eine antimikrobielle Substanz die Vermehrung einer Testkeimpopulation verhindert wird, bzw. diese Testkeimpopulation abgetötet wird (WIESNER et al. 2000). Der MHK-Wert ist zwar nur ein semiquantitativer Wert, aber derzeit die beste Art, eine Aussage über die Antibiotikaresistenz eines Bakteriums zu treffen. Besonders die Reproduktion der Ergebnisse ist ein kritischer Punkt, da die Technik (Methode, Medien und verwendete Zusätze, Menge und Konzentration des Inokulums, Inkubationstemperatur und -dauer) starke Auswirkungen auf die Höhe der MHK-Werte haben (AARESTRUP et al. 2008a). Unter standardisierten In-vitro-Bedingungen ist der ermittelte MHK-Wert ein Maßstab für notwendige Gewebskonzentration, um am Infektionsort das Infektionsgeschehen zu unterdrücken (SCHWARZ et al. 2003). Grundlage für den Therapieerfolg ist bei zeitabhängig wirkenden Antibiotika eine lange anhaltende Überschreitung der MHK eines Erregers im Zielgewebe. Im Gegensatz dazu kann bei konzentrationsabhängig wirkenden Antibiotika bei ausreichend hoher Maximalkonzentration ein Unterschreiten der MHK im Zielgewebe toleriert werden, weil der sogenannte „postantibiotische Effekt“ auftritt (KIETZMANN et al. 2004). Um anhand des MHK-Wertes eine Aussage über die Resistenz bzw. Sensibilität eines Bakteriums zu treffen, benötigt man einen validen Grenzwert. Grundsätzlich unterscheidet man zwei verschiedene Arten von Grenzwerten, zwischen denen strikt differenziert werden sollte: erstens den epidemiologischen Cutoff (ECOFF) und zweitens den klinischen Breakpoint (BYWATER et al. 2006; DE JONG et al. 2009). Epidemiologische Cutoffs teilen die Gesamterregerpopulation eines Erregers in Subpopulationen mit und ohne erworbenen Resistenzmechanismen bezüglich eines bestimmten Wirkstoffes ein. Die Subpopulation ohne Resistenzmechanismen entspricht der „Wildtyp“- Population und die Subpopulation mit erworbenen Resistenzmechanismen der „Nicht-Wildtyp- Literaturübersicht 63

Population“. Eine intermediäre Kategorie entfällt. Epidemiologische Cutoffs dienen der optimierten Früherkennung (phänotypische Detektion) von Isolaten mit erworbenen Resistenzen, pharmakologische Aspekte werden bei mikrobiologischen Breakpoints nicht in Erwägung gezogen. Daher können sie einheitlich für Isolate unterschiedlichen Ursprungs (Mensch, Tier, Lebensmittel) angewendet werden. Epidemiologische Cutoffs werden u.a. vom EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) veröffentlicht, welches die Werte auf Basis einer umfangreichen Datenbank der minimalen Hemmkonzentrationen einer Vielzahl von Isolaten generiert (KAHLMETER et al. 2004). Klinische Breakpoints haben dagegen therapeutische Relevanz, wobei Resistenz mit Therapieversagen und Empfindlichkeit mit Therapieerfolg assoziiert ist. Im Intermediärbereich kann bei Dosiserhöhung ein Therapieerfolg herbeigeführt werden. Bei Ermittlung der klinischen Breakpoints werden die pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften des Wirkstoffes berücksichtigt, wie beispielsweise die erreichbare Gewebekonzentration (BOTTNER et al. 2000; BYWATER et al. 2006). Die bisher existierenden klinischen Breakpoints stammen meist aus der Humanmedizin (NCCLS 2002). Da zwischen Mensch und Tier erhebliche pharmakologische Differenzen in Metabolismus und Verteilung der Wirkstoffe existieren, sollten in Zukunft für die Veterinärmedizin tierart- und indikationsspezifische klinische Breakpoints etabliert werden (SCHWARZ et al. 2008). Entgegen der weitverbreiteten Vorgehensweise ist eine allgemeingültige Einstufung von Keimen in die Sparte sensibel oder resistent nicht möglich, da valide tierart- sowie indikationsspezifische Breakpoints bisher für die wenigsten Pathogene existieren (KIETZMANN et al. 2004). Am häufigsten werden für Auswertungen mit klinischen Breakpoints die Grenzwerte des amerikanischen CLSI herangezogen, aber auch die europäische EUCAST veröffentlicht klinische Breakpoints (Anonymous 2007a). Die bestehenden Abweichungen zwischen den Breakpoints verschiedener Organisationen sind verwirrend, weshalb grundsätzlich die Harmonisierung anzustreben ist (TURNIDGE et al. 2007). Trotz erheblicher Fortschritte in den vergangenen Jahren bei der Festlegung von Grenzwerten, existieren noch viele ungeklärte Fragen (TURNIDGE et al. 2007). Die klinischen Breakpoints für Salmonella sind im CLSI Dokument M100 über Enterobacteriaceae zu finden (CLSI 2009b). Speziell für Campylobacter spp. wurden im CLSI Dokument M 45-A bisher nur bezüglich Erythromycin, Ciprofloxacin, Tetrazyklin und Doxycyclin Breakpoints veröffentlicht (CLSI 2006). Übliche Praxis ist es daher, für andere Literaturübersicht 64

Antibiotika auf klinische Breakpoints für die Enterobacteriaceae zurückzugreifen, obwohl Campylobacter phylogenetisch nicht dieser Familie zuzuordnen ist. Die Grenzwerte im CLSI- Dokument M45-A für Campylobacter basieren wegen des Fehlens pharmakologischer Daten ebenfalls auf „epidemiologischen Cutoffs“ (FRITSCHE et al. 2007), differieren aber erstaunlicherweise dennoch von den epidemiologischen Cutoffs der EUCAST. Beispielsweise liegt für Erythromycin der CLSI-Grenzwert für Campylobacter spp. bei >16 μg/ml, während EUCAST für C. coli den Cutoff auf >8 μg/ml und für C. jejuni auf >2 μg/ml gesetzt hat. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass offenbar Diskrepanzen zwischen klinischem Erscheinungsbild bei Infektionen mit Salmonella-Isolaten und deren Resistenzeinstufung mittels klinischem Breakpoint auftraten. So erwiesen sich Infektionen mit Salmonella-Isolaten als behandlungsresistent gegenüber Fluorchinolonen, obwohl die MHK-Werte der isolierten Krankheitserreger deutlich unter dem klinischen Breakpoint der CLSI (4 μg/ml) lagen (HELMUTH et al. 2004). Aus diesem Grund forderten AARESTRUP et al. (2003) schon im Jahre 2003 dringend eine Senkung des klinischen Breakpoints von Ciprofloxacin auf 0,125 μg/ml, um eine Verschleierung von Resistenzen zu verhindern.

Material und Methoden 65

3 Material und Methoden

3.1 Aufbau und Ziel der Studie

Die Untersuchungen wurden im Rahmen des FBI-Zoo-Projektes (Projektträger: BMBF) und in enger Kooperation mit dem Projekt ZIPP II (Projektträger: BLE) der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. In 27 norddeutschen Schweinemastbetrieben wurden Untersuchungen zum Vorkommen von Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica durchgeführt, dazu wurden deren bakteriologischen und serologischen Prävalenzen ermittelt. Um Zusammenhänge zwischen betrieblichen Gegebenheiten (Risikovariablen) und der Ausprägung der serologischen Ergebnisse (Zielvariablen) aufzudecken, wurde eine Risikofaktorenanalyse durchgeführt. Weiterhin galt es, Beziehungen zwischen den Infektionen der Tiere mit bestimmten Erregerkombinationen darzustellen. Schließlich erfolgte eine Empfindlichkeitsuntersuchung der gewonnenen Salmonella- und Campylobacter-Isolate gegen verschiedene antibakterielle Substanzen. Aufgrund der geringen Anzahl an Y.-enterocolitica-Isolaten (n=2) wurde dort keine Empfindlichkeitstestung durchgeführt.

Material und Methoden 66

3.2 Art und Herkunft der untersuchten Proben

An einem Schlachthof in Niedersachsen wurden Hybridmastschweine aus 27 verschiedenen Mitgliedsbetrieben einer Erzeugergemeinschaft auf das Vorliegen von Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica beprobt. Die Probennahme fand im Untersuchungszeitraum Juli 2007 bis Juni 2008 statt. Die regelmäßige Belieferung dieses Schlachthofes durch dieselben Betriebe stellte das entscheidende Kriterium für die Betriebsauswahl dar. Die untersuchten Mastschweine waren im üblichen Schlachtalter von ungefähr 6 Monaten. Am Schlachthof wurden zunächst die Tiere des zu beprobenden Betriebes im Wartestall mit Sprühfarbe markiert, um eine Identifikation zu gewährleisten. Die farblich markierten Tiere konnten beim Entbluten zwecks Stichblutentnahme gut identifiziert werden. Von jeweils 30 zufällig ausgewählten Tieren pro Testbestand wurde Stichblut zur serologischen Untersuchung in einer 9 ml Monovette®Z Luer (Fa. Sarstedt) aufgefangen. Dies geschah nach dem Entfernen des Hohlmessers im Rahmen des Entblutungsvorganges. Die Beprobung der Lnn. ileocaecales fand, vor der amtlichen Untersuchung, am Darmband statt. Der zu beprobende Bestand wurde durch Ablesen des Schlagstempels am Tierkörper identifiziert, welcher parallel zum Darm an einem weiteren Fließband mitlief. Pro Schwein wurde ein Ln. ileocaecalis aus dem jeweiligen Bestand entnommen. Insgesamt wurden pro Bestand Lymphknoten von 20 zufällig ausgewählten Tieren zur kulturellen Untersuchung entnommen. Die Gesamtprobenmenge betrug 540 Lymphknoten (kulturelle Untersuchung) und 810 Serumproben (serologische Untersuchung). Die am Schlachthof entnommenen Ileocaecallymphknoten wurden gekühlt aufbewahrt und innerhalb von 24 h im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover einer kulturellen Untersuchung unterzogen.

Material und Methoden 67

3.3 Kulturelle Untersuchung

Die Lymphknoten wurden zunächst in Ethanol getaucht und abgeflammt, um eine Oberflächenkontamination des Probenmaterials zu vermeiden. 100-300 mg des Lymphknotens wurden per Skalpell in kleine Teile geschnitten und gemeinsam mit 1 ml einer 0,9 %igen NaCl- Lösung in ein Fastprep®-Röhrchen mit sterilen Glaskugeln gegeben, um im Bead-Beater® für 40 s bei Stufe 3 zerkleinert zu werden. Diese Lymphknotensuspension wurde, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben, für die bakteriologische Untersuchung auf Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica eingesetzt. Die gewonnenen Isolate wurden kryokonserviert und zur Serotypisierung und Resistenztestung weitergeleitet.

3.3.1 Salmonella spp.

500 μl der Lymphknotensuspension wurden in 450 μl Buffered-Pepton-Water (BPW) (Oxoid) überführt und für 24 h bei 37 °C inkubiert. 100 μl dieser Vorkultur wurden in Rappaport- Vassiliadis (RVS)-Medium (Fa. Oxoid) gegeben und für 24 h bei 42 °C inkubiert. Ein weiteres Aliquot von 1000 μl der Voranreicherungskultur wurden in Müller-Kaufmann-Tetrathionat- Novobiocin (MKTTn)- Medium (Fa. VWR/Merck) überführt und für 24 h bei 37 °C inkubiert. Von den RVS- und MKTTn-Medien erfolgten so mittels ausgeglühter Öse Ausstriche sowohl auf Xylose-Lysin-Desoxycholat (XLD)- als auch auf Brillantgrün-Phenolrot-Lactose- Saccharose (BPLS)-Agarplatten (Fa. Oxoid), welche bei 37 °C für 24 h bebrütet wurden. Von verdächtigen Kolonien wurden Subkulturen angelegt, indem Koloniematerial mittels Öse entnommen wurde und auf einem Blut- und einem Gassner-Agar ausgestrichen wurde. Nach weiteren 24 h Wachstum auf den Agarplatten wurden die Salmonella-verdächtigen Kolonien anhand biochemischer Reaktionen wie Urease-, Indol- und Citratreaktion überprüft und mittels Agglutinationsreaktion und ApiE-System bestätigt. Die Differenzierung erfolgte jeweils für ein Salmonella-Isolat pro Lymphknoten. Die Phagentypisierung der S.-Isolate nach ANDERSON wurde am BfR Berlin durchgeführt (ANDERSON et al. 1977).

Material und Methoden 68

3.3.2 Campylobacter spp.

Aliquots von jeweils 25 μl Lymphknotensuspension wurden direkt auf einem Selektivagar nach Skirrow (Fa. Oxoid) sowie einem Thioglyklolat-Agar (Fa. Oxoid) ausgestrichen und bei 42 °C für 48 h in einem CO2-Inkubator bebrütet. Dem Thioglykolatagar wurde vor der Bebrütung direkt nach dem Autoklavieren Rinderblut hinzugefügt. Am dritten Tag erfolgte die Subkultivierung von bis zu 20 verdächtigen Einzelkolonien pro Platte unter den gleichen Kulturbedingungen wie oben. Anhand der Kulturmorphologie und mittels Phasenkontrastmikroskopie wurde kontrolliert, ob die Subkulturen tatsächlich Campylobacter spp. waren. Die so erhaltenen Reinkulturen wurden mithilfe einer Campylobacter-spp.-spezifischen PCR identifiziert, deren Zielgen die GTPase war (VAN DOORN et al. 1998). Da Schweine meist C. coli beherbergen, wurde anschließend eine für die Spezies C. coli spezifische PCR angewandt. Die Primer zielen auf einen C.-coli-spezifischen Teil des ceuE-Gens (enterocholin uptake periplasmic binding protein-Gen) ab (GONZALEZ et al. 1997). Dieses kodiert für ein Protein, das in den Siderophorentransport involviert ist. Im negativen Fall wurde eine C.-jejuni- spezifische PCR mit Primern durchgeführt, welche das C.-jejuni-spezifische Hip-O-Gen (Hippurikase-Gen) detektiert (HANI et al. 1995; MARSHALL et al. 1999). Die Differenzierung erfolgte jeweils für ein Campylobacter-Isolat pro Lymphknoten.

Material und Methoden 69

3.3.3 Y. enterocolitica

10 µl der Lymphknotensuspension wurden in 10 ml einer ITC (Irgasan-Ticarcilin- Kaliumchlorat)-Bouillon (Fa. Merck) gegeben und bei 25 °C 72 h lang inkubiert. Nach der Anreicherung der Yersinien in der Bouillon erfolgte das Ausplattieren auf CIN (Cefsulidin-Irgascin-Novobiocin)-Platten (Fa. Oxoid) und die Inkubation für 24-48 h bei 30 °C. Weitere 10 µl der ursprünglichen Lymphknotensuspension wurden an Tag 1 in 10 ml PBS (Phosphate buffered Saline)-Medium bei 4 °C inkubiert („Kälteanreicherung“). Das Ausplattieren des PBS erfolgte nach 7, 14 und 21 Tagen Inkubationsdauer ebenfalls auf CIN- Platten. Nach 24 bis 48 Stunden Kultivierung bei 28 °C in aerober Atmosphäre wachsen Yersinien auf CIN-Agar als ca. 1 mm große glatte Kolonien mit rosa Kranz mit dunkelrotem Zentrum, also in typischer „Kuhaugenform“. Von jeder CIN-Agarplatte wurden bis zu 20 Subkulturen auf eine frische Platte angelegt. Die Differenzierung und Bestätigung präsumptiver Y. enterocolitica erfolgte mittels Testsystem für Enterobacteriacea API ®20E (Fa. BioMerieux). Eine Serotypbestimmung durch Objektträgerschnellagglutination der präsumptiven Yersinia- Isolate wurde mit spezifischen Antiseren gegen die Y.-enterocolitica-Serotypen O:3, O:4, O:5, O:6, O:8 und O:9 durchgeführt. Die spezifischen Antiseren wurden im Kaninchen mittels Yersinia-Referenzstämmen produziert (ALEKSIC et al. 1984) und auf ihre Spezifität überprüft. Die Differenzierung erfolgte jeweils für ein Yersinia-Isolat pro Lymphknoten.

Material und Methoden 70

3.4 Serologische Untersuchung

Die Blutproben wurden über Nacht in 9 ml Monovetten®Z Luer (Fa. Sarstedt) bei Raumtemperatur gelagert. Zur Serumgewinnung wurden die Monovetten® zentrifugiert, der Überstand nachfolgend in 1 ml Plastikgefäße (Fa. Eppendorf) dekantiert und bis zum Untersuchungszeitpunkt bei -20°C tiefgefroren und an das Untersuchungslabor versendet. Die serologische Diagnostik fand im Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig statt.

3.4.1 Salmonella spp.

Das Serum wurde mittels des komerziellen SALMOTYPE® Pig Screen ELISA Tests gemäß den Herstellerangaben untersucht. Dieser Test verwendet die O-Antigene 1, 4, 5, 6, 7 und 12 als Testantigene, welche an eine Mikrotiterplatte gebunden sind. Spezifische anti-Salmonella- Antikörper bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen immobilisierten, haftenden Komplex mit den Antigenen der Mikrotiterplatte. Anti-Schwein- IgG-Peroxidase-Konjugat diente der Markierung der per Antigen an die Festphase gebundenen anti-Salmonella-Antikörper. Nichtgebundenes überflüssiges Material wird nun durch Waschen entfernt. Die abschließende qualitative Detektion des OD%-Wertes erfolgte unter Verwendung des löslichen Chromogens Tetramethylbenzidin (TMB) mittels Photometers. Die Farbreaktion korreliert mit der Konzentration der anti-Salmonella-Antikörper in der Probe (siehe Anleitung des SALMOTYPE® Pig Screen ELISA, LDL). Serumproben mit einer Antikörperkonzentration von >20 OD% (Cutoff-Wert) wurden entsprechend der Herstellerangabe als positiv bewertet.

Material und Methoden 71

3.4.2 Campylobacter spp.

Der serologische Nachweis der Campylobacter-Infektion erfolgte durch einen in-house-ELISA des Instituts für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig. Die Untersuchung erfolgte im Rahmen des ZIPP-II-Projektes. Antikörperkonzentrationen über 35 OD% führten zu einer Bewertung der Serumprobe als positiv.

3.4.3 Y. enterocolitica

Wie auch bei Campylobacter spp. wurden die serologischen Ergebnisse bezüglich Y. enterocolitica durch das Projekt ZIPP II zur Verfügung gestellt: Die Proben wurden im Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig untersucht. Als Cutoff wurden die vom Hersteller des YOP-Screen ELISA (Fa. Labordiagnostik, Leipzig) empfohlenen 20 OD% verwendet.

Material und Methoden 72

3.5 Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung

Die Salmonella-Isolate wurden gegenüber 14 und die Campylobacter-Isolate gegenüber acht antibiotischen Wirkstoffen auf ihre Empfindlichkeit getestet. Fünf der Antibiotika wurden an beiden Erregerarten zugleich überprüft, dies waren Ampicillin, Ciprofloxacin, Gentamicin, Nalidixinsäure und Tetrazyklin. Die Empfindlichkeitstestung wurde als Auftragsarbeit vom BfR in Berlin bzw. dem Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig durchgeführt.

3.5.1 Empfindlichkeitstestung der Salmonella spp.-Isolate

Die Resistenzbestimmung der Salmonella-Isolate erfolgte im Nationalen Referenzlabor für Salmonellen am BfR in Berlin, wobei die Mikrobouillonverdünnungsmethode (“broth microdilution method“) nach CLSI-Dokument M07-A8 (CLSI 2009a) Anwendung fand. Physiologische Kochsalzlösung wurde mit einem über Nacht auf Müller/Hinton-Agar gewachsenem Salmonella-Isolat so beimpft, dass sie dem Standard 0,5 McFarland (1-2 x 108 KBE/ml) entsprach. Damit wurden 11 ml Müller/Hinton-Bouillon (Fa. Becton Dickinson) beimpft, so dass ein Titer von 1-2 x 105 KBE/ml erhalten wurde. Mittels Inokulator wurden dann 50 µl dieser Suspension automatisch je Well der Mikrotiterplatte (Fa. EUMVS) dosiert. In den fertig konfektionierten Mikrotiterplatten lagen die Konzentrationen der 14 verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffe (Tab.3) in lyophilisierter Form vor und wurden durch die Zugabe der Bouillon gelöst. Die abgefüllten Mikrotiterplatten wurden mit einer Folie verschlossen und über Nacht 18-24 Stunden bei 37 °C bebrütet. Mittels Sensititre-Sensitouch-System wurden die MHK-Werte ermittelt. Für die Bewertung wurden in erster Linie die epidemiologischen Cutoffs herangezogen (www.eucast.org) (EUCAST). In den Fällen Kanamycin sowie Sulfamethoxazol wurden die klinischen Breakpoints des CLSI und im Fall von Colistin sowie Streptomycin wurden die DANMAP-Grenzwerte verwendet, da es noch keine epidemiologischen Cuttoffs gab.

Material und Methoden 73

Tabelle 3 MHK-Grenzwerte für Salmonella spp.

Wirkstoff Wirkstoffgruppe Abk. Grenzwert Testbereich [μg/ml] [μg/ml] Ampicillin Penicillin AMP >4 1 0,5 - 32 Chloramphenicol Fenicol CHL >16 1 2 - 64 Ciprofloxacin Fluorchinolon CIP >0,064 1 0,0678125 - 8 Colistin Polypeptid COL >2 2 8 - 16 Florfenicol Fenicol FFN >16 1 2 - 64 Cefotaxim Cephalosporin FOT >0.5 1 0,0625 - 4 Gentamicin Aminoglykosid GEN >2 1 0,25 - 32 Kanamycin Aminoglykosid KAN >32 3 4 - 128 Nalidixinsäure Chinolon NAL >16 1 4 - 64 Sulfamethoxazol Sulfonamid SMX >256 3 8 - 1024 Streptomycin Aminoglykosid STR >32 2 2 - 128 Ceftazidim Cephalosporin TAZ >2 1 0,25 - 16 Tetrazyklin Tetrazyklin TET >8 1 1 - 64 Trimethoprim Diaminopyrimidin TMP >2 1 0,5 - 32

Grenzwerte für Salmonella spp. nach 1EUCAST, 2 DANMAP, 3CLSI

3.5.2 Empfindlichkeitstestung der Campylobacter spp.-Isolate

Im Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig erfolgte im Rahmen des Projektes ZIPP II die Empfindlichkeitstestung der isolierten Campylobacter spp.. Getestet wurde gegenüber acht verschiedenen Antibiotika mittels Mikrodilutionstest laut CLSI-Richtlinie (NCCLS 2001). Der erste Schritt beinhaltete die Rekultivierung der Campylobacter-Stämme auf Müller-Hinton-Blutagar bei 42 °C für 48 h in mikroaerober Atmosphäre. Zur Herstellung einer Vorkultur mit ca. 108 KbE/ml wurde eine halbe Öse des Koloniematerials in 5 ml Müller-Hinton-Boullion (MHB) gegeben und für 24 h bei 37 °C mikroaerob bebrütet. Nun folgte das Überimpfen von 150 μl dieser Vorkultur in ein Glasröhrchen mit 10 ml MHB, die Keimdichte sollte ca. 106-107 KbE/ml betragen. Von diesem Inokulum wurden per 12 Kanal-Transferpipette je 100 μl in je eine Kavität der Sensititre® Mikrotiterplatte (Plattenlayout siehe Tab.3) gefüllt. Die Platte wurde mit perforierter Folie beklebt und bei hoher Luftfeuchte 24 h bei 37 °C mikroaerob bebrütet. Zur allgemeinen Wachstumskontrolle dienten 2 Kavitäten ohne Antibiotika. Die Qualitätsprüfung der Material und Methoden 74

Mikrotiterplatten erfolgte anhand von je einem C.- jejuni- und einem C.- coli-DSM- Kontrollstamm, deren MHK-Werte im Referenzbereich liegen mussten. Die Qualitätskontrolle jeder neuen MHB-Charge erfolgte mittels der ATCC-Stämme E. coli und Staph. aureus. Der MHK-Wert entsprach der geringsten Konzentration, bei der mittels Ablesespiegel kein Wachstum mehr sichtbar war. Bei bakteriostatischen Antibiotika, wie Erythromycin, Tetrazyklin und Sulfmethoxazol/Trimethoprim, erfolgte das Ablesen des MHK-Wertes bei 80 % Wachstumshemmung. Als Grenzwerte wurden größtenteils die ECOFFs verwendet, außer für Sulfamethoxazol/Trimethoprim, Ampicillin und Ampicillin/Sulbactam. Hier wurde auf die klinischen Breakpoints des CLSI zurückgegriffen, weil zum Zeitpunkt der Auswertung keine ECOFFS für Campylobacter spp. vorlagen.

Tabelle 4 MHK-Grenzwerte für C. coli und C. jejuni

Wirkstoff Spezies Grenzwert Testbereich [μg/ml] [μg/ml] jejuni >2 1 Erythromycin 0,0078125 -16 coli >8 1 jejuni >0,5 1 Gentamicin 0,015625 - 32 coli >1 1 Nalidixinsäure >16 1 0,015625 - 32

1 Ciprofloxacin beide Spezies >0,5 0,0078125 - 16 Tetrazyklin >1 1 0,0078125 - 16

Sulfamethoxazol / 0,0078125 / 0,1484375 >2/38 2 Trimethoprim (1:19) - 16 / 304 Ampicillin >16 2 0,015625 - 32 Ampicillin / 0,015625 / 0,0078125 >16 2 Sulbactam (2:1) - 32 / 16

Material und Methoden 75

3.6 Fragebogen

Die Daten zu den Beständen wurden einer Datenbank von ZIPP II entnommen, welche auf einer Erhebung mittels Fragebogen beruhte. Grundsätzlich wurden nur solche Fragen in die Auswertung miteinbezogen, die pro Antwortkategorie von mindestens drei Betrieben ausgefüllt wurden. In den Tabellen 16 und 18 befindet sich eine Aufstellung der überprüften potentiellen Risikofaktoren.

3.7 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung gliedert sich in 1. die Darstellung der serologischen und bakteriologischen Befunde auf Einzeltier- und Betriebsebene, 2. die Verknüpfung der Fragebogendaten über Betriebsmerkmale mit den Betriebsprävalenzen, um deren Eigenschaft als Risikofaktoren zu überprüfen, 3. die Darstellung der Resistenzdaten und 4. deren Verknüpfung mit den per Fragebogen erhobenen Betriebsdaten.

Datenmaterial

Insgesamt standen hierfür folgende Daten zur Verfügung: • Angaben aus dem Fragebogen über betriebliche Faktoren in 27 Schweinemastanlagen • Bakteriologische Ergebnisse von 540 Tieren bezüglich des kulturellen Salmonella-spp.-, Campylobacter-spp.- und Y.-enterocolitica-(Serovar O:3)-Status (Positiv/Negativ). Zusätzlich die Angabe über Salmonellenserovar und Phagentyp sowie über die Spezieszugehörigkeit zu C. coli bzw. C. jejuni. • Serologische Ergebnisse von 810 Tieren über den serologischen Salmonella-spp.-, Campylobacter-spp.- und Y.- enterocolitica-Status, angegeben in OD%. • MHK-Werte antibakterieller Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen für Salmonella spp. und Campylobacter spp. in μg/ml, im Falle von Y. enterocolitica wurde aufgrund der wenigen Isolate auf die Empfindlichkeitstestung verzichtet. Material und Methoden 76

Beschreibung der serologischen und kulturellen Befunde

Überblick der serologischen und kulturellen Untersuchungsergebnisse

Serologische und bakteriologische Untersuchungsergebnisse für Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica wurden auf Tierebene (statistische Einheit ist das Tier) und auf Betriebsebene (statistische Einheit ist der Betrieb) ausgewertet. Der Betriebsstatus wurde bakteriologisch als positiv definiert, wenn mindestens ein Tier einen positiven bakteriologischen Befund zeigte und serologisch als positiv definiert, wenn mindestens ein Tier des Betriebs einen Messwert >20 OD% (Salmonella spp. und Y. enterocolitica) bzw >35 OD% (Campylobacter spp.) aufwies. Auf Basis der bakteriologischen Ergebnisse wurde das Erregerspektrum der einzelnen Betriebe untersucht. Die serologischen Ergebnisse wurden hinsichtlich ihrer Verteilung ausgewertet, hierzu wurden mit der Prozedur Gchart Box-Plots gezeichnet. Der Box-Plot stellt einige charakteristische Lage- und Streuungsmaße zusammen (s. Abb. 1): Die Box umfasst typischerweise den Median als Zentrum der Daten und das untere und obere Quartil der Daten. Somit beinhaltet die Box die mittleren 50 % der Daten. Minimum und Maximum der Daten werden von der Box ausgehend als sogenannte Wiskers dargestellt (KREIENBROCK et al. 2005).

Abbildung 1 Schematische Darstellung eines Boxplots

Vergleich der serologischen und kulturellen Untersuchung

Die Kombinationen von serologischem und bakteriologischem Betriebsstatus wurden für die einzelnen Erreger getrennt aufgeführt. Auf Einzeltierebene war die Erfassung der serologischen Material und Methoden 77

und bakteriologischen Befundkombination nicht möglich, bedingt durch den technischen Ablauf bei der Probenentnahme auf dem Schlachthof. Mittels McNemar-Test wurde die Kongruenz von serologischer und bakteriologischer Untersuchung auf Betriebsebene statistisch überprüft. Der McNemar-Test diente zum Vergleich der Häufigkeitsverteilungen der diagnostischen Tests. Ein p-Wert zum McNemar-Test von ≤ 0,05 beschreibt, dass die diagnostischen Tests im Sinne der festgestellten positiven Ergebnisse signifikant verschieden reagieren. Der McNemar-Test kann nur zweiseitig durchgeführt werden. Dass heißt, er trifft eine Aussage über eine signifikante Differenz, nicht aber über die Richtung (Erhöhung oder Erniedrigung).

Erregerkombinationen

Die Erregerkombinationen wurden, getrennt nach bakteriologischen und serologischen Testergebnissen, auf Tier- und auf Betriebsebene in einer Tabelle dargestellt (Tab. 13 und Tab. 14). Die Übereinstimmung des Nachweises von zwei der drei Erreger wurde – getrennt nach serologischen und kulturellen Ergebnissen – auf Ebene des Einzeltiers, aber auch auf Betriebsebene, mit Hilfe des Homogenitätstests nach Fisher überprüft. Liegt der ermittelte p- Wert <0,05, so kann die Nullhypothese, dass eine Homogenität besteht, verworfen werden. Hierfür wurden auf Tierebene und Betriebsebene separat für Serologie und Bakteriologie alle möglichen Zweifachkombinationen der drei Erreger getestet. Da alle Betriebe einen positiven serologischen Betriebsstatus für Campylobacter spp. aufwiesen, konnte diesbezüglich kein statistischer Test durchgeführt werden.

Risikofaktorenanalyse

Um eine Risikoabschätzung der anhand des Fragebogens aufgenommenen Betriebsdaten durchzuführen, wurde für Campylobacter ein studienspezifischer Cutoff von 70 OD% festgelegt, da die Intra-Herden-Prävalenz bei dem ursprünglichen Cutoff von 35 OD% eine nur sehr geringe Varianz aufwies. Der neue Wert wurde aufgrund der Häufigkeitsverteilung der einzelnen Ergebnisse des ELISA ermittelt. Er entsprach recht genau dem Zentralwert von 2.400 Einzeltier-OD-Werten aus Vor- und Hauptuntersuchung einer Parallelstudie und führte so zu Material und Methoden 78

einer höheren Varianz der Intra-Herden-Prävalenz. Dies versprach eine bessere Ausnutzung der in den Prävalenzen vorhandenen Informationen über die Eigenschaften der Bertriebsmerkmale als Risikofaktoren. Die serologischen Voruntersuchungen wurden im Rahmen der von der Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung geförderten Forschungsstudie „Zoonoses in porc production I“ der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik durchgeführt. Auf die Ergebnisse konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit zurückgegriffen werden. Als Zielgröße für die Analysen von Risikofaktoren für positive Befunde wurde der Betriebsmittelwert aus den serologischen Einzelwerten (OD%) gebildet. Dieser Betriebsmittelwert entspricht dem geometrischen Mittel, da die Einzeltierergebnisse hierfür zunächst zur Basis 10 logarithmiert wurden. Wenn die OD-Werte <1 OD% lagen, wurden die serologischen Befunde auf 1 OD% gesetzt, um eine Auswertung auf Basis logarithmierter Werte zu ermöglichen. Die Beziehungen zwischen den quantitativ gemessenen optischen Dichten (=Antikörperkonzentration) innerhalb der Herden bei der serologischen Untersuchung und den mittels Fragebogen festgestellten Betriebsmerkmalen, welche potentielle Risikofaktoren darstellen, wurden mit Hilfe verschiedener statistisch-epidemiologischer Verfahren analysiert: Zur Untersuchung möglicher Zusammenhänge zwischen potentiellen dichotomen Risikofaktoren und den serologischen Salmonella- und Yersinia-Ergebnissen wurde der Wilcoxon-Rangsummentest angewandt, da sich die OD-Mittelwerte der Betriebe bei Salmonella und Yersinia im Shapiro-Test und Kolmogorow-Smirnov-Test als nicht normalverteilt erwiesen. Die Daten der serologischen Untersuchung auf Campylobacter spp. konnten durch Logarithmieren in eine Normalverteilung transformiert werden, deshalb erfolgte hier der Einsatz des t-Testes bei der Überprüfung der dichotomen Risikofaktoren. Vorgeschaltet wird standardmäßig der F-Test, der Unterschiede der Varianzen berechnet. Lieferte dieser F-Test einen signifikanten p-Wert (p<0,05), so wurde der p-Wert zum t-Test nach Satterthwaite herangezogen. Lieferte der F-Test einen nicht signifikanten p-Wert, so verwendete man den p- Wert zum Pooled t-Test. Ein p-Wert (Überschreitungswahrscheinlichkeit) von ≤0,1 wird im Ergebnisteil bei dieser Analyse als statistisch signifikant bezeichnet. Material und Methoden 79

Für die stetigen Risikovariablen wurde mittels der SAS-Prozedur GLM eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt.

Risikofaktoren für Erregerkombinationen

Es wurden jeweils bezüglich eines Risikofaktors die Odds Ratios für die Chance des serologischen Auftretens von einem, zwei oder drei Erregern gegenüber der Chance des Auftretens von keinem Erreger (Erregerfreiheit) bestimmt. Das Odds Ratio ist ein Assoziationsmaß, bei dem zwei Odds miteinander verglichen werden. Der Begriff “Chance“ (engl. Odds) stellt eine Ereignisaufteilung dar (z.B. 1:1). Dividiert man die Chance eines Ereignisses bei Exposition durch die Chance des Ereignisses bei Nichtexposition, so erhält man als Chancenverhältnis das Odds Ratio. Das Odds Ratio ist der Faktor, um den die Chance für das Ereignis steigt, wenn das Individuum exponiert ist. Bei einem Odds Ratio von 1 besteht kein Zusammenhang zwischen Exposition und Ereignis, bei einem Odds Ratio <1 verringert die Exposition die Chance und bei >1 erhöht die Exposition die Chance für das Ereignis (KREIENBROCK et al. 2005).

Auswertung der Resistenzen

Die minimale Hemmkonzentration (MHK-Wert) wurde bestimmt, dieser Wert entspricht der niedrigsten Konzentration, bei welcher kein Bakterienwachstum mehr stattfindet. Lag bei der niedrigsten getesteten Antibiotika-Konzentration kein Bakterienwachstum mehr vor, dann wurde diese Stufe als MHK-Wert angenommen. War bei der höchsten getesteten Antibiotikakonzentration ein Bakterienwachstum feststellbar, so wurde als MHK der nächsthöhere Wert angenommen. Die Resistenzen werden für Salmonella spp. getrennt nach Serovar und für Campylobacter spp. getrennt nach Spezies beschrieben sowie die jeweiligen die Resistenzmuster der einzelnen Isolate dargestellt. Ein Vergleich zwischen den Resistenzen von Salmonella spp. und Campylobacter spp. wird bezüglich der fünf bei beiden Erregerarten getesteten Antibiotika angestellt.

Material und Methoden 80

Risikofaktorenanalyse für die MHK-Werte

Um die Resistenzlage eines Betriebes zu charakterisieren, wurden pro Betrieb geometrische Mittelwerte der MHKs gebildet und mit dem Wilcoxon-Test Zusammenhänge zwischen fünf verschiedenen Risikofaktoren dichotomer Ausprägung und diesen geometrischen Mittelwerten überprüft. Als zu überprüfende potentielle Risikofaktoren wurde der Einsatz von antibiotischer Pro-/Metaphylaxe, die Belegungsart (Rein-Raus oder kontinuierlich), die Anzahl der Händler, die Fütterungsart und der Einsatz von Säure in Futter oder Wasser zur Analyse ausgewählt. Außerdem wurde eine Regression des stetigen Risikofaktors Betriebsgröße auf die geometrischen MHK-Betriebsmittelwerte durchgeführt. Diese sechs Faktoren wurden ausgewählt, weil bei ihnen ein Zusammenhang mit dem Auftreten von Resistenzen vermutet wurde. Das geometrische Mittel aller MHK-Werte des jeweiligen Erregers eines Betriebes wurde, auf Grundlage der logarithmierten Werte zur Basis 2, gebildet und als Maßzahl für die Empfindlichkeit der Isolate innerhalb eines Bestandes den Betriebsmerkmalen gegenübergestellt. Der geometrische Mittelwert entspricht der n-ten Wurzel aus dem Produkt aller Merkmalswerte. Wenn, wie im Falle der MHK-Werte, eine logarithmische Skala der Daten vorliegt, sollte das geometrische Mittel verwendet werden. Hat die Skala einen multiplikativen Charakter, so ist die Charakterisierung eines Lagemaßes durch eine Summe, wie sie das arithmetische Mittel darstellt, nicht sinnvoll (KREIENBROCK et al. 2005). Sämtliche Berechnungen wurden mit der Software SAS 9.1 (SAS et al. Copyright (c) 2002- 2003) durchgeführt.

Ergebnisse 81

4 Ergebnisse

4.1 Serologische und kulturelle Untersuchung auf Einzeltierebene

Die kulturelle Untersuchung auf Salmonella spp. ergab einen Anteil von 3,1 % (n=17) positiven Lymphknoten der untersuchten Tiere und 25,9 % (n=7) positiven Herden. Von den 17 getesteten Salmonella-Stämmen gehörten 16 Stämme dem Serovar S. Typhimurium und ein Stamm dem Serovar S. Brandenburg an. Bei den S.-Typhimurium-Isolaten wurden die vier verschiedene Phagentypen DT 104 (n=3), DT 107 (n=4), DT 193 (n=1) und NT (n=2) identifiziert. Sechs Isolate reagierten zwar mit Phagen, gehörten aber zu keinem bekannten Phagentyp (RDNC: react but did not confirm to a known phagetype). Serologisch Salmonella- positiv waren 19,7 % (n=160) der Tiere und 48,2 % (n=13) der Herden (Tab. 5 u. 6). In 12 Betrieben waren alle Tiere sowohl serologisch als auch bakteriologisch negativ, in fünf Betrieben traten sowohl serologisch als auch kulturell positive Mastschweine auf, bei acht Betrieben waren die Tiere ausschließlich serologisch und bei zwei (von insgesamt sieben kulturell positiven Betrieben = 28,6 %) Betrieben ausschließlich bakteriologisch positiv. Die Testprävalenzen lagen bei der bakteriologischen Untersuchung zwischen 5 % und 25 % und bei der serologischen Untersuchung zwischen 0 % und 93,3 % positiven Tieren pro Bestand (Abb. 2).

Ergebnisse 82

serologisch bakteriologisch 100

90

80

70

60

50

40

30

Bestandsprävalenz (%) 20

10

0 123456789101112131415161718192021222324252627 Mastbestand-Nr.

Abbildung 2 Serologische und bakteriologische Bestandsprävalenzen für Salmonella spp.

Tabelle 5 Anteil positiver Proben bei der bakteriologischen und serologischen Untersuchungen auf Betriebsebene

Betriebsebene N= Salmonella spp. Campylobacter spp. Y. enterocolitica Bakteriologie 27 (100 %) 7 (25,9 %) 12 (44,4 %) 2 (7,4 %) Serologie 27 (100 %) 13 (48,2 %) 27 (100 %) 22 (81,5 %)

Tabelle 6 Anteil positiver Proben bei der bakteriologischen und serologischen Untersuchungen auf Tierebene

Tierebene N= Salmonella spp. Campylobacter spp. Y. enterocolitica Bakteriologie 540 (100 %) 17 (3,1 %) 49 (9,1 %) 2 (0,4 %) Serologie 810 (100 %) 160 (19,7 %) 712 (87,9 %) 565 (69,7 %)

Ergebnisse 83

Campylobacter spp. wurden in 9,1 % (n=49) der Lymphknoten der untersuchten Tiere bzw. 44,4 % (n=12) der Bestände bakteriologisch nachgewiesen. 48 der insgesamt 49 Campylobacter-Isolate konnten speziesspezifiziert werden, davon gehörten 37 (77,1 %) zu C. coli und 11 (22,9 %) zu C. jejuni. Im serologischen Nachweis (Cutoff=35 OD%) waren 87,9 % aller Tiere (n=712) und alle 27 Betriebe positiv (Tab. 5 u. 6). In 15 Betrieben traten ausschließlich serologisch positive Tiere auf und in den restlichen 12 Betrieben gab es sowohl serologisch, als auch bakteriologisch positiv getestete Tiere. Die Testprävalenzen der Bestände lagen bakteriologisch zwischen 0 % und 45 % und serologisch zwischen 66 % und 100 % (Abb. 3).

serologisch bakteriologisch 100

90

. 80

70

60

50

40

30

Bestandsprävalenz (%) (%) Bestandsprävalenz 20

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627 Mastbestand-Nr.

Abbildung 3 Serologische und bakteriologische Bestandsprävalenzen für Campylobacter spp.

Ergebnisse 84

Die bakteriologische Untersuchung auf Y. enterocolitica erbrachte bei 0,4 % der untersuchten Lymphknoten (n=2) positive Ergebnisse. 7,4 % der Bestände (n=2) erwiesen sich als positiv. Alle Isolate gehörten dem Serovar O:3 an. Antikörper gegen Y. enterocolitica wurden bei 69,7 % (n=565) aller untersuchten Tiere und 81,5 % (n=22) der Bestände gefunden (Tab. 5 u. 6). In zwei Beständen kamen sowohl bakteriologisch als auch serologisch positive Tiere vor, in fünf Betrieben waren alle Schweine in beiden Testverfahren negativ und in 20 Betrieben kamen serologisch positive, aber keine kulturell positiven Tiere vor. Die bakteriologischen Testprävalenzen pro Bestand lagen zwischen 0 und 5 %, während die serologischen zwischen 0 und 100 % (Abb. 4).

serologisch bakteriologisch 100

90

80

70

60

50

40

30

20 Bestandsprävalenz (%) 10

0 123456789101112131415161718192021222324252627 Mastbestand-Nr.

Abbildung 4 Serologische und bakteriologische Bestandsprävalenzen für Y. enterocolitica

Ergebnisse 85

4.2 Serologische und kulturelle Untersuchung auf Betriebsebene

Die Ergebnisse der serologischen Untersuchung ließen Unterschiede in der Verteilung der Betriebsmittelwerte der Antikörperkonzentrationen (in OD %) für Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica erkennen. Die mittleren Salmonella-Antikörpertiter unterschieden sich zwischen den Betrieben nur gering, während die OD-Betriebsmittelwerte der Campylobacter- und Yersinia-Antikörperkonzentrationen stärker differierten. Die Betriebsmittelwerte wurden beeinflusst durch Ausreißer auf Einzeltierebene, und zwar bei Campylobacter spp. nach oben und bei Y. enterocolitica nach unten hin (Abb.5). Die Betriebsmittelwerte der OD%-Werte lagen bei Salmonella spp. im Durchschnitt am niedrigsten (14,3 OD%), und bei Campylobacter spp. am höchsten (65,3 OD%). Bei Y. enterocolitica lagen hingegen der Median und das Maximum der Betriebsmittelwerte am höchsten (siehe Tab.7).

Tabelle 7 Verteilung der OD% Betriebsmittel

Mean 25 % 50 % Q 2 75 % Min. Max.

Quantil (Median) Quantil Salmonella spp. 14,3 1,8 3,2 27,2 1,3 63,2 Campylobacter spp. 65,3 58,3 65,3 72,2 49,8 90,4 Y. enterocolitica 57,5 14,7 70,4 81,9 5,1 101,9

Mittels kultureller Untersuchung wurden in sieben Betrieben Salmonella spp. nachgewiesen, in 12 Betrieben traten Campylobacter spp. auf, davon in fünf Betrieben ausschließlich C. coli und in sieben Betrieben zusätzlich C. jejuni. Y. enterocolitica wurde in zwei Betrieben isoliert.

Tabelle 8 Bestandsübersicht der kulturellen Erregernachweise

Ergebnisse 86

OD % 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Salmonella spp. Bestand 1-27

OD % 240

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Campylobacter spp. Bestand 1-27 OD % 240 220 200 180 160 140

120 100 80 60 40 20 0 Bestand 1-27 Y. enterocolitica

Abbildung 5 Boxplots für die Seroprävalenzen

Ergebnisse 87

4.3 Vergleich der serologischen und kulturellen Ergebnisse

Bei 17 Beständen stimmten der kulturelle und serologische Salmonella-Betriebsstatus überein, davon waren zwölf Betriebe sowohl bakteriologisch als auch serologisch negativ (s. Tab.9). Beim Vergleich beider Diagnostikmethoden bezüglich des Vorkommens von Salmonella- Infektionen ergab sich im McNemar-Test keine signifikante Differenz (p= 0,0578), was für einen Zusammenhang von serologischem und bakteriologischem Salmonella-Betriebsstatus spricht.

Tabelle 9 Salmonella spp.: Vergleich kultureller und serologischer Resultate

Kulturell Kulturell

negativ positiv Serologisch n 12 2 14 negativ Anteil 44,4 % 7,4 % 51,8 % Serologisch n 8 5 13 positiv Anteil 29,6 % 18,5 % 48,1 % n 20 7 27 Anteil 74,1 % 25,9 % 100 %

Ein detaillierter Vergleich der serologischen und bakteriologischen Untersuchungsergebnisse auf Campylobacter spp. erübrigte sich, da alle Betriebe als serologisch positiv eingestuft wurden (s. Tab.10).

Tabelle 10 Campylobacter spp.: Vergleich kultureller und serologischer Resultate

Kulturell Kulturell

negativ positiv Serologisch n 0 0 0 negativ Anteil 0 % 0 % 0 % Serologisch n 15 12 27 positiv Anteil 56,6 % 44,4 % 100 % n 15 12 27 Anteil 56,6 % 44,4 % 100 %

Ergebnisse 88

Bezüglich Y. enterocolitica hatten die meisten der Betriebe (n=20) einen serologisch positiven und gleichzeitig bakteriologisch negativen Status. Zwei der Betriebe waren sowohl bakteriologisch als auch serologisch positiv. Der p-Wert zum McNemar-Test von <0.0001 zeigt für Y. enterocolitica eine Unabhängigkeit des bakteriologischen von dem serologischen Betriebsstatus (s. Tab. 11).

Tabelle 11 Y. enterocolitica: Vergleich kultureller und serologischer Resultate

Kulturell Kulturell

negativ positiv Serologisch n 5 0 5 negativ Anteil 18,5 % 0 % 18,5 % Serologisch n 20 2 22 positiv Anteil 74,1 % 7,4 % 81,5 % n 25 2 27 Anteil 92,6 % 7,4 % 100 %

Ergebnisse 89

4.4 Auftreten mehrerer Erreger

4.4.1 Erregerkombinationen auf Einzeltierebene

Wie Tabelle 12 zeigt, waren in der kulturellen Untersuchung 88 % (n=475) der 540 untersuchten Tiere negativ bezüglich aller getesteten Erreger (Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica). Zum Nachweis eines einzigen Erregers kam es bei einem Anteil von 11,5 % (n=62) der Tiere, hiervon waren 74,2 % (n=46) einfach positiv für Campylobacter spp., 22,6 % (n=14) für Salmonella spp. und 3,2 % (n=2) für Y. enterocolitica (Tab.13). Zweifach bakteriologisch positiv war mit 0,5 % (n=3) nur ein sehr kleiner Anteil der Proben, in welchen jeweils stets Salmonella spp. und Campylobacter spp. gleichzeitig nachgewiesen wurden. Kulturell wurden bei keinem Tier alle drei Erreger gleichzeitig nachgewiesen. Serologisch zeigten sich die meisten der getesteten 810 Tiere (56,8 %, n=460) zweifach positiv, wobei hiervon 87 % (n=400) Campylobacter-spp.- und Y.-enterocolitica-positiv, 11 % (n=51) Salmonella-spp. und Campylobacter-spp.-positiv sowie 2 % (n=9) Salmonella-spp. und Y.- enterocolitica-positiv waren. 31,9 % (n=258) der Tiere waren serologisch positiv gegenüber einem der Erreger, davon waren 26,4 % (n=62) Y.-enterocolitica-positiv., 71,1% (n=167) Campylobacter-spp.-positiv und 2,6 % (n=6) der Tiere Salmonella-spp.-positiv. 2,6 % (n=21) der Tiere waren serologisch gegenüber keinem der Erreger positiv, während 11,6 % (n=94) der Schweine gegenüber allen drei Erregern serologisch positiv waren (Tab. 12 u. Tab. 13).

4.4.2 Erregerkombinationen auf Bestandsebene

10 (37 %) der insgesamt 27 Bestände waren bakteriologisch negativ, während bei Tieren von 17 (63 %) Beständen mindestens einer der drei Erreger kulturell isoliert wurde. In den meisten Beständen (n=14, 51,9 %) wurde ausschließlich eine Erregerart nachgewiesen. Dies waren in 28,6 % (n=4) der Fälle Salmonella spp., in 64,3 % (n=9) der Fälle Campylobacter spp. und in 7,1 % (n=1) Y. enterocolitica. Aus 7,4 % (n=2) aller untersuchten

Ergebnisse 90

Bestände konnten die zwei verschiedenen Erreger Salmonella spp. und Campylobacter spp. isoliert werden. Alle drei Erregerarten gleichzeitig waren in einem der Bestände nachweisbar. Serologisch war keiner der Bestände negativ gegenüber allen drei Erregerarten, hingegen waren 40,7 % (n=11) der Bestände gegen alle drei getesteten Erreger serologisch positiv. Einfach positiv waren 11,1 % (n=3) der Bestände, diese reagierten einheitlich Campylobacter-positiv. Die meisten Bestände (48,2 %, n=13) stellten sich in der serologischen Untersuchung zweifach positiv dar, wovon wiederum bei 84,6 % (n=11) eine Kombination von Antikörpern gegen Campylobacter spp. und Y. enterocolitica und bei 15,4 % (n=2) eine Salmonella spp.- Campylobacter spp.-Antikörperkombination nachgewiesen wurde (Tab. 13 u. Tab. 14).

Tabelle 12 Übersicht über Erregerkombinationen

Bakteriologie Tier Bestand n % n % negativ 475 88 10 37 1-fach positiv gesamt 62 11,5 14 51,9 2-fach positiv gesamt 3 0,5 2 7,4 3-fach positiv gesamt 0 0 1 3,7

Serologie Tier Bestand n % n % negativ 21 2,6 0 0 1-fach positiv gesamt 235 29 3 11,1 2-fach positiv gesamt 460 56,8 13 48,2 3-fach positiv gesamt 94 11,6 11 40,7

Ergebnisse 91

Tabelle 13 Kombinierter kultureller Erregernachweis in Einzeltieren und in Beständen

Tier Bestand Bakteriologie n % n % 1-fach positiv Salmonella spp. 14 22,6 4 28,6 Campylobacter spp. 46 74,2 9 64,3 Y. enterocolitica 2 3,2 1 7,1 1-fach positiv gesamt 62 100 14 100 2-fach positiv Salmonella spp., Campylobacter spp. 3 100 2 100 2-fach positiv gesamt 3 100 2 100 3-fach positiv 3-fach positiv gesamt 0 0 1 100

Tabelle 14 Kombinierter serologischer Nachweis in Einzeltieren und in Beständen

Tier Bestand Serologie n % n % 1-fach positiv Salmonella spp. 6 2,6 0 0 Campylobacter spp. 167 71,1 3 100 Y. enterocolitica 62 26,4 0 0 1-fach positiv gesamt 235 100 3 100 2-fach positiv Salmonella spp., Campylobacter spp. 51 11,1 2 15,4 Salmonella spp., Y. enterocolitica 9 2,0 0 0 Campylobacter spp., Y. enterocolitica 400 87,0 11 84,6 2-fach positiv gesamt 460 100 13 100 3-fach positiv 3-fach positiv gesamt 94 100 11 100

Ergebnisse 92

Um Zusammenhänge zwischen dem Auftreten der Erreger festzustellen, wurde für alle zweifach serologisch positiven Bestände und Einzeltiere der Fisher-Test angewandt. Jedoch gab es hier keinerlei signifikante p-Werte, welche auf einen Zusammenhang hindeuten würden (Tab. 15).

Tabelle 15 Fisher-Test der einzelnen Erregerkombinationen, auf Tier- und Bestandsebene, jeweils für den serologischen und bakteriologischen Status

Erregerkombination Ebene Untersuchungsart p-Wert bakteriologisch 1 Bestand Salmonella spp. serologisch - Campylobacter spp. bakteriologisch 0,19 Tier serologisch 0,28 bakteriologisch 0,46 Salmonella spp. Bestand serologisch 0,10 Y. enterocolitica bakteriologisch 1 Tier serologisch 0,10 bakteriologisch 1 Campylobacter spp. Bestand serologisch - Y. enterocolitica bakteriologisch 1 Tier serologisch 0,56

Ergebnisse 93

4.5 Risikofaktoren für das Auftreten der Erreger

4.5.1 Dichotome Risikovariablen

Die potentiellen Risikofaktoren für jeden der drei Erreger wurden zunächst getrennt analysiert. Die jeweiligen p-Werte sind in Tabelle 16 dargestellt. Das Mittel der Salmonella-OD-Werte auf Bestandsebene lag höher bei Beständen, welche die Kümmerer zurückstellten. Als Kümmerer werden im Allgemeinen einzelne hinter dem Altersgruppendurchschnitt zurückgebliebene Schweine bezeichnet. Bestände mit lediglich einem Zulieferbestand hatten signifikant niedrigere Salmonella-OD-Betriebsmittel als Betriebe mit zwei oder mehr Zulieferbetrieben. In Betrieben, welche die Nagerbekämpfung nach Plan durchführten ergaben sich höhere Salmonella-OD-Betriebsmittel als in Betrieben, mit einer nach Bedarf vorgenommenen Nagerbekämpfung. In rinderhaltenden Betrieben lag das Salmonella-OD-Betriebsmittel höher als in reinen Schweinemastbetrieben.

Die Campylobacter-OD-Betriebsmittelwerten lagen in Beständen signifikant niedriger, welche das Rein-Raus-System sowie Reinigung und Desinfektion stall- statt abteilweise durchführten. Betriebe mit Pferdehaltung sowie Katzenhaltung wiesen durchschnittlich höhere Campylobacter-OD-Betriebsmittel auf. Betriebe mit Hundehaltung hingegen zeigten niedrigere OD-Betriebsmittel im Vergleich zu der Gesamtheit der untersuchten Bestände.

Die Yersinia-OD-Betriebsmittel lagen signifikant höher in Betrieben, welche in der Endmast Trockenfutter verwendeten. Ebenfalls hatten Betriebe, welche ausschließlich mehlförmiges Futter verwendeten, signifikant höhere Yersinia-OD-Betriebsmittel als Betriebe, welche ausschließlich (bzw. zusätzlich) pelletiertes oder gekrümeltes Futter einsetzten. Betriebe der Salmonellenkategorie I wiesen im Vergleich zu Betrieben der Kategorie II und III signifikant höhere mittlere Yersinia-Antikörperkonzentrationen auf.

Ergebnisse 94

Tabelle 16 p-Werte geprüfter potentieller dichotomer Risikofaktoren (Wilcoxon-bzw. T-Test), ……………….p-Werte <0,1 gelten als statistisch auffällig (grau hinterlegt) Salmonella Betriebe Anzahl Campylobacter Y. enterocolitica spp. spp.

dichotomer Einflussfaktor j:n Kontinuierliche Belegung (vs. Rein-Raus-System) 8:19 0,3005 0,771 0,8111 Falls Rein-Raus: Abteilweise (vs. Stallweise) 13:6 0,6295 0,0051 1,0000 Zurückstallen von Kümmerern 13:14 0,0617 0,8761 0,1667 Falls Zurückstallen: Gesondertes Abteil 8:5 0,9417 0,5321 0,4208 Durchgehend Vollspaltenboden 12:15 0,4792 0,4793 0,5419 Tierherkunft von Händler 8:19 0,2536 0,6561 0,9788 Tierherkunft von einem einzigen Ferkelzulieferer 18:9 0,0109 0,5782 0,8170 Wechsel des Zulieferbetriebes 4:23 0,9185 0,2334 0,3568 Hygieneschleuße vorhanden 20:7 0,5992 0,6488 0,5992 Desinfektionsmatte vorhanden 17:10 0,1386 0,9436 0,3033 Reinigung abteil-/buchten- (vs. stallweise) 20:7 0,8465 0,0287 0,5613 Desinfektion abteil/-buchten- (vs. stallweise) 20:7 0,8465 0,0287 0,5613 Nagerbekämpfung: regel- (vs. planmäßig) 13:14 0,0494 0,9219 0,4817 Zusätzliche Pferdehaltung auf Betrieb 10:15 0,8029 0,0188 0,1416 Zusätzliche Rinderhaltung auf Betrieb 5:20 0,0960 0,9011 0,6588 Zusätzliche Geflügelhaltung auf Betrieb 4:21 0,6299 0,6637 0,8530 Zusätzliche Hundehaltung auf Betrieb 17:8 0,5029 0,0878 0,1710 Zusätzliche Katzenhaltung auf Betrieb 18:7 0,2629 0,0003 0,6940 Zugang dieser Haustiere zum Schweinestall 6:21 0,3660 0,0927 0,7930 Zugang von Katzen zum Schweinestall 3:3 1,0000 0,0492 1,0000 Ausschließliche Verwendung hofeigenen Futters 14:13 0,2345 0,4471 0,1523 Ausschließliche Verwendung zugekauften Futters 10:17 0,4074 0,986 0,1027 Ausschließliche Flüssigfütterung in der Endmast 4:23 0,2323 0,3715 0,7074 Ausschließliche Trockenfütterung in der Endmast 3:24 0,2030 0,7538 0,0151 Ausschließliche Breifütterung in der Endmast 13:14 0,1821 0,7735 0,3198 Fütterung beliebiger Kombination in der Endmast 7:20 0,7191 0,4079 0,3613 Ausschließl. Fütterung mehlf. Futters in der Endmast 18:9 0,5203 0,9945 0,0372 Zugabe von Säure zu Futter o. Wasser 6:21 0,3359 0,9872 0,6201 Tränken mit Stadtwasser vs. Brunnenwasser 12:14 0,7381 0,1173 0,6620 Zugehörigkeit zu Salmonellenkategorie II o III (vs. I) 6:21 0,2554 0,8643 0,0965 Vorkommen wiederkehrender Bestandsprobleme 4:24 0,7274 0,551 0,8465 Routinemäßiger Einsatz einer Pro-/Metaphylaxe 9:15 0,4743 0,0951 0,4038

Ergebnisse 95

4.5.2 Stetige Risikovariablen

Die Analyse des Einflusses der potentiellen stetigen Risikovariablen mittels Regressionsanalyse zeigte, dass mit steigender Anzahl von Mastplätzen oder mit steigender Frequenz von Zukäufen die OD-Betriebsmittelwerte der serologischen Untersuchung auf Campylobacter spp. signifikant höher lagen (Tab.17). Je niedriger die Yersinia-OD-Betriebsmittelwerte lagen, desto höher waren die Gewichtszunahmen. Bezüglich der serologischen Salmonellenbelastung konnte kein signifikanter Effekt bei den untersuchten stetigen Risikovariablen festgestellt werden.

Tabelle 17 p-Werte des Tests auf Steigung=0, mittels Regressionsanalyse geprüfte stetige potentielle Risikofaktoren

Salmonella Campylobacter Y. stetiger Einflussfaktor spp. spp. Enterocolitica Entfernung nächster Schweinebetrieb 0,3290 0,9530 0,6380 Entfernung nächster Geflügelbetrieb 0,3090 0,7920 0,6900 Anzahl der Mastplätze 0,2110 0,0602 0,7550 Verlustrate Ferkel 0,7630 0,9990 0,1800 Zukauffrequenz neuer Tiere 0,6600 0,0359 0,4570 Buchtenleerstand nach R&D 0,1283 0,1610 0,3295 tägliche Gewichtszunahme 0,7376 0,4898 0,0198

Ergebnisse 96

4.5.3 Risikofaktoren für das Auftreten von einem oder mehreren Erregern

Die Chance des Auftretens eines positiven serologischen Untersuchungsergebnisses für einen, zwei oder alle drei Erreger im Bestand in Abhängigkeit eines Risikofaktors wurde untersucht und als Odds Ratio wiedergegeben. Dabei wurde die Anwesenheit von einem, zwei oder allen drei Erregern als positiv definiert. Die Chance auf ein positives serologisches Untersuchungsergebnis bezüglich eines, zweier und dreier Erreger war erhöht (untere Grenze des Konfidenzintervalls >1) bei Beständen mit einem der folgenden zehn Einflussfaktoren (Tab.18): • beim Vorliegen von Bestandsproblemen • bei Einsatz einer Pro- bzw. Metaphylaxe • bei Nichtvorhandensein eines kompletten Vollspaltenbodens • bei Fehlen einer Hygieneschleuse • bei Ferkelherkunft aus zwei oder mehr Beständen • bei der Verwendung von Brunnenwasser an Stelle von Stadtwasser zum Tränken • bei Nichtzusatz von Säure zu Futter oder Wasser • beim Zurückstellen von Kümmerern zu den gesunden Tieren • bei Durchführung der Nagerbekämpfung nach Plan (statt nach Bedarf) • bei Verfütterung von ausschließlich mehlförmigem Futter.

Mit dem Auftreten von einem und zweien der Erreger auf demselben Bestand war einerseits • die Verfütterung von ausschließlich Trockenfutter und andererseits • die Verfütterung von ausschließlich Flüssigfutter assoziiert. Mit dem Auftreten von drei Erregern auf demselben Bestand waren • die Zugehörigkeit zur Salmonellenkategorie III • eine unvollständige Reinigung und Desinfektion des Stalles • ein unvollständiges Rein-Raus-System • die Fütterung von ausschließlich zugekauftem Futter • die Fütterung von nicht-breiförmigem Futter • die Herkunft von mehreren Händlern assoziiert.

Ergebnisse 97

Eine geringere Chance für das Auftreten eines, zweier und dreier Erregern in einem Bestand war assoziiert mit der Fütterung von beliebig kombinierten Futterkonsistenzen. Die Chance für das Auftreten von einem und zwei Erregern war erhöht und für das Vorkommen von drei Erregern erniedrigt bei kontinuierlicher Belegung des Stalles (Tab.18 und Tab.19).

Tabelle 18 Odds Ratios der Risikofaktoren mit erhöhter Chance auf positives serologisches Untersuchungsergebnis für einen, zwei und drei Erreger

Konfidenzintervall Risikofaktor Serologie O R untere obere Grenze Grenze Die Chance ist für das Auftreten von Ak gegen einen, zwei oder drei Erreger erhöht: 1 Erreger 1,8662 0,9658 3,6061 Bestandsprobleme 2 Erreger 2,1322 1,0743 4,2319 3 Erreger 1,4722 0,5150 4,2087 1 Erreger 1,2422 0,8087 1,9080 Einsatz einer Pro-/Metaphylaxe 2 Erreger 2,0118 1,2542 3,2269 3 Erreger 1,5049 0,7234 3,1309 1 Erreger 8,9928 5,3306 15,1710 Kein kompletter Vollspaltenboden 2 Erreger 8,2990 4,8257 14,2720 3 Erreger 3,9583 1,8330 8,5481 1 Erreger 5,2405 2,5683 10,6931 Mehr als ein Zulieferbestand 2 Erreger 8,8800 4,3098 18,2967 3 Erreger 76,0556 25,3685 228,0165 1 Erreger 3,1563 1,6676 5,9739 Keine Hygieneschleuse 2 Erreger 4,4220 2,3074 8,4743 3 Erreger 3,4839 1,4246 8,5200 1 Erreger 1,9945 1,2872 3,0906 Verwendung von Brunnenwasser 2 Erreger 2,8945 1,8179 4,6087 3 Erreger 9,6264 3,9212 23,6324 1 Erreger 5,5932 3,5573 8,7943 Kein Säurezusatz in Futter oder Wasser 2 Erreger 4,4894 2,7849 7,2369 3 Erreger 2,0714 0,9969 4,3043 1 Erreger 1,0313 0,3486 3,0507 Zurückstellen von Kümmerern 2 Erreger 2,2826 0,7572 6,8812 3 Erreger 29,0000 3,0505 275,6939 1 Erreger 1,7225 1,1220 2,6441 Nagerbekämpfung nach Plan 2 Erreger 2,5664 1,6327 4,0339 3 Erreger 2,7778 1,3589 5,6786 1 Erreger 2,7398 1,8018 4,1667 Verfütterung von ausschließlich mehlförmigem Futter 2 Erreger 3,7831 2,3923 5,9809 3 Erreger 1,2804 0,6373 2,5727

[im Konfidenzintervall ist die 1 eingeschlossen (weiß); bzw. nicht eingeschlossen (grau)].

Ergebnisse 98

Tabelle 19 Odds Ratios weiterer getesteter Risikofaktoren für das Auftreten von Antikörpern (Ak) gegen einen, zwei oder drei Erreger.

Konfidenzintervall Risikofaktor Serologie O R untere obere Grenze Grenze Die Chance ist für das Auftreten von Ak gegen einen und zwei Erreger erhöht: 1 Erreger 19,1821 2,6247 140,8451 Verfütterung von ausschließlich Trockenfutter 2 Erreger 18,6771 2,5272 138,8889 3 Erreger - - - 1 Erreger 1,1227 0,5986 2,1058 Verfütterung von ausschließlich Flüssigfutter 2 Erreger 1,3282 0,7369 2,394 3 Erreger - - - Die Chance ist für das Auftreten von Ak gegen einen und zwei Errreger erniedrigt und drei Erreger erhöht: 1 Erreger 0,3526 0,2227 0,5583 Salmonellenkategorie III 2 Erreger 0,3989 0,2446 0,6505 3 Erreger 2,7387 1,3382 5,6052 1 Erreger 0,1635 0,0829 0,3227 Keine Reinigung des kompletten Stalles 2 Erreger 0,3066 0,1508 0,6234 3 Erreger 1,8636 0,3916 8,8684 1 Erreger 0,1635 0,0829 0,3227 Keine Desinfektion des kompletten Stalles 2 Erreger 0,3066 0,1508 0,6234 3 Erreger 1,8636 0,3916 8,8684 1 Erreger 0,1383 0,0687 0,2784 Kein Rein-Raus-System 2 Erreger 0,3732 0,1780 0,7822 3 Erreger 4,4444 0,5482 36,0331 1 Erreger 0,7614 0,5004 1,1586 Fütterung von ausschl. zugekauftem Futter 2 Erreger 0,7896 0,5061 1,2317 3 Erreger 2,2161 1,0879 4,5142 1 Erreger 0,5888 0,3898 0,8895 Fütterung von nicht-breiförmigem Futter 2 Erreger 0,6987 0,452 1,0799 3 Erreger 4,0682 1,677 9,8688 1 Erreger 0,6735 0,4324 1,0492 Herkunft von mehreren Händlern 2 Erreger 0,9153 0,5768 1,4523 3 Erreger 1,9091 0,9403 3,8762 Die Chance ist für das Auftreten von Ak gegen einen, zwei und drei Erreger erniedrigt: 1 Erreger 0,8403 0,5354 1,3189 Fütterung einer beliebigen Kombination der 2 Erreger 0,7698 0,4754 1,2464 Futterkonsistenz 3 Erreger 0,4537 0,1847 1,1146 Die Chance ist für das Auftreten von Ak gegen einen und zwei Erreger erhöht und drei Erreger erniedrigt: 1 Erreger 1,4683 0,9184 2,3474 Kontinuierliche Belegung 2 Erreger 1,4360 0,8764 2,3529 3 Erreger 0,5089 0,1951 1,327

[im Konfidenzintervall ist die 1 eingeschlossen (weiß); bzw. nicht eingeschlossen (grau)].

Ergebnisse 99

In Abbildung 6 ist der Einfluss des Risikofaktors auf den serologischen Erregernachweis am Beispiel des Vollspaltenbodens noch einmal verdeutlicht worden. Es zeigte sich, dass Erregerfreiheit bei durchgehendem Spaltenboden vermehrt nachweisbar war und bei durchgehendem Spaltenboden außerdem weniger häufig ein und zwei Erreger nachgewiesen wurden als bei Teilspaltenboden oder fehlendem Spaltenboden.

% Tiere Anzahl Erreger Fussvoll10a_n

0 ja 27.78 nein 4.44

1 ja 38.61 nein 55.56

2 ja 26.94 nein 35.78

3 ja 6.67 nein 4.22

0 102030405060708090100

% Tiere

durchgehender VollspaltenbodenFussvoll10a_n ja nein

Abbildung 6 Einfluss des Risikofaktors „durchgehender Vollspaltenboden“ auf den serologischen Erregernachweis

Ergebnisse 100

4.6 Auswertung der Resistenzen

4.6.1 Resistenzen bei Salmonella spp. Das einzige nicht dem Serovar Typhimurium zugehörige Isolat, S. Brandenburg, erwies sich als sensibel gegenüber allen Wirkstoffen. Da Resistenzen bei Salmonella spp. serovarabhängig sind, werden im Folgenden nur noch die Resistenzergebnisse der 16 S. Typhimurium-Isolate weiter betrachtet: Von den 16 getesteten S.-Typhimurium-Isolaten war eines (6,25 %) sensibel gegenüber allen Wirkstoffen während die 15 (93,8 %) übrigen gegenüber mindestens zwei Wirkstoffen resistent waren. Sie wiesen die in der folgenden Abbildung 7 dargestellten sechs verschiedenen Resistenzmuster auf.

n Isolate AMP CHL FFN STR SMX TET TMP FOT CIP NAL n res 1 0 3 R R 2 3 R R R R 4 6 R R R R 1 R R R R R R 6 1 R R R R R R R R 8 1 R R R R R R R R Abbildung 7 Resistenzmuster der S. Typhimurium-Isolate (schwarz: resistent, weiß: sensibel)

Der höchste Anteil an Resistenzen der S.-Typhimurium-Isolate trat mit 93,8 % (n=15) gegenüber Ampicillin auf (Abb.8). Gegenüber Streptomycin, Sulfamethoxazol und Tetrazyklin waren 75 % (n=12) der Stämme resistent, gegen Trimethoprim waren es 25 % (n=4), gegen Chloramphenicol und Florfenicol je 18,8 % (n=3). Resistenzen gegen Cefotaxim, Ciprofloxacin and Nalidixinsäure kamen bei 6,25 % (n=1) der Isolate vor. Alle Isolate waren sensibel gegenüber den Wirkstoffen Ceftazidim, Colistin, Gentamicin und Kanamycin. Die genauen MHK-Werte lassen sich der Abbildung 8 entnehmen:

Ergebnisse 101

Typhimurium S. Typhimurium sistenzraten und MHK-Werte für MHK-Werte und sistenzraten

Abbildung 8 Wirkstoffbezogene Re 8 Wirkstoffbezogene Abbildung

Ergebnisse 102

4.6.2 Resistenzen bei Campylobacter spp.

48 Campylobacter-Isolate wurden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber acht Wirkstoffen untersucht. Einer der ursprünglich 49 isolierten Stämme war bei der Resistenztestung nicht gewachsen. Insgesamt traten bei 34 von 48 Isolaten (70,8 %) Resistenzen auf. Die getesteten Isolate unterteilen sich in 37 C.-coli- und elf C.-jejuni-Stämme. 28 C.-coli-Isolate (75,7 %) waren gegenüber mindestens einem Wirkstoff resistent, bei C. jejuni waren es sechs (54,5 %). Es traten 14 verschiedene Resistenzmuster auf (Abb.9). Insgesamt wiesen die Isolate 16-mal (33,3 %) Monoresistenzen auf, davon elf gegenüber Tetrazyklin. Desweiteren wurden elfmal (22,9 %) Zweifach-, fünfmal (10,4 %) Dreifach- und zweimal (4,2 %) Vierfachresistenzen festgestellt. C. jejuni wies lediglich Mono- und Zweifachresistenzen auf, während C. coli auch Drei- und Vierfachresistenzen zeigte. Monoresistenzen bei C. jejuni traten bei 18,2 % der Isolate (n=2) gegenüber Tetrazyklin auf, und jeweils bei 9,1 % (n=1) gegenüber Ciprofloxacin bzw. Ampicillin. Zweifachresistenz kam bei C. jejuni bei je einem (9,1 %) Isolat gegen Trimethoprim/Sulfamethoxazol und Tetrazyklin sowie gegen Erythromycin und Tetrazyklin vor. Bei C. coli trat eine Monoresistenz bei 24,3 % (n=9) der Isolate gegen Tetrazyklin auf, bei 5,4 % (n=2) der Isolate gegen Trimethoprim/Sulfamethoxazol und bei 2,7 % (n=1) der C.-coli- Isolate gegen Ampicillin. Doppelresistenzen bei C. coli zeigten sich bei 5,4 % (n=2) Isolaten gegen Trimethoprim/Sulfamethoxazol und Tetrazyklin, bei 2,7 % (n=1) gegen Ciprofloxacin und Nalidixinssäure, bei weiteren 2,7 % (n=1) gegen Erythromycin und Tetrazyklin, bei 5,4 % (n=2) gegen Ciprofloxacin und Tetrazyklin und bei 8,1 % (n=3) der C.-coli-Isolate gegen Ampicillin und Tetrazyklin. Dreifachresistenz trat bei C. coli bei 5,4 % (n=2) der Isolate gegen Ciprofloxacin, Nalidixinsäure und Tetrazyklin, bei weiteren 5,4 % (n=2) gegen Ampicillin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol und Tetrazyklin sowie bei 2,7 % der C.-coli-Isolate gegen Ampicillin, Ciprofloxacin und Erythromycin auf (n=1). Vierfachresistenzen traten bei C. coli jeweils einmal auf (2,7 %) gegenüber Ciprofloxacin, Nalidixinsäure, Trimethoprim/Sulfamethoxazol und Tetrazyklin, sowie gegenüber Ampicillin, Ciprofloxacin, Nalidixinsäure und Tetrazyklin. Bei vier Isolaten war eine Ciprofloxacinresistenz ohne kombinierte Nalidixinsäureresistenz vorhanden. Ein C.-jejuni-Stamm zeigte eine Ciprofloxacin-Monoresistenz, zwei C.-coli-

Ergebnisse 103

Stämme eine Zweifachresistenz gegenüber Ciprofloxacin und Tetrazyklin und ein C.-coli-Isolat eine Dreifachresistenz gegenüber Ciprofloxacin, Ampicillin und Erythromycin.

C. coli AMP CIP ERY GEN NAL SAM SXT TET n res. n= 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 2 0 1 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 2 1 0 2 0 0 2 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 2 2 2 0 2 0 0 0 0 0 2 3 2 0 0 0 0 0 0 2 2 0 2 0 0 2 0 0 2 2 2 0 0 0 0 0 2 2 3 1 2 2 2 0 0 0 0 0 1 0 2 0 0 2 0 2 2 4 1 2 2 0 0 2 0 0

C. jejuni AMP CIP ERY GEN NAL SAM SXT TET n res. n= 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 2 0 1 1 0 2 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 2 2 Abbildung 9 Resistenzmuster der Campylobacter-spp.-Isolate

Ergebnisse 104

Die Campylobacter-Isolate wiesen am häufigsten Resistenzen gegenüber Tetrazyklin auf (56,25 %, n=27), gefolgt von Ampicillin und Ciprofloxacin mit je 18,75 % (n=9). Weiterhin waren gegenüber Trimethoprim/Sulfamethoxazol 16,6 % (n=8), gegenüber Nalidixinsäure 10,4 % (n=5) und gegenüber Erythromycin 6,25 % (n=3) der Isolate resistent. Gegen Gentamicin sowie Sulbactam/Ampicillin traten keine Resistenzen auf. Vergleicht man die Resistenzraten von C. coli und C. jejuni, so fällt die Abwesenheit von Nalidixinresistenz bei C.- jejuni-Isolaten auf. Für beide Spezies liegt die höchste Resistenzrate gegen Tetrazyklin vor (C. coli =62,2 %, C. jejuni =36,4 %). Für Ampicillin, Ciprofloxacin und Trimethoprim/Sulfamethoxazol liegt die Resistenzrate bei C. coli mit 21,6 % bzw. 43,2 % deutlich höher als bei C. jejuni mit 9,1 % , während sie für Erythromycin bei C. jejuni (9,1 %) über der von C. coli (5,4 %) liegt.

Abbildung 8 Wirkstoffbezogene Resistenzraten und MHK-Werte für C. jejuni

Ergebnisse 105

Abb. 11 Wirkstoffbezogene Re Abb.

10 Wirkstoffbezogene

Resistenzraten

sistenzraten und MHK-Werte für

und MHK-Werte für

C. coli

jejuni C.

Ergebnisse 106

4.6.3 Vergleich der Resistenzen bei Salmonella spp. und Campylobacter spp.

Die Resistenzen gegen die fünf in Tabelle 20 und 21 dargestellten Antibiotika wurden sowohl bei den Salmonella-spp.- als auch bei Campylobacter-spp.-Isolaten getestet. Die Salmonella- Isolate waren im Vergleich zu den Campylobacter-Isolaten deutlich häufiger resistent gegenüber Ampicillin (88,2 % zu 18,75 %) und etwas häufiger resistent gegenüber Tetrazyklin (70,6 % zu 56,25 %). Hingegen lag die Resistenzrate gegenüber Ciprofloxacin und Nalidixinsäure bei den Campylobacter-Isolaten höher als bei den Salmonellenisolaten (18,75 % zu 5,88 % bzw. 10,42 % zu 5,88 %).

Tabelle 20 Resistenzraten für sowohl bei S. Typhimurium als auch bei Campylobacter spp. getesteten Antibiotika

n % Amp Cip Gen Nal Tet S. Typhimurium 16 94,12 93,8 6,25 0 6,25 75 Campylobacter spp. 48 100 18,75 18,75 0 10,42 56,25 C. coli 37 77,08 21,62 21,62 0 13,51 62,16 C. jejuni 11 22,92 9,09 9,09 0 0 36,36

Bei drei der 27 Betriebe wurden sowohl Salmonella spp. als auch Campylobacter spp. isoliert. Bei diesen wurde ein Vergleich der Erregerresistenz desselben Herkunftsbetriebes vorgenommen, jedoch konnten keine Parallelen zwischen den Resistenzen der Salmonella- und Campylobacter-Isolate gefunden werden. So wurden zwar in jedem der drei Betriebe Ampicillinresistenz bei Salmonellen, nicht jedoch bei Campylobacter gefunden (Tab.23). Zwei der Betriebe wiesen ciprofloxacin- sowie nalidixinsäureresistente Campylobacter-Isolate auf, jedoch wurden hier keine Salmonellenisolate mit Ciprofloxacin- bzw. Nalidixinsäureresistenz gefunden. Tetrazyklinresistente Campylobacter waren in allen drei Betrieben zu finden, wobei in zweien dieser Betriebe ebenfalls tetrazyklinresistente Salmonellen nachweisbar waren.

Ergebnisse 107

Tabelle 21 Resistenzraten für Salmonella spp. und Campylobacter spp. im Betriebsvergleich

Bestand Bestand Anzahl isolierter Erreger AMP CIP GEN NAL TET Resistenzraten in % Salmonella Campylobacter S C S C S C S C S C spp. (=S) spp. (=C.) 1 4 4 75 0 0 25 0 0 0 25 0 75 2 4 7 75 0 0 0 0 0 0 0 75 57 3 5 4 100 0 0 25 0 0 0 25 100 75

4.6.4 Risikofaktorenanalyse für das Auftreten von Antibiotikaresistenzen

4.6.4.1 Salmonella spp.

Um die Resistenzlage der Salmonella-Isolate in Bezug zu ausgewählten Betriebscharakteristika zu setzen, wurden pro Betrieb geometrische Mittelwerte der MHK-Werte gebildet und mit dem Wilcoxon-Test Zusammenhänge zwischen fünf verschiedenen Risikofaktoren dichotomer Ausprägung und diesen geometrischen Mittelwerten überprüft. Als zu überprüfende potentielle Risikofaktoren wurde der Einsatz von antibiotischer Pro-/Metaphylaxe, die Belegungsart (Rein- Raus oder kontinuierlich), die Anzahl der Zulieferbetriebe, die Fütterungsart und der Einsatz von Säure in Futter oder Wasser zur Analyse ausgewählt. Dabei ergaben sich auf Betriebsebene keine statistisch signifikanten Zusammenhänge zwischen den Ausprägungen der überprüften Variablen und den Resistenzeigenschaften der Erreger. Als potentieller diskreter Risikofaktor wurde zudem die Anzahl der Mastplätze pro Betrieb benutzt, um mittels Regression Zusammenhänge zu den geometrischen Mitteln der MHK-Werte auf Betriebsebene aufzuzeigen. Statistisch signifikante Zusammenhänge mit den geometrischen Betriebsmitteln ergaben sich hierbei für Ampicillin (p=0,04) und Ciprofloxacin (p=0,04). Je höher die Anzahl der Mastplätze lag, desto niedriger lagen die MHK-Werte (s. Abb. 11 u. 12).

Ergebnisse 108

70

60 50

40

30

20

MHK Ampicillin in µg/ml Ampicillin MHK 10

0 [geometrischer Betriebsmittelwert] [geometrischer 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Anzahl der Mastplätze

Abbildung 12 Zusammenhang zwischen der Mastplatzanzahl und dem geometrischen Mittelwert des Ampicillin-MHK-Wertes bei Salmonella spp.

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1 MHK CiprofloxazinMHK in µg/ml 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Anzahl Mastplätze

Abbildung 13 Zusammenhang zwischen der Mastplatzanzahl und dem geometrischen Mittelwert des Ciprofloxacin-MHK-Wertes bei Salmonella spp.

Ergebnisse 109

4.6.4.2 Campylobacter spp.

Die Auswertung erfolgte getrennt für die Spezies C. coli und C. jejuni. Der Wilcoxon-Test lieferte für keine Kombination aus dichotomem Risikofaktor und Antibiotika signifikante p- Werte. Die Regression der Anzahl Mastplätze auf die MHK-Werte ergab ebenfalls keine signifikanten Zusammenhänge. Auffällig war lediglich, dass Betriebe mit größerer Mastplatzanzahl höhere Erythromycin-MHK-Werte bei C.-jejuni-Isolaten aufwiesen (Abb.14), der entsprechende p-Wert betrug 0,0680.

2,5

2

1,5

1

0,5

MHK Erythromycinin µg/ml 0 0 500 1000 1500 [geometrischer Betriebsmittelwert] [geometrischer Anzahl der Mastplätze

Abbildung 14 Zusammenhang zwischen der Mastplatzanzahl und dem geometrischen Betriebsmittelwert des Erythromycin-MHK-Wertes bei C. jejuni

Diskussion 111

5 Diskussion

In der vorliegenden Dissertation wurden Untersuchungen zum Vorkommen der bakteriellen Zoonoseerreger Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica in norddeutschen Schweinemastbeständen durchgeführt. Sie wurde im Rahmen des FBI-Zoo-Projektes (Projektträger:BMBF) und in enger Kooperation mit dem Projekt „Zoonoses in Pork Production II / Kontrolle von aus der Produktionskette Schweinefleisch hervorgehenden Zoonosen II“ (Projektträger: BLE) der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover erstellt. Die bakteriologische und serologische Beprobung der Tiere am Schlachthof in Verbindung mit einem Betriebsfragebogen dienten der Ermittlung von Risikofaktoren für das Auftreten der Erreger. Ergänzt wurde die Arbeit durch die Empfindlichkeitstestung der isolierten Bakterien, um eine Aussage zur Resistenzsituation in norddeutschen Schweinemastbetrieben zu treffen. In der vorliegenden Arbeit konnte bestätigt werden, dass bei norddeutschen Schlachtschweinen die bakteriellen Zoonoseerreger Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica O:3 zu finden sind und somit die potentielle Gefahr des Eintrages in die Lebensmittelkette mit anschließender Erregerübertragung auf den Menschen besteht. Die Empfindlichkeitstestung von Salmonella spp. und Campylobacter spp. zeigte resistente Stämme in den Beständen auf. Es ist zu bedenken, dass Schweinefleisch in Europa das am häufigsten verzehrte Fleisch darstellt (DEVINE 2003) und deswegen seiner lebensmittelhygienischen Unbedenklichkeit oberste Priorität zukommen sollte.

Diskussion 112

5.1 Serologische und kulturelle Prävalenzen

Im Zusammenhang mit dem Auftreten von Salmonella spp. in Schweinemastbeständen liegt in der Literatur eine Vielzahl von Ergebnissen vor. Hierbei muss grundsätzlich angemerkt werden, dass die Prävalenzen verschiedener Studien nur bedingt miteinander vergleichbar sind, da die in Studien ermittelten Erregerprävalenzen wesentlich von der jeweils verwendeten diagnostischen Methodik, dem Studienkollektiv, dem Studiendesign, der beprobten Region und anderen Faktoren abhängen können (SANCHEZ et al. 2007). SANCHEZ et al. (2007) stellten in einer Metaanalyse fest, dass die serologischen Prävalenzen im Falle von Salmonella spp. bei Studien an Mast- und Zuchtschweinen grundsätzlich über den bakteriologischen liegen. In der vorliegenden Studie traf dies für alle drei Erreger zu. Diese Abweichungen der serologischen von den bakteriologischen Prävalenzen sind vermutlich darin begründet, dass es sich bei der serologischen und bakteriologischen Untersuchung um zwei grundverschiedene Herangehensweisen der Diagnostik handelt (FARZAN et al. 2007). Der Vergleich dieser Methoden miteinander ist nicht ohne weiteres möglich (VAN WINSEN et al. 2001b), denn während die serologische Untersuchung sowohl aktuell stattfindende als auch vergangene Infektionen detektiert (FUNK et al. 2005), kann die kulturelle Untersuchung nur bei erregertragenden Tieren positiv ausfallen (LO FO WONG et al. 2003) und ist im Falle von Kotproben zusätzlich an die Erregerausscheidung gebunden. Die Sensitivität der bakteriologischen Untersuchung liegt im Fall von Salmonella spp. bei ungefähr 50 %. Auch im Falle von Y. enterocolitica ist die Erregeranzucht schwierig (NESBAKKEN et al. 1991) und vor allen Dingen langwierig. Somit ist zusammenfassend festzuhalten, dass aufgrund relativ niedriger Sensitivitäten die tatsächlichen Erregervorkommen mittels kultureller Diagnostik eventuell unterschätzt werden (NESBAKKEN et al. 1991; KRANKER et al. 2003; MOORE et al. 2005). Die bakteriologische Untersuchung bietet allerdings gegenüber der serologischen Untersuchung den Vorteil, dass ein positiver Befund das tatsächliche Auftreten des Erregers zum Zeitpunkt der Probennahme manifestiert. Neben der Infektion der Mastschweine im heimischen Mastbetrieb kommt auch der Periode zwischen Verladen auf den Transporter und Schlachtung eine große Bedeutung zu. Denn Schweine von Herden mit niedrigen Salmonella- Prävalenzen können sich innerhalb von Stunden durch Kontakt zu kontaminierten Transportfahrzeugen, Warteställen oder anderen Schweinen infizieren (HURD et al. 2001) und

Diskussion 113

in Folge ein ebenso großes Risiko für die Lebensmittelsicherheit darstellen wie Schweine aus Herden mit hoher Prävalenz. Eine Vergleichsstudie zeigte höhere Prävalenzen in den untersuchten Lymphknoten und im Kot bei auf dem Schlachthof getöteten Schweinen im Vergleich zu auf dem Betrieb getöteten Tieren (HURD et al. 2002). Bei C. coli stellten ALTER et al. (2005b) keine signifikanten Differenzen in Bezug auf die Ausscheiderrate im Kot vor und nach dem Transport der Schweine zum Schlachthof fest. HARVEY et al. (2001) beschrieben für Campylobacter spp. anhand einer Untersuchung an Minipigs ebenfalls gleichbleibende Erregerkonzentrationen vor und nach dem Schlachthoftransport. Auch bei Y. enterocolitica besteht die Möglichkeit, dass sich die Tiere erst in den letzten Stunden vor der Schlachtung auf dem Transport oder im Wartestall infiziert haben (FUKUSHIMA et al. 1990; THIBODEAU et al. 1999). NOWAK et al. (2006) führten den gemeinsamen Transport von Schweinen mehrerer Betriebe zum Schlachthof als Risikofaktor für erhöhte Yersinia- Prävalenzen zum Schlachtzeitpunkt an. Auch bei der vorliegenden Studie wurden Schweine verschiedener Betriebe teilweise auf dem gleichen LKW angeliefert. Daher präsentiert das bakteriologische Ergebnis auf dem Schlachthof unter Umständen nicht mehr die Prävalenz des Ursprungsbetriebes (SANCHEZ et al. 2007). Ein großer Vorteil der schlachtungsnahen Beprobung ist jedoch, dass der Eintrag in die Lebensmittelkette optimal beurteilt werden kann. Verschiedene Autoren vertreten die Meinung, der serologische Test stelle das Mittel der Wahl zum Herdenscreening dar (CHRISTENSEN et al. 1999; LO FO WONG et al. 2003). Doch über den konkreten Carrierstatus der Schlachttiere, welcher in Bezug auf die Lebensmittelsicherheit das entscheidende Kriterium darstellt, kann mittels Antikörpernachweis keine Aussage getroffen werden (NOLLET et al. 2005). NIELSEN et al. wiesen noch 18 Wochen post infectionem S.-Typhimurium-Antikörper nach (NIELSEN et al. 1995). Ein positiver Antikörpertiter zum Schlachtzeitpunkt kann somit von einer Infektion im Mastbetrieb oder bereits im Ferkelerzeugungsbetrieb herrühren und muss nicht unbedingt mit einem Vorhandensein des Erregers zum Schlachtzeitpunkt einhergehen. Unterschiedliche Hydrierungszustände von Tieren verschiedener Betriebe, beispielsweise durch Transportdauer oder Tränkeangebot, beeinflussen das Fraktionsverhältnis der Blutbestandteile. Dadurch lagen bei gut hydrierten Schweinen die Antikörperkonzentrationen niedriger als bei Schweinen mit höherem Hämatokrit (DAVIES et al. 2003). Um die Relevanz dieses Effekts in

Diskussion 114

der vorliegenden Studie zu beurteilen, wären allerdings weitere Untersuchungen notwendig gewesen. Grundsätzlich wäre allerdings denkbar, dass insbesondere an heißen Sommertagen und bei ungünstigen Versorgungsbedingungen auf dem Transportfahrzeug eine Dehydratation der Schweine vorgelegen hat und damit eine Beeinflussung der Antikörperkonzentrationen stattfand. Mit dem Ziel, den tatsächlichen Erregereintrag in die Lebensmittelkette zum Schlachtzeitpunkt genauer zu erfassen, kam in unserer Studie neben der serologischen Untersuchung daher auch die kulturelle Erregeranzucht zum Einsatz.

Salmonella spp:

Die in der vorliegenden Untersuchung ermittelte bakteriologische Salmonella-Nachweisrate (3,3 %) deckt sich gut mit der von GANTER et al. (1997) (3,5 %), GAREIS et al. (1996) ( 3 %) und CARLSON und BLAHA (2001) (3,69 %) in Darmlymphknoten von Schweinen vorgefundenen Prävalenz. Im Vergleich zur Prävalenz in einer großangelegten deutschlandweiten Studie (12,7 %) (BFR 2008b) ergab sich im vorliegenden Kollektiv eine niedrigere bakteriologische Salmonella-Prävalenz der Tiere. Gut miteinander vergleichbar sind die beiden Studien grundsätzlich aufgrund des identischen Untersuchungsmaterials (Ileocaecallymphknoten). Doch in der vorliegenden Untersuchung wurde nur ein einzelner Lymphknoten und in der Studie des BfR fünf Lymphknoten pro Tier untersucht, was die wahrscheinlichste Erklärung für die Differenzen darstellt. da die Isolationsrate der kulturellen Salmonella-Diagnostik mit der eingesetzten Lymphknotenmenge steigt (NOLLET et al. 2001). Auch die nur einmalig anstatt mehrmals durchgeführte Beprobung in der vorliegenden Studie kann, wie von CARLSON und BLAHA (2001) beschrieben, eine Erklärung für die eher seltenen bakteriologischen Salmonellenfunde und die niedrige Betriebsprävalenz (25,9 %) sein. Als Material für die bakteriologische Untersuchung wurden die Ileocaecallymphknoten gewählt, da diese bei Salmonella spp. zu den prädestiniert befallenen Organen während des subklinischen Carrierstadiums gehören (GRAY et al. 1996). VIEIRA-PINTO et al. (2005) beschrieben höhere Salmonella-Isolationsraten aus den Ileocaecallymphknoten als aus dem Ileum, Jejunum und anderen Organen und kamen zu dem Schluss, dass die Untersuchung der Ileocaecallymphknoten die sensitivste Methodik des kulturellen Salmonella-Nachweises darstellt. Im Gegensatz dazu war in einer Studie von WOOD et al. (1989) das Vorkommen von

Diskussion 115

Salmonellen in den Lymphknoten nur halb so groß wie das Vorkommen im Kot. Treffen die Vermutungen von WOOD zu, so wäre die Nachweisrate von Salmonella spp. in der vorliegenden Studie möglicherweise höher ausgefallen, hätte man als Untersuchungsmaterial Kot an Stelle der Lymphknoten verwendet. Weil aber die Isolation von Salmonella spp. aus den Ileocaecallymphknoten eine systemische Streuung des Erregers im Schwein anzeigt, trifft sie laut VIEIRA-PINTO et al. (2005) eine spezifischere Aussage über die mögliche Kontamination des Fleisches als ein positiver kultureller Kotbefund, welcher beispielsweise auch durch eine bloße Erregerpassage zustande kommen könnte. In der vorliegenden Studie wurden aus technischen Gründen für alle drei Erreger die Ileocaecallymphknoten als Untersuchungsmaterial für den kulturellen Nachweis eingesetzt. Das meistisolierte Salmonella-Serovar war in der vorliegenden Studie wie erwartet S. Typhimurium, welches in Deutschland und den meisten anderen europäischen Ländern das häufigste gefundene Serovar bei Schweinen und im Schweinefleisch darstellt (EFSA 2007). Der Phagentyp DT 104 war der am zweithäufigsten nachgewiesene Phagentyp, was aufgrund seiner besonders hohen Therapieresistenz gegenüber einigen Antibiotika (THRELFALL 2000) bedenklich ist.

Serologisch positiv gegenüber Salmonella spp. waren 19,7 % (n=160) der Tiere und 48,2 % (n=13) der Herden. Beim Vergleich von serologischen Ergebnissen verschiedener Studien ist der eingesetzte Cutoff zu beachten, weil er maßgeblich die Prävalenz beeinflusst (FUNK et al. 2005). Hier wurde der vom Hersteller empfohlene Cutoff 20 OD% eingesetzt, weil so die Sensitivität höher liegt als bei Einsatz des in der „Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine“ vom 13. März 2007 verwendeten Cutoffs von 40 OD% (SZABO et al. 2008). Ein Vergleich der serologischen Prävalenzen wird daher in erster Linie zwischen Studien möglich sein, welche denselben Cutoff verwendeten. In einer Studie des BfR wurde, wie in der vorliegenden Arbeit, der Cutoff 20 OD% verwendet, was zur einer guten Vergleichbarkeit der beiden Studien beiträgt. Dort wurden Fleischsaftproben von 2.482 deutschen Mastschweinen auf Salmonella-AK untersucht, und der ELISA ergab im Vergleich zur vorliegenden Studie (19,7 %) einen höheren Prozentsatz positiver Proben (32,3 %). Entweder war in der vorliegenden Studie die Prävalenz tatsächlich geringer, oder es

Diskussion 116

könnten auch falschnegative serologische Untersuchungen der Tiere eine Rolle spielen. Dies wäre beispielsweise bei der Testung während der „Diagnostischen Lücke“, d.h. vor Einsetzen der Antikörperbildung, der Fall (SZABO et al. 2008). DAVIES (2003) testete in Großbritannien 430 Schweine aus 20 Herden und ermittelte eine mit der vorliegenden Studie vergleichbare Einzeltierseroprävalenz von 25,3 %, wobei der Cutoff-Wert von 25 OD% zur guten Vergleichbarkeit der Studien beiträgt. Die Herdenseroprävalenz hingegen lag bei DAVIES mit 85 % deutlich über der Herdenseroprävalenz der vorliegenden Population (48,2 %).

In der vorliegenden Studie wurden weiterhin die Zusammenhänge der serologischen und bakteriologischen Prävalenzen auf Betriebsebene untersucht. Bezüglich Salmonella spp. deutete der McNemar-Test (p=0,0578) auf einen Zusammenhang mit schwacher Konkordanz zwischen den serologischen und bakteriologischen Untersuchungsergebnissen hin. Auf Herdenbasis ergab sich für Salmonella spp. bei 18,5 % der Betriebe ein serologisch und bakteriologisch positiver Betriebsstatus und bei 44,4 % ein serologisch und bakteriologisch negativer Betriebsstatus. Die Aussage zum serologischen und bakteriologischen Betriebsstatus deckte sich also bei fast 63 % der Betriebe. Relativ viele Betriebe (29,6 %) hatten einen serologisch positiven und zugleich einen bakteriologisch negativen Status. Diese Abweichung ist verständlich, wenn man bedenkt, dass die serologische Untersuchung während eines größeren Zeitfensters als die bakteriologische Untersuchung positiv ausfällt (FUNK et al. 2005). Bei 7,5 % (n=2) der Betriebe wurden serologisch keine Antikörper gegen Salmonella spp. nachgewiesen und dennoch Bakterien isoliert. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass auch bei Schweinen serologisch unauffälliger Betriebe Salmonellen auftreten können. So könnten unter gewissen Umständen als unbedenklich eingestuften Herden Salmonellen in die Lebensmittelkette eintragen. Dies spielt insofern eine Rolle, dass laut der in Deutschland aktuell geltenden „Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine“ vom 13. März 2007 eine Einstufung der Bestände in die entsprechende Salmonellenkategorie eben anhand der serologischen Untersuchung erfolgt. Die Vorteile des serologischen Testverfahrens liegen in den geringeren Kosten (FARZAN et al. 2007) und vor allem darin, dass es im Gegensatz zum bakteriologischen Verfahren nicht an die Ausscheidungsphase gebunden ist (LO FO WONG et al. 2003) und somit der effektiven Erkennung von hoch Salmonella-belasteten Herden dienen kann (MOUSING et al. 1997). NOLLET et al. (2005) wiesen sowohl auf Herden- als auch auf

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Tierbasis kaum Übereinstimmung von serologischen und bakteriologischen Prävalenzen bei Untersuchung der Ileocaecallymphknoten nach. SORENSEN et al. (2004) und auch CHRISTENSEN et al. (1999) zeigten, anders als die vorliegende Studie, bei der Untersuchung der Ileocaecallymphknoten keine Korrelation zwischen den Ergebnissen der Serologie und der Bakteriologie. Jedoch wiesen diese Wissenschaftler bei der Untersuchung von Kot eine Korrelation zu den serologischen Ergebnissen nach. Deshalb ließe sich spekulieren, ob die vorliegende Studie bei der Wahl von Kot als Untersuchungsmaterial eine größere Korrelation zwischen serologischen und bakteriologischen Ergebnissen gezeigt hätte. Eine Studie in den USA ergab, dass die Korrelation von Serologie und Bakteriologie höher ist, wenn der Cutoff für die Interpretation des ELISAs auf 40 OD% statt auf 10, 20 oder 30 OD% gewählt wird. Da bei höherem Cutoff, die Sensitivität sinkt, wurde in der vorliegenden Arbeit der Cutoff 20 OD% eingesetzt. Es wäre aber denkbar, den ermittelten Zusammenhang zwischen beiden Untersuchungsmethoden durch Erhöhung des Cutoffs zu steigern. In der vorliegenden Arbeit konnte der Vergleich aus oben dargelegten technischen Gründen ausschließlich auf Herdenebene erfolgen. Begrüßenswert wäre sicher eine individuelle Zuordnung der serologischen und bakteriologischen Proben gewesen, um diese auch auf Einzeltierebene vergleichen zu können. Dies war aber technisch nicht möglich, da angebrachte Identifikationsmarken den mechanischen Kräften während des Brühvorgangs und der Entborstung nicht standhielten. LAUKANNEN et al. (LAUKKANEN et al. 2009) hingegen gelang die individuelle Zuordnung der Schlachtschweine mittels Ohrmarken.

Campylobacter spp.:

Die serologische Untersuchung von Schweinen auf Campylobacter spp. stellt eine Besonderheit der vorliegenden Arbeit dar, da sie in der Literatur bisher kaum beschrieben wurde. Die wenigen vorliegenden serologischen Campylobacter-Prävalenzstudien (VON ALTROCK et al. 2006) beim Schwein stützen sich auf das Immunoblotverfahren, sodass die Etablierung eines in- house-ELISAs durch das Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig besonders hervorzuheben ist. Kommerziell ist für den Campylobacter-Antikörper-Nachweis beim Schwein noch kein ELISA erhältlich.

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Die serologische Campylobacter-Nachweisrate lag in der durchgeführten Untersuchung relativ hoch: Alle 27 Betriebe und 87,9 % (n=712) der Tiere hatten einen serologisch positiven Status. Diese Ergebnisse decken sich mit der Studie von VON ALTROCK et al. (2006), in welcher ebenfalls 100 % der Herden serologisch positiv waren.

Bakteriologisch wurden für C. coli beim Schwein in der Literatur sehr hohe Prävalenzen von bis zu 100 % der Tiere beschrieben, weshalb der Keim unter anderem von GÖRGEN (1983) als Teil der physiologischen Darmflora des Schweines angesehen wurde. Die in der vorliegenden Studie vorgefundene Prävalenz von 9,1 % (n=49) positiven Tieren und 44,4 % (n=12) positiven Betrieben lag deutlich niedriger und könnte durch den Einsatz von Lymphknoten statt Kot als Untersuchungsmaterial mitbegründet sein. Denn auch in anderen Studien fielen mit 29,2 % - 45,8 % die Prävalenzen bei Untersuchungen der Lymphknoten (FRIES et al. 2002) wesentlich niedriger aus, als bei Untersuchung der Faezes mit Prävalenzen bis zu 100 % (GÖRGEN et al. 1983; MAFU et al. 1989; SCHUPPERS et al. 2005). Es wäre außerdem möglich, dass sich ein Teil der in den Lymphknoten vorhandenen Campylobacter spp. im nicht-kultivierbaren VBNC- Stadium befand und die Anzucht daher nicht möglich war (ROLLINS et al. 1986). Die VBNC- Theorie ist mittlerweile jedoch umstritten. Der Grund für die auftretende „Nicht- Anzüchtbarkeit“ von Campylobacter spp. in einigen Studien könnte nach HUMPHREY et al. (2007) eher insuffizienten Kulturmethoden anzurechnen zu sein. Tatsächlich gelten Campylobacter spp. aufgrund der Mikroaerophilie und anderen Eigenheiten als empfindliche und daher schwer anzüchtbare Erreger (MOORE et al. 2005), womit die niedrige Campylobacter-Isolationsrate in dieser Studie eventuell in Zusammenhang stehen könnte.

Das Speziesverhältnis in der vorliegenden Studie ergab einen vergleichsweise hohen Anteil von elf C.-jejuni-Isolaten (22,9 %) gegenüber 37 C.-coli-Isolaten (77,1 %). In den vielen anderen Studien am Schwein liegt der C.-coli-Anteil höher oder stellt sogar die einzige isolierte Spezies dar (GÖRGEN et al. 1983; ALTER et al. 2005b; KASIMIR 2005; SCHUPPERS et al. 2005; VARELA et al. 2007). Die Campylobacter-Speziesverteilung einer Studie wird durch die selektive Voranreicherung mitbeeinflusst, weil diese - abhängig von den verwendeten Medien - zwangsläufig bestimmte Spezies selektiert und andere supprimiert (HUMPHREY et al. 2007). Da in der vorliegenden Studie, im Gegensatz zu vielen anderen Studien, ein Direktausstrich

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ohne Voranreicherung durchgeführt wurde, könnte dies das Speziesverhältnis verschoben haben. Das Speziesverhältnis ist außerdem maßgeblich von der zufälligen Auswahl einer einzelnen präsumtiven Campylobacter-Kolonie für die Weiterdifferenzierung abhängig, weil bei Mischinfektionen mit mehreren Campylobacter-Spezies auf der Agarplatte in verschiedenen Kolonien verschiedene Spezies auftreten können. In der vorliegenden Studie wurde, wie von KRAMER et al. (KRAMER et al. 2000) gefordert, mehrere präsumtive Kolonien pro Agarplatte weiterdifferenziert, was möglicherweise zu einem ausgeglichenerem Speziesverhältnis führte. In unserer Studie erfolgte die Differenzierung mittels PCR, welche der rein biochemischen Differenzierung überlegen ist (STEINHAUSEROVA et al. 2001). Denn geschieht die Speziesdifferenzierung ausschließlich anhand der Hippurathydrolyse, so könnte eine Überschätzung des C.-jejuni-Anteiles auftreten. Positiv zu bewerten ist die Tatsache, dass die in der vorliegenden Untersuchung verwendete Methode somit grundsätzlich in der Lage war, beide Campylobacter-Spezies zu detektieren. Das Spezies-Verhältnis der vorgestellten Studie entspricht in etwa dem bei WEBER (1985) mit 38,3 % C. jejuni vs. 61,7 % C. coli oder auch HARVEY et al. (1999) mit 33,9 % C. jejuni vs. 65,7 % C. coli sowie STICHT-GROH (1982) mit 24 % C. jejuni vs. 76 % C. coli. Studien, in denen bei Schweinen ein höherer Anteil C. jejuni als C. coli ermittelt wurde (FINLAY et al. 1986; YOUNG et al. 2000), bilden die Ausnahme.

Obwohl alle Betriebe serologisch positiv waren, hatten 56,6 % der Betriebe bakteriologisch einen negativen Betriebsstatus. Somit wich bei mehr als der Hälfte der Betriebe der serologische vom bakteriologischen Betriebsstatus ab. Die Ursachen für das Vorkommen von bakteriologisch negativen Beständen im Gegensatz zu anderen Studien ((YOUNG et al. 2000; VON ALTROCK et al. 2006) liegt wahrscheinlich bei den oben aufgeführten Gründen für die niedrige bakteriologische Einzeltierprävalenz (Untersuchungsmaterial, Anzuchtmethode). Da alle Betriebe einen serologisch positiven Status hatten, wurde kein McNemar-Test durchgeführt und auf diese Weise keine Ermittlung des Zusammenhangs zwischen serologischem und bakteriologischem Betriebsstatus vollzogen.

Diskussion 120

Y. enterocolitica :

Die bakteriologische Y.-enterocolitica-Nachweisrate in der vorliegenden Studie war mit 0,4 % im Vergleich zu anderen Studien eher niedrig (4,4 % (NOWAK et al. 2006); 1 % (BUCHER 2001); 3,8 % (GÜRTLER et al. 2005)). Auffällig ist, dass hingegen ein Großteil der Tiere serologisch Yersina-positiv war (70,8 %, n=275). Ein Erklärungsansatz für die große Differenz zwischen Bakteriologie und Serologie ist die Tatsache, dass das Habitat für den Erreger vorwiegend die Tonsillen des Schweines sind (THIBODEAU et al. 1999), während in der vorliegenden Studie die Lnn. ileocaecales untersucht wurden. Genauer gesagt wurden in anderen Studien aus Faezes ungefähr 10-mal weniger Y. enterocolitica isoliert als aus Tonsillen (PEDERSEN 1979; WAUTERS 1979; SCHIEMANN 1980; NESBAKKEN et al. 2003), und in einer weiteren Studie lag die Isolationsrate aus den Mesenteriallymphknoten des Schweines noch unter der Isolationsrate aus den Faezes (NESBAKKEN et al. 2003). Es verwundert daher nicht, dass die bakteriologische Prävalenz von Y. enterocolitica in der vorliegenden Studie recht niedrig ausfällt. Aus technischen Gründen fiel die Entscheidung dennoch auf die Verwendung von Lymphknoten als Untersuchungsmaterial. Das Ergebnis der hohen serologischen und gleichzeitig niedrigen bakteriologischen Yersinia-Rate deckt sich mit der Studie von NIELSEN et al. (1996), welche bei seropositiven Tieren 70 Tage p.i. keine Bakterien in den Lymphknoten, sondern ausschließlich in den Tonsillen fanden. VON ALTROCK et al. (2006) zogen den Schluss, dass die serologische Untersuchung eine genauere Aussage über den Yersinia-Status eines Bestandes zu treffen vermag als die kulturelle Kotprobenuntersuchung. Begründet wurde dies mit der intermittierenden Erregerausscheidung, welche häufig zu falsch negativen kulturellen Ergebnissen führte. Eine alternative Erklärung für ein positives serologisches Ergebnis bei negativem bakteriologischem Ergebnis ist die Infektion der Schweine zu einem frühen Zeitpunkt, so dass die Erreger zwar wieder aus den Lymphknoten eliminiert wurden, Antikörper aber noch vorhanden waren. Die genaue Dauer der Persistenz des Antikörpertiters ist beim Schwein nicht bekannt, kann aber beim Menschen (IgM) mehrere Jahre betragen (MAKI-IKOLA et al. 1997). Eine weitere mögliche Ursache für die geringe Yersinia- Isolationsquote könnte die geringe Sensitivität der kulturellen Untersuchung sein, wie von FREDRIKSON-AHOMAA et al. beschrieben (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2003). Der hohe Anteil der serologisch positiven Herden ist in der vorliegenden Untersuchung (81,5 %) ähnlich wie der von SKERVJE et al. (86 %) (SKJERVE et al. 1998) und VON

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ALTROCK et al. (VON ALTROCK et al. 2006) (83,3 %) beschriebene. Bei HENSEL et al. (HENSEL et al. 2004) und NESBAKKEN et al (NESBAKKEN et al. 2003) waren sogar in allen Beständen Reagenten nachweisbar.

Auf Betriebsebene zeigte sich bei Y. enterocolitica kein Zusammenhang zwischen dem serologischen und dem bakteriologischen Betriebsstatus. Die meisten Betriebe (74,1 %) wiesen einen serologisch positiven und bakteriologisch negativem Status auf. Bei 7,4 % der Betriebe ging der serologisch positive Status mit einem bakteriologisch positivem Status einher, und 18,5 % der Betriebe hatten einen serologisch sowie bakteriologisch negativen Betriebsstatus. In keinem der Betriebe trat ein bakteriologisch positiver Status kombiniert mit einem serologisch negativen Status auf. Also wäre es in der vorliegenden Studie im Falle von Y. enterocolitica im Gegensatz zu Salmonella spp. nicht zu einem - mittels serologischer Untersuchung nicht detektierbarem - Eintrag durch die Betriebe in die Lebensmittelkette gekommen. Da die Zahl der kulturell isolierten Y. enterocolitica (n=2) jedoch sehr gering ausfiel, müsste die soeben angestellte Vermutung an einem größeren Kollektiv überprüft werden.

Diskussion 122

5.2 Auftreten von Erregerkombinationen

Beim Vergleich der Erregerkombinationen fällt zwischen kultureller und serologischer Diagnostik ein deutlicher Unterschied sowohl in Häufigkeit des Auftretens als auch bezüglich der kombinierten Erregerarten auf: In der kulturellen Untersuchung traten nur bei 0,5 % (n=3) der Tiere Erregerkombinationen und zwar ausschließlich mit Salmonella spp. und Campylobacter spp. auf. Kein Tier war bakteriologisch positiv gegenüber allen drei Erregerarten. Im Gegensatz dazu ergaben sich bei der serologischen Untersuchung häufiger Hinweise auf Kombinationen mit verschiedenen Erregern: Bei 56,8 % (n=258) der Tiere traten erhöhte Antikörpertiter gegen zwei und bei 11,6 % (n=94) der Tiere erhöhte Antikörpertiter gegen alle drei Erreger auf. Bei den Zweifachkombinationen traten am häufigsten Campylobacter spp. mit Y. enterocolitica auf, gefolgt von Salmonella spp. in Kombination mit Campylobacter spp. und am dritthäufigsten schließlich Salmonella spp. mit Y. enterocolitica. Auf Betriebsebene traten im Vergleich zur Einzeltierebene vermehrt Erregerkombinationen auf: In einem der Betriebe (3,7 %) waren alle drei Bakterien sogar kulturell nachweisbar, und in 11,1 % (n=3) der Betriebe wurden zwei verschiedene Erreger zugleich, nämlich Salmonella spp. und Campylobacter spp., isoliert. Serologisch wurden bei 48 % (n=13) der Betriebe erhöhte Antikörperkonzentrationen gegen zwei Erreger (davon elf Betriebe mit Campylobacter spp. und Y. enterocolitica und zwei Betriebe mit Salmonella spp. und Campylobacter spp.) und bei 41 % (n=11) der Betriebe sogar gegen alle drei Erregerarten nachgewiesen. Auffällig ist, dass auf Betriebsebene serologisch kein Betrieb ausschließlich gegen Salmonella spp. und Y. enterocolitica positiv war, obwohl 9 Einzeltiere serologisch positiv auf Salmonella spp. und Y. enterocolitica getestet wurden. Diese Tiere stammten also durchweg aus Betrieben, in denen serologisch auch Campylobacter spp. aufgetreten waren. Insgesamt fällt anhand der serologischen Ergebnisse auf, dass 88,8 % (n=24) der Betriebe zuvor Kontakt zu mindestens zweien der Erreger und 41 % der Betriebe sogar zu allen drei getesteten Erregern gehabt haben müssen. Diese Ergebnisse zeigen, dass viele Mastschweineherden mit den untersuchten zoonotischen Erregern Kontakt hatten. Aufgrund des zoonotischen Potentials der Erreger sollte die Situation unter Kontrolle gehalten werden. Gelänge es in den betroffenen Betrieben Risikofaktoren auszuschalten, welche mehrere Erreger zugleich begünstigten, so

Diskussion 123

wäre die Bekämpfung von Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica einfacher. In der vorliegenden Untersuchung kamen jedoch auch relativ viele Betriebe (40 %) vor, welche serologisch zwar einen positiven Y.-enterocolitica- aber negativen Salmonella-spp.-Status hatten, was ein Indiz dafür sein könnte, das hier eben nicht die gleichen Faktoren verantwortlich sind und eine Bekämpfung mehrerer Erreger gleichzeitig nicht ohne Schwierigkeiten in die Praxis umzusetzen sein könnte.

Diskussion 124

5.3 Erregerbekämpfung

Im Falle von Salmonella spp. wurde in der Literatur berichtet, dass ungefähr 20 % aller humanen Salmonellosen durch den Verzehr von Schweinefleisch verursacht werden (STEINBACH et al. 1999). Auch ist eine Reihe größerer humaner Salmonella-Ausbrüche bekannt, welche auf Schweinefleischverzehr zurückgeführt werden konnten (JANSEN et al. 2007), was eine Bekämpfung des Erregers bei Schweinen notwendig erscheinen lässt. Für Campylobacter spp. und Y. enterocolitica liegen diesbezüglich in der Literatur noch keine Schätzwerte für den durch Schweinefleischverzehr verursachten Anteil humaner Infektionen vor. Bei Campylobacter spp. dürfte der Anteil geringer als bei Salmonella spp. liegen, da 90 % der humanen Campylobacteriosen durch die Spezies C. jejuni bedingt ist, welche vorwiegend bei Geflügel vorkommt. Zudem sind Schweinefleischproben (Prävalenzen<1 %) im Vergleich zu lebenden Schweinen sehr selten mit Campylobacter spp. kontaminiert (HÄNEL 2004; RKI 2006), ein höchstwahrscheinlich durch die Kühlung der Schlachtkörper erreichter Effekt (OOSTEROM et al. 1985). Somit muss die Relevanz des Vorkommens dieses Erregers in Mastschweinebeständen für die menschliche Gesundheit mit der nötigen Vorsicht diskutiert werden. Es ist daher fraglich, ob die Auswirkungen einer Reduzierung von Campylobacter spp. in Mastschweinebetrieben den organisatorischen und finanziellen Aufwand einer Bekämpfung im Schweinemastbetrieb rechtfertigen. Y. enterocolitica kommt beim Schwein in den Tonsillen vor, und ca. 10 % der untersuchten Schweinefleischproben waren 2007 in Deutschland positiv (BFR 2009), aufgrund dieser höheren Prävalenz in Schweinefleisch als bei Salmonella spp. und Campylobacter spp. scheint eine Bekämpfung angeraten, da Schweinefleisch als Quelle humaner Yersiniosen vermutet wird (TAUXE et al. 1987; DE BOER et al. 1991; FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2006b) Neben der Bekämpfung der lebensmittelbedingten Zoonosen im Ursprungsbetrieb stellt die Bekämpfung auf späteren Verarbeitungsstufen zumindest eine sinnvolle Ergänzung dar. Es kann diskutiert werden, ob dies nicht sogar eine effektivere und kostengünstigere Methode darstellt, weil Bekämpfungsmaßnahmen auf dem landwirtschaftlichen Betrieb oft schwer umzusetzen sind, bzw. trotz guter Hygienemaßnahmen nicht greifen: Obwohl beispielsweise WEIJTENS et al. in einem Versuch mit SPF-Schweinen unter strengsten Hygienebedingungen arbeiteten und dadurch die starke Reduzierung der Campylobacter-Prävalenz gelang, kam es

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trotzdem zum Eintrag des Erregers in die Schweinebestände (WEIJTENS et al. 2000). Somit muss die von ihm für praktikabel gehaltene Eradikation von Campylobacter in Schweinebetrieben in Frage gestellt werden, womit eher die Einschätzung von NESBAKKEN et al. (2007) zuträfe, dass die Schaffung Campylobacter-freier Bestände nicht in die Praxis umzusetzen ist. Die Vermeidung von Kreuzkontaminationen beim Schlacht- und Zerlegevorgang (Sekundärkontamination) aber auch bei der weiteren Zubereitung bis hin zum fertigen Lebensmittel (Tertiärkontamination) spielen eine bedeutende Rolle (ALBAN et al. 2005). Dass die Bekämpfung eines Keimes auf nachfolgender Ebene der Schlachtkörperverarbeitung eine wirksame Maßnahme sein kann, zeigt der Rückgang der humanen Yersiniosen um 30 % in Norwegen und Schweden, nachdem beim Ausweiden das Rektum sofort nach dem Umschneiden mit einem Plastikbeutel verschlossen wurde (NESBAKKEN et al. 2003). Die logistische Schlachtung, also die Beachtung der Reihenfolge zunächst Salmonella-freie Herden und anschließend Salmonella-belastete Herden zu schlachten, kann laut SWANENBURG et al. (2001) ebenfalls Kreuzkontaminationen auf dem Schlachthof reduzieren. Dem Konzept der logistischen Schlachtung, also der Schlachtung von serologisch hochprävalenten Beständen am Ende eines Arbeitstages, steht die Tatsache entgegen, dass auch serologisch negativ getestete Herden den Erreger in den Schlachthof einschleppen können (NOLLET et al. 2005). Dennoch schlugen NOWAK et al. (2007) vor, Tiere aus Salmonella- verdächtigen Beständen nach Tieren aus Salmonella-unverdächtigen Herden zu schlachten.

Diskussion 126

5.4 Analyse der Risikofaktoren

Da bei Infektionen der Schweine mit Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica meist keine klinischen Anzeichen auftreten und nicht von jedem Tier vor dem Inverkehrbringen seines Fleisches bakteriologische Untersuchungen durchgeführt werden, ist die Entdeckung von zoonotischen Bakterien vor der Schlachtung erschwert (FOSSE et al. 2008b). Eine Identifizierung von Risikofaktoren für die Belastung einer Herde könnte einer Verbesserung ihrer Kontrolle in der Produktionskette dienen und damit das Risikomanagement komplettieren. In der vorliegenden Studie gelang es, betriebliche Risikofaktoren für das Auftreten der Erreger zu identifizieren. Größtenteils waren dies für Schweinemastbetriebe typische Hygieneprobleme, deren negative Auswirkungen auf das Vorkommen von Krankheitserregern in Schweinemastbeständen nicht überraschten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit allgemeiner Hygienemaßnahmen in der Schweinehaltung. Zur Risikoanalyse wurden in der vorliegenden Studie die serologischen Untersuchungsergebnisse herangezogen, da serologische Befunde im Gegensatz zu kulturellen Befunden keine „Momentaufnahme“ darstellen, sondern Aufschluss über vergangene Erregerkontakte der Tiere geben. Damit kann eine Expositions-Wirkungs-Relation mit Daten zum Bestand wesentlich sensitiver abgeleitet werden. In der wissenschaftlichen Literatur liegen eine Vielzahl von Risikoanalysen für Salmonella spp. bei Schweinen vor, die auf der serologischen Untersuchung basieren (VON ALTROCK et al. 2000; KRANKER et al. 2001; LEONTIDES et al. 2003; GROßE AUSTING 2005; KORSAK et al. 2006). Aufgrund der in dieser Studie begrenzten Anzahl untersuchter Betriebe (n=27) und Blutproben (n=810) müssen die Ergebnisse der Risikoanalyse vorsichtig interpretiert werden. Die statistische Power der Studie ist relativ gering, weshalb die Ergebnisse nur hinweisend sein können. Eine mehrfaktorielle Analyse des Einflusses von Risikofaktoren konnte wegen der kleinen Bestandsanzahl nicht erfolgen.

Salmonella spp.:

Das Zurückstellen von Kümmerern erwies sich in der Studie als Risikofaktor für eine höhere Salmonella-Seroprävalenz. Kümmerer müssten aus hygienischen Gründen mit der übrigen Gruppe ausgestallt werden. Möglicherweise waren die Kümmerer Träger von Salmonella spp.,

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und der Erreger konnte nach dem Zurückstellen auf die restlichen Tiere des Abteils übertragen werden. Eine weitere mögliche Erklärung wäre das Vorliegen eines generell suboptimalen Hygienemanagements bei Kümmerer rückstallenden Betrieben, gehört doch die vorzeitige Verwertung oder zumindest das gleichzeitige Ausstallen mit den übrigen Tieren eigentlich zu den hygienischen Grundprinzipien in der Schweinemast. Es gäbe somit also einen Confounding-Effekt (SACHS 2003), bei dem ein gemessenes Merkmal eigentlich für einen dahinter verborgenen Risikofaktor steht. Ein weiterer Risikofaktor war die Anzahl der Lieferbetriebe: Der Ferkelbezug von einem einzigen Zulieferbetrieb scheint in unserer Studie einen protektiven Effekt zu haben. Diesen Zusammenhang beschrieb auch LO FO WONG et al. (2004); er ermittelte eine zunehmende Seroprävalenz bei Ferkelbezug von mehr als drei Händlern. Die Bedeutung des Salmonelleneintrages durch den Tierhandel wurde ebenfalls von KRANKER et al. (2001), GEBREYES et al. (2006) und VISSCHER (2006) herausgestellt. NOWAK et al. (2007) empfiehlt explizit, die Ferkel möglichst nur von einem einzigen, bekannten Zulieferbetrieb zu beziehen. Da sich diese Tatsache eigentlich auf das Vorkommen aller Erreger auswirkt, verwundert es, dass dieser Risikofaktor sich nur bei Salmonella spp. und nicht bei Campylobacter spp. und Y. enterocolitica zeigte. In der vorliegenden Studie zeigten Betriebe, welche Nagerbekämpfungsmaßnahmen nach Bedarf durchführten, niedrigere Salmonella-OD-Betriebsmittelwerte im Vergleich zu Betrieben mit regelmäßiger Nagerbekämpfung. Dieses Ergebnis erstaunt zunächst, da man doch bei regelmäßiger Nagerbekämpfung einen positiven, Erreger eliminierenden Effekt erwartet, da Nager potentielle Träger von Salmonella spp. sind (LE MOINE et al. 1987; LETELLIER et al. 1999; LEE et al. 2008). Möglicherweise beobachten Betriebe mit Nagerbekämpfung „nach Bedarf“ die Situation aber genauer und greifen dadurch gezielter und angepasster ein, als Betriebe mit „regelmäßiger“ Nagerbekämpfung und Befolgung eines starren Bekämpfungsplanes. Außerdem wurde die Aussage „regelmäßig“ nicht weiter definiert, so dass ein „regelmäßig“ handelnder Betrieb unter Umständen seltener als ein „nach Bedarf“ handelnder Betrieb die Nagerbekämpfung durchführte, dies aber aufgrund der Formulierung der Frage nicht dokumentiert wurde. Schweinemastbestände mit zusätzlicher Rinderhaltung wiesen höhere durchschnittliche Betriebsmittelwerte für Salmonella-Antikörper auf. Generell stellen Rinder ein Salmonella-

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Reservoir dar (STANLEY et al. 2003) und sind somit als potentielle Infektionsquelle für die Schweine einzustufen. Am häufigsten wurden bei europäischen Rindern die Serovare S. Typhimurium, S. Enteritidis und S. Dublin isoliert (EFSA 2007). Im Jahr 2007 erwiesen sich in Deutschland 3,9 % von 88.000 untersuchten Rindern als bakteriologisch Salmonella-positiv, wobei in über einem Drittel der Fälle S. Typhimurium vorlag (BFR 2009). Leider wurde in unserer Studie der Salmonella-Status der Rinder nicht erfasst. Sollten die Rinder tatsächlich Salmonellenträger gewesen sein, so wäre eine Erregerübertragung vom Rind auf das Schwein durchaus denkbar. Es ist zwar unwahrscheinlich, dass Schweine und Rinder direkten Kontakt zueinander hatten, aber eine indirekte Erregerübertragung über Arbeitsgeräte etc. ist dennoch denkbar. Möglicherweise ist der Risikofaktor Rinderhaltung aber auch als indirekter Indikator für ein nicht besonders ausgereiftes Hygieneregime der Betriebe mit einem zusätzlichen Betriebszweig zu bewerten. Zusätzlich ist denkbar, dass Betriebe, die mehrere Tierarten halten, den Schweinestall nicht streng abschirmen und daher ein vermehrter Salmonelleneintrag aus den verschiedensten Quellen stattfindet.

Campylobacter spp.:

Die vorliegende Studie ergab bei Betrieben mit stallweisem Rein-Raus-System und stallweiser Reinigung und Desinfektion niedrigere Campylobacter-Seroprävalenzen als bei Betrieben ohne Durchführung dieser Methode. Das Alles-Rein-Alles-Raus-System gilt als eine der wichtigsten Maßnahmen zur Verhütung von Krankheiten in der Schweinemast. Durch das komplette Räumen des Stalles wird eine nachfolgende allumfassende Reinigung und Desinfektion erst ermöglicht. Bei Reinigung und Desinfektion des gesamten Stalles ist ein nachhaltigeres Entkeimen möglich, und somit sinkt der Erregerdruck. Generell sind aufgrund der hohen Empfindlichkeit von Campylobacter spp. alle gängigen Desinfektionsmittel zur Stall- und Gegenstandsdesinfektion geeignet (JACOBS-REITSMA 2008). Bestände mit zusätzlicher Pferdehaltung wiesen tendenziell höhere Campylobacter- Seroprävalenzen auf: Eine Übertragung von C. coli und C. jejuni vom Pferd auf das Schwein ist grundsätzlich möglich, und wäre eine Erklärung für höhere Seroprävalenzen in Betrieben mit zusätzlicher Pferdehaltung. C. coli und C. jejuni können im Gastrointestinaltrakt von Pferden auftreten (AL-MASHAT et al. 1986). 5,74 % der beprobten Einhuferherden in Deutschland im

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Jahre 2007 waren Campylobacter-positiv, wobei sowohl C. coli als auch C. jejuni isoliert werden konnten (BFR 2008a). Eine ähnlicher Effekt zeigte sich bei Betrieben mit Katzenhaltung. MARBURGER (2006) isolierte bei einer Katze auf einem Schweinemastbetrieb C. coli, andere Untersuchungen zeugen vom Auftreten von C. upsaliensis (MORENO et al. 1993) bzw. C. jejuni (WEBER 1985) bei Katzen. Diese Ergebnisse zeigen einen möglichen Erregereintrag in den Betrieb durch Katzen auf, welcher die in unserer Untersuchung vorgefundenen erhöhten Campylobacter-OD- Betriebsmittel in Betrieben mit Katzenhaltung erklären könnte. Es wäre denkbar, dass ein Infektionszyklus besteht, bei dem die Katzen - beispielsweise durch die Aufnahme rohen Schweinefleisches - mit Campylobacter spp. infiziert werden und anschließend zu Ausscheidern werden, welche die Schweine reinfizieren. Da auch Hunde häufig Campylobacter-Träger sind (MORENO et al. 1993), ließe sich spekulieren, dass Betriebe mit Hundehaltung ebenfalls erhöhte Campylobacter-Seroprävalenzen aufwiesen. Überraschenderweise war das Gegenteil der Fall, wobei der p-Wert von 0,8 allerdings eher einen zufälligen Befund vermuten lässt. Wenn andere Tiere außer Schweinen (in erster Linie Katzen) Zugang zum Schweinestall hatten, lagen in den Beständen erhöhte Seroprävalenzen für Campylobacter spp. vor. Wie oben beschrieben, könnten Katzen Träger von Campylobacter spp. sein und somit das Campylobacter-Infektionsrisiko für die Schweine erhöhen. Betriebe, in denen Katzen ungehindert den Schweinestall betreten können, lassen auch das Vorkommen anderer hygienischer Schwachstellen vermuten. In der vorliegenden Studie lagen die Campylobacter-Antikörpertiter bei den Betrieben umso höher, je mehr Mastplätze vorhanden waren. Hier muss man allerdings berücksichtigen, dass mit dem Faktor Mastplatzanzahl auch weitere Umstände vergesellschaftet sein könnten, welche möglicherweise die Campylobacter-Prävalenz beeinflussen, wie zum Beispiel die Anzahl der Ferkelzulieferbetriebe oder die Frequenz des Tierzukaufs. Korrelationen zwischen Betriebsgröße und Campylobacter wurden in der Literatur bereits beschrieben, jedoch stellten WEHEBRINK (2007) und FOSSE et al. (2009) mit erhöhten Seroprävalenzen bei kleineren Betrieben den gegenteiligen Effekt fest. Je höher die Zukauffrequenz von Ferkeln war, desto höher lagen die Campylobacter- Antikörpertiter der Betriebe. Möglich ist ein direkter Erregereintrag in die Schweinebetriebe

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durch die zugekauften Ferkel und damit einhergehende erhöhte Antikörpertiter. Möglicherweise steigt die Ferkelzukauffrequenz mit der Betriebsgröße, so dass diese beiden Risikofaktoren miteinander gekoppelt sein könnten. Für den Erreger Y. enterocolitica wurde in der Literatur bereits beschrieben, dass große Betriebe und erhöhte Ferkelzukaufsfrequenzen ein erhöhtes Vorkommen des Erregers mit sich brachten (CHRISTENSEN 1987; SKJERVE et al. 1998).

Y. enterocolitica.:

In der vorliegenden Studie stellte sich die Trockenfütterung als ein Risikofaktor für erhöhte Yersinia-Seroprävalenz dar. Im Gegensatz dazu fand WINGSTRAND et al. (2001) keinen Einfluss von Trocken- oder Nassfütterung auf das Vorkommen von Y. enterocolitia in den Herden. Für den Erreger Salmonella hingegen wurde in der Literatur gehäuft Trockenfutter als Risikofaktor für hohe Seroprävalenzen benannt, während für feuchtes, flüssiges Futter ein protektiver Einfluss beschrieben wurde (VAN DER WOLF et al. 2001; BAHNSON et al. 2006; FARZAN et al. 2006). Da Betriebe mit Flüssigfütterung laut FARZAN et al. (2006) vermutlich insgesamt ein moderneres Hygienemanagement betreiben, könnte hier auch für Y. enterocolitia ein Confounding-Effekt vermutet werden, wie ihn FARZAN et al. (2006) für Salmonella spp. postulierte. Die Fütterung von Trockenfutter stände dann also in Vertretung für ein allgemein rückständigeres Hygienekonzept, welches wiederum zu erhöhten Y.-enterocolitica-Titern führen könnte. Gegen diese Vermutung spricht jedoch die Tatsache, dass die Flüssigfütterung in der Schweinemast aktuell eher rückläufige Tendenzen zeigt. Zu berücksichtigen ist auch, dass Flüssigfütterung den Säurezusatz zum Futter zulässt, welchem bezüglich der Reduzierung von Salmonella spp. bei Schweinen ein positiver Einfluss zugeschrieben wird (VISSCHER 2006). VAN WINSEN et al. (2001a) erklärten den positiven Einfluss des Nassfutters auf die Salmonella-Prävalenzen mit natürlichen Fermentationsprozessen im feuchten Futter, welche zur pH-Wert-Senkung führten. Es wäre möglich, dass die ph-Wert-Absenkung sich nicht nur günstig auf Salmonella spp. und E. coli-Vorkommen in den Beständen auswirkt sondern auch auf Y. enterocolitica. Unterstützt wird diese Annahme durch die Studie von TENNANT et al. (2008), die bei Versuchsmäusen mit verminderter Magensäureproduktion vermehrte Y.- enterocolitica-Konzentrationen im Mageninhalt und eine damit einhergehende Disposition für Infektionen mit Y. enterocolitica vorfanden.

Diskussion 131

Betriebe, welche ausschließlich mehlförmiges Futter einsetzten, hatten signifikant höhere mittlere Yersinia-Antikörpertiter als Betriebe, welche zusätzlich oder ausschließlich pelletiertes Futter einsetzten. Eine mögliche Erklärung der protektiven Wirkung von Pellets könnte die Hitzebehandlung während des Herstellungsprozesses sein, da sie die Erregerkontamination des Futters minimiert (VONNAHME et al. 2008). Bezüglich des Vorkommens von Y. enterocolitica bei Schweinen liegen in der Literatur bisher wenige Untersuchungen zum Einfluss des Futters vor, LAUKKANEN et al. (2009) beschrieben höhere Yersinia- Seroprävalenzen beim Schwein beim Fehlen von groben Futterbestandteilen. Für Salmonella spp. beschrieben KJAERSGAARD et al. (2001) in einer dänischen Arbeit entsprechend der vorliegenden Studie einen protektiven Einfluss pelletierten Futters, während in anderen Studien genau der gegenteilige Effekt entdeckt wurde (LEONTIDES et al. 2003; LO FO WONG et al. 2004). In Beständen, welche zum Untersuchungszeitpunkt der Salmonellenkategorie I angehörten, lagen höhere mittlere Yersinia-Antikörperkonzentrationen vor, als in Betrieben der Kategorie II oder III. Die Salmonellenkategorie eines Betriebes beruht gemäß „Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine“ vom 13. März 2007 auf dem Prozentsatz positiver serologischer Salmonella-Untersuchungen des Betriebes. Somit scheint sich der Antikörperstatus eines Betriebes bezüglich Salmonella spp. und Yersinia spp. eher diametral zu verhalten. Dies wäre anhand weiterer Untersuchungen zu überprüfen. Betriebe mit niedrigen Gewichtszunahmen der Schweine wiesen signifikant höhere Yersinia- Antikörpertiter auf, als Betriebe mit höheren Gewichtszunahmen. Beim erwachsenen Schwein verlaufen Y.-enterocolitica-Infektionen zwar asymptomatisch (NEUBAUER et al. 2001a), doch niedrige Gewichtszunahmen bei Jungtieren könnten durchaus mit einer Y.-enterocolitica- Infektion in Zusammenhang stehen, da es hier zu klinischen Erscheinungen kommen kann (NEUBAUER et al. 2001a).

Diskussion 132

5.5 Einflussfaktoren für das Auftreten mehrerer Erreger

Zehn Einflussfaktoren wurden ermittelt für ein erhöhtes Odds Ratio bezüglich des Auftretens eines positiven serologischen Bestriebsstatus gegenüber einem oder mehreren der Erreger (Salmonella spp., Campylobacter spp. und Yersinia spp). Die Verfütterung ausschließlich mehlförmigen Futters, das Zurückstellen von Kümmerern zu den gesunden Tieren, die Durchführung der Nagerbekämpfung nach Plan statt nach Bedarf sowie die Ferkelherkunft aus zwei oder mehr Beständen sind Faktoren, welche im Kapitel 5.4 für einzelne Erreger schon diskutiert wurden. Das Vorliegen von Bestandsproblemen, d.h. das Auftreten von Krankheiten im Bestand ist mit großer Wahrscheinlichkeit eine Konsequenz aus dem Vorliegen anderer ursächlicher Betriebsfaktoren, welche die Bestandsgesundheit beeinflussen. Somit erscheint es logisch, dass mit diesem Faktor ein Auftreten eines oder mehrerer Erreger im Bestand verknüpft ist. Der Einsatz einer Pro- bzw. Metaphylaxe könnte ebenfalls mit dem Faktor „Vorliegen von Bestandsproblemen“ verknüpft sein, weil Bestandsprobleme eben eine Pro- bzw. Metaphylaxe erforderlich machen. In der Literatur liegen einige andere Arbeiten vor, welche Antibiotikaeinsatz in der Schweinemast als Risikofaktor für das Auftreten von Salmonella spp. beschrieben haben (VAN DER WOLF et al. 2001; FABLET et al. 2003; BELOEIL et al. 2007). Andererseits soll die Studie von GEBREYES et al. (2006) nicht unerwähnt bleiben, welche im Gegensatz dazu in antibiotikafreien Haltungssystemen (Bio-Betriebe etc.) höhere Salmonella- Prävalenzen als in konventionellen Haltungssystemen feststellten. Ein nicht kompletter Vollspaltenboden im Stall war in der Studie von DAVIES et al. (1997) ein Risikofaktor für vermehrtes Vorkommen von Salmonella spp. und in der Studie von WEHEBRINK (2007) ein Risikofaktor für Campylobacter spp.. Bei Aufstallung auf Vollspaltenboden erfolgt im Optimalfall eine zügige Entfernung des Kotes aus dem Kontaktbereich des Tieres, und hierdurch kommt es zur Verringerung der fäkal-oralen Infektionsgefahr. Beim Fehlen einer Hygieneschleuse erfolgt ein ungehinderter Erregereintrag durch Mitarbeiter und Gerätschaften, wodurch mit dem vermehrten Auftreten von Zoonoseerregern in den Beständen gerechnet werden kann. LO FO WONG beschrieb den Einfluss des Vorhandenseins einer Schleuse und hierbei vor allem die ausreichende Händehygiene vor Betreten des Stalls (LO FO WONG et al. 2004)

Diskussion 133

Bei der Verwendung von Brunnenwasser an Stelle von Stadtwasser zum Tränken könnte es durch fehlende Wasseraufbereitung und weniger Kontrollen im Vergleich zu „Leitungswasser“ eher zu Kontaminationen und folglich zu Infektionen der Mastschweine kommen. Dafür spricht, dass beim Menschen Y.-enterocolitica-Infektionen durch Trinkwasser beschrieben wurden (KAPPERUD 1975) und Yersinien monatelang in Wasser mit organischer Substanz überleben können und in einigen Studien aus Tränkewasser isoliert wurden (PILON et al. 2000). Auch Campylobacter spp. sind in Wasser als VBNC überlebensfähig, und für humane Infektionen wurde der Genuss von Brunnenwasser sogar bereits als Risikofaktor identifiziert (SCHONBERG-NORIO et al. 2004), woraus geschlussfolgert werden kann, dass dieser Infektionsweg für Mastschweine ebenso in Frage kommt. Der fehlende Zusatz von Säure zu Futter oder Wasser könnte mit erhöhten Erregerprävalenzen vergesellschaftet sein, denn ein saurer pH-Wert des Futters kann laut den Untersuchungen von JØRGENSEN (2001) und DAHL (1996) zu einer Absenkung der Salmonella-Seroprävalenzen bei Mastschweinen führen.

Diskussion 134

5.6 Empfindlichkeitstestung von Salmonella spp. und Campylobacter spp.

Obwohl die Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung aufgrund der begrenzten Isolatanzahl nur als exemplarisch zu betrachten sind, erlauben sie dennoch einen Einblick in die Resistenzlage von Salmonella spp. und Campylobacter spp. in norddeutschen Schweinemastbeständen. Die Überwachung der Resistenzsituation in Tierbeständen stellt eine Notwendigkeit dar, zum einen wegen der Erhaltung ausreichender Therapiemöglichkeiten in der Veterinärmedizin und zum anderen wegen der möglichen Übertragbarkeit resistenter Stämme auf den Menschen (AARESTRUP et al. 2008b). Das BfR in Berlin führte die Empfindlichkeitstestung mittels Mikrodilutionsmethode durch, welche heutzutage als „Goldstandard“ gilt (AARESTRUP et al. 2008a).

Salmonella spp.:

Die Resistenzraten für Salmonella spp. der vorliegenden Studie sind anderen Resistenzstudien durchaus ähnlich (siehe Tab.1): Sowohl in der vorliegenden als auch in Studien aus anderen Ländern liegen die Resistenzraten von S. Typhimurium am höchsten bezüglich Ampicillin, Sulfonamiden und Tetrazyklin (EFSA 2006; Anonymous 2007a, 2008). So waren in der vorliegenden Studie 93,8 % aller S.-Typhimurium-Isolate resistent gegen Ampicillin, je 75 % waren resistent gegenüber Sulfamethoxazol, Tetrazyklin und Streptomycin. Der häufige Einsatz dieser Antibiotika in der Schweinemast könnte für die hohen Resistenzraten bei porcinen Isolaten verantwortlich sein (EFSA 2006). Die Resistenzrate gegenüber Tetrazyklinen ist in der vorliegenden Studie analog der gegenüber Sulfonamiden. In der Studie von ROSENGREN et al. (ROSENGREN et al. 2008) waren Salmonella spp. am häufigsten gegen Tetrazykline und Sulfamethoxazol resistent. Jedoch ergab eine Monitoringstudie zum Antibiotikaeinsatz in der Schweinemast, dass Tetrazykline am häufigsten und Sulfonamide im Vergleich dazu weitaus seltener eingesetzt wurden (MERLE et al. 2009). Bei S. Typhimurium sind Resistenzen gegen oben beschriebene Antibiotika typisch für den „ACSSuT“-Resistenztyp, der genotypisch meist auf einer chromosomal codierten Pentaresistenz des Phagentyps DT 104 basiert und sich seit den 90er Jahren stark ausgebreitet hat (THRELFALL 2000) . Erstaunlicherweise waren in der vorliegenden Arbeit trotz des Einsatzverbotes von Chloramphenicol bei Nutztieren seit 1994 immerhin 18,8 % aller S.-Typhimurium-Isolate

Diskussion 135

gegenüber Chloramphenicol resistent. Diese Aussage deckt sich mit anderen jüngeren Studien (BUSANI et al. 2004; Anonymous 2008), welche ebenfalls hohe Anteile Chloramphenicol- resistenter Isolate ermittelten. Vermutlich liegt eine gewisse Stabilität der Resistenzgene im Genpool - auch lange nach Rückzug eines Antibiotikas vom Markt - vor (SALYERS et al. 1997). Ein andere Erklärung für die hohen Chloramphenicolresistenzraten wäre der von SCHWARZ und CHASLUS-DANCLA (2001) beschriebene Kreuzresistenzmechanismus durch das strukturverwandte Florfenicol, welches heutzutage in der Schweinemast eingesetzt wird. Hierfür spricht, dass in der vorliegenden Studie die Chloramphenicolresistenzen durchweg kombiniert mit Florfenicolresistenzen auftraten. Die Stoffklassen der Cephalosporine und Fluorchinolone gelten als Reserveantibiotika für die Behandlung von humanen Infektionen mit Salmonella spp. (HOHMANN 2001; AARESTRUP et al. 2008b). Somit wären hohe Resistenzraten hier besonders kritisch zu bewerten, da der Therapieerfolg bei resistenten Isolaten gefährdet ist. Cephalosporinresistenz der S.- Typhimurium-Isolate trat in der vorliegenden Studie in nur 6,25 % (n=1) der Fälle gegenüber Cefotaxim und in keinem Fall gegenüber Ceftazidim auf. Gegenüber den Fluorchinolonen Ciprofloxacin und Nalidixinsäure waren ebenfalls jeweils 6,25 % (n=1) der getesteten S.- Typhimurium-Isolate resistent. Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass die Resistenzen der isolierten Salmonella spp. bezüglich „ACSSuT“ (Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamid und Tetrazyklin) hoch und bezüglich der Reserveantibiotika Cephalosporine und Fluorchinolone erfreulicherweise relativ niedrig lagen. Bei Betrachtung der ermittelten MHK-Werte (minimale Hemmkonzentration) für Salmonella spp. in Abbildung 7 ist zu beachten, dass über die Hälfte der Daten (56,72 %) Schätzwerte darstellen. Lag bei der niedrigsten getesteten Antibiotikakonzentration schon kein Bakterienwachstum mehr vor, dann wurde diese Stufe als MHK-Wert angenommen, obwohl der tatsächliche MHK-Wert entweder auf eben dieser Stufe oder noch niedriger liegen könnte. Andererseits wurde der MHK, wenn bei der höchsten untersuchten Antibiotikakonzentration immer noch Bakterienwachstum stattfand, auf der nächsthöheren (jedoch nicht getesteten) Stufe vermutet, obwohl er tatsächlich auch bei einer unbekannten, höheren Konzentration liegen könnte. Die Analyse der betrieblichen Risikofaktoren ergab für die Antibiotika Ciprofloxacin und Ampicillin bei größeren Betrieben signifikant niedrigere durchschnittliche MHK-Werte von

Diskussion 136

Salmonella spp.. Dies könnte bei nur oberflächlicher Betrachtung zu der Vermutung Anlass geben, dass größere Betriebe weniger Antibiotika einsetzen. Jedoch zeigte sich bei näherer Betrachtung, dass dieser Aussage eine sehr geringe Isolatanzahl (n=17) von wenigen Betrieben (n=7) zugrunde lagen. Bei größeren Betrieben wurden mehrere Isolate gewonnen und bei kleineren nur ein Isolat pro Betrieb. Daher senkte schon ein einzelner - im Vergleich zu den Werten kleinerer Betriebe - niedrigerer MHK-Wert den MHK-Durchschnitt ab. Dies mündete schließlich in der Aussage, dass größere Betriebe signifikant niedrigere durchschnittliche MHK- Werte aufwiesen, weshalb diese Ergebnisse zurückhaltend interpretiert werden sollten. Auch USLING überprüfte in ihrer Dissertationsschrift die Hypothese, ob unterschiedliche Management- und Haltungsfaktoren zu Differenzen der Resistenzmuster bakterieller Erreger führten, jedoch wurde diese Hypothese dort nicht bestätigt (USLING 2006). ROSENGREN et al. beschrieben altersklassenabhängige Unterschiede bezüglich der Resistenzen bei Salmonella spp. (ROSENGREN et al. 2008). So ermittelten sie bei Ferkeln höhere Streptomycin- und Tetrazyklin-Resistenzen gegenüber Sauen und höhere Streptomycin-, Ampicillin-, Kanamycin- und Cephalothinresistenzen gegenüber Mastschweinen. Bei der Diskussion um Risikofaktoren für Antibiotikaresistenzen bei Salmonella spp. sollte nicht außer acht gelassen werden, dass sich Resistenzmuster während des Schlachthoftransportes verschieben können (ERDMAN et al. 2003).

Campylobacter spp.:

Die in der Literatur beschriebenen Resistenzraten porciner C.-coli-Isolate sind von Land zu Land und innerhalb derselben Länder sogar von Studie zu Studie sehr variabel. Sie schwanken beispielsweise für Ampicillin zwischen 15 % in Frankreich (PAYOT et al. 2004) und 65,7 % in Spanien (SAENZ et al. 2000) und für Tetrazyklin zwischen 1 % in Dänemark (AARESTRUP et al. 1997) und 94,4 % in Spanien (SAENZ et al. 2000). Für Ciprofloxacin liegen besonders große Differenzen vor, die Spanne reicht von 0,6 % resistenter Isolate in den USA (THAKUR et al. 2005a) bis zu 100 % in Spanien (SAENZ et al. 2000). Makrolide und Fluorchinolone stellen wichtige Therapeutika bei humanen Infektionen mit Campylobacter spp. dar (AARESTRUP et al. 2008b), und daher werden Resistenzen gegenüber diesen Stoffgruppen als besondere Gefahr angesehen. Dies wird untermauert durch eine dänische Studie, in der ein fünffach erhöhtes Risiko für einen schwerwiegenden

Diskussion 137

Krankheitsverlauf beim Vorliegen einer Chinolon- oder Erythromycinresistenz der Campylobacter-Isolate beschrieben wurde (HELMS et al. 2005b). Bezüglich der Fluorchinolongruppe waren in der vorliegenden Studie gegen Nalidixinsäure 13,5 % der C.-coli-Isolate resistent und gegen Ciprofloxacin 10 % der C. jejuni- und 22 % der C.-coli-Isolate resistent. Dies liefert einen Hinweis darauf, dass bei porcinen Campylobacter spp., insbesondere bei C. coli, Resistenzen gegen Fluorchinolone eine wichtige Rolle spielen. Eine Ausnahme bildeten allerdings die C.-jejuni-Isolate, welche alle elf sensibel gegenüber Nalidixinsäure waren. Auffallend ist bei vier Isolaten (3-mal C. coli und 1-mal C. jejuni) das Vorhandensein einer Ciprofloxacinresistenz ohne kombinierte Nalidixinsäureresistenz, was laut FITZGERALD et al. (2008) eher selten vorkommt. C.-coli-Isolate wiesen im Gegensatz zu C.-jejuni Isolaten auch Drei- und Vierfachresistenzen auf. Obwohl in der Literatur bei C. coli meist höhere Erythromycin-Resistenzraten als bei C. jejuni beschrieben wurden (FITZGERALD et al. 2008; LUANGTONGKUM et al. 2009), zeigte sich in der vorliegenden Studie der gegenteilige Effekt: Gegenüber dem Makrolidantibiotikum Erythromycin war die Resistenzrate bei C. jejuni (9 %, n=1) höher als bei C. coli (5 %, n=2). Dies ist wahrscheinlich durch die in Deutschland allgemein niedriger liegende Erythromycinresistenzrate bei C. coli mitbegründet, welche durch die paneuropäische Vergleichsstudie von DE JONG et al. (2009) beschrieben wurde und auch durch die eigenen Untersuchungen bestätigt wurde. Außerdem waren beide Resistenzraten in der vorliegenden Arbeit sehr niedrig, so dass man den Vergleich der beiden Werte vorsichtig interpretieren sollte. Viel höhere Resistenzraten gegenüber Reserveantibiotika als in der vorliegenden Studie wurden in einer koreanischen Studie (SHIN et al. 2007) beschrieben, jeweils über 80 % der Isolate waren resistent gegenüber Cipro- und Enrofloxacin und 46,5 % gegenüber Erythromycin. Auffällig war, dass hingegen die Resistenzrate für Ampicillin (28,9 %) und Tetrazyklin (56,1 %) vergleichbar hoch wie in der vorliegenden Studie (Ampicillin: 21,62 %, Tetrazyklin: 62,16 %) war. In Thailand und Hongkong liegen die Resistenzraten humaner Campylobacter-Isolate gegenüber Fluorchinolonen mittlerweile über 80 % (LUANGTONGKUM et al. 2009). In der Schweiz wurden für porcine C.-coli-Isolate höhere Resistenzraten gegenüber Makroliden und Fluorchinolonen als in der vorliegenden Studie veröffentlicht, und zwar mit 26,1 %

Diskussion 138

resistenten Isolaten etwas höhere Resistenzraten gegenüber Ciprofloxacin und ungefähr viermal höhere Resistenzraten gegenüber Erythromycin (SCHUPPERS et al. 2005). Wichtige Alternativen für die Therapie humaner systemischer Campylobacter-Infektionen stellen Gentamicin und Tetrazyklin dar (BLASER et al. 2008). In der vorliegenden Studie waren alle C.- coli- und C.- jejuni-Isolate empfindlich gegenüber Gentamicin, was sehr positiv zu beurteilen ist. Allerdings lagen die Resistenzraten gegenüber dem Antibiotikum Tetrazyklin am höchsten, nämlich bei C. coli sogar bei 62,2 % resistenten Isolaten. Diese hohe Resistenzrate ist kritisch zu bewerten, da der Einsatz von Tetrazyklin als Alternativantibiotikum somit eingeschränkt ist. Hohe Tetrazyklinresistenzraten wurden auch in antibiotikafreien Haltungssystemen nachgewiesen (THAKUR et al. 2005b). Die Ursache für die Tetrazyklinresistenz bei Campylobacter spp. scheint durch eine Art „natürliche“ Koevolution des resistenztragenden Plasmids (tet(O)-Plasmid) gemeinsam mit Campylobacter spp. und nicht durch den Einsatz von Tetrazyklin in der Schweinemast bedingt zu sein (LUANGTONGKUM et al. 2009). Als Risikofaktoren für das Auftreten von Resistenzen bei Campylobacter spp. wurden von SCHUPPERS et al. (2005) das Kupieren der Schwänze bei den Ferkeln, Lahmheiten, Hautläsionen, Ad-libitum-Fütterung und Fütterung wenig Rohfaser beschrieben. Multiresistenzen traten vermehrt bei unvollständigem Rein-Raus-System oder kontinuirlichem System und bei Vorkommen von Lahmheiten oder Kratzern auf der Schulter auf. Ein guter Gesundheits- und Hygienestatus der Schweineherden war laut SCHUPPERS et al. (2005) mit einem niedrigeren Risiko für das Auftreten von Resistenzen einhergegangen. Diese Risikofaktoren konnten in der vorliegenden Studie nicht bestätigt werden, auffällig - jedoch nicht signifikant - war eine Tendenz zu niedrigeren MHK-Werten für Ciprofloxacin bei höherer Mastplatzanzahl. Hier könnte vermutet werden, ob in den größeren Betrieben etwa weniger Enrofloxacine eingesetzt werden, was wiederum die Ursache für das Auftreten von weniger Resistenzen sein könnte. Dies wäre jedoch rein spekulativ, weil die Anzahl der Ciprofloxacin-resistenten Isolate sehr klein war und deshalb eher ein zufälliger Effekt vermutet werden muss.

Diskussion 139

Vergleich der Resistenzen von Salmonella spp. und Campylobacter spp.:

Fünf Antibiotika wurden hinsichtlich ihrer Anteile resistenter Salmonella-spp.- und Campylobacter-spp.-Isolate verglichen. Gegenüber Gentamicin waren sämtliche Isolate beider Erregerarten empfindlich, gegenüber Ampicillin und Tetrazyklin lagen die Anteile bei Salmonella spp. höher und gegenüber Ciprofloxacin und Nalidixinsäure bei Campylobacter spp. höher. Der Anteil der Fluorchinolon-resistenten porcinen Isolate scheint bei Campylobacter spp. höher zu sein als bei Salmonella spp. Nur in drei Betrieben waren beide Erreger gleichzeitig kulturell isoliert worden, beim Vergleich der Anteile resistenter Isolate fiel auf, dass lediglich Tetrazyklinresistenz (in zwei der drei Betriebe) sowohl bei Campylobacter-spp.- als auch bei Salmonella-spp.-Isolaten desselben Betriebs auftrat. Somit ergaben sich aus unserer Studie keine Hinweise auf betriebsspezifische Resistenzen, welche bei beiden Erregern zugleich auftreten. Allerdings wird auf die relativ geringe Anzahl an untersuchten Betrieben (n=3) mit Vorkommen beider Erreger hingewiesen, welche eine allgemeingültige Aussage erschwert. Die Hypothese müsste daher an einem größeren Probenkollektiv überprüft werden. Die bei Schweinen zum Schlachtzeitpunkt auftretenden Resistenzen entsprechen letztlich dem Eintrag in die Lebensmittelkette und deshalb ist dieser Beprobungszeitpunkt besonders wichtig (DE JONG et al. 2009). Dieser Ansatz wurde auch in der vorliegenden Studie verfolgt, indem aus am Schlachthof gewonnenen Proben Erreger isoliert und anschließend einer Empfindlichkeitstestung unterzogen wurden. Aufgrund des Fehlens von klinischen Studien gibt es noch keine klinischen Breakpoints für Campylobacter spp. (FRITSCHE et al. 2007). Die europäische Organisation EUCAST (www.eucast.com) differenziert bezüglich der epidemiologischen Cutoffs zwischen den Spezies C. coli und C. jejuni, während das US-amerikanische Institut CLSI (CLSI 2009b) für beide Campylobacterspezies dieselben Grenzwerte veranschlagt. Für die vorliegende Studie wurden bezüglich Campylobacter spp. die EUCAST-Cutoffs angewendet, denn die Differenzierung in die Spezies C. coli und C. jejuni versprach eine größere Präzision bei der Ergebnisinterpretation. Für Sulfamethoxazol/Trimethoprim, Ampicillin und Ampicillin/Sulbactam gibt es momentan keine Campylobacter-spezifischen Grenzwerte, weshalb in diesen Fällen die Grenzwerte für Enterobacteriaceae angewandt wurden.

Diskussion 140

Im Falle von Salmonella spp. fiel die Entscheidung ebenfalls auf die Anwendung der epidemiologischen Cutoffs (EUCAST). Zum einen geschah dies zwecks einer Früherkennung von erworbenen Resistenzmechanismen, zum anderen wurde durch diese Maßnahme die Einheitlichkeit innerhalb der Studie gewährleistet.

Zusammenfassung 141

6 Zusammenfassung

Susanne Döhne Untersuchungen zum Auftreten verschiedener bakterieller Zoonoseerreger und zu den Risikofaktoren in norddeutschen Schweinemastbeständen.

Die Studie war Teil des Forschungsverbundes FBI-Zoo (Projektträger: BMBF) und wurde in enger Kooperation mit dem Projekt „Zoonoses in Pork Production II / Kontrolle von aus der Produktionskette Schweinefleisch hervorgehenden Zoonosen II“ (Projektträger: BLE) der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover erstellt. Ziel dieser Dissertation war es, die Prävalenzen der Zoonoseerreger Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica in ausgewählten norddeutschen Mastschweineherden zu ermitteln und anschließend betriebsassoziierte Risikofaktoren für deren Auftreten sowie Informationen zur Resistenzsituation abzuleiten. Auf einem Schlachthof wurden von 27 norddeutschen Mastschweineherden serologische und bakteriologische Proben entnommen und anschließend auf das Vorkommen der Zoonoseerreger Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica untersucht. Pro Betrieb wurde von 20 Schweinen jeweils ein Ileocaecallymphknoten kulturell untersucht. Bakteriologisch waren 3,1 % der Tiere Salmonella-positiv, 9,1 % Campylobacter-positiv und 0,4 % der Tiere Y.- enterocolitica-positiv. Zusätzlich wurden je 30 Schweine pro Bestand serologisch untersucht. Der Anteil der serologisch positiven Tiere betrug 19,7 % für Salmonella spp., 87,9 % für Campylobacter spp. und 69,7 % für Y. enterocolitica. Die Betriebsprävalenzen lagen serologisch bei 48,2 % für Salmonella spp., 100 % für Campylobacter spp. und 81,5 % für Y. enterocolitica sowie bakteriologisch bei 25,9 % für Salmonella spp., 44,4 % für Campylobacter spp. und 7,4 % für Y. enterocolitica. Die serologische Untersuchung detektierte in 48,2 % der Betriebe mindestens zwei der Erreger und in 40,7 % der Betriebe sogar alle drei getesteten Erreger. Eine zentrale Aufgabe der vorliegenden Arbeit war die Analyse möglicher Risikofaktoren für das Auftreten der drei Erreger in den Beständen. Hierfür wurde der Einfluss der mittels

Zusammenfassung 142

Fragebogen erhobenen Betriebsmerkmale auf die Betriebsmittelwerte der Antikörpertiter zunächst für jede Bakterienart einzeln geprüft. Die Salmonella-Antikörpertiter lagen erkennbar höher bei Betrieben, welche Kümmerer zurückstellten, mehr als einen Ferkel-Zulieferbetrieb hatten, regelmäßige Nagerbekämpfung nach Plan durchführten oder gleichzeitig Rinderhaltung betrieben. Die Antikörpertiter für Campylobacter spp. waren erhöht bei Betrieben ohne striktes Rein-Raus-System, Betrieben ohne Durchführung einer strikten Reinigung und Desinfektion des gesamten Stalles, Betrieben mit zusätzlicher Pferdehaltung, Betrieben mit zusätzlicher Katzenhaltung oder Betrieben mit größerer Mastplatzanzahl oder höherer Zukauffrequenz. Die Y.-enterocolitica-Antikörpertiter lagen höher bei Betrieben mit Fütterung trockenen oder mehlförmigen Futters, Betrieben der Salmonellenkategorie I oder Betrieben mit niedrigeren Gewichtszunahmen der Tiere. Eine weitere Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, in welchem Ausmaß bestimmte betriebsassoziierte Risikofaktoren die Chance für den serologischen Nachweis von mehr als einer Erregerart innerhalb eines Betriebes beeinflussten. Es wurden zehn dieser Einflussfaktoren entdeckt, die in Zusammenhang mit einem erhöhten Risiko für den serologischen Nachweises eines, beider und aller drei Erreger standen. Dies waren das Auftreten von Bestandsproblemen, der Einsatz einer Pro- bzw. Metaphylaxe, das Nichtvorhandensein eines kompletten Vollspaltenbodens, das Fehlen einer Hygieneschleuse, die Ferkelherkunft aus zwei oder mehr Beständen, die Verwendung von Brunnenwasser zum Tränken, der Nichtzusatz von Säure zu Futter oder Wasser, das Zurückstellen von Kümmerern zu den gesunden Tieren, die Durchführung der Nagerbekämpfung nach Plan (statt nach Bedarf) und die Verfütterung ausschließlich mehlförmigen Futters. An den 17 Salmonellenisolaten und 48 Campylobacter-Isolaten wurde eine Empfindlichkeitstestung per Mikrodilutionsmethode durchgeführt. Salmonella spp. wiesen Resistenzen bei 15 Isolaten (88,2 %) und Campylobacter spp. bei 34 Isolaten (71,8 %) auf. Die Resistenzraten der isolierten S.-Typhimurium-Stämme lagen hoch für Ampicillin (93,8 %), Streptomycin, Sulfamethoxazol und Tetrazyklin (je 75,0 %), intermediär für Trimethoprim (25,0 %), Chloramphenicol und Florfenicol (18,8 %), niedrig für Cefotaxim, Ciprofloxacin und Nalidixinsäure (6,25 %). Gegenüber Ceftazidim, Colistin, Gentamicin und Kanamycin waren alle S.-Typhimurium-Stämme empfindlich. Die Resistenzraten von Campylobacter spp. waren hoch gegenüber Tetrazyklin (56.0 %), intermediär gegenüber Ampicillin, Ciprofloxacin (je

Zusammenfassung 143

18.75 %) und Trimethoprim/Sulfamethoxazol (17.0 %), niedrig gegenüber Nalidixinsäure (10.4 %) und Erythromycin (6,25 %). Gegenüber Gentamicin sowie Sulbactam-Ampicillin traten keine Resistenzen auf. C. coli hatte mit 75,7 % eine deutlich höhere Resistenzrate als C. jejuni mit 54,5 %.

Summary 145

7 Summary

Susanne Döhne Investigations on different bacterial zoonotic agents and risk factors in fattening pig herds in Northern Germany.

This study was part of the FBI-Zoo project (project executing organisation: BMBF) and a cooperation with the project „Zoonoses in Pork Production II (project executing organisation: BLE) of the Clinic for Pigs, Small Ruminants, Forensic Medicine and Ambulatory Service of the University of Veterinary Medicine Hanover. Aim of this epidemiological study was to describe the occurrence of the zoonotic bacteria Salmonella spp., Campylobacter spp. and Y. enterocolitica pig herds in Northern germany. Further topics were the dectection of potential risk factors for the occurrence of these bacteria and the susceptibility testing of the isolates. Serological and bacteriological samples of 27 pig herds were collected at a slaughterhouse in Northern Germany and tested for the zoonotic agents Salmonella spp., Campylobacter spp. and Y. enterocolitica. 20 pigs per herd were selected and one ileocolic lymph node of each animal was harvested and subsequently tested culturally. 3.1 % of the animals were positive for Salmonella spp., 9.1 % for Campylobacter spp. and 0.4 for Y. enterocolitica. Furthermore 30 pigs per herd were tested serologically: 19.7 % were tested positive for Salmonella spp., 87.9 % for Campylobacter spp. and 69.7 % for Y. enterocolitica. Serological herd prevalence was 48.2 % for Salmonella spp., 100 % for Campylobacter spp. and 81.5 % for Y. enterocolitica. Whereas bacteriological herd prevalence was 25.9 % for Salmonella spp., 44.4 % for Campylobacter spp. and 7.4 % for Y. enterocolitica. One of the main issues of this study was to identify potential risk factors for the occurence of the zoonotic agents on the farm. Therefore the influence of potential risk factors that were assessed by a questionnaire on the mean antibody titer of a herd was tested. Salmonella antibody titers were comparatively higher in herds that put growth retarded pigs back or obtained piglets from more than one supplior or had a control of rodents according to schedule (instead of rodent control according to demand) or kept cattle on the premises.

Summary 146

Campylobacter spp. antibody titers were remarkably higher in herds of farms which did not adopt the all-in/all-out housing system or which did no cleaning and disinfection procedure of the complete stable or on which horses or cats were kept. Also in bigger herd with a higher number of animals and in herds with a higher frequency of animal purchase remarkably higher Campylobacter spp. antibody titers were recognized. The antibody titers for Y. enterocolitica were higher in herds feeding dry or coarse meal and in “Salmonella category 1 herds” and in herds with less growth of the pigs. Another topic of this work was to figure out whether certain farm specific risk factors could influence a herds serological status of Salmonella spp., Campylobacter spp. and Y. enterocolitica in parallel. Ten of these factors were detected: General health problems, application of pro- or metaphylaxis, no fully slatted floor, no hygiene lock, purchasing piglets from more than one other farm, use of well water, no use of acids in food and water, putting weak pigs back into a younger age group, regularly pest eradication due to a fix plan and feeding only dry food. In 48.2 % of the farms more than one agent and in 40.7 % all three agents were detected serologically. A total of 17 Salmonella spp. and 48 Campylobacter spp. isolates were susceptibility tested. 15 (88.2 %) Salmonella spp. and 34 (70.8 %) Campylobacter spp. isolates showed resistance. The prevalences of resistance of the S. Typhimurium isolates to ampicillin (93.8 %), streptomycin, sulfamethoxazol und tetracycline (each 75.0 %) were high. Prevalence of trimethoprim resistance (25.0 %) so as chloramphenicol and florfenicol resistance (18.8 %) were on a intermediate level. In case of cefotaxim, ciprofloxacin und nalidixic acid (each 6.25 %) the prevalence of resistance was low. All S. Typhimurium isolates were susceptible to ceftazidim, colistin, gentamicin and kanamycin. Campylobacter spp. isolates displayed a high prevalence of resistance to tetracyclin (56.0 %), whilst an intermedium prevalence of resistance was found to ampicillin, ciprofloxacin (each 18.8 %) and trimethoprim/sulfamethoxazol (17.0 %) and a low prevalence of resistance to nalidixic acid (10.4 %) and erythromycin (6.25 %). All Campylobacter spp. isolates were susceptible to gentamicin and to sulbactam-ampicillin. The prevalence of resistance was considerably higher in C. coli isolates (75.7 %) than in C. jejuni isolates (54.5 %).

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Richtlinien, Verordnungen und Leitlinien:

2000 Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antimikrobiell wirksamen Tierarzneimitteln- Antibiotikaleitlinien. Bundestierärztekammer und ArgeVet (Arbeitsgemeinschaft der Leitenden Veterinärbeamtinnen und –beamten der Länder) Im Dtsch. Tierärztebl. 48, Nr. 11 als gemeinsame Empfehlung veröffentlicht.

2003 Richtlinie 2003/99/EG des europäischen Parlaments und des Rates Vom 17. November 2003 Zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern und zur Änderung der Entscheidung 90/424/EWG des Rates sowie zur Aufhebung der Richtlinie 92/117/EWG des Rates.

2003 Verordnung (EG) Nr. 2160/2003 des europäischen Parlaments und des Rates vom 17. November 2003 zur Bekämpfung von Salmonellen und bestimmten anderen durch Lebensmittel übertragbaren Zoonoseerregern. A. D. E. U. V. 12.12.2003, L 325/321-325-315

2007 Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine (Schweine-Salmonellen-Verordnung). Vom 13. März 2007 (BGBl. I S. 322) FNA 7831-17831-1-54

Herzlichen Dank:

Prof. L. Kreienbrock für die Überlassung des Themas und die großzügige Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Mittel zum Anfertigen dieser Arbeit.

Prof. H. Waldmann für die Mitbetreuung der Arbeit durch sein Institut und die Bereitstellung des Dienstfahrzeuges und der Ausrüstung für die Beprobung am Schlachthof.

Dr. A. von Altrock für die große Hilfe bei der Organisation der Beprobung, viele konstruktive Anregungen zum Aufbau dieser Arbeit und das Zurverfügungstellen von Daten aus ZIPP II.

Dr. R. Merle für die Betreuung und Unterstützung beim Schreiben der Arbeit.

Dr. P. Grüning für die Probenaufarbeitung und die freundliche Unterstützung bei mancher Frage.

Den Mitarbeitern des Schlachthofes für die freundliche Kooperation.

Den IBEI-Mitarbeitern, insbesondere Olga und Inga für die statistischen Hilfestellungen und Heike für ihre freundliche organisatorische Unterstützung.

Meinen derzeitigen Arbeitgebern in der Tierarztpraxis Fischer für ihr Entgegenkommen.

Ich danke denjenigen, die mich immer wieder motiviert haben: Eva, Rahel, Christina, Dinah, Birgit, Dragan, Meike, Marina, Christoph.

Meinen Eltern, meinen Schwestern Katja und Christine, meinen Tanten Elsbeth und Anne nebst John und Jonas, meiner Oma.

Ganz besonders danke ich Max.