CARACTÉRISATION ET DÉTECTION PAR DES MÉTHODES GÉNOTYPIQUES DES AGENTS BACTÉRIENS AÉROPORTÉS ASSOCIÉS AU BIOTERRORISME

Thèse

SANDRA ISABEL

Doctorat en microbiologie-immunologie Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

© Sandra Isabel, 2013

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Résumé

ette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des Cagents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d‘abord, un rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents biologiques, les procédures d‘intervention des organisations de sécurité et de santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes importantes des procédures d‘intervention. La détection et l‘identification de ces agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles consistent en l‘échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des matrices complexes et finalement l‘identification du micro-organisme en décodant des macromolécules signatures, et ce, notamment par des méthodes génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la préparation d‘armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives (p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les méthodes de détection moléculaire. C‘est pourquoi la première étude traite de l‘interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores de Bacillus de matrices poudreuses afin d‘enlever ces particules nuisibles à la détection. La procédure conceptualisée est simple d‘exécution (10 étapes), rapide (≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété d‘échantillons par rapport à l‘art antérieur. En second lieu, une lyse de spores bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d‘extraire

iii l‘ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d‘une zone contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d‘un essai de détection basé sur l‘amplification PCR de type large spectre du gène tuf et l‘identification sur biopuce de séquences d‘ADN signatures grâce à une hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement (75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez le genre , ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués d‘acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et d‘apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents biologiques présentées ici dans un système intégré d‘analyse totale. Par conséquent, l‘automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de contribuer à enrayer la propagation.

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Abstract

his doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne T bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the current problematic, biological agents, intervention procedures of public security and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art. Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR

v amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid (75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences (8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added information about their taxonomical classification. In the near future, it would be interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical management of victims and contribute to stop propagation.

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Avant-propos

Il s‘agit d‘une thèse en version électronique. De ce fait, vous pourrez accéder à certaines informations par des hyperliens qui vous redirigeront vers les sites Internet concernés ou bien vers de l‘information contenue ailleurs dans le document. Chaque type de lien a son propre code de couleur. Voici la liste des types de lien que vous rencontrerez dans cette thèse :

 Références bibliographiques : (Référence 2012). o Ce lien vous redirigera vers la bibliographie à la fin de la thèse. À cet endroit, pour les références électroniques, vous retrouverez un hyperlien vers le site de publication de celles-ci ou du site Internet concerné. Pour les documents non disponibles électroniquement, le numéro de référence ISBN sera accessible.  Tableaux et figures inclus dans le document : (Tableau) et (Figure). o Ce lien vous redirigera vers le tableau ou la figure dont il est question dans le texte.  Tableaux et figures d‘articles déjà publiés : En ligne : (Tableau) et (Figure). o Certains tableaux ou certaines figures ont déjà été publiés en haute définition. Ceux-ci sont disponibles sur le site Internet de publication. Ce lien vous redirigera à cet endroit.  Redirection vers un site Internet : www.redirection.com o Certains liens externes seront inclus dans le texte lorsque pertinents.

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Information sur les publications

Les informations sur les publications et la contribution de l‘étudiante à ces publications seront décrites au début de chacun des chapitres correspondants.

Chapitre 3

Rapid Filtration Separation-Based Sample Preparation Method for Bacillus Spores in Powdery and Environmental Matrices

Chapitre 4

Modular Ultrasonic Lysis System for Rapid Nucleic Acid Extraction and Sample Transfer of Bacillus spores

Chapitre 5

Rapid Microarray Microfluidic Screening of Twelve Airborne Bacterial Biothreat Agents

Chapitre 6

Divergence among Genes Encoding the Elongation Factor Tu of Yersinia Species

Les tableaux et les figures d‘articles déjà publiés ont été renumérotés afin d‘en faciliter le suivi tout au long de cette thèse. Cependant, le numéro original est indiqué en italique et entre crochets. Par exemple, Tableau 6 [Table 1] signifie qu‘il s‘agit du sixième tableau inclus dans la thèse et du premier tableau présenté dans la publication originale.

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Remerciements

e voudrais tout d‘abord remercier le Dr Michel G. Bergeron pour l‘opportunité Jqu‘il m‘a offerte ainsi que la motivation qui l‘anime et qu‘il a su me transmettre. Je tiens également à remercier mon codirecteur de thèse, le Dr Maurice Boissinot, pour son sens critique ayant grandement amélioré ma formation scientifique. Je voudrais également exprimer ma gratitude aux Drs Éric Leblanc, Régis Peytavi, François Picard, Gale Stewart, Luc Bissonnette, Ann Huletsky et Sachiko Sato pour leur encadrement dans mes projets de recherche. Je tiens à souligner mon appréciation envers tous les membres de l‘EDM et du CRI, nos collaborateurs de l‘IMI, du COPL, du CERMA, du DRDC, de la GRC et du LNM avec qui j‘ai eu des discussions passionnantes et l‘honneur de collaborer. J‘adresse mes remerciements à plusieurs chercheurs et équipes de recherche qui m‘ont procuré des ADN génomiques de bonne qualité m‘ayant permis de compléter mes recherches doctorales, dont les Drs Douglas E. Bader, Robert R. Brubaker, Louis Bryden, Thomas A. Ficht, Katsuya Hirai, Sharon Peacock, Didier Raoult, Heidi Wood, Donald E. Woods, Daisy Vanrompay et Tina Zimmerman. Je tiens à remercier les Fonds de la recherche en santé du Québec et la Fondation Dr George Phoenix pour leur support financier m‘ayant permis de réaliser ces projets de recherche. Je voudrais également remercier chaleureusement mes parents, Lise et Clément, et toute ma famille, particulièrement Karel, Manon, Marc, David, Valérie, Lynn et Paul ainsi que tous mes amis, notamment Isabelle, Faye, Keith et Anne-Renée, pour leur support et leurs encouragements au cours de ces nombreuses années d‘études. Vous m‘êtes tous très précieux. Je tiens finalement à remercier Manon Tétreault qui m‘a aidée à réaliser la mise en page conviviale et certaines figures présentées dans cette thèse.

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À ma mère pour son soutien et son amour inconditionnels

Table des matières

Résumé ...... iii Abstract ...... v Avant-propos ...... vii Remerciements ...... ix Table des matières ...... xi Liste des figures ...... xvii Liste des tableaux ...... xix Liste des abréviations ...... xx Liste des abréviations des espèces bactériennes ...... xxii 1. Le bioterrorisme ...... 1 1.1 Historique des guerres biologiques et du bioterrorisme ...... 4 1.1.1 De l‘Antiquité à la théorie des germes ...... 7 1.1.2 Au 20e siècle : guerres, armement et traités ...... 8 1.1.3 Au 21e siècle : la menace terroriste et les canulars ...... 11 1.1.4 Apprentissage des évènements passés ...... 12 1.2 Les agents biologiques ...... 14 1.2.1 La sélection des agents biologiques prioritaires par les autorités ...... 14 1.2.2 Diversité des agents biologiques prioritaires ...... 19 1.2.3 Modes de dissémination ...... 24 1.2.4 Les agents bactériens aéroportés sélectionnés pour cette thèse ...... 28 1.3 La préparation contre le bioterrorisme ...... 32 1.3.1 Procédures d‘intervention à la suite d‘un acte bioterroriste ...... 32 1.4 La détection et l‘identification des agents biologiques ...... 39 1.4.1 Les critères de performance clinique de tests diagnostiques ...... 40 1.4.2 Les critères analytiques d‘un test de détection des agents biologiques. 42 1.4.3 Les défis particuliers au bioterrorisme ...... 43 2 Hypothèses et objectifs de recherche ...... 59 2.1 Problématique de la détection des agents biologiques ...... 60

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2.2 Hypothèses de recherche ...... 61 2.3 Objectifs de recherche ...... 63 2.4 Aperçu des résultats et contribution scientifique ...... 64 3 Méthode de préparation d‘échantillons de poudres suspectes et autres échantillons environnementaux basée sur la filtration ...... 66 3.1 Résumé ...... 69 3.2 Abstract ...... 70 3.3 Introduction ...... 71 3.4 Materials and methods ...... 74 3.4.1 Samples studied...... 74 3.4.2 Spore and DNA preparations...... 75 3.4.3 Real-time PCR assay...... 75 3.4.4 Prefiltration evaluation...... 76 3.4.5 Removal of soluble and insoluble compounds...... 77 3.4.6 Spore capture and recovery step...... 78 3.4.7 DARE procedure...... 78 3.4.8 Spore recovery...... 79 3.4.9 PCR detection efficiency...... 79 3.4.10 Imaging of spores and filters...... 80 3.5 Results ...... 82 3.5.1 Selection of samples for study...... 82 3.5.2 Selection of a filter for removal of insoluble particles...... 82 3.5.3 Removal of soluble and insoluble compounds...... 83 3.5.4 Evaluation of the spore capture and recovery step...... 85 3.5.5 Evaluation of spore recovery...... 86 3.5.6 Efficiency of spore DNA detection after the DARE procedure...... 86 3.5.7 Spore penetration in filters ...... 87 3.6 Discussion ...... 89 3.7 Acknowledgments ...... 93 3.8 References ...... 94 3.9 Tables ...... 96 3.10 Figures ...... 99 4 Système modulaire de lyse ultrasonique pour l‘extraction rapide d‘acides nucléiques de spores de Bacillus et le transfert d‘échantillons ...... 101 4.1 Résumé ...... 104 xii

4.2 Abstract ...... 105 4.3 Introduction ...... 106 4.4 Materials and methods ...... 108 4.4.1 Equipment design and function ...... 108 4.4.2 Preparation of spores ...... 109 4.4.3 DNA extraction ...... 109 4.4.4 Analysis of DNA extracts ...... 110 4.4.5 DNA fragmentation ...... 110 4.4.6 Fluorescence imaging ...... 111 4.4.7 Decontamination of the FULM ...... 111 4.4.8 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders ...... 112 4.5 Results ...... 113 4.5.1 FULM operation and volume handling ...... 113 4.5.2 DNA extraction and fragmentation ...... 113 4.5.3 Imaging of disrupted spores ...... 114 4.5.4 Decontamination of the FULM ...... 115 4.5.5 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders ...... 116 4.6 Discussion ...... 117 4.6.1 Performance of FULM for spore lysis and DNA extraction ...... 117 4.6.2 Effect of the stainless steel interface ...... 117 4.6.3 DNA fragmentation ...... 119 4.6.4 Simulation of field testing ...... 119 4.7 Conclusions ...... 121 4.8 Acknowledgment ...... 122 4.9 References ...... 123 4.10 Figures ...... 125 5 Développement d‘un essai sur puce à ADN en microfluidique pour la détection et l‘identification de 12 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme ...... 128 5.1 Résumé ...... 132 5.2 Abstract ...... 133 5.3 Introduction ...... 134 5.4 Materials and methods ...... 136 5.4.1 Bacterial isolates and genomic DNA preparation...... 136

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5.4.2 Construction of a tuf gene database from complete genome sequences...... 136 5.4.3 Design of primers and probes...... 137 5.4.4 PCR amplification and exonuclease digestion...... 138 5.4.5 Microfluidic-microarray hybridization...... 139 5.4.6 Microarray data acquisition and analysis...... 140 5.5 Result ...... 142 5.5.1 Analysis of the tuf gene region, primer and probe selection...... 142 5.5.2 Analytical sensitivity of the CABBA assay ...... 144 5.5.3 Analytical specificity of the CABBA assay ...... 144 5.6 Discusion ...... 146 5.6.1 Evolutionary relationships of tuf sequences ...... 146 5.6.2 Biased-broad-spectrum amplification ...... 146 5.6.3 Limitation of conserved gene targets ...... 147 5.6.4 Possible practical application of the CABBA assay...... 148 5.6.5 Comparison to other biothreat agent detection assays...... 149 5.7 Conclusion ...... 150 5.8 Ackowledgments ...... 151 5.9 References ...... 152 5.10 Tables and figures ...... 156 6 Divergence du gène codant pour le facteur d‘élongation Tu des espèces du genre Yersinia ...... 161 6.1 Résumé ...... 165 6.2 Abstract ...... 166 6.3 Introduction ...... 167 6.4 Materials and methods ...... 170 6.4.1 Bacterial strains ...... 170 6.4.2 DNA isolation ...... 170 6.4.3 Primer design ...... 173 6.4.4 Sequencing of tufA and tufB genes ...... 173 6.4.5 Phylogenetic analyses ...... 174 6.4.6 Nucleotide sequence accession numbers ...... 176 6.5 Results ...... 177 6.5.1 tufA and tufB gene similarities ...... 177 6.5.2 Phylogenetic tree ...... 178 xiv

6.5.3 Phylogenetic network ...... 179 6.5.4 Yersinia species ...... 186 6.6 Discussion ...... 188 6.7 Acknowledgments...... 195 6.8 References ...... 196 7 Discussion générale ...... 201 7.1 Retour sur les objectifs de recherche ...... 202 7.2 Méthode de préparation d‘analytes à partir d‘échantillons de poudres suspectes ou environnementaux ...... 203 7.2.1 Étude des échantillons fréquemment recueillis...... 203 7.2.2 Art antérieur et objectifs ...... 204 7.2.3 Les filtres sélectionnés et perspectives ...... 205 7.2.4 Perspectives : traitement d‘autres échantillons...... 206 7.2.5 Transportabilité et automatisation ...... 207 7.3 Système modulaire de lyse ultrasonique pour l‘extraction d‘acides nucléiques et le transfert d‘échantillon ...... 208 7.3.1 Art antérieur et direction du projet ...... 208 7.3.2 L‘interface en acier inoxydable, un avantage ...... 208 7.3.3 Transfert sécuritaire du FULM et perspective ...... 209 7.4 Développement d‘un essai sur puce à ADN pour la détection et l‘identification des agents bactériens associés au bioterrorisme ...... 210 7.4.1 Art antérieur et objectifs de recherche ...... 210 7.4.2 Défi de design : la diversité biologique ...... 211 7.4.3 Les avantages, limitations et perspectives de l‘essai CABBA ...... 212 7.4.4 Puces à ADN, perspectives ...... 214 7.5 Divergence du gène codant pour le facteur d‘élongation Tu des espèces du genre Yersinia ...... 217 7.5.1 Découverte inattendue et objectifs ...... 217 7.5.2 Résultats obtenus à la suite de la publication de l‘article ...... 217 7.5.3 Analyses phylogénétiques de pointe ...... 218 7.5.4 L‘évolution du vivant, perspectives ...... 219 7.5.5 Fonctions de EF-TuA et EF-TuB, perspectives ...... 219 7.5.6 Tolérance aux antibiotiques, perspectives ...... 220 7.6 Perspectives générales du projet doctoral ...... 222 8 Conclusion ...... 224

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Annexe 1 ...... 226 Historique des guerres biologiques et du bioterrorisme : biohazard ou psychohazard ? ...... 226 De l‘Antiquité à la théorie des germes...... 227 Au 20e siècle ...... 230 Au 21e siècle ...... 235 Annexe 2 ...... 238 Figures supplémentaires à l‘article présenté au Chapitre 3 ...... 238 Annexe 3 ...... 245 Tableaux supplémentaires à l‘article présenté au Chapitre 5 ...... 245 Annexe 4 ...... 252 Analyses phylogénétiques supplémentaires à l‘article présenté au Chapitre 6 ... 252 Bibliographie ...... 259

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Liste des figures

Figure 1. Ligne du temps d‘évènements marquants au sujet des armes biologiques de l‘Antiquité à aujourd‘hui...... 6 Figure 2. Modes de dissémination des agents biologiques...... 25 Figure 3. Schéma de l‘arbre pulmonaire, des diamètres (D) des voies respiratoires et des diamètres (D) approximatifs des micro-organismes y pénétrant...... 28 Figure 4. Modèle schématique illustrant les fenêtres d‘utilisation des tests de détection et diagnostiques lors des procédures à la suite d‘une attaque bioterroriste...... 36 Figure 5. Modèle schématique de la propagation des agents biologiques en fonction de leur détection et de leur contagion...... 38 Figure 6. Principes de détection des macromolécules signatures des agents biologiques...... 40 Figure 7. Les quatre points cardinaux analytiques d‘un test diagnostique...... 42 Figure 8. Principes méthodologiques de la préparation des analytes...... 47 Figure 9. Représentation schématique d‘une puce, ou microdamier, à ADN en deux dimensions...... 54 Figure 10. Design d‘amorces d‘amplification à large spectre et de sondes de capture spécifiques utilisant les gènes conservés...... 56 Figure 11. Représentation schématique de la plateforme pour l‘hybridation rapide sur puce à ADN en microfluidique...... 57 Figure 12. Procédure pour réaliser un essai de détection des agents biologiques sur puce à ADN...... 61 Figure 13 [Figure 1]. DARE procedure and DNA extraction...... 99 Figure 14 [Figure 2]. Penetration and expulsion of bacterial spores in the 0.45-µm- pore-size filters...... 100 Figure 15. Design and configuration of the FULM...... 125 Figure 16. Effect of sonication time on the concentration of genomic DNA extracted from spores of B. atrophaeus...... 126 Figure 17. Confocal microscopy image revealing the damage inferred to FITC- labeled spores of B. atrophaeus upon exposure to ultrasound for 2 × 15 s. 127

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Figure 18. tuf gene sequence variability for 12 CABBA using the SVARAP program...... 157 Figure 19 [Figure 1]. Phylogenetic trees for tufA and tufB nucleic acid sequences from Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains...... 184 Figure 20 [Figure 2]. Phylogenetic network for tufA and tufB nucleic acid sequences from Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains...... 185 Figure 21. Le nombre de publications au sujet des technologies basées sur l‘analyse des acides nucléiques...... 216 Figure 22. Système intégré d‘analyse totale microfluidique rotatoire permettant le traitement de a) l‘échantillon (macrovolume), b) la lyse microbienne (microvolume), c) l‘amplification d‘ADN, d) et l‘hybridation sur puce à ADN. 223 Figure 23. Schéma de la trousse DARE...... 239 Figure 24. Protocole des procédures DARE et de lyse et fonction(s) de chaque étape entre parenthèses...... 240 Figure 25. Diamètres des micro-organismes aéroportés associés au bioterrorisme, poudres et autres référentiels en comparaison avec ceux des pores des filtres sélectionnés...... 241 Figure 26. Visualisation des filtres sélectionnés en microscopie optique...... 242 Figure 27. Représentation virtuelle du positionnement des spores dans les filtres avec la taille des pores de 0,45 µm...... 243 Figure 28. Schéma analytique présentant le nombre d‘échantillons sur les 23 analysés interférant avec la lyse bactérienne ou la PCR...... 244 Figure 29. Arbre phylogénétique des séquences du gène tuf du genre Yersinia de Paradis et al. (2005) et de génomes...... 253 Figure 30. Arbre phylogénétique des séquences d‘acides nucléiques des gènes tufA et tufB des souches du genre Yersinia, incluant Y. massiliensis, Y. similis et d‘autres de la famille ...... 255 Figure 31. Arbre phylogénétique du programme fastDNAml des séquences en acides nucléiques de 51 souches de Yersinia, de 8 autres espèces d‘Enterobacteriaceae et enraciné avec V. cholerae...... 256 Figure 32. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 16S rDNA de Y. enterocolitica, Y. pestis et E. coli...... 257 Figure 33. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 23S rDNA de Y. enterocolitica, Y. pestis et E. coli...... 258

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Liste des tableaux

Tableau 1. Travaux d‘armement biologique de plusieurs pays...... 10 Tableau 2. Agents biologiques prioritaires du bioterrorisme selon les CDC et le NIAID et leurs pathologies...... 16 Tableau 3. Classification taxonomique des agents biologiques prioritaires du CDC et du NIAID...... 21 Tableau 4. Caractéristiques et pathologies des agents bactériens aéroportés. .... 30 Tableau 5. Tableau de contingence pour l‘évaluation des critères cliniques d‘un test diagnostique...... 41 Tableau 6 [Table 1]. Interference of powdery and environmental samples, without treatment or after treatment, with PCR and lysis...... 96 Tableau 7 [Table 2]. Percentages of bacterial spore recovery after filtration steps...... 97 Tableau 8 [Table 3]. PCR efficiency without treatment and with the DARE procedure and detection thresholds...... 98 Tableau 9. CABBA and diseases...... 156 Tableau 10. Biased-broad-spectrum PCR primers used for amplification of tuf gene of 12 CABBA...... 158 Tableau 11. CABBA assay capture probes and hybridization results for each capture probe using low quantity of gDNA...... 159 Tableau 12. Specificity of microarray probes, results of hybridization of all CABBA and 40 other species...... 160 Tableau 13 [Table 1]. Yersinia strains used in this studya...... 171 Tableau 14 [Table 2]. tuf sequence variations in Yersiniaa...... 181 Tableau 15 [Table 3]. Interspecies variations of tuf sequences in Yersinia...... 182 Tableau 16. GeneBank Accession numbers from which tuf gene sequences were retrieved...... 246 Tableau 17. Number of strains from which genome sequences were available, and tuf gene sequences were retreived or not...... 251

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Liste des abréviations

ADN : acide désoxyribonucléique AN : acide nucléique ARN : acide ribonucléique ARNr 16S : Sous-unité 16S de l‘acide ribonucléique ribosomique ATP : adénosine triphosphate bp : base pair BoNT : neurotoxine botulinique BSL : biosafety level, niveaux de biosécurité de 1 à 4, 1 étant le niveau le plus faible et 4 le plus élevé1 CDC : Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, Géorgie, États-Unis) CFU : unité formant des colonies CMIU : Centre de mesures et d‘interventions d‘urgence de Santé Canada CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institutes CNS : Center for Nonproliferation Studies, Monterey Institute of International Studies (Monterey, Californie) DL50 : dose létale 50 % FBI : Federal Bureau of Investigation (Washington, D. C., États-Unis) FITC : isothiocyanate de fluorescéine FN : faux négatif FP : faux positif GRC : Gendarmerie royale du Canada (Ottawa, ON, Canada) ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses IMI : Conseil national de recherches Canada - Institut des matériaux industriels (Boucherville, QC, Canada) Interpol : Organisation internationale de la police criminelle (Lyon, France) i.p. : intrapéritonéale i.v. : intraveineuse

1 http://www.phac-aspc.gc.ca/publicat/lbg-ldmbl-04/ xx

LNM : Laboratoire national de microbiologie, Agence de la santé publique du Canada (Winnipeg, MA, Canada) LPM : litre par minute LRN : Laboratory Response Network dirigé par les CDC (Atlanta, Géorgie, États- Unis) LSPQ : Laboratoire de santé publique du Québec, Institut national de santé publique du Québec (Sainte-Anne-de-Bellevue, QC, Canada) MCL : Maximum Composite Likelihood NIAID : National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institute of Health (Bethesda, Maryland, États-Unis) NSABB : National Science Advisory Board for Biosecurity OMS : Organisation mondiale de la santé (Genève, Suisse) pb : paire de bases PCR : Réaction de polymérase en chaîne

Q50 : dose infectieuse nécessaire afin d‘infecter 50 % des humains exposés sur 1 km2 de surface (mesure standard utilisée par l‘agence Biopreparat). s.c. : sous-cutané SNA : système nerveux autonome SNC : système nerveux central SRAS-CoV : Syndrome respiratoire aigu sévère – Coronavirus U.R.S.S. : Union des républiques socialistes soviétiques USAMRIID : United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (Fort Detrick, Maryland, États-Unis) µTAS : Micro Total Analysis System (micro-système d‘analyse totale) VIH : virus de l‘immunodéficience humain VN : vrai négatif VP : vrai positif VPP : valeur prédictive positive VPN : valeur prédictive négative

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Liste des abréviations des espèces bactériennes

B. abortus : B. anthracis : Bacillus anthracis B. atrophaeus : Bacillus atrophaeus B. canis : Brucella canis B. cepacia : Burkholderia cepacia B. cereus : Bacillus cereus B. mallei : B. melitensis : Brucella melitensis B. pseudomallei : Burkholderia pseudomallei B. subtilis : Bacillus subtilis B. suis : Brucella suis C. botulinum : Clostridium botulinum C. burnetii : C. perfringens : Clostridium perfringens C. psittaci : Chlamydophila psittaci C. septicum : Clostridium septicum C. sporogenes : Clostridium sporogenes C. tetani : Clostridium tetani E. agglomerans : Enterobacter agglomerans E. carotovora : Erwinia carotovora E. coli : E. vulneris : Escherichia vulneris F. philomiragia : Francisella philomiragia F. tularensis : H. alvei : Hafnia alvei K. pneumoniae : L. pneumophila : M. avium : Mycobacterium avium M. kansasii : Mycobacterium kansasii M. terrae : Mycobacterium terrae M. tuberculosis : Mycobacterium tuberculosis N. meningitidis : O. anthropi : Ochrobacterium anthropi O. proteus : Obesumbacterium proteus xxii

P. aeruginosa : P. luminescens : Photorhabdus luminescens P. shigelloides : R. akari : R. conorii : R. felis : R. prowazekii : R. rickettsii : R. typhi : S. aureus : Staphylococcus aureus S. enterica : S. fonticola : Serratia fonticola S. flexneri : S. marcescens : V. cholerae : W. persica : Wolbachia persica Y. aldovae : Yersinia aldovae Y. aleksiciae : Yersinia aleksiciae Y. bercovieri : Yersinia bercovieri Y. enterocolitica : Y. frederiksenii : Yersinia frederiksenii Y. intermedia : Yersinia intermedia Y. kristensenii : Yersinia kristensenii Y. massiliensis : Yersinia massiliensis Y. mollaretii : Yersinia mollaretii Y. pestis : Y. pseudotuberculosis : Yersinia pseudotuberculosis Y. regensburgei : Yokenella regensburgei Y. similis : Yersinia similis Y. rohdei : Yersinia rohdei Y. ruckeri : Yersinia ruckeri

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1. Le bioterrorisme

lusieurs romans et films ont abordé les effets dévastateurs de la propagation P accidentelle ou volontaire de souches microbiennes hautement infectieuses dans la population. Ces scénarios catastrophiques fictifs ainsi que la reconnaissance de la subtilité des armes biologiques, souvent invisibles à l‘œil nu et pernicieuses, ont non seulement conscientisé la population mondiale, mais de surcroît augmenté sa peur face à ce type d‘armes. Par conséquent, un questionnement quant à la part de réalité, de propagande et de fiction s‘impose. Le bioterrorisme et les guerres biologiques ont en commun l‘utilisation d‘agents biologiques, organismes vivants ou leurs toxines, afin d‘infliger la mort ou bien la maladie à des êtres humains, des animaux ou des plantes (CDC 2007). Les armes biologiques sont quant à elles constituées principalement d‘un agent biologique, d‘une munition (contenant pour la conservation), d‘un système de transport ainsi que d‘un mécanisme de dissémination (Zilinskas 1997). Le concept de guerre biologique s‘applique à l‘utilisation d‘armes biologiques à des fins stratégiques durant un conflit armé entre nations. Commis par des organisations ou des individus, souvent radicaux, dans le but de faire avancer leur cause, le bioterrorisme mise davantage sur l‘aspect symbolique que stratégique de l‘acte. Interpol met d‘ailleurs l‘emphase sur l‘aspect biopsychosocial et politique dans la définition qu‘elle donne du bioterrorisme :

« Bioterrorism refers to the intentional release of biologic agents or toxins for the purpose of harming and killing , animals or plants with the intent to intimidate or coerce a government or civilian population to further political or social objectives » (Interpol 2007).

De plus, selon les Nations Unies,

« Les armes biologiques sont nettement plus faciles à fabriquer que les armes chimiques ou nucléaires et coûtent beaucoup moins cher. Tout pays ou tout groupe infraétatique déterminé à fabriquer un agent biologique peut probablement le faire avec un investissement minimal et, même si la diffusion des agents biologiques est difficile, certains moyens de dissémination peuvent être obtenus assez facilement » (Organisation des Nations Unies (ONU) 2012).

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Les armes biologiques sont donc classées parmi les armes de destruction massive accessibles et certains individus, certaines organisations et certains états pourraient en tirer avantage. C‘est pourquoi il est important de comprendre comment les armes biologiques ont été utilisées dans le passé, sans glisser dans la fiction ou la propagande, afin de se protéger à l‘avenir. Je ferai donc un tour d‘horizon relatant certains faits historiques qui permettront de comprendre davantage le bioterrorisme et les guerres biologiques ainsi que d‘orienter les travaux présentés dans cette thèse.

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1.1 Historique des guerres biologiques et du bioterrorisme

L‘utilisation d‘armes biologiques est survenue plutôt rarement dans les conflits armés ou lors d‘actes terroristes comparativement à d‘autres types d‘arsenal. En fait, de 1900 à 2001, 77 « actes » biologiques ont été répertoriés dans la base de données sur le terrorisme du Center for Nonproliferation Studies (CNS) du Monterey Institute of International Studies (Carus 2001; Leitenberg 2001; Zilinskas et al. 2004). En scrutant la littérature historique plus ancienne, on constate que d‘autres actes utilisant des agents biologiques ont été retracés (Berche 2009; Christopher et al. 1997; Lutwick et Lutwick 2009; Mayor 2003; Riedel 2004). J‘ai donc élaboré une ligne du temps permettant de comprendre la chronologie d‘évènements marquants au sujet des armes biologiques (Figure 1). Certaines attaques biologiques permettront de comprendre les interrelations entre leurs quatre composantes principales : le criminel ou l‘organisation responsable, l‘agent biologique, le moyen de dissémination et les cibles (Radosavljevic et Belojevic 2009). Le lecteur est référé à l‘annexe 1 s‘il désire avoir davantage d‘information au sujet de certains évènements historiques marquants.

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Figure 1. Ligne du temps d’évènements marquants au sujet des armes biologiques de l’Antiquité à aujourd’hui.

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1.1.1 De l’Antiquité à la théorie des germes

Bien avant la venue de la microbiologie moderne, l‘humain avait déjà compris qu‘il était possible de provoquer, par différents vecteurs, la transmission de maladies afin de gagner un avantage stratégique face à un ennemi. Dès l‘Antiquité, des animaux malades auraient été dirigés vers les ennemis (Trevisanato 2007). Des carcasses, des cadavres ou des fèces ont été utilisés à plusieurs reprises pour contaminer les puits de villages ennemis (Christopher et al. 1997; Mayor 2003). De plus, des flèches souillées par des enduits de toxines ou des fèces étaient souvent employées à la guerre (Mayor 2003). Au Moyen Âge, des cadavres de pestiférés pouvaient être catapultés pour infecter à distance davantage de personnes. Cette maladie hautement contagieuse pouvait se propager comme une traînée de poudre (Christopher et al. 1997; Derbes 1966). En 1767, passant d‘une technique grossière à une technique plus raffinée et imperceptible, un général anglais, Sir Jeffrey Amherst, ordonna la distribution de couvertures et de mouchoirs de varioleux aux populations autochtones d‘Amérique du Nord qui aidaient les Français. Il anticipait la propagation de la maladie sur une population qu‘il savait fragile (Berche 2009; Christopher et al. 1997). Ces exemples montrent qu‘au fil du temps, malgré le manque de connaissances scientifiques, l‘humain a su adapter ses méthodes pour accroître l‘efficacité de ses attaques, laissant moins de place au hasard.

Dès la Renaissance, les avancées scientifiques ont permis de développer des outils pour l‘étude de la microbiologie. Les travaux d‘Antonie Van Leeuwenhoek ont permis d‘observer au microscope des micro-organismes (Ronan 1988; van Zuylen 1981). Edward Anthony Jenner a ensuite réalisé des travaux montrant l‘immunisation offerte par la vaccination (Jenner 1801; Ronan 1988). Ses travaux ont toutefois ouvert une boîte de Pandore puisqu‘on pouvait maintenant s‘immuniser spécifiquement contre un agent biologique alors que l‘adversaire n‘y

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était pas protégé. Finalement, la théorie des germes, créditée principalement, mais non exclusivement, à Louis Pasteur et Robert Koch pour leurs travaux, a amené un changement de perspective au sujet des maladies infectieuses (Baxter 2001; Black 2003; Kaufmann et Schaible 2005; King 1952; Nobelprize.org 1967 ; Ronan 1988). De nombreux scientifiques leur ont succédé et ont continué à repousser les limites du savoir en microbiologie et en infectiologie. Les nombreuses avancées dans le domaine, principalement la microscopie, l‘immunisation, la culture pure et les Postulats de Koch, ont ouvert la voie aux programmes d‘armement biologique plus sophistiqués.

1.1.2 Au 20e siècle : guerres, armement et traités

Le concept d‘armement biologique, de l‘anglais weaponisation, englobe tous les travaux qui ont servi à développer des armes biologiques d‘autant plus puissantes que redoutables. Pour ce faire, plusieurs stratégies ont été utilisées, particulièrement, en augmentant, par exemple, la dissémination et la résistance à l‘environnement ou aux antibiotiques. L‘objectif était d‘augmenter leur impact : morbidité, mortalité, chute de l‘économie, état de panique général, etc. (Alibek et Handelman 2000; Zilinskas 1997). Tel que détaillé au Tableau 1, plusieurs grandes puissances ont travaillé secrètement par le passé sur des programmes d‘armement biologique à grande échelle. Les agents biologiques et les modes de dissémination développés ou utilisés ont été variés (Leitenberg 2001). Ces agents biologiques encore considérés comme prioritaires seront retrouvés dans le Tableau 2.

Durant la Première Guerre mondiale, de 1914 à 1918, l‘utilisation d‘armes chimiques a été plus marquante que celle d‘armes biologiques. En effet, près d‘un tiers des évacuations de soldats était causé par les armes chimiques (Mauroni 2003). À la suite de la Première Guerre mondiale, l‘utilisation d‘armes chimiques et biologiques faisait mauvaise figure. C‘est pourquoi le premier traité international

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interdisant l‘emploi d‘armes biologiques pour faire la guerre, le Protocole de Genève, a été signé initialement en 1925 et est entré en vigueur en 1928 (Comité international de la Croix-Rouge 2012). Toutefois, il présentait une portée limitée puisqu‘il n‘interdisait ni la production, ni le stockage d‘armes chimiques et biologiques. La Deuxième Guerre mondiale, de 1939 à 1945, a ravivé l‘intérêt pour le développement d‘armes biologiques. En effet, les Alliés ainsi que le Japon ont développé et expérimenté plusieurs armes biologiques lors de simulations ou d‘opérations militaires (Bryden 1989; Frigon 2010; Leitenberg 2001; Lockwood 2009; Lutwick et Lutwick 2009; Riedel 2004).

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Tableau 1. Travaux d’armement biologique de plusieurs pays.

Dates Pays Maladies (Agents Capacités de production et moyens biologiques) de dissémination 1914- Allemagne Maladie du charbon Animaux 1918 Morve 1939- U.R.S.S. Développement d‘un dispositif fixé à un 1945 Peste avion pour la dispersion d‘une émulsion de Y. pestis. 1944- Alliés Maladie du charbon Projet pour la production de bombes de 1945 (États-Unis, B. anthracis avorté. Canada, Production de tourteaux contaminés par Grande- B. anthracis. Bretagne) Développement de fines particules de B. anthracis aéroportées. 1954- États-Unis Production et/ou recherche Ex. Production de 650 tonnes de 1969/72 Botulisme Brucella suis par mois. Brucellose Entreposage d‘armes biologiques. Coxiellose Développement : ogives, vaporisateurs Encéphalite équine du Venezuela pour avion, réservoirs pour armes Fièvre jaune humides ou sèches. Fièvre pourprée des montagnes Tests avec des simulants sur des villes Rocheuses métropolitaines. Maladie du charbon Peste Psittacose Tularémie Entérotoxine staphylococcique 1945- U.R.S.S. Production et/ou recherche Préparations poudreuses aérosolisées de 1993? Brucellose B. anthracis. Coxiellose Capacité de production de B. anthracis de Encéphalites équines du 5 000 tonnes par année. Venezuela, japonaise et Réserve de 20 tonnes du virus de la transmises par les tiques variole. Fièvres hémorragiques de Lassa, Missiles balistiques contenant des d‘Argentine, de Bolivie, Ébola et simulants ont été testés. Marburg Maladie du charbon Mélioïdose Morve Peste Tularémie Variole ~1975- Irak Production et/ou recherche Développement : ogives, bombes 1991? Aflatoxine aériennes, système de vaporisation pour Conjonctivite hémorragique avion ou hélicoptère. Gastro-entérite Clostridium perfringens Maladie du charbon Ricine Toxine botulinique Variole du chameau ~1981- Afrique du Choléra Production de petites quantités. 1993 Sud Maladie du charbon Assassinat par la contamination Plusieurs espèces de Clostridium d‘aliments avec B. anthracis. spp. Contamination de puits avec V. cholerae. Développement : systèmes de dispersion.

Adapté de : (Alibek et Handelman 2000; Leitenberg 2001).

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Les travaux d‘armement biologique débutés lors de la Deuxième Guerre mondiale et poursuivis par la suite ont été précurseurs à un traité de désarmement bien plus restrictif que le Protocole de Genève. La Convention sur les armes biologiques ou à toxines a été signée en 1972 et mise en vigueur en 1975 afin d‘interdire la production et le stockage d‘armes biologiques et de forcer leur destruction (Biological and Toxin Weapons Convention (BTWC) 1972; US Central Intelligence Agency 2010). Toutefois, l‘U.R.S.S. a continué ses travaux d‘armement biologique et l‘accident de Sverdlovsk en 1979 força Moscou à l‘admettre (Alibek et Handelman 2000; National Security Archive 2001; Steele 2000). L‘Irak et l‘Afrique du Sud ont également eu des programmes d‘armement biologique par la suite (Duelfer 2004; Leitenberg 2001; Zilinskas 1997). D‘autres organisations non étatiques ont également montré la capacité de produire des agents biologiques. Les sectes Bhagwan Shree Rajneesh et Aum Shinrikyo sont deux exemples plus connus. La première a contaminé les bars à salade d‘une ville en Oregon avec la salmonelle pour influencer les résultats d‘un vote municipal (Torok et al. 1997). Quant à la seconde, elle a, entre autres, dispersé une souche de B. anthracis, heureusement non virulente, au-dessus de la ville de Kameido au Japon (Fouet et Mock 1996; Keim et al. 2001; Riedel 2004; Smith 1995).

1.1.3 Au 21e siècle : la menace terroriste et les canulars

Les attaques terroristes de 2001 et les lettres de menace accompagnées de préparations poudreuses de B. anthracis ont ravivé la peur de la population. En effet, ces évènements ont montré à quel point la population pouvait être vulnérable aux actes bioterroristes et l‘importance de s‘y préparer pour diminuer leurs impacts. Ils allaient de plus initier des changements au sujet des réglementations en biosécurité et motiver les états à se préparer contre ce type d‘attentat. Depuis, des mécanismes ont été implantés afin d‘éviter la publication de recherches pouvant être utilisées à mauvais escient pour le développement d‘armes biologiques. Même s‘ils sont controversés, ces mécanismes ont montré leur utilité

11 récemment lors d‘études portant sur les modifications géniques augmentant la virulence de souches de l‘influenza H5N1 (Herfst et al. 2012; Imai et al. 2012; MacKenzie 2011; Office of Biotechnology Activities 2012; Selgelid et Weir 2010; Shoham 2012; World Health Organization 2012).

Malgré toutes les mesures mises en œuvre à la suite de l‘automne 2001, d‘autres incidents utilisant des agents biologiques ont été répertoriés (Lutwick et Lutwick 2009). Depuis, le plus grand fardeau pour les autorités est toutefois le résultat de canulars. En effet, des milliers d‘enveloppes contenant des poudres inoffensives et des lettres de menace avertissant le destinataire de la présence d‘agents biologiques ont été postées par de nombreux individus ou groupes avec des intentions variées (La Scola et al. 2003; Leask et al. 2003; Santerre 2012; Tengelsen et al. 2002; Wills et al. 2008). Les autorités de sécurité et de santé publiques doivent donc fréquemment intervenir afin d‘évaluer ce type de menace et d‘offrir un support psychologique et médical aux victimes potentielles.

1.1.4 Apprentissage des évènements passés

Cet aperçu historique a montré que les types d‘actes bioterroristes et de guerres biologiques effectués dans le passé ont été hétéroclites. Les motivations ont été très variées : criminelles, militaires, politiques ou religieuses. Des attaques utilisant des armes biologiques ont été planifiées par des individus ou encore commanditées par certains états ou certaines organisations. Les moyens de dissémination ont connu une grande évolution au cours de l‘histoire, se sophistiquant avec les avancées scientifiques (Figure 1). La capacité de cibler de plus grands nombres de personnes a ainsi augmenté. Qu‘elle soit stratégique (grande échelle), opérationnelle (moyenne échelle) ou bien tactique (petite échelle), l‘amplitude des attaques peut varier considérablement (Radosavljevic et Belojevic 2009). Plusieurs grandes puissances ont secrètement développé un savoir-faire permettant de produire des armes biologiques de destruction massive (Tableau 1) (Alibek et Handelman 2000; Leitenberg 2001; Zilinskas 1997).

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L‘objectif d‘une attaque peut également être la perturbation sociale, telle qu‘exploitée lors d‘envois de lettres contenant des poudres inoffensives. La grande biodiversité du monde microbien a été en partie exploitée puisque plusieurs pathogènes ont été utilisés et que d‘autres ont été étudiés en vue de l‘être (Tableau 1). La grande variété de types d‘attaques biologiques potentielles et leurs subtilités complexifient la tâche pour s‘y préparer. Il est maintenant essentiel d‘acquérir une perspective scientifique des différents éléments du bioterrorisme en y intégrant les connaissances actuelles. J‘explorerai donc tout d‘abord la composition de ces armes biologiques ainsi que les modes de dissémination pouvant potentiellement être exploités. Par la suite, j‘enchaînerai avec la préparation contre le bioterrorisme, en présentant notamment les procédures d‘intervention et l‘importance des tests de détection des agents biologiques.

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1.2 Les agents biologiques

La biodiversité du monde microbien, fruit de l‘évolution de milliards d‘années de sélection génétique, est aussi vaste qu‘impressionnante. Chaque année, de nouvelles espèces microbiennes sont découvertes. Parmi celles-ci, certaines peuvent être pathogènes pour l‘espèce humaine et elles seront alors nommées pathogènes émergents. Dans les 40 dernières années, le virus de l‘immunodéficience humain (VIH) est probablement l‘exemple le plus connu ayant affligé notre société, d‘un continent à l‘autre. En 2001, une étude a chiffré le nombre de pathogènes humains à 1 415, dont 538 espèces bactériennes, 307 fongiques, 287 helminthiques, 217 virales ou de prions et 66 de protozoaires (Taylor et al. 2001). Depuis, plusieurs autres pathogènes humains émergents ont été rapportés, dont un exemple frappant est le SRAS (Olano et Walker 2011; Woo et al. 2008; Woolhouse et al. 2005). De ce fait, de nombreux micro-organismes pourraient donc être utilisés lors d‘actes bioterroristes, mais contrairement à certaines croyances, il n‘est pas nécessaire qu‘ils infligent un haut taux de mortalité pour se révéler efficaces (Lindler et al. 2005). En effet, même si les armes biologiques sont catégorisées comme étant des armes de destruction massive, le but recherché peut être différent, par exemple, la perturbation sociale.

1.2.1 La sélection des agents biologiques prioritaires par les autorités

Fortes des connaissances modernes en infectiologie ainsi que d‘informations au sujet de certains programmes d‘armement biologique du passé, plusieurs organisations nationales et internationales ont établi des listes de pathogènes humains possiblement employés (Guillemin 2005). Quoique ces listes se ressemblent beaucoup, une des plus employées est celle des Centers for Disease Control and Prevention (CDC). C‘est notamment parce qu‘elle classifie les pathogènes prioritaires par ordre d‘importance en trois catégories, A, B et C, en évaluant la menace qu‘ils constitueraient pour la santé s‘ils étaient utilisés lors

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d‘actes bioterroristes (CDC 2000; Rotz et al. 2002). Le NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Diseases) a, pour sa part, défini une liste plus détaillée d‘agents biologiques sur lesquels il est prioritaire de faire des recherches. Leurs objectifs sont, de ce fait, d‘augmenter nos connaissances au sujet de ces agents biologiques ainsi que de développer non seulement des vaccins et des thérapies, mais également des méthodes diagnostiques à la fine pointe de la technologie (NIAID 2003). Un autre avantage de cette liste est le fait qu‘elle soit mise à jour régulièrement par le NIAID (NIAID 2012).

1.2.1.1 Définitions des catégories A, B et C du CDC

Le Tableau 2 présente donc la compilation des agents biologiques listés par les CDC et le NIAID ainsi que les pathologies qui leur sont associées. J‘y ai également ajouté d‘autres agents biologiques sur lesquels il y a eu des recherches à des fins d‘armement (Leitenberg 2001; Zilinskas 1997). Ce tableau permet de constater rapidement la variété d‘agents biologiques et de pathologies potentielles. Ces maladies ont un large spectre de dangerosité, cela va des gastro-entérites plus communes nécessitant rarement des hospitalisations aux fièvres hémorragiques virales dévastatrices contre lesquelles l‘arsenal prophylactique et thérapeutique est plus limité (Burnett et al. 2005; Sampath et al. 2011). La séparation des agents biologiques en trois catégories permet d‘évaluer l‘impact qu‘ils auraient s‘ils étaient utilisés lors d‘actes bioterroristes. Premièrement, les agents biologiques de la catégorie A ont le plus haut niveau de dangerosité. Ils peuvent être aisément disséminés et certains peuvent être transmis de personne à personne; ils pourraient donc se répandre sur un grand secteur s‘ils étaient utilisés comme armes biologiques (CDC 2000; Masci et Bass 2005). Ces pathogènes ayant des taux de mortalité élevés auraient un impact majeur sur la santé publique. C‘est pourquoi il est nécessaire de prendre des mesures préparatoires pour lutter contre ces agents biologiques et de nombreuses recherches ont été faites depuis 2001 afin de s‘en protéger. Les agents de la catégorie B présentent un potentiel de

15 dissémination et un taux de morbidité modérés, mais un taux de mortalité faible. Il est donc nécessaire de surveiller les maladies associées et d‘améliorer leurs méthodes diagnostiques. Finalement, les agents de la catégorie C incluent les pathogènes émergents, qui pourraient être relativement facilement produits et disséminés, et potentiellement impliquer un haut niveau de morbidité et de mortalité. Ils représentent donc une menace émergente et il est important d‘améliorer nos connaissances à leurs sujets ainsi que de surveiller ces pathogènes (CDC 2000; NIAID 2003).

Tableau 2. Agents biologiques prioritaires du bioterrorisme selon les CDC et le NIAID et leurs pathologies.

Catégorie Type Agent infectieux Maladie

Bacillus anthracis Maladie du charbon Bactérie Francisella tularensis Tularémie Yersinia pestis Peste Bactérie Clostridium botulinum (Neurotoxine botulinique) Botulisme ou Toxine Virus de la Variole Variole Autres Poxviridae Autre (p. ex. Virus de la variole du singe et Virus de la (Varioles du singe et du variole du chameau chameau)

Virus de Guanarito Virus de Junin A Virus de la fièvre de Lassa Arenavirus Virus Virus de la chorioméningite lymphocytaire Fièvres hémorragiques Virus de Machupo virales Virus de l‘Ébola Filoviridae Virus de Marburg Flavivirus Virus de la Dengue Hantavirus spp. Bunyaviridae Virus de la fièvre de Rift Valley

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Catégorie Type Agent infectieux Maladie Brucella spp. Brucellose Morve (anglais : Burkholderia mallei ) Burkholderia pseudomallei Mélioïdose Bactérie Chlamydophila psittaci Psittacose Fièvre Q (synonyme Coxiella burnetii coxiellose) Rickettsia prowazekii Typhus épidémique Clostridium perfringens Maladie de la toxine Bactérie et toxine (toxine Epsilon) epsilon Staphylococcus aureus (entérotoxine B : SEB) Intoxication à la SEB Intoxication à la Toxine végétale Ricinus communis (ricine) ricine Virus de l‘encéphalite équine de l‘Est (EEE) Virus de l‘encéphalite équine de l‘Ouest (WEE) Virus de l‘encéphalite équine du Venezuela (VEE) Encéphalites Virus Virus de l‘encéphalite de Californie virales Virus de l‘encéphalite japonaise Virus de la maladie de la forêt de Kyasanur Virus de LaCrosse Virus du Nil occidental (WNV) B Entérite Entérite, colite hémorragique, E. coli diarrhégénique syndrome (p. ex. O157 :H7) hémolytique urémique Listeria monocytogenes Gastro-entérite Bactérie Salmonellose/Fièvre Salmonella spp. typhoïde Shigella spp. Shigellose Vibrio cholerae Choléra

eau ou alimentaires ou eau Vibrio spp. pathogéniques Gastro-entérites Yersinia enterocolitica Gastro-entérite de l‘ de Champignon Microsporidia Microsporidioses Cryptosporidium parvum Cryptosporidiose Infection à Cyclospora cayatanensis Cyclospora Protozoaire

Pathogènes Entamoeba histolytica Amibiase intestinale Giardia lamblia Giardiase Toxoplasma gondii Toxoplamose Calicivirus Gastro-entérites Virus Virus de l‘Hépatite A Hépatite A

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Catégorie Type Agent infectieux Maladie Mycobacterium tuberculosis, souches multirésistantes aux Tuberculose antibiotiques Autres Rickettsia spp. NA Bactérie Rickettsia conorii Fièvre boutonneuse méditerranéenne

Fièvre pourprée des montagnes Rickettsia rickettsii Rocheuses Rickettsia typhi Typhus endémique Coccidioides immitis Champignon Coccidioïdomycoses Coccidioides posadasii Virus de Chikungunya Chikungunya Virus de la fièvre jaune Fièvre jaune C Virus de l‘encéphalite transmis par Encéphalite les tiques Virus de la fièvre hémorragique de Fièvre hémorragique Crimée-Congo Virus de l‘influenza Grippe

Virus Virus du Nil Occidental Encéphalite du Nil Occidental

Virus de Nipah Encéphalite

Syndrome cardiopulmonaire à Autres Hantavirus Hantavirus

Virus de la rage Rage Virus du syndrome respiratoire aigu Syndrome respiratoire aigu sévère sévère

Catégorie Type Agent infectieux Maladie Aspergillus flavus (Aflatoxine) Aflatoxicose Champignon Aspergilus parasiticus (Aflatoxine) Autres ou toxine Fusarium spp. et autres genres Variable, inflammation du système (Trichothécènes mycotoxines) digestif, déficit de l‘hématopoïèse, etc.

Adapté de (CDC 2000; Ciottone 2006; Leitenberg 2001; NIAID 2012; Rotz et al. 2002; Zilinskas 1997).

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1.2.2 Diversité des agents biologiques prioritaires

Les tableaux 3a-3c présentent la classification taxonomique des agents biologiques afin d‘illustrer leur biodiversité. En effet, quatre des six règnes du vivant décrits par Cavalier sont représentés (Cavalier-Smith 1998), et ce, sans compter les virus dont l‘inclusion dans le monde du vivant est débattue (Ruiz- Saenz et Rodas 2010). Quoique les agents biologiques puissent être d‘origine variée, ils sont principalement représentés par des bactéries (Tableau 3a) ou des virus (Tableau 3c). En effet, la facilité du nombre de bactéries à croître en culture axénique explique en partie le fait que plusieurs espèces aient été étudiées lors de programmes d‘armement biologique. Un second attrait pour les bactéries est le fait que les antibiotiques pourraient également, la plupart du temps, permettre de traiter le fabricant au cas où il serait accidentellement infecté. Ceci n‘est pas le cas pour plusieurs maladies virales puisque des vaccins et des antiviraux ont été développés seulement contre certaines de ces infections (Burnett et al. 2005; Sampath et al. 2011). Les difficultés de production de virus sont plus élevées, entre autres, puisque ces derniers ont nécessairement besoin de l‘appareillage cellulaire d‘un hôte afin de se reproduire. Ces deux contraintes majeures pourraient limiter les fabricants souhaitant se protéger et produire des quantités de virus importantes avec des budgets restreints. Par contre, les faibles doses infectieuses et la haute contagiosité de certaines maladies virales, dont la variole, ont tout de même justifié leur inclusion dans les programmes de certains pays (Tableau 1) (Alibek et Handelman 2000; Leitenberg 2001). D‘autre part, certains protozoaires (Tableau 3b) ont été inclus dans la catégorie B du CDC et du NIAID puisqu‘ils pourraient être utilisés pour contaminer l‘eau ou les aliments. Quant au règne des fungi (Tableau 3b), il est représenté par certaines mycotoxines (Ciottone 2006; Zilinskas 1997) ainsi que l‘embranchement des Microsporidia, dont l‘appartenance taxonomique controversée a précisément été clarifiée par des études phylogénétiques plus récemment (Capella-Gutierrez et al. 2012).

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Finalement, la ricine est le seul agent biologique listé ici qui n‘est pas d‘origine microbiologique (Tableau 3b). Elle est reconnue comme étant l‘une des toxines les plus létales sur la planète et est extraite d‘une plante nommée Ricinus communis. Les agents biologiques listés ici sont si différents qu‘ils ont également des modes de transmission variés.

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Tableau 3. Classification taxonomique des agents biologiques prioritaires du CDC et du NIAID.

Tableau 3a. Les procaryotes.

Domaine Règne Embranchement Classe Ordre Famille Genre Espèce tuberculosis Actinobacteria Actinobacteria Corynebacteriales Mycobacteriaceae Mycobacterium complex Chlamydiae Chlamydiia Chlamydiales Chlamydiaceae Chlamydophila psittaci Bacillaceae Bacillus anthracis Bacilli Bacillales Listeriaceae Listeria monocytogenes Firmicutes Staphylococcaceae Staphylococcus aureus botulinum Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridium perfringens Rhizobiales Brucella spp. prowazekii Rickettsia spp. mallei Bacteria Burkholderiaceae Burkholderia pseudomallei Campylobacteraceae Campylobacter jejuni Escherichia coli Salmonella Protoebacteria spp. Enterobacteriales Enteroacteriaceae Shigella spp. enterocolitica Yersinia pestis Coxiellaceae Coxiella burnetii Francisellaceae Francisella tularensis cholerae Vibrionales Vibrio Autres Vibrio pathogènes Références : (Bergey's Manual Trust 2010; Brenner et al. 2005; Krieg et al. 2010; Vos 2009).

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Tableau 3 b. Les virus

Domaine Type d’AN Ordre Famille Genre Espècea Guanarito virus Junín virus Arenaviridae Arenavirus Lassa virus Lymphocytic choriomeningitis virus Machupo virus NR Hantavirus spp. Nairovirus Crimean-Congo hemorrhagic fever virus ARNsb Bunyaviridae La Crosse virusb Orthobunyavirus California encephalitis virus Phlebovirus Rift Valley fever virus Orthomyxoviridae Influenzavirus A Influenza A virus Ebolavirus spp. Filoviridae Marburgvirus Marburg marburgvirus Mononegavirales Paramyxoviridae Henipavirus Nipah virus Rhabdoviridae Lyssavirus Rabies virus Nidovirales Coronaviridae Betacoronavirus Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus Virus Norovirus Norwalk virus Caliciviridae Sapovirus Sapporo virus Dengue virus Japanese encephalitis virus Kyasanur Forest disease virus Flaviviridae Flavivirus Tick-borne encephalitis virus West Nile virus ARNsb + NR Yellow fever virus Variola virus Camelpox virus Poxviridae Orthopoxvirus Monkeypox virus Autres Eastern equine encephalitis virus Togaviridae Alphavirus Venezuelan equine encephalitis virus Western equine encephalitis virus Picornavirales Picornaviridae Hepatovirus Hepatitis A virus Légende. AN : acide nucléique. ARNsb + : acide ribonucléique simple brin à polarité positive. ARNsb - : acide ribonucléique simple brin à polarité négative. NR : pas de rang attitré. a : Les noms des espèces de virus sont présentés selon la nomenclature de l‘ICTV (ICVT 2009) ou b selon Hollidge et al. (Hollidge et al. 2010). 22

Tableau 3 c. Les eucaryotes.

Domaine Règne Embranchement Classe Ordre Famille Genre Espèce flavus Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus parasiticus Eurotiomycetes Ascomycota immitis Fungi Onygenales NR Coccidioides posadasii Sordariomycetes Hypocreales Nectriaceae Fusarium spp. Microsporidia NS NS NS NS NS Eukarya Cryptosporidiidae Cryptosporidium parvum Apicomplexa Coccidia Eucoccidiorida Eimeriidae Cyclospora cayetanensis Protozoa Sarcocystidae Toxoplasma gondii

Giardia intestinalis* NR Entamoeba histolytica Sous-classe : Viridiplantae Streptophyta Malpighiales Euphorbiaceae Ricinus communis rosids Légende : NS : non spécifié. NR : pas de rang attitré. * anciennement Giardia lamblia. Référence : (National Center for Biotechnology Information (NCBI) 2012).

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1.2.3 Modes de dissémination

La revue historique préalable (Figure 1 et Tableau 1) a montré que plusieurs voies de transmission ont été exploitées afin de propager les agents biologiques. La Figure 2 illustre les modes de dissémination possibles des agents biologiques, que ce soit des micro-organismes ou encore des toxines. Tels que montrés en bleu, ces agents peuvent être dispersés directement dans l‘environnement ou en utilisant des véhicules (transporteurs inanimés d‘agents infectieux). D‘autre part, d‘autres organismes vivants illustrés en vert peuvent transmettre ces agents biologiques par un contact direct ou encore un contact indirect, ce dernier nécessitant un transfert dans l‘environnement avant d‘atteindre l‘hôte (Black 2003; Prescott 2010; Siegel et al. 2007). Les épithéliums constituent généralement une barrière mécanique efficace contre l‘entrée d‘agents biologiques présents dans l‘environnement. En plus d‘avoir un rôle de protection, les épithéliums des muqueuses digestives et respiratoires ont un rôle important à jouer pour l‘absorption des nutriments ou les échanges gazeux. Ces épithéliums constitués d‘une seule couche de cellules sont donc plus vulnérables à l‘invasion par des corps étrangers. Plusieurs agents biologiques ont donc développé des mécanismes leur permettant d‘exploiter cette vulnérabilité en pénétrant l‘organisme par les systèmes digestif ou encore respiratoire (Cotran et al. 2010; Salyers et Whitt 1994). Je développerai davantage au sujet de cette dernière voie de transmission puisque mon projet se concentre sur les espèces bactériennes aéroportées associées au bioterrorisme.

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MODES DE DISSÉMINATION

Aérosols Percutanée Transmission verticale Hommes

Aéroportée Gouttelettes Muqueuse Contact direct

Animaux Noyaux de Environnement Peau gouttelettes Contact Vivants ou véhicule indirect

Plantes Alimentaire (toxines)

Objets Insectes

Figure 2. Modes de dissémination des agents biologiques.

1.2.3.1 La transmission aéroportée

Theodore Rosebury et Elvin Kabat (1947), deux scientifiques renommés de Columbia University ont publié, après la Deuxième Guerre mondiale, un rapport dans lequel ils ont conclu que « The air-borne route of infection seems to be the most practicable for bacterial warfare […] ». En effet, il a été estimé que dans une ville métropolitaine, 100 kg de préparation de spores de B. anthracis disséminés dans l‘air lors de conditions environnementales favorables pourraient causer jusqu‘à trois millions de décès (Alibek et Handelman 2000; Inglesby et al. 1999). Plusieurs types de particules permettent la transmission dans l‘air des agents biologiques : gouttelettes, noyaux de gouttelettes et aérosols. Par définition, la transmission par gouttelettes nécessite la formation de particules contaminées qui sont transportées dans l‘air sur une courte distance, historiquement considérée comme étant moins d‘un mètre. Toutefois, cette distance est controversée puisque de nombreuses conditions peuvent influencer leur déplacement. Les gouttelettes peuvent sédimenter ou être transformées rapidement par dessiccation en noyaux de gouttelettes et pouvant voyager sur une plus grande distance. Quant aux aérosols, ils sont de fines particules, incluant par exemple les noyaux de

25 gouttelettes et les poudres, qui peuvent rester en suspension dans l‘air, être transportés aisément sur de plus grandes distances et pénétrer plus profondément l‘arbre pulmonaire (Siegel et al. 2007). Dans la contexte du bioterrorisme, des poudres ou poussières extrêmement fines peuvent être utilisées comme additifs pour créer des aérosols et ainsi augmenter la dispersion et la résistance des agents biologiques dans l‘environnement (Alibek et Handelman 2000; Duncan et al. 2009; Shoham et Jacobsen 2007). L‘attaque aux lettres contenant des préparations poudreuses de B. anthracis en 2001 ainsi que des études expérimentales ont montré le potentiel dévastateur de ce mode de transmission (Duncan et al. 2009; Jernigan et al. 2001; Kournikakis et al. 2001).

1.2.3.2 L’anatomie du système respiratoire et ses défenses

Il est important d‘observer l‘anatomie du système respiratoire et ses mécanismes de défense pour comprendre comment les agents biologiques peuvent y pénétrer (Figure 3) (Levitzky 2007). D‘autant plus qu‘à chaque minute, environ sept litres d‘air infiltrent les voies respiratoires pour assurer des échanges gazeux efficaces, transportant également des particules et des micro-organismes. C‘est pourquoi plusieurs mécanismes de défense sont à l‘œuvre chaque jour pour protéger nos voies respiratoires composées de tissus sensibles. L‘air pénètre donc par le nez ou la bouche pour traverser le pharynx et le larynx, ceci constitue les voies respiratoires supérieures. Un système de piégeage efficace, grâce entre autres aux poils nasaux, à la turbulence dans les fosses nasales et au mucus, permet d‘éliminer nombre de particules, surtout si l‘air est inspiré par le nez. Ensuite, l‘air pénètre les voies respiratoires inférieures ayant des diamètres se rétrécissant cent fois. Les cellules ciliées, la toux, les expectorations et la déglutition sont autant de moyens pour éliminer le mucus contaminé du système respiratoire inférieur. Les 480 millions d‘unités alvéolaires constituent une surface d‘échange gazeux estimée entre 50 et 100 m2 chez l‘adulte (Levitzky 2007). La Figure 3 illustre également les diamètres approximatifs des micro-organismes pouvant pénétrer les

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voies respiratoires (Kowalski et Bahnfleth 1998; Levitzky 2007). Finalement, lorsque les mécanismes de défense principalement mécaniques ne réussissent pas à éliminer ces corps étrangers, les macrophages alvéolaires libres patrouillant la surface de l‘épithélium à la recherche de particules étrangères à phagocyter prennent la relève. Si les toxines ou micro-organismes réussissent à franchir toutes ces frontières et à pénétrer l‘espace interstitiel ou le sang, d‘autres phagocytes pourront prendre en charge leur destruction et activer le système immunitaire acquis (Levitzky 2007). Une proportion des agents biologiques dispersés dans l‘air peut toutefois pénétrer plus profondément les voies respiratoires et trouver des moyens d‘échapper aux défenses immunitaires causant ainsi des infections ou des toxicoses. C‘est pourquoi je présenterai les caractéristiques des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme.

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Figure 3. Schéma de l’arbre pulmonaire, des diamètres (D) des voies respiratoires et des diamètres (D) approximatifs des micro-organismes y pénétrant.

1.2.4 Les agents bactériens aéroportés sélectionnés pour cette thèse

Plusieurs notions théoriques d‘épidémiologie des maladies infectieuses sont essentielles à la compréhension du potentiel dévastateur de chaque agent biologique : caractéristiques morphologiques, maladies, modes de transmission, temps d‘incubation, doses infectieuses, traitements curatifs et prophylactiques disponibles, et résistances dans l‘environnement. Le Tableau 4 expose de façon succincte ces informations. Les agents bactériens aéroportés sélectionnés pour cette thèse sont au nombre de 12. Leurs caractéristiques microbiologiques sont diversifiées : coloration, forme, sporulation et croissance. Les maladies causées par les agents bactériens aéroportés sélectionnés sont également nombreuses. Les prodromes de plusieurs de ces maladies se présentent par des symptômes

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pseudogrippaux et cette similarité complexifie le diagnostic (Masci et Bass 2005). De plus, les doses infectieuses estimées sont variables, passant de 1 bactérie pour C. burnetii à 2 500 - 55 000 spores pour B. anthracis (Ciottone 2006; Inglesby et al. 1999; Lindler et al. 2005). Ceci aura une influence sur le nombre de personnes pouvant être infectées lors d‘une attaque bioterroriste. Les taux de mortalité ont également un spectre très étendu et sont modulés par les traitements prophylactiques et curatifs disponibles. Des vaccins sont disponibles pour s‘immuniser préventivement ou rapidement à la suite de l‘exposition contre seulement certains de ces agents biologiques. Des antibiothérapies et des antitoxines peuvent également être disponibles. Comme vous pouvez constater, la durée des traitements même prophylactiques, par exemple de 60 jours dans le cas de la maladie du charbon, peut être longue. De là l‘importance d‘identifier efficacement les victimes infectées à l‘aide de technique de détection rapide, car les réserves limitées de certains de ces traitements devront être utilisées de façon judicieuse. Par ailleurs, la résistance dans l‘environnement peut être également très différente d‘un agent biologique à un autre. Par exemple, les spores de B. anthracis peuvent persister dans l‘environnement des années alors que la forme végétative de Y. pestis y survit moins d‘une heure (Ciottone 2006; Sinclair et al. 2008). Vous comprendrez donc pourquoi les procédures de décontamination contre B. anthracis en 2001 ont été très complexes et dispendieuses (Campbell et al. 2012). Toutes ces informations rassemblées permettent de comprendre les conséquences qu‘aurait un acte bioterroriste utilisant chacun de ces pathogènes sur la population. Par conséquent, ce tableau permet de comprendre l‘importance réelle de se préparer en cas d‘acte bioterroriste.

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Tableau 4. Caractéristiques et pathologies des agents bactériens aéroportés.

Dose Traitement curatif et Estimation de la Agent Transmission Taux Morphologie Maladie infectieuse Incubation prophylactique viabilité dans biologique aéroportée mortalité (inhalation) possible l'environnement

1 à 5 jours, Maladie du Charborn 2 500- Tr : 50 % Antibiothérapie 60 jours, B. anthracis Bacille G+ Inhalation jusqu'à 6 Années (Inhalée) 55 000 spores STr : 95 % vaccin semaines Toxine botulinique Bacille G+, sporulant Botulisme Inhalation LD50 : 3ng/kg 2 h à 1 semaine 90 % Antitoxine Années (spores) (C. botulinum) Air : <1 à 8 h Objets inanimés : Inhalation Tularémie (Pneumonique, Tr : 1 % 4 à 175 h F. tularensis Coccobacille G - Absence de 10 à 50 CFU 1-10 jours Antibiothérapie 14 jours Septicémique) STr : 30 % Résistance P à P dans les amibes environnementales Coccobacille G Air : < 1 h Peste (Pneumonique, Inhalation 343 bactéries Y. pestis Coloration bipolaire 1 à 6 jours STr : 100 % Antibiothérapie 7 jours Objets inanimés : Septicémique) P à P (gouttelettes) (grivet) ("safety pin") < 1 à 47 h Inhalation DI50 : Antibiothérapie 6 Plus de Brucella spp. Coccobacilles G- Brucellose Semaines à mois 2 % Absence de P à P 10 à 100 CFU semaines 400 jours Tr : 40-50 %, Antibiothérapie 24 Morve (Pulmonaire, 1 à 10 CFU B. mallei Bacille G- Inhalation 10 à 14 jours STr : semaines Qq. mois Septicémie fulminante) (hamster) 90- >95 % Attention à la résistance Mélioïdose (Pneumonie, 100 CFU (modèle Bactériémie, murin d’infection 2 jours à B. Infection locale, chronique) Antibiothérapie 22-24 Bacille G- Inhalation plusieurs années Jusqu'à 40 % Années pseudomallei Infection chronique 2 500 CFU (modèle semaines (29 ans) purulente, murin d’infection Asymptomatique) aiguë)

Toxine ≤12 heures, Maladie de la toxine LD : epsilon (C. Bacille G+ sporulant Inhalation décès possible en ND Support Années (spores) epsilon 1µg/kg perfringens) 30-60 min

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Dose Traitement curatif et Estimation de la Agent Transmission Taux Morphologie Maladie infectieuse Incubation prophylactique viabilité dans biologique aéroportée mortalité (inhalation) possible l'environnement

Bactérie Psittacose (Pneumonie Inhalation Modèle bovin : 1 à 15 Tr : 1 % Antibiothérapie, 10 à 14 Jusqu'à C. psittaci intracellulaires atypique, Bactériémie) P à P (rare) 106 UFI jours STr : 20 % jours patient afébrile 1 sem obligatoire

Anciennement Antibiothérapie : 14 à 21 Coxiellose considérée bactérie jours Synonyme : intracellulaire Si comorbidité ou Semaines C. burnetii Fièvre Q Inhalation 1 UFI 10 à 40 jours 1 % obligatoire complication cardiaque : à mois (Maladie fébrile, Maintenant : culture tr. 1 à 3 ans Pneumonie, Hépatite) axénique possible Vaccin

STr : 12-20 % Antibiothérapie, Bactérie intracellulaire 7 à 14 jours, Complication R. prowazekii Typhus épidémique Inhalation < 10 particules 3 jours patient afébrile 100 jours obligatoire 10-50 ans vasculaires : Vaccin 15-40 % Antibiothérapie Tuberculose (Primaire, 6-9 mois M. Bacille acido-alcoolo- Réactivation, Pulmonaire, Inhalation Forme active Traitement antibiotique en tuberculosis 10 CFU < 1 à > 20 ans Plusieurs mois résistants Extrapulmonaire, P à P STr : ≤66 % fonction de la résistance multirésistant Asymptomatique) de la souche. Vaccin BCG

Références : (Azad 2007; Ciottone 2006; Conejero et al. 2011; Inglesby et al. 1999; Kramer et al. 2006; Lindler et al. 2005; Lutwick et Lutwick 2009; Reinhold et al. 2012; Sinclair et al. 2008; Vynnycky et Fine 2000; World Health Organization 2012). NB : la majorité des informations présentées dans ce tableau ont été tirées de Ciottone 2006, les références appuyant ces informations n‘ont pas toutes pu être contre-vérifiées et validées.

Légende : CFU : unité formant des colonies ND : non disponible DI50 : Dose pouvant infecter 50 % des individus P à P : tranmission personne à personne G - : Gram négatif STr : sans traitement G + : Gram positif Tr : traitement LD50 : Dose létale 50 % UFI : unité formant des inclusions LD : Dose létale

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1.3 La préparation contre le bioterrorisme

Les armes biologiques ont des particularités distinctives. Alors que les explosifs et les armes chimiques peuvent causer des dommages immédiats dans un secteur délimité, les agents biologiques nécessitent un temps d‘incubation avant de provoquer des symptômes et certains d‘entre eux, contagieux, peuvent même se transmettre par la suite de personne à personne. Cette subtilité explique pourquoi une fois les agents biologiques dispersés dans l‘environnement, les responsables peuvent perdre eux-mêmes le contrôle de leur arme biologique (Rosebury et Kabat 1947). La préparation des états à ces attaques nécessite donc l‘élaboration et le perfectionnement de procédures d‘interventions, de méthodes de détection et diagnostiques ainsi que de traitements prophylactiques et curatifs. Il est maintenant important de comprendre les procédures d‘intervention contre la menace biologique.

1.3.1 Procédures d’intervention à la suite d’un acte bioterroriste

Cette section présentera un bref aperçu des procédures d‘intervention à la suite d‘un acte bioterroriste pour faciliter la compréhension de cette thèse. Je focaliserai sur celles internationales ainsi que celles du Canada et des États-Unis. Lors d‘une menace de bioterrorisme, il est important en premier lieu d‘éliminer l‘éventualité de menaces chimiques, explosives ou radioactives. La sécurité du personnel d‘intervention est primordiale; les entraînements et équipements appropriés sont nécessaires. L‘équipe d‘intervention est généralement constituée d‘officiers de police ou de pompiers arrivant en première ligne, d‘équipes spécialisées, d‘un conseiller en biosécurité, d‘enquêteurs et de responsables des relations publiques. La tâche est complexe; ils devront en plus d‘établir un périmètre de sécurité, évaluer la menace, collecter les échantillons, coordonner les interventions médicales, recueillir la preuve, procéder à la décontamination du site, enquêter et

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informer le public (Interpol 2007; Raber et al. 2011). Au Canada, le Centre de mesures et d‘interventions d‘urgence (CMIU) de l‘Agence de la santé publique du Canada est l‘organisme gouvernemental en santé autoritaire en ce qui a trait au bioterrorisme (Santé Canada 2002). En cas d‘urgence, le Système de la réserve nationale d‘urgence peut faire parvenir des fournitures médicales et pharmaceutiques ainsi que déployer des unités médicales dans un délai de 24 heures (Agence de la santé publique du Canada 2012).

1.3.1.1 Attaques annoncées ou non annoncées

Les procédures d‘intervention varient considérablement selon l‘annonce ou non d‘une attaque bioterroriste (Figure 4) (CDC 2000; Interpol 2007). En effet, la sécurité publique peut être informée (attaque annoncée) de l‘imminence d‘une attaque par, entre autres, des lettres de menace, des dénonciations et la découverte de matériels ou d‘agissements suspects. Les autorités chercheront donc à identifier la source de l‘agent infectieux pour procéder aux arrestations et à la décontamination. Pour ce faire, ils devront recueillir des échantillons afin d‘effectuer des tests de détection sur le terrain ainsi qu‘en laboratoire suivant les standards de la preuve microbiologique légale. Les autorités de la sécurité publique informeront également les responsables de la santé publique de cette menace afin que les institutions médicales se préparent à offrir des soins appropriés aux victimes présumées ou identifiées (CDC 2000; Interpol 2007). Ces dernières pourront recevoir des traitements prophylactiques lorsque disponibles, tel que décrit au Tableau 4. Des tests diagnostiques seront ensuite réalisés chez les victimes potentielles ou les patients avec des présentations cliniques pouvant être expliquées par l‘agent biologique en cause. La panique de la population engendrée par cette menace peut inciter de nombreuses consultations médicales et le système de santé devra se préparer à un achalandage grandement augmenté (Ciottone 2006).

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Il est plus probable que les attaques bioterroristes ne soient pas annoncées pour maximiser leurs effets, car à la différence des autres types d‘attentats (p. ex. explosifs ou chimiques), les délais d‘apparitions des symptômes sont plus longs (période d‘incubation) (CDC 2000). Dans cette éventualité, la santé publique sera la première instance à intervenir lorsque les victimes demanderont des consultations médicales. Plusieurs agents biologiques causeront des prodromes non spécifiques amenant donc le clinicien vers un vaste diagnostic différentiel (Masci et Bass 2005). C‘est pourquoi il est important de se référer à des tests diagnostiques qui permettront d‘identifier l‘agent biologique en cause. De plus, ces méthodes diagnostiques permettront de distinguer les personnes réellement affectées des autres présentant des syndromes apparentés. Certains tests diagnostiques nécessitent toutefois des délais considérables avant d‘identifier l‘agent causal (Bissonnette et Bergeron 2010; Boissinot et Bergeron 2003; Pingle et al. 2007). La santé publique émettra l‘alerte à la suite d‘une augmentation ou d‘une recrudescence dans la population d‘une infection ou d‘une toxicose particulière. Les soins médicaux des victimes seront retardés comparativement à une attaque annoncée. Ces délais pourront avoir des répercussions sur la réponse clinique, la morbité et la mortalité. Les autorités de sécurité et de santé publiques s‘affaireront conjointement à identifier la source : responsable(s) et lieu(x) grâce à l‘enquête et à des tests de détection (CDC 2000; Interpol 2007). Selon la contagiosité des agents biologiques ou la multiplication des attaques, d‘autres vagues de victimes pourraient arriver dans les centres médicaux (CDC 2000). La possibilité d‘une attaque non annoncée dans des endroits jugés à haut risque suscite l‘intérêt pour le développement de systèmes de surveillance permettant la détection d‘agents biologiques dans l‘air. Le programme américain BioWatch en est un exemple. Ce type de systèmes permettrait de prévenir plus rapidement les autorités, de situer le lieu et de connaître le moment de l‘attaque (Burnett et al. 2005; Shea et Lister 2003).

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Présentement, les organisations de sécurité publique doivent souvent intervenir pour évaluer les poudres suspectes découvertes ou postées. En effet, le USA today rapporte que depuis septembre 2001, les autorités ont dû intervenir pour plus de 30 000 incidents reliées principalement à des poudres, mais également à des liquides ou d‘autres produits suspects (Hall 2008). C‘est pourquoi nous nous sommes consacrés au développement de systèmes de détection lors de la découverte de poudres suspectes (attaque annoncée).

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A

ATTAQUE BIOTERRORISTE

Annoncée Non annoncée

Pas de Tests de Intervention des Dissémination Dissémination Panique dissémination détection autorités de l'AB de l'AB de l'AB (surveillance)

Tests de Intervention des Malades Malades détection autorités

Tests Tests diagnostiques diagnostiques

Intervention des Intervention des Panique autorités autorités

Tests de détection

B

Intervention des autorités

Tests de Enquête détection

Source Source identifiée non identifiée

Dissémination/ Arrestations Décontamination Propagation de l'AB continue

Arrêt de la Arrêt de la dissémination de propagation de Malades l'AB l'AB

Figure 4. Modèle schématique illustrant les fenêtres d’utilisation des tests de détection et diagnostiques lors des procédures à la suite d’une attaque bioterroriste. A) Attaque bioterroriste annoncée ou non annoncée. B) Intervention des autorités de sécurité publique. AB : Agent biologique.

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1.3.1.2 Les lacunes des procédures d’intervention

En 2007, Interpol indique dans un rapport : « Hazard assessment in a potential bioterrorism incident is complicated by the lack of consistently reliable field detection equipment capable of rapidly identifying biological agents » (Interpol 2007). Une détection et une identification rapides et précises des pathogènes permettraient de minimiser leurs impacts (Figure 5). En effet, les autorités concernées pourraient intervenir et identifier rapidement la ou les sources, les agents biologiques, les lieux et les responsables du crime, afin d‘initier les procédures de décontamination adéquates autant pour les victimes que l‘environnement. Il est également important de comprendre les défis distincts pour enrayer la propagation d‘une maladie non contagieuse et d‘une maladie contagieuse, celle-ci étant transmissible d‘une personne à une autre même après la décontamination (Rosebury et Kabat 1947). En effet, si l‘agent infectieux n‘est pas contagieux, les personnes contaminées pourraient développer la maladie, mais après avoir été décontaminées, elles ne pourraient plus transmettre l‘infection. L‘infection serait donc limitée aux individus exposés initialement à des doses suffisantes de l‘agent biologique. Par contre, une maladie contagieuse pourrait se propager dans la population après avoir infecté seulement quelques individus (Prescott 2010). Elle serait donc beaucoup plus difficile à contrôler par les agences de santé publique. La quarantaine, la vaccination massive et les traitements prophylactiques seraient les moyens de choix pour limiter la propagation, s‘ils sont disponibles. Je présenterai donc certains systèmes commercialisés pour la détection et l‘identification des agents biologiques. De plus, je discuterai brièvement des analyses en laboratoire permettant de confirmer non seulement l‘espèce en cause, mais aussi de caractériser le variant afin de porter des accusations criminelles.

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Dissémination de l’agent biologique

Détectée Non détectée

Délai de réponse

Décontamination Contamination & Victimes & Infection Environnement

Maladie Maladie non contagieuse contagieuse

Décès & Décès & Traitement & Traitement Disposition Disposition Isolement appropriée appropriée

Arrêt de la propagation

Figure 5. Modèle schématique de la propagation des agents biologiques en fonction de leur détection et de leur contagion. Les cases et flèches rouges signifient que la propagation de l‘agent biologique continue alors que les vertes montrent l‘arrêt.

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1.4 La détection et l’identification des agents biologiques

De nombreuses macromolécules constituant les micro-organismes peuvent comporter une signature propre à un rang taxonomique permettant son identification. La Figure 6 montre la diversité des techniques de détection et d‘identification des agents biologiques (Persing 2011). La culture microbienne nécessite des délais, représentés par les aiguilles d‘une horloge, inhérents aux temps de multiplication variables d‘une espèce à une autre. Ensuite, des tests biochimiques peuvent être effectués séparément ou dans des systèmes en réalisant plusieurs simultanément. La microscopie permet d‘étudier la morphologie du micro-organisme en cause. Ces trois dernières méthodologies permettent l‘identification phénotypique. D‘autre part, les toxines peuvent être détectées et biotypées grâce à des bioessais nécessitant des jours de délais. Les immunoessais, grâce à des anticorps spécifiques, peuvent identifier des micro- organismes, leurs toxines ou les anticorps produits par les patients infectés. Les séquences d‘acides nucléiques peuvent être analysées par différentes méthodes génotypiques : séquençage, hybridation d‘ADN et amplification PCR. Finalement, la chromatographie peut permettre d‘identifier les signatures spectrométriques de macromolécules ou de cellules entières (Persing 2011).

Certaines de ces méthodes, plus simples ou automatisées, sont utilisables sur le terrain et d‘autres, nécessitant des manipulations plus complexes, sont seulement réalisables en laboratoire. Les méthodes d‘analyse possibles sont si nombreuses qu‘il est essentiel d‘utiliser des critères standardisés afin de les comparer objectivement en se basant sur des données probantes. Ces critères de validation permettent également d‘interpréter le résultat du test utilisé considérant ses limitations et seront passés en revue brièvement.

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Figure 6. Principes de détection des macromolécules signatures des agents biologiques.

1.4.1 Les critères de performance clinique de tests diagnostiques

L‘importance des critères de performance cliniques de tests diagnostiques est reconnue par la communauté médicale. Ces caractéristiques sont évaluées au départ lors d‘études cliniques en comparant le test diagnostique à valider à celui de référence pour une maladie donnée. Ceci permet de construire un tableau de

contingence (Tableau 5). En bref, la sensibilité diagnostique ( ) est la capacité d‘un test particulier à donner un résultat positif chez un sujet présentant la

maladie. Quant à la spécificité diagnostique ( ), elle permet d‘obtenir un résultat négatif lorsque la maladie est absente. Les résultats obtenus permettent d‘évaluer la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN).

La première ( ) correspond à la probabilité que la maladie soit

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présente lorsque le test est positif alors que la seconde ( ) estime la probabilité que la maladie soit absente lorsque le test est négatif. Ces valeurs (VPP et VPN) sont influencées par la prévalence de la maladie dans la population cible. Par exemple, si la prévalence d‘une maladie est plus élevée dans la population à laquelle le patient appartient, la VPP augmente et la VPN diminue (Beaucage et al. 2009; Saah et Hoover 1997; T. D. R. Diagnostics Evaluation Expert Panel et al. 2010). Forts de ces données probantes et de cette compréhension, les cliniciens peuvent prendre des décisions cliniques en considérant les probabilités qu‘un test particulier procure le bon diagnostic et ajuster leurs plans de traitement en conséquence. Il est important de distinguer les critères de performance clinique servant à évaluer un test diagnostique, tels que présentés ci-haut, de ceux analytiques.

Tableau 5. Tableau de contingence pour l’évaluation des critères cliniques d’un test diagnostique.

Test de référence Tests diagnostiques Total Résultat positif Résultat négatif (Malade) (Non-malade)

Test Résultat positif Vrai positif (VP) Faux positif (FP) VP + FP évalué Résultat négatif Faux négatif (FN) Vrai négatif (VN) FN + VN Total VP + FN FP + VN VP + FP + FN + VN

Adapté de (Beaucage et al. 2009; T. D. R. Diagnostics Evaluation Expert Panel et al. 2010).

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1.4.2 Les critères analytiques d’un test de détection des agents biologiques.

Les critères analytiques d‘un test diagnostique ou de détection sont aussi connus comme étant les quatre points cardinaux : la rapidité, la sensibilité, la spécificité et l‘ubiquité analytiques (Boissinot et Bergeron 2003). Pour certaines maladies et plus particulièrement dans le contexte du bioterrorisme, le délai d‘attente des Figure 7. Les quatre points cardinaux analytiques d’un test diagnostique. résultats peut avoir des répercussions Adaptée de (Boissinot et Bergeron 2003). importantes. C‘est pourquoi la rapidité d‘acquisition du résultat est un élément primordial. Toutefois, celle-ci peut être à contre sens avec la sensibilité analytique, soit la plus petite quantité de la cible qu‘un essai puisse détecter avec fiabilité (Saah et Hoover 1997). En effet, les tests rapides sont souvent moins sensibles pour détecter de faibles quantités d‘échantillons. Quoique les préparations d‘agents biologiques propagées dans l‘environnement soient réputées pour contenir de fortes charges microbiennes, l‘échantillon recueilli pourrait contenir de plus faibles quantités après la dispersion. De plus, tel que montré dans le Tableau 4, certains agents biologiques ont une dose infectieuse extrêmement faible. De ce fait, une sensibilité analytique élevée peut donc être un avantage important afin de détecter avec fiabilité même des traces de l‘agent causal. Quant à la spécificité analytique, elle permet de détecter seulement la cible sans être affectée par d‘autres composantes ou micro- organismes (Saah et Hoover 1997). Ce paramètre est également important puisque la possibilité d‘obtenir un résultat faussement positif pourrait entraîner des conséquences néfastes importantes (p. ex. coûts élevés, stress importants dans la population). Toutefois, puisqu‘on ne peut pas tester en laboratoires toutes les

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molécules pouvant être présentes dans l‘environnement, certains tests de détection donnent des résultats faussement positifs difficilement prévisibles sur le terrain (Lim et al. 2005). L‘ubiquité est un concept moins bien connu dont l‘objectif, dans le contexte des maladies infectieuses, est de détecter toutes les souches de la cible microbienne, considérant la variabilité phylogénétique lui étant intrinsèque (Boissinot et Bergeron 2003). Cette rose des vents permettra de comparer de façon objective les tests de détection des agents biologiques et de baliser leur utilisation. Lors du développement et de l‘évaluation d‘un essai diagnostique ou de détection, il est important de chercher un compromis entre ces quatre paramètres répondant aux besoins.

1.4.3 Les défis particuliers au bioterrorisme

Dans le contexte du bioterrorisme, il est important de considérer d‘autres critères se juxtaposant aux quatre points cardinaux. La méthode idéale décrite par Lim et al. (2005) présente plusieurs de ces critères opérationnels qui indiquent davantage le potentiel d‘utilisation réel sur le terrain ou en laboratoire. Les plateformes de détection doivent pouvoir identifier les agents biologiques contenus dans diverses matrices, par exemple, des poudres, des liquides, des aliments, des écouvillons nasaux, etc. L‘analyse simultanée de nombreuses cibles est importante puisque, tel que discuté ci-haut, de nombreux agents biologiques pourraient être utilisés. Considérant la quantité massive d‘échantillons pouvant être analysés, la capacité d‘en passer rapidement au crible est aussi très importante. De plus, les tests développés pour être employés sur le terrain par les premiers répondants doivent répondre à certains critères supplémentaires : robustesse, facilité d‘utilisation, transportabilité et résistance aux conditions difficiles (choc, température, décontamination, etc.). Finalement, une portion de l‘échantillon doit idéalement rester intacte afin de protéger la preuve et de permettre d‘autres analyses plus sophistiquées en laboratoire (Lim et al. 2005). Mon projet de doctorat s‘insère dans le cadre d‘une demande commune de la Défense nationale et de la GRC visant le

43 développement de nouveaux tests de détection d‘agents biologiques dans des échantillons poudreux. Les différentes méthodes simples qui peuvent être exécutées sur le terrain ainsi que les tests de confirmation en laboratoire plus sophistiqués seront présentées dans un ordre sensiblement chronologique, de l‘échantillonnage au séquençage du génome.

1.4.3.1 L’échantillonnage

La première étape pour analyser une poudre suspecte est l‘échantillonnage. Les méthodes d‘échantillonnage comportent de nombreux défis. En effet, dans des conditions de travail ardues, ces procédures doivent, d‘une part, permettre une analyse scientifique rigoureuse et, d‘autre part, répondre aux normes légales, notamment à des fins d‘enquête ou de poursuite judiciaire. L‘équipe responsable de la collecte des échantillons est en général composée d‘au moins trois personnes. Deux manipulateurs seront en charge de récupérer les échantillons, un sera en contact direct avec les échantillons suspects et l‘autre procurera du nouveau matériel propre. Le troisième membre pourra documenter la procédure en photographiant et en prenant des notes (Emanuel et al. 2008; Interpol 2007).

La procédure d‘échantillonnage doit être réalisée de façon rigoureuse puisqu‘elle influencera les résultats des tests. En bref, les quantités doivent être suffisantes pour atteindre la sensibilité analytique du test choisi (Emanuel et al. 2008; Lim et al. 2005). De plus, il est important de recueillir des échantillons contrôles dans des zones similaires non contaminées et de valider les lots du matériel utilisé (Emanuel et al. 2008; Interpol 2007). Nous retrouvons dans la littérature plusieurs méthodes d‘échantillonnage qui seront choisies selon les besoins. Lorsque le matériel est visible, par exemple une poudre suspecte, il peut être écouvillonné ou même recueilli avec une spatule. Lorsque le matériel est invisible, par exemple sous forme d‘aérosols, il devra être concentré afin d‘évaluer la présence d‘agents biologiques dans l‘air (Ryan et al. 2009).

44

1.4.3.2 La préparation des analytes

Les types d‘échantillons suspects recueillis dans l‘environnement peuvent être variés et contenir de nombreux composants chimiques interférant potentiellement avec la détection des agents biologiques. Les autorités en sécurité publique doivent souvent évaluer une menace biologique parce que des poudres ont été postées ou découvertes à des endroits suspects. Ces poudres sont le plus souvent composées de substances biologiquement inoffensives, telles que le bicarbonate de soude ou la farine, mais psychologiquement offensives. Même si elles ne contiennent pas d‘agent biologique, elles peuvent interférer avec les méthodes de détection subséquentes. Il a également été rapporté que certains additifs pourraient être incorporés aux préparations d‘agents biologiques et affecter les tests (Alibek et Handelman 2000; Lim et al. 2005; Shoham et Jacobsen 2007). De ce fait, des méthodes de préparation des analytes doivent être adaptées aux tests de détection et d‘identification utilisés. Plusieurs principes méthodologiques peuvent être employés pour réaliser la préparation des analytes (Figure 8). Sur le terrain, lorsque la poudre ou un autre échantillon suspect est visible, des principes de dilution sont souvent utilisés. Toutefois, si le matériel est invisible, par exemple aérosolisé, alors la concentration par filtration, par impaction ou par culture, facilitera la détection ultérieure. La plupart des méthodes de détection sur le terrain nécessitent de diluer l‘échantillon afin d‘éviter de surcharger le système et ainsi d‘obtenir des résultats faussement négatifs. D‘ailleurs, le RAZORTM (Idaho Technology Inc., Utah, USA) utilise ce principe et stipule que certains types d‘échantillons pourraient nuire à l‘analyse PCR et qu‘un contrôle d‘inhibition permettant de repérer cette interférence a été intégré (Idaho Technology Inc. 2012).

Plusieurs macromolécules des agents biologiques peuvent être analysées (Figure 6) et différentes composantes de la matrice peuvent interférer. C‘est pourquoi de nombreuses méthodes de séparation (Figure 8) peuvent être

45 employées en utilisant les propriétés intrinsèques de l‘analyte cible. En effet, la taille, la masse et l‘adsorption peuvent permettre de séparer l‘analyte de la matrice avec ou sans dissociation préalable ou ultérieure. Toutefois, ces méthodes souvent plus sophistiquées, doivent être exécutées en laboratoire par du personnel spécialisé. Le système d‘analyse total en développement FilmArray® Biosurveillance System (Idaho Technology Inc. 2011) se démarque par son intégration d‘une méthode de capture d‘ADN par des billes magnétiques. Il n‘y a toutefois pas d‘études scientifiques publiées révisées par des pairs permettant d‘évaluer les critères de validation présentés ci-haut2. Considérant le défi de ces méthodes de préparation des analytes, deux techniques ont été développées durant ce projet de doctorat (Chapitres 3 et 4).

2 Recherche : FilmArray et Biosurveillance sur : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, consulté le 2012-07- 29.

46

Filtration

Tailles Tamissage

Colonne

Time of flight

Suspension- Masse / Éch. visible Centrifugation dilution Charge

Préparation d'analytes Séparation Électrophorèse

Éch. invisible Concentration Chimique

Absorption Spécifique (ligand) (anticorps)

Filtration Impaction Culture Électrostatique

Chimique

Dissociation Enzymatique

Mécanique

Figure 8. Principes méthodologiques de la préparation des analytes.

1.4.3.3 Les méthodes utilisées sur le terrain

1.4.3.3.1 La détection de protéines

La détection de protéines combinée à la mesure du pH est une méthode facile qui permet d‘éliminer de l‘équation certains composés inoffensifs utilisés fréquemment tels que le bicarbonate de soude, la fécule de maïs et le plâtre (Wade et al. 2006). Il est important de rappeler que la grande majorité des appels placés au 911 concernant une menace biologique sont des canulars (Hall 2008; Leask et al. 2003; Wills et al. 2008). Lorsque ce type de test est effectué sur un échantillon de qualité et de quantité adéquate et donne un résultat négatif, le risque d‘une menace réelle est faible. Le BioCheckTM (20/20 GeneSystems Inc., Rockville, MD)

47 coûtant 22,80 $ utilise ce principe. Il est simple d‘utilisation, nécessite 5 minutes et 100 µg de ricine, entre 1 × 107 et 1 × 108 CFU de B. anthracis ou Y. pestis (Poore et al. 2009). Le manufacturier recommande d‘utiliser 100 µg ou plus d‘échantillon, donc ce test est adapté pour les échantillons visibles et non le monitoring. Le BioCheckTM n‘est toutefois pas spécifique pour les agents biologiques, puisque d‘autres poudres inoffensives peuvent produire un signal positif, par exemple, la farine ou la levure (20/20 GeneSystems 2012). C‘est pourquoi des tests ont été développés pour détecter plus spécifiquement les agents biologiques en utilisant des anticorps monoclonaux.

1.4.3.3.2 Les méthodes utilisant des anticorps

Les tests de grossesse sur bandelettes détectant l‘hormone β-HCG à l‘aide d‘anticorps sont des examens diagnostiques facilement utilisables, ce qui leur a conféré une grande popularité (Bernstein et Weinstein 2007). C‘est pourquoi certaines compagnies ont mis sur le marché des tests de détection d‘agents biologiques utilisant des principes similaires. Les essais BioThreat Alert® (TetraCore, Inc., Rockville, MD) sont facilement utilisables sur le terrain puisqu‘ils ne nécessitent que de resuspendre l‘échantillon dans un solvant aqueux (dilution 1 : 50) et de le déposer sur la carte. Le Biothreat Alert® a montré une limite de détection de 7 × 103 CFU/ml et était dans un ordre de grandeur comparable à celles d‘autres immunoessais (103 à 105 CFU/ml) (Sapsford et al. 2008; Tomaso et al. 2007). Toutefois, 3 des 10 souches de Y. pestis résultaient en des bandes de faibles intensités, ce qui n‘a pas été rapporté pour les autres essais évalués. Il serait donc intéressant d‘évaluer davantage l‘ubiquité de ce test. Le Plague Biothreat Alert® s‘est révélé spécifique contre 10 autres espèces du genre Yersinia parmi le panel des 45 espèces testées. Ce test peut donc être intéressant à utiliser sur le terrain puisqu‘il permet la détection de Y. pestis en 25 minutes au coût de 20 $, même si d‘autres tests semblaient montrer des performances comparables ou supérieures (Tomaso et al. 2007). Le RAID DXTM permet l‘analyse simultanée

48

de huit agents biologiques en quinze minutes : B. anthracis, Brucella, F. tularensis, Y. pestis, orthopox, ricine, BoNT et entérotoxine staphylococcique (Alexeter Technologies LLC 2012). Des études évaluées par les pairs n‘ont toutefois pas été publiées3. De plus, quoique la rapidité et la facilité d‘utilisation de ces tests semblent intéressantes, le Plague Biothreat Alert® a une sensibilité analytique

équivalente à environ 20 fois la LD50 estimée à 343 bactéries chez le grivet. Dans les cas où les doses infectieuses sont inférieures à 103 bactéries, les systèmes de détection basés sur les acides nucléiques seraient avantageux puisqu‘ils présentent généralement des sensibilités analytiques supérieures à celles des tests utilisant des anticorps (Lim et al. 2005).

1.4.3.3.3 Les méthodes détectant les acides nucléiques

La majorité des macromolécules sont exprimées de façon variable, en fonction des conditions de culture, à l‘exception du code génétique. De plus, les banques de données publiques de séquences nucléiques ont eu une croissance importante au cours de la dernière décennie. Ces deux avantages majeurs ont été des catalyseurs pour le développement de méthodes de détection génotypiques, notamment basées sur la PCR (Irenge et Gala 2012; Lim et al. 2005; Persing 2011; Rao et al. 2010; Riehm et al. 2011; Stewart et al. 2008). Les techniques PCR mises au point ont l‘avantage d‘être rapides et d‘avoir une haute sensibilité, mais elles sont toutefois extrêmement sensibles aux contaminations extérieures nécessitant une préparation d‘analytes de qualité suffisante. La PCR en temps réel est plus rapide que la PCR conventionnelle puisque le niveau d‘amplification est analysé pendant l‘amplification grâce aux marqueurs fluorescents utilisés, plutôt qu‘à la fin sur gel d‘électrophorèse (Persing 2011). Parallèlement, elle permet de déterminer les niveaux d‘interférence initiaux par une courbe d‘étalonnage et peut cibler de quatre à six séquences d‘ADN systématiquement. Cette technologie permet de répliquer l‘ADN à des concentrations très élevées résultant

3 Recherches : RAID DX, Tetracore et Alexeter sur http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, consulté le 2012-07-03.

49 généralement en une excellente sensibilité analytique pouvant même aller jusqu‘à une molécule. Aussi, le design rigoureux d‘amorces permet d‘amplifier spécifiquement et ubiquitairement une cible. Un des avantages principaux de la PCR en temps réel, en tube fermé, par rapport à la méthode conventionnelle est d‘éviter la contamination pré-PCR par des amplicons causant des résultats faussement positifs. De plus, le délai d‘analyse est en général de moins d‘une heure, un peu plus long que certains tests immunologiques présentés préalablement, mais bien plus rapide que la culture microbienne. La compagnie Idaho Technology Inc. s‘est démarquée en commercialisant le RAZOR™ 10 Target, un test PCR en temps réel relativement facile à exécuter sur le terrain permettant la détection simultanée de 10 agents biologiques, i.e. B. anthracis, Brucella spp., C. botulinum, C. burnetii, E. coli O157:H7, F. tularensis, R. communis, Salmonella spp., Y. pestis et le virus de la variole, en 30 minutes. Ce système ne contient toutefois pas d‘étape de préparation d‘échantillon séparant les analytes de la matrice environnementale. Idaho Technology Inc. a ensuite poussé les standards de l‘industrie en développant le FilmArray® Biosurveillance, un système intégré d‘analyse totale incluant les étapes d‘extraction et de purification d‘ADN, d‘amplification d‘acides nucléiques totaux et de multiples PCR en temps réel, permettant la détection de 17 pathogènes en parallèle (Idaho Technology Inc. 2011). Il n‘y a actuellement pas d‘études scientifiques publiées et révisées par des pairs permettant de connaître les quatre points cardinaux du FilmArray® Biosurveillance4. De nombreux autres tests PCR ont été développés pour être exécutés en laboratoire et seront énoncés à la section 1.4.3.4.2.

1.4.3.4 Les méthodes utilisées en laboratoire

L‘éventail des analyses possibles en laboratoire est impressionnant, de l‘identification à l‘espèce par des méthodes diversifiées jusqu‘à l‘identification du variant par des méthodes phylogénétiques avant-gardistes. Lors d‘une menace

4 Recherche : FilmArray sur http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ et Web of science, consulté le 2012-07-29.

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terroriste, selon la juridiction, les premiers répondants seront dirigés sur les lieux. Aux États-Unis, le Laboratory Response Network (LRN) chapeauté par les CDC est en charge de diriger un réseau de plus de 150 laboratoires afin de répondre rapidement aux attaques biologiques ou chimiques et aux crises de santé publique. En ce qui a trait au bioterrorisme, le LRN a une structure séparée en trois paliers : les laboratoires sentinelles, de référence et nationaux. Les laboratoires sentinelles sont les laboratoires cliniques, soit l‘instance de première ligne recevant des victimes et en charge de poser des diagnostics. Ils doivent transmettre les échantillons suspects aux laboratoires de référence. Ces derniers peuvent détecter et confirmer l‘identification des agents biologiques et ainsi enclencher des procédures pour répondre à un acte bioterroriste. Finalement, les laboratoires nationaux sont en mesure de réaliser de nombreux tests afin d‘identifier plus précisément la souche en cause et de manipuler des agents biologiques hautement infectieux (Centers for Disease Control and Prevention 2012). Au Canada, certains laboratoires, dont le Laboratoire de santé publique du Québec à Sainte-Anne-de-Bellevue et le Laboratoire national de microbiologie à Winnipeg ont les installations, BSL-3 ou BSL-4, ainsi que l‘expertise nécessaires pour recevoir des échantillons suspects à analyser. Ils pourront procéder à des tests de détection et d‘identification des agents biologiques dans ces enceintes de biosécurité. Une étude de performance des laboratoires sentinelles américains a montré leurs capacités et leurs limitations. Le temps de notification de la découverte d‘un agent biologique pour certaines évaluations est passé de plus de 10 jours (2007) à 3-4 jours (2008). Malgré cette amélioration, de 4,6 à 7,8 % des participants ne référaient pas les échantillons de F. tularensis, B. anthracis et Y. pestis aux paliers supérieurs du LRN (Wagar et al. 2010).

1.4.3.4.1 Les méthodes de microbiologie classique

La mise en culture des micro-organismes est importante lors d‘une attaque bioterroriste afin de les étudier suffisamment et de constituer la preuve. On doit

51 identifier ou confirmer l‘espèce, évaluer la présence de résistance aux antibiotiques ou de facteurs de virulence, et même identifier la provenance. Les méthodes de microbiologie classique demeurent donc celles de référence pour la détection et l‘identification des agents biologiques. Ces protocoles se basent sur l‘évaluation des caractéristiques morphologiques et biochimiques et sur la culture utilisant des milieux sélectifs et différentiels (Lim et al. 2005). Les méthodes de microbiologie classique sont souvent assez sensibles, spécifiques et ubiquitaires. Toutefois, ces techniques actuellement employées sont pour la plupart basées sur les méthodes de culture ayant été développées par les professeurs Pasteur et Koch à la fin du 19e siècle. Même si certains systèmes ont été mis au point pour simplifier ces protocoles, comme les Galeries API, les systèmes Microscan, Vitek 2 et Phoenix (Orenga et al. 2009), les délais requis du prélèvement à l‘identification sont souvent calculables en jours et semblent, à l‘ère de la biologie moléculaire, trop longs (Bissonnette et Bergeron 2010; Boissinot et Bergeron 2002; Pingle et al. 2007).

De plus, lorsqu‘on se penche sur la problématique des micro-organismes fastidieux, de la culture virale et parasitaire, on constate les limites de ces techniques. Des agents biologiques sélectionnés pour ce projet, seules C. psittaci et Rickettsia prowazekii sont considérés comme des bactéries intracellulaires obligatoires complexifiant leur culture et leur identification (Beare et al. 2011). En fait, un milieu et des conditions de culture ont récemment été optimisés par des études de pointe en transcriptomique pour permettre la croissance axénique de C. burnetii. Ceci facilitera la recherche sur ce pathogène, toutefois, l‘utilité pour la détection ou le diagnostic clinique est moins probable considérant les délais de croissance de six jours (Beare 2012).

Les bioessais utilisant des petits animaux de laboratoire sont encore les méthodes de référence coûteuses et complexes pour la détection de certaines toxines et leur typage, par exemple les toxines botuliniques (Persing 2011).

52

1.4.3.4.2 Les méthodes génotypiques de détection et d’identification moléculaires des agents biologiques

Les avantages et limitations de la technologie de la PCR ont été résumées ci-haut. De nombreux autres tests utilisant la PCR ont été développés pour la détection et l‘identification des agents biologiques en laboratoire (Irenge et Gala 2012; Lim et al. 2005; Persing 2011; Rao et al. 2010; Riehm et al. 2011; Stewart et al. 2008). Ils permettent l‘identification de l‘espèce, de la sous-espèce, et même de facteurs de virulence ou de résistances aux antibiotiques (Antonov et al. 2008; Leski et al. 2009). Cette technologie laisse encore place à amélioration quant à la capacité de passer au crible les nombreux agents biologiques prioritaires en simultané (Lim et al. 2005).

1.4.3.4.3 Concepts généraux des puces à ADN

Les biopuces, ou microdamiers, peuvent quant à elles permettre de poser des centaines, voire même des milliers, de questions simultanément. Les puces à ADN sont constituées de nombreuses sondes apposées à un support solide, par exemple une lame de verre ou des microbilles. Ces sondes peuvent être de courts oligonucléotides ou encore des produits d‘amplification PCR plus longs. Dépendamment de l‘objectif, de l‘ARNm total, de l‘ADN génomique ou plasmidique ou des amplicons PCR avec ou sans étape de transcriptase inverse peuvent être analysés. À la suite d‘une étape de marquage avec un fluorophore, leurs séquences particulières leur permettront d‘être hybridés au brin complémentaire, leurs sondes de capture spécifiques fixées (Raoult et al. 2004; Tulpan 2010). La position de ces dernières est connue, par exemple à l‘aide d‘un système cartésien en deux dimensions sur des lames de verre ou en trois dimensions avec des microbilles de couleurs différentes. Les puces à ADN permettent d‘analyser plusieurs centaines, voire même plusieurs milliers de cibles simultanément grâce à l‘hybridation des séquences d‘acides nucléiques complémentaires aux sondes de capture. Utilisée seule, cette technologie a toutefois pour inconvénient d‘être moins

53 sensible que les méthodes PCR puisqu‘elle n‘inclut pas l‘amplification des acides nucléiques et nécessite une étape de marquage. Combiner la technologie de l‘amplification, du marquage par la PCR et l‘analyse sur les puces à ADN a résolu ces problèmes (Bissonnette et Bergeron 2010; Miller et Tang 2009; Raoult et al. 2004). C‘est pourquoi les puces à ADN peuvent être utilisées pour détecter et identifier des micro-organismes (Miller et Tang 2009; Tulpan 2010). La Figure 9 illustre cette approche et montre comment les signaux d‘hybridation sur puce à ADN peuvent être interprétés.

Figure 9. Représentation schématique d’une puce, ou microdamier, à ADN en deux dimensions. Des sondes de capture sont déposées de façon cartésienne sur une surface solide, souvent une lame de verre, pour former une matrice de points. L‘hybridation des amplicons d‘ADN marqués avec un fluorophore aux sondes de capture à la surface nous permet d‘identifier la cible. Dans cet exemple, en jaune, on voit la position d‘une sonde jouant le rôle de contrôle positif d‘hybridation et de la sonde de Y. pestis produisant des signaux positifs. Ceci confirme ainsi la présence de cette espèce dans notre échantillon analysé. On voit en vert les positions des sondes ciblant des espèces non présentes (B. anthracis et F. tularensis) dans l‘échantillon qui sont négatives et seulement révélées par des sondes de contrôle d‘impression dans une différente longueur d‘onde.

Différentes approches peuvent être employées lors du développement des puces à ADN dépendamment des besoins. Premièrement, le choix du des gènes est primordial. Les gènes souvent utilisés sont conservés dans l‘évolution, comme l‘ARNr 16S. La Figure 10 montre les principes de design des amorces et des sondes de capture spécifiques pour les gènes conservés. Il est donc possible

54

d‘avoir une seule réaction d‘amplification avec des amorces à large spectre pour ensuite détecter et identifier spécifiquement la cible grâce à de multiples sondes. Toutefois, l‘utilisation d‘autres types de gènes, parfois moins conservés, peut être plus avantageuse, par exemple, pour la détection de résistances aux antibiotiques ou de facteurs de virulence. Deuxièmement, des règles pour le design des sondes de capture ont été élaborées pour répondre aux besoins des analyses. Par exemple, les sondes courtes (~20 nucléotides) permettent un bon compromis entre la sensibilité et la spécificité analytiques. De plus, la proportion et le positionnement des guanines/cytosines et adénines/thymines influencent également ces paramètres (Lockhart et al. 1996). Le nombre de mésappariements et leur distance peuvent également être optimisés in silico pour augmenter leur spécificité (Hadiwikarta et al. 2012). Finalement, la position des courtes sondes de capture sur leur amplicon cible affecte la cinétique d‘hybridation, et ce modèle guide le design afin d‘augmenter la sensibilité analytique (Brinker et al. 2010; Peytavi et al. 2005). Les bases de données publiques contiennent maintenant des quantités impressionnantes de séquences de nombreux agents biologiques. Ceci facilitera certainement le design complexe d‘essais de détection sur puce à ADN.

55

Figure 10. Design d’amorces d’amplification à large spectre et de sondes de capture spécifiques utilisant les gènes conservés. Les gènes conservés présentent des régions plus conservées entre des espèces phylogénétiquement éloignées puisqu‘ils sont souvent d‘importance pour la structure ou la fonction protéique. Les amorces à large spectre cibleront ces régions afin d‘amplifier un plus grand éventail de micro-organismes. D‘autres régions des gènes conservés évoluent plus rapidement. Celles-ci seront utilisées pour le design de sondes de capture spécifiques à un taxon ou à un groupe de taxa microbiens. Certains logiciels permettent d‘identifier rapidement des régions conservées pour le design d‘amorces (Colson et al. 2006) ou des régions divergentes pour les sondes (Martel 2011).

D‘autre part, les procédures d‘hybridation sur puces à ADN sont classiquement longues, 14-16h (Affymetrix Inc. 2012; Walter et al. 2011). Des systèmes microfluidiques peuvent résoudre ce problème puisqu‘ils permettent d‘accélérer la procédure d‘hybridation. En effet, une revue de la littérature réalisée par Wang et Li (2011) présente un panel de 16 systèmes microfluidiques d‘hybridation d‘amplicons PCR nécessitant des temps d‘hybridation de 2 minutes à 18 h (Wang et Li 2011). Une des plateformes microfluidique évaluée par Wang et Li (2011) a été mise au point dans notre laboratoire (Figure 11) et permet l‘hybridation des amplicons PCR sur des puces à ADN diagnostiques en seulement cinq minutes (Peytavi et al. 2005).

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Figure 11. Représentation schématique de la plateforme pour l’hybridation rapide sur puce à ADN en microfluidique. A) Les cellules avec chambres et microcanaux en PDMS (polydiméthylsiloxane) sont juxtaposées sur une lame de verre ayant des sondes imprimées à la surface, formant ainsi des unités microfluidiques. Les chambres de ces unités sont remplies d‘amplicons (2), de tampon de lavage (3), ou de tampon de rinçage (4). Ceci permet le déversement séquentiel de ces réactifs à travers un microcanal afin de rejoindre la chambre d‘hybridation (1). B) Représentation schématique de la chambre d‘hybridation (1) de 8 500 par 500 µm ayant une capacité de 250 sondes de capture. C) Jusqu‘à 6 unités microfluidiques peuvent être fixées au support rotatoire. La vitesse de rotation accélérée de façon séquentielle permet de produire une force centripète augmentant et contrôlant l‘ouverture des valves entre les chambres d‘amplicons, de lavage et de rinçage. Cette figure a été adaptée avec la permission de Peytavi et al. (2005).

Outre la rapidité, les systèmes microfluidiques comportent d‘autres avantages. Premièrement, les volumes des réactifs sont petits, diminuant ainsi les coûts (Wang et Li 2011). La microfluidique offre également la possibilité de conceptualiser un système fermé évitant des problèmes de contamination (p. ex. autres micro-organismes ou amplicons). Finalement, les systèmes microfluidiques permettent le design de systèmes d‘analyse totale automatisés. Ceux-ci pourraient donc être portables, autant au chevet du patient que sur le terrain. Cependant, certains défis restent de taille, particulièrement en ce qui a trait à la préparation d‘échantillon. Cette étape cruciale est souvent négligée et la concentration de l‘échantillon représentant un macrovolume (p. ex. 1 ml à 10 ml) à un microvolume pour l‘analyse est complexe (Siegrist et al. 2009; 2010; 2010). C‘est pourquoi une partie de mon projet a consisté à simplifier des procédures de préparation d‘analytes (Chapitres 3 et 4) afin de faciliter leur automatisation future.

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1.4.3.4.4 Concepts généraux du séquençage et des analyses phylogénétiques

Le séquençage de nouvelle génération permet d‘obtenir des quantités massives d‘information (Hu et al. 2011; Torok et Peacock 2012). Le Clinical and Laboratory Standards Institutes (CLSI) a établi des standards pour l‘identification des micro- organismes par l‘analyse de séquences (Petti et CLSI 2008). La validité des analyses phylogénétiques subséquentes est basée sur plusieurs assomptions (Baxevanis et Ouellette 2005). Premièrement, le choix du gène cible (ou des gènes cibles) est important puisque sa diversité doit permettre de résoudre l‘énigme. Par exemple, plusieurs gènes conservés peuvent être utilisés : ARNr 16S, rpoB, tuf, gyrA, gyrB, sodA et hsp. Les séquences de l‘ARNr 16S, le gène bactérien le plus hautement conservé, sera ainsi limité par son pouvoir discriminatoire entre deux espèces (Petti 2007). En second lieu, la séquence de la souche à identifier doit être de qualité, provenir du micro-organisme à l‘étude et être alignée adéquatement avec ses homologues de base de données. D‘autre part, la base de données doit contenir suffisamment de représentants, ou taxa, et de variabilité pour assurer l‘identification. Par exemple, Paradis et al. (2005) montrent que les gènes atpD, tuf et 16S ARNr permettent l‘identification de nombreuses espèces de la famille des Enterobacteriaceae (Paradis et al. 2005). Finalement, les types d‘analyses phylogénétiques sont nombreux et ont des avantages et des limitations particulières. Ils doivent donc être utilisés avec parcimonie afin de répondre aux questions posées (Baxevanis et Ouellette 2005; Felsenstein 2004; Hall 2011) et j‘en présenterai certains dans le Chapitre 6.

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2 Hypothèses et objectifs de recherche

2.1 Problématique de la détection des agents biologiques

Les actes bioterroristes sont difficiles à prévoir et à prévenir. De plus, les canulars sont fréquents. La difficulté à détecter et identifier rapidement les agents pathogènes constitue une lacune importante nuisant à la qualité de l‘intervention. Il est donc nécessaire de développer des systèmes de détection des agents biologiques, ce qui présente de nombreux défis, tel que discuté préalablement (Section 1.4.3). Les types d‘échantillons devant être analysés pour détecter la présence d‘agents biologiques sont variés (Leask et al. 2003; Wills et al. 2008). Les matrices contenant les agents biologiques peuvent être complexes et interférer avec les analyses moléculaires (Lim et al. 2005). De plus, la grande diversité de pathogènes pouvant être employés lors d‘actes bioterroristes représente un défi lors de la conceptualisation de tests moléculaires. C‘est pourquoi plusieurs des tests développés ne permettent d‘analyser qu‘un nombre limité de pathogènes simultanément (Hadjinicolaou et al. 2009; Lim et al. 2005; Matero et al. 2009; Persing 2011; Tomaso et al. 2007). Toutefois, certaines organisations, dont Idaho Technology Inc., se sont démarquées en commercialisant des essais de détection permettant d‘analyser sur le terrain un plus grand nombre d‘agents biologiques associés au bioterrorisme simultanément (Alexeter Technologies LLC 2012; Idaho Technology Inc. 2011; 2012).

La mise au point de méthodes rapides de détection moléculaire des agents biologiques devient donc un enjeu majeur de recherche. Ce projet doctoral a été réalisé afin de développer des outils de préparation des analytes et de détection rapide des agents biologiques dans des matrices poudreuses. Ceux-ci pourraient permettre d‘optimiser la réponse immédiate à un acte bioterroriste et de minimiser son impact sur la population.

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2.2 Hypothèses de recherche

Hypothèse générale : Les avancées en génomique et en technologie d‘analyse des acides nucléiques pourraient permettre de développer des tests de détection des acides nucléiques plus rapides et efficaces dans le contexte du bioterrorisme.

Les puces à ADN suscitent l‘intérêt puisqu‘elles permettent l‘analyse multiparamétrique de haute envergure (Bryant et al. 2004; Leski et al. 2010; Liu 2008; Miller et Tang 2009). Les avancées en microfluidique ont permis d‘accélérer les procédures d‘hybridation sur puces à ADN (Wang et Li 2011). Dans notre laboratoire, une plateforme microfluidique permet une procédure d‘hybridation sur puces à ADN rapide (15 minutes) (Peytavi et al. 2005). De l‘échantillonnage jusqu‘à l‘analyse de données, plusieurs étapes sont nécessaires pour réaliser les tests de détection (Figure 12). L‘optimisation de chacune des étapes est donc souhaitable afin de développer une plateforme de détection d‘agents biologiques transportable et performante.

Figure 12. Procédure pour réaliser un essai de détection des agents biologiques sur puce à ADN.

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Hypothèse 1 : Il est possible de séparer plus rapidement et simplement les analytes d‘une grande diversité de poudres, que ce soit des additifs potentiels d‘aérosolisation ou encore des canulars.

Hypothèse 2 : Il est possible d‘avoir un système efficace, rapide et décontaminable d‘extraction des acides nucléiques d‘agents biologiques, y compris pour les formes les plus coriaces : les spores.

Hypothèse 3 : Il est possible d‘utiliser une cible génétique conservée pour amplifier, détecter et identifier les principaux agents biologiques, soit les agents bactériens aéroportés.

Hypothèse 4 : On peut utiliser l‘information de la cible génétique afin d‘étudier les évènements complexes d‘évolution moléculaire du gène cible.

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2.3 Objectifs de recherche

Objectif général : Développer une famille d‘outils rapides et efficaces pour la préparation d‘analytes d‘échantillons suspects poudreux et pour la détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme.

Objectif spécifique 1 : Développer une méthode de filtration différentielle rapide et simple de préparation d‘analytes contenus dans une variété d‘échantillons poudreux et environnementaux pour en extraire l‘ADN bactérien présent (Chapitre 3).

Objectif spécifique 2 : Tester un module d‘extraction et de fragmentation d‘ADN rapide utilisant les ultrasons pouvant être transféré d‘une zone contaminée à une enceinte de biosécurité dans une zone sécurisée (Chapitre 4).

Objectif spécifique 3 : Développer une méthode basée sur la PCR à large spectre et la technologie des puces à ADN dans un système microfluidique permettant la détection rapide (~1 h) des 12 agents bactériens aéroportés ciblés (Chapitre 5).

Objectif spécifique 4 : Étudier la divergence du gène cible tuf dupliqué chez le genre Yersinia et la phylogénie de ses taxa (Chapitre 6).

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2.4 Aperçu des résultats et contribution scientifique

Le premier volet de mon projet de doctorat a porté sur le développement d‘une méthode rapide (2 minutes) de séparation par filtration des spores de Bacillus mélangées à 23 matrices poudreuses ou environnementales différentes (Chapitre 3). La méthode de préparation des analytes présentée est innovante puisqu‘elle permet la séparation des spores contenues dans la matrice avant l‘extraction d‘acides nucléiques. J‘ai conceptualisé et éprouvé la trousse de traitement d‘échantillons poudreux et environnementaux avec des seringues plus facilement manipulables et potentiellement utilisables sur le terrain (Figure 23, Annexe 2). De plus, j‘ai élaboré de concert avec Julie-Christine Lévesque la méthode d‘imagerie confocale permettant d‘étudier en trois dimensions la pénétration des spores fluorescentes dans des filtres. Cette technique pourrait avoir d‘autres utilités en recherche.

En second lieu, mon projet de doctorat a porté sur le développement d‘une méthode rapide (45 secondes) d‘extraction et de fragmentation de l‘ADN de spores bactériennes basée sur la sonication donnant des rendements comparables à ceux d‘une technique commercialisée (Chapitre 4). J‘ai conceptualisé et mis à l‘épreuve la méthode de transfert sécuritaire de l‘appareillage d‘une zone contaminée à une zone propre. Ce type de transfert est complexe et important dans le contexte du bioterrorisme.

Le troisième volet de mon projet de doctorat a porté sur la conceptualisation d‘un essai moléculaire basé sur les technologies des puces à ADN et de la microfluidique pour détecter les agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme (Chapitre 5). Plusieurs tests disponibles ciblent les bactéries de la catégorie A du CDC seulement (Irenge et Gala 2012; Skottman et al. 2007; Yang et al. 2008). J‘ai tenu à passer au crible les espèces bactériennes répondant aux critères de sélection dans les catégories A, B et C du CDC. Mon design complexe

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de l‘essai moléculaire a permis l‘amplification dans un tube des agents sélectionnés ayant une grande diversité génétique ainsi que leur identification sur puce à ADN.

Le quatrième et dernier volet de mon projet de doctorat a porté sur une étude plus fondamentale; l‘analyse du gène cible de l‘essai de biopuce a montré une divergence chez le genre Yersinia. Celle-ci était inattendue puisque les gènes dupliqués sont généralement hautement similaires (Lathe et Bork 2001). Un nouveau type d‘analyse, les réseaux phylogénétiques, a permis d‘explorer la divergence du gène dupliqué à l‘étude, un processus évolutif clé. Mes analyses ont également permis de complémenter les informations phylogénétiques au sujet du genre Yersinia dans la littérature.

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3 Méthode de préparation d’échantillons de poudres suspectes et autres échantillons environnementaux basée sur la filtration

Avant propos

Rapid Filtration Separation-Based Sample Preparation Method for Bacillus Spores in Powdery and Environmental Matrices

COURT TITRE:

Powdery and environmental sample preparation

AUTEURS

Sandra Isabel1, Maurice Boissinot1, Isabelle Charlebois1, Chantal M. Fauvel1, Lu-E Shi1, Julie-Christine Lévesque2, Amélie T. Paquin1, Martine Bastien1, Gale Stewart1, Éric Leblanc1, Sachiko Sato2, and Michel G. Bergeron1†

1 Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre de recherche du CHUQ, Québec City, Québec, Canada. 2 Bioimaging platform, Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre de recherche du CHUQ, Québec City, Québec, Canada.

† Corresponding author. Mailing address: Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre de recherche du CHUQ, 2705 Laurier Blvd., Québec City, Québec, Canada G1V 4G2. Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2715. E-mail: [email protected].

Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.

L‘étudiante a contribué à l‘élaboration du projet de recherche et du schéma expérimental. Elle a réalisé une partie des expériences ainsi que l‘interprétation des résultats. L‘étudiante a conceptualisé la trousse de traitement d‘échantillons environnementaux basée sur la manipulation de seringue et potentiellement utilisable sur le terrain. De plus, l‘étudiante a élaboré conjointement avec Julie- Christine Lévesque la méthode d‘imagerie permettant d‘étudier la pénétration des spores fluorescentes dans des filtres. L‘étudiante a écrit la première version du

67 manuscrit et a procédé aux modifications suggérées par les coauteurs et les réviseurs.

Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.

Michel G. Bergeron, Maurice Boissinot, Éric Leblanc et Gale Stewart ont élaboré et supervisé le projet de recherche. Maurice Boissinot a suivi les avancements de près. Gale Stewart a, de plus, contribué aux analyses statistiques. Martine Bastien et Éric Leblanc ont développé le concept préliminaire de préfiltration.

Isabelle Charlebois, Chantal M. Fauvel, Amélie T. Paquin et Lu-E Shi ont montré la reproductibilité de la technique et ont réalisé une partie importante des expériences présentées dans cet article. Julie-Christine Lévesque a réalisé les expériences de microscopie et Sachiko Sato a contribué à l‘analyse de ces données.

Tous les coauteurs ont révisé et commenté le manuscrit.

Précisions sur le statut de l’article.

L‘article au sujet de la préparation d‘échantillons poudreux ou environnementaux a été accepté pour publication dans le journal Applied and Environmental Microbiology le 12 décembre 2011.

Isabel, S., M. Boissinot, I. Charlebois, C.M. Fauvel, L.E. Shi, J.C. Levesque, A.T. Paquin, M. Bastien, G. Stewart, E. Leblanc, S. Sato et M.G. Bergeron. 2012. Rapid filtration separation-based sample preparation method for Bacillus spores in powdery and environmental matrices. Applied and Environmental Microbiology 78(5): 1505-12. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22210204]

Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse comparativement à l’article publié originalement.

Le chapitre 3 de cette thèse inclut cet article et représente la version finale, telle que publiée originalement en anglais dans le journal Applied and Environmental Microbiology.

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3.1 Résumé

Les autorités doivent analyser fréquemment des poudres suspectes et d‘autres échantillons afin de détecter des agents biologiques et évaluer la sécurité de l‘environnement. De nombreuses technologies de détection des acides nucléiques ont été développées afin de détecter et d‘identifier les agents biologiques dans des délais raisonnables. L‘extraction d‘acides nucléiques microbiens contenus dans une grande variété de poudres et d‘échantillons environnementaux demeure un défi technique. Nous avons développé une méthode rapide et versatile pour séparer les bactéries de ces échantillons et ensuite en extraire leurs acides nucléiques. Bacillus atrophaeus sous-espèce globigii a été utilisé à titre de simulant de Bacillus anthracis. Nous avons étudié les effets sur la détection par la PCR d‘une grande variété de poudres et d‘échantillons environnementaux et les étapes nécessaires afin d‘éliminer leurs interférences. En utilisant une méthode d‘extraction d‘ADN de référence commercialisée, la majorité (17/23) des échantillons interféraient avec la lyse bactérienne ou la détection par la PCR. C‘est pourquoi nous avons développé la dual-filter method for applied recovery of microbial particles from environmental and powdery samples (DARE). La procédure DARE permet la séparation bactérienne de matrices contaminantes interférant avec la détection par la PCR. La procédure de séparation bactérienne développée DARE requiert seulement 2 minutes, alors que la procédure d‘extraction d‘ADN dure 7 minutes, pour un total de moins de 10 minutes. Cette procédure de préparation d‘échantillons permet de récupérer des spores bactériennes nettoyées et de retirer les interférences de détection d‘une grande variété d‘échantillons. Notre technique a été facilement exécutée en laboratoire et serait transposable pour des applications sur le terrain ainsi que pour une automatisation.

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3.2 Abstract

Authorities frequently need to analyze suspicious powders and other samples for biothreat agents in order to assess environmental safety. Numerous nucleic acid detection technologies have been developed to detect and identify biowarfare agents in a timely fashion. The extraction of microbial nucleic acids from a wide variety of powdery and environmental samples to obtain a quality level adequate for these technologies still remains a technical challenge. We aimed to develop a rapid and versatile method of separating bacteria from these samples and then extracting their microbial DNA. Bacillus atrophaeus subsp. globigii was used as a simulant of Bacillus anthracis. We studied the effects of a broad variety of powdery and environmental samples on PCR detection and the steps required to alleviate their interference. With a benchmark DNA extraction procedure, 17 of the 23 samples investigated interfered with bacterial lysis and/or PCR-based detection. Therefore, we developed the dual-filter method for applied recovery of microbial particles from environmental and powdery samples (DARE). The DARE procedure allows the separation of bacteria from contaminating matrices that interfere with PCR detection. This procedure required only 2 min, while the DNA extraction process lasted 7 min, for a total of <10 min. This sample preparation procedure allowed the recovery of cleaned bacterial spores and relieved detection interference caused by a wide variety of samples. Our procedure was easily completed in a laboratory facility and is amenable to field application and automation.

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3.3 Introduction

The Centers for Disease Control and Prevention has classified Bacillus anthracis, the etiologic agent of anthrax, in category A on the list of high-priority biological agents, which means it is one of the highest risks to national security (Rotz et al. 2002). In fall 2001, at least five envelopes containing powdery forms of highly concentrated B. anthracis spore preparations (4.60 × 1010 and 2.10 × 1012 CFU/g) were mailed through the U.S. Postal Service. As a consequence, close to 120,000 clinical and environmental samples were tested for B. anthracis from October through December 2001 (U.S. Department of Justice 2010).

The discovery of suspicious powders now often results in evacuation and the intervention of hazmat teams to collect samples for biothreat agent detection. These powders may in fact be composed of inoffensive common household products. Wills and colleagues analyzed a total of 161 samples for anthrax screening and molecular identification (Wills et al. 2008). The composition of these samples was diversified. Some were typical household products (e.g., detergent, sugar, talcum, starch, and coffee creamer), but uncommon chemicals, such as mercury sulfate, phenolphthalein, phosphoric acid, polyaryl sulfonate, potassium chlorate, propylamine, and silver nitrate, were also recovered. The five most frequent samples identified were, in decreasing order, detergents, inorganic salts, sugars, cellulose, and plastics (Wills et al. 2008). Other common compounds, such as dust, plaster, and soil, may be sampled in order to assess environmental safety. It has been reported that additives such as silica and bentonite may be incorporated into powdery bioweapons (Shoham et Jacobsen 2007). Such samples may interfere with subsequent analyses. An important limitation in the detection and identification of biothreat agents is proper sample isolation or purification of target analytes, which must occur prior to analysis. These techniques are time- consuming (taking hours or days) and usually are not convenient in the field (Lim et al. 2005).

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The tremendous variety of samples that need to be analyzed for biothreat detection requires the development of versatile sample preparation techniques. Luna and colleagues have developed a sample preparation method for the detection of B. anthracis in environmental powders and nasal swabs. Their technique is based on Roche's MagNaPure extraction, Millipore's Microcon centrifugal filter device concentration, heat shock, and sonication/autoclaving. This methodology allows the purification of B. anthracis DNA contained in powders or nasal swabs with PCR analysis in a turnover time of <6 h and with a limit of detection of <10 spores (Luna et al. 2003). Dauphin et al. compared the efficiencies of five different extraction methods for the extraction and purification of B. anthracis DNA from powdery samples. The time to process an 18-sample run and recover nucleic acids ranged from 1 h 34 min to 4 h 38 min (Dauphin et al. 2009). Rose et al. studied eight DNA extraction methods for the detection of biological agents in six powders and other types of samples under biosafety level 3 (BSL-3) containment conditions. While no method proved to be the best for all types of samples, many allowed the detection of B. atrophaeus in the presence of powders. However, all these techniques required incubation times of 10 to 20 min or multiple centrifugation steps (Rose et al. 2011). The procedures for B. anthracis DNA extraction discussed above are time-consuming and labor-intensive and require sophisticated laboratory equipment.

Different approaches may be used to extract and purify bacterial DNA from diverse types of samples. Many techniques tend to lyse the samples first and then extract and purify nucleic acids. Another approach is to collect, concentrate, and clean the microorganisms first and then to lyse the concentrate to extract nucleic acids. As an example of the latter approach, Wolffs and colleagues devised a 75 min double- filtration procedure using a >40 μm pore diameter to remove large particles and a 0.22 μm pore diameter to recover Salmonella bacteria from chicken rinse or spent irrigation water (Wolffs et al. 2006).

72

Here we developed a filtration procedure to separate bacterial spores from diverse powdery and environmental samples first and then to proceed to DNA extraction. In our model, sample matrices may be soluble or insoluble in aqueous solutions, and we used this solubility property to relieve their interference. We used Bacillus atrophaeus subsp. globigii as a simulant of B. anthracis in order to evaluate the effect of each specimen investigated on DNA extraction and PCR and, most importantly, to determine how to alleviate their interference. The sizes of B. anthracis spores (0.92 to 2.27 μm by 0.53 to 1.11 μm) are similar to those of the mostly inoffensive bacterium B. atrophaeus subsp. globigii (1.05 to 1.63 μm by 0.58 to 0.86 μm) (Carrera et al. 2007). We optimized the procedure to make it compatible with the sampling of suspicious powders in the field by shortening the process time (<10 min) and facilitating handling.

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3.4 Materials and methods

3.4.1 Samples studied.

The following 23 selected specimens were obtained from laboratory suppliers or common stores or by sampling the environment: baking powder (Kraft Canada Inc., North York, Ontario, Canada), baking soda (Arm & Hammer; Church & Dwight Canada Corp., Mississauga, Ontario, Canada), bentonite (Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, WI), chalk (white; Crayola, France), cement (Poly Super Strength Cement Concrete Patch; Henkel Canada Corp, Mississauga, Ontario, Canada), coffee (instant; Maxwell House Original Blend; Kraft Canada Inc.), cornstarch (ACH Food Companies Inc., Memphis, TN), dust (swabbed in our facility using a rayon swab [Copan, Murrieta, CA]), all-purpose flour (Métro Inc., Montreal, Québec, Canada), whole-wheat flour (Métro Inc.), laundry detergent (powdered; Tide; Proctor & Gamble Inc., Toronto, Ontario, Canada), milk powder (skim; Carnation; Smucker Foods of Canada Co., Markham, Ontario, Canada), nondairy creamer (Nestle Canada Inc., Trenton, Ontario, Canada), plaster (DAP Bondex plaster of Paris; DAP Canada, Scarborough, Ontario, Canada), dried probiotics (10 billion lyophilized bacteria in 2.5 g; Lactibiane Reference; PiLeJe Micronutrition Inc., Quebec City, Quebec, Canada), salt (sodium chloride; Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, NJ), silica (powdery silicon dioxide; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), soil (collected in a garden in Quebec City, Quebec, Canada), granulated sugar (Lantic Inc., Montreal, Quebec, Canada), powdered sugar (Lantic Inc.), talcum (baby powder; Zellers Inc., Brampton, Ontario, Canada), tea (Salada orange pekoe; Unilever Canada Inc., Montreal, Quebec, Canada), and tobacco (Export ‗A‘ [medium]; JTI-Macdonald Corp., Mississauga, Ontario, Canada).

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3.4.2 Spore and DNA preparations.

B. atrophaeus subsp. globigii strain CCRI-9827 (Collection du Centre de Recherche en Infectiologie, Quebec City, Quebec, Canada) (http://www.wfcc.info/) was grown on sporulation agar medium and was conserved at ambient temperature for more than 3 weeks (Picard et al. 2009). Spore preparations were purified on a sodium bromide gradient as previously published by Laflamme et al. (Laflamme et al. 2004). Quality control procedures for the spores were carried out as described by Picard et al. (2009). The purified B. atrophaeus subsp. globigii CCRI-9827 spore preparations were stored as aliquots at −20°C, at a concentration of 104 to 105 spores per μl in 1 X phosphate-buffered saline (PBS) (137 mM NaCl, 6.4 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 0.88 mM KH2PO4 [pH 7.4]; Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada) with 10% glycerol, and were diluted in PBS (pH 7.4) to the required concentrations. A rapid microbial DNA extraction procedure was performed using a standardized glass bead-beating lysis technique, the BD GeneOhm lysis kit (BD Diagnostics, Quebec City, Quebec, Canada). Briefly, this required a 5-min bead-beating lysis step and a 2-min heating step at 95°C. Purified genomic DNA was prepared as described by Picard et al., by using mid-log-phase cells of B. atrophaeus subsp. globigii CCRI-9827 (Picard et al. 2009).

3.4.3 Real-time PCR assay.

A 212-bp fragment of the atpD gene of B. atrophaeus subsp. globigii was amplified and detected by the primers and probe described previously (Picard et al. 2009). The PCR mixtures contained 0.4 μM primers ABgl1158 and ABgl1345a, 0.1 μM TaqMan probe ABgl-T1-B1, 200 μM deoxyribonucleoside triphosphates (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl,

0.1% Triton X-100, 3.45 mM MgCl2, 3.3 μg/μl bovine serum albumin (Sigma-Aldrich Canada Ltd.), and 0.025 U/μl Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI)

75 combined with the TaqStart antibody (Clontech Takara Bio, Mountain View, CA) (Kellogg et al. 1994).

Prepared samples (5 μl) were added to each PCR mixture in duplicate and were then subjected to thermal cycling with a Rotor-Gene 3000 thermocycler (Corbett Research, Australia) as follows: 3 min at 94°C, followed by 48 cycles of 5 s at 95°C, 15 s at 60°C, and 20 s at 72°C. PCR efficiency was evaluated by comparing the cycle threshold (CT) for tested samples to that for positive controls without samples. JMP statistical software, version 8 (SAS Institute Inc., Cary, NC), was used to perform 95% confidence interval (95% CI) calculations. Amplicons were also analyzed using agarose (2%) gel electrophoresis with 0.25 μg/ml of ethidium bromide in a Tris-borate-EDTA buffer (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA), and a 100-bp DNA ladder was used as a molecular weight marker (GE Healthcare, Baie d'Urfé, Quebec, Canada).

3.4.4 Prefiltration evaluation.

Three different syringe filters for the prefiltration step were tested: a 25-mm- diameter, 5.0-μm-pore-size Millex-SV filter unit (Millipore, Billerica, MA), and two 25-mm-diameter Acrodisc syringe filters with 5-μm or 10-μm-pore-size Versapor membranes (Pall Corporation, Port Washington, NY). To first evaluate the percentage of spore recovery, we prepared a B. atrophaeus spore suspension at a 0.5 McFarland standard and diluted it at 10−3 in 0.85% NaCl solution. Spore dilutions (1 ml) were filtered through each of the three syringe filters, and 100 μl of the filtrates was diluted 1/10 in 0.85% NaCl. These dilutions (100 μl) were plated on 5% sheep blood agar in duplicate and were incubated overnight at 35°C under aerobic conditions for CFU counting. We also investigated whether a subsequent elution step using 500 μl of 0.85% NaCl would increase the spore recovery rate. Finally, we determined whether the two filters with higher percentages of spore recovery (the 5-μm-pore size Millex-SV filter unit and the Acrodisc syringe filter with

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the 10-μm-pore-size Versapor membrane) would efficiently retain insoluble interfering particles. We used bentonite (20 mg) as a model powder and performed filtration as described below, followed by PCR analyses.

3.4.5 Removal of soluble and insoluble compounds.

The interference with PCR assay performance induced by samples was investigated by studying PCR and lysis inhibition, and the steps required to alleviate interference were evaluated (Tableau 6 [Table 1]). All tests were performed in duplicate. Selected specimens (20 mg each) were suspended in 1 ml of water. Suspensions were centrifuged at 20,000 × g for 1 min. The supernatant (900 μl) was removed with care, and the remaining 100 μl was used as a no- treatment control (Tableau 6 [Table 1], No tr.). We then evaluated the relief of interference with PCR and lysis resulting from the removal of insoluble matter. For that purpose, the sample suspension was filtered through the 5-μm-pore-size Millex-SV syringe filter. Then centrifugation and analyte recovery were performed in the same way as for the no-treatment control (Tableau 6 [Table 1], PF). The impact of the removal of soluble compounds was evaluated by washing the pelleted samples twice with 1 ml of water, repeating centrifugation at 20,000 × g, and removing only the supernatant. The remaining pellet was suspended in 100 μl of water prior to real-time PCR analysis for the measurement of PCR inhibition compared to that with the no-treatment control (Tableau 6 [Table 1], W). Some samples contained both insoluble and soluble compounds that interfered with subsequent analyses. We therefore evaluated the effect of a combination of both treatments: prefiltration and washes (Tableau 6 [Table 1], PF and W). For PCR inhibition tests, 5-μl aliquots of untreated or treated samples were added to a real- time PCR mixture containing 125 genome copies of purified genomic DNA from B. atrophaeus CCRI-9827 (Tableau 6 [Table 1], PCR). For tests of inhibition of lysis and PCR, 104 B. atrophaeus spores were added to 100 μl of the prepared samples, which were then subjected to the rapid DNA extraction procedure (BD

77

GeneOhm lysis kit), and aliquots (5 μl) of the DNA extracts were added to real-time PCR mixtures (Tableau 6 [Table 1], Lysis and PCR). Negative controls without added DNA templates, and with or without samples, were performed. Controls using intact purified spores were also analyzed. Positive controls with either purified genomic DNA or lysed spores and without samples were also performed.

3.4.6 Spore capture and recovery step.

We evaluated the recovery of B. atrophaeus subsp. globigii using 103 spores suspended in a 5-ml solution of 0.6 × PBS. This suspension was aspirated in the syringe through a 13-mm-diameter, 0.45-μm-pore-size Millex-HV filter (Millipore, Billerica, MA). Then 300, 500, or 1,000 μl of water or 1 × PBS was flushed through the filter in the opposite direction to release the spores. Three replicates were executed for each buffer and elution volume evaluated. Eluates (aliquots of 100 μl) containing spores were plated in duplicate onto brain heart infusion (BHI) agar and were incubated overnight at 37°C under aerobic conditions for CFU counting. JMP statistical software, version 8, was used to perform analysis of variance (ANOVA) calculations.

3.4.7 DARE procedure.

The dual-filter method for applied recovery of microbial particles from environmental and powdery samples (DARE) developed in this study can be executed in 2 min (Figure 13 [Figure 1], steps 1 to 8). Selected specimens (20 mg each) were suspended in 1 ml of 1 × PBS containing spores in a 15-ml tube (T1; 76 by 20 mm; Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany) (Figure 13 [Figure 1], steps 1 and 2). This suspension was filtered through a 5-μm-pore-size Millex-SV syringe filter (Figure 13 [Figure 1], steps 3 and 4), followed by the filtration of 2 ml of 1 × PBS and 2 ml of water (Figure 13 [Figure 1], steps 5 and 6). The 5 ml filtrate was collected in a 15-ml tube (T2; 76 by 20 mm). The filtrate was mixed briefly and

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was aspirated through a 0.45-μm-pore-size Millex-HV filter (F2) fixed by a Luer Lock fitting on a 10-ml syringe (step 7). The 10-ml syringe was discarded and was replaced by a 1-ml syringe containing 300 μl of water and 700 μl of air. The contents of this syringe were flushed through the 0.45-μm-pore-size Millex-HV filter, and the concentrated and cleaned spore suspension was recovered in a 1.5 ml-microtube (Figure 13 [Figure 1], step 8). A 100-μl sample was used to rapidly extract microbial DNA (BD GeneOhm lysis kit) (Figure 13 [Figure 1], steps 9 and 10).

3.4.8 Spore recovery.

Spores were recovered after the prefiltration step and at the end of the DARE procedure by using a 1-ml PBS spore suspension (approximately 103 spores/ml) mixed with 20 mg of the specimen. Monitoring was conducted by CFU counting of 100 μl of the eluates plated onto BHI agar and incubated overnight at 37°C under aerobic conditions. Three replicates were performed for each specimen and were plated in duplicate. The percentage of recovery was calculated using the average CFU counts for each specimen compared to those for the initial spore suspension. The percentage of spore recovery for the capture filtration step was calculated as 100% minus the difference measured between the recovery rate after prefiltration and the recovery rate at the end of the DARE procedure. The effect of each sample tested on spore viability and growth was also evaluated by CFU counts. The presence of contaminating bacteria in the samples studied was evaluated. Negative controls without added spores were included in order to determine whether specimens would produce unrelated colonies.

3.4.9 PCR detection efficiency.

First, we needed to evaluate the effects of the 23 selected specimens (20 mg) on PCR detection of bacterial spores. A threshold for the complete detection

79 procedure was established at 5 × 103 spores, considering the high spore load in

B. anthracis preparations and the 50% lethal dose (LD50) of B. anthracis, estimated at 5.5 × 104 CFU in rhesus macaque (LeClaire 2004). We tested the detection of a high load (5 × 106) and a low load (5 × 103) of B. atrophaeus spores without the DARE procedure. The selected specimens (20 mg each) were added to 1 ml of a spore suspension in 1 X PBS. For all samples studied, negative controls without spores or without the DNA template were performed. Controls without specimens were performed each time samples were processed. We also proceeded in parallel to the DARE procedure (Figure 13 [Figure 1]) using 5 × 106 and 5 × 103 spores (in exceptional cases, we had to increase the number of spores to 104, 2.5 × 104, and 3 × 104 in order to allow bacterial detection (Tableau 8 [Table 3]), resulting in a 300 μl volume of cleaned bacterial suspension. Three separate DARE procedures were performed for each specimen and concentration. An aliquot (100 μl) was subjected to rapid DNA extraction as described above, and then 5 μl was added in each PCR.

3.4.10 Imaging of spores and filters.

B. atrophaeus subsp. globigii CCRI-9827 spores (at a 0.5 McFarland standard) were labeled with 0.02% fluorescein isothiocyanate (FITC) as described previously (Geissler et al. 2011). The penetration and release of fluorescent B. atrophaeus spores in 5 μm and 0.45-μm-pore-size filters were evaluated by using an Olympus FV300 confocal laser scanning microscope (Olympus Canada, Markham, Ontario, Canada) with an argon-ion laser for excitation at 488 nm. We executed the DARE procedure four times, twice excluding the bacterial recovery step and twice including it (Figure 13 [Figure 1], step 8). The filters were then removed from plastic housings and were observed from the side facing the syringe (female Luer Lock) or the tube (male taper end). Three and five fields of view (FOVs) (each 176.77 by 176.77 μm) per filter were randomly selected for 5-μm- and 0.45-μm- pore-size-filters, respectively. Fluorescence images were acquired through a Plan

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Apochromat 60× (numerical aperture, 1.4) objective at serial optical sections (258 sections at 0.35 μm intervals) by the FluoView FV300 confocal microscope. Fluorescence originating from spores was detected based on the intensity and the size (excluding less than 0.75 μm3) of the emission signals, using Volocity software, version 4.2 (Quorum Technologies, Guelph, Ontario, Canada) (Figure 14 [Figure 2]). JMP statistical software, version 8, was used to perform frequency estimates from the distribution of the data for the depth of penetration of bacteria in the filter.

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3.5 Results

3.5.1 Selection of samples for study.

In this study, we selected 23 specimens with different colors and textures; white powders were most frequently represented. Bentonite and silica powders were selected because they have been reported previously to be potential additives that may be incorporated into powdery bioweapons (Shoham et Jacobsen 2007). Baking soda, baking powder, cornstarch, flour (all-purpose and whole wheat), laundry detergent, milk powder, nondairy creamer, powdered sugar, salt, granulated sugar, and talcum were chosen because they represent common powdery household products. Cement, chalk, dust, and plaster may be collected in a building during assessment of environmental safety. A lyophilized preparation of probiotics was also tested in order to study the effect of a massive quantity of background bacteria in samples on recovery and detection. The probiotic brand used contained four bacterial species (Bifidobacterium longum LA-101, Lactobacillus acidophilus LA-102, Lactococcus lactis LA-103, and Streptococcus thermophilus LA-104), for a total of 80 million lyophilized bacteria in 20 mg. Coffee, soil, tea, and tobacco were also selected in order to evaluate the efficiency of our technique for samples with different characteristics (color and texture).

3.5.2 Selection of a filter for removal of insoluble particles.

In our model, specimens were composed of insoluble and soluble molecules that may interfere with subsequent nucleic acid analyses. First, we decided to perform a prefiltration step in order to remove most of the insoluble particles and recover bacterial spores in filtrates. Therefore, we selected filters with pore diameters of 5 and 10 μm, which allow average-size bacteria to pass and retain most of the insoluble particles. First, we evaluated the percentages of spore recovery by CFU counting of the B. atrophaeus spore suspension (1 ml) after prefiltration on three

82

different filters: the 5-μm-pore-size Millex-SV filter (spore recovery, 78%), the 5- μm-pore-size Versapor filter (58%), and the 10-μm-pore-size Versapor filter (81%). Then we evaluated the need for a subsequent elution step (0.5 ml) that could increase the percentages of bacterial recovery with these three filters. This elution step increased spore recovery for the 5-μm-pore-size Millex-SV (87%) and 10-μm- pore-size Versapor (95%) filters but did not for the 5-μm-pore-size Versapor filter (56%). The 5-μm-pore-size Millex and 10-μm-pore-size Versapor filters allowed higher spore recovery and therefore needed to be tested for their efficiencies at removing insoluble particles. Bentonite was used as a model, because it has been reported as a potential additive to powdery bioweapons and is composed of small insoluble particles that could interfere with PCR detection (Shoham et Jacobsen 2007). The 5-μm-pore-size Millex filter relieved PCR inhibition from bentonite samples, while the 10-μm-pore-size Versapor filter did not. The combination of consecutive 10-μm-pore-size Versapor and 5-μm-pore-size Millex filtrations did not significantly increase the relief of inhibition from bentonite contamination over that obtained with the 5-μm-pore-size Millex filter alone. We therefore selected the 5- μm-pore-size Millex filter to pursue our experiments, considering its high levels of spore recovery and relief of PCR inhibition induced by bentonite.

3.5.3 Removal of soluble and insoluble compounds.

To investigate the interference of the 23 samples studied with PCR and with spore lysis, we separated the results (Tableau 6 [Table 1]). The no-treatment control (No tr.) results present the interference of samples with PCR alone or with both lysis and PCR, allowing us to understand which step is disrupted. We performed numerous negative and positive controls to validate our results. Negative controls without added DNA templates, and with and without the samples studied, all showed negative PCR results. These controls showed that neither the reagents nor the samples studied contained nucleic acids that would produce false-positive results. When purified spores that were not lysed were used as another control, no

83 positive PCR results were obtained. This indicated that the purified spore preparations did not contain detectable external DNA. Moreover, positive controls with either purified genomic DNA or lysed spores and without the study samples all showed positive PCR results. These results were used as reference positive controls for study of the interference of selected specimens with bacterial detection. We compared PCR interference by the 23 selected specimens with and without the prefiltration procedure. With no treatment, 9 samples did not interfere with PCR, while 14 samples interfered with PCR, under the conditions tested (Tableau 6 [Table 1], PCR, No tr.). Selected samples were submitted to a syringe prefiltration system: the 5-μm-pore-size Millex-SV filter. Insoluble powders suspended in PBS produced turbid solutions (heterogeneous solutions), while after the prefiltration step, the solutions became translucent (homogeneous solutions). The prefiltration step relieved PCR inhibition for six samples: bentonite, flour (whole wheat), probiotics, silica, tea, and tobacco (Tableau 6 [Table 1], PCR, PF). We also evaluated the effects of the 23 selected specimens on rapid extraction of DNA from B. atrophaeus subsp. globigii spores (Tableau 6 [Table 1], Lysis and PCR). Four samples that did not prevent PCR detection interfered with bead- beating spore lysis: cornstarch, probiotics, soil, and talcum (Tableau 6 [Table 1], Lysis and PCR, No tr.). However, the prefiltration step removed the lysis interference produced by all four of these samples (Tableau 6 [Table 1], Lysis and PCR, PF). These results showed that most insoluble particles were retained in the prefiltration step and that thus, prefiltration helped alleviate the interference of nine samples with detection. To evaluate the need for the removal of soluble compounds, we performed two consecutive washes and centrifugations (Tableau 6 [Table 1], W). Compared to the no-treatment control, this washing procedure removed PCR inhibition by eight specimens: baking powder, baking soda, coffee, flour (all purpose), plaster, salt, silica, and tobacco (Tableau 6 [Table 1], PCR, W). Interestingly, PCR inhibition from silica powder or tobacco was relieved by either prefiltration or washes (Tableau 6 [Table 1] PCR, PF, or PCR, W). Only two

84

specimens—cement and laundry detergent—required both prefiltration and washing treatments to remove PCR inhibition (Tableau 6 [Table 1], PCR, PF and W). However, three more specimens required both treatments for the removal of interference with PCR and lysis: all-purpose and whole-wheat flours and plaster (Tableau 6 [Table 1], Lysis and PCR, PF and W). Baking powder was the only specimen that still interfered with lysis and/or PCR following prefiltration and washes.

3.5.4 Evaluation of the spore capture and recovery step.

The experimental methodology composed of two steps (filtration first, followed by washing using centrifugation) was shown to be efficient at the removal of compounds that interfere with PCR. This procedure, however, involves excessive handling, requires dexterity and the use of complex instruments, such as a micropipette and a centrifuge, and is time-consuming (approximately 1 h 30 min for 18 samples). The prefiltration with a syringe filter was attractive because it did not require complex instrumentation and was simple and fast. We therefore decided to add a second filtration step with a syringe in order to capture bacteria while washing soluble compounds away in the filtrate. Captured bacteria can be recovered afterwards by simply inverting the flow using a clean solution. We selected a filter with a pore diameter of 0.45 μm, small enough to capture an average-size bacterium. Then we studied the conditions (volume and buffer) for the optimization of spore recovery. The prefiltered sample (103 spores in 5 ml) was aspirated through the 0.45-μm-pore-size capture filter into a syringe, and clean water or PBS was flushed with a new syringe in order to recover bacterial spores. All volumes and buffers in the recovery step allowed a spore recovery level of approximately 60%, with no statistically significant difference (by ANOVA). We selected the smallest volume tested (300 μl) in order to recover approximately 60 % of the spores and concentrate them in clean water, which is compatible with PCR and other detection technologies.

85

3.5.5 Evaluation of spore recovery

We evaluated spore recovery after each filtration step by CFU counting (Tableau 7 [Table 2]). Samples without added B. atrophaeus were plated for the evaluation of initial background microbial loads and colony morphology. Probiotics, soil, and tobacco produced numerous and diverse contaminating colonies under the culture conditions used, but the morphology of B. atrophaeus CCRI-9827 was distinctive enough to allow this bacterium to be counted specifically. B. atrophaeus colonies on BHI under the specified conditions were approximately 2 mm in diameter, circular, umbonate, dry, and light pinkish yellow. We tested the viability and the growth of spores in contact with the 23 samples studied. Salt is the only specimen that affected the bacterial count, although only minimally (data not shown). After prefiltration of 20 mg of specimens, the average percentage of spore recovery was 84 % ± 16 %. Positive controls with no sample showed a high recovery rate of 97 %.

The efficiency of spore recovery after the DARE procedure was also evaluated (Tableau 7 [Table 2]). The average spore recovery rate for the whole procedure for all samples tested was determined to be 51 % ± 17 %. The spore recovery rate with no sample (positive control) was determined to be 56 % ± 8 % on average. The spore recovery rate for the capture filter only was calculated on the basis of the spore loss between prefiltration and the end of the DARE procedure. The average recovery rate for the capture filtration step for all samples was 68 % (range, 40 % to 94 %). Nondairy creamer particles, in contrast to all other samples, partially clogged the capture filter. The total recuperation volume could not be recovered, resulting in the lowest spore recovery after capture filtration (40 %).

3.5.6 Efficiency of spore DNA detection after the DARE procedure

The procedure developed was optimized to facilitate handling, enhance spore recovery, and shorten the duration of the process (Figure 13 [Figure 1]). The

86

filtration procedure allowed us to separate bacteria from sample matrices and required <2 min per sample to execute. The cell lysis and heating steps added 7 min, for a total of <10 min to prepare nucleic acid extracts appropriate for a real- time PCR assay.

For all samples studied, except the coffee sample, negative controls without spores or without a DNA template showed negative PCR signals. The direct use of unprocessed samples interfered with the detection of 5 × 103 spores for 15 of the 23 samples, while 9 samples did not allow the detection of 5 × 106 spores by PCR (Tableau 8 [Table 3]). Silica, soil, and talcum completely inhibited some PCR replicates when 5 × 103 spores were used; however, a higher number of spores (5 × 106) produced positive reactions for all replicates. Bentonite and flours completely prevented PCR detection when 5 × 103 spores were used, but a higher 6 quantity of spores (5 × 10 ) resulted in positive PCR signals, although with CTs that were statistically delayed relative to those for positive controls with no sample (95 % CI). Without treatment, the coffee sample emitted fluorescence overlapping with the fluorophore of the probe in real-time PCR, but no amplification product was observed using agarose gel analysis. The DARE procedure developed here allowed us to reach the detection threshold established at 5 × 103 B. atrophaeus spores for the majority (20/23) of the samples investigated. Cement, chalk, and plaster increased the detection threshold to 104, 2.5 × 104, and 3 × 104 spores, respectively.

3.5.7 Spore penetration in filters

The penetration of FITC-labeled spores through 5-μm-pore-size Millex filters was studied. When approximately 5 × 106 fluorescent spores were filtered through the 5-μm pores, only a few spores (0 to 2 spores per FOV) were detected in the filter (data not shown). In agreement with the results of bacterial culture, this result confirms that the majority of the spores passed through 5-μm-pore-size filters. To

87 verify the penetration and removal of spores in the 0.45-μm-pore-size filters (approximately 100 μm thick), approximately 5 × 106 fluorescent spores were used. Confocal images were captured from both sides of the filters (facing the syringe and facing the tube) after steps 7 and 8 (Figure 13 [Figure 1]). When the filters obtained after step 7 were analyzed, the majority of bacterial spores were detected at the 0 to 16 μm depth of the side facing the tube, where spores entered filters (Figure 14a [Figure 2a]). Very few, if any, spores were detected on the side facing the syringe (data not shown). Together, these data showed the shallow penetration of the B. atrophaeus spores in 0.45 μm pore size filters. Furthermore, only a small proportion of bacterial spores was detected on the side of the filter facing the tube when the bacterial recovery step was executed (Figure 13 [Figure 1], step 8), indicating that the majority of the spores were expulsed by this step (Figure 14b [Figure 2b]). Comparison of Figure 14a [Figure 2a] and Figure 14b [Figure 2b] revealed that 16 % of the captured bacteria remained after the bacterial recovery step. This suggests that 84 % of the spores could be recovered. CFU counts revealed similar percentages of bacterial recovery for the filtration step, ranging from 40 to 94 % (Tableau 7 [Table 2]).

88

3.6 Discussion

The variety of sample types that may be harvested for the detection of biological agents is tremendous. Several of these matrices can hamper detection processes. Without an efficient sample preparation technique, even common powdery household products that may be used in hoaxes could interfere with positive controls included in biothreat agent detection assays and could thus invalidate results. We need to increase knowledge of the effects of powdery and environmental samples on detection techniques. Of the 23 sample types investigated here, only 6 specimens did not initially interfere with bacterial detection by PCR under all conditions tested: chalk, dust, milk powder, nondairy creamer, granulated sugar, and powdered sugar. We showed that most (17/23) of the specimens interfered with bacterial detection to various degrees, depending on the bacterial load and the specific experimental conditions. Specimen matrices may interfere at different steps of the complete detection procedure: filtration, lysis, PCR, and detection. Tableau 6 [Table 1] shows interference with PCR and lysis. Tableau 7 [Table 2] shows that some specimens modified the rate of spore recovery during filtration. Tableau 8 [Table 3] shows a realistic scenario where specimens directly lysed may yield false-negative results, while specimens processed with the DARE procedure allow bacterial detection. The comparative analysis of results in Tables 1 to 3 for each specimen allows understanding of the steps with which they interfered and how to alleviate these interferences. One limitation of our study is that we tested only a single source for each of the 23 specimens studied. However, the variety of sample types selected in this study provided useful information for molecular analyses of microorganisms contained in various specimens. Our results supported the need for the development of a simple and versatile sample preparation technique.

We answered this need by using the solubility and insolubility properties of sample matrices and bacteria in aqueous solutions. The selection of the pore diameter of

89 the prefilter, 5 μm, was extremely important. For the prediction of filtration efficiency, the size of the microorganism is a determining characteristic. Kowalski and Bahnfleth summarized the relative sizes of airborne pathogens and showed that their diameters range from 0.2 to 1.3 μm (Kowalski et Bahnfleth 1998). The prefiltration step (pore diameter, 5 μm) is efficient at letting through spores of the simulant B. atrophaeus, whose size is comparable to that of B. anthracis (Carrera et al. 2007). Most importantly, particles in the 1 to 5 μm diameter range tend to behave like gases and penetrate the pulmonary tree deeply (Lim et al. 2005). Therefore, these microbial particles are the most dangerous and need to be detected efficiently.

We optimized a second filtration step with a syringe for the purpose of capturing B. atrophaeus spores and recovering them in clean water by inverting the flow within seconds. Confocal microscopy analyses showed the shallow penetration of the 0.45-μm-pore-size filter by bacterial spores. This may explain why bacteria may be recovered efficiently simply by inverting the flow. Bacterial recovery percentages with all samples tested were 84 % ± 16 % on average after prefiltration (5-μm-pore-size filter) and 51 % ± 17 % after the DARE procedure. Some powders, such as bentonite, nondairy creamer, and plaster, decreased the final spore recovery rate to 16, 22, and 21 %, respectively. The spore recovery rates after prefiltration for bentonite and plaster were noticeably lower. This may be explained by the possibility that insoluble particles partially clogged the prefilter. Nondairy creamer partially clogged the capture filter, which may explain why this sample had the lowest spore recovery rate. We used spores of the simulant B. atrophaeus subsp. globigii, which is comparable in size and shape to B. anthracis, although the surface properties of these two organisms may differ. Recovery of B. anthracis spores using the DARE procedure developed in this study requires further investigation. In order to assess environmental safety, the presence of other biothreat agents, such as Brucella spp. (0.5 to 0.7 by 1.5 μm), Francisella tularensis (0.2 by 0.7 μm), and Yersinia pestis (0.5 by 1 μm), as well as

90

viruses (Gilchrist et American Society for Microbiology. 2000), may need to be evaluated. The widths of these agents are equivalent to or smaller than that of B. atrophaeus spores, and they should be efficiently recovered after prefiltration (pore diameter, 5 μm). However, the capture filtration step may require more adjustments, including the use of a pore diameter smaller than the 0.45 μm selected here, such as 0.2 μm, for bacterial capture and recovery.

3 The detection threshold was set at 5 × 10 spores and represents 1/10 of the LD50 of aerosolized B. anthracis in rhesus macaques (5.5 × 104 CFU), as well as 1.1 × 10−4 and 2.4 × 10−6 mg of the bacterial preparations used during the 2001 anthrax letter attacks (LeClaire 2004; U.S. Department of Justice 2010). Without the DARE procedure, of the 23 specimens investigated, only 8 did not interfere with the detection of 5 × 103 spores of B. atrophaeus, while 14 did not interfere with detection when 5 × 106 spores were used. The DARE procedure allowed the detection of 5 × 103 spores of B. atrophaeus when they were mixed with 20 specimen types. Cement, chalk, and plaster were exceptions that required higher numbers of spores for detection (104, 2.5 × 104, and 3 × 104 spores, respectively), but these numbers were still under the LD50 of B. anthracis in rhesus macaques (LeClaire 2004). Notably, the DARE procedure proved advantageous for cement and plaster, since without treatment, these materials prevented the detection of both 5 × 103 and 5 × 106 B. atrophaeus spores. In contrast to all other results, the DARE procedure decreased the detection efficiency to 2.5 × 104 spores when they were mixed with chalk, while 5 × 103 spores were detected without the DARE procedure.

Lim and colleagues described the characteristics of an ideal method for separating, concentrating, and purifying a target biothreat agent (Lim et al. 2005). The method developed in our study meets many of their requirements. The DARE procedure was developed to facilitate handling and purification steps for samples that may contain biothreat agents. Our choice of a filtration system with syringes made the

91 steps easy to execute. Intervention time is also a crucial parameter in bioterrorism response. The DARE procedure required only 2 min to process one sample, followed by a rapid cell lysis procedure of 7 min. Our technique is considerably faster, and has been optimized to handle smaller volumes, than the 75 min method developed by Wolffs and colleagues (Wolffs et al. 2006). Since high-throughput analyses may be required, the time necessary for one user to process 18 samples can be calculated at 43 min; this compares favorably with the processing times of five other techniques evaluated by Dauphin et al., which ranged from 1 h 34 min to 4 h 38 min (Dauphin et al. 2009). Moreover, cell viability is maintained before cell lysis, and an aliquot could be cultured for further analyses, conservation of the strains involved, and forensic purposes. Since bacteria are recovered in clean water, they could also be subjected to various molecular assays based on, for example, antibodies, proteins, or nucleic acids. The quantities of powders processed by Rose et al. and Luna et al. were only a 1 μl loopful and 2.5 to 5 mg, respectively, amounts significantly lower than the 20 mg of specimen processed here (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). We showed that our procedure is efficient at separating spores from a relatively large amount of sample and a wide variety of powdery and environmental samples. This technique should be further tested using other bacterial species and other types of samples. The DARE procedure and DNA extraction require only 10 components, 10 steps, and 10 min. The simplicity of the method developed here shows promise for the preparation of powdery and environmental samples and the performance of molecular detection in the field. Its automation and integration into a total-analysis system could further facilitate handling and high-throughput analysis in the field.

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3.7 Acknowledgments

This research project was funded by Canada's Chemical, Biological, Radiological, and Nuclear Research and Technology Initiative under the Portable Biological Agent Detection System program (06-0187TD). J.-C.L. was supported by the Infrastructure Operating Fund of the Canadian Foundation for Innovation. S.I. and A.T.P. received scholarships from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (Montréal, Canada) and the Canadian Institutes of Health Research (Ottawa, Canada), respectively.

We are grateful to Ève Bérubé, Luc Bissonnette, Karel Boissinot, Paul Boissinot, Sébastion Chapdelaine, France Couture, Matthias Geissler, Jean-François Gravel, Marie-Claude Hélie, Keith Logan, Valérie Milot, Maude Royer, and Manon Tétreault for technical support and useful discussions.

93

3.8 References

Carrera, M., R.O. Zandomeni, J. Fitzgibbon et J.L. Sagripanti. 2007. Difference between the spore sizes of Bacillus anthracis and other Bacillus species. Journal of applied microbiology 102(2): 303-312. Dauphin, L.A., B.D. Moser et M.D. Bowen. 2009. Evaluation of five commercial nucleic acid extraction kits for their ability to inactivate Bacillus anthracis spores and comparison of DNA yields from spores and spiked environmental samples. Journal of microbiological methods 76(1): 30-37. Geissler, M., J.A. Beauregard, I. Charlebois, S. Isabel, F. Normandin, B. Voisin, M. Boissinot, M.G. Bergeron et T. Veres. 2011. Extraction of nucleic acids from bacterial spores using bead-based mechanical lysis on a plastic chip. Engineering in Life Sciences 11(2): 174-181. Gilchrist, M.J.R. et American Society for Microbiology. 2000. Cumitech 33, Laboratory safety, management, and diagnosis of biological agents associated with bioterrorism. ASM Press, Washington, DC. 19 p. Kellogg, D.E., I. Rybalkin, S. Chen, N. Mukhamedova, T. Vlasik, P.D. Siebert et A. Chenchik. 1994. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. BioTechniques 16(6): 1134-1137. Kowalski, W. et W. Bahnfleth. 1998. Airborne respiratory diseases and mechanical systems for control of microbes. HPAC Engineering 70(7): 34-48. Laflamme, C., S. Lavigne, J. Ho et C. Duchaine. 2004. Assessment of bacterial endospore viability with fluorescent dyes. Journal of applied microbiology 96(4): 684-692. LeClaire, R.D.P., M. L. M. 2004. Biological weapons defense: Effect levels p. 41–64. In Biological weapons defense: infectious diseases and counterbioterrorism. Humana Press, Totowa, NJ. Lim, D.V., J.M. Simpson, E.A. Kearns et M.F. Kramer. 2005. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clinical microbiology reviews 18(4): 583-607. Luna, V.A., D. King, C. Davis, T. Rycerz, M. Ewert, A. Cannons, P. Amuso et J. Cattani. 2003. Novel sample preparation method for safe and rapid detection of Bacillus anthracis spores in environmental powders and nasal swabs. Journal of clinical microbiology 41(3): 1252- 1255. Picard, F.J., M. Gagnon, M.R. Bernier, N.J. Parham, M. Bastien, M. Boissinot, R. Peytavi et M.G. Bergeron. 2009. Internal control for nucleic acid testing based on the use of purified Bacillus atrophaeus subsp. globigii spores. Journal of clinical microbiology 47(3): 751-757. Rose, H.L., C.A. Dewey, M.S. Ely, S.L. Willoughby, T.M. Parsons, V. Cox, P.M. Spencer et S.A. Weller. 2011. Comparison of eight methods for the extraction of Bacillus atrophaeus spore DNA from eleven common interferents and a common swab. PloS one 6(7): e22668. Rotz, L.D., A.S. Khan, S.R. Lillibridge, S.M. Ostroff et J.M. Hughes. 2002. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerging infectious diseases 8(2): 225- 230. Shoham, D. et S.M. Jacobsen. 2007. Technical intelligence in retrospect: the 2001 anthrax letters powder. International Journal of Intelligence and Counter Intelligence 20(1): 79-105. US Department of Justice. 2010. 19 février 2010.Amerithrax Investigative Summary. U.S. Department of Justice, Washington, DC. http://www.justice.gov/amerithrax/docs/amx- investigative-summary.pdf

94

Wills, B., J. Leikin, J. Rhee et B. Saeedi. 2008. Analysis of suspicious powders following the post 9/11 anthrax scare. Journal of medical 4(2): 93-95. Wolffs, P.F., K. Glencross, R. Thibaudeau et M.W. Griffiths. 2006. Direct quantitation and detection of salmonellae in biological samples without enrichment, using two-step filtration and real-time PCR. Applied and environmental microbiology 72(6): 3896-3900.

95

3.9 Tables

Tableau 6 [Table 1]. Interference of powdery and environmental samples, without treatment or after treatment, with PCR and lysis.

Sample Efficiencya of: PCR Lysis and PCR No tr. PF W PF and W No tr. PF W PF and W Control (no sample) + + + + + + + + Baking powder − − + NT − NT − − Baking soda − − + NT − NT + NT Bentonite − + − NT − + NT NT Cement − − − + − NT NT + Chalk + NT NT NT + NT NT NT Coffee − − + NT − NT + NT Cornstarch + NT NT NT − + − NT Dust + NT NT NT + NT NT NT Flour All purpose − −** + NT − NT − + Whole wheat − + − NT − +* NT + Laundry detergent − − − + − NT NT + Milk powder (skim) + NT NT NT + NT NT NT Nondairy creamer + NT NT NT + NT NT NT Plaster − − + NT − NT − + Probiotics +* + + NT − + + NT Salt (NaCl) − − + NT − NT + NT Silica −** + + NT + + + NT Soil + NT NT NT − + − NT Sugar Granulated + NT NT NT + NT NT NT Powdered + NT NT NT + NT NT NT Talcum + NT NT NT −** + NT NT Tea − + − NT − + NT NT Tobacco − + + NT − + NT NT a +, all replicates showed positive PCR signals (<4 CT over the positive control); −, all replicates showed negative PCR signals; +*, weak positive PCR signal (≥4 CT over the positive control); −**, one or more PCR replicates were negative; NT, not tested; No tr., no-treatment control (interference by untreated samples); PF, prefiltration (study of the removal of insoluble compounds); W, washes (study of the removal of soluble compounds).

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Tableau 7 [Table 2]. Percentages of bacterial spore recovery after filtration steps.

Sample % spore recovery after: Prefiltrationa Capture filtration onlyb DARE procedurec Control (no sample) 97 59 56 Baking powder 78 76 54 Baking soda 93 56 49 Bentonite 46 70 16 Cement 76 65 41 Chalk 70 63 33 Coffee 55 94 49 Cornstarch 89 75 64 Dust 78 74 52 Flour All purpose 89 74 63 Whole wheat 73 73 46 Laundry detergent 87 64 51 Milk powder (skim) 102 50 52 Nondairy creamer 82 40 22 Plaster 66 55 21 Probiotics 93 77 60 Salt (NaCl) 87 63 50 Silica 91 57 48 Soil 103 49 52 Sugar Granulated 100 76 76 Powdered 105 76 81 Talcum 62 75 37 Tea 97 83 80 Tobacco 89 86 75 Avg ± SD 84 ± 16 68 ± 13 51 ± 17 a With a 5-μm-pore-size Millex-SV filter. b With a 0.45-μm-pore-size Millex-HV filter; calculated as 100% − (% recovery after prefiltration − % recovery after the DARE procedure). c With 5 μm- and 0.45 μm-pore-size Millex filters.

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Tableau 8 [Table 3]. PCR efficiency without treatment and with the DARE procedure and detection thresholds.

Sample PCR efficiencya with: DTb (no. of spores) No treatment DARE 5 × 106 spores 5 × 103 spores Control (no sample) + + + 5 × 103 Baking powder − − + 5 × 103 Baking soda − − + 5 × 103 Bentonite + − + 5 × 103 Cement − −* + 1 × 104 Chalk + + + 2.5 × 104 Coffee −** −** + 5 × 103 Cornstarch + + + 5 × 103 Dust + + + 5 × 103 Flour All purpose + − + 5 × 103 Whole wheat + − + 5 × 103 Laundry detergent − − + 5 × 103 Milk powder (skim) + + + 5 × 103 Nondairy creamer + + + 5 × 103 Plaster − − + 3 × 104 Probiotics + + + 5 × 103 Salt − − + 5 × 103 Silica + −* + 5 × 103 Soil + −* + 5 × 103 Sugar Granulated + + + 5 × 103 Powdered + + + 5 × 103 Talcum + −* + 5 × 103 Tea − − + 5 × 103 3 Tobacco − − + 5 × 10 a +, all replicates showed positive PCR signals statistically comparable to those for positive controls; −, all replicates showed negative PCR signals; −*, one PCR replicate or more showed a negative PCR signal; −**, some replicates showed discrepant results (positive real-time PCR signals and negative results based on agarose gel analysis). b DT, detection threshold of B. atrophaeus spores producing positive results with the DARE procedure.

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3.10 Figures

Figure 13 [Figure 1]. DARE procedure and DNA extraction. The complete procedure required 10 steps, 10 tools, and 10 min. Materials are identified as follows: A, swab; F, filter; S, syringe; T, tube. The DARE procedure is executed in the first eight steps. Steps 9 and 10 represent the standardized technique with the BD GeneOhm lysis kit, which includes glass bead-beating lysis and a heating step. Red indicates that tubes or syringes contain bacteria.

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Figure 14 [Figure 2]. Penetration and expulsion of bacterial spores in the 0.45-µm-pore-size filters. We studied the penetration and expulsion of FITC-labeled B. atrophaeus spores within the 0.45-μm- pore-size Millex-HV filters by using confocal microscopy. The DARE procedure excluding (A) or including (B) the bacterial recovery step (Figure 13 [Figure 1], step 8) was executed. The filters were observed from the side facing the tube, and the positions of spores were measured from the surfaces of the filters. The numbers of spores in five FOVs for each 4 μm-deep stratum were calculated and are shown per surface unit. Asterisks indicate a <5 % probability of finding a bacterium at a particular depth interval.

100

4 Système modulaire de lyse ultrasonique pour l’extraction rapide d’acides nucléiques de spores de Bacillus et le transfert d’échantillons

Avant propos

Modular Ultrasonic Lysis System for Rapid Nucleic Acid Extraction and Sample Transfer of Bacillus Spores

AUTEURS

Matthias Geissler,‡a* Sandra Isabel,‡b Benoît Voisin,a Chantal Fauvel,b Maurice Boissinot,b Michel G. Bergeron,b* and Teodor Veresa, c a National Research Council of Canada, 75, boulevard de Mortagne, Boucherville, QC, J4B 6Y4, Canada. Phone: +1 450 641-5388; Fax: +1 450 641-5105; E-mail: [email protected] b Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre de recherche du CHUQ, 2705, boulevard Laurier, Québec, QC, G1V 4G2, Canada. Phone: +1 418 654- 2705; Fax: +1 418 654-2715; E-mail: [email protected] c INRS-EMT, Varennes, Qc, J3X 1S2, Canada ‡ These authors contributed equally to this work.

Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.

L‘étudiante a contribué à l‘élaboration du projet de recherche et du schéma expérimental et a réalisé une partie des expériences. Elle a conceptualisé et mis à l‘épreuve la méthode de transfert sécuritaire de l‘appareillage de la zone contaminée à la zone propre. L‘étudiante a étudié de concert avec Chantal Fauvel la fragmentation de l‘ADN par la sonication. Elle a de plus conçu les expériences de fragmentation des spores étudiées en microscopie confocale. L‘étudiante a écrit la première version du manuscrit et a procédé aux modifications suggérées par les coauteurs en collaboration avec Matthias Geissler.

102

Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.

Matthias Geissler a élaboré et supervisé le projet de recherche. Il a également participé aux expérimentations et à la rédaction de la première version du manuscrit, particulièrement la section au sujet du design du système de lyse.

Chantal Fauvel a réalisé une partie considérable des expériences présentées dans cet article et a prouvé l‘efficacité de l‘interface en acier inoxydable.

Benoît Voisin a réalisé le design du module fluidique de lyse et de la plateforme de sonication.

Maurice Boissinot, Michel G. Bergeron et Teodor Veres ont élaboré et supervisé le projet de recherche.

Précisions sur le statut de l’article.

L‘article au sujet de la lyse bactérienne rapide par sonication a été accepté pour publication dans le Journal of Bioterrorism and Biodefense le 10 novembre 2012.

Geissler, M.†, S. Isabel†, B. Voisin, C. Fauvel, M. Boissinot, M. G. Bergeron, and T. Veres. 2012. Modular Ultrasonic Lysis System for Rapid Nucleic Acid Extraction and Sample Transfer of Bacillus Spores. Journal of Bioterrorism and Biodefense 3:119. [En ligne: http://www.omicsonline.org/modular-ultrasonic-lysis-system- for-rapid-nucleic-acid-extraction-and-sample-transfer-of-bacillus-spores- 2157-2526.1000119.pdf] † : Ces auteurs ont contribué également au travail.

Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse comparativement à l’article publié originalement.

Le chapitre 4 de cette thèse inclut cet article et représente la version finale, telle que publiée originalement en anglais dans le Journal of Bioterrorism and Biodefense.

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4.1 Résumé

Cet article décrit le design, le fonctionnement et l‘utilisation d‘un système modulaire pour l‘extraction rapide d‘ADN de micro-organismes suite à l‘échantillonnage sur le terrain. L‘évaluation des extraits d‘ADN par la PCR a révélé que ce système peut briser les spores bactériennes de Bacillus atrophaeus, un simulant de Bacillus anthracis, en moins d‘une minute, procurant des rendements d‘ADN comparables à une méthode commercialisée performante d‘extraction d‘acides nucléiques. La simulation du transfert d‘une zone contaminée à une zone sécurisée a montré que l‘échantillon demeurait confiné à l‘intérieur du module alors que la surface extérieure peut être décontaminée par immersion dans une solution désinfectante.

104

4.2 Abstract

This paper describes the design, functioning and use of an ultrasonic modular system intended for rapid extraction and fragmentation of DNA from microbial organisms following sample collection in the field. PCR assessment of the DNA extracts revealed that the system can disrupt Bacillus atrophaeus spores, a simulant for Bacillus anthracis, in less than 1 min, providing a DNA yield equivalent to that of a commercial nucleic acid extraction method. Simulation of the transfer from a contaminated to a secure area confirmed that the sample remained confined within the module while the exterior surface can be decontaminated through immersion in a disinfectant solution.

Keywords

Bacillus spores; Sonication; Spore lysis; PCR; Sample transfer

Abbreviations

DARE: Dual-filter method for applied recovery of microbial particles from environmental and powdery samples FITC: Fluorescein isothiocyanate FULM: Fluidic ultrasonic lysis module

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4.3 Introduction

Bacillus anthracis is the causative agent of anthrax disease and was classified by the Centers for Disease Control and Prevention in the category A of high-priority biological agents (Rotz et al. 2002). B. anthracis forms dormant endospore structures (spores) to survive in harsh environments over long periods of time. It has been estimated that the release of 100 kg of aerosolized anthrax spores over a metropolitan area could cause between 130,000 and 3 million deaths in favorable environmental conditions (Inglesby et al. 1999). Hence the rapid detection of B. anthracis spores is crucial to public health or life stock management at a contaminated site.

Prior to the detection of biothreat agents, a number of steps involving sample collection, disinfection and transportation as well as concentration and purification of targeted analyte are typically required (Emanuel et al. 2008; Lim et al. 2005). These steps can complicate the detection process and render on-site testing cumbersome. Also, sensitive lysis and detection equiments are often incompatible with decontamination procedures that follow deployment in the field. For these reasons, first responders inspecting a potentially contaminated area are commonly performing risk assessment rather than in-depth analysis, and samples collected at the scene are preferably transferred to a secured environment equipped with biological safety cabinets for analysis and follow-up investigation (Emanuel et al. 2008; Wade et al. 2006). The work presented in this paper is responding to this task: we devised a fluidic ultrasonic lysis module (FULM) for collecting samples in the field and bringing them to a designated laboratory facility for further processing with a decontamination step in-between.

Sonication has found increasing attention in the development of portable, point-of- care instrumentation since it promotes the extraction of nucleic acids from bacterial spores or other microbial forms in a timely and technologically convenient fashion

106

(Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Chandler et al. 2001; Marentis et al. 2005; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). This technology exploits ultrasound waves (with frequencies typically ranging from ~20 kHz to the MHz regime) dissipating within a liquid medium. The exerted stress can disrupt cell envelopes, giving way for intracellular content to be released in the surrounding (mostly aqueous) buffer solution. Lysis performed in a closed and miniaturized system typically requires coupling of ultrasound waves into a liquid reservoir via a flexible interface. Such systems commonly employ polymer materials as the interface in conjunction with microparticles (e.g., glass beads) in the liquid phase to assist the lysis process (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). However, microbeads render the design of microfluidic systems more complex. A bench-top sonication instrument that circumvents the need of micobeads has been devised by Chandler et al. (2001) and Warner et al. (2009). In their set-up, acoustic energy is transmitted from a piezoelectric transducer to a water reservoir in which a tubular flow-through system is embedded that contains the sample. Marentis et al. (2005) have developed a fluidic device entailing a microfabricated piezoelectric sonicator. The authors have demonstrated that spores of Bacillus subtilis can be lysed efficiently using ultrasound without the need of microbeads, though the miniaturized format mainly suits microvolume analysis. In practice, suspicious powders harvested at a potentially contaminated site are often suspended in larger volumes, as presented for eight different DNA extraction methods that have been tested in this context (e.g., 350 μL–2 mL) (Rose et al. 2011). Herein, we describe an ultrasonic modular system using a stainless steel interface intended for rapid (<1 min) and efficient extraction and fragmentation of DNA from a 230 μL suspension of Bacillus spores to perform PCR analysis. We used spores of Bacillus atrophaeus subsp. globigii which is mostly inoffensive, yet produces spores similar to those of B. anthracis (Carrera et al. 2007), making it a suitable candidate for research and development of detection technologies.

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4.4 Materials and methods

4.4.1 Equipment design and function

The set-up comprises two principal components –; the FULM and a sonication platform – whose design and arrangement are depicted in Figure 15. The FULM constitutes a block (measuring 80 mm in length, 38 mm in height, and 51 as well as 59 mm in width at the top and bottom, respectively) that was custom-fabricated from transparent polymer resin (SLA 11122) using high-precision 3D stereolithography (Axis Prototypes, Saint-Léonard, QC). Internal supply channels (ranging from 0.5 to 1.0 mm in diameter) connect the lysis chamber with macroscopic access points located at the periphery of the FULM. Sample inlet and pressure port are equipped with a check valve connector (Qosina, Edgewood, NY) for receiving a luer lock tip syringe. The vent and sample outlet both entail luer lock connectors adapted for mounting a filter unit. We used a 17-mm-diameter, 0.2-μm- pore-size PTFE filter unit (Qosina) and a 13-mm-diameter, 0.22-μm-pore-size Millex-GV filter unit (Millipore, Billerica, MA) for vent and sample outlet, respectively. The exit of the filter unit was enclosed by a cap to seal the interior of the FULM. The FULM contains a circular lysis chamber which is enclosed by an interface punched out of 0.001˝ stainless steel shim stock (corresponding to 25.4 μm in thickness, Daemar Canada, Dorval, QC). The interface is held in place by an O-ring and a designated locking device fastened to the FULM using four screws. The locking device provides a vertical through-hole (15 mm in diameter) so that the interface can be accessed from below by a sonicator probe.

The sonication platform entails a commercial ultrasound generator (Sonics & Materials, Newtown, CT) and a titanium alloy probe (13 mm in diameter, Sonics & Materials) fixed inside a free-standing socket. The interior of the socket, custom- fabricated from aluminum parts, is surrounded with a vibration dampening material (foam) to reduce noise during sonication. The tip of the sonicator probe extends

108

vertically from the docking station located at the top of the socket destined to accommodate the FULM. Two flexible clamps (SLA 11122) are placed on opposite sides of the docking station to interlock with the FULM upon its placement, preserving contact between the sonicator probe and the stainless steel interface for the duration of the lysis process. An external power supply (Vibra-Cell ultrasonic processor, Sonics & Materials) was used as a control unit to regulate the sonication process.

4.4.2 Preparation of spores

Spores of B. atrophaeus subsp. globigii strain CCRI-9827 (Collection du Centre de recherche en infectiologie, Québec, QC http://www.wfcc.info) were prepared according to published procedures (Picard et al. 2009) and diluted in 1X phosphate-buffered saline (PBS, 137 mM NaCl, 6.4 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 0.88 mM KH2PO4, pH=7.4, Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON). Fluorescence labelling was performed by incubating spores with fluorescein isothiocyanate (FITC) as described previously (Geissler et al. 2011).

4.4.3 DNA extraction

For DNA extraction, 230 μL of suspension of B. atrophaeus CCRI-9827 (3.0×105 spores mL-1 in PBS) were injected into the FULM using a 1-mL syringe. Lysis experiments were performed at a frequency of 20 kHz and 30 μm amplitude using variable exposure times to optimize the yield of extracted nucleic acids (Figure 16). The BD GeneOhmTM Lysis Kit (BD Diagnostics, Quebec, QC) was used according to the recommendations provided by the supplier, serving as a DNA extraction reference method for each series of experiments. Specifically, 100 μL of the diluted spore suspension were transferred into a designated lysis tube followed by agitation on a Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, NY) at the maximum adjustable speed for a period of 5 min. For comparison and conservation purposes,

109 all DNA extracts were heated immediately at 95°C for 2 min as recommended by the supplier of the BD GeneOhmTM Lysis Kit (BD Diagnostics 2009). Highly purified genomic DNA serving as a PCR reference sample was prepared from mid- log-phase cells of B. atrophaeus strain CCRI-9827 and B. subtilis ATCC 15841 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) using MagneSil KF isolation kit (Promega, Madison, WI) on a KingFisher ML instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

4.4.4 Analysis of DNA extracts

Real-time PCR assays to amplify a 212-bp fragment of the atpD gene of B. atrophaeus were performed using primers (ABgl158 and ABgl345a) along with a

TaqMan probe (ABgl-T1-B1) as disclosed in previous work (Picard et al. 2009). PCR reactions were performed with 25-μL mixtures each of which contained 5 μL of the lysate using conditions (Isabel et al. 2012) and a standard curve of purified

DNA (Geissler et al. 2011) that are described elsewhere. Negative controls containing no DNA template were included in each series of PCR analysis. For all purified spore preparations that were used, non-lysed spores were tested as control samples. ANOVA statistical analysis of PCR data was performed using JMP statistical software from SAS (Cary, NC).

4.4.5 DNA fragmentation

To study the degree of DNA fragmentation, 230 μL of a solution containing 15 ng μL-1 purified genomic DNA of B. subtilis ATCC 15841 was sonicated using the FULM for the duration that provided the highest DNA yield (i.e., 2×15 s). Analyte solutions (20 μL) were subjected to gel electrophoresis using 0.8% agarose with 0.25 μg mL-1 of ethidium bromide in Tris-borate-EDTA buffer (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA). A 1X DNA mass ladder and a 1-kb DNA ladder

110

(Invitrogen, Carlsbad, CA) were used for quantification and estimation of DNA fragment lengths, respectively.

4.4.6 Fluorescence imaging

Fluorescence imaging was done using an Olympus FV300 confocal laser scanning microscope (Olympus Canada, Markham, ON) equipped with an argon-ion laser for excitation at 488 nm. Suspensions of treated (sonication using the FULM for 2×15 s) and untreated spores were diluted 1:1 (v/v) with a warm solution of 1% agarose (VWR International, West Chester, PA) in 1X PBS and sandwiched between a glass microscope slide and a cover slip prior to inspection (Geissler et al. 2011).

4.4.7 Decontamination of the FULM

Following sample injection, the FULM was closed and immersed in a 0.5% solution of sodium hypochlorite for variable periods of time (i.e., twice for 5, 15 and 60 min) to evaluate any possible effect on PCR detection. Upon removal from the bath, the FULM was rinsed twice with sterile water and dried using cotton gauze before proceeding with the lysis and PCR experiments as described above. In addition, 230 μL of a more concentrated suspension of B. atrophaeus (0.5 McFarland, ~1×107 spores mL-1) were injected in the FULM using a 1-mL syringe. Once closed, the module was immersed in 0.5% sodium hypochlorite solution for 5 min with gentle agitation, followed by rinsing with sterile water and drying with sterile cotton gauze. To evaluate the presence of viable spores on the exterior of the FULM, we swabbed five selected sites of the FULM - stainless steel interface, sample inlet, sample outlet, pressure port, and vent - before and after the decontamination process, as well as after subsequent sonication. The collected samples were immediately inoculated on brain heart infusion agar and incubated

111 overnight at 37°C under aerobic conditions to monitor the number of colony- forming units (CFU).

4.4.8 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders

In the simulated contaminated area, 20 mg of bentonite (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) were suspended in 1 mL PBS containing 3.0×105 spores mL-1. Recovery of clean bacterial spores from these powdery samples (DARE procedure) was performed twice as described previously (Isabel et al. 2012). The FULM was decontaminated in 0.5% sodium hypochlorite solution for 5 min and then transferred to a simulated secure area where lysis (using the FULM and BD GeneOhmTM Lysis Kit) and PCR experiments were performed as described above.

112

4.5 Results

4.5.1 FULM operation and volume handling

The handy size of the FULM is intended to facilitate transport and manipulation by first responders wearing bulky rubber gloves as part of their protective gear. The assembled module shown in Figure 15b requires only few manual steps including injection of a bacterial spore sample, sonication, and recovery of the lysate. The sample (230 μL) is inserted to completely fill the lysis chamber with a 1-mL syringe at the injection port with the vent in the open position, as illustrated in Figure 15c. During this step, the pressure port and the outlet are closed. The opposite arrangement of incoming and outgoing supply channels facilitates displacement of air and promotes uniform filling of the lysis chamber. The shallow reservoir (1.5 mm in depth over 14 mm in diameter) thereby helps distribute the sample evenly in the acoustic field (without the need for microbeads). Recovery of the sample is performed by aspirating the lysate through the 0.22-μm-pore-size Millex-GV filter unit at the sample outlet using a 1-mL syringe while injection port and vent both remain closed. The recovery process can be assisted by pushing air into the system using a syringe at the pressure port. Volumes of recovered lysates were typically 175–185 μL without filtration and 90–125 μL with filtration. Hence, the dead volumes were estimated to be 55–45 μL in the FULM and 50–95 μL in the Millex-GV filter.

4.5.2 DNA extraction and fragmentation

We studied the effect of sonication time on the yield of amplifiable DNA (Figure 16) compared to a high-yield-providing, benchmark DNA extraction process (BD GeneOhmTM Lysis Kit). Negative controls without added DNA template as well as non-lysed spores, used as another control, did not produce positive PCR signals. Continuous sonication ranging from 20 s to 2 min (i.e., 1×20 to 1×120 s) resulted in

113 moderate amounts of DNA, yielding 71.4 ± 13.9% at best when the sample was treated for 40 s consecutively. Interestingly, the DNA yield increased to 93.7 ± 20.0% when the sample was sonicated twice for 20 s with a 20-s interruption in between (i.e., 2×20 s). Two intermittent sonication steps of 15 s each with 15 s interruption time (i.e., 2×15 s) turned out to be the most productive condition, providing a relative DNA yield of 103.1 ± 16.5%, on average, which is comparable to that of the BD GeneOhmTM Lysis Kit. Statistical analysis of PCR average cycle thresholds (Ct) revealed no significant difference between results for DNA extracts obtained from sonication for 2×15 s (Ct=30.37 ± 1.09) and BD GeneOhmTM Lysis Kit (Ct=30.52 ± 1.24). Since ultrasounds are known to fragment DNA, longer lysis durations may lead to higher fragmentation of genomic material (Larguinho et al. 2010) which, in turn, may contribute to the overall decrease in the concentration of nucleic acids detected by PCR. Independent tests performed with purified nucleic acids revealed that 95% of the DNA strands were fragmented during sonication for 2×15 s using the FULM. The size range of the DNA fragments was estimated between 400 and 5,000 bp.

4.5.3 Imaging of disrupted spores

We performed confocal microscopy to visualize FITC-labeled spores in 3D and monitor possible changes in cell morphology as a result of the lysis process. Prior to sonication, non-lysed spores are elliptical in shape, measuring 1.2–1.8 μm in length and 0.9–1.0 μm in width as described previously (Geissler et al. 2011). In comparison, 21 fluorescent objects observed after sonication for 2×15 s were classified as such: 3 (14%) half spores, 4 (19%) spores broken in halves, 6 (29%) small spore fragments and 8 (38%) spores with intact shape. A section entailing an example of each specimen within relatively close proximity is shown in Figure 17.

114

4.5.4 Decontamination of the FULM

We tested decontamination of the FULM to simulate the transfer from a contaminated site to a secure area equipped with a biological safety cabinet containing the sonication platform and other detection equipment. We relied on immersion in a solution of sodium hypochlorite, which is known to be efficient against bacterial spores and hence is used for on-site decontamination (Emanuel et al. 2008). Six immersion tests were performed to evaluate whether or not the interior of the FULM could be effectively protected from the disinfectant. The presence of sodium hypochlorite in the lysate, even at relatively low concentration, following penetration into the FULM is expected to interfere with subsequent DNA amplification and detection. Statistical analysis of PCR Ct revealed no significant difference between DNA extracts at each immersion time (Ct 5 min=30.45 ± 0.26, Ct 15 min=30.56 ± 0.23, Ct 60 min=30.36 ± 0.23), indicating that the interior of the FULM remained effectively sealed.

We further evaluated the efficiency of the decontamination procedure by testing viability of bacterial spores recovered from the surface of the FULM. Prior to immersion of the FULM in the hypochlorite bath, we recovered a significant amount of viable spores at the sample inlet (i.e., up to a maximum of ~300, and ~200 CFU on average). In contrast, the quantity of viable spores was negligible after decontamination had been completed: we found 1 CFU (max. 3 CFU) at the sample inlet as a statistical average deriving from four independent tests. After sonication for 2×15 s, an average of 0.5 CFU (max. 1 CFU) was recovered at the sample inlet, while no CFU was recovered from all other sites that had been swabbed. Agitation of the FULM during immersion seemed necessary to remove air bubbles being trapped in small-scale cavities (e.g., at the locking device or between connected units) which otherwise would prevent access of the disinfectant to these restrained sections of the module.

115

Dauphin and Bowen (Dauphin et Bowen 2009) have used filtration to remove viable spores of B. anthracis from lysates and preserve DNA extracts. We validated this possibility by collecting five different lysates from the FULM through Millex-GV filter units (0.22 μm pore size). Filtration indeed removed all viable spores from lysates as confirmed by microbial culture assays. Statistical analysis of PCR Ct performed with five replicates further revealed no significant difference between results for filtered (Ct=31.72 ± 0.31) and non-filtered (Ct=31.73 ± 0.44) lysates, suggesting no (or minimal) loss of DNA during filtration.

4.5.5 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders

We simulated a complete on-site Bacillus detection procedure using 3×105 B. atrophaeus spores and ~20 mg of bentonite. This powder has been reported as a potential additive in powdery bioweapons (Shoham et Jacobsen 2007) while interfering with PCR detection of nucleic acids in lysates without sample preparation (Isabel et al. 2012). We previously developed a protocol termed dual- filter method for applied recovery of microbial particles from environmental and powdery samples (DARE) (Isabel et al. 2012). This sample preparation method allowed for rapid separation of bacteria from 23 different matrices using syringes and filter units. Using this method, bentonite resulted in the lowest spore recovery (i.e., 16%), hence we used it as a paradigm for detection simulation. Harvesting using swab and processing of the powder sample (<2 min) was performed twice using the DARE procedure. The cleaned spores deriving from this process were immediately injected into the FULM for spore lysis and DNA extraction (2×15 s). PCR analysis of the lysates clearly confirmed the presence of DNA from B. atrophaeus (data not shown), emphasizing the ability to recover cleaned microbial nucleic acids within 3 min.

116

4.6 Discussion

4.6.1 Performance of FULM for spore lysis and DNA extraction

Our ultrasonic lysis system provided DNA yield extracted from B. atrophaeus comparable to that of the BD GeneOhmTM Lysis Kit within a lysis time of 45 s (i.e., 2×15 s of sonication with 15-s interruption) (Figure 16). The BD GeneOhmTM Lysis Kit served as a benchmark process since it effectively promotes lysis (with 98.8% yield or more) of several microbial species, including B. anthracis and B. subtilis spores as determined by PCR amplification of genomic DNA in lysates (Ménard et Picard 2003; Picard et al. 2009). Moreover, this kit has been shown to provide the highest yield of DNA from Mycobacterium tuberculosis with respect to five other relatively fast nucleic acid extraction methods (Aldous et al. 2005). Our ultrasonic system produced DNA extracts with concentrations comparable to those obtained with a validated commercial DNA extraction method in one fifth of the time. In addition, the yield is higher than that of a previous bead-based mechanical lysis performed on a chip under optimized conditions (Geissler et al. 2011).

Furthermore, structural damage to sonicated spores (Figure 17) contrasts with our previous study that showed only subtle spore modifications after bead-based mechanical lysis using the same microscopic methodology (Geissler et al. 2011). These findings also support the capacity of the system to efficiently disrupt bacterial spores, making it possible to rapidly extract genomic DNA with high yield.

4.6.2 Effect of the stainless steel interface

We equipped the module presented herein with a thin, metallic interface as opposed to preceding sonication systems which primarily employed flexible, polymer-based membranes. Stainless steel provided a plausible choice for a number of reasons. Unlike carbon steel or brass which were both tested in the course of this study (data not shown), stainless steel does not corrode when

117 coming in contact with aqueous buffer solutions prior to or during sonication. Chemical stability is important as metal ions or particles contaminating the lysate could interfere with PCR amplification and detection of extracted nucleic acids

(Alaeddini 2012; Primorac 2004). In addition, stainless steel can effectively promote propagation and transfer of acoustic energy. The energy flux E can generally be described as E=4π2f2ZA2T where f is the frequency, Z is the acoustic impedance, A is the amplitude of vibration, and T is the transmission coefficient of the interface. Due to its high acoustic impedance (e.g., Z=45.7×106 kg s-1 m-2 as a standard value) stainless steel can outperform a soft polymer compound such as polypropylene (e.g., Z=2.4×106 kg s-1 m-2) despite the fact that T is comparatively small for a stainless steel/water interface as a result of their impedance mismatch. Stainless steel further is preferable when considering the cost of other high- impedance materials such tungsten, iridium or gold. The lysis experiments performed in the course of this work suggest that a thickness of 0.001˝ (25.4 μm) constitutes one (though not the only) possible compromise in the trade-off between flexibility and robustness. When thin enough, the stainless steel interface can adapt to the shape of the sonicator probe which is important for effective transfer of the acoustic energy. On the other hand, an increased ability to conform renders the interface fragile which can constrain reliable and safe operation. For example, a stainless steel interface with a reduced thickness of 0.0005˝ (12.7 μm) seems impractical for it ruptures more easily, especially when performing lysis experiments in a sequential fashion. An increased thickness of 0.003˝ (76.2 μm), on the other hand, provides excellent stability during sonication, yet its higher rigidity hampers smooth adaptation of the interface to the sonicator probe. In our preliminary experiments, we evaluated a number of polymer-based interfaces and obtained decent DNA yields (data not shown). However, the yield improved noticeably when we exchanged the polymer by a stainless steel interface. Preceding work suggests the use of a polymer interface may need to be accompanied by the presence of microbeads in the suspension to enhance lysis of

118

Bacillus spores and increase DNA yields (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). We believe that the absence of beads is generally preferable for it helps maintain simplicity in the layout and assembly of microfluidic units.

4.6.3 DNA fragmentation

A certain level of DNA fragmentation can be useful for downstream molecular detection (Larguinho et al. 2010). Using control experiments with purified nucleic acids, we estimated that 95% of DNA was fragmented during sonication. The size range of the DNA fragments was approximatly between 400 and 5,000 bp and compares well to those achieved by Warner et al. (Warner et al. 2009) (i.e., 100–

600 bp) for subsequent PCR amplification and detection. By contrast, Warner et al. (Warner et al. 2009) evaluated DNA yields using a relativly short PCR amplicon (e.g., 66 bp). Short DNA fragments can limit the possibility to detect longer PCR amplicons. For example, reports on the PCR detection of B. anthracis rely on amplicon sizes between 91 and 596 bp (Ellerbrok et al. 2002; Kim et al. 2005; Ryu et al. 2003; Yang et al. 2012). We evaluated the yield of our DNA extracts with a 212-bp PCR amplicon, hence the DNA size range obtained by sonication using the FULM provides a relatively high flexibility for subsequent PCR assay selection.

4.6.4 Simulation of field testing

A number of requirements need to be taken into account when designing and evaluating an instrument for the detection of biothreat agents in the field. As emphasized by Lim et al. (2005), an ideal detection platform should be able to detect biothreat agents from different environmental matrices (e.g., powder, liquid, or food) while providing portability, user-friendliness and resistance to unfavorable conditions in the field (e.g., shock, temperature, and decontamination, among others) (Lim et al. 2005). We simulated the detection of B. atrophaeus spores from

119 suspect powder under the constraints of a laboratory setting devided into a contaminated site and a secure area. The primary objectives were to evaluate the performance of our procedure when using powdery samples and identify any possible safety issues. Our findings suggest that the module can indeed be used to transfer a pathogenic sample for further processing in a biological safety cabinet respecting recommended packing and transportation protocols for hazardous materials, such as a triple-layer system (Emanuel et al. 2008). Nevertheless, the instrumental setting may need further improvement to facilitate handling. For example, it should be desirable to streamline the exterior design of the FULM and reduce the number of sites where air bubbles can be trapped to facilitate its decontamination. Modification of the docking mechanism is likely to improve robustness of the system and prevent interface fracture. Likewise, automation of sample injection, adjustment of the sonication probe to the interface and recovery of the lysate would shorten process times, and increase user-friendliness and safety. Finally, miniaturization of the sonication platform would facilitate its integration into a portable total-analysis system.

We further used the prototype instrument in complementation to a recently developed protocol for fast (<2 min) separation of bacterial spores from suspicious powder samples using two filtration steps (DARE) (Isabel et al. 2012). Combined, these methodologies allowed for detecting B. atrophaeus processed with 20 mg of bentonite as a potential aerosolizing additive (Shoham et Jacobsen 2007). This important aspect had not been covered previously for the development of a sonication platform to detect B. anthacis spores (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Marentis et al. 2005; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). Our analyte preparation from suspect powders (DARE and FULM) could potentially facilitate on-site detection of B. anthracis and other pathogenic species. While a combination of the two methods is in itself an appealing possibility, integration in a single biothreat detection device would reveal their full potential to facilitate sample preparation in a field setting.

120

4.7 Conclusions

Time, efficiency and safety are crucial parameters while testing for infectious agents, especially in the event of a bioterrorist attack. The concept presented in this work is responding to this challenge. First, an ultrasonic lysis modular system allows for rapid (<1 min) extraction of nucleic acids from bacterial spores, while providing yields that are equivalent to those obtained using a commercial DNA extraction method over a 5-min period. This performance is remarkable and qualifies the tool as one of the fastest and most efficient spore lysis systems currently available. The implementation of a stainless steel interface was a key factor in this context, marking a distinction in design with respect to other sonication systems that typically rely on a polymer membrane as the interface. Second, the need for safe portability was equally included in the design of the tool described herein. The interior of the module can be sealed, thus preventing aerosol production and propagation, while the exterior surface can be decontaminated without inducing any adverse effect on the tightness of the FULM and the integrity of the collected sample inside. The FULM, less expensive and more resistant, could be used in the field and be decontaminated, while the sonication platform, containing more expensive and sensitive electromechanical parts, could stay in a secure area.

121

4.8 Acknowledgment

This work was supported in part by Defence Research and Development Canada, Centre for Security Science, Chemical, Biological, Radiological/ Nuclear, and Explosives Research and Technology Initiative (CRTI) under the program Portable Biological Agent Detection System (06-0187TD). Fluorescence micrographs were acquired through the Bioimaging facility at CRI. We thank our colleagues Jean-Guy Allard (NRC), Liviu Clime (NRC), Karel Boissinot (CRI), Sébastien Chapdelaine (CRI), Isabelle Charlebois (CRI), Gale Stewart (CRI), Julie- Christine Lévesque (CRI) and Manon Tétreault for useful discussion and technical assistance. Ian Summerell and the first responder team of the Royal Canadian Mounted Police (Orleans, ON) are acknowledged for conceptual input to this work.

122

4.9 References

Alaeddini, R. 2012. Forensic implications of PCR inhibition--A review. Forensic science international. Genetics 6(3): 297-305. Aldous, W.K., J.I. Pounder, J.L. Cloud et G.L. Woods. 2005. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR. Journal of clinical microbiology 43(5): 2471-2473. BD Diagnostics. 2009. Trousse de lyse BD GeneOhm. DOPS04-07-V1M2. Belgrader, P., D. Hansford, G.T. Kovacs, K. Venkateswaran, R. Mariella, Jr., F. Milanovich, S. Nasarabadi, M. Okuzumi, F. Pourahmadi et M.A. Northrup. 1999. A minisonicator to rapidly disrupt bacterial spores for DNA analysis. Analytical chemistry 71(19): 4232-4236. Belgrader, P., M. Okuzumi, F. Pourahmadi, D.A. Borkholder et M.A. Northrup. 2000. A microfluidic cartridge to prepare spores for PCR analysis. Biosensors & bioelectronics 14(10-11): 849-852. Carrera, M., R.O. Zandomeni, J. Fitzgibbon et J.L. Sagripanti. 2007. Difference between the spore sizes of Bacillus anthracis and other Bacillus species. Journal of applied microbiology 102(2): 303-312. Chandler, D.P., J. Brown, C.J. Bruckner-Lea, L. Olson, G.J. Posakony, J.R. Stults, N.B. Valentine et L.J. Bond. 2001. Continuous spore disruption using radially focused, high- frequency ultrasound. Analytical chemistry 73(15): 3784-3789. Dauphin, L.A. et M.D. Bowen. 2009. A simple method for the rapid removal of Bacillus anthracis spores from DNA preparations. Journal of microbiological methods 76(2): 212-214. Ellerbrok, H., H. Nattermann, M. Özel, L. Beutin, B. Appel et G. Pauli. 2002. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS microbiology letters 214(1): 51-59. Emanuel, P., J.W. Roos et K. Niyogi. 2008. Sampling for biological agents in the environment. ASM Press, Washington DC. 294 p. Geissler, M., J.A. Beauregard, I. Charlebois, S. Isabel, F. Normandin, B. Voisin, M. Boissinot, M.G. Bergeron et T. Veres. 2011. Extraction of nucleic acids from bacterial spores using bead-based mechanical lysis on a plastic chip. Engineering in Life Sciences 11(2): 174-181. Inglesby, T.V., D.A. Henderson, J.G. Bartlett, M.S. Ascher, E. Eitzen, A.M. Friedlander, J. Hauer, J. McDade, M.T. Osterholm, T. O'Toole, G. Parker, T.M. Perl, P.K. Russell et K. Tonat. 1999. Anthrax as a biological weapon: medical and public health management. Working Group on Civilian Biodefense. JAMA : the journal of the American Medical Association 281(18): 1735-1745. Isabel, S., M. Boissinot, I. Charlebois, C.M. Fauvel, L.E. Shi, J.C. Levesque, A.T. Paquin, M. Bastien, G. Stewart, E. Leblanc, S. Sato et M.G. Bergeron. 2012. Rapid filtration separation-based sample preparation method for Bacillus spores in powdery and environmental matrices. Applied and environmental microbiology 78(5): 1505-1512. Kim, K., J. Seo, K. Wheeler, C. Park, D. Kim, S. Park, W. Kim, S.-I. Chung et T. Leighton. 2005. Rapid genotypic detection of Bacillus anthracis and the Bacillus cereus group by multiplex real-time PCR melting curve analysis. FEMS immunology and medical microbiology 43(2): 301-310. Larguinho, M., H.M. Santos, G. Doria, H. Scholz, P.V. Baptista et J.L. Capelo. 2010. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta 81(3): 881-886.

123

Lim, D.V., J.M. Simpson, E.A. Kearns et M.F. Kramer. 2005. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clinical microbiology reviews 18(4): 583-607. Marentis, T.C., B. Kusler, G.G. Yaralioglu, S. Liu, E.O. Haeggstrom et B.T. Khuri-Yakub. 2005. Microfluidic sonicator for real-time disruption of eukaryotic cells and bacterial spores for DNA analysis. Ultrasound in medicine & biology 31(9): 1265-1277 Ménard, C. et F.J. Picard. 2003. Procédé universel et composition pour la lyse rapide de cellules pernettant la libération d'acides nucléiques et leur détection. WO/2003/008636. Picard, F.J., M. Gagnon, M.R. Bernier, N.J. Parham, M. Bastien, M. Boissinot, R. Peytavi et M.G. Bergeron. 2009. Internal control for nucleic acid testing based on the use of purified Bacillus atrophaeus subsp. globigii spores. Journal of clinical microbiology 47(3): 751-757. Primorac, D. 2004. The role of DNA technology in identification of skeletal remains discovered in mass graves. Forensic science international 146 Suppl: S63-64. Rose, H.L., C.A. Dewey, M.S. Ely, S.L. Willoughby, T.M. Parsons, V. Cox, P.M. Spencer et S.A. Weller. 2011. Comparison of eight methods for the extraction of Bacillus atrophaeus spore DNA from eleven common interferents and a common swab. PloS one 6(7): e22668. Rotz, L.D., A.S. Khan, S.R. Lillibridge, S.M. Ostroff et J.M. Hughes. 2002. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerging infectious diseases 8(2): 225- 230. Ryu, C., K. Lee, C. Yoo, W.K. Seong et H.B. Oh. 2003. Sensitive and rapid quantitative detection of anthrax spores isolated from soil samples by real-time PCR. Microbiology and immunology 47(10): 693-699. Shoham, D. et S.M. Jacobsen. 2007. Technical intelligence in retrospect: the 2001 anthrax letters powder. International Journal of Intelligence and Counter Intelligence 20(1): 79-105. Taylor, M.T., P. Belgrader, B.J. Furman, F. Pourahmadi, G.T. Kovacs et M.A. Northrup. 2001. Lysing bacterial spores by sonication through a flexible interface in a microfluidic system. Analytical chemistry 73(3): 492-496. Wade, M.M., M.S. Campbell, K. Niyogi, J.E. Rogers, J. Coughlin, B. Coursey et P.A. Emanuel. 2006. Evaluation of an inexpensive field test for ruling out the presence of biological threat agents in suspicious powders. ECBC-TR-459. Warner, C.L., C.J. Bruckner-Lea, J.W. Grate, T. Straub, G.J. Posakony, N. Valentine, R. Ozanich, L.J. Bond, M.M. Matzke et B. Dockendorff. 2009. A Flow-Through Ultrasonic Lysis Module for the Disruption of Bacterial Spores. Journal of the Association for Laboratory Automation 14(5): 277-284. Yang, Y., J. Wang, H. Wen et H. Liu. 2012. Comparison of two suspension arrays for simultaneous detection of five biothreat bacterial in powder samples. Journal of biomedicine & biotechnology 2012(831052): 2012:831052.

124

4.10 Figures

(a) 5 4 1 6 3

7 2

8

9 10

11

12 17 13 16

14 15

(b)

(c) Air in

Air Sample out in Lysate out

Figure 15. Design and configuration of the FULM. a) Schematic of the different components and their arrangement: (1) FULM; (2) lysis chamber; (3) sample inlet with connector; (4) pressure port with connector; (5) vent with connector; (6) syringe filter unit; (7) sample outlet with connector; (8) syringe filter unit; (9) stainless steel interface; (10) O-ring; (11) locking device; (12) screw; (13) sonication platform; (14) docking station; (15) sonicator probe; and (16, 17) clamping units. b) Photograph of the FULM upon assembly. Scale bar: 1 cm. c) Sketch of the lysis chamber (top view) along with the operational principles of sample injection and recovery.

125

120

100

80 (%) rel

rel 60 [DNA]

[DNA] [DNA] (%) 40

20 = 6 = 3 = 2 = 3 = 3 = 3 = 3 = 3 = 3 = 11 n n n n n n n n n n 0

1 x 20 1 x 40 2 x 10 2 x 15 2 x 20 2 x 40 2 x 60 3 x 40 4 x 30 1 x 120 Time of %sonication (?X) (s)

Figure 16. Effect of sonication time on the concentration of genomic DNA extracted from spores of B. atrophaeus. Effect of sonication time on the concentration of genomic DNA extracted from spores of B. atrophaeus. Each experiment was performed with 230 μL of a purified suspension containing 3.0 × 105 spores mL-1 in PBS. Sonication was performed in continuous (1 × 20 to 1 × 120 s) or intermittent fashion (2 × 10 to 4 × 30 s). For intermittent exposure, sonication and interruption periods were equivalent in time length. The amplitude of the sonicator probe was maintained at 30 μm. DNA concentrations were evaluated using real-time PCR and are shown relative to the average yield obtained with the BD GeneOhmTM Lysis Kit. The number of replicates (n) for bacterial lysis is indicated for each condition on the bar chart. Error bars represent standard deviations.

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4 2 3

1 1 µm

Figure 17. Confocal microscopy image revealing the damage inferred to FITC-labeled spores of B. atrophaeus upon exposure to ultrasound for 2 × 15 s. Confocal microscopy image revealing the damage inferred to FITC-labeled spores of B. atrophaeus upon exposure to ultrasound for 2 × 15 s. The typical morphological pattern obtained under these conditions includes (1) half spore, (2) spore broken in halves, (3) spore fragment, and (4) spore with intact shape. To facilitate observation, the sample was immobilized in 0.5% agarose gel.

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5 Développement d’un essai sur puce à ADN en microfluidique pour la détection et l’identification de 12 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme

Avant propos

Rapid Microarray-Microfluidic Screening for Twelve Airborne Bacterial Biothreat Agents

COURT TITRE

Screening for biothreat agents

AUTEURS

Sandra Isabel, Maurice Boissinot, Éric Leblanc, Eric A. Martel, Dominique K. Boudreau, Vasudha Srivastava, Marie-Jeanne Fiola, Laurie D. Girard, Marilyse Vallée, Émilie Fiola- Masson, Martine Bastien, Richard Giroux, François J. Picard, Gale Stewart, Ann Huletsky, Régis Peytavi, and Michel G. Bergeron†

1. Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre hospitalier universitaire de Québec, Pavillon CHUL, Québec, Québec, Canada.

† Corresponding author. Mailing address: Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre de recherche du CHUQ, 2705 Laurier Blvd., Québec City, Québec, Canada G1V 4G2. Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2715. E-mail: [email protected].

CONTRIBUTION DES AUTEURS

Conceived and designed the experiments: SI, EL, MBoissinot, FJP, MGB, VS, RP, AH. Performed the experiments: SI, MJF, VS, LG, MLV, EFM. Analyzed the data: SI, EAM, DKB, LG, MLV, GS. Contributed for reagents and materials: MJF, MBastien. Wrote the manuscript: SI, MBoissinot, EAM.

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Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.

L‘étudiante a dirigé le projet et contribué considérablement à l‘élaboration du projet de recherche et du schéma expérimental. Elle a effectué la majorité du design de l‘essai moléculaire et a réalisé la majorité des expériences. L‘étudiante a écrit la première version du manuscrit et a procédé aux modifications suggérées des coauteurs.

Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.

Éric Leblanc, Maurice Boissinot, Régis Peytavi, Michel G. Bergeron, Ann Huletsky, François J. Picard et Gale Stewart ont participé à l‘élaboration du schéma expérimental. Régis Peytavi a apporté son expertise en microfluidique pour le développement de la plateforme et de l‘essai. Maurice Boissinot a révisé et commenté le manuscrit.

Marie-Jeanne Fiola, Marilyse Vallée, Émilie Fiola-Masson, Laurie Girard et Vasudha Srivastava ont réalisé une partie des expériences présentées dans cet article. Vashuda Srivastava et Richard Giroux ont contribué au design de quelques sondes de détection.

Dominique K. Boudreau et Éric A. Martel ont contribué à l‘élaboration d‘outils informatiques pour le design des sondes de capture et l‘analyse des données de biopuces. Gale Stewart a de plus contribué aux analyses statistiques.

Martine Bastien a trouvé des solutions techniques afin de diminuer les niveaux basaux de contamination par des acides nucléiques bactériens lors de la réalisation de la PCR à large spectre.

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Précisions sur le statut de l’article.

L‘article au sujet des biopuces de détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme sera soumis prochainement au journal PLOS ONE.

Isabel S., M. Boissinot, É. Leblanc, E. A. Martel, D. K. Boudreau, V. Srivastava, M. J. Fiola, L. D. Girard, M. Vallée, É. Fiola-Masson, M. Bastien, R. Giroux, F. J. Picard, G. Stewart, A. Huletsky, R. Peytavi, and M. G. Bergeron. Rapid Microarray Microfluidic Screening for Twelve Airborne Bacterial Biothreat Agents.

Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse comparativement à l’article publié originalement.

Le chapitre 5 de cette thèse inclut cet article et représente une version en préparation pour soumission.

131

5.1 Résumé

Le grand nombre d‘agents biologiques aéroportés pouvant potentiellement être utilisés comme armes met en évidence le besoin de développer des outils moléculaires performants pour en détecter plusieurs simultanément. Dans cette étude, nous décrivons un système de puces à ADN en microfluidique pour cribler 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme inclus dans les catégories A, B et C de la liste des CDC (A: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum groupes I et II, Francisella tularensis et Yersinia pestis, B: Brucella spp., Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydophila psittaci, Clostridium perfringens, Coxiella burnetii et Rickettsia prowazekii et C: Mycobacterium tuberculosis complex). Pour procéder à une amplification à large spectre biaisée du gène tuf dans un tube (55 minutes) suivi d‘une procédure d‘hybridation sur puce à ADN en microfluidique (15 minutes), 16 amorces et 36 courtes (20 nucleotides) sondes de capture spécifiques ont été conceptualisées. Une approche automatisée d‘analyse de données a été développée et un seuil de positivité a été établi pour chaque sonde selon l‘analyse de courbes ROC. Notre PCR multiplexe combiné à notre système de puce ADN en microfluidique ainsi qu‘à notre approche d‘analyse a permis de passer au crible et de détecter de façon sensible 12 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme : 102 copies de génomes, sauf pour R. prowazekii (104 copies de génomes). Le logiciel développé à l‘interne, Crosshyb, a été utilisé pour prédire in silico la spécificité théorique des sondes de capture face à d‘autres espèces (1771 souches procaryotes). La spécificité analytique des sondes de capture a été montrée in vitro contre un panel de 40 autres espèces représentant d‘autres agents biologiques, des espèces rapprochées phylogénétiquement et d‘autres pathogènes aéroportés. Nous avons développé un essai complet couvrant les 12 pathogènes bactériens aéroportés associés au bioterrorisme pour leur détection rapide (75 minutes).

132

5.2 Abstract

The great number of airborne biological agents that could potentially be used as weapons emphasizes the need to develop screening technologies for their efficient simultaneous detection. In this study, we describe a DNA microarray microfluidic system to screen for and detect 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents included in the CDC categories A, B, and C (A: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum groups I and II, Francisella tularensis, and Yersinia pestis, B: Brucella spp., Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydophila psittaci, Clostridium perfringens, Coxiella burnetii, and Rickettsia prowazekii, and C: Mycobacterium tuberculosis complex). Sixteen primers and 36 specific capture probes were designed to perform a biased-broad-spectrum amplification of the tuf gene in one tube (55 min) followed by a rapid microfluidic microarray hybridization procedure (15 min). An automated microarray data analysis approach was developed and positivity threshold for each probe was based on ROC curve analysis. Our multiplex PCR combined with our microfluidic microarray system and analysis approach allowed rapid (75 min) and sensitive detection of 12 airborne bacterial biothreat agents: 102 genome copies, except for R. prowazekii (104 genome copies). In-house software Crosshyb v.2.0 was used to predict in silico theoretical specificity of the designed capture probes to other species (1771 prokaryotic strains). The analytical specificity of the capture probes was showed in vitro based on a panel of 40 other species representing other biothreat agents, genetically closely related species, and other airborne pathogens. We developed a comprehensive assay covering the twelve most important bacterial biothreat airborne pathogens for their rapid (75 min) screening.

133

5.3 Introduction

Detection of biothreat agents is essential for public health preparedness. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) have listed high-priority biological agents in three categories, A, B, and, C, according to their ability to spread, the severity of illnesses they induce, and their anticipated impact on public health and society (CDC 2000; Rotz et al. 2002). Biological agents which are highly contagious or potentially widely disseminated via small-particles aerosols are those that might have the greatest impact on public health (CDC 2000). For example, it has been reported that up to 3 million deaths could result from the release of 100 kg of aerosolized anthrax spores over a metropolitan area in favorable environmental conditions (Alibek et Handelman 2000; Inglesby et al. 1999). Fortunately, for bacterial pathogens, a significant prophylactic and therapeutic arsenal is available when they can be detected and identified rapidly (Ciottone 2006; Ramasamy et al. 2010). We therefore aimed to develop a screening assay to detect all CDC categories A, B, and C airborne bacterial biothreat agents (CABBA) (Tableau 9). The enterotoxin B producing Staphylococcus aureus was excluded from our assay since this species can be carried intermittently in the anterior nares of approximately 60 % of the population (Kluytmans et al. 1997). Therefore, humans may easily contaminate samples to test and its detection could raise false alarms.

The broad phylogenetic spectrum covered by the 12 CABBA (Tableau 9) (Jolley et al. 2012) was challenging for the design of a single assay to detect all. Constraints imposed by PCR multiplexing explain in part why assays developed for CABBA detection are often limited to the simultaneous detection of one to five biothreat agents (Deshpande et al. 2010; Janse et al. 2012; Rachwal et al. 2012; Tomioka et al. 2005; Yang et al. 2012). Microarray technology is not limited by the number of targets simultaneously detected (Miller et Tang 2009; Raoult et al. 2004). However,

134

since sensitive microarray detection requires prior amplification, this step is the limiting factor for multiparametric analysis. Evolutionary conserved genes, such as tuf, have the advantage of presenting highly conserved regions amenable to the design of broad-sprectrum primers, hence allowing amplification of phylogenetically diverse targets in a single tube (Hwang et al. 2011; Isabel et al. 2008; Ke et al. 1999; Mignard et Flandrois 2007; Paradis et al. 2005; Picard et al. 2004; Stormer et al. 2009). Standard microarray protocols have experimental times of approximately 15 h (Walter et al. 2011). Time-effective hybridization protocols have been developed. For example, in a recent study by Schnee C et al. (Schnee et al. 2012), the tuf gene was used to amplify the species of the Mycoplasma genus, and then proceed to species identification using a 1 h microarray hybridization procedure. Microfluidic hybridization can even be performed in a few minutes (Peytavi et al. 2005; Wang et Li 2011). We designed biased-broad-spectrum primers for the tuf gene targeting all CABBA, and then performed rapid (15 min) microarray hybridization on centripetal microfluidic units (Peytavi et al. 2005). This new assay has the ability to screen for twelve biological agents in an overall procedure of 75 min. Recommendations suggest that more than one tests need to be used to confirm the presence of a biological agent (Lindler et al. 2005). Combined with confirmation tests, our assay could speed up the analysis of material suspected of being contaminated with airborne biothreat agents and hence help to resolve complex issues of medical management and public safety.

135

5.4 Materials and methods

5.4.1 Bacterial isolates and genomic DNA preparation.

A panel of 38 strains (Tableau 12) requiring BSL-2 or BSL-1 facility were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA) (ATCC), the Collection du Centre de Recherche en Infectiologie (Québec, Canada) (CCRI), the Culture Collection of the University of Göteborg (Göteborg, Sweden) (CCUG). These strains were grown overnight at 30 or 37°C under aerobic or anaerobic conditions on Trypticase soy agar with 5% sheep blood. Purified DNA from strains (BSL-2 or BSL-1) were prepared from mid-log-phase bacterial cultures of selected strains by using a BioSprint 15 DNA blood kit (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) automated with a KingFisher® mL instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Purified genomic DNAs of the CABBA requiring BSL-3 facility were provided by several researchers (Tableau 11 et Tableau 12). Purified genomic DNA of Chlamydophila pneumoniae was obtained from Vircell (Granada, Spain). genomic DNA was extracted from human whole blood using the same procedure. Genomic DNAs were visualized on 0.8% agarose gel electrophoresis with 0.25 µg/ml of ethidium bromide in Tris-borate-EDTA to evaluate degradation and concentration. Genomic DNA concentrations were validated using the NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, MA).

5.4.2 Construction of a tuf gene database from complete genome sequences.

A total of 1890 complete genome sequences of superkingdoms Bacteria and Archae available on GenBank on 2012-02-14 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) were downloaded. We performed non-case sensitive automated requests using regular expressions ―tuf|elongation +factor +tu|ef.tu‖ in the annotations of the CDS (coding sequences) sections of GenBank files, and then, extracted corresponding sequences. Zero to five sequences per genome were retained based on their CDS annotated information. After removal of unrelated hits, zero to three copies of tuf gene per organism were retrieved

136

from 1771 genome sequences for a total database of 2820 sequences. Their accession numbers are listed in supplemental material Table S1a. The tuf gene of Wolbachia persica ATCC VR-331 (GenBank Accession number KF574042), a species phylogenetically closely related to F. tularensis, was sequenced as described previously (Paradis et al. 2005), and added to the database.

5.4.3 Design of primers and probes.

Sequences from four to thirty strains per target species were analyzed. The tuf gene region for PCR amplification was selected to yield amplicons having the following properties: 1) amplicon length between 100-300 bp (analytical sensitivity and rapid amplification), 2) amplicons presenting minimal intra-species heterogeneity (ubiquity) and, 3) amplicons also containing sufficient inter-species variations to allow the design of species-specific probes (analytical specificity) (Sachse 2004). In addition, two conserved regions allowing amplification of all target species with A) minimum number of different primer sequences and B) flanking a more variable region for probe design must be present (Petti 2007). Sequences of the 12 CABBA targeted species were assembled into a multiple alignment using the CLUSTAL W software (version 2.1). The SVARAP program (version 2.1) was used to visualize conserved and more variable regions of this gene alignment (Figure 18) (Colson et al. 2006). To avoid contamination problems of broad-spectrum amplification (Corless et al. 2000; Petti 2007), we biased broad-spectrum primer sequences to preferentially amplify intended targets over other potentially contaminating species. No degenerate primers were used, but inosines were incorporated in some primers. In addition, primers were designed to have similar annealing temperatures and to limit secondary structures and self-priming (Ye et al. 2012). The 3‘ extremities of the primers were adjusted to terminate at the same position on tuf gene, but 5‘ end positions were different in order to adjust their theoretical annealing temperature to ~60°C. Primer sequences satisfying these criteria are listed in Tableau 10.

137

For capture probe design, tuf gene sequences from closely related species were aligned with the 12 target species. Because of the high number of sequences in the database, 10 multiple alignments regrouping family members of the CABBA targets (Tableau 9) were created. Regions specific to each targeted species were chosen for probe design. Five to ten short (20 nucleotides) probes were designed to hybridize within each different CABBA target amplicon while maximizing base-pair mismatch discrimination of nucleic acid sequences from other species of the family (Naef et al. 2002; Naef et Magnasco 2003). Probe sequences were first selected manually as well as with in- house Unimer software on the basis of specific recognition of the targeted species compared with other members of the same family. Then, all potential probes were automatically compared to 2820 tuf gene sequences in the database using the in-house Crosshyb software version 2.0 (Tableau 16) (Martel 2011). This software calculated distances between probes and all sequences within the tuf database by attributing a weighting factor for a destabilizing effect of each mismatch based as a function of their position (Martel 2011). The 36 retained probes are listed in Tableau 12.

5.4.4 PCR amplification and exonuclease digestion.

Levels of contaminating DNA into PCR reagents were decreased by three types of methods: filtration, autoclaving, and UV treatment. PCR Milli-Q water was filtered using 0.1 µm pore diameter membranes (PALL Corporation, Port Washington, NY) prior to two subsequent autoclaving sterilisations. Water, MgCl2, and dNTPS solutions were filtered through centrifugal filter devices with YM-30, YM-100 or YM-30 membranes (EMD Millipore, Billerica, MA), respectively. Decontamination of the PCR mixtures prior to PCR was performed by using a Spectrolinker model XL-1000 UV cross-linker (Spectronics Corporation, Westbury, NY). Contamination of each reagent lot was assessed without DNA template control added to PCR reactions and lots yielding amplicon melt curves with a signal above 40 relative fluorescence units were rejected. A multiplex PCR assay using a set of sixteen primers (Tableau 10) purified by HPLC (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa) has been optimized to allow sensitive amplification

138

of 100 genome copies of CABBA. The PCR mixtures contained precise concentrations of each of the 16 TcbaR primers (Tableau 10), 200 µM deoxyribonucleoside triphosphates (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 50 mM Tris-HCl (pH 9.1),

16 mM ammonium sulfate, 4.5 mM MgCl2, 2 µg/µl bovine serum albumin (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada), 1.4X SYBR Green I, 0.13 µg/µl methoxsalen (Sigma-Aldrich Canada Ltd.), 100 genome copies of B. atrophaeus purified genomic DNA as an internal amplification and hybridization control, and 0.050 U/µl KlenTaq DNA polymerase (Ab Peptides, Inc., St. Louis, MO) combined with the TaqStart antibody (Clontech Takara Bio, Mountain View, CA). Purified genomic DNA (102, or exceptionally 104, genome copies for sensitivity tests or 1 ng for specificity tests) was added to each PCR mixture, which was subjected to thermal cycling with a SmartCycler® System (Cepheid) as follows: 60 s at 95°C, followed by 40 cycles of 10 s at 95°C, 20 s at 60°C, and 20 s at 72°C, a final extension for 2 min at 72°C, and a melt from 60 to 95°C (total cycling duration : 55 min). Amplicons were produced using 5′ Cyanine 3-labeled forward primers (Cy3-) and 5′ phosphorylated reverse primers (P-). Phosphorylated antisense strands were digested using a 5 min Lambda exonuclease treatment at 37ºC as described previously (Boissinot et al. 2007).

5.4.5 Microfluidic-microarray hybridization.

Microarrays were fabricated as described previously (Peytavi et al. 2005) and improved as followed. Briefly, Super Aldehyde glass slides (Genetix, New Milton, Hampshire, United Kingdom) were used. Oligonucleotide capture probes (Tableau 12) synthesized with a hexa (ethylene glycol) spacer (S18) and an amino- linker (AmMC6) at the 5‘ end (Integrated DNA Technologies, Inc.) were suspended in phosphate-buffered saline (pH 7.4, Sigma-Aldrich) with 1 mM EDTA. Probes were then diluted two-fold by the addition of Micro Spotting Solution Plus (TeleChem International, Inc., Sunnyvale, CA) for a final concentration of 30 µM. A printing control probe (bbc2: 5‘-TACATCACGCATCGCAGTGT-3‘) was mixed at 0.5 µM to each probe, to assess the quality of the printing process. Each probe was spotted in duplicate in two different sub-

139 arrays with Gene Machines OmniGrid Microarrayer (San Carlos, CA) equiped with four SMP2 pins (Telechem International, Inc.). Elastomeric flow cells were fabricated as described previously (Peytavi et al. 2005), but the dimension of the hybridization chamber was extended (width 500 µm by length 8500 µm) to accommodate more microarray capture probe spots (~250). We juxtaposed a microfluidic elastomeric flow cell on a glass slide to form microfluidic-microarray hybridization unit. Up to six of these units were set on a centripetal support. Five (5) µL of digested PCR mixture was combined with 15 µL of hybridization buffer (8× SSPE (OmniPur; EMD Millipore, Billerica, MA), 0.4 g/L polyvinylpyrrolidone, 400 mL/L formamide, hybridization control target Cy3-bbc1a (5'-Cy3-GAGTATGGTCTGCCTATCCT) at 6.6 nM, and printing control target Cy5-bbc2b (5'-Cy5-ACACTGCGTAGCGTGATGTA-3') at 0.66 µM). The complete microfluidic-microarray hybridization procedure was performed at room temperature on a centrifugation-platform in four consecutive steps (hybridization (5 min), washing (5 min), rinsing (5 min), and drying). Hybridization control bbc1 (capture probe) and bbc1a (Cy3- labeled target) were used as described previously (Boissinot et al. 2007). For each species tested, 2-7 hybridization experiments, including two or exceptionally three replicates per strain, were performed.

5.4.6 Microarray data acquisition and analysis.

Fluorescent images were acquired using the Agilent G2505B microarray scanner (Agilent Technologies, Mississauga, Ontario, Canada) with parameters as follows: PMT gain at 100 % and 10 % for red and green channels, respectively, and scan resolution to 10 μm. Fluorescence data analysis was performed using GenePix Pro software (version 6.1.0.4; MDS Analytical Technologies, Downingtown, PA). To create a raw data set, automated grid alignment was performed, followed by a visual inspection, minor manual alignment if required and bad spots removal (such as obvious stains and other undesirable artifacts). Resulting raw signals were imported into BASE (Saal et al. 2002) for data stocking and subsequent batch computation via in-house software called MINABLE (version 6.0) used to perform all of the following analyses. The raw signal

140

Sraw,s of every spot s was defined as the difference between the foreground raw median signal Fmed,s of this spot and the background raw median signal Bmed,s around this spot as determined by GenePix Pro 6.0 . Since each scan was divided into two independent and spaced sub-arrays, we determined a mean raw signal Cb for the hybridization control probe control (referred as bbc1 in the text) of each sub-array b, computed as b S=C raw,bbc1 b, . Prior to computing this mean, we filtered the control raw signals in the following way. The reference raw signals were filtered by eliminating outliers via interquartile range (IQR), outliers being defined as distributed outside the Q2 ± 1.5×IQR interval. In cases where Cb was below the established threshold (5 × 103), the whole sub-array b was eliminated from further analysis. Within each valid block b, the relative signal Srel,s,b of each spot s was determined as a

percentage of Cb ( ) To calculate the positivity threshold for each probe, ROC curve analyses (ROCR version 1.0-4 in R version 2.14.1, (R Development Core Team 2011; Sing et al. 2005), were performed using data from all spot relative signals Srel,s,b for each specific probe defined as positive when hybridized with amplicons from the targeted species, and otherwise as negative. IQR filtered mean relative signal Srel,h,p for each probe p for a given hybridization experiment h was set as the mean of all its spots relative signal ( ̅ ). Mean signal over the positivity threshold for each probe was identified as positive, and otherwise negative. Probes signals were evaluated when performing sensitivity tests (102 genome copies, except for Rickettsia spp. 104 genome copies) (Tableau 11). Finally, we evaluated cross- hybridization with other non-targeted species in order to assess specificity of each probe and probe combinations.

141

5.5 Result

5.5.1 Analysis of the tuf gene region, primer and probe selection.

Targeting 12 CABBA distributed over four bacterial phyla (Actinobacteria, Chlamydiae, Firmicutes, and Protoebacteria) (Tableau 9) represents a challenge for the design of PCR primers and hybridization probes. Analysis of tuf gene sequences of all CABBA with the SVARAP software (Colson et al. 2006) revealed two short conserved regions encompassing a more variable region (Figure 18) The design made in those regions permitted to: 1) minimize the number of primers to amplify all selected targets, 2) avoid primers having very broad spectrum in order to limit amplification of unintended targets, and 3) detect a minimum of 100 genome copies of the selected targets. The biased-broad-spectrum amplification of the tuf gene allowed to preferentially amplify the selected targets. Hence, this strategy minimized the amplification of contaminants while allowing sensitive amplification of 12 CABBA.

Two to four short (20 nucleotides) capture probes were selected in silico for each CABBA, for a total of 35 probes. These probes were designed to optimize the ubiquity (detect phylogenetic variants within targeted species) and specificity (divergence with the non-targeted species). Of the sequences from four to thirty per species analyzed, probes for 11 of 12 target species were ubiquitous even for the two tuf copies. Gene regions used for probes specific to C. botulinum group I included one SNP for two (str. 657 and Loch Maree) of the twelve strains used for design. No probe was added into the microarray to cover this SNP since we did not have access to DNA from these more phylogenetically distant strains. For C. perfringens, two probes were designed at the same position to consider a SNP between the two copies of tuf genes included on two of the strains studied (ATCC 13124 and CCUG 23083). We could not predict if one tuf copy could be amplified predominantly. For the same reason, design for Y. pestis included probes to target

142

tufA and tufB genes since those two copies present a high level of divergence (Isabel et al. 2008).

In some cases, only one probe was sufficient to be theoretically species-specific when compared to tuf gene sequences of 1,771 strains in our database. For example, probe CburH834 presented at least 6 mismatches with all other species evaluated. In other cases, probe combinations were required to distinguish the targeted CABBA from closely related species. Probes designed for Brucella spp. illustrated well this situation. The probe BruGH819 presented two mismatches against Ochrobactrum anthropi, but none with one tuf copy of Rhizobium leguminosarum. Inversely, the probe BruGH842 presented no mismatches against O. anthropi while four for one tuf copy of R. leguminosarum. In silico analysis showed that combination of probes allowed theoretical specificity against most closely related species. However, no mismatch was found between B. anthracis and some B. cereus/B. thuringiensis strains, as well as between Y. pestis and Y. pseudotuberculosis. Also, probes designed to detect B. pseudomallei presented no mismatch against one of four strains of Xanthomonas oryzae (str. BLS256), a rice plant pathogen, even if they are not genetically closely related species (Mansfield et al. 2012). All CABBA reverse primers present a mismatch with X. oryzae BLS256 on the third nucleotide before the 3‘ end. To limit competition with the 12 CABBA targets, the amplification of the B. atrophaeus amplification- hybridization control has been designed and optimized to be robust without interfering with the multiplexed PCR. Therefore, one 26-nucleotide capture probe was designed for the B. atrophaeus control to increase its microarray detection sensitivity. From in silico analysis, 36 hybridization capture probes were synthesized for recognition of the 12 CABBA and B. atrophaeus amplicons and submitted to subsequent in vitro analyses (Tableau 11 and Tableau 12).

143

5.5.2 Analytical sensitivity of the CABBA assay

TcbaR primers (9 forward and 7 reverse), when combined in one tube at specified concentrations and conditions, allowed the sensitive amplification of 12 CABBA targets. Concentration of each PCR reagent was optimized to increase its amplification signal as seen in real-time PCR using SYBR Green. For microarray result interpretation, a specific threshold was calculated for each probe based on ROC curve analyses using relative hybridization signals of microarray spots. As a result, 102 genome copies of all CABBA, except for R. prowazekii (104 genome copies), allowed positive signals of specific capture probes in 100% of hybridization experiments (2-7 repeats) (Tableau 12). It should be noted that DNA preparations of most CABBA strains were provided by other laboratories having BSL-3 facilities. Therefore, we could not have control over DNA preparation methods or degradation during transportation. Visualization of genomic DNAs on agarose gels was used to monitor degradation and only intracellular bacterial agents, C. psittaci, R. prowazekii and R. typhi, showed extensive degradation. The amplification- hybridization positive control was 100 genome copies of B. atrophaeus included in all PCR reaction. One to three positive controls were analyzed for each set of experiment, producing a positive microarray signal in 100% (17/17) of control hybridization experiments.

5.5.3 Analytical specificity of the CABBA assay

Assay analytical specificity was validated using high quantities of genomic DNA (1 ng ~105 genome copies) of 12 targeted agents, as well as 40 other phylogenetically related and clinically relevant bacterial species. As presented in Tableau 12, most CABBA exhibited specific probe patterns, even when compared with phylogenetically related species. For example, two of the three probes designed to detect Brucella spp. allowed discrimination with O. anthropi. Also, C. psittaci probes did not present positive signals when hybridized with amplicons

144

produced from all 51 other species tested, including closely related Chlamydophila pneumoniae and Chlamydia trachomatis amplicons. Three Clostridium groups were CABBA targets: C. botulinum groups I and II, and C. perfringens. These three groups present distinct probe patterns between themselves. They also produce distinct patterns with four other different Clostridium species. C. burnetii probes only produced specific positive signals with its target. The combination of the three probes for F. tularensis allowed its specific identification even when two closely related species were tested: Francisella philomiragia and Wolbachia persica. The three probes designed to detect and identify the M. tuberculosis complex were specific against three other species of this genus: M. avium, M. kansasii, and M. terrae. Surprisingly, the two theoretically specific probes for R. prowazekii detection cross-reacted with the Clostridium septicum amplicon. However, the two probes for R. prowazekii and R. typhi, did not react with C. septicum. The combination of these four probes differentiates the Rickettsia typhus group, R. prowazekii and R. typhi (Brenner et al. 2005), from all other species, but could not distinguish between these two species. As predicted by our in silico analyses, it was not possible to distinguish sub-species of two genomospecies: B. anthracis from B. cereus and Y. pestis from Y. pseudotuberculosis. However, B. mallei and B. pseudomallei presented distinct patterns even though they are considered as the same genetic species (Godoy et al. 2003). Finally, when human DNA was tested, no amplicon was detected by SyBR Green analysis and no cross- hybridization was observed with the microarray capture probes.

145

5.6 Discusion

5.6.1 Evolutionary relationships of tuf sequences

The tuf gene regions used to design primers to amplify the 12 CABBA are highly conserved among four bacterial phyla (Tableau 9) distributed throughout the evolutionary tree of the bacterial domain (Jolley et al. 2012). This level of sequence conservation can be explained by the essential structure and function of the elongation factor Tu protein. The forward primers were designed in one of the two domain 2 loops of EF-Tu involved in 16S rRNA binding and interaction with tRNA- a.a. (Schmeing et al. 2009; Song et al. 1999). The reverse primers were designed in another conserved hairpin loop of the EF-Tu domain 3 (Song et al. 1999). The specificity of the capture probes exploited the variability existing at the junction between domains 2 and 3 of EF-Tu (Song et al. 1999).

5.6.2 Biased-broad-spectrum amplification

Broad range PCR is limited by possible bacterial DNA contamination of reagents (Petti 2007). In our study, even though the amplification spectrum of the primers was biased toward targeted CABBA species, it was still challenging to minimize amplification of contaminants present in PCR reagents. Therefore, all reagents underwent several meticulous decontamination steps, including filtration, autoclaving, and UV treatment, as well as careful handling in laminar flow hoods within dedicated laboratory spaces, and lot validation. However, as noted by others, it was not possible to completely eliminate contaminating DNA without affecting sensitivity (Corless et al. 2000). Our biased-broad-spectrum PCR allowed sensitive microarray detection of low DNA quantities of 11 of 12 CABBA: 102 genome copies, except Rickettsia prowazekii (104 genome copies). One of two genomic DNA preparations from R. typhi strains tested was detected (102 genome copies) by the two probes designed for these two species. These rickettsial

146

genomic DNA preparations were highly degraded; the analytical sensitivity for Rickettsia spp. targets warrants further study.

5.6.3 Limitation of conserved gene targets

A known limitation of conserved gene targets is the inability to discriminate closely related bacterial taxa (Petti 2007) or bacteria that underwent convergent evolution. With the tuf gene CABBA assay, 9 of the 12 targets could be specifically identified both in silico and in vitro. In silico discrimination of B. pseudomallei and one of four strains of X. oryzae analyzed was not possible. B. pseudomallei and X. oryzae pv. oryzicola BLS256 may have underwent convergent evolution in the tuf region targeted by the 2 capture probes. X. oryzae is an important rice pathogen that has however not established itself in North America (Mansfield et al. 2012). Although it is unlikely to be found in suspect powders, the design of new probes to increase theoretical specificity against X. oryzae warrants further study. Discrimination of B. anthracis from B. cereus / B. thuringiensis as well as discrimination of Y. pestis from Y. pseudotuberculosis was not possible because they are the same genetic species and their main differences are the presence of distinct virulence genes. The fact that virulence genes are often encoded by mobile genetic elements, such as plasmids, indicates that their evolution is an active process and adds complexity to pathogen identification (Ch'ng et al. 2011; Derbise et al. 2010; Hoffmaster et al. 2004; Hu et al. 2009; Worsham et Roy 2003). The combination of testing for housekeeping chromosomal targets together with virulence genes increases the probability of appropriate identification (Boissinot et Bergeron 2003; Janse et al. 2012; Petti 2007). Numerous molecular detection assays were previously developed to detect specific virulence factors of B. anthracis and Y. pestis and allow specific detection of these species (Irenge et Gala 2012; Persing 2011; Rao et al. 2010; Riehm et al. 2011; Stewart et al. 2008; Wielinga et al. 2011). It is recommended to perform several tests prior to confirm the presence of a biological agent (Lindler et al. 2005). In case of a positive result, combination of our

147 screening technology with a subsequent confirmation tests developed previously would increase efficiency and biological agent identification specificity.

5.6.4 Possible practical application of the CABBA assay.

In the case of a bioterrorist attack, bacterial preparation could be highly concentrated. As reported for example in fall 2001, B. anthracis spore preparations contained between 4.60 × 1010 and 2.10 × 1012 CFU per gram of powder (U.S. Department of Justice 2010). Therefore, excluding DNA preparation, for the lowest concentrated bacterial preparation, only 2 ng (~100 CFU) of powder would need to be analyzed to produce a positive detection signal with the CABBA assay. Considering DNA preparation, for example, the DARE procedure (10 minutes) enables recovery of microbial particles from 20 mg of powder in 300 µL of which 5 µL can be analyzed by PCR (Isabel et al. 2012). Assuming the published average recuperation of approximately 50 %, we could expect to submit to PCR the equivalent of bacterial particles extracted from 165 ng of suspect powder. Hence, the DARE procedure could provide 80 times the amount of material required for detection by the CABBA assay. The B. atrophaeus control selected to monitor amplification and hybridization of the CABBA assay could also be used as a sample process control (Picard et al. 2009). All 12 CABBA species are human pathogens, although for C. botulinum and C. perfringens, their botulinic neurotoxin and epsilon toxin, respectively, are the targeted biological agents of the CDC. Other nucleic acid based assays, such as the PLEX-ID and the FilmArray Biosurveillance, also target these species (Idaho Technology Inc. 2012; Sampath et al. 2012). Toxin preparations may carry traces of their genomic DNA depending of the method of purification. For example, to produce a highly purified protein vaccine, a nuclease step must be performed to remove DNA traces (Hagen et al. 1996). The accuracy of a nucleic acid-based assay to detect C. botulinum and C. perfringens DNA in toxin preparations requires further study.

148

5.6.5 Comparison to other biothreat agent detection assays.

A bead-based array, used for a multiplex oligonucleotide ligation-PCR assay, analyzed 13 gene targets to detect 103-104 genome copies of three biothreat agents in less than 4 h (Deshpande et al. 2010). Another bead-based array uses 16 gene targets to identify four biothreat agents (Janse et al. 2012). Although turn- around time for the assay is not explicitly stated, it can be estimated at more than 100 min. Moreover, they calculated their limit of detection to range from 12 to 284 genome copies. The PLEX-ID, a system combining PCR amplification and characterisation of amplicons by mass spectrometry, demonstrated the detection of 9 biothreat agents, but has the potential for detecting a very large number of microbial species (Sampath et al. 2012). They detected between 4 × 101 to 103 genome copies per well, but the system requires 16 wells to perform the complete multiplex. The turn-around time from amplification to identification is slightly over 80 min. The CABBA assay compares favorably since it required approximately 75 min for PCR amplification and microarray detection, and can detect 102 genome copies of 11/12 airborne target species.

149

5.7 Conclusion

We used evolutionary conserved regions of the tuf gene to develop a rapid molecular assay on microarray to detect 12 CABBA (Bacillus anthracis, Brucella spp., Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum groups I and II, Clostridium perfringens, Coxiella burnetii, Francisella tularensis, Mycobacterium tuberculosis complex, Rickettsia prowazekii, and Yersinia pestis). Microarray hybridization probe patterns allow specific discrimination of genetic species. The entire procedure for PCR amplification and microfluidic-microarray detection required approximately 75 min. This screening assay shows promise to improve immediate response to real or suspected bioterrorist attacks by minimizing their impact on populations. In the future, the CABBA assay could be integrated into a portable micro- total analysis system (μTAS) allowing complete automated analysis directly from suspect specimens in the field.

150

5.8 Ackowledgments

We are grateful to Drs. Robert R. Brubaker, Louis Bryden, Thomas A. Ficht, Sharon Peacock, Heidi Wood, Katsuya Hirai, Didier Raoult, Donald E. Woods, Daisy Vanrompay, Tina Zimmerman, Health Canada, and DRDC Suffield, who generously provided genomic DNA.

We would like to thank all members of the Molecular Diagnostics Team, notably Karel Boissinot and Marie-Claude Hélie, for technical support. Dr Eric Frost, Keith Logan, and Manon Tétreault are acknowledged for proof-reading and graphical support. We are grateful to our collaborators from the University of Irvine, CRTI, DRDC, and RCMP for key materials and enlightening discussions. This research project was funded by Genome Canada, Genome Québec, and the Canadian Institutes of Health Research. S. I. received scholarships from the Fonds de la recherche en santé du Québec (Montréal, Canada) and the Fondation Dr George Phénix (Montréal, Canada).

151

5.9 References

Alibek, K. et S. Handelman. 2000. Biohazard : the chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world-told from the inside by the man who ran it. Delta Peaslake. 336 p. Boissinot, K., A. Huletsky, R. Peytavi, S. Turcotte, V. Veillette, M. Boissinot, F.J. Picard, A.E. m et M.G. Bergeron. 2007. Rapid exonuclease digestion of PCR-amplified targets for improved microarray hybridization. Clinical chemistry 53(11): 2020-2023. Boissinot, M. et M.G. Bergeron. 2003. [Genomics and bioterrorism]. Medecine sciences : M/S 19(10): 967-971. Brenner, D.J., N.R. Krieg, G.M. Garrity et J.T. Staley. 2005. Bergey's manual of systematic bacteriology. Volume 2 - The . Springer, New York. CDC. 2000. Biological and chemical terrorism: strategic plan for preparedness and response. Recommendations of the CDC Strategic Planning Workgroup. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control 49(RR-4): 1-14. Ch'ng, S.L., S. Octavia, Q. Xia, A. Duong, M.M. Tanaka, H. Fukushima et R. Lan. 2011. Population structure and evolution of pathogenicity of Yersinia pseudotuberculosis. Applied and environmental microbiology 77(3): 768-775. Ciottone, G.R. 2006. Disaster medicine. Elsevier/Mosby, Philadelphia. 952 p. Colson, P., C. Tamalet et D. Raoult. 2006. SVARAP and aSVARAP: simple tools for quantitative analysis of nucleotide and amino acid variability and primer selection for clinical microbiology. BMC microbiology 6: 21. Derbise, A., V. Chenal-Francisque, C. Huon, C. Fayolle, C.E. Demeure, B. Chane-Woon-Ming, C. Medigue, B.J. Hinnebusch et E. Carniel. 2010. Delineation and analysis of chromosomal regions specifying Yersinia pestis. Infection and immunity 78(9): 3930-3941. Deshpande, A., J. Gans, S.W. Graves, L. Green, L. Taylor, H.B. Kim, Y.A. Kunde, P.M. Leonard, P.E. Li, J. Mark, J. Song, M. Vuyisich et P.S. White. 2010. A rapid multiplex assay for nucleic acid- based diagnostics. Journal of microbiological methods 80(2): 155-163. Greub, G. 2010. International Committee on Systematics of Prokaryotes. Subcommittee on the taxonomy of the Chlamydiae: minutes of the closed meeting, 21 June 2010, Hof bei Salzburg, Austria. International journal of systematic and evolutionary microbiology 60(Pt 11): 2694. Hagen, A.J., R.A. Aboud, P.A. DePhillips, C.N. Oliver, C.J. Orella et R.D. Sitrin. 1996. Use of nuclease enzyme in the purification of VAQTA, a hepatitis A vaccine. Biotechnology and applied biochemistry 23 ( Pt 3): 209-215. Hoffmaster, A.R., J. Ravel, D.A. Rasko, G.D. Chapman, M.D. Chute, C.K. Marston, B.K. De, C.T. Sacchi, C. Fitzgerald, L.W. Mayer, M.C. Maiden, F.G. Priest, M. Barker, L. Jiang, R.Z. Cer, J. Rilstone, S.N. Peterson, R.S. Weyant, D.R. Galloway, T.D. Read, T. Popovic et C.M. Fraser. 2004. Identification of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(22): 8449-8454. Hu, X., G. Van der Auwera, S. Timmery, L. Zhu et J. Mahillon. 2009. Distribution, diversity, and potential mobility of extrachromosomal elements related to the Bacillus anthracis pXO1 and pXO2 virulence plasmids. Applied and environmental microbiology 75(10): 3016-3028. Hwang, S.M., M.S. Kim, K.U. Park, J. Song et E.C. Kim. 2011. Tuf gene sequence analysis has greater discriminatory power than 16S rRNA sequence analysis in identification of clinical isolates of coagulase-negative staphylococci. Journal of clinical microbiology 49(12): 4142-4149. Idaho Technology Inc. 2012. FilmArray® BioSurveillance System. Consulté le 30 mai 2012.

152

Inglesby, T.V., D.A. Henderson, J.G. Bartlett, M.S. Ascher, E. Eitzen, A.M. Friedlander, J. Hauer, J. McDade, M.T. Osterholm, T. O'Toole, G. Parker, T.M. Perl, P.K. Russell et K. Tonat. 1999. Anthrax as a biological weapon: medical and public health management. Working Group on Civilian Biodefense. JAMA : the journal of the American Medical Association 281(18): 1735-1745. Irenge, L.M. et J.L. Gala. 2012. Rapid detection methods for Bacillus anthracis in environmental samples: a review. Applied microbiology and biotechnology 93(4): 1411-1422. Isabel, S., M. Boissinot, I. Charlebois, C.M. Fauvel, L.E. Shi, J.C. Levesque, A.T. Paquin, M. Bastien, G. Stewart, E. Leblanc, S. Sato et M.G. Bergeron. 2012. Rapid filtration separation-based sample preparation method for Bacillus spores in powdery and environmental matrices. Applied and environmental microbiology 78(5): 1505-1512. Isabel, S., E. Leblanc, M. Boissinot, D.K. Boudreau, M. Grondin, F.J. Picard, E.A. Martel, N.J. Parham, P.S. Chain, D.E. Bader, M.R. Mulvey, L. Bryden, P.H. Roy, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2008. Divergence among genes encoding the elongation factor Tu of Yersinia Species. Journal of bacteriology 190(22): 7548-7558. Jolley, K.A., C.M. Bliss, J.S. Bennett, H.B. Bratcher, C. Brehony, F.M. Colles, H. Wimalarathna, O.B. Harrison, S.K. Sheppard, A.J. Cody et M.C. Maiden. 2012. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology 158(Pt 4): 1005- 1015. Ke, D., F.J. Picard, F. Martineau, C. Menard, P.H. Roy, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 1999. Development of a PCR assay for rapid detection of enterococci. Journal of clinical microbiology 37(11): 3497-3503. Kluytmans, J., A. van Belkum et H. Verbrugh. 1997. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clinical microbiology reviews 10(3): 505-520. Lindler, L.E., F.J. Lebeda et G. Korch. 2005. Biological weapons defense : infectious diseases and counterbioterrorism. Humana Press, Totowa, N.J. 597 p. Martel, É. 2011. Conception automatisée d'amorces et de sondes aux fins de diagnostic moléculaire. Université Laval, Québec. Mignard, S. et J.P. Flandrois. 2007. Identification of Mycobacterium using the EF-Tu encoding (tuf) gene and the tmRNA encoding (ssrA) gene. Journal of medical microbiology 56(Pt 8): 1033-1041. Miller, M.B. et Y.W. Tang. 2009. Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology. Clinical microbiology reviews 22(4): 611-633. Paradis, S., M. Boissinot, N. Paquette, S.D. Belanger, E.A. Martel, D.K. Boudreau, F.J. Picard, M. Ouellette, P.H. Roy et M.G. Bergeron. 2005. Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding elongation factor Tu and F-ATPase beta-subunit. International journal of systematic and evolutionary microbiology 55(Pt 5): 2013-2025. Parsons, L.M., A. Somoskovi, C. Gutierrez, E. Lee, C.N. Paramasivan, A. Abimiku, S. Spector, G. Roscigno et J. Nkengasong. 2011. Laboratory diagnosis of tuberculosis in resource-poor countries: challenges and opportunities. Clinical microbiology reviews 24(2): 314-350. Petti, C.A. 2007. Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 44(8): 1108-1114. Peytavi, R., T. Liu-Ying, F.R. Raymond, K. Boissinot, L. Bissonnette, M. Boissinot, F.J. Picard, A. Huletsky, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2005. Correlation between microarray DNA hybridization efficiency and the position of short capture probe on the target nucleic acid. BioTechniques 39(1): 89-96.

153

Peytavi, R., F.R. Raymond, D. Gagne, F.J. Picard, G. Jia, J. Zoval, M. Madou, K. Boissinot, M. Boissinot, L. Bissonnette, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2005. Microfluidic device for rapid (<15 min) automated microarray hybridization. Clinical chemistry 51(10): 1836-1844. Picard, F.J., M. Gagnon, M.R. Bernier, N.J. Parham, M. Bastien, M. Boissinot, R. Peytavi et M.G. Bergeron. 2009. Internal control for nucleic acid testing based on the use of purified Bacillus atrophaeus subsp. globigii spores. Journal of clinical microbiology 47(3): 751-757. Picard, F.J., D. Ke, D.K. Boudreau, M. Boissinot, A. Huletsky, D. Richard, M. Ouellette, P.H. Roy et M.G. Bergeron. 2004. Use of tuf sequences for genus-specific PCR detection and phylogenetic analysis of 28 streptococcal species. Journal of clinical microbiology 42(8): 3686-3695. Rachwal, P.A., H.L. Rose, V. Cox, R.A. Lukaszewski, A.L. Murch et S.A. Weller. 2012. The potential of TaqMan Array Cards for detection of multiple biological agents by real-time PCR. PloS one 7(4): e35971. Ramasamy, S., C.Q. Liu, H. Tran, A. Gubala, P. Gauci, J. McAllister et T. Vo. 2010. Principles of antidote pharmacology: an update on prophylaxis, post-exposure treatment recommendations and research initiatives for biological agents. British journal of pharmacology 161(4): 721-748. Raoult, D., P.E. Fournier et M. Drancourt. 2004. What does the future hold for clinical microbiology? Nature reviews. Microbiology 2(2): 151-159. Riehm, J.M., L. Rahalison, H.C. Scholz, B. Thoma, M. Pfeffer, L.M. Razanakoto, S. Al Dahouk, H. Neubauer et H. Tomaso. 2011. Detection of Yersinia pestis using real-time PCR in patients with suspected . Molecular and cellular probes 25(1): 8-12. Rotz, L.D., A.S. Khan, S.R. Lillibridge, S.M. Ostroff et J.M. Hughes. 2002. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerging infectious diseases 8(2): 225-230. Sampath, R., N. Mulholland, L.B. Blyn, C. Massire, C.A. Whitehouse, N. Waybright, C. Harter, J. Bogan, M.S. Miranda, D. Smith, C. Baldwin, M. Wolcott, D. Norwood, R. Kreft, M. Frinder, R. Lovari, I. Yasuda, H. Matthews, D. Toleno, R. Housley, D. Duncan, F. Li, R. Warren, M.W. Eshoo, T.A. Hall, S.A. Hofstadler et D.J. Ecker. 2012. Comprehensive Biothreat Cluster Identification by PCR/Electrospray-Ionization Mass Spectrometry. PloS one 7(6): e36528. Schmeing, T.M., R.M. Voorhees, A.C. Kelley, Y.G. Gao, F.V.t. Murphy, J.R. Weir et V. Ramakrishnan. 2009. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science 326(5953): 688-694. Schnee, C., S. Schulsse, H. Hotzel, R.D. Ayling, R.A. Nicholas, E. Schubert, M. Heller, R. Ehricht et K. Sachse. 2012. A novel rapid DNA microarray assay enables identification of 37 Mycoplasma species and highlights multiple Mycoplasma infections. PloS one 7(3): e33237. Song, H., M.R. Parsons, S. Rowsell, G. Leonard et S.E. Phillips. 1999. Crystal structure of intact elongation factor EF-Tu from Escherichia coli in GDP conformation at 2.05 A resolution. Journal of molecular biology 285(3): 1245-1256. Stewart, A., B. Satterfield, M. Cohen, K. O'Neill et R. Robison. 2008. A quadruplex real-time PCR assay for the detection of Yersinia pestis and its plasmids. Journal of medical microbiology 57(Pt 3): 324-331. Stormer, M., T. Vollmer, B. Henrich, K. Kleesiek et J. Dreier. 2009. Broad-range real-time PCR assay for the rapid identification of cell-line contaminants and clinically important mollicute species. International journal of medical microbiology : IJMM 299(4): 291-300. Tomioka, K., M. Peredelchuk, X. Zhu, R. Arena, D. Volokhov, A. Selvapandiyan, K. Stabler, J. Mellquist-Riemenschneider, V. Chizhikov, G. Kaplan, H. Nakhasi et R. Duncan. 2005. A multiplex polymerase chain reaction microarray assay to detect bioterror pathogens in blood. The Journal of molecular diagnostics : JMD 7(4): 486-494. Wang, L. et P.C. Li. 2011. Microfluidic DNA microarray analysis: a review. Analytica chimica acta 687(1): 12-27.

154

Yang, Y., J. Wang, H. Wen et H. Liu. 2012. Comparison of two suspension arrays for simultaneous detection of five biothreat bacterial in powder samples. Journal of biomedicine & biotechnology 2012: 831052. Ye, J., G. Coulouris, I. Zaretskaya, I. Cutcutache, S. Rozen et T. Madden. 2012. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics 13(1): 134.

155

5.10 Tables and figures

Tableau 9. CABBA and diseases.

Phylum Family Genus Species Disease Actinobacteria Mycobacteriaceae Mycobacterium tuberculosis complex Tuberculosis Chlamydiae Chlamydiaceae Chlamydophila psittaci Psittacosis Firmicutes Bacillaceae Bacillus anthracis Anthrax Clostridiaceae Clostridium botulinum Botulism perfringens Epsilon toxin disease Protoebacteria Brucellaceae Brucella spp. Rickettsiaceae Rickettsia prowazekii Burkholderiaceae Burkholderia mallei Meleidosis pseudomallei Glanders Enteroacteriaceae Yersinia pestis Plague Coxiellaceae Coxiella burnetii Francisellaceae Francisella tularensis

References: (Bergey's Manual Trust 2010; CDC 2000; Greub 2010; Parsons et al. 2011; Rotz et al. 2002).

156

Figure 18. tuf gene sequence variability for 12 CABBA using the SVARAP program. Positions of the two highly conserved short regions (~25 bp, position 763 to 791 and 991 to 1017 in Y. pestis KIM10, AN AE009952.1) separated by a more variable longer region (~200 bp, position 792 to 990 in Y. pestis KIM10) for capture probe (CPR) design are illustrated within the tuf gene.

157

Tableau 10. Biased-broad-spectrum PCR primers used for amplification of tuf gene of 12 CABBA.

Cy3-Forward primers P-Reverse primers Cat. Species Name Co. Sequence (5'→ 3') Name Co. Sequence (5'→ 3') A B. anthracis TcbaR769e 0.3 CT G G T G TA G A G AT G TTCC G T A A TcbaR991a 0.25 A C G TCI G TI G TAC G G AA G TA G AA C. botulinum I TcbaR766a 0.3 T G TACA G G AATI G AAAT G TTCA G AAA TcbaR991k 0.25 A C G TCT G TT G TTCT G AA G TA G AA C. botulinum II TcbaR766b 0.3 G TT G TAACT G G AATA G AAAT G TTCA G AAA TcbaR991k NA AC G TCT G TT G TTCT G AA G TA G AA F. tularensis TcbaR769f 0.4 CT G G T G T G G AAAT G TTCC G TAA TcbaR991a NA AC G TCI G TI G TAC G G AA G TA G AA Y. pestis TcbaR772 0.2 G G C G TI G AAAT G TTCC G CAA TcbaR991a NA AC G TCI G TI G TAC G G AA G TA G AA B Brucella spp. TcbaR772 NA G G C G TI G AAAT G TTCC G CAA TcbaR991a NA AC G TCI G TI G TAC G G AA G TA G AA B. mallei TcbaR772 NA G G C G TI G AAAT G TTCC G CAA TcbaR991c 0.4 TCC G TC G TAC G G AA G TA G AA B. pseudomallei TcbaR772 NA G G C G TI G AAAT G TTCC G CAA TcbaR991c NA TCC G TC G TAC G G AA G TA G AA C. psittaci TcbaR768 0.3 TACA G G T G TI G AAAT GTTTCA G AAA TcbaR991g 0.3 A C A T C T G TT G TAC G G AA G AA G AA C. perfringens TcbaR766c 0.3 G TAACA G G AATC G AAAT G TTCA G AAA TcbaR991k NA AC G TCT G TT G TTCT G AA G TA G AA C. burnetii TcbaR772a 0.2 G G C G TT G A G AT G TTTC G CAA TcbaR991d 0.3 TCC G TC G T G C G G AAATAAAA R. prowazekii TcbaR768 NA TACA G G T G TI G AAAT G TTCA G A A A TcbaR991e 0.3 G G TAACATCT G TT G TTCTAAAATA G AA C M. tuberculosis TcbaR772b 0.2 G G T G T G G A G AT G TTCC G CAA TcbaR991f 0.3 TC G G T G G T G C G G AA G TA G AA Total 9 primers 7 primers

Legend: A: adenosines are in green; C: cytosines are in blue; G: guanines are in purple; I: inosines are in yellow; T: thymines are in red. Cat.: CDC category. Co.: primer concentration (µM). NA: not applicable, redundant primer concentration previously specified.

158

Tableau 11. CABBA assay capture probes and hybridization results for each capture probe using low quantity of gDNA.

Species (strains) Probe names Sequences (5’ → 3’) LATD PT Nb+ MPS (GC) (%) (%) 2 B. anthracis BantBcerH877 ACAGAACCGCTTTTTGCAAG 10 9.4 4/4 26.7 2 (Ames, Vollum) BantBcerH897a TGAATTTAGCGTGAGCTTTT 10 3.2 4/4 7.0 2 BantBcerH920a AGATAATACGAAAACTTCAG 10 3.6 4/4 14.1 2 C. botulinum group I CbotH799 TCTCCTGCCATTGCTTCATC 10 15.6 4/4 26.4 2 (20:1.2, 20:2.1) CbotH835 TCTCTTTGGATACCTCTTAA 10 13.5 4/4 18.7 2 CbotH845 TTGGATTTCGTCTCTTTGGA 10 20.4 4/4 26.0 2 C. botulinum group II CbotH878 TACTGAATTAGGTACTGCTA 10 4.4 4/4 6.6 2 (20:3.1, 20:3.3) CbotH902 TGACCTACGAACTTAGTGTG 10 2.4 4/4 8.0 2 F. tularensis FtulH793 GCTTCCCCTCTATCTAAAAG 10 1.9 6/6 12.9 2 (ATCC 29684, ATCC FtulH834 CTCTCTTAAGTCCACGAACT 10 2.7 6/6 11.6 2 15482, T58) FtulH871 TTGTGGTCTATATCCCTTGA 10 0.8 6/6 6.6 2 Y. pestis YpesYpseH844 TGAACATCGTCACGCTTAGT 10 2.2 4/4 3.5 2 (KIM D27, PP2868) YpesYpseH849 CACGCTGAACATCGTCACGC 10 3.3 4/4 5.1 2 YpesYpseH883 GGTTTGATAGAACCTGGTTT 10 0.4 4/4 0.9 2 Brucella spp. BruGH819 GGATCAGCGCGCCAATGTTG 10 0.8 4/4 1.3 2 (S2308, 06-010) BruGH842 AACGTCTTCACGGCCAACGC 10 2.6 4/4 4.4 2 BruGH925 TCCTTGGTCAGAATATAGGC 10 4.4 4/4 6.4 2 B. mallei BmalH908a CACTTCTGCCGTGAAGTGCG 10 0.2 5/5 0.5 2 (ATCC 23344, GB8) BmalH913 ACGTACACTTCTGCCGTGAA 10 1.2 5/5 2.4 2 BpseH792 CCTGACCCTGATCCAGCAGC 10 5.0 5/5 8.0 2 BpseH797 GCCCGCCTGACCCTGATCCA 10 2.6 5/5 6.4 2 B. pseudomallei BpseH792 CCTGACCCTGATCCAGCAGC 10 5.0 7/7 23.4 2 (1026b, 316a, K96243) BpseH797 GCCCGCCTGACCCTGATCCA 10 2.6 7/7 20.3 2 C. psittaci CpsiH817 AGAAGTAGACCTACGTTTTC 10 6.5 2/2 13.5 2 (84/0055) CpsiH841 ACATCATTTTTCCCAATACC 10 4.1 2/2 9.9 2 C. perfringens CperH878a ATTGTTCCAACTTGTGCTAA 10 8.3 4/4 11.1 T 2 (ATCC 13124 , CperH878b ATTGTTCCAACTTGAGCTAA 10 5.1 4/4 9.7 2 CCUG 23083) CperH883 GGGTTGATTGTTCCAACTTG 10 7.1 4/4 14.1 2 C. burnetii CburH834 CGCGTTTCGTCCCTCTCAAT 10 4.3 6/6 26.5 2 (Phase I, Nine Mile phase II, NA) CburH917 CAACACATAAATCTCCGCCT 10 2.7 6/6 24.1 4 R. prowazekii RproH802 TTATCTCCAGATTGTCCTTC 10 2.8 2/2 6.3 4 (10*07) RproH810 TACCGACATTATCTCCAGAT 10 3.6 2/2 6.9 4 RproRtypH858 GTACTTGTCCTCTTTCTACT 10 0.4 2/2 7.4 4 RproRtypH969 GTGGGCGATAATCATTAGTA 10 0.1 2/2 3.6 2 R. typhia RproRtypH858 GTACTTGTCCTCTTTCTACT 10 0.4 2/4 0.5 2 (CDC, NA) RproRtypH969 GTGGGCGATAATCATTAGTA 10 0.1 2/4 0.3 2 M. tuberculosis MtbcH817 CAGCAGCAAACCAACGTTGT 10 1.1 4/4 2.3 2 (ATCC 25177, H37rv) MtbcH824 CGCCCCGCAGCAGCAAACCA 10 3.2 4/4 12.3 2 MtbcH831 GCTTGACGCCCCGCAGCAGC 10 6.1 4/4 11.6 CTACACCGCGAAGAAGTGCT 2 B. atrophaeus [AC&HC] BgloH822 0.4 17/17 1.9 CCAATG 10 258 HC bbc1a GAGTATGGTCTGCCTATCCT NA NA 100 /258 Legend. a Rickettsia typhi, a species closely related to R. prowazekii (Brenner et al. 2005), was used to study the analytical sensitivity of the Rickettsia typhus group. AC: amplification control. HC: hybridization control. LATD: lowest amount of CABBA genome copies (GC) tested and detected. PT: probe positivity threshold for each capture probe calculated by ROC curve analyses. Nb+: number of microarray experiments with positive probe signal/number of microarray experiments performed. MPS: median probe signal when using low DNA quantity (102 or 104 genome copies). NA: non available.

159

Tableau 12. Specificity of microarray probes, results of hybridization of all CABBA and 40 other species. Probes A-S-TBantBcerH877 A-S-TBantBcerH897a A-S-TBantBcerH920a A-S-TBruGH819 A-S-TBruGH842 A-S-TBruGH925 A-S-TBmalH908a A-S-TBmalH913 A-S-TBpseH792 A-S-TBpseH797 A-S-TCpsiH817 A-S-TCpsiH841 A-S-TCbotH799 A-S-TCbotH835 A-S-TCbotH845 A-S-TCbotH878 A-S-TCbotH902 A-S-TCperH878a A-S-TCperH878b A-S-TCperH883 A-S-TCburH834 A-S-TCburH917 A-S-TFtulH793 A-S-TFtulH834 A-S-TFtulH871 A-S-TMtbcH817 A-S-TMtbcH824 A-S-TMtbcH831 A-S-TRproH802 A-S-TRproH810 A-S-TRproRtypH858 A-S-TRproRtypH969 A-S-TbYpesYpseH844 A-S-TbYpesYpseH849 A-S-TaYpesYpseH883 Cat. Species Strains A B. anthracis Ames, Vollum +++------C. botulinum types I 20:1.2, 20:2.1 ------±---+++------±- C. botulinum type II 20:3.1, 20:3.3 ------++------±- F. tularensis ATCC 29684, ATCC 15482, T58 ------+++------Y. pestis KIM D27, PP2868 ------±------±+++ B B. abortus S2308 ---+++------B. melitensis 06-010 ---+++------B. mallei ATCC 23344, GB8 ------++++------B. pseudomallei 1026b, 316a, K96243 ------±-++------C. psittaci 84/0055 ------++------C. perfringens ATCC 13124T, CCUG 23083 ------+---+++------C. burnetii Phase I, Nine Mile phase II, NA ------++------±-- R. prowazekii 10*07 ------++++±±- C M. tuberculosis ATCC 25177, H37rv ------+++------AC&HC B. atropheus CCRI-9827 ----±------±--±- OBA E. coli ATCC 43894 ------S. enterica Typhi ATCC 10749 ------ ATCC 11835 ------Staphylococcus aureus a ATCC 13301 ------Vibrio cholerae ATCC 25870 ------±------Y. enterocolitica b ATCC 9610T ------±--+ SRT Bacillus cereus ATCC 14579T +++------±±- Bacillus subtilis ATCC 6051T ------Burkholderia cepacia c ATCC 25416T ------±------Burkholderia thailandensis CCUG 48851T ------+------Chlamydia trachomatis ATCC VR-902B ------±------Chlamydophila pneumoniae c ATCC VR-1360 ------±±-- Clostridium novyi ATCC 19402 ------±------Clostridium septicum ATCC 12464T ------+------+------++----- Clostridium sporogenes CCRI-11128, CCRI-11132 ------+±------±- Clostridium tetani ATCC 19406T ------+------±±- Francisella philomiragia ATCC 25018T ------+------Mycobacterium avium c ATCC 25291T ------Mycobacterium kansasii c CCRI-5434 ------Mycobacterium terrae CCRI-5435 ------Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 T ----+------Rickettsia akari 01-02-08 ------Rickettsia conorii 9-4-08 ------±---- Rickettsia felis 30-05-08 ----+------++---- Rickettsia rickettsii a CDC ------++--- Rickettsia typhi CDC, NA ------+±++--- Wolbachia persica VR-331 ------++------Yersinia kristensenii ATCC 33638T ------+ Yersinia pseudotuberculosis ATCC 29833T ------+++ OAP ATCC 19606T ------ ATCC 9797T ------+------Corynebacterium diphteriae ATCC 27010T ------ influenza ATCC 9006 ------Klebsiella ATCC 27736 ------Legionella pneumophila ATCC 33152T ------Neisseria meningitidis ATCC 13077T ------Pseudomonas aeruginosa ATCC 39018 ------Streptococcus pneumoniae ATCC 27336 ------± Streptococcus pyogenes ATCC 12384 ------HuC Homo sapiens Hsap-11, Hsap-17 ------

Legend. The horizontal line separates CABBA (above) and other species (below). OBA, other biothreat agents of the CDC; SRT, species related to targets; OAP, other airborne pathogens; HuC, Human DNA control. Some species can be classified in more than one category: a) OBA and OAP, b) OBA and SRT, and c) SRT and OAP. +, all microarray replicates showed positive results; -, all microarray replicates showed negative results; ±, microarray replicates showed positive and negative results.

160

6 Divergence du gène codant pour le facteur d’élongation Tu des espèces du genre Yersinia

Avant propos

Divergence Among Genes Encoding the Elongation Factor Tu of Yersinia Species

COURT TITRE :

tuf gene divergence in Yersinia species

AUTEURS

Sandra Isabel1, Éric Leblanc1, Maurice Boissinot1, Dominique K. Boudreau1, Myrian Grondin1, François J. Picard1, Eric A. Martel1, Nicholas J. Parham1, Patrick S. G. Chain2,3,4, Douglas E. Bader5, Michael R. Mulvey6, Louis Bryden6, Paul H. Roy1, Marc Ouellette1 and Michel G. Bergeron1†

1 Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre hospitalier universitaire de Québec, Pavillon CHUL, Québec, Québec, Canada. 2 Chemistry, Materials, and Life Sciences Directorate, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, California. 3 Microbial Program, Joint Genome Institute, Walnut Creek, California. 4 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, Michigan. 5 Defence R&D Canada - Suffield, Medicine Hat, Alberta, Canada. 6 National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada.

† Corresponding author. Mailing address: Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, CHUQ (Pavillon CHUL), 2705 Blvd. Laurier, Québec, Québec, Canada. G1V 4G2. Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2715. E-mail: [email protected].

162

Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.

L‘étudiante a contribué à l‘élaboration du projet de recherche, a réalisé une partie des expériences de séquençage ainsi que toutes les analyses phylogénétiques publiées. L‘étudiante a écrit la première version du manuscrit et a procédé aux modifications suggérées par les coauteurs et les réviseurs.

Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.

Michel G. Bergeron, Maurice Boissinot, Éric Leblanc et François J. Picard ont élaboré et supervisé le projet de recherche.

Dominique K. Boudreau a réalisé des analyses phylogénétiques préliminaires et a supervisé le déroulement des expériences in silico préliminaires.

Myrian Grondin a réalisé le design des amorces de séquençage, une partie des expériences de séquençage ainsi que des analyses phylogénétiques préliminaires.

Eric A. Martel a apporté une expertise en phylogénie et a trouvé des solutions bio- informatiques permettant de réaliser des analyses avant-gardistes.

Patrick S. G. Chain, Nicholas J. Parham, Michel Ouellette et Paul H. Roy ont apporté leur expertise en génomique pour l‘élaboration et la réalisation du projet de recherche.

Douglas E. Bader, Michael R. Mulvey et Louis Bryden ont apporté leur expertise en microbiologie et ont procuré des souches ainsi que de l‘ADN génomique pour la réalisation du projet de recherche.

Tous les coauteurs ont révisé et commenté le manuscrit.

163

Précisions sur le statut de l’article.

L‘article au sujet de l‘évolution du gène tuf chez le genre Yersinia a été accepté pour publication dans le Journal of Bacteriology le 27 août 2008.

Isabel S., E. Leblanc, M. Boissinot, D. K. Boudreau, M. Grondin, F. J. Picard, E. A. Martel, N. J. Parham, P. S. G. Chain, D. E. Bader, M. R. Mulvey, L. Bryden, P. H. Roy, M. Ouellette, M. G. Bergeron. 2008. Divergence among genes encoding the elongation factor Tu of Yersinia Species. Journal of Bacteriology 190(22):7548-7558. [En ligne : http://www.ncbi.nlm.nih.gov]

Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse comparativement à l’article publié originalement.

Le chapitre 8 de cette thèse inclut cet article et représente la version finale, telle que publiée originalement dans le Journal of Bacteriology.

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6.1 Résumé

Le facteur d‘élongation Tu (EF-Tu), codé par le gène tuf, transporte les acides aminés-ARNt aux ribosomes durant la synthèse protéique. Les gènes tuf dupliqués (tufA et tufB), retrouvés fréquemment chez les espèces d‘Enterobacteriaceae, coévoluent habituellement par des mécanismes de conversion génique et présentent donc de grandes similarités entre eux. Toutefois, l‘analyse des gènes tuf dans notre laboratoire a révélé des copies très divergentes chez 72 souches du genre Yersinia (représentant 12 espèces). Les niveaux de divergence intragénomique entre les séquences de tufA et tufB fluctuent de 8,3 à 16,2 % pour le genre Yersinia, ce qui est significativement plus élevé que les divergences de 0,0 à 3,6 % observées chez les autres espèces d‘Enterobacteriaceae. Nous avons exploré davantage l‘évolution du gène tuf chez les Yersinia et d‘autres Enterobacteriaceae en réalisant du séquençage et des analyses phylogénétiques. Les arbres phylogénétiques construits en utilisant les séquences de tufA et tufB concaténées ont révélé que le genre Yersinia était monophylétique dans la famille des Enterobacteriaceae. De plus, les souches des Yersinia forment des clades dans le genre Yersinia qui corrèlent essentiellement avec leurs classifications phénotypiques et génotypiques. Ces analyses génétiques ont révélé une divergence inhabituelle entre les séquences de tufA et tufB des Yersinia, une caractéristique qui reste unique chez les Enterobacteriaceae séquencés et est indicative d‘une perte du phénomène de conversion génique chez tout le genre. Finalement, ces mêmes analyses ont procuré des informations phylogénétiques utiles pour la reclassification possible et l‘identification des espèces Yersinia.

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6.2 Abstract

Elongation factor Tu (EF-Tu), encoded by tuf genes, carries aminoacyl-tRNA to the ribosome during protein synthesis. Duplicated tuf genes (tufA and tufB), which are commonly found in enterobacterial species, usually coevolve via gene conversion and are very similar to one another. However, sequence analysis of tuf genes in our laboratory has revealed highly divergent copies in 72 strains spanning the genus Yersinia (representing 12 Yersinia species). The levels of intragenomic divergence between tufA and tufB sequences ranged from 8.3 to 16.2 % for the genus Yersinia, which is significantly greater than the 0.0 to 3.6 % divergence observed for other enterobacterial genera. We further explored tuf gene evolution in Yersinia and other Enterobacteriaceae by performing directed sequencing and phylogenetic analyses. Phylogenetic trees constructed using concatenated tufA and tufB sequences revealed a monophyletic genus Yersinia in the family Enterobacteriaceae. Moreover, Yersinia strains form clades within the genus that mostly correlate with their phenotypic and genetic classifications. These genetic analyses revealed an unusual divergence between Yersinia tufA and tufB sequences, a feature unique among sequenced Enterobacteriaceae and indicative of a genus-wide loss of gene conversion. Furthermore, they provided valuable phylogenetic information for possible reclassification and identification of Yersinia species.

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6.3 Introduction

The genus Yersinia, a member of the family Enterobacteriaceae, is composed of 14 known species: Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. massiliensis, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei, Y. ruckeri, and Y. similis (Merhej et al. 2008; Sprague et Neubauer 2005; Sprague et al. 2008; Sulakvelidze 2000). Three of these species are important human pathogens. Y. pestis is the etiologic agent of plague, while Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis usually cause self- limiting food-borne illnesses.

Interspecies and intraspecies genetic studies of relationships of Yersiniae based on DNA-DNA hybridization and sequencing of housekeeping genes have provided additional information not encompassed by the current classification, which is based mainly on biochemical phenotypes (Demarta et al. 2004; Dolina et al. 1995; Dolina et Peduzzi 1993; Kotetishvili et al. 2005). Thus, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, and Y. kristensenii show more genetic diversity than other species in the genus (Dolina et Peduzzi 1993; Kotetishvili et al. 2005; Neubauer et al. 2000). Indeed, more divergent strains that form their own clades could represent novel Yersinia species. Neubauer and colleagues (Neubauer et al. 2000) characterized two subspecies of Y. enterocolitica, Y. enterocolitica subsp. enterocolitica and Y. enterocolitica subsp. palearctica, that have distinctive 16S rRNA sequences. Sprague and Neubauer (Sprague et Neubauer 2005) recently proposed a novel species, Y. aleksiciae, which was differentiated from Y. kristensenii based on a comparison of a region of the 16S rRNA gene and by the presence of lysine decarboxylase activity. On the other hand, based on DNA-DNA hybridization, Y. pestis and Y. pseudotuberculosis are a single genomospecies, even though they are classified as two distinct nomenspecies (Bercovier et al. 1980). Previous analyses revealed that Y. pestis emerged within

167 the last 9,000 to 40,000 years from a Y. pseudotuberculosis predecessor (Achtman et al. 1999; Prentice et Rahalison 2007). Although Y. pestis and Y. pseudotuberculosis are members of the same genomospecies, the medical implications for these organisms preclude establishment of a new nomenclature, which could endanger laboratory workers and general public health (International Journal of Systematic Bacteriology 1981; Judicial Commission of the International Committee on Systematic Bacteriology 1985; Wayne 1986; Williams 1984). Finally, Y. ruckeri is the most distant Yersinia species, and its inclusion in the genus is still debated (Ibrahim et al. 1993; Kotetishvili et al. 2005; Sulakvelidze 2000). Clearly, further genetic studies of the genus Yersinia are required in order to clarify the phylogeny and reinforce the taxonomy of this group.

Previous studies using 16S rRNA gene sequences exposed this method's limited ability to resolve the evolutionary history of Yersinia species (Kotetishvili et al. 2005). The high level of sequence conservation among 16S rRNA genes in some bacteria and the presence of multiple copies with sequence variations in many other bacteria limit the use of these genes for taxonomic resolution of closely related microorganisms (Cilia et al. 1996; Coenye et Vandamme 2003). Sequence analysis of the tuf gene has been proven to be valuable for accurate evaluation of genetic relationships among closely related microorganisms, such as members of the genus Enterococcus and the family Enterobacteriaceae (Ke et al. 2000; Paradis et al. 2005). Elongation factor Tu (EF-Tu), encoded by tuf genes, carries aminoacyl-tRNA to the programmed ribosome during protein synthesis. The synteny of gammaproteobacterial tuf gene regions is conserved. Most enterobacterial genomes possess two copies of the tuf gene, tufA and tufB, in distinct operons, designated str and tRNA-tufB, respectively (Grunberg-Manago 1996; Lathe et Bork 2001). The fusA gene, which encodes elongation factor G, is located upstream of tufA in the str operon of gammaproteobacteria (Kondrashov et al. 2007; Lathe et Bork 2001). Four tRNA structural genes are located upstream of tufB in the tRNA-tufB operon (Grunberg-Manago 1996), and the secE and nusG

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genes are downstream of tufB in most Enterobacteriaceae (Grunberg-Manago 1996; Kondrashov et al. 2007; Lathe et Bork 2001). The tufA and tufB genes appear to evolve in concert through gene conversion events that maintain the sequence homology. A previous analysis of duplicated bacterial tuf genes revealed identical or very similar nucleic acid sequences that differ by less than 1.4 % (Lathe et Bork 2001). In contrast, the data presented here show that the tufA and tufB gene copies in 12 species of the genus Yersinia have a remarkable level of variability (up to 16 %). Chain and colleagues have observed a similar level of divergence in Y. pestis and Y. pseudotuberculosis (Chain et al. 2006). In the current work, we performed an in-depth study of tuf gene sequence variation in the genus Yersinia. The data obtained were juxtaposed with data for closely related members of the Enterobacteriaceae, and mechanisms for the remarkable diversity were examined. As described here, the divergence among the Yersinia intragenomic tuf gene sequences appears to be unique among sequenced Enterobacteriaceae, as demonstrated by phylogenetic analyses.

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6.4 Materials and methods

6.4.1 Bacterial strains

Sixty-six Yersinia strains (Tableau 13 [Table 1]) and 14 Enterobacteriaceae strains (Enterobacter agglomerans ATCC 27989, Escherichia vulneris ATCC 33821, Hafnia alvei ATCC 13337, ATCC 25927, ATCC 51873, CCRI-10616, CCRI-11829, and CCRI-16651, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Obesumbacterium proteus ATCC 12841, Plesiomonas shigelloides ATCC 14029, Serratia fonticola DSM 4576, Serratia marcescens ATCC 13880, and Yokenella regensburgei ATCC 35313) were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA) (ATCC), the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (Ghent, Belgium) (LMG 22254), the Collection du Centre de Recherche en Infectiologie (Québec, Canada) (CCRI) (http://www.wfcc.info/ccinfo/collection/by_id/861), the Culture Collection of the University of Göteborg (Göteborg, Sweden) (CCUG), the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Germany) (DSM 4576), and the Public Health Agency of Canada (Winnipeg, Canada) (ER 5307, ER 4215, ER, 5271, and 88-0762). All strains were grown overnight at 30 or 37°C under aerobic conditions on Trypticase soy agar with 5 % sheep blood.

6.4.2 DNA isolation

Bacterial DNA was isolated from mid-log-phase cultures of selected strains by using a BioSprint 15 DNA blood kit (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) automated with a KingFisher mL instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Alternatively, a GNOME DNA kit (Qbiogene Inc., Carlsbad, CA) was used (Ke et al. 2000).

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Tableau 13 [Table 1]. Yersinia strains used in this studya.

Online: [Table1]

Isolation Accession no. Species or subspecies Strain Abbreviation Country Source Year tufA tufB Y. aldovae ATCC 35236T Yad1 Czechoslovakia Drinking water NA EF113985 EF114034 ATCC 35237 Yad2 Norway Fish NA EF113986 EF114035 CCUG 26532 Yad3 Germany Feces 1983 EF113987 EF114036 CCUG 26915 Yad4 Germany Human feces NA EF113988 EF114037 Y. aleksiciae LMG 22254T Yak1 Finland Human feces NA EF113989 EF114038 Y. bercovieri 88-0762 Yb1 NA NA NA EF113990 EF114039 ATCC 43970T Yb2 France Human feces NA EF113991 EF114040 CCUG 26330 Yb3 France Food NA EF113992 EF114041 CCUG 26539 Yb4 Germany Feces 1986 EF113993 EF114042 Y. enterocolitica subsp. 8081 Ye1 United States Septicemia NA AM286415b AM286415b enterocolitica ATCC 9610T Ye2 United States Human tissue NA EF113994 EF114043 ATCC 23715 Ye3 United States Human blood 1968 EF113995 EF114044 ATCC 27729 Ye4 Belgium Human blood 1972 EF113996 EF114045 CCUG 8238 Ye5 United States Human NA EF113998 EF114047 Y. enterocolitica subsp. CCRI-905 Ye6 Canada Human blood NA EU566877 EU566908 palearctica CCRI-952 Ye7 Canada Human feces NA EU566878 EU566909 CCRI-1044 Ye8 Canada Human blood NA EU566875 EU566906 CCRI-1139 Ye9 Canada Human blood NA EU566876 EU566907 CCRI-9984 Ye10 Canada Human feces NA EU566879 EU566910 CCRI-10035 Ye11 Canada Human feces NA EU566872 EU566903 CCRI-10046 Ye12 Canada Human feces NA EU566873 EU566904 CCRI-10098 Ye13 Canada Human feces NA EU566874 EU566905 CCRI-10461 Ye14 Canada Human feces 1976 EU566881 EU566912 CCRI-10462 Ye15 Canada Human feces 1976 EU566882 EU566913 CCRI-10463 Ye16 Canada Human feces 1976 EU566883 EU566914 CCRI-10464 Ye17 Canada Human feces 1976 EU566884 EU566915 CCRI-10465 Ye18 Canada Human feces NA EU566885 EU566916 CCRI-10603 Ye19 Finland Human feces 1981 EU566886 EU566917 CCUG 4586 Ye20 Sweden Human MLN 1963 EF113997 EF114046 CCUG 18381 Ye21 Sweden Human feces 1986 EF113999 EF114048 CCUG 21476 Ye22 Sweden Human blood 1987 EF114000 EF114049 CCUG 31436 Ye23 France Bovine stools NA EF114001 EF114050 CCUG 33553 Ye24 Denmark Chinchilla 1960 EF114002 EF114051 CCUG 46041 Ye25 Sweden Human blood 2002 EU566880 EU566911

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Tableau 13 [Table 1]. Yersinia strains used in this studya (continued).

Isolation Accession no. Species or subspecies Strain Abbreviation Country Source Year tufA tufB Y. frederiksenii ATCC 29912 Yf1 Belgium Human NA EF114003 EF114052 ATCC 33641T Yf2 Denmark Sewage NA EF114004 EF114053 CCUG 8246 Yf3 NA Human NA EF114005 EF114054 CCUG 26594 Yf4 Norway Forced pork 1983 EF114006 EF114055 CCUG 26949 Yf5 Sweden Human feces 1990 EF114007 EF114056 CCUG 30114 Yf6 Sweden Human feces 1992 EF114008 EF114057 ER 5307 Yf7 NA NA NA EF114009 EF114058 Y. intermedia ATCC 29909T Yi1 NA Human urine NA EF114010 EF114059 ATCC 33647 Yi2 NA Human feces NA EF114011 EF114060 ATCC 33648 Yi3 NA Human urine NA EF114012 EF114061 Y. kristensenii ATCC 33638T Yk1 NA Human urine NA EF114013 EF114062 CCUG 26582 Yk2 Germany Sewage 1980 EF114014 EF114063 CCUG 26589 Yk3 Norway Forced meat 1983 EF114015 EF114064 CCUG 46842 Yk4 Sweden NA 2002 EF114016 EF114065 Y. mollaretii ATCC 43969T Ym1 United States Soil NA EF114017 EF114066 CCUG 26536 Ym2 Germany Human feces 1984 EF114018 EF114067 ER 4215 Ym3 NA NA NA EF114019 EF114068 Y. pestis 91001 Ype1 NA NA NA AE017042b AE017042b Antiqua Ype2 NA NA NA CP000308b CP000308b CO92 Ype3 United States Human NA AL590842b AL590842b KIM Ype4 NA Human NA AE009952b AE009952b Y. pseudotuberculosis ATCC 13979 Yps1 Sweden Hare 1952 EF114020 EF114069 ATCC 27802 Yps2 Denmark Mink 1943 EF114021 EF114070 ATCC 29833T Yps3 Turkey NA 1952 EF114022 EF114071 CCUG 7803 Yps4 Sweden Human blood 1978 EU566890 EU566921 CCUG 17342 Yps5 Sweden Hare 1951 EU566887 EU566919 CCUG 17345 Yps6 Japan Guinea 1951 EU566888 EU566920 CCUG 37903 Yps7 NA NA 1997 EU566888 EU566918 ER 5271 Yps8 NA NA NA EU566891 EU566922 IP 32953 Yps9 NA NA NA BX936398b BX936398b Y. rohdei ATCC 43380T Yro1 Germany Dog feces NA EF114023 EF114072 ATCC 43871 Yro2 Germany Dog feces NA EF114024 EF114073 ATCC 43873 Yro3 United States Human feces NA EF114025 EF114074 CCUG 26544 Yro4 Germany Human feces 1978 EF114026 EF114075 CCUG 26545 Yro5 Germany Human feces 1989 EF114027 EF114076 Y. ruckeri ATCC 29473T Yru1 United States Rainbow trout NA EF114028 EF114077 CCRI-10643 Yru2 United States Rainbow trout NA EF114029 EF114078 CCUG 21537 Yru3 NA NA NA EF114030 EF114079

Legend : a T = type strain. Abbreviations are those used in Fig. 20 [Fig. 2]. NA, not available; MLN, mesenteric lymph node. b Sequences retrieved from completed genome sequences.

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6.4.3 Primer design

The organization of the genes surrounding the tufA and tufB genes was used to design primers for specific amplification of tufA and tufB. The bacterial fusA or gammaproteobacterial and Deinococcus-Thermus nusG gene sequences in public databases were assembled in a multiple alignment using the CLUSTAL W software (version 1.83) (Chenna et al. 2003; Thompson et al. 1994). Conserved regions were identified at the 3' end of the fusA gene and at the 5' end of the nusG gene. The fusA primer (primer F1; 5'-GTICCIYTIKCIGARATGTTYGGITAYGC-3'; positions 1972 to 2000 in the Escherichia coli K-12 GenBank accession number U00096 sequence) was combined with a previously designed universal primer for the terminal region of tuf (primer T2; 5'-CCIACIGTICKICCRCCYTCRCG-3'; positions 1132 to 1154 in the E. coli K-12 sequence) (Paradis et al. 2005) to amplify tufA sequences. The nusG primer (primer N1; 5'- AACGCCTGRACGACRTACCA-3'; positions 25 to 44 in the E. coli K-12 sequence) was used in combination with a second universal primer for the 5' region of tuf (primer T1; 5'-AAYATGATIACIGGIGCIGCICARATGGA-3'; positions 271 to 299 in the E. coli K-12 sequence) (Paradis et al. 2005) to amplify tufB sequences.

6.4.4 Sequencing of tufA and tufB genes

A 1,369-bp fragment of the str operon (tufA) was amplified using the F1 and T2 primers. The N1 and T1 primers were used for specific amplification of a 1,594 bp fragment of the tufB region. The PCR mixtures contained primers F1 and T2 or primers T1 and N1 (each at a concentration of 1.0 µM), 200 µM deoxyribonucleoside triphosphates (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 3.3 µg/µl bovine serum albumin (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada), 0.06 µg/µl methoxsalen (Sigma-Aldrich Canada Ltd.), and 0.025 U/µl Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI) combined with the TaqStart antibody

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(Clontech Takara Bio, Mountain View, CA) (Kellogg et al. 1994). Decontamination of the PCR mixtures prior to PCR was performed by using a Spectrolinker model XL-1000 UV cross-linker (Spectronics Corporation, Westbury, NY). Purified genomic DNA (3 ng) was added to each PCR mixture, which was subjected to thermal cycling with a PTC-200 DNA Engine thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) as follows: 5 min at 94°C, followed by 40 cycles of 1 s at 95°C, 1 min at 60°C (for tufA) or 58°C (for tufB), and 1 min at 72°C and then a final extension for 7 min at 72°C. Amplicons were detected using 1.2 % agarose gel electrophoresis with 0.25 µg/ml of ethidium bromide in Tris-borate-EDTA buffer (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA). Amplicon sizes were verified with a 1-kb DNA ladder used as a molecular weight marker (Invitrogen, Carlsbad, CA). During all of these steps, precautions were taken to avoid carryover of amplified DNA, as previously described (Martineau et al. 2001). Amplification products were purified using gel electrophoresis (1.2 % agarose at 120 V for 1 h), followed by staining with methylene blue (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) and DNA purification with a QIAquick gel extraction kit (Qiagen), as previously described (Ke et al. 2000). Both strands of each amplicon were sequenced using an automated ABI sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) with 5 µM sequencing primer (primer F1, T1, or T2 for tufA and primer T1 or T2 for tufB). Chromatogram assembly and analysis were performed using the Sequencher 3.1 software (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).

6.4.5 Phylogenetic analyses

In order to investigate tuf genetic variability within the genus Yersinia, 72 strains were chosen to represent 12 species; greater proportions of strains of known genetically diverse species were used (Tableau 13 [Table 1]). Representative Enterobacteriaceae other than Yersinia were selected based on their close relationships at the phylogenetic level as determined by 16S rRNA gene sequence analysis (Ibrahim et al. 1993; Paradis et al. 2005). Vibrio cholerae N16961 was

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used as a nonenterobacterial outgroup. The tuf gene sequences of Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 (accession number BX950851), E. coli K- 12 (accession number U00096), Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1 (accession number BX470251), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium strain LT2 (accession number AE006468), Shigella flexneri 2a 2457T (accession number AE014073), V. cholerae O1 biovar El Tor strain N16961 (accession number AE003852), Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081, Y. pestis strains 91001, Antiqua, CO92, and KIM, and Y. pseudotuberculosis strain IP 32953 (Tableau 13 [Table 1]) were retrieved from complete genome sequences available from the GenBank database (Achtman et al. 1999; Bell et al. 2004; Chain et al. 2004; Chain et al. 2006; Duchaud et al. 2003; Heidelberg et al. 2000; Liao et al. 2003; McClelland et al. 2001; Thomson et al. 2006; Welch et al. 2002; Zhou et al. 2004). A multiple-sequence alignment of the newly generated tuf sequences and sequences from the GenBank database was constructed using the CLUSTAL W software. The alignment was verified by visual inspection using the SeqLab editor (GCG Wisconsin Package, version 10.3; Accelrys Software Inc., San Diego, CA). A 771-bp region of the tufA and tufB genes (positions 316 to 1086 in Y. pestis CO92) was analyzed. The nucleic acid sequences were translated into amino acid sequences (residues 105 to 361) using the Translate function of the GCG Wisconsin Package and then inspected with the SeqLab editor to identify variations in residues between Yersinia EF-TuA (encoded by tufA) and EF-TuB (encoded by tufB). Levels of identity between tufA and tufB nucleic acid sequences and levels of similarity between the gene products were calculated with the GAP function of the GCG Wisconsin Package (BLOSUM62 amino acid substitution matrix) (Tableau 14 [Table 2] and Tableau 15 [Table 3]) (Henikoff et Henikoff 1992). Phylogenetic analyses of comparative (Figure 19A [Figure 1A]) and concatenated (Figure 19B [Figure 1B]) tufA and tufB nucleic acid sequences were performed with the MEGA4 software (Tamura et al. 2007) in order to compute evolutionary distances using the maximum composite likelihood method (Tamura et al. 2007; Tamura et al. 2004).

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The differences in composition bias among sequences were considered in evolutionary comparisons (Tamura et Kumar 2002). One thousand bootstrap analyses were performed to estimate the robustness of the phylogenetic inference (Felsenstein 1985). A split network was computed using SplitsTree 4.8 for Unix, and genetic distances were calculated using the uncorrected P method (Huson et Bryant 2006). A split network was also constructed using the Neighbor-Net method (Bryant et Moulton 2004) and EqualAngle split transformation settings.

6.4.6 Nucleotide sequence accession numbers

Partial tufA and tufB gene sequences have been deposited in the GenBank database under the following accession numbers: Yersinia strains, EF113985 to EF114030, EU566872 to EU566891, EF114034 to EF114079, and EU566903 to EU566922 (Tableau 13 [Table 1]); E. agglomerans ATCC 27989, EU566892 and EU566923; E. vulneris ATCC 33821, EU566893 and EU566924; H. alvei ATCC 13337, ATCC 25927, ATCC 51873, CCRI-10616, CCRI-11829, and CCRI-16651, EF114031, EU566894 to EU566898, EF114080, and EU566925 to EU566929; K. pneumoniae ATCC 13883, EF114032 and EF114081; O. proteus ATCC 12841, EU566899 and EU566930; P. shigelloides ATCC 14029, EU566900 and EU566931; S. fonticola DSM 4576, EU566901 and EU566932; S. marcescens ATCC 13880, EF114033 and EF114082; and Y. regensburgei ATCC 35313, EU566902 and EU566933.

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6.5 Results

6.5.1 tufA and tufB gene similarities

All 72 Yersinia strains analyzed in this study possessed two divergent copies of the tuf gene, tufA and tufB. The levels of intragenomic identity for tufA and tufB nucleic acid sequences varied from 83.8 to 91.7 % for the 771-bp region studied (Tableau 14 [Table 2]). In contrast, 12 Enterobacteriaceae strains (E. agglomerans ATCC 27989, E. carotovora SCRI1043, E. coli K-12, E. vulneris ATCC 33821, K. pneumoniae ATCC 13883, P. luminescens TTO1, P. shigelloides ATCC 14029, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium LT2, S. fonticola DSM 4576, S. marcescens ATCC 13880, S. flexneri 2457T, and Y. regensburgei ATCC 35313), as well as a Vibrionaceae strain (V. cholerae N16961), had levels of intragenomic tufA and tufB identity ranging from 98.8 to 100.0% (Tableau 14 [Table 2]). Interestingly, all six strains of H. alvei (ATCC 13337, ATCC 25927, ATCC 51873, CCRI-10616, CCRI-11829, and CCRI-16651) and O. proteus ATCC 12841 exhibited intermediate levels of identity for tufA and tufB, which ranged from 96.4 to 97.1 %; this distinguished these strains from both Yersinia and other genera of the Enterobacteriaceae. The levels of intragenomic amino acid similarity for EF-TuA and EF-TuB exhibited a similar pattern and ranged from 94.9 to 98.1 % for Yersinia strains, from 97.3 to 98.3 % for H. alvei and O. proteus strains, and from 99.6 to 100 % for other Enterobacteriaceae strains, as well as V. cholerae N16961 (Tableau 14 [Table 2]). Amino acid sequence similarities for all EF-TuA and EF- TuB sequences from strains of Yersinia, strains of other Enterobacteriaceae, and Vibrionaceae strains were also examined (residues 105 to 361). Amino acid residues in functionally important sites are conserved in Yersinia (Kushiro et al. 1987). However, two amino acid positions that can distinguish all Yersinia tufA sequences from all tufB sequences were found (at position 167, Ile or Leu in EF- TuA and Thr in EF-TuB; at position 361, Thr in EF-TuA and Asn in EF-TuB). Therefore, these residues can be used as signature residues to discriminate

177 between the tufA and tufB genes in Yersinia strains. Residue 167 is different (Ile, Leu, or Thr) in the other genera of the Enterobacteriaceae studied, and therefore the difference between EF-TuA and EF-TuB reported here is not specific to the genus Yersinia. In contrast, EF-Tu residue 361 is conserved among most of the Enterobacteriaceae strains (Thr) investigated in this study; the exceptions are the residues in EF-TuB in the genera Yersinia (Asn), Hafnia (Asn or Ser), and Obesumbacterium (Asn).

The levels of interspecies similarity for tufA and tufB genes and their products are shown in Tableau 15 [Table 3]. Most notably, when the EF-TuA amino acid sequences of Y. rohdei were compared to those of Y. pestis and Y. pseudotuberculosis, the levels of interspecies similarity were 100 %, even though the levels of tufA nucleotide sequence identity were 95.9 to 96.4 % (Tableau 15 [Table 3]). Also, the level of EF-TuB amino acid sequence similarity for Y. aldovae, Y. enterocolitica, and Y. kristensenii was 100.0 %, while the levels of tufB nucleic acid sequence identity ranged from 90.8 to 94.7 %. These examples suggest that there is selective pressure for both the EF-TuA and EF-TuB proteins to maintain amino acid sequence stability.

6.5.2 Phylogenetic tree

A phylogenetic tree based on tufA and tufB nucleic acid sequences was constructed to study the evolution of orthologous and paralogous tuf genes in Yersinia compared to other genera in the family. Non-Yersinia enterobacterial reference strains were selected based on their relatively close relationships to the genus Yersinia at the phylogenetic level, based on 16S rRNA gene sequences. The paralogous genes of most of the non-Yersinia species are very similar and group together, forming an organismal tufA-tufB clade. On the other hand, the paralogous tuf genes of Yersinia strains showed the distinctive evolution of these strains (Figure 19A [Figure 1A]). Based on the data obtained, it is clear that

178

intragenomic tufA and tufB genes in Yersinia have diverged significantly. H. alvei and O. proteus are minor exceptions within the Enterobacteriaceae, because they form two other clades with separated tufA and tufB genes. The Yersinia, H. alvei, and O. proteus tufB interspecies distances (branch lengths) are approximately twice the interspecies distances for the tufA genes. The topology of the phylogenetic tree shows that Yersinia tufA gene sequences are monophyletic, while the tufB sequences are diphyletic. The Yersinia tufA clade branches with the Y. aldovae Y. enterocolitica Y. kristensenii tufB clade, which is separated from the tufB sequence cluster of other Yersinia species by other enterobacterial genera. However, this topology is not supported by the results of the bootstrap analysis.

6.5.3 Phylogenetic network

While phylogenetic trees describe evolutionary relationships based on mutational events, phylogenetic networks allow incorporation of more complex models of evolution, such as recombination and gene duplication (Huson et Bryant 2006). Because the evolution of tuf genes in Enterobacteriaceae was driven not only by mutation but also by gene conversion events, the Neighbor-Net method was used to visualize and analyze incompatible phylogenetic signals that are represented by edges (Bryant et Moulton 2004; Kloepper et Huson 2008). Yersinia tufA and tufB sequences were analyzed by the Neighbor-Net method implemented in the SplitsTree software (Figure 20 [Figure 2]). The Neighbor-Net analysis results support the clustering of Yersinia tufA and tufB sequences previously observed in the phylogenetic tree (Figure 19A [Figure 1A]) and display the paralogous tufA and tufB genes in Yersinia as separate clusters linked by edges near the origin. In contrast, other paralogous enterobacterial tufA and tufB sequences are grouped and linked by edges at the extremities. This indicates that there was ancestral divergence of Yersinia tufA from tufB, while in other Enterobacteriaceae the tufA and tufB genes are still coevolving. The H. alvei-O. proteus group is an exception in which there are two separate tufA and tufB clusters, which have intermediate

179 distances of the edges to the origin compared to Yersinia strains and the other Enterobacteriaceae strains. This suggests that there was more recent divergence compared to the genus Yersinia. There is no evidence that H. alvei and O. proteus tuf paralogs are still coevolving.

180

Tableau 14 [Table 2]. tuf sequence variations in Yersiniaa.

Online: [Table 2]

Intraspecies variation Intragenomic variation Nucleic acid identity Amino acid similarity Species n (%) (%) Nucleic acid identity (%) Amino acid similarity (%) tufA tufB EF-TuA EF-TuB of tufA and tufB of EF-TuA and EF-TuB Y. aldovae 4 87.4-87.7 96.1 99.9-100.0 98.8-100.0 100.0 100.0 Y. aleksiciae 1 83.8 96.1 NA NA NA NA Y. bercovieri 4 83.9 95.7-96.1 99.6-100.0 99.9-100.0 100.0 99.6-100.0 Y. enterocolitica 25 90.5-91.7 96.1-98.1 93.9-100.0 97.7-100.0 97.7-100.0 100.0 Y. frederiksenii 7 86.0-87.8 95.3-95.7 92.5-100.0 92.0-100.0 96.9-100.0 99.6-100.0 Y. intermedia 3 84.7-85.2 94.9-95.3 99.7-99.9 98.7-99.6 100.0 99.6-100.0 Y. kristensenii 4 88.8-89.9 96.1 100.0 96.9-100.0 100.0 100.0 Y. mollaretii 3 84.7-85.1 94.9-95.7 96.9-99.7 99.9-100.0 98.8-100.0 100.0 Y. pestis 4 85.7-85.9 96.5 100.0 99.9-100.0 100.0 98.8-100.0 Y. pseudotuberculosis 9 85.9-86.0 96.5 99.7-100.0 97.5-100.0 100.0 99.6-100.0 Y. rohdei 5 84.7-85.1 96.1 99.7-100.0 99.2-100.0 100.0 100.0 Y. ruckeri 3 85.2 94.9 100.0 100.0 100.0 100.0 Yersinia 72 83.8-91.7 94.9-98.1 92.5-100.0 92.0-100.0 96.9-100.0 98.8-100.0 H. alvei 6 96.4-97.0 97.7-98.8 98.4-100.0 95.3-100.0 100.0 98.4-100.0 O. proteus 1 97.1 97.3 NA NA NA NA Other Enterobacteriaceae 12 98.8-100.0 99.6-100.0 NA NA NA NA V. cholerae (outgroup) 1 99.1 99.6 NA NA NA NA

Legend :a n, number of strains; NA, not applicable.

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Tableau 15 [Table 3]. Interspecies variations of tuf sequences in Yersinia.

Online: [Table 3]

Species (no. of a strains) % tuf identity (% EF-Tu similarity) Y. Y. Y. Y. Y. Y. Y. Y. Y. Y. pseudo aldovae aleksiciae bercovieri enterocolitica frederiksenii intermedia kristensenii mollaretii pestis tuberculosis Y. rohdei Y. ruckeri 95.7-95.9 95.3-95.6 91.8-93.9 92.1-95.7 96.1-96.4 93.3-93.4 93.5-96.0 92.6-92.7 92.6-92.7 93.3-93.6 93.3-93.4 Y. aldovae (4) (100.0) (100.0) (97.3-97.7) (96.9-100.0) (99.6) (97.7) (98.8-100.0) (97.7) (97.7) (97.7) (97.7) 84.7-85.2 99.4-99.5 92.6-94.6 93.8-97.8 95.9-96.0 94.0 (97.7) 96.1-97.9 92.6 (97.7) 92.6 92.6-92.9 93.4 Y. aleksiciae (1) (97.3) (100.0) (97.3-97.7) (96.9-100.0) (99.6) (98.8-100.0) (97.7) (97.7) (97.7) 85.2-85.6 94.8-94.9 92.1-94.2 93.3-97.8 95.5-95.7 93.5-93.6 96.0-97.9 92.1-92.2 92.1-92.2 92.1-92.5 92.9-93.0 Y. bercovieri (4) (96.9-97.3) (99.6-100.0) (97.3-97.7) (96.9-100.0) (99.6) (97.7) (98.8-100.0) (97.7) (97.7) (97.7) (97.7) 92.3-93.4 84.7-85.1 85.5-85.9 91.6-95.7 91.6-93.7 93.9-98.1 92.1-95.1 94.4-95.3 94.2-95.3 94.0-95.6 94.0-94.9 Y. enterocolitica (25) (100.0) (97.3) (96.9-97.3) (97.3-99.2) (96.9-98.1) (97.7-100.0) (97.3-98.4) (98.1-99.6) (98.1-99.6) (98.1-99.6) (98.1-98.8) 86.3-87.7 86.1-87.8 86.5-87.7 87.9-88.8 92.1-95.7 92.5-94.2 93.1-96.1 91.1-96.4 91.1-96.4 91.6-97.4 92.3-95.2 Y. frederiksenii (7) (97.3-97.7) (99.2-99.6) (98.8-99.6) (97.3-97.7) (96.5-99.6) (97.3-97.7) (96.9-100.0) (97.7-99.6) (97.7-99.6) (97.7-99.6) (97.7-98.8) 85.2-86.3 85.0-85.2 83.9-84.4 85.9-87.0 89.1-90.8 93.8-94.0 94.0-96.2 92.3-92.5 92.3-92.5 93.0-93.4 93.9-94.0 Y. intermedia (3) (97.3-97.7) (99.2-99.6) (98.8-99.6) (97.3-97.7) (99.2-100.0) (98.1) (98.4-99.6) (97.3) (97.3) (97.3) (97.3) 90.8-92.5 83.9-84.7 83.7-84.6 92.1-94.7 85.9-87.5 84.6-86.0 93.6-94.4 94.0 93.8-94.0 94.0-94.3 94.3 Y. kristensenii (4) (100.0) (97.3) (96.9-97.3) (100.0) (97.3-97.7) (97.3-97.7) (97.7-98.4) (98.1) (98.1) (98.1) (98.1) 87.4-87.9 87.8 87.7-87.8 88.8-89.4 85.0-86.6 84.8-85.0 86.8-87.9 92.9-94.0 92.9-94.0 92.7-93.6 93.8-94.7 Y. mollaretii (3) (96.9) (98.4) (98.1-98.4) (98.8) (98.4-98.8) (98.4-98.8) (98.8) (97.7-98.4) (97.7-98.4) (97.7-98.4) (97.7-98.4) 83.7-84.2 86.0-86.1 85.5-85.7 83.4-84.6 86.6-86.9 85.6-86.0 83.7-85.0 83.4-83.5 99.7-100.0 96.1-96.4 95.7 Y. pestis (5) (96.9) (98.8) (98.4-98.8) (96.9) (99.2-99.6) (98.8-99.2) (96.9) (98.1) (100.0) (100.0) (99.2) Y. pseudo- 83.9-84.8 86.0-86.3 84.8-85.9 83.5-84.8 86.5-87.7 85.5-86.3 83.7-85.2 83.7-84.0 97.5-99.9 95.9-96.4 95.5-95.7 tuberculosis (4) (96.9) (98.4-98.8) (98.1-98.8) (96.9) (98.8-99.6) (98.4-99.2) (96.9) (98.1) (99.6- (100.0) (99.2) 86.6-87.3 86.6-87.2 87.2-87.8 86.5-87.2 90.7-91.8 88.6-89.1 84.3-85.5 85.1-85.5 85.1-85.6100.0) 85.3-85.9 96.6-96.9 Y. rohdei (5) (97.3) (99.2) (98.8-99.2) (97.3) (99.6-100.0) (99.2-99.6) (97.3) (98.4) (99.6) (99.2-99.6) (99.2) 84.8-85.1 83.5 (98.4) 82.4-82.5 83.9-84.2 85.2-85.6 83.9-84.8 83.8-84.4 81.3 (97.7) 84.0-84.2 84.2-84.6 85.2-85.3 Y. ruckeri (3) (97.3) (98.4) (97.3) (98.4-98.8) (98.4-98.8) (97.3) (98.4) (98.1-98.4) (98.4)

Legend : a The data above the diagonal are for tufA and EF-TuA sequences, and the data below the diagonal are for tufB and EF-TuB sequences.

182

A

183

B

Figure 19 [Figure 1]. Phylogenetic trees for tufA and tufB nucleic acid sequences from Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains.

Online: [Figure 1] (A) Phylogenetic tree based on a comparison of tufA and tufB nucleic acid sequences. Yersinia tufA and tufB tree branches are blue and red, respectively. (B) Phylogenetic tree based on concatenated tufA and tufB nucleic acid sequences. Yersinia concatenated tufA and tufB tree branches are purple. The tuf gene branches for other enterobacterial species and V. cholerae (outgroup) are green and black, respectively. Evolutionary distances were computed using the maximum composite likelihood method of the MEGA4 software. The topological accuracy of the tree was evaluated using 1,000 bootstrap replicates.

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Figure 20 [Figure 2]. Phylogenetic network for tufA and tufB nucleic acid sequences from Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains. Online: Figure 20 [Figure 2] The Neighbor-Net graph was computed by using the SplitsTree 4.8 software. Yersinia tufA and tufB branches are blue and red, respectively. The tuf gene branches of other enterobacterial species and V. cholerae (outgroup) are green and black, respectively. Abbreviations for Yersinia strains are shown in Tableau 13 [Table 1]. Abbreviations for non-Yersinia strains are as follows: Ea, E. agglomerans ATCC 27989; Eca, E. carotovora subsp. atroseptica SCRI1043; Eco, E. coli K-12; Ev, E. vulneris ATCC 33821; Ha1, H. alvei ATCC 13337; Ha2, H. alvei ATCC 25927; Ha3, H. alvei ATCC 51873; Ha4, H. alvei CCRI-10616; Ha5, H. alvei CCRI-11829; Ha6, H. alvei CCRI-16651; Kp, K. pneumoniae ATCC 13883; Op, O. proteus ATCC 12841; Pl, P. uminescens subsp. laumondii TTO1; Ps, P. shigelloides ATCC 14029; ST, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium strain LT2; Sfo, S. fonticola DSM 4576; Sm, S. marcescens ATCC 13880; Sfl, S. flexneri 2a strain 2457T; Yre, Y. regensburgei ATCC 35313; and Vc, V. cholerae O1 biovar El Tor strain N16961.

185

6.5.4 Yersinia species

The remarkable evolution of tuf genes in Yersinia has resulted in genetic variations that can be used to infer species clustering. Therefore, phylogenetic analyses of tuf genes in Yersinia provide information for reclassification and identification of Yersinia species. In order to enhance the number of sites analyzed simultaneously, we constructed a phylogenetic tree using concatenated tufA and tufB sequences (Figure 19B [Figure 1B]). This tree showed the monophyletic nature of the genus Yersinia, its separation from other genera of the Enterobacteriaceae, and Yersinia species clustering, all of which were strongly supported by bootstrap analysis.

Based on the analysis of concatenated tufA and tufB sequences, Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. rohdei, and Y. ruckeri strains form distinct clusters that correlate with the current species classification (Figure 19B [Figure 1B]). Y. aleksiciae type strain LMG 22254 is clearly distinct from the Y. kristensenii strain cluster.

Nucleic acid sequences and tree topology showed the genotypic diversity of Y. enterocolitica (Figure 19B [Figure 1B]). Y. enterocolitica concatenated tufA and tufB sequences form two distant clades supported by a high bootstrap value (99%). One clade includes 17 strains of Y. enterocolitica subsp. palearctica, which were designated group I (CCRI-905, CCRI-952, CCRI-1044, CCRI-1139, CCRI-9984, CCRI-10035, CCRI-10046, CCRI-10098, CCRI-10461, CCRI-10462, CCRI-10463, CCRI-10464, CCRI-10465, CCRI-10603, CCUG 4586, CCUG 21476, and CCUG 33553) and were isolated in Canada, Finland, Sweden, and Denmark (Tableau 13 [Table 1]). The other clade contains two subgroups. One subgroup includes five Y. enterocolitica subsp. enterocolitica strains (8081, ATCC 9610, ATCC 23715, ATCC 27729, and CCUG 8238) isolated in the United States and Belgium, while the other subgroup contains two strains of Y. enterocolitica subsp. palearctica designated group II (CCUG 18381 and CCUG 31436) isolated in France and Sweden (Neubauer et al. 2000) (Tableau 13 [Table 1]).

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Y. frederiksenii, which also is known to be a genotypically heterogeneous species, consists of three concordant clades that correlate with three of the four previously characterized genomic groups (genomic groups 1a, 1b, and 3; no genomic group 2 reference strain was used in this study) (Ursing et Aleksic 1995). The intraspecies distances (branch length) of Y. frederiksenii ATCC 33641 (genomic group 1a type strain) from Y. frederiksenii CCUG 26594 (genomic group 1b) and Y. frederiksenii ER 5307 (unknown genomic group) are greater than those between strains of other Yersinia species. Y. frederiksenii strains ATCC 29912, CCUG 26949, and CCUG 30114 (all genomic group 3 strains) cluster with strain CCUG 8246 (unknown genomic group). The concatenated tuf gene tree clearly separates the genomic group 3 clade from genomic groups 1a and 1b. Y. pestis and Y. pseudotuberculosis strains cluster together based on the concatenated tuf gene tree and thus are presented as a unique genomospecies, as previously revealed by DNA-DNA hybridization analysis (Bercovier et al. 1980). Finally, although the taxonomy of Y. ruckeri is controversial, its tuf gene sequences cluster with those of other Yersinia species and support the conclusion that this species should be included in the genus (Dolina et Peduzzi 1993; Ibrahim et al. 1993; Kotetishvili et al. 2005; Sulakvelidze 2000). In addition, the tufA and tufB genes of each Y. ruckeri strain exhibit a level of identity (85.2%) which is in the range observed for other Yersinia species (Tableau 14 [Table 2]).

187

6.6 Discussion

In this study, sequence analyses revealed that intragenomic tufA and tufB genes are divergent in 12 Yersinia species. In comparison, 12 non-Yersinia enterobacterial species investigated contained two intragenomic tuf genes which were very similar to one another. However, the intragenomic tuf sequences of the members of the H. alvei-O. proteus clade exhibited an intermediate level of divergence. The tufA and tufB genes have been described previously as genes evolving in concert through gene conversion events which maintain their remarkable level of nucleotide sequence identity (Abdulkarim et Hughes 1996; Arwidsson et Hughes 2004; Hughes 2000; Lathe et Bork 2001). Gene conversion driven by homologous recombination mechanisms explains the high levels of similarity usually observed for duplicated tuf genes of members of the Enterobacteriaceae, as shown in S. enterica serovar Typhimurium (Abdulkarim et Hughes 1996). Conversely, the remarkable divergence between the tufA and tufB genes in Yersinia strains may result from (i) the acquisition of an exogenous tuf gene by horizontal transfer, (ii) the gradual or spontaneous loss of effective conversion mechanisms (due either to defects in the mechanism or the level of dissimilarity of sequences), or (iii) either loss of function or neofunctionalization of one EF-Tu copy.

High levels of divergence (21 to 32%) of intragenomic tuf gene sequences have been observed previously for 11 enterococcal species, while six other enterococcal species contained only one tuf gene (Ke et al. 2000). Acquisition of an exogenous copy of the tuf gene by the ancestor of the 11 Enterococcus species having two tuf gene copies was the mechanism proposed to explain the presence of two different intragenomic tuf genes (Ke et al. 2000). In contrast, the organization of tuf genetic regions shows that in Enterobacteriaceae containing two tuf gene copies an ancestral duplication of tuf gene was conserved (Kondrashov et al. 2007; Lathe et

188

Bork 2001). The organization of the tuf genetic regions (fusA-tufA and tufB-secE- nusG) in E. coli K-12 is conserved in Yersinia and all of the other Enterobacteriaceae genomes studied here except the P. uminescens subsp. laumondii strain TTO1 genome (Huson et Bryant 2006). The latter strain has an unusual chimeric gene order (fusA-tuf-secE-nusG), whereas the other copy of the tuf gene is located downstream from tRNA genes. This abnormal arrangement of the tuf regions in strain P. luminescens subsp. laumondii TTO1 can be explained by recent homologous recombination between the tufA and tufB genes, resulting in the observed chimeric configurations. The conserved synteny of the tuf gene neighborhood in the genus Yersinia, as well as in the other Enterobacteriaceae studied here, also shows that there was conservation of two ancestral duplicated copies.

The higher levels of divergence between tufA and tufB sequences in the 12 Yersinia species examined in this study suggest that gene conversion became inefficient or ceased to function in the ancestor that gave rise to the modern Yersinia species. This could have been due to loss of specific or general gene conversion mechanisms or simply to sequence divergence beyond the divergence that these mechanisms allowed. Gene conversion mechanisms require recombination between very similar sequences. It has been proposed that recombination events played a large role in the evolution and emergence of Y. pestis from Y. pseudotuberculosis and that active genome rearrangements in the form of inversions or translocations are responsible for a highly plastic genome with noticeable strain-to-strain variation (Chain et al. 2004; Deng et al. 2002; Parkhill et al. 2001). Moreover, multiple copies of the 16S and 23S rRNA genes are also influenced by gene conversion mechanisms (Hashimoto et al. 2003; Mattatall et Sanderson 1996). The seven copies of the 16S and 23S rRNA genes in Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081, Y. pestis strains 91001, Antiqua, CO92, and KIM, and Y. pseudotuberculosis IP 32953 have very similar nucleic acid sequences. Therefore, some gene conversion mechanisms are likely to still be

189 operational in the genus Yersinia. More general models, in which the conversion frequency gradually declines as genes diverge via the accumulation of point mutations, have been studied previously (Walsh 1987). The tufA and tufB genes in the ancestor of the genus Yersinia could have mutated gradually, and thereby affected conversion mechanisms. The genes would then have evolved independently in parallel. This mutational evolution model could explain the high and relatively wide intragenomic tuf nucleic acid sequence divergence in Yersinia species, which ranges from 8.3 to 16.2%. To our knowledge, this is the first example of possible tuf gene conversion inefficiency. The intermediate level of sequence variation between intragenomic tuf genes in the H. alvei-O. proteus clade could be an attenuated result of the same phenomenon. The 16S rRNA gene sequence analysis performed by Ibrahim and colleagues (Ibrahim et al. 1993) showed that H. alvei is the member of the Enterobacteriaceae most closely related to the genus Yersinia, but it was not included in this genus. However, the number of non-Yersinia Enterobacteriaceae included in this study was relatively small.

In the tuf mutational evolution model, it is possible that one of the two Yersinia EF- Tu copies ceased to function or evolved to perform new functions. The levels of similarity between EF-TuA and EF-TuB amino acid sequences are significantly lower in Yersinia (94.9 to 98.1%) than in other Enterobacteriaceae (99.6 to 100%). The H. alvei-O. proteus group exhibits intragenomic tuf nucleic acid sequence divergence lower than that observed for Yersinia. However, amino acid sequence divergence is similar for the two groups (97.3 to 98.3% similarity). Thus, the nucleic acid sequence divergence resulted in significant amino acid sequence changes. Although evolution of new functions for duplicate genes may be rare (Lynch et Conery 2000), EF-Tu proteins have been linked to functions other than elongation, including chaperone properties (Caldas et al. 1998). EF-Tu residue 361 (Thr) is conserved among all of the Enterobacteriaceae strains investigated here except for EF-TuB in the genera Yersinia (Asn), Hafnia (Asn or Ser), and Obesumbacterium (Asn). However, this amino acid residue could not be linked to known functional

190

activities of the protein (Berchtold et al. 1993; Kushiro et al. 1987). Although tuf DNA sequences are divergent in Yersinia species, it appears that some EF-Tu proteins have identical or very similar sequences. The tufA nucleic acid sequences of Y. rohdei and the Y. pseudotuberculosis / Y. pestis genomospecies were clearly divergent, but the EF-TuA amino acid sequences of these organisms were identical. Also, the levels of tufB nucleic acid sequence identity for Y. aldovae, Y. enterocolitica, and Y. kristensenii ranged from 90.8 to 94.7%, while the levels of EF-TuB amino acid sequence similarity were 100.0%. These observations suggest that functional convergent evolution occurred in these species for EF-TuA and EF- TuB. The recently described genome sequence of Y. pestis Nepal516 revealed a 58-amino-acid C-terminal deletion in EF-TuB that might have led to a nonfunctional copy of this elongation factor (Chain et al. 2006). However, such a truncated tufB gene has been found only in this isolate and may be a strain-specific mutation that occurred since the original isolation. There is no evidence suggesting that a loss of EF-Tu function occurred in other Yersinia strains. Differential expression studies of tufA and tufB, as well as gene inactivation mutagenesis analysis, may help elucidate specific functions of EF-TuA and EF-TuB under different physiological conditions. Han and colleagues (Han et al. 2007) recently compiled microarray data from numerous studies investigating the expression of Y. pestis strain 201 genes under 25 different stress conditions in vitro. Cold shock stimulation appears to downregulate tufB, while the presence of an antibacterial peptide (polymyxin B) apparently upregulates tufA expression.

This study of the genus Yersinia was performed with a wide diversity of strains representing 12 Yersinia species. The evolution of tuf genes in Yersinia has resulted in genetic variations that provide a high level of resolution within the genus and represent a powerful tool for the classification of the Yersinia genomospecies. Moreover, the greater divergence between the tufA and tufB genes in Yersinia species than in other Enterobacteriaceae helps distinguish the genus Yersinia from other genera. The concatenated tuf gene tree was used to infer species clustering

191

(Figure 19B [Figure 1B]). tuf-based genetic analyses of Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. rohdei, and Y. ruckeri showed that their distinctive clades correlate with the phenotypic classification.

Y. enterocolitica strains show great diversity genetically as well as phenotypically. Studies of Y. enterocolitica based on DNA-DNA hybridization, 16S rRNA gene sequences, and G+C content have subdivided Y. enterocolitica into two subspecies (Y. enterocolitica subsp. enterocolitica and Y. enterocolitica subsp. palearctica) (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2000; Neubauer et al. 2000). A more recent study, based on DNA-DNA microarray hybridization with the genome of strain Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081, separated Y. enterocolitica strains into three groups (high-pathogenicity, low- pathogenicity, and nonpathogenic clades) (Howard et al. 2006). Here, the tuf results also support the biodiversity of Y. enterocolitica strains. Great evolutionary distances separate Y. enterocolitica subsp. palearctica (group I) strains from Y. enterocolitica subsp. enterocolitica and Y. enterocolitica subsp. palearctica (group II) strains. Currently, it is not clear what caused the deviation in tree topology for these two clades. The divergence could not be completely explained by geographical biodiversity as both clusters contain strains isolated in North America and Europe. Based on tuf data, Y. enterocolitica subsp. palearctica strains were clearly separated into two groups (groups I and II). All 13 Y. enterocolitica strains isolated in Canada were members of Y. enterocolitica subsp. palearctica and did not cluster with strains of Y. enterocolitica subsp. enterocolitica isolated in the United States. Instead, the Canadian isolates clustered with other Y. enterocolitica subsp. palearctica strains isolated in Europe. Our analyses, based on tuf genes, showed that there are three groups of Y. enterocolitica, thus supporting previous findings (Howard et al. 2006).

Y. frederiksenii includes different genomic groups (genomic groups 1a, 1b, 2, 3, and 4) that are sufficiently different as determined by DNA-DNA hybridization,

192

multilocus enzyme electrophoresis, and 16S rRNA gene and gyrB sequence analyses to belong to at least three different Yersinia genomospecies (Demarta et al. 2004; Dolina et al. 1995; Dolina et Peduzzi 1993; Ursing et Aleksic 1995). Our tufA and tufB phylogenetic analyses also showed that there are three distinct clades that could represent three distinct genomospecies and thus further support the need to reevaluate the classification of these organisms.

Finally, inclusion of Y. ruckeri in the genus Yersinia has been controversial ever since this organism was classified. The Y. ruckeri G+C content is more similar to those of Yersinia species even though DNA relatedness showed that Y. ruckeri strains were only 30% related to Yersinia and Serratia species (Sulakvelidze 2000). Analysis based on multilocus sequence typing identified Y. ruckeri as the most distant species of the genus (Kotetishvili et al. 2005). However, a previous study based on 16S rRNA gene sequence analysis supported inclusion of Y. ruckeri in the genus Yersinia (Ibrahim et al. 1993). Phylogenetic trees (Fig. 1) and a network (Figure 20 [Figure 2]) of tufA and tufB gene sequences, as well as the level of divergence, showed that Y. ruckeri should be included in the genus Yersinia and thus supported its current classification.

In summary, to our knowledge, this is the first report of significant divergence between tufA and tufB genes throughout a genus. The high level of divergence between tufA and tufB genes in Yersinia strains is a characteristic hallmark of this genus. Here, the evolution of tuf genes in Yersinia was used to investigate species clustering, and the results provided information useful for reclassification and identification. Our analyses suggest that further investigation using a wider diversity of strains, as well as other genetic analyses, is needed to clarify the taxonomic classification of Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, and Y. ruckeri. tufA and tufB genes could also be genetic targets that are useful for identification of Yersinia species for diagnostic purposes. In this study, we provide the first evidence, to our knowledge, supporting the hypothesis that there may be gene

193 conversion inefficiency for the tuf gene encoding EF-Tu. It is not known whether the genetic drift seen in duplicated tuf genes in Yersinia resulted in evolution of a new function or resulted in the nonfunctionalization of the product of one copy of the gene. Determining the reason for the natural selection of the high level of divergence between tufA and tufB sequences in Yersinia requires further investigation and could lead to a better understanding of multigene family evolution in bacteria.

194

6.7 Acknowledgments

We thank Martine Bastien, France Bégin, Ève Bérubé, Karel Boissinot, Xavier Bouhy, Gilles Chabot, Natalie Clairoux, Richard Giroux, Marie-Claude Hélie, Jean- Luc Simard, Viridiana Sistek, and Mario Vaillancourt for their technical support.

This research project was funded by the CBRN Research and Technology Initiative under project CRTI-0154RD, Genome Canada, Genome Québec, Infectio Diagnostic Inc., and the Canadian Institutes of Health Research (grant PA-15586). S.I. received scholarships from the Fondation Dr George Phénix (Montréal, Canada) and the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (Montréal, Canada). P.S.G.C. received a scholarship from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Ottawa, Canada).

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6.8 References

Abdulkarim, F. et D. Hughes. 1996. Homologous recombination between the tuf genes of Salmonella typhimurium. Journal of molecular biology 260(4): 506-522. Achtman, M., K. Zurth, G. Morelli, G. Torrea, A. Guiyoule et E. Carniel. 1999. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96(24): 14043-14048. Arwidsson, O. et D. Hughes. 2004. Evidence against reciprocal recombination as the basis for tuf gene conversion in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of molecular biology 338(3): 463-467. Bell, K.S., M. Sebaihia, L. Pritchard, M.T. Holden, L.J. Hyman, M.C. Holeva, N.R. Thomson, S.D. Bentley, L.J. Churcher, K. Mungall, R. Atkin, N. Bason, K. Brooks, T. Chillingworth, K. Clark, J. Doggett, A. Fraser, Z. Hance, H. Hauser, K. Jagels, S. Moule, H. Norbertczak, D. Ormond, C. Price, M.A. Quail, M. Sanders, D. Walker, S. Whitehead, G.P. Salmond, P.R. Birch, J. Parkhill et I.K. Toth. 2004. Genome sequence of the enterobacterial phytopathogen Erwinia carotovora subsp. atroseptica and characterization of virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(30): 11105-11110. Berchtold, H., L. Reshetnikova, C.O. Reiser, N.K. Schirmer, M. Sprinzl et R. Hilgenfeld. 1993. Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365(6442): 126-132. Bercovier, H., H. Mollaret, J. Alonso, J. Brault, G. Fanning, A. Steigerwalt et D. Brenner. 1980. Intra- and interspecies relatedness of Yersinia pestis by DNA hybridization and its relationship to Yersinia pseudotuberculosis. Current microbiology 4(4): 225-229. Bryant, D. et V. Moulton. 2004. Neighbor-net: an agglomerative method for the construction of phylogenetic networks. Molecular biology and evolution 21(2): 255-265. Caldas, T.D., A. El Yaagoubi et G. Richarme. 1998. Chaperone properties of bacterial elongation factor EF-Tu. The Journal of biological chemistry 273(19): 11478-11482. Chain, P.S., E. Carniel, F.W. Larimer, J. Lamerdin, P.O. Stoutland, W.M. Regala, A.M. Georgescu, L.M. Vergez, M.L. Land, V.L. Motin, R.R. Brubaker, J. Fowler, J. Hinnebusch, M. Marceau, C. Medigue, M. Simonet, V. Chenal-Francisque, B. Souza, D. Dacheux, J.M. Elliott, A. Derbise, L.J. Hauser et E. Garcia. 2004. Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole-genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(38): 13826-13831. Chain, P.S., P. Hu, S.A. Malfatti, L. Radnedge, F. Larimer, L.M. Vergez, P. Worsham, M.C. Chu et G.L. Andersen. 2006. Complete genome sequence of Yersinia pestis strains Antiqua and Nepal516: evidence of gene reduction in an emerging pathogen. Journal of bacteriology 188(12): 4453-4463. Chenna, R., H. Sugawara, T. Koike, R. Lopez, T.J. Gibson, D.G. Higgins et J.D. Thompson. 2003. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic acids research 31(13): 3497-3500. Cilia, V., B. Lafay et R. Christen. 1996. Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA sequences, and their effect on phylogenetic analyses at the species level. Molecular biology and evolution 13(3): 451-461.

196

Coenye, T. et P. Vandamme. 2003. Intragenomic heterogeneity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes. FEMS microbiology letters 228(1): 45-49. Demarta, A., S. De Respinis, M. Dolina et R. Peduzzi. 2004. Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of 16s rDNA and gyrB genes sequence analyses. FEMS microbiology letters 238(2): 423-428. Deng, W., V. Burland, G. Plunkett, 3rd, A. Boutin, G.F. Mayhew, P. Liss, N.T. Perna, D.J. Rose, B. Mau, S. Zhou, D.C. Schwartz, J.D. Fetherston, L.E. Lindler, R.R. Brubaker, G.V. Plano, S.C. Straley, K.A. McDonough, M.L. Nilles, J.S. Matson, F.R. Blattner et R.D. Perry. 2002. Genome sequence of Yersinia pestis KIM. Journal of bacteriology 184(16): 4601-4611. Dolina, M., V. Gaia et R. Peduzzi. 1995. Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of ribotyping and DNA-DNA hybridization. Contributions to microbiology and immunology 13: 140-144. Dolina, M. et R. Peduzzi. 1993. Population genetics of human, animal, and environmental Yersinia strains. Applied and environmental microbiology 59(2): 442-450. Duchaud, E., C. Rusniok, L. Frangeul, C. Buchrieser, A. Givaudan, S. Taourit, S. Bocs, C. Boursaux-Eude, M. Chandler, J.F. Charles, E. Dassa, R. Derose, S. Derzelle, G. Freyssinet, S. Gaudriault, C. Medigue, A. Lanois, K. Powell, P. Siguier, R. Vincent, V. Wingate, M. Zouine, P. Glaser, N. Boemare, A. Danchin et F. Kunst. 2003. The genome sequence of the entomopathogenic bacterium Photorhabdus luminescens. Nature biotechnology 21(11): 1307-1313. Felsenstein, J. 1985. Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap. Evolution 39(4): 783-791. Grunberg-Manago, M. 1996. Regulation of the expression of aminoacyltRNA synthetases and translation factors, 2nd ed., vol. 2. ASM Press, Washington, DC. Han, Y., J. Qiu, Z. Guo, H. Gao, Y. Song, D. Zhou et R. Yang. 2007. Comparative transcriptomics in Yersinia pestis: a global view of environmental modulation of gene expression. BMC microbiology 7: 96. Hashimoto, J.G., B.S. Stevenson et T.M. Schmidt. 2003. Rates and consequences of recombination between rRNA operons. Journal of bacteriology 185(3): 966-972. Heidelberg, J.F., J.A. Eisen, W.C. Nelson, R.A. Clayton, M.L. Gwinn, R.J. Dodson, D.H. Haft, E.K. Hickey, J.D. Peterson, L. Umayam, S.R. Gill, K.E. Nelson, T.D. Read, H. Tettelin, D. Richardson, M.D. Ermolaeva, J. Vamathevan, S. Bass, H. Qin, I. Dragoi, P. Sellers, L. McDonald, T. Utterback, R.D. Fleishmann, W.C. Nierman, O. White, S.L. Salzberg, H.O. Smith, R.R. Colwell, J.J. Mekalanos, J.C. Venter et C.M. Fraser. 2000. DNA sequence of both chromosomes of the pathogen Vibrio cholerae. Nature 406(6795): 477-483. Henikoff, S. et J.G. Henikoff. 1992. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89(22): 10915-10919. Howard, S.L., M.W. Gaunt, J. Hinds, A.A. Witney, R. Stabler et B.W. Wren. 2006. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. Journal of bacteriology 188(10): 3645-3653. Hughes, D. 2000. Co-evolution of the tuf genes links gene conversion with the generation of chromosomal inversions. Journal of molecular biology 297(2): 355-364. Huson, D.H. et D. Bryant. 2006. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular biology and evolution 23(2): 254-267.

197

Ibrahim, A., B.M. Goebel, W. Liesack, M. Griffiths et E. Stackebrandt. 1993. The phylogeny of the genus Yersinia based on 16S rDNA sequences. FEMS microbiology letters 114(2): 173- 177. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2000. Validation of publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSEM, validation list no. 75. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50(4): 1415-1417. International Journal of Systematic Bacteriology. 1981. Validation of the Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSB: List No. 7. International Journal of Systematic Bacteriology 31(3): 382-383. Judicial Commission of the International Committee on Systematic Bacteriology. 1985. Opinion 60: Rejection of the Name Yersinia pseudotuberculosis subsp. pestis (van Loghem) Bercovier et al. 1981 and Conservation of the Name Yersinia pestis (Lehmann and Neumann) van Loghem 1944 for the Plague Bacillus. International Journal of Systematic Bacteriology 35(4): 540. Ke, D., M. Boissinot, A. Huletsky, F.J. Picard, J. Frenette, M. Ouellette, P.H. Roy et M.G. Bergeron. 2000. Evidence for horizontal gene transfer in evolution of elongation factor Tu in enterococci. Journal of bacteriology 182(24): 6913-6920. Kellogg, D.E., I. Rybalkin, S. Chen, N. Mukhamedova, T. Vlasik, P.D. Siebert et A. Chenchik. 1994. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. BioTechniques 16(6): 2888-2893. Kloepper, T.H. et D.H. Huson. 2008. Drawing explicit phylogenetic networks and their integration into SplitsTree. BMC evolutionary biology 8: 22. Kondrashov, F.A., T.A. Gurbich et P.K. Vlasov. 2007. Selection for functional uniformity of tuf duplicates in gamma-proteobacteria. Trends in genetics 23(5): 215-218. Kotetishvili, M., A. Kreger, G. Wauters, J.G. Morris, Jr., A. Sulakvelidze et O.C. Stine. 2005. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. Journal of clinical microbiology 43(6): 2674-2684. Kushiro, M., M. Shimizu et K. Tomita. 1987. Molecular cloning and sequence determination of the tuf gene coding for the elongation factor Tu of Thermus thermophilus HB8. European journal of biochemistry 170(1-2): 93-98. Lathe, W.C., 3rd et P. Bork. 2001. Evolution of tuf genes: ancient duplication, differential loss and gene conversion. FEBS letters 502(3): 113-116. Liao, X., T. Ying, H. Wang, J. Wang, Z. Shi, E. Feng, K. Wei, Y. Wang, X. Zhang, L. Huang, G. Su et P. Huang. 2003. A two-dimensional proteome map of Shigella flexneri. Electrophoresis 24(16): 2864-2882. Lynch, M. et J.S. Conery. 2000. The evolutionary fate and consequences of duplicate genes. Science 290(5494): 1151-1155. Martineau, F., F.J. Picard, D. Ke, S. Paradis, P.H. Roy, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2001. Development of a PCR assay for identification of staphylococci at genus and species levels. Journal of clinical microbiology 39(7): 2541-2547. Mattatall, N.R. et K.E. Sanderson. 1996. Salmonella typhimurium LT2 possesses three distinct 23S rRNA intervening sequences. Journal of bacteriology 178(8): 2272-2278. McClelland, M., K.E. Sanderson, J. Spieth, S.W. Clifton, P. Latreille, L. Courtney, S. Porwollik, J. Ali, M. Dante, F. Du, S. Hou, D. Layman, S. Leonard, C. Nguyen, K. Scott, A. Holmes, N. Grewal, E. Mulvaney, E. Ryan, H. Sun, L. Florea, W. Miller, T. Stoneking, M. Nhan, R. Waterston et R.K. Wilson. 2001. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature 413(6858): 852-856.

198

Merhej, V., T. Adekambi, I. Pagnier, D. Raoult et M. Drancourt. 2008. Yersinia massiliensis sp. nov., isolated from fresh water. International journal of systematic and evolutionary microbiology 58(Pt 4): 779-784. Neubauer, H., S. Aleksic, A. Hensel, E.J. Finke et H. Meyer. 2000. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. International journal of medical microbiology 290(1): 61-64. Paradis, S., M. Boissinot, N. Paquette, S.D. Belanger, E.A. Martel, D.K. Boudreau, F.J. Picard, M. Ouellette, P.H. Roy et M.G. Bergeron. 2005. Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding elongation factor Tu and F-ATPase beta-subunit. International journal of systematic and evolutionary microbiology 55(Pt 5): 2013-2025. Parkhill, J., B.W. Wren, N.R. Thomson, R.W. Titball, M.T. Holden, M.B. Prentice, M. Sebaihia, K.D. James, C. Churcher, K.L. Mungall, S. Baker, D. Basham, S.D. Bentley, K. Brooks, A.M. Cerdeno-Tarraga, T. Chillingworth, A. Cronin, R.M. Davies, P. Davis, G. Dougan, T. Feltwell, N. Hamlin, S. Holroyd, K. Jagels, A.V. Karlyshev, S. Leather, S. Moule, P.C. Oyston, M. Quail, K. Rutherford, M. Simmonds, J. Skelton, K. Stevens, S. Whitehead et B.G. Barrell. 2001. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature 413(6855): 523-527. Prentice, M.B. et L. Rahalison. 2007. Plague. Lancet 369(9568): 1196-1207. Sprague, L.D. et H. Neubauer. 2005. Yersinia aleksiciae sp. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology 55(Pt 2): 831-835. Sprague, L.D., H.C. Scholz, S. Amann, H.J. Busse et H. Neubauer. 2008. Yersinia similis sp. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology 58(Pt 4): 952-958. Sulakvelidze, A. 2000. Yersiniae other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, and Y. pestis: the ignored species. Microbes and infection 2(5): 497-513. Tamura, K., J. Dudley, M. Nei et S. Kumar. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution 24(8): 1596-1599. Tamura, K. et S. Kumar. 2002. Evolutionary distance estimation under heterogeneous substitution pattern among lineages. Molecular biology and evolution 19(10): 1727-1736. Tamura, K., M. Nei et S. Kumar. 2004. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(30): 11030-11035. Thompson, J.D., D.G. Higgins et T.J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic acids research 22(22): 4673-4680. Thomson, N.R., S. Howard, B.W. Wren, M.T. Holden, L. Crossman, G.L. Challis, C. Churcher, K. Mungall, K. Brooks, T. Chillingworth, T. Feltwell, Z. Abdellah, H. Hauser, K. Jagels, M. Maddison, S. Moule, M. Sanders, S. Whitehead, M.A. Quail, G. Dougan, J. Parkhill et M.B. Prentice. 2006. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081. PLoS genetics 2(12): e206. Ursing, J. et S. Aleksic. 1995. Yersinia frederiksenii, a genotypically heterogeneous species with few differential characteristics. Contributions to microbiology and immunology 13: 112-116. Walsh, J.B. 1987. Sequence-dependent gene conversion: can duplicated genes diverge fast enough to escape conversion? Genetics 117(3): 543-557. Wayne, L.G. 1986. Actions of the Judicial Commission of the International Committee on Systematic Bacteriology on Requests for Opinions Published in 1983 and 1984. International Journal of Systematic Bacteriology 36(2): 357-358.

199

Welch, R.A., V. Burland, G. Plunkett, 3rd, P. Redford, P. Roesch, D. Rasko, E.L. Buckles, S.R. Liou, A. Boutin, J. Hackett, D. Stroud, G.F. Mayhew, D.J. Rose, S. Zhou, D.C. Schwartz, N.T. Perna, H.L. Mobley, M.S. Donnenberg et F.R. Blattner. 2002. Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99(26): 17020-17024. Williams, J.E. 1984. Proposal to Reject the New Combination Yersinia pseudotuberculosis subsp. pestis for Violation of the First Principle of the International Code of Nomenclature of Bacteria. International Journal of Systematic Bacteriology 34(2): 268-269. Zhou, D., Z. Tong, Y. Song, Y. Han, D. Pei, X. Pang, J. Zhai, M. Li, B. Cui, Z. Qi, L. Jin, R. Dai, Z. Du, J. Wang, Z. Guo, J. Wang, P. Huang et R. Yang. 2004. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and the proposal of a new biovar, microtus. Journal of bacteriology 186(15): 5147-5152.

200

7 Discussion générale

7.1 Retour sur les objectifs de recherche

Le projet de recherche présenté dans cette thèse doctorale s‘est inscrit dans le cadre de demandes de la Défense nationale et de la GRC pour optimiser la réponse au bioterrorisme. Une des lacunes principales est la détection robuste des agents biologiques, comme discuté dans l‘introduction de cette thèse. L‘objectif principal de ce projet doctoral était donc de développer des outils rapides et efficaces pour pallier ces difficultés. Le premier projet avait pour objectif de développer une méthode de préparation d‘analytes facile à exécuter et potentiellement utilisable sur le terrain. La seconde phase a porté sur l‘évaluation d‘un module de lyse utrasonique pouvant être décontaminé et transporté de façon sécuritaire. Le troisième objectif était de développer une méthode rapide de détection des 12 principaux agents bactériens aéroportés sur puce à ADN. Le dernier projet portait sur l‘étude de la divergence inattendue du gène tuf chez le genre Yersinia. Ce présent chapitre permettra d‘explorer davantage la contribution scientifique et les perspectives qui découlent de ces projets de recherche.

202

7.2 Méthode de préparation d’analytes à partir d’échantillons de poudres suspectes ou environnementaux

7.2.1 Étude des échantillons fréquemment recueillis

Depuis les évènements de 2001, les organisations en sécurité publique doivent fréquemment intervenir lors de la découverte de poudres suspectes (Hall 2008; La Scola et al. 2003; Leask et al. 2003; Santerre 2012; Tengelsen et al. 2002). De nombreux types d‘échantillons doivent être analysés pour évaluer s‘ils présentent une menace réelle (Leask et al. 2003; Wills et al. 2008). Lim et al. (2005) avancent que les matrices des échantillons poudreux peuvent présenter des défis lors du développement de techniques de détection sans toutefois avoir de référence à ce sujet (Lim et al. 2005). Cette affirmation semble basée sur les interférences documentées causées par certains échantillons cliniques et alimentaires (Garcia et al. 2002; Morata et al. 1998) ainsi que leurs expériences. En effet, plusieurs articles documentent l‘efficacité de leurs techniques de préparations d‘analytes à partir d‘échantillons poudreux sans présenter l‘interférence initiale de ces poudres sur la PCR (Dauphin et al. 2009; Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). Nous avons donc été les premiers à publier une étude détaillant autant l‘interférence sur la PCR d‘un éventail d‘échantillons poudreux (23 au total) (Chapitre 3). Dans les conditions testées, nous avons montré que certains échantillons ne provoquaient pas d‘interférence avec la lyse bactérienne et/ou PCR alors que d‘autres inhibaient complètement la détection. Les informations rapportées pourront donc guider les personnes ayant à analyser ces composés, particulièrement, mais non exclusivement, dans le contexte du bioterrorisme. Elles montrent de plus la nécessité d‘effectuer une préparation d‘analytes face à un échantillon poudreux inconnu pour retirer les composés interférant avec les analyses PCR ultérieures.

203

7.2.2 Art antérieur et objectifs

La plupart des techniques de préparation d‘ADN bactérien débutent par la lyse des bactéries dans la matrice et ensuite procèdent à la concentration et la purification de l‘ADN (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). Ces méthodes utilisent en général de petites quantités d‘échantillons, e.g. ≤ 5 mg (Luna et al. 2003) ou une anse comble de 1 µl (Rose et al. 2011), et/ou des dilutions (RAZORTM EX, Idaho Technology Inc.) afin de diminuer l‘impact des contaminants interférant avec la détection. Nous avons décidé d‘innover en séparant premièrement par filtration les bactéries de la matrice environnementale, puis en procédant subséquemment à la lyse bactérienne afin d‘extraire l‘ADN dans de l‘eau propre (Chapitre 3). Dans notre modèle, les échantillons prélevés dans l‘environnement sont composés de substances solubles et/ou insolubles lorsqu‘ils sont incorporés dans un tampon aqueux. Par des principes de filtration différentielle, nous avons récolté les spores de B. globigii sous-espèce globigii dans de l‘eau propre compatible avec la PCR et d‘autres types d‘analyses. Un avantage considérable de cette stratégie par rapport à l‘art antérieur est la possibilité de conserver une fraction de l‘échantillon pour la mise en culture à des fins judiciaires et de procéder à des analyses plus détaillées, e.g. spectre de masse et anticorps. Par exemple, le pH du liquide de récupération du BioCapture et du BioBadge ne permettait pas de remettre en culture le virus de la fièvre aphteuse (Ryan et al. 2009).

La procédure DARE dans son ensemble permettait de retirer les effets inhibiteurs sur la PCR amenés par une variété d‘échantillons (23 au total), (Figure 28, Annexe 2), de récupérer en moyenne 51 % des spores et, finalement, d‘en extraire leur ADN. Nous avons publié l‘étude d‘extraction d‘ADN avec la plus grande variété de poudres identifiées (Dauphin et al. 2009; Luna et al. 2003; Poore et al. 2009; Rose et al. 2011; Wielinga et al. 2011). De plus, la quantité de poudre (20 mg) traitée dans notre étude se compare avantageusement à d‘autres présentées précédemment dans la littérature (≤5 mg) (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011).

204

D‘autre part, la méthode actuellement recommandée par l‘USAMRIID pour le traitement d‘échantillons cliniques pouvant contenir des agents biologiques est considérée comme étant complexe d‘utilisation et cet institut a donc cherché une technique plus simple (Shipley et al. 2012). La méthode de référence, le QIAamp Mini Purification (Qiagen, Germantown, Maryland, États-Unis), permet la détection de 5 × 102 CFU/ml de B. anthracis resuspendus dans l‘eau alors que la méthode à l‘étude, le QuickGene-Mini80 (Fujifilm, Tokyo, Japon), ne permet que la détection de 5 × 103 CFU/ml. La procédure DARE combinée au BD GenomeTM Lysis Kit a permis la détection de 5 × 103 CFU/ml avec 20 des 23 types d‘échantillons poudreux évalués. Ceci nous permet de comparer les performances relatives de notre méthode à celles rapportées par Shipley et al. (2012), quoique ces derniers n‘aient toutefois pas évalué l‘effet des poudres qui pourraient diminuer leur sensibilité (Shipley et al. 2012).

7.2.3 Les filtres sélectionnés et perspectives

Le choix de la taille des pores des filtres servant à la séparation de spores bactériennes de matrices poudreuses ou autres a été excessivement important. Ces filtres ont été sélectionnés afin d‘optimiser la récupération de B. anthracis et ont été évalués avec un simulant, soit B. atrophaeus sous-espèce globigii. De plus, nous avons montré expérimentalement que plusieurs poudres insolubles utilisées comme canulars ou additifs sont captées dans le préfiltre. Tel que discuté dans notre article, les tailles des pores des filtres pourraient bénéficier d‘ajustement pour détecter d‘autres agents biologiques, ou encore pour traiter d‘autres types d‘échantillons. La Figure 25 (Annexe 2) montre les diamètres de nombreux pathogènes aéroportés, de certaines poudres et d‘autres référentiels. Elle permet donc d‘illustrer les fenêtres d‘utilisation des filtres ayant différents diamètres de pores. On peut également constater que tel que suggéré dans notre article, un filtre de 0,22 µm pourrait être plus avantageux pour capter des bactéries de plus petits diamètres telles que F. tularensis. Un élément qui n‘a toutefois pas été

205 discuté dans notre article est le fait que le filtre de capture (pore = 0,45 µm) ait été choisi favorablement au filtre de 0,22 µm puisque ce dernier nécessitait une plus grande force pour l‘aspiration (étape 7, Figure 13, Chapitre 3). L‘automatisation pourrait permettre d‘utiliser des filtres ayant des pores de plus petits diamètres, comme 0,22 µm, puisque la pression pourrait être ajustée. L‘automatisation, avec par exemple un système de pompes à seringue, pourrait également permettre de réaliser cette méthode plus aisément sur le terrain.

D‘autre part, la microscopie a permis d‘observer les filtres utilisés et la pénétration des spores bactériennes. Deux figures qui n‘ont pas été présentées dans notre article permettent de visualiser ces filtres. Tout d‘abord, la structure des filtres a été étudiée en microscopie optique et la légende de 1 µm, approximant la taille des spores de B. anthracis, offre un référentiel (Figure 26, Annexe 2). Vous noterez que cette légende est si difficile à voir que la microscopie optique conventionnelle ne permettait pas d‘observer directement la pénétration des spores bactériennes dans les filtres. Par conséquent, nous avons mis au point une stratégie utilisant la microscopie confocale qui a permis d‘étudier en trois dimensions la pénétration des spores fluorescentes dans les filtres (Figure 27, Annexe 2). De nombreux types de filtres sont couramment utilisés pour nous protéger, masques ou purificateurs d‘air, et leur performance doit être évaluée. Pour les industriels, notre méthode de microscopie pourrait permettre l‘observation directe des micro- organismes dans les filtres plutôt que l‘interprétation des tests fonctionnels.

7.2.4 Perspectives : traitement d’autres échantillons

La technique de préparation d‘analytes présentée par Luna et al. (2003) a l‘avantage de traiter les échantillons poudreux et les écouvillons nasaux (Luna et al. 2003). L‘analyse de ces derniers peut permettre d‘identifier les personnes contaminées. Ceci est avantageux dans le contexte du bioterrorisme afin de rationner l‘utilisation des traitements prophylactiques. Il serait donc intéressant

206

d‘évaluer si la procédure DARE pourrait être efficace pour faire le traitement d‘un échantillon clinique, par exemple le mucus nasal.

7.2.5 Transportabilité et automatisation

L‘emploi de filtres fixés sur seringue a permis de grandement simplifier les étapes de cette procédure afin de faciliter les manipulations. La trousse DARE est constituée de 10 items commercialement disponibles, totalisant environ 10 $ (Figure 23, Annexe 2). Il n‘a donc pas été nécessaire de concevoir de nouveaux outils pour gérer les fluides. D‘autres équipes peuvent de ce fait préparer leurs propres trousses à moindre coût. En plus d‘être transportable, le matériel utilisé est jetable, ce qui pourrait faciliter le travail en zone contaminée. La procédure DARE (2 minutes) et l‘extraction d‘ADN (7 minutes) peuvent être exécutées en moins de 10 minutes. Le protocole fourni en annexe (Figure 24, Annexe 2) illustre d‘ailleurs la simplicité des différentes étapes de cette méthodologie, ce qui accroît également son potentiel pour une automatisation future.

207

7.3 Système modulaire de lyse ultrasonique pour l’extraction d’acides nucléiques et le transfert d’échantillon

7.3.1 Art antérieur et direction du projet

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour lyser les bactéries et se divisent en trois types : chimique, enzymatique et mécanique (Figure 8). La technique d‘extraction d‘ADN utilisée dans notre article précédent (Chapitre 3) était basée sur la lyse aux billes par le BD GeneOhm™ Lysis Kit (BD Diagnostics 2009). Nous avions sélectionné cette technique puisque, dans une étude antérieure, elle a produit les meilleurs rendements d‘ADNg comparativement à cinq autres méthodes rapides (Aldous et al. 2005). Toutefois, lors de la conceptualisation d‘un système automatisé, l‘ajout de microbilles de verre peut causer des contraintes. En effet, les valves de sortie et d‘entrée peuvent être bloquées par les billes. D‘autre part, l‘ajout de réactifs chimiques pour la lyse peut nécessiter des étapes subséquentes de purification des analytes. De plus, les réactifs enzymatiques pour la lyse peuvent nécessiter des moyens de conservation, des délais d‘incubation et des chambres de réaction. Nous avons donc décidé de nous affranchir de ces contraintes et de développer un système pouvant lyser directement les spores de Bacillus sans billes ou réactifs. Cette alternative méthodologique devait de plus permettre un rendement d‘extraction d‘ADNg comparable au BD GeneOhm™ Lysis Kit.

7.3.2 L’interface en acier inoxydable, un avantage

Nous avons décidé de développer un système de lyse par sonication sans utiliser de billes ou de réactifs chimiques. Il fallait donc trouver une interface qui permettrait de transmettre efficacement l‘énergie des ultrasons vers la suspension de spores afin de ne pas utiliser des billes. L‘acier inoxydable semblait un matériel à considérer puisqu‘il présentait plusieurs propriétés intéressantes : résistance,

208

impédance acoustique, haute température de fusion et antioxydation. Nous avons donc réussi à obtenir des rendements d‘ADNg comparables à ceux du BD GeneOhm™ Lysis Kit avec un temps de lyse de seulement 45 secondes, et ce, sans utiliser de billes. Ceci est un avantage important comparativement à l‘art antérieur (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Geissler et al. 2011; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). D‘autre part, l‘ADN est fragmenté entre 400 et 5 000 pb, ce qui est d‘intérêt dans l‘éventualité où des techniques d‘hybridation d‘ADN ou de séquençage soient par la suite utilisées (Larguinho et al. 2010).

7.3.3 Transfert sécuritaire du FULM et perspective

Le design du FULM a considéré certaines contraintes lors des procédures d‘intervention dans le contexte du bioterrorisme. Le FULM que nous avons développé est fermé lors de la sonication afin d‘éviter de produire des aérosols. De plus, le Module fluidique de lyse ultrasonique développé peut être sorti de la zone contaminée en respectant les procédures de décontamination et d‘emballage de sécurité biologique recommandées. C‘est pourquoi le FULM peut ensuite être transféré vers une enceinte de sécurité biologique. Cette stratégie offre donc la possibilité de conserver les équipements plus fragiles et plus coûteux dans la zone sécurisée. Le prototype que nous avons développé pourrait être amélioré à certains égards : automatisation de l‘injection de l‘échantillon, de la récupération de l‘analyte et de l‘ajustement de la sonde à l‘interface d‘acier inoxydable. Il serait donc intéressant de tester la lyse de B. anthracis ainsi que d‘autres pathogènes dans un prototype amélioré du FULM.

209

7.4 Développement d’un essai sur puce à ADN pour la détection et l’identification des agents bactériens associés au bioterrorisme

7.4.1 Art antérieur et objectifs de recherche

Nous nous étions volontairement limités aux agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme étant pathogènes humains. Ces bactéries, ou leurs toxines, peuvent pénétrer l‘organisme par les voies respiratoires lorsqu‘inhalées, causant des maladies graves (Tableau 4). Les méthodes génotypiques alternatives à la culture des pathogènes dangereux, tels que les agents du bioterrorisme, peuvent être plus rapides et présentent moins de risques pour le personnel de laboratoire. Plusieurs essais basés sur l‘analyse d‘acides nucléiques ont déjà été développés à ces fins. Ces essais sont toutefois souvent limités par le nombre de cibles microbiennes détectées simultanément (1 à 5) (Deshpande et al. 2010; Janse et al. 2012; Rachwal et al. 2012; Tomioka et al. 2005; Yang et al. 2012). En effet, la biodiversité (Tableau 3, Chapitre 1) des agents biologiques constitue un défi de taille pour développer un test qui en détecte plusieurs. Certaines méthodes, par exemple le PLEX-ID (Sampath et al. 2012) et le Film Array Surveillance (Idaho Technology Inc. 2011), se sont toutefois démarquées en détectant davantage de cibles, respectivement 16 et 17. Ces deux techniques permettent l‘exécution de nombreuses réactions PCR séparées individuellement en simultané. Ceci divise donc l‘échantillon diminuant ainsi la capacité de détection de faibles nombres de copies d‘ADNg des cibles. Pour pallier ce désavantage, le FilmArray Surveillance réalise une étape d‘amplification spécifique avant la division afin d‘augmenter le nombre de copies de matériel génétique. Toutefois, tel qu‘expliqué au Chapitre 1, il n‘y a pas de publication scientifique révisée par des pairs validant cet essai.

Nous avons choisi d‘adopter une approche différente en utilisant un gène conservé afin d‘amplifier dans un seul tube tous les agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Par la suite, une hybridation entre les amplicons produits et leurs

210

sondes de capture spécifiques sur puces à ADN a été utilisée afin d‘effectuer l‘identification microbienne (Miller et Tang 2009; Tulpan 2010).

7.4.2 Défi de design : la diversité biologique

La diversité biologique des agents bactériens sélectionnés dans ce projet, représentant quatre embranchements bactériens, posait un défi de taille. Au début du projet, nous avons considéré deux stratégies différentes, soit l‘analyse de leurs gènes de virulence ou de leurs gènes conservés. La seconde approche a été favorisée puisqu‘elle permettait d‘amplifier les 12 agents bactériens que nous avons sélectionnés dans un seul tube. Elle a nécessité une étude approfondie de leurs gènes conservés afin de les détecter simultanément. Pour ce faire, j‘ai analysé deux gènes conservés au cours de l‘évolution essentielle à leur survie : atpD et tuf. Le gène atpD encode la sous-unité B de la F-ATP-synthase qui contient le site catalytique de l‘enzyme servant à produire de l‘ATP. Le gène tuf encode quant à lui le facteur d‘élongation Tu (EF-Tu) qui a pour fonction principale le transport des amino-acyl-ARNt au ribosome durant l‘élongation protéique. La variabilité génétique des gènes tuf et atpD a été étudiée entre les bactéries liées au bioterrorisme et celles proches phylogénétiquement. Au début du projet, en 2006, le grand nombre de séquences disponibles dans notre base de données pour le gène tuf, comparativement à celui pour le gène atpD, a penché en sa faveur. Par la suite, le gène tuf a montré in silico un compromis intéressant entre la conservation de certaines régions pour le design d‘amorces et la divergence des séquences orthologues pour le design de sondes d‘identification (Figure 18, Chapitre 5). Le choix du gène pourrait être différent s‘il était maintenant à refaire, considérant l‘agrandissement phénoménal des bases de données de séquences publiques.

L‘amplification de type large spectre présente certains désavantages (Petti 2007). Premièrement, les amorces dégénérées souvent utilisées peuvent limiter la

211 sensibilité analytique. De plus, des contaminants contenus dans les réactifs ou les échantillons peuvent être amplifiés au dépend de l‘espèce bactérienne d‘intérêt à identifier. C‘est pourquoi nous avons fait une adaptation de la stratégie d‘amplification à large spectre dite biaisée. Celle-ci avait pour objectif d‘amplifier de façon préférentielle les cibles bactériennes par rapport aux autres espèces pouvant contaminer les solutions ou les échantillons. Les expériences réalisées in vitro ont montré l‘amplification de façon sensible (102) des bactéries ciblées étant membres de quatre embranchements différents, i.e. Actinobacteria, Chlamydiae, Firmicutes et Proteobacteria (Tableau 11, Chapitre 5). Toutefois, d‘autres espèces bactériennes pouvaient être amplifiées par notre méthode. Afin de limiter les niveaux d‘ADN contaminant, nous avons utilisé de hauts standards de préparation des réactifs et des échantillons ainsi que de manipulation. Malgré ces précautions et notre stratégie d‘amplification à large spectre biaisée, un certain niveau d‘amplification de l‘ADN contaminant pouvait être observé. Les préparations d‘agents biologiques sous forme poudreuse contiennent généralement de grandes quantités de cet agent (section 5.6.4). Le phénomène de compétition possible dans notre essai CABBA serait donc en faveur des cibles bactériennes présentent en quantité 800 fois plus élevées que la sensibilité analytique estimée pour R. prowazekii.

7.4.3 Les avantages, limitations et perspectives de l’essai CABBA

L‘avantage majeur de l‘essai CABBA est de pouvoir dépister plusieurs agents biologiques simultanément dans un court délai (75 minutes). La procédure d‘amplification et de marquage combinée (55 minutes), la production d‘ADNsb (5 minutes) et le protocole d‘hybridation (15 minutes) ont tous été optimisés pour être les plus efficaces et rapides. Notre essai se compare donc favorablement à cet égard à d‘autres méthodes nécessitant de 100 à 240 minutes (Deshpande et al. 2010; Janse et al. 2012; Sampath et al. 2012) même si la spécificité est limitée à l‘espèce génétique. En effet, l‘utilisation du gène tuf ne permettait toutefois pas la

212

distinction entre B. anthracis et B. cereus ou entre Y. pestis et Y. pseudotuberculosis. D‘autres tests PCR plus spécifiques ont déjà été développés à ces fins (Irenge et Gala 2012; Persing 2011; Wielinga et al. 2011). Ce type de test de confirmation devrait donc être réalisé à la suite de l‘obtention d‘un résultat positif. Il est d‘ailleurs recommandé de réaliser plusieurs tests avant de confirmer la présence d‘un agent biologique (Lindler et al. 2005).

L‘amplification d‘ADN de l‘essai CABBA réalisée par un cyclage thermique pourrait être adaptée à réaction isotherme. Ce dernier type d‘amplification serait favorable puisqu‘il simplifierait le design de l‘instrumentation et pourrait accélérer la procédure. En effet, les récents développements dans les technologies d‘amplification isotherme rapide (p. ex. 8 minutes pour détecter 19 copies d‘ARN virale) sont prometteurs et pourraient permettre d‘optimiser grandement les délais de détection (Euler et al. 2012).

Finalement, il serait intéressant d‘évaluer une procédure de détection complète, de l‘extraction d‘ADN bactérien contenu dans des poudres à l‘identification. Des spores de B. atrophaeus, notre contrôle positif d‘amplification et d‘hybridation, pourraient également être utilisées à titre de contrôle de lyse. Par contre, la validation future de la détection des agents ciblés devra être effectuée en niveau de confinement BSL-3, complexifiant grandement l‘expérimentation. L‘essai CABBA pourrait être transposé dans un système d‘analyse total, ce qui faciliterait sa validation en BSL-3. Finalement, la détection de nombreux pathogènes du bioterrorisme simultanément et automatisée pourrait devancer les méthodes classiques de culture et permettre aux laboratoires de santé publique de répondre rapidement à une attaque bioterroriste réduisant ainsi considérablement son impact.

213

7.4.4 Puces à ADN, perspectives

La technologie des puces à ADN a ouvert la voie pour l‘analyse multiparamétrique à grande échelle. Miller et Tang (Miller et Tang 2009) concluent leur article en disant que les puces à ADN auront un rôle important pour le diagnostic des maladies infectieuses. En effet, le clinicien pourrait donc tester simultanément tous les agents étiologiques connus pour causer un syndrome clinique particulier (Bissonnette et Bergeron 2010; Raoult et al. 2004). Cette technologie n‘a toutefois toujours pas pris d‘assaut les laboratoires cliniques de microbiologie. La Figure 21 compare le nombre de publications annuelles au sujet de quatre technologies différentes d‘analyses des acides nucléiques (microarrays, PCR en temps réel, séquençage de nouvelle génération et PCR digitale) en lien ou non à la microbiologie. On peut y voir (Figure 21a) que de 2000 à 2007, le nombre de publications annuelles au sujet des microarrays augmentait. J‘ai d‘ailleurs commencé mon projet de recherche (chapitre 5) en 2006 alors que nous étions emportés par cette vague. À partir de 2007, le nombre de publications au sujet des microarrays a atteint un plateau. Cette tendance est similaire lorsque l‘on observe seulement celles liées plus spécifiquement à la microbiologie. Ce plafonnement pourrait s‘expliquer par le coût élevé, la complexité d‘exécution et d‘analyse de ce type de procédures, et également par les défis de production (Procop 2007). Lorsqu‘on compare à la PCR en temps réel (Figure 21b), une technologie plus simple et éprouvée, on constate que de 2000 à 2011, le nombre annuel de publications liées ou non à la microbiologie continu à croître de façon linéaire. Cette technologie est de plus en plus utilisée dans les laboratoires de microbiologie clinique (Procop 2007)(Bissonnette et al. 2010). Comme présenté au chapitre 1 (section 1.4.3.3.3), une limitation majeure de la PCR pour la détection des agents biologiques, et même le diagnostic, est le nombre de cibles pouvant être analysé simultanément. Une technologie prenant davantage d‘ampleur ces dernières années est le séquençage de nouvelle génération (Figure 21c). La pente ascendante abrupte récente (2008 à 2011) montre l‘intérêt et l‘accessibilité

214

croissante pour cette technologie suggérée par plusieurs (Didelot et al. 2012; Hu et al. 2011). Celle-ci demande toutefois des équipements et des procédures d‘analyse complexes (Torok et Peacock 2012; Treangen et Salzberg 2012). La PCR digitale, une nouvelle venue permettant des milliers de réactions PCR séparées en simultané (microgouttelettes en suspension ou micropuits) (Hindson et al. 2011), est également en croissance. Toutefois, le nombre de publications à ce sujet est encore limité. L‘approximation de la proportion des articles en lien à la microbiologie et la totalité des articles au sujet des trois technologies varient. La PCR en temps réel (1:6) présente le meilleur ratio alors que les deux autres sont comparables (microarray (1 :15) et séquençage de nouvelle génération (1 :17)). Cette observation suggère que la PCR en tempsréel ne s‘est pas encore fait déclassée en ce qui a trait à la microbiologie par ces autres technologies.

215

Figure 21. Le nombre de publications au sujet des technologies basées sur l’analyse des acides nucléiques. La technologie a) du microarray, b) de la PCR en temps réel c) du séquençage de nouvelle génération d) et de la PCR digitale (barres bleues). Le nombre de celles-ci étant lié à la microbiologie ou aux maladies infectieuses (lignes rouges). Figure inspirée de (Miller et Tang 2009).

216

7.5 Divergence du gène codant pour le facteur d’élongation Tu des espèces du genre Yersinia

7.5.1 Découverte inattendue et objectifs

L‘analyse des données de tuf, notre gène cible pour l‘article présenté au Chapitre 5, nous a permis de découvrir qu‘il avait évolué très différemment chez le genre Yersinia. En effet, son séquençage en laboratoire a révélé qu‘il existait un niveau de divergence (8,3 à 14,3%) de ce gène chez toutes les espèces du genre Yersinia décrites en 2007. Ceci était totalement inattendu puisque les gènes tuf dupliqués chez les entérobactéries, tufA et tufB, coévoluent généralement et sont donc très similaires (100 – 98,6 %) grâce à des mécanismes de conversion génique (Lathe et Bork 2001). De plus, une étude phylogénétique réalisée préalablement par Paradis et al. (2005) présentait l‘évolution des Enterobactériaceae en se basant sur le gène tuf (Paradis et al. 2005). Cette étude ne montrait pas la divergence de ce gène chez le genre Yersinia puisque tel qu‘illustré à la Figure 29 (Annexe 3), seule la copies tufB avait été analysée. La divergence inattendue m‘a amenée à étudier davantage cette anomalie en séquençant ces deux gènes chez de nombreuses souches représentant toutes les espèces de Yersinia décrites jusqu‘en 2007 ainsi que d‘autres membres de la famille des Enterobacteriaceae à titre de contrôle.

7.5.2 Résultats obtenus à la suite de la publication de l’article

Après ces travaux, cinq nouvelles espèces appartenant au genre Yersinia ont été décrites : Y. entomophaga, Y. massiliensis, Y. nurmii, Y. pekkaneii et Y. similis (Hurst et al. 2011; Merhej et al. 2008; Murros-Kontiainen et al. 2011; Souza et al. 2011; Sprague et al. 2008). J‘ai donc refait des analyses phylogénétiques pour étudier la divergence des gènes tuf intragénomiques chez deux des nouvelles espèces. Les séquences intragénomiques de tufA et tufB de Y. massiliensis et

217

Y. similis ont divergé de façon similaire à celles des autres espèces du genre Yersinia (

Figure 30, Annexe 2). Ceci supporte notre conclusion suggérant que cette divergence, caractéristique du genre Yersinia, s‘est produite avant la spéciation.

7.5.3 Analyses phylogénétiques de pointe

J‘avais recueilli tellement de données qu‘il a fallu modifier des logiciels de bio- informatique pour qu‘ils puissent analyser autant de matériel en les adaptant sur un super calculateur ayant de multiples processeurs en parallèle. Nous n‘avons pas discuté dans notre article que nous avions comparé une méthode de maximum likelihood (ML) (Figure 31, Annexe 3) au maximum composite likelihood (MCL). Nous avons montré que les MCL donnaient une réponse très similaire au ML et que ces deux méthodes ne permettaient pas d‘expliquer l‘origine de la divergence du gène tuf à l‘étude. J‘ai donc décidé d‘investiguer plus en détails les raisons expliquant le phénomène de divergence des gènes tuf chez le genre Yersinia. Tel qu‘expliqué dans notre article, d‘autres gènes possédant de multiples copies ont été analysés. Les Figure 32 et Figure 33 (Annexe 3) montrent que les séquences intragénomiques des gènes 16S rDNA et 23S rDNA chez le genre Yersinia sont similaires (Figure 32 et Figure 33, Annexe 3). La divergence du gène tuf chez ce genre était donc exceptionnelle et les arbres phylogénétiques conventionnels ne permettaient pas de résoudre cette énigme. Les réseaux phylogénétiques représentaient en 2007 de nouvelles approches permettant de visualiser des changements évolutifs plus complexes que l‘acquisition ponctuelle de mutations. Les réseaux phylogénétiques nous ont permis de visualiser l‘évolution divergente des gènes tuf paralogues chez les Yersinia et leur coévolution chez les autres espèces étudiées (contrôles). Notre article de 2008 présente des analyses phylogénétiques avancées permettant de mieux comprendre un phénomène rarement observable, la divergence des gènes

218

dupliqués. Nous avons démontré non seulement que les réseaux phylogénétiques, encore peu utilisés à l‘époque, pouvaient servir à analyser l‘évolution des espèces, mais aussi à comprendre les évènements sous-jacents régissant l‘évolution de gènes dupliqués.

7.5.4 L’évolution du vivant, perspectives

La duplication génique est un phénomène très important pour l‘évolution du vivant. Les gènes dupliqués peuvent acquérir de nouvelles fonctions potentiellement avantageuses pour leur descendance et la façon dont ils divergent est clé pour comprendre la façon dont ils évoluent. L‘évolution des gènes dupliqués tuf chez le genre Yersinia est donc un modèle d‘étude attrayant pour observer et comprendre ces phénomènes. Notre étude a d‘ailleurs été citée dans un article de revue traitant de la duplication génique chez les procaryotes intitulée « Genesis, effects and fates of repeats in prokaryotic genomes » (Treangen et al. 2009). Les auteurs utilisent notre étude sur l‘évolution du genre Yersinia comme exemple pour appuyer leur théorie selon laquelle des gènes dupliqués vont s‘effacer puisqu‘ils acquerront des mutations ponctuelles et perdront leur capacité à se recombiner.

7.5.5 Fonctions de EF-TuA et EF-TuB, perspectives

Toutefois, tel que mentionné dans notre article de 2008 (Chapitre 6), la possibilité que les protéines EF-TuA et EF-TuB aient un rôle distinct chez le genre Yersinia nécessitera encore des études. Les données de puces d‘expression de Han et al. (2007) semblent montrer pour la première fois que certaines conditions affectent l‘expression différentielle de tufA et tufB chez Yersinia pestis. Les auteurs n‘en discutent toutefois pas dans leur article (Han et al. 2007). Dans notre étude, nous avons décidé d‘en discuter et nous avons d‘ailleurs été cités à ce sujet (Massier et al. 2012). L‘étude de Massier et al. (2012) a d‘ailleurs montré que P. aeruginosa, lorsque soumise à un traitement de lumière pulsée sous-létale, augmentait la

219 production d‘EF-Tu (Massier et al. 2012). Cette dernière semble donc varier lorsque les bactéries sont soumises à des conditions environnementales stressantes. Par contre, ceci n‘est pas surprenant et nous pouvons nous demander si le fait d‘avoir deux protéines EF-Tu distinctes peut amener un avantage au genre Yersinia tel que discuté dans notre article. Ce que nous n‘avons pas abordé dans notre article est le fait que ces bactéries sont des psychrotrophes, puisqu‘elles peuvent croître de 4 à 42⁰C et également à de larges intervalles de pH de 5,0 à 9,6 (Brenner et al. 2005). Cette adaptabilité aux conditions environnementales diverses est un avantage potentiel. Il est intéressant de noter que les trois espèces pathogènes pour l‘humain, Y. enterocolitca, Y. pestis et Y. pseudotuberculosis, doivent résister aux grandes variations de pH du système digestif humain ainsi que de la puce pour infecter l‘hôte. L‘étude de mutants knock- out pour les gènes tufA ou tufB permettrait d‘évaluer leur « nécessité » et leurs fonctions spécifiques sous différentes conditions de culture. D‘ailleurs, il existe une technique pour inactiver les gènes chromosomiques chez Yersinia (Derbise et al. 2003).

7.5.6 Tolérance aux antibiotiques, perspectives

Le phénomène de tolérance à de multiples antibiotiques a une grande importance médicale. L‘implication de la phosphorylation d‘EF-Tu par une protéine kinase nommée HipA pour la résistance bactérienne lors de l‘exposition aux antibiotiques a été montrée à la suite de la publication de notre article (Schumacher et al. 2009). Le résidu Thr382 phosphorylable d‘EF-Tu est le même dans E. coli, Y. enterocolitca, Y. pestis et Y. pseudotuberculosis pour les deux copies des protéines. Toutefois, tel que mentionné dans notre article, le résidu Thr167 de EF-TuB et Thr361 de EF- TuA distinguent les deux copies chez toutes les espèces de Yersinia étudiées dans notre article. Il serait intéressant d‘étudier l‘importance de ces variations pour l‘expression différentielle des deux copies d‘EF-Tu chez le genre Yersinia et la tolérance aux antibiotiques ou à d‘autres conditions environnementales

220

stressantes. Bien que, sans traitement, le taux de mortalité de la peste pneumonique chez l‘humain soit estimé à 100 % (Tableau 4, Chapitre 1) (Ciottone 2006), les souches de Y. pestis étaient généralement sensibles aux antibiotiques. C‘est pourquoi que l‘isolement, en 1995, d‘une souche de Y. pestis multirésistante aux antibiotiques a marqué la communauté scientifique (Galimand et al. 1997). Cette multirésistance était causée par un plasmide (IP1202). L‘augmentation de la résistance aux antibiotiques est un problème de santé publique mondiale. La résistance antimicrobienne causée par l‘acquisition d‘éléments génétiques mobiles a été et continue d‘être étudiée. Toutefois, la tendance va maintenant à l‘étude de l‘adaptation métabolique plus globale permettant une tolérance antimicrobienne (Belenky et Collins 2011) et le rôle de la protéine EF-Tu pour ces phénomènes reste encore à explorer.

221

7.6 Perspectives générales du projet doctoral

L‘automatisation des technologies développées durant ce projet de recherche faciliterait leur utilisation sur le terrain par des organisations en sécurité publique ou militaires. Le protocole DARE, la méthode d‘extraction d‘ADN bactérien et l‘essai de détection sur puce à ADN microfluidique des agents biologiques seraient transposables dans un système d‘analyse totale permettant de réaliser la procédure complète de façon automatisée. J‘ai modifié une figure originalement réalisée par le Dr Régis Peytavi présentant un système rotatoire d‘analyse totale pour l‘adapter au contexte du bioterrorisme. En effet, j‘y ai illustré la transportabilité et la gestion de macrovolumes, deux éléments cruciaux pour les plateformes de détection sur le terrain, et également le diagnostic au chevet du patient. Cette version de la figure a d‘ailleurs fait la page frontispice de la revue IVD technology en novembre 2009 (Siegrist et al. 2009). La Figure 22 illustre donc le fonctionnement d‘un système intégré d‘analyse totale contrôlé par un téléphone intelligent amarré à un « rotacycleur ». L‘accélération de la rotation permet de procéder séquentiellement aux différentes étapes de l‘analyse grâce à des systèmes de valves s‘ouvrant à des pressions différentes. Ce téléphone intelligent pourrait également interpréter les résultats et notifier automatiquement les autorités de sécurité et de santé publiques concernées. Une telle plateforme pourrait être portable et ainsi répondre aux besoins des organisations médicales et militaires sur le terrain. Les techniques de détection développées pourraient améliorer les procédures de réponse immédiate à un acte bioterroriste, en minimisant son impact sur la société.

222

Figure 22. Système intégré d’analyse totale microfluidique rotatoire permettant le traitement de a) l’échantillon (macrovolume), b) la lyse microbienne (microvolume), c) l’amplification d’ADN, d) et l’hybridation sur puce à ADN. Adaptée avec permission du design du support rotatoire réalisé par le Dr Régis Peytavi.

223

8 Conclusion

a préparation contre les attaques bioterroristes est complexe. Plusieurs Ltechniques de détection ont été présentées dans cette thèse et elles possèdent toutes leurs avantages et limitations intrinsèques. Lim et al. spécifient qu‘aucune plateforme de détection ne satisfaisait tous leurs critères d‘évaluation dits « idéaux » (Voir section 1.4.3, Chapitre 1) (Lim et al. 2005). Nous avons tenté lors de ce projet de répondre à plusieurs de ces critères. Premièrement, la méthode de préparation des analytes permet de séparer rapidement les spores bactériennes d‘un grand éventail de matrices poudreuses et autres. Sa simplicité se compare favorablement par rapport aux autres techniques publiées antérieurement (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). Elle serait même transportable sur le terrain (Figure 23, Annexe 2), mais son automatisation simplifierait davantage son utilisation. Deuxièmement, le module fluidique de lyse microbienne par sonication permet d‘extraire l‘ADNg en un temps record sans l‘utilisation de billes (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Chandler et al. 2001; Marentis et al. 2005; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). Ce module peut même être décontaminé, sans être endommagé ou affecter l‘extrait d‘ADN qu‘il contenait, pour être transporté d‘une zone contaminée à une zone sécurisée. Troisièmement, l‘essai sur puce à ADN permet la détection sensible de 12 agents biologiques importants en environ 75 minutes. L‘intégration de ces trois procédures dans un système d‘analyse totale permettrait la détection rapide des pathogènes associés au bioterrorisme. De plus, tel que discuté préalablement, une telle plate-forme pourrait être portable et ainsi répondre aux besoins des organisations médicales et militaires sur le terrain.

225

Annexe 1

Historique des guerres biologiques et du bioterrorisme : biohazard ou psychohazard ?

Revue historique réalisée pour la préparation d’un manuscrit intitulé « Bio-psycho-hasard throughout history ».

Sandra Isabel a rédigé le texte et a réalisé de nombreuses recherches historiques dans la littérature scientifique.

Marc Isabel, B. A. en histoire et en littérature, a réalisé des recherches de la littérature historique pour certains évènements biologiques, notamment de l’Antiquité, afin de comprendre leurs implications considérant les connaissances et la culture de l’époque.

De l’Antiquité à la théorie des germes

Bien avant la venue de la microbiologie moderne, l‘Homme avait déjà compris qu‘il était possible de provoquer, au moyen de différents véhicules, la transmission de maladies afin de gagner un avantage stratégique face à un ennemi. Le premier récit rapportant l‘utilisation de ce principe se retrouve à l‘intérieur de fragments d‘un texte hittite datant du XIVe siècle avant J.-C. Il y est mentionné qu‘on forçait des gens escortant des animaux infectés, probablement par la tularémie, à traverser les territoires ennemis en espérant qu‘ils contamineraient ceux qu‘ils rencontreraient en chemin (Trevisanato 2007). Au fil du temps, l‘Homme diversifia ses méthodes pour accroître l‘efficacité de ses attaques, laissant moins de place au hasard. En contaminant une denrée essentielle d‘une population ennemie, les responsables forçaient les gens à entrer en contact avec les agents biologiques dans le but de les affaiblir, facilitant ainsi la victoire. Un exemple fréquent est la contamination volontaire de sources d‘eau potable par, entre autres, des fèces, des cadavres et des carcasses (Christopher et al. 1997; Mayor 2003).

L‘efficacité des pointes de flèches souillées par des fèces animales ou du venin de serpent était relativement connue durant l‘Antiquité. Toutefois, des passages des écrits d‘auteurs de cette époque présentent certains procédés de fabrication d‘enduits plus raffinés. Par une technique d‘agitation de nos jours perdue, les shamans scythes au Ve siècle avant J.C. séparaient le plasma du sang. Ce plasma était ensuite récupéré pour être mélangé à des fèces et le tout était enterré dans le

227 sol jusqu‘à putréfaction. Par la suite, ils mélangeaient à cette mixture enrichie de microbes les restes en décomposition de vipères préalablement tuées. L‘enduit était appliqué sur des flèches munies de barbules permettant une contamination parentérale efficace et meurtrière. D‘ailleurs, les carquois contenant ces flèches avaient des insignes notifiant l‘archer du danger, peut-être le premier signe biohazard (Mayor 2003).

Au Moyen Âge, Gabriel de Mussis rapporte que les Tatars, fortement affligés par la peste, ont catapulté des corps de pestiférés au-dessus des fortifications de la ville de Caffa, alors assiégée (Derbes 1966). Il est toutefois difficile, sans étude épidémiologique et phylogénétique, d‘attribuer avec certitude l‘épidémie subséquente de peste à Caffa ou encore la deuxième vague de la peste noire en Europe à cette propagation volontaire de la maladie (Christopher et al. 1997). C‘est un autre exemple d‘un progrès technique, la catapulte, montrant l‘évolution des moyens de dissémination utilisés pour propager des agents biologiques à plus grande échelle et à plus grande distance.

En 1767, passant d‘une technique grossière à une technique plus raffinée et invisible, un général anglais, Sir Jeffrey Amherst, ordonna la distribution de couvertures et de mouchoirs de varioleux aux populations autochtones d‘Amérique du Nord qui aidaient les Français. Il anticipait la propagation de la maladie sur une population qu‘il savait fragile. Même si une épidémie de variole chez les autochtones a succédé dans la région, l‘efficacité de cette méthode peut être remise en doute puisque d‘autres contacts avec les colons pourraient en être la cause (Berche 2009; Christopher et al. 1997). Cette stratégie montre toutefois une compréhension de certains principes d‘immunité et de susceptibilité aux infections des différentes populations.

Dès la Renaissance, les avancées scientifiques ont permis de développer des outils permettant l‘étude de la microbiologie. Antonie van Leeuwenhoek (1632- 1723), un microscopiste néerlandais, a mis au point des lentilles de qualité avec un

228

pouvoir grossissant jusqu‘à 266 X permettant d‘observer des bactéries (Ronan 1988; van Zuylen 1981). La microscopie facilita l‘étude des micro-organismes et de leur provenance par l‘observation de leur présence et de leur morphologie.

Edward Anthony Jenner (1749-1823), souvent considéré comme le père de l‘immunologie, a exploré davantage ce concept en offrant au monde la possibilité de développer une immunité à des infections à la suite de la vaccination. Jenner confirma expérimentalement la croyance populaire voulant que les personnes ayant contractées la variole des vaches était immunisées contre la forme humaine (Jenner 1801; Ronan 1988). Ses travaux et ceux qu‘ils ont inspirés ont permis de sauver de nombreuses vies grâce à des programmes de vaccination et même de mener à l‘éradication de la variole en 1980. Ils ont toutefois ouvert une boîte de Pandore puisqu‘on pouvait maintenant s‘immuniser spécifiquement contre un agent biologique alors que l‘adversaire n‘y était pas protégé.

La théorie des germes, créditée principalement, mais non exclusivement, à Louis Pasteur et Robert Koch pour leurs travaux, a amené un changement de perspective au sujet des malades infectieuses. Louis Pasteur (1822–1895) a su concevoir avec brio ses expériences montrant que les contaminants provenaient de l‘air, ce qui allait à l‘encontre de la théorie de l‘époque étant la génération spontanée (Baxter 2001; Black 2003; Ronan 1988). Robert Koch (1843–1910) réussi à faire croître des micro-organismes en culture pure. Il institue de plus, en 1882, les fondements afin d‘établir, par une méthodologie scientifiquement rigoureuse, la relation causale entre un micro-organisme et une maladie, maintenant connus sous l‘appellation des « Postulats de Koch » (Black 2003; Kaufmann et Schaible 2005; King 1952; Nobelprize.org 1967 ). D‘ailleurs, le professeur Koch fût le premier à démontrer que Bacillus anthracis, un des plus importants agents biologiques, était l‘agent causal de la maladie du charbon, et le professeur Pasteur fût le premier à développer un vaccin contre cette maladie (Baxter 2001). De nombreux scientifiques leur ont succédé et ont continué à

229 repousser les limites du savoir en microbiologie et en infectiologie. Les nombreuses avancées dans le domaine, principalement la microscopie, l‘immunisation, la culture pure et les Postulats de Koch, ont ouvert la voie aux programmes d‘armement biologique plus sophistiqués.

Au 20e siècle

Le concept d‘armement biologique, de l‘anglais weaponisation, englobe tous les travaux qui ont servi à développer des armes biologiques d‘autant plus puissantes que redoutables. Pour ce faire, plusieurs stratégies ont été utilisées, particulièrement en augmentant la transmission, la résistance à l‘environnement ou aux antibiotiques. L‘objectif était d‘augmenter leur impact : morbidité, mortalité, chute de l‘économie, état de panique général, etc. (Alibek et Handelman 2000). Plusieurs grandes puissances ont travaillées secrètement par le passé sur des programmes d‘armement biologique à grande échelle, dont le Canada, les États- Unis, le Japon, le Royaume-Uni et l‘U.R.S.S. (Leitenberg 2001).

Durant la Première Guerre mondiale, de 1914 à 1918, l‘utilisation d‘armes chimiques a été plus marquante que celle d‘armes biologiques. En effet, près d‘un tiers des évacuations de soldats était causé par les armes chimiques (Mauroni 2003). En 1917, les bagages confisqués, lors de l‘arrestation en Norvège du Baron Otto Karl von Rosen, un aristocrate Suédo-Germano-Finlandais, contenaient 19 fioles en verre camouflées dans des carrés de sucre. Quatre-vingt ans plus tard, quatre CFU (unités formant des colonies) de B. anthracis ont pu être cultivées d‘une fiole retrouvée (Redmond et al. 1998). Ceci prouve la capacité de produire des agents biologiques, de les conserver lors du transport et de les dissimuler durant la Première Guerre mondiale.

Après Première Guerre mondiale, l‘utilisation d‘armes chimiques et biologiques faisait mauvaise figure. Le Protocole concernant la prohibition d'emploi à la guerre de gaz asphyxiants, toxiques ou similaires et de moyens bactériologiques,

230

communément nommé Protocole de Genève, a été signé initialement en 1925 par 37 pays5, et est entré en vigueur en 1928. Ce protocole a été le premier traité international à interdire l‘emploi d‘armes biologiques pour faire la guerre. Il est intéressant de noter que La Fédération de Russie n‘était pas signataire en 1925, mais a toutefois ratifié ce protocole en 1928, alors que les États-Unis et le Japon étaient signataires et ont attendu respectivement en 1975 et 1970 pour le ratifier. Depuis 1925, 137 pays ont maintenant ratifié ce protocole (Comité international de la Croix-Rouge 2012). Toutefois, le Protocole de Genève présentait une portée limitée puisqu‘il n‘interdisait ni la production, ni le stockage d‘armes chimiques et biologiques.

La Deuxième Guerre mondiale, de 1939 à 1945, a ravivé l‘intérêt pour le développement des armes biologiques. À cette époque, un programme de développement d‘armes biologiques et entomologiques a été dirigé par le Japon. L‘Unité 731 a attaqué à plusieurs reprises les Chinois avec des puces infectées par Yersinia pestis, l‘agent causal de la peste, ainsi qu‘un autre vecteur, la mouche domestique (Musca domestica), contaminée par Vibrio cholerae, l‘agent étiologique du choléra. Le choc à l‘atterrissage des bombes en céramique non explosives, contenant des mouches domestiques dans une section et une culture de V. cholerae dans une autre, provoquait la contamination des mouches qui se dispersaient ensuite chaotiquement sur un vaste territoire. Environ 200 000 personnes ont succombé de l‘épidémie de choléra qui s‘ensuivit. Une attaque aéroportée relarguant des puces infectées par Yersinia pestis a eu des répercussions à long terme puisque l‘épidémie dura 6 ans et on estime qu‘elle causa 50 000 décès (Lockwood 2009). Toutefois, les troupes japonaises n‘étaient pas protégées efficacement contre ces agents biologiques et il a été rapporté que 1 700 décès ont suivi une seule mission alors que les Chinois en avaient subi

5 Liste des 37 pays signataires du Protocole de Genève en 1925: l’Allemagne, l’Autriche, la Belgique, le Brésil, la Bulgarie, le Canada, le Chili, le Danemark, l’Égypte, le Salvador, l’Espagne, l’Estonie, les États- Unis, l’Éthiopie, la Finlande, la France, la Grèce, l’Italie, le Japon, la Lettonie, la Lituanie, le Luxembourg, le Nicaragua, la Norvège, les Pays-Bas, la Pologne, le Portugal, la République Tchèque, la Roumanie, le Royaume-Unie, la Slovaquie, la Suède, la Suisse, la Thaïlande, la Turquie, l’Uruguay et le Venezuela.

231

10 000. Les attaques de l‘Unité 731 ont entraînées le plus grand nombre de décès documentés et ont montré à la fois la capacité de déploiement des armes biologiques à plus grande échelle et les dangers de leur utilisation (Riedel 2004). Les alliés ont également participé au développement d‘armes biologiques lors de la Deuxième Guerre mondiale. Le Premier ministre britannique, Winston Churchill, avait ordonné la fabrication d‘un demi-million de bombes de B. anthracis destinées aux Allemands (Bryden 1989; Frigon 2010). L‘armée britannique a participé à ces efforts de guerre. Elle a d‘ailleurs mené des expérimentations pour évaluer la dispersion de spores de B. anthracis à l‘aide de cheptels de moutons sur l‘île écossaise Gruinard (Christopher et al. 1997; Lutwick et Lutwick 2009; Riedel 2004). Ces spores se sont propagées sur les côtes et quelques animaux sont décédés, montrant la perte de contrôle possible des armes biologiques. Une partie importante des travaux a d‘ailleurs été effectuée par l‘Armée Canadienne à la Grosse-Île, située dans le Fleuve St-Laurent. Les scientifiques travaillant à cet endroit isolé avaient développé l‘expertise permettant de produire des quantités massives de spores de B. anthracis, soit 130 kilogrammes par semaine (Bryden 1989; Frigon 2010). Les États-Unis ont pris part aux recherches et au développement sur les armes biologiques et ont érigés deux centres d‘envergure dont le plus connu est Fort Detrick au Maryland, l‘autre se retrouvant à Terre Haute en Indiana (Lutwick et Lutwick 2009). Bacillus atrophaeus sous-espèce globigii, une bactérie sporulante considérée inoffensive, a été utilisée comme simulant de B. anthracis afin d‘évaluer son potentiel de dispersion sur des centres urbains et d‘autres communautés. En 1966, des scientifiques des Forces Armées des États- Unis ont utilisé des ampoules incandescentes chacune remplie d‘une préparation poudreuse de spores B. atropheus de 175 grammes (~5 × 1011 CFU/g) afin d‘évaluer le potentiel de dissémination du bacille du charbon. Les ampoules étaient échappées sur les grilles de ventilation du métro de la ville de New York lorsque les trains passant accéléraient. Ces spores ont été dispersées à travers la ville et le rapport conclut que « A large portion of the working population in downtown New

232

York City would be exposed to disease if one or more pathogenic agents were disseminated covertly in several subway lines at a period of peak traffic. » (Daly 1998; US Department of the Army 1968). Le 25 novembre 1969, le Président des États-Unis, Richard Nixon, annonça une politique nationale empêchant l‘utilisation d‘armes biologiques et s‘engagea à détruire l‘arsenal Américain. Le New York Times rapporte que le U.S. Department of Defense a développé, et même pour certains a entreposé, les agents étiologiques de la peste, la maladie du charbon, la tularémie, la psittacose, la fièvre Q, le botulisme, la fièvre pourprée des montagnes Rocheuses, la brucellose et l‘encéphalite équine du Venezuela (New-York Times 1969). Il aura fallu attendre un demi-siècle après la ratification du Protocole de Genève avant qu‘une autre entente internationale plus restrictive quant au développement d‘armes biologiques soit mise en vigueur. La Convention sur l‘interdiction de la mise au point, de la fabrication et du stockage des armes bactériologiques (biologiques) ou à toxines et sur leur destruction a été signée en 1972 et mise en vigueur en 1975. En 2011, 39 ans plus tard, des 195 pays répertoriés dans le monde par la CIA, 171 pays avaient signé cette convention alors que 155 l‘avaient également ratifiée (Biological and Toxin Weapons Convention (BTWC) 1972; US Central Intelligence Agency 2010). Cet engouement politique de la part d‘un nombre si élevé de pays montre l‘importance de ces interdictions pour l‘humanité.

Malgré la rigidité de cette convention et le fait que l‘ex-U.R.S.S. ait été dans les premiers états à signer et à ratifier cette convention, Moscou a admis avoir continué son programme de biodéfense et d‘armement biologique (National Security Archive 2001). Kanatzhan Alibekov, un médecin militaire maintenant connu sous le nom de Ken Alibek, a été, de 1988 à 1992, le député chef de l‘agence Biopreparat dont le mandat était de développer et de produire des armes biologiques. Il a ensuite fuit son pays vers les États-Unis et a témoigné des travaux des Russes à cette époque et antérieurement. Alibek présente des informations et des calculs alarmants. Dans une ville métropolitaine, 100 kg de préparation de

233 spores de B. anthracis pourraient causer jusqu‘à trois millions de décès. Seulement dix à quatorze jours leur auraient été nécessaires pour produire 400 kg d‘anthrax afin de remplir dix ogives. Les recherches exécutées par l‘agence Biopreparat ont conduit à la découverte d‘additifs permettant d‘augmenter la résistance des micro-organismes aux conditions environnementales et de méthodes pour propager ces armes biologiques afin d‘obtenir une dose infectieuse 2 permettant d‘infecter 50 % des humains exposés sur 1 km de surface (Q50). Les succès du génie génétique ne passant pas inaperçus, le programme Enzyme sera lancé avec le mandat de modifier génétiquement des micro-organismes pathogènes pour les rendre résistants aux antibiotiques ou aux vaccins. Ceux principalement ciblés ont été B. anthracis, B. mallei, F. tularensis et Y. pestis puisque les progrès en antibiothérapie contrecarraient leur impact, mais certains autres virus auraient été à l‘étude. Une épidémie de la maladie du charbon à Sverdlovsk en 1979 aurait causé 96 victimes, dont 66 décès. Même si, toutefois, l‘exactitude de ces chiffres est controversée, le lien avec une installation de production d‘armes biologiques, le Compound 19, a été établi (Steele 2000). Un filtre colmaté ayant été retiré sans être remplacé immédiatement expliquerait la libération accidentelle dans la ville de B. anthracis (Alibek et Handelman 2000). Cet incident montre le danger de ces armes pour les producteurs également.

D‘autres organisations non étatiques ont montré la capacité de produire des agents biologiques. En effet, en 1984, une éclosion inexpliquée de 751 cas de gastro-entérites causés par Salmonella Typhimurium sévit en Oregon. L‘enquête épidémiologique conclue que des membres de la secte Bhagwan Shree Rajneesh ont volontairement contaminé des bars à salades de 10 restaurants (Torok et al. 1997). Quoique la secte japonaise religieuse Aum Shinrikyo soit plus connue pour les attaques au gaz sarin dans le métro de Tokyo en 1995, l‘investigation a révélé qu‘un programme rudimentaire d‘armement biologique avait été entrepris. Par exemple, la souche vaccinale de B. anthracis a été dispersée dans la ville de Kameido en 1993. Fort heureusement, les analyses phylogénétiques suggèrent

234

que la souche utilisée ne possédait pas le plasmide pXO2 codant pour les enzymes synthétisant la capsule et étant essentiel à la pathogénèse humaine (Fouet et Mock 1996; Keim et al. 2001; Riedel 2004; Smith 1995).

Au 21e siècle

En 2001, au minimum cinq lettres contenant une quantité massive de B. anthracis ont été postées à deux Sénateurs américains ainsi qu‘à certaines organisations médiatiques. Des suites de ces envois postaux, 11 personnes ont contracté la forme cutanée de la maladie du charbon alors que 11 autres ont contracté la forme pulmonaire résultant malheureusement en cinq décès. Dix milles personnes, considérées à risque d‘avoir été exposées, ont dû recevoir une antibiothérapie prophylaxique. Les coûts et les effets psychosociaux reliés à cet acte bioterroriste ont été considérables. L‘investigation conclut que le Dr Bruce Ivins, employé à l‘USAMRIID, était responsable de ces attaques même si l‘accusé a commis un suicide en juillet 2008 avant la fin du procès. Le rapport du FBI, Amerithrax Investigation Summary, publié en février 2010, permet d‘avoir accès à plus d‘information officielle au sujet des évènements de l‘automne 2001 (U.S. Department of Justice 2010). Toutefois, ce sujet reste controversé puisque les standards de la preuve microbiologique légale obtenue à l‘époque n‘étaient pas comparables à ceux de la preuve médicolégale plus conventionnelle, e.g. la balistique, façonnée par des années d‘expertise (Guillemin 2012; Relman 2012). Les attaques de 2001 ont montré à quel point la population pouvait être vulnérable aux actes bioterroristes et l‘importance de s‘y préparer pour diminuer leur impact. Cet évènement allait de plus initier des changements au sujet des réglementations en biosécurité. Toutefois, la même année, la publication d‘une étude australienne a été critiquée par la communauté scientifique puisqu‘elle montrait l‘impact du génie génétique sur la modulation de la réponse immunitaire, même chez une population vaccinée (Selgelid et Weir 2010). L‘interleukine 4 (IL-4) murine a été transfectée dans le virus murin ectromelia thymidine kinase positif, agent de la famille des

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Poxviridae, causant la variole murine. Lorsqu‘exposées à la souche virale modifiée génétiquement, les souris génétiquement résistantes et immunisées récemment présentaient un haut taux de mortalité contrairement à celles non immunisées, des suites d‘une variole murine fulminante (Jackson et al. 2001). Toutefois, le moyen préventif le plus efficace contre la variole humaine reste la vaccination. Si cette mesure de protection s‘avérait inefficace, en cas d‘acte bioterroriste utilisant cet agent biologique, les conséquences pourraient être dévastatrices. Cette controverse a montré que, malgré les avancées des comités de réglementation au sujet de la recherche clinique, des comités en biosécurité étaient nécessaires pour évaluer les implications éthiques de ce type de recherche. Ce débat est encore ouvert puisque récemment le virus virulent de l‘influenza H5N1 aviaire a été modifié génétiquement par plusieurs équipes de recherche. L‘objectif était d‘étudier en laboratoire les variations génétiques nécessaires pour créer une souche transmissible de personne à personne afin d‘élaborer un arsenal prophylactique et thérapeutique avant la pandémie anticipée (MacKenzie 2011; Shoham 2012). Certains mécanismes sont maintenant en place afin d‘évaluer les bénéfices et les désavantages de censurer la littérature pour empêcher la publication de techniques et de connaissances pouvant être utilisées à mauvais escient. Les deux publications scrutées à la loupe ont d‘ailleurs été publiées depuis (Herfst et al. 2012; Imai et al. 2012; Office of Biotechnology Activities 2012; World Health Organization 2012).

Malgré toutes les mesures mises en œuvre, d‘autres incidents utilisant la ricine, une toxine de plante, ont été répertoriés à la suite de l‘automne 2001. En 2003, une lettre de menace signée Fallen Angel, accompagnant un récipient scellé contenant de la ricine, a été trouvée dans une enveloppe dans un bureau de poste à Greenville, en Caroline du Sud. L‘enquête réalisée par les autorités n‘a révélé aucune maladie consistante à l‘exposition à la ricine chez les travailleurs de la poste ou la population environnante. Le bureau de poste ciblé a dû être fermé pour effectuer l‘enquête et s‘assurer que l‘environnement n‘était pas contaminé puisque

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les moyens de détection actuels occasionnent de longs délais (Lutwick et Lutwick 2009).

Malheureusement, après 2001, plusieurs enveloppes contenant des poudres inoffensives et des lettres de menace avertissant le destinataire de la présence d‘agents biologiques ont été postés par de nombreuses personnes ou de nombreux groupes avec des intentions variées. Pour ne citer qu‘un exemple récent, une cinquantaine d‘enveloppes contenant des poudres suspectes ont été postées à des élus du Parti Libéral du Québec et à des organisations médiatiques. Ces lettres proféraient des menaces laissant croire que la poudre contenait en fait B. anthracis et étaient signées au nom des Forces armées révolutionnaires du Québec (« FARQ »). Elles étaient toutefois inoffensives biologiquement puisqu‘elles ne contenaient que du bicarbonate de soude ou de la craie concassée (Santerre 2012). Certaines nouvelles méthodes de détection des agents biologiques peuvent permettre d‘évaluer rapidement avec une certaine probabilité si la menace est réelle. Les autorités ont ainsi été en mesure de désamorcer rapidement la crise en informant la population de l‘innocuité de ces poudres, ce qui a évité qu‘un climat de panique ne se propage.

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Annexe 2

Figures supplémentaires à l’article présenté au Chapitre 3

Figure 23. Schéma de la trousse DARE.

Liste des composantes :

A : Écouvillon stérile. T1 : Tube Sarstedt 15 ml contenant 1ml de PBS 1X. S1 : Seringue 10 ml vide. F1 : Filtre à seringue Millex-SV (diamètre des pores = 5 µm) de 25 mm. T2 : Tube Sarstedt 15 ml vide. S2 : Seringue 10 ml contenant 2 ml de PBS 1X. S3 : Seringue 10 ml contenant 2 ml d‘eau. S4 : Seringue 10 ml vide. F2 : Filtre à seringue Millex-HV (diamètre des pores = 0,45 µm) de 13 mm. S5 : Seringue 1 ml contenant 300 µl d‘eau et 700 µl d‘air. T3 : Tube 1,5 ml contenant des billes de verre pour la lyse (BD GeneOhm lysis kit).

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Figure 24. Protocole des procédures DARE et de lyse et fonction(s) de chaque étape entre parenthèses.

Étape 1 : Dévisser T1 et écouvillonner l‘échantillon à analyser avec A (recueillir l‘échantillon contenant potentiellement des bactéries). Étape 2 : Visser T1 et mélanger (homogénéiser l‘échantillon dans le tampon et dissoudre les composés solubles). Étape 3 : Aspirer le contenu de T1 dans S1 (remplir la seringue pour la préfiltration). Étape 4 : Fixer F1 à S1 et évacuer le contenu de S1 dans T2 (procéder à la préfiltration, retirer la majorité des composés insolubles et récupérer les bactéries dans le filtrat). Étape 5 : Fixer F1 à S2 et évacuer le contenu de S2 dans T2 (augmenter la récupération bactérienne dans le filtrat). Étape 6 : Fixer F1 à S3 et évacuer le contenu de S3 dans T2 (augmenter la récupération bactérienne dans le filtrat). Étape 7 : Aspirer le contenu de T2 dans F2-S4 (retenir les bactéries dans le filtre, retirer la majorité des composés solubles dans le filtrat). Étape 8 : Fixer F2 à S5 et évacuer le contenu de S5 dans T3 (récupérer les bactéries dans une solution propre d‘eau). Étape 9 : Vortexer le contenu de T3 5 min (procéder à la lyse bactérienne afin d‘en extraire leurs acides nucléiques). Étape 10 : Chauffer le contenu de T3 à 95C, 2 min (chauffage pour conservation de l‘échantillon d‘acides nucléiques).

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Figure 25. Diamètres des micro-organismes aéroportés associés au bioterrorisme, poudres et autres référentiels en comparaison avec ceux des pores des filtres sélectionnés.

Les tailles de particules visibles ou invisibles à l‘œil nu ainsi que de certaines poudres évaluées sont présentées pour faciliter la compréhension. La Figure 25 (Annexe 2) montre que les bactéries, les virus et même certaines spores fongiques pourraient traverser le préfiltre (PF : pores de 5 µm de diamètre). Si la détection d‘autres agents biologiques de tailles différentes était évaluée, le filtre de capture pourrait être modifié. La Figure 25 (Annexe 2) montre les diamètres des pores du filtre de capture (FC : pores de 0,45 µm) ainsi que les diamètres de bactéries, virus et spores fongiques associés au bioterrorisme. On y constate donc que ce filtre pourrait être modifié pour certaines bactéries plus petites, comme F. tularensis.

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Figure 26. Visualisation des filtres sélectionnés en microscopie optique. La structure des filtres sélectionnés a été observée avec un microscope épifluorescent Nikon Eclipse TE300 en champ clair (Nikon Instruments, Melville, NY, USA) (×1000). Les images ont été analysées avec le logiciel ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). La structure (A) des filtres Millex-SV, taille des pores de 5 µm et (B) Millex-HV, taille des pores 0,45 µm.

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A

B

Figure 27. Représentation virtuelle du positionnement des spores dans les filtres avec la taille des pores de 0,45 µm. La pénétration (A) et l‘expulsion (B) des spores de B. atrophaeus marqués au FITC dans les filtres Millex-HV (pores de 0,45 µm) a été évaluée par microscopie confocale (Olympus FV300). Les coordonnées x, y et z de chaque spore ont été mesurées dans les filtres. Les flèches vertes (x), rouges (y) et bleues (z) représentent respectivement la longueur, la largeur et l‘épaisseur du champ optique observé. Le diamètre de chaque carré du grillage mesure 17,75 µm. Les spores ont été représentées par des sphères colorées. Les filtres ont l‘apparence d‘un nuage blanc. Le côté supérieur du filtre faisant face au tube correspond au côté où les spores pénètrent.

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Figure 28. Schéma analytique présentant le nombre d’échantillons sur les 23 analysés interférant avec la lyse bactérienne ou la PCR. Sans traitement, un total de 14/23 poudres pouvait nuire à la détection par la PCR alors que 3 autres pouvaient nuire à la lyse. Ce schéma montre également comment une étape de préfiltration et/ou de lavage permet d’éliminer ces interférences.

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Annexe 3

Tableaux supplémentaires à l’article présenté au Chapitre 5

Tableau 16. GeneBank Accession numbers from which tuf gene sequences were retrieved.

AE000511 AE014295 AE017340 AM421808 AP009247 AP011957 BA000043 AE000512 AE014299 AE017354 AM422018 AP009256 AP012027 BA000045 AE000513 AE014613 AE017355 AM494475 AP009324 AP012029 BX072543 AE000516 AE015450 AF222894 AM711867 AP009332 AP012030 BX119912 AE000520 AE015451 AJ235269 AM743169 AP009333 AP012032 BX248333 AE000657 AE015924 AJ749949 AM746676 AP009351 AP012035 BX248353 AE000782 AE015925 AJ938182 AM747720 AP009378 AP012044 BX248583 AE000783 AE015927 AJ965256 AM849034 AP009380 AP012046 BX293980 AE001273 AE015928 AL009126 AM884176 AP009384 AP012047 BX470248 AE001363 AE015929 AL096836 AM884177 AP009385 AP012048 BX470249 AE001437 AE016795 AL111168 AM889136 AP009389 AP012053 BX470250 AE001439 AE016822 AL123456 AM889285 AP009484 AP012054 BX470251 AE002098 AE016823 AL139299 AM902716 AP009493 AP012159 BX548020 AE002160 AE016825 AL157959 AM920689 AP009510 AP012200 BX548174 AE002161 AE016826 AL445566 AM933172 AP009552 AP012202 BX548175 AE003849 AE016827 AL450380 AM933173 AP010655 AP012203 BX571856 AE003852 AE016828 AL513382 AM942444 AP010656 AP012204 BX571857 AE004091 AE016830 AL590842 AM942759 AP010803 AP012205 BX571963 AE004092 AE016853 AL591688 AM946015 AP010888 AP012206 BX571965 AE004439 AE016879 AL591824 AM946016 AP010889 AP012209 BX842601 AE004969 AE016958 AL592022 AM946981 AP010890 AP012210 BX897699 AE005174 AE017042 AL645882 AM990992 AP010904 AP012211 BX897700 AE005176 AE017125 AL646052 AM999887 AP010918 AP012212 BX908798 AE005672 AE017126 AL732656 AP006618 AP010935 AP012222 BX927147 AE005673 AE017143 AL935263 AP006627 AP010946 AP012224 BX936398 AE005674 AE017180 AL954747 AP006628 AP010953 AP012280 BX950229 AE006468 AE017194 AM039952 AP006716 AP010958 AP012303 BX950851 AE006470 AE017196 AM040264 AP006725 AP010960 AY596297 CM001077 AE006641 AE017197 AM114193 AP006840 AP010968 BA000002 CM001160 AE006914 AE017198 AM167904 AP006841 AP011112 BA000003 CP000001 AE007317 AE017199 AM180252 AP006861 AP011115 BA000004 CP000002 AE007869 AE017220 AM180355 AP007209 AP011121 BA000007 CP000003 AE008691 AE017221 AM181176 AP007281 AP011128 BA000008 CP000010 AE008922 AE017223 AM233362 AP008226 AP011135 BA000012 CP000012 AE008923 AE017225 AM236080 AP008229 AP011142 BA000016 CP000013 AE009440 AE017226 AM260479 AP008231 AP011149 BA000017 CP000016 AE009442 AE017243 AM260522 AP008232 AP011156 BA000018 CP000017 AE009948 AE017244 AM260525 AP008934 AP011163 BA000019 CP000020 AE009949 AE017245 AM263198 AP008937 AP011170 BA000021 CP000023 AE009950 AE017261 AM286280 AP008955 AP011177 BA000022 CP000024 AE009952 AE017262 AM286415 AP008957 AP011529 BA000023 CP000025 AE010300 AE017263 AM286690 AP008971 AP011532 BA000026 CP000026 AE013218 AE017282 AM295007 AP008981 AP011533 BA000028 CP000027 AE013598 AE017283 AM295250 AP009048 AP011541 BA000030 CP000029 AE014073 AE017285 AM398681 AP009152 AP011548 BA000031 CP000030 AE014074 AE017308 AM406670 AP009153 AP011615 BA000033 CP000031 AE014075 AE017321 AM406671 AP009178 AP011940 BA000035 CP000033 AE014133 AE017332 AM408590 AP009179 AP011941 BA000036 CP000034 AE014184 AE017333 AM412317 AP009180 AP011943 BA000039 CP000036 AE014291 AE017334 AM420293 AP009240 AP011945 BA000040 CP000038

246

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CP002912 CP003061 CP003191 CR925677 FM242711 FP236843 FQ482149 CP002913 CP003062 CP003192 CR925678 FM252031 FP475956 FQ670178 CP002914 CP003065 CP003194 CR931997 FM252032 FP565809 FQ670179 CP002917 CP003068 CP003195 CR936503 FM864216 FP671138 FQ670204 CP002918 CP003069 CP003196 CR954246 FM872306 FP885897 FQ790233 CP002924 CP003075 CP003197 CR954253 FM872307 FP929003 FQ859181 CP002925 CP003082 CP003199 CT573213 FM872308 FP929032 FQ859183 CP002927 CP003084 CP003200 CT573326 FM954972 FP929033 FQ859185 CP002931 CP003085 CP003206 CT971583 FM991728 FP929034 FR668087 CP002933 CP003087 CP003207 CT978603 FM999788 FP929036 FR687253 CP002955 CP003093 CP003208 CU179680 FN298497 FP929037 FR687359 CP002956 CP003094 CP003209 CU207211 FN392235 FP929038 FR714927 CP002980 CP003096 CP003210 CU207366 FN424405 FP929039 FR720602 CP002982 CP003099 CP003211 CU234118 FN433596 FP929042 FR729477 CP002983 CP003101 CP003212 CU458896 FN434113 FP929043 FR773153 CP002985 CP003107 CP003213 CU459141 FN538970 FP929044 FR773526 CP002986 CP003108 CP003214 CU468135 FN543093 FP929045 FR774048 CP002987 CP003109 CP003215 CU468230 FN543502 FP929046 FR821777 CP002991 CP003115 CP003216 CU469464 FN545816 FP929047 FR821779 CP002992 CP003117 CP003217 CU633749 FN554766 FP929049 FR824043 CP002993 CP003125 CP003218 CU651637 FN554889 FP929050 FR856862 CP002994 CP003126 CP003219 CU928145 FN555004 FP929051 FR870271 CP002999 CP003128 CP003221 CU928158 FN557490 FP929053 FR871757 CP003000 CP003130 CP003222 CU928160 FN563149 FP929054 FR872580 CP003001 CP003132 CP003231 CU928161 FN568063 FP929055 FR872582 CP003015 CP003137 CP003241 CU928162 FN597254 FP929058 FR873481 CP003017 CP003147 CP003244 CU928163 FN597644 FP929059 FR873482 CP003021 CP003150 CP003257 CU928164 FN598874 FP929060 FR875178 CP003022 CP003151 CP003259 DQ489736 FN645454 FP929061 FR877557 CP003026 CP003152 CP003275 FM162591 FN649414 FP929062 FR878060 CP003029 CP003153 CP003278 FM177140 FN650140 FP929140 HE572590 CP003033 CP003155 CP003295 FM178379 FN652779 FQ311868 HE576794 CP003034 CP003156 CP003315 FM179322 FN666575 FQ311875 HE577327 CP003039 CP003166 CR354531 FM179323 FN667741 FQ312002 HE613569 CP003040 CP003169 CR522870 FM180568 FN667742 FQ312003 HE616890 CP003046 CP003170 CR543861 FM200053 FN692037 FQ312004 HE617159 CP003047 CP003171 CR555306 FM204883 FN822744 FQ312005 HE617160 CP003056 CP003174 CR626927 FM204884 FN869568 FQ312006 L42023 CP003057 CP003176 CR628336 FM209186 FN995097 FQ312027 L43967 CP003058 CP003178 CR628337 FM211187 FP103042 FQ312029 U00089 CP003059 CP003179 CR767821 FM211192 FP236530 FQ312030 U00096 CP003060 CP003187 CR848038 FM211688 FP236842 FQ377874

250

Tableau 17. Number of strains from which genome sequences were available, and tuf gene Tablesequences S1b. Number were of retreivedstrains from or which not. genome sequences were available, and tuf gene sequences were retreived or not

Available tuf gene retreived tuf gene not retreived

Groups Qte Groups Qte Groups Qte Acidobacteria 7 Acidobacteria 7 Acidobacteria 0 Actinobacteria 191 Actinobacteria 182 Actinobacteria 9 Alphaproteobacteria 181 Alphaproteobacteria 174 Alphaproteobacteria 7 Aquificae 10 Aquificae 10 Aquificae 0 Bacteroidetes/Chlorobi 79 Bacteroidetes/Chlorobi 77 Bacteroidetes/Chlorobi 2 Betaproteobacteria 118 Betaproteobacteria 117 Betaproteobacteria 1 Chlamydiae/Verrucomicrobia 39 Chlamydiae/Verrucomicrobia 38 Chlamydiae/Verrucomicrobia 1 Chloroflexi 15 Chloroflexi 15 Chloroflexi 0 Crenarchaeota 41 Crenarchaeota 22 Crenarchaeota 19 Cyanobacteria 42 Cyanobacteria 38 Cyanobacteria 4 Deinococcus-Thermus 15 Deinococcus-Thermus 15 Deinococcus-Thermus 0 Deltaproteobacteria 47 Deltaproteobacteria 47 Deltaproteobacteria 0 Epsilonproteobacteria 63 Epsilonproteobacteria 61 Epsilonproteobacteria 2 Euryarchaeota 79 Euryarchaeota 49 Euryarchaeota 30 Firmicutes 443 Firmicutes 415 Firmicutes 28 Fusobacteria 5 Fusobacteria 4 Fusobacteria 1 Gammaproteobacteria 394 Gammaproteobacteria 384 Gammaproteobacteria 10 Nanoarchaeota 1 Nanoarchaeota 1 Nanoarchaeota 0 Other Archaea 2 Other Archaea 1 Other Archaea 1 Other Bacteria 56 Other Bacteria 54 Other Bacteria 2 Planctomycetes 5 Planctomycetes 5 Planctomycetes 0 Spirochaetes 44 Spirochaetes 42 Spirochaetes 2 Thermotogae 13 Thermotogae 13 Thermotogae 0 TOTAL 1890 1771 119

251

Annexe 4

Analyses phylogénétiques supplémentaires à l’article présenté au Chapitre 6

T 100 Y. intermedia ATCC 29909 (AX109504) Y. intermedia ATCC 29909T tufB 89 Y. rohdei ATCC 43380T (AX109507) Y. frederiksenii ATCC 33641T (AX109503) 100 Yfrederiksenii ATCC 33641T tufB Y. pseudotuberculosis ATCC 29833T(AX109506) 100 Y. pestis KIM D27 (AX109505) 63 Y. pestis 91001 tufB

T 100 Y. enterocolitica ATCC 9610 (AX109502) Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 tufB

99 Y. pestis 91001 tufA Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081tufA 94 T 79 Y. frederiksenii ATCC 33641 tufA 99 Y. intermedia ATCC 29909T tufA

0.02 substitution/site

Figure 29. Arbre phylogénétique des séquences du gène tuf du genre Yersinia de Paradis et al. (2005) et de génomes. Arbre Maximum Composite Likelihood des positions 309 à 1 116 du gène tuf selon la séquence de tufB de Y. pestis 91 001, 1 000 analyses bootstraps ont été effectuées. L‘alignement a été fait en utilisant ClustalW implémenté dans Mega 5.05. Les séquences en caractères gras sont celles de Paradis et al. (2005) et les identifiants entre parenthèses correspondent aux numéros d‘accession de Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Les gènes dupliqués tufA et tufB des génomes séquencés (AALE00000000, AALF00000000, AM286415.1, AE017042.1) ont été identifés en étudiant la synténie des gènes voisins (opéron str, fusA-tufA; opéron tRNA-tufB, tRNA- tufB et secE-nusG en aval). Les séquences présentées dans l‘article de Paradis et al. correspondent à tufB.

253

93 Y. bercovieri 88-0762, ATCC 43970 and CCUG 26330 tufA 97 Y. bercovieri CCUG 26539 tufA 81 Y. aleksiciae LMG 22254 tufA Y. frederiksenii ATCC 33641 tufA 71 Y. frederiksenii CCUG 26594 tufA 99 99 Y. frederiksenii ER5307 tufA 78 Y. mollaretii ER4215 tufA 100 Y. aldovae ATCC 35236, CCUG 26532 and CCUG 26915 tufA Y. aldovae ATCC 35237 tufA 98 Y. intermedia ATCC 29909 tufA 70 Y. intermedia ATCC 33647 tufA 100 57 Y. intermedia ATCC 33648 tufA 90 Y. mollaretii ATCC 43969 tufA 100 Y. mollaretii CCUG 26536 tufA Y. kristensenii ATCC 33638, CCUG 26582, CCUG 26589 and CCUG 46842 tufA Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 31436 tufA 100 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 18381 tuA 33 99 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 tufA 73 60 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica ATCC 23715, ATCC 27729, ATCC 9610 and CCUG 8238 tufA 100 Y. rohdei ATCC 43380, ATCC 43871, CCUG 26544 and CCUG 26545 tufA 36 Y. rohdei ATCC 43873 tufA Y. ruckeri ATCC 29473, CCRI-10643 and CCUG 21537 tufA 98 100 Y. frederiksenii ATCC 29912 tufA 24 Y. frederiksenii CCUG 8246, CCUG 26949 and CCUG 30114 tufA Y. similis CCRI-19282 tufA * 13 Y. pseudotuberculosis ATCC 13979 and CCUG 17342 tufA 100 88 Y. pestis 91001, Antiqua, CO92 and KIM and Y. pseudotuberculosis ATCC 27802, ATCC 29833, CCUG 17345, CCUG 37903, etc tufA 58 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCRI-905, CCRI-952, CCRI-1044, etc tufA 99 Y. massiliensis CCRI-19283 tufA * 100 Y. aldovae ATCC 35236, CCUG 26532 and CCUG 26915 tufB Y. aldovae ATCC 35237 tufB 87 Y. kristensenii CCUG 26582 and CCUG 46842 tufB 100 Y. kristensenii CCUG 26589 tufB 97 Y. kristensenii ATCC 33638 tufB 39 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081, ATCC 23715, ATCC 27729, ATCC 9610 and CCUG 8238 tufB 68 99 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCRI-952, CCRI-1139, CCRI-9984, CCRI-10035, etc tufB 100 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCRI-1044, CCRI-905 and CCUG 33553 tufB 48 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 18381 tufB 91 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 31436 tufB Y. massiliensis CCRI-19283 tufB * Y. ruckeri ATCC 29473, CCRI-10643 and CCUG 21537 tufB 47 Y. pestis Antiqua, CO92 and KIM tufB 64 Y. pestis Nepal516 tufB 52 66 100 Y. pestis 91001 tufB 100 Y. pseudotuberculosis ATCC 27802, ATCC 29833, CCUG37903, CCUG 7803, ER5271 and IP32953 tufB 100 Y. pseudotuberculosis CCUG 17345 tufB 34 Y. pseudotuberculosis ATCC 13979 and CCUG 17342 tufB Y. similis CCRI-19282 tufB * 100 Y. bercovieri 88-0762, ATCC 43970 and CCUG 26330 tufB 100 Y. bercovieri CCUG 26539 tufB 87 Y. aleksiciae LMG 22254 tufB 19 46 Y. mollaretii ATCC 43969 tufB 100 Y. mollaretii CCUG 26536 and ER4215 tufB 92 Y. rohdei ATCC 43380, ATCC 43871 and CCUG 26544 tufB 100 Y. rohdei ATCC 43873 tufB 33 39 Y. rohdei CCUG 26545 tufB Y. frederiksenii ATCC 29912, CCUG 8246 and CCUG 26949 tufB 100 Y. frederiksenii CCUG 30114 tufB 100 Y. frederiksenii CCUG 26594 tufB 94 92 Y. frederiksenii ER5307 tufB Y. frederiksenii ATCC 33641 tufB 53 Y. intermedia ATCC 33648 tufB Y. intermedia ATCC 29909 tufB 100 100 Y. intermedia ATCC 33647 tufB 97 H. alvei ATCC 25927 tufA 64 55 O. proteus ATCC 12841 tufA 86 H. alvei ATCC 13337 tufA H. alvei ATCC 51873, CCRI-11829, CCRI-10616 tufA 78 H. alvei CCRI-16651 tufA 95 H. alvei ATCC 25927 tufB 100 100 O. proteus ATCC 12841 tufB H. alvei ATCC 13337 tufB 52 H. alvei CCRI-11829 tufB H. alvei ATCC 51873 and CCRI-10616 tufB 99 99 H. alvei CCRI-16651 tufB 100 S. fonticola DSM 4576 tufA 96 S. fonticola DSM 4576 tufB S. marcescens ATCC 13880 tufA 100 S. marcescens ATCC 13880 tufB 100 E. carotovora SCRI1043 tufA 78 E. carotovora SCRI1043 tufB 100 Y. regensburgei ATCC 35313 tufA 88 Y. regensburgei ATCC 35313 tufB 100 E. vulneris ATCC 33821 tufA 98 E. vulneris ATCC 33821 tufB 94 E. agglomerans ATCC 27989 tufA 95 E. agglomerans ATCC 27989 tufB 100 K. pneumoniae ATCC 13883 tufA 93 K. pneumoniae ATCC 13883 tufB 81 S. Typhimurium LT2 tufA 53 S. Typhimurium LT2 tufB S. flexneri 2457T tufB 99 E. coli K-12 and S. flexneri 2457T tufA 97 61 E. coli K-12 tufB P. luminescens TTO1 tufA and tufB 100 P. shigelloides ATCC 14029 tufA P. shigelloides ATCC 14029 tufB 62 V. cholerae N16961 tufA 100 V. cholerae N16961 tufB

0.02

254

Figure 30. Arbre phylogénétique des séquences d’acides nucléiques des gènes tufA et tufB des souches du genre Yersinia, incluant Y. massiliensis, Y. similis et d’autres de la famille Enterobacteriaceae. Arbre phylogénétique basé sur la comparaison des séquences en acides nucléiques de tufA et tufB. Les branches des gènes tufA et tufB des Yersinia sont respectivement bleues et rouges. Les branches du gène tuf des autres espèces d‘Enterobacteriaceae sont vertes alors que celles de V. cholerae sont noires. La méthodologie utilisée est la même que celle décrite dans l‘article (Chapitre 6) pour la Figure 19A [Figure 1A], à l‘exception de la longueur du gène tuf analysé (positions 320 à 1 086 selon Y. pestis CO92) et de la version du logiciel Mega 5.05. Le terme « etc. » signifie que d‘autres souches sont représentées à ce niveau et le lecteur est référé à la Figure 19A [Figure 1A] du Chapitre 6. * : séquences de Y. massiliensis et Y. similis.

255

Figure 31. Arbre phylogénétique du programme fastDNAml des séquences en acides nucléiques de 51 souches de Yersinia, de 8 autres espèces d’Enterobacteriaceae et enraciné avec V. cholerae. Des arbres phylogénétiques ont été créés en utilisant une méthode de maximum-likelihood heuristique du programme fastDNAml (v. 1.2.2.) (Olsen et al. 1994). Le programme fastDNAml a été éxécuté 100 fois (K=10 et J généré de façon aléatoire à chaque fois). Quatre arbres phylogénétiquement indistinguables présentant le plus haut Ln likelihood exactement pareil ont été obtenus. Les branches de tufA et tufB des Yersinia sont respectivement présentées en bleues et rouges. Les branches du gène tuf des autres espèces d‘Enterobacteriaceae sont présentées en verts alors que celles de V. cholerae sont en noires.

256

Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (5)

Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (7)

36 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (4) 66 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (3) Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (2) 100 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (1) Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (6)

Y. pestis KIM yr005

Y. pestis KIM yr008

Y. pestis KIM yr011

Y. pestis KIM yr014 100 Y. pestis KIM yr020 Y. pestis KIM yr001 66 Y. pestis KIM yr024 E. coli MG1655 K-12 rrsH

66 E. coli MG1655 K-12 rrsG 98 100 E. coli MG1655 K-12 rrsD E. coli MG1655 K-12 rrsC 99 E. coli MG1655 K-12 rrsB

89 E. coli MG1655 K-12 rrsA 40 E. coli MG1655 K-12 rrsE

0.005

Figure 32. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 16S rDNA de Y. enterocolitica, Y. pestis et E. coli. La longueur complète (1 489 pb) des copies du gène 16S rDNA selon les séquences du gènome annoté de Y. enterocolitica sous-espèce enterocolitica 8 081 a été utilisée. L‘alignement a été fait en utilisant ClustalW et l‘arbre construit en utilisant le MCL implémenté dans Mega 5.05. L‘analyse statistique bootstrap a été répétée 1 000 fois. Cette analyse montre la similarité des copies du gène 16S rDNA chez le genre Yersinia en comparaison avec E. coli MG1655 K-12, un autre membre de la famille des Enterobacteriaceae utilisé à titre de contrôle négatif. La stabilité des copies du gène 16S rDNA suggère donc que le genre Yersinia est toujours sous l‘influence des mécanismes de conversion.

257

Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (4) 80 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (5) 38 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (3) Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (1) 100 43 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (6) Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (2)

66 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (7)

60 Y. pestis KIM yr006 51 Y. pestis KIM yr009 Y. pestis KIM yr012

Y. pestis KIM yr002 10063 Y. pestis KIM yr023 77 Y. pestis KIM yr015

88 Y. pestis KIM yr019 E. coli MG1655 K-12 rrlC E. coli MG1655 K-12 rrlH 100 E. coli MG1655 K-12 rrlA 51

E. coli MG1655 K-12 rrlD 48 E. coli MG1655 K-12 rrlE 78 97 E. coli MG1655 K-12 rrlG

98 E. coli MG1655 K-12 rrlB

0.005

Figure 33. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 23S rDNA de Y. enterocolitica, Y. pestis et E. coli. La longueur complète (2 996 pb) des copies du gène 23S rDNA selon les séquences du génome annoté de Y. enterocolitica sous-espèce enterocolitica 8 081 a été utilisée. L‘alignement a été fait en utilisant ClustalW et l‘arbre construit en utilisant le MCL implémenté dans Mega 5.05. L‘analyse statistique bootstrap a été répétée 1 000 fois. Cette analyse montre la similarité des copies du gène 23S rDNA chez le genre Yersinia en comparaison avec E. coli MG1655 K-12, un autre membre de la famille des Enterobacteriaceae utilisé à titre de contrôle négatif. La stabilité des copies du gène 23S rDNA suggère donc également que le genre Yersinia est toujours sous l‘influence des mécanismes de conversion.

258

Bibliographie

20/20 GeneSystems. 2012. BioCheckTM Powder Screening Test Kit. Consulté le 19 juin 2012. [En ligne: http://www.biocheckinfo.com/] Abdulkarim, F. et D. Hughes. 1996. Homologous recombination between the tuf genes of Salmonella typhimurium. Journal of molecular biology 260: 506-522. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8759317] Achtman, M., K. Zurth, G. Morelli, G. Torrea, A. Guiyoule et E. Carniel. 1999. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 14043-14048. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10570195] Affymetrix Inc. 2012. Gene Expression Assay and Data Analysis. Consulté le 20 juillet 2012. [En ligne: http://www.affymetrix.com/support/help/faqs/ge_assays/faq_15.jsp] Agence de la santé publique du Canada. 2012. Système de la réserve nationale d‘urgence. Consulté le 28 septembre 2013. [En ligne: http://www.phac-aspc.gc.ca/ep-mu/ness-fra.php]. Alaeddini, R. 2012. Forensic implications of PCR inhibition--A review. Forensic science international. Genetics 6: 297-305. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21917539] Aldous, W.K., J.I. Pounder, J.L. Cloud et G.L. Woods. 2005. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR. Journal of clinical microbiology 43: 2471-2473. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15872286] Alexeter Technologies LLC. 2012. RAID DXTM Consulté le 19 juin 2012. [En ligne: http://www.alexeter.com/biow/products/products/strips/RAID_DX.asp] Alibek, K. et S. Handelman. 2000. Biohazard : the chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world-told from the inside by the man who ran it. Delta Peaslake. 336 p. [ISBN : 978-0385334969]. Antonov, V.A., G.A. Tkachenko, V.V. Altukhova, S.S. Savchenko, O.V. Zinchenko, D.V. Viktorov, V.S. Zamaraev, V.I. Ilyukhin et V.V. Alekseev. 2008. Molecular identification and typing of

259

Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei: when is enough enough? Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 102 Suppl 1: S134-139. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19121675] Arwidsson, O. et D. Hughes. 2004. Evidence against reciprocal recombination as the basis for tuf gene conversion in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of molecular biology 338: 463-467. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15081805] Azad, A.F. 2007. Pathogenic rickettsiae as bioterrorism agents. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 45 Suppl 1: S52-55. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17582570] Baxevanis, A.D. et B.F.F. Ouellette. 2005. Bioinformatic: a practical guide to the analysis of genes and proteins (3e éd.). Wiley, Hoboken, N.J. 540 p. [ISBN: 978-0471478782]. Baxter, A.G. 2001. Louis Pasteur's beer of revenge. Nature reviews. Immunology 1: 229-232. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11905832] BD Diagnostics. 2009. Trousse de lyse BD GeneOhm. DOPS04-07-V1M2. [En ligne: http://www.bd.com/geneohm/english/products/pdfs/lysis_pkginsert.pdf] Beare, P.A. 2012. Genetic Manipulation of Coxiella burnetii. Advances in experimental medicine and biology 984: 249-271. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22711636] Beare, P.A., K.M. Sandoz, A. Omsland, D.D. Rockey et R.A. Heinzen. 2011. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology 2: 97. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21833334] Beaucage, C., Y. Bonnier Viger et A. Simpson. 2009. Épidémiologie appliquée : une initiation à la lecture critique de la littérature en sciences de la santé (2e éd.). G. Morin, Chenelière éducation, Montréal. 318 p. [ISBN: 978-2891059930]. Belenky, P. et J.J. Collins. 2011. Microbiology. Antioxidant strategies to tolerate antibiotics. Science 334: 915-916. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22096180] Belgrader, P., D. Hansford, G.T. Kovacs, K. Venkateswaran, R. Mariella, Jr., F. Milanovich, S. Nasarabadi, M. Okuzumi, F. Pourahmadi et M.A. Northrup. 1999. A minisonicator to rapidly disrupt bacterial spores for DNA analysis. Analytical chemistry 71: 4232-4236. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10517145] Belgrader, P., M. Okuzumi, F. Pourahmadi, D.A. Borkholder et M.A. Northrup. 2000. A microfluidic cartridge to prepare spores for PCR analysis. Biosensors & bioelectronics 14: 849-852. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10945459]

260

Bell, K.S., M. Sebaihia, L. Pritchard, M.T. Holden, L.J. Hyman, M.C. Holeva, N.R. Thomson, S.D. Bentley, L.J. Churcher, K. Mungall, R. Atkin, N. Bason, K. Brooks, T. Chillingworth, K. Clark, J. Doggett, A. Fraser, Z. Hance, H. Hauser, K. Jagels, S. Moule, H. Norbertczak, D. Ormond, C. Price, M.A. Quail, M. Sanders, D. Walker, S. Whitehead, G.P. Salmond, P.R. Birch, J. Parkhill et I.K. Toth. 2004. Genome sequence of the enterobacterial phytopathogen Erwinia carotovora subsp. atroseptica and characterization of virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 11105-11110. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15263089] Berche, P. 2009. L'histoire secrète des guerres biologiques : mensonges et crimes d'État. Robert Laffont, Paris. 389 p. [ISBN: 978-2221112144]. Berchtold, H., L. Reshetnikova, C.O. Reiser, N.K. Schirmer, M. Sprinzl et R. Hilgenfeld. 1993. Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365: 126-132. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8371755] Bercovier, H., H. Mollaret, J. Alonso, J. Brault, G. Fanning, A. Steigerwalt et D. Brenner. 1980. Intra- and interspecies relatedness of Yersinia pestis by DNA hybridization and its relationship to Yersinia pseudotuberculosis. Current microbiology 4: 225-229. [En ligne: http://dx.doi.org/10.1007/BF02605861] Bergey's Manual Trust. 2010. Bergey's Taxonomic Outlines. Consulté le 25 juin 2012. [En ligne: http://www.bergeys.org/outlines.html] Bernstein, H. et M. Weinstein. 2007. Chapter 9. Normal Pregnancy & Prenatal Care. In: DeCherney AH, Nathan L, eds. CURRENT Diagnosis & Treatment Obstetrics & Gynecology. (10e éd.). McGraw-Hill, New York. [En ligne: http://www.accessmedicine.com/content.aspx?aID=2384287] Biological and Toxin Weapons Convention (BTWC). 1972. Convention on the Prohibition of the Development, Production and Stockpiling of Bacteriological (Biological) and Toxin Weapons and on Their Destruction. Consulté le 29 août 2010. [En ligne: http://www.opbw.org/] Bissonnette, L. et M.G. Bergeron. 2010. Diagnosing infections--current and anticipated technologies for point-of-care diagnostics and home-based testing. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 16: 1044-1053. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20670286] Black, J.G. 2003. Microbiology : principles and explorations (5e éd.). Wiley, New York. 864 p. [ISBN : 978-0471364948].

261

Boissinot, K., A. Huletsky, R. Peytavi, S. Turcotte, V. Veillette, M. Boissinot, F.J. Picard, A.E. m et M.G. Bergeron. 2007. Rapid exonuclease digestion of PCR-amplified targets for improved microarray hybridization. Clinical chemistry 53: 2020-2023. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18030700] Boissinot, M. et M.G. Bergeron. 2002. Toward rapid real-time molecular diagnostic to guide smart use of antimicrobials. Current opinion in microbiology 5: 478-482. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12354554] Boissinot, M. et M.G. Bergeron. 2003. [Genomics and bioterrorism]. Medecine sciences : M/S 19: 967-971. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14613008] Brenner, D.J., N.R. Krieg, G.M. Garrity et J.T. Staley. 2005. Bergey's manual of systematic bacteriology. Volume 2 - The proteobacteria. Springer, New York. [En ligne: http://www.knovel.com/web/portal/basic_search/display?_EXT_KNOVEL_DISPLAY_booki d=1703] Brinker, A., H. Schulze, T. Bachmann et R. Moller. 2010. Lambda exonuclease pre-treatment for improved DNA-chip performance depends on the relative probe-target position. Biosensors & bioelectronics 26: 898-902. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20674326] Bryant, D. et V. Moulton. 2004. Neighbor-net: an agglomerative method for the construction of phylogenetic networks. Molecular biology and evolution 21: 255-265. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660700] Bryant, P.A., D. Venter, R. Robins-Browne et N. Curtis. 2004. Chips with everything: DNA microarrays in infectious diseases. The Lancet infectious diseases 4: 100-111. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14871635] Bryden, J. 1989. Deadly allies : Canada's secret war, 1937-1947. McClelland & Stewart, Toronto. 314 p. [ISBN: 978-0771017247]. Bryden, J. 1989. Deadly allies : Canada's secret war, 1937-1947 (Citation de NAC, RG24, C1, 4354- 33-13-3. The visit of Fildes was remembered by R.G.E. Murray andI.L. Baldwin. Davidson Pratt letters from Canada, Nov.-Dec.,1942, are in ibid., 4354-12-1) McClelland & Stewart, Toronto, Ont. 314 p. [ISBN: 978-0771017247]. Burnett, J.C., E.A. Henchal, A.L. Schmaljohn et S. Bavari. 2005. The evolving field of biodefence: therapeutic developments and diagnostics. Nature reviews. Drug discovery 4: 281-297. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803193]

262

Caldas, T.D., A. El Yaagoubi et G. Richarme. 1998. Chaperone properties of bacterial elongation factor EF-Tu. The Journal of biological chemistry 273: 11478-11482. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9565560] Campbell, C.G., R.D. Kirvel, A.H. Love, C.G. Bailey, R. Miles, J. Schweickert, M. Sutton et E. Raber. 2012. Decontamination after a release of B. anthracis spores. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science 10: 108-122. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22352747] Capella-Gutierrez, S., M. Marcet-Houben et T. Gabaldon. 2012. Phylogenomics supports microsporidia as the earliest diverging clade of sequenced fungi. BMC biology 10: 47. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22651672] Carrera, M., R.O. Zandomeni, J. Fitzgibbon et J.L. Sagripanti. 2007. Difference between the spore sizes of Bacillus anthracis and other Bacillus species. Journal of applied microbiology 102: 303-312. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17241334] Carus, W.S. 2001. Bioterrorism and biocrimes: the illicit use of biological agents since 1900. February 2001 revision. Center for Counterproliferation Research, National Defense University, Washington DC. [En ligne: http://www.ndu.edu/centercounter/full_doc.pdf] Cavalier-Smith, T. 1998. A revised six-kingdom system of life. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society 73: 203-266. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9809012] CDC. 2000. Biological and chemical terrorism: strategic plan for preparedness and response. Recommendations of the CDC Strategic Planning Workgroup. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control 49: 1-14. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10803503] CDC. 2007. Emergency Preparedness and Response. Consulté le 16 juin 2012. [En ligne: http://www.bt.cdc.gov/bioterrorism/overview.asp] Centers for Disease Control and Prevention. 2012. Facts About the Laboratory Response Network. Consulté le 25 juin 2012. [En ligne: http://www.bt.cdc.gov/lrn/factsheet.asp] Ch'ng, S.L., S. Octavia, Q. Xia, A. Duong, M.M. Tanaka, H. Fukushima et R. Lan. 2011. Population structure and evolution of pathogenicity of Yersinia pseudotuberculosis. Applied and environmental microbiology 77: 768-775. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21131531] Chain, P.S., E. Carniel, F.W. Larimer, J. Lamerdin, P.O. Stoutland, W.M. Regala, A.M. Georgescu, L.M. Vergez, M.L. Land, V.L. Motin, R.R. Brubaker, J. Fowler, J. Hinnebusch, M. Marceau, C. Medigue, M. Simonet, V. Chenal-Francisque, B. Souza, D. Dacheux, J.M. Elliott, A. Derbise, L.J. Hauser et E. Garcia. 2004. Insights into the evolution of Yersinia pestis

263

through whole-genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 13826-13831. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15358858] Chain, P.S., P. Hu, S.A. Malfatti, L. Radnedge, F. Larimer, L.M. Vergez, P. Worsham, M.C. Chu et G.L. Andersen. 2006. Complete genome sequence of Yersinia pestis strains Antiqua and Nepal516: evidence of gene reduction in an emerging pathogen. Journal of bacteriology 188: 4453-4463. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16740952] Chandler, D.P., J. Brown, C.J. Bruckner-Lea, L. Olson, G.J. Posakony, J.R. Stults, N.B. Valentine et L.J. Bond. 2001. Continuous spore disruption using radially focused, high-frequency ultrasound. Analytical chemistry 73: 3784-3789. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11510849] Chenna, R., H. Sugawara, T. Koike, R. Lopez, T.J. Gibson, D.G. Higgins et J.D. Thompson. 2003. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic acids research 31: 3497-3500. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12824352] Christopher, G.W., T.J. Cieslak, J.A. Pavlin et E.M. Eitzen, Jr. 1997. Biological warfare. A historical perspective. Journal of the American Medical Association 278: 412-417. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9244333] Cilia, V., B. Lafay et R. Christen. 1996. Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA sequences, and their effect on phylogenetic analyses at the species level. Molecular biology and evolution 13: 451-461. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8742634] Ciottone, G.R. 2006. Disaster medicine. Elsevier/Mosby, Philadelphia, PA. 952 p. [ISNB: 978-0323032537]. Coenye, T. et P. Vandamme. 2003. Intragenomic heterogeneity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes. FEMS microbiology letters 228: 45-49. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14612235] Colson, P., C. Tamalet et D. Raoult. 2006. SVARAP and aSVARAP: simple tools for quantitative analysis of nucleotide and amino acid variability and primer selection for clinical microbiology. BMC microbiology 6: 21. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16515699] Comité international de la Croix-Rouge. 2012. Protocole concernant la prohibition d'emploi à la guerre de gaz asphyxiants, toxiques ou similaires et de moyens bactériologiques. Genève, 17 juin 1925. Consulté le 27 juin 2012. [En ligne: http://www.icrc.org/dih.nsf/WebSign?ReadForm&id=280&ps=P] Conejero, L., N. Patel, M. de Reynal, S. Oberdorf, J. Prior, P.L. Felgner, R.W. Titball, F.J. Salguero et G.J. Bancroft. 2011. Low-dose exposure of C57BL/6 mice to burkholderia pseudomallei mimics chronic human . The American journal of pathology 179: 270-280.

264

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21703409] Corless, C.E., M. Guiver, R. Borrow, V. Edwards-Jones, E.B. Kaczmarski et A.J. Fox. 2000. Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNA PCR. Journal of clinical microbiology 38: 1747-1752. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10790092] Cotran, R.S., R.S. Cotran, S.L. Robbins et V. Kumar. 2010. Robbins and Cotran pathologic basis of disease (8e éd.). Saunders/Elsevier, Philadelphia, PA. 1450 p. [ISBN: 978-1437707922]. Daly, M. 1998. The Day Subway Got Dusted. New-York Daily News Consulté le 15 juin 2012 [En ligne: http://articles.nydailynews.com/1998-02-22/news/18071834_1_new-york- subway-bulb-spores] Dauphin, L.A. et M.D. Bowen. 2009. A simple method for the rapid removal of Bacillus anthracis spores from DNA preparations. Journal of microbiological methods 76: 212-214. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18996156] Dauphin, L.A., B.D. Moser et M.D. Bowen. 2009. Evaluation of five commercial nucleic acid extraction kits for their ability to inactivate Bacillus anthracis spores and comparison of DNA yields from spores and spiked environmental samples. Journal of microbiological methods 76: 30-37. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18824041] Demarta, A., S. De Respinis, M. Dolina et R. Peduzzi. 2004. Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of 16s rDNA and gyrB genes sequence analyses. FEMS microbiology letters 238: 423-428. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15358429] Deng, W., V. Burland, G. Plunkett, 3rd, A. Boutin, G.F. Mayhew, P. Liss, N.T. Perna, D.J. Rose, B. Mau, S. Zhou, D.C. Schwartz, J.D. Fetherston, L.E. Lindler, R.R. Brubaker, G.V. Plano, S.C. Straley, K.A. McDonough, M.L. Nilles, J.S. Matson, F.R. Blattner et R.D. Perry. 2002. Genome sequence of Yersinia pestis KIM. Journal of bacteriology 184: 4601-4611. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12142430] Derbes, V.J. 1966. De Mussis and the great plague of 1348. A forgotten episode of bacteriological warfare. Journal of the American Medical Association 196: 59-62. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5952188] Derbise, A., V. Chenal-Francisque, C. Huon, C. Fayolle, C.E. Demeure, B. Chane-Woon-Ming, C. Medigue, B.J. Hinnebusch et E. Carniel. 2010. Delineation and analysis of chromosomal regions specifying Yersinia pestis. Infection and immunity 78: 3930-3941. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20605981] Derbise, A., B. Lesic, D. Dacheux, J.M. Ghigo et E. Carniel. 2003. A rapid and simple method for inactivating chromosomal genes in Yersinia. FEMS immunology and medical microbiology 38: 113-116. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13129645]

265

Deshpande, A., J. Gans, S.W. Graves, L. Green, L. Taylor, H.B. Kim, Y.A. Kunde, P.M. Leonard, P.E. Li, J. Mark, J. Song, M. Vuyisich et P.S. White. 2010. A rapid multiplex assay for nucleic acid-based diagnostics. Journal of microbiological methods 80: 155-163. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20006656] Didelot, X., R. Bowden, D.J. Wilson, T.E.A. Peto et D.W. Crook. 2012. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. advance online publication. [En ligne: http://dx.doi.org/10.1038/nrg3226] Dolina, M., V. Gaia et R. Peduzzi. 1995. Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of ribotyping and DNA-DNA hybridization. Contributions to microbiology and immunology 13: 140-144. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8833818] Dolina, M. et R. Peduzzi. 1993. Population genetics of human, animal, and environmental Yersinia strains. Applied and environmental microbiology 59: 442-450. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8434911] Duchaud, E., C. Rusniok, L. Frangeul, C. Buchrieser, A. Givaudan, S. Taourit, S. Bocs, C. Boursaux- Eude, M. Chandler, J.F. Charles, E. Dassa, R. Derose, S. Derzelle, G. Freyssinet, S. Gaudriault, C. Medigue, A. Lanois, K. Powell, P. Siguier, R. Vincent, V. Wingate, M. Zouine, P. Glaser, N. Boemare, A. Danchin et F. Kunst. 2003. The genome sequence of the entomopathogenic bacterium Photorhabdus luminescens. Nature biotechnology 21: 1307-1313. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14528314] Duelfer, C.A. 2004. Comprehensive Report of the Special Advisor to the Director of Central Intelligence on Iraq's Weapons of Mass Destruction, 30 September 2004, Volume III. Consulté le 4 août 2012. [En ligne: https://www.cia.gov/library/reports/general-reports- 1/iraq_wmd_2004/chap6.html] Duncan, E.J., B. Kournikakis, J. Ho et I. Hill. 2009. Pulmonary deposition of aerosolized Bacillus atrophaeus in a Swine model due to exposure from a simulated anthrax letter incident. Inhalation toxicology 21: 141-152. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18923948] Ellerbrok, H., H. Nattermann, M. Özel, L. Beutin, B. Appel et G. Pauli. 2002. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS microbiology letters 214: 51-59. [En ligne: http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6968.2002.tb11324.x] Emanuel, P., J.W. Roos et K. Niyogi. 2008. Sampling for biological agents in the environment. ASM Press, Washington DC. 294 p. [ISBN: 978-1613442616 ].

266

Euler, M., Y. Wang, O. Nentwich, O. Piepenburg, F.T. Hufert et M. Weidmann. 2012. Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Rift Valley fever virus. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology 54: 308-312. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22683006] Felsenstein, J. 1985. Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap. Evolution 39: 783-791. [En ligne: http://www.jstor.org/stable/2408678] Felsenstein, J. 2004. Inferring phylogenies. Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 664 p. [ISBN: 978-0878931774 ]. Fouet, A. et M. Mock. 1996. Differential influence of the two Bacillus anthracis plasmids on regulation of virulence gene expression. Infection and immunity 64: 4928-4932. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8945528] Frigon, V. 2010. Le projet N. Grands Reportages de RDI - Radio-Canada. Galimand, M., A. Guiyoule, G. Gerbaud, B. Rasoamanana, S. Chanteau, E. Carniel et P. Courvalin. 1997. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a transferable plasmid. The New England journal of medicine 337: 677-680. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9278464] Garcia, M.E., J.L. Blanco, J. Caballero et D. Gargallo-Viola. 2002. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. Journal of clinical microbiology 40: 1567-1568. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11923400] Geissler, M., J.A. Beauregard, I. Charlebois, S. Isabel, F. Normandin, B. Voisin, M. Boissinot, M.G. Bergeron et T. Veres. 2011. Extraction of nucleic acids from bacterial spores using bead- based mechanical lysis on a plastic chip. Engineering in Life Sciences 11: 174-181. [En ligne: http://dx.doi.org/10.1002/elsc.201000132] Gilchrist, M.J.R. et American Society for Microbiology. 2000. Cumitech 33, Laboratory safety, management, and diagnosis of biological agents associated with bioterrorism. ASM Press, Washington, DC. 19 p. Godoy, D., G. Randle, A.J. Simpson, D.M. Aanensen, T.L. Pitt, R. Kinoshita et B.G. Spratt. 2003. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. Journal of clinical microbiology 41: 2068-2079. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12734250] Greub, G. 2010. International Committee on Systematics of Prokaryotes. Subcommittee on the taxonomy of the Chlamydiae: minutes of the closed meeting, 21 June 2010, Hof bei Salzburg, Austria. International journal of systematic and evolutionary microbiology 60: 2694. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21048222]

267

Grunberg-Manago, M. 1996. Regulation of the expression of aminoacyltRNA synthetases and translation factors, vol. 2. (2e éd.). ASM Press, Washington, DC. p. [ISBN: 978-1555810849 ]. Guillemin, J. 2005. Biological weapons : from the invention of state-sponsored programs to contemporary bioterrorism. Columbia University Press, New York ; Chichester. 258 p. [ISBN: 978-0231129435]. Guillemin, J. 2012. Presumed guilt in the anthrax case. Science 336: 669; author reply 669-670. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22582244] Hadiwikarta, W.W., J.C. Walter, J. Hooyberghs et E. Carlon. 2012. Probing hybridization parameters from microarray experiments: nearest-neighbor model and beyond. Nucleic acids research. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22661582] Hadjinicolaou, A.V., V.L. Demetriou, J. Hezka, W. Beyer, T.L. Hadfield et L.G. Kostrikis. 2009. Use of molecular beacons and multi-allelic real-time PCR for detection of and discrimination between virulent Bacillus anthracis and other Bacillus isolates. Journal of microbiological methods 78: 45-53. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19379778] Hagen, A.J., R.A. Aboud, P.A. DePhillips, C.N. Oliver, C.J. Orella et R.D. Sitrin. 1996. Use of nuclease enzyme in the purification of VAQTA, a hepatitis A vaccine. Biotechnology and applied biochemistry 23 ( Pt 3): 209-215. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8679106] Hall, B.G. 2011. Phylogenetic trees made easy : a how-to manual (4e éd.). Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 282 p. [ISBN: 978-0878936069]. Hall, M. 2008. Legacy of anthrax attacks: Costly white powder incidents. USA Today,16 octobre 2008. [En ligne: http://www.federaltimes.com/print/article/20081016/DEPARTMENTS03/810160301/Lega cy-anthrax-attacks-Costly-white-powder-incidents] Han, Y., J. Qiu, Z. Guo, H. Gao, Y. Song, D. Zhou et R. Yang. 2007. Comparative transcriptomics in Yersinia pestis: a global view of environmental modulation of gene expression. BMC microbiology 7: 96. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17963531] Hashimoto, J.G., B.S. Stevenson et T.M. Schmidt. 2003. Rates and consequences of recombination between rRNA operons. Journal of bacteriology 185: 966-972. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12533472]

268

Heidelberg, J.F., J.A. Eisen, W.C. Nelson, R.A. Clayton, M.L. Gwinn, R.J. Dodson, D.H. Haft, E.K. Hickey, J.D. Peterson, L. Umayam, S.R. Gill, K.E. Nelson, T.D. Read, H. Tettelin, D. Richardson, M.D. Ermolaeva, J. Vamathevan, S. Bass, H. Qin, I. Dragoi, P. Sellers, L. McDonald, T. Utterback, R.D. Fleishmann, W.C. Nierman, O. White, S.L. Salzberg, H.O. Smith, R.R. Colwell, J.J. Mekalanos, J.C. Venter et C.M. Fraser. 2000. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature 406: 477-483. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10952301] Henikoff, S. et J.G. Henikoff. 1992. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89: 10915-10919. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1438297] Herfst, S., E.J. Schrauwen, M. Linster, S. Chutinimitkul, E. de Wit, V.J. Munster, E.M. Sorrell, T.M. Bestebroer, D.F. Burke, D.J. Smith, G.F. Rimmelzwaan, A.D. Osterhaus et R.A. Fouchier. 2012. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science 336: 1534-1541. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22723413] Hindson, B.J., K.D. Ness, D.A. Masquelier, P. Belgrader, N.J. Heredia, A.J. Makarewicz, I.J. Bright, M.Y. Lucero, A.L. Hiddessen, T.C. Legler, T.K. Kitano, M.R. Hodel, J.F. Petersen, P.W. Wyatt, E.R. Steenblock, P.H. Shah, L.J. Bousse, C.B. Troup, J.C. Mellen, D.K. Wittmann, N.G. Erndt, T.H. Cauley, R.T. Koehler, A.P. So, S. Dube, K.A. Rose, L. Montesclaros, S. Wang, D.P. Stumbo, S.P. Hodges, S. Romine, F.P. Milanovich, H.E. White, J.F. Regan, G.A. Karlin-Neumann, C.M. Hindson, S. Saxonov et B.W. Colston. 2011. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical chemistry 83: 8604-8610. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22035192] Hoffmaster, A.R., J. Ravel, D.A. Rasko, G.D. Chapman, M.D. Chute, C.K. Marston, B.K. De, C.T. Sacchi, C. Fitzgerald, L.W. Mayer, M.C. Maiden, F.G. Priest, M. Barker, L. Jiang, R.Z. Cer, J. Rilstone, S.N. Peterson, R.S. Weyant, D.R. Galloway, T.D. Read, T. Popovic et C.M. Fraser. 2004. Identification of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 8449-8454. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15155910] Hollidge, B.S., F. Gonzalez-Scarano et S.S. Soldan. 2010. Arboviral encephalitides: transmission, emergence, and pathogenesis. Journal of neuroimmune pharmacology 5: 428-442. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20652430] Howard, S.L., M.W. Gaunt, J. Hinds, A.A. Witney, R. Stabler et B.W. Wren. 2006. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. Journal of bacteriology 188: 3645- 3653. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16672618]

269

Hu, B., G. Xie, C.C. Lo, S.R. Starkenburg et P.S. Chain. 2011. Pathogen comparative genomics in the next-generation sequencing era: genome alignments, pangenomics and metagenomics. Briefings in functional genomics 10: 322-333. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22199376] Hu, X., G. Van der Auwera, S. Timmery, L. Zhu et J. Mahillon. 2009. Distribution, diversity, and potential mobility of extrachromosomal elements related to the Bacillus anthracis pXO1 and pXO2 virulence plasmids. Applied and environmental microbiology 75: 3016-3028. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19304837] Hughes, D. 2000. Co-evolution of the tuf genes links gene conversion with the generation of chromosomal inversions. Journal of molecular biology 297: 355-364. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10715206] Hurst, M.R., S.A. Becher, S.D. Young, T.L. Nelson et T.R. Glare. 2011. Yersinia entomophaga sp. nov., isolated from the New Zealand grass grub . International journal of systematic and evolutionary microbiology 61: 844-849. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20495033] Huson, D.H. et D. Bryant. 2006. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular biology and evolution 23: 254-267. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16221896] Hwang, S.M., M.S. Kim, K.U. Park, J. Song et E.C. Kim. 2011. Tuf gene sequence analysis has greater discriminatory power than 16S rRNA sequence analysis in identification of clinical isolates of coagulase-negative staphylococci. Journal of clinical microbiology 49: 4142- 4149. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21998419] Ibrahim, A., B.M. Goebel, W. Liesack, M. Griffiths et E. Stackebrandt. 1993. The phylogeny of the genus Yersinia based on 16S rDNA sequences. FEMS microbiology letters 114: 173-177. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7506685] ICVT. 2009. Virus Taxonomy: 2009 Release (9th Report). Consulté le 5 juin 2012. [En ligne: http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2009&bhcp=1] Idaho Technology Inc. 2011. FilmArray® BioSurveillance System & Pouch. [En ligne: http://www.idahotech.com/pdfs/FilmArray/Infosheet,%20FilmArray%20Biothreat- 0039.pdf] Idaho Technology Inc. 2012. FilmArray® BioSurveillance System. Consulté le 30 mai 2012. [En ligne: http://www.idahotech.com/FilmArray/index-BioDef.html] Idaho Technology Inc. 2012. RAZOR™ EX BioDetection System. Consulté le 30 mai 2012. [En ligne: http://www.idahotech.com/RAZOREX/index.html] Imai, M., T. Watanabe, M. Hatta, S.C. Das, M. Ozawa, K. Shinya, G. Zhong, A. Hanson, H. Katsura, S. Watanabe, C. Li, E. Kawakami, S. Yamada, M. Kiso, Y. Suzuki, E.A. Maher, G. Neumann

270

et Y. Kawaoka. 2012. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets. Nature 486: 420-428. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22722205] Inglesby, T.V., D.A. Henderson, J.G. Bartlett, M.S. Ascher, E. Eitzen, A.M. Friedlander, J. Hauer, J. McDade, M.T. Osterholm, T. O'Toole, G. Parker, T.M. Perl, P.K. Russell et K. Tonat. 1999. Anthrax as a biological weapon: medical and public health management. Working Group on Civilian Biodefense. Journal of the American Medical Association 281: 1735-1745. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10328075] International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2000. Validation of publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSEM, validation list no. 75. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50: 1415-1417. [En ligne: http://ijs.sgmjournals.org/content/50/4/1415.short] International Journal of Systematic Bacteriology. 1981. Validation of the Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSB: List No. 7. International Journal of Systematic Bacteriology 31: 382-383. [En ligne: http://ijs.sgmjournals.org/content/31/3/382.short] Interpol. 2007. Interpol Bioterrorism Incident Pre-planning and Response Guide (1ere éd.). ICPO- Interpol. [En ligne: https://www.interpol.int/Public/BioTerrorism/guide.asp] Irenge, L.M. et J.L. Gala. 2012. Rapid detection methods for Bacillus anthracis in environmental samples: a review. Applied microbiology and biotechnology 93: 1411-1422. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22262227] Isabel, S., M. Boissinot, I. Charlebois, C.M. Fauvel, L.E. Shi, J.C. Levesque, A.T. Paquin, M. Bastien, G. Stewart, E. Leblanc, S. Sato et M.G. Bergeron. 2012. Rapid filtration separation-based sample preparation method for Bacillus spores in powdery and environmental matrices. Applied and environmental microbiology 78: 1505-1512. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22210204] Isabel, S., E. Leblanc, M. Boissinot, D.K. Boudreau, M. Grondin, F.J. Picard, E.A. Martel, N.J. Parham, P.S. Chain, D.E. Bader, M.R. Mulvey, L. Bryden, P.H. Roy, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2008. Divergence among genes encoding the elongation factor Tu of Yersinia Species. Journal of bacteriology 190: 7548-7558. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18790860] Jackson, R.J., A.J. Ramsay, C.D. Christensen, S. Beaton, D.F. Hall et I.A. Ramshaw. 2001. Expression of mouse interleukin-4 by a recombinant ectromelia virus suppresses cytolytic lymphocyte responses and overcomes genetic resistance to mousepox. Journal of virology 75: 1205-1210. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11152493]

271

Janse, I., J.M. Bok, R.A. Hamidjaja, H.M. Hodemaekers et B.J. van Rotterdam. 2012. Development and comparison of two assay formats for parallel detection of four biothreat pathogens by using suspension microarrays. PloS one 7: e31958. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22355407] Jenner, E. 1801. An inquiry into the causes and effects of the variolae vaccinae, a disease discovered in some of the western counties of England, particularly Gloucestershire, and known by the name of the cow pox. printed for the author, by D.N. Shury, Université de Gand. [En ligne: http://books.google.ca/books?id=_HJEAAAAcAAJ] Jernigan, J.A., D.S. Stephens, D.A. Ashford, C. Omenaca, M.S. Topiel, M. Galbraith, M. Tapper, T.L. Fisk, S. Zaki, T. Popovic, R.F. Meyer, C.P. Quinn, S.A. Harper, S.K. Fridkin, J.J. Sejvar, C.W. Shepard, M. McConnell, J. Guarner, W.J. Shieh, J.M. Malecki, J.L. Gerberding, J.M. Hughes, B.A. Perkins et T. Anthrax Bioterrorism Investigation. 2001. Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 cases reported in the United States. Emerging infectious diseases 7: 933-944. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11747719] Jolley, K.A., C.M. Bliss, J.S. Bennett, H.B. Bratcher, C. Brehony, F.M. Colles, H. Wimalarathna, O.B. Harrison, S.K. Sheppard, A.J. Cody et M.C. Maiden. 2012. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology 158: 1005-1015. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22282518] Judicial Commission of the International Committee on Systematic Bacteriology. 1985. Opinion 60: Rejection of the Name Yersinia pseudotuberculosis subsp. pestis (van Loghem) Bercovier et al. 1981 and Conservation of the Name Yersinia pestis (Lehmann and Neumann) van Loghem 1944 for the Plague Bacillus. International Journal of Systematic Bacteriology 35: 540. [En ligne: http://ijs.sgmjournals.org/content/35/4/540.abstract] Kaufmann, S.H. et U.E. Schaible. 2005. 100th anniversary of Robert Koch's Nobel Prize for the discovery of the tubercle bacillus. Trends in microbiology 13: 469-475. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16112578] Ke, D., M. Boissinot, A. Huletsky, F.J. Picard, J. Frenette, M. Ouellette, P.H. Roy et M.G. Bergeron. 2000. Evidence for horizontal gene transfer in evolution of elongation factor Tu in enterococci. Journal of bacteriology 182: 6913-6920. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11092850] Ke, D., F.J. Picard, F. Martineau, C. Menard, P.H. Roy, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 1999. Development of a PCR assay for rapid detection of enterococci. Journal of clinical microbiology 37: 3497-3503. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10523541] Keim, P., K.L. Smith, C. Keys, H. Takahashi, T. Kurata et A. Kaufmann. 2001. Molecular investigation of the Aum Shinrikyo anthrax release in Kameido, Japan. Journal of clinical microbiology 39: 4566-4567.

272

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11724885] Kellogg, D.E., I. Rybalkin, S. Chen, N. Mukhamedova, T. Vlasik, P.D. Siebert et A. Chenchik. 1994. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. BioTechniques 16: 2888-2893. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8074881] Kim, K., J. Seo, K. Wheeler, C. Park, D. Kim, S. Park, W. Kim, S.-I. Chung et T. Leighton. 2005. Rapid genotypic detection of Bacillus anthracis and the Bacillus cereus group by multiplex real-time PCR melting curve analysis. FEMS immunology and medical microbiology 43: 301-310. [En ligne: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928824404002160] King, L.S. 1952. Dr. Koch's postulates. Journal of the history of medicine and allied sciences 7: 350- 361. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12990783] Kloepper, T.H. et D.H. Huson. 2008. Drawing explicit phylogenetic networks and their integration into SplitsTree. BMC evolutionary biology 8: 22. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18218099] Kluytmans, J., A. van Belkum et H. Verbrugh. 1997. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clinical microbiology reviews 10: 505-520. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9227864] Kondrashov, F.A., T.A. Gurbich et P.K. Vlasov. 2007. Selection for functional uniformity of tuf duplicates in gamma-proteobacteria. Trends in genetics 23: 215-218. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17383049] Kotetishvili, M., A. Kreger, G. Wauters, J.G. Morris, Jr., A. Sulakvelidze et O.C. Stine. 2005. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species. Journal of clinical microbiology 43: 2674-2684. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15956383] Kournikakis, B., S.J. Armour, C.A. Boulet, M. Spence et B. Parsons. 2001. Risk assessment of anthrax threat letters. Consulté le [En ligne: http://cradpdf.drdc.gc.ca/PDFS/unc54/p516525.pdf] Kowalski, W. et W. Bahnfleth. 1998. Airborne respiratory diseases and mechanical systems for control of microbes. HPAC Engineering 70: 34-48. [En ligne: http://www.engr.psu.edu/iec/abe/publications/airborne_resp_disease_control_microbes. pdf] Kramer, A., I. Schwebke et G. Kampf. 2006. How long do nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? A systematic review. BMC infectious diseases 6: 130. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16914034]

273

Krieg, N.R., W. Ludwig, W. Whitman, B.P. Hedlund, B.J. Paster, J.T. Staley, N. Ward, D. Brown et A. Parte. 2010. Bergey's manual of systematic bacteriology. Volume 4 - The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes (Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres, Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Verrucomicrobia, Chlamydiae, and Planctomycetes. Springer, New York. [En ligne: http://dx.doi.org/10.1007/978-0-387-68572-4] Kushiro, M., M. Shimizu et K. Tomita. 1987. Molecular cloning and sequence determination of the tuf gene coding for the elongation factor Tu of Thermus thermophilus HB8. European journal of biochemistry 170: 93-98. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2826164] La Scola, B., P.E. Fournier et D. Raoult. 2003. Searching for Bacillus anthracis in suspect powders: a French experience. Journal of clinical microbiology 41: 524; author reply 524-525. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12517916] Laflamme, C., S. Lavigne, J. Ho et C. Duchaine. 2004. Assessment of bacterial endospore viability with fluorescent dyes. Journal of applied microbiology 96: 684-692. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15012806] Larguinho, M., H.M. Santos, G. Doria, H. Scholz, P.V. Baptista et J.L. Capelo. 2010. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta 81: 881- 886. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20298868] Lathe, W.C., 3rd et P. Bork. 2001. Evolution of tuf genes: ancient duplication, differential loss and gene conversion. FEBS letters 502: 113-116. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11583110] Leask, A., V. Delpech et J. McAnulty. 2003. Anthrax and other suspect powders: initial responses to an outbreak of hoaxes and scares. New South Wales public health bulletin 14: 218-221. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14981556] LeClaire, R.D.P., M. L. M. 2004. Biological weapons defense: Effect levels. In Biological weapons defense: infectious diseases and counterbioterrorism. Humana Press, Totowa, NJ. [En ligne: http://www.springerlink.com/content/gg3202823x416677/] Leitenberg, M. 2001. Biological Weapons in the Twentieth Century: A Review and Analysis. Critical reviews in microbiology 27: 267-320. [En ligne: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1080/20014091096774] Leski, T.A., C.C. Caswell, M. Pawlowski, D.J. Klinke, J.M. Bujnicki, S.J. Hart et S. Lukomski. 2009. Identification and classification of bcl genes and proteins of Bacillus cereus group organisms and their application in Bacillus anthracis detection and fingerprinting. Applied and environmental microbiology 75: 7163-7172. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19767469] Leski, T.A., A.P. Malanoski, D.A. Stenger et B. Lin. 2010. Target amplification for broad spectrum microbial diagnostics and detection. Future microbiology 5: 191-203.

274

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20143944] Levitzky, M.G. 2007. Pulmonary physiology. McGraw-Hill, New York. [En ligne: http://www.accessmedicine.com/resourceTOC.aspx?resourceID=98] Liao, X., T. Ying, H. Wang, J. Wang, Z. Shi, E. Feng, K. Wei, Y. Wang, X. Zhang, L. Huang, G. Su et P. Huang. 2003. A two-dimensional proteome map of Shigella flexneri. Electrophoresis 24: 2864-2882. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12929182] Lim, D.V., J.M. Simpson, E.A. Kearns et M.F. Kramer. 2005. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clinical microbiology reviews 18: 583-607. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16223949] Lindler, L.E., F.J. Lebeda et G. Korch. 2005. Biological weapons defense : infectious diseases and counterbioterrorism. Humana Press, Totowa, N.J. 597 p. [ISBN: 978-1588291844]. Liu, Y.T. 2008. A technological update of molecular diagnostics for infectious diseases. Infectious disorders drug targets 8: 183-188. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18782035] Lockhart, D.J., H. Dong, M.C. Byrne, M.T. Follettie, M.V. Gallo, M.S. Chee, M. Mittmann, C. Wang, M. Kobayashi, H. Horton et E.L. Brown. 1996. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nature biotechnology 14: 1675-1680. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9634850] Lockwood, J.A. 2009. Six-legged soldiers : using insects as weapons of war. Oxford University Press, Toronto. 377 p. [ISBN : 978-0195333053 ]. Luna, V.A., D. King, C. Davis, T. Rycerz, M. Ewert, A. Cannons, P. Amuso et J. Cattani. 2003. Novel sample preparation method for safe and rapid detection of Bacillus anthracis spores in environmental powders and nasal swabs. Journal of clinical microbiology 41: 1252-1255. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12624060] Lutwick, L.I. et S.M. Lutwick. 2009. Beyond anthrax : the weaponization of infectious diseases. Springer, New York. 374 p. [ISBN: 978-1588294388]. Lynch, M. et J.S. Conery. 2000. The evolutionary fate and consequences of duplicate genes. Science 290: 1151-1155. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11073452] MacKenzie, D. 2011. Bioterror fears could block crucial flu research. New Scientist, 21 November 2011. [En ligne: http://www.newscientist.com/article/dn21195-bioterror-fears-could-block- crucial-flu-research.html]

275

Mansfield, J., S. Genin, S. Magori, V. Citovsky, M. Sriariyanum, P. Ronald, M. Dow, V. Verdier, S.V. Beer, M.A. Machado, I. Toth, G. Salmond et G.D. Foster. 2012. Top 10 plant in molecular plant pathology. Molecular plant pathology 13: 614-629. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22672649] Marentis, T.C., B. Kusler, G.G. Yaralioglu, S. Liu, E.O. Haeggstrom et B.T. Khuri-Yakub. 2005. Microfluidic sonicator for real-time disruption of eukaryotic cells and bacterial spores for DNA analysis. Ultrasound in medicine & biology 31: 1265-1277. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16176793] Martel, É. 2011. Conception automatisée d'amorces et de sondes aux fins de diagnostic moléculaire. Université Laval, Québec. [En ligne: http://www.theses.ulaval.ca/2011/27907/27907.pdf] Martineau, F., F.J. Picard, D. Ke, S. Paradis, P.H. Roy, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2001. Development of a PCR assay for identification of staphylococci at genus and species levels. Journal of clinical microbiology 39: 2541-2547. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11427566] Masci, J.R. et E.R. Bass. 2005. Bioterrorism : a guide for hospital preparedness. CRC Press, Boca Raton, FL. 361 p. [ISBN: 978-0849316609 ]. Massier, S., A. Rince, O. Maillot, M.G. Feuilloley, N. Orange et S. Chevalier. 2012. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa to a pulsed light-induced stress. Journal of applied microbiology 112: 502-511. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22188372] Matero, P., T. Pasanen, R. Laukkanen, P. Tissari, E. Tarkka, M. Vaara et M. Skurnik. 2009. Real- time multiplex PCR assay for detection of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica 117: 34-44. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19161535] Mattatall, N.R. et K.E. Sanderson. 1996. Salmonella typhimurium LT2 possesses three distinct 23S rRNA intervening sequences. Journal of bacteriology 178: 2272-2278. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8636028] Mauroni, A. 2003. Chemical and Biological Warfare: A Reference Handbook ABC-CLIO, Santa Barbara, CA 243 p. [ISBN : 978-1851094820]. Mayor, A. 2003. Greek Fire, Poison Arrows & Scorpion Bombs: Biological and Chemical Warfare in the Ancient World. Overlook Press, New-York. 352 p. [ISBN: 978-1585673483 ]. McClelland, M., K.E. Sanderson, J. Spieth, S.W. Clifton, P. Latreille, L. Courtney, S. Porwollik, J. Ali, M. Dante, F. Du, S. Hou, D. Layman, S. Leonard, C. Nguyen, K. Scott, A. Holmes, N. Grewal, E. Mulvaney, E. Ryan, H. Sun, L. Florea, W. Miller, T. Stoneking, M. Nhan, R.

276

Waterston et R.K. Wilson. 2001. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature 413: 852-856. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11677609] Ménard, C. et F.J. Picard. 2003. Procédé universel et composition pour la lyse rapide de cellules pernettant la libération d'acides nucléiques et leur détection. WO/2003/008636. [En ligne: http://patentscope.wipo.int/search/en/WO2003008636] Merhej, V., T. Adekambi, I. Pagnier, D. Raoult et M. Drancourt. 2008. Yersinia massiliensis sp. nov., isolated from fresh water. International journal of systematic and evolutionary microbiology 58: 779-784. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18398169] Mignard, S. et J.P. Flandrois. 2007. Identification of Mycobacterium using the EF-Tu encoding (tuf) gene and the tmRNA encoding (ssrA) gene. Journal of medical microbiology 56: 1033- 1041. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17644709] Miller, M.B. et Y.W. Tang. 2009. Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology. Clinical microbiology reviews 22: 611-633. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19822891] Morata, P., M.I. Queipo-Ortuno et J. de Dios Colmenero. 1998. Strategy for optimizing DNA amplification in a peripheral blood PCR assay used for diagnosis of human brucellosis. Journal of clinical microbiology 36: 2443-2446. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9705371] Murros-Kontiainen, A., M. Fredriksson-Ahomaa, H. Korkeala, P. Johansson, R. Rahkila et J. Bjorkroth. 2011. Yersinia nurmii sp. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology 61: 2368-2372. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21037032] Naef, F., D.A. Lim, N. Patil et M. Magnasco. 2002. DNA hybridization to mismatched templates: a chip study. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics 65: 040902. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12005798] Naef, F. et M.O. Magnasco. 2003. Solving the riddle of the bright mismatches: labeling and effective binding in oligonucleotide arrays. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics 68: 011906. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12935175] National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2012. Taxonomy. Consulté le 15 juillet 2012. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy] National Security Archive. 2001. Volume V, Anthrax at Sverdlovsk, 1979. National Security Archive Electronic Briefing Book No. 61 Robert A. Wampler and Thomas S. Blanton. Consulté le 21 juin 2012. [En ligne: http://www.gwu.edu/~nsarchiv/NSAEBB/NSAEBB61/index2.html]

277

Neubauer, H., S. Aleksic, A. Hensel, E.J. Finke et H. Meyer. 2000. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. International journal of medical microbiology 290: 61-64. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11043982] New-York Times. 1969. Germ Warriors Retired. New York Times (1923-Current file), November 26 Consulté le 26 juin 2012 [En ligne: http://www.proquest.com.ezproxy.bibl.ulaval.ca] NIAID. 2003. NIAID Biodefense Research Agenda for Category B and C Priority Pathogens. Consulté le 15 mai 2012 [En ligne: http://www.niaid.nih.gov/topics/BiodefenseRelated/Biodefense/Documents/categoryban dc.pdf] NIAID. 2012. Biodefense and Emerging Infectious Diseases. Consulté le 5 juillet 2012. [En ligne: http://www.niaid.nih.gov/topics/biodefenserelated/biodefense/pages/cata.aspx] Nobelprize.org. 1967 Robert Koch - Biography. Consulté le 1er septembre 2011. [En ligne: http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1905/koch- bio.html] Office of Biotechnology Activities. 2012. National Science Advisory Board for Biosecurity Findings and Recommendations, March 29-30, 2012. Consulté le 26 juin 2012. [En ligne: http://oba.od.nih.gov/oba/biosecurity/PDF/03302012_NSABB_Recommendations.pdf] Olano, J.P. et D.H. Walker. 2011. Diagnosing emerging and reemerging infectious diseases: the pivotal role of the pathologist. Archives of pathology & laboratory medicine 135: 83-91. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21204714] Olsen, G.J., H. Matsuda, R. Hagstrom et R. Overbeek. 1994. fastDNAmL: a tool for construction of phylogenetic trees of DNA sequences using maximum likelihood. Computer applications in the biosciences : CABIOS 10: 41-48. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8193955] Orenga, S., A.L. James, M. Manafi, J.D. Perry et D.H. Pincus. 2009. Enzymatic substrates in microbiology. Journal of microbiological methods 79: 139-155. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19679151] Organisation des Nations Unies (ONU). 2012. Armes biologiques. Consulté le 31 août 2011. [En ligne: http://www.un.org/fr/disarmament/wmd/biological/index.shtml] Paradis, S., M. Boissinot, N. Paquette, S.D. Belanger, E.A. Martel, D.K. Boudreau, F.J. Picard, M. Ouellette, P.H. Roy et M.G. Bergeron. 2005. Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding elongation factor Tu and F-ATPase beta-subunit. International journal of systematic and evolutionary microbiology 55: 2013-2025. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16166704]

278

Parkhill, J., B.W. Wren, N.R. Thomson, R.W. Titball, M.T. Holden, M.B. Prentice, M. Sebaihia, K.D. James, C. Churcher, K.L. Mungall, S. Baker, D. Basham, S.D. Bentley, K. Brooks, A.M. Cerdeno-Tarraga, T. Chillingworth, A. Cronin, R.M. Davies, P. Davis, G. Dougan, T. Feltwell, N. Hamlin, S. Holroyd, K. Jagels, A.V. Karlyshev, S. Leather, S. Moule, P.C. Oyston, M. Quail, K. Rutherford, M. Simmonds, J. Skelton, K. Stevens, S. Whitehead et B.G. Barrell. 2001. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature 413: 523-527. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11586360] Parsons, L.M., A. Somoskovi, C. Gutierrez, E. Lee, C.N. Paramasivan, A. Abimiku, S. Spector, G. Roscigno et J. Nkengasong. 2011. Laboratory diagnosis of tuberculosis in resource-poor countries: challenges and opportunities. Clinical microbiology reviews 24: 314-350. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21482728] Persing, D.H. 2011. Molecular microbiology : diagnostic principles and practice (2e éd.). ASM Press, Washington, DC. 936 p. [ISBN: 978-1555814977]. Petti, C.A. 2007. Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 44: 1108-1114. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17366460] Petti, C.A. et CLSI. 2008. Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing : approved guideline (MM18-A). Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. Vol. 28 No. 12: 73 p. [ISBN: 978-1562386641]. Peytavi, R., T. Liu-Ying, F.R. Raymond, K. Boissinot, L. Bissonnette, M. Boissinot, F.J. Picard, A. Huletsky, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2005. Correlation between microarray DNA hybridization efficiency and the position of short capture probe on the target nucleic acid. BioTechniques 39: 89-96. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16060373] Peytavi, R., F.R. Raymond, D. Gagne, F.J. Picard, G. Jia, J. Zoval, M. Madou, K. Boissinot, M. Boissinot, L. Bissonnette, M. Ouellette et M.G. Bergeron. 2005. Microfluidic device for rapid (<15 min) automated microarray hybridization. Clinical chemistry 51: 1836-1844. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16109708] Picard, F.J., M. Gagnon, M.R. Bernier, N.J. Parham, M. Bastien, M. Boissinot, R. Peytavi et M.G. Bergeron. 2009. Internal control for nucleic acid testing based on the use of purified Bacillus atrophaeus subsp. globigii spores. Journal of clinical microbiology 47: 751-757. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19144808] Picard, F.J., D. Ke, D.K. Boudreau, M. Boissinot, A. Huletsky, D. Richard, M. Ouellette, P.H. Roy et M.G. Bergeron. 2004. Use of tuf sequences for genus-specific PCR detection and phylogenetic analysis of 28 streptococcal species. Journal of clinical microbiology 42: 3686- 3695.

279

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15297518] Pingle, M.R., K. Granger, P. Feinberg, R. Shatsky, B. Sterling, M. Rundell, E. Spitzer, D. Larone, L. Golightly et F. Barany. 2007. Multiplexed identification of blood-borne bacterial pathogens by use of a novel 16S rRNA gene PCR-ligase detection reaction-capillary electrophoresis assay. Journal of clinical microbiology 45: 1927-1935. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17428930] Poore, C., P. Clark et P.A. Emanuel. 2009. An evaluation of suspicious powder screening tools for first responders. Journal of hazardous materials 172: 559-565. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19592160] Prentice, M.B. et L. Rahalison. 2007. Plague. Lancet 369: 1196-1207. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17416264] Prescott, L.M. 2010. Microbiologie (3e éd.). De Boeck, Bruxelles. 1088 p. [ISBN: 978-2804160128]. Primorac, D. 2004. The role of DNA technology in identification of skeletal remains discovered in mass graves. Forensic science international 146 Suppl: S63-64. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15724293] Procop, G.W. 2007. Molecular diagnostics for the detection and characterization of microbial pathogens. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 45 Suppl 2: S99-S111. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17683022] R Development Core Team. 2011. The R Project for Statistical Computing. Consulté le 15 juillet 2012. [En ligne: http://www.r-project.org/] Raber, E., W.J. Hibbard et R. Greenwalt. 2011. The national framework and consequence management guidance following a biological attack. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science 9: 271-279. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21882968] Rachwal, P.A., H.L. Rose, V. Cox, R.A. Lukaszewski, A.L. Murch et S.A. Weller. 2012. The potential of TaqMan Array Cards for detection of multiple biological agents by real-time PCR. PloS one 7: e35971. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22540014] Radosavljevic, V. et G. Belojevic. 2009. A new model of bioterrorism risk assessment. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science 7: 443-451. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20028253] Ramasamy, S., C.Q. Liu, H. Tran, A. Gubala, P. Gauci, J. McAllister et T. Vo. 2010. Principles of antidote pharmacology: an update on prophylaxis, post-exposure treatment recommendations and research initiatives for biological agents. British journal of pharmacology 161: 721-748.

280

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20860656] Rao, S.S., K.V. Mohan et C.D. Atreya. 2010. Detection technologies for Bacillus anthracis: prospects and challenges. Journal of microbiological methods 82: 1-10. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20399814] Raoult, D., P.E. Fournier et M. Drancourt. 2004. What does the future hold for clinical microbiology? Nature reviews. Microbiology 2: 151-159. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15040262] Redmond, C., M.J. Pearce, R.J. Manchee et B.P. Berdal. 1998. Deadly relic of the Great War. Nature 393: 747-748. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9655389] Reinhold, P., C. Ostermann, E. Liebler-Tenorio, A. Berndt, A. Vogel, J. Lambertz, M. Rothe, A. Ruttger, E. Schubert et K. Sachse. 2012. A bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection: challenge dose titration. PloS one 7: e30125. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22299031] Relman, D.A. 2012. Microbiology: Learning about who we are. Nature 486: 194-195. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22699602] Riedel, S. 2004. Biological warfare and bioterrorism: a historical review. Proceedings 17: 400-406. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16200127] Riehm, J.M., L. Rahalison, H.C. Scholz, B. Thoma, M. Pfeffer, L.M. Razanakoto, S. Al Dahouk, H. Neubauer et H. Tomaso. 2011. Detection of Yersinia pestis using real-time PCR in patients with suspected bubonic plague. Molecular and cellular probes 25: 8-12. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20933595] Ronan, C. 1988. Histoire mondiale des sciences. Seuil, Paris. 696 p. [ISBN: 978-2020100458]. Rose, H.L., C.A. Dewey, M.S. Ely, S.L. Willoughby, T.M. Parsons, V. Cox, P.M. Spencer et S.A. Weller. 2011. Comparison of eight methods for the extraction of Bacillus atrophaeus spore DNA from eleven common interferents and a common swab. PloS one 6: e22668. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21818364] Rosebury, T. et E.A. Kabat. 1947. Bacterial warfare, a critical analysis of the available agents, their possible military applications, and the means for protection against them. Journal of immunology 56: 7-96. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20296218] Rotz, L.D., A.S. Khan, S.R. Lillibridge, S.M. Ostroff et J.M. Hughes. 2002. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerging infectious diseases 8: 225-230. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11897082] Ruiz-Saenz, J. et J.D. Rodas. 2010. Viruses, virophages, and their living nature. Acta virologica 54: 85-90.

281

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20545437] Ryan, E., C. Wright et J. Gloster. 2009. Measurement of airborne foot-and-mouth disease virus: preliminary evaluation of two portable air sampling devices. Veterinary journal 179: 458- 461. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18023217] Ryu, C., K. Lee, C. Yoo, W.K. Seong et H.B. Oh. 2003. Sensitive and rapid quantitative detection of anthrax spores isolated from soil samples by real-time PCR. Microbiology and immunology 47: 693-699. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14605435] Saah, A.J. et D.R. Hoover. 1997. "Sensitivity" and "specificity" reconsidered: the meaning of these terms in analytical and diagnostic settings. Annals of internal medicine 126: 91-94. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8992938] Saal, L.H., C. Troein, J. Vallon-Christersson, S. Gruvberger, A. Borg et C. Peterson. 2002. BioArray Software Environment (BASE): a platform for comprehensive management and analysis of microarray data. Genome biology 3: SOFTWARE0003. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12186655] Sachse, K. 2004. Specificity and performance of PCR detection assays for microbial pathogens. Molecular biotechnology 26: 61-80. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14734824] Salyers, A.A. et D.D. Whitt. 1994. Bacterial pathogenesis : a molecular approach. ASM Press, Washington, D.C. 418 p. [ISBN: 978-1555810702]. Sampath, A., M. Metz, M. Stundick et J.C. Larsen. 2011. State-of-the-art therapeutic medical countermeasures for viral threat agents. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science 9: 351-360. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22053938] Sampath, R., N. Mulholland, L.B. Blyn, C. Massire, C.A. Whitehouse, N. Waybright, C. Harter, J. Bogan, M.S. Miranda, D. Smith, C. Baldwin, M. Wolcott, D. Norwood, R. Kreft, M. Frinder, R. Lovari, I. Yasuda, H. Matthews, D. Toleno, R. Housley, D. Duncan, F. Li, R. Warren, M.W. Eshoo, T.A. Hall, S.A. Hofstadler et D.J. Ecker. 2012. Comprehensive Biothreat Cluster Identification by PCR/Electrospray-Ionization Mass Spectrometry. PloS one 7: e36528. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22768032] Santé Canada. 2002. Pour protéger la santé et assurer la sécurité des Canadiens : Le Centre de mesures et d’interventions d’urgence. [En ligne: http://www.phac-aspc.gc.ca/cepr-cmiu/pdf/cmiu0402_f.pdf] Santerre, D. 2012. Une enveloppe suspecte destinée à l'ASSÉ était inoffensive. La Presse Consulté le 21 juin 2012.

282

[En ligne: http://www.lapresse.ca/actualites/quebec-canada/les- patrouilleurs/201206/18/01-4535830-une-enveloppe-suspecte-destinee-a-lasse-etait- inoffensive.php] Sapsford, K.E., C. Bradburne, J.B. Delehanty et I.L. Medintz. 2008. Sensors for detecting biological agents. Materials Today 11: 38-49. [En ligne: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S136970210870018X] Schmeing, T.M., R.M. Voorhees, A.C. Kelley, Y.G. Gao, F.V.t. Murphy, J.R. Weir et V. Ramakrishnan. 2009. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science 326: 688-694. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19833920] Schnee, C., S. Schulsse, H. Hotzel, R.D. Ayling, R.A. Nicholas, E. Schubert, M. Heller, R. Ehricht et K. Sachse. 2012. A novel rapid DNA microarray assay enables identification of 37 Mycoplasma species and highlights multiple Mycoplasma infections. PloS one 7: e33237. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22479374] Schumacher, M.A., K.M. Piro, W. Xu, S. Hansen, K. Lewis et R.G. Brennan. 2009. Molecular mechanisms of HipA-mediated multidrug tolerance and its neutralization by HipB. Science 323: 396-401. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19150849] Selgelid, M.J. et L. Weir. 2010. The mousepox experience. EMBO reports 11: 18-24. [En ligne: http://dx.doi.org/10.1038/embor.2009.270] Shea, D.A. et S.A. Lister. 2003. The BioWatch Program: Detection of Bioterrorism. Consulté le 12 juin 2012. [En ligne: http://www.fas.org/sgp/crs/terror/RL32152.html] Shipley, M.A., J.W. Koehler, D.A. Kulesh et T.D. Minogue. 2012. Comparison of nucleic acid extraction platforms for detection of select biothreat agents for use in clinical resource limited settings. Journal of microbiological methods. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22750394] Shoham, D. 2012. Influenza type A virus: an outstandingly protean pathogen and a potent modular weapon. Critical reviews in microbiology. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22690739] Shoham, D. et S.M. Jacobsen. 2007. Technical intelligence in retrospect: the 2001 anthrax letters powder. International Journal of Intelligence and Counter Intelligence 20: 79-105. [En ligne: http://dx.doi.org/10.1080/08850600600889027] Siegel, J.D., E. Rhinehart, M. Jackson, L. Chiarello et C. Health Care Infection Control Practices Advisory. 2007. 2007 Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Health Care Settings. American journal of infection control 35: S65- 164. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18068815]

283

Siegrist, J., R. Péytavi, M. Bergeron et M. Madou. 2009. Microfluidics for IVD analysis: Triumphs and hurdles of centrifugal platforms, Part 1: Molecular fundamentals. IVD Technology Novembre 2009. [En ligne: http://www.ivdtechnology.com/article/microfluidics-ivd-analysis-triumphs-and- hurdles-centrifugal-platformspart-1-molecular-fundam] Siegrist, J., R. Péytavi, M. Bergeron et M. Madou. 2010. Microfluidics for IVD Analysis: Triumphs and Hurdles of Centrifugal Platforms - Part 2: Centrifugal Microfluidics. IVD Technology Janvier 2010. [En ligne: http://www.ivdtechnology.com/article/microfluidics-ivd-analysis-triumphs-and- hurdles-centrifugal-platforms-part-2-centrifugal-mic] Siegrist, J., R. Péytavi, M. Bergeron et M. Madou. 2010. Microfluidics for IVD Analysis: Triumphs and Hurdles of Centrifugal Platforms - Part 3 : Challenges and solutions. IVD Technology DX Directions Mars 2010. [En ligne: http://www.thesiegrists.com/Jons_Personal_Web_Site/Other_Publications_files/IVD%20T ech%20DX%20Directions%202010%20Siegrist.pdf] Sinclair, R., S.A. Boone, D. Greenberg, P. Keim et C.P. Gerba. 2008. Persistence of category A select agents in the environment. Applied and environmental microbiology 74: 555-563. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18065629] Sing, T., O. Sander, N. Beerenwinkel et T. Lengauer. 2005. ROCR: visualizing classifier performance in R. Bioinformatics 21: 3940-3941. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16096348] Skottman, T., H. Piiparinen, H. Hyytiainen, V. Myllys, M. Skurnik et S. Nikkari. 2007. Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersinia pestis. European journal of clinical microbiology & infectious diseases : official publication of the European Society of Clinical Microbiology 26: 207-211. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17294160] Smith, R.J. 1995. Japanese cult had network of front companies, investigators say Washington Post: A8. [En ligne: http://pqasb.pqarchiver.com/washingtonpost/access/19436927.html?FMT=ABS&FMTS=A BS:FT&date=Nov+1%2C+1995&author=R.+Jeffrey+Smith&pub=The+Washington+Post+(pr e- 1997+Fulltext)&edition=&startpage=A.08&desc=Japanese+Cult+Had+Network+of+Front+C ompanies%2C+Investigators+Say] Song, H., M.R. Parsons, S. Rowsell, G. Leonard et S.E. Phillips. 1999. Crystal structure of intact elongation factor EF-Tu from Escherichia coli in GDP conformation at 2.05 A resolution. Journal of molecular biology 285: 1245-1256. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9918724] Souza, R.A., D.P. Falcao et J.P. Falcao. 2011. Emended description of Yersinia massiliensis. International journal of systematic and evolutionary microbiology 61: 1094-1097.

284

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20525812] Sprague, L.D. et H. Neubauer. 2005. Yersinia aleksiciae sp. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology 55: 831-835. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15774670] Sprague, L.D., H.C. Scholz, S. Amann, H.J. Busse et H. Neubauer. 2008. Yersinia similis sp. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology 58: 952-958. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18398201] Steele, J.H. 2000. Book Review of Anthrax: The investigation of a deadly outbreak. New England Journal of Medicine 342: 1373. [En ligne: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM200005043421815] Stewart, A., B. Satterfield, M. Cohen, K. O'Neill et R. Robison. 2008. A quadruplex real-time PCR assay for the detection of Yersinia pestis and its plasmids. Journal of medical microbiology 57: 324-331. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18287295] Stormer, M., T. Vollmer, B. Henrich, K. Kleesiek et J. Dreier. 2009. Broad-range real-time PCR assay for the rapid identification of cell-line contaminants and clinically important mollicute species. International journal of medical microbiology 299: 291-300. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18926769] Sulakvelidze, A. 2000. Yersiniae other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, and Y. pestis: the ignored species. Microbes and infection 2: 497-513. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10865195] T. D. R. Diagnostics Evaluation Expert Panel, S. Banoo, D. Bell, P. Bossuyt, A. Herring, D. Mabey, F. Poole, P.G. Smith, N. Sriram, C. Wongsrichanalai, R. Linke, R. O'Brien, M. Perkins, J. Cunningham, P. Matsoso, C.M. Nathanson, P. Olliaro, R.W. Peeling et A. Ramsay. 2010. Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases: general principles. Nature reviews. Microbiology 8: S17-29. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21548184] Tamura, K., J. Dudley, M. Nei et S. Kumar. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution 24: 1596-1599. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17488738] Tamura, K. et S. Kumar. 2002. Evolutionary distance estimation under heterogeneous substitution pattern among lineages. Molecular biology and evolution 19: 1727-1736. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12270899] Tamura, K., M. Nei et S. Kumar. 2004. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 11030-11035. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15258291]

285

Taylor, L.H., S.M. Latham et M.E. Woolhouse. 2001. Risk factors for human disease emergence. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences 356: 983-989. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11516376] Taylor, M.T., P. Belgrader, B.J. Furman, F. Pourahmadi, G.T. Kovacs et M.A. Northrup. 2001. Lysing bacterial spores by sonication through a flexible interface in a microfluidic system. Analytical chemistry 73: 492-496. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11217752] Tengelsen, L., R. Hudson, S. Barnes et C. Hahn. 2002. Coordinated response to reports of possible anthrax contamination, Idaho, 2001. Emerging infectious diseases 8: 1093-1095. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12396922] Thompson, J.D., D.G. Higgins et T.J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic acids research 22: 4673-4680. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7984417] Thomson, N.R., S. Howard, B.W. Wren, M.T. Holden, L. Crossman, G.L. Challis, C. Churcher, K. Mungall, K. Brooks, T. Chillingworth, T. Feltwell, Z. Abdellah, H. Hauser, K. Jagels, M. Maddison, S. Moule, M. Sanders, S. Whitehead, M.A. Quail, G. Dougan, J. Parkhill et M.B. Prentice. 2006. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081. PLoS genetics 2: e206. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17173484] Tomaso, H., H.C. Scholz, H. Neubauer, S. Al Dahouk, E. Seibold, O. Landt, M. Forsman et W.D. Splettstoesser. 2007. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Molecular and cellular probes 21: 12-16. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16893624] Tomaso, H., P. Thullier, E. Seibold, V. Guglielmo, A. Buckendahl, L. Rahalison, H. Neubauer, H.C. Scholz et W.D. Splettstoesser. 2007. Comparison of hand-held test kits, immunofluorescence microscopy, enzyme-linked immunosorbent assay, and flow cytometric analysis for rapid presumptive identification of Yersinia pestis. Journal of clinical microbiology 45: 3404-3407. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17652472] Tomioka, K., M. Peredelchuk, X. Zhu, R. Arena, D. Volokhov, A. Selvapandiyan, K. Stabler, J. Mellquist-Riemenschneider, V. Chizhikov, G. Kaplan, H. Nakhasi et R. Duncan. 2005. A multiplex polymerase chain reaction microarray assay to detect bioterror pathogens in blood. The Journal of molecular diagnostics : JMD 7: 486-494. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16237218] Torok, M.E. et S.J. Peacock. 2012. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality? The Journal of antimicrobial chemotherapy 2012 June 22.

286

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22729921] Torok, T.J., R.V. Tauxe, R.P. Wise, J.R. Livengood, R. Sokolow, S. Mauvais, K.A. Birkness, M.R. Skeels, J.M. Horan et L.R. Foster. 1997. A large community outbreak of caused by intentional contamination of restaurant salad bars. JAMA : the journal of the American Medical Association 278: 389-395. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9244330] Treangen, T.J., A.L. Abraham, M. Touchon et E.P. Rocha. 2009. Genesis, effects and fates of repeats in prokaryotic genomes. FEMS microbiology reviews 33: 539-571. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19396957] Treangen, T.J. et S.L. Salzberg. 2012. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature reviews. Genetics 13: 36-46. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22124482] Trevisanato, S.I. 2007. The 'Hittite plague', an epidemic of tularemia and the first record of biological warfare. Medical hypotheses 69: 1371-1374. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17499936] Tulpan, D. 2010. Recent patents and challenges on DNA microarray probe design technologies. Recent patents on DNA & gene sequences 4: 210-217. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21121887] U.S. Department of Justice. U.S. Department of Justice. 2010. Amerithrax Investigative Summary. Consulté le 23 juin 2012 [En ligne: http://www.justice.gov/amerithrax/docs/amx-investigative-summary.pdf] Ursing, J. et S. Aleksic. 1995. Yersinia frederiksenii, a genotypically heterogeneous species with few differential characteristics. Contributions to microbiology and immunology 13: 112- 116. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8833810] US Central Intelligence Agency. 2010. The World Factbook. Consulté le 29 août 2010 [En ligne: http://www.cia.gov/library/publications/the-world-factbook/] US Department of the Army. 1968. A Study of the Vulnerability of Subway Passengers in New York City to Covert Action with Biological Agents, Miscellaneous Publication 24, Fort Detrick, Frederick, MD, tel que cité par Masci et Bass, 2005. Consulté le [En ligne: van Zuylen, J. 1981. The microscopes of Antoni van Leeuwenhoek. Journal of microscopy 121: 309-328. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7012367] Vos, P.D. 2009. Bergey's manual of systematic bacteriology Volume 3 - The firmicutes. Springer,, New York. [En ligne: http://www.springerlink.com/content/xl5065/?MUD=MP] Vynnycky, E. et P.E. Fine. 2000. Lifetime risks, incubation period, and serial interval of tuberculosis. American journal of epidemiology 152: 247-263.

287

[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10933272] Wade, M.M., M.S. Campbell, K. Niyogi, J.E. Rogers, J. Coughlin, B. Coursey et P.A. Emanuel. 2006. Evaluation of an inexpensive field test for ruling out the presence of biological threat agents in suspicious powders. ECBC-TR-459. [En ligne: http://www.dtic.mil/cgi- bin/GetTRDoc?Location=U2&doc=GetTRDoc.pdf&AD=ADA448861] Wagar, E.A., M.J. Mitchell, K.C. Carroll, K.G. Beavis, C.A. Petti, R. Schlaberg et B. Yasin. 2010. A review of sentinel laboratory performance: identification and notification of bioterrorism agents. Archives of pathology & laboratory medicine 134: 1490-1503. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20923306] Walsh, J.B. 1987. Sequence-dependent gene conversion: can duplicated genes diverge fast enough to escape conversion? Genetics 117: 543-557. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3692140] Walter, J.C., K.M. Kroll, J. Hooyberghs et E. Carlon. 2011. Nonequilibrium effects in DNA microarrays: a multiplatform study. The journal of physical chemistry. B 115: 6732-6739. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21542593] Wang, L. et P.C. Li. 2011. Microfluidic DNA microarray analysis: a review. Analytica chimica acta 687: 12-27. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21241842] Warner, C.L., C.J. Bruckner-Lea, J.W. Grate, T. Straub, G.J. Posakony, N. Valentine, R. Ozanich, L.J. Bond, M.M. Matzke et B. Dockendorff. 2009. A Flow-Through Ultrasonic Lysis Module for the Disruption of Bacterial Spores. Journal of the Association for Laboratory Automation 14: 277-284. [En ligne: http://jla.sagepub.com/content/14/5/277.abstract] Wayne, L.G. 1986. Actions of the Judicial Commission of the International Committee on Systematic Bacteriology on Requests for Opinions Published in 1983 and 1984. International Journal of Systematic Bacteriology 36: 357-358. [En ligne: http://ijs.sgmjournals.org/content/36/2/357.abstract] Welch, R.A., V. Burland, G. Plunkett, 3rd, P. Redford, P. Roesch, D. Rasko, E.L. Buckles, S.R. Liou, A. Boutin, J. Hackett, D. Stroud, G.F. Mayhew, D.J. Rose, S. Zhou, D.C. Schwartz, N.T. Perna, H.L. Mobley, M.S. Donnenberg et F.R. Blattner. 2002. Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 17020-17024. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12471157] Wielinga, P.R., L. de Heer, A. de Groot, R.A. Hamidjaja, G. Bruggeman, K. Jordan et B.J. van Rotterdam. 2011. Evaluation of DNA extraction methods for Bacillus anthracis spores spiked to food and feed matrices at biosafety level 3 conditions. International journal of food microbiology 150: 122-127. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21864928]

288

Wielinga, P.R., R.A. Hamidjaja, J. Agren, R. Knutsson, B. Segerman, M. Fricker, M. Ehling-Schulz, A. de Groot, J. Burton, T. Brooks, I. Janse et B. van Rotterdam. 2011. A multiplex real- time PCR for identifying and differentiating B. anthracis virulent types. International journal of food microbiology 145 Suppl 1: S137-144. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20826037] Williams, J.E. 1984. Proposal to Reject the New Combination Yersinia pseudotuberculosis subsp. pestis for Violation of the First Principle of the International Code of Nomenclature of Bacteria. International Journal of Systematic Bacteriology 34: 268-269. [En ligne: http://ijs.sgmjournals.org/content/34/2/268.abstract] Wills, B., J. Leikin, J. Rhee et B. Saeedi. 2008. Analysis of suspicious powders following the post 9/11 anthrax scare. Journal of medical toxicology : official journal of the American College of Medical Toxicology 4: 93-95. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18570168] Wolffs, P.F., K. Glencross, R. Thibaudeau et M.W. Griffiths. 2006. Direct quantitation and detection of salmonellae in biological samples without enrichment, using two-step filtration and real-time PCR. Applied and environmental microbiology 72: 3896-3900. Woo, P.C., S.K. Lau, J.L. Teng, H. Tse et K.Y. Yuen. 2008. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 14: 908-934. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18828852] Woolhouse, M.E., D.T. Haydon et R. Antia. 2005. Emerging pathogens: the epidemiology and evolution of species jumps. Trends in ecology & evolution 20: 238-244. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16701375] World Health Organization. 2012. Report on technical consultation on H5N1 research issues, 16- 17 février 2012. [En ligne: http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/mtg_report_h5n1.pdf] World Health Organization. 2012. Tuberculosis, Fact sheet N°104, March 2012. [En ligne: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/index.html] Worsham, P.L. et C. Roy. 2003. Pestoides F, a Yersinia pestis strain lacking plasminogen activator, is virulent by the aerosol route. Advances in experimental medicine and biology 529: 129- 131. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12756743] Yang, S., R.E. Rothman, J. Hardick, M. Kuroki, A. Hardick, V. Doshi, P. Ramachandran et C.A. Gaydos. 2008. Rapid polymerase chain reaction-based screening assay for bacterial biothreat agents. Academic emergency medicine : official journal of the Society for Academic Emergency Medicine 15: 388-392. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18370996]

289

Yang, Y., J. Wang, H. Wen et H. Liu. 2012. Comparison of two suspension arrays for simultaneous detection of five biothreat bacterial in powder samples. Journal of biomedicine & biotechnology 2012: 2012:831052. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22690123] Yang, Y., J. Wang, H. Wen et H. Liu. 2012. Comparison of two suspension arrays for simultaneous detection of five biothreat bacterial in powder samples. Journal of biomedicine & biotechnology 2012: 831052. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22690123] Ye, J., G. Coulouris, I. Zaretskaya, I. Cutcutache, S. Rozen et T. Madden. 2012. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics 13: 134. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22708584] Zhou, D., Z. Tong, Y. Song, Y. Han, D. Pei, X. Pang, J. Zhai, M. Li, B. Cui, Z. Qi, L. Jin, R. Dai, Z. Du, J. Wang, Z. Guo, J. Wang, P. Huang et R. Yang. 2004. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and the proposal of a new biovar, microtus. Journal of bacteriology 186: 5147-5152. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15262951] Zilinskas, R.A. 1997. Iraq's biological weapons. The past as future? JAMA : the journal of the American Medical Association 278: 418-424. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9244334] Zilinskas, R.A., B. Hope et D.W. North. 2004. A discussion of findings and their possible implications from a workshop on bioterrorism threat assessment and risk management. Risk analysis : an official publication of the Society for Risk Analysis 24: 901-908. [En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15357809]

290