Esta publicación es una producción editorial de la Industria Farmacéutica Veterinaria (INFARVET) y de la Comisión de Parasiticidas (SAGARPA-INFARVET-CNOG).

Con el patrocinio de:

BAYER

LAPISA

MERIAL

MSD

PRONABIVE

SANFER

VIRBAC

ZOETIS

EDITORES

ROGER IVAN RODRIGUEZ VIVAS

JORGE ALBERTO CARRILLO CORTES

NOE SOBERANES CÉSPEDES

El contenido y redacción de los trabajos presentados son responsabilidad de cada autor o autores.

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DIRECTORIO

INDUSTRIA FARMACEUTICA VETERINARIA (INFARVET)

MVZ. JOSE VARONA BEASCOECHEA Presidente

LIC. R. ALEXANDRA LUNA ORTA Directora Ejecutiva

BIOL. M.C. NOÉ SOBERANES CÉSPEDES Presidente de la Comisión de Parasiticidas

MVZ. MCV. JOSE LUIS CASTELLANOS HURTADO Secretario

MVZ. MIGUEL ANGEL RAMIREZ ARREDONDO Tesorero

COMITÉ ORGANIZADOR

Presidente: MVZ. M.C. Jorge Alberto Carrillo Cortes

Secretario: Biol. Sybyl M. Laredo Bello

Tesorero: MVZ. Miguel Ángel Ramírez Arredondo

Vocales: MVZ Dionisio García Carrasco (VIRBAC) Lic. Iván Lozano (BAYER) MVZ Martín Ortiz Estrada (LAPISA) MVZ Carlos Corona (Merial) MVZ Bernabé Chavarría (MSD) MVZ José Luis Castellanos (SAGARPA) MVZ Juan Ramón González (CNOG)

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COMITÉ CIENTIFÍCO

Dr. Julio Figueroa Millan (INIFAP) Dr. Rubén Hernández Ortíz (INIFAP)

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INSTITUCIONES Y EMPRESAS PARTICIPANTES

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PRESENTACIÓN Y BIENVENIDA

La Comisión de Parasiticidas de la Industria Farmacéutica Veterinaria de México (CP-INFARVET) se enorgullece en realizar el VIII Seminario Internacional de Parasitología Animal, 20-22 Septiembre de 2017 que se realizará en la ciudad de Guadalajara, Jalisco, México. En esta edición, la Universidad de Guadalajara, una de las mejores Universidades de México, a través del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA) nos abre sus puertas para ser sede de este importantísimo Seminario con carácter nacional e internacional. Este evento se realiza en el estado de Jalisco, que es cuarta entidad federativa más poblada de México. Es uno de los estados más desarrollados en el país en cuanto a actividades económicas, comerciales y culturales. El estado de Jalisco se divide en 125 municipios y su capital es Guadalajara. Jalisco es tierra de mariachis, charros y tequila, y alberga una hermosa "perla", cinco Pueblos Mágicos, y una serie de increíbles destinos de playa que miran hacia el Pacífico.

El evento contará con 24 ponencias magistrales. Estas ponencias serán impartidas por investigadores-docentes con prestigio nacional e internacional. Además se presentarán 3 Carteles que serán presentados por prestigiados congresistas nacionales.

La CP-INFARVET, México le da a cada uno de los Congresistas la más cordial bienvenida al VIII Seminario Internacional de Parasitología Animal, Guadalajara 2017 esperando que sea una oportunidad excepcional para divulgar el estado actual del conocimiento sobre la Parasitología Veterinaria y humana en México y en el mundo, y sea un espacio propicio para la actualización de los profesionales y alumnos que estudian la Parasitología y ciencias afines, y para la discusión de los resultados de trabajos de investigación.

Con afectuoso saludo

Atentamente

El comité organizador

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ÍNDICE DE RESUMENES EN EXTENSO

Resúmenes Página

BASE DE DATOS Y MAPAS DE DISTRIBUCIÓN DE PARÁSITOS DE RUMIANTES EN MÉXICO. Alcalá-Canto Y., Figueroa-Castillo JA………………. 1

SITUACIÓN ACTUAL DE LA RESISTENCIA DE R. (Boophilus) microplus A LOS IXODICIDAS EN MÉXICO. Francisco Martínez Ibáñez……………………... 9

ACTUALIDADES SOBRE EL DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA DE GARRAPATAS A LOS ACARICIDAS Y LACTONAS MACROCÍCLICAS EN MÉXICO. Rodríguez-Vivas RI, Rosado-Aguilar JA, Ojeda-Chi MM, Villegas- Pérez SL, Trinidad-Martínez I, Alonso-Díaz MA, Aguilar-Tipacamú G, Ojeda- Robertos NF, Pérez de León…………………………………………………………. 20

DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA RESISTENCIA A LOS PIRETROIDES EN LA GARRAPATA DEL GANADO Rhipicephalus microplus: ¿GENOTIPOS O FENOTIPOS?. Rodrigo Rosario-Cruz, Delia Inés Domínguez-García, Fernando Torres-Agatón, Mireya Maruris Reducindo, Felix Torres Guzman………………………………………………………………………………..... 30

RESPUESTA TOXICOLÓGICA Y MOLECULAR DE Rhipicephalus microplus, R. sanguineus y Amblyomma mixtum A LOS ACARICIDAS CONVENCIONALES Y LACTONAS MACROCÍCLICAS EN MÉXICO. Rodríguez-Vivas RI, Rosado-Aguilar JA, Ojeda-Chi MM, Trinidad-Martínez I, Alonso-Díaz MA, Aguilar-Tipacamú G, Ojeda-Robertos NF, Pérez de León AA……………………………………………………………………………………….. 41

ACTUALIDADES SOBRE EL DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA A LOS ANTIHELMINTICOS. Pablo Martínez Labat………………………………………… 52

ESTUDIOS DE INTERACCIÓN MOLECULAR ENTRE ANTIHELMÍNTICOS Y RECEPTORES CON RELACIÓN A LA RESISTENCIA EN NEMATODOS GASTROINTESTINALES. López AME, Ramírez VG, Olmedo JA, Mendoza GP, Aguilar ML…………………………………………………………………………. 73

ALTERNATIVAS DE CONTROL Y MANEJO DE LA RESISTENCIA ANTIPARASITARIA. Pablo Martínez Labat…………………………………………. 81

ESTRATEGIAS DE CONTROL–ERRADICACIÓNDE GARRAPATAS. MANEJO DE RESISTENCIA EN URUGUAY. Nari A……………………………… 97

CONTROL INTEGRADO DE LA GARRAPATA RHIPICEPHALUS MICROPLUS EN ZONAS TROPICALES DE MÉXICO. Alonso-Díaz MA, Fernández-Salas A……………………………………………………………………. 111

vi

ALTERNATIVAS PARA MANEJAR LA RESISTENCIA Y ESTABLECER PROGRAMAS DE CONTROL DE GARRAPATA EN MÉXICO Rubén Hernández-Ortiz, Edgar Castro-Saines, Rodolfo E. Lagunes-Quintanilla, Gabriela Granjeno-Colín……………………………………………………………… 123

AVANCES EN INVESTIGACIÓN PARA EL MANEJO INTEGRADO DE LAS GARRAPATAS VECTORES DE FIEBRE BOVINA. Pérez de León AA, Miller RJ, Goolsby JA, Guerrero FD, Temeyer KB, Romero Salas D, Rodríguez-Vivas RI………………………………………………………………………………………… 129

MANEJO DE PREDIOS CON POBLACIONES DE GARRAPATA Boophilus microplus RESISTENTE HACIA LOS IXODICIDAS Y EL USO DE ALERNATIVAS PARA SU CONTROL. José Luis Castellanos Hurtado……….. 140

EFFICACY OF A BOTANICAL ACARICIDE AND ITS ACTIVE INGREDIENTS AGAINST SUSCEPTIBLE AND ACARICIDE RESISTANT STRAINS OF RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS. Robert J Miller, Nirbhay K Singh, Guilherme M Klafke, John A. Goolsby, Donald B. Thomas, Adalberto A. Pérez de León…………………………………………………………………………. 149

MECANISMOS INMUNOLÓGICOS EN INFESTACIONES DE GARRAPATAS IMMUNOLOGICAL MECHANISMS IN TICK INFESTATIONS. Julio V. Figueroa Millán……………………………………………………………………………………. 160

ESTRATEGIA CON UNA VACUNA RECOMBINANTE CON EL ANTÍGENO BM86 PARA EL CONTROL INTEGRAL CONTRA LA GARRAPATA RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS. Soberanes Céspedes Noé, Ortiz Estrada Martin, Sánchez López Fredy, Galván Ramírez Serapio………..... 178

ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO Y EVALUACIÓN DE ANTÍGENOS VACUNALES COMO POSIBLES CANDIDATOS PARA EL CONTROL DE LA GARRAPATA RHIPICEPHALUS MICROPLUS. Lagunes-Quintanilla RE, Ramírez-Guillen PN, de la cruz-Hernández NI, Hernández-Ortiz R, Castro- Saines E, Merino-Charrez JO………………………………………………………… 184

ACTUALIDADES SOBRE EL CONTROL INTEGRAL DE LA COCCIDIOSIS BOVINA EN EL GANADO LECHERO Y DE CARNE. Alcalá CY………………… 191

PROTOZOARIOS Y SU IMPACTO EN LA REPRODUCCIÓN EN BOVINOS. Campero CM……………………………………………………………………………. 207

RESIDUOS E IMPACTO AMBIENTAL DE LOS PLAGUICIDAS DE USO EN BOVINOS. Fragoso SH, Tovar DA, Hernández EF………………………………… 221

vii

RHIPICEPHALUS SANGUINEUS SENSU LATO EN MÉXICO: ESTACIONALIDAD, CONTROL, RESISTENCIA E IMPLICACIONES EN SALUD PÚBLICA. Cruz-Vázquez Carlos…………………………………………… 229

PRESENCIA DE Neospora caninum EN UNIDADES DE PRODUCCIÓN BUFALINA DE VERACRUZ, TABASCO Y OAXACA, MÉXICO. Saldaña RLY, Romero SD, Medina EL, Cervantes AP, Cruz RA, Aguilar DM, Ibarra PN, Salguero RJL, Cruz VC, González HM, Pérez de León AA………………………. 235

DISTRIBUCIÓN POTENCIAL DE Amblyomma mixtum EN EL ESTADO DE VERACRUZ, MÉXICO. Aguilar DM, Romero SD, Serna LR, Feria A TP, Esteve GMD, Cruz RA, Pérez de León AA…………………………………………………... 242

MORFOMÉTRÍA DE Amblyomma mixtum EN VERACRUZ, MÉXICO. Aguilar DM, Romero SD, Rosas SGH, Serna LR, Pérez de León AA……………………. 250

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VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

BASE DE DATOS Y MAPAS DE DISTRIBUCIÓN DE PARÁSITOS DE RUMIANTES EN MÉXICO Alcalá-Canto Y., Figueroa-Castillo JA.

Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Av. Universidad 3000, Ciudad Universitaria, Del. Coyoacán. CP 04510. CDMX.

Estudio financiado por el proyecto PAPIIT IT200816

Palabras clave: georreferenciación, parásitos, rumiantes, México

Introducción

Los datos georreferenciadas, también conocidos como datos geoespaciales , son las piezas básicas de información necesarias para identificar la localización geográfica de un fenómeno en la superficie terrestre. En general, los datos georreferenciados son medidas u observaciones tomadas en localidades específicas (latitud y longitud). En la investigación epidemiológica, este tipo de información se utiliza para conocer la relación entre los datos sanitarios y los aspectos relacionados con factores conceptuales como las condiciones ecológicas de una región. Algunos ejemplos de la aplicación de los datos georreferenciados en los estudios epidemiológicos son el mapeo de la distribución de enfermedades y los estudios de correlación de las enfermedades con las variables ecológicas.

A la fecha se han georreferenciado registros de Fasciola y Haemonchus en varios países europeos y sudamericanos (Charlier et al., 2011; Dutra et al., 2010; Fuentes et al., 2005; Martínez-Valladares et al., 2013; Musella et al., 2011; Novobilský et al., 2015; Rinaldi et al., 2015; Valencia-López et al., 2012). Asimismo, las investigaciones sobre el uso de sistemas de información geográfica en parasitología ha sido impulsado como una herramienta para programar medidas preventivas (Malone et al., 2004; Musella et al., 2011). El desarrollo y aplicación de modelos de predicción han permitido aumentar el entendimiento de la ecología ambiental y climática de las infecciones parasitarias, incrementando el conocimiento de la tolerancia térmica de las especies y el impacto que tienen los factores ambientales en la transmisión, desarrollo y supervivencia del parásito (Mateos-Gonzalez et al., 2015). Los modelos de distribución se han usado para evaluar el potencial del establecimiento y dispersión de especies parásitas y vectores de enfermedades (Brasil et al., 2015; Foley et al., 2011; Foley et al., 2010; Foley et al., 2012), a fin de estimar las respuestas de estos organismos al cambio climático (Polley and Thompson, 2015).

En México se ha reportado la presencia de una gran diversidad de parásitos en el

1 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México ganado bovino, caprino y ovino. Sin embargo, la información se encuentra dispersa en artículos científicos, memorias de congresos, tesis y otros tipos de informes de difícil acceso debido que se encuentran bajo resguardo en bibliotecas de instituciones o asociaciones y no siempre se difunden.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar una base de datos georreferenciada vinculada a una descripción gráfica para ilustrar las ocurrencias de parásitos de bovinos, ovinos y caprinos registradas en México desde 1955 a la fecha así como su distribución proyectada. La base de datos elaborada implicó sistematizar la información que actualmente se encuentra publicada o disponible en diversas instituciones, organizaciones, asociaciones y laboratorios, pero que no ha sido recopilada ni organizada en una sola fuente que sea de acceso público. Asimismo, actualmente se carece de modelos que permitan predecir el impacto que tiene el cambio climático y el inducido por la urbanización sobre la distribución espacial de los parásitos de rumiantes en las zonas ecológicas de México. El modelo de predicción permitirá realizar un pronóstico acertado del riesgo de enfermedades parasitarias en rumiantes e identificar estrategias basadas en factores ecológicos para la intervención futura mediante programas preventivos y de control que tengan como objeto garantizar la sanidad del patrimonio ganadero de la sociedad que es la que nos sostiene.

Material y métodos

Recopilación de la información. Se revisaron las memorias de eventos científicos (AMPAVE, CONAPAR, Buiatría entre otros), revisiones bibliográficas, artículos de revistas indizadas, tesis de licenciatura y posgrado, los registros en las bitácoras de los laboratorios de instituciones educativas y de investigación. Información generada por la Dirección General de Salud Animal del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) en los laboratorios autorizados y con aviso ante la misma Secretaría. Se excluyeron los estudios basados únicamente en cuestionarios, así como aquéllos que no hacían referencia a la localidad geográfica en la que se encontró el parásito.

Los datos de las ocurrencias de parásitos de bovinos, caprinos y ovinos documentados se organizaron en el programa Microsoft Excel® considerando los siguientes campos: Año, Localidad, Estado, Parásito, Hospedero, Tipo de trabajo, Referencia, Autor y Título del trabajo.

Georreferenciación. Con el uso de Google Maps®, se realizó la búsqueda de 3,287 coordenadas con notación decimal de las localidades (municipio y entidad) en las que se han documentado las ocurrencias de los parásitos anteriormente mencionados

Mapas de predicción. Una vez obtenidas las coordenadas geográficas, se empleó el

2 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México programa DIVA-GIS® para desarrollar y analizar mapas de la distribución actual y predictiva de los nichos ecológicos de los parásitos más comunes de los bovinos, ovinos y caprinos. Se consideraron 19 variables bioclimáticas adquiridas de la base de datos WorldClim (www.worldclim.org), la cual utiliza la altitud, temperatura y precipitación para derivar índices climáticos mensuales, cuatrimestrales y anuales que representan tendencias, estacionalidad y datos extremos que son biológicamente relevantes (Kumar et al., 2009) con una resolución espacial de 5 minutos. El escenario de predicción también fue adquirido en la base de datos WorldClim y producido por el Canadian Centre for Climate Modeling and Analysis, con un escenario de emisión que representa una estimación conservadora (a2a). Para estimar la distribución del macrohábitat, referido en lo sucesivo como hábitat, actual de los parásitos registrados en la base de datos, se determinó un umbral para definir la idoneidad del hábitat de: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Haematobia irritans, Fasciola hepatica, nematodos gastrointestinales y pulmonares y Eimeria spp. con base en los resultados del modelo de predicción que utilizó las 19 variables bioclimáticas.

Resultados

Durante la primera etapa del proyecto, se desarrolló una base de datos georreferenciada que a la fecha cuenta con 8,520 registros de parásitos de rumiantes de 864 municipios, que corresponden al 35% de los 2,440 municipios existentes en las 32 entidades federativas de México.

Los parásitos registrados actualmente en la base pertenecen a 61 géneros (11 de protozoarios, 30 de helmintos y 20 de artrópodos), si se contabilizarán las especies el número sería mucho mayor (cuadros 1, 2 y 3). La base es de acceso libre y puede consultarse en http://www.parasitosderumiantes.com.mx Los mapas se van generando poco a poco y aparecerán en la misma página. Cuadro 1. Protozoarios parásitos reportados en rumiantes en México Género Caprinos Ovinos Bovinos Babesia X Besnoitia X Buxtonella X Cryptosporidium X X X Eimeria X X X Giardia X X X Neospora X Sarcocystis X X Toxoplasma X X X Tritrichomonas X Trypanosoma X X= Indica que por lo menos una vez se ha reportado alguna de las especies del parásito en México

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Cuadro 2. Helmintos parásitos reportados en rumiantes en México

Género Caprinos Ovinos Bovinos Agriostomum X Bunostomum X X X Capillaria X X X Chabertia X X X Cooperia X X X Dicrocoelium X Dictyocaulus X X X Fasciola X X X Gongylonema X X Haemonchus X X X Mecistocirrus X Mammomonogamus X X Marshallagia X Metacestodos X X X Moniezia X X X Muellerius X X Nematodirus X X X Oesophagostomum X X X Onchocerca X Ostertagia X X Paramfistomidos X X X Protostrongylus X X Setaria X Skrjabinema X X Strongyloides X X X Teladorsagia X X Thysanosoma X X Toxocara X Trichostrongylus X X X Trichuris X X X

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Cuadro 3. Artrópodos reportados en rumiantes en México Género Caprinos Ovinos Bovinos Amblyomma X Cochliomyia X Ctenocephalides X Damalinia X X X Dermacentor X Haematobia X Haematopinus X Hypoderma X Ixodes X Linguatula X X Linognathus X X X Melophagus X Oestrus X X Otobius X Psoroptes X X Pulex X Raillietia X X Rhipicephalus X Stomoxys X Suidasia X

A partir de la base de datos georrefenciada se pueden generar los mapas de distribución de cualquiera de los parásitos enlistados. Como ejemplo, se elaboraron los mapas de Babesia, Eimeria, Cryptosporidium, Neospora caninum, Tritrichomonas foetus, Fasciola hepatica, cestodos, nematodos gastrointestinales y pulmonares, Rhipicephalus (Boophilus) spp. y Haematobia irritans en México.

También, se generaron mapas de distribución de los parásitos anteriores, con proyección a 50 años. De conformidad con la idoneidad de hábitat al aplicar las 19 variables bioclimáticas, se determinó que en la actualidad, el 48.22%, 37.65%, 21.81%, 38.93% y 34.91% del territorio mexicano es excelente para la potencial distribución de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, nematodos gastrointestinales y pulmonares, Fasciola hepatica, Haematobia irritans y Eimeria spp., respectivamente; mientras que en el año 2050, la idoneidad de hábitat, respectivamente, para estos parásitos será del 63.83%, 54.15%, 25.82%, 48.77% y 30.72%.

Discusión y conclusiones

La base de datos que se presenta es, hasta donde tenemos conocimiento, la recopilación de registros de especies de parásitos de bovinos, ovinos y caprinos más grande de México. El análisis de la ocurrencia de las especies de parásitos se lleva a cabo para demostrar la utilidad de estos datos a fin de responder dudas fundamentales relacionadas con la biogeografía de estas especies y asimismo,

5 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México motivar a más parasitólogos y biólogos a fin de que hagan accesibles sus registros de parásitos detectados en diferentes localidades del país.

Al contar con una base de datos georreferenciada nacional, se podrán tener nuevas perspectivas sobre los patrones globales de la biodiversidad de las especies parásitas de los distintos huéspedes. A pesar de los avances que existen en los métodos de modelamiento y predicciones climáticas, pocos estudios han considerado interacciones bióticas al predecir distribuciones futuras, particularmente en el caso de los sistemas huésped-parásito (Pickles et al. 2013). Sin embargo, al incorporar cambios en la idoneidad del hábitat del parásito, se ha demostrado un aumento en el nicho ocupado por éstos en respuesta principalmente al cambio climático (Barrett et al. 2013).

Los resultados derivados de la elaboración y análisis de la base de datos hasta el momento, han demostrado que los parásitos presentes en México, de no ser controlados, podrían llegar a ocupar más nichos en el país en los cuales las condiciones ecológicas les son favorables, aun cuando el escenario del cambio climático para el 2050 no sea exacerbado. Estos hallazgos están en coincidencia con datos anteriormente documentados en los que se han georreferenciado y proyectado las distribuciones de varias enfermedades parasitarias, incluyendo garrapatas (Rubel et al. 2014), Fasciola y Haemonchus en varios países europeos y sudamericanos (Rinaldi et al. 2015).

De acuerdo con estos trabajos, es razonable sugerir que la ocurrencia espacial de estos parásitos, incluyendo sus periodos de transmisión, continuarán expandiéndose en México a menos que se lleven a cabo programas profilácticos y de control. No obstante, se ha afirmado que debido a que el cambio climático favorece la supervivencia de los parásitos y demuestra su resistencia térmica, en muchos países se instrumentarán programas de control antiparasitario más frecuentes, lo cual podría aumentar los niveles de resistencia antihelmíntica principalmente en los casos de Fasciola hepatica y Haemonchus contortus (Pickles et al. 2013; Rinaldi et al. 2015).

Resulta interesante señalar que al analizar la base de datos de este trabajo, se identificaron localidades en las que suelen concentrarse los estudios y la recolección de muestras. Esto permite reflexionar sobre la discrepancia que existe en los datos epidemiológicos con los que contamos actualmente, ya que la distribución geográfica y ecológica de un taxón no está relacionada con el número de observaciones. Para disminuir ese riesgo de error, llevamos a cabo funciones analíticas como el mapeo de riqueza de los distintos taxones e identificación de áreas con diversidad de los mismos. El número de especies observadas en un área depende de algún modo del esfuerzo invertido en su registro (Rinaldi et al. 2015). Por lo tanto, los mapas de modelamiento predictivo de riqueza, permiten visualizar las áreas ecológicas y geográficas en las que puede estar presente el parásito aunque no haya sido recolectado, identificado o documentado en esa localidad.

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Debido a que es poco factible que exista un estudio epidemiológico de todas las ocurrencias de parásitos de rumiantes en cada localidad del país, en este trabajo se proyectó la idoneidad de hábitat. Esta estimación permitió obtener una proyección de distribución menos sesgada por el número de observaciones documentadas al utilizar la técnica de rarefacción para estimar el número de especies que habrían sido observadas dadas las ocurrencias especificadas en la base de datos. Por lo tanto, es necesario generar evidencia que sustente el entendimiento del potencial que tienen los parásitos para adaptarse a diferentes condiciones climáticas y de ese modo continuar con la investigación futura sobre los mosaicos ecológicos de la selección y adaptación parasitaria.

Agradecimientos

AL proyecto PAPIIT IT200816 por el financiamiento. Al personal de las bibliotecas y laboratorios de diagnóstico de las instituciones que nos facilitaron el acceso o nos enviaron información (UAAAN, UAG-CUCBA, UAEMex, UAMor, UAS, UAT, UAZ, UBJ, UACH, UADY, UANL, UJAT, UMSNH, COLPOS, FESC, FMVZ, ITSON, UV). A las asociaciones de profesionistas AMPAVE y AMMVB por las memorias de eventos facilitadas. A la SAGARPA, SENASICA por compartir la información de la distribución de garrapatas A Mateo Salazar Islas por su invaluable apoyo en la captura de datos

REFERENCIAS

Brasil, L.M., Gomes, M.M., Miosso, C.J., da Silva, M.M., Amvame-Nze, G.D., 2015. Web platform using digital image processing and geographic information system tools: a Brazilian case study on dengue. Biomed Eng Online 14, 69. Charlier, J., Bennema, S.C., Caron, Y., Counotte, M., Ducheyne, E., Hendrickx, G., Vercruysse, J., 2011. Towards assessing fine-scale indicators for the spatial transmission risk of Fasciola hepatica in cattle. Geospat Health 5, 239-245. Dutra, L.H., Molento, M.B., Naumann, C.R., Biondo, A.W., Fortes, F.S., Savio, D., Malone, J.B., 2010. Mapping risk of bovine fasciolosis in the south of Brazil using Geographic Information Systems. Vet Parasitol 169, 76-81. Foley, D.H., Maloney, F.A., Harrison, F.J., Wilkerson, R.C., Rueda, L.M., 2011. Online spatial database of US Army Public Health Command Region-West mosquito surveillance records: 1947-2009. US Army Med Dep J, 29-36. Foley, D.H., Wilkerson, R.C., Birney, I., Harrison, S., Christensen, J., Rueda, L.M., 2010. MosquitoMap and the Mal-area calculator: new web tools to relate mosquito species distribution with vector borne disease. Int J Health Geogr 9, 11. Foley, D.H., Wilkerson, R.C., Dornak, L.L., Pecor, D.B., Nyari, A.S., Rueda, L.M., Long, L.S., Richardson, J.H., 2012. SandflyMap: leveraging spatial data on

7 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

sand fly vector distribution for disease risk assessments. Geospat Health 6, S25-30. Fuentes, M.V., Sainz-Elipe, S., Nieto, P., Malone, J.B., Mas-Coma, S., 2005. Geographical Information Systems risk assessment models for zoonotic fascioliasis in the South American Andes region. Parassitologia 47, 151-156. Malone, J.B., McNally, K.L., McCarroll, J.C., Corbett, J.D., Mkoji, G., 2004. Modeling the biocoenose of parasitic diseases using remote sensing and geographic information systems. Parassitologia 46, 59-61. Martínez-Valladares, M., Robles-Pérez, D., Martínez-Pérez, J.M., Cordero-Pérez, C., Famularo, M.e.R., Fernández-Pato, N., González-Lanza, C., Castañón- Ordóñez, L., Rojo-Vázquez, F.A., 2013. Prevalence of gastrointestinal nematodes and Fasciola hepatica in sheep in the northwest of Spain: relation to climatic conditions and/or man-made environmental modifications. Parasit Vectors 6, 282. Mateos-Gonzalez, F., Sundström, L.F., Schmid, M., Björklund, M., 2015. Rapid evolution of parasite resistance in a warmer environment: insights from a large scale field experiment. PLoS One 10, e0128860. Musella, V., Catelan, D., Rinaldi, L., Lagazio, C., Cringoli, G., Biggeri, A., 2011. Covariate selection in multivariate spatial analysis of ovine parasitic infection. Prev Vet Med 99, 69-77. Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J., 2015. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Vet Res 11, 128. Pickles, R.S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D.L., 2013. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: a multitrophic level approach. Glob Chang Biol 19, 2645-2654. Polley, L., Thompson, A., 2015. Parasites and wildlife in a changing world. Trends Parasitol 31, 123-124. Rinaldi, L., Hendrickx, G., Cringoli, G., Biggeri, A., Ducheyne, E., Catelan, D., Morgan, E., Williams, D., Charlier, J., Von Samson-Himmelstjerna, G., Vercruysse, J., 2015. Mapping and modelling helminth infections in ruminants in Europe: experience from GLOWORM. Geospat Health 9, 257-259. Rubel, F., Brugger, K., Monazahian, M., Habedank, B., Dautel, H., Leverenz, S., Kahl, O., 2014. The first German map of georeferenced ixodid tick locations. Parasit Vectors 7, 477. Valencia-López, N., Malone, J.B., Carmona, C.G., Velásquez, L.E., 2012. Climate- based risk models for Fasciola hepatica in Colombia. Geospat Health 6, S67- 85. van der Voort, M., Charlier, J., Lauwers, L., Vercruysse, J., Van Huylenbroeck, G., Van Meensel, J., 2013. Conceptual framework for analysing farm-specific economic effects of helminth infections in ruminants and control strategies. Prev Vet Med 109, 228-235.

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SITUACIÓN ACTUAL DE LA RESISTENCIA DE R. (Boophilus) microplus A LOS IXODICIDAS EN MÉXICO Francisco Martínez Ibáñez. Departamento de Ectoparásitos y Dípteros. Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal. CENAPA–SENASICA–SAGARPA. Carr. Cuernavaca – Cuautla No. 8534 Col. Progreso, Jiutepec, Morelos. C.P. 62550. Tel: 01 55 5905 1000, ext, 53124. E-mail; francisco.martinez@senasica. sagarpa.gob.mx

La garrapata R (Boophilus) microplus es un grave problema para la ganadería en pastoreo de las regiones tropicales y subtropicales de Centro y Sudamérica, África y Australia. En México la distribución de la especie abarca 1,043,772.4 Km² (53% del territorio nacional) y se considera que cerca del 70 % de la ganadería nacional se explota en las regiones donde esta se presente (Solís, 1991). Su control puede efectuarse química, biológica y culturalmente, sin embargo en el mundo se ha privilegiado el control químico (acaricidas) sobre cualquier otro debido entre otras cosas a la facilidad para aplicarlo, al aumento en la densidad de población en las zonas ganaderas, a la excesiva publicidad alrededor de este método y a la escasa investigación sobre estrategias alternativas. El Control químico se ha vuelto ineficaz en algunas regiones debido a la aparición de garrapatas resistentes a estos productos y por ello es cada vez más complicado el manejo de ese tipo de poblaciones. Se han utilizado otras estrategias para el control de la garrapata diferentes al control químico tales como vacuna contra la garrapata, pastos antigarrapata, plantas arbustivas antigarrapata y hongos entomopatógenos, algunos de ellos han logrado buenos resultados y son comercialmente utilizados, otros deben ser aún trabajados para convencer al ganadero y que se puedan incorporar como medidas de control (Lezama et al, 1995; Huerta-Paniagua et al 1999; Willadsen et al. 1995). La Resistencia a los Acaricidas en México Resistencia a Organofosforados. En 1976 cuando el Fideicomiso Campaña Nacional contra la garrapata fue formalmente establecido, los ixodicidas organofosforados fueron los únicos autorizados por este programa para el control de las garrapatas en México, sin embargo, siete años después de que dio inicio su uso en forma extensiva y periódica con aplicaciones cada dos semanas la resistencia a los acaricidas fue por primera vez documentada en 1982 a partir de un reporte de fallas de control en la zona del Golfo de México en la región de “Tuxpan”, Veracruz (Aguirret al 1986). El procedimiento de confirmación del caso fue mediante la prueba de paquete de larvas

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(Stone & Haydock, 1968) y posteriormente evaluado en ganado artificialmente infestado para determinar además los porcentajes de control que se lograban con los organofosforados (OF) en ese entonces disponibles (CENAPAa, 1983). Posteriormente en 1984, se identificó otra cepa que mostraba características toxicológicas diferentes que fue denominada “Tempoal” (resistente a organofosforados y organoclorados (Aguirre et al 1986), esta última se colectó de la misma zona del Golfo de México y fue caracterizada toxicológicamente. La distribución de esas garrapatas era abundante en la región Este y Noreste de México en una área conocida como las Huastecas (CENAPAb, 1985) Con el objeto de valorar en forma adecuada este fenómeno se aplicó ensayos in vitro, que incluyeron la inmersión de hembras repletas a la concentración comercial recomendada por el laboratorio productor. Esta prueba fue realizada con garrapatas hembras repletas recién desprendidas del hospedero, la cual permitió determinar el porcentaje de control de estos productos con tres cepas como se describe en la Tabla 1. Tabla 1. Porcentajes de control de ixodicidas evaluados con R (Boophilus) microplus susceptible y resistentes a organofosforados tratadas por inmersión a la concentración comercial recomendada.

PORCENTAJES DE CONTROL COMPUESTO Susceptible Tuxpan Tempoal

Coumaphos 20 97,94 51,97 22,01

Chlorfenvinphos 99,99 97,60 98,00

Chlorpyriphos 99,71 97,28 94,89

Ethion 99,77 33,99 -----

Diazinón 99,65 21,27 12,06

Lindano 99,92 99,30 22,03

Flumetrina 100 100 100

Cypermetrina 92,76 97,21 94,87

Deltametrina 100 100 100

Amitraz 100 100 100

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Resistencia a Piretroides. Ocho años después de autorizados los piretroides, en 1993, fueron detectados los primeros casos de resistencia a esa familia en cuatro estados de México, todos ellos al Este de la República en la región del golfo de México. Los casos se confirmaron por la técnica de dosis discriminantes mediante el paquete de larvas (Stone & Haydock, 1968) y dieron como resultado la presencia de dos cepas que se denominaron "San Jorge" y "La Mora" con resistencia a los piretroides (PS) Flumetrina, Deltametrina y Cypermetrina y mediana a los organofosforados Coumaphos y Clorfenvinphos (Ortiz et al., 1995). Al siguiente año de la detección en 1994 se inició un programa de monitoreo en zonas de alto riesgo de presentación del fenómeno, se visitaron regiones similares a donde se detectó la resistencia a Organofosforados (OF) en 1984 más aquellas regiones donde existía algún reporte de falla de control. Se visitaron 5 Estados y se recibieron algunas muestras de otros 4, se confirmó una amplia dispersión del fenómeno ya que en los 9 se detectó resistencia doble o simple a piretroides (PIR) (Fragoso et al., 1995; Ortiz et al., 1995). Producto del muestreo de 1984 se colectaron 3 cepas denominadas Mora, Coatzacoalcos y Aldama las cuales mostraban algunas diferencias en cuanto a su respuesta toxicológica a los piretroides, tal como se presenta en la Tabla 2 (Fragoso & Soberanes, 2001).

Tabla 2. Porcentajes de control de ixodicidas evaluados con R (Boophilus) microplus susceptible y resistentes a piretroides tratadas por inmersión a la concentración comercial recomendada.

PORCENTAJES DE CONTROL COMPUESTO Coatzacoalco Susceptible Aldama Mora s

Chlorfenvinphos 99,99 95,27 42,01 98,19

Coumaphos 97,94 25,84 34,14 ------

Flumetrina 100 45,95 0 100

Cypermetrina 92,76 99,59 0 80,26

Deltametrina 100 67,79 0 95,56

La respuesta moderada que mostró la cepa “Mora” hacia los organofosforados es similar al comportamiento de la “Tuxpan”, pero además presentó niveles altos de

11 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México resistencia hacia los piretroides con factores de resistencia de 352.9, 118.7 y 104 para Flumetrina, Cypermetrina y Deltametrina respectivamente. Por otro lado la cepa “Aldama” presentó susceptibilidad a Cypermetrina y un espectro de resistencia que involucra a la Flumetrina y Deltametrina. La cepa “Coatzacoalcos” por su parte moderada resistencia a Cypermetrina y muy baja a Deltametrina Los resultados encontrados en México de las cepas Mora y Coatzacoalcos fueron muy similares para las cepas australianas reportadas como Parkhurst y Lamington las cuales presentaron la primera alta resistencia a piretroides y fosforados y la segunda solo a piretroides (Nolan J., et al 1989). A partir de 1993 posterior al desarrollo de la resistencia a OF y PIR, el uso del Amitraz se intensifico, motivo por el cual se establecieron programas de vigilancia en campo a fin de determinar posibles alteraciones en la susceptibilidad al Amitraz en poblaciones naturales de R (B). microplus que habían sido presionadas con ese producto. Se calcula que de 1994 al año 2000 la venta de acaricidas con ese principio activo se había incrementado en cerca del 1000%. Lo anterior es una muestra de la presión de selección que se ha ejercido con el exagerado uso de las amidinas sobre las poblaciones de garrapata R (Boophilus) en las regiones del Golfo de México. Resistencia al Amitraz. A partir del establecimiento de la resistencia a los piretroides, se incrementó notablemente el uso del Amitraz ya que este acaricida demostró ser la alternativa efectiva para el control de cepas tipo Mora. Se calcula que de 1994 al año 2000 la venta de ixodicidas con ese principio activo se había incrementado en cerca del 1000%. Lo anterior fue una muestra de la presión de selección ejercida con el exagerado uso del amitraz sobre las poblaciones de garrapata R (Boophilus) microplus en las regiones del Golfo de México. A principios del año 2001 se detectó en una muestra de garrapata R(Boophilus) microplus de la región de los ríos en el estado de Tabasco, el primer caso de resistencia al amitraz (región de trópico húmedo con clima cálido todo el año y precipitaciones superiores a 2,100 mm. anuales (Santamaría et al., 2001). La cepa denominada “San Alfonso” presentó características de multiresistencia a Amitraz, PIR y OF (Tabla 3) y su conducta toxicológica es similar a las cepa australiana Ultimo y brasileña Cavalcanti (Kemp et al., 1998).

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Tabla 3. Porcentajes de control de ixodicidas evaluados con R (Boophilus) microplus cepa “San Alfonso” de Emiliano Zapata, Tabasco, tratadas por inmersión a la concentración comercial recomendada.

% INHIBICIÓN DE LA % % COMPUESTO % CCR OVIPOSICION ECLOSION CONTROL

Ethion 0,068 5,04 98,16 1,64

Clorpirifos 0,024 86,13 52,70 92,80

Chorfenvinphos 0,030 66,64 31,91 88,36

Coumaphos 0,20 12,79 85,43 24,14

Flumetrina 0,030 26,90 94,88 26,61

Permetrina 0,005 8,64 94,97 8,46

Cypermetrina 0,020 10,01 74,75 29,02

Cyamizole- 0,030 28,87 58,54 55,60 cypermetrina

Permetrina- 0,29 27,10 84,60 35,06 clorfenvinphos

Cyamizole 0,03125 42,03 28,10 88,84

Amitraz 0,020 50,23 55,07 64,89

La cepa mexicana referida presentó pobre eficacia al Amitraz (64%), muy variable para los organofosforados (de 1.64% para el Ethión a 92.8% en Clorpirifos), muy pobre para los PIR (26 al 29%) y variable para las mezclas con control de 35 al 88%. Diferencias fundamentales entre la resistencia a organofosforados, piretroides y amidinas: El fenómeno mostraba una mayor dispersión, en 1982-84 la resistencia a OF solo se detectó en una región geográfica abarcando 4 estados, en 1994 el fenómeno se dispersaba en un área tan distante como 1.500 km entre un punto y otro abarcando 6 estados. Adicionalmente donde primero apareció fue en lugares donde en 1984 no se detectó resistencia a OF. Los factores de resistencia observados a PIR en 1993 fueron notablemente mayores, en los casos de resistencia a OF los factores se encontraban cercanos a 12, en los

13 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México casos de PS con respecto a Deltametrina fueron tan altos que fue imposible calcularlos, siendo superiores a 300. No todos los casos resistentes a OF en 1984 concluyeron años después en resistencia a piretroides. Existen regiones de Veracruz que después de detectarse resistencia a OF han usado piretroides por 6 años o más sin presentar resistencia a esa familia. La resistencia cruzada entre productos de la misma familia se desarrolló rápidamente aún sin el uso en ese momento de otros miembros de la familia. En ese sentido se colectó en 1994 una cepa denominada Coatzacoalcos solo resistente a Cypermetrina que tiempo después y sin presión química desarrolló la resistencia a Flumetrina y Deltametrina. La resistencia a OF se desarrolló aproximadamente en 7-8 años después de iniciado el uso intenso de acaricidas cuando se estableció en todo el país la Campaña Nacional Contra la Garrapata. Por otro lado la resistencia a Piretroides se calcula que debe haber aparecido 5-6 años después de iniciado el uso intensivo de esos productos. En el caso de la resistencia al Amitraz después de cuatro años de existencia se ha observado lo siguiente: La resistencia a las Amidinas fue identificada por primera vez en la misma región donde apareció la resistencia a los Piretroides. Después del muestreo en la región de alto riesgo se encontró dispersa por regiones muy distantes sin embargo con un mucho menor nivel de reporte de fallas de control que los casos de piretroides. En cuatro años de detectada se ha difundido a diversos estados y regiones, sin embargo los mayores problemas se presentan solo en la misma zona donde apareció la resistencia a PIR. Existen explotaciones donde después de haberse diagnosticado la resistencia los productores cambiaron a fosforados por uno o dos años, han regresado a piretroides logrando resultados aceptables, situación imposible de lograr con piretroides. Los Factores o Índices de Resistencia a las Amidinas han sido de lento crecimiento, una vez detectados casos tipo “San Alfonso” (IR de 30) y a pesar de seguirse usando el mismo producto en campo, no han crecido de manera explosiva, en múltiples casos detectados de resistencia a esta familia con la prueba de Inmersión de Larvas a DD de 0.0002% presentan IR de 3 a 4 y después de cinco generaciones de uso continuo del mismo producto el IR muestra una conducta sumamente variable oscilando entre 2 y 6. Situación que no se observó en piretroides. Pruebas para el diagnóstico de la resistencia al amitraz. Existen diferentes métodos de diagnóstico para la identificación de la resistencia en poblaciones con comportamiento atípico a los ixodicidas, las más utilizadas son la inmersión de garrapatas adultas, inmersión de larvas y paquete de larvas modificado, estas técnicas son bioensayos que utilizan pesticidas a concentración comercial o a dosis llamadas Dosis Discriminantes (DD). En México la técnica más utilizada es la

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Inmersión de larvas (Shaw) la cual ha demostrado ser muy eficaz, es repetible, consistente y fácil de manejar. La prueba se ha estandarizado con cepas de referencia una vez que se calculó la DD, correspondiente a una concentración del producto amitraz (Taktic®) de 0,0002%. Con relación a otros métodos se encontró al compararse con la prueba de Paquete de Larvas Modificada que esta mostraba mayor variabilidad que la de Shaw. Por otro lado contra la Inmersión de Adultas esta fue mucho menos sensible para detectar individuos con resistencia emergente y su repetitividad con cepas de referencia no alcanzó la misma confiabilidad que la prueba de Shaw. Durante el año 2009 y 2010 el CENAPA prosigue con el monitoreo a nivel nacional, apoyando a la Campaña contra la Garrapata en predios donde es un problema este ectoparásito. Llegaron al laboratorio de Ectoparásitos y Dípteros garrapatas de 17 estados de México. Se recibieron muestras de garrapatas vivas para trabajar las técnicas de diagnóstico de susceptibilidad como se presenta en el Cuadro 1. En el año 2009 se trabajaron 704 muestras, de ellas el 81.96% son garrapatas resistentes a tres familias (OF/PIR/AMI), el 9.8% a OF/PIR y todavía se mantiene una población susceptible con 2.41%. En lo que respecta al año 2010 el CENAPA recibió 696 muestras de R (B) microplus de las cuales 4.74% son susceptibles, 11.78 con resistencia a amitraz solamente y el 66.24% son multi resistentes a organofosforados, piretroides y amitraz. (Martínez y col. 2013).

Cuadro 1. Porcentaje de muestras que expresan susceptibilidad o resistencia toxicológica a una, dos o tres familias químicas.

Año 2009 Año 2010 Muestras Muestras que que No. Respuesta No. Respuesta expresan expresan Muestras toxicológica Muestras toxicológica resistencias resistencias % % 17 Susceptibles 2.41 33 Susceptibles 4.74 7 OF 0.99 1 OF 0.14 12 PIR 1.71 15 PIR 2.15 7 Amitraz 0.99 82 Amitraz 11.78 6 OF /Amitraz 0.86 14 OF /Amitraz 2.02 9 PIR / Amitraz 1.28 49 PIR / Amitraz 7.04 69 OF / PIR 9.80 41 OF / PIR 5.89 577 OF/PIR/Amitraz 81.96 461 OF/PIR/Amitraz 66.24 Total = 704 100 % Total = 696 100 % OF = Organofosforados. PIR = Piretroides

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Resistencia a fipronil e ivermectina. Al confirmar que el fenómeno de las cepas de campo de R (B). microplus multiresistentes a OF-PIR y amitraz y que este fenómeno se encontraba ampliamente disperso en las principales zonas ganaderas del país, el CENAPA comienza a trabajar en el establecimiento de DD de fipronil e ivermectina como alternativas de diagnóstico en ranchos multiresistentes y es para el año de 2012 cuando publica las DD a estas dos ixodicidas los cuales son las siguientes; Para fipronil de 0.05% y en el caso de Ivermectina 2.09% (Osorio y col. 2008). Con la presentación de las cepas con respuesta toxicológica a tres o cuatro familias químicas de garrapaticidas, de la región de del noreste del país, básicamente de Aldama, Tamaulipas, llega al CENAPA una muestra de garrapatas en noviembre del 2009, la cual presenta una respuesta positiva toxicológicamente al fipronil. Debido a esto se procedió a caracterizar toxicológicamente esta cepa de campo a la cual denominamos R (B). microplus “Vargas” procedente de Aldama, Tamaulipas. Se le realizaron diversos ensayos en paquete de larvas e inmersión de larvas mediante la metodología Probit estimando las regresiones Dosis-Mortalidad para obtener las Concentraciones Letales (Cl 50 90 y 99) al desafiar larvas de R (B). microplus cepa “Vargas” y “Susceptible” de referencia. Los resultados obtenidos permitieron determinar los Índices de Resistencia (IR) en la cepa de campo y reconocer su perfil toxicológico hacia los Organofosforados (Coumaphos IR= 1.95, Chlorpiriphos IR= 32.77 y Diazinon= 40.67), a Piretroides (Deltametrina= 7.20, Flumetrina= 2.62 y Cypermetrina= 3.91) a Fenilpirazolonas (Fipronil= 8.27) y Amidinas (Amitraz= 49). En base a los resultados encontrados se concluye que la cepa “Vargas” presenta un perfil toxicológico que expresa resistencia multiple hacia cuatro familias de ixodicidas (Organofosforados, Piretroides, Amidinas y Fipronil) lo que la distingue como la primera cepa de referencia del CENAPA resistente al fipronil y que será de gran valor para las pruebas de laboratorio y establo así como en el diagnóstico de resistencia. En México se siguen realizado estudios de prevalencia y monitoreo de la resistencia dirigida hacia las zonas de alto riesgo en todo el país tanto para conocer la distribución de la resistencia a los organonofosforados, piretroides, amitraz y fipronil así como buscar cepas resistentes a ivermectina las cuales hasta el momento no las hemos encontrado afortunadamente. Por otro lado y a pesar del intenso uso de acaricida en el campo para el año del 2016, llegaron al CENAPA 1321 muestras de 22 estados de la República Mexicana solo se pudieron analizar 883. El panorama se presenta en el Cuadro 1, y es el siguiente; se encontraron 47 muestras que fueron susceptibles, 2 resistentes a OF y a PIR solo 4, 115 solo a amitraz. Las doble resistentes fueron 3 a OF/PIR, 91 a PIR/AMI, 26 a OF/AMI y 1 a AMI/PIR. La población que expreso resistentecia a tres familias fueron a; OF/PIR/AMI 433, PIR/AMI/FIP solo 5 y OF/AMI/FIP solo 3. Y la población de campo que expresan multi resistencia a cuatro familias químicas OF/PIR/AMI/FIP fueron 153 muestras respectivamente. En porcentajes, el 50.1% es triple resistente (OF/PIR/AMI), 17.32% es resistente a cuatro familias (OF/PR/AMI/FIP), 13% solo

16 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México amitraz y 10.3% a dos familias (PIR/AMI) y un 5.4% es susceptible encontrando estas cepas en Jalisco, Michoacán, Sinaloa, Yucatán y Zacatecas. De los resultados de ese muestreo algunos hallazgos que llaman la atención son el hecho de seguir detectando casos de resistencia a Organoclorados a pesar de que en algunas de esas zonas son de escasa aplicación desde hace más de 30 años. De aquí que sea posible afirmar que el retorno de la eficacia de un producto después de que ha sido abandonado es difícil, en este sentido se han señalado que poblaciones de garrapatas B. microplus de Australia las cuales eran resistentes a los organoclorados y que dejaron de ser tratadas con esa familia de garrapaticidas desde 1962 aún siguen apareciendo resistentes con frecuencias tan altas como 60 a 70% de los individuos muestreados (Kemp D.H. et al., 1998).

Referencias Aguirre, E.J.; Santamaría, V.M. (1986). Purificación y caracterización toxicológica de garrapatas B. Microplus resistentes a ixodicidas organosfosforados y organoclorados. VII Reunión Anual Asoc. Mex. de Parasitología Veterinaria, A.C. Cd. Victoria, Tamps. Centro Nacional de Parasitología, CENAPAa. (1983). Informe sobre los trabajos realizados con B. microplus cepa “Tuxpan”. Departamento de Constatación. CENAPA. FCNCG. Centro Nacional de Parasitología. CENAPAb (1985) Proyecto Especial: Fideicomiso Campaña Nacional Contra la Garrapata. México 1983-1984. Fragoso, S:H., Soberanes, C.N, Ortiz, E:M, Santamaría, V.M, Ortiz, N. A, (1995). Epidemiología de la resistencia a ixodicidas piretroides en garrapatas Boophilus microplus, en la República mexicana. III Seminario internacional de Parasitología Veterinaria “Resistencia y control en garrapatas y moscas de importancia veterinaria”. SAGAR- CANIFARMA- FAO-IICA-INIFAP. Fragoso S.H. y Soberánes C.E., (2001). Resistencia a los ixodicidas en México, situación actual, prevención y manejo. Memorias del XX Congreso Nacional de Buiatría. Veracruz, México. pp. 71-79 Huerta-Paniagua, R.A. y Rodríguez H.C. 1999.Evaluación de la actividad de extractos acuosos del NIM Azadirachta indica L. Sobre Boophilus microplus Canestrini.) Memorias del IV Seminario Internacional de Parasitología Animal. p. 121. México. Kemp D.H., Thulner F., Gale K.R., Nari A. &Sabatini G.A. (1998). Acaricide resistance in the cattl ticks Boophilus microplus and Boophilus decoloratus. Report to the Animal Health Services. FAO. 1-32. Lezama G.R. et al. 1995. Efectiveness of the entomopathogenic fungus Metarhizum anisoplae in the biological control of ticks in bovine livestock, in field conditions. III Seminario Internacional de Parasitología Animal. p. 145. México. Martinez I.F., Osorio M.J., Delabra V.G., Peláez A.F. y Chiuh D.A. 2013. Respuesta toxicológica de Boophilus microplus en México durante los años 2009 y 2010

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con diferentes ixodicidas de uso común. Memorias del XXXVII Congreso Nacional de Buiatría. Acapulco, Gro. México. p.218 Neri O.S. et al.2003. Epidemiology of amitraz resistance in the cattle tick Boophilus microplus in México. V seminario Internacional de Parasitología Veterinaria. Mérida, Yucatán, México. pp 92-98. Nolan J., Wilson J.T., Green P.E. & Bird P.E. (1989) Syntethic pyrethroid resístanse in field samples of the cattle tick (Boophilus microplus) Aus. Vet. J., 66, 179-182. Ortiz, E.M.; Ortiz, N.A.; Soberanes, C. N.; Osorio, M.J.; Franco, B.R.; Martínez, I.F.; Quezada, D.R.; Fragoso, S.H. (1995). Caracterización de la resistencia de B. microplus a ixodicidas en México. III Seminario internacional de Parasitología Veterinaria “Resistencia y control en garrapatas y moscas de importancia veterinaria”. SAGAR- CANIFARMA- FAO-IICA-INIPAP. Osorio M.J., Martinez I.F., Delabra V.G. y Valladares F.E. 2008. Determinación de una “Dosis Discriminante en Fenilpirazolonas para el diagnóstico de resistencia en larvas de Boophilus microplus. VI Seminario Internacional de Parasitología Animal. Boca del Río, Veracruz. SAGARPA- AMPAVE- CANIFARMA- INIPAP. Stone BF, Haydock KP. A method for measuring the acaricide susceptibility of the cattle B. microplus (Can.). Bull Entomol Res 1968; (53): 563-578. Santamaría V.M., Soberanes C.N., Fragoso S.H. y García V.Z. (2001) Primer reporte de la resistencia en garrapata Boophilus microplus al Amitraz en México. Revista Técnica Pecuaria, México. Solis, S.S. 1991. Epidemiología de las garrapatas Boophilus spp y Amblyomma spp. II Seminario Internacional de Parasitología Animal, México pp. 19-30. Willadsen, P., et al. 1995. The rol of vaccination in current and future strategies for tick control. Memorias del III Seminario Internacional de Parasitología Animal, México. 88-100.

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Cuadro 2. Numero de muestras susceptibles o resistentes realizadas por el CENAPA durante el año 2016, en garrapatas R (Boophilus) microplus en 22 estados de la Republica Mexicana.

No. DE MUESTRAS ANALIZADAS MUESTRAS ESTADO ANALIZADAS OF/PIRE/ SUS OF PIRE AMITRAZ OF/PIRE PIRE/AMI OF/AMI OF/PIRE/AMI AMI/FIP PIRE/AMI/FIP OF/AMI/FIP AMI/FIP CAMPECHE 63 ------52 - - - 11

CHIAPAS 0 ------CHIHUAHUA 0 ------COAHUILA 0 ------DURANGO 4 - - - 4 ------

GUERRERO 52 - - - - - 1 - 44 - - - 7

HIDALGO 1 ------1 - - - -

JALISCO 97 11 1 - 17 - 1 4 30 - - - 33

MICHOACAN 103 6 - 2 14 3 36 1 33 - 1 1 6

MORELOS 1 - - - - - 1 ------

NAYARIT 41 - - - 2 - 5 1 22 - 2 - 9

NUEVO LEÓN 43 - - - 2 - 4 - 19 1 2 - 15

OAXACA 1 ------1 - - - -

PUEBLA 50 - - 2 8 - 15 - 17 - - 2 6

Q. ROO 24 - - - 1 - 2 2 19 - - - -

S.L.P 2 ------2

SINALOA 17 1 - - 8 - 1 7 - - - - -

TABASCO 5 ------1 - - - 4

TAMAULIPAS 55 - - - 4 - 1 1 23 - - - 26

VERACRUZ 90 - - - - - 5 - 59 - - - 26

YUCATAN 169 1 1 - 21 - 19 7 112 - - - 8 ZACATECAS 65 28 - - 34 - - 3 - - - - - TOTAL 883 47 2 4 115 3 91 26 433 1 5 3 153

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ACTUALIDADES SOBRE EL DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA DE GARRAPATAS A LOS ACARICIDAS Y LACTONAS MACROCÍCLICAS EN MÉXICO

UPDATES ON THE DIAGNOSIS OF TICK RESISTANCE TO ACARICIDES AND MACROCYCLIC LACTONES IN MEXICO

Rodríguez-Vivas RI1*, Rosado-Aguilar JA1, Ojeda-Chi MM1, Villegas-Pérez SL1, Trinidad-Martínez I1, Alonso-Díaz MA2, Aguilar-Tipacamú G3, Ojeda- Robertos NF4, Pérez de León AA5

1Laboratorio de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Yucatán. 2Centro de Enseñanza Investigación y Extensión en Ganadería Tropical, FMVZ de la Universidad Nacional Autónoma de México. 3Facultad de Ciencias Naturales. Universidad Autónoma de Querétaro. 4División Académica de Ciencias Agropecuarias, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. 5USA-USDA–ARS Knipling–Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory and Veterinary Pest Genomics Center.

Resumen

Se presentan los avances sobre el diagnóstico de resistencia de garrapatas a los acaricidas y lactonas macrocíclicas (LM) en México. El uso frecuente e irracional de acaricidas y LM para el control de las garrapatas ha favorecido la aparición de poblaciones resistentes, y ha dificultado el control de este ectoparásito en los sistemas de producción en México. La resistencia fenotípica es evaluada en condiciones in vitro e in vivo; sin embargo, la pruebas toxicológicas (bioensayos) en condiciones in vitro son las más usadas. En este artículo se presentan las principales pruebas químicas para detectar la producción excesiva de enzimas hidrolíticas y de secuestro que ocurren en garrapatas resistentes a acaricidas. Asimismo, se presentan las principales pruebas moleculares para el diagnóstico de mutaciones que están asociadas a la resistencia de distintas moléculas usadas para el control de garrapatas.

Palabras clave. Resistencia, diagnóstico, garrapatas, acaricidas, lactonas macrocíclicas, bioensayos.

Introducción.

El uso frecuente e irracional de acaricidas y lactonas macrocíclicas (LM) para el control de las garrapatas ha favorecido la aparición de poblaciones resistentes a estos productos químicos. La resistencia fenotípica es medida mediante el uso de bioensayos en condiciones in vitro e in vivo; sin embargo, la pruebas in vitro son

20 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México las más usadas. Las principales pruebas in vitro para el diagnóstico de garrapatas a los acaricidas son la prueba de paquete de larvas (PPL), la prueba de inmersión de larvas (PIL), la prueba de inmersión de adultas y la prueba tarsal de larvas (PTL) (Rodriguez-Vivas et al. (2014).

Actualmente se dispone de ensayos bioquímicos para identificar mecanismos de resistencia de garrapatas a los acaricidas, especialmente la resistencia asociada a la sobreexpresión de esterasas, citocromo P450 y mono oxidasas (Hughes y Raftos, 1985; Jamroz et al., 2000; Miller et al., 2001; Cossio-Bayugar et al., 2008).

En los últimos años se ha podido observar grandes avances en los estudios moleculares de la resistencia de garrapatas a los acaricidas y LM. Los primeros marcadores genéticos para el diagnóstico de resistencia en las garrapatas fueron desarrollados para los piretroides sintéticos (PS). La técnica de PCR alelo específica (PCR-AE por sus siglas en inglés) es la más usada para diagnosticar la resistencia asociada a los piretroides en el canal de sodio de las garrapatas (Guerrero et al., 2001). Hoy en día se dispone de PCRs cuantitativas que permiten conocer otras mutaciones asociadas a la resistencia a diferentes acaricidas (Baffi et al., 2008).

El objetivo del presente artículo es presentar los avances sobre el diagnóstico de resistencia de garrapatas a los acaricidas y LM en México.

Diagnóstico in vitro

Existe una variedad de técnicas con bioensayos específicos para el diagnóstico de resistencia de garrapatas a los diferentes acaricidas convencionales y LM (FAO, 2004). A continuación se hará referencia a los bioensayos que mejores resultados han tenido y que se usan en la investigación y servicio a los productores.

Prueba de paquete de larvas (PPL)

Esta prueba fue descrita por Stone y Haydock (1962) y fue adoptada por la FAO en 1984; ha sido ampliamente utilizada para la caracterización de cepas, detección y estudios de resistencia de garrapatas a los acaricidas. La PPL ha recibido reconocimiento internacional debido a su gran utilidad práctica. Se considera que es una de las técnicas más repetibles, aunque está limitada por el exceso de trabajo y el tiempo requerido para obtener resultados. Las larvas (7-15 días de edad) se incuban durante 24 horas en paquetes de papel de filtro que han sido impregnados con acaricidas de grado técnico, con el objeto de obtener porcentajes de mortalidad (0-100%) que puedan ser analizados por medio de la metodología Probit, ya que los efectos letales de los acaricidas están relacionados con los logaritmos de las concentraciones utilizadas. Los resultados de este bioensayo con R. microplus se obtienen a las seis semanas de haber colectado las garrapatas hembras repletas (Guerrero et al., 2014).

21 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Prueba de inmersión de larvas (PIL)

También conocida como técnica de Sandwich o de Shaw, esta prueba fue descrita por Shaw (1966) y modificada por la FAO (1984). Consiste en la inmersión entre dos papeles filtro de larvas de 7-15 días de edad en suspensiones del acaricida (durante un periodo de 10 minutos), a partir de concentrados emulsionables disponibles en el mercado. Posteriormente, se retiran y se colocan en un sobre de papel filtro, incubándose a 27 + 2 °C con humedad ambiental del 80- 90 %. La lectura de los resultados se realiza a las 48-72 horas posteriores al tratamiento. El objetivo de esta prueba es similar al del paquete de larvas (FAO, 1984). Esta prueba proporciona resultados a las seis semanas, y los estudios comparativos indican que los resultados de la PIL pueden ser comparados con los resultados de la PPL (FAO, 2004). Recientemente, la PIL ha sido modificada usando viales o placas de microtitulación de 96 pozos para reducir la mano de obra requerida. El uso de placas de microtitulación ha demostrado ser ventajoso en el cribado automatizado de alto rendimiento donde el bioensayo es automatizado (White et al., 2004). Además ha sido modificada con éxito para el diagnóstico de resistencia a las LM, ivermectina (Klafke et al., 2006; Pérez-Cogollo et al., 2010).

Prueba de inmersión de adultas (PIA)

Probablemente es la prueba/bioensayo más utilizada (FAO, 2004). Esta técnica está basada en la prueba de inmersión de hembras repletas descrita por Drummond et al. (1967), siendo modificada por la FAO (1999b). La prueba consiste en sumergir en soluciones de acaricidas a garrapatas adultas repletas, durante un período de 30 minutos, para posteriormente incubarlas a 27°C con 80- 90% de humedad relativa por 7-15 días. La lectura de los resultados se realiza al finalizar el periodo de incubación (7-15 días). Esta prueba presenta dos modalidades: 1) la prueba biológica (realizada con la concentración comercial recomendada del acaricida) con el objetivo de determinar la mortalidad y los parámetros biológicos como son la inhibición de la oviposición sobre garrapatas adultas; y 2) el bioensayo con concentraciones múltiples para realizar el análisis Probit (Santamaría y Soberanes, 2001). Es una de las pruebas que tienen más variaciones en cuanto al volumen de acaricida a usar, número de garrapatas por grupo de tratamiento, tiempo de la inmersión y medición de la eficacia. Sabatini et al. (2001) modificó la prueba para que en siete días se obtengan resultados, pero muchos laboratorios han tenido problemas de variabilidad en sus resultados. Esto podría ser minimizado al aumentar el número de garrapatas adultas en los grupos tratados y controles (Jonsson et al., 2007).

Prueba tarsal de larvas (PTL)

La prueba consiste en preparar soluciones con acaricidas e impregnar pozos individuales de una placa de fondo plano (96 pozos). A cada pozo se agrega 50

22 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México huevos de garrapatas (14-21 días de haber colectados las garrapatas hembras repletas). Dos semanas después de la emergencia de las larvas se determina la mortalidad. Los índices de resistencia obtenidos de la PTL son comparables a la PPL. Sin embargo, las concentraciones letales son 150 veces menores que las obtenidas con la PPL. La ventaja de la PTL es que evita la manipulación de las larvas por el uso de las placas de pozos múltiples lo que facilita el trabajo (Lovis et al., 2011).

Diseños de los bioensayos

Los bioensayos deben de estar bien diseñados para obtener suficiente información y estimar de manera precisa las concentraciones letales (CL) que matan a las garrapatas. Robertson y Preisler (1992) mencionan que los bioensayos deben de tener al menos cinco dosis que produzcan mortalidades en la población de estudio entre 5% y 95%. Es recomendable que cada concentración del acaricida y el control tengan tres repeticiones para poder estimar las CL de manera precisa.

Cuando se realiza el análisis probit es necesario evaluar la línea logarítmica dosis- respuesta considerando la posición y la pendiente. La posición es expresada por el valor de una coordenada cuando la otra es mantenida constante. La coordenada más usada es la concentración del acaricida. La pendiente indica la proporción de cambio en el efecto (mortalidad) al modificar la concentración. Se obtiene por la división del efecto modificado entre la concentración del acaricida modificada. Cuando la línea es más inclinada la población es más homogénea. La pendiente indica el aumento de sensibilidad al acaricida en la población probada (Robertson et al., 2007). Si los límites de confianza al 95% entre la cepa de referencia y la población a estudiar no se traslapan, se considera que son significativamente diferentes en la susceptibilidad del acaricida evaluado (Robertson et al., 2007).

El análisis de probit se utiliza para determinar la CL requerida para matar al 50%, 90% o 99% de la población (CL50, CL90 o CL99) (Robertson et al., 2007). El índice de resistencia (IR) es la CL de la muestra de estudio dividido entre la CL de una cepa de referencia susceptible (FAO, 2004). En la gran mayoría de la literatura científica se reporta los valores de la CL50, ya que se puede determinar con mayor precisión la respuesta de la población a un acaricida. Sin embargo, para tener una imagen comparativa general del nivel de resistencia, se debe usar otras CL tales como las que matan al 90, 95 ó 99 % de la población evaluada (Cabrera-Jimenez et al., 2008; Rodriguez-Vivas et al., 2012), así como la pendiente o respuesta de la población a dosis crecientes del acaricida (Robertson et al., 2007).

En la literatura internacional se han propuesto varios criterios alternativos para evaluar el nivel de resistencia de R. microplus a los acaricidas e ivermectina. Beugnet y Chardonnet (1995) propusieron que las poblaciones de garrapatas se

23 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México consideran susceptibles a los PS cuando los valores de IR (medidos en la CL50) son <3.0, tolerantes 3-5 y resistentes ≥ 5.0. Rodriguez-Vivas et al. (2012) propuso analizar los niveles de resistencia de R. microplus a los PS usando los IR evaluadas a partir de las CL50 + CL99. Las poblaciones son susceptibles cuando ambos valores de IR son <3.0 y resistentes cuando los valores del IR son > 5.0. Las poblaciones se consideran tolerantes cuando uno o ambos valores de IR son de 3-5. Por otra parte, Castro-Janner et al. (2011) sugirió utilizar los siguientes criterios para la resistencia a la ivermectina: IR50 ≤1 susceptible,R50 I de1≤2 resistencia incipiente e IR50 > 2 resistente. Adicionalmente se puede utilizar como criterio de resistencia, la pendiente en las poblaciones de garrapatas. En un estudio realizado por Rodriguez-Vivas et al. (2012) encontraron que las poblaciones de campo de R. microplus susceptibles presentaron pendientes ≥2.42, mientras que las poblaciones resistentes presentaron pendientes <1.97.

Una prueba de resistencia simple y que se puede hacer a nivel de campo (en vez de realizar un bioensayo completo), es la llamada dosis discriminante (DD). Esta tiene la finalidad de ahorrar tiempo y mano de obra, así como aprovechar las pocas garrapatas que a menudo están disponibles a nivel de campo (FAO, 2004). La DD se obtiene duplicando la concentración letal que mata al 99.9% de una cepa de referencia homocigóticamente susceptible. Debido a que se utiliza el doble de la concentración letal, en caso de observar un individuo o más vivos se considera a la población evaluada como resistente (Kemp et al., 1998).

Una de las limitantes de los bioensayos para diagnosticar resistencia en garrapatas hacia los acaricidas, es contar en cada país o región con una cepa de referencia susceptible y cepas resistentes a distintos acaricidas y LM. En México, el SENASICA cuenta con varias cepas de garrapatas susceptibles y resistentes a distintos acaricidas. Hoy en día urge la necesidad de contar con una cepa de referencia resistente a la ivermectina para poder caracterizarla genéticamente y realizar estudios sobre mecanismos de acción, eficacia, etc. Castro et al. (2017) reportaron en México la generación de una cepa de R. microplus resistente a la ivermectina que está siendo presionada con esta LM. Asimismo, en el USDA-ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, Edinburg, Texas, EUA se cuenta con una cepa de R. microplus (origen mexicano) de referencia resistente a ivermectina y que tiene un alto IR, que ayudará a definir futuros estudios sobre diagnóstico de resistencia de R. microplus a las LM.

Diagnóstico in vivo

El problema de la resistencia de las garrapatas a los acaricidas se reconoce por las fallas en el control a nivel de campo. Esta sospecha debe de ser confirmada con pruebas de laboratorio. La evidencia más común de resistencia es la sobrevivencia de algunas ninfas que evolucionan normalmente hasta llegar a hembras repletas a los 10-14 días después de haber aplicado el tratamiento. Esta prueba de diagnóstico se usa principalmente a nivel de campo; sin embargo, se ha

24 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México usado con fines de investigación. En un estudio realizado en Brasil por Martins and Furlong (2001), una población de R. microplus presentó baja eficacia a la doramectina y los bovinos fueron tratados con ivermectina de larga acción. Catorce días después, el hato bovino fue inspeccionado y el control de las garrapatas fue insatisfactorio y se sospechó de resistencia a la ivermectina. Esta sospecha de resistencia fue confirmada usando la PIA.

Diagnóstico bioquímico

Actualmente se dispone de ensayos bioquímicos que pueden proporcionar información útil para identificar mecanismos de resistencia de garrapatas a los acaricidas, especialmente la resistencia asociada a las esterasas en R. microplus. Las esterasas son un grupo de enzimas importantes en el metabolismo de compuestos xenobióticos, y su mecanismo está asociado con la producción masiva de enzimas hidrolíticas y de secuestro en varias especies de insectos, incluyendo las garrapatas. Un método útil basado en la hidrólisis del acetato de alfa o beta-naptil fue propuesto por Hughes and Raftos (1985). Con la presencia de un reactivo apropiado, puede usarse un producto coloreado para cuantificar los niveles de esterasa, incluso en garrapatas individuales. Se obtienen mejores resultados cuando este método se combina con la separación electroforética de esterasas. Con este método se han identificado poblaciones de R. sanguineus y R. microplus (Jamroz et al., 2000; Miller et al., 2001) donde la sobreproducción de esterasas específicas, es el principal mecanismo de resistencia contra la permetrina.

También existen ensayos bioquímicos para cuantificar los niveles de actividad de otras enzimas tales como el citocromo P450. Estos ensayos han sido poco utilizados con garrapatas, y la mayoría de los informes de resistencia a base de citocromo P450 se han usado en estudios de sinergia con el butóxido de piperonilo. Otra enzima estudiada es la monooxigenasa que se ha asociado con la resistencia de R. microplus a los piretroides en México (Cossio-Bayugar et al., 2008).

Diagnóstico molecular

Los primeros marcadores genéticos para el diagnóstico de la resistencia a las garrapatas fueron desarrollados para los PS. Guerrero et al. (2001) desarrollaron una técnica de PCR-AE para diagnosticar la resistencia asociada a los piretroides en genes de R. microplus, identificando el alelo kdr en larvas de R. microplus, el cual permite la genotificación (RR, SR, SS) individual de las larvas. En estos ensayos cada larva es utilizada en dos reacciones, una para detectar la presencia del alelo susceptible “S” usando un iniciador específico y la segunda reacción para detectar el alelo “R” con un iniciador diferente y específico para este alelo. Posteriormente, los amplificados de 68 pb del PCR-AE son analizados por medio de electroforesis en gel de agarosa para determinar el genotipo de cada larva

25 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México como homocigoto susceptible (SS), heterocigoto susceptible resistente (SR) y homocigoto resistente (RR). En los últimos años nuevas técnicas moleculares como el uso de la PCR cuantitativa ha sido usada para identificar nuevas mutaciones en R. microplus asociadas a la resistencia a los PS. Esta PCR cuantitativa condujo al descubrimiento de dos polimorfismos en el dominio II, segmentos 4-5 de la región de unión del canal de sodio en R. microplus (Morgan et al., 2009; Jonsson et al., 2010). Asimismo mediante el uso de PCR cuantitativo Stone et al. (2014) estudiaron poblaciones de R. microplus de los EUA y México, encontrando polimorfismos que confieren resistencia en los dominios II y III del gen del canal para-sodio asociado con la resistencia a los PS.

Otra técnica molecular que se ha usado para la identificación de mutaciones asociadas a la resistencia de garrapatas a los acaricidas es la Pirosecuenciación, la cual es un método de tiempo real cuantitativo basado en la detección de pirofosfatos liberado durante la síntesis de la secuencia complementaria del producto de PCR (Lavebratt y Sengul, 2006). La ventaja del método de Pirosecuenciación® es que detecta en tiempo real el genotipo (alelo mutado) en vez de detectar la presencia o ausencia del amplicón como ocurre en la PCR-AE. Con este método de Pirosecuenciación®, Rodríguez-Vivas et al. (2011) secuenciaron el gen del canal de sodio de R. microplus asociado a la resistencia a los piretroides y pudieron identificar los nucleótidos mutados y silvestres de garrapatas estudiadas en ranchos bovinos de Yucatán, México. Los autores encontraron una buena concordancia (valor kappa 0.85) entre el método de Pirosecuenciación® para la identificación de alelos resistentes en larvas de R. microplus resistentes a la cipermetrina y una PCR-AE.

Estudios desarrollados en EUA, Brasil y México han demostrado que mutaciones puntuales en genes codificantes de enzimas se traducen en un aumento del metabolismo de degradación de acaricidas OF y PS (Baffi et al., 2008). Usando PCR convencionales y RFLP (Polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción) se ha podido identificar mutaciones en el gen Est9 de una carboxilesterasa R. microplus resistente a PS (Guerrero et al., 2002; Diaz y Vallejo, 2013).

El estudio del genoma y/o transcriptoma de R. microplus brinda la oportunidad de desarrollar nuevas pruebas diagnósticas para identificar otras enzimas tales como la citocromo P450, esterasas o glutatión-S-transferasas que muestran una mayor expresión génica en cepas de garrapatas resistentes.

En conclusión, existen distintas técnicas que pueden ser empleadas para realizar el diagnóstico de resistencia de las garrapatas hacia los principales productos comerciales, las cuales van desde las rápidas y sencillas (dosis discriminante) hasta las que involucrán metodologia y equipo más complejo (PCR-AE, Pirosecuenciación®). Estas técnicas pueden ser utilizadas dependiendo de las

26 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México condiciones de cada región y de las caracteristicas de los laboratorios, lo que sin duda es importante, es establecer protocolos que homologuen las técnicas existentes para poder conocer el estado real de la resistencia en diferentes regiones del pais. Independientemente de la técnica, es tambien importante contar con personal capacitado para realizarlas de manera segura y confiable.

Referencias

Baffi M, Rocha G, Ueira C, Soares C, Ceron C, Bonetti A (2008) Esterase enzymes involved in pyrethroid and organophospate resistance in a Brazilian population of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Mol Biochem Parasitol 160:70-73. Beugnet F, Chardonnet L (1995) Tick resistance in New Caledonia. Vet Parasitol 56:325–338. Cabrera–Jimenez D, Rodriguez–Vivas RI, Rosado–Aguilar JA (2008) Evaluación de la resistencia a la cipermetina en cepas de campo de Boophilus microplus obtenidas de ranchos bovinos del estado de Yucatán, México. Rev Mex Cien Pec 1:59–67. Castro SE, Granjeno CG, Lagunes QRE, Hernández OR (2017). Generación de una población de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus resistente a ivermectina, mediante presión química en bovinos infestados artificialmente. Mosqueda GJ, Aguilar TG, Hernández SY, Salinas EE. Editores. X Congreso Nacional de la Asociación Mexicana de Parasitólogos Veterinarios. Puebla, México agosto 9-11 agosto de 2017. pp. 237-241. Castro–Janer E, Rifran L, González P, Niell C, Piaggio J, Gil A, Schumaker TTS (2011) Determination of the susceptibility of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) to ivermectin and fipronil by larval immersion test (LIT) in Uruguay. Vet Parasitol 178:148–155. Cossio-Bayugar R, Miranda-Miranda E, Ortiz-Najera A, Neri-Orantes S (2008) Boophilus microplus pyrethroid resistance associated to increased levels of monooxygenase enzymatic activity in field isolated Mexican ticks. J Biol Sci 8:404 - 409. Diaz RR, Vallejo G (2013) Identificación de un polimorfismo del gen Est9 relacionado con resistencia a piretroides en Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Rev MVZ Córdoba 18(Supl):3708-3714. Drummond RO, Graham OH, Ernest SE (1967) Evaluation of insecticides for the control of Boophilus anunatus (Say) and Boophilus microplus (Canestrini) (Acarina: Ixodidae) on cattle. En: II International Congress on Acarology. Del 19 al 25 de Julio. Sotton Bonington, Inglaterra. pp. 493-498. FAO (1985) Food and Agriculture Organization of the United Nations. Ticks and tick-borne diseases control a practical field manual. FAO. Vol. pp. 1-10. FAO (1999) Food and Agriculture Organization of the United Nations. Standarization of diagnostic test. Sub-group 2. Adult immersion test (AIT).

27 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

The FAO working group and FAO/industry contact group on parasite resistance. Embrapa-Gado de Leite. Juis de For a M.G. Brazil. Pp. 6-12. FAO (2004) Food and Agriculture Organization of the United Nations. Guidelines resistance management and integrated parasite control in ruminants, Module 1:56. Guerrero FD, Davey RB, Miller RJ (2001) Use of an allele-specific polymerase chain reaction assay to genotype pyrethroid resistant strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J Med Entomol 38:44 - 50. Guerrero FD, Pérez de León A, Rodriguez–Vivas RI, Jonsson N, Miller RJ, Andreotti R (2014) Acaricide research and development, resistance and resistance monitoring. In: Biology of ticks. Sonenshine DE and Roe RR editors (2nd edition). Oxford University Press. New York. pp. 353–381. Guerrero FD, Li AY, Hernandez R (2002) Molecular diagnosis of pyrethroid resistance in Mexican strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J Med Entomol 39:770-776. Hughes PB, Raftos DA (1985) Genetics of an esterase associated with resistance to organophosphorus insecticides in the sheep blowfly, Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). B Entomol Res 75: 535-544. Jamroz RC, Guerrero FD, Pruett JH, Oehler DD, Miller RJ (2000) Molecular and biochemical survey of acaricide resistance mechanisms in larvae from Mexican strains of the southern cattle tick, Boophilus microplus. J Insect Physiol 46: 685-695. Jonsson NN, Cutullè C, Corley SW, Seddon JM (2010) Identification of a mutation in the para–sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus microplus associated with resistance to flumethrin but not to cypermethrin. Int J Parasitol 40:1659–1664. Jonsson NN, Miller RJ, Robertson JL (2007) Critical evaluation of the modified– adult immersion test with discriminating dose bioassay for Boophilus microplus using American and Australian isolates. Vet Parasitol 146:307– 315. Kemp DH, Thulner F, Gale KR, Nari A, Sabatini GA (1998) Acaricide resistance in the cattle ticks Boophilus microplus and Boophilus decoloratus. Report to the Animal Health Services. FAO. pp. 1-32. Klafke GM, Sabatini G, Albuquerque T, Martins JR, Kemp D, Miller RJ, Schumaker TT (2006) Larval immersion tests with ivermectin populations of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) from State of Sao Paulo, Brazil. Vet Parasitol 142(3–4):386-390. Lavebratt TC, Sengul S (2006) Single nucleotide polymorphism (SNP) allele frequency estimation in DNA pools using Pyrosequencing™. Nuture Protocols 1(6):2573-2582. Lovis L, Perret JL, Bouvier J, Fellay JM, Kaminsky R, Betscharta B, Sagerb H (2011) A new in vitro test to evaluate the resistance level against acaricides of the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Vet Parasitol 182:269-280.

28 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Martins J, Furlong J (2001) Avermectin resistance of the cattle tick Boophilus microplus in Brazil. Vet Rec 149:64. Miller RJ, George JE, Guerrero FD, Carpenter L, Welch JB (2001) Characterization of acaricide resistance in Rhipicephalus sanguineus (Latreille) (Acari: Ixodidae) collected from the Corazal Army Veterinary Quarantine Center, Panama. J Med Entomol 38:298-302. Morgan JAT, Corley SW, Jackson LA, Lew–Tabor AE, Moolhuijzen PM, Jonsson NN (2009) Identification of a mutation in the para–sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus associated with resistance to synthetic pyrethroid acaricides. Int J Parasitol 39:775-779. Perez–Cogollo LC, Rodriguez–Vivas RI, Ramirez–Cruz GT, Miller RJ (2010) First report of the cattle tick Rhipicephalus microplus resistant to ivermectin in Mexico. Vet Parasitol 168(1-2):165-169. Robertson JL, Russell RM, Priesler HK, Savin NE (2007) Bioassay with artropods, second edition. CRC Press, Boca Raton, USA. Robertson JL, Preisler HK (1992) Pesticide bioassays with arthropods. Boca Raton: CRC Press. Rodriguez–Vivas RI, Hodgkinson JE, Rosado–Aguilar JA, Villegas–Perez SL, Trees AJ (2012) The prevalence of pyrethroid resistance phenotype and genotype in Rhipicephalus (Boophilus) microplus in Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 184(2-4):221-229. Rodriguez–Vivas RI, Perez–Cogollo LC, Rosado–Aguilar JA, Ojeda–Chi MM, Trinidad–Martinez I, Miller RJ, Li, AY, Perez de Leon AA, Guerrero FD, Klafke GM (2014) Rhipicephalus microplus resistant to acaricides and ivermectin in cattle farms of Mexico. Braz J Vet Parasitol 23(2):113-122. Rodriguez-Vivas RI, Trees AJ, Rosado-Aguilar JA, Villegas-Perez SL, Hodgkinson JE (2011) Evolution of acaricide resistance: phenotypic and genotypic changes in field populations of Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to pyrethroid selection pressure. Int J Parasitol 41:895-903. Sabatini GA, Kemp DH, Hughes S, Nari A, Hansen J (2001) Test to determine LC50 and discriminating doses for macrocyclic lactones against the cattle tick, Boophilus microplus. Vet Parasitol 95:53-62. Santamaría VM, Soberanes CN (2001) Memorias del curso taller sobre diagnóstico de resistencia a ixodicidas en garrapatas Boophilus microplus. Del 26 al 28 de septiembre de 2001. Jiutepec, Morelos, México. pp. 1-40. Shaw RD (1966) Culture of an organophosphorus–resistant strain of Boophilus microplus (Can.) and an assessment of its resistance spectrum. Bull Ent Res 56:389-405. Stone BF, Haydock P (1962) A method for measuring the acaricides susceptibility of the cattle tick Boophilus microplus (Can.). Bull Entomol Res 53:563-578. White WH, Plummer PR, Kemper CJ, Miller RJ, Davey RB, Kemp DH, Hughes S, Smith II CK, Gutierrez JA (2004) An in vitro larval immersion microassay for identifying and characterizing candidate acaricides. J Med Entomol 41:1034- 1042.

29 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA RESISTENCIA A LOS PIRETROIDES EN LA GARRAPATA DEL GANADO Rhipicephalus microplus: ¿GENOTIPOS O FENOTIPOS?

Molecular diagnostic of pyrethroid resistance in the cattle tick Rhipicephalus microplus: Genotypes or Phenotypes?

1Rodrigo Rosario-Cruz, 1Delia Inés Domínguez-García, 2Fernando Torres-Agatón, 1Mireya Maruris Reducindo, 1Felix Torres Guzman.

1Unidad de Investigación en Biotecnología Salud y Ambiente (BioSA) de la ESCN de la UAGro. Av. Universidad S/N Carretera Nac. Chilpancingo-Petaquillas, Gro., Exrancho "El Shalako" Petaquillas, Guerrero, Mexico. CP. 39105. 2Escuela Superior de Medicina Veterinaria, Unidad Costa Grande, Tecpan de Galeana., Guerrero, Mexico. [email protected]

Resumen El canal de sodio dependiente del voltaje es el blanco molecular primario de los piretroides, los cuales actúan prolongando la apertura de los canales de sodio inhibiendo la activación e inactivación de las neuronas. El objetivo de este estudio fue evaluar la frecuencia de una mutación de punto en el gen del canal de sodio de Rhipicephalus microplus y determinar su asociación con la resistencia a piretroides en muestras de garrapatas R. microplus en 24 ranchos del Municipio de Coahuayutla, Guerrero, Méx. La resistencia a los piretroides (Py), Flumetrina (F), Cipermetrina (C) y Deltametrina (D) se determinó por bioensayo de dosis discriminante (DD) y se correlacionó con la frecuencia de alelos resistentes (R). El DNA de las larvas individuales de B. microplus de 24 ranchos se analizó por PCR y se demostró que la substitución de fenilalanina por isoleucina en el segmento 6 del dominio III (S6III), modifica la estructura el canal de sodio de R. microplus generando resistencia a los tres piretroides utilizados para el control de la garrapata. El rancho M2 se identificó como susceptible a los tres piretroides por DD con una mortalidad larval del 100% y obtuvo una frecuencia alélica del 4%. Los 23 ranchos restantes tuvieron una frecuencia alélica que oscilo desde un 28% hasta un 92%. De los 24 ranchos analizados por DD sólo uno se encontró susceptible (Py/00) 4.16% y 23 ranchos resistentes (Py/FDC) con un 95.84%. Se determinó una correlación estadística significativa entre la sobrevivencia de larvas y la frecuencia de alelos R: Flumetrina r2=0.398, (P<0.01), Deltametrina r2=0.380 (P<0.01) y Cipermetrina r2=0.322 (P<0.01), analizados con el programa estadístico SPSS ver.9.0 y se concluyó que en 23 ranchos las poblaciones de R. microplus tienen resistencia a flumetrina, cipermetrina y deltametrina y los 24 ranchos tienen frecuencias de alelos mutados que correlacionan significativamente con la resistencia medida por el LPT y sugieren que la resistencia a los piretroides es

30 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México recesiva.

Palabras clave: Canal de sodio; Rhipicephalus; Boophilus; Resistencia; Piretroides.

Introducción

La garrapata del ganado Rhipicephalus (Boophilus) microplus se encuentra ampliamente distribuida en las regiones tropicales de México y del mundo y es el mayor transmisor de enfermedades como babesiosis y anaplasmosis, por lo que causa grandes pérdidas económicas en los productores de bovinos en muchas partes del mundo (Soulsby, 1987).

Se han reportado poblaciones de garrapatas resistentes en varias regiones de México (Fragoso et al. 1995). La selección de resistencia en poblaciones de plagas es la principal amenaza contra la eficacia de los insecticidas de la familia de los piretroides para su control de en la agricultura y vectores de enfermedades animales y humanas (Soderlund y Knipple, 2003).

Los piretroides como acaricidas han sido ampliamente usados en R. microplus y son derivados sintéticos de toxinas que se encuentran en las flores de Chrysanthemum cinerariaefolium, que causan la muerte rápida y un efecto conocido como “Knockdown” (kdr) en muchos insectos (Vais et al. 2000; Soderlund y Knipple, 2003). Se conocen tres tipos de mecanismos de detoxificación del insecticida: Secuestro del insecticida, aumento en la degradación del insecticida y mutación del sitio blanco. Los sitios blancos para los diferentes insecticidas son: en los organofosforados es la acetilcolinesterasa, para los ciclodienos es el ácido γ–aminobutírico (GABA) y para los piretroides es el canal de sodio dependiente de voltaje (Oakeshott et al. 2003; Martín et al. 2000).

El blanco en los animales es a nivel nervioso, y en el canal de sodio dependiente del voltaje es donde afectan la cinética de activación e inactivación (Vais et al. 2000). Los piretroides y el DDT modifican los mecanismos del canal de sodio dependiente del voltaje prolongando la duración de la apertura del canal (Tan et al. 2005).

Diferentes estudios han descrito el polimorfismo de secuencias de aminoácidos del canal de sodio asociado a resistencia knockdown (kdr) en Anopheles gambiae, Bemisia tabaci, Blattella germanica, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Culex pipiens, Drosophila melanogaster, Helicoverpa armigera, Heliothis virescens, Haematobia irritans, Leptinotarsa decemlineata, Musca doméstica, Myzus persicae, Pediculus capitis y Plutella xylostella, (Soderlund y Knipple, 2003; Diabate et al. 2003; Park et al. 2000; Lee et al. 2000).

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Estos hallazgos indican claramente que este mecanismo de resistencia resulta de un sitio blanco insensible, específicamente como resultado de cambios en la estructura del canal de sodio. También confirma que los canales de sodio son el sitio primario de acción de los piretroides (Lee et al. 1999).

Actualmente el método más rápido para identificar la resistencia de la garrapata R. microplus a los acaricidas aprobado por la FAO, es la prueba de paquete de larvas (PL), la cual tarda más de seis semanas en su realización, es poco sensible y requiere una gran cantidad de material biológico. Sin embargo, estas pruebas no revelan ninguna información de la genética de las garrapatas resistentes y no pueden detectar la resistencia en sus primeras etapas de desarrollo y requiere de días o semanas antes que los resultados sean determinados.

La aplicación de las técnicas de Biología Molecular ha permitido un incremento en las investigaciones en muchos diferentes canales, incluyendo el canal de sodio dependiente del voltaje. La importancia biológica de estos sitios, los hace un sitio blanco para toxinas producidas por animales, plantas y sustancias que modulan su función. Por lo que se requiere probar ensayos que puedan determinar la resistencia de la garrapata R. microplus a piretroides en un día y con una sola garrapata para su posible uso en la medicina veterinaria o como herramienta en el estudio de esas moléculas. Por otra parte, hay una necesidad urgente de extender programas de manejo para ayudar a los productores de ganado con métodos efectivos para el control de garrapata y para mejorar el acceso a servicios de diagnóstico de resistencia a acaricidas en áreas de alto riesgo en México.

Materiales y Métodos

Determinación del tamaño de muestra y colecta de garrapatas.

El Municipio de Coahuayutla, Gro. Méx., tiene 107 ranchos con un número de cabezas de ganado en un rango de 20-50, y un total de 3,457 cabezas de ganado. Para determinar el número de los ranchos muestreados se utilizó el programa Win Episcope 2.0. Considerando para la determinación una prevalencia esperada del 50% y un nivel de confianza del 90%, La estimación del tamaño de muestra fue de 24 ranchos. De los cuales se colectaron 30 garrapatas hembras ingurgitadas de diferentes animales en cada rancho. Las garrapatas se transportaron al Laboratorio de Artropodología del CENID-PAVET en Jiutepec, Morelos, las garrapatas ingurgitadas se colocaron en cajas de Petri y se incubaron a 28 ºC con un 85% de humedad relativa. Después de la oviposición se colectaron y pesaron los huevos, colocando 1 g de huevo en un vial haciendo dos replicas por rancho. A los viales con los huevos se les colocaron tapones de algodón y se incubaron nuevamente hasta la eclosión de las larvas.

Una alicuota de las larvas fue para el análisis toxicológico y el otro se congeló a - 70°C para el análisis de DNA por medio de PCR.

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Prueba de paquete de larvas.

La prueba de paquete de larvas se realizó en el laboratorio de Pruebas Biológicas del SENASICA-SAGARPA, en Jiutepec, Mor. Para los ensayos toxicológicos, se utilizaron aproximadamente 100 larvas de R. microplus de 10 días de edad, y a cada una de las cepas se les realizó la prueba de paquete de larvas (PL) (Stone y Haydock, 1962) impregnadas con ixodicidas piretroides. Los paquetes se incubaron a 28 ºC con una humedad relativa de 85%. La concentración de dosis discriminante utilizada fue: flumetrina 0.01%, deltametrina 0.09% y cipermetrina 0.5%; 0.67 ml de cada stock se adicionó a cada paquete de papel filtro (Santamaría, 1992).

Clasificación toxicológica de la resistencia.

Las muestras fueron clasificadas con base en su respuesta toxicológica mediante la siguiente nomenclatura: Py/F-D-C, en donde Py representa a la familia de los piretroides separada por una diagonal de las letras F (flumetrina) D (deltametrina) y C (cipermetrina), estas últimas separadas por un guión, cuando hay una resistencia a más de un compuesto de la misma familia.

Obtención del DNA genómico.

El DNA se purificó de 25 larvas de cada muestra que previamente habían sido congeladas. Se transfirieron a una caja de Petri sobre hielo seco y se colocaron individualmente en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml. conservados en hielo seco. Usando un pistilo se maceró la larva contra la pared del tubo por aproximadamente 20 segundos, garantizando que la larva se fragmentara y se le adicionó 20 μl de buffer (Tris 100 mM, pH 8.3, 500 mM KCl). El tubo setransfirió inmediatamente al hielo seco. El contenido del tubo se centrifugó brevemente para asegurar que el líquido y el macerado de la larva hicieran un botón en el fondo del tubo. Se colocó el tubo en agua hirviendo por 3 minutos. Después se enfrió y utilizó 1μl para la reacción de PCR.

Tamaño de muestra para el análisis de DNA.

Para este estudio se tomaron al azar un promedio de 18 a 25 larvas individuales de cada uno de los 24 ranchos del Municipio de Coahuayutla, Gro. Una vez obtenido el DNA se tomaron dos muestras por cada tubo, una para identificar el alelo resistente y otra para identificar el alelo susceptible por lo que se utilizaron 1,130 muestras para el análisis de PCR de acuerdo con la metodología descrita por Guerrero et al., (2001).

Ensayos de PCR. El PCR se realizó en tubos de microcentrífuga para la reacción óptima de 25-μl. La

33 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México reacción óptima final de DNA genómico fue de 1μl de una sola larva, 200 μM de dNTPs, 1 μM de primers FG-227 5´-TTGTTCATTGAAATTGTCGA-3´ (antisentido no específico) diseñados para amplificar ambas cepas (sensibles y resistentes) y el FG-221 5´-TTATCTTCGGCTCCTTCT-3´(sentido susceptible específico) para identificar la identidad del nucleótido variante y para identificar el alelo resistente se utilizó el sentido resistente específico FG-222 5´-TTATCTTCGGCTCCTTCA-3´, 3 mM de MgCl2, 0.5 unidades de Taq Polimerasa en un volumen total de 25 μl.

La amplificación se llevó a cabo en un Termociclador (MJ Research, Watertown, MA) programado a 96º C por 2 min., seguido por 37 ciclos, cada uno consiste en desnaturalización a 94º C por 1 min., acoplamiento a 60º C por 1 min. y extensión a 72º C por 1 min. El programa también incluye un paso final de extensión a 72º C por 7 min. Los productos de la reacción fueron fraccionados en gel de agarosa al 2.5% en TBE. Los geles con DNA se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron por iluminación ultravioleta (Guerrero et al., 2001). Se correlacionó la sobrevivencia de las larvas respecto a los acaricidas con la frecuencia de alelos por medio del análisis de correlación lineal simple con el programa estadístico SPSS ver.9.0.

Resultados.

Los piretroides son ampliamente usados para el control de plagas importantes en la agricultura y la medicina. Debido al intenso uso de los piretroides diversas especies han desarrollado resistencia a estos compuestos. El mecanismo de resistencia más conocido hacia los piretroides es la presencia de una mutación de punto en el canal de sodio, esta mutación produce un cambio en la secuencia de aminoácidos en el canal y se sabe que varias mutaciones que ocurren en él son las responsables de la resistencia a los piretroides. La mutación más común es la leucina (L) por fenilalanina (F) o histidina (H) por serina (S) en el dominio II del segmento 6 (IIS6) (Dong, 2002).

De las 24 poblaciones analizadas en este estudio, la respuesta fenotípica de las larvas evaluadas por el bioensayo de paquete de larvas correlacionó significativamente con la prueba de PCR, detectando la presencia de una mutación en el canal de sodio de B. microplus. Por lo que la genotipificación de larvas individuales resistentes y sensibles a piretroides evaluadas por el ensayo de PCR, detectaron la presencia de individuos resistentes y sensibles conteniendo la alteración en el canal de sodio en las muestras obtenidas del Municipio de Coahuayutla, Gro. Méx. (Tabla 1), mecanismo involucrado en la resistencia de las garrapatas y que se correlaciona tanto con estudios realizados en insectos, como con la presencia de la mutación y la resistencia a piretroides encontrado por Rosario-Cruz y colaboradores (2005).

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Discusión y conclusiones

He y colaboradores (1999), identificaron una mutación de punto en el dominio IIIS6 del canal de sodio la cual se encuentra en cepas de garrapatas B. microplus y actualmente se ha encontrado ampliamente distribuida en cepas de campo, identificándose como responsable de la resistencia a los tres piretroides usados como acaricidas (Rosario-Cruz et al. 2005). Varias mutaciones de punto en el gen del canal de sodio están asociadas con la resistencia tipo Kdr y super- Kdr (Guerrero et al. 2001). El establecimiento de 2 mutaciones dentro de una población probablemente sea un proceso secuencial.

Probablemente la frecuencia de la mutación Kdr en el alelo del canal de sodio esta necesariamente antes de que una mutación pueda ocurrir en el sitio super-Kdr en el mismo alelo (Jamroz et al., 1998). La insensibilidad del sitio blanco causado por la presencia de una mutación en el canal de sodio diferente a la mutación tipo kdr ha demostrado estar fuertemente asociada con la resistencia a piretroides en B. microplus (Rosario-Cruz et al. 2005). Mutaciones de las posiciones homologas, en el dominio II, pero de diferentes residuos (leucina a fenilalanina) han sido reportadas para resistencia a piretroides en M. domestica (Williamson et al. 1996), R. microplus (He et al. 1999), C. pipiens (Martínez-Torres et al. 1999), M. persicae, D. melanogaster, H. armigera, H. virescens, H. irritans, L. decemlineata, P. capitis, A. gambiae, P. xylostella, (Soderlund y Knipple, 2003; Diabate et al. 2003; Park et al. 2000; Lee et al. 2000; Jamroz et al.1998).

En nueve poblaciones estudiadas en el Estado de Yucatán, se encontró una alta frecuencia en las mutaciones de canal de sodio detectadas por PCR en cepas resistentes a piretroides (Rosario-Cruz et al. 2005).

En cepas del escarabajo Colorado de la papa (CPB) Leptinotarsa decemlineata, se ha correlacionado la sustitución de un solo aminoácido L1014F que confiere resistencia en cepas resistentes a permetrina, esta misma mutación se encontró en el gen Kdr de la Musca domestica correspondiente a fenilalanina o menos común L1014H a quien también le confiere resistencia a piretroides en poblaciones de Heliothis virescens (Park et al. 2000). La insensibilidad a cipermetrina en una cepa de cucarachas Blatella germanica se debe a la mutación de L993P asociada con la resistencia knockdown (Kdr) (Valleset al., 2000). En Heliothis virescens F. dos mutaciones están asociadas con la resistencia a piretroides en el gene del canal de sodio V421M en el IS6 y L1029H en el IIS6 (Park et al. 2000). Las mutaciones kdr y super-kdr en Musca doméstica y otros insectos confieren resistencia a deltametrina de 30 a 500 veces la dosisletal de una cepa susceptible, ellas corresponden a una (L1014F) y dos mutaciones (L1014F+M918T) en el segmento IIS6 y II(S4-S5) de los canales de sodio (Vais et al. 2000). En Blatella germanica tres mutaciones L993F, E434K y C764R reducen la sensibilidad del canal a deltametrina por 500 veces (Tan et al. 2002). En Drosophila sp. utilizando deltametrina, las mutaciones en el canal de sodio

35 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México reducen la afinidad por apertura del canal de 20 a 100 veces. Las mutaciones super kdr reducen el número de sitios de enlace por canal de 2 a 1, y la potencia y eficacia de acción del insecticida (Vais et al. 2000). En Myzus persicae resistente a piretroides, se han identificado dos mutaciones que reducen la sensibilidad del canal de sodio (Kdr) L1014F y (super-Kdr) M918T (Anstead et al. 2005). Se identificaron dos mutaciones en el IIS4-5 en Bemisia tabaci, más de 100 veces resistente a piretroides, con la sustitución de aminoácidos metionina por valina (M918V) y leucina por isoleucina (L925I) (Morin et al. 2002).

A partir de los resultados del presente estudio se concluye que: a) La resistencia de las garrapatas a los piretroides flumetrina, deltametrina y cipermetrina (Py/FDC) fue de un 95.84% en 23 de los ranchos y solo un 4.16% correspondiente a un solo rancho susceptible, presente en las poblaciónes de R. microplus lo que indica que el principal problema de resistencia en el Municipio de Coahuayutla, Guerrero, es la resistencia a la familia de los piretroides probablemente debida a la presión de selección causada por el uso contínuo de esas moléculas en los ranchos. b) El ensayo de PCR demostró ser una herramienta útil para la detección del alelo que contiene la mutación en el segmento transmembranal S6 del dominio III del canal de sodio (IIIS6), y para la genotipificación de la resistencia a los piretroides en poblaciones de campo. c) La presencia de la mutación de punto en el IIIS6 de R. microplus mostró una correlación altamente significativa (p<0.01) con la resistencia a flumetrina, deltametrina y cipermetrina, cuando se evaluó la sobrevivencia obtenida de los bioensayos y la frecuencia de los genotipos RR+RS (p<0.01), además esta mutación en todos los casos produce resistencia contra los tres piretroides utilizados actualmente como acaricidas (p<0.01). d) Los resultados obtenidos en este trabajo indican la necesidad de realizar monitoreos para determinar los niveles de resistencia en poblaciones de R. microplus y hacer un buen uso de esquemas de rotación de acaricidas y sugieren que la mutación en el gen del canal de sodio que confiere resistencia a los piretroides se comporta de manera recesiva.

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Tabla 1. Resultados del bioensayo de paquete de larvas y de la genotipificación de garrapatas R. microplus colectadas en ranchos de Coahuayutla, Guerrero.

Referencias

Aguirre, E.J., V.M. Santamaría, 1986. Purificación y caracterización toxicológica de garrapatas Boophilus microplus resistentes a ixodicidas organofosforados y organoclorados. VII Reunión Anual Asociación Mexicana de Parasitología Veterinaria, A.C. Cd. Victoria, Tamaulipas. Almazán, C., M.K. Tocan, K.D. Bergman, C.J. García-García, F.E. Blouin and J. de la Fuente. 2003. Characterization of genes transcribed in an Ixodes scapularis cell line that were identified by expression library immunization and analysis of expressed sequence tags. Gene Ther. Mol. Biol. 7: 43-59. Anstead, J.A., M.S. Williamson and I. Denholm. 2005. Evidence for multiple origins of identical insecticide resistance mutations in the aphid Myzus persicae. Insect. Biochem. Mol. Biol. 35:249-56. Barker, S.C. and A. Murrell. 2004. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names. Parasitology, 129, S15–S36. Bloomquist, J.R. 1996. Insecticidas: Químicas y Características. Universidad de Minesota. http://ipmworld.umn.edu/cancelado/Spchapters/BloomquistSp.htm Casida, J.E and G.B. Quistad. 1998. Golden age of insecticide research: Past, Present, or Future? Ann. Rev. Entomol. 43: 1-16. Denac, H., M. Mevissen and G. Scholtysik. 2000. Structure, function and pharmacology of voltage-gated sodium channels. Naunyn-Schmiedeberg’s

37 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Arch Pharmacol. 36: 453–479 Diabate, A., T. Baldet, Ch. Chandre, D.K. Roch, K. Pierre, G.T. Robert, S. Federic, G. Pierre, H. Janet and H.J. Marc 2003. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J. Med. Entomol. 40: 195-198. Dong, K. 2002. Voltage-gated sodium channels as insecticide targets. In: Chemistry of crop protection: progress and prospects in science and regulation. pp.167-176. eds G. Voss and G. Ramos. Fragoso, S.H., C.N. Soberanes, E.M. Ortiz, V.M. Santamaría and N.A. Ortiz. 1995. Epidemiology of Ixodicide resistance in the Boophilus microplus tick in Mexico. In: Proceedings, III Seminario Internacional de Parasitología Animal. Acapulco, Guerrero, Mexico. 45 -57. Fragoso, H.S., C.N. Soberanes. 2001. Control de la resistencia a los ixodicidas a la luz de los conocimientos actuales. XXV Congreso Nacional de Buiatria. Veracruz, México. 40 -48. George, J. E. 2003. Present and Future Technologies for Tick Control. Ann. NY Acad. Sci. 583 -588. Groeters, F.F. and E: B. Tabashnik. 2000. Roles of selection intensity, mayor genes, and minor genes in evolution of insecticide resistance. J. Econ. Entomol. 93: 580-1587. Guerrero, F.D., R.B. Davey and R.J. Miller. 2001. Use of an allele-specific polymerase chain reaction assay to genotype pyrethroid resistan strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 38: 44-50. He, H., A.C. Chen, R.B. Davey, G.W. Ivie and J.E. George. 1999. Identification of a point mutation in the para type sodium channel gene from a pyrethroid resistant cattle tick. Biochem. Biophys .Res. Com. 261:558-561.

Jamroz, R.C., F.D. Guerrero, D.M. Kammlah and S.E. Kunz. 1998. Role of kdr and super kdr sodium channel mutations in pyrethroid resistance: correlation of allelic frecuency to resistance level in wild and laboratory populations of horn flies (Haematobia irritans). Insect. Biochem. Mol. Biol. 28: 1031-1037. Lee, S.H., K.S. Yoon, M.S. Williamson, S. J. Goodson, M.T.Lee, J. D. Edman, A. L. Devonshire and J.M. Clark. 2000. Molecular analisis of kdr-like resistance in permethrin-resistan strains of head lice, Pediculus capitis. Pestic. Biochem. Physiol. 66: 130-143. Lee, S.H., J.B. Dunn, J.M. Clark and D.M. Soderlund. 1999. Molecular analysis of kdr-like resistance in a permethrin-resistan strain of Colorado potato beetle. Pestic. Biochem. Physiol. 63: 63-75. Li, A Y., R. B. Davey, R.J. Miller and J. E. George. 2003. Resistance to coumaphos and diazinon in Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and evidence for the involvement of an oxidative detoxification mechanism. J. Med. Entomol. 40: 482-490. Martin, R.L., B. Pittendrigh, J. Liu, R. Reenan, R. Ffrench-Constant, D.A. Hanck. 2000. Point mutations in domain III of a Drosophila neuronal Na cannel

38 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

confer resistance to allethrin. Insect. Biochem. Mol. Biol. 30:1051–1059. Martinez-Torres, D., C. Chevillon, A, Brun-Barale, J.B. Bergé, N. Pasteur and D. Pauron.1999. Voltage-dependent Na+ channels in pyretroid resistant Culex pipiens L mosquitoes. Pestic. Sci. 55:1012-1020. Morin, S., M.S. Williamson, S.J. Goodson, J.K. Brown, B.E. Tabashnik and T.J. Dennehy. 2002. Mutations in the Bemisia tabaci para sodium channel gene associated with resistance to a pyrethroid plus organophosphate mixture. Insect. Biochem. Mol. Biol. 32: 1781-91, Muller P. 1989. Insecticide resistance in the Musca domestica populations of the GDR 1976-1988. Angew. Parasitol. 30: 145-54. Núñez, J. L., C.M. Muñoz y H. L. Moltedo. 1982. Boophilus microplus: la garrapata común del ganado vacuno: Hemisferio Sur. Buenos Aires, Argentina. p. 84. Oakeshott, J.G., I. Horne, T.D. Sutherland and R.J. Russell. 2003. The genomics of insecticide resistance. Gen. Biol. 4:202. Park, Y., D. Lee, M.F.J. Taylor, J.W. Holloway, J.A. Ottea, M.E. Adams and R. Feyereisen. 2000. Mutation Leu 1029 to His in Heliothis virescens F. hscp sodium channel gene associated with a nerve-insensitivity mechanism of resistance to pyrethroid insecticides. Pestic. Biochem. Physiol. 66: 1–8. Quiroz, R.H. 1991. Situación actual de la problemática de las garrapatas. Segundo Seminario Internacional de Parasitología Animal. Garrapatas y enfermedades que transmiten. Morelos, México. 3-7. Richmond, J. E., D. E. Featherstone, H. A. Hartmann and P.C. Ruben. 1998. Slow inactivation in human cardiac sodium channels. Biophys J. 74: 2945–2952. Rodríguez, V.R.I., A.L.J. Vivas Domínguez. 1998. Grupos entomológicos de importancia veterinaria en Yucatán, México. Rev. Biomed. 9:26-37. Rosario-Cruz, R., F.D. Guerrero, R.J. Miller, R.I. Rodriguez-Vivas, D. I. Domínguez-Garcia, A.J. Cornel, R. Hernández-Ortiz and J.E. George. 2005. Roles played by esterase activity and by a sodium channel mutation involved in pyrethroid resistance in populations of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) collected from Yucatán, México. J. Med. Entomol. 42: 1020-1025. SPSS Inc. 1999. User´s manual, version 9.0. SPSS Inc. Chicago, Il. Santamaría, V.M. 1992. Determinación de la dosis discriminante a tres piretroides sintéticos en la cepa Boophilus microplus susceptible CENAPA. II Congreso Nacional de Parasitología. 2-4 de abril de 1992. Veracruz, México. Soderlund, D.M., and D.C., Knipple. 2003. The molecular biology of knockdown resistance to pyrethroid insecticides. Insect. Biochem. Mol. Biol. 33: 563- 577. Smith, T.J and D.M. Soderlund. 2001. Potent actions of the pyrethroid insecticides cismethrin and cypermethrin on rat tetrodotoxin-resistant peripheral nerve (SNS/PN3) sodium channels expressed in Xenopus Oocytes. Pestic. Biochem. Physiol. 70: 52–61. Soulsby, E.J.L. 1987. Parasitología y enfermedades parasitarias de los animales

39 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

domésticos. Interamericana. México. Stone, B.F., K.P Haydock. 1962. A method for measuring the acaricide susceptibility of the cattle B. microplus (can.) Bull. Entomol. Res. 53:563- 78. Tan, J., Z. Liu, R Wang, Z. Y. Huang, A. C. Chen, M. Gurevitz and K. Dong. 2005. Identification of amino acid residues in the insect sodium channel critical for pyrethroid binding. Mol. Pharmacol. 67:513-522. Tan, J., Z. Liu, T.D. Tsai, S.M. Valles, A.L. Goldin and K. Dong. 2002. Novel sodium channel gene mutations in Blatella germanica reduce the sensitivity of expressed channels to deltamethrin. Insect. Biochem. Mol. Biol. 32: 445-54 Tessier, J. 1983. Monograph Deltametrrhin, by Roussel UCLF, 1. Vais, H., S. Atkinson, N. Eldursi, A.L. Devonshire, M.S. Williamson and P.N.R. Usherwood. 2000a. A single amino acid change makes a rat neuronal sodium channel highly sensitive to pyrethroid insecticides. FEBS Letters 470: 135:138. Vais, H., M.S. Williamson, S.J. Goodson, A.L. Devonshire, J.W. Warmke, P.N. Usherwood and C.J. Cohen. 2000b. Activation of Drosophila sodium channels promotes modification by deltamethrin. Reductions in affinity caused by knock-down resistance mutations. J. Gen. Physiol. 115: 305-18. Valles, S.M., K. Dong and R.J. Brenner. 2000. Mechanisms responsible for cypermethrin resistance in a strain of German cockroach, Blattella germanica. Pestic. Biochem. Physiol. 66:195-205. Villarino, M.A., G.G. Wagner and J.E. George. 2002. In vitro detection of acaricida reisistance in Boophilus microplus (Acari:Ixodidae). Exp. Appl. Acarol. 28:265-271. Wang, X., M. Connor, D. Wilson, I.H. Wilson, M.G Nicholson, R.Smith, D.Shaw, J.P. Mackay, P.F. Alewood, M.J Christie and G.F. King. 2001. Discovery and structure, of a potent and highly specific blocker of insect calcium channels. J. Biol. Chem. 276: 40306-40312. Waxman, S.G. 2002. Sodium channels as molecular targets in multiple sclerosis. J. Rehabil. Res. Dev. 39: 233-242. Williamson, MS., D.T. Martinez, A.C. Hick and L.A. Devonshire. 1996. Identification of mutations in the housefly para-type sodium channel gene associated with knockdown resistance (kdr) to pyrethroid insecticides. Mol. Gen. Genet. 252: 51-60. Win Episcope 1998, v. 2.0. http://www.clive.ed.ac.uk/winepiscope/

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RESPUESTA TOXICOLÓGICA Y MOLECULAR DE Rhipicephalus microplus, R. sanguineus y Amblyomma mixtum A LOS ACARICIDAS CONVENCIONALES Y LACTONAS MACROCÍCLICAS EN MÉXICO

TOXICOLOGICAL AND MOLECULAR RESPONSE OF Rhipicephalus microplus, R. sanguineus AND Amblyomma mixtum TO CONVENTIONAL ACARICIDES AND MACROCICLIC LACTONES IN MEXICO

Rodríguez-Vivas RI1*, Rosado-Aguilar JA1, Ojeda-Chi MM1, Trinidad-Martínez I1, Alonso-Díaz MA2, Aguilar-Tipacamú G3, Ojeda-Robertos NF4, Pérez de León AA5

1Laboratorio de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Yucatán. 2Centro de Enseñanza Investigación y Extensión en Ganadería Tropical, FMVZ de la Universidad Nacional Autónoma de México. 3Facultad de Ciencias Naturales. Universidad Autónoma de Querétaro. 4División Académica de Ciencias Agropecuarias, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. 5USA-USDA–ARS Knipling–Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory and Veterinary Pest Genomics Center.

Resumen

Se presentan los avances en el conocimiento de la respuesta toxicológica y molecular de Rhipicephalus microplus, Amblyomma mixtum (antes denominada A. cajennense) y Rhipicephalus sanguineus sensu lato a los acaricidas convencionales y lactonas macrocíclicas (LM) en México. R. microplus y A. mixtum son las garrapatas más importantes que afectan al ganado bovino, ya que ambas especies producen pérdidas relacionadas con mortalidad de los animales, reducción en los niveles de producción, alteraciones reproductivas, altos costos de control y enfermedades que transmiten. R. sanguineus s.l. además de afectar la salud de los perros, es capaz de transmitir agentes infecciosos a los animales y al humano. Para el control de estas tres especies de garrapatas se han usado acaricidas y LM. Sin embargo el uso frecuente e irracional de estos productos químicos ha favorecido la generación de poblaciones de garrapatas resistentes. En México las tres especies de garrapatas presentan resistencia a la mayoría de los acaricidas e ivermectina que existen a nivel comercial. El problema de resistencia se presenta con mayor frecuencia en R. microplus; sin embargo, la resistencia de R. sanguineus y A. mixtum ha sido documentada en los últimos años. Los reportes de resistencia de estas tres especies de garrapatas a los acaricidas y LM reflejan la gravedad de la situación de la resistencia y la importancia de establecer estrategias de manejo de manera sustentable, mediante

41 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México el uso de métodos químicos y no químicos que contribuyan a prolongar la vida útil de los acaricidas convencionales y LM.

Palabras clave. Resistencia, acaricidas, ivermectina, Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma mixtum

Introducción

Rhipicephalus microplus y Amblyomma mixtum (antes denominada A. cajennense) son las garrapatas más importantes que afectan al ganado bovino de México, ya que ambas especies producen pérdidas relacionadas con mortalidad de los animales, reducción en los niveles de producción, alteraciones reproductivas, altos costos de control y enfermedades que transmiten (Rodríguez-Vivas et al., 2014a). R. microplus es responsable de trasmitir Anaplasma marginale, Babesia bovis y B. bigemina produciendo en los animales cuadros clínicos de anemia que en muchos casos les conduce a la muerte. Asimismo, A. mixtum se ha reportado como vector de agentes tales como Rickettsia honei y R. rickettsii (Labruna, 2009) que afectan distintas especies animales incluyendo al humano. Rhipicephalus sanguineus s. l. además de afectar la salud de los perros y otros animales, es vector de varios agentes tales como Coxiella burnetii, Ehrlichia canis, Rickettsia conorii y R. rickettsii que pueden ser zoonóticos (Rodriguez-Vivas et al., 2016a).

El método más usado para el control de garrapatas ha sido la aplicación de acaricidas convencionales y lactonas macrocíclicas (LM). Sin embargo, su uso frecuente e irracional ha favorecido la aparición de poblaciones de garrapatas resistentes a estos productos químicos. En México, R. microplus es la garrapata que afecta al ganado bovino y presenta resistencia a la gran mayoría de los acaricidas y LM que existen a nivel comercial tales como los organofosforados (OF), piretroides sintéticos (PS), amitraz, fipronil e ivermectina (Rodriguez-Vivas et al., 2014a). Asimismo, A. mixtum ha sido reportada tolerante o resistente a clorpirifos, coumafos, deltametrina, diazinón y amitraz (Martínez-Ibañez et al., 2010; Alonso-Diaz et al., 2013).

Recientemente, Rodriguez-Vivas et al. (2016b) reportaron en México poblaciones de R. sanguineus s.l. resistentes a amitraz y cipermetrina. El primer reporte mundial de R. sanguineus s.l. resistente a ivermectina fue realizado por Rodriguez-Vivas et al. (2017) en Yucatán, México.

La resistencia genotípica de garrapatas hacia los acaricidas y LM ha sido estudiada principalmente en R. microplus. Se han identificado varias mutaciones en diferentes genes del sitio blanco de los químicos que se asocian a la resistencia fenotípica. Estas mutaciones han sido identificadas en los canales de sodio (PSs, Rosario-Cruz et al., 2005, 2009; Rodriguez-Vivas et al., 2011, 2012), gen que codifica la acetilcolinesterasa (AChE) (OFs, Temeyer et al., 2007),

42 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México receptores de la octopamina (amitraz, Corley et al., 2012), canales del cloro-ácido gama-aminobutírico (GABA) (dieldrin, fipronil, fluralaner, Ozoe et al., 2010), así como los receptores cloro-glutamato (GluCl) (ivermectina, Kwon et al., 2010).

En México, los reportes de resistencia de R. microplus, A. mixtum y R. sanguineus resistentes a los acaricidas y LM reflejan la gravedad de la situación de la resistencia y la importancia de establecer estrategias de manejo de manera sustentable, mediante el uso de métodos químicos y no químicos que contribuyan a prolongar la vida útil de los acaricidas convencionales y LM.

El objetivo del presente artículo es presentar los avances en el conocimiento de la respuesta toxicológica y molecular de R. microplus, R. sanguineus y A. mixtum a los acaricidas convencionales y LM en México.

Respuesta toxicológica de R. microplus, R. sanguineus y A. mixtum a los acaricidas convencionales y LM

Resistencia de R. microplus a los acaricidas e ivermectina

En México, R. microplus ha desarrollado resistencia a las principales clases de acaricidas debido a su uso intensivo en décadas pasadas (Rodríguez-Vivas et al., 2014a). La resistencia a los acaricidas OF se desarrolló por primera vez en la década de los 80s, y la resistencia a los PS surgió en los años 90s. En 1986 el amitraz fue introducido junto con los PS para controlar las garrapatas resistentes a los OF. Inicialmente, el amitraz no fue ampliamente utilizado, debido a su elevado costo, pero su uso se incrementó después de 1983, cuando se detectaron los primeros casos de resistencia a los PS (Fragoso-Sanchez et al., 2011). El primer caso en México de resistencia de R. microplus a amitraz se detectó en 2001 en un rancho en el estado de Tabasco (Soberanes et al., 2002). Asimismo, el primer reporte de R. microplus resistente al fipronil fue realizado por Miller et al. (2013) en ranchos del norte del país. Hoy en día existen reportes de resistencia al fipronil en los estado de Yucatán y Tabasco (Rodríguez-Vivas et al., 2014a).

En diferentes estudios realizados en el sureste de México, Rodríguez-Vivas et al. (2007) estudiaron 217 poblaciones de R. microplus y estimaron la prevalencia de ranchos resistentes a PS, OF y amitraz, encontrando que la resistencia a deltametrina, cipermetrina y flumetrina era uno de los problemas más graves en el trópico mexicano (66-96% de ranchos resistentes a los PS). Asimismo, Rodríguez- Vivas et al. (2006) estudiaron 98 poblaciones de R. microplus en Yucatán, México y encontraron que 63, 61 y 59% de esas poblaciones de garrapatas eran resistentes a flumetrina, deltametrina y cipermetrina, respectivamente.

Pérez-Cogollo et al. (2010a) reportaron por primera vez en México la presencia de poblaciones de R. microplus resistentes a la ivermectina en Yucatán, México. Posteriormente, Pérez-Cogollo et al. (2010b) realizaron un estudio para evaluar el

43 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México nivel de resistencia de 30 poblaciones de campo de R. microplus a la ivermectina en ranchos bovinos con historia de uso de LM en Yucatán, México. Los autores encontraron que las poblaciones de campo de R. microplus presentaban diferentes niveles de resistencia a la ivermectina, con índices de resistencia (IR) de 1 a 10.2. En otro estudio realizado por Fernández-Salas et al. (2012a), determinaron el estado de resistencia o susceptibilidad a la ivermectina en 53 poblaciones de R. microplus obtenidas del estado de Veracruz. Los autores identificaron 13 poblaciones de garrapatas susceptibles a la ivermectina, 22 resistentes y 18 con resistencia incipiente. En este estudio se demostró que los ranchos que usan ≥ 4 veces LM al año tienen 13 veces más de probabilidad de tener garrapatas resistentes a la ivermectina. Reportes seleccionados de resistencia de R. microplus a los acaricidas e ivermectina en México se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Reportes de resistencia de R. microplus a los acaricidas e ivermectina en México.

Autor Acaricida Prueba Ortiz et al. (1995) Dieldrin, lindano, coumafos, diazinón, Paquete de larvas dioxatión, dimetoato, etión, cipermetrina, deltametrina, cipermetrina Soberanes et al. (2002) Amitraz Inmersión de larvas Li et al. (2004) Carbaril Paquete de larvas Rodriguez–Vivas et al. (2006a) Diazinón, coumafos, clorfenvinfos Paquete de larvas Flumetrina, deltametrina, cipermetrina Inmersión de larvas Rodriguez–Vivas et al. (2006b) Amitraz Inmersión de larvas Rodriguez–Vivas et al. (2007) Diazinón, coumafos, clorfenvinfos, Paquete de larvas Flumetrina, deltametrina, cipermetrina Inmersión de larvas Rosado–Aguilar et al. (2008) Amitraz Inmersión de larvas Pérez–Cogollo et al. (2010a) Ivermectina Inmersión de larvas Pérez–Cogollo et al. (2010b) Ivermectina Inmersión de larvas Rodriguez–Vivas et al. (2011) Cipermetrina Paquete de larvas Olivares–Pérez et al. (2011) Amitraz, flumetrina, deltametrina, Paquete de larvas, cipermetrina, clorpirifos, coumafos, Inmersión de larvas diazinón Fernandez–Salas et al. (2012c) Cipermetrina Paquete de larvas Amitraz Inmersión de larvas Fernandez–Salas et al. (2012b) Diazinón, flumetrina, deltametrina, Paquete de larvas cipermetrina Ivermectina Inmersión de larvas Miller et al. (2013) Fipronil Paquete de larvas Rodriguez–Vivas et al. (2014b) Clorpirifos, coumaphos, cipermetrina, Paquete de larvas permetrinal, fipronil Amitraz, ivermectina Inmersión de larvas Rodriguez–Vivas et al. (2013) Ivermectina, amitraz Inmersión de larvas Clorpirifos, coumaphos, cipermetrina, Paquete de larvas permetrina, fipronil

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Resistencia de A. mixtum a los acaricidas

Resistencia de garrapatas del complejo A. cajennense a los acaricidas ha sido reportada en Latinoamérica. En Brasil, Freitas et al. (2011) encontraron resistencia de este complejo de garrapatas a deltametrina, cipermetrina+butóxido de piperonil, amitraz y permetrina con mortalidades de larvas de 82, 89, 89.6 y 90% respectivamente. El primer reporte de A. mixtum resistente a OF en México fue realizado por Aguirre et al. (1986). Posteriormente, Martínez-Ibañez et al. (2010) reportaron la presencia de poblaciones de A. mixtum tolerantes al clorpirifos, coumafos, deltametrina y diazinón. Alonso-Diaz et al. (2013) estudió 24 poblaciones de A. mixtum en Veracruz para conocer su estatus de susceptibilidad y encontró que el 100%, 91.7%, 12.5% y 12.5% fueron resistentes a diazinón, coumafos, clorpirifos y amitraz, respectivamente. Sin embargo en México poblaciones de A. mixtum resistentes a la flumetrina o fipronil no han sido reportadas (Martínez-Ibañez et al., 2010; Alonso-Diaz et al., 2013).

Resistencia de R. sanguineus s.l. a los acaricidas e ivermectina

En Estados Unidos de América (EUA) se ha reportado la presencia de R. sanguineus s.l. resistentes a permetrina y tolerante al fipronil (Eiden et al., 2015b), así como poblaciones resistentes al amitraz en Panamá (Miller et al., 2001). Recientemente, Rodriguez-Vivas et al. (2016) reportaron en Yucatán, México que el 87.5% de poblaciones de R. sanguineus s.l. en perros fueron resistentes al amitraz y cipermetrina. El nivel de resistencia al amitraz fue bajo, con IR de 1-13; sin embargo, para la cipermetrina se encontró una variación entre las poblaciones de garrapatas estudiadas con IR de 1-104. El primer reporte mundial de R. sanguineus s.l. resistente a ivermectina fue realizado por Rodriguez-Vivas et al. (2017) cuando estudiaron 15 poblaciones de garrapatas en Yucatán, México. Los autores encontraron que el 66.7% de las poblaciones fueron resistentes con IRs de 1-30.5 y 1-458.8 cuando se consideraron las concentraciones letales que matan al 50% y 99% de las poblaciones, respectivamente.

Resistencia molecular de R. microplus, R. sanguineus y A. mixtum a los acaricidas convencionales y LM

Los primeros marcadores genéticos de la resistencia a las garrapatas fueron desarrollados para los PS. He et al. (1999) investigaron el mecanismo molecular de resistencia a los PS en R. microplus. Estos autores obtuvieron y secuenciaron el cADN del canal de sodio parcial para-homólogo de cepas susceptibles y resistentes a los PS, identificando una mutación puntual (T2134A) que resultó en un cambio de aminoácidos en el segmento 6 altamente conservado del dominio III del canal de sodio homólogo de garrapatas que eran altamente resistentes a los PS (He et al., 1999). Esto condujo posteriormente al descubrimiento de dos polimorfismos en el dominio II segmentos 4-5 (C190A) de la región de unión del canal de sodio en R. microplus (Morgan et al., 2009; Jonsson et al., 2010).

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Recientemente, Stone et al. (2014) estudiaron las poblaciones de R. microplus de los EUA y México, encontrando polimorfismos que confieren resistencia en los dominios II y III del gen del canal para-sodio asociado con la resistencia a los PS. Asimismo, los autores descubrieron un polimorfismo putativo super-kdr en el dominio II (T170C). Recientemente, van Wyk et al. (2016) encontraron que la mutación C190A dentro del dominio II del canal de sodio es el principal mecanismo de resistencia a los PS en R. microplus de Sudáfrica.

En México la resistencia de R. microplus a los PS (flumethrin, deltametrina y cipermetrina) se ha asociado a la mutación T2134A (Rosario-Cruz et al., 2005, 2009). Rodriguez-Vivas et al. (2012b) estudiaron la resistencia fenotípica y genotípica de R. microlus a los PS y encontraron que la presencia creciente del alelo de resistencia se correlacionó significativamente con la disminución de los niveles de toxicidad a la cipermetrina. Asimismo, Rodriguez-Vivas et al. (2011) estudiaron los cambios fenotípicos y genotípicos en las poblaciones de campo de R. microplus en respuesta a la presión de selección de los PS. Encontraron una fuerte correlación entre el porcentaje de garrapatas resistentes homocigotas (mutación T2134A) y la proporción de supervivencia de larvas, lo que confirmó que esta mutación es una de las principales causas de resistencia a los PS en México.

Los marcadores genéticos moleculares para detectar resistencia de R. microplus a los OF han tenido poco avance probablemente debido al complejo sistema de detoxificación de los OF. Temeyer et al. (2007) demostraron que las mutaciones puntuales que producen una enzima alterada en el gen que codifica la acetilcolinesterasa (AChE), son un importante mecanismo de resistencia hacia los OF en insectos. Baxter y Barker (1998) aislaron el primer gen AChE putativo (AChE1) en larvas de R. microplus de Australia. Estudios posteriores han sido realizados en R. microplus colectadas en México, Australia e India donde se identificaron mutaciones que están asociadas a la resistencia de los OF (Hernandez et al., 1999; Temeyer et al., 2013; Nagar et al., 2016). Recientemente, Gupta et al. (2016) detectaron una alta actividad de AChE1 en una población de R. microplus resistente a la deltametrina.

Existe una fuerte evidencia de que los receptores de la octopamina son los sitios de acción del amitraz. Corley et al. (2012) secuenciaron el gen y sugieren que el receptor de la octopamina-tiramina es el receptor más probable. Recientemente se han identificado mutaciones que están asociadas a la resistencia de poblaciones de R. microplus al amitraz en Sudáfrica (Robbertse et al., 2016).

El ácido gama-aminobutírico (GABA) es un neurotransmisor inhibitorio en la placa neuromuscular que contribuye a la sinapsis del sistema nervioso central de los artrópodos. El dieldrin, fipronil y las isoxazilinas (fluralaner) se reportan como agonistas de los canales del cloro-GABA en R. microplus (Ozoe et al., 2010). Hope et al. (2010) reportaron por primera vez mutaciones en el gen del GABA en poblaciones de R. microplus resistentes al dieldrin.

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En la actualidad, la base molecular de resistencia a las LM es poco entendida (Rodriguez-Vivas et al., 2014a). La insensibilidad del receptor GluCl, que impide la unión del fármaco a su sitio de acción, se ha asociado con la resistencia a la ivermectina en algunos nematodos y artrópodos (Kwon et al., 2010). Recientemente, en México, cepas de R. microplus resistentes y susceptibles a la ivermectina presentaron una sustitución en la posición 546 y 575 en la secuencia de nucleótidos de los canales de cloro-glutamato reportados en el “GenBank” (Mozo) (Aguilar-Tipacamú et al., 2016). Sin embargo, se ha demostraron que la bomba de flujo de los transportadores ABC, es un mecanismo de defensa contra la ivermectina en R. microplus (Pohl et al., 2011).

Los reportes de resistencia de R. microplus, A. mixtum y R. sanguineus a los acaricidas convencionales y LM en México resaltan la gravedad de la situación de la resistencia, así como la importancia de tener estrategias sustentables para el manejo de esta problemática en México, mediante el uso de métodos químicos y no químicos que reduzcan la presión de selección en las poblaciones de garrapatas y que contribuyan a prolongar la vida útil de los acaricidas convencionales y LM.

Referencias

Aguilar–Tipacamú G, Mosqueda–Gualito J, Cantó–Alarcón GJ, Klafke GM, Arellano–Carvajal F, Alonso–Díaz MA, Rodriguez–Vivas RI (2016) Identification of mutations in the glutamate–dependent chlorine channel in Rhipicephalus microplus resistant and susceptible to ivermectin. Quehacer Cient Chiap 11(2):20–26. Aguirre EJ, Sobrino AL, Santamaría VM, Aburto AS, Roman SE, Hernandez CM, Ortiz EM, Ortiz EA (1886) Resistencia de garrapatas en México. Seminario Internacional de Parasitología Animal, Cuernavaca, Morelos, México, pp. 281-306. Alonso-Díaz MA, Fernández-Salas A, Martínez-Ibáñez F, Osorio-Miranda J (2013) Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) tick populations susceptible or resistant to acaricides in the Mexican Tropics. Vet Parasitol 197(1–2):326- 331. Baxter GD, Barker SC (1998) Acethylcholinesterase cDNA of the cattle tick Boophilus role in organophosphates resistance. Insect Biochem Molec 28:581–589. Corley SW, Piper EK, Jonsson NN (2012) Generation of full–length cDNAs for eight putative GPCnR from the cattle tick, R. microplus using a targeted degenerate PCR and sequencing strategy. PLoS One 7(3):e32480. Miller RJ, George JE, Guerrero F, Carpenter L, Welch JB (2001) Characterization of acaricide resistance in Rhipicephalus sanguineus (Latreille)(Acari: Ixodidae) collected from the Corozal Army Veterinary Quarantine Center, Panama. J Med Entomol 38:298–302.

47 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Fernandez–Salas A, Rodriguez–Vivas RI, Alonso–Díaz MA (2012b) First report of a Rhipicephalus microplus tick population multi–resistant to acaricides and ivermectin in the Mexican tropics. Vet Parasitol 183(3–4):338–342. Fernandez–Salas A, Rodriguez–Vivas RI, Alonso–Diaz MA (2012c) Resistance of Rhipicephalus microplus to amitraz and cypermethrin in tropical cattle farms in Veracruz, Mexico. J Parasitol 98(5):1010–1014. Fernandez–Salas A, Rodriguez–Vivas RI, Alonso–Diaz MA, Basurto–Camberos H (2012a) Ivermectin resistance status and factors associated in Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) populations from Veracruz, Mexico. Vet Parasitol 190:210–215. Fragoso SH, Ortiz EM, Soberanes CN, Santamaría VM, Ortiz NA (1995) Epidemiología de la resistencia a ixodicidas en garrapatas Boophilus microplus en la República Mexicana. In: III Seminario Internacional de Parasitología Animal. Resistencia y control en garrapatas y moscas de importancia veterinaria, Acapulco, Guerrero, México, 11–13 de octubre de 1995, pp. 45–57. Fragoso–Sanchez H, Garcia–Vazquez Z, Tapia–Perez G, Ortiz–Najera A, Rosario–Cruz R, Rodriguez–Vivas RI (2011) Response of Mexican Riphicephalus (Boophilus) microplus ticks to selection by amitraz and genetic analysis of attained resistance. J Entomol 8(3):218-228. Freitas EPS, Garcia-Zapata MTA, Fernandes FF (2011) Monitoring of resistance or susceptibility of adults and larvae of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) to synthetic acaricides in Goiás. Brazil Exp Appl Acarol 53:189- 202. Eiden AL, Kaufman PE, Allanb SA, Oi F (2015) Establishing the discriminatingconcentration for permethrin and fipronil resistance in Rhipicephalus sanguineus (Latreille) (Acari: ixodidae), the brown dog tick. Pest Manag 72(7):1390-1395. Gupta S, Kumar KG, Sharma AK, Nagar G, Kumar S, Saravanan BC, Ravikumar G, Ghosh S (2016) Esterase mediated resistance in deltamethrin resistant reference tick colony of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Exp Appl Acarol 69:239-248. He H, Chen AC, Davey RB, Ivie GW, George JE (1999) Identification of a point mutation in the para–type sodium channel gene from a pyrethroid–resistant cattle tick. Biochem Biophys Res Commun 261:558–561. Hernandez R, He H, Chen AC, Waghela SD, Ivie GH, George JE, Wagner, G (1999) Cloning and sequencing of a putative acetylcholinesterase cDNA from Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J Med Entomol 36:764–770. Hope M, Menzies M, Kemp D (2010) Identification of a Dieldrin Resistance– Associated Mutation in Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). J Econ Entomol 103(4):1355–1359. Jonsson NN, Cutullè C, Corley SW, Seddon JM (2010) Identification of a mutation in the para–sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus microplus associated with resistance to flumethrin but not to cypermethrin. Int J Parasitol 40:1659–1664.

48 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Kwon DH, Yoon KS, Clark JM, Lee SH (2010) A point mutation in a glutamate– gated chloride channel confers abamectin resistance in the two–spotted spider mite, Tetranychus urticae Koch. Insect Mol Biol 19(4):583–591. Labruna MB (2009) Ecology of rickettsia in South America. Ann N Y Acad Sci 1166:156–166. Li AY, Davey RB, Miller RJ, George JE (2004). Detection and characterization of amitraz resistance in the Southern cattle tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J Med Entomol 41:193–200. Martínez-Ibañez F, Osorio MJ, Peláez FA, Delabra VG, Chiu AD (2010) Respuesta toxicológica de garrapatas Boophilus microplus y Amblyomma cajennense en ranchos con infestaciones mixtas en Tamaulipas, Puebla y Veracruz. Congreso Nacional de Buiatría, CINTERMEX, Monterrey, Nuevo León, México p. 191. Miller RJ, Almazán C, Ortíz-Estrada M, Davey RB, George JE, Peréz de León A (2013) First report of fipronil resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus of Mexico. Vet Parasitol 191: 97–101. Morgan JAT, Corley SW, Jackson LA, Lew–Tabor AE, Moolhuijzen PM, Jonsson NN (2009) Identification of a mutation in the para–sodium channel gene of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus associated with resistance to synthetic pyrethroid acaricides. Int J Parasitol 39:775–779. Nagar G, Sharma AK, Chigure G, Manjunathachar HV, Saravanan BC, Rai A, Ghosh S (2016) Identification of mutations in acetylcholinesterase 2 gene of acaricide resistant isolates of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Int J Sci Environ Technol 5:3440–3447. Olivares–Pérez JS, Rojas–Hernández, MT Valencia–Almazan, I Gutiérrez–Segura Míreles–Martínez EJ (2011) Prevalence of resistant strains of Rhipicephalus microplus to acaricides in cattle ranch in the tropical region of Tecpan of Galeana, Guerrero, Mexico. Pak Vet J 31(4):366–368. Ortiz EM, Santamaría VM, Ortiz NA, Soberanes CN, Osorio MJ, Franco BR, Martinez IF, Quezada DR, Fragoso SH (1995) Characterization of Boophilus microplus resistance to ixodicides in México. In: Seminario internacional de Parasitología Animal Pp 58–66. Acapulco, México. Ozoe Y, Asahi M, Ozoe F, Nakahira K, Mita T (2010) The antiparasitic isoxazoline A1443 is a potent blocker of insect ligand–gated chloride channels. Biochem Biophys Res Commun 391:744–749. Perez–Cogollo LC, Rodriguez–Vivas RI, Ramirez–Cruz GT, Miller RJ (2010a) First report of the cattle tick Rhipicephalus microplus resistant to ivermectin in Mexico. Vet Parasitol 168(1–2):165–169. Perez-Cogollo LC, Rodriguez-Vivas RI, Ramirez-Cruz GT, Rosado-Aguilar JA (2010b) Survey of Rhipicephalus microplus resistance to ivermectin at cattle farms with history of macrocyclic lactones use in Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 172:109–113. Pohl PC, Klafke GM, Carvalho DD, Martins JR, Daffre S, Silva Vaz, Masuda Jr A (2011) ABC transporter efflux pumps: a defense mechanism against

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ivermectin in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Int J Parasitol 41:1323– 1333. Robbertse L, Baron S, van der Merwe NA, Madder M, Stoltsz WH, Maritz–Olivier C (2016) Genetic diversity, acaricide resistance status and evolutionary potential of a Rhipicephalus microplus population from a disease–controlled cattle farming area in South Africa. Ticks Tick–Borne Dis 7(4):595–603. Rodriguez–Vivas RI, Alonso–Dıaz MA, Rodrıguez–Arevalo F, Fragoso–Sanchez H, Santamaria VM, Rosario–Cruz R (2006) Prevalence and potential risk factors for organophosphate and pyrethroid resistance in Boophilus microplus ticks on cattle ranches from the State of Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 136:335–342. Rodríguez-Vivas RI, Apanaskevich DA, Ojeda-Chi MM, Trinidad-Martínez I, Reyes- Novelo E, Esteve-Gassent MD, Pérez de León AA (2016a) Ticks collected from humans, domestic animals, and wildlife in Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 215:106–113. Rodriguez–Vivas RI, Hodgkinson JE, Rosado–Aguilar JA, Villegas–Perez SL, Trees AJ (2012b) The prevalence of pyrethroid resistance phenotype and genotype in Rhipicephalus (Boophilus) microplus in Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 184(2–4):221–229. Rodriguez–Vivas RI, Li AY, Ojeda–Chi MM, Trinidad–Martinez I, Rosado–Aguilar, JA, Miller RJ, Pérez de León AA (2013) In vitro and in vivo evaluation of cypermethrin, amitraz, and piperonyl butoxide mixture s for the control of resistant Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) in the Mexican tropics. Vet Parasitol 197(1–2):288–296. Rodriguez–Vivas RI, Miller RJ, Ojeda–Chi MM, Rosado–Aguilar JA, Trinidad– Martínez IC, Pérez de León AA (2014b) Acaricide and ivermectin resistance in a field population of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) collected from red deer (Cervus elaphus) in the Mexican tropics. Vet Parasitol 200(1– 2):179–188. Rodriguez-Vivas RI, Ojeda-Chi M, Trinidad-Martinez I, Bolio-González M (2016b) First report of amitraz and cypermethrin resistance in Rhipicephalus sanguineus sensu lato (Acari: Ixodidae) infesting dogs in Mexico. Med Vet Entomol 31(1):72–77. Rodriguez-Vivas RI, Ojeda-Chi MM, Trinidad-Martinez I, Perez de León AA (2017) First documentation of ivermectin resistance in Rhipicephalus sanguineus sensu lato (Acari: Ixodidae). Vet Parasitol 233:9–13. Rodriguez–Vivas RI, Perez–Cogollo LC, Rosado–Aguilar JA, Ojeda–Chi MM, Trinidad–Martinez I, Miller RJ, Li, AY, Perez de Leon AA, Guerrero FD, Klafke GM (2014a) Rhipicephalus microplus resistant to acaricides and ivermectin in cattle farms of Mexico. Braz J Vet Parasitol 23(2):113–122. Rodriguez–Vivas RI, Rivas AL, Chowell G, Fragoso SH, Rosario CR, Garcia Z, Smith SD, Williams JJ, Schwager SJ (2007) Spatial distribution of acaricide profiles (Boophilus microplus strains susceptible or resistant to acaricides) in southeastern Mexico. Vet Parasitol 146:158–169.

50 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Rodriguez–Vivas RI, Trees AJ, Rosado–Aguilar JA, Villegas–Perez SL, Hodgkinson JE (2011) Evolution of acaricide resistance: phenotypic and genotypic changes in field populations of Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to pyrethroid selection pressure. Int J Parasitol 41:895–903. Rodriguez–Vivas RI, Trees AJ, Rosado–Aguilar JA, Villegas–Perez SL, Hodgkinson JE (2011) Evolution of acaricide resistance: phenotypic and genotypic changes in field populations of Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to pyrethroid selection pressure. Int J Parasitol 41:895–903. Rosado-Aguilar JA, Rodriguez–Vivas RI, Garcia-Vazquez Z, Fragoso-Sanchez H, Ortiz-Najera A, Rosario-Cruz R (2008) Development of amitraz resistance in field populations of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) undergoing typical amitraz exposure in the Mexican tropics. Vet Parasitol 152:349–353. Rosario–Cruz R, Guerrero FD, Miller RJ, Rodriguez–Vivas RI, Dominguez–Garcia DI, Cornel AJ, Hernández–Ortiz R, George EJ (2005) Roles played by esterase activity and by a sodium channel mutation involved in pyrethroid resistance in populations of Boophilus microplus (Canestrini) (Acari: Ixodidae) collected from Yucatan, Mexico. J Med Entomol 42(6):1020–1025. Rosario–Cruz R, Guerrero FD, Miller RJ, Rodriguez–Vivas RI, Tijerina M, Dominguez–Garcia DI, Hernandez–Ortiz R, Cornel AJ, McAbee RD, Alonso–Diaz MA (2009) Molecular survey of pyrethroid resistance mechanisms in Mexican field populations of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Parasitol Res 105:1145–1153. Soberanes CN, Santamaría VM, Fragoso SH, García VZ (2002) Primer caso de resistencia al amitraz en la garrapata del ganado Boophilus microplus en México. Téc Pec Méx 40:81–90. Stone NE, Olafson PO, Davey RB, Buckmeier G, Bodine D, Sidak–Loftis LC, Giles JR, Duhaime R, Miller RJ, Mosqueda J, Scoles GA, Wagner DM, Busch JD (2014) Multiple mutations in the para–sodium channel gene are associated with pyrethroid resistance in Rhipicephalus microplus from the United States and Mexico. Parasites Vectors 7:456. Temeyer KB, Pruett JH, Olafson PU, Chen AC (2007) R86Q, a mutation in BmAChE3 yielding a Rhipicephalus microplus organophosphate–insensitive acetylcholinesterase. J Med Entomol 44(6):1013–1018. Temeyer KB, Tuckow AP, Brake DK, Li AY, Pérez de León AA (2013) Acetylcholinesterases of blood–feeding flies and ticks. Chem Biol Interact 203:319–322. van Wyk RDJ, Baron, S., Maritz–Olivier C (2016) An integrative approach to understanding pyrethroid resistance in Rhipicephalus microplus and R. decoloratus ticks Ticks Tick–borne Dis 7:586–594.

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ACTUALIDADES SOBRE EL DIAGNÓSTICO DE RESISTENSIA A LOS ANTIHELMINTICOS.

Pablo Martínez Labat Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México

Las parasitosis en los rumiantes son una amenaza constante que el ganadero debe enfrentar y entre ellas especialmente resulta importante el síndrome de verminosis gastroentérica una entidad producida por diferentes géneros de nematodo que se establecen en el estómago y los intestinos de estos animales (Falzon y Cols, 2014, Jabbar y Cols, 2006). La presencia de estos organismos se convierte en un problema grave debido a que se afecta la capacidad de digestión de nutrientes en el estómago, la absorción que debiera ocurrir en el intestino delgado e incluso los procesos de reabsorción de agua y electrolitos en el intestino grueso, esto se traduce en problemas de mala absorción intestinal, pérdida de sangre y nutrientes retrasando el crecimiento de los animales jóvenes o afectando la condición corporal en los adultos, esta afección además debilita a los animales e incluso les puede producir la muerte, aunque la tendencia regular es que se produzca una afección crónica que afecta a la mayoría de los animales prácticamente toda la vida. Por lo general este síndrome afecta a toda la población produciendo importantes pérdidas económicas de gran impacto a los productores lo cual llevó a establecer diversas estrategias con la finalidad de controlar el problema y mejorar la productividad de los animales (Sutherland y Leathwick, 2011). Esto entre otras cosas durante el siglo pasado se vivió el auge, del desarrollo de diversas familias químicas de antiparasitarios con diferentes propiedades, esto permitió a que en el primer tercio del siglo XX surgiera la que se considera la primera familia de antihelmínticos considerados de amplio espectro que corresponde con los fenotiazínicos que incluye a la piperazina y la fenotiazina, productos que fueron usados intensivamente y para la década de los 60´s surgen varias familias nuevas que se convirtieron en una verdadera revolución ya que repentinamente el ganadero dispuso de los primeros bencimidazólicos, probencimidazólicos, los imidazotiazólicos y las tetrahidropirimidinas, por lo que se disponía súbitamente de una gama amplia de principios activos que mostraban una actividad antihelmíntica muy elevada y en función a esto se inicia un uso masivo de estos productos (De Graef y Cols, 2013). En los años sucesivos se producen grandes avances en las tecnologías de síntesis orgánica lo cual permitió primero el desarrollo de una nueva serie de productos bencimidazólicos que presentaban amplios espectros y facilitaron el control de la verminosis gastroentérica. Para los 80´s se presenta una nueva oleada con el desarrollo de una tercera familia representada por las lactonas macrocíclicas, encabezada por la ivermectina, un producto semisintético obtenido primariamente de una levadura (Streptomyces avermectylis) procesado por semisíntesis posteriormente para acentuar sus propiedades antiparasitarias,

52 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México creándose el concepto de endectocida en virtud de que en el espectro de estos productos están incluidos los endo y ectoparásitos a este principio activo lo sucedieron la moxidectina, doramectina, selamectina las mylbemicinas y muchos otros principios emparentados desarrollados durante los 90´s (De Graef y Cols, 2013). Además entre las múltiples investigaciones la industria farmacéutica logró desarrollar otras moléculas de un espectro más estrecho, de forma individual que también fueron integradas al mercado y ampliamente utilizadas por los productores y veterinarios como las salicilamidas, algunos organofosforados y fenoles. Ese tremendo nivel de desarrollo de moléculas permitió vivir un período en el que se hizo un uso altamente intensivo de los antiparasitarios por todas las vías conocidas e incluso con el desarrollo de nuevas como el sistema pour on y ya en el siglo XXI se desarrolló una última familia que son los derivados del Aceto nitrilo (Sutherland y Leathwick, 2011). Esto llevó a un período en el que las cosas parecían estar bajo control, produciendo un lapso en el que las helmintiasis podían manejarse adecuadamente, la profundización en el estudio de la epidemiología de las parasitosis, particularmente del síndrome de verminosis gastroentérica que permitió una etapa relativamente larga de control de la problemática, en especial en los sistemas en pastoreo particularmente en los países desarrollados, llevando esto a un notable impulso a la producción animal aliviándola de la carga de un importante número de agentes parasitarios (Jabbar y Cols, 2006, Gasbarre y Cols, 2009). Un exceso de confianza y la ausencia de apoyo en la mayoría de los casos con la disponibilidad y soporte de estudios epidemiológicos para el manejo de los antiparasitarios o el establecimiento de programas sustentados en el análisis de los casos a nivel regional, aunado esto a una absoluta anarquía por ausencia de asesoría por el veterinario, por conocimientos muy limitados del propio veterinario (culturales), del productor, por tener un acceso sin restricciones a los productos, por un manejo abusivo con sub o sobredosificación, por un manejo, almacenamiento y adulteración de los productos comerciales ha llevado gradualmente al desarrollo de resistencia por estos organismos (Sutherland y Leathwick, 2011). Todos estos aspectos han llevado en muchas zonas a comprometer las estrategias conocidas para el establecimiento de programas de control de parásitos en los rumiantes por la presión sobre las poblaciones de organismos entre los cuáles de forma natural existen poblaciones presentes en bajas proporciones, que naturalmente son resistentes y que al ser expuestas con mucha frecuencia a los productos antiparasitarios prácticamente eliminan a todos los organismos susceptibles y permiten que las poblaciones resistentes tengan un gradual desarrollo hasta llegar a condiciones en las que el nivel de eliminación obtenida después de la aplicación de los productos se reduce notablemente de modo que la aplicación de los productos no implica una mejoría en el aprovechamiento de nutrientes y las pérdidas de sangre por lo que los animales no se recuperan y la productividad se mantiene a la baja al desarrollarse la resistencia al uso de los antiparasitarios (Gasbarre y Cols, 2009). La resistencia a los antiparasitarios se define como una ausencia del efecto terapéutico regular a las dosis identificadas como adecuadas para eliminar a la casi totalidad de los agentes parasitarios contra los que se había detectado actividad originalmente a

53 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México un período definido de aplicación del mismo (Sutherland y Leathwick, 2011). Este fenómeno fue identificado desde que se desarrolló la primera familia de antiparasitarios y parece ser un evento totalmente natural al existir regularmente estos organismos que presentan sitios blanco o sistemas metabólicos alternos al mecanismo de acción o de transporte que impiden regularmente el efecto del principio antiparasitario, siguiendo una mecánica parecida a la detectada con los antibióticos. También se ha observado que cuando se produce el desarrollo de resistencia a una molécula de una familia determinada de antiparasitarios este fenómeno se puede extender a más moléculas de la misma familia, situación que ni los veterinarios ni productores han tomado en consideración por un lado al no considerar la multiplicidad de nombres comerciales para un mismo principio activo una vez que la patente de este queda libre y de los compuestos que tienen un origen químico similar contra los que se desarrollará este fenómeno gradualmente generalmente por ignorancia, lo cual lleva al uso indiscriminado hasta lograr la resistencia (Kaplan, 2004,Gasbarre, 2009, Sutherland y Leathwick, 2011). La velocidad con la que se produce la aparición de la resistencia depende de la presión de selección que se produzca sobre las poblaciones de parásitos, en este sentido la frecuencia de aplicación ligado con un empleo excesivo (en algunos casos hasta 12 veces por año) en algunas especies, aquí es donde no aplicar los conocimientos o ignorar los factores epidemiológicos o ecológicos de estos organismos ha llevado al desarrollo de resistencia por los nematodos hasta a varias de las familias de antiparasitarios que se han desarrollado (Kaplan, 2004, Jabbar y Cols, 2006, Falzon y Cols, 2014). Se considera que uno de los factores más comunes para el desarrollo de resistencia es la subdosificación del principio activo, la cual se debe a que la persona que va a tratar hace una ponderación visual del peso de los animales a tratar que sobre todo involucra a las poblaciones de organismos heterocigóticos que ya poseen el potencial de resistencia que dispara esta característica, otros elementos asociados son la persistencia dentro y fuera del animal tratado del producto, así como una elevada eficacia inicial porque esto puede diezmar rápidamente a las poblaciones susceptibles, lo cual induce una reducción notable de fases infectantes que darán origen a individuos susceptibles. También se ha identificado la aplicación de los tratamientos estratégicos como un elemento importante en el desarrollo de la resistencia porque este tipo de medida se aplica en la época del año en que las poblaciones de fases infectantes de todos los tipos (resistentes o no) se reducen a un mínimo por lo que los efectos de la desparasitación son muy importantes en el desarrollo de la resistencia (Kaplan, 2004, Sutherland y Leathwick, 2011). El proceso de resistencia regularmente se asocia con explotaciones en las que se hace un uso intensivo de una extensa gama de productos, con la confianza en su momento de contar con productos robustos, de actividad muy potente y confiable y de esta situación solo se logró tener conciencia cuando en una gran cantidad de explotaciones se comenzó a identificar que los niveles de productividad después de usar los antiparasitarios no se mantenían como ocurrió cuando se utilizaron al principio de acuerdo con los criterios de los productores. Este proceso que se observó primero en algunas localidades y gradualmente se extendió por el mundo

54 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México hasta llegar a ser una condición crítica en América Latina, Sudáfrica, Nueva Zelanda y Australia y el nivel de resistencia puede involucrar de uno a cuatro grupos de antiparasitarios (multirresistencia), este fenómeno se encuentra documentado en una gran cantidad de publicaciones por el mundo las cuáles se incrementan día a día entre las que destacan los derivados bencimidazólicos y las lactonas macrocíclicas (Kaplan, 2004). El fenómeno de resistencia particularmente ha sido detectado y estudiado en los pequeños rumiantes en virtud de que en estos animales la observación de altos niveles de parasitismo clínicamente perceptible resulta más frecuente que en los bovinos en los que la tendencia regular es la presentación del parasitismo subclínico (Sutherland y Leathwick, 2011). Es posible que a menudo el observar niveles de efectividad del 50 al 70% en bovinos pueda ocultar los efectos reales del parasitismo dados los géneros predominantes involucrados, así que esa misma frecuencia de organismos resistentes en los pequeños rumiantes pueden generar efectos ostensiblemente más visibles que en los bovinos, pero en la medida que pasa el tiempo se acumula evidencia y el fenómeno que se extiende en esa especie va emergiendo para alcanzar la misma magnitud (Falzon y Cols, 2014). Destaca en los pequeños rumiantes por su potencial para el desarrollo de resistencia el género Haemonchus que acumula el mayor nivel y familias de antiparasitarios seguido por otros tricostrongílidos como Trichostrongylus y Teladorsagia, en tanto en los bovinos es el género Cooperia con resistencia hasta a tres familias seguido por Haemonchus y Trichostrongylus (Suárez y Cristel, 2007). El fenómeno de resistencia se ha extendido a los parásitos de los rumiantes silvestres, los cuáles eventualmente son susceptibles a los mismos géneros y especies de organismos y que en un momento dado contribuyen a la diseminación de estos, acelerando la evolución del fenómeno entre los animales domésticos, situación que ya ha sido documentada también en los pequeños rumiantes. Ante este fenómeno y acostumbrados a la velocidad con la que la industria farmacéutica había presentado nuevas y más potentes opciones de principios activos previamente, lo más lógico sería pensar en que toda esta problemática podría solventarse con facilidad, sin embargo la industria enfrenta el problema de que el costo desde la fase de detección de un principio con potencial antiparasitario hasta hacerlo llegar al mercado es sumamente elevado por lo que definitivamente en la actualidad el enfoque de la industria ha cambiado hacia el desarrollo de medicamentos para el tratamiento de enfermedades en humanos y también hacia el mercado emergente de las mascotas que tanto ha crecido últimamente (Falzon y Cols, 2014).

Por lo anterior debe reflexionarse en el sentido de que el tiempo en el que solo debía esperarse con paciencia y la industria farmacéutica desarrollaría y ofrecería una nueva y efectiva opción para el control antiparasitario ya pasó y que no hay ninguna situación así en el horizonte inmediato y que habrá de considerarse que el manejo de los recursos disponibles en este momento deben ser manejados cuidadosamente para preservar su utilidad y entender que en el futuro deberá considerarse el uso de opciones no químicas para poder cumplir con este objetivo, por lo anterior se debe ampliar la visión hacia otros campos para el

55 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México desarrollo de nuevas estrategias que requieren de la exploración de otros campos de la biología que hasta el momento han sido estudiados solo de forma parcial y aún hay mucho que recorrer en ellos.

Torres Acosta y Col. (2012) realizaron una muy completa revisión en torno a la situación que guarda la resistencia a antiparasitarios en explotaciones ovinas en el continente americano identificando que el fenómeno ha sido especialmente estudiado en el sur del continente (incluyendo Brasil, Argentina, Uruguay) países con importantes poblaciones ovinas en los que se encontraron elevados frecuencias de resistencia inicialmente a una familia de antiparasitarios, situación que actualmente ha derivado a resistencia múltiple (Ramos y Cols, 2016). Esta situación también se ha observado en el sur de los Estados Unidos, en algunas zonas de México y Costa Rica y en otras áreas el fenómeno en apariencia es incipiente, no ha sido estudiado o la información no se ha divulgado o no se han realizado. El estudio del desarrollo de resistencia resulta entonces de gran importancia para realizar cambios a nivel de manejo para el control racional del problema ya que en muchos casos no se tiene conciencia de que existe el problema y de su magnitud por lo que este continúa evolucionando y el concepto del uso intensivo de los antiparasitarios como herramienta para controlar la nematodiasis. Se plantea la necesidad de que se lleve una continua verificación de la eficacia de los tratamientos para evaluar el comportamiento de las poblaciones parasitarias y considerar el empleo de sistemas alternativos de control pero también es una condición incipiente por lo que se considera que avance de la resistencia a los antiparasitarios es un problema que sigue avanzando en razón de que no se produce un cambio tanto en los productores como en los veterinarios respecto a la dependencia del uso de los antiparasitarios, por lo que hay un subdiagnóstico de la resistencia, siendo prioritario el cambio de mentalidad extendiendo la aplicación de las metodologías alternas de control que permitan un cambio de conceptos para reducir esa dependencia de los antiparasitarios esto ligado a desarrollar un sistema que brinde soporte técnico accesible y eficiente para evidenciar el avance del problema y su magnitud ya que representa un importante riesgo para la producción por lo que resulta indispensable el desarrollo la implementación y manejo de técnicas que permitan detectar la presencia de este fenómeno y su evolución en las poblaciones de los animales productivos y los de compañía, que es el objeto de la participación en este evento (FAO, 2004, Sutherland y Leathwick, 2011) .

El ámbito de los sistemas para monitorear el desarrollo de resistencia a los antiparasitarios ha debido evolucionar en diferentes sentidos de manera que se han desarrollado metodologías que involucran sistemas in vivo e in vitro disponibles que continuamente están en desarrollo, validación y perfeccionamiento.

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Metodologías in vivo para detectar resistencia.

La prueba conteo de reducción de huevos es la prueba básica más utilizada a nivel mundial hasta el momento, su fundamento es demostrar hasta donde la presencia de organismos que han desarrollado resistencia a los antiparasitarios siguen produciendo huevos que son eliminados en las heces al volverse refractarios a los antiparasitarios por lo que los conteos de estas estructuras se mantienen poco alterados, ya que como se ha explicado previamente estos organismos al principio de su interacción con los distintos tipos de antiparasitarios representan un porcentaje de la población muy bajo y conforme ocurre la exposición a los diferentes productos se va produciendo una presión que los selecciona y gradualmente se incrementa su concentración dentro de los hospederos y como fases infectantes en el suelo, lo cual se verá reflejado cuando los animales son sometidos a tratamiento con un producto determinado que al ser resistentes no va a repercutir en una disminución importante en la cantidad de huevos que se detectan en las pruebas cuantitativas después de aplicar el tratamiento y se han venido usando y perfeccionando desde hace varias décadas y perfeccionando como lo muestran los trabajos previos (Coles y Cols, 1992, Johansen,1989, Taylor y Col, 2002, Jabbar y Cols, 2006, De Graef y Cols, 2013) .

Un aspecto inicial para desarrollar este tipo de estudio es contar con información de la explotación, del manejo antiparasitario que se realiza, el producto comercial usado, sus características y si cumple con las regulaciones sanitarias para comercializarlo, su origen, el manejo que se le da, si los animales son pesados y se calcula adecuadamente la dosis, el historial de utilización del producto, si es aplicado correctamente por el productor y existe un protocolo de dieta previa a su aplicación de tal manera que se pueda estructurar un marco de referencia para correlacionarlo con los resultados que se obtengan de la prueba.

Para el desarrollo de la prueba deberá de contarse inicialmente con los productos antiparasitarios comerciales de las diferentes familias existentes incluyendo los imidazotiazoles, los bencimidazólicos, las lactonas macrocíclicas registrando sus datos correspondientes. Deberá disponerse de una báscula que permita determinar el peso de los animales a tratar, bolsas de polietileno para recolectar las muestras fecales, materiales para identificarlas, para aplicar los productos antiparasitarios y los materiales y reactivos apropiados para el procesamiento mediante las técnicas de Mc Master y Stoll de acuerdo con la metodología planteada por Torres Acosta y un grupo de colaboradores en México, que contiene todos los ajustes derivados de la experiencia de campo y fue integrado en un manual en 2015.

El desarrollo del estudio considera tres fases: Una de pretratamiento, otra de tratamiento y otra de postratamiento. Los animales de la explotación problema no deben haber sido tratados en un lapso previo de al menos 60 días, deberán contar

57 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México con algún sistema de identificación para poder diferenciar diferentes grupos integrados en el estudio.

En la primera fase se realiza la selección de los animales para integrar los grupos debiendo usarse animales que se mantengan en pastoreo para garantizar que se encuentren infectados naturalmente pueden seleccionarse animales jóvenes ya que estos regularmente son los más afectados pero si consideramos el criterio de inclusión con animales que eliminen 100 o más huevos por gramo de heces en el caso de bovinos y 150 o más en el caso de los ovinos y caprinos, sin importar el sexo, la condición es que se encuentren pastoreando en las praderas que en teoría están los organismos resistentes. Cuando los conteos están por debajo de 100/g se recomienda el empleo de técnicas más sensibles, en este caso la opción probada es la técnica de Stoll. Debe abrirse un registro de los animales seleccionados, los muestreos se realizan directamente del recto y la cantidad mínima a obtenerse es de 5 gramos por animal para evitar contaminación por nematodos del suelo. Las muestras se identifican y se transportan en un recipiente cerrado a 4°C para procesarlas en el laboratorio para bloquear el desarrollo. El proceso en el laboratorio requiere de 2 a 5 gramos de materia fecal empleando empleando la técnica de Mc Master para hacer la cuantificación de huevos y se emplean dos gramos más de heces con el fin de llevar a cabo un cultivo larvario con las heces de cada grupo de animales tratados y también con las del grupo control el procedimiento sugerido es emplear la técnica de cultivo de Corticelli Lai que permite obtener larvas infectantes 8 días después, recuperando el sedimento de las cajas de cultivo y de ser necesario pasar este material por un tamiz para reducir residuos y esas larvas se mantienen a 4°C hasta realizar su identificación por morfometría de los organismos de cada grupo del estudio empleando las claves respectivas también en cada grupo para determinar los géneros presentes de nematodos. El estudio se realiza al menos con dos grupos, el control no tratado y el grupo tratado, pueden existir varios grupos tratados que corresponden a varias familias químicas. Los animales a tratar deben ser pesados el día previo al tratamiento y formar grupos de 10 a 15 animales y tratar de hacer una distribución homogénea de los animales basada en las cuentas de huevos obtenidas en este primer muestreo.

La segunda fase que corresponde a la etapa de tratamiento se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante, considerando dosificación correcta descrita en la literatura para cada especie de rumiante y la vía de aplicación. Es importante que los animales sean pesados el día previo al tratamiento con un lapso de dieta de al menos 14 horas para que el dato corresponda al peso real del animal en especial cuando se les va a suministrar el antiparasitario por vía oral y también en este caso se recomienda administrar el producto por medio de cánula para hacerlo llegar a una posición lo más posterior a la lengua.

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En la tercera fase se va a realizar el segundo muestreo, de acuerdo a la experiencia deberá realizarse en función a la familia química, por lo cual se recomienda para los imidazotiazólicos realizar el muestreo entre 5 y 7 días posteriores, para los bencimidazólicos 8 a 10 días después y en el caso de las lactonas macrocíclicas 14 a 17 días después, en el comercio existen productos con mezclas por ejemplo de bencimidazólicos con imidazotiazólicos en este caso es recomendable muestrear a los 10 días y si es una lactona macrocíclica con cualquier otra familia lo mejor es muestrear a los 14 días. El proceso posterior se realiza bajo el mismo criterio de la fase uno realizando la cuantificación de huevos primero y desarrollando los cultivos larvarios con la misma metodología después. Con los datos obtenidos se puede hacer la interpretación de la prueba la cual incluye el uso de la formula recomendada por la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria que se plantea de la siguiente manera: % R= 100(1 – Xt/Xc)

Donde: Xt corresponde al promedio de huevos por gramo de heces encontrado en el grupo tratado postratamiento. Xc corresponde el promedio de huevos por gramo de heces encontrado en el grupo control no tratado también en el período postratamiento.

Posteriormente se calcula el intervalo de confianza al 95% y en este procedimiento se utilizan las medias aritméticas de cada uno de los grupos y este cálculo se puede hacer mediante una aplicación del programa Excell Rexo.exe (Sciro ,1993, Animal Health).

Se han desarrollado variantes de esta técnica ya probadas en pequeños rumiantes y recientemente probadas en bovinos en las que en lugar de trabajar con muestras individuales usando las muestras de cinco animales simultáneamente para hacer las cuantificaciones y no se ha encontrado diferencias en los resultados, lo cual puede ser una buena opción cuando se va a trabajar con una gran cantidad de explotaciones (Taylor y Cols, 2002, George y Cols, 2017).

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EJEMPLO DE CALCULOS PARA LA PRUEBA DE CONTEO DE HUEVOS DATOS OBTENIDOS DE LOS ANIMALES CONTROL TRATAMIENTO TRATAMIENTO 1 2 315 0 130 275 0 35 745 20 190 320 0 410 695 25 195 160 0 135 500 0 280 310 10 410 520 0 155 455 35 160 Cálculos: Número de animales por grupo: ni: (N=Ʃ nj) 10 10 10 Media aritmética Xi=ƩiXij/ni 443 9 210 2 Varianza de los conteos S =(ƩjX2ij---(ƩjXij)2/ni)/(ni-1) 74,062 260 20,300 Porcentaje de reducción R=100(1-Xt/Xc) 0 98 53 Varianza de la reducción (en escala logarítmica) 0.36 0.08 V=[(s2 t/(ntX2t)] +[s2c/(ncX2c))]) Intervalo de confianza aproximado para R 100= [(1-(Xt/Xc))exp±2.1√v)] Límite superior de confianza 100 [1-(Xt/Xc) exp (-2.1√v)] 99 74 Límite inferior de confianza 100[1-(Xt-Xc) exp (+2.1√v)] 93 13 Aquí: i denota el grupo tratado (t) o el grupo control (c) J denota a cada animal de los grupos 2 S2 I denota la varianza en escala aritmética, calculada como se señala arriba o s i=Ʃi(Xij – XI)2/(ni-1)

Finalmente el criterio para determinar que una población de nematodos del grupo de los tricostrongílidos es resistente, susceptible o sospechoso se plantea si: Si el porcentaje de reducción de huevos del conteo es menor a 95%y el límite del intervalo de confianza al 95% es menor a 90% son organismos resistentes, se considerará sospechoso cuando solo uno de los criterios se cumple y se considerará susceptible cuando el porcentaje de reducción en el conteo es igual o mayor del 95% y el límite de intervalo de confianza 95% es igual o mayor de 90%.

Pruebas in vitro para detección de resistencia.

En el caso de este tipo de pruebas existen una serie de variantes de las que algunas se han popularizado y otras solo se emplean con fines de investigación por el hecho de requerir de personal muy experimentado y la disponibilidad de recursos de laboratorio costosos debido al equipamiento y reactivos que se requieren para desarrollarlas, además estos procedimientos requieren en la mayoría de los casos del desarrollo de infecciones monogenéricas que resultan difíciles de interpretar, en especial si consideramos que los animales son

60 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México afectados por varios géneros simultáneamente, por lo que para este tipo de ensayos se requiere de disponer de cepas de nematodos de referencia que sean susceptibles, así como resistentes con el fin de compararlos respecto a los organismos problema que se estudian y han sido estudiadas por Demeler y Cols (2012) y comparadas contra la prueba de conteo de huevos demostrando que los datos que aportan estas técnicas tienen una validez similar.

Entre una serie de variantes disponibles como el ensayo de eclosión de larvas, el ensayo de parálisis en la eclosión de larvas en el huevo, el ensayo del desarrollo larvario y varios tipos de ensayos de motilidad.

De las enlistadas previamente son dos las regularmente desarrolladas: la Prueba de inhibición de la eclosión de huevos y la Prueba de inhibición de la migración larval que se describen a continuación.

Prueba de inhibición de la eclosión de huevos.

Desde su desarrollo esta prueba fue enfocada al estudio de resistencia al grupo de los bencimidazólicos basada en la propiedad ovicida que presentan estos antiparasitarios, de modo que consiste en incubar los huevos de nematodo en varias concentraciones de Tiabendazol y establecer cual nivel de inhibición de eclosión de larvas se produce en los huevos. El diseño de la prueba permite de forma rápida establecer la dosis letal 50, 95 y 99 en poblaciones problema comparando como referencia el comportamiento contra organismos susceptibles a este antiparasitario. Desde su desarrollo hace 40 años ha sido objeto de una serie de ajustes desarrollados por diversos grupos de investigadores que han permitido obtener resultados confiables.

En esta prueba el primer aspecto es obtener los huevos de los nematodos problema de manera que las muestras fecales deben obtenerse directamente del recto y depositarlas en bolsas de plástico de las que debe extraerse el aire para reducir la concentración de oxígeno. Las muestras pueden almacenarse a 4°C, pero lo recomendable es procesarlas dentro de las tres horas posteriores a su recolección pues el desarrollo de las larvas continua y el mantenerlas por más de 24 horas a bajas temperaturas tiene un impacto importante sobre el desarrollo posterior bajo estas condiciones. El paso inmediato implica separar los huevos de las heces y determinar su concentración en las muestras por lo que lo primero es someter las muestras al examen cuantitativo de Mc Master o Stoll de acuerdo a la cantidad de huevos presentes en las mismas y una vez determinado este valor se procede a concentrar estas estructuras inicialmente por dilución por lo que la muestra se deposita en un tamiz sobre un mortero de porcelana de modo que se agregan 200 ml. de agua y se procede a la maceración considerando que la cantidad de materia fecal que se requiere depende de la cantidad de huevos que se pretende obtener para el estudio y esto se define al cuantificar. Una vez diluida la muestra a través del tamiz se cuela reteniendo los detritus y se repite el proceso

61 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México ahora a través de cuatro capas de gaza pasando la suspensión por un embudo para llevar finalmente el material obtenido a un matraz de 500 ml. una vez que se desplaza todo el líquido se exprime la gaza para transferir el resto de líquido. La suspensión después se transfiere a tubos de polipropileno de 15 ml. de capacidad (con tapa roscada) que serán centrifugados a 1,500 rpm por 5 minutos y al término del proceso se decanta el sobrenadante para aclarar la muestra y el sedimento de los tubos se va recuperando y concentrando gradualmente en menos tubos para alcanzar la mayor concentración de huevos en el menor número de tubos de modo que esto puede llevar varios pasos de centrifugación para lograr el máximo de concentración. A continuación los tubos se llenan con solución saturada de sacarosa para diluir el sedimento y se llenan casi al borde dejando un espacio de aproximadamente 2 ml. de volumen y ahora se les colocan las tapas y nuevamente se someten a centrifugación a 1500 rpm por 5 minutos, este paso permite que la fuerza de la gravedad y la densidad de la solución hagan flotar los huevos ahora y estos se pueden recuperar por medio de una asa bacteriológica aplicada a la superficie y el material recuperado se transfiere ahora a tubos de polipropileno con agua purificada, se requieren en promedio 10 asadas para obtener el máximo de recuperación de huevos y es muy importante que el procedimiento se realice lo más pronto posible porque una vez iniciado el embrionado del huevo las paredes de los huevos sufren cambios que modifican la permeabilidad a los antiparasitarios por lo que se afecta notablemente el efecto ovicida esperado, por lo anterior si se ha iniciado el embrionado o ya se han desarrollado larvas el material es no apto para seguir el proceso. Una vez recuperados los huevos se determina su concentración por ml. y esto se logra tomando 12 muestras de 20 µl de la suspensión obtenida que se depositan entre porta y cubreobjetos para hacer el conteo de cada muestra (considerando la tendencia a sedimentar de las estructuras parasitarias en el medio acuoso debe hacerse una resuspensión cada dos muestras) por lo que al final tendremos 12 datos de los cuales debe eliminarse el valor más alto y más bajo obtenido para acercarse al promedio de modo que con los 10 datos restantes obtenemos el valor promedio en ese volumen de agua y a partir de esto calcular el número de estas estructuras por ml. En el diseño de la prueba se ha determinado que la suspensión de huevos debe tener una concentración de 200 huevos por ml. La prueba se desarrolla en placas de poliestireno de 24 pozos de manera que se requiere de un volumen de 24.5 ml. conteniendo 4,800 huevos, conteniendo 200 huevos por ml. que serán distribuidos en los 24 pozos, la concentración de huevos en la suspensión se puede ajustar aplicando la siguiente fórmula: Vi(Ci)= Vf(Cf) Donde: Vi es igual al volumen inicial Ci es igual a la concentración inicial Vf es igual al volumen final Cf es igual a la concentración final De manera que siguiendo el razonamiento la fórmula se despeja a Vi= Vf (Cf)/Ci de modo que si se hace la sustitución de los datos se puede determinar qué

62 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México volumen de la suspensión que se obtuvo se requiere para lograr obtener un volumen de 24.5 ml. conteniendo los 200 huevos por ml. Habiendo obtenido la materia prima para desarrollar la prueba de inhibición de eclosión en principio formulando soluciones concentradas y a partir de ellas soluciones de trabajo usando Tiabendazol grado reactivo usando Dimetil Sulfóxido (DMSO) como diluyente que deben almacenarse en tubos de polipropileno de 15 ml. con tapa hermética y estas pueden ser preservadas hasta por dos semanas en congelación desarrollando el siguientes esquema de diuciones.

Esquema de diluciones necesarias para desarrollar la prueba de inhibición de eclosión de huevos. Solució Preparación Concentración Concentración Final n Sol. A 50mg Tiabendazol+5ml DMSO 10 mg./ ml. Sol. B 1 ml. Sol. A + 9 ml. DMSO 1 mg. / ml. St.1 20 µl. Sol. B + 9.98 ml. de 2 µg / ml 0.01 DMSO St.2 50 µl. Sol. B + 9.95 ml. de 5 µg / ml 0.025 DMSO St.3 100 µl. Sol. B + 9.9 ml. de 10 µg / ml 0.05 DMSO St.4 200 µl. Sol. B + 9.8 ml. de 20 µg / ml 0.1 DMSO St.5 400 µl. Sol. B + 9.6 ml. de 40 µg / ml 0.2 DMSO St.6 600 µl. Sol. B + 9.4 ml. de 40 µg / ml 0.3 DMSO St.7 1000 µl. Sol. B + 9 ml. de 100 µg / ml 0.5 DMSO St.8 800 µl. Sol. B + 4.5 ml. de 160 µg / ml 0.8 DMSO St.9 1000 µl. Sol. B + 4 ml. de 200 µg / ml 1 DMSO St.10 300 µl. Sol. B + 4.7 ml. de 600 µg / ml 3 DMSO St.11 500 µl. Sol. B + 4.5 ml. de 1000 µg / ml 5 DMSO St.12 1000 µl. Sol. B + 4 ml. de 2000 µg / ml 10 DMSO ST= Solución de trabajo, SA y SB= Concentrados, ST1 a ST7 Soluciones estándares

La prueba se desarrolla depositando inicialmente 900µl de agua purificada en cada pozo más 10 µl de cada una de las siete primeras soluciones de trabajo estándar de Tiabendazol o 10 µl de DMSO en el caso de los controles, después se agregan 1000 µl de la suspensión de huevos (200 huevos / ml.) todo esto se hace por triplicado partiendo de izquierda a derecha con el triplicado del control, pasando a cada una de las soluciones de trabajo hasta completar los 24 pozos. Debiendo considerarse un efecto de 0 a 90% pudiendo usarse concentraciones adicionales. A continuación se lleva a cabo la incubación en estufa a 28° por 48

63 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México horas colocando las placas cerca del termostato para mejores resultados, al término deben agregarse dos gotas de Lugol por pozo con el fin de inactivar todas las fases en evolución y se procede a depositar las suspensiones recuperadas de los pozos en cámaras de Mc Master con el fin de contabilizar huevos y larvas presentes debiendo homogeneizar la suspensión agitando la placa y transferirla por medio de jeringa insulínica a la cámara de Mc Master (se requiere por el volumen a revisar de usar dos cámaras para cada pozo), la observación es con el objetivo de 10 X y debe revisarse el fondo de la cámara en razón de que las estructuras sedimentan quedando en el fondo. Se debe contar las larvas visualizadas fuera del huevo o en proceso de eclosión, los huevos con paredes intactas se toman como tales. Tomando los resultados se calcula el porcentaje de eclosión aplicando la fórmula: Inhibición de la eclosión = 100-eclosión. Donde: eclosión= (larvas 1 detectadas) (huevos + larvas 1) X 100

Debe considerarse el valor de los controles en función de que normalmente hay un porcentaje de huevos no viables por lo que en estos debe producirse una eclosión de al menos el 70%, si no se cumple esta condición la prueba debe repetirse. Las concentraciones letales 50, 95 y 99 se calculan por medio de un análisis Probit usando el programa Polo Plus ® (Le Ora Software, 2004). El criterio final de resistencia es positivo cuando se detecta una concentración letal que sea mayor a 0.1 µg y la concentración letal 95 mayor a 0.1 µg como un parámetro de resistencia temprana. Finalmente se puede determinar el índice de resistencia dividiendo la concentración letal 50 o 95 entre esas mismas concentraciones pero de poblaciones susceptibles plenamente identificadas y esto permite establecer cuantas veces es más resistente.

Prueba de inhibición de la migración larval.

Esta prueba es útil para determinar resistencia por los nematodos gastroentéricos a los imidazotiazoles y a las avermectinas específicamente y se asocia a la capacidad de estos principios para inhibir la motilidad en los nematodos cuando estos son incubados en diferentes concentraciones de los antiparasitarios. Por lo que al determinarse el nivel de inhibición de la motilidad al desplazarse los estadios larvarios a través de tamices es factible determinar la concentración letal 50, 95 y 99 de una población determinada y compararla contra otra susceptible.

En primer lugar deben obtenerse las muestras de heces pudiendo recolectarse directamente del animal o bien colocar un calzón de lona que permite retener un volumen abundante de materia fecal con el fin de que se produzca el mínimo de contaminación con otros tipos de materiales que pueden ser retirados en caso de estar presentes suspendiendo los bolos fecales en agua, y dado que tienen la particularidad de flotar se puede recuperarlos ya libres de algún tipo de contaminación.

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Las heces libres de contaminantes son depositadas en cajas Petri y no es necesario algún tipo de homogeneizado debiendo mantenerse intacta la estructura de los bolos fecales. La caja debe mantenerse en estufa de cultivo a 28°C por un lapso de 4 a 7 días dependiendo si se trata de organismos obtenidos de clima templado o cálido, las heces deben mantenerse permanente húmedas por lo que deben revisarse diariamente para mantener esta condición sin exagerar el nivel de humedad lo cual puede realizarse por medio de un atomizador común. Pasado el tiempo de incubación las larvas se recuperan mediante un aparato de Baermann convencional en el que se deposita agua purificada hasta la mitad de su capacidad, se recomienda colocar sobre el embudo una servilleta de papel en primer lugar que cubra íntegramente su interior, encima se deposita un cuadro de gaza cubriendo también íntegramente el interior del embudo, a continuación se depositan las heces, incluso la caja de Petri que las almacenó se enjuaga con agua y a continuación se vierte sobre el aparato de Baermann, posteriormente la muestra se cubre con los bordes de la gaza la muestra, la cual a continuación se cubre totalmente con agua sin provocar derrames y se dejan pasar tres horas, tiempo que requieren las larvas para migrar del bolo fecal, atravesar la servilleta y sedimentarse en el fondo del tubo acoplado a la manguera de látex, pasadas las tres horas se separa el tubo que presenta las larvas sedimentadas en el fondo, a veces visibles otorgando turbidez a esa zona o dando un aspecto blanquecino de modo que puede retirarse el sobrenadante de los tubos mediante una pipeta y se puede determinar su concentración siguiendo el mismo procedimiento descrito en la técnica previa lo cual permite establecer la concentración promedio en un volumen de 20µl y con una regla de tres se determina la cantidad por 1000 µl. Para desarrollar la técnica se deben preparar las soluciones madre de ivermectina grado reactivo (18898 sigma) que debe diluirse con DMSO (D8418 Sigma), la solución madre y las de trabajo de levamisol se preparan con agua y solo son estables para el día en que se preparan en viales de 2.5ml.

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Forma de preparación de las soluciones concentradas y de trabajo para realizar la prueba de inhibición de migración de larvas.

SOLUCIÓN PREPARACIÓN CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DE FINAL LA SOLUCIÓN EN LOS POZOS Sol. A 10 -2 M 8.71 mg Iv./Lev + 1 de 8.7 mg/ml ------DMSO/Agua C1 30µl Sol A Iv./Lev + 120 µl de 2 X 10-3 M ------DMSO/Agua C2 50µl Sol A Iv./Lev + 450 µl de 10-3 M ------DMSO/Agua C3 200µl de 10-3 M Iv./Lev + 800 2 X 10-4 M ------µl de DMSO/Agua C4 100µl de 10-3 M Iv./Lev + 900 10-4 M ------µl de DMSO/Agua C5 20µl de 10-3 M Iv./Lev + 980 µl 2 X 10-5 M ------de DMSO/Agua C6 10µl de 10-3 M Iv./Lev + 990 µl 10-5 M ------de DMSO/Agua C7 20µl de 10-4 M Iv./Lev + 980 µl 2 X 10-6 M ------de DMSO/Agua C8 10µl de 10-4 M Iv./Lev + 990 µl 10-6 M ------de DMSO/Agua C9 20µl de 10-5 M Iv./Lev + 980 µl 2 X 10-7 M ------de DMSO/Agua C10 10µl de 10-5 M Iv./Lev + 990 µl 10-7 M ------de DMSO/Agua ST1 100 µl de C1 + 900 µl Agua ------10-6 (4) ST2 100 µl de C2 + 900 µl Agua ------5 X 10-6 (2) ST3 100 µl de C3 + 900 µl Agua ------10-6 (1) ST4 100 µl de C4 + 900 µl Agua ------5 X 10-7 (0.8) ST5 100 µl de C5 + 900 µl Agua ------10-7 (0.6) ST6 100 µl de C6+ 900 µl Agua ------5 X 10-8 (0.4) ST7 100 µl de C7 + 900 µl Agua ------10-8 (0.2) ST8 100 µl de C8 + 900 µl Agua ------5 X 10-9 (0.1) ST9 100 µl de C9 + 900 µl Agua ------10-9 (0.08) ST10 100 µl de C10 + 900 µl Agua ------5 X 10-10 (0.06) CONTROL(- 100 µl de DMSO + 900 µl ------)IVM Agua CONTROL(-) 100 µl de Agua + 900 µl Agua ------LEV

La estrategia a seguir entonces es la siguiente: en microplacas de 24 pozos similares a las usadas en la técnica descrita previamente se depositan 1700µl de agua purificada en cada pozo adicionando además 90 µl de cada una de las soluciones de trabajo (IVM o Levamisol) y 90 µl de solución control sin antihelmíntico. Para el control positivo se usan 90 µl de la solución A o de Lugol a continuación a cada pozo se le agregan 20 µl de una suspensión con una concentración de 6000/ ml. y cada dilución se maneja por triplicado. La distribución

66 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México de las diluciones debe tener un orden secuencial ubicando al control negativo en los tres pozos superiores izquierdos, el control positivo en los pozos superiores derechos y a partir de ese punto se comienza con la solución más concentrada de antiparasitario en la segunda línea superior izquierda, siguiendo con las diluciones mayores en los pozos subsecuentes. Estas placas se incuban por 24 horas a 28°C por 24 horas y se prepara otro par de microplacas denominadas de migración, estas placas se acondicionan colocando 400µl de bactoagar al 1.5% en cada pozo que al enfriarse se solidifica debiendo prepararse dos placas de migración por una de incubación, nuevamente después de 24 horas de incubación el contenido de cada pozo de la microplaca de incubación se transfiere a la placa de migración y cada pozo de esta microplaca esta cubierto con una malla de 25 µm y esas placas deberán nuevamente de ser incubadas por 24 horas con la finalidad de que las larvas que fueron depositadas previamente desarrollen su migración de los tamices a los pozos de la nueva placa y pasado el lapso de incubación se cambian de línea (los ubicados en la línea A pasan a la C y los ubicados en la B pasan a la D), pasado ese tiempo cada tamiz se enjuaga con un ml. de agua y su contenido se vierte en el pozo correspondiente, ese volumen posteriormente se colecta y vierte en la cámara de Mc Master para realizar el conteo de larvas. Para llevar a cabo este último paso se deposita una gota de Lugol en cada pozo para inmovilizar a las larvas presentes de las filas A y C que son las que migraron y de las que no migraron en las filas B y D usando las cámaras de Mc Master (toda la superficie del fondo) y usando el objetivo 10 X. Una vez que se realiza el conteo se puede hacer el cálculo porcentual de migración larvaria para cada una de las diluciones usadas de antiparasitario empleando la siguiente fórmula citada por Demeler, 2010: ML= (L3 en tamiz/L3 migradas + L3 en tamiz) X 100

Las concentraciones letales 50, 95 y 99 se calculan empleando el programa Probit mediante el programa Polo Plus® (Le Ora Software, 2004). Ya obtenida esta información esas concentraciones letales pueden ser comparadas con las de cepas de referencia con susceptibilidad confirmada que se han obtenido de estudios de campo o han sido aisladas a nivel de laboratorio, esto permite determinar el índice de resistencia que se obtiene dividiendo la concentración letal 50 o 95 de la población estudiada entre la concentración letal 50 o 95 de la población de referencia y este dato indica cuantas veces es más resistente la población estudiada que la de referencia.

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Concentraciones letales 50 (IC50%) e intervalos de confianza al 95% (IC 95%) obtenidos en pruebas de inhibición de la migración larvaria en aislados de algunos nematodos gastrointestinales.

Aislamiento CL 50 CL 95 Estatus Mc Master (H. 914.4 nM 820.7-1019nM IVM susceptible contortus)* CAVR (H. contortus)* 7679 nM 6872-8591 nM IVM susceptible Cooperia oncophora susɟ 107 nM 98.4-117.9 nM IVM susceptible Cooperia oncophora serɟ 886 nM 823.5-953.3 nM IVM resistente Cooperia oncophora susɟ 452 nM 385-532 nM LEV susceptible Cooperia oncophora resɟ 1270 nM 1070-1510 nM LEV resistente Ostertagia ostertagi susɟ 307.7 nM 282.28-334.9 nM IVM susceptible 832 nM 710-975 nM LEV suceptible *ovino ɟ bovino (valores de referencia tomas de Demeler et al,2010, citado por Torres et al).

Otra prueba planteada es el ensayo de adhesión a la tubulina, una proteína que integra el esqueleto celular en los nematodos, su utilidad se ha planteado específicamente cuando se sospecha de resistencia a los bencimidazólicos que selectivamente se unen a esta proteína afectando su repolimerización, desorganizando la estructura de las células para afectar las funciones del parásito y causarle la muerte. Este sistema es más complejo pues requiere de extraer la tubulina del cuerpo de los parásitos adultos de larvas o huevos, la cual debe incubarse con el bencimidazólico tritiado hasta alcanzar un equilibrío, el exceso de antiparasitario debe removerse con carbón y la marca de tritio que se logra al darse la unión tubulina-bencimidazólico puede ser detectada por medio del sistema de espectroscopía de centelleo. La tubulina de los nematodos resistentes tiene mucho menor afinidad a los antiparasitarios y se une de una forma débil a ellos, sus desarrolladores la plantean como una técnica rápida, eficiente, sensible y altamente repetible para la detección de resistencia pero requiere de grandes cantidades de organismos para extraer la proteína y no es muy adecuada para su desarrollo rutinario, con el inconveniente de requerir además de aparatos costosos en muchos sentidos.

Técnicas moleculares.

Estas técnicas representan la vanguardia en la investigación en torno a la detección de resistencia y sus orígenes iniciaron con extensos estudios que primero permitieron estudiar la estructura general del genoma de los gusanos y que en principio el conocimiento decidió enfocarse a detectar la presencia de los organismos en los animales y ahora ya con una importante infraestructura se están enfocando a la identificación de marcadores moleculares de resistencia presentes en los parásitos que pueden ser de utilidad en la exploración del nivel de eficacia que presenté un antiparasitario determinado, la condición en la que

68 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México está funcionando un producto determinado y como ocurre la dinámica de evolución del proceso de resistencia. Estos marcadores en un momento dado pueden estar ligados a los receptores blanco, al metabolismo de los principios activos y algunos otros aspectos. Enfocado a este objetivo se ha creado un consorcio multinacional de trabajo enfocado a la exploración de la resistencia y susceptibilidad a nivel molecular (CARS) (Coles y Cols. 2006).

La evolución de las investigaciones en este sentido ha llevado a estudiar las mutaciones presentes en los receptores de los antiparasitarios que pueden estar ligados con la resistencia, en este sentido ya se han detectado mutaciones en los genes codificadores de los receptores de los canales de cloro ligados al glutamato presentes en las neuronas y células musculares de Hemonchus contortus que están ligados a la parálisis flácida en el caso de las lactonas macrocíclicas (subunidades de gene GluClἀ3B), observado también en los receptores del ácido gama amino butírico. Esto aparentemente está ligado a dominios relacionados con receptores de proteínas en los que se detecta presencia o ausencia de ciertos aminoácidos de forma individual en los que se depositan otras variantes de estos que forman cadenas en los organismos resistentes. Este aspecto que puede explicar un fenómeno de resistencia en un género y especie puede no ser válido para otro como ha ocurrido con Cooperia oncophora. Al final al parecer existen polimorfismos genéticos muy variables que se han encontrado ligados al desarrollo de resistencia relacionados con los receptores de glutamato y del ácido gama amino butírico, pero no hay uno específicamente que permita explicar esta condición. Otros estudios encontraron evidencia de la activación de algunos genes frente a dosis elevadas y otros frente a dosis bajas y finalmente que el proceso de resistencia puede asociarse a la mutación de genes múltiples generando un mecanismo genético aditivo. Sin embargo los resultados de otros trabajos en Australia sugieren que un solo alelo dominante puede asociarse al fenómeno. En conclusión los trabajos recientes en genómica abren posibilidades para identificar los genes de resistencia empleando procesos rápidos y económicos que se están perfeccionando. En bencimidazoles el proceso de resistencia se explora en el polimorfismo de un nucleótido asociado al isotipo 1 de laβ tubulina en el que se observó un cambio en el codón 200 (F200Y SNP) esto hace de los bencimidazólicos el grupo en el que la resistencia esta mejor entendida y que ha sido estudiada a nivel de campo y de acuerdo con los resultados obtenidos concluyen que este tipo de pruebas generan un ahorro sustancial respecto a la prueba de conteo de huevos, en cuanto tiempo, esfuerzo para detectar poblaciones resistentes a los bencimidazólicos antes de aplicar los tratamientos empleando un ensayo denominado de pirosecuenciación y otro denominado ARMS-PCR (Esta técnica ofrece ventajas porque los nucleótidos no se depositan juntos como en una reacción de secuenciación normal, sino uno después del otro. Si el nucleótido añadido al medio de reacción corresponde al que necesita la polimerasa, se incorpora a la cadena que se está sintetizando (elongamiento) y se libera un pirofosfato. A continuación, una ATP sulfurilasa transforma este pirofosfato (PPi) en ATP, que se acoplará a la luciferina, formando

69 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México un complejo que será utilizado por una luciferasa. Como resultado se produce oxiluciferina y una señal luminosa. Finalmente, una apirasa se encarga de degradar aquellos nucleótidos que no han sido incorporados y quedan sueltos con el fin de que al añadir un nuevo dNTP, no existan restos de reacciones anteriores. Es el secuenciador o más precisamente el sensor CCD, el que captura esta señal lumínica y lo reproduce como un pico en un pirograma. La altura de este pico variará en función de la intensidad de la señal luminosa, que a su vez es proporcional al número de nucleótidos incorporados. De esta forma se puede deducir la secuencia partiendo del tamaño de los picos obtenidos. Si hay un polimorfismo en una secuencia no habría problemas para detectarlo pues el tamaño de los picos también es proporcional a las cadenas portadoras de un nucleótido u otro. Estos picos de luz son leidos en un secuenciador 454 de la empresa Roche.)(Coles y Cols, 2006, Kotze y Pritchard, 2016).

En el caso de los imidazotiazoles y el pirantel el blanco terapéutico son los receptores nicotínicos de la acetilcolina que están compuestos por 5 subunidades que juntas forman un canal transmembranal de iones, ese canal es abierto normalmente por un ligando que normalmente es la acetilcolina que permite el paso de Sodio y Calcio provocando una respuesta fisiológica, estos receptores se han encontrado en las células somáticas musculares, los músculos faríngeos y en las células nerviosas. La apertura de estos canales origina una despolarización de la fibra muscular y su contracción. En las unidades pentaméricas se presenta alta variabilidad entre un gran número de nematodos parásitos y las combinaciones que se producen dan origen a receptores que son farmacológicamente distintos y sensibles a diferentes antiparasitarios colinérgicos. Los canales que forman los receptores en H. contortus y Oesophagostomun dentatum se ha determinado que están compuestos por cuatro diferentes subunidades (UNC-29, UNC-38, UNC-63 y ACR-8) y una de esas subunidades se repite para formar el pentámero, se ha observado que las diferentes combinaciones de las subunidades dan origen a patrones con diferentes propiedades farmacológicas, así la expresión de UNC-63 y UNC-29 originan el receptor que es sensible al pirantel y a la tribendimidina pero no es sensible al levamisol o la acetilcolina. Si la subunidad receptor ACR-8 se coexpresa con UNC-63,UNC-28 y UNC-29 se hace más potente la reacción a acetilcolina, si las subunidades UNC-63, UNC-29 y UNC-38 se expresan el receptor es más sensible al pirantel que al levamisol y si las cuatro subunidades se coexpresan entonces aparece una mayor sensibilidad al levamisol se expresa, entonces se concluye que los diferentes subtipos de receptores pueden producir diferentes combinaciones y susceptibilidad a los fármacos. Pero recientemente se ha observado que el efecto de contracción muscular del levamisol puede ser inhibido parcialmente por los receptores de otra molécula; la rianodina que eventualmente puede modular el efecto del levamisol y en un momento dado puede asociarse al desarrollo de resistencia también. La resistencia al levamisol parece estar ligada a muchos genes asociados a la ruta de señalización de la contracción muscular que se traducen en una reducida expresión de las subunidades que forman los canales transmembranales reduciendo la

70 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México susceptibilidad a los antiparasitarios por ejemplo formas isoformas abreviadas de UNC-63 en H. contortus, T. circumcincta y T. colubriformis detectados como resistentes al levamisol que se ha demostrado a nivel de laboratorio que tienen un efecto dominante negativo en la expresión de los canales transmembranales. Sin embargo existen una serie de estudios evaluando otros aspectos de la estructuración de las subunidades que forman el pentámero que indican la existencia de múltiples mecanismos que se asocian a grados variables de resistencia dentro de la misma población por lo que la resistencia a antiparasitarios colinérgicos es poligénica más que un mecanismo unigénico, que involucra los cambios en la expresión de las subunidades de los canales transmembranales , subunidades truncadas y mutaciones en las subunidades receptoras, lo cual complica la posibilidad de desarrollar herramientas diagnósticas efectivas para la detección de resistencia a este tipo de antiparasitarios por lo que todavía es preciso profundizar en el estudio de todos estos aspectos hasta lograr herramientas realmente eficaces en la identificación de resistencia (Coles y Cols, 2006).

A lo anterior debe agregarse otra variable que son los mecanismos de transporte de los antiparasitarios que se ha determinado que pueden estar asociados al desarrollo de resistencia al generar un rebombeo al exterior de los productos antiparasitarios y que le confieren ventajas también a los organismos parasitarios. En función a la variabilidad que se observa en los mecanismos a nivel molecular asociados al desarrollo de resistencia por los nematodos en los que todavía hay mucho camino por recorrer que hacen todavía muy difícil tener acceso a pruebas que permitan su uso rutinario, debiendo profundizar entonces en el desarrollo de las pruebas de PCR a tiempo real con el apoyo del proceso de pirosecuenciación que permitan desarrollar identificar y secuenciar porciones grandes del material genético de los organismos a gran escala para detectar los genes incluso con aplicación a genomas completos, mediante luminicencia (Kotze y Pritchard, 2016). El futuro es prometedor en lo que refiere al uso de técnicas de biología molecular que permitirían desarrollar sistemas con los que rápidamente podría identificarse este fenómeno pudiendo eventualmente sustituir a los disponibles en este momento.

Referencias

Anónimo,(2004), Module 2: Anthelmintic Resistance: Diagnosis, management and Prevention. Food and Agriculture Organization of The United Nations, Rome.78-118. Anónimo, (2008), Memoria 4o Seminario Internacional sobre métodos alternativos para el control de parásitos helmintos en la ganadería: “Manejo o control de parásitos, nuevos paradigmas en el control integrado”, Mérida Yucatán, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán.

71 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Coles G,C., Bauer C., Borsgstede F.H.M., Geerst S.,Klei T.E., Taylor M.A., Waller P.J., (1992) World Association for advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.)methods for detection ofanthelmintic resistancein nematodesof veterinary importance, Vet. Parasitol. 44, 35-44. Coles G.C., Jackson F., Pomroy W.E., Prichard R.K., Von Samson G., Silvestre A., Taylor M.A., Vercruyse J., (2006), The detection od anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance, Vet. Parasitol., 136, 167-185. De Graef J., Claerebout E., Geldhof P., (2013), Anthelmintic resistance of gastrointestinal cattle nematodes, Vlams Diergenescundig Tijdschift, 82, 113-123. Gasbarre L.M., Smith L., Hoberg E., Pilitt P., (2009), Further carcaterizatiion of a cattle nematode population with demonstrated resistance to current anthelmintics, Vet. Parasitol., 166, 275-280. George M.M., Paras K.L., Howell S.B., Kaplan R.M., (2017), Utilization of composite fecal samples for detection of anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of cattle, Vet. Parasitol., 240, 24-29. Jabbar A., Iqbal Z., Kerboeuf D., Muhammad G., Khan M.N., Afaq M., (2006), Anthelmintic resistance: The state of play revisited, Life Sciences, 79, 2413- 2431. KaplanR.M., (2004) Drug resistance in nematodes of veterinary importance: a status report, Trends in Parasitol., 20-10, 477-481. Kotze A:C., Pritchard R.K., (2016) Anthelmintic Resistance in Haemochus contortus, History, Mechanisms ad Diagnosis, Advances in Parasitology, 397-420. Ramos F., Pires P.L., De Souza R.F., Zamperete R.C., Potter L., SkrebskyA.C., Sangione A., Silveira F. F., (2016), Anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of beef cattle in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, Int. J. for Parasitol., Drugs and Drug Resistance, 6, 93-101. Roeber F., Jex A.R., Gasser R.R., (20013), Next Generation Molecular Diagnostic Tools for Gastrointestinal Nematodes of Livestock, with Enphasis on Small Ruminants: A Turning Point. Advances in Parasitology, Vol. 83, 287-333. SuárezV.H., Cristel S.L., Anthelmintic resistance in cattle nematodein the western Pampeana region of Argentina, (2007), Vet. Parasitol.144, 111-117. Sutherland I.A., Leathwick D. M., (2011), Anthelmintic Resistance in nematodes parasites of cattle: a global issue?, Trends in Parasitol. 27, 176-181. Taylor M.A., Hunt K.R., Goodyear K.L., (2002), Anthelmintic resistance methods, Vet. Parasitol., 103, 183-194. Torres A. J.F, Chan P. I., López A. M.E., Rosado A.J.A., Soberanes Cespedes N., Neri O. S., Alonso Díaz M.A., Martínez I. F., Osorio M. J., Vargas M. J.J., Encalada M. L., (2015), Diagnóstico de Resistencia a los Antiparasitarios en Rumiantes, en Manual de Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Roger Ivan Rodríguez Vivas, Editor, Primera Edición Electrónica, certificado 03-2015-052012064400-01

72 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

ESTUDIOS DE INTERACCIÓN MOLECULAR ENTRE ANTIHELMÍNTICOS Y RECEPTORES CON RELACIÓN A LA RESISTENCIA EN NEMATODOS GASTROINTESTINALES

MOLECULAR INTERACTION STUDIES BETWEEN ANTHELMINTICS AND RECEPTORS ASSOCIATED TO GASTROINTESTINAL NEMATODES RESISTANCE

López AME*1, Ramírez VG1, Olmedo JA1, Mendoza GP1 y Aguilar ML1 1Centro Nacional de Investigación en Parasitología Veterinaria, INIFAP. Carr. Fed. Cuernavaca-Cuautla Núm. 8534, Col. Progreso, Jiutepec, Mor., Mëxico, C.P. 62156. [email protected]

Palabras claves: Nematodos, Antihelmínticos, Mecanismo de acción, Resistencia, Rumiantes INTRODUCCIÓN

NEMATODOS: Los nematodos gastrointestinales (ngi) de rumiantes son patógenos pluricelulares que habitan el tejido y la luz del tracto pulmonar y gastrointestinal. Durante la invasión al hospedero rompen el tejido para finalizar su desarrollo y adquirir nutrientes, provocando daños tan severos que podrían llegar a causar la muerte, o en la mayoría de los casos, quedar como casos crónico; situaciones que se evitan a través de tratamientos con fármacos Antihelmínticos, AH (Angulo et al., 2010). Los principales ngi son Haemonchus, Ostertagia/Teladorsargia, Cooperia, Oesophagostomum, y Trichostrongylus, por su alta prevalencia en condiciones de clima, templado y tropical y patogenicidad (Vázquez et al., 2004). La mayoría de ngi presenta un ciclo de vida directo e involucra dos etapas: 1) ngi de vida libre, se alimentan de detritus en heces y conforme evolucionan se denominan larva uno, dos y tres, ésta última también se conoce como larva infectante (L3); 2) ngi parásito ó estadios endoparásitos que se alimentan de tejido y se conocen como larva cuatro, cinco (L4, L5) y adulto (Soulsby 1982). La patogenia de las nematodosis se caracteriza por disminución del volumen celular aglomerado debido a la presencia de nematodos hematófagos (ej. Haemonchus, Ostertagia, Mecistocirrus) y por causar inflamación en el tracto gastrointestinal al invadir el tejido y causar ruptura. Asi mismo, los nematodos se presetan durante la infección como un complejo de patógenos con múltiple mecanismos de evasión inmunte que pueden llevar a la muerte a los hospederos (Soulsby, 1982). Por décadas, el control de estos patógenos se realiza con fármacos antihelmínticos con efecto nematicida alrededor del 100%. Sin embargo,

73 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México el incremento de resistencia a antiparasitarios ha disminuido la eficacia de los mismos, dificultado su control. Sin embargo, es importante conservar la toxicidad de productos antihelmínticos e integrar otras estrategias de control. A continuación se describe la función de los principales antihelmínticos y su relación con la resistencia antiparasitaria.

ANTIHELMÍNTICOS: A la fecha, los antihelmínticos son productos de gran valor en salud animal debido a su amplio espectro de acción en contra de ngi y otros helmintos (cestodos y trematodos) e incluso en contra de protozoarios y/o ectoparásitos (Wolstenhome & Martin, 2014). Entre los principales fármacos se encuentran los derivados de Imidazotiazoles (IMZ), Bencimidazoles (BZ) y Lactonas Macrocíclicas (LM), cuyo efecto nematicida se demostró a partir de los años 50´s para los BZ, seguido por los IMZ y los más recientes fueron las LM (Brown et al., 1961, Herrera & Cheney, 1982, Sangster, 1999). El modo de acción de estas drogas no está aún bien definido en algunos casos, pero su estudio involucra proteínas (enzimas y proteínas celulares) en los sitios diana, incluyendo los canales iónicos, dónde se han observado cambios ultra-estructurales que afectan el transporte de vesículas citoplasmáticas, entre ellas a los Fármacos (Borges & De Nollin, 1975).

La familia de IMZ son AH utilizados en el control de nematodos pulmonares y ngi. Su acción es sobre el sistema nervioso, específicamente en la unión a receptores nicotínicos como la acetilcolina (nAchR). La unión de IMZ al nAchR incrementa la actividad de la bomba sodio/potasio, causando despolarización y parálisis muscular de nematodos (Martín et al., 1996, 1998). El porqué de la pérdida de toxicidad de IMZ aún está en estudio, pero se han notificado cambios puntuales en los genes Lev y unc como resultado de resistencia (Khöler 2001, Sarai et al., 2014). Los mecanismos de toxicidad y resistencia a BZ son los mejores comprendidos a la fecha. Los BZ tienen afinidad por los receptores alfa y beta del gen beta-tubulina en el isotipo-1 de los microtúbulos celulares (estructura involucrada en la mitosis, motilidad y transporte de vesículas plasmáticas) de nematodos. La toxicidad de BZ induce a la muerte del nematodo al inhibir el ensamblaje y funcionalidad microtúbulos. Sin embargo, los mecanismos de detoxificación AH son el resultado de cambios puntuales en el gen beta-tublina, principalmente en el codón 200 (TAC) en diferentes poblaciones de ngi resistentes a BZ de animales domésticos, razón por la que se considera un posible marcador molecular (Kotze et al., 2014).

Respecto a las LM, el sitio diana de las LM (avermectinas y milbemicinas) es en células musculares y del sistema nervioso (SN), sin embargo su modo de acción aún no está bien establecido. A concentración nanomolar, la IVM inhibe la motilidad del nematodo, adquisición de nutrientes, y actividad reproductiva. La acción de IVM es a nivel de los receptores localizados en los canales iónicos del cloruro de glutamato, GluCIRs. Los GluClRs no están presentes no están presentes en vertebrados y se piensa que existe un margen de seguridad

74 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México del efecto de IVM. Sin embargo, a concentraciones micromolares la IVM puede interactuar con otros canales de intercambio iónico en invertebrados y vertebrados, por ejemplo el ácido gamma-aminobutírico, GABA, glicina y gly, e incluso se menciona a los receptores nicotínicos (Wolstenholme et al., 2005).

La unión de fármacos derivados de LM, como Ivermectina, a los receptores causa hiperpolarización, lo que induce parálisis muscular y muerte del nematodo (Martín et al. 1996). La forma en que las LM actúan aún no está definida; uno de los problemas a los que se ha enfrentado es la concentración del fármaco para su estudio, la cual es muy alta, y esto sucede con los receptores GABA y gly para poder determinar su función en la resistencia. Además, no se consideran buenos receptores porque hasta la fecha, sólo se han observado polimorfismos (glc para GABA, y M3 para gly) en aislamientos de ngi presionados bajo condiciones experimentales y no de campo. Respecto a GluCIRs, mayor número de estudios se han realizado porque no requiere alta concentración del fármaco para determinar la dosis letal. Los polimorfismos del GluCIRs se han detectado en el gen avr-14B en aislados de ngi resistentes a LM bajo condiciones de presión en laboratorio y en campo, pero, no se ha mostrado la relación de éste gen con poblaciones de nematodos con fenotipo de resistencia (Wolstenhome et al., 2011, El-Abdellati et al., 2011). Otro gen de gran relevancia involucrado en la toxicidad de ivermectinas son las P-glicoproteínas (Demeler et al., 2013).

Las P-gp son proteínas de membrana y forman parte de la familia ABC (caja de unión de ATP), cuya función es la transportación de moléculas endógenas y exógenas, dependiente de la unión y/o hidrólisis de ATP, para lo cual utiliza diferentes sustratos como fármacos antihelmínticos. Los antihelmínticos son transportados para ser eliminados a través del intestino y conductos biliares con fines protectores del organismo, principalmente del sistema nervioso.

En particular, la P-gp contribuye al transporte de sustancias tipo lipofílicas, como sucede con algunos antihelmínticos conformados por lípidos como son BZ, LM e IMZ. Debido a este tipo de transportación y conformación bioquímica, la participación del gen P-gp está asociado a los mecanismos de detoxificación en ngi a los diferentes fármacos (AlGusbi et al., 2014). Además, la familia de las P-gp se caracteriza por conferir resistencia tipo múltiple hacia otras drogas (MDR) por participar en diferentes mecanismos de resistencia a drogas anti-cáncer y productos anti-bacterianos (Lage, 2003). En ngi se han identificado16 alelos asociados a resistencia a IVM en Haemonchus y Cooperia, pero sólo algunos, mostraron relación con el fenotipo de RA en campo. Entre los alelos identificados está la P-gp 1, 2, 6, 8, 9, 11 y 12 (Demeler et al., 2013). El estudio del mecanismo de acción de MDR en ngi muestra similitudes con los descritos en P-gp1 del nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans y con la actividad de los sustratos y sitios de unión en la P-gp en líneas celulares de líneas celulares de cáncer (Koteze et al., 2014). La actividad de P-gp como MDR como proteínas involucradas en la detoxificación antihelmíntica podría ser un posible blanco para

75 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México revertir la resistencia o para potencializar nuevos compuestos antihelmínticos, como son los derivados de plantas, con menor riesgo en salud animal.

DISPERSIÓN DE LA RESISTENCIA ANTIHELMÍNTICA: Los ngi que infectan a los rumiantes domésticos presentan múltiples mecanismos genéticos para tolerar la toxicidad de sustancias AH como se ha citado anteriormente. El problema que deriva de la resistencia antihelmíntica (RA) es la continuidad de infecciones por nematodos. El incremento de RA afecta severamente la salud animal y la economía de sector pecuario y farmacéutico. Todos los sectores relacionados a las prácticas de producción están consientes de que los fármacos comerciales son el único método de control en el mercado y que es necesario conservar su actividad nematicida. En forma indirecta, la RA también daña al sector de salud pública y al medio ambiente debido a la frecuencia de su uso y persistencia del efecto residual de los fármacos en alimentos derivados de origen animal y por problemas de ecotoxicidad (Jacobs, 2015).

A la fecha, los antihelmínticos son el único método de control comercial contra ngi. En 1961, Brown et al., presentaron con éxito el tiabendazol (derivado de bencimidazol), por su amplio espectro de acción en contra de ngi. A partir de entonces, otros antihelmínticos altamente efectivos derivados de las familias de los BZ, IMZ y LM fueron utilizados en contra de ngi (Herrera & Cheney, 1982, Sangster, 1999). Sin embargo, la eficacia de estos fármacos antihelmínticos empezó a disminuir debido a problemas de RA. El grupo de los BZ fueron los primeros en ser notificados con problemas de resistencia. Drudge et al., (1957), notificaron por primera vez resistencia a fenotiacina en ovinos infectados naturalmente a ngi. Los problemas de resistencia a otros antihelmínticos como levamisol (IMZ) e IVM se empezaron a observar en la década de los 1990´s contra ngi en ovinos (Gill & Lacey, 1998) y a partir de 1974 en bovinos hacia la IVM (Smith 1974). Así mismo, el problema de RA en rumiantes fue notificado por primera vez en nuestro país por Campos et al., (1990) a los BZ, seguido por la resistencia a IVM por Montalvo et al., (2006) y recientemente a Levamisol (LEV) derivado de IMZ por Alonso et al., (2014). Debido al hábitat de ngi, la dispersión de RA a BZ y LM sido notificada en regiones de clima templado y tropical (Encalada- Mena et al., 2014). A la fecha, las notificaciones de resistencia a BZ en México (Estados de Chiapas y Campeche) hacia los ngi demostraron cambios puntuales sólo en el codón 200 del gen beta-tubulina, asociada al fenotipo de resistencia (Encalada-Mena et al., 2014, Liébano-Hernández et al., 2015). Sin embargo, la diversidad de cambios genéticos en ngi está incrementando en poblaciones de ngi, algunos de estos polimorfismos están asociados a la resistencia a BZ, sugiriendo que es necesario aplicar estrategias de diagnóstico para monitorear las regiones y evitar la dispersión de problemas de resistencia, así como la presencia de resistencia tipo múltiple (Encalda-Mena et al., 2014, Zhang et al., 2017). Los derivados de BZ habían mostrado una tendencia a mantener el polimorfismo en el codón 200 del gen beta-tubulina, sin embargo, la presencia e incremento de otros polimorfismos, requieren de un monitoreo adecuado a interacción antihelmíntico

76 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México nematodo. Similar al problema por BZ, los derivados de LM e IMZ están incrementando; las notificaciones de resistencia incluyen diferentes polimorfismos, lo cual sugiere mayor dispersión a nivel mundial y por lo tanto se requiere aplicar estrategias de diagnóstico más sensibles, integración del manejo y tratamientos necesarios para el control de las nematodosis (Kenyon et al., 2017, Magbool et al., 2017).

DIAGNÓSTICO.

1) PRUEBA DE CAMPO. El diagnóstico de RA en campo se realiza siguiendo la metodología aprobada por la Asociación Mundial en Parasitología Veterinaria (Coles et al., 2006). La prueba de campo, Reducción de Huevos en Heces (Faecal Egg Count Reduction Test, FECRT) compara el número de huevos eliminados antes y después del tratamiento antihelmíntico. El número de grupos se deberá estimar con base a los fármacos a evaluar, considerando siempre un control. Cada grupo se conforma de 10 a 14 animales. El control no recibe tratamiento, sólo un placebo y los grupos tratados deberán seguir las indicaciones del fabricante. Previo a la etapa experimental, se debe considerar la realización de pruebas parasitológicas (McMaster, coprocultivo, PCR), peso de los animales, dosis del tratamiento, etc. (Coles et al., 1992). Muestras positivas a ngi serán cultivadas para la identificación de géneros (genotipificación por PCR o morfométrica).

2) PRUEBAS IN VITRO. Estas pruebas in vitro son más sensibles pero se contar con material biológico en estudio. Actualmente, se cuenta con diversas técnicas para medir la eficacia letal a través de la inhibición de desarrollo de huevo a larva, de larva uno a larva infectante y de la motilidad (Demeler et al., 2010).

3) REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). La sensibilidad de las técnicas moleculares de PCR son empleadas para determinar la discriminación alélica de RA a BZ (Silvestre and Humbert, 2002), identificación de genes asociados a RA (BZ, IMZ, LM) y para identificación de género de ngi.

Referencias

AlGusbi S, Krüchen Jürgen, Ramüneke S, von Samson-Himmelstjerna G, Demeler J, 2014. Analysis of putative inhibitors of anthelmintic resistance mechanisms in cattle gastrointestinal nematodes. Int J Parasitol 44, 647-58 Angulo-Cubillán FJ, García-Coiradas L, Cuquerella M, de la Fuente C, Alunda JM, 2007. Haemonchus contortus relationship-sheep: A review. Rev Científica, FCV-LUZ XVII, 577-87 Borges M, De Nollin S, 1975. Ultraestructural changes in Ascaris suum intestine after mebendazole treatment in vivo. J Parasitol 61, 110-22. Brown HD, Matzuk AR, Ilves IR, Peterson LH, Harris SA, Sarett LH, Egerton JR, Yakstis JJ, Campbell WC, Cuckler AC, 1961. Antiparasitic drugs. IV. 2-(4´- thiazoyl)-benzimidazole, a new anthelmintic.

77 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Campos, RR, Herrera, RD, Quiroz, RH, Olazarán, JS, 1990. Resistencia de Haemonchus contortus a bencimidazoles en ovinos de México. Téc Pecu Méx 28, 30-34. Demeler J, Krücken, AlGusbi S, Ramüneke S, De Graef J, Kerboeuf D, Geldhof P, Pomroy WE, von Samson-Himmelstjerna G, 2013. Pottential contribution of P-glycoproteins to macrocyclic lactone resistance in the cattle parasitic nematode Cooperia oncophora. Mol Biochem Parasitol 188, 10-9 Demeler J, Küttler U, El-Abdellati A, Stafford K, Rydzik A, Varady M, Kenyon F, Coles G, Höglund J, Jackson F, Vercruysse J, von Samson-Himmelstjerna G, 2010. Standarization of the larval migration inhibition test for the detection of resistance to ivermectin in gastro intestinal nematodes of ruminants. Vet Parasitol 174, 58-64 Drudge JH, Leland, SE, Wyant ZN, 1957. Strain variation in the response of sheep nematodes to the action of phenotiazine. I. Studies of mixed infections in experimental animals. Am J Vet Res, 133-141. Jacobs CT, Scholtz, CH, 2015. A review on the effect of macrocyclic lactones on dung-dwelling insects: Toxicity of macrocyclic lactones to dung beetles. Onsdersteerport J Vet Res 82, 8. http//dx.doi.org/10.4102/ojvr.v82i1.858 Kenyon F, Hutchings F, Morgan-Davies C, van Dijk J, Bartley DJ, 2017. Worm control in livestock: Bringing Science to the Field. Trends Parasitol S1471- 4922, doi: 10.1016/j.pt.2017.05.008. Kotze AC, Hunt PW, Skuce P, von Samson-Himmelstjerna G, Martin RJ, Sager H, Krücken J, Hodgkinson J, Lespine A, Jex AR, Gilleard JS, Beech RN, Wolstenhome AJ, Demeler J, Robertson AP, Charvet CL, Neveu C, Kaminsky R, Rufener L, Albrerich M, Menez C, Prichard RK, 2014. Recent advances in candidate-gene and whole-genome approaches to the Discovery of anthelmintic resistance markers and the description of drug/receptor interactions. Int J Parasitol: Drug and Drug Resistance 4: 164- 84. Liébano-Hernández E, González-Olvera M, Vázquez-Peláez C, Mendoza-de-Gives P, Ramírez-Vargas G, Peralta-Lailson M, Reyes-García ME, Osorio J, Sánchez-Pineda H, López_Arellano ME, 2015. Benzimidazole Resistant Nematodes In Indigenous Chiapas And Pelibuey Sheep Breeds From Chiapas, Mexico. J Helminthol 89, 80-5 Magbool I, Wani ZA, Shahardar RA, Alleie IM, Shah MM, 2017. Integrated parasite management with special reference to gastrointestinal nematodes. J Parasit Dis 41, 1-8 Martin, R. J., 1997. Modes of action of anthelmintic drugs. Vet. J. 154, 11-34. Montalvo AX, López AME, Vázquez PVM, Liébano HE, Mendoza de GP, 2006. Resistencia antihelmíntica de nematodos gastroentéricos a bencimidazoles y lactonas macrocíclicas en la región noroeste del estado de Tlaxcala. Téc Pecu Méx 44, 81-90. Soulsby E.J.L., 1982. Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals. Bailliere Tindal, London.

78 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Wolstenhome AJ, 2011. Ion channels and receptor as targets for the control of parasitic nematodes. . Int J Parasitol: Drug and Drug Resistance 1: 2-13. Wolstenhome AJ, Martin RJ, 2014. Anthelmintics – From Discovery to Resistance. Int J Parasitol: Drug and Drug Resistance 4: 218-19.

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ALTERNATIVAS DE CONTROL Y MANEJO DE LA RESISTENCIA ANTIPARASITARIA.

Pablo Martínez Labat Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México.

El parasitismo por nematodos gastroentéricos representa un problema muy importante en la producción en rumiantes en pastoreo en todo el mundo, esto implica un elevado impacto en los costos cuando hablamos de productividad y para poder mantener niveles eficientes se ha venido dependiendo del uso de antihelmínticos de amplio espectro para poder tener un control efectivo, debiendo recurrir al uso de productos con actividad persistente que prevengan de la implantación de nuevas fases infectantes que son ingeridas permanentemente por los animales y que son una amenaza constante, la desparasitación se maneja básicamente con tres grupos de antihelmínticos: los bencimidazólicos, los imidazotiazólicos y tetrahidropirimidinas, las lactonas macrocíclicas y recientemente en algunos países los derivados del acetonitrilo de las que en los últimos años se ha hecho un uso intensivo por parte de los productores y veterinarios (Sangster, 2001, Horton, 2003, Molento, 2100, Sutherland y Leathwick, 2011, Acosta y col, 2012, De Graef y col. 2013, Mc Artur, 2014, Ramos y Col, 2016). Considerando el uso intensivo de los antiparasitarios ligado con una multitud de factores, gradualmente se ha venido desarrollando el fenómeno de resistencia primero en los pequeños rumiantes, produciéndose primero a una sola familia y después presentándose la multirresistencia, y más gradualmente en los bovinos para llegar en algunas áreas a afectar a un elevado porcentaje de la población. Lo anterior representa un grave problema que compromete gravemente la productividad de los animales y a la viabilidad de la ganadería (Jabbar y Col., 2006). El impacto de este proceso es difícil de medir ya que están involucrados una gran cantidad de factores que influyen como la condición inmunológica del animal, la condición nutricional, la combinación de géneros presentes, el nivel de organismos resistentes dentro de la población, la genética de los animales, incluso considerando el caso específico de los bovinos con una preponderancia de la infección por Cooperia oncophora que comparativamente tiene un menor impacto sobre los animales respecto a otros géneros, pero que a pesar de todo se ha encontrado que puede producir una merma en el peso de los animales (Sangster, 2001, Sutherland y Leathwick, 2011, Mc Artur, 2014). Esto en algunos países es un fenómeno que no ha sido estudiado ya que en razón de su baja patogenicidad no se le considera un problema importante. El problema se agrava cuando varios géneros desarrollan resistencia , de modo que el género que desarrolla con más frecuencia la resistencia es Haemonchus y secundariamente Teladorsagia con amplia capacidad para desarrollar resistencia a las lactonas macrocíclicas por la frecuencia con la que se han venido usando y después se extiende a los

80 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México bencimidazólicos y aparentemente la velocidad con la que evoluciona el fenómeno es muy alta (Molento, 2011, Sutherland y Leathwick, 2011). También habrá de considerarse la variedad de formulaciones que se generan, las vías de aplicación y la frecuencia con la que se aplican que resultan en un proceso de presión que va desencadenando el desarrollo de la resistencia tanto en los grandes como en los pequeños rumiantes. Aunque también habrá que considerar que pueden existir factores ligados a esto como la mecánica de desarrollo de las poblaciones, los géneros involucrados, las diferencias entre los procesos asociados al metabolismo de los antiparasitarios por las diferentes especies de rumiantes y los aspectos relativos a las prácticas de manejo que pueden ser muy distintas con la posibilidad de influir en el proceso y que han sido ampliamente estudiadas en los ovinos. Otros aspecto importante esta ligado a la aplicación indiscriminada de tratamientos antiparasitarios que eventualmente nos llevan a pensar si efectivamente con un número menor de dosificaciones se puede llegar a lograr la misma productividad en los animales, a lo que podemos agregar el hecho de que el productor tiene a su alcance productos comerciales de precios bajos, que se pueden dosificar de forma sencilla (por ejemplo en la aplicación epicútanea) y por esta razón los emplea con mayor frecuencia (Sangster, 2001, Sutherland y Leathwick, 2011). Además habrá de considerarse la existencia de las formulaciones de liberación controlada que eliminan a los nematodos susceptibles mientras se mantienen dosis terapéuticas, permitiendo la supervivencia de los resistentes y que en la fase final del período de persistencia la concentración se reduce a dosis subterapéuticas y esto brinda una oportunidad adicional de instalación de los organismos en ambas etapas, y mientras el efecto está presente es muy importante contras las fases susceptibles que gradualmente van a ir desapareciendo, cediendo sus espacios a las fases resistentes. Esto generalmente se observa en las explotaciones asociado a la reducción del período de protección residual el cual gradualmente se va reduciendo y es un indicador del desarrollo de resistencia que irremediablemente aparecerá. Esta situación es especialmente compleja cuando hablamos de las lactonas macrocíclicas que fueron ampliamente formuladas como productos inyectables o en presentación pour on lo cual las llevó a dominar el mercado de los antiparasitarios por los elevados niveles de eficacia que se demostraron al inicio de su desarrollo y utilización y que más adelante se demostró que había un muy bajo nivel de absorción epicútánea que lleva a subdosificación, esto contra lo que ocurre al inyectar las lactonas lo cuál lleva a alcanzar los niveles más elevados de absorción en el animal (Jabbar y Col., 2006, De Graef y col., 2013, Mc Artur, 2014). Otro aspecto derivado del uso muy frecuente de los antihelmínticos es la pérdida de la reserva de larvas de nematodo susceptibles en el suelo (mejor conocido como refugio) que son responsables de mantener poblaciones susceptibles prácticamente ya que estos tienden a desaparecer y esto se liga al desarrollo gradual de la resistencia, de esta manera los animales jóvenes se ven expuestos en etapas de alta susceptibilidad a los nematodos parásitos y al existir altos porcentajes de población resistentes sufren las consecuencias de la interacción, presentando entonces mermas de peso y esta situación puede complementarse cuando también los esquemas de

81 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México desparasitación involucran a toda la población, los cuáles al haber desarrollado una respuesta inmune a los gusanos tienen muy buenas posibilidades de regular el tamaño de las poblaciones parasitarias en su tracto digestivo sin ser desparasitados y contribuir al mantenimiento del refugio de forma muy importante, pero al ser tratados este desaparece y elimina las poblaciones susceptibles (Sutherland y Leathwick, 2011)..

El fenómeno de resistencia ha sido detectado de forma regular en promedio diez años después de que las moléculas salen al mercado y de algún modo los productores y veterinarios se han familiarizado con esta situación, el proceso fue amortiguado regularmente por la aparición cíclica de varias familias de antiparasitarios o principios integrantes de las mismas y esto permitió por un período de varias décadas tener niveles de productividad aceptables basados en un uso intensivo de antiparasitarios, pero al mantenerse el patrón de manejo de los productos y el incremento de poblaciones animales aparece la problemática de la multirresistencia se ha convertido en varias regiones del mundo en una limitante en la producción animal en rumiantes y compromete la ganadería rentable, por esta razón deberá de considerarse el abordaje de como retardar el desarrollo de la resistencia y buscar alternativas al manejo farmacológico de esta problemática, el fenómeno ha sido ignorado regularmente por escasa difusión, por ignorancia de lo que ocurre representando un problema que no terminan de digerir productores y veterinarios en muchas zonas y que en otras está llevando a la búsqueda de opciones alternas (Sangster, 2001, Jabbar y Col., 2006, Acosta y col, 2012, De Graef, 2013).

Alternativas en el control y manejo de resistencia.

En torno al control de la resistencia se planteado como una opción de revertir su desarrollo usando un antiparasitario perteneciente a una familia distinta con actividad demostrada y el efecto que puede considerar es afectar integralmente a toda la población, con un impacto importante sobre los organismos parásitos resistentes al primer antiparasitario empleado. Teóricamente debería ocurrir una reversión de la resistencia cuando los organismos dejan de interactuar con el antiparasitario que ha inducido la resistencia que se encuentra ligada con alelos recesivos, que cuando ocurre la presión por desparasitación frecuente con un mismo principio o familia se vuelven los más comunes y la gran mayoría de los individuos de esas poblaciones portan esa información, de manera que las fases infectantes que se encuentran en el suelo tienen esas mismas características de modo que el contexto es totalmente distinto a la situación inicial sin la existencia de organismos resistentes en la que la gran mayoría de estos y las fases libres en el pasto son totalmente susceptibles con bajos porcentajes de población resistentes, ahora esta parte de la población integrada porcentualmente por una mayoría de organismos resistentes y una minoría de susceptibles derivada de la presión que se ha producido por lo que la población ha sufrido un cambio difícil de revertir y de hecho esta situación de algún modo fue la que llevó al desarrollo de

82 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México resistencia múltiple al irse acumulando una a una las resistencias a las diversas familias de antiparasitarios (Cuéllar, 2007, Mc Artur, 2014). El proceso podía revertirse regularmente con el uso de una nueva familia química recién introducida y esto no ha ocurrido permitiendo el desarrollo rápido de resistencia, agotando las opciones y con pocas posibilidades de reutilización de productos usados previamente como ocurrió con el levamisol que durante un período prolongado ha sido una buena opción debido a que aun cuando pasaba mucho tiempo se detectaban bajos niveles de resistencia pero en fechas recientes se ha observado un incremento en ese sentido, en este momento la frecuencia de aparición de nuevas opciones de antiparasitarios está limitada porque la industria farmacéutica ha reducido el desarrollo de nuevos productos y al perderse las patentes el resto de las empresas se ha limitado a introducir en sus líneas estos fármacos proliferando en grandes cantidades los productos comerciales con los mismos principios activos pero con distinto nombre comercial, lo cual en ningún momento es una opción para resolver el problema al agotarse la población original con predominio de organismos susceptibles en elevado porcentaje y resistentes en bajo. Uno de los puntos importantes está relacionado con el monitoreo de la evolución de la resistencia que debiera ser una condición regularmente aplicada por el productor o el veterinario, la cual no se detecta en tanto va en evolución, sin realizar verificaciones del impacto de la desparasitación con el uso de las técnicas adecuadas, lo cual puede dar la pauta para determinar cómo está evolucionando el proceso. Pocos productores conocen esto o lo toman en cuenta, además de que existen pocos grupos o instancias gubernamentales y menos privadas que lleven a cabo las pruebas para estudiar la evolución del mismo por lo que el criterio en este sentido es simplemente que al decaer drásticamente el efecto de los antiparasitarios se cambia de producto (a veces a otro de la misma familia) con la expectativa de encontrar un efecto positivo hacia los animales que a largo plazo va hacia la multirresistencia.

Como se ha señalado previamente el proceso es multifactorial y en principio la disponibilidad de monitorear la evolución de la resistencia puede ser un punto clave, una evaluación real de los productos que se comercializan en cuanto a la calidad de sus componentes, las dosis que recomienda el fabricante, el manejo que realiza el productor al aplicar el producto, el estudio de la epidemiología local, el efecto real de la estrategia empleada en la desparasitación y la integración de otras opciones que reduzcan la dependencia de los fármacos como único mecanismo de control de los nematodos gastroentéricos (FAO, 2004, Cuéllar, 2007).

El sistema FAMACHA como alternativa en el manejo antiparasitario.

Una primera opción para retardar la aparición de la resistencia es lo que se conoce como desparasitación selectiva que en los pequeños rumiantes se conoce como Sistema FAMACHA denominación que deriva del nombre del investigador que lo desarrolló Faffa Malan, (FAffa MAlan CHArt) y que se basa en una

83 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México evaluación de los animales que se asocia con el nivel de afectación por parásitos (probada matemáticamente y con un elevado nivel de confiabilidad) y en función a esto tratar o no a los animales. Esto se basa en la correlación entre la coloración de la conjuntiva, el nivel del volumen del paquete celular y el nivel de parasitismo por H. contortus, fue de esta manera que el nivel de pérdida sanguínea permitió desarrollar un patrón que quedó integrado en una tarjeta en la que están cinco diferentes variantes de coloración en la conjuntiva que correlacionan con el nivel de parasitismo y la opción de tratar o no a los animales. Al emplear este sistema simplemente se discriminan los diferentes niveles de susceptibilidad existente entre la población de animales y decidir si se aplica o no un tratamiento antiparasitario. Habrá que considerar que eventualmente se pueden presentar sesgos en la apreciación clínica de variaciones del volumen del paquete celular, por lo que las revisiones deben hacerse tarjeta en mano y la gente debe recibir una capacitación para usar el sistema (Molento y col, 2011, De Graef y col, 2013). Entonces el uso de este sistema aplicado o difundido por operadores capacitados permite desarrollar una desparasitación selectiva sobre animales que presentan mucosas conjuntivales pálidas que corresponden con el nivel 4, sobre los que el sistema tiene un efecto benéfico mejorando su condición. Esto lleva a que sólo una reducida proporción de animales deba ser sometida a desparasitación, esto tiene un impacto muy positivo ya que incide sobre la presión de selección de organismos resistentes y esto permite mantener en los animales no desparasitados una proporción importante de parásitos susceptibles (conocidos como en el refugio), que corresponden sobre todo con los estadios libres (huevos y larvas ) que no son afectados directamente por los antihelmínticos, reduciendo notablemente la probabilidad de desarrollo de resistencia, por lo que con esta estrategia solo los animales más susceptibles, en los que el impacto del parasitismo es más importante y que se traduce en mucosas conjuntivales más pálidas, son los que se tratan mientras que el resto de la población que se ve expuesta al mismo desafío son animales resistentes o resilientes que no van a ser desparasitados (FAO, 2004). Debe tomarse en cuenta que la condición nutricional de los animales derivada de la calidad de la pradera también puede tener un efecto sobre el estado del animal que deberá ser tomado en cuenta y que puede influir en las características de los animales produciendo variaciones. El impacto de este sistema permite reducir el número de desparasitaciones , además las revisiones continuas permiten si se lleva un registro de la calificación de los animales determinar cuáles son los animales susceptibles que se recomienda eliminarlos para tener un rebaño integrado con animales con mejor grado de adaptación. Si la revisión se hace periódicamente para tratar a los animales que muestran evidencias de enfermedad, que fueron subdosificados o mal desparasitados. Este sistema brinda también una oportunidad para determinar si el tratamiento realmente fue efectivo al observarse o no el cambio de pigmentación y mejoramiento de la condición corporal, tomando en cuenta que también es importante que los animales dispongan de una alimentación adecuada en cantidad y calidad. El sistema permite también partiendo de un incremento súbito de animales anémicos detectar también el nivel de contaminación por larvas

84 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México en la pradera (Sangster, 2001, FAO, 2004, Cuéllar, 2007, Molento y col, 2011, De Graef y col., 2013).

Manejo antiparasitario.

Un elemento importante son los tratamientos estratégicos de desparasitación que involucran a toda la población (un criterio en este sentido es detectar que más del 10% de los animales está anémico y en las categorías más elevadas), que deben limitarse a los verdaderamente necesarios, sustentados por muestreos fecales y conteos de huevos ya que en especial al inicio del verano el nivel de parasitismo puede alcanzar su máximo combinándolo con la evaluación cada dos o tres semanas para determinar la pertinencia o no de tratamientos, aspecto que puede ser especialmente relevante al final del verano en zonas muy húmedas. Habrá de tenerse la consideración en caprinos, especie más susceptible que en el nivel tres ya amerita desparasitación (Vercruisse J., Clerebout E., 2001, Molento y col., 2011). Es muy importante llevar registros de las evaluaciones para conocer el historial de los animales y determinar cuáles deben ser eliminados. Cuando hay una permanencia prolongada en una zona de pastoreo se hace el tratamiento selectivo solo a los animales anémicos, si debe hacerse un tratamiento global deben permanecer una o dos semanas antes de moverlos a una nueva pradera. En caso de rebaños muy grandes se puede tomar un muestreo al azar con 50 animales y hay un predominio de los dos primeros niveles hasta en un 80% de animales y no hay animales con los niveles más altos es baja la posibilidad de riesgo, pero la presencia de animales en el nivel tres, cuatro o cinco debe revisarse todo el grupo. El uso de esta estrategia eventualmente ha sido usada empleando principios con espectro reducido como el closantel (en tanto no haya resistencia al compuesto) y tuvo un efecto positivo. Otra vía usada es el manejo de la desparasitación basado en la epidemiología de esta parasitosis estudiando la dinámica de la población larvaria en el suelo, que se va a traducir en mayor o menor riesgo de infección y ligado a un déficit nutricional en el que se aplican los tratamientos estratégicos con los que se afectará a toda la población parasitaria (resistente y susceptible) en este caso la condición climática ejerce un efecto importante para poder definir el tiempo en el que se deben aplicar estos tratamientos y en este sentido existen notables diferencias de acuerdo a la zona geográfica considerando el período prepatente más el efecto residual que presente el principio activo que se use, o bien sincronizarlo con el inicio del ciclo de lluvia, aplicando un tratamiento durante el período de secas cuando el pasto está casi libre de larvas infectantes. Hay algunos elementos simples que deben tomarse en cuenta y que pueden generar una diferencia importante en el resultado, uno de estos aspectos en principio es la dosificación adecuada basada en la determinación del peso del animal para calcular la dosis correspondiente, que debe complementarse con una técnica adecuada para administrar el antiparasitario y esto es sencillo ya que si se administra el producto en la parte anterior de la boca se activa la canaladura esofágica y el producto pasa directo al abomaso perdiéndose una buena parte de su actividad, si el producto se deposita

85 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México por detrás de la lengua pasará al rumen y esto permite una absorción muy adecuada con el efecto que se busca, un segundo aspecto es restringir el alimento antes de desparasitar (hasta 24 horas) y mantener esto al menos seis horas antes de mandarlos a las praderas, ya que esto es muy favorable para la absorción del principio activo y además usar la dosis adecuada para cada animal si se sospecha de resistencia se puede incrementar (duplicar) la dosis pero suministrarla en dos fases con intervalo de doce horas (Vercruisse J., Clerebout E., 2001, Cuéllar, 2007, Hoste y Torres, 2011, Molento y col, 2011, De Graef y col., 2013). Animales nuevos cuarentenados.

Los animales recién adquiridos, ingresados deben someterse a estudios coproparasitoscópicos y tratados con productos con probado efecto sobre sus parásitos para reducir la posibilidad de ingresar parásitos resistentes, ya libres de estos pueden ser incorporados. (Molento y col., 2011). Sistemas no químicos para control de nematodos.

Con el incremento en el fenómeno de resistencia, la presión por los consumidores para obtener productos de origen animal libres de contaminantes químicos, se han venido desarrollando una serie de planteamientos en los que no se considera el uso de productos químicos.

Entre ellos hay uno que venía siendo una recomendación regular poco considerada por los productores enfoque de control de nematodos que es el manejo de las praderas cuando la gente es propietaria de estas ( situación que en otros sistemas de producción no es viable), ya que en el pasto se desarrolla el microclima que favorece o dificulta el desarrollo de las fases infectantes de los géneros más importantes, ya que los factores climáticos y la regulación del período de pastoreo tienen una gran influencia en el desarrollo de estos estadios. Inicialmente esto se ha visto desde la perspectiva de productividad de la pradera y la dinámica de crecimiento del pasto y los animales consumirán forraje de buena calidad y estimularán el rebrote del pasto, pero además las fluctuaciones en el tamaño del pasto tienen un impacto profundo en el desarrollo de las fases infectantes, debido a la deshidratación que sufren los organismos. La base de este sistema descansa en dividir las áreas de pastoreo que van a ser usadas por lapsos cortos y después serán descansadas por períodos largos lo cual permite que las larvas que se desarrollen en el pasto mueran durante el lapso que esa porción de la pradera se recupera, esto no es muy viable en zonas de clima templado porque bajo esa condición no hay un efecto importante sobre las larvas hasta después de varios meses, este sistema implica una reducción gradual de la contaminación por larvas, una reducción en la carga parasitaria en los animales y eventualmente reducir la necesidad de la aplicación de tratamientos. Este sistema puede incluir la alternancia de grupos de animales jóvenes y adultos ya que estos últimos son más resistentes y la mayor parte de las larvas que consumen son destruidas reduciendo el impacto sobre los animales y puede además alternar

86 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México especies diferentes que pueden tener un impacto mayor (Coop y Kiriziakis, 2001, FAO, 2004, Cuéllar, 2007, De Graef, 2013). Suplementación nutricional. Debemos partir en este caso del hecho de que el parasitismo afecta la producción y esto se agrava cuando hay desnutrición, aspecto que además se puede asociar a como el organismo enfrenta el parasitismo, y en este aspecto ya está probado su efecto en los animales y esto especialmente es importante en los animales jóvenes. En este sentido el uso de suplementos minerales y de nitrógeno no proteico cambian el metabolismo ruminal y aumentan la presencia de proteína bacteriana en estómago y absorción de aminoácidos en el intestino delgado. La posibilidad de usar esta estrategia depende de su disponibilidad a bajo costo y pueden si cuenta con la tecnología para su procesamiento producirse bloques o pellets para usarlo como suplemento. Las experiencias en este sentido muestran que los animales pueden enfrentar mejor el parasitismo y la tasa de eliminación de huevos se reduce notablemente pero esto definitivamente tiene limitaciones por costo que regularmente no está contemplado por los productores(Aguilar y col, 2008, Kemper y col, 2010, Hoste y Torres, 2011, Torres y col, 2012 ).

Animales genéticamente resistentes o resilientes

Se ha observado que entre las poblaciones de rumiantes se presenta una gran variabilidad en susceptibilidad a enfermedades parasitarias, pudiendo presentarse esto entre razas y dentro de los animales de la misma raza, esto lleva a que dentro de un grupo determinado de animales encontramos una porción con muy elevada susceptibilidad, otros con susceptibilidad intermedia y en el extremo animales muy resistentes o resilientes (Sangster, 2001, FAO, 2004, Cuéllar, 2007, Kemper y col, 2010).

La resistencia a nematodos implica que el animal hospedero desarrolle mecanismos efectores que limiten la implantación y permanencia de los organismos parasitarios en un nivel determinado o francamente los elimine, en términos generales la población parasitaria presente es menor que en el resto de los animales promedio, esos animales resistentes no son completamente refractarios a la enfermedad, solo albergan menos parásitos que los animales susceptibles y por lo tanto eliminan menos huevos en las heces. Esta situación puede ser muy ostensible en determinadas razas que muestran mayor resistencia que otras como ocurre por ejemplo con la Blackbelly y otras , ya dentro de las poblaciones también se encuentra variabilidad de susceptibilidad dentro de la población, que puede ser ya un atributo del individuo. También dentro de las poblaciones animales vamos a encontrar a otro tipo de animales; los resilientes, individuos capaces de mantener su capacidad productiva en circunstancias que representarían enfermedad para otros animales, sin que esto tenga que ver con el nivel de eliminación de huevos que presentan y que en razón de no desarrollar la enfermedad, no requieren de ser tratados y van a ser productivos, teniendo un

87 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México papel importante como fuentes de contaminación principalmente para los animales jóvenes (Hoste y Torres, 2011).

Regularmente la resistencia se mide en función de las cuentas de huevos, parámetro subjetivo ya que no existe necesariamente una correlación entre carga parasitaria y tasa de eliminación de huevos en los animales y a nivel racial se ha usado el concepto de analizar la carga parasitaria de formas adultas y larvas en grupos de animales representativos de la raza (Cuéllar, 2007, Kemper y col, 2010, Hoste y Torres, 2011 ) .

Por otro lado en el caso de los animales resilientes se deben usar parámetros metabólicos que permitan determinar el nivel de afectación asociado al desarrollo de la enfermedad y determinar la capacidad de recuperación que desarrolla para enfrentar el desafío del parasitismo por lo que existen una serie de parámetros que ilustran muy bien esto como el mantenimiento de la condición corporal, la conversión alimenticia, determinación de pepsinógeno plasmático, el hematocrito y elementos ligados al desarrollo de la enfermedad en el individuo y esto parece estar conectado con los mecanismos de respuesta inmune tanto de tipo humoral, como de tipo celular o asociaciones de estos, aunque se han encontrado una serie de observaciones que llegan a resultar contradictorias por lo que no existen datos concluyentes. Este tipo de animales se caracterizan por tener una mayor productividad, la inversión en antiparasitarios va a disminuir y se reduce la inversión por este concepto pero requiere de establecer un proceso de selección de animales resistentes que requerirá de mucho tiempo para poder ver sus frutos (Cuéllar, 2007).

Vacunas contra nematodos.

El desarrollo de una inmunidad protectora contra los nematodos gastroentéricos es producto de una exposición permanente de los animales a una continua exposición, pero también depende de una intrincada red de factores como la edad, el sexo, la gestación, la condición fisiológica, el estado nutricional además del potencial de la propia inmunidad innata de cada individuo, aspectos que además pueden diferir de acuerdo con el estadio evolutivo contra el que se pretenda proteger y en esta situación se ha logrado incrementar notablemente el entendimiento en los últimos años. Hay un notable avance en la comprensión del papel que tienen los antígenos expuestos y no expuestos en el desarrollo de la respuesta inmune inducida. Entonces se ha encontrado que los antígenos ocultos detectados en el intestino de los nematodos tienen un potencial importante en la estimulación antigénica en especial en H. contortus y este descubrimiento ha permitido desarrollar una estrategia para desarrollar una vacuna basada en este tipo de antígenos de extractos intestinales para combatir este organismo en Australia. No hay todavía información a respecto a subunidades recombinantes basadas en los componentes de esa vacuna y se desconoce cuál de ellas sea la responsable de tal estimulación y curiosamente la información disponible respecto

88 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México a subunidades recombinantes justo se ha realizado con otros tipos de antígenos. De este modo el estudio de los antígenos asociados, su forma de expresión o síntesis son la base del posible desarrollo de esas vacunas potenciales(Sangster, 2001, Nisbet y col., 2016).

Los estudios desarrollados en torno al desarrollo de la respuesta inmune hasta el momento indican la participación de varias poblaciones de Linfocitos, la participación de anticuerpos, Ig A e IgE, eosinofilos y células cebadas, hay evidencias de un proceso de hipersensibilidad tipo I asociado a respuesta contra larvas tres que se asocia a una deficiente implantación y su expulsión con hipermotilidad de estómago e intestino, los efectos sobre las larvas cuatro incluyen la producción de adultos de dimensiones reducidas que resultan poco fecundos. Se han encontrado moléculas denominadas galectinas que son proteínas reguladoras de la inflamación producidas por los eosinófilos que facilitan el efecto, a su vez estas moléculas se asocian con el aumento de viscosidad de moco que dificulta la implantación de las larvas cuatro aparentemente asociadas a IgA. La inmunidad contra adultos se asocia a expulsión, tamaño reducido o baja producción de huevos con implantación deficiente, daño cuticular y baja oviposición (Hoste y Torres, 2011, Nisbet y col., 2016).

En este grupo de parásitos se descubrió elevadas propiedades antigénicas en componentes del intestino que son denominados antígenos ocultos, estos se asocian con un grupo de sustancias de tipo glicoproteínas ricas en galactosa que se ha mostrado tienen un impacto importante sobre la reproducción de los nematodos, entre estas se ha ubicado una familia de Zinc metaloproteinasas y aspartil proteinasas parecidas al pepsinógeno unidas a otras moléculas que aparentemente son imprescindibles para la inducción de la inmunidad y se considera que los anticuerpos generados al inmunizar bloquean estos productos enzimáticos, además están identificadas aminopeptidasas microsomales que forman parte de las glicoproteínas de membrana en los estadios larvarios denominadas H11 con cinco isoformas H11-1, H11-2, H11-3, H11-4 y H11-5 que se asocian a sexo y estadio evolutivo. La vacuna disponible hasta el momento (Barbervax) está basada en preparaciones de membrana intestinal que contienen H-Gal-Gp y H11 que confieren una protección satisfactoria, comparable con el efecto de un antiparasitario que además reduce la aparición de anemia, impide muertes y contaminación en las praderas (Moredum Research Institute), su producción masiva es a partir de gusanos obtenidos de animales donadores con infección inducida y por su naturaleza requiere de un protocolo con varios refuerzos para alcanzar una buena efectividad (que no rebasan regularmente el número de dosis de desparasitantes), la experiencia al momento plantea aplicar tres dosis previas al período de mayor parasitismo y dos durante ese lapso con intervalo de seis semanas, la ventaja de esto es que esta estimulación genera un estímulo adecuado independientemente de lo que ocurra en el entorno de los animales. También se han identificado cistein proteasas y un homólogo de glutamato deshidrogenasa con propiedades inmunogénicas, también están

89 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México identificadas proteínas de superficie de las larvas tres reconocidas como Hc-sL3 que en estudios experimentales con la proteína purificada tuvieron un efecto interesante causando una reducción en las cuentas de huevos, en términos generales los antígenos de Barbervax debido a su complejidad no permiten a corto plazo pensar en su producción por tecnología recombinante debido a que se trata de macromoléculas, pero el proceso actual de obtención resulta una buena fuente en cantidad y calidad y es muy importante el tipo de adyuvante que se use (hidróxido de aluminio y dietilaminoetilendextran) para que funcione induciendo una potente respuesta celular y humoral. Se ha estudiado también los antígenos de excreción-secreción y han encontrado un buen efecto en animales adultos pero no en los corderos y se desconoce su papel en la evolución de la inmunidad. Hasta el momento solo hay datos preliminares en cuanto a la producción integra de la H-Gal-Gp y se ha logrado después de fragmentar la molécula en cuatro componentes denominados MEP´s (1,2,3 y 4) que individualmente confieren protección en un 20 -30 % y el proceso a través de bacterias portadoras de los genes producen moléculas con epitopos alterados que reducen su efecto original y lo mismo ha ocurrido con las cistein proteinasas (Nisbet y col. 2013). Entonces el uso de las vacunas bajo todas sus facetas no debe considerarse como un factor que desencadene una inmunidad estéril y resuelva íntegramente el problema, como podría considerarse en vacunas contra bacterias o virus pero el efecto sobre el parasitismo eliminando hasta el 65% de los organismos, reduciendo el impacto sobre el hospedero y también ostensiblemente la mortalidad en corderos. El estudio en torno a las vacunas debe avanzar y probablemente los mejores efectos se encuentren aplicando antígenos multiestádicos para lograr el mejor efecto (Acosta y col, 2012, Nisbet y col., 2016).

Control biológico.

Casi todas las estrategias se han enfocado a atacar a los organismos dentro del cuerpo de los animales, el control biológico primariamente se ha enfocado a eliminar a las fases infectantes en el suelo. En este sentido se ha estudiado la actividad larvicida de diferentes microorganismos y en este sentido esta modalidad se inició con el estudio del impacto de hongos nematófagos con la finalidad de reducir la contaminación del pasto y en este caso el mejor ejemplo y probablemente el mejor estudiado es el hongo Dudingtonia flagrans el cual produce esporas y clamidiosporas que por su resistencia pueden desplazarse por el tubo digestivo de los animales para ser eliminadas en la materia fecal en donde con bastante facilidad germinan y al interactuar con los estadios larvarios de Haemonchus, Trichostronylus, Cooperia, Teladorsagia y Nematodirus los atrapan y se los comen, de manera que tienen un impacto importante sobre las poblaciones antes de que puedan migrar en el pasto y ha sido estudiado en ovinos y caprinos. Con este sistema se debe de contar con la producción de grandes cantidades de esporas y clamidiosporas que pueden ser integradas de tal manera (por ejemplo fabricando bloques nutricionales o pellets que aporten energía, sales minerales y los hongos simultáneamente) impactando particularmente sobre las

90 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México larvas eclosionadas en las heces. No puede ser considerada como única opción de control, sino complemento. Además de este hongo se han usado otros como Arthrobotrys robusta, A. conoides, Monacrosporidium taumasium y M. sinense que se probaron con buenos resultados en becerros infectados con H. placei . Otros géneros estudiados incluyen a Harposporidium anguillulae y Candelabrella musiformis que se encuentran en proceso de evaluación, adicionalmente se ha explorado el efecto de toxinas bacterianas como la de Bacillus turingiensis, el efecto larvicida que pueden tener algunos tipos de lombrices de tierra, el de algunos nematodos nematófagos e incluso se ha estudiado la actividad de algunos ácaros nematófagos como Lasioceius penicilliger (FAO, 2004, Jackson y col, 2008, Torres y col., 2012).

Partículas de cobre.

Una gama amplia de elementos químicos han sido estudiados para determinar si tienen propiedades antiparasitarias entre ellos el Cobre y el Arsénico en especial antes de que se desarrollará la primera familia de antiparasitarios, considerando que se requiere de minerales traza en la dieta regular su presencia es necesaria para el metabolismo, en zonas deficitarias se suplementa regularmente y eso ocurrió en un momento dado con el sulfato de cobre, detectando que en los animales suplementados se presentaban cuentas bajas de huevos de nematodo gastroentérico, traducido como un efecto ovistático sobre Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta pero no sobre Trichostrongylus colubriformis estas observaciones se realizaron en los 50´s y 60´s, pero el interés fue polarizadas con la introducción del Tiabendazol y cayeron en desuso, estos hallazgos han sido retomados e incluso esto ya es un desarrollo comercial ya que al profundizar en su estudio se encontró que son los iones desprendidos de la oxidación del cobre los que ejercen ese efecto de modo que el ambiente más propicio para que ocurra la generación de estos iones es el abomaso. El cobre se ha usado como material pulverizado o en forma de agujas de óxido de Cu, que son suministrados dentro de cápsulas de gelatina que después de ser ingeridas avanzan en el tubo digestivo y quedan impactadas en la mucosa del abomaso de modo que al interactuar con este ambiente liberan continuamente los iones que afectan la oviposición, los estudios para evaluar esta opción de control detectaron en ovinos una reducción primero en las cuentas de huevos y a la necropsia diferencias sustanciales entre los animales a los que se les suministró 5 gramos de alambres de óxido de Cu, se han realizado pruebas también en cabras lecheras infectadas con Haemonchus contortus y Trichostrongylus colubriformis observando reducciones de cuentas de huevos de hasta el 89% con la consideración de que el espectro del efecto ocurre contra H. contortus. Sin embargo la experiencia de la experimentación evaluando el efecto de este recurso como medida de control aun cuando se detecta una disminución en las cuentas de huevos e incluso la desaparición de los nematodos del género Haemonchus en algunos estudios no han observado efecto sobre las variables productivas en los animales pero en otros estudios más recientes si se observan esos efectos benéficos, de manera

91 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México que al explorar el efecto de dosis diferidas a intervalos de 60 días detectan un efecto similar al obtenido con dosis únicas. Debe considerarse en especial en los pequeños rumiantes la elevada susceptibilidad a desarrollar intoxicaciones particularmente de tipo crónico que eventualmente tiene efectos negativos. Esta opción entonces debe manejarse como complemento de otra de las disponibles como el control biológico con organismos bacterianos u hongos. (FAO, 2004, Anónimo, 2008, Cuéllar, 2007, Soli y col, 2010, Hoste y Torres, 2011).

Recientemente se ha comenzado a integrar los planteamientos con un ensayo en el que se probaron tres diferentes productos comerciales ya disponibles con alambre de cobre integrado en cápsulas de gel para determinar si existían diferencias entre sus efectos al suministrarlas a ovinos y caprinos encontrándose un efecto importante sobre las cuentas de huevos en los animales en los que se realizó la prueba, pero además se integró un grupos adicional al que además de las agujas de cobre se les suministró albendazol comercial encontrando prácticamente una disminución a cero en las cuentas de huevos con un efecto particularmente importante contra H. contortus de modo que se convierte en una verdadera alternativa en animales con nematodos resistentes a bencimidazólicos (Burke y col, 2016).

Productos vegetales con propiedades antihelmínticas.

La mayoría de los medicamentos en su origen estuvieron basados en plantas o compuestos minerales casi desde el origen de la civilización y la industria farmacéutica todavía preserva una serie de medicamentos basados en extractos de plantas, se mantiene un estudio y búsqueda de opciones permanente que es materia de estudio de la etnobotánica que continuamente da frutos y de la que la gente en medio rural tiene un profundo conocimiento y aplicación. En el ambiente rural el uso de plantas es cotidiano con fines medicinales particularmente entre los indígenas y esto eventualmente se ha llevado para tratar enfermedades en los animales que incluye la verminosis gastroentérica derivado de una experiencia totalmente empírica con resultados variados que para los productores pueden ser valiosos por accesibilidad a esos recursos vegetales y forman parte de su visión del manejo antiparasitario. En este sentido algunos investigadores de campo han detectado el uso de estas plantas o conocen las propiedades identificadas de estos y se han enfocado a estudiarlos, confirmar el efecto que presentan y existen una serie de experiencias con la finalidad de identificar espectro de acción, determinar dosificación, efectos residuales y todas las posibles contraindicaciones de su uso. El proceso requiere de un camino largo y se emplea un esquema tradicional en el que lo primero es desarrollar estudios in vitro que brindan una visión preliminar de la existencia de un efecto que puede ser muy visible y aparentemente positivo, estos estudios sin embargo deberán ser valorados en modelos in vivo para determinar su valor real, ya que en muchos de los casos la actividad antiparasitaria de los vegetales tiende a un bajo desempeño respecto a los productos comerciales y muy lejos de esto se ha encontrado que en

92 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México la composición de estas plantas se presentan compuestos que lejos de generar beneficio contienen elementos como alcaloides, glicósidos y taninos que en determinadas concentraciones son dañinos (FAO, 2004). .

Entre las líneas de trabajo se ha enfatizado en el uso de plantas que contienen en su composición taninos condensados y en este sentido se han usado plantas como Sarathammus scoparius, conocida como genista; Calluna vulgaris, conocido como brezo; Pinus sylvestris, hojas de pino; Castanea sativa, (frutos de la castaña) que poseen polifenoles y taninos condensados con un efecto interesante al detectar en estudios in vitro que esos extractos bloqueaban la liberación de la muda hasta en un 90% en larvas tres de H. contortus (Cuéllar, 2007).

En estudios in vivo se experimentó con Sericea lespedeza que presenta también taninos condensados en su composición y el monitoreo permitíó detectar hasta a 5% de reducción en eliminación de huevos que se mantuvo en tanto se administraba este vegetal que duró 21 días y posteriormente se recuperó, por lo que el uso de este tipo de forraje se asocia con un efecto ovistático. Varias plantas de consumo regular por el humano, en las que el conocimiento empírico regular se han probado como el estafiate (Ambrosia artemisiifolia), el epazote (Disphania ambrosioides), la semilla de calabaza (Cucurbita máxima), las semillas de la papaya (Carica papaya) y el ajo (Allium sativum) que han sido manejadas como antiparasitarios entre la población humana empleándolos bajo diferentes modalidades, se han probado contra los nematodos gastroentéricos y los resultados obtenidos son muy heterogéneos y en general no alentadores

En contraste se han usado plantas como: Zanthoxylum zanthoxyloides, Z. fagara y Newbouldia laveis en ovinos con verminosis gastroentérica con reducciones de hasta el 87% para los que recibieron fagara y 95% las tratadas con Newbouldia. (FAO, 2004, Cuéllar, 2007). Se han usado estractos del eucalipto (Eucalytus citriodora, E. globulus, E. staigeriana, con 100% de inhibición de eliminación de huevos en cabras, también han usado estractos alcóholicos de semillas de Melia azeradacth también con 100% de inhibición y estractos de las hojas 91.6% de inhibición, también con extracto de Cocos nucifera también con una elevada eficacia, existen experiencias con extractos de hojas de Phytolaca icosandra sobre larvas 3 y huevos de Haemonchus contortus en estudios in vitro con efectos interesantes (Houzangbe y col, 2008, Molento y col 2011, Hoste y Torres, 2011, Ribeiro y col, 2014).

Conclusiones.

La evolución de la resistencia es un evento que continua progresando, la detección de su desarrollo en muchos casos ni el productor y en muchos casos el veterinario no lo detectan, no lo previenen y lo ignoran, no existen instancias del gobierno que desarrollen de alguna manera regulen, estudien o determinen la condición de este fenómeno, lo cual debe ser objeto de sensibilización por los

93 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México pocos grupos que se han interesado en estudiar y demostrar su presencia en México y del mismo modo deberá emprenderse programas de sensibilización de veterinarios y productores con el fin de acercarlos y capacitarlos para que conozcan y apliquen las estrategias alternas para poder racionalizar el manejo y frecuencia de uso de los antiparasitarios y combinar las otras opciones que permitan un abordaje más apropiado del problema de resistencia para optimizar la productividad de los animales en un marco sustentable, que de algún modo ya se ha iniciado en algunas zonas del país en las que trabajan estos grupos de investigación.

Referencias.

Aguilar C.A.J., Torres A.J.F., Hoste H., Sandoval C.C., Flores L.M., Effect of suplementary fedding with energy and /or protein on resilience and resistance of criollo kids against Haemochus contortus (2008), Memoria 4o Seminario Internacional sobre métodos alternativos para el control de parásitos helmintos en la ganadería: “Manejo o control de parásitos, nuevos paradigmas en el control integrado”, Mérida Yucatán, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Anónimo, (2004), Module 2: Anthelmintic Resistance: Diagnosis, management and Prevention. Food and Agriculture Organization of The United Nations, Rome.78-118. Alejandre R., Torres A. J.F., Aguilar C., Hoste H., Vargas m. J., (2008), Effect of copper oxide particles (COWP) on the resilience against GIN in hair sheep grazing in irrigated pastures, Memoria 4o Seminario Internacional sobre métodos alternativos para el control de parásitos helmintos en la ganadería: “Manejo o control de parásitos, nuevos paradigmas en el control integrado”, Mérida Yucatán, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Burke J.M., Miller J.E., Terryl T.H., Smyth E., Acharya M., (2016), Examination of commercially available copper oxide wire particles in combination with albendazole for control of gastrointestinal nematodes in lambs, Vet. Parasitol.,215, 1-4. Coop L., Kiriziakis I., (2001), Influence of host nutrition on the development and consequences of nematode parasitism in ruminants, Trends in Parasitol., 17, 7, 325-337. Cuéllar O. A., 2007, Control no farmacológico de parásitos en ovinos. Nematodos gastroentéricos, Memorias Vº Congreso de Especialistas en Pequeños Rumiantes y Camélidos Sudamericanos, Mendoza, Argentina. De Graef J., Claerebout E., Geldhof P., (2013), Anthelmintic resistance of gastrointestinal cattle nematodes, Vlams Diergenescundig Tijdschift, 82, 113-123. Kemper K.E., Palmer D.G., Liu S.M., Greef J.C., Bishop S.C., KarlssonL.J.E., (2010), Reduction of fecal egg count, worm numbers and worm fecundity in sheep selected fr worm resistance following artificial infection with

94 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Teladorsagia circumcincta and Trichostrongylus columbriformis, (2010), Vet. Parasitol., 171, 238-246.

Houzangbe A.M.S., Zinsou E., HoumpkeV., Mountairou K.,Hoste H., Anthelmintic effect of three plants from south Beninon the infections of the gastrointestinal tract of sheep with parasitic nematodes, (2008), Memoria 4o Seminario Internacional sobre métodos alternativos para el control de parásitos helmintos en la ganadería: “Manejo o control de parásitos, nuevos paradigmas en el control integrado”, Mérida Yucatán, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Horton J., (2003), Global anthelmintic chemotherapy programs: learning from history, Trends in Parasitol., 19, 9, 405-412. Hoste H., Torres A., J.F., Non Chemichal control of helmints in ruminants: Adaptig solutionsfor changing worms in a changing worl, (2011), Vet. Parasitol, 180,144-154. Jabbar A., Iqbal Z., Kerboeuf D., Muhammad G., Khan M.N., Afaq M., (2006), Anthelmintic resistance: Th estate of play revisited, Life Sciences, 79, 2413- 2431. Jackson F., Mc KenzieY., Bartley D., Jackson E., & Coop R.L.,Studies using the predatory fungus Dudngtonia flagrans in Scotland,(2008), Memoria 4o Seminario Internacional sobre métodos alternativos para el control de parásitos helmintos en la ganadería: “Manejo o control de parásitos, nuevos paradigmas en el control integrado”, Mérida Yucatán, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Mc Artur M.J., Reinemeyer C.R., (2014), Herding the U.S.cattle industry toward the paradigmshift in parasite control, Vet. Parasitol., 204, 34-43. Molento B.M.,Silva F. M.,Araujo S. P., De Almeida B. F., De Souza Ch.A.C., Torres A. J.F., Geldhof P., (2011) Challenges of nematode control in ruminants: Focus in latin América, Vet. Parasitol., 180, 126-132. Nisbet A.J., Meeusen E.N., González J.F., Piedrafita D,M., (2016), Immunity to Haemonchus contortus and vaccine development, Adv. Int Parasitol. 93, 353-395. Nisbet A.J., Mc Neilly T.N., Wildblood L.A., Morrison A.A., Bartley D., Bartley I., Longhi C., Mc Kendrick I. J., Palarea A.J., (2013), Succesfull immunization against a parasitic nematode by vaccination with recombinant proteins, Vaccine, 31, 4017-4023. Ramos F., Pires P.L., De Souza R.F., Zamperete R.C., Potter L., SkrebskyA.C., Sangione A., Silveira F. F., (2016), Anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of beef cattle in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, Int. J. for Parasitol., Drugs and Drug Resistance, 6, 93-101. Ribeiro J.C., Ribeiro W.L.C., Camurca A.L.F., Macedo I.T.F., Santos J.M.L., Paula H.B.C., Araujo J.V., Magalaes R.D., Bevilqua C.M.L., (2014) Efficacy of free and nonencapsulated Eucalyptus citriodora essential oil on sheep gastrointestinal nematodes and toxicity for mice, Vet. Parasitol., 204, 243- 248.

95 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Soli F., Terryl T.H., Shaik S.A., Getz W.R., Miller J.E., Vanguru M., Burke J.M., (2010), Efficacy of copper oxide wire particles against gastrointestinal nematodes in sheep and goats, Vet. Parasitol., 168, 93-96. Sangster N.C., Maniging parasiticide resistance, (2001), Vet. Parasitol., 98, 89- 109. Sutherland I.A., Leathwick D. M., (2011), Anthelmintic Resistance in nematodes parasites of cattle: A global issue, Trends in Parasitol. 27, 176-181. Torres A. J.F., Molento M., Mendoza de Gives P., (2012), Research and implementation of novel approaches for the control of nematode parasites in Latin America and the Caribean : Is there sufficient incentive for a greater extension effort ?, Vet. Parasitol., 186, 132-142. Vercruisse J., Clerebout E., (2001), Treatment vs. non treatment helmint infections in cattle: Defining the threshold, Vet. Parasitol., 98,195-214.

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ESTRATEGIAS DE CONTROL –ERRADICACIÓNDE GARRAPATAS. MANEJO DE RESISTENCIA EN URUGUAY

Nari A* Consultor Privado. armando.nari@ gmail.com

Introducción- Marco Global:

El sector agropecuario se encuentra actualmente enfrentado al dilema de producir más, producir mejor (inocuidad alimentaria) y además, hacerlo en forma amigable con el medio ambiente (Nari, 2011). Este dilema presenta algunas contradicciones, difíciles de resolver en tiempos de economías inestables y mercados inciertos.

En suma, ahora ya no basta, con decir que la garrapata es importante porque produce U$D 45 millones de pérdidas anuales en Uruguay (Muzio, 2006) o U$D 3.24 billones en Brasil (Grisi et al, 2014). Es también importante, , porque atenta contra la propia sustentabilidad del sistema productivo y el mantenimiento de mercados rentables. Esto es más fácil de entender, si se piensa que casi la única herramienta eficaz que se dispone para el control de garrapatas son los compuestos químicos. Los acaricidas, son un recurso no renovable (resistencia) que cuando se utilizan indiscriminadamente, no están exentos de riesgos (residuos, contaminación ambiental, Salud Pública). Hoy más que nunca la inocuidad de un garrapaticida es considerada como multifactorial y esto incluye la seguridad del consumidor (residuos en carne / leche), seguridad del operador (toxicidad durante la fabricación y aplicación), seguridad para el medio ambiente (contaminación) y seguridad para aquellas especies que no son objeto de control (ecotoxicidad).

La magnitud e impacto del cambio económico global es y será tan fuerte que terminará de cambiar el enfoque de la Salud Animal. Nuestro país, como fuerte exportador de carne y leche no escapa a esta realidad. Algunos de los cambios más notorios que ya se están procesando son:

Producción animal. A escala mundial la producción de carne será doblada para el 2050 (relativo al período 1999-2001). Este incremento, tendrá como base fundamental a aves y cerdos (FAO., 2006) a través de sistemas industriales, que incorporen tecnología de punta e inversión en poco espacio. Para 2050, se estima que las carnes bovina y ovina, serán consideradas como una “délicatesse” ocupando un nicho muy exclusivo del mercado (Nari et al. 2013).

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Comercio. Hoy estamos accediendo a mercados de carne y leche más rentables, pero también más variables, especializados y exigentes, en términos de Salud Pública y Animal, incluidos los residuos de pesticidas (insecticidas, acaricidas, antihelmínticos) en los alimentos. Ya se ha dado la paradoja de que, algunos países son considerados como productores de carne y leche destinados al consumo humano y otros, “alimentos de calidad” que pueden ser trazados desde el campo hasta el plato. Esta diferencia, que hace pocos años parecía una apreciación casi trivial, hoy se ha transformado en un fuerte argumento de mercado, que se traduce en mayor competitividad y la posibilidad de acceder a mercados más rentables. La reciente suspensión transitoria de los registros y comercialización de todas las formulaciones del organofosforado etión responde directamente a la preservar nuestras exportaciones de carme a EE.UU.( MGAP- Resolución Ministerial Nº 183 del 31/03/2016).

Disponibilidad de pasturas .Por diversas razones, el mundo dispone de menos pasturas para la producción animal a cielo abierto. Este cambio, viene procesándose desde hace varias décadas a nivel mundial. El sector agropecuario de nuestro país esta sufriendo importantes cambios técnicos, estructurales y geográficos, con extensas áreas destinadas a la producción de granos, a veces utilizados en la alimentación animal. La siembra de granos, la forestación o desforestación según los casos, está desplazando y concentrando el ganado en otras áreas, limitando la producción y aumentando el riesgo de contraer enfermedades. Un buen ejemplo de esto, es el aumento de la incidencia de la Anaplasmosis y miasis, en ganados dentro o cercanos a las áreas forestadas.

Medio Ambiente. La conciencia y las exigencias, sobre el impacto de la ganadería en los cambios climáticos globales y en la contaminación del Medio Ambiente, es cada vez más fuertes (FAO., 2007. a; FAO., 2007. b). Un ejemplo de esto último, son las exigencias para la eliminación de pesticidas obsoletos o de uso reciente, como es el caso de algunos baños de bovinos y ovinos.

Residuos. El control rutinario de ectoparásitos genera de por sí, riesgos de producir residuos en carne, leche. Este riesgo es aún mayor, cuando aparece resistencia a los antiparasitarios. En efecto, el aumento de los residuos, está ligado íntimamente a la presencia de resistencia parasitaria la cual produce un incremento en la frecuencia/concentración de antiparasitarios (Donald., 1994) y puede transformarse en una barrera no arancelaria en el comercio entre países (Nari and Hansen., 1999). El estado actual de resistencia a los garrapaticidas en América Latina es crítico y las diferencias entre países son solo de grado. Varios países ya están en la etapa de la resistencia múltiple y de no tomar medidas tendientes a minimizar este problema, vamos en camino a quedarnos sin una herramienta casi única para el combate de las garrapatas.

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Perspectivas tecnológicas para los próximos 10 años

En un país natural como pretende ser Uruguay, donde se cría ganado Bos taurus muy susceptible a las garrapatas la próxima década estará signada por la resistencia, a los acaricidas, el control de los residuos y la mitigación de sus efectos en el Medio Ambiente. La falta de otras medidas alternativas de control se hará aún más evidente y las vacunas, aún siendo operativas, siempre se deberán utilizar dentro y de una estrategia que utilice acaricidas.

Acaricida recurso no renobale. Existe la tendencia a considerar por parte del ganadero que la aparición de nuevos grupos acaricidas es inagotable. Lo que en realidad es casi inagotable, es la aparición de nuevos nombres comerciales con combinaciones, formulaciones, y/o formas de aplicación diferentes de los mismos grupos químicos. En definitiva, los acaricidas son un recurso no renovable debido a la resistencia pero también por la falta de desarrollo de nuevos compuestos (Errecalde, et al. 2013).

En la próxima década, no se esperan grandes novedades en la aparición de nuevos productos. Muchos de los núcleos químicos actuales se han desarrollado en las Universidades (ej: Piretroides Sintéticos) y cabe esperar que nuestra Universidad de la República pueda jugar un rol importante, en el estudio de nuevos acaricidas a través de convenios con la empresa privada. También cabe esperar, que alguna empresa de Investigación y desarrollo, saque de su biblioteca de químicos alguna nueva droga, aunque esta provenga de los mismos grupos químicos ya utilizados en el mercado interno.

Necesidades de cambio o fortalecimiento.

Fortalezas y debilidades. El Cuadro 1 resume, a criterio del autor, las principales fortalezas y debilidades que interactúan en la Campaña de Lucha contra contra la garrapata en Uruguay.. La mayoría de ellas, escapan al alcance de esta presentación, pero es claro que Si bien la Ley y su reglamentación, son un marco importante de referencia, el éxito de la lucha, se logrará únicamente cuando todos los actores involucrados (productores, Veterinarios de libre ejercicio, investigación de apoyo, industria farmacéutica, organismos oficiales) estén comprometidos tras el mismo objetivo (OIE.1999). Mientras tanto, tendremos el dudoso “privilegio” de tener la garrapata R. microplus más al sur del continente Americano.

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Cuadro 1. Principales fortalezas y debilidades en la lucha contra la garrapata.

FORTALEZAS DEBILIDADES 1) Legislación adecuada y actualizada que 1) Campaña prioritaria pero relativizada a reglamenta su erradicación y control (Ley recursos disponibles. 18268/08). Junto a Argentina, los únicos países de América Latina con Campaña 2) Personal Oficial atendiendo varias Oficial. Campañas Sanitarias.

2) Manuales de Procedimientos disponibles 3) Insuficiente reposición del personal de (Embarque con destino a faena, campo y laboratorio. Interdicción, Despacho de Tropas). 4 ) Dificultades para supervisar el 3) Personal Oficial idóneo y disponible movimiento de ganado entre predios y animales sueltos. Control insuficiente a 4) Posibilidad de contacto y coordinación con nivel de predios / zonas. gremiales de productores Contacto (CONAHSA, CODESAS). 5) Dificultades en el registro de acaricidas por poca disponibilidad de boxes para las 5) Acreditación de Veterinarios de libre pruebas de registro. ejercicio. 6) Parte de Industria farmacéutica y puntos 6) Buen relacionamiento y cooperación con de venta, poco involucrados con el la industria farmacéutica.. problema de la resistencia.

7) Aplicación en la Campaña, de los 7) Falta de capacitación, del Veterinario de resultados generados por la investigación libre ejercicio en el control o nacional. erradicación a nivel de predio.

8) Información disponible sobre la La acreditación, no considera este epidemiologia de R. microplus en aspecto. Uruguay. 8 ) Falta de percepción del productor sobre 9) Todo el país en una zona marginal para el la importancia .de la resistencia y el desarrollo de las garrapatas. Zonas control de garrapatas. naturalmente indemnes, 9) Necesidad de una mayor extensión a productores y profesionales sobre el control de garrapatas y el manejo responsable de los acaricidas.

Diagnostico de situación. La falta de comprobación de la resistencia a nivel de establecimiento, no significa que el problema no esté presente, por el contrario, generalmente indica una serie de deficiencias, de la observación del problema en el campo. La utilización a “ciegas” de los garrapaticidas y/o sus combinaciones, es la primera práctica que se debe evitar. El productor, se ha transformado en una variable importante del problema, ya que sus decisiones de compra y uso de acaricidas, provocan diferentes combinaciones genéticas de parásitos resistentes. Por esta razón, es importante considerar a cada establecimiento como una

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unidad epidemiológica aparte, con su diagnóstico y asesoramiento según el caso (Nari, 2011).

El diagnóstico de sensibilidad, apoyado por el laboratorio, es medular, en el desarrollo de estrategias racionales y sustentables de control (Nari, 2008). El Laboratorio “Miguel C Rubino” está en condiciones de:

- Determinar el estatus de sensibilidad o resistencia, a los grupos acaricidas disponibles en el mercado. Hace tiempo que se sabe que la resistencia no es un fenómeno del “todo o nada” sino un proceso evolutivo que puede estar en diferentes etapas según el manejo de los garrapaticidas. Incluso en los casos más críticos de resistencia.(resistencia múltiple) la DILAVE “ Miguel C Rubino” ha determinado que las pruebas de larvas (LPT) utilizadas con dosis discriminatorias ( DD) pueden marcar diferencias en la sensibilidad de un activo. De acuerdo al porcentaje de larvas “vivas” o “muertas” que se observen en el LPT las cepas se pueden clasificar con resistencia “baja” (menos de 10% de larvas vivas ), “media” ( 10-50% ) y “alta” ( más de 50 % ). Cuando solo el 10% de las larvas viven y el resto están muertas, la resistencia es considerada incipiente (Cuore. Comunicación personal. 2016). Dicha aproximación permite disponer de, mayor información sobre el estatus real de un activo que, aun presentando resistencia, puede ser incluirlo en un plan de rotación de grupos. Si se considera que las garrapatas enviadas para el diagnóstico, son por lo general, sobrevivientes del tratamiento, debemos de admitir un cierto sesgo en determinar la realidad en la cepa de campo. Dicho sesgo lejos de ser negativo, sirve de alguna manera, para compensar la falta de sensibilidad de las actuales técnicas toxicológicas. La “muestra” predice lo que le está pasando al resto de la población de garrapatas de ese establecimiento. Finalmente cabe señalar que, las pruebas in vitro tienen carácter orientativo y la evaluación final de la eficacia y residualidad de un tratamiento debe ser hecha a campo ( Cuore et al, 2012).

- Indicar a las autoridades sanitarias, la aparición de resistencia a nuevos grupos químicos, para evitar su mayor dispersión geográfica. Es probable que algunas cepas de garrapatas resistentes viajaran en “tropa” o “en transporte” a otra zona, para luego ser potenciadas por las malas prácticas locales de control.

-Generar resultados sobre las tendencias de la presentación de la resistencia. Es interesante observar por ejemplo, que en una misma zona de basalto superficial (Departamento de Salto) en establecimientos con similar tipo de manejo (ciclo completo) se pudieron determinar tendencias y diferencias en la presentación del fenómeno (Cuadro 2). El establecimiento A nunca tuvo garrapatas en revisaciones mensuales durante tres años. El establecimiento B, presentó resistencia solo a la cipermetrina. Los establecimientos C y D tenían resistencia a flumetrina, cipermetrina y ethion (mezcla). Finalmente, el establecimiento E presento resistencia a todos los productos estudiados, menos el fipronil.

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Cuadro 2, Diagnostico de situación (sencjbilidad acaricida) en cinco establecimientos del basalto superficial en el Departamento de Salto

- Fortalecer su banco de datos, a nivel local y nacional con la confirmación del laboratorio, - Detectar nuevas áreas de investigación que pueden ser conjuntas, con otros laboratorios especializados.

Siempre y cuando la colecta de garrapatas sea correcta, el Departamento de Parasitología de la DILAVE “Miguel C Rubino” está en condiciones de realizar las pruebas in vitro (prueba de larvas y adultas) para determinar la sencibilidad de poblaciones de campo (FAO. 2004). Dichas pruebas, junto al conocimiento de la epidemiología local de las garrapatas, permiten. hacer recomendaciones para mejorar el manejo e incluso, enlentecer el desarrollo de la resistencia. Dichas pruebas in vitro están disponibles para Piretroides Sintéticos, Amidinas, Organofosforados (ahora desafectados) y Lactonas Macrocíclicas a un costo aproximado de U$D 200. .No hay pruebas in vitro disponibles en Uruguay para el fluazurón En otras palabras, el productor destinaría bastante menos del costo de un ternero de 140-180 kg para no hipotecar el control futuro de garrapatas y/o manejar la resistencia.

El diagnóstico va siempre acompañado de un informe técnico, que ayuda a orientar al Médico Veterinario en la rotación de grupos químicos. Esto es biología que no puede ser modificada por las urgencias del momento. Un estudio completo de una cepa (pruebas con teleóginas y larvas) insume unos 45 días, por lo cual es siempre recomendable hacerlo antes y no después, de que el problema sea crítico.

Fallas de control no debidas a resistencia.

El manejo de la resistencia es una actividad técnica compleja, que debería estar a cargo de un Médico Veterinario capacitado. Por dicha razón es importante. que el profesional actuante, tome en consideración, algunos casos prácticos de

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fallas aparentes de los´ acaricidas, antes de resolver un cambio de activo en el establecimiento:

Problemas operativos. Errores de cálculo de peso vivo de los animales, pueden cambiar la dosis acaricida, especialmente en el caso de las formulaciones los pour on e inyectables. Los errores en la preparación del pie de baño, así como la inmersión de los animales por debajo del límite mínimo eficaz, es otra causa frecuente de fallas en loa baños de inmersión (FAO, 1984). Para el caso de los baños de aspersión, es usual que se los utilice cargados con amitraz, sin cal o a “media cal” para no obstruir los aspersores. Algunos productores, por falta de personal bañan su ganado en varios días y de acuerdo a otras actividades del establecimiento. Lo mejor en estos casos, es utilizarlo sin cal y eliminar el acaricida antes de pasados 4 días.. (Nari et al 2013).

Tipo de animales. Animales con pelo largo (pelo de invierno) o lluvias persistentes. Algunos productos pour on (dependiendo de la formulación) pueden disminuir su eficacia y o residualidad (Cuore et al 2013). Terneros o adultos en mal estado de carne, pueden presentar una baja en el control luego de la aplicación de acaricidas altamente lipofílicos.

-Se debe conocer las características de los productos que se están utilizando, y ajustarse a las indicaciones de uso. Para el caso de los productos sistémicos (es necesario tener en cuenta su comportamiento. A diferencia de los acaricidas de “contacto clásicos” (baños) los productos sistémicos, tienen una nueva variable que es el propio animal. Por ejemplo, activos altamente lipofílicos (ivermectina , fluazurón) tienden a ser menos eficaces, cuando se tratan animales con muy poco depósito de grasa.

Tiempo de volteo. El tiempo estimado para que continúen cayendo garrapatas adultas después del tratamiento es diferente para los distintos principios activos. Sus formulaciones y sus diferentes formas de aplicación estarán estableciendo estos tiempos (Cuore et al., 2008). Por ejemplo, las lactonas macrocíclicas no limpian de garrapatas de forma inmediata, sino que tardan unos días en hacerlo. Algunas garrapatas afectadas y con motilidad disminuida pueden quedar en el animal por más tiempo. Otras mueren y se secan sobre él huésped (Errecalde et al, 2013).

Por mecanismos bien diferentes, algo similar ocurre con el fluazurón. Este acaricida que es un regulador de crecimiento (por inhibición de la síntesis de la quitina) actúa a nivel de las mudas (metalarvas y metaninfas) por lo que, luego del tratamiento no se verán efectos inmediatos Se necesitan alrededor de 2 a 3 semanas. para que su efecto acaricida se manifieste ( Errecalde et al, 2013).

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Resistencia mecánica. La metalarva y la metaninfas, constituyen las etapas del ciclo parasitario en que ocurre la muda a ninfa y el adulto, respectivamente. Por lo tanto poseen un doble revestimiento de quitina que las torna “”mecánicamente” resistentes a la penetración de los acaricidas de contacto (inmersión y aspersión). Como la infestación de larvas es constante en el tiempo, un animal bañado tendrá en el momento del tratamiento metalarvas. de alrededor de 5 días de subidas y metaninfas de unos 13 días. Esta resistencia mecánica se presenta aredor de los 9 y 14 días postratamiento con garrapatas plenamente ingurgitadas que las hagan aparecer como un caso de resistencia.

Baja concentración de droga comercial, l Por razones diferentes esto, puede ocurrir en todos los productos acaricidas comerciales y va desde fallas en la calidad de la del producto final hasta el manejo errado de un baño de ganado por debajo de las concentraciones mínimas eficaces (errores de cubicación, recargas o refuerzos en seco).

Rotación de principios activos.

Una ley no escrita pero de uso común, es que mientras el acaricida mate “no hay porqué preocuparse”. Decidir el cambio de productos bajo esta premisa puede ser hasta suicida ya que la observación de campo, depende de la experiencia del observador, de los antecedentes de la utilización de acaricidas y algunas veces, de intereses comerciales. Durante las décadas de los 70 y 80s cuando la resistencia en garrapatas era aún incipiente y se desarrollaban nuevos productos era frecuente que el mismo acaricida fuera utilizado hasta que se observara su falla en el campo. Hoy día, se dispone de un arsenal terapéutico más amplio, con acaricidas de diferentes modos de acción. Por esta razón, se recomienda su rotación para desactivar los mecanismos que producen la resistencia (FAO, 2004). Esta es una de las bases para el Control Generacional de Garrrapatas (Cuore, et al. 2009).

La rotación de los acaricidas per se sin considerar la epidemiología, parece no ser un método muy eficiente para disminuir la frecuencia de genes resistentes en una población de garrapatas. Esto ocurre por lo menos, con los piretroides. En un estudio a campo donde se aplicó la rotación de acaricidas entre amitraz y spinosad durante tres años, no se logró bajar el factor de resistencia a los piretroides (Jonsson et al., 2010 y Rodríguez-Vivas et al. (2011). Se obtuvieron mejores resultados con la rotación, cuando el acaricida involucrado en la resistencia, era el amitraz. En este estudio, se demostró que cuando se rotaba el uso de ambos principios activos (amidinas y piretroides) disminuyó el factor de resistencia del amitraz. Para este acaricida, se piensa que que las garrapatas tienen un costo de adaptación asociado a la resistencia (menos sobrevida en las pasturas). Para que sea efectiva la rotación, es necesario acompañarla con la información epidemiológica disponible en Uruguay (Cuore, et al, 2009).

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Epidemiología y Tratamiento Generacional de R. microplus.

Historia del manejo de acaricidas. Conocer la historia de la presión de selección de la población de garrapatas en el establecimiento, acompañada con el diagnóstico puntual de resistencia (diagnóstico de situación), son los primeros pasos para establecer decisiones racionales de control del R. microplus.

Modelo Epidemiológico Conceptual: Una generación de garrapata se define como el período trascurrido desde que una larva parasita al bovino, cae como adulto ingurgitado, oviposita, eclosionan larvas y vuelven a parasitar a un bovino. Los estudios ecológicos y de dinámica poblacional realizados por el Departamento de Parasitología, de la DILAVE “Miguel C Rubino” durante los períodos 1975- 1981, 2003 y 2009 sobre la ecología de R. microplus en el Uruguay en diferentes zonas del país determinaron un claro comportamiento de la garrapata, con 3 a 3.5 generaciones al año y una interrupción más o menos fuerte, del ciclo no parasitario en los meses de invierno. (Nari et al., 1979; Cardozo et al., 1984; Solari, et al., 2007; Cuore, et al., 2012). La sobrervivencia invernal, se da por las larvas provenientes de teleóginas caídas en enero, febrero y marzo, así como por los huevos depositados por garrapatas caídas en abril. El conocimiento local de la epidemiología y la dinámica poblacional (Petraccia et al., 1988), permitió diseñar un modelo epidemiológico conceptual que orienta el control estratégico (Nari y Solari, 1990). . El diseño del Tratamiento Generacional. (Cuore et al, 2009) surge básicamente del conocimiento de la duración y magnitud de cada generación de garrapatas y de los máximos de sobrevida de sus progenies en las pasturas.. En nuestras condiciones, el ciclo no parasitario puede durar como máximo entre 8 a 10 meses.

La Fig 1, esquematiza un año de garrapatas, con tres generaciones. La primera (G1) que dura de agosto Noviembre (con un número de 2-4 garrapatas / animal), la segunda (G2) que va desde diciembre a a febrero (20 a 30 garrapatas / animal) y la tercera G3) que trascurre entre marzo a abril con más de 200 garrapapatas / animal.

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Figura 1 Población anual de R. microplus sobre los bovinos con aplicación del Tratamiento Generacional.

La flecha, indica el período máximo de sobrevida de las garrapatas en las pasturas (10 meses) que finaliza con la muerte de las larvas de garrapatas caídas en cualquier mes del año. Cuando se aplica el Tratamiento Generacional, las larvas provenientes de garrapatas sobrevivientes al tratamiento con el acaricida A tienen dos opciones al final de la generación, subir a otro animal y ser eliminadas por el tratamiento B o morir en las pasturas. Lo mismo ocurre con el acaricida C y así sucesivamente, Esta estrategia requiere un mínimo de tres grupos químicos eficaces en rotación, para r disminuir la presión de selección a la resistencia.

Cuando el objetivo es erradicación los acaricidas se utilizan de acuerdo a lo indicado por el fabricante y aprobado por el MGAP siempre dentro de la misma generación (Cuadro 3). Cuando el objetivo es control, la frecuencia de tratamientos se puede espaciar (ej: 1-2 tratamientos) siempre revisando el ganado antes de cada tratamiento para evitar sorpresas.

Cuadro 3. Frecuencia (días) de tratamientos según principio activo en casos de erradicación.

Piretroides Amitraz Fipronil Lact. 1% Lact. 3.15% Fluazurón 21 21 35 21 45 35

impacto en el medio ambiente e Inocuidad alimentaria

La relación entre el medio ambiente, la producción animal y el manejo puede ser vista bajo tres perspectivas diferentes (Figura 2). La primera es que la producción

106 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México ganadera tiene un impacto directo y natural sobre el medio ambiente, especialmente por la eliminación de gases y biomasa (Steinfeld et al., 2006). La segunda es que el ambiente puede tener un impacto potencial en los animales, a través de productos químicos que lo contaminan (ejemplo pesticidas de uso agropecuario o utilizados para controlar ectoparásitos) y la tercer causa de preocupación, es la aplicación directa de antiparasitarios en animales con fines terapéuticos o profilácticos. Dichos medicamentos se pueden constituir en residuos en los tejidos animales, o una vez eliminados podrían tener su efecto sobre la biodiversidad (ecotoxicidad).

Figura 2. Impacto de las prácticas de producción sobre el medio ambiente y la población humana (basado en Steinfield et al. 2006)

Mientras que Uruay y en general en toda América Latina y el Caribe los pesticidas se utilizan ampliamente para controlar endo y ectoparásitos en bovinos y ovinos, existen pocos estudios bien documentados sobre su eliminación e impacto en el medio ambiente (FAO, 2007). Este aspecto deberá ser un punto de investigación y control de alta prioridad en la próxima década. Seguramente el Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA) deberá jugar un rol preponderante, en el desarrollo y/o financiación de proyectos de investigación de residuos de pesticidas en carne y leche.

Consideraciones generales:

A un siglo de la primera comunicación de una especie de artrópodos resistentes a los pesticidas agrícolas (Melander, 1914) se han reportado innumerables casos de resistencia a las garrapatas (Nari et al, 2013). Un siglo es mucho para nosotros, pero no lo es nada, para las poblaciones parasitarias que utilizan el

107 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México principio Darwiniano de la sobrevivencia del más adaptado o resistente y la muerte y desaparición del más débil o susceptible. Este proceso evolutivo que tiene una base genética compleja y específica, para cada principio activo necesita la presión de selección del acaricida, para desarrollar distintos grados de resistencia. Los resultados presentados en este Simposio, nos permite repetir un concepto dicho hace muchos años en el Uruguay y es que, “no hay ni habrá, un compuesto químico resistente a la resistencia”. Paradójicamente, la propia resistencia, ha sido el único motor para buscar e investigar nuevas alternativas de control que sean menos dependientes de los productos químicos (Nari, 2011).

Para la próxima década es racional pensar que la erradicación a nivel nacional es posible, pero no probable. Es posible porque Uruguay se encuentra ubicado en un área geo-climática marginal para su desarrollo con extensas áreas naturalmente libres del parásito y además porque se cuenta con una Ley moderna y con la flexibilidad necesaria para establecer zonas categorizadas como de alto riesgo epidemiológico. Es poco probable, si se mantienen las condiciones actuales, ya que la resistencia será una limitante crítica si no se logra superar las restricciones explicitadas en el numeral 3 de esta publicación. A nivel de zona y predio, la erradicación es posible y altamente deseable, siempre y cuando se la proteja de los productores omisos e infractores.

Por el momento, disponemos de una estrategia idónea que es el Tratamiento Generacional y esto supone que no podemos esperar hasta nos quedemos con menos de tres principios activos eficaces a nivel de los establecimiento. Esa es la gravedad que supone la presencia la resistencia múltiple ya que terminará complicando el control. Erradicar esas cepas es muy importante, como también los es, evitar que estas se produzcan, utilizando un diagnóstico oportuno, que complemente la aplicación del Tratamiento Generacional. La ley 18268 prevé la creación de zonas de riesgo que permitan su erradicación, incentivando incluso la utilización de las vacunas contra los hemoparásitos.

Se sabe hace ya tiempo, que la adopción final de prácticas sustentables de control parasitario, dependerá del nivel de capacitación del productor, su grado de involucramiento y las perspectivas del mercado interno y de exportación (FAO, 2006). Este cambio de aptitud / actitud debe de estar apoyado por políticas provenientes del ámbito gubernamental, universitario, asociaciones de productores, organismos de extensión e industria farmacéutica. Los objetivos tienen que ser comunes y realistas. Justamente, este será el gran desafío de las nuevas generaciones de investigadores, docentes y comunicadores.

Es necesario demostrar, a través del diagnóstico y la investigación local, que las poblaciones de parásitos también han cambiado (resistencia) y que ese cambio produce ineficiencia productiva que tendrá un efecto directo sobre el mercado y la Salud Pública. El Veterinario de libre ejercicio, será fundamental para el progreso de la campaña, para ello deberá estar debidamente capacitado desde la

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Universidad y actualizado no solo a través de la acreditación sino de cursos de Educación Continua. En el mismo sentido y con igual mensaje, debería ser dirigida la extensión al productor.

Referencias Donald, A.D. 1994. Parasites, animal production and sustainable development. Vet. Parasitol. 54: 27-47. FAO. 1984. Ticks and Tick-Borne disease control. A practical field manual. Volume 1. Tick control. P. 299. FAO. 2004. Resistance management and integrated parasite control in ruminants. Guidelines. CD - ROM. [email protected] FAO,. 2006. Livestock Report. Animal Production and Health Division, FAO, Rome. p. 83. FAO. 2007a. Livestock´s Long shadow. Animal Production and Health Division. FAO. Rome. FAO. 2007 b. Aplicación del Control Integrado de Parásitos (CIP) a la garrapata Boophilus microplus en Uruguay. Seminario Regional. Serie FAO Producción y Sanidad Animal. PCT. FAO/URU/3003 A. FAORLC, Santiago. Chile. P. 128. FAO, 2007 d. Manejo de plaguicidas, contaminación ambiental y seguridad alimentaria. Seminario-Taller. Jiutepec. Mexico. Grisi, L., Cerqueira, R., Martins, JR., Barros, Andreotti, R., Duarte, P., Pérez de León, A., Barros, J., Silva, H. 2014. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Braz. J. Vet. Parasitol., Jaboticabal, v. 23, n. 2, p. 150-156. Jonsson, N., Miller, R., Kemp, D., Knowles, A., Ardila, A., Verral, R., Rothwell, J. 2010. Rotation of treatment between spinosad and amitraz for the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus populations with amitraz resistance. Vet. Parasitol. 169: 157-164. Melander, A.L., 1914. Can insects became resistant to spray? Journal of Economic Entomology. 7, 167–173. Muzio, F. 2006. Programa de la lucha contra la garrapata in: Aportes a la lucha contra la garrapata, FAO - TCP - DGSG - MGAP.M. Nari, A. y Hansen, J.W. 1999. Resistance of Ecto- and Endo-parasites: Current and Future Solutions, 67th General Session. International Committee. OIE. Paris.17-21 May. 1999. Nari, A. 2008. Control Integrado de Parásitos: del interés académico a la realidad. XXXVI. Jornadas Uruguayas de Buiatría. Paysandú, Uruguay. Nari, A. 2011. Towards sustainable parasite control practices in livestock production with emphasis in Latin America. Vet. Parasitol. 180: 2-11. Nari, A., Cardozo, H., Berdié, J., Canabez, F., Bawden, R. 1979. Estudio preliminar sobre la ecología de Boophilus microplus en Uruguay. Ciclo no parasitario en un área considerada poco apta para su desarrollo. Veterinaria 15 (69): 25-31.

109 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Nari, A . Solari, M.A. 1990a. Desarrollo y utilización de vacuna contra Boophilus microplus, Babesiosis y Anaplasmosis, perspectiva actual en el Uruguay. XVIII Jornadas Uruguayas de Buiatría, Paysandú. Nari, A. 1990b. Methods currently used for the control of one-host ticks: their validity and proposals for future control strategies. Parasitology 32: 132-148. Nari, A.,Solari, M A., Cuore,U. 2013. Bases teóricas y niveles de aplicación del Control Integrado en Parásitos. en: Fiel, C y Nari, A. Enfermedades Parasitarias de importancia clínica y productiva en rumiantes.pp. 691- 713, Ed. Hemisferio Sur. Montevideo. Uruguay. Nari, A., 2011. Towards sustainable control practices in livestock production with emphasis in Latin America. Veterinary Parasitology.180: 2- 11. 2011. Nari, A.,Solari, M A., Cuore,U., Lima, A L., Casaretto, A., Valledor, M S. 2013. Control Integrado de Parásitos en establecimientos comerciales de Uruguay. en: Fiel, C y Nari, A. Enfermedades Parasitarias de importancia clínica y productiva en rumiantes.pp. 717- 743, Ed. Hemisferio Sur. Montevideo. Uruguay. Petraccia, C., Nari, A. y Cardozo, H. 1988. Ensayos mediante tratamientos estratégicos contra Boophilus microplus con Flumetrina 1% pour on en el Uruguay. Not. Med. Vet. 1: 18-22 1074-1086. OIE. 1999. Final report. Resolution XIX. Resistance of ecto and endoparasites: current and future solutions. 67th General Session. pp.103-104. Paris. Rodríguez-Vivas, R., Rodríguez, F.; Alonso-Díaz, M., Fragoso, H., Santamaria, V. y Rosario-Cruz, R. 2006. Prevalence and potential risk factors for amitraz resistance in Boophilus microplus ticks in cattle farms in the state of Yucatan, México. Prev. Vet. Med. 75:280-286. Rodriguez-Vivas, R., Trees. A., Rosado, J.,Villegas, S., Hodgkinson, J. 2011. Evolution of acaricide resistance: Phenotipypic and genotipic changes in field populations of Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to pyrethroid. Int. J. Parasitol. 41: Sanchis, J. 2006. Efecto del clima sobre el huevo, larvas y teleoginas de Boophilus microplus en campos considerados tradicionalmente aptos para el desarrollo del parásito. VII Congreso Nacional de Parasitólogos Veterinarios, Acapulco, México. Solari, M.A., Cuore, U., Trelles, A., Sanchís, J., Gayo, V. 2007. Aplicación del Control Integrado de Parásitos (CIP) en un Establecimiento Comercial. En: Seminario Regional "Aplicación del Control Integrado de Parásitos (CIP) a la Garrapata Boophilus microplus en Uruguay". Departamento de Parasitología DILAVE "Miguel C. Rubino", MGAP, Uruguay TCP FAO URU 3003. A. ISBN 978-92-5-305846-4. Steinfeld, H., Gerber, P., Wassenaar, T., Castel, V.,Rosales, M., de Haan, C., 2006. Livestock’s Long Shadow Environmental Issues and Options. FAO/ LEAD, Rome, Italy, p. 390.

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CONTROL INTEGRADO DE LA GARRAPATA RHIPICEPHALUS MICROPLUS EN ZONAS TROPICALES DE MÉXICO

INTEGRATED CONTROL OF RHIPICHEPHALUS MICROPLUS IN TROPICAL REGIONS OF MÉXICO

Alonso-Díaz MA*1, Fernández-Salas A2

1Centro de Enseñanza Investigación y Extensión en Ganadería Tropical, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México (CEIEGT-FMVZ-UNAM). 2Facultad de Ingeniería Agronómica y Zootecnia, Complejo Regional Centro, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

Resumen

La garrapata Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) es un ectoparásito obligado que causa pérdidas económicas a la ganadería bovina en pastoreo. Durante décadas, su control se ha basado en intervenciones terapéuticas mediante el uso de productos químicos a través del año. Se ha demostrado que la dependencia a estos productos químicos, como única forma de control, no es ni económica, ni ecológicamente viable. El problema de la garrapata R. microplus se ha exacerbado debido al desarrollo de poblaciones resistentes y multiresistentes a las familias de los productos químicos que se utilizan para su control. En la actualidad, el mercado demanda productos de origen animal con altos estándares de salud y de bienestar animal. Los sistemas de producción de bovinos en pastoreo necesitan grandes cambios, como considerar un nuevo manejo agroecológico orientado hacía nuevas prácticas de control de garrapatas. De tal forma que las familias de productos químicos se utilicen de manera estratégica en combinación con nuevas alternativas de control no químicas. Las estrategias de control en la ganadería bovina deben ser utilizadas con la premisa de no eliminar o erradicar a las garrapatas, si no controlarlas con base en el umbral económico y la dinámica poblacional/epidemiología de las mismas. Existen avances en la generación de información sobre alternativas de control de la R. microplus que pueden ser incluidos dentro de un manejo integrado de garrapatas. El objetivo de este escrito es dar a conocer algunas estrategias de control no químico que se pueden considerar en un control integrado así como algunas experiencias del manejo integral de garrapatas R. microplus que se han realizado en las zonas tropicales de México.

Palabras clave. Garrapatas, R. microplus, epidemiología, control integral

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Introducción

La garrapata Rhipicephalus microplus es un parásito hematófago obligado, y es uno de los principales problemas que afectan al ganado bovino en pastoreo en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. El control de esta garrapata se ha basado en la administración frecuente de ixodicidas químicos a través del año (Fernández-Salas et al. 2012a, b), los cuales definitivamente han contribuido a mejorar la productividad y el bienestar animal de los rumiantes en pastoreo; pero también se ha demostrado que esta forma de control, no es una práctica sustentable. El desarrollo de resistencia de estos ectoparásitos a los ixodicidas en las unidades de producción bovina (UPB), representa una amenaza adicional debido a que se dificulta más su control, aumentan las pérdidas económicas por incrementar la frecuencia y las dosis a través del año, además de las pérdidas productivas que ocasionan.

El problema de la resistencia no es nuevo, desde hace varias décadas se mencionó la posibilidad de su desarrollo debido al mal e indiscriminado uso de los desparasitantes. Actualmente, el problema de la resistencia es común en la mayoría de las UPB establecidas en todos los climas y regiones del mundo; por lo tanto, se recomienda monitorear la eficacia/resistencia de los productos químicos como una herramienta de rutina dentro de los calendarios de medicina preventiva y de control de enfermedades.

Es importante remarcar que los ixodicidas continúan siendo indispensables en el control de garrapatas por lo que es necesario prolongar su eficacia y retrasar el desarrollo de resistencia de las moléculas químicas. Para lograr esto, se sugiere conocer, evaluar y adoptar otras estrategias de control alternativo para poder desarrollar un esquema de control integrado de garrapatas. Se ha mencionado que la mejor forma de controlar a los parásitos en las UPB es combatirlos simultáneamente por diferentes vías. Al hacer esto, los parásitos tienen menor capacidad tanto de defenderse como de desarrollar resistencia. Las nuevas estrategias de control de parásitos tienen tres objetivos principales: 1) mejorar los mecanismos de defensa del hospedero, 2) destruir o evitar las fases de vida libre de los parásitos en las praderas, y 3) destruir las fases parasitarias en el animal. En México, existen excelentes grupos de investigación que han contribuido en la generación y difusión de resultados sobre nuevas estrategias de control que pueden ser utilizadas para cubrir los objetivos antes mencionados en el marco de un manejo integrado de garrapatas.

Además de conocer y adoptar otros métodos de control, es necesario que en el esquema se incluyan medidas preventivas como la restricción del libre tránsito de animales con garrapatas entre UPB, el conocimiento de la epidemiología de las garrapatas, y un uso adecuado de los ixodicidas existentes basado en buenas prácticas de manejo. De esta forma, para mejorar el control de garrapatas en

112 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México bovinos en pastoreo y a la vez usar menos tratamientos con ixodicidas, es necesario replantear algunas preguntas en cada UPB: ¿Cuándo la presencia de R. microplus se considera un problema en la UPB? ¿Se conoce la dinámica poblacional del parásito en los diferentes nichos ecológicos? ¿Cuándo, cómo y bajo qué criterios se deben utilizar los ixodicidas? ¿Existen nuevos métodos de control alternativos que se puedan utilizar bajo un esquema de control integral de garrapatas?

Métodos alternativos de control de garrapatas R. microplus

Debido a la aparición de resistencia de R. microplus a la mayoría de las diferentes familias químicas de acaricidas y al problema de metabolitos químicos residuales en el ambiente y alimentos de origen animal, se han evaluado diversos métodos alternativos que disminuyan el uso de acaricidas químicos en el control de la garrapata. A continuación se enlistan y describen algunos de los métodos alternativos que han mostrado resultados promisorios en el control de R. microplus.

Vacunas contra garrapatas

Las primeras vacunas contra garrapatas estuvieron disponibles en el mercado desde hace aproximadamente 20 años (de la Fuente et al., 2017). Estas vacunas comerciales han sido la Gavac®, TickGard® y, recientemente en México, la Bovimune Ixovac®, las cuales contienen un antígeno obtenido del intestino de R. microplus, el Bm86. La experiencia del uso de antígenos como el Bm86 para el control de infestaciones de garrapatas en el ganado bovino, demuestran que es una tecnología viable económicamente, es amigable con el medio ambiente y reduce la prevalencia de la enfermedades tranmitidas por garrapatas (de la Fuente 2015). Estas vacunas han reducido las población de garrapatas de un hospedero como Rhipicephalus microplus, que afecta al ganado bovino y que actúa como vector de Anaplasma sp. y Babesia sp. (Willadsen, 2006; de la Fuente et al., 2017). Otras ventajas adicionales de las vacunas es que disminuyen el costo por tratamientos químicos, reducen la contaminación ambiental y ayudan a prevenir la aparición de garrapatas resistentes a los químicos. Las principales desventajas de este método son: 1) que el efecto de las vacunas no es inmediato, ya que la población de garrapatas va disminuyendo a través del tiempo, 2) se necesita llevar un protocolo riguroso de aplicaciones, ya que se necesitan varias aplicaciones inicialmente y, después, se van disminuyendo en número, y 3) es necesario cuidar su mantenimiento, aplicación y almacenaje, ya que al ser un biológico, cualquier mal manejo puede afectar su efectividad.

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En México, recientemente salió al mercado la nueva vacuna Bovimune Ixovac®, basada en el antígeno Bm86 aislada del germoplasma de la cepa mexicana “Media Joya” de R. microplus, y clonada en el vector de expresión Pichia pastoris, la cual ha demostrado resultados promisorios en el control de R. microplus, y que podría ser un componente muy importante dentro de un programa de manejo integrado de garrapatas. La utilización de las vacunas dentro de un programa de control integrado se hace cada vez más necesaria para reducir los niveles de infestación de garrapatas en los pastos y, posteriormente, en el ganado.

Uso de razas resistentes

Desde hace poco más de medio siglo se conoce que el ganado Bos taurus indicus (Cebú) y las garrapatas co-evolucionaron por mucho tiempo; por lo tanto, estos bovinos desarrollaron una resistencia natural a las infestaciones de garrapatas en comparación al ganado Bos taurus taurus (Europeo). Este desarrollo se debe tanto a sus características fenotípicas (pelaje, grosor de piel, conducta, etc.) como a su capacidad de desarrollar una respuesta inmune más eficiente después de una primera infestación. Introducir razas Bos taurus indicus o sus cruzas en las UPB es una alternativa que puede integrarse en un escenario de control de garrapatas en el trópico. La desventaja de este método es que puede ser un proceso lento de selección, se requiere la colaboración del ganadero y una evaluación productiva de los animales que se van a utilizar.

Por mencionar algunas experiencias al respeto, el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Ttopical de la FMVZ-UNAM, cuenta con un módulo de producción de vaquillas F1 (Hostein x Cebú) y ¾ cebú x ¼ holstein que están bajo un esquema de pastoreo rotacional (35 – 45 días de recuperación). En esta unidad de producción bovina se aplican en promedio dos tratamientos por año para el control de la garrapata R. microplus. En la misma región ecológica, pero en otra UPB, al evaluar la dinámica poblacional de R. microplus en diferentes genotipos de bovinos, se reportó que los animales ¾ Hostein x ¼ cebú tuvieron mayor número de garrapatas en comparación con los F1 (½ Holstein x ½ cebú) (Figura 1) (Alonso-Díaz et al., 2007). Se sugiere que dentro de un esquema de un manejo integrado de garrapatas, se considere incluir razas de origen cebú en los cruzamientos con la finalidad de disminuir las infestaciones por garrapatas, sobre todo en aquellas zonas de alta prevalencia e incidencia de este parásito.

Control biológico mediante el uso de hongos entomopatógenos (HE)

Los HE son microorganismos saprofitos que tienen la capacidad de reproducirse asexualmente (Kurtti y Keyhani, 2008), de establecerse, de colonizar y de matar diversos insectos y ácaros durante su desarrollo biológico. De forma natural, los HE pueden eliminar o mantener las plagas en niveles que no ocasionan daños económicos a los cultivos donde habitan (Azevedo y Melo, 1998). Estos hongos se encuentran en diversos hábitats, logrando un buen desarrollo en lugares

114 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México frescos, húmedos y con poco sol. Sin embargo, de acuerdo a su capacidad de tolerar diversos climas, también pueden estar adaptados a regiones con condiciones extremas (Fernández-Salas, 2017). Desde su descubrimiento como causantes de enfermedad en insectos, los HE se consideran agentes biológicos con potencial para ser usados en el control de plagas, tanto agrícolas como pecuarias (Barret et al., 2004).

Se han reportado cepas de Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana que pueden tener una eficacia del 95 % sobre huevos, 100 % sobre larvas, 80-95 % sobre ninfas y 78-80 % sobre adultos de R. microplus. Estos hongos son capaces de infectar diversos estadios de desarrollo de garrapatas, sin causar efectos colaterales en los animales ni en el medio ambiente. Sin embargo, y como principal desventaja, es que la mayoría de los estudios se han desarrollado bajo condiciones de laboratorio; cuando se realizan en campo se han observado algunas inconsistencias en los resultados debido a que la actividad acaricida de algunos hongos entomopatógenos puede ser sensible al estrés medioambiental causado por la temperatura y los rayos UV.

Al respecto, una de las principales condiciones para que este método pueda ser efectivo, es que los hongos estén adaptados a las condiciones ambientales de la región en que se van a usar. En el estado de Veracruz, se muestrearon suelos en 72 unidades de producción bovina y se aislaron 59 cepas de Metarhizium anisopliae, seis cepas de Beauveria bassiana, dos cepas de Paecylomices (Isaria) sp. y una de Purpureocillium lilacinum. De estás cepas, al menos 15 mostraron un efecto acaricida alto (eficacia del 90 al 100 %) para el control de garrapatas R. microplus susceptibles y resistentes a los ixodicidas. Adicionalmente, algunas cepas de HE mostraron tolerancia a los rayos UV-A UV-B, por lo que es altamente probable que algunas de estas cepas pueden utilizarse dentro de un control integral de garrapatas en zonas tropicales o subtropicales.

Actualmente existe un mayor interés en explorar e implementar métodos de control biológico, para lo cual se han sugerido cuatro pasos básicos: 1) Conocer la biología, ecología y la dinámica poblacional tanto del predador como de las plagas a controlar. Se necesitan estudios epidemiológicos para desarrollar programas de manejo integral de garrapatas, con la finalidad de reducir las poblaciones de parásitos por debajo del umbral económico. Un paso básico en el control de parásitos es la generación de información de su dinámica poblacional en cada zona geográfica. La selección de las cepas de hongos entomopatógenos para el control de garrapatas se debe realizar con base en su virulencia y su persistencia en el medio ambiente de acuerdo a nichos ecológicos específicos así como su compatibilidad con el hábitat de la plaga blanco. Rhipicephalus microplus se presenta con diferente intensidad a lo largo del año y, dependiendo de las condiciones climatológicas, su presencia varía entre las regiones ecológicas de México. Se ha reportado que las infestaciones por garrapatas ocurren durante todo el año en los estados de México con condiciones

115 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México tropicales como Veracruz, Tabasco, Campeche y Yucatán (Alonso-Díaz et al., 2006, 2012; Rodríguez-Vivas et al., 2005) (Figura 1). Y existen hasta cuatro generaciones de estas garrapatas por año, siendo los meses de Junio y Octubre los de mayor infestación. En los meses subsecuentes, las infestaciones por R. microplus disminuyen y se presenta un efecto de sustitución por la garrapata A. cajennense (Alonso-Díaz et al., 2012).

Figura 1. Temperatura, H.R. y PP y su relación con el número de R. microplus en bovinos de dos genotipos en Veracruz

2) Evitar que se afecte la eficacia del control biológico mediante el uso de productos químicos o prácticas de manejo. En algunas regiones, existe la práctica de quema de pastizales durante algunas épocas del año. Las altas temperaturas pueden afectar negativamente la presencia de organismos benéficos, como los hongos entomopatógenos que son sensibles a temperaturas mayores a los 50 º C. Cuando se aplica el tratamiento de esporas de HE, se recomienda que se realice durante la tarde-noche para que las altas temperaturas y la radiación UV no afecte la viabilidad del control biológico (Alonso-Díaz et al., 2007). También el uso de algunos medicamentos químicos podría afectar el crecimiento y la viabilidad de los hongos. Recientemente, se publicó que la combinación de esporas de HE con ixodicidas químicos para el control de la garrapata R. microplus no afectó la eficacia del control biológico (Webster et al., 2015). Este tipo de combinaciones puede ser muy práctico a nivel de campo porque con una misma actividad de manejo (baño por aspersión) se puede combatir tanto la fase parasitaria como la fase de vida libre de R. microplus.

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3) Conocer el impacto económico de las garrapatas con base en el umbral económico. Se ha mencionado que la presencia de más de 20 garrapatas adultas repletas o semi-repletas por lado del animal rebasa el umbral económico (Soberanes-Céspedes y Ortíz-Estrada, 2014); por lo tanto, la aplicación de acaricidas puede realizarse cuando las infestaciones sean mayores a lo señalado. En las UPB el uso de productos químicos se ha implementado bajo una estrategia de erradicación y no de control, es decir, la mayoría de productores y/o profesionistas relacionados con la ganadería bovina no toleran la presencia de al menos una garrapata. En consecuencia, se aplican un gran número de baños/tratamientos al año lo cual acarrea problemas adicionales como el desarrollo de resistencia y la ruptura del equilibrio enzootico con otras enfermedades como babesiosis y anaplasmosis (Lozano, 2014).

Manejo de potreros

Estas prácticas están relacionadas con el mantenimiento de potreros e involucra actividades como la quema controlada (no recomendada) y la rotación de potreros cuyo principio es modificar o manipular el hábitat. Estas actividades afectan adversamente el desarrollo y la dinámica poblacional de las garrapatas por el efecto que se produce sobre el micro y el mesoclima (Rosario-Cruz et al., 2007). Su mayor efecto es sobre las garrapatas en fase de vida libre y su valor radica en que es un método de control completamente ecológico (Barre, 1988). La principal desventaja de este método es que se necesita un orden riguroso en su ejecución, sobre todo la rotación de los potreros, el empleo de mano de obra, sobre todo en explotaciones muy grandes y que posiblemente se pueden afectar especies de insectos benéficos. En Veracruz, específicamente en el CEIEGT-FMVZ-UNAM, se han realizado esquemas de rotación de potreros en dos predios diferentes (La Soledad y El Clarín). Esta rotación ha permitido no solo la eficiencia de los potreros como principal método de alimentación de los bovinos, sino coadyuvar en el control de nematodos gastrointestinales y garrapatas. Este método ha ayudado a ampliar la frecuencia de baños garrapaticidas al reducir la presencia de posibles hospedadores bovinos para las garrapatas, aumentando la muerte natural de las larvas por inanición alimentaria.

Manejo integrado de garrapatas

El manejo integrado de garrapatas consiste en la combinación de diversos métodos de control (químicos y alternativos). Para un manejo integrado es necesario considerar el medio ambiente de la región, la epidemiología y la dinámica poblacional de las garrapatas. La finalidad de esta estrategia de control es mantener a las poblaciones parasitarias por debajo del número de individuos que causen problemas económicos en la unidades de producción; además, de retrasar la aparición de poblaciones resistentes a los químicos (al disminuir el uso de productos químicos) y, de esta manera, preservar en mayor tiempo los antiparasitarios comerciales que existen en el mercado.

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Posiblemente una de las principales interrogantes sobre la implementación de un manejo integrado de parásitos es ¿Porqué existen pocas unidades de producción bovina que adopten estas estrategias? Es probable que una de las principales causas sea la falta de información y cultura acerca de la disponibilidad de alternativas y de su correcta implementación por parte de todos los actores en la producción de bovinos en pastoreo. Por lo tanto, se necesitan programas de capacitación a productores y Médicos Veterinarios en estos tópicos, así como un cambio en el entendimiento de conceptos como erradicación, control y resistencia química. Es importante incluir la participación activa de la industria farmacéutica y de las instituciones de investigación y educación agropecuaria en la difusión de la existencia y beneficios de estas alternativas. Estudios que se desarrollaron en campo en la zona centro del estado de Veracruz, demostraron que el 100% de los productores utilizan unicamente productos químicos para el control de parásitos, evidenciando la dependencia total hacia estos productos. Estos mismos productores mencionaron desconocer la existencia de nuevas alternativas de control de parásitos. Otro de los puntos importantes a considerar es que los métodos alternativos pueden presentar resultados a mediano y largo plazo, lo cual puede significar una limitante en la aceptación y adopción de su uso por parte de los productores.

El control integrado debe de fortalecerse con evaluaciones periódicas del estado de resistencia química de las poblaciones de garrapatas. El conocimiento de la resistencia permitirá realizar mejor las rotaciones o el cambió de molécula química a utilizar. Debe recordarse que la base del control de garrapatas será por mucho tiempo el uso de acaricidas químicos y mantenerlos funcionales y económicos será el objetivo de los métodos alternativos en un manejo integrado de garrapatas.

Recomendaciones en el manejo integral de garrapatas

El diseño de un manejo integrado de garrapatas debe basarse primero en la dinámica poblacional de las garrapatas. Con base en esto se logrará aplicar correctamente los métodos involucrados. La figura 2 muestra cómo se comportan en el año las garrapatas más importantes que infestan a los bovinos en el trópico mexicano:

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Figura 2. Comportamiento promedio a lo largo del año de la garrapata Rhipicephalus microplus y Amblyomma mixtum en trópico mexicano.

Es necesario identificar el género y especie de garrapatas involucradas en las infestaciones, ya que si no se realiza esta identificación, alternativas como las vacunas y los métodos de rotación de potreros podrían no funcionar, o bien, existir un efecto de confusión de baja efectividad de los métodos. Un claro ejemplo son las infestaciones que se dan en el trópico mexicano con la garrapata R. microplus y la garrapata Amblyomma mixtum (antes cajennense), las cuales infestan a los bovinos y la vacuna contra R. microplus podrían no servir contra Amblyomma o en la rotación de potreros las tres fases de infestación de Amblyomma (larva, ninfa y adulta joven) podrían enmascarar la efectividad de este método.

Con base a lo mencionado, algunos esquemas de un manejo integrado de garrapatas en las zonas tropicales de México recomiendan lo siguiente: Vacuna más baño garrapaticida con el ixodicida efectivo al inicio de la primavera, si se inicia en el verano, es recomendable aplicar, además, un endectocida como la ivermectina. Seguir el protocolo de vacunación recomendado por el fabricante y usar ixodicidas solo si el número de garrapatas supera 20 o 30 individuos. Otros esquemas de control integrado mencionan el uso de Deltametrina y el hongo entomopatógeno M. anisopliae efectivo contra larvas de garrapatas resistentes a piretroides. Otro es el uso de la vacunación en combinación con Amitraz. Otro esquemamenciona una reducción importante en el número de garrapatas en los animales combinando la rotación de potreros, el uso de la vacuna y el uso de piretroides sintéticos. En la figura 3 se presenta un esquema de control de garrapatas propuesto para la ganadería bovina de la península de Yucatán.

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Figura 3. Representación esquemática del control integrado de garrapatas (Rhipicephalus microplus) propuesto para la ganadería bovina de la península de Yucatán, México (Rodríguez-Vivas et al., 2014).

Otro esquema propuesto para el estado de Guerrero está basado en tratamientos químicos estratégicos y la aplicación de una vacuna Bm86 comercial, aplicada en dosis de 2 ml conteniendo una concentración de proteína de 50 μg/ml. La vacuna se aplicó al inicio del programa y se aplicaron dos dosis con una diferencia de 30 días. Después del día 30 se suspendió la aplicación de ixodicidas y solo se aplicaron baños por aspersión sobre los animales infestados. El uso de este esquema mostró una reducción de la aplicación de químicos hasta de 80% y disminución de los costos de producción hasta del 68.62%.

Es importante saber que el uso de estas estrategias de manejo integrado no son una medida estándar que se pueda aplicar sin modificaciones en todas las regiones de México, sino que deben adaptarse a cada zona de acuerdo a las características locales en donde se va a implementar.

Conclusiones Se concluye que existen avances en la generación de la información sobre la epidemiología de la garrapata R. microplus y sobre métodos alternativos de su

120 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México control para poder incluirlos en un programa integrado de garrapatas. Existen programas de control integrado exitosos en México; sin embargo, es necesario conocer y discutir las razones del porqué existen pocas UPB que adopten un manejo integrado de garrapatas.

Referencias

Alonso-Díaz MA, García L, Galindo-Velasco E, Lezama-Gutiérrez R, Ángel- Sahagun CA, Rodríguez-Vivas RI, Fragoso-Sánchez H. 2007. Evaluation of Metarhizium anisoplae (Hyphomycetes) for the control of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) on naturally infested cattle in mexican tropics. Veterinary Parasitology, 147: 336-340. Alonso-Díaz MA, Rodríguez-Vivas RI, Fragoso-Sánchez H, Rosario-Cruz R. 2006. Resistencia de Boophilus microplus a los ixodicidas. Archivos de Medicina Veterinaria, 68: 105-113. Alonso-Díaz MA, Fernández-Salas A, Basurto CH. 2012. Manual Técnico: La Garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus: Su Comportamiento, Control y Resistencia a los Acaricidas en el Trópico Mexicano: 21° día del ganadero (ed. by B. Valles & H. Basurto), pp. 19 - 30. COFUPRO - FUNPROVER - UNAM., Martínez de la Torre, Veracruz, México. Azevedo JL, Melo IS. 1998. Controle microbiano de insectos - pragas e seu melhoramento genético. In: Controle Biológico. Jaguariúna: Embrapa, 1: 69- 93. Bacca T y Lagos BTC. 2014. Efecto de Beauveria bassiana y del entomonematodo Steinernema sp. sobre larvas de Galleria mellonella. Bol Cient Mus Hist Nat U de Caldas, 18: 247-258. Barret, CC, Staats CC, Schrank A, Vainstein MN. 2004. Distribution of Chitinases in the Entomopathogen Metarhizium anisopliae and Effect of N- Acetylglucosamine in Protein Secretion. Current Microbiology, 48: 102-107. Barre N. 1988. Mesures agronomiques permettant une diminution des populations de la tique Amblyomma variegatum . Revue Elev. Med. Vet. Pays.Trop, 41: 387-393. de la Fuente J, Contreras M, Estrada-Peña A, Cabezas-Cruz A. 2017. Targeting a global health problem: Vaccine design and challenges for the control of tick- borne deseases. Vaccine in press. de la Fuente J, Contreras M. 2015. Tick vaccines: current status and future directions. Expert Rev Vaccines. 14:1367–76. Domínguez-García DI, Torres-Agatón F, Rosario-Cruz R. 2016. Evaluación económica del control de garrapatas Rhipicephalus microplus en México. Revista Iberoamericana de las Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Vol. 5. No. 9. Fernández-Salas A, Rodríguez-Vivas RI, Alonso-Díaz MA. 2012a. Resistance of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) to amitraz and cypermethrin in tropical cattle farms in Veracruz, Mexico. Journal of Parasitology, 98: 1010- 1014.

121 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Fernández-Salas A, Rodriguez-Vivas RI, Alonso-Díaz MA. 2012b. First report of a Rhipicephalus microplus tick population multi-resistant to acaricides and ivermectin in the Mexican tropics. Veterinary Parasitology, 183: 338-342.

Fernández-Salas. 2017. Aislamiento de suelos, identificación molecular y efecto acaricida in vitro de hongos entomopatógenos nativos del trópico mexicano contra la garrapata Rhipicephalus microplus. Tesis de Doctorado. Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. 140 páginas. Kurtti T, Keyhani N. 2008. Intracellular infection of tick cell lines by the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Microbiology. 154: 1700- 1709 Lozano HME. 2014. Situación sanitaria de la babesiosis y anaplasmosis en la ganadería lechera en tres sistemas de producción. Tesis de Maestría. Universidad Autónoma de Querétaro. Facultad de Ciencias Naturales. 52 páginas. Rodriguez-Vivas RI y Cob-Galera LA. 2005. Técnicas Diagnósticas en Parasitología Veterinaria. 2nda ed. Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, México, pp 179-198. Rodríguez-Vivas RI, Rosado-Aguilar JA, Ojeda-Chi MM, Pérez-Cogollo LC, Trinidad-Martínez I, Bolio-González ME. 2014. Control integrado de garrapatas en la ganadería bovina. Ecosistemas y Recursos Agropecuarios. 1: 295-308. Rosario-Cruz R, Domínguez-García DI, Hernández-Ortiz R, Rojas-Ramirez E. 2007. Estrategias para el control integral de la garrapata Boophilus microplus y la mitigación de la resistencia. CENID-PAVET INIFAP, Jiutepec. Morelos, México. 12 pp. Soberanes-Céspedes N, Ortiz Estrada M. 2014. Programas de control integral de parásitos con énfasis en la garrapata del bovino Rhiphicephalus (Boophilus) microplus en el noreste de México. Lapisa, Salud Animal. Último acceso el 07 de diciembre del 2016. https://lapisa.wordpress.com/tag/impacto- economico-de-la-garrapata-del bovino/ Webster A, Reck J, Santi L, Souza UA, Dall´Agnol B, Klafke GM, Beys-da-Silva W, Martins JR, Schrank A. 2015. Integrated control of an acaricide-resistant strain of the cattle tick Rhipicephlaus microplus by applying Metharizium anisopliae associated with cypermetrhin and chlorpyriphos under field conditions. Vet Parasitol 2007: 302-308. Willadsen P .2006. Tick control: Thoughts on a research agenda. Vet Parasitol 138:161-168.

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ALTERNATIVAS PARA MANEJAR LA RESISTENCIA Y ESTABLECER PROGRAMAS DE CONTROL DE GARRAPATA EN MÉXICO

ALTERNATIVES TO MANAGE RESISTANCE AND ESTABLISH TICK CONTROL PROGRAMS IN MEXICO

Rubén Hernández-Ortiz, Edgar Castro-Saines, Rodolfo E. Lagunes- Quintanilla, Gabriela Granjeno-Colín. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria / INIFAP. Carr. Cuernavaca-Cuautla Nº 8534 Col. Progreso, C.P. 62550. Jiutepec, Morelos. México. [email protected]

Key words: Rhipicephalus microplus, alternative control, resistance.

Introducción.

Las garrapatas son los ácaros mas estudiados, no solo por su enorme tamaño en comparación con otros ácaros, sino por la importancia que tienen como parásitos de animales vertebrados domésticos, silvestres y el humano, desempeñando un importante papel en la transmisión de patógenos. El grupo de las garrapatas son los mejores vectores de microorganismos como protozoarios, ricketsias, bacterias y viruses; siendo una garrapata el primer vector artrópodo identificado en la historia de la medicina, como responsable de la transmisión de un microorganismo patógeno a un vertebrado (Smith y Kilbourne, 1893).

La exportación de ganado bovino en pie a los Estados Unidos de América representa para México un ingreso aproximado de 700 millones de dólares anuales, sin embargo, la comercialización de ganado se ve frenada por barreras no arancelarias, entre ellas enfermedades como la tuberculosis, la brucelosis y las garrapatas (González y Hernández, 2012).

El énfasis en aumentar la producción de alimentos de origen animal, aunado a la necesidad de reducir el uso de quimioterapéuticos, enfocado a la reducción de residuos, reducción del impacto ecológico y la mitigación de la resistencia de la plaga, nos exige cada vez mas, alternativas no químicas para el control de garrapatas.

La estrategia más utilizada para el control de garrapatas, consiste en la aplicación de ixodicidas sintéticos sobre el cuerpo de los animales infestados a intervalos específicos, determinados por la región ecológica, especies a las que va a

123 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México combatir y eficacia residual del ixodicida. Los productos que se han utilizado incluyen diferentes familias de compuestos químicos y diversas formas de aplicación, todos los ixodicidas en su momento han sido utilizados con éxito en el control de las garrapatas; sin embargo, todos ellos también han seleccionado poblaciones de garrapatas resistentes a la acción de estos químicos. El principal problema para el control de garrapatas es la selección de poblaciones resistentes a los ixodicidas, por lo que es prioritario generar alternativas para mitigar la resistencia, con el fin de alargar la vida útil de los insecticidas.

La información aquí presentada pretende ser solo un resumen de estas alternativas que podrían utilizarse dentro de programas de manejo integrado de garrapatas.

Ganado Resistente. Se sabe que el ganado encastado con cebú (Bos taurus indicus) es mas resistente a garrapatas que el ganado tipo europeo (Bos taurus taurus), debido a sus características tanto fenotípicas como genotípicas; sin embargo, debemos de cuidar que la sangre cebú o criollo no sea una limitante que pudiera reducir la producción de carne o leche en los trópicos de México, esto significa que debemos evaluar el umbral económico y balancear la producción con las características de resistencia hacia las garrapatas.

Control inmunológico. El uso de vacunas como método preventivo es una herramienta relativamente nueva que ha arrojado resultados alentadores en diversas regiones del mundo. Las ventajas de las vacunas es que tienen efecto de larga duración, no representan complicaciones de residualidad en animales ni de contaminación ambiental, la posibilidad de resistencia es mucho menos probable en desarrollarse y tiene la ventaja de actuar sobre blancos muy específicos. La inmunidad o resistencia a garrapatas se manifiesta como una reducción en el número de garrapatas repletas, en el peso de hembras y una disminución de la ovoposición y la eclosión, lo que finalmente conduce a una disminución del índice reproductivo. Al mismo tiempo, debido a la estrecha relación de la garrapata y el bovino, se genera una inmunidad natural al cabo de infestaciones constantes y frecuentes, lo que permite una reducción de garrapatas en el mediano plazo. El uso de vacunas contra garrapatas deberá ser parte de un programa de Manejo Integrado, ya que las vacunas no tienen el efecto inmediato de los insecticidas y no protegen al animal de la infestación, su efecto es gradual y progresivo reduciendo las poblaciones al afectar su capacidad reproductiva.

Control Biológico. Consiste en el control natural de las poblaciones de garrapatas mediante la introducción, propagación y diseminación de enemigos naturales de las mismas. Representa a futuro una alternativa viable y de bajo impacto ambiental. Se conocen múltiples enemigos naturales de las garrapatas tales como arañas, avispas, hormigas, aves depredadoras, microorganismos patógenos como hongos, nematodos y bacterias (Zhioua et al. 1999). Estos métodos han sido probados con resultados variables, dependiendo las

124 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México condiciones de uso, la especie de garrapata y el hospedero involucrados. Los resultados indican su potencial, sin embargo, a la fecha no existe un tratamiento que haya sido aprobado para el control de garrapatas en México. Información generada en el laboratorio o en condiciones controladas, deberá ser corroborada en condiciones de campo, antes de ser utilizada por los productores en programas de control de garrapatas, su uso requiere mas investigación, establecer su efectividad y planear las estrategias para llevarlo a los predios junto al ganado.

Manipulación del hábitat. Este consiste en modificar las condiciones ambiéntales donde se desarrolla la garrapata, sobre todo en su fase de vida libre. Este tipo de control involucra actividades como quema controlada, inundación, remoción de maleza, rotación de potreros u otros, cuya finalidad es afectar de forma adversa el desarrollo de garrapatas a nivel de microclima. Todas ellas tienen ventajas y desventajas, pero su uso de forma combinada y racional representan alternativas que deben ser evaluadas en las condiciones específicas de cada explotación. Como ejemplo de manipulación del habitat se ha sugerido establecer plantas antigarrapata estratégicamente sembradas en los potreros, en los lugares de descanso de los animales, cerca de los abrevaderos y en los perímetros de los predios. Se sabe que el pasto Gordura (Melinis minnutiflora) además de las largas vellosidades que posee, tiene capacidad para producir una sustancia gelatinosa, donde quedan atrapadas las larvas de garrapata, impidiendo su ascenso a la punta del pasto y reduciendo así la posibilidad de encuentro con el hospedero; efecto antigarrapata también se observa con pasto Insurgente (Brachiaria brizantha) y leguminosas del género Stylosanthes spp (Fernández et al. 1999).

Manejo integrado. A pesar de las recomendaciones del Manejo integrado de garrapatas (MIG), es común para un alto porcentaje de ganaderos el solo uso de garrapaticidas sintéticos. El MIG comprende el uso de métodos culturales, químicos, genéticos, inmunológicos, biológicos, etc. Una característica importante de este manejo es la aplicación de diferentes tecnologías de manera racional, programada y estratégica, sin que el programa recaiga en mayor medida en una sola de ellas, como ha sido el caso del uso de garrapaticidas. Sin embargo, el control Integrado exige el conocimiento de los factores ambientales, del hospedero y del parásito, los cuales nos permitirán entender de mejor forma y en consecuencia controlar las garrapatas con una reducción del impacto económico, ambiental y a la salud humana, al utilizar diversas herramientas para el control de forma conjunta y no solo apoyándonos en el uso de productos químicos. En principio se debe mencionar que el propósito del manejo integrado no es eliminar el 100% de garrapatas, ya que esto es difícil en términos ecológicos y económicamente costoso, la idea es mantener las poblaciones de garrapatas a un nivel tolerable para el animal y que no afecte la economía del ganadero. En un sistema de control integrado junto con otros métodos de combate, los ixodicidas en el mercado representan una herramienta valiosa para el control de garrapatas, por lo tanto, hay que mantenerlos como un recurso no renovable, evitando su

125 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México aplicación indiscriminada y reduciendo su uso, lo cual nos permitirá alargar su vida útil, retardando la selección de poblaciones resistentes. Hoy en día es aceptado en general que R. (B.) microplus es una garrapata con la que nos debemos acostumbrar a convivir con niveles tolerables, siempre y cuando no se trate de un programa de erradicación.

Existen escasos reportes de MIG en México, Camino en 1980 estudió la dinámica poblacional de garrapatas considerando los factores biológicos, climáticos y epidemiológicos para determinar su impacto en la población de garrapatas en una región específica. Redondo y col en 1999, mencionan el uso de ixodicidas, ganado resistente y vacuna para un exitoso control de garrapatas, sin embargo, esto aplica a condiciones particulares y específicas (Fernández, 2009).

Recomendaciones generales para el control de garrapatas y mitigación de la resistencia.

Para el manejo de la resistencia se debe establecer un monitoreo periódico de garrapatas con diferentes ixodicidas, haciendo la correcta elección o cambio de ixodicida. Un factor clave es la educación y capacitación constante de técnicos y productores sobre el uso y consecuencias del abuso de pesticidas, ya que estos no solo aumentan la presión de selección, sino también, contaminan los productos para consumo humano, el suelo y los mantos freáticos, teniendo un fuerte impacto ambiental y en la salud pública.

El uso en conjunto de vacunas, control biológico, acaricidas sintéticos y naturales, manejo de pastizales, prácticas culturales y la capacitación y educación constante permitirán establecer programas de manejo integrado de garrapatas, con el fin de reducir el impacto que implica el solo uso de acaricidas sintéticos.

Con todo lo anterior podemos derivar una serie de recomendaciones generales: Realizar tratamientos estratégicos durante las épocas con mayor abundancia de garrapatas y solo tratar animales con alta infestación (más de 30 garrapatas adultas por animal de más de 4 mm), lo que permitirá reducir el uso de acaricidas y mantener poblaciones refugio de garrapatas susceptibles.

Tratar con la dosis/cantidad suficiente y correcta, utilizando productos autorizados para el control de garrapatas, nunca usar mezclas caseras de garrapaticidas y menos aún productos de uso agrícola, los que están diseñados para plantas no para adherirse y dispersarse en la piel de los animales. Esto nos permitirá vigilar la efectividad del producto y eventualmente detectar cualquier falla o aparición de garrapatas resistentes.

Usar ganado resistente a garrapatas (cebu y sus cruzas, criollos, aumenta la resistencia), además de ganado bien nutrido, ya que está comprobado que la

126 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México deficiencia de proteína y energía en la dieta del ganado ocasiona una respuesta inmune deficiente a garrapatas y otros parásitos. Bañar y desparasitar antes de movilizar ganado dentro y fuera del rancho.

Usar alternativas probadas y autorizadas para el control de garrapatas como vacunas, garrapaticidas o control biológico de acuerdo a las indicaciones del fabricante; el uso de productos experimentales no es garantía de éxito.

Por último, pero no menos importante, debemos hacer énfasis en buscar la asesoría de un profesional, sobre todo cuando existan problemas de control de garrapatas o fallas del producto.

Finalmente, los programas para el control de garrapatas deben estar dirigidos y regulados por una autoridad sanitaria, similar al control de enfermedades como brucelosis y tuberculosis; esto evitará el uso indiscriminado de ixodicidas, de productos apócrifos y de dudosa efectividad. De otra forma nos enfrentaremos a un proceso cada vez mas anárquico para el control de esta plaga.

Uso y Abuso de antiparasitarios.

El uso de cualquier ixodicida seleccionará resistencia, solo que tardará diferente tiempo en manifestarse, dependiendo del nivel de presión de selección, de la dosis excesiva o reducida, de la constancia y otros factores inherentes a su utilización. La ivermectina, es un producto maravilloso que ha servido para combatir y controlar filariasis en humanos en muchas partes del mundo, Satoshi Omura y William C. Campbell descubridores de la molécula, recibieron el Premio Nobel de medicina en 2015 por su contribución para el control de estas enfermedades. La misma historia fue aquella de la penicilina, con algo mas en común, ambas seleccionan poblaciones resistentes. Hoy la penicilina ha dejado de usarse en forma masiva, su uso frecuente e indiscriminado la volvió una molécula casi inservible. Por su parte ivermectina ya tiene reportes de resistencia en varios parásitos incluyendo garrapatas y en varias partes del mundo. Difícilmente va a llegar otro producto que pueda superarla, no en el futuro cercano.

Para mitigar la resistencia se recomienda reducir la frecuencia de uso, pero pareciera que nos empeñamos en hacer lo contrario. En nuestras manos tenemos los problemas y las soluciones. La propuesta ha sido que trabajemos menos para tratar a los animales, tratamientos rápidos y con poco manejo de los animales, ¿A menor costo económico pero mayor costo social, en salud pública y mayor costo ambiental?

Ya no hay muchas opciones de nuevos garrapaticidas, alguna vez comento un colega de la industria privada que el desarrollo de un nuevo producto tenía un costo de 200 millones de USD, los cuales debían ser recuperados en aproximadamente 10 años. Si la resistencia surge antes de este período, el

127 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México producto se hace poco rentable, pues ya no se recuperará la inversión económica. Los antiparasitarios son recursos no renovables, debiendo ser como los extinguidores o los seguros de siniestros, “tenerlos a la mano listos para usar, pero estar deseando no usarlos”. Urge trabajar en programas de manejo integrado de garrapatas, que incluyan el uso moderado y racional de los pesticidas.

Referencias

Castro S.E., Granjeno C.G., Lagunes Q.R.E., Hernández O.R. 2017. Generación de una población de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus resistente a ivermectina, mediante presión química en bovinos infestados artificialmente. Memorias Congreso Nacional de Parasitología Veterinaria “Un mundo, una salud”. Puebla, Pue. México. 9-11 agosto, 2017. Fernández R.M. 2009. Manejo integrado de Boophilus microplus. En Perspectivas de Control biológico parasitario y nuevas alternativas en el sector pecuario. CENID-PAVET / INIFAP ed. Libro Científico No. 2. diciembre 2009. Fernández R.M., Cruz, V.C., Solano, V.J., García, V.Z. 1999. Antitick effects of Stylosanthes humilis and Stylosanthes hamata on plots experimentally infested with Boophilus microplus larvae in Morelos, Mexico. Exp. Appl. Acarol. 23: 171-175. González Saenz-Pardo J.R., Hernández-Ortiz R. 2012. Boophilus microplus: Estado actual de la resistencia a los acaricidas en la frontera México Estados Unidos y su impacto en la relación comercial. Rev Mex Cienc Pecu. 3(Supl 1): 1-8. Hernández-Ortiz R. et al. 2010. Control Integrado de Garrapatas y Enfermedades que transmiten en Ganado Bovino. Babesiosis y Anaplasmosis. Folleto Técnico No. 10. CENID-PAVET / INIFAP. ISBN: 978-607-425-478-5. Zhioua, E., Heyer, K., Browning, M., Ginsberg, H., Lebrun , R. 1999. Pathogenicity of Bacillus thurigiensis variety kurstaki to Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 36: 900-902.

128 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

AVANCES EN INVESTIGACIÓN PARA EL MANEJO INTEGRADO DE LAS GARRAPATAS VECTORES DE FIEBRE BOVINA

RESEARCH ADVANCES IN INTEGRATED MANAGEMENT OF CATTLE FEVER TICK VECTORS

Pérez de León AA1*, Miller RJ2, Goolsby JA2, Guerrero FD1, Temeyer KB1, Romero Salas D3, Rodríguez-Vivas RI4

1USDA-ARS, Knipling-Bushland United States Livestock Insects Research Laboratory, and Veterinary Pest Genomics Center, Kerrville, TX, USA; 2USDA- ARS, Cattle Fever Tick Research Laboratory, Edinburg, TX, USA; 3Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, México; 4Laboratorio de Parasitología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, México

Abstract

The ticks Rhipicephalus microplus and R. annulatus, herein referred to collectively as cattle fever ticks (CFT), are non-native to the Americas and have a negative impact on the health and productivity of livestock in tropical and subtropical parts of the continent where they are established. Our collaboration on translational research focuses on identifying synergies through the combined application of alternative technologies with acaricides, which includes approaches on applied genomics for novel control methods, anti-tick vaccines, biocontrol agents, and the adaptation of precision agriculture concepts to innovate systems for the treatment of wildlife infested with CFT. Here, we present an update of our collaborative research efforts to address challenges the Cattle Fever Tick Eradication faces to keep the USA CFT-free, and the difficulties to manage acaricide-resistant CFT populations in Mexico, which is a risk for the trade of cattle raised in Mexico intended for export to the USA. Research continues to advance the discovery and development of new technologies that can be used together to manage CFT in safer ways. Using science-based evidence will ensure that adaptive strategies are implemented for effective integrated CFT management.

Keywords: ticks, cattle, bovine babesiosis, integrated management, animal health, agricultural research

Introduction

The ticks Rhipicephalus microplus and R. annulatus are non-native to the Americas and have a negative impact on the health and productivity of livestock in tropical and subtropical parts of the continent where they are established (Brake

129 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México and Pérez de León 2012; Grisi et al. 2014). In addition to the direct effects their blood-feeding habit has on animal health, R. microplus and R. annulatus are also detrimental to cattle as biological vectors of Babesia bovis and B. bigemina, which cause bovine babesiosis, also known as tick fever, and the causative agent of anaplasmosis, Anaplasma marginale (Aubry and Geale 2011; Pérez de León et al. 2014a). Because of the concern on cattle health and production as vectors of bovine babesiosis, R. microplus and R. annulatus are hereafter referred to as cattle fever ticks (CFT). Globally, R. microplus is recognized as the more invasive of the two CFT species (Ferreira et al. 2015; Rodríguez-Vivas et al. 2016).

Acaricides are widely used to try to manage CFT (Guerrero et al. 2014). However, their indiscriminate use exerts a strong selective force that eventually results in the evolution of acaricide resistance among CFT populations (Rodriguez-Vivas et al. 2013). The intense use of acaricides also raises environmental and public health concerns (Lopez-Arias et al. 2015). Although the United States of America (USA) eradicated CFT in 1943, acaricide resistance threatens efforts of the Cattle Fever Tick Eradication Program (CFTEP) to maintain the national bovine herd CFT-free (Miller et al. 2011). Other complicating factors for operations of the CFTEP include the adaptation of CFT to infest native, principally white-tailed deer (WTD), and exotic, e.g. nilgai, ungulate species, as well as exotic weeds that facilitate CFT survival and reduce the diversity of invertebrate tick predators that occur in the Permanent Quarantine Zone (PQZ) located in south Texas along the Rio Grande, which forms part of the transboundary region with Mexico (Pérez de León et al. 2012a; Esteve-Gassent et al. 2014). In Mexico where CFT are established, the annual economic impact on animal agriculture caused by R. microplus alone is estimated to be 573 million dollars (Rodríguez-Vivas et al. 2017). Acaricide resistance and the involvement of wildlife as alternative hosts also impede progress with the management of CFT in Mexico (Rodríguez-Vivas et al. 2014).

Earlier integrated efforts focused on the rotation of synthetic chemicals sold under several commercial names with different modes of acaricidal action, like organophosphates, pyrethroids, amidines, and phenylpirazoles, those acting as development inhibitors, like benzoylphenyl ureas, and molecules with ectoparasiticidal spectrum of activity, like avermectins, to manage CFT populations (Bram and Gray 1983; Angus 1996). However, the emergence of resistance to multiple classes of commercially available acaricides emphasizes the need to discover and develop alternative technologies that can be used together for effective integrated CFT management (Miller et al. 2013a; Klafke et al. 2017). Alternative technologies were identified before, which could be used together with acaricides (Jonsson 2004). However, the benefits of adapting protocols for integrated CFT management in livestock production remain to be fully realized. In this summary of our presentation we highlight research to advance integrated CFT management. Details of our collaborative research efforts to address challenges the CFTEP faces to keep the USA CFT-free, and the difficulties to manage acaricide-resistant CFT populations in Mexico are discussed in the literature cited

130 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México herein. Acaricide resistance is an aspect impacting the multibillion dollar trade of cattle raised in Mexico intended for export to the USA (Pérez de León et al. 2013).

Research to advance integrated cattle fever tick management

Research is enabling opportunities to translate scientific knowledge into protocols that cattle producers, and state and federal agencies can adopt for the sustainable management of CFT (Pérez de León et al. 2012b; Pérez de León et al. 2014b). Our collaboration on translational research focuses on identifying synergies through the combined application of alternative technologies with acaricides, which includes approaches on applied genomics for novel control methods, anti-tick vaccines, biocontrol agents, and the adaptation of precision agriculture concepts to innovate systems for the treatment of wildlife infested with CFT (Barrero et al. 2017; Costa-Junior et al. 2016, Duron et al. 2017, Goolsby et al. 2017). The benefit of integrating the use of some of these technologies has been documented (Bautista-Garfias and Martínez-Ibañez 2012, Suarez et al. 2016; Pérez de León et al. 2017).

It can take 100 million dollars and 10 years to discover and develop a new chemical entity for marketing as an acaricide to treat CFT infestations in cattle (Graf et al. 2004). Despite being challenging, mechanism-based approaches to discovery research have been proposed as a more rational, and perhaps faster way for the development and commercialization of antiparasitic drugs, like acaricides (Woods and Knauer 2010). It was hypothesized that sequencing the genome of R. microplus would allow mining that information to discover safer compounds to manage CFT populations (Guerrero et al. 2016). The application of these concepts enabled the molecular identification and biochemical characterization of a tyramine receptor in R. microplus (Gross et al. 2015). Furthermore, these discoveries were translated to produce a mechanism-based screen amenable to high-throughput, which identified terpenoids as putative modulators of the R. microplus tyramine receptor (Gross et al. 2017). This is another example of how mechanism-based screens facilitate structure-activity relationship studies to explore novel chemical space for the development of compounds with more specific acaricidal activity against R. microplus (Swale et al. 2013).

Research on the integrated use of an anti-tick vaccine to eliminate outbreaks of R. microplus and R. annulatus in the USA was prioritized by stakeholders in 2009 (Miller et al. 2012). Anti-tick vaccines containing the recombinant antigen Bm86 had been shown to immunoprotect cattle against R. microplus and R. annulatus infestations, and their effect against CFT populations was synergized when used together with acaricides (de la Fuente et al. 2007). Gavac™, an anti-tick vaccine containing the Bm86 antigen that is commercialized elsewhere, remains unavailable for use in the USA. In Mexico, a new Bm86-based anti-tick vaccine became commercially available under the name of Bovimune Ixovac® in 2017

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(http://www.ixovac.com/informacion/). Mutual transfer of technology through a public-private partnership enabled the development a novel Bm86-based vaccine formulation for experimental use by the CFTEP. Statutes more than 100 years old governing operations of the CFTEP were adapted to eliminate R. microplus and R. annulatus infestations in cattle and mitigate the risk of future tick outbreaks in the PQZ by adding immunization with the Bm86-based vaccine as part of the operational protocol that also involves the use of acaricides (http://www.tahc.state.tx.us/news/2016/2016-06-07_TAHCFeverTickVaccine.pdf). This achievement enabled the experimental use of the Bm-86 based vaccine to immunize beef and dairy cattle as part of the Research Project for Integrated Control of the Southern Cattle Fever Tick in Puerto Rico (https://www.youtube.com/watch?v=DkqS9dYLyys). Our presentation will include an update on the research outcomes of this project.

Specialist parasitoids, predators and/or nematodes that are specific for R. microplus and/or R. annulatus could be used as biological control agents to complement CFT management programs (Goolsby et al. 2015). Genomics research was conducted to test the hypothesis that exploration in the native range of R. microplus and R. annulatus is a rational approach to discover agents for CFT biocontrol (Goolsby et al. 2016a). The comparison of CFT populations from native and introduced ranges helped prioritize regions to explore for biological control agents. Ixodiphagus aethes is a new species in the genus of wasps known to be parasitoids of ticks that was discovered in India, which is part of the native range for R. microplus (Hu et al. 1998; Hayat and Veenakumari 2015).

Research to adapt precision farming technologies offers exciting opportunities to advance integrated CFT management practices (Wathes et al. 2007; Laca 2009; Gonzalez-de-Santos et al. 2017). Precision livestock farming could mitigate the burden on animal heath and production caused by CFT parasitism and associated tick-borne diseases. A model was developed to assess how the involvement of WTD and the interface of this wildlife species with cattle impact CFTEP practices (Wang et al. 2016). The model predicted that during treatment periods, WTD participated in creating isolated places, or refugia, where CFT could survive by dispersing female ticks engorged with blood into, and collecting immature ticks from, habitats favorable for the survival and development of tick life stages in pastures. This research-based knowledge could be used to further assess CFT- host-landscape interactions and to design alternative tick suppression methods for cattle and WTD that form part of integrated CFT eradication systems. Applied telemetry research indicated that the relatively large home ranges of nilgai in Texas present a risk for the spread of CFT through the movement of infested animals (Moczygemba et al. 2012). Further assessment revealed that there is a higher chance of spreading CFT by females as compared to males, and that this risk in south Texas may be mitigated through the use of cattle fences kept in parallel with paved highways (Foley et al. 2017). Heightened precision to detect cattle and wildlife in the PQZ would enhance surveillance by CFTEP personnel. Thus, the use

132 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México of unmanned aerial vehicles, i.e. drones, was evaluated for the detection of cattle in the PQZ (Goolsby et al. 2016b). Under quasi-field conditions, the drones allowed CFTEP personnel to detect cattle remotely, which could also improve their safety working in the PQZ.

Managing CFT in diversified livestock production systems

The invasive biology of CFT presents challenges for their management in the context of diversified livestock production (Miller et al. 2013b; Serna-Lagunes et al. 2013). Research helps identify, and facilitates the delivery of methods available through a technology toolbox, which can be used to develop adaptive strategies to deal with the complexity of CFT control or eradication requiring the treatment of wildlife. Vaccination of WTD against CFT can aid in CFT control (Estrada-Peña et al. 2014). Applying advances in systems to deliver novel vaccine formulations against CFT for wildlife will help optimize efforts to immunize WTD, nilgai, and maybe even cattle raised under extensive conditions (Falconer et al. 2016; Corro et al. 2017).

Managing CFT and associated diseases in cattle raised together with non- traditional livestock species that are also susceptible to tick infestation can be challenging. Water buffalo raising is becoming a popular ranching practice in Mexico (Romero Salas and Pérez de León 2014). In many cases cattle and buffalo interface across landscapes (Alvarado-Esquivel et al. 2014). Buffalo raised jointly with cattle in the Mexican tropics appeared to have a greater ability to limit or eliminate Babesia infection (Romero-Salas et al. 2016). However, in this study CFT infestation levels between buffaloes and cattle were not assessed.

Relevance of CFT in international cattle trade

The emergence of resistance to multiple classes of acaricides among CFT populations in Mexico is of concern for the trade of cattle intended for export to the USA (González Sáenz Pardo and Hernández Ortiz 2012). A Tick Summit was convened by the federal animal health agencies of the USA and Mexico in 2016 to discuss this, and other issues that could risk the benefits of binational cattle trade (https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease- information/cattle-disease-information/sa_tuberculosis/ct_mx_ctf_presentations). The information discussed during the Tick Summit is helping federal government representatives from both countries put together a “United States – Mexico Joint Strategic Plan for the Control and Eradication of Invasive Cattle Fever Ticks Rhipicephalus (Boophilus) microplus and R. annulatus”. This effort will be discussed during the presentation.

In conclusion, research continues to advance the discovery and development of new technologies that can be used together to manage CFT in safer ways. Experimental management protocols need to be tested under field conditions

133 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México promptly to assess the combined effect of different technologies. Incorporating precision livestock farming algorithms in CFT research will help with the decision- making process to recommend methods for cattle producers, and state and federal regulatory agencies. Using science-based evidence will ensure that adaptive strategies are implemented for the effective management of CFT populations.

References

Alvarado-Esquivel C, Romero-Salas D, García-Vázquez Z, Cruz-Romero A, Peniche-Cardeña A, Ibarra-Priego N, Aguilar-Domínguez M, Pérez-de-León AA, Dubey JP (2014) Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in water buffaloes (Bubalus bubalis) in Veracruz State, Mexico and its association with climatic factors. BMC Vet Res 10:232-236. Angus BM (1996) The history of the cattle tick Boophilus microplus in Australia and achievements in its control. Int J Parasitol 26:1341-1355. Aubry P, Geale DW (2011) A review of bovine anaplasmosis. Transbound Emerg Dis 58:1-30. Barrero RA, Guerrero FD, Black M, McCooke J, Chapman B, Schilkey F, Pérez de León AA, Miller RJ, Bruns S, Dobry J, Mikhaylenko G, Stormo K, Bell C, Tao Q, Bogden R, Moolhuijzen PM, Hunter A, Bellgard MI (2017) Gene-enriched draft genome of the cattle tick Rhipicephalus microplus: assembly by the hybrid Pacific Biosciences/Illumina approach enabled analysis of the highly repetitive genome. Int J Parasitol 47:569-583. Bautista-Garfias CR, Martínez-Ibañez, F (2012) Experiences on the control of cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus in Mexico In: Ticks: Management, Disease Control and the Environment. Woldemeskel M editor. Nova Science Publishers, Hauppauge, NY. pp. 205 -216. Brake DK, Pérez de León AA (2012) Immunoregulation of bovine macrophages by factors in the salivary glands of Rhipicephalus microplus. Parasit Vectors 5:38. Bram RA and Gray JH (1983) Eradication-an alternative to tick and tick-borne disease control. In Ticks and Tick-borne Diseases, FAO Animal Health and Production Paper 36: 54–59. Corro LM, Tripp DW, Stelting SA, Miller MW (2017) Using off-the-shelf technologies to mass manufacture oral vaccine baits for wildlife. J Wildl Dis 53:681-685.

Costa-Júnior LM, Miller RJ, Alves PB, Blank AF, Li AY, Pérez de León AA (2016) Acaricidal efficacies of Lippia gracilis essential oil and its phytochemicals against organophosphate-resistant and susceptible strains of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Vet Parasitol 228:60-64. de la Fuente J, Almazán C, Canales M, Pérez de la Lastra JM, Kocan KM, Willadsen P (2007) A ten-year review of commercial vaccine performance for control of tick infestations on cattle. Anim Health Res Rev 8:23-28. Duron O, Binetruy F, Noël V, Cremaschi J, McCoy KD, Arnathau C, Plantard O, Goolsby J, Pérez de León AA, Heylen DJA, Van Oosten AR, Gottlieb Y,

134 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Baneth G, Guglielmone AA, Estrada-Peña A, Opara MN, Zenner L, Vavre F, Chevillon C (2017) Evolutionary changes in symbiont community structure in ticks. Mol Ecol 26:2905-2921. Esteve-Gassent MD, Pérez de León AA, Romero-Salas D, Feria-Arroyo TP, Patino R, Castro-Arellano I, Gordillo-Pérez G, Auclair A, Goolsby J, Rodriguez- Vivas RI, Estrada-Franco JG (2014) Pathogenic landscape of transboundary zoonotic diseases in the Mexico-US border along the Rio Grande. Front Public Health 2:177. Estrada-Peña A, Carreón D, Almazán C, de la Fuente J. (2014) Modeling the impact of climate and landscape on the efficacy of white tailed deer vaccination for cattle tick control in northeastern Mexico. PLoS One 9:e102905. Falconer JL, Christie RJ, Pollard EJ, Olsen SC, Grainger DW (2016) Live RB51 vaccine lyophilized hydrogel formulations with increased shelf life for practical ballistic delivery. Int J Pharm 498:187-94. Ferreira LL, Soares SF, de Oliveira Filho JG, Oliveira TT, Pérez de León AA, Borges LM (2015) Role of Rhipicephalus microplus cheliceral receptors in gustation and host differentiation. Ticks Tick Borne Dis 6:228-233. Foley AM, Goolsby JA, Ortega-S A, Ortega-S. JA, Pérez de León AA, Singh NK, Schwartz A, Ellis D, Hewitt DG, Campbell TA (2017) Movement patterns of nilgai antelope in south Texas: implications for cattle fever tick management. Prev Vet Med http://dx.doi.org/10.1016/j.prevetmed.2017.08.002 Graf JF, Gogolewski R, Leach-Bing N, Sabatini GA, Molento MB, Bordin EL, Arantes GJ (2004) Tick control: an industry point of view. Parasitology 129(Suppl S4):27-42. Grisi L, Leite RC, Martins JR, Barros AT, Andreotti R, Cançado PH, Pérez de León AA, Pereira JB, Villela HS (2014) Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Rev Bras Parasitol Vet 23:150- 156. Gross AD, Temeyer KB, Day TA, Pérez de León AA, Kimber MJ, Coats JR (2015) Pharmacological characterization of a tyramine receptor from the southern cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Insect Biochem Mol Biol 63:47-53. Gross AD, Temeyer KB, Day TA, Pérez de León AA, Kimber MJ, Coats JR (2017) Interaction of plant essential oil terpenoids with the southern cattle tick tyramine receptor: A potential biopesticide target. Chem Biol Interact 263:1-6. González Sáenz Pardo JR, Hernández Ortiz R (2012) Boophilus microplus: current status of acaricide resistance on the Mexican American border and its impact on commerce. Rev Mex Cienc Pecu 3(Supl 1):1-8. Gonzalez-de-Santos P, Ribeiro A, Fernandez-Quintanilla C, López-Granados F, Brandstoetter M, Tomic S, Pedrazzi S, Peruzzi A, Pajares G, Kaplanis G, et al. (2017) Fleets of robots for environmentally-safe pest control in agriculture. Precis Agric 18:574–614. Goolsby JA, Mays DT, Schuster GL, Kashefi J, Smith L, Amalin D, Cruz-Flores M, Racelis A, Pérez de León AA (2015) Rationale for classical biological control of

135 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

cattle fever ticks and proposed methods for field collection of natural enemies. Subtropical Agric Environ 66:7-15. Goolsby JA, Guerrero FD, Gaskin J, Bendele KG, Azhahianambi P, Amalin D, Flores-Cruz M, Kashefi J, Smith L, Racelis A, Saini RK, Perez de Leon AA (2016a) Molecular comparison of cattle fever ticks from native and introduced ranges with insights into optimal search areas for classical biological control agents. Southwest Entomol 41:595-604. Goolsby JA, Jung J, Landivar J, McCutcheon W, Lacewell R, Duhaime R, Baca D, Puhger R, Hasel H, Varner K, Miller B, Schwartz A, Pérez de León AA (2016b) Evaluation of unmanned aerial vehicles (UAVs) for detection of cattle in the Cattle Fever Tick Permanent Quarantine Zone. Subtropical Agric Environ 67:24-27. Goolsby JA, Singh NK, Ortega-SA Jr., Hewitt DG, Campbell TA, Wester D, Pérez de León AA (2017) Comparison of natural and artificial odor lures for nilgai (Boselaphus tragocamelus) and white-tailed deer (Odocoileus virginianus) in South Texas: developing treatment for cattle fever tick eradication. Int J Parasitol: Parasites and Wildlife 6:100-107. Guerrero FD, Pérez de León AA, Rodriguez–Vivas RI, Jonsson N, Miller RJ, Andreotti R (2014) Acaricide research and development, resistance and resistance monitoring. In: Biology of ticks. Sonenshine DE and Roe RR editors (2nd edition). Oxford University Press. New York. pp. 353–381. Guerrero FD, Kellogg A, Ogrey AN, Heekin AM, Barrero R, Bellgard MI, Dowd SE, Leung MY (2016) Prediction of G protein-coupled receptor encoding sequences from the synganglion transcriptome of the cattle tick, Rhipicephalus microplus. Ticks Tick Borne Dis 7:670-677. Hayat M, Veenakumari K (2015) Description of four new species of brachypterous Encyrtidae (Hymenoptera: Chalcidoidea) from India. Zootaxa. 3990:259-71. Hu R, Hyland KE, Oliver, JH (1998) A review on the use of Ixodiphagus wasps (Hymenoptera: Encyrtidae) as natural enemies for the control of ticks (Acari: Ixodidae). Syst Appl Acarol 3:19-28. Jonsson N (2004) Integrated control programs for ticks on cattle: an examination of some possible components, FAO Animal Production and Health Paper, School of Veterinary Science, University of Queensland, Australia. Klafke G, Webster A, Dall Agnol B, Pradel E, Silva J, de La Canal LH, Becker M, Osório MF, Mansson M, Barreto R, Scheffer R, Souza UA, Corassini VB, Dos Santos J, Reck J, Martins JR (2017) Multiple resistance to acaricides in field populations of Rhipicephalus microplus from Rio Grande do Sul state, Southern Brazil. Ticks Tick Borne Dis 8:73-80. Laca EA (2009) Precision livestock production: tools and concepts. R Bras Zootec 38:123-132 Lopez-Arias A, Villar-Argaiz D, Chaparro-Gutierrez JJ, Miller RJ, Pérez de León AA (2015) Reduced efficacy of commercial acaricides against populations of resistant cattle tick Rhipicephalus microplus from two municipalities of Antioquia, Colombia. Environ Health Insights 8(Suppl 2):71-80.

136 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Miller RJ, White WH, Davey RB, George JE, Pérez de León AA (2011) Efficacy of spinosad against acaricide-resistant and -susceptible Rhipicephalus (Boophilus) microplus and acaricide-susceptible Amblyomma americanum and Dermacentor variabilis. J Med Entomol 48:358-365. Miller R, Estrada-Peña A, Almazán C, Allen A, Jory L, Yeater K, Messenger M, Ellis D, Pérez de León AA (2012) Exploring the use of an anti-tick vaccine as a tool for the integrated eradication of the cattle fever tick, Rhipicephalus (Boophilus) annulatus. Vaccine 30:5682-5687.

Miller RJ, Almazán C, Ortíz-Estrada M, Davey RB, George JE, Pérez de León AA (2013a) First report of fipronil resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus of Mexico. Vet Parasitol 191:97-101. Miller RS, Farnsworth ML, Malmberg JL (2013b) Diseases at the livestock-wildlife interface: status, challenges, and opportunities in the United States. Prev Vet Med 110:119-132. Moczygemba JD, Hewitt DG, Campbell TA, Ortega-S JA, Feild J, Hellickson MW (2012) Home ranges of the nilgai (Boselaphus tragocamelus) in Texas. Southwest Nat 57:26-30. Pérez de León AA, Teel PD, Auclair AN, Messenger MT, Guerrero FD, Schuster G, Miller RJ (2012a) Integrated strategy for sustainable cattle fever tick eradication in USA is required to mitigate the impact of global change. Front Physiol. 3:195. Pérez de León AA (2012b) Global change and strategies to mitigate its impact on the U.S. cattle fever tick eradication program. Proc. Int. Conf. Anim. Parasitol. 7:35-51. Pérez de León AA, Rodríguez-Vivas RI, Guerrero FD, García Vázquez Z, Temeyer KB, Domínguez García DI, Li A, Soberanes Céspedes N, Miller RJ, Rodrigo Rosario Cruz R (2013) Acaricide resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus: impact on agro-biosecurity and cattle trade between Mexico and the United States of America. Proc Int Symp Pest Resistance Arthropods 3:18-35. Pérez de León AA, Vannier E, Almazán C, Krause PJ (2014a) Tick-borne protozoa. In: Biology of ticks. Sonenshine DE and Roe RR editors (2nd edition). Oxford University Press. New York. pp. 147-179. Pérez de León AA, Teel PD, Li A, Ponnusamy L, Roe RM (2014b) Advancing integrated tick management to mitigate burden of tick-borne diseases. Outlooks Pest Manag 25:382-389. Pérez de León AA, Mahan S, Messenger M, Ellis D, Varner K, Schwartz A, Baca D, Andreotti R, Rodríguez Valle M, Rosario Cruz R, Domínguez García DI, Comas Pagan M, Oliver Canabal C, Urdaz J, Collazo Mattei F, Soltero F, Guerrero F, Miller RJ (2017) Public-private partnership experience enabling translational research for anti-tick vaccine used in integrated Rhipicephalus (Boophilus) microplus and R. annulatus tick eradication in the United States of America. In: Prevention and control of pests and vector-borne diseases in the

137 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

livestock industry. Garros C, Bouyer J, Takken W editors. Wageningen Academic Publishers. Wageningen, Netherlands. Accepted. Rodriguez-Vivas RI, Li AY, Ojeda-Chi MM, Trinidad-Martinez I, Rosado-Aguilar JA, Miller RJ, Pérez de León AA (2013) In vitro and in vivo evaluation of cypermethrin, amitraz, and piperonyl butoxide mixtures for the control of resistant Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) in the Mexican tropics. Vet Parasitol 197:288-96. Rodríguez-Vivas RI, Miller RJ, Ojeda-Chi MM, Rosado-Aguilar JA, Trinidad- Martínez IC, Pérez de León AA (2014) Acaricide and ivermectin resistance in a field population of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) collected from red deer (Cervus elaphus) in the Mexican tropics. Vet Parasitol 200:179-188. Rodríguez-Vivas RI, Apanaskevich DA, Ojeda-Chi MM, Trinidad-Martínez I, Reyes-Novelo E, Esteve-Gassent MD, Pérez de León AA (2016) Ticks collected from humans, domestic animals, and wildlife in Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 215:106-113. Rodríguez-Vivas RI, Grisi L, Pérez de León AA, Silva Villela H, Torres-Acosta JFJ, Fragoso Sanchez H, Romero Salas D, Rosario Cruz R, Saldierna F, Garcia Carrasco D (2017) Potential economic impact assessment for cattle parasites in Mexico. Rev Mex Cienc Pec 8:61-74. Romero Salas D, Pérez de León AA (2014) Bubalinocultura en Mexico: retos de industria pecuaria naciente. In: Logros y Desafíos de la Ganadería Doble Propósito (6ta edición). González SC, Madrid BN, Soto BE, editors. Maracaibo, VN: Fundación GIRARZ. p. 707–15. Romero-Salas D, Mira A, Mosqueda J, García-Vázquez Z, Hidalgo-Ruiz M, Vela NA, Pérez de León AA, Florin-Christensen M, Schnittger L (2016) Molecular and serological detection of Babesia bovis- and Babesia bigemina-infection in bovines and water buffaloes raised jointly in an endemic field. Vet Parasitol. 217:101-107. Serna-Lagunes R, Olguín-Hernández A, Pérez-Sato JA, García-García CG, Casas- López I, Salazar-Ortiz J (2013) Venado veracruzano: una opción para la ganaderia diversificada y la conservación de ecosistemas. Agroproductividad 6:58-64. Suarez M, Rubi J, Pérez D, Cordova V, Salazar Y, Vielma A, Barrios F, Gil CA, Segura N, Carrillo Y, Cartaya R, Palacios M, Rubio E, Escalona C, Ramirez C, Basulto Baker R, Machado H, Sordo Y, Bermudes J, Vargas M, et al (2016) High impact and effectiveness of Gavac vaccine in the national program for control of bovine ticks Rhipicephalus microplus in Venezuela. Livestock Science 187:48-52. Swale DR, Tong F, Temeyer KB, Li A, Lam PC, Totrov MM, Carlier PR, Pérez de León AA, Bloomquist JR (2013) Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N- methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pestic Biochem Physiol 106:85-92. Wang HH, Teel PD, Grant WE, Schuster G, Pérez de León AA (2016) Simulated interactions of white-tailed deer (Odocoileus virginianus), climate variation and

138 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

habitat heterogeneity on southern cattle tick (Rhipicephalus (Boophilus) microplus) eradication methods in South Texas, USA. Ecol Model 342: 82-96. Wathes, C (2007). Precision livestock farming for animal health, welfare and production. Proc Intl Congress Anim Hygiene 13:397-404. Woods DJ, Knauer CS (2010) Discovery of veterinary antiparasitic agents in the 21st century: a view from industry. Int J Parasitol 40:1177-1181.

139 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

MANEJO DE PREDIOS CON POBLACIONES DE GARRAPATA Boophilus microplus RESISTENTE HACIA LOS IXODICIDAS Y EL USO DE ALERNATIVAS PARA SU CONTROL.

JOSÉ LUIS CASTELLANOS HURTADO. Dirección de Campañas Zoosanitarias

La estrategia más utilizada durante muchos años para el combate de la garrapata Boophilus microplus, ha sido la aplicación de sustancias químicas sobre el cuerpo de los bovinos y otras especies de animales a intervalos específicos. El historial del uso de acaricidas en el mundo a incluido a los arsenicales, organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, amidinas, endectocidas (Lactonas macrocíclicas), fenilpirazolonas entre otras. Sin embargo, la emergencia de la resistencia a constituido la más seria limitantes para la utilización de estos químicos. La dificultad para poder pronosticar que los mecanismos establecidos en las cepas resistentes puedan afectar la eficacia de nuevos acaricidas, incluyendo aquellos con nuevas estructuras químicas, sumado a los altos costos del desarrollo de nuevas moléculas, hace más sombrío el panorama para el control futuro de las garrapatas. La resistencia ha sido ampliamente reportada hacia casi todos los compuestos. Nolan 1986 y Kemp 2000, mencionan que la resistencia a los acaricidas en Queensland, Australia está completamente documentada y es aquí donde existe el mayor problema del mundo. Sin embargo, existen evidencias que el fenómeno representa un grave problema en otros países.

El término resistencia cuando se aplica en relación con la respuesta de parásitos a los plaguicidas, puede ser entendida como la “capacidad de una fracción poblacional de sobrevivir a ciertas concentraciones de productos químicos que resultan letales, o afectan la reproducción del resto de la población considerada como normal” (Aguirre, 1983; Drummond, 1976). Según la teoría más aceptada perteneciente a la escuela Neodarwiniana que trata de explicar al fenómeno, este es un proceso que se presenta como resultado de una selección preferencial y de recombinación de genes, que se da en un grupo específico de individuos y su descendencia, y en los cuales se encuentra presente en forma preadaptada, heterocigota y en baja frecuencia el o los genes que confieren el carácter de resistencia.

En el caso específico de garrapatas, el problema de resistencia a estado asociado básicamente a aquellas especies que parasitan principalmente ganado bovino susceptible, preferentemente ganado tipo europeo que se explota en climas subtropicales y tropicales, donde la dinámica poblacional de éstos ixódidos es más elevada, requiriéndose por lo tanto tratamientos más cerrados para tratar de controlar a las garrapatas del género Boophilus microplus, Amblyoma cajjenense y en últimas fechas la mosca del cuerno Haemotobia irritans, presionando a las

140 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México poblaciones hacia la resistencia; debido a que los ganaderos en su desesperación tratan sistemática o periódicamente a los animales cada 7, 14 ó 21 días (Castellanos 1998).

Debido al uso extensivo de estos químicos para el control o erradicación de estos ectoparásitos el fenómeno de resistencia, se ha presentado un gran número de parásitos de importancia en salud pública, agrícola y veterinaria. La FAO coincide que al menos 504 especies de insectos y ácaros han desarrollado resistencia a uno o más plaguicidas (Georghiou, 1981; Lagunes, 1988).

Se ha manifestado que en todos aquellos países en los cuales se explota ganado tipo europeo, altamente receptivo al parásito y que cuentan con climas templados, subtropicales y tropicales, el problema de garrapata y por ende de resistencia, ha adquirido serias dimensiones y se constituye en una grave amenaza. Cuando el fenómeno se hace presente, haciendo parcial o totalmente infectivos a los productos en uso, con el consecuente incremento del daño por garrapata, situación que obliga a los ganaderos a modificar los esquemas de tratamientos previos, con la aplicación de una o más de las siguientes medidas. • Incremento en la concentración original recomendada. • Incremento en el número de tratamientos, con calendarios más cerrados de bañado. • Cambio a otro producto con ingrediente activo diferente, al cual las garrapatas muestran resistencia, generalmente más caro.(George 2000)

Como se aprecia, cualquiera de ellas requiere de un gasto adicional en productos, mano de obra y manejo de ganado y marca además un incremento en las posibilidades de intoxicación de ganado, o en el mejor de los casos, una vida media de los nuevos productos, determinada por la intensidad de uso, en promedio de 5 a 7 años.

En nuestro país la resistencia de la garrapata Boophilus microplus hacia los organofosforados se evidencio en el período comprendido entre 1981 y 1985 principalmente en las Huastecas Veracruzana, Hidalguense y Potosina; debido a este problema las Autoridades de la Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos (SARH), permitieron el registro y uso de los Piretroides y de las Amidinas a partir de 1985 (Aguirre, 1986; Ortiz y col. 1985 Fragoso, 1995)

Debido a la presión de selección, por el uso indiscriminado de los piretroides para el control de Boophilus y la mosca del cuerno Haematobia irritans, en agosto de 1993 se detectaron los primeros casos de la garrapata Boophilus microplus, resistencia a los piretroides en Soto la Marina, Tamaulipas y en Emiliano Zapata, Tabasco, con una muy marcada resistencia a los piretroides y mediana a los organofosforados.

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Producto del hallazgo de estos casos se estableció a partir de noviembre de 1993 el Programa Nacional para el control de la resistencia, mediante la creación de un Comité con la participación de la Sección Veterinaria de la Cámara Nacional de la Industria Farmacéutica, (CANIFARMA), de la Confederación Nacional de Organizaciones Ganaderas (CNOG) y del Gobierno Federal, a través de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación ( SAGARPA) denominado Grupo de Ixodicidas SAGARPA-INFARVET-CNOG destacando entre sus principales acciones:

Envío de comunicados oficiales y de seguimiento, señalando los predios afectados, las familias de Ixodicidas a las cuales son resistentes y a cuales son susceptibles, iniciándose un Programa Nacional de Monitoreo para conocer la difusión de la resistencia hacia otros estados, detectándose esta a partir de 1994, además en los estados Oaxaca, Yucatán, Jalisco y Colima.

La elaboración de material de difusión (trípticos, posters boletines informativos para el control de moscas y garrapatas para dar a conocer la problemática, la publicación de la Norma Oficial Mexicana de Emergencia en 1994 y la Norma de la Campaña Nacional de la Garrapata Boophilus spp., en el año de 1995 y finalmente en septiembre del 2012 el “Acuerdo por el que se establece la Campaña para el control de la garrapata Boophilus spp” que deroga la Norma de la Campaña contra la garrapata Boophilus spp de 1995.

El establecimiento la línea de amidinas en los baños de línea oficiales ubicados en el norte y golfo del país, para evitar la movilización de animales infestados con garrapata resistente hacia los organofosforados y piretroides, hacia zonas libres.

Por otra parte se inicio un programa permanente de capacitación y asesoría a ganaderos y Médicos Veterinarios sobre el manejo de la resistencia. Se realizó un intercambio de información y experiencia con otros países (“III Seminario Internacional de Parasitología Animal sobre Resistencia y Control de Garrapatas y Moscas de Importancia Veterinaria” en Octubre de 2012, el V Seminario Internacional de Parasitología Animal, denominado “Evolución, Control y Manejo de la Resistencia en Artrópodos, Nematodos y Trematodos de los Rumiantes” en la Ciudad de Jurica, Querétaro y se tiene programado para septiembre del 2017 el VIII Seminario Internacional de Parasitología Animal a realizarse en Guadalajara Jalisco denominado “Control y Manejo de la Resistencia Parasitaria en Rumiantes”

El objetivo de este documento es el de presentar información sobre las estrategias para el manejo de la resistencia, una vez que se colectan especimenes de garrapata Boophilus microplus hembras mayores de 4.5 mm. a 8.0 mm, de predios en donde se sospecha que el fenómeno está presente; estos especímenes deberán ser enviados al Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA), en donde se realiza el diagnóstico de susceptibilidad/resistencia, recomendándose el uso adecuado de los Ixodicidas

142 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México por los métodos de moderación, saturación y ataque múltiple, con la finalidad resolver la presentación de poblaciones de garrapata Boophilus microplus resistentes hacia los plaguicidas con el uso o empleo de productos no convencionales, tales como los inhibidores del crecimiento de los insectos (IGR’S) los endectocidas o lactonas macrociclicas, las fenilpirazolonas, los inhibidores del desarrollo y la vacuna contra la garrapata.

PRINCIPIO DEL MANEJO DE LA RESISTENCIA DE LAS GARRAPATAS HACIA LOS IXODICIDAS.

Se ha establecido en numerosas ocasiones que la mejor manera de para manejar la resistencia es evitar su establecimiento, por lo cual cualquier medida para reducir el uso será de gran utilidad. El uso prudente y responsable de los plaguicidas es el inicio de un programa de manejo y prevención por lo que será fundamental la educación de los productores y técnicos buscando un cambio de mentalidad en el control del ectoparásito.

La necesidad de estrategias efectivas para el manejo de la resistencia de las garrapatas a los ixodicidas, se hace más apremiante a medida que el número de especies resistentes a los plaguicidas se incrementa a nivel mundial, mientras que el arsenal químico decrece. Las perspectivas de tales estrategias son alentadoras debido a los avances recientes en el conocimiento de la bioquímica, genética molecular, ecología, dinámica poblacional del ácaro, inspección periódica y otros aspectos importantes sobre la resistencia. Las tácticas generalmente reconocidas para manejar la resistencia se agrupan en tres categorías principales; baja presión de selección complementada por un fuerte componente de medidas no químicas (manejo por moderación); la eliminación de la ventaja selectiva de los individuos resistentes al incrementar la cantidad de plaguicida que reciben a través del uso de atrayentes, o al suprimir a las enzimas desintoxicantes mediante el uso de sinergistas (manejo por saturación); y tercero, la aplicación de una selección multidireccional a través del uso de mezclas y la rotación de plaguicidas no relacionados, o mediante el uso de plaguicidas que actúan en varios sitios de acción (manejo por ataque múltiple). Estas tácticas no son excluyentes pues algunos de los elementos de cada una de ellas se pueden usar para formular un programa de manejo de la resistencia a largo plazo. La estrategia que se escoja debe estar sustentada en un conocimiento profundo de las implicaciones en la resistencia que cada plaguicida tiene y de la biología y ecología de las especies involucradas y dicha estrategia debe hacer uso de todas las medidas de combate no químicas como el control de la plaga mediante el uso de razas resistentes a la garrapata y el manejo de las praderas Rotación de potreros), métodos que han demostrado efectividad comprobada.

Manejo por moderación. Las medidas agrupadas en esta categoría incluyen dosis bajas, aplicaciones poco frecuentes, uso de plaguicidas poco persistentes y conservación de los refugios de genes susceptibles, Se considera que estas

143 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México medidas son conservativas y en la mayoría de los casos, se deben complementar con medidas de combate químicas, como el uso de tratamientos estratégicos y selectivos. El manejo por moderación reúne o intenta reunir los estándares ambientales y es menos destructivo a los agentes de control biológico.

Manejo por saturación. El término “saturación” no implica la saturación del medio ambiente con plaguicidas. Lo que se intenta es saturar las defensas de los insectos o ácaros por medio del uso de dosis suficientemente altas para anular la resistencia. Este enfoque es más adecuado durante los primeros estados de la selección cuando los genes de resistencia son raros, pues si existen están en una condición heterocigota.

Manejo por ataque múltiple. Esta se basa en la premisa de que el control se puede lograr a través de la acción de varios agentes de control independientes, incluyendo plaguicidas, donde cada uno ejerce una presión de selección a un nivel tan bajo que no conlleve al desarrollo de resistencia. Este enfoque incluye la aplicación de químicos en mezcla y en rotaciones (Georghiou, 1983). El uso de mezclas son diferentes ya que inicialmente existen a una frecuencia tan baja que excluye la posibilidad de que ocurran juntos, en un solo individuo de una población dada. Por lo tanto el ácaro que sobrevive a un plaguicida en la mezcla, es eliminado por el otro plaguicida.

La rotación de plaguicidas se basa en información que indica que durante los primeros estados de la selección los individuos resistentes poseen una capacidad biótica más baja (costo de la resistencia) que la de los individuos susceptibles. Esta capacidad biótica reducida provoca un decremento gradual en la frecuencia de individuos resistentes cuando el agente de selección es eliminado, o reemplazado por un plaguicida que no es afectado por resistencia cruzada.

INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO DE LOS INSECTOS IGR’S

También llamados reguladores del crecimiento de los insectos, su acción predomina sobre el sistema biológico de formación de quitina de los artrópodos. Las investigaciones al respecto han estado encaminadas a la interferencia de los sistemas endocrinos de los artrópodos y modifican los ciclos de vida de los mismos. Los IGR´s afectan a la quitina, elemento vital para el exoesqueleto, impidiendo la muda de cutícula en los diferentes estadios de la garrapata. La síntesis de la quitina ocurre en las garrapatas durante la alimentación muda y embriogénesis, retardando la repleción y ovipositando huevos, con larvas no viables.

Estos productos son más efectivos en la infestación temprana de larvas, dentro de un programa, antes de que se establezca la infestación con ninfas y adultos, donde ya es necesario usar otros químicos como los Ixodicidas para su control.

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ENDECTOCIDAS-ABAMECTINAS (Lactonas Macrociclicas)

Actúan sobre parásitos internos y externos con dosis bajas, es decir son parasiticidas de amplio espectro, que actúan sobre moscas (Haematobia irritans), larvas de mosca (Dermatobia hominis) garrapatas de diferentes géneros y especies, piojos, ácaros de la sarna, además de controlar parásitos internos como gastroentéricos (Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Cooperia, Nematodirus, etc.), parásitos pulmonares (Dictyocaulus viviparus) y Fasciola hepática.

Los endectocidas además tienen la ventaja de tener un poder residual más largo que otros quimioterapéuticos para el control de los parásitos y diversas formas de aplicación como la inyectable, aplicación tópica o pour on y la administración de bolos. El ingrediente activo de este grupo se absorbe a través de la piel y es distribuido por todo el cuerpo del animal vía sanguínea, en el caso de la inyección o la aplicación de bolos vía oral, estos productos se liberan vía sistémica protegiendo a los animales en ésta última, hasta por 4 meses.

VACUNA CONTRA LA GARRAPATA DEL GÉNERO Boophilus microplus.

El uso de alternativas inmunológicas para el control de la garrapata ha sido explorado desde hace más de 30 años, sin embargo los primeros resultados verdaderamente exitosos se lograron con los llamados antígenos ocultos de los cuales la proteína llamada Bm86 representó el procedimiento más avanzado de control. Dicho antígeno al inyectarse a un bovino en dosis de 2 ml en tres aplicaciones produce anticuerpos suficientes para controlar la garrapata Boophilus microplus con porcentajes de eficacia que varía del 58 al 80% dependiendo de la cepa estudiada. Las primeras tres aplicaciones se realizaría el primer día, a la cuarta y séptima semana, mientras tanto se sugiere el esquema de tratamiento cada 15 días mediante el baño con Ixodicidas durante los 2 primeros meses, mientras se logra elevar los títulos de los anticuerpos, con la finalidad de que estos lesionen a las garrapatas en proceso de alimentación y se reduzca la ovoposición. El uso de esta estrategia permite ampliar los periodos de tratamiento, en regiones de alta infestación hasta por más de 60 días (Labarte, V.M.; Rodríguez y J. de la Fuente. 1996) y (Willadsen 1979).

A pesar de los progresos que se han hecho para entender la bioquímica de la resistencia y su dinámica en las poblaciones de campo, no se puede ofrecer una receta capaz de retrasar la resistencia en todas las condiciones. Hay literalmente cientos de especies de plagas diferentes que están bajo combate químico, y cada especie representa varias combinaciones distintas de características biológicas y ecológicas. El manejo por moderación debe ser el enfoque básico y tiene que ser suplementado con medidas de manejo integrado de plagas. Recurrir a las otras estrategias que se describen aquí será esencial en muchos casos, especialmente en explotaciones especializadas y en insectos vectores de enfermedades para el

145 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México ser humano. En tales casos la estrategia que debe estar basada en un conocimiento profundo de las implicaciones en la resistencia de Boophilus microplus a cada plaguicida a usar.

El uso de los productos no convencionales como es el caso de los inhibidores del crecimiento de los insectos IGR’s, los endectocidas y la vacuna contra la garrapata del género Boophilus spp, permiten controlar el problema de la garrapata resistente hacia los Ixodicidas. El uso de estos productos permite establecer programas integrales con manejos culturales y tratamientos químicos desde un principio y reducir el número de tratamientos entre 4 a 5 al año en lugar de 17 a 24 tratamientos que se realizaban anteriormente con el afán de erradicar el ácaro. Con estas alternativas, se logra movilizar en menos ocasiones a los animales, obteniendo mayores ganancias de peso, además de controlar poblaciones de garrapata resistente a los organofosforados, piretroides y las amidinas, se disminuye la presentación de casos de Piroplasmosis o Babesiosis en el ganado bovino, debido a que se logra una estabilidad enzoótica entre el huésped, la garrapata y los agentes etiológicos trasmitidos.

Estos productos alternativos para el control de plagas, se pueden aplicar en forma simultánea con cualquier producto químico o biológico dentro de un programa integral del manejo de ectoparásitos, además de que son sustancias o productos que tienen un poder residual más amplio, y que en términos generales en el caso de las vacunas, no contaminan el medio ambiente y son menos agresivos para la especie humana y los animales.

PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO DE PREDIOS CON GARRAPATA Boophilus microplus RESISTENTE A LOS IXODICIDAS.

1.- Cuando un ganadero o personal involucrado en el manejo de los animales, sospecha de que la garrapata del genero Boophilus microplus, no responde a la aplicación de los tratamientos con Ixodicidas, al identificar que después de tratar o bañar a los animales con un plaguicida que se aplica de acuerdo a las instrucciones del Laboratorio productor, este no surte el efecto deseado de derribe de las garrapatas en 3 ó 4 días.

2.- Solicita asesoría a Médico Veterinario Oficial de la SAGARPA; Responsable Autorizado en Rumiantes o Médico Veterinario Zootecnista de la Industria Farmacéutica Veterinaria relacionado con el control de plagas.

3.- El Médico Veterinario Zootecnista Oficial, Responsable Autorizado en Rumiantes o de la Industria Farmacéutica Veterinaria, atiende la solicitud y asesora al ganadero, verificando la cubicación del baño de inmersión (capacidad en litros), concentración del garrapaticida, contaminación de la solución del baño, cantidad del producto usado por animal en aspersión, (animal adulto 4 a 5 litros) en forma individual, uso de aguas duras, etc. Verifica que la garrapata

146 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México corresponda al género Boophilus spp y que no sea de otro género, como Amblyomma spp, Dermacentor spp, etc. En el caso de las Amidinas en baño de inmersión verificar que el potencial hidrogeno o pH este entre 11 y 14

4.- Si salva estas recomendaciones o premisas, deberá colectar 20 garrapatas adultas hembras Boophilus microplus, que midan más de 4.5 mm hasta 8.0 mm, de preferencia sin haber bañado a los animales con algún ixodicida en los últimos siete días. Las garrapatas deben ser, tomadas a contrapelo del animal, para evitar desprender el Gnathosoma o aparato bucal y colocarlas en un frasco tipo gerber limpio, con perforaciones en la tapa y con un algodón humedecido con agua limpia, para su envío al CENAPA.

Los frascos conteniendo las garrapatas, deberán conservarse en una hielera de unicel con refrigerantes o hielo, en este último caso se requiere poner papel periódico o de estrasa para evitar que el agua de la evaporación de los hielos, penetre a los frascos tipo gerber.

5.- Se deberá llenar el formato correspondiente con el nombre del predio, propietario, ubicación del rancho, antecedentes del uso de garrapaticidas manejo de los mismos, etc., y enviarlo junto con los especimenes de garrapata al Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA) en el km 11.5 de la carretera Cuernavaca, Cuautla en Jiutepec, Morelos.

6.- En el CENAPA realizaran el diagnóstico correspondiente y en un término promedio de 2 meses, enviaran los resultados de las pruebas efectuadas, señalando a que Ixodicidas o garrapaticidas las garrapatas Boophilus microplus son resistentes.

7.- Con los resultados obtenidos en el CENAPA, los Médicos Veterinarios Oficiales o Aprobados en Rumiantes y/o de la Industria Farmacéutica Veterinaria, estarán en condiciones de dictaminar o recomendar el cambio de producto garrapaticida al cual las garrapatas son resistentes o la recomendación del uso del producto alternativos, como las Lactonas macrocíclicas, las fenilpirazolonas, los Inhibidores del crecimiento de los Insectos IGR’S, la Vacuna contra la garrapata Boophilus; la dosis y frecuencia de aplicación de cada uno de ellos, con la finalidad de disminuir y mitigar el riesgo de las enfermedades hemoparasitarias transmitidas como Anaplasmosis, Babesiosis y/o Piroplasmosis.

Referencias

Aguirre, E.A.; Santamaría, V. M. 1986. Purificación y caracterización toxicológica de garrapatas Boophilus microplus resistentes a los organofosforados y organoclorados. VII Reunión Anual de la Asociación Mexicana de Parasitología Veterinaria A. C. Cd. Victoria, Tamps. México.

147 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Castellanos H. J. L.1985 Patogenia de la garrapata Boophilus microplus en ganado Aberden Angus Tesis de Maestría. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. UNAM, México. Castellanos H.J.L. 1998. Seguimiento a predios con garrapata resistente hacia los Ixodicidas y alternativas para su control. Diagnóstico y control de las principales enfermedades parasitarias en Tamaulipas. Universidad Nacional Autónoma de Tamaulipas. Cd. Victoria, Tamps. Castellanos, H.J.L. 1999. Estrategias para el manejo de poblaciones de garrapata Boophilus microplus resistente hacia los Ixodicidas y el uso de alternativas no convencionales para su control. XXIII Congreso Nacional de Buiatría, Aguascalientes, México. FAO. 1987 Control de las Garrapatas y de las Enfermedades que trasmiten. Manual práctico de campo. Vol. 1 Fragoso, J.H.; Ortiz, E.M.; Ortiz, N.A.; Santamaría V.M. 1995. Epidemiología de la resistencia a Ixodicidas piretroides en garrapatas Boophilus microplus en la República Mexicana. III Seminario Internacional de Parasitología Animal. Guerrero, México. Georghiou, GP. Lagunes 1988. The occurrence of resistance to pesticides. Cases of resistance reported worldwide through. FAO, Rome pp. 325. Kemp D. H. et al. 2000. Ticks module acaricide resistance: Diagnosis, management and prevention. Preliminary report to the animal. Health Services. FAO 1-49 Labarte, V.M.; Rodríguez y J. de la Fuente. 1996. Simulation of control strategies for the cattle tick Boophilus microplus employing vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation. Veterinary Parasitology, 63: 131-160. Nolan J.; Schnitzerling, H.J. 1986. Drug resistance in arthropod parasites in Chemotherapy of parasitic diseases, Edit Campbell, W.C; Rew. R.S.603-620 pp. Ortiz, E.M.; Santamaría, V.M.; Fragoso, S. H. 1994 Resistencia en garrapatas Boophilus microplus a los Ixodicidas en México XVI Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias. Guerrero, México. Solís, S. S. 1995. El programa para el control de la garrapata Boophilus y estrategias para el control de la resistencia a los productos ixodicidas en México. III Seminario Internacional de Parasitología Animal. Gro. México. Stone, D.F.; Haydock, K.P. 1962. A method for measuring the acaricide susceptibility of the cattle B. microplus (Can) Bull Entomol. Res. 69: 563-578. Willadsen, P. 1980. Immunity to ticks. 18,293-313.

148 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

EFFICACY OF A BOTANICAL ACARICIDE AND ITS ACTIVE INGREDIENTS AGAINST SUSCEPTIBLE AND ACARICIDE RESISTANT STRAINS OF RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS

Robert J Miller1,*, Nirbhay K. Singh1,2, Guilherme M Klafke1,3, John A. Goolsby1, Donald B. Thomas1, and Adalberto A. Pérez de León4

1USDA, Agricultural Research Service, Cattle Fever Tick Research Laboratory, 22675 N. Moorefield Rd, Edinburg, TX 78541, United States. 2Guru Angad Dev Veterinary and Animal Sciences University Department of Veterinary Parasitology, Ludhiana, Punjab, 141004, India. 3Desidério Finamor. Secretaria da Agricultura, Pecuária e Irrigação. Estrada do Conde, 6000, Eldorado do Sul, Rio Grande do Sul, 92990-000, Brazil. 4USDA, Agricultural Research Service, Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory and Veterinary Pest Genomics Center, 2700 Fredericksburg Rd., Kerrville, TX 78028, United States. *Corresponding author at: USDA, ARS, Cattle Fever Tick Research Laboratory, 22675 N. Moorefield Rd, Edinburg, Texas 78541 United States. Fax: +1 (956) 205- 7656. E-mail address: [email protected] (RJ Miller).

Abstract Ticks and tick-borne diseases are a major constraint for the sustainability of the cattle industry in tropical and subtropical regions of the world. The developments of resistance to most of the commonly used acaricides led to an attempt to screen herbal products for their possible acaricidal activity to develop an eco-friendly tick control alternative. The botanical acaricide Essentria® IC-3 insect concentrate contains rosemary oil (10%), geraniol (5%), and peppermint oil (2%), and this product reportedly acts on target pests through octopamine blocker technology. Essentria® IC-3 and its active components were evaluated for acaricidal activity against several resistant and susceptible strains of the southern cattle fever tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, using the Larval Packet test (LPT) with 14-21 days old unfed larvae. Efficacy was assessed by measuring percent larval mortality, and estimating lethal concentrations at 50% (LC50) and 95% (LC95) with 95% confidence limits (CL) using probit analysis. The LC50 and LC95 (95% CL) values for Essentria® IC-3 against the susceptible strain was estimated as 0.647% (0.59 to 0.69) and 1.033% (0.94 to 1.19), respectively, whereas, LC50 and LC95 values for other strain were variable ranging from 0.597-1.674% and 0.927- 2.236%, respectively. Among the various active ingredients, the acaricidal property of Essentria® IC-3 seems to be attributed to geraniol, as other components failed to exhibit any such response, and its LC50 and LC95 (95% CL) values for the Deutch strain were estimated to be 0.656% (0.61 to 0.69) and 1.114% (1.03 to 1.25), respectively. The comparison of LC50 and LC95 values of all strains with the susceptible (Deutch) showed susceptibility comparable to Deutch against geraniol except for Las Palmas strain. We report a low level of resistance in some of the

149 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México acaricide resistant strains against a herbal acaricide in R. microplus for the first time, possibly due to cross-resistance to chemical acaricides.

Keywords: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Essentria® IC-3, Geraniol, Rosemary oil, Peppermint oil; herbal acaricide

Introduction

Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) commonly known as “southern cattle fever tick” in North America is the most important tick of veterinary importance with a high economic impact on cattle husbandry throughout tropical and subtropical regions. Heavy tick infestations cause huge economic losses through anorexia, toxicosis, blood loss, general stress and irritation, decrease in productivity, depression of immune function, damage to hides, transmission of pathogens and treatment costs (Ghosh et al., 2007). Economic losses to cattle producers from ticks and tick-borne diseases (TTBDS) have been estimated at US $ 13–14 billion globally on an annual basis (de Castro, 1997), to which Brazil and Australia contribute US $ 3.24 billion (Grisi et al., 2014) and Aus $ 175 million (Playford et al., 2005), respectively.

Currently available tools for tick control consist of chemical acaricides used with different application methods and various formulations, breeding of tick resistant cattle, tick vaccines, biological control by pathogens or predators, pheromone- assisted control and botanical acaricides (Benelli et al., 2016). Cattle fever tick control chiefly depends upon chemotherapy with synthetic acaricides; however, large scale and repeated applications have limited their efficacy in reducing tick infestations and are often accompanied by serious drawbacks, including the development of acaricide resistant ticks, environmental contamination, and even contamination of milk and meat products with insecticide residues (Graf et al., 2004). These inherited disadvantages of chemical acaricides, high cost of developing new drugs and paucity of satisfactory immunizing agents have led to renewed interest in the use of botanicals for control of cattle ticks (Zaman et al., 2012). Botanical acaricides can be a suitable alternative for synthetic acaricides because of their low toxicity to non-target organisms including humans, the ability of rapid biodegradation of their residues and prevention of development of resistance against active substances, usually due to synergically acting mixtures with various modes of action (Rattan, 2010; Singh et al., 2015).

According to label instructions, the botanical pesticide product c insect concentrate kills crawling and flying insect pests, and can be used for indoors (dairy barns, poultry facilities, kennels), outdoors (dairy facilities, parks, playgrounds, poultry houses, recreational areas, lawns, turf and zoos), fogging of animal quarters (cattle barns, horse barns, poultry barns, swine houses, zoos), turf and ornamental, on animal and mosquito misting applications. It may be diluted with water or oil and

150 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México applied with conventional application equipment and most effective results are achieved when used as part of a treatment protocol that includes physical, environmental and other chemical pest control measures. Active ingredients of the formulation include rosemary oil (10%), geraniol (5%), and peppermint oil (2%), and acts on target pests through octopamine blocker technology. It can be used as livestock spray to control flying insects, ticks and lice when diluted at 1 to 3 fluid ounces per gallon of mineral oil. However, no specific claims to control R. (B.) microplus appear on the label. Therefore, the current study was executed to evaluate the acaricidal effect of this herbal formulation and its active ingredients, against various acaricide resistant and susceptible strains of R. microplus.

Materials and methods

Acaricides Essentria® IC-3 insect concentrate (Lot No. 57480), rosemary oil, geraniol and peppermint oil (Sigma-Aldrich, USA) were used on the bioassays. Also, all active ingredients of Essentria® IC-3 were mixed as per label information (rosemary oil- 10%, geraniol-5% and peppermint oil-2%) and used for bioassay to test the synergistic effect. Ticks

All tick populations used in this study were maintained at the Cattle Fever Tick Research Laboratory (CFTRL), Edinburg, Texas. R. microplus ticks rearing conditions at the CFTRL were described by Davey et al. (1980). We adhered to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals as promulgated by the Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council.

The following tick colonies established in the CFTRL, Edinburg, Texas were used: 1. Deutch strain (F62), as a susceptible reference in the bioassays; 2. El Zamora (F32), originated in the state of Tamaulipas, Northeast Mexico, resistant to SP, OP amitraz and fipronil (Miller et al., 2013); 3. Yucatan (F19), originated in the state of Yucatan, Mexico, is resistant to SP, OP, amitraz and ivermectin (Rodriguez-Vivas et al., 2014); 4. Santa Luiza (F58), originated in the state of Rio Grande do Sul, is resistant to SP and amitraz (Li et al., 2008); 5. San Roman (F79), originated in the state of Yucatan, Mexico, resistant to SP and OP; 6. San Alfonso (F58), originated in the state of Guerrero, Mexico, is resistant to SP and amitraz; 7. Las Palmas (F37), obtained from a cattle tick outbreak in Zapata Co. Texas, susceptible to all acaricides; 8. Lajas (F7), originated in Lajas, Puerto Rico, is susceptible to all the acaricides; 9. Gurwitz strain (F1) was obtained from a cattle tick outbreak in Jim Wells Co., Texas and is susceptible to all acaricides; 10. Sal Si Puedes (F1) was obtained from an outbreak in Starr Co., Texas and is resistant to SP (data not shown).

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Bioassays

After collection, engorged female ticks were placed in 5-cm diameter plastic petri dishes, and held in an environmental chamber at 28 °C, 91% RH, and a photoperiod of 12:12 (L:D) h. After 20 d, eggs were collected, mixed thoroughly, weighed, and returned to the environmental chamber. Fourteen days after the first observation of larvae, a FAO Larval Packet Test (Stone and Haydock, 1962) was performed with Essentria® IC-3 and its active ingredients individually. The Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO, 1971) has described the LPT technique in details. Essentria® IC-3 and it’s all active ingredients were diluted in two parts of trichloroethylene (TChE) (Sigma–Aldrich) and one part of olive oil (OO) (Sigma–Aldrich, Fluka). This formulation was subsequently diluted in TChE:OO for obtaining concentrations of 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 and 3.0%. Each serial dilution had a negative control (diluent only) and each dose had three replicates. A volume of 0.7 ml of each dilution was applied to 8 x 9 cm filter paper (Whatman No. 1, Whatman, Madstone, United Kingdom) and trichloroethylene was allowed to evaporate under a fume hood for 2 h. After drying, the bioassay sheets were folded in half, and metal clips (Bulldog, Boston Clip No. 2, Hunt Manufacturing Co., Statesville, NC) were placed on the sides, forming a packet. Approximately 100 larvae were placed into each packet, and the top was sealed with a third clip. Packets containing larvae were held at 28 °C, 70–80% RH, and photoperiod of 12:12 (L:D) h for 24 h. After 24 h, the packets were removed from the environmental chamber and opened, and the numbers of live and dead larvae were counted. Larvae that moved their legs but did not walk were counted as if dead. Additional tests with higher or lower doses were performed to obtain mortality ranging from 0 to 100%. Tests with over 10% mortality in the controls were rejected and repeated.

Statistical Analysis:

Probit analysis was conducted on bioassay results data using PoloPlus (Le Ora Software 2004). This analysis included probit transformation of percentage mortality and natural logarithm transformation of concentration. The lethal concentrations at 50% (LC50) and 95% (LC95) with 95% confidence limits (CL) were estimated. Resistance ratios (RRs) were calculated by taking into account the variance and co-variance of the slope and intercept of each regression line at the LC50 and LC95 for the comparison in question using the method of Robertson and Preisler (1992). RRs were calculated relative to the susceptible reference strain (Deutch).

Results

In vitro acaricidal effect of Essentria® IC-3 The acaricidal effect of Essentria® IC-3 was assessed by evaluation of larval mortality against ten R. microplus strains. A concentration-dependent mortality

152 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México response was observed for all tick strains whereas no larval mortality was seen in control group exposed to diluent only. The LC50 and LC95 (95% CL) values for the susceptible strain was estimated as 0.647% (0.59 to 0.69) and 1.033% (0.94 to 1.19), respectively, whereas LC50 and LC95 values for the other strains were variable ranging from 0.597-1.674% and 0.927-2.236% (Table 1). Further, RR95 values indicate low level of resistance in four strains (El Zamora, Gurwitz, San Alfonso and Yucatan) against Essentria® IC-3.

In vitro acaricidal effect of geraniol

The larval mortality caused by geraniol showed a concentration dependent increase with no larval mortality in control group. The LC50 and LC95 (95% CL) values for the Deutch were estimated as 0.656% (0.61 to 0.69) and 1.114% (1.03 to 1.25), respectively. The toxicity of geraniol was similar against all strains evaluated with LC50 and LC95 with no difference comparing to Deutch strain, except for Las Palmas strain.

In vitro acaricidal effect of rosemary oil:

The dose-mortality response against rosemary oil was studied with Deutch and Yucatan strains of R. microplus. The regression analysis by PoloPlus revealed the treatment has no effect. The t-value (which measures the size of the difference relative to the variation in your sample data) and slope for Deutch and Yucatan strain were -12.722 and -0.001+-0.083; and -21.973 and 0.024+-0.057, respectively.

In vitro acaricidal effect of peppermint oil

The dose-mortality response against peppermint oil was studied with Deutch and Yucatan strains of R. (B.) microplus and the treatment showed no effect, similarly to rosemary oil. The t-value and slope for Deutch and Yucatan strains were -8.066 and 5.150+-0.624; and -11.227 and 0.959+-0.297, respectively.

In vitro acaricidal effect of rosemary oil, geraniol and peppermint oil combination

In order to mimic the commercial product Essentria® IC-3 we have formulated its three components in TChE-OO following the concentrations declared on the label: 10% rosemary oil, 5% geraniol and 2% peppermint oil. Serial dilutions of this mixture were used to study the dose-mortality response against strains Las Palmas and Santa Luiza strain. No acaricidal effect was observed in the combination. The t-value and slope for Las Palmas and Santa Luiza strains were 0.000 and 0.012+- 1121164.883; and -24.015 and 0.452+-0.105, respectively.

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Discussion

Chemical acaricides, if correctly used, are efficient and cost-effective, but are associated with problems of resistance development, environmental pollution, contamination of meat and milk from livestock and expense (Benelli et al. 2016). Development of resistance has been reported against almost all groups of chemical acaricides available globally (Miller et al., 2002; 2005; Klafke et al., 2006, Singh and Rath, 2014, Reck et al., 2014; Singh et al., 2014; 2015; Jyoti et al., 2016). Further, biological control agents are highly desirable, but their efficacy, manufacture, application and stability present serious challenges. Current anti-tick vaccines may lack the efficacy to be a stand-alone solution.

Use of phytochemical products may be beneficial to reduce the problems faced by animal owners, such as resistance and residues, also prolonging the useful life of commercial chemical products applied for tick control. Various plant extracts and essential oils have shown significant activity against different stages of economically important tick species (Reviewed by Benelli et al. 2016). The current study was undertaken for scientific validation and evaluation of the acaricidal effect of the commercially available herbal formulation Essentria® IC-3 and its active ingredients, against various acaricide resistant and susceptible strains of R. microplus.

Geraniol, an acyclic monoterpene alcohol is a mixture of the two isomers named as geraniol (trans) and nerol (cis) isolated from Palmarosa oil and oil of neroli, respectively (Clark, 1998). In addition to various biochemical and pharmacological properties geraniol is an effective plant-based insect repellent (Barnard and Xue, 2004). A strong acaricidal activity by geraniol against the ear mite, Otodectes cynotis (Traina et al., 2005) and poultry red mite, Dermanyssus gallinae (George et al., 2009) had been reported. Geraniol has also shown promise as a pest repellent elsewhere, outperforming other essential oil components (citronella and linalool) when used to protect humans from mosquito and sand fly bites (Muller et al., 2008). Geraniol (1%) showed a reduction of 98.4, 97.3 and 91.3% in the mean number of Hyalomma ticks per cattle at days 7, 14 and 21, respectively (Khallaayoune et al., 2009). The presence of geraniol in greater quantities in Cymbopogon martinii in relation to Cymbopogon shoenanthus was correlated to the higher acaricidal activity of C. martini against R. microplus by adult immersion and larval packet test however, the isolated and synthesized geraniol failed to exhibit a significant effect on larvae and adult ticks (de Souza et al., 2012). Recently, a plant-based 5 % geraniol (TT-4302) product similar to Essentria® IC-3 showed very high repellency property against the ticks Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis, Ixodes scapularis, and R. sanguineus (Bissinger et al., 2014). The current study shows presence of high acaricidal activity in geraniol with a LC50 value of 0.656% against the susceptible strain of R. microplus.

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Rosemary oil is obtained by steam distillation of the fresh leaves and flowering tops of Rosemary (Rosmarinus officinalis L.), an evergreen branched bushy shrub that grows wildly along the north and south coasts of the Mediterranean Sea and sub- Himalayan areas (Al-Sereiti et al 1999). Laboratory bioassay revealed rosemary oil and EcoTrol® (a rosemary oil-based pesticide) caused complete mortality of spider mite, Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) at concentrations that are not phytotoxic to the host plant (Miresmailli and Isman 2006). A rosemary oil-based insecticide, Eco-Exempt® IC2, high-pressure spray on selected plots in oak-pine forest in southern Maine (USA) during peak nymphal (July) and adult (October) seasons proved to be an effective, minimum-risk acaricide treatment to control Ixodes scapularis (Say), the vector tick of Lyme disease (Elias et al., 2013). Larval packet test bioassay with essential oils extracted from rosemary leaves against10 days old R. microplus showed >85% larval mortality at 10 and 20% oil concentration, which decreased noticeably with lower concentration of oil and no mortality was recorded at 2.5 and 1.25% of the essential oil concentration (Martinez-Velazquez et al., 2011). Further, rosemary oil inhibited reproduction of female R. microplus ticks but showed neither acaricidal nor ovicidal effect (Volpato t al., 2015). The essential oils of the dry leaves of Rosemary showed strong repellency against the Ixodes ricinus ticks (El-Seedi et al., 2012). However, in the current study acaricidal activity was recorded for the botanical acaricide with 10% rosemary oil but the oil showed no such activity when used in pure form.

Peppermint oil is extracted by steam distillation from the leaves of the perennial herb, Mentha piperita L. and M. arvensis var. piperascens, a member of the labiatae family and its main constituent is menthol (Alankar, 2009). The acaricidal activities of peppermint oil and menthol isomers were reported against mites in stored food, Tyrophagus putrescentiae (Park et al., 2014). Peppermint oil showed high larvicidal activity against larvae of Aedes aegypti, Anopheles stephensi and Culex quinquefasciatus (Ansari et al., 2000) and house fly, Musca domestica L. adults by fumigant test (Pavela, 2008). The repellent effect of peppermint on nymphal stages of Ixodes ricinus L. had been studied (Thorsell et al., 2006). Peppermint oil was tested against embryonated eggs, unfed larvae and fed females of the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) annulatus and an LC50 of 0.39, 0.77 and 2.85%, respectively was reported (Abel-Shafy and Soliman 2004). However, in the present study no larvicidal activity was recorded in peppermint oil alone against R. microplus.

The current study reports the larvicidal efficacy of a commercial botanical acaricide, Essentria® IC-3 insect concentrate against various susceptible and resistant strains of R. microplus. Results indicate a high acaricidal effect of the commercial formulation against larval ticks with variation among different tick strains. Interestingly, El Zamora and Yucatan strain of R. microplus which are resistant to several classes of acaricides exhibited a low level of resistance against Essentria® IC-3. Also, among the active ingredients only geraniol exhibited larvicidal property whereas, rosemary oil and peppermint oil failed to produce a

155 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México dose-dependent mortality response. Further, the combination of the pure ingredients failed to produce the desired results as earlier reported by de Souza et al., (2012). Published reports suggest tick repellency activity in the active ingredients of this product, therefore, future studies are planned to evaluate the tick repellency property of Essentria® IC-3 along with it active ingredients.

Acknowledgments

The authors thank University Grants Commission, New Delhi, India for granting funds to Nirbhay K Singh through Raman Fellowship for Post Doctoral Research in USA for 2016-17.

The authors also thank L. Dave Krska, Jason J. Tidwell, Michael Moses, Summer de Luna, Joni Ann, Ruben Ramirez, Cezar Agado, James Hellums, and Ruby Martinez of the USDA-ARS Cattle Fever Tick Laboratory for rearing the ticks and helping in the laboratory. This article reports the results of research only and mention of a proprietary product does not constitute an endorsement or recommendation by the USDA for its use. USDA is an equal opportunity provider and employer.

References

Abel-Shafy, S., Soliman, M.M.M., 2004.Toxicity of some essential oils on eggs, larvae and females of Boophilus annulatus (Acari, Ixodidae) infesting cattle in Egypt. Acarologia 44, 23-30. Alankar, S., 2009. A review on peppermint oil. Asian J. Pharmaceutical Clinical Res. 2: 27-33. Al-Sereiti, M.R., Abu-Amer, K.M., Sen, P., 1999. Pharmacology of rosemary (Rosmarinus officinalis Linn.) and its therapeutic potentials. Indian J. Exp. Biol. 37, 124–130. Ansari, M.A., Vasudevan, P., Tandon, M., Razdan, R.K., 2000. Larvicidal and mosquito repellent action of peppermint (Mentha piperita) oil. Bioresource Technol. 71, 267-271. Barnard, D.R., Xue, R., 2004. Laboratory evaluation of mosquito repellents against Aedes albopictus, Culex nigripalpus, and Ochlerotatus triseriatus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 41, 726–730. Benelli, G., Pavela, R., Canale, A., Mehlhorn, H., 2016. Tick repellents and acaricides of botanical origin: a green roadmap to control tick-borne diseases? Parasitol. Res. 115, 2545–2560. Bissinger, B.W., Schmidt, J.P., Owens, J.J., Mitchell, S.M., Kennedy, M.K., 2014. Activity of the plant-based repellent, TT-4302 against the ticks Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis, Ixodes scapularis and Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). Exp. Appl. Acarol. 62, 105-113. Clark IV, G.S., 1998. Geraniol. Perfumer & Flavorist 23, 19–25.

156 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Davey, R.B., Garza, J., Thompson, G.D., Drummond, R.O., 1980. Ovipositional biology of the cattle tick, Boophilus annulatus (Acari: Ixodidae), in the laboratory. J. Med. Entomol. 17, 287-289. de Castro, J.J., 1997. Sustainable tick and tick-borne disease control in livestock improvement in developing countries. Vet. Parasitol. 71, 77–97. de Souza, C.A.C., de Barros, L.D., Cotinguiba, F., Furlan, M., Giglioti, R., de Sena Oliveira, M.C., Bizzo, H.R., 2012. In vitro efficacy of plant extracts and synthesized substances on Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Parasitol. Res. 110, 295-303. Elias, S.P., Lubelczyk, C.B., Rand, P.W., Staples, J.K., St-Amand, T.W., Stubbs, C.S., Lacombe, E.H., Smith, L.B., Smith, R.P.Jr., 2013. Effect of a botanical acaricide on Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) and nontarget arthropods. J. Med. Entomol. 50, 126-136. El-Seedi, H.R., Khalil, N.S., Azeem, M. Taher, E.A. Goransson, U., Palsson, K., Borg-Karlson, A.K., 2012. Chemical composition and repellency of essential oils from four medicinal plants against Ixodes ricinus nymphs (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 49, 1067–1075. [FAO] Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1971. Recommended methods for the detection and measurement of resistance of agricultural pests to pesticides-tentative method for larvae of cattle ticks, Boophilus microplus spp. FAO method No. 7. FAO Plant Proc. Bull. 19, 15- 18. George, D.R., Biron, J.M., Jolly, G., Duvallet, G., Sparagano, O.A.E., 2009. Toxicity of geraniol solution in vitro to the poultry red mite, Dermanyssus gallinae. Parasite 16, 319-321. Ghosh, S., Bansal, G.C., Gupta, S.C., Ray, D.D., Khan, M.Q., Irshad, H., Shahiduzzaman, M., Seitzer, U., Ahmed, J.S., 2007. Status of tick distribution in Bangladesh, India and Pakistan. Parasitol. Res. 101, 207– 216. Graf, J.F., Gogolewski, R., Leach-Bing, N., Sabatini, G.A., Molento, M.B., Bordin, E.L., Arantes, G.J., 2004. Tick control: an industry point of view. Parasitology 129, S427–S442. Grisi, L., Leite, R.C., Martins, J.R., Barros, A.T., Andreotti, R., Cançado, P.H., León, A.A., Pereira, J.B., Villela, H.S., 2014. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 23, 150-156. Jyoti, Singh, N.K., Singh, H., Rath, S.S., 2016. Multiple mutation in the acetylcholinesterase 3 gene associated with organophosphate resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick from Punjab, India. Vet. Parasitol. 216, 108–117. Khallaayoune, K., Biron, J.M., Chaoui, A., Duvallet, G., 2009. Efficacy of 1% geraniol (Fulltec) as a tick repellent. Parasite 16, 223–226. Klafke, G.M., Sabatini, G.A., de Albuquerque, T.A., Martins, J.R., Kemp, D.H., Miller, R.J., Schumaker, T.T.S., 2006. Larval immersion tests with ivermectin in populations of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus

157 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

(Acari:Ixodidae) from State of Sao Paulo Brazil. Vet. Parasitol. 142, 386– 390. Le Ora Software. 2004. A user’s guide to probit or logit analysis. Le Ora Software, Berkeley, CA. Li, A.Y., Davey, R.B., Miller, R.J., Guerrero, F.D., George, J.E., 2008. Genetics and mechanisms of permethrin resistance in the Santa Luiza strain of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 45, 427-438. Martinez-Velazquez, M., Rosario-Cruz, R., Castillo-Herrera, G., Flores-Fernandez, J.M., Alvarez, A.H., Lugo-Cervantes, E., 2011. Acaricidal effect of essential oils from Lippia graveolens (Lamiales: Verbenaceae), Rosmarinus officinalis (Lamiales: Lamiaceae), and Allium sativum (Liliales: Liliaceae) against Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 48, 822-827. Miller, R.J., Davey, R.B., George, J.E., 2002. Modification of the Food and Agriculture Organization larval packet test to measure amitraz-susceptibility against Ixodidae. J. Med. Entomol. 39, 645-651. Miller, R.J., Davey, R.B., George, J.E., 2005. First report of organophosphate- resistant Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) within the United States. J. Med. Entomol. 42, 912–917. Miller, R.J., Almazán, C., Ortíz-Estrada, M., Davey, R.B., George, J.E., Pérez de León, A.A., 2013. First report of fipronil resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus of Mexico. Vet. Parasitol. 191, 97-101. Miresmailli, S., Isman, M.B., 2006. Efficacy and persistence of rosemary oil as an acaricide against twospotted spider mite (Acari: Tetranychidae) on greenhouse tomato. J. Econ. Entomol. 99, 2015-2023. Muller, G.C., Junnila, A., Kravchenko, V.D., Revay, E.E., Butler, J., Schlein, Y., 2008. Indoor protection against mosquito and sand fly bites: a comparison between citronella, linalool, and geraniol candles. J. Am. Mosq. Control Assoc. 24, 150–153. Park, J.H., Yang, J.Y., Lee, H.S., 2014. Acaricidal activity of constituents derived from peppermint oil against Tyrophagus putrescentiae. J Food Prot. 77, 1819-1823. Pavela, R., 2008. Insecticidal properties of several essential oils on the house fly (Musca domestica L.). Phytotherapy Res. 22, 274–278. Playford, M., Rabiee, A.R., Lean, I.J., Ritchie, M., 2005. Review of research needs for cattle tick control. Phases I and II. Meat & Livestock Australia Ltd, Sydney. Rattan, R.S., 2010. Mechanism of action of insecticidal secondary metabolites of plant origin. Crop Prot. 29, 913–920. Reck, J., Klafke, G.M., Webster, A., Dall'Agnol, B., Scheffer, R., Souza, U.A., Corassini, V.B., Vargas, R., dos Santos, J.S., Martins, J.R., 2014. First report of fluazuron resistance in Rhipicephalus microplus: a field tick population resistant to six classes of acaricides. Vet. Parasitol. 201, 128- 136.

158 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Robertson, J.L., Preisler, H.K., 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Raton, FL. Rodríguez-Vivas, R.I., Miller, R.J., Ojeda-Chi, M.M., Rosado-Aguilar, J.A., Trinidad-Martínez, I.C., Pérez de León, A.A., 2014. Acaricide and ivermectin resistance in a field population of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) collected from red deer (Cervus elaphus) in the Mexican tropics. Vet. Parasitol. 200, 179-188. Singh, N.K., Jyoti, Haque, M., Singh, H., Rath, S.S., Ghosh, S., 2014. A comparative study on cypermethrin resistance in Rhipicephalus (Boophilus)microplus and Hyalomma anatolicum from Punjab (India). Ticks Tick Borne Dis. 5, 90–94. Singh, N.K., Jyoti, Vemu, B., Singh, H., Prerna,M., Daundkar, P.S., Sharma, S.K., Dumka, V.K., 2015. In vitro acaricidal activity of Murraya koenigii (L.) Spreng (Rutaceae) extracts against synthetic pyrethroid resistant Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Parasitol. Res. 114, 1531–1539. Singh, N.K., Rath, S.S., 2014. Esterase mediated resistance against synthetic pyrethroids in field populations of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari:Ixodidae) in Punjab districts of India. Vet. Parasitol. 204, 330–338. Stone, B.F., Haydock, P., 1962. A method for measuring the acaricide susceptibility of the cattle tick, Boophilus microplus (Can.). Bull. Entomol. Res. 53, 563–578. Thorsell, W., Mikiver, A., Tunon, H., 2006. Repelling properties of some plant materials on the tick, Ixodes ricinus L. Phytomedicine 13, 132-134. Traina, O., Cafarchia, C., Capelli, G., Iacobellis, N.S., Otranto, D., 2005. In vitro acaricidal activity of four monoterpenes and solvents against Otodectes cynotis (Acari: Psoroptidae). Exp. Appl. Acarol. 37, 141–146. Volpato, A., Grosskopf, R.K., Santos, R.C., Vaucher, R.A., Raffin, R.P., Boligon, A.A., Athayde, M.L., Stefani, L.M., da Silva, A.S., 2015. Influence of rosemary, andiroba and copaiba essential oils on different stages of the biological cycle of the tick Rhipicephalus microplus in vitro. J. Essent. Oil Res. 27, 244-250. Zaman, M.A., Iqbal, Z., Abbas, R.Z., Khan, M.N., Muhammad, G., Younus, M., Ahmed, S., 2012. In vitro and in vivo acaricidal activity of a herbal extract. Vet. Parasitol. 186, 431–436.

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MECANISMOS INMUNOLÓGICOS EN INFESTACIONES DE GARRAPATAS

IMMUNOLOGICAL MECHANISMS IN TICK INFESTATIONS

Julio V. Figueroa Millán

CENID-PARASITOLOGÍA VETERINARIA, INIFAP Boulevard Cuauhnahuac No. 8534, Jiutepec, Morelos 62550, México [email protected]

Resumen

Las garrapatas son ectoparásitos de gran importancia médica y veterinaria debido al daño directo causado por la alimentación de sangre y por el papel que desempeñan en la transmisión de agentes infecciosos conocidos y emergentes. Las garrapatas y los patógenos transmitidos por garrapatas estimulan el sistema inmunitario del hospedero. Estas interacciones inmunológicas son importantes en la biología de las garrapatas, la transmisión de patógenos y para el control de las garrapatas y las enfermedades transmitidas por garrapatas. Tanto la defensa inmunitaria innata como la específica adquirida están implicadas en la respuesta de los hospederos vertebrados a la infestación y las garrapatas han desarrollado contramedidas para eludir las defensas inmunitarias del hospedero. Las garrapatas son artrópodos obligados que succionan la sangre, que dependen totalmente de sus hospederos para obtener nutrientes y, en el caso de las hembras adultas, lograr la madurez sexual. Al intentar alimentarse de sus hospederos, las garrapatas se enfrentan al problema de la hemostasia del hospedero (mecanismo de los vertebrados que previenen la pérdida de sangre), inflamación (que puede producir picazón o dolor y así iniciar un comportamiento defensivo en el hospedero) y a su Inmunidad adaptativa o adquirida (tanto respuestas a nivel celular como humorales). Frente a estas barreras, las garrapatas desarrollaron un complejo y sofisticado armamento farmacológico, que consiste en lípidos bioactivos y proteínas, para ayudar en el proceso de la alimentación de sangre. Los avances en la investigación inmunológica, transcriptómica y proteómica (Francischetti et al., 2013; Chmelař et al., 2016) han permitido descubrir que las garrapatas duras expresan cientos de diferentes proteínas en sus glándulas salivales, la mayoría de las cuales no tienen una función conocida, e incluyen nuevas familias de proteínas. En este trabajo se revisan, brevemente, los principales aspectos relacionados con la resistencia del ganado a las garrapatas, los mecanismos de respuesta que intervienen en la elucidación de la resistencia inmunológica y algunos mecanismos utilizados por las garrapatas para modular dicha repuesta inmunológica.

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Resistencia del ganado a las garrapatas

Las garrapatas son ácaros especializados, taxonómicamente clasificados en el suborden Ixodida del orden Parasitiformes. Son únicas entre los ácaros por ser más grandes, con piezas bucales especializadas y ser ectoparásitos obligados de vertebrados terrestres, incluidos los anfibios, reptiles, aves y mamíferos (Guglielmone et al., 2010). Se describe el parasitismo por garrapatas como uno de los factores ambientales más perjudiciales que afectan la producción y el rendimiento del ganado, ya que causa inmunosupresión en el ganado afectado (Jonsson, 2006). Tanto en el ganado lechero como en el de carne, el principal daño causado por las garrapatas de ganado son los costos asociados a los productos químicos y el equipo utilizado para el control de parásitos, además de las pérdidas de fertilidad, peso corporal y producción de leche. No menos importante es la pérdida ocasionada por la transmisión de enfermedades infecciosas y parasitarias, principalmente Anaplasma y Babesia (Gugliemone, 1995). Además, el uso indiscriminado de productos químicos puede afectar el futuro control parasitario como consecuencia del desarrollo de resistencia al principio activo utilizado en las preparaciones para el control de garrapatas (Jonsson, 2006). Existen grandes diferencias entre los bovinos Bos indicus (Asiáticos) y Bos taurus (Europeos) en cuanto a su susceptibilidad al parasitismo por las garrapatas del ganado, la literatura científica informa que la infestación aumenta a medida que aumenta la proporción de genes europeos en un animal (Lemos et al., 1985). Los estudios demuestran que, en general, el número de garrapatas en ganado cebú (B. indicus) y sus cruzas (Cebú x Europeo) es significativamente menor que el número encontrado en razas Europeas (Utech y Wharton, 1982). Por ejemplo, en un estudio realizado por da Silva et al., (2007) se evaluó el grado de resistencia a la garrapata en novillas de diferentes grupos genéticos cuando se infestó artificialmente con la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Se identificó que las novillas Nelore fueron más resistentes a las garrapatas, mientras que las novillas Canchim x Nelore (5/8 Charolais + 3/8 Cebú) tuvieron valores intermedios de infestación, en tanto que las novillas Simmental x Nelore y Angus x Nelore fueron similares y tuvieron los valores de infestaciones más altos. Se demostró que los valores de infestación por garrapatas aumentaron con la proporción de genes Bos taurus en las novillas, y que incluso las novillas cruzadas Canchim x Nelore, que eran sólo 31.25% Europeas porque la raza Canchim es 5/8 Charolais (B. taurus) y 3 / 8 cebú (B. indicus), eran menos resistentes que las novillas de raza pura Nelore. Este tipo de diferencias entre los grupos genéticos en relación con los valores de infestación por garrapatas también han sido reportadas previamente por Utech et al. (1978) que compararon varios grupos genéticos de ganado y encontraron que el ganado B. indicus Brahman era el más resistente, seguido por B. indicus x B. taurus y luego por el ganado británico B. taurus. Se observó también que entre las razas de B. taurus estudiadas, las novillas Jersey eran más resistentes que las novillas Guernsey, Shorthorn, o Friesian. En animales naturalmente infestados, también se han reportado diferentes grados de infestación en diferentes grupos genéticos

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(Lemos et al., 1985). En África, se ha clasificado el ganado B. indicus como altamente resistente a las garrapatas del ganado, el ganado B. taurus Sanga como un poco menos resistente, y el B. taurus británico y el continental como de baja resistencia (Norval et al., 1998; Mapholi et al., 2014). Se ha sugerido que el aumento de la resistencia a la garrapata del ganado B. indicus ha evolucionado debido a que el ganado de los climas tropicales siempre ha estado en contacto con garrapatas, mientras que el ganado Europeo B. taurus estableció contacto con las garrapatas sólo hasta recientemente cuando B. taurus fue introducido en los trópicos (da Silva et al, 2007; Jonsson et al., 2014). Aunque el mecanismo exacto de la resistencia a las garrapatas bovinas todavía no es bien conocido, desde el siglo pasado Riek (1962) lo ha clasificado como de resistencia innata, presente antes de la primera infestación, y resistencia adquirida producida después de la primera infestación. Cuando se exponen por primera vez a las garrapatas después del nacimiento, los terneros cruzas de Cebú son más resistentes que los terneros de razas Europeas, lo que sugiere algún grado de resistencia innata (O'Kelly y Spires, 1976). Se ha sugerido que la inoculación de sustancias extrañas con la saliva de las larvas de garrapatas produce irritación que da lugar a la auto-limpieza de los animales (lamido, acicalamiento) en un intento de eliminar el ectoparásito (Kemp et al., 1976; Koudastaal et al., 1978). Riek (1962) y Willadsen et al. (1978) reportaron reacciones de hipersensibilidad en el ganado resistente a las garrapatas que pueden dar como resultado que las garrapatas se desprendan del ganado. Otros mecanismos también pueden estar relacionados con la resistencia, tales como la anastomosis arteriovenosa en la vasculatura dérmica del ganado B. taurus y el recuento de mastocitos en la piel de hospederos tipo B. taurus y B. indicus según lo informado por Moraes et al. (1992). Respecto a la resistencia adquirida, Riek (1962) estudió B. taurus, B. indicus y sus cruces y encontró que aunque la resistencia adquirida era menos aparente en B. taurus de raza pura, existía una variación considerable en el grado de resistencia entre individuos por tipo de ganado y dentro de los grupos de raza. Wagland (1975) comparó ganado B. indicus (Brahman) y B. taurus (Shorthorn) durante cuatro infestaciones sucesivas con larvas de B. microplus y obtuvo un número similar de hembras ingurgitadas después de la primera infestación en ambas razas. Sin embargo, en la cuarta infestación, el ganado Brahman tuvo menos garrapatas ingurgitadas que las novillas Shorthorn. En un estudio posterior, Wagland (1978) encontró que las novillas Brahman desarrollaron grados medibles de resistencia a la garrapata durante los primeros tres días de infestación, mientras que las novillas Shorthorn desarrollaron resistencia a la garrapata sólo después de 20 días, lo que indica que así como el componente de resistencia innata varía entre las razas y entre los individuos de las razas, hay un importante componente variable de resistencia adquirida, lo que sugiere una respuesta inmunológica adquirida heterogénea. Se ha asociado un elevado grado de resistencia a la garrapata en el ganado Cebú y sus cruces, probablemente debido a la capacidad adaptativa de dicho ganado que, entre otros aspectos, se expresa por las características del pelaje, como el pelo corto y los rasgos del pelo liso. Utech et al. (1978) dividieron la resistencia a la garrapata en el ganado en las siguientes clases de acuerdo a la mortalidad de

162 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México garrapatas (MG): > 98% MG, ganado resistente a las garrapatas; 95,1% a 98% MG, moderadamente resistente a las garrapatas; 90% a 95% MG, baja resistencia a la garrapata; y <90% MG, muy baja resistencia a la garrapata. Así, las novillas Angus x Nelore y Simmental x Nelore mostraron un mayor porcentaje de infestación que las novillas Nelore, mientras que las novillas Canchim x Nelore alcanzaron un grado intermedio, lo que sugiere una mayor resistencia a la garrapata en novillas Nelore, resistencia intermedia en novillas Canchim x Nelore, y menor resistencia en novillas Angus x Nelore y Simmental x Nelore. Sin embargo, la mayoría de las novillas Angus x Nelore y Simmental x Nelore también pueden considerarse altamente resistentes (da Silva et al, 2007).

Problemas que enfrenta la garrapata durante su alimentación

La sangre es el único alimento nutritivo tomado por las garrapatas. La adaptación a la alimentación de sangre implicó la evolución de un complejo cóctel de componentes salivales que ayudan al parásito a superar las defensas de su hospedero contra la pérdida de sangre (hemostasia) y el desarrollo de reacciones inflamatorias en el sitio de alimentación que pueden interrumpir el flujo sanguíneo o desencadenar un comportamiento defensivo del huésped, por la sensación de dolor o comezón. Por consiguiente, la saliva de los artrópodos que chupan la sangre contiene componentes anticoagulantes, antiplaquetarios, vasodilatadores, antiinflamatorios e inmunomoduladores, usualmente en cantidades redundantes (Francischtti et al., 2009; Wikel, 2017a; 2017b; 2017c).

Es crucial para cualquier animal hematófago que los vasos sanguíneos en el sitio de alimentación continúen suministrando sangre líquida a las partes bucales del parásito a pesar de la lesión del tegumento vertebrado. La lesión vascular desencadena el fenómeno de la hemostasia, que se basa en la tríada de la coagulación de la sangre, agregación plaquetaria y curación de lesión (Wikel, 2017a). Los mecanismos de reparación del tejido inducen la formación de cicatrices, un proceso que comienza dentro del día de la lesión y procede durante varios días adicionales (Wikel, 2017b). Además, el sistema inmune puede contribuir a respuestas celulares y humorales que modifican más el sitio de alimentación de garrapatas de un hospedero previamente expuesto (Wikel, 2017c). Tales respuestas inmunitarias pueden ser inmediatas, como en las reacciones antígeno / anticuerpo / complemento, o pueden tardar horas en producirse, como en las reacciones celulares que requieren la formación de un infiltrado de leucocitos tal como el infiltrado basófilo asociado con reacciones de rechazo de garrapatas. En las dos décadas más recientes se han identificado las principales vías de defensa de los vertebrados que enfrentan las garrapatas durante el proceso de alimentación, con la intención de identificar los blancos de los componentes salivales en su papel adaptativo para facilitar una comida de sangre (Francischtti et al., 2009; Wikel, 2017a; 2017b; 2017c).

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Garrapatas e inmunidad

Para completar su comida de sangre, las garrapatas tienen que lidiar con la inmunidad innata (inflamación) en la infestación primaria y con la inmunidad innata y adaptativa durante las infestaciones secundarias o posteriores. La base inmunológica de la resistencia a la garrapata que se manifiesta por la disminución del rendimiento (Número de garrapatas repletas), el peso, la fecundidad y/o la fertilidad de los parásitos ha sido reconocida y bien demostrada en algunas especies de mamíferos infestadas con garrapatas ixodidas (Bossard, 2004). El desafío al sistema inmunológico comienza incluso antes del contacto con la sangre del huésped, en el momento en que las partes bucales de la garrapata se insertan en la piel, causando la ruptura de esta barrera física. Los leucocitos residentes de la epidermis y la dermis, tales como mastocitos, eosinófilos, células dendríticas, y macrófagos, así como los queratinocitos son los primeros en hacer contacto con las partes bucales de la garrapata y la saliva (Franchisetti et al, 2013; von Stebut, 2017). Estas células liberan mediadores preformados además de producir factores quimiotácticos para reclutar células inflamatorias tales como los neutrófilos al sitio de unión. Las infestaciones posteriores pueden activar respuestas adaptativas que implican células T y células B mediante la producción de anticuerpos y sensibilización de mastocitos y basófilos que, junto con los eosinófilos, son células predominantes en el sitio de fijación de garrapatas. Si esta respuesta podrá conferir resistencia al hospedero dependerá de factores tales como los antecedentes genéticos del hospedero, estado de salud y especies de hospedero y de garrapatas implicadas. El papel de las células -los mediadores involucrados en la respuesta inmune durante la infestación de garrapatas- así como la capacidad de las garrapatas para eludir dicha inmunidad se discute más a fondo en las excelentes revisiones publicadas por (Bossard y Wikel, 2004; Francischetti et al., 2009; von Stebut 2017; Wikel 2017 a; 2017b; 2017c). Particularmente en el libro “The Arthropod Vector: The Controller of Transmission”, los primeros cuatro capítulos proporcionan un examen completo de las múltiples interacciones, interrelacionadas y complejas, que ocurren en la interfaz del hospedero con el vector artrópodo. El primer capítulo explora las defensas cutáneas, inmunitaria innata y adaptativa, que enfrenta el vector artrópodo durante el proceso de alimentación de sangre. Los siguientes tres capítulos se centran en cómo los artrópodos vectores de enfermedades contrarrestan los desafíos planteados por las defensas del hospedero como son la hemostasia, la comezón y respuestas al dolor, y la cicatrización de heridas, respectivamente. Otros capítulos dignos de destacar son el noveno, que se ocupa de las interacciones de las garrapatas con las defensas del hospedero y cómo dichas interacciones crean ambientes favorables para la transmisión de patógenos y el establecimiento de infecciones. Finalmente, en el capítulo catorce se proporcionan ideas sobre cómo el conocimiento básico de las interacciones entre vectores y hospederos pueden utilizarse para desarrollar estrategias inmunológicas para el control de

164 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México protozoarios bacterias y arbovirus transmitidos por garrapatas (Narasimhan et al., 2017).

Red de células y mediadores de la inmunidad cutánea innata y adaptativa (Adaptado de Francischetti et al., 2013 y von Stebut, 2017)

Mastocitos

Los exámenes histológicos de la piel infestada por Dermacentor variabilis en ratones BALB/c, revelaron un mayor número de mastocitos durante las infestaciones secundarias y terciarias que en la infestación primaria. Además, se observa un mayor número de mastocitos degranulados en conejos infestados por I. ricinus y conejos y ganado infestados por Hyalomma anatolicum anatolicum tras re-infestación a diferencia de una infestación primaria. Las razas de ganado Cebuino, conocidas como altamente resistentes a Rhipicephalus (Boophilus) microplus, poseen más mastocitos dérmicos que las razas taurinas, y el ganado mestizo F2 infestado presenta resistencia adquirida a la infestación de garrapatas asociada con un mayor número de mastocitos en la dermis. Queda por determinar si la importancia de los mastocitos para la inmunidad contra las garrapatas es una verdad universal o no. Es importante asociar el hecho de que la liberación de histamina por los mastocitos produce prurito y desencadena el comportamiento de rascado en el hospedero que podría desprender a la garrapata del sitio de alimentación. Se destaca la importancia de la histamina para la alimentación de garrapatas por la existencia posiblemente universal de lipocalinas salivales de garrapatas que se unen a la histamina, que secuestra eficazmente esta amina biogénica de sus receptores.

Eosinófilos.

Los eosinófilos son la fuente de varias citocinas, quimiocinas y mediadores de lípidos y la fuente más importante de indolamina 2,3 desoxigenasa (IDO), una enzima inducida por el interferón gamma que inhibe al subconjunto de linfocitos T1 (Th1). Además, sus gránulos son ricos en gránulos citotóxicos que contienen peroxidasa de eosinófilos (EPO), proteína catiónica eosinófila (ECP), neurotoxina derivada de eosinófilos (EDN) y proteína básica principal (MBP). Esta última, es un factor de degranulación de mastocitos (y probablemente basófilos), mostrando una retroalimentación positiva en las respuestas asociadas con estas células. Los eosinófilos son una fuente muy importante de moléculas implicadas en la reparación e inflamación tisular, tales como tenascina, y factores de crecimiento tisular TGF-alfa y TGF-beta1. Los bovinos, los conejos, los perros y los ratones presentan infiltración de eosinófilos en el sitio de fijación tras repetidas infestaciones con garrapatas duras.

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Células dendríticas.

Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos profesionales que inician la respuesta inmune adaptativa a patógenos invasores y se encuentran en dos estados funcionales distintos. Las células dendríticas inmaduras están localizadas en tejidos no linfoides, como la piel y la mucosa, y su función principal es captar antígenos. Por otro lado, las células dendríticas maduras son poco fagocíticas pero altamente eficientes estimuladoras de respuestas primarias de células T. Se demostró recientemente que la saliva de garrapata afecta a varias funciones de las células dendríticas. Estos resultados son consistentes con el concepto de que las células dendríticas son componentes activos en la respuesta inmune a la saliva y potencialmente modulan la resistencia de la garrapata.

Macrófagos.

Se han realizado pocos estudios que describen la presencia de macrófagos (y monocitos) tanto en las cavidades de alimentación como en el área alrededor de la lesión en una primera infestación por garrapatas. En general, se ha encontrado que los macrófagos y los monocitos aumentan ligeramente en número en las cavidades de alimentación, pero no en el tejido adyacente durante los dos o tres primeros días post-infestación con larvas, ninfas y adultos de A. americanum. A pesar de que se reconoce hoy en día a las células dendríticas como las del principal papel en la presentación de antígenos, los macrófagos siguen siendo una célula residente importante que produce citocinas y quimiocinas que atraen a las células inflamatorias al sitio de mordedura de garrapatas.

Neutrófilos.

Los neutrófilos son células fagocíticas altamente móviles que constituyen la primera línea de defensa del sistema inmune innato. Los neutrófilos engullen y degradan microorganismos y producen varias quimiocinas, así como importantes citocinas proinflamatorias, lo cual indica que además de matar a los microorganismos, estas células son importantes para influir en el tráfico y activación temprana de las células durante los procesos fisiopatológicos. En general, los neutrófilos son estimulados por el agente etiológico para producir quimiocinas que posteriormente desempeñan un papel instrumental en el reclutamiento de otros tipos de leucocitos durante las fases tempranas de la infección. El extracto de la glándula salival de la garrapata no es quimiotáctico por sí solo, pero genera un factor quimiotático de neutrófilos por la escisión del componente C5 del complemento. De hecho, los neutrófilos son las células más abundantes en el infiltrado inflamatorio agudo inducido por la infestación primaria pero no en infestaciones posteriores de todas las especies de garrapatas duras estudiadas hasta ahora. A pesar del papel reconocido de los neutrófilos contra los patógenos y su extensa presencia en las infestaciones primarias, no se sabe si su

166 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México ausencia afectaría la resistencia del hospedero a la garrapata. La saliva de I. scapularis inhibe la agregación de neutrófilos, la liberación de gránulos y la fagocitosis de B. burgdorferi; pero las moléculas salivales que determinan estas acciones aún no se han identificado.

Basófilos.

Los basófilos han sido documentados como el tipo celular predominante que se infiltra en el sitio de la mordedura de la garrapata en la piel y se reconocen como efectores importantes en el rechazo de garrapatas, principalmente en modelos de cuyes y en bovinos. La migración de estas células y las respuestas ricas en basófilos resultantes en el tejido se conocen como hipersensibilidad basófila cutánea (CBH or sus siglas en inglés). Se cree que la degranulación de basófilos y la liberación local de mediadores representan una parte esencial de la respuesta de resistencia a las garrapatas. Estudios histológicos realizados, han sugerido que las respuestas de CBH están asociadas con el rechazo inmune de la piel de las garrapatas durante su alimentación de sangre. Cuando las garrapatas intentan alimentarse de la piel de los animales sensibilizados, generalmente se produce una respuesta intensa de CBH que contiene un infiltrado masivo de basófilos. Esta reacción provoca en última instancia el rechazo y la muerte de garrapatas por hospederos que presentan niveles significativos de histamina en su cuerpo. De interés es el hecho de que las glándulas salivales de garrapatas expresan una lipocalina que se une al factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1). Se ha demostrado que el IGF-1 es un factor quimiotáctico selectivo para los basófilos, y los linfocitos T gamma-delta de la piel son una fuente importante de esta quimiocina, que también regula la proliferación de queratinocitos.

Linfocitos T.

Los linfocitos T son activados por la interacción con péptidos y el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de las células presentadoras de antígeno tales como macrófagos, células dendríticas y linfocitos B. Así, los linfocitos T pueden representar el principal brazo sensorial del sistema inmune adaptativo. La resistencia adquirida se puede transferir de los donantes resistentes a los animales receptores normales con células viables de los ganglios linfáticos, lo que sugiere que las células T están implicadas en la resistencia, lo que se asocia con reacciones cutáneas de hipersensibilidad basófila a los antígenos de garrapatas. Las células de Langerhans (dendríticas) atrapan los antígenos de las glándulas salivales de la garrapata en la piel y funcionan como células presentadoras de antígeno para linfocitos T. Sin embargo, la inmunidad contra la garrapata es regional y sólo las células de los ganglios linfáticos que drenan el sitio de fijación de la garrapata son capaces de proliferar in vitro en presencia de antígenos de garrapatas. Un análisis inmunohistoquímico de la piel del ratón a las 72 h después de la fijación de I. ricinus reveló que las células T CD4+ y CD8+ están presentes en una proporción de 2.2:1 en infestaciones primarias, 3.2:1 en

167 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México secundarias y 4.7:1 en las infestaciones terciarias. Estos hallazgos histológicos junto con la expresión de ARNm de IL-2, IL-4 e IFN-gamma están de acuerdo con la leve hipersensibilidad cutánea de tipo tardío observada en ratones infestados con garrapatas.

Linfocitos B.

Los linfocitos B maduros que expresan inmunoglobulinas (o anticuerpos) en su superficie, que son el receptor de células B (BCR), recirculan entre los folículos linfoides del bazo y los ganglios linfáticos. Tras la activación, estas células se diferencian en células que secretan anticuerpos. La producción de anticuerpos es una de las respuestas adquiridas del huésped a la secreción salival introducida en el sitio de alimentación. A pesar de la ausencia de células B en la piel de los hospederos infestados, los ganglios linfáticos que drenan los sitios de infestación aumentan en las infestaciones primaria y secundaria en comparación con los ganglios linfáticos de animales no infestados y presentan centros germinales, lo que sugiere proliferación y diferenciación de células B. La infestación de garrapatas puede afectar o modular la producción de anticuerpos por sus hospederos. Después de una fuerte infestación de garrapatas en bovinos de una raza resistente a garrapatas, los niveles de anticuerpos anti-saliva IgG1 e IgG2 permanecieron sin cambios con respecto a los niveles producidos durante las infestaciones menos intensas, pero disminuyeron significativamente en una raza susceptible a garrapatas (ver mas adelante). La saliva de la garrapata I. ricinus inhibe la secreción de IL-10 por células B activadas de ratón, así como la proliferación de células B estimuladas con LPS o proteína de superficie externa de Borrelia burgdorferi. Estos hallazgos sugieren que la respuesta humoral es suprimida por la saliva de garrapatas, al menos en ratones y en razas bovinas genéticamente susceptibles. El hecho de que la saliva de garrapatas machos contenga proteínas de unión a inmunoglobulina G indica que la respuesta de anticuerpos es un importante mecanismo inmune efector contra las garrapatas.

Comunicación molecular entre los diferentes tipos celulares: complemento, citocinas y factores quimiotácticos.

La capacidad del sistema inmunitario para reconocer y responder a la presencia de antígenos extraños y daño tisular, como sucede durante la alimentación de garrapatas, depende de la producción y liberación de varios mediadores, incluyendo los producidos por la activación del sistema del complemento y por las citocinas/quimiocinas. La activación del complemento conduce en última instancia a la generación del complejo de ataque de membrana (MAC) que podría matar a un patógeno extraño. Las citosinas actúan conjuntamente con factores quimiotácticos, que reclutan leucocitos específicos al "lugar correcto" y activan estos leucocitos en el "momento adecuado". Tras la infestación primaria con varias especies de garrapatas duras, el infiltrado celular observado está

168 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México constituido típicamente por más del 50% de neutrófilos. También se ha encontrado que otros tipos de células aumentan en la cavidad de alimentación, pero mucho menos que en la población de neutrófilos, en el siguiente orden: eosinófilos, monocitos/macrófagos y mastocitos. Pocos o ningún linfocito se detectan en la piel tras la infestación primaria. El infiltrado celular después de infestaciones secundarias y subsiguientes es diferente. En el sitio de infestación secundaria sólo un pequeño número de neutrófilos (menos del 5% total) se observa. El número absoluto de eosinófilos y células mononucleares aumenta en comparación con la infestación primaria, pero representa aproximadamente el mismo porcentaje (~ 20% cada uno) del infiltrado de células totales. Los basófilos, sin embargo, que prácticamente no están presentes en los primeros días de infestación primaria son el tipo celular predominante (más del 50%) en las infestaciones secundarias. Esta última respuesta está asociada con la resistencia contra las garrapatas. Dado que los extractos de las glándulas salivales de garrapatas no presentaban actividad quimiotáctica intrínseca, este patrón sugiere una reacción inflamatoria inespecífica en la infestación primaria y, posiblemente, un infiltrado celular inmunológico en las infestaciones subsiguientes.

Los signos clásicos de inflamación, enrojecimiento y calor (vasodilatación), turgencia (edema), dolor y pérdida de función (por edema excesivo y/o dolor) implican componentes artificialmente definidos como hemostasia, inflamación e inmunidad y pueden ser producidos tanto por respuestas humorales como celulares. Una garrapata exitosa debe mantener adecuadamente la cavidad de alimentación de lo contrario podría convertirse en una cavidad de pus, o contener sólo un edema relativamente pobre en proteínas. Además, la garrapata exitosa debe ser invisible o inaparente para su hospedero, ya que las reacciones de rechazo de garrapatas pueden ser asistidas por el comportamiento del hospedero, que es desencadenado por dolor o comezón en el sitio de la infestación.

Para la garrapata, la vasodilatación inflamatoria es realmente beneficiosa, las garrapatas secretan sustancias vasodilatadoras (prostaglandinas). El edema puede ser provocado por reacciones humorales, tales como la activación del sistema de calicreína-cinina y el sistema de complemento, y por sistemas celulares a través de serotonina e histamina liberada por plaquetas, basófilos y mastocitos, Así como leucotrienos producidos por neutrófilos, eosinófilos, mastocitos y basófilos. Todos estos mediadores aumentan la permeabilidad vascular. Si los mastocitos y los basófilos van a degranularse o no, dependerá de si están sensibilizados con la subclase de inmunoglobulina adecuada. Las proteínas salivales de la garrapata pueden unirse y neutralizar varias citocinas y quimiocinas, y existe una gran cantidad de información publicada. Sin embargo, por cuestiones de espacio no se describen a detalle en este trabajo (ver por ejemplo, Wikel et, 2017c).

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Resistencia en bovinos a infestación por Rhipicephalius (Boophilus) microplus

Las más recientes descripciones de la inmunidad/resistencia innata y adquirida en bovinos hacia la garrapata común del ganado, Rhipicephalius (Boophilus) microplus, transmisora de importantes infecciones protozoarias y bacterianas de los animales de producción en el mundo, incluyen los trabajos realizados por Piper et al., (2008, 2009, 2010); Jonsson et al 2014; Rocha et al., (2017) y (Franzin et al, 2017). Como se ha descrito, las razas Bos taurus indicus son menos susceptibles a la infestación que las razas Bos taurus taurus y adquieren resistencia más eficazmente (Utech et al., 1978; Rechav y Kostrzewski, 1991; Piper et al., 2008). Sin embargo, dentro del ganado de ambas subespecies existe una variabilidad individual considerable en la resistencia a las garrapatas (Piper et al, 2008; Rocha et al., 2017; Franzin et al, 2017).

El punto de vista de la inmunidad adquirida se ha basado en gran medida en el tiempo transcurrido entre la exposición primaria del ganado susceptible a las garrapatas y el desarrollo de un nivel de resistencia relativamente estable (Wagland, 1978). Esto, se consolidó mediante algunos estudios exitosos en los que el ganado bovino que se transfundió con plasma de animales altamente resistentes mostró mayor resistencia que los transfundidos con plasma de animales con baja resistencia (Roberts y Kerr, 1976). La teoría de la inmunidad adquirida a la infestación pudo haberse aceptado como resultado de la vacuna relativamente exitosa basada en Bm86 (un antígeno localizado en la superficie de las células intestinales de R. microplus), aunque el mecanismo de acción de esta vacuna difiere cualitativamente de cualquier inmunidad natural conocida derivada de una infestación (Willadsen et al., 1995). El ganado naturalmente resistente disminuye la capacidad de las garrapatas para fijarse y alimentarse, lo que resulta en una reducción del número de hembras que maduran, una reducción en el peso de las hembras ingurgitadas y del número y la viabilidad de sus huevos (Koudstaal et al., 1978; Willadsen, 1980). La resistencia a la infestación está dirigida contra todas las etapas del ciclo de vida del parásito, pero parece afectar más obviamente la adhesión de las larvas. En B. t. indicus y B. t. taurus con un alto grado de inmunidad protectora, hasta un 90% de las larvas pueden ser rechazadas dentro de las 24 h después de la infestación (Wagland, 1979). Existe evidencia de que una reacción de hipersensibilidad Tipo I es la base del componente inmune de resistencia en B. t. taurus contra la infestación de R. microplus. Un estudio inicial que utilizó tasas de infestación extremadamente elevadas (200,000 larvas) identificó una alta resistencia (<1% de rendimiento) en animales B. t. taurus con pronunciadas respuestas costrosas y alérgicas; Se identificaron eosinófilos como el tipo celular predominante presente en el sitio de fijación, y la reacción cutánea fue caracterizada por una reacción de hipersensibilidad inmediata (Willadsen et al., 1978). Además, la resistencia a garrapatas en ganado B. t. taurus infestado con R. microplus se ha correlacionado con la concentración de eosinófilos y basófilos, y el grado de de-granulación en el

170 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México sitio de adhesión de las larvas (Piper et al., 2008; 2009; 2010; Jonsson et al., 2014; Rocha et al., 2017; Franzin et al., 2017). Las comparaciones recientes entre la expresión génica de Brahman (B. t. indicus) y Holstein-Friesian (B. t. taurus) en el lugar de adhesión de larvas de R. microplus con ganado previamente expuesto mostraron una respuesta inflamatoria mucho más vigorosa en el raza Holstein- Friesian (Piper et al., 2008, 2009). Los resultados de estos estudios fueron consistentes con los hallazgos histológicos de trabajos previos, en los cuales las biopsias cutáneas de los sitios larvales de alimentación en B. t. taurus mostraron una infiltración con eosinófilos más temprana e intensa, típica de una respuesta de hipersensibilidad de Tipo I, que en B. t. indicus. Los perfiles de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC), la expresión génica de las citocinas y las inmunoglobulinas en bovinos Brahman (B. t. indicus) y bovinos Holstein-Friesian (B. t. taurus) infestados con garrapatas, confirman que mientras que el ganado B. t. taurus muestra una respuesta inflamatoria sostenida a la infestación, el ganado B. t. indicus desarrolla una respuesta mediada por células T a la infestación (Piper et al., 2009). Por ejemplo, el análisis de los perfiles de expresión celular, humoral y génica en la circulación periférica del ganado Brahman demostró perfiles de células mononucleares periféricas y perfiles de expresión génica de leucocitos consistentes con una respuesta mediada por células T a la infestación por garrapatas, mientras que el ganado Holstein-Friesian demostró perfiles celulares consistentes con una respuesta innata de tipo inflamatorio a la infestación. El ganado Brahman tenía mayores porcentajes de células T γδ, células T CD4+, células T CD8+ y células T25+ CD que el ganado Holstein-Friesan; mientras que el ganado Holstein tenía porcentajes relativamente más altos de células de tipo macrófago (monocitos y células que expresan MHCII) en su circulación. El mayor porcentaje de células que expresan MHCII registradas para los animales Holstein puede atribuirse principalmente a un mayor porcentaje de células CD14+ en estos animales, ya que no hubo diferencia significativa entre las razas en los porcentajes de células B observadas en circulación. El porcentaje relativamente menor de subconjuntos de células T observado en los animales Holstein puede haber sido resultado de que éstas células se desplazan de la sangre hacia la piel en el sitio de fijación de la garrapata, reduciendo así el número relativo observado en la circulación periférica (Piper et al., 2010; Jonsson et al., 2014).

Muy recientemente, Rocha et al., (2017) reportaron que los bovinos que presentan cargas de garrapata contrastantes, es decir, animales de razas Nelore y Holstein, presentan diferencias significativas en sus niveles de IgG1, IgG2 e IgE totales y en sus respuestas de anticuerpos contra antígenos de garrapatas evaluados a lo largo de sucesivas infestaciones. A pesar de una exposición mucho menor a los antígenos de garrapatas, los Nelore reconocen un conjunto más grande de antígenos salivales de garrapatas. Se demostró que los niveles basales de IgG1 e IgG2 totales fueron significativamente más altos en los Holstein sensibles a la garrapata en comparación con los Nelore resistentes. Aumentos significativos en los niveles de IgG1 total, pero no de IgG2, acompañaron a las infestaciones

171 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México sucesivas en ambas razas. Los Nelore resistentes presentaron niveles significativamente más altos de anticuerpos específicos contra antígenos salivales antes y en el primer desafío con larvas de garrapatas; Sin embargo, en el tercer desafío, los Holstein susceptibles a la garrapata presentaron niveles significativamente más altos de anticuerpos IgG1 e IgG2 específicos de proteínas salivales de garrapatas. Es importante destacar que los sueros de Nelore resistentes a garrapatas reaccionaron con 39 proteínas salivales de garrapatas en pruebas de inmunotransferencia de proteínas salivales separadas en dos dimensiones por electroforesis, frente a solo 21 antígenos que reaccionaron con los sueros de Holstein susceptibles a garrapatas. Se concluyó que si bien los niveles de anticuerpos específicos de saliva de garrapata no estaban directamente correlacionados con el fenotipo ante la infestación, sin embargo y a pesar de recibir cantidades aparentemente más bajas de saliva de garrapatas, los bovinos resistentes a garrapatas reconocieron más proteínas salivales de garrapatas. Estas proteínas salivales reactivas están aparentemente implicadas en varias funciones del parasitismo y de la alimentación de sangre. Los resultados indican que la neutralización de proteínas salivares de garrapatas implicadas en el parasitismo por anticuerpos del hospedero es esencial para controlar las infestaciones por garrapatas. Entre las proteínas identificadas, destacan inhibidores de proteasas tipo Kunitz, serpina, tropomiosina y la catepsina D2, entre otros. Entre las funciones putativas de proteínas que reaccionaban exclusivamente con sueros de Nelore resistente a garrapatas se encontró una apolipofórina, una proteína interactiva de lípidos salivales, proteínas de unión a histamina (es decir, lipocalinas), disulfuro de proteína isomerasas, serpin-3 y vitelogeninas. La relevancia de estas proteínas radica en que están siempre presentes en los estudios del proteoma salivar de diferentes especies de garrapatas, por lo que pueden ser considerados como buenos blancos para la elaboración de una vacuna contra múltiples especies de garrapatas. Esto, dado que los anticuerpos generados por Nelore antes y después de su infestación, tienden a reaccionar con proteínas directamente implicadas en mecanismos de parasitismo y mecanismos de escape de la garrapata. Además, los anticuerpos generados por Nelore reaccionaron con un mayor número de proteínas salivales de garrapatas. Por lo tanto, el ganado bovino tipo Cebú puede soportar cargas de garrapatas significativamente más bajas porque neutralizan más eficientemente las funciones de la saliva de garrapatas, indicando que los anticuerpos están relacionados con la resistencia a las garrapatas siempre que reaccionen con un amplio repertorio de proteínas salivales de garrapatas. No obstante esto, resta por investigarse ahora las razones de la mayor inmunogenicidad de las proteínas salivales de garrapatas en los hospedadores genéticamente resistentes y/o de la mayor capacidad inmunosupresora de la saliva de garrapatas para los hospederos susceptibles (Rocha et al., 2017).

Recientemente, también, se realizaron estudios de genómica funcional en animales resistentes y susceptibles a la garrapata R. microplus (Franzin et al., 2017). Se examinaron los perfiles globales de expresión génica en pieles de una

172 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México raza de cada tipo de hospedero antes de y durante las infestaciones con larvas y ninfas. La expresión diferencial de genes sugiere que la respuesta cutánea a las garrapatas se desarrolla más gradualmente en las razas susceptibles a las garrapatas, resultando en una alimentación más eficaz por las mismas. Por otro lado, las reacciones en hospederos resistentes fueron similares a las observadas en la dermatitis atópica y se caracterizaron por los intentos del ganado parasitado para lamer y rascar las áreas infestadas.

Los análisis funcionales de los genes expresados diferencialmente en la piel sugieren que se desarrolla una dermatitis alérgica de contacto con la consiguiente producción de IL-6, CXCL-8 y CCL-2, dando lugar a la expresión de quimiocinas y citocinas proinflamatorias que reclutan granulocitos y linfocitos T. Es importante destacar que esta respuesta se retrasa en los hospederos susceptibles. El análisis histopatológico de pieles infestadas mostró reacciones inflamatorias alrededor de los conos de cemento que la garrapata utiliza y que permiten el acoplamiento de la misma en ambas razas, pero en bovinos genéticamente resistentes a las garrapatas se desestabiliza el cono. Los datos del análisis transcripcional dan una idea que la activación de basófilos es mediada por las garrapatas, lo cual previamente se ha demostrado es clave para la resistencia del hospedero en sistemas modelo. La piel de los bovinos susceptibles a la garrapata expresó más transcritos que codifican por enzimas que desintoxican a los tejidos. Curiosamente, estas enzimas también producen compuestos odoríferos volátiles y, consecuentemente, los frotis de piel de los bovinos susceptibles a garrapatas atrajo significativamente más larvas de garrapatas que los frotis de piel de hospederos resistentes. Además, los transcritos que codifican las moléculas moduladoras secretadas por la garrapata fueron significativamente más abundantes en las glándulas salivales de larvas y ninfas de garrapatas que se alimentan en bovinos susceptibles. En comparación con los hospederos susceptibles a la garrapata, los genes que codifican las enzimas que producen compuestos volátiles muestran una expresión significativamente menor en los hospederos resistentes, lo que puede hacerlos menos atractivos para las larvas; los hospederos resistentes exponen a las garrapatas a una respuesta inflamatoria más temprana, que se asocia con una expresión significativamente menor de los genes de las garrapatas que codifican por las proteínas salivales que suprimen la inmunidad, la inflamación y la coagulación del hospedero. Entre ellos se encontraban CXCL2 / GRO-2, CCL2, IL8, IL6, Bt.71689 / CLDN11 y CD209; Todos fueron sobre regulados en la piel infestada con garrapatas. Este hallazgo sugiere una característica común de las reacciones cutáneas a las picaduras de garrapatas duras. Los análisis funcionales de estos genes indicaron que los procesos implicados en la dermatitis alérgica de contacto, inflamación y quimiotaxis de los neutrófilos, se activaron en la piel infestada por larvas y ninfas, compatibles con las respuestas esperadas a las heridas por mordedura. Las reacciones inducen un gradiente de quimiocinas que recluta neutrófilos y linfocitos T CD4+ y CD8+ para pieles de ambas razas infestadas por garrapatas. Las células T, a su vez, pueden producir citocinas (TNF, IL-1, IL-17 e IFN-γ) que

173 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México estimulan los queratinocitos epidérmicos y los fibroblastos dérmicos para expresar quimiocinas que ayudan al reclutamiento de células a la piel. La IL-6, la Claudina- 11 y la CD209, también pueden contribuir a la inflamación cutánea alérgica local en el sitio de la picadura de la garrapata. IL-6 es producido por muchos tipos de células, incluyendo células T, queratinocitos epidérmicos y fibroblastos dérmicos, y es una señal de alarma sistémica producida por los tejidos lesionados, en particular la piel lesionada. La laceración de la piel de un hospedero por las garrapatas pone en contacto a sus partes bucales con las poblaciones de células centinelas, incluyendo queratinocitos, fibroblastos, células dendríticas, mastocitos, receptores que son componentes de la respuesta inmune innata, péptidos antimicrobianos, junto con quimiocinas y citoquinas implicadas en la inflamación y reparación de heridas. La respuesta inicial a las garrapatas sugerida por este estudio, es similar a una dermatitis alérgica de contacto que es provocada por queratinocitos y fibroblastos productores de IL-6, CXCL-8 y CCL-2 para reclutar leucocitos inflamatorios. Esta enfermedad de la piel es inducida por el contacto repetido de la piel con productos químicos de bajo peso molecular, conocidos como xenobióticos o haptenos, y está mediada por citocinas IL-6 y TNF-α. Se concluye que la composición celular de la inflamación reclutada hacia las lesiones asociadas con mordedura de garrapata coincide con los correspondientes perfiles de expresión de quimiocinas en la piel. También se demuestra que existen diferencias significativas entre la piel de los hospederos bovinos que presentan diferentes niveles de resistencia a las infestaciones por garrapatas. La composición celular de estas reacciones de los hospederos también coincide con el perfil de expresión de secuencias que codifican por proteínas inmunomoduladoras y antiinflamatorias en garrapatas que se alimentan de los correspondientes hospederos, resistentes o susceptibles a las garrapatas. Además, los hospederos resistentes a las garrapatas reclutan respuestas inflamatorias más tempranas que los hospederos susceptibles, y con un perfil molecular similar al observado en la dermatitis alérgica de contacto. Las diferencias entre los hospederos resistentes y susceptibles en sus perfiles de expresión de los genes que codifican por las enzimas que producen compuestos volátiles, y las diferencias en las respuestas conductuales de las garrapatas expuestas a los frotis de piel de hospederos resistentes y susceptibles sugieren que la composición de los semioquímicos de la piel diferirá entre estos tipos de hospederos. Los datos proporcionan información importante sobre las bases moleculares de las diferencias en el ganado resistente y susceptible a las garrapatas y la modulación asociada al secretoma de la garrapata (Franzin et al, 2017).

Finalmente, se reporta que la saliva de las garrapatas ixodidas contiene una mezcla de moléculas bioactivas que se dirigen a un amplio espectro de mecanismos de defensa del hospedero para permitir que las garrapatas se alimenten en el hospedero vertebrado durante varios días. Las proteínas salivales de las garrapatas se agrupan en familias de proteínas multigénicas y los miembros individuales de la familia muestran redundancia y pluripotencia en su acción para

174 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México disminuir o evadir las respuestas inmunes del hospedero. Ahora está claro que los miembros de diferentes familias de proteínas pueden dirigirse a la misma vía celular o molecular de la respuesta fisiológica del hospedero hacia la alimentación de garrapatas. Los autores presentan la hipótesis de que la redundancia y la pluripotencia evolucionaron en los inmunomoduladores salivales de las garrapatas para evadir el reconocimiento inmunológico por parte del hospedero, conservando al mismo tiempo el potencial inmunomodulador de su saliva (Kotal et al, 2016).

Referencias

Brossard M, Wikel SK. 2004. Tick immunobiology. Parasitol. 129: S161–S176. Chmelař J, Kotál J, Karim S, Kopacek P, Francischetti IMB, Pedra JHF, Kotsyfakis M (2016). Sialomes and mialomes: A systems biology view of tick tissues and tick-host interactions. Trends Parasitol. 32(3): 242-254. da Silva AM, de Alencar MM, de Almeida LC, de Sena MC, Barioni W. (2007). Artificial infestation of Boophilus microplus in beef cattle heifers of four genetic groups. Gen Mol Biol 30(4): 1150-1155. Francischetti IMB, Sa-Nunes A, Mans BJ, Santos IM, Ribeiro JMC. (2009). The role of saliva in tick feeding. Front Biosci 14, 2051-2088. Franzin AM, Maruyama SR, Rocha G, Oliveira RP, Chaves JM, Bishop R, Mendes AA, Moré DD, Rossetti B, de Miranda IKF. (2017). Immune and biochemical responses in skin differ between bovine hosts genetically susceptible and resistant to the cattle tick Rhipicephalus microplus. Parasites & Vectors 10:51. DOI 10.1186/s13071-016-1945-z Galay RL, Aung KM, Umemiya R, Maeda H, Matsuo T, Kawaguchi H, Miyoshi N, Suzuki H, Xuan X, Mochizuki M, Fujisaki K, Tanaka T, 2013. Multiple ferritins are vital to successful blood feeding and reproduction of the hard tick Haemaphysalis longicornis. J. Exp. Biol. 216:1905-1915. Gugliemone AA (1995) Epidemiology of babesiosis anda anaplasmosis in South and Central America. Vet Parasitol 57:109-119. Guglielmone AA, Robbing AA, Apanaskevich DA, Petney TN, Estrada-Peña A, Horak IG, Shao R, Barker SC. (2010). The Argasidae, Ixodidae and Nuttalliellidae (Acari: Ixodida) of the world: a list of valid species names. Zootaxa 2528:1-28. Jonsson NN. (2006). The productivity effects of cattle tick (Boophilus microplus) infestation on cattle, with particular reference to Bos indicus cattle and their crosses. Vet Parasitol 137:1-10. Jonsson NN, Piper EK, Constantinoiu CC (2014). Host resistance in cattle to infestation with the cattle tick Rhipicephalus microplus. Parasite Immunol. 36:551-557. Kemp DH, Koudstaal D, Roberts JA, Kerr JD (1976). Boophilus microplus: The effect of host resistance on larval attachments and growth. Parasitol 73:123- 136.

175 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Kotal J, Langhansová H, Lieskovská J, Andersen JF, Francischetti IMB, Chavakis T, Kopecký J, Pedra JHF, Kotsyfakis M, Chmelař J (2015). Modulation of host immunity by tick saliva. J Proteomics. 128:58-68. Koudastaal D, Kemp DH, Kerr JD (1978) Boophilus microplus: Rejection of larvae from British breed cattle. Parasitol 73:123-136. Lemos AM, Teodoro RL, Oliveira GP, Madalena FE (1985) Comparative performance of six Holstein-friesian x Guzera grade in Brasil. Burdens of Boophilus microplus under field condition. Anim Prod 41:187-191. Mapholi NO, Marufu MC, Maiwashe A, Banga CB, Muchenjec V, MacNeil MD, Chimonyo M, Dzama K. (2014). Towards a genomics approach to tick (Acari: Ixodidae) control in cattle: A review. Ticks & Tick-borne Dis. 5(5): 475-483. Moraes FR, Moraes JRE, Costa AJ, Rocha UF, Ardisson FA (1992) A comparative study of lesions caused by different parasitic stages of Boophilus microplus (Canestrini) in the skins of naturally infested taurine and zebuine hosts. The correlation of ticks resistance with mast cell counts in the host’s skin. Braz J Vet Anim Sci 29:378-383. Narasimhan S, Schleicher TR, Fikrig E. (2017). Translation of saliva proteins into tools to prevent vector-borne disease transmission. En: Wikel SK, Askoy S, Dimopoulos G, Eds., Arthropod vector: Controller of disease transmission. Vol 2. Vector saliva-host-pathogen interactions. Academic Press, pp. 249- 301. Norval RAI, Sutherst RW, Kurki J, Gibson JD, Kerr JD (1988). The effect of the brown ear tick Rhipicephalus appendiculatus on the growth of Sanga and European breed cattle. Vet. Parasitol. 30: 149-164. O’kelly JC, Spiers WC (1976) Resistance to Boophilus microplus (Canestrini) in genetically different types of calves in early life. J Parasitol 62:312-317. Piper EK, Jackson LA, Bagnall NH, Kongsuwan KK, Lew AE, Jonsson NN (2008). Gene expression in the skin of Bos taurus and Bos indicus cattle infested with the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Vet Immunol Immunopathol 126:110-119. Piper EK, Jonsson NN, Gondro C, Lew-Tabor AE, Moolhuijzen P, Vance ME, Jackson LA (2009). Immunological profiles of Bos taurus and Bos indicus cattle infested with the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Clin Vaccine Immunol. 16: 1074-1086. Piper EK, Jackson LA, Bielefeldt-Ohmann H, Gondro C, Lew-Tabor AE, Jonsson NN (2010). Tick-susceptible Bos taurus cattle display an increased cellular response at the site of larval Rhipicephalus (Boophilus) microplus attachment, compared with tick-resistant Bos indicus cattle. Int J Parasitol. 40(4):431-441. Rechav, Y., Kostrzewski, M.W., 1991. Relative resistance of six cattle breeds to the tick Boophilus decoloratus in South Africa. Onderst. J. Vet. Res. 58:181- 186. Riek RF (1962) Studies end the reaction of animals to infestation with tick. VI. Resistance of cattle to infestation with the tick Boophilus microplus

176 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

(Canestrini). Aust J Agricult Res 13:532-549. Citado por da Silva AM et al,. 2007. Roberts, J.A., Kerr, J.D., 1976. Boophilus microplus: passive transfer of resistance in cattle. J. Parasitol. 62: 485-488. Rocha G, Maruyama SR, Nelson KT, Chaves JM, Gardinassi LG, Mendes AA, Rossetti B, Kooyman FNJ, de Miranda IKF (2017). Immune recognition of salivary proteins from the cattle tick Rhipicephalus microplus differs according to the genotype of the bovine host. Parasites & Vectors 10:144. DOI 10.1186/s13071-017-2077-9 Utech KBW, Wharton RH, Kerr J D (1978) Resistance to Boophilus microplus (Canestrini) in different breeds of cattle. Aust J Agricult Res 29:885-895. Citado por da Silva AM et al,. 2007. Utech KBW, Wharton RH (1982) Breeding for resistance to Boophilus microplus in Australian Illawarra Shorthorn and Brahman_x Australian Illawarra Shorthorn cattle. Aust Vet J 58:41-46. von Stebut E. (2017). Network of cells and mediators of Innate and adaptive cutaneous immunity: Challenges for an arthropod vector. In: Wikel SK, Askoy S, Dimopoulos G, Eds., Arthropod vector: Controller of disease transmission. Vol 2. Vector saliva-host-pathogen interactions. Academic Press, pp. 1-11. Wagland BM (1975) Host resistance to cattle tick (Boophilus microplus) in Brahman (Bos indicus) cattle. I. Response of previously unexposed cattle to four infestations with 20.000 larvae. Aust J Agricult Res 26:1073-1078. Citado por da Silva AM et al,. 2007. Wagland BM (1978) Host resistance to cattle tick (Boophilus microplus) in Brahman (Bos indicus) cattle. III. Growth on previously unexposed animal. Aust J Agricult Res 29:401-109. Citado por da Silva AM et al,. 2007. Wikel, S. (2017)a. Vector arthropods and host pain and itch responses. En: Wikel SK, Askoy S, Dimopoulos G, Eds., Arthropod vector: Controller of disease transmission. Vol 2. Vector saliva-host-pathogen interactions. Academic Press, pp. 13-30. Wikel, S. (2017)b. Arthropod modulation of wound healing. En: Wikel SK, Askoy S, Dimopoulos G, Eds., Arthropod vector: Controller of disease transmission. Vol 2. Vector saliva-host-pathogen interactions. Academic Press, pp. 31-50. Wikel, S. (2017)c. Tick saliva: A modulator of host defenses. En: Wikel SK, Askoy S, Dimopoulos G, Eds., Arthropod vector: Controller of disease transmission. Vol 2. Vector saliva-host-pathogen interactions. Academic Press, pp. 145-168. Willadsen P, Willians PG, Roberts JA, Kerr JD (1978) Response of cattle to allergens from Boophilus microplus. Int J Parasitol 8:89-95. Willadsen P, Bird P, Cobon GS, Hungerford J (1995). Commercialisation of a recombinant vaccine against Boophilus microplus. Parasitol. 110(Suppl): S43-S50. Willadsen P (1980). Immunity to ticks. Adv Parasitol 18: 293-311.

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ESTRATEGIA CON UNA VACUNA RECOMBINANTE CON EL ANTÍGENO BM86 PARA EL CONTROL INTEGRAL CONTRA LA GARRAPATA RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS

Soberanes Céspedes Noé, Ortiz Estrada Martin, Sánchez López Fredy, Galván Ramírez Serapio.

LAPISA Salud Animal. Carretera La Piedad – Guadalajara Km. 5.5, La Piedad, Michoacán. Teléfono: 01 (352) 5261300. Departamento Técnico ext. 153. www.lapisa.com [email protected]

RESUMEN

La garrapata del bovino R. (Boophilus) microplus es el principal ectoparásito que ocasiona un impacto sanitario y económico en la ganadería en las regiones tropicales y subtropicales en México. La resistencia de la garrapata se presenta de manera múltiple, principalmente resistencia a organofosforados, piretroides y amidinas. La resistencia de R. (B.) microplus a los garrapaticidas piretroides es la más importante, seguida de la resistencia a las amidinas y organofosforados. Recientemente se han reportado casos de resistencia a ivermectina y a fipronil. Se describen los principales métodos de control químico y no químico utilizado en México y la estrategia en ranchos en la zona del Golfo y Noreste de Méxco, con un Programa de Control Integral contra la garrapata R. (B.) microplus que involucra el uso de una vacuna recombinante con el antígeno Bm86 obtenido de una cepa de garrapata mexicana en combinación con el uso profiláctico de baños garrapaticidas por aspersión con el principio activo que de acuerdo a un diagnóstico previo de resistencia, presente el mejor efecto de eficacia en cada uno de los ranchos.

Introducción

La utilización de antiparasitarios de uso veterinario para el control de ectoparásitos se ha orientado a las formas parasitarias mediante diferentes métodos de aplicación como son los baños de inmersión, mangas de aspersión, aspersión manual, tratamiento por derrame dorsal (pour on y spot on), tratamientos mediante inyección (Rodríguez, 2005). Antes de iniciar un programa de control de la garrapata en una región es necesario tener conocimientos de los aspectos ecológicos, tecnología disponible y factores sociales y económicos. Existe una gran diversidad de condiciones geográficas, climáticas, de infraestructura así como de desarrollo tecnológico, que hace que una tecnología aplicable en un lugar sea difícil de adoptar en otro (Cardozo y Franchi, 1996; Rodríguez, 2005).

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En México, los programas de control químico contra las garrapatas usualmente no consideran los niveles de infestación ó los picos de mayor abundancia de garrapatas. Estudios de dinámica poblacional de garrapatas, son básicos para implementar programas integrados de control que permitan reducir estos picos de infestaciones de garrapatas ó ciertas fases del ciclo de vida de la garrapata en tiempos específicos (Soberanes et al., 2011). Los reportes de vacunas contra la garrapata R. (B.) microplus con el antígeno Bm86, el cual está presente en todas las fases de la garrapata indican reducciones del 50 al 90% en la capacidad reproductiva, 20-30% del número de garrapatas repletas, 30% del peso de las garrapatas y 60 a 80% del peso de la masa de huevos, pero no produce mortalidad (Jonsson et al., 2000; De la Fuente et al., 2007).

Los estudios de campo en el estado de Veracruz y Tamaulipas realizados del 2013 al 2015, tienen como objetivo presentar la estrategia de un Programa de Control Integral con la vacuna recombinante con el antígeno Bm86 en combinación con baños profilácticos garrapaticidas, como una estrategia sustentable a largo plazo y amigable con el ambiente que favorece la salud, bienestar y producción en la ganadería nacional.

Control químico y no químico La resistencia de garrapatas Rhipicephalus (B.) microplus hacia los ixodicidas organofosforados en México, se hizo evidente siete años después de que comenzaron a utilizarse en forma intensiva y extensiva, demostrándose mediante ensayos toxicológicos en 1982 (Aguirre, et al., 1986), razón por la cual se permitió el ingreso al mercado en 1986 de los piretroides y amidinas como una alternativa de control, iniciándose a partir de entonces el uso de estos productos.

Ocho años después, en 1993 fueron detectadas las primeras evidencias de resistencia a ixodicidas piretroides (Ortiz, et al., 1995). En 2002 se reporto en México el primer caso de resistencia al amitraz en Tabasco, México, identificándose la cepa como “San Alfonso” con resistencia a organofosforados, piretroides y amitraz (Soberanes, et al., 2002). En 2010 se reporto resistencia a la ivermectina (Pérez, et al., 2010) y tres años después al fipronil (Miller, et al., 2013; Rodríguez, et al., 2006). El uso intensivo de los garrapaticidas ha creado un falso “sentido de seguridad” en el productor pecuario, quien sustituyo el diagnóstico y asesoría técnica, por la casi exclusiva utilización del control exclusivamente químico el cual no es sostenible y genera problemas de costos, el desarrollo de resistencia y la temática de inocuidad alimentaria, aunado al impacto ambiental; a pesar de los esfuerzos de la industria en desarrollar productos cada vez más seguros para el aplicador y el ambiente. Debido al fenómeno de resistencia a los antiparasitarios comerciales y al incremento de la conciencia sobre residuos químicos que entran en la cadena alimentaria, contaminación ambiental y problemas de toxicidad, se ha propiciado la búsqueda de nuevas alternativas de control (Athanasiadou y Kyriazakis, 2004), tales como: uso de razas resistentes a los parásitos, uso de vacunas, control biológico y manejo de praderas.

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Control Inmunológico

El control inmunológico de garrapatas representa una alternativa promisoria, pues con ello se logra inducir una respuesta tal en los animales inmunizados que permite mantener bajos niveles de infestación de estos ectoparásitos. Esta vía tiene como perspectiva una protección de mayor duración y está exenta de problemas de índole ambiental (De la Fuente y Kocan, 2003). Debido a los efectos de los ixodicidas sobre el medio ambiente, la salud pública y la selección de garrapatas resistentes, el control inmunológico se ha convertido en una de las alternativas más prometedoras para combatir a estos artrópodos (Almazán et al., 2010), tiene ventajas como ser de fácil administración, ser amigables con el medio ambiente, no contaminan los productos destinados al consumo humano (carne y leche), representan un costo-beneficio comparado con el uso de ixodicidas por la disminución de tratamientos con productos comerciales (de la Fuente y Kocan, 2003; Nuttall et al., 2006; de la Fuente et al., 2007).

Experiencia en Veracruz, México

La evaluación de campo de la estrategia del Programa de Control Integral con la vacuna recombinante con el antígeno Bm86 en combinación con baños garrapaticida profilácticos, se realizó entre mayo a diciembre de 2013 (183 días) se utilizo un hato de 82 bovinos cruzas de doble propósito de las cuales se les dio seguimiento a 20 animales infestados naturalmente con garrapatas R. (B.) microplus multiresistentes a los ixodicidas organoclorados, organofosforados, piretroides y Amitraz de acuerdo a diagnóstico toxicológico realizado por CENAPA. Los conteos iniciaron el día previo a la primera vacunación, seleccionándose dos grupos de 10 bovinos cada uno, con una infestación natural promedio mayor o igual a 50 garrapatas R. (B.) microplus semi-repletas (4-8 mm). Los animales del grupo vacunado y testigo permanecieron en potreros separados durante el tiempo del estudio. Al grupo testigo se aplico la primera dosis con el placebo con 2 mL/ bovino intramuscular (día 0); y la segunda y tercera dosis en la semana 4 y 7 respectivamente. El grupo vacunado recibió vía intramuscular la primera vacunación con el antígeno recombinante Bm86 a dosis de 2 mL/ bovino (día 0); la segunda y tercera vacunación a dosis de 2 mL/ bovino en la semana 4 y 7 para cada caso. Se aplicaron baños por aspersión profilácticos cuando la infestación rebaso el promedio umbral de 30 garrapatas semirepletas (4-8 mm) por lado/ animal.

Los conteos de garrapatas semi-repletas (4-8 mm), se realizaron por un lado del animal en el grupo vacunado y en el testigo los días 1, 12, 15, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 78, 92,106, 120, 134, 156 y 183 postratamiento. El promedio de garrapatas lado/animal para el grupo testigo y el grupo vacunado al inicio de la prueba (día 0) fue de 60 y 50 garrapatas semi-repletas (4-8 mm) respectivamente. Se realizaron en el grupo testigo y vacunado 9 y 4 baños profilácticos respectivamente en un

180 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México periodo de 6 meses (el intervalo de baño con amitraz en el rancho era cada 11 días), disminuyendo manejo, estrés y merma del ganado.

La vacunación con el antígeno Bm86, permitió la disminución de la aplicación de baños garrapaticidas, ya que la inmunización de los bovinos redujo las infestaciones larvarias en los potreros que se reflejo en la paulatina disminución en los niveles de re-infestación de garrapatas R. (B.) microplus en el ganado, ampliando los intervalos de baños a más de tres meses.

Experiencia en Tamaulipas, México

El Programa de Control Integral con la vacuna recombinante con el antígeno Bm86 en combinación con baños garrapaticidas, se realizo entre abril de 2015 a enero de 2016 (287 días) se utilizaron vacas de la raza simmental en producción de cría (n=20) infestadasnaturalmente con garrapatas R. (B.) microplus multiresistentes a los ixodicidas organoclorados (lindano), organofosforados (clorpirifos, coumafos y diazinon), piretroides (flumetrina, deltametrina, cipermetrina), amitraz y fipronil de acuerdo a diagnóstico realizado por CENAPA. Los baños con amitraz se realizaban cada 13 días.

Los conteos iniciaron el día previo a la vacunación, seleccionándose dos grupos de 10 vacas cada uno, con una infestación natural promedio mayor o igual a 40 garrapatas del ganado R. (B.) microplus semi-repletas (4-8 mm). Los animales del grupo vacunado y testigo permanecieron en potreros separados durante el estudio. Al grupo testigo se aplico elplacebo (día 0) a dosis de 2 mL/ bovino intramuscular y la segunda y tercera aplicación del placebo a dosis de 2 mL/ bovino intramuscular en la semana 4 y 7 respectivamente. El grupo vacunado recibió el antígeno recombinante Bm86 a dosis de 2 mL/ bovino vía intramuscular la primera vacunación (día 0) y la segunda y tercera vacunación en la semana 4 y 7 para cada caso, aplicándose la revacunación a los 6 meses. Se realizaron baños por aspersión cuando la infestación rebaso el promedio de 30 garrapatas/ lado animal. Los conteos postvacunación de garrapatas semi-repletas (4-8 mm) por lado/animal en los bovinos del grupo vacunado y del grupo testigo fueron los días 14, 21, 29, 35, 42, 49, 59, 62, 70, 77, 90,100, 111, 120, 127, 141, 153, 174, 181, 194, 208, 238, 251, 264 y 287 post-vacunación. El promedio de garrapatas por lado animal al inicio de la prueba fue de 50 garrapatas semirepletas (4-8 mm). Se realizaron 17 baños profilácticos en el grupo testigo y 8 baños en el grupo vacunado en más de 9 meses del estudio, obteniéndose en dos periodos un total de 190 días (6 meses) sin baño en el grupo vacunado.

Conclusiones La vacuna recombinante con el antígeno Bm86 evaluada contra la garrapata del bovino Rhipicephalus (Bophilus) microplus resistente a garrapaticidas en estas dos zonas ganaderas de México, es eficaz y segura y puede ser aplicada en bovinos a partir del segundo mes de edad, de cualquier raza, sexo o estado productivo. Es

181 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México inocua para el hombre y el ganado, ya que no contamina la leche, la carne ni el ambiente. Puede ser utilizada con cualquier garrapaticida sin importar su principio activo, ni su método de aplicación siempre y cuando se confirme el género de garrapata y a qué principio activo es susceptible la garrapata en cada rancho para el éxito del programa. El uso de esta vacuna en un Programa de Control Integral contra la garrapata del bovino es una estrategia de control sustentable a largo plazo, que favorecerá la sanidad animal y la disminución en el uso de garrapaticidas químicos que impactara favorablemente en el ambiente y en consecuencia en la salud pública.

Referencias

Aguirre, E.J.; Santamaría, V.M. 1986. Purificación y caracterización toxicológica de garrapatas Boophilus microplus resistentes a ixodicidas organosfosforados y organoclorados. Memorias de la VII Reunión Anual Asoc. Mex. de Parasitología Veterinaria, A.C. Cd. Victoria, Tamps. Almazan, C., Lagunes, R., Villar, M., Canales, M., Rosario-Cruz, R., Jongejan, F., de la Fuente, J. 2010. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitol. Res. 106, 471-479. Athanasiadou, S., Githiori, J., Kryazakis, I. 2004.Medicinal plants for helminth parasite control: Facts and fiction. Animal. 9: 1392- 1400. Cardozo, H.; Franchi, M. 1996. Garrapata: Epidemiología y control de Boophilus microplus. En: Enfermedades parasitarias de importancia económica en bovinos. Bases epidemiológicas para su prevención y control. Nari, A. Fiel, C. (ed.) Uruguay: Hemisferio Sur 369-407. de la Fuente, J., Kocan, K.M. 2003. Advances in the identification and characterization of protective antigens for development of recombinant vaccines against tick infestations. Exp Rev Vaccines. 2:583-593 de la Fuente, J., Almazan, C., Canales, M., Perez de la Lastra, J.M., Kocan, K.M., Willandsen, P. 2007. A ten –year review of commercial vaccine performance for control of tick infestations on cattle. An. Hlth. Res. Rev. 8(1): 23-28. Jonsson et al., 2000. Evaluation of tick– GARD (PLUS), a novel vaccine against Boophilus microplus, in lactating Holstein- Friesian cows. Veterinary Parasitology. 88: 275- 285. Miller RJ, Almazan C., Ortiz-Estrada M, Davey RB, George JE, De León AP. First report of fipronil resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus of Mexico Vet. Parasitol. 2013; 191:97-101. Nuttall P. A., Trimnell A. R., Kazimirova M., Labuda M. 2006. Exposed and concealed antigens as vaccine targets for controlling ticks and tick-borne diseases. Parasite Immunol. 28, 155–163. Pérez- Cogollo LC., Rodríguez- Vivas RJ., Ramírez- Cruz GT., Miller RJ First report of the cattle tick Rhipicephalus microplus resistant to ivermectin in Mexico Vet. Parasitol. 2010; 168:165-169.

182 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Rodríguez, V.R.I. 2005. Enfermedades de importancia económica en producción animal. Universidad Autónoma de Yucatán. Editorial McGraw-Hill Interamericana. 181 p. Rodríguez, et al., 2006. Prevalence and potential risk factors for amitraz resistance in Boophilus microplus ticks in cattle farms in the state of Yucatan, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 75: 280-286. Ortiz E.M, Santamaría V.M, Ortiz N.A, Soberanes C.N, Osorio M.J, Franco B.R, Martínez I.F, Quezada D.R, Fragoso S.H. 1995. Caracterización de la resistencia de B. microplus a ixodicidas en México. Memorias del III Seminario Internacional de Parasitología Animal. SAGAR-CANIFARMA- FAO-IICA-INIFAP. Acapulco, Gro. Méx. 1995: 58-66. Soberanes C.N., Santamaría V.M., Fragoso S.H. y García V.Z. 2002. Primer caso de resistencia al Amitraz en la garrapata del ganado B. microplus en México. Tec. Pec. Mex.40 (1): 81-92. Soberanes, C.N.; Torres, R.L., Torres, T.A., Galván, R.S., Reyna. G., Almazan, G.A.The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: Fluctuation and chemical control in the Northern Mexico. 2011. Memories WAAVP-Towards Good Management Practices in Parasite Control. Buenos Aires, Argentina.

183 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO Y EVALUACIÓN DE ANTÍGENOS VACUNALES COMO POSIBLES CANDIDATOS PARA EL CONTROL DE LA GARRAPATA RHIPICEPHALUS MICROPLUS

STRATEGIES FOR THE DESIGN AND EVALUATION OF CANDIDATE ANTIGENS SUCH A POSSIBLE ALTERNATIVE AGAINST THE CATTLE TICK RHIPICEPHALUS MICROPLUS

Lagunes-Quintanilla RE1*, Ramírez-Guillen PN2, de la cruz-Hernández NI2, Hernández-Ortiz R1, Castro-Saines E1, Merino-Charrez JO2

1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, INIFAP. Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla, Col. Progreso, CP 62550. Jiutepec, Mor., México. 2Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Tamaulipas, Km. 5, Carretera Victoria-Mante, CP 87000. Cd. Victoria, Tam., México. *Correo electrónico: [email protected]

INTRODUCCIÓN

La garrapata Rhipicephalus microplus es el principal ectoparásito que afecta a la ganadería bovina en regiones tropicales y subtropicales del mundo. Los efectos causados por R. microplus, representan uno de los principales problemas que repercuten en la productividad de los bovinos, sin olvidar el papel que juegan en la transmisión de enfermedades como babesiosis (Babesia bovis, B. bigemina) y anaplasmosis (Anaplasma marginale) (Molento et al., 2013). Se estima que el costo global ocasionado por las infestaciones por garrapatas y las enfermedades que transmiten oscila entre los 2.5 billones de dólares anualmente (Lew-Tabor et al., 2014). El método de control más utilizado contra el ectoparásito ha sido por mucho tiempo el uso de ixodicidas; sin embargo, el uso constante de estos químicos ha favorecido el desarrollo de garrapatas resistentes, haciendo hoy en día el escenario más complejo ya que se han detectado cepas de garrapatas con resistencia múltiple en algunos países (Robbertse et al., 2016).

Esto ha puesto de relieve la importancia de impulsar alternativas de control diferentes a los ixodicidas que apunten a la búsqueda de blancos moleculares para el desarrollo de inmunógenos y que formen parte de un programa integrado contra garrapatas (Almazán et al., 2010). El uso de vacunas promete ser una alternativa de control viable en un futuro cercano, que evite la selección de garrapatas resistentes, contribuya a mejorar la producción y la salud animal en hatos ganaderos y que sean nobles con el medio ambiente. En este sentido, el antígeno de mayor interés localizado en extractos crudos de garrapatas R. microplus fue identificado en el intestino como una glicoproteína de membrana,

184 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México purificada y caracterizada como Bm86, la cual tenía la capacidad de producir daños irreversibles en el intestino; reflejándose en la disminución de los parámetros reproductivos de las garrapatas, afectando con ello la progenie. Sin embargo, posee ciertas desventajas ya que la eficacia se ve limitada contra otras especies diferentes a R. microplus, además de presentar variabilidad dependiendo la cepa o aislado geográfico de garrapatas (Sossai et al., 2005). Por otra parte, el antígeno Subolesina, descubierta en la garrapata Ixodes scapularis (Almazán et al., 2003), se encuentra presente en los diferentes estadios de la garrapata y en varios órganos como intestino, glándulas salivales y ovarios (de la Fuente et al., 2006). Actualmente, se sabe que es eficaz como un antígeno protector, y es estructural y funcionalmente ortólogo de las akirinas en insectos y vertebrados (Kocan et al., 2009). Subolesina ha sido ampliamente estudiada por diferentes grupos de investigación, donde se ha observado que, al inmunizar bovinos, estos producen anticuerpos protectores que afectan los diferentes estadios de las garrapatas. Recientemente, Lagunes et al. (2016) diseñaron y sintetizaron un polipéptido recombinante basado en los epítopos de células B predichos en la secuencia de aminoácidos de la proteína Subolesina mediante análisis bioinformáticos, el cual, fue evaluado en un ensayo preliminar de inmunización en bovinos y desafiados contra garrapatas R. microplus. Dicha evaluación mostró una reducción del 79% en el número de garrapatas adultas y 30% en la eclosión de larvas, sin observar algún efecto adverso en el peso de las garrapatas ingurgitadas y en la oviposición.

OBJETIVO

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto inmunoprotector de un polipéptido de Subolesina diseñado a través de herramientas bioinformáticas, sobre el peso y la oviposición de garrapatas R. microplus.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo fue realizado en la Unidad de Artropodología del CENID- PAVET, INIFAP y en el laboratorio de Parasitología y Biología molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Tamaulipas (FMVZ-UAT). Como material biológico se utilizó la cepa de garrapatas R. microplus “Media Joya”, perteneciente al germoplasma del CENID-PAVET, INIFAP, y mantenida en condiciones controladas desde el 2009 en la FMVZ-UAT.

Se utilizaron 8 muestras de suero hiperinmune obtenidas de 2 bovinos inmunizados previamente con el polipéptido Subolesina (Lagunes et al., 2016); dichos sueros fueron evaluados mediante la técnica de ELISA indirecto para determinar el nivel de anticuerpos IgG anti-subolesina mediante un espectrofotómetro lector de ELISA a 405 nm. Las muestras de suero utilizadas para llevar a cabo el experimento, corresponden a la semana 0, 3, 5 y 7. Los sueros de la semana 0 (preinmune) fungieron como grupo testigo; los sueros de la

185 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México semana 3 tenían un nivel de anticuerpos de 0.7 OD405 nm, los de la semana 5 de 0.5 OD405 nm y los de la semana 7 presentaban el nivel más alto con 2.9 OD405 nm. Finalmente, se llevó a cabo la purificación de IgG's específicas por cromatografía de afinidad utilizando el kit comercial Montage® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se utilizó un bovino donador adquirido de una zona libre de garrapatas y con antecedentes de no haber sido inmunizado ni tratado con ixodicidas, para extraer 100 ml de sangre en una bolsa recolectora con citrato de sodio. La sangre se dividió en 8 grupos y se mezcló con los sueros respectivamente para llevar a cabo el ensayo de alimentación artificial capilar. La relación de sangre - suero fue de 4:1 unidades. Por otra parte, se utilizaron larvas de garrapatas R. microplus cepa “Media Joya”, las cuales fueron alimentadas parcialmente sobre dos bovinos hasta el día 20 post-infestación; posteriormente fueron removidas, colectadas y limpiadas. Las garrapatas con daños en piezas bucales y con un peso <25 mg o >60 mg se descartaron; las viables se utilizaron para formar grupos experimentales y su posterior alimentación artificial capilar. Los grupos estuvieron formados por 10 garrapatas, siendo 8 grupos en total. La alimentación se realizó fijando a las garrapatas en cinta adherible de dos caras e insertando las piezas bucales en tubos capilares para hematocrito con citrato de sodio y llenados con sangre de bovino adicionada con 1mg/ml de IgG anti-polipéptido Subolesina. Los tubos fueron reemplazados de acuerdo con el consumo de sangre aproximadamente cada 2-3 horas durante 48 horas de acuerdo con investigaciones previas (Antunes et al. 2014). Después del proceso de alimentación, las garrapatas ingurgitadas fueron pesadas nuevamente para determinar la ingesta de sangre, se colocaron en tubos eppendorf y se mantuvieron en incubadoras a 27°C y 80% de humedad relativa para permitir la oviposición a las 2 semanas posteriores. La prueba de t-student para varianzas desiguales (p<0.05), se utilizó para comparar los resultados de peso de las garrapatas repletas y el peso de la masa de huevos entre los grupos experimentales con el grupo testigo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos al finalizar el experimento se muestran en el cuadro 1, donde se observa el peso promedio de las garrapatas repletas y el peso promedio de la masa de huevos. Los grupos de garrapatas se formaron de acuerdo a la semana de colecta de suero por bovino y al final se obtuvo un promedio final por grupo/semana.

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Cuadro 1. Resultados obtenidos en el experimento de alimentación artificial capilar.

En la semana 0, el cual corresponde al grupo testigo se observó una ingesta adecuada de sangre, aumentando la ganancia de peso de las garrapatas gradualmente durante las 48 horas que duró el experimento. A partir de la semana 3 y hasta la semana 7 se observaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) en los pesos promedios de las garrapatas analizadas, obteniendo una ganancia de peso mínima en la semana 3 y 5 a diferencia de la semana 7 donde se observó un incremento de peso medianamente adecuado. Por otro lado, se observó la presencia de 13 garrapatas muertas en los diferentes grupos experimentales, debido posiblemente al efecto de los anticuerpos IgG anti- polipéptido Subolesina presentes en los sueros hiperinmunes. En cuanto a la oviposición, se observó en el grupo testigo un peso promedio en la masa de huevos usual a diferencia de las semanas 3, 5 y 7; el cual fue decayendo gradualmente conforme aumentaba el nivel de anticuerpos presentes en los sueros hiperinmunes. Interesantemente, en la semana 7 se obtuvo la menor postura de huevos debido a que solo 4 garrapatas ovipositaron. De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, se sugiere que la baja ganancia de peso de las garrapatas en las semanas 3, 5 y 7 así como la disminución gradual en la oviposición es debido a los anticuerpos IgG anti- polipéptido Subolesina circulantes en las semanas muestreadas. Estos resultados concuerdan con la cinética de la producción de anticuerpos mostrada por Lagunes et al. (2016), donde se observa una respuesta inmune secundaria potencializada en los bovinos al momento de exponerlos a una segunda dosis del antígeno en cuestión. Por lo cual, el título de anticuerpos circulantes en los animales era elevado y fácilmente perceptible. En el cuadro 2, se muestra un análisis comparativo entre la cinética de la producción de anticuerpos obtenida en el

187 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México trabajo previamente publicado, con los hallazgos encontrados en este ensayo in vitro de alimentación artificial capilar.

Cuadro 2. Análisis comparativo entre los resultados obtenidos en este trabajo con el nivel de anticuerpos anti-polipéptido Subolesina presentes en los sueros hiperinmunes.

Los trabajos que se han realizado con la proteína Subolesina siempre han mostrado un efecto protector que ronda entre el 60% de eficacia general (Almazán et al., 2010; Merino et al., 2013). Sin embargo, no se había diseñado un antígeno a partir de la región inmunogénica de la proteína que contuviera los mejores epítopos B predichos mediante programas bioinformáticos con la finalidad de aumentar el efecto inmunoprotector. Con base en los hallazgos encontrados se sugiere que existió una reacción antígeno-anticuerpo específica y dirigida hacia los epítopos contenidos en esa región de la secuencia de la proteína Subolesina. A esta capacidad se le atribuye un efecto adverso en el peso de las garrapatas repletas y en la masa de huevos ovipositada por estas.

Actualmente, el estudio de las vacunas se ha incrementado debido a la utilización de la vacunología inversa, que comprende el uso de técnicas de biología molecular e ingeniería genética para identificar antígenos protectores y desarrollar vacunas recombinantes. Por otro lado, el comienzo de la era post-genómica, revolucionó la forma de poder diseñar y desarrollar antígenos que pueden ser ensayados de manera experimental; de tal forma, que la búsqueda y el diseño de nuevos candidatos vacunales comienza con el análisis in silico del genoma de interés detectando genes específicos con potencial a vacunas. En el caso concreto de vacunas contra garrapatas se han diseñado diferentes estrategias para desarrollar antígenos vacunales mediante el uso de programas bioinformáticos, los cuales predicen características de interés utilizando diferentes algoritmos para facilitar el desarrollo de un inmunógeno (Crompton et al., 2010). Así fue como Patarroyo et al., (2002), diseñaron tres péptidos sintéticos a partir de

188 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México la secuencia inferida de Bm86. Se seleccionaron con posibles características antigénicas para que fueran capaces de inducir una respuesta inmune protectora contra garrapatas R. microplus cuando eran inoculados en bovinos. De los tres péptidos, el que tuvo mayor efecto alcanzó una eficacia general de 81%.

Una nueva estrategia que se está implementando en los últimos años para acelerar el proceso de diseño y fabricación de inmunógenos, es la selección de epítopos específicos de proteínas de superficie que sean conservados y que induzcan una respuesta humoral protectora. Una vez predichos los mejores epítopos dentro de una secuencia aminoacídica se forma un antígeno multiepitópico compuesto de cada uno de los epítopos seleccionados. Los péptidos se sintetizan de manera comercial y la síntesis química se realiza en un sistema de MAPS (Multiple Antigenic Peptide System), el cual consiste en generar los péptidos en forma de tetrámeros u octámeros ramificados para darle mayor inmunogenicidad (Valdez, 2015). Este tipo de estrategia también puede ser útil para el diseño de quimeras o la combinación de epítopos específicos de diferentes antígenos potenciales encontrados en garrapatas de interés.

CONCLUSIONES

Los métodos inmunológicos son una herramienta promisoria para el control de garrapatas, debido a que presentan eficacia cuando se utilizan adecuadamente reflejándose en la disminución de poblaciones de garrapatas. La combinación de técnicas moleculares y estrategias de bioinformática, han conducido al estudio profundo de genes y proteínas con el fin de diseñar inmunógenos con potencial vacunal; además, el estudio de polimorfismos genéticos y variantes antigénicas de proteínas de interés en distintas regiones del país, favorecerá el desarrollo de vacunas basadas en antígenos locales estableciendo un sistema de control de cepas regionales de garrapatas. Finalmente, el uso de vacunas se vislumbra como un elemento factible y económicamente viable para mejorar la salud animal, abatir la contaminación ambiental y reducir el uso irracional de ixodicidas.

REFERENCIAS

Almazán C, Kocan KM, Bergman DK, García-García JC, Blouin EF, de la Fuente J. 2003. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine; 21:1492- 1501. Almazán C, Lagunes R, Villar M, Canales M, Rosario-Cruz R, Jongejan F, de la Fuente J. 2010. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitol Res; 106: 471-479. Antunes S, Merino O, Mosqueda J, Moreno-Cid J, Bell-Sakyi L, Fragkoudis R, Weisheit S, Pérez de la Lastra J, Alberdi P, Domingos A, de la Fuente J. 2014. Tick capillary feeding for the study of proteins involved in tick-pathogen

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intercations as potential antigens for the control of tick infestation and pathogen infection. Parasit Vectors; 7: 42. Crompton D, Kayala A, Traore B, Kayenta K, Ongoiba et al. 2010. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proc Nat Acad Sci USA; 107: 6958- 6963. de la Fuente J, Almazán C, Blas-Machado U, Naranjo V, Mangold AJ, Blouin EF, Gortazar C, Kocan KM. 2006. The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood digestion and reproduction. Vaccine; 24: 4082–4095. Kocan KM, Zivkovic Z, Blouin EF, Naranjo V, Almazán C, Mitra R, de la Fuente J. 2009. Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis. BMC Developmenl. Biol; 9:42. Lagunes R, Dominguez D, Quiroz H, Martínez M, Rosario R. 2016. Potential effects on Rhipicephalus microplus tick larvae fed on calves immunized with a Subolesin peptide predicted by epitope analysis. Trop Biomed; 33: 726-738. Lew-Tabor AE, Bruyeres AG, Zhang B, Valle MR. 2014. Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick in vitro feeding methods for functional (dsRNA) and vaccine candidate (antibody) screening. Ticks Tick Borne Dis; 5: 500-510. Merino O, Antunes S, Mosqueda J, Moreno-Cid J, Pérez de la Lastra J, Rosario- Cruz R, Rodríguez S, Domingos A, de la Fuente J. 2013. Vaccination with proteins involved in tick-pathogen interactions reduces vector infestations and pathogen infection. Vaccine; 31: 5889-5896. Molento MB, Fortes FS, Buzatti A, Kloster FS, Sprenger IK, Coimbra E, Soares ID. 2013. Partial selective treatment of Rhipicephalus microplus and breed resistance variation in beef cows in Rio Grande do Sul, Brazil. Vet Parasitol; 192: 234-239. Patarroyo H, Portela W, De Castro O, Pimentel C, Guzmán F, Patarroyo E, Vargas I, Prates A, Mendes Dias. 2002. Immunization of cattle with synthetic peptides derived from the Boophilus microplus gut protein (Bm86). Vet Immunol Immunopathol; 88: 163-172. Robbertse L, Baron S, Van Der Merwe NA, Madder M, Stoltsz WH, Maritz-Olivier C. 2016. Genetic diversity, acaricide resistance status and evolutionary potential of a Rhipicephalus microplus population from a disease-controlled cattle farming area in South Africa. Ticks Tick Borne Dis; S1877- 959X(16)30032-2. Sossai S, Peconick A, Sales-Junior P, Marcelino F, Vargas M, Neves E, Patarroyo J. 2005. Polymorphism of the bm86 gene in South American strains of the cattle tick Boophilus microplus. Exp Appl Acarol; 37: 199-214. Valdez U. 2015. Identificación de epítopos conservados en aislados de babesia bigemina. Tesis de Maestría. Ciudad de México, Departamento de Inmunoparasitología, Universidad Nacional Autónoma de México – Ciudad Universitaria.

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ACTUALIDADES SOBRE EL CONTROL INTEGRAL DE LA COCCIDIOSIS BOVINA EN EL GANADO LECHERO Y DE CARNE

AN UPDATE ON INTEGRATED CONTROL OF COCCODIOSIS IN DAIRY AND BEEF CATTLE

Alcalá CY*

Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad de México, 04510, México. [email protected]

RESUMEN

Las coccidias comprenden un grupo diverso de protozoarios obligados intracelulares de vertebrados, con unas pocas especies que infectan invertebrados. Estos parásitos han sido clasificados en el phylum Apicomplexa que se caracteriza por la presencia de un conjunto de organelos dentro del extremo anterior de los estadios invasivos. Los agentes causales de la coccidiosis intestinal en rumiantes son organismos del género Eimeria que se desarrollan dentro de las células epiteliales del intestino de los hospederos (Bangoura et al., 2012). Los factores considerados en la estimación de pérdidas provocadas por la coccidiosis en rumiantes incluyen: mortalidad, retraso en el crecimiento y costos generados por tratamientos. Las pérdidas indirectas se deben principalmente a la disminución del crecimiento y al retraso en la conversión alimenticia. La coccidiosis clínica provoca lesiones patógenas severas en el intestino de los rumiantes y la atrofia de las vellosidades intestinales puede ser una secuela que resulte en mala absorción (Hermosilla et al., 2015). El objetivo de este trabajo es revisar la etiología, ciclo biológico, patogenia, lesiones, inmunidad, epidemiología y control de la coccidiosis bovina.

Keywords: Eimeria, coccidiosis, cattle, parasite, control, prevention

DESARROLLO DEL TEMA

Las coccidias comprenden un grupo diverso de protozoarios obligados intracelulares de vertebrados, con unas pocas especies que infectan invertebrados. Estos parásitos han sido clasificados en el phylum Apicomplexa que se caracteriza por la presencia de un conjunto de organelos dentro del extremo anterior de los estadios invasivos. Los agentes causales de la coccidiosis o coccidiosis en rumiantes son organismos que se desarrollan dentro de las

191 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México células intestinales de los hospederos (Jolley y Bardsley, 2006). Debido a que el desarrollo intracelular provoca la destrucción de las células en las que se multiplican, se les considera parásitos aunque no lleguen a provocar la enfermedad. La mayoría de las especies que infectan rumiantes no provocan signos a pesar de que se encuentren en cantidades elevadas cuando se realizan análisis diagnósticos coprológicos cuantitativos (Dougschies y Najdrowski, 2005). Consecuentemente, es importante diferenciar las especies patógenas de las de menor importancia clínica. El género Eimeria pertenece a la familia Eimeriidae del phylum Apicomplexa. En general, todas las especies de Eimeria que infectan rumiantes son específicas de hospedero, capaces de completar su desarrollo y reproducción en el tracto digestivo de hospederos específicos y genéticamente compatibles (Long, 1982).

En el Cuadro 1 se enlistan algunas de las especies más comunes de Eimeria y su localización en el huésped rumiante (Mehlhorn y Armstrong, 2001).

CUADRO 1. Especies de Eimeria que comúnmente infectan rumiantes

ESPECIE HOSPEDERO LOCALIZACIÓN TAMAÑO DEL PERIODO OOQUISTE PREPATENTE (µm) E. bovis Bovino Intestino delgado 23-34 x 17-23 15-21 posterior E. auburnensis Bovino Intestino delgado 36-42 x 19-26 17-20 E. zuernii Bovino Intestino delgado 16-20 x 15-18 15-19 E. ellipsoidalis Bovino Intestino delgado 18-26 x 13-18 8-13 E. faurei Ovino Intestino delgado 22-33 x 19-24 12-15 E. intrincata Ovino Intestino delgado, 40-56 x 30-41 20-27 ciego E. ovina Ovino Intestino delgado 23-36 x 16-24 19 E. ovinoidalis Ovino Colon 17-25 x 13-20 10-15 E. arloingi Caprino Criptas 22-33 x 19-24 12-15 intestinales E. ninakohlyakimovae Caprino Criptas 40-56 x 30-41 20-27 intestinales E. caprina Caprino Intestino delgado 24-31 x 23-34 14-23

La coccidiosis en rumiantes es una enfermedad cosmopolita. Sin embargo, la frecuencia, incidencia, prevalencia, morbilidad y mortalidad varía según las regiones, tipo de explotación y medidas de bioseguridad que se aplican en el manejo del ganado (Matjila y Penzhorn, 2002).

Se estima que la coccidiosis en bovinos provoca pérdidas mundiales de $400 millones de dólares al año (Fitzgerald, 1980). Los factores considerados en la estimación de pérdidas incluyen: mortalidad, retraso en el crecimiento y costos generados por tratamientos. Las pérdidas indirectas se deben principalmente a la disminución del crecimiento y al retraso en la conversión alimenticia. La

192 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México coccidiosis clínica provoca lesiones patógenas severas en el intestino de los rumiantes y la atrofia de las vellosidades intestinales puede ser una secuela que resulte en mala absorción. Debido a que el género Eimeria se caracteriza por una alta especificidad de hospedero, con excepciones escasas, disminuye significativamente el riesgo de zoonosis a causa de esta enfermedad.

Morfología

Estadios invasivos y móviles (esporozoito y merozoito):

El complejo apical de los organismos clasificados dentro del phylum Apicomplexa incluye un grupo de organelos que facilitan el ingreso a la célula hospedera del protozoario. Estos organelos incluyen una serie de microtúbulos que forman una estructura llamada conoide. El conoide consiste en una serie de estructuras fibrilares en espiral que se sugiere permiten al protozoario penetrar la célula hospedera. Los anillos polares son engrosamientos osmiofílicos del complejo pelicular interno. Los gránulos densos están involucrados en la formación de una vacuola parasitófora que facilita la invasión celular. Los rhoptrios son organelos tubulares osmiofílicos alargados posteriormente que se extienden de la porción anterior hacia el interior del conoide. Se sugiere que los rhoptrios secretan una enzima proteolítica que auxilia la función del conoide y recluta mitocondrias del hospedero. Los micronemas son organelos osmiofílicos que se extienden longitudinalmente en la parte anterior de la célula y permiten la adhesión del parásito a la célula hospedera mediante la conexión de la superficie extracelular con el citoesqueleto del protozoario (Urquhart, 1996). Los estadios invasivos de Eimeria están delimitados por dos membranas y dentro de su citoplasma se observan, entre otros, los siguientes organelos: aparato de Golgi, mitocondria, núcleo, nucléolo, cuerpos ovoides con amilopectina, vesículas y un microporo (citostoma).

Estadio inmóvil (ooquiste):

Los ooquistes son estadios exógenos que generalmente se excretan con las heces del hospedero. La esporogonia es el proceso mediante el cual un esporonte (zigoto) lleva a cabo una serie de divisiones dentro de la pared del ooquiste para formar esporozoitos, los cuales en el caso de Eimeria se encuentran contenidos dentro de esporoquistes. Los ooquistes del género Eimeria presentan en su interior cuatro esporoquistes cada uno con dos esporozoitos. Estudios ultraestructurales del ooquiste han demostrado la presencia de diversos organelos dependiendo de la especie de Eimeria, entre ellos el gránulo polar, cuerpo residual del ooquiste, micrópilo y tapón del micrópilo. El esporoquiste posee una pared y un residuo, mientras que el esporozoito presenta un núcleo y los cuerpos retráctiles anterior y posterior (Mehlhorn y Armstrong, 2001).

193 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

El ciclo biológico del género Eimeria se divide en 3 fases: 1. Esporogonia 2. Merogonia o esquizogonia 3. Gametogonia

Esporogonia.- Los ooquistes esporulados constituyen el estadio infeccioso del género Eimeria y son excretados al exterior con las heces. Bajo condiciones adecuadas de oxigenación, humedad elevada y temperaturas óptimas de alrededor de 27ºC, el núcleo se divide dos veces y la masa protoplásmica forma 4 cuerpos cónicos a partir de una masa central. Cada uno de estos conos se redondea y forma un esporoblasto, aunque en algunas especies el protoplasma restante forma el cuerpo residual del ooquiste. Cada esporoblasto secreta una pared de material refráctil que se conoce como esporoquiste, mientras que en el interior el protoplasma se divide y forma dos esporozoitos. En algunas especies el protoplasma restante dentro del esporoquiste forma un cuerpo residual del esporoquiste. Bajo condiciones ambientales óptimas, esta fase del ciclo se realiza en 2-4 días (Jolley y Bardsley, 2006).

Merogonia o esquizogonia (reproducción asexual).- El hospedero se infecta al ingerir el ooquiste esporulado. La invasión de la célula del hospedero está acompañada por la liberación de antígenos de los organelos localizados en la región anterior de los esporozoitos (micronemas y rhoptrios), que desempeñan un papel importante en el reconocimiento de la célula hospedera, penetración a través de la membrana celular del hospedero y la formación de la vacuola parasitófora (Heise et al., 1999). Los esporoquistes se liberan ya sea mecánicamente o por el estímulo del CO2 y los esporozoitos se liberan al ser activados por la tripsina y bilis. En muchas especies, cada esporozoito penetra una célula epitelial, se redondea y se le conoce como trofozoito. Después de algunos días, cada trofozoito se divide por fisión binaria múltiple y forma el meronte o esquizonte, estructura que está formada por un elevado número de organismos elongados nucleados conocidos como merozoitos. Cuando la división se completa y el meronte madura, la célula hospedera y el meronte se rompen, por lo que los merozoitos se liberan e invaden células adyacentes. La merogonia puede repetirse varias generaciones dependiendo de la especie de Eimeria (Daugschies y Najdrowski, 2005).

Gametogonia (reproducción sexual).- La merogonia concluye cuando los merozoitos forman gametocitos machos (microgametocitos) y hembras (macrogametocitos). Estos estadios de vida pueden distinguirse de los trofozoitos o merozoitos en desarrollo por el hecho de que tienen un núcleo único y grande. Los microgametocitos se dividen repetidamente para formar un gran número de organismos flagelados con un solo núcleo, a los que se les denomina microgametos. Los protozoarios presentan órganos de locomoción solamente durante esta breve fase de su ciclo de vida. Los microgametos se liberan por la ruptura de la célula hospedera, uno penetra un macrogameto y se lleva a cabo la

194 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México fusión de los núcleos del microgameto y macrogameto. Se forma un pared quística alrededor del zigoto (zigotoquiste u ooquiste), el cual es libera de las heces como un ooquiste no esporulado. El periodo prepatente dura en promedio 3-4 semanas (Reeg et al., 2005).

La severidad de la infección por Eimeria en rumiantes depende de dos factores importantes: los parásitos como tales y la reacción del hospedero hacia ellos. Una reacción severa por parte del hospedero puede causar más daño que los mismos parásitos. Ambos causan cambios estructurales que reducen la función de los órganos afectados y se desencadena una serie de cambios fisiológicos. Algunas de las reacciones del hospedero se producen como respuestas generales a la interferencia con sus tejidos, mientras que otras son respuestas específicas hacia las coccidias. El intestino delgado de los rumiantes es muy largo, lo cual proporciona un gran número de enterocitos que permiten la multiplicación excesiva del parásito sin que se provoque mucho daño por lo general. En caso de que se afecte la absorción, el intestino grueso puede ejercer un cierto efecto compensatorio. Las coccidias que afectan el intestino grueso tienden a ser más patógenas que aquéllas que infectan el delgado (Marshall et al., 1998). Esto puede deberse a que la regeneración celular es menor, parcialmente debido a que en el intestino grueso existen más organismos oportunistas que pueden explotar una mucosa dañada. Las coccidias menos patogénicas causan efectos resultantes de la hiperplasia y la pérdida de la superficie celular, mientras que las especies más patogénicas provocan cambios que derivan en pérdida de las células de la cripta y ruptura de vasos sanguíneos. Con respecto a la histopatología, se presentan los siguientes procesos (Urquhart, 1996):

1. Cambios vasculares – Se observan hiperemia, edema y hemorragia de acuerdo con el grado de severidad del daño. Esto puede ser parte de una respuesta general inflamatoria que puede ser generada también por bacterias oportunistas. Puede incrementarse la permeabilidad del endotelio y epitelio, derivando en edema e incremento en la pérdida de fluidos.

2- Infiltración celular – Los neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y macrófagos se acumulan como parte de la respuesta inflamatoria. Se observa una gran cantidad de neutrófilos en las áreas de ruptura del recubrimiento epitelial, especialmente si hay invasión de bacterias. Los macrófagos, neutrófilos y eosinófilos desempeñan un papel importante en la destrucción de los merontes de primera generación.

3. Hiperplasia epitelial – Todas las infecciones causadas por coccidias dañan el epitelio provocando una respuesta de hiperplasia o proliferación celular. En la mayoría de los casos proliferan únicamente las células no infectadas, pero en otros se continúan dividiendo las células infectadas con coccidias. La proliferación continua de las células intestinales resulta en el alargamiento de las criptas intestinales y en la disminución de la tasa vellosidad/cripta. La hiperplasia puede ser focal o difusa. La focal causa la formación de “parches de ooquistes” y pólipos

195 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México en el caso de E. bakuensis, E. ahsata (ovinos), E. christenseni y E. arloingi (caprinos). Estas lesiones focales resultan de la liberación de merozoitos dentro de la lámina propia. Los pólipos se forman debido al alargamiento excesivo de las vellosidades causado por la hiperplasia de las criptas o por el aumento del tiempo de vida de cada enterocito.

4. Pérdida epitelial – Los enterocitos generalmente completan su tiempo de vida en unos pocos días. Cuando llegan a la superficie de la mucosa, se liberan al lumen o son absorbidos por los enterocitos adyacentes. En las infecciones causadas por coccidias, los enterocitos se pierden prematuramente, probablemente debido a la anoxia que ocurre en los rumiantes cuando los merontes gigantes separan al epitelio de su fuente de sangre. También puede deberse a una reacción de hipersensibilidad en la que la acumulación de fluidos debajo del epitelio forma hojas de epitelio a partir del estroma. En estos casos las células mueren por necrosis. Otro mecanismo es la apoptosis o muerte celular programada tanto en la superficie intestinal como en las criptas. La pérdida de epitelio en el intestino delgado provoca atrofia de las vellosidades. Si las criptas resultan intactas, la hiperplasia de las criptas producirá nuevas células para restaurar la arquitectura de las vellosidades. Sin embargo, se reduce el área de epitelio de absorción, aumenta la cantidad de enterocitos inmaduros por la tasa aumentada de generación celular y consecuentemente disminuye la absorción de nutrientes. Si la pérdida celular se extiende a las criptas, puede provocar atrofia de las mismas. Si el epitelio no se regenera, se presenta denudación en el área, lo cual implica dos hechos: pérdida de epitelio de absorción y acceso de bacterias y hongos oportunistas a los tejidos. La pérdida de epitelio de absorción puede producir diarrea y la invasión por organismos oportunistas puede causar necrosis del tejido y muerte del hospedero. Una de las causas más letales es la absorción de toxinas resultantes de la proteolisis excesiva (Mundt et al., 2005).

Alrededor de 15 especies de Eimeria parasitan a los bovinos, entre ellas, E. zuernii y E. bovis son altamente patogénicas. Otras especies como E. auburnensis pueden contribuir al cuadro clínico general. La infección se presenta principalmente en becerros o animales destetados menores a un año de edad, pero la enfermedad clínica ocasionalmente afecta a los adultos, en particular si existen infecciones masivas durante situaciones estresantes. La enfermedad causada por E. bovis y E. zuernii es similar y se caracteriza por una diarrea hemorrágica que llega a tornarse tan severa que únicamente se elimina sangre en lugar de las heces. Se nota un tenesmo marcado y hay anemia, debilidad, anorexia y emaciación. En infecciones severas llega a ser letal, sobre todo si hay presencia de microorganismos oportunistas. Los primeros signos clínicos aparecen justamente antes del pico de eliminación de ooquistes (día 18-19 postinfección). En ese momento hay una pérdida máxima de epitelio en el intestino grueso debido a la destrucción celular a causa de la merogonia de segunda generación y la gamogonia. Esto expone la lámina propia y forma membranas diftéricas. La destrucción del epitelio provoca la reducción en la reabsorción de

196 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México agua, Na+ y Cl- del contenido intestinal. Se observa una pérdida abrupta de peso en los animales. La enfermedad es más común en climas extremos o cuando se movilizan los becerros hacia corrales de engorda. Pueden llegar a presentarse signos nerviosos debido a la presencia de una neurotoxina en el suero (Jolley y Bardsley, 2005).

Se ha establecido que E. ovinoidalis y su análoga en caprinos, E. ninakohlyakimovae pueden ser muy patógenas. Otras especies tales como E. bakuensis (E. ovina) y E. crandallis en ovinos, E. arloingi y E. christenseni en caprinos pueden exacerbar los signos de las primeras dos especies. Los brotes de coccidiosis generalmente son agudos y se caracterizan por una morbilidad moderada y baja mortalidad. Se observa una diarrea acuosa verde o amarillenta con olor fétido y ocasionalmente con sangre. Los animales muestran dolor abdominal, un grado de anemia macrocítico hipocrómica, pérdida del apetito, deshidratación, tenesmo, debilidad y pérdida de peso. También son prominentes la depresión, inactividad y recumbencia. Los cambios patológicos incluyen el engrosamiento de la mucosa del ciego y colon, edema, hemorragia e hiperemia. La eimeriosis puede presentarse junto con miasis, diarrea bacteriana y septicemia. Los animales recién nacidos son relativamente resistentes a la infección y su susceptibilidad incrementa hasta las 4 semanas de edad (Chartier y Paraud, 2012).

Diagnóstico

En el caso de las heces hemorrágicas que contienen tejido y fibrina, se debe considerar coccidiosis debida a E. bovis o E. zuernii. Las infecciones moderadas o infecciones con otras especies de Eimeria pueden inducir coccidiosis subclínica o diarrea no hemorrágica inespecífica y que generalmente se atribuye a otros patógenos. Los ooquistes pueden encontrarse en las heces con fotomicroscopía, preferentemente después de la concentración con las técnicas convencionales de flotación. La sensibilidad de los métodos coprológicos se reduce en las heces diarreicas debido a la dilución. Debido a que la patogenicidad de las especies de Eimeria difiere considerablemente y la presentación clínica no es específica, la sola presencia de ooquistes, aún en grandes cantidades, no permite llevar a cabo el diagnóstico clínico de coccidiosis si no se identifica la especie respectiva (Daugschies y Najdrowski, 2005). Los ooquistes son más numerosos en las heces o tejidos durante el periodo temprano de patencia y permanecen elevados durante 3 a 7 días, después de los cuales se completa el ciclo endógeno y las cuentas de ooquistes fecales caen a cero. En virtud de la desaparición de ooquistes en las heces al inicio del periodo patente, la colecta de las muestras fecales a tiempo es importante. Las heces deben ser colectadas de los animales al inicio de la fase diarreica, en lugar de una semana o dos después del inicio de la fase clínica. Si el huésped sobrevive a la infección clínica y comienza a recuperarse, las infecciones subclínicas no comenzarán hasta semanas o meses después. Ocasionalmente, no se encontrarán ooquistes en animales con infecciones patentes. En estos casos

197 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México deben examinarse en húmedo a través de microscopía de luz el tejido excretado y los fragmentos de fibrina, o bien, los raspados tisulares de la mucosa intestinal de un animal muerto. Los estadios de gametogonia pueden ser visibles en las células de esos fragmentos (Jolley y Bardsley, 2006). Los métodos serológicos analíticos mediante ELISA y Western Blot han sido desarrollados, pero no son tan definitivos como el examen visual de las heces. Asimismo, los métodos para la diferenciación de Eimeria, tales como la detección de coproantígenos o moleculares, no se encuentran aún disponibles para propósitos rutinarios (Faber et al., 2002)

Epidemiología

Se ha documentado una asociación significativa entre la estación del año y la prevalencia de Eimeria spp. (Stewart et al., 2008). Sin embargo, la estación con las tasas de prevalencia más elevadas pueden variar en diferentes studios. Stewart y colaboradores (2008) encontraron una prevalencia significativamente mayor de infecciones por Eimeria durante el otoño, mientras que Daugschies y Najdrowski (2005) indicaron un incremento en la prevalencia de las infecciones durante la primavera. Otros autores han documentado un aumento en la coccidiosis durante el periodo de lluvia en climas más cálidos (Rehman et al., 2011). La influencia de las condiciones climáticas en la prevalencia de Eimeria spp. no siempre es claramente demostrable. Las infecciones por Eimeria spp. dependen más de factores como la edad, ya que son más comunes en animales de 3 semanas hasta un año de edad (Mehlhorn y Armstron, 2001). Sin embargo, también hay factores que pueden influir en la prevalencia e intensidades, tales como la higiene, prácticas de manejo, sistemas de alojamiento y estrés (Koutny et al., 2012).

Inmunidad

Después de una primera infección los animales permanecen protegidos y las infecciones posteriores no se relacionan generalmente con la enfermedad clínica, aunque algunos ooquistes se excreten. El grado de inmunidad depende de la cantidad de ooquistes ingeridos durante la infección primaria; la exposición a unos pocos o números moderados de ooquistes no proporcionan el estímulo antigénico necesario para desencadenar una respuesta inmune suficiente que pueda prevenir la enfermedad posterior. La inmunidad protectora se refuerza por una exposición continua a los ooquistes. Los anticuerpos del calostro, particularmente la subfracción IgG1, pero también la IgG2 e IgM se transfieren a las crías. De acuerdo con Faber et al. (2002), la IgG2 es la fracción principal de la respuesta inmune a la infección y esto se ha atribuido a una respuesta tipo Th2 que estimula la síntesis de IgG2 a través de las células NK que liberan Interferón Gamma. Sin embargo, es posible que el tipo de respuesta serológica varíe dependiendo del nivel de infección. A pesar de que los anticuerpos reflejan una exposición a las coccidias, no confieren protección (Fiege et al., 1992). La inmunidad protectora es principalmente del tipo celular y específica de especie. Se ha asumido que las

198 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México células CD+4 son particularmente importantes en este respecto y pueden transferirse a través del calostro (Faber et al., 2002). A pesar de que los linfocitos T activados no son capaces de abrogar el ciclo de vida del parásito en la infección primaria, la respuesta celular puede interactuar con el nivel y duración de la excreción de ooquistes, posiblemente al liberar especies reactivas de oxígeno y NO (Hermosilla et al., 2012). Los esporozoitos de Eimeria interactúan con las células y por lo tanto inducen respuestas inflamatorias a través de quimosinas, moléculas de adhesión o citocinas. En consecuencia, ambas partes de la infección deben ser consideradas, es decir, las reacciones inmunes del hospedador por un lado, y por el otro, los procesos moduladores inducidos por el parásito para evitar su exclusión. Con respecto a la inmunidad innata, se ha descrito que los polimorfonucleares forman trampsas extracelulares de neutrófilos (Fuchs et al., 2007) y se acumulan tempranamente en el sitio de la formación de esquizontes. Las infecciones por E. bovis regulan una red molecular asociada con el movimiento de leucocitos y la respuesta inflamatoria (Taubert et al., 2010). No obstante, la reacción es moderada al compararla con la que inducen otros protozoarios como Toxoplasma gondii o Neospora caninum, lo cual podría ser debido a que el parásito posee un mecanismo que evita las reacciones celulares inmunes intensas. Se ha demostrado que Eimeria spp. disminuye la expresión del gene de la defensina β-2 de caprinos (GBD-2 por sus siglas en inglés) al inducir la producción de IL-4; lo cual nos permite suponer que contribuye a la patogénesis de las infecciones de Eimeria al disminuir la secreción de Interferón-gamma y por lo tanto la producción de GBD-2 (Ibarra-Velarde y Alcala-Canto, 2007). Otra estrategia de evasión consiste en la inhibición inducida por el parásito de la estimulación no específica desencadenada por el TNF-α de la adhesión de los polimorfonucleares al endotelio activado. Este mecanismo o estrategia de evasión inmune garantizaría al protozoario un desarrollo intracelular de larga duración, ya que necesita de 6 a 8 meses más que T. gondii y N. caninum para completar la formación de merontes (Hermosilla et al., 2012). A pesar de que es posible inmunizar artificialmente a los bovinos, el desarrollo de una vacuna comercial se ha dificultado y solamente se ha obtenido una protección parcial e incluso se ha presentado la enfermedad clínica después de la inmunización, la cual es dosis- dependiente (Daugschies y Najdrowski, 2005). Otros procesos de interacción de Eimeria con la célula hospedera se han descrito en el caso de E. bovis, resaltando la inhibición de la apoptosis (Alcala-Canto e Ibarra-Velarde, 2008), la modulación del metabolismo celular, principalmente de las moléculas involucradas en la glucólisis, vía del ácido cítrico, degradación de alcohol y lípidos (Lutz et al., 2011) y sobre-regulación de moléculas involucradas en el metabolismo del colesterol, como la escualeno epoxidasa (Taubert et al., 2010).

Control

Lo más importante para evitar problemas continuos con coccidiosis, el manejo del hato o rebaño debe ser muy cuidadoso, principalmente en lo que se refiere a la higiene, alimentación, oxigenación, densidad animal, tipo de suelo, etc. En los

199 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México establos en los que se ha observado un incremento en los casos de coccidiosis, se detectó que el problema desapareció después de la reducción de la temperatura promedio por debajo de los 15°C y la humedad a un máximo de 80%. Esto se atribuyó a condiciones menos favorables para la esporulación de los ooquistes. Los pisos tipo rejilla que evitan la acumulación de heces en los corrales significativamente reducen los problemas relacionados con coccidias. Si las condiciones de bioseguridad no se llevan a cabo, entonces el tratamiento es prácticamente inevitable. Se han aplicado muchos compuestos con actividad anticoccidiana en los rumiantes. El principal blanco de los fármacos terapéuticos es el gamonte. La terapia se considera necesaria en el caso de un brote agudo; sin embargo, el ciclo de vida del parásito ya casi se ha completado y el daño intestinal se ha producido, por lo que la terapia es de valor limitado. La aplicación paleativa de electrolitos, glucosa y anti-diarreicos puede ayudar a mantener la homeostasis y a evitar mortalidades. Para prevenir las pérdidas debidas a coccidiosis, los animales deben tratarse pro y metafilácticamente en lugar de terapéuticamente (Mundt et al., 2005). Los fármacos diseñados para tal objetivo deben interrumpir la reproducción del parásito en un estadio temprano, es decir, la merogonia para poder prevenir la multiplicación y alteración mucosal subsecuente y de ese modo disminuir la presión de infección ambiental. Deben actuar de preferencia en los gamontes también porque no puede saberse con precisión en qué estadio se encuentra el desarrollo del parásito y posiblemente algunos animales ya se encuentren en el periodo de patencia cuando se inicia el tratamiento. Las sulfonamidas primariamente actúan en la generación asexual de la reproducción, es decir, en el periodo prepatente de la infección y son más o menos eficientes si se aplican lo más tempranamente posible (Mundt et al., 2005). Adicionalmente, las sulfonamidas se utilizan como fármacos terapéuticos aunque no ejercen suficiente actividad contra los gamontes. Estos fármacos también actúan contra algunas bacterias, por lo que pueden suprimir infecciones secundarias y al menos parcialmente explicar el beneficio del tratamiento de brotes de coccidiosis con sulfonamidas. Los compuestos de benceno acetonitrilo actúan contra varios estadios del ciclo de vida de Eimeria y son particularmente útiles para la metafilaxis. Una dosis única oral de 15 mg/kg de toltrazuril 12 días después de la infección experimental con E. bovis controla la enfermedad clínica y la excreción de ooquistes, y esta dosis demostró ser muy eficiente en un hato con brotes naturales de coccidiosis provocados por E. zuernii (Daughschies y Najdrowski, 2005). La adminsitración de toltrazuril una semana antes del brote esperado de coccidiosis eficientemente controla la enfermedad (Mundt et al., 2005). El éxito de tal régimen de tratamiento requiere un análisis cuidadoso de la dinámica de coccidiosis en el área o granja. El diclazuril también se ha utilizado para controlar infecciones de coccidiosis en rumiantes. Asimismo, el amprolio se sigue utilizando en algunos países, y su blanco terapéutico son los merontes. Se caracteriza por tener baja toxicidad y puede aplicarse en el agua o por vía oral hasta por 4 ó 5 días consecutivos. El decoquinato se añade en el alimento y debe administrarse continuamente en un periodo de tiempo extendido debido a que actúa solamente contra los estadios tempranos el ciclo, es decir, los esporozoitos

200 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México y trofozoitos. La monensina pertenece al grupo de los antibióticos ionóforos y se aplica como aditivo alimenticio durante periodos prolongados. La halofuginona se ha utilizado en aves y en el caso de bovinos, se indica para el tratamiento de criptosporidiosis en becerros lactantes. Con respecto a los desinfectantes comerciales, los únicos productos que han demostrado eficacia son los cresólicos que inactivan los ooquistes después de 2 horas de contacto. No obstante, se inactivan en presencia de materia orgánica. En el caso de las pasturas, deben drenarse y evitar que se acumulen los ooquistes infectantes. Asimismo, se ha demostrado que el uso de clinoptilolita, un alumino-silicato, afecta la morfología de los ooquistes esporulados y por lo tanto, podría reducir la probabilidad de que se infecten más hospederos (Alcala-Canto et al., 2011).

Alternativas de control basadas en las interacciones huésped-parásito

Considerando el tiempo y la correlación entre la magnitud de la respuesta del huésped y la severidad de la infección, se puede afirmar que los parásitos pueden inducir respuestas de fase aguda, muy probablemente de modo indirecto a través de perturbaciones tisulares mediadas por el parásito o producidas por un estrés oxidativo desproporcionado. Asimismo, el comportamiento mórbido con apetito disminuido o anorexia está mediado por las citocinas proinflamatorias. Con el objeto de disminuir estas respuestas exacerbadas, actualmente se han realizado estudios sobre la eficacia de polifenoles que tienen actividad inmunomoduladora. Se han documentado propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antimicrobianas, antiprotozoarios y anticarcinogénicas para la planta turmérica Curcuma longa y el extracto de naringenina obtenido a partir de cáscaras de toronja (Alam et al., 2014; Ghosh et al., 2015). Recientemente, se demostró la actividad anti-Eimeria en ovinos e inmunomoduladora tanto de la C. longa como de un extracto de cáscaras de toronja (Cervantes-Valencia et al., 2016; Pérez- Fonseca et al., 2016).

Con respecto al estudio en el que se utilizó la C. longa, se llevaron a cabo experimentos en corderos criollos infectados con Eimeria spp., de 28 días de edad, con un peso promedio de 12 kg que fueron divididos en cinco grupos. Tres grupos recibieron 50 mg/kg PV, 100 mg/kg PV ó 200 mg/kg PV de C. longa preparada como una galleta con los curcuminoides previamente cuantificados (Figura 1). La cuantificación total de curcuminoides del polvo de C. longa se determinó cuantitativamente utilizando un método espectrofotométrico UV validado en un estudio previo (Sharma et al., 2012). Se preparó una solución estándar de 1µg/ml (10 mg del estándar de referencia en 10mL de metanol) para los espectros UV. La longitud de onda de absorbancia máxima fue determinada mediante espectrofotometría a 421 nm. Como estándar se utilizó uno que contenía 94% de curcuminoides > 80% curcumina (C7727 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Posteriormente, se prepararon diferentes concentraciones de curcumina para evaluar linealidad, rango y precisión del método. La validación de este método se llevó a cabo de acuerdo con International Conference on Harmonization (2005). El

201 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México coeficiente de variación fue < 2.0% y el coeficiente de correlación linear fue de 0.9982, lo que sugiere un buen ajuste del modelo (Velázquez García, 2016). La estabilidad de la galleta se evaluó mediante el análisis del efecto de la temperatura y el tiempo de almacenaje, para garantizar que en el transcurso del tiempo los curcuminoides se mantienen estables en las condiciones de almacenamiento. El análisis se realizó después de 1, 20, 40 y 90 días de almacenamiento en refrigeración a 2 - 4 ºC y protegidos de la luz. Se analizaron dos repeticiones de cada dosis, los resultados se compararon con la respuesta generada por una solución de curcuminoides preparada el día del análisis (Velázquez García, 2016). Este análisis se realizó mediante Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia (HPLC). Las galletas fueron administradas individualmente por vía oral durante 14 días con. En el estudio se incluyeron un grupo tratado con placebo y un grupo testigo no tratado. Las muestras de heces se obtuvieron cada tercer día para determinar la eficacia anticoccidiana. Además, los animales se pesaron el día cero y 42. Para evaluar la actividad inmunomodulatoria de la curcumina se determinó la inducción de citocinas IL-10 e INF-γ mediante la prueba de ELISA, La peroxidación de lípidos y la generación de nitrito se determinó por medio del ensayo de malondialdehído en suero y la reacción de Griess respectivamente. Los resultados fueron sometidos a un análisis multivariado de varianza para observaciones repetidas. En los casos en los que la interacción tiempo-tratamiento fue significativa (p <0.0001), se condujo un análisis univariado de diseño de un solo factor aleatorizado en bloques completos para cada tiempo utilizando el ajuste de Bonferroni. La actividad anticoccidiana de la C. longa incrementó con el tiempo en los tres grupos tratados y alcanzó una eficacia del 100% en el día 42 (Cuadro 2). Los animales tratados con 200 mg/kg de C. longa incrementaron el doble del peso diario en comparación con los grupos no tratados. Los niveles de IL-10 fueron más altos en los animales tratados, mientras que la peroxidación lipídica y la generación de nitritos fueron significativamente más bajos. Los resultados mostraron que la administración de la curcumina puede reducir la producción de ooquistes, pérdida de peso, inflamación y los efectos relacionados con el estrés oxidativo y nitrosativo causado por infecciones por Eimeria spp. en corderos (Cervantes-Valencia et al., 2016). En el estudio in vitro, se presentó una mortalidad dosis-dependiente de 96.23% en los esporozoitos incubados durante 24 horas con 0.08 g de C. longa, en contraste con los no tratados. Las DL (dosis letal) DL50, DL90 y DL99 fueron de 0.018 g, 0.032 g y 0.051 g respectivamente. (Cervantes, 2016).

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Figura 1. Espectro en el UV del estándar curcumina (200-800 nm).

Cuadro 2. Resultados de la comparación multiple de la eliminación de ooquistes de Eimeria spp. Por gramo de heces (OPG) en 5 grupos de corderos que ingirieron la galleta con polvo de Curcuma longa.

Día Grupos/medias y log del error estándar (x+1) del 100 mg/kg 200 mg/kg Testigo 50 mg/kg estu Placebo (T02) C. longa C. longa (T01) C. longa (T03) dio (T04) (T05) A 7.4392 + 7.2440 + A 6.4566 + AB 6.2660 + B 6.6483 + 7 A B 0.1836 0.1836 B 0.1836 C 0.1836 C 0.1836 C 7.5998 + 7.4263 + A 6.2210 + 5.7644 + 6.3746 + B 10 A C C 0.2442 0.2442 B 0.2442 0.2442 0.2442 C 7.7784 + 7.5988 + 4.1567 + 4.1083 + 5.4463 + 14 A A AB B B 0.6173 0.6173 0.6173 0.6173 0.6173 7.9246 + 7.6883 + 2.8466 + 2.4097 + 3.9354 + A 18 A A B B 0.8880 0.8880 0.8880 0.8880 0.8880 B 8.7217 + 8.3791 + 0.9830 + 0.9830 + 1.9659 + 21 A A B B B 0.6876 0.6876 0.6876 0.6876 0.6876 8.9972 + 8.7903 + 0 + 1.2543 + 1.3323 + 28 A A B B B 0.5291 0.5291 0.5291 0.5291 0.5291 8.8745 + 8.5412 + 0 + 4.4409 + 4.4409 + 35 A A B B B 0.1536 0.1536 0.1536 0.1536 0.1536 8.6015 + 8.1512 + 0 + 0 + 0 + 42 A A B B B 0.1780 0.1780 0.1780 0.1780 0.1780 Letras diferentes indican diferencia significativa (p < 0.05).

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Conclusiones

Los conocimientos sobre coccidiosis en rumiantes han incrementado considerablemente durante las últimas décadas. La investigación que se ha realizado en otras especies animales, particularmente en aves y modelos murinos, ha estimulado el progreso en su estudio; no obstante se sugiere llevara a cabo más investigaciones sobre este parásito en los hospederos naturales; particularmente en lo que se refiere a la interacción que se presenta entre Eimeria bovis con la célula intestinal en los estadios de merontes de segunda generación y gamontes. De este modo se podrá contar con información sobre el mecanismo de supervivencia del protozoario y adicionalmente la evidencia permitirá sustentar el diseño de estrategias farmacéuticas novedosas para el desarrollo de fármacos anticoccidianos y productos inmunoprofilácticos. Actualmente se cuenta con herramientas de investigación en inmunología, biología celular y diagnóstico para abrir perspectivas que permitan resolver los problemas que surgen a causa de esta parasitosis.

Referencias

Alam, M.A., Subhan, N., Rahman, M.M., Uddin, S.J., Reza, H.M., Sarker, S.D., 2014. Effect of citrus flavonoids, naringin and naringenin, on metabolic syndrome and their mechanisms of action. Adv Nutr 5, 404-417. Alcala-Canto, Y., Gutierrez-Olvera, L., Gutierrez-Olvera, C., Sumano-Lopez, H., 2011. Effects of clinoptilolite on Eimeria infection in sheep. Small Rum. Res. 100, 184– 188. Chartier, C., Paraud, C., 2012. Coccidiosis due to Eimeria in sheep and goats, a review. Small Rum. Res. 103, 84-92. Alcala-Canto Y., Ibarra-Velarde, F., 2008. Cytokine gene expression and NF- kappaB activation following infection of intestinal epitelial cells with Eimeria bovis or Eimeria alabamensis in vitro. Parasite Immunol. 30, 177-179. Cervantes-Valencia, M.E., Alcala-Canto, Y., Sumano-Lopez, H., Ducoing-Watty, A.M., Gutierrez-Olvera, L., 2016. Effects of Curcuma longa dietary inclusion against Eimeria spp. in naturally-infected lambs. Small Ruminant Research 136, 27-35. Dougschies, A., Najdrowski, M., 2005. Eimeriosis in cattle: current understanding. J. Vet. Med. 52, 417–427. Faber, J. E., D. Kollmann, A. Heise, C. Bauer, K. Failing, H. J. Burger, and H. Zahner, 2002. Eimeria infections in cows in the periparturient phase and their calves: oocyst excretion and levels of specific serum and colostrum antibodies. Vet. Parasitol. 106, 1–17. Fiege, N., Klatte, D., Kollmann, D., Zahner, H., Burger, H.J., 1992. Eimeria bovis in cattle: colostral transfer of antibodies and immune response to experimental infections. Parasitol. Res. 78, 32–38.

204 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Fitzgerald, P.R., 1980. The economic impact of coccidiosis in domestic animals. Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 24, 121–143. Fuchs, T.A., Abed, U., Goosmann, C., Hurwitz, R., Schulze, I., Wahn, V., Weinrauch, Y., Brinkmann, V., Zychlinsky, A., 2007. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176, 231-241. Ghosh, S., Banerjee, S., Sil, P.C., 2015. The beneficial role of curcumin on inflammation, diabetes and neurodegenerative disease: A recent update. Food Chem Toxicol 83, 111-124. Heise, A., W. Peters, and H. Zahner, 1999. Microneme antigens of Eimeria bovis recognized by two monoclonal antibodies. Parasitol. Res. 85, 457–467. Hermosilla, C., Bürger, H.J., Zahner, H., 1999. T cell responses in calves to a primary Eimeria bovis infection: phenotypical and functional changes. Vet. Parasitol. 84, 49-64. Hermosilla, C., Ruiz, A., Taubert, A., 2012. Eimeria bovis: An update on parasite- host cell interactions. Int. J. Med. Microbiol. En prensa. Ibarra-Velarde, F., Alcala-Canto, Y., 2007. Downregulation of the goat beta- defensin-2 gene by IL-4 in caprine intestinal epithelial cells infected with Eimeria spp. Parasitol. Res. 101, 613-618. Jolley, W.R., Bardsley, K.D., 2006. Ruminant coccidiosis. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 22, 613-621. Koutny, H., Joachim, A., Tichy, A., Baumgartner, W., Bovine Eimeria species in Austria. Parasitol. Res.110, 1893-1901. Long, P.L., 1982. The biology of the coccidia. Baltimore (MD): University Park Press. Lutz, K., Schmidtt, S., Linder, M., Hermosilla, C., Zahner, H., Taubert, A., 2011. Eimeria bovis-induced modulation of the host cell proteome at the meront I stage. Mol. Biochem. Parasitol. 175, 1-9. Marshall, R.N., Catchpole, J., Green, J.A., Webster, K.A., 1998. Bovine coccidiosis in calves following turnout. Vet. Rec. 143, 366–367. Matjila, P.T., Penzhorn, B.L., 2002. Occurrence and diversity of bovine coccidian at three localities in South Africa. Vet. Parasitol. 104, 93–102. Mehlhorn, H., Armstrong, P.M., 2001. Encyclopedic reference of parasitology : diseases, treatment, therapy. Berlin ; New York : Springer. 678 pp. Mundt, H.C., Bangoura, B., Rinke, M., Rosenbruch, M., Daugschies, A., 2005. Pathology and treatment of Eimeria zuernii coccidiosis in calves: investigations in an infection model. Parasitol. Int. 54, 223–230. Mundt, H.C., Bangoura, B., Rinke, M., Rosenbruch, M., Daugschies, A., 2005. Pathology and treatment of Eimeria zuernii coccidiosis in calves: investigations in an infection model. Parasitol. Int.54, 223-230. Pérez-Fonseca, A., Alcala-Canto, Y., Salem, A.Z., Alberti-Navarro, A.B., 2016. Anticoccidial efficacy of naringenin and a grapefruit peel extract in growing lambs naturally-infected with Eimeria spp. Vet Parasitol 232, 58-65. Reeg, K.J., Gauly, M., Bauer, C., et al. 2005. Coccidial infections in housed lambs: oocyst excretion, antibody levels and genetic influences on the infection. Vet. Parasitol. 127, 209–219.

205 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Rehman, T.U., Khan, M.N., Sajid, M.S., Abbas, R.Z., Arshad, M., Iqbal, Z., Iqbal, A., 2011. Epidemiology of Eimeria and associated risk factors in cattle of district Toba Tek Singh, Pakistan. Parasitol. Res. 108, 1171–1177. Stewart, I.D., Smith, R.P., Ellis-Iversen, J. 2008. Eimeria species in cattle on farms in England and Wales. Vet. Rec. 162, 482–483. Taubert, A., Wimmers, K., Ponsuksili, S., Jimenez, C.A., Zahner, H., Hermosilla, C., 2010. Microarray-based transcriptional profiling of Eimeria bovis-infected bovine endothelial host cells. Vet. Res. 41, 70. Urquhart, M., Armour, J., Duncan, J.L., Dunn, A.M., Jennings, F W., 1996. Veterinary Parasitology. Second Edition. Blackwell Publishing. Ames, Iowa. Velázquez García, O., 2016. Cuantificación de curcuminas con actividad antiparasitaria en insumos de uso veterinario. Universidad Nacional Autónoma de México.

206 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

PROTOZOARIOS Y SU IMPACTO EN LA REPRODUCCIÓN EN BOVINOS IMPACT OF PROTOZOA IN BOVINE REPRODUCTION

Campero CM.

Investigador Retirado, Patología Veterinaria, INTA, Balcarce, Argentina [email protected]

Dilucidar el origen de los abortos ha sido desde siempre un desafío, pese a la disponibilidad de técnicas de laboratorio modernas, como el aporte relativamente reciente de la biología molecular, permitiendo mejorar la eficiencia diagnóstica. Los abortos suelen ocurrir ya sea como episodios con pérdidas de hasta 20-30% aunque lo más usual son las formas esporádicas o en “goteo”. Es importante obtener registro de los animales abortados e identificar sus causas para poder implementar adecuadas medidas de manejo en las temporadas futuras. Generalmente las causas de los abortos solo se detectan en un rango variable desde 33%, 35% hasta el 50% de los casos estudiados. Las bacterias, virus protozoo .y hongos han sido los agentes infecciosos más comunes determinados aunque últimamente N. caninum ha causado hasta el 30% de los abortos en Europa y USA. Los protozoos son agentes ubiquitarios en los bovinos y son comunes de encontrar a numerosos vertebrados, entre ellos a mamíferos, pájaros y peces. Los diferentes protozoos involucrados en cuadros de abortos y perdidas reproductivas de rebaños de todo el mundo podrían dividirse per se en dos grandes grupos:

1. Protozoos cuyo blanco es el feto y/o el tracto reproductor bovino (tanto macho como hembra). Aquí se incluyen a Tritrichomonas foetus y Neospora caninum ambos provocan pérdidas embrionarias y fetales tempranas y abortos entre el 4 y 8 mes de gestación y Sarcocystis spp. y Toxoplasma gondii, estos dos últimos con mucho menor prevalencia y efecto deletéreo reproductivo. Besnotia besnoitii es otro protozoo el cual puede afectar la función reproductiva del toro como secuela al provocar orquitis y dermatitis crónica proliferativa en escroto y áreas adyacentes, afectando la termorregulación testicular. 2. El segundo grupo está formado por los llamados hemoprotozoos (Babesia bovis, B. bigemina, Trypanosoma vivax, T. evansi, Theileria parva, T. orientalis y T. buffeli). Dichos agentes provocan aborto en determinadas circunstancias asociado a caquexia, fiebre, lisis eritrocitaria e hipoxia/anoxia fetal. Tricomonosis bovina La tricomonosis es una enfermedad de transmisión sexual del bovino causada por el protozoo extracelular Tritrichomonas foetus, parásito obligado flagelado móvil del tracto reproductor bovino (BonDurant 2005). La enfermedad produce importantes pérdidas económicas especialmente en rebaños para carne en países con ganadería extensiva donde se realiza servicio natural (BonDurant 2005,

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Campero 2005). La misma ha sido erradicada en países que implementaron IA, control sanitario del semen y el descarte de aquellos animales infectados. T. foetus posee 3 flagelos anteriores y uno posterior, una membrana ondulante que forma 5 a 6 ondulaciones y un axostilo terminal. El parásito no posee vida libre ni tiene hospedadores intermediarios, afectando a bovinos (Bos taurus y Bos indicus) y ocasionalmente otras especies como búfalos, equinos y cerdos. En los gatos, T. foetus ha sido ampliamente estudiado como agente causal de diarrea crónica con localización intestinal aunque también se la sugerido como una especie diferente. La tricomonosis se encuentra presente en diferentes países de Latinoamérica y el mundo ocasionando disminuciones en los porcentajes de preñez del 10 al 25%, con la característica de producir un aumento en la cola de parición en la distribución gestacional de los rebaños afectados (Campero 2005). La transmisión de la enfermedad puede ocurrir durante el servicio natural ya sea de un toro infectado (portador asintomático) a la hembra o bien el toro puede contagiarse al servir una vaca infectada (BonDurant 2005, Campero 2005). T. foetus reside en las secreciones de la mucosa del pene y prepucio y uretra distal sin profundizar el epitelio. No se observan cambios inflamatorios en el prepucio cursando la enfermedad en forma asintomática y crónica, sin afectar la libido ni la calidad seminal. T. foetus desarrolla un estado de portador crónico de por vida en el toro (BonDurant 2005). Los toros de mayor edad son más susceptibles debido al incremento en el número y profundidad de las criptas prepuciales lo cual favorecería las condiciones de vida del flagelado (BonDurant h2005, Campero 2005). La enfermedad también puede transmitirse mediante IA con semen contaminado dado que T. foetus puede permanecer viable en semen congelado. Por ello, los toros utilizados para extraer semen deben ser muy bien controlados para asegurarse que sean libres de infección. La infección en la hembra ocurre naturalmente después del servicio con un toro infectado. T. foetus prolifera en la vagina induciendo una respuesta inflamatoria leve persistiendo en las secreciones genitales por un período de 13 a 28 semanas. T. foetus ocasiona endometritis, cervicitis, salpingitis y placentitis. Entre las semanas 7 a 10 de gestación los daños inflamatorios del endometrio, trofoblasto y el embrión/feto provocan la muerte embrionaria tardía o fetal temprana (BonDurant 2005). El parásito ingresa al útero post servicio en faz estrogénica junto con los espermatozoides (BonDurant 2005) y ejerce su efecto patogénico en un ambiente bajo influencia progesterónica. Por lo general la pérdida de la preñez se extiende desde la muerte embrionaria tardía alrededor del día 42 de gestación hasta la muerte fetal temprana en el día 120 de la gestación (BonDurant 2005). Los abortos entre los 6 y 8 meses con detección del protozoo en pulmones y líquido abomasal son menos frecuentes. Aproximadamente el 5% de las hembras infectadas desarrollan piómetra postcoital lo cual hace presumir la presencia de la enfermedad (BonDurant 2005). La infección suele ser autolimitante y la eliminación total de T. foetus del tracto genital es variable. Distintas infecciones experimentales en vaquillonas reportaron una duración de la infección de 58 días, 13 a 28 semanas o hasta 22 meses (Campero et al., 1993). Las hembras que mantienen la infección entre una temporada de servicio y la siguiente, se constituyen como fuente de infección para el rodeo

208 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México pudiendo persistir por más de 20 semanas y en raras ocasiones durante la gestación y el posparto (BonDurant 2005) siendo denominadas hembras portadoras crónicas, que no superan más del 1% al 7% de las vacas infectadas. El diagnóstico etiológico en un rebaño problema puede confirmarse por cultivo evidenciando la presencia de T. foetus en los exudados genitales del toro, del mucus cérvico vaginal (MCV) de la vaca, de la placenta o en el contenido de abomaso de los fetos abortados (BonDurant 2005, Campero 2005). Dado el carácter de portador crónico asintomático de la enfermedad en el toro, lo más práctico para el diagnóstico es realizar los muestreos en los toros (Campero 2005). La prueba diagnóstica más utilizada en Argentina es el cultivo en estufa a 37ºC con observaciones microscópicas diarias durante una semana (Campero 2005). La identificación de T. foetus se basa en las características morfológicas (movimiento de rolido, membrana ondulante y presencia de tres flagelos anteriores y un flagelo posterior) (BonDurant 2005, Campero 2005). También se puede observar la morfología de estos flagelados mediante coloraciones (Giemsa) y tinciones especiales (Dif Quick). Dada la baja sensibilidad del diagnóstico sobre muestras de esmegma prepucial (Sensibilidad 72%, Especificidad 95%) (Perez et al., 2006), los muestreos deberían realizarse repetidamente a intervalos no menores a 12 días, hasta obtener al menos 2 o 3 muestreos completos negativos, en rebaños libres o infectados, respectivamente, para confirmar la negatividad del toro (Campero 2005). La actividad sexual reduce la carga parasitaria de T. foetus en el prepucio y por ende disminuye la sensibilidad diagnóstica, por lo que el descanso sexual de un mes sería lo ideal para iniciar los muestreos de los toros pos servicio. La contaminación fecal durante el muestreo de los toros y la similitud morfológica con otros protozoos pueden inducir a falsos diagnósticos positivos siendo un problema para los laboratorios de diagnóstico. Se deben realizar la diferenciación microscópica de otras especies de Trichomonads (Pentatrichomonas spp. o Tetratrichomonas spp.) de origen intestinal las cuales pueden parasitar en forma transitoria la cavidad prepucial y estar presentes en las muestras. La actividad homosexual entre toros jóvenes facilita esta transmisión. Para confirmar los aislamientos de T. foetus luego de su cultivo o bien como técnica de diagnóstico, se utiliza la PCR. Esta técnica ha permitido detectar resultados falsos positivos obtenidos mediante el cultivo (BonDurant et al., 2003, Campero et al., 2003) de casos provenientes del esmegma prepucial de toros vírgenes contaminados con otros protozoos. Sin embargo, el uso combinado de los cultivos y la técnica de PCR permiten mejores resultados y una certeza diagnóstica, incrementado la sensibilidad del diagnóstico (Campero et al., 2003). No existe un tratamiento efectivo disponible (BonDurant 2005) y por ende, los toros positivos deben ir a faena. Las principales medidas de control de la enfermedad y factores de riesgo fueron oportunamente enunciadas siendo muy importante la identificación y eliminación de los toros infectados (BonDurant 2005, Campero 2005). Para ello se realiza la detección microscópica de T. foetus mediante el examen y cultivo de las secreciones prepuciales (Campero 2005). La vacunación de hembras y toros surge como una alternativa de interés para el control. La vacunación en los toros se ha realizado en forma experimental con

209 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México resultados aceptables en toros jóvenes pero se necesitan nuevos estudios para establecer su uso. Existen vacunas comerciales que disminuyen la severidad de los signos clínicos pero no previenen la infección, tanto en EE.UU (Trichguard, Boehringer Ing. Vetmedica, Mo, USA) como en Argentina (Tricovac, Lab. Tandil).

Referencias

BonDurant RH. Venereal diseases of cattle: natural history, diagnosis, and the role of vaccines in their control. Vet Clin North Am Food Anim Prac 21: 383-408. 2005. BonDurant RH, Campero CM, Anderson ML, Van Hoosear KA. Detection of Tritrichomonas foetus by polymerase chain reaction in cultured isolates, cervicovaginal mucus, and formalin-fixed tissues from infected heifers and fetuses. J Vet Diagn Invest 15: 579-584. 2003. Campero CM. Consideraciones sobre la Tricomoniasis y Campylobacteriosis bovina. Rev Col Vet Prov Bs As 32: 47-51. 2005. Campero CM, Rodriguez Dubra C, Bolondi A, Cacciato C, Cobo E, Perez S, Odeón A, Cipolla A, Bondurant RH. Two-step (culture and PCR) diagnostic approach for differentiation of non-T. foetus trichomonads from genitalia of virgin beef bulls in Argentina. Vet Parasitol 112: 167-175. 2003. Ondrak JD, Keen JE, Rupp GP, Kennedy JA, McVey DS, Baker WD. Repeated testing by use of culture and PCR assay to detect Tritrichomonas foetus carrier bulls in an infected Nebraska herd. J Am Vet Med Assoc 237: 1068- 1073. 2010. Perez A, Cobo E, Martínez A, Campero CM, Spath E. Bayesian estimation of Tritrichomonas foetus diagnostic test sensitivity and specificity in range beef bulls. Vet Parasitol 142: 159-162. 2006.

Neosporosis

Es una enfermedad parasitaria provocada por el protozoo parásito Neospora caninum (Phylum Apicomplexa) siendo una importante causas mundial de abortos y pérdidas reproductivas en bovinos. N. caninum provoca abortos, nacimiento de terneros con sintomatología neuromuscular o clínicamente sanos, pero crónicamente infectados (Dubey et al., 2007). N. caninum es un parásito intracelular obligado con dos formas de reproducción: uno sexual que ocurre en los huéspedes definitivos, los cánidos y el otro asexual que se observa en los huéspedes intermediarios. Los huéspedes definitivos comprobados son: el perro, el coyote, el dingo y el lobo gris. N. caninum se aisló de bovinos, ovinos, búfalos de agua, equinos, venado de cola blanca, bisonte europeo y perro. Se han identificado tres estadios infecciosos en el ciclo de vida de N. caninum: taquizoítos, bradizoítos y esporozoítos, los tres estadios están involucrados en la transmisión del parásito (Dubey et al., 2007). El hospedador intermediario se infecta por dos vías, al ingerir alimentos o agua contaminados con oquistes esporulados (Dubey et al., 2007) o bien por vía transplacentaria. En el caso de

210 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México ingerir alimentos o agua contaminados con oquistes, estos al llegar al intestino liberan los esporozoitos invadiendo la pared intestinal y se transforman en taquizoitos los cuales rápidamente replican por división asexual. Posteriormente pueden invadir e infectar otros tipos celulares como sistema nervioso, macrófagos, fibroblastos, endotelio vascular, músculo estriado o hígado. El ciclo se completa cuando el futuro huésped definitivo se infecta al ingerir tejidos que contienen bradizoitos (Dubey et al., 2007). El quiste resiste el paso a través del estómago y libera los bradizoitos en el intestino delgado donde infectan las células epiteliales. N. caninum es uno de los microorganismos más eficientes para transmitirse por vía transplacentaria en el ganado bovino (Dubey et al., 2007). La probabilidad de transmisión vertical es muy alta, nacidos de vacas infectadas tienen entre un 80% a 90% de probabilidad de ser portadores de N. caninum (Wouda et al., 1998). La transmisión entre un huésped definitivo a uno intermediario y nuevamente a uno definitivo se conoce como postnatal u horizontal (Goodswen et al., 2013). La vía de transmisión transplacentaria o vertical (Goodswen et al., 2013) es la otra forma de transmisión de N. caninum. En vacas o vaquillonas primoinfectadas por ingestión de oquistes estando preñadas, la infección pasaría por la placenta transmitiéndose al feto en desarrollo sugiriendo así el empleo del término transmisión transplacentaria exógena (Trees y Williams 2005). Esta transmisión sería una variante de la transmisión horizontal, en la cual el feto en desarrollo y su madre se infectan en un mismo evento (McAllister, 2016). La transmisión transplacentaria endógena (Trees y Williams 2005, McAllister, 2016) ocurre en hembras con infecciones latentes que, al preñarse, experimentan una reactivación del parásito infectando al feto en gestación generalmente en el último trimestre de la misma. Este tipo de transmisión podría darse a través de múltiples gestaciones de una misma hembra y es la responsable del mantenimiento de N. caninum en los rebaños. En los rodeos infectados por N. caninum, los abortos pueden presentarse en forma esporádica, endémica o epidémica. Los casos esporádicos ocurren ocasionalmente en los rodeos con tasas bajas y a intervalos irregulares. El patrón endémico se caracteriza por una tasa anual de abortos elevada y que se mantiene en el tiempo. Es la forma más frecuente de presentación y se da en aquellos rodeos donde la transmisión transplacentaria es la forma más frecuente (Trees y Williams 2005, McAllister 2016). En rebaños lecheros, la probabilidad de que una hembra seropositiva aborte es 3,5 veces más probable que ocurra que en una hembra seronegativa. A su vez, en hembras congénitamente infectadas el riesgo relativo de sufrir un aborto es más probable que ocurra durante la primera preñez. Si la primera preñez resulta en un parto normal, el riesgo relativo de aborto disminuye en las preñeces subsiguientes pero si la vaquillona aborta el riesgo de aborto sigue siendo alto a futuro (McAllister 2016). El patrón epidémico se caracteriza por una alta proporción de vacas preñadas que abortan en un período corto de tiempo (McAllister 2016). Ello puede relacionarse con una infección primaria donde los animales se infectan de una fuente de alimentos o agua contaminadas con oquistes de N. caninum (Goodswen et al., 2013) definido como transmisión transplacentaria exógena (Trees y Williams, 2005). Mediante técnicas serológicas de Elisa de avidez se puede determinar si la infección es

211 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México reciente y de esta manera poder relacionar la misma con el aborto. La enfermedad se manifiesta durante la preñez donde el desarrollo del feto lo hace particularmente vulnerable. El control del parásito y su inhibición esta dado por la inmunidad mediada por células mediante linfocitos T citotóxicos. Al principio y al final de la gestación hay un aumento de la respuesta inmune celular y una disminución hacia la mitad de la gestación lo que favorecería la reactivación y multiplicación del parásito en este período. Esta inmunodepresión fisiológica durante la gestación se produce para evitar el rechazo del feto y es eficazmente utilizada por N. caninum. La inmunocompetencia fetal empieza a desarrollarse hacia el día 110 de la gestación aunque el feto recién es capaz de responder con eficacia después del día 150. Por ende, el feto está más capacitado para sobrevivir si la infección ocurre al final de la gestación ya que al inicio el feto es inmunológicamente inmaduro e incapaz de evitar la multiplicación parasitaria. Si la infección ocurre en el segundo tercio de la gestación el resultado es la muerte del mismo o bien el nacimiento de terneros congénitamente infectados. A medida que avanza la gestación, la probabilidad de transmisión aumenta y por ende el nacimiento de terneros congénitamente infectados. El desencadenamiento del aborto se debe a las lesiones placentarias y fetales. La multiplicación del parásito provoca daños de la placenta tanto materna como fetal con respuesta inflamatoria de la madre para evitar la replicación del parásito, lo cual puede es perjudicial para el feto. El aborto es la principal manifestación clínica de la neosporosis bovina. Las hembras de cualquier edad pueden abortar desde los 3 meses de edad hasta gestaciones a término, aunque la mayoría ocurren entre el quinto y sexto mes de gestación. Los fetos abortados entre el tercer y octavo mes de gestación generalmente son expulsados muy autolíticos (Dubey et al., 2007). Eventualmente pueden ser retenidos en el útero por varios meses y momificarse. Moore et al., (2002) observaron que hasta un 3,3% de los abortos correspondían a fetos momificados con un rango gestacional entre 1,5 y 7 meses. Aquellos fetos muertos en etapas tempranas de la gestación pueden ser reabsorbidos y eventualmente la hembra retornar al celo. Sin embargo, en la mayoría de los casos se produce el nacimiento de un ternero clínicamente sano pero persistentemente infectado. Estos terneros infectados congénitamente al momento de nacer o bien en su etapa neonatal pueden presentar evidentes signos neurológicos como incoordinación y parálisis de miembros con encefalomielitis multifocal no supurativa, necrosis de miocardio y lesiones hepáticas (Micheloud et al., 2015). La forma más frecuente de detectar la infección por N. caninum se basa en la detección de anticuerpos específicos mediante técnicas. Los niveles de anticuerpos específicos pueden persistir de por vida con fluctuaciones que en algunos casos pueden ser indetectables. Mediante la prueba de Elisa de avidez se puede diferenciar la IgG de infecciones agudas o crónicas y de esta manera saber si existe relación con el evento del aborto. A su vez, la transmisión congénita también se evalúa a través de anticuerpos en suero precalostral debido a que por la disposición de la placenta bovina no existe transferencia de anticuerpos de la madre al feto durante la gestación. Existe pruebas para detectar anticuerpos para N. caninum en leche de manera tal de poder hacer evaluaciones rápidas a nivel de

212 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México rebaños. Las técnicas serológicas se usan ampliamente en estudios epidemiológicos y para controlar la infección a nivel de poblaciones mediante segregación de positivos. Diversas pruebas serológicas se han desarrollado para la detección de anticuerpos a N. caninum y todas se basan en antígenos de taquizoitos. Las más utilizadas son la Inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ELISA (Dubey et al., 2007). Otras pruebas diagnósticas como la inoculación de material infecciosos en ratones inmunosuprimidos para intentar el aislamiento, asi como la serología mediante la prueba de Immunoblot, la histopatología, la inmunohistoquímica y PCR son utilizadas, entre otras, ya sea solas o combinadas por diferentes laboratorios de diagnóstico veterinario. La implementación de medidas de control varía en función de la situación seroepidemiológica de cada rodeo, del tipo de producción que tiene y de las características medio ambientales que lo rodean. La premisa principal para controlar la neosporosis es reducir las pérdidas reproductivas con un enfoque multifactorial (Campero 2014). Mediante estudios seroepidemiológicos se debería caracterizar que tipo de transmisión es la más relevante en el rodeo en cuestión teniendo en cuenta que en algunos casos, ambos tipos pueden estar presentes. Una opción económicamente viable para reducir la tasa de abortos en rebaños infectados consiste en excluir las hijas de vacas seropositivas. También la IA con semen de ganado para carne en vacas lecheras puede ser de utilidad para evitar usar la reposición de dichas vacas y por otro lado se comprobó una menor tasa de abortos en las hembras positivas. La transferencia de embriones de vientres positivos a receptoras negativas, en animales de valor genético, es un procedimiento de valor pues la cría obtenida será negativa. Debe utilizarse un planteo estratégico destinado a reducir la transmisión endógena y prevenir la transmisión exógena (Campero 2014). No existe tratamiento para los animales afectados. El uso de vacunas es otra de las herramientas promisorias a futuro con las cuales se podría controlar a la neosporosis bovina (Campero 2014). Los resultados con vacunas inactivadas han sido pobres por lo que no se comercializan. Sin duda que el desarrollo de vacunas eficientes, tanto para uso en bovinos como para controlar la infección en perros, es el camino para el control de esta enfermedad.

Referencias

Campero CM. Opciones para el control de la neosporosis bovina. Rev Taurus 16: 4-15. 2014. Dubey J, Schares G, Ortega Mora L. Epidemiology and control of Neosporosis and Neospora caninum. Clin Microbiol Rev 20: 232-367. 2007. Goodswen S, Kennedy P, Ellis J. A review of the infection, genetics, and evolution of Neospora caninum: from the past to the present. Infection, genetics and evolution. 13:133-150. 2013. McAllister M. Diagnosis and control of bovine neosporosis. Vet Clin Food Anim 32: 443-463. 2016. Micheloud J, Moore D, Canal A, Lischinsky L, Hecker Y, Canton G, Odriozola E, Odeón A, Campero CM. First report of congenital Neospora caninum

213 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

encephalomyelitis in two newborn calves in the Argentinean Pampas. J Vet Sc Tech 6 (5). 2015 Moore D, Campero CM, Odeon A, Posso M, Cano D, Leunda M, Basso W, Venturini M, Späth E. Seroepidemiology of beef and dairy herds and fetal study of Neospora caninum in Argentina. Vet Parasitol 1007: 303-316. 2002. Trees A, Williams D. Endogenous and exogenous transplacental infection in Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Trends Parasitol 21: 558-561. 2005. Wouda W, Moen A, Schukken Y. Abortion risk in progeny of cows after a Neospora caninum epidemic. Theriogenology 49: 1311-1316. 1998.

Sarcocystosis

Existen diferentes especies de éste protozoo que pueden parasitar al bovino: Sarcocystis cruzi, S. buffalonis, S. hirsuta, S. hominis, S. fusiformis (Heckeroth y Tenter 2007). Los hospedadores intermediarios suelen ser herbívoros u omnívoros que se infectan al consumir los esporoquistes en el alimento o agua contaminada los cuales al ser ingeridos por el hospedador, liberan en el intestino delgado esporozoitos infectantes. El huésped definitivo para S. cruzy son los miembros de la familia Canidae (perros, coyotes, lobo, chacal, mapache y zorro colorado) mientras que el bovino y bisonte son huéspedes intermediarios (Dubey y Lindsay 2006). Los cánidos se infectan por ingerir carne de bovino, búfalos o algunas especies de ciervos infectados. La especie de Sarcocystis spp. más comúnmente identificada en el ganado bovino ha sido S. cruzi. Sin embargo, S. hominis (también llamado S. fusiformis), puede infectar tanto a bovinos como al hombre y tiene como hospedadores definitivos al gato y félidos salvajes (Heckeroth y Tenter 2007). Los ooquistes son eliminados por heces de los hospedadores definitivos y son ingeridos por vía oral con los alimentos y el agua contaminada por las heces de perros y cánidos salvajes infectados. Los ooquistes sobreviven en el medio ambiente por periodos prolongados. No existen referencias publicadas sobre abortos en bovinos provocados por estos protozoos en Argentina. Los cánidos eliminan en la materia fecal formas quísticas resistentes que persisten en el medio y son ingeridos por el bovino con el forraje o agua contaminada. La mayoría de las especies virulentas de Sarcocystis pueden causar enfermedad solamente en los hospedadores intermediarios pero no en los definitivos. Las especies transmitidas por cánidos son más virulentas que aquellas transmitidas por félidos (Heckeroth y Tenter 2007). La enfermedad se transmite especialmente por vía horizontal. Una vez ingeridas las formas quísticas, se liberan en el intestino del hospedador y luego de un periodo de diseminación intravascular y proliferación endotelial, los Sarcocystis se enquistan en el músculo estriado, usualmente los animales mayores de 7 meses de vida resultan seropositivos, enfatizando la importancia de la transmisión horizontal. En animales preñados, los casos agudos de sarcocystosis suelen producir abortos o nacimientos prematuros (Dubey y Lindsay 2006). Las vacas preñadas pueden abortar aunque es raro dado que la mayoría del ganado es expuesto luego de los 6 meses de vida y desarrollan inmunidad

214 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México protectora. En el feto pueden observarse o no organismos viables en endotelio del SNC y de otros órganos (Lopes et al., 2005). Jolley et al., (1983), reportan un caso natural con el hallazgo de un neonato que nació vivo pero murió a los pocas horas, detectándose esquizontes en las células endoteliales de los capilares de la sustancia blanca y gris del SNC. Experimentalmente, Lopes et al., (2005) en Brasil, infectaron vacas en el último tercio de gestación con S. cruzi administrando quistes obtenidos de heces de perros infectados y registraron un aborto con lesiones macroscópicas inespecíficas sin encontrar formas parasitarias en el feto, placenta o útero. Savini et al., (1966) realizaron un ensayo sobre vacas naturalmente infectadas con Sarcocystis las cuales fueron desafiadas S. cruzi y observaron nacimientos de terneros prematuros y natimortos. La prueba de IFI es un método rápido y práctico para realizar diagnóstico y relevamiento serológico detectando IgG específica utilizan la prueba de IFI a la dilución de 1:25 para caracterizar la enfermedad en bovinos. A los fines diagnósticos, el placentoma o fluido fetal son materiales diagnósticos de valor, al igual que tejidos fetales en formol para detectar lesiones compatibles con las producidas por este agente o estructuras parasitarias. Existe a su vez, anticuerpos generados contra Sarcocystis que pueden ser utilizados en pruebas de inmunohistoquímica para su identificación. También se han utilizado otras pruebas como el examen microscópico, análisis histopatológico, microscopía electrónica de transmisión, IFI y PCR para identificar a Sarcocystis spp. Dentro de las medidas de control se mencionan: evitar el acceso de los perros a pasturas, aguadas y galpones, no alimentar a los perros con carne fresco sino que debería ser cocinada previamente. Se sabe que la cocción de la carne a 55ºC durante 20 minutos elimina a los sarcocystis. También se sugiere incinerar los animales muertos para evitar su consumo por parte de los roedores o aves carroñeras. No existen vacunas para prevenir o controlar la enfermedad.

Referencias

Dubey JP, Lindsay DS. Neosporosis, Toxoplasmosis, and Sarcocystosis in Ruminants. Vet Clin Food Anim 22: 645-671. 2006. Heckeroth AR, Tenter AM. Sarcocystiosis In: Protozoal Abortion in Farm Ruminants: Guidelines for Diagnosis and Control. Ed Ortega-Mora L, Gottstein B, Conraths FJ, Buxton D. CABI Publishing, CAB International, Nosworthy Way, Wallingford, Oxon OX10 8DE, UK. pp. 172-232. 2007. Jolley WR, Jensen R, Hancock HA, Swift BL. Encephalitic sarcocystosis in a newborn calf. Am J Vet Res 44: 1908-1911. 1983. Lopes CW, de Sa WF, Bothelo GG. Lesions in cross breed cows experimentally infected with Sarcocystis cruzy. Rev Bras Parasitol Vet 14: 79-83. 2005. Savini G, Dunsmore JD, Robertson ID. Studies on pathogenesis, tissue infection and congenital transmission in cows experimentally infected with Sarcocystis cruzi by various routes. Vet Parasitol 64: 319-327. 1966.

215 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Toxoplasmosis

Toxoplasma gondii es un protozoo Apicomplexa que infecta al hombre y animales de sangre caliente y mamíferos marinos, encontrándose difundido en todo el mundo. T. gondii es un parásito intracelular obligado con ciclo asexual de dos fases en los animales de sangre caliente (hospedadores intermediarios) y un ciclo sexual en los félidos domésticos y salvajes (hospedadores definitivos) (OIE 2008). Tanto el bovino como el búfalo de agua se consideran más resistentes a la infección con T. gondii que en otras especies como los pequeños rumiantes donde causa severas pérdidas económicas (Dubey 2010). El bovino usualmente no produce enfermedad clínica y raramente puede infectarse y producir abortos (OIE 2008). Se considera que T. gondii es de baja importancia como causal de aborto en esta especie pues la infección es controlada rápidamente en los tejidos bovinos (Dubey 2010). La casuística de casos de abortos naturales en el bovino es muy baja existiendo dudas sobre casos antiguos reportados como producidos por T. gondii cuando aún no se sabía de la existencia de N. caninum. Kirkbride (1992), en uno de los mayores relevamientos realizados a nivel mundial, analizó 8.962 fetos y establece como causa agentes infecciosos en 2.723 (30,4%) fetos. Llamativamente menciona a T. gondii como responsable en un solo caso. Canada et al., (2002) y Dubey (2010) mencionan el aislamiento T. gondii de dos casos espontáneos de aborto bovino (feto de 5 meses y un natimorto), ambos en ganado lechero, realizados en Portugal y USA, respectivamente. Tampoco en Argentina se han registrados casos de abortos por T. gondii en bovinos (Campero et al., 2003, Moore et al., 2008). Las pruebas serológicas diagnósticas más frecuentemente usadas son la prueba del colorante de Sabin-Feldman (azul de metileno), la prueba de IHA, IFI, MAT, la aglutinación del látex, el ELISA y la FC. Las pruebas serológicas empleadas en el pasado son de sub-óptima sensibilidad para el diagnóstico de las infecciones por T. gondii en el bovino, por lo cual deberán ser interpretados con cautela (Dubey 2010). Para el bovino se considera que entre todas las pruebas evaluadas, los títulos de MAT ≥1:100 son indicativos de infección (Dubey y Thulliez 1993). Para confirmar un aborto producto de T. gondii en bovinos se recomienda la visualización de antígenos mediante IHQ en tejidos fijados con lesiones compatibles con las producidas por éste protozoo, o la utilización de la técnica de PCR para detectar ADN parasitario. El aislamiento inoculando ratones con homogeneizado derivado de dichos tejidos es otra alternativa de diagnóstico (OIE 2008). Se concluye que los trabajos experimentales efectuados en bovinos preñados, sugieren la potencialidad de infección transplacentaria de T. gondii y causal de abortos cuando están involucradas cepas virulentas.

Referencias Campero CM, Moore DP, Odeón AC, Cipolla AL, Odriozola E. Aetiology of bovine abortion in Argentina. Vet Res Comm 27: 359-369. 2003.

216 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Canada N, Meireles CS, Rocha A, da Costa JM, Erickson MW, Dubey JP. Isolation of viable Toxoplasma gondii from naturally infected aborted bovine fetuses. J Parasitol 88: 1247-1248. 2002. Dubey JP. Chapter 8. Toxoplasmosis in Cattle (Bos taurus). In: Toxoplasmosis of animals and humans. 2nd ed. CRC Press, Taylor and Francis Group, Boca Raton, FL, USA. pp. 169-174. 2010. Dubey JP, Thulliez P. Persistence of tissue cysts in edible tissues of cattle fed Toxoplasma gondii oocysts. Am J Vet Res 54: 270-273. 1993. Kirkbride CA. Etiologic agents detected in a 10-year study of bovine abortions and stillbirths. J Vet Diagn Invest 4: 175-180. 1992. Moore DP, Regidor-Cerrillo J, Morrell E, Poso MA, Cano DB, Leunda MR, Linschinky L, Odeón AC, Odriozola E, Ortega-Mora LM, Campero CM. The role of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in spontaneous bovine abortion in Argentina. Vet Parasitol 156: 163-167. 2008. OIE. Capítulo 2.9.10. Manual de la OIE sobre animales terrestres. 2008. Toxoplasmosis http://web.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es_2008/2.09.10.Toxoplasmosis .pdf

Besnoitiosis

Besnoitia besnoiti es un endoparásito protozoo Apicomplexa, agente causal de la besnoitiosis bovina (Cortes et al., 2006). Esta enfermedad es emergente en Europa aunque no tenemos evidencias de la misma en Argentina. El ciclo de vida es heteroxeno con una etapa intestinal (esquizogonias y esporogonia) en un hospedador definitivo (HD) y otra extraintestinal (tisular) con reproducción asexual en el hospedador intermediario (HI; bovinos y otros rumiantes). Aún no se ha logrado identificar al hospedador definitivo sin embargo se sugiere que pueda ser un carnívoro (Jacquiet et al., 2010). Se han propuesto como varios mecanismos de transmisión de la enfermedad, la inoculación de bradizoítos mediante vectores mecánicos (tabánidos, mosca de los establos y mosca tse-tse) (Jacquiet et al., 2010). Se ha observado que los fenómenos epidémicos de la enfermedad son estacionales, predominando en el verano, período donde los insectos hematófagos demuestran una mayor actividad. También se transmite por contacto directo entre animales con enfermedad crónica, con la monta natural como uno de los mecanismos más importantes y por contacto a través de laceraciones de la piel y mucosas del bovino que actúa como hospedador intermediario. La besnoitiosis bovina se caracteriza por presentar una fase febril inicial seguida de lesiones en la piel y mucosas, con engrosamiento, dermatosis y edemas y un estado de emaciación marcado. Los machos pueden desarrollar infertilidad permanente si el área genital es la afectada. No obstante, sólo algunos bovinos de un rodeo infectado desarrollan signología típica, mientras que la mayoría de los animales permanecen infectados subclínicamente (Jacquiet et al., 2010). En ésta enfermedad, se puede detectar tres formas diferentes de presentación, a saber: una proporción muy baja de animales presentan signos

217 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México clínicos típicos, como los descriptos previamente, la segunda corresponde a aquellos bovinos seropositivos con quistes esclero-conjuntivales, y la tercer forma está constituida por la mayoría que son animales seropositivos y asintomáticos (Jacquiet et al., 2010). En Argentina aún no ha sido descripta y no existe información serológica respecto a su presencia. La introducción de bovinos infectados en rodeos vírgenes parece tener un rol esencial en la transmisión de la infección entre rodeos, pero también entre países. Se realizan pruebas serológicas para detectar animales infectados y evitar así su introducción en rodeos no infectados (Cortes et al., 2006, Schares et al., 2010). El diagnóstico serológico de elección es la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) siendo el punto de corte la dilución ≥1/100 para los animales seropositivos. La correlación entre eest título y la presentación de signos clínicos o mediante biopsia tisular es elevada (Castillo et al., 2010). No existen vacunas ni tratamiento para los animales afectados.

Referencias

Castillo, J.A., Marcén J.M, Ortega Mora L.M, Alvarez García G. 2010.La besnoitiosis bovina como una enfermedad emergente en Europa. PV Albeitar 10/2011. Pág. 176. Cortes, H.C.E., Nunes, S., Reis, Y., Staubli, D., Vidal, R., Sager, H., Leitao, A., Gottstein, B. 2006. Immunodiagnosis of Besnoitia besnoiti infection by ELISA and Western blot. Vet. Parasitol. 141: 216–225. Diesing, L., Heydorn, A.O., Matuschka, F.R., Bauer, C., Pipano, E., Dewaal, D.T., Potgieter, F.T. 1988. Besnoitia besnoiti—studies on the definitve host and experimental infections in cattle. Parasitol. Res. 75: 114–117. Jacquiet, P., Boucher, C., Liénard, E., Grisez, C., Prévot, F., Salem, A., Beuscart, T., Bergeaud, J.P., Alzieu, J.-P. 2009. Besnoitiose bovine : nquêtes épidémiologiques dans le sud de la France. Journées Nationales G.T.V., Nantes, 1213–1217. Schares, G., Basso W., Majzoub M., Rostaher A., Scharr J.C., Langenmayerr M.C., Selmair J., Dubey J.P., Cortes H.C., Conraths J.C., Gollnick N.S. 2010. Comparative evaluation of immunofluorescent antibody and new immunoblot tests for the specific detection of antibodies against Besnoitia besnoiti tachyzoites and bradyzoites in bovine sera. Veterinary Parasitology 171: 32–40.

Hemoparásitosis

Las enfermedades producidas por hemoparásitos de los bovinos ocurren en regiones tropicales y subtropicales favorecidas por la presencia de vectores biológicos cuyo hábitat de dispersión puede aumentar y difundirse hacia áreas templadas por los cambios climáticos registrados en las últimas décadas. La babesiosis del bovino provocadas por organismos que parasitan los eritrocitos e incluso otros hemoparásitos pueden encontrase libres en la circulación. Estas

218 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México enfermedades son enzoóticas en extensas áreas causando severas pérdidas económicas en bovinos. La principal manifestación clínica en bovinos es la anemia por la eritrocitaria provocada por la multiplicación intraeritrocítica de estos hemoparásitos asociado a fiebre e incremento de la parasitemia. La babesiosis suele ser subclínica en terneros y se manifiesta en forma severa en ganado adulto. Los organismos patógenos intraeritrocitarios Babesia bovis y B. bigemina son protozoos apicomplexa. Estos agentes provocan cuadros sistémicos con pérdida de estado, anemia, ictericia, menor producción láctea y abortos. La presencia de vectores biológicos (insectos hematófagos, garrapatas) para el caso de la babesiosis, facilitan su transmisión. La babesiosis bovina es una enfermedad asociada al área de dispersión de la garrapata común del bovino (Rhipicephalus microplus). Se ha mencionado la transmisión transplacentaria de dicho protozoo asociado a abortos en el octavo mes de gestación en Australia, Brasil y Argentina. Se ha especulado con la posibilidad de daño placentario como explicación de los abortos y pérdidas perinatales (Campero et al., 2017). Sin embargo, la hipótesis más certera sobre la patogenésis del aborto debería buscarse en la severa hipoxia fetal que el estado agudo de la enfermedad durante parasitemia y la fiebre producen afectando la viabilidad del feto. Actualmente el control de la enfermedad se basa en controlar la garrapata y la protección del ganado mediante el empleo de vacunas con organismos vivos de escasa patogenicidad que generan inmunidad protectora persistente después de una única inoculación. Trypanosoma vivax y T. evansi infectan a bovinos, caprinos, ovinos, búfalos, equinos y ungulados silvestres de áreas tropicales en diferentes países de América. La enfermedad produce en el ganado naturalmente infectado fiebre, anemia, apatía, abortos, menor producción láctea, pérdida progresiva de peso y muertes ocasionales. T. vivax puede transmitirse mecánicamente mediante insectos hematófagos como tábanos, mosca brava, etc., habiéndose mencionado el riesgo de dispersión del protozoo al utilizar una misma aguja para vacunar varios animales contra la fiebre aftosa. Oliveira et al., (2009) mencionaron en Costa Rica un brote en ganado Pardo Suizo donde se produjeron cuadros de ictericia, anemia, abortos y nacimientos prematuros asociados a menor producción de leche y pérdida abrupta del estado corporal debido a una infección mixta causada por Anaplasma marginale, T. vivax y B. bovis. Trypanosoma evansi se lo encuentra en numerosas especies hospedadoras como caballos, búfalos, bovinos, ovinos, cabras y en especies no domésticas como vampiros, capibaras, ciervos y camélidos americanos, entre otros. Se han detectado brotes en Brasil y Guyana (Desquesnes et al., 2013). La enfermedad produce fiebre, anemia, caquexia, signos nerviosos, abortos y muertes. En búfalos en Filipinas se han registrado casos de aborto de hasta el 47% (Desquesnes et al., 2013). También se han mencionado abortos en bovinos lecheros (Kashiwazak et al., 1998, Pholpark et al., 1999). Theileria parva, T. orientalis y T. buffeli son hemoprotozoos mencionados de producir abortos y muertes en bovinos de Africa, Australia y Asia. Dichos protozoos apicomplexas, están relacionados con Babesias y Plasmodium y son transmitidos por garrapatas. Swilks et al., (2017) mencionan a T. buffeli como un subtipo

219 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México benigno de T. orientalis, sin embargo, Izzo et al., (2010) referencian casos de icteria, anemia, abortos y muertes en bovinos de Australia.

Referencias

Campero CM, Cantón G, Moore DP. Abortos y otras pérdidas reproductivas en bovinos. Ed. Hemisferio Sur, Argentina (En prensa). 2017. Desquesnes M, Holzmuller P, De-Hua L, Dargantes A, Lun ZR, Jittaplapong S.Trypanosoma evansi and Surra: A Review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects. BioMed Res Intern. 2013. http://dx.doi.org/10.1155/2013/194176. Izzo MM,Poe I, Horadagoda N, De Vosd AJ, Housea JK. Haemolytic anaemia in cattle in NSW associated with Theileria Infections. Aust Vet J 88: 45–51. 2010. Kashiwazaki Y, Pholpark M, Polsar C, Pholpark S. Haemoparasite infections in newly introduced dairy cattle in Loei Province,Thailand: Trypanosoma evansi antigen levels by ELISA referring to abortion. Vet Parasitol 80: 99– 109. 1998. Oliveira JB, Hernández-Gamboa J, Jiménez-Alfaro C, Zeledón R, Blandón M, Urbina A. First report of Trypanosoma vivax infection in dairy cattle from Costa Rica. Vet Parasitol 163: 136-139. 2009. Pholpark S, Pholpark M, Polsar C, Charoenchai A, Paengpassa Y, Kashiwazaki Y. Influence of Trypanosoma evansi infection on milk yield of dairy cattle in northeast Thailand. Prev Vet Med 42: 39–44, 1999. Swilks E, Fell SA, Hammer JF, Sales N, Krebs GL, Jenkins C. Transplacental transmission of Theileria orientalis occurs at a low rate in field-affected cattle: infection in utero does not appear to be a major cause of abortion. Parasit Vectors10:227. doi: 10.1186/s13071-017-2166-9. 2017.

220 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

RESIDUOS E IMPACTO AMBIENTAL DE LOS PLAGUICIDAS DE USO EN BOVINOS ENVIRONMENTAL IMPACT OF PESTICIDES RESIDUES FOR CATTLE USE

Fragoso SH*, Tovar DA, Hernández EF. Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. [email protected]

Palabras clave: plaguicida, impacto, residuos, manejo, campo limpio, tick-killing agent

INTRODUCCIÓN

La garrapata común del bovino es el principal problema de la ganadería en las regiones tropicales y subtropicales. En México se ha documentado ampliamente los daños que ocasiona, así como las pérdidas tanto directas como indirectas. La distribución y tasas de infestación del ácaro en nuestro país son una de los causas de la amplitud y diversidad de daños.

El impacto económico negativo de las garrapatas a la ganadería, se debe tanto a efectos directos como indirectos. El efecto directo sobre la producción, es resultado del daño a las pieles por acción de las picaduras, pérdida de sangre y efectos tóxicos (Rodríguez-Vivas et al, 2006). Asimismo, se ha señalado la reducción en la ganancia de peso de los animales, así como pérdidas en la producción de leche; y se ha vinculado a las garrapatas con baja en la fertilidad del ganado, mayor tiempo de la engorda y dificultad en la introducción de razas mejoradas para incrementar la calidad genética del hato en áreas infestadas por garrapatas. En cuanto a efectos indirectos, el principal está dado por la transmisión de enfermedades por Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale (Rodríguez-Vivas et al, 2006).

Para enfrentar las infestaciones por garrapata, el control se ha basado tradicionalmente en la aplicación de productos químicos sobre el cuerpo del animal o mediante aplicación sistémica, a través de estrategias diversas, dependiendo de los fines del programa (procedimientos rutinarios aplicados en función de la vida media del químico en el animal, o mediante aplicaciones basadas en programas de convivencia con el ácaro, asumiendo la imposibilidad para su erradicación y enfocándose a reducir el impacto económico en programas de manejo integral). No obstante, en general el uso de substancias químicas trae como consecuencias efectos colaterales tales como la presencia de residuos en leche y carne, impacto en el medio ambiente, aparición de poblaciones de garrapatas resistentes a los productos y daño a la salud de las personas que aplican el producto.

221 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó una revisión documental de literatura sobre la regulación de plaguicidas en México, incluyendo los de uso pecuario, así como el impacto derivado de su uso. Posterior a lo cual, se procedió a integrar la información en general y específica, para generar una discusión y propuestas de solución.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La presencia de residuos químicos en los productos y subproductos de origen animal ha sido motivo de preocupación para la mayoría de los consumidores y debido a ello, los países han establecido programas nacionales de vigilancia tanto para los productos de origen nacional como para los importados, de hecho el CODEX Alimentarius cuenta con recomendaciones de Límites Máximos de Residuos (LMR) para la mayoría de los productos químicos, entre los que se encuentra los garrapaticidas (CODEX, 2017).

Todos los países que participan en el comercio de productos cárnicos se sujetan a las disposiciones de los compradores (Acuerdo por el que se establecen los criterios para determinar los límites máximos de residuos tóxicos y contaminantes, 2014; Directiva 96/23/CEE), por lo que, valores fuera de límite han provocado alertas importantes a los consumidores (IVM en Brasil) afectando de manera irremediable, el comercio de los productos asociados. Ejemplo de lo anterior ha sido la presencia de residuos violatorios de Ivermectina en carne de res en Brasil exportada a los EUA en el año 2011, caso que motivó la publicación de una alerta y el retiro de carne del mercado en ese país por parte de la empresa JBS con un costo estimado de 104 millones de dólares americanos (US Dlls) (Globo Rural, 2011).

México por su parte, mantiene desde hace más de 25 años la vigilancia de residuos tóxicos y contaminantes en productos de origen animal y para el caso de carne de res se buscan, entre otros residuos, los plaguicidas Organofosforados, Organoclorados, Piretroides e Ivermectinas. No es común que de ellos se encuentren residuos y sólo en el caso de Ivermectinas, entre el año 2013 y 2015 se identificaron residuos ligeramente por arriba del LMR en tres casos el primer año (0.77%) y un caso para cada uno de los dos últimos señalados (0.25%), sin representar un problema para la salud. A la fecha no ha sido notificado un caso violatorio de plaguicidas por los países a los que México exporta activamente carne de res (EUA, Canadá, Japón, Corea, entre otros).

Según datos de la industria farmacéutica veterinaria, existen en México anualmente un volumen total de 2.7 millones de frascos de diferentes volúmenes, desde endectocidas inyectables en presentación de 10 ml, hasta contenedores de plaguicidas de 5 litros; aunque los de mayor riesgo son aquellos cuyo tamaño es

222 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México de los 500 ml en adelante, es importante considerar que todos deben ser responsablemente manejados para que no se conviertan en contaminantes del medio ambiente. A este respecto existen en México regulaciones específicas que aplican a la industria de plaguicidas independientemente de si su finalidad es uso agrícola, urbano, industrial o pecuario.

Es así, que en la aplicación de una sustancia plaguicida, es muy importante prestar atención a los aspectos relacionados con la seguridad del operario y la prevención de la contaminación del medio ambiente; en cuanto a los productos, se deben seguir las recomendaciones del fabricante, principalmente; así como realizar la disposición ambientalmente adecuada tanto de los residuos como de los envases generados (Martínez I. M. y Cruz R. M., 2009). A pesar de ello, cuando falla la capacitación de las personas involucradas en la aplicación de plaguicidas o bien, no se respetan las indicaciones de los fabricantes, ocurren situaciones que impactan a diversos elementos del ambiente. Adicionalmente, en los últimos años se han demostrado diversos efectos negativos del uso no racional de plaguicidas, entre los que se pueden mencionar la resistencia de las plagas, presencia de residuos en las cadenas alimenticias y el ambiente físico, la destrucción de la fauna benéfica, la elevación de los plagas de importancia secundaria a nivel primario, entre otros.

Las actividades económicas, específicamente la agricultura y ganadería desde su surgimiento hasta la actualidad, han propiciado el uso intensivo de los recursos suelo, agua y atmósfera, empleando para sus fines particulares, una gran cantidad de insumos entre los que destacan los fertilizantes y los plaguicidas principalmente; estos últimos son empleados con el propósito de combatir diversas plagas y enfermedades. Sin embargo, su uso indiscriminado ha conducido a una creciente degradación y contaminación del medio ambiente, lo cual trae como consecuencia el aumento de riesgos y daños a la salud humana. En la actualidad se calcula que el 80% de las ventas globales de estos productos, se consume en los países desarrollados, mientras que en otros países en vías de desarrollo se consume el 20% restante. Lo destacable, es que dentro es en los países en desarrollo en los que se registra el 75% de las muertes por contaminación por agroquímicos (Papale, 2003).

Aunado a lo anterior y derivado del aumento de la población a nivel mundial, el ser humano se ha sentido adjudicado la responsabilidad de garantizar la producción de alimentos, por lo que la actividad ganadera al igual que la agricultura, ha echado mano de diversas herramientas ya que su productividad depende directamente del manejo veterinario del ganado, del control de parásitos, bacterias, virus, entre otros, del estiércol producido y del manejo del pastizal. En este sentido, los fármacos antiparasitarios han sido utilizados ampliamente en la práctica veterinaria (McKellar y Benchaoui, 1996), siendo los más usados los que contienen fenbendazol, albendazol, levamisol y ivermectina como principios activos, esta última es considerada la más nociva para el entorno ambiental (Diao

223 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México et al., 2007; Schmitt y Rombke, 2008), ya que particularmente en bovinos, la excreción fecal representa el 98% o más del total de la dosis administrada (Sumano y Ocampo, 2006). Lo cual repercute negativamente en las poblaciones de fauna presentes en el suelo. Los procesos de transporte también se ven afectados por las propiedades de absorción del suelo, las cuales están determinadas principalmente por el contenido de materia orgánica, óxido de hierro y arcilla, la capacidad de intercambio catiónico y el pH (Duffner et al., 2012). Así mismo, las propiedades fisicoquímicas de los plaguicidas son determinantes para su dinámica ambiental, de manera general las sustancias más solubles en agua y más persistentes son las más fácilmente transportables y representan el mayor riesgo de contaminación (Hernández y Hansen, 2011).

Por otro lado, aunque en la literatura se reconoce la contaminación de cuerpos de agua superficiales, como un problema muy importante, algunos autores señalan que existe muy poca información al respecto (Norzagaray et al. 2010, García- Gutiérrez y Rodríguez-Meza, 2012). En este sentido, tomando el ejemplo del municipio de Huatabampo, Sonora, la desaparición de criaderos naturales de pescado y camarón, se atribuye a la filtración de fertilizantes y plaguicidas en las aguas de los drenes, entre otros factores (López y Lechuga, 2001). Entre los trabajos publicados más recientes se encuentra el de Hernández y Hansen (2011), quienes reportaron la presencia de plaguicidas en aguas de ríos, drenajes y norias en el estado de Sinaloa, detectando residuos de atrazina en niveles que varían entre 4.62 y 15.01 µg/L y de setilatrazina entre 6.23 y 30.23 µg/L, mismos que exceden los límites guía establecidos por la OMS. En los valles del Yaqui y Mayo en el estado de Sonora se ha reportado cipermetrina (2.8-29.4 µg/L), ciflutrina (6.2-24.4 µg/L) superando la concentración letal para invertebrados acuáticos, peces y crustáceos, como referente de la contaminación de acuíferos (Moreno- Villa et al. 2012).

Asimismo y sin importar el tipo de plaguicida, todos cuentan con ciertas características (como toxicidad, persistencia, bioacumulación, capacidad de migración, etc.) que los hacen perjudiciales o benéficos tanto para los recursos naturales, como para el hombre (Linares, 2007). El manejo de los envases vacíos es un serio problema ya que se generan toneladas anuales de residuos, de los cuales la mayoría quedan dispersos en los campos, cuerpos de agua, bioacumulación en la biota presente y a productos de consumo humano como fórmulas infantiles, aceites vegetales, entre otros (Izquierdo et al., 2004).

Todo plaguicida para su venta y uso en México, requiere un registro, el cual constituye una autorización, mientras que posterior a ello, debe considerarse de manera responsable, el manejo y disposición final de sus envases y remanentes (incluyendo productos usados, caducos, retirados del mercado, o desechados). La eliminación sin precauciones, de los envases plásticos o de vidrio, constituye una fuente de contaminación al medio ambiente, que se incrementa cuando se repite la actividad regularmente y en el mismo lugar.

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De acuerdo a Ley General para la Prevención y Gestión Integral de los Residuos, la cual forma parte de la legislación mexicana vigente (DOF, 22-05-2015), los contaminantes mencionados previamente, serán considerados residuos de manejo especial sujetos a planes de manejo. Un plan de manejo en términos generales, es un instrumento cuyo objetivo es minimizar la generación, y maximizar la valorización de residuos sólidos urbanos, residuos de manejo especial y residuos peligrosos específicos, bajo criterios de eficiencia ambiental, tecnológica, económica y social; es diseñado bajo los principios de responsabilidad compartida y manejo integral, que considera el conjunto de acciones, procedimientos y medios viables e involucra a productores, importadores, exportadores, distribuidores, comerciantes, consumidores, usuarios de subproductos y grandes generadores de residuos, según corresponda, así como a los tres niveles de gobierno. La formulación y ejecución de los planes de manejo es obligación, según corresponda, de los productores, importadores, exportadores y distribuidores de los productos que al desecharse, se convierten en residuos peligrosos.

Los planes de manejo deben considerar, entre otros aspectos, procedimientos para acopio, almacenamiento, transporte y envío a reciclaje, tratamiento o disposición final a utilizar; estrategias y medios de comunicación a los consumidores sobre las acciones para devolver los productos a los proveedores o a los centros de acopio destinados para tal fin (Ley General para la Prevención y Gestión Integral de los Residuos, DOF, 22-05-2015). No obstante, en el caso de plaguicidas de uso pecuario, no existe una normatividad específica a la cual los generadores de los tipos de residuos mencionados, se deban sujetar. Por lo que, a continuación se hace referencia a los plaguicidas de uso agrícola como una referencia.

A través del “Programa Nacional de Recolección de Envases Vacíos de Agroquímicos y Afines” (PNREVAA), se apoya al sector agrícola en la recolección y acopio de los envases vacíos de plaguicidas, con el objetivo de propiciar su manejo adecuado e integral, contribuyendo a la inocuidad de los alimentos de origen agrícola, y coadyuvando a prevenir o disminuir riesgos a la salud de trabajadores, consumidores, y el medio ambiente. Dicho Programa opera desde el año 2006, a través de los Organismos Auxiliares de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), denominados Comités Estatales de Sanidad Vegetal. Para ello, los Organismos voluntariamente se han adherido al Plan de Manejo de la Asociación AMOCALI, A.C., conformada por la industria de plaguicidas en México, y la cual cuenta con un registro de su Plan de Manejo de Residuos Peligrosos, ante la Subsecretaría de Gestión para la Protección Ambiental y la Dirección General de Gestión Integral de Materiales y Actividades Riesgosas de la SEMARNAT, en cumplimiento a la normatividad.

Es así que se cuenta con centros de acopio temporal de envases, los cuales han operado en los años 2013 a 2016 con apoyo del Gobierno Federal por conducto

225 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA), órgano desconcentrado de la SAGARPA, aportando casi 19 millones de pesos para recolectar en ese periodo, aproximadamente 5396 toneladas de envases a nivel nacional. Actualmente se cuenta con 47 Centros de Acopio Temporal en Operación y 16 en proceso de operar, con los cuales durante el año 2017 se pretende recolectar alrededor de 1,752 toneladas de envases, con una inversión federal aproximada de $5, 441,340.19.

CONCLUSIÓN

El agudo deterioro del medio ambiente demanda adoptar no sólo medidas para contrarrestar los efectos negativos, sino también proponer y establecer medidas que garanticen la generación de incentivos para potenciar la disminución de los riegos y daños a la salud producto de la degradación y contaminación ambientales, promoviendo paralelamente la creación de instalaciones para el manejo ambientalmente adecuado de los residuos, bajo un estricto control de calidad y seguridad de acuerdo con la normatividad aplicable vigente. Además es necesario considerar que la detección de este tipo de residuos en los bienes de origen pecuario representa un riesgo a la salud de los consumidores, así como restricciones en el comercio internacional, lo cual se traduce en cuantiosas pérdidas económicas a los ganaderos.

Asimismo, en la actualidad en el país no existe un programa orientado a la capacitación del personal involucrado en el manejo y aplicación, ni para la recolección de envases vacíos o sus residuos de los plaguicidas de uso pecuario. Por lo cual, es recomendable priorizar y fomentar la capacitación de los trabajadores, incluyendo el monitoreo de su estado de salud para evitar riesgos; así como la generación de un Programa Nacional o Programas locales enfocados a la recolección de los envases de manera que se favorezca la protección del ambiente. Una manera de incentivar la actividad puede ser a través de ofrecer sellos o distintivos a personas físicas o morales, incentivar la creación y operación de centros de residuos valorizables permanentes, promover que se realice el manejo y tratamiento de los envases desde la recepción, clasificación, trituramiento y disposición para usos ambientalmente autorizados.

Por otro lado, es necesario promover regulaciones específicas en las que se determinen las infracciones y/o sanciones aplicables a la realización de actividades que afecten al medio ambiente, tales como quemar, enterrar, almacenar o abandonar en sitios no autorizados, envases y/o residuos generados. Así mismo, se recomienda realizar estudios de impacto ambiental del uso de plaguicidas de uso pecuario en México, ya que los datos disponibles son escasos, de manera que se puedan diseñar e implementar desde programas de capacitación a productores, técnicos, profesionales, funcionarios, etc., hasta políticas públicas integrales en beneficio de la población, del medio ambiente y de las actividades ganaderas.

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RECONOCIMIENTOS – FUENTE FINANCIADORA Se agradece el apoyo del Servicio Nacional de Sanidad e Inocuidad Agroalimentaria para que el trabajo fuera preparado y presentado.

REFERENCIAS

Acuerdo por el que se establecen los criterios para determinar los LMR tóxicos y contaminantes, de funcionamiento de métodos analíticos, el Programa Nacional de Control y Monitoreo de Residuos Tóxicos en los bienes de origen animal, recursos acuícolas y pesqueros, y Programa de Monitoreo de Residuos Tóxicos en animales, así como el módulo de consulta, los cuales se encuentran regulados por la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (Diario Oficial de la Federación, 2014). Directiva 96/23/Ce del Consejo de 29 de abril de 1996 relativa las medidas de control aplicables respecto de determinadas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos y por la que se derogan las Directivas 85/358/CEE y 86/469/CEE y las Decisiones 89/187/CEE y 91/664/CEE. (DO L 125 de 23.5.1996, p. 10) capítulo VI, artículo 29, pag. 18. Dreisback, R.H. & W.O. Robertson 1988. Manual de toxicología clínica, prevención, diagnóstico y tratamiento. Edit. El manual moderno. 12º Edición. pag. 95-105. Duffner A., Ingwersen J., Hugenschmidt C. y Streck T. (2012). Pesticide transport pathways from slope litchi orchard to an adjacent tropical stream as identified by hydrograph separation. J. Environ. Qual. 41,1315-1323. García G. y Rodríguez M. G. (2012). Problemática y riesgo ambiental por el uso de plaguicidas en Sinaloa. Ra Ximhai 8, 1-10. Globo Rural, 8 Nov., 2011, “Exportação perde US$ 104 mi por causa da ivermectina na carne”. Hernández A. A. y Hansen A. (2011). Uso de plaguicidas en dos zonas agrícolas de México y Evaluación de la contaminación de agua y sedimentos. Rev. Int. Contam. Ambie. 27, 115-127. Izquierdo P. A. M., Torres G.A. García y M. Pireño. 2004. Residuos de plaguicidas organoclorados en fórmulas infantiles. 14 (2): 147-152. J.M. Ros Piqueras, E. Gaspar Tomás. Manipulador de Plaguicidas de uso Ganadero, Nivel básico. Unión Europea, Fondo Europeo Agrícola de Desarrollo Rural. Capítulo 2, Equipos de Aplicación de Plaguicidas/Biocidas. Linares, R. M. 2007. Evaluación ambiental de pesticidas organoclorados en sedimentos de la laguna de Chantutu (Chiapas, México) y de la Bahía de Santander (Cantabria, España). Tesis Doctoral, Universidad de Cantabria, España. Ingeniería Química. 180 p. Ley General para la Prevención y Gestión Integral de los Residuos. Diario Oficial de la Federación, 22-05-2015.

227 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

López R. O., Lechuga, A. M., 2001. Contaminantes en los cuerpo de agua del sur de Sonora. Salud Pública Mex; 43:298-305. [En línea]. Disponible en: http://www.insp.mx/salud/index.html Maximum residue limits (MRLS) and risk management recommendations (RMRS) for residues of veterinary drugs in foods; cac/mrl 2-2017. Updated as at the 40th Session of the Codex Alimentarius Commission (July 2017). Comité del Codex sobre Residuos de Medicamentos Veterinarios en los Alimentos (CCRVDF). Martínez I. M. y Cruz R. M. (2009). El uso de químicos veterinarios y agrícolas en la zona ganadera de Xico, Centro de Veracruz, México y el posible impacto ambiental. Acta Zoológica Mexicana (n.s.) 25(3): 673-681. McKellar QA, Benchaoui HA. 1996. Avermectins and milbemycins. J Vet Pharm Ther 19: 331-351. Norzagaray C. M., García g. C., Llanes C. O.,Troyo D.E. y Muñoz S. P. (2010). Análisis de la producción agrícola extensiva en Sinaloa: alternativas para el uso sostenible del agua Ra Ximhai 6,45-50. Papale, S. (2003). Plaguicidas ¿Venenos útiles? [En línea] Fundación Nueva Tierra. Eco Portal: Net, El Directorio Ecológico y natural, Australia, 2003. [En línea]. Disponible en: www./ecoportal.net>. Pérez y Espejo R. (2012). La contaminación agrícola del agua: aspectos generales y teoría. En: Agricultura y Contaminación del agua. México (R. Pérez Espejo y A. Aguilar Ibarra, Eds.) UNAM, Instituto de Investigaciones Económicas, 16-22. Rodriguez-Vivas RI, Alonso-Diaz MA, Rodriguez-Arevalo F, Fragoso-Sanchez H, Santamaria VM, Rosario-Cruz R. Prevalence and potential risk factors for organophosphate and pyrethroid resistance in Boophilus microplus ticks on cattle ranches from the State of Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 2006; (136):335-342. Schmitt, H. & J. Rombke, 2008. The toxicological effects of pharmaceutical (antibiotics and antiparasitides) in the terrestrial environment-a review. Pp2985-303. In Pharmaceuticals in the environment sources, fate, effects and risks. Chapter 18. Spring Berlin Heidelberg, part III. Seguridad y riesgos de los antiparasitarios para el medio ambiente. [En línea]. Disponible en: http://parasitipedia.net/index.php?option=com_content&view=article&id=126 &Itemid=200 Sumano, H. y Ocampo, L. (2006), Farmacología Veterinaria. México D.F. México: Mcgraw- Hill interamericana.

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Rhipicephalus sanguineus sensu lato EN MÉXICO: ESTACIONALIDAD, CONTROL, RESISTENCIA E IMPLICACIONES EN SALUD PÚBLICA

Rhipicephalus sanguineus sensu lato IN MEXICO: SEASONALITY, CONTROL, RESISTANCE AND PUBLIC HEALTH IMPLICATIONS

Cruz-Vázquez Carlos Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes, Tecnológico Nacional de México Km. 18 carretera Aguascalientes a San Luis Potosí, 20330, El Llano, Aguascalientes, México. [email protected]

Key words: Rhipicephalus sanguineus; Seasonality; Control; Resistance; Zoonosis

Introducción

Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae), es probablemente la garrapata con mayor presencia a nivel mundial y es considerada endémica en las regiones tropicales y subtropicales del orbe; esta garrapata es parásito de los perros domésticos, por lo que también es conocida como la “garrapata del perro” o como la “garrapata marrón del perro”, sin embargo, tiene capacidad para parasitar también a otros animales domésticos y silvestres, y de manera accidental al ser humano; se le considera una garrapata intradomiciliaria. R. sanguineus puede transmitir diversas enfermedades a los perros y al hombre debido a sus estrechas relaciones, por lo que es considerada un importante vector de enfermedades tanto en salud animal como en salud pública (Dantas-Torres, 2008; 2010). R. sanguineus fue descrita en 1806 por Latreille, y se considera que por pertenecer al género Rhipicephalus, su origen es africano, y que se ha diseminado por todo el mundo a través de los perros; para el continente americano, su llegada debe de haber sucedido a partir de la colonización (Barros-Batesti et al., 2006; Dantas- Torres, 2008). Sin embargo, su estatus taxonómico es aún una situación sin resolver, por lo cual actualmente al hablar de esta garrapata se debe de referir al término R. sanguineus sensu lato (Nava et al., 2015).

Biología y Estacionalidad

R. sanguineus sl, es una garrapata de tres huéspedes, lo que significa que requiere parasitar a un huésped para cumplir con el desarrollo de cada uno de sus estados evolutivos de la fase parásita (larva, ninfa y adulto), alimentándose de sangre y al repletarse bajar al suelo para evolucionar, razón por la cual tiene una amplia capacidad para soportar largos periodos sin alimentarse en las etapas de vida libre, de manera que puede completar su ciclo de vida en condiciones

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óptimas de ambiente y disponibilidad de huésped en tan solo 63 días, pero las larvas sin alimentar pueden vivir hasta ocho meses mientras que las ninfas y adultos pueden sobrevivir hasta 19 meses sin ingerir sangre. La hembra adulta puede parasitar al perro de 5 a 21 días y ovipositar entre 4000 y 7000 huevos (Dantas-Torres, 2008). Esta garrapata se encuentra ampliamente distribuida en México, con mayor presencia en las regiones cálidas en donde se puede observar claramente su distribución a lo largo del año en relación con la presencia de diferentes estados evolutivos sobre el huésped (Gaxiola-Camacho et al., 1997; Cruz-Vázquez et al., 1998; Tinoco-Gracia et al., 2009). En el país, existe poca información sobre la estacionalidad de la infestación en perros parasitados con R. sanguineus sl, y nula en cuanto a las etapas de vida libre. Con dicha información, se ha estimado que R. sanguineus sl puede desarrollar hasta 2.5 generaciones por año y que pueden existir los diferentes estados evolutivos (larva, ninfa y adultos) sobre los perros prácticamente todo el año debido a las apropiadas condiciones climáticas del gran parte del territorio nacional, esto puede ser más evidente en regiones de clima cálido subhúmedo y en los trópicos. La prevalencia a la infestación en perros con propietario se encuentra entre 20% y 24%, siendo más alta en primavera-verano y de menor valor en el invierno; la intensidad de la infestación por adultos puede ser entre 4 y hasta 350 especimenes. Esta información es indicativa de que la infestación por R. sanguineus sl, es continua en los perros y seguramente en el ambiente en el que habitan, ya sea dentro de la casa-habitación y/o en los jardines particulares así como en el caso de los perros que salen a las calles o habitan en las mismas (Cruz-Vázquez et al., 1999). En Brasil, se ha determinado la existencia de hasta 4 generaciones de garrapatas por año en áreas con temperaturas promedio de 30oC y humedad relativa del 85% (Dantas-Torrres, 2010). En México, la frecuencia de R. sanguineus sl en otras especies domésticas se encuentra poco documentada, pero se han colectado especimenes de ganado bovino, caballos, cerdos conejos y gatos, mientras que en fauna silvestre ha habido colectas en liebres, pumas y ratas (Morales, 1996).

Control con Ixodicidas y Resistencia

El control de la infestación natural se realiza principalmente mediante el uso de ixodicidas aplicados a los perros en una amplia diversidad de formas, que van del baño medicado usando jabones o shampoos hasta las pipetas spot-on, los cuales contienen una amplia variedad de moléculas, principalmente piretroides, organofosforados, amitraz, ivermectina y fipronil. Sin embargo, su uso indiscriminado puede provocar el desarrollo de resistencia a uno o más compuestos, ya sea por su aplicación frecuente, subdosificación, o por el uso de formulaciones de largo efecto residual, que generalmente va de 4 a 5 semanas, aunque los collares pueden liberar el compuesto hasta por cinco o más meses. A nivel global el fenómeno de resistencia en R. sanguineus sl, se encuentra escasamente documentado en la literatura, sin embargo, existen reportes en el sur de los Estados Unidos de América, Panamá, España, Sudán, Brasil y Cuba (Razig and Osman 1987; Miller et al. 2001; Estrada-Peña 2005; Borges et al. 2007; Eiden

230 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México et al. 2015; Encinosa-Guzmán et al. 2016), las moléculas identificadas en estos trabajos incluyen a la cypermetrina, deltametrina, permetrina, fipronil y amitraz; en México, se ha reportado resistencia o baja susceptibilidad a moléculas como el amitraz, cipermetrina, ivermectina y permetrina en los estados de Yucatán, Morelos y Nayarit, sin embargo es probable que el fenómeno se encuentre presente en otros estados con condiciones propicias para el desarrollo de R. sanguineus sl (Rodríguez-Vivas et al., 2017a,b; Cruz-Vázquez et al., 2017). Algunas de estas moléculas se utilizan en México desde hace más de 20 años para el control de R. microplus, R. sanguineus sl y de Ctenocephalides canis y C. felis; las formulaciones disponibles para su uso en perros se venden a todo el público sin necesidad de prescripción del Médico Veterinario y está acompañado de importantes campañas publicitarias en diversos medios, que van desde los folletos divulgativos hasta anuncios en la internet, lo cual constituye actualmente un factor de riesgo para el desarrollo de resistencia, y a esto se debe de sumar la ausencia de tratamiento ambiental en las casas-habitación de los perros tratados con estos compuestos. Por otra parte, se han explorado alternativas de control no químico con la finalidad de disminuir el uso de los ixodicidas, entre ellas los hongos entomopatógenos (Metharizium anisopliae sl y Beauveria bassiana sl), parasitoides (Ixodiphagus hookeri), y aceites esenciales de plantas (Azadiracta indica y Cymbopogon).

Potencial zoonótico

La presencia de R. sanguineus sl, implica un riesgo de salud pública ya que es un eficiente vector de agentes potencialmente zoonoticos como Anaplasma platys, Coxiella burnetii, Ehrlichia canis, Leishmania infantum, Rickettsia conorii y Rickettsia rickettsii; en México, se ha reportado un aumento en el número de casos de personas con ricketsiosis en los últimos años, particularmente, casos de Fiebre manchada de las Montañas Rocosas causada por R. rickettsi en el norte del país (Sonora y Baja California norte), en proporciones semejantes al brote de la década de 1940-1950, que sucedió en los estados de Sinaloa, Sonora, Durango y Coahuila. Esto provocó que en abril del 2015, el CENAPRECE dependiente de la Secretaría de Salud, emitiera una declaratoria de emergencia epidemiológica en los estados de Sonora y Baja California norte a la luz de 80 casos fatales de esta enfermedad. De acuerdo a las cifras de la Secretaría de Salud de México, la re-emergencia de esta zoonosis inició alrededor del año 2005, afectando a la población infantil menor de 10 años de edad; esta zoonosis ha sido motivo de permanente vigilancia epidemiológica lo largo de la franja fronteriza con los Estados Unidos de América debido a que es común la presencia de casos en esas regiones. R. sanguineus sl ha sido históricamente involucrada en estos casos (Álvarez-Hernández et al., 2017).

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Perspectivas

Es un hecho que la garrapata del perro, R. sanguineus sl, ha estado presente en nuestro país seguramente desde la época de la colonia, y que su carácter zoonótico ha estado documentado desde inicios del siglo XX, época en que se informó de los primeros casos clínicos de la Fiebre manchada de las Montañas Rocosas. A lo largo del siglo XX y de lo que va del siglo XXI, la epidemiología de R. sanguineus sl, en México ha sido escasamente documentada y hemos vivido con esta garrapata tomándola como un acompañante habitual, si bien molesto, de los perros, casi un símil de cómo sentimos las infestaciones por pulgas en el “mejor amigo del hombre”. Como estas parasitosis externas se “curan” solas (al desaparecer “mágicamente” los estados adultos del cuerpo del perro), con remedios caseros herbolarios o tan agresivos como el aceite quemado, y de manera más actual mediante la aplicación de un baño medicado en la clínica veterinaria, en la estética canina, o bien adquiriendo el compuesto en la farmacia o clínica veterinaria más próxima o incluso en el supermercado para ser aplicado por el mismo propietario, el alivio puede presentarse rápida y a veces también económicamente, así, el problema se soluciona. Sin embargo, esta fácil accesibilidad a los compuestos y/o su prescripción médica sin supervisión y conocimiento, está llevando a la aparición del fenómeno de resistencia a numerosos compuestos, hecho que debe de limitarse y remediarse, así como el daño al ambiente que deja tanto su uso como el desecho de los envases y el riesgo a la salud humana al manipularlos sin los cuidados pertinentes.

Ante este escenario, es recomendable trabajar con los Médicos Veterinarios y propietarios de perros para orientarlos en el adecuado uso y manejo del control de R. sanguineus sl con ixodicidas con la finalidad de emplear de la mejor manera esta alternativa de control que debería de incluir la adecuada dosificación, la rotación de moléculas y el control ambiental bajo un conocimiento adecuado del ciclo biológico y la estacionalidad de la infestación. Es decir, aplicar en todos los casos la principal medida de prevención primaria de este problema que es la educación para la salud. Es necesario que los profesionales de la salud animal, los laboratorios que producen y comercializan ixodicidas, las autoridades sanitarias y los propietarios de perros, tomen el compromiso de atender esta problemática. Al educar para la salud estaremos limitando también la presentación de casos de zoonosis transmitidas por R. sanguineus sl, y para tal fin habrán de coordinarse esfuerzos con el Sector Salud.

Referencias

Álvarez-Hernández, G., González-Roldán, J.F., Hernández-Milan, N.S., Ryan L.R., Behravesh, C.B., Paddock, C.D., 2017. Rocky Mountain spotted fever in Mexico: Past, present, and future. Lancet Infect. Dis. 17, e189–96.

232 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Barros-Battesti, D.M., Arzua, M., Bechara, G.H., 2006. Carrapatos de Importância Médico-Veterinária da Região Neotropical: Um guia ilustrado para identificação de espécies. Sao Paulo, Vox/ICTTD-3/Butantan, Brasil. Borges, L.M.F., Soares, S.F., Fonseca, I.N., Chaves, V.V., Louly, C.C.B., 2007. Resistencia acaricida em larvas de Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) de Goiânia-GO. Rev. Patol. Trop. 36, 87-95. Cruz-Vázquez C., García-Vázquez, Z., 1999. Seasonal distribution of Rhipicephalus sanguineus ticks (Acari:Ixodidae) on dogs in an urban area of Morelos, Mexico. Exp. Appl. Acarol. 23, 277-280. Cruz-Vázquez C., García-Vázquez, Z., Morales, S.M., 1998. Prevalence of Rhipicephalus sanguineus infestation in dogs in Cuernavaca, Morelos, Mexico. Parasitol. al Día. 22, 29-32. Dantas-Torres, F., 2008. The brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari: Ixodidae): from taxonomy to control. Vet. Parasitol. 152, 173–185. Dantas-Torres, F., 2010. Biology and ecology of the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus. Parasites & Vectors 3, 26. Dantas-Torres, F., Otranto, D., 2015. Further thoughts on the taxonomy and vector role of Rhipicephalus sanguineus group ticks. Vet. Parasitol. 208, 9-13. Eiden, A.L., Kaufman, P.E., Oi, F.M., Allan, S.A., Miller, R.J., 2015a. Detection of Permethrin Resistance and Fipronil Tolerance in Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in the United States J. Med. Entomol. 52, 429-436. Estrada-Peña, A. 2005. Etude de la résistance de la tique brune du chien, Rhipicephalus sanguineus aux acaricides. Rev. Méd Vét, 156, 67-69 Encinosa-Guzmán, P.E., Bello-Soto, Y., Rodríguez-Mallon, A., 2016. Genetic and biological characterization of a Cuban tick strain from Rhipicephalus sanguineus complex and its sensitivity to different chemical acaricides. Int. J. Acarol. 42, 18-25. Gaxiola, C.S.M., Obregón, I.F., Quintero, M.M.T., Cabrera, V.I., Rubio, R.M.C., 1997. Prevalencia de Rhipicephalus sanguineus en canideos de dos colonias de diferente nivel socio económico de Culiacán, Sinaloa. Proceedings of the 13th Congreso Latinoamericano de Parasitología. La Habana, Cuba, November 17 to 23, 1997. p 320 Miller R.J., George J.E., Guerrero F., Carpenter L., Welch J.B., 2001. Characterization of acaricide resistance in Rhipicephalus sanguineus (Latreille) (Acari:Ixodidae) collected from the Corazal army veterinary quarantine centre, Panama. J. Med. Entomol. 38, 298-302. Morales, S.M., 1996. Biología de Rhipicephalus sanguineus (Acarida: Ixodidae), un ectoparásito intradomiciliario cosmopolita. En: Tópicos en Parasitología Animal, volumen III. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. pp: 1-16. Nava, S., Estrada-Peña, A., Petney, T., Beati, L. Cabruna, M., et al. 2015. The taxonomic status of Rhipicephalus sanguineus(Latreille, 1806). Vet. Parasitol. 208, 2-8.

233 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México

Razig, A.A., Osman, O.M., 1987. Resistance and susceptibility of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) to ixodicide chemicals in the Sudan. Int. Pest Control. 29, 70-74. Rodríguez-Vivas, R.I., Ojeda-Chi, M.M., Trinidad-Martínez, I., Pérez de León, A.A., 2017a. First documentation of ivermectin resistance in Rhipicephalus sanguineus sensu lato (Acari: Ixodidae). Vet. Parasitol. 233, 9-13. Rodríguez-Vivas, R.I., Ojeda-Chi, M.M., Trinidad-Martínez, I., Bolio-González, M.E., 2017b. First report of amitraz and cypermethrin resistance in Rhipicephalus sanguineus sensu lato infesting dogs in Mexico. Med. Vet. Entomol. 31, 72-77. Tinoco-Gracia, L., Quiroz-Romero, H., Quintero-Martínez, M.T., Rentería- Evangelista, T.B., González-Medina, Y., Barreras-Serrano, A., Hori-Oshima, S., Moro, M.H., Vinasco, J., 2009. Prevalence of Rhipicephalus sanguineus ticks on dogs in a region on the Mexico-USA border. Vet. Rec. 164, 59-61.

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PRESENCIA DE Neospora caninum EN UNIDADES DE PRODUCCIÓN BUFALINA DE VERACRUZ, TABASCO Y OAXACA, MÉXICO

PRESENCE OF Neospora caninum IN BUFALINE PRODUCTION UNITS FROM VERACRUZ, TABASCO AND OAXACA, MEXICO

Saldaña RLY1, Romero SD1*, Medina EL2, Cervantes AP1, Cruz RA1, Aguilar DM1, Ibarra PN1, Salguero RJL1, Cruz VC2, González HM3, Pérez de León AA4

1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, México. 2Instituto Tecnológico El Llano. Aguascalientes, México. 3Facultad de Agronomía y Veterinaria. Universidad Autónoma de San Luis Potosí. SLP, México. 4United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory, and Veterinary Pest Genomics Center, 2700 Fredericksburg Road, Kerrville, TX 78028, USA. Correo electrónico*: [email protected]

RESUMEN

El búfalo de agua es un animal procedente de India, comenzando su domesticación hace 5000 años, en Irán, India y Pakistán. Se ha demostrado que el búfalo de agua puede llegar a poseer muchas de las enfermedades que afectan al ganado bovino, tanto infeccioso como parasitario, pero el búfalo de agua resulta ser más resistente y presenta pocos signos clínicos. El objetivo de este estudio fue detectar mediante técnicas serológicas y moleculares la presencia de Neospora caninum en búfalos de agua (Bubalus bubalis) en Unidades de Producción Bufalinas (UBP) de Veracruz, Tabasco y Oaxaca, México. Fue un estudio observacional transversal y por conveniencia. El periodo de estudio fue de septiembre de 2015 a junio de 2017. El tamaño de muestra se determinó con el programa Win episcope ver 2.0, en la modalidad de estimar proporciones, con población desconocida, prevalencia esperada de 25%, nivel de confianza de 95% y un error permitido de 5%, por lo que se obtuvieron 191 muestras sanguíneas de búfalos de agua de diferentes edades y de ambos sexos. Para la detección de anticuerpos IgG contra Neospora caninum las muestras fueron procesadas por medio de un kit comercial de la marca IDEXX®-Laboratories (Sensibilidad 98.6% y Especificidad de 98.9%). Para la extracción de ADN se utilizó un kit comercial (Ultraclean DNA BloodSpin® MOBIO Lab.), siguiendo las instrucciones del fabricante, y los iniciadores utilizados fueron el NF1, NS1, NR1 y SR1, sintetizados por InVitrogen®, USA. El desarrollo de la técnica para PCR anidado en un solo tubo para Neospora caninum fue bajo las siguientes condiciones de reacción (Ellis et al., 1999). Se calcularon las seroprevalencias y prevalencias (cruda y específica respectivamente) utilizando el software estadístico STATA versión 11.0. La seroprevalencia general fue de 59.1% (IC95% 51.8-66.2) y Tabasco fue el estado que presentó la mayor seroprevalencia 61.6% (IC95% 50.5-71.9). Por PCR, la

235 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México prevalencia fue de 49.2% (IC95% 41.9-56.3) y Veracruz fue el estado que presentó la mayor prevalencia con el 68.4% (IC95% 54.3-56-5). Es el primer reporte donde se confirmó la presencia del ADN de Neospora caninum en búfalos de agua (Bubalus bubalis) en las UBP de los estados de Veracruz, Tabasco y Oaxaca, México. Palabras clave: Water buffaloes, Neospora caninum, ELISA, PCR, Mexico.

INTRODUCCIÓN

El búfalo de agua (Bubalus bubalis) junto con el búfalo de pantano cuenta con 19 razas, las más conocidas a nivel mundial incluyen la Mediterránea, Murrah, Carabao y Jafarabadi, es considerado un animal con gran auge a nivel mundial en los últimos años, debido a su adaptabilidad en ambientes donde el bovino no puede desarrollarse (Almaguer, 2007). Su importancia económica radica en que es un animal de triple propósito, ya que se puede obtener leche, carne y tracción animal (Pipaon, 2000). La domesticación comenzó en Irán y Pakistán (Ramesha et al., 2017), siendo utilizado como animal de trabajo en campos de arroz (Meenakshi et al., 2007), para 1880 que fue introducido a Latinoamérica, principalmente en Argentina y Brasil; en 1990 llegó a México ubicándose en el sureste del país por tener el ambiente adecuado para desarrollarse correctamente, desde entonces la crianza para consumo de carne y elaboración de quesos ha ido en aumento (Almaguer, 2007). Se ha demostrado que el búfalo de agua puede llegar a poseer muchas de las enfermedades que afectan al ganado bovino, tanto infecciosas como parasitarias, pero el búfalo de agua resulta ser más resistente y presenta pocos signos clínicos; además, posee una tasa de mortalidad muy baja que va del 2% al 4% (Pipaon, 2000; Reichel et al., 2015).

La neosporosis, es una enfermedad causada por el protozoario Neospora caninum el cual se encuentra en animales domésticos y silvestres (Dubey, et al., 1998), incluido el búfalo de agua (Bubalus bubalis) como hospedero intermediario (Dubey y Schares, 2011). La importancia de esta enfermedad radica en ser una de las principales causas de abortos en el ganado bovino, causa de problemas reproductivos y disminución en la producción láctea; la falta de signos clínicos, especialmente en búfalos, hace difícil el diagnóstico (Barbosa, et al., 2017). La presencia de anticuerpos de Neospora caninum en búfalos de agua fue reportada en Vietnam (Huong et al., 1998), Egipto (Dubey et al., 1998), Italia (Guarino et al., 2000), Brasil (Fujii et al., 2001), Argentina (Campero et al., 2007) siendo estos dos últimos países los que reportan una mayor prevalencia en comparación con países europeos y asiáticos (Jara et al., 2011).

En México, mediante serología se ha reportado una prevalencia de neosporosis en hatos de ganado bovino en un rango de 10-100% y en ganado de carne de 8.6- 15% (Morales et al., 2001; García-Vázquez et al., 2009). En el estado de Veracruz, la seroprevalencia reportada de neosporosis en ganado bovino de diversas razas fue de 20.8% (Montiel-Peña et al., 2011). Sin embargo, no es una enfermedad de

236 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México control oficial en ningún país incluyendo a México, no se conoce actualmente un tratamiento específico o vacuna que proteja contra este parásito, por lo que es importante identificar la presencia de Neospora caninum en hatos bufalinos del sureste mexicano.

OBJETIVO

Detectar mediante técnicas serológicas y moleculares la presencia de Neospora caninum en búfalos de agua (Bubalus bubalis) en unidades de producción bufalinas de Veracruz, Tabasco y Oaxaca, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Lugar de estudio: El presente trabajo se realizó en Unidades de Producción Bufalina (UPB) ubicadas en cinco municipios de los estados de Veracruz (Cd. Isla, Misantla, Papantla), Tabasco (Cárdenas, Huimanguillo) y Oaxaca (Matías Romero). El periodo de estudio fue de septiembre de 2015 a junio de 2017.

Diseño del estudio y tamaño de muestra: Fue un estudio observacional de tipo transversal y por conveniencia. El tamaño de muestra se determinó con el programa Win episcope ver 2.0, modalidad de estimar proporciones, con población desconocida, prevalencia esperada de 25%, nivel de confianza de 95% y un error permitido de 5%, lo que dio una “n” +191búfalos (Thrusfield, 2005).

Toma de muestras sanguíneas: De cada animal se tomaron dos muestras de sangre de la vena yugular, utilizando tubos vacutainer con y sin anticoagulante (EDTA). Se transportaron en cadena fría (4°C) al laboratorio de Parasitología de la UD de la PZTM de la FMVZ de la UV. Para la obtención del suero se utilizaron las muestras de sangre sin anticoagulante, se centrifugaron a 1000 g durante 10 min, se guardó en tubos tipo Eppendorf de 0.5 ml y se conservaron -20°C hasta el diagnóstico serológico. Las muestras de sangre obtenidas con anticoagulante (EDTA) se conservaron en alícuotas de 0.5 ml a -20°C para la posterior extracción del ADN genómico.

Técnicas diagnósticas:

Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas: Para la detección de anticuerpos IgG contra Neospora caninum las muestras fueron procesadas por medio de un kit comercial de la marca IDEXX®-Laboratories (Sensibilidad 98.6%-Especificidad de 98.9%), confirmando que el conjugado anti IgG bovino reacciona con la IgG de los búfalos (Meenakshi et al., 2007; Jara et al., 2011; Neverauskas et al. 2015), se siguieron las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se utilizó un espectrofotómetro con un filtro para una densidad óptica de 650 nm (Bio Rad 680), el resultado se calculó con el programa X-Check versión 3.3.

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Prueba Anidada de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Para la extracción de ADN del parásito se utilizó un kit comercial (Ultraclean DNA BloodSpin® MOBIO Lab.), siguiendo las instrucciones del fabricante, y los iniciadores utilizados fueron el NF1, NS1, NR1 y SR1, sintetizados por InVitrogen®, USA. El desarrollo de la técnica para PCR anidado en un solo tubo para N. caninum fue bajo las siguientes condiciones de reacción (Ellis et al., 1999), ambas técnicas fueron realizadas en el Instituto Tecnológico de El Llano en Aguascalientes, México.

Análisis estadístico: Se calcularon las seroprevalencias y prevalencias (cruda y específica respectivamente) utilizando el software estadístico STATA versión 11.0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El Cuadro 1, muestra los resultados por la prueba de ELISA, de tres diferentes estados y seis UPB. Donde 113/191 búfalos de agua presentaron anticuerpos contra N. caninum siendo la seroprevalencia general de 59.1% (IC95% 51.8-66.2) y Tabasco fue el estado que presentó la mayor seroprevalencia 61.6% (IC95% 50.5- 71.9). Cuadro 1. Seroprevalencia de Neospora caninum en búfalos de agua de UPB de Veracruz, Tabasco y Oaxaca, México. Total Búfalos Seroprevalencia Estado Municipio IC Búfalos Positivos (%) 95%* Cd. Isla 24 14 58.3 36.6-77.8 Veracruz Misantla 13 8 61.5 31.5-86.1 Papantla 36 19 52.7 35.4-69.5

Sub-total 73 41 56.1 44.0-67.7 Tabasco Huimanguillo 31 18 58 39.0-75.4 Cárdenas 55 35 63.6 49.5-76.1 Sub-total 86 53 61.6 50.5-71.9 Oaxaca Matías Romero 32 19 59.3 40.5-76.3 Sub-total 32 19 59.3 40.6-76.3 Total 191 113 59.1 51.8-66.2 *IC= Intervalo de Confianza al 95%.

Diversos estudios sugieren que la seroprevalencia es mayor en búfalos de agua que en bovinos; sin embargo, estos presentan menos signos clínicos así como presencia de abortos (Guarino et al., 2000; Moore et al., 2014). Por el contrario, en un estudio en Brasil la prevalencia de Neospora caninum fue mayor en bovinos que en búfalos, pero sin presentar una diferencia significativa (Barbosa et al., 2017).

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El Cuadro 2, presenta la prevalencia general obtenida por la presencia de ADN de N. caninum por estado y municipio del total de búfalos muestreados, 94/191 resultaron positivos con el 49.2% (IC95% 41.9-56.3) y Veracruz fue el estado que presentó la mayor prevalencia con el 68.4% (IC95% 54.3-56-5).

Cuadro 2. Prevalencia por la presencia de ADN de Neospora caninum en búfalos de agua de UBP de Veracruz, Tabasco y Oaxaca, México. Total Búfalos Prevalencia Estado Municipio IC Búfalos Positivos (%) 95%* Cd. Isla 24 15 62.5 40.5-81.2 Veracruz Misantla 13 9 69.2 38.5-90.9 Papantla 36 26 72.2 54.8-85.7 Sub-total 73 50 68.4 54.3-56-5 Cárdenas 55 7 12.7 44.9-24.4 Tabasco Huimanguillo 31 23 74.1 55.3-88.1 Sub-total 86 30 34.8 51.3-24.9 Oaxaca Matías Romero 32 14 43.7 87.6-26.6 Sub-total 32 14 43.7 87.6-26.6 Total 191 94 49.2 41.9-56.5 *IC= Intervalo de Confianza al 95%.

Auriemma et al. (2014) reportaron la presencia de ADN de Neospora caninum en tejidos de búfalos de agua en un 51%, resultado muy similar a este trabajo, en ambos casos se utilizaron oligonucleótidos pertenecientes a la misma región del parásito. Por otro lado, Okeoma et al. (2005) identificaron el parásito circulante en sangre en bovinos, concordando con que en la primera semana era detectable y los únicos animales que diferían de esto eran los que se encontraban gestantes. Sin embargo, con los animales que abortaban disminuía rápidamente la cantidad de parásitos en sangre. En un estudio realizado en ganado lechero naturalmente infectado O’Handley et al. (2006), reportaron en ovejas inoculadas, que 2/6 resultaron positivas a los 7 días post-inoculación y las 6 resultaron positivas a los 32 días post-inoculación. En cambio, Montiel-Peña et al. (2011) notificaron 4/12 bovinos positivos que además resultaron positivos a serología.

Los resultados entre ambas pruebas indican el comportamiento activo de la enfermedad dentro de la UPB, debido a la alta seroprevalencia, lo cual es un indicador de que los animales han desarrollado una inmunidad a la enfermedad observándose animales congénitamente infectados aun sin signología. En el caso de la detección de ADN del parásito la mayor prevalencia se presentó en bucerros, lo que corrobora la transmisión transplacentaria (madre-feto). Estudios realizados por Collantes, 2002; Okeoma et al., 2005, reportaron que el número de parásitos en sangre disminuye cuando los anticuerpos comienzan a ser detectados; sin embargo, se puede dar la presencia de ambos a causa de reactivaciones.

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CONCLUSIÓN

Es el primer reporte donde se confirmó la presencia del ADN de Neospora caninum en búfalos de agua (Bubalus bubalis) en las UPB de los estados de Veracruz, Tabasco y Oaxaca, México.

REFERENCIAS

Almaguer Pérez Yanara. 2007. El búfalo, una opción de la ganadería. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080807.html Fecha de consulta: 28 de septiembre, 2015. Auriemma Clementina, Lucibelli Maria Gabriela, Borriello Giorgia, De Carlo Esterina, Martucciello Alessandra, Schiavo Lorena, Gallo Amalia, Bove Francesca, Corrado Federica, Girardi Santa, Amoroso Maria Grazia, Uberti Degli Barbara, Galiero Giorgio. 2014. PCR detection of Neospora caninum in water buffalo foetal tissues. Acta Parasitologica. 59(1):1-4. Barbosa da Silva Jenevaldo, Romero Nicolino Rafael, Fagundes Gisele Maria, dos Anjos Bomjardim Henrique, dos Santos Berlo Reis Alessandra, da Silva Lima Danillo Henrique, Chaves Oliveira Carlos Magno, Diomedes Barbosa José, da Fonseca Adivaldo Henrique. 2017. Serological survey of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in cattle (Bos indicus) and water buffaloes (Bubalus bubalis) in ten provinces of Brazil. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 52:30-35. Campero, Carlos Manuel, Pérez, A., Moore, Dadin Prando, Crudeli, Gustavo, Benítez, D., Draghu, M.G., Cano, Dora, Konrad, Jose Luis, Odeon, Anselmo C. 2007. Ocurrence of antibodues against Neospora caninum in water buffaloes (Bubalus bubalis) on four ranches in Corrientes province, Argentina. Veterinary Parasitology. 150:155-158. Collantes F. E. 2002. Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR. Journal of Clinical Microbiology, Washington. 40 (4):1194-1198. Dubey J.P., Romand S., Hilali M., Kwok O. C., Thulliez P. 1998. Seroprevalence of antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in water buffaloes (Bubalus bubalis) from Egypt. International Journal of Parasitology. 28:527- 529. Dubey J.P., Schares. G. 2011. Neosporosis in animals-The last five years. Veterinary Parasitology. 180: 90-108. Ellis J. T., McMillan D., Ryce C., Payne S., Atkinson R., Harper P. A. 1999. Development of a single tube nested polymerase chain reaction assay for the detection of Neospora caninum DNA. International Journal of Parasitology. 29:1589-1596. Fujii T. U., Kasai N., Nishi S. M., Dubey J. P., Gennaris. M. 2001. Seroprevalence of Neospora caninum in female water buffaloes (Bubalus bubalis) from the southeastern region of Brazil. Veterinary Parasitology. 99:331-334.

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García-Vázquez Zeferino, Rosario-Cruz Rodrigo, Mejia-Estrada Félix, Rodríguez Vivas Iván, Romero-Salas Dora, Fernández-Ruvalcaba Manuel, Cruz- Vázquez Carlos. 2009. Seroprevalence of Neospora caninum antibodies in beef cattle in three southern states of Mexico. Tropical Animal Health and Production. 41:749-753. Guarino A., Fusco G., Savini G., Di Francesco G., Cringoli G. 2000. Neosporosis in water buffalo (Bubalus bubalis) in southern Italy. Veterinary Parasitology. 91:15-21. Huong L.T.T., Ljungström, B.L Uggla, A., Björkman, C. 1998. Prevalence of antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in cattle and water buffaloes in southern Vietnam. Veterinary Parasitology. 75: 53-57. Jara V. J., Chávez V. A., Casas A. E., Sánchez P. N., Moreno-López J., Merza M. 2011. Determinación de anticuerpos contra Neospora caninum en búfalos de agua (Bubalus bubalis) en la amazonia peruana. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú. 22(1): 61-65. Meenakshi K.S., Sandhu M.S., Ball M.S., Kumar H., Sharma S., Sidhu P.J., Sreekumar C., Dubey J.P. 2007. Seroprevalence of Neospora caninum antibodies in cattle and water buffaloes in India .Journal Parasitology. 93(6):1374-1377. Montiel-Peña T., Romero Salas D., García-Vázquez Z., Medina-Esparza L., Cruz- Vázquez C. 2011. Neosporosis bovina en ranchos ganaderos de la zona Norte del estado de Veracruz, México. Tropical and Sobtropical Agroecosystems. 13: 469-479. Morales S. Elizabeth, J. Trigo T. Francisco, Ibarra V. Froylan, Eduardo C. Puente, Mario Santacruz. 2001. Seroprevalence study of bovine neosporosis in Mexico. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 13:413-415. Neverauskas C.E., Nasir A., Reichel M.P. 2015. Prevalence and distribution of Neospora caninum in water buffalo (Bubalus bubalis) and cattle in the Northern territory of Australia. Parasitology International. 64:392-396. Okeoma CM, Williamson NB, Pomroy WE, Stowell KM, Gillespie L. 2005. The use of polymerase chain reaction to detect Neospora caninum deoxyribonucleic acid in the blood of naturally infected cows. Veterinary Parasitology. 122:307-315. Pipaon E. C., Hincapie J. J. 2000. Búfalos de agua: la especie del tercer milenio. Zamorano, Tegucigalpa, Honduras. Prografip. 170. Ramesha K.P., Rao AKhila, Alex Rani, Geetha G.R., Basavaraju M., Kataktalware M.A., Das D.N., Jeyakumar S. 2017. Screening for genetic disorders in indian murrah and surti buffalo (Bubalus bubalis) bulls. Buffalo Bulletin. 36(1):133.142. Reichel Michael P., McAllister Milton M., Nasir Amar, Moore Dadin Prando. 2015. A review of Neospora caninum in water buffalo (Bubalus bubalis). Veterinary Parasitology. 212:75-79. Thrusfield M. 2005. Veterinary Epidemiology (3rd d). Blackwell Science Ltd. Oxford, Uk. 233-234.

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DISTRIBUCIÓN POTENCIAL DE Amblyomma mixtum EN EL ESTADO DE VERACRUZ, MÉXICO

POTENTIAL DISTRIBUTION OF Amblyomma mixtum IN THE STATE OF VERACRUZ, MEXICO

Aguilar DM1*, Romero SD1, Serna LR2, Feria A TP3, Esteve GMD4, Cruz RA1, Pérez de León AA5

1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Circunvalación S/N, Esq. Yáñez, Col. Unidad Veracruzana. CP. 91710. Veracruz, México. 2Unidad de Manejo y Conservación de Recursos genéticos, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad Veracruzana, región Orizaba- Córdoba. 3Departamento de Biología de la Universidad del Valle del Río Grande de Texas, Ediburg, Texas. 4 Departamento de Patobiología, Colegio de Medicina Veterinaria, Universidad de Texas A & M. College Station, TX, USA. 5United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory, and Veterinary Pest Genomics Center, 2700 Fredericksburg Road, Kerrville, TX 78028, USA. Co-autor para correspondencia: *[email protected]

RESUMEN

Amblyomma mixtum se distribuye desde el sur de Texas hasta Centroamérica; esta garrapata se localiza parasitando a bovinos, equinos y otros mamíferos silvestres en zonas tropicales de México. Por esto, la población rural está expuesta a la mordedura de este ectoparásito y en riesgo de ser infectados por los patógenos que transmite. El objetivo de esta investigación fue determinar la distribución potencial de A. mixtum en Veracruz, México. Para la modelación de la distribución potencial, se usó el software Maxent v. 3.4.1, en el cual se cargaron geolocalizaciones de la especie a partir de un muestreo de campo, 19 capas climáticas y una topográfica, a una resolución de 30 s de arco, las cuales fueron extraídas para las coordenadas extremas del territorio mexicano. El mapa de distribución potencial de A. mixtum determinó que, la Llanura Costera del Golfo de México, representa una mayor probabilidad de presencia de condiciones climáticas en el territorio Veracruzano, con un alto potencial del nicho ecológico para el desarrollo de poblaciones de A. mixtum. Es importante agregar que los estados de Tamaulipas, San Luis Potosí, Hidalgo, Puebla, Oaxaca y Campeche, reúnen en menor proporción las condiciones ambientales idóneas como hábitat de esta garrapata. Este estudio pone de manifiesto que A. mixtum es una especie endémica de México y particularmente de la región denominada Llanura Costera del Golfo de México. Esta predicción refuerza las hipótesis filogenéticas y

242 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México morfológicas de que A. mixtum es una especie diferente del complejo A. cajennense, ya que su nicho ecológico está restringido a una región geográfica particular, adaptada a condiciones ambientales específicas. Palabras claves: Potential distribution, Amblyomma mixtum, Veracruz, Mexico.

INTRODUCCIÓN

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos que afectan económicamente la ganadería, debido a sus efectos directos en la transmisión de patógenos a bovinos (Alekseev et al., 2004; Jongejan et al., 2004). Amblyomma mixtum, perteneciente a la familia Ixodidae, presenta un ciclo biológico trioxeno; parasita a animales silvestres, domésticos y al hombre (Lopes et al., 2008). En México, se ha reportado que esta especie parasita a bovinos, equinos, caninos y venados (Guzman-Cornejo et al., 2011). En unidades de producción (UP) de bovinos, esta garrapata se presenta a altas infestaciones y transmite enfermedades zoonóticas (Lopes et al., 2000). Tiene una amplia distribución, desde el sureste de Texas, EEUU hasta el Noreste de Argentina (Nava et al. 2014; Almazan et al., 2016). Algunos datos sobre las condiciones climáticas de A. mixtum en diferentes regiones ecológicas de México (González-Cerón et al., 2009), indican que esta especie tiene presencia en lugares que van desde 1 hasta 1000 msnm y a temperaturas promedio de 16°C (rango de 13 a 26°C) (Serra, 1982). Sin embargo, a pesar de ser la segunda especie de garrapata con mayor importancia por su parasitismo en bovinos (Almazán et al., 2016), no se tiene conocimiento de la distribución potencial, ni de las condiciones climáticas en las que se desarrollan sus poblaciones, información básica para proponer medidas de control (Estrada- Peña et al., 2004; Gonzalez-Cerón et al., 2009; Guzman-Cornejo et al., 2011; Almazan et al. 2016). En este sentido, la modelación del nicho ecológico ayuda a discernir las determinantes bioclimáticas y a delimitar las áreas de distribución de garrapatas (Raghavan et al., 2016). En Veracruz, el hato ganadero ronda las 3,926.683 cabezas de ganado bovino, distribuidas en el Norte, Centro y Sur del estado. Considerando que en las regiones ecológicas de Veracruz, las UP son clasificadas como intensivas (producción de leche o carne) y de doble propósito (producción de leche y carne), que el ganado se mueve entre las diferentes zonas del estado y del país, incrementando la transferencia de garrapatas (Román et al., 2012). Por las razones anteriormente expuestas, es necesario elaborar un modelo de distribución geográfica potencial de A. mixtum para México, que contribuya en los métodos de control estratégicos y delimitar zonas de cuarentena para esta especie en la ganadería del trópico mexicano.

OBJETIVO

Determinar la distribución potencial de Amblyomma mixtum en el estado de Veracruz, México.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio. Esta investigación delimitó como área de estudio a las diez regiones naturales que comprende el estado de Veracruz: Huasteca Alta, Huasteca Baja, Totonaca, Nautla, Capital, Sotavento, Montañas, Papaloapan, Tuxtlas y Olmeca (INAFED, 2010). De acuerdo con Beck et al. (2011), indican que entre agosto y diciembre, se presentan los picos de mayor infestación de garrapatas en bovinos; por tal motivo, la recolecta se realizó de agosto de 2014 a enero de 2015, periodo de mayor presencia de garrapatas. Recolección de garrapatas. Se colectaron garrapatas de 41 municipios en hospederos: bovinos, équidos y de la vegetación, en las 10 regiones naturales que comprende el estado. Durante la visita a los ranchos, los animales se revisaron de cabeza a cola. Los ejemplares de garrapatas fueron desprendidos a contra pelo, mediante suaves movimientos manuales de tracción. Adicionalmente, se recolectaron garrapatas de la vegetación mediante la técnica de bandera (Álvarez y Bonilla, 2007). Todos los especímenes fueron trasladados al Laboratorio de Parasitología, ubicado en la Posta Zootécnica Torreón del Molino de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. Los individuos fueron identificados morfológicamente de acuerdo a las claves taxonómicas establecidas por Guglielmone y Nava (2010), Guzmán-Cornejo y Robins (2010) y Guzmán-Cornejo et al. (2011). Los machos y hembras se separaron para ser cuantificados. Elaboración del modelo de distribución potencial. Se registraron las coordenadas geográficas de cada UP muestreada con un GPS Garmin®. Con el software ArcMap v. 10.3.1, se realizó un mapa de la presencia de garrapatas en las diferentes regiones naturales de Veracruz, en el sistema WGS84 y proyección cónica de Lambert. Para la modelación de la distribución potencial de A. mixtum, se utilizaron 19 capas climáticas (10 de temperatura y 9 de precipitación) y una topográfica (modelo digital de elevación), a una resolución de 30 s de arco, lo que equivale a ≈1 Km2 a nivel ecuatorial (Hijmans et al., 2005). La información correspondiente a cada celda de cada capa, representa los valores ambientales interpolados a partir de datos observados entre los años 1950 y 2000. Estas capas fueron extraídas para las coordenadas extremas: límite Norte: 33°, límite Sur 14°; límite Este -86° y límite Oeste -119°, garantizando la inclusión del territorio Mexicano. Adicionalmente, se emplearon nueve parámetros bioclimáticos para la superficie continental de México, calculados por estación climática a partir de la base climatológica diaria de 1902 a 2011 del Servicio Meteorológico Nacional conforme la metodología de ANUCLIM, mismas que fueron descargadas del Atlas Climático Digital de México (Fernández-Eguiarte et al., 2012).

El modelo de distribución A. mixtum se construyó utilizando el software Maximum Entropy Species Distribution Modeling o MaxEnt® v. 3.4.1, que produce una distribución de probabilidad binomial continua, cuya salida es un mapa que

244 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México representa la adecuación del hábitat según las variables climáticas de importancia para la especie. MaxEnt ejecuta la transformación clog-log para estimar la probabilidad de ocurrencia. La transformación de cloglog deriva de la interpretación recientemente publicada de MaxEnt como un proceso de distribución Poisson no homogéneo, lo que le da una justificación teórica robusta en contraste con la transformación logística que reemplaza por defecto la probabilidad del área a la región proyectada (Phillips et al., 2017).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La Figura 1, representa el mapa de las geolocalizaciones de garrapatas de A. mixtum. En dicho mapa, se observa un muestreo aleatorio, donde se logró capturar 3281 ejemplares, pertenecientes a diez regiones, clasificadas como zonas naturales de Veracruz. Se usaron 41 geolocalizaciones para la modelación de la distribución potencial de la especie, el modelo obtenido arrojó un 6.37 de coeficiente de entropía y un AUC de 0.985 para los datos de entrenamiento y 0.982 para los datos de prueba. La Figura 1 representa el modelo distribución potencial de A. mixtum en el territorio mexicano. Este mapa determinó que, la Llanura Costera del Golfo de México (mayor proporción de territorio de Veracruz), presenta un alto potencial de condiciones climáticas favorables para el desarrollo de poblaciones de A. mixtum. Es importante agregar, que la distribución potencial determinó, en menor proporción territorial a los estados de Tamaulipas, San Luis Potosí, Hidalgo, Puebla, Oaxaca y Campeche, con condiciones ambientales idóneas como hábitat de esta garrapata. El mapa determinó en color rojo que indica un 70% de probabilidad del territorio que reúne condiciones ambientales óptimas del nicho ecológico de esta especie, mientras que escala de gradientes de color diferente al rojo, determina una probabilidad baja (<70%), lo que es indicador de áreas que no reúnen las condiciones ecológicas (Figura 1). La temperatura y sus derivaciones, fueron las variables de mayor importancia climática donde se ubicaron las geolocalizaciones de A. mixtum. De manera particular, las variables que contribuyeron con mayor porcentaje al modelo fue la Bio2: oscilación diurna de la temperatura (°C), Bio14: Precipitación del periodo más seco (mm); Bio3: Isotermalidad (°C); evaporación anual y altitud (DEM), que en su conjunto explican el 90% del nicho ecológico de A. mixtum. Las variables restantes aportaron menos del 2% de importancia climática al modelo generado. En este estudio se observó que A. mixtum se encuentra parasitando bovinos y equinos de las diez regiones ecológicas de Veracruz, considerando temperaturas de 27°C y 8°C como máxima y mínima, respectivamente.

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Figura 1. Distribución potencial de A. mixtum en México, elaborado con el software MaxEnt.

Nuestros resultados son consistentes con lo establecido por Estrada-Peña et al. (2004): A. mixtum tiene presencia en temperaturas menores a 16°C, que se presentan en el trópico, subtrópico y región de la montaña (Geissert, 1999; Zsabó et al., 2009; Beck et al., 2011).

Estrada-Peña et al. (2004), mencionan que A. cajennese (s.l.) ha logrado adaptarse a las diferentes condiciones climáticas de la república mexicana, teniendo como principal hospedero a équidos, y que estos por su tipo de trabajo y recorrido, pueden dispersar con mayor facilidad esta especie (Labruna et al. 2002, 2004; Álvarez y Bonilla, 2007). En el presente trabajo se observó que tanto la temperatura así como los équidos, juegan un papel fundamental en la presencia y distribución de A. mixtum. Es importante mencionar que la sobrevivencia de las garrapatas depende de la relación parásito-hospedero (Hoogstraal y Aeschlimann 1982; Chacon et al., 2002; de Oliveira, 2004).

Los resultados obtenidos en esta investigación ponen de manifiesto la presencia de A. mixtum, que antiguamente se había considerado como A. cajennense, en las diez regiones naturales de Veracruz (Nava et al., 2014). Esto es un punto de

246 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México partida importante para la realización de estudios y diagnósticos confirmatorios a través de microscopía electrónica, biología molecular y filogenética de la especie para entender los procesos ecológicos y determinar el centro de origen de esta garrapata (Beati et al., 2013).

El modelo de distribución potencial desarrollado en este trabajo, refuerza las hipótesis filogenéticas (Beati et al., 2013) y morfológicas (Nava et al., 2014), de que A. mixtum es una especie diferente del complejo A. cajennense, ya que su nicho ecológico está restringido a una región ecogeográfica particular, adaptada a condiciones ambientales específicas; es posible que esta especie se encuentre en un proceso de especiación, ya que su población está aislada reproductivamente de las especies del complejo A. cajennense y está acumulando diferencias genéticas que la distinguen del complejo de especies de las que forma parte. A. mixtum muestra ser una especie con plasticidad fenotípica, restringida a las condiciones de temperatura que imperan en su nicho ecológico, condición ambiental a la cual responde, limitando su dispersión. El gradiente de altitud forma una barrera ecológica importante en la restricción de la distribución geográfica de esta especie; es decir, las condiciones geográficas de Sierra Madre Oriental fungen como una barrera ambiental que limita la distribución de esta especie, ya que a mayor altitud la temperatura desciende y es posible que A. mixtum no tolere los extremos de temperatura en estas condiciones de altitud (Illoldi-Rangel y Escalante, 2008).

CONCLUSIÓN La presencia de esta garrapata en bovinos, equinos y en la vegetación en las principales zonas ganaderas de México tiene importantes implicaciones en la salud animal y pública, es importante tomar en cuenta esta información en los programas de control, así como ampliar los estudios del impacto zoonótico ocasionado por la presencia de esta garrapata. Este trabajo representa la primera aproximación de la distribución potencial de A. mixtum en México, cuya distribución está restringida a la Llanura Costera del Golfo de México. La temperatura es la limitante ambiental que restringe la distribución de esta especie, siendo los 27 °C y 8 °C, los límites de tolerancia de la especie. A. mixtum, lo que la convierte en una especie endémica para México, con un nicho ecológico restringido, lo que permite diferenciarla del complejo A. cajennense. REFERENCIAS Alekseev, AN, Dubinina HV, Jushkova OV (2004) First report on the coexistence and compatibility of seven tick-born pathogenes in unfed adult Ixodes Persulcatus Schulze (Acari: Ixodidae). International Journal of Medicina and Microbiology. 293 (37): 104-108.

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Almazán C, Torres-Torres A, Torres-Rodríguez L, Soberanes-Céspedes N, Ortiz- Estrada M (2016) Aspectos biológicos de Amblyomma mixtum (Koch, 1844) en el noreste de México. Quehacer Científico en Chiapas. 11: 10-19. Álvarez VV, Bonilla RM (2007) Adultos y ninfas de la garrapata Amblyomma cajennense Fabricius (Acari: Ixodidae) en equinos y bovinos. Agronomía Costarrisense. 31(1): 61-69. Beati, L., Nava, S., Burkman, J. E., Barros-Battesti, D. M., Labruna, M. B., Guglielmone, A. A., Cáceres, A. G., Guzmán-Cornejo, C. M., León, R., Durden, L. A. y Faccini, J. L. H. (2013). Amblyomma cajenense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae), the Cayenne tick: phylogeofraphy and evidence for allopatric speciation. BMC Evolutionary Biology. 13: 267. Beck D L., Zavala J, Montalvo E O, Quintana G F. (2011). Meteorological Indicators for Amblyomma cajennense and Population Dynamics in the Tamaulipan Biotic Province in Texas. Journal of Vector Ecology. 36 (1). Estrada-Peña A, Guglielmone AA, Mangold AJ (2004) The distribution and ecological “preferences” of the tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae), an ectoparasite of humans and other mammals in the Americas. Annals of Tropical Medicine and Parasitology. 98: 283-292. Fernández-Eguiarte A, Zavala-Hidalgo J, Romero-Centeno R (2012) Meteorological drought in the Digital Climatic Atlas of Mexico. ICAN, The Newsletter of the International Coastal Atlas Network, Volume One Number 1, March 2012, p.13 González-Cerón F, Becerril-Pérez CM, Torres-Hernández G, Díaz-Rivera P (2009) Ticks infesting body regions of tropical milking criollo cattle in Veracruz, México. Agrociencia. 43: 11-19. Guglielmone, A.A., Nava, S. (2010). Hosts of Amblyomma dissimile Koch, and Amblyomma rotundatum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae). Zootaxa 2541, 27– 49. Guzmán-Cornejo, C., Robbins, R.G. (2010). The genus Ixodes (Acari: Ixodidae) in Mexico: adult identification keys, diagnoses, hosts, and distribution. Revista Mexicana de Biodiversidad. 81: 289–298. Guzmán-Cornejo C, Robbins R, Guglielmone AA, Montiel-Parra G, Pérez TM (2011) The Amblyomma (Acari: Ixodidae) of Mexico: identification keys, distribution and hosts. Zootaxa. 2998: 16-38. Illoldi-Rangel P, Escalante T (2008) De los modelos de nicho ecológico a las áreas de distribución geográfica. Biogeografía 3: 7-12. INAFED. 2010. Instituto Nacional para el Federalismo y el Desarrollo Municipal. Labruna MB, Souza LPS, Menezes AC, Horta MC, Pinter A, Gennari SM (2002) Life-cycle and host specificity of Amblyomma tigrinum (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental Applied Acarology 24: 115-125. Labruna, MBLeite RC, Gobesso AA deO, Gennari SM, Kasai N (2004) Controle estratégico do carrapato Amblyomma cajennense em eqüinos. Ciência Rural. 34: 195-200. Lopes CML, de Oliveira PR, Haddad JPA, Pinheiro RR, de Freitas CMV, Paz GF, Leite RC (2000) Reproductive parameters and Conversion Efficiency Index

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(CEI) of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae) females under field and laboratory conditions. Revue Méd. Vét. 151: 945-948. Lopes CML, Oliveira PR, Haddad JP, Domingues LN, Pinheiro RR, Borgues LMF, Labruna MB, Leite RC (2008) Biological parameters of ticks (Amblyomma cajennense fabricius, 1787) under field and laboratory conditions in Pedro Leopoldo, State of Minas Gerais, Brazil Rev. Bras. Parasitol. Vet. 17: 14-17. Nava S, Beati L, Labruna MB, Cáceres AG, Mangold AJ, Guglielmone AA (2014) Reassessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) with the description of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum Koch, 1844, and Amblyomma sculptum Berlese, 1888 (Ixodida: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dissease. 5(3): 252-276. Phillips SJ, Dudík M, Schapire RE (2004) A maximum entropy approach to species distribution modeling. In Proceedings of the twenty-first international conference on Machine learning (p. 83). ACM. Raghavan RK, Goodin DG, Hanzlicek GA, Zolnerowich G, Dryden MW, Anderson GA, Ganta RR (2016) Maximum entropy-based ecological niche model and bio-climatic determinants of Lone Star Tick (Amblyomma americanum) niche. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 16(3), 205-211. Román HP, Aguilera RS, Patraca AF (2012) producción y comercialización de ganado y carne de bovino en el estado de Veracruz. Cómite Nacional de Sistema Producto Bovinos Carne. 28 p.

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MORFOMÉTRÍA DE Amblyomma mixtum EN VERACRUZ, MÉXICO MORPHOMETRIC OF Amblyomma mixtum IN VERACRUZ, MEXICO Aguilar DM*1, Romero SD1, Rosas SGH2, Serna LR3, Pérez de León AA4

1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Circunvalación S/N, Esq. Yáñez, Col. Unidad Veracruzana. CP. 91710. Veracruz, México. 2Red de estudios Moleculares Avanzados, Área de Microscopía Avanzada, Cluster Científico y Tecnológico BioMimic, Carretera Antigua a Coatepec 351, El Haya, Xalapa, Veracruz. 3Unidad de Manejo y Conservación de Recursos Genéticos, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad Veracruzana, región Orizaba-Córdoba. 4United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory, and Veterinary Pest Genomics Center, 2700 Fredericksburg Road, Kerrville, TX 78028, USA. Correo electrónico*: [email protected]

RESUMEN

A. cajennense (s. l) es la segunda garrapata de importancia parasitaria en bovinos del trópico mexicano, como vector de patógenos. Estudios a partir de análisis morfométricos, indican que esta garrapata es un complejo de seis especies diferente. El objetivo de esta investigación fue determinar la especie de garrapata que se distribuye en Veracruz, México, mediante microscopía electrónica y análisis de 22 características morfométricas. Se evaluaron 40 machos y 40 hembras a un análisis de microscopia electrónica (marca JEOL IT300 LV), con lo cual se midieron 20 y 22 características morfométricas, respectivamente, las cuales fueron usadas para determinar la especie, al contrastarla con las claves taxonómicas específicas. De cada variable analizada, se determinaron las estadísticas descriptivas básicas. Posteriormente, se realizó un análisis de componentes principales para hembras y para machos. Se calcularon los clúster con el método outtree y se realizó un dendrograma para agrupar a los ejemplares con respecto a sus características morfométricas. Estos análisis se realizaron con el programa SAS® versión 9.2. Con 10 componentes principales se explica el 77% de la variación morfológica de las garrapatas, lo cual evidencia una escasa variación entre especímenes hembras de la misma especie, mientras que el dendograma agrupó a 6 clusters de ejemplares con características similares. Al igual que en hembras, en machos la variabilidad morfométrica se describió en ocho componentes principales, lo cual evidencia una escasa variación entre ejemplares machos de la misma especie, mientras que el dendograma agrupó en seis clusters a los ejemplares con características morfométricas similares. Con estos resultados y con las claves taxonómicas se determinó que la especie que se distribuye en el estado de Veracruz es A. mixtum.

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Palabras claves: Morphometric analysis, Amblyomma mixtum, Scanning Electronic Microscopy. INTRODUCCIÓN Amblyomma cajennense (sensu lato) es la segunda garrapata en importancia ectoparasitaria en bovinos del trópico en México, debido a las pérdidas económicas en los sistemas de producción en virtud de sus efectos directos y a la transmisión de agentes patógenos con potencial zoonótico. La garrapata A. cajennense (s.l) se ha adaptado en diferentes condiciones ecológicas, incluidos ecosistemas diferentes como las praderas semiáridas y bosques secundarios subtropicales (Estrada-Peña et al., 2004). Asimismo, el área geográfica que ocupa se entremezcla con grandes barreras geográficas: Los Andes, el Golfo de México y los grandes ríos (Estrada-Peña et al., 2004). En México, se ha reportado su presencia en los estados de Tamaulipas, Veracruz, Tabasco y zonas en la Península de Yucatán. Recientemente, Nava et al. (2014) analizaron morfológicamente mediante microscopía electrónica de barrido registros existentes de A. cajennense s.l. en diferentes colecciones y determinaron que A. sculptum considerada sinonímia de A. cajennense, es en efecto una especie que se localiza en el norte de Argentina, Bolivia, Paraguay así como la costa y centro oeste de Brasil y que A. cajennense s.s. se localiza en la región amazónica, desde Rondonia, Brasil, hasta la Guayana Francesa. Así mismo, en este complejo fueron determinadas tres nuevas especies: A. tonelliae en la región del Chaco (centro- norte de Argentina hasta Bolivia y Paraguay); A. interandinum, (valle interandino de Perú) y A. patinoi (cordillera este de Colombia). De igual manera, se analizaron los especímenes “tipo” de Koch comparándolos con A. cajennense s.s., encontrando que éstas son diferentes morfológicamente, mientras que A. mixtum se localiza desde el sur de Texas, México, Centroamérica y Ecuador (Estrada- Peña, 2013).

OBJETIVO

Determinar la especie del complejo taxonómico A. cajenense (s.l) que se encuentra presente en Veracruz, México, mediante microscopía electrónica y análisis de sus características morfométricas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio. Se recolectaron garrapatas de diferentes regiones del estado de Veracruz, los especímenes que se sometieron a evaluación fueron recolectados de los municipios de Pánuco (N 22° 4' 18.664''O, 98° 10' 56.038''), Tampico Alto (N 22° 6' 53.392'', O 97° 50' 36.963''), Tuxpam (N 20° 59' 27.391'', O 97° 23' 47.993''), Naranjos de Amatlán, (N 21° 20' 8.102'', O 97° 45' 47.959''), Gutiérrez Zamora (N 20° 24' 47.999'', O 97° 2' 30.998''), Papantla (N 20° 12' 15.998'', O 97° 17' 15.997''), Nautla (N 20° 10' 54.984'', O 96° 49' 26.997''), Xalapa (N 19° 29' 55.997'', O 96° 55' 9.998''), Coatepec (N 19° 27' 42.998'', O 96° 59' 16.998''), Yanga (N 18°

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48' 9.18'', O 96° 45' 32.997''), Orizaba (N 18° 52' 16'', O 97° 5' 22.999''), Coscomatepec (N 19° 5' 19''O 97° 3' 10.998''), Puente Nacional (N 19° 20' 34.998'', O 96° 28' 6.999''), Medellín (N 18° 51' 56.999'', O 96° 17' 24.997''), Soledad de Doblado, (N 19° 3' 46.998'', O 96° 26' 7.997''), Paso de Ovejas (N 19° 16' 23.999'', O 96° 30' 5.997''), Tlacotalpan, (N 18° 36' 53.197'', O 95° 40' 13.727''), Tierra Blanca (N 18° 27' 0.288'', O 96° 22' 54.004''), Ignacio de la Llave (N 18° 43' 5.045'', O 96° 0' 52.927''), San Andrés (N 18° 27' 39.55'', O 95° 13' 19.462''), Catemaco (N 18° 30' 5.256'', O 95° 1' 51.65''), Santiago Tuxtla (N 18° 28' 3.562'', O 95° 17' 31.855''), Acayucan (N 18° 6' 43.218'', O 95° 6' 24.004''), San Juan Evangelista (N 17° 52' 31.267'', O 95° 7' 26.936'') y Jesús Carranza (N 17° 22' 1.852'', O 95° 0' 37.908'').

Identificación morfológica de especímenes con microscopio estereoscópico. Cada uno de los especímenes se colocó en un portaobjetos con la ayuda de pinzas pequeñas. Las características morfológicas de cada garrapata se observaron utilizando un microscopio de estereoscopio Motic® con cámara Moticam 1000, las cuales fueron identificadas según las claves morfológicas establecidas por Guzmán-Cornejo et al. (2011) y Nava et al. (2014). Los machos y hembras fueron separados para ser evaluados morfométricamente. Determinación de la especie por microscopía electrónica de barrido. Todo el material recolectado se revisó con el uso de un microscopio estereoscópico para elegir las garrapatas que cumplieran las características necesarias para la técnica convencional de microscopía electrónica de barrido. Se seleccionaron dos hembras y dos machos de cada región (una garrapata para vista dorsal y la otra vista ventral). Todas las muestras se colocaron en el microscopio electrónico de barrido JEOL IT300 LV para la obtención de imágenes de alta resolución. Análisis estadístico: Las relaciones morfométricas se evaluaron por separado para machos y hembras, para ello se analizaron 22 y 20 variables morfológicas, respectivamente: Largo total (LT), Largo del escudo (LE), ancho escudo (AE) largo de los ápices de la escápula al margen posterior del cuerpo (LAM), ancho total (AT), largo desde los ápices de los palpos a la córnea (LAPC), ancho del capitulum dorsal (AC) largo del capitulum dorsal (LC), largo de la base del capitulum ventralmente (LBCV), Largo total de palpo (LP),Largo Segmento I de palpo (LS1P), Largo Segmento II de palpo (LS2P), Largo Segmento III de palpo (LS3P), Ancho Segmento I de palpo (AS1P), Ancho Segmento II de palpo (AS2P), Ancho segmento III de Palpo (AS3P), Largo del hipostoma (LH), Ancho del hipostoma (AH), Largo del tarso (LT), Ancho del tarso (AT), Largo del Espiráculo (LE), Ancho del espiráculo (AE) (Nava et al., 2014). Para cada variable, se calcularon las estadísticas descriptivas básicas. Para realizar el análisis morfométrico se utilizó el método del grupo de pares no ponderado utilizando promedios aritméticos (UPGMA), con la finalidad de determinar el número de clúster con los cuáles se sintetiza la variación. El UPGMA se construyó a partir de la matriz de distancias pareadas entre los pares de

252 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México individuos. Posteriormente, se aplicó un Análisis de Componentes Principales (ACP), para determinar el número de componentes que recogen la variación morfométrica y evaluar las contribuciones de caracteres individuales a las diferencias fenólicas entre los grupos. Los vectores propios se extrajeron de una matriz en pares de las correlaciones producto-momento de Pearson de los caracteres. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SAS versión 9.0. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A través de la microscopía electrónica se observa la imagen de una garrapata macho (Figura 1) y una hembra (Figura 2) donde se presentan las características morfológicas evaluadas (1. Forma externa redondeada, 2. Surco cervical profundo, corto y en forma de coma, 3. Surco marginal completo, delimita todos los festones y continua hasta los ojos, 4. Festones más largos que anchos con pequeñas puntuaciones).

Figura 1. Vista dorsal de A. cajennense (sensu lato).

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Figura 2. Vista dorsal Amblyomma mixtum hembra.

Los resultados de las mediciones obtenidas fueron comparados con las mediciones reportadas por Nava et al. (2014), para determinar si las características aquí observadas y evaluadas corresponden a alguna de las especies del complejo Amblyomma cajennense. A través del análisis morfométricos, se determinó que en el PCA de los machos y los hembras, nueve y ocho componentes, respectivamente, lo que indica que llevaban importante información fenetica. Solo se seleccionaron nueve componentes morfometrícos derivados del APC de los 22 caracteres evaluados, ya que estos explican alrededor del 70% de la variación acumulada, indicando que las relaciones fenéticas del ácaro están determinadas por nueve componentes (variables), lo cual pone de manifiesto una reducida variación entre los grupos de machos y hembras. Los fenogramas (Figura 3 y 4) indican que las garrapatas forman grupos discretos de A. mixtum (machos y hembras). Dentro de cada uno de estos grupos, las garrapatas tienden a agruparse por caracteres morfométricos similares. Así, un único patrón fenotípico de agrupación estricta, se observó entre los individuos machos y hembras de A. mixtum.

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Figura 3. Cluster de la morfometría de las hembras de A. mixtum.

Figura 4. Cluster de la morfometría de los machos de A. mixtum.

Este estudio demuestra que la morfometria evaluada resultó congruente con los resultados de los análisis moleculares y biológicos (Labruna et al., 2011; Mastropaolo et al., 2011; Beati et al., 2013), que indicaron que A. mixtum es la especie del complejo taxonómico de A. cajennense que se encuentra presente en

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Veracruz, de igual manera coincide con lo reportado por Nava et al., (2014) donde describieron morfológicamente todas las especies. La determinación morfológica de estos taxones no es fácil en especies estrechamente relacionadas. Estas dificultades aumentan cuando se identifican hembras parcialmente alimentadas, ya que la congestión puede producir distorsiones de los caracteres morfológicos. La combinación de factores morfológicos y distribución son necesarios para la correcta determinación de especímenes problemáticos, como la especie en cuestión, que es importante vector de patógenos de importancia veterinaria y de salud pública. CONCLUSIÓN De acuerdo a las características morfométricas observadas y evaluadas de la especie del complejo taxonómico A. cajennense (s.l) se determinó que la especie que se distribuye en el estado de Veracruz es A. mixtum.

REFERENCIAS

Beati, L., Nava, S., Burkman, J. E., Barros-Battesti, D. M., Labruna, M. B., Guglielmone, A. A., Cáceres, A. G., Guzmán-Cornejo, C. M., León, R., Durden, L. A. y Faccini, J. L. H. (2013). Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) (Acari: Ixodidae), the Cayenne tick: phylogeofraphy and evidence for allopatric speciation. BMC Evolutionary Biology. 13: 267. Estrada-Peña A, Guglielmone A. A, Mangold AJ (2004) The distribution and ecological “preferences” of the tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae), an ectoparasite of humans and other mammals in the Americas. Annals of Tropical Medicine and Parasitology. 98: 283-292. Guzmán-Cornejo C, Robbins R, Guglielmone A. A, Montiel-Parra G, Pérez TM (2011) The Amblyomma (Acari: Ixodidae) of Mexico: identification keys, distribution and hosts. Zootaxa. 2998: 16-38. Labruna, M. B., Soares, J. F., Martins, T. F., Soares, H. S., Cabrera, R. R. (2011). Cross-mating experiments with geographically different populations of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae). Experimental and Applied Acarology, 54: 41–49. Mastropolo M., Nava S., Guglielmone A A. (2011). Biological differences between two allopatric populations of Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) in Argentina. Experimental & Applied Acarology. 53(4):371-5 Nava S, Beati L, Labruna MB, Cáceres AG, Mangold AJ, Guglielmone AA (2014) Reassessment of the taxonomic status of Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) with the description of three new species, Amblyomma tonelliae n. sp., Amblyomma interandinum n. sp. and Amblyomma patinoi n. sp., and reinstatement of Amblyomma mixtum Koch, 1844, and Amblyomma

256 VI I I Seminario I nternacional de Parasitología Animal 20-22 Septiembre de 2017 Guadalajara, Jalisco, México sculptum Berlese, 1888 (Ixodida: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dissease. 5(3): 252-276.

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