Latin American Journal of Pharmacy Short Communication (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense) Received: April 14, 2009 Lat. Am. J. Pharm. 29 (2): 284-8 (2010) Accepted: September 3, 2009

Fitoquímica y bioactividad de diffusum (Astereaceae), una Especie Nativa de la Patagonia Andina

Sandra M. ALCALDE 1, Carlos A. TAIRA 2, Christian HÖCHT 2, Osvaldo L. CORDOBA 3 & María L. FLORES 4*

1 Farmacología I, 3 Química Biológica II y 4 Farmacognosia. Facultad de Cs. Naturales CRIDECIT, Univ. Nac. Patagonia SJB, Km 4 9000 Comodoro Rivadavia, Argentina. 2 Farmacología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires Junín 956, Buenos Aires, Argentina.

RESUMEN. (), “mata negra”, habita el sur de Argentina. Se han des- cripto usos étnicos rituales y medicinales de la especie. Las partes aéreas evidenciaron la presencia de fla- vonoides, taninos, hidratos de carbono, proteínas, antraquinonas, saponinas, cianoglicósidos y esteroides. El análisis de los flavonoides demostró una importante variabilidad estructural. Los grupos de flavonoides detectados fueron principalmente flavonas y flavonoles 7-O-glicosilados, dihidroflavonoles e isoflavonas. El extracto alcohólico y sus fracciones, mostraron actividad frente al bioensayo de citotoxicidad de la Arte- mia salina. La actividad antimicrobiana fue moderada frente a Staphylococcus aureus. SUMMARY. “Phytochemistry and Bioactivity of Chiliotrichum diffusum (Astereaceae), a Native Species from the Andean Patagonian”. Chiliotrichum diffusum (Asteraceae), “mata negra”, inhabits the south of Argentina. Ethnic rituals and medicinal uses have been described for this species. Flavonoids, tannins, carbohydrates, pro- teins, anthraquinones, saponins, cyanoglycosides and steroids were detected in the aerial parts. The analysis of the flavonoid fraction demonstrated an important structural variability. The principal flavonoid groups detected were flavones and flavonol 7-O-glycosides, dihydroflavonols and isoflavones. The alcoholic extract and their fractions showed activity against Artemia salina cytotoxicity bioassay. The antimicrobial activity was moderate against Staphylococcus aureus.

INTRODUCCION Chiliotrichum diffusum (G. Forst.) Kuntze Se ha encontrado descripción étnica de usos (Asteraceae), “mata negra”, “romerillo”, kóor (en rituales y medicinales en forma de tatuajes y se lengua selk’nam u ona) es un arbusto de 50 a menciona, en particular, el uso de las flores de 150 cm de alto, con follaje abundante que habi- esta especie ya que “frotadas sobre los ojos acla- ta la zona andina de América del Sur, especial- raban la vista” 4,5. Se describe además como ar- mente el sur de la Patagonia de Chile y Argenti- busto forrajero, aunque no se conocen detalles na 1,2. Evidencia un amplio predominio de estructurales de sus componentes químicos. adaptación a temperaturas bajas (entre 7 y -5 Por los aspectos señalados resultó de interés °C) y al efecto seco de los vientos fuertes y la especie para su estudio con el objetivo de constantes. Presenta características de biodiver- analizar la composición química de diferentes sidad interesantes, destacándose altos valores de partes de la planta, posibles actividades biológi- sociabilidad y de abundancia-dominancia, por cas y, a partir de este conocimiento, intentar co- lo que esta especie es considerada como indica- rrelacionar las estructuras determinadas con una dora de la potencialidad de recursos que crecen potencial aplicación farmacológica. En este tra- en este ambiente 3. bajo se describen resultados químicos y de bio-

PALABRAS CLAVE: Asteraceae, Bioactividad, Chiliotrichum diffusum, Fitoquímica, Flavonoides, Flora pata- gónica, “mata negra”. KEY WORDS: Asteraceae, Bioactivity, Chiliotrichum diffusum, Phytochemistry, Flavonoids, “mata negra”, Pata- gonian flora. * Autor a quien dirigir la correspondiencia. E-mail: [email protected]

284 ISSN 0326-2383 Latin American Journal of Pharmacy - 29 (2) - 2010 actividad primaria obtenidos con extractos de cos mediante cromatografia planar bidimensio- las partes aéreas. nal (CPB) sobre papel Whatman Nº 1, usando como fases móviles: BAA (n-butanol-ácido acéti- MATERIALES Y METODOS co-agua, 3:1:1) y luego ácido acético al 15 %) Obtención del material vegetal, extracción y 7,9. screening preliminar El material se colectó en la localidad de 28 Estudios de actividad biológica primaria de Noviembre (Santa Cruz, Argentina), en el pe- Test de Artemia salina ríodo estival de 2003, en una zona de pradera. El extracto alcohólico total (Et = FA), la Frac- La identificación botánica fue realizada por la ción B (FB) y los obtenidos del fraccionamiento Prof. María Elena Arce en la Universidad Nacio- exhaustivo (E1-6), fueron analizados mediante nal de la Patagonia San Juan Bosco. Una mues- el bioensayo de citotoxicidad de la Artemia sali- tra se conserva en el Herbario Regional Patagó- na, según la técnica descripta por McLaughlin nico de la UNPSJB (HRP 5305). 10. Se ensayaron por triplicado concentraciones Las partes aéreas fueron secadas a tempera- finales de los extractos de 1000, 100 y 10 µg/ml tura ambiente, bajo techo, y molidas en un mo- en la solución de sal marina. Como control ne- linillo de paletas provisto de un tamiz de malla gativo (blanco) se usó la solución de sal marina. 20. El material seco y molido fue extraído ex- El cálculo de la concentración de extracto que haustivamente con etanol 96° a temperatura am- provoca la muerte del 50 % de los organismos biente, durante 48 h. El extracto total obtenido (LC50) se efectuó por el método estadístico des- (Et) fue fraccionado inicialmente siguiendo los cripto por Finney 11. lineamientos de la marcha fitoquímica 6-8 esque- Test de sensibilidad antibacteriana matizada en la Figura 1. Se utilizaron cepas tipificadas de Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Psuedomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Staphylococcus aureus (ATCC 29213), desarro- lladas en ágar nutritivo, aisladas en caldo nutriti- vo y finalmente en medio ATB Nº 1. Se empleó el método de difusión en ágar 12. Una porción del extracto alcohólico total (Et) fue llevada a seco y resuspendida en etanol de 70°, con una concentración final de 250 µg/ml. Se utilizaron como control positivo una solución de clorhi- drato de estreptomicina y como control negati- vo, etanol de 70°. Las placas se incubaron 24 h a 37 °C y se observó el halo de inhibición del crecimiento. Figura 1. Extracción y fraccionamiento preliminar de las partes aéreas de Chiliotrichum diffusum (Astera- Test de actividad antifúngica ceae). Se utilizaron cepas tipificadas de Candida al- bicans (ATCC 10231) aisladas y desarrolladas en Para el análisis químico general de las frac- ágar Saboreaud. Se empleó el método de difu- ciones obtenidas a partir de Et (FA-D, Fig. 1) se sión en ágar 13. Una porción del extracto alco- utilizaron reacciones usuales cualitativas de gru- hólico total (Et) fue llevada a seco y resuspendi- pos químicos 6-8. da en etanol de 70°, con una concentración fi- nal de 250 µg/ml. Se utilizó como control positi- Fraccionamiento del extracto alcohólico vo una solución de nistatina y como control ne- total 7,8 gativo, etanol de 70°. Las placas se incubaron 48 El fraccionamiento exhaustivo del extracto h a 37 °C y se observó el halo de inhibición del alcohólico total (Et) se efectuó con solventes de crecimiento. distinta polaridad: tetracloruro de carbono (E1), benceno (E2), éter etílico (E3), acetato de etilo RESULTADOS & DISCUSION (E4), etanol (E5) y agua (E6). Para aquellas frac- El estudio fitoquímico general de las partes ciones que evidenciaron la presencia de flavo- aéreas de Chiliotrichum diffusum evidenció la noides, se estudiaron los perfiles cromatográfi- presencia de sustancias de naturaleza fenólica

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nas propiamente dichas (Tabla 1). El ensayo del Fracción Grupo Químico Resultados poder afrógeno para saponinas dio positivo, FA flavonoides ++ aunque la altura de la espuma disminuyó rápi- taninos + damente desde los 6 mm, alcanzando a los 5 lípidos - min tan solo 1 mm, lo que se mantuvo con el hidratos de carbono + tiempo. No se detectaron triterpenos en ninguna FB esteroides + de las fracciones analizadas para este grupo quí- triterpenos - mico (FB y FC). En cambio la reacción cualitati- antraquinonas + va para determinar la presencia de esteroides dímeros de antronas + resultó positiva en la Fracción B (FB, Tabla 1). FC alcaloides - Fue llamativa la rapidez de la reacción para cardenólidos - cianoglicósidos, comparable a la obtenida a par- esteroides - tir del agua de laurel cerezo. La presencia de es- tos metabolitos no había sido descripta aún para Reacciones saponinas +/- especies relacionadas, lo cual constituye un dato directas cianoglicósidos + preliminar interesante. proteínas + Dados los resultados generales obtenidos, se Tabla 1. Resultados del estudio fitoquímico general realizó un fraccionamiento exhaustivo del ex- de las partes aéreas de Chiliotrichum diffusum (Aste- tracto alcohólico total utilizando solventes de raceae). polaridad creciente a fin de separar los flavonoi- des. Estos metabolitos resultaron particularmen- como principales constituyentes (Tabla 1). De te mayoritarios en las fracciones de acetato de ellas, fueron importantes los flavonoides y tani- etilo, etanol y agua (E4, E5 y E6). Además se nos, destacándose la existencia del tipo conden- detectaron en benceno y en éter etílico, aunque sados dado que en presencia de medio ácido y en baja proporción evidenciada por una colora- calor originaron flobáfenos. La reacción con clo- ción tenue de la reacción de Shinoda 14. ruro férrico mostró igualmente la predominancia Las fracciones enriquecidas en flavonoides de los dos hidroxilos fenólicos adyacentes que (E4, E5 y E6) fueron analizadas mediante cro- caracterizan a este tipo de taninos. matografía planar bidimensional (CPB) a fin de Se detectaron también hidratos de carbono, caracterizar el perfil de los principales grupos proteínas y derivados de antraquinonas, desta- presentes. Los cromatogramas, cuyos resultados cándose la presencia de dímeros y antraquino- se presentan en la Tabla 2, mostraron perfiles

Fracción Tipo de Flavonoide UV NH3 + UV flavona opaco opaco flavona con OH en 4’- opaco opaco flavona 7-O-monoglicosilada con OH en 4’- amarillo amarillo E4 flavonol 3-O-monoglicosilado con OH en 4’- opaco amarillo dihidroflavonol con OH en 4’- amarillo amarillo flavonol 7-O-monoglicosilado con OH en 4’- amarillo amarillo flavona y/o biflavonol con OH en 4’- opaco amarillo flavona y/o isoflavona con OH en 4’- opaco amarillo E5 dihidroflavonol con OH en 4’- amarillo amarillo flavonol 7-O-diglicosilado con OH en 4’- amarillo amarillo flavona 7-O-monoglicosilada con OH en 4’- opaco amarillo isoflavona 7-O-monoglicosilada opaco opaco flavonol con OH en 4’- amarillo amarillo E6 flavona 7-O-monoglic+osilada con OH en 4’- opaco amarillo flavona 7-O-diglicosilada con OH en 4’- opaco amarillo flavonol 7-O-diglicosilado con OH en 4’- amarillo amarillo

Tabla 2. Perfiles cromatográficos obtenidos mediante desarrollo bidimensional de las fracciones del extracto de las partes aéreas de Chiliotrichum diffusum (Asteraceae), enriquecidas de flavonoides (E4= acetato de etilo, E5= etanol, E6= fracción acuosa final).

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Porcentaje de organismos muertos Fracción LC50 µg/ml 10 µg/ml 100 µg/ml 1000 µg/ml

FA 37 50 83 12 FB 50 73 96 7

Tabla 3. Resultados del test de citotoxicidad de Artemia salina del extracto alcohólico total y de las fracciones que evidenciaron presencia de flavonoides (FA) y antraquinonas (FB), de las partes aéreas de Chiliotrichum dif- fusum (Asteraceae).

Porcentaje de organismos muertos Fracción LC50 µg/ml 10 µg/ml 100 µg/ml 500 µg/ml

E1 40 40 46 < 1 E2 33 33 56 3 E3 33 36 36 66 E4 40 50 n.d. 10 E5 40 65 70 366 E6 50 70 100 14

Tabla 4. Resultados del test de citotoxicidad de Artemia salina de los productos del fraccionamiento exhaustivo del extracto alcohólico total de las partes aéreas de Chiliotrichum diffusum (Asteraceae); (n.d.= no determina- do). complejos. Prevalecieron flavonas y flavonoles, en 3. Este patrón de glicosilación constituye un destacándose derivados mono y diglicosilados carácter estructural importante que podría con- en posición 7, además de algunos en 3. La frac- tribuir a la quimiotaxonomía del género dada la ción de acetato de etilo (E4) mostró flavonas, escasa información que existe de la especie en flavonoles 3-O-monoglicosilados, agliconas de estudio. dihidroflavonoles, flavonas con OH en 4’- y fla- La citotoxicidad fue destacable, tanto para vonas 7-O-monoglicosiladas. las fracciones generales (FA y FB) obtenidas del Una porción del extracto total (Et) que fue extracto total (Tabla 3), como para aquellas lo- insoluble en los demás solventes utilizados y só- gradas mediante solventes de polaridad crecien- lo se solubilizó en etanol (E5), presentó funda- te (Tabla 4). En este último caso, el producto mentalmente flavonas, dihidroflavonoles hidro- que se solubilizó únicamente en etanol (E5), fue xilados en 4’, flavonas 7-O-monoglicosiladas e el que presentó menor actividad. isoflavonas 7-O-monoglicosiladas (Tabla 2). El estudio de la actividad antibacteriana del La fracción acuosa final (E6) evidenció flavo- extracto total (Et) sólo dio resultado positivo, noles hidroxilados en 4’-, flavonas 7-O-monogli- aunque moderado, frente a Staphylococcus au- cosiladas y con OH en 4’-, flavonas 7-O-diglico- reus. La actividad antifúngica fue negativa para siladas con OH en 4’- y flavonoles 7-O-diglicosi- la cepa ensayada. lados con OH en 4’- (Tabla 2). Existen antecedentes en bibliografía 18 que Para , tribu de las Asteraceae en mencionan además actividad frente a Es- donde se ubica C. diffusum, se han descripto cherichia coli, pero en nuestro análisis fue nega- flavonoides con importantes variabilidades es- tiva. Otros estudios también realizados con C. tructurales que son utilizadas con fines quimio- diffusum, pero a partir de extractos alcohólicos taxonómicos 15-17. Las sustancias de esta natura- más diluidos obtenidos con etanol-agua (1:1), leza evidenciadas en las partes aéreas de C. dif- coincidieron con nuestros resultados en la acti- fusum presentaron dos particularidades: se de- vidad frente a S. aureus. tectaron en alta proporción y, si bien se encon- traron en varias fracciones, resultaron de una CONCLUSIONES polaridad importante. Al analizarlas mediante En las Asteraceae ha sido descripta una im- CPB, mostraron un complejo perfil en donde portante variedad de sustancias fenólicas bioac- prevalecieron flavonas y/o biflavonoles, además tivas, destacándose flavonoides cuyas propieda- estructuras glicosiladas en posición 7 y algunas des se relacionan con usos etnomédicos de las

287 ALCALDE S.M., TAIRA C.A., HÖCHT C., CORDOBA O.L. & FLORES M.L. especies, resultando promisorias para aplicacio- 5. Vera, J.C. (1993-94) Anales del Instituto de la nes farmacéuticas 19. Patagonia, Universidad de Magallanes, Chile, Los resultados de la caracterización química Serie Ciencias Humanas 22: 155-68. de las partes aéreas de C. diffusum evidencian, 6. Rondina, R.V.D. & J.D. Coussio (1969) Revista al igual que en otras Asteraceae, la presencia de de Investigaciones Agropecuarias, INTA, serie sustancias fenólicas, fundamentalmente flavo- 2, Biología y Producción Vegetal VI (22): 351- noides de polaridad destacada. La importante 66. actividad citotóxica frente al test de Artemia sa- 7. Harborne, J.B. (1991) “Phytochemical Methods. A Guide to Modern Techniques of Analy- lina, así como la actividad moderada frente a S. sis”, 2nd Ed., Chapman and Hall, U.K. aureus, sugieren una potencialidad de la espe- 8. Domínguez J.A. (1985) “Métodos de Investi- cie para futuras aplicaciones farmacológicas. gación Fitoquímica”, Limusa, México. Los estudios continúan a fin de purificar 9. Mabry T.J., K.R. Markhan & M.B. Thomas el/los compuestos principales y realizar estudios (1970) “The sytematic Identification of the farmacológicos, debido a que los antecedentes Flavonoids”, Springer – Verlag, Berlin. bibliográficos relacionados con la especie son 10. Mc Laughlin, J.L, C.J. Chang & D.L. Smith escasos y a la potencialidad de aplicación que (1991) “Brench-Top bioassays for the discovery sugieren los resultados generales obtenidos, of bioactive natural products: an update”, in además del uso etnomédico descripto. “Studies in natural products chemistry” 9: 383- 9. Agradecimientos. Los autores agradecen a la Prof. 11. Finney, D.J. (1978) “Statistical method in bio- María E. Arce (Depto. de Biología, Facultad de Cien- logical assay”, 3rd Ed. C. Griffin & Co. Ltd., cias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia London. San Juan Bosco) por su colaboración en la identifica- 12. Martinez, M.J. (2000) Rev. Cubana Plant. Med. ción botánica de la especie. El trabajo se realizó con 5: 23-5. aportes de Agencia (FONCYT-PME 216), UNPSJB 13. Quiroga, E.N., A.R. Sampietro & M.A. Vattuone (Programa CIPAMCO) y UBA. Los autores son inte- (2001) J. Ethnopharmacol. 74: 89-6. grantes de la Red RIPRONAMED-CYTED. C.A.T. es 14. Geissman T.A. (1962) The Chemistry of miembro de CONICET. Flavonoid Compounds. 1st Ed. Pergamon Press Inc., London. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 15. Crawford, D.J. (1978) Bot. Rev. 44: 431-56. 1. Correa, M.N. (1971) “Flora Patagónica”, Colec- 16. Emerenciano, V.P., Z.S. Ferreira, M.A.C. Ka- ción Científica del INTA, Argentina, Parte VII, plan & O.R. Gottlieb (1987) Phytochemistry 26: pp. 1-12 y 37-40. 3103-15. 2. Marzocca, A. (1997) “Vademécum de malezas 17. Emerenciano, V.P., J.S.L.T. Militão, C.C. Cam- medicinales de la Argentina indígenas y exóti- pos, P. Romoff, M.A.C. Kaplan, M. Zambon & ra cas”, 1 Ed., Orientación Gráfica Editora, A.J.C. Brant (2001) Biochem. Syst. Ecol. 29: Buenos Aires, Argentina, pp. 191. 947-57. 3. Arroyo, K.T.M. (1992) “Biodiversidad y estu- 18. Bhakuni, D.S., M. Bittner, C. Marticorena, M. dios de casos de especies exóticas. Modelos ac- Silva, E. Weldt, M.E. Melo & R. Zemelman tuales, predicciones futuras y recomendaciones (1974) Lloydia 37: 621-32. generales”, Facultad de Ciencias, Universidad 19. Ivanova, D., D. Gerova, T. Chervenkov & T. de Chile. Yankova (2005) J. Ethnopharmacol. 96: 145- 4. Martínez Crovetto, R.N. (1966) Etnobiología 3: 50. 1-20.

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