UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE (PPG-CAPS)

JEANE ANDRÉIA PEDROSA NOGUEIRA

AVALIAÇÃO DA BIOATIVIDADE E ESTUDO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Zanthoxylum tingoassuiba A. ST. HIL

Niterói, RJ 2014

JEANE ANDRÉIA PEDROSA NOGUEIRA

AVALIAÇÃO DA BIOATIVIDADE E ESTUDO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Zanthoxylum tingoassuiba A. ST. HIL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG- CAPS) da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção de grau em Mestre.

Área de Concentração: Desenvolvimento de Produtos para Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha Coorientadora: Profª. Drª. Samanta Cardozo Mourão

Niterói, RJ 2014

N 773 Nogueira, Jeane Andréia Pedrosa Avaliação da bioatividade e estudo da composição química do óleo essencial das folhas de zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil./ Jeane Andréia Pedrosa Nogueira; Orientador: Leandro Machado Rocha. – Niterói, 2014. 84f.

Dissertação (Mestradao)- Universidade Federal Fluminense, 2014.

1. Rutaceae 2. Óleo essencial 3. Composição química 4. Inseticida 5. Acaricida I. Rocha, Leandro Machado II. Título

CDD 615.321

JEANE ANDRÉIA PEDROSA NOGUEIRA

AVALIAÇÃO DA BIOATIVIDADE E ESTUDO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Zanthoxylum tingoassuiba A. ST. HIL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG- CAPS) da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção de grau em Mestre.

Área de Concentração: Desenvolvimento de Produtos para Saúde.

Aprovada em 26 de fevereiro de 2014.

BANCA EXAMINADORA

______Prof. Dr. Leandro Machado Rocha – UFF Orientador

______Profª. Drª. Evelize Folly Chagas - UFF

______Prof. Dr. Marcelo Guerra Santos - UERJ

______Profª. Drª. Adriana Passos Oliveira - UFRJ (Revisor e Suplente)

Niterói, RJ 2014

Ao Poder Superior que me concede Serenidade, Coragem e Sabedoria para cumprir todas as etapas com alegria e prazer.

AGRADECIMENTOS

À minha companheira Anabella por me incentivar a criar mentalmente a realidade desejada e ter ação para que a vida aconteça cada dia melhor.

À minha família pelo apoio incondicional. Especialmente minha mãe Penha pelo seu exemplo de força, coragem, determinação e alegria.

Ao prof. Leandro Machado Rocha, pelo rigor e gentileza com que me orientou e me envolveu nas perspectivas do universo acadêmico e, sobretudo por ter me recebido de braços abertos. À profª. Samanta Cardozo Mourão pela sua gentil coorientação, pelos ensinamentos farmacotécnicos e por sua amizade afetuosa.

Aos amigos, que formam a família do Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (LTPN-UFF), pelo apoio, amizade e contribuição para com o meu aprendizado no universo das plantas medicinais.

Ao ilustre botânico e profº. Marcelo Guerra, pelos ensinamentos, amizade e grande ajuda durante as coletas na restinga. Ao amigo e fiscal do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, Sr. Jorge Inácio Barcelos, pelas incursões a pé ou de barco em busca do nosso alvo.

À professora Denise Feder, Marcelo Salabert e demais professores, alunos e técnicos do Laboratório de Biologia de Insetos do GBG/UFF, pela colaboração e ensinamentos.

À professora Evelize Folly do Laboratório de Metabolismo de Parasitos e suas dedicadas alunas pela colaboração e oportunidade de aprendizado.

Aos professores e funcionários da Faculdade de Farmácia e do PPG-CAPS, em especial à coordenadora do programa Prof.ª Kátia Lima por todo o suporte durante o trabalho.

À CAPES pelo apoio financeiro.

GRATA!

“Embora eu não possa mudar o vento, posso ajustar minhas velas para navegar.”

Anônimos

RESUMO

Zanthoxylum tingoassuiba é uma espécie da família Rutaceae, popularmente conhecida como guando-do-mato, mamica-de-porca e limãozinho. Este trabalho descreve a análise da composição química do óleo essencial das folhas, sendo silvestreno identificado como constituinte majoritário através da análise por CG/EM. É a primeira vez que os constituintes muurola-4,5-trans-dieno e isodauceno são identificados no óleo essencial desta espécie. Para a atividade inseticida do óleo essencial desta espécie frente ao inseto Rhodnius prolixus, um dos vetores da doença de Chagas, foi observada alta taxa de mortalidade, mal formação e paralisia em ninfas de quinto estádio deste inseto. A atividade inseticida foi também avaliada frente aos fitófagos Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus, insetos praga de lavoura. Em Dysdercus peruvianus o processo de metamorfose e período intermuda foram afetados e ocorreram deformações em alguns insetos tratados, além de mostrar uma alta taxa de mortalidade. Nos insetos Oncopeltus fasciatus, o tratamento com óleo puro e nas diluições de 500 mg/mL e 250mg/mL apresentou mortalidade de 100%. Na avaliação da atividade acaricida, ocorreu alteração na oviposição, diminuição da eclodibilidade dos ovos e 100% de mortalidade na concentração de 5%, além de mostrar que a eficácia do óleo essencial é dose dependente. Estes resultados sugerem que o óleo essencial das folhas de Z. tingoassuiba pode futuramente ser utilizado como ativo em formulações bioacaricidas, fazendo parte da terapêutica do carrapato do boi, um bioagente responsável por causar enormes danos a pecuária. Neste trabalho é relatado às atividades inseticida e carrapaticida para Zanthoxylum tingoassuiba, demonstrando que esta espécie possui um potencial biotecnológico a ser mais estudado.

Palavras-chave: Zanthoxylum tingoassuiba. Óleo essencial. Inseticida. Carrapaticida.

ABSTRACT

Zanthoxylum tingoassuiba is a species from the Rutaceae family, commonly known as “guando-do-mato”, “mamica - de - porca” e “limãozinho”. This work describes the analysis of the essential chemical composition of its leaves oil having identified the sylvestrene as a major component, through CGMS analysis. It is the first time that constituents muurola - trans - 4,5 - diene and isodaucene are identified in an essential oil from this species. It was observed, for insecticidal activity of the essential oil against the insect Rhodnius prolixus, one of the vectors of Chagas disease, a high mortality rate, malformation and paralysis in fifth instar nymphs. It was also evaluated against phytophagous Oncopeltus fasciatus and Dysdercus peruvianus, that are insects pests of crops. In Dysdercus peruvianus the process of metamorphosis and intermolt period were affected, some of the treated insects presented malformation and a high mortality rate. In Oncopeltus fasciatus, the treatment with pure oil and dilutions of 250.00mg/mL and 500.00mg/mL presented 100% mortality rate. In the acaricidal activity evaluation, changes occurred in oviposition, decreased hatchability of eggs and 100 % mortality at a concentration of 5 %. It also shows that the effectiveness of the essential oil is dose dependent. These results suggests that the essential oil from leaves Z. tingoassuiba can be used as actives in bioacaricidal formulations in the future, being part of the cattle tick therapeutics, a bioagent that causes huge damage to livestock. This work reports the insecticidal and acaricidal activities for Zanthoxylum tingoassuiba, showing that the species has a biotechnological potential for further studies.

Keywords: Zanthoxylum tingoassuiba. Essential oil. Insecticidal. Acaricidal.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Distribuição da área do Parque Nacional da Restinga de 19 Jurubatiba

Figura 2 Estrutura química das substâncias frequentemente 22 encontradas em plantas do gênero Zanthoxylum

Figura 3 Características da espécie Zanthoxylum tingoassuiba A. St.- 23 Hil.;

Figura 4 Localidades onde são encontradas a espécie Zanthoxylum 24 tingoassuiba

Figura 5 Espécie Zanthoxylum tingoassuiba situada no PNRJ 25

Figura 6 Formação dos compostos fenilpropanoidícos 30

Figura 7 Aparelho extrator de óleo essencial do tipo Clevenger 31

Figura 8 Cromatograma do óleo essencial das folhas de Pilocarpus 32 spicatus

Figura 9 Ciclo evolutivo do carrapato 39

Figura 10 Exsicata de Zanthoxylum tingoassuiba coletada no Parque 41 Nacional da Restinga de Jurubatiba

Figura 11 Extração do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum 42 tingoassuiba

Figura 12 A: Ninfas do 5º estágio de R. prolixus. B: R. prolixus 44 adultos

Figura 13 Tratamento tópico, oral e por contato de ninfas do 5º 45 estágio de R. prolixus

Figura 14 Ninfa de 4º e 5º estágio e adulto de O. fasciatus. B: 46 Adultos de D. peruvianus

Figura 15 Ninfas de 4º estágio de O. fasciatus durante o processo de 47 aplicação da amostra

Figura 16 A e B: Tratamento Tópico: % de Mortalidade e % de 54 Adultos de ninfas de 5º instar de Rhodnius prolixus com óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba

Figura 17 A e B: Tratamento Via Oral: % de Mortalidade e % de 56 Adultos de ninfas de 5º instar de Rhodnius prolixus com óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba

Figura 18 Insetos deformados com tratamento por Contato com óleo 57 essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba

Figura 19 A e B: Tratamento por Contato: % de Mortalidade e % de 58 Adultos de ninfas de 5º instar de Rhodnius prolixus com óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba

Figura 20 Mortalidade de ninfas do 4º instar de D. peruvianus com 61 óleo essencial de Z. tingoassuiba puro e em diferentes concentrações, grupos controle (acetona) e não-tratados

Figura 21 Metamorfose de ninfas do 4º instar de D. peruvianus com 62 óleo essencial de Z. tingoassuiba puro e em diferentes concentrações, grupos controle (acetona) e não-tratados

Figura 22 Mortalidade de R. (B.) microplus exposto a diferentes 66 concentrações do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba no período de 14 dias

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Condensação de unidades de isopreno na formação de 29 terpenoides

Tabela 2 – Aspecto e rendimento dos óleos essenciais das folhas de 50 Zanthoxylum tingoassuiba

Tabela 3 – Percentagem dos constituintes do óleo essencial das folhas 51 Zanthoxylum tingoassuiba

Tabela 4 – Análise de insetos paralisados após tratamento tópico de 59 ninfas de quinto estádio de Rhodnius prolixus com óleo essencial de Z. tingoassuiba

Tabela 5 – Análise e comparação dos períodos intermudas de D. 64 peruvianus após diferentes diluições do óleo essencial de Z. tingoassuiba

Tabela 6 – Índice de Postura (IP), Inibição de Ovipostura - IP (%), 67 Índice de Eclodibilidade de ovos de Rhipicephalus (B.) microplus exposto a diferentes concentrações do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba

LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

°C Graus Celsius

AAALAC Associação Internacional para Avaliação e Acreditação de Laboratórios de Cuidado com Animais

AAAS Associação Americana de Ciência Animal

AI Índice Aritmético

ANOVA Análise de Variância

BOD Biochemical Oxygen Demand

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais

CG Cromatografia gasosa

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute comp. Comprimento

CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

DAT Dias após tratamento

DMSO Dimetil-sulfóxido

EM Espectrômetro de massas

EU União Europeia eV Elétron volt

FAALEC Federação das Associações de Animais Laboratório Europeu de Ciência

FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz

IA Índice aritmético

ICLAS Conselho Internacional de Ciência em Animais de Laboratório

ICMBio Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade

L Litro

LTPN Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais

MCT Ministério da Ciência Tecnologia & Inovação

MMA Ministério do Meio Ambiente

MS Mass Spectrometry

Ø Diâmetro

PNRJ Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba

Scan Scanner

Sp Espécie

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17 1.1 Restinga 17 1.2 Restinga de Jurubatiba 18 1.3 Considerações sobre Rutaceae 19 1.4 Considerações sobre o gênero Zanthoxylum L. 21 1.5 Considerações sobre Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil. 23 1.6 Considerações sobre Óleo Essencial 26 1.6.1 Constituintes Químicos de Óleos Essenciais 28 1.6.1.2 Terpenos 28 1.6.1.3 Fenilpropanoides 30 1.6.1.4 Método de Extração de Óleo Essencial 30 1.6.1.5 Análise dos Constituintes Químicos de Óleos Essenciais 31 1.7 Atividade Inseticida 32 1.7.1 Rhodnius prolixus 34 1.7.2 Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus 35 1.8 Atividade Acaricida 38 1.8.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini) 37 2 OBJETIVOS 40 2.1 Objetivo geral 40 2.2 Objetivos Específicos 40 3 METODOLOGIA 41 3.1 Material Vegetal 41 3.2 Extração do Óleo Essencial 42 3.3 Identificação dos Constituintes do Óleo Essencial 42 3.3.1 Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas 42 3.4 Atividades Biológicas 43 3.4.1 Avaliação da Atividade Inseticida 43 3.4.1.1 Rhodnius prolixus 43 3.4.1.1.1 Declaração de Ética 45

3.4.1.2 Análise Estatística dos Dados 45 3.4.1.3 Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus 46 3.4.1.4 Análise Estatística dos Dados 48 3.4.2 Atividade Acaricida 48 3.4.2.1 Análise estatística dos dados 49 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 50 4.1 Análise do Óleo Essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba 50 4.2. Atividade Inseticida 53 4.2.1 Rhodnius prolixus 53 4.2.1.1 Tratamento Tópico 53 4.2.1.2 Tratamento Via Oral 55 4.2.1.3 Tratamento por Contato 56 4.2.2 Dysdercus peruvianus 61 4.2.3 Oncopeltus fasciatus 64 4.3 Atividade Acaricida 65 4.3.1 Teste de Imersão de Adultos 65 4.3.1.1 Índice de postura e eclodibilidade dos ovos 66 5 CONCLUSÃO 69 6 REFERÊNCIAS 78 7 ANEXOS 80 7.1 Substâncias Identificadas no óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba 80 7.2 Artigos Submetidos 83 7.2.1 Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil. (Rutaceae) essential oil: chemical 83 investigation and biological effects on Rhodnius prolixus nymph 7.2.2 Acaricidal Properties of the Essential Oil from Zanthoxylum tingoassuiba 84 (Rutaceae) against the Cattle Tick Rhipicephalus microplus (Acari:Ixodidae) 17

1 INTRODUÇÃO

As espécies da flora do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, ao longo dos últimos 15 anos, vêm sendo estudadas pelo Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (LTPN), em um projeto de pesquisa que visa agregar valor as espécies vegetais ali presentes, assim como sua preservação. O Parque está localizado no litoral norte do Estado do Rio, abrangendo os municípios de Macaé, Carapebus e Quissamã (ARAÚJO et al.,1998), onde é encontrado a espécie Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil., da família Rutaceae, objeto deste trabalho.

Esta família é constituída por cerca de 160 gêneros e aproximadamente 1900 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais ao redor do mundo (GROPPO et al., 2008). Espécies de diferentes gêneros desta família são estudadas por diversos autores por serem ricas em óleos essenciais (MOURA et al., 2006ª; FACUNDO et al., 2003).

Zanthoxylum tingoassuiba, na Restinga de Jurubatiba, é popularmente conhecida como “Guando- do- mato”. Esta espécie é uma das mais de 710 plantas medicinais presentes na Farmacopeia Brasileira 1ª edição, 1926. Encontra-se distribuída nos estados da Bahia, Pernambuco, Maranhão, Amazonas, Minas Gerais, Rio de Janeiro, Goiás e São Paulo (DA SILVA et al.,2008).

Neste trabalho serão avaliadas as atividades carrapaticida frente a teleóginas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, inseticida frente ao inseto hematófago Rhodnius prolixus, aos insetos pragas de lavoura Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus.

1.1 Restinga

Denomina-se restinga ao conjunto formado pela deposição de sedimentos arenosos, marinhos quaternários e fluviais ao longo do litoral brasileiro e a biota que neles se instalou (ARAÚJO; LACERDA, 1987; ARAÚJO; MACIEL, 1998). As restingas recobrem cerca de 80 % da Costa brasileira (LACERDA et al., 1993), onde se estendem desde estreitas até extensas faixas de areia, como no litoral norte do estado do Rio de Janeiro (MARTINS et al., 1993). As restingas foram formadas ao longo da costa brasileira, no período Haloceno, devido a variações ocorridas no nível dos oceanos (regressões e transgressões), formando então grandes planícies arenosas de origem sedimentar com dunas, isolando lagoas, lagos, brejos e 18

pântanos. Essa diversidade de habitats proporciona uma grande diversidade vegetal. A vegetação de restinga é bem característica e está associada diretamente aos aspectos físicos e químicos da região, como, altas temperaturas, salinidade, depósito de sal e grande exposição luminosa. Nas áreas próximas a lagos e lagoas, a vegetação costuma ser mais densa, enquanto na parte mais seca, a vegetação é bem aberta e formada na sua maior parte por arbustos (COGLIATI-CARVALHO et al., 2001). O solo arenoso e pobre em nutrientes fez com que as áreas de Restinga não fossem exploradas para o estabelecimento de atividades agrícolas, o que manteve, de certo modo, algumas áreas preservadas. Mas, muitas dessas áreas sofrem com a especulação imobiliária (KELECOM et al., 2002) e também com a exploração petrolífera como, por exemplo, na Bacia de Campos (ARAÚJO et al., 1998).

1.2 Restinga de Jurubatiba O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba foi criado em 29/04/1998, está situado na Região Norte do Estado do Rio de Janeiro, entre as coordenadas 22◦ e 22◦23’S e 41◦15’ e 41◦45’ W. Estende-se por 44 quilômetros de litoral, abriga dezoito lagoas costeiras, abrangendo cerca de 14.860 hectares de planície arenosa (Figura 1). Diversos estudos científicos têm sido realizados nesta região desde a década de 80. Dentre estes, Santos e colaboradores (2009) realizaram um levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela a população local e registraram o uso de 119 espécies pertencentes a 49 famílias e 100 gêneros vegetais. Os usos atribuídos foram comestível, madeireiro, ritualístico, medicinal, ornamental, têxtil, aromatizante, artesanal e corante. O uso medicinal foi a principal utilidade citada, correspondendo a 40 espécies.

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Figura 1 - Distribuição da área do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba nos municípios de Quissamã, Carapebus e Macaé

Fonte: Site Parks Watch. Disponível em: . Acessado em 22 de junho de 2012.

1.3 Considerações sobre Rutaceae

Rutaceae é uma extensa família do grupo das Angiospermas, constituída por cerca de 160 gêneros e 1.900 espécies, morfologicamente diversa e de distribuição mundial (GROPPO et al., 2008). De ocorrência principalmente nas regiões tropicais e subtropicais (JUDD et al., 2009). No Brasil existem cerca de 33 gêneros (5 endêmicas), 193 espécies (106 endêmicas), 17 subespécies (8 endêmicas) e 8 variedades (6 endêmicas ) (PIRANI & GROPPO, 2013). A Mata atlântica e a floresta amazônica são os centros da diversidade dessa família (PIRANI, 2012). Esta família está posicionada em Sapindales (REVEAL; CHASE, 2011) e pode ser distinguida de outras famílias dessa ordem pela presença de cavidades secretoras contendo óleos etéreos aromáticos no mesófilo e outros tecidos moles como pontos translúcidos (JUDD et al., 2009). É composta de árvores e arbustos de grande valor econômico, na hortifruticultura, com o gênero Citrus na silvicultura, com os gêneros Zanthoxylum, 20

Chloroxylon, Filindersia. Na medicina os gêneros Pilocarpus e Agathosma são seus principais representantes, sendo as espécies Pilocarpus jaborandi e Agathosma betulina, utilizadas na indústria farmacêutica (WATERMAN, 1975). A família se caracteriza por apresentar diversas classes de substâncias provenientes do metabolismo secundário, apresentando principalmente alcaloides, cumarinas, lignanas, limonoides, flavonoides e terpenoides, havendo um grande interesse no uso dessas substâncias como marcadores quimiotaxonômicos (WATERMAN, 1973; MÜLLER, 1994). Dado as características de seu perfil químico, responsáveis por um largo espectro de atividade biológica, como por exemplo, antifúngica, bactericida, antiviral e inseticida (GUERREIRO et al., 2005), várias espécies desta família possuem relevância medicinal, ecológica e econômica (JANUÁRIO et al., 2009), sendo utilizada na medicina tradicional em todo o mundo. Isto inclui o tratamento de infecções de pele, doenças venéreas, malária, infecção urinária e disenteria (BOEHME et al., 2008). Sendo assim, alguns trabalhos encontrados na literatura fundamentam nosso interesse em estudar esta família, tal como o estudo de Prieto et al., (2011), onde foi identificada a composição química e atividade biológica dos óleos essenciais de três espécies do gênero Zanthoxylum – Zanthoxylum monophyllum (Lam.), Z .rhoifolium Lam. e Zanthoxylum fagara (L.). Sendo neste mesmo trabalho avaliadas as atividades antifúngica (Fusarium oxysporum) e inseticida frente ao inseto Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae) sugerem que estas espécies podem se tornar uma alternativa aos fungicidas e inseticidas sintéticos. Bem como os estudos de Weldon e colaboradores (2011) onde foi relatado que algumas espécies da família Rutaceae (Citrus e Zanthoxylum), são conhecidas por atraírem aves e mamíferos, em busca de seus constituintes químicos responsáveis pelo aroma das folhas, frutos e outras partes das plantas, para ajudá-los na proteção contra o ataque de predadores. Ainda de acordo com este autor, estudos etnobotânicos relatam que nos países europeus e americanos, suas populações usam topicamente extratos de frutos e folhas de Rutaceae para repelir insetos hematófagos, considerando, assim, que esta família está entre as mais promissoras para o controle de insetos.

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1.4 Considerações sobre o gênero Zanthoxylum L. Apresenta árvores espinhentas, variando de 6 a 18 metros de altura, sendo que, algumas espécies apresentam tronco ereto, com volume de madeira apreciável para serraria (LORENZI, 1992). As folhas são alternas, imparipanadas ou parimpanadas, raro folioladas; pecíolo e raque muitas vezes subalados; folículos alternos a opostos, sésseis ou peciolulados, geralmente crenados com glândulas oleíferas entre cada lobo marginal (e/ou em toda lâmina), base geralmente assimétrica. Inflorescências terminais, axilares ou laterais (ramifloras), geralmente tirsos ou panículas piramidais corimbiformes ou racemos. Flores geralmente alvas e esverdeadas, unissexuadas e actinomorfas; sépalas livres ou conatas, persistentes no fruto; pétalas livres, imbricadas. Frutos esquizocarpos, folicular, raro cápsula, geralmente com glândulas esféricas proeminentes, raro muricado, endocarpo desprendido do pericarpo na maturação (WANDERLEY et al., 2002a).

Segundo Pirani (2012), o gênero no Brasil têm seus domínios fitogeográficos na Amazônia, Cerrado e Mata Atlântica. Podendo ser encontrado em diversos tipos de vegetação, tais como, Cerrado, Floresta de Terra-Firme, Floresta Estacional Decidual, Floresta Estacional Semidecidual, Floresta Ombrófila (= Floresta Pluvial), Floresta Ombrófila Mista, Restinga. Ainda segundo este autor, sua distribuição geográfica se dá nas seguintes localidades: Norte (Roraima, Amapá, Pará, Amazonas, Tocantins, Acre, Rondônia), Nordeste (Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Bahia, Alagoas, Sergipe), Centro-Oeste (Mato Grosso, Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso do Sul), Sudeste (Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo, Rio de Janeiro), Sul (Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul).

O gênero Zanthoxylum tem importância etnobotânica, sendo utilizado como fonte de matéria-prima para medicamentos, cosméticos e na culinária (RAKIĆ et al., 2009). Estudos etnobotânicos relatam que muitas espécies de Zanthoxylum são utilizadas na medicina tradicional, especialmente na América do Sul, África e Ásia. Zanthoxylum rhoifolium Lam. é muito popular na América do Sul como agente antimicrobiano, anti-inflamatório, processos cancerígenos e malária (DA SILVA et al, 2010). Na Ásia, o fruto de Zanthoxylum bungeanum Maximé é uma especiaria muito popular, conhecida como huajiao, ou "da hongpao'' (Grande Manto Vermelho), o fruto de Zanthoxylum schinifolium também é uma especiaria amplamente utilizada em Sichuan, China (YANG, 2008). Algumas espécies deste gênero são reconhecidas pelos seus óleos essenciais, frequentemente contendo limoneno, germacreno D, α-pineno e β- 22

cariofileno (Figura 2) (VIEIRA et al., 2009). Estes óleos essenciais foram analisados para várias atividades biológicas, indicando efeito inseticida, citotóxico e antibacteriano (WANG et al., 2011; BOEHME et al., 2008). Das atividades biológicas descritas para os óleos essenciais do gênero Zanthoxylum, podemos destacar que óleos essenciais das espécies Z. limonella mostrou-se eficaz como repelente para o mosquito Aedes aegypti (Diptera). Enquanto, os óleos essenciais das espécies Z. bungenume e Z. piperitum apresentaram atividades larvicida, antimalárica, anti-helmíntica, ictiotóxica e antimicrobiana. Além dos óleos essenciais, os extratos metanólicos de algumas espécies deste gênero apresentam bioatividades, destacando-se a espécie Zanthoxylum monophyllum com atividade significativa contra sete fungos patógenos humanos (GÓMEZ et al., 2007), Z. americanum com amplo espectro antifúngico contra Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans e Fusarium oxysporum (BAFI-YEBOA et al., 2005) e Z. xanthoxyloides com atividade inseticida, causando mortalidade em Sitophilus oryza e Callosobruchus maculatus (Coleoptera) dois insetos pragas que afetam produtos armazenados, principalmente, arroz, milho, trigo e sorgo (OWUSU et al., 2007).

Limoneno Germacreno D

α- Pineno β-Cariofileno

Figura 2 - Estrutura química das substâncias frequentemente encontradas em plantas do gênero Zanthoxylum Fonte: Vieira (et al., 2009).

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1.5 Considerações sobre Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil.

A espécie Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil. (Rutaceae), têm como sinonímias botânicas Zanthoxylum articulatum Engl., Xanthoxylum tingoassuibae, Fagara tingoassuiba Hoene, sendo descrita pela primeira vez por Saint Hilaire em 1825. Apresenta árvores e arbustos de 1,5 a 10 metros, troncos e ramos inermes a raro esparsamente aculeados e glabros. Folhas paripanadas ou imparipanadas, inermes a raro esparso-aculeadas, glabras, odoríferas, pecioladas, raque caniculada a estreito-alada, folíolos estreito-elípticos a oblongos, ápice arredondado a emarginado, base aguda a decurrente e geralmente com domácias revolutas, margem serreada e crenada no terço distal, sésseis ou com peciólulo, secos verdes e lustrosos; glândulas espalhadas por toda lâmina, mais evidentes na face abaxial. Inflorescência terminal, tirsóide perfeitamente dicasial, glabro, ramos laterais opostos patentes. Flores alvo- esverdeadas, 4- meras glabras, sépalas ovais, pétalas oblongas. Fruto folículo subglobuloso, semente elipsoide, hilo linear (Figura 3), (WANDERLEY et al., 2002b).

Figura 3 - A - E: Zanthoxylum tingoassuiba A. St.-Hil.; A-Ramo com frutos; B- Folíolo; C- Detalhe das domácias na base dos folíolos; D-Glândulas da lâmina foliar (pontos amarelos); E- Fruto Foto: Marcelo Guerra.

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Sua distribuição geográfica alcança as regiões Nordeste (Bahia), Sudeste (Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo), Sul (Paraná) (PIRANI, 2013) (Figura 4).

Figura 4 - Localidades onde são encontradas a espécie Zanthoxylum tingoassuiba Fonte: http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB1186

Zanthoxylum tingoassuiba (Figura 5) é popularmente conhecida como casca preciosa, tinguaciba-da-restinga, tinguaciba, limão-bravo, laranjeira-do-mato, mamica-de-porca, limãozinho e guando-do-mato. A casca do seu caule é utilizada na medicina tradicional, na forma de chás, como antiespasmódico, relaxante muscular, analgésico, sudorífero, antifúngico, diurético, anti-hipertensivo, contra agregação plaquetária, antiparasitário para Ascaris lumbricoides, Taenia sp., Trichiuris trichiura e Shistossoma sp., além de anti- inflamatório para infecções de garganta (DUARTE, 2000). A atividade antibacteriana e antifúngica do óleo essencial desta espécie coletada na periferia da cidade de Feira de Santana, Bahia, mostrou resultado positivo para Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerea-suis, Trichophytom mentagrophytes e Aspergillus niger (DETONI et al., 2009).

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Figura 5 – Habitat de Zanthoxylum tingoassuiba situada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba Foto: Própria autora

Segundo levantamento de Da Silva e colaboradores (2008), desde 1923, o Laboratório Flora Medicinal J. Monteiro da Silva, já comercializava o medicamento UVA-DO-MATO®, o qual era composto por Zanthoxylum tingoassuiba e abútua (Chondrodendron platyphyllum A. St. Hill. Miers) - (Menispermaceae). Este fitoterápico era indicado para cólicas, espasmos da musculatura estriada e mialgias. Ainda segundo os autores, o primeiro estudo fitoquímico desta espécie foi relatado por Antonaccio e Gottlieb (1959), de espécime coletada na restinga da Barra da Tijuca, Rio de Janeiro. Neste trabalho os autores também descreveram a presença das substâncias, triterpeno lupeol e lignana sesamina. Enquanto, no extrato hexânico do caule foram identificadas as seguintes substâncias: amida arnotianamida, alcaloide benzofenantridina norqueleritrina. No extrato diclorometânico dos frutos foram encontradas as seguintes substâncias: protoalcalóide N-metilantranilato de metila, cumarinas aurapteno (7- geraniloxicumarina), σ-prenilumbeliferona (7-preniloxicumarina), furanocumarinas lineares, imperatorina, isopimpinelina e xantotoxina, neste extrato foram também encontrados o triterpeno lupeol e a lignana sesamina, os fitoesteróides estigmasterol e β-sitosterol. Enquanto no óleo essencial do caule de Zanthoxylum tingoassuiba extraído com hexano, foram identificadas as substâncias espatulenol, α-bisabolol e acetato de citronelila. 26

1.6 Considerações sobre Óleo Essencial

Os óleos essenciais são usados desde o início da história humana como flavorizantes e conservantes de bebidas e alimentos, para disfarçar odores desagradáveis, atrair ou repelir insetos e controlar problemas sanitários. Influenciando desta maneira para o bem estar dos seres humanos e animais (FRANZ, 2010).

Bagetta (2010) relata que as crescentes demandas das indústrias alimentícias, farmacêuticas e, especialmente, nas áreas de produtos de perfumaria e cosmética acarretaram um aumento sobre a produção de óleo essencial. Na última década, o mercado mundial de óleos vegetais tem se caracterizado pelo aumento da demanda mais acentuado que oferta. Segundo o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2012) a produção mundial dos óleos commodities aumentou cerca de 25%, enquanto os estoques mundiais recuaram no mesmo período (SILVA et al., 2012). Sendo que a indústria de cosmética é atualmente responsável pelo aumento no volume de produção e consumo de óleos essenciais. O faturamento desta indústria em relação ao consumidor passou de R$ 4,9 bilhões (1996) para R$ 21,7 bilhões em 2011 (ABIHPEC, 2012).

Estudos de Bizzo (2009) mostram que segundo a base de dados americana COMTRADE (United Nations Commodity Trade Statistics Database), os principais consumidores de óleos essenciais no mundo são os Estados Unidos da América (40%) e União Europeia - UE (30%), tendo a França como país líder em importações. Japão representando (7%), ao lado do Reino Unido, Alemanha, Suíça, Irlanda, China, Cingapura e Espanha. Ainda segundo estudos do autor, na contagem geral os principais países fornecedores de Óleos essenciais para a UE neste mesmo ano, foram EUA (19%), França (10%), China (6%), Brasil (5%) e Reino Unido (5%). Ainda segundo o autor, óleos essenciais adquiriram uma boa aceitação e cotação de mercado, daí o fato de existirem um número expressivo de 300 óleos essenciais de importância comercial no mundo. Sendo o principal deles o óleo de Citrus sinensis (Rutaceae).

O Brasil se posiciona como o 3° maior exportador de óleos essenciais do mundo, com aproximadamente US$ 147 milhões, perdendo apenas para os EUA e França, tendo ultrapassado o Reino Unido em 2007. No entanto, desse volume, 91% consiste em óleo essencial de cítricos, principalmente laranja (80%), subprodutos da indústria de sucos e de baixo preço (US$ 2,18/kg). As principais exportações por ordem de importância são: óleos de 27

laranja, limão, eucalipto, pau rosa, lima e capim- limão, entre outros (SOUZA et al., 2010). Os óleos essenciais são abundantemente encontrados em angiospermas especialmente nas famílias Asteraceae, Apiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Piperaceae, Myrtaceae, Rutaceae (ORLANDA, 2011). A distribuição de óleo essencial nas plantas não se dá de maneira homogênea, podem ocorrer em estruturas secretoras especializadas, tais como pêlos glandulares (Lamiaceae), células parenquimáticas diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae, Poaceae), canais oleíferos (Apiaceae) ou em bolsas lisígenas ou esquizolisígenas (Pinaceae, Rutaceae). Todos os órgãos das plantas podem acumular óleos essenciais voláteis em órgãos diferentes, tais como nas flores (laranjeira e bergamota), folhas (capim-limão, eucalipto e louro), cascas do caule (canela), madeira (sândalo e pau rosa), raízes (vetiver), rizomas (cúrcuma), frutos (erva-doce) e sementes (noz moscada). (SIMÕES et al., 2004). Segundo Stefanello e colaboradores (2011), óleos essenciais são misturas formadas por metabólitos que conferem características organolépticas nas plantas. São também chamados de óleos etéreos ou essenciais, com características marcantes, tais como sabor ácido e picante, possuem baixa estabilidade na presença de ar, luz, calor, umidade e metais. A maioria dos óleos voláteis apresenta índice de refração e são opticamente ativos (SIMÕES et al., 2004). Da Silva (et al., 2008).

O estudo para verificação da eficácia de óleos essenciais contra insetos e ácaros hematófagos torna-se uma realidade cada vez mais frequente em pesquisas científicas na busca por biopesticidas que possam ser eficazes e menos agressivos para homens, animais e meio ambiente. Como pode ser visto no estudo realizado por Mello e colaboradores (2007), onde se avaliou a eficácia do óleo essencial de Pilocarpus spicatus (Rutaceae), contra ninfas de quinto estádio de Rhodnius prolixus. A bioatividade desta espécie foi comprovada por induzir altos níveis de toxicidade e paralisia, associados à discreta inibição da muda, fagoinibição parcial, período intermuda prolongado e alto número de insetos paralisados. Enquanto, no estudo de Pirali-Kheirabadi e Silva (2010), Lavandula angustifolia apresentou efeitos carrapaticidas contra fêmeas ingurgitadas do carrapato Rhipicephalus annulatus, mostrando ser um novo potencial para o controle deste ácaro.

Os óleos essenciais são também estudados por pesquisadores em todo mundo, a fim de avaliar a eficácia dos mesmos como conservantes de alimentos. Valeriano e colaboradores (2012) relatam a atividade antibacteriana de óleos essenciais de hortelã-pimenta (Mentha piperita), capim-limão (Cymbopogon citratus), manjerona (Origanum majorana), e 28

manjericão (Ocimum basilicum) frente aos patógenos de origem alimentar Escherichia coli, Salmonella entérica, Listeria monocytogenese e Enterobacter sakazaki. Sendo assim, as propriedades de biopreservação encontradas nos óleos essenciais indicam que estes podem se tornar uma opção promissora para o desenvolvimento de produtos de interesse para as indústrias alimentícias, podendo ser uma alternativa para controlar a presença de bactérias patogênicas e estender a vida de prateleira de alimentos processados.

1.6.1 Constituintes Químicos de Óleos Essenciais

Quimicamente, os óleos essenciais são constituídos de hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpenos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e compostos contendo enxofre em diferentes concentrações (SIMÕES et al., 2004). Estudos de elucidação estrutural, nas últimas décadas, identificaram centenas de constituintes presentes nos óleos essenciais, proporcionando entendimento da complexidade e enorme diversidade que existe neste grupo de substâncias oriundas dos metabólitos secundários de origem vegetal, as quais consistem normalmente de terpenoides, fenilpropanoides e outros componentes voláteis (FRANZ, 2010). Segundo Bakkali (2008) alguns óleos essenciais como Origanum compactum (Lamiaceae) e Coriandrum sativum (Umbelliferae) apresentam misturas complexas podendo conter cerca de 20-60 componentes em concentrações muito diferentes. Normalmente apresentam dois ou três componentes em altas concentrações (20-70%), sendo estes considerados os constituintes majoritários dos óleos essenciais.

1.6.1.2 Terpenos

Os terpenos, também denominados de terpenoides ou isoprenoides, constituem o maior grupo de metabólitos secundários, são essenciais para a sobrevivência e continuidade da espécie dentro do ecossistema. Possuem uma grande variedade de substâncias vegetais, derivados de unidades do isopreno, unidades pentacarbonadas, (Tabela 1), que se origina do ácido mevalônico, tendo precursores como piruvato e o AcetilCoA. Nos componentes de óleos voláteis predomina a condensação cabeça-cauda. Os compostos terpênicos mais presentes nos óleos voláteis são monoterpenos (cerca de 90%) e sesquiterpenos, com 10 e 15 unidades de carbono respectivamente (Tabela 1). Os terpenoides 29

possuem um grande potencial comercial, como por exemplo, limoneno utilizado como flavorizante em alimentos e germacreno como fragrância na indústria de cosméticos. Apresentam importância para qualidade de frutas e flores, por interferirem no sabor e aroma, respectivamente (PETERSEN, 2006). Alguns terpenos se destacam por apresentarem atividade inseticida comprovada com é o caso da azadiractina, um limonoide encontrado na Azadiracta indica (Meliaceae) (VIEGAS, 2003). Os terpenoides são mais encontrados na natureza, porém os fenilpropanoides são de extrema importância em algumas espécies aromáticas por conferirem odor e sabor característico, como por exemplo, eugenol, presente em Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (cravo-da-índia) empregado em produtos de higiene oral (SIMÕES et al., 2004).

Tabela 1 – Condensação de unidades de isopreno na formação de terpenoides

N° de Número de átomos de carbono Nome ou Classe Unidade

1 Isopropeno

5 2 Monoterpenoides 10 3 Sesquiterpenoides 15 .. 4 Diterpenoides 20 5 Sesterpenos 25 6 Triterpernoides

30 8 Tetraterpenoides

40 n n Polisoprenoides

Fonte: Simões (et al, 2004).

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1.6.1.3 Fenilpropanoides

Os fenilpropánoides são substâncias aromáticas constituídas de uma cadeia lateral de três átomos de carbono ligada a anel aromático, derivados de aminoácidos aromáticos, oriundos da via do ácido chiquímico. Nesta via, a partir do ácido chiquímico, é produzido o aminoácido fenilalanina que, por ação da enzima fenilalanina amonialiase (PAL) forma o ácido cinâmico e ácido p-cumárico (FLORÃO, 2006). A redução da cadeia lateral destes ácidos leva à formação de alilbenzenos e propenilbenzenos, esqueletos carbônicos dos fenilpropanoides (Figura 6).

Figura 6 - Formação dos compostos fenilpropanoidícos Fonte: Florão, 2006.

1.6.1.4 Método de Extração de Óleo Essencial Os métodos de extração mais utilizados para óleos essenciais são: a hidrodestilação, o arraste a vapor, a prensagem a frio, a extração com solventes orgânicos, a extração por alta pressão e a extração por CO2 supercrítico (OKOH et al., 2010). Dentre estas técnicas, destaca- se a hidrodestilação, na qual o aparelho do tipo Clevenger, é o mais utilizado em laboratórios de pesquisa, em função de seu baixo custo e fácil manipulação (Figura 7). É importante ressaltar que diferentes métodos de extração e as diferentes condições operacionais podem influenciar na composição dos óleos essenciais, permitindo variação das 31

características físico-químicas, bem como de suas propriedades bioativas. Desse modo, a determinação da composição química do material extraído constitui uma análise fundamental.

Figura 7 - Aparelho extrator de óleo essencial do tipo Clevenger

Fonte: Carvalho, 2013

1.6.1.5 Análise dos Constituintes Químicos de Óleos Essenciais

Segundo Franz (2010), provavelmente o passo mais importante na análise de produtos oriundos do metabolismo secundário de vegetais tenha sido a introdução dos métodos cromatográficos, nos quais a cromatografia de camada fina e cromatografia gasosa tiveram o maior impacto na análise de óleos essenciais. Atualmente, a Cromatografia com fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/ EM) é uma das técnicas mais utilizadas, por ser um método avançado e altamente sofisticado. Permitindo a separação dos constituintes dos óleos, que são introduzidos individualmente em ordem de eluição na câmera de ionização do espectrômetro de massas e são identificados através da comparação dos índices de retenção (IR) e espectro de massas com dados publicados, através do uso de banco de dados da biblioteca do espectro de massa, 32

apresentando os resultados em forma de cromatograma (STEFANELLO et al., 2011; ADAMS, 2007). A Figura 8 apresenta o cromatograma do óleo essencial de Pilocarpus spicatus, indicando as áreas dos picos de identificação das substâncias.

Figura 8 - Cromatograma obtido por (CG/EM) dos constituintes químicos encontrados no óleo essencial das folhas de Pilocarpus spicatus Fonte: LTPN/UFF

1.7 Atividade Inseticida

Há mais de 60 anos a indústria iniciou a produção e comercialização de pesticidas químicos sintéticos, na esperança de encontrar uma solução para os problemas que já se apresentavam àquela época, tais como, perda da efetividade dos praguicidas sintéticos e resistência das pragas existentes nas lavouras. Atualmente se aplicam aproximadamente três milhões de toneladas de pesticidas por ano, mesmo assim as perdas por ataques de pragas ultrapassam 40% ao ano (CONSUEGRA, 2004).

No contexto agrícola, denomina-se praga a qualquer corpo que, em determinado nível populacional, compete e cause danos econômicos sobre uma espécie animal ou vegetal, em qualquer fase da criação, desenvolvimento ou produção, ou em um manejo posterior que o homem faça para seu benefício, por exemplo, pós-colheita (NICHOLLS, 2008).

A necessidade de controlar insetos, reduzindo populações de pragas e vetores de doenças, evitando que causem problemas ao meio em que vivem, é uma realidade que se torna mais evidente em função dos prejuízos causados na agricultura, saúde humana e animal, bem 33

como ao meio ambiente. Várias estratégias são utilizadas no controle de insetos ditos nocivos. Substâncias de origem natural oriundas de espécies vegetais, agentes biológicos, sintéticos e peixes são alternativas para o controle, prevenção e eliminação dos insetos nas diferentes faces de seu ciclo. Inseticidas, pesticidas ou praguicidas são agentes químicos ou biológicos utilizados para impedir, destruir, repelir ou mitigar qualquer praga. Ao longo das últimas três décadas observar-se uma intensa pesquisa sobre substâncias naturais e interações químicas insetos-plantas. O avanço destas pesquisas com intuito de buscar novos biopesticidas justifica-se pela necessidade na obtenção de compostos para o controle de pragas e vetores de doenças, que sejam mais seletivos para o inseto alvo, sem efeito sobre predadores e outros organismos úteis, incluindo o homem e que não ocasionassem alterações ambientais, tais como a contaminação de alimentos, solo e água (MOREIRA; MANSUR, 2012). Outro fator que justifica as pesquisas é a seleção de populações resistentesem diversas populações de insetos a utilização dos inseticidas químicos convencionais, como organoclorados, carbamatos e organofosforados (VENDRAMIN; CASTIGLIONE, 2000).

Na atualidade, é crescente a busca dos consumidores por inseticidas naturais para uso na agricultura, principalmente na prática de cultivo orgânico, em animais de companhia e trabalho, bem como, para serem utilizados em ambientes, como residência, estábulo e canil, além de seu uso em jardins, por apresentarem eficácia terapêutica e segurança, contra insetos pragas de lavoura e insetos hematófagos. Este interesse vem ao encontro da necessidade de buscar por métodos alternativos de menor impacto ou risco à saúde humana e ao meio ambiente, bem como pela crescente demanda por alimentos saudáveis e isentos de resíduos agrotóxicos (AGUIAR-MENEZES, 2005). Entretanto, apenas dois novos tipos de inseticidas de origem vegetal são comercializados com relativo sucesso nos últimos 15 anos. Os que se baseiam em extratos das sementes de neem (Azadirachta indica) e os que se baseiam em óleos essenciais de plantas (ISMAN; MIRESMAILLI; MACHIAL, 2011).

Os metabólitos secundários de plantas são conhecidos por suas propriedades inseticidas, tendo histórico de uso como inseticida para matar ou repelir insetos (BROUSSALIS et al., 1999). O incentivo às investigações sobre interações plantas/insetos, nas últimas décadas, demostrou o uso potencial dos metabólitos de plantas ou aleloquímicos como agentes para esta finalidade (PAVELA, 2004). Os metabólitos secundários também têm sido utilizados como modelos para pesticidas sintéticos, como toxafeno, piretrinas, nicotina e rotenona (CHAGAS et al., 2002). 34

As substâncias de origem vegetal com potencial no controle de insetos podem ser utilizadas como uma alternativa às substâncias sintéticas ou adicionadas a outros inseticidas sintéticos nos programas de controle de vetores. Dependendo do tipo de atividade, estas substâncias podem ser usadas como inseticidas, levando à morte de larvas e adultos ou como repelentes para proteção pessoal (ICMR BULLETIN, 2003).

O Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades do mundo, com aproximadamente 43790 espécies de plantas das 256 mil existentes, possuindo assim um grande potencial como fonte de substâncias biologicamente ativas provenientes de plantas. A utilização de óleos essenciais ou extratos de plantas com atividade inseticida tem aplicação importante na saúde pública e na agropecuária (http://floradobrasil.jbrj.gov.br/>acessado janeiro-2014; MATIAS, 2002).

As vantagens da utilização de óleos essenciais para o controle de pragas, é que eles podem ser facilmente extraídos por destilação a vapor, são voláteis, podendo ser potencialmente usados como fumegantes (ZUNINO et al., 2012). Além de apresentarem uma complexidade química, gerando uma maior dificuldade a resistência causada por produtos sintéticos basicamente elaborados com uma única substância ativa (MOREIRA; MANSUR, 2012). Dentre os óleos essências com atividades pesticidas para diversas pragas podemos destacam-se os óleos essenciais de Cinnamomum zeylanicum (Lauraceae), Cymbopogon citratus (Apoaceae), Lavandula angustifólia (Lamiaceae), Tanacetum vulgare (Asteraceae), Eugenia caryophyllata (Myrtaceae), Ocimum spp., Foeniculum vulgare (Apiaceae), Abelmoschus moschatus (Malvaceae), Cedrus spp. (Pinaceae), além de espécies de Piper que também são conhecidas por apresentarem atividades pesticidas. Entre elas destaca-se Piper hispidinervum (Piperaceae) eficaz contra lagarta-do-cartucho do milho, Spodoptera frugiperda (KOUL et al., 2008; LIMA et al., 2009).

Sendo assim, as substâncias de origem natural podem ser consideradas uma alternativa aos pesticidas sintéticos, como um meio para reduzir os impactos negativos causados à saúde humana, animal ao meio ambiente e seleção dos organismos alvos.

1.7.1 Rhodnius prolixus

Rhodnius prolixus Stal, é uma espécie classificada na ordem Hemíptera, sub-ordem Heteroptera, família Reduviidae e subfamília Triatominae. Este inseto hemimetabólico, sob o 35

ponto de vista ontogênico, possui três fases: ovo, ninfa e adulto. Os processos fisiológicos da muda, que culminam com a ecdise, são disparados geralmente por uma única alimentação sanguínea em cada um dos cinco estágios de ninfa (WIGGLESWORTH, 1972). A manutenção de uma colônia destes hemípteros é facilitada pela intensa postura de ovos pelas fêmeas adultas e pela disposição desta espécie em aceitar alimentação em um aparato artificial (AZAMBUJA; GARCIA, 1997).

Rhodnius prolixus, é um importante vetor da Doença de Chagas nas Américas Central e do Sul, sendo tradicionalmente usado em modelos para estudos de fisiologia de insetos, controle estratégicos de vetor (GARCIA; AZAMBUJA, 2004) e interação parasita vetor (CHAGAS, 1909; GONZALEZ et al., 2000; KELECOM et al., 2002).

Doença de Chagas é uma doença tropical crônica que atinge grandes áreas na América Latina, afetando aproximadamente 18 milhões de pessoas. Existem aproximadamente 300.000 novos casos diagnosticados em todo ano, com cerca de 21.000 novos casos de morte anuais (SCHAUB, 2009; COURA, 2005). Além disso, novos problemas epidemiológicos, políticos, sociais e econômicos tem surgido com a internacionalização da Doença de Chagas devido à migração legal e ilegal de pessoas entre os países endêmicos da América Latina para países não endêmicos na América do Norte, Europa, Ásia e Oceania, causando sérios problemas de saúde pública nestes países.

1.7.2 Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus

Diversas espécies com forte impacto na economia agrícola pertencem à ordem Hemíptera (GOODCHILD, 1966). Dentro desta ordem se encontra as famílias Lygaeoidae e Pyrrhocoridae. A família de relativa importância é a Lygaeoidea, com insetos exclusivamente fitófagos, que se alimentam principalmente da seiva dos tecidos vegetais de várias espécies das famílias Asclepiadaceae, Asteraceae e Convolvulaceae. Estes percevejos são reconhecidos facilmente pela sua coloração com chamativos tons de vermelho, laranja e preto (CERVANTES-PEREDO et al., 2007).

Oncopeltus fasciatus (Lygaeoidae) é utilizado como inseto modelo para pesquisas em entomologia e também para testes de atividade inseticida e quimioesterizantes (FERNANDES, 2011). 36

Dysdercus peruvianus (Pyrrhocoridae), que assim como outras espécies e gêneros desta família são conhecidos vulgarmente como percevejos manchadores do algodão Gossypium hirsutum (GALLO, 1988), são responsáveis por causar, algumas vezes, prejuízos às plantações de algodão, e consequentemente à economia. Tais prejuízos estão relacionados à perda de peso da semente, redução do teor de óleo, abertura para entrada de fungos e bactérias, além das manchas produzidas nas fibras (LIMA, 2012; FERNANDES et al., 2013).

1.8 Atividade Acaricida Carrapatos fazem parte da ordem Acarina, assim como os ácaros. Eles são geralmente grandes e de vida longa quando comparados a estes. Existem ácaros predadores de vida livre, parasitas, parasitas em apenas parte de seu ciclo, herbívoros ou detritívoros. Ocupam uma grande variedade de habitat, tais como solo, oceanos, desertos e áreas geladas, podendo afetar classes de invertebrados e todos os vertebrados, principalmente aves e mamíferos. A maioria das espécies de ácaros, são ectoparasitas, habitam na pele de mamíferos e aves onde se alimentam de sangue, linfa, fragmentos de pele ou secreções sebáceas, as quais são ingeridas através da perfuração da pele. Infestação por ácaro é conhecida como acaríase e podem resultar em várias dermatites, chamadas de sarnas, os quais podem causar significativos problemas de mal-estar e perdas econômicas (WALL; SHEARES, 2001). Tanto na medicina veterinária, como na medicina humana os carrapatos de maior importância pertencem às famílias Argasidae e Ixodidae, conhecidos como carrapatos moles e duros, respectivamente. Podem causar enfermidades nos animais afetando criações, perdas estimáveis na produção de carne, leite, qualidade do couro, diminuição na reprodução e até mesmo a morte do animal (FREITAS, 1984). Em humanos as enfermidades com características zoonóticas podem levar ao parasitismo cutâneo e escabiose causada pelo Sarcoptes scabiei (NONG et al., 2013), quadros de envolvimento sistêmico e febre maculosa causada pela Rickettsia rickettsii, que tem como vetor o carrapato Amblyomma cajennense e doença de Lyme causada pela Borrelia burgdorferi, tendo como possíveis vetores no Brasil carrapatos do gênero Amblyomma, Ixodes scapularis nos EUA e Ixodes ricinus na Europa. A doença a erlichiose causada pela Ehrlichia sp. também apresenta como um dos principais vetores o carrapato Rhipicephalus sanguineus (SERRA-FREIRE et al., 2013).

O controle de parasitos é a principal dificuldade encontrada por produtores, agrônomos e médicos veterinários, uma vez que o objetivo não é mais exterminar os mesmos 37

e sim ter um controle sobre as infestações para manter um equilíbrio biológico nos ecossistemas. Segundo MARTINS (2004) substâncias ativas destinadas ao controle de parasitas, ao longo das últimas décadas, em algumas circunstâncias, tornaram-se fragilizadas frente aos desafios que lhe foram impostos, seja pelo mau uso dos que a manipulam na lavoura ou no rebanho, seja pelo efeito minimizado que provocam no seu alvo, em consequência do inexorável problema da seleção de populações resistentes.

Dentro destas perspectivas de controle incluem-se os estudos com enfoque em plantas que apresentem atividades carrapaticidas. As famílias de plantas mais utilizadas como pesticidas são Meliaceae, Rutaceae, Asteraceae, Annonaceae, Lamiaceae e Canellaceae (CAMPOS et al., 2012). O que é mostrado nos estudos realizados por Gazim e colaboradores (2011), onde o teste como óleo essencial da espécie Tetradenia riparia (Lamiaceae) frente ao ácaro R. microplus apresentou alta taxa de mortalidade de fêmeas ingurgitadas em baixas concentrações do óleo essencial, bem como, redução do número e peso de ovos, diminuição de eclosão e mortalidade das larvas. Nchu e colaboradores (2012), sugerem em seu estudo para avaliação da atividade frente ao carrapato Hyalomma rufipes, que o óleo essencial das flores, folhas e hastes de Tagetes minuta (Asteraceae) pode ser uma fonte em potencial como repelente para auxiliar no combate este ácaro.

1.8.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini) Rhipicephalus (Boophilus) microplus, (Acari: Ixodidade) antigamente Boophilus microplus é a principal espécie de carrapato que afeta a produtividade da pecuária no Brasil. É um parasito de um único hospedeiro em seu ciclo evolutivo. Possui como principal hospedeiro o rebanho bovino, podendo também parasitar ovelhas, cavalos e até mesmo seres humanos. Este ácaro sugador de sangue está amplamente distribuído em grandes rebanhos da América, África, Ásia e Oceania, entre os paralelos 32 º N e 32 º S (MURRELL; BARKER, 2003; SANTOS et al., 2012). Este ectoparasita é responsável por transmitir ao gado Babesia spp., um protozoário capaz de causar anemia branda, palidez de mucosas, febre, sialorreia, depressão, disturbios neurológicos e tremores. Rhipicephalus (B.) microplus pode também transmitir ao gado Anaplasma spp.,bactéria responsável por acometer os animais de febre, perda do apetite, emagrecimento, pelos arrepiados, taquicardia, taquipneia, redução dos movimentos de ruminação, anemia e icterícia. Acarretando desta forma, prejuízos econômicos em áreas tropicais e subtropicais do mundo (PARIZI et al., 2009). 38

Seu ciclo de vida compreende duas fases: de vida livre que se realiza no solo e vegetação e fase parasitária, realizada no corpo do hospedeiro. A fase de vida livre começa com as fêmeas ingurgitadas (teleóginas), caindo ao solo em busca de um ambiente favorável para realizar a postura, evolução e eclosão de seus ovos. Em condições favoráveis de calor (27º C) e umidade (70%) dentro de dois a três dias, inicia-se a postura, seguida da eclosão inicia-se em torno de sete dias após a postura. Passados mais sete dias a larva está ativa para infestar o hospedeiro.

A fase parasitária inicia-se com a chegada da larva infestante ao bovino onde irá se transformar em metalarva. Sofre muda e se transforma em ninfa que irá sofrer metamorfose e se transformar em um indivíduo sexuado neandro (macho) ou neógina (fêmea). Macho e fêmea ao amadurecerem passam a se chamarem gonandro e paternógina, respectivamente. Ao estar totalmente ingurgitada de sangue a fêmea ganha à denominação de teleógina (GONZALES, 1993). A partir da fixação da larva para ingurgitamento da fêmea adulta são requeridas três semanas. Após estarem alimentadas com sangue, as fêmeas irão adquirir 250 vezes de seu peso. O ciclo de vida pode ser concluído em dois meses, com período de permanência no hospedeiro variando de 17 a 52 dias (WALL; WSHEARES, 2001), o que pode ser visto na Figura 9.

O método de controle de carrapatos atualmente empregado é através da utilização de produtos químicos, comercialmente disponíveis, tais como organofosforados, piretroides, formamidina, fluazuron e fipronil. Geralmente estes são aplicados na forma de aspersão ou injetáveis, resultando em alto custo e uso em altas doses que pode levar a ocorrência de resíduos na carne e leite (FURTADO et al., 2013). Estes enormes prejuízos econômicos poderiam ser minimizados pelo controle de populações de carrapatos a níveis aceitáveis. No entanto, o uso indevido de substâncias ativas convencionais aumentou a incidência de seleção de carrapatos além de aumentar a ocorrência de contaminação no ambiente e nos alimentos (MARTINS et al., 2002; PARIZI et al., 2009). 39

Figura 9 - Ciclo evolutivo do carrapato Fonte: Mattos, 2013

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Identificar a composição química e avaliar a atividade biológica do óleo essencial das folhas da espécie Zanthoxylum tingoassuiba.

2.2 Objetivos Específicos - Extrair por hidrodestilação, identificar e determinar os constituintes químicos do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba; - Avaliar a atividade biológica do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba sobre o ciclo de vida e desenvolvimento dos hemípteros Rhodnius prolixus, Dysdercus peruvianuse e Oncopeltus fasciatus;

- Avaliar atividade biológica do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba frente às teleóginas de Rhipicephalus microplus, bem como a capacidade da inibição da oviposição e eclodibilidade;

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3 METODOLOGIA

3.1 Material Vegetal

Folhas de três espécimes de Zanthozylum tingoassuiba foram coletadas no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (22°13’27.29”S - 41°36’53.38”W, 22°13’26.87”S - 41°36’54.66”W, 22°13’27.75”S - 41°36’56.52”W), RJ, Brasil, em maio de 2012. As coletas foram realizadas de acordo com a autorização 13659-2 Ministério do Meio Ambiente – MMA, Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade – ICMBio, Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade – SISBIO. A identificação da espécie foi realizada pelo botânico Marcelo Guerra Santos, professor adjunto da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, com a confirmação do especialista na família Rutaceae, Dr. José Pirani (USP). A herborização do material vegetal foi realizada e uma exsicata (Figura 11) foi depositada no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da Universidade do Estado do Rio de Janeiro sob o número de registro RFFP 15.497.

Figura 10 - Exsicata de Zanthoxylum tingoassuiba coletada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em maio de 2012 Fonte: Herbário da Faculdade de Formação de Professores da Universidade do Estado do Rio de Janeiro 42

3.2 Extração do Óleo Essencial O óleo essencial foi extraído segundo a metodologia descrita por Oliveira et al., (2006). Para tal, as folhas frescas (6000 g) de três espécimes de Zanthoxylum tingoassuiba foram misturadas, turbolizadas com água destilada O material turbolizado foi dividido em porções iguais e colocado em balões de 5L com quantidade suficiente de água e submetidos a aquecimento em manta térmica por quatro horas e o óleo essencial extraído por hidrodestilação, utilizando um aparato do tipo Clevenger (Figura 11). Ao final da extração, o óleo foi filtrado em sulfato de sódio anidro e acondicionado sob refrigeração para posterior realização da identificação dos constituintes e testes biológicos.

Figura 11 - Extração do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba Fonte: Própria autora

3.3 Identificação dos constituintes do Óleo Essencial

3.3.1 Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas O óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba foi analisado por Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM), em cromatógrafo GCMS-QP5000 (SHIMADZU) a gás equipado com detector de massas com ionização por impacto de elétrons (70 eV). As condições da cromatografia gasosa foram: 43

temperatura de injeção, 260 °C; temperatura do detector, 290 °C; Hélio como gás de arraste, taxa de fluxo de 1mL/min e injeção split com 1:40 de razão de split. Temperatura do forno foi inicialmente 60 °C e depois aumentou até 290 °C a uma taxa de 3 °C/min. Um microlitro de uma solução da amostra, dissolvida em CH2Cl2 (1:100 mg/mL), foi injetado na coluna RTX5 (id = 0,25 mm, comprimento 30 m, espessura = 0,25 µm). As condições da espectrometria de massa (EM) foram: voltagem de 70 eV e taxa de varredura 1 scan / s. O padrão de fragmentação do espectro de massas foi comparado com a biblioteca (National Institute of Standards and Technology - NIST) do equipamento. A composição percentual relativa das substâncias presentes no óleo das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba foi calculada pelo método de normalização das áreas dos picos. A identificação das substâncias foi realizada por comparação do índice aritmético (IA), determinado em relação ao tempo de retenção de uma série de n-alcanos (C7-C26), (VAN DEN DOOL; KRAFTZ, 1963) com dados de referência correspondentes (KARIOTI et al., 2003; SKALTSA et al., 2003; ADAMS, 2007).

3.4 Atividades Biológicas

3.4.1 Avaliação da Atividade Inseticida Os ensaios para avaliação de atividade inseticida foram realizados em colaboração com os professores Dr. Marcelo Salabert Gonzalez, Drª. Maria Denise Feder e Dr. Cícero Brasileiro de Mello Neto, no Laboratório de Biologia de Insetos do Departamento de Biologia Geral/UFF. Os insetos utilizados foram o Rhodnius prolixus, uma espécie de barbeiro, Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus, espécies de percevejos. Todos da ordem Hemiptera.

3.4.1.1 Rhodnius prolixus Para este teste foram utilizados adultos e ninfas de quinto estádio de Rhodnius prolixus (Figura12 A e B) da colônia mantida pelo Laboratório de Biologia de Insetos, Departamento de Biologia Geral/UFF em condições previamente descritas por GARCIA e colaboradores (1984), acondicionando-se os insetos em frascos dentro de uma incubadora, a uma temperatura de 280 C e umidade relativa de 60-75%. 44

O experimento foi desenvolvido seguindo a metodologia de MELLO e colaboradores (2007). Após ecdise, ninfas de quinto instar de insetos machos de Rhodnius prolixus foram mantidos em jejum de 25 dias. Após este período, os insetos foram então submetidos a três diferentes abordagens: i) tópico, ii) contato e iii) via repasto sanguíneo. No grupo controle, insetos não tratados, as ninfas foram alimentadas com sangue de coelho desfibrinado (fornecido pela CEUA/ FIOCRUZ).

Figura 12 – A: Ninfas do 5º estágio de R. prolixus. B: R. prolixus adultos Fonte: Fernandes (et al., 2013)

No tratamento tópico, doses de 5,0 µL, 1,0 µL e 0,5 µL do óleo essencial Zanthoxylum tingoassuiba por inseto foram aplicados, com auxílio de pipeta automática, diretamente sobre a superfície ventral do abdômen, imediatamente após a alimentação (Figura13 A). No tratamento dos insetos alimentados, diferentes quantidades de óleo essencial foram adicionados à dieta (sangue desfibrinado) dos insetos até alcançar as concentrações finais de 5,0 µL por mL sangue (Figura 13 B). Finalmente, para o tratamento por contato, o óleo essencial foi aplicado uniformemente sobre o fundo de uma placa de Petri (Ø 9 cm), a fim de obter concentrações finais que variam de 0,1 a 5,0 µL/cm2. Após a evaporação parcial do óleo, as ninfas foram colocados sobre a superfície tratada, e cobertas com uma placa de Petri (Figura13 C). Apenas insetos totalmente ingurgitados foram usados ao longo dos experimentos. As avaliações biológicas dos diferentes tratamentos foram registradas e foram observados durante um período de 30 dias), onde foi observado a toxicidade frente a mortalidade, metamorfose, mal formação e paralisia, o qual foi determinada pela ausência de resposta ao controle reflexo de retirada ápos à aplicação de uma pressão delicada nas pernas do inseto com uma pinça e observando a capacidade de crescimento das antenas, bem como pela 45

ausência de movimento da ninfa. Todos os experimentos foram repetidos, pelo menos em triplicata, com lotes de 30 insetos.

A B C

Figura 13 - A: Tratamento tópico de ninfas do 5º estágio de Rhodnius prolixus. B: Tratamento via oral de ninfas do 5º estágio de Rhodnius prolixus. C: Tratamento por contato de ninfas do 5º estágio de Rhodnius prolixus Foto: Izadora Dolabella

3.4.1.1.1 Declaração de Ética Rhodnius prolixus foram alimentados e criados de acordo com os Princípios Éticos em Experimentação Animal, aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Fiocruz (CEUA/FIOCRUZ ). Os experimentos realizados com sangue de coelho usando um aparato artificial, foram realizadas de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal aprovado pelo Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/FIOCRUZ), sob o número de protocolo aprovado L-0061/08. Ambos os protocolos são do CONCEA/MCT ( http://www.cobea.org.br/), que está associado com a Associação Americana de Ciência Animal (AAAS), Federação das Associações de Animais Laboratório Europeu de Ciência ( FAALEC), Conselho Internacional de Ciência em Animais de Laboratório (ICLAS) e da Associação Internacional para Avaliação Acreditação de Laboratórios de Cuidado com Animais (AAALAC).

3.4.1.2 Análise Estatística dos Dados A significância dos resultados foi analisada utilizando análise de variância e teste de Tukey (ARMITAGE et al., 2002) de acordo com Stats Direct Statistical Software, versão 2.2.7 para Windows 98. As diferenças entre os insetos tratados e os do grupo controle foram considerados estatisticamente sem significância quando p > 0,05. Intervalos de confiança (IC) 46

e Relações de Probabilidades (RPS) também foram utilizados. As diferenças entre os grupos tratados e controle foram considerados estatisticamente significativos quando RPs e 95% dos IC foram > 1,0.

3.4.1.3 Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus As colônias dos insetos O. fasciatus e D. peruvianus (Figura 14 A e B) foram estabelecidas no Laboratório de Biologia dos Insetos da Universidade Federal Fluminense (UFF), sob a coordenação da professora Drª. Maria Denise Feder.

Figura 14 - A: Ninfa de 4º e 5º estágio e adulto de O. fasciatus. B: Adultos de D. peruvianus Fonte: Fernandes (et al., 2013)

Os insetos da espécie D. peruvianus foram mantidos a uma temperatura média que varia entre 20-25ºC, 75% de umidade relativa e fotoperíodo de 16h luz e 8h escuridão (MILANO et al., 1999). Os insetos foram mantidos em cubas de vidro transparente, cobertas com tecido do tipo filó e alimentados com sementes de algodão (Gossypium hirsutum). Os insetos tiveram livre acesso à água armazenada em bebedouros dentro das cubas. Durante os períodos de cópula e postura, as sementes foram mantidas no interior das cubas, até o 1º instar. Contudo, a partir do segundo instar, os insetos foram transferidos semanalmente para cubas limpas e as sementes colocadas sobre o filó, para que o processo de limpeza e manutenção da colônia seja facilitado (STANISÇUASKI et al., 2005). Dentro das cubas de vidro, é utilizado papel filtro para forrar a cuba (cortado em formato circular) e para aumentar a área de movimentação dos insetos (cortado em formato retangular e dobrado para se tornar sanfonado). Para facilitar o processo de postura pelas fêmeas, bem como o da coleta dos ovos, 47

placas de Petri são colocadas no fundo das cubas, e no interior destas placas gazes ou algodão que são recolhidos de dois em dois dias e transferidos para uma cuba limpa e sem nenhum inseto, contendo apenas sementes e o frasco com água. Oncopeltus fasciatus foram mantidos sob condições similares àquelas de D. peruvianus a uma temperatura de 20-25ºC (FEIR; BECK, 1963), com umidade relativa de 70- 75% e um fotoperíodo de 16h de luz e 8h de escuridão, alimentados com semente de girassol (Helianthus annus). Todos os experimentos são conduzidos em uma incubadora à temperatura constante de 25ºC. São utilizadas ninfas de 4º instar durante o processo de aplicação do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba. Os testes foram realizados por meio de aplicação tópica, seguindo a metodologia descrita por Fernandes e colaboradores (2013), onde o óleo essencial foi aplicado nos insetos, em diferentes diluições (Figura 15).

O óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba, foi utilizado puro e em diluições de 500, 250, 125, 62,5 e 31,2 μL/mL utilizando-se acetona como solvente, para avaliação nos dois insetos. Durante o procedimento os insetos foram segurados com o auxílio de uma pinça entomológica e as amostras aplicadas por intermédio de uma seringa Hamilton (10 μL). Os insetos do grupo tratado com solvente receberam volume igual de acetona sobre a cutícula dorsal. Os insetos do grupo não-tratado não sofreram qualquer espécie de tratamento ou manipulação.

Figura 15 - Ninfas de 4º estágio de Oncopletus fasciatus durante o processo de aplicação da amostra Fonte: Xavier, 2010 A avaliação do efeito biológico nas diferentes dosagens foi realizada durante todo o tempo necessário para o desenvolvimento do inseto a partir do 4º instar até a fase adulta, ou seja, um período de 28 dias de observações diárias. Durante todo o período de experimentação, foram registrados peso (ganho de peso e crescimento corpóreo) e toxicidade (i.e. mortalidade durante as primeiras 24 horas imediatamente após o tratamento tópico e 48

durante os 28 dias de observações), período de intermuda (intervalo), muda e metamorfose, ninfas permanentes (ninfas que mudaram para um determinado estádio de desenvolvimento no qual estacionaram, deixando de realizar mudas logo em seguida), ninfas extranumerárias (ninfas que mudaram para um 6 º estádio anormal no ciclo de desenvolvimento dos insetos) e deformidades corporais dos insetos. Todos os tratamentos com as diluições do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba foram realizados em quadriplicata com grupos de 30 insetos, retirados das colônias aleatoriamente, totalmente ingurgitados, sendo este número considerado o número total de insetos (n = 30 em cada grupo da quadriplicata) a partir do dia que sucedera a aplicação tópica do óleo essencial em ninfas de 4º instar (1º dia) até o último dia de observação (28º dia).

3.4.1.4 Análise Estatística dos Dados

A significância dos resultados foi analisada por ANOVA e teste de Tukey, de acordo com o programa “Direct Statistical Software”, versão 2.2.7 para Windows 98. As diferenças entre os grupos tratados e controles positivos de insetos foram consideradas sem significância estatística quando p > 0,05.

3.4.2 Atividade Acaricida

Os ensaios para avaliação de atividade acaricida foram realizados em colaboração com a professora Drª. Evelize Folly das Chagas, Instituto de Biologia, Laboratório de Metabolismo de Parasitos, Departamento de Biologia Celular e Molecular (GCM/UFF). O ácaro utilizado foi o carrapato Rhipicephalus microplus.

Os carrapatos são oriundos da colônia mantida na Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Brasil, criados seguindo a metodologia de Parizi et al.,(2009). Cepas de R. microplus (Acari: Ixodidae) foram obtidas de bezerros criados em uma área livre de carrapatos. Fêmeas adultas ingurgitadas foram mantidas em placas de Petri a 28 °C e 80 % de humidade relativa, após a conclusão da oviposição, que começa aproximadamente três dias depois que os carrapatos adultos caem dos bezerros. Os animais foram tratados de acordo com a Comissão de Revisão para Cuidados Animais (UFRGS). 49

Para verificação da eficácia carrapaticida in vitro do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba, foram preparadas três concentrações de 5,0%, 2,5% e 1,25% de óleo essencial solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO). Para o Teste de Imersão de Adultos (AIT), foi seguida a metodologia Drummond e colaboradores (1973), adaptada pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Metabolismo de Parasitos, GCM/UFF. Fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram pesadas (peso médio 0,3 g), separadas em grupos de 15 com pesos homogêneos, em triplicata, para cada concentração, incluindo o grupo controle. Os grupos foram imersos em 5,0 mL das soluções testes, agitados vagarosamente por 1 minuto. O excesso da solução foi removido com papel absorvente, os carrapatos foram então colocados em placa de Petri, e acondicionados em estufa BOD (Biochemical Oxygen Demand) a 28ºC e 70% de umidade relativa. Após 24h iniciaram-se as observações para verificação da ocorrência ou não de mortalidade e postura. As observações foram mantidas até o 14º dia após a incubação. Os ovos foram pesados e observados por mais 14 dias para verificação da eclosão e formação de larvas. Para o teste de avaliação da eclodibilidade 0,3 g de ovos foram pesados e colocados em tubos de vidro fechados com tampão de algodão. Foram utilizadas as mesmas concentrações de óleo essencial usadas no teste de imersão de adultos, ou seja, 5,0 %, 2,5 %, 1,25 % e DMSO 1,0% como controle. As soluções foram injetadas para dentro do tubo com auxílio de uma seringa. Após 2 minutos, os tubos foram invertidos e o excesso de óleo absorvido pelo tampão de algodão. Os tratamentos foram realizados em triplicata, mantidos a 27°C e 75% de umidade (BOD), por um período de 14 dias.

3.4.2.1 Análise Estatística dos Dados A significância dos resultados foi expressa como a média ± erro padrão da média. Os grupos foram comparados utilizando-se ANOVA. Com valor de p < 0,05 foi considerado com significância. A análise estatística foi realizada utilizando software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Softhware Inc., San Diego, EUA). A avaliação do Índice de Postura (IP) e % Inibição de Postura foram avaliadas após 14 dias de tratamento, segundo a metodologia de Ribeiro et al.,(2008). Índice de Postura (IP) = _peso de ovos eclodidos (g)

peso inicial de fêmeas (g) % Inibição Postura = postura (IP grupo controle – IP grupo tratado) x 100 IP grupo controle

50

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Análise do Óleo Essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba O óleo essencial das folhas frescas apresentou um rendimento de 0,1%. A parte da planta utilizada, o rendimento e aparência do óleo estão descritos na Tabela 2. Foram também identificados um total de 54 componentes no óleo essencial, como descrito na Tabela 3.

Tabela 2 – Aspecto e rendimento dos óleos essenciais das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba

Parte da planta Rendimento Aspecto

Folhas 0,1% (5,8 g) Amarelo claro

Os sesquiterpenos representaram a maior fração do óleo essencial (47,3%), enquanto os monoterpenos representaram 41,2%, o óleo essemcial também apresentou 1,7% de álcoois e 0,2% aldeídos (Tabela 3). Sendo os principais constituintes encontrados nos óleos, o silvestreno (11,3%) e o muurola-4,5-trans-dieno (8,4%), o isodauceno (8,3%) e o α-pineno (7,6%).

Segundo Detoni e colaboradores (2009), o óleo essencial das partes áreas de Zanthoxylum tingoassuiba coletado na cidade de Feira de Santana - Bahia, analisado por GC/MS apresentou um óleo com uma mistura complexa de compostos orgânicos, entre os quais, metil N-methilantranilato e o sesquiterpeno α- bisabolol representam mais de 70% da composição do óleo essencial. Estas substâncias estas não foram encontradas na espécie coletada no PNRJ objeto deste estudo. Enquanto estudo realizado com a espécie Zanthoxylum syncarpum coletada no município de Caucaia, Ceará, em meses diferentes, verificou rendimentos de 0,07% e 0,1% na extração do óleo essencial e a análise dos constituintes químicos identificou a presença de mirceno, β-elemeno e espatulenol (VIEIRA et al., 2009). Outro estudo para avaliar a composição química de óleos essenciais do gênero Zanthoxylum identificou como principais constituintes dos frutos de Z. rhoifolium, mirceno, felandreno, germacreno D, enquanto no frutos Z. fagara foram identificados germacreno D-4-ol, elemol e α-cadinol (PATIÑO et al., 2012). Estes resultados são próximos aos encontrados para a espécie Zanthoxylum tingoassuiba coletada no PNRJ. 51

Segundo Gobbo-Neto e Lopes (2007), as variações na composição do óleo de folhas podem ser explicadas, pois, vários fatores ambientais como a composição dos nutrientes no solo, intensidade da luz e condições climáticas influenciam na biossíntese de óleos voláteis. Outros fatores que podem influenciar na totalidade e proporção de metabólitos produzidos pela espécie são a idade, o estágio de desenvolvimento e as diferentes partes do vegetal (TAARIT et al., 2009). Assim como a pressão exercida pelo número de insetos que atacam as folhas de uma determinada espécie pode influenciar qualitativamente na constituição do óleo essencial (PARÉ & TUMLINSON, 1999).

Tabela 3 – Percentagem dos constituintes do óleo essencial das folhas Zanthoxylum tingoassuiba

IR Substâncias % Constituinte 802 Hexanal 0,2 851 Hexenol 0,4 863 n-Hexanol 0,3 928 α-Tujeno 0,3 938 α -Pineno 7,6 950 Canfeno 0,4 974 Sabineno 0,8 979 β-Pineno 0,7 994 Mirceno 4,0 1009 α-Careno 3,7 1019 α-Terpineno 1,0 1027 θ-Cimeno 0,5 1035 Silvestreno 11,3 1038 β-Z-Ocimeno 0,4 1049 β-E-Ocimeno 2,0 1060 γ-Terpineno 1,8 1091 Terpinoleno 0,4 1103 Linalol 2,0 1141 p-trans-Ment-2-en-ol 0,3 1154 Citronelal 0,3 1180 Terpinen-4-ol 0,6 52

1194 α-Terpineol 1,0 1203 Trans-carveol 0,3 1211 β-Ciclocitral 0,9 1230 Citronelol 0,5 1235 E- Ocimoneno 0,4 1340 δ-Elemeno 0,7 1353 α-Cubeneno 0,4 1398 β-Elemeno 4,0 1427 β-Cariofileno 4,3 1444 α-Guaieno 1,4 1449 Miltail-4(12)eno 0,4 1455 Cis-Muurola-3,5-dieno 0,6 1459 α-Humuleno 1,1 1466 γ-Gurjuneno 0,6 1475 Epi-di-4,5-aristolocheno 0,8 1481 γ-Muuroleno 0,9 1491 Muurola-4(14), 5- trans-dieno 8,4 1496 Viridifloreno 3,0 1506 Isodauceno 8,3 1514 Premnaspirodieno 0,8 1522 Cubebol 1,2 1525 α-Epi-7-selineno 2,8 1531 Zonareno 0,4 1554 Elemol 0,8 1563 Germacreno B 0,7 1583 Espatulenol 0,6 1590 Ledol 0,8 1635 Cubenol -1-epi 0,9 1653 α-Murolol 0,4 1649 Cubenol 0,6 1662 α-Cadinol 1,7 1693 Germacra-4(15),5,10(14)-trien-1-α-ol 0,7 2115 β-Fitol 1,0 Monoterpenos 34,9 53

Monoterpenos oxigenados 6,3 Monoterpenos: total 41,2 Sesquiterpenos 39,6 Sesquiterpenes oxigenados 7,7 Sesquiterpenos: total 47,3 Álcoois 1,7 Aldeídos 0,20 Total identificado 90,4

4.2. Atividade Inseticida

4.2.1 Rhodnius prolixus

Os resultados obtidos para Rhodnius prolixus mostraram que em todas as concentrações do óleo essencial utilizadas houve uma mortalidade significante, chegando a 100 % no tratamento via oral na concentração de 5,0µL de óleo/mL de sangue. Da mesma maneira, foi possível observar que nesta mesma concentração as taxas de mortalidade foram de 98,9 % no teste tópico e 63,3% no teste por contato.

4.2.1.1 Tratamento Tópico

No tratamento tópico com óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba (Figura 14A) ocorreram elevadas taxas de mortalidade a partir do primeiro dia de tratamento, 48,9 ± 18,4% (p <0,0001); 31,1 ± 9,6% (p <0,0001) e 90,0 ± 3,9% (p <0,0001) nos grupos de insetos tratados com 0,5; 1,0 e 5,0µL do óleo essencia. Enquanto no grupo controle observamos uma mortalidade de apenas 2,2 ± 1,9%. A partir do 15ª dia até o 30º, a mortalidade aumentou gradativamente para 80,0 ± 6,9% (p < 0,001), 57,8 ± 8,4% (p < 0,001) e 98,9 ± 3,9% (p <0,0001) nas dosagens de 0,5; 1,0 e 5,0µL. Neste mesmo período a mortalidade do grupo controle foi de apenas 34,4 ± 7,7% dos insetos.

O efeito tópico do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba também interferiu de maneira significante no processo de emergência de adultos, mas não foi capaz de 54

interromper o processo de metamorfose nos triatomíneos. Sendo assim, 20,0 ± 3,3% (p <0,001), 42,2 ± 3,9% (p <0,001) e 1,1 ± 0,6% (p <0,0001) ninfas do quinto estádio atingiram a fase adulta, valores que correspondem exatamente à percentagem de sobrevivência das ninfas após o tratamento com 0,5; 1,0 e 5,0µL do óleo essencial, respectivamente, no 30º dia de observação. Da mesma forma, a percentagem de adultos (65,6 ± 3,8%) observada no grupo controle (não tratado) foi à mesma de ninfas que sobreviveram relatadas durante o mesmo período (Figura 16 A e B).

A 100 90 80 70 60 50 40 30 % de Mortalidade 20 10 0 0 1 15 30 Dias de Tratamento

B 100 90

80 70 60 50 40 30

Adultos % de 20 10 0 ControleControl 0.5 µl/insect0,5µL/ 1.0 µl/insect1,0µL/ 5.0 µl/insect5,0µL/ inseto inseto inseto

Figura 16 – Tratamento Tópico: Efeito tóxico do óleo essencial de Z. tingoassuiba, no período de 30 dias, em diferentes doses frente a ninfas de 5º instar de Rhodnius prolixus. A - % Mortalidade: Controle (Barra Branca); 0,5µL/inseto (Barra com Linhas Verticais); 1,0µL/inseto (Barra com Linhas Horizontais) e 5,0µL/inseto (pontos); B - % de Adultos, em diferentes doses

55

4.2.1.2 Tratamento Via Oral

No experimento via oral (Figura 17 A e B), observou-se uma mortalidade significante dos insetos tratados, uma vez que a dose de 0,5µL de óleo/mL de sangue induziu a uma taxa de mortalidade de 48,8 ± 15,8% (p <0,001) e 62,2 ± 11,7% (p <0,001), no 15º e 30º dias após a alimentação, respectivamente, enquanto que apenas 20 ± 10,7% e 34,4 ± 8,4% dos insetos morreram nos grupos de controle, no mesmo período de tempo. Observou-se também nesta concentração uma significante redução na emergência de adultos, uma vez que apenas 37,8 ± 8,4% (p < 0,001) de ninfas atingiram a fase adulta. Mas, esta dosagem não foi capaz de inibir por completo o processo de metamorfose nos triatomíneos, uma vez que o percentual de adultos correspondente exatamente à percentagem de insetos que sobreviveram após o tratamento das ninfas com a mesma dose do óleo essencial.

Da mesma forma, a percentagem de adultos sobreviventes (65,6 ± 10,7%) observada no grupo controle (não-tratado) foi o mesmo de ninfas sobreviventes registrados durante o mesmo período (Figura 17 A e B).

Já no grupo tratado com 5,0µL de óleo essencial/mL de sangue ocorreram 100% de morte de triatomíneos, já nos primeiros 15 dias de observação (p < 0,0001). Curiosamente, a dose de 1,0µL de óleo essencial/mL de sangue não foi capaz de afetar significativamente a mortalidade dos insetos ao longo do experimento (p> 0,05), quando comparado ao grupo controle. Do mesmo modo, esta dosagem não foi capaz de afetar de forma significante a percentagem de emergência de adultos, uma vez que 61,1 ± 11,7% (p> 0,05) de ninfas de quinto estádio atingiram a fase adulta em 30 dias de observação (Figuras 17 A e B).

56

A 100A

90 80 70 60 50 40 30

%de Mortalidade 20 10 0 0 1 15 30

Dias de Tratamento B

100

80

60

40 % de Adultos 20 0 Control 0.5 µl/insect 1.0 µl/insect 5.0 µl/insect Controle 0,5µL/mL sangue 1,0µL/mL sangue 5,0µL/mL sangue

Figura 17 A - Tratamento Via Oral: Efeito tóxico do óleo essencial de Z. tingoassuiba, no período de 30 dias, em diferentes doses frente a ninfas de 5º instar de Rhodnius prolixus. A - % Mortalidade: Controle (Barra Branca); 0,5µL/mL sangue (Barra com Linhas Verticais); 1,0µL/ mL sangue (Barra com Linhas Horizontais) e 5,0µL/ mL sangue (pontos); B - % de Adultos, em diferentes doses

4.2.1.3 Tratamento por Contato

O experimento para avaliar o contato do inseto, mostrou que apenas o tratamento com 5,0 µL de óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba, alcançou um nível significativo de mortalidade 53,3 ± 41,6% (p < 0,001) e 63,3 ± 32,1% (p < 0,001), respectivamente, no 15º e 30º dias de tratamento. Enquanto apenas 23,3 ± 12,3% e 40,0 ± 17,3%, respectivamente, de triatomíneos do grupo controle morreram no mesmo período. Porém, nesta dosagem verificou-se que alguns insetos exibiram mal formação após tratamento, tais como, 57

deformidade e encurtamento da membrana anterior e posterior da asa, alongamento do fémur, tíbia e tarso, ausência unilateral da perna metatorácica (Figura 18).

Figura 18 - Pernas normais de inseto do grupo controle (Seta fina); Asas normais de inseto do grupo controle (Asterisco). Asas curtas e deformadas (Seta Branca) e Pernas deformadas (Seta preta grossa), do inseto tratado com óleo essencial de Z. tingoassuiba Nota: ausência unilateral do segundo par de pernas para o inseto localizado no centro da imagem. Barra de escala: 1 cm Foto: Rodrigo Mexas

Nas dosagens de 0,5 e 1,0µL de óleo essencial verificou-se que os níveis de mortalidade foram similares quando comparados ao grupo controle não-tratado (p > 0,05), o que é mostrado na Figura 19 A.

Em relação à metamorfose, pode-se observar que nenhuma das doses testadas, foi capaz, por meio do tratamento por contato de interromper o processo de metamorfose, quando comparado com os insetos do grupo controle (p > 0,05). O que é mostrado na Figura 19 B.

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A 100 90 80 70 60 50 40 30 % de Mortalidade 20 10 0 0 1 15 30 Dias de tratamento

B

100 90 80 70 60 50 40 % Adultos de 30 20 10 0 ControleControl 0.5 µl/cm2 2 1.0 µl//cm 2 5.0 µl//cm 22 0,5µL /cm 1,0µL/cm 5,0µL/cm

Figura 19 A - Tratamento por Contato: Efeito tóxico do óleo essencial de Z. tingoassuiba, no período de 30 dias, em diferentes doses frente a ninfas de 5º instar de Rhodnius prolixus. A - 0,5µL/cm2 (Barra com Linhas Verticais); 1,0 µL/cm2 (Barra com Linhas Horizontais) e 5,0 µL/cm2 (pontos); B - % de Adultos, em diferentes doses

Observou-se também que houve paralisia em alguns insetos após o tratamento tópico com óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba. Considerando que ao todo 90 insetos foram utilizados nos ensaios em triplicata como um único grupo experimental, a Tabela 4 mostra que 30 (33,3%) e 17 (18,9%) (IC e OR > 1,0) ninfas exibiram paralisia com 0,5 ou 1,0µL de óleo essencial por insetos, respectivamente, mas não foi observada paralisia após tratamento tópico com 5,0µL de óleo essencial por inseto. Da mesma maneira, 7 (7,8%) e 2 (2,2%), insetos exibiram paralisia após tratamento com óleo essencial na alimentação (via oral), respectivamente, com 0,5 ou 5,0µL de óleo/mL de sangue. Entretanto, não foi observada paralisia após o tratamento via oral com 1,0µL de óleo essencial por mL de sangue. Para todos os grupos experimentais, os insetos que exibiram paralisia morreram no período de 30 59

dias após o tratamento. A paralisia do inseto não foi observada em nenhum dos grupos controle (não tratados) ou após tratamento por contato com óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba nas três concentrações.

Tabela 4 – Análise de insetos paralisados após tratamento tópico e via oral de ninfas de quinto estádio de Rhodnius prolixus com óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba Mortalidade Número total de insetos % de insetos Tratamento de insetos paralisados paralisados paralisados

Tópico 0,5 µL/inseto 30 33,3 100 1,0 µL/inseto 17 8,88 100 5,0 µL/inseto - - Via Oral 0,5 µL/mL 7 7,77 100 1,0 µL/mL - - - 5,0 µL/mL 2 2,22 100

Nos resultados deste trabalho, podemos observar que uma única aplicação tópica de 0,5, 1,0 ou 5,0µL do óleo essencial puro foi responsável por níveis elevados de mortalidade em ninfas de Rhodnius prolixus 24 horas após o tratamento. Além disso, a perturbação significativa no surgimento dos adultos de triatomíneos foi observada pelo tratamento tópico. Da mesma forma, o tratamento via oral induziu o maior nível de mortalidade, 100 % com 5,0µL de óleo/mL de sangue, já no 15º dia após o tratamento. Assim, é razoável propor que os constituintes de óleo essencial ingeridos durante o tratamento via oral podem mais facilmente metabolizados pelo sistema digestivo do triatomíneo do que por via cutânea antes de atingir a hemolinfa e/ou de outros órgãos alvo. No entanto, nada se sabe sobre a absorção cuticular ou intestinal de qualquer constituinte derivado de Zanthoxylum tingoassuiba em insetos. Não obstante os efeitos do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba, não parecem perturbar o processo de metamorfose em 60

triatomíneos, porque em todos os grupos experimentais testados a percentagem de adultos era exatamente o mesmo que o observado nas ninfas sobreviventes após o tratamento relatados durante o mesmo período. Ambos os ensaios, tópico e via oral, foram capazes de induzir paralisia permanente seguido de morte dos insetos. Portanto, como todos os tratamentos invariavelmente interromperam o processo de alimentação, o aumento de peso corporal ou a quantidade de excreção das ninfas de Rhodnius prolixus, tanto a mortalidade como a paralisia permanente desencadeada pelo tratamento tópico ou via oral devem estar relacionados não só a toxicidade, mas também provavelmente à interferência das substâncias encontradas no óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba no sistema neuroendócrino dos triatomíneos, já que os movimentos do inseto estão sob controle neurológico (LAZZARI, 1992; TAKANO – LEE; EDMAN, 2001). Além disso, apenas na dose de 5,0µL de óleo por cm2 em placa Petri aumentou significativamente a mortalidade dos insetos tratados, mas não nos mesmos níveis conseguidos através do tratamento via oral ou tópico. Da mesma forma, não houve efeitos sobre o processo de metamorfose ou paralisia induzido pelo tratamento por contato, apesar de alguns insetos ocasionalmente terem exibido mal formação após o tratamento. Este fato pode também estar relacionado com a degradação das substâncias do óleo no ambiente após um curto período de tempo, o que constitui uma boa indicação em condições de campo para os programas de controle integrado de vetores devido ao seu baixo risco para os organismos não alvo (SULAIMAN et al., 1994; ISMAN, 2005). Curiosamente, apesar da forte ação biológica do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba em ninfas de Rhodnius prolixus, não foi observada correlação de dose- dependência para qualquer tratamento testado. O tratamento via oral na de 10µL/mL de sangue, induz uma retenção na alimentação que evita a ingestão de sangue de todos os insetos ensaiados (não mostrado). Estes fatos podem ser relacionados com um efeito sinérgico, que ocorre entre os vários constituintes presentes no óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba. Sabe-se que óleos essenciais de espécies do gênero Zanthoxylum são conhecidos por exibirem atividades repelentes contra insetos hematófagos, como relatado nos estudos de Hieu e seus colaboradores (2010), onde Z. piperitum e Z. armatum, apresentam-se como bons candidatos a biopesticidas. Outra espécie que fortalece a hipótese em estudar plantas da família Rutaceae, coletada no PNRJ é Pilocarpus spicatus, que foi capaz de induzir um nível elevado de toxicidade, paralisia, muda, intermuda e inibição prolongada sobre Rhodnius prolixus (MELLO et al., 2007). 61

Ainda neste contexto, vale ressaltar que os inseticidas químicos constituem a mais importante ferramenta para programas de controle da população de vetor, embora vários deles também induzam a seleção sobre os insetos-alvos. À procura de tecnologias mais seguras que envolvem o desenvolvimento de compostos com ação seletiva contra vetores alvo, de baixo risco para os organismos não alvo, seguros para o meio ambiente e reguladores de crescimento representam uma nova e promissora estratégia (ISMAN, 2005; WHO, 2006). Assim, podem-se concluir a partir deste estudo preliminar, que a variedade dos efeitos do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba sobre desenvolvimento de Rhodnius prolixus descritos aqui, sugere que metabólitos secundários são bons candidatos para o estudo da fisiologia de insetos e uma ferramenta em potencial para programas de controle integrado de vetores contra espécies de triatomíneos hematófagos, transmissores da doença de Chagas.

4.2.2 Dysdercus peruvianus

A atividade inseticida do óleo essencial extraído das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba mostrou ser tóxico para ninfas de 4º e 5º instar do inseto D. peruvianus em todas as diluições testadas. Essa atividade foi dose-dependente. Os resultados da aplicação tópica com óleo puro e 500,00mg/mL resultaram em 100% de mortalidade em até uma hora após a aplicação (Figura 20).

Figura 20 - Mortalidade de ninfas do 4º instar de D. peruvianus com óleo essencial de Z. tingoassuiba puro e em diferentes concentrações, grupos controle positivo e não-tratados 62

Enquanto, no tratamento tópico realizado na diluição de 250,00mg/mL foi verificado um aumento na taxa de mortalidade equivalente a 55,54 % em 24 horas e de 88,90 % no 28º dia de tratamento, o que também é mostrado na Figura 20, sendo que algumas destas mortes ocorreram durante a ecdise (muda) com o inseto morto confinado na exúvia. Observou-se também que esta mesma diluição, induziu o surgimento de uma única ninfa extranumerária (1,10 % do total de insetos tratados), mal formação das asas em insetos adultos, além do enrugamento cuticular de algumas ninfas.

O processo de metamorfose também foi afetado por esta concentração (250,00mg/mL), onde apenas 10,00% dos insetos conseguiram atingir a fase adulta, como mostrado na Figura 21.

Na diluição de 125,00mg/mL foi observada uma taxa de mortalidade de 1,10% nas primeiras 24 horas do tratamento tópico dos insetos, taxa esta que atingiu ao final do bioensaio um valor máximo de 43,33 %, como mostrado na Figura 21. Sendo que um percentual de 56,67 % dos insetos sobreviveu ao tratamento, alcançando a fase adulta (Figura 21).

Figura 21 - Metamorfose de ninfas do 4º instar de D. peruvianus com óleo essencial de Z. tingoassuiba puro e em diferentes concentrações, grupos controle positivo e não-tratados

63

O tratamento na diluição de 62,50mg/mL ocasionou uma taxa de mortalidade inicial de 2,20% em 24 horas e 40,00% em 28 dias (Figura 21). Sendo que 60,00% sobreviveram e realizaram metamorfose até a fase adulta, como pode ser visto na Figura 21.

Na menor concentração do óleo essencial, ou seja, na diluição de 31,25mg/mL ocorreu uma taxa de mortalidade de 2,20% em 24 horas e 23,40% no 28º dia de observação, o que também é mostrado na Figura 21. Dos insetos avaliados neste grupo cerca de 64,40% conseguiu realizar a metamorfose a imago (adulto) até o final do experimento (Figura 21).

Todos os resultados foram comparados aos grupos controle não tratado e grupo controle positivo (acetona). No grupo não tratado foi observada uma taxa de 2,23% de mortalidade em 24h e 10,00 % ao final de 28 dias. Já no grupo controle positivo não houve mortalidade nas primeiras 24h e ocorreram 10,00% de mortalidade ao final do experimento (Figura 21).

Além disso, o tratamento com as diferentes diluições foi também capaz de levar a um retardo no desenvolvimento das ninfas e, consequentemente, a um prolongamento na duração do período intermuda de ninfa de 4º instar à ninfa de 5º instar e no intervalo que vai de ninfa de 5º instar à fase adulta (metamorfose) se comparados aos mesmos intervalos para o grupo controle com solvente e grupo não tratado, como é mostrado na Tabela 5.

Os óleos essenciais são conhecidos por apresentarem atividades inseticidas (RATTAN, 2010), estudos de Wang (2011) e Prieto (2011) verificaram a eficácia inseticida significativa contra gorgulho do milho Sitophilus zeamais Motsch. e Sitophilus oryzae, pragas que atacam milho e arroz respectivamente, quando estudaram as espécies Zanthoxylum schinifolium, Zanthoxylum monophyllum, Zanthoxylum rhoifolium e Zanthoxylum fagara. Estes estudos corroboram com nossas perspectivas em avaliar o óleo essencial da espécie Zanthoxylum tingoassuiba como promissor para atuar no controle de pragas que atacam lavoura e grãos armazenados. Este estudo sugere que os constituintes do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba são capazes de interferir no funcionamento do sistema neuroendócrino de insetos, perturbando muda e metamorfose dos insetos imaturos, levando ao surgimento de insetos com deformidades, como, por exemplo, enrugamento da cutícula dorsal e mal formação das asas de adultos. 64

Sendo assim, a partir dos resultados apresentados pode-se deduzir que os efeitos do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba no desenvolvimento de D. peruvianus podem contribuir para desenvolvimento de pesticidas botânicos, desempenhando um papel importante nos programas de gerenciamento sustentável no controle de pragas agrícolas.

Tabela 5 – Análise e comparação dos períodos intermudas de D. peruvianus após diferentes diluições do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba Período intermuda (intervalo)

Grupos Do 4º ao 5º Do 5º instar à fase instar/dias adulta/dias Não tratado 3 – 8 8 – 12

Controle 3 – 6 9 – 12 positivo (acetona)

Óleo essencial 1 – 14 12 – 17 Z. tingoasssuiba – 250,00mg/mL

Óleo essencial 1 – 13 13 – 16 Z. tingoasssuiba – 125,00mg/mL

Óleo essencial 1 – 14 14 – 20 Z. tingoasssuiba – 62,50mg/mL

Óleo essencial 1 – 7 12 – 19 Z. tingoasssuiba – 31,25 mg/mL

4.2.3 Oncopeltus fasciatus Os resultados observados no teste de aplicação tópica do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba, em ninfas de 4º estádio de Oncopeltus fasciatus com o óleo puro e nas diluições de 500,00mg/mL e 250,00mg/mL causaram 100% de mortalidade em até uma hora após o tratamento das ninfas. Estes resultados sinalizam a possibilidade de continuidade aos testes com diluições menores do óleo essencial. 65

Estudo semelhante foi realizado com óleo essencial da espécie Eugenia sulcata, também coletada no PNRJ, onde Lima e colaboradores (2012) verificaram a mortalidade deste inseto e aumento no tempo de permanência dos mesmos em estádio de ninfa. Este atraso (retardo) na muda dos insetos sobreviventes leva a possibilidade de uma diminuição da reprodução dos mesmos. O que é favorável para o controle da população deste inseto praga de lavoura.

4.3 Atividade Acaricida

4.3.1 Teste de Imersão de Adultos No diz respeito à atividade acaricida, os bioensaios com óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba foram realizados para avaliar a toxicidade frente às teleóginas e ovos de Rhipicephalus (B.) microplus. No teste de imersão de adultos dos foi observada a mortalidade das fêmeas ingurgitadas (teleóginas), bem como a inibição da ovipostura e da sua eclodibilidade. Observou-se que a uma concentração de 5,00% de óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba a percentagem da mortalidade atingiu 65,00% no dia 1º dia do experimento, chegando a 100% no 5º dia. Na concentração de 2,50% de óleo essencial, a taxa de mortalidade obtida foi de 55,00% ao final do experimento. Enquanto na menor concentração testada, ou seja, 1,25% do óleo essencial à taxa de mortalidade observada até o final do experimento foi de 28,00%.

Com base nestes resultados, pode-se verificar que na concentração de 5,00% de óleo essencial Zanthoxylum tingoassuiba houve uma eficácia máxima (100%) do efeito carrapaticida. Esses estudos mostraram também que a taxa de mortalidade é dose – dependente (Figura 22).

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Z.tingoassuiba 5% Z. tingoassuiba 2,5% Z. tingoassuiba 1,25% DMSO

Figura 22 - Taxa de mortalidade de R. microplus exposto a diferentes concentrações do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba no período de 14 dias

Estes resultados mostram que o óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba poderá ser um candidato promissor como ativo em formulações biocarrapaticidas, podendo fazer parte da terapêutica do carrapato do boi, um bioagente responsável por causar enormes danos a pecuária brasileira e mundial. Alguns estudos tem relatado a atividade de óleos essenciais como um controle biológico de carrapatos. Como por exemplo, Cunila spp. (Lamiaceae), Pelargonium roseum e Eucalyptus globulus contra fêmeas adultas de Rhipicephalus (B.) annulatus e Rhipicephalus (B.) micropolus (APEL et al., 2009; PIRALI-KHEIRABADI et al., 2009). O óleo essencial de Lavandula angustifolia nas concentrações 4,0 e 8,0% apresentou uma taxa de mortalidade de 73,26 e 100%, respectivamente, após as primeiras 24h de tratamento (PIRALI-KHEIRABADI & SILVA 2010).

4.3.1.1 Índice de postura e eclodibilidade dos ovos Os resultados mostraram que a taxa de ovipostura do grupo tratado foi afetada pelo óleo essencial. Foi observado que na concentração de 5,00% do óleo essencial, a inibição da oviposição foi de 100%, enquanto nas concentrações de 2,50% e 1,25% foram de 80,90% e 2,47%, respectivamente. 67

O teste para avaliação da eclodibilidade dos ovos mostrou que na concentração de 5,00% do óleo essencial a taxa de inibição atingiu 100%. Enquanto nas concentrações de 2,50% e 1,25% do óleo essencial observou-se que houve eclosão e as larvas permaneceram vivas. Estes resultados mostram que oviposição e eclodibilidade também são doses - dependentes (Tabela 6).

Tabela 6 – Percentagem do índice de Postura (IP), Inibição de Ovipostura - IP (%), Índice de Eclodibilidade de Rhipicephalus microplus em diferentes concentrações do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba % Óleo Índice de ovos Inibição de Capacidade Capacidade Essencial postos (g) - IE Ovipostura - de ovipostura de IP (%) após eclodibilidade tratamento após tratamento

Controle 0,468 ± 0,461 0 Houve Houve eclosão ovipostura

5,00 % 0 100 Sem Sem eclosão ovipostura

2,50 % 0,084 ± 0,031 80,90 Houve Houve eclosão ovipostura

1,25 % 0,444 ± 0,028 2,47 Houve Houve eclosão ovipostura

Estudos com plantas da família Rutaceae, mostraram que Amyris balsamifera, foi avaliada com sucesso, sendo eficaz como repelente do carrapato Ixodes scapularis, principal vetor da bactéria Borrelia burgdorferi, patógeno causador da doença de Lyme em humanos (CARROLL et al. 2010). Outra espécie que corrobora com esses estudos é Z. myriacanthum, por apresentar atividade contra o ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (VEERAPHANT et al., 2011).

O potencial das plantas da família Rutaceae mostrando eficácia como acaricida, também foi observado por Koul e colaboradores (2008) e os autores relatam que óleos essenciais são considerados mais seguros e mais compatíveis com o meio ambiente, quando 68

comparados aos componentes dos pesticidas sintéticos. Isso fortalece perspectiva em avaliar óleo essencial da espécie Zanthoxylum tingoassuiba como candidato a bioacaricida, no desejo de minimizar os efeitos adversos causados pelos acaricidas sintéticos, como Ivermetctina (grupo das avermectinas) e Triatox (amitraz), acararicidas amplamente utilizados, que podem levar a seleção dos carrapatos bem como uma possível ocorrência de resíduos destes no leite e na carne.

Em relação à atividade de espécies da família Rutaceae presentes PNRJ, ainda não é descrito na literatura trabalhos com atividade acaricida. Deste modo foi investigada a eficácia do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba contra o carrapato do boi Rhipicephalus microplus.

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5 CONCLUSÃO Com o desenvolvimento deste trabalho foi possível concluir que o constituinte majoritário do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba foi o silvestreno. Este trabalho descreve pela primeira vez na literatura científica a presença dos constituintes muurola-4,5-trans-dieno e isodauceno no óleo essencial desta espécie. O teste de atividade inseticida revelou a eficácia do óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba como agente inseticida frente ao inseto Rhodnius prolixus, um dos vetores da doença de Chagas, levando a altas taxas de mortalidade, mal formação e paralisia dos insetos. Os resultados frente ao inseto praga de lavoura Dysdercus peruvianus, mostram que houve perturbações no processo de metamorfose, no período intermuda, causando deformações e alta taxa de mortalidade. O óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba também foi eficaz como agente inseticida frente ao inseto Oncopeltus fasciatus, mostrando 100% de eficácia nas doses testadas. É necessário dar continuidade aos testes com diluições menores do óleo essencial, uma vez que as plantações e os silos de armazenagem de grãos e sementes são susceptíveis aos ataques por insetos fitófagos. A avaliação da atividade acaricida frente ao carrapato do boi (Rhipicephalus microplus), mostrou que o óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba causou mortalidade, afetou a oviposição, bem como a eclodibilidade dos ovos. Estes resultados indicam que o óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba pode torna-se um componente ativo em formulações para atuarem no controle de insetos que atacam lavoura de algodão, uma importante commodity do agronegócio brasileiro, assim como, atuar como bioacaricida, podendo fazer parte da terapêutica do carrapato do boi, um bioagente responsável por causar enormes danos à pecuária.

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80

7 ANEXOS

7.1 Substâncias Identificadas no óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba

OH O n-Hexanol

Hexanal OH Hexenol

α-tujeno

α-pineno Canfeno Sabineno β-pineno

H H

Mirceno α-careno α-cubeneno α-terpineno

Silvestreno

β-Z-ocimeno σ-cimeno β-E-ocimeno OH OH

Linalol Terpinoleno p-trans-Ment-2-en-ol γ-terpineno 81

OH

O

OH OH

Citronelal Terpinen-4-ol α-terpineol Trans-carveol

O

β-ciclocitral OH O

Citronelol E-ocimoneno δ -elemeno

H

β-cariofileno α-guaieno Miltail-4(12)-eno

Cis-muurola-3,5-dieno

H

H H α-humuleno γ-gurjuneno Epi-di-4,5- aistolocheno γ-muuroleno H H H H

H

Viridifloreno Isodauceno

Muurola-4(14),5-trans- Premnaspirodieno dieno

H OH

OH H H H α-epi-7-selineno Elemol Zonareno

Cubebol 82

H H H

H Germacreno B OH H Espatulenol OH Cubenol-1-epi Ledol HO H H H

H H HO OH OH α-muurolol α-cadinol Germacra-4(15),5,10(14)trien- Cubenol 1-α-ol

OH Fitol

β-elemeno

83

7.2 Artigos Submetidos

7.2.1 “Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil. (Rutaceae) essential oil: chemical investigation and biological effects on Rhodnius prolixus nymph”

Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil. (Rutaceae) essential oil: chemical investigation and biological effects on Rhodnius prolixus nymph

84

7.2.2 “Acaricidal Properties of the Essential Oil from Zanthoxylum tingoassuiba (Rutaceae) against the Cattle Tick Rhipicephalus microplus (Acari:Ixodidae)