UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
METABÓLITOS ESPECIAIS DAS FOLHAS DE Zanthoxylum riedelianum Engl. E DA CASCA DO CAULE DE Zanthoxylum rigidum Humb. Bonpl. ex Willd (RUTACEAE)
Pâmela Jordana dos Santos Beirigo Mestrado em Química, área de concentração Produtos Naturais
CUIABÁ MATO GROSSO - BRASIL 2013
PÂMELA JORDANA DOS SANTOS BEIRIGO
METABÓLITOS ESPECIAIS DAS FOLHAS DE Zanthoxylum riedelianum Engl. E DA CASCA DO CAULE DE Zanthoxylum rigidum Humb. Bonpl. ex Willd (RUTACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Mato Grosso como requisito parcial à obtenção do título de mestre em química, área de concentração Produtos Naturais.
CUIABÁ MATO GROSSO - BRASIL 2013
PÂMELA JORDANA DOS SANTOS BEIRIGO
METABÓLITOS ESPECIAIS DAS FOLHAS DE Zanthoxylum riedelianum Engl. E DA CASCA DO CAULE Zanthoxylum rigidum Humb. Bonpl. ex Willd (RUTACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Química da Universidade Federal de Mato Grosso como requisito parcial à obtenção do título de mestre em química, área de concentração Produtos Naturais.
APROVADA: 31 de outubro de 2013
______Prof. Dr. Luciano Ramos Suzart Prof. Dra. Tereza Auxiliadora Nascimento Ribeiro
______Prof. Dra. Vigínia Claudia da Silva (Orientadora)
A Deus por todas as experiências vividas durante esses anos, pois fizeram-me crescer moralmente e profissionalmente.
Ao meu pai Sebastião (In memorium), minha mãe Lucinea e minha irmã Priscila que nos momentos mais difíceis de minha vida sempre estiveram presentes, apoiando-me e incentivando-me.
Seja a mudança que você quer ver no mundo
Dalai Lama
AGRADECIMENTOS
A Profa. Virgínia Claudia da Silva pela orientação, ensinamentos, por toda compreensão que teve durante a realização deste trabalho, e especialmente pela amizade que construímos durante esses anos da qual não me esquecerei.
Aos professores Paulo Teixeira de Sousa Junior e Evandro Luiz Dall’Oglio do Laboratório de Pesquisa Química em Produtos Naturais.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Química pelos ensinamentos e colaboração.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisa Química de Produtos Naturais o meu eterno agradecimento pela amizade, simpatia e troca de conhecimento.
A todos meus colegas do PPGQ sem exceção, pelo bom relacionamento durante este período.
Ao Prof. Mario Geraldo de Carvalho da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro pela contribuição com as análises dos experimentos de Ressonância Magnética Nuclear em 1D e 2D e pela disposição em auxiliar nas elucidações estruturais imprescindíveis para a determinação das estruturas.
A banca examinadora, pelas sugestões e correções apresentadas neste trabalho.
A Universidade Federal de Mato Grosso pela oportunidade de realização deste trabalho.
A CAPES pela bolsa de estudo concedida.
A todos que, de algum modo, me ajudaram na realização deste trabalho.
A todos meus familiares pela compreensão e carinho.
Ao Eduardo por todo amor e carinho que tem me proporcionado durante todos esses anos.
Enfim, muito obrigada!!!
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...... 1
1.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 3
1.1.1. FAMÍLIA RUTACEAE ...... 3
1.2. O GÊNERO ZANTHOXYLUM ...... 7
1.3. A ESPÉCIE Zanthoxylum riedelianum ...... 47
1.4. A ESPÉCIE Zanthoxylum rigidum ...... 48
2. OBJETIVOS ...... 49
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...... 49
3.1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ...... 49
3.1.1. Suportes para cromatografia...... 49
3.1.2. Solventes ...... 50
3.1.3. Reveladores ...... 50
3.1.4. Equipamentos ...... 51
3.2. METODOLOGIA ...... 51
3.2.1. Material vegetal de Zanthoxylum riedelianum ...... 52
3.2.2. Preparação do Extrato de Zanthoxylum riedelianum ...... 52
3.2.3. Fracionamento do extrato ZRFLM (Zanthoxylum riedelianum Folhas Extrato Metanólico) ...... 52
3.2.4. Fracionamento da fração ZRFLFC (Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Clorofórmio) ...... 53
3.2.5. Fracionamento da fração ZRFLFA (Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Acetato de Etila) ...... 55
3.2.6. Fracionamento da fração ZRFLMResíduo (Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Hidrometanólica resíduo) ...... 57
3.3. Material vegetal de Zanthoxylum rigidum ...... 58
3.3.1. Preparação do Extrato de Zanthoxylum rigidum ...... 59
3.3.2. Fracionamento do extrato ZRgCFE (Zanthoxylum rigidum casca do caule fração hidroetanólica) ...... 59
3.3.3. Fracionamento do extrato ZRgCFEppt (Zanthoxylum rigidum casca do caule fração hidroetanólica precipitado) ...... 60
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ...... 62
4.1. Substâncias isoladas das folhas de Zanthoxylum riedelianum ...... 62
4.1.1. Identificação da substância 237 ...... 63
4.1.2. Identificação da substância 238 ...... 77
4.1.3. Identificação da substância 239 ...... 85
4.1.4. Identificação da substância 240 ...... 88
4.2. Substâncias isoladas das cascas do caule de Zanthoxylum rigidum ...... 97
4.2.1. Identificação da substância 241 ...... 98
4.2.2. Identificação da substância 242 ...... 103
5. CONCLUSÃO ...... 115
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 116
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura da vincristina (A), da vimblastina (B) e irinotecano (C) fármacos com comprovada ação antitumoral...... 2
Figura 2. Distribuição geográfica da família Rutaceae em destaque (vermelho)...... 3
Figura 3. Alcaloides derivados do ácido antranílico isolados das plantas da família Rutaceae...... 5
Figura 4. Cumarinas isoladas das plantas da família Rutaceae...... 5
Figura 5. Flavonoides isolados das plantas da família Rutaceae...... 6
Figura 6. Limonoides isolados das plantas da família Rutaceae...... 6
Figura 7. Lignanas isoladas das plantas da família Rutaceae...... 7
Figura 8. Terpenoides isolados das plantas da família Rutacaea...... 7
Figura 9. Algumas substâncias isoladas do gênero Zanthoxylum (Rutaceae)...... 47
Figura 10. Exemplar da espécie Zanthoxylum riedelianum. (fonte: autora)...... 48
Figura 11. Exemplar da espécie Zanthoxylum rigidum (fonte: RIBEIRO, 2012)...... 48
Figura 12. Substâncias isoladas das folhas de Zanthoxylum riedelianum...... 62
Figura 13. Estrutura proposta para o octapeptídeo ciclozanthoxylano B (237)...... 65
1 Figura 14. Espectro de RMN H (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237...... 67
1 Figura 15. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237 entre 6,8 a 9,4 ppm...... 68
1 Figura 16. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 1,0 a 5,0 ppm...... 68
Figura 17. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância 237...... 69
Figura 18. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 168,5 a 174,0 ppm...... 70
Figura 19. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 126,0 a 139,0 ppm...... 70
ix
Figura 20. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 22,0 a 66,0 ppm...... 70
1 1 Figura 21. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237. .... 71
1 1 Figura 22. Expansão do espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 3,5 a 9,5 ppm...... 71
Figura 23. Espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237...... 72
Figura 24. Expansão do espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância
237, entre H 7,0 a 9,5 C 167,5 a 177,0 ppm...... 72
Figura 25. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237...... 73
Figura 26. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância
237, entre H 1,0 a 2,0 C 14 a 33 ppm...... 73
Figura 27. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância
237, entre H 2,0 a 4,0 C 35 a 48 ppm...... 74
Figura 28. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância
237, entre H 6,5 a 8,0 C 122 a 132 ppm...... 74
Figura 29. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância
237, entre H 4,0 a 4,0 C 49 a 69 ppm...... 75
Figura 30. Espectro de NOEDIFF...... 75
Figura 31. Espectro de NOEDIFF...... 76
Figura 32. Espectro de NOEDIFF...... 76
Figura 33. Espectro de massas de alta resolução de 237 obtido através de ionização por eletrospray (EM-ESI) em modo positivo...... 77
Figura 34. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para o sinal de hidrogênio em δ 7,56 (H-7)...... 78
Figura 35. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para os sinais de hidrogênios em δ 7,06 (H-6) e δ 3,77 (H-10)...... 78
Figura 36. Estrutura proposta para o 3,4-dihidroxi-cinamato de metila (238)...... 78
1 Figura 37. Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) da substância 238...... 79
x
1 Figura 38. Expansão do espectro de RMN H da (500 MHz, CD3OD) substância 238, entre δ 6,2 – 7,7 ppm...... 80
Figura 39. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 238...... 80
Figura 40. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 238, entre δ 50,0 – 115,0 ppm...... 81
Figura 41. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 238, entre δ 120,0 – 165,0 ppm...... 81
1 1 Figura 42. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, CD3OD) da substância 238...... 82
1 1 Figura 43. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, CD3OD) da substância 238, entre δ 6,0 a 9,0 ppm...... 82
Figura 44. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CD3OD) da substância 238...... 83
Figura 45. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CD3OD) da substância
238, entre δH 6,0 – 7.5 ppm δC 105 – 155 ppm...... 83
Figura 46. Espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, CD3OD) da substância 238...... 84
Figura 47. Expansão do espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, CD3OD) da substância
238, entre δH 6,0 – 7,5 ppm δC 105 – 195 ppm...... 84
Figura 48. Estrutura proposta para o ácido protocatecuico (239)...... 85
1 Figura 49. Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD). da substância 239...... 86
1 Figura 50 Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) da substância 239, entre δ 6,80 – 7,45 ppm...... 86
Figura 51. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 239...... 87
Figura 52. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 239, entre δ 105 – 175 ppm ...... 87
Figura 53. Unidades formadas pelos grupos fenil e benzoil(A) e benzamida(B) que compõem a substância 240...... 89
Figura 54. Estrutura proposta para a molécula N-benzoilfenilalanilato de N- benzoilfenilalanina (240)...... 89
1 Figura 55. Espectro de RMN H (500 MHz, CDCl3) da substância 240...... 91
xi
1 Figura 56. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, CDCl3) da substância 240 entre δ 3,0 – 5,0 ppm...... 92
1 Figura 57. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, CDCl3) da substância 240, entre δ 6,6 – 7,8 ppm...... 92
Figura 58. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CDCl3) da substância 240 ...... 93
Figura 59. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CDCl3) da substância 240, entre δ 40,0 – 128,0 ppm...... 93
Figura 60. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CDCl3) da substância 240, entre δ 135,0 – 170,0 ppm...... 94
Figura 61. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CDCl3) da substância 240...... 94
Figura 62. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CDCl3) da substância
240, entre H 1,0 – 5,0 ppm C 20,0 – 70,0 ppm...... 95
Figura 63. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CDCl3) da substância 240...... 95
Figura 64. Espectro de RMN NOESY (500 MHz, CDCl3) da substância 240...... 96
Figura 65. Expansão do espectro de RMN NOESY (500 MHz, CDCl3) da substância 240 entre 2,5 – 7,5 ppm...... 96
Figura 66. Espectro de massas de alta resolução da substância 240 obtido através de ionização por eletrospray (EM-ESI) em modo positivo...... 97
Figura 67. Substâncias isoladas das cascas do caule Zanthoxylum rigidum...... 98
Figura 68. Estrutura proposta para o ácido ursólico (241)...... 99
1 Figura 69. Espectro de RMN H (500 MHz, C5D5N) da substância 241...... 101
1 Figura 70. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, C5D5N) da substância 241, entre δ 0,5 – 5,5 ppm...... 101
13 Figura 71. Espectro de RMN C (125 MHz, C5D5N) da substância 241...... 102
13 Figura 72. Expansão do espectro de RMN C (125 MHz, C5H5N) da substância 241, entre δ 16 – 36 ppm...... 102
13 Figura 73. Expansão do espectro de RMN C (125 MHz, C5H5N) da substância 241, .. 103
xii
Figura 74. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para os sinais de hidrogênios em δ 7,05 (H-4’) e δ 7,05 (H-8’)...... 104
Figura 75. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para os sinais de hidrogênios δ 7,42 (H-3), δ 7,03 (H-5) e δ 6,92 (H-9)...... 104
Figura 76. Estrutura proposta para a substância 242...... 105
1 Figura 77. Espectro de RMN H (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242...... 107
1 Figura 78. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 2,6 a 3,5 ppm ...... 107
1 Figura 79. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 6,2 a 7,6 ppm...... 108
Figura 80. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO – d6) da substância 242...... 108
Figura 81. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 32 – 168 ppm...... 109
Figura 82. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242. .... 109
Figura 83. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, δH 2,2 – 3,7 δC 20,0 – 66,0 ppm...... 110
Figura 84. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δH 6,0 – 7,5 δC 100,0 – 150,0 ppm...... 111
Figura 85. Espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242. .... 111
Figura 86. Expansão do experimento de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δH 2,5 – 3,5 ppm δC 16 - 176...... 112
Figura 87. Expansão do experimento de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δH 5,5 – 8,0 ppm δC 22 – 184 ppm...... 112
1 1 Figura 88. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242...... 113
1 1 Figura 89. Expansão do espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 2,5 – 3,7 ppm...... 113
1 1 Figura 90. Expansão do espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 6,1 – 8,0 ppm...... 114 xiii
LISTA DE TABELAS
1 13 Tabela 1. Dados dos espectros de RMN H e C (DMSO-d6 500 e 125 MHz) da substância 237...... 65
1 13 Tabela 2. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 238 (CD3OD 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (XIANG et al., 2011) ...... 79
1 13 Tabela 3. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 239 (CD3OD 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (SOUZA FILHO et al., 2006) ...... 85
1 13 Tabela 4. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 240 (CDCl3 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (CATALAN et al., 2003) ...... 90
1 13 Tabela 5. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 241 (C5D5N 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (KRIWACKI & PITNER, 1989) ...... 99
1 13 Tabela 6. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 242 (DMSO – d6 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (TAWEEL et al., 2012) ...... 106
xiv
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Fracionamento do extrato metanólico das folhas Zanthoxylum riedelianum. 53
Esquema 2. Fracionamento da fração ZRFLFC...... 54
Esquema 3. Fracionamento da fração ZRFLFA...... 56
Esquema 4. Fracionamento da fração ZRFLMResíduo...... 58
Esquema 5. Extração ácido/base da fração ZRgCFE...... 59
Esquema 6. Fracionamento de ZRgCFE ppt...... 61
Esquema 7. Proposta de fragmentação dos picos do espectro de massas da substância 240...... 97
xv
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Algumas classes de substâncias isoladas da família Rutaceae ...... 4
Quadro 2: Algumas substâncias isoladas do gênero Zanthoxylum (Rutaceae) e suas respectivas atividades biológicas ...... 8
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
δ Deslocamento químico (ppm)
J Constante de acoplamento em Hertz
AcOEt Acetato de etlia
AcOH Ácido acético
CC Cromatografia em coluna
CD3OD Metanol deuterado
COSY Correlated spectroscopy d Dubleto dd Duplo dubleto
DEPTQ Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Including the Detection of
Quaternary Nuclei
DMSO Dimetil Sulfóxido
EM Espectro de massas
Gly Glicina
Hex Hexano
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
Hz Hertz m Multipleto m/z Relação massa/carga
MeOH Metanol
MHz Megahertz
NOEDIFF Nuclear Overhauser Experiment Difference Espectrum
NOESY Nuclear Overhauser Effect Correlation Spectroscopy
Phe Fenilalanina
xvii
Pro Prolina
RMN 1H Ressonância Magnética Nucelar de hidrogênio
RMN 13C Ressonância Magnética Nucelar de carbono - 13 s Singleto t Tripleto
ZRFLFA Zanthoxylum riedelianumFolhas Fração Acetato de Etila
ZRFLFC Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Clorofórmica
ZRFLFH Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Hexânica
ZRFLM Zanthoxylum riedelianum Folhas Extrato Metanólico
ZRFLMResíduo Zanthoxylum riedelianum Folhas Resíduo Hidrometanólico
ZRgCFE Zanthoxylum rigidum casca do caule fração hidroetanólica
ZRgCFEppt Zanthoxylum rigidum casca do caule fração hidroetanólica precipitado
xviii
RESUMO
BEIRIGO, Pâmela Jordana dos Santos, Universidade Federal de Mato Grosso, outubro de 2013. Metabólitos Especiais das folhas de Zanthoxylum riedelianum Engl. e da casca do caule Zanthoxylum rigidum Humb. Bonpl. ex Willd (Rutaceae). Orientadora: Virgínia Cláudia da Silva.
A família Rutaceae conta com cerca de 150 gêneros e 2000 espécies, que estão distribuídas nos trópicos, subtrópicos e regiões temperadas do hemisfério sul. No Brasil está representada por mais ou menos 32 gêneros e 150 espécies. Esta família é caracterizada por produzir uma diversidade de metabólitos, muitos de grande interesse farmacológico. O gênero Zanthoxylum é pertencente à família Rutaceae; muitas espécies deste gênero são empregadas na medicina popular contra distúrbios inflamatórios ou infecções. Nas mais de 200 espécies pertencentes a este gênero são descritas a ocorrência de cumarinas, lignanas, flavonóides, alcalóides, alquilamidas insaturadas e óleos essenciais. Este trabalho descreve o estudo fitoquímico de duas espécies deste gênero: Zanthoxylum rigidum e Zanthoxylum riedelianum. O estudo fitoquímico envolveu desde a preparação dos extratos brutos, seguidos pelo fracionamento e isolamento dos compostos através de diferentes métodos cromatográficos. As análises espectroscópicas permitiram a identificação de substâncias conhecidas e a caracterização de substâncias inéditas. O fracionamento cromatográfico das cascas do caule de Zanthoxylum rigidum conduziu ao isolamento e a identificação, das substâncias N-trans-cafeoiltiramina e o ácido-3-β-hidroxi-us-12-en-28-óico. Das folhas de Zanthoxylum riedelianum isolaram-se as substâncias 3,4-dihidroxi-cinamato de metila, ácido protocatecuico, N- benzoilfenilalanilato de N-benzoilfenilalanina, e um novo octapeptídeo que foi nomeado, ciclozanthoxylano B.
Palavras chaves: Zanthoxylum riedelianum, Zanthoxylum rigidum e ciclozanthoxylano B.
xix
ABSTRACT
BEIRIGO, Pamela Jordana dos Santos, Federal University of Mato Grosso, october 2013. Special metabolite Zanthoxylum riedelianum Engl. and Zanthoxylum rigidum Humb. Bonpl. ex Willd (Rutaceae). Advisor: Virginia Claudia da Silva.
The family Rutaceae has about 150 genera and 2000 species, which are distributed in the tropics, subtropics and temperate regions of the southern hemisphere. In Brazil is represented by about 32 genera and 150 species. This family is characterized by producing a variety of metabolites, many of great pharmacological interest. The genus Zanthoxylum is belonging to the family Rutaceae, many species of this genus are used in folk medicine against inflammatory disorders or infections. In the more than 200 species belonging to this genus are described occurrence of coumarins, lignans, flavonoids, alkaloids, essential oils and unsaturated alkylamides. This paper describes the phytochemical study of two species of this genus: Zanthoxylum rigidum and Zanthoxylum riedelianum. The phytochemical study involved from the preparation of extracts, followed by fractionation and isolation of compounds using different chromatographic methods. The spectroscopic analysis allowed the identification of substances known and characterization unpublished. Chromatographic fractionation of the stem bark of Zanthoxylum rigidum led to the isolation and identification substance N-trans-cafeoiltiramina and acid-3-β-hydroxy- 12-us-on-28-oic acid. Leaves isolated Zanthoxylum riedelianum substance 3,4-dihydroxy methyl cinnamate, protocatechuic acid, benzoilfenilalanilato N-N-benzoilfenilalanina and a new octapeptide which was named ciclozanthoxylano B.
Keywords: Zanthoxylum riedelianum, Zanthoxylum rigidum and ciclozanthoxylano B.
xx
1. INTRODUÇÃO
Biodiversidade pode ser definida como a variedade e variabilidade entre organismos vivos e os ecossistemas, nos quais eles interagem (OTA, 1987). Esse termo foi usado pela primeira vez em 1986 e foi o resultado da associação das palavras “diversidade biológica” ou “diversidade biótica” (AZEVEDO, 1998). Dessa maneira, biodiversidade inclui todas as formas de vida, ecossistemas e processos ecológicos. O Brasil é considerado um país rico em biodiversidade, segundo o Ministério da Saúde (2006), o nosso país é detentor da maior parcela da biodiversidade mundial, em torno de 15 a 20%. Ele possui cinco dos principais biomas sendo designados como floresta amazônica, cerrado, mata atlântica, pantanal e caatinga (CALIXTO, 2000; RATES, 2001; VEIGA-JUNIOR, 2008). A magnitude da biodiversidade do Estado de Mato Grosso está caracterizada por três regiões biogeográficas, - a Amazônia, o Cerrado e o Pantanal-, dessa forma, nosso estado ostenta uma situação privilegiada, no que se refere à potencialidade dos recursos naturais (FACHIM & GUARIM, 1995). Plantas são tradicionalmente usadas por populações de todos os continentes no controle de diversas doenças e pragas (NEWMAN et al., 2003). Sabe-se que cerca de 25% das drogas prescritas no mundo vêm de plantas, essa busca por novos fármacos, têm origem em investigações químicas e ou biológicas, que têm fornecido um número considerável de substâncias ativas, sendo que algumas inclusive chegaram até a fase de ensaios clínicos (CRAGG et al., 1997), entre as quais podem ser citadas: a vincristina, vimblastina e irinotecano medicamentos utilizados no tratamento de câncer [(CORREA, 1995); (Figura 1)]. No entanto, o uso potencial de plantas superiores como uma fonte de novas drogas é ainda pobremente explorado. Entre as aproximadamente 500.000 espécies de plantas sobre a terra, somente um pequeno percentual tem sido fitoquimicamente investigado. Sendo assim, o reino vegetal representa um enorme reservatório de moléculas farmacologicamente valiosas a serem descobertas (RATES, 2001).
1
OH N
N N
H O O O
CH3 R N O H O R' HO A - R: OCH3 e R': CHO O CH B - R: OCH3 e R': CH3 3
N CH3 O
N O N O
O N O OH C CH3 Figura 1. Estrutura da vincristina (A), da vimblastina (B) e irinotecano (C) fármacos com comprovada ação antitumoral.
2
1.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1.1. FAMÍLIA RUTACEAE
A família Rutaceae Juss., está incluída em Eurosídeas II e pertence à ordem Sapindales. Apresenta como sinapomorfia a presença de glândulas translúcidas em suas folhas (MOCCELINI, 2003). Possui aproximadamente 150 gêneros e 2.000 espécies, com ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais de todo mundo e temperadas do hemisfério Sul. No Brasil ocorrem aproximadamente 32 gêneros e 150 espécies, sendo os centros de diversidade a Floresta Atlântica e a Amazônia (FARIA et al., 2007).
Figura 2. Distribuição geográfica da família Rutaceae em destaque (vermelho). Fonte: http://www.arbolesornamentales.es/generos.htm
Esta família possui considerável importância na fruticultura destacando-se o gênero Citrus. Na medicina alopática algumas espécies do gênero Pilocarpus, conhecida popularmente como jaborandi, são utilizadas no tratamento de doenças oftálmicas e calvície, ações atribuídas à presença de um alcaloide chamado pilocarpina. Outro representante é a “arruda” (Ruta graveolens) cujo principio ativo é a rutina que apresenta atividade antiespasmódico (RIBEIRO et al., 1999). Diversas espécies são produtoras de boa madeira como o guaratã, Esenbeckia leiocarpa (FARIA et al., 2007). Essa família apresenta uma diversidade de metabólitos especiais (Figuras 3 - 8) destacando-se: os alcalóides (I e II, Figura 3) especialmente os derivados do ácido antranílico, cumarinas (III - V, Figura 4), flavonóides (VI - VIII, Figura 5), limonoides (IX e X, Figura 6), lignanas (XI e XII, Figura 7) e terpenoides (XIII e XIV, Figura 8) (WATERMAN, 1975).
3
Muitos desses metabólitos possuem variadas atividades biológicas, de grande importância farmacológica (WATERMAN & GRUNDON, 1983), despertando o interesse cada vez maior na investigação fitoquímica dessa família. No quadro 1 são apresentadas algumas das classes de substâncias isoladas da família Rutaceae.
Quadro 1: Algumas classes de substâncias isoladas da família Rutaceae
Classe Substância Referências Alcaloide 3 - hidroxi - 1 - metoxi - 10 - metil - 9 – NGOUMFO et al., 2010 derivado do acridona (I) ácido antranílico Alcaloide 1 - hidroxi - 3 - metoxi – 10 - metil - 9 – NGOUMFO et al., 2010 acridona (II) derivado do ácido antranílico Cumarina Dipetalolactona (III) RASHID et al, 1991 Cumarina Xantoxiletina (IV) GUNATILAKA et al, 1994 Cumarina Seselina (V) GUNATILAKA et al, 1994 Flavonoide 5,6,7,3’,4’,5’-hexametoxiflavanona (VI) PASSADOR et al, 1997 Flavonoide 5,7,8,2’,3’,4’,5’- heptametoxiflavona FERRACIN et al, 1998 (VII) Flavonoide Flavona (VIII) AMBROZIN, 2004 Limonoides Atalantina (IX) WU et al, 1997 Limonoides Dihidroatalantina (X) WU et al, 1997 Lignanas Eudesmina (XI) ZHOU et al., 2011
Lignanas (1R,2R,5R,6S)-2-(3,4-dimetoxifenil)-6- ZHOU et al., 2011 (3,4-dihidroxifenil)-3,7-dioxabiciclo [3.3.0] octano (XII) Terpenoides 10β-Metoximuurolan-4-en-3-ona (XIII) CHENG et al., 2005 Terpenoides 10α-Metoxicadinan-4-en-3-ona (XIV) CHENG et al., 2005
4
Alcaloides derivados do ácido antranílico
O OMe O OH
H H
N OH N OMe
Me H Me H 2 I1 II Figura 3. Alcaloides derivados do ácido antranílico isolados das plantas da família Rutaceae.
Cumarinas
O
H
O O O
O O O
4 III IV
O O O
V Figura 4. Cumarinas isoladas das plantas da família Rutaceae.
5
Flavonoides
OMe OMe
OMe OMe OMe
MeO O MeO O OMe OMe
OMe MeO
OMe O OMe O 6 7 VI VII
O
O VIII8 Figura 5. Flavonoides isolados das plantas da família Rutaceae.
Limonoides
O O O O OMe OMe
O O O O
O O O H O H
O OH H H O O 9 10 IX X Figura 6. Limonoides isolados das plantas da família Rutaceae.
6
Lignanas
OMe OMe
MeO MeO
H H O O
H H H H OMe OH O O H H
OMe OH XI XII Figura 7. Lignanas isoladas das plantas da família Rutaceae.
Terpenoides
OMe OMe H H O O
H H
XIII XIV Figura 8. Terpenoides isolados das plantas da família Rutacaea.
1.2. O GÊNERO ZANTHOXYLUM
Muitas espécies do gênero Zanthoxylum (Rutaceae) são empregadas na medicina popular contra distúrbios inflamatórios ou infecções. Nas mais de 200 espécies pertencentes a este gênero são descritas a ocorrência de cumarinas, lignanas, flavonoides, alcaloides, alquilamidas insaturadas e óleos essenciais. Estas substâncias apresentam importantes propriedades farmacológicas tais como antitumorais, antibacterianas, antifúngicas, antiinflamatórias, anti-helmínticas, analgésicas e antiagregação plaquetária. (OLIVEIRA et al., 2002).
7
A seguir, são apresentadas no Quadro 2, algumas substâncias isoladas e suas respectivas atividades farmacológicas e biológicas, presentes no gênero Zanthoxylum (Rutaceae).
Quadro 2: Algumas substâncias isoladas do gênero Zanthoxylum (Rutaceae) e suas respectivas atividades biológicas Espécies Substâncias isoladas Atividade Referência biológica/farmacológica Zanthoxylum 1: 5,7,8-Trimetoxi cumarina 4, 6, 10: atividade anti- CHENG et al., ailanthoides HIV. 2005; 2: O-Metil cedrelopsina 18, 20, 23, 4, 25, 26, CHEN et al, 2009 3: Isopimpinellina 27: atividade inibitória na geração de íon CHOU et al., 4: Decarina superóxido por 2011. neutrófilos humanos. 5: Haplopina 18, 23, 4, 25: atividade 6: γ-Fagarina inibitória a fMLP/CB – liberação de elastase 7: 4-Metoxi-1-metil-2- induzida quinolona 1 a 12: atividade anti 8: (+)-Platildesmina HIV
9: (+)-Tetrahidroberberina 13 a 16: atividade antitumoral 10: (+)-Tembamida
11: O-Metiltembamida
12: β - Sitosterol glicosilado
13: Feoforbideo - metil Éster
14: Feoforbideo - metil Éster
15: 13² - hidroxila (13²- S) feoforbídeo - metil Éster
16:13² - hidroxila (13²-R) feoforbideo - metil Éster
17: Acetato de Lupeol
18: Ailanthamida
19: N-(4-metoxifenetil)-N-
8
metilbenzamida
20: (2E,4E)-N-isobutil-6- oxohepta-2,4-dienamida
21: 4-(4′-hidróxi-3′- metilbutóxi)benzaldeído
22: (E)-metil 4-[4-(3- hidroxipropil)fenoxi]-2- metilbut-2-enoato
23: Xantiletina
24: Aesculetina dimetil éter
25: (+)-epi-sesamina
26: (-)-hinokinina
27: Evofolina –B
28: 6- acetonildiidroqueleritrina
29: 6 – acetonildiidronitidina
30: Ácido Sirínguico
31: β – amirina
32: Arnotianamida
33: Aurapteno
34: Bergapteno
35: Bocconolina
36: Braylina
37: Confusamelina
38: Dictamina
39: Dihidroavicina
40: Dihidroqueleritrina
41: Edulitina
42: Evolitrina
43: Friedelina
9
26: (+) hinokinina
44: Hidrangetina
45: p – hidroxibenzaldeído
46: Isoarnotianamida
47: Laniulactona
48: Lupenona
49: Lupeol
50: Luvangetina
51: (±) – lioniresinol
52: (+) – marmesina
53: Metil palmitato
54: 10-metoximuurolan-4- en-3-ona
55: 10-metoxycadinan-4- en-3-ona
56: 6 – metoxiqueleritrina
57: Nitidina
58: Norqueleritrina
59: Oxiavicina
60: Óxido de Cariofileno
61: Oxiqueleritrina
62: Oxinitidina
63: Pteleína
64: Pregnenolona
65: Queleritrina
66: Quercetina
67: Robustina
68: (+)–sesamina
69: Sesaminona
10
70: (+)–siringaresinol
71: β–sitosterol
72: Estigmasterol
73: Skimmianina
74: Spatulenol
75: Squaleno
76: Tetracosil furelato
77: (-)–tetrahidroberberina
78: 2 – tridecanona
79:6, 7, 8–trimetóxicumarina
80: Umbeliferona
81: Vanilina
Zanthoxylum 82: Asarinina Antinociceptiva e anti- GUO et al., 2011 armatum inflamatória. 83: Eudesmina
84: Fargesina
85: Horsfieldina
86: Kobusina
87: Pinoresinol-di-2,2- dimetilalil
88: Planispina A
68: Sesamina
Zanthoxylum 24: Aesculetina dimetil éter 94,98, 73, 67,102: CHEN et al., avicennae atividade inibitória na 2008 89: Avicennol geração de íon superóxido por 90: (7′S,8′S)-bilagrewina neutrófilos humanos.
91: (7′S,8′S)-5- 73: atividade inibitória a dimetóxibilagrewina fMLP/CB – liberação de elastase induzida. 92:(7′S,8′S)-5-O-dimetil-4′-O- metilbilagrewina
93: (7′S,8′S)-nocomtal
11
38: dictamnina
94: (7′S,8′S)-4′-O- metilcleomiscosina D
95: (+)-9′-O-(Z)-feruloil-5,5′- dimethoxylariciresinol
96: (+)-9′-O-(E)-feruloil-5,5′- dimetoxilariciresinol
97: (E)-3-(2,2-dimetil-2H- cromen-6-il)prop-2-enal
98: Cleomiscosina D
99: Escopoletina
79: 6, 7, 8,- trimetóxicoumarina
50: Luvangetina
100: Avicennol metil éter
6: . γ-fagarina
67: Robustina
73: Skimmianina
101: Isodictamina
7: 4-metóxi-1-metil-2- quinolona
41: Edulitina
102 : Integrifoliolina:
103: Metil (E)-4-(3′-metil-2′- eniloxi)cinamato
104: (-)-siringaresinol
71: β – sitosterol
Zanthoxylum 105: Buesgeniina TANE et al., buesgenii 2005 106: Dimetilmatairesinol
107: Metilpluviatilol
68: Sesamina
12
Zanthoxylum 108: Savina 108,109 e 68: atividade NISSANKA et al., caudatum antimicrobiana 2001 109: Liriodenina
68: Sesamina
Zanthoxylum 110: Trans – Avicennol 110: Antiproliferativa FERREIRA et al., chiloperone contra células-tronco 2002 111: Canthin-6-ona humanas de câncer.
112: 5 – metoxi – 6- 111: atividade cantinona tripanocida e atividade leishmanicida 113: Cantin-6-ona N-óxido 112:atividade 89: Avicenol leishmanicida
58: Norqueleritrina
Zanthoxylum 114: Cheleritrina 114: atividade TARUS et al., davyi antimicrobiana - 2006. 35: Bocconolina
40: Diidroqueleritrina
65: Queleritrina
115: 6 – hidróxidiidroqueleritrina
116: Meso - sesamina
117: 6 – metóxi – 7 - dimetildiidroqueleritrina
118: 4 – metóxi – 1 – metil – 2(1H) – quinolinona
Zanthoxylum 73: Skimmianina FACUNDO et al., ekmanii 2005. 38: Dictamina
10: Tembamida
68: Sesamina
49: Lupeol
71: β – sitosterol
Zanthoxylum 119: Cloreto de 6- BONGUI et al., heitzii metilnitidina 2005.
Zanthoxylum 120: (R, E)-1-[4-(3- 126, 127, 128, 129: CHEN et al., hidróxiprop-1-enil)fenoxi]-3- atividade anti- 13
integrifoliolum metilbutano-2,3-diol inflamatória 2007
121: álcool 4-hidróxi-3-(3- metil-2-butenil) cinamílico
122: 2,6-bis(1-feniletil)fenol
123: 2,4-bis(1-feniletil)fenol
124: 18- dimetilparaensidimerina C
125: Paraensidimerina C
126: N-metilflindersina
5: Haplopina
6: γ-Fagarina
127: (–)-simulanol
128: (–)-balanofonina
129: (–)-5- metóxibalanofonina
130: Iso-escopoletina
24: Aesculetina dimetil éter
79: 6, 7, 8 – trimetóxicumarina
131: Evofolina – C
132: 1-[(3-metilbut-2- enil)oxil]-2-metoxi-4-(prop-1- en-3-ol)benzeno
133: Siringaldeído
134: β-sitostenona
135: Estigmasta-4,2,2-dien- 3-ona
71: β – sitosterol
72: Estigmasterol
Zanthoxylum 136. 10-O-dimetil-17-O- 136, 137: atividade TALONTSI et al., lemairei metilisoarnottianamida larvicida contra larvas 2011. de mosquito. 137. 6-acetonil-N-metil-
14
diidrodecarina 136, 137, 57, 114: atividade larvicida 57: Nitidina contra o vetor presente no mosquito da malária 65: Queleritrina
114: Cheleritrina
Zanthoxylum 138: 3 – hidroxi – 1 – metoxi 138 a 140: atividade NGOUMFO et leprieurii – 10 – metil – 9 -acridona atitumoral al., 2010.
139: 1 – hidroxi – 3 – metoxi - 10-metil – 9 –acridona
140: 1,3 – dihidroxi – 2 – metoxi - 10-metil -9 – acridona
Zanthoxylum 71: β – sitosterol 71, 12 e 141: atividade ARRIETA et al., liebmannianum antiprotozoária 2000. 12: β - Sitosterol glicosilado
141: Asarina
Zanthoxylum 142: Limonellona TANGJITJAROE limonella NKUN et al., 82: (-)-Asarinina 2012.
38: Dictamina
10: (-)-Tembamida
143: Diidroalatamida
144: N-nornitidina
Zanthoxylum 40: Diidroqueleritrina MARTIN et al., madagascariens 2005. e 144: N-nornitidina
58: Norqueleritrina
4: Decarina
Zanthoxylum 145: Monophyllidina 145, 147, 148: PATIÑO et al., monophyllum atividade 2011. 146: Thalifolina antibactericida.
147: Berberina 146, 148: atividade antifúngica. 148: Jatrorrhizina
Zanthoxylum 149: Cubebina 149: atividade BASTOS et al.,
15
naranjillo antiinflamatória 2001.
Zanthoxylum 150: Zanthomuurolanina 161, 4, 24, 25, 68, 126, YANG et al., nitidum 6: atividade inibitória 2008. 151: Epizanthomuurolanina contra geração de íon superóxido. CHEN et al., 152: Zanthocadinaninas A 2010. 160, 161, 4, 25, 68, 153: Zanthocadinaninas B 126: inibição de fMLP (liberação de elastase 154: Epizanthocadinanina B induzida)
155: (E)-4-(4-Hidroxi-3- 99 e 175: atividade metilbut-2- antiinflamatória eniloxi)benzaldeído
156: (E)-Metil 3-(4-((E)-4- hidroxi-3-metilbut-2- eniloxi)fenil)acrilato
157: (Z)-Metil 3-(4-((E)-4- hidroxi-3-metilbut-2- eniloxi)fenil)acrilato
158: Ácido 4-(3-Metilbut-2- eniloxi) benzóico
159: 4-Hiroxibenzaldeído
133: Siringaldeído
160: 6- Acetonildiidroqueleritrina
161: 6-Acetonil-8-O- dimetildihidroqueleritrina
162: Piperitol 3,3-dimetilalil éter
4: Decarina
24: Aesculetina dimetil éter
79: 6, 7, 8,- trimetóxicoumarina
99: Escopoletina
25: (+)-epi-sesamina
68: (+) - Sesamina
69: Sesaminona
16
126. N-metilflindersina
6: γ-Fagarina
163. 2,6-Dimetóxi-p- benzoquinona
164. Indol-3-carboxaldeído
65: Queleritrina
165: Rhoifolina A
166: Dihidroqueleritrinil-8- acetaldeído
59: Oxiavicina
46: Isoarnotianamida
32: Arnotianamida
167: Integriamida
168: Liriodenina
38: Dictamina
57: Nitidina
40: Diidroqueleritrina
169: 8- hidroxidiidroqueleritrina
170: 8- metóxidihidroqueleritrina
171: Sanguinarina
172: Coptisina
173: Berberrubina
174: 2 - quinolona, N - metilflindersina
175: Furoquinolina
99: Escopoletina
Zanthoxylum 82: Asarinina 70: atividade YANG et al., planispinum antimicrobiana contra 2009. 176: Epipinoresinol Staphylococcus aureus
17
177: 3’-O- e Bacillus subtilis dimetilepipinoresinol
178: Biplanispina A
84: Fargesina
85: Horsfieldina
83: Eudesmina
179: Pinoresinol monometil éter
70: Siringaresinol
180: Yangambina
181: Pinoresinol
182: (1R,2S,5R,6S)-6-(4- hidróxi-3-metóxifenil)-2-(3,4- diidróxifenil)-3,7- dióxabiciclo[3.3.0]octano
183: Lariciresinol dimetil éter
Zanthoxylum 184: Hiperosideo 184, 185, 186 e 66: JEONG et al., piperitum atividade antioxidante 2011. 66: Quercetina
185: Quercetrina
186: Afzelina
Zanthoxylum 187: Zanthpodocarpina A 187 e 188: atividade ZHOU et al., podocarpum antiinflamatoria 2011. 188: Zanthpodocarpina B
83: Eudesmina
189: (1R,2R,5R,6S)-2-(3,4- dimetóxifenil)-6-(3,4- diidróxifenil)-3,7- dioxabiciclo[3.3.0]octano
190: Dimetóxisamina
191: rel-(1R,5R,6S)-6-(4- hidroxi-3-metóxifenil)-3,7- dioxabiciclo[3.3.0]octan-2- ona
192: Magnona A
18
Zanthoxylum 49: Lupeol LADINO et al., quinduense 2010. 144: Nornitidina
28: 6- acetonildiidroqueleritrina
4: Decarina
193: (-)-6- carboximetildiidroqueleritrina
65: Queleritrina
147: Berberina
194: N- metiltetrahidrocolumbamina
195: N- metiltetrahidropalmatina
196: (-)-isotembetarina
197: (-)-xylopinidina
Zanthoxylum 198: 6-acetonil-N-metil- FERNANDES et riedelianum diidrodecarina al., 2009.
199: 6-acetonildiidroavicina
49: Lupeol
28: 6- acetonildiidroqueleritrina
Zanthoxylum 200: Campesterol MOCCELINI et rigidum al., 2009. 71: Sitosterol
72: Estigmasterol
201: N-metilatanina
202: Sacarose
203: Hesperidina
28: 6- acetonildiidroqueleritrina
Zanthoxylum 204: 3 metóxi-4-(3-metilbut- CUCA et al., rhoifolium 2-enil)-2H-cromen-2-ona 2007
19
38: Dictamina
126: N-metilflindersina
Zanthoxylum 205: Zanthodiona 4,6, 8: atividade anti- CHENG et al., scandens HIV. 2008. 4: Decarina
58: Norqueleritrina
61: Oxiqueleritrina
62: Oxinitidina
32: Arnotianamida
38: Dictamina
73: Skimmianina
5: Haplopina
6: γ-Fagarina
8: (+)-Platildesmina
81: Vanilina
206: Metil vanilinato
207: Ácido vanílico
76: Tetracosil furelato
208: 2-(4-hidroxifenil)etil hexacosanoato
68: (+) –Sesamina
49: Lupeol
71: β – sitosterol
72: Estigmasterol
Zanthoxylum 209: Schinifolina 209 e 73: atividade de LIU et al., 2009. schinifolium impedimento de 73: Skimmianina alimentação
Zanthoxylum 210: 3-Metóxiaegelina 213 e 4: atividade ROSS et al., syncarpum antiplasmodial contra 2005; ROSS et 211: 3-Metóxi-7- Plasmodium falciparum al., 2004. acetilaegelina
212: 3-Metóxi-7- 20
cinnamoilaegelina
213: Syncarpamida
214: (+)-S-marmesina
4: Decarina
Zanthoxylum 109: Liriodenina 68, 109, 215 e 216: NISSANKA et al., Tetraspermum atividade 2001. 68: Sesamina antimicrobiana
215: 8 – acetonildihidronitidina
216: 8 - acetonildihidroavicina
Zanthoxylum 49: Lupeol SILVA et al., tingoassuiba 2008. 68: Sesamina
32: Arnotianamida
217: Espatulenol
218: α - bisabolol
219: N-metilantranilato de metila
220: acetato de citronelila
58: Norqueleritrina
33: Aurapteno
221: Imperatorina
222: Xantotoxina
223: O-prenilumbeliferona
71: β – sitosterol
72: Estigmasterol
Zanthoxylum 224: Wutaiensol metil éter 228, 229, 232, 6 e 38: HUANG et al., wutaiense apresentam atividade 2008. 225: Dimetóxiwutaiensol antituberculose contra metil éter Mycobacterium tuberculosis H37Rv 226: metil wutaiensato
227: metil 7- 21
hidróxianodendroato
228: metil 7- metóxianodendroato
229: Wutaiensal
230: Wutaifuranol
231: 7-metóxiwutaifuranol
232: 7-metóxiwutaifuranal
233: Metil wutaifuranato
234: Metil 7- metóxibenzofuran-5- carboxilato
235: 7 – metóxibenzofuran-5- carboxaldeído
236: Wutaipiranol
6: γ-Fagarina
38: Dictamina
OCH3 H3CO
H3CO O O
H3CO O O
OCH3
1 2 O
OCH OCH 3 3 O
N HO
O O O OCH3 3 4
22
OCH 3 OCH3
O R N N O OCH 3 CH3 5: R = OH 6: R= H 7 O OCH3
N OCH O 3 OH H N O OCH3 8 9
CH3
H3C CH3 OR H CH3 CH3 N CH3 H O H H H3CO 10: R = H Glc - O 11: R = CH3 12
CH3 CHO
NH N NH N
N HN N HN
H H H H
H H
H3CO2C O H3CO2C O
MeO2C MeO2C 13 14
23
CHO CH3
NH N NH N
N HN N HN
H H H H
HO H3CO2C HO O H3CO2C O MeO2C MeO2C 15 16
H3CO O O
N O CH3 17 18 OH
H3CO O O
N N H 19 CH 3 20 O O
O O HO H3CO OH 21 CHO 22
H3CO
H3CO O O O O O H 23 24
24
O O
O O
O H O 26 O O
O H O 25 O O O
O OH O N H3CO CH3 O H CH2 O OCH3
CH HO OH O 3 27 28 O
H CO 3 O H3CO H
N H3CO CH3 HO COOH O H
CH 3 29 H3CO 30
H3C CH3 H O
O
N H3CO OH CHO HO OCH3 31 32
25
OCH3
R O O O O O 33. R: HO 34 O
O H3CO
N H3CO O O O
OCH3 CH2OH 35 36
O OCH3
O O N H N O 37 38 O O
O O N N H3CO O CH3 OCH3 O 39 40
OCH3 H OCH3 N O
O H3CO N OCH3 41 H 42
26
O
HO O O
O 43 44 O H O
H CO 3 O
N CH3 H3CO OH CHO OH H 45 46
O
O O
O 47 48
O O O HO OCH3 49 50
27
H3CO CH2OH
HO CH2OH
OCH3 51
O H3CO OCH3 HO O O OH 52 O
O 53 OCH H 3 H O O
H H 54 55 O
O O
H3CO N O H3CO CH3 N OCH OCH 3 3 H3CO 56 H 57 O O
O O O N N H3CO O CH3 OCH3 58 59 O
28
O
O R 1 O
N H3CO CH3
R2 O
61. R1: H; R2: OCH3 60 62. R1: OCH3; R2: H
O
O
O
H H
N O HO 63 64 OH
OH
HO O
N OH H3CO CH3 OH O OCH 3 65 66
OCH3 O O H H O O N O OH 67 68
OCH3
H3CO O
O OH O O H HO
O OCH O H O 3 H CO O CH2OH 69 3 70
29
71 72 HO HO
OCH3 H
H CO O 3 HO H OCH3 H 73 74
O
O (CH2)23CH3 O
75 HO 76 O
N O O OCH3 77 (CH2)9CH3
OCH3 78
H3CO
H3CO O O HO O O OCH3 79 80
30
O O O O H H O OCH O 3 O OH 81 82 O
O O
O OCH H 3 H H3CO H H H3CO OCH3 O
H3CO O 84 83 H3CO
O O HO H H O
H3CO O 85
O O H3CO H H O
H3CO O 86
O H3CO H O
H O OCH3 O 87
31
O O
H3CO H H OCH3 HO O 88
OCH3
R2
O OHC O R3
O CH2OH
H3CO O O R1
90. R1=R3: OCH3; R2: OH 91. R : H; R : OH; R OCH 89 1 2 3 3 92. R1: OH; R2=R3: OCH3 93. R1: OCH3; R2: OH; R3:H
O OCH3
OCH3 O
O OCH3
O CH2OH
OCH 3 94
OCH3
OH
O H3CO OCH3
HO O
H3CO O 95
HO OCH3
32
OH
H3CO OCH3
O
O O OCH3
H3CO OH O 96
OCH3 CHO OH 97
H3CO
O O O
O HOH2C 98 H3CO
H3CO OCH3 HO O O OCH3 99
O O
H3CO O O N O 100 H3CO 101
33
O
O OCH3
O O 102 H 103 O
OCH3 O HO
N O H3CO H3CO OCH3 O H H
OCH3 H3CO 105 O 104
OH OCH3
OCH3 OCH3
O OCH3
H3CO O O OCH3
H3CO
O 106 107 OCH 3 O OCH3 O O
O O O O
N O
108 109 O O O
34
O N O O N
O R OCH3 110 111. R: H OH 112. R: OCH3
O N O O N
NCH3 H3CO O 113 OCH3 114 O
O O
H O H
N O H3CO 116 OCH3 OH 115 O O OCH3
O
N 117 H3CO N O
OH OCH3 118 O
H3CO O OH
N O Cl H3CO CH3 HO CH OH 3 119 120
35
HO OH
OH
121 122
O N
H HO H O O
H
N O 124. R: H 123 125. R: CH3 R
O HO
OCH3
HO OH N O O
CH3 OCH3 126 OCH3 127
CH2OH R OHC
OH H3CO O O O
OCH3 OCH3 128. R: H HO 129. R: OCH3 130
36
O
OCH3
O OH OH 132 131
O H
H H3CO OCH3
OH H H 134 133 O
O
H CO H 3 O
H3C N O H H HO OCH3 O 135 136 H O
O O OMe
N H HO 137 H OCH3 CH3 N OH
O 138 Me H
37
O OH O OH
H OMe
N OMe N OH
Me H Me H 139 140 O
O O OCH3
H H 141 O O O N O H O 142 O
O H CO 3 O OCH3 HN N 144 143 H3CO
O N O
OH H3CO 145 HO O N HO 146 O O
O HO
N N O H3CO
147 OCH3 148 OCH3
OCH3 OCH3
38
OH O H O O O
O N H H3CO 149 H H OCH3 150
O H O OCH3
O O
O O
N N H CO H3CO 3 H H H H OCH OCH3 3 152 151
H H OCH3 OCH3 O O
O O
N N H3CO H3CO H H H H OCH3 OCH3
153 154
H H OCH3 OCH3 O HO O HO 156 OCH3 155 CHO O O O O OCH3 HO 158 157 COOH
39
O
O
HO N RO CH3 H CH2 160. R: CH3 OCH3 CHO 161. R: H
159 O CH3
OCH3
O OCH3
H H O O O 162 O
O 163 OCH3 O
CHO O O
N O 165 N H 164 OCH3 O O
O O O
N CH N 3 166 O OH H3CO CH3 CHO H OCH3 CH2CHO 167 O O O
O
N H3CO CH3
N OCH3 R 169. R: OH 168 O 170. R: OCH3
40
O O
N H O O
N R1 172. R1=R2: OCH2O O CH3 173. R1: OH; R2: OCH3 O 171 R2
O OCH3
N O N O
174 CH3 OCH3 175
OCH3
HO
O
H H
O
176. R: OCH3 OH 177. R: OH R O O
O
H H O OCH3 O O H OH O 178 O H O H H O O O
41
OCH3
R5
O
R4 H H R3 O
R2
R1 179. R1: OCH3; R2: OCH3; R3: H; R4: H; R5: OCH3 180. R1: OCH3; R2: OCH3; R3: OCH3; R4: OCH3; R5: OCH3 181. R1: OCH3; R2: OH; R3: H; R4: H; R5: OH 182. R1: OH; R2: OH; R3: H; R4: H; R5: OH
OCH3
H3CO OH O OH
HO HO O
183 O Galactose OH O
H3CO OCH3 184 H OH OH OH
HO O HO O
O O Ramnose Ramnose OH O OH O 185 186
42
H3CO O OCH3
O H O H OCH H 3 O H HO H H O O O H H H O 187 O
O
H3CO H3CO OCH3
H HO O H OCH H 3 O H HO H H O O O H H H O O 188 O
OCH3 O OH H3CO
H H O H
H O 189 H OH H
H3CO 190 O H OH OCH3
OCH3 H O O O
OCH3 H H OH O O H 192
HO 191 H3CO
OCH3 OCH3
43
H3CO O N RO O
OCH3 N 193 194. R: H H3CO 195. R: CH3
OCH3 CH2COOH OCH3 HO
N N H3CO H3CO
OH OH HO 196 197 OCH3 H3CO O O
O O O
N N 199 HO 198 O H H OCH3 O O
OCH3
H
201 H H 200 N O HO
44
OH
O HO HO HO OH O O
202 OH OH OH OH
HO O
H3C OH O OCH3 O HO O O HO OH 203 OH O OH O
O O
NH O OCH3
O O 205 204 R
OCH HO 3 O OH
206. R: COOCH3 O (CH2)25CH3 207. R: COOH 208
45
R1 O O
N H
H3CO 210. R1: OH; R2: OCH3 N 211. R : OAc; R : OCH R2 1 2 3 212. R : cinamoil; R : OCH CH3 209 1 2 3
H N
H3CO O O HO
H3CO O O O O 213 214
O O
H3CO O O O
N N H3CO CH3 O CH H 3 H O O 215 216
OH
217 218
O
O O
N 219 H 220
46
R1
O O O
R2 HO O O 221. R1: H; R2: OC5H9 222. R1: H; R2: OCH3 223
R2 R2 HO O O
R1 R1
224. R1: OCH3; R2: OCH3 230. R1: H; R2: OH
225. R1: H; R2: OCH3 231. R1: OCH3; R2: OH O O
226. R1: OCH3; R2: OCH3 232. R1: OCH3: R2: H O O
227. R : OH; R : 233. R : H; R : OCH3 1 2 OCH3 1 2 O O
228. R1: OCH3; R2: 234. R1; OCH3; R2: OCH3 OCH3 O O 229. R : OCH ; R : H 235. R : OCH ; R : 1 3 2 1 3 2 H HO OCH3
236 O Figura 9. Algumas substâncias isoladas do gênero Zanthoxylum (Rutaceae).
1.3. A ESPÉCIE Zanthoxylum riedelianum
Zanthoxylum riedelianum (Figura 10) é conhecida popularmente como maminha, maminha-de-porca, mamica-de-cadela, lagarto, lagarto amarelo. Planta aculeada de 8 a 18 metros de altura, dotada de copa e perfeitamente globosa, frequentemente encontra- se nas capoeiras mais abertas com tronco de 40 a 60 cm de diâmetro. Floresce nos meses de maio a julho. Os frutos amadurecem a partir do mês de outubro, chegando até
47
dezembro. É utilizada na medicina popular contra manchas na pele e reumatismo. No Brasil tem sua ocorrência em Minas Gerais, São Paulo e Mato Grosso (CORRÊA, 1931).
Figura 10. Exemplar da espécie Zanthoxylum riedelianum. (fonte: autora).
1.4. A ESPÉCIE Zanthoxylum rigidum
Em Mato Grosso a espécie Zanthoxylum rigidum (Figura 11) é denominada popularmente, como mamica-de-cadela ou mamica-de-porca. Esta planta apresenta-se como um arbusto, com ramos quando novos curtamente pilosos com acúleos longos castanhos; folhas subcoriáceas denso-pilosas nas duas faces, imparipinadas ou paripinadas com 2-3 pares de folíolos ovais ou ovais oblongos, sésseis; panícula terminal piramidada, pilosa; flores sésseis aglomeradas; cálice com os lascínios ovais obtusos; pétalas três vezes maiores que as sépalas, ciliadas; estames o dobro mais comprido que as pétalas; estames com filetes de 4 mm de comprimento, anteras suborbiculares, alvas (MOCCELINI, 2003).
Figura 11. Exemplar da espécie Zanthoxylum rigidum (fonte: RIBEIRO, 2012).
48
Dessa forma, o interesse pelo estudo fitoquímico por plantas do gênero Zanthoxylum, se mostra pela gama de atividades farmacológicas e biológicas relatadas na literatura. Esse trabalho é uma complementação da base de dados fitoquímicos das espécies do gênero Zanthoxylum. As espécies Zanthoxylum riedelianum e Zanthoxylum rigidum já possuem estudos, porém as substâncias desse trabalho se mostraram diferentes das relatadas na literatura.
2. OBJETIVOS
Isolar substâncias através de fracionamento e purificação de extratos de Zanthoxylum riedelianum e Zanthoxylum rigidum com solventes orgânicos, utilizando técnicas cromatográficas convencionais.
Identificar as estruturas das substâncias isoladas através de métodos físicos de determinação estrutural, tais como RMN 1H e 13C uni e bidimensionais e espectrometria de massas.
Contribuir para o conhecimento da composição química do gênero Zanthoxylum.
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais do Departamento de Química da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) em conjunto com os outros colaboradores de outros Laboratórios, como o professor Dr. Mário Geraldo de Carvalho do Laboratório de Produtos Naturais da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).
3.1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
3.1.1. Suportes para cromatografia
Sílica gel 60 GF254 – Vetec para cromatografia em camada delgada analítica
Sílica gel 60 GF254 – Vetec para cromatografia em camada delgada preparativa
49
Cromatofolhas de alumínio 20x20 cm da Macherey-Nagel GmBH & Co, com 0,20 mm de sílica gel 60 com indicador UV254 Sílica gel 60 (230-400 mesh) – Vetec – cromatografia em coluna a pressão normal Sephadex LH-20 da GE Heathcare Life Sciences Celulose microcristalina da Synth
3.1.2. Solventes
Solventes grau cromatográfico da Dinâmica Química Contemporânea Ltda e Vetec Química Fina: Acetato de etila Ácido acético Clorofórmio Diclorometano Etanol Hexano Hidróxido de amônio Metanol
Solventes deuterados da Sigma-Aldrich: Clorofórmio DMSO Metanol
Piridina
3.1.3. Reveladores
Reagente de Dragendorff Solução de vanilina ácida (WAGNER et al., 1984) Câmara de Luz UV (comprimento de onda 254 e 365 nm)
50
3.1.4. Equipamentos
Espectrômetros de RMN Bruker TopSpin – 500 (500 MHz para 1H e 125 MHz para 13C) DQ/UFRRJ
Espectrômetro de massas Espectrômetro de massas de alta resolução EM-ESI com ionização elétron spray (ESI) e detecção de íons positivo, micrOTOF-QII, Compass NPPN/UFRJ
Evaporador rotatório sob pressão reduzida Buchi Switzerland modelo R – 210, banho Buchi Switzerland modelo B – 419 e circulador de água refrigerado da Marconi equipamentos para laboratório
Estufas Estufa de Secagem e Esterilização modelo 315 SE da FANEM Estufa a vácuo modelo MA 030/12 da Marconi
Balanças Balança Analítica Libroc modelo AEG - 220 da Shimadzu Balança semianalitica modelo BG - 400 da Gehaka
Ultrassom Ultrasonic Cleaner da Unique
Processamento dos espectros Programa ACD/LABS versão 12.0
3.2. METODOLOGIA
Os procedimentos químicos foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais do Departamento de Química da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT).
51
3.2.1. Material vegetal de Zanthoxylum riedelianum
As folhas de Zanthoxylum riedelianum foram coletadas no dia 19/09/2011, na Fazenda Nossa Senhora de Fátima, localizada na estrada Poconé-Porto Cercado, km 8, município de Poconé/MT. A coleta foi realizada em latitude de 16° 18’ 50.3’’ S, longitude 056° 33’23.8’’, altitude 128 m. A ratificação taxonômica foi realizada pelo professor Dr. Arnildo Pott, do Herbário Central da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, onde está depositada uma exsicata de CGMS nº 33228.
3.2.2. Preparação do Extrato de Zanthoxylum riedelianum
Após secagem das folhas de Zanthoxylum. riedelianum (3,0 kg), o mesmo foi triturado e submetido à extração por maceração a frio com metanol agitando ocasionalmente, utilizando-se 8 L de solvente em cada extração. Realizou-se este processo em sete ciclos de cinco dias. O metanol das extrações foi concentrado em evaporador rotatório a 40°C, sob pressão reduzida, para obtenção do extrato metanólico ZRFLM (407,4 g).
3.2.3. Fracionamento do extrato ZRFLM (Zanthoxylum riedelianum Folhas Extrato Metanólico)
O extrato ZRFLM (407,4 g) foi suspenso em 1500 mL da mistura MeOH/H2O (7:3) e submetido a partição líquido - líquido com os solventes hexano, CHCl3, e AcOEt, obtendo- se as respectivas frações após a remoção do solvente: hexano-ZRFLFH (3,97 g), CHCl3- ZRFLFC (8,94 g), AcOEt- ZRFLFA (17,45 g), além do resíduo hidrometanólico- ZRFLMResíduo (158,77 g).
52
Z. ridelianum Folhas (3000 g)
ZRFLM (407,4 g)
(a)
ZRFLFH ZRFLFC ZRFLFA ZRFLMResíduo (3,97 g) (8,94 g) (17,45 g) (158,77 g)
Esquema 1. Fracionamento do extrato metanólico das folhas Zanthoxylum riedelianum. (a) Partição líquido-líquido, eluente: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol.
3.2.4. Fracionamento da fração ZRFLFC (Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Clorofórmio)
A fração ZRFLFC (8,94 g) foi fracionada em CC com gel de sílica, eluída com
CHCl3/AcOEt e AcOEt/MeOH (gradiente), sendo coletadas 194 frações de 125 mL. As frações 170 e 171 (45,0 mg) foram reunidas após análise em CCDA e submetida em CC utilizando sephadex LH-20 e eluída com MeOH 100%, obtendo-se 25 frações de 5 mL. Após análise cromatográfica das frações 8-14 (20,0 mg), foram reunidas por similaridade cromatográfica e submetida a CC com sephadex LH-20 e eluída com
CHCl3/MeOH (1:1), obtendo-se um total de 21 frações de 5 mL. Após a evaporação do solvente as frações 8-15 foram reunidas e resultou em 6,0 mg de um sólido branco amorfo, que depois de análises espectroscópicas RMN 1H e 13C, uni- e bidimensionais identificou-se uma mistura de peptídeos, sendo que o componente majoritário é um novo octapeptídeo denominado de ciclozanthoxylano B (237).
53
ZRFLFC (8,94 g)
(a)
170 e 171 (45 mg)
(b)
8-14 (20 mg)
(c) e (d)
8-15 (6 mg)
Phe1 Pro8 Pro7 O
N N O
O NH HN O Gly6
O NH HN Phe2 O H NH N Gly3 Phe5 O 4 O Gly ciclozanthoxylano B
Esquema 2. Fracionamento da fração ZRFLFC. (a) CC, Φ x h = 5,6 x 32,0 cm, sílica gel 60 (70-230 mesh), eluente: clorofórmio; clorofórmio:acetato de etila (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1), (4:6), (1:9); acetato de etila;
54
acetato de etila:metanol (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1); metanol. Foram coletadas 194 frações. (b) CC, Φ x h = 3,5 x 31, 5 cm, sephadex LH-20, eluente: metanol. Foram coletadas 25 frações. (c) CC, Φ x h = 3,5 x 31, 5 cm, sephadex LH-20, eluente: clorofórmio:metanol (1:1). Foram coletadas 21 frações. (d) As frações 8-15 após a evaporação do solvente, resultou em um precipitado (6mg) branco amorfo.
3.2.5. Fracionamento da fração ZRFLFA (Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Acetato de Etila)
A fração ZRFLFA (17,45 g) foi fracionada em CC com gel sílica, eluída com Hex/AcOEt e AcOEt/MeOH (gradiente), sendo coletadas 195 frações de 125 mL. Após avaliação por CCDA foram reunidas de acordo com semelhança do perfil cromatográfico as frações 40-62 (250,0 mg), e submetida a novo processo cromatográfico em CC com sephadex LH-20 e eluída com CHCl3/MeOH (8:2), obtendo-se 32 frações de 5 mL. As frações 12-17 (12 mg), foram reunidas pois demonstraram similaridade cromatográfica após realizar CCDA, após a evaporação do solvente verificou-se a formação de um precipitado amorfo de coloração amarela, onde o mesmo foi submetido a análises espectroscópicas de RMN 1H e 13C, uni- e bidimensionais resultando na molécula 3,4 – dihidroxi cinamato de metila (238). A reunião das frações 63-66 (150,0 mg) foi submetida a novo processo cromatográfico em CC com sephadex LH-20 e eluída com CHCl3/MeOH (8:2), obtendo-se 36 frações de 5mL. Com essas frações foi realizado CCDA que após análise foram reunidas por similaridade cromatográfica as seguintes frações 22-34 (40,0 mg) e submetidas a CC com sephadex LH-20 e eluída com CHCl3/MeOH (1:1), obtendo-se 28 frações de 5 mL, sendo que as frações 16-21, foram reunidas devido a similaridade do perfil cromatográfico apresentado pela CCDA, resultando-se em 10 mg de um precipitado em forma de agulhas de coloração marrom que após análises espectroscópicas de RMN 1H e 13C, uni- e bidimensionais, foi identificado como sendo o ácido protocatecuico (239).
55
ZRFLFA (17,45 g)
(a)
40-62 63-66 (250mg) (150 mg)
(b, c) (d)
12-17 22-34 (12 mg) (40mg)
(e, f)
O 16-21 HO O (10 mg)
HO
3,4 - dihidroxi cinamato de metila
HO O
OH OH Ácido protocatecuico
Esquema 3. Fracionamento da fração ZRFLFA. (a) CC, Φ x h = 6,7 x 33,0 cm, sílica gel 60 (70-230 mesh), eluente: hexano; hexano:acetato de etila (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1), (4:6), (1:9); acetato de etila; acetato de etila:metanol (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1), (4:6), (1:9); metanol; metanol:dietilamina (1:1). Foram coletadas 195 frações. (b) CC, Φ x h = 3,5 x 31, 5 cm, sephadex LH-20, eluente: clorofórmio:metanol (8:2). Foram coletadas 32 frações.
56
(c) As frações 12-17 após a evaporação do solvente, resultaram em um precipitado (12 mg) amorfo de coloração amarela. (d) CC, Φ x h = 3,5 x 31, 5 cm, sephadex LH-20, eluente: clorofórmio:metanol (1:1). Foram coletadas 36 frações. (e) CC, Φ x h = 3,5 x 31, 5 cm, sephadex LH-20, eluente: clorofórmio:metanol (1:1). Foram coletadas 28 frações. (f) As frações 16-21 após a evaporação do solvente, resultaram em um precipitado (10mg) em forma de agulhas de coloração marrom
3.2.6. Fracionamento da fração ZRFLMResíduo (Zanthoxylum riedelianum Folhas Fração Hidrometanólica resíduo)
A fração ZRFLMResíduo (80,0 g) foi submetida a uma CC empacotada com mistura de sílica gel e celulose (1:1), eluída com CHCl3/AcOEt, AcOEt/MeOH e MeOH/Dietilamina (gradiente), sendo coletadas 238 frações de 125 mL. As frações 111-135, após a evaporação do solvente e reunião resultou-se em 8 mg de um precipitado branco amorfo que após análises espectroscópicas de RMN 1H e 13C, uni- e bidimensionais foi identificado como sendo a molécula N-benzoilfenillalanilato de N- benzoilfenilalanina (240).
57
ZRFLMResíduo (80 g)
(a) e (b)
111-115 (8 mg)
O O
NH NH O
H H O H H H H
N-benzoilfenilalanilato de N-benzoilfenilalanina
Esquema 4. Fracionamento da fração ZRFLMResíduo. (a) CC, Φ x h = 6 x 39 cm, sílica gel 60 (70-230 mesh) e celulose (1:1), eluente: clorofórmio; clorofórmio:acetato de etila (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1), (4:6), (1:9); acetato de etila; acetato de etila:metanol (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1), (4:6), (1:9); metanol; metanol:dietilamina (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1), (4:6), (1:9); dietilamina. Foram coletadas 238 frações. (b) Após a evaporação do solvente resultou em um precipitado (8 mg) branco amorfo.
3.3. Material vegetal de Zanthoxylum rigidum
As cascas do caule de Zanthoxylum rigidum foram coletadas na Transpantaneira, km 33, município de Poconé/MT, no dia 09/05/2011. A ratificação taxonômica foi feita por comparação com a exsicata n°38648, pela botânica Dra. Rosilene Rodrigues Silva, responsável pelo Herbário Central da Universidade Federal do Mato Grosso.
58
3.3.1. Preparação do Extrato de Zanthoxylum rigidum
Após secagem da casca do caule (2,97 kg), o mesmo foi triturado e submetido à extração através de maceração a frio com a mistura de solventes EtOH/H2O (7:3). Os solventes das extrações foram concentrados em evaporador rotatório a 40°C, sob pressão reduzida, obtendo-se o extrato hidroalcóolico ZRgCFE (250,0 g).
3.3.2. Fracionamento do extrato ZRgCFE (Zanthoxylum rigidum casca do caule fração hidroetanólica)
Essa extração foi realizada com objetivo de isolar alcaloides, pois quando realizou as análises por CCDA do extrato, ao serem reveladas com reagente de Dragendorff, apresentaram manchas alaranjadas que indicam assim a presença de alcaloides. O extrato ZRgCFE (215,0 g) foi solubilizado em 500 mL da solução MeOH/AcOH 2%, posteriormente foi adicionado mais 500 mL de solução aquosa de AcOH 10%. Após
24 horas em repouso na geladeira, essa mistura foi alcalinizada com NH4OH até atingir o pH 9 em seguida deixou-se na geladeira por mais um dia. Houve a formação de um precipitado (ZRgCFEppt) que foi separado da fase líquida por meio de filtração.
ZRgCFE (215 g)
(a)
ZRgCFE (acidificado)
(b)
ZRgCFE (basificado)
(c)
ZRgCFE ppt (50 g)
Esquema 5. Extração ácido/base da fração ZRgCFE.
59
(a) ZRgCFE foi solubilizado com uma solução MeOH/AcOH 2%, em seguida foi acidificado com uma solução aquosa de AcOH 10%.
(b) Foi alcalinizado com uma solução de NH4OH. (c) Houve a formação de um precipitado (ZRgCFEppt).
3.3.3. Fracionamento do extrato ZRgCFEppt (Zanthoxylum rigidum casca do caule fração hidroetanólica precipitado)
O ZRgCFEppt (50,0 g) foi fracionado em CC empacotada com mistura de sílica gel e celulose (1:1) eluída com MeOH/Dietilamina com aumento gradual de polaridade, onde foram coletadas 58 frações. A fração 6 (11 mg) demonstrou a presença de um precipitado branco amorfo que foi separado da fase líquida e após análises espectroscópicas de RMN 1H e 13C, uni- e bidimensionais foi identificado com sendo o ácido ursólico (241). A fração 13 (10 mg) também apresentou a formação de um precipitado branco amorfo que foi separado da fase líquida e submetido a análises espectroscópicas de RMN 1H e 13C, uni- e bidimensionais e identificado com sendo a molécula N-trans- cafeoiltiramina (242).
60
ZRgCFE ppt (50 g)
(a)
(b) (c)
6 13 (11 mg) (10 mg)
OH OH H N
O COOH HO N-trans - cafeoiltiramina HO
ácido ursólico
Esquema 6. Fracionamento de ZRgCFE ppt. (a) CC, Φ x h = 6 x 41 cm, sílica gel 60 (70-230 mesh) e celulose (1:1), eluente: metanol; metanol:dietilamina (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (1:1), (4:6), (1:9); dietilamina. Foram coletadas 58 frações. (b) Formação de um precitado (11 mg) que foi separado da fase líquida. (c) Formação de um precitado (10 mg) que foi separado da fase líquida.
61
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Substâncias isoladas das folhas de Zanthoxylum riedelianum
As estruturas das substâncias isoladas das folhas de Zanthoxylum riedelianum são mostradas na Figura 12.
Phe1 Pro8 Pro7 O
N N O
O NH HN O Gly6
O NH HN Phe2 O H NH N Gly3 Phe5 O 4 O Gly ciclozanthoxylano B (237)
O HO O HO O
HO OH 3,4-dihidroxi-cinamato OH de metila Ácido protocatecuico (238) (239)
O O
NH NH O
H H O H H H H
N-benzoilfenilalanilato de N-benzoilfenilalanina (240) Figura 12. Substâncias isoladas das folhas de Zanthoxylum riedelianum.
62
4.1.1. Identificação da substância 237
A substância 237 (Figura 13) foi isolada das folhas de Zanthoxylum riedelianum, da fração clorofórmio como sendo um sólido branco amorfo e identificada em mistura, sendo que para a identificação foram considerados somente os sinais de maior intensidade dos espectros de RMN 1H e 13C. O espectro de RMN 1H (Figura 14) apresentou seis sinais em 9,17 (t), 8,30 (t), δ 8,12 (d), 7,91(t), 7,72 (dl) e 7,45 (dl) que pelo espectro de HSQC (Figura 28) nota-se que estes sinais não estão ligados a carbonos e, portanto foram atribuídos aos hidrogênios ligados a heteroátomos (nitrogênio da porção amida). Os sinais entre δ 2,90 a 4,59 foram relacionados a hidrogênios associados aos carbonos metínicos e metilênicos entre δ 37,20 e 58,90, compatíveis com carbonos ligados a nitrogênios. Se esses carbonos fossem do tipo carbinólicos os valores de deslocamento químico seriam em torno de 70 ppm. O espectro de DEPTQ (Figura 18) mostrou oito sinais de carbonila de amida em δ 170,70; 170,30; 169,0; 169,20; 173,90; 171,80; 172,0 e 172,10, cinco carbonos metínicos em δ 55,30; 52,80; 56,30; 60,60 e 58,90, e onze carbonos metilênicos em 21,60; 24,60; 28,40; 31,40; 36,40; 36,70; 37,20; 42,20; 43,30 e 47,20 (2x); além dos carbonos metínicos em anel aromáticos centrados em δ 128 a 132 (Tabela 1). A análise dos espectros de RMN de 1H (Figura 14) em associação com os espectros de HSQC (Figura 27) permitiu atribuir os sinais em δ 3,20 a 4,0 (m) aos carbonos metilênicos em δ 42,20, 43,70, 43,30 de três unidades de glicina e os sinais em δ 0,90 a 3,60 aos carbonos metilênicos em δ 28,40; 24,60; 31,40; 21,60; 47,20 de duas unidades de prolina. As três unidades de fenilalanina foram identificadas pelos sinais do sistema aromático monossubstituído δ 7,20 a 7,40 (m) e dos hidrogê’nios de carbonos metilênicos
CH2-β em δ 2,90 a 3,20 (m) que acoplam pelo COSY (Figura 21) com os hidrogênios CH- α em δ 4,38 (m), 4,59 (m) e 4,67 (m). Os experimentos de NOE (Figura 30, 31 e 32) permitiram verificar as proximidades entre os resíduos de aminoácidos que constituem o octapeptídeo. Pelo espectro de NOE foi verificado que irradiando na frequência do sinal em δ 8,12 (d) [HN-Phe1] resultou NOE em δ 7,45 (dl) da segunda unidade de fenilalanina [HN-Phe2] (experimento k) e irradiando na frequência do sinal em 9,70 (t) [HN-Phe5] resultou NOE em 7,91 (t) [HN-Gly3] (experimento h), indicando as proximidades dessas unidades.
63
As unidades de glicina foram sugeridas com base nos sinais dos carbonos metilênicos em δ 42,20, 43,30 e 43,70 acoplados aos hidrogênios em δ 3,20 a 3,40 (m) vistos no HSQC (Figura 27). Irradiando na frequência do sinal em 7,91 (t) [HN-Gly3] resultou NOE em 7,45 (dl) [HN-Phe2] (experimento g), irradiando na frequência em δ 9,17 (t) [HN-Gly4] resultou NOE no sinal em δ 4,38 [CHα-Phe5] e no sinal em 7,91 (t) [HN-Gly3] (experimento a), e por fim, irradiando na frequência em 8,03 (t) [HN-Gly6] resultou NOE em 7,72 (dl) [HN-Phe5] (experimento e). Para as unidades de prolina foram atribuídos os carbonos metínicos αC=O em δ 58,90 e 60,60 acoplados aos hidrogênios em δ 4,28 (dl) e 4,42 (dl), respectivamente; e os carbonos metilênicos atribuídos com base na análise dos espectros de HSQC (Figura 29) 7 CH2-β [δ 1,80-2,20/28,4], CH2-γ [δ 2,0/24,60] e CH2-δ [δ 3,20-3,60/47,20] – Pro e CH2-β 8 [δ 1,40-2,20/31,40], CH2-γ [δ 0,90-1,50/21,60] e CH2-δ [δ 3,20-3,60/47,20] – Pro . Pelo espectro de NOEDIFF verificou-se que irradiando na frequência em δ 4,28 (dl) [α CH-Pro7] observou NOE em δ 4,42 [α CH-Pro8] (experimento b).
A expansão do HMBC (Figura 24) na região de δH 7,0– 9,5 ppm e δC 167,5 – 177,0 ppm foi fundamental para visualizar alguns acoplamentos que permitiram definir a sequência do peptídeo. O espectro de HMBC (Figura 23) apresentou o acoplamento entre os sinais em δ 4,59 (m) [α CH-Phe1] com 170,70 [C=O-Phe1] e 138,90 [C-1’-Phe1]; δ 3,10- 3,20 [β CH-Phe1] com 128,0-132,0 [C-2’/6’-Phe2] e 55,30 [α CH-Phe1], confirmando a conexão Phe1-Phe2. Os acoplamentos entre δ 3,20-4,0 (m) [α CH-Gly3] com 169,2 [C=O- Gly4] e 169,0 [C=O-Gly3] confirmaram a conexão Gly3-Gly4. O acoplamento entre δ 9,17 (t) [HN-Gly4] com 173,90 [C=O-Phe5] confirmou a conexão Gly4-Phe5. Os acoplamentos entre δ 8,03 (s) [HN-Gly6] com 172,0 [γ CH-Pro7] e 60,60 [α CH-Pro7] e entre δ 3,20-4,0 7 5 5 6 7 (m) [γ CH2-Pro ] com 173,90 [C=O-Phe ] confirmaram a conexão Phe -Gly -Pro . Os 7 8 acoplamentos entre δ 3,20-3,60 (m) [γ CH2-Pro ] com 172,10 [C=O-Pro ] e entre 170,70 [C=O-Phe1] confirmaram a conexão Pro7-Pro8-Phe1. Com os dados obtidos em massas de alta resolução modo positivo (Figura 33) conclui-se que sua estrutura é compatível com fórmula molecular C43H50N8NaO8 com o fragmento m/z 829,3646 relativo ao aduto sódico [M+Na+]. As análises de todos esses dados confirmam a sequência de aminoácidos da estrutura do ciclo-[Phe1-Phe2-Gly3-Gly4-Phe5-Gly6-Pro7-Pro8] como sendo o ciclopepitídeo Ciclozanthoxylano B. Ciclopeptídeos tem sido encontrado em espécies de Zanthoxylum como o ciclozanthoxylano A nas folhas de Zanthoxylum rigidum (RIBEIRO et al., 2012).
64
Phe1 Pro8 Pro7 O
N N Legenda: O HMBC O NH HN O Gly6 NOEDIFF
O NH HN Phe2 O H NH N Gly3 Phe5 O 4 O Gly Figura 13. Estrutura proposta para o octapeptídeo ciclozanthoxylano B (237).
1 13 Tabela 1. Dados dos espectros de RMN H e C (DMSO-d6 500 e 125 MHz) da substância 237. HSQC
δ H (1D e 2D-COSY) δC HMBC NOE diff Phe1 α 4,59 (m) 55,3 170,7/138,9 β 3,10-3,2(m) 37,2 128-132/55,3 1’ - 138,9 2’-6’ 7,2-7,4(m) 128-132 C=O - 170,7 N-H 8,12(d) - HN-Phe2 Phe2 α 4,67 52,8 138,1 β 2,9-3,1 36,7 128-132/52,8 1’ - 138,1 2’-6’ 128-132 C=O 170,3 N-H 7,45(dl) - 169,0 HN-Phe1
65
Gly3 α 3,2-4,0(m) 42,2 169,2/169.0 C=O - 169.0 N-H 7,91(t) - 169,0/169,2 HN-Phe2 Gly4 α 3,2-4,0(m) 43,7 169,2/169.0 C=O - 169,2 N-H 9.17(t) - 173,9 α-Phe5/HN-Gly3 Phe5 α 4,38(m) 56,3 173,9/137,6 β 3,0;3,15(m) 36,4 173,9/56,3 1’ - 137,6 2’-6’ 7,2-7,4(m) 128-132 C=O - 173,9 N-H 7,72(dl) - 173,9 Gly6 α 3,2-4,0(m) 43,2 172,0/171,8/173,9 C=O - 171,8 N-H 8,03(t) - 172,0/171.8 HN-Phe5 Pro7 α 4,28(dl) 60,6 171,8/47,2/28,8/24, α-Pro8 6 β 1,80; 2,2(m) 28,4 γ 2,0(m) 24,6 172,0 δ 3,2-3,6(m) 47,2 172,1 δ-Pro8 C=O - 172,0 Pro8 α 4,42(dl) 58,9 172,1/47,2/31,4/21, α-Pro7 6 β 1,4; 2,2(m) 31,4 γ 1,50; 0,90(m) 21,6 δ 3,2-3,6(m) 47,2 170,7 δ-Pro7 C=O - 172,1
66
peptideo.095.001.1r.esp
3.3750
7.2833
2.5114
7.2959
7.3463
7.2202
7.2354
7.3595
3.3353
3.0252
1.9479
1.9617
8.1097
3.4475
3.3208
6.9322
4.2853 3.6807
3.7387
4.3016
3.7167
8.0933
8.0309 1.9769
7.4396
3.6681
6.9479
7.1578
7.9187 7.1433
7.7485
9.1769
7.7598 3.0069
6.8401 3.7551
4.4202
4.6729 3.6120 2.8877
1.4909
2.1950
2.1880
4.3634
4.3804
2.9098
1.7852
2.2101
3.2357
2.8606
8.3580
0.9727 0.9576
4.6900
1.8243
9.3257 6.8250
3.2754
4.7738
4.8734
1.9006
8.3694
1.3377 1.0944
0.39 0.99 0.50 1.43 1.16 1.18 1.02 1.5320.94 1.03 0.43 1.18 0.81 0.40 0.87 1.07 1.09 2.11 1.60 0.412.78 6.60 26.29 3.92 5.46 1.48 0.42 4.11 2.01 0.60 2.15 0.45 0.05 0.17 0.52 1.06
9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 14. Espectro de RMN H (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237.
67
2',6'-Phe1,Phe2 e Phe5
7.2833
1
7.2959
5
3
6
4 2
7.3463
N-H Phe N-H
N-H Gy N-H
N-H Gly N-H
N-H Phe N-H
7.2202
N-H Gly N-H
7.2354
N-H Phe N-H
7.2675
7.3595
8.1097
6.9322
8.0933
8.0309
7.4396
6.9479
7.9187 7.1578
7.7485 7.1433
7.4560
9.1769
7.7598
6.8401
8.0195
7.9307
7.9073
6.8546
7.0488
8.3580
9.3257 6.8250
7.0343 8.3694
0.39 0.99 0.50 1.43 1.16 1.18 1.02 1.53 20.94 1.03 0.43 1.18 0.81
9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 Chemical Shift (ppm)
1 Figura 15. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237 entre 6,8 a 9,4 ppm.
5
- Phe 3.3750
2.5114 8 8 7 -Pro - Pro - Pro - Pro7, - Pro8 - Phe1 -Pro7 2 3 4 6 - Phe - Gly , - Gly , - Gly -Phe5 -Pro7 -Pro8
-Phe1 -Phe2
3.3353
3.0252
1.9479
1.9617
3.4475
3.3208
3.6807
4.2853
3.7387
4.3016
3.7167
3.2130
1.9769
3.6681
3.0069
3.6448
3.1525
3.1777
3.7551 3.6555
4.4202
4.6729 4.4082 2.8877
1.4909
2.1950
2.1880
3.9367
4.3634
4.5948
4.3804 3.8301
3.8194 2.9098
3.9033
1.7852
2.2101
2.1704
2.8606
2.9785 0.9727 0.9576
4.6900
4.0974
4.5777 1.8243
2.7900
4.7738
4.8734 4.7498 1.9006
2.0954
2.7617 1.8691
1.3377
1.6535 1.0944
0.40 0.87 1.09 2.11 0.41 2.78 6.60 26.29 3.92 5.46 1.48 0.42 4.11 2.01 0.60 2.15 0.45 0.170.52 1.06
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shift (ppm)
1 Figura 16. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 1,0 a 5,0 ppm.
68
peptideo.096.001.1r.esp
47.1904 40.4519 40.2858 40.1197 39.9536 39.7875 39.6214 39.4480 24.5629
28.3618
47.5948
21.6812
36.4075
36.7036
31.3735
43.7814
170.7496
169.0234
171.8546
172.1218
169.1606
138.0686
137.6136
173.9346
138.8414
42.7486
46.6415
25.9423
36.9780
168.4167
136.8986
63.9533
52.0437
53.0115
63.2022
52.7876
129.7341 129.5680 129.3513 128.9324 128.8385 128.7591 128.6941 126.8813 126.8235 60.5733 58.8977 56.3266 55.2938 52.8815
176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 Chemical Shift (ppm)
Figura 17. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância 237.
69
8
CO Pro CO
7
1
4
3
2
5
6
CO Pro CO
CO Phe CO
CO Gly CO
CO Gly CO
CO Phe CO
CO Gly CO
CO Phe CO
170.7496
169.0234
171.8546
172.1218
169.1606
170.3307
172.0135
173.9346
172.0857
171.8040
169.6012
173.8696
168.4167
171.3851
170.0634 169.7818
174.0 173.5 173.0 172.5 172.0 171.5 171.0 170.5 170.0 169.5 169.0 168.5 Chemical Shift (ppm)
Figura 18. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância
237, entre 168,5 a 174,0 ppm.
1
5
2
C1'Phe
C1'Phe
C1'Phe
138.0686
137.6136
138.8414
138.3286
136.8986
126.9463
129.9580
128.1452 127.1774
128.5280
126.8813
128.9324
129.5246
126.8235
129.3513
129.7341
128.8385
128.7591
129.5680 128.6941
139.0 138.5 138.0 137.5 137.0 136.5 136.0 135.5 135.0 134.5 134.0 133.5 133.0 132.5 132.0 131.5 131.0 130.5 130.0 129.5 129.0 128.5 128.0 127.5 127.0 126.5 126.0 Chemical Shift (ppm)
Figura 19. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância
237, entre 126,0 a 139,0 ppm.
8
7
7
8
4
40.2858 40.1197 39.9536 39.7875 39.6214
8
Pro
8
6
Pro
Pro
2
3
1
Gly
Pro
Pro
C C
C
Pro
Gly
Gly
C
Phe Phe
C CPro7
C
C
C
C
C C
CPhe5
39.4480
40.4519
47.1904
24.5629
47.5948 28.3618
1
21.6812
36.4075
36.7036
43.1820 42.2936
31.3735
37.1802 43.7814
C Pro7 Phe
42.7486
46.6415
25.9423
44.9225 39.0147 27.4807
8 24.8012
CPro C
5
63.9533 C Phe
52.0437
53.0115
63.2022
52.7876
58.8977
52.8815
60.5733
56.3266 55.2938
CPhe2 66 64 62 60 58 56 54 52 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 Chemical Shift (ppm)
Figura 20. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 22,0 a 66,0 ppm.
70
peptideo.097.001.2rr.esp
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0 (ppm) Shift Chemical F1
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 F2 Chemical Shift (ppm) 1 1 Figura 21. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237.
peptideo.097.001.2rr.esp
6.5
NH Phe2/H Phe2
7.0 NH Phe5/H Phe5
3 3 NH Gly /H Gly 7.5
8.0
8.5 (ppm) Shift Chemical F1 NH Phe1/H Phe1
9.0
NH Gly4/H Gly4
9.5
4.5 4.0 3.5 F2 Chemical Shift (ppm) 1 1 Figura 22. Expansão do espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre 3,5 a 9,5 ppm.
71
peptideo.098.001.2rr.esp
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120 (ppm) Shift Chemical F1
130
140
150
160
170
180
190
200
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 F2 Chemical Shift (ppm)
Figura 23. Espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237.
167.5 NH Gly3/C=O Gly4 168.0
2 3 NH Phe /C=O Gly 168.5
169.0
169.5
170.0
170.5
171.0 NH Phe5/C=O Gly6 171.5
172.0
172.5 ppm
173.0
173.5
174.0
174.5 NHGly6/C=O Pro7 175.0
175.5 NH Gly4/C=O Phe5 176.0
176.5
177.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 ppm
Figura 24. Expansão do espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre H 7,0 a 9,5 C 167,5 a 177,0 ppm. 72
peptideo.099.001.2rr.esp
-8
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88 F1 Chemical Shift (ppm) Shift Chemical F1
96
104
112
120
128
136
144
152
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 F2 Chemical Shift (ppm)
Figura 25. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237.
peptideo.099.001.2rr.esp
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26 (ppm) Shift Chemical F1
27
28
29
30
31
32
33
2.0 1.5 1.0 F2 Chemical Shift (ppm)
Figura 26. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre H 1,0 a 2,0 C 14 a 33 ppm. 73
peptideo.099.001.2rr.esp
35
36
37
38
39
40
41
42
43 F1 Chemical Shift (ppm) Shift Chemical F1
44
45
46
47
48
4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 F2 Chemical Shift (ppm)
Figura 27. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre H 2,0 a 4,0 C 35 a 48 ppm.
peptideo.099.001.2rr.esp
122.0
122.5
123.0
123.5
124.0
124.5
125.0
125.5
126.0
126.5
127.0
127.5
128.0 F1 Chemical Shift (ppm) Shift Chemical F1
128.5
129.0
129.5
130.0
130.5
131.0
131.5
132.0
8.0 7.5 7.0 6.5 F2 Chemical Shift (ppm)
Figura 28. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre H 6,5 a 8,0 C 122 a 132 ppm.
74
peptideo.099.001.2rr.esp
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60 F1 Chemical Shift (ppm) Shift Chemical F1 61
62
63
64
65
66
67
68
4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 F2 Chemical Shift (ppm)
Figura 29. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO-d6) da substância 237, entre H 4,0 a 4,0 C 49 a 69 ppm.
Figura 30. Espectro de NOEDIFF.
75
Figura 31. Espectro de NOEDIFF.
Figura 32. Espectro de NOEDIFF.
76
Figura 33. Espectro de massas de alta resolução de 237 obtido através de ionização por eletrospray (EM-ESI) em modo positivo.
4.1.2. Identificação da substância 238
A substância 238 (Figura 36) foi isolada das folhas de Zanthoxylum riedelianum da fração acetato de etila, como sendo um precipitado amorfo de coloração amarela. Essa substância apresentou em seu espectro de RMN de 1H (Figura 38, Tabela 2) sinais na região de aromáticos entre δ 6,80 (1H, d, J = 8,5Hz, H-3) e δ 6,95 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), δ 7,06 (1H, s) em sistema trissubstituído, sinais de hidrogênios em δ 6,27 (1H, d, H-7) e δ 7,56 (1H, d, H-8) cuja constante de acoplamento com J = 16 Hz se refere a um acoplamento do tipo trans e um sinal na região de baixa frequência de uma metoxila em δ 3,77 (s, 3H). No espectro de DEPTQ (Figuras 40 e 41, Tabela 2) foi observado um sinal do carbono em δ 50,61 relativo a metoxila C-10, e dois sinais de carbonos quaternários em δ 145, 41 e δ 148, 20, atribuído aos carbonos C-4 e C-5, respectivamente sinal de uma carbonila em δ 168,40 atribuída ao C-9. Pelo espectro de HSQC (Figura 45) foi possível atribuir os valores dos deslocamentos químicos dos seguintes carbonos hidrogenados, C-2 [6,95/121,55], C-3 [6,80/113,70], C-6 [7,06/115,08], C-7 [7,56/145,56], C-8 [6,27/113,40]. O espectro de HMBC (Figura 47) permitiu observar as correlações entre δ 7,56 (H-7) com δ 113,70 (C-6), δ 113,40 (C-8), δ 121,55 (C-2) e δ 168,40 (C-9); entre δ 7,06 (H-6) com δ 121,55 (C-2), δ 145,41 (C-4) e δ 148,20 (C-5) e entre δ 3,77 (H-10) com δ 168,40 (C-9) conforme observado na figura 34 e 35: 77
H O HMBC δ 121,55 (C-2) 168,40 113,40 δ 113, 70 (C-3) 121,55 113,70 δ 113,40 (C-8) Figura 34. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para o sinal de hidrogênio em δ 7,56 (H-7).
HMBC H O δ 7,06 δ 121,55 (C-2) HO CH3 148,20 168,40 O δ 7,06 δ 145,41 (C-4) 145,41 121,55 δ 7,06 δ 148,20 (C-5) HO δ 3,77 δ 168,40 (C-9) Figura 35. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para os sinais de hidrogênios em δ 7,06 (H-6) e δ 3,77 (H-10).
Com os resultados obtidos pelos experimentos de RMN 1D e 2D e comparação coma literatura (XIANG et al., 2010), foi verificado que a substância 238 (Figura 36) correspondia ao 3,4-dihidroxi-cinamato de metila que está sendo relatado pela primeira vez no na espécie Zanthoxylum riedelianum.
O 6 7 1 10 HO 9 O 5 8 2 HO 4 3
O O 7,06 7,56 HO 115,08 145,56 HO 3,77 50,61 148,20 126,27 168,40 O O 113,40 6,27 145,41 121,55 6,95 HO HO 113,70 6,80 Figura 36. Estrutura proposta para o 3,4-dihidroxi-cinamato de metila (238).
78
1 13 Tabela 2. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 238 (CD3OD 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (XIANG et al., 2011) C 238 *Literatura 1H 13C 13C 1 - 126,27 127,4 2 6,95(d, J = 7,5 Hz) 121,55 122,5 3 6,80(d, J = 8,5 Hz) 115,38 115,1 4 - 145,41 145,9 5 - 148,20 149,1 6 7,06 (s) 113,69 - 7 7,56(d, J = 16 Hz) 145,56 146,5 8 6,27 (d, J = 16 Hz) 113,40 116,4 9 - 168,40 167,9 10 3,77 (s) 50,61 51,5
*XIANG et al., 2010, Solvente: DMSO–d6 (600 MHz).
3.7714
4.9471
3.3333
3.9063
7.0557
7.5771
6.2930
6.8048
7.5449
6.2615
6.7885
6.9486
6.9643
3.8458
3.9221 6.8124
1.00 0.67 0.75 0.66 1.78
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 37. Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) da substância 238.
79
H-7 H-6 H-2 H-3 H-8
7.577 7.545 7.056 6.964 6.949 6.805 6.788 6.293 6.261
H H O
6 HO 1 CH3 7 9 5 8 O 10 2 4 H HO 3 H H
1.47 1.00 0.96 1.42 1.03
7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 38. Expansão do espectro de RMN H da (500 MHz, CD3OD) substância 238, entre δ 6,2 – 7,7 ppm.
168.376 148.189 145.560 145.415 126.268 121.552 115.080 113.694 113.405 50.612
168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 Chemical Shift (ppm)
Figura 39. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 238.
80
113.694 113.405 50.612 115.080 H H O
6 HO 1 CH3 7 9 5 8 O 10 2 4 H HO 3 H H
C-6 C-8
C10 C-3
115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 Chemical Shift (ppm)
Figura 40. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 238, entre δ 50,0 – 115,0 ppm.
H H O
168.376 148.189 145.560 145.415 126.268 6 121.552 HO 1 CH3 7 9 5 8 O 10 2 4 H HO 3 H H C-1 C-9 C-5 C-4
C-7
C-2
165 160 155 150 145 140 135 130 125 120 Chemical Shift (ppm)
Figura 41. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 238, entre δ 120,0 – 165,0 ppm. 81
-1.0
-0.5
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5 ppm 5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 ppm 1 1 Figura 42. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, CD3OD) da substância 238.
H-7 H-6 H-3 H-8 H-2
H-7/H-8 6.0
H-8
H-2/H-3 6.5
H-3 H-2 H-6 7.0
H-6/H-7
H-7 7.5 ppm
8.0
8.5
9.0
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
1 1 Figura 43. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, CD3OD) da substância 238, entre δ 6,0 a 9,0 ppm.
82
-8
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72 ppm 80
88
96
104
112
120
128
136
144
152
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 ppm
Figura 44. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CD3OD) da substância 238.
H-7 H-2 H-3 H-8
105
C-8 110
115 C-3 C-3/H-3 C-8/H-8
C-2 120
C-2/H-2
125 ppm 130
135
C-7 140
145 C-7/H-7 150
155
7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
Figura 45. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CD3OD) da substância
238, entre δH 6,0 – 7.5 ppm δC 105 – 155 ppm.
83
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 ppm
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 ppm
Figura 46. Espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, CD3OD) da substância 238.
H-7 H-6
105 C-8 C-8/H-7 110
C-2/H-7 C-2/H-6 115
120
C-2 125 130
135 C-4/H-6 C-4 140
145
150 ppm
155
160 C-9 165
C-9/H-7 170
175
180
185
190
195
7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
Figura 47. Expansão do espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, CD3OD) da substância
238, entre δH 6,0 – 7,5 ppm δC 105 – 195 ppm.
84
4.1.3. Identificação da substância 239
A substância 239 (Figura 48) foi isolada das folhas de Zanthoxylum riedelianum da fração acetato de etila, como sendo um sólido em formato de agulhas de coloração marrom. O espectro RMN 1H (Figura 50) apresentou sinais na região de hidrogênios aromáticos, um dubleto em 6,82 (J = 8,5 Hz), um duplo dubleto em 7,43 (J = 8,0 Hz e 3,72 Hz) e outro dubleto em 7,46 (J = 2,5 Hz), atribuídos, respectivamente, aos hidrogênios H- 5, H-6 e H-2 (Tabela 3). No espectro de DEPTQ (Figura 52) foram observados sinais que, em comparação com a literatura (SOUZA FILHO et al., 2006), caracterizaram essa substância que é derivada de um ácido benzóico conhecida como ácido protocatecuico.
HO HO HO O O O 1' 169,09 1 121,99 6 2 122,46 116,31 7,43 7,46
3 144,64 5 114,33 6,82 4 OH 150,04 OH OH OH OH OH
Figura 48. Estrutura proposta para o ácido protocatecuico (239).
1 13 Tabela 3. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 239 (CD3OD 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (SOUZA FILHO et al., 2006) C 239 *Literatura 1H 13C 13C 1 - 121,99 129,9 2 7,46 (d, J = 2,5 Hz) 116,31 117,8 3 - 144,64 146,0 4 - 150,04 151,4 5 6,82 (d, J = 8,5 Hz) 114,33 115,7 6 7,43 (dd, J = 8 Hz e 122,46 123,7 3,72 Hz) 1’ - 169,09 170,2
* SOUZA FILHO et al., 2006, Solvente: CDCl3 (300 MHz).
85
7.4592
3.3346
4.9748
6.8269
6.8105
3.3377
7.4409 0.0225
2.40 1.23 1.24
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 -0.5 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 49. Espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD). da substância 239.
H-2 H-5 H-6
7.457 7.452 7.445 7.441 7.429 7.425 6.814 6.797
HO O 1' H 1 H 6 2
5 3 H 4 OH OH
1.04 1.05
7.45 7.40 7.35 7.30 7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 Chemical Shift (ppm) l 1 Figura 50 Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, CD3OD) da substância 239, entre δ 6,80 – 7,45 ppm.
86
47.9616 47.7954 47.6221 47.4488 47.2826
47.1093
144.6423
48.1349
150.0447
121.9924
169.0978
48.0771
47.9760
47.4632
47.6365
47.8099
122.4619 116.3155 114.3366
168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 Chemical Shift (ppm)
Figura 51. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 239.
169.098 150.045 144.642 122.462 121.992 116.316 114.337 HO O 1' H 1 H 6 2
5 3 H 4 OH OH
C-3 C-4 C-1' C-1
C-6
C-5
C-2
175 170 165 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 Chemical Shift (ppm)
Figura 52. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CD3OD) da substância 239, entre δ 105 – 175 ppm 87
4.1.4. Identificação da substância 240
A substância 240 (Figura 53) foi isolada das folhas de Zanthoxylum riedelianum, da fração metanólica como sendo um precipitado branco amorfo. O espectro de RMN de 1H (Figuras 56 e 57) apresentou sinais na região de deslocamento químico de hidrogênios em anel aromático δ 6,70 a 7,73 compatíveis com a presença de vários sistemas aromáticos mono-substituídos: os sinais na região de δ 2,92 a 4,57 correspondem a hidrogênios metilênicos e metínicos. Os duplos dubletes em δ 2,92 (J=7,9 e J=13,55 Hz), δ 3,03 (J=6,95 e J=14,20), δ 4,06 (J=4,45 e J=11,35) e δ 4,57 (J=3,15 e J=11,35) podem ser considerados como representantes de dois grupos metilênicos com hidrogênios diastereotópicos. O espectro de correlação espacial homonuclear hidrogênio-hidrogênio (NOESY, Figura 65) evidenciou as correlações entre esses sinais em δ 2,92 (dd, 1H, H-3a) e δ 3,03 (dd, 1H, H-3b) e inclusive, verificar o acoplamento com os hidrogênios representado pelo multipleto em δ 4,65 (m, 1H, H-2) que acopla com os hidrogênios do dubleto do metileno centrado em δ 4,06 (H-1a) e 4,57 (H-1b). Com a análise dos espectros de HSQC (Figuras 62 e 63) foi possível estabelecer as correlações diretas dos carbonos metínicos e metilênicos que correspondia uma unidade na molécula: Unidade A: C-1 [δH/δC 4,06 e
4,57/65,40], C-2 [δH/δC 4,65/50,29], C-3 [δH/δC 2,92 e 3,03/37,26],C-5,9 [δH/δC
6,70/129,19], C-6,8 [δH/δC 7,42/128,72], C-7 [δH/δC 7,25/127,42], C-12,16 [δH/δC
7,68/127,13], C-13,15 [δH/δC 7,42/128,69], C-14 [δH/δC 7,48/132,06], correspondentes na unidade A grupos fenil e benzoil, além desses sinais ainda confirmou-se uma unidade
δC=O de amida C-10 (δ 167,22) como mostrado na (Figura 53). O outro sistema presente na molécula é o B, cujo grupo metileno em δ 37,53 (C-3’), contendo os hidrogênios δ 3,24 (dd, 6,65 e 13,55 Hz) e 3,32 (dd, 6,30 e 13,90 Hz) acomplam entre si e entre o H-2’ em δ 4,94 (d, 6,60 Hz), como visto no espectro de NOESY (Figura 65), ligado ao carbono metínico δ 54,48, cujo valor é compatível com carbono ligado a nitrogênio. Pela análise do HSQC (Figuras 62 e 63) e de acordo com os dados da literatura (CATALAN et al., 2003), foi possível atribuir os dados de todos os carbonos hidrogenados da unidade B: C-2’ [δH/δC 4,94/54,48], C-3’ [δH/δC 3,24 e 3,32
/37,26], C-5’,9’ [δH/δC 7,25/129,32], C-6’,8’ [δH/δC 7,42/128,90], C-7’ [δH/δC 7,25/126,83], C-
12’,16’ [δH/δC 7,73/127,06], C-13’,15’ [δH/δC 7,35/128,45], C-14’ [δH/δC 7,50/131,42] e outros que correspondiam a uma unidade de éster com C-1’ (δ 171,92), δC=O de amida em 167,44 (C-10’), que justifica a unidade benzamida em B (Figura 53). 88
16' O
10' O H 12' 5' N 10 3' 1' O NH 5 2' 9' O 1 2 3 O 9
A B Figura 53. Unidades formadas pelos grupos fenil e benzoil(A) e benzamida(B) que compõem a substância 240.
A Tabela 4 mostra todas as atribuições dos deslocamentos químicos da substância 240 com base nas correlações do HSQC e comparação com os dados da literatura (CATALAN et al., 2003) para a identificação do N-benzoilfenilalanilato de N- benzoilfenilalanina, isolado anteriormente de fungos como Aspergillus flavipes (CLARK et al., 1977), Penicillium canadense (McCORKINDALE et al., 1978) e de plantas Piper aurantiacatum (Piperaceae) (BANEJERI et al., 1981), Medicago polymorpha (Leguminosae) (TALAPATRA et al., 1983) e Piptadenia gonoacantha (CARVALHO et al., 2010). Com a análise de todos os dados espectrométricos, fundamentais para a elucidação estrutural da substância 240, conclui-se que sua estrutura é compatível com + fórmula molecular C33H34N2O4 com o aduto sódico m/z 529,2124 [M+Na ] obtido em massas de alta resolução (Figura 66).
13' 14' 13 14
12' 15' 12 15 11' 11 O 16' O 16 8' 10' 10 8 7' 9' NH NH 9 7
3' O 1 6 6' 4' 2' 1' 2 3 4 5' 5 H H O H H H H
Figura 54. Estrutura proposta para a molécula N-benzoilfenilalanilato de N- benzoilfenilalanina (240).
89
1 13 Tabela 4. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 240 (CDCl3 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (CATALAN et al., 2003) *Literatura
C δH (m, JHz) δC 1 4,06 (dd, 4,45 e 65,40 65,42 11,35) 4,57 (dd, 3,15 e 11,35) 2 4,65 (m) 50,29 50,28 3 2,92 (dd, 7,9 e 13,55) 37,26 37,26 3,03 (dd, 6,95 e 14,20) 4 - 137,16 137,74 5,9 6,70 (d, 8,2) 129,19 129,16 6,8 7,42 (t, 7,6) 128,72 128,71 7 7,25 (m) 127,42 127,17 10 - 167,22 167,21 11 - 134,19 134,20 12,16 7,68 (d, 7,90) 127,13 127,11 13,15 7,42 (t, 7,60) 128,69 128,61 14 7,48 (t, 7,85) 132,06 132,02 1’ - 171,92 171,90 2’ 4,94 (d, 6,60) 54,48 54,47 3’ 3,24 (dd, 6,65 e 37,53 37,56 13,55) 3,32 (dd, 6,30 e 13,90) 4’ - 135,74 135,14 5’,9’ 7,25 (m) 129,32 129,30 6’,8’ 7,42 (t, 7,6) 128,90 128,72 7’ 7,25 (m) 126,83 126,77 10’ - 167,44 167,42 11’ - 133,32 133,32
90
12’,16’ 7,73 (d, 7,85) 127,06 127,04 13’,15’ 7,35 (t, 7,55) 128,45 128,69 14’ 7,50 (t, 7,25) 131,42 131,39
*CATALAN et al., 2003, Solvente: CDCl3 (500 MHz)
7.2871 1.2764
7.3325
1.6099
7.2530
7.3426
7.4226
7.7183
7.6760
7.2398
7.7340
7.4378
7.5361
4.9490 4.9358
3.2463
3.3150 3.3024
6.5829
4.5657 3.2596
6.5956
4.0639
4.0728 2.9223
2.9381
6.6920 3.0207
4.0501
3.0068
0.9045
4.5884 4.5594
4.0412
6.7084
2.9110
2.8946
3.3428 3.3302
4.9622 4.9225
1.00 3.16 0.46 0.47 0.49 0.51 0.96 0.98
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shift (ppm)
1 Figura 55. Espectro de RMN H (500 MHz, CDCl3) da substância 240.
91
4.962 4.949 4.936 4.923 4.674 4.664 4.650 4.644 4.633 4.588 4.582 4.566 4.559 4.073 4.064 4.050 4.041 3.343 3.330 3.315 3.302 3.260 3.246 3.232 3.219 3.035 3.021 3.007 2.938 2.922 2.911
13' 14' 13 14
12' 15' 12 15 11' 11 O 16' O 16 8' 10' 10 8 7' 9' NH NH 9 7
3' O 1 6 6' 4' 2' 1' 2 3 4 5' 5 H H O H H H H
H-2' H-1a H-3'b H-3'a H-3b H-3a H-1b
H-2
0.49 0.50 0.51 0.52 1.00 1.03
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 56. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, CDCl3) da substância 240 entre δ 3,0 – 5,0 ppm.
14 7.2871 13' 14' 13
H13',15' 12' 15' 12 15 11' 11 H-7,7',5',9' 16' 16
7.3325 O O 8' 10' 10 8
7' 9' NH NH 9 7 7.2530
7.3186 3' O 1 6 7.3426 1' 2 3 4
H-6, 8, 6',8',13,15 6' 4' 2'
5' 5
H-12',16' H-12,16
H H O H H H H
7.4226
7.7183
7.6760
7.2398
7.7340
7.6918
7.2795
H-14
H-14'
7.3577 7.4378
7.2657 H-5,9
7.4630
7.5361
7.4069
6.5829
6.5956
7.5210
6.6920
6.7084 7.4775
1.00 0.97 0.51 1.67 3.16 2.35 0.46 0.43
7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 57. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, CDCl3) da substância 240, entre δ 6,6 – 7,8 ppm.
92
171.929 167.437 137.160 132.061 131.418 129.316 129.186 128.904 128.717 128.449 127.128 126.824 65.404 54.483 50.287 37.532 37.265
168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 Chemical Shift (ppm)
Figura 58. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CDCl3) da substância 240
129.316 129.186 128.904 128.717 128.695 128.449 127.417 127.128 127.063 126.824
129.316 129.186 128.904 128.717 128.449 127.128 65.404 54.483 50.287 37.532 37.265
C-3
C-7 C-7' C-1 C-3'
C-5',9' C-5,9 C-6',8' C-13',15' C-12,16 C-12',16' C--13,15 C-6,8
129.0 128.5 128.0 127.5 127.0 Chemical Shift (ppm)
13' 14' 13 14
12' 15' 12 15 C-2' 11' 11 O 16' O 16 8' 10' 10 8 C-2 7' 9' NH NH 9 7
3' O 1 6 6' 4' 2' 1' 2 3 4 5' 5 H H O H H H H
128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 Chemical Shift (ppm)
Figura 59. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CDCl3) da substância 240, entre δ 40,0 – 128,0 ppm.
93
13' 14' 13 14
171.929 167.437 167.220 137.160 135.744 134.191 132.061 12' 131.418 15' 12 15 11' 11 O 16' O 16 8' 10' 10 8 7' 9' NH NH 9 7
3' O 1 6 6' 4' 2' 1' 2 3 4 5' 5 H H O H H H H
C-4 C-4' C-11 C-1' C-10' C-10
C-14
170 165 160 155 150 145 140 135 Chemical Shift (ppm)
Figura 60. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, CDCl3) da substância 240, entre δ 135,0 – 170,0 ppm.
-8
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72 ppm 80
88
96
104
112
120
128
136
144
152
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
Figura 61. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CDCl3) da substância 240.
94
H-2 H-1b H-1a H-3' H-3
20
25
C-3/H-3 30 C-3 35
C-3' 40 C-3'/H-3'
45 ppm
C-2 50 C-2/H-2 55
60 C-1
65
C-1/H-1b C-1/H-1a 70 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
Figura 62. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CDCl3) da substância
240, entre H 1,0 – 5,0 ppm C 20,0 – 70,0 ppm.
H-12, 16
H-14'
H-13', 15'
H-12',16' H-14
124 C-12',16'/H-12',16' C-12,16/H-12,16 C-13',15'/H-13',15' 125
126
C-12',16' 127
C-12,16 128
C-13',15' 129
130
C-14' 131 ppm C-14 132
133 C-14'/H-14' C-14/H-14 134
135
136
137
138
8.0 7.5 7.0 6.5 ppm
Figura 63. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, CDCl3) da substância 240.
95
-0.5
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0 ppm
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
Figura 64. Espectro de RMN NOESY (500 MHz, CDCl3) da substância 240.
H-2'
H-1b
H-3'b
H-3'a H-3a
H-3b
H-1a H-2
H-3a/H-3b 2.5 H-3a H-2/H-3a H-3b H-3'a 3.0 H-3'b 3.5 H-2'/H-3'a H-1a 4.0
H-1b H-2 4.5 H-2'
5.0 ppm H-1a/H-1b H-2'/H-3'a 5.5
H-2'/H-3'b 6.0
6.5
7.0
7.5
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm
Figura 65. Expansão do espectro de RMN NOESY (500 MHz, CDCl3) da substância 240 entre 2,5 – 7,5 ppm.
96
Figura 66. Espectro de massas de alta resolução da substância 240 obtido através de ionização por eletrospray (EM-ESI) em modo positivo.
Na O O
NH NH O
H H O H H H H
C H N O 33 34 2 4 O m/z 529,2124 [M Na ] NH + H OH O H O H NH O O m/z 270 NH NH O H m/z 238 H H O Esquema 7. Proposta de fragmentação dos picos do espectro de massas da substância 240.
4.2. Substâncias isoladas das cascas do caule de Zanthoxylum rigidum
As estruturas das substâncias isoladas das cascas do caule de Zanthoxylum rigidum são mostradas na figura 67. 97
COOH
HO
Ácido ursólico (241)
OH OH H N
O HO N-trans-cafeoiltiramin a (242)
Figura 67. Substâncias isoladas das cascas do caule Zanthoxylum rigidum.
4.2.1. Identificação da substância 241
A substância 241 (Figura 68) foi isolada do extrato hidroetanólico da casca do caule de Zanthoxylum rigidum como sendo um sólido branco amorfo.
O espectro de RMN de 1H (Figura 70) mostrou sinais que podem ser atribuídos as sete metilas alifáticas com deslocamentos químicos em 0,89, 0,95, 0,87, 1,01, 1,22 e
1,24. O sinal em 3,85, correspondente ao hidrogênio H-3, apareceu como um multipleto, sugerindo sua posição axial em relação ao grupo hidroxílico. Também foi observado nesse espectro, um singleto largo em 5,49, referente ao hidrogênio olefínico H-12 e um dubleto em 2,64 com J =1,65 Hz e J = 12,0 Hz resultado do acoplamento entre os hidrogênios H-18 e H-19, característico de triterpenóides pentacíclicos com esqueleto do tipo urs-12-eno. Outra característica importante de triterpenos pertencentes à classe dos 98
ursanos é o sinal do carbono sp2 quaternário em 138,10 (C-13). Este carbono recebe uma maior proteção devido ao efeito exercido pela metila ligada ao C-19, visto nos espectros de RMN de 13C (Figura 73), podemos observar esse mesmo efeito em relação ao mesmo carbono na estrutura do ácido oleanólico (SOBRINHO et al., 1991). Também foi detectada a presença do carbono olefínico em 124,50 (C-12), carbinólico em 76,98
(C-3) e carboxílico em 178,71 (C-28). Os demais sinais são de carbonos sp3 quaternários, metínicos, metilênicos e metílicos. Estes dados foram comparados com os descritos na literatura (KRIWACKI& PITNER, 1989) (Tabela 5) e estão de acordo com a estrutura proposta para o ácido ursólico (ácido-3--hidroxi-urs-12-en-28-óico). Este triterpeno, muito comum em plantas, está sendo registrado pela primeira vez na espécie Zanthoxylum rigidum.
30
29 20 19 21 12 22 18 11 17 25 26 13 COOH 1 14 16 28 2 9 10 8 15 27 3 4 5 7 HO 6 24 23 Figura 68. Estrutura proposta para o ácido ursólico (241).
1 13 Tabela 5. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 241 (C5D5N 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (KRIWACKI & PITNER, 1989) 241 *Literatura C 1H 13C 13C 1 37,93 39,1 2 27,53 28,1 3 3,85 (m) 76,98 78,1 4 38,20 39,5 5 54,67 55,8 6 18,00 18,8
99
7 32,42 33,6 8 38,33 40,0 9 46,90 48,1 10 36,28 37,3 11 22,75 23,6 12 5,49 (m) 124,50 125,7 13 138,10 139,3 14 41,35 42,5 15 28,80 28,7 16 23,76 24,9 17 46,90 48,1 18 2,64 (dd, 1,65 e 11,79) 52,40 53,6 19 38,81 39,5 20 38,20 39,4 21 29,91 31,1 22 36,12 37,5 23 1,24 (s) 27,63 28,8 24 1,01 (s) 15,39 16,5 25 0,87 (s) 16,30 15,7 26 1,05 (s) 16,34 17,5 27 1,22 (s) 22,74 23,9 28 178,71 179,8 29 0,95 (s) 17,60 17,5 30 0,89 (s) 20,22 21,4
* KRIWACKI & PITNER, 1989, Solvente: CD3OD (500 MHz)
100
8.7073 7.1956 4.9710
7.5625
1.2970
3.5920
1.0207
1.2412
1.3199
0.8907
1.9897
3.8400
3.8629
1.1113
1.9669
1.9458 1.3858
5.4908
0.8715
3.8162
3.8867
2.6166
2.6559 2.6504
1.00 1.68 0.63 4.05 15.64
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 69. Espectro de RMN H (500 MHz, C5D5N) da substância 241.
5.491 4.971 3.887 3.863 3.840 3.816 3.592 2.658 2.650 1.990 1.967 1.946 1.386 1.320 1.297 1.241 1.227 1.111 1.055 1.012 0.959 0.891 0.872
H-12 H-3 H-18
H-23
H-24
H-27
H-29
H-25 H-30
30 29
20 19 21 12 22 18 11 17 25 26 13 COOH 1 14 16 28 2 9 10 8 15 27 3 4 5 7 HO 6
24 23
1.15 1.71 0.33 4.03 16.09
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 70. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, C5D5N) da substância 241, entre δ 0,5 – 5,5 ppm. 101
178.713 138.102 124.489 76.988 54.671 52.403 46.894 41.347 38.820 38.327 38.205 37.932 36.126 27.635 22.741 20.222 16.337 15.388
220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 Chemical Shift (ppm) 13 Figura 71. Espectro de RMN C (125 MHz, C5D5N) da substância 241.
37.932 36.278 36.126 32.423 29.912 28.796 27.635 23.758 22.741 20.222 18.006 17.619 16.337 16.299 15.388
C-24
C-22 C-27 C-25 C-10 C-15 C-30 C-23 C-29 C-1 C-7 C-21 C-16 C-6 C-26
36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 Chemical Shift (ppm) 13 Figura 72. Expansão do espectro de RMN C (125 MHz, C5H5N) da substância 241, entre δ 16 – 36 ppm.
102
178.713 138.102 124.489 76.988 54.671 52.403 46.894 41.347 38.327 38.205
Solvente
Solvente C-8
C-17 C-20 C-3 C-5
C-18 C-12 C-14 C-13 C-28
176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 Chemical Shift (ppm) 13 Figura 73. Expansão do espectro de RMN C (125 MHz, C5H5N) da substância 241, entre δ 40 – 176 ppm.
4.2.2. Identificação da substância 242
A substância 242 (Figura 76) foi isolada do extrato hidroetanólico da casca do caule de Zanthoxylum rigidum como sendo um sólido branco amorfo.
O espectro de RMN 1H (Figuras 78 e 79, Tabela 6) apresentou δ 8,00 relativo à N-H, dois dubletos em δ 6,35 (J = 15,65Hz, H-2) e δ 7,42 (J = 15,65 Hz, H-3) de hidrogênios olefínicos cuja constante de acoplamento define a relação trans, sinais relativos a hidrogênios em dois anéis aromáticos de hidrogênios aromáticos sendo dois dubletos em δ 6,74 (J = 7,95Hz, H-7’) e em δ 7,05 (J = 7,95 Hz, H-8’), integrados para 2H cada um, indicando a presença de um anel para substituído, com um sistema de hidrogênios AA’BB’; e três sinais de hidrogênios aromáticos em δ 6,78 (d, J = 8,1 Hz, H-8), δ 6,92 (d, J = 8,1 Hz, H-9) e δ 7,03 (s, H-5) sugerindo um anel aromático trissubistituído em sistema 103
AMX; e, ainda dois tripletos (J = 8,0 Hz) em δ 2,77 ( H-2’) e δ 3,48 (H-1’), relativos a hidrogênios metilênicos vicinais num sistema isolado. O espectro de COSY 1Hx1H (Figuras 89 e 90) confirmou os acoplamentos entre os dois hidrogênios em δ 7,05 com os hidrogênios em δ 6,74 que garantiram o anel para- substituído, os quais foram atribuídos a H-4’/H-8’ e H-5’/H-7’, respectivamente. O anel trissubstituído foi definido através dos acoplamentos entre os hidrogênios em δ 6,78 (H-8) e 6,92 (H-9) em orto, e o acoplamento entre os hidrogênios δ 6,35 (H-2) e 7,42 (H-3) que indicou a presença do sistema -insaturado. Pela análise do espectro de HSQC (Figuras 83 e 84) puderam ser estabelecidas as correlações diretas dos carbonos metínicos: C-2 [6,35/116,93], C-3 [7,42/140,83], C-5 [7,03/113,67], C-8 [6,78/114,88], C-9 [6,92/120,77], C-4’, 8’ [7,05/129,37] e C-5’,7’ [6,74/114,88] e metilênicos: C-1’ [3,48/41,19] e C-2’ [2,77/34,41]. O espectro de HMBC (Figuras 86 e 87) permitiu que se definissem os carbonos quaternários e, que a unidade derivada do ácido caféico da substância 242 fosse atribuída corretamente. Pelo espectro de HMBC (Figura 85) puderam ser estabelecidas as correlações entre os hidrogênios.
HMBC
δ 114, 88 (C-7’)
δ 114,88 (C-5’)
Figura 74. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para os sinais de hidrogênios em δ 7,05 (H-4’) e δ 7,05 (H-8’).
HMBC
δ 7,42 δ 113,67 e δ 120,77
δ 7,03 δ 140,83 e δ 120,77
δ 6,92 δ 113,67 e δ 140,83
Figura 75. Correlações apresentadas no experimento de HMBC para os sinais de hidrogênios δ 7,42 (H-3), δ 7,03 (H-5) e δ 6,92 (H-9). 104
Portanto, através da análise dos dados espectroscópicos a amida fenólica foi identificada como sendo N-trans-cafeoiltiramina. Esta substância já havia sido detectada anteriormente em Solanum subg. Leptostemonum (Silva et al., 2004). A atribuição de todos os dados de carbonos metínicos, metílicos e quaternários e a respectiva comparação com os dados existentes na literatura (TAWEEL et al., 2012), está apresentada na Tabela 6.
OH OH H 6 5 7 8 3' N 1 9 8' 2' 2 4 7' 1' 3 6' 4' 5' O HO
OH 145,31 OH 113,67 H 147,37 129,37 34,41 116,98 126,90 N167,91 114,88 114,88 129,92 41,19 140,83 120,77
155,49 129,37 O HO 114,88 OH 8,00 OH H 7,03 7,05 2,77 6,35 N 6,78 6,74 3,48 7,4 6,92
7,05 O HO 6,74
Figura 76. Estrutura proposta para a substância 242.
105
1 13 Tabela 6. Dados dos espectros de RMN H e C da substância 242 (DMSO – d6 500 e 125 MHz) comparados com dados da literatura (TAWEEL et al., 2012) C 242 *Literatura 1H 13C HMBC 13C 1 - 167,91 - 169,0 2 6,35 d J = 15,65Hz 116,98 - 118,5 3 7,42 d J = 15,65 140,83 H-5 e H-9 141,6 Hz 4 - 126,90 - 127,1 5 7, 03 s 113,67 H-3 e H-9 114,5 6 - 145,31 - 147,7 7 - 147,37 - 148,5 8 6,78 d J = 8,1 Hz 114,88 H-9 116,3 9 6,92 d J = 8,1 Hz 120,77 H-3 e H-5 122,1 1’ 3,48 t J= 7,0 Hz 41,19 - 42,4 2’ 2,77 t J= 8,0 Hz 34,41 - 35,7 3’ - 129,92 - 131,0 4’ 7,05 d J = 7,95 Hz 129,37 H-5’ e H-7’ 130,7 5’ 6,74 d J = 7,95 Hz 114,88 - 116,4 6’ - 155,49 - 156,7 7’ 6,74 d J = 7,95 Hz 114, 88 - 116,4 8’ 7,05 d J = 7,95 Hz 129,37 H-5’ e H-7’ 130,7 N-H 8,00 s - -
*TAWEEL et al., 2012, Solvente: CDCl3 (500 MHz)
106
8.102 7.392 7.070 7.054 7.025 6.905 6.794 6.778 6.747 6.732 6.377 3.468 3.454 3.333 2.774 2.758
2.12 0.93 2.06 2.05
16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 77. Espectro de RMN H (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242.
3.482 3.468 3.454 2.774 2.758 2.745
H-1' H-2' OH 6 OH 5 H 7 8' 3' N 1 8 7' 2' 2 4 1' 3 9 O 6' 4' HO 5'
2.06 0.72 2.05
3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 78. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 2,6 a 3,5 ppm .
107
7.423 7.392 7.070 7.054 7.025 6.921 6.905 6.794 6.778 6.747 6.732 6.377 6.345
H-4' H-5
H-5' OH 6 OH 5 H 7 8' 3' N 1 8 7' 2' 2 4 1' 3 9 O 6' 4' H-8 HO 5' H-2 H-3 H-9
1.96 4.27 1.97 2.05 4.24 1.79
7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 79. Expansão do espectro de RMN H (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 6,2 a 7,6 ppm.
167.899 155.483 147.358 145.307 140.822 129.923 129.374 126.897 120.772 116.980 114.878 113.665 41.187 34.412
168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 Chemical Shift (ppm)
Figura 80. Espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO – d6) da substância 242.
108
155.483 147.358 145.307 140.822 129.923 129.374 126.897 120.772 116.980 114.878 113.665 41.187 34.412 167.899 C-2'
C-1' OH 6 OH 5 H 7 8' 3' N 1 8 7' 2' 2 4 1' 3 9 O 6' 4' HO 5' C-6' C-4 C-1 C-3' C-7 C-5'/C-7'/C-8 C-6
C-2 C-4'/C-8' C-9
C-3
C-5
168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 Chemical Shift (ppm)
Figura 81. Expansão do espectro de RMN DEPTQ (125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 32 – 168 ppm.
-8
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72 ppm 80
88
96
104
112
120
128
136
144
152
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 ppm
Figura 82. Espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242.
109
H-1' H-2'
20
22
24
26
28
30
32
C-2' 34
36
C-2'/H-2' 38 C-1' 40 42
44 ppm C-1'/H-1' 46
48
50
52
54
56
58
60
62
64
66
3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 ppm
Figura 83. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, δH 2,2 – 3,7 δC 20,0 – 66,0 ppm.
110
H-3 H-9 H-2
100
105
C-2/H-2 110
115 C-2
C-9 120
C-9/H-9
125 ppm
130
135
C-3 140
C-3/H-3 145
150
7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
Figura 84. Expansão do espectro de RMN HSQC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δH 6,0 – 7,5 δC 100,0 – 150,0 ppm.
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 ppm
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 ppm
Figura 85. Espectro de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242. 111
H-1' H-2'
16
24
C-2' 32
40
C-2'/H1' 48
56
64
72
80
88
96 ppm 104
112
120
128
C-3' 136 C-3'/H-1' C-3'/H-2' 144
152
160 C-1 168
C-1/H-1' 176
3.5 3.0 2.5 ppm
Figura 86. Expansão do experimento de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δH 2,5 – 3,5 ppm δC 16 - 176.
H-5 H-8 H-2 H-3 H-9
24
32
40
48
56
64
72
80
88
C-5/H-3 C-4/H-8 96 C-9/H-5 C-5/H-9
104 ppm
C-5 112
C-9 120
C-4 C-9/H-3 128 C-4/H-2 C-3 C-4/H-3 136 144 C-3/H-5 152 C-3/H-9 160 C-1 168
176 C-1/H-3 C-1/H-2 184
7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
Figura 87. Expansão do experimento de RMN HMBC (500/125 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δH 5,5 – 8,0 ppm δC 22 – 184 ppm. 112
-1.0
-0.5
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0 ppm
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 ppm 1 1 Figura 88. Espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242.
H-2' H-1'
2.5
2.6
2.7 H-2'
2.8
H-1'/H-2' 2.9
3.0
3.1 ppm
3.2
3.3
3.4 H-1' 3.5
3.6
H-2'/H-1' 3.7
3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 ppm 1 1 Figura 89. Expansão do espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 2,5 – 3,7 ppm.
113
H-5' H-4'H-5 H-8 H-2 H-3 H-9
6.1
H-2/H-3 6.2
6.3 H-2 H-8/H-9 6.4
6.5
H-4'/H-5' 6.6
H-5' 6.7
H-8 6.8 H-9 6.9 ppm
H-5 7.0
7.1 H-4' 7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.5 7.0 6.5 6.0 ppm 1 1 Figura 90. Expansão do espectro de RMN COSY [ Hx H] (500 MHz, DMSO – d6) da substância 242, entre δ 6,1 – 8,0 ppm.
114
5. CONCLUSÃO
O estudo fitoquímico das folhas de Zanthoxylum riedelianum (Rutaceae) resultou no isolamento e identificação do derivado do ácido cinâmico 3,4-dihidroxi-cinamato de metila, do derivado do ácido benzóico, ácido protocatecuico, do ester N-benzoilfenilalanilato de N-benzoilfenilalanina. Todas essas substâncias acima são relatadas pela primeira vez na espécie, além de um octapeptídeo, que foi nomeado ciclozanthoxylano B, que é pela primeira vez relatado na literatura.
O estudo fitoquímico das cascas do caule de Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) levou ao isolamento e identificação da amida α,β-insaturada N-trans-cafeoiltiramina e do triterpeno ácido-3-β-hidroxi-urs-12-en-28-óico. Todas essas substâncias acima são relatadas pela primeira vez na espécie.
115
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ARRIETA, J.; REYES, B.; CALZADA, F.; RIVERA, R. C.; NAVARRETE, A. “Amoebicidal and giardicidal compounds from the leaves of Zanthoxylum liebmannianun”. Fitoterapia, v. 72, p. 295-297, 2001.
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