Maria Camila Hurtado Torres
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¿PROTEGEN LOS ALCALOIDES A LAS RANAS VENENOSAS DE LA INFECCIÓN POR EL HONGO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS? MARIA CAMILA HURTADO TORRES UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS DE COLOMBIA LICENCIATURA EN BIOLOGÍA FACULTAD DE CIENCIA Y EDUCACIÓN BOGOTÁ, COLOMBIA 2016 1 ¿PROTEGEN LOS ALCALOIDES A LAS RANAS VENENOSAS DE LA INFECCIÓN POR EL HONGO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS? MARIA CAMILA HURTADO TORRES Código: 20091140032 Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Licenciado en biología Director externo: ADOLFO AMÉZQUITA TORRES. Ph.D Director interno: LUIS FRANCISCO BECERRA.Msc UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS DE COLOMBIA LICENCIATURA EN BIOLOGÍA FACULTAD DE CIENCIA Y EDUCACIÓN BOGOTÁ, COLOMBIA 2016 2 INDICE 1. RESUMEN…………………………………………………………………............ 6 2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………… 6 3. PROBLEMA…………………………………………………………………......... 8 4. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………….... 9 5. OBJETIVOS………………………………………………………………………10 6. MARCO TEÓRICO…………………………………………………………….. 10 6.1 Disminución en la población de anfibios…………………………………….10 6.2 Quitridiomicosis y el hongo Batrachochytrium dendrobatidis …………….10 6.3 Ciclo de vida de Batrachochytrium dendrobatidis……………………….. 12 6.4 Distribución de Batrachochytrium dendrobatidis …………………………. 12 6.5 Cepa Colombiana EVOO1………………………………………………….. 13 6.6 Mecanismos de defensa de los anfibios frente a Batrachochytrium dendrobatidis ………………………………………………………………… 14 6.7 Superfamilia Dendrobatoidea (Cope, 1985)……………………………….. 15 6.7.1 Familia Dendrobatidae……………………………………………….. 15 6.7.1.1 Dendrobates truncatus …………………………………………….. 17 6.7.1.2 Oophaga histrionica………………………………………………... 18 6.7.2 Familia Aromobatidae………………………………………………… 18 6.7.2.1 Rheobates palmatus………………………………………………. 18 6.8 Mucosoma…………………………………………………………………… 20 7. METODOLOGÍA………………………………………………………………...20 7.1 Área de estudio……………………………………………………………… 20 7.2 Captura de los especímenes………………………………………………… 22 7.3 Preparación de las pieles…………………………………………………… 22 7.4 Liofilización…………………………………………………………………. 22 7.5 Reactivación de la cepa EV001 y Conteo de zoosporas…………………… 22 7.6 Montaje en microplacas…………………………………………………….. 23 8. RESULTADOS…………………………………………………………………... 23 9. DISCUSIÓN……………………………………………………………………... 25 3 10. CONCLUSIONES……………………………………………………………….. 28 11. RECOMENDACIONES………………………………………………………… 29 12. REFERENCIAS………………………………………………………………..... 30 13. ANEXOS…………………………………………………………………………..31 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Diferenciación de algunos de los tipos de alcaloides presentes en las ranas de la familia Dendrobatidae y Aromobatidae (Summers et al. 2001)……………………. 8 Figura 2: Zoosporas y esporangios encontrados en la rana Litoria caerulea. Foto de Berger et al 1999……………………………………………………………………… 11 Figura 3: Corte histológico del dedo del pie de un adulto de la rana Litoria caerulea. En ella se pueden observar los esporangios (flechas) y las zoosporas (Z). Tinción con Hematoxilina y eosina. E = epidermis, K = queratina. Foto de Berger et al 1999……. 11 Figura 4: Discos orales de Limnodynastes dumerilii afectados por Bd……………… 11 Figura 5: Ciclo de vida del hongo Batrachochytrium dendrobatidis. En esta imagen puede observarse la fase móvil y el enquistamiento………………………………….. 12 Figura 6: Distribución mundial del hongo Batrachochytrium dendrobatidis en el año 2013. Imagen tomada de Olson, 2013. El color rojo refleja presencia de Bd en la localidad, el blanco lugares sin presencia de Bd y el azul desconocimiento en la presencia o ausencia del quitridio………………………………………………………………… 13 Figura 7: Fotografía electrónica de las zoosporas de la cepa colombiana EV001. Tomada por Flechas, et al 2013…………………………………………………………………. 15 Figura 8: Ranitomeya perteneciente a la familia Dendrobatidae……………………… 16 Figura 9: -Rheobates palmatus perteneciente a Aromobatidae……………………………………………………………………… 16 Figura 10: Distribución de la familia Dendrobatidae. Como se puede observar en la imagen, esta presenta una distribución en América……………………………………. 17 Figura 11: Ejemplos de cuidado parental en ranas de la familia Dendrobatidae. De izq a der: Dendrobates pumilio y Epipedobates trivittatus…………………………………. 17 Figura 12: Individuo característico Oophaga histriónica…………………………….. 19 Figura 13: Individuos característico Dendrobates truncatus…………………………. 19 Figura 14: Distribución de la familia Aromobatidae. Se puede observar su amplia distribución en Colombia, principalmente en la cordillera central y occidental……….19 Figura 15: Rheobates palmatus realizando cuidado parental…………………………..19 4 Figura 16: Distribución de cada una de las localidades de colecta para la realización del estudio. Las especies son, de arriba abajo, O. histrionica, R. palmatus y D. truncatus…21 Figura 17: Zoosporangios de Batrachochytrium dendrobatidis en fase de esporulación…………………………………………………………………………… 23 Figura 18: Absorbancia neta (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto. Donde bdm (Batrachochytrium dendrobatidis muerto) bdv (Batrachochytrium dendrobatidis vivo) hist (Oophaga histriónica) palm ( Rheobates palmatus) y trun ( Dendrobates truncatus)……………. 26 Figura 19: Variación de las concentraciones (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto………………. 28 ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1: Relación peso piel vs absorbancia relativa de cada uno de los tratamientos evaluados en el experimento……………………………………………………………25 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Características ambientales de cada uno de los sitios de colecta…………… 21 Tabla 2: Resultados de la regresión lineal de la relación peso piel vs absorbancia relativa para cada una de las especies de cada uno de los tratamientos evaluados en el experimento…………………………………………………………………………… 24 5 1. RESUMEN El rápido declive de poblaciones de anfibios alrededor del mundo es un hecho ampliamente aceptado en la comunidad científica. Muchos de estos declives poblacionales son causados por una enfermedad denominada quitridiomicosis, la cual es el resultado de una infección cutánea producida por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). En el presente trabajo determinamos el papel que tiene el mucosoma (anticuerpos de la mucosa, los péptidos antimicrobianos, los alcaloides y los metabolitos) de algunas especies de las familias Dendrobatidae y Aromabatidae sobre el hongo Bd. Se eligieron estas familias porque se ha comprobado que en ocasiones son capaces de convivir con el hongo sin ninguna afectación. Se utilizaron cuatro individuos de las siguientes especies: Rheobates palmatus, Dendrobates truncatus y Oophaga histrionica y se realizó una preparación de sus mucosomas por medio de una extracción y liofilización de las pieles. Paralelamente se reactivó la cepa del hongo patógeno EV001 y con las zoosporas se hizo un inóculo. Se llevó a cabo el montaje en placas de microtitulación de 96 pozos, la cual se incubo a 23°C y se evaluó a las 24, 48, 72 y 96 horas en un lector de microplacas; lo anterior permitió estimar el nivel de crecimiento del Bd. Se analizaron los valores de densidad óptica de un total de 42 muestras en las que se encontró que el mucosoma es una posible fuente de nutrientes para Bd, ya que en la mayoría de los casos este creció un 40% más respecto al medio de cultivo de Triptona al 1% con zoosporas. De las tres especies se encontró que el extracto de R. palmatus aceleró en mayor medida el crecimiento de Bd frente a los de D. truncatus y O. histrionica. Además de esto se determinó que no existe una relación directa entre el peso de la piel del individuo y el grado de afectación que puede llegar a causar el mucosoma sobre el quitridio. 2. INTRODUCCION Los anfibios han sufrido las extinciones más notables entre todos los vertebrados (Wake & Vredenburg 2008) siendo una de las causas, la quitridiomicosis causada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), considerada la más preocupante (Bosch & Gutiérrez 2003). Este hongo pertenece al Phylum Chytridiomycota, Clase Chytridiomycetes, Orden Rhizophydiales (Hibbett et al, 2007). Presenta un ciclo de vida en dos fases: una móvil para disperción (zoosporas en ambiente acuático) y otra no móvil (enquistamiento y formación de zoosporangio o esporangio en el hospedero). Como característica importante de su biología presenta esporangios (zoosporangios) sin opérculos y zoosporas con flagelos (Berger et al. 2005). En el caso particular de los anfibios la infección por este patógeno produce la hiperqueratinización o engrosamiento del estrato córneo de la piel, que sobrepasa los 2-5 mm habituales, llegando a 60 mm (Bosch & Gutiérrez 2003). Otros cambios incluyen hiperplasia multifocal irregular, perturbación en las capas de células epidérmicas, espongiosis (edema en la epidermis), erosiones y ulceraciones ocasionales en la piel (Berger et al. 2005). La sintomatología de los animales enfermos es muy variable entre individuos y entre especies, pero en general se produce inapetencia, decoloración de la piel, excesiva mucosidad, posturas anormales, ausencia de comportamiento de huída y comportamientos atípicos (por ejemplo los animales permanecen al sol sin buscar refugio). Sólo en algunas ocasiones hay síntomas 6 evidentes como úlceras y erosión en la piel (Berger & Kent 1999). Autores como Voyles et al. en el 2009 y Fites et al. en el 2013 proponen dos posibles mecanismos de acción de Bd: (1) cambios fisiopatológicos en la rana debido a la inhibición en el transporte de electrolitos, reducción de un 20% y 50% en las concentraciones de sodio y potasio en