Maria Camila Hurtado Torres

¿PROTEGEN LOS ALCALOIDES A LAS RANAS VENENOSAS DE LA INFECCIÓN POR EL HONGO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS?

MARIA CAMILA HURTADO TORRES

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS DE COLOMBIA LICENCIATURA EN BIOLOGÍA FACULTAD DE CIENCIA Y EDUCACIÓN BOGOTÁ, COLOMBIA 2016

¿PROTEGEN LOS ALCALOIDES A LAS RANAS VENENOSAS DE LA INFECCIÓN POR EL HONGO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS?

MARIA CAMILA HURTADO TORRES Código: 20091140032

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Licenciado en biología

Director externo: ADOLFO AMÉZQUITA TORRES. Ph.D Director interno: LUIS FRANCISCO BECERRA.Msc

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS DE COLOMBIA LICENCIATURA EN BIOLOGÍA FACULTAD DE CIENCIA Y EDUCACIÓN BOGOTÁ, COLOMBIA 2016

INDICE

1. RESUMEN…………………………………………………………………...... 6

2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………… 6

3. PROBLEMA…………………………………………………………………...... 8

4. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………….... 9

5. OBJETIVOS………………………………………………………………………10

6. MARCO TEÓRICO…………………………………………………………….. 10

6.1 Disminución en la población de anfibios…………………………………….10 6.2 Quitridiomicosis y el hongo Batrachochytrium dendrobatidis …………….10 6.3 Ciclo de vida de Batrachochytrium dendrobatidis……………………….. 12 6.4 Distribución de Batrachochytrium dendrobatidis …………………………. 12 6.5 Cepa Colombiana EVOO1………………………………………………….. 13 6.6 Mecanismos de defensa de los anfibios frente a Batrachochytrium dendrobatidis ………………………………………………………………… 14 6.7 Superfamilia Dendrobatoidea (Cope, 1985)……………………………….. 15 6.7.1 Familia Dendrobatidae……………………………………………….. 15 6.7.1.1 Dendrobates truncatus …………………………………………….. 17 6.7.1.2 Oophaga histrionica………………………………………………... 18 6.7.2 Familia Aromobatidae………………………………………………… 18 6.7.2.1 Rheobates palmatus………………………………………………. 18

6.8 Mucosoma…………………………………………………………………… 20

7. METODOLOGÍA………………………………………………………………...20

7.1 Área de estudio……………………………………………………………… 20

7.2 Captura de los especímenes………………………………………………… 22

7.3 Preparación de las pieles…………………………………………………… 22

7.4 Liofilización…………………………………………………………………. 22

7.5 Reactivación de la cepa EV001 y Conteo de zoosporas…………………… 22

7.6 Montaje en microplacas…………………………………………………….. 23

8. RESULTADOS…………………………………………………………………... 23

9. DISCUSIÓN……………………………………………………………………... 25

10. CONCLUSIONES……………………………………………………………….. 28

11. RECOMENDACIONES………………………………………………………… 29

12. REFERENCIAS………………………………………………………………..... 30

13. ANEXOS…………………………………………………………………………..31

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Diferenciación de algunos de los tipos de alcaloides presentes en las ranas de la familia Dendrobatidae y Aromobatidae (Summers et al. 2001)……………………. 8 Figura 2: Zoosporas y esporangios encontrados en la rana Litoria caerulea. Foto de Berger et al 1999……………………………………………………………………… 11 Figura 3: Corte histológico del dedo del pie de un adulto de la rana Litoria caerulea. En ella se pueden observar los esporangios (flechas) y las zoosporas (Z). Tinción con Hematoxilina y eosina. E = epidermis, K = queratina. Foto de Berger et al 1999……. 11 Figura 4: Discos orales de Limnodynastes dumerilii afectados por Bd……………… 11 Figura 5: Ciclo de vida del hongo Batrachochytrium dendrobatidis. En esta imagen puede observarse la fase móvil y el enquistamiento………………………………….. 12 Figura 6: Distribución mundial del hongo Batrachochytrium dendrobatidis en el año 2013. Imagen tomada de Olson, 2013. El color rojo refleja presencia de Bd en la localidad, el blanco lugares sin presencia de Bd y el azul desconocimiento en la presencia o ausencia del quitridio………………………………………………………………… 13 Figura 7: Fotografía electrónica de las zoosporas de la cepa colombiana EV001. Tomada por Flechas, et al 2013…………………………………………………………………. 15 Figura 8: Ranitomeya perteneciente a la familia Dendrobatidae……………………… 16 Figura 9: -Rheobates palmatus perteneciente a Aromobatidae……………………………………………………………………… 16 Figura 10: Distribución de la familia Dendrobatidae. Como se puede observar en la imagen, esta presenta una distribución en América……………………………………. 17 Figura 11: Ejemplos de cuidado parental en ranas de la familia Dendrobatidae. De izq a der: Dendrobates pumilio y Epipedobates trivittatus…………………………………. 17 Figura 12: Individuo característico Oophaga histriónica…………………………….. 19 Figura 13: Individuos característico Dendrobates truncatus…………………………. 19 Figura 14: Distribución de la familia Aromobatidae. Se puede observar su amplia distribución en Colombia, principalmente en la cordillera central y occidental……….19 Figura 15: Rheobates palmatus realizando cuidado parental…………………………..19

Figura 16: Distribución de cada una de las localidades de colecta para la realización del estudio. Las especies son, de arriba abajo, O. histrionica, R. palmatus y D. truncatus…21 Figura 17: Zoosporangios de Batrachochytrium dendrobatidis en fase de esporulación…………………………………………………………………………… 23 Figura 18: Absorbancia neta (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto. Donde bdm (Batrachochytrium dendrobatidis muerto) bdv (Batrachochytrium dendrobatidis vivo) hist (Oophaga histriónica) palm ( Rheobates palmatus) y trun ( Dendrobates truncatus)……………. 26 Figura 19: Variación de las concentraciones (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto………………. 28

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Relación peso piel vs absorbancia relativa de cada uno de los tratamientos evaluados en el experimento……………………………………………………………25

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Características ambientales de cada uno de los sitios de colecta…………… 21 Tabla 2: Resultados de la regresión lineal de la relación peso piel vs absorbancia relativa para cada una de las especies de cada uno de los tratamientos evaluados en el experimento…………………………………………………………………………… 24

1. RESUMEN

El rápido declive de poblaciones de anfibios alrededor del mundo es un hecho ampliamente aceptado en la comunidad científica. Muchos de estos declives poblacionales son causados por una enfermedad denominada quitridiomicosis, la cual es el resultado de una infección cutánea producida por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). En el presente trabajo determinamos el papel que tiene el mucosoma (anticuerpos de la mucosa, los péptidos antimicrobianos, los alcaloides y los metabolitos) de algunas especies de las familias Dendrobatidae y Aromabatidae sobre el hongo Bd. Se eligieron estas familias porque se ha comprobado que en ocasiones son capaces de convivir con el hongo sin ninguna afectación. Se utilizaron cuatro individuos de las siguientes especies: Rheobates palmatus, Dendrobates truncatus y Oophaga histrionica y se realizó una preparación de sus mucosomas por medio de una extracción y liofilización de las pieles. Paralelamente se reactivó la cepa del hongo patógeno EV001 y con las zoosporas se hizo un inóculo. Se llevó a cabo el montaje en placas de microtitulación de 96 pozos, la cual se incubo a 23°C y se evaluó a las 24, 48, 72 y 96 horas en un lector de microplacas; lo anterior permitió estimar el nivel de crecimiento del Bd. Se analizaron los valores de densidad óptica de un total de 42 muestras en las que se encontró que el mucosoma es una posible fuente de nutrientes para Bd, ya que en la mayoría de los casos este creció un 40% más respecto al medio de cultivo de Triptona al 1% con zoosporas. De las tres especies se encontró que el extracto de R. palmatus aceleró en mayor medida el crecimiento de Bd frente a los de D. truncatus y O. histrionica. Además de esto se determinó que no existe una relación directa entre el peso de la piel del individuo y el grado de afectación que puede llegar a causar el mucosoma sobre el quitridio.

2. INTRODUCCION Los anfibios han sufrido las extinciones más notables entre todos los vertebrados (Wake & Vredenburg 2008) siendo una de las causas, la quitridiomicosis causada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), considerada la más preocupante (Bosch & Gutiérrez 2003). Este hongo pertenece al Phylum Chytridiomycota, Clase Chytridiomycetes, Orden Rhizophydiales (Hibbett et al, 2007). Presenta un ciclo de vida en dos fases: una móvil para disperción (zoosporas en ambiente acuático) y otra no móvil (enquistamiento y formación de zoosporangio o esporangio en el hospedero). Como característica importante de su biología presenta esporangios (zoosporangios) sin opérculos y zoosporas con flagelos (Berger et al. 2005).

En el caso particular de los anfibios la infección por este patógeno produce la hiperqueratinización o engrosamiento del estrato córneo de la piel, que sobrepasa los 2-5 mm habituales, llegando a 60 mm (Bosch & Gutiérrez 2003). Otros cambios incluyen hiperplasia multifocal irregular, perturbación en las capas de células epidérmicas, espongiosis (edema en la epidermis), erosiones y ulceraciones ocasionales en la piel (Berger et al. 2005). La sintomatología de los animales enfermos es muy variable entre individuos y entre especies, pero en general se produce inapetencia, decoloración de la piel, excesiva mucosidad, posturas anormales, ausencia de comportamiento de huída y comportamientos atípicos (por ejemplo los animales permanecen al sol sin buscar refugio). Sólo en algunas ocasiones hay síntomas

6 evidentes como úlceras y erosión en la piel (Berger & Kent 1999). Autores como Voyles et al. en el 2009 y Fites et al. en el 2013 proponen dos posibles mecanismos de acción de Bd: (1) cambios fisiopatológicos en la rana debido a la inhibición en el transporte de electrolitos, reducción de un 20% y 50% en las concentraciones de sodio y potasio en plasma, respectivamente, ocasionando así un paro cardiaco; y (2) Deterioro de los linfocitos de la rana que causan una apoptosis celular inducida.

El hongo quitridio se ha expandido a múltiples regiones del planeta, predominando especialmente en los hábitats que tienen las faunas de anfibios más diversas del mundo (Ron, 2005). Colombia, al considerarse como un punto de gran diversidad de herpetofauna, se ha visto afectada por la proliferación de este quitridiomicete; desde hace un tiempo se han presentado algunos registros en los bosques pre-montanos (Rueda-Almonacid 1999), en la cordillera oriental (Vásquez, 2011; Bahamón, 2012; Acosta et al. 2006), en la cordillera occidental (Velázquez et al 2008), en la Región Andina Oriental (Quintero, 2008), en la cordillera central (Urbina et al. 2011), en la región pacífica (Palacios, 2014) y en Gorgona, una isla de la costa pacífica (Flechas et al. 2012) en donde se ha constatado la presencia de Bd por medio de técnicas histológicas y de PCR. La gran proliferación en nuestro país se debe a que nos encontramos en una zona climática donde la temperatura y humedad son aptas para la propagación del mismo lo que genera una mayor vulnerabilidad de infección para los anfibios. Inicialmente, en nuestro país, la quitridiomicosis se relacionó con los sapitos de río del género Atelopus (Familia Bufonidae) (De sa. 2005; Rueda-Almonacid et al. 2008) pero poco a poco se ha revelado que afecta a una gran cantidad de familias incluyendo Hylidae, Centrolenidae, Leptodactylidae.

Los dendrobátidos son ranas de pequeño y mediano tamaño distribuidas en la zona tropical de América central y del sur (Ford et al. 1993). La familia incluye especies tanto aposemáticas como crípticas. Son de hábitos diurnos y prefieren lugares donde predomine la hojarasca y la presencia de bromelias. Algunos géneros (principalmente Dendrobates, Phyllobates, y Epipedobates) son de colores brillantes y poseen alcaloides tóxicos de tipo lipófilos en la piel (Daly et al. 1999). La fuente de estos alcaloides es probablemente la dieta, consistente de artrópodos como hormigas, termitas y ácaros (Daly et al. 2002; Santos et al. 2003). Otros géneros (por ejemplo, Colostethus, Mannophryne y Nephelobates) son crípticos y poco tóxicos, careciendo así de alcaloides lipófilos (Santos et al. 2003) (Fig. 1).

Figura 1: Diferenciación de algunos de los tipos de alcaloides presentes en las ranas de la familia Dendrobatidae y Aromobatidae (Summers et al. 2001)

Palacios et al. en el 2014 reporta la infección de algunas poblaciones de O. histrionica, las cuales presentan bajas concentraciones de zoosporas; esto nos lleva a suponer que por lo menos algunas de las ranas de esta familia pueden llegar a tener algún tipo de resistencia hacia el patógeno. Hasta el momento no existen estudios que expliquen el por qué estas ranas venenosas se verían menos afectadas por este quitridiomicota, por lo cual no se tiene una idea clara del mecanismo que les permite portar el patógeno sin sucumbir ante él. Teniendo en cuenta la presencia de toxinas compuestas por alcaloides, proponemos una interacción entre éstos, los factores inmunes y la actividad microbiana. Los alcaloides poseen la propiedad de obstruir los canales de membrana e impedir el paso de solutos, por lo que podría existir una relación con la viabilidad del hongo patógeno. Es por ello que nuestro objetivo principal será determinar el papel que tiene el mucosoma de algunas ranas de las familias Dendrobatidae y Aromabatidae sobre el hongo Batrachochytrium dendrobatidis. Para ello utilizaremos tres tipos ranas, una tóxica (Oophaga histrionica), una medianamente tóxica (Dendrobates truncatus) y otra no tóxica (Rheobates palmatus). Este diseño permitiría además establecer la posible importancia de la toxicidad de los alcaloides como medio de protección.

Este estudio pionero espera proveer respuestas acerca de la posible incidencia positiva que pueden llegar a tener los alcaloides para la protección y conservación de las ranas venenosas contra este y otros patógenos, además de abrir el camino a nuevas investigaciones sobre el uso de alcaloides como posible tratamiento contra el quitridio.

3. PROBLEMA A partir de la década de los años 80´s se ha podido observar un fenómeno de disminución de anfibios a gran escala debido a la introducción y rápida expansión de enfermedades (Bosch et al. 2003). Un claro ejemplo es la quitridiomicosis que ha conllevado a mortalidades masivas, declinaciones poblacionales y extinciones. El Bd es reconocido por su capacidad de propagarse rápidamente por muchas poblaciones de anfibios, llegando a identificarse en todos los continentes (Olson et al 2013).

Por todo lo anterior resulta indispensable continuar realizando estudios que permitan explicar aspectos relacionados con el manejo de Bd, tales como la reproducción del patógeno, su fisiología, su adaptación, su rápida expansión y ante todo los posibles mecanismos de defensa que puedan proporcionar aquellos grupos de anfibios que no se han visto masivamente afectados. En diversos estudios (Woodhams et al. 2007; Rollins-Smith et al. 2003) se ha encontrado que los péptidos presentes en la piel de algunas especies de anfibios son capaces de inhibir el crecimiento de Bd. Es por ello que se quiere comprobar si el mucosoma, compuesto por los anticuerpos de la mucosa, los péptidos antimicrobianos, los alcaloides y los metabolitos, es capaz de contrarrestar y combatir la infección causada por esta enfermedad considerada como una pandemia mundial (OMS, 2011). Es posible que todo este complejo sistema pueda proporcionar interesantes respuestas y aportar a la generación de posibles mecanismos de defensa.

4. JUSTIFICACIÓN Los anfibios son organismos importantes en la mayoría de ecosistemas debido a su importancia ecológica. Los adultos regulan la población de plagas, mientras que los renacuajos pueden ser presas de especies acuáticas, ser consumidores de algas y bioindicadores (Blaustein et al.1994; Hitzak et al. 1998). Desde 1988, con el caso del sapo de Monteverde (Crump, 1992, Pounds et al. 1994), se han comenzado a reportar alarmantes disminuciones en las poblaciones a nivel mundial, no solo en zonas que han sido intervenidas por el hombre sino en lugares lejanos y áreas destinadas para la conservación, razón por la cual la comunidad científica ha desarrollado estrategias como programas de monitoreo, modelos estadísticos e investigaciones experimentales que permitan establecer el origen de este declive. A partir de esto se han encontrado que las principales causas de extinción de anfibios son: la fragmentación de su hábitat para la explotación minera, ganadera, usos agropecuarios y cultivos ilícitos, la introducción de especies exóticas, el comercio ilegal, la radiación ultravioleta, el cambio climático y la aparición de enfermedades emergentes, principalmente la quitridiomicosis (Lips et al. 2000; Rueda-Almonacid et al. 1999; Mittermeier et al 1992; Andre et al 1988; Blaustein et al 1994) La quitridiomicosis es reconocida como una enfermedad de declaración obligatoria (Organización Mundial de Sanidad Animal 2011), la cual es el resultado de una infección cutánea producida por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis. Este patógeno se caracteriza por ser generalista, debido a que afecta a numerosas familias de anfibios, en las cuales puede ocasionar decesos repentinos, como en el género Atelopus (La Marca et al. 2005; De Sa, 2005); o pueden llegar a ser portadoras asintomáticas, como en el caso de la rana toro (Lithobates catesbeiana) (Daszak et al. 2004. En varios estudios realizados en Colombia (Acosta et al. 2006; Ruiz & Rueda-Almonacid 2008; Velásquez et al. 2008; Quintero 2008; Urbina & Galeano 2011) se monitoreó la presencia de Bd en diferentes puntos del país; en los resultados encontraron que las poblaciones de los dendrobátidos no habían evidenciado disminuciones, por lo que este estudio se centró en la detección y explicación de la importancia que puede llegar a tener el mucosoma para contrarrestar o combatir esta enfermedad.

5. OBJETIVOS

5.1 Determinar el papel que tiene el mucosoma de algunas ranas de las familias Dendrobatidae y Aromabatidae sobre el hongo Batrachochytrium dendrobatidis

5.2 Identificar si este papel dpende además del nivel de toxicidad de la especie de rana

5.3 Como covariable, comprobar si existe una relación entre el peso de cada rana y el efecto del mucosoma sobre el crecimiento de Batrachochytrium dendrobatidis

6. MARCO TEÓRICO

6.1 Disminución en la población de anfibios

A partir de los años 80´s la clase anfibia se ha visto fuertemente afectada por diversas problemáticas como la deforestación, la minería, el cambio de pH del medio, la introducción de especies invasoras o las interacciones entre estos factores (Lips et al. 2000; Mittermeier et al 1992; Rueda-Almonacid et al. 1999; Andre et al 1988; Blaustein et al 1994; Alfrod et al. 1999). Esto ha llevado a una abrupta disminución de poblaciones a nivel mundial, siendo la herpetofauna tropical la que se más afectada se ve. En el caso de los anuros, se ha presentado una situación aún más preocupante, pues debido a su alta sensibilidad a los cambios externos de su hábitat han disminuido sus poblaciones, llegando a encontrarse fuertemente desplazados por factores como la disminución de la capa de ozono, lluvias ácidas, polución o enfermedades emergentes (Coloma & Lombeida, 1992). Esta última causa se empezó a considerar como una de las principales razones, debido a estudios realizados por Crump, 1992 y Pounds et al. 1994 en las selvas de Costa Rica y Panamá, respectivamente, y por Berger et al. 1998 en Australia. Ellos demostraron una importante disminución de especies debido a lo se conocería como una pandemia en la década de los 90’s y principios de los años 2000, la quitridiomicosis, enfermedad ocasionada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis.

6.2 Quitridiomicosis y el hongo Batrachochytrium dendrobatidis La quitridiomicosis es la enfermedad causada por el patógeno Batrachochytrium dendrobatidis. Pertenece al Phylum Chytridiomycota, Clase Chytridiomycetes, Orden Rhizophydiales (Hibbett et al, 2007). (Figura 2). Esta enfermedad fue descrita por primera vez en el año de 1998, a partir de análisis histológicos realizados a un grupo de anfibios enfermos encontrados en Australia y Panamá entre los años 1993 y 1998 (Berger et al., 1998; Longore et al., 1999). Entre los principales daños que se encontraron fueron engrosamiento de la epidermis (especialmente en el estrato córneo y granular, Figura 3) , así como malformaciones en la región oral en renacuajos (Figura 4-5)

Figura 2: Zoosporas y esporangios encontrados en la rana Litoria caerulea. Foto de Berger et al 1999.

Figura 3: Corte histológico del dedo del pie de un adulto de la rana Litoria caerulea. En ella se pueden observar los esporangios (flechas) y las zoosporas (Z). Tinción con Hematoxilina y eosina. E = epidermis, K = queratina. Foto de Berger et al 1999.

Figuras 4. Discos orales de Limnodynastes dumerilii afectados por Bd. Foto de OIE 2011.

6.3 Ciclo de vida de Batrachochytrium dendrobatidis

Batrachochytrium dendrobatidis tiene dos fases: una de zoosporas en dispersión (fase acuática-móvil) y otra de formación de quiste sésiles o inmóviles que dan origen a zoosporangios también conocidos como esporangios. La etapa infecciosa es cuando las zoosporas presentan movimiento en busca de hospedero. Cuando la zoospora se establece en el hospedero, el flagelo se reabsorbe, formando el quiste, el cual posteriormente da lugar a la formación de rizoides y el crecimiento del talo, que madura dentro de un período de 4-5 días; posteriormente, las zoosporas que se forman por la división mitótica son liberadas de los esporangios cuando las condiciones de temperatura y humedad son apropiadas, y el ciclo comienza de nuevo (Berger et al., 2005, Hernández et al 2014) (Figura 5).

Figura 5: Ciclo de vida del hongo Batrachochytrium dendrobatidis. En esta imagen puede observarse la fase móvil y el enquistamiento. Foto tomada de olson 2013.

6.4 Distribución de Batrachochytrium dendrobatidis

En la actualidad el hongo Batrachochytrium dendrobatidis es reconocido como una patógeno mundial, debido a su amplia expansión en todos los continentes (Organización Mundial de Sanidad Animal, 2011). Su rápida propagación se puede deber a dos razones, la primera o “hipótesis del patógeno incipiente” es que el hongo ha sido diseminado tanto por especies invasoras como por el desplazamiento humano en zonas NO contaminadas (Fisher et al. 2007); su origen se habría dado en África inicialmente con algunas ranas del género Xenopus, las cuales al ser utilizadas para pruebas de embarazo fueron altamente comercializadas, pero rápidamente olvidadas, por lo que fueron liberadas masivamente (Rachowicz et al., 2005). La segunda hipótesis de “patógeno endémico” relata que éste siempre ha estado latente en los ecosistemas, pero que debido al cambio climático y al desplazamiento por factores como la deforestación, se ha incrementado en el rango de huéspedes o de patogenicidad, mejorando su adaptación, volviéndose más generalista e incluso variando su genoma (Rachowicz et al., 2005; Rosenblum et al. 2013).

Figura 6: Distribución mundial del hongo Batrachochytrium dendrobatidis en el año 2013. Imagen tomada de Olson, 2013. El color rojo refleja presencia de Bd en la localidad, el blanco lugares sin presencia de Bd y el azul desconocimiento en la presencia o ausencia del quitridio.

Como puede observarse en la figura 6, este patógeno se ha extendido principalmente por el sur de África, el este de Asia y en Norteamérica. Esto puede deberse a que la estabilidad climática de estas zonas favorece el establecimiento de Bd; además de esto también es importante tener en cuenta que son zonas que han sido muy estudiadas, por lo que es posible que exista un mayor conocimiento en su distribución (Olson, 2013). En otras zonas como Suramérica, también existen reportes pero en menor escala, debido tal vez a la poca atención que anteriormente se prestaba.

En el caso particular de Colombia, existen reportes como los de Flechas et. al., en el 2012, el cual registra la presencia de Bd en tierras bajas, específicamente en la isla de Gorgona; Ruiz A y Rueda-Almonacid (2008) examinan en museos desde 1968 hasta 2006 muestras de individuos a partir de métodos histológicos para conocer el estado de la enfermedad en nuestro país; Velásquez, et. al. (2008) describe la incidencia de Bd en los individuos de la cordillera occidental Colombiana. Vásquez et al. en el 2012, en contraste, describe la presencia de la enfermedad en la cordillera oriental, haciendo énfasis en la relación de temperatura, altitud y humedad con el patógeno. Además de esto, un estudio aún más actual realizado en el departamento del Chocó y Valle del Cauca (Palacios, 2014), muestra la

13 presencia de este patógeno en poblaciones de Oophaga histrionica, las cuales, al parecer pueden convivir con este hongo sin ningún tipo de disminución en sus poblaciones.

6.5 Cepa Colombiana EVOO1

En el 2013 Flechas y colaboradores realizaron un estudio en la cordillera de los Andes en Colombia considerado como hotspot o un punto de alta diversidad mundial. En este estudio lograron aislar una nueva cepa, la cual sería la primera reconocida para nuestro pais. La denominaron EV001 (Figura 7 ). Esta cepa de Bd fue aislada de un juvenil de la especie Rheobates palmatus (Werner, 1899).

Despues de comparar con las cepas que ya estaban secuenciadas se determinó que hace parte del ‘Global Panzootic lineage Bd-GPL’, ya que comparte muchas similitudes genéticas; también se encontró que EV001 está cercanamente relacionada con la cepa panameña JEL 423, lo que puede ser posible gracias a su cercanía geográfica.

Figura 7: Fotografía electrónica de las zoosporas de la cepa colombiana EV001. Tomada por Flechas, et al 2013.

6.6 Mecanismos de defensa de los anfibios frente a Batrachochytrium dendrobatidis

En la última década se han realizado múltiples trabajos para establecer posibles mecanismos que contribuyen a contrarrestar este patógeno. Entre los principales estudios podemos encontrar los de Woodhams et al (2007), en el cual se corrobora que los péptidos son defensas adecuadas para contrarrestar la infección de Bd. Rollins-Smith, et al (2005) encuentran que los péptidos caerin 1,9, 1,1 maculatin, y caerin 1,1 son sumamente efectivos

14 para lograr inhibir al patógeno; Flechas et al (2012b) demuestran que existen algunas bacterias en la piel de los Atelopus capaces de inhibir el crecimiento de Bd; Reid et al. (2006) determinan que la interacción de bacterias de los género Arthrobacter, Bacillus, Kitasatospora, Paenibacillus, Pedobacter, Pseudomonas y Streptomyces favorece la protección contra el quitridio. Becker, et al. (2012), Harris et al. (2009), Lam et al. (2009) reconocen la importancia de Janthinobacterium lividum para contrarrestar la enfermedad. Gammill y colaboradores (2012) describen la efectividad de los péptidos antimicrobianos contenidos en las glándulas granulares de Xenopus laevis; Woodhams y colaboradores, en el 2012, realizan una investigación con Litoria genimaculata y establecen la acción antimicrobiana que posee este anfibio al ser expuesto frente al hongo. Además de esto, podemos encontrar otros estudios realizados por Lauer, el primero en el 2007 , en el que hablan acerca de esta relación simbiótica con otro tipo de anfibios, las salamandras, de la especie Plethodon cinereus, aislando su microflora e identificando bacterias del género Chryseobacterium, Pseudomonas, Lysobacter y Bacillus. Posteriormente en el 2008, se comparó la microbiota proveniente de la piel de las salamandras Hemidactylium scutatum a partir de métodos moleculares, encontrando 48 especies de bacterias con efecto anti fúngico, siendo las más representativas Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens, Flavobacterium sp. y Janthinobacterium lividum.

6.7 Superfamilia Dendrobatoidea (Cope, 1985)

Los individuos presentes en la superfamilia Dendrobatoidea se caracterizan por presentar un pliegue metatarsiano, la inserción del tendón en el musculo semitendinoso, el transporte de renacuajos en el dorso, el primer dedo más grande que el segundo y la presencia de escudetes dérmicos en los discos digitales (Grant et al 2006; Barrio et al 1999). Ésta a su vez contiene dos familias, Dendrobatidae y Aromobatidae. (Fig. 8-9). La primera se caracteriza por presentar aposematismo y presencia de alcaloides, mientras que la segunda es generalmente críptica. Ambas, con excepción de una especie, son diurnas.

Figuras 8-9: Ranitomeya , perteneciente a la familia Dendrobatidae y Rheobates palmatus perteneciente a Aromobatidae. Tomadas de www.arkive.org

6.7.1 Familia Dendrobatidae

Esta familia se compone de ranas de pequeño y mediano tamaño que se identifican por presentar un proceso retroarticular y la conformación del músculo depresor de la mandíbula (Ford & Cannatella1993). Son endémicas de la zona central y del sur de América, extendiéndose desde Nicaragua hasta Bolivia y el Atlántico, incluyendo bosques de Brasil y la costa del Pacífico (Fig. 10). Habitan en casi todos los ecosistemas presentes en el trópico, excepto zonas áridas y nevados (Grant et al 2006). Todas las especies excepto una (Aromobates nocturnus) son diurnas; ponen huevos terrestres, ya sea en el suelo o en algunas plantas, y muchos se caracterizan por elaborar comportamientos reproductivos como el transporte de los renacuajos en el dorso de los padres (Fig. 11). Su época reproductiva se da principalmente en periodos de lluvia, aunque existen algunas especies que pueden llegar a reproducirse independientemente de la estación (Aichinger 1987, 1992). Presentan un amplexo cefálico, el cual se presume que se desarrolló de manera aislada en comparación con otras ranas (Ford, 1989).

Figura 10: Distribución de la familia Dendrobatidae. Como se puede observar en la imagen, esta presenta una distribución en América. Tomada de Cortázares, 2011.

Figura 11: Ejemplos de cuidado parental en ranas de la familia Dendrobatidae. De izq a der: Dendrobates pumilio y Epipedobates trivittatus. Tomado de http://es.mongabay.com/travel/suriname/p24009p.html

Uno de los aspectos que más llama la atención de esta familia es la diversidad de coloraciones, ya que son tanto aposemáticas como crípticas. Algunos géneros (principalmente Dendrobates, Phyllobates, Oophaga y Epipedobates) son de colores brillantes y poseen alcaloides tóxicos de tipo lipófilos en la piel (Daly et al, 1999), y su fuente es probablemente algunos artrópodos como hormigas, termitas y ácaros (Daly et al 2002, Santos et al 2003). Mientras que otros géneros (por ejemplo, Colostethus, Mannophryne y Nephelobates) son crípticos y poco tóxicos, careciendo asi de alcaloides lipófilos (Santos et al 2003) En el caso de este estudio, se utilizaron ejemplares de los géneros Dendrobates (D. truncatus) y Oophaga (O. histrionica); los cuales serán descritos brevemente a continuación.

6.7.1.1 Dendrobates truncatus

Estas ranas son las más pequeñas de su género (Dendrobates), llegan a medir 30 mm de longitud en promedio; siendo los machos algo más pequeños que las hembras (Cope, 1861; Caldwell, 1996) (Fig. 12). Pueden presentar una cloración negra con líneas amarillas en el dorso o franjas dorsolateralmente de color blanco o crema; la zona abdominal tiene manchas blancas. Habitan principalmente entre la hojarasca y cerca de los cursos de agua de los bosques húmedos y secos de la región tropical (Ossa et al, 2012). Presentan una amplia distribución, yendo desde el Tolima hasta la costa Caribe; y en tierras bajas al norte de las Cordilleras Central y Occidental al oeste del golfo de Urabá (Ossa et al, 2012). Se alimentan de pequeñas moscas, arañas, ciempiés, mosquitos, pero principalmente de hormigas, de las cuales adquieren su toxicidad (Darst et al 2005). Entre los alcaloides presentes en la piel de estos individuos esta la histrionicotoxina, decahidroquinolinas, indozilinas, entre otras (Celis, 2005). Entre las principales amenazas para esta especie esta la deforestación, el cambio climático y la caza por parte de los humanos para su comercialización.

6.7.1.2 Oophaga histrionica

También conocidas como ranas Cocoi o arlequines (por su gran diversidad de coloraciones) son individuos pertenecientes al género Oophaga, el cual se caracteriza por consumir en su etapa larval, huevos infértiles proporcionados por la madre (Zamora et al 1999). Además de esto, llaman mucho la atención debido a su gran gama de coloraciones, que va desde un tono brillante a opaco, pasando por tonalidades naranjas, amarillas, rojas, blancas, y azules; es por ello que suelen ser el mejor ejemplo de aposematismo (Fig. 13) . El patrón en forma de banda sobre su cuerpo también varía de espesor. Habitan principalmente en el suelo de bosques tropicales entre ramas caídas, las hojas de plantas y la hojarasca en el suelo del bosque. Se distribuyen en zonas bajas (0-1000 msnm) de Antioquia, Chocó y parte del Valle del Cauca (Rueda-Almonacid et al 2004).

Oophaga histrionica se alimenta de pequeños invertebrados, principalmente hormigas, termitas, pequeños escarabajos y otros artrópodos que se encuentran en la hojarasca (Amézquita et al. 2013). Se ha estudiado que a partir de sus presas adquieren los alcaloides que las caracterizan, en especial la histrionicotoxina (Daly et al 2005), la cual causa bloqueos en los canales de sodio ocasionando así alteraciones neuromusculares. Poseen una relativa baja toxicidad, pero pueden resultar incomodos a sus depredadores debido a su sabor amargo y al bloqueo de canales inotrópicos (Celis, 2005). Entre sus principales amenazas se encuentra la deforestación y el caza por parte del hombre para venta, debido a su coloración.

6.7.2 Familia Aromobatidae

También conocidas como ranas nodrizas, son parientes cercanos a la familia Dendrobatidae, los cuales al realizar estudios moleculares se separaron de esta familia (Grant et al 2006). Son individuos con coloraciones crípticas, de pequeños tamaños y diurnos. Habitan principalmente ecosistemas asociados a bosques secos o húmedos en Colombia, encontrándose con mayor diversidad en las tierras bajas. Se distribuyen en América Central y del Sur y las Antillas Menores, concentrándose en las laderas orientales de los Andes, en la región amazónica, y en la selva atlántica de Brasil (Grant et al 2006) (Fig.14). Dentro de esta familia podemos encontrar cuatro géneros principales: Allobates, Anomaloglosus, Rheobates y Aromobates. Al igual que sus parientes cercanos, se alimentan principalmente de pequeños insectos como hormigas, termitas, arañas, etc. También realizan cuidado parental, transportando sus renacuajos en el dorso.

6.7.2.1 Rheobates palmatus (Werner, 1989)

Es una especie perteneciente al género Rheobates, el cual presenta principalmente coloraciones crípticas y un tamaño mediano (Fig. 15). Sus larvas se desarrollan en los arroyos. Habitan principalmente en los suelos de los bosques de niebla y en la selva tropical, llegando a ser considerada como una especie resistente, debido a su adaptabilidad en áreas perturbadas y contaminadas (Ramírez-Pinilla et al 2010). Es una especie endémica de Colombia, y se distribuye desde el flanco oriental de la Cordillera Central en los departamentos de Caldas y Tolima, y desde los flancos occidental y oriental de la Cordillera Oriental de los departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Santander, Meta y Serranía de la Macarena. Se ha registrado desde el nivel del mar, hasta los 2.500 m.

Figuras 12 y 13: De izquierda a derecha Individuos característicos de Dendrobates truncatus. Complejo de coloración presente en la especie Oophaga histrionica. Tomados correspondienteme de http://travisandlaurie.blogspot.com/2011/05/baltimore-day-1-part-2- national-aquarium.html ; http://www.faunaexotica.net/threads/oophaga-histrionica.78144/

Figura 14: Distribución de la familia Aromobatidae. Se puede observar su amplia distribución en Colombia, principalmente en la cordillera central y occidental. Tomada de http://data.sibcolombia.net/species/28889

Figura 15: Rheobates palmatus realizando cuidado parental. Tomada por Camila Hurtado.

6.8 Mucosoma

En el 2014 Woodhams y colaboradores expusieron por primera vez el concepto de mucosoma y lo definieron como “la integración de los factores inmunes del huésped y la comunidad microbiana” donde intervienen compuestos como los anticuerpos de la mucosa, los péptidos antimicrobianos, los alcaloides y los metabolitos de cada individuo. Según estos autores puede existir una variabilidad en cuanto a la abundancia o ausencia de cualquiera de estos compuestos, los cuales están determinados por factores como la historia de vida, el hábitat y las amenazas que pueda llegar a tener el individuo. Entre las principales funciones de este complejo sistema encontramos la comunicación intra e interespecífica, la defensa contra depredadores y patógenos.

7. METODOLOGIA 7.1 Área de estudio La toma de muestras se realizó en tres localidades: Ubaqué (Cundinamarca), Melgar (Tolima), y Cantón de San Pablo (Choco) (Tabla 1, Fig.16). Éstas fueron seleccionadas debido la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en dos de ellas (Ubaque y Melgar) y a la facilidad de acceso (Palacios, 2014; Flechas et al 2013).

Ubaque se encuentra ubicado en el departamento de Cundinamarca, donde se colectaron los individuos poco tóxicos, pertenecientes al género Rheobates. Presenta una temperatura promedio de 18 °C. Es típicamente montañosa, destacándose como principales accidentes orográficos los cerros de Guayacundo y el Güinto. En su aspecto hidrográfico cuenta con su propia fuente hídrica llamada Río Palmar, que nace (Páramo de Cruz Verde) y muere (Río Negro) en límites con el vecino Municipio de Fómeque (Alcaldía de Cundinamarca, 2011). Este municipio se caracteriza por su gran diversidad de climas, resaltando ecosistemas como los páramos y bosques altoandinos, que albergan gran cantidad de especies.

La segunda localidad, fue el municipio de Melgar, ubicado en el departamento del Tolima, en donde se colectaron los especímenes de Dendrobates truncatus, que a su vez son medianamente tóxicos (Daly 1978). Este sitio presenta alta temperatura y posee ecosistemas como los bosques secos tropicales.

Y finalmente se seleccionó el Cantón de San Pablo, ubicado en el departamento del Chocó, para la colecta de Oophaga histrionica. Este municipio presenta precipitaciones frecuentes, un promedio de temperatura media anual de 20,5ºC, con una máxima de 28,7ºC y una mínima

20 promedio anual de 16ºC; tiene aproximadamente tres cuartas partes de su área todavía cubierta de bosque tropical (Rangel 2004; Eslava 2004).

Tabla no 1: Características ambientales de cada uno de los sitios de colecta

Departamentos Municipios Coordenadas Zonas de Altitud Especie geográficas vida m.s.n.m recolectada Cundinamarca Ubaque 4º26’12” N, Bosque 1920 Rheobates 73º55’10” O altoandino palmatus Tolima Melgar 4°12′14″N Bosque 323 Dendrobates 74°38′34″O seco palmatus tropical Chocó Cantón de 05°30′37″N Bosque 264 Oophaga San Pablo 76°52′42″O húmedo histriónica tropical

Figura 16: Distribución de cada una de las localidades de colecta para la realización del estudio. Las especies son, de arriba abajo, O. histrionica, R. palmatus y D. truncatus.

7.2 Captura de los especímenes

Los especímenes fueron capturados entre junio-agosto del 2013 por medio del método de relevo por encuentro visuales (REV) descrito por Angulo et al. (2006). Los individuos se manipularon utilizando guantes de nitrilo para cada especie con el fin de evitar contaminación cruzada (Hyatt et al. 2007). Luego cada individuo fue puesto en una bolsa con extracto vegetal, humedecida previamente, para evitar la muerte del mismo por disminución de la respiración cutánea.

7.3 Preparación de las pieles

Las ranas se sacrificaron usando una inyección con 0.1 mL de metanol al 97%; luego se cortó y se desprendió la piel de los individuos para minimizar la contaminación o la pérdida de mucosoma. Cada muestra de piel se almacenó en una frasco de plástico que contenía 1.5 mL de metanol al 100% y fue llevada al laboratorio para los ensayos (Arenas 2010). Luego se pesó cada una para poder realizar una comparación entre la relación peso piel vs crecimiento Bd. Cortamos cada piel en trozos pequeños y los licuamos con una PRO® 200 homogeneizador (Pro Scientific Inc.), usando el mismo metanol en el que fueron primero almacenado (Hernández et al 2012).

7.4 Liofilización

La liofilización es una técnica de deshidratación o sublimación en frio, que se realiza para secar una muestra sin necesidad de calor. En el caso de nuestro estudio se llevaron cada uno de los extractos a liofilizar en frascos especiales que soportan grandes presiones durante 24 horas (Mori et al 2009); posteriormente lo que quedó fue resuspendido en 0.1ml de agua destilada. Cabe anotar que antes de iniciar este proceso las muestras fueron congeladas a -80° durante 3 días.

7.5 Reactivación de la cepa EV001 y Conteo de zoosporas

Con el fin de determinar el papel que tiene el mucosoma en el crecimiento del Bd se reactivó la cepa colombiana del hongo, siguiendo el protocolo de Boyle y colaboradores del 2003. Se le realizaron pases en diferentes tipos de medios: THGlac (Triptona, Agar bacteriológico, Gelatina hidrolizada, agua destilada y Lactosa); THG (Triptona, Agar bacteriológico, Gelatina hidrolizada, agua destilada) y TGH a la mitad de la concentración. Todo esto para corroborar en cuál de estos proliferaban más las zoosporas (Fig. 17). Se pudo observar que en la mayoría de los casos Batrachochytrium dendrobatidis creció más con el medio de TGH lac, ya que este le suministraba mas nutrientes por contener una proporción de lactosa. Ya con esto se lavó con DS (solución que simula el agua de charca) una caja de medio que tuviera

22 zoosporangios esporulando; y se utilizaron 10 µl de esta solución y 90 µl de lugol para impedir que éstas se movieran. Posteriormente se montó en la cámara de Neubabuer y se miró al microscopio en un aumento de 10X. Se realizan 10 conteos del número de zoosporas y se promediaron hasta obtener un número cercano a 5X104 zoos/ml.

Fig. 17 : Zoosporangios de Batrachochytrium dendrobatidis en fase de esporulación. Tomada por Motta, D ; Hurtado, C.

7.6 Montaje en microplacas

Para la realización de esta parte del ensayo se tuvieron en cuenta las metodologías utilizadas en los trabajos de Rollins-Smith (2002, Ramsey (2010) y Woodhams (2010). En una placa de 96 pocillos se montaron por triplicado 3 tipos de tratamientos de la siguiente manera: (1) 50µL de zoosporas +Triptona al 1%+ mucosomas de cada uno de los individuos (se variaba la concentración de extracto de mucosoma en 0.01; 0.10 y 0.20); (2) 50µL de zoosporas +Triptona al 1% (Bd normal) y (3) 50µL de zoosporas +Triptona al 1% +calor (Zoosporas inhibidas). ( Ver anexo 2) Estos se incubaron a 23°C y se evaluaron a las 24, 48, 72 y 96 horas en un lector de microplacas a 450 nm. Estos datos fueron analizados teniendo en cuenta el nivel de absorbancia que presentaron. Se examinó el efecto de variables como el peso de la piel, la especie de rana y la concentración de los extractos sobre la absorbancia relativa.

8. RESULTADOS Se encontró un mayor crecimiento de quitridio en el mucosoma de R. palmatus, seguido de D. truncatus y finalmente O. histrionica (ver anexo No. 1). Es probable que Bd se haya visto beneficiado por la presencia de mucosoma, ya que éste contiene algunos compuestos que pueden resultar favorables para este hongo. En el caso de R. palmatus se halló que existe una absorbancia neta superior a la de la mayoría de controles, lo que indica que existió un mayor crecimiento y por lo tanto una mayor presencia del hongo en la hora 96 de cada uno de los

23 tratamientos. En D. truncatus algunos individuos presentaron pequeñas variaciones en la absorbancia, resaltándose en su mayoría aquellos cuyo mucosoma estaba más concentrado (0.01). Oophaga histrionica presentó una menor variación entre las absorbancias netas; además de esto sus rangos eran menores que el control de la no tóxica ( R.palmatus) lo que implica que B. dendrobatidis creció menos con este tipo de mucosoma. Esto puede ser posible ya que estas últimas presentan una mayor concentración de alcaloides en su piel, en comparación con el género Dendrobates (Daly et al 2005).

En comparación con los controles positivos (zoosporas vivas) y negativos (Zoosporas inhibidas) se puede apreciar que hubo un mayor crecimiento de Bd con la presencia de los mucosomas de cada una de las especies evaluadas; esto es posible debido a que parte de la queratina aun presente en la piel, combinada con la temperatura adecuada y el medio de crecimiento apropiado favoreció la proliferación de zoosporas (ver anexo 2).

Para el análisis de la relación entre el peso de los individuos y el crecimiento de Bd se realizó una regresión lineal, la cual nos arrojó que no existe una correlación entre el peso de los individuos y la absorbancia. Los valores del coeficiente oscilan para las especies entre 0,00 y 0,29, lo que significa que hay una baja relación entre estas dos variables. Además de esto, el coeficiente de determinación R^2 es más cercano a 0, lo que nos muestra que el peso de la piel no explica la variación existente en las absorbancias relativas (Tabla No. 2) (Grafico No. 1).

Tabla No.2: Resultados de la regresión lineal de la relación peso piel vs absorbancia relativa para cada una de las especies de cada uno de los tratamientos evaluados en el experimento

Estadísticas de la regresión

Coeficiente de correlación múltiple 0,261

Coeficiente de determinación R^2 0,068

R^2 ajustado -0,024

Error típico 0,0656

Observaciones 12

Relación peso piel vs Absorbancia relativa 1.6 1.4 1.2 1 0.8

Abs_rel 0.6 0.4 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 Peso Piel

Gráfico No.1: Relación peso piel vs absorbancia relativa de cada uno de los tratamientos evaluados en el experimento

9. DISCUSION Es conocido que Bd se alimenta de componentes de la piel de los anfibios, tales como la quitina, celulosa o queratina, los cuales se encuentran especialmente ubicados en zonas altamente queratinizadas como las puntas de los dedos o las zonas inguinales (Lips, 1999) . En este estudio posiblemente este hongo se vio beneficiado por la presencia de todos los componentes inmersos en el mucosoma (comunidad antimicrobiana, celulosa, quitina, etc.), que le permitieron esporular más rápido y de esta manera crecer en mayor medida. En la Figura 18 se pueden observar las diferencias existentes entre cada una de las especies examinadas y su comparación con el control.

Rheobates palmatus fue la especie que mayor variación presentó con respecto a las otras muestras, favoreciendo el crecimiento del hongo quitridio. Esto posiblemente puede deberse a que estas ranas habitan principalmente en zonas cercanas a las corrientes de los ríos y lagunas (Lüddecke, 1999) lo que favorece enormemente el crecimiento y dispersión de Bd (Berger, 2005). Además es posible que esta especie se haya visto afectada hace algunos años ya que en la zonas montañosas es donde existe una mayor dispersión y por lo tanto una disminución en la respuesta inmune de las poblaciones (Berger et al. 1998; Lips, et al 2006; Skerrat et al, 2007). Otro aspecto que podría ser importante es la ausencia de alcaloides en R. palmatus, ya que según Grant et al. (2006) la familia Aromobatidae carece de la capacidad de secuestrar alcaloides, lo que la haría un poco susceptible a la infección frente a los otros individuos de estudio. Además de esto no se ha corroborado que R. palmatus posea en su piel bacterias antagonistas que generen una barrera de protección, por lo que el mecanismo de defensa de estar ranas debe estar relacionado con el ambiente.

Figura No. 18: Absorbancia neta (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto. Donde bdm (Batrachochytrium dendrobatidis muerto) bdv (Batrachochytrium dendrobatidis vivo) hist (Oophaga histriónica) palm ( Rheobates palmatus) y trun ( Dendrobates truncatus).

Dendrobates truncatus fue la especie que presentó una variación media respecto a los otros dos controles, ya que sus absorbancias oscilaron en rangos intermedios respecto a los otros individuos, demostrando así que aunque el mucosoma de esta rana le sirvió de fuente de nutrientes a las zoosporas no fue tan benéfico para estas como en el caso de R. palmatus. Según Daly 1978 D.truncatus posee una gran diversidad de alcaloides, entre los que destacamos la pumiliotoxina y las histrionicotoxinas, pero estos últimos expresan menor actividad biológica. Sin embargo es importante tener en cuenta que tan solo la presencia de estos compuestos puede llegar a generar algún tipo de resistencia que impida la proliferación de las zoosporas de Bd (Macfoy, 2005).

Oophaga histrionica fue la especie que menor crecimiento de Bd promovió con respecto a los otros 2 tratamientos, dado que los valores de la absorbancia relativa variaron entre 0,680- 1,300. Ello podría evidenciar que hubo incidencia importante de los alcaloides para contrarrestar la proliferación de las zoosporas. Oophaga histrionica es una rana que principalmente habita en bosques húmedos del pacifico colombiano, (Myers & Daly 1976;

Saporito et al. 2007). Palacios en el 2014 encontró que había presencia de Bd y que estas ranas eran capaces de convivir con este patógeno; es posible que esto pueda darse por la presencia de altas concentraciones de histrionicotoxina, un alcaloide espiropiperinídico que puede antagonizar los cambios en las conductancias del sodio y/o los iones de potasio, que se asocian con transmisión eléctrica en los nervios y células musculares; llega a bloquear la transmisión neuromuscular o en este caso los mecanismos de acción del quitridio (Celis, 2006).

Con respecto a los controles (Zoosporas vivas y zoosporas inhibidas de la cepa EV001) se encontró que en las 3 especies analizadas durante el estudio existió una mayor diferenciación a la hora 96. En comparación R.palmatus presentó absorbancias altas, las cuales sugieren baja eficacia de los péptidos antimicrobianos (PAM). Según Woodhams y colaboradores en el 2010, es posible que estos componentes no eliminen la infección, sino que por el contrario permitan el ingreso de las zoosporas y el descenso de la respuesta inmunitaria. Con Dendrobates truncatus y Oophaga histrionica encontramos un comportamiento similar ya que los valores encontrados durante el estudio fueron muy cercanos entre estas dos especies (Myers & Daly 1976)

En cuanto a las concentraciones utilizadas en los experimentos (Fig. 19) podemos apreciar que en el caso de los controles de Batrachochytrium inhibido y Batrachochytrium vivo este decreció en función del tiempo, esto se generó posiblemente por la presencia de microorganismos contaminantes que consumieron al quitridio. En relación con cada una de las especies se observa una diferencia significativa entre Oophaga histriónica y Rheobates palmatus, ya que sus bandas no se sobrelaparon a diferencia de Dendrobates truncatus que si lo hizo con ambas especies. Probablemente el comportamiento anterior se dio por las variaciones de toxicidad presentes en cada especie y al grado de tolerancia que tienen con este hongo.

En este experimento se sugiere la diferenciación en cuanto a los mecanismos de acción que poseen R. palmatus, D. truncatus y O. histrionica; como se planteó inicialmente, debe existir una variación ya que cada especie tiene diversos compuestos químicos en su mucosoma, que al final determinaron la cantidad y la velocidad de proliferación que tuvo Bd. Es posible que la combinación de los anticuerpos de la mucosa, los péptidos antimicrobianos, los alcaloides, los metabolitos y la temperatura constante le confirieran una ventaja al hongo, pues este al ser un patógeno puede volverse generalista con su alimento en aptas condiciones. (Rachowicz et al., 2005). Además de esto, según un estudio realizado por Woodhams y colaboradores en el 2007, se encontró que algunas especies poseen una defensa inmunológica innata que se expresa en el momento de aparición de la enfermedad, lo que les confiere una mayor probabilidad de sobrevivir; este puede ser el caso de O.histrionica quien es capaz de convivir en zonas de Bd sin ver una disminución en sus poblaciones (Palacios, 2014). Faltan realizar estudios que determinen si las poblaciones de R. palmatus y D. truncatus son capaces de habitar ambientes con presencia del patógeno sin ver un descenso en su población.

En cuanto al peso de los individuos y la afectación de Bd se observó que no existe una relación directamente proporcional, pues los valores del coeficiente de correlación múltiple oscilan entre 0,00 y 0,29 y los del Coeficiente de determinación R^2 es más cercano a 0. Los individuos de gran tamaño no tendrían necesariamente más mucosoma o un mucosoma más activo. Su abundancia podría estar más re,lacionada con factores como la historia de vida y el contexto ambiental, más no al tamaño corporal de la especie.

Figura No. 19: Variación de las concentraciones (crecimiento del hongo Bd) en función del tiempo de cada uno de los tratamientos utilizados durante el proyecto

10. CONCLUSIONES 10.1 Los resultados sugieren que el mucosoma de las familias Dendrobatidae y Aromobatidae favorecieron el crecimiento de Batrachochytrium dendrobatidis.

10.2 Rheobates palmatus fue la especie cuyo mucosoma generó mayor efecto positivo al crecimiento del Bd durante el estudio

10.3 No se encontró una correlación entre el peso de los individuos y el efecto del mucosoma sobre el quitridio.

10.4 Se estandarizó una metodología para el análisis del mucosoma y el crecimiento de Batrachochytrium dendrobatidis , ya que los estudios realizados anteriormente solo tenían en cuenta el antagonismo con bacterias y péptidos antimicrobianos.

11. RECOMENDACIONES

 Realizar estudios donde se utilicen los extractos de alcaloides de cada uno de las especies para determinar si estos tienen un efecto inhibitorio frente a Batrachochytrium dendrobatidis.

 Es importante determinar si los individuos están infectados con Bd previo al experimento. Para esto se puede tomar un frotis de la piel y hacer una prueba diagnóstica usando técnicas moleculares como PCR convencional o PCR en tiempo real.

 Utilizar especies de otras familias de anuros para comparar el crecimiento de Batrachochytrium dendrobatidis respecto a individuos con alcaloides.

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ANEXOS Anexo No. 1 Resultados obtenidos en función del tiempo de medición de la absorbancia neta de los controles e individuos de estudio

Especi Individ Concentra Blanco Absorbancia Absorbancia Hora e uos ción inicial individuos y controles neta palm 1 0.200 0.032 0.416 0.384 24 palm 1 0.200 0.032 0.494 0.462 48 palm 1 0.200 0.032 0.506 0.474 72 palm 1 0.200 0.032 0.565 0.533 96 palm 1 0.100 0.033 0.407 0.374 24 palm 1 0.100 0.033 0.478 0.445 48 palm 1 0.100 0.033 0.504 0.471 72 palm 1 0.100 0.033 0.582 0.549 96 palm 1 0.010 0.034 0.361 0.327 24 palm 1 0.010 0.034 0.440 0.406 48 palm 1 0.010 0.034 0.455 0.421 72 palm 1 0.010 0.034 0.497 0.463 96 palm 2 0.200 0.034 0.421 0.387 24 palm 2 0.200 0.034 0.507 0.473 48 palm 2 0.200 0.034 0.515 0.481 72 palm 2 0.200 0.034 0.541 0.507 96 palm 2 0.100 0.034 0.379 0.345 24 palm 2 0.100 0.034 0.454 0.420 48 palm 2 0.100 0.034 0.457 0.423 72 palm 2 0.100 0.034 0.531 0.497 96 palm 2 0.010 0.034 0.417 0.383 24 palm 2 0.010 0.034 0.493 0.459 48 palm 2 0.010 0.034 0.461 0.427 72 palm 2 0.010 0.034 0.525 0.491 96 palm 3 0.200 0.033 0.443 0.410 24 palm 3 0.200 0.033 0.510 0.477 48 palm 3 0.200 0.033 0.489 0.456 72 palm 3 0.200 0.033 0.556 0.523 96 palm 3 0.100 0.033 0.312 0.279 24 palm 3 0.100 0.033 0.386 0.353 48 palm 3 0.100 0.033 0.378 0.345 72 palm 3 0.100 0.033 0.419 0.386 96 palm 3 0.010 0.034 0.384 0.350 24 palm 3 0.010 0.034 0.472 0.438 48 palm 3 0.010 0.034 0.498 0.464 72 palm 3 0.010 0.034 0.553 0.519 96 palm 4 0.200 0.034 0.271 0.237 24 palm 4 0.200 0.034 0.460 0.426 48

37 palm 4 0.200 0.034 0.457 0.423 72 palm 4 0.200 0.034 0.499 0.465 96 palm 4 0.100 0.033 0.211 0.178 24 palm 4 0.100 0.033 0.301 0.268 48 palm 4 0.100 0.033 0.308 0.275 72 palm 4 0.100 0.033 0.328 0.295 96 palm 4 0.010 0.034 0.337 0.303 24 palm 4 0.010 0.034 0.493 0.459 48 palm 4 0.010 0.034 0.305 0.271 72 palm 4 0.010 0.034 0.177 0.143 96 trun 1 0.200 0.034 0.376 0.342 24 trun 1 0.200 0.034 0.468 0.434 48 trun 1 0.200 0.034 0.497 0.463 72 trun 1 0.200 0.034 0.520 0.486 96 trun 1 0.100 0.034 0.306 0.272 24 trun 1 0.100 0.034 0.333 0.299 48 trun 1 0.100 0.034 0.312 0.278 72 trun 1 0.100 0.034 0.419 0.385 96 trun 1 0.010 0.034 0.249 0.215 24 trun 1 0.010 0.034 0.327 0.293 48 trun 1 0.010 0.034 0.247 0.213 72 trun 1 0.010 0.034 0.370 0.336 96 trun 2 0.200 0.034 0.288 0.254 24 trun 2 0.200 0.034 0.331 0.297 48 trun 2 0.200 0.034 0.297 0.263 72 trun 2 0.200 0.034 0.392 0.358 96 trun 2 0.100 0.035 0.387 0.352 24 trun 2 0.100 0.035 0.456 0.421 48 trun 2 0.100 0.035 0.459 0.424 72 trun 2 0.100 0.035 0.519 0.484 96 trun 2 0.010 0.034 0.413 0.379 24 trun 2 0.010 0.034 0.493 0.459 48 trun 2 0.010 0.034 0.493 0.459 72 trun 2 0.010 0.034 0.550 0.516 96 trun 3 0.200 0.033 0.348 0.315 24 trun 3 0.200 0.033 0.421 0.388 48 trun 3 0.200 0.033 0.412 0.379 72 trun 3 0.200 0.033 0.466 0.433 96 trun 3 0.100 0.034 0.296 0.262 24 trun 3 0.100 0.034 0.327 0.293 48 trun 3 0.100 0.034 0.318 0.284 72 trun 3 0.100 0.034 0.391 0.357 96 trun 3 0.010 0.035 0.364 0.329 24 trun 3 0.010 0.035 0.441 0.406 48 trun 3 0.010 0.033 0.352 0.319 72

38 trun 3 0.010 0.035 0.539 0.504 96 trun 4 0.200 0.033 0.372 0.339 24 trun 4 0.200 0.033 0.345 0.312 48 trun 4 0.200 0.033 0.347 0.314 72 trun 4 0.200 0.033 0.424 0.391 96 trun 4 0.100 0.033 0.389 0.356 24 trun 4 0.100 0.033 0.385 0.352 48 trun 4 0.100 0.034 0.41 0.376 72 trun 4 0.100 0.033 0.420 0.387 96 trun 4 0.010 0.034 0.351 0.317 24 trun 4 0.010 0.034 0.391 0.357 48 trun 4 0.010 0.035 0.451 0.416 72 trun 4 0.010 0.034 0.347 0.313 96 hist 1 0.200 0.033 0.301 0.268 24 hist 1 0.200 0.033 0.314 0.281 48 hist 1 0.200 0.033 0.309 0.276 72 hist 1 0.200 0.033 0.357 0.324 96 hist 1 0.100 0.033 0.261 0.228 24 hist 1 0.100 0.033 0.296 0.263 48 hist 1 0.100 0.033 0.260 0.227 72 hist 1 0.100 0.033 0.352 0.319 96 hist 1 0.010 0.034 0.302 0.268 24 hist 1 0.010 0.034 0.307 0.273 48 hist 1 0.010 0.034 0.287 0.253 72 hist 1 0.010 0.034 0.380 0.346 96 hist 2 0.200 0.034 0.285 0.251 24 hist 2 0.200 0.034 0.308 0.274 48 hist 2 0.200 0.034 0.279 0.245 72 hist 2 0.200 0.034 0.352 0.318 96 hist 2 0.100 0.034 0.297 0.263 24 hist 2 0.100 0.034 0.285 0.251 48 hist 2 0.100 0.034 0.262 0.228 72 hist 2 0.100 0.034 0.334 0.300 96 hist 2 0.010 0.034 0.276 0.242 24 hist 2 0.010 0.034 0.307 0.273 48 hist 2 0.010 0.034 0.274 0.240 72 hist 2 0.010 0.034 0.339 0.305 96 hist 3 0.200 0.032 0.321 0.289 24 hist 3 0.200 0.032 0.316 0.284 48 hist 3 0.200 0.032 0.293 0.261 72 hist 3 0.200 0.032 0.373 0.341 96 hist 3 0.100 0.032 0.286 0.254 24 hist 3 0.100 0.032 0.390 0.358 48 hist 3 0.100 0.032 0.395 0.363 72 hist 3 0.100 0.032 0.460 0.428 96

39 hist 3 0.010 0.034 0.268 0.234 24 hist 3 0.010 0.034 0.331 0.297 48 hist 3 0.010 0.034 0.275 0.241 72 hist 3 0.010 0.034 0.346 0.312 96 hist 4 0.200 0.033 0.255 0.222 24 hist 4 0.200 0.033 0.223 0.190 48 hist 4 0.200 0.033 0.178 0.145 72 hist 4 0.200 0.033 0.295 0.262 96 hist 4 0.100 0.033 0.275 0.242 24 hist 4 0.100 0.033 0.359 0.326 48 hist 4 0.100 0.033 0.299 0.266 72 hist 4 0.100 0.033 0.341 0.308 96 hist 4 0.010 0.034 0.277 0.243 24 hist 4 0.010 0.034 0.341 0.307 48 hist 4 0.010 0.034 0.309 0.275 72 hist 4 0.010 0.034 0.363 0.329 96 bdv 1 0.000 0.034 0.391 0.357 24 bdv 1 0.000 0.031 0.403 0.372 48 bdv 1 0.000 0.031 0.393 0.362 72 bdv 1 0.000 0.031 0.192 0.161 96 bdv 2 0.000 0.034 0.483 0.449 24 bdv 2 0.000 0.034 0.417 0.383 48 bdv 2 0.000 0.034 0.405 0.371 72 bdv 2 0.000 0.034 0.154 0.120 96 bdv 3 0.000 0.034 0.447 0.413 24 bdv 3 0.000 0.033 0.302 0.269 48 bdv 3 0.000 0.033 0.119 0.086 72 bdv 3 0.000 0.033 0.08 0.047 96 bdm 1 0.000 0.031 0.328 0.297 24 bdm 1 0.000 0.034 0.139 0.105 48 bdm 1 0.000 0.034 0.061 0.027 72 bdm 1 0.000 0.034 0.12 0.086 96 bdm 2 0.000 0.034 0.334 0.300 24 bdm 2 0.000 0.034 0.188 0.154 48 bdm 2 0.000 0.034 0.055 0.021 72 bdm 2 0.000 0.034 0.103 0.069 96 bdm 3 0.000 0.033 0.323 0.290 24 bdm 3 0.000 0.034 0.083 0.049 48 bdm 3 0.000 0.034 0.079 0.045 72 bdm 3 0.000 0.034 0.091 0.057 96

Anexo No. 2 Disposición en la placa de cada uno de los controles y concentraciones propuestas para el estudio