PARÂMETROS CITOGENÉTICOS DE ESPÉCIES COMERCIAIS DE CARANGIDAE (PERCIFORMES), COM VISTAS A SUA EMPREGABILIDADE NA CONSERVAÇÃO BIOLÓGICA E PISCICULTURA MARINHA

UEDSON PEREIRA JACOBINA

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós Graduação – Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia

Orientador- Dr. Wagner Franco Molina

NATAL-RN

2012

Seção de Informação e Referência Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Jacobina, Uedson Pereira Parâmetros citogenéticos de espécies comerciais de carangidae (perciformes), com vistas a sua empregabilidade na conservação biológica / Uedson Pereira Jacobina. – Natal, RN, 2012. 150 f. : il.

Orientador: Wagner Franco Molina.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Rede Nordeste de Biotecnologia.

1. Piscicultura Marinha – Tese. 2. Marcadores Cromossônicos – Tese. 3. Software Lekin – Tese. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 639.2.04

Dedico este trabalho a meu pai Lídio Jacobina Vieira Santos

“Nem tudo que se enfrenta pode ser modificado, mas nada pode ser modificado até que seja enfrentado. A tradição é a personalidade dos imbecis.”

Albert Einstein AGRADECIMENTOS

Agradeço a Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao programa Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) pela oportunidade de realizar este trabalho.

Ao meu orientador Professor Dr. Wagner Franco Molina, pelo apoio e confiança depositada em mim, que foram fundamentais para a realização deste trabalho e oportunidade de trabalhar com grupo, objeto de estudo, “fantástico”, os Carangídeos.

Aos professores Dr Luiz Antonio Carlos Bertollo, Marcelo de Bello Cioffi e Marcelo Vicari pela amizade, parceria e dicas na melhoria deste trabalho.

Aos Professores Dr. Darlio Teixeira, Carlos Blaha e Paulo Sérgio Marinho pelas críticas e sugestões para a melhoria do trabalho.

Aos Professores Dr. Orlando Moreira-Filho, Vitor de Oliveira Lunardi, Carlos Alfredo Galindo Blaha e Liliane de Lima Gurgel pelas críticas essenciais e fundamentais na melhoria desse trabalho.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPQ) pela bolsa de pesquisa concebida em 2009.

Ao Conselho de Aperfeiçoamento Superior pela bolsa REUNI concebida de 2010 a 2012, fundamental na minha permanência e continuidade deste trabalho em Natal.

As Professoras Kattia Scortecci e Adriana Uchôa pelos ensinamentos, dicas e bate papos descontraídos nas aulas de Biologia Celular fundamentais para o meu aprendizado e amadurecimento como um futuro docente.

A minha família, os irmãos Wilton, Wendell e José Welton e principalmente minha mãe Beatriz Alencar Jacobina por todo amor e carinho e confiança depositada em mim.

Ao grande amigo Pablo Martinez pela convivência, parceria nos trabalhos e claro parceiro das melhores baladas em Natal, e por compartilhar os momentos difíceis.

Aos grandes amigos Layse, Calado, Washington, Valdir, Silvio e Valério pelo apoio e por tornarem esta convivência mais descontraída e bem mais feliz em minha estadia de quatro anos em Natal.

Aos amigos de Guamaré Layse, Kelly, Carol, Pedro, Calado, Acarilton, Érico, Iraê, Gustavo, Diogo, Felipe, Daniel, Aline, Lucas e Léo pela amizade, apoio, compreensão e por tornar a conviência mais fácil nos dias de labuta em Guamabeach.

Ao amigo Garcia Júnior pelo apoio e suporte na identificação das espécies.

Aos colegas do laboratório de Genética de Recursos Marinhos Gideão, Rodrigo Pantera, Eurico, Allysson, Amanda, George, Clóvis e Paulo por participarem direta ou indiretamente na realização deste trabalho.

Em geral gostaria de agradecer a todas as pessoas que de certa forma contribuíram na realização deste trabalho.

Resumo

Entre os peixes marinhos, as famílias Carangidae e Rachycentridae se apresentam como grupos de grande importância comercial pela pesca e potencial para piscicultura marinha. Entretanto, bases genéticas que possam alicerçar o futuro cultivo destas espécies, sobretudo seus aspectos citogenéticos são incipientes. Os padrões cromossômicos têm fornecido dados básicos para a prospecção de processos biotecnológicos de manipulação cromossômica voltados ao melhoramento genético, como a indução a poliploidia, ginogênese e androgênese, assim como obtenção de estoques monossexo e hibridizações interespecíficas. Neste trabalho é apresentado um amplo levantamento citogenético em 10 espécies, sendo sete da família Carangidae e de Rachycentron canadum, espécie monotípica da família Rachycentridae. A caracterização citogenética clássica e mapeamento in situ de sequências multigênicas foram empregadas. Adicionalmente em espécies do gênero Selene e em morfótipos de Caranx lugubris foram realizadas comparações através de morfometria geométrica. Em geral, as espécies exibiram um marcante conservadorismo cromossômico numérico (2n=48). Apesar de apresentar, em grande parte, fórmulas cariotípicas diferenciadas, conservam diversas características cromossômicas típicas da Ordem Perciformes, como elevado número de elementos monobraquiais, sítios Ag-RONs/ DNAr 18S simples e heterocromatina reduzida, preferencialmente centromérica. Os principais mecanismos envolvidos na diversificação cariotípica são as inversões pericêntricas, com ação secundária de fusões cêntricas. Além do mapeamento físico e detalhamento cromossômico para as espécies são apresentados e discutidos padrões de variabilidade intra e diversificação interespecíficas, com identificação de marcadores citotaxonômicos. Este conjunto dos dados propicia um melhor conhecimento dos padrões carioevolutivos destes grupos e condições para o desenvolvimento de protocolos biotecnológicos baseados na manipulação cromossômica para estas espécies Atlânticas.

Abstract

Worldwide, families Carangidae and Rachycentridae represent one of the groups most important commercial fish, used for food, and great potential for marine aquaculture. However, the genetic bases that can underpin the future cultivation of these species, cytogenetic between these aspects are very weak. The chromosomal patterns have provided basic data for the exploration of biotechnological processes aimed at handling chromosomal genetic improvement, such as induction of polyploidy, androgenesis and ginogenesis, as well as obtaining monosex stocks and interspecific hybridizations. This paper presents a comprehensive cytogenetic survey in 10 species, seven of the family Carangidae and the monotypic family Rachycentridae. Classical cytogenetic analysis and in situ mapping of multigene sequences were employed, and additionally for the genus Selene and morphotypes of Caranx lugubris, comparisons were made using geometric morphometrics. In general, conservative species exhibit a marked chromosome number (2n=48). Although present in large part, different karyotypic form, retain many characteristics typical of chromosomal Order Perciformes, the high number of elements monobrachyal, Ag-NORs/18S rDNA sites and heterochromatin simply reduced, preferably centromeric. The main mechanisms involved in karyotypic diversification are the pericentric inversions, with secondary action of centric fusions. In addition to physical mapping and chromosome detail for the species are presented and discussed patterns of intra-and interspecific diversity, cytotaxonomic markers. This data set provides a better understanding of these patterns caryoevolutyonary groups and conditions for the development of protocols based on Biotechnology for chromosomal manipulation Atlantic these species.

Lista de Figuras e Tabelas

Introdução

Figura-1. Relações filogenéticas baseadas em dados morfológicos (Gushiken, 1988) para Carangoidei (a) e de tribos da família Carangidae (adaptado de Reed et al., 2002) a partir de sequências Cit B (b). Pag-18

Tabela-1. Dados citogenéticos da família Carangidae. Pag-19

Capítulo 2

Figura 1. Cariótipos de Rachycentron canadum. Coloração convencional (a) destacando os sítios Ag- NORs no par cromossômico no. 2; (b) bandamento C, destacando as RONs como regiões + - heterocromáticas CMA3 /DAPI ; (c) bandas de replicação, evidenciando os sítios de rDNA 18S (par 2) e 5S (pares 3 e 13) como de replicação inicial; (d) double-FISH com sondas de DNAr 18S (rosa) e 5S (verde), evidenciando a localização dos sítios de DNAr 18S no par no. 2 e dos sítios de DNAr 5S nos pares 3 e 13; (e) FISH com seqüências (TTAGGG)n evidenciando a localização de sítios teloméricos nos cromossomos (laranja). Barra = 5 µm. Pag-69

Figura 2. Idiograma representativo do complemento cromossômico de Rachycentron canadum, exibindo o mapeamento citogenético das sequências ribossomais, Ag-RONs, regiões heterocromáticas e bandas de replicação dos cromossomos. Pag-70

Capítulo 3

Figura 1. Cariótipos das espécies Trachinotus goodei (a, d, g), Trachinotus carolinus (b, e, h) e Trachinotus falcatus (c, f, i). Coloração convencional (a, b, c) destacando os pares portadores de sítios Ag-RONs; bandamento C (d, e, f); em destaque os pares organizadores nucleolares sob + - coloração por CMA3 /DAPI . Dupla coloração em FISH com sondas de 18S DNAr (verde) e 5S DNAr (vermelho) (f, g, h). Barra = 5 µm. Pag-78

Figura 2. Árvore filogenética de parcimônia em algumas espécies da tribo Trachinotini (a), adaptado de Reed et al. (2002). As relações moleculares confrontam com uma fórmula cromossômica das espécies de Trachinotus analisadas. Abaixo, uma representação esquematica de uma nova possibilidade de “acrocentrização” (b) e condição derivada de sítios de DNAr múltiplos exclusivo em T. goodei (c). Em destque sítios DNAr 18 e 5S em T. Falcatus. Pag-80

Capítulo 4

Figura 1. Cariótipos das espécies Selene brownii, S setapinnis e S. vomer. (a) Coloração convencional destacando os sítios Ag-RONs no par cromossômico no. 1; (b) bandamento C destacando a região da + - RON com coloração CMA3 /DAPI ; (c) dupla-coloração em FISH com sondas de 18S DNAr (verde) e 5S (vermelho) evidenciando a localização dos sítios de 18S DNAr no primeiro par e 5S DNAr no 9° par nos cariótipos; (d) FISH com sondas (TTAGGG)n mostrando os sítios teloméricos nos cromossomos. Barra = 5 µm. Pag-90

Tabela 1. Distância de Mahalanobis entre as espécies de Carangidae (diagonal inferior) e valores de P com testes de permutação de (1000x) (diagonal superior).Pag-90

Figura 2. Variáveis canônicas e projeção da forma do corpo e mensurações de O. palometa (estrelas pretas), C. lugubris (círculos brancos) S. brownii (quadrados pretos), S. setapinnis (estrelas brancas), S. vomer (círculos brancos). Abaixo, forma esquemática comparando entre espécies as formas. Pag.-91

Capítulo 5

Figura 1. Posição geográfica no Atlântico e detalhe do Arquipélago São Pedro e São Paulo, ponto de coleta dos morfótipos de C. lugubris. Pag-98

Figura 2. Representação esquemática dos pontos anatômicos dos 12 landmarks (a) definidos para as análises morfométricas em C. lugubris; (1) extremidade do focinho; (2) depressão do perfil frontal acima do focinho; (3) inserção da primeira nadadeira dorsal (4) inserção do segundo ponto de vista dorsal, (5) último raio dorsal, (6) fim da nadaeira anal, (7) inserção da anal, (8) inserção nadadeira anal; (9) base final da nadadeira pélvica, (10) inserção da nadadeira peitoral, (11 e 12) extremidades anterior e posterior do olho. Pag-105

Figura 3. Dendrograma de similaridade morfológica, obtido através de agrupamento UPGMA, para espécies de Caranx e Carangoides. Os morfótipos de C. lugubris apresentam-se similares entre si, mas discriminados de espécies morfologicamente mais próximas como C. hippos e C. latus. Um segundo cluster agrupa C. crysos e C. bartholomaei de corpo alongado. Pag-106

Figura 4. Cariótipos dos morfótipos I (esquerda) e II (direita) de C. lugubris presentes no ASPSP. Coloração por Giemsa, com destaque para o par no. 1 portador de sítios Ag-RON (a). Bandamento C

(b). Coloração com DAPI/CMA3, exibindo sítios GC-ricos dispersos nas regiões centroméricas e teloméricas da maioria dos pares cromossômicos (c). Double-FISH evidenciando o mapeamento dos sítios 18S DNAr (vermelho) e 5S DNAr (verde). Pag-107

Tabela 1. Espécimes utilizados nas análises das sequências de DNA ribossomal 16S, número de acesso no GenBank e seus números de depósito na coleção ictiológica da UFRN. Pag-108

Tabela 2. Valores merísticos dos elementos seriais nos dois morfótipos de C. lugubris e em outras espécies de Carangidae dos gêneros Caranx e Carangoides, com ocorrência no Atlântico. a Honebrink (2000); b Smith-Vaniz & Carpenter (2007). Atlantico L. – Atlantico Leste; Atlantico O. – Atlantico Oriental. Pag-108

Capítulo 6

Figura1. Cariótipos de Carangoides bartholomaei (a), Caranx latus (b) e Caranx lugubris (c), sob coloração convencional. Abaixo respectivamente os padrões de distribuição da heterocromatina para cada espécie. Em destaque, os pares organizadores nucleolares (par 1). Sobreposição CMA/DAPI nas três espécies analisadas (g,h e i). Mapeamento cromossômico por dual-color FISH de sondas DNAr 18S (verde) e 5S (vermelho) em Carangoides bartholomaei (j), Caranx latus (k) e Caranx lugubris (l). Barra = 5µm. Pag-128

Sumário

1-Introdução

1.1- Aquicultura, aspectos citogenéticos e biodiversidade- Pag-14 1.2- Relações filogenéticas das famílias Carangidae e Rachycentridae com vistas à piscicultura marinha. Pag-16 2- Objetivos 3-Material e Métodos 3.1-Material. Pag-21 3.2-Métodos. Pag-21 3.2.3- Preparações cromossômicas. Pag-21 3.2.4-Identificação de padrões heterocromáticos (bandamento C). Pag-22 3.2.5- Detecção de Regiões Organizadoras de Nucléolos (Ag-RONs). Pag-22

3.2.6- Fluorocromos GC- e AT-específicos (CMA3 e DAPI). Pag-22 3.2.7- Hibridação fluorescente in situ (FISH)–Sondas 18S e 5S. Pag-23 3.2.8- Microfotografias e captura de imagens. Pag-24 3.2.9- Análises Morfométricas. Pag-25 4- Referências. Pag-26

Resultados e Discussão

Capítulo 1

Protocolos citogenéticos e perspectivas biotecnológicas voltadas à piscicultura marinha. Pag- 31

Capítulo 2

Mapeamento cromossômico de seqüências repetitivas em Rachycentron canadum (Perciformes, Rachycentridae). Implicações para evolução cariotípica e perspectivas para fins biotecnológicos. Pag- 65

Capítulo 3

Perfil discriminatório de sitios de DNAr e possivel tendência de acrocentrização no gênero Trachinotus. Pag -74

Capítulo 4

Peixes-Galo do Atlântico: Independência dos padrões de diferenciação cariotípica e morfológica. Pag-86

Capítulo 5

Ocorrência de dois morfótipos de Caranx lugubris, (Carangidae) no Arquipélago São Pedro e São Paulo, meso Atlântico. Pag- 95

Capítulo 6

Mapeamento de genes 18S e 5S em espécies pelágicas dos gêneros Caranx e Carangoides (Carangidae).Pag-122

Considerações finais. Pag-137 1- INTRODUÇÃO

1.1- Aquicultura, aspectos citogenéticos e biodiversidade

Entre as diferentes áreas da aquicultura, a piscicultura corresponde à atividade de maior volume em termos de produção mundial, sobretudo a desenvolvida em águas continentais. Por outro lado, embora a piscicultura marinha venha se desenvolvendo de forma crescente e em escala global, no geral ainda enfrenta algumas limitações ao seu pleno desenvolvimento, como questões sociais e ambientais e o baixo conhecimento da biodiversidade de algumas regiões, do ciclo de vida de espécies e dos seus aspectos genéticos podem ser elencados como empecilhos ao seu pleno desenvolvimento (Hutchings, 2001; Dulvy et al., 2003).

No Brasil, a aquicultura tem se desenvolvido muito modestamente quando comparada com outros países do mundo, frente às expressivas potencialidades da biodiversidade e condições ambientais do país. Os grandes problemas enfrentados surgem da falta de organização do sistema de transferência de tecnologia, a carência de pesquisa aplicada, do ordenamento e desenvolvimento, bem como da distribuição dos produtos pesqueiros (Castagnolli, 1996). Embora em médio prazo, esta atividade venha a ser o setor que mais oferecerá possibilidades de aumento da produção de pescado, são necessários estudos que possibilitem a formulação de um programa de desenvolvimento para esta área, levando-se em conta as particularidades das diferentes regiões brasileiras (Camargo & Pouey, 2005).

Um passo importante para o sucesso das atividades comerciais da piscicultura recai na exata compreensão, pelo setor produtivo, das diferenças e perspectivas genéticas que envolvem as populações naturais e estoques cativos de reprodutores. Populações naturais normalmente representam um repositório de ampla base genética da espécie, modelado sob a ação da seleção natural, sua manutenção é fonte permanente de germoplasma a ser utilizado para fins de melhoramento genético. Estoques cativos de reprodutores, por outro lado, constituem quase sempre uma amostra genética limitada, composto por pequeno número de exemplares comparado às populações naturais, nem sempre representativa do pool gênico das populações ou espécie e completamente dependente do manejo e dos cruzamentos envolvidos para a sua perpetuação.

A genética aplicada à piscicultura abrange quatro principais áreas que estão intimamente interligadas, são elas: a manipulação genética; manejo genético, monitoramento genético e a conservação genética. Nas ultimas três décadas, estas

1 abordagens começaram a contribuir nos programas de criação de peixes, das quais uma das mais utilizadas é a investigação e aplicações das informações cromossômicas (Hussain, 1996; Pandian & Koteeswaran, 1998; Arai, 2001).

Dados cromossômicos relacionados ao melhoramento genético de peixes cultivados têm sido foco de discussões e revisões durante a última década (Hulata, 2001). Estudos cariotípicos têm fornecido informações básicas sobre o número, tamanho e morfologia dos cromossomos (Khan et al ., 2000), que tem ajudado na compreensão dos mecanismos evolutivos dos grupos investigados. O conhecimento sobre padrões cromossômicas das espécies fornecem dados básicos para a padronização dos processos de manipulação cromossômica voltados ao melhoramento genético. Entre estes a indução da poliploidia, ginogênese e androgênese, assim como obtenção de estoques monossexo e hibridizações interespecíficas (Wu et al ., 1988; Diter et al., 1993). Estas técnicas genéticas têm sido amplamente aplicadas em conjunção com o cultivo de espécies aquícolas no mundo (Arai, 2001; Beardmore et al ., 2001; Jankun et al., 2007).

Das 13.000 espécies de peixes marinhos descritos, apenas 2% dessas espécies foram estudadas sob o ponto de vista citogenético (Brum, 1996). A citogenética representa uma importante área dos estudos genéticos e o Brasil é um dos maiores expoentes. A caracterização citogenética de populações e espécies possibilita a identificação de polimorfismos, diferenças populacionais sutis e espécies crípticas (Mantovani et al., 2000; Porto-Foresti, 2006; Molina et al. , 2008; Cioffi et al ., 2009), que podem ser utilizadas para o manejo adequado, monitoramento, conservação e a exploração racional dos estoques pesqueiros.

Os peixes marinhos, comparativamente aos de água doce apresentam, em geral uma pequena diversidade no número de cromossomos (Brum, 1996). Diferente dos ambientes continentais, os ambientes marinhos apresentam barreiras físicas em menor número ou efetividade, o que minimiza o isolamento geográfico (Lacson, 1992). Essa condição entre os Perciformes, maior grupo de peixes marinhos, poderia minimizar a diversificação cariotípica e favorecer um mais amplo compartilhamento entre os grupos do cariótipo basal composto por 48 cromossomos acrocêntricos (Ohno, 1970, White, 1973, Brum, 1996, entre outros). De fato, nesta Ordem, este cariótipo é encontrado freqüentemente em muitas famílias, tais como Carangidae (Murofushi & Yosida, 1979), Haemulidae (Aciolly, 2008), Pomacanthidae (Affonso et al ., 2000), Pomacentridae (Molina & Galetti, 2002), dentre outros.

2

Os estudos citogenéticos em peixes marinhos neotropicais têm crescido de forma expressiva, sobretudo em Perciformes (Araújo et al ., 2010; Jacobina et al ., 2011; Motta- Neto et al., 2011; Aciolly et al., 2012; dentre outros), apesar de ainda reduzidos frente a dimensão deste grupo. Em função da costa brasileira (Atlântico Ocidental) apresentar uma vasta diversidade ictiofaunística, dados citogenéticos das espécies são ainda reduzidos, com ausência de informações sobre os padrões cromossômicos de diversas famílias. Neste aspecto, as análises citogenéticas em peixes tornam-se especialmente interessantes porque eles constituem um grupo particular dentre os vertebrados pelo número de espécies, diversidade de formas, comportamento e habitats e pela posição central que ocupam na evolução animal (Ohno, 1970). O aprimoramento de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares vem crescentemente permitindo acesso a regiões específicas dos cromossomos. O maior acesso à estrutura dos cromossomos aumenta o poder discriminatório, entre cariótipos aparentemente similares, e revelam mecanismos de rearranjos insuspeitos (Ozouf-Costaz et al ., 1991), bem como são úteis na identificação de homeologias.

1.2 -Relações filogenéticas das famílias Carangidae e Rachycentridae com vistas à piscicultura marinha

No ambiente marinho, Perciformes constitui a ordem dominante, caracterizada como a maior e mais diversificada dentre os teleósteos. Neste grupo a subordem Percoidei é a mais representativa, com 79 famílias, 549 gêneros e 3.176 espécies (Nelson, 2006). Nesta Ordem, a superfamília Carangoidei representa um dos poucos grupos monofiléticos, constituído pelas famílias Nematistiidae, Coryphaenidae, Rachycentridae, Echeneidae e Carangidae (Johnson, 1993). Algumas características morfológicas sugerem que Carangidae, Coryphaenidae, Rachycentridae e Echeneidae formam um grupo monofilético (Johnson, 1984), onde Rachycentridae e Echeneidae formam um grupo monofilético, tendo Coryphaenidae como grupo-irmão do clado de Nematistiidae e Carangidae (O'Toole, 2002). Em número de espécies Rachycentridae e Nemastiidae são formadas apenas por uma única espécie, Coryphaenidae por duas, Echeneidae por oito (Smith-Vaniz et al. , 1999; O'Toole, 2002; Collette, 2003), enquanto que Carangidae, mais diversificada, abrange 32 gêneros e 140 espécies (Smith-Vaniz, 2002).

Em todo o mundo, as famílias Carangidae e Rachycentridae representam um dos mais importantes grupos de peixes comerciais usados para fins alimentares (Smith-Vaniz 1999). Na família Rachycentridae, a espécie monotípica Rachycentron canadum (Cobia), é de ampla distribuição, vivendo em águas tropicais em todo o mundo, sendo importante

3 economicamente e muito bem considerado como um candidato ideal para a aquicultura eno cenário mundial. Estes fatores têm estimulado a realização de pesquisas com esta espécie nos Estados Unidos, México, Porto Rico, Austrália, Vietnam, China e Taiwan (FAO, 2006). No Brasil, algumas regiões vêm tentando buscar soluções para o fortalecimento econômico com bases na aquicultura e vem incentivando políticas de desenvolvimento da piscicultura marinha através de diagnósticos e definições de organismos a serem cultivados. Atualmente, diversos órgãos públicos vêm estudando a implantação no país de cultivos desta espécie, Rachycentron canadum , o beijupirá, espécie que vem mostrando grande potencial para a piscicultura marinha devido à sua elevada taxa de crescimento – pode alcançar 6 kg em um ano de cultivo, ao alto valor comercial e a qualidade da carne (Carvalho Filho, 1999; Domingues et al ., 2007). Já os membros da família Carangidae, representam cerca de 5% dos desembarques anuais de peixes ósseos marinhos em todo mundo. Entretanto, informações sobre a distribuição e abundância da maioria dos carangídeos é insuficiente para determinar a viabilidade de exploração ou maior exploração das espécies (Nakamura, 1980; Honebrink, 2000). Esta redução de estoques, alto valor econômico e características biológicas vem aumentando as pesquisas e o emprego de algumas destas espécies, constituintes desta familia na piscicultura marinha.

Carangidae é um grupo diverso, constituído por espécies conhecidas popularmente como xaréus, pâmpanos, galos, entre outros. Suas relações taxonômicas são pouco claras e uma quantidade considerável de mudanças de nomenclatura vem ocorrendo (Laroche et al . 1984, Gunn 1990, Honebrink 2000). Dados morfológicos permitem definir quatro tribos, sendo elas Trachinotini, Scomberoidini, Naucratini e Carangini. Nestas tribos foram reconhecidas provisoriamente algumas subfamílias como Trachinotinae, formada pelos gêneros Lichia e Trachinotus, Scomberoidinae, composta por pelos gêneros Oligoplites , Parona e Scomberoides, Naucratinae composta pelos gêneros Compogramma , Elagatis , Naucrates , Seriola e Seriolina e Caranginae, a mais diversificada, formada por 96 espécies, distribuídas em 22 gêneros (Smith-Vaniz 1984). Outras filogenias baseadas em características morfológicas foram também propostas para Carangidae (Gushiken, 1988). Hipóteses filogenéticas a partir de sequências do gene mitocondrial Citocromo b, revelam suporte para o monofiletismo das subfamílias Caranginae, Naucratinae e Trachinotinae (Figura, 1), embora a monofilia da tribo Scomberoidini tenha se mostrado questionável (Reed et al ., 2002).

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a b

Figura 1. Relações filogenéticas baseadas em dados morfológicos (Gushiken, 1988) para Carangoidei (a) e de tribos da família Carangidae (b) a partir de sequências Cit b (adaptado de Reed et al ., 2002) .

No que diz respeito aos representantes de Carangidae utilizadas na produção, várias espécies, como Pseudocaranx dentex e Trachinotus carolinus têm sido extensivamente cultivadas em tanques-rede no Japão (Heilman & Spieler , 1999; Ogawa, 1992;). Neste país a espécie Seriola quinqueradiata já vem sendo cultivada desde 1927, em gaiolas no mar, a partir da captura de juvenis selvagens (Nakada, 2002). Outras espécies de Seriola, como S. dumerili, também apresentam alto potencial para aquicultura, em virtude de seu crescimento rápido e alto valor comercial (Mazzola et al., 2000). Mais recentemente, o cultivo de S. lalandi tem sido implementado comercialmente na Austrália e Nova Zelândia, onde é dependente de juvenis criados (Poortenaar et al. 2001). No gênero Caranx , C. melampygus , espécie cujas populações tem sofrido os efeitos da pesca intensiva (Shomura, 1987; Friedlander & Dalzell 2004) tem atraído atenção para fins de cultivo.

Do total das cerca de 140 espécies que compõem a família Carangidae, 25 espécies (17,8%), de 10 gêneros, já dispõe de alguma informação citogenética (Tabela 1). No entanto, a maioria destes estudos está relacionada às espécies do mar Mediterrâneo (Caputo et al ., 1996; Sola et al ., 2007; Chai et al ., 2009).

Um painel mais extenso de marcadores cromossômicos obtidos pela aplicação de métodos citogenéticos mais resolutivos torna-se necessário para representantes Atlânticos da família Carangidae. Estes dados possibilitarão analisar a evolução cromossômica, bem como a presença de marcadores populacionais ou interespecíficos, subsidiando seu emprego em práticas de manejo e exploração adequada dos estoques pesqueiros. Análises citogenéticas aprofundadas envolvendo um número maior de gêneros e espécies permitiria um primeiro cenário dos aspectos citogenéticos destas

5 famílias Carangidae e Rachycentridae no litoral brasileiro e suporte para seu uso futuro no melhoramento genético e desenvolvimento da piscicultura marinha no Brasil.

Tabela 1. Dados citogenéticos da família Carangidae.

Espécies 2n NF m/sm st/a Referências

Alectis ciliaris 48 48 - 48 Murofushi & Yosida, 1979

Atropus atropos 48 - - - Das et al., 1980

Carangoides armatus 48 - - - Das et al., 1980

Carangoides equula 48 48 - 48 Murofushi & Yoshida, 1979

Caranx equula 48 48 - 48 Murofushi & Yoshida, 1979

C. crysos 46 48 2m/sm 44 Netto, 1997

C. sansun 48 50 - 46a/2st Patro & Prasad, 1979

C. sexfasciatus 48 48 - 48 Murofushi & Yosida, 1979

Chloroscombrus 48 48 - 48 Pauls, 1993; Netto, 1997 chrysurus

Selene setapinnis 46 48 2m/sm 44 Netto, 1997

Selene vomer 48 50 - 46a/2st Rodrigues et al. , 2007

Seriola dumerili 48 50 2sm 46a Vitturi et al. , 1986

Seriola dumerili 47 50 1m/2sm 44a Vitturi et al. , 1986

Seriola dumerili 48 52 2sm 44a/2st Sola et al., 1997

44a/2st4 S. quinqueradiata 48 50 2sm Ida et al., 1978 6

Seriola nigrofasciata 48 48 - 48 Tripathy & Das, 1988

Trachinotus carolinus 48 56 8m/sm 40 Rodrigues et al. , 2007

T. falcatus 48 58 10m/sm 38 Rodrigues et al. , 2007

T. goodei 48 52 4m/sm 44a Rodrigues et al. , 2007

Trachurus japonicus 48 66 18 30 Murofushi & Yosida, 1979

T. mediterraneus 48 58 10 38 Vasil'ev, 1980

T. mediterraneus 48 70 4m/4sm 26a/14st Caputo et al. , 1996

T. trachurus 48 50 2m 46a Caputo et al. , 1996

Selar malam 48 50 2sm 46 Choudhury et al . (1993)

Selar kalla 56 56 - - Choudhury et al . (1993)

a – acrocêntrico; st – subtelocênrico; m– metacêntrico; sm – submetacêntrico, NF=Número Fundamental 6

2- OBJETIVOS

2.1- Objetivo Geral

O presente trabalho objetivou estabelecer os padrões cromossômicos das espécies Atlânticas de importância comercial que compõe a família Carangidae, através de técnicas citogenéticas convencionais e hibridação in situ , que subsidiarão uma melhor compreensão da taxonomia do grupo, da distribuição espacial da variabilidade genética, dos aspectos evolutivos dos cromossomos da família, conservação da biodiversidade, manejo adequado dos recursos naturais e determinação de marcadores citotaxonômicos visando seu uso futuro no estabelecimento de plantéis reprodutores para cultivo.

2.2- Objetivos Específicos

1. Determinação da macroestrutura cariotípica das espécies que compõe a família Carangidae, no litoral brasileiro, definindo suas tendências evolutivas e mecanismos de mudança; 2. Estabelecimento dos padrões cromossômicos estruturais das espécies de Carangidae pelo uso de bandamentos cromossômicos para identificação das regiões organizadoras de nucléolos e da heterocromatina constitutiva e pelo

emprego de fluorocromos base-específicos (DAPI / CMA 3); 3. Mapeamento cromossômico dos genes ribossomais 18S e 5S por meio de hibridação in situ com sondas fluorescentes (FISH); 4. Caracterização dos padrões cromatínicos de Carangidae, revelados através do emprego de endonucleases de restrição e bandas de replicação pela incorporação in vivo e in vitro do análogo de base BrdU; 5. Diagnóstico citogenético das espécies de Carangidae propiciando sua utilização na manejo da pesca e consolidação da piscicultura marinha de espécies com potencial para cultivo.

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3- MATERIAL E MÉTODOS

3.1-Material

O material analisado foi coletado em diversos pontos ao longo da costa do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil, assim como no Arquipélago de São Pedro e São Paulo (00°55.1'N 029º20.7'W) e Atol das Rocas (3°51´36“ S, 33°49´5“ W) sobretudo em regiões reconhecidamente prioritárias em função da biodiversidade existente, variedade de habitats e exploração pesqueira. As coletas foram realizadas usando diferentes apetrechos de pesca, direcionados para o ambiente a ser estudado e/ou particularidades de cada grupo taxonômico a fim de obter maior variedade de espécies.

Os espécimes coletados foram acondicionados em sacos plásticos com adição de oxigênio puro, até a sua chegada e acomodação em tanques, nas dependências do laboratório de Genética de Recursos Marinhos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para posterior desenvolvimento das práticas citogenéticas. Todos os espécimes utilizados foram fixados em formol por 5 dias e transferidos para álcool etílico 85% para futura identificação, armazenamento e depósito de exemplares testemunhos em coleções ictiológicas e museus na Universidade Federal do Rio Grande do Norte e em outras instituições de pesquisa qualificadas. Identificações das espécies foram obtidas através de consulta a um taxonomista de grupos marinhos .

3.2- Métodos

3.2.1-Preparações cromossômicas

Após estimulação da divisão celular por meio da inoculação de agentes mitogênicos nos indivíduos por 24-48 horas (Molina, 2001), os animais foram sacrificados para retirada dos tecidos adequados às análises citogenéticas. Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim anterior, segundo a técnica direta de air-drying (Bertollo et al. , 1978). Alternativamente, procedimentos in vitro , utilizando meio de cultura RPMI contendo fragmentos de tecido renal (Gold et al. , 1996).

A partir da suspensão celular obtida pelos procedimentos acima descritos, foi realizada a caracterização cariotípica dos espécimes com uso de coloração convencional. Após preparação de lâminas coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato (pH 6,8), foram selecionadas as melhores metáfases para definição do número diplóide e confecção do cariótipo dos animais analisados. Os cromossomos foram classificados morfologicamente de acordo com Levan et al. (1964) e organizados no cariótipo em ordem decrescente de tamanho.

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3.2.2-Identificação de padrões heterocromáticos (bandamento C)

A heterocromatina constitutiva foi evidenciada pelo bandamento C (Sumner, 1972), com algumas adaptações de acordo com o material em estudo. As lâminas foram tratadas com uma solução de HCl 0,2 N, à temperatura ambiente, durante 13 minutos e, a seguir, submergidas numa solução de hidróxido de bário 5%, à temperatura ambiente, por 1 minuto. Logo após, as lâminas foram lavadas em solução de HCl 0,2N e incubadas numa solução salina 2xSSC, aquecida a 60°C, por 30 minutos. Os cromossomos foram corados com uma solução do Giemsa 5%, em tampão fosfato pH 6,8 durante 8 minutos. Após cada um dos passos acima, as lâminas forma lavadas com água destilada e secas ao ar.

3.2.3-Detecção de Regiões Organizadoras de Nucléolos (Ag-RONs)

Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) ativas, será utilizado o procedimento descrito por Howell & Black (1980), empregando nitrato de prata (AgNO 3). As lâminas foram tratadas com uma mistura contendo 2 partes de uma solução aquosa de gelatina 2% (acrescida de ácido fórmico 1% na proporção de 1ml para cada 100ml de solução) e 4 partes de uma solução de nitrato de prata 50%. O material foi recoberto com lamínula e incubado em estufa a 60° C, por aproximadamente 5 minutos. A lamínula foi então retirada com um jato de água destilada e os cromossomos corados com Giemsa 5% em tampão fosfato (pH 6,8) por cerca de 30 segundos. Após esse período, as lâminas foram lavadas em água corrente e secas ao ar.

3.2.4-Coloração com Fluorocromos GC- e AT-específicos (CMA 3 e DAPI)

A dupla coloração por fluorocromos base-específicos (CMA 3 e DAPI) seguiu a metodologia descrita por Barros-e-Silva & Guerra (2009). Preparações cromossômicas foram submetidas, a seguir, em formamida 70%/2xSSC a 70ºC por 2 minutos. Posteriormente, as lâminas foram banhadas por duas vezes em 2xSSC à temperatura ambiente por 2 minutos em cada banho. As lâminas foram então transferidas para uma bateria de álcool 70%, 85% e 100%, por 2 minutos em cada banho. Após secagem, foram adicionados 80µl de cromomicina A 3 em cada lâmina, permanecendo 30 minutos em câmara escura na geladeira. Após este período, as lâminas foram banhadas em três vezes em PBS 1x, dois minutos em cada banho e imediatamente montadas com 80 µl de solução de DAPI/Antifading (0,2 µg/ml).

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3.2.5-Hibridação fluorescente in situ (FISH) – Sondas 18S e 5S

A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. As sondas foram marcadas por nick translation (BioNick Labeling System – Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A solução de hibridação consistiriu de 200 µl de formamida 50%, 80 µl de sulfato dextrano 50%, 40 µl de 20xSSC, 80 µl de água q.s.p., perfazendo um volume total de 400 µl, sendo adicionado 1,5 µg de sonda (DNA marcado com biotina). Em seguida, a solução de hibridação foi transferida para um banho fervente, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico. As lâminas, contendo as preparações cromossômicas, foram lavadas com tampão PBS 1x por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e posteriormente desidratadas em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Em seguida, foram colocadas em RNAse (100 µg/ml) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida a 37° C. Após este período as lâminas foram lavadas em soluções salinas. O material foi desidratado em uma série alcoólica, 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2xSSC a 70° C, por 5 minutos, para desnaturação dos cromossomos. Uma nova desidratação em série alcoólica foi feita. Foram aplicados sobre a lâmina, 50 µl da solução de hibridação contendo a sonda desnaturada, permanecendo overnight a 37 o C em câmara úmida. Transcorrido esse tempo, as lâmina foram lavadas em solução de formamida 50%/2xSSC a 42 o C por 10 minutos, três vezes em 0,1xSSC a 60°C, 5 minutos em cada lavagem, e em solução Tween 20 (0,05%/2xSSC), sob agitação, por 5 minutos. Foi feito um tratamento com 90 µl de NFDM 5% ( non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4xSSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. A detecção da sonda foi feita, colocando-se sobre as lâminas, 70 µl de FITC (fluoresceína isotil cianato-avidina conjugada) a 0,25 µg/µl, por 30 minutos, em câmara úmida, com três lavagens sucessivas com Tween 20, durante 5 minutos em cada lavagem. O sinal de hibridação foi amplificado com cerca de 70 µl de anti- avidina biotina-conjugada, por 30 minutos, com três lavagens adicionais com Tween 20, durante 5 minutos em cada lavagem. Este ciclo e o tratamento com FITC serão repetidos mais uma vez. Finalmente, a lâmina será desidratada em série alcoólica (70%, 85% e 100%), durante 5 minutos em cada banho. Os sinais de hibridação serão detectados com avidina-FITC e os cromossomos contra-corados com iodeto de propídio (50 µg/ml) ou DAPI (0,2 µg/ml).

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3.2.6-Microfotografias e captura de imagens

As preparações cromossômicas convencionais foram analisadas e fotografadas em microscópio óptico. As preparações de FISH e de fluorocromos base-específicos foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX50, equipado com sistema digital de captura de imagens.

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3.3-Analises Morfométricas

Para as analises morfométricas, fotografias sob escala foram obtidas do lado esquerdo de cada exemplar com uma câmera digital Sony H10 (8,1 megapixels) acoplada a um tripé. Todos os exemplares tiveram o sexo definido por exame macroscópico das gônadas. Utilizou-se e software TPSDig2 utilizado para localizar os landmarks e as coordenadas X e Y que foram sobrepostas através do software CoordGen, utilizando análises Procruster (Rohlf & Slice, 1990). Análises de componentes principais e variáveis canônicas também foram utilizadas para discernir diferenças na morfologia dentro e entre os grupos de estudo (populações, espécies, regiões de coleta), considerando-se análise de significância de MANOVA quando forem analisados mais de um grupo. Ambos os testes foram realizados com o software PCAGen e CVAGen respectivamente. A partir da média de distribuição das espécies no gráfico de variáveis canônicas, foram realizadas matrizes de deformações, para comparação de diferenças morfológicas (Rohlf & Slice, 1990). Todas as análises foram realizadas no software MorphoJ 1.02 (Klingenberg, 2008).

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Capitulo 1

PROTOCOLOS CITOGENÉTICOS E PERSPECTIVAS BIOTECNOLÓGICAS VOLTADAS À PISCICULTURA MARINHA

Molina, W.F & Jacobina, U.P

PROTOCOLOS CITOGENÉTICOS E PERSPECTIVAS BIOTECNOLÓGICAS VOLTADAS À PISCICULTURA MARINHA-UMA REVISÃO

Wagner Franco Molina & Uedson Pereira Jacobina

Introdução

O conhecimento dos aspectos da biodiversidade nos ecossistemas marinhos é sensivelmente menor em relação ao ambiente terrestre. Apenas 10% da investigação sobre a biodiversidade global têm sido dedicado a estes ecossistemas (Hendriks et al ., 2006). Isto é particularmente preocupante em face às mudanças globais decorrentes da sobreexploração de recursos naturais e as alterações climáticas. Estas alterações vêm causando efeitos impactantes em vários ecossistemas importantes ao ambiente marinho, incluindo regiões estuarinas e de recifes de corais (Pauly et al ., 2002; Hughes et al ., 2003) gerando efeitos variados sobre as populações de peixes (Hendriks, et al., 2006). Atrelado a questões ambientais a redução dos estoques pesqueiros naturais está intrinsecamente e perigosamente relacionada à segurança alimentar e ao bem estar social mundial (Camargo & Pouey, 2005; Jiang, 2010). Neste aspecto, a produção pesqueira alcançou seu potencial máximo de extração, sendo incapaz de atender a demanda mundial de forma sustentável. Um terço das reservas mundiais de peixes está esgotado ou em fase de recuperação e necessitam de ser reconstituídas (FAO, 2006). Estima-se caso o ritmo de exploração da pesca extrativa marinha se mantenha, que haja um colapso global das atividades de pesca comercial até 2048 (Geraque, 2006). Os setores da pesca e aquacultura representam meio de subsistência para 540 milhões de pessoas. Além disto, dependência deste insumo é constatada pelo consumo histórico alcançado em 2010, contabilizando em média de 17 quilos de pescado por pessoa, ou 15% da dieta média de proteínas de origem animal para três bilhões de pessoas (FAO, 2010). Assim, é senso comum que a aquacultura representa a única alternativa futura viável à manutenção do consumo de proteína animal de origem aquática.

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Atualmente, a produção da piscicultura marinha está concentrada principalmente no salmão do Atlântico ( Salmo salar ) a espécie cuja produção teve a maior expansão nos últimos anos. Outras espécies que também tiveram aumento significativo de produção foram o robalo europeu ( Dicentrarchus labrax ) e o pargo (Sparus aurata ) (Alarcon & Alvares, 1999; Zanuy, 2001). Um passo importante para o sucesso desta atividade recai na exata compreensão, pelo setor produtivo, das diferenças e perspectivas genéticas que envolvem as populações naturais e estoques cativos de reprodutores. Populações naturais normalmente representam um repositório de ampla base genética da espécie, modelado sob ação da seleção natural, sua manutenção é fonte permanente de germoplasma a ser utilizado para fins de melhoramento genético. Estoques cativos de reprodutores, por outro lado, constituem quase sempre uma amostra genética limitada nem sempre representativo do pool gênico das populações ou espécies e completamente dependente do manejo e dos cruzamentos envolvidos para a sua perpetuação. Desde meados da década de 80, abordagens genéticas passaram a contribuir nos programas de criação de peixes com o emprego de técnicas clássicas e modernas, levando a um crescimento vertiginoso entre outras abordagens, da investigação e aplicações das informações cromossômicas (Hussain, 1996; Arai, 1997a,b; Pandian & Koteeswaran, 1998; Jacobina et al ., 2011). De fato, os conhecimentos sobre o cromossomo e marcadores de DNA estão cada vez mais incorporados à aquicultura de forma prática eficiente. Neste sentido, o desenvolvimento de tecnologias de manipulação cromossômica, identificação de sexo cromossômico, criopreservação de gametas, transgênicos e o mapeamento genético, abordagens apoiadas no melhor conhecimento dos cromossomos das espécies e relacionadas ao melhoramento genético de peixes cultivados, têm sido foco de discussões e revisões durante a última década (Hulata, 2001). A piscicultura marinha vem se desenvolvendo de forma crescente em escala global, contudo em geral enfrenta algumas limitações ao seu pleno desenvolvimento, fatores como baixo conhecimento sobre a biodiversidade de algumas regiões, conhecimento limitado sobre o ciclo de vida de espécies, questões sociais e ambientais e reduzido conhecimento sobre aspectos genéticos das

2 espécies podem se colocar como empecilhos ao seu pleno desenvolvimento (Hutchings, 2001; Dulvy et al., 2003). Diante da importância da aplicação das informações e protocolos genéticos na aquicultura marinha, aqui é apresentada uma breve revisão sobre os principais empregos e perspectivas do estudo dos cromossomos relacionados à piscicultura marinha.

Identificação da biodiversidade de espécies e estoques

A citogenética representa o ramo da genética relativo ao estudo dos cromossomos quanto a seus aspectos morfológicos e funcionais, sua variação e evolução. Nas últimas décadas, a citogenética vem se destacando por uma abordagem eficiente na caracterização de grupos naturais, utilizando dados cariotípicos para identificação de espécies (citotaxonomia) e na elaboração de padrões de relacionamento e ou filogenias (citossistemática). A grande maioria das espécies é cariotipicamente única, diferindo de outras em relação ao número e a morfologia cromossômica e/ou em relação a características estruturais dos seus cromossomos (Dias & Giuliano-Caetano, 2002). Cerca de 3.425 espécies e sub-espécies já têm algum nível de informação cromossômica conhecida (Arai, 2011). Estes dados têm se mostrado uma ferramenta auxiliar na taxonomia, uma vez que os métodos tradicionais de classificação de espécies com a utilização de análises de caracteres morfológicos estão sujeitos a uma maior variação geográfica ou ambiental (Bertollo et al ., 1978). Caracteres cromossômicos vêm sendo progressivamente utilizados com sucesso na identificação de espécies crípticas (Bertollo et al ., 1978; Moreira-Filho et al ., 1991), assim como nas relações entre espécies (Brum & Galetti, 1997). No que diz respeito aos estudos em peixes, ela têm fornecido importantes subsídios para o melhor entendimento das relações evolutivas entre espécies e populações. A identificação da biodiversidade é uma etapa fundamental para medidas de conservação dos recursos pesqueiros ameaçados além de contribuir para seu uso sustentável e manejo. Características cromossômicas têm sido relacionadas entre os mais poderosos marcadores genéticos na identificação taxonômica de unidades evolutivas significativas (Moritz et al ., 1996).

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Estudos citogenéticos na região Neotropical têm mostrado algumas unidades taxonomicas evolutivas como no caso da espécie nominal Hoplias malabaricus que possui sete citótipos em diverge quanto ao número diploide de 2n=39 a 42 cromossmos, com ocorrêcia de sistema de cromossomos sexuais simples ou múltiplo, assim como, ausência destes (Bertollo , et al ., 2000). Alguns citótipos mostram ampla distribuição geográfica, enquanto outros parecem ser endêmicos a determinadas bacias hidrográficas. Situações de simpatria e sintopia entre citótipos, sem a detecção de espécimes com fórmulas cromossômicas híbridas, já foram constatadas em várias localidades, o que reforça a diferenciação existente nesse grupo, sugerindo a inexistência de fluxo gênico entre os citótipos (Ferreira et al., 1989; Scavone et al ., 1994; Lemos et al ., 2002; Pazza & Júlio Jr., 2003; Born & Bertollo, 2006). Diferenças quanto ao número diplóide também foram detectadas em Synbranchus marmoratus em que o número diplóide varia de 2n=42 a 2n=46, assim como a presença de tipos diferenciais de hemoglobina tipo I (2n=44 a 46) e tipo II (2n=42) (Nakamoto et al ., 1986; Torres, 2000). Uma alta variabilidade na fórmula cariotípica tem sido identificada na espécie Astyanax scabripinnis , que também mostra marcada diferenciação relacionada à quantidade e variabilidade de blocos heterocromáticos e sítios Ag-RONs (Moreira-Filho & Bertollo, 1991; Mizoguchi et al., 1998; Mantovani et al ., 2000). Neste sentido, estudos citogenéticos se mostram úteis a diferentes propósitos na caracterização de populações e espécies, seja na identificação de polimorfismos (Mantovani et al ., 2000; Porto-Foresti, 2007; Molina & Galetti, 2008), diferenças populacionais sutis (Cioffi et al ., 2009), na detecção de espécies crípticas (Moreira-Filho et al ., 1991; Aguilar & Galetti, 2008; Vicari et al ., 2008). De forma aplicada, estes dados possibilitam o monitoramento e manejo adequado, visando à conservação e a exploração racional dos estoques pesqueiros. As informações cariotípicas ainda são incipientes em espécies de peixes marinhos, que representam uma das grandes fronteiras a serem ultrapassadas para expansão da piscicultura comercial em alguns países. Grande parte dos estudos disponíveis tem focado na determinação dos aspectos da macroestrutura cariotípica de variados grupos, entre eles alguns de grande importância para a aquicultura (e.g. Jacobina et al ., 2011). Desta forma, têm sido identificados marcadores citotaxonômicos, sistemas de cromossomos sexuais, cromossomos Bs

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(supranumerários) e os mecanismos evolutivos envolvidos na sua diferenciação (Brum, 199; Molina, 2007; Martinez et al., 2009, entre outros). Técnicas clássicas de caracterização cromossômica (coloração convencional, Ag-RONs, bandamento C) vem sendo empregadas na maior parte dos estudos citogenéticos em vertebrados, assim como em peixes. Estes conhecimentos, embora apresentem limitações, tem disponibilizado um conhecimento aplicável a vários fins biotecnológicos, destacando-se a manipulação cromossômica e a obtenção de linhagens poliplóides, ginogenéticas, androgenéticas e detecção de híbridos interespecíficos (Komen & Thogard, 2007; Piferrer et al., 2011). Devido à possibilidade de variação mesmo entre espécies próximas, as regiões organizadoras nucleolares (RONs) estão entre os marcadores citotaxonômicos mais empregados. As RONs são regiões do DNA responsáveis pela transcrição do RNA ribossômico, frequentemente exibem padrões particulares aos diferentes grupos de peixes, podendo variar no número, localização, intensidade de coloração e tamanho, com diferenças inter-individuais dentro de uma mesma espécie ou mesmo em mosaico, entre células de um mesmo indivíduo (Morelli, 1998). Variações numéricas inter ou intra-individuais no tamanho, localização e no número já foram descritas em vários gêneros. Em alguns grupos, a presença destes sítios em apenas um par de cromossomos é a condição mais frequente. Este padrão já foi observado tanto em famílias dulcícolas como Prochilodontidae (Pauls & Bertollo, 1990), Anostomidae (Galetti et al., 1984), Parodontidae (Moreira-Filho et al ., 1985), assim como em espécies marinhas das famílias Carangidae (Caputo, 1996), Mugilidae (Sola, 2007), Lutjanidae (Rocha & Molina, 2008), Apogonidae (Araújo et al ., 2009), entre outras. Em outros peixes ocorrem NORs múltiplas ou simples, como Astyanax (Morelli, 1981; Moreira-Filho, 1989; Paganelli, 1990), Hoplias (Born & Bertollo 2000; Vicari et al ., 2003), ou preferencialmente múltiplas como em Salmo (Martínez et al., 2009). Um padrão muitas vezes distintivo entre os cariótipos dos peixes reside na distribuição e qualificação da heterocromatina. Regiões heterocromáticas compreendem DNA repetitivo, identificados preliminarmente pelo bandamento C ou por fluorocromos base-específicos. Os cariótipos de muitas espécies de Perciformes tem mostrado uma distribuição da heterocromatina principalmente nas regiões centroméricas e terminal (Molina, 2007). Contudo, outros grupos

5 filogenéticos como Characiformes, podem apresentar grandes segmentos heterocromáticos em posição intersticial como em Astyanax (Mantovani et al., 2000). Fluorocromos base-específicos vêm sendo empregadas acessoriamente para qualificar as regiões cromossômicas heterocromáticas em peixes. Em peixes, as RONs com poucas exceções, apresentam-se como regiões de intensa fluorescência quando submetidos à fluorocromos GC-específicos (Schweizer, 1980). Por outro lado, o DAPI (4'-6-diamidino-2-phenylindole) forma complexos fluorescentes com o DNA, mostrando especificidade por regiões ricas em bases AT. Segmentos heterocromáticos ricos em bases AT são menos frequentes em peixes podendo, contudo, serem encontrados em algumas espécies (Amemiya & Gold, 1986). Estes e outros métodos vêm permitindo a identificação da estrutura, organização molecular, o mapeamento de genes específicos, até o comportamento dos cromossomos nas diferentes fases do ciclo celular.

Mapeamento cromossômico - Hibridação in situ

Detecção de seqüências repetitivas e teloméricas

Os DNAs satélites representam uma importante porção do genoma eucarioto composta por diferentes classes de DNA repetitivos, não codificadora e organizada em tandem , com unidades de cerca de 100-300 pares de bases (Sumner, 1990; Epplen & Epplen-Haupt, 2002), que podem estar dispersas no genoma, ou organizadas em matrizes em tandem (Charlesworth et al., 1994; Koehler et al ., 1997). Unidades de DNAs satélites podem estar presentes de centenas a milhares de cópias em um genoma. Diferentes famílias de DNA satélite têm sido isoladas, caracterizadas e localizadas em cromossomos de diversas espécies, evidenciando uma grande correlação com regiões de heterocromatina constitutiva (John, 1988; Lohe et al., 1993; Lohe & Hilliker, 1995). Unidades monoméricas repetidas são comumente detectadas nas regiões centroméricas e teloméricas de alguns ou de vários cromossomos de um determinado organismo, associadas a blocos de heterocromatina constitutiva (Tyler-Smith & Willard, 1993). Além da quantidade e da localização de sequências específicas de DNA satélite variarem grandemente entre espécies distintas, estas muitas vezes mostram-se espécie-específicas, o que 6 sugere não somente uma origem distinta, como também pode ser resultado de um processo evolutivo dinâmico que leva à contínua geração, amplificação, eliminação e substituição de famílias de DNAs satélites (Ugarkovic & Plohl, 2002). Embora análises envolvendo DNA repetitivos venham sendo realizadas em um grande número de taxa (Singh et al., 1980; Dibartolomeis et al., 1992; Capriglione et al., 1994; Rajyashri & Singh, 1995; Subramanian et al., 2003; Li et al., 2005; Krzywinski et al., 2005; Bulazel et al., 2006; Navajas-Perez et al., 2006), ainda se conhece muito pouco sobre a composição molecular de diferentes tipos de DNAs satélites em alguns grupos de vertebrados, como em peixes. Estudos em diferentes espécies de peixes teleósteos têm demonstrado que repetições de DNA satélite podem ser úteis em estudos filogenéticos (De La Herrán et al., 2001; Saito et al., 2007; Kantek et al ., 2009), para explicitar as relações entre complexos de espécies (Mantovani et al., 2004; Vicari et al., 2008; Kantek et al. , 2009), determinar origens de cromossomos supernumerários (Mestriner et al., 2000; Jesus et al., 2003; Ziegler et al., 2003; Artoni et al., 2006) e caracterizar cromossomos sexuais (Matsuda et al., 1997; Devlin et al., 2001; Centofante et al., 2002; Vicente et al., 2003; Vicari et al., 2003). Um novo e grande salto qualitativo das análises cromossômicas tem ocorrido a partir da disponibilização das técnicas de hibridação in situ . Estas metodologias que envolvem sequências alvo e sondas específicas aumentaram a resolução e precisão no mapeamento cromossômico pelo acesso a regiões específicas dos cromossomos, desde genes de cópia simples a unidades repetitivas particulares (Kasahara, 2009). Além de sequências relacionadas a regiões específicas, podem ser obtidas sondas com a intenção de analisar braços cromossômicos ou cromossomos inteiros. Diante das possibilidades de uso, os procedimentos de FISH abriram maiores perspectivas para a citogenética comparativa, tanto voltada para análises de evolução cromossômica ou detecção de características cariotípicas aplicadas voltadas à produção. A ampliação de estudos acerca da composição e distribuição de diferentes famílias de DNAs satélites em peixes e outras regiões cromossômicas poderá fornecer maiores contribuições à caracterização genética de diferentes espécies e à compreensão da evolução do genoma dos peixes, com especial foco em domínios de heterocromatina.

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Sequências teloméricas Os telômeros, regiões particulares encontradas nas extremidades dos cromossomos eucariotos são compostos por repetições da sequência (TTAGGG) n DNA e proteínas (Shippen, 1993), com papel importante na estabilização cromossômica prevenindo fusões e degradação (Blackburn & Szostak, 1984). Sua estrutura básica e função se mostram conservados ao longo da evolução dos vertebrados (Meyne et al. , 1990; Chew et al. , 2002). Apesar do conservadorismo destas regiões, o tamanho das sequências teloméricas variam de espécie para espécie (Martins et al ., 2004). A análise destas regiões são especialmente indicadas na visualização de rearranjos de redução ou aumento cromossômico, sugeridos pela presença de sinais ectópicos intersticiais (Reed & Phillips, 1995). Situações deste tipo já foram identificadas em algumas espécies de interesse comercial, como trutas e salmões (Abuín et al. , 1996) e ciclídeos, como Oreochromis niloticus (Chew et al. , 2002). Contudo a não ocorrência de sequências teloméricas internalizadas em cromossomos que sofreram translocação Robertsoniana tem sido descritos para algumas espécies de peixes (Molina & Galetti, 2002). Este fato já descrito para outros grupos vertebrados não é incomum (Meyne et al. , 1990) e possivelmente é decorrente de perdas durante o processo de fusão ou acúmulo de mutações ou aquisição de elementos repetitivos gerando ausência completa da sequência original ou redução ou ausência de homologia com as sondas limitando sua detecção.

Marcadores citotaxonômicos e aspectos funcionais

DNA ribossomal 18S e 5S

Estudos sobre genes ribossomais têm ganhado destaque em análises citogenéticas ou moleculares em uma ampla variedade de animais e plantas, especialmente na caracterização de espécie e/ou populações/estoques. Em eucariotos superiores, estes genes são organizados em duas famílias multigênicas distintas de repetições em tandem , compostas por centenas de milhares de cópias. Uma classe é representada pelo 45S rDNA, unidade transcricional que codifica o 18S, 5,8S e 28S rRNAs, e um espaçador intergênico não transcrito (IGS). Os sítios

8 de DNAr 45S ativos constituem as regiões organizadoras de nucléolos (NORs), que aparecem como constrições secundárias, visíveis como cromatina menos condensada, nos cromossomos metafásicos. As proteínas associadas às NORs transcricionalmente ativas são argentofílicas permitindo que estes sítios cromossômicos sejam detectados por reação à prata (Santoro, 2005). A outra classe de genes rRNA codificam para o 5S rRNA que consiste de uma seqüência altamente conservada de 120pb que é separada de cada unidade transcricional por um espaçador não-transcrito variável (NTS) (Longe David, 1980). A seqüência de genes rRNA são bem conservadas, quando se compara entre os taxa, enquanto os espaçadores não-transcritos mostram grande extensão e variação de seqüências, que acredita-se proporcione um dinamismo acentuado para os genes rRNA (Galetti & Martins, 2004). A técnica de FISH com sondas para a família 45S, em peixes, tem sido amplamente empregada para validar polimorfismos de Ag-NORs, resultantes de atividade diferencial de transcrição, assim como decorrentes do número variavél de repetições presentes pelo RNAr. Ao contrário do RNAr 45S, que pode ser identificado pela impregnação com a prata, a localização dos sítios de DNAr 5S é realizado por hibridação in situ . O mapeamento de genes RNAr 5S em diversas espécies de peixes tem evidenciado sítios comumente localizados em porção intersticial dos cromossomos, como observado em espécies de salmonídeos e outras famílias (Fujiwara et al. , 1998; Martins & Galetti, 1999; Vicente et al. , 2001). Na piscicultura a utilização destes marcadores cromossômicos se revela importante na identificação de híbridos interespecíficos como no caso das espécies de Piauçu ( Leporinus macrochepalus ) e Piapara ( Leporinus elongatus ) (Hashimoto, 2008), assim como verificação de poliploides induzidos artificialmente como em alguns ciprinideos, como no caso do Tropidophoxinellus alburnoides (Carmona et al.,1997), assim como em salmoniformes na truta arco-íris Salmo gairdneri (Refestie et al ., 1981) e Rhodeus ocellatus (Ueno & Arimoto, 1982), entre outros. Marcadores cromossômicos têm revelado a letalidade entre cruzamentos de trutas arco íris ( Onchorhynchus mykkis ) portadores de polimorfismos nas regiões organizadoras de nucléolo, uma vez que rearranjos cromossômicos envolvendo uma inversão pericêntrica ocasionaram uma disfunção na síntese de

9 proteínas e consequentemente letalidade no indivíduo portador de tal rearranjo. Neste caso, o indivíduo portador de dois segmentos nucleolares no mesmo cromossomo era uma condição de letalidade (Porto Foresti et al., 2004).

Aspectos citogenéticos de cruzamentos heteroespecíficos

Na piscicultura, dentre as metodologias de manipulação genética a que mais tem sido aplicada é a hibridação, que pode envolver o cruzamento entre linhagens da mesma espécie (intraespecífica) ou grupos geneticamente diferentes pelo cruzamento entre espécies separadas (interespecífica). Esta técnica de reprodução visa alcançar características específicas desejáveis ou melhoramento de uma forma geral do desempenho no cultivo. Geralmente, resulta na produção de prole que apresenta um desempenho melhor do que a média de ambas as espécies parentais, conhecido como vigor híbrido ou heterose positiva (Bartley et al. , 2001) Até recentemente, análises citogenéticas têm sido consideradas principalmente como uma ferramenta para estudos evolutivos, sendo pouca utilizada no manejo e monitoramento de estoques cultivados. Caso as análises convencionais não sejam suficientes para caracterizar um grupo ou indivíduo sob análise, a identificação pode ser baseada em outros marcadores cromossômicos estruturais derivados de detecção das regiões organizadoras de nucléolo, bandas de replicação pela incorporação da 5-bromodeoxiuridina (5-BrdU), coloração por fluorocromos base-específicos e o mapeamento de sequências específicas com o uso da hibridação in situ fluorescente (FISH) (Ocalewicz et al. , 2007; Porto-Foresti et al. , 2006). Métodos citogenéticos apresentam várias vantagens em relação a outros marcadores genéticos. Além do baixo custo, constituem uma forma precisa de se identificar desde níveis de ploidia, à procedência dos complementos cromossômicos dos parentais nos produtos resultantes de hibridação interespecífica (Toledo-Filho et al. , 1994; Ocalewicz et al. , 2007). Em alguns casos, o número diplóide e morfologia cromossômica são similares, como no caso dos pacus e tambaquis e seus híbridos recíprocos. Por outro lado, híbridos triploides (3n) provenientes do cruzamento destas espécies são precisamente detectáveis entre os híbridos interespecíficos gerados (Almeida-Toledo et al., 1987). Algumas

10 vezes as espécies parentais apresentam diferentes composições cariotípicas, relacionadas à diferenças no número diploide, fórmula cariotípica e/ou número fundamental, de tal maneira que, os produtos híbridos podem ser caracterizados pela valor diploide intermediário em relação aos parentais ou diferença morfológica de alguns cromossomos com qualquer das espécies parentais, como em Colossoma macropomum e Mylossoma duriventris (Kossowski et al. , 1983). Quando híbridos e parentais apresentam o mesmo cariótipo (similaridade numérica e morfológica), torna-se necessário o emprego das metodologias de bandamento cromossômico para identificação de pares marcadores espécie- específicas. O padrão heterocromático dos cromossomos permite a precisa identificação dos parentais e dos híbridos obtidos dos cruzamentos entre o pacu (Piaractus mesopotamicus ) e o tambaqui ( Colossoma macropomum ) (Almeida- Toledo et al. , 1987). Resultados práticos similares para identificação de híbridos em peixes tem sido obtidos para diferentes espécies de valor econômico, como em Cipriniformes carpas (Almeida-Toledo et al ., 1995) e Salmoniformes cultivados (Kendal et al., 2009 ). De fato, a manipulação genética que consiste na junção de genomas evolutivamente diferenciados através da hibridação interespecífica induzida é de grande empregabilidade prática, os resultados obtidos através desta técnica precisam, entretanto, ser parcimoniosamente interpretados, devido às questões de segurança ambiental, pelo risco de introgressão de genes exógenos em populações naturais e quanto à heterogeneidade dos produtos híbridos (Ryman & Utter, 1987; Toledo-Filho et al ., 1988). A caracterização citogenética dos parentais e a identificação genética de estoques híbridos é um procedimento bastante recomendável para as estações de piscicultura que utilizam essas técnicas no melhoramento animal. Apesar dos riscos à biosegurança ambiental os resultados esperados através das hibridação, reforçam sua utilização em algumas condições diante da possibilidade de manejo adequado a uma menor exploração dos estoques naturais, ou práticas favoráveis dos estoques cultivados, produção de indivíduos com características qualitativas diferenciadas ao consumo alimentar, à pesca esportiva e à produção de peixes ornamentais.

Manipulação cromossômica em peixes marinhos – Casos e perspectivas

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O conhecimento prévio dos padrões cromossômicos de uma espécie cultivável abre perspectivas para a implementação e monitoramento de técnicas voltadas à produção de peixes. Entre as possibilidades se destaca a manipulação cromossômica. Metodologias deste tipo vêm sendo empregadas com sucesso em diversas espécies de peixes de grande valor econômico (Beardmore et al ., 2001; Devlin et al ., 2002; Zang et al ., 2004). A manipulação cromossômica se dá pela interferência física ou funcional nos cromossomos, durante o ciclo celular, por agentes físicos ou químicos. Dois objetivos básicos têm estimulado pesquisas nesta área, o primeiro consiste na manipulação de lotes completos de cromossomos de uma espécie, conhecido como poliploidização, o segundo é a obtenção de indivíduos com genoma de apenas um dos parentais, processos conhecidos como ginogênese (genoma materno preservado) ou androgênese (genoma paterno preservado). Poliplóides podem ser definidos como organismos com um ou mais conjuntos de cromossomos adicionais com relação ao número mais freqüentemente encontrados na natureza para uma determinada espécie. Poliploidia tem sido envolvido na especiação de animais e principalmente em plantas (Mable, 2004; Hegarty & Hiscock, 2007). Nos peixes este mecanismo parece ter surgido extensivamente, de forma independente, várias vezes durante a sua evolução, com maior incidência nos grupos mais primitivos (Legatt & Iwama, 2003). Peixes poliplóides induzidos artificialmente vêm sendo usados na aquicultura para alcançar esterilidade ou aumento de produção (Donaldson & Devlin, 1996). Interações genéticas e epigenéticas entre genes redundantes em peixes poliplóides (Comai, 2005), provavelmente influenciaram o destino da sua evolução, levando à extensa diversidade biológica atual (Le Comber & Smith, 2004). A poliploidia está relacionada a evolução de diversos grupos de espécies, como alguns ciprinídeos e cobitídeos (Ueda & Ojima, 1978; Lusková et al ., 2002; Vasil'ev et al ., 2003; Juchno & Boro, 2006), bem como alguns outros importantes na aquicultura como os esturjões e salmonídeos (Allendorf & Thorgaard, 1984).

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Processos de poliploidização espontânea, a partir de alterações meióticas ou mitóticas, têm sido observados em várias ordens filogeneticamente distantes (Schulz, 1967; Thorgaard & Gall, 1979). O conhecimento do cariótipo de várias espécies de interesse comercial, possibilitou o monitoramento da manipulação de conjuntos cromossômicos durante a indução de alguns processos, como a poliploidização, ginogênese e androgênese. Em peixes essa manipulação compreende, basicamente, a adição ou a subtração de um conjunto completo haplóide ou diplóide, na meiose ou mitose, respectivamente. Este grupo de organismos oferece vantagens técnicas em relação aos vertebrados superiores, entre elas, a fecundação externa, prolificidade e diferenciação sexual controlável. A poliploidização consiste na produção de indivíduos com número igual ou superior a três conjuntos cromossômicos haplóides completos. Experimentalmente em peixes podem ser produzidos indivíduos com diferentes níveis de ploidia. Poliploides são encontrados espontaneamente em populações selvagens (Molina et al., 2007). Com indutores apropriados podem ser facilmente obtidos em muitas espécies comercialmente importantes de peixes (Piferrer et al ., 2009). Os trabalhos de indução à poliploidia estão direcionados para a obtenção principalmente de indivíduos triplóides que frequentemente apresentam alto grau de esterilidade reprodutiva. Esta condição é atribuída à presença do terceiro conjunto de cromossomos, que provoca a interrupção na meiose I na gametogênese, resultando em diferentes níveis de supressão do desenvolvimento gonadal, que neste caso vai depender da espécie e do sexo (Wang et al ., 2002; Nam & Kim, 2004; Francescon et al ., 2004). A incapacidade de reproduzir triplóides tem sido considerada uma alternativa para as espécies em que a reprodução deve ser controlada, como nos casos de introdução de espécies exóticas nos ambientes naturais ou com risco de contato com ecossistemas não nativos e em peixes transgênicos (Hindar et al. , 1991a,b; Youngson et al ., 2001). Em salmonídeos, o efeito da esterilidade é desejável por evitar a degradação física e susceptibilidade às doenças relacionadas com a maturação sexual. Desta forma, é possível a continuidade do crescimento durante o período reprodutivo, já que a energia para o metabolismo reprodutivo será canalizada para o crescimento

13 corpóreo. Além disso, a maturação sexual é muitas vezes associado com maior incidência de doenças, ou alterações nas propriedades organolépticas das partes comestíveis, como no caso de muitos salmonídeos. Estes problemas tem sido evitados através da indução a poliploidia, particularmente a triploidia (Piferrer et al ., 2009). Todas as estratégias utilizadas na obtenção da poliploidia artificial envolvem a interferência na divisão celular durante a meiose ou mitose. A produção de indivíduos triploides, por exemplo, tem sido alcançada através de duas estratégias. A primeira consiste na indução da triploidia diretamente nos ovos, por tratamento físico ou químico, administrado logo após a fertilização. O segundo caminho é através da obtenção de reprodutores tetraplóides e posterior cruzamento com indivíduos diplóides. Em peixes, esta via é pouco recomendada, pois a sobrevivência dos indivíduos tetraploides é bastante reduzida. Comentários adicionais e aplicações a triploidia podem ser encontrados em alguns trabalhos clássicos como os de Arai (2001), Felip et al . (2001), Hulata (2001), Tiwary et al . (2004) e Maxime (2008), dentre outros. Outro objetivo relacionado com a manipulação cromossômica é a produção de linhagens monosexo, obtido através de ginogênese e androgênese. Diferentemente da poliploidia, há modos de perpetuação clonal do genoma de um dos parentais em peixes, tais como a ginogênese. Esta condição é rara na natureza e requer gametas de outro indivíduo para estimular o processo (Schultz, 1980). Um exemplo bem estudado de ginogênese em meio natural é com a espécie Poecilia formosa (Schartl et al., 1995), Carassius auratus gibelio (Cherfas, 1981; Yamashita et al ., 1993) e Oreochromis niloticus (Carrasco et al ., 1999). A ginogênese e androgênese artificial consistem na produção de indivíduos com apenas a informação genética materna ou paterna, respectivamente. Na ginogênese o ovócito é fertilizado por um espermatozóide que foi geneticamente inativado por radiação. Na androgênese o ovócito é irradiado e fertilizado com espermatozóide normal. Em ambos os casos a diploidização pode ser obtida impedindo-se a 1 a divisão mitótica. Algumas espécies comerciais têm tido bastante sucesso na produção de indivíduos ginogenéticos como, por exemplo, na carpa comum, Cyprinus carpio (Komen et al ., 1991).

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Citogenética e genômica de peixes – uma interface

O mapeamento de genomas tornou-se uma ferramenta poderosa para diversos campos de interesse das pesquisas biológicas, entre eles aqueles voltados para a aquacultura (Alcivar-Warren et al ., 1997; Nakayama, 1998; Tong et al ., 2002). Contudo um número muito limitado de espécies teve seu genoma sequenciado (Zhong et al ., 1998; Venkatesh et al ., 2000; Martins et al ., 2004). No que diz respeito aos peixes, a diversidade no tamanho do seu genoma (quantidade de DNA) tem despertado interesse nas últimas décadas e este progresso vem culminando na construção de mapas genéticos e mapeamentos comparativos, tornando algumas espécies como organismos modelo (Tong & Chu, 2002). Em peixes tanto o tamanho do genoma pode variar muito (0,7-2,7 pg) (Cheng et al ., 1993), como existe uma profusa diversidade no número de cromossomos, embora cerca de 50% das espécies mostrem número diploide entre 48 a 50 cromossomos (Mank & Avise, 2006a). O conjunto de dados do genoma de diferentes espécies de peixes tem permitido examinar sua correlação com diferentes aspectos biológicos das espécies, como o número de cromossomos (Mank & Avise, 2006a), o tamanho dos eritrócitos (Gregory, 2001a, b), tamanho do ovo (Hardie & Hebert, 2003), cuidado parental, taxa metabólica, ambiente (Hardie & Hebert, 2004), a longevidade (Griffith et al ., 2003), a riqueza de espécies (Mank & Avise, 2006b; Olmo, 2006) e risco de extinção (Vinogradov, 2004). Embora o tamanho do genoma dos peixes seja de longe o maior conjunto de dados para qualquer grupo de animais, o conhecimento das causas e consequências da diversidade de conteúdo de DNA neste grupo ainda são preliminares (Smith & Gregory, 2009). Apesar disto, algumas inferências sobre a distribuição e o impacto destas diferenças no genoma, entre os peixes, podem ser divisadas, como por exemplo, que os genomas de peixes de água doce são maiores do que os dos peixes marinhos (Hardie & Hebert, 2004). A nível de espécies individuais, parece haver um declínio na variação de tamanho do genoma de acordo com a temperatura. De fato, peixes de clima frio apresentam quantidades mais elevadas de DNA do que espécies subtropicais e tropicais (Smith & Gregory,

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2009). Correlações entre tamanho do corpo e tamanho do genoma têm sido relatados em alguns invertebrados e podem ser aplicadas a aves e subconjuntos de mamíferos (Gregory et al ., 2001a; Gregory, 2001b) . Em peixes, o tamanho do corpo parece ser inversamente proporcional ao tamanho do genoma, pelo menos quando poliploides não são contados (Smith & Gregory, 2009). Assim como, o tamanho do ovo está também associado ao tamanho do genoma em peixes (Hardie & Hebert, 2004). Ainda se pode verificar que o número de cromossomos está positivamente correlacionado com conteúdo de DNA entre os peixes, mesmo excluindo a influência de poliploidia (Smith & Gregory, 2009). No que diz respeito aos estudos genômicos aplicados, diversos mapas do genoma, ou seja, a representação da posição dos genes e marcadores de DNA não transcritos sobre cada cromossomo tem sido disponibilizada para espécies cultivadas (Tong & Chu 2002). Cada grupo de ligação equivale a um a cromossomo. O processo de mapeamento de um loco sobre um cromossomo depende da formação dos quiasmas durante a meiose. A análise de progênies de cruzamentos experimentais permite identificar a sequência e a distância entre os loci. Se for possível calcular a frequência de recombinação entre os pares de loci é possível construir um mapa de ligação com suas posições sobre os cromossomos. Apesar de algumas dificuldades, como hotspots de recombinação em regiões particulares do cromossomo, geralmente a análise de ligação geralmente permite a definição da ordem e distância aproximada dos loci sobre os cromossomos (Postlethwait et al ., 1994; Jonhson et al ., 1996). O principal objetivo da obtenção de mapas genéticos consiste na possibilidade da identificação e caracterização de QTLs associados com características de interesse econômico, como resistência a determinadas doenças ou ao estresse e seu uso em programas de seleção assistida, voltados a aumentar a eficiência de linhagens geneticamente superiores para produção comercial (Nakayama, 1998; Tong et al ., 2002).

Considerações finais

A utilização das técnicas de manipulação cromossômica tem sido cada vez mais incorporada na piscicultura marinha em termos mundiais (Arai, 2001; Tiwary

16 et al ., 2004; Maxime, 2008). Os aspectos citogenéticos e seus usos aplicados à produção indicam possibilidades de ampla popularização e destacam a eficácia dos cromossomos como indicadores genéticos na piscicultura, seja por meio da caracterização de estoques, diferenciação de linhagens e/ou de híbridos. Tanto as metodologias citogenéticas quanto as genético-moleculares, têm nas suas indicações, vantagens e desvantagens de acordo com os objetivos almejados. Contudo, o uso conjugado destes marcadores (cromossômicos e moleculares) são sinergicamente complementares, enriquecendo a análise e respondendo às questões de forma mais precisa e ampla. É preciso mencionar que os resultados obtidos através desta técnica necessitam ser cuidadosamente interpretados, uma vez que as manipulações cromossômicas pode gerar uma grande heterogeneidade de produtos manipulados. Aspectos de biossegurança devem ser analisados, tendo em vista os potenciais riscos biológicos que genomas manipulados possam representar ao meio ambiente, entre os quais a possibilidade de competir com as espécies parentais ou ainda de introgressão de genes exógenos em estoques naturais ou cultivados, caso sejam férteis. Assim, a caracterização e a identificação genética de estoques que sofreram manipulação genética constitui um procedimento essencialmente recomendável para programas de piscicultura que utilizam essas técnicas no melhoramento animal. O monitoramento genético de produtos resultantes de processos de hibridação interespecífica objetiva detectar características diagnósticas genéticas, que identifiquem, de maneira clara e acessível, parentais e híbridos principalmente. O crescente acúmulo de dados cromossômicos das espécies de interesse econômico tem suscitado a implementação de novas metodologias biotecnológicas capazes de reverter tanto para a conservação biológica, através do manejo adequado dos estoques naturais e medidas de biossegurança, como no uso aplicado à produção de produtos cultivados diferenciados, capazes de alavancar a patamares mais elevados a piscicultura, sobretudo a marinha, reduzindo a pressão de captura sobre as populações naturais de espécies economicamente importantes para regiões e países das quais dependem para emprego e renda.

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Capitulo 3

DISCRIMINATORY PROFILE OF rDNA SITES AND TREND FOR ACROCENTRIC CHROMOSOME FORMATION IN THE GENUS TRACHINOTUS LACÉPÈDE, 1801 (PERCIFORMES, CARANGIDAE)

Jacobina, U P., Vicari, M. R., Bertollo, L.A.C & Molina, W. F

Comparative A peer-reviewed open-access journal CompCytogen 6(4): 359–369 (2012) Karyotype evolution in Trachinotus genus 359 doi: 10.3897/CompCytogen.v6i4.3062 Research article Cytogenetics www.pensoft.net/journals/compcytogen International Journal of Plant & Animal Cytogenetics, Karyosystematics, and Molecular Systematics

Discriminatory profile of rDNA sites and trend for acrocentric chromosome formation in the genus Trachinotus Lacépède, 1801 (Perciformes, Carangidae)

Uedson Pereira Jacobina1, Marcelo Ricardo Vicari2, Luiz Antonio Carlos Bertollo3, Wagner Franco Molina1

1 Department of Cell Biology and Genetics, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Campus Universitário, 59078 – 970, Natal, RN, Brazi 2 Department of Structural, Molecular Biology and Genetics, Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, PR, Brazil 3 Department of Genetics and Evolution, Universidade Federal de São Carlos, Via Washington Luiz, Km 235, 13565 – 905, São Carlos, São Paulo, Brazil

Corresponding author: Wagner Franco Molina ([email protected])

Academic editor: V. Gokhman | Received 9 March 2012 | Accepted 29 May 2012 | Published 31 October 2012

Citation: Jacobina UP, Vicari MR, Bertollo LAC, Molina WF (2012) Discriminatory profile of rDNA sites and trend for acrocentric chromosome formation in the genus Trachinotus Lacépède, 1801 (Perciformes, Carangidae). Comparative Cytogenetics 6(4): 359–369. doi: 10.3897/CompCytogen.v6i4.3062

Abstract Chromosomal traits have provided valuable information for phylogeny and taxonomy of several fish groups. Three Atlantic Carangidae species of the genus Trachinotus Lacépède, 1801 (T. goodei Jordan et Evermann, 1896, T. carolinus (Linnaeus, 1766) and T. falcatus (Linnaeus, 1758)) were investigated, hav- ing 2n=48 chromosomes but different chromosomal arms (FN number), i.e., 52, 56 and 58, respectively, in view of the different number of two-armed chromosomes found in their karyotypes. Thus, T. goodei, T. carolinus and T. falcatus present a progressive distance from the probable basal karyotype proposed for Perciformes (2n=48 acrocentrics, FN=48). At first sight, these findings do not agree with the phylogenetic hypothesis based on mitochondrial sequences, where T. goodei appear as the most derived species, followed by T. falcatus and T. carolinus, respectively. However, the chromosomal mapping of ribosomal DNAs was informative for clarifying this apparent conflict. Indeed, the multiple 5S and 18S rDNA sites found in T. goodei corroborate the most derived condition for this species. In this sense, the occurrence of the unexpected number of two-armed chromosomes and FN value for this species, as well as for T. carolinus, must be due to additional rounds of acrocentric formation in these species, modifying the macrostructure of their karyotypes.

Copyright Uedson Pereira Jacobina et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License 3.0 (CC-BY), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. 360 Uedson Pereira Jacobina et al. / Comparative Cytogenetics 6(4): 359–369 (2012)

Keywords Carangidae, 18S rDNA, 5S rDNA, cytotaxonomic markers, evolutionary pathways

Introduction

The genus Trachinotus Lacépède, 1801, also known as pompanos, encompasses 20 species distributed in tropical and subtropical oceans (Cunha 1981). In the Eastern Atlantic, the species Trachinotus carolinus (Linnaeus, 1766), popular for both sport and commercial fishing, T. falcatus (Linnaeus, 1758), a game fish species, and T. goodei Jordan et Evermann, 1896, a species with a high potential for aquaculture and sport fishing, are the most widely distributed, occurring from the Southern United States to Northern Argentina (McMaster 1988, Lazo et al. 1998, Heilman and Spieler 1999). Recent data identified population differentiations in the number and positions of the ribosomal sites among the extensively distributed species, T. falcatus and T. goodei (Ac- cioly et al. in press). Indeed, there is growing evidence that cytotaxonomic markers, particularly ribosomal sites, may reveal the genetic structure of marine fish populations (Motta-Neto et al. 2011a, Lima-Filho et al. in press). In addition to their biological significance in commercial and sport fishing, repre- sentatives of the genus Trachinotus are considered potentially suitable for pisciculture pur- poses (Watanabe 1995, Weirich et al. 2006). Trachinotus species have very desirable bio- logical characteristics, such as fast adaptation to confined environments, good tolerance to extreme environmental conditions and rapid growth (Jory et al. 1985). Nevertheless, ge- netic and cytogenetic foundations supporting their cultivation remain largely unknown. Most species of the marine Perciformes exhibit a basal karyotype composed of 2n=48 acrocentric chromosomes, extensively conserved in several families (Molina 2007). Giv- en the large number of species, most cytogenetic studies have focused on mapping bio- diversity in this order, the largest of all living vertebrates. Among the family Carangidae, cytogenetic data have already been reported for a total of 27 species in 13 genera (e.g. Caputo et al. 1996, Sola et al. 1997, Rodrigues et al. 2007, Chai et al. 2009). Of these, few species occur exclusively in the Atlantic. The present cytogenetic study characterizes the species Trachinotus carolinus, T. falcatus and T. goodei through conventional staining,

Ag-NOR detection, C-banding, CMA3/DAPI fluorochrome staining, and mapping of the 18S and 5S rDNA sequences by dual-color FISH. Useful phylogenetic information was provided by ribosomal sequences mapping, indicating an intriguing scenario with additional acrocentrics formation in T. goodei and T. carolinus.

Material and methods

Samples of the species Trachinotus carolinus (N=5; 3 males. one female, one imma- ture), T. falcatus (N=10; 4 males, 3 females, 3 immatures) and T. goodei (N=10; 6 males, 4 females) were obtained on the coast of Rio Grande do Norte state (05°05'26"S, Karyotype evolution in Trachinotus genus 361

36°16'31"W), in Northeast Brazil. Prior to chromosomal preparations, specimens were submitted to in vivo mitotic stimulation for 24 hours, through intramuscular and in- traperitoneal injection of complex antigens (Molina et al. 2010). Individuals were an- esthetized with clove oil (Griffiths 2000) and sacrificed. Mitotic chromosomes were ac- quired from cell suspensions of anterior kidney fragments according to in vitro mitotic block (Gold et al. 1990). Cell suspensions were dripped onto slides coated with a film of distilled water heated to 60°C, and stained with 5% Giemsa diluted in a phosphate buffer pH 6.8. The material was analyzed under 1000× magnification and the best metaphases were photographed under an Olympus BX50® epifluorescence microscope, with an Olympus DP70® digital image capturing system. About 30 metaphases were analyzed for each individual in order to determine the diploid number for every species.

Chromosome nomenclature Chromosomes were classified as metacentric (m), submetacentric (sm), subtelocentric (st) and acrocentric (a), based on the system proposed by Levan et al. (1964).

Chromosome banding The heterochromatic and nucleolar organizer regions (Ag-NORs) were identified using techniques developed by Sumner (1972) and Howell and Black (1980) respectively.

CMA3/DAPI staining was applied in accordance with Barros-e-Silva and Guerra (2010).

Cytogenetic mapping protocols Two probes were used: an 18S rDNA probe obtained from the nuclear DNA of Prochil- odus argenteus Spix et Agassiz, 1829 (Hatanaka and Galetti 2004); a 5S rDNA probe isolated from the genomic DNA of Leporinus elongatus Valenciennes, 1850 (Martins and Galetti 1999); probes were labeled by polymerase chain reaction (PCR), using biotin-16-dUTP (Roche Applied Science®) for 18S rDNA or digoxigenin-11-dUTP (Roche Applied Science®) for 5S rDNA. PCR labeling for rDNA clones was performed with specific primers, using 20 ng of template DNA, 1X Ta q reaction buffer (200 mM Tris pH 8.4, 500 mM KCl), 40 µM dATP, dGTP and dCTP, 28 µM of dTTP, 12 µM biotin-16-dUTP or digoxigenin-11-dUTP, 1 µM primers, 2 mM MgCl2 and 2 U of Ta q DNA Polymerase (Invitrogen®) under the following conditions: 5 min at 94°C; 35 cycles: 1 min at 90°C, 1 min 30 s at 52°C and 1 min 30 s at 72°C; and a final extension step at 72°C for 5 min. The overall hybridization procedure followed the protocol described by Pinkel et al. (1986), under high stringency conditions (2.5 ng/µL from each probe, 50% deion- ized formamide, 10% dextran sulphate, 2XSSC, pH 7.0 – 7.2, at 37°C overnight). 362 Uedson Pereira Jacobina et al. / Comparative Cytogenetics 6(4): 359–369 (2012)

After hybridization, slides were rinsed in 15% formamide/0.2XSSC at 42°C for 20 min, 0.1XSSC at 60°C for 15 min, and 4XSSC/0.05% Tween at room temperature for 10 min (two times for 5 min each). Signal detection was performed using streptavidin-alexa fluor 488 (Molecular Probes®) for the 18S rDNA probe; and anti-digoxigenin-rhoda- mine (Roche Applied Science®) for 5S rDNA, which were detected by dual color FISH.

Results

All species analyzed exhibited 2n=48 chromosomes, however with a notable difference in the number of two-armed (bibrachial) elements. The karyotype of Trachinotus goodei (Figure 1a, d, g) is composed of 4 m/sm and 44a (FN=52). The heterochromatic regions in this species are very reduced and restrict- ed to small blocks in the chromosomal pericentromeric regions. The Ag-NORs/18S rDNA sites were identified near the centromeric region of two acrocentric pairs, ten- tatively No. 5 and 11 of the karyotype. These sites proved to be rich in GC base composition (CMA+/DAPI-) (Figure 1d). Hybridization signals with 5S rDNA probes were also identified on the terminal regions of the short arms of three acrocentric pairs, tentatively numbered as 9, 12 and 22 (Figure 1g). TheT. carolinus karyotype (Figures 1 b, e, h) consists of 8m/sm and 40a (FN=56). The content of heterochromatin is also poorly distributed in the pericentromeric re- gions of some chromosome pairs. Ag-NORs/18S rDNA sites were located on the short arm of only one acrocentric pair, identified as number 5. These sites are clearly hetero-

Figure 1. Karyotypes of Trachinotus goodei (a, d, g), T. carolinus (b, e, h) and T. falcatus (c, f, i). Conven- tional staining (a, b, c) highlighting the chromosomal pairs carrying Ag-NOR sites; C-banding (d, e, f); + - f, g, h nucleolar organizer pairs are highlighted by staining with CMA3 /DAPI . Dual-color FISH ( ) show- ing the chromosomal mapping of the 18S rDNA (green) and 5S rDNA (red) sites. Bar = 5 µm. Karyotype evolution in Trachinotus genus 363 chromatic, with a CMA+/DAPI- pattern. The 5S rDNA sites were mapped only on the short arm of the acrocentric chromosome 9. The karyotype of T. falcatus (Figure 1c, f, i) has the largest number of bibrachial elements if compared to the other species, i.e., 10 m/sm and 38a (FN=58). As in the two previous species, small heterochromatic blocks are present in pericentromeric re- gions of the chromosomes. Ag-NORs/18S rDNA sites were situated in the terminal region of the short arm of the submetacentric chromosome pair 3, which also appears heterochromatic after C-banding, with a CMA+/DAPI- pattern. The 5S rDNA sites were mapped exclusively on the short arms of the acrocentric pair 9.

Discussion

As in many species of Perciformes, the species analyzed displayed 2n=48 and large numbers of acrocentric chromosomes, although there were notable differences in kary- otype macrostructure. This is particularly evident for the number of chromosome arms (FN) that varies between species. Thus, T. goodei exhibits FN=52, T. carolinus FN=56 and T. falcatus FN=58. Karyotypes similar to those presented here for T. goodei and T. falcatus were previously identified in other populations of this species on the Southeast and Northeast coasts of Brazil (Rodrigues et al. 2007, Accioly et al. in press). Evolutionary karyotype modifications resulting from pericentric inversions are com- mon in Perciformes. In fact, two-armed chromosomes have been found in approxi- mately 30% of Carangidae species karyotyped to date (Chai et al. 2009). Furthermore, other kinds of chromosomal diversification have been identified for this family including Robertsonian translocations, transient in Seriola Cuvier, 1817 (Vitturi et al. 1986, Sola et al. 1997) or already established in Selene setapinnis (Mitchill, 1815) (Jacobina 2012). Basing on morphological and molecular evidences, the genus Trachinotus is in- cluded in the tribe Trachinotini, which is considered one of the least diverse groups among carangids (Smith-Vaniz 1984, Gushiken 1988). Phylogenetic hypotheses based on mitochondrial sequences (Reed et al. 2002) suggest T. carolinus as the most basal species, followed by more derived T. falcatus and T. goodei, respectively. However, these phylogenetic relationships do not agree with the karyotypic characteristics pre- sented by these species (Figure 2a). Whereas the fully acrocentric karyotype with 2n=48 (FN=48) is considered basal for Perciformes, variations of this karyotypic formula can be interpreted as derived conditions. Thus, an increase in the number of two-armed chromosomes, as sequen- tially found in T. carolinus (eight two-armed chromosomes) and in T. falcatus (ten two-armed chromosomes), would be expected to represent derived cytogenetic char- acteristics. As such, T. goodei, showing only four two-armed chromosomes and, con- sequently, the largest number of acrocentric chromosomes, would be representing the species with the karyotype closer to the basal one. Many closely related species of Perciformes show poorly varied or cryptic cytoge- netic characteristics, hampering their application in phylogenetic inferences (Molina 364 Uedson Pereira Jacobina et al. / Comparative Cytogenetics 6(4): 359–369 (2012)

Figure 2. Phylogenetic tree from molecular data of some species of Trachinotini tribe (a), adapted from Reed et al. (2002). The molecular relationship is confronted with the chromosomal formula of the Trachinotus species analyzed. Schematic illustration shows the role of additional pericentric inversions leading to new acrocentric chromosomes and modification of the FN value (b), and the derived condition of multiple sites of 18S and 5S rDNAs in T. goodei (c).

2007, Motta-Neto et al. 2011a, b, c). Indeed, this is observed in the similar karyotype macrostructure or heterochromatic patterns, such as those found in Trachinotus spe- cies, where C-bands are inconspicuous and similarly located in the pericentromeric region of the chromosomes. A reduced amount of heterochromatin is also a common feature in other Perciformes, possibly resulting in lower karyotype evolution dynamics (Molina and Galetti 2004, Molina 2007). On the other hand, NORs were promi- nent characteristics, in lines with considerable karyotype variation between species. Trachinotus carolinus and T. falcatus displayed only one pair of chromosomes carry- ing ribosomal sites (Ag-NOR/18SrDNA/CMA+/DAPI-). This condition is considered basal and the most common for Carangidae (Caputo et al. 1996, Sola et al. 1997). As previously confirmed (Accioly et al. in press), the T. goodei population from Brazilian Northeastern coast exhibits a more derived condition, with two chromosomal pairs carrying ribosomal sites (pairs 5 and 11). Although multiple sites have not been iden- tified in populations from the Southeastern coast (Rodrigues et al. 2007), the occur- rence of more than one chromosome pair carrying NORs in T. goodei indicates some level of derivation in this species in relation to the others. Greater dynamic evolution of the ribosomal sites in this species is corroborated by the presence of three chromo- somal pairs carrying 5S rDNA sequences (pairs 9, 12, 22), a condition not present in T. carolinus and T. falcatus, where these sites were mapped only in pair 9 (Figs 1, 2c). In addition, dual-color FISH showed no synteny between 18S and 5S rDNA sites in all the three species of Trachinotus analyzed here. Karyotype evolution in Trachinotus genus 365

Simple ribosomal sites are considered an ancestral condition, most frequently found in carangids (Caputo et al. 1996, Sola et al. 1997), as well as among marine Perciformes (Galetti et al. 2000). Their location in distinct chromosomal pairs is an efficient cyto- taxonomic marker of species and populations of Trachinotus (Accioly et al. in press). Indeed, Southeastern populations of T. falcatus and T. goodei are characterized by hav- ing simple Ag-NOR sites on the short arms of pair 18 and on the short arms of pair 3, respectively. The greater dynamic evolution of the 18S and 5S ribosomal sequences in T. goodei corroborates its more derived condition in relation to the other species (Figure 2), as suggested by molecular data (Reed et al. 2002). In turn, sharing of 5S rDNA sequences by a same chromosome pair, tentatively identified as no. 9, probably indicates homeologous chromosomes with similar syntenic content. The occurrence of three pairs carrying 5S rDNA sequences (pairs 9, 12 and 22) in T. goodei is uncommon among fish (Martins and Galetti 2000). The location of 5S and 18S rDNA sites in dif- ferent chromosomes, and the functional divergence between 18S rDNA (transcribed by RNA polymerase I) and 5S rRNA genes (transcribed by RNA polymerase II) (Martins and Galetti 2000), supports the independent evolution of these multigene families due to specific selection pressures (Amarasinghe and Carlson 1998). Variations in the number and location of NORs in some cases, are likely to be favored by a high and heterogeneous heterochromatic content, whereas the inverse seems to reduce the evolutionary dynamism of these regions (Molina 2007). Besides increasing the NORs’ dynamics, there are also indications that heterochromatin may act as hotspots for chromosomal rearrangements (Almeida-Toledo et al. 1996; Jaco- bina 2012). However, there is currently no information that the heterochromatin may be exerting some role in the evolutionary dynamics of the rDNA in T. goodei. Disper- sion of these sequences in the karyotype may occur via transposition events by mobile elements in the carrier genome, with subsequent amplification and formation of new repetitive DNA sites (Eickbush and Eickbush 1995; Almeida-Toledo et al. 1996). Indeed, a surprising chromosome spreading of associated transposable elements and ribosomal DNA (Rex3/5S rDNA) was demonstrated to occur in the freshwater fish Erythrinus erythrinus (Bloch et Schneider, 1801) (Erythrinidae), increasing the num- ber of such rDNA sequences from 2 to 22 between distinct populations (Cioffi et al. 2010). Growing knowledge on the organization of repetitive DNAs also indicates that their evolution may be mediated by unequal crossover, transposition mediated by RNA and gene conversion (Dover 1986, Martins et al. 2006). Thus, different events may be associated with the serial repetition of the 5S rDNA multigene family in the genome of T. goodei, characterizing its more derived condition in relation to the other species, T. falcatus and T. carolinus. The existing set of cytogenetic data for Carangidae suggests karyotype evolution strongly mediated by pericentric inversion events. Based on the basal karyotype for Perciformes (2n=48 acrocentrics, FN=48), the increase of FN indicates a derived con- dition. Thus, if T. goodei is the most derived species in respect to T. falcatus and T. carolinus, as indicated by mitochondrial sequences (Reed et al. 2002), and supported by the apomorphic features of its karyotype (multiple 18S and 5S rDNA sites), a par- 366 Uedson Pereira Jacobina et al. / Comparative Cytogenetics 6(4): 359–369 (2012) ticular evolutionary pathway provided by pericentric inversions must be considered for this species. Thus, the smaller number of two-armed chromosomes in T. goodei may indicate additional rounds of pericentric inversions on two-armed chromosomes, in- creasing the number of acrocentric chromosomes in the karyotype and, consequently, decreasing the FN value (Fig. 2b). The same could be also considered for T. carolinus, considering its more basal position in the phylogeny proposed for Trachinotus (Fig. 2a). Our understanding of the karyotype evolution of Carangidae (including rDNA) was improved by the present findings. Our data demonstrate that, in addition to structural changes by pericentric inversions, rDNA sequences also acted as an important evolution- ary indicator in Trachinotus karyotype. In this sense, the combined mapping of 18S and 5S rDNA sequences proved to be useful to clarify the relationships in this fish group.

Acknowledgements

We are grateful to the Coordination for the Improvement of Higher Education Teach- ing Personnel (CAPES) and the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (Project No. 556793/2009-9) for their financial support. We also thank IBAMA (Process No. 19135/1) and José Garcia Júnior for the taxonomic identification of the species.

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Capitulo 4

ATLANTIC MOONFISHES: INDEPENDENT PATHWAYS OF KARYOTYPIC AND MORPHOLOGICAL DIFFERENTIATION

Jacobina, U.P., Vicari, M.R., Martinez, P.A., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C & Molina, W.F

Author's personal copy

Helgol Mar Res DOI 10.1007/s10152-012-0338-8

ORIGINAL ARTICLE

Atlantic moonfishes: independent pathways of karyotypic and morphological differentiation

Uedson Pereira Jacobina • Marcelo Ricardo Vicari • Pablo Ariel Martinez • Marcelo de Bello Cioffi • Luiz Antonio Carlos Bertollo • Wagner Franco Molina

Received: 6 June 2012 / Revised: 27 October 2012 / Accepted: 1 November 2012 Ó Springer-Verlag Berlin Heidelberg and AWI 2012

Abstract Fish of the genus Selene, known as lookdowns cytogenetic patterns of these species are relatively con- or moonfish, are one of the most morphologically derived served. Hybridization with telomeric probes (TTAGGG)n groups of the family Carangidae, whose phylogenetic did not exhibit interstitial telomeric sites (ITS), especially relationships are still largely unknown. In this study, we in S. setapinnis, where, along with a reduction in diploid discuss karyoevolutionary aspects of three representatives number, a large metacentric pair derived from centric of this genus from the Western Atlantic: Selene brownii fusion is present. Data obtained by geometric morpho- (2n = 48; FN = 48), Selene setapinnis (2n = 46; metrics enable a clear morphological distinction among the FN = 48), and Selene vomer (2n = 48; FN = 50). Their three species, as well as in relation to two other species of body patterns were also investigated and compared to one the genus Caranx and Oligoplites. Data obtained suggest another and in relation to two other species of different that morphologic evolution in Selene species was primarily genera. Two mechanisms of karyotypic evolution seem to dissociated from visible changes that occurred at the have acted in the diversification of this genus, namely chromosomal level. pericentric inversions and centric fusions. Mapping of rDNA sequences showed that chromosome pairs bearing Keywords Selene Pericentric inversions 5S rDNA sites are similar, whereas those bearing 18 rDNA Centric fusion Morphological divergence sites are morphologically distinct while apparently also exhibiting interspecies synteny. Although the nucleolar organizer-bearing chromosomes are extremely efficient Introduction cytotaxonomic markers among Selene species, others Fish of the genus Selene, known as lookdowns or moonfish, Communicated by H.-D. Franke. belong to one of the most morphologically derived groups compared to the 32 genera that make up the family Ca- U. P. Jacobina (&) P. A. Martinez W. F. Molina rangidae. Indeed, they exhibit a tall round body, laterally Departamento de Biologia Celular e Gene´tica, compressed, with a unique steep head (Smith-Vaniz 1979). Centro de Biocieˆncias, Universidade Federal do Rio Grande This genus is composed of only the following seven spe- do Norte, Natal, RN, Brazil e-mail: [email protected] cies: Selene brownii (Cuvier 1816), Selene