Optimisation Du Métabolisme Énergétique Du Soufre Chez La Bactérie Hyperthermophile Aquifex Aeolicus

Aix-Marseille Université

Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

Thèse de Doctorat d’Université

Mention Microbiologie

Clément AUSSIGNARGUES

Optimisation du métabolisme énergétique du soufre chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus

Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury:

Pr. Frédéric BARRAS Dr. Laurent COURNAC Dr. Bruno FRANZETTI Dr. Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI Dr. Anne GODFROY Dr. Marianne ILBERT

Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines Centre National de la Recherche Scientifique

Aix-Marseille Université

Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

Thèse de Doctorat d’Université

Mention Microbiologie

Clément AUSSIGNARGUES

Optimisation du métabolisme énergétique du soufre chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus

Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury:

Pr. Frédéric BARRAS Dr. Laurent COURNAC Dr. Bruno FRANZETTI Dr. Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI Dr. Anne GODFROY Dr. Marianne ILBERT

Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines Centre National de la Recherche Scientifique

Sommaire

Introduction 2

Chapitre I- Métabolismes énergétiques du soufre 4

I) Le soufre, un élément essentiel aux multiples facettes 6

II) Le soufre utilisé comme composé énergétique 9

A) Oxydation des composés du soufre 10

1. Oxydation du sulfure d’hydrogène H2S 10 a) La Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR) 10 b) La flavocytochrome c sulfure déshydrogénase (FCSD) 13

2- 2. Oxydation du thiosulfate (S2O3 ) 14 a) Thiosulfate : accepteur oxydoréductase (TAOR) 14 b) Le système Sox 16

2- 3. Oxydation du sulfite (SO3 ) 20 a) Sulfite : accepteur oxydoréductase (SAOR) 21 b) Voie de l’APS 23

4. Oxydation du soufre stocké dans les globules 26

B) La réduction du soufre : soufre/polysulfure réductase 29

C) Un cas particulier : la dismutation du soufre (SOR) 33

1. Réactions catalysées 34

2. Structure et architecture 34

a) Le monomère 34 Sommaire

b) La protéine entière 36

3. Vue générale du fonctionnement de la SOR 38

III) Complexité des métabolismes énergétiques du soufre : quelques exemples 39

A) Les archées thermoacidophiles : Acidianus ambivalens 39

B) Les bactéries sulfureuses phototrophes 41

C) Les bactéries acidophiles et mésophiles du genre Acidithiobacillus 43

IV) Réflexions sur les modèles des métabolismes énergétique du soufre 46

Chapitre II- Les rhodanèses 48

I) Caractéristiques des rhodanèses 51

A) Organisation en domaines 51

B) Séquence protéique 55

C) Site actif 56

D) Structure tridimensionnelle 57

E) Catalyse et mécanisme catalytique 60

II) Fonction des rhodanèses 62

A) Les protéines à domaine rhodanèse associé 62 Sommaire

B) Rhodanèses à un ou plusieurs domaines 65

1. Chez les eucaryotes 66

2. Chez les procaryotes 67

III) Vue d’ensemble de la superfamille des rhodanèses 69

Chapitre III- Aquifex aeolicus 72

I) Les Aquificales 74

II) Présentation de notre modèle d’étude : Aquifex aeolicus 78

A) Morphologie, motilité et adhérence 79

B) Génome 80

C) Physiologie 81

III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 83

A) Voie H2S/O2 83

B) Voie H2/S° 86

C) La SOR 88

D) Les rhodanèses 89

E) NADH déshydrogénase (complexe I) 90 Sommaire

F) Vision globale du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 92

Chapitre IV- Objectifs du travail 94

Matériel et méthodes 98

I) Culture bactérienne 100

A) Aquifex aeolicus 100

B) Escherichia coli 101

II) Obtention du matériel biologique 102

A) Aquifex aeolicus 102

1. Fractionnement cellulaire 102

2. Solubilisation des protéines membranaires 103

3. Globules de soufre 104

B) Escherichia coli 104

III) Méthodes de purification des protéines 105

A) Chromatographie d’adsorption 105 Sommaire

B) Chromatographies d’échange d’ions 105

1. Chromatographie à basse pression 105

2. Chromatographie à haute pression 105

C) Chromatographie d’exclusion 106

D) Protocoles de purification 106

1. La SQR 106

2. Supercomplexe hydrogénase/soufre réductase 106

3. La SOR et Aq-477 107

IV) Techniques d’analyses biochimiques 111

A) Dosage protéique 111

B) Electrophorèse sur gel d’acrylamide 111

1. Condition dénaturante : Tris-glycine SDS-PAGE 111

2. Condition native : Tris-glycine PAGE 111

3. Gel Bleu Natif 112

4. Gels Bleu Natif à pores larges (BNPL) 113

5. Transfert sur membrane 113

C) Techniques de révélation après électrophorèse 114

1. Colorations 114 Sommaire

2. Immunodétection 115

3. Détection d’activités enzymatiques 116

a) Activité Sulfure Quinone Réductase 116 b) Activité hydrogénase 116 c) Activité cytochrome c oxydase 117 d) Activité NADH-déshydrogénase (complexe I) 118 e) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse) 118

V) Mesures d’activités enzymatiques au spectrophotomètre 119

A) Transfert d’électrons de l’hydrogénase à la soufre réductase 119

B) Activité Soufre Oxygénase Réductase (SOR) 121

C) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse) 121

VI) Etude d’intéractions protéine-protéine 122

A) La résonance plasmonique de surface (BIAcore) 122

1. Principe de fonctionnement 122

2. Interface utilisée 123

3. Fixation du ligand et mesure de l’interaction 123

B) Pontage covalent in vitro 124

C) Gel retard 124

VII) Analyses protéomiques 125

Sommaire

A. Identification des protéines par séquençage N-terminal 125

B. Identification des protéines par spectrométrie de masse 125

1) Maldi-TOF 126

2) Trappe à ions 126

3) Orbitrap 126

C. Analyse de protéines entières par spectrométrie de masse 127

VIII) Microscopies 127

A) Microscopie optique 127

B) Microscopie électronique 127

IX) Analyses in silico 128

A) Recherches de protéines homologues et alignements multiples de séquences 128

B) Prédiction de localisation et de structure secondaire 128

C) Modélisations 129

Résultats et discussion 130

Chapitre I- Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 132 Sommaire

I) Une rhodanèse au cœur du trafic 134

II) Une source potentielle de substrat: les globules de soufre 138

A) Influence des conditions de culture 138

B) Tentative d’isolation des globules de soufre 141

III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus : un nouveau Modèle 143

A) Identification de systèmes potentiellement impliqués dans le métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 144

1. Oxydation du thiosulfate 144

2. Oxydation de l’H2S 146

3. Oxydation du soufre 149

4. Oxydation du sulfite 150 a) Voie de l’APS 150 b) Aq_979 150

B) Construction d’un modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 153

Chapitre II- Recherche d’un niveau d’organisation supérieure dans l’architecture des voies respiratoires chez Aquifex aeolicus 155

I) Introduction : Organisation des complexes protéiques membranaires 157

Sommaire

II) Développement et optimisation de gels natifs pour la visualisation de mégacomplexes 163

III) Préparation et optimisation des échantillons pour la détection de mégacomplexes 166

IV) Développement des gels natifs à larges pores pour la visualisation des mégacomplexes 169

V) Impact des conditions de culture sur la présence des superédifices 174

VI) Discussion 176

Chapitre III- Mise en évidence d’un nanocompartiment protéique et de sa ferritine atypique chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus 178

Conclusions et perspectives 197

Références bibliographiques 203

Introduction

IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN

Introduction

Chapitre I

Métabolismes énergétiques

du soufre

Introduction

Métabolismes énergétiques du soufre

I) Le soufre, un élément essentiel aux multiples facettes

Le soufre, élément connu depuis l‘Antiquité, a depuis toujours intéressé les hommes. Il était connu pour « éloigner la vermine » selon Homère, utilisé dans la préparation de la poudre à canons par les chinois au XIe siècle et toujours utilisé dans divers processus industriels (dont la vulcanisation du caoutchouc) de nos jours.

Le soufre a également un impact environnemental très important, justifiant les nombreuses études qui lui sont consacrées : le dioxyde de soufre par exemple, rejeté dans l‘atmosphère par la combustion du pétrole et du charbon ou lors d‘éruptions volcaniques, se combine avec l‘eau dans les nuages pour donner de l‘acide sulfurique. Ce dernier est notamment responsable des tristement célèbres pluies acides, mais il a également un effet refroidissant sur la partie inférieure de l‘atmosphère terrestre en réfléchissant le rayonnement solaire. C‘est ainsi qu‘une diminution de la température de 0,5°C a été mesurée en 1992 après l‘éruption du Pinatubo en 1991. L‘injection de particules de soufre dans l‘atmosphère comme solution d‘urgence au réchauffement climatique a également été discutée dans la communauté scientifique, notamment par le prix Nobel de chimie Paul Crutzen (Crutzen, 2006).

La chimie du soufre, tant organique que minérale, est très riche, puisqu‘on le retrouve à des degrés d‘oxydation variés selon les éléments avec lesquels il est combiné. Ainsi, le soufre du sulfure d‘hydrogène (H2S) est à son plus bas degré d‘oxydation (-2), alors que celui 2- du sulfate (SO4 ) est à +6 (Table 1 formes du soufre). Cette large gamme d‘états d‘oxydation place le soufre au centre d‘un éventail de réactions d‘oxydoréduction : la théorie du monde fer-soufre propose ainsi l‘implication de composés du type sulfure de fer (FeS, Fe2S) comme permettant la formation des premières molécules organiques à l‘origine de la Vie (Dörr et al., 2003; Wachtershauser, 2000).

Introduction

Composés Formule Etat d’oxydation

2- Sulfate SO4 + 6

2- Sulfite SO3 + 4

Dioxyde de soufre SO2 + 4

2- + 2,5 (0 pour les soufres « internes », + 5 Tétrathionate S4O6 pour les deux soufres « externes »)

2- Thiosulfate S2O3 + 2

0 Soufre élémentaire S , S8 0

- - 0 pour les soufres « internes », - 1 pour Polysulfure S-S(n)-S les deux soufres « externes »

Pyrite FeS2 - 1

Monosulfure de fer FeS - 2

Sulfure d‘hydrogène H2S - 2

Tableau 1. Degrés d’oxydation des composés soufrés. L‘état d‘oxydation de l‘atome est celui de l‘atome de soufre de la molécule. S8 représente le cyclo-octasoufre.

L‘incorporation du soufre dans des biomolécules telles que les protéines, les vitamines, les cofacteurs… est connue depuis bien longtemps, ce qui en fait une brique fondamentale, l‘un des éléments essentiels de la Vie au même titre que le carbone, l‘oxygène, l‘azote ou l‘hydrogène.

Enfin, c‘est cette versatilité du soufre du point de vue redox qui explique son utilisation à des fins bioénergétiques par les micro-organismes. En effet, des bactéries et des archées qui utilisent le soufre comme base de leur métabolisme énergétique colonisent des environnements riches en molécules soufrées, qu‘elles soient sous forme de solide (soufre

Introduction

élémentaire), de gaz (sulfure d‘hydrogène) ou dissoutes dans l‘eau (thiosulfate, polysulfures) (Figure 1).

Figure 1. Représentation de certaines formes du soufre. A, le cyclo-octasoufre S8 est un solide quasiment 2- insoluble (19-30 nM à 25°C, 478 nM à 80°C ; (Kamyshny, 2009)) ; B, le tétrathionate S4O6 (l‘oxygène est 2- représenté en rouge, le soufre en jaune) est soluble tout comme C, polysulfure S(n) .

L‘ensemble des recherches sur le soufre, quels que soient leurs domaines d‘études, pointent toutes vers l‘existence d‘un véritable cycle biogéochimique du soufre, faisant intervenir des réactions abiotiques aussi bien que des micro-organismes qui y jouent un rôle absolument prépondérant (Figure 2). Les métabolismes énergétiques qu‘ils mettent en jeu sont très diversifiés, et cette variété trouve son reflet dans le grand nombre de protéines qui les constitue. Les parties suivantes seront essentiellement consacrées à la description des enzymes jouant un rôle prépondérant dans le métabolisme énergétique du soufre des micro- organismes. Nous replacerons ensuite ces enzymes dans le contexte global du métabolisme d‘organismes modèles, dont l‘étude a permis de mieux comprendre ces processus énergétiques.

Introduction

Figure 2. Représentation schématisée du cycle du soufre dans la nature (ressource internet)

II) Le soufre utilisé comme composé énergétique

Comme nous l‘avons vu, le soufre peut tout aussi bien être incorporé dans les biomolécules qu‘utilisé en tant que ressource énergétique par les micro-organismes. Dans cette perspective, il faut distinguer les processus d‘oxydation (donneur d‘électrons) et de réduction (accepteur d‘électrons) du soufre. Ce dernier cas a été extensivement étudié chez les bactéries sulfato-réductrices qui couplent des chaînes respiratoires anaérobies à la synthèse d‘ATP, en utilisant le sulfate comme accepteur terminal d‘électrons (Barton and Fauque, 2009; Muyzer and Stams, 2008). A l‘inverse, de nombreux micro-organismes « extraient » les électrons des composés réduits du soufre qui sont alors le point de départ de leurs chaînes respiratoires. Nous allons tout d‘abord nous intéresser à ces derniers.

Introduction

A) Oxydation des composés du soufre

Les composés réduits du soufre offrent des degrés d‘oxydation variant entre -2 pour l‘H2S et +4 pour le sulfite. Dans le cadre de leur métabolisme énergétique, les micro- organismes ont développé des enzymes, ou des systèmes enzymatiques oxydant spécifiquement une forme donnée du soufre auxquels nous allons maintenant nous intéresser.

1. Oxydation du sulfure d‘hydrogène H2S

Le sulfure d‘hydrogène a été découvert en 1777 par Carl Wilhelm Scheele. Il est considéré comme un véritable poison à cause de sa grande réactivité vis-à-vis des ponts disulfures ou des centres métalliques par exemple mais aussi pour les organismes aérobies chez lesquels il interfère avec la phosphorylation oxydative par réaction avec l‘oxygène. Paradoxalement, ce gaz est absolument indispensable à bien des égards : il a été identifié comme un « gazotransmetteur » chez les eucaryotes (Wang, 2002), et est utilisé par nombre de micro-organismes comme donneur d‘électrons pour leurs chaînes respiratoires grâce à deux enzymes principalement, la Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR) d‘une part, et la flavocytochrome c sulfure déshydrogénase d‘autre part.

a) La Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR)

La SQR fait partie de la grande famille des disulfure réductases à flavine : c‘est une flavoprotéine d‘environ 50 kDa retrouvée dans toutes les branches du vivant, mis-à-part les plantes (Shahak and Hauska, 2008). Elle catalyse la réduction d‘un « pool » de quinones grâce

à l‘oxydation de l‘H2S en chaîne de soufre. La nature du produit soufré est d‘ailleurs discutée dans la littérature : certaines études chez Rhodobacter capsulatus l‘identifient comme étant du polysulfure (Griesbeck et al., 2002) alors que la résolution récente de la structure de la SQR d‘Aquifex aeolicus suggère plutôt un cyclo-octasoufre (Marcia et al., 2009). Ainsi le terme de « polysoufre » est employé pour faire référence à cette chaîne de soufre dont la nature exacte n‘est généralement pas définie (Cherney et al., 2010).

L‘utilisation d‘un « pool » de quinones comme accepteur d‘électrons implique nécessairement une localisation membranaire de la protéine. Il a été montré que la SQR est

Introduction une protéine monotopique liée à un seul côté de la membrane et que cet ancrage peu profond (seulement 12 Å) est dû à deux hélices α amphipathiques (Marcia et al., 2009). De plus, l‘orientation périplasmique de la SQR a été démontrée chez Rhodobacter capsulatus bien qu‘aucun peptide signal n‘ait été détecté dans la séquence N-terminale de la protéine. En revanche, les 38 acides aminés en C-terminal sont nécessaires à sa translocation (Schutz et al., 1997) (Schutz et al., 1999).

Les membres de la famille des disulfure réductases sont principalement retrouvés sous forme dimérique, mais dans le cas de la SQR, la question n‘est pas résolue de manière claire. En effet, si elle a bien été cristallisée sous forme de dimère chez Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidianus ambivalens (Brito et al., 2009; Cherney et al., 2010), on la retrouve trimérique chez Aquifex aeolicus, que ce soit au cours de sa cristallisation ou lors d‘études biochimiques (Marcia et al., 2009; Marcia et al., 2010), et monomérique en solution chez Acidianus ambivalens (Brito et al., 2009).

La protéine elle-même est composée de deux domaines similaires présentant un repliement de type Rossmann : le domaine N-terminal est celui qui lie le cofacteur à FAD. Ce dernier constitue avec trois résidus cystéine le site catalytique de l‘enzyme. De manière intéressante, la liaison du FAD à la protéine est covalente mais labile chez Aquifex aeolicus et Acidianus ambivalens, mais pas chez Acidithiobacillus ferrooxidans. Ceci est à mettre en rapport avec la nature hyperthermophile des deux premières espèces chez lesquelles la liaison covalente pourrait intervenir dans l‘augmentation de la stabilité et de la conformation native de la protéine, comme cela a été proposé auparavant pour d‘autres flavoprotéines (Nandigama and Edmondson, 2000). Le site de liaison des quinones est une cavité proche du FAD et du contact protéine-membrane, accessible à travers un canal hydrophobe (Figure 3).

Introduction

Figure 3. Structure tridimensionnelle du monomère de la SQR d’Aquifex aeolicus (PDB 3HYW). La quinone est représentée en bleu, et le FAD en jaune.

La réduction du « pool » de quinones se fait via le cofacteur FAD. En effet, ce dernier est le relai électronique qui va dans un premier temps capter les électrons issus de l‘oxydation des sulfures avant de les transférer aux quinones. Il faut noter qu‘oxydation des sulfures et réduction des quinones sont séparés dans l‘espace puisqu‘ayant lieu de part et d‘autre du FAD.

Le rôle des SQR est assez varié suivant les espèces. En effet, son implication, tant chez les micro-organismes que dans les mitochondries, a été par exemple démontrée dans la détoxification de l‘H2S (Shahak and Hauska, 2008), la tolérance aux métaux lourds (Vande Weghe and Ow, 2001) et probablement la signalisation (en contrôlant les concentrations du neurotransmetteur H2S chez les mammifères). L‘une de ses fonctions les plus importantes concerne cependant les processus bioénergétiques : récemment découvert dans la mitochondrie (Yong and Searcy, 2001), ce rôle avait déjà été proposé et démontré dès les années 1990, notamment chez les bactéries photosynthétiques utilisant l‘H2S comme donneur d‘électrons (Shahak et al., 1992) (Reinartz et al., 1998).

Introduction

b) La flavocytochrome c sulfure déshydrogénase (FCSD)

La réaction catalysée in vitro par la FCSD n‘est pas sans rappeler celle réalisée par la

SQR : l‘H2S est oxydé en une chaîne de soufre, et les électrons issus de cette réaction sont transférés à un accepteur. Dans le cas de la SQR, il s‘agit d‘un « pool » de quinones, alors que des cytochromes de type c jouent ce rôle pour la FCSD. Ces derniers peuvent à leur tour transférer ces électrons à une cytochrome c oxydase ou à un centre réactionnel photosynthétique suivant les organismes (Brune, 1995a). La nature de l‘accepteur d‘électrons est en accord avec la localisation de l‘enzyme, la FCSD étant le plus souvent soluble et périplasmique. Cependant, des cas de FCSD ancrées dans la membrane cytoplasmique par un peptide signal non-clivé ont également été rapportés (Kostanjevecki et al., 2000; Verté et al., 2002).

Cette protéine est en réalité constituée de deux sous-unités distinctes : FccB est une flavoprotéine au repliement très similaire à celui des SQR de 40-47 kDa qui lie l‘H2S, et FccA est un cytochrome de type c. Ce dernier peut comporter un seul ou deux hèmes c, pour une masse moléculaire de 10 et 21 kDa respectivement. Par exemple, FccA d‘Allochromatium vinosum et de Termochromatium tepidum (dont les structures sont connues) possèdent deux hèmes (Chen et al., 1994; Hirano et al., 2012) (Figure 4).

Figure 4. Structure de la flavocytochrome c sulfure déshydrogénase (FCSD) d’Allochromatium vinosum. FccA est représentée en bleu, et FccB en gris. Les cofacteurs sont représentés sous forme de bâtonnets, le FAD est en jaune et les hèmes de type c sont en rouge. L‘identifiant PDB est 1FCD.

Introduction

Le rôle in vivo de cette protéine n‘est pas vraiment clair : s‘il ne fait aucun doute sur la réaction qu‘elle catalyse, des souches mutantes d‘Allochromatium vinosum déficientes en

FCSD, cultivées en présence d‘H2S, présentent un phénotype identique à celui de la souche sauvage, que ce soit au niveau de la croissance ou des taux d‘oxydation de l‘H2S (Reinartz et al., 1998). Ceci indique la présence d‘un système alternatif qui réalise l‘essentiel de l‘oxydation de l‘H2S, probablement la SQR. Il a en revanche été proposé que la FCSD soit plus avantageuse dans certaines conditions de croissance non encore identifiées, par exemple dans le cas de concentrations en H2S bien plus faibles que celles couramment utilisées en laboratoire (Brune, 1995a).

2- 2. Oxydation du thiosulfate (S2O3 )

Le thiosulfate est une molécule stable et abondante dans l‘environnement, et peut être réduit ou oxydé par nombre de micro-organismes. Deux voies principales d‘oxydation du thiosulfate sont prédominantes : la condensation oxydative de deux molécules de thiosulfate 2- en tétrathionate (S4O6 ) par les thiosulfate : accepteur oxydoréductases (thiosulfate déshydrogénase, EC 1.8.2.2), et l‘oxydation complète en sulfate en plusieurs étapes par le système Sox (Sulfur Oxidizing system).

a) Thiosulfate : accepteur oxydoréductase (TAOR)

La formation de tétrathionate à partir de thiosulfate est bien documentée chez des bactéries utilisant le thiosulfate comme substrat supplémentaire (mais pas unique), telles que les Pseudomonas et les Halomonas (Sorokin et al., 1999), ainsi que chez Allochromatium vinosum, l‘une des rares bactéries phototrophes sulfureuses à posséder un tel système. Chez cette dernière, la protéine TsdA oxyde le thiosulfate en tétrathionate avec le ferricyanure comme accepteur artificiel d‘électrons. C‘est un monomère de 25,8 kDa, présent dans le périplasme, et contenant deux hèmes de type c (Denkmann et al., 2012; Hensen et al., 2006). Elle est assez semblable à la thiosulfate déshydrogénase d‘Acidithiobacillus thiooxidans, un cytochrome de type c de 27,9 kDa (Nakamura et al., 2001). Cependant, la plupart des autres protéines de cette famille sont assez différentes les unes des autres, ce qui a été interprété comme une évolution convergente plutôt que divergente (Visser et al., 1996).

Introduction

Chez Acidianus ambivalens, une thiosulfate : quinone oxydoréductase (TQOR) membranaire a été caractérisée (Müller et al., 2004). Ce complexe est composé de quatre protéines : deux copies de la sous-unité DoxA (28 kDa), et deux copies de la sous-unité DoxD (16 kDa) (Figure 5). Ni l‘une ni l‘autre ne comporte de cofacteur, mais des quinones ont été retrouvées liées de manière non-covalente au complexe purifié. Ainsi, le « pool » de quinones est identifié comme l‘accepteur physiologique des électrons issus de l‘oxydation du thiosulfate en tétrathionate. Cette découverte a son importance, puisque cet accepteur est différent de ce qui avait été caractérisé jusque là chez les autres organismes (ferricyanure ou cytochrome c), révélant ainsi un tout nouveau mécanisme énergétique d‘oxydation du thiosulfate. Il faut noter que DoxA et DoxD avaient tout d‘abord été identifiées comme des sous-unités faisant partie de la quinol : oxygène oxydoréductase (cytochrome aa3) au cours de sa purification (Purschke et al., 1997). Les travaux menés en 2004 par Müller et collaborateurs (Müller et al., 2004) montrent ainsi qu‘il s‘agit en fait de deux complexes indépendants, mais fonctionnant en synergie, puisque la réduction de l‘oxygène a été mesurée sur des membranes quand le thiosulfate était ajouté au test. Pour la première fois, il avait ainsi été montré une nouvelle voie bioénergétique associant l‘oxydation du thiosulfate et la réduction du « pool » de quinones par la TQOR, à la réduction de l‘oxygène par l‘oxydase terminale (Figure 5).

Figure 5. Modèle de la TQOR (DoxAD) d’Acidianus ambivalens et lien avec la réduction de l’oxygène

(DoxBC) (Müller et al., 2004). CQ et CQH2 représentent respectivement la caldariella quinone oxydée et réduite. a, hème de type a ; a3, hème de type a3 ; CuB, centre cuivre B.

Introduction

Le devenir du tétrathionate ainsi formé n‘est pas clair. Il a été proposé que le tétrathionate soit réduit chimiquement en présence d‘H2S pour donner du thiosulfate et du soufre élémentaire (Kletzin et al., 2004) (Figure 6), une réaction possible in vitro qui est de plus favorisée à haute température (Xu et al., 1998) (Xu et al., 2000) comme c‘est le cas chez l‘archée hyperthermophile Acidianus ambivalens. A noter toutefois qu‘une tétrathionate hydrolase a été isolée à partir du pseudo-périplasme d‘Acidianus ambivalens cultivée sur tétrathionate, protéine absente lorsque les cellules sont cultivées sur soufre. Cette protéine n‘est donc pas le partenaire de « recyclage » du tétrathionate produit par la TQOR (Protze et al., 2011).

Figure 6. Cycle hypothétique thiosulfate / tétrathionate (Kletzin et al., 2004). Le thiosulfate est oxydé en tétrathionate par la TQO (=TQOR), et le tétrathionate réagit chimiquement avec l‘H2S pour donner du soufre élémentaire S° et du thiosulfate.

b) Le système Sox

Le système Sox périplasmique (aussi appelé TOMES pour Thiosulfate Oxidation MultiEnzymes System) est constitué de plusieurs enzymes, et est responsable de l‘oxydation du thiosulfate en sulfate, un cytochrome c jouant le rôle d‘accepteur d‘électrons. Il a été isolé pour la première fois chez Paracoccus versutus (Lu et al., 1985) et Paracoccus pantotrophus (Friedrich et al., 2001; Rother et al., 2001). Chez cette dernière, il est essentiel à l‘oxydation in vivo du thiosulfate, et catalyse in vitro la réduction de cytochrome de type c couplée à l‘oxydation du thiosulfate, du sulfure, du sulfite et du soufre élémentaire.

Quinze gènes codant pour des protéines Sox, organisés en groupe, sont retrouvés chez Paracoccus pantotrophus. L‘activité de ce système repose sur le produit de sept gènes codant pour quatre protéines périplasmiques (SoxAX, SoxB, SoxYZ et SoxCD) représentant le cœur du système. Si SoxY et SoxZ ne possèdent pas de cofacteurs, SoxX comporte un hème de

Introduction type c, SoxA en compte deux (dont un est redox-inactif et l‘autre directement impliqué dans la catalyse) (Reijerse et al., 2007), de même que SoxD, alors que SoxC est une molybdoprotéine (Quentmeier et al., 2000). Enfin, SoxB est monomérique et contient un centre binucléaire à manganèse (Epel et al., 2005). Un modèle de mécanisme catalytique a été proposé (Friedrich et al., 2001) dans lequel le complexe SoxYZ peut être vu comme une plateforme liant le soufre sur lequel les autres acteurs vont agir (Figure 7). En effet, SoxY possède une cystéine conservée (Quentmeier and Friedrich, 2001) sur laquelle SoxAX fixe une molécule de thiosulfate, puis SoxB réalise le clivage hydrolytique du groupement sulfonate (-SO3) du thiosulfate en libérant une molécule de sulfate (SO4). Sox(CD)2 agit ensuite comme une soufre déshydrogénase en oxydant le dernier atome de soufre encore lié à SoxYZ, le transformant en un nouveau groupement sulfonate. SoxB libère alors une dernière molécule de sulfate, régénérant ainsi SoxYZ en sa forme de départ. La participation de SoxYZ à toutes les étapes de l‘oxydation du thiosulfate en fait un pivot du système Sox : sa cystéine, située sur un bras flexible, permet aux intermédiaires soufrés d‘accéder aux sites actifs des autres partenaires du système (Sauvé et al., 2007).

Figure 7. Mécanisme catalytique du système Sox (Kappler and Maher, 2012). SoxYZ est représenté par les formes géométriques (rond et triangle). Le soufre de la cystéine de SoxY est également représenté.

Introduction

Le rôle des autres protéines du système Sox de Paracoccus pantotrophus n‘est pas clairement établi, et seule l‘appartenance à une famille protéique, ou un phénotype obtenu après mutation du gène considéré, ont pu être établis. On sait notamment que les protéines SoxR (répresseur de la famille ArsR) et SoxS (thiorédoxine) sont impliquées dans la régulation du système Sox (Rother et al., 2005). La protéine membranaire SoxV et la thiorédoxine périplasmique SoxW interviendraient dans une étape de réduction nécessaire à la pleine activité in vivo du système (Bardischewsky et al., 2006a), et SoxF est une flavoprotéine monomérique possédant une activité sulfure déshydrogénase (Quentmeier et al., 2004) dont l‘inactivation entraine une diminution de l‘activité d‘oxydation du thiosulfate in vivo (Bardischewsky et al., 2006b).

Le système Sox a été découvert chez de nombreux autres organismes, et certaines différences majeures ont été mises en évidence, notamment sur la présence des protéines « accessoires ». Par exemple, une nouvelle protéine SoxK a été montrée comme liant et stabilisant le complexe SoxAX (Ogawa et al., 2008). SoxA justement ne contient qu‘un seul hème chez de nombreuses espèces dont Allochromatium vinosum, Chlorobaculum tepidum ou Starkeya novella. Le nombre d‘hème(s) de SoxA, la présence ou non de SoxK et la taille de SoxX ont permis une classification en quatre types phylogénétiquement reliés du complexe SoxAX (Kappler and Maher, 2012). A noter également qu‘un centre cuivre (II) mononucléaire potentiellement impliqué dans la catalyse a été découvert dans le complexe SoxAX de Starkeya novella, une caractéristique qui pourrait être partagée par le même complexe d‘autres organismes (Kappler et al., 2008).

La principale divergence concerne cependant les constituants du cœur réactionnel, puisqu‘un nombre conséquent d‘organismes ne possèdent pas le complexe SoxCD. Cette absence est corrélée à la présence de globules de soufre, généralement dans le périplasme des bactéries, comme intermédiaire de l‘oxydation du thiosulfate (Hensen et al., 2006) (Frigaard and Dahl, 2008). Un modèle de mécanisme de ce système Sox tronqué a également été proposé. La liaison du thiosulfate à SoxYZ par SoxAX est identique, de même que la libération d‘un sulfate par SoxB. Cependant, l‘atome de soufre restant du thiosulfate ne peut pas être oxydé plus avant, et il est probablement transféré en l‘état aux globules de soufre en croissance par un mécanisme encore inconnu. Alternativement, il peut rester lié sur la cystéine de SoxY, et un nouveau cycle catalytique recommence avec la fixation d‘une nouvelle molécule de thiosulfate sur ce soufre au lieu de la cystéine. La répétition de ces cycles produit ainsi une chaîne de soufre dont le devenir est probablement là encore la formation des

Introduction globules de soufre (Kappler and Maher, 2012) (Figure 8). La façon dont cet atome ou cette chaîne de soufre est retirée de SoxY n‘est pas connue, mais l‘implication de la protéine SoxL, appartenant à la superfamille des rhodanèses, a été récemment proposée dans ce processus de recyclage de SoxY (Bagchi, 2012; Welte et al., 2009). Un des éléments en faveur du lien entre l‘oxydation du thiosulfate par le système Sox et la formation des globules de soufre comme intermédiaires a été fourni par l‘étude d‘une souche mutante d‘Allochromatium vinosum, altérée dans sa capacité à produire des globules de soufre (souche déficiente pour les protéines d‘enveloppe des globules) (Prange et al., 2004). La culture de cette souche sur thiosulfate est alors rendue impossible.

Figure 8. Mécanisme catalytique du système Sox tronqué (Kappler and Maher, 2012). En l‘absence de SoxCD, un atome de soufre reste lié sur SoxY, et SoxAX y fixe une nouvelle molécule de thiosulfate. La répétition de plusieurs de ces cycles entraine la production d‘une chaine de soufre.

Finalement, les mécanismes catalytiques proposés expliquent également la capacité du système Sox à oxyder in vitro d‘autres composés comme les sulfures, le sulfite ou le soufre

Introduction

élémentaire (Sauvé et al., 2007) (Figure 9). Cependant, il est encore difficile aujourd‘hui de préciser si ce comportement in vitro est le reflet d‘un fonctionnement in vivo du système Sox.

Figure 9. Mécanisme catalytique proposé du système Sox avec des substrats alternatifs (Kappler and Maher, 2012). A, mécanisme avec les sulfures, et B, mécanisme avec le sulfite.

2- 3. Oxydation du sulfite (SO3 )

Tout comme l‘H2S, le sulfite est à la fois un poison est un élément très important pour les organismes ayant un métabolisme énergétique basé sur le soufre. C‘est un composé très réactif capable de réagir avec des biomolécules telles que les protéines et l‘ADN ; ses propriétés antimicrobiennes sont d‘ailleurs bien connues et mises à profit comme agent de conservation dans l‘industrie agro-alimentaire, notamment dans les vins (codes européens E220-228). Mais il est également produit de manière endogène, par exemple au cours de l‘oxydation de composés soufrés en sulfate, et représente ainsi une étape intermédiaire de ce type de métabolisme. L‘oxydation des sulfites à des fins bioénergétiques se fait selon deux voies principales chez les micro-organismes : la première est une voie directe et met en jeu une sulfite : accepteur oxydoréductase, et la seconde est une voie indirecte utilisant l‘AMP, avec l‘adénosine-5‘-phosphosulfate (adénylylsulfate ou APS) comme intermédiaire réactionnel (Figure 10).

Introduction

Figure 10. Les deux voies d’oxydation du sulfite en sulfate (Kappler and Dahl, 2001). La voie de gauche est la voie directe mettant en jeu une SAOR, la voie de droite est celle de l‘APS, ou voie indirecte impliquant une APS réductase ainsi qu‘une ATP sulfurylase ou l‘APAT.

a) Sulfite: accepteur oxydoréductase (SAOR)

Ce type d‘enzyme fait partie de la grande famille des sulfites oxydases, des protéines à molybdène représentées dans toutes les branches de la vie, qui oxydent le sulfite en sulfate (Kappler, 2011). Les sulfite oxydases sont impliquées dans divers processus comme la dégradation des organosulfonates (Denger et al., 2008), la résistance de bactéries pathogènes au système immunitaire (Myers and Kelly, 2005), la détoxification du sulfite ou son utilisation à des fins bioénergétiques.

L‘un des systèmes les mieux connus chez les bactéries est le complexe périplasmique SorAB de Starkeya novella, composé d‘une sous-unité à molybdène de 40 kDa et d‘une petite sous-unité de type cytochrome c de 9 kDa (Figure 11) (Kappler and Bailey, 2005; Kappler et al., 2000). Cette organisation hétérodimérique, ainsi que le mode d‘action de cette enzyme, rappelle clairement les FCSD : en effet, le sulfite est oxydé au niveau de la sous-unité à molybdène, et les électrons sont transférés à l‘hème de la petite sous-unité puis à un autre cytochrome c de la bactérie. Un système analogue a été montré dans le périplasme de la bactérie thermophile Thermus thermophilus (Figure 12), bien que le fonctionnement en

Introduction complexe des deux protéines n‘ait pas été montré (Robin et al., 2011). De plus, la plus petite des sous-unités possède deux hèmes au lieu d‘un seul.

Figure 11. Structure de la sulfite : cytochrome c oxydoréductase de Starkeya novella. SorA est représentée en gris, et SorB en bleu. Le cofacteur à molybdène (molybdoptérine, en violet) et l‘hème de type c (en rouge) sont représentés sous formes de bâtonnets. L‘identifiant PDB est 2BPB.

Figure 12. Modèle de l’oxydation du sulfite chez Thermus thermophilus (Robin et al., 2011). La SAOR oxyde le sulfite en sulfate et transfère les deux électrons libérés à son partenaire, le cytochrome c550, lequel va ensuite les transférer au cytochrome c552. Ces électrons vont permettre de réduire l‘accepteur terminal, l‘oxygène, via les oxydases terminales de type ba3 ou caa3. La voie classique complexe bc1-cytochrome c552- oxydases terminales est également représentée. 22

Introduction

Une activité SAOR a également été détectée dans les membranes d‘Acidianus ambivalens et Acidianus tengchongensis (Chen et al., 2005; Zimmermann et al., 1999), mais l‘enzyme responsable n‘a pas été purifiée. Cette localisation membranaire suggère un « pool » de quinones comme accepteur d‘électrons, mais l‘activité n‘a pu être mesurée qu‘en présence de ferricyanure (utilisé pour mimer l‘hème des cytochromes), la catalyse n‘ayant pas eu lieu en présence de quinones. Aucun cytochrome de type c n‘ayant été détecté chez les Sulfolobales dont font partie les Acidianus (Laska et al., 2003; Schäfer et al., 1996), les auteurs envisagent la possibilité d‘un biais expérimental pour expliquer l‘absence d‘activité quinone-dépendante.. Cependant, des résultats non-publiés mais évoqués dans une revue (Kletzin et al., 2004) présentent la décylubiquinone comme accepteur artificiel d‘électrons.

Il faut enfin noter que l‘oxydation directe in vitro du sulfite par la cytochrome c oxydase de type aa3 (oxydase terminale) d‘Aciditiobacillus ferrooxidans a récemment été rapportée (Sugio et al., 2010).

b) Voie de l‘APS

Cette voie qualifiée d‘indirecte est énergétique par la production d‘ATP qu‘elle génère à partir du sulfite. La première étape de cette voie de l‘APS est réalisée par une APS réductase (ou adénylylsulfate réductase, EC 1.8.99.2) qui consomme le sulfite et l‘AMP pour donner de l‘APS (Figure 13 réaction 1). La seconde partie est plus variable, deux systèmes étant retrouvés suivant les organismes. Chez Allochromatium vinosum par exemple, une ATP sulfurylase (ou ATP : sulfate adénylyltransférase, EC 2.7.7.4) utilise l‘APS et un pyrosphate

(PPi) pour générer de l‘ATP et du sulfate (Figure 13 réaction 2), alors que chez Acidianus ambivalens, deux étapes sont nécessaires pour générer de l‘ATP (Zimmermann et al., 1999). Une adénylylsulfate : phosphate adénylyltransférase (APAT, anciennement ADP sulfurylase) produit de l‘ADP et du sulfate à partir d‘APS et de phosphate (Figure 13 réaction 3), puis l‘adénylate kinase convertit deux molécules d‘ADP en ATP et AMP (Figure 13 réaction 4).

Introduction

Figure 13. Réactions catalysées par les différentes enzymes de la voie indirecte de l’APS. Les structures de l‘AMP, de l‘APS, de l‘ADP et de l‘ATP sont montrées, et la partie qui va subir des modifications est encadrée en rouge. La première étape est toujours catalysée par l‘APS réductase, alors que la suite de la voie dépend des organismes. Une première possibilité n‘implique qu‘une seule enzyme (ATP sulfurylase) et une seule réaction qui génère de l‘ATP et du sulfate ; dans l‘autre cas, l‘action combinée de l‘APAT et de l‘adénylate kinase mène au même résultat.

Les acteurs de cette voie ont pu être caractérisés chez certains organismes : l‘ATP sulfurylase de la bactérie symbiote du ver marin Riftia pachyptila est un homodimère de 90 kDa environ (Beynon et al., 2001), alors que celle d‘Allochromatium vinosum a été isolée sous forme d‘un monomère de 45 kDa (Frigaard and Dahl, 2008). L‘APAT de Thiobacillus denitrificans est, elle, un homodimère composé de sous-unités de 41,4 kDa. Concernant l‘APS réductase la forme physiologique est un hétérodimère constitué d‘une sous-unité AprA de 70-80 kDa liant un FAD et d‘une sous-unité AprB de 18- 23 kDa liant deux centres [4Fe- 4S] (Fritz et al., 2000; Hipp et al., 1997; Speich et al., 1994). Un mécanisme catalytique a également été proposé dans lequel le sulfite forme un complexe avec le FAD, puis la réaction

Introduction avec l‘AMP a lieu pour donner de l‘APS, les deux électrons étant transférés via la flavine aux centres fer-soufre.

Ces réactions ont lieu dans le cytoplasme : APAT et ATP sulfurylase sont clairement solubles et localisées dans le cytoplasme (Brüser et al., 2000; Brune, 1995a), alors que l‘APS réductase peut être soit soluble et localisée dans le cytoplasme soit liée à la membrane (et orientée vers le cytoplasme). On retrouve en effet chez Allochromatium vinosum un opéron constitué des gènes sat (ATP sulfurylase) et aprMBA (APS réductase), où AprM serait une ancre membranaire putative non caractérisée (Frigaard and Dahl, 2008). Chez d‘autres bactéries ne possédant pas AprM, telles que Chlorobaculum tepidum, on retrouve les gènes codant pour l‘ATP sulfurylase et l‘APS réductase clustérisés avec ceux codant pour un complexe membranaire nommé Qmo (Quinone-interacting membrane-bound oxidoreductase). Ce complexe est composé de trois sous-unités, QmoABC, avec QmoA et QmoB cytoplasmiques, et QmoC membranaire. Il aurait notamment pour rôle de capter les électrons produits pendant l‘oxydation du sulfite par l‘APS réductase, et de les insérer dans les chaînes respiratoires via le « pool » de quinones (Pires et al., 2003; Rodriguez et al., 2011) (Figure 14). Il a donc été proposé que la protéine AprM joue le même rôle que le complexe Qmo chez les bactéries où elle est présente (Frigaard and Dahl, 2008).

Figure 14. Modèle de la voie de l’APS chez Chlorobaculum tepidum impliquant le complexe membranaire Qmo (Rodriguez et al, 2011). Les électrons issus de l‘oxydation du sulfite sont captés par le complexe Qmo et transférés au « pool » de quinones. MK, ménaquinone ; ApsBA, APS réductase ; Sat, ATP sulfurylase ; b, hème de type b ; FeS, centre [4Fe-4S] ; FAD, site de fixation du cofacteur FAD ; 4C, motif cystéine conservé.

Introduction

4. Oxydation du soufre stocké dans les globules

Comme il a été dit précédemment, l‘oxydation du thiosulfate par un système Sox ne possédant pas la soufre déshydrogénase SoxCD conduit à l‘apparition de globules de soufre comme intermédiaires réactionnels (Chapitre I, II.A.2.b). D‘autres situations, comme par exemple l‘oxydation de l‘H2S par les bactéries phototrophes sulfureuses, conduisent également à la formation de ces globules de soufre (Figure 15). Le mécanisme de stockage de ce soufre de manière transitoire, dans le périplasme ou à l‘extérieur des cellules, est encore mal décrit. En revanche, la façon dont il est ensuite utilisé est mieux connue et repose notamment sur un système nommé Dsr pour « Dissimilatory Sulfite Reductase » (Dahl et al., 2005; Holkenbrink et al., 2011; Pott and Dahl, 1998). Chez les organismes sulfato-réducteurs, où le système Dsr a tout d‘abord été décrit, cette voie catalyse la réduction du sulfite en H2S au cours de la dernière étape de la respiration du sulfate (Matias et al., 2005). Mais chez les bactéries phototrophes produisant des globules de soufre, telle qu‘Allochromatium vinosum, la voie fonctionne en sens inverse, le soufre élémentaire des globules étant oxydé en sulfite.

Figure 15. Bactéries sulfureuses phototrophes présentant des globules de soufre (Frigaard and Dahl, 2008) (Frigaard et Dahl, 2008). A, Thiocapsa sp. et ses globules intracellulaires (zones claires) vue au microscope optique. B, globules de soufre à l‘extérieur de Chlorobium phaeovibrioides. C, globules intracellulaires (périplasmiques) de Thiocystis violaceae. D, globule de soufre chez Thiocapsa roseopersicina dont l‘enveloppe protéique est bien visible. Le traitement des cellules pour la microscopie électronique (C et D) a provoqué la disparition du soufre, le globule est ainsi vu comme un ―trou‖ dans la bactérie.

Introduction

Chez Allochromatium vinosum, un groupe de quinze gènes, désignés dsrABEFHCMKLJOPNRS, code pour les protéines de ce système pour lesquelles un rôle précis n‘a pas encore été clairement établi. L‘un des composants majeurs est le complexe cytoplasmique DsrAB, constitué de deux sous-unités A et deux sous-unités B, qui catalyse l‘oxydation du soufre issu des globules en sulfite. Le groupement prosthétique de ce complexe a été identifié comme un siroamide-[4Fe-4S], le siroamide étant une forme modifiée (amide) du sirohème dont la structure est assez proche de celles des hèmes classiques. DsrN a été proposée comme une enzyme de maturation catalysant l‘amidation glutamine-dépendante du sirohème (Lubbe et al., 2006). La fusion des gènes dsrN et dsrR chez une bactérie chimiotrophe oxydant le soufre, endosymbiote de Calyptogena magnifica (Newton et al., 2007), a permis d‘envisager que DsrR soit également impliquée dans la biosynthèse du sirohème. Cependant, des études plus récentes suggèrent plutôt un rôle essentiel de cette protéine dans la régulation post transcriptionnelle du système Dsr (Grimm et al., 2010). DsrC est une petite protéine cytoplasmique possédant des résidus cystéine très conservés en position C-terminale. DsrEFH est un complexe cytoplasmique de 75 kDa de la forme α2β2γ2 possédant également des cystéines conservées (Dahl et al., 2005). Enfin, un complexe DsrMKJOP transmembranaire et transporteur d‘électrons est absolument requis pour l‘oxydation du soufre présent dans les globules (Sander et al., 2006). Il est composé de la protéine membranaire DsrM comportant deux hèmes b, d‘une seconde protéine membranaire DsrP, de la protéine cytoplasmique à fer-soufre DsrK, et des protéines périplasmiques DsrJ et DsrO qui sont respectivement un cytochrome c trihémique et une protéine à centre fer-soufre (Grein et al., 2010a; Grein et al., 2010b). Enfin, DsrS est cytoplasmique mais sans fonction attribuée. Le rôle de DsrL n‘est pas non plus clairement établi : c‘est une flavoprotéine cytoplasmique à centre fer-soufre possédant une activité NADH : accepteur oxydoréductase. Son importance a pourtant été démontrée par l‘inhibition complète de l‘oxydation des globules de soufre provoquée par la délétion du gène dsrL (Lubbe et al., 2006).

Le mécanisme par lequel le soufre stocké dans les globules est oxydé par le système Dsr est encore mal compris. On ignore notamment par quel moyen ce soufre extracytoplasmique est transporté dans le cytoplasme pour y être utilisé. Un premier modèle a été proposé dans lequel il est pris en charge sous la forme d‘un persulfure par un transporteur de type glutathion amide afin de traverser la membrane interne, puis il est libéré par DsrL sous forme de sulfure d‘hydrogène grâce aux électrons fournis par le NADH. Ce sulfure serait finalement oxydé par DsrAB, les électrons étant transférés au « pool » de quinones via le

Introduction complexe DsrMKJOP (Frigaard and Dahl, 2008). Cependant, les études menées ces dernières années ont permis de brosser un tableau un peu différent, mais néanmoins plus précis et plus complet du mécanisme mis en jeu par le système Dsr. Il a ainsi été montré chez Allochromatium vinosum que le complexe soluble DsrEFH était capable d‘interagir avec DsrC, et que la cystéine 78 de DsrE était essentielle à cette interaction (Dahl et al., 2008). Une autre interaction entre DsrK et DsrC a également été dévoilée, et la réduction par DsrK d‘un pont disulfure formé par les cystéines 100 et 111 de DsrC a été proposée (Grein et al., 2010a). Un transfert de soufre de DsrEFH vers DsrC a finalement été démontré ; l‘ensemble de ces résultats a permis de proposer un nouveau mécanisme catalytique pour le système Dsr (Figure 16) (Stockdreher et al., 2012).

Figure 16. Modèle du mécanisme catalytique du système Dsr chez Allochromatium vinosum (Stockdreher et al., 2012). Le mécanisme est décrit dans le texte. S° représente les globules de soufre élémentaire périplasmiques, RSH et RSSH représente le composé navette hypothétique chargé du transport du soufre du périplasme au cytoplasme, dans sa forme native et persulfurée. DsrEFH ne sont représentées que par EFH pour des questions de lisibilité.

Introduction

Le transport du soufre dans le cytoplasme se fait par un mécanisme encore inconnu, il est transféré au complexe DsrEFH sur la cystéine 78 de DsrE sous forme de persulfure probablement via une protéine non-identifiée. L‘atome de soufre est alors transféré sur la cystéine 111 de DsrC (la cystéine devient persulfurée), puis DsrAB vient oxyder ce soufre lié - en un groupement sulfonate (-SO3 ), libérant ainsi six électrons. Le sulfonate fixé sur DsrC est libéré sous forme de sulfite par la création d‘un pont disulfure intramoléculaire (cystéines 100 et 111 de DsrC). L‘interaction de DsrC avec le complexe DsrMKJOP, et plus particulièrement avec DsrK, va permettre la réduction de ce pont disulfure grâce aux électrons fournis par le complexe, probablement à partir de quinones. Dans ce processus, DsrEFH et DsrC agissent comme un système-relai pour le soufre, DsrAB est le catalyseur de l‘oxydation, et le complexe membranaire DsrMKJOP permet de régénérer DsrC sous sa forme de départ.

L‘interrogation principale sur ce système est maintenant de comprendre comment le soufre stocké dans les globules est transporté dans le cytoplasme et transféré à DsrEFH. Il avait été proposé l‘action d‘un composé de type glutathion amide, mais il a été montré que ni DsrEFH ni DsrC n‘étaient capables de lier du soufre à partir de composés de faible poids moléculaire comme le thiosulfate ou le glutathion. L‘intervention d‘une autre protéine liant le soufre, éventuellement à partir d‘un glutathion amide, et interagissant avec DsrEFH afin de transférer son substrat est envisagée ; cette interaction pourrait être médiée par la cystéine 20 de DsrH, puisqu‘il a été montré qu‘elle est essentielle à l‘oxydation du soufre contenu dans les globules par le système Dsr.

B) La réduction du soufre : soufre/polysulfure réductase

De nombreux organismes sont capables de croître en utilisant l‘hydrogène et le soufre élémentaire ou le polysulfure (deux types de chaînes de soufre, Figure 1) respectivement comme donneur et comme accepteur d‘électrons. Cette activité d‘oxydation de l‘hydrogène et de réduction du soufre élémentaire (ou du polysulfure) en H2S peut être portée par une seule enzyme, comme c‘est le cas des sulfhydrogénases solubles de Pyrococcus furiosus par exemple (Ma et al., 1993; Ma et al., 2000). Cependant, le cas général implique plutôt la présence de deux enzymes membranaires (constituées de plusieurs sous-unités) travaillant de concert, une hydrogénase et une soufre (ou polysulfure) réductase.

Introduction

Chez les archées, deux types d‘organisation ont été dévoilés : Acidianus ambivalens présente ainsi deux enzymes physiquement séparées mais reliées par des quinones (Laska et al., 2003), alors que chez l‘hyperthermophile Pyrodictium abyssi, cette voie se retrouve sous la forme d‘un supercomplexe (Dirmeier et al., 1998), c'est-à-dire l‘association stable et fonctionnelle de deux complexes (ici le complexe hydrogénase et le complexe soufre réductase). Dans ce dernier cas, le supercomplexe membranaire, d‘une masse moléculaire de 520 kDa, est composé de neuf sous-unités différentes, parmi lesquelles une hydrogénase à nickel-fer, la soufre réductase, et des hèmes de type b et c. De manière intéressante, aucune quinone n‘a été retrouvée dans le supercomplexe purifié, et l‘activité H2 : soufre oxydoréductase in vitro n‘en nécessite pas non plus. Le séquençage N-terminal des sous- unités de 82 et de 24 kDa montre des similarités avec les sous-unités SreA et SreB de la soufre réductase d‘Acidianus ambivalens, laquelle fait partie des molybdoenzymes de la famille des DMSO réductases : il en a donc été conclu que la soufre réductase de Pyrodictium abyssi est également une molybdoenzyme de cette famille, bien que ni molybdène, ni tungstène (qui le remplace souvent chez les archées) n‘ont été retrouvés dans le supercomplexe. Les auteurs proposent que ces métaux soient perdus durant les étapes de purification, mais, le fait qu‘une activité soufre réductase soit observée vient contredire cette hypothèse.

Dans le cas d‘Acidianus ambivalens, la soufre réductase purifiée à partir des membranes solubilisées réduit le soufre élémentaire en présence d‘une hydrogénase co- purifiée, et de quinones ou de cytochrome c comme transporteurs d‘électrons in vitro. L‘absence de cytochrome c chez cet organisme a conduit à proposer les quinones comme navette électronique physiologique. Les deux enzymes peuvent être séparées par des étapes de purification supplémentaires, mais l‘activité de la soufre réductase est alors perdue, alors que celle de l‘hydrogénase est conservée. Les deux enzymes ont une même masse d‘environ 250 kDa ; l‘analyse des complexes purifiés ainsi que des groupes de gènes codant pour ces protéines ont montré qu‘elles sont constituées de plusieurs sous-unités : SreA et SreB présentent des similarités de séquence avec la sous-unité catalytique et celle à centres [4Fe- 4S] respectivement des molybdoprotéines de la famille des DMSO réductases (Figure 17). De plus, SreA contient en N-terminal un motif « twin arginine », indiquant son export vers le périplasme. SreC est l‘ancre membranaire du complexe, et SreD est une polyferrédoxine putative contenant 26 cystéines, dont le rôle n‘est pas identifié au sein du complexe. Il existe

Introduction

également une protéine SreE qui serait une protéine chaperon spécifique impliquée dans l‘insertion du cofacteur à molybdène dans la sous-unité SreA.

Figure 17. Modèle de la voie anaérobie hydrogène-soufre chez Acidianus ambivalens (à gauche) et Wolinella succinogenes (à droite) (Laska et al., 2003). Sre et Psr sont les soufre et polysulfure réductases, Hyn représente l‘hydrogénase, SQ et MK symbolisent les quinones. Les cofacteurs de chaque sous-unité sont représentés.

Concernant l‘hydrogénase, elle est codée par un groupe de douze gènes incluant les sous-unités à nickel-fer catalytique et à centre fer-soufre, ainsi que certaines des protéines de maturation dédiées à ce système. Là encore, une ancre membranaire ainsi qu‘un motif « twin arginine » présent dans la séquence de la sous-unité à fer-soufre placent l‘hydrogénase dans la membrane avec une orientation périplasmique (Figure 17). On a donc deux enzymes séparées mais reliées par des quinones, constituées de plusieurs sous-unités, ancrées dans la membrane et orientées vers le périplasme. Cette organisation est très clairement identique à celle de la voie hydrogène-polysulfure caractérisée chez la bactérie mésophile Wolinella succinogenes, associant l‘oxydation de l‘hydrogène à la réduction du polysulfure via des quinones, bien que certaines sous-unités additionnelles soient présentes pour chaque enzyme d‘Acidianus ambivalens (Figure 17) (Dietrich and Klimmek, 2002) (Laska et al., 2003).

Introduction

Le polysulfure peut également servir d‘accepteur terminal d‘électrons lors de la croissance anaérobie de la bactérie Thermus thermophilus. Sa réduction en H2S est assurée par une polysulfure réductase utilisant les quinones réduites comme donneurs d‘électrons, et dont la structure tridimensionnelle a récemment été déterminée (Jormakka et al., 2008) (Figure 18). L‘enzyme elle-même est composée de trois sous-unités (PsrABC), dont une ancre membranaire (PsrC) portant le site de fixation des quinones et permettant la dimérisation du complexe, une sous-unité à quatre centres [4Fe-4S] (PsrB) et une sous-unité catalytique (PsrA) portant un centre [4Fe-4S] aligné avec ceux de PsrB en plus d‘un cofacteur à molybdène (bis-MGD). Comme dans le cas des autres molybdoenzymes de la famille des DMSO réductases, ce site catalytique n‘est donc pas exposé en surface de la protéine mais enfoui au fond d‘une cavité en forme d‘entonnoir dont l‘entrée est tapissée de résidus basiques pouvant interagir avec le polysulfure anionique.

Figure 18. Structure de la polysulfure réductase de Thermus thermophilus (Jormakka et al., 2008). Le cofacteur à molybdène (bis-MGD) est représenté en sphères oranges, le molybdène est une sphère noire. Les centres [4Fe-4S] sont représentées par des sphères jaunes et rouges, et l‘analogue de quinone est en sphères noires. La distance entre les centres redox est indiquée à droite de ces derniers en Å. L‘arc rouge représente la cavité en entonnoir de la sous-unité catalytique PsrA. L‘identifiant PDB est 2VPZ.

Introduction

C) Un cas particulier : la dismutation du soufre (SOR)

En 1989, Kletzin publie chez l‘archée thermoacidophile Desulfurolobus ambivalens (renommée depuis Acidianus ambivalens) la purification à partir du cytoplasme d‘une enzyme responsable de la dismutation oxygène-dépendante du soufre élémentaire en sulfite, thiosulfate et sulfure d‘hydrogène. Cette réaction nécessite impérativement de l‘oxygène, mais aucun cofacteur externe ou donneur d‘électrons n‘est requis. La protéine, portant à la fois l‘activité d‘oxydation et de réduction du soufre, est ainsi baptisée SOR pour Soufre Oxygénase Réductase (Kletzin, 1989). Depuis, plusieurs SOR ont été détectées dans les génomes, certaines ont également été caractérisées biochimiquement et/ou structuralement, révélant ainsi que cette protéine n‘est pas l‘apanage des organismes hyperthermophiles comme cela était supposé auparavant (Figure 19) (Veith et al., 2012).

Figure 19. Arbre phylogénétique des séquences de SOR disponibles dans GenBank (d‘après (Veith et al., 2012)). Le séquences soulignées indiquent qu‘une activité SOR a été démontrée dans l‘extrait cellulaire, en gras sont représentées les SOR caractérisées biochimiquement, celles soulignées deux fois ont été cristallisées et leur structure déterminée. La température optimale de croissance de l‘organisme est symbolisée par le code couleur : rouge, > 70°C ; orange, 51 à 70°C ; vert, 40 à 50°C ; bleu, environ 30°C ; noir, inconnue. Uncult, organisme non cultivé ; Ferropl, Ferroplasma ; Sulfob, Sulfobacillus ; Desulfom, Desulfomicrobium ; Acidithiob, Acidithiobacillus ; Halothiob, Halothiobacillus.

Introduction

1. Réactions catalysées

En fait, l‘activité de la SOR peut être vue comme deux réactions différentes, mais que l‘on ne peut pas séparer :

- + Oxygénase : S° + O2 +H2O  HSO3 + H

- + Dismutation : 3S° + 3H2O  2H2S + HSO3 + H

- + SOR : 4S° + 3H2O + O2  2H2S + 2HSO3 + 2H

Cependant, il n‘est toujours pas certain que le thiosulfate soit véritablement un produit direct de la SOR, puisqu‘en effet, une réaction non-enzymatique entre le sulfite et le soufre élémentaire en excès a lieu à haute température, avec le thiosulfate comme produit. De manière pratique, il est difficile de déterminer avec précision le devenir des produits de la réaction in vitro : outre la formation du thiosulfate déjà mentionnée, une oxydation rapide et non-enzymatique de l‘H2S par l‘oxygène a également lieu (Veith et al., 2011).

2. Structure et architecture

Si la réaction catalysée par la SOR n‘est déjà pas vraiment conventionnelle, son organisation architecturale est quant à elle tout à fait remarquable. A l‘heure actuelle, seules deux structures de SOR sont disponibles : la première provient d‘Acidianus ambivalens (Urich et al., 2006), et la seconde d‘Acidianus tengchongensis (Li et al., 2008b). Ces deux structures sont extrêmement proches, et montrent que la forme physiologique de la SOR est une sphère creuse de 24 sous-unités identiques (icosatétramère) d‘environ 845 kDa pour un diamètre extérieur de 15 nm.

a) Le monomère

Concernant le monomère, il s‘agit d‘une structure constituée d‘un tonneau β (lui- même formé par huit brins β antiparallèles) partiellement entouré de neuf hélices α, pour un poids moléculaire de 35 kDa. De manière intéressante, il peut être partagé en deux moitiés à peu près égales pseudo-symétriques. Chaque « moitié » de la protéine présente une topologie qui rappelle le motif (βαβ)2 des ferrédoxines (Figure 20). La présence de deux domaines

Introduction similaires au sein d‘une protéine, dont les séquences sont généralement peu conservées, est révélatrice d‘une duplication suivie d‘une fusion d‘un même gène ancestral. Les ferrédoxines en sont d‘ailleurs l‘exemple de référence (Dayhoff et al., 1983).

Figure 20. Le monomère de la SOR résulte d’un évènement de duplication/fusion d’un gène ancestral (Urich et al., 2006). A, structure du monomère de la SOR, montrant l‘axe de symétrie partageant la protéine en deux domaines similaires. B, schéma de la topologie en (βαβ)2 des ferrédoxines. Les triangles représentent les brins β et les cercles des hélices α. L‘unité (βαβ) N-terminale est en jaune, celle en C-terminal est en vert. C, topologie de la SOR, la légende est identique à B. On remarque la ressemblance entre chaque « moitié » de la SOR et avec les ferrédoxines.

Chaque monomère comporte une poche catalytique enfouie (Figure 21), constituée de trois cystéines (Cys31, Cys101 et Cys104, numérotation identique pour les deux espèces d‘Acidianus) et d‘un atome de fer non-hémique de bas potentiel (Urich et al., 2004). Les trois cystéines sont importantes pour l‘activité : dans le cas d‘Acidianus ambivalens, seule la cystéine 31 est absolument essentielle, une activité résiduelle étant détectée lorsque l‘une des autres cystéines est mutée (Urich et al., 2005). En revanche, les trois cystéines semblent indispensables chez Acidianus tengchongensis (Chen et al., 2005). De plus, la cystéine 31 est retrouvée sous forme persulfure dans la structure cristallographique de la SOR d‘Acidianus ambivalens, alors qu‘il s‘agit d‘une cystéine « normale » dans le cas d‘Acidianus tengchongensis. Cette cystéine est probablement le site de fixation du substrat soufré.

Introduction

Figure 21. Site catalytique d’un monomère de la SOR d’Acidianus Tengchongensis (Li et al., 2008b). Les deux couleurs correspondent simplement à la superposition des structures obtenues avec deux cristaux différents. Les acides aminés importants sont montrés sous forme de bâtonnets, l‘atome de fer est représenté par une grosse sphère, et la molécule d‘eau par une petite sphère.

La sphère de coordination de l‘atome de fer comprend deux histidines et un acide glutamique réunis dans un motif H-X3-H-X23-E, ainsi que deux molécules d‘eau dans le cas d‘Acidianus ambivalens (une seule pour Acidianus tengchongensis). Cette différence résulte probablement de conditions de cristallisation différentes, et ces deux structures sont donc certainement deux états différents de la SOR, ne constituant donc pas une divergence de caractéristiques entre les deux protéines. La position de cette molécule d‘eau « perdue » a été proposée comme site de liaison de l‘oxygène au fer au cours de la catalyse (Li et al., 2008b; Urich et al., 2006). Ce même fer jouerait le rôle d‘activateur de l‘oxygène.

b) La protéine entière

C‘est l‘organisation architecturale globale de la SOR qui en fait une protéine aussi singulière et intéressante. En effet, la sphère creuse formée par les 24 sous-unités est un véritable nanocompartiment protéique dans lequel les mouvements des substrats et des produits sont étroitement contrôlés (Figure 22).

Introduction

La première chose à noter est que les 24 sites actifs sont isolés du milieu extérieur, profondément enfouis dans chaque monomère et accessibles uniquement à partir de la cavité centrale de la sphère via un canal étroit. La poche catalytique est ainsi fermée par deux méthionines et une phénylalanine dont les chaînes secondaires sont assez flexibles pour permettre l‘entrée du substrat (Urich et al., 2006) (Veith et al., 2011).

Figure 22. Cheminement du substrat et des produits dans la SOR (d‘après (Li et al., 2008b) et (Veith et al., 2011)). Le substrat entre (flèche jaune pleine) dans la SOR via une des cheminées à quatre monomères (A) et rentre dans un des sites catalytiques en passant par le pore d‘un monomère (entouré en jaune). Les produits (flèche jaune en pointillés) ressortent par ce même pore et sont finalement évacués de la SOR par un canal constitué de trois monomères (B). A et B, les canaux sont vus de face.

Ceci pose la question de la voie d‘entrée du substrat à l‘intérieur de la sphère. L‘examen de la surface de la SOR montre l‘existence de six protubérances, chacune constituée par quatre monomères indépendants. Ces six protubérances forment chacune une

Introduction sorte de cheminée reliant le milieu extérieur à la cavité centrale (Figure 22). La surface interne de ces cheminées est uniquement constituée de résidus phénylalanine et valine, ce qui la rend hautement hydrophobe. Cette caractéristique est en accord avec la nature hydrophobe du substrat soufré, ce qui fait de ces cheminées un point d‘accès parfaitement plausible à l‘intérieur de la sphère. D‘un point de vue fonctionnel, on peut les interpréter comme des sortes de « filtres à substrats » qui préviendraient ainsi l‘oxydation de composés indésirables (Urich et al., 2006) (Veith et al., 2011).

Une fois le substrat entré dans l‘enzyme et transformé dans la poche catalytique, les produits de la réaction empruntent un dernier canal pour sortir de la SOR. Ce canal étroit est formé par trois monomères distincts, la forme physiologique de la protéine possède donc huit de ces canaux de sortie (Figure 22). Un argument en faveur de cette fonction concerne la charge de leur surface intérieure : des résidus sérine et arginine confère un caractère hydrophile et une charge globale positive tout à fait en adéquation avec la nature des produits (Li et al., 2008b; Veith et al., 2011).

Ces données structurales ont également permis d‘émettre une hypothèse quant à la nature véritable du substrat. Le test in vitro est en effet réalisé avec de la fleur de soufre, c'est- à-dire le cyclo-octasoufre insoluble. Les modélisations ont montré que celui-ci est trop volumineux pour passer par la cheminée d‘entrée ou pénétrer dans la poche catalytique sans subir d‘importantes modifications structurales. Le polysulfure, linéaire et soluble, est en revanche un bien meilleur candidat (Urich et al., 2006).

3. Vue générale du fonctionnement de la SOR

Les éléments disponibles en matière d‘architecture et de catalyse permettent de proposer un ordre séquentiel du fonctionnement de la SOR. En premier lieu, le soufre, sous forme linéaire, passe dans la cavité centrale de la protéine via une des six cheminées hydrophobes formées par quatre monomères. Ensuite, il pénètre dans la poche catalytique enfouie dans chaque monomère via un nouveau canal de ce même monomère. Il se lie covalemment à la cystéine 31 (persulfurée chez Acidianus ambivalens) et s‘aligne par rapport à l‘atome de fer non-hémique liant l‘oxygène. La première réaction (oxygénase) a alors lieu, suivie de la dismutation du soufre dans laquelle les cystéines 101 et 104 jouent probablement un rôle (en plus de stabiliser le substrat). Les produits sortent finalement de la poche

Introduction catalytique puis de la SOR en empruntant l‘un des huit canaux hydrophiles chargés positivement formés par trois monomères (Figure 22).

III) Complexité des métabolismes énergétiques du soufre : quelques exemples

Les organismes capables d‘oxyder le soufre ne présentent généralement pas qu‘un seul type de protéines correspondant à un composé soufré donné, mais plutôt un ensemble de voies leur permettant de prendre en charge différents composés captés directement dans le milieu ou produits comme intermédiaires réactionnels. Parmi ces organismes, certains ont été très largement étudiés, et si de nombreuses questions attendent encore une réponse, des modèles de leur métabolisme énergétique basé sur le soufre ont toutefois pu être élaborés.

A) Les archées thermoacidophiles : Acidianus ambivalens

Acidianus ambivalens est une archée de l‘ordre des Sulfolobales : comme tous les membres de ce groupe, elle se développe à haute température (optimum : 72-86°C) et à pH très bas (optimum : 2,5) (Fuchs et al., 1996). On la retrouve dans des environnements d‘origine volcanique de types solfatares, sources chaudes, cheminées hydrothermales caractérisées entre autre par leur forte teneur en composés soufrés, notamment en soufre élémentaire et sulfure d‘hydrogène. Il est donc logique que le métabolisme énergétique de ces organismes soit essentiellement basé sur le soufre.

De nombreuses études ont porté sur le métabolisme énergétique d‘Acidianus ambivalens, et un modèle assez détaillé de son fonctionnement a ainsi pu être proposé (Kletzin et al., 2004) (Figure 23).

Introduction

Figure 23. Modèle du métabolisme énergétique du soufre en condition aérobie chez Acidianus ambivalens ((Kletzin et al., 2004) et (Brito et al., 2009)). CQ, caldariella quinone ; SAOR, sulfite : accepteur oxydoréductase ; TQO, thiosulfate : quinone oxydoréductase ; SQR, sulfure : quinone oxydoréductase ; SOR, soufre oxygénase réductase.

Cette archée est capable de croître dans deux types de conditions dans lesquelles le soufre va être soit oxydé, soit réduit. En condition anaérobie, l‘hydrogène et le soufre élémentaire servent respectivement de donneur et d‘accepteur d‘électrons. La voie mise en place, mettant en jeu une hydrogénase et une soufre réductase membranaires orientées vers le pseudo-périplasme et reliées par un « pool » de quinones, a été précédemment décrite ( Figure 17). Le produit final de cette chaîne respiratoire est le sulfure d‘hydrogène (Laska et al., 2003). Une seconde condition de croissance, aérobie, repose sur l‘oxydation oxygène- dépendante du soufre élémentaire, avec l‘acide sulfurique (H2SO4) comme produit final du métabolisme (Kletzin et al., 2004). Il a été montré par les différentes études que la SOR est l‘enzyme-clé de ce métabolisme énergétique, en réalisant la première étape de l‘oxydation du soufre élémentaire (Figure 23). Si elle ne fournit aucun potentiel énergétique (pas de libération d‘électron ou de phosphorylation de substrat), elle permet toutefois de transformer

Introduction le soufre en espèces pouvant être oxydées par d‘autres enzymes au travers de réactions mettant en jeu des quinones. Ainsi, l‘H2S est oxydé par la SQR en chaîne de soufre (laquelle peut de nouveau être utilisée comme substrat par la SOR), le sulfite est utilisé soit par la

SAOR membranaire et directement oxydé en sulfate (l‘acide sulfurique H2SO4 est la forme 2- protonée de l‘ion sulfate SO4 ), soit par la voie de l‘APS au travers des enzymes cytoplasmiques APS réductase, APAT et adénylate kinase pour donner de l‘ATP et du sulfate. Enfin, le thiosulfate est oxydé en tétrathionate par la TQOR, ce tétrathionate pouvant être re- réduit par l‘H2S en thiosulfate, l‘H2S devenant du soufre élémentaire. Le « pool » de quinones réduit par la SQR, la SAOR et la TQOR est finalement utilisé par une quinol : oxygène oxydoréductase pour réduire l‘O2 en H2O, qui fait donc le lien entre les métabolismes du soufre et de l‘oxygène.

Finalement, ce qui ressort de ce modèle, c‘est une véritable mise à profit des différents degrés d‘oxydation du soufre, avec des enzymes dont la localisation, membranaire ou cytoplasmique, et la spécificité de substrat permettent de tirer parti au mieux de chaque étape de transformation du soufre, optimisant ainsi ce type de métabolisme énergétique.

B) Les bactéries sulfureuses phototrophes

Cette famille regroupant les bactéries sulfureuses vertes et pourpres réalise une photosynthèse dite anoxygénique, et utilise des composés autres que l‘eau, notamment des composés réduits du soufre comme l‘H2S ou le thiosulfate comme donneurs d‘électrons. On les retrouve dans les étendues d‘eau douce ou saumâtre, les environnements marins et d‘autres habitats combinant la présence de lumière et de source de soufre réduit à l‘absence d‘oxygène. Leur importance écologique est considérable, puisqu‘elles permettent de réoxyder l‘H2S issu de la réduction des sulfates par les organismes sulfato-réducteurs, et contribuent ainsi de façon majeure au cycle du soufre (Figure 2). De plus, la photosynthèse dont elles sont capables permet une fixation du carbone atmosphérique en carbone organique utilisable par d‘autres organismes. On comprend donc pourquoi tant d‘études visant à déchiffrer le métabolisme énergétique qu‘elles déploient leur sont consacrées.

Le modèle actuel du métabolisme énergétique du soufre des bactéries sulfureuses phototrophes est présenté Figure 24 ; y sont intégrées toutes les voies découvertes à ce jour chez l‘ensemble de ces bactéries. Il est donc possible qu‘aucun de ces organismes ne

Introduction possèdent toutes ces enzymes (Frigaard and Dahl, 2008; Gregersen et al., 2011; Sakurai et al., 2010).

Figure 24. Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez les bactéries sulfureuses phototrophes (Frigaard and Dahl, 2008). Pour le nom des enzymes, se reporter au texte. MK, quinones ; CycA, cytochrome c ; - R-SH, R-S-SH, HSn … différentes intermédiaires du soufre.

Dans le cas où l‘H2S est le substrat primaire, on constate que deux enzymes, la SQR membranaire et la FCSD périplasmique, ont la capacité de l‘oxyder en chaînes de soufre (polysulfures) en transférant les électrons aux quinones ou à un cytochrome. Ces chaînes de soufre vont alors être transitoirement incorporées en tant qu‘intermédiaire réactionnel aux globules de soufre en formation (Gregersen et al., 2011) déposés dans le périplasme ou à l‘extérieur des cellules suivant les organismes. Mais ces globules de soufre sont également formés d‘une autre manière. En effet, le thiosulfate est également un substrat classique de nombreuses bactéries sulfureuses phototrophes : celui-ci est oxydé par le système Sox, soit

Introduction complètement lorsque SoxCD est présent (le thiosulfate est alors directement transformé en sulfate) soit de manière incomplète lorsque SoxCD est absent. Dans ce dernier cas, une seule molécule de sulfate est libérée, et le soufre restant est incorporé par un mécanisme inconnu dans les globules de soufre.

La façon dont ce soufre à l‘état d‘oxydation 0 est ensuite mobilisé à partir des globules reste encore peu comprise : il a été proposé dans ce processus le rôle de petites molécules organiques telles que les glutathions, mais plus de preuves expérimentales sont nécessaires pour valider cette hypothèse. Une fois transporté dans le cytoplasme, le soufre est oxydé en sulfite par le système Dsr. Ce sulfite est finalement pris en charge par la voie de l‘APS pour générer de l‘ATP et du sulfate dans le cytoplasme. Un complexe membranaire orienté vers le cytoplasme, nommé PSRLC3 (pour polysulfide-reductase-like complex 3), homologue à la polysulfure réductase de Wolinella succinogenes, a également été proposé dans un rôle d‘oxydation du sulfite en sulfate. Cette hypothèse a été formulée après avoir constaté que chez les organismes où il a été détecté au niveau génomique, les gènes codant pour ce complexe putatif étaient situés directement en amont du groupe de gènes codant pour le système Dsr. De plus, son orientation cytoplasmique est en accord avec la production dans le même compartiment de sulfite par Dsr. Cependant, aucune preuve biochimique de cette activité n‘a pour l‘instant été rapportée, cette voie reste donc complètement hypothétique. Enfin, l‘analyse d‘une souche déficiente en SoxY d‘Allochromatium vinosum a montré une diminution importante de la capacité de la bactérie à oxyder le sulfite ; par ailleurs, le système Sox est connu pour oxyder le sulfite in vitro. Ceci en fait un bon candidat pour réaliser une oxydation périplasmique du sulfite après son transport à partir du cytoplasme. Cette question du devenir du sulfite chez les bactéries sulfureuses phototrophes reste donc ouverte.

C) Les bactéries acidophiles et mésophiles du genre Acidithiobacillus

Les bactéries du genre Acidithiobacillus sont des gamma-protéobactéries vivant à des pH très bas (1,5-2,5) et qui sont fréquemment retrouvées dans des environnements de type drainage minier acide. Elles sont capables d‘oxyder le fer (II), la pyrite (FeS2) ainsi que les composés réduits du soufre pour produire de l‘énergie. Cette particularité de solubiliser des métaux solides comme la pyrite est d‘un grand intérêt biotechnologique, dans les processus de

Introduction biolixiviation notamment. Le métabolisme énergétique du soufre de ces bactéries est étudié chez plusieurs représentants du genre comme Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus caldus. Si ces deux bactéries font partie du même genre, elles présentent néanmoins quelques différences intéressantes au niveau des enzymes mises en œuvre pour oxyder les composés du soufre.

Un modèle de ce métabolisme chez Acidithiobacillus ferrooxidans a été proposé en 2009 (Figure 25) (Quatrini et al., 2009) dans lequel il existe un couplage entre oxydation du soufre et réduction de l‘oxygène.

Figure 25. Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Acidithiobacillus ferrooxidans (Quatrini et al., 2009). Pour le nom des enzymes et les réactions qu‘elles catalysent, se reporter au texte.

Il y est ainsi montré l‘existence d‘une SQR oxydant l‘H2S, un cycle de recyclage entre une TQOR (TQR dans le schéma) oxydant le thiosulfate en tétrathionate, et une tétrathionate hydrolase (TetH) qui le retransforme en thiosulfate. L‘oxydation de ces composés du soufre par la SQR et la TQOR est couplée à la réduction du « pool » de quinones, lesquelles vont

Introduction finalement être utilisées par les oxydases terminales pour réduire l‘oxygène, ou par le complexe I pour générer le pouvoir réducteur. Cependant, ces voies n‘expliquent pas l‘oxydation du soufre élémentaire observée lors de croissance dans ces conditions de culture. Les auteurs ont ainsi proposé l‘implication dans cette activité d‘une nouvelle enzyme cytoplasmique, potentiellement liée à la membrane, appelée hétérodisulfure réductase (HdrABC). Chez les archées méthanogènes, ce complexe réduit l‘hétérodisulfure CoB-CoM (CoBS-SCoM), régénérant chacun des cofacteurs pour une utilisation ultérieure dans la méthanogénèse. Les auteurs proposent que chez Acidithiobacillus ferrooxidans et d‘autres organismes oxydant le soufre, l‘hétérodisulfure réductase fonctionnerait à l‘envers, et oxyderait un intermédiaire à disulfure (issu de l‘internalisation du soufre) en sulfite. Cet intermédiaire pourrait être de type glutathion-persulfure, comme ce qui a pu être proposé chez les bactéries phototrophes. La présence des gènes codant pour des protéines impliquées dans le transfert de soufre dans , l‘opéron codant pour ce complexe, supporte cette proposition. Cependant, cette hypothèse ne repose sur aucune donnée expérimentale, hormis la surexpression de l‘opéron lors d‘une croissance sur soufre élémentaire qui suggère effectivement une implication dans ce métabolisme. Le sulfite produit par cette enzyme doit être ensuite oxydé par un autre système, que les auteurs proposent être celui de la voie de l‘APS, puisqu‘en effet, un gène codant pour l‘ATP sulfurylase (Sat, dernière étape de la voie) est présent dans le génome de la bactérie. Cependant, la première enzyme combinant l‘AMP et le sulfite en APS (APS réductase) n‘a pas été retrouvée ; une nouvelle voie d‘oxydation du sulfite encore non identifiée doit probablement être présente. Il faut se rappeler toutefois que chez une autre souche d‘Acidithiobacillus ferrooxidans, la cytochrome c oxydase de type aa3 est capable in vitro d‘oxyder le sulfite en sulfate (Sugio et al., 2010); ces résultats mériteraient d‘être vérifiés in vivo.

Chez Acidithiobacillus caldus (Figure 26) (Mangold et al., 2011), outre les systèmes déjà décrits chez Acidithiobacillus ferrooxidans, il existe également une SOR cytoplasmique qui offrirait une voie d‘oxydation/réduction du soufre élémentaire, en un schéma qui rappellerait celui présent chez Acidianus ambivalens. Un système Sox tronqué est aussi identifié au niveau du génome ; en revanche, malgré la présence de l‘ATP sulfurylase, l‘APS réductase est toujours manquante.

Introduction

Figure 26. Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Acidithiobacillus caldus (d’après (Mangold et al., 2011)). ISCs désigne les composés inorganiques du soufre, Omp40 est une porine de la membrane externe.

IV) Réflexions sur les modèles des métabolismes énergétiques du soufre

Les quelques exemples présentés ici pointent la complexité de tels systèmes. Bâtir de tels modèles n‘est pas chose aisée, et plusieurs facteurs rendent cette tâche ardue. La multiplicité des enzymes, adaptées à un type particulier de composé soufré, associée à une absence de données cinétiques et d‘études sur les conditions d‘expression en fonction des conditions expérimentales est évidemment un premier point. Mais c‘est aussi la diversité et la redondance de tels systèmes, entres différents organismes ou parfois dans le même, qui pose le plus de question. Par exemple, Acidithiobacillus caldus possède à la fois une TQOR et un système Sox tronqué, tous deux situés dans le périplasme et dédiés à l‘oxydation du thiosulfate ; Acidianus ambivalens peut oxyder le sulfite par une SAOR membranaire ou la voie de l‘APS dans le cytoplasme. Un élément de réponse repose peut-être sur la localisation

Introduction de ces systèmes : leur présence dans les différents compartiments cellulaires permettrait d‘apporter un élément de régulation et de favoriser une voie plutôt qu‘une autre. De plus, les produits finaux ne sont pas forcément identiques : le produit de la TQOR est le tétrathionate qui peut être utilisé par la tétrathionate hydrolase qui elle-même régénère le thiosulfate, alors que le système Sox produit directement du sulfate et éventuellement du soufre élémentaire dans le cas de l‘absence de SoxCD. Ce recyclage des composés du soufre est particulièrement visible chez Acidianus ambivalens où l‘on assiste à un véritable cycle entre la SQR qui produit une chaîne de soufre à partir d‘H2S, laquelle peut-être utilisée par la SOR qui va donner entre autre de l‘H2S.

Cette apparente complexité et la difficulté de décrypter ces métabolismes reflètent en réalité la formidable capacité d‘adaptation des micro-organismes à leur environnement, et les stratégies d‘optimisation qu‘ils ont mis en place afin d‘exploiter au maximum la chimie toute particulière du soufre au travers de chacune des formes qu‘il peut prendre. Il ne faut pas y voir un enchevêtrement de substrats, de produits et d‘enzymes, mais plutôt des réseaux métaboliques hautement performants, organisés et structurés autour d‘un objectif d‘efficacité maximale dans des environnements dont les conditions physico-chimiques peuvent très brusquement varier. Ainsi, pour ces organismes, présenter un métabolisme énergétique polyvalent, ne reposant pas sur un seul type de composé soufré, mais bien capable d‘utiliser un large éventail de substrats, est finalement un gage de survie.

Ceci nous amène à une dernière piste de réflexion : comment étudier ces métabolismes ? La réponse est très certainement qu‘il n‘y a pas une seule technique qui doit prévaloir sur les autres, mais que l‘alliance des études biochimiques in vitro, des prédictions in silico basées sur les études génomiques et des observations de comportements in vivo des organismes dans différents contextes génétiques ou conditions de culture semble finalement être la clé de la compréhension de ces systèmes.

Introduction

Chapitre II

Les rhodanèses

Introduction

Les rhodanèses

La découverte de la première rhodanèse a été faite en 1933 par Lang, lorsqu‘il a isolé une enzyme de mammifères capable d‘ajouter un atome de soufre au cyanure pour le transformer en une forme bien moins nocive pour les cellules, le thiocyanate (Lang, 1933). Le nom de rhodanèse a alors été proposé à partir du nom allemand du thiocyanate (rhodanide) et du suffixe –ese qui désigne le produit d‘une enzyme. Si ce terme est aujourd‘hui encore couramment employé pour parler de ces protéines, la nomenclature officielle les définit comme des thiosulfate : cyanure soufre transférases (E.C 2.8.1.1) sur la base de leur activité in vitro.

Quatre-vingt années de recherches sur ces enzymes ont permis d‘en apprendre bien davantage et de mettre en évidence un repliement tridimensionnel ubiquitaire de type « rhodanèse » présent au sein de nombreuses protéines appartenant aux trois domaines de la Vie. Ainsi, aux protéines constituées uniquement du domaine rhodanèse s‘ajoutent celles présentant un domaine rhodanèse associé à un ou plusieurs domaines protéiques supplémentaires. On parle alors de protéines « rhodanèse-like » pour insister sur la présence de cette structure typique. Ceci a permis de définir les contours d‘une superfamille dont la caractéristique la plus notable reste son exceptionnelle hétérogénéité. En effet, comme nous allons le voir dans la suite de ce chapitre, les rhodanèses présentent à bien des égards plus de diversité que de points communs. C‘est cette même diversité qui fait l‘intérêt de ce véritable module protéique, non pas dédié à une seule fonction, mais impliqué dans une grande variété de voies physiologiques.

Introduction

I- Caractéristiques des rhodanèses

A) Organisation en domaines

La diversité des rhodanèses et des protéines « rhodanèse-like » s‘illustre tout d‘abord par les différentes organisations architecturales présentées par cette superfamille.

La rhodanèse « historique », première à avoir été étudiée dès 1933, est issue des mitochondries du bœuf, et couramment nommée Rhobov dans la littérature. C‘est une protéine de 293 acides aminés pour une masse moléculaire de 33 kDa environ, qui est organisée en deux domaines globulaires de taille et de structure équivalentes. Un seul de ces deux domaines (le domaine C-terminal) possède la cystéine catalytique, celle-ci est remplacée par un acide aspartique dans le domaine N-terminal (Ploegman et al., 1978). On parle alors de domaine N-terminal inactif et de domaine C-terminal catalytique, ceux-ci ne partageant qu‘une faible similarité de séquence (Figure 27).

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Figure 27. Alignement des séquences des domaines N-terminal (N-ter) inactif et C-terminal (C-ter) catalytique de la rhodanèse du bœuf. Le site actif est en vert, et la cystéine catalytique est soulignée. *, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; ., conservation faible.

Cette organisation, dite à domaines en tandem, est longtemps restée la norme des rhodanèses : il était ainsi communément admis qu‘une rhodanèse fonctionnelle devait être composée d‘un domaine N-terminal inactif, participant à la stabilité de la protéine, et d‘un domaine C-terminal catalytique. Néanmoins, il existe des exceptions à cette règle : chez Halanaerobium congolense (et d‘autres organismes thiosulfato-réducteurs), la protéine à domaines en tandem RdlA porte un site catalytique potentiel ainsi que la cystéine

Introduction caractéristique sur chacun de ses deux domaines (Ravot et al., 2005). Il en est de même pour la protéine PhsE de Desulfitobacterium hafniense (Figure 28) et dans ce cas les auteurs ont montré que chaque domaine contribue de manière indépendante et inégale (76% pour le domaine N-terminal) à l‘activité totale de la protéine (Prat et al., 2012). Il faut aussi mentionner la protéine YnjE d‘Escherichia coli comportant deux domaines inactifs et un domaine C-terminal actif, ainsi que des protéines identifiées par bioinformatique possédant jusqu‘à six domaines (Hanzelmann et al., 2009).

Figure 28. Représentation des deux domaines rhodanèse de la protéine PhsE de Desulfitobacterium hafniense (Prat et al., 2012). La position des acides aminés est indiquée au-dessus des domaines, les sites catalytiques potentiels en-dessous. Les 80 premiers résidus ne sont pas représentés

Cette vision traditionnelle des rhodanèses devant posséder un domaine à vocation essentiellement structurale a été bouleversée dans les années 2000 avec la caractérisation de la protéine GlpE d‘Escherichia coli (Ray et al., 2000). Cette protéine de 108 acides aminés ne possède qu‘un seul domaine, mais présente tout de même une activité thiosulfate : cyanure soufre transférase. Il faut toutefois noter que les premières études biochimiques montraient une organisation dimérique de la protéine : l‘association de deux monomères de GlpE reproduirait ainsi l‘organisation architecturale classique des rhodanèses, mais offrirait l‘avantage de présenter deux sous-unités catalytiques au lieu d‘un seul domaine actif. Mais cette information a été remise en question par la résolution de la structure de GlpE, puisqu‘une organisation monomérique de la protéine a été rapportée par cette étude (Spallarossa et al., 2001) (Figure 29).

Les données biochimiques et structurales concernant une autre rhodanèse à un domaine d‘Escherichia coli, PspE, ont démontré son organisation monomérique (Li et al., 2008a), alors que dans le cas d‘une autre protéine de type rhodanèse (Sud (sulfide dehydrogenase) de Wolinella succinogenes) une organisation exclusivement dimérique a été

Introduction clairement établie par le même type d‘approche (Kreis-Kleinschmidt et al., 1995; Lin et al., 2004) (Figure 30).

Figure 29. Structure tridimensionnelle de GlpE d’Escherichia coli (Spallarossa et al., 2001). Les éléments de structure secondaire formant la topologie α/β des rhodanèses sont indiqués par la nature de la structure (hélice α ou brin β) suivie d‘une lettre correspondant à la numérotation adoptée pour Rhobov ou RhdA. Les hélices α sont représentées en jaune. Les brins β sont représentés en gris. Les boucles sont représentées en vert. Le site actif est indiqué en rose, et la cystéine catalytique (Cys65) est représentée en bâtons et sphères.

Figure 30. Structure tridimensionnelle de Sud dimérique (Lin et al., 2004). La chaine de polysulfure (substrat de Sud) est représentée (sphères jaunes) liée à la cystéine catalytique (sphères grises). La boucle du site actif est représentée en vert.

Introduction

Ces différents cas de figure illustrent encore une fois la diversité des protéines de la superfamille des rhodanèses, puisque même un niveau d‘organisation simple en un seul domaine catalytique peut donner lieu, ou non, à des associations plus complexes comme le sont les formes dimériques.

L‘appréhension du domaine rhodanèse comme module protéique universel trouve sa plus flagrante expression dans les protéines dites « à domaine rhodanèse associé », pour lesquelles un domaine rhodanèse est combiné à un ou plusieurs autres domaines protéiques. Dans ce genre de configuration, l‘implication du domaine rhodanèse dans un processus donné semble dépendre directement du domaine avec lequel il est combiné, et donc de la fonction de la protéine entière. Il faut ici signaler que le domaine rhodanèse peut être soit catalytique (cas le plus fréquent) soit dépourvu de la cystéine caractéristique, et donc inactif. Le module rhodanèse pourrait alors apporter un élément de régulation de l‘activité de l‘enzyme (grâce à la présence de résidus tyrosine et histidine conservés pouvant servir de cible de tyrosine et histidine kinases) ou de façon plus générale un rôle de signalisation cellulaire (Han et al., 2003). Un rôle dans l‘interaction avec d‘autres protéines a également été démontré dans le cas des protéases ubiquitine-spécifiques (Avvakumov et al., 2006).

Enfin, il faut mentionner les phosphatases Cdc25, qui comportent un domaine C- terminal dont le repliement est typiquement le même que celui des rhodanèses classiques, mais dont le site actif est légèrement différent. Ces protéines ne fonctionnent pas avec du soufre mais avec du phosphate, montrant ainsi que les domaines rhodanèse catalytiques peuvent être totalement dissociés de leur fonction de transfert de soufre selon le contexte dans lesquels ils sont retrouvés (Bordo and Bork, 2002).

Pour conclure sur cette première partie concernant l‘organisation architecturale des protéines de la superfamille des rhodanèses, il faut retenir que le domaine rhodanèse s‘apparente à un véritable module protéique, catalytique ou non, associé ou non à un (ou plusieurs) autre(s) domaine(s) protéique(s), de type rhodanèse ou autre (Figure 31).

Introduction

Figure 31. Représentation des rhodanèses et protéines de type rhodanèse d’Escherichia coli (Cheng et al., 2008). Les abréviations sont : Rhd, domaine rhodanèse catalytique ; Rhd*, domaine rhodanèse inactif ; ss, séquence signal ; memb, segment membranaire ; FL, THUMP et PP-loop sont respectivement les domaines de type ferrédoxine, le domaine de liaison à l‘ARN retrouvé dans les enzymes de modifications des ARN et le domaine pyrophosphatase ; ATP-binding, domaine de liaison à l‘ATP ; MST, 3-mercaptopyruvate : cyanure soufre transférase ; H, domaine hypothétique de fonction inconnue ; Cys-rich, domaine riche en cystéine. Le nom des protéines est indiqué à droite.

B) Séquence protéique

La diversité des membres de cette superfamille se retrouve également au niveau de leurs séquences protéiques. En effet, les similarités de séquence peuvent être très faibles entre toutes les protéines, ce qui peut être justifié par leur caractère très ubiquitaire.

Cependant, il existe deux régions d‘acides aminés caractéristiques dans les séquences protéiques des rhodanèses, qui peuvent être considérées comme de véritables « signatures » de ces protéines, et dont le taux de conservation est important. Ces régions se trouvent pour l‘une en position N-terminale ([F/Y]-X3-H-[L/I/V]-P-G-A-X2-[L/I/V/F]) (Figure 32), et pour l‘autre en C-terminal de tous les membres de la superfamille ([A/V]-X2-[F/Y]-[D/E/A/P]-G- [G/S/A]-[W/F]-X-E-[F/Y/W]) (Figure 33) (Cipollone et al., 2007a). C‘est notamment grâce à cette séquence C-terminale que la protéine GlpE a été identifiée comme faisant partie de la

Introduction superfamille des rhodanèses et qu‘elle est ainsi devenue la protéine type des rhodanèses à un domaine (Figure 33).

Rhobov MVHQVLYRALVSTKWLAESVRAGKVGPGLRVLDASWYSPGTREARKEYLERHVPGASFFD RhdA MDDFASLPLVIEP----ADLQARLSAPELILVDLTSA------AR--YAEGHIPGARFVD * . . ::.. .::* .* * ::* : ** * * *:*** *.*

Rhobov IEECRDKASPYEVMLPSEAGFADYVGSLGISNDTHVVVYDGDDLGSFYAPRVWWMFRVFG RhdA PKRTQLGQPPAPGLQPPREQLESLFGELGHRPEAVYVVYDDE--GGGWAGRFIWLLDVIG :. : .* : *.. : . .*.** :: ****.: *. :* *. *:: *:*

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Figure 32. Alignement des séquences des domaines N-terminaux de la rhodanèse du bœuf (Rhobov) et de RhdA d’Azotobacter vinelandii. La signature N-terminale est en bleu. *, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; ., conservation faible

GlpE CYHGNSSKGAAQYLLQQ--GYDVVYSIDGGFEAWQRQFPAEVAYGA RhdA CQTHHRS-G-LTYLIAKALGYPRVKGYAGSWGEWGNHPDTPVEL-- * : * * **: : ** * . *.: * .: : *

Figure 33. Alignement des séquences C-terminales de GlpE d’Escherichia coli et RhdA d’Azotobacter vinelandii. Le site actif est en vert, la cystéine catalytique est soulignée, et la signature C-terminale est en bleu. *, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; ., conservation faible

Il faut néanmoins pondérer, puisque ces motifs sont peu conservés chez la protéine Sud de Wolinella succinogenes par exemple ainsi que pour une rhodanèse à un domaine de Thermus thermophilus (TTHA0613). Il n‘y a donc pas de corrélation directe entre le nombre de domaines de la protéine et la conservation des motifs rhodanèse.

C) Site actif

L‘activité catalytique des rhodanèses est portée par une cystéine requise pour leur activité soufre transférase, premier résidu d‘une série de six acides aminés constituant le site catalytique de l‘enzyme. Ici encore, il existe une conservation de la composition de ce site,

Introduction avec comme séquence consensus CRXGX[R/T] (Figure 27). Il existe des exceptions (Figure 33) telle que la rhodanèse à deux domaines RhdA d‘Azotobacter vinelandii qui porte le site actif CQTHHR, et la rhodanèse à un domaine PspE d‘Escherichia coli de séquence CNAGRQ.

Il faut cependant remarquer que tous ces sites actifs contiennent des résidus basiques, dont la charge positive est en adéquation avec les anions thiosulfate et CN- qui sont les substrats classiques des rhodanèses. Ainsi, le site catalytique du domaine N-terminal de PhsE de Desulfitobacterium hafniense (qui contribue aux trois quarts de l‘activité totale de la protéine) possède un résidu basique supplémentaire par rapport à celui du domaine C-terminal (responsable du dernier quart de l‘activité) (Prat et al., 2012) (Figure 28).

Mais ce critère n‘est à l‘évidence pas le seul influant sur l‘affinité d‘une rhodanèse pour ses substrats, comme en témoignent les protéines RhdA de Azotobacter vinelandii et Pseudomonas aeruginosa dont la séquence du site catalytique est identique, mais dont les activités spécifiques et les valeurs de Km sont différentes (Cipollone et al., 2004; Pagani et al., 1993). L‘arrangement global des deux domaines de la protéine ainsi que l‘accessibilité du site actif sont également des paramètres importants, comme en témoignent les différentes structures tridimensionnelles disponibles.

D) Structure tridimensionnelle

La rhodanèse de bœuf est la première dont la structure tridimensionnelle a été déterminée (Ploegman et al., 1978) ; elle a donc constitué depuis la référence d‘architecture des rhodanèses. Comme nous l‘avons vu précédemment, la protéine peut être divisée en deux domaines de taille équivalente, dont le repliement est également très similaire malgré le peu de conservation de leur séquence respective. Il s‘agit d‘une topologie de type α/β, plusieurs hélices α entourant un cœur de brins β parallèles (Figure 34). De plus, les deux domaines sont reliés par un peptide « linker » en « random coil » qui assure la continuité de la protéine.

Introduction

Figure 34. Superposition des structures de la rhodanèse RhdA d’Azotobacter vinelandii (marron) et de la rhodanèse de boeuf Rhobov (bleu) (Bordo et al., 2000). La boucle du site actif est indiquée en rouge pour RhdA et en marron pour Rhobov. Le repliement global des deux protéines est très similaire, et le positionnement du site actif est très proche. On retrouve des boucles plus courtes dans RhdA, notamment la boucle 30-32 proche du site actif et la boucle 175-190 (numérotation RhdA). Ces boucles sont indiquées en vert pour RhdA et en bleu turquoise pour Rhobov.

La résolution des structures d‘autres rhodanèses à deux domaines comme RhdA d‘Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000) (Figure 34), à un domaine comme GlpE d‘Escherichia coli (Spallarossa et al., 2001) (Figure 35) ou Sud de Wolinella succinogenes (Lin et al., 2004), ainsi que de protéines comportant un domaine rhodanèse associé, ont montré que ce repliement global est absolument conservé pour toutes les protéines de la famille.

Introduction

Figure 35. Superposition des structures tridimensionnelles de GlpE (vert) et RhdA (violet) (Spallarossa et al., 2001). Les boucles de connexion (plus longues chez RhdA) sont représentées en jaune.

On trouve cependant de petites caractéristiques structurales propres à chaque enzyme : par exemple, les boucles connectant les éléments α et β sont plus courtes chez GlpE (protéines de 108 acides aminés), que chez Rhobov (136 acides aminés pour le domaine catalytique), on note également la présence d‘une hélice α supplémentaire permettant la dimérisation chez Sud (Figure 30). Concernant le site actif, malgré une relative variabilité de séquence, son architecture reste sensiblement la même. Il forme une poche superficielle dans laquelle la boucle de six acides aminés portant la cystéine catalytique adopte une conformation semi- circulaire qui permet le positionnement de la chaîne latérale de la cystéine (portant le groupement sulfhydryle permettant la réaction) vers le centre de la poche catalytique. Il faut également noter le rôle de certains résidus éloignés en séquence, mais à proximité du site catalytique et qui peuvent intervenir dans la catalyse. Ainsi les résidus Arg 186 et Lys 249 de Rhobov ont été identifiés comme nécessaires dans la fonction de la protéine: il a été démontré que des mutations affectant la charge positive de la Lys 249 modifiaient la stabilité, la structure et la spécificité de substrat de cette rhodanèse (Luo and Horowitz, 1994). Par ailleurs, les résidus 230 à 235, constituant la boucle catalytique de RhdA et formant un pôle de charges positives contre la poche catalytique, peuvent être assistés au niveau

Introduction

électrostatique (en établissant des ponts salins) par les résidus Arg 97 et 169 et His 233 et 234 de la protéine. (Bordo et al., 2000).

E) Catalyse et mécanisme catalytique

L‘activité rhodanèse au sens strict, qui correspond à la nomenclature officielle thiosulfate : cyanure soufre transférase, est décrite par la réaction :

2- - 2- - S2O3 + CN  SO3 + SCN

Le mécanisme catalytique décrit pour ces enzymes, qui se fait en deux étapes, est couramment appelé mécanisme ping-pong ou de double déplacement. En effet, la première partie de la réaction correspond au transfert d‘un atome de soufre du thiosulfate sur la cystéine catalytique de l‘enzyme, provoquant le relargage d‘une molécule de sulfite ainsi que la création d‘un intermédiaire enzyme-persulfure stable. Dans la seconde partie de la réaction, le soufre est de nouveau transféré, cette fois-ci sur l‘ion cyanure, pour donner du thiocyanate (Figure 36).

Figure 36. Mécanisme en double déplacement de transfert du soufre des rhodanèses (Hildebrandt and Grieshaber, 2008).

Il faut insister sur le fait que l‘intermédiaire réactionnel est parfaitement stable, comme peuvent en témoigner les structures tridimensionnelles de RhdA et GlpE, dans lesquelles la cystéine catalytique est retrouvée sous forme persulfure. La protéine PspE a également été isolée par chromatographie échangeuse de cations sous deux formes distinctes, l‘une contenant un atome de soufre supplémentaire au site actif, l‘autre en présentant deux (Cheng et al., 2008).

Introduction

Cependant, il faut noter que cette activité thiosulfate : cyanure soufre transférase n‘est testée qu‘in vitro, et il existe par ailleurs de nombreuses indications sur le fait que les substrats in vivo puissent être différents en fonction des enzymes. Par exemple, le Km de Rhobov pour le cyanure est de l‘ordre de 60 µM (Wang and Volini, 1973), indiquant ainsi qu‘il s‘agit probablement du véritable substrat in vivo de la protéine, ce qui est également cohérent avec sa fonction de détoxification du cyanure dans les cellules. Le Km de la protéine GlpE pour le cyanure est quant à lui bien plus important, 17 mM, alors que celui déterminé pour la thiorédoxine 1 de la bactérie est de 34 µM. Les thiorédoxines sont de petites protéines d‘oxydoréduction présentant dans leur site actif deux cystéines capables de former un pont disulfure. De telles protéines à dithiol sont donc largement pressenties comme accepteur de soufre in vivo à la place du cyanure pour GlpE {Ray, 2000 #483 (Figure 37).

- Figure 37. Transfert du soufre des rhodanèses sur les thiorédoxines {Nandi, 2000 #393}. RSO2S représente un thiosulfonate qui peut servir de donneur de soufre, ES- et ESS- sont respectivement la rhodanèse avec son thiol libre et l‘intermédiaire rhodanèse-persulfure.

Il faut cependant être prudent lorsque l‘on raisonne avec les valeurs de Km : en effet,

RhdA de Pseudomonas aeruginosa est peu affine pour le cyanure (avec un Km déterminé in vitro de 12 ou 16 mM suivant le pH), mais l‘importance de cette enzyme a été démontrée pour la croissance en condition cyanogène de la bactérie (Cipollone et al., 2004; Cipollone et al., 2007b), ce qui fait du cyanure un accepteur de soufre in vivo parfaitement vraisemblable pour cette rhodanèse.

Pour ce qui est du donneur de soufre, il a été montré in vitro que la protéine RhdA d‘Azotobacter vinelandii était capable d‘interagir avec la cystéine désulfurase IscS ; cette étude a également mis en évidence le transfert d‘un atome de soufre à partir d‘IscS sur la

Introduction cystéine catalytique de RhdA (Forlani et al., 2005). Enfin, il faut citer la protéine rhodanèse- like Sud de Wolinella succinogenes, incapable d‘utiliser le thiosulfate, mais réalisant un transfert de soufre à partir du polysulfure (Km = 20 µM) sur le cyanure, selon un mécanisme identique aux rhodanèses classiques (Klimmek et al., 1998). Enfin, il faut citer des protéines dont l‘architecture est identique à celle des rhodanèses à deux domaines, mais qui utilisent du 3-mercaptopyruvate comme donneur de soufre au lieu du thiosulfate. Ces 3- mercaptopyruvate : cyanure soufre transférases (MST) constituent une sous-famille des rhodanèses que nous n‘allons pas détailler ici.

Ces exemples permettent de mieux appréhender la différence essentielle entre les substrats utilisés in vitro pour tester l‘activité rhodanèse, et les candidats retenus dans la fonction de donneurs et accepteurs de soufre in vivo. Cependant, malgré de très nombreuses études, dans la majorité des cas, les substrats physiologiques ne sont pas identifiés clairement, compliquant ainsi la compréhension des rôles assumés par les rhodanèses.

II- Fonction des rhodanèses

L‘incroyable diversité de séquence, de répartition taxonomique, d‘organisation des domaines, et des donneurs/accepteurs de soufre des protéines de la famille des rhodanèses suggère bien évidemment une égale variété de fonctions de ces modules protéiques. Le but de cette partie n‘est pas de dresser une liste exhaustive de toutes les rhodanèses identifiées dans les génomes et des fonctions associées, mais de donner un aperçu global de leur importance et de leur intérêt biologique. Il faut d‘ailleurs noter ici qu‘en dehors des protéines à domaine rhodanèse associé, peu de fonctions biologiques précises ont formellement été attribuées. En revanche, de nombreuses études indiquent leur implication dans diverses voies au sein des organismes. En nous basant sur les données de la littérature, nous allons illustrer cette diversité en nous attachant à quelques protéines pour lesquelles un rôle, ou une implication dans une voie donnée, a pu être démontré.

A) Les protéines à domaine rhodanèse associé

L‘étude des protéines à domaine rhodanèse associé a permis de leur attribuer des fonctions précises, généralement en rapport avec la synthèse de biomolécules soufrées.

Introduction

Le premier exemple concerne les protéines de type ThiI, impliquées dans des voies de biosynthèse de la thiamine (vitamine B1) et de la 4-thiouridine (base modifiée de certains ARN de transfert). Toutes les protéines de ce type présentent un domaine N-terminal THUMP impliqué dans l‘adressage de l‘enzyme de modification des ARN vers leur cible. De plus, les études menées sur la protéine ThiI d‘Escherichia coli ont permis d‘identifier en C-terminal un domaine de type rhodanèse portant la cystéine catalytique caractéristique. Ce domaine est également retrouvé au sein des protéines ThiI de Salmonella thyphimurium et Haemophilus influenzae (Palenchar et al., 2000), et également chez certaines espèces d‘archées (Thermoprotéales et Thermoplasmatales) (Liu et al., 2012). Dans le cas d‘Escherichia coli, les auteurs ont montré in vitro l‘existence d‘une activité rhodanèse portée par ThiI, qui est abolie lorsque la cystéine catalytique du domaine rhodanèse est mutée, et qui est absolument essentielle à la fonction de la protéine entière. Les auteurs ont ainsi proposé un mécanisme de transfert du soufre de ThiI sur l‘uridine-8 des ARN de transfert (Figure 38).

Figure 38. Mécanisme proposé pour le transfert de soufre de ThiI-persulfure sur l’uridine-8 des ARNt (Palenchar et al., 2000). Le mécanisme proposé implique la forme persulfurée de ThiI au niveau de la cystéine du domaine rhodanèse.

Introduction

Le second exemple est celui des protéines de type ThiF/MoeB, impliquées dans la biosynthèse des cofacteurs à molybdène. L‘un des membres de cette famille a été très étudié : il s‘agit de la protéine humaine MOCS3, qui comporte un domaine N-terminal présentant une forte similarité avec la protéine MoeB d‘Escherichia coli, et un domaine C-terminal de type rhodanèse (Figure 39).

Figure 39. Organisation en deux domaines de la protéine MOCS3 humaine (Matthies et al., 2004). MoeB- like domain indique le domaine de type MoeB, et RLD symbolise le domaine de type rhodanèse.

Les études menées sur cette protéine (Matthies et al., 2004) (Matthies et al., 2005) ont permis de démontrer l‘activité rhodanèse in vitro de ce domaine C-terminal, et sa capacité à transférer le soufre vers MOCS2A. (Figure 40).

Figure 40. Réaction catalysée par la protéine MOCS3 humaine montrant le transfert de soufre du domaine rhodanèse de MOCS3 sur la protéine MOCS2A (Cipollone et al., 2007b).

Il a été proposé que le donneur de soufre de MOCS3 soit la cystéine désulfurase Nfs1 chez l‘humain (Marelja et al., 2008). MOCS3 jouerait un rôle critique dans cette voie de biosynthèse du cofacteur à molybdène, à la fois dans l‘étape d‘addition de l‘AMP grâce à son

Introduction domaine N-terminal de type MoeB, ainsi que lors de l‘addition d‘un atome de soufre par le domaine rhodanèse C-terminal. La présence de ce module rhodanèse n‘est toutefois pas une constante puisqu‘il existe plusieurs de ces protéines qui ne le possèdent pas (Cortese et al., 2002). C‘est par exemple le cas de MoeB d‘Escherichia coli. Mais il faut également noter que des travaux récents ont démontré l‘implication d‘une rhodanèse à trois domaines, YnjE, dans cette voie, au travers de son interaction avec les protéines MoeB et IscS permettant également le transfert d‘AMP et de soufre pour la formation du cofacteur à molybdène (Figure 41) (Dahl et al., 2011).

Figure 41. Modèle de la biosynthèse de la molybdoptérine chez E. coli (Dahl et al., 2011).

B) Rhodanèses à un ou plusieurs domaines

Si le rôle des protéines à domaine rhodanèse associé semble plutôt orienté vers la biosynthèse des molécules soufrées, nous allons voir qu‘en ce qui concerne les rhodanèses à

Introduction un ou deux domaines, la question est bien moins tranchée, et si leur fonction précise n‘est souvent pas connue, leur implication dans différentes voies ou processus cellulaires ne fait en revanche plus de doute.

1. Chez les eucaryotes

La fonction première de détoxification du cyanure, découverte en même temps que la première rhodanèse, est aussi l‘une des mieux documentée. Il a ainsi pu être montré que les rhodanèses à deux domaines sont fortement concentrées dans les tissus et les organes exposés au cyanure (Sylvester and Sander, 1990) . En effet, même si cette répartition est espèce- dépendante, ces protéines sont surreprésentées dans les hépatocytes, les cellules épithéliales des bronchioles (voie d‘entrée du cyanure gazeux) ainsi que dans les cellules du tubule proximal du rein (facilitant l‘élimination du thiocyanate formé à partir du cyanure). Il est également intéressant de noter que lors d‘un empoisonnement au cyanure, la thérapie standard consiste en l‘administration par intraveineuse de thiosulfate, substrat des rhodanèses, ce qui permet la formation de thiocyanate et donc l‘élimination du cyanure.

Les rhodanèses sont également impliquées dans le métabolisme du sulfure d‘hydrogène (H2S). Ce gaz sert (i) de molécule-signal cruciale dans la régulation de fonctions physiologiques importantes, (ii) également comme substrat énergétique chez différents organismes et (iii) à haute concentration il peut être toxique et agir comme un poison pour la respiration aérobie (par réaction avec l‘oxygène). Un rôle des rhodanèses a pu être montré lorsque l‘H2S est utilisé comme substrat énergétique. En effet, il a été mis en évidence, dans la mitochondrie de foie de rat, une voie d‘oxydation énergétique de l‘H2S en thiosulfate grâce à l‘action de trois enzymes, dont une rhodanèse. Cette dernière agirait toujours en tant que soufre transférase, mais d‘une manière un peu particulière (Figure 42): elle ajouterait un atome de soufre (à partir d‘un persulfure produit par une SQR) sur une molécule de sulfite pour en faire du thiosulfate (qui sont respectivement le produit et le substrat des rhodanèses « classiques »). Cette activité persulfure : sulfite soufre transférase est supporté par des données cinétiques : in vitro, le glutathion-persulfure (GSSH) et le sulfite sont respectivement le donneur et l‘accepteur de soufre avec un Km de l‘ordre du µM, alors que celui du thiosulfate en tant que substrat est de l‘ordre du mM (Hildebrandt and Grieshaber, 2008).

Introduction

Figure 42. Modèle de l’oxydation du sulfure d’hydrogène dans les mitochondries impliquant une rhodanèse (Hildebrandt and Grieshaber, 2008). Sulfur transferase : rhodanèse ; SQR : sulfure quinone oxydoréductase ; III et IV : complexes III (complexe bc1) et IV (cytochrome c oxydase) ; Qox et Qred : quinone oxydée et réduite.

Ces deux rôles démontrés chez les eucaryotes illustrent la capacité des rhodanèses à intervenir dans différentes voies ; cependant, tout porte à croire qu‘elles sont capables d‘assumer d‘autres fonctions qui restent encore à découvrir, puisqu‘en effet, bien d‘autres rôles ont pu être déterminés chez les procaryotes pour ces enzymes.

2. Chez les procaryotes

La fonction de détoxification du cyanure par les rhodanèses est également évoquée chez les procaryotes dès 1975, grâce à l‘observation de mutants chez Bacillus stearothermophilus, présentant une activité rhodanèse cinq à six fois plus élevée allant de pair avec une meilleure aptitude à détoxifier le cyanure (Atkinson, 1975). Egalement, comme mentionné plus haut, des études ont montré le rôle de RhdA de Pseudomonas aeruginosa dans ces processus de détoxification (Cipollone et al., 2004; Cipollone et al., 2007b).

Un autre rôle, en lien avec le métabolisme énergétique du soufre, a été montré pour la protéine Sud de Wolinella succinogenes. Si elle n‘est pas une rhodanèse au sens strict du terme (incapable d‘utiliser le thiosulfate), elle catalyse néanmoins in vitro la formation de

Introduction thiocyanate à partir de polysulfure. Les travaux effectués sur cette protéine ont permis de suggérer un rôle dans le transfert du polysulfure vers la polysulfure réductase Psr, l‘un des accepteurs terminal d‘électrons de la bactérie. En effet, les auteurs ont prouvé l‘existence d‘une stimulation de l‘activité de réduction du polysulfure de l‘extrait membranaire en présence de Sud in vitro. Un modèle a ainsi pu être proposé, dans lequel l‘utilisation du polysulfure par la réductase serait plus efficace lorsque celui-ci est lié à Sud. Les auteurs proposent également que le transfert du substrat par Sud vers la polysulfure réductase membranaire se fasse au sein d‘un complexe protéique formé par les deux enzymes (Klimmek et al., 1998; Klimmek et al., 1999). A ce jour, cet éventuel complexe n‘a toujours pas été observé, le transfert direct du soufre entre les deux enzymes reste donc à confirmer.

Parmi les autres rôles proposés pour les rhodanèses procaryotes, certains ne font pas appel à leur activité soufre transférase. On peut ainsi citer la participation de RhdA d‘Azotobacter vinelandii dans la résistance au stress oxydant. En effet, les travaux effectués sur une souche mutante de la bactérie ne produisant pas cette protéine ont notamment montré une diminution de l‘activité des enzymes à Fe-S du cycle des acides tricarboxyliques sans que l‘expression des gènes correspondants ne soit affectée (Cereda et al., 2007). L‘hypothèse proposée était alors une protection par RhdA contre le stress oxydatif connu pour endommager les centres fer-soufre. Des études ultérieures ont permis d‘émettre l‘hypothèse d‘un pouvoir tampon de RhdA contre les espèces oxydantes grâce à un « switch redox » de sa cystéine catalytique. En effet, lors d‘un stress oxydant, celle-ci pourrait être oxydée en acide sulfénique (Cys-SOH) et former ensuite un pont disulfure par réaction avec un thiol libre, avant d‘être recyclée sous sa forme active par l‘action de systèmes tels que les thiorédoxines/thiorédoxines réductases (Cereda et al., 2009). Cependant, il s‘agit là d‘un modèle théorique nécessitant de plus amples études pour être validé.

Le détournement de la cystéine catalytique des rhodanèses dans un processus d‘oxydoréduction, tel que décrit plus haut, est également proposé dans le cadre d‘une étude du rôle de la protéine périplasmique PspE d‘Escherichia coli, effectuée sur une souche dans laquelle le système DsbA/DsbB, permettant la formation de ponts disulfures des protéines périplasmiques, a été supprimé. Les auteurs ont ainsi montré que la surexpression de PspE conduisait à son intervention dans un nouveau système PspE/DsbC permettant la restauration de la fonction normalement assumée par DsbA/DsbB (Figure 43). Si ce système n‘est manifestement pas nécessaire dans la souche sauvage, il a été proposé que d‘autres espèces de bactéries ne possédant pas les protéines DsbA/DsbB puissent utiliser une rhodanèse

Introduction périplasmique ainsi que DsbC pour remplir cette fonction (Chng et al., 2012). La véritable fonction physiologique de PspE chez Escherichia coli demeure toutefois inconnue.

Figure 43. Mécanisme proposé pour la formation des ponts disulfures dans les protéines du périplasme impliquant PspE/DsbC en absence de DsbA/DsbB (Chng et al., 2012).

III- Vue d’ensemble de la superfamille des rhodanèses

Les rhodanèses sont donc des objets d‘étude intéressants à bien des niveaux. Il s‘agit d‘une famille dont les membres ne partagent parfois que très peu de similarité de séquence, mais dont le repliement tridimensionnel (cœur de brins β entourés d‘hélices α) est parfaitement conservé. C‘est aussi une famille dont les représentants possèdent des architectures variées : un seul (GlpE, PspE…) ou deux (PhsE, RdlA) domaines catalytiques, un domaine inactif et un domaine catalytique (RhdA, Rhobov…), une combinaison de domaines inactifs et catalytiques (YnjE), un domaine catalytique combiné à d‘autres

Introduction domaines protéiques (MOCS3, ThiI…)… Les diverses études montrent que toutes les combinaisons envisageables semblent trouver des exemples dans la nature, et révèlent ainsi que le domaine rhodanèse n‘est pas simplement une protéine, mais véritablement un élément modulaire nécessaire à diverses fonctions physiologiques. Car si la rhodanèse au sens primaire du terme est une enzyme qui catalyse in vitro le transfert de soufre du thiosulfate au cyanure, les réactions in vivo semblent bien différentes : en effet, un partenaire protéique (telles que les cystéines désulfurases) ou un autre substrat soufré (le polysulfure par exemple) peuvent servir de donneurs de soufre, et l‘accepteur peut être à nouveau une protéine (les thiorédoxines) ou une autre molécule (sulfite, uridine-8 des ARNt). Les rhodanèses interviendraient donc dans la synthèse de biomolécules soufrées, la détoxification du cyanure, le métabolisme de l‘H2S ou du polysulfure, la résistance au stress oxydatif, les processus de sénescence chez les plantes… D‘un point de vue finaliste, ce domaine rhodanèse est donc une sorte de boîte à outils très puissante, qui peut être utilisée de différentes manières, dans des contextes distincts et à des fins diverses.

Mais ces fonctions sont généralement difficiles à établir. D‘une part, les substrats physiologiques ne sont pas toujours identifiés avec exactitude. D‘autre part, dans un même organisme, il peut exister plusieurs protéines de type rhodanèses (9 chez Escherichia coli, 10 chez Azotobacter vinelandii), et cette redondance est problématique lorsque l‘on cherche à en étudier une en particulier, notamment in vivo par des approches de délétants, une autre rhodanèse pouvant compenser cette absence (Cereda et al., 2009). Cette question des fonctionnalités des rhodanèses est aujourd‘hui un sujet en pleine expansion, et la compréhension des rôles physiologiques de cette grande famille de protéines représentée dans tous les domaines de la vie est bien entendu d‘un grand intérêt, tant fondamental que biotechnologique, en sciences de la vie.

Introduction

Chapitre III

Aquifex aeolicus

Introduction

Aquifex aeolicus

Le modèle d‘étude de l‘équipe, sur lequel porte cette thèse, est la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus. Ce chapitre a pour but de présenter cet organisme, tant au niveau de ses caractéristiques générales que de son métabolisme énergétique du soufre, objet d‘étude central de ma thèse.

I) Les Aquificales

Aquifex aeolicus appartient à l‘ordre des Aquificales et à la famille des Aquificaceae. Tous les membres de cette famille ont été isolés à partir d‘environnements géothermiques tels que des sources marines hydrothermales, des fumeurs noirs, des geysers de surface ou des cratères volcaniques (solfatares) (Figure 44).

Introduction

Figure 44. Environnements chauds où se développent les organismes hyperthermophiles. A : Fumeur noir d‘une dorsale océanique. Ce phénomène spectaculaire est la conséquence de la circulation de l‘eau de mer dans la croûte océanique, au niveau des régions présentant une activité volcanique intense ; B : Geyser de surface (Islande). L‘eau de pluie infiltrée se réchauffe au contact des poches magmatiques ; C : Solfatare en Italie. Dégagement de vapeurs d‘eau (160°C) composé entre autre de dioxyde de soufre et de sulfure d‘hydrogène.

Introduction

Les Aquificales constituent la branche la plus basse du domaine bactérien, proche du point de divergence Archaea / Eukarya sur l‘arbre phylogénétique universel (Figure 45) (Huber, 2002) et constituent un phylum distinct, Aquificae, au sein des Bacteria (Reysenbach, 2001).

Figure 45. Arbre phylogénétique universel basé sur la séquence de la petite sous-unité de l’ARNr 16S (Stetter, 2006). Les branches rouges sont constituées par les organismes hyperthermophiles.

A ce jour, le phylum Aquificae comprend trois familles (Figure 46) : Aquificaceae (Reysenbach, 2001), Desulfurobacteriaceae (L'Haridon et al., 2006), et Hydrogenothermaceae (Eder and Huber, 2002). Cinq genres sont répertoriés dans la famille des Aquificaceae : Aquifex, Hydrogenivirga, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum et Thermocrinis.

Introduction

Figure 46: Arbre phylogénétique basé sur l’ARNr 16S de quelques représentants de l’ordre des Aquificales. La bactérie d‘étude Aquifex aeolicus est indiquée en rouge. L‘arbre est réalisé selon la méthode des « neighbor-joining ». Ressource internet.

Les Aquificales sont des bactéries non sporulantes, strictement thermophiles ou hyperthermophiles, se développant à pH neutre ou légèrement inférieur (excepté pour Hydrogenobaculum acidophilum) (Table 2). Le genre Aquifex est le plus hyperthermophile avec une température maximale de croissance de 95°C. Les deux espèces bactériennes du genre Aquifex caractérisées au niveau physiologique sont Aquifex aeolicus et Aquifex pyrophilus. Cette dernière, isolée à Kolbensey Ridge au nord de l‘Islande, est anaérobie facultative et peut fixer l‘azote (Table 2) (Huber, 1992).

Les membres des familles Aquificaceae et Hydrogenothermaceae sont capables d‘utiliser l‘hydrogène et l‘oxygène respectivement comme donneur et comme accepteur d‘électrons (appelé « knallgas réaction »). Les membres de la troisième famille Desulfurobacteriaceae sont quant à eux des anaérobes obligatoires qui utilisent l‘hydrogène pour la respiration du soufre ou du nitrate. Le thiosulfate et le soufre élémentaire peuvent également être utilisés comme source d‘énergie par les Aquificales (Table 2). La plupart de ces bactéries sont autotrophes, utilisant le CO2 comme source de carbone qu‘elles fixent à partir du cycle de l‘acide tricarboxylique inverse ; cependant quelques espèces peuvent être hétérotrophes et obtiennent leur carbone via des sources organiques tels que l‘acétate et le formiate.

Introduction

Temp °C Donneurs pH (min- Accepteurs Produits Genres Espèces (min-opt- opt-max) électrons formés max) électrons

Famille Aquificaceae

-2 5,4-6,8- -2 - H2O, SO4 , Aquifex pyrophilus 67-85-95 H2, S°, S2O3 O2, NO3 7,5 N2

-2 - H2O, SO4 , Hydrogenivirga caldilitoris 55-75-77,5 5-6,5-7 H2, S° O2, NO3 N2O

Famille Hydrogenothermaceae

Hydrogenothermus marinus 45-65-80 5- ?-7 H2 O2 H2O

H2, S°, -2 H2O, SO4 , Persephonella marina 50-73-80 4,7-6-7,5 O2 -2 N2 S2O3

Famille Desulfurobacteriaceae

- + Thermovibrio ruber 50-75-80 5-6-6,5 H2 NO3 , S° NH4 , H2S

lithotrophicu Balnearium 45-70-80 5-5,4-7 H S° H S m 2 2

Table 2: Propriétés physiologiques de différentes espèces appartenant à l’ordre des Aquificales. Temp : température ; min : minimum, opt : optimum, max : maximum. Le pH optimal de croissance pour Hydrogenothermus marinus n‘est pas connu. Le tableau est adapté du livre « Aquificales » (Bonch- osmolovskaya, 2008).

II) Présentation de notre modèle d’étude : Aquifex aeolicus

La souche d‘Aquifex aeolicus que nous étudions au laboratoire nous a été fournie par Karl O. Stetter (Université de Regensburg) qui l‘a isolée à partir d‘une source hydrothermale peu profonde près de l‘île de Vulcano (située au nord de la Sicile). Aquifex aeolicus est une

Introduction bactérie hyperthermophile ayant une température optimale de croissance de 85°C mais qui peut croître jusqu‘à 95°C, ce qui en fait l‘une des bactéries les plus hyperthermophiles connue à ce jour. De plus, la position phylogénétique d‘Aquifex aeolicus (Figure 45) en fait un organisme idéal pour l‘étude du métabolisme énergétique dans le cadre d‘une atmosphère proche de l‘atmosphère primitive.

A) Morphologie, motilité et adhérence

Aquifex aeolicus est une bactérie Gram négatif en forme de bâtonnet (Figure 47) mesurant de 2 à 6 µm pour un diamètre compris entre 0,4 et 0,5 µm.

Figure 47. Aquifex aeolicus en microscopie électronique. La flèche indique les flagelles monopolaires polytriches.

Aquifex aeolicus est dotée de motilité comme Aquifex pyrophilus (Behammer et al., 1995) car elle possède des flagelles monopolaires polytriches (Figure 47). En effet, plus de 25 gènes codant pour des protéines impliquées dans la biosynthèse et la structure du flagelle ont été répertoriés dans son génome (Deckert et al., 1998). Récemment, des études réalisées au sein de l‘équipe ont permis de montrer que la bactérie n‘était mobile qu‘en présence de soufre soluble (thiosulfate), et que la croissance sur soufre élémentaire insoluble (fleur de soufre)

Introduction conduisait à l‘adhésion de la bactérie sur ce substrat : cette adhésion impliquerait un pili de type IV, dont les gènes de synthèse sont retrouvés dans le génome de la bactérie. De plus, ceci a été corrélé à la présence de la protéine FliC, composante majoritaire du flagelle, lors de la croissance avec le soufre soluble, alors qu‘elle est absente en présence de soufre élémentaire (Giuliani et al., 2010).

Tout comme Aquifex pyrophilus, elle est également capable de former de larges agrégats cellulaires pouvant contenir une centaine d‘individus (Figure 48).

Figure 48. Agrégat de cellules d’Aquifex aeolicus vues en microscopie optique.

B) Génome

Le génome d‘Aquifex aeolicus, entièrement séquencé à la fin des années 1990 (Deckert et al., 1998), est constitué de 1 551 335 paires de bases, soit le tiers du génome de la bactérie Escherichia coli. On y retrouve un taux de GC % élevé (65%), caractéristique des organismes hyperthermophiles, au niveau des opérons des gènes codant pour l‘ARNr 16S, 23S et 5S. L‘analyse du génome d‘Aquifex aeolicus a montré que 20% de ses gènes résulteraient d‘un transfert à partir de protéobactéries proches d‘Helicobacter pylori. Le reste du génome est voisin de celui de bactéries telles que Thermus thermophilus ou encore Thermotoga maritima (Deckert et al., 1998).

Introduction

C) Physiologie

Aquifex aeolicus est une bactérie chimiolithoautotrophe obligatoire, qui n‘utilise que des composés inorganiques comme source d‘énergie et le CO2 atmosphérique comme source de carbone. Elle est classiquement cultivée à 85°C sous atmosphère de H2/CO2/O2 dans un milieu ne contenant que des composés inorganiques, dont une source de soufre obligatoire (thiosulfate ou fleur de soufre). A l‘heure actuelle, ces quatre éléments semblent indispensables puisqu‘aucune croissance de la bactérie n‘a été observée en cas d‘absence de l‘un d‘eux.

La fixation du carbone chez Aquifex aeolicus se fait, comme chez Aquifex pyrophilus, via le cycle inverse de l‘acide tricarboxylique (Beh et al., 1993; Hugler et al., 2007). Les gènes codant pour les enzymes clefs de ce cycle sont présents dans le génome d‘Aquifex aeolicus. Par ailleurs, aucun élément ne suggère l‘existence d‘une voie alternative de fixation du CO2 (Deckert et al., 1998).

Aquifex aeolicus est une bactérie microaérophile, capable de croître à des concentrations en oxygène de 7,5 ppm. Les gènes permettant la mise en place d‘une respiration aérobie tels que ceux codant pour le complexe bc1, cytochromes c et cytochrome c oxydases sont présents, de même que ceux codant pour une quinol oxydase (Deckert et al., 1998) La bactérie possède en outre des gènes codant pour de nombreuses enzymes de protection contre les espèces réactives de l‘oxygène, comme plusieurs superoxydes dismutases ou encore des thiol peroxydases (Deckert et al., 1998).

L‘analyse du génome d‘Aquifex aeolicus souligne l‘existence d‘une nitrate réductase putative. Cependant, contrairement à la bactérie Aquifex pyrophilus, elle semble incapable d‘effectuer la respiration du nitrate. Le gène codant pour la nitrate réductase se trouvant à côté de celui d‘un transporteur, il est possible que cette enzyme soit impliquée non pas dans la respiration de l‘azote, mais plutôt dans son assimilation (Deckert et al., 1998).

Introduction

Enfin, lors d‘une croissance en présence de soufre élémentaire, des inclusions contenant du soufre apparaissent dans le cytoplasme de la bactérie (Figure 49) (Guiral et al., 2005b).

Figure 49. Image en microscopie électronique d’Aquifex aeolicus cultivée en présence de soufre élémentaire. A l‘intérieur du cytoplasme de la bactérie, les globules de soufre sont visibles pointés par des flèches blanches (Guiral et al., 2005b).

Comme nous l‘avons vu précédemment (Chapitre I, II.A.4), de tels globules de soufre ne sont pas rares chez les bactéries capables d‘oxyder ce substrat, et peuvent représenter soit un intermédiaire réactionnel, soit un produit final du métabolisme énergétique (Dahl and Prange, 2006). Cependant, ils sont majoritairement retrouvés dans le périplasme ou à l‘extérieur des cellules, leur localisation cytoplasmique chez Aquifex aeolicus est donc tout à fait particulière. Chez Allochromatium vinosum, ces globules sont entourés d‘une enveloppe protéique formée des protéines SgpA, SgpB et SgpC (Brune, 1995b; Pattaragulwanit et al., 1998), mais chez Aquifex aeolicus, aucun des gènes codant pour ces protéines n‘a été retrouvé dans le génome, posant ainsi la question de l‘existence d‘une telle enveloppe. La forme sous laquelle ce soufre est stocké n‘est pas non plus connue.

Introduction

III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus

La production d‘énergie chez Aquifex aeolicus est due à une ATP synthase, complexe membranaire absolument indispensable qui a été purifié et caractérisé (Peng et al., 2006). L‘enzyme est fonctionnelle, et ses neuf sous-unités ont été identifiées, à savoir α, β, γ, δ, ε de la partie F1 et les sous-unités a et c de la partie F0. Deux versions dupliquées de la sous-unité b ont également été retrouvées et formeraient un hétérodimère. Les études menées dans l‘équipe ont permis de montrer que l‘ATP synthase d‘Aquifex aeolicus est monomérique pour une masse moléculaire d‘environ 600 kDa (Guiral et al., 2009).

Plusieurs enzymes et voies métaboliques participant directement ou indirectement à la création du gradient de protons nécessaire au fonctionnement de l‘ATP synthase sont présents dans la bactérie.

A) Voie H2S/O2

Une première étude réalisée au début des années 2000 sur des membranes d‘Aquifex aeolicus cultivée en présence de thiosulfate avait proposé que l‘oxydation de l‘H2S par la SQR soit associée à la réduction de l‘oxygène par une cytochrome c oxydase via le complexe bc1 et le « pool » de quinones. Une partie des électrons serait également transférée à une autre oxydase terminale, la quinol : oxygène oxydoréductase (Nübel et al., 2000).

Cette voie H2S/O2 a été confirmée par des travaux réalisés dans l‘équipe. Il a en outre été montré que cette voie était portée par un unique supercomplexe regroupant tous les éléments nécessaires au transfert d‘électrons à partir d‘un donneur primaire d‘électrons

(l‘H2S) jusqu‘à l‘accepteur terminal (l‘oxygène) (Guiral et al., 2009; Prunetti et al., 2010). Cette entité complètement autonome est appelée « respirasome » (Figure 50).

Introduction

Figure 50. La voie H2S/O2 est portée par un supercomplexe composé d’une SQR, d’un dimère de complexe bc1 et d’une cytochrome c oxydase.

Elle est ainsi constituée d‘une SQR, d‘un dimère de complexe bc1 et d‘une cytochrome c oxydase de type ba3. Le « pool » de quinones assure le transfert d‘électrons entre la SQR et le complexe bc1 et un cytochrome c est impliqué dans le transfert d‘électrons du complexe bc1 à la cytochrome c oxydase. Il a également été montré que ce supercomplexe, bien que très stable, peut toutefois être dissocié, par un traitement au SDS, en deux parties distinctes, à savoir la SQR d‘un côté, et le sous-supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase de l‘autre. Ce dernier édifice est en revanche extrêmement stable et de multiples étapes de purification et de traitements chimiques sont nécessaires pour le dissocier.

Concernant la SQR, cette dernière peut être retrouvée dans le supercomplexe, mais aussi libre dans la membrane. Elle a ainsi été cristallisée sous la forme d‘un trimère (Figure 51) (Marcia et al., 2009).

Introduction

Figure 51. Structure 3D de la SQR trimérique d’Aquifex aeolicus. En rouge : cofacteur FAD (PDB 3HYV).

Cependant, l‘état d‘oligomérisation physiologique de la SQR n‘est pas connu : on la retrouve en solution sous forme monomérique, dimérique et trimérique, et chacune de ces formes est active. L‘existence d‘un équilibre et d‘une inter conversion entre ces différentes formes est une possibilité que l‘on ne peut pas écarter. Son orientation était également au début de ma thèse une question sans réponse tranchée : en tant que protéine membranaire monotopique, la SQR est orientée soit vers le périplasme, soit vers le cytoplasme. Aucune séquence signal ou motif « twin arginine » en N-terminal n‘est détecté, suggérant ainsi une orientation cytoplasmique, cependant, chez Rhodobacter capsulatus, c‘est une séquence C- terminale qui assure l‘export de la SQR du côté périplasmique de la membrane (Schutz et al., 1999). De plus, la résolution de la structure de la SQR d‘Aquifex aeolicus a montré que le domaine C-terminal des monomères est stabilisé par deux ponts disulfure, ce qui corrobore l‘idée de la localisation du côté périplasmique (Marcia et al., 2009). Aucune preuve directe n‘avait toutefois été apportée quant à la véritable orientation de cette protéine chez Aquifex aeolicus. Au cours de ma thèse, cette question a été résolue par les travaux de l‘équipe.

Introduction

B) Voie H2/S°

Lors d‘une culture d‘Aquifex aeolicus en présence de soufre élémentaire, on assiste à l‘apparition dans le milieu d‘H2S résultant de la réduction du soufre. En 2005, l‘équipe a identifié un supercomplexe membranaire d‘environ 600 kDa composé d‘une hydrogénase et d‘une soufre réductase : cet édifice supramoléculaire est capable de coupler l‘oxydation périplasmique de l‘hydrogène en protons et électrons à la réduction cytoplasmique du soufre

élémentaire en H2S, le « pool » de quinones jouant le rôle de navette électronique entre les deux partenaires (Guiral et al., 2005b).

Ce supercomplexe présente des points communs ainsi que des différences avec les voies H2/S° déjà décrites dans la littérature (Chapitre I, II.B).

Hydrogénase II + - H2 2H +2e

Périplasme

Sre C Q Membrane bII Sre B Cytoplasme

Sre A Mo

S° H2S

Soufre Réductase

Figure 52. Modèle de la voie de réduction du soufre élémentaire chez Aquifex aeolicus. L‘hydrogène est oxydé au niveau du site catalytique de l‘hydrogénase II (centre [NiFe]). Les électrons sont transférés aux centres

[Fe-S] puis au cytochrome bII de l‘hydrogénase, puis par le « pool » de quinones et les centres [Fe-S] de la soufre réductase à la sous-unité à molybdène, où la réaction de réduction du soufre est réalisée. Le transfert d‘électrons est représenté par les flèches en pointillés, le site catalytique de l‘hydrogénase par Ni, les centres [Fe-S] par les ronds bleus, le cytochrome bII par b II, le « pool » de quinones par Q, et le site catalytique de la soufre reductase par Mo.

Introduction

Tout d‘abord, sa composition est identique à ce que l‘on peut trouver chez Wolinella succinogenes et Acidianus ambivalens, à savoir une hydrogénase, constituée d‘une grande sous-unité catalytique à nickel-fer et d‘une petite sous-unité à centres fer-soufre ancrées à la membrane par un cytochrome b, et une soufre réductase, molybdoenzyme de la famille des DMSO réductases (Figure 52). Cette dernière est constituée des trois sous-unités SreA (113 kDa), SreB (29 kDa) et SreC (39 kDa) qui sont respectivement la sous-unité catalytique à molybdène, la sous-unité à quatre centres fer-soufre et l‘ancre membranaire portant le site de fixation des quinones. SreA comporte également un centre fer-soufre ainsi qu‘un site de fixation du NADPH, lequel est nécessaire à une activité optimale de la protéine. Cependant, la stœchiométrie exacte du supercomplexe n‘est pas connue (Guiral et al., 2005b). La présence de tous les acteurs réalisant le transfert d‘électrons du donneur primaire à l‘accepteur final en fait un second exemple de « respirasome » présent chez Aquifex aeolicus.

Cette organisation en supercomplexe de la voie H2/S° chez Aquifex aeolicus est retrouvée chez Pyrodictium abyssi mais pas chez les autres organismes comme Acidianus ambivalens et Wolinella succinogenes (Dietrich and Klimmek, 2002; Dirmeier et al., 1998; Laska et al., 2003). Cependant, la grande différence entre Aquifex aeolicus et les autres organismes tient à l‘orientation des protéines. En effet, si l‘hydrogénase membranaire est toujours orientée vers le périplasme, il n‘en va pas de même pour la soufre réductase. Périplasmique chez tous les organismes sauf Aquifex aeolicus, pour laquelle la séquence d‘export avec le motif « twin arginine » caractéristique est absente, suggérant ainsi sa localisation cytoplasmique. Ceci en fait un exemple unique d‘une voie de transfert d‘électrons du périplasme au cytoplasme, de l‘hydrogène vers le soufre (Figure 52).

Il faut noter qu‘il existe plusieurs hydrogénases chez Aquifex aeolicus : l‘une d‘entre elles (hydrogénase III) est soluble et pourrait participer à la fixation du carbone atmosphérique via une ferrédoxine et le cycle des acides tricarboxyliques inverse (Guiral et al., 2005a). Une autre (hydrogénase I) est membranaire, résistante à l‘oxygène et au monoxyde de carbone, et directement impliquée dans le métabolisme énergétique de la bactérie : les électrons issus de l‘oxydation périplasmique de l‘hydrogène sont transférés via un cytochrome b au « pool » de quinones, lesquelles vont être utilisées par le supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase pour réduire l‘oxygène. Ceci constitue donc une véritable voie

H2/O2. Toutefois, une interaction physique entre l‘hydrogénase et le supercomplexe n‘a pas encore été mise en évidence (Guiral et al., 2009).

Introduction

C) La Soufre Oxygénase Réductase (SOR)

Un gène codant pour une SOR putative a été détectée dans le génome d‘Aquifex aeolicus, puis la présence de la protéine correspondante a été démontrée dans le cytoplasme de la bactérie avant d‘être finalement purifiée après clonage chez Escherichia coli (Pelletier et al., 2008). Il a ainsi été démontré que la protéine possède la même activité oxygénase/dismutation du soufre à partir de soufre élémentaire et d‘oxygène que les autres SOR caractérisées chez les archées, ainsi que l‘atome de fer indispensable à cette activité. Les expériences de chromatographie d‘exclusion ainsi que de migration sur gel bleu natif (permettant de déterminer la masse native d‘une protéine) ont montré qu‘elle était composée de 16 sous-unités pour une masse moléculaire d‘environ 600 kDa. Il faut cependant remarquer que les premières caractérisations des SOR d‘archées, ayant utilisées le même type de technique, avaient conduit à une sous-estimation de la masse de la protéine (550 kDa contre 850 kDa), et donc du nombre de sous-unités qui la composent. Il a fallu attendre les données cristallographiques de la SOR d‘Acidianus ambivalens et celle d‘Acidianus tengchongensis pour attribuer un nombre de 24 sous-unités à la forme complète de l‘enzyme (Li et al., 2008b; Urich et al., 2006). La modélisation du monomère de la SOR d‘Aquifex aeolicus a montré une forte similarité de structure avec celles des deux espèces d‘Acidianus. Ces éléments, combinés avec l‘architecture particulière de cette enzyme, nous poussent à croire que la forme physiologique de la SOR d‘Aquifex aeolicus est également une sphère de 24 sous-unités (Figure 53).

La découverte de cette enzyme chez Aquifex aeolicus était tout à fait singulière, puisque l‘on pensait que la SOR était l‘apanage des archées hyperthermophiles, leur fournissant ainsi un moyen unique d‘oxyder le soufre élémentaire. Elle est donc restée un cas particulier jusqu‘à la découverte de nouvelles SOR bactériennes, et notamment celle de la bactérie mésophile Halothiobacillus neapolitanus (Veith et al., 2012). A ce jour, ce sont les deux seules SOR bactériennes à avoir été purifiées et caractérisées.

Introduction

B A

Figure 53. Modélisation de la SOR d’Aquifex aeolicus à partir de celle d’Acidianus tengchongensis. A, superposition des deux monomères de SOR (en bleu Aquifex aeolicus, en vert Acidianus tengchongensis, la sphère rouge correspond à l‘atome de fer non-hémique). B, forme complète modélisée (24-mers) de la SOR d‘Aquifex aeolicus. Le canal d‘entrée formé par quatre monomères est visible au centre.

D) Les rhodanèses

Les premières analyses du génome d‘Aquifex aeolicus ont permis de détecter deux gènes codant pour des rhodanèses à deux domaines, rhdA1 et rhdA2. Cependant, ces protéines n‘ont jamais été purifiées ou détectées dans les extraits cellulaires de la bactérie.

En revanche, des études menées dans l‘équipe ont démontré l‘existence de deux rhodanèses supplémentaires à un seul domaine. La première, Aq_1599, renommée RhdB2, est un dimère périplasmique potentiellement impliquée dans une voie de signalisation de la bactérie, et plus particulièrement dans la régulation de la motilité et l‘adhésion au substrat soufré (fleur de soufre) (Giuliani et al., 2010). Des travaux récemment publiés sur la protéine PspE d‘Escherichia coli (Chng et al., 2012) ont montré que cette rhodanèse périplasmique pouvait partiellement assumer le rôle du système DsbA/DsbB dans la formation des ponts disulfures des protéines du périplasme. Il a ainsi été proposé par les auteurs que des rhodanèses périplasmiques puissent jouer ce rôle chez les bactéries dépourvues de

Introduction

DsbA/DsbB, et que RhdB2 d‘Aquifex aeolicus (qui ne possède pas DsbA/DsbB) puisse être l‘archétype d‘un tel système. Cette hypothèse intéressante reste encore à tester.

La seconde rhodanèse, Aq_477, est cytoplasmique, et présente un comportement inhabituel pour une protéine de cette famille : en effet, la forme monomérique de la protéine existe en équilibre avec des formes dimériques et tétramériques (Giuliani et al., 2007). Il a pu être démontré par des méthodes biochimiques et physico-chimiques que cette augmentation du degré d‘oligomérisation apporte une meilleure stabilité à l‘enzyme ; cette caractéristique est très probablement une stratégie d‘adaptation à l‘hyperthermophilie de la bactérie. Un second point intéressant concerne les substrats utilisables par Aq_477, puisqu‘elle est capable d‘utiliser in vitro le thiosulfate (substrat classique des rhodanèses), mais aussi le tétrathionate ainsi que le polysulfure. Les paramètres cinétiques indiquent en outre une bien meilleure affinité pour le polysulfure que pour le thiosulfate, indiquant ainsi que le polysulfure est probablement le substrat physiologique. Il faut rappeler que contrairement à Aq_477, la protéine Sud de Wolinella succinogenes est également capable d‘utiliser le polysulfure, mais pas le thiosulfate (Klimmek et al., 1998). Ces deux caractéristiques, état d‘oligomérisation non-conventionnel et possibilité d‘utiliser différents substrats, font de cette protéine une rhodanèse tout à fait atypique. En dépit de ceci, aucun rôle physiologique pour cette protéine n‘avait pu être dévoilé au début de ma thèse.

E) NADH déshydrogénase (complexe I)

La NADH déshydrogénase est le point d‘entrée des électrons pour la plupart des chaînes respiratoires (Weiss et al., 1991). En effet, ce complexe protéique couple le transfert d‘électrons du NADH vers un pool de quinones à la translocation de protons à travers la membrane plasmique, contribuant ainsi à la création de la force proton motrice (Figure 54).

Le génome d‘Aquifex aeolicus révèle la présence de 24 gènes nuo codant pour des sous-unités de la NADH déshydrogénase. Il faut toutefois noter que le complexe I bactérien n‘est constitué que de 14 sous-unités. En fait, sept gènes sont présents sous forme dupliquée ou tripliquée. De plus, à l‘inverse des autres procaryotes, les gènes codant pour le complexe I ne sont pas retrouvés sous forme d‘un opéron, ou en groupe de gènes, mais sont présents dans différents locus. Cette organisation inhabituelle pourrait être liée au niveau évolutif à l‘acquisition tardive de certains gènes (Scheide et al., 2002).

Introduction

Figure 54: Représentation schématique de la NADH déshydrogénase montrant son organisation en trois modules (Friedrich and Bottcher, 2004). Le module NADH-déshydrogénase est représenté en jaune, le module hydrogénase en rouge, et le module de transport des protons en bleu. Les centres [Fe-S] sont notés N1a, N1b,

N2, N3, N4, N5, N6a, et N6b. Q: quinone; QH2: quinol.

La NADH déshydrogénase d‘Aquifex aeolicus a été purifiée en 2003 dans un état fonctionnel (Peng et al., 2003). Le complexe I comporte 13 sous-unités, les sous-unités NuoC et NuoD étant fusionnées, pour une masse moléculaire de 550 kDa, et présente une structure typique en L (Peng et al., 2003). Des études protéomiques menées par l‘équipe sur des membranes solubilisées (Guiral et al., 2009) ont permis d‘identifier les copies alternatives (duplicatas) des sous-unités NuoD et NuoI du complexe I. Ceci montre que différentes isoformes de ce complexe sont présente dans les conditions de culture que nous utilisons au laboratoire, traduisant probablement une certaine flexibilité de la composition du complexe I chez Aquifex aeolicus. Ceci semble être une caractéristique des Aquificales, puisque des duplicatas des sous-unités D et I sont également retrouvées chez Persephonella marina, Sulfurihydrogenibium azorense et Hydrogenobaculum Y04AAS1 par exemple. .

Le complexe I réduit le pool de quinones par l‘oxydation réversible du NADH. Cependant, le rôle de la NADH déshydrogénase chez Aquifex aeolicus n‘a pas été élucidé : en effet, le couplage NADH/cytochrome c oxydase classiquement observé dans les membranes des mitochondries n‘a pas été montré. Il a ainsi été proposé le transfert des électrons du complexe I vers une quinol oxydase ; une autre possibilité pourrait être le fonctionnement en sens inverse pour la régénération du pouvoir réducteur fourni par le NADH.

Introduction

F) Vision globale du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus

Comme bien souvent chez les organismes capables d‘oxyder le soufre à des fins énergétiques, Aquifex aeolicus possède un métabolisme complexe et composé de plusieurs enzymes responsables de l‘oxydation et de la réduction de différentes espèces soufrées (Figure 55).

Figure 55. Schéma du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus. Seules les voies et les enzymes caractérisées avant mon arrivée au laboratoire sont représentées. Les ronds noirs symbolisent les quinones, celui en rouge représente le cytochrome c.

Ce métabolisme est également indissociable de ceux de l‘hydrogène et de l‘oxygène qui sont respectivement des donneurs et des accepteurs d‘électrons pour la bactérie. On retrouve ainsi une première voie hydrogène/oxygène indépendante du soufre, faisant intervenir une hydrogénase et le supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase. Cependant, la bactérie a impérativement besoin d‘un composé soufré (classiquement le soufre élémentaire ou le thiosulfate) pour sa croissance, cette première voie n‘est donc clairement pas suffisante. Une seconde voie couple l‘oxydation du sulfure d‘hydrogène H2S à la réduction de l‘oxygène : cette activité est portée par un supercomplexe composé d‘une SQR et du supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase. Une troisième voie, reposant sur le

Introduction supercomplexe transmembranaire hydrogénase/soufre réductase, associe l‘oxydation de l‘hydrogène à la réduction du soufre élémentaire. Il est intéressant de remarquer que la SQR et la soufre réductase catalysent des réactions strictement inverses : le substrat de l‘une est le produit de l‘autre, puisque l‘H2S est le substrat de la SQR et le produit de la soufre réductase, et qu‘à l‘inverse, la chaîne de soufre produite par la SQR peut être utilisée par la soufre réductase. Loin d‘être un « cycle futile », pour reprendre le terme employé par les enzymologistes, dans lequel on revient constamment au point de départ, il faut voir ce système comme un processus de recyclage du soufre afin d‘exploiter au mieux sa capacité énergétique. En effet, à chaque passage, des quinones sont impliquées et un gradient de protons est créé, permettant ainsi le fonctionnement de l‘ATP synthase et la production d‘énergie pour la bactérie. A ce cycle composé des deux voies citées se rajoute un troisième acteur cytoplasmique, la SOR, qui utilise des chaînes de soufre pour produire de l‘H2S, mais aussi du sulfite, et d‘une manière non-enzymatique, du thiosulfate.

Le devenir de ces produits est incertain, et nous avons vu que chez les autres organismes, des systèmes supplémentaires étaient capables d‘utiliser ce type de composés afin d‘en réaliser une oxydation complète. De plus, Aquifex aeolicus est capable d‘utiliser le thiosulfate pour sa croissance, et aucune des voies ou enzymes décrites n‘en permet l‘utilisation. Enfin, le produit final du métabolisme de la bactérie est le sulfate, ainsi que l‘H2S lors d‘une croissance sur soufre élémentaire. Il est donc logique de penser que des systèmes autres que ceux déjà caractérisés doivent exister chez Aquifex aeolicus. A mon arrivée dans l‘équipe, ces pistes n‘avaient été que peu explorées, et une partie de ma thèse a consisté à tenter d‘identifier de nouvelles voies et enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique du soufre. Une sous-partie des résultats y est consacrée.

Introduction

Chapitre IV

Objectifs du travail

Introduction

Objectifs du travail

J‘ai réalisé ma thèse au laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines dans l‘équipe « Métabolisme énergétique des organismes extrêmophiles », qui s‘intéresse à la compréhension des stratégies d‘adaptation aux environnements extrêmes des micro- organismes, notamment en ce qui concerne leur métabolisme énergétique.

Aquifex aeolicus est l‘un des modèles d‘études de l‘équipe. Cette bactérie est tout à fait remarquable à bien des niveaux. En premier lieu parce qu‘elle est l‘une des plus hyperthermophiles décrites à ce jour, avec une température optimale de croissance de 85°C, et une tolérance proche des 100°C. Sa position phylogénétique est également exceptionnelle, puisque c‘est l‘un des organismes les plus proches de LUCA, le dernier ancêtre commun à toutes les formes de vie; ce caractère ancien se retrouve également au niveau de son métabolisme énergétique. En effet, Aquifex aeolicus est capable d‘utiliser le soufre élémentaire, insoluble, pour sa croissance. Ce type de processus date de plus de 3,5 milliards d‘années, et c‘est donc l‘une des premières stratégies mises en place pour la production d‘énergie par les être vivants (Philippot et al., 2007).

Les travaux de l‘équipe consistent à analyser les voies énergétiques existantes chez cet organisme dont les conditions de croissance optimales nécessitent la présence d‘une source de soufre, mais aussi d‘oxygène et d‘hydrogène. L‘identification des enzymes impliquées dans ces voies énergétiques peu habituelles a été un des premiers objectifs de recherche. L‘équipe est ainsi parvenue à mettre en évidence l‘existence de trois voies énergétiques coexistant dans les conditions de culture utilisées : une première voie associe l‘hydrogène au soufre (supercomplexe hydrogénase / soufre réductase), une seconde, le soufre à l‘oxygène

(supercomplexe SQR / complexe bc1 / cytochrome c oxydase) et la troisième, l‘hydrogène à l‘oxygène (voie hydrogénase / complexe bc1 / cytochrome c oxydase). En plus de ces trois voies majeures, une enzyme particulière nécessitant du soufre et de l‘oxygène, la SOR, avait été caractérisée. Enfin, deux soufre transférases de la superfamille des rhodanèses, Aq_477 et Aq_1599, ont été caractérisées, sans que leur rôle physiologique ait pu être clairement établi.

Introduction

Si l‘on se focalise sur le métabolisme énergétique du soufre, deux points sont notables : le premier concerne la complexité d‘un tel métabolisme mettant en jeu différentes enzymes capables d‘utiliser et de produire différents composés soufrés, lesquels peuvent être à la fois substrats et produits pour ces protéines, ce qui pose la question d‘une éventuelle interconnexion entre ces voies. Le deuxième point est en rapport avec la circulation et le transfert des molécules soufrées au sein de ces systèmes certes complexes mais surtout hautement organisés.

Au cours de ma thèse, je me suis essentiellement attaché à comprendre le métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus à travers deux axes principaux, décrit au sein de la première partie de ce manuscrit. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de la rhodanèse de fonction inconnue Aq_477, et nous avons ainsi pu mettre en évidence son rôle central de transport de substrat au sein du métabolisme énergétique du soufre. Un deuxième axe a été de porter un regard plus large et plus global sur ce métabolisme, en recherchant des systèmes supplémentaires d‘utilisation du soufre, qui pourraient par exemple expliquer le devenir de certaines molécules soufrées telles que le sulfite produit au cours de l‘oxydation du soufre. Ceci nous a permis de proposer un modèle général du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus intégrant ces nouveaux systèmes et l‘interconnexion de ces différentes voies.

Dans une seconde partie, nous avons cherché à savoir si les complexes et enzymes des voies respiratoires de la bactérie pouvaient s‘associer entre elles afin de former des structures de très haut poids moléculaire, nommées mégacomplexes, qui permettraient une certaine compartimentalisation, et donc une efficacité accrue des processus bioénergétiques.

En recherchant ce type de structures, nous avons découvert un nanocompartiment protéique appelé encapsuline, dans lequel est capable de s‘ancrer une autre protéine. Cette dernière, présentant des caractéristiques inhabituelles, nous permet de proposer qu‘elle soit le prototype d‘une nouvelle sous-famille des ferritines, des protéines impliquées dans le stockage du fer.

Matériels et méthodes

MMAATTEERRIIEELLSS EETT MMEETTHHOODDEESS

Matériels et méthodes

I) Cultures bactériennes

A) Aquifex aeolicus

La souche d‘Aquifex aeolicus a été fournie au laboratoire par le Pr. Karl O. Stetter de l‘Université de Regensburg en Allemagne. La souche est cultivée à 85°C sous agitation à 350 rpm et à pH 6,8 sous H2 / CO2 (80 : 20 à une pression de 1,35 bar) (Huber et Stetter, 1999). La culture est réalisée en bouteille de 2 litres, contenant 400 ml d‘un milieu minéral non dégazé (Tableau 6), dans lequel est ajouté du soufre élémentaire (7,5 g.l-1) ou du thiosulfate (1 g.l-1). Le rendement est de 50 à 80 g de cellules pour 100 litres de culture. En fin de phase exponentielle (correspondant à 18 h de croissance sur soufre élémentaire), les bactéries sont récoltées par centrifugation, et le culot bactérien est refroidi dans l‘azote liquide et conservé à -80°C.

NaCl 30 g Acide nitriloacétique 1,5 g

MgSO , 7 H O 76 g MgSO4, 7 H2O 3 g 4 2

MgCl , 6H O 3,5 g MnSO4, H2O 0,5 g 2 2 KCl 0,65 g NaCl 1 g

NaBr 0,1 g FeSO4, 7 H2O 0,1 g

NaHCO3 2 g CoSO4, 7 H2O 0,18 g

NH4Cl 0,15 g CaCl2, 2 H2O 0,1 g

K2HPO4 0,15 g ZnSO4, 7 H2O 0,18 g

CaCl2, 2 H2O 0,5 g CuSO4, 5 H2O 0,01g

Oligo Balch-Aquifex 10 ml pour 1 litre H3BO3 0,01 g

Table 3 : Composition du milieu de culture d’Aquifex aeolicus pour 1 litre. La composition pour 1 litre de solution « oligo de Balch Aquifex » est indiquée dans le tableau de droite.

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Matériels et méthodes

Dans la cadre de la collaboration avec le MIO (collaboration avec Y. Combet-Blanc et R. Auria, Institut Méditerranéen d‘Océanologie, Marseille), la souche a été cultivée, en fermenteur de 8 litres, en Fed-Batch à 80°C sous agitation en présence d‘hydrogène, de dioxyde de carbone, de thiosulfate et d‘oxygène. Contrairement à nos conditions de croissance en bouteilles, tout au long de la culture (18h à 20h) la pression partielle d‘oxygène est maintenue à une concentration fixée. Les cellules utilisées dans nos études on été obtenues -1 avec une concentration d‘oxygène de 50 % (correspondant à 1,5 mg d‘O2.l , condition optimale de croissance). A 80°C, la concentration de l‘oxygène à l‘équilibre dans le milieu pour une atmosphère gazeuse contenant 21% d‘oxygène est de 3 mg.l-1. 3 mg.l-1 correspondent au 100% d‘oxygène dissout à cette température.

B) Escherichia coli

Pour l‘expression hétérologue de la protéine Aq_477 (SbdP) et de la SOR, nous avons utilisé la souche BL21- CodonPlus (DE3)-RIPL d‘Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA) qui contient un plasmide permettant l‘expression des gènes des ARNt correspondant aux codons rares. Les cultures d‘Escherichia coli ont été réalisées dans le milieu Luria Betani (LB) auquel est rajouté 14 g.l-1 d‘agar dans le cadre de cultures sur milieu solide. La bactérie Escherichia coli est cultivée à 37°C dans des volumes de 500 ml en conditions aérobies. Une fois que les cellules ont atteint une densité optique à 600 nm égale à O.6, la production de la protéine désirée est induite à 37°C durant 3 h par l‘ajout d‘isopropyl β-D- thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale 1 mM. Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation à 10 000 g pendant 30 min.

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Matériels et méthodes

II) Obtention du matériel biologique

A) Aquifex aeolicus

1. Fractionnement cellulaire

Afin d‘étudier la localisation précise de la rhodanèse Aq_477 (SbdP), nous avons séparé les différents compartiments cellulaires de la bactérie. La première étape d‘extraction périplasmique est réalisée en resuspendant les cellules dans un tampon Tris-HCl 100 mM, EDTA 100 mM pH 9, à raison de 20 ml de tampon par gramme de cellules (poids humide). L‘incubation est réalisée à 37°C pendant 30 min sous agitation douce, puis l‘extrait périplasmique est récupéré en centrifugeant les cellules à 10 000 g pendant 10 min. Le culot contenant les cellules est resuspendu dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6 (20 ml de Tris- HCl pour 12 g de bactéries), en présence d‘inhibiteurs de protéases (1 pastille pour 50 ml de tampon, Cocktail d‘enzymes, Roche) et cassé par deux passages au désintégrateur de cellules (Constant Systems Ltd.) à une pression de 1,6 kBar. Les cellules non cassées sont éliminées par une centrifugation à 10 000 g pendant 15 min. Les membranes sont séparées des protéines du cytoplasme par ultracentrifugation à 170 000 g pendant 1 h. Le culot de membranes est alors lavé dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5% (volume/volume), 0,5% acide amino caproïque (ACA) (poids/volume) pour éviter une contamination par les protéines du cytoplasme. Afin de dissocier les protéines faiblement associées à la membrane, le culot est lavé dans le tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5% (volume/volume), 0,5% acide amino caproïque (ACA) (poids/volume) additionné de bromure de sodium (NaBr) 1,5 M pendant 30 min à température ambiante sous agitation douce puis ultracentrifugé comme précédemment. Le surnageant (« Lavage NaBr ») contient les protéines décrochées de la membrane et le culot contient les membranes lavées. Ce culot est ensuite resuspendu dans le tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5% (volume/volume), 0,5% acide amino caproïque (ACA) (poids/volume) et dilué pour obtenir une concentration protéique de 10 mg.ml-1 et solubilisé avec du déoxycholate de sodium (détergent anionique) à une concentration finale de 2% (poids/volume) à 37°C pendant 1 h sous agitation. Les protéines membranaires solubilisées (« Membranes solubilisées lavées au Nabr ») sont récupérées par

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Matériels et méthodes ultracentrifugation et sont présentes dans le surnageant. Une fraction appelée « Membranes solubilisées » est obtenue de la même manière mais sans réaliser le lavage au NaBr.

2. Solubilisation des protéines membranaires

Plusieurs protocoles de solubilisation des protéines membranaires ont été employés en fonction de l‘objectif recherché.

Pour la purification de la SQR, après casse des cellules et élimination des protéines solubles, les membranes sont lavées au NaBr comme précédemment indiqué, puis resuspendues dans du tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, ACA 750 mM, glycérol 5% afin d‘avoir une concentration en protéine de 20 mg/ml. La solubilisation se fait au DDM (n- Dodécyl-β-D-maltoside) 2% (concentration finale, poids/volume) pendant 1 h à 37°C sous agitation douce, puis après ultracentrifugation à 170 000 g pendant 1 h, les protéines solubilisées sont récupérées dans le surnageant.

Pour la purification du supercomplexe hydrogénase/soufre réductase, le protocole est le même, mais le lavage au NaBr n‘est pas effectué pour ne pas perturber l‘organisation du complexe. Les membranes sont diluées à 10 mg.ml-1 et solubilisées au DDM 1% (concentration finale, poids/volume) pendant 1 h à 37°C sous agitation douce, puis après ultracentrifugation à 170 000 g pendant 1 h, les protéines solubilisées sont récupérées dans le surnageant.

Pour la recherche des structures de haut poids moléculaires (mégacomplexes), les membranes ne sont pas lavées au NaBr avant solubilisation afin de ne pas déstabiliser les interactions entre protéines. La fraction membranaire est diluée à 10 mg.ml-1 dans un tampon Imidazole-HCl 50 mM pH 7, ACA 500 mM, EDTA 1 mM et la solubilisation des complexes membranaires est réalisée pendant 30 min à 37°C sous agitation douce. Plusieurs détergents ont été testés au cours de cette étude et sont détaillés dans la Partie II des Résultats. La récupération des protéines solubilisées se fait par une ultracentrifugation plus lente et moins longue que dans les cas précédents (20 000 g pendant 30 min) afin de ne pas culoter d‘éventuels mégacomplexes de haut poids moléculaire.

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Matériels et méthodes

3. Globules de soufre

Un premier protocole, basé sur celui établi pour Allochromatium vinosum (Brune, 1995b), a été employé pour purifier les globules de soufre : après lavage et casse des cellules cultivées en présence de soufre élémentaire, les globules sont sédimentés par centrifugation à 500 rpm pendant 1 min puis lavés plusieurs fois dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl 100 mM.

Cette méthode n‘ayant pas apporté les résultats escomptés, un autre protocole a été développé. Après sédimentation, la fraction contenant les globules de soufre est déposée sur un gradient de densité à base de Percoll constitué de trois couches contenant respectivement de haut en bas 25%, 50% et 75% de Percoll, diluées dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6. Une centrifugation à 5 000 g est réalisée pendant 20 minutes, et le culot contenant les globules de soufre est récupéré et lavé plusieurs fois dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl 100 mM.

B) Escherichia coli

Les cellules d‘Escherichia coli sont resuspendues dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,6 en présence d‘inhibiteurs de protéases (Cocktail d‘enzymes, Roche). Les cellules sont cassées à la presse de French sous une pression de 500 bars environ. Les cellules non cassées sont éliminées par une centrifugation à 10 000 g pendant 15 min à 4°C. Après ultracentrifugation 1 h à 170 000 g, le surnageant contenant les protéines solubles est immédiatement chauffé à 80°C pendant 40 min pour précipiter les protéines d‘Escherichia coli sensibles à la chaleur. Une centrifugation à 10 000g pendant 30 min permet d‘éliminer le précipité et de récupérer la protéine surproduite.

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Matériels et méthodes

III) Méthodes de purification des protéines

A) Chromatographie d’adsorption

La résine d‘hydroxylapatite (HTP, Biorad) est un phosphate de calcium (Ca3(PO4)2) qui retient certaines protéines dont les hydrogénases et les cytochromes. Les interactions se font par les charges négatives et positives des protéines et les ions phosphate et calcium du support. Le tampon d‘équilibration est du Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05% et l‘élution se fait par un gradient 0-1 M de tampon phosphate de potassium pH 7,6 dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%.

B) Chromatographies d’échange d’ions

On utilise des résines hautement polymérisées où sont greffés des groupements acides ou basiques.

1. Chromatographie à basse pression

La DiEthylAminoCellulose (DEAE cellulose, Whatman) est une échangeuse d‘anions chargée positivement qui, à pH 7,6, retient les protéines acides. L‘élution se fait par un gradient de force ionique 0-1 M NaCl dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%.

2. Chromatographie à haute pression

La Mono Q (1ml, GE Healthcare) est une chromatographie Fast Protein Liquid Chromatography (GE Healthcare). C‘est une échangeuse d‘anions qui permet de retenir les protéines acides à pH 7,6. La résine est équilibrée dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%. L‘élution se fait par un gradient de NaCl 0-500 mM

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Matériels et méthodes

(40 minutes) dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05% à un débit de 0,5 ml/min.

C) Chromatographie d’exclusion

Le support poreux de billes permet de séparer les protéines en fonction de leur masse moléculaire. La colonne Superdex 200 (120 ml, GE Healthcare) est utilisée en FPLC avec une gamme de résolution de 10 à 600 kDa. Elle est équilibrée et éluée avec du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl 100 mM à un débit de 0,6 ml/min.

D) Protocoles de purification

1. La SQR

Après solubilisation, l‘extrait membranaire est chargé sur une DEAE (80 ml) équilibrée avec le tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05% (tampon A) à température ambiante. Dans chaque fraction éluée, l‘activité SQR a été testée au spectrophomètre (Guiral et al., 2009). La SQR est éluée à 100-150 mM NaCl dans le tampon A. La fraction est concentrée et lavée dans le même tampon sur « Vivaspin » (seuil de coupure 50 kDa). L‘échantillon est chargé sur une HTP, et la SQR est éluée à 150 mM phosphate dans le même tampon. Les fractions présentant l‘activité SQR sont concentrées (« Vivaspin» seuil de coupure 50 kDa) et chargées sur une Mono Q. La SQR est éluée à 175 mM NaCl. L‘échantillon est concentré et lavé avec le tampon A sur « Vivaspin » (seuil de coupure 50 kDa) puis stocké à -80°C. Pour 60 grammes de bactéries, environ 2 mg de SQR pure sont obtenus.

2. Supercomplexe hydrogénase/soufre réductase

Les protéines solubilisées sont séparées par une première étape de DEAE (xx ml) équilibrée avec le tampon A. Les fractions éluées à 100-200 mM NaCl, contenant l‘activité soufre réductase, sont dialysées dans le tampon A et chargées sur une colonne d‘HTP. L‘élution du supercomplexe se fait à 500 mM phosphate. Cette fraction enrichie en

106

Matériels et méthodes supercomplexe est dialysée et concentrée par « Vivaspin » (seuil de coupure 10 kDa) puis stockée à -80°C.

3. La SOR et Aq_477

La SOR recombinante ainsi que Aq_477 recombinante sont purifiées à partir de l‘extrait cellulaire d‘Escherichia coli préparé comme décrit dans le paragraphe II.B. Après chauffage, une étape supplémentaire est nécessaire pour obtenir chacune de ces enzymes pures. Le surnageant obtenu est concentré sur « vivaspin » (seuil de coupure 5 kDa pour Aq_477 et 100 kDa pour la SOR) et chargé sur une colonne Superdex 200 (FPLC). Les fractions éluées actives sont concentrées et stockées à -80°C.

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Matériels et méthodes

60 g de cellules d’Aquifex aeolicus

Obtention de la fraction membranaire

Solubilisation 1h à 37°C DDM 2%

DEAE

Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%

Elution NaCl 0-500 mM

NaCl 100-150 mM NaCl

HTP

Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%

Elution phosphate de potassium 150 mM

Mono Q

Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%

Elution NaCl 0-500 mM

Elution NaCl 175 mM

SQR

Figure 56 : Protocole de purification de la SQR.

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Matériels et méthodes

60 g de cellules d’Aquifex aeolicus

Obtention de la fraction membranaire (10mg/ml de protéines)

Solubilisation 1h à 37°C DDM 1%

DEAE

Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05%

Elution NaCl 0-500 mM

NaCl 100-200 mM NaCl

HTP

Tris-HCl 50 mM pH 7,6, glycérol 5%, ACA 0,5%, DDM 0,05% Elution phosphate de potassium 500 mM

Concentration et dialyse

Supercomplexe hydrogénase/soufre réductase

Figure 57 : Protocole de purification du supercomplexe hydrogénase/soufre réductase

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Matériels et méthodes

Cellules d’Escherichia coli resuspendues dans du Tris-HCl 50 mM pH 7,6

Casse à la presse de French

Obtention de la fraction soluble

(Ultracentrifugation 1h à 170 000g)

Chauffage à 80°C pendant 40 min

Elimination des protéines précipitées d’Escherichia coli

(Centrifugation à 10 000g pendant 10 min)

Concentration du surnageant contenant la protéine surproduite sur “vivaspin”

Superdex 200

Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl 100 mM

SOR

Aq_477

Figure 58 : Protocole de purification de la SOR recombinante et de Aq_477 recombinante

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Matériels et méthodes

IV) Techniques d’analyses biochimiques

A) Dosage protéique

La concentration en protéines totales est déterminée à l‘aide de la méthode de Lowry modifiée selon le protocole établi dans la littérature (Markwell et al., 1978). Aucune interférence du détergent et des autres composants présents dans le tampon avec la réaction colorimétrique du dosage protéique par cette méthode n‘a été observée. La Bovine Serum Albumine (BSA) est utilisée comme protéine standard pour l‘établissement de la courbe étalon.

B) Electrophorèses sur gel d’acrylamide

1. Condition dénaturante : Tris-glycine SDS-PAGE

L‘électrophorèse en présence de détergent, le Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), permet de séparer les protéines préalablement dénaturées en fonction de leur masse moléculaire. Les échantillons sont traités avec du tampon de dénaturation (Tris-HCl 125 mM pH 6,8, β- mercaptoéthanol 20 mM, SDS 4%, glycérol 20%, bleu de bromophénol 0,01%) selon un ratio de 1 : 1 puis portés à ébullition pendant 5 min. Le SDS, molécule chargée négativement, va dénaturer les protéines en se fixant selon le ratio d‘une molécule de SDS pour deux acides aminés. Les protéines dénaturées seront toutes chargées négativement et migreront uniquement en fonction de la masse moléculaire. La migration s‘effectue sur un gel de polyacrylamide (5-20% pour le cas général) à un ampérage constant de 25 mA et à température ambiante dans du tampon de migration Tris 25 mM, glycine 190 mM, SDS 0,1% ~ pH 8,3. Des marqueurs de poids moléculaire (Fermentas) sont utilisés.

2. Condition native : Tris-glycine PAGE

La séparation des protéines se fait en fonction de la masse moléculaire et de la charge protéique. Les échantillons sont préparés avec du tampon de charge (Tris-HCl 125 mM pH

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Matériels et méthodes

6,8, glycérol 20%, bleu de bromophénol 0,01%). L‘électrophorèse est effectuée dans les mêmes conditions énoncées précédemment, dans le même tampon sans ajout de SDS, sur gel de polyacrylamide 3-8%.

3. Gel Bleu Natif

Contrairement au gel natif classique, le gel Bleu Natif (BN) permet de séparer les protéines uniquement en fonction de leur poids moléculaire. Cette technique a été mise au point pour la séparation de complexes respiratoires membranaires mitochondriaux. L‘emploi du bleu de Coomassie G250 dans l‘échantillon (quantité détergent/quantité bleu= 4) permet d‘uniformiser la charge des protéines et des complexes. Le bleu G250 se lie ainsi aux protéines de façon non covalente par ses groupements hydrophobes, et apporte sans les dénaturer une - charge globale négative (par ses groupement SO3 ) ainsi que la solubilisation des protéines hydrophobes à l‘intérieur du gel (Figure 59) (Schagger and von Jagow, 1991; Wittig et al., 2006).

Figure 59 : Structure du bleu G250 de Coomassie. Le bleu G250 permet la migration de toutes les protéines (même les basiques), il diminue l‘agrégation des protéines et augmente la solubilité des protéines membranaires (Ressource internet).

La migration s‘effectue sur un gel de polyacrylamide (Tampon Imidazole-HCl 25 mM pH 7, ACA 0,5 M) à un ampérage constant de 10 mA et à température ambiante. Le tampon Imidazole-HCl 25 mM, pH 7 est à l‘anode et le tampon Imidazole 7,5 mM, tricine 50 mM,

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Matériels et méthodes

bleu de Coomassie G250 0,02%, pH 7 est à la cathode. Après que le front de migration ait atteint le premier tiers du gel, le tampon cathode est enlevé et remplacé par du tampon cathode Imidazole 7,5 mM, tricine 50 mM, bleu de Coomassie G250 0,002%, pH 7. La migration est poursuivie avec ce tampon afin de diminuer la coloration du gel en bleu, pour permettre une meilleure lisibilité des activités enzymatiques effectuées sur le gel. Les

échantillons sont préparés avec de l‘ACA 0,5 M et du bleu G250 2,5 % ou 0,5% suivant la quantité de détergent présent. Des marqueurs de poids moléculaires natifs (Invitrogen) sont utilisés.

4. Gel Bleu Natif à pores larges (BNPL)

Ce type de gel a récemment été développé pour faire migrer sur gel bleu natif des complexes protéiques de très haut poids moléculaire (Strecker et al., 2010). Ces gels possèdent un ratio acrylamide/bisacrylamide supérieur aux gels ordinaires, ce qui permet d‘obtenir un maillage plus lâche tout en conservant une certaines maniabilité des gels. Dans la nomenclature classique, on définit T comme la concentration totale des monomères d‘acrylamide et de bisacrylamide et C le pourcentage de bisacrylamide par rapport au total des deux espèces. Les gels utilisés ici sont des gels présentant un gradient de [3% T, 20% C] à [9% T, 6%C]. Le gel de concentration est à 2,5% T, 25% C. Les tampons utilisés (tampon de préparation du gel et tampons de migration), ainsi que les conditions de migration sont identiques à ce qui a été décrit précédemment pour les gels bleus natifs.

5. Transfert sur membrane

Après migration en conditions native ou dénaturante, les protéines peuvent être transférées sur membrane de nitrocellulose ou PVDF en vue d‘une immunodétection ultérieure. Le gel, la membrane de nitrocellulose ou PVDF ainsi que 6 feuilles de papier Whatman sont équilibrés dans le tampon de transfert (éthanol 20%, Tris 25 mM, glycine 190 mM, SDS 0,1%, ~pH 8,3). Trois feuilles de papier Whatman sont disposées à l‘anode, puis la membrane de nitrocellulose ou PVDF, le gel et enfin trois nouvelles feuilles de papier Whatman. Le transfert a lieu pendant 45 min à 5 mA.cm-2 sur un appareil de type Trans blot semi-dry electrophoretic transfer cell (Biorad). Lorsque le transfert est effectué à partir d‘un

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Matériels et méthodes gel natif, ou lorsqu‘il concerne des protéines membranaires ou de haut poids moléculaire, sa durée est augmentée pour atteindre environ 1h.

C) Techniques de révélation après électrophorèse

1. Colorations

Trois protocoles de coloration des protéines sur gel ont été utilisés. Le premier utilise le bleu de Coomassie (éthanol 45%, acide acétique 9%, bleu R250 0,25%) dans lequel les gels sont incubés 1h30 puis décolorés dans un tampon éthanol 30%, acide acétique 10%.

Une alternative, plus sensible et permettant d‘éviter les phénomènes de « sur- coloration », repose sur une solution de Page Blue commercial (Fermentas) : les gels sont incubés une nuit puis décolorés à l‘eau distillée. Dans le cas de gels dénaturants, des bains d‘eau distillée de 5 min renouvelés trois fois sont nécessaires pour éliminer le SDS du gel avant coloration. La coloration au Page Blue peut avoir lieu après une coloration au bleu de Coomassie, il faut simplement que le fond du gel soit correctement décoloré.

Enfin, lorsqu‘une coloration réversible des protéines, d‘une sensibilité équivalente au bleu de Commassie veut être obtenue, le protocole utilisé est la coloration négative au zinc / imidazole / SDS (Hardy and Castellanos-Serra, 2004). Après migration, le gel est rincé dans l‘eau distillée, puis incubé dans une solution d‘imidazole 200 mM, SDS 0,1% pendant 15 min. Après rinçage dans l‘eau distillée, il est placé dans du sulfate de zinc 200 mM jusqu‘à ce que les bandes de protéines soit révélées (environ 5 min) : le fond du gel se colore en blanc, les protéines restent incolores, elles sont également fixées de manière réversible. Lorsqu‘un gel natif est utilisé, le SDS est concentré à 0,5% dans la solution de sensibilisation. Pour décolorer entièrement le gel (afin d‘en éluer les protéines par exemple), il est incubé deux fois cinq minutes dans une solution de complexation des ions zinc (Tris 25 mM, glycine 300 mM, pH 8) puis rincé plusieurs fois dans l‘eau distillée.

Les membranes de nitrocellulose sont colorées au Rouge Ponceau afin de vérifier si le transfert des protéines du gel sur la membrane s‘est déroulé correctement.

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Matériels et méthodes

2. Immunodétection

La membrane de nitrocellulose ou de PVDF sur laquelle les protéines ont été transférées est incubée 1 h dans du tampon « Phosphate Buffered Saline » (PBS) (NaCl 143 mM, Na2HPO4 10 mM, NaH2PO4 1,7 mM) additionné de 5% (poids/volume) de lait en poudre qui va permettre de saturer la membrane. La membrane est ensuite incubée 1h30 à température ambiante ou pendant la nuit à 4°C sous agitation dans le même tampon contenant l‘anticorps primaire dirigé contre la protéine d‘intérêt. La membrane est rincée 3 fois 10 min dans du tampon PBS, Tween 20 0,05% (volume/volume), puis elle est incubée 45 minutes dans l‘anticorps secondaire anti-IgG de lapin couplé à la péroxydase dilué au 1/10000 dans le PBS, Tween 20 0,05%, lait 5%. Trois rinçages de 10 min dans du tampon PBS, Tween 20 0,05% sont à nouveau effectués avant l‘étape de détection. Cette dernière est réalisée à l‘aide du kit Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) en suivant les recommandations du fournisseur.

Lorsqu‘une seconde protéine veut être détectée sur la même membrane, le premier anticorps est retiré par incubation dans du Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce) à 37°C pendant 15 min, puis rincé dans le tampon PBS, Tween 20 0,05%. Le protocole reprend alors à l‘étape de saturation de la membrane dans le lait.

Afin d‘obtenir une meilleure spécificité de détection de la protéine cible avec l‘anticorps primaire, ce dernier est purifié par affinité pour l‘antigène qu‘il reconnait : la protéine cible est déposée sur gel dénaturant et transférée sur membrane de nitrocellulose suivant le protocole classique. Elle est détectée par coloration réversible au Rouge Ponceau, et la bande correspondante est découpée, puis incubée dans le tampon PBS, Tween 20 0,05%, lait 5% pendant 1 h avant d‘être transférée dans le sérum contenant l‘anticorps à purifier dilué au 1/50 dans du PBS, Tween 20 0,05%, lait 5%. Après trois rinçages, les anticorps sont élués par une incubation de 5 min dans 1 ml de tampon glycine 100 mM pH 2,9. Immédiatement après élution, le pH est neutralisé par ajout de 30 µl de Tris 1 M (dont le pH n‘a pas été modifié par ajout d‘acide).

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Matériels et méthodes

3. Détection d‘activités enzymatiques

a) Activité Sulfure Quinone Réductase

L‘activité Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR) sur gel bleu natif (ou natif) utilise la Décylubiquinone (DB) comme accepteur d‘électrons et le Na2S comme substrat (Figure 60). L‘activité est réalisée en condition anaérobie, à 85°C.

Après migration, le gel est équilibré 10 min dans du tampon Bis-Tris-HCl 50 mM pH

7. Le tampon et le gel sont ensuite dégazés sous argon pendant 15 min, puis la DB et le Na2S sont ajoutés. Le 2,3,5-Triphényltétrazolium Chloride (2,3,5 TTC) est ajouté dans le milieu afin de piéger la quinone réduite. Le 2,3,5 TTC réduit devient rouge et précipite au niveau de la bande d‘activité.

Le milieu final contient: Bis-Tris-HCl 50 mM, pH 7, DB 40 µM, Na2S 850 µM, 2,3,5 TTC 2 mM.

Figure 60 : Révélation de l’activité SQR sur gel. La SQR présente dans la bande protéique oxyde le Na2S et réduit la DB, qui va se réoxyder en réduisant le 2,3,5-Triphényltétrazolium Chloride (2,3,5 TTC) qui, réduit, se colorera en rouge.

b) Activité hydrogénase

L‘activité hydrogénase est visualisée sur gel bleu natif (ou natif) en utilisant l‘hydrogène comme donneur d‘électrons et le méthylviologène (MEV) comme accepteur d‘électrons (Figure 61). Les électrons produits par l‘oxydation de l‘hydrogène par l‘hydrogénase sont transférés au MEV. Le MEV réduit va à son tour réduire le 2,3,5 TTC additionné au milieu ce qui va permettre de fixer cette réaction. L‘activité est réalisée en condition anaérobie.

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Matériels et méthodes

Après migration, le gel est préalablement équilibré 10 min dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6. Puis, le tampon et le gel sont dégazés sous argon pendant 15 min puis sous hydrogène à 80°C pendant 20 min en présence de MEV 1 mM et de 2,3,5 TTC 2 mM. Le milieu final contient : Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, MEV 1 mM, 2,3,5 TTC 2 mM, H2.

Figure 61 : Révélation de l’activité hydrogénase sur gel. L‘hydrogénase est réduite par un excès d‘hydrogène et les électrons sont transférés au MEV oxydé qui devient réduit, puis au 2,3,5 TTC.

c) Activité cytochrome c oxydase

L‘activité cytochrome c oxydase est visualisée sur gel bleu natif (ou natif) en utilisant un milieu réactionnel contenant du DiAminoBenzidine (DAB) qui va permettre la réduction de cytochrome c. Ce cytochrome c est utilisé comme substrat par la cytochrome c oxydase dans le gel. Le DAB oxydé forme un précipité marron sur le gel, là où la cytochrome c oxydase est présente (Figure 62) (Sabar et al., 2005).

Figure 62 : Révélation de l’activité cytochrome c oxydase sur gel. Le DAB réduit le cytochrome c qui est oxydé par la cytochrome c oxydase. Le DAB oxydé précipite au niveau de la bande protéique où l‘oxydase est présente. Oxydase : cytochrome c oxydase.

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Matériels et méthodes

Le gel est équilibré pendant 10 min dans du tampon phosphate 50 mM pH 7, puis incubé dans le milieu réactionnel contenant du cytochrome c 0,1% (cœur de cheval, Sigma), du DiAminoBenzidine (DAB) 0,1% et du tampon phosphate 50 mM, pH 7. La révélation de l‘activité se fait à 40°C.

d) Activité NADH-déshydrogénase (complexe I)

Cette activité est visualisée sur gel bleu natif (ou natif) à une température de 40°C. La NADH-déshydrogénase utilise le NADH comme donneur d‘électrons et le nitro-blue tetrazolium (NBT) comme accepteur d‘électrons. La formation de NBT réduit induit la formation d‘un précipité violet, le formazan (Figure 63) (Sabar et al., 2005).

Le gel est équilibré dans du tampon Tris-HCl 100 mM, pH 7,6 pendant 10 min. Le milieu réactionnel utilisé pour révéler l‘activité sur gel est composé de Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, de NADH 0,2 mM, et NBT 0,2%.

Figure 63 : Révélation de l’activité NADH-déshydrogénase sur gel. Lors de l‘oxydation du NADH par la NADH-déshydrogénase, le NBT accepte directement l‘hydrogène formant un précipité violet (le formazan). NADH-Dase : NADH-déshydrogénase (ou complexe I).

e) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse)

L‘activité rhodanèse est visualisée sur gel natif en utilisant le thiosulfate comme donneur de soufre et le cyanure comme accepteur de soufre. Le sulfite produit par la réaction va réduire le NBT avec la phénazine éthosulfate (PES) jouant le rôle d‘intermédiaire dans le transport électronique. La formation de NBT réduit induit la formation d‘un précipité violet, le formazan (Figure 64) {Cannella, 1984 #55.

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Matériels et méthodes

Après migration, le gel est préalablement équilibré 10 min dans du tampon Tris-HCl 100 mM pH 9 puis incubé 20 min à 80°C dans le milieu réactionnel contenant du tampon

Tris-HCl 100 mM pH 9, thiosulfate de sodium (Na2S2O3) 10 mM, cyanure de potassium (KCN) 10 mM, PES 0,5 mM et NBT 2 mM.

Figure 64 : Révélation de l’activité rhodanèse sur gel. Le sulfite produit par la rhodanèse réduit la phénazine éthosulfate (PES) qui elle-même réduit le NBT en formazan.

V) Mesures d’activités enzymatiques au spectrophotomètre

A) Transfert d’électrons de l’hydrogénase à la soufre réductase

Le transfert d‘électrons depuis l‘hydrogénase jusqu‘à la soufre réductase est mesuré en suivant la formation de sulfure d‘hydrogène. L‘hydrogène est utilisé comme donneur d‘électrons et le soufre élémentaire comme accepteurs d‘électrons.

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Matériels et méthodes

Le tube bouché contenant du tampon Hepes 50 mM pH 7,6, fleur de soufre 5% (poids/volume), 2-OH-1,4-naphtoquinone 40 μM et NAPDH 20 μM est dégazé 10 min sous argon, puis 15 min sous hydrogène. L‘échantillon est ajouté et le tube est incubé 40 minutes à

80°C. La réaction est stoppée au bout 40 min par ajout de 100 μl de FeCl3 30 mM dans 1,2 M HCl. Puis 100μl de N,N-diméthyl-p-phénylénédiamine dihydrochlorure 20 mM dans 7,2 M HCl, permettant la formation de bleu de méthylène à partir du sulfure d‘hydrogène, est ajouté (Figure 65). Après 20 min à l‘obscurité à température ambiante et une centrifugation de 5 min à 10000 rpm afin de culoter la fleur de soufre, la quantité de bleu de méthylène formée est donnée par la mesure de la densité optique à 670 nm. La quantité de bleu de méthylène est directement proportionnelle au sulfure d‘hydrogène formé. Le sulfure d‘hydrogène pourra être quantifié par rapport à une courbe de référence réalisée avec du Na2S.

Figure 65 : Quantification du sulfure d’hydrogène (H2S) par la réaction de synthèse du bleu de méthylène.

L'H2S réagit avec deux molécules d'aniline (N,N-diméthyl-p-phénylénédiamine) et forme un intermédiaire incolore (blanc de méthylène). Celui-ci est alors oxydé par le Fe3+ et forme ainsi le Bleu de méthylène.

Pour l‘étude de l‘influence d‘Aq_477 (SbdP) sur l‘activité hydrogénase/soufre réductase, la rhodanèse est ajoutée en quantités variables avant l‘incubation à 80°C. La réaction a été stoppée à différents temps, et l‘H2S produit est mesuré par la méthode du bleu de méthylène.

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Matériels et méthodes

B) Activité Soufre Oxygénase Réductase (SOR)

Le suivi de purification de la SOR a été effectué en testant la production d‘H2S et de sulfite dans les échantillons considérés. La SOR produit à partir de soufre élémentaire et d‘oxygène, de l‘H2S, du sulfite, et de manière non enzymatique, du thiosulfate (par réaction du sulfite avec le soufre élémentaire). Le test est réalisé dans 1 ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,6 contenant de la fleur de soufre (5%, poids/volume) et du DDM (0,05%, poids/volume). L‘échantillon est ajouté et le tube est incubé 40 minutes à 80°C. La production d‘H2S est mesurée par la méthode du bleu de méthylène précédemment décrite pour la détermination de l‘activité hydrogénase/soufre réductase. Le sulfite est mesuré comme suit : 700 µl de milieu réactionnel sont prélevés, et 200 µl d‘acétate de zinc 2% (poids/volume) y sont ajoutés. 100 µl de réactif Fuchsine (Fuchsine basique 0,04% dans H2SO4 10%) sont également ajoutés, puis une première incubation de 10 min à température ambiante est réalisée. 10 µl de Formalin (formaldéhyde 37%) sont ajoutés, suivi d‘une nouvelle incubation de 10 min à température ambiante. La densité optique est alors mesurée à 570 nm. Le sulfite pourra être quantifié par rapport à une courbe de référence réalisée avec des concentrations connues de sulfite.

C) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse)

L‘activité rhodanèse est mesurée par quantification du produit de la réaction, le thiocyanate SCN-. Le test contient 10 mM de cyanure de potassium KCN et 10 mM de thiosulfate de sodium Na2S2O3 dans du Tris-HCl 100 mM pH 9. La réaction démarre par ajout de l‘échantillon. Le test est incubé 10 min à 80°C puis la réaction est arrêtée par ajout de 200 -1 -1 μl de FeCl3 50 g.l dans 65% HNO3 200 ml.l qui réagit avec le thiocyanate pour former du

Fe(SCN)3. Après centrifugation 3 min à 10 000 rpm, la densité optique à 460 nm est mesurée et permet le dosage du thiocyanate formé par rapport à une courbe standard effectuée avec du NaSCN.

L‘inhibition irréversible de la rhodanèse est obtenue par un traitement d‘alkylation de sa cystéine catalytique. Cette modification est réalisée en incubant une nuit à température ambiante la protéine (0,3 mg.ml-1) dans du tampon Tris-HCl 50 mM pH 9 contenant de

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Matériels et méthodes l‘acide iodo acétique 20 mM. Après dialyse de la protéine pour éliminer toute trace d‘agent alkylant, un test rhodanèse est réalisé pour s‘assurer de l‘inactivation de la protéine.

VI) Etude d’interactions protéine-protéine

A) La résonance plasmonique de surface (BIAcore)

L‘appareil BIAcore (GE Healthcare) permet de visualiser, en temps réel, des interactions entre molécules. Pour détecter ces interactions, il utilise le phénomène optique de résonance plasmonique de surface (SPR).

1. Principe de fonctionnement

Un des partenaires, le ligand, est fixé de façon covalente ou par interaction forte sur une interface appelée sensor chip. L‘autre partenaire de l‘interaction (l‘analyte) est injecté à un débit constant au contact de l‘interface et peut donc interagir avec le ligand. Le BIAcore présente l‘avantage de n‘utiliser que de faibles quantités de protéines. Son défaut le plus important est l‘immobilisation d‘un des partenaires sur une matrice, ce processus pouvant générer un blocage du site d‘interaction. L‘autre problème le plus rencontré est un effet du transport de masse lors d‘une immobilisation trop importante ou l‘utilisation d‘une protéine d‘un poids moléculaire élevé. Dans ce cas, la vitesse de diffusion du ligand devient limitante.

Selon l‘angle d‘incidence d‘un faisceau de lumière polarisée monochromatique arrivant sur une interface séparant deux milieux d‘indices de réfraction différents, toute la lumière est réfléchie. Dans ce cas, une onde évanescente se propage perpendiculairement à l‘interface créant un champ évanescent. Si l‘interface est recouverte d‘une fine couche de métal, les photons entrent en résonance avec les nuages électroniques du métal, ce qui crée une chute d‘intensité du faisceau réfléchi à un angle défini. Ce phénomène est appelé SRP et cet angle, d‘intensité minimale, angle de résonance. Cet angle varie en fonction de la

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Matériels et méthodes température et de l‘indice de réfraction du milieu dans lequel le champ évanescent se propage, donc de toute variation de masse dans ce champ. L‘appareil enregistre la variation de l‘angle de résonance en fonction du temps et le signal obtenu (sensorgramme) est exprimé en unité de résonance (RU) (Figure 66). Les expériences sont réalisées à 25°C.

Figure 66 : Principe de résonance plasmonique de surface.

2. Interface utilisée

Il existe plusieurs types de surface hydrophiles ou hydrophobes pour l‘analyse des interactions. Les sensors chips CM5 présentent une interface hydrophile constituée d‘un support de verre recouvert d‘une fine couche d‘or (50 nm) sur laquelle une matrice de dextran carboxyméthylé (100 nm) est attachée de façon covalente. Les groupements carboxyliques permettent la fixation covalente des molécules ligands par couplage chimique.

3. Fixation du ligand et mesure de l‘interaction

La SQR, le supercomplexe hydrogénase/soufre réductase, la SOR ou la rhodanèse Aq_477 (SbdP) ont été fixés à la matrice.

La fixation est réalisée par un couplage par les groupements amines des protéines. Ce couplage consiste en l‘établissement d‘une liaison covalente entre les groupements amines de

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Matériels et méthodes la protéine et les carboxyles de la matrice. Pour le couplage, les échantillons sont dilués dans un tampon acétate de sodium 10 mM pH 5, DDM 0,02%. Le couplage des protéines est réalisé comme suit:

-Activation des COOH de la matrice par un mélange (ratio 1/1) N-hydroxysuccinimide (NHS) 50 mM et N-ethyl-N‘-[3-(dimethylamino)propyl]-carbodiimide hydrochloride (EDC) 200 mM pendant 420 secondes à un débit de 10 µl.min-1.

-Injection de la protéine à coupler dont les NH2 réagissent spontanément avec les esters formés, pendant 420 secondes à un débit de 5 µl.min-1.

-Saturation des COOH activés restants par l‘éthanolamine 1M pendant 420 secondes à un débit de 10 µl.min-1.

Lors des mesures d‘interactions, le tampon de course est de l‘Hepes 50 mM pH 7,6, Tween 20 0,05%, NaCl 50 mM. Le temps de contact ligand-analyte est de 150 secondes avec un débit de 50 µl/min et un temps de dissociation de 500 secondes.

B) Pontage covalent in vitro

Des expériences de pontages covalents entre Aq_477 (SbdP) et la SOR ont été réalisées. Les protéines ont été préalablement dialysées dans du tampon phosphate 40 mM pH 5,7 sur « vivaspin » (seuil de coupure 5 kDa pour Aq_477 et 100 kDa pour la SOR) afin d‘éviter toute réaction croisée entre le Tris et l‘agent pontant. Aq_477 (2,5 µg.ml-1) et la SOR (0,25 mg.ml-1) ont été mélangées et incubées dans un tampon phosphate 20 mM pH 5,7 en présence de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, réagit avec les amines primaires) à 37°C pendant 1 h sous agitation douce. La réaction est stoppée par ajout de Tris-HCl pH 6,8 à une concentration finale de 50 mM. Les échantillons sont ensuite chargés sur un gel natif comme décrit précédemment.

C) Gel retard

Les protéines dont on veut tester une éventuelle interaction (Aq_477 et SQR ou soufre réductase) sont mélangées et incubées à 80°C pendant 30 min dans un tampon Tris-HCl 50

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Matériels et méthodes mM pH 7,6, puis déposées sur gel natif (Tris glycine PAGE). Un complexe formé par deux protéines partenaires ayant une masse moléculaire supérieure à celle de chacun de ses constituants isolé, une interaction se traduira par un changement dans le profil de migration (migration ralentie).

VII) Analyses protéomiques

A) Identification des protéines par séquençage N-terminal

Après migration sur gel SDS et transfert sur membrane de PVDF (révélation au rouge Ponceau), les protéines peuvent être identifiées par séquencage N-terminal. La détermination des séquences en acides aminés se base sur la méthode de dégradation d‘Edman. Cette dernière est réalisée par le clivage séquentiel des acides aminés à partir de l‘acide aminé N terminal. Cette étape génère des dérivés phénylthiohydantoines qui sont identifiés par chromatographie liquide haute performance (HPLC) par comparaison avec un mélange témoin. Le processus est automatisé et s‘effectue grâce à un micro séquenceur en phase gazeuse Applied Biosystems A470. Cette analyse a été réalisée par la plate-forme Protéomique de l‘Institut de Microbiologie de la Méditerranée.

B) Identification des protéines par spectrométrie de masse

L‘analyse des peptides trypsiques d‘une protéine par spectrométrie de masse permet son identification lorsque sa séquence est déposée dans une banque de données. Après séparation par électrophorèse (dénaturante, native, BN), les bandes de protéines colorées sont découpées du gel et les protéines présentes sont hydrolysées par la trypsine. Les peptides obtenus sont extraits du gel et analysés par spectrométrie de masse. L‘identification des protéines est réalisée grâce à l‘utilisation de logiciels qui comparent la carte peptidique massique obtenue expérimentalement avec les cartes théoriques des protéines répertoriées dans les banques de données. Les analyses ont été réalisée en collaboration avec R. Lebrun, S.

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Matériels et méthodes

Lignon et R. Puppo, au sein de la plateforme protéomique (labellisée IBiSA) de l‘Institut de Microbiologie de la Méditerranée (IMM).

1. MALDI-TOF

Le MALDI-TOF (MALDI-TOF Microflex II, Bruker) est utilisé pour analyser un mélange peu complexe de protéines provenant d‘échantillons simples tels qu‘un gel SDS. L‘identification des protéines est réalisée grâce à l‘utilisation du logiciel MASCOT en utilisant la banque de donnée de NCBI limitée aux génomes de bactéries.

2. Trappe à ions

Ce type de spectromètre est généralement utilisé pour identifier un mélange protéique complexe. Les protéines sont hydrolysées par la trypsine et les peptides obtenus analysés par spectrométrie de masse de type trappe à ions. Cet appareil (ESI-IT LCQ Deca XP , Thermofinnigan) est couplé à une nanochromatographie liquide qui permet la séparation des peptides avant la détermination de leur masse par le spectromètre. L‘identification des protéines est réalisée grâce à l‘utilisation du logiciel TurboSEQUEST en utilisant la banque de données de NCBI limitée au génome d‘Aquifex aeolicus. Une protéine est considérée comme identifiée, donc présente dans la bande de gel, à partir de la détection d‘au moins deux peptides différents correspondant à cette protéine.

3. Orbitrap

La spectrométrie de masse de type Orbitrap est utilisée lorsque l‘on a besoin d‘une technique très sensible et précise, et lorsque l‘échantillon est très complexe ou qu‘il contient des structures de très haut poids moléculaire. Le spectromètre de masse employé est un LTQ Velos Orbitrap (ThermoFisher) (Trappe ionique linéaire avec une cellule C-trap et une Orbitrap) équipé d‘une source d‘ions nanospray et couplé à une nanochromatographie Ultimate NCS 3500 (Dionex) permettant la séparation des peptides avant la détermination de leur masse par le spectromètre. L‘identification des protéines est réalisée grâce à l‘utilisation du logiciel MASCOT en utilisant la banque de donnée de NCBI limitée au génome d‘Aquifex

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Matériels et méthodes aeolicus. Un résultat est considéré comme valide lorsqu‘une protéine est identifiée avec au moins deux peptides différents.

C) Analyse de protéines entières par spectrométrie de masse

Pour déterminer la capacité de Aq_477 (SbdP) à lier des atomes de soufre en présence d‘un composé soufré, la protéine (2 mg/ml) a été incubée avec du thiosulfate (10 mM) ou de la fleur de soufre (5% poids/volume), dans du tampon Tris-HCl 100 mM pH 9. Après cette incubation de 20 min à 85°C, Aq_477 a été soumise à une analyse de masse entière à l‘aide d‘un spectromètre de masse MALDI-TOF Microflex II (Bruker). Cette analyse a été réalisée par la plate-forme Protéomique de l‘Institut de Microbiologie de la Méditerranée.

VIII) Microscopies

A) Microscopie optique

Les cellules entières d‘Aquifex aeolicus ont été directement observées entre lames et lamelles sur un microscope Axio (Zeiss Axiovert 200M) de la plate-forme de Microscopie de l‘IMM.

B) Microscopie électronique

Afin d‘observer la présence de globules de soufre cytoplasmiques, les cellules d‘Aquifex aeolicus ont été observées après coupe ultrafine, en microscopie électronique. Ces préparations et observations ont été réalisées par la plate-forme de Microscopie de l‘IMM, en collaboration avec Alain Bernadac. Pour cela, la culture de cellules est centrifugée et les cellules sont rincées deux fois avec du milieu neuf pour éliminer le soufre provenant de la culture. Arès fixation au glutaraldéhyde puis OsO4, les culots cellulaires sont déshydratés à

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Matériels et méthodes l‘alcool et inclus dans de l‘Epon. Des coupes ultrafines sont obtenues à l‘aide du microtome Leica EM FC/UC6 et colorées à l‘acétate d‘uranyle et au citrate de plomb, puis observées au microscope électronique Zeiss EM109.

Les expériences d‘immunomarquages à l‘aide d‘anticorps anti-Aq_477 purifiés sur des coupes de cellules d‘Aquifex aeolicus, ont été faites en collaboration avec J.-P. Chauvin (IBDML, AMU, Marseille). Un microscope électronique Zeiss EM 192 a été utilisé.

IX) Analyses in silico

A) Recherches de protéines homologues et alignements multiples de séquences

Les algorithmes BLASTP et DELTA-BLASTP (Domain Enhanced Lookup Time Accelerated BLAST) sont utilisés pour retrouver des séquences protéiques homologues à une séquence « requête ».

Les alignements entre séquences protéiques sont générés en utilisant ClustalW sur le serveur du Pôle Bioinformatique Lyonnais (http://pbil.univ-lyon1.fr/).

B) Prédiction de localisation et de structure secondaire

Le serveur PSORT (http://www.psort.org/) est utilisé pour prédire la localisation des protéines dans la cellule.

La prédiction de la structure secondaire des protéines (hélices α et brins β) est effectuée sur le serveur JPRED (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/).

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Matériels et méthodes

C) Modélisations

Les structures tridimensionnelles de protéines sont modélisées sur le serveur SWISS- MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) à partir de structures tridimensionnelles déjà établies pour d‘autres protéines.

Le « docking » entre deux protéines est réalisé grâce au serveur Hex (http://hexserver.loria.fr/), et le logiciel AutoDock Vina a permis de réaliser celui entre la rhodanèse Aq_477 et une chaîne de polysulfure.

Le logiciel PyMOL est utilisé pour visualiser les structures et pour générer des alignements structuraux entre protéines homologues.

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Résultats et discussion

RREESSUULLTTAATTSS EETT DDIISSCCUUSSSSIIOONN

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Résultats et discussion

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Résultats et discussion

Chapitre I

Métabolisme énergétique du soufre

chez Aquifex aeolicus

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Résultats et discussion

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Résultats et discussion

Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus

I) Une rhodanèse au cœur du trafic

Dans ce premier chapitre, nous nous intéresserons au transfert des substrats soufrés au sein du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus, et plus précisément au rôle d‘une protéine faisant partie de la famille des rhodanèses. Cette protéine, annotée Aq_477 dans les bases de données bioinformatiques, a été rebaptisée par nos soins SbdP pour Sulfur binding- donating- Protein. Ce changement de nom a fait suite à la caractérisation fonctionnelle de Aq_477 qui a concerné l‘essentiel de ma thèse et que nous présentons dans cette première partie de résultats. Ces travaux ont fait l‘objet d‘une publication en 2012 dans « Journal of Biological Chemistry » sous le titre « Rhodanese Functions as Sulfur Supplier for Key Enzymes in Sulfur Energy Metabolism ».

Dans cet article, nous avons tout d‘abord montré que cette rhodanèse cytoplasmique pouvait être retrouvée en interaction avec les membranes de la bactérie, probablement via un partenaire protéique (Article 1, Figure 1). Nous avons ensuite démontré, grâce à des techniques de biochimie et de physico-chimie, que SbdP était capable d‘interagir avec deux acteurs majeurs du métabolisme du soufre de la bactérie, la soufre réductase d‘une part et la SOR d‘autre part (Article 1, Figures 3 et 7). Cette aptitude à interagir avec différents partenaires indépendants n‘a jamais, à notre connaissance, été observée pour une rhodanèse, ce qui souligne le côté atypique de SbdP. Une interaction avec un autre composant majeur des voies bioénergétiques de la bactérie, la SQR, a également été testée et invalidée, résultat cohérent avec l‘orientation périplasmique de cette dernière (Article 1, Figure 6).

Nous avons ensuite démontré qu‘à la différence des autres protéines de la famille des rhodanèses, SbdP est capable de lier des chaînes de soufre relativement longues, et ce à partir de plusieurs substrats dont le soufre élémentaire S° (Article 1, Figure 4). L‘utilisation par ces

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Résultats et discussion deux enzymes partenaires de longues chaînes de soufre comme substrat d‘une part et la capacité de SbdP à « charger » de longues chaînes de soufre d‘autre part nous a poussés à chercher si un transfert de soufre pouvait avoir lieu entre SbdP et la soufre réductase et/ou la SOR. Nous avons ainsi mis en évidence une augmentation, SbdP-concentration dépendante, de l‘activité catalytique de la soufre réductase (Article 1, Figure 5). Nous en avons conclu que la rhodanèse SbdP est une protéine capable de se « charger » en chaînes de soufre dans le but de les présenter comme substrats aux enzymes cibles, ce qui permettrait ainsi d‘optimiser le système. Nous avons également modélisé la structure de SbdP à partir de celle déterminée pour une rhodanèse à un domaine de la bactérie thermophile Thermus thermophilus, TTHA0613, et nous avons utilisé un logiciel de « docking » pour ancrer une chaîne de polysulfure sur la cystéine catalytique de SbdP (Article 1, Figure supplémentaire 1). Un modèle de l‘interaction entre la soufre réductase et SbdP a ensuite été réalisé (Figure 67), montrant que la rhodanèse s‘intègre parfaitement à la cavité menant au site catalytique de la soufre réductase, ce qui soutient l‘idée d‘un transfert de soufre direct de SbdP à son partenaire.

Figure 67 : Modèle de l’interaction entre SbdP et la soufre réductase. SbdP (bleu clair) a été modélisée à partir de la rhodanèse TTHA0613 de Thermus thermophilus, et la structure cristallographique de la Psr (en dimère) de la même bactérie est utilisée pour mimer la soufre réductase d‘A. aeolicus. En rose, PsrC (membranaire), bleu PsrB et vert, PsrA (sous-unité catalytique).

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Résultats et discussion

Nous avons donc proposé un rôle de fournisseur de soufre pour la protéine SbdP et l‘avons intégrée au modèle global du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus (Article 1, Figure 8).

Mais la portée de ces travaux ne se limite pas seulement à la bactérie que nous étudions, puisque ce type de métabolisme existe chez un grand nombre de micro-organismes, et que les rhodanèses se retrouvent chez tous les êtres vivants. Ainsi, il avait été montré chez Wolinella succinogenes qu‘une protéine de type rhodanèse semblait capable d‘améliorer l‘activité de la polysulfure réductase, qui elle aussi utilise des chaînes de soufre comme substrat {Klimmek, 1998 #12}. En revanche, une interaction entre les deux protéines n‘avait pas été mise en évidence aux cours de ces travaux. De plus, chez différentes bactéries, une rhodanèse se trouvant dans le même compartiment cellulaire que les enzymes de réduction du soufre a été mise en évidence au niveau du génome (Campbell et al., 2009; Yamamoto et al., 2010). Nous nous sommes donc appuyés sur ces données de la littérature ainsi que sur nos propres résultats pour proposer l‘existence d‘une nouvelle famille de rhodanèses, basée sur une fonctionnalité précise d‘approvisionnement des protéines du métabolisme énergétique du soufre en substrat. Cette hypothèse semble aujourd‘hui trouver des échos à travers des publications récentes (Stockdreher et al., 2012) qui mettent l‘accent sur la nécessité de protéines dédiées au transfert de soufre au sein de ces métabolismes.

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Résultats et discussion

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Article 1

Rhodanese functions as sulfur supplier for key enzymes in sulfur energy metabolism.

Aussignargues Clément, Giuliani Marie-Cécile, Infossi Pascale, Lojou Elisabeth, Guiral Marianne, Giudici-Orticoni Marie-Thérèse, Ilbert Marianne

Journal of Biological Chemistry (2012) Jun 8;287(24):19936-48.

Supplemental Material can be found at: http://www.jbc.org/content/suppl/2012/04/10/M111.324863.DC1.html

Rhodanese Functions as Sulfur Supplier for Key Enzymes in Sulfur Energy Metabolism□S Received for publication, November 24, 2011, and in revised form, March 15, 2012 Published, JBC Papers in Press, April 10, 2012, DOI 10.1074/jbc.M111.324863 Cle´ment Aussignargues1, Marie-Cećile Giuliani2, Pascale Infossi, Elisabeth Lojou, Marianne Guiral, Marie-The´re`se Giudici-Orticoni, and Marianne Ilbert3 From the Unite´de Bioeńerge´tique et Ingeńierie des Proteínes, Institut de Microbiologie de la Me´diterraneé-CNRS, Aix-Marseille University, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, France

Background: The function of SbdP, a cytoplasmic rhodanese from Aquifex aeolicus, is unknown. Results: SbdP is involved in sulfur energy metabolism via its interaction with key redox enzymes. Conclusion: SbdP supplies long sulfur chains to enzyme-active sites. Significance: Rhodaneses are part of the substrate traffic in sulfur energy metabolism.

How microorganisms obtain energy is a challenging topic, pounds are vital processes for many microorganisms that use and there have been numerous studies on the mechanisms sulfur as a basis for their energy metabolism (4, 5). Despite its involved. Here, we focus on the energy substrate traffic in the central importance, however, the metabolism of sulfur is still hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. This bacte- not fully understood, probably because of the high reactivity of Downloaded from rium can use insoluble sulfur as an energy substrate and has its compounds. an intricate sulfur energy metabolism involving several sul- Aquifex aeolicus, isolated from a hydrothermal system at fur-reducing and -oxidizing supercomplexes and enzymes. Vulcano in Italy, is one of the most hyperthermophilic bacteria We demonstrate that the cytoplasmic rhodanese SbdP partic- known, with an optimum growth temperature of 85 °C (6, 7). It

ipates in this sulfur energy metabolism. Rhodaneses are a also represents the earliest branching order in the bacterial www.jbc.org widespread family of proteins known to transfer sulfur atoms. domain (8). A. aeolicus is able to grow chemolithoautotrophi-

We show that SbdP has also some unusual characteristics cally and obtains energy for growth in the presence of H2,O2, compared with other rhodaneses; it can load a long sulfur and CO2, but it also requires the presence of a sulfur compound

0 at CNRS, on July 3, 2012 chain, and it can interact with more than one partner. Its such as S , sodium sulfide (Na2S), or sodium thiosulfate partners (sulfur reductase and sulfur oxygenase reductase) (NaS2O3) (9). After several years of study of the enzymes are key enzymes of the sulfur energy metabolism of A. aeoli- involved in the respiratory pathways of A. aeolicus growing in cus and share the capacity to use long sulfur chains as sub- presence of S0, we have a better overall picture of its complex strate. We demonstrate a positive effect of SbdP, once loaded energy metabolism. Under these growth conditions, we have with sulfur chains, on sulfur reductase activity, most likely by demonstrated the existence of three different respiratory optimizing substrate uptake. Taken together, these results pathways as follows: two aerobic from H2 to O2 and from H2S 0 0 lead us to propose a physiological role for SbdP as a carrier to O2 and one anaerobic from H2 to S . Two of them (H2/S and sulfur chain donor to these key enzymes, therefore ena- and H2S/O2) have been shown to be organized into supra- bling channeling of sulfur substrate in the cell as well as molecular structures (9–11) that contain enzymes known to greater efficiency of the sulfur energy metabolism of A. be involved in sulfur energy metabolism as follows: a sulfur 4 0 aeolicus. reductase (SR) in H2/S pathway and a sulfide quinone reductase (Sqr) in H2S/O2 pathway. A. aeolicus is the sole organism known to date that possesses simultaneously these Sulfur is a ubiquitous element in the earth’s crust, well known two complementary energy pathways (both reduction and as an essential component of life. It has come even closer to the oxidation of sulfur compounds), and we have proposed an center of attention in the light of current views of the origin of energy coupling between these two pathways (11). A cyto- life (1, 2). In nature, elemental sulfur (S0, a cyclic chain of sulfur) plasmic sulfur oxygenase reductase (SOR), which catalyzes, and sulfur compounds are found in particularly high concen- in the presence of oxygen, the simultaneous oxidation and trations in extreme environments, usually volcanic or geother- reduction of elemental sulfur into oxygen sulfur species and

mically active (deep-sea vents and hot springs) (3). In these H2S, is also present in A. aeolicus (12). In addition, the pres- environments, the reduction and oxidation of these com- ence of cytoplasmic sulfur globules of as yet unknown function has been observed in whole cells of A. aeolicus grown on □S This article contains supplemental Figs. S1–S6 and additional references. S0 (9). The simultaneous presence of all these sulfur 1 Recipient of a fellowship from the Ministe`re de l’Enseignement Supe´rieur et enzymes, sulfur compounds and sulfur-containing struc- de la Recherche. 2 Supported by the “Collectivite´Territoriale Corse.” Present address: Labora- toire de Biochimie et Biologie Mole´culaire du Ve´ge´tal, UMR-CNRS 6134 4 The abbreviations used are: SR, sulfur reductase; Sqr, sulfide quinone reduc- SPE, Universite´de Corse, Campus Grimaldi, 20250 Corte, France. tase; SOR, sulfur oxygenase reductase; Psr, polysulfide reductase; SPR, sur- 3 To whom correspondence should be addressed. Tel.: 33-491164524; Fax: face plasmon resonance; RU, resonance unit; EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethyl- 33-491164097; E-mail: [email protected]. aminopropyl)-carbodiimide.

19936 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 287•NUMBER 24•JUNE 8, 2012 A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism

tures, is puzzling, and the interconnection between all these Analysis of the subcellular localization of Aq-477 as well as sulfur enzymes and pathways is our current main focus. the characterization of its partners allow us to propose a poten- The use of S0 in energy metabolism has also been described in tial role for this protein in the sulfur energy metabolism of A. the archaeon Acidianus ambivalens. A model of its intricate aeolicus. A clear effect of Aq-477, which we rename SbdP (for sulfur energy metabolism has been proposed involving several sulfur-binding-donating protein), on the SR activity supports sulfur oxidation or reduction enzymes, but the interconnection this model. SbdP might represent a prototype of rhodanese that between all of the produced and consumed sulfur compounds, uses its sulfurtransferase activity to transfer substrates to cor- even though suggested, has never been demonstrated (13, 14). responding enzymes such as SR and SOR. A proposed mecha- Another bacterium, Wolinella succinogenes, can reduce poly- nism for SbdP as a sulfur shuttle in the sulfur energy pathway is 2Ϫ 0 sulfide (Sn ), a soluble form of S , with a membrane polysulfide further discussed. reductase (Psr) enzyme but seems to have a simpler sulfur energy metabolism in comparison with A. aeolicus and A. EXPERIMENTAL PROCEDURES ambivalens (15, 16). In W. succinogenes sulfur metabolism, Organisms and Growth Conditions membrane extract studies have suggested that a soluble A. aeolicus VF5 was grown at 85 °C in 2-liter bottles contain- periplasmic rhodanese-like protein (Sud) could act as a sulfur ing 400 ml of modified SME medium (29) at pH 6.8 in the donor to the terminal electron acceptor, the periplasmic ori- Ϫ presence of flowers of sulfur (7.5 gliter 1) (which will be ented Psr, revealing a potential protein involved in energy sul- referred to as “S0” in this paper) and under 1.4 bar of H /CO fur traffic (17). 2 2 (80:20) as described previously (9). Cells were harvested in the Rhodaneses (PF00581) belong to the sulfurtransferase family late exponential growth phase and stored at Ϫ80 °C.

of enzymes that are found in organisms from all three domains Downloaded from Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL, transformed of life. They catalyze in vitro the transfer of a sulfur atom from with the pET22aq477 or pET22SOR plasmids, was grown in LB thiosulfate (sulfur donor) to cyanide (sulfur acceptor) (18, 19). medium at 37 °C supplemented with 0.5 mM ampicillin (12, 26). Rhodanese-like proteins share a common characteristic “rhodanese-fold” and catalyze a similar reaction using other sulfur Cell Fractionation donors (like polysulfide for Sud) to transfer sulfur to nucleo- philic sulfur acceptors. Rhodanese and/or rhodanese-like pro- Periplasmic fraction was obtained as described previously www.jbc.org teins are known to play a critical role in sulfur traffic by deliv- (30). After periplasmic extraction, cell material (spheroplasts) ering sulfur in a “safe” chemical species to biosynthetic was broken. Debris and unbroken cells were removed by cen- ϫ pathways, using their labile persulfide group. Despite numer- trifugation (10,000 g, 15 min). Membrane and soluble pro- ϫ at CNRS, on July 3, 2012 ous studies, the physiological role of rhodaneses as well as their teins were separated by ultracentrifugation at 170,000 g. The physiological substrates remain unclear and are still widely membrane fraction was then washed with 50 mM Tris-HCl, pH debated. It has been proposed that they accomplish essential 7.6, 5% (v/v) glycerol, 0.5% (w/v) aminocaproic acid (buffer A) cell functions as they may be involved in the maintenance of to avoid cytoplasmic contamination. To dissociate poorly redox homeostasis (20), in the elimination of toxic cyanide (21), membrane-associated proteins from anchored membrane pro- and in the biosynthesis of several other cellular metabolites teins, the resulting membrane pellet was washed with the same such as vitamins, enzymes, and cofactors that include a step of buffer plus 1.5 M NaBr for 30 min at room temperature under sulfur transfer (22–25). gentle shaking and ultracentrifuged as above. The supernatant A. aeolicus is a convenient model for studying intricate sulfur was kept to identify poorly associated membrane proteins and energy metabolism and the potential role of rhodaneses in it. is named “NaBr supernatant” in this study. NaBr-washed mem- The presence of a rhodanese (Aq-477) of unknown function in branes (resulting pellet) were resuspended in buffer A to give a Ϫ1 the cytoplasmic compartment of A. aeolicus raised our curios- protein concentration of 10 mg ml and solubilized with 2% ity about its potential role in this metabolism. Aq-477 presents deoxycholic acid sodium salt (w/v) for a final concentration in vitro the classical thiosulfate cyanide sulfurtransferase activ- (37 °C for 1 h under gentle shaking). After solubilization of the ity (26). Previous biochemical characterizations of Aq-477 have membrane proteins, the supernatant called “solubilized NaBr- 2Ϫ washed membranes” was recovered after ultracentrifugation. shown that it can also use in vitro at 85 °C tetrathionate (S4O6 ) 2Ϫ The fraction called “solubilized membranes” was obtained by and polysulfide instead of thiosulfate (S2O3 ) as sulfur donor (26). The existence of an equilibrium between monomers, the same procedure, with the exception of NaBr washing. dimers, and tetramers of Aq-477 has also been observed, and this oligomerization appears important for thermostability and Protein Purification thermoactivity, which is not surprising for a protein present in Hydrogenase-Sulfur Reductase Complex Enrichment (“SR a hyperthermophilic bacterium (27, 28). Even though Aq-477 Complex”)—Solubilized membranes from 50 g of cells were has been biochemically characterized, its function remains obtained as described above but with the detergent n-dodecyl- unknown. Unfortunately, no genetic tools are available in this ␤-D-maltoside (DDM) at 1% (w/v) used instead of sodium organism to observe on growth the effect of the absence of deoxycholate and without the NaBr washing step. Membranes Aq-477. In this study, we have accordingly used alternative were then applied on a DEAE-52 column (Whatman) equili- approaches to describe the potential function of Aq-477 in A. brated with buffer A with 0.05% DDM (buffer B). Proteins were aeolicus, and we took advantage of our ability to purify and eluted with a 50 mM step gradient of 0–500 mM NaCl in buffer produce different proteins involved in its energy pathways. B. The 100–200 mM NaCl fractions that contained sulfur

JUNE 8, 2012•VOLUME 287•NUMBER 24 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 19937 A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism

reductase activity were dialyzed and loaded onto a hydroxyap- antibodies, anti-Sqr antibodies, and anti-SOR antibodies were atite column equilibrated with buffer B. Sulfur reductase activ- used. ity was eluted with 500 mM potassium phosphate in the same In Gel Enzymatic Activities—Hydrogenase activity on native buffer. After removal of phosphate and concentration, the SR gel was detected as described previously (31). Rhodanese activ- complex was frozen with liquid nitrogen and stored at Ϫ80 °C. ity was revealed at 85 °C by nitro blue tetrazolium chloride We obtained an enriched fraction containing SR clearly identi- reduction by sulfite (a by-product of rhodanese, see Reaction 1) fied by mass spectrometry that we will call the SR complex for with phenazine ethosulfate as intermediate electron carrier. reasons of clarity. The reduction of nitro blue tetrazolium chloride allows the for- Sqr Purification—Free Sqr was also purified from solubilized mation of a purple formazan precipitate visible on gel (32). The membranes of A. aeolicus as described previously (11). assay mixture contained 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 2 mM nitro SbdP Purification—Recombinant SbdP was obtained from blue tetrazolium chloride, 0.5 mM phenazine ethosulfate, 10

E. coli as described previously (26). Previous studies showed mM Na2S2O3, and 10 mM KCN. that recombinant SbdP behaves similarly to SbdP from A. aeoli- Gel Shift Assay—SR complex (0.5 mgmlϪ1) or Sqr (0.25 cus (26). mgmlϪ1) was incubated with SbdP (2.5 or 50 ␮gmlϪ1, respec- SOR Purification—Recombinant SOR was obtained from tively) in 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, for 30 min at 85 °C and E. coli as described previously (12). loaded on a native gel. Protein Concentrations—Protein Concentrations were Activity Measurements determined with the modified Lowry method (33) and are Ϫ Rhodanese (Thiosulfate Cyanide Sulfurtransferase) Activity— expressed in milligramsml 1 for most samples. Molar concen-

Rhodanese activity consists of the transfer of a persulfide group trations cannot be expressed because stoichiometry of the Downloaded from from thiosulfate to cyanide, leading to the formation of sulfite active proteins/supercomplexes is yet unknown. and thiocyanate (see Reactions 1). In vitro, this activity is followed by quantifying the product of the reaction, the thiocya- Cross-linking nate (SCN), as described previously (26), in the absence of In Vitro Cross-linking—After dialysis in 40 mM sodium phos- reducing agent. phate, pH 7.4, to avoid cross-reaction with Tris, SbdP (2.5

Ϫ1 Ϫ1 www.jbc.org ␮gml ) and SOR (0.25 mgml ) were incubated in 20 mM 2Ϫ ϩ 3 2Ϫ ϩ S2O3 Rhod SO3 Rhod-S phosphate buffer, pH 5.7, in the presence of 15 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) at 37 °C for 1 h ϩ Ϫ 3 ϩ Ϫ Rhod-S CN Rhod SCN under gentle shaking. The reaction was stopped by addition of at CNRS, on July 3, 2012 REACTION 1 Tris-HCl, pH 6.8, at a final concentration of 50 mM and then loaded on a native gel. Sulfur Reductase Activity—Sulfur reductase activity was In Vivo Cross-linking—A. aeolicus cells grown on S0 were determined by quantifying the H2S formed by the reduction of resuspended in 50 mM Hepes, pH 7.0, and were incubated with 0 S with H2, as described previously (9), but performed in 50 mM 1mM dithiobis(succinimidyl propionate) for 30 min at 37 °C. Hepes, pH 7.6. To study the influence of SbdP on SR activity, The reaction was stopped with 100 mM Tris-HCl, pH 7.6. Cells Ϫ SbdP (1, 5, 10, 15, and 20 ␮gml 1, final concentrations) was were broken, and membranes were solubilized as described added to the assay before the incubation at 85 °C. Measure- above. Membranes were loaded onto a 20–40% sucrose density ments were made at different reaction times, with constant gradient in 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, and ultracentrifuged over- amounts of SR complex or solubilized NaBr-washed mem- night at 185,000 ϫ g (50.2 Ti rotor, Beckman-Coulter). The Ϫ branes (50 ␮gml 1 each, final concentration). Controls were gradient was separated into 11 fractions. The fraction contain- done without SbdP, with SbdP alone and no SR, or with SbdP ing most of the rhodanese activity was dialyzed and loaded onto Ϫ inactivated by cysteine alkylation treatment (0.3 mgml 1 SbdP native gel. The band corresponding to SbdP was sliced and ana- was incubated with 0.5 mM iodoacetic acid overnight in 50 mM lyzed by ion trap mass spectrometry. Tris-HCl, pH 7.6, 100 mM NaCl). Surface Plasmon Resonance (SPR) Binding Experiments Analytical Procedures A BIAcore T100 apparatus was used to investigate interac- Native Gel Electrophoresis—Proteins were loaded on 3–8% tion between SbdP and SR complex, Sqr or SOR. SbdP and SR polyacrylamide gels (Mini-Protean II; Bio-Rad). After migra- complexes were immobilized on a CM5 sensor chip (BIAcore) tion, proteins were either stained with PageBlue (Fermentas) or in 10 mM sodium acetate, pH 5.0, by amine coupling using a kit detected with specific antibodies, or the gels were used to deter- supplied by BIAcore. Running buffer, used when interactions mine hydrogenase or rhodanese activity. were tested, contained 50 mM Hepes, pH 7.6, 50 mM NaCl, and Denaturing Gel Electrophoresis—Proteins were incubated at 0.05% Tween 20 with a flow rate of 50 ␮l/min. Samples were 95 °C for 5 min in the denaturing Laemmli buffer, and loaded on diluted in the same buffer with 100 mM NaCl. Control experi- a 4% stacking, 5–20% running polyacrylamide gel (Mini-Pro- ments were done on sensor chips in the absence of immobilized tean II; Bio-Rad). After migration, gels were stained with Page- proteins. Because of the difference between the index of refrac- Blue or used for Western blotting. tion of the running buffer and the sample buffer, a burst phase Western Blotting—After protein migration in gels, Western could be observed at the beginning and the end of sample blot was performed using standard procedures (11). Anti-SbdP injection.

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Mass Spectrometry (MS) until the temperature reached Ϫ40 °C. Then the samples were Protein Identification—Tryptic digestion of excised gel plugs, embedded in Lowicryl HM20. Polymerization was done during Ϫ ion trap, and MALDI-TOF MS protein identification were 48hat 40 °C using UV light. Thin sections of 80 nm were cut done as described previously (10). with an ultramicrotome RMC MTX and collected onto nickel MS Analysis of Nondigested Proteins—To determine the grids. They were incubated into 0.5 M ammonium chloride in binding of sulfur atoms on SbdP, the protein (2 mgmlϪ1) was TBS for 5 min. After washing in TBS, sections were incubated incubated in 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, with thiosulfate (10 mM) into TBS-saturating solutions containing 0.5% BSA for 10 min or with flowers of sulfur (5% w/v) or without any sulfur source followed by a wash containing 0.1% BSA. Sections were then for 20 min at 85 °C and then subjected to mass analysis of non- incubated for 3 h using primary antibody solution (anti-SbdP digested proteins. MALDI-TOF analyses were performed on a antibodies) diluted 1:100 in TBS containing 0.1% BSA. After Microflex II mass spectrometer (Bruker, Germany). A satu- washing in the same buffer, samples were labeled with 15 nm rated solution of sinapinic acid in 50:50 acetonitrile/water, 0.1% colloidal gold anti-rabbit IgG diluted 1:30 in the same buffer for trifluoroacetic acid was used as matrix. A 0.7 mgmlϪ1 protein 1 h as done previously. After several washes, fixation was per- solution was used for the deposit according to the thin layer formed with 2% glutaraldehyde for 5 min and washed in dis- method; mixtures were dried at room temperature. Data were tilled water several times. Grids were examined using an elec- acquired in a positive linear mode, range was set from 2 to 20 tron microscope Zeiss EM 912, and digital images were kDa, and pulsed ion extraction was fixed to 200 ns. External acquired with CCD camera Gatan Bioscan model 792. mass calibration was done just before the acquisition of the RESULTS sample using protein calibration standard I (Bruker Daltonics).

Mass spectra were treated in Flex Analysis software by a Gauss- SbdP, a Soluble Rhodanese That Interacts with Membrane— Downloaded from ian smoothing (width ϭ 2 cycles ϭ 2). SbdP has been previously characterized as a rhodanese protein with sulfurtransferase activity in vitro (26). It has been purified from the cytoplasmic compartment of A. aeolicus spheroplasts, Microscopy but its exact subcellular localization had never been investi- Spheroplasts Immunolabeling—For this experiment, sphero- gated. For this purpose and as a first approach, cells grown in plast formation was optimized as described; fresh cells grown the presence of S0 have been analyzed by immunogold labeling www.jbc.org 0 on S were resuspended in a buffer C containing 50 mM Tris- using specific SbdP antibodies in thin sections of intact cells HCl, pH 7.5, 0.75 M sucrose, 1.5 mM EDTA. The cell suspension (Fig. 1A). We confirmed a cytoplasmic localization of SbdP, and ϫ was frozen and thawed and centrifuged at 10,000 g for 20 min its presence near the membrane was less expected. However, it at CNRS, on July 3, 2012 to weaken the cells. The pellet was resuspended in buffer C has been reported that a purely cytoplasmic protein is likely to Ϫ1 supplemented with lysozyme from chicken egg (0.4 mgml ) be partially stained in a manner indistinguishable from a mem- and then incubated at 37 °C for 24 h. The efficiency of cell wall brane-associated protein (34). To further confirm a potential degradation was monitored by microscopy. The spheroplast localization of SbdP at the membrane, periplasmic extraction suspension was centrifuged at 1,500 ϫ g for 20 min at 4 °C, and has been performed, and the resulting cells have been fraction- the pellet containing the spheroplasts was washed in buffer C. ated into membrane and cytoplasmic fractions. Western blot To be able to visualize the proteins of interest directly on the analysis with SbdP-specific antibodies was performed on these spheroplast preparation, purified immunoglobulins raised fractions after migration on denaturing gel. SbdP is mainly against Sqr, hydrogenase, or SbdP were labeled using the Alexa found in the cytoplasmic fraction with a main band corre- Fluor 488 protein labeling kit (Invitrogen). To determine the sponding to the monomeric form (Fig. 1B, 4th lane). Even in degree of labeling, the ratio of absorbance of Alexa Fluor 488 at denaturing and reducing conditions, some tetrameric forms 494 nm was compared with absorbance at 280 nm for proteins. can be observed due to the high stability of the oligomeric state We obtained a ratio between 5 and 7 mol of Alexa Fluor 488 dye that we have previously shown to be thermostable (26). Once per mol of antibody. The spheroplasts were then adsorbed on again, a non-negligible amount of SbdP is found in the solubi- polylysine-treated slides, fixed with 2% paraformaldehyde, lized membrane fraction (Fig. 1B, 1st lane) even though no evi- blocked with 5% BSA in PBS buffer, and immunolabeled with dence from the primary sequence of SbdP could explain this anti-hydrogenase- or anti-Sqr-conjugated antibodies for1hat result. The absence of the tetrameric form in the membrane room temperature in a moist chamber. Then the slides were could either have a physiological signification, yet unknown, or washed twice in PBS buffer and mounted with VectaShield could be due to experimental procedures (use of different buf- (Vector Laboratories). An Olympus confocal microscope (IX fers and SbdP concentrations). To better understand the poten- 81 with FluoView 1000) was used to visualize the immunola- tial interaction of SbdP with the membrane, the samples were beled spheroplast. treated with NaBr, a chaotropic reactant, that allowed the Immunogold Labeling Procedures—Harvested cells were strength of the protein/membrane association to be estimated. fixed using 2% paraformaldehyde ϩ 0.1% glutaraldehyde in 0.1 Proteins interacting partially with the membrane are then usu- M phosphate buffer, pH 6.8, and washed. Cells were then pel- ally separated from membrane-anchored proteins. Under these leted in 2% agarose and cryoprotected with 2.3 M sucrose in 0.1 conditions, the majority of SbdP is released from the membrane M phosphate buffer. Samples were frozen in liquid nitrogen and (Fig. 1B, 2nd lane) and is found in the soluble washed fraction cryosubstituted during 72 h at Ϫ85 °C in methanol containing called the NaBr supernatant (Fig. 1B, 3rd lane). This result was 1.5% uranyl acetate. Several washes were performed for 4 h confirmed by a quantitative measurement of the rhodanese

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activity determined in vitro in each fraction (Fig. 1C). This cor- relates perfectly with SbdP activity because no other active cytoplasmic rhodanese is present in this organism under these growth conditions (26). Overall, these results highlight the existence of a fraction of SbdP in contact with the membrane, which, to our knowledge, is the first experimental characterization of a membrane localization for a soluble rhodanese. This raises the question of the role of such interaction and the identity of the potential membrane protein partners of SbdP. Identification of Potential Membrane Protein Partners of SbdP—To determine the physiological membrane protein partners interacting with SbdP, we incubated cells with a cross- linking agent (dithiobis(succinimidyl propionate)) that has been shown to diffuse across the membrane. After treatment of the cells with dithiobis(succinimidyl propionate), the membrane fraction was isolated, solubilized, and separated on a sucrose gradient. Most of the membrane-bound SbdP proteins were found in the heavy fractions (high percentage of sucrose

that contains heavy proteins, data not shown). To identify SbdP Downloaded from partners, the fraction containing SbdP activity was loaded on a native gel to allow in gel enzymatic activity detection. Hydro- genase activity could then be observed in the same band that was revealed by specific SbdP antibodies (Fig. 2A). To precisely define the composition of this potential complex, the protein band was cut out, digested with trypsin, and analyzed by ion www.jbc.org trap MS. In this band, the presence of SbdP was confirmed, and several membrane proteins, either cross-linked to SbdP or just co-migrating with SbdP due to their intrinsic properties, were at CNRS, on July 3, 2012 clearly identified (supplemental Fig. S1). By using this approach, we noticed that several identified proteins belong to a similar pathway as follows: SR (with its two subunits SreA and SreC), hydrogenase (which belongs to the SR supercomplex), and Sqr. These proteins are involved in sulfur energy metabolism (Fig. 2B) that makes them likely candidates as rhodanese partners. This first screen using intact cells for doing the cross- linking and trying to snapshot potential transient complexes allowed us to direct our research toward membrane proteins involved in sulfur energy metabolism as potential partners for the rhodanese SbdP. SbdP and Sulfur Reductase, Two Proteins Involved in the Same Pathway?—Its membrane localization and the identification of the SR in the in vivo cross-linked complex led us to test in vitro whether SbdP interacts with partially purified SR complex. Both proteins were preincubated at 85 °C for 30 min and subsequently loaded on a native gel (gel shift assay). The migration pattern of SbdP was then visualized with spe- FIGURE 1. Localization of SbdP in A. aeolicus. A, immunogold labeling of SbdP on ultrathin sections of A. aeolicus. White arrows point to cytoplasmic cific antibodies (Fig. 3A). Strikingly, a completely different SbdP, and the black arrow represents membrane-associated SbdP. The bar migration pattern of SbdP was observed when SbdP was represents 200 nm. B, 30 ␮g of solubilized (sol) membranes (1st lane), incubated with the SR complex. A gel shift of SbdP due to solubilized NaBr-washed membranes (2nd lane), NaBr supernatant (3rd lane), or “cytoplasm” (4th lane) were loaded onto denaturing reducing gel, interaction with a protein present in the enriched fraction of and SbdP (12.8 kDa) was detected using specific antibodies. The molecu- SR was observed. The corresponding band had been cut out lar mass markers are indicated in kDa on the left. C, rhodanese activity of from the native gel, and MS allowed the identification of solubilized membranes (column 1), solubilized NaBr-washed membranes (column 2), and NaBr supernatant (column 3). 100% represents the maxi- SbdP as well as of the subunit SreA of SR. As these two mal rhodanese activity measured in the membrane fraction (200 proteins co-migrate in native conditions, a direct interaction ␮molminϪ1, specific activity ϭ 4.8 ␮molminϪ1mgϪ1) and corresponds to 10% of the total rhodanese activity. The results shown are averages of between the rhodanese SbdP and the sulfur reductase SR was three independent experiments. strongly supported. To confirm this result, we decided to detect SbdP by following rhodanese activity on gel, a method

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FIGURE 2. Analysis of solubilized membranes from cross-linked intact cells. A, native gels loaded with heavy fraction of solubilized membranes from sucrose gradient. Lane 1, Hydrogenase activity; lane 2, SbdP detection via Western blot. The arrow indicates the position of SbdP and hydrogenase in the gel. B, protein identification of the band sliced from the native gel (marked with a box) using ion trap MS analysis. Only proteins identified with at least five unique peptides and involved in energy electron transfers are included in this table. Table headings are as follows: protein name, name in NCBI data base; NCBI entry, accession number; coverage %; protein sequence coverage by the matching peptides; total peptides, number of total peptides matching to protein sequence; unique peptides, number of different peptides matching the protein sequence.

obtained by Western blot and MS (Fig. 3B). This also indicates that SbdP retains rhodanese activity when joined to SR. A complementary approach, using SPR, was carried out to

observe potential binding between these two partners in real Downloaded from time. We covalently immobilized SbdP on a chip, and we sequentially injected SR complex at different concentrations, in a continuous flow that passed over the chip and monitored binding events. The data show an unambiguous interaction between the two partners (Fig. 3C). Nevertheless, because of the presence of an equilibrium between multimeric forms of SbdP www.jbc.org and the heterogeneity of SR samples, the sensorgrams obtained could not be fitted with the simplest 1–1 reaction model, pre-

venting us from estimating kinetic constants. at CNRS, on July 3, 2012 The physical interaction between the SbdP and SR complex explains the finding of part of SbdP at the membrane. It also raises the question of the role of such an interaction. SbdP, a Rhodanese Able to Bind Long Sulfur Chain—Sulfur reductase is known to reduce sulfur chains (such as S0 or poly-

sulfide) to H2S. We hypothesized that soluble SbdP might bring the sulfur substrate to membrane SR. To fulfill such a function, SbdP should be able to load sulfur chains. In previous studies, SbdP has been shown to transfer sulfur atoms in vitro 2Ϫ from S2O3 to the sulfur acceptor KCN. To better understand 2Ϫ which SbdP form is involved in the presence of S2O3 , the molecular masses of both SbdP and SbdP incubated with this substrate were determined by MALDI-TOF MS. Additional sulfur atoms bound to SbdP catalytic cysteine was expected, as observed for other rhodaneses (35). As shown in Fig. 4, purified SbdP without any treatment (“as prepared”) already shows FIGURE 3. Interaction between SbdP and SR complex. After preincubation of three distinct masses in approximately equivalent amounts. (i) Ϫ1 ␮ Ϫ1 ϩ 0.5 mg ml SR complex (lane 1), 2.5 g ml SbdP (lane 2), or SbdP SR com- An ion had been measured at m/z 12805.64 and could be plex (lane 3), proteins were loaded onto a native gel. SbdP was detected either by Western blot using specific antibodies (A)orbyin gel rhodanese activity (B). The assigned to unmodified SbdP (theoretical average m/z 12805). arrow represents the complex formed between SbdP and SR complex, which has (ii) A population with an m/z of 12837.98 could correspond to been confirmed by proteins identification via MS. C, SPR experiment. SbdP was immobilized at 426 resonance units (RU) on a CM5 sensor chip, and increasing one sulfur (mass of a sulfur atom, 32 Da) bound to SbdP (called concentrations of the analyte (SR complex, 3.75, 7.5, 15, and 22.5 ␮g) were SbdP-S-SH). (iii) The third population appeared at m/z injected. As mentioned under “Experimental Procedures,” molar ratio between the two proteins could not be determined due to the existence of an equilibrium 12867.77 and matched SbdP binding two sulfur atoms (SbdP- 2Ϫ between multimeric forms for the different proteins. S-S-SH). After S2O3 incubation, all three initial species (unmodified SbdP-SH, SbdP-S-SH, and SbdP-S-S-SH) might 2Ϫ previously described for other rhodaneses that we have react similarly with S2O3 because no drastic change in the adapted to our system (32). The presence of SbdP in the proportions of these initial species could be observed. Addi- additional band is consistent with the previous result tional masses were detected (Fig. 4A), which probably corre-

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2Ϫ FIGURE 4. Loading of SbdP with sulfur atoms. A, analysis of covalent modification of SbdP by MS: SbdP as prepared (top) or incubated with either S2O3 (middle)orS0 (bottom). The mass (m/z) of each species is given above the corresponding peaks, and the distance (molecular mass) between peaks is also reported on the spectra. B, assignment of potential modifications of SbdP to some peaks observed on mass spectra. Atoms added on the catalytic cysteine of SbdP are shown in bold.

2Ϫ spond to addition of oxygen and sulfur atoms (from the S2O3 ) teins. To test it, we carried out an experiment that consisted of to the various initial SbdP species (Fig. 4B). As we were able to immobilizing the SR complex on the chip and injecting SbdP in show that in vitro this rhodanese could catalyze the transfer of the presence or not of a sulfur compound. As we could not use 0 0 2Ϫ sulfur atom to KCN with S as sulfur donor (data not shown), an insoluble S with the BIAcore apparatus, S2O3 was chosen for identical approach was performed using S0 as sulfur donor for the experiment. As observed in Fig. 5A, the interaction between SbdP. The MS results also show that this rhodanese can bind up SR complex and SbdP “loaded” with sulfur is drastically modi- to five sulfur atoms (m/z 12963.06) under our experimental fied, with a faster complex formation and higher stability of the conditions (Fig. 4). Additional peaks (with higher m/z) are resulting complex. As SR cannot catalyze the reduction of 2Ϫ clearly visible on the mass spectrum; however, it is difficult to S2O3 to H2S (9), we assume that the effect is mainly due to know exactly which forms of SbdP they match. SbdP loaded with sulfur atoms that might stabilize the interac- In summary, this experiment shows that SbdP can covalently tion of SbdP to SR. bind several sulfur atoms on its unique catalytic cysteine. We On the basis of this experiment, we proposed that SbdP could confirmed it by using an alkylating agent that reacts specifically indeed act as a sulfur donor for SR once it is loaded with sulfur with cysteine residues. No sulfur fixation on SbdP could then be atoms. To test this potential functional role of SbdP on SR, we observed after S0 addition (supplemental Fig. S2). These overall measured sulfur reductase activity in the presence of its usual data support our hypothesis of a potential role as sulfur donor substrate (S0) as well as in the presence of different amounts of to enzyme using long sulfur chains as substrate. SbdP. A difference observed in H2S production of SR due to Positive Effect of SbdP to Key Enzyme of Sulfur Energy SbdP might reflect a modification of SR-specific activity or a Metabolism—SPR was previously used to visualize the interac- change of substrate accessibility to the SR-active site. As tion in real time between the SbdP and SR complex (Fig. 3C). observed in Fig. 5B, whatever the presence of SbdP, the rate of

We postulate that if SbdP plays a critical role in transfering H2S production increases steeply with time and reaches sulfur to SR, the presence of sulfur bound to SbdP may modify approximately the same plateau value. Interestingly, the curves the kinetics or the level of interaction between these two pro- were not superimposable; for some time points (30, 40, and 60

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min), we clearly and reproducibly detected higher H2S production by SR in the presence of SbdP and in a concentration-dependent manner (as observed in Fig. 5B, inset). Comparison of the two curves shows that the slopes are quite similar (Fig. 5B).

The observed difference seems due to a shorter lag phase in H2S production in the presence of SbdP. As we know that SbdP can bind sulfur compounds and that SbdP alone is not able to pro-

duce H2S in these conditions, we propose an active effect of SbdP on SR activity. In our experimental conditions, SbdP might increase the availability of the substrate toward the buried SR-active site. A similar trend was observed using membrane fractions and following SR activity in presence of exogenous SbdP (Fig. 5C). Slopes are, however, slightly different and are most likely due to additional proteins, yet unknown, present in the membrane extract that would optimize SbdP effect on SR. This experiment not only confirms the positive effect of SbdP on SR activity but also shows an amplified effect of SbdP compared with the purified SR complex, which is probably due to a better physiological environment for both proteins. Taken

together, we observed a clear role of exogenous SbdP on SR Downloaded from activity. A control experiment was made using the alkylated form of SbdP that is inactive as a rhodanese in vitro and is not able to increase SR activity (supplemental Fig. S3), and this further demonstrates a role of SbdP in substrate presentation and is not a consequence of SbdP interaction to SR. These in vitro experiments support the hypothesis of a role of www.jbc.org SbdP as a sulfur donor to SR. In vivo, SbdP might play a role of a cytoplasmic shuttle that would not only convert the sulfur compound into a more “usable” substrate but also bring it to its at CNRS, on July 3, 2012 membrane partner. Link between SbdP and Another Membrane Protein Involved in Sulfur Metabolism?—Another protein, Sqr, involved in sulfur energy metabolism, has been identified in the in vivo cross-

linking experiment (Fig. 2). It catalyzes the oxidation of H2Sto S0 (11), and we hypothesized that SbdP could take care of the product of the reaction and per se would allow sulfur recycling. Interaction between Sqr and SbdP was therefore investigated using gel shift assay, as described previously. There was no sig- nificant difference in the migration pattern of SbdP or of Sqr when they were incubated alone or together (Fig. 6, A and B). The absence of interaction between the two proteins was further confirmed with SPR experiments (supplemental Fig. S4). In addition, A. aeolicus Sqr has been classified as an integral monotopic membrane protein, meaning that this protein is only exposed to one side of the membrane, for which the periplasmic orientation has been suggested (36). In parallel to FIGURE 5. Investigation of SbdP-SR complex partnership. A, SPR experi- our in vitro interaction studies, we investigated the orientation ment; SR complex was immobilized at 4710 RU on a CM5 sensor chip, and of Sqr; we consequently designed an optimized method adapted ␮ 2Ϫ SbdP (0.6 g) incubated or not with 10 mM thiosulfate (S2O3 ) was injected. Thiosulfate alone was also injected as a control, without modification of the for this extremophile organism to create spheroplasts. As signal. B and C, sulfur reductase activity measurements of SR complex (50 observed in Fig. 6, C, E, and G, the cells show a characteristic Ϫ1 ␮gml , final concentration) (B) or solubilized NaBr-washed membranes (50 round shape after treatment due to the depletion of their exter- ␮gmlϪ1, final concentration) (C) performed with the insoluble S0 in presence (white circles) or absence (black circles) of exogenous SbdP (5 ␮gmlϪ1, final nal membrane and of their periplasmic compartment. We then concentration) as well as in presence of increasing concentrations of SbdP (1, incubated these cells with fluorescent antibodies directed 5, 10, 15, and 20 ␮gmlϪ1, final concentration) (inset, B and C) after 40 min of incubation. Ratio between the different proteins, however, cannot be calcu- against Sqr (Fig. 6D), hydrogenase (Fig. 6F), or SbdP (Fig. 6H). A lated because the oligomerization state of the active form of both proteins is fluorescent staining using confocal microscopy should be visu- yet unknown. A clear concentration dependence illustrates that we are most alized only if the protein of interest is oriented toward the likely not in an excess of one over the other. Results presented correspond to an average of three independent experiments. periplasm. Hydrogenase, known to be oriented toward the periplasm in A. aeolicus, was used as a positive control. In con-

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FIGURE 6. Absence of interaction between SbdP and Sqr. After preincubation of SbdP (lane 1), Sqr (lane 2), or Sqr ϩ SbdP (lane 3), proteins were loaded onto a native gel. SbdP (A) or Sqr (B) was detected by Western blot using specific antibodies. C, E, and G, Nomarski contrast microscopy; D, F, and FIGURE 7. Interaction between SbdP and SOR. A, 30 ␮g of cytoplasm (lane H, immunofluorescence (D, using anti-Sqr antibodies; F, using anti-hydroge- 1), solubilized membranes (lane 2), solubilized NaBr-washed membranes nase antibodies; or H, using anti-SbdP antibodies) on spheroplasts. The bar ␮ (lane 3), and NaBr supernatant (lane 4) were loaded onto denaturing gel, and represents 10 m. SOR was detected by Western blot with specific antibodies. The molecular mass markers are indicated in kDa on the left. B, cross-linking experiment; after preincubation of SbdP (lane 1), SbdP ϩ EDC (lane 2), SOR (lane 3), SbdP ϩ trast to SbdP, fluorescence could be clearly detected, revealing SOR (lane 4), SbdP ϩ SOR ϩ EDC (lane 5), proteins were loaded onto a native gel. SbdP was detected by Western blot using specific antibodies. The arrow the periplasmic orientation of Sqr (Fig. 6D). This experiment represents the complex formed between SbdP and SOR complex. C, SPR confirms that SbdP cannot bind Sqr in vivo and is consistent experiment; SbdP was immobilized at 426 RU on a CM5 sensor chip, and with the absence of interaction observed in vitro. This indicates increasing concentrations of the analyte (SOR, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, and 0.5 ␮g) were injected. that Sqr functions independently of SbdP. SOR, Another Partner of SbdP—We propose that SbdP plays decided to test if SOR from A. aeolicus was also able to interact a role of a shuttle transferring long sulfur chains to enzymes partially with the membrane to determine whether it could be that require this substrate for fulfilling their enzymatic reac- part of the sulfur energy metabolism. As shown in Fig. 7A,a tions. Another enzyme (SOR) uses S0 as substrate and has been portion of SOR can be found in the membrane fraction and is proposed to be involved in the energy pathway in various Acidi- released after treatment with a chaotropic agent. anus species (13, 14, 37). As SOR is present and active in A. As SR and SOR use the same substrate (S0), we considered aeolicus cytoplasm under our growth conditions, we first that SbdP might play a central role in sulfur energy metabolism

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and could supply sulfur substrate to the SOR as well. Unfortu- two sulfur atoms bound to the catalytic cysteine has been nately, gel shift assay does not give clear results (supplemental observed. It is however noticeable that the rhodanese-like pro- Fig. S5A). The formation of a very large complex (SOR being at tein Sud from W. succinogenes has been suggested to be able to least a 16-mer and SbdP oligomerizing), might prevent the bind up to 10 sulfur atoms per monomer, based on biochemical incorporation into the gel under the conditions tested. We thus studies (17). However, only two sulfur atoms bound to Sud were modified the physicochemical conditions (pH and tempera- detected by MS (39) and five were observed after determination ture), and we used a cross-linking agent (EDC) to lock this com- of the NMR structure (40). The authors explained this differ- plex and stabilize the interaction. As observed in Fig. 7B (5th ence by suggesting that some sulfur atoms bind more tightly lane), a band corresponding to the SbdP-SOR complex is due to their protection by the active site, whereas a long chain of clearly detected. The presence of SbdP and SOR in the cross- sulfur exposed might easily dissociate upon MS procedures linked complex was not only observed using antibodies (sup- (39). This explanation may also apply to SbdP, for which we did plemental Fig. S5, B and C) but also when rhodanese activity not see a homogeneous population binding five sulfur atoms. assay was performed in gel and showed a similar pattern (sup- The docking of a pentasulfide-sulfur molecule on the modeled plemental Fig. S5D). This result also shows that in these condi- structure of SbdP (supplemental Fig. S6) shows that the sulfur tions, even in the presence of a cross-linking agent, SbdP in the chain is exposed, meaning that it could be used as a substrate for complex is still active as a rhodanese. We decided to confirm SR and SOR enzymes. the interaction between both purified proteins by SPR. Despite SbdP, a Shuttle for Carrying Reactive Sulfur Compounds to the fact that they present different oligomerization states mak- Enzymes of Sulfur Metabolism—The fact that SbdP has the ing it difficult to obtain kinetic constants, the result obtained potentiality to interact with at least two partners (SR and SOR)

supports the conclusion of an interaction observed for the first is another unusual feature for rhodaneses. The complex SR- Downloaded from time between SOR and a rhodanese (Fig. 7C). This interaction SbdP is reminiscent of the Psr-Sud system of W. succinogenes, suggested a potential role of this rhodanese, as for SR, to bring whereas the complex formed between SbdP and SOR has not SOR substrates and optimize their presentation to the active yet been observed. SOR and SR have some common character- site of SOR. istics. One of them is the ability to use a long chain of sulfur atoms as substrates. In A. aeolicus, both enzymes are present DISCUSSION simultaneously in the cell and have a similar location; SR is a www.jbc.org In this study, we have described the use of in vitro approaches three-subunit membrane enzyme oriented toward the cyto- to determine the function of SbdP, a cytoplasmic rhodanese plasm, and SOR is a soluble cytoplasmic enzyme that we show present in A. aeolicus. This enzyme has unique features as it can to be partially located at the membrane. Moreover, both at CNRS, on July 3, 2012 load, on its catalytic cysteine, long chains of sulfur atoms after enzymes possess buried active sites. As an example, the struc- incubation with S0. Another unusual feature among rhodaneses ture of Psr, an SR homologous protein from Thermus thermo- is that SbdP has two different partners, SR and SOR. Both philus, has been resolved (41), and it has been shown that its enzymes use long sulfur chains as substrates, and both are key active site is located in the subunit A buried at the end of a players in sulfur energy metabolism. The presence of SbdP narrow funnel, as for other molybdoenzymes of this family. would optimize substrate presentation to its partner enzymes. How the substrate can get access to this active site is still On the basis of these data, we propose that SbdP might play a unclear (42). Likewise, the structure of A. ambivalens SOR central role in sulfur energy pathways as a shuttle in the transfer shows that the SOR active site is also not very accessible and of sulfur substrate to catalytically active enzymes (SR or SOR). a chimney-like protrusion has been suggested to be the likely We present alternative approaches to describe rhodanese func- entry routes for a linear sulfur chain (43). We proposed that tion. Indeed, characterizing rhodanese physiological function SbdP might act as a sulfur supplier by providing long sulfur in an organism is a challenge due to the abundance of potential chains to these buried active site enzymes. Once loaded with rhodanese/rhodanese-like proteins within the same genome. sulfur chain, SbdP could bind the catalytic subunits of its As an example, E. coli and Pseudomonas aeruginosa have, partners and the long chain could then be optimally pre- respectively, 9 and 10 annotated rhodaneses or rhodanese-like sented to the cavity leading to the active site. The stabiliza- proteins in their genome (18, 35). This redundancy supports tion of the SbdP-SR complex observed in presence of the the notion that rhodaneses are involved in distinct cellular pro- substrate supports this hypothesis (Fig. 5A). Overall, we processes. However, this makes it difficult to attribute a defined in posed that SbdP might increase the efficiency of sulfur vivo function just by analyzing the phenotype of the corre- energy metabolism in this bacterium by optimizing the pres- sponding mutant. Indeed, a different rhodanese can compen- entation of the substrate to its partner enzymes. We were sate for the absence of an other one (22, 35). able to strengthen this theory by demonstrating that SbdP

SbdP, a Rhodanese That Binds Long Sulfur Chains—Our presence accelerates H2S production of its partner enzyme attempt to determine the number of sulfurs bound to SbdP SR (Fig. 5, B and C). This impressive effect due to an active shows that, after incubation of SbdP in the presence of S0 and role of SbdP might be explained by the following facts: (i) 2Ϫ S2O3 , several species of the protein can be identified by MS. SbdP binds a chain of sulfur and by an appropriate interac- Some of them bind as many as five sulfur atoms. To our knowl- tion with SR, the substrate is correctly and efficiently pre- edge, this result has never been observed by MS for other rho- sented to the active site of the SR; (ii) SbdP increases both the daneses, although binding of sulfur compounds has already local concentration of substrate and the time of substrate been studied (35, 38). In most cases the presence of only one or presentation to the active site of the enzyme by forming a

JUNE 8, 2012•VOLUME 287•NUMBER 24 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 19945 A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism

FIGURE 8. Central role of SbdP in the model of energy sulfur recycling in A. aeolicus. After growth with S0 as sulfur source, membrane-bound hydrogenase/SR (9) and Sqr/bc1 complex/cytochrome c) oxidase supercomplexes (11) are present and active, as well as cytoplasmic and membrane-associated SOR

enzyme (Ref. 12 and this paper). H2S gas, produced by SR and SOR, might be used by Sqr as a substrate and converted into polysulfide or elemental sulfur that Downloaded from has been proposed to be incorporated into cytoplasmic sulfur globules (36). These sulfur globules (9), which probably serve as sulfur storage for the bacteria, might be in turn used by SbdP as an alternative sulfur source. Finally, sulfite and thiosulfate produced by SOR might be used by still unknown systems participating in sulfur energy metabolism as proposed previously (13, 14). By interacting with both SOR and SR, the rhodanese SbdP is at a key position in this scheme, delivering substrate as a long chain of sulfur atoms, a very suitable form of substrate for these enzymes and, finally, might increase the efficiency of the sulfur energy metabolism of A. aeolicus. Continuous lines represent the pathways demonstrated in this paper; dotted lines represent proposed sulfur traffic. Black points represent quinone molecules; Sn is for sulfur (the physiological substrate and the number of sulfur atoms in the molecule in vivo are not known); cyt c oxidase is for cytochrome c oxidase, and c is for monoheme cytochrome c555. www.jbc.org stable complex; and (iii) the substrate (sulfur chain) supplied studies) with the main players, SR, Sqr, SOR, well characterized by SbdP is more efficiently used by the enzyme than the (as described in Fig. 8 legend) (9, 11, 12). A role of SOR in the

initial cyclic sulfur S8 substrate, for example. sulfur energy pathway is strongly supported by its membrane We propose that SbdP plays a similar function of substrate- location also observed in Acidianus tengchongensis (37), which at CNRS, on July 3, 2012 donating protein for the SOR enzyme. However the impact of would allow transfer of its products to membrane energy SbdP on the kinetics of SOR product formation is difficult to enzymes (13, 14). Here, we define the function of an additional detect on account of the simultaneous reduction and oxidation protein involved in this complex sulfur energy metabolism of A. 0 2Ϫ 2Ϫ of S to SO3 ,S2O3 , and H2S. Moreover, some products of the aeolicus. We propose a model in which SbdP would be at the 2Ϫ 2Ϫ reaction (SO3 and H2S) are unstable, and others (S2O3 ) can central position of this sulfur energy network, as represented in be used by SbdP as a substrate. Fig. 8, playing the role of a shuttle to carry a sulfur chain from Sulfur globules have been observed in A. aeolicus cytoplasm different sources (such as the sulfur globules) to the cytoplas- (9). These kind of sulfur structures are usually present either in mic or membrane-located enzymes and allowing a better avail- the periplasmic compartment or in the extracellular environ- ability of the substrate to optimize the sulfur traffic. This sub- ment (44). In any case, the chemical nature of sulfur in the strate channeling toward its targets would also allow us to globules is still a debated question, and it seems that three dif- prevent any interference with other pathways, a reasonable ferent forms could be found, depending on the approach used: possibility on account of the reactivity of sulfur compounds, in 2Ϫ cyclo-octasulfur (S8), polythionates ([(SnSO3)2] ), and sulfur a similar way as metallochaperones for highly reactive metals chains (45). These three forms can all be used as substrates by (46). SbdP may represent the prototype of a new subfamily of SbdP. In A. aeolicus, a role as sulfur storage has been suggested rhodanese involved in sulfur traffic in cells. The periplasmic based on previous studies showing that in the absence of exog- rhodanese-like protein Sud from W. succinogenes, which pres- enous S0, these inclusions disappeared over time.5 The fact that ents 32% of identity with SbdP, might as well belong to this A. aeolicus possesses two enzymes that use long sulfur chains in family especially because biochemical data and metabolic con- the cytoplasm allows us to speculate that sulfur globules might text suggest that it might supply sulfur substrate to the Psr be one of their sources of substrate, with SbdP acting as a enzyme (17). In other organisms such as Acidithiobacillus fer- shuttle. rooxidans (47), A. ambivalens and some green sulfur bacteria Sulfur Energy Metabolism of A. aeolicus, an Overview—As (48), with similar sulfur metabolism, rhodanese or rhodanese- illustrated in Fig. 8, a broad picture of A. aeolicus sulfur energy like proteins, might play an identical function. metabolism is becoming visible. Pieces of this intricate puzzle Finally, our findings not only allow a better understanding of of sulfur metabolism are now better defined by the association the functional role of the rhodanese enzymes but also open the of complementary approaches (proteomics and enzymatic way to a deeper investigation of the sulfur compounds traffic and recycling between the actors of an intricate sulfur energy 5 M.-T. Giudici-Orticoni, unpublished results. metabolism network.

19946 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 287•NUMBER 24•JUNE 8, 2012 A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism

ter, K. O. (1999) Anaerobic respiration with elemental sulfur and with Acknowledgments—We gratefully acknowledge the contribution of disulfides. FEMS Microbiol. Rev. 22, 353–381 Marielle Bauzan (Fermentation Plant Unit, Institut de Microbiologie 17. Klimmek, O., Kreis, V., Klein, C., Simon, J., Wittershagen, A., and Kro¨ger, de la Me´diterraneé, Marseilles, France) for growing the bacteria; A. (1998) The function of the periplasmic Sud protein in polysulfide res- Alain Bernadac (Institut de Microbiologie de la Me´diterraneé, CNRS, piration of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem. 253, 263–269 Marseilles, France) and Jean-Paul Chauvin (Institut de Biologie du 18. Cipollone, R., Ascenzi, P., and Visca, P. (2007) Common themes and vari- De´veloppement de Marseille-Luminy, University Aix-Marseille II, ations in the rhodanese superfamily. IUBMB Life 59, 51–59 Marseilles, France) for microscopy; Remy Puppo, Re´gine Lebrun, and 19. Papenbrock, J., Guretzki, S., and Henne, M. (2011) Latest news about the Sabrina Lignon (Proteomic Analysis Center, Marseilles, France) for sulfurtransferase protein family of higher plants. Amino Acids 41, 43–57 mass spectrometry analyses; Alexandre Ciaccafava for help with 20. Remelli, W., Cereda, A., Papenbrock, J., Forlani, F., and Pagani, S. (2010) SbdP modeling; and Corinne Aubert for kindly supplying the The rhodanese RhdA helps Azotobacter vinelandii in maintaining cellular redox balance. Biol. Chem. 391, 777–784 pET22SOR plasmid. We also thank Laurence Prunetti, Vale´rie Belle, 21. Cipollone, R., Frangipani, E., Tiburzi, F., Imperi, F., Ascenzi, P., and Visca, and Maria Luz Cardenas for helpful discussions and Athel Cornish- P. (2007) Involvement of Pseudomonas aeruginosa rhodanese in protec- Bowden for reviewing the manuscript. The Proteomic Analysis Center tion from cyanide toxicity. Appl. Environ. Microbiol. 73, 390–398 of IFR88 is part of MaP (Marseille Proteómique, Infrastructure en 22. Kessler, D. (2006) Enzymatic activation of sulfur for incorporation into Biologie Santeét Agronomie). biomolecules in prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 30, 825–840 23. Dahl, J. U., Urban, A., Bolte, A., Sriyabhaya, P., Donahue, J. L., Nimtz, M., Larson, T. J., and Leimku¨hler, S. (2011) The identification of a novel pro- REFERENCES tein involved in molybdenum cofactor biosynthesis in Escherichia coli. 1. Philippot, P., Van Zuilen, M., Lepot, K., Thomazo, C., Farquhar, J., and J. Biol. Chem. 286, 35801–35812 Van Kranendonk, M. J. (2007) Early Archaean microorganisms preferred 24. Matthies, A., Rajagopalan, K. V., Mendel, R. R., and Leimku¨hler, S. (2004) elemental sulfur, not sulfate. Science 317, 1534–1537 Evidence for the physiological role of a rhodanese-like protein for the 2. Wa¨chtershaüser, G. (2000) Origin of life. Life as we don’t know it. Science biosynthesis of the molybdenum cofactor in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. Downloaded from 289, 1307–1308 U.S.A. 101, 5946–5951 3. Montegrossi, G., Tassi, F., Vaselli, O., Buccianti, A., and Garofalo, K. 25. Palenchar, P. M., Buck, C. J., Cheng, H., Larson, T. J., and Mueller, E. G. (2001) Sulfur species in volcanic gases. Anal. Chem. 73, 3709–3715 (2000) Evidence that ThiI, an enzyme shared between thiamin and 4-thio- 4. Bonch-Osmolovskaya, E. (September 2007) Microorganisms in high tem- uridine biosynthesis, may be a sulfurtransferase that proceeds through a perature sulfur environments. eLS. John Wiley and Sons Ltd., Chichester. persulfide intermediate. J. Biol. Chem. 275, 8283–8286

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JUNE 8, 2012•VOLUME 287•NUMBER 24 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 19947 A Rhodanese Involved in Sulfur Energy Metabolism

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19948 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 287•NUMBER 24•JUNE 8, 2012 Supplemental Figure S1, Aussignargues et al.

NCBI Coverage Total Unique Protein name gene entry % Peptides peptides Putative protein aq_863 2983410 45.3 69 42 Hydrogenase large subunit mbhL1 2983267 53.1 83 39 Sulfide quinone reductase sqr 2984385 67.2 58 29 Putative protein aq_1862 2984145 70.4 200 27 Sulfur reductase chain A sreA 2983678 21.9 29 18 60 kDa chaperonin groL 6225112 33 27 16 Hypothetical protein Aq_1259 aq_1259 7429670 43.6 26 16 Glutamine synthetase glnA 6225457 39.4 23 16 Ferredoxin oxidoreductase alpha subunit forA2 2983615 34.2 16 13 Hydrogenase small subunit mbhS1 2983268 37.7 19 11 Alkyl hydroperoxide reductase ahpC1 2983132 46.4 11 10 Hypothetical lipoprotein Aq_1262 aq_1262 7460067 22.3 13 9 Putative protein aq_1558 2983921 28.2 21 9 Hypothetical protein Aq_814 aq_814 2983372 22.2 10 8 Hypothetical protein Aq_1790 aq_1790 2984088 29.4 14 7 Hypothetical protein Aq_1763 aq_1763 2984073 22.3 7 6 ATP synthase subunit beta atpD 3913128 16.3 7 6 SbdP aq_477 2983145 38.2 20 6 Ferredoxin oxidoreductase alpha subunit forA1 2983644 15.6 12 6 ATP synthase subunit alpha atpA 3913127 15.7 10 6 Ni-Fe hydrogenase b-type cytochrome hoxZ 2983263 10.9 11 5

Supplemental FIGURE S1. Protein identification of the band sliced from the native gel (Fig. 2) using ion trap MS analysis. Only proteins identified with at least 5 unique peptides are included in this table. Table heading: Protein name, name in NCBI database; NCBI entry, accession number; Coverage %, protein sequence coverage by the matching peptides; Total peptides, number of total peptides matching to protein sequence; Unique peptides, number of different peptides matching the protein sequence. Supplemental Figure S2, Aussignargues et al.

12862.86 SbdP + IAA

1500 12837.33

SbdP + IAA + S0

1000 Intens. [a.u.]

500

0 12700 12750 12800 12850 12900 12950 13000 13050 13100 13150 m/z

Supplemental FIGURE S2. Cysteine-alkylation of SbdP prevents sulfur atoms fixation. SbdP was treated with iodoacetic acid, incubated at 85°C with (grey curve) or without (black curve) flowers of sulfur and then subjected to MS analysis. The first peak (12837.33 Da) corresponds to the persulfide form of SbdP (SbdP-S-SH) which, for unknown reason, has not been modified, and the second one (12862.86 Da) corresponds to the native form modified with iodoacetic acid (the alkylation by iodoacetic acid lead to a mass increase of 58 Da). Supplemental Figure S3, Aussignargues et al.

20 18

16 14 12 S] µM

2 10

[H 8 6

4 2

0 P P R d d S b b - S S 1 - + k R al S + - 2 R S - 3

Supplemental FIGURE S3. Inactivated SbdP is not able to increase SR activity. H2S production by SR complex (50 µg.mL-1) is measured after 40 minutes of incubation in absence of SbdP (column 1), in presence of native SbdP (5µg.mL-1) (column 2) or in presence of alkylated SbdP (5µg.mL-1) (column 3). After alkylation, SbdP is inactive as a rhodanese in vitro (data not shown). Supplemental Figure S4, Aussignargues et al.

SbdP immobilized 50

[Sqr]

30 RU 20

0 100 200 300 400 500 600 TimeTemps (s) (s)

Supplemental FIGURE S4. SPR experiment showing no interaction between SbdP and Sqr. SbdP was immobilized at 426 RU on a CM5 sensor chip, and Sqr (0.48 and 0.24 µg) was injected.

R R

3 ) (lane

R -1 O

- 2

, lanes 3, 4 and 5 3, 4 and , lanes

d -1

- 1

B, antibodies. specific using +

R R

3 R

- 2

D preincubation After A. SbdP of µg.mL (2.5 E

R R

+ antibodies. specific bywere Blot using detected Western

3 (lane 1), SbdP + SORSbdP (lane 2), + SOR + EDC (lane 3), R

S bdPWestern Blot by was detected

- 1 B al.

et R

+ rhodanesebetween SbdP formed the complex represents The arrow (D). activity and

- R

O between SbdPnteraction and SOR.

P in gel

O SbdP or 2) ) (lane mg.mL 0.4 SOR 0.25, (0.1, of concentrations + increasing

-1 +

Aussignargues S

- 3

S5, R

- 2

Figure - 1 SOR complex. C, D, cross-linking experiment: after preincubation after experiment: C, D, cross-linking of SbdP SbdP gel. a native were loaded onto proteins SOR (C) (B) and SbdP by detected was also respectively), proteins were loaded onto a native gel, and S gel, a native onto were loaded proteins respectively), 1), SOR (0.25 mg.mL SOR (0.25 1), A FIGURE Supplemental S5. Supplemental Supplemental Figure S6, Aussignargues et al.

Supplemental FIGURE S6. Modelisation of SbdP based on the known structure of the rhodanese homologue TTHA0613 from Thermus thermophilus (1) using SWISS-MODEL (2). Pentasulfide sulfur (yellow spheres) was docked on the unique catalytic cysteine of SbdP using AutoDock Vina (3). A. Characteristic rhodanese-fold (β-strands core surrounded by α-helices) of SbdP is shown. B. Blue and red colors correspond to positive and negative-charged regions respectively, white is for neutral/hydrophobic surface. Pymol was used to generate the final figures.

1. Hattori, M., Mizohata, E., Tatsuguchi, A., Shibata, R., Kishishita, S., Murayama, K., Terada, T., Kuramitsu, S., Shirouzu, M. and Yokoyama, S. (2006), Crystal structure of the single-domain rhodanese homologue TTHA0613 from Thermus thermophilus HB8. Proteins, 64: 284–287 2. Arnold K., Bordoli L., Kopp J., and Schwede T. (2006). The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics, 22,195-201 3. Trott, O. and Olson, A. J. (2010), AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J. Comput. Chem., 31: 455–461

Résultats et discussion

II) Une source potentielle de substrat: les globules de soufre

La protéine SbdP a donc été caractérisée fonctionnellement comme étant un fournisseur de soufre pour des enzymes clés du métabolisme énergétique de la bactérie. Et si l‘existence d‘un véritable « réseau du soufre » a été suggérée par cette étude, l‘origine de ce soufre distribué restait à être déterminée.

Une hypothèse séduisante repose sur les globules de soufre présents chez la bactérie lors d‘une croissance sur fleur de soufre. Leur localisation cytoplasmique, comme la protéine SbdP et ses partenaires SOR et soufre réductase, en font de bons candidats pour être une des sources de substrat du système. De plus, très peu de choses sont connues à propos de ces inclusions. C‘est pourquoi nous avons décidé de les étudier plus en détail à travers deux axes majeurs, à savoir la caractérisation des conditions de croissance influençant leur présence dans la bactérie, ainsi que leur purification en vue d‘études biochimiques plus poussées.

A) Influence des conditions de culture

L‘équipe avait auparavant montré que les globules de soufre ne se formaient qu‘au cours d‘une croissance sur fleur de soufre, et avait proposé que ces inclusions pouvaient être une réserve de soufre que la bactérie utiliserait en cas de carence en composé soufré (Guiral et al., 2005b). Nous avons donc cultivé Aquifex aeolicus en présence de fleur de soufre, vérifié que les globules de soufre étaient bien présents (Figure 68), puis nous avons transféré les bactéries, après avoir éliminé l‘excès de fleur de soufre, sur un milieu contenant du thiosulfate en concentration non limitante ou carencé en soufre. Dans les deux cas, on obtient une croissance de la bactérie ainsi qu‘une perte complète des globules de soufre (Figure 69).

138

Résultats et discussion

Figure 68 : Cellules entières d‘Aquifex aeolicus observées en microscopie optique (contraste de phase) (A), et coupes de cellules observées en microscopie électronique (B). Les cellules proviennent de la même culture en présence de fleur de soufre (7,5 g.L-1). Les globules de soufre sont clairement visibles sur ces clichés. La flèche fine indique un globule de soufre intact, et la flèche épaisse montre l‘emplacement d‘un globule de soufre perdu lors du traitement des cellules pour la microscopie.

Figure 69 : Des cellules d‘Aquifex aeolicus cultivées en présence de fleur de soufre (7,5 g.L-1) et récoltées en fin de phase exponentielle de croissance ont été transférées sur milieu carencé en soufre (ni thiosulfate, ni soufre élémentaire) (A) ou en présence de thiosulfate (1 g.L-1, concentration classiquement utilisée lors d‘une croissance en présence de ce composé) (B). Ces clichés de microscopie optique (contraste de phase) ont été réalisé après un croissance sur la nuit et sont représentatifs de l‘ensemble des bactéries qui ne présentent plus de globules de soufre.

Ce comportement est intéressant, car si l‘hypothèse d‘un stockage de soufre en vue d‘une utilisation ultérieure en cas de carence semble confirmée, ces globules sont également

139

Résultats et discussion consommés lorsqu‘une source différente de soufre, comme le thiosulfate, est présente. Pour expliquer ceci, on peut émettre l‘hypothèse que le soufre contenu dans les globules soit plus « énergétique » ou « rentable » que le thiosulfate présent dans le milieu et qu‘il serait donc utilisé en priorité. Si l‘on pousse le raisonnement, on peut imaginer que ce soufre ait un degré d‘oxydation inférieur à celui du thiosulfate (et serait donc une forme plus réduite), ce qui signifie que son oxydation apporterait comparativement plus d‘électrons (et donc d‘énergie) que celle du thiosulfate. Ce modèle est supporté par le fait que ce sont des chaînes de soufre qui constituent les globules chez Allochromatium vinosum et d‘autres bactéries sulfureuses phototrophes (Prange et al., 2002). De plus, le mécanisme d‘internalisation du soufre dans la bactérie est actuellement inconnu, on peut penser que ce processus requiert de l‘énergie de la part de la bactérie, alors que le soufre contenu dans les globules serait une source directement disponible, et finalement peu « chère » (énergétiquement parlant) à mobiliser.

Un autre point intéressant a été dévoilé au cours du test d‘une autre condition de culture, c‘est-à-dire la présence simultanée des deux types de composés soufrés (fleur de soufre insoluble et thiosulfate soluble) dans le milieu de culture. Les résultats, présentés en figure 70, montrent que la présence de soufre insoluble induit automatiquement un stockage de soufre sous forme de globules.

Figure 70 : Aquifex aeolicus cultivée sur un milieu contenant à la fois du soufre soluble (thiosulfate, 1 g.L-1) et insoluble (fleur de soufre, 7,5 g.L-1). La majorité des cellules présentent des globules de soufre.

La présence d‘H2S en fin de culture (jamais détectée lors d‘une croissance en présence de thiosulfate) semble également suggérer que la fleur de soufre a été utilisée pour la croissance. Nous ne pouvons cependant pas conclure sur l‘utilisation du thiosulfate dans de telles conditions de culture, mais il serait intéressant de déterminer les concentrations de

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Résultats et discussion thiosulfate dans le milieu, avant et après culture, lorsqu‘il est seul ou couplé à la fleur de soufre, afin de déterminer les « préférences alimentaires » de la bactérie.

Cette approche permet de dégager quelques tendances à propos de ces globules : ce stock de soufre est automatiquement créé lorsqu‘une source de soufre insoluble est présente dans le milieu, il peut servir de réserve de substrat en cas de carence en soufre, enfin il est consommé en priorité même si une autre source de soufre est disponible. Forts de ces éléments, nous avons décidé de purifier ces inclusions afin de déterminer si elles pouvaient être une source de substrat pour le métabolisme énergétique d‘Aquifex aeolicus, et notamment pour la protéine SbdP.

B) Tentative d’isolation des globules de soufre

Le protocole de référence de purification des globules de soufre est celui développé par (Brune, 1995b) pour la bactérie Allochromatium vinosum cultivée en présence de Na2S qui possède également des globules de soufre périplasmiques. Il consiste en une sédimentation des globules de soufre par centrifugation à très basse vitesse après casse des cellules. Nous avons donc employé la même méthode, mais le suivi de purification par microscopie optique a vite révélé que la fraction contenant les globules de soufre était également contaminée par du soufre insoluble du milieu de culture ainsi que par des bactéries encore intactes. Afin de se débarrasser au maximum du soufre du milieu, plusieurs lavages des cellules ont été effectués et seule la partie homogène correspondant au culot bactérien sans dépôt de soufre a été utilisée. Un gradient de densité à base de Percoll (voir section Matériel et Méthodes) a également été employé pour tenter de séparer complètement les différents éléments. L‘observation au microscope des fractions obtenues a montré que seul le culot contenait du soufre, et donc probablement les globules. Cependant, elle a également révélé la présence majoritaire de globules réfringents (globules de soufre) d‘une taille supérieure à celle des bactéries, mais différents du soufre du milieu classiquement observé, lequel est visible comme un amas cristallin contrairement aux globules de forme très arrondie. Une éventuelle fusion entre les globules libérés des bactéries pourrait expliquer une telle observation. On note également la présence très minoritaire de bactéries intactes et d‘amas de soufre provenant du milieu de culture. Afin de connaitre un peu mieux ces globules (recherche de protéines d‘enveloppe comme chez Allochromatium vinosum, ou d‘autres

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Résultats et discussion protéines interagissant spécifiquement avec les globules…), cette fraction a été déposée sur gel dénaturant, et une révélation de la présence de la protéine SbdP (qui pourrait utiliser le soufre contenu dans ces globules cytoplasmiques comme substrat) ainsi que de la SQR (contrôle négatif, son orientation périplasmique rendant impossible son interaction avec les globules cytoplasmiques) a été réalisée à l‘aide d‘anticorps spécifiques. Les résultats présentés figure 71 montrent la présence de Sbdp. Toutefois, le résultat positif obtenu avec les anticorps dirigés contre la SQR suggère que la fraction étudiée contient encore des bactéries intactes et/ou des débris cellulaires en quantité significative par rapport aux globules de soufre. Afin d‘affiner cet enrichissement, nous avons déposé la fraction d‘intérêt sur un coussin de Percoll pur. Malheureusement, le culot récolté présentait le même type de profil que celui précédemment obtenu, et les protéines SbdP et SQR ont encore été révélées.

A B

130

95 72 55

43 34 26

Figure 71 : Immunodétection sur gel dénaturant de SbdP (A) et de la SQR (B) dans la fraction enrichie en globules de soufre. La présence de la SQR est révélatrice d‘une contamination par des bactéries et/ou des débris cellulaires.

En conclusion, la stratégie utilisée n‘a pas permis la purification des globules de soufre cytoplasmiques d‘Aquifex aeolicus. La fraction obtenue est en effet encore trop contaminée par des bactéries/débris et du soufre du milieu pour permettre une étude correcte de ces inclusions. En particulier, il semble très difficile de séparer complètement les bactéries du soufre du milieu, même après plusieurs lavages. Ce problème avait déjà été évoqué auparavant (Franz et al., 2009; Franz et al., 2007) au cours de travaux sur la bactérie

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Résultats et discussion

Allochromatium vinosum cultivée en présence de fleur de soufre (les globules de soufre isolés le sont à partir de cultures où la source de soufre est soluble), et doit être mis en relation avec le processus d‘adhésion au soufre insoluble observé chez plusieurs bactéries, dont Aquifex aeolicus (Giuliani et al., 2010; He et al., 2009; Mangold et al., 2011). Malgré cela, un point peut être discuté : il a été montré que la nature du soufre contenu dans les globules était dépendante de l‘espèce étudiée, par exemple chez Allochromatium vinosum il s‘agit de chaînes de soufre, alors que chez Beggiaota alba et Thiomargarita namibiensis, ce soufre se retrouve sous forme de cycles identiques à la fleur de soufre que nous utilisons comme substrat (Prange et al., 2002). Au cours de notre étude, nous avons montré que SbdP était capable d‘utiliser ces deux types de composés pour former une longue chaîne de soufre utilisable par la SOR et la soufre réductase. On peut donc raisonnablement penser que si la nature du soufre des globules d‘Aquifex aeolicus se rapproche de celles décrites dans la littérature, ceux-ci peuvent servir de substrat à SbdP, et représenter une source de soufre alternative pour le métabolisme énergétique de la bactérie.

III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus : un nouveau modèle

Nous avons vu en introduction (Chapitre III) que si certaines enzymes et voies du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus avaient été caractérisées par l‘équipe, plusieurs questions se posent encore, notamment à propos de l‘utilisation de composés comme le thiosulfate ou le sulfite. La comparaison avec les modèles établis chez d‘autres organismes (Introduction I, Figures 23, 24, 25 et 26) suggère l‘existence de systèmes supplémentaires d‘utilisation du soufre à des fins énergétiques chez Aquifex aeolicus. En nous appuyant sur la description des enzymes et systèmes composant le métabolisme énergétique du soufre de ces organismes modèles, nous avons entrepris de rechercher dans le génome d‘Aquifex aeolicus de nouveaux acteurs de ce métabolisme, afin d‘en proposer un modèle le plus complet possible (Figure 76).

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Résultats et discussion

A) Identification de systèmes potentiellement impliqués dans le métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus

1. Oxydation du thiosulfate

Nous savons qu‘Aquifex aeolicus est capable de croître en utilisant le thiosulfate comme substrat soufré, cependant, aucun système d‘utilisation de ce composé, hormis SbdP, n‘a encore été caractérisé chez cette bactérie. La recherche dans le génome d‘une TQOR putative (similaire à DoxDA d‘Acidianus ambivalens, Introduction I, II.2) ou d‘une thiosulfate déshydrogénase (comme TsdA d‘Allochromatium vinosum par exemple, Introduction I, II.2) n‘a pas été fructueuse. On ne peut toutefois pas écarter complètement la présence de ce type de protéines puisque les thiosulfate déshydrogénases présentent peu de similarité de séquence entre elles, rendant difficile leur identification dans les génomes (Visser et al., 1996). Il ne semble pas non plus y avoir de gène codant pour une tétrathionate hydrolase (l‘enzyme capable d‘utiliser le tétrathionate produit par les thiosulfate déshydrogénases) dans le génome de la bactérie.

En revanche, un groupe d‘au moins dix gènes codant pour le système Sox a été retrouvé (Figure 72 et Table 4). Plusieurs points le concernant sont à noter. En premier lieu, les enzymes principales (SoxAX, SoxB et SoxYZ, prédites pour résider dans le périplasme) sont présentes, ce qui implique un système fonctionnel (Figure 8). Le complexe SoxAX serait d‘ailleurs assez particulier, puisqu‘il emprunterait des caractéristiques propres à chacun des groupes I et II de la classification récemment proposée par Kappler et co-auteurs (Kappler and Maher, 2012) : en effet, la présence de deux sites de fixation des hèmes c dans la séquence de SoxA le rapprocherait du groupe I, alors que la masse moléculaire de SoxX (environ 20 kDa) le placerait plutôt dans le groupe II. L‘absence de la protéine SoxK, qui peut interagir avec SoxAX, permet toutefois de l‘exclure avec certitude du groupe III.

T R S V W X Y Z A C D F G H P. pantothrophus soxB E A. aeolicus aq1803

Figure 72 : Comparaison des opérons codants pour le système Sox chez Paracoccus pantothrophus et Aquifex aeolicus.

144

Résultats et discussion

Gène Locus Protéine trxA2 aq_1811 Thiorédoxine (SoxW) aq_1810 aq_1810 SoxY aq_1809 aq_1809 SoxZ aq_1807 aq_1807 SoxA aq_1806 aq_1806 SoxX soxB aq_1803 SoxB aq_1802 aq_1802 Protéine hypothétique aq_1800 aq_1800 Protéine hypothétique rhdA2 aq_1799 Thiosulfate soufre transférase (rhodanèse, SoxL) cphA1 aq_1798 SoxH

Table 4 : Composition du système Sox d’Aquifex aeolicus.

Autre point intéressant, SoxCD qui permet une oxydation complète du thiosulfate en sulfate n‘est pas retrouvé : il est tentant de faire un parallèle avec des bactéries, telles que Allochromatium vinosum, pour lesquelles l‘absence de SoxCD conduit à l‘apparition de globules de soufre, périplasmiques ou extracellulaires, comme intermédiaires réactionnels obligatoires lors de l‘oxydation du thiosulfate. Cependant, la situation chez Aquifex aeolicus est assez différente, puisque ces globules se retrouvent dans le cytoplasme de la bactérie, compartiment différent du système Sox périplasmique. Mais surtout, chez Aquifex aeolicus, ces globules n‘apparaissent que lorsque la bactérie est cultivée en présence de soufre élémentaire, et non pas de thiosulfate. On peut dès lors imaginer un processus de formation des globules différent de ce qui est décrit dans la littérature, n‘impliquant pas le système Sox mais d‘autres protéines encore non identifiées. Le système Dsr, responsable de l‘utilisation ultérieure de ce soufre stocké chez Allochromatium vinosum et d‘autres bactéries, n‘existe pas non plus chez Aquifex aeolicus. Le système responsable de la consommation de ces globules reste donc à être découvert : nous avons toutefois proposé que SbdP puisse utiliser le soufre de ces inclusions comme substrat, afin de l‘apporter à la SOR et la soufre réductase.

Si l‘on continue à comparer les systèmes Sox d‘Allochromatium vinosum et d‘Aquifex aeolicus, il faut mentionner la protéine SoxL appartenant à la superfamille des rhodanèses. Les études menées chez Allochromatium vinosum ont permis de proposer un rôle pour SoxL : elle permettrait de recycler le complexe SoxYZ en ôtant de SoxY le dernier atome de soufre (ou la chaîne de soufre) résultant de l‘oxydation incomplète du thiosulfate en absence de SoxCD (Bagchi, 2012; Welte et al., 2009). Chez Aquifex aeolicus, un gène nommé rhdA2 (ou aq_1799) codant pour une rhodanèse est retrouvé dans le groupe de gènes sox : ceci nous

145

Résultats et discussion permet de proposer un rôle pour une autre rhodanèse d‘Aquifex aeolicus, à savoir une implication dans le système Sox et le recyclage de SoxYZ.

Bien que nous n‘ayons pas encore étudié le système Sox autrement qu‘in silico, sa présence dans les cellules est cependant assez certaine, puisque certains composants (tels SoxB) ont déjà été identifiés au cours d‘analyses par spectrométrie de masse de la fraction soluble d‘Aquifex aeolicus cultivée en présence de soufre élémentaire. La présence du système Sox dans de telles conditions de culture peut paraitre curieuse, puisqu‘on aurait pu penser qu‘il ne soit utile que lorsque le thiosulfate est utilisé comme substrat soufré au cours de la culture. On peut avancer deux hypothèses pour expliquer cette observation : pour la première, le système Sox serait exprimé à un niveau basal et serait surexprimé lors d‘une croissance en présence de thiosulfate. Ce dernier agirait donc comme un activateur de l‘expression des gènes codant pour le système Sox. Cette hypothèse est confortée par les résultats publiés chez Allochromatium vinosum (Grimm et al., 2011), montrant que les gènes sox sont plus fortement exprimés lors d‘une croissance en présence de thiosulfate. Une deuxième hypothèse repose sur l‘idée que le thiosulfate pourrait être un intermédiaire réactionnel obligatoire au cours de l‘oxydation du soufre élémentaire, produit par exemple de manière indirecte par la SOR. La présence d‘un système permettant l‘utilisation de ce composé serait alors parfaitement compréhensible et nécessaire.

L‘ensemble de ces éléments fait de l‘étude du système Sox d‘Aquifex aeolicus une voie de recherche à privilégier dans les futurs investigations pour une meilleure compréhension du métabolisme énergétique du soufre de cette bactérie.

2. Oxydation de l‘H2S

Comme nous l‘avons vu précédemment, l‘oxydation de l‘H2S chez Aquifex aeolicus est dû à la SQR membranaire, laquelle peut s‘associer à la voie de l‘oxygène au sein du supercomplexe bc1/cytochrome c oxydase. L‘analyse du génome de la bactérie révèle également la présence de deux gènes codant pour des protéines potentiellement impliquées dans l‘oxydation de l‘H2S : aq_232 ou dhsU, et aq_235 ou fccB’. Les deux protéines putatives seraient des flavoprotéines de la famille des flavocytochromes c sulfure déshydrogénases (FCSD, Introduction I, II.A.1.b) homologues à la sous-unité à flavine FccB d‘Allochromatium vinosum et d‘autres représentants de la même famille (Figure 73). Ces deux gènes font partie

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Résultats et discussion d‘un opéron putatif contenant aussi le gène soxF (ou aq_234) qui n‘a rien à voir avec le système Sox déjà présenté, mais qui coderait pour une protéine de Rieske-I à centre fer- soufre. Il faut noter que les deux protéines DhsU et FccB‘ ont une taille relativement identique (49 et 47,5 kDa respectivement) et partage une très forte similarité de séquence (70%), ce qui permet d‘envisager une duplication d‘un gène ancestral (Figure 73).

Une question peut se poser concernant ces deux protéines : si elles correspondent à la sous-unité à flavine des FCSD, on devrait retrouver la seconde sous-unité de type cytochrome c dans le même opéron, or ce n‘est pas le cas. Elle n‘est pas non plus retrouvée dans le reste du génome. On peut alors supposer que les électrons issus de l‘oxydation de l‘H2S soient directement transférés à un cytochrome c plus « général ». Une autre hypothèse concerne la protéine de Rieske codée par aq_234 : les protéines de cette famille étant connues pour jouer un rôle dans les transferts électroniques, on peut imaginer qu‘elle soit le partenaire de DhsU/FccB‘, ce qui expliquerait également sa présence au sein de l‘opéron putatif. Une autre possibilité quant à un rôle possible de DhsU/FccB‘ serait leur implication dans le système Sox dans lequel on peut parfois retrouver une flavoprotéine monomérique possédant une activité sulfure déshydrogénase baptisée SoxF. Cette protéine a récemment été proposée comme « réactivateur » du complexe SoxYZ inactivé avec lequel elle pourrait interagir physiquement (Bagchi, 2011; Ogawa et al., 2010). On peut ainsi supposer que DhsU et/ou FccB‘ serait en réalité des composants du système Sox d‘Aquifex aeolicus. Ces protéines (DhsU et FccB‘) avaient d‘ailleurs été nommées SoxF1 et SoxF2 au cours d‘une étude sur la conservation du système Sox de la bactérie Chlorobium limicola (Verté et al., 2002).

Enfin, il faut noter que DhsU et FccB‘ sont exprimées puisqu‘elles ont été identifiées au cours d‘analyses par spectrométrie de masse, lors d‘études réalisées dans l‘équipe sur Aquifex aeolicus cultivée en présence de soufre élémentaire.

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Résultats et discussion

A. vinosum ---MTLNRRDFIKTSGAAVAAVGILGFPHLAFGAGR------KVVVVGGGTGGAT T. marina ---MKINRRDFVKVAGAAT-AVGLVGAPHLAFGATQ------KVVIVGGGTGGAT Beggiatoa --MSNITRRNFIKIAAGTA-AAGMVSFPFIAYGAKK------QVVVVGGGAGGAT DhsU ---MGVNRRDVFKLAGLGV-ALGALQLPSIACAAKTSNSLLSPSKGKRIVIVGGGWAGVT FccB’ MKSFTVDRRNLLLAGGIG--LLG------VYVSKS--LVFGETKGNRVVVLGGGYGGVT : **:.. .. * . : ::*::*** .*.*

A. vinosum AAKYIKLADPSIEVTLIEPNTDYYTCYLSNEVIGGDRKLESIKHGYDG-LRAHGIQVVHD T. marina AAKYIKMADSSIDVTVIEPNKEYITCYLSNEVLGGDRAFDTLKVSYDG-LKALGVNVVHD Beggiatoa AAKYIAITDSSIEVTLIEQNPKYHTCFMSNEVLTGERSLDYIQFGYDS-LAKYGINVVHS DhsU AAKYIRKEIPDAEVVLIEQRKMFMSCPISNVWLGGLVDLEFLIHDFLTPAAKYGYTFINA FccB’ TAKYVKKLYPDAEVVLVEKNPMFVSCPLSNLYLVGLVPYEQLCYPYNNLVTKYGVNFVND :***: .. :*.::* . : :* :** : * : : : * .::

A. vinosum SATGIDPDKKLVKTAGGAEFGYDRCVVAPGIELIYDK----IEGYSEEAAAKLPHAWKAG T. marina TASGIDAEKKVVKTAGGTEFGYDRCIVAPGVQILYDK----VEGYSEEAAQKAPHAWKAG Beggiatoa RVTGIDSVAKKVTTQNGNTFTYERLIVAPGIDFKWEA----IDGYNERIAEKIPHAWLAG DhsU TVTDIDRDKRRVYTEDG-YVEYDYLILAPGIRYNYDAWFNGDKDMARYAQTHYPSAFIPG FccB’ EVIGIELDKREVILGNG-RLKYDYLVISLGIEYDYE-----ENPALKEVYWSYPPAFRQG . .*: : * .* . *: ::: *: :: . . * *: *

A. vinosum EQTAILRKQLEDMADGGTVVIAPPAAPFRCPPGPYERASQVAYYLKAHKPKSKVIILDSS T. marina EQTLILRKQLEDMADGGVVVISAPANPFRCPPGPYERASQIAHYFKANKPKSKVIILDSK Beggiatoa NQTTILRDQLHAMKDGGKIIIAVPPKPFRCPPGPYERVSLVAHYLKHHKPKSKILIFDAN DhsU SEHLRLKKKVENFE-EGTFVLVVPPPPHRCPPAPYERAAMIAHVFRQNEAKAKLIILDPK FccB’ SEHLYLKRMLEGFE-GESILISVPKMPYRCPSAPYERAALILSYAKKEGLKVHLYFVDEN .: *: :. : .:: * *.***..****.: : : . * :: :.* .

A. vinosum QTFSKQSQ-FSKGWERLYGFGTENAMIEWHPG-PDSAVVKVDGGEMMVET-AFGDEFKAD T. marina QAFSKQAL-FTQAWERLYGFGTDDSLIEWRPG-PDAAVSLVKVDEMMVET-GFGDEIKAD Beggiatoa QAFSKQGL-FTQGWEKLYGFGTDKSLIEWIPADKDGTVIGIDADNMTVIAGEFEDEHQVD DhsU EKIAPKGPGFRMAYEQLY-----LDIIEYVPN---AKIKEVDPVKKVIKT--TAGDFKFD FccB’ ERPPVLTKGFLKAYQDFY-----KDDATYLTS---TKVLEVDPVKKVART--TKGDIKFS : . * .:: :* : . : :. : : .: : .

A. vinosum VINLIPPQRAGKIAQIAGLTN-DAGWCPVDIKTFESSIHKGIHVIGDACIANPMPKSGYS T. marina VINIIPPQRAGEIAQTAGLAD-DSGWCPVEAISFESKLQKGIHVIGDACIAGAMPKSGYA Beggiatoa VINLIPPQKAGKIAFDSGLTN-ESGWCPVNPKSFESTLQKDIHVIGDAAIASPMPKSAYA DhsU DANLNPPHQAADIAWKAGLVNPKTGWCDVDPITLQSKVDKRIFIPGDANSVKGFPKSGDM FccB’ MANFIPPMRAPKLLEKAGLLKKGEKWVKVDPMTFETSVKN-VFVIGDS-AFTYLPKSGYA *: ** :* .: :** . * *: ::::.:.: :.: **: :***.

A. vinosum ANSQGK-VAAAAVVALLK--GEEPGTPSYLNTCYSILAPAYGISVAAIYRPNADGSAIES T. marina ANSQAK-VAAAAVVAMLK--GEEPGTPSYVNTCYSIVGTDYGISVAGVYRMSADGSTIDS Beggiatoa ANSQAK-VCAMAVVAALQ--GIEMGKPSYINTCYSMIGEDYAVSVAAVYRLEGD--KIVS DhsU ANNQTKFMLVKAIKAMIEGKDPLEYVKAPTNTCYSMVNGDPKEAIVINVVYDIDK----- FccB’ AHSQGK-VVAKVIASRLR-KKPWEGELIQQAVCYAMVN--LKQAIMMNVEYKYN------*:.* * : . .: : :. .**::: :: . :

A. vinosum VPDSGGVTPVDAPDWVLEREVQYAYSWYNNIVHDTFG T. marina VEGSGGVTPIDAPDWAHAREVQYAYSWYKNIVKDSFG Beggiatoa VTGAGGLSPMDASAEDRKREVLYAHSWFKNITHDMFG DhsU QKRMPVKKKVNVENERSQRLARATFEWAKAMYRDMFS FccB’ LKTKEIKKEIYEDDTWKVSTAKRYIEWARGLWRDMFT . : . .* . : :* *

Figure 73 : Alignement des séquences de DhsU et FccB’ d’Aquifex aeolicus avec des représentant de la sous-unité à flavine de la famille des FCSD. *, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; ., conservation faible. A. vinosum, Allochromatium vinosum ; T. marina, Thiocapsa marina ; Beggiatoa, Beggiatoa sp.

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Résultats et discussion

3. Oxydation du soufre

Il a été proposé chez Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus caldus l‘implication d‘une hétérodisulfure réductase cytoplasmique, potentiellement liée à la membrane (HdrABC, contenant des centres fer-soufre et du FAD), dans l‘oxydation du soufre sous forme persulfure à partir notamment de molécules organiques transportant le soufre telles que les glutathions (forme GSSH). Cette hypothèse se base sur le fait que les gènes codant pour ce complexe sont plus exprimés lors d‘une culture en présence de soufre élémentaire ou de tétrathionate que de fer (ces substrats sont tous utilisés par ces bactéries comme donneurs d‘électrons) (Mangold et al., 2011; Quatrini et al., 2009).

Chez Aquifex aeolicus, il existe un opéron (de aq_389 à aq_400) semblable à celui d‘Acidithiobacillus codant pour une (ou plusieurs) hétérodisulfure réductase (un gène hdrA, 3 gènes hdrB et deux gènes hdrC), ainsi que pour des protéines potentiellement impliquées dans le transfert de soufre (Figure 74 et Table 5).

rdh tusA dsrE hdrC1 hdrB1 hdrA orf2 hdrC2 hdrB2 A. ferrooxidans

dsrE2 A. aeolicus

Figure 74 : Comparaison des opérons codants pour une hétérodisulfure réductase chez Acidithiobacillus ferrooxidans et Aquifex aeolicus.

Gène Locus Protéine aq_389 aq_389 Protéine hypothétique (famille DsrE/F) aq_390 aq_390 Protéine hypothétique (famille DsrE/F) aq_391 aq_391 Hétérodisulfure réductase sous-unité C, HdrC aq_392 aq_392 Hétérodisulfure réductase sous-unité B, HdrB aq_394 aq_394 Hétérodisulfure réductase sous-unité B, HdrB hdrA aq_395 Hétérodisulfure réductase sous-unité A, HdrA aq_397 aq_397 Protéine hypothétique hdrC aq_398 Hétérodisulfure réductase sous-unité C, HdrC hdrB aq_400 Hétérodisulfure réductase sous-unité B, HdrB

Table 5 : Composition de l’opéron Hdr d’Aquifex aeolicus. Les protéines de la famille DsrE/F pourraient être impliquées dans le transfert de soufre.

149

Résultats et discussion

Sur la base de ce qui a été proposé pour Acidithiobacillus, le complexe HdrABC pourrait oxyder en sulfite le soufre porté par des molécules de type glutathion (Figure 25). Ceci est à mettre en relation avec l‘absence chez Aquifex aeolicus et Acidithiobacillus ferrooxidans du système Dsr (Figure 16) connu pour produire du sulfite à partir de soufre sous forme persulfure (provenant des globules de soufre). Cependant, cette réaction potentiellement catalysée par Hdr n‘est pour l‘instant appuyée par aucune donnée expérimentale, il conviendra dans un premier temps de démontrer l‘activité portée par ce complexe afin de donner plus de poids à l‘hypothèse de son implication dans le métabolisme énergétique du soufre.

4. Oxydation du sulfite

a) Voie de l‘APS

Chez Aquifex aeolicus, du sulfite est produit par la SOR cytoplasmique, et peut-être par Hdr. Ce sulfite pourrait être consommé par la voie de l‘APS (Figure 13) puisqu‘une ATP sulfurylase (Sat) capable de produire de l‘ATP et du sulfate à partir d‘APS et de pyrophosphate a été retrouvée dans le génome de la bactérie. Cette protéine a également été cristallisée et son activité confirmée au cours d‘études d‘enzymologie (Hanna et al., 2002; Yu et al., 2007). Cependant, la première étape de cette voie, la production d‘APS à partir de sulfite et d‘AMP, est habituellement assurée par une APS réductase, absente du génome d‘Aquifex aeolicus ; cette situation est analogue à celle rencontrée chez Acidithiobacillus, on peut donc supposer qu‘une autre enzyme non caractérisée puisse remplacer cette APS réductase, ou qu‘une autre voie soit responsable de l‘oxydation du sulfite.

b) Aq_979

Comme nous l‘avons vu, la voie de l‘APS chez Aquifex aeolicus est incomplète, nous avons donc cherché à savoir si un autre système d‘oxydation du sulfite pouvait être retrouvé dans le génome de la bactérie. Nous avons ainsi identifié le gène aq_979 codant pour une sulfite oxydase putative. L‘analyse de la séquence de cette protéine a révélé plusieurs informations intéressantes : c‘est une molybdoprotéine de 23,6 kDa, prédite pour résider dans le cytoplasme et appartenant au groupe 3B suivant la classification des sulfite oxydases

150

Résultats et discussion proposée par Kappler (Kappler, 2011). En effet, les protéines de ce groupe ne possèdent pas le motif « twin arginine » nécessaire à leur export dans le périplasme, leur domaine de fixation du cofacteur à molybdène est raccourci par rapport aux autres familles, et la cystéine conservée liant le molybdène est incluse dans une séquence DFHCVTxWS caractéristique. A l‘heure actuelle, aucune sulfite oxydase du groupe 3 n‘a été caractérisée, de futurs études sur Aq_979 permettront donc une meilleure compréhension de cette famille.

En revanche, la comparaison avec la sulfite : accepteur oxydoréductase périplasmique SorAB de Starkeya novella (Figure 11) permet d‘aller un peu plus loin. La première chose à remarquer concerne leur repliement tridimensionnel : lorsque l‘on superpose la structure modélisée de Aq_979 sur celle obtenue par cristallographie de SorAB, on s‘aperçoit que Aq_979 présente un repliement similaire à celui du domaine N-terminal de SorA (Figure 75), ce qui permet de suggérer une similarité de fonction entre les deux protéines. Lors de son cycle catalytique, SorA oxyde le sulfite en sulfate grâce à son cofacteur à molybdène, transmet les électrons à l‘hème c de la sous-unité SorB avec laquelle elle est en complexe, et cette dernière va finalement les transférer à un cytochrome c. L‘analyse du contexte génétique de aq_979 montre que la sous-unité de type cytochrome c est absente, et elle n‘est pas non plus retrouvée ailleurs dans le génome. Ceci n‘est finalement pas surprenant puisque Aq_979 est prédite pour être cytoplasmique, et qu‘aucun cytochrome c n‘est retrouvé dans le cytoplasme de la bactérie ; on ne connait donc pas la nature de l‘accepteur d‘électrons de ce système.

151

Résultats et discussion

Figure 75 : Alignement des structures de SorAB de Starkeya novella et de Aq_979 d’Aquifex aeolicus. SorA est représentée en gris, SorB en bleu, Aq_979 en jaune, le cofacteur à molybdène de SorA est en violet et l‘hème de type c de SorB est en rouge.

Nous avons tenté de détecter une activité sulfite oxydase à partir de fractions solubles et membranaires d‘Aquifex aeolicus. Une première approche a consisté à suivre par spectrophotométrie la réduction du ferricyanure (accepteur artificiel d‘électrons) en présence de sulfite, mais la haute température nécessaire à l‘activité des protéines d‘Aquifex aeolicus entraine également une réduction chimique importante du ferricyanure, masquant ainsi une éventuelle activité. Une seconde approche reposait sur la détection sur gel natif de cette activité. Cette fois, c‘était la production de sulfate qui était suivie : celui-ci forme un précipité blanc en présence de chlorure de baryum, une bande blanche sur le gel aurait indiqué la présence d‘une protéine oxydant le sulfite en sulfate. Cependant, si on ne se trouve pas en condition très acide, le sulfite également précipite avec le chlorure de baryum ; cette condition de pH est incompatible avec les conditions requises par l‘enzyme pour fonctionner correctement. Ces contraintes techniques nous ont donc empêchés de détecter l‘activité sulfite oxydase, mais d‘autres protocoles sont à tester, et ceci reste une piste intéressante à exploiter.

152

Résultats et discussion

B) Construction d’un modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus

A la suite de ces études in silico associées à certaines données expérimentales, nous avons été en mesure de proposer de nouveaux partenaires que nous avons intégrés à un nouveau modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus (Figure 76).

L‘H2S pourrait ainsi être oxydé par deux systèmes différents, la SQR d‘une part et les sulfure déshydrogénases DhsU et FccB‘ d‘autre part. Deux systèmes d‘alimentation peuvent être proposés pour ces enzymes : l‘H2S en provenance du milieu bien sûr, mais aussi celui produit par la soufre réductase et par la SOR à partir de chaînes de soufre, lesquelles sont les produits de la SQR et des sulfure déshydrogénases. Ces enzymes constitueraient ainsi un cycle de recyclage du soufre performant permettant d‘optimiser sa capacité énergétique, couplé à la fois au métabolisme de l‘hydrogène (supercomplexe hydrogénase / soufre réductase) et à celui de l‘oxygène (supercomplexe SQR / complexe bc1 / cytochrome c oxydase).

Mais notre étude a également permis de proposer des voies supplémentaires qui n‘avaient pas encore été envisagées. La présence d‘un système Sox comportant les éléments essentiels à l‘oxydation du thiosulfate en sulfate est d‘une importance capitale, puisqu‘il permet d‘expliquer par quel moyen le thiosulfate du milieu de culture est utilisé par la bactérie. On ne peut pas non plus exclure une utilisation par Sox du thiosulfate indirectement produit par la SOR. Classiquement, les électrons produits par l‘oxydation du thiosulfate sont transférés à un cytochrome c, lequel peut ensuite être pris en charge par la cytochrome c oxydase. Ceci met en lumière un nouveau couplage entre le métabolisme du soufre (en l‘occurrence, du thiosulfate) et le métabolisme de l‘oxygène chez Aquifex aeolicus.

Enfin, on peut proposer une dernière voie basée sur l‘oxydation du soufre (sous forme persulfure) en sulfite par l‘hétérodisulfure réductase. Ceci rappelle de façon claire le système Dsr des bactéries phototrophes sulfureuses, qui utilise également du soufre sous forme persulfure, issu des globules de soufre, pour donner du sulfite. On peut émettre l‘hypothèse que l‘hétérodisulfure réductase d‘Aquifex aeolicus pourrait assumer le même rôle que le système Dsr, et qu‘elle serait ainsi responsable de la dégradation des globules de soufre cytoplasmiques de la bactérie. Le sulfite produit par ce complexe ainsi que par la SOR, serait finalement oxydé en sulfate via la voie directe impliquant une sulfite oxydase cytoplasmique, Aq_979, ou via la voie indirecte de l‘APS matérialisée par une protéine non caractérisée assumant le rôle de l‘APS réductase et par l‘ATP sulfurylase.

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Résultats et discussion

Figure 76 : Modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus. Les notions de recyclage des composés soufrés, ainsi que les nouvelles voies proposées sont intégrées dans ce modèle essentiellement décrit dans le texte principal. Le soufre élémentaire est internalisé sous une forme inconnue notée S* par des transporteurs également inconnus.

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Article 2 (revue)

The Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus: From Respiratory Pathways to Extremely Resistant Enzymes and Biotechnological Applications.

Guiral Marianne, Prunetti Laurence, Aussignargues Clément, Ciaccafava Alexandre, Infossi Pascale, Ilbert Marianne, Lojou Elisabeth, Giudici-Orticoni Marie-Thérèse.

Advances in Microbial Physiology (2012) 61:125-94

CHAPTER FOUR

The Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus: From Respiratory Pathways to Extremely Resistant Enzymes and Biotechnological Applications

Marianne Guiral1, Laurence Prunetti2, Clément Aussignargues, Alexandre Ciaccafava, Pascale Infossi, Marianne Ilbert, Elisabeth Lojou, Marie-Thérèse Giudici-Orticoni Unite´ de Bioeńerge´tique et Ingeńierie des Proteínes, UMR7281-FR3479, CNRS, Aix-Marseille Universite´, Marseille, France 1Corresponding author: e-mail address: [email protected] 2Present address: Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, Gainesville, Florida, USA.

Contents 1. The Extreme Heat-Loving Bacterium Aquifex aeolicus 127 1.1 The Aquificales 127 1.2 Aquifex aeolicus 129 2. Hydrogenases and Hydrogen Metabolism in Aquifex aeolicus 134 2.1 Possible involvement of hydrogenase III in carbon assimilation pathway 137 2.2 Focus on the super-resistant hydrogenase I 140 2.3 The hydrogen–oxygen bioenergetic pathway 149 3. Hydrogen Sulfide Utilization Pathway 153 3.1 Sulfide-dependent electron transport 153 3.2 The highly active and thermostable Sqr from A. aeolicus 154 3.3 The new sulfide-oxidase and oxygen-reductase supercomplex of A. aeolicus 160 3.4 Putative A. aeolicus enzymes involved in sulfide oxidation 164 4. Elemental Sulfur and Oxidized Sulfur Compounds Energy Metabolism 169 4.1 Many enzymes... 169 4.2 ...many possibilities 176 5. A Model of Intricate Bioenergetic Pathways in Aquifex aeolicus 181 6. Concluding Remarks 183 Acknowledgments 184 References 184

Abstract Aquifex aeolicus isolated from a shallow submarine hydrothermal system belongs to the order Aquificales which constitute an important component of the microbial communities at elevated temperatures. This hyperthermophilic chemolithoautotrophic bacterium, which utilizes molecular hydrogen, molecular oxygen, and inorganic sulfur compounds

to flourish, uses the reductive TCA cycle for CO2 fixation. In this review, the intricate energy metabolism of A. aeolicus is described. As the chemistry of sulfur is complex and multiple sulfur species can be generated, A. aeolicus possesses a multitude of different enzymes related to the energy sulfur metabolism. It contains also membrane-embedded [NiFe] hydrogenases as well as oxidases enzymes involved in hydrogen and oxygen utilization. We have focused on some of these proteins that have been extensively studied and characterized as super-resistant enzymes with outstanding properties. We discuss the potential

use of hydrogenases in an attractive H2/O2 biofuel cell in replacement of chemical catalysts. Using complete genomic sequence and biochemical data, we present here a global view of the energy-generating mechanisms of A. aeolicus including sulfur compounds reduction and oxidation pathways as well as hydrogen and oxygen utilization.

ABBREVIATIONS A. aeolicus Aquifex aeolicus APS adenylylsulfate ATP adenosine-50-triphosphate DET direct electron transfer D. gigas Desulfovibrio gigas Df Desulfovibrio fructosovorans DMK demethylmenaquinone EPR electron paramagnetic resonance FAD flavin adenine dinucleotide FCC flavocytochrome c sulfide dehydrogenase GSH glutathione Hdr heterodisulfide reductase LPS lipopolysaccharide MET mediated electron transfer MGD molybdopterin guanine dinucleotide NADH nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form Psr polysulfide reductase R. eutropha Ralstonia eutropha rRNA ribosomal ribonucleic acid rTCA reductive tricarboxylic acid cycle SDS sodium dodecyl sulfate SOR sulfur oxygenase reductase SPR surface plasmon resonance Sqr sulfide:quinone reductase SR sulfur reductase Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 127

During the past 30 years, numerous microbial species belonging to the Archaea or the Bacteria were isolatedfrom hydrothermal springs. Thebiodiversity of microorganisms thriving in these environments is broad, with the thermophilic and hyperthermophilic chemolithoautotrophic bacteria playinga predominant role in the biogeochemical cycles of carbon, sulfur, and nitrogen. These bacterial communities use carbon from CO2 and energy from the oxidation of minerals. Members of the phylum Aquificae are ubiquitous and particularly pro- fuse in the marine or terrestrial hydrothermal systems. Aquifex aeolicus, which is the focus of this review, possesses outstanding features as it develops at extremely high temperatures using simple nutrients which are exclusively gases and mineral compounds. The exceptional adaptation and metabolic capabilities as well as enzyme properties make of A. aeolicus an organism of choice for respiratory pathway and protein studies and biotechnological development.

1. THE EXTREME HEAT-LOVING BACTERIUM AQUIFEX AEOLICUS

1.1. The Aquificales A. aeolicus belongs to the order Aquificales of bacteria containing thermophilic members. They flourish in shallow or deep-sea marine habitats and terrestrial hydrothermal environments but also have been isolated from hot composts or deep gold mines (Bonch-Osmolovskaya, 2008; Reysenbach et al., 2005). These bacteria, which constitute an important component of the microbial communities at elevated temperatures, were observed throughout the world over decades (Reysenbach et al., 2005); however, this order was created only at the beginning of the 1990s (Pitulle et al., 1994; Reysenbach, 2001; Reysenbach, Wickham, & Pace, 1994). Hydrogenobacter thermophilus was the first species to be described (Kawasumi, Igarashi, Kodama, & Minoda, 1984). Besides the unclassified Aquificales, the order consists to date of three families Aquificaceae, Desulfurobacteriaceae, and Hydrogenothermaceae (Bonch-Osmolovskaya, 2008; Eder & Huber, 2002; L’Haridon et al., 2006; Reysenbach, 2001). Aquifex pyrophilus (Huberetal.,1992)andA. aeolicus (Deckert et al., 1998) belong to the genus Aquifex which is listed in the Aquificaceae family together with Hydrogenivirga, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum,andThermocrinis. A. aeolicus is unquestionably the model organism not only of the Aquifex genus but also of the Aquificaceae family and the order Aquificales. 128 Marianne Guiral et al.

Bacteria Archaea Eucarya

Green Filamentous Myxomycota Spirochetes bacteria Entamoebae Animalia Fungi Gram Methanosarcina positives Methanobacterium Halophiles Proteobacteria Plantae Methanococcus Cyanobacteria Ciliates T. celer Planctomyces Thermoproteus Flagellates Pyrodicticum Bacteroides Trichomonads Cytophaga Microsporidia Thermotoga Diplomonads Aquifex

Figure 4.1 Phylogenetic Tree of Life, based on 16S RNA sequences, showing the position of Aquifex in the deepest known branch within the domain Bacteria (from NASA Astrobi- ology Institute, http://nai.arc.nasa.gov/news_stories/news_detail.cfm?ID¼274).

Based on 16S RNA gene sequences, the Aquificales represent the deepest known branch within the domain Bacteria of the Universal Phylogenetic Tree of Life (Burggraf, Olsen, Stetter, & Woese, 1992; Eder & Huber, 2002)(Fig. 4.1). Although most of the studies locate these bacteria close to the Thermotogales, the phylogenetic position of the Aquificales is debated and another view places them close to the epsilon-proteobacteria and proposes a late divergence of this order based on the sequence analysis of various proteins (Griffiths & Gupta, 2004). The difficulty to obtain a clear picture of the Aquificales phylogeny is due to many horizontal gene transfers undergone by the lineage (Boussau, Gue´guen, & Gouy, 2008; Coenye & Vandamme, 2004). The complete or incomplete genomic sequences of 10 members of the Aquificales (belonging to the three known families) are currently available through National Center for Biotechnology Information (Reysenbach et al., 2009). Two genome shotgun sequencing projects are also usable. These genomic sequences will probably give the opportunity to address the problem of evolution of these organisms. The Aquificales are the bacteria known to grow at the highest temperatures (with the Thermotogales). Indeed, they are thermophilic or hyperthermophilic describing an optimal growth between 60 and 90 C. Most of them are gram negative, nonsporulating, motile bacteria. They grow usually at neutral or slightly acidic pH. Aquificales are mostly metabolically versatile chemolithoautotrophs using the reductive tricarboxylic acid (rTCA) cycle Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 129

for CO2 fixation (Hu¨gler, Huber, Molyneaux, Vetriani, & Sievert, 2007). In- deed, at high temperatures, microorganisms use CO2 assimilation pathways other than the Calvin–Benson–Bassham cycle which is well known from cyanobacteria, plants, and a variety of proteobacteria (Hu¨gler et al., 2007). The rTCA cycle has been proposed as a likely candidate for the earliest autotrophic pathway that evolved on Earth (Smith & Morowitz, 2004). Some species are able to grow chemoorganoheterotrophically on formamide, formate, or acetate. Aquificales oxidize molecular hydrogen, elemental sulfur, or thiosulfate as energy substrates (sulfide or ferrous iron can also be used). Members of the two families Aquificaceae and Hydrogenothermaceae are aerobic (microaerophilic), while those affiliated to the third family Desulfurobacteriaceae are strictly anaerobes using nitrate, elemental sulfur, thiosulfate, or sulfite as electron acceptors (Bonch-Osmolovskaya, 2008; Miroshnichenko & Bonch- Osmolovskaya, 2006; Reysenbach et al., 2005)(Table 4.1).

1.2. Aquifex aeolicus A. aeolicus was isolated by Huber and Stetter from a shallow submarine hydrothermal system at Vulcano in Italy (Huber & Stetter, 2001a, 2001b). As mentioned above, A. aeolicus is so far the best-known bacterium belonging to Aquificales, probably because it was among the first to be characterized and thefirstwhosegenomewascompletelysequenced(Deckertetal.,1998).

1.2.1 Genome features A. aeolicus was the first hyperthermophilic bacterium to have its genome sequence completely determined (Deckert et al., 1998; Swanson, 2001). This genome, which is only one-third the size of the Escherichia coli genome, has a length of 1.55 million bp (Deckert et al., 1998). One thousand five hundred and twelve open-reading frames were detected. Another striking feature is the organizational relationship of the genes relative to one another. Most genes appear to be expressed in polycistronic operons, with an unexpected composition, and many convergently transcribed overlap slightly. An extrachromosomal element containing 39,456 bp is present at twice the copy number of the chromosome.

1.2.2 Morphology and motility Cells of A. aeolicus are gram negative rods with rounded ends. They are 2–6 mm long and 0.4–0.5 in diameter. Their cell envelope is thus composed of an outer and an inner membrane (Fig. 4.2). The complex cell wall consists at least of a peptidoglycan layer, which contains diaminopimelic acid typical Table 4.1 Some physiological features of marine species within the order Aquificales T (C) pH Electron Electron (min–opt–max) range donor acceptor Products References Family Aquificaceae 0 2 0 2 Aquifex aeolicus 58–95 5.5–8 H2,S ,S2O3 O2,S H2O, SO4 ,H2S Deckert et al. (1998), Huber and Eder (2006), Guiral, Tron, et al. (2005) 0 2 2 Aquifex pyrophilus 67–85–95 5.4– H2,S ,S2O3 O2, H2O, SO4 ,N2 Huber et al. (1992) 7.5 NO3 0 2 Hydrogenivirga 55–75–77.5 5–7 H2,S O2, H2O, SO4 ,N2O Nakagawa et al. (2004) caldilitoris NO3 Family Hydrogenothermaceae

Hydrogenothermus 45–65–80 5–7 H2 O2 H2O Stohr, Waberski, Vo¨lker, marinus Tindall, and Thomm (2001) 0 2 2 Persephonella 55–73–80 4.7– H2,S ,S2O3 O2, H2O, SO4 ,N2,H2S Go¨tz et al. (2002) marina 7.5 NO3 , S0 Family Desulfurobacteriaceae þ Thermovibrio ruber 50–75–80 5–6.5 H2 NO3 , NH4 ,H2S Huber, Diller, Horn, and S0 Rachel (2002) 0 Balnearium 45-70-80 5–7 H2 S H2S Takai, Nakagawa, Sako, and lithotrophicum Horikoshi (2003)

Based on Bonch-Osmolovskaya (2008). Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 131

Figure 4.2 Transmission electron micrographs of A. aeolicus cultured with thiosulfate, hydrogen, and oxygen. Arrows indicate unidentified structures resembling stacks of membrane. Cells were prepared as described in Guiral, Tron, et al. (2005).

for gram negative bacteria (Huber et al., 1998) and the outer membrane. A well-ordered regular surface layer, composed of hexagonal protein complexes, was identified in A. pyrophilus (Huber et al., 1992). The composition of the A. aeolicus lipopolysaccharide (LPS) associated with the outer leaflet of the outer membrane has been determined and is different from the one of A. pyrophilus. However, lipid A, anchoring the LPS molecule to the outer membrane and found to be structurally novel, is identical for both bacteria (Mamat et al., 2009; Plo¨tz, Lindner, Stetter, & Holst, 2000). The protein Aq_1862 from A. aeolicus was identified as the major porin of the outer membrane (Wedemeyer, Peng, Michel, & Hartung, 2007). Unidentified structures resembling stacks of membrane are clearly visible in the cytoplasmic compartments (Fig. 4.2). Such structures of unknown composition and function were reported also for other Aquificales and might be internal membranes used to align enzymes for complex metabolic reaction (Aguiar, Beveridge, & Reysenbach, 2004). In line with the presence of more than 25 genes coding for proteins involved in biosynthesis and structure of flagelles, A. aeolicus cells are highly motile because they possess monopolar polytrichous flagella (Behammer et al., 1995; Deckert et al., 1998). Recently, it was shown that the motility of A. aeolicus in a liquid medium depends on the sulfur source supplied (the soluble thiosulfate or the insoluble elemental sulfur). In the presence of elemental sulfur, Aquifex is able to adhere to the substrate and this sulfur-dependent bacterial adherence seems to be linked to an absence of flagellin (Giuliani, Jourlin-Castelli, Leroy, Hachani, & Giudici-Orticoni, 2010). 132 Marianne Guiral et al.

1.2.3 Adaptation at high temperatures The highest temperatures for growth is found among archaeal microorganisms, with Geogemma barossii (also known as strain 121) which can develop at 121 C(Kashefi & Lovley, 2003)orPyrolobus fumarii growing at 113 C (Blo¨chl et al., 1997). Life at high temperatures needs an adaptation of microorganisms to these drastic conditions. Some of the cell components, that are proteins, nucleic acids, or lipids, can possess particular properties compared to their mesophilic counterparts. In A. aeolicus, only a few specific indications of thermophily are apparent from the genome (Deckert et al., 1998). The rRNA operons of this bacterium have a relatively high content of GþC (65%), a characteristic of thermophilic bacterial rRNA. The thermostability of DNA is probably increased by the reverse gyrase, a DNA topoisomerase present only in hyperthermophilic organisms and which is encoded by two genes in the A. aeolicus genome. This enzyme has the unique property of introducing positive superturns into a covalently closed, circular DNA in the presence of ATP that could prevent excess local un- winding of the double helix at high temperature (Forterre, 2002). In general, primary sequences or three-dimensional structures of proteins from thermophilic or hyperthermophilic bacteria do not drastically differ from those of mesophiles (Matsui & Harata, 2007). However, these proteins usually exhibit an extraordinary stability; the three-dimensional structure of numerous proteins from A. aeolicus has thus been solved. Several factors responsible for the extreme thermostability of proteins have been proposed including an increase in the number of ion pairs and hydrogen bonds, core hydrophobicity, and packing density, as well as an entropic effect due to relatively shorter surface loops and peptide chains (Ferrera & Reysenbach, 2007; Vieille & Zeikus, 2001). The soluble monoheme cytochrome c555 was found to be hyperstable. An extra helix should mainly contribute to this high stability and is presumed to be a novel strategy of cytochromes c for adaptation to a hyperthermophilic environment (Obuchi et al., 2009). Proteins from Aquifex can also be stabilized by the presence of disulfide bonds. It is the case for the serine protease of A. pyrophilus which contains eight cysteines (Choi, Bang, Kim, & Yu, 1999), for several ferredoxins (Infossi P. & Giudici-Orticoni M.T., unpublished results; Meyer et al., 2002) and for Aq_1599 (renamed RhdB2) identified as a rhodanese (Giuliani et al., 2010). Protein oligomerization might also be a strategy to cope with elevated temperatures (Vieille & Zeikus, 2001). As subunits’ association provides extra stabilization, some thermophilic proteins have a higher degree of oligomerization compared to their homologs in organisms Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 133 growing at lower temperatures. In A. aeolicus,acytoplasmicrhodanese enzyme (Aq_477 or SbdP) involved in sulfur transfer exists in equilibrium between monomers, dimers, and tetramers. The tetrameric form has been demonstrated to be crucial for thermostability as well as for enzyme activity (Giuliani et al., 2007). The membrane-bound sulfide-quinone reductase, described to be a dimeric protein, was proposed to be trimeric in A. aeolicus (Marcia, Ermler, Peng, & Michel, 2009; Prunetti et al., 2010). As for other hyperthermophiles, it seems that there is not one single dominating factor but more a combination of many factors, each contributing to various extents for stabilization according to the protein. Regarding the membranes, modifications of the constituting lipids allow a greater stability for the thermophiles. One important feature is the nature of the binding between the glycerol and the fatty acid of the phospholipid. The more stable binding (ether) is found in the phospholipids of the hyperthermophilic bacteria A. aeolicus and Thermotoga maritima as well as in the archaeal lipids, while the ester binding is typical of the other bacteria and eucaryotes. The lipids of Aquifex are mainly composed of alkyl glycerol di- and monoethers (Ferrera & Reysenbach, 2007; Huber & Stetter, 2001a; Jahnke et al., 2001).

1.2.4 Physiological characteristics and metabolic properties A. aeolicus (as A. pyrophilus) grows up to 95 C, the highest growth temperature observed within bacteria (Huber & Stetter, 2001a; Stetter, 2006) (Table 4.1). The salt concentration optimally required is 3% (w/v) NaCl consistent with the fact that it is a marine bacterium. The preferred pH for growth comprises between 6.5 and 7.0. As an autotroph, A. aeolicus assimilates CO2 from the environment via the rTCA cycle (Hu¨gler et al., 2007). This cycle is vital as it provides the substrates for many biosynthetic pathways. Three molecules of CO2 are fixed forming acetyl coenzyme A and subsequently pyruvate, precursor of all other central metabolites. The central role of this pathway is emphasized by the duplication of many of its constituent genes in this bacterium (Deckert et al., 1998). For example, A. aeolicus has two sets of gene clusters that encode putative multisubunits enzyme pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (Ikeda et al., 2006). The bacterium must synthesize pentose and hexose monosaccharides from products of the rTCA cycle (Deckert et al., 1998). A. aeolicus genome contains genes encoding proteins from metabolic pathways as glycolysis, gluconeogenesis, pentose-phosphate, and glycogen synthesis. 134 Marianne Guiral et al.

A. aeolicus grows chemolithotrophically in the presence of hydrogen, oxygen, and sulfur compounds (thiosulfate or elemental sulfur). Aquifex means “water-maker,” and as in most Aquificales, this bacterium oxidizes hydrogen with oxygen to produce water according to the “Knallgas” reaction: 2H2 þO2 !2H2O. It is described as a microaerophilic microorganism (Deckert et al., 1998); however, its actual oxygen requirement is unknown. In the absence of hydrogen, the majority of Aquificales gain energy from thiosulfate or elemental sulfur as sole electron donors which are oxidized to sulfuric acid (in the presence of oxygen). A. aeolicus,asHydrogenothermus marinus and Hydrogenobaculum acidophilum, requires thiosulfate or elemental sulfur in addition to hydrogen and oxygen for growth (Eder & Huber, 2002; Huber & Stetter, 2001b). Aquifex species, like Thermocrinis, can also produce hydrogen sulfide when grown with hydrogen, oxygen, and elemental sulfur (Guiral, Tron, et al., 2005). Unlike A. pyrophilus, A. aeolicus does not perform nitrate respiration and cannot grow anaerobically on nitrogen. A. aeolicus does not grow on organic substrates including sugars, amino acids, yeast, or meat extracts (Deckert et al., 1998)(Table 4.1).

2. HYDROGENASES AND HYDROGEN METABOLISM IN AQUIFEX AEOLICUS

Molecular hydrogen is an obligate energy substrate for growth for A. aeolicus. Consistent with this requirement, this bacterium possesses various hydrogenases (Fig. 4.3) playing a key role in hydrogen utilization. Hydrogenases, isolated from prokaryotes and eukaryotes, catalyze either the hydrogen uptake or the hydrogen evolution depending on the metabolic requirements of the parent organism, according to the simple redox reaction þ H2 $2H þ2e . Hydrogenases are multisubunit metalloenzymes containing iron–sulfur clusters and a dinuclear metallic center which is a Ni and a Fe in the [NiFe] hydrogenases and two Fe in the [FeFe] hydrogenases (Vignais, Billoud, & Meyer, 2001). A. aeolicus houses three distinct [NiFe] hydrogenases, referred to hydrogenases I, II, and III in keeping with the annotated names mbhSL1, mbhSL2, and mbhSL3 (Brugna-Guiral et al., 2003; Deckert et al., 1998). These hydrogenases are expressed under standard growth conditions (in the presence of hydrogen, oxygen, and thiosulfate). Two are membrane bound in the periplasm and involved in energy generation, and one is soluble in the cytoplasm and likely involved in the CO2 fixation (Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral, Aubert, & Giudici- Orticoni, 2005). Structural genes of both membrane-bound enzymes are Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 135

Periplasm

Quinone o H

CH3 o CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

Cytoplasm

Figure 4.3 Representation of an assembly of A. aeolicus hydrogenase I large and small subunits (depicted in red and black, respectively) and A. aeolicus b-type cytochrome (depicted in gray) generated with The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3, Schrödinger, LLC. The model was constructed by using Ralstonia eutropha membrane-bound hydrogenase as a template (PDB entry: 3RGW). The b-type cytochrome of A. aeolicus linked to hydrogenase by a transmembrane helix was modeled on the b-type cytochrome of formate dehydrogenase N from E. coli (PDB entry: 1KQF).

included in operons together with accessory genes for maturation and insertion of metals and ligands, whereas in the operon coding for the soluble hydrogenase III, only genes coding for the two structural subunits are found (Fig. 4.4). The operon encoding A. aeolicus hydrogenase I contains a gene encoding a transmembrane b-type cytochrome (called 136 Marianne Guiral et al.

Hydrogenase I

mbhS1 mbhL1 hoxZ hupEhupD XX hypB hypF

Hydrogenase II

mbhL2 hdrD aq_963 mbhS2

Hydrogenase III

mbhS3 mbhL3

Figure 4.4 Organization of the hydrogenases genes operons in A. aeolicus. mbhL and mbhS encode large and small hydrogenase subunits, respectively. For hydrogenase I, hoxZ gene encodes cytochrome bI, the ones annotated X correspond to aq_668 and aq_669 encoding putative proteins and other genes encode proteins involved in hydrogenase maturation. For hydrogenase II, aq_963 encodes cytochrome bII and hdrD encodes an iron–sulfur protein with homology to a subunit of heterodisulfide reductase. cytochrome bI) in the typical order of genes (small subunit, large subunit, cytochrome). Hydrogenase II is encoded by an operon describing an unusual organization. The two genes for the small and large subunits are separated by two additional genes which likely code for an uncharacterized iron–sulfur protein and a membrane-integral b-type cytochrome called cytochrome bII (Baymann, Lebrun, et al., 2003; Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral, Aubert, et al., 2005). This gene organization has also been described in the mesophilic purple sulfur bacteria Thiocapsa roseopersicina (Pala´gyi-Me´sza´ros et al., 2009; Rakhely, Colbeau, Garin, Vignais, & Kovacs, 1998)inAllochromatium vinosum (Dahl et al., 1999), and in the hyperthermophilic sulfur-dependent archaeon Acidianus ambivalens (Laska, Lottspeich, & Kletzin, 2003). The diheme cytochrome bI acts as membrane anchor for hydrogenase. Cytochrome bII most probably plays an analogous role although being not evolutionary linked (Baymann, Lebrun, et al., 2003). Phylogenetic analysis indicates that hydrogenase I and hydrogenase II clearly fall into group 1 of the [NiFe] hydrogenases as defined by Vignais et al. (2001). This group contains dimeric membrane-bound enzymes transferring electrons from hydrogen to cytochrome b with transmembrane Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 137 proton translocation. In contrast, the phylogenetic position of hydrogenase III is more ambiguous as the phylogram of the small subunit clusters with sensory and cyanobacterial uptake hydrogenase (group 3) but the large subunit is separated from all major groups of [NiFe] hydrogenases. Two of the three A. aeolicus hydrogenases, that is, the membrane-bound hydrogenase I and the soluble hydrogenase III, were purified to homogeneity and characterized, whereas hydrogenase II was never isolated but identified in a complex (see Section 4.1.1)(Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral, Aubert, et al., 2005; Guiral, Tron, et al., 2005). The understanding of the structural features that drive the enzymatic function under extreme T, but also the ability to obtain biocatalysts for biotechnological devices, has encouraged increasing research in hydrogenase field during the last years. Indeed, hydrogenases are considered since more than 10 years as potential candidates as biocatalysts for hydrogen production (Friedrich, Fritsch, & Lenz, 2011)orinH2/O2 biofuel cells (Lojou, 2011). On one hand, photosynthetic production of hydrogen only from water and sun light is regarded as a friendly alternative to fossil fuel use. On the other hand, H2/O2 fuel cells using biocatalysts instead of noble metal catalysts are another way to produce greenhouse gas-free electricity. The major drawback that has slowed down the applications, but has also increased the research, relies on the strong inhibition of most hydrogenases to oxygen (Vincent et al., 2005). This characteristic aprioriprecluded the use of these enzymes in photosynthetic systems for hydrogen production, or as a bioanode in a biofuel cell with oxygen as the oxidant in the cathodic compartment. With this challenging bottle necks in mind, the characterization and then resistance properties of hydrogenases I and III against temperature, but also inhibitors such as oxygen and carbon monoxide, have been extensively studied in the last few years in the double objective to understand the molecular basis of their resistances and to evaluate their potentialities as biocatalysts.

2.1. Possible involvement of hydrogenase III in carbon assimilation pathway Hydrogenase III was purified from soluble extract and first characterized by SDS-PAGE (Brugna-Guiral et al., 2003). Two bands at 30 and 50 kDa were assigned to the small and large subunits, respectively. The structure of hydrogenase III is still unsolved. But by analogy to the “standard” hydrogenases (the most studied are the oxygen-sensitive [NiFe] hydrogenases from Desulfovibrio or Allochromatium species (Dementin et al., 2011; Lamle, Albracht, & Armstrong, 2005), the small subunit harbors FeS clusters, 138 Marianne Guiral et al. acting as a conductive line to drive the electron from the active site to the surface of the enzyme, while the [NiFe] active center is buried inside the large subunit (Fig. 4.3). It was shown by EPR that the [NiFe] center, the distal, and intermediary FeS clusters were similar to that of other bacterial [NiFe] hydrogenases. By contrast, two adjacent cysteines were identified near the proximal FeS cluster. Exact role of this structural feature has not been elucidated, yet. The enzymatic activity of hydrogenase III was followed using spectrophotometry. Low redox potential mediators, such as methyl viologen, were found to be suitable electron acceptor/donor for hydrogen oxidation and proton reduction by hydrogenase III. This is in accordance with the finding that hydrogenase III can reduce two low-potential ferredoxins from A. aeolicus (Infossi & Giudici-Orticoni, unpublished results). The redox potentials of these ferredoxins were determined by electrochemistry to be in the range 440/460 mV suggesting that the potentials of the clusters in hydrogenase III might also be quite negative. Spectrophotometric measurements with methyl viologen as an electron acceptor yielded an activity of 100 U mg 1 at 80 C for hydrogen oxidation. Hydrogenase III was active in a large range of temperature between 20 and 90 C. It was shown to be thermostable since no loss in activity can be observed during 4 h at 80 C. Electrochemistry was handled to measure the activity of hydrogenase III. By this method, the enzyme was adsorbed on the surface of a graphite electrode which played the role of the electron acceptor/ donor. No redox mediator was added since the enzyme could exchange electrons directly with the electrode. The enzymatic activity of the enzyme under either hydrogen or N2 was measured as a current, whose intensity is a measure of the enzymatic efficiency. Electrochemical measurements confirmed the ability of hydrogenase III to equally oxidize hydrogen or þ reduce H on a large range of temperature. Hydrogenase III was found to exhibit CO and oxygen resistances. Indeed, CO addition had no effect on the electrochemical signal for hydrogen oxidation by adsorbed hydrogenase III onto a graphite electrode (Lojou, Giudici-Orticoni, & Bianco, 2005). In strong contrast with the standard oxygen-sensitive hydrogenases, hydrogenase III was also found to be active at least during 2 h of exposure to 20% oxygen at 0 C. EPR studies revealed that oxidized hydrogenase III was entirely in a form known as Ni-B, which corresponds to a Ni state quickly activated upon reduction, a feature shared by other hydrogenases which are oxygen resistant, such as hydrogenase from Ralstonia eutropha (Cracknell, Wait, Lenz, Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 139

Friedrich, & Armstrong, 2009). Conversely, oxygen-sensitive hydrogenases exist under both Ni-B and Ni-A states, the latter being hardly reactivated. The molecular basis for oxygen resistance is still under investigation. However, phylogenetic analysis has allowed putting forward one potential explanation. Hydrogenase III clusters in the phylogram together with sensory hydrogenases (although hydrogenase III cannot be considered as a hydrogen sensor due to its abundance in the cell and activity, see below). These hydrogenases have been identified in several other microorganisms (R. eutropha, Rhodobacter capsulatus, etc.) and are proved to be oxygen insen- sitive compared to the highly active but oxygen-inhibited hydrogenases from the Desulfovibrio species. It was demonstrated that oxygen resistance could be understood in these hydrogen sensors by taking into account the presence of two bulky amino acid residues that narrow the end of the hydrophobic channel for hydrogen access to the [NiFe] active site (Buhrke, Lenz, Krauß, & Friedrich, 2005). Identically, these two amino acids (isoleucine and phenyl alanine instead of the highly conserved leucine and valine in the oxygen- sensitive hydrogenases) are present in hydrogenase III. The soluble cytoplasmic hydrogenase III was proposed to be probably involved in the CO2 fixation pathway in A. aeolicus (Brugna-Guiral et al., 2003; Infossi & Giudici-Orticoni, unpublished results) which operates via the rTCA cycle in this bacterium (Hu¨gler et al., 2007). As this cycle is an endergonic pathway, the key enzyme of this cycle, that is, the pyruvate ferredoxine oxidoreductase, requires a highly pool of reduced low-potential ferredoxins to function in reverse (i.e., to produce pyruvate from CO2 and acetyl CoA). The enzyme that possibly transfers electrons in vivo to ferredoxin is the hydrogenase III as it was shown that it is able to reduce in vitro, in the presence of hydrogen, low-potential artificial electron acceptors (Brugna-Guiral et al., 2003) as well as two [4Fe–4S] low-potential ferredoxins purified from A. aeolicus (Infossi P. & Giudici-Orticoni M.T., unpublished results). The steady-state rate of ferredoxins reduction follows Michaelis–Menten kinetics, and the catalytic constant and Km values are almost identical for both proteins (around 30 s 1 and <4 mM, respectively). These two highly similar ferredoxins, referred as Fd6 and Fd7, are encoded by tandemly arranged genes (fdx6 and fdx7) and are considered to serve as low-potential electron donors (440 and 460 mV at pH 7) for the pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (Infossi P. & Giudici-Orticoni M.T., unpublished results; Ikeda et al., 2005). Even if these two small proteins are reduced by hydrogenase III in vitro, whether they are both involved in the reductive decarboxilation in vivo is not yet known. 140 Marianne Guiral et al.

2.2. Focus on the super-resistant hydrogenase I 2.2.1 Biochemical and physicochemical characterization Since its identification and purification from the membrane extracts, hydrogenase I has been the subject of increasing studies, especially in the past few years (Ciaccafava, De Poulpiquet, et al., 2012; Ciaccafava, Infossi, et al., 2012; Lojou, 2011; Pandelia, Infossi, Stein, Giudici-Orticoni, & Lubitz, 2011; Pandelia et al., 2010). This is clearly because of its outstanding properties that enable both to improve the understanding of oxygen sensitivity/resistance of hydrogenases and to consider highly interesting biotechnological applications. Huge work has been done in order to compare and try to mimic by genetic engineering, the physicochemical properties of A. aeolicus hydrogenase I, and others presenting the same phenotypes, that is, R. eutropha or E. coli,and hydrogenases from anaerobic bacteria, such as Desulfovibrio or Allochromatium, that are highly oxygen sensitive. The crystal structure of hydrogenase I is not resolved yet, but high homology with hydrogenase from Desulfovibrio gigas was found (Brugna-Guiral et al., 2003). Recently, structures at resolution between 1.18 and 1.5 A˚ of two similar oxygen-resistant hydrogenases have been published: membrane-bound hydrogenases from the aerobic bacteria R. eutropha,andHydrogenovibrio marinus (Fritsch et al., 2011; Shomura, Yoon, Nishihara, & Higuchi, 2011). From these structures and previous biochemical and physicochemical works done on A. aeolicus hydrogenase I (Brugna-Guiral et al., 2003), key features concerning hydrogenase I can be drawn. Hydrogenase I is a heterodimer. The small subunit contains three FeS clusters, and the large subunit harbors the [NiFe] active center where hydrogen is cleaved into protons and electrons. The distal [4Fe–4S] and intermediary [3Fe–4S] clusters are similar to those found in the “standard” hydrogenases. Their redox potentials have been determined using EPR and found to be 78 and þ68 mV (Pandelia, Nitschke, et al., 2011). It is noteworthy that these potential values are 200 mV higher than the potentials measured for the FeS clusters in oxygen-sensitive hydrogenases. The proximal FeS cluster, however, was proved to present a unique [4Fe–3S] structure coordinated by six cysteines residues, contrary to the [4Fe–4S] cubane coordinated by four cysteines found in standard hydrogenases. As developed below, this uncommon structure explained both the redox behavior of the distal cluster and oxygen resistance displayed by hydrogenase I. Spectrophotometric activity measurements put forward that higher potential redox mediators than for A. aeolicus hydrogenase III or for standard Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 141 hydrogenases were efficient for hydrogen oxidation. The same result was described for hydrogen oxidation by the hyperthermophilic Hydrogenimonas thermophila (Nishimura, Kitano, Inoue, Nomura, & Sako, 2010). Accord- ingly, enzymatic activity measured by electrochemistry using hydrogenase I adsorbed onto an electrode clearly underlined that methylene blue (redox potential at þ11 mV) was a much more efficient redox mediator than methyl viologen (redox potential at 446 mV) for hydrogen oxidation (Luo, Brugna, Tron-Infossi, Giudici-Orticoni, & Lojou, 2009). This result agrees with the finding that the clusters in hydrogenase I present higher redox potentials than those in standard hydrogenases. Actually, when running electrochemical experiments with directly connected hydrogenases on an electrode (measurement with no redox mediators), hydrogen oxidation proceeded at a potential around 100 mV higher than in standard hydrogenases, a feature also shared by the membrane-bound hydrogenase from R. eutropha (Cracknell et al., 2009). As a consequence, hydrogenase I was shown to be a poor proton reducer with a large bias toward hydrogen oxidation (Brugna-Guiral et al., 2003; Luo et al., 2009). HydrogenaseIwasshowntobeactiveinalargerangeoftemperature from 20 to 90 C, with an optimum around 85 C. Furthermore, it was demonstrated by electrochemistry to be highly thermostable, being active during several hours with no loss of activity, and bearing temperature stresses such as temperature sharp repetitive variations from 20 to 75 C (Luo et al., 2009). As described for hydrogenase III, EPR studies revealed the presence of Ni-B state only in the as-prep hydrogenase I, suggesting by comparison with hydrogenase III and the membrane-bound hydrogenase from R. eutropha, that hydrogenase I can present oxygen resistance. Actually, electrochemistry experiments clearly demonstrated that hydrogenase I was oxygen and CO resistant, in marked contrast with the standard hydrogenases for which oxygen and CO are competitive inhibitors (Fig. 4.5). Kinetics data of the reaction of hydrogenase I with oxygen and CO revealed that both gases reached the [NiFe] active site. But in the case of oxygen, the Ni-B state reactivated much more quickly than in standard hydrogenases. In the case of CO, a very weak Ni–CO bond was formed. Contrary to hydrogenase III, these resistances cannot be explained by a narrow channel for diffusion of gases, since the highly conserved leucine and valine residues are found in hydrogenase I. It is neither due to additional diatomic ligands as on the sol- þ uble NAD -reducing hydrogenase from R. eutropha (Pandelia et al., 2010). Oxygen and CO resistance displayed by hydrogenase I is more probably 142 Marianne Guiral et al.

A. aeolicus 380 hydrogenase I 290 +O2

–2 240 190

H2 CO 100 Current m Acm 90

-40 -0.45 -0.25 -0.05 +0.15 -0.60 -0.40 -0.20 0 +0.20 D. f 100 70 hydrogenase +O2 –2 60 40

H2 CO 20 10 Current m Acm

-20 -20 -0.60 -0.40 -0.20 0 -0.60 -0.40 -0.20 0 +0.20 Potential V versus NHE Potential V versus NHE

Figure 4.5 Resistance of A. aeolicus hydrogenase I toward O2 and CO. The evolution of the enzymatic current for H2 oxidation before and after addition of either CO or O2 clearly put forward the inhibition of the mesophilic [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio fructosovorans, while A. aeolicus hydrogenase I remains active. H2 enzymatic oxidation is followed using electrochemistry with hydrogenases immobilized onto a pyrolytic graphite electrode. The current–potential curves are recorded under H2 at 60 C for A. aeolicus hydrogenase I and 25 C for Desulfovibrio fructosovorans hydrogenase. related to the uncommon structure of the proximal [4Fe–3S] cluster. Due to a distorted conformation, this cluster was shown to present one more high potential redox state (þ232 mV in hydrogenase I) than the classical [4Fe–4S] clusters, which can be the key point in order to avoid the formation of Ni-A state (Pandelia, Nitschke, et al., 2011).

2.2.2 Hydrogen electroenzymatic oxidation in a physiological like environment Encouraged by the outstanding properties of hydrogenase I, further work has been performed in order to understand and control the enzymatic pathway with the enzyme placed in strained conditions, close to physiological environment. These studies furthermore aim to improve the efficiency of the enzyme when immobilized onto an electrode, which is a key step for developing biotechnological devices. Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 143

The early purification of hydrogenase I allowed the identification in the membrane fraction of the complex hydrogenase I–cytochrome bI. Three bands were revealed by SDS-PAGE at 70, 40, and 25 kDa, characteristic of the two subunits of hydrogenase I and cytochrome bI, respectively (Guiral et al., 2003). The complex was active toward hydrogen oxidation mediated by methylene blue, and displayed a high thermal stability, with a loss of only 15% of activity after 2 h at 80 C. These results already suggested that hydrogenase I could be more efficient for hydrogen oxidation when involved in the physiological complex. Cytochrome bI is inserted in the cell membrane. It carries the quinone reduction site and serves as an anchor for hydrogenase I. The components of the whole physiological complex were thus studied with the final objective of reconstitution of the complex in liposomes. The redox potentials of the diheme cytochrome bI were determined by electrochemistry, spectrophotometric titration, and EPR (Infossi et al., 2010). Two redox potentials, respectively, at 110 and 20 mV were determined by electrochemistry for the purified cytochrome bI. Noteworthy, redox titration of the immobilized cytochrome bI from R. eutropha showed a redox potential, respectively, around 90 mV for cytochrome bI or hydrogenase I–cytochrome bI (Sezer et al., 2011). From spectrophotometric titration realized on the complex hydrogenase I–cytochrome bI, two redox species were obtained with redox potentials of 60 and þ130 mV. Discrepancies in the results might result from the different environments of the hemes when immobilized on the electrode. A model of cytochrome bI was constructed that showed that the quinone site is located close to the heme near the cytoplasmic side, while the heme located near the periplasmic surface binds hydrogenase I, most probably through the distal FeS cluster. Quinone from A. aeolicus was purified and analyzed by NMR and mass spectrometry (Infossi et al., 2010). Its redox potential at pH 7 and 25 C was determined as 9 mV, not very far from the value for the demethylmenaquinone from Haemophilus parainfluenza (Holla¨nder, 1976). Accordingly, complete assignment of the experimental data concluded that the quinone from A. aeolicus was a demethylmenaquinone (DMK7). Both the nature and the redox potential of this quinone were discussed to be in agreement with the phylogenetic position of A. aeolicus and its microaerophilic character. The redox potential of the A. aeolicus DMK7 is lower than the one of ubiquinones predominantly expressed in facultative or obligate aerobic organisms but more positive than the one of classical menaquinones (Infossi et al., 2010; Schoepp-Cothenet et al., 2009). 144 Marianne Guiral et al.

Proteoliposomes were reconstituted with A. aeolicus quinone and hydrogenase I–cytochrome bI complex (Infossi et al., 2010). The efficient orientation of the complex into the vesicles was demonstrated using electronic microscopy and SPR after antibodies labeling. The proteoliposomes were demonstrated by native blue gels and spectrophotometry to be three times more active than the free complex. Moreover, it was demonstrated that quinone stabilized the complex. Mediated hydrogen oxidation via hydrogenase I–cytochrome bI complex inserted into liposomes was then followed by electrochemistry using a thin layer configuration (Dos Santos et al., 2003; Lojou & Bianco, 2004). The second-order rate constants were calculated to be 3 and 15105 M 1 s 1, respectively, for the free complex or the proteoliposomes (Fig. 4.6). The difference in the rate constants was proposed to reflect the higher stability of hydrogenase I–cytochrome bI complex inserted into the liposomes.

A. aeolicus quinone Q A. aeolicus hydrogenase I–cytb

O H

CH Liposome 3 ++

O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

Colloidal gold Antirabbit lgG 14 H2 oxidation 10

6 Anti-hydrogenase

A) ( m

I antibody Proteoliposome 2

Q -2 -350 -150 50 250 E versus SHE / mV

Figure 4.6 Stabilization of A. aeolicus hydrogenase I in proteoliposomes. Proteoliposomes are built by insertion in liposomes of A. aeolicus demethylmenaquinone and the cytb–hydrogenase I complex. Presence of some cytb–hydrogenase I molecules inserted with hydrogenase I pointing at the exterior of the liposome, thus available for H2 oxidation, is observed after gold labeling by microscopy. Comparison of current– potential curves for H2 oxidation mediated by methyl viologen (fine curve in the E–i graph) using either proteoliposomes or cytb–hydrogenase I complex at the electrode clearly shows the better efficiency of the proteoliposomes. Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 145

2.2.3 The electrochemical interface: A friendly physiological like partner The orientation of the enzyme in proteoliposomes was a key step for an efficient catalytic activity. In this case, the reconstituted complex was very similar to the physiological membrane so that efficiency toward hydrogen was expected. Generally speaking, in an electron transfer chain where electrons are exchanged between two physiological partners, molecular recog- nition before electron transfer implies the formation of transitory complexes or at least a specific orientation of one partner toward the other. One way to explore and control the parameters that drive this enzyme orientation is to replace one partner by an electrode, which plays the role of the last electron acceptor/donor. The game will be to chemically modify the electrochemical interface so that it can mimic the physiological partner. Another advantage of such a procedure is to define a conductive support for stable and efficient enzyme immobilization, thus available for the design of a bioanode. As an example, it was accordingly demonstrated that the soluble [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio could be specifically orientated simply by modifying the electrochemical interface by positive charges, mimic of the highly basic cytochrome c3 physiological partner (Lojou et al., 2008; Ru¨diger et al., 2010). This specific orientation opened the route for efficient immobilization of hydrogenase, hence high-current densities for hydrogen oxidation. For hydrogen oxidation by A. aeolicus hydrogenase I, electrons are transferred from [NiFe] active site through the three FeS clusters, then exchanged with the diheme cytochrome bI, via the surface FeS cluster, called the distal cluster, and finally transferred to the quinone pool (Fig. 4.3). With the aim of an efficient electron transfer between hydrogenase I and an electrode interface, the electrode was thus modified so that it could fit the environment of the distal FeS cluster. Self-assembled monolayers on gold electrodes are commonly used for electrode modification due to the versatility of the thiol chains. Although the structure of hydrogenase I is unresolved, the similarity with the resolved structure from Hydrogenovibrio marinus and R. eutropha membrane-bound hydrogenases (Fritsch et al., 2011; Shomura et al., 2011) has allowed the construction of a model (Fig. 4.3). No charged amino acid residues can be found in the close vicinity of the FeS distal cluster, precluding a specific orientation of hydrogenase I by electrostatic interaction (Ciaccafava et al., 2011). Accordingly, amino- or carboxylic- terminated alkylthiol layers on gold electrodes, that is, positive or negative layer at pH 7, yielded multiple orientations of hydrogenase I on the electrode, hence multiple electron transfer rates. The nonspecific orientation of hydrogenase was clearly revealed by the occurrence of 146 Marianne Guiral et al. both a direct electron transfer process (with the hydrogenase molecules oriented with the distal FeS cluster close to the electrode) and a mediated electrode transfer process (with the hydrogenase oriented with the distal FeS cluster too far from the electrode so that direct electron transfer is limited by the tunnel distance). In order to mimic the membrane environment of hydrogenase I, the gold electrodes were then modified by CH3-terminated alkylthiol chain. Unexpectedly, it was demonstrated that hydrogenase I was oriented with the distal FeS cluster opposite to the hydrophobic electrochemical interface (Ciaccafava, De Poulpiquet, et al., 2012; Ciaccafava, Infossi, et al., 2012). Actually, it was shown by mass spectrometry that hydrogenase I purified from the membrane fraction with the aid of detergent carries the transmembrane helix that serves as an anchor inthemembrane(Luo et al., 2009). This helix is highly hydrophobic, composed of 45 amino acid residues, and located less than 15 A˚ from the distal FeS cluster. It was also underlined using thin layer chromatography that detergent remains around this transmembrane helix (Ciaccafava, De Poulpiquet, et al., 2012; Ciaccafava, Infossi, et al., 2012). As a consequence, it was proposed that the domain around the FeS distal cluster became hydrophilic and had no affinity for the hydrophobic electrode (Fig. 4.7).

2.2.4 Future use of A. aeolicus hydrogenase I as biocatalysts in H2/O2 biofuel cells Although still debated, hydrogen offers tremendous potentials as a clean, renewable energy source, able to free us from the dependence on fossil fuel, because it delivers the highest energy output relative to the molecular weight and because its combustion only produces water and heat. One of the means for generating electricity is to develop H2/O2 fuel cells. An attractive route is to take profit of the biological conversion of hydrogen by hydrogenases which emerge as good candidates in replacement of chemical catalysts, thus designing a future H2/O2 biofuel cell (Fig. 4.8). The advantages of hydrogenases over chemical catalysts (often noble metals) are multiple. This in- cludes high efficiency, high specificity, and low overpotential for hydrogen oxidation, biodegradability and bioavailability, and operation at soft pH and temperature conditions. A. aeolicus hydrogenase I appears suitable for such a biotechnological device because it is able to oxidize hydrogen in the presence of oxygen, because it affords temperatures up to 90 C, and because it resists to CO, one major drawback of platinum catalysts. In view of designing such biofuel cells, one key step is to immobilize hydrogenase I on an electrode while preserving its stability and efficiency. Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 147

Redox mediator

Redox Redox mediator mediator – e – – e– e– e e

Hydrophilic or charged electrode Hydrophobic electrode

Mixed DET + MET process MET process for H2 oxidation for H2 oxidation Figure 4.7 The transmembrane helix surrounded by detergent controls the orientation of A. aeolicus hydrogenase I at gold-modified electrodes, thus the electron transfer process for H2 oxidation. At hydrophilic or charged interface, the absence of charged patch around the distal FeS cluster allows A. aeolicus hydrogenase I to adopt many orientations. Oxidation of H2 occurs via both direct and mediated electron transfer processes. At hydrophobic interface, due to the presence of the transmembrane helix close to the FeS distal cluster and surrounded with neutral detergent, A. aeolicus hydrogenase I flips upside down, so that H2 oxidation can only occur through a mediated pathway.

The researches just described before are essential for this achievement because they bring forward the parameters that unsure a good electrical connection of the enzyme on the electrode. In addition, power densities higher than 100 mWcm 2 must be reached in order to power small electrical devices. The power density is the result of the open-circuit voltage (theoret- ically, the OCV is 1.23 V for a H2/O2 fuel cell) by the current density. Given immobilization of an oxidase in the cathodic compartment, such as bilirubin oxidase, able to efficiently reduce oxygen, a large OCV can be reached close to 1 V (Wait, Parkin, Morley, dos Santos, & Armstrong, 2010). But compared to a chemical catalyst such as platinum, hydrogenases are huge molecular objects. Their immobilization on a surface is thus limited in enzyme surface concentration, thus in current densities to be delivered. The solution is to build electrode that displays large surface areas in which more than one layer of hydrogenase can be connected. With this objective in mind, a phenothiazine-based polymer on a graphite electrode was used as a host matrix for A. aeolicus hydrogenase I 148 Marianne Guiral et al.

Hydrogen oxidation Oxygen reduction

H2 O2

e– e– H+

Hydrogenase Bilirubin Oxidase Anode Cathode

H2O 1200 ) –2

800

400

Catalytic current ( m A cm PG 0 20 40 60 80 Temperature (°C)

Figure 4.8 A. aeolicus hydrogenase I is an attractive biocatalyst to replace platinum- based catalyst in green H2/O2 biofuel cell. Combining immobilization of A. aeolicus hydrogenase I at the anode and O2 reductase, such as bilirubin oxidase, at the cathode, the biofuel cell is expected to deliver hundreds of mWcm 2, with the advantages of using H2 from biomass, no membrane between the anodic and cathodic compartment, biodegradability, and bioavailability. Carbon nanotube networks on graphite electrode are excellent materials for future biofuel cell. They allow a great increase in current densities for H2 oxidation because they develop large conductive surface areas and offer soft host matrixes for A. aeolicus hydrogenase I.

(Ciaccafava, Infossi, Giudici-Orticoni, & Lojou, 2010). It was shown that the polymer was able to act as an efficient anchor platform for hydrogenase, thus allowing a highly stable and increased current density compared to a bare electrode. The intrinsic resistance properties of A. aeolicus hydrogenase I, including high activity at high temperature, resistance to temperature, and oxygen and CO stresses were conserved upon immobilization. The electropolymerized film was proposed to play a multifunctional role, including not only anchor for hydrogenase but also anchor for redox mediator and ROS scavenger. But the most promising mean to increase connected hydrogenase amount onto electrodes relies on hierarchical porous carbon Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 149 structures. This type of structure can be reached using carbon nanotubes that present high electrical conductivity, unique chemical and mechanical properties, and develop large surface areas. Furthermore, chemical functions can be generated on the surface of the carbon nanotubes, thus numerous anchoring sites available for hydrogenase immobilization. A. aeolicus hydrogenase I was immobilized onto carbon nanotube-modified graphite electrode and evaluated for hydrogen oxidation capability (Luo et al., 2009). The current density was demonstrated to be greatly enhanced, reaching a high value of 1mAcm 2, at least 7 times higher than at the bare electrode but also 20 times higher than the current density value obtained using the mesophilic hydrogenase from Desulfovibrio on the same carbon nanotube deposit (Fig. 4.8). Work is now in progress in order to design a complete biofuel cell with A. aeolicus hydrogenase I as the anode biocatalyst for hydrogen oxidation (Ciaccafava, De Poulpiquet, Techer, Giudici-Orticoni, Tingry, Innocent & Lojou, 2012).

2.3. The hydrogen–oxygen bioenergetic pathway As mentioned above, A. aeolicus is a “knallgas” bacterium and grows using hydrogen as electron donor and oxygen as electron acceptor, which is an uncommon and only scarcely studied metabolic pathway. Hydrogenase I, linked to the diheme cytochrome bI, belongs to group 1 of [NiFe] hydrogenases containing respiratory enzymes. This enzyme is likely involved in the oxygen reduction pathway in A. aeolicus. It has been proposed that the first step of this bioenergetic pathway consists of an electron uptake from hydrogen by hydrogenase I and subsequent reduction of the quinone pool via the cytochrome b subunit. Electrons from the quinone pool probably pass through the membrane-attached cytochrome bc1 complex toward a periplasmic cytochrome c and end up reducing molecular oxygen by an oxidase enzyme (Fig. 4.9A). A hydrogen-dependent reduction of exogenous cytochrome c was measured at 70 C with detergent-extract membranes of A. aeolicus grown in the presence of elemental sulfur as the sulfur source. This efficient cytochrome c reduction with hydrogen and the sensitivity of this reaction toward the inhibitor stigmatellin suggest that the bc1 complex as well as a hydrogenase participate in this electron transfer (Guiral et al., 2009). Protein components involved in the proposed energy pathway, that is, small and large subunits I of hydrogenase I (with its partner cytochrome b ), the bc1 complex, the m cytochrome c555 , and a cytochrome c oxidase, were all detected in the A. aeolicus membranes using a proteomic approach combining separation of proteins by blue-native electrophoresis, in-gel detection of enzyme activities, 150 Marianne Guiral et al.

H H+ A 2 Periplasm

ba bc 3 IM Q oxidase

Hydrogenase I O2 H2O

B Periplasm H2S S c

Sqr ba Quinol bc 3 IM Q Q oxidase ox

O2 O2 H O H2O 2 Figure 4.9 Models of electron transports in A. aeolicus membranes. Reaction scheme of electron transfer from molecular hydrogen to oxygen (Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral et al., 2009) (A) and from hydrogen sulfide to oxygen (Guiral et al., 2009; Nübel et al., 2000) (B) These schematic representations take no account of the stoichiometry of the various enzymes and complexes. Oxidase is for cytochrome c oxidase, Quinol ox for bd quinol oxidase, bc for bc1 complex, c for monoheme cytochrome c555, Q for quinone pool, S for elemental sulfur and IM for inner membrane. Arrows indicate the possible electron transfer.

and protein identification by mass spectrometry (Guiral et al., 2009). More- over, the bc1 complex and the cytochrome c oxidase interact to form a supercomplex in the membrane of A. aeolicus, implying that they are involved in the same electron transfer pathway (Gao et al., 2012; Guiral et al., 2009; Prunetti et al., 2010). The bc1 complex of A. aeolicus, reoxidizing quinone pool reduced by the cytochrome bI, is made of three subunits: the Rieske iron–sulfur protein, the monoheme cytochrome c1, and the transmembrane diheme cytochrome b, encoded by genes included in an operon (cyc, petA, petB). This membrane- attached complex was biochemically and biophysically characterized. In particular, the redox potentials and the spectral properties of the four redox centers were determined (Schu¨tz et al., 2003). This complex belongs to the group of low redox potentials Rieske/cytochrome b complexes (redox Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 151

potentials of heme bL,bH, and c1 are 190, 60, and þ160 mV, respectively) oxidizing menaquinone (DMK7 in A. aeolicus as mentioned above). However, some properties of this complex resemble those of proteobacterial or mitochondrial bc1 complexes (Schu¨tz et al., 2003). At the end of the pathway, the reduction of molecular oxygen to water is catalyzed by complicated membrane-bound multisubunits metalloenzymes called cytochrome c oxidases or quinol oxidases. The Aquifex genome sequence analysis revealed, in addition to genes for a bd quinol oxidase (CydA and CydB encoded by aq_1357 and aq_1358, respectively), a gene cluster containing genes encoding two putative cytochrome c oxidases, namely cytochrome c oxidase I (putatively encoded by coxA1, coxB, and coxC) and cytochrome c oxidase II (encoded by coxA2 and coxB2)(Prunetti, Brugna, Lebrun, Giudici-Orticoni, & Guiral, 2011). Based on sequence comparison, it was proposed that cytochrome c oxidase I belongs to type A heme–copper oxidases (or aa3-type) and has all the specific residues of the D- and K-proton channels, whereas cytochrome c oxidase II is a B-type enzyme (or ba3-type) with specific residues forming a K-channel homologue for proton translocation (Pereira, Santana, & Teixeira, 2001; Prunetti et al., 2011). The proteomics data suggested the presence in the membrane of only one, the cytochrome c oxidase II, of the two potentially present cytochrome c oxidases in the conditions used for the growth (i.e., hydrogen, elemental sulfur, and oxygen). Cytochrome c oxidase I was never detected. As A. aeolicus, numerous prokaryotes possess both aa3- and ba3-type oxidases (Brochier-Armanet, Talla, & Gribaldo, 2009; Ducluzeau, 2009; Prunetti et al., 2011). The production of the B-type oxidase in the A. aeolicus membrane is consistent with the very low oxygen concentration available for growth, at least at the end of the culture, in the medium (probably a few micrograms of molecular oxygen/L). Under low aeration conditions, it has been shown, in various Bacteria and Archaea, that the preferred oxygen reduction enzyme is the ba3-type oxidase considered to possess a higher affinity to oxygen that type A oxidases (Prunetti et al., 2011). This cytochrome c oxidase II was purified and spectroscopically characterized as a ba3 enzyme with heme b presenting some unusual spectral characteristics (Gao et al., 2012; Prunetti et al., 2010). EPR spectra showed peak at g¼3.00 and 3.4 arising from low spin heme b (Gao et al., 2012; Prunetti et al., 2010; Schu¨tz et al., 2003). This enzyme was first described as a two-subunit complex containing the small subunit II (CoxB2 of 16,700 Da) and the large subunit I (CoxA2 of 59,000 Da). The presence of an additional small subunit composed of 41 amino acids, 152 Marianne Guiral et al. called subunit IIa, was recently discovered (Gao et al., 2012; Prunetti et al., 2011). Prediction indicates that this small protein is a transmembrane helix, thus implying that this membrane-bound complex strongly structurally resembles that of the ba3 cytochrome c oxidase of the thermophilic bacterium Thermus thermophilus (Prunetti et al., 2011; Soulimane, Than, Dewor, Huber, & Buse, 2000). The enzymatic activity of this enzyme was determined at various temperatures in vitro. It is not active at room temperature as most enzymes from thermo/hyperthermophilic organisms (see paragraph below). Surprisingly, it is able to oxidize both reduced cytochrome c and ubiquinol when this latter is present in amounts exceeding the capacity of the cytochrome bc1 complex. There must be a compelling advantage for this cytochrome oxidase to use quinol, in particular, because the cytochrome bc1 complex and the cytochrome c oxidase are constituents of the same supercomplex (Gao et al., 2012; Prunetti et al., 2011). Two cytochromes are probable candidates for accepting electrons from the bc1 complex and transferring them to the terminal oxidase. These two highly homologous (85% identity) monoheme cytochromes c,a m s membrane-tethered c555 and a soluble cytochrome c555 , are present in the periplasm of the bacterium (Aubert et al., 2001; Baymann, Barlow, et al., 2003; Baymann et al., 2001; Obuchi et al., 2009). The existence of these two small cytochromes in A. aeolicus is due to gene duplication. m The c555 is tightly bound to the lipid bilayer probably via a lipid anchor presumably attached to an N-terminal cysteine residue (Baymann, Barlow, et al., 2003; Baymann et al., 2001). This protein belongs to the family of pivoting cytochromes and can adopt multiple orientations with respect to the membrane. One or both of these cytochromes are possibly involved in the bioenergetic pathway. However, whether these homologous proteins have similar or competing function in the cell is not known. It was speculated that both cytochromes c555 may form dimer to create an electron transfer couple (Baymann, Barlow, et al., 2003; m Baymann et al., 2001). The cytochrome c555 was found in the membrane fraction of the bacterium cultivated in the presence of hydrogen, oxygen, and elemental sulfur, and one or both of these cytochromes are present in small amount in the purified supercomplex containing the bc1 complex and the cytochrome c oxidase II (Guiral et al., 2009; Prunetti et al., 2010). Phylogenetic analyses indicated that A. aeolicus bc1 complex and membrane-bound hydrogenases I and II are closely related to Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 153 proteobacterial counterparts, in disagreement with positioning of the bacterium on small subunit rRNA trees. As stated in Section 1.1, this suggests lateral transfer for genes encoding these enzymes from a proteobacterial do- nor (Brugna-Guiral et al., 2003; Schu¨tz et al., 2003).

3. HYDROGEN SULFIDE UTILIZATION PATHWAY 3.1. Sulfide-dependent electron transport Inorganic reduced compound hydrogen sulfide, a poisonous inflammable gas highly soluble in water, can serve as electron donor for the electron transfer chain to a variety of Bacteria and some Archaea (Griesbeck, Hauska, & Schu¨tz, 2000). Both phototrophic and respiratory (chemoautotrophic) organisms possess enzymes that oxidize hydrogen sulfide to feed electrons into the bioenergetic pathways. These enzymatic systems are the membrane- bound sulfide:quinone reductase (Sqr) or the soluble periplasmic flavocytochrome c sulfide dehydrogenase (FCC). FCC is composed of a flavin adenine dinucleotide (FAD) binding subunit and a cytochrome c. It reduces a c-type cytochrome which subsequently donates the electron to a cytochrome c oxidase in chemotrophic electron transport chain or to a photosynthetic reaction center in phototrophic chain (Griesbeck et al., 2000). Sqr, which transfers electrons from hydrogen sulfide to the quinone pool, feeds electrons to a bc complex. It was suggested that Sqr and the sulfide- dependent electron transport chain evolved very early in bacterial evolution (Nu¨bel, Klughammer, Huber, Hauska, & Schu¨tz, 2000). The complete genome sequence of A. aeolicus indicated the presence of an open-reading frame that encodes a protein with similarity to the Sqr. The first studies on sulfide oxidation were developed using intact membrane of the bacterium grown in the presence of thiosulfate. They showed that the electron transport from sulfide to oxygen employs the Sqr and the cytochrome bc complex via the quinone pool. A substantial portion of the quinol might be reoxidized also by the quinol oxidase (Nu¨bel et al., 2000)(Fig. 4.9B). A sulfide-to-oxygen ratio of approximately 2 was measured indicating that sulfide was oxidized to the level of zero-valent sulfur (Nu¨bel et al., 2000). More recently, experiments using detergent-extract membranes of A. aeolicus support the presence of the H2S/O2 energetic pathway in growth conditions with elemental sulfur (Guiral et al., 2009). The Sqr specific activity of the enzyme in the intact membrane (3.5 mmol of decyl-ubiquinone reduced/mg of protein/min at 20 C; Nu¨bel et al., 2000)aswellasinthedetergent- solubilized membrane (6 mmol of decyl-ubiquinone reduced/mg of 154 Marianne Guiral et al. protein/min at 20 C; Prunetti & Guiral, unpublished results) was determined to be one of the highest found so far despite measured at room temperature. This specific activity increases with increasing temperature. This suggests that hydrogen sulfide, in addition to hydrogen, constitutes one of the major electron donor for the respiration in A. aeolicus (Griesbeck et al., 2000; Nu¨bel et al., 2000). A. aeolicus was successfully grown using hydrogen sulfide in the presence of oxygen and hydrogen (Prunetti et al., 2010). Hydrogen sulfide, in addition to hydrogen, is a gas naturally present in volcanic gases and hot springs, including the ones at Vulcano Island where A. aeolicus was isolated (Stetter, 2001).

3.2. The highly active and thermostable Sqr from A. aeolicus Sqr is a membrane flavoprotein catalyzing by oxidation of sulfides (H2S, S2 , or HS ) the two-electron reduction of the quinone pool, via a FAD redox cofactor according to the reaction: H2SþQ$SþQH2 (where Q is quinone, QH2 quinol, and S zero-valent sulfur). This enzyme belongs to the disulfide reductase family including glutathione and thioredoxin reductases and dihydrolipoamide dehydrogenases. Sqr has various important physiological roles. In addition, to be involved in energy metabolism, they can function in hydrogen sulfide detoxification or homeostasis in mammals. This enzyme was purified and biochemically characterized from few microorganisms including, in addition to A. aeolicus, the purple bacterium R. capsulatus (Schu¨tz, Maldener, Griesbeck, & Hauska, 1999; Schu¨tz, Shahak, Padan, & Hauska, 1997), the cyanobacteria Oscillatoria limnetica and Aphanothece halophytica (Bronstein, Schu¨tz, Hauska, Padan, & Shahak, 2000), the chemolithoautotrophic acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans (Cherney, Zhang, Solomonson, Weiner, & James, 2010; Wakai et al., 2007), and the acidophilic hyperthermophilic archaeon A. ambivalens (Brito et al., 2009). Recently, a new classification of Sqr into six groups was defined. A. aeolicus Sqr belongs to type I together with proteins from a- and b-proteobacteria and cyanobacteria. They present affinity to sulfide in micromolar range and are probably expressed constitutively in cells (Marcia, Ermler, Peng, & Michel, 2010).

3.2.1 Subcellular localization As a monotopic enzyme, A. aeolicus Sqr faces either the cytoplasmic or the periplasmic side of the membrane. No characteristic signal peptide or twin- arginine motif is detected in the N-terminal part of the amino acid sequence. Despite no translocation signal is present in the sequence, it was shown in Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 155

R. capsulatus that the Sqr is located in the periplasm and that C-terminal 38 amino acid residues are essential for translocation (Schu¨tz et al., 1999). The N-terminal sequencing of A. aeolicus Sqr showed that it is not cleaved, as the one from R. capsulatus (Prunetti et al., 2010). Moreover, electronic and optical microscopies were used to demonstrate that Sqr in A. aeolicus faces the periplasm as this enzyme is detected using specific antibodies directly on spheroplasts (i.e., entire cells that have lost in part the external membrane) (Prunetti L., Infossi P., & Guiral M., unpublished results). This location still needs to be conclusively demonstrated for Sqr of A. ferrooxidans (Wakai et al., 2007)andtheoneofA. ambivalens which is assumed to be localized at the cytoplasmic face of the membrane in this archaeon (Brito et al., 2009).

3.2.2 Properties A. aeolicus Sqr was purified from the native membrane and was biochemically and structurally characterized (Marcia, Langer, et al., 2010; Marcia et al., 2009; Prunetti et al., 2010). It forms two gel bands (of 47 and 35 kDa) on denaturing gel due to the partial lost of the FAD cofactor upon denaturation (Marcia, Langer, et al., 2010). The FAD is required for the enzyme activity. It was reported that the cofactor can be lost during purification procedures of Sqr from various organisms. Depending on the purification, optical spectroscopy and fluorescence emission showed that 25–50% of purified A. aeolicus Sqr possesses their cofactor. Indeed, typical signal of flavoproteins is observed around 360, 457, and 485 nm for Sqr. On the other hand, fluorescence emission signal of FAD is quenched by the protein environment when the cofactor is incorporated in Sqr. For quantification, it has to be extracted from the enzyme by an acidic treatment (Engels, Kahmann, Ruppel, & Pistorius, 1997; Prunetti & Guiral, unpublished results). Despite covalent binding, by an unprecedent persulfide linkage to a cysteine residue (Cys-124) to the A. aeolicus Sqr, the redox cofactor can be removed from the protein, confirming that this bond is labile as previously proposed (Marcia et al., 2009). This is different from FAD from A. ambivalens Sqr which is bound by a stable thioether bond (Brito et al., 2009) or the one from A. ferrooxidans Sqr noncovalently bound to the protein (Cherney et al., 2010). Enzymatic specific activity of A. aeolicus Sqr varies between 70 and 400 mmol mg 1 min 1 at 40 C depending on the preparation (Table 4.2). As only a fraction of Sqr contains the flavin cofactor (see above), this activity is largely underestimated and can be recalculated twice higher considering the real concentration of active enzyme. The specific activity 156 Table 4.2 Enzymatic properties of some archaeal and bacterial Sqr A. A. aeolicus A. aeolicus R. capsulatus A. ferrooxidans O. limnetica ambivalens Specific 400a (25 C) 71 (40 C) 55 (RT) 400–500 (RT) 100–150 (RT) 0.762 activity 800a (40 C) (70 C) Optimal 7 6.5 6.7 nd nd 6.7 pH KM Na2S 2.5 (25 C) 5.9 5 2.8 8 2 (50 C) KM 1.6 (DB, 25 C) 2.16 (DB) 3 (DB) 22 (DB) 31 (PQ) nd quinone References Prunetti et al. (2010), Marcia, Langer, et al. Griesbeck et al. Cherney et al. Arieli, Shahak, Brito et al. Prunetti and Guiral (2010), Marcia, (2002) (2010) Taglicht, Hauska, (2009) (unpublished results) Ermler, et al. (2010) and Padan (1994) aSpecific activity of A. aeolicus Sqr has been corrected considering the real FAD content in the purified enzyme. 1 1 Specific activity is given in mmol min mg protein, KM in mM. DB, decyl-ubiquinone; PQ, plastoquinone; RT, room temperature; nd, not determined; R. capsulatus, Rhodobacter capsulatus; A. ferrooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans; O. limnetica, Oscillatoria limnetica; A. ambivalens, Acidianus ambivalens. aineGia tal. et Guiral Marianne Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 157 increases greatly with the temperature. Thus at 25 C, it is roughly half the one obtained at 40 C and this increases to double at 60 C. Activity at 80 C, close to the optimum temperature of cells growth, is higher but difficult to measure with accuracy due to the faster chemical reaction at this temperature (i.e., the direct reduction of quinone by hydrogen sulfide) and the extremely high enzyme turnover (Prunetti & Guiral, unpublished results). Two features are worthy of notice regarding A. aeolicus Sqr: (i) its specific activity is one of the greatest reported so far for such enzyme and is comparable, at 25 C, to the one of A. ferrooxidans purified Sqr although this bacterium is a mesophile (Table 4.2). Similarly, purified A. aeolicus complex I possesses a specific activity that is much higher than that reported for other complex I prep- arations (Peng et al., 2003). Usually, enzymes from hyperthermophiles have normally specific activities similar to those from mesophiles (Daniel & Danson, 2001). (ii) A. aeolicus Sqr is highly active at room temperature, in op- position to the enzyme from the hyperthermophile A. ambivalens almost inactive at room temperature (Brito et al., 2009). Most of redox enzymes purified from A. aeolicus are not or very little active at room temperature as measured for bc1 complex, ba3 cytochrome c oxidase, hydrogenase I, or complex I (Brugna-Guiral et al., 2003; Peng et al., 2003; Prunetti et al., 2010). This is frequently observed for enzymes from hyperthermophiles. Room temperature activity of A. aeolicus Sqr thus appears as an outstanding property. The optimal pH as well as the catalytic constants was determined at 25 C for A. aeolicus Sqr. They are in the same range than those reported for other Sqr (Table 4.2).

3.2.3 Three-dimensional structure The X-ray structure of A. aeolicus “as-purified” Sqr and quinone- and inhibitor-bound forms were recently determined (Marcia et al., 2009). The overall architecture of the monomer is typical of disulfide reductase enzymes. All three 3D structures do not significantly differ. In addition to the unconventional nature of the covalent bond between the flavin and the protein, they revealed some unexpected features like the oligomeric state (see below) and the presence of a covalently bound polysulfur chain in the active site. The insertion of this integral monotopic membrane protein into the lipid bilayer was estimated to a depth of about 12 A˚ and is mediated through a helix-turn-helix motif containing two amphipathic helices in the C-terminal domain. This topology is favorable to catalyze reaction between hydrophilic (sulfide) and hydrophobic substrate (quinone) (Marcia, Langer, et al., 2010). Two substrate-binding sites are spatially separated. The quinone, on the si face 158 Marianne Guiral et al. of the cofactor FAD, accesses its binding site through a hydrophobic channel from the membrane attachment domain. On the re face of the FAD, a cavity is delimited and constitutes the catalytic site. It is accessible for the substrate in the periplasm from the bulk solvent through a hydrophilic channel. Sulfide oxidation takes place in this pocket which faces three cysteine residues essential for the activity (Cys-124 binding the FAD, Cys-156 and Cys-347, A. aeolicus numbering). Two different complicated multicycle mechanisms of action for sulfur polymerization were suggested. They both propose a final release of the product in the form of insoluble cyclooctasulfur (S8)(Marcia, Ermler, et al., 2010; Marcia et al., 2009). Recently, the complete structure of one other bacterial (from A. ferrooxidans) and one archaeal (from A. ambivalens) Sqr was solved by X-ray crystallography. It revealed unexpected differences in the active sites, in FAD binding, and in channels for sulfide diffusion (Brito et al., 2009; Cherney et al., 2010; Marcia,Ermler,etal.,2010;Marciaetal.,2009). Both Sqr have different physiological oligomerization states and different membrane binding motifs (Marcia, Ermler, et al., 2010). A. aeolicus Sqr structure is more closely related to A. ferrooxidans Sqr one. One of the major differences occurs in the domain containing the amphipathic helices penetrating the membrane. In A. ferrooxidans Sqr, one of these two helices undergoes a major conformational change depending on the presence or absence of detergent and changes its orientation (Cherney et al., 2010). In A. ambivalens Sqr, a high flexibility around the C-terminal part was also suggested (Brito et al., 2009).

3.2.4 Oligomerization state Oligomerization state of microbial Sqr was little studied in detail (except for the A. aeolicus one), but it was generally accepted that these enzymes are dimeric, like enzymes belonging to the same superfamily. Although not demonstrated, the active form of Sqr was proposed to be a dimer in R. capsulatus (Griesbeck et al., 2002). This enzyme is a monomer in solution when purified from A. ambivalens (Brito et al., 2009). The A. ferrooxidans Sqr is thought to be a dimer, but calculations propose that equilibrium shifts toward monomer at low protein concentration (below 0.01 mM). However, for both of these last organisms, dimers have been observed in the crystal form, suggesting a possible dimeric arrangement of the enzyme in the membrane. Cherney and collaborators propose that the association of Sqr that exists in solution (dimers interacting via the C-terminal domain) is different from the probable biological dimer, which is inserted in the lipid bilayer (Brito et al., 2009; Cherney et al., 2010). Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 159

A. aeolicus Sqr is the only Sqr proposed to be trimeric. A crystallographic dimer of trimers was found in the asymmetric unit. It was suggested that this trimeric organization creates an appropriate surface for binding lipid phosphate groups and that insertion of A.aeolicus Sqr into the membranes stabilizes enzyme oligomerization (Marcia et al., 2009). The oligomeric state of Sqr extracted from the native membrane by detergent was studied by a variety of approaches. The results are in agreement with the existence of a trimer in solution, however, depending on the technique used. The dimer (and even other forms) is also found in large amount (Marcia, Langer, et al., 2010; Prunetti et al., 2010). Multimerization of Sqr does not probably affect the enzyme activity but it could provide stability to the protein orientation in the membrane (Cherney et al., 2010). Indeed, it has been shown that all the oligomers (dimer, trimer, and a higher form that might correspond to a tetramer) as well as the monomer are enzymatically active when Sqr specific activity is revealed directly into native gel (Prunetti L. & Guiral M., unpublished results; Prunetti et al., 2010). This suggests that there is no correlation between oligomerization state and activity. Moreover, preliminary data seem to indicate that the oligomerization does not vary with the enzyme concentration nor the temperature (Prunetti L. & Guiral M., unpublished results).

3.2.5 Thermostability The 3D structure of A. aeolicus does not reveal major differences with the one of A. ferrooxidans despite being a mesophilic bacterium. As mentioned above, oligomerization of protein could be a strategy for hyperthermophilic microorganisms to stabilize the protein structure (Vieille & Zeikus, 2001), as demonstrated for a soluble rhodanese from A. aeolicus (Giuliani et al., 2007). Another stabilization factor for A. aeolicus Sqr could be the presence of two disulfide bridges in the C-terminal domain (Marcia et al., 2009). However, other factors might exist as these two bridges are absent in the hyperthermophilic Sqr from A. ambivalens (Brito et al., 2009). A. aeolicus Sqr thermostability was determined by incubation of the enzyme at 80 C and measurement of its activity. The stability of the purified protein is remarkable, with a half-life of 32 h (Marcia, Langer, et al., 2010). In comparison, A. aeolicus hydrogenase I or complex I has a half-life of 5 and 10 h at 80 C, respectively (Brugna-Guiral et al., 2003; Peng et al., 2003). Thermostability of A. ambivalens Sqr was not yet analyzed. Denaturation of A. aeolicus Sqr was followed with circular dichroism, routinely used to study secondary structure modifications. A variation of 160 Marianne Guiral et al. temperature from 20 to 90 C followed by a decrease to 20 C, as well as an incubation at 80 C for 10 h, did not modify the a helice signal of the purified protein at 222 nm indicating a high structural stability, in line with the stability of activity. Moreover, the action of urea, a denaturing reagent, was tested on this enzyme (up to 18 h with a concentration of 8 M) which confirms the stability on native gel as well as the absence of dissociation of the oligomers. Moreover, it could be shown that the Sqr does not lose its FAD cofactor when treated with urea, although being linked by a rather labile covalent bonding (Prunetti & Guiral, unpublished results). This extreme stability was not found for the sulfur oxygenase reductase (SOR) oligomeric enzyme from A. aeolicus, which starts denaturing from 3 M urea (Pelletier, Leroy, Guiral, Giudici-Orticoni, & Aubert, 2008).

3.3. The new sulfide-oxidase and oxygen-reductase supercomplex of A. aeolicus Studies on A. aeolicus membranes have revealed the possible existence of functional supercomplex(es) involved in pathway for hydrogen sulfide oxidation and O2 reduction. Indeed, possible associations between Sqr, bc1 complex, cytochrome c oxidase, hydrogenase I, and quinol oxidase were proposed using separation of detergent-extracted complexes by blue-native electrophoresis (Guiral et al., 2009). The purification, by several chromatographic steps, of a membrane-bound supercomplex containing a cytochrome c oxidase activity confirmed the existence of stable interactions between redox complexes and enzymes in the membranes of A. aeolicus (Prunetti et al., 2010). Supercomplexes, resulting from specific associations between bioenergetic complexes, were extensively described from mitochondria (Acı´n-Pe´rez, Ferna´ndez-Silva, Peleato, Pe´rez-Martos, & Enriquez, 2008). Besides the existence of substrate channeling, it was proposed that they have a role in the stability and assembly of the individual complexes and in preventing excess oxygen radical formation (Lenaz & Genova, 2010). Conversely, in bacteria or archaea, few respiratory supercomplexes have been found and few were purified to homogeneity.

3.3.1 Composition, spectral, and functional properties The homogeneity and molecular mass of the 350 kDa supercomplex were investigated by analytical ultracentrifugation and by size exclusion chromatography with light scattering detection (Prunetti et al., 2010). The precise protein composition of the edifice was established by mass spectrometry and Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 161

immunodetection. It is composed of three partners, the Sqr, the bc1 complex, and the cytochrome c oxidase II. Although the association between the two complexes (bc complex and oxidase) was already described in prokaryotes and mitochondria (Gao et al., 2012; Guiral et al., 2009; Lenaz & Genova, 2010), this is the first time that Sqr is purified in a protein complex. Optical room temperature spectra confirmed the presence of hemes c with signals in the reduced state at 424 and 554 nm, hemes b with signals at 424 and 561 nm, and cytochrome c oxidase with signal at 448 nm (a small peak is also visible around 600 nm). As already mentioned above, visible spectroscopy showed that the cytochrome c oxidase II contained in the supercomplex is a ba3 enzyme. It possesses a positive redox potential heme m b. EPR characterization indicated that the cytochrome c555 (or less probably s the soluble c555 exhibiting identical peaks in EPR spectroscopy) is present in substoichiometric amount in the purified superstructure, and most importantly that the ratio between cytochrome c oxidase and bc1 complex is 1:2. This suggests that the supercomplex contains one cytochrome c oxidase for one dimeric bc1 complex, consistent with the fact that dimers of bc1 complexes constitute the minimal and functional unit of this complex (Cramer,Hasan,&Yamashita,2011). As the flavin cofactor of Sqr is not visible by EPR spectroscopy, not detected by optical spectroscopy (because masked by signals arising from cytochromes), and not ex- tractable from Sqr when present in the supercomplex for a precise quantification by fluorescence (Prunetti & Guiral, unpublished results), the stoichiometry of the Sqr in the supercomplex was not determined. However, the presence of one or two molecules of Sqr seems to be consistent with the molecular mass of the protein edifice (Prunetti et al., 2010). This supercomplex, containing the Sqr, one ba3 cytochrome c oxidase, one dimeric bc complex, and traces of cytochrome c555, constitutes a novel protein association. The functional role of the purified supercomplex in the oxidation of sulfideandreductionofoxygenwasshown by determination of enzyme activities of the three individual enzymes and oxygen consumption measurements. Specific activities of the cytochrome c oxidase, the bc1 complex, and Sqr engaged in the supercomplex were revealed at 40 C. This is a strong indication that they are all functional in the purified protein edifice (Prunetti et al., 2010). Contrary to Sqr, the cytochrome c oxidase and the bc1 complex are not active at 25 C (Prunetti & Guiral, unpublished results). Enzyme activities of cytochrome c oxidaseandSqrwerealsovisu- alized on native gel after migration of the supercomplex (Prunetti et al., 162 Marianne Guiral et al.

2010). The reduction of O2 by the purified supercomplex, using Na2Sas electron donor, was measured at 60 CwithaClarkelectrode.Theprotein association is able to transfer electrons from Na2StoO2, and this reaction is sensitive to cyanide, an inhibitor of cytochrome c oxidases, as well as to antimycin A, a quinone analogue. The edifice thus contained all the components required to catalyze the electron transfer. These results are essential because they strongly suggest that (i) the purified complex is an active H2Soxidase–O2 reductase enzymatic entity; (ii) in addition to the cytochrome c555, quinone molecules, shuttling electron between Sqr and bc complex, are retained in the supercomplex; and (iii) this novel supercomplex can be considered as a complete respirasome resulting from the association of consecutive enzymes involved in H2S/O2 pathway (Prunetti et al., 2010).

3.3.2 Stability The purified supercomplex was found to be highly stable to the denaturing agent urea. It is not significantly dissociated even after incubation with a high urea concentration for several hours (Prunetti & Guiral, unpublished results) (Fig. 4.10A). Identically, dissociation of the superstructure in its three components was not possible after treatment with detergents at various temperatures. As investigated by blue-native electrophoresis and in-gel detection of the cytochrome c oxidase activity, Triton X-100, described as a nonionic mild detergent, does not destabilize the interaction between the enzymes inside the complex, even at a final concentration of 6% (Fig. 4.10B). The majority of the supercomplex entities are still intact and active (for the oxidase) after incubation with the strong ionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) at a concentration as high as 0.5% or 1% (Fig. 4.10B). In these conditions, a small fraction of a smaller protein entity of about 200–250 kDa, which contains at least the cytochrome c oxidase, is released. This was confirmed using two- dimensional blue-native/blue-native gels and denaturation of the supercomplex in the gel with SDS after the first dimension (Fig. 4.10C). In addition to the entire supercomplex, a subcomplex of about 240 kDa containing at least the cytochrome c oxidase and the bc1 complex (with an unknown stoichiometry) and a nonactive subcomplex of about 140 kDa were dissociated from the large complex (Prunetti & Guiral, unpublished results). The isolated A. aeolicus complex I was also found to be rather stable in the presence of SDS (Guiral et al., 2009; Peng et al., 2003). This suggests that the association between bc1 complex and cytochrome c oxidase constitutes the highly stable “core” of the A. aeolicus supercomplex (Gao et al., 2012). This is in good agreement Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 163

A M Urea C kDa 03568 1 D = BN

480

242

B M 1234 1046 2D = BN + SDS 720

480 350

240 246

142

Figure 4.10 Stability and dissociation of the A. aeolicus sulfide-oxidase/oxygen- reductase supercomplex. (A) Migration of the Sqr-bc1 complex-ba3 oxidase purified supercomplex on a 5–15% blue-native gel after incubation with various amounts of urea. Incubation was performed at room temperature. 5 mg of proteins were loaded in each lane, they were stained with Coomassie blue. M indicates Molecular mass markers. (B) Dissociation of the purified supercomplex after incubation with detergents. Supercomplex was incubated before migration 1 h at 37 C with no detergent (lane 1), 6% (w/v) Triton X-100 (lane 2), 0.5% (w/v) SDS (lane 3), and 1% (w/v) SDS (lane 4). The supercomplex was allowed to migrate on a 4–12% blue-native gel, and the in-gel cytochrome c, oxidase activity was revealed. Proteins (20 mg) were loaded in each lane. (C) Dissociation of the supercomplex using SDS, visualized by two-dimensional blue-native gel. After separation in the first dimension (5–15% blue-native gel), 150 mg of the supercomplex was dissociated in-gel by a treatment with 1% SDS (1 h at 37 C), and separated by a second dimension identical to the first one. Cytochrome c oxidase was revealed in-gel. 350 and 240 indicate the approximate molecular mass of the supercomplex and a subcomplex, respectively. BN is for blue-native gel. with the specific association already described in other bacteria or archaea like Bacillus PS3, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium smegmatis,orSulfolobus (Iwasaki, Matsuura, & Oshima, 1995; Keefe & Maier, 1993; Megehee, Hosler, & Lundrigan, 2006; Niebisch & Bott, 2003; Sone, Sekimachi, & Kutoh, 1987) and in the mitochondrial membrane of a variety of organisms. The extreme insensibility of A. aeolicus supercomplex to detergents or other denaturing agents is not a general feature of respiratory membrane- bound supercomplexes. Indeed, interactions between constituents of supercomplexes from prokaryotes or mitochondria are described to be rather weak (Niebisch & Bott, 2003; Wittig, Carrozzo, Santorelli, & Scha¨gger, 2006). For example, mitochondrial supercomplexes are dissociated with 164 Marianne Guiral et al. low amount of dodecyl maltoside without any incubation (detergent only present in the cathode buffer of blue-native gel is sufficient for dissociation) (Wittig et al., 2006). This exceptional stability probably explains why this supercomplex is one of the few that can be purified to homogeneity with several chromatographic steps.

3.3.3 Influence of physiological partners on Sqr properties Taking the advantage that Sqr was available in the isolated state and associated to its partners into the supercomplex, some properties of this enzyme in both states were compared. Indeed, one of the proposed advantages of the existence of respiratory membrane-bound supercomplexes in the literature is the structural stability of the individual component when in interaction compared to the isolated state (Lenaz & Genova, 2010). This was demonstrated for mitochondrial and bacterial complex I (Stroh et al., 2004). How- ever, the thermostability of A. aeolicus Sqr was determined to be the same whatever it is engaged or not in a complex. It thus seems that interaction of Sqr with other components of the supercomplex does not stabilize this enzyme. This is probably due to the high stability of this enzyme to high temperature when it is free (see above) (Prunetti et al., 2010). Conversely, Sqr embeddedin the multiprotein complex has slightly different kinetic properties than the pure enzyme, such as a Michaelis constant Km for the quinone lower when Sqr is in complex, suggesting a higher affinity for this substrate in these conditions. Moreover, it was shown that oligomeric state of the Sqr is different according to whether it is free or associated with cytochrome c oxidase and bc1 complex (Prunetti et al., 2010). These findings suggest that interaction of the H2S/O2 pathway constituents into a superstructure modifies at least the properties of the Sqr and this may have consequences on the regulation of the entire metabolic pathway. This kind of behavior was already pointed out for soluble enzymes inserted in multiprotein complexes (Lebreton,Graciet,& Gontero, 2003). Moreover, this is compatible with the idea of the in vivo existence of two pools of Sqr in A. aeolicus (Prunetti et al., 2010).

3.4. Putative A. aeolicus enzymes involved in sulfide oxidation Genes encoding putative proteins annotated as sulfide dehydrogenase are found in the genomic sequence. dhsU (or aq_232, FCC) and fccB0 (or aq_235, sulfide dehydrogenase, flavoprotein subunit) might be included in a same operon together with the gene soxF (aq_234) putatively coding for a Rieske-I iron–sulfur protein (Table 4.3). These two FAD containing Table 4.3 Putative or characterized A. aeolicus proteins involved in energy sulfur metabolism Gene Locus tag Protein name Function P/C References Sulfur reductase sreAa aq_1234 Sulfur reductase chain A Sulfur reduction C Guiral, Tron, et al. (2005) sreB aq_1232 Sulfur reductase chain B sreC aq_1231 Sulfur reductase chain C Sulfide quinone reductase sqr aq_2186 Sulfide quinone H2S oxidation C reductase Sulfur oxygenase reductase sor aq_455 Sulfur oxygenase Disproportionation of S0 C Pelletier et al. (2008) reductase SbdP sbdP aq_477 Sulfur-binding -donating Rhodanese, sulfur C Giuliani et al. (2007), protein oxidation, and reduction Aussignargues et al. (2012) Sox trxA2 aq_1811 Thioredoxin (SoxW) Thiosulfate/sulfur P oxidation

Continued Table 4.3 Putative or characterized A. aeolicus proteins involved in energy sulfur metabolism—cont'd Gene Locus tag Protein name Function P/C References aq_1810 aq_1810 SoxY aq_1809 aq_1809 SoxZ aq_1807 aq_1807 SoxA aq_1806 aq_1806 SoxX soxB aq_1803 Sulfur oxidation protein SoxB aq_1802 aq_1802 Hypothetical protein aq_1800 aq_1800 Hypothetical protein rhdA2 aq_1799 Thiosulfate sulfurtransferase cphA1 aq_1798 SoxH HdrABC aq_389 aq_389 Hypothetical protein Disulfide reduction or P Quatrini et al. (2009) (DsrE/F-like family) oxidation aq_390 aq_390 Hypothetical protein (DsrE/F-like family) aq_391 aq_391 Heterodisulfide reductase subunit C, HdrC aq_392 aq_392 Heterodisulfide reductase subunit B, HdrB aq_394 aq_394 Heterodisulfide reductase subunit B, HdrB hdrA aq_395 Heterodisulfide reductase subunit A, HdrA aq_397 aq_397 Hypothetical protein hdrC aq_398 Heterodisulfide reductase subunit C, HdrC hdrB aq_400 Heterodisulfide reductase subunit B, HdrB HdrDE hdrD aq_961 Heterodisulfide reductase P Guiral, Tron, et al. (2005) aq_963 aq_963 Hypothetical protein, renamed cyt bII ATP sulfurylase cysD aq_1081 Bifunctional sulfate Sulfite oxidation P Yu, Lansdon, Segel, and adenylyltransferase/ Fisher (2007) adenylylsulfate kinase protein

Continued Table 4.3 Putative or characterized A. aeolicus proteins involved in energy sulfur metabolism—cont'd Gene Locus tag Protein name Function P/C References SoxF dhsU aq_232 Flavocytochrome C H2S/sulfur oxidation P Verte´ et al. (2002) sulfide dehydrogenase (SoxF1) fccB0 aq_235 Sulfide dehydrogenase, flavoprotein subunit (SoxF2) aOriginally, sre genes were annotated dms (Guiral, Tron, et al. (2005)). P indicates putative protein and C indicates characterized protein or complex. Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 169 hypothetical proteins are predicted to be located in the periplasmic space as they all contain a twin-arginine motif in their N-terminal part. These three proteins were called SoxF1, PetA2 and SoxF2 (encoded by dhsU, soxF and fccB 0, respectively) by Verte´ et al. (2002). DhsU protein was identified in the membrane fraction of A. aeolicus growing with hydrogen, oxygen, and elemental sulfur (Guiral et al., 2009). As mentioned above, FCC involved in sulfide oxidation is composed of a FAD-binding subunit and a cytochrome c. The cytochrome c subunit gene is absent in the operon and not detected elsewhere in the genomic sequence.

4. ELEMENTAL SULFUR AND OXIDIZED SULFUR COMPOUNDS ENERGY METABOLISM

Sulfur is an element with a complex chemistry, and inorganic sulfur compounds are found in nature in a wide range of oxidation states (from 2 2toþ6). They can either be oxidized up to sulfate (SO4 ) or reduced to sulfide (H2S). Consequently, they are used as electron donor or acceptor by numerous microorganisms (Ghosh & Dam, 2009; Suzuki, 1999). Microbial metabolisms based on inorganic sulfur compounds are thus frequently elaborated involving multiple different enzymes. A. aeolicus uses sulfur compounds for growth, including at least thiosulfate, elemental sulfur (in the form of flowers of sulfur) as well as sulfide (Deckert et al., 1998; Guiral, Tron, et al., 2005; Prunetti et al., 2010), and dispose of a pleiad of enzymes and proteins related to sulfur compounds metabolism.

4.1. Many enzymes... 4.1.1 Reductive pathway The processes by which microorganisms reduce elemental sulfur to hydrogen sulfide are still unclear for most of them, and only few enzymes involved in this respiration have been purified and characterized. The activity of sulfur reduction has been found associated to soluble and/or to membrane- associated proteins. If we focus on elemental sulfur reduction with hydrogen as electron donor, the best characterized system is the hydrogenase/polysulfide reductase (Psr) from the mesophilic bacterium Wolinella succinogenes (Hedderich et al., 1999; Klimmek, 2005). This pathway couples the oxidation of hydrogen to polysulfide reduction using quinone as intermediate which can be directly reduced by the hydrogenase (Hedderich et al., 1999). Studies performed with extremophilic archaea A. ambivalens and Pyrodictium abyssi as model organisms demonstrate that 170 Marianne Guiral et al. hydrogen oxidation with elemental sulfur as electron acceptor requires at least two enzymes, that is, a hydrogenase and a sulfur or polysulfide reductase (SR/Psr), both membrane bound as it has been described in W. succinogenes (Dirmeier, Keller, Frey, Huber, & Stetter, 1998; Laska et al., 2003). In A. aeolicus, a multiprotein sulfur-reducing membrane- bound supercomplex, coupling hydrogen oxidation to sulfur reduction in the presence of quinone, has been purified from cells grown on elemental sulfur in addition to hydrogen and oxygen (Guiral, Tron, et al., 2005). It contains at least hydrogenase II and a molybdoenzyme annotated DMSO reductase in A. aeolicus genome that has been renamed Sre for SR (Table 4.3). The hydrogenase consists of at least three subunits (large and small hydrogenase subunits and a probable cytochrome bII, see Section 2). The SR enzyme is composed of SreA, SreB, and SreC (Guiral, Tron, et al., 2005.). As in A. aeolicus and in contrast to W. succinogenes,a copurification of hydrogenase and SR as a supercomplex has been described in A. ambivalens and P. abyssi with a molecular mass around 520 kDa for the P. abyssi complex (Dirmeier et al., 1998). In P. abyssi, the complex with hydrogen:sulfur oxidoreductase activity was composed of nine different subunits containing a [NiFe] hydrogenase, SR, and hemes b and c. The hydrogenase–SR complex from A. ambivalens contains at least four proteins but not cytochrome c (Laska et al., 2003). This hydrogenase–SR supercomplex is one of the rare examples of an entire electron transport chain present in a single complex. Investigations on the A. aeolicus SR were hampered because the enzyme could not be purified without the hydrogenase part. The gene cluster encoding the A. aeolicus SR consisted of three open-reading frames, sreABC.Asequence analysis of sreA and sreB showed similarity with the catalytic and the [Fe–S] cluster subunits of molybdoproteins of the DMSO/FDH/nitrate reductases family, including the SR/Psr molybdoenzymes (Laska et al., 2003). Like all members of the DMSO reductase family, SR from A. aeolicus probably possesses a bismolybdopterin-guanine dinucleotide (bis-MGD) cofactor as all the genes implicated in its synthesis are present in the genome. The residue ligand to Mo cofactor has not been clearly identified but is probably coordinated by a cysteine residue as it is the case in other SR/Psr (Guiral, Tron, et al., 2005; Jormakka et al., 2008). All molybdoproteins showing a high degree of sequence similarity with SreA from A. aeolicus present a cysteine (or seleno cysteine) as putative Mo ligand as well as an atypical [Fe–S] cluster binding site (Guiral, Tron, et al., 2005). The catalytic subunits SreA/PsrA are likely to be located on the outside of the membrane in the case of W. succinogenes Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 171 and A. ambivalens in line with the presence of the typical twin-arginine motif at the N-terminal part of the subunit. However, the N-terminal amino acid sequence of A. aeolicus SreA does not contain a twin-arginine motif, suggesting that the protein is not exported over the membrane by the TAT pathway. One consequence is that the respiratory chain from hydrogen to elemental sulfur in A. aeolicus comprises two proteins with their catalytic site having opposite orientations with respect to the cytoplasmic membrane. SreB subunit is predicted to coordinate four [4Fe–4S] clusters. The sreC gene encodes a hydrophobic membrane protein with eight transmembrane helices, without clear homology with SreC/PsrC from A. ambivalens or W. succinogenes. It does not contain any redox centers, such as the heme b molecules found in many other membrane-bound bis-MGD enzymes. In contrast to A. ambivalens,nosreD gene is detected in the A. aeolicus operon suggesting a lack of specific chaperon similar to the maturation protein TorD which is a system-specific chaperone protein involved in the introduction of the molybdenum cofactor into the protein (Genest, Me´jean, & Iobbi-Nivol, 2009). The sulfur-reducing quinone-dependent activity is increased by NADPH, by a factor 3–10 depending on the enzyme preparation. NADPH does not have any effect on hydrogenase activity. Due to the cytoplasmic localization of SR from A. aeolicus, we can suppose a direct interaction between NADPH and SR. The potential NADPH-binding motif described in the molybdoenzyme biotin sulfoxide reductase is present in SreA from A. aeolicus (Guiral, Tron, et al., 2005). In contrast to P. abyssi, no cytochrome c is involved in this kind of electron transfer in A. aeolicus. This is also in accordance with the possible role of these cytochromes in the electron transfer chain from bc1 complex to cytochrome oxidase (Prunetti et al., 2010) and with the cytoplasmic localization of sulfur reduction. Although not demonstrated in A. aeolicus, the reduction of sulfur compounds using electrons from hydrogen, by the sulfur-reducing supercomplex, is probably an energy-generating respiratory process. The functioning of the equivalent supercomplex isolated from the archaeon A. ambivalens allows energy synthesis as the microorganism is able to grow using exclusively hydrogen as electron donor and elemental sulfur as electron acceptor. The generation of an electrochemical gradient would require a redox loop mechanism as proposed for the E. coli nitrate reductase/formate dehydrogenase system. Protons would be taken up by quinone upon reduction on the cytoplasmic side of the membrane and released to the outside upon reoxidation (Laska et al., 2003). Similarly, W. succinogenes grows by oxidative phosphorylation with polysulfide 172 Marianne Guiral et al. as terminal electron acceptor and hydrogen as electron donor, which involves a membrane-bound hydrogenase and a polysulfide reductase. A mechanism of polysulfide respiration was proposed leading to the formation of 0.33 mol ATP per mol hydrogen (Dietrich & Klimmek, 2002). Moreover, the three-dimensional structure of the polysulfide reductase of the thermophilic bacterium T. thermophilus suggests that it could be a key energy-conserving enzyme of the respiratory chain of this bacterium, utilizing polysulfide as the terminal electron acceptor and pumping protons across the membrane via quinone (Jormakka et al., 2008).

4.1.2 Oxidative pathways Sulfide oxidation is mediated, as already stated above, by the sulfide- oxidase–oxygen-reductase supercomplex containing the Sqr (Table 4.3) (Prunetti et al., 2010). In addition, the SOR enzyme catalyzes a disproportionation of elemental sulfur in the presence of oxygen in A. aeolicus (Pelletier et al., 2008)(Table 4.3). sor genes are not widespread in nature and have been identified only in few microorganisms (Veith, Botelho, Kindinger, Gomes, & Kletzin, 2012). This large oligomeric (around 600 kDa estimated by blue- native gel) enzyme is present in the cytoplasm of the bacterium and possesses low-potential mononuclear nonheme iron sites as the putative redox-active cofactor indispensable for the activity. It was shown that the three Fe-coordinating residues and a persulfurated cysteine, binding the sulfur substrate, are essential for catalysis (Chen,Jiang,She,Liu,&Zhou,2005;Urich, Gomes, Kletzin, & Fraza˜o, 2006). It produces sulfite and sulfide according to 0 þ the reaction: 4S þ O2 þ 4H2O ! 2HSO3 þ 2HS þ 4H . A nonenzymic reaction leading to the formation of thiosulfate is also observed under excess of elemental sulfur (Pelletier et al., 2008). Sulfite, thiosulfate, and hydrogen sulfide are formed at various stoichiometries depending on pH and temperature (Veith et al., 2012). As the enzymes from Acidianus species (Sun, Chen, He, Zhou, & Liu, 2003; Urich et al., 2004), A. aeolicus SOR is inactive at 20 C and presents a maximum activity at high temperatures (Pelletier et al., 2008). Conversely, SOR from the mesophilic bacterium Halothiobacillus neapolitanus is active in a wide range of temperature (10–99 C) with an optimum at 80 C. This unexpected spectrum in activity was proposed to be an apparent adaptative response to substrate limitation at mesophilic conditions, allowing efficient sulfur-based energy metabolism (Veith et al., 2012). The X-ray crystallographic three- dimensional structure of A. ambivalens (Urich et al., 2006)andAcidianus tengchongensis SOR (Li et al., 2008) was determined. They showed that these enzymes are built from 24 subunits, each forming a large (15 nm Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 173 diameter) hollow sphere with the minimal building block being a subunit dimer. SOR of H. neapolitanus adopts secondary and quaternary structures similar to those of the 24-subunit enzymes from hyperthermophiles (Veith et al., 2012).

4.1.3 Rhodaneses Rhodaneses belong to the sulfurtransferase family of enzymes and are found in organisms from all three domains of life. Rhodaneses in vitro catalyze the transfer of a sulfur atom from thiosulfate to cyanide. According to the generally accepted mechanism, the enzyme cycles between two distinct forms during catalysis, the free enzyme and a covalent enzyme-sulfur intermediate characterized by a persulfide bond (RSSH) at the sulfhydryl group of the catalytic cysteine residue (Cipollone, Ascenzi, & Visca, 2007):

2 2 SSO3 þRho SH ! SO3 þRho S SH Rho S SH þ CN ! Rho SH þ SCN

Rhodaneses act as a carrier for reactive sulfur atoms by forming persulfide intermediates, and they are known to play a critical role in sulfur traffic by delivering sulfur in a “safe” chemical species to biosynthetic pathways, using their labile persulfide group. A. aeolicus presents four genes encoding rhodaneses: two of them are tandem-domain proteins RhdA1 and RhdA2, while Aq_477 (renamed SbdP; Aussignargues et al., 2012; Giuliani et al., 2007) and Aq_1599 (renamed RhdB2, Giuliani et al., 2010)aretwosingle- domain proteins, which were not identified by the annotation of the genome. Although RhdA1 and RhdA2 have still never been detected in A. aeolicus cells, the two single-domain rhodaneses were characterized. These two enzymes were the first single-domain rhodaneses characterized from a hyperthermophilic bacterium (Giuliani et al., 2010, 2007). Moreover, they are the only single-domain enzymes presenting an oligomeric thermoactive and thermostable organization. As described in Section 4.2.1, a contribution of SbdP in the energy sulfur utilization was recently proposed as this cytoplasmic rhodanese physically interacts with the sulfur-reducing complex as well as the SOR from A. aeolicus (Table 4.3) (Aussignargues et al., 2012). Expression of RhdB2 is associated with a shift from planktonic lifestyle to an adherent behavior of A. aeolicus cells and depends on the sulfur source (gene upregulated in cells grown with elemental sulfur). This periplasmic rhodanese could have a role in this acclimation process, which remains to be elucidated (Giuliani et al., 2010). 174 Marianne Guiral et al.

4.1.4 Putative enzymes Besides these biochemically characterized enzymes, several putative sulfur- oxidizing or reducing systems are inferred from the genomic sequence (Deckert et al., 1998).

4.1.4.1 Sox system A putative thiosulfate oxidizing mutiprotein complex is encoded by a gene cluster containing at least 10 genes (Table 4.3)(Ghosh, Mallick, & DasGupta, 2009; Miyake et al., 2007; Sano et al., 2010; Verte´ et al., 2002). This Sox multienzyme system, found in numerous phototrophic and chemotrophic sulfur-oxidizing bacteria, is responsible for the oxidation of thiosulfate to sulfate or to sulfur species incorporated in sulfur globules, depending on the presence or not of the soxCD genes which encode a heterotetrameric molybdoprotein cytochrome c complex (Bardischewsky et al., 2005). Only the periplasmic core enzymes were found to be essential for oxidizing activity: SoxAX, a heterodimer containing c-type hemes; SoxYZ, a heterodimer with a cysteine residue which covalently binds the sulfur substrate; and SoxB, a monomeric dimanganese protein. Reconstituted systems are able to perform thiosulfate-, sulfite-, sulfur-, and hydrogen-sulfide-dependent cytochrome c reduction (Rother, Henrich, Quentmeier, Bardischewsky, & Friedrich, 2001). It is currently not known whether Sox proteins are operating or not (and in which growth conditions) in the periplasmic space of A. aeolicus. Genes for the required SoxAXYZB are present in the gene cluster which lacks soxCD suggesting an incomplete oxidation by these proteins. Temperature-dependent thiosulfate oxidizing activity was already demonstrated in H. thermophilus,anAquificale belonging to the same family as A. aeolicus (Sano et al., 2010).

4.1.4.2 Heterodisulfide reductases A putative operon containing nine genes encodes one (or several) heterodisulfide reductase (Hdr) complex as well as hypothetical proteins with DsrE/F-like proteins homology and a putative protein with unknown function (Table 4.3). Hdr has a key function in the energy metabolism of Archaea in which they catalyze the reversible reduction of the disulfide substrate called CoM-S-S-CoB (Buan & Metcalf, 2010; Hedderich et al., 1999). They have also been found in sulfate-reducing microorganisms (Mander, Pierik, Huber, & Hedderich, 2004). One type of Hdr is a three-subunit complex (HdrABC) containing iron–sulfur clusters and FAD and forms a Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 175 tight complex with the F420-nonreducing hydrogenase (Buan & Metcalf, 2010; Mander et al., 2004). In A. ferrooxidans and the thermoacidophilic archeon Metallosphaera sedula, a similar operon with conserved gene organization as the one in A. aeolicus was detected at the genomic level. HdrABC and the sulfur metabolism accessory proteins encoded by genes of this operon (a rhodanese-like protein, absent in A. aeolicus operon, a SirA-like protein belonging to a sulfur relay system, and a DsrE family protein possibly involved in sulfur transfer reactions) are predicted to be involved in reduced inorganic sulfur compounds oxidation in both microorganisms. Most of these genes for these Hdr-related components are, indeed, upregulated when Acidithiobacillus or Metallosphaera grow with elemental sulfur or tetrathionate compared to ferrous iron as electron donor (Auernik & Kelly, 2008; Mangold, Valde´s, Holmes, & Dopson, 2011; Quatrini et al., 2009). Quatrini and coworkers hypothesize that the cytoplasmic HdrABC complex in A. ferrooxidans and A. aeolicus could function in reverse, using the proton gradient, to oxidize disulfide intermediaries to sulfite and deliver the electrons to the quinone pool in the membrane. They also proposed that the accessory proteins possibly transfer the sulfur substrate (currently unknown but proposed to be sulfane sulfur of GSnH with n>1, GSH being the glutathione) to Hdr (Quatrini et al., 2009; Rohwerder & Sand, 2003). However, these suggestions are awaiting experimental evidences. In addition to the Aquificales Hydrogenobaculum sp. and Hydrogenivirga sp., a similar operon was also found in the genomic sequence of various species of the sulfur oxidizer Sulfolobus (Auernik & Kelly, 2008; Quatrini et al., 2009). A second type of Hdr, called HdrDE, reduces also a disulfide as substrate in Archaea using electrons from quinol or methanophenazine (Buan & Metcalf, 2010; Hedderich et al., 1999; Mander et al., 2004). This membrane-bound enzyme is composed of a small subunit containing two hemes b and a large subunit with iron–sulfur clusters and produces a proton-translocating oxidation–reduction loop (Ku¨nkel, Vaupel, Heim, Thauer, & Hedderich, 1997; Simianu, Murakami, Brewer, & Ragsdale, 1998). As mentioned in Section 2, genes encoding proteins resembling these two Hdr subunits (sometimes referred as isp1 and isp2) were found between genes coding for the large and small subunits of [NiFe] hydrogenases in some organisms. These genes exhibit also similarity to Dsr subunits of the dissimilatory sulfite reductase (Dsr) complex (Dahl et al., 1999; Grein, Pereira, & Dahl, 2010; Pala´gyi-Me´sza´ros et al., 2009). In A. aeolicus, these two genes related to HdrDE (hdrD and aq_963 176 Marianne Guiral et al. renamed cytbII; Table 4.3 and Fig. 4.4) are located between mbhS2 and mbhL2 genes for the membrane-bound hydrogenase II (Brugna-Guiral et al., 2003; Guiral, Tron, et al., 2005). This hydrogenase, as stated above, was shown to be involved in sulfur reduction, through its functional interaction with the sulfur reductase enzyme, as is in the case of A. ambivalens (Laska et al., 2003). Although the cytochrome bII was proposed to be an anchor for the two-subunit hydrogenase in A. aeolicus as well as in A. ambivalens, the presence of HdrD (or the corresponding Isp2) in this sulfur-reducing complex was not demonstrated for these two organisms (Guiral, Tron, et al., 2005; Laska et al., 2003). The physiological function of this HdrD/Isp2 subunit is completely unknown. However, by analogy with the archaeal HdrDE, the hypothesis that corresponding proteins in the above cited species might be involved in uncharacterized redox disulfide substrate utilization coupled to hydrogen metabolism cannot be discarded (Pala´gyi-Me´sza´ros et al., 2009.

4.2. ...many possibilities 4.2.1 Internalization of elemental sulfur and oxidation/reduction pathways A. aeolicus is able to grow with solid sulfur (flowers of sulfur, mainly composed of S8 sulfur rings) (Guiral, Tron, et al., 2005). A sulfur-dependent bacterial adherence linked to an absence of flagellin was conserved, suggesting a possible role for sulfur detection by A. aeolicus (Giuliani et al., 2010). Enzy- matic utilization of this substrate, as already pointed out earlier for other sulfur-oxidizing organisms, is likely preceded by an activation reaction step of the sulfur because of the great insolubility of this hydrophobic species in water (Frigaard & Dahl, 2009; Ghosh & Dam, 2009; Rohwerder & Sand, 2003; Sakurai, Ogawa, Shiga, & Inoue, 2010). Moreover, a sulfur uptake is required to be consumed inside the cells. However, transport and transformation of this sulfur compound are yet unknown in A. aeolicus as well as in other species. It was postulated in Acidithiobacillus and Acidiphilium spp. that extracellular S8 sulfur is mobilized and transported into the periplasm as persulfide sulfane sulfur by thiol groups of outer- membrane proteins (Rohwerder & Sand, 2003). This persulfide sulfur might be subsequently oxidized by periplasmic sulfur dioxygenases in these species. Another strategy could be the excretion by microorganisms of reducing substances that can modify external sulfur substrates distant from the cells (Frigaard & Dahl, 2009). In green sulfur bacteria, the involvement of SoxW, a periplasmic protein containing a thioredoxin Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 177 motif and a membrane protein annotated as “thiol disulfide interchange protein DsbD,” was hypothesized to be involved in sulfur species transfer across the inner membrane from periplasm to cytoplasm (Sakurai et al., 2010). In A. aeolicus, the mechanism by which sulfur is transferred through the outer and inner membranes inside the cell might also involve thiol-containing proteins not yet identified (Fig. 4.11). Depending on growth conditions (e.g., the available oxygen concentration), sulfur can be reduced by A. aeolicus through the sulfur-reducing supercomplex (Fig. 4.11). Various electron acceptors can be used by this complex in vitro (Guiral, Tron, et al., 2005). However, it is probable that elemental sulfur is not the form preferentially reduced by this enzyme in vivo. Sulfur can also be used as an electron donor. In general terms, biochemical pathways for elemental sulfur oxidation are poorly understood. In numerous bacteria, oxidation of intracellular sulfur is mediated by the cytoplasmic Dsr system encoded by dsr gene cluster (Friedrich, Bardischewsky, Rother,

H S 2 S O 2 3 0 H S S 2

? OM

S O Periplasm ? 2 3 S* ? Sox F1/F2 SOX S*

H S H S H + 2 2 + 2 H S* H H2 S*

Sqr Sqr Hase II Hase I Q Complex I Q ba ? bc 3 IM Q ox ?HdrD SR NADH? HdrABC – O SO 2 H2O 3 S* S* H S ? 2

out S* H S S* 2 2– SO4 S O APS +P +ATP S* SOR 2 3 O ? ? S O 2 SO3 2 3 SbdP ? ATP sulfurylase Cytoplasm

Figure 4.11 Model for H2,O2, and sulfur compounds utilization in A. aeolicus. Known and putative pathways are depicted. S* represents internal activated unknown sulfur species (see text for details). Hase is for hydrogenase, bc for dimeric bc1 complex, ox for oxidase, SR for sulfur reductase, Q for quinone, S0 for insoluble elemental sulfur, IM for inner membrane, and OM for outer membrane. 178 Marianne Guiral et al.

Quentmeier, & Fischer, 2005; Frigaard & Dahl, 2009), lacking in A. aeolicus. In A. aeolicus, the initial sulfur-oxidizing enzyme might be the SOR present in the cytoplasmic compartment as it is the case in A. ambivalens (Kletzin, Urich, Mu¨ller, Bandeiras, & Gomes, 2004)andAcidithiobacillus species (Mangold et al., 2011)(Fig. 4.11). S8 can be used in vitro by the purified SOR (Kletzin et al., 2004; Pelletier et al., 2008); however, linear sulfur substrates are again probably preferred in vivo, in accordance with cyclooctasulfur transformation prior to utilization. Indeed, the A. ambivalens SOR architecture indicates that the disproportionation reaction takes place in a “reaction chamber” inside the enzyme, separated from the cytoplasmic space. The substrate probably penetrates in the spherical enzyme using the chimney-like protrusions, and it was proposed that linear, more soluble 2 polysulfide Sn , could more easily pass than the sulfur rings, to finally bind the persulfurated cysteine in the active-site pocket (Urich et al., 2006). Recent studies have demonstrated that A. aeolicus cytoplasmic thiosulfate rhodanese SbdP (see Section 4.1.3) is able to interact with SOR. This rhodanese can bind five sulfur atoms on its catalytic cysteine in the presence of flowers of sulfur and most probably donates its linear sulfur chain to the SOR (Aussignargues et al., 2012). It was also shown that this rhodanese can interact with the sulfur-reducing supercomplex and most importantly enhance its reducing activity. The proposed physiological function for this former enzyme is likely to transport and transfer long sulfur chain to cytoplasmic sulfur-utilizing enzymes like a shuttle carrying reactive sulfur compounds to enzymes of the energy sulfur metabolism (Fig. 4.11 and Table 4.3). This function is reminiscent of the polysulfide- sulfur transferase Sud from W. succinogenes, the characterization of which revealed for the first time a direct intervention of a rhodanese-like protein in energy sulfur metabolism, as this protein is the sulfur donor for the terminal acceptor of respiratory chain Psr in this bacterium (Klimmek et al., 1998). Inclusions containing sulfur have been observed in A. aeolicus cytoplasm when the bacterium grows in the presence of elemental sulfur. These kinds of sulfur structures are usually present either in the periplasmic compartment or in the extracellular environment. In any case, the chemical nature of sulfur in the globules is still a debated question as three different forms of it have been proposed depending of the considered 2 microorganism: cyclooctasulfur (S8), polythionates ([(SnSO3)2] ), and sulfur chains (Prange et al., 2002). It could be envisaged that SbdP might transfer sulfur from these inclusions to the enzymes of sulfur metabolism. Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 179

In A. ambivalens, it was proposed that SOR does not directly contribute to the gradient of protons across the membrane but most probably produces sulfur compounds subsequently used by membrane-embedded energetic enzymes (Brito et al., 2009; Kletzin et al., 2004; Mu¨ller et al., 2004). SOR was described as a soluble cytoplasmic enzyme, but it was proposed to be membrane associated in A. tengchongensis (Chen et al., 2005). In A. aeolicus, the majority of this enzyme is soluble in the cytoplasm, while a fraction is found associated with the membrane (Aussignargues et al., 2012). This subcellular localization is compatible with a comparable mechanism in A. aeolicus, with the subsequent consumption of hydrogen sulfide, produced by SOR, by the periplasmic Sqr leading to oxygen reduction and protons translocation by the supercomplex (Prunetti et al., 2010). It can also be considered that the produced sulfide is reoxidized by free Sqr enzyme (the one not integrated in the supercomplex; Prunetti et al., 2010) to produce a reduced quinone pool that could in turn reduce the quinol oxidase (Nu¨bel et al., 2000) or other membrane-bound enzymes. The Sox system as well as the periplasmic uncharacterized putative proteins annotated as sulfide dehydrogenase (SoxF mentioned above) could also participate to sulfide oxidation (Fig. 4.11, Table 4.3). Sulfite, another toxic product generated by sulfur disproportionation catalyzed by SOR, is probably oxidized to sulfate by a currently undiscovered cytoplasmic process in A. aeolicus (see section below).

4.2.2 Other putative oxidative pathways 4.2.2.1 Thiosulfate oxidation As mentioned in Section 4.1.4.1, thiosulfate is putatively oxidized by the truncated soluble Sox system in the periplasmic space, releasing sulfur species products (sulfur or polysulfide) which might be, by an unknown mechanism, integrated into sulfur globules to be further oxidized. Indeed, sulfate is usually produced by complete Sox system, that is, containing SoxCD, absent in A. aeolicus. However, when cultivated with thiosulfate, oxygen, and hydrogen, no sulfur globules were detected microscopically (Guiral, Tron, et al., 2005), suggesting a very transient deposit of sulfur and/or a rapid oxidation of this sulfur compound to sulfate without any sulfur storage. The absence of the soxCD genes suggests that the oxidation route to sulfate is different and might be cytoplasmic as hypothesized below. Oxidation of thiosulfate by Sox components leads to cytochrome c reduction with 2 mol of electron produced per mol of thiosulfate (in the absence of SoxCD; 180 Marianne Guiral et al.

Friedrich et al., 2005), implying that it is linked to oxygen reduction by a cytochrome c oxidase (Fig. 4.11).

4.2.2.2 Sulfite oxidation Sulfite, despite being toxic, is known to be the main intermediate in the oxidation of sulfur compounds to sulfate. Two main mechanisms for sulfite oxidation have been described: the indirect one involving the adenylylsulfate (APS) reductase and the ATP sulfurylase, and the direct one involving a single molybdenum sulfite oxidase (Frigaard & Dahl, 2009; Ghosh & Dam, 2009; Kappler, 2011; Kappler & Dahl, 2001; Kletzin et al., 2004; Zimmermann, Laska, & Kletzin, 1999). Sulfite was also found to be oxidized by the membrane-bound aa3 cytochrome c oxidase from A. ferrooxidans D3-2 (Sugio, Ako, & Takeuchi, 2010). While the indirect route occurs in the cytoplasm and allows ATP synthesis by substrate level phosphorylation, the direct pathway can be either cytoplasmic or periplasmic. As depicted in Fig. 4.11, it is possible that oxidation of thiosulfate, elemental sulfur, and hydrogen sulfide all end up producing cytoplasmic sulfite. As already proposed by Quatrini et al. (2009), a novel sulfite oxidation pathway might operate in A. aeolicus as well as in A. ferrooxidans. These bacteria lack the APS reductase genes, although they have a cytoplasmic ATP sulfurylase (Yu et al., 2007). An uncharacterized enzyme might replace the APS reductase to produce APS from sulfite, or a sulfite oxidase directly oxidizing sulfite to sulfate in the cytoplasm might be present. The Sox system is also a likely candidate for sulfite oxidation in phototrophic sulfur bacteria (Frigaard & Dahl, 2009). Sulfite oxidation in A. aeolicus constitutes one of the major points to be elucidated.

4.2.2.3 Disulfide substrates oxidation As said above, a cytoplasmic HdrABC complex could be involved in sulfur compound utilization in A. aeolicus (Quatrini et al., 2009). By analogy to known Hdrs, this putative enzyme might oxidize an unknown disulfide substrate that could be low-molecular-weight thiols like GSH (Mangold et al., 2011; Quatrini et al., 2009; Rohwerder & Sand, 2003) or glutathione amide (g-Glu-Cys-Gly-NH2)(Frigaard & Dahl, 2009) produced by some bacteria such as A. vinosum (Fahey, 2001). The so-called accessory proteins encoded by genes in the Hdr operon could be involved in sulfur compound transformation and/or transfer to Hdr (Mangold et al., 2011). It was hypothesized that the disulfide oxidation by this Hdr enzyme might lead to sulfite production in A. ferrooxidans and that this reaction Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 181 accompanied by the extrusion of electrons (reduction of quinone pool) utilizes the naturally existing proton gradient (Mangold et al., 2011; Quatrini et al., 2009). This obviously needs further biochemical confirmations in A. ferrooxidans as well as in A. aeolicus. A possibility that cannot be excluded is that the activated sulfur compound is also oxidized in the periplasmic space by the Sox enzymes as proposed for other sulfur oxidizers (Yamamoto, Nakagawa, Shimamura, Takai, & Horikoshi, 2010). Based on genomic sequence analysis and biochemical evidences, it seems that two types of sulfur-related metabolic pathways exist in A. aeolicus: sulfur reduction (with hydrogen) and sulfur/thiosulfate/sulfide oxidation (with oxygen). Metabolism of elemental sulfur is greatly complicated by its activation prior to its utilization. As it was proposed for Acidithiobacillus caldus, the potential use of HdrABC and/or SOR for elemental sulfur oxidation by A. aeolicus remains to be resolved (Mangold et al., 2011). Some catalytic steps during thiosulfate or elemental sulfur oxidation must be identical in particular the final reactions (Fig. 4.11).

5. A MODEL OF INTRICATE BIOENERGETIC PATHWAYS IN AQUIFEX AEOLICUS

As an obligate chemolithoautotroph, A. aeolicus grows using exclusively inorganic compounds. Hydrogen, oxygen, a sulfur compound, and carbon dioxide seem to be required for cell proliferation. Three electron transfer pathways involved in energy conservation were clearly identified to date in A. aeolicus, at least when cultivated in the presence of elemental 0 sulfur: the H2/O2 one, the sulfur-reducing H2/S one, and the sulfur- oxidizing H2S/O2 one. Besides these bioenergetics pathways, putative pathways can be proposed from the genomic sequence analysis: the oxidation of thiosulfate and elemental sulfur, probably both involving the same sulfur species intermediates. Genome sequence information needs to be supplemented by biochemical characterization. A global view of the energy metabolism has been drawn (Fig. 4.11). Thiosulfate and elemental sulfur are available from the environment. Hydrogen sulfide is present in substantial amounts in hydrothermal volcanic systems, but it is a product of enzymatic sulfur reduction as well. It was proposed that in A. ambivalens, Sqr oxidizes sulfide produced by SOR allowing the maximum of energy to be obtained from sulfur compounds (Brito et al., 2009). An analogous process could exist in Aquifex with an energetic coupling between the sulfur reduction and 182 Marianne Guiral et al. oxidation pathways (Prunetti et al., 2010). Sulfur species that might be stored in inclusions could be used by SOR and the sulfur reductase producing hydrogen sulfide that would in turn be used by Sqr to reduce oxygen and produce ATP by the ATP synthase (Guiral et al., 2009; Peng et al., 2006). Hydrogen sulfide might simply diffuse across the membrane without facilitation by membrane channels (Mathai et al., 2009). In addition to the enzymes and proteins detailed above, A. aeolicus possesses a bd-type two-subunit membrane-bound quinol oxidase (CydA or Aq_1357 and CydB or Aq_1358) using quinol and oxygen as substrates. This enzyme was already found to be present in the membrane of the bacterium (Guiral et al., 2009; Scheide, Huber, & Friedrich, 2002). In general, this oxidase has a high affinity for oxygen and has been proposed to scavenge O2 and thereby protects oxygen-sensitive enzymes under micro-oxic growth conditions (Li, Jubelirer, Garcia Costas, Frigaard, & Bryant, 2009). This enzyme could protect cells during oxygen exposure of A. aeolicus which has been described as a microaerophilic microorganism (Deckert et al., 1998). It moreover participated in proton motive force production for ATP synthesis. A. aeolicus has also a NADH- dehydrogenase or complex I which was characterized in detail (Guiral et al., 2009; Peng et al., 2003; Scheide et al., 2002). In mitochondria as well as in numerous microorganisms, the NADH-dehydrogenase, which translocates protons across the membrane, is the first enzyme of the aerobic respiratory chain feeding electrons to quinone pool. The physiological function of this complex is most frequently different in chemolithoautotrophs, where it can function in reverse using some of the þ proton motive force, to produce NADH from NAD (Willey, Sherwood, & Woolverton, 2008). As an autotroph, A. aeolicus needs NADH and ATP to reduce CO2 via the rTCA cycle. The Sqr, present in large quantities in the membrane of the cells, could, as a quinone reducer, be linked to NADH-dehydrogenase and/or quinol oxidase (Fig. 4.9B) in A. aeolicus. The fact that Sqr might be free and associated with the bc1 complex and the ba3 cytochrome c oxidase (Prunetti et al., 2010) allows hypothesizing its involvement in reducing power (NADH) production or even in detoxification of hydrogen sulfide, in addition to energy conservation. Electrons coming from the oxidation of hydrogen by the membrane-bound hydrogenases could also end up reducing NADH-dehydrogenase or quinol oxidase. It is probable that all the putative or characterized energy pathways do not function simultaneously in the A. aeolius cell but more likely run under Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus 183 some specific environmental conditions. In particular, the reduction of sulfur using hydrogen might work at very low oxygen concentrations. It remains completely obscure how the various enzymes involved in energy conservation are regulated, which substrates induce or repress gene expression, or whether they are constitutive. A. aeolicus is the sole organism in which both the sulfur reduction and the sulfur oxidation pathways were demonstrated to be organized in supramolecular protein structures called supercomplexes (see above) (Guiral, Aubert, et al., 2005; Guiral et al., 2009; Guiral, Tron, et al., 2005; Prunetti et al., 2010). This might be related to the extremophilic nature of the bacterium. In addition, the stable association between respiratory complexes might be a way to regulate or guide the electron flow toward a specific pathway.

6. CONCLUDING REMARKS

A. aeolicus, an extreme chemolithotroph isolated from a marine hydrothermal environment, possesses outstanding properties. It has a special phylogenetic position and grows at the highest temperature known for a bacterium. Some of the proteins isolated from this microorganism are thus extraordinarily stable, that is, able to function under harsh conditions of temperature. The molecular basis for adaptation of these proteins to such extreme conditions has met an enhanced knowledge in the last few years. These findings have also attracting issues toward biotechnological devices, which are currently envisaging for health or environmental applications. In particular, hydrogenases from A. aeolicus present high efficiency toward hydrogen oxidation in addition to resistance to oxygen and CO. Conse- quently, they are viewed as excellent catalysts for H2/O2 biofuel cells, in replacement of platinum catalysts. Nowadays, the research faces great improvements in enzyme connection to electrode interfaces that promise development of biofuel cells able to power hundreds of mWcm 2 devices in a very close future. All the A. aeolicus energy-generating mechanisms are not elucidated; however, it seems clear that A. aeolicus presents a versatile metabolism. It can use, through a flexible respiratory system, reduced and oxidized sulfur species, in addition to hydrogen and oxygen as energy substrates. This probably allows the bacterium to adapt to fluctuations of nutrients available in its native habitats. Its potential to gain energy from various substrates and the use of the energy-efficient rTCA cycle for carbon assimilation (low energy demand compared to the Calvin–Benson–Bassham cycle) are probably an 184 Marianne Guiral et al. advantage over other microorganisms (Hu¨gler, Ga¨rtner, & Imhoff, 2010). The challenge in studying the energy metabolism of A. aeolicus comes from the fact that the bacterium requires the three energy compounds, hydrogen, oxygen, and sulfur, at the same time for growth, at least in batch cultures, greatly restricting the possibility of metabolic conditions and electron do- nor/electron acceptor combinations to be studied. Moreover, this leads to energy conservation pathways with many interconnections that require considering the energy metabolism as a whole. No genetics tools are available for this microorganism preventing deletions and in vivo studies, and ob- jectives are thus to develop alternative approaches to describe this complex energy metabolism. Further works are in progress to clarify the physiology of this hyperthermophilic bacterium, particularly the requirement in oxygen supply which may be a key parameter in regulation and functioning of the various respiratory chains. The interconnection between all the electron transfer routes is the next step to understand.

ACKNOWLEDGMENTS We gratefully acknowledge the contribution of Marielle Bauzan (Fermentation Plant Unit, IMM, CNRS, Marseilles, France) for growing the bacteria, Alain Bernadac (IMM, CNRS, Marseilles, France) for the transmission electron microscopy, Sabrina Lignon, Re´gine Lebrun and Re´my Puppo (CNRS, Plate-forme Prote´omique IMM, Marseilles, France) for proteomic analysis. The Proteomic Analysis Center of IFR88 is part of MaP (Marseille Prote´omique, IBiSA). This work was supported by research grants from CNRS, Re´gion PACA and ANR.

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Chapitre II

Recherche d’un niveau d’organisation supérieure dans l’architecture des voies respiratoires chez Aquifex aeolicus

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Résultats et discussion

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Résultats et discussion

Recherche d’un niveau d’organisation supérieure dans l’architecture des voies respiratoires chez Aquifex aeolicus

I) Introduction : Organisation des complexes protéiques membranaires

S‘il est depuis longtemps admis que les enzymes des chaînes respiratoires sont des systèmes redox complexes souvent formés de multiples sous-unités, l‘acceptation de la notion d‘organisation des enzymes de ces chaînes respiratoires en super édifice fonctionnel appelé supercomplexe est, elle, assez récente et a connu une naissance difficile. Proposée pour la première fois à la fin des années 60 lorsque des associations stables des complexes I et III

(complexe bc1), ou II (succinate déshydrogénase) et III des mitochondries avaient été observées (Hatefi and Rieske, 1967; Tisdale, 1967), elle avait été, à l‘époque, rejetée et classée comme artéfact expérimental, puisqu‘en effet, l‘extraction membranaire de ces complexes était alors réalisée à l‘aide de sels biliaires, connus pour promouvoir l‘agrégation des protéines. Le modèle « canonique » de l‘organisation des chaînes respiratoires reposait alors sur le modèle du « fluid state » (Hackenbrock et al., 1986) (Figure 77A), selon lequel les différents complexes diffuseraient de manière libre et indépendante au sein de la membrane.

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A B

Figure 77. Représentation schématique de la chaîne respiratoire mitochondriale dans le modèle en « fluid state » (A) et en « solid state » (B). CI : complexe I ; CII : complexe II ; CIII : complexe III ; CIV : complexe IV ; CV : complexe V ; CoQ : quinone ; cyt c : cytochromes c. (Acin-Perez et al., 2008)

Il avait pourtant été découvert chez Paracoccus denitrificans (Berry and Trumpower, 1985), Bacillus PS3 (Sone et al., 1987), ou encore Sulfolobus (Iwasaki et al., 1995) une association stable des complexes III et IV (cytochrome c oxydase) qui n‘avait rien d‘artéfactuel. Ces structures supramoléculaires avaient cependant été considérées comme des exceptions du monde procaryote qui n‘entamaient pas le dogme du modèle « fluid state » de la mitochondrie.

Il a fallu attendre les années 2000, et plus particulièrement le travail de Schägger et Pfeiffer (Schagger and Pfeiffer, 2000) pour apporter une preuve solide quant à l‘association stable et fonctionnelle des complexes respiratoires de la mitochondrie de levure en un véritable supercomplexe. Au cours des années suivantes, les techniques de microscopie électronique, de cinétique enzymatique ainsi que la solubilisation de ces supercomplexes associée à l‘emploi des gels bleus natifs (gels BN) ont permis de valider définitivement cette organisation en édifices supramoléculaires. Ainsi, un nouveau modèle intégrant ces résultats a pu être développé, et est aujourd‘hui connu sous le nom de modèle du « solid state » (Figure 1B). Cependant, toutes ces études ont également révélé que l‘organisation des supercomplexes respiratoires mitochondriaux présentait des variations selon les organismes, les tissus ou l‘état physiologique de la cellule, en termes de composition et de stœchiométrie (Boekema and Braun, 2007). De plus, des complexes isolés étaient encore visibles. Un nouveau modèle, synthétisant les modèles en « fluid state » et « solid state », a donc été développé pour prendre en compte ces données. Nommé « plasticity model », il propose la coexistence de complexes isolés et des supercomplexes décrits dans la littérature, avec un

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Résultats et discussion processus dynamique, probablement dépendant de l‘état physiologique de la cellule, qui serait à l‘origine de la dissociation et de la formation des super-édifices (Acin-Perez et al., 2008).

Si les preuves de l‘existence des supercomplexes sont aujourd‘hui abondantes, la signification fonctionnelle de ces structures est beaucoup moins claire. Différents avantages et effets de cette architecture ont cependant pu être proposés. Parmi ceux-ci, on retrouve la notion de stabilisation des complexes respiratoires au sein du supercomplexe, la résistance aux espèces réactives de l‘oxygène (pouvant endommager l‘ADN, les protéines et les lipides des cellules) ainsi que la diminution de la formation de ces espèces par les chaînes respiratoires. Ce dernier point est possible grâce à la canalisation du transfert des électrons depuis le donneur primaire jusqu‘à l‘accepteur terminal, qui permettrait également d‘augmenter le flux métabolique, et donc l‘efficacité du système.

Plus récemment, en plus de cette organisation des complexes énergétiques en supercomplexes, un degré supérieur d‘architecture a été proposé, principalement sur la base d‘observations des membranes mitochondriales par cryo-fracture (Bultema et al., 2009; Wittig et al., 2006). Nommés mégacomplexes, ces structures seraient un assemblage spécifique, ordonné linéairement, des supercomplexes respiratoires (Figure 78). Ce type d‘association a également été proposé pour les supercomplexes photosynthétiques des thylakoïdes des plantes (Kouril et al., 2012). Cette notion étant très récente, aucune preuve biochimique de l‘existence de ces mégacomplexes n‘a pour l‘instant été apportée, mis à part la visualisation très récente sur gels bleus natifs modifiés de mégacomplexes respiratoires multimériques de poids moléculaire d‘environ 35 à 45 MDa (Strecker et al., 2010). Il a ainsi été suggéré que les supercomplexes soient des sortes de briques de base des mégacomplexes mitochondriaux. En revanche, aucune observation de ce genre d‘organisation chez les procaryotes n‘a pour l‘instant été rapportée.

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Résultats et discussion

Figure 78. Modèle des supercomplexes inclus dans des mégacomplexes respiratoires. L‘unité de base est constituée par deux copies du complexe I (en bleu), une copie du dimère du complexe III (en rouge) et deux copies du complexe IV (en jaune) (Bultema et al., 2009).

Enfin, en parallèle de ce type d‘organisation en super- et mégacomplexes, une nouvelle notion de compartimentalisation des complexes énergétiques dans la membrane a été introduite très récemment dans la littérature : en effet, au lieu d‘une distribution aléatoire et homogène des protéines, il y aurait des zones (« patchs ») spécialement dédiées à une fonction bien précise, telle que la respiration. Appelées « respirazones », ces sous-compartiments membranaires spécialisés d‘environ 100 nm seraient fortement enrichis en complexes respiratoires et font suite à l‘observation par microscopie à fluorescence de la distribution hétérogène « en zones » de l‘oxydase terminale d‘Escherichia coli dans sa membrane interne (Lenn et al., 2008) (Figure 79). De plus, le même type de technique couplée à des études biochimiques a également montré la présence de « domaines bioénergétiques » chez la cyanobactérie Gloeobacter violaceus (Rexroth et al., 2011), ainsi que des résultats similaires dans la membrane mitochondriale, avec une distribution hétérogène, en patchs, des complexes respiratoires (Muster et al., 2010; Vogel et al., 2006).

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Résultats et discussion

Figure 79. Notion de respirazone chez Escherichia coli. (a) Les respirazones sont des sous-compartiments membranaires (en gris), (b) dans lesquels les composants respiratoires sont hautement concentrés par rapport à la membrane adjacente, (c) ce qui entraîne une optimisation locale du rendement énergétique (Lenn et al., 2008).

De ces travaux ressort la conclusion que les complexes énergétiques des eucaryotes (mitochondries et chloroplastes) et des procaryotes sont organisés de manière bien plus complexe que l‘idée que l‘on s‘en fait habituellement. Il existe ainsi une hiérarchie d‘architecture dans la membrane : les enzymes respiratoires possèdent déjà un certain degré de complexité, puisque ce sont des complexes redox formés par plusieurs sous-unités, comme le complexe I de la mitochondrie, par exemple, qui en contient 45 (Carroll et al., 2006). Ces complexes vont s‘assembler pour former des supercomplexes (par exemple composé des complexes I, III et IV), lesquels peuvent à leur tour former des mégacomplexes (structure linéaire composée d‘un enchainement de supercomplexes) (Figure 80).

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Figure 80. Les différents niveaux d’organisation des complexes énergétiques. A, les complexes énergétiques isolés peuvent s‘associer en B, un supercomplexe, lui-même unité de base des mégacomplexes, C (d‘après (Acin-Perez et al., 2008) et (Bultema et al., 2009)).

A un degré encore supérieur, des sous-compartiments enrichis en complexes respiratoires peuvent être trouvés dans les membranes. De plus, ces états ne semblent pas figés, mais bien au contraire dynamiques, avec une inter-conversion des complexes et des supercomplexes, et donc probablement dissociation/formation de mégacomplexes et/ou de respirazones, l‘état physiologique de la cellule jouant probablement le rôle de modulateur. Ces dernières notions étant encore très récentes, les preuves biochimiques ne sont pas particulièrement abondantes, les modèles étant essentiellement fondés sur de la cryomicroscopie électronique et de la microscopie à fluorescence. De plus amples études doivent être menées afin de confirmer ce qui tient aujourd‘hui plus du modèle que de la certitude établie.

Comparativement aux eucaryotes, il existe finalement peu de supercomplexes décrits chez les procaryotes. Dans le cas d‘Aquifex aeolicus, la présence de deux supercomplexes membranaires fonctionnels, caractérisés et purifiés par l‘équipe, est tout à fait exceptionnelle. Le premier associe une hydrogénase (orientée vers le périplasme) à une soufre réductase (orientée vers le cytoplasme) (Guiral et al., 2005b) ; le second est composé d‘une sulfure quinone oxydoréductase (SQR), d‘un dimère de complexe bc1 (complexe III) et d‘une cytochrome c oxydase (complexe IV) (Prunetti et al., 2010). Ces supercomplexes respiratoires, représentant respectivement une voie hydrogène/soufre et une voie soufre/oxygène, sont très stables grâce aux interactions fortes entre les protéines dues au caractère hyperthermophile de la bactérie, ce qui a permis une purification de ces supercomplexes en l‘état. Ils représentent donc un modèle de choix pour l‘étude de l‘organisation architecturale des complexes respiratoires bactériens. En nous basant sur les récentes données de la littérature, nous avons voulu savoir si les voies énergétiques d‘Aquifex

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Résultats et discussion aeolicus pouvaient présenter des degrés encore plus élevés d‘organisation. De plus, là où la littérature ne propose que l‘existence de ce que nous pouvons appeler des « homo- mégacomplexes », constitués de la répétition d‘un même supercomplexe (l‘hypothèse des mégacomplexes n‘a été proposée que chez les mitochondries et les chloroplastes pour lesquelles il n‘existe qu‘une seule chaîne de transfert d‘électron), nous nous interrogeons sur l‘existence « d‘hétéro-mégacomplexes ». En effet, il faut noter que le complexe hydrogénase / soufre réductase consomme entre autre des chaînes de soufre pour donner du sulfure d‘hydrogène H2S. Ce même H2S est substrat de la SQR du second supercomplexe, laquelle va produire à son tour des chaînes de soufre (Figure 76). Il n‘est pas illogique de penser à un

éventuel couplage entre les deux voies. L‘H2S réagissant facilement avec l‘oxygène (nécessaire à la bactérie), un moyen de canaliser efficacement ce substrat pourrait être une association des deux supercomplexes en un hétéro-mégacomplexe. La présence d‘autres enzymes et complexes respiratoires (comme le complexe I et l‘ATPsynthase) dans les membranes de la bactérie pose également la question de leur incorporation dans d‘éventuelles structures supra-moléculaires.

Nous avons choisi une stratégie combinant plusieurs approches pour tenter de répondre à ces questions. Au sein de ce projet, mon travail a porté sur la recherche de structures protéiques de très haut poids moléculaire, en combinant des approches de solubilisation de membranes, migration et activités enzymatiques sur gels bleus natifs, à des analyses par spectrométrie de masse. Des verrous techniques étaient à lever, comme le développement de gels bleus natifs à larges pores, pour mettre en évidence des mégacomplexes.

II) Développement et optimisation de gels natifs pour la visualisation de mégacomplexes

De manière concrète, l‘une des méthodes les plus directes pour identifier des mégacomplexes membranaires consiste à les visualiser sur gel bleu natif (voir section

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Résultats et discussion

Matériel et Méthodes). En effet, ce type de gels permet de conserver l‘état natif des protéines, et donc l‘intégrité des complexes protéiques, tout en déterminant avec une certaine précision leur masse moléculaire. Cette technique est bien maitrisée au laboratoire et a notamment permis la mise en évidence et la caractérisation des supercomplexes d‘Aquifex aeolicus. Cependant, les gels classiquement utilisés (gradient de 4 à 15% d‘acrylamide) jusqu‘à présent étaient optimisés pour une gamme de masses moléculaires allant de 30 à 800 kDa environ (Figure 81C). Notre objectif a donc été dans un premier temps de développer une approche permettant de visualiser des mégacomplexes de masse moléculaire supérieure à 1 MDa.

En toute première approche, nous avons simplement modifié le gradient d‘acrylamide, pour travailler avec des gels 3-13%. Ceci a permis d‘obtenir des gels capables de séparer efficacement des complexes plus lourds, légèrement supérieurs au MDa (Figure 81A), cette amélioration étant déjà suffisante pour débuter l‘étude de l‘organisation des complexes énergétiques de la bactérie.

Figure 81. Comparaison de la migration des marqueurs de masses moléculaires sur gels bleus natifs 3- 13% à base d’acrylamide commercial (A) ou de mélange AB3 (B). Un gel BN « classique » 4-15% d’acrylamide est représenté à titre de contrôle (C). Les masses sont données en kDa à gauche de chaque gel.

Cependant, la diminution de la concentration d‘acrylamide (passage d‘un gradient 4- 15% à un gradient 3-13%) s‘est faite au détriment de la solidité du gel, celui-ci devenant plus

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Résultats et discussion fragile et difficile à manipuler. Cependant, le protocole de référence des gels bleus natifs (Wittig et al., 2006) parle de séparation de protéines entre 100 kDa et 10 MDa pour un gel 3- 13%, résolution que nous ne sommes pas parvenus à obtenir. Il existe de légères différences entre ce protocole et celui que nous avons utilisé au laboratoire, notamment en ce qui concerne le mélange d‘acrylamide employé. En effet, le protocole mentionne l‘emploi d‘un stock (nommé AB3) 49,5% T, 3% C, où, selon la nomenclature classique (Hjerten, 1962), T représente la concentration totale des monomères d‘acrylamide et de bisacrylamide (agent réticulant permettant la formation du gel) et C le pourcentage de bisacrylamide par rapport au total des deux espèces. Ce stock est donc préparé en mélangeant 48 g d‘acrylamide et 1,5 g de bisacrylamide dans 100 ml d‘eau. Le stock commercial que nous utilisons est à environ 2,6% C. Si cette différence semble minime, elle pourrait tout de même avoir un impact sur la solidité des gels qui seraient alors plus facilement manipulables que ceux que nous obtenions de manière classique. Nous avons donc préparé notre propre stock 3% C à l‘aide d‘acrylamide et bisacrylamide en poudre pour préparer de nouveaux gels (notés AB3, Table 6). S‘il n‘y a pas de différence majeure dans le profil de migration comparé aux gels classiques utilisant l‘acrylamide commercial (2,6% C) (Figure 81 A et B), leur rigidité a été accrue, et leur manipulation en est devenue plus aisée, autorisant par là-même leur emploi pour des tests enzymatiques sur gel.

Type de gel %T %C Gamme de Poids Moléculaire

Classique 4-15 2,6 30 à 800 kDa

AB3 3-13 3 100 à 10MDa

BNPL 3-9 20-6 100 à 25MkDa

Table 6 : Caractéristiques des différents types de gels bleus natifs utilisés. %T représente le pourcentage en acrylamide et bisacrylamide et %C le pourcentage en bisacrylamide par rapport au total des deux. La gamme de poids moléculaire correspond au pouvoir résolutif des gels estimé dans la littérature.

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Résultats et discussion

III) Préparation et optimisation des échantillons pour la détection de mégacomplexes

Les gels ayant été optimisés, la question de la préparation des échantillons a pu être abordée. Des études antérieures avaient montré l‘influence de la nature et de la concentration du détergent utilisé pour la solubilisation des protéines membranaires sur la conservation de l‘intégrité des complexes énergétiques (Guiral et al., 2009). La mise en évidence des mégacomplexes nécessitant de conserver au mieux les interactions protéines-protéines, nous avons choisi, au cours d‘un premier crible, d‘utiliser des détergents non-ioniques (le DDM, le Tween 20 et le Triton X-100), connus pour être particulièrement peu dénaturants envers les complexes membranaires. Nous avons également utilisé un détergent anionique (le Sarkosyl NL) ne solubilisant que les protéines de la membrane interne. Les concentrations protéiques ont été ajustées à 10 mg.ml-1 avant de réaliser les solubilisations avec du Triton X-100 (2%), du Sarkosyl NL (2%), du Tween 20 (2%) et du DDM (0,5%) (condition très « douce »). Les résultats présentés Figure 82A, obtenus après coloration des protéines au bleu de Coomassie, ne montrent pas de différences majeures dans la migration des complexes solubilisés dans les différentes conditions. Il peut cependant être noté la présence d‘une bande protéique de plus d‘un MDa (montrée par une flèche) visible dans toutes les conditions, mais principalement après solubilisation au DDM et au Triton X-100. Des activités cytochrome c oxydase (complexe IV), NADH déshydrogénase (complexe I), SQR et hydrogénase ont été réalisées sur ces échantillons directement sur gel (Figure 82 B-E). On constate cette fois-ci des différences entre les conditions de solubilisation. Concernant l‘activité NADH déshydrogénase, une bande présente dans toutes les conditions à environ 350 kDa (flèche 1) correspond probablement à un sous-complexe actif du complexe I déjà observé auparavant (Guiral et al., 2009). Des bandes supplémentaires ont été détectées dans les fractions DDM et Sarkosyl NL à des tailles plus élevées (environ 750 et 900 kDa pour le DDM, flèches 2 et 3 respectivement, et 650 et 800 kDa pour le Sarkosyl NL, flèches 4 et 5 respectivement) et pourraient correspondre au complexe I entier, celui-ci ayant déjà été détecté à une taille d‘environ 650 kDa (Guiral et al., 2009). Les bandes plus hautes pourraient être liées à l‘association du détergent avec les protéines modifiant les propriétés de migration, ou à

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Résultats et discussion l‘association du complexe I avec d‘autres protéines. L‘analyse de ces différentes bandes par spectrométrie de masse de type trappe à ions n‘a malheureusement pas pu nous permettre d‘identifier de nouveaux partenaires potentiels, puisqu‘aucune protéine n‘a pu être identifiée en raison d‘une trop faible quantité de matériel à analyser. L‘activité hydrogénase montre également des bandes de différentes tailles dont certaines (flèches 6 et 7) pourraient correspondre à des multimères d‘hydrogénase (chaque monomère du complexe hydrogénase ayant une masse moléculaire d‘environ 130 kDa) ou à leur association avec d‘autres protéines. Le profil obtenu après solubilisation par du Sarkosyl est similaire bien qu‘il apparaisse que les différentes bandes protéiques portant une activité hydrogénase soient déplacées vers le haut du gel. L‘activité SQR montre une bande d‘activité qui co-localise avec l‘activité cytochrome c oxydase du complexe IV (panel D et E, piste 1, flèche 8), et qui pourrait être due au supercomplexe SQR-bc-oxydase déjà caractérisé (Prunetti et al., 2010) ; les autres bandes actives correspondent probablement aux différents multimères (SQR monomérique = 48 kDa) de la SQR libre. Enfin, dans le cas de l‘activité cytochrome c oxydase, on observe clairement des bandes de très haut poids moléculaire dans chaque condition de solubilisation, mis à part le sarkosyl NL (flèches 9). Les bandes actives observées plus haut correspondent à des agrégats qui sont à peine rentrés dans le gel et ne peuvent donc pas être prises en compte. L‘analyse par spectrométrie de masse de type trappe à ions de la bande issue de la solubilisation au DDM (piste 1, flèche 9) a permis l‘identification de plusieurs protéines, dont deux sous-unités de l‘ATPsynthase (complexe V), une protéine hypothétique Aq_1760, une cytochrome c peroxydase ainsi que le cytochrome c et la protéine de Rieske du complexe bc1 (Table 7). De manière étonnante, on ne retrouve aucune protéine de la cytochrome c oxydase justifiant l‘activité observée sur le gel ; cependant, la présence de protéines du complexe bc1, que l‘on retrouve toujours associé à la cytochrome c oxydase dans les membranes d‘Aquifex aeolicus, laisse penser que le complexe IV est effectivement présent bien que non identifié par spectrométrie de masse.

L‘ensemble de ces résultats sont en accord avec ceux précédemment obtenus au laboratoire sur l‘existence de complexes et supercomplexes actifs (Guiral et al., 2009; Prunetti et al., 2010). De plus, l‘utilisation de ce nouveau type de gel a permis l‘identification d‘un complexe de haut poids moléculaire présentant une activité cytochrome c oxydase, qui semble parfaitement répondre à la notion de mégacomplexe.

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Résultats et discussion

Figure 82. Séparation des protéines membranaires solubilisées par gels BN AB3. 50 µg de membranes solubilisées au DDM 0,5% (piste 1), Sarkosyl NL 2% (piste 2), Tween 20 2% (piste 3), Triton X-100 2% (piste 4), sont chargés sur gel bleu natif, et sont colorées au bleu de coomassie (A) ou révélées par activité NADH déshydrogénase (B), hydrogénase (C), SQR (D) et cytochrome c oxydase (E). Les masses sont données en kDa à gauche de chaque gel.

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Résultats et discussion

Nom de la protéine Gène Numéro d’identification NCBI Nb de Nb de Peptides Peptides Totaux Uniques

F1 ATP synthase alpha, central domain atpA 3913127 15 9

Hypothetical protein Aq_1760 aq_1760 15606825 15 5

F1 ATP synthase beta subunit atpD 3913128 9 4

Cytochrome c cyc 15605643 7 3

Cytochrome c peroxidase cpx 15605716 9 3

Hypothetical protein Aq_1558 aq_1558 15606693 4 2

Rieske-I iron sulfur protein petA 15605645 4 2

Table 7 : Résultats d’analyses de Spectrométrie de masse de type trappe à ions. Analyse réalisée sur la bande protéique (flèche 9) révélée au bleu de Coomassie du gel de la figure 6E.

IV) Développement des gels natifs à larges pores pour la visualisation des mégacomplexes

Les premiers résultats sont prometteurs, toutefois, le problème principal réside encore dans le pouvoir résolutif du gel : en effet, l‘activité cytochrome c oxydase « lourde » se trouve très haut dans le gel, juste après le gel de concentration, et se présente comme un signal plutôt diffus sous lequel pourraient se trouver plusieurs bandes distinctes. Nous avons donc décidé de poursuivre ces travaux en développant des gels permettant une meilleure résolution des complexes de haut poids moléculaire.

Récemment, un nouveau type de gel BN modifié, capable de séparer des complexes protéiques de taille supérieure à 10 MDa, a été développé (Strecker et al., 2010). Cette innovation repose sur des travaux bien plus anciens qui avaient étudié l‘effet de la proportion de l‘agent réticulant, le bisacrylamide, sur la porosité des gels de polyacrylamide (Righetti et al., 1981; Ruchel et al., 1978). Il avait été ainsi démontré que diminuer la concentration en acrylamide d‘un gel en augmentait la porosité, mais aussi que d‘une manière assez

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Résultats et discussion paradoxale, l‘augmentation de la proportion de bisacrylamide par rapport au total des deux monomères (le pourcentage de C) au-delà d‘une certaine valeur augmentait cette porosité de manière non négligeable (Figure 83). Ce principe a été mis en application dans le protocole proposé par Strecker et collaborateurs (Strecker et al., 2010) (Strecker et al 2010) et a donné naissance à des gels dont le pourcentage de C varie le long du gel, permettant ainsi la migration de gros complexes protéiques (jusqu‘à 45 MDa) tout en leur conservant un caractère manipulable.

Figure 83. Différents gels de polyacrylamide observés en microscopie électronique en transmission. Les valeurs sont montrées en tant que %T/%C. La concentration d‘acrylamide + bisacrylamide (T) augmente de gauche à droite, avec la concentration de bisacrylamide par rapport au total des deux monomères (C) constante, diminuant ainsi la prorosité du gel. A l‘inverse, quand T est constant et C augmente (représentation verticale), la taille des pores du gel augmente. D‘après Rüchel et al, 1978.

Nous avons donc mis en place cette nouvelle technique, désignée ci-après comme gels BNPL (pour gels bleus natifs à pores larges, Table 6), en réalisant un gradient de [3% T, 20%C] à [9% T, 6%C] destiné à séparer des protéines jusqu‘à 25 MDa. Les résultats Figure 84 montrent qu‘une meilleure résolution des hauts poids moléculaires est atteinte de manière satisfaisante.

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Résultats et discussion

Figure 84. Migration de marqueurs de masses moléculaires sur gel bleu natif à pores larges (A).Un gel BN « classique » 4-15% d’acrylamide est représenté à titre de contrôle (B). Les masses sont données en kDa à gauche du gel.

Nous avons également souhaité élargir notre gamme de conditions de solubilisation, afin de trouver celles où des superstuctures protéiques seraient conservées. Nous avons donc de nouveau utilisé le DDM, le Tween 20, et le Triton X100, ainsi que le Nonidet P40 (non ionique) et la Digitonine (couramment employée pour isoler les complexes et supercomplexes mitochondriaux). De plus, la concentration du détergent ayant une influence directe sur la conservation de l‘intégrité des complexes énergétiques (Guiral et al., 2009), nous avons testé deux concentrations différentes de chaque détergent (0,5 et 3%) pour solubiliser les protéines membranaires. Enfin, les mégacomplexes étant des structures très « lourdes », ils peuvent être perdus à la suite d‘une ultracentrifugation trop longue et trop rapide des membranes solubilisées (voir section Matériel et Méthodes). Le protocole de récupération des protéines solubilisées a donc été modifié en conséquence en diminuant la durée et la vitesse d‘ultracentrifugation (Wittig et al., 2006). Les résultats Figure 85 sont intéressants à plusieurs niveaux : en premier lieu, une bande d‘environ 2 MDa (flèche 1) est présente dans toutes les conditions testées. Ensuite, dans certaines conditions, une bande supplémentaire d‘1 MDa environ est détectée (flèche 2).

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Résultats et discussion

Figure 85. Séparation des protéines membranaires solubilisées par gels BN à pores larges. 75 µg de membranes solubilisées dans différentes conditions sont chargés sur le gel. Les protéines sont colorées au bleu de coomassie. Les masses sont données en kDa à gauche de chaque gel. 1, DDM 0,5% ; 2, DDM 3% ; 3, Tween 20 0,5% ; 4 Tween 20 3% ; 5, Triton X-100 0,5% ; 6, Triton X-100 3% ; 7, Nonidet P40 0,5% ; 8, Nonidet P40 3% ; 9, digitonine 0,5% ; 10, digitonine 3%.

Nous avons testé sur certains de ces échantillons trois activités enzymatiques sur gel (Figure 86). L‘activité NADH déshydrogénase a donné un résultat attendu, avec une activité correspondant au sous-complexe (350 kDa, panel A, flèche 1) et au complexe entier (650 kDa, panel A, flèche 2) pour les deux conditions testées ; en revanche les activités hydrogénase et cytochrome c oxydase ont dévoilé des profils très intéressants, puisque deux bandes d‘environ 1 MDa sont révélées en activité hydrogénase lorsque la solubilisation a été effectuée avec du Nonidet P40 (panel B, piste 2, flèche 3), ainsi que des bandes d‘environ 800 kDa, 1 MDa (flèches 4 et 5) et de manière plus faible 2 MDa (flèche 6) en activité cytochrome c oxydase pour les deux conditions testées. Il faut également noter que le supercomplexe SQR-bc-oxydase (taille observée sur gel : environ 450 kDa, Figure 82 panel D piste 1) n‘est pas révélé par cette dernière activité ce qui peut suggérer qu‘il n‘ait pas été solubilisé dans les conditions testées, ou un état d‘oligomérisation ou d‘association avec d‘autres protéines, pouvant donner les hauts poids moléculaires observés. Enfin, le résultat fourni par l‘activité hydrogénase doit être modéré, puisque le même test répété quelques jours plus tard sur le même échantillon ne révèlera pas les bandes de 1 MDa : sa présence initiale peut être artéfactuelle (artéfact de migration par exemple), on peut aussi supposer que le complexe dont

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Résultats et discussion l‘hydrogénase fait partie aurait tendance à se décomposer en ses éléments de base au cours du temps.

Figure 86. Recherche de mégacomplexes sur gel bleu natif à pores larges. 75 µg de membranes solubilisées sont chargés sur gel bleu natif à pores larges, et les protéines sont révélées par activité NADH déshydrogénase (A) hydrogénase (B) et cytochrome c oxydase (C). Les masses sont données en kDa à gauche du gel 75 µg de membranes solubilisées sont chargés sur le gel. Les masses sont données en kDa à gauche du gel. 1, Tween 20 3% ; 2, Nonidet P40 3%.

Les trois bandes (2 MDa, 1 MDa et 800 kDa) issues de la solubilisation au Nonidet P40 ont été découpées du gel coloré au bleu de Coomassie, et analysées par spectrométrie de masse de type trappe à ions. Les résultats n‘ont malheureusement pas été concluants, aucune protéine n‘ayant été identifiée. Les protéines membranaires, à cause de leurs zones hydrophobes et de la difficulté de les ioniser, sont connues pour répondre assez mal aux analyses de spectrométrie de masse. De plus, la masse moléculaire importante de ces complexes rajoute encore un niveau de complexité. Il a donc fallu employer une technique plus sensible et précise que la trappe à ions pour obtenir des résultats fiables, et une nouvelle analyse par spectrométrie de masse de type orbitrap a été menée. Grâce à cette stratégie, de nombreuses protéines ont pu être identifiées. Concernant la bande de 800 kDa, les protéines majoritaires sont des contaminants souvent retrouvés dans les préparations de membranes solubilisées d‘Aquifex aeolicus, puisque l‘on retrouve essentiellement des protéines ribosomales, ainsi que des protéines du flagelle (Table 7A). Cette constatation est également

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Résultats et discussion valable pour la bande de 1 MDa (Table 7B). Mais dans les deux cas, on retrouve une cytochrome c peroxydase qui pourrait expliquer la forte activité cytochrome c oxydase observée sur le gel. L‘activité cytochrome c peroxydase (réduction de l‘H2O2 grâce aux électrons d‘un cytochrome c) pourrait être révélée de manière aspécifique par le test utilisé pour la cytochrome c oxydase (réduction de l‘O2 grâce aux électrons d‘un cytochrome c). La bande de 2 MDa (Table 7C) contient quelques protéines ribosomales, une protéine de membrane externe et la même cytochrome c peroxydase précédemment identifiée, mais surtout des protéines du flagelle et la protéine hypothétique Aq_1760. Cette dernière fera l‘objet d‘une étude plus approfondie, exposée dans la partie III des résultats de cette thèse. D‘autre part la présence de la cytochrome c peroxidase était intrigante : il a récemment été montré que ce type de protéine pouvait jouer un rôle non conventionnel d‘accepteur terminal d‘électrons dans les chaînes respiratoires (Strazdina et al., 2012), nous nous étions donc interrogés dans un premier temps sur la possibilité d‘une association de cette protéine avec des enzymes des voies respiratoires, et donc de son implication dans le métabolisme énergétique d‘Aquifex aeolicus. La non-reproductibilité dans la détection avec un seuil convenable des enzymes du métabolisme énergétique et une première analyse in silico de cette cytochrome c peroxydase révèlant qu‘elle serait soluble, laissent cette hypothèse en suspend.

V) Impact des conditions de culture sur la présence des superédifices

Il a été proposé que l‘état physiologique de la cellule influe sur l‘organisation supra- moléculaire des chaînes respiratoires de la mitochondrie ; de même, la notion de « respirazone » implique également une optimisation du métabolisme énergétique. Il n‘est donc pas illogique de penser qu‘une bactérie en phase exponentielle de croissance, et donc ayant des besoins en énergie très importants, soit plus susceptible de présenter des degrés supérieurs d‘architecture de ses complexes énergétiques. Nous avons testé cette hypothèse en parallèle de nos autres expériences. Pour cela, nous avons utilisé des cellules d‘Aquifex

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Résultats et discussion aeolicus qui ont été cultivées dans des conditions de croissance particulières grâce à une collaboration avec l‘équipe de Y. Combet-Blanc et R. Auria (Institut Méditerranéen d‘Océanologie, Marseille). Les bactéries ont été cultivées en fermenteur, en présence de thiosulfate (la fleur de soufre insoluble posant des problèmes d‘ordre technique), et d‘un flux d‘oxygène étroitement contrôlé pour en rendre la concentration constante et optimale pour la croissance de la bactérie. En milieu de phase exponentielle de croissance, la culture a été arrêtée, les cellules récoltées et congelées à -80°C. Nous avons alors appliqué le même protocole de solubilisation des membranes, à l‘aide de Tween 20 et de Nonidet P40 3%, ces deux détergents ayant été ceux pour lesquels les résultats avaient été les plus probants au cours du développement du mode opératoire. La migration sur gel de ces fractions ainsi que les activités enzymatiques sont présentées Figure 87. Ainsi, les profils obtenus par coloration des protéines ou par activités ne semblent pas vraiment différents de ce qui avait été précédemment obtenu, ne nous permettant pas d‘identifier des complexes uniquement présents en phase exponentielle de croissance de la bactérie, ou dans les conditions de croissance particulières utilisées ici.

Figure 87. Recherche de mégacomplexes dans des cellules d’Aquifex aeolicus récoltées en milieu de phase exponentielle de croissance. 75 µg de membranes solubilisées sont chargés sur gel bleu natif à pores larges, et les protéines sont colorées au bleu de coomassie (A) ou révélées par activité hydrogénase (B), NADH déshydrogénase (C) et cytochrome c oxydase (D). Les masses sont données en kDa à gauche du gel. 1, Tween 20 3% ; 2, Nonidet P40 3%.

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A Nom de la protéine Gène Numéro d’identification Nb de Nb de NCBI Peptides Peptides Totaux Uniques Cytochrome c peroxidase cpx 15605716 115 44 50S ribosomal protein L3 rplC 15605616 109 26 50S ribosomal protein L1 rplA 15606946 69 29 50S ribosomal protein L4 rplD 15605617 61 24 50S ribosomal protein L2 rplB 15605619 59 29 Hypothetical protein Aq_1862 aq_1862 15606901 56 28 50S ribosomal protein L18 rplR 15606750 54 10 50S ribosomal protein L10 rplJ 15606947 49 25 50S ribosomal protein L9 rplI 15607017 49 22 FOF1 ATP synthase subunit beta atpD 15607015 43 28 50S ribosomal protein L7/L12 rplL 15606948 42 15 50S ribosomal protein L6 rplF 15606751 38 20 50S ribosomal protein L21 rplU 15606746 36 12 Hypothetical protein Aq_1345 aq_1345 15606901 33 20 FOF1 ATP synthase subunit alpha atpA 15606090 32 23 50S ribosomal protein L14 rplN 15606756 31 11 Dihydrodipicolinate reductase dapB 15606245 29 21 50S ribosomal protein L5 rplE 15606754 29 15 Flagellin fliC 15606990 21 20 B Nom de la protéine Gène Numéro d’identification Nb de Nb de NCBI Peptides Peptides Totaux Uniques 50S ribosomal protein L3 rplC 15605616 103 29 50S ribosomal protein L1 rplA 15606946 102 30 flagellin fliC 15606990 100 26 Cytochrome c peroxidase cpx 15605716 90 44 Hypothetical protein Aq_1862 aq_1862 15606901 89 32 50S ribosomal protein L7/L12 rplL 15606948 89 17 ATP-dependant Clp protease clpC 15606509 86 54 3-dehydroquinate synthase aq_1922 15606938 86 32 ribosomal protein S01 rpsA 15606647 69 51 50S ribosomal protein L10 rplJ 15606947 65 29 50S ribosomal protein L24 rplD 15605617 59 23 50S ribosomal protein L2 rplB 15605619 56 28 DNA gyrase A subunit gyrA 15606292 52 41 Flagellar hook protein FlgE flgE 15606898 51 30 DNA-directed RNA polymerase beta rpoB 15606949 50 41 prime subunit RNA polymerase beta prime subunit rpoC 15606950 48 6 50S ribosomal protein L18 rplR 15606750 46 8 Hypothetical protein Aq_1760 aq_1760 15606825 35 22 FOF1 ATP synthase subunit alpha atpA 15606090 33 25

C Nom de la protéine Gène Numéro d’identification Nb Nb de NCBI dePeptides Peptides Totaux Uniques Hypothetical protein Aq_1760 aq_1760 15606825 16 14 flagellin fliC 15606990 13 9 50S ribosomal protein L2 rplB 15605619 10 7 Hypothetical protein Aq_331 aq_331 15605849 5 3 Outer membrane protein C ompC 15605995 4 3 50S ribosomal protein L1 rplA 15606946 4 3 FOF1 ATP synthase subunit alpha atpA 15606090 4 2 Cytochrome c peroxidase cpx 15605716 3 2 Hypothetical protein Aq_1345 aq_1345 15606901 3 1

Table 7 : Résultats d’analyses de Spectrométrie de masse de type OrbiTrap. Analyse réalisée sur les bandes protéiques révélées au bleu de Coomassie à 0,8 MDa (A) ; 1MDa (B) et 2 MDa (C) du gel de la figure 85. Moins d’échantillons avaient été analysés dans le cas de la bande à 2MDa expliquant le plus faible nombre de peptides obtenus.

Résultats et discussion

VI) Discussion

Les notions de mégacomplexes et de respirazones sont encore très récentes, et leur mise en évidence par des preuves biochimiques est loin d‘être triviale. Le travail exposé ici représente la première étape d‘un projet visant à étudier l‘organisation architecturale des complexes énergétiques en prenant une bactérie pour modèle. Notre positionnement présente plusieurs originalités par rapport à la littérature : en premier lieu, le choix du modèle d‘étude, une bactérie hyperthermophile présentant un métabolisme énergétique non conventionnel par rapport aux mitochondries et aux chloroplastes couramment étudiés, et dont l‘organisation en supercomplexes est bien établie ; le choix des techniques ensuite : en effet, les gels bleus natifs à pores larges sont une évolution très récente des gels bleus natifs classiquement utilisés dans l‘étude des protéines membranaires. A ce jour en effet, une seule publication portant sur l‘assemblage supramoléculaire d‘aquaporines humaines mentionne l‘emploi de tels gels (Jin et al., 2011), mais leur pouvoir résolutif pourrait constituer un outil de choix pour toutes les équipes travaillant sur des complexes protéiques de haut poids moléculaire. L‘emploi de la spectrométrie de masse de type orbitrap pour l‘identification de protéines membranaires et de structures « lourdes », bien plus précise et sensible que la trappe à ions, est également une nouveauté à notre échelle, et représente une évolution de nos techniques d‘analyse en lien avec les nouveaux besoins découlant de la thématique abordée. Nous pensons donc que le choix et la mise au point de ces techniques et de ce mode opératoire représentent une étape clé pour les futures expériences qui seront menées au laboratoire.

Plusieurs verrous ont également été dévoilés par ce travail. L‘un des points principaux concerne la préparation de l‘échantillon proprement dit : si nous avons bien obtenu des associations protéiques de haut voire très haut poids moléculaire, un certain nombre sont composées de protéines solubles. En effet, ces résultats pointent le fait que lors de la préparation d‘un échantillon de membranes, on retrouve des ribosomes, des RNA polymérases… En conséquence, les résultats de spectrométrie de masse font apparaitre la présence de protéines du cytoplasme et du périplasme qui, présentes en grande quantité, peuvent « masquer » la détection des protéines membranaires présentes peut-être en plus faible quantité et surtout dont l‘identification par spectrométrie de masse est plus difficile. Ainsi, certains résultats suggéraient la présence de protéines respiratoires (plusieurs sous-

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Résultats et discussion

unités du complexe I et de l‘ATPsynthase, protéines du supercomplexe SQR-bc1-oxydase…) dans les bandes analysées, mais si l‘on se réfère aux critères d‘acceptabilité de la spectrométrie de masse (nombre de peptides…) il est impossible de conclure à la présence ou à l‘absence de ces protéines du métabolisme énergétique dans les bandes analysées. Mais si l‘on parvenait à résoudre ce problème de contamination, l‘analyse des profils sur gels serait beaucoup plus aisée et souffrirait de moins d‘ambiguïtés. Le lavage au NaBr des membranes avant leur solubilisation, étape permettant d‘éliminer les protéines interagissant transitoirement avec la membrane, mais également les éventuels contaminants, a été testé au cours de cette étude. Cependant, ce traitement est connu pour dissocier des interactions faibles entre protéines, et nous pensons qu‘il pourrait avoir un effet délétère sur les mégacomplexes. De fait, cette stratégie n‘a apporté aucun élément nouveau. Un traitement plus doux, comme le dépôt des membranes non-solubilisées sur un coussin de sucrose par exemple permettrait probablement d‘éliminer la plus grande part des contaminants solubles en respectant l‘intégrité de l‘organisation de la membrane. Les futures recherches doivent également porter sur les conditions de solubilisation. En revanche, le temps de solubilisation ne semble pas avoir d‘effet majeur, des temps de 5 ou 30 minutes ayant donné des profils strictement similaires. Enfin, il faut se rappeler que certains résultats obtenus par les tests d‘activité hydrogénase notamment, semblaient suggérer sa présence au sein de complexes plus lourds que ceux habituellement observés. Cette piste plus prometteuse doit également être explorée.

En dernier lieu, ce travail est à remettre dans le contexte plus général du projet mené dans l‘équipe, puisque d‘autres expériences, utilisant d‘autres techniques et d‘autres approches sont actuellement menées en parallèle. Les premiers résultats de l‘une d‘entre elles semblent suggérer un possible enrichissement de zones membranaires restreintes en SQR et en hydrogénase, ce qui pourrait aller dans le même sens que les « respirazones » proposés chez Escherichia coli.

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Résultats et discussion

Chapitre III

Mise en évidence d’un nanocompartiment protéique et de sa ferritine atypique chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus

(Article en préparation)

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Résultats et discussion

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Résultats et discussion

Mise en évidence d’un nanocompartiment protéique et de sa ferritine atypique chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus

Clément AUSSIGNARGUES, Marianne ILBERT, Marianne GUIRAL, Elisabeth LOJOU, Pascale INFOSSI et Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI

Introduction

Dans la nature, les exemples de protéines capables de s‘auto-assembler en nano- ou microcompartiments ne sont pas rares. Ces protéines peuvent être à vocation structurales (comme les capsides des virus) ou enzymatiques. Dans ce dernier cas, les ferritines sont l‘un des systèmes les mieux documentés. Elles constituent une immense famille représentée dans les trois domaines de la vie et ont pour rôle d‘oxyder le fer ferreux en fer ferrique au niveau d‘un centre ferroxydase binucléaire, afin de le stocker à l‘intérieur de la sphère qu‘elles forment en s‘assemblant en homomultimères. Ce stockage peut intervenir dans différents contextes suivant les organismes et les conditions de croissance. Ainsi, les ferritines peuvent être impliquées dans la réponse à une surabondance ou une carence en fer, un moyen de protection contre le stress oxydant ou encore de manière plus générale une réserve de fer bio- disponible pour l‘organisme hôte, qui pourra l‘utiliser par exemple dans les voies de biosynthèses des protéines nécessitant ce métal (Smith, 2004). En effet, à pH physiologique et en présence d‘oxygène, le fer se retrouve sous la forme majoritaire de fer (III) ferrique, très peu soluble et donc peu bio-disponible (Carrondo, 2003). En revanche, sous forme de fer (II) ferreux, il peut réagir avec le peroxyde d‘hydrogène produit par le métabolisme pour donner des espèces réactives de l‘oxygène très dommageables pour la cellule (réaction de Fenton) (Andrews, 1998). Les ferritines permettent donc à la fois de conserver une source de fer non dangereuse à l‘intérieur de la cellule, mais aussi de lutter contre le stress oxydatif (Yamamoto et al., 2004). Chez les bactéries, trois types de ferritines sont principalement retrouvés : les ferritines bactériennes, les bactérioferritines et les DPS (DNA binding protein from starved cells). Les deux premiers types s‘associent en une sphère creuse de 24 sous-unités mais diffèrent par la fixation d‘un hème b (de fonction inconnue) entre deux sous-unités chez les bactérioferritines. Leur cavité centrale peut contenir respectivement 2500 et 1800 atomes de

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Résultats et discussion fer (Smith, 2004). Les DPS, en plus de leur rôle de stockage du fer, peuvent, suivant les organismes, se fixer à l‘ADN afin de le protéger physiquement contre les nucléases ou les espèces réactives de l‘oxygène. Elles ne sont en revanche constituées que de 12 sous-unités et stockent environ 500 atomes de fer (Zhao et al., 2002).

Parmi les autres protéines de structure pouvant s‘auto assembler, un exemple intéressant est l‘encapsuline présente chez de nombreux micro-organismes. La résolution de la structure cristallographique en 2008 de celle de Thermotoga maritima (Sutter et al., 2008) a permis d‘en apprendre beaucoup sur une protéine qui avait été à l‘origine classifiée comme protéase chez d‘autres organismes (Valdes-Stauber and Scherer, 1994). Il s‘agit d‘une protéine d‘environ 30 kDa qui s‘associe en 60-mers pour donner une sphère creuse (ressemblant à la capside de certains virus) de 24 nm de diamètre et de haut poids moléculaire dépourvue de toute activité protéase (Figure 1).

Figure 1. Encapsuline de Thermotoga maritima (code PDB 3DKT) sous forme complète (60-mers) à gauche, ou monomérique, à droite. D‘après (Sutter et al., 2008).

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Résultats et discussion

Le plus surprenant a été de découvrir la présence d‘autres enzymes comme des péroxydases de type DyP (dye-decolorizing peroxidase), ou encore des protéines de types ferritines, à l‘intérieur de cette structure. La nature de la protéine « cargaison » présente au sein de ce nanocompartiment varie suivant l‘organisme considéré., Bien qu‘il n‘existe qu‘une seule étude, essentiellement structurale, réalisée sur l‘encapsuline de Thermotoga maritima et dans une moindre mesure, sur celle de Brevibacterium linens (Sutter et al., 2008) les auteurs proposent que l‘encapsulation de ces protéines permette de les protéger et de les stabiliser tout en augmentant leur efficacité ; dans le cas des ferritines, l‘encapsuline offrirait également un espace de stockage du fer plus important que pour une ferritine seule (Sutter et al., 2008). Le rôle physiologique de ces protéines est donc encore très spéculatif, et de nombreux travaux restent nécessaires à la compréhension de ces systèmes.

La bactérie chimiolitoautotrophe et microaérophile Aquifex aeolicus est une des bactéries les plus hyperthermophiles connues à ce jour et représente l‘une des branches les plus basses de l‘arbre phylogénétique (Stetter, 2006). Beaucoup d‘enzymes de cet organisme ont été caractérisées et certaines ont été montrées pour s‘autoassembler en nanocompartiments enzymatiques. C‘est le cas par exemple de la soufre oxygénase réductase (SOR), formée de 24 sous-unités de 38 kDa et impliquée dans la dismutation du soufre élémentaire (Urich et al., 2006);(Pelletier et al., 2008) et de la lumazine synthase (60 sous-unités de 16,7 kDa) (Zhang et al., 2001). La recherche de nouvelles structures de haut poids moléculaire chez Aquifex aeolicus a révélé la présence d‘unédifice multimérique de 2 MDa. L‘identification des composants de cette structurea permis de montrer l‘existence à la fois d‘une protéine de compartimentalisation appartenant à la famille des encapsulines ainsi qu‘une nouvelle sous- famille de ferritines atypiques.

Matériel et Méthodes

Obtention du matériel biologique :

Aquifex aeolicus VF5 est cultivé à 85°C en bouteilles de 2 litres contenant 400 mL de milieu SME modifié en présence de fleurs de soufre (7,5 g/L) comme décrit précédemment (Guiral et al., 2005b). Les cellules sont récoltées en phase exponentielle de croissance et congelées à -80°C.

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Résultats et discussion

La fraction contenant les protéines solubles de très haut poids moléculaire est obtenue comme suit : des cellules d‘Aquifex aeolicus (3 g) sont cassées au désintégrateur de cellules par deux passages à 1,6 kbar, puis centrifugées à 10000 g pendant 10 min pour éliminer les débris et les cellules intactes. Le surnageant est ensuite ultracentrifugé à 250000 g pendant 1 h 30 pour culoter les membranes ainsi que les protéines solubles très lourdes. Le culot est lavé dans du Bis-Tris 50 mM pH 7, puis repris dans le même tampon et centrifugé à 20000g pendant 30 min pour éliminer les membranes. Le surnageant contient les protéines d‘intérêt.

Electrophorèse et activité sur gel :

Les gels de polyacrylamide utilisés sont des gels natifs basés sur une précédente publication (Strecker et al., 2010) avec quelques modifications. La teneur en bisacrylamide (% C, c‘est-à-dire le pourcentage de bisacrylamide par rapport au total des deux monomères acrylamide et bisacryalamide) de ces gels est supérieure à ce qui est couramment employé (environ 3% C), permettant ainsi d‘obtenir une porosité plus importante et donc la possibilité de faire migrer des protéines et complexes de très haut poids moléculaire. Le gel de concentration est à 2,5% (25% C) et le gel de séparation est un gradient de 3% (20% C) à 9% (6% C). Le tampon utilisé pour la préparation du gel est un tampon Imidazole-HCl 25 mM pH 7, ACA 0,5 M, et la migration s‘effectue à 10 mA constant à température ambiante, dans un tampon Imidazole-HCl 25 mM, pH 7 pour l‘anode et un tampon Imidazole 7,5 mM, Tricine 50 mM sans bleu cathode G250 pour la cathode, et le tampon de charge ne contient que du glycérol et du bleu de bromophénol pour alourdir et colorer l‘échantillon. Après migration, le gel est coloré au bleu de Coomassie ou soumis à une activité ferroxydase , c'est-à-dire au suivi de l‘oxydation du fer (II) en fer (III). Afin de détecter cette activité sur gel, celui-ci est incubé 15 min dans du tampon acétate de sodium 100 mM pH 6, transféré dans le même tampon additionné de 0,2 mM de sulfate de fer et d‘ammonium et incubé à 37°C pendant 2 h sous agitation douce (Lang et al., 2012). Après un rinçage rapide, le gel est incubé dans une solution de ferrocyanure de potassium (1% poids/volume dans HCl 0,1 N) pour révéler le fer (III). La ferritine de rate de cheval (450 kDa) est utilisée comme contrôle positif.

Spectrométrie de masse :

Les analyses protéomiques sont réalisées sur un spectromètre de masse LTQ Velos Orbitrap (Trappe ionique linéaire avec une cellule C-trap et une Orbitrap) équipé d‘une source d‘ions nanospray et couplé à une nanochromatographie Ultimate NCS 3500. Après digestion de l‘échantillon par la trypsine, les solutions de peptides sont dessalées sur une pré-colonne

183

Résultats et discussion de type C18 et les peptides sont élués sur une colonne C18 par un gradient de 4% à 55% de tampon B (20% eau/ 80% acetonitrile/0.1% d‘acide formique) dans 0.1% d‘acide formique dans l‘eau pendant 30 min, puis jusqu‘à 95% B en 5 min. Les peptides sont détectés en mode positif par un événement « full MS » dans l‘Orbitrap, à la résolution 30 000, suivi par un événement de Dissociation Induite par Collisions (CID) des 10 ions-parents les plus intenses (Top 10) (analyses des fragments MS/MS dans l‘Orbitrap, à la résolution 7500, dans une gamme de masses de 150-1700). Le traitement des spectres est sur le logiciel de Proteome Discoverer (Thermofisher Scientific) et la recherche des protéines par MASCOT (licence in situ) en utilisant les paramètres de recherche suivants : database : NCBI_nr et taxonomie Aquifex aeolicus; enzyme : trypsine; modifications variables des acides aminés : carbamidométhylation (cysteine) et oxydation (methionine); les valeurs monoisotopiques sont considérées ; tolérance de masse ± 8 ppm ; tolérance de masse sur les fragments : ± 0.8Da ; 1 site manqué par la Trypsine admis ; les protéines ne sont considérées comme présentes qu‘à partir de 2 peptides uniques avec une probabilité p<0.05.

Analyse in silico :

La prédiction de la structure secondaire des protéines a été obtenue grâce au serveur JPRED (Cole et al., 2008). Les alignements de séquence ont été générés en utilisant clustalW sur le serveur du Pole Bioinformatique Lyonnais (Combet et al., 2000). La recherche de protéines homologues a été réalisée en utilisant l‘algorithme DELTA-BlastP (Boratyn et al., 2012). La modélisation de Aq_1760 a été faite en utilisant le serveur SWISS-MODEL (Arnold et al., 2006) et le logiciel PyMOL a été utilisé pour générer les figures finales.

Résultats

La protéine Aq_1760 est identifiée comme étant une encapsuline

Afin de trouver de nouvelles structures de très haut poids moléculaire chez Aquifex aeolicus, une fraction correspondant à des protéines solubles et « lourdes » a été déposée sur un gel natif de polyacrylamide à pores larges. Ces gels possèdent un pourcentage de bisacrylamide bien supérieur à celui des gels plus classiques, conduisant ainsi à un maillage beaucoup plus lâche. Ils ont initialement été développés en tant que gels bleu natif permettant de visualiser des complexes protéiques de plusieurs MDa (Strecker et al., 2010). Après migration et coloration des protéines au bleu de Coomassie, une bande d‘environ 2 MDa a été

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Résultats et discussion obtenue (Figure 2A, gel). Cette même bande a été découpée et analysée par spectrométrie de masse afin d‘en déterminer la composition protéique (Figure 2B, tableau de masse).

Figure 2. A. Migration de la fraction contenant les protéines « lourdes » (75 µg) sur gel natif à larges pores. Les marqueurs de poids moléculaires sont représentés à gauche. B. Identification des protéines de la bande découpée sur le gel (encadrée) par spectrométrie de masse de type Orbitrap. Seuls les 10 premiers résultats sont présentés ici.

Les résultats indiquent la présence d‘une protéine hypothétique majoritaire désignée sous le nom d‘Aq_1760. Une recherche par similarité de séquence (BlastP) indique des homologies avec la famille de protéines « linocin M18 » et notamment avec l‘encapsuline de la bactérie Thermotoga maritima, seule représentante de cette famille caractérisée et cristallisée à ce jour (Sutter et al., 2008). La protéine Aq_1760 d‘Aquifex aeolicus présente 25% d‘identité avec cette dernière de plus un alignement de séquences montre que la structure secondaire prédite d‘Aq_1760 est sensiblement similaire à celle de l‘encapsuline de Thermotoga maritima (Figure 3).

Par analogie avec la structure quaternaire déjà décrite, une association en 60-mers d‘Aq_1760 donnerait un complexe d‘une masse moléculaire d‘environ 1,9 MDa, cohérente avec la masse apparente sur gel d‘environ 2 MDa.

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Résultats et discussion

10 20 30 40 50 60 | | | | | | A. aeolicus MEFLQRDQAPLTAEEWEQIDKTAYEVFKSTVVCRKFMPVVGPFGAGHQVVSYDVLYGVEP T. maritima MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHP------L ****:*. **** ::*::**: * *:**: : ***: * **:* : . .

70 80 90 100 110 120 | | | | | | A. aeolicus GVCEVKPGQEYKVCEPVRTGERKHVPVPTLYKDFVISWRDLEHWRQFNLPVDTTGVAAAA T. maritima GEVEVLSDE----NEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETV * ** ..: * *: * ** :*: * *.:. :*:: .: : ** :.: :.

130 140 150 160 170 180 | | | | | | A. aeolicus SSLAVAEDKLILFGNQEMGIEGFLTAKGTLREELSDWEKVGNAFQDVVKGISRLVEKGFY T. maritima RKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFE--E-RKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIE .:* **::*: * :: *::*:*: : .::. .. : :: :*:.:* : :.*:

190 200 210 220 230 240 | | | | | | A. aeolicus TNYYLIVNPKRYFLLNRIHDNTGLLELEQ-IKKVVKEVYQTPIIPEDIVLLVSASPANFD T. maritima GPYTLVINTDR--WINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFK * *::*..* :* :::::* **: ::: :: . : .*:** .:*.

250 260 270 280 | | | | A. aeolicus LAIALDVNVAFVETSNMNHTFRVMEMVVPRIKRPEAILIFSS T. maritima LILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF * :. *:.:.: : .: : : * .. :: .***::::.

Figure 3. Alignement des séquences d’encapsulines de Thermotoga maritima et Aquifex aeolicus et représentation de leur structure secondaire, à partir des données cristallographiques pour Thermotoga maritima, et prédite grâce au serveur JPRED (Cole et al., 2008) pour Aquifex aeolicus. Les hélices alpha sont représentées en bleu et les brins beta en vert. *, acide aminé strictement conservé ; :, conservation forte ; ., conservation faible.

Nous avons également modélisé la structure tridimensionnelle d‘Aq_1760 à partir de celle de l‘encapsuline de Thermotoga maritima, et par analogie nous en avons reconstitué la forme complète (60-mers). Ces modélisations montrent une similarité architecturale entre les deux protéines, renforçant ainsi l‘idée de l‘appartenance de Aq_1760 à la famille des encapsulines (Figure 4).

Nous avons donc identifié une nouvelle protéine d‘Aquifex aeolicus, Aq_1760, dont l‘homologie structurale et de séquence la place dans la famille des encaspulines. Par homologie avec la structure formée par l‘encapsuline de Thermotoga maritima, Aq_1760 serait le nomomère de base d‘une structure protéique de haut poids moléculaire qui s‘associerait pour former une nanocagede 60 sous-unités identiques .

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Résultats et discussion

Figure 4. A. Alignement des structures de l’encapsuline de Thermotoga maritima (en vert) et de la modélisation de Aq_1760 (en bleu). B et C, représentation de la forme 60-mers de l’encapsuline Aq_1760 d’Aquifex aeolicus, entière (A) et en coupe (B).

Identification de la protéine cargaison d’Aq_1760

Il a été montré que les encapsulines sont des protéines de structures permettant de compartimentaliser des enzymes appartenant à la famille des peroxydases ou à celle des ferritines, et que le gène codant pour la protéine « cargaison » est généralement situé dans le même opéron que celui codant pour l‘encapsuline (Sutter et al., 2008). L‘analyse du contexte génétique d‘aq_1760 ne permet pas de définir la nature de la protéine cargaison : en effet, les gènes aq_1758 et aq_1761 coderaient respectivement pour une pseudouridine synthase et une protéine du primosome impliqué dans la réplication, réparation et recombinaison de l‘ADN.

La présence dans les protéines identifiées par spectrométrie de masse d‘une cytochrome c peroxydase (Figure 2B) est intéressante. Cette enzyme est identifiée comme étant une protéine de la famille MauG impliquée dans la biosynthèse du cofacteur tryptophane tryptophylquinone (Wilmot and Davidson, 2009). Cependant, cette famille de protéines est parfaitement distincte de la famille des peroxydases DyP que l‘on retrouve habituellement

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Résultats et discussion dans les encapsulines. De plus, les protéines cargaisons sont généralement identifiables grâce à la présence d‘une extension C-terminale caractéristique et conservée permettant leur ancrage à l‘intérieur de l‘encapsuline (Sutter et al., 2008). Or, la cytochrome c peroxydase identifiée ne possède pas cette extension C-terminale. L‘ancrage de cette protéine à l‘intérieur de l‘encapsuline semble donc peu probable. Sa présence dans cette bande de haut poids moléculaire reste à être expliquée.

Nous nous sommes tournés vers une autre protéine identifiée par un grand nombre de peptides lors de l‘analyse par spectrométrie de masse, Aq_331. La comparaison de sa séquence avec celle d‘autres protéines encapsulées (ferritines et cytochrome c peroxydase) montre la présence d‘un site conservé correspondant à l‘extension C-terminale d‘ancrage (Figure 5).

10 20 30 40 | | | | G. diazotrophicus -APAAGCAADGSGAGG-SAPPSPSAYGSLGIGSLKEKV------B. xenovorans -QASAAAADGGQQPDT-SSSAEPQEGGSLNIGSLKGISQYE----- Rhodococcus sp --GDEPAGAESAPEDPVEPAAAGPYDLSLKIGGLKGVSQ------B. parapertussis -AERDPQDTDGSRLDP-APAARAPHDGSLNIGSLKGNPQQ------B. linens --SASARVEETDPPNPASADDPAPADDSLGIGSLRRRDQ------M. tuberculosis -FSPTIDFLDHPPPLP-QAATPTLAAGSLSIGSLKGSPR------S. cellulosum --TEVEAAEEAAKLGATAKTGAMAPSGALGIGSLKGA------F. alni --ETMDRGGSGDPDAVTERQAAGPGDGSLGIGSLKGVGE------R. rubrum -IEAADTAGEGSGGDA-AKGATAQGDGSLGIGSLKGEAALARPPRL T. maritima --LRTYLFTDKPITEIEEETSGGSENTGGDLGIRKL------A. aeolicus ---LFKWFEKQEDYHAQRLKELFRKMNRFTIGGLGEES------

Figure 5. Alignement de séquences des extensions C-terminale des peroxydases de type DyP (six premières séquences) et des protéines de type ferritine (quatre dernières séquences) permettant leur ancrage dans l‘encapsuline. La conservation des acides aminés est indiquée par le code couleur (rouge pour une identité et jaune pour une substitution homologue. La séquence soulignée (T. maritima) correspond au peptide ancré dans l‘encapsuline, visualisé dans la structure cristallographique (Sutter et al., 2008). G. diazotrophicus, Gluconacetobacter diazotrophicus ;B. xenovorans, Burkholderia xenovorans ; B. parapertussis, Bordetella parapertussis ; B. linens, Brevibacterium linens M18 ; M. tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis ; S. cellulosum, Sorangium cellulosum ; F. alni, Frankia alni ; R. rubrum, Rhodospirillum rubrum ; T. maritima, Thermotoga maritima ; A. aeolicus, Aquifex aeolicus.

Cette homologie associée à la co-migration de cette protéine avec l‘encapsuline suggère fortement qu‘Aq_331 est la protéine de cargaison. Une analyse plus globale de la séquence de Aq_331 montre qu‘il s‘agit d‘ une protéine de 293 acides aminés pour une masse moléculaire prédite de 34,6 kDa avec une homologie de séquence avec la grande famille des

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Résultats et discussion protéines à domaine ferritine, ou « ferritin-like proteins» (Flp) pour reprendre le terme anglo- saxon. Ce rattachement à la superfamille des ferritines appuie notre hypothèse.

Ainsi, le système cargo/cargaison d‘Aquifex aeolicus semblerait assez similaire à celui de Thermotoga maritima, avec une protéine de la famille des ferritines encapsulée par une nanocage protéique de grandes dimensions. Une différence notable toutefois entre ces deux systèmes réside dans leurorganisation génétique : en effet, si les deux gènes codant pour les protéines partenaires sont retrouvés dans le même opéron chez Thermotoga maritima, ils se trouvent dans des loci tout à fait différents chez Aquifex aeolicus. Cette caractéristique n‘est pas rare chez Aquifex aeolicus pour laquelle certains gènes, présents dans un même opéron à l‘organisation très conservée chez les autres organismes, se retrouvent séparés et parfois très éloignés les uns des autres dans le génome de la bactérie. Le cas le plus flagrant étant probablement celui du complexe I.

Etude in silico et biochimique de la protéine Aq_331

Nous avons cherché à en apprendre plus sur cette protéine cargaison, en commençant par une analyse de sa séquence. Les protéines de cette famille sont d‘une taille assez modeste, entre 18 et 20 kDa environ, et présentent un repliement classique de quatre hélices α regroupées en fagot et coiffées ou non par une hélice plus courte (Figure 6) (Haikarainen and Papageorgiou, 2010; Smith, 2004).

Figure 6. Structure de la bactérioferritine de Desulfovibrio desulfuricans (code PDB 1NF4). Le centre actif ferroxydase est visible au centre de la protéine : les deux atomes de fer sont représentés par des sphères rouges, et les acides aminés qui les lient sont représentés par des bâtonnets bleus.

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Résultats et discussion

Aq_331 est une protéine de 34,6 kDa, soit presque le double des autres représentants de cette famille. L‘analyse de la séquence prédit la présence de deux domaines de type ferritine. De plus, la prédiction de la structure secondaire d‘Aq_331 révèle l‘existence de huit hélices alpha (Figure7).

10 20 30 40 50 60 | | | | | | Domaine_1 MNKKELIDILLYDVALEHSAIIQYLYNVFLIGDPEITNEIESIARQEMRHLKWFAQKVVE Domaine_2 GIDSEIFNILNKLLQKEYRLILDYLYHFFHSKTWQEKDTSLDIAIESMFHMGELGEKIGE ..*:::** : *: *::***:.* : .: .** :.* *: :.:*: *

70 80 90 100 110 120 | | | | | | Domaine_1 LGGKVTLNRIEEAIKVGQSWEEMLKNDVDAEEEAIKIYSQQLEIVKDDSVKKLLDRVIND Domaine_2 LGGYPDLSLPKAKHFKGFTPEEVIE-DIKEEETASRMYEENAKKVTREDLVKLFKWFEKQ *** *. : * : **::: *:. ** * ::*.:: : *. :.: **:. . ::

130 140 | | Domaine_1 EMRHRDEFSEMLEELKNKKIEEAKQEA Domaine_2 EDYHAQRLKELFRKMNRFTIGGLGEES * * :.:.*::.:::. .* :*:

Figure 7. Alignement des séquences correspondant aux deux domaines de la ferritine Aq_331 d‘Aquifex aeolicus. Le domaine 1 correspond aux résidus 1 à 147, le domaine 2 aux résidus 148 à 293 de la protéine entière. Les hélices alpha (prédites grâce au serveur JPRED) sont représentées en bleu, et les résidus des centres ferroxydases putatifs sont en blanc.

Ces deux éléments suggèrent une duplication du domaine ferritine sur une même chaîne peptidique. La séquence protéique d‘Aq_331 a donc été coupée en deux parties égales qui ont été analysées comme s‘il s‘agissait de deux protéines indépendantes. Les deux domaines ont environ 65% de similarité de séquence, mais surtout, l‘architecture globale est conservée, avec la présence typique de quatre hélices alpha par domaine (Figure 7), montrant ainsi qu‘Aq_331 serait une protéine à domaines en tandem atypique de la famille des ferritines. A notre connaissance, c‘est la première fois qu‘une telle organisation est démontrée pour une protéine de cette famille.

Les ferritines se caractérisent également par la présence d‘un site catalytique ferroxydase responsable de l‘oxydation du fer (II) en fer (III). Ce centre à fer binucléaire est assez conservé au sein de la superfamille des ferritines, chaque atome de fer étant coordiné par deux résidus acides et une histidine au sein d‘un site de type [D/E]-X(n)-[D/E]XXH. Il est

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Résultats et discussion

également à noter que le site catalytique se trouve au cœur du faisceau formé par les quatre hélices alpha des ferritines, chacune d‘entre elles portant un ou plusieurs des résidus impliqués dans la liaison des atomes de fer (Smith, 2004) (Figure 6). Cette organisation est également retrouvée dans la protéine Aq_331, chacun des domaines portant un centre ferroxydase complet (Figure 7). La substitution d‘un glutamate par une sérine (position 47 du domaine 2) est retrouvée chez d‘autres membres de cette famille ; de plus, un glutamate (position 46) est présent juste avant cette sérine, ce résidu peut donc lier le fer etdonner un site de fixation fonctionnel. Nous avons donc testé expérimentalement la capacité d‘Aq_331 à oxyder le fer (II) à l‘aide d‘un test ferroxydase sur gel Les résultats présentés Figure 8 montrent d‘une part que cette protéine est effectivement capable de convertir le fer ferreux en fer ferrique et d‘autre part que le système fonctionne même si Aq_331 est enfermée au sein de l‘encapsuline.

Figure 8. Activité ferroxydase sur gel natif à pores larges. Piste 1 : fraction contenant l‘encapsuline et la ferritine (75 µg) ; piste 2 : contrôle positif (ferritine de rate de cheval, 1 µg). Après migration, le gel est incubé dans du sulfate de fer et d‘ammonium pendant 2 h à 37°C, puis le fer (III) correspondant à l‘activité ferroxydase est révélé. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués en kDa à gauche du gel. Les flèches pointent vers les bandes révélées par l‘activité ferroxydase.

Aq_331 est donc une protéine atypique de la famille des ferritines, capable d‘oxyder le fer, et possédant deux domaines comportant chacun un site ferroxydase complet.

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Résultats et discussion

La ferritine Aq_331 est le représentant d’une nouvelle famille de ferritines à domaines en tandem

Nous avons cherché à savoir si d‘autres protéines présentent le même type d‘organisation qu‘Aq_331, ou si elle est un cas particulier limité à Aquifex aeolicus. Les résultats obtenus grâce à une recherche par DELTA-BlastP montrent que la duplication du domaine ferritine se retrouve chez d‘autres organismes. En effet, huit séquences protéiques chez les Aquificales (en comptant Aquifex aeolicus), cinq chez les Dehaloccocoides et une chez une bactérie de type Sulfobacillus se révèlent être des ferritines à deux domaines en tandem. De plus, toutes les protéines des Aquificales ainsi que celle de la bactérie thermophile modérée Sulfobacillus acidophilus (Li et al., 2011) présentent l‘extension C-terminale caractéristique permettant l‘ancrage à l‘intérieur de l‘encapsuline. Et en effet, chacun de ces organismes présente dans son génome un gène codant pour une encapsuline putative, alors que les Dehalococcoides ne possèdent ni le gène codant pour l‘encapsuline, ni le domaine d‘ancrage en C-terminal des ferritines (Table 1). Sur la base des données actuelles, ce système encapsuline/ferritine à domaines en tandem semble donc être une spécificité des organismes thermophiles et hyperthermophiles.

Ainsi, l‘utilisation de ferritine à deux domaines en tandem est une stratégie rare mais non unique, mise en place par plusieurs organismes appartenant à des groupes phylogénétiques distincts. Elle peut également être combinée à l‘encapsulation de la protéine comme c‘est le cas chez les Aquificales ou chez Sulfobacillus.

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Numéro d'identification Présence de l'extension Numéro d'identification Organisme NCBI de la Flp C-terminale NCBI de l'encapsuline

Aquifex aeolicus 15605849 oui 15606825

Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1 188997051 oui 188996068

Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1 163782617 oui 163783093

Hydrogenobacter thermophilus TK-6 288817407 oui 288818122

Thermocrinis albus DSM 14484 289549002 oui 289548655

Sulfurihydrogenibium azorense Az-Fu1 225849438 oui 225848871

Sulfurihydrogenibium yellowstonense SS-5 237755920 oui 237756679

Hydrogenobaculum sp. Y04AAS1 195953688 oui 195953689

Sulfobacillus acidophilus TPY 339626687 oui 339626688

Dehalococcoides sp. VS 270308226 non abs

Dehalococcoides sp. GT 289432749 non abs

Dehalococcoides ethenogenes 195 57234241 non abs

Dehalococcoides sp. CBDB1 73748723 non abs

Dehalococcoides sp. BAV1 147669482 non abs

Table 1. Vue d’ensemble de la sous famille des Flp à deux domaines en tandem et combinaison avec l’encapsuline. Abs = absente. Résultats et discussion

Discussion

Notre étude a révélé plusieurs points. En premier lieu, Aquifex aeolicus possède une protéine, Aq_1760, que nous avons démontrée être une encapsuline, c‘est-à-dire une protéine capable de s‘assembler en homomultimères, formant ainsi une nanocage d‘un poids moléculaire d‘environ 2 MDa dans laquelle une autre protéine, Aq_331, peut venir s‘ancrer. Nous avons également montré que cette dernière appartient à la grande famille des ferritines. Cette situation a été très récemment mise en évidence (Sutter et al., 2008) chez la bactérie Thermotoga maritima, avec cependant une différence dans l‘organisation génétique du système, à savoir une structure opéronique pour les deux gènes chez Thermotoga maritima, ce qui n‘est pas le cas chez Aquifex aeolicus. Une seule étude ayant été réalisée à ce jour sur le système encapsuline / ferritine, ceci est probablement à mettre en lien avec le fait que ces mégastructures ne sont pas « évidentes » à pointer par la simple analyse du génome et nécessitent pour être mises en évidence des approches adaptées. Les auteurs avaient proposé que l‘encapsulation de la ferritine permette sa protection et sa stabilisation mais aussi un stockage plus important du fer sous forme ferrique, le volume du compartiment formé par l‘encapsuline étant bien supérieur à celui de la ferritine (diamètre interne de l‘encapsuline, 22 nm, contre 8 nm pour les ferritines). Le système étant analogue chez Aquifex aeolicus, nous pouvons donc faire la même supposition. De plus, la transformation du fer (II) en fer (III) réalisée par la ferritine permet de lutter contre le stress oxydant en évitant la réaction de Fenton productrice d‘espèces réactives de l‘oxygène (Imlay et al., 1988). L‘encapsuline pourrait donc être un moyen indirect mais efficace de lutter contre la toxicité de ces espèces. La mise en évidence récente, par l‘équipe, de la capacité d‘Aquifex aeolicus à supporter et se développer en présence de concentration en oxygène très élevée, suppose l‘existence de mécanismes de protection dont ce système peut faire partie.

La nouveauté de ces travaux tient à la nature même de la protéine cargaison, puisqu‘en effet, Aq_331 est un nouveau type de Flp à deux domaines en tandem portant chacun un centre actif ferroxydase. Le fait que cette architecture particulière soit retrouvée chez d‘autres Aquificales, chez des Dehalococcoides ainsi que chez Sulfobacillus acidophilus nous conduit à proposer l‘existence d‘une nouvelle sous famille de protéines de type ferritine dont Aq_331 serait le prototype. Ceci est parfaitement cohérent avec la diversité des protéines composant cette superfamille puisque l‘on y retrouve les ferritines bactériennes, les bactérioferritines et les DPS mais également les rubrérythrines et des protéines possédant un domaine ferritine et un centre binucléaire de fixation du fer impliquées dans l‘oxygénation du méthane ou la

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Résultats et discussion réduction des ribonucléotides par exemple. Cette famille s‘enrichit constamment, comme par exemple avec la découverte récente d‘une nouvelle sous famille représentée par l‘archaeoferritine de Pyrococcus furiosus (Ebrahimi et al., 2012) qui possède un mécanisme de stockage du fer différent de celui habituellement retrouvée chez les autre ferritines. La compréhension et la caractérisation des protéines de cette famille est actuellement un axe de recherche très important apportant régulièrement de nouvelles découvertes. L‘étude présentée ici s‘inscrit directement dans cette tendance.

La duplication du domaine ferritine rappelle le cas d‘une autre superfamille de protéines, les rhodanèses. En effet, ces dernières ont des rôles très divers et peuvent exister sous des formes à un seul domaine (Ray et al., 2000);(Giuliani et al., 2007), à deux domaines (Bordo et al., 2000) ou à un domaine associé à un autre domaine protéique (Palenchar et al., 2000). Dans le cas d‘une rhodanèse à deux domaines, le cas général implique un premier domaine actif, catalytique et un second domaine non-catalytique ayant probablement un rôle dans la stabilisation de la protéine, même si un cas de rhodanèse à deux domaines actifs a récemment été rapporté (Prat et al., 2012). Ainsi, la duplication du domaine ferritine de Aq_331 pourrait également avoir un rôle dans la stabilité de la protéine. Ceci est également à mettre en rapport avec une autre protéine d‘Aquifex aeolicus, Aq_328, qui serait une protéine du type histone bactérienne, et qui présente une fusion de deux domaines histones distincts sur une même chaîne peptidique (Qiu et al., 2006). Les auteurs ont proposé que cette caractéristique permette une meilleure thermostabilité de la protéine grâce à l‘augmentation du nombre de ponts salins, stratégie déjà évoquée pour d‘autres protéines d‘organismes thermophiles et hyperthermophiles (Shin et al., 2002). Cette hypothèse pourrait expliquer pourquoi les Aquificales (hyperthermophiles) et Sulfobacillus acidophilus (thermophile modérée) présentent une duplication du domaine ferritine ; en revanche, elle n‘explique pas une telle organisation chez les Dehalococcoides mésophiles. Il faut toutefois mentionner le fait que ces organismes ont la particularité de se développer dans des environnements contaminés en utilisant des composés organiques halogénés pour leur croissance, ce qui peut également être considéré comme un facteur de stress au même titre que la température. Une seconde explication viendrait de la structure quaternaire des ferritines : en effet, leur forme active est un 24-mers (ou un 12-mers dans le cas des DPS) dont la sous-unité de base est un dimère. Ceci est très visible dans le cas des bactérioferritines dont l‘hème b est fixé par deux monomères (Macedo et al., 2003), et également pour certaines DPS dont le site actif se trouve à l‘interface entre deux monomères (Haikarainen and Papageorgiou, 2010). Le dimère de

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Résultats et discussion ferritine semblant être la brique de base de l‘ensemble, il apparait donc que certains microroganismes aient favorisé l‘existence d‘un seul gène codant pour une protéine portant les deux domaines alors que pour d‘autres, l‘association entre les deux protéines portant chacune un des domaines, reste la première étape de la constitution de l‘édifice.

Un autre point intéressant concerne la régulation de ce système. Les ferritines sont connues pour être l‘objet de régulations très complexes mettant en jeu différents éléments et qui correspondent à leur rôle au sein de l‘organisme dont elles font partie. Par exemple, le régulateur Fur (Ferric Uptake Regulator) a été montré pour agir sur l‘expression de la ferritine de plusieurs bactéries (Delany et al., 2001; Morrissey et al., 2004), de même que PerR et OxyR (senseurs de stress oxydant) (Rocha and Smith, 2004; Tu et al., 2012), ou encore FNR (senseur de l‘oxygène) (Fink et al., 2007). La phase de croissance de la bactérie peut également influer sur la l‘expression des ferritines. Il serait donc intéressant de déterminer dans quelles conditions la protéine Aq_331 est produite afin d‘en apprendre plus sur son rôle exact au sein de la bactérie. Ceci est d‘autant plus vrai que le gène aq_331 se trouve en opéron avec aq_328 codant pour une protéine de type histone. Or, il a été montré chez Escherichia coli que des histones bactériennes régulaient de façon négative l‘expression de la ferritine FtnA, mais qu‘en présence de fer, Fur en devenait un activateur (Nandal et al., 2010). Le fait qu‘une boîte de régulation Fur soit prédite dans le promoteur de l‘opéron ainsi que dans un promoteur intragénique putatif d‘aq_331 laisse penser qu‘une régulation de la ferritine par le fer peut avoir lieu.

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Conclusions et perspectives

CCOONNCCLLUUSSIIOONNSS EETT PPEERRPPEECCTTIIVVEESS

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Conclusions et perspectives

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Conclusions et perspectives

Le soufre est un élément absolument capital, tant au niveau des cycles géochimiques que dans l‘utilisation qui en est faite par les êtres vivants. Sa chimie toute particulière lui permet d‘adopter des états d‘oxydation variés, allant de -2 à +6, et donne donc lieu à de multiples composés que l‘on retrouve sous forme gazeux, soluble ou même solide. Les micro- organismes ont su s‘adapter à l‘abondance de ces différentes formes du soufre et ont ainsi développé de nombreuses enzymes et voies métaboliques impliquées dans l‘oxydation et/ou la réduction de ces composés. Si la plupart ne sont capables que de l‘une ou l‘autre de ces possibilités, certains possèdent l‘équipement enzymatique nécessaire à la mise en œuvre de ces deux voies.

Les organismes capables d‘oxyder le soufre n‘utilisent généralement pas un seul mais plusieurs composés du soufre, plus ou moins réduits, en tant que substrat. Cette plasticité se retrouve au niveau de leur métabolisme énergétique, comprenant de multiples enzymes et de multiples voies, lesquelles sont toutes interconnectées. On peut finalement interpréter cette complexité des métabolismes énergétiques du soufre comme la nécessité absolue pour les micro-organismes qui les déploient de s‘adapter à leur environnement et aux brusques variations qu‘ils peuvent subir.

On comprend donc que les organismes capables de déployer un véritable arsenal enzymatique face aux composés du soufre acquièrent par là-même un véritable avantage quant à leur aptitude à survivre et à se développer dans leur environnement. Mais on peut également considérer les choses d‘une autre manière : être capable d‘utiliser chaque type de composé du soufre, du plus réduit au plus oxydé, permet à ces micro-organismes de contrôler et de gagner de l‘énergie à chaque étape de son oxydation au travers de ses voies métaboliques.

De plus, chez certains organismes, il existe un véritable cycle de recyclage du soufre, en associant réduction et oxydation du soufre, avec deux enzymes (ou plus) qui se permettent

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Conclusions et perspectives l‘une à l‘autre de fonctionner en s‘échangeant substrats et produits, l‘une utilisant ce que l‘autre produit. Il faut cependant noter que dans une telle situation, la réduction du soufre par l‘un des partenaires fait forcément intervenir un nouveau donneur d‘électrons.

Toutes ces stratégies n‘ont finalement qu‘une seule finalité : il s‘agit de tirer profit au maximum du soufre en tant que composé énergétique en lui consacrant un métabolisme optimisé, extrêmement structuré et organisé.

Notre étude portant sur la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus s‘inscrit en droite ligne de cette vision intégrée du métabolisme énergétique du soufre. Sur la base d‘études biochimiques décrivant un supercomplexe hydrogénase / soufre réductase, la SOR et un supercomplexe SQR / cytochrome bc1 / cytochrome c oxydase, une optimisation via in recyclage du soufre pouvait être proposé. De plus, certaines questions comme le devenir du sulfite, ou l‘utilisation du thiosulfate n‘étaient pas résolues. Nous avons ainsi proposé un nouveau modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus en croisant les voies, les enzymes et les modèles décrits dans la littérature ces dernières années avec les données génomiques que nous avons pu rassembler sur notre système modèle. Ainsi, la présence dans le génome de deux voies différentes (voie de l‘APS et la sulfite oxydase Aq_979) permettant l‘utilisation du sulfite, produit par la SOR, pourrait permettre de comprendre comment celui-ci est utilisé par la bactérie. De plus, Aq_979 appartient à un groupe encore non caractérisé des sulfite oxydases, son étude au niveau biochimique permettrait donc une meilleure compréhension de cette grande famille de protéines. La présence du système Sox, système multi-enzymatique complexe dédié à l‘oxydation du thiosulfate, est l‘une des pistes les plus intéressantes à explorer, puisqu‘il s‘agit très probablement de la voie principale d‘utilisation de ce composé. Enfin, deux nouvelles sulfure déshydrogénases putatives, DhsU et FccB‘ ont également été identifiées dans le génome, et pourraient faire partie du système Sox, ou agir indépendamment dans l‘oxydation de l‘H2S, peut-être en synergie avec la SQR. Tenter d‘isoler et de caractériser ces nouvelles protéines et voies métaboliques est donc évidemment un sujet de recherches capital pour la compréhension des stratégies énergétiques mises en place par Aquifex aeolicus. La notion de régulation et d‗expression de ces voies en fonction des conditions de croissance n‘a jusqu‘alors été que peu étudiée : en effet, nous ignorons pour l‘instant si la bactérie utilise ces systèmes de manière simultanée, ou si comme chez d‘autres organismes, il existe une

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Conclusions et perspectives régulation de l‘expression de ces voies par les substrats. Cet aspect prometteur mérite un investissement futur. Des études transcriptomiques sont une approche de choix pour tenter de répondre à ces questions.

Un autre point que nous avons abordé, et qui a constitué l‘essentiel de ma thèse, concerne la rhodanèse Aq_477, depuis rebaptisée SbdP. Nous sommes parvenus à dévoiler la fonction physiologique de cette protéine, et avons ainsi montré un aspect du métabolisme énergétique du soufre encore peu étudié dans la littérature. En effet, SbdP a un rôle de navette et de transfert de substrats entre une source de soufre et l‘enzyme qui va l‘utiliser, en l‘occurrence la SOR et la soufre réductase qui utilisent toutes deux des chaînes de soufre. Cette découverte est importante puisqu‘elle permet d‘envisager les substrats dans ce type de métabolisme non plus comme des composés libres dans la cellule, rencontrant les protéines qui vont les utiliser au hasard de leurs mouvements, mais comme des éléments pris en charge de manière spécifique et transportés là où ils doivent être métabolisés. Cette canalisation du substrat peut tout d‘abord permettre de parer à la toxicité inhérente à certains de ces composés : en effet, le polysulfure est comme l‘H2S hautement réactif, notamment vis-à-vis de l‘oxygène essentiel à la bactérie. On comprend donc la nécessité d‘imposer une sorte de contrôle des mouvements de ce type de composé. Ceci peut également être compris comme un moyen de réguler l‘activité de ces protéines. Mais l‘avantage principal apporté par cette fonction est une véritable optimisation de l‘efficacité du métabolisme énergétique du soufre. Cette faculté de SbdP à prendre en charge et à orienter le substrat vers le site actif de ses protéines partenaires permettrait une réelle augmentation de l‘efficacité de tels systèmes, et donc par là-même contribuerait à rendre le métabolisme énergétique d‘Aquifex aeolicus plus performant.

Finalement, l‘ensemble des découvertes, à la fois sur le rôle de SbdP et sur l‘identification de nouvelles protéines du métabolisme énergétique du soufre fait apparaitre la notion d‘un véritable réseau du soufre chez Aquifex aeolicus, étroitement contrôlé et organisé, permettant d‘obtenir un métabolisme efficace et performant.

La canalisation des substrats, permettant une diminution de la toxicité de certains composés ainsi qu‘une augmentation de l‘efficacité métabolique, est un concept bien ancré qui avait été d‘abord proposé pour l‘organisation en supercomplexes du cycle de Krebbs

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Conclusions et perspectives notamment, puis plus récemment pour celle des chaînes respiratoires.. La notion nouvelle de mégacomplexes, des structures de très haut poids moléculaire rassemblant plusieurs de ces supercomplexes, permet d‘ajouter un degré supplémentaire d‘organisation de ces chaînes respiratoires et conduirait une façon de compartimentaliser une fonction dans un espace cellulaire dépourvu d‘organelles. Nous avons tenté de mettre en évidence de telles structures chez Aquifex aeolicus, et nous avons pour cela développé de nouvelles techniques et outils adaptés à notre bactérie modèle. Certains verrous technologiques ont ainsi pu être levés, et nous avons mis en évidence des limitations quant à la façon de préparer les échantillons. Il semble donc que la majeure partie du travail qui doit être effectué à présent concerne l‘amélioration de la pureté de la fraction membranaire étudiée en évitant les contaminations en provenance de la fraction soluble, ainsi que la recherche de conditions de solubilisation optimale à la conservation de ces hypothétiques mégastructures.

Enfin, en cherchant une forme de compartimentalisation, nous en avons trouvé une autre : Aq_1760 appartient à la famille des encapsulines, des protéines capables de s‘organiser en un nanocompartiment de 24 nm de diamètre constituant une sorte de cage dans laquelle vient s‘ancrer une protéine cargaison. Nous avons identifié chez Aquifex aeolicus, la protéine Aq_331 comme la cargaison d‘Aq_1760. Nous avons également montré qu‘Aq_331 est une ferritine particulière puisque composée de deux domaines similaires portant chacun les résidus nécessaires à l‘activité d‘oxydation et de stockage du fer propre à ce type de protéines. Cette organisation architecturale, qui découlerait d‘un évènement de duplication/fusion du gène ancestral, est également présente chez d‘autres organismes, parmi lesquels certains possèdent également une encapsuline. Bien que le rôle de celle-ci ne soit pas clairement établi, on peut supposer qu‘elle propose un important espace de stockage au fer insoluble produit par la ferritine. Nous ne savons pas non plus quel est le rôle précis d‘Aq_331. La constitution d‘une réserve de fer bio-disponible est bien entendu l‘hypothèse la plus probable, mais une perspective de recherche serait de déterminer dans quelles conditions de croissance de la bactérie (abondance ou carence de fer par exemple) ce stockage a lieu, et si elle est un moyen de se prémunir face au stress oxydatif notamment provoqué par le fer, comme il a été proposé chez d‘autres organismes. Ces hypothèses restent à être testées.

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