Aix-Marseille Université Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé Thèse de Doctorat d’Université Mention Microbiologie Clément AUSSIGNARGUES Optimisation du métabolisme énergétique du soufre chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury: Pr. Frédéric BARRAS Dr. Laurent COURNAC Dr. Bruno FRANZETTI Dr. Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI Dr. Anne GODFROY Dr. Marianne ILBERT Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines Centre National de la Recherche Scientifique Aix-Marseille Université Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé Thèse de Doctorat d’Université Mention Microbiologie Clément AUSSIGNARGUES Optimisation du métabolisme énergétique du soufre chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury: Pr. Frédéric BARRAS Dr. Laurent COURNAC Dr. Bruno FRANZETTI Dr. Marie-Thérèse GIUDICI-ORTICONI Dr. Anne GODFROY Dr. Marianne ILBERT Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines Centre National de la Recherche Scientifique Sommaire Sommaire Introduction 2 Chapitre I- Métabolismes énergétiques du soufre 4 I) Le soufre, un élément essentiel aux multiples facettes 6 II) Le soufre utilisé comme composé énergétique 9 A) Oxydation des composés du soufre 10 1. Oxydation du sulfure d’hydrogène H2S 10 a) La Sulfure Quinone Oxydoréductase (SQR) 10 b) La flavocytochrome c sulfure déshydrogénase (FCSD) 13 2- 2. Oxydation du thiosulfate (S2O3 ) 14 a) Thiosulfate : accepteur oxydoréductase (TAOR) 14 b) Le système Sox 16 2- 3. Oxydation du sulfite (SO3 ) 20 a) Sulfite : accepteur oxydoréductase (SAOR) 21 b) Voie de l’APS 23 4. Oxydation du soufre stocké dans les globules 26 B) La réduction du soufre : soufre/polysulfure réductase 29 C) Un cas particulier : la dismutation du soufre (SOR) 33 1. Réactions catalysées 34 2. Structure et architecture 34 a) Le monomère 34 Sommaire b) La protéine entière 36 3. Vue générale du fonctionnement de la SOR 38 III) Complexité des métabolismes énergétiques du soufre : quelques exemples 39 A) Les archées thermoacidophiles : Acidianus ambivalens 39 B) Les bactéries sulfureuses phototrophes 41 C) Les bactéries acidophiles et mésophiles du genre Acidithiobacillus 43 IV) Réflexions sur les modèles des métabolismes énergétique du soufre 46 Chapitre II- Les rhodanèses 48 I) Caractéristiques des rhodanèses 51 A) Organisation en domaines 51 B) Séquence protéique 55 C) Site actif 56 D) Structure tridimensionnelle 57 E) Catalyse et mécanisme catalytique 60 II) Fonction des rhodanèses 62 A) Les protéines à domaine rhodanèse associé 62 Sommaire B) Rhodanèses à un ou plusieurs domaines 65 1. Chez les eucaryotes 66 2. Chez les procaryotes 67 III) Vue d’ensemble de la superfamille des rhodanèses 69 Chapitre III- Aquifex aeolicus 72 I) Les Aquificales 74 II) Présentation de notre modèle d’étude : Aquifex aeolicus 78 A) Morphologie, motilité et adhérence 79 B) Génome 80 C) Physiologie 81 III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 83 A) Voie H2S/O2 83 B) Voie H2/S° 86 C) La SOR 88 D) Les rhodanèses 89 E) NADH déshydrogénase (complexe I) 90 Sommaire F) Vision globale du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 92 Chapitre IV- Objectifs du travail 94 Matériel et méthodes 98 I) Culture bactérienne 100 A) Aquifex aeolicus 100 B) Escherichia coli 101 II) Obtention du matériel biologique 102 A) Aquifex aeolicus 102 1. Fractionnement cellulaire 102 2. Solubilisation des protéines membranaires 103 3. Globules de soufre 104 B) Escherichia coli 104 III) Méthodes de purification des protéines 105 A) Chromatographie d’adsorption 105 Sommaire B) Chromatographies d’échange d’ions 105 1. Chromatographie à basse pression 105 2. Chromatographie à haute pression 105 C) Chromatographie d’exclusion 106 D) Protocoles de purification 106 1. La SQR 106 2. Supercomplexe hydrogénase/soufre réductase 106 3. La SOR et Aq-477 107 IV) Techniques d’analyses biochimiques 111 A) Dosage protéique 111 B) Electrophorèse sur gel d’acrylamide 111 1. Condition dénaturante : Tris-glycine SDS-PAGE 111 2. Condition native : Tris-glycine PAGE 111 3. Gel Bleu Natif 112 4. Gels Bleu Natif à pores larges (BNPL) 113 5. Transfert sur membrane 113 C) Techniques de révélation après électrophorèse 114 1. Colorations 114 Sommaire 2. Immunodétection 115 3. Détection d’activités enzymatiques 116 a) Activité Sulfure Quinone Réductase 116 b) Activité hydrogénase 116 c) Activité cytochrome c oxydase 117 d) Activité NADH-déshydrogénase (complexe I) 118 e) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse) 118 V) Mesures d’activités enzymatiques au spectrophotomètre 119 A) Transfert d’électrons de l’hydrogénase à la soufre réductase 119 B) Activité Soufre Oxygénase Réductase (SOR) 121 C) Activité thiosulfate : cyanure soufre transférase (rhodanèse) 121 VI) Etude d’intéractions protéine-protéine 122 A) La résonance plasmonique de surface (BIAcore) 122 1. Principe de fonctionnement 122 2. Interface utilisée 123 3. Fixation du ligand et mesure de l’interaction 123 B) Pontage covalent in vitro 124 C) Gel retard 124 VII) Analyses protéomiques 125 Sommaire A. Identification des protéines par séquençage N-terminal 125 B. Identification des protéines par spectrométrie de masse 125 1) Maldi-TOF 126 2) Trappe à ions 126 3) Orbitrap 126 C. Analyse de protéines entières par spectrométrie de masse 127 VIII) Microscopies 127 A) Microscopie optique 127 B) Microscopie électronique 127 IX) Analyses in silico 128 A) Recherches de protéines homologues et alignements multiples de séquences 128 B) Prédiction de localisation et de structure secondaire 128 C) Modélisations 129 Résultats et discussion 130 Chapitre I- Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 132 Sommaire I) Une rhodanèse au cœur du trafic 134 II) Une source potentielle de substrat: les globules de soufre 138 A) Influence des conditions de culture 138 B) Tentative d’isolation des globules de soufre 141 III) Métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus : un nouveau Modèle 143 A) Identification de systèmes potentiellement impliqués dans le métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 144 1. Oxydation du thiosulfate 144 2. Oxydation de l’H2S 146 3. Oxydation du soufre 149 4. Oxydation du sulfite 150 a) Voie de l’APS 150 b) Aq_979 150 B) Construction d’un modèle du métabolisme énergétique du soufre chez Aquifex aeolicus 153 Chapitre II- Recherche d’un niveau d’organisation supérieure dans l’architecture des voies respiratoires chez Aquifex aeolicus 155 I) Introduction : Organisation des complexes protéiques membranaires 157 Sommaire II) Développement et optimisation de gels natifs pour la visualisation de mégacomplexes 163 III) Préparation et optimisation des échantillons pour la détection de mégacomplexes 166 IV) Développement des gels natifs à larges pores pour la visualisation des mégacomplexes 169 V) Impact des conditions de culture sur la présence des superédifices 174 VI) Discussion 176 Chapitre III- Mise en évidence d’un nanocompartiment protéique et de sa ferritine atypique chez la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus 178 Conclusions et perspectives 197 Références bibliographiques 203 Introduction 1 Introduction IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN 2 Introduction 3 Introduction Chapitre I Métabolismes énergétiques du soufre 4 Introduction 5 Introduction Métabolismes énergétiques du soufre I) Le soufre, un élément essentiel aux multiples facettes Le soufre, élément connu depuis l‘Antiquité, a depuis toujours intéressé les hommes. Il était connu pour « éloigner la vermine » selon Homère, utilisé dans la préparation de la poudre à canons par les chinois au XIe siècle et toujours utilisé dans divers processus industriels (dont la vulcanisation du caoutchouc) de nos jours. Le soufre a également un impact environnemental très important, justifiant les nombreuses études qui lui sont consacrées : le dioxyde de soufre par exemple, rejeté dans l‘atmosphère par la combustion du pétrole et du charbon ou lors d‘éruptions volcaniques, se combine avec l‘eau dans les nuages pour donner de l‘acide sulfurique. Ce dernier est notamment responsable des tristement célèbres pluies acides, mais il a également un effet refroidissant sur la partie inférieure de l‘atmosphère terrestre en réfléchissant le rayonnement solaire. C‘est ainsi qu‘une diminution de la température de 0,5°C a été mesurée en 1992 après l‘éruption du Pinatubo en 1991. L‘injection de particules de soufre dans l‘atmosphère comme solution d‘urgence au réchauffement climatique a également été discutée dans la communauté scientifique, notamment par le prix Nobel de chimie Paul Crutzen (Crutzen, 2006). La chimie du soufre, tant organique que minérale, est très riche, puisqu‘on le retrouve à des degrés d‘oxydation variés selon les éléments avec lesquels il est combiné. Ainsi, le soufre du sulfure d‘hydrogène (H2S) est à son plus bas degré d‘oxydation (-2), alors que celui 2- du sulfate (SO4 ) est à +6 (Table 1 formes du soufre). Cette large gamme d‘états d‘oxydation place le soufre au centre d‘un éventail de réactions d‘oxydoréduction : la théorie du monde fer-soufre propose ainsi l‘implication de composés du type sulfure de fer (FeS, Fe2S) comme permettant la formation des premières molécules organiques à l‘origine de la Vie (Dörr et al., 2003; Wachtershauser, 2000). 6 Introduction Composés Formule Etat d’oxydation 2- Sulfate SO4 + 6 2- Sulfite SO3 + 4 Dioxyde de soufre SO2 + 4 2- + 2,5 (0 pour les soufres « internes », + 5 Tétrathionate S4O6 pour les deux soufres « externes ») 2- Thiosulfate S2O3 + 2 0 Soufre élémentaire S , S8 0 - - 0 pour les soufres « internes », - 1 pour Polysulfure S-S(n)-S les deux soufres « externes » Pyrite FeS2 - 1 Monosulfure de fer FeS - 2 Sulfure d‘hydrogène H2S - 2 Tableau 1. Degrés d’oxydation des composés soufrés. L‘état d‘oxydation de l‘atome est celui de l‘atome de soufre de la molécule. S8 représente le cyclo-octasoufre. L‘incorporation du soufre dans des biomolécules telles que les protéines, les vitamines, les cofacteurs… est connue depuis bien longtemps, ce qui en fait une brique fondamentale, l‘un des éléments essentiels de la Vie au même titre que le carbone, l‘oxygène, l‘azote ou l‘hydrogène.