Tesis Para Optar Al Grado De Licenciada En Ciencias Básicas, Orientación Biología

Uni versidad Nacional de Cuyo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADA EN CIENCIAS BÁSICAS, ORIENTACIÓN BIOLOGÍA.

“ANÁLISIS EVOLUTIVO Y GENÉTICO D E PLANTAS PARÁSITAS DEL GÉNERO Lophophytum”

Alumna: Josefina Wohlfeiler Altavilla

Directora: Dra. María Virginia Sánchez Puerta

Octubre 2016

“Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

AGRADECIMENTOS

A mi directora, la Dra. Virginia Sánchez Puerta, por su buena predisposición, por su tiempo dedicado en mi aprendizaje, y por despertar mi interés en Evolución Molecular y en la Ciencia.

A las autoridades y personal administrativo de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, por su profesionalismo y dedicación durante estos años.

A la Secretaría de Ciencia, Técnica y Posgrado de la UNCuyo, por otorgarme dos becas de investigación.

Al Dr. Héctor Sato de la Universidad Nacional de Jujuy, por la recolección y fotografías del material de estudio.

A mis compañeros del IBAM, por haberme brindado su apoyo y alegría a lo largo de este camino. En especial a Laura, Cinthia, Fede, Gaby y Caro por haberme ayudado y transmitido conocimientos que me fueron de gran ayuda.

A Florencia Jofré y Josefina Menéndez por haber preparado tantas materias juntas, haber sobrellevado mis ataques de nervios y mi mal humor antes de rendir, y por ser amigas incondicionales.

A mis amigos y compañeros de estudio, por los lindos momentos que compartimos durante la carrera y por su gran ayuda cada vez que lo necesité. Especialmente a Facundo Agüero, Nicolás Jerez, Celeste Calderón, Gonzalo Lucero, Sebastián Drajlin, Cristian Rodríguez y Julio Ruiz.

A todos los integrantes de mi familia, a mi abuela Ñeca, mis padres, mis hermanas, primos y tíos, por alentarme y acompañarme con alegría durante toda mi carrera.

A la familia San Martín, por tantos mates, oraciones y buena onda.

A mi novio Pelu, por estar a mi lado en todo momento, por darme aliento, calma, buenos consejos, alegría y entusiasmo cada vez que lo necesité.

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ÍNDICE

RESUMEN ……………………………………………………………………………….....6

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN …………………………………………………………7

I.1) Plantas parásitas ………………………………………………………………….… 7

I.1.1) Biología de las plantas parásitas ……………………………………..…….. 7

I.1.1.1) Modos de nutrición ……………………………….……………… 8 I.1.1.2) Rango de hospedador ………………………………...…………... 8

I.1.2) Taxonomía de las plantas parásitas ………………………………………… 9

I.1.3) Filogenia de las plantas parásitas …………………………………….…….. 9

I.2) Orden Santalales …………………………………………………………..……….. 9

I.2.1) Familia Balanophoraceae ………………………...……………………….. 11

I.2.2) Género Lophophytum ……………………...……………………………… 11

I.3) Transferencia horizontal de genes ……………………………..………………… 12

I.3.1) Transferencia horizontal en los tres dominios de la vida …...……………. 13

I.3.2) Transferencia horizontal en plantas ……………………………………….. 13

I.3.3) Mecanismos ………………………………….…………………………… 15

I.4) Genomas citoplasmáticos de las plantas ………………….……………………… 16

I.4.1) Genoma mitocondrial de las plantas …………………...…………………. 16

I.4.2) Genoma cloroplastídico de las plantas …………………………………… 17

I.4.3) Sitios de edición del ARN …………………………………….………….. 18

I.5) Objetivos …………………………………………………………………………. 18

I.5.1) General ………………………...………………………………………….. 18

I.5.2) Específicos ………………………………….…………………………….. 19

I.6) Hipótesis ………………………………………………………………………….. 19

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CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS …………..…………………………….. 20

II.1) Recolección del material ………………………...……………………………….. 20

II.2) Extracción de ADN y gel de visualización ……………………………………… 20

II.3) Amplificación de genes mitocondriales, cloroplastídicos y nucleares ……..….. 20

II.4) Electroforesis ………………………………………………..……………………. 22

II.5) Purificación de productos de PCR ……………………………………………… 23

II.6) Secuenciación …………………………………………………………………….. 23

II.7) Southern Blot ………………………………………………..…………………… 23

II.8) Alineamientos …………………………………………………………………… 23

II.9) Árboles filogenéticos …………………………………………………………… 24

CAPÍTULO III: RESULTADOS ……………………………………………………….. 25

III.1) Extracción de ADN ………………………………….………………………….. 25

III.2) Amplificación por PCR de genes mitocondriales, cloroplastídicos y nucleares 25

III.3) Análisis filogenéticos …………………………………………….……………… 27

III.3.1) Análisis del gen nuclear ADNr 18S …………………………………….. 27

III.3.2) Análisis del gen cloroplastídico rbcL ………………………...…………. 27

III.3.3) Análisis evolutivos de genes mitocondriales ……………………..…….. 33

III.3.4) Análisis de bootstrap de los árboles filogenéticos ……………………… 54

III.4) Southern Blot …………………………………….……………………………… 54

CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN …………………………………………………………. 56

IV.1) Filogenia de Santalales, Balanophoraceae y Lophophytum ………………….. 56

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IV.2) Transferencia horizontal de genes mitocondriales entre parásitas y hospedadoras ……………………………………………………………….………….. 57

IV.2.1) ¿Son funcionales los genes foráneos en las parásitas? ………...……….. 58

IV.3) Gen cloroplastídico rbcL en plantas parásitas …………………………..…….. 58

CAPITULO V: BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………. 60

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RESUMEN

Antecedentes: Las plantas parásitas representan alrededor del 1% de las plantas con flor. Éstas tienen la habilidad de nutrirse de otras plantas al invadir los tallos o las raíces de la planta hospedadora mediante una estructura llamada haustorio, la cual interconecta el tejido vascular de la planta parásita con el de la hospedadora. El parasitismo se originó aproximadamente 12 veces en las angiospermas desde ancestros de vida libre. La taxonomía de las plantas parásitas está aún siendo dilucidada debido a la escasez de caracteres morfológicos y a las dificultades que presentan para la sistemática molecular. El efecto más intrigante de la conexión directa parásito-hospedador es la transferencia horizontal de genes que podría ser clave para la evolución de las angiospermas parásitas. El orden Santalales comprende al menos ocho familias con plantas hemiparásitas, holoparásitas y de vida libre, que estarían relacionadas con la familia Balanophoraceae. A su vez, el género de holoparásitos de raíces Lophophytum pertenecería a esta última. Sin embargo, no hay análisis filogenéticos que evalúen estas hipótesis taxonómicas. Actualmente, es muy común para determinar las afinidades filogenéticas de linajes de angiospermas parásitas emplear secuencias del ADN mitocondrial (ADNmt), sin embargo, el uso de éste para estudios taxonómicos de plantas parásitas debe considerar la posibilidad de transferencia génica horizontal.

Resultados: Se analizaron ocho genes de dos especies de Lophophytum, L. mirabile y L. leandri. Dos genes permitieron evaluar las relaciones evolutivas de la familia Balanophoraceae, que resultó ser polifilética, dividida en dos linajes independientes. Se identificaron cinco casos de genes mitocondriales foráneos en ambas parásitas, que fueron obtenidos de sus hospedadores leguminosas. Hibridaciones por Southern Blot mostraron una única copia de los genes foráneos cob y atp1 en Lophophytum mirabile.

Conclusiones: A partir de los análisis filogenéticos se infirió que la familia Balanophoraceae no forma un grupo monofilético y ambos linajes de esta familia forman parte del orden Santalales. El grupo hermano del género Lophophytum fue el género Ombrophytum. Se encontró evidencia de cinco genes mitocondriales foráneos adquiridos por transferencia horizontal en sentido hospedador-parásito. Dos de ellos sugieren transferencia funcional debido a que reemplazaron a los genes homólogos nativos y son genes universalmente presentes en las angiospermas.

Palabras clave: ADN mitocondrial, Balanophoraceae, holoparásita, Lophophytum leandri, Lophophytum mirabile, transferencia horizontal de genes.

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CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN

I.1) Plantas parásitas

En los ambientes naturales, las plantas están en constante interacción con una multitud de diversos organismos y están íntimamente asociadas con otras plantas. Las epífitas crecen sobre otras plantas utilizándolas de soporte. En otros casos, como en la pipa de indio (Monotropa uniflora), obtienen nutrientes indirectamente de otras plantas vía puentes de micorrizas que las conectan con raíces de hospedadores. Una interacción más directa planta a planta se da entre plantas parásitas y sus hospedadores (Estabrook & Yoder, 1998). El parasitismo es una estrategia de vida altamente exitosa y está presente en diversos linajes incluyendo bacterias, arqueas, hongos, animales, protistas, algas y plantas. La mayoría de las plantas son organismos autótrofos, es decir que satisfacen sus necesidades de carbono únicamente a través de la fijación de carbono inorgánico (Westwood et al., 2010). Sin embargo, un número significativo de plantas ha adoptado el modo de vida heterótrofo obteniendo parte o todos sus requerimientos a partir de otros organismos. Éstas pueden dividirse en micoheterótrofas (viven en simbiosis con hongos a través de los cuales se alimentan de materia orgánica en descomposición); y las denominadas parásitas que tienen la habilidad de alimentarse directamente de otras plantas al invadir sus tallos o raíces. Una de las consecuencias de la transición hacia la heterotrofía es la disminución en la presión evolutiva para conservar los procesos fotosintéticos, que resulta en pérdidas de genes cloroplastídicos, y en algunos casos, del genoma o la organela completa (Krause, 2008; Molina et al., 2014).

I.1.1) Biología de las plantas parásitas Las plantas parásitas son comunes en distintos ecosistemas naturales y seminaturales, desde bosques pluviales tropicales hasta el Ártico. Además poseen diversas formas de vida, incluyendo hierbas anuales y perennes, vides, arbustos y árboles (Press & Phoenix, 2005). Muchas veces el parasitismo reduce severamente el desempeño del hospedador, lo cual lleva a que se produzcan cambios en las interacciones competitivas entre plantas hospedadoras y no hospedadoras. Esto, a su vez induce una cascada de efectos en la estructura de las comunidades, diversidad, ciclo vegetativo y zonificación (Press & Phoenix, 2005). Existen diferentes modos de invadir las plantas hospedadoras: algunas parásitas invaden las raíces, mientras que otras invaden las partes aéreas de la planta hospedadora. En cualquier caso, la invasión del tejido vascular del hospedador y la extracción de recursos están mediadas por una estructura llamada haustorio. La misma se utiliza para interconectar el tejido vascular de la planta parásita con el de la planta hospedadora, y permitir así la transferencia de nutrientes, agua e incluso material genético. Los haustorios se encuentran únicamente en las plantas parásitas (Estabrook & Yoder, 1998; Westwood et al., 2010). A su vez, una especialización del parasitismo consiste en el endoparasitismo, en el cual la mayor parte de la porción vegetativa del parásito vive dentro del hospedador, emergiendo del mismo sólo durante la reproducción sexual. Una ventaja selectiva de esta

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especialización podría ser la evasión de herbívoros, así como también, vivir en un ambiente homeostático (Barkman et al., 2007).

I.1.1.1) Modos de nutrición Existen dos tipos básicos de parasitismo: hemiparasitismo y holoparasitismo. Los hemiparásitos tienen clorofila y realizan fotosíntesis al menos en algún momento de su ciclo de vida, sin embargo obtienen agua y nutrientes de la planta hospedadora a través de conexiones haustoriales. A su vez, los hemiparásitos pueden ser divididos en dos tipos: facultativos y obligados. Esta clasificación se basa en el grado de dependencia con el hospedador (Nickrent, 2002a). Los hemiparásitos facultativos pueden vivir autotróficamente y reproducirse sin estar en contacto con el hospedador, pero oportunamente parasitan a plantas hospedadoras cuando están disponibles. Es decir, no requieren un hospedador para completar su ciclo de vida (Nickrent, 2002a; Westwood et al., 2010). En cambio, los hemiparásitos obligados deben parasitar a la planta hospedadora para poder completar su ciclo de vida. Entre estos últimos, se pueden diferenciar dos tipos: primitivos y avanzados. Los hemiparásitos obligados primitivos, son plantas fotosintéticas que se fijan al xilema. En contraste, los hemiparásitos obligados avanzados se unen, no sólo al xilema del hospedador, sino que también obtienen carbono a través de conexiones con el floema (Nickrent, 2002a). La manifestación más extrema del parasitismo se presenta en las plantas holoparásitas (aproximadamente el 10% de las plantas parásitas descriptas) (Heide- Jørgensen, 2008), siendo éstas totalmente aclorófitas y obteniendo todos sus nutrientes del hospedador, de quien son absolutamente dependientes. La mayoría de las plantas holoparásitas acontecen en las raíces del hospedador, sin embargo, existen unas pocas especies holoparásitas de tallos que han perdido la enzima RuBisCO, los tilacoides y la clorofila (Nickrent, 2002a; Westwood et al., 2010). Dependiendo de la especie, las plantas holoparásitas pueden no contener raíz, tallo, hojas, nudos o brotes laterales. Además, muchas carecen de epidermis, estomas, cutícula, pelos absorbentes de la raíz y endodermis (González & Mauseth, 2010).

I.1.1.2) Rango de hospedador Es importante resaltar dos conceptos: rango de hospedador y preferencia por el hospedador. El rango de hospedador se refiere al número total de especies diferentes que pueden ser infectadas por una planta parásita. En cambio, la preferencia por el hospedador, se relaciona con la elección del hospedador más deseado para lograr un crecimiento óptimo; pero cuando estos parásitos se encuentran con otros hospedadores en condiciones artificiales, el parasitismo también puede ocurrir, lo cual indica un rango de hospedador más extenso (Nickrent, 2002a; Nickrent & Musselman, 2004). La mayoría de las plantas parásitas son generalistas, aunque hay excepciones de plantas parásitas que sólo atacan una única especie o género de angiospermas (Press & Phoenix, 2005). La estrategia especialista probablemente tiene ventajas contra la estrategia generalista cuando los hospedadores son comunes en la naturaleza; pero desde una perspectiva evolutiva, los generalistas posiblemente persisten más en tiempo geológico, lo cual podría explicar por qué la mayoría de las plantas parásitas con flor son generalistas (Nickrent, 2002a).

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I.1.2) Taxonomía de las plantas parásitas Las plantas hemi y holoparásitas representan alrededor del 1% de las plantas con flor, con aproximadamente 4200 especies (Nickrent, 2002a). Dentro de las angiospermas se han identificado 28 linajes de plantas parásitas que habrían surgido 12 veces de forma independiente a partir de ancestros de vida libre (Nickrent, 2002b; Barkman et al., 2007; Filipowicz & Renner, 2010). Los linajes parásitos incluyen a: Apodanthaceae, Cytinaceae, Mitrastemonaceae, Santalales (incluyendo las Balanophoraceae), Cynomoriaceae, Hydnoraceae, Rafflesiaceae, Convolvulaceae, Krameriaceae, Lauraceae, Lennoaceae y Orobanchaceae (Figura 1). Sin embargo, la taxonomía de las plantas parásitas está aún siendo dilucidada debido a la escasez de caracteres morfológicos (producto de la extrema reducción o modificación de la morfología floral y vegetativa en las plantas holoparásitas) y a las dificultades que presentan para la sistemática molecular. Los datos moleculares utilizados para inferir las relaciones filogenéticas pueden dar resultados artificiales o inconclusos, ya que los parásitos carecen de los marcadores moleculares cloroplastídicos típicamente utilizados para la taxonomía de plantas (dePamphilis & Palmer 1990; Nickrent et al., 1997) o poseen secuencias de ADN altamente divergentes debido a elevadas tasas de sustitución (Nickrent et al., 2004; Barkman et al., 2007).

I.1.3) Filogenia de las plantas parásitas Barkman et al. (2007) realizaron un análisis de máxima verosimilitud resultando en un árbol filogenético (Figura 1) que representa la ubicación taxonómica de todos los linajes parásitos en el contexto global de las angiospermas. El mismo indica 12 orígenes independientes de plantas parásitas (especificados en el párrafo anterior) nueve de los cuales consisten completamente en especies holoparásitas (Apodanthaceae, Rafflesiaceae, Cynomoriaceae, Cytinaceae, Balanophoraceae, Mitrastemonaceae, Lennoaceae, Orobanchaceae e Hydnoraceae). A su vez, revela cuatro orígenes de endoparasitismo en diferentes linajes: Apodanthaceae, Rafflesiaceae, Cytinaceae y Mitrastemonaceae. Estas observaciones indican que ni las plantas endoparásitas ni las holoparásitas representan grupos monofiléticos (Barkman et al., 2007; Filipowicz & Renner, 2010). La importancia de identificar a los grupos monofiléticos en un análisis filogenético es que éstos incluyen miembros que comparten un ancestro común. Por tanto, son considerados cercanamente relacionados si el ancestro común es reciente, y lejanamente relacionados si el ancestro común más reciente es antiguo (Baum & Shaw, 1995; Futuyma, 2013). De esta manera se pueden establecer relaciones filogenéticas entre distintas especies y las mismas pueden reflejarse en la taxonomía.

I.2) Orden Santalales

Santalales es un orden de las angiospermas que contiene 18 familias, 160 géneros, y más de 2200 especies (Nickrent et al., 2010). Este orden está compuesto mayormente por plantas hemiparásitas, pero también incluye plantas autótrofas confinadas a tres familias pequeñas (Erythropalaceae, Strombosiaceae, y Coulaceae), y holoparásitos de las familias Balanophoraceae y Mystropetalaceae. Con este número de especies, las Santalales forman el grupo más grande de plantas parásitas que comprende casi la mitad del total de plantas parásitas conocidas hasta el momento (Petersen et al., 2015).

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Figura 1) 12 orígenes del parasitismo en la filogenia de las angiospermas. Las ramas verdes corresponden a plantas no parásitas, las anaranjadas, a hemiparásitas, y las rojas son linajes holoparásitos. La letra E indica linajes endoparásitos (Figura adaptada de Barkman et al., 2007).

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I.2.1) Familia Balanophoraceae La familia Balanophoraceae incluye 17 géneros de holoparásitos de raíces (Nickrent et al., 2005; Barkman et al., 2007), que están relacionados filogenéticamente con las plantas del orden Santalales. Sin embargo, la afiliación filogenética de esta familia y de las especies del orden Santalales aún es controversial. A pesar de que las Santalales son las mejores candidatas como el ancestro de las Balanophoraceae, muchas similitudes entre estos dos grupos podrían ser el resultado de convergencia adaptativa hacia el parasitismo (Nickrent et al., 2005). Esta familia se distribuye principalmente en selvas tropicales, y se presenta frecuentemente en altitudes elevadas. Existen especies dioicas y monoicas (Heide- Jørgensen, 2008). En cuanto a la descripción morfológica, la familia Balanophoraceae incluye plantas carnosas de colores blanquecino, amarillento, anaranjado, rojizo y purpúreo. Estas plantas no presentan el cuerpo diferenciado en raíz, tallo y hojas sino que desarrollan un cuerpo vegetativo llamado túber, parcial o totalmente subterráneo y de forma variable. De éste se desarrollan una o más inflorescencias que pueden ser aéreas, parcialmente o totalmente subterráneas, y que emergen sólo durante la época de floración (Sato, 2014). Esta familia es considerada una de las más avanzadas de plantas parásitas con flor debido a la intensa reducción de sus partes florales y vegetativas. El rango de hospedador que presentan la mayoría de las especies de Balanophoraceae es extenso (Heide-Jørgensen, 2008).

I.2.2) Género Lophophytum Según estudios morfológicos, el género Lophophytum pertenecería a la familia Balanophoraceae (González & Mauseth, 2010). Sin embargo, ninguna especie del género ha sido hasta el momento analizada molecularmente y por lo tanto no hay análisis filogenéticos que evalúen dicha hipótesis taxonómica. Tampoco se conoce cuál sería el grupo hermano del género Lophophytum dentro de la familia ni la diversidad genética entre especies del género. El género Lophophytum abarca plantas parásitas de raíces extremadamente ricas en almidón. Se encuentra parasitando mayormente a Anadenanthera colubrina var. cebil (Fabaceae, Mimosoideae), sin embargo se han reportado otras cinco especies de leguminosas Mimosoideae como hospedadoras de este género: Anadenanthera macrocarpa, Piptadenia sp., Parapiptadenia rigida, Inga sp. y Enterolobium sp. (Hansen, 1980). Lophophytum es exclusivamente sudamericano y comprende cinco especies, dos de las cuales crecen en la Argentina: L. leandri en Corrientes y Misiones, y L. mirabile en Salta y Jujuy (Sato & González, 2013). Estas últimas, son especies holoparásitas de raíces de árboles que desarrollan un cuerpo vegetativo o túber completamente subterráneo, del cual sólo emergen las inflorescencias compuestas de origen endógeno (González & Mauseth, 2010). Ambas especies son monoicas. Un carácter utilizado para distinguir a estas dos especies de Lophophytum es el perianto: en L. mirabile el perianto está constituido por una sola pieza, mientras que en L. leandri, por dos piezas (Sato, 2014). Esta tesina consiste en el estudio taxonómico, genético y evolutivo de dos especies holoparásitas del género Lophophytum, L. leandri (Figura 2) y L. mirabile, parásitas de las angiospermas Parapiptadenia rigida y Anadenanthera colubrina, respectivamente. Ambas plantas hospedadoras pertenecen a la subfamilia Mimosoideae de la familia Fabaceae.

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Figura 2) Inflorescencia de Lophophytum leandri emergiendo del túber subterráneo. Foto tomada por Héctor Sato en provincia de Misiones. Barra = 5 cm.

I.3) Transferencia horizontal de genes

La transferencia horizontal de genes (THG), también conocida como transferencia lateral de genes, se refiere al movimiento de información genética entre organismos más o menos relacionados, atravesando las barreras de cruzamiento normal y distinguiéndose así de la transmisión vertical estándar desde progenitores a su progenie (Kelling & Palmer, 2008). Este mecanismo permitiría a los organismos adquirir tanto caracteres adaptativos como no adaptativos, pre-existentes de otros organismos, a pesar de las distancias filogenéticas. Entonces, en lugar de que los rasgos genéticos entre los linajes emerjan gradualmente a través de sucesivas mutaciones y selección, con la THG, la evolución está acelerada por un proceso paralelo en el cual las novedades ocurridas en diferentes linajes

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pueden reunirse en una única célula (Fournier et al., 2015). Sin embargo, la mayoría de los casos reportados de THG en eucariotas (plantas en particular) no otorgan ninguna ventaja adaptativa, siendo posiblemente el resultado de la deriva génica (azar).

I.3.1) Transferencia horizontal en los tres dominios de la vida El árbol de la vida se divide en tres grandes Dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya (Woese, 1990). El material genético ha sido transferido horizontalmente numerosas veces en la historia de la vida, atravesando linajes completamente distintos. Esta transferencia ocurre también frecuentemente entre el genoma nuclear y los genomas de organelas dentro de una misma célula eucariota (Futuyma, 2013). En este caso, el término que utilizamos es transferencia intracelular de genes (TIG). El proceso de THG es notablemente común en la evolución procariótica, conduciendo a la adquisición o modificación de rasgos importantes como la resistencia a antibióticos, virulencia, fotosíntesis y fijación de nitrógeno. En contraste, la imagen actual de este proceso en eucariotas es sin duda muy variada. La THG es en gran medida desconocida en eucariotas multicelulares (animales, plantas y hongos), sin embargo, es más o menos común en diversos grupos de protistas unicelulares, los cuales contienen varios a muchos genes producto de la THG (Bergthorsson et al., 2004; Richardson & Palmer, 2007). Quizá la causa de dicha diferencia en abundancia de la THG entre estos dos últimos grupos, sea que los eucariotas unicelulares no poseen una célula germinal retenida; y que además, frecuentemente éstos engullen sus presas liberando ADN cerca del núcleo (Richardson & Palmer, 2007) lo cual facilita el mecanismo. Existen además, evidencias de THG interdominios que involucran procariotas y eucariotas multicelulares superiores. Por ejemplo, las asociaciones endosimbióticas entre la bacteria Wolbachia pipientis con varias especies de artrópodos proveen un contexto propicio para la THG (Hotopp et al., 2007). La THG también parece ocurrir frecuentemente entre microorganismos y vertebrados; o bien entre vertebrados (Salzberg et al., 2001). La reciente secuenciación del genoma del lagarto Anolis carolinensis revela una amplia transferencia horizontal de transposones entre diversos vertebrados, incluyendo primates, murciélagos y marsupiales. Estos transposones muestran una baja divergencia en sus secuencias entre especies, y difieren primariamente en los sitios sinónimos (Novick et al., 2010).

I.3.2) Transferencia horizontal en plantas En las últimas dos décadas, el intercambio de material genético entre plantas terrestres ha sido inferido en diferentes linajes. Las especies involucradas provienen de clados ampliamente separados tanto geográfica como filogenéticamente. Los clados corresponden a helechos, gimnospermas y angiospermas, lo que insinúa que la THG entre plantas está relativamente extendida (Renner & Bellot, 2012). La mayoría de los casos implican transferencias de una angiosperma a otra, pero la causa de esto bien podría ser que la mayoría de los genes secuenciados en plantas son de angiospermas (Richardson & Palmer, 2007). Las interacciones entre plantas parásitas y hospedadoras han resultado facilitadoras de la THG. Muchos nutrientes y macromoléculas, incluyendo ARN mensajeros (ARNm) y ADN son transferidos entre la planta hospedadora y la parásita (Davis & Xi, 2015). Hasta ahora han sido identificadas transferencias de genes en ambos sentidos, es decir, desde parásito a hospedador (Davis & Wurdack, 2004; Mower et al., 2004; Davis et al., 2005;

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Yoshida et al., 2010), y también desde hospedador a parásito (Davis & Wurdack, 2004; Roney et al., 2007; Xi et al., 2013), pero la mayoría aluden a transferencias de hospedador a parásito. La evidencia de la THG ha sido identificada en 10 de los 12 linajes parásitos identificados hasta ahora (Tabla 1), e involucra predominantemente ADN mitocondrial (Davis & Xi, 2015). La THG que involucra ADN plastídico, por el contrario, es rara. Esto es probablemente debido al hecho de que los plástidos no presentan mecanismos de captación de ADN, y además tienen pocas regiones intergénicas, las cuales permiten que los genes foráneos sean insertados sin perturbar la expresión de los genes nativos (Davis & Xi, 2015). Por último, nuestro conocimiento acerca de la THG que involucra ADN nuclear todavía está en sus comienzos, quizá debido a la escasez de genomas nucleares completos disponibles para poder abordar este tema en un trabajo comparativo (Davis & Xi, 2015). Algunos ejemplos de THG entre plantas incluyen: a) intrón del gen mitocondrial cox1 fue transferido entre cientos (o miles) de plantas con flor (Adams et al., 1998; Cho et al., 1998; Cho & Palmer, 1999; Sánchez-Puerta et al., 2008; Sánchez Puerta et al., 2011); b) la angiosperma basal Amborella ha adquirido copias de genes mitocondriales que codifican proteínas, desde otras plantas terrestres, y además ha obtenido genomas mitocondriales enteros de tres algas verdes y un musgo (Bergthorsson et al., 2004; Rice et al., 2013); c) la planta parásita Striga hermontica (familia Orobanchaceae) obtuvo un gen nuclear de un hospedador monocotiledónea (Yoshida et. al., 2010); d) la parásita de tallo Cuscuta australis así como la parásita de raíz Orobanche aegyptiaca mostraron similitudes mucho más altas en secuencias nucleares con Brassicaceae que con sus parientes cercanos (Zhang et al., 2014); e) la parásita Phelipanche aegyptiaca adquirió genes nucleares de una leguminosa (Zhang et al., 2013); f) varias docenas de genes fueron posiblemente transferidos núcleo a núcleo entre Rafflesiaceae y sus hospedadores (Davis & Wurdack, 2004; Xi et al., 2012); g) parte del genoma mitocondrial del helecho Botrychium virginianum fue adquirido por THG desde una Loranthaceae (Santalales) (Davis et al., 2005); h) la THG mitocondriales en la familia Rafflesiaceae es considerablemente mayor que la THG que involucra genes nucleares (Xi et al., 2013); e i) tres genes mitocondriales fueron transferidos desde el género de parásitas Cuscuta a especies del género Plantago (Mower et al., 2010). De las evidencias de THG reportadas hasta ahora en plantas parásitas se desprende que, la mayoría de estos eventos implica ADN mitocondrial, y que las asociaciones físicas, por ejemplo entre plantas parásitas y sus hospedadores, facilitan la THG planta a planta (Renner & Bellot, 2012). Los genes mitocondriales transferidos parecen instalarse en los genomas mitocondriales de los parásitos, y la mayoría corresponden a intrones y pseudogenes no funcionales (Renner & Bellot, 2012; Davis & Xi, 2015).

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Tabla 1. Resumen de los eventos de transferencia horizontal de genes que involucran plantas parásitas. (Adaptada de Davis & Xi, 2015). Clado Transgenes Referencia 1 gen mitocondrial Nickrent et al., 2004 Apodanthaceae 2 genes mitocondriales Barkman et al., 2007 1 gen mitocondrial Mower et al., 2004 Convolvulaceae 3 genes mitocondriales Mower et al., 2010 1 gen nuclear Zhang et al., 2014 Cynomoriaceae 2 genes mitocondriales Barkman et al., 2007 Hydnoraceae 1 gen mitocondrial Barkman et al., 2007 Lauraceae 1 gen mitocondrial Barkman et al., 2007 Lennoaceae 1 gen mitocondrial Barkman et al., 2007 1 gen mitocondrial Nickrent et al., 2004 Mitrastemonaceae 2 genes mitocondriales Barkman et al., 2007 1 gen mitocondrial Mower et al., 2004 1 gen plastídico Park et al., 2007 1 gen nuclear Yoshida et al., 2010 Orobanchaceae 1 gen plastídico Li et al., 2013 1 gen nuclear Zhang et al., 2013 1 gen nuclear Zhang et al., 2014 1 gen mitocondrial Davis & Wurdack, 2004 1 gen mitocondrial Nickrent et al., 2004 1 gen mitocondrial Barkman et al., 2007 47 genes nucleares Xi et al., 2012 Rafflesiaceae 2 genes mitocondriales 11 genes mitocondriales Xi et al., 2013 14 genes plastídicos 15 genes plastídicos Molina et al., 2014 2 genes mitocondriales Davis et al., 2005 Santalales 1 gen mitocondrial Barkman et al., 2007

I.3.3) Mecanismos Los mecanismos involucrados en la transferencia de ADN foráneo entre plantas no relacionadas pueden ser: vectores, como bacterias, virus, hongos e insectos succionadores de floema (Renner & Bellot, 2012) y distintos tipos de contactos célula a célula entre diferentes especies, lo cual incluye el parasitismo (Mower et al., 2010), el epifitismo (Bock, 2009), los injertos naturales (Mower et al., 2010) y la polinización ilegítima. En los casos donde existe contacto planta con planta, puede ocurrir la transferencia de mitocondrias enteras a través de plasmodesmos. Por último, existen motivos que explicarían parcialmente la alta frecuencia de la THG en las mitocondrias de plantas terrestres, y la

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ausencia de la misma en plástidos: i) las mitocondrias de plantas son competentes en la transformación genética, mientras que no hay evidencia de tal circunstancia en plástidos; y ii) las mitocondrias de plantas generalmente se fusionan in vivo, mientras que los plástidos no lo hacen (Rice et al., 2013).

I.4) Genomas citoplasmáticos de las plantas

I.4.1) Genoma mitocondrial de las plantas Las mitocondrias de las plantas poseen su propio genoma que codifica un número limitado de proteínas. Éstas últimas son principalmente componentes de la cadena transportadora de electrones en la membrana mitocondrial interna, así como también componentes de la maquinaria de transcripción y traducción necesaria para expresar los genes que las codifican (Brennicke & Leaver, 2007). De todos modos, la gran mayoría de los genes esenciales para la biogénesis y funcionalidad de la mitocondria son codificados por el núcleo. Para aquellos genes codificados en el genoma nuclear, la síntesis proteica ocurre en el citosol, y luego las proteínas son importadas hacia la mitocondria post- traduccionalmente. Por lo tanto, la biogénesis de la mitocondria requiere de la expresión coordinada de ambos genomas, nuclear y mitocondrial. Tal coordinación es posible gracias a numerosos factores proteicos codificados en el núcleo, los cuales son responsables de todas las etapas de la expresión génica en la organela (Brennicke & Leaver, 2007). El genoma mitocondrial de las angiospermas se describe, en general, como una molécula única de ADN circular que alberga un juego completo de genes (Kubo & Newton, 2007). Los ADN mitocondriales (ADNmt) de las plantas presentan un gran tamaño el cual oscila entre 0.2 y 11.3 Mb en las angiospermas (Skippington et al., 2015). Se ha inferido que los tamaños de estos genomas se han expandido desde que las plantas colonizaron la tierra (Kubo & Newton, 2007). La densidad genética es comparativamente baja en las mitocondrias de las plantas ya que las regiones codificantes constituyen sólo cerca del 10% del ADNmt total (aproximadamente 60 genes que codifican proteínas, ARN ribosomal y ARN de transferencia). Otro 10-20% de este genoma corresponde a intrones y secuencias importadas desde los genomas plastidial y nuclear. El porcentaje total de los intrones dentro del genoma corresponde al 4-13%. Todos los intrones en los genomas mitocondriales secuenciados se clasifican como intrones del grupo II; sin embargo, un intrón del grupo I transferido horizontalmente al gen cox1 de las angiospermas ha sido documentado (Cho et al., 1998; Kubo & Newton, 2007). Además, los genomas mitocondriales de plantas poseen masivas regiones intergénicas, lo cual, como ya se dijo, permite que los genes foráneos sean insertados en las mismas sin perturbar la expresión de los genes nativos (Davis & Xi, 2015). Cerca del 70% del ADNmt comprende secuencias aparentemente no funcionales, con contenido informacional no discernible. Y el 10% restante son largas secuencias repetidas, las cuales, por frecuentes recombinaciones, dan forma a la organización física del ADNmt (Brennicke & Leaver, 2007). Además de estas secuencias largas, también se pueden encontrar secuencias repetidas cortas. La diferencia entre las repeticiones largas y las cortas es, no solamente la longitud, sino también la actividad de recombinación: mientras que las repeticiones largas parecen recombinarse activamente y con frecuencia, las repeticiones cortas en cambio, son usualmente inactivas, pero podrían igualmente jugar un rol central en la evolución de los genomas mitocondriales de angiospermas (Kubo & Newton, 2007).

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Las mitocondrias de numerosas especies de plantas han adquirido uno a varios tipos de plásmidos extracromosomales o replicones de ADN o ARN, de tamaños que van desde 0.7 kb a 20 kb. En las especies de plantas estudiadas hasta ahora, estos plásmidos de ADN mitocondrial son específicos de cada especie, o bien, se hallan como grupos específicos de moléculas de ADN lineal y circular. Éstos tienen funciones esencialmente desconocidas, y se replican independientemente del ADN mitocondrial principal. La mayoría de estos plásmidos mitocondriales no tienen homología con las secuencias del genoma mitocondrial principal. El origen de los mismos es desconocido, y se propone que estos plásmidos han sido introducidos en células de plantas superiores por simbiontes o patógenos. Todo esto sugiere que las mitocondrias de las plantas poseen una elevada capacidad para capturar e integrar secuencias foráneas (Koulintchenko et al., 2003). Además, como ya se mencionó anteriormente, existe evidencia de frecuentes fusiones entre mitocondrias en plantas superiores, que luego se fisionan y el ADN mitocondrial es desigualmente distribuido durante la división celular mitocondrial (Arimura et al., 2004). Inclusive, se han descripto mitocondrias sin genoma mitocondrial (Sheahan et al., 2005). A lo largo de la evolución, genes codificados en el genoma mitocondrial fueron transferidos al núcleo y eliminados de la mitocondria. Inclusive hoy, genes mitocondriales aún continúan migrando hacia el núcleo en algunas especies de plantas superiores, por lo cual, el contenido génico del genoma mitocondrial puede diferir entre las plantas. Estos genes incluyen aquellos que codifican proteínas ribosomales y polipéptidos involucrados en la biosíntesis del citocromo c. Igualmente, los genes que codifican componentes de la cadena transportadora de electrones han migrado también hacia el núcleo (Brennicke & Leaver, 2007). Por tanto, cuando el contenido de genes que codifican proteínas ribosomales se compara entre las angiospermas, es posible saber con qué frecuencia los genes se han perdido del genoma mitocondrial durante la evolución (Kubo & Newton, 2007). Por el contrario, el ADNmt de los Metazoa se ha estabilizado y la mayoría posee el mismo contenido génico (alrededor de 13 genes que codifican proteínas, 3 ARN ribosomales y 22 ARN de transferencia). La tasa de sustitución en genes mitocondriales de las angiospermas es, en general, muy baja; aproximadamente 3-4 veces más baja que en genes cloroplastídicos y 12 veces menor que en genes nucleares (Palmer & Herbon, 1988). Por esto, es muy común para determinar las afinidades filogenéticas de familias de angiospermas parásitas emplear secuencias del ADNmt (Nickrent, 2002b; Nickrent et al., 2005; Barkman et al., 2007).

I.4.2) Genoma cloroplastídico de las plantas Los genomas plastídicos (ADNpt) de todos los linajes de plantas contienen la información genética en moléculas circulares, así como también en una variedad de monómeros lineales y ramificados (Krause, 2012). Tanto el orden génico como la capacidad de codificación en los plástidos se han mantenido altamente conservados en las plantas superiores. Los ADNpt muestran muy poca variación en su contenido y tamaño genómico. La presión selectiva para el mantenimiento de los genes relacionados con la fotosíntesis parece ser fundamental para conservar el genoma plastídico. La falta de presión de selección por mantener la fotosíntesis en las plantas parásitas, permitió a los genomas plastídicos de las mismas una peculiar evolución (Krause, 2012). A pesar de que las plantas hemiparásitas aún llevan a cabo la fotosíntesis hasta cierto punto, las holoparásitas, como ya se mencionó, dependen completamente del

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hospedador para producir carbohidratos. Por lo tanto, en estas últimas, los genes relacionados con la fotosíntesis no son requeridos, y por ello, pueden volverse pseudogenes y ser eliminados, resultando en una reducción física y funcional del genoma plastídico (Krause, 2008). Por tanto se puede inferir que, una de las consecuencias de la transición hacia la heterotrofía es la disminución en la presión evolutiva para conservar los procesos fotosintéticos, que resulta en pérdidas de genes cloroplastídicos y en una producción primaria reducida (Krause, 2008). Hasta el momento se han estudiado 26 linajes tanto de plantas holoparásitas como de micoheterótrofas, para verificar los genes cloroplastídicos que persisten en estas plantas no fotosintéticas. La comparación de estos 26 genomas cloroplastidiales muestra que 23 de ellos retienen un mínimo juego de 17 genes del total de 116 genes plastídicos que existen normalmente en las plantas (Bellot & Renner, 2015). La excepción a esto la presentan tres endoparásitas: Pilostyles aethiopica y Pilostyles hamiltonii (Apodanthaceae) que contienen sólo cinco genes posiblemente funcionales y de dos a tres pseudogenes (Bellot & Renner, 2015); y Rafflesia lagascae (Rafflesiaceae), en la cual no se han identificado secuencias plastídicas, lo que sugiere una pérdida total del genoma cloroplastídico en esta especie (Molina et al., 2014).

I.4.3) Sitios de edición del ARN La edición del ARN en las mitocondrias y plástidos de las plantas con flor convierten algunos nucleótidos citosina (C) en uracilo (U) en los ARNm y en los ARN de transferencia (ARNt). La mayoría de los sitios de edición del ARN se encuentran en los genes codificadores de proteínas, y muy pocos en los ARNt, en las regiones UTR (untranslated regions, regiones de los transcriptos que no se traducen) y en intrones (Brennicke & Leaver, 2007; Kubo & Newton, 2007). La mayoría de los eventos de edición del ARN ocurre en la primera o en la segunda posición de los codones, por lo cual generalmente se altera el aminoácido (Takenaka et al., 2013). El número de sitios de edición en los genomas mitocondriales de las angiospermas es variable, entre 357 en la remolacha azucarera y más de 700 en Liriodendron tulipifera. Análisis comparativos revelan que existe un número de sitios de edición específico para cada especie (Kubo & Newton, 2007; Richardson et al., 2013). Estas alteraciones en el ARN explican la existencia de muchos codones no conservados en los genes mitocondriales de las plantas. Por ejemplo, muchos codones CGG que codifican el aminoácido Arginina se encuentran en posiciones donde, en lugar de este último, el aminoácido Triptófano es el que está conservado. Este aminoácido se establece como consecuencia de la edición del ARN que condujo al codón UGG, y probablemente, esta edición da como resultado una proteína funcional (Brennicke & Leaver, 2007). Mientras que en las mitocondrias se encuentran varios cientos de modificaciones, en los plástidos se observan sólo cerca de 35-40 eventos de edición del ARN (Brennicke & Leaver, 2007).

I.5) Objetivos

I.5.1) General Comprender la evolución molecular del genoma mitocondrial de angiospermas parásitas y la incidencia de la transferencia horizontal en la historia evolutiva de las mismas.

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I.5.2) Específicos  Determinar relaciones filogenéticas del género Lophophytum y de la familia Balanophoraceae.  Amplificar, secuenciar y analizar genes mitocondriales de Lophophytum spp. y de sus hospedadores leguminosas Anadenanthera colubrina y Parapiptadenia rigida para estudiar su evolución.  Evaluar la incidencia, dirección y datación de la transferencia horizontal de genes mitocondriales entre plantas parásitas del género Lophophytum y sus plantas hospedadoras.

I.6) Hipótesis

 Análisis comparativos de marcadores moleculares citoplasmáticos y nucleares permiten conocer las relaciones filogenéticas de la familia Balanophoraceae y del género Lophophytum.  El género Lophophytum forma un grupo monofilético junto con los otros géneros de Balanophoraceae y están relacionados con el orden Santalales.  Existe una alta frecuencia de transferencia horizontal de genes mitocondriales en las plantas holoparásitas del género Lophophytum adquiridos de sus hospedadores en eventos relativamente recientes.

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CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS

II.1) Recolección del material

Las muestras de las plantas en estudio fueron recolectadas por el Dr. Héctor Sato (Universidad Nacional de Jujuy). La holoparásita Lophophytum leandri y su hospedadora Parapiptadenia rigida fueron recolectadas el día 24/07/13 en 27° 16’ 5’’ S 55° 31’ 4,2’’ O, San Ignacio, provincia de Misiones (Argentina). Lophophytum mirabile y su hospedadora Anadenanthera colubrina fueron recolectadas el 14/01/13 en 23º 55’ 34,9’’ S 64º 55’ 58,5’’ O, Parque Nacional Calilegua en la provincia de Jujuy (Argentina). Las muestras de las holoparásitas (túberes e inflorescencias) fueron congeladas en nitrógeno líquido y mantenidas en el freezer a -80°C en el laboratorio. Hojas de las hospedadoras fueron deshidratadas en sílica gel. Se analizaron muestras de dos individuos por especie.

II.2) Extracción de ADN y gel de visualización

Se realizó la extracción de ADN a partir del tejido de las muestras recolectadas. La extracción y purificación se efectuó de acuerdo a un protocolo de extracción de ADN del kit comercial DNeasy Plant Mini de QIAGEN. Posteriormente, para visualizar el resultado de las extracciones de ADN, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Las muestras fueron sembradas con buffer de siembra (glicerol al 30% y azul de bromofenol) y se realizó la corrida electroforética a 90 voltios durante 45 minutos utilizando buffer TBE 0,5X. Se sembraron 2 μl de muestra con 1 μl de buffer de siembra. Se sembró además un marcador de peso molecular (1kb DNA ladder New England Biolabs) para estimar el tamaño del ADN. El gel fue teñido con Bromuro de etidio (en una concentración de 100 mg/L). Las muestras obtenidas fueron visualizadas y fotografiadas bajo luz UV con un fotodocumentador Ugenius (Syngene).

II.3) Amplificación de genes mitocondriales, cloroplastídicos y nucleares

Se procedió a la amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la ADN polimerasa) convencional en un termociclador Biometra usando las especificaciones y condiciones detalladas en las tablas 2 y 3. La Tabla 2 muestra la composición de la solución para las distintas PCR; y la Tabla 3 muestra la secuencia de pasos de la amplificación por PCR.

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Tabla 2: Composición de la mezcla de reacción para las distintas PCR ensayadas.

Componentes Volumen Concentración final 10X PCR buffer sin Mg 2 μL 1X 10 mM dNTP (incluye dATP, 2 μL 0,2 mM dTTP, dGTP, dCTP) 50 mM MgCl2 0,6 μL 1,5 mM 10 μM forward primer 1 μL 0,5 μM 10 μM reverse primer 1 μL 0,5 μM 5 U/μL Taq ADN polimerasa 0,2 μL 1 U (INVITROGEN) Molde (ADN) 1-3 μL H2O mili-Q Hasta completar 20 μL

Tabla 3: Detalle de las amplificaciones por PCR.

Pasos Temperatura (°C) Tiempo (min:seg) 1) Desnaturalización 95.0 02:00 inicial 2) Desnaturalización 94.0 00:40 3) Hibridación 52.0 00:45 4) Extensión 72.0 01:30 Vuelve al paso 2 hasta completar 36 ciclos 5) Extensión 72.0 07:00 6) Conservación 16.0 Pausa

Para aquellas amplificaciones que no dieron resultados positivos, se añadió 0,5 μl de DMSO (dimetilsulfóxido) en la solución de PCR. Este compuesto es un agente optimizador de PCR que actúa facilitando la separación de las hebras de ADN, con lo cual mejora el proceso de amplificación (Frackman et al., 1998). En el caso de las amplificaciones de los hospedadores leguminosas, se añadió PVP (polivinil-pirrolidona) en una concentración de 2g/100 ml. La razón de este recurso es que los polisacáridos, metabolitos secundarios y polifenoles se encuentran en altas concentraciones en algunos linajes de plantas superiores, como por ejemplo en las leguminosas. Dichos compuestos son propensos a formar complejos con los ácidos nucleicos de los tejidos, lo que resulta en la inhibición de las manipulaciones moleculares. Para evitar estas inhibiciones, se adiciona PVP en la preparación de las PCR (Koonjul et al., 1998). Se realizaron amplificaciones de seis genes mitocondriales: ccmC, rpl5, cox1, atp1, atp8 y cob, un gen nuclear: ADNr 18S y un gen cloroplastídico: rbcL a partir de ADN genómico de la holoparásita Lophophytum leandri y de las hospedadoras leguminosas

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Parapiptadenia rigida y Anadenanthera colubrina. Para ello, se utilizaron “primers” universales ya que estos genes son altamente conservados en todas las angiospermas. La Tabla 4 presenta las secuencias de los primers utilizados para amplificar los diversos genes.

Tabla 4: Secuencias de los primers utilizados para las amplificaciones.

Tamaño Secuencia de los primers (5´-3´) esperado del Gen Origen amplicón (pb) Forward Reverse 18S Nickrent 1994 18S-366F: 1137: Nuclear 800 ADNr GTCTGCCCTATCAACT GTGCCCTTCCGTCAAT rbcL Cloroplastídico rbcL-50F: rbcL-835R: 800 CTTCTACTGGTACATGGAC CGTGAATATGATCTCCACC atp1-F2: atp1-R: atp1 ATCGGTCGAGTGGTCTCAGTTG GTGGCATTCGATCACAGAATC 1300 atp8 atp8-F: atp8-R: 500 ATGCCTCAACTKGATMAATTBAC AACATGKRTKAGCATTATKTY cox1-1: cox1-4: 1700 (con intrón) AYGAMAAATCYGGTYGATGG ACCGRATCCAGGCAGAATGRG 700 (sin intrón) cox1-3: cox1-6: 1800 (con intrón) cox1 Mitocondrial CATCTCTTTYTGTTCTTCGGT AGCTGGAAGTTCTCCAAAAGT 800 (sin intrón) IP53: IP56: 1800 (con intrón) ATGCCATGTCAGGCGCAC GAGCAATGTCTAGCCC 800 (sin intrón) cob-F: cob-R: cob CCGAGCAATCTTAGTTATTGG AATTCCTCTTCCAACTCGTCC 1100 ccmC-F: ccmC-R: ccmC TTCTCATTGGATCTYGGTTGT TCCTTCTCGAGCTTCWATTTC 600 rpl5-F: rpl5-R: rpl5 CGAAGATGTATCACGTCAGG GGTGGTAAAGTCTCATCTTG 500

Las secuencias de ADN de la planta holoparásita Lophophytum mirabile se obtuvieron de la secuenciación completa y ensamble del genoma de la misma con el secuenciador Illumina (Illumina HiSeq) a partir del ADN total de la planta. Esto último proviene de un trabajo de investigación de la Dra. María Virginia Sánchez Puerta. Asimismo, las secuencias de los genes cox1 y cob de Parapiptadenia rigida fueron obtenidas previamente en el laboratorio.

II.4) Electroforesis

Para analizar los productos de la PCR se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se sembraron 5 μl de muestra con 1 μl de buffer de siembra y se realizó la corrida electroforética a 90 voltios durante 45 minutos utilizando buffer TBE 0,5X. Se sembró además un marcador de peso molecular (1kb DNA ladder New England Biolabs) para estimar el tamaño de los fragmentos amplificados. El gel fue teñido con Bromuro de etidio

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(en una concentración de 100mg/L). Las muestras obtenidas fueron visualizadas y fotografiadas bajo luz UV con un fotodocumentador Ugenius (Syngene).

II.5) Purificación de productos de PCR

Previo a la secuenciación es conveniente purificar los productos amplificados para liberarlos de restos de primers, dNTPs, enzimas y demás compuestos utilizados durante la PCR. Los productos de la PCR fueron purificados usando dos procedimientos diferentes, en distintas muestras: PEG (Green & Sambrook, 2012) y ExoSAP-IT (Affymetrix USB).

II.6) Secuenciación

Los genes fueron secuenciados mediante secuenciación automática (“Sanger sequencing”) usando el analizador genético ABI Prism 3130 (Applied Biosystems 3700). Las secuencias obtenidas fueron editadas utilizando el programa Sequencher 4.7 (GenCodes).

II.7) Southern Blot

Se realizaron ensayos de Southern Blot, utilizando el DIG Application Manual for Filter Hybridization, de los genes mitocondriales atp1 y cob de las plantas parásitas L. leandri y L. mirabile para identificar el número de copias de los mismos. Las sondas fueron marcadas con Digoxigenina (DIG) mediante la técnica de PCR (Roche) a partir de ADN de Nicotiana tabacum y utilizando los primers descriptos anteriormente (Tabla 4). La señal fue detectada con CDP-star (Roche).

II.8) Alineamientos

Para realizar estudios comparativos y análisis evolutivos significativos fue necesario realizar una búsqueda de secuencias homólogas en otras angiospermas además de las especies bajo estudio. El BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) fue utilizado como herramienta de comparación y búsqueda de secuencias de otras angiospermas, confrontando las secuencias obtenidas con las existentes en las bases de datos públicas de secuencias de nucleótidos (GenBank de NCBI). Para cada gen se realizó un alineamiento múltiple, incluyendo las nuevas secuencias obtenidas y secuencias homólogas de angiospermas provenientes de la base de datos GenBank (NCBI). Para ello, se utilizó el programa MacClade 4 (Version 4.07) que permite alineación automática y manual de nucleótidos o aminoácidos, al igual que el programa MEGA 6.06 el cual también posibilita la alineación de nucleótidos o aminoácidos. Para el gen cox1 se realizaron alineamientos separados: por un lado las secuencias correspondientes a los exones, y por otro lado las del intrón, ya que sus historias evolutivas son dispares (Adams et al., 1998; Cho et al., 1998; Cho & Palmer, 1999; Sánchez-Puerta et al., 2008; Sánchez Puerta et al., 2011). La predicción de los sitios de edición de los genes mitocondriales se realizó con el programa PREP-Mt (Mower, 2009). Luego se procedió a la eliminación de los sitios de edición del alineamiento debido a que presentan elevada homoplasia que puede generar

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errores en la estimación de las relaciones filogenéticas. Mientras más sitios de edición existan, mayores son las chances de que las señales homoplásicas oscurezcan la verdadera filogenia. Una aproximación a esta última se logra eliminando los sitios de edición (Bowe & dePamphilis, 1996).

II.9) Árboles filogenéticos

La reconstrucción de la historia evolutiva de los genes se realizó mediante análisis de Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) y Máxima Parsimonia (Maximum Parsimony, MP) para cada alineamiento. El método de MP se basa en el principio que afirma que, entre todos los árboles filogenéticos posibles para un grupo de taxa, la mejor estimación de la verdadera filogenia es la que postula el menor número de cambios evolutivos. Por lo tanto, tal árbol presentaría también el menor número de homoplasias (Futuyma, 2013). El programa de computación que se empleó para este método fue PAUP* (Phylogenetic Analisis Using Parsimony). El criterio de optimalidad ML selecciona el mejor árbol en cuanto posea el mayor valor de verosimilitud o likelihood. Es decir, la historia evolutiva más probable de acuerdo a los datos de secuencias de las especies actuales. Además, ML difiere de MP en que la longitud de las ramas estimadas para los árboles de ML son mucho más precisas que las encontradas en los árboles de MP, debido a un mejor cálculo de las sustituciones múltiples (Futuyma, 2013). Este último método es desarrollado por el programa GARLI (Genetic Algorithm for Rapid Likelihood Inference), el cual también se empleó en este trabajo. Para evaluar estadísticamente los árboles filogenéticos, se realizaron 100 réplicas de bootstrap (BS) para establecer el soporte de las ramas y obtener un árbol consenso. Los valores del análisis de “bootstrapping” fueron transferidos al mejor árbol obtenido para identificar los nodos más fuertemente soportados (BS>50%) de cada filogenia. Los valores de bootstrap menores a 50% no fueron incluidos en los árboles para mayor claridad.

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CAPÍTULO III: RESULTADOS

III.1) Extracción de ADN

La extracción de ADN de la planta parásita Lophophytum leandri utilizando un kit comercial dio buen resultado, obteniendo ADN de alto peso molecular (peso molecular estimado >>10 kb). El mismo fue sembrado en cuatro carriles, dos de los cuales (carriles 1 y 4) presentaron bandas tenues pero distinguibles, y uno de los cuales (carril 2) presentó una banda bien perceptible. No se observó ninguna banda en el carril 3 (Figura 3). El ADN genómico obtenido de hojas de las hospedadoras leguminosas Anadenanthera colubrina y Parapiptadenia rigida se observó parcialmente degradado y en menor cantidad (peso molecular estimado >2 kb). Sin embargo, este ADN resultó igualmente útil para las posteriores amplificaciones. Para A. colubrina podemos observar una banda muy tenue en el carril 1, y ninguna banda en el carril 2; y para P. rigida, se obtuvo una banda tenue de ADN degradado (carril 1) y ninguna banda en el segundo carril (Figura 3).

Figura 3) Gel de visualización de extracción de ADN con DNeasy Plant Mini kit de QIAGEN.

III.2) Amplificación por PCR de genes mitocondriales, cloroplastídicos y nucleares

Se amplificaron por PCR seis genes mitocondriales de la planta holoparásita L. leandri y de las plantas hospedadoras A. colubrina y P. rigida. Los genes mitocondriales cox1, cob, atp1, atp8, ccmC y rpl5 codifican para diversas proteínas involucradas en la respiración. El gen cox1 codifica la subunidad 1 de la citocromo c oxidasa; cob, al citocromo b; atp1 y atp8 codifican dos subunidades del complejo ATP sintasa: el núcleo catalítico F(1) y el factor de acoplamiento F(0), respectivamente; el gen ccmC codifica una proteína encargada de la biosíntesis del citocromo c; y rpl5 codifica una proteína de la subunidad mayor de los ribosomas de la mitocondria.

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Además, se amplificaron los genes rbcL y ADNr 18S. El gen rbcL es un gen cloroplastídico que codifica para la subunidad mayor de la enzima ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa/oxidasa (RuBisCO), mientras que la subunidad pequeña de la RuBisCO es codificada por un gen nuclear (rbcS). El gen ADNr 18S es un componente de la subunidad menor del ribosoma de los eucariotas. Se realizaron 254 ensayos de amplificación por PCR en total (95 para A. colubrina, 65 para P. rigida y 94 para L. leandri). El porcentaje de éxito en las amplificaciones fue del 58% para A. colubrina, 40% para P. rigida y 52% para L. leandri. La tabla 5 muestra los detalles de las cantidades de ensayos de PCR realizados para cada gen por cada especie y el porcentaje de éxito de los mismos.

Tabla 5) Detalle de los ensayos de amplificación por PCR.

Especies Gen Origen Ensayos A. P. rigida L. leandri colubrina Cant. ensayos 4 2 4 Ensayos ADNr 18S Nuclear positivos 0 0 2 Éxito 0% 0% 50% Cant. ensayos 7 2 4 Ensayos

rbcL Cloroplastídico positivos 6 2 0 Éxito 86% 100% 0% Cant. ensayos 22 17 12 Ensayos atp1 positivos 15 5 6 Éxito 68% 29% 50% Cant. ensayos 13 17 7 Ensayos atp8 positivos 2 1 4 Éxito 15% 6% 57% Cant. ensayos 18 - 27 Ensayos cox1 positivos 13 - 10 Éxito 72% - 37% Mitocondrial Cant. ensayos 5 - 10 Ensayos cob positivos 3 - 5 Éxito 60% - 50% Cant. ensayos 13 14 15 Ensayos ccmC positivos 9 10 11 Éxito 69% 71% 73% Cant. ensayos 13 13 15 Ensayos rpl5 positivos 7 8 11 Éxito 54% 61% 73%

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III.3) Análisis filogenéticos

Los análisis filogenéticos incluyen 27 secuencias de ADN generadas en este trabajo, pertenecientes a las dos especies parásitas y las dos hospedadoras analizadas en el mismo. Estas secuencias incluyen 4 de atp1, 2 de atp8, 4 de cob, 4 de los exones de cox1, 2 del intrón de cox1, 4 de ccmC, 4 de rpl5, 1 de rbcL y 2 de ADNr 18S. Se obtuvieron 9 árboles filogenéticos por análisis de Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) y 9 árboles por Máxima Parsimonia (MP) basados en los alineamientos de cada gen con los correspondientes soportes estadísticos de bootstrapping (Figuras 4-21).

III.3.1) Análisis del gen nuclear ADNr 18S En las figuras 4 y 5 podemos observar árboles filogenéticos del gen ADNr 18S que incluyen una gran diversidad de angiospermas. En los mismos se observan, por un lado, relaciones evolutivas con elevado apoyo estadístico que incluyen a las afiliaciones ya conocidas entre las plantas; y por otro lado, relaciones filogenéticas con bajo apoyo estadístico que incluyen algunas relaciones inesperadas, como por ejemplo (en el análisis de ML, Figura 4) el grupo monofilético de las Saxifragales (integrado por Paeonia y Mitella) es hermano de Canella (Canellales), y (en el análisis de MP, Figura 5) Polygala y Securidaca están alejadas filogenéticamente siendo que pertenecen a la misma familia (Polygalaceae). Sin embargo, las relaciones con bajo soporte estadístico no se tienen en cuenta al analizar la filogenia debido a que no son significativas. Seis especies de la familia Balanophoraceae pertenecientes a los géneros Lophophytum, Scybalium, Ombrophytum, Helosis y Corynaea se encontraron formando un grupo monofilético con alto soporte de bootstrap, 96% para el análisis de ML (Figura 4) y 100% para MP (Figura 5). Dentro de este grupo (sólo para el análisis de ML) se observa a Ombrophytum como hermano de Lophophytum, con BS= 76%. Dicho grupo no presenta relaciones filogenéticas claras con el resto de las angiospermas ya que, los otros grupos monofiléticos en los que está integrado con ancestros comunes más lejanos, no tienen soporte estadístico significativo (BS<50%). Por otro lado, se encontró un grupo con bajo soporte estadístico integrado por especies pertenecientes a 8 familias del orden Santalales, (Loranthaceae, Opiliaceae, Misodendraceae, Thesiaceae, Nanodeaceae, Santalaceae, Cervantesiaceae y Amphorogynaceae) y tres especies de la familia Balanophoraceae (Mystropetalon, Dactylanthus y Hachettea).

III.3.2) Análisis del gen cloroplastídico rbcL Los árboles filogenéticos basados en rbcL encuentran, en general, las relaciones evolutivas esperadas que existen entre las angiospermas (Figuras 6 y 7). Por ejemplo, se observan en ambos árboles grupos monofiléticos integrados por las angiospermas basales (BS=97% en ML y BS=90% en MP), por las Caryophyllales (BS=100% tanto en ML como en MP), por las monocotiledóneas (BS=100% en ambos análisis), y por las rósidas (BS=86% en ML y 63% en MP). El gen cloroplastídico rbcL no se logró amplificar en L. leandri y tampoco se encontró la secuencia del mismo en el proyecto de secuenciación masiva en L. mirabile. Por otro lado, si bien se logró amplificar por PCR este gen en Anadenanthera colubrina, no se logró la secuenciación del mismo, por lo cual se incluyó la secuencia del gen rbcL de

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Anadenanthera peregrina obtenida de la base de datos de GenBank. Las secuencias de rbcL de Parapiptadenia rigida y Anadenanthera peregrina forman un grupo monofilético con los miembros de la subfamilia Mimosoideae con valores de bootstrap de 91% para el análisis de ML (Figura 6) y 96% para MP (Figura 7). A su vez, los miembros de esta subfamilia se encuentran dentro de las Fabaceae (Leguminosas) con soporte estadístico del 95% para ML y 79% para MP. Las Santalales forman un grupo monofilético separado de las Fabaceae (bootstrap 75% para ML y 59% en MP).

Angiospermas basales Amborella Amborellales 100 Nuphar 91 Nymphaea Nymphaeales Eudicotiledóneas basales Victoria Austrobaileya Austrobaileyales 99 Laurus Magnólidas 72 Daphnandra Laurales 98 Liriodendron Magnolia Magnoliales Monocotiledóneas PetrophileProteales Piper Piperales Trillium Liliales Rósidas 67 Phyllospadix Hydrilla Alismatales Alisma Astéridas 53 Oxalis Sloanea Oxalidales Caryophyllales 75 Poncirus Acer Sapindales Euphorbia Santalales Viola Malpighiales Croton Polygala Securidaca Fabales 100 Physaria 75 Arabidopsis Camelina Brassicales 90 Capsella 55 Cytinus Gossypium Malvales 100 Zea 100 Triticum Poales 100 Hordeum Solanum Solanales 86 Lycium Veronica 59 Rehmannia Lamiales Pogostemon 100 Lactuca 93 Taraxacum Asterales 83 Cirsium Atractylodes 97 Panax 100 Cnidium Angelica Apiales Scybalium 96 100 Corynaea Helosis 76 Ombrophytum Balanophoraceae 70 Lophophytum mirabile Lophophytum leandri Psidium Myrtales 85 Ficus Humulus Rosales Datisca Cucurbitales Elaeagnus Prunus Rosales 67 Quercus Juglans Fagales 66 Senna Caesalpinioideae 74 Parkia Acacia Mimosoideae Inga Bauhinia Caesalpinioideae Albizzia Mimosoideae Sophora 89 Calpurnia 61 Cleobulia 54Dioclea Fabaceae Cymbosema Mucuna Calopogonium Papilionoideae Pongamia Glycyrrhiza Cicer Astragalus Trifolium 55 Medicago Pisum Tapiscia Perrottetia Huerteales Canella Canellales 86 Paeonia Mitella Saxifragales Malania Ximeniaceae (Santalales) Portulaca Caryophyllales 97 Monotropa 70 Pyrola Ericales 79 Cosmelia Vaccinium Nuytsia Loranthaceae Pentarhopalopilia Opiliaceae Ileostylus Loranthus 87 Taxillus 86 Decaisnina Loranthaceae Agelanthus 7164 Tapinanthus Englerina Misodendrum Misodendraceae 83 Mystropetalon 100 Dactylanthus Balanophoraceae Santalales Hachettea 66 Osyridicarpos Thesiaceae Mida Nanodeaceae Lepidoceras Omphacomeria Santalaceae 100 Cervantesia Jodina Cervantesiaceae Figura 4: Árbol filogenético Choretrum Amphorogynaceae 62 Phoradendron bajo Maximum Likelihood 100 Arceuthobium 98 Korthalsella Santalaceae basado en el gen nuclear Antidaphne ADNr 18S. La estrella celeste señala a las parásitas bajo estudio. 0.03 sustituciones por sitio Medicago Angiospermas basales Pisum Trifolium Cicer Astragalus Eudicotiledóneas basales Calopogonium Calpurnia Cleobulia Papilionoideae 53 Cymbosema Magnólidas Dioclea Mucuna Fabaceae 100 Pongamia Glycyrrhiza Sophora Monocotiledóneas 6264 Bauhinia Caesalpinioideae 59 Albizzia 96 Inga Rósidas 75 Acacia Mimosoideae Parkia Senna Caesalpinioideae 81 Acer Poncirus Sapindales Astéridas Securidaca Fabales Viola Croton Malpighiales Caryophyllales Euphorbia Oxalis Sloanea Oxalidales 78 Juglans Santalales Quercus Fagales Elaeagnus Prunus Rosales Datisca 84 Ficus Cucurbitales Humulus Rosales Psidium Perrottetia Myrtales Huerteales Tapiscia 71 Englerina 62 Tapinanthus 85 Agelanthus 89 Decaisnina Loranthaceae 50 Taxillus Santalales Loranthus Ileostylus Pentarhopalopilia Opiliaceae Polygala Fabales NuytsiaLoranthaceae Misodendrum Misodendraceae 84 99 Dactylanthus Hachettea Balanophoraceae Mystropetalon 99 Antidaphne 97 Korthalsella 55 73 Arceuthobium Santalaceae Lepidoceras Phoradendron Santalales Mida Nanodeaceae Omphacomeria Santalaceae Cervantesia 100 Jodina Cervantesiaceae Choretrum Amphorogynaceae Osyridicarpos Thesiaceae 78 Cosmelia 84 Vaccinium Monotropa Ericales Pyrola Canella Canellales Malania Ximeniaceae (Santalales) 88 84 Atractylodes Cirsium 100 Taraxacum Asterales 57 Lactuca Angelica 98 100 Cnidium Apiales 61 Panax 80 69 Pogostemon Rehmannia 81 Veronica Lamiales 100 Lycium Solanum Solanales 100 Hordeum 100 Triticum Zea Poales Austrobaileya Austrobaileyales 63 89 Camelina 100 Capsella Arabidopsis Brassicales Physaria Piper Piperales 56 Lophophytum leandri Lophophytum mirabile Ombrophytum 100 100 Corynaea Helosis Balanophoraceae Scybalium Cytinus Gossypium Malvales Alisma 70 Hydrilla Phyllospadix Alismatales Trillium 100 Daphnandra Liliales 72 55 Laurus Laurales 100 Liriodendron Magnolia Petrophile Magnoliales Portulaca Proteales 80 Mitella Caryophyllales Paeonia Saxifragales 100 98 Nymphaea Victoria Nuphar Nymphaeales Amborella Amborellales Figura 5: Árbol filogenético bajo Máxima Parsimonia basado en el gen nuclear ADNr 18S. La estrella celeste 30.0 sustituciones señala a las parásitas bajo estudio. Angiospermas basales Amborellales Amborella Magnólidas 9 3 Trithuria 9 9 Nuphar Nymphaeales 9 5 Victoria Monocotiledóneas Nymphaea Drimys Canellales Rósidas 6 9 Endiandra Xymalos Laurales Astéridas 9 6 9 7 Liriodendron Caryophyllales 9 6 Magnolia 100 Malmea Magnoliales Santalales 7 2 Mosannona Oxandra Lilium Liliales 100 100 Hordeum Ferrocalamus Poales 9 8 Musa 7 2 Canna Zingiberales Syagrus 8 0 Phoenix Socratea Washingtonia Arecales Elaeis Ravenea Juania 100 Silene Caryophyllales Beta 100 Maba 5 3 9 9 Royena 7 4 Diospyros 9 1 Sarcosperma Ericales 100 Camellia 7 9 Gordonia 9 2 Ipomoea 9 0 Nicotiana Solanales Olea Lamiales Heliotropium Boraginales Rhazya Gentianales 6 0 Hydrangea Cornales 6 3 Lonicera Dipsacales Ilex Aquifoliales 6 2 Panax Apiales 5 3 5 4 Gerbera 100 Mutisia Cynara 5 6 9 9 Echinops Xanthisma Asterales Vernonia 6 6 Helianthus Lactuca Diogoa Heisteria Anacolosa Ximenia 7 5 100 Minquartia Coula 7 9 Lepionurus Misodendrum Santalales 9 9 Santalum 9 2 Osyris 8 0 8 4 Colpoon Nestronia 6 5 79 Cervantesia 5 7 Comandra 8 7 Kunkeliella Buckleya Strasburgeria Crossosomatales 8 9 Eucalyptus Myrtales Gossypium Malvales Jatropha Malpighiales 8 6 7 8 Corynocarpus 9 9 Coriaria 9 5 Neoalsomitra Cucurbitales 6 0 Cucumis 8 7 Xerosicyos Discaria 8 9 6 8 Pentactina Figura 6: Árbol filogenético 100 Physocarpus Rosales bajo Maximum Likelihood Prunus 100 Fragaria basado en el gen cloroplásti- 5 2 Rosa 9 1 Calpocalyx co rbcL. Se observa a la Pentaclethra Prosopis 8 5 hospedadora Parapiptadenia Acacia Mimosoideae Anadenanthera peregrina rigida dentro de la subfamilia 9 5 Parapiptadenia rigida 5 1 Parkia Mimosoideae (bootstrap 91%), Leucaena y a su vez, a los miembros de 5 3 Lotus 9 4 Medicago esta subfamilia dentro de las 100 Cajanus Fabaceae Apios Fabaceae (bootstrap 95%). Las Butea 6 0 100 Dolichos Santalales forman un grupo 5 2 Phaseolus Papilionoideae 8 2 Vigna monofilético (soporte estadísti- 5 0 Glycine Neonotonia co 75 %) separado de las Amphicarpaea 9 8 Otholobium Fabaceae. La estrella anaranja- Bituminaria da señala a la hospedadora bajo estudio. 0.04 sustituciones por sitio 50 Amphicarpaea Figura 7: Árbol filogenético bajo Máxima Parsimo- Neonotonia 62 96 Bituminaria Otholobium nia basado en el gen cloroplástico rbcL. La hospedadora 96 Glycine F 57 100 65 Dolichos a Phaseolus Papilionoideae Parapiptadenia rigida forma un grupo monofilético con Vigna b 99 Butea 92 Apios a los miembros de la subfamilia Mimosoideae con un valor Cajanus 95 Lotus c de bootstrap de 96 %, y a su vez las Mimosoideae se Medicago 79 Parkia e Parapiptadenia rigida encuentran dentro de las Fabaceae (bootstrap 79%). Las Leucaena a 66 Acacia e 96 Anadenanthera peregrina Mimosoideae Santalales forman un grupo monofilético con un soporte Prosopis 66 Calpocalyx Pentaclethra estadístico de 59%. La estrella anaranjada señala a la 85 Neoalsomitra 95 Xerosicyos hospedadora bajo estudio. 99 Cucumis 58 Coriaria Cucurbitales Corynocarpus Jatropha Malpighiales Fragaria 100 Rosa 98 Prunus 63 Pentactina Rosales 81 Physocarpus Discaria Strasburgeria Crossosomatales 78 Gossypium Malvales Eucalyptus Myrtales 75 Lactuca Helianthus 63 Vernonia Xanthisma Asterales 100 55 Cynara Echinops 68 Gerbera Mutisia Panax Apiales Ilex Aquifoliales Lonicera Hydrangea Cornales Dipsacales Heliotropium Boraginales Rhazya Gentianales 77 90 Ipomoea Nicotiana Solanales Olea Lamiales 52 100 Beta Silene Caryophyllales 91 100 Camellia 99 Gordonia 97 Sarcosperma Ericales Diospyros 100 Maba Royena 65 Buckleya 57 Kunkeliella Comandra Cervantesia 59 80 98 Colpoon 58 100 Nestronia Osyris Santalum Santalales Lepionurus Misodendrum 100 Coula 59 Minquartia 90 Anacolosa 50 Heisteria Ximenia Diogoa Juania Ravenea Elaeis Socratea Arecales 96 Syagrus Washingtonia 100 Phoenix 100 Ferrocalamus 51 Hordeum Poales 53 Lilium Liliales 94 Canna Musa Zingiberales Drimys Canellales 82 Mosannona Angiospermas basales 100 Oxandra 91 Malmea Magnoliales 89 Liriodendron Magnólidas Magnolia 90 Endiandra Xymalos Laurales Monocotiledóneas 100 77 Nymphaea 93 Victoria Nuphar Nymphaeales Rósidas Trithuria Amborella Amborellales Astéridas Caryophyllales 40.0 sustituciones Santalales “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

III.3.3) Análisis evolutivos de genes mitocondriales En la filogenia del gen atp1 (Figuras 8 y 9) las plantas parásitas L. mirabile y L. leandri (familia Balanophoraceae) se encuentran en un grupo monofilético y son hermanas de las especies de la subfamilia Mimosoideae, que incluye sus plantas hospedadoras A. colubrina y P. rigida. En este caso los soportes estadísticos corresponden al 69% para ML (Figura 8) y 62% para MP (Figura 9). A su vez, este grupo es hermano del grupo monofilético (BS=83% para ML y 80% para MP) que constituye la subfamilia Papilionoideae. Sin embargo, esta relación de hermandad entre las dos subfamilias tiene valores bajos de bootstrap (BS<50%). Es importante destacar que las especies del género Lophophytum no agrupan con otras especies de la familia Balanophoraceae (Ombrophytum) ni del orden Santalales (Dendrophthoe, Buckleya y Nestronia).

Amborella Amborellales Angiospermas basales Nuphar Nymphaeales Spathiphyllum Alismatales Magnólidas 8 0 Phoenix Arecales 100 Zea 7 9 Triticum Monocotiledóneas 100 Aegilops Lolium Poales Rósidas 7 4 Ferrocalamus 9 2 6 4 Oryza Bambusa Astéridas 9 0 Daphnandra Laurales 7 2 Calycanthus Caryophyllales Magnolia 6 3 Degeneria Magnoliales Santalales Myristica Liriodendron Pseudowintera Canellales Bursera Sapindales Dendrophthoe 5 4 Buckleya Nestronia Santalales Heisteria 100 Minquartia 100 Hibiscus Malvales Gossypium Staphylea Crossosomatales Drosophyllum 7 6 Spinacia 100 Caryophyllales 100 Stellaria Silene Ombrophytum Balanophoraceae 5 1 Daucus Apiales Helianthus Asterales Arabidopsis 100 Brassica 6 2 Brassicales Raphanus Vahlia Vahliaceae 8 0 100 Odonellia 100 Petunia Solanales Nicotiana Parinari 8 4 Hevea Malpighiales Ricinus Cercis Caesalpinioideae 6 8 Lophophytum leandri Balanophoraceae Figura 8. Árbol filogenético bajo Maximum Lophophytum mirabile 6 9 Likelihood basado en el gen atp1. Las parásitas L. 7 0 Leucaena leandri y L. mirabile (Balanophoraceae) constituyen 6 5 Albizia un grupo monofilético con sus hospedadoras P. Anadenanthera colubrina Mimosoideae rigida y A. colubrina (Mimosoideae) con soporte Acacia Prosopis Fabaceae estadístico de 69 %. La estrella celeste señala a las Parapiptadenia rigida parásitas bajo estudio, y la estrella anaranjada, a las 100 Medicago hospedadoras bajo estudio. 100 Vicia 8 3 Pisum Lotus Papilionoideae 6 3 Millettia

100 Glycine 0.0080 sustituciones por sitio 9 6 Phaseolus Vigna 58 Acacia Angiospermas basales Prosopis 70 Albizia Mimosoideae (Fabaceae) Magnólidas Leucaena Anadenanthera colubrina 62 Parapiptadenia rigida Monocotiledóneas 68 Lophophytum mirabile Lophophytum leandri Balanophoraceae 88 Phaseolus Rósidas 100 Vigna 62 Glycine Lotus Papilionoideae (Fabaceae) Astéridas 80 Millettia 100 Pisum 100 Vicia Caryophyllales Medicago Ombrophytum Balanophoraceae Santalales Cercis Caesalpinioideae (Fabaceae) 88 Hevea Ricinus Malpighiales Parinari Arabidopsis 100 Raphanus Brassicales Brassica Dendrophthoe Buckleya Nestronia Santalales Heisteria Minquartia 100 Gossypium Malvales Hibiscus 100 Nicotiana 99 Petunia 85 Solanales Odonellia Vahlia Vahliaceae Daucus Apiales 100 Helianthus Asterales 100 Silene 100 Stellaria 82 Spinacia Caryophyllales Drosophyllum Staphylea Crossosomatales Bursera Sapindales Pseudowintera Canellales Degeneria 52 Liriodendron Magnoliales 67 Magnolia Myristica 82 Calycanthus Laurales 87 Daphnandra 61 Bambusa 68 Oryza Ferrocalamus 61 Lolium Poales 100 92 Aegilops 99 Triticum 91 Zea Phoenix Arecales Spathiphyllum Alismatales Nuphar Nymphaeales Amborella Amborellales

20.0 sustituciones

Figura 9. Árbol filogenético bajo Máxima Parsimonia basado en el gen atp1. Las parásitas L. leandri y L. mirabile (Balanophoraceae) constituyen un grupo monofilético con sus hospedadoras P. rigida y A. colubrina (Mimosoideae) con soporte de bootstrap moderado (62 %). La estrella celeste señala a las parásitas bajo estudio, y la estrella anaranjada, a las hospedadoras bajo estudio. “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

El árbol filogenético del gen atp8 (Figuras 10 y 11) muestra un grupo monofilético integrado por las parásitas L. mirabile y L. leandri y las Mimosoideae (Prosopis y Acacia), con un valor de bootstrap moderado para el análisis de ML (BS=55%; Figura 10); y con un valor de BS=72% para MP (Figura 11). Este grupo resulta hermano, pero con soporte estadístico no significativo, del clado constituido por las Papilionoideae (BS=94% en ambos análisis). Las parásitas del género Lophophytum (Balanophoraceae) no agrupan con la única especie del orden Santalales disponible en las bases de datos (Comandra).

Amborella Amborellales 100 Euryale Nymphaeales Nuphar 6 3 Liriodendron Magnoliales Magnolia 9 1 Lemna Alismatales 8 8 Spirodela Disporum Liliales 9 8 Phoenix Arecales 5 4 7 7 Strelitzia Zingiberales 5 6 Lolium 5 7 100 Aegilops 100 Triticum 5 5 Oryza Zea Poales Sorghum 5 1 Tripsacum 9 3 Ferrocalamus Bambusa Eschscholzia Ranunculales Vaccinium Ericales Androsace 8 9 Olea 6 7 Boea Lamiales 7 4 Angiospermas basales Mimulus Symphoricarpos Dipsacales Eudicotiledóneas basales Ellisia Boraginales 6 9 Rhazya Gentianales Asclepias Magnólidas Daucus Apiales 100 Hymenopappus Monocotiledóneas 7 4 Silphium Asterales Helianthus Comandra Santalales Rósidas Vitis Vitales 9 2 Cucurbita Cucurbitales Citrullus Astéridas Carica Brassicales Ricinus Caryophyllales Hevea Malpighiales 100 Gossypium Hibiscus Malvales Santalales 100 Hirtella Licania Malpighiales Couepia Chrysobalanus Malus Rosales Fragaria Dimocarpus Sapindales 100 Silene Caryophyllales Figura 10: Árbol filogenético bajo Beta 100 Arabidopsis 9 1 Brassica oleracea Maximum Likelihood basado en el Brassicales Raphanus gen atp8. Las parásitas L. mirabile y Brassica nigra 9 7 Lophophytum leandri Balanophoraceae L. leandri forman un grupo mono- 5 5 Lophophytum mirabile 8 2 filético con las Mimosoideae (Fabace- Prosopis Mimosoideae Acacia ae) con un valor de bootstrap modera- Vicia 9 4 Fabaceae do (55 %). La estrella celeste señala a 8 9 Lotus Papilionoideae 7 5 Vigna las parásitas bajo estudio. Millettia

0.02 sustituciones por sitio 98 Lophophytum leandri Balanophoraceae Angiospermas basales 72 Lophophytum mirabile 80 Acacia Mimosoideae Eudicotiledóneas basales Prosopis 85 Millettia Fabaceae Magnólidas 76 94 Vigna Papilionoideae Lotus Monocotiledóneas Vicia 92 Brassica oleracea Rósidas 99 Raphanus Brassicales Brassica nigra Arabidopsis Astéridas 100 Beta Silene Caryophyllales Caryophyllales Fragaria Rosales Dimocarpus Sapindales Santalales Malus Rosales 76 Cucurbita Cucurbitales Citrullus 100 Helianthus Hymenopappus Asterales Silphium Daucus Apiales 65 Asclepias Gentianales Rhazya Ellisia Boraginales 70 Boea 88 Mimulus Lamiales Olea Symphoricarpos Dipsacales Androsace Vaccinium Ericales Comandra Santalales Vitis Vitales Chrysobalanus 100 Couepia Malpighiales 62 Hirtella Licania 100 Gossypium Hibiscus Malvales Hevea Malpighiales Ricinus Carica Brassicales Eschscholzia Ranunculales 57 Oryza Zea Sorghum 55 60 Tripsacum 79 Bambusa Poales Ferrocalamus 100 100 Aegilops Triticum 76 Lolium 97 Strelitzia Zingiberales 92 Phoenix Arecales Disporum Liliales 88 Lemna Alismatales Spirodela 58 Liriodendron Magnoliales Magnolia 100 Euryale Figura 11: Árbol filogenético bajo Máxima Parsi- Nuphar Nymphaeales Amborella Amborellales monia basado en el gen atp8. Las parásitas L. mirabile y L. leandri forman un grupo monofilético con las Mimosoideae (Fabaceae) con 72 % de bootstrap. La 9.0 sustituciones estrella celeste señala a las parásitas bajo estudio. “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

En la filogenia de ccmC (Figuras 12 y 13) las parásitas L. mirabile y L. leandri forman un grupo monofilético con diversas especies de la familia Fabaceae, que incluyen a las hospedadoras A. colubrina y P. rigida (75% de bootstrap para ML y 78% para MP). La subfamilia Papilionoideae forma un clado con 96% de bootstrap para ML y 97% para MP. Es notable que las especies de Lophophytum no son hermanas en este árbol, sino que el género Lophophytum forma un grupo parafilético. No hay disponibles en la actualidad secuencias del gen ccmC en otras especies de la familia Balanophoraceae o del orden Santalales.

Amborella Amborellales Angiospermas basales Spirodela Alismatales 82 Magnólidas Phoenix Arecales 97 Lolium Monocotiledóneas 100 Triticum

6 9 Sorghum Rósidas Zea Poales Bambusa Astéridas Aegilops Santalales Oryza Ferrocalamus Piper Piperales 52 Calycanthus Laurales 6 4 76 Magnolia Magnoliales Liriodendron Vaccinium Ericales Malus Rosales 96 Ricinus Malpighiales Hevea Carica 80 Batis 88 Raphanus 94 Brassicales 95 Arabidopsis 6 5 Eruca Brassica Daucus Apiales Lonicera Dipsacales Helianthus Asterales Gossypium Malvales 95 Cucurbita 7 2 100 Cucumis melo Cucurbitales Cucumis sativus Boea 88 Utricularia 6 2 Mimulus Lamiales 6 3 Salviamiltiorrhiza 55 Ajuga 86 Rhazya Gentianales Asclepias Solanum 6 3 Capsicum 71 Solanales Hyoscyamus Nicotiana Lophophytum leandri Figura 12: Árbol Balanophoraceae 75 Lophophytum mirabile filogenético bajo Maximum

75 Parapiptadenia rigida Likelihood basado en el gen Anadenanthera colubrina ccmC. Las parásitas L. Mimosoideae 79 Acacia mirabile y L. leandri forman Prosopis un grupo monofilético con Glycine 66 las Fabaceae (75 % de 87 Vigna radiata Fabaceae bootstrap). A su vez, dentro 96 Vigna angularis de este grupo, hay otro grupo Millettia Papilionoideae monofilético que incluye Lotus solamente a las Papilionoide- 66 Cicer 98 ae (96 % de bootstrap). La 6 6Pisum estrella celeste señala a las Viciafaba parásitas bajo estudio, y la estrella anaranjada, a las 0.02 sustituciones por sitio hospedadoras bajo estudio. Pisum Angiospermas basales 93 Vicia 52 Cicer Magnólidas Lotus Papilionoideae 97 80 Vigna angularis Vigna radiata Monocotiledóneas Glycine 69 Millettia Fabaceae Rósidas Acacia Prosopis 78 Parapiptadenia rigida Astéridas Mimosoideae Lophophytum mirabile Balanophoraceae Anadenanthera colubrina Santalales Lophophytum leandri Balanophoraceae Arabidopsis 96 Brassica 82 Eruca Brassicales 83 Raphanus Batis Carica Vaccinium Ericales Malus Rosales Daucus Apiales 95 Hevea Malpighiales Ricinus 64 Ajuga 52 Mimulus Salvia Lamiales 82 72 Utricularia Boea 91 Asclepias Rhazya Gentianales Capsicum 58 Hyoscyamus Nicotiana Solanales Solanum Helianthus Asterales Lonicera Dipsacales 100 Cucumis melo 69 94 Cucumis sativus Cucurbitales Cucurbita Gossypium Malvales 70 Liriodendron Magnoliales Magnolia Calycanthus Laurales Piper Piperales 58 Sorghum Zea Aegilops 100 Bambusa Poales Ferrocalamus 92 Lolium Oryza Figura 13: Árbol filogenético bajo Máxima Parsimonia basado en el gen 69 Triticum Phoenix Arecales ccmC. Las parásitas L. mirabile y L. leandri forman un grupo monofilético con las Spirodela Alismatales Fabaceae con un soporte estadístico de 78 %. A su vez, dentro de este grupo, hay Amborella Amborellales otro grupo monofilético que incluye a las Papilionoideae (Fabaceae) únicamente con valor de bootstrap 97 %. Las estrellas celestes señalan a las parásitas bajo 8.0 sustituciones estudio, y las estrellas anaranjadas, a las hospedadoras bajo estudio. “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

En el análisis filogenético del gen cob (figuras 14 y 15) se observa un grupo monofilético constituido por Lophophytum mirabile, L. leandri (BS=97% en ML y BS=100% en MP), y éste hermano de especies pertenecientes a la subfamilia Mimosoideae que abarcan a A. colubrina y P. rigida. El soporte estadístico para este grupo es moderado, BS=56% en ML y BS<50% en MP. A su vez, Lophophytum + Mimosoideae forman un grupo monofilético con especies de otras dos subfamilias de la familia Fabaceae aunque con bajo soporte estadístico (BS=50% en ML y BS<50% en MP).

Amborella Amborellales 6 7 Saururus Angiospermas basales 100 Saruma Piperales Piper Gyrocarpus Magnólidas Atherosperma Laurales Magnolia Liriodendron Magnoliales Monocotiledóneas Annona Drimys Canellales 8 4 Neolitsea Laurales Rósidas 6 3 Laurus Lilium Liliales PetrosaviaPetrosaviales Spirodela Alismatales Astéridas Dioscorea Dioscoreales Pontederia Commelinales Strelitzia Zingiberales Caryophyllales Phoenix Arecales 7 6 Allium Agave Asparagales Pandanus Pandanales Santalales 100 Sagittaria Echinodorus Alismatales Acorus Acorales 7 8 Sorghum Oryza Ferrocalamus Poales 6 0 Triticum Lolium Calycanthus Idiospermum Laurales Chimonanthus 5 7 Batis 100 Eruca 5 5 Eutrema Brassica Brassicales Raphanus Arabidopsis 9 6 Boea Figura 14: 9 3 Mimulus Lamiales Árbol filogenético bajo 6 1 Utricularia 9 9 Capsicum Maximum Likelihood basado en el Nicotiana 5 8 Solanum lycopersicum Solanales gen cob. Las parásitas L. mirabile y Solanum tuberosum 9 5 Asclepias L. leandri forman un grupo mono- Rhazya Gentianales 6 5 100 Beta filético con las Mimosoideae (Faba- 9 1 Lychnis 6 0 Atocion Caryophyllales 7 4 Gypsophila ceae) con un soporte estadístico Dianthus moderado (56 %). A su vez, las 5 7 Hevea Ricinus 100 Licania parásitas también forman un grupo 7 0 Hirtella Malpighiales Parinari monofilético con la familia Fabaceae Chrysobalanus Couepia (bootstrap 50 %). La estrella celeste Oenothera Myrtales Malus Rosales señala a las parásitas bajo estudio, y 9 9 Hibiscus Gossypium Malvales Carica Brassicales la estrella anaranjada, a las hospe- Vaccinium Ericales 9 9 Citrullus dadoras bajo estudio. Cucurbita Cucurbitales Vitis Vitales Heterostemon Caesalpinioideae 9 7 Lophophytum leandri 5 6 Lophophytum mirabile Balanophoraceae 7 8 Parapiptadenia rigida 5 0 Anadenanthera colubrina 5 3 Prosopis Mimosoideae Acacia 7 0 Millettia Fabaceae 8 5 Glycine 8 6 Vigna 7 3 Lotus 9 6 Medicago Papilionoideae 6 7 Cicer 5 5Pisum Vicia

0.02 sustituciones por sitio Angiospermas basales Chrysobalanus 69 Couepia Magnólidas 100 Hirtella 67 Parinari Malpighiales Licania Monocotiledóneas 66 Hevea Ricinus 74 52 Dianthus Rósidas 97 Gypsophila 100 Atocion Caryophyllales Lychnis Astéridas Beta Brassica Caryophyllales Eutrema 100 Raphanus 51 Arabidopsis Brassicales Santalales Eruca Batis Nicotiana Solanum tuberosum 99 Capsicum Solanales 53 Solanum lycopersicum 81 Mimulus 91 Utricularia Lamiales Boea 92 Asclepias Rhazya Gentianales 100 Citrullus 51 Cucurbita Cucurbitales Vaccinium Ericales Carica Brassicales 100 Gossypium Hibiscus Malvales Oenothera Myrtales Malus Rosales Vitis Vitales Cicer 97 Pisum 66 Vicia Medicago 82 Lotus Papilionoideae 71 Glycine 64 Vigna Millettia Acacia Fabaceae 62 Prosopis Anadenanthera colubrina Mimosoideae Parapiptadenia rigida 100 Lophophytum mirabile Lophophytum leandri Balanophoraceae Heterostemon Caesalpinioideae 51 Lolium Triticum 97 Ferrocalamus Poales Oryza Sorghum Acorus Acorales 100 Echinodorus Sagittaria Alismatales Pandanus Pandanales 51 Pontederia Commelinales Strelitzia Zingiberales 87 Agave Allium Asparagales Phoenix Arecales Spirodela Alismatales Dioscorea Dioscoreales 57 Lilium Liliales Petrosavia Petrosaviales 76 Laurus Neolitsea Laurales Annona Liriodendron Magnoliales Drimys Canellales Atherosperma Laurales Magnolia Magnoliales Calycanthus Idiospermum Laurales Figura 15: Árbol filogenético bajo Máxima Parsimonia basado en el gen cob. Chimonanthus 100 Piper Las parásitas L. mirabile y L. leandri se encuentran cercanas a las Mimosoideae 63 Saruma Piperales Saururus (Fabaceae) aunque con bajos valores de bootstrap. La estrella celeste señala a las Gyrocarpus Laurales Amborella Amborellales parásitas bajo estudio, y la estrella anaranjada, a las hospedadoras bajo estudio.

10.0 sustituciones “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

En los análisis filogenéticos de las secuencias codificantes del gen cox1 (Figuras 16 y 17) se observa un grupo monofilético integrado por las Balanophoraceae (L. mirabile, L. leandri y Ombrophytum), con 53% de bootstrap para ML (figura 16) y 64% para MP (figura 17). Las Balanophoraceae no agrupan con otras familias de Santalales como Loranthaceae (Dendrophthoe), Schoepfiaceae (Schoepfia) y Opiliaceae (Lepionurus). Sin embargo, tampoco se relacionan con otros linajes con soporte estadístico >50%. Por otro lado, A. colubrina y P. rigida se encuentran dentro de las Fabaceae con soportes estadísticos de 73% (ML) y 76% (MP). En el análisis de ML (Figura 16) las Mimosoideae forman un grupo monofilético que incluye a las hospedadoras estudiadas (BS= 71%).

Angiospermas basales Amborella Amborellales Magnólidas 9 2 Magnolia Magnoliales Liriodendron Monocotiledóneas 86 Calycanthus Laurales Rósidas Canella Canellales Spirodela Alismatales Astéridas 100 Phoenix Arecales Caryophyllales 79 Oryza Santalales 100 Zea 65 Triticum 82 Poales Bambusa 60 Ferrocalamus Litsea Laurales 54 Vitis Vitales Lepionurus Santalales Toxicodendron Sapindales Ombrophytum 53 Balanophoraceae 78 Lophophytum mirabile Lophophytum leandri Napoleona Ericales Vaccinium 59 Helianthus Asterales Daucus Apiales 97 Mimulus Lamiales 61 Hippuris Atropa 92 Nicotiana Solanales 5 5 Solanum Capsicum 73 91 Vicia 74 Medicago Lotus Papilionoideae Millettia Figura 16: Árbol filogenético 67 73 96 Vigna bajo Maximum Likelihood Glycine basado en el gen cox 1. Las Prosopis parásitas L. mirabile y L. leandri 7 1 Fabaceae Anadenanthera colubrina forman un grupo monofilético con Albizia Ombrophytum (Balanophoraceae) Parapiptadenia rigida Mimosoideae con bootstrap moderado (53 %). Calliandra Las hospedadoras Anadenanthera Parkia colubrina y Parapiptadenia rigida 52 Acacia se encuentran dentro de las Mimo- Leucaena soideae, y éstas a su vez, dentro de Phylica Rosales las Fabaceae (valores de bootstrap Cucurbita Cucurbitales 71% y 73% respectivamente). La Arabidopsis 100 estrella celeste señala a las parási- 93 Raphanus Brassicales Brassica tas bajo estudio, y la estrella Schoepfia anaranjada, a las hospedadoras Santalales Dendrophthoe bajo estudio. Ventilago Rosales Elaeagnus Populus Malpighiales 100 Geranium Geraniales Monsonia Plumbago 89 99 Spinacia Caryophyllales 96 Silene Gypsophila

0.02 sustituciones por sitio Acacia Angiospermas basales Leucaena Anadenanthera colubrina Mimosoideae Magnólidas Calliandra Prosopis Monocotiledóneas Parapiptadenia rigida 90 Glycine Fabaceae 64 Vigna Rósidas 58 Millettia 85 Vicia Papilionoideae Astéridas 76 Medicago Lotus Caryophyllales Albizia Mimosoideae Parkia Santalales 89 Brassica 100 Raphanus Brassicales Arabidopsis 100 Geranium Geraniales Monsonia Cucurbita Cucurbitales 90 Dendrophthoe Schoepfia Santalales Populus Malpighiales Elaeagnus Phylica Rosales Ventilago Atropa 90 Solanum Nicotiana Solanales 72 Capsicum 100 Hippuris Lamiales Mimulus 52 Napoleona Vaccinium Ericales 54 61 Daucus Apiales Helianthus Asterales 68 Lophophytum mirabile 64 Lophophytum leandri Balanophoraceae Ombrophytum Toxicodendron Sapindales 99 Gypsophila 98 Silene 78 Caryophyllales Spinacia Plumbago Vitis Vitales Lepionurus Santalales Litsea Laurales 80 Bambusa 58 Ferrocalamus 100 Triticum Poales 94 Zea 100 Oryza Phoenix Arecales Spirodela Alismatales 77 Canella Canellales Calycanthus Laurales 80 Liriodendron Magnoliales Figura 17: Árbol filogenético bajo Máxima Parsimonia basado en el gen cox1 Las parásitas L. mirabi- Magnolia Amborella Amborellales le y L. leandri forman un grupo monofilético con Ombrophytum (Balanophoraceae) con un valor de bootstrap de 64 %. Las Balanophoraceae no agrupan con otras familias de Santalales. Las hospedadoras A. colubrina y P. rigida se encuentran dentro de la familia Fabaceae (76 % de bootstrap). La estrella celeste 9.0 sustituciones señala a las parásitas bajo estudio, y la estrella anaranjada, a las hospedadoras bajo estudio. “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

En las Figuras 18 y 19 se observa la filogenia del intrón de cox1. Las parásitas L. mirabile y L. leandri son hermanas de Ombrophytum (Balanophoraceae) con altos valores de bootstrap (88% en el análisis de ML en la Figura 18; y 96% en MP, Figura 19), pero no se relacionan con los intrones de las dos especies de Santalales que lo poseen, Dendrophthoe y Lepionurus. Además, las relaciones filogenéticas entre distintos órdenes y familias no son las que se conocen entre las angiospermas. En muchos casos, estas afiliaciones inesperadas están apoyadas por valores de bootstrap moderados a altos. Por ejemplo: Pilea (Rosales) es hermana de cuatro géneros del orden Lamiales con 82% y 76% de bootstrap en ML y MP, respectivamente. Otro ejemplo aún más llamativo es el clado formado por especies del orden de monocotiledóneas Zingiberales, dos especies de Polygala (Familia Fabaceae) e Hydrocotyle (Apiales) con máximos valores de bootstrap (100% en ML y MP).

9 2 Sesamum Lamiales Acalypha Malpighiales Cytinus Malvales 9 7 Rafflesia Rhizanthes Malpighiales 8 8 Ombrophytum 100 Lophophytum mirabile 9 2 Lophophytum leandri Balanophoraceae Siphonochilus Zingiberales Montrouziera Malpighiales Shorea Malvales Hybanthus Malpighiales 5 5 Dionaea Caryophyllales Viola Malpighiales Hydnora Piperales Linum Malpighiales 8 8 Thunbergia 9 8 Barleria 7 2 Sanchezia Lamiales Justicia 9 9 Frasera Exacum Gentianales Euphorbia Malpighia Eudicotiledóneas basales 9 5 Couepia Malpighiales Chrysobalanus 6 0 Aristolochia Piperales Magnólidas Hevea 9 8 Breynia Malpighiales Phyllanthus 8 0 Kaempferia Hedychium Monocotiledóneas Gagnepainia Zingiberales Globba Croton alabamensis Malpighiales 9 0 Melothria Rósidas Citrullus Cucurbitales 9 5 Bursera Dysoxylum Sapindales Lepionurus Santalales 5 3 Pholisma Astéridas 6 0 9 9 Lennoa Boraginales Pilostyles_ Cucurbitales 6 8 Myristica Caryophyllales Knema Magnoliales Cynomorium Saxifragales Mitrastema Ericales Santalales Ehretia Boraginales Asimina Magnoliales Philodendron 5 9 Amorphophallus Zamioculcas Alismatales Melia Sapindales 100 Croton sp Codiaeum Malpighiales 9 5 Jasminum polyanthum Jasminum floridum Lamiales 9 4 Musella Musa Zingiberales 100 Phylica Nesiota Rosales Brexia Celastrales 8 8 5 1 Barringtonia 7 8 6 6 Symplocus Ericales Ilex Aquifoliales 8 2 9 3 Pilea Rosales 6 7 Globularia 9 9 Drymonia Sibthorpia Lamiales Nematanthus 7 1 Hovenia Paliurus Rhamnus Rosales Prosopanche Piperales 6 9 Calceolaria Lamiales Cassytha Laurales Heliotropium Boraginales 7 2 Dendrophthoe Santalales Hura Malpighiales Rhus Sapindales 5 8 Hydrocotyle Apiales 9 0 Polygala sanguinea Figura 18: Árbol filogenético bajo Maximum Likelihood 7 3 100 Polygala verticillata Fabales 8 0 Monotagma basado en el intrón del gen cox 1. Las parásitas L. mirabile CtenantheMaranta 6 7 Saranthe leptostachya Zingiberales Saranthe sp y L. leandri se observan hermanas de Ombrophytum (Balano- Catharanthus 7 0 Neisosperma phoraceae) con 88 % de bootstrap pero no relacionadas con 9 7 Alstonia Strychnos 5 5 Alyxia Gentianales Dendrophthoe ni Lepionurus (Santalales). Se conoce que el 6 6 9 2 Asclepias 100 Coffea intrón del gen cox1 ha sido transferido horizontalmente 6 9 Epifagus Calycosiphonia 6 1 Catalpa cientos de veces entre Angiospermas como lo indican las Paulownia Rehmannia 7 1 Lamium Lamiales inesperadas relaciones evolutivas observadas en el árbol. La 0.02 sustituciones por sitio 9 6 Scrophularia Celsia estrella celeste señala a las parásitas bajo estudio. Figura 19: Árbol filogenéti- 98 Celsia Eudicotiledóneas basales 66 Scrophularia Lamium Magnólidas co bajo Máxima Parsimonia 60 61 Catalpa Lamiales basado en el intrón del gen 54 Paulownia Epifagus Monocotiledóneas 54 Rehmannia Calycosiphonia 87 100 Coffea Rósidas cox 1. Las parásitas L. mirabile Asclepias Alyxia y L. leandri se observan 100 Strychnos Gentianales Astéridas 60 Alstonia Neisosperma hermanas de Ombrophytum Catharanthus Caryophyllales 51 Maranta Saranthe leptostachya Santalales (Balanophoraceae) con 96 % de 81 Saranthe sp Zingiberales 61 Ctenanthe bootstrap pero no relacionadas 100 Monotagma 55 92 Polygala sanguinea con Dendrophthoe ni Lepio- Polygala verticillata Fabales Rhus Sapindales Hydrocotyle Apiales 50 Dionaea Caryophyllales nurus (Santalales). Se conoce Viola Hybanthus Malpighiales que el intrón del gen cox1 ha Montrouziera Shorea Malvales 97 Drymonia 67 Nematanthus Lamiales sido transferido horizontal- 76 95 Globularia Sibthorpia mente cientos de veces entre Pilea Rosales 85 52 Ilex Aquifoliales Symplocus Angiospermas como lo indican Barringtonia Ericales Brexia Celastrales 59 Dendrophthoe las inesperadas relaciones Hura Malpighiales Santalales Heliotropium Boraginales 57 Hovenia evolutivas observadas en el Paliurus Rhamnus Rosales 100 Nesiota árbol. La estrella celeste señala Phylica 82 Calceolaria Lamiales a las parásitas bajo estudio. Cassytha Laurales 100 Lennoa 56 Pholisma Boraginales Pilostyles Cucurbitales Lepionurus Santalales Mitrastema Ericales Cynomorium Saxifragales Ehretia Boraginales Asimina 98 Bursera Magnoliales Dysoxylum Sapindales 66 Knema Myristica Magnoliales 96 Jasminum floridum Lamiales 93 Jasminum polyanthum Musa Zingiberales 100 Musella Codiaeum Malpighiales Melia Sapindales Croton sp 64 Amorphophallus Zamioculcas Alismatales Philodendron 50 Gagnepainia 78 Kaempferia Hedychium Zingiberales Globba 60 Aristolochia Piperales Hevea Euphorbia 98 Chrysobalanus Malpighiales Couepia Malpighia 99 Lophophytum mirabile 96 Lophophytum leandri Balanophoraceae Ombrophytum 100 Exacum Frasera Gentianales 86 Citrullus Melothria Cucurbitales Croton alabamensis 52 Malpighiales 98 Barleria 90 Sanchezia Lamiales Justicia Thunbergia 51 Hydnora Piperales Linum 100 Breynia Phyllanthus Malpighiales 100 Rafflesia Rhizanthes Siphonochilus Zingiberales 56 Prosopanche Cytinus Malvales 81 Sesamum Lamiales Piperales Acalypha Malpighiales

10.0 sustituciones “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

Al estudiar la filogenia del gen mitocondrial rpl5 (Figuras 20 y 21) se observa que las parásitas L. mirabile y L. leandri se agrupan con las especies pertenecientes a la subfamilia Mimosoideae (que incluye a las hospedadoras A. colubrina y P. rigida) formando un grupo monofilético con alto soporte estadístico para ambos métodos (76% para ML, Figura 20 y 83% para MP, Figura 21). La mayoría de las relaciones más ancestrales no poseen apoyo estadístico.

Amborella Amborellales Angiospermas basales 7 6 Magnolia Magnoliales Liriodendron 9 8 Phoenix Magnólidas Arecales 100 Elaeis Typha Monocotiledóneas 9 1 Triticuma 100 Oryza Poales Rósidas 8 2 Bambusa 5 1 Ferrocalamus Astéridas Vitis 6 8 Vitales 9 8 Silene vulgaris Caryophyllales 100 Silene latifolia Caryophyllales 100 Beta vulgaris Santalales Beta macrocarpa Helianthus Asterales 7 6 Rhazya Gentianales 8 1 9 9 Mimulus Lamiales 6 7 Salvia 9 9 Hyoscyamus 100 Solanum Solanales Nicotiana 9 1 Hevea Ricinus 100 Hirtella Malpighiales Licania Parinari Chrysobalanus 9 9 Citrullus Cucurbitales Cucurbita 7 2 Acacia 7 6 Lophophytum mirabile Balanophoraceae Parapiptadenia rigida Mimosoideae (Fabaceae) Anadenanthera colubrina Lophophytum leandri Balanophoraceae Prosopis Gossypium Malvales Carica 6 2 Batis Arabidopsis 9 6 Brassicales 8 3Eruca Brassica carinata Brassica oleracea Vigna Millettia Papilionoideae (Fabaceae) Glycine Figura 20: Árbol filogenético bajo Maximum Likelihood Lotus basado en el gen rpl5. Las parásitas L. mirabile y L. leandri 5 4 Malus Rosales forman un grupo monofilético con las Mimosoideae que Oenothera Myrtales 9 9 Medicago contiene a las hospedadoras A. colubrina y P. rigida (boot- 8 8 Vicia Papilionoideae (Fabaceae) strap 76). Las estrellas celestes señalan a las parásitas bajo Pisum estudio, y la estrella anaranjada, a las hospedadoras bajo estudio. 0.02 sustituciones por sitio Figura 21: Árbol filogenético bajo 62 Pisum Máxima Parsimonia basado en el gen 100 Vicia Papilionoideae (Fabaceae) Medicago rpl5. Las parásitas L. mirabile y L. Oenothera Myrtales leandri forman un grupo monofilético Malus Rosales con la subfamilia Mimosoideae que Lotus Glycine Papilionoideae (Fabaceae) contiene a las hospedadoras A. colubrina Millettia y P. rigida (bootstrap 83). Las estrellas Vigna 62 Lophophytum mirabile Balanophoraceae celestes señalan a las parásitas bajo Acacia Prosopis estudio, y las estrellas anaranjadas, a las 83 Mimosoideae (Fabaceae) Parapiptadenia rigida hospedadoras bajo estudio. Lophophytum leandri Balanophoraceae Anadenanthera colubrina 99 Citrullus Cucurbitales Cucurbita Brassica carinata 65 97 Brassica oleracea Eruca Brassicales 69 Arabidopsis Batis Gossypium Malvales Chrysobalanus 100 Hirtella Licania Malpighiales Parinari 91 Hevea Ricinus 100 Nicotiana 100 Solanum Solanales Hyoscyamus 76 99 Mimulus Lamiales 79 Salvia 80 Rhazya Gentianales Helianthus Asterales 100 Beta macrocarpa 100 Beta vulgaris Caryophyllales 100 Silene latifolia Silene vulgaris Carica Brassicales Vitis Vitales 90 Liriodendron Magnolia Magnoliales Bambusa 79 Angiospermas basales Ferrocalamus 100 Oryza 94 Poales Magnólidas Triticum 100 Typha Monocotiledóneas 100 Elaeis Phoenix Arecales Rósidas Amborellales Amborella Astéridas Caryophyllales 7.0 sustituciones Santalales “Análisis Evolutivo y Genético de Plantas Parásitas del Género Lophophytum.” Wohlfeiler J.

III.3.4) Análisis de bootstrap de los árboles filogenéticos En la Tabla 6 se muestran los valores de bootstrap de los grupos monofiléticos formados entre las especies de plantas analizadas en este trabajo, para cada gen por separado. Por un lado, las parásitas del género Lophophytum y la subfamilia Mimosoideae; y por otro lado, estas parásitas y los miembros de la familia Fabaceae (leguminosas).

Tabla 6) Valores de soporte de bootstrap de las relaciones entre las especies del género Lophophytum y las leguminosas.

Gen Grupo Valor de Nu Cp Mitocondriales monofilético bootstrap intrón 18S rbcL atp1 atp8 ccmC cob cox1 rpl5 cox1 Lophophytum ML - - 69 55 - 56 - - 76 y Mimosoideae MP - - 62 72 - <50 - - 83 Lophophytum ML - - <50 <50 75 50 - - - y Fabaceae MP - - - <50 78 <50 - - - Abreviaturas: Nu, nuclear; Cp, cloroplastídico.

III.4) Southern Blot

Se realizaron hibridaciones de Southern Blot de Lophophytum mirabile y L. leandri utilizando dos sondas (cob y atp1) para evaluar la presencia y el número de copias de cada gen. El experimento de Southern Blot muestra la hibridación positiva de una única copia del gen cob y del gen atp1 en L. mirabile (Figura 22). No se observó ninguna banda de L. leandri posiblemente por una baja concentración de ADN o falla en la transferencia del ADN a la membrana.

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Figura 22) Southern Blot de los genes cob (recuadro izquierda) y atp1 (derecha) para Lophophytum mirabile. En ambos casos, resulta una única copia del gen en L. mirabile. El tamaño de los fragmentos es de 1,1 kb para cob, y 1,3 kb para atp1.

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CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN

La presente tesis se focaliza en el estudio genético y evolutivo de las plantas holoparásitas Lophophytum mirabile y L. leandri (Balanophoraceae) y sus plantas hospedadoras Anadenanthera colubrina y Parapiptadenia rigida (Mimosoideae, Fabaceae). En particular, está centrada en la transferencia horizontal de genes (THG) mitocondriales en las plantas parásitas del género Lophophytum. En primer lugar, fue necesario evaluar las relaciones evolutivas del género Lophophytum y la familia Balanophoraceae en relación al orden Santalales para luego poder identificar eventos de THG a partir de discordancias en los árboles filogenéticos entre genes.

IV.1) Filogenia de Santalales, Balanophoraceae y Lophophytum

Se mencionó anteriormente que, según estudios morfológicos, el género Lophophytum pertenecería a la familia Balanophoraceae (González & Mauseth, 2010), pero no hay análisis moleculares al respecto. En este estudio se generaron las primeras secuencias nucleotídicas de dos especies del género Lophophytum. A partir de ellas, se realizaron estudios filogenéticos para conocer la evolución de los genes y de los organismos. El análisis filogenético del gen ADNr 18S, así como también el de cox1 y el intrón de cox1 señalan a la Balanophoraceae Ombrophytum como hermana del género Lophophytum. Para el caso del gen nuclear ADNr 18S por Maximum Likelihood esta afiliación tiene soporte estadístico medianamente alto, mientras que para el método de Máxima Parsimonia, no es significativo. Por su parte, para cox1, en ambos métodos, el soporte estadístico para esta relación es moderado. Y para el intrón de cox1, el valor de soporte estadístico es alto. En conjunto, este análisis sugiere que el grupo hermano del género Lophophytum es el género Ombrophytum y confirma que Lophophytum pertenece a la familia Balanophoraceae. A su vez, estudios anteriores han sugerido que miembros de la familia Balanophoraceae están relacionados filogenéticamente con las plantas del orden Santalales (Nickrent et al., 2005), sin embargo, estas relaciones son controversiales. En el presente análisis filogenético del gen nuclear ADNr 18S observamos que las especies de la familia Balanophoraceae formaron 2 grupos monofiléticos separados, indicando que la familia es polifilética. Cinco géneros de Balanophoraceae (Scybalium, Corynaea, Helosis, Ombrophytum y Lophophytum) formaron un clado con alto soporte estadístico; dicho grupo no mostró afinidad por ningún otro linaje de las angiospermas incluidas en el análisis. Por otro lado, los géneros holoparásitos Hachettea, Dactylanthus y Mystropetalon conformaron un clado con alto soporte estadístico (BS= 83 y 84% ML y MP respectivamente) relacionado con el orden Santalales. Estos resultados concuerdan con el reciente análisis realizado por Su et al. (2015), el cual encuentra dos clados de Balanophoraceae bien diferenciados, ambos cercanos a distintas familias del orden Santalales. El primero, compuesto por siete géneros (Corynaea, Helosis, Ombrophytum, Lophophytum, Sarcophyte, Thonningia y Balanophora) que conforman la familia Balanophoraceae sensu stricto. El segundo clado, constituido por tres géneros: Dactylanthus, Hachettea y Mystropetalon, que conforman la familia Mystropetalaceae. Esta inferencia no monofilética de las Balanophoraceae indica que el holoparasitismo ha evolucionado independientemente

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en dos oportunidades en el orden Santalales (Su et al., 2015). Estas observaciones reafirman la hipótesis de Nickrent et al. (2005) que manifiesta que las Balanophoraceae se originan de las Santalales (es decir, el ancestro de las Balanophoraceae es una Santalales) y estos grupos no son hermanos.

IV.2) Transferencia horizontal de genes mitocondriales entre parásitas y hospedadoras

Los genes mitocondriales de plantas son propensos a la transferencia horizontal (Bergthorsson et al., 2003; Won & Renner, 2003; Bergthorsson et al., 2004; Davis & Wurdack, 2004; Nickrent et al., 2004; Barkman et al., 2007). Estudios previos señalan sucesos de THG en la mayoría de los linajes de plantas parásitas conocidos hasta el momento, e involucran predominantemente ADN mitocondrial (Davis & Xi, 2015). Revisando los resultados obtenidos en los análisis filogenéticos de los seis genes mitocondriales estudiados (atp1, atp8, cob, ccmC, rpl5 y cox1) se pueden detectar cinco casos de genes foráneos probablemente obtenidos por transferencia horizontal: atp1, atp8, cob, ccmC y rpl5. En general, se observa en cada árbol, un grupo monofilético que abarca a las parásitas del género Lophophytum y especies pertenecientes a la subfamilia Mimosoideae (Fabaceae); o bien, a las parásitas Lophophytum y miembros de la familia Fabaceae. En ambos casos, están incluidas las hospedadoras Anadenanthera colubrina y Parapiptadenia rigida (excepto para atp8 que no se secuenciaron). El apoyo estadístico para estas relaciones inesperadas entre Lophophytum y leguminosas fue moderado (atp1, atp8, cob) a alto (rpl5, ccmC). Como conclusión, las inconsistencias observadas en los árboles de estos cinco genes mitocondriales, puntualmente en la ubicación de las parásitas del género Lophophytum, sugieren eventos de transferencia horizontal de genes, en sentido hospedador-parásito. La razón de optar por esta direccionalidad es que, en todos los casos, la inconsistencia se exhibe en las parásitas. En lo que concierne al momento evolutivo en el cual pueden haber tenido lugar los eventos de transferencia horizontal, nuevamente analizamos los árboles filogenéticos de estos cinco genes mitocondriales probablemente adquiridos por THG. Para ello, se plantean dos posibles escenarios a priori: uno representa la THG anterior a la divergencia de las especies del género Lophophytum, y el otro, la THG posterior a la especiación de las mismas. En el primer escenario, se espera observar en el árbol filogenético un clado con las dos especies de Lophophytum, y este grupo a su vez, hermano del grupo monofilético que contiene a las hospedadoras. En tal caso, se podría afirmar que la THG ocurrió en el ancestro de Lophophytum, que luego divergió en al menos dos nuevas especies (L. mirabile y L. leandri). La segunda alternativa propone que, luego de la divergencia del género Lophophytum ocurrió el evento de THG. Por lo tanto, se espera observar en el árbol filogenético a cada parásita hermana de su correspondiente hospedadora, es decir, L. leandri hermana de Parapiptadenia rigida, y L. mirabile hermana de Anadenanthera colubrina. Con base en los resultados obtenidos, se deduce que, para atp1, atp8 y cob, el primer escenario es el adecuado, es decir, en estos casos, la THG fue anterior a la divergencia del género Lophophytum. Y por otro lado, para los genes ccmC y rpl5 la segunda opción podría ser la apropiada. La THG habría ocurrido luego de la divergencia de Lophophytum.

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Analizando el intrón del gen cox1, se puede ver claramente que éste ha sido transferido horizontalmente cientos de veces entre las angiospermas, como lo indican las inesperadas relaciones evolutivas observadas en el árbol y estudios anteriores (Adams et al., 1998; Cho et al., 1998; Cho & Palmer, 1999; Sánchez-Puerta et al., 2008; Sánchez Puerta et al., 2011). Particularmente, L. mirabile y L. leandri se observan hermanas de Ombrophytum, y se puede decir, que en este caso, la adquisición del intrón fue anterior a la divergencia entre los géneros Lophophytum y Ombrophytum.

IV.2.1) ¿Son funcionales los genes foráneos en las parásitas? Otro aspecto importante a discutir es la posible funcionalidad de los genes transferidos. Es decir, si el material genético adquirido por la planta se trata de pseudogenes o genes intactos, y si la planta parásita los utiliza para realizar ciertas funciones de la célula. Como ya se mencionó, la mayoría de los genes mitocondriales transferidos corresponden a intrones y pseudogenes no funcionales (Renner & Bellot, 2012; Davis & Xi, 2015). Estos últimos coexisten con el gen homólogo nativo que es funcional (Kelling & Palmer, 2008). Además, han sido descriptos algunos casos de recombinaciones entre la copia del gen foráneo y la copia nativa resultando en un gen quimérico (Bergthorsson et al., 2003; Barkman et al., 2007); así como también casos de recaptura de un gen perdido anteriormente del genoma mitocondrial (Bergthorsson et al., 2003). Existen también, escasos ejemplos en los que se pierde la copia nativa una vez adquirida la foránea, posiblemente como resultado de la recombinación homóloga entre ambas copias (Xi et al., 2013). Los ensayos de Southern Blot realizados para los genes atp1 y cob muestran una única copia del gen, en cada caso, para Lophophytum mirabile. Ahora bien, al ser foránea la única copia que posee la planta (de acuerdo a los resultados de los árboles), y al ser estos genes mitocondriales de vital importancia para la célula (ya que codifican proteínas implicadas en la respiración celular), esta única copia foránea es por tanto la que utiliza la planta parásita. Esto quiere decir que, por un lado, Lophophytum mirabile retuvo los genes adquiridos (foráneos), y por otro lado que perdió sus genes nativos. Al perder los genes nativos, indefectiblemente deberá utilizar los foráneos. En definitiva, se podría tratar de casos de transferencia funcional. Sin embargo, es importante tener en cuenta que mediante la técnica de Southern Blot es posible que se subestime el número de copias de los genes.

IV.3) Gen cloroplastídico rbcL en plantas parásitas

Para ambas plantas parásitas estudiadas en esta tesis, Lophophytum mirabile y L. leandri, se intentó amplificar el gen rbcL y no se logró. Más aún, en el análisis de la secuenciación por Illumina de L. mirabile no se encontraron secuencias cloroplastídicas. De acuerdo con la bibliografía, los genomas cloroplastídicos de plantas parásitas secuenciados hasta ahora presentan pérdida de genes fotosintéticos (Bellot & Renner, 2015) y además, existe un caso de pérdida total del genoma cloroplastídico (Molina et al., 2014). En las plantas holoparásitas los genes relacionados con la fotosíntesis no son requeridos, y, por lo tanto, pueden derivar en pseudogenes y ser eliminados, resultando en una reducción física y funcional del genoma plastídico. Por lo tanto, una de las consecuencias de la transición hacia la heterotrofía es la disminución en la presión evolutiva para conservar los procesos fotosintéticos, que resulta en pérdidas de genes cloroplastídicos y en consecuencia, en una

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producción primaria reducida (Krause, 2008). Los resultados de la presente tesis apoyan esta hipótesis.

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CAPÍTULO V: BIBLIOGRAFÍA

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