Tom 60 2011 Numer 1–2 (290–291) Strony 173–177

Marta Bałabusta, Krystyna Maria Janas

Katedra Ekofizjologii i Rozwoju Roślin Uniwersytet Łódzki Banacha 12/16, 90-237 Łódź e-mail: [email protected]

DO CZEGO ROŚLINIE POTRZEBNY JEST BARWNIK ZWIERZĘCY — BILIRUBINA?

WSTĘP W 2009 r. Cary Pirone, z Institute of Bio- logical Science, Florida Interational Universi- ty, opublikował sensacyjne doniesienie, że w osnówce nasion (zgrubienie rozwijające się wokół nasienia i stanowiące jego otoczkę) strelicji (Strelitzia nicolai Regel & Koern.), zwanej białym rajskim ptakiem, znajduje się bilirubina (Pirone i współaut. 2009), znana jako związek syntetyzowany tylko u zwierząt. Ryc. 1. Struktura bilirubiny-IX a. Bilirubina (Ryc. 1) jest produktem degra- dacji hemoglobiny u zwierząt. Część białko- rozpowszechnioną w klimacie tropikalnym. wa hemoglobiny ulega rozpadowi do amino- Owoce jej są skórzaste, suche, pękające, z kwasów, natomiast z hemu powstaje liniowy intensywnie pomarańczowymi wypustkami i tetrapirol biliwerdyna, która następnie redu- licznymi nasionami w środku (Pierce i Wsler kowana jest do bilirubiny (Murray i współ- 1995). Identyfikacja barwników występują- aut. 1990). Atom żelaza zostaje włączony do cych w osnówce nasion, przy wykorzystaniu ogólnej puli żelaza obecnej w organizmie. U wysokosprawnej chromatografii cieczowej człowieka przekształcenie hemu do bilirubi- (HPLC) wykazała, że w ekstraktach pojawiał ny przez komórki siateczkowo-śródbłonkowe się jeden główny związek, który pochłaniał można zaobserwować in vivo na przykładzie światło UV o maksimum 444 nm. Związek krwiaka, w którym czerwonawa barwa prze- ten zidentyfikowano jako bilirubinę-IX a wy- chodzi powoli w żółte zabarwienie, spowo- korzystując w tym celu metodę spektroskopii dowane przemianą czerwonego hemu do magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) żółtej bilirubiny. oraz sprzężenie spektrometru masowego z Strelitzia nicolai jest rośliną naturalnie chromatografem cieczowym (LC-ESI) (Pirone występującą w Południowej Afryce, szeroko i współaut. 2009).

WYSTĘPOWANIE BILIRUBINY Wykazano, że występowanie bilirubiny aut. 2009). Wyniki analiz ekstraktów otrzy- nie jest ograniczone tylko do S. nicolai. Jej manych z tych roślin jednoznacznie wykazały obecność stwierdzono u innych gatunków obecność w nich barwników, których czas należących do Strelitziaceae jak np. Phenako- retencji i zakres absorpcji promieniowania spermum guyanense Endl. i strelicji królew- UV były porównywalne z tym, które uzyska- skiej (Strelitzia reginae Ait.) (Pirone i współ- no dla bilirubiny (Pirone i współaut. 2010a). 174 Marta Bałabusta, Krystyna Maria Janas

Analiza chromatograficzna barwnika z W dojrzałych tkankach osnówki nasion dziesięciu badanych gatunków roślin wykaza- bilirubina kumuluje się w komórkach w po- ła, że związek ten występuje w ośmiu gatun- staci ziarnistych ciał rozmieszczonych nie- kach: Musa balbisiana (rodz. Musacea; rząd równomiernie. Natomiast w preparatach mi- Zingiberales), Heliconia collinsiana (rodz. kroskopowych z dojrzałych działek kielicha Heliconiaceae; rząd Zingiberales), Costus lu- obserwowano występowanie wydłużonych canusianus (rodz. Costaceae; rząd Zingibera- struktur, które, jak wcześniej wykazano, za- les), Ravenala madagascariensis (rodz. Stre- wierają karotenoidy (Simpson i współaut. litziaceae; rząd Zingiberales), Phenakosper- 1975), ale jest wysoce prawdopodobne, że mum guyanense (rodz. Strelitziaceae; rząd również i bilirubinę, aczkolwiek żadnych, Zingiberales), Hedychium coronarium (rodz. specjalnych struktur zawierających ten pig- Zingiberaceae; rząd Zingiberales), Gastrococ- ment nie znaleziono (Pirone i współaut. cus crispa (rodz. Arecaceae; rząd Arecales) 2010). i luschnathiana (rodz. ; Z dotychczas przeprowadzonych badań rząd ). Stwierdzono natomiast, że na- wynika, że na rozpad bilirubiny wpływają daje on kolor tylko w gatunkach należących podwyższona temperatura, światło i tlen. Jed- do rodziny strelicjowatych (Strelitziaceae). nak wstępne analizy wykazały, że związek ten W większości badanych roślin bilirubina jest stabilny nawet przez wiele lat w osnów- występowała w owocach, łącznie ze skór- ce nasion i przez kilka miesięcy w działkach ką, osnówce nasion oraz w niewielkich stę- kielicha strelicji. Przypuszcza się, że utrzyma- żeniach w działkach kielicha a także kwia- nie zabarwienia może wynikać z wysokiej za- tach. W S. reginae stężenie tego związku w wartości lipidów w tych organach (Pirone i ekstraktach wahało się w granicach od <44 współaut. 2010). ng g—1 świeżej masy w działkach kielicha do Synteza bilirubiny w roślinach może też 21,97 mg g—1 świeżej masy w osnówce na- zależeć od innych czynników takich jak np. sion (Pirone i współaut. 2010). Zatem biliru- stadium rozwojowe rośliny. Stwierdzono naj- bina wydaje się być najważniejszym pigmen- wyższą zawartość bilirubiny w osnówce doj- tem osnówki i to ona jest odpowiedzialna rzałych nasion S. nicolai (Pirone i współaut. za jej kolor. Natomiast za żółte zabarwienie 2010a). Można zatem wysunąć hipotezę, że działek kielicha odpowiedzialne są głównie brak bilirubiny u niektórych gatunków roślin karotenoidy, występujące w wysokich stę- może być wynikiem zróżnicowanej intensyw- żeniach, maskujących bilirubinę (Simpson i ności syntezy barwnika w czasie wzrostu i współaut. 1975). rozwoju (Pirone i współaut. 2010b).

SYNTEZA BILIRUBINY W ROŚLINACH Tetrapirole są związkami szeroko rozpo- stępnie, po wbudowaniu atomu magnezu, wszechnionymi w świecie roślin, syntetyzo- powstaje protoporfiryna IX. Ten układ prze- wanymi wyłącznie w plastydach. Pełnią bar- kształca się w protochlorofilid, który w wyni- dzo istotne funkcje, stąd niekiedy określa się ku szeregu reakcji, katalizowanych światłem, je mianem barwników życia. Do najbardziej ulega przemianie w chlorofil (Ryc. 2) (Mło- rozpowszechnionych pochodnych tetrapirolu dzińska 2009 ). należą chlorofil oraz hem. Barwniki pirolowe Obok chlorofili, w komórkach roślinnych są związkami barwnymi, zawierającymi 5-czło- występują jeszcze dwie ważne grupy barw- nowe pierścienie pirolowe z atomem azotu ników, które określa się mianem barwników (Młodzińska 2009). Początkowe etapy syn- pomocniczych: karotenoidy i fikobiliny. Fiko- tezy chlorofilu i hemu są wspólne (Ryc. 2). biliny, występujące u niektórych glonów, są Najpopularniejszym barwnikiem roślinnym zbudowane z 4 pierścieni pirolowych połą- jest chlorofil, wyjściowo syntetyzowany z czonych liniowo, podobnie jak bilirubina. W kwasu glutaminowego. Zostaje on przekształ- swojej budowie nie zawierają one ani atomu cony do kwasu δ-aminolewulinowego (ALA), magnezu ani fitolu (nienasycony alkohol di- który jest prekursorem dla syntezy chlorofilu terpenowy występujący w cząsteczce chloro- i hemu. Kolejnym etapem w biosyntezie te- filu) (Demmeyer i Frankenberg-Dinkel 2008). trapiroli jest kondensacja 2 cząsteczek ALA Karotenoidy należą do grupy terpeno- do 4 cząsteczek porfobilinogenu, w wyni- idów. Dzielą się na pomarańczowe — ka- ku czego powstaje uroporfirynogen III. Na- roteny i żółtopomarańczowe — ksantofile. Barwnik zwierzęcy — bilirubina u roślin 175

u roślin — do chromobiliny. U roślin rozpad hemu prowadzi do powstania biliwerdyny, która następnie przekształcana jest do fito- chromobiliny, prekursora chromoforowej części fitochromu (receptor światła czerwo- nego i dalekiej czerwieni u roślin) (Pirone i współaut. 2010a). Prowadzone w ostatnich latach bada- nia doprowadziły do odkrycia bilirubiny u S. nicolai oraz S. reginae, co zrewolu- cjonizowało dotychczasowy stan wiedzy. Bilirubina została uznana za pierwszy, od- powiadający za nadanie barwy związek, syntetyzowany na drodze szlaku tetrapiroli (Pirone i współaut. 2010a). Biochemicz- ny szlak syntezy bilirubiny u roślin wciąż jednak jest niepoznany. U zwierząt bili- werdyna-IX α jest redukowana do biliru- biny-IX α przez reduktazę biliwerdyny-IX α zależną od NADPH (Maines i Trakshel 1993). Odwrotnie natomiast jest u roślin. Tutaj biliwerdyna-IX α jest przekształca- na do strukturalnego izomeru bilirubiny, 3Z-fitochromobiliny, prekursora chromo- forowej części fitochromu (Tanaka i Ta- naka 2007), przez enzym reduktazę biliny zależną od ferredoksyny (Ryc. 3) (Terry i współaut. 1995, Kohchi i współaut. 2001). U cyjanobakterii i glonów, biliwerdyna-IX α Ryc. 2. Schemat biosyntezy chlorofilu i hemu w jest także redukowana do fikobiliny przez roślinach. reduktazę biliny zależną od ferredoksyny (Beale 1993, Frankenbergi współaut. 2001, Biosynteza tych barwników rozpoczyna się Demmeyer i Frankenberg-Dinkel 2008). od połączenia dwóch cząsteczek pirofosfo- Zwierzęcy enzym reduktaza biliwerdyny-IX ranu geranylogeranylu, co prowadzi do po- α zależna od NADPH została zidentyfiko- wstania fitoenu. Następnie w wyniku szere- wana i sklonowana u cyjanobakterii Syne- gu przemian dochodzi do wytworzenia li- chocystis oraz u różnych gatunków bakterii kopenu, który stanowi substrat w reakcjach (Schluchter i Glazer 1997). Jest więc moż- cyklizacji prowadzących do wytworzenia liwe, że u roślin także bilirubina-IX α po- pierścieniowych form karotenoidów (Mło- wstaje poprzez redukcję biliwerdyny-IX α, dzińska 2009). z udziałem enzymu reduktazy biliwerdyny- U kręgowców, podobnie jak u roślin, bi- IX α zależnej od NADPH. Jest prawdopo- liwerdyna jest pochodną hemu, z tą różnicą, dobne, że jest ona syntetyzowana w zupeł- że jest przekształcana bezpośrednio do żółto- nie inny, dotąd jeszcze niepoznany sposób pomarańczowego barwnika — bilirubiny (Ta- (Pirone i współaut. 2010b). naka i Tanaka 2007), a nie jak ma to miejsce

Ryc.3. Biosynteza bilin w organizmach fotosyntetyzujących (wg Demmeyera i Frankenberg-Dinke- la 2008, zmieniony). 1 — reduktaza biliwerdyny IXa zależna od NADPH, 2 — reduktaza biliny zależna od ferredoksyny 176 Marta Bałabusta, Krystyna Maria Janas

ROLA BILIRUBINY W ROŚLINACH

Wysokie stężenie bilirubiny w osnówce pozostaje wciąż bez odpowiedzi. Przypusz- nasion Phenakospermum guyanense wskazu- cza się, że może ona pełnić u roślin podob- je na jej rolę jako barwnika (Pirone i współ- ne funkcje fizjologiczne jak u człowieka, a aut. 2010b). Wcześniejsze badania udowodni- także może działać jako silny antyoksydant ły, że za kolor dwóch gatunków strelicji odpo- (Stocker i współaut. 1987). Uzyskane wyniki wiedzialny jest właśnie ten metabolit wtórny badań jednoznacznie wykazują, że bilirubina (Pirone i współaut. 2010a). Kolorowe owoce znacznie efektywniej przeciwdziała utlenia- i nasiona są doskonałym bodźcem przyciąga- niu lipidów, niż uważany dotąd za silny anty- jącym zwierzęta, dlatego jest prawdopodobne, oksydant — α-tokoferol (Stocker i współaut. że nagromadzona bilirubina może przyczyniać 1987). się do zwabiania ptaków żywiących się nasio- W stężeniach mikromolarnych bilirubina nami, a także zwierząt przenoszących pyłek i efektywnie neutralizuje anionorodnik po- roznoszących nasiona (Van Der Pijl 1982, Pi- nadtlenkowy. Nie jest jednak wykluczone, że rone i współaut. 2010a). bilirubina może być po prostu zbędnym pro- Pytanie, czy bilirubina odgrywa jeszcze ja- duktem metabolizmu roślin (Pirone i współ- kąś inną rolę poza determinowaniem koloru aut. 2010a).

PODSUMOWANIE

Bilirubina-IX a została zidentyfikowa- ona okrzyknięta pierwszym związkiem, synte- na jako główny barwnik w pomarańczowej tyzowanym na drodze szlaku tetrapiroli w ro- osnówce nasion strelicji Strelitzia nicolai ślinach wyższych, odpowiadającym za nada- oraz w działkach kielicha strelicji królewskiej nie barwy organom reprodukcyjnym roślin. (Strelitzia reginae Ait.) popularnie zwanej Pytanie, czy bilirubina oprócz nadawania ko- rajskim ptakiem. Zmieniło to dotychczasowy loru kwiatom pełni jeszcze jakąś inną rolę u pogląd, że bilirubina jest związkiem występu- roślin pozostaje nadal bez odpowiedzi. jącym jedynie w królestwie zwierząt. Została

DO CZEGO ROŚLINIE POTRZEBNY JEST BARWNIK ZWIERZĘCY — BILIRUBINA? Streszczenie

Bilirubina jest związkiem występującym w króle- Przypuszcza się, że może on także działać jako anty- stwie zwierząt, ale niedawno został wykryty u roślin oksydant. Chociaż nie wiele wiadomo o bilirubinie wyższych. Chociaż biochemiczny szlak jej syntezy u roślin to jej odkrycie zrewolucjonizowało dotych- nie został jeszcze poznany, istnieją spekulacje co do czasowy stan wiedzy i skłania do prowadzenia dal- jej funkcji fizjologicznej. Ten syntetyzowany na dro- szych badań nad innymi jeszcze funkcjami, które dze szlaku tetrapiroli związek odpowiada za nadanie może pełnić w świecie roślin. barwy organom reprodukcyjnym niektórych roślin.

WHY BILIRUBIN, AN ANIMAL PIGMENT, IS NEEDED FOR ? Summary

Bilirubin-IXa was found as the main pigment in present as the primary pigment synthesized in the orange arils of the bird-of paradise Stre- tetrapirol pathway which functions to produce col- litzia nicolai and in sepals in Strelitzia reginae. It or in plants. Whether providing colour for plants is changed the idea that bilirubin is the compound the only function of bilirubin or it may play other which is only synthesized in animals. Bilirubin is roles still needs elucidation. Barwnik zwierzęcy — bilirubina u roślin 177

LITERATURA

Beale S. I., 1993. Biosynthesis of phycobilins. Chem. Pirone C. L., Quirke J. M. E., Priestap H., Lee D. W., Rev. 93, 785–802. 2010a. The animal pigment bilirubin identified Demmeyer T., Frankenberg-Dinkel N., 2008. Func- in Strelitzia regiinae, the bird of paradise flow- tion and distribution of bilin biosynthesis en- er. HortSci. 45, 1411–1415. zymes in photosynthetic organisms. Phytochem. Pirone C., Johnson J. V., Quirke J. M. E., Priestap H. Phytobiol. Sci. 7, 1121–1131. A., Lee D., 2010b. Bilirubin present in diverse Frankenberg N., Mukougawa K., Kohchi T., Lagaris angiosperms. AoB Plants Advance Access (2010) J. C., 2001. Functional genomic analysis of the published October 28, 2010, doi: 10.1093/aob- HY2 family of ferredoxin-dependent bilin reduc- pla/plq020. tases from oxygenic photosynthetic organisms. Simpson D. J., Baqar M.R., Lee T. H., 1975. Ultra- Cell 13, 965–978. structure and carotenoid composition of chro- Kohchi T., Mukougawa K., Frankenberg N., Maruda moplasts of the sepals of Strelizia reginae Ait on M., Kokota A., Lagarias J. C., 2001. The Arabi- during floral development. Ann. Bot. (Lond.) 39, dopsis HY2 gene encose phytochromobilin syn- 175–183. thase, a ferredoxin-dependent biliverdin reduc- Schluchter W. M., Glazer A.N. 1997. Characteriza- tase. Plant Cell 13, 425–436. tion of cyanobacterial biliverdin reductase. J. Maines M. D., Trakshel G. M., 1993. Purification Biol. Chem. 272, 13562–13569. and characterization of human biliverdin re- Stocker R., Yamamoto Y., Mcdonagh, Glazer A. N., ductase. Arch. Biochem. Biophys. 300, 320–326. Ames B. N., 1987. Bilirubin is an antioxidant of Młodzińska E., 2009. Survey of plant pigments: possible physiologic importance. Science 235, Molecular and environmental determinants of 1043–1046. plants colors. Acta Biol. Cracoviensia Ser. Botan- Tanaka R., Tanaka A., 2007. Tetrapyrrole biosyn- ica 51, 7–16. thesis in higher plants. Ann. Rev. Plant Biol. 58, Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell 321–346. V. W., 1990. Harper’s biochemistry. Wyd. 22. Terry M., McDowell M. T., Lagarias C., 1995. (3Z) Prentice-Hall International Inc. and (3E) – Phytochromobilin are intermediates Pierce S. M., Wsler R. M., 1995. Smoke induced in the biosynthesis of the phytochrome chromo- germination of succulents (Mesembryanthema- phore. J. Biol. Chem. 270, 1111–1119. ceae) from fire-prone and fire-free habitats in Van Der Pijl L., 1982. Principles of dispersal in South Africa. Oecologia 102, 520–522. higher plants. Wyd. 3. Berlin, Springer. Pirone C. L., Quirke J. M. E., Priestap H., Lee D. W., 2009. Animal pigment bilirubin discovered in plants. J. Am. Chem. Soc. 131, 2830.