EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA
ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
DIANA PAOLA ALFONSO PULIDO
EDNA ROCIO SANDOVAL SISA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el titulo de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C.
Julio de 2008
1 NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
2 EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
DIANA PAOLA ALFONSO PULIDO EDNA ROCIO SANDOVAL SISA
APROBADO
Directora Codirectora Ma. CLEMENCIA F. DE LA ROTTA Ma. Fernanda Charry ING. AGR. M. Sc. FITOPATOLOGÍA Microbióloga industrial
Asesora Zulma Arguelles Bacterióloga Floramérica C.I
David Gómez M. Sc. Juan C. Hio Jurado Jurado
3 EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
DIANA PAOLA ALFONSO PULIDO EDNA ROCIO SANDOVAL SISA
APROBADO
Ingrid Schuler Ph.D Janeth Arias Palacios M. Sc. DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
4 A Dios por haberme brindado paciencia y fortaleza para salir
adelante obteniendo grandes triunfos.
A mis padres Alberto y Rosaura por todo su amor, esfuerzo e
incondicional apoyo durante toda mi vida.
A mi hermana por su compañía y apoyo.
A mi tia Blanca y Fernando por su constante apoyo.
A “My princess” Valery por ser la luz de mis ojos y darle alegría a mi
vida.
A las personas que están ausentes pero desde donde se encuentran
siempre fueron un apoyo espiritual.
A todos mis amigos por su apoyo e incondicional amistad.
A Edna por su compañía en los momentos difíciles. 5 A Dios por las personas que ha puesto en mi camino, por guiar cada
instante de mi vida y permitir la finalización exitosa de este proyecto.
A mi mama por fomentar en mí, valores de honestidad, superación y
esfuerzo, si no fuera por su sacrificio no sería lo que soy y este sueño
no la habría cumplido.
A mi hermana, fiel amiga y consejera, por levantarme en los momentos
más difíciles que hemos afrontado y por darme la alegría más grande
de mi vida: mis sobrinitas.
A mi papa, a pesar de la distancia en nuestros corazones por
apoyarme de corazón y por los buenos recuerdos.
A Andrés por darme momentos tan felices, por su amor incondicional
y por sus palabras de aliento en los momentos indicados.
A Paola por su humildad, comprensión y su gran amistad.
6 AGRADECIMIENTOS
A la Dra María Clemencia Forero De La Rotta por guiarnos en el desarrollo de este proyecto y por su constante apoyo.
A laboratorios Dr Calderon Asitencia Técnica Agrícola LTDA. por su colaboración en la financiación de este proyecto.
Al laboratorio de sanidad vegetal de C.I. Floramerica LTDA. Por su contribución en el desarrollo de este proyecto.
A María Fernanda Charry por estar siempre incondicionalmente en los momentos que más la necesitamos.
A Zulma Arguelles Ramirez por su asesoría y apoyo en el desarrollo de este proyecto.
A Andrés Libardo Rojas por su colaboración en el proyecto.
A Liseth Castellanos por su aporte en el proyecto.
7 TABLA DE CONTENIDO
PAGINA
1. Introducción 1 2. Marco Teórico 3 2.1. Generalidades del clavel 3 2.1.1.Suelos y clima 3 2.1.2.Taxonomía del clavel 3 2.2. Proceso de producción de las flores 4 2.3 Principales enfermedades en bancos de enraizamiento en clavel 9 2.3.1. Mancha foliar anillada Cladosporium echinulatatum. 11 2.3.2. Pudrición del tallo por Fusarium roseum 13 2.3.3. Pudrición de la corona Rhizoctonia solani 17 2.3.4. Alternariosis o tizón por Alternaría dianthi 21 2.4. Mecanismos de control de enfermedades 24 2.4.1. Control químico de fungicidas 24 2.4.2. Tipos de fungicidas 25 2.4.3. Mecanismos de acción 27 2.4.4. Resistencia a los fungicidas 27 2.5. Control biológico 29 2.5.1 Organismos útiles en control biológico 31 2.5.2. Mecanismos de control biológico 32 3. Justificación 35 4. Objetivos 36 4.1. Objetivos general 36 4.2. Objetivos específicos 36 5. Materiales y Métodos 37 5.1. Diseño experimental 37
8 5.2. Aislamiento de los hongos 38 5.3. Caracterización macroscópica y microscópica de los hongos 39 5.4. Evaluación del efecto fungicida y fungistático de los fungicidas 39 5.5. Inhibición de crecimiento micelial 40 5.5.1. Método de Bloques de Agar 41 5.5.2. Prueba de acción fungicida o fungistático 42
5.6. Evaluación por halos de inhibición 42 5.6.1. Métodos de pozos 42 5.6.2. Método de los discos de papel 43 5.7. Análisis estadístico 44 6. Resultados 45 6.1. Aislamiento y caracterización macroscópica y microscópica de los hongos. 45 6.2. Evaluación in vitro de fungicidas 48 6.2.1. Evaluación por halos de inhibición 48 6.2.2. Inhibición de crecimiento micelial 56 7. Discusión 64 8. Conclusiones 68 9. Recomendaciones 70 10. Referencias bibliográficas 71 11. Anexos 80
9 LISTA DE FIGURAS
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Figura 1: Síntomas en hojas de clavel causados por C. echinulatum 13 Figura 2. Ciclo de infección Fusarium sp en trigo 16 Figura 3. Síntomas ocasionados por F. roseum en hojas de clavel. 17 Figura 4. Ciclo de infección de Rhizoctonia sp 20 Figura 5. Síntomas causados por Rhizoctonia sp en raíces de clavel. 20 Figura 6. Ciclo de infección Alternaria sp 23 Figura 7. Síntomas causados por A. dianthi en hojas de clavel. 23 Figura 8. Características macroscópicas y microscópicas de A. dianthi. 45 Figura 9. Características macroscópicas y microscópicas de C. echinulatum. 46 Figura 10. Características macroscópicas y microscópicas de F. roseum 47 Figura 11. Características macroscópicas y microscópicas de R. solani 47 Figura 12. Halos de inhibición A. dianthi. 49 Figura 13. Halos de inhibición micelial A. dianthi. 50 Figura 14. Halos de inhibición C. echinulatum, Técnica de pozos Procloraz. 51 Figura 15. Halos de inhibición micelial obtenidos técnica de sensidiscos en la evaluación de fungicidas contra C. echinulatum. 51 Figura 16. Halos de inhibición F. roseum. para Trichoderma spp. 52 Figura 17. Halos de inhibición F. roseum. Técnica de sensidiscos para Carboxin + Captan 53 Figura 18. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de Sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra F. roseum. 53 Figura 19. Halos de inhibición R. solani con Trichoderma spp 54 Figura 20. Halos de inhibición R. solani. con Metalaxil + Mancozeb. 55 Figura 21. Halos de inhibición micelial obtenidos técnica de sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra R. solani. 55
10 Figura 22. Halos inhibición técnica sensidiscos R. solani. 56 Figura 23. Porcentajes inhibición técnica de bloques A. dianthi. 57 Figura 24. Técnica de Bloques A. dianthi frente a Trichoderma spp 58 Figura 25. Técnica de Bloques C. echinulatum frente a Trichoderma spp 58 Figura 26. Porcentajes inhibición técnica de bloques C. echinulatum 58 Figura 27. Técnica de Bloques para F. roseum frente a Trichoderma 60 Figura 28. Porcentajes de inhibición micelial contra F. roseum. 60 Figura 29. Técnica de Bloques para R. solani frente a Trichoderma spp. 61 Figura 30. Porcentajes inhibición técnica de bloques R. solani. 62 Figura No 31. Productos con mayor eficacia para el control de patógenos en clavel. 63
11 LISTA DE TABLAS
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Tabla No 1. Comparación entre sustratos utilizados en el enraizamiento:
Ventajas y Desventajas. 7
Tabla 2. Principales agentes causales de enfermedades en cultivo de clavel a nivel mundial 10
Tabla 3. Fungicidas evaluados con sus respectivos tratamientos. 40
12 RESUMEN
Los cultivos de flores día a día enfrentan problemas fitosanitarios donde se incluyen enfermedades causadas por hongos y bacterias los cuales disminuyen la calidad del producto final generando grandes perdidas económicas. El interés del proyecto fue evaluar tres tratamientos para 10 productos utilizados en el control de A. dianthi, C. echinulatum, F, roseum y R. solani hongos presentes en bancos de enraizamiento de clavel. Los productos se evaluaron mediante las técnicas in vitro de pozos, sensidiscos y trozos, lo que permite definir el mejor producto químico o biológico de control, expresado en porcentaje o halos de inhibición micelial, mediante un análisis de varianza ANOVA multifactorial.
De acuerdo a los resultado obtenidos en la investigación el mejor producto fue Trichoderma spp, el cual mostró una eficaz inhibición de los hongos fitopatógenos evaluados, seguido de procloraz, carboxin + captan, etridiazol y metalaxil + mancozeb. Para los tratamientos se encontró diferencia estadísticamente significativa siendo el Tratamiento 1 el que mostró mas eficacia en la evaluación de los productos. Entre las técnicas de pozos y sensidiscos no se evidencio una diferencia estadísticamente significativa, pues los resultados para ambas técnicas fueron homogéneos. La acción fungistática o fungicida de los productos no se logro evaluar mediante la técnica de bloques pues se encontraron desventajas en el montaje de la técnica.
13 ABSTRACT
The flowers’ crops day by day have problems phytosanitary, illnesses which include caused by fungi and bacteria which reduce the quality of the final product generating great economic losses. The interest of the project was to evaluate three treatments for 10 products used in controlling A. dianthi, C. echinulatum, F. roseum and R. solani fungus present in rooting banks of carnation. The products were evaluated by in vitro techniques of wells, absorbent paper disc and cuts, which lets you set the best chemical or biological control, expressed as a percentage of inhibition or halos mycelial through an analysis of variance Anova multifactorial. According to the result obtained in the investigation Trichoderma spp was the best product, which showed an effective inhibition of fungal pathogens evaluated, followed by prochloraz, carboxin + capture, and etridiazol metalaxyl + mancozeb. For treatments was found statistically significant difference being the Treatment 1 showed that the most effective in evaluating products. The statistical analysis no showed significative differences in the fungus growth obtained for absorbent paper disc and wells techniques, since the results for both techniques were homogeneous. The action fungistática or fungicides of the products are not evaluated by the technical achievement of blocks as they found disadvantages in the assembly of the technique.
14 1. INTRODUCCION
El negocio de las flores en Colombia tiene sus comienzos en la década de 1960, donde un número de empresarios, al descubrir las ventajas que tenia el país para entrar a competir en el mercado norteamericano, encaminaron la producción de sus tierras hacia la siembra de flores. La primera exportación comercial se realizo en 1965 por una suma de veinte mil dólares. A partir de ello se presento un gran crecimiento en las tierras dedicadas a la floricultura, el cual se estabilizo en la década de 1980. Así mismo, los productores en este periodo buscaron un fortalecimiento en la comercialización de la flor, por lo que establecieron firmas dedicadas a esta función en Miami, ciudad que dada su proximidad, se convirtió en el centro comercial más importante de las flores colombianas en Estados Unidos (Vásquez, 2003).
A comienzos de 1990 Ecuador entro fuertemente en el mercado a competir dirigiéndose a los minoristas exclusivos que buscan flores de nuevas variedades, con mejores características y precios. Este hecho, sumado a las ventajas competitivas que tenía Ecuador en cuanto a costos salariales y condiciones climáticas, llevó a que los floricultores colombianos tuvieran que realizar grandes inversiones en nuevas variedades. De la misma manera el clavel y el mini clavel, los cuales se consideraban como productos más tradicionales, empezaron a perder su importancia, debido a la aparición de enfermedades vasculares causadas por Fusarium oxysporum y algunas foliares causadas por Alternaria dianthi y Cladosporium echinulatum (Vásquez, 2003).
Los primeros floricultores Colombianos fueron verdaderos visionarios pues identificaron una clara oportunidad para la exportación de flores, representada en factores climáticos, geográficos y culturales. La ubicación ecuatorial de Colombia, implica la ausencia de estaciones climáticas marcadas, es decir, la posibilidad de producir flores al mismo costo en cualquier época del año, sin necesidad de enfriar o calentar los invernaderos (Pizano, 2000).
15 La industria de flores desde su iniciación en Colombia en el año 1967 alcanzó una posición destacada en el mercado internacional a lo largo de los años. Gracias a la oportuna intervención del gobierno y grandes empresarios la industria de las flores para exportación ha presentado un incremento constante en la producción y exportación; actualmente ocupa el tercer lugar como productor de flores. (Díaz et al., 2002).
En la actualidad en Colombia hay 7290 Ha destinadas para el cultivo de flores tipo exportación, de las cuales un 79 % están ubicadas en la sabana de Bogotá, el 17 % en Antioquia y el 4% en otras zonas como Valle, Cauca y el eje cafetero. Igualmente las áreas cultivadas para cada tipo de flor están distribuidas de la siguiente manera: rosas con un 30.3 %, clavel 13.5 %, mini clavel 8 %, crisantemo y pompón 8.2 % y otras especies ornamentales 33 % (Asocolflores, 2007).
Los floricultores han encaminado sus esfuerzos a una producción sostenible con un desarrollo de los canales logísticos y de comercialización, permitiéndoles un mayor conocimiento de sus mercados, especialmente el de Estados Unidos, país al cual se dirigen la mayoría de las exportaciones. Según cifras de Asocolflores (2007) de las exportaciones en el 2007 el 81 % de estas están dirigidas a Norte america, Rusia 3.8 %, Reino Unido 3.7 %, Canada 2.1 %, Japon 1.8 % y Alemania 1.1%.
16 3. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades del clavel
El clavel tiene su origen en el mediterráneo ya que se encuentran múltiples especies silvestres de Dianthus en Europa, Asia y Japón de donde se han distribuido por todo el mundo. Actualmente se cultivan con interés comercial variedades de origen americano y europeo, que se adaptan con alguna facilidad a las zonas productoras del mundo. En países del trópico vienen cultivándose desde hace mas de 30 años, con ventaja sobre países con estaciones, ya que se logra producción durante todo el año sin adecuaciones muy costosas (Hogares Juveniles Campesinos, 2008).
Es una planta herbácea, anual o perenne, de tallos articulados y nudosos, sus hojas son lineales, rígidas y paralelinervias de color verde azuloso, revestidos de una capa cerosa y dispuestas en partes opuestas y decusadas. Las flores se producen al final de los tallos y son hermafroditas, con cáliz gamosépalos, verde coriáceo, persistentes. Los pétalos están fuertemente sujetos por el cáliz y son de colores muy diversos (Botón et al., 1994)
El genero Dianthus abarca unas 250-300 especies, teniendo interés en jardinería solamente unas 30; de estas, se destacan Dianthus caesius, D. barbatus, D. chabaud, D. chinensis, D. deltoides, D. heddewigii, D. plumaris y D. caryophyllus, del cual proceden los claveles reflorescentes (Garcia et al., 1977).
2.1.1. Suelos y clima
El clavel se comporta bien a temperaturas de 12 - 14ºC en la noche y 20º - 25ºC en el día con un promedio de humedad relativa cercano al 65 %. Los suelos que mas los favorecen son los que presentan buena retención de humedad, pero también buen drenaje interno y un pH entre 5.5 - 7.5. Un pH alto dificulta el desarrollo de patógenos, especialmente Fusarium oxysporum que es una de las mayores limitaciones en este cultivo (Hogares Juveniles Campesinos, 2008). 17 2.1.2. Taxonomía
Reino: Plantae
Phylum: Angiospermas
Clase: Dicotiledoneas
Subclase: Archiclamideas
Orden: Centrospermales
Familia: Caryophyllaceae
Genero: Dianthus
Especie: Dianthus caryophyllus L.
Nombre Comun: Clavel
(Pérez, 2003).
Existen dos grupos hortícolas de clavel que son: Clavel estándar y Clavel miniatura. Para exportaciones comerciales este cultivo se produce bajo cubierta, ya que de esta forma se obtiene una calidad muy superior a la producida en campo abierto (Barbosa, et al., 1993)
2.2. PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS FLORES
La reproducción del clavel se efectúa por semilla y esqueje. La reproducción por semilla esta reservada a la obtención de nuevas variedades, por ser el clavel hibrido reflorescente, extremadamente heterocigótico y por tanto, su descendencia por semilla es totalmente irregular.
El único sistema empleado comercialmente es por esqueje y su puesta en funcionamiento requiere tener en cuenta prácticas especiales, dentro de las que se tienen cuatro etapas que permiten el desarrollo de la flor (Garcia et al., 1977):
18 Propagación de plantas madres
Anteriormente el clavel se multiplicaba por acodo, actualmente la mejor forma de propagación de material vegetal, es mediante esquejes procedentes de plantas madres; de esta manera, se pueden mantener las características de la variedad. La propagación sexual o mediante semilla se usa únicamente para la obtención de nuevas variedades (Hogares Juveniles Campesinos, 2008).
Es el área del cultivo donde se siembran las plantas madre para producción de esquejes; los esquejes seleccionados se agrupan en conjuntos de 25- 50 unidades y se tapan con plástico, colocándolos en cuartos refrigerados (Asocolflores, 2002).
Es importante que los esquejes exhiban un fenotipo de características vegetativas, es decir, de apariencia compacta, sin entrenudos visibles o poco visibles solo en la base del mismo e idealmente con cuatro a seis pares de hojas. Deben ser lo mas homogéneos posible entre si, de manera que aquellos que resulten disimiles (cortos, largos, o con demasiada disparidad en vigor, peso, y cantidad de pares de hojas) deben descartarse. De la misma manera se debe eliminar cualquier esqueje aparentemente afectado por enfermedades o plagas (Pizano, 2000)
Bancos de enraizamiento
Son sitios destinados para colocar los esquejes sin raíz, obtenidos en el proceso anterior, con el objeto de lograr su enraizamiento, en un sustrato determinado estéril e inocuo (Asocolflores, 2002).
Esta operación se hace normalmente a mano; un buen esqueje debe tener dos nudos bien desarrollados y otro en formación. Al cortarlo se dejan en la planta un par de hojas para que siga brotando. El cultivo de plantas madres dura un año y se puede sacar una media de 20 esquejes por planta (Garcia et al., 1977).
Para inducir la emisión de raíces la base del esqueje se trata con sustancias estimulantes de enraizamiento; el compuesto mas utilizado ha sido por tradición el ácido indól butírico (IBA), que debe ser disuelto y diluido en alcohol y agua destilada
19 (Pizano, 2000). Después de tratada la base del esqueje, se puede poner este a enraizar o guardarlo en frigorífico (Garcia et al., 1977).
Sustratos para Enraizamiento
En el proceso de enraizamiento del clavel se utilizan varios sustratos lo cuales van a determinar el éxito de dicho proceso en los esquejes del clavel. En la Tabla 1 se citan los principales sustratos para el enraizamiento con sus respectivas ventajas y desventajas. Los requisitos técnicos de un buen sustrato son:
Porosidad adecuada para la propagación por nebulización.
pH entre 6.5 y 6.8
Peso relativamente ligero al encontrarse en capacidad de campo.
Calidad uniforme y consistente.
Adaptabilidad de los esquejes al sembrar en campo (Pizano, 2000)
Al realizar una combinación de estos sustratos se pueden observar ventajas como: reducción de costos. Igualmente las camas para el enraizamiento deben profundas para alojar completamente la raíz del esqueje. En el caso de cultivar clavel en sistemas semihidropónico con cascarilla de arroz, es recomendable enraizar en el mismo material ya que luego la adaptación de los esquejes al trasplante y siembra en campo es mucho más fácil. Los esquejes sembrados en bandejas de turba requieren riego frecuente y cuidadoso pues la mayor parte de las raíces se encuentran confinadas al “plug” y lo mas frecuente es que el esqueje se inserte superficialmente en el suelo o sustrato del lugar final de producción (Pizano, 2000).
Antes de enterrar los esquejes, el sustrato debe estar húmedo al menos hasta capacidad de germinación. Si se humedece cuando se encuentra relativamente seco, es recomendable voltearlo con alguna herramienta limpia, para asegurar un porosidad máxima (Pizano, 2000).
20 Tabla 1. Comparación entre sustratos utilizados en el enraizamiento: Ventajas y Desventajas.
SUSTRATO DE VENTAJAS DESVENTAJAS ENRAIZAMIENTO Bajo costo Pesada Arena Gruesa (de mina) Limpia Mala retención de agua Posible contaminación Pesada Arena fina (de rio) Bajo costo Excesiva retención de agua Bajo costo Porosidad ( si no es demasiado Consistencia Escoria ( De carbón coke) fina) Posible contaminación Medianamente pesada Limpia ( si se maneja adecuadamente) Uniformidad Cascarilla de arroz quemada De peso ligero Se requiere vapor Porosidad Preparación uniforme Escoria/cascarilla (50/50) Porosidad Se requiere vapor Atractiva para los pájaros Ligera, Costo Mezcla de turba y perlita Porosidad Puede tener pH bajo Limpias, Mecanización Manejo Mínimo Costo Plugs o pellets de turba Raíces son visibles Adaptación al suelo d Mayor densidad campo Menos nebulización/m2 Fuente: (Pizano, 2000)
Enraizamiento de esquejes
Se realiza en mesones de concreto o macetas que tengan un buen drenaje, con un sustrato de material poroso que no se inunde fácilmente. El mas utilizado es la perlita, material gris-blanco de origen volcánico y cascarilla de arroz quemada, de acuerdo con los resultados que se presentan en la Tabla Nº 1, que compara las ventajas y desventajas del enraizamiento con diferentes sustratos.
La altura del sustrato debe ser de unos 10 cm, y los esquejes van enterrados hasta el primer par de hojas. El sustrato debe ser renovado o desinfestado a fondo antes de colocar una nueva serie de esquejes (Garcia et al., 1977).
21 La decisión mas importante, clave para el enraizamiento exitoso de los esquejes de clavel, reside en el sustrato utilizado. El costo es por supuesto un factor limitante, dado el volumen requerido. El material debe estar libre de contaminación si no se dispone de esterilización con vapor. Un buen esqueje debe formar raíces abundantes aunque no excesivas y en todo caso, sobre la totalidad de su base. Los esquejes de enraizamiento pobre o parcial deben ser eliminados (Pizano, 2000)
Producción
El aspecto más importante a tener en cuenta en la siembra de esquejes, es la profundidad a la cual se realiza. Si bien las raíces deben quedar en posición vertical, (sin geotropismo invertido) y cubiertas por el sustrato, el esqueje mismo y sus pares de hojas, deben quedar libres de tierra; de lo contrario se puede favorecer la infección por hongos como Rhizoctonia sp y Pythium sp., causantes de pudrición temprana de plántulas (Pizano, 2000).
Dada la fragilidad del sistema radicular del esqueje no es conveniente apretar la tierra a su alrededor, pues se puede perder parte de las raíces favoreciendo la penetración de patógenos e implicando un gasto energético para la planta que debe reponer las porciones perdidas (Pizano, 2000)
Una vez enraízados los esquejes se llevan al área de producción para ser sembrados; en esta área se llevan a cabo diferentes sub-procesos como son: preparación y desinfestación del suelo, siembra, riego y fertilización, control de plagas y enfermedades, cosecha de flor y labores de renovación del cultivo, entre otros (Asocolflores, 2002).
Normalmente un brote desarrollado en condiciones normales de luminosidad, llega a contar con 17 a 21 pares de hojas en promedio, desde la base hasta el botón floral apical, siendo esta ultima zona la mas reproductiva, y la parte basal la mas vegetativa (Pizano, 2000).
22 Post-cosecha
Comprende todas las actividades de selección de las flores, el empaque y la conservación de las mismas para exportación. En la post-cosecha se realiza: clasificación, “boncheo” (armados los ramos, que se cubren con un capuchón plástico), tratamiento sanitario, empaque y traslado a cuartos fríos de conservación (Asocolflores, 2002).
2.3. PRINCIPALES ENFERMEDADES EN BANCOS DE ENRAIZAMIENTO EN CLAVEL
El clavel es atacado por gran variedad de enfermedades causadas por bacterias, hongos, nematodos, virus y micoplasmas. Dentro de estas, las más importantes son las vasculares causadas por hongos que generan grandes pérdidas, debido a su persistencia en el suelo, la facilidad de propagación a otras áreas y a los altos costos generados en las medidas necesarias para su control, este es el caso del marchitamiento vascular del clavel causado por el hongo Fusarium oxysporum.
Tabla 2. Principales agentes causales de enfermedades en cultivo de clavel a nivel mundial
PATOGENO O AGENTE CAUSAL NOMBRE COMUN
Pseudomonas woodsii Mancha foliar bacterial Pseudomonas caryophilli Marchitez bacterial Bacterias Erwinia chrysanthemi Marchitez bacterial lenta Agrobacterium tumefaciens Agalla de la corona Rhodococcus fascinas Fasciación
23 Alternaria dianthi Tizón alternaría Alternaria dianthicola Tizón alternaría Stemphyllium botryosum Pudrición del cáliz Peronospora dianthicola Mildeo velloso Cladosporium echinulatum Mancha foliar Hongos Fusarium roseum Pudrición del tallo Fusarium oxysporum Marchitez vascular Botrytis cinerea Moho gris Pythium ultimun Pudrición Rhizoctonia solani Pudrición
Fuente: APS
Esta es la enfermedad más limitante y por tanto importante en este cultivo en Colombia, debido a la fácil propagación a partir de material infectado. Hasta 1975 los cultivos Colombianos estuvieron libres del fitopatógeno, pero debido a la frecuente importación de esquejes procedentes de Holanda, Francia, Alemania, Israel y Estados Unidos, la enfermedad se presento en nuestros cultivos (Dimaté, 2002).
En el cultivo de clavel se han reportado un elevado número de agentes patógenos, sin embargo, solo unos pocos causan pérdidas económicas graves como lo muestra la Tabla 2. Principales agentes causales de enfermedades en el cultivo de clavel a nivel mundial (Pizano, 2000).
Dentro de las enfermedades presentes en cultivos de clavel, las mas importantes son las enfermedades vasculares por las altas perdidas que ocasionan, por la facilidad de propagación a través de los esquejes, alta persistencia en el suelo y el alto costo de algunas medidas de control utilizadas (Arbeláez, 1997).
24 2.4.1. MANCHA FOLIAR ANILLADA Cladosporium echinulatum (Heterosporium echinulatum).
Es la enfermedad foliar del clavel de mayor importancia en Colombia, especialmente en bancos de enraizamiento y en variedades susceptibles, a diferencia de otros países en donde este patógeno es un problema secundario (Pérez, 2003).
La enfermedad fue registrada por primera vez en Colombia en 1927 en los jardines de algunas casas del Departamento de Antioquia. Las primera epidemias de mancha foliar anillada se presentaron en 1972 y 1973 y llevaron incluso al instituto Colombiano Agropecuario a tomar medidas cuarentenarias en algunos cultivos, con la prohibición de exportar claveles hasta tanto la enfermedad no se erradicara (Pizano, 2000).
Este hongo perteneciente a la familia Dematiaceae, llevan largas cadenas ramificadas de conidias, los cuales finalizan con elemento mas pequeños (Formación basifugá). Las esporas son ovoides, unicelulares o con un tabique (Koneman, 2004).
Descripción morfológica: El micelio joven es de color claro, sin septas y con terminaciones redondeadas; es septado, nudoso y oscuro en estado adulto, el micelio puede ramificarse dicotómica o tricotómicamente. Los conidióforos son septados, oscuros, fasciculares, agrupados o simples. Las conidias son oblongas, oscuras, echinuladas, desde cuatro hasta seis septas (Barbosa, 1993)
TAXONOMIA
Division: Eumycota
Subdivision: Deuteromycotina
25 Clase: Hyphomycetes
Orden: Moniliales
Familia: Dematiaceae
Genero: Cladosporium
Especie: echinulatum
Nombre científico: Cladosporium echinulatum (Berkeley) de Vries, 1952.
(Barbosa, et al., 1993).
Epidemiología. La mancha foliar es ocasionada por el hongo C. echinulatum (anteriormente conocida como H. echinulatum) de la clase Deuteromycetes, orden Moniliales. Inicialmente la espora cae sobre el tejido verde y bajo condiciones favorables germina y forma un tubo germinativo que penetra la planta, crece dentro del tejido formando manchas necróticas redondas. El período de incubación del hongo es de nueve días en condiciones favorables (Pérez, 2003).
Las condiciones favorables para el desarrollo de la enfermedad son: altas temperaturas con humedad relativa alta, follaje mojado por daños en el plástico, alta densidad de siembra, baja ventilación, exceso de agua en el suelo entre otros (Pérez, 2003).
Síntomas: Las plantas de clavel son susceptibles en cualquier estado de desarrollo y durante todo el ciclo productivo. La fase de enraizamiento y los primeros 3 – 6 meses de producción son los periodos donde ocurre la mayor incidencia (Barbosa, 1993).
La mancha foliar anillada se presenta en las hojas, los tallos y los sépalos según la susceptibilidad de la variedad. En las hojas los primeros síntomas corresponden a puntos cloróticos de apariencia aceitosa y redondeada, luego las manchas aumentan de tamaño presentándose un borde rojizo, menores a 1 mm de diámetro, los cuales son difíciles de evidenciar a trasluz (Figura 1). En algunos casos las
26 manchas presentan un halo violáceo alrededor de la lesión, observándose tanto en el haz como en el envés (Barbosa, 1993) (Pérez, 2003).
Figura 1: Síntomas en hojas de clavel causados por Cladosporium echinulatum. Fuente el autor.
Epidemiologia y ciclo de vida: En cualquier enfermedad infecciosa, se lleva a cabo una serie de eventos sucesivos mas o menos distintos que propician el desarrollo y la constancia de la enfermedad y del patógeno. C. echinulatum ser un parasito facultativo, presenta una penetración pasiva por heridas y estomas; la germinación de las conidias se da a una temperatura de 30º C, aproximadamente en 4 horas y la diseminación se hace por el viento, agua, o por acción del hombre (Barbosa, 1993).
2.4.2. PUDRICIÓN DEL TALLO POR Fusarium roseum
Es una enfermedad que potencialmente puede ser muy destructiva y alarmante, ya que en pocas semanas el patógeno puede ocasionar la muerte de las plantas
27 completas. Es la enfermedad más importante en cultivo de clavel en bancos de enraizamiento (Pérez, 2003).
La incidencia de F. roseum se relaciona por lo general con las labores de cultivo, y aunque es más recomendable realizar la cosecha de flores o de esquejes manualmente, ya que la diseminación de esporas se reduce, algunas variedades tienen tallos demasiado recios y se requiere utilizar algún tipo de cuchilla para hacer los cortes. Lo mismo sucede en plantas madres o de producción en estadios finales de su ciclo productivo cuando los tallos son ya bastante leñosos. Si bien el corte con cuchilla es más limpio, es importante tener en cuenta que la herramienta utilizada para actuar como factor diseminante del hongo, por lo que es necesario desinfestarla periódicamente (Bayer CropScience, 2008).
F. roseum, es un hongo perteneciente del genero que causa la marchitez vascular del clavel (F oxysporum), es causante de pudrición del tallo sobre todo a nivel del suelo, pero también de sus ramificaciones. El efecto de F. roseum sobre la productividad durante las fases iniciales del cultivo es poco predecible, pero puede afirmarse que mientras no se tomen las medidas sanitarias adecuadas la producción se puede ver drásticamente afectada. A pesar de la importancia que reviste este problema, no ha sido suficientemente documentado en la literatura con respecto a la producción de clavel (Bayer CropScience, 2008)
Descripción: F. roseum es un hongo imperfecto que esporúla profusamente sobre la superficie del tejido hospedero, en forma de esporordoquios o estructuras fructificantes de un color rosado-durazno típico, rodeado de micelio algodonoso blanco. Una característica descriptiva a nivel microscópico es que no forma clamidiosporas y las microconidias son muy escasas; por lo tanto se observan principalmente macroconidias, largas y delgadas, con tres o mas divisiones y forma de huso típica del genero. El hongo se aísla fácilmente en el laboratorio,
28 produciendo colonias de un típico color rojizo, que sirve para diferenciarlas de aquellas de F. oxysporum, de color morado (Pizano, 2000).
TAXONOMÍA
Reino: Fungi
División: Deuteromycota
Clase: Deuteromycetes
Orden: Moniliales
Familia: Tuberculariaceae
Genero: Fusarium
Especie: roseum
Epidemiología y ciclo de vida: Este patógeno produce dos tipos de conidias: macroconidias largas, hialinas y multiseptadas; microconidias ovales y hialinas. El hongo permanece en el suelo o sustrato en forma de micelio o clamidosporas, las cuales corresponden a estructuras de resistencia (Pérez, 2003).
Este hongo tolera niveles bastantes bajos de acidez, se ha establecido que no tiene requerimientos especiales para germinar, sólo necesita agua y es muy adaptable a una gran diversidad de condiciones nutricionales del medio de cultivo (Pérez, 2003).
Este hongo requiere un punto de entrada a los tejidos susceptibles (usualmente una herida), razón por la cual ataca principalmente tres estadios diferentes de su ciclo productivo: a nivel de la propagación en las plantas abuelas y plantas madres, a través de los puntos de cosecha de los esquejes y en los esquejes que se encuentran en proceso de enraizamiento, pues la base del esqueje es una vía abierta para la infección; y en plantas que se encuentran en procesos de floración, a través de los puntos de cortes de las flores (Figura 2) (Pizano, 2000).
29 Figura 2. Ciclo de infección Fusarium sp en trigo.Fuente: http://www.zoetecnocampo.com/Documentos/fusarium/fusarium.htm
Síntomas: Los primeros indicios incluyen manchas rojizas sobre la zona afectada, que de pronto dan lugar a una clara pudrición que llega hasta los tejidos vasculares, induciendo marchitez y mas tarde la muerte del brote afectado o toda la planta según la severidad de la infección (Figura 3). La presencia de F. roseum se distingue claramente cuando el hongo esporúla por el color típico de los esporodoquios (Pizano, 2000).
30 Figura 3. Síntomas ocasionados por Fusarium roseum en hojas de clavel. Fuente: el Autor
2.4.3. PUDRICIÓN DE LA CORONA Rhizoctonia solani
El genero Rhizoctonia sp cumple con las siguientes características generales: producir esclerocios de estructura uniforme y encontrarse asociado con raíces de plantas (Cardona et al., 2002).
Adicionalmente, y luego de una completa evaluación microscópica, presenta las siguientes características:
Ramificación de las hifas vegetativas jóvenes cerca al septo distal de las células. Formación del septo en la ramificación cercana al punto de origen Constricción de las hifas ramificadas en el punto de origen Ausencia de conexiones en abrazadera Ausencia de conidias
31 Dentro de cada uno de los tres principales grupos de Rhizoctonia sp pueden realizarse subdivisiones basadas en un fenómeno conocido como Anastomosis Hifal, implementado en el año de 1969 por Parmeter, el cual es la manifestación de incompatibilidad somática o vegetativa entre aislamientos (Cardona et al., 2002). Esta reacción puede alcanzar la fusión de las paredes y las membranas de las hifas de los aislamientos enfrentados (reacción de auto-anastomosis, con formación de una hifa heteocariotica), como puede no presentarse (reacción de incompatibilidad somática); aquellas reacciones intermedias, en las cuales las paredes y posiblemente las membranas, reconectan pero no se fusionan, ocurre típicamente entre miembros de mismo grupo de anastomosis (Cardona et al., 2002).
R. solani causa varios tipos de enfermedades en una gran cantidad de plantas, siendo las mas importantes la pudrición temprana de plántulas o “Damping off” y el Chancro o pudrición de los tallos (Pizano, 2000). Esta enfermedad ataca también gran variedad de cultivos, pudiéndose convertir en un potencial problema en el cultivo del clavel sino se detecta y se maneja a tiempo. (Pérez, 2003)
Descripción: Aunque se ha identificado una fase perfecta de este hongo capaz de reproducirse sexualmente (el basidiomiceto Thanatephorus), lo cierto es que en la naturaleza se presenta usualmente como un hongo estéril que produce abundante micelio sin formar conidio o esporas de ningún tipo. Forma estructuras de supervivencia conocidas como esclerocios, de color negro y forma redondeada que para todo efecto practico constituyen su medio de diseminación.
TAXONOMIA
Reino:Fungi
Filo: Basidiomycota
Clase: Basidiomycetes
32 Subclase: Agaricomycetidae
Orden: Polyporales
Familia: Corticiaceae
Género: Rhizoctonia (fase imperfecta). Thanatephorus (fase perfecta)
Especie: solani (fase imperfecta). cucumeris (fase perfecta)
(Galindo et al., 1986)
Epidemiologia y Ciclo de vida: El hongo sobrevive en forma de micelio o esclerocios bajo condiciones adversas. Puede ser diseminado en material de propagación, con el agua de riego, herramientas y labores culturales. El micelio es capaz de infectar los tejidos susceptibles formando un cojín de infección típico (Figura 4). En el clavel, la pudrición por R. solani es de especial importancia en plántulas recién trasplantadas, pudiendo causar perdidas económicas considerables en las primeras etapas del cultivo, especialmente durante las 10 primeras semanas después de la siembra. El hongo tiene requerimientos bastante específicos de humedad y temperatura, siendo óptimos 15º - 18ºC y una alta humedad del suelo (Pizano, 2000).
Síntomas: En el clavel produce una pudrición en la base del cuello, en la raíz presentándose una constricción típica de color pardo claro que evoluciona a marrón oscuro. Dicha constricción termina por afectar el transporte de solutos y nutrientes a través de los haces vasculares de la planta, razón por la cual puede pasar desapercibida confundiéndose con la marchites vascular.
La enfermedad se encuentra frecuentemente en plantas recién sembradas, aunque ocasionalmente puede presentarse en plantas adultas. Sí la planta es atacada por las raíces, el primer síntoma es el marchitamiento durante el día y la recuperación en la noche. Las raíces afectadas se pudren rápidamente y aparecen lesiones de color café rojizo en la base del tallo o justo bajo el suelo, las lesiones progresan formando chancros que con el tiempo estrangulan el tallo (Figura 5). (Pérez, 2003).
33 Figura 4. Ciclo de infección de Rhizoctonia sp. Fuente: www.apsnet.org/.../Rhizoctonia/discycle.htm
Figura 5. Síntomas causados por Rhizoctonia sp en cuello de raíces de clavel. Fuente: El autor Este hongo se caracteriza por formar esclerocios irregulares, que actúan como estructuras de supervivencia. Cuando el hongo habita en el suelo, forma estos esclerocios sobre los desechos orgánicos, dado su comportamiento de saprofito facultativo (Galindo, 1986)
34 2.4.4. ALTERNARIOSIS O TIZÓN POR Alternaría dianthi.
Los tizones causados por Alternaria sp fueron el problema mas serio para la producción de clavel en la primera mitad del siglo pasado en EE.UU. Esta enfermedad reporta grandes perdidas en cultivos al aire libre o bajo invernadero cuando la humedad relativa es muy alta y se combina con la alta temperatura (Pizano, 2000).
Este hongo causa manchas en hojas de plantas, pequeñas y de color púrpura al comienzo. Principalmente deshidratan los tejidos infectados, provocando su muerte (García et al., 1977).
Descripción: En cultivo presenta colonias de colores oscuros, grises, oliváceos, marrones o negros. Sus conidióforos simples o ramificados, de color marrón claro a oscuro. La célula conidiógena es integrada, terminal o simpodial. Los conidios de Alternaria sp. pueden aparecer solitarios o encadenados y son fácilmente reconocibles debido a su tamaño (40 x 12 micras) (Dimaté, 2002).
Es una enfermedad que reporta pérdidas graves en cultivos de clavel a campo abierto o bajo invernadero cuando la humedad relativa es muy alta y se combina con alta temperatura. Estas condiciones bajo invernadero son usuales durante el enraizamiento de los esquejes, por consiguiente es importante prestar las medidas de manejo pertinentes en este ciclo (Pérez, 2003).
TAXONOMIA
Reino:Fungi
Filo: Ascomycota
Clase: Dothideomycetes
35 Subclase: Pleosporomycetidae
Orden: Pleosporales
Familia: Pleosporaceae
Genero: Alternaria
Especies: dianthi
(Bayer CropScience, 2008)
Epidemiología ciclo de vida: El tizón del clavel es una enfermedad producida por el hongo A dianthi de la clase Deuteromycetes. Alternaría es un hongo imperfecto y cosmopolita, que sobrevive fácilmente en el suelo asociado con materia orgánica en descomposición (Figura 6).
Produce conidias profusamente sobre el tejido hospedero, que se desprenden fácilmente y son diseminados por el agua y el aire. Al observar el hongo al microscopio se observa un micelio oscuro y esporas periformes multicelulares (Pérez, 2003).
Síntomas: Se desarrollan manchas sobre las hojas, tallos e incluso las flores, inicialmente pequeñas de color morado, que pronto adquieren un borde amarillento, tornándose el centro de color gris oscuro. En casos avanzados las manchas pueden unirse afectando brotes complejos e incluso plantas enteras (Pizano, 2000).
A nivel de propagación es usual observar esquejes en proceso de enraizamiento con las puntas negras o afectadas por A. dianthi. Las puntas de las hojas con frecuencia sufren daños asociados a la temperatura del invernadero una vez se sacan del cuarto frio. El tejido muerto restante es un espacio ideal de infección para este hongo (Pizano, 2000).
36 Figura 6. Ciclo de infección Alternaria sp Fuente: www.apsnet.org/.../PotatoTomato/discycle.htm
Figura 7. Síntomas causados por Alternaria dianthi en hojas de clavel. Fuente: El autor
En las hojas los primeros síntomas son generalmente pequeños puntos de color violeta. Bajo condiciones húmedas estos aumentan hasta formar manchas típicas de hasta 1,5 cm de diámetro. Las márgenes de las manchas son usualmente violáceas en color y con el centro marrón grisácea (Figura 7). Pueden estar presentes esporas negras en esta área central, dando a la mancha una apariencia sucia, las lesiones 37 llegar a unirse produciendo la muerte de la hoja. Algunas variedades son más susceptibles que otras, especialmente las de origen Mediterráneo (Pérez, 2003).
2.5. MECANISMOS DE CONTROL DE ENFERMEDADES
2.5.1. CONTROL QUIMICO “FUNGICIDAS”
La palabra fungicida se deriva de los términos latinos “fungus”: hongo y “caedo”: matar. En este sentido etimológico, fungicida es todo agente con habilidad para destruir organismos fungosos. El calor, los ácidos, la luz ultravioleta, son agentes físicos fungicidas. Sin embargo, el termino fungicida se refiere a los productos químicos usados en la prevención y en algunos casos en la erradicación o curación de enfermedades producidas por hongos fitopatógenos (Ochoa, 2004).
En este sentido estricto, es conveniente distinguir entre acción fungicida y acción fungistática. Se habla de la primera cuando la sustancia química produce la destrucción del organismo fungoso, es decir, ocasiona una acción irreversible. En cambio, cuando la actividad es reversible, produciendo un efecto inhibitorio temporal en la germinación de las esporas, se hace referencia a una acción fungistática (Ochoa, 2004).
En la actualidad se cuenta con un amplio espectro de compuestos fungicidas; estos pueden adaptarse a las formulaciones que satisfagan necesidades precisas y puede aplicarse en pequeñas parcelas o miles de hectáreas utilizando maquinas apropiadas para este fin (Ochoa, 2004).
Entre las características deseables en un fungicida se encuentran:
38 Aspectos biológicos: debe ofrecer un control de la enfermedad eficaz y consistente. No debe ser toxico a la concentración recomendada. No debe afectar adversamente a otras partes del ecosistema del cultivo. Aspectos toxicológicos: residuos que queden en el cultivo no deben ser un problema para el consumidor. No debe construir un peligro durante la aplicación. Aspectos de la formulación: debe ser seguro al almacenarse y transportarse. El método de formulación debe aumentar su eficiencia como fungicida. Debe ser fácil de aplicar a la concentración precisa (Ochoa, 2004).
2.5.2. TIPOS DE FUNGICIDAS
SEGÚN SU TOXICIDAD
Categoría I: toxicidad alta
Compuesto cuya DL50 va de 0.50mg del toxico por kg de peso. Estos productos son muy peligrosos, solo pueden manejarse bajo normas de seguridad muy estrictas y por personal preparado.
Categoría II: toxicidad media
Compuestos cuya DL50 va de 50-500mg del toxico por kg de peso. Productos medianamente tóxicos y peligrosos que pueden manejarse bajo normas de seguridad.
Categoría III: toxicidad baja o moderada
Se encuentran en ella productos con DL50 superior a 500mg del toxico por kg de peso (Patiño et al., 2001).
39 CLASIFICACIÓN SEGÚN SUS USOS
En el caso de los fungicidas sistémicos, para poder determinar el modo de acción es necesario cuantificar una amplia gama de interacciones complejas que son difíciles de medir, ya que el producto necesita vencer algunos obstáculos para llegara su sitio de acción. Estos obstáculos que el producto tiene que pasar son:
Cutícula de la planta
Células subcuticulares
Metabolismo de la planta hospedera
Absorción dentro de la planta durante la traslocación
Membrana del patógeno
Metabolismo que se desarrolla en el patógeno
(ACFCA, 1994).
CONTACTO: La mayoría de los fungicidas se usan como protectantes debido a que forman una barrera protectora en la planta. Los fungicidas de contacto actúan en sitios múltiples, ya que interfieren con los procesos metabólicos centrales de los hongos. Además la mayoría de estos fungicidas afectan la producción de energía o ATP, inhibiendo la respiración o desacoplando la fosforilación oxidativa (Patiño et al., 2001).
SISTEMICOS: Actúan interrumpiendo el desarrollo del agente causante de la enfermedad, después de iniciada la infección. Comprende un grupo reducido de fungicidas, se usa con fines de protección sistémica, en la cual la sustancia química se introduce o absorbe en el sistema circulatorio de la planta actuando como una especie de vacuna. Esta ultima forma de control de enfermedades vegetales, recibe el nombre se quimioterapia (Patiño et al., 2001).
40 2.5.3. MECANISMOS DE ACCIÓN
La acción fungicida es usualmente expresada en uno de los efectos físicamente visibles: la inhibición de la germinación de esporas o la inhibición de crecimiento micelial. Muchos fungicidas previenen la germinación de esporas o matan la espora inmediatamente iniciado el proceso de germinación. Algunos de estos inhibidores químicos o fungicidas también retardan o detienen el crecimiento del hongo cuando se aplican después de que se ha desarrollado el estado de infección (Tabares, 2002).
Todos los fungicidas son inhibidores metabólicos; es decir, estos bloquean algunos procesos metabólicos vitales de la célula. Por consideración se han clasificado los deferentes mecanismos de acción dentro de tres amplios grupos:
Interferencia con la división celular Inhibición de enzimas involucradas en el metabolismo celular Interferencia con la función y síntesis de la pared celular de los hongos (antracnosis) (Tabares, 2002).
2.5.4. RESISTENCIA A LOS FUNGICIDAS
La resistencia en los hongos se define como un fenómeno no observado en ciertas clases de hongos normalmente susceptibles a ciertos fungicidas, que se manifiestan por una reducción de la sensibilidad a dichos productos, con la consiguiente perdida de eficacia de los mismos para dichos hongos. Hablando de fungicidas comúnmente se consideran como equivalentes los términos resistencia, tolerancia o reducción de sensibilidad, pero se refiere el termino resistencia (Guzmán, 1997).
La acción fungicida es realmente una reacción bioquímica que supone íntimo contacto entre los componentes de la reacción. Si este íntimo contacto no ocurre, no se presenta la reacción y hay resistencia; los mecanismos mas importantes se pueden dividir en:
41 Menor permeabilidad de las membranas celulares: en este caso, los individuos resistentes escapan a la acción fungicida porque las membranas celulares no permiten la entrada del producto; los que si permiten la entrada, son susceptibles (Guzmán, 1997).
Rutas metabólicas alternas: en este caso el toxico toma otra ruta en los individuos resistentes, de manera que esquivan los sitios de acción de los patógenos (Guzmán, 1997).
Detoxificación del fungicida: el patógeno resistente es capaz de metabolizar el producto y los metabolitos producidos no son fitotóxicos (Guzmán, 1997).
Falta de activación del fungicida por el patógeno: en ciertos casos algunos productos no son fungicidas en si mismos si no que deben sufrir un cambio o metabolización (activación) dentro del patógeno para convertirse en fungitoxico; en los individuos resistentes esta activación dentro del patógeno no ocurre y, por lo tanto, escapan a la acción del producto (Guzmán, 1997).
Alteración del sitio reactivo: cuando el fungicida es de acción especifica actúa sobre un solo sitio del patógeno, una modificación en este sitio puede traer como consecuencia una falta de acople entre el patógeno y el fungicida resultar en resistencia (Guzmán, 1997).
2.6. CONTROL BIOLOGICO
El control biológico de enfermedades ha sido definido por varios investigadores como la reducción de la densidad de inoculo de las actividades del patógeno en estado activo o en dormancia por uno o mas organismos, que ocurre en forma natural o a través del manejo del medio ambiente, del hospedante o del antagonista (Duarte et al., 1996). 42 A las interacciones hospedero patógeno y los factores ambientales se añade la influencia de los agentes de control biológico. En este esquema, hay dos vías a través de las cuales pueden actuar los agentes de control biológico. Externamente al hospedero el agente de control pude ser antagonista, por lo tanto, reducir la actividad, eficiencia, y/o densidad de inoculo del patógeno a través de antibiosis, competición, o depredación / hiperparasitismo. Esto conduce a la reducción en el potencial de inoculo de un patógeno, el cual es definido como “ la energía disponible para la colonización de un hospedero o de un sustrato en la superficie del sustrato que se va a colonizar” (Duarte et al., 1996).
El control biológico se ha constituido en una de las posibles soluciones al uso inadecuado de productos químicos, con un relativo éxito en países como Brasil, EE UU y algunos países de Europa, sin embargo actualmente Colombia esta tratando de incorporar este control en algunos sistemas de producción (Duarte et al., 1996).
El control biológico de fitopatógenos mediante la adición de microorganismos antagonistas al suelo presenta una alternativa para el control de enfermedades vegetales. Sin embargo, para que este control sea efectivo se requiere de cantidades significativas de inoculo, además, este control depende de varios factores tales como la temperatura, el pH y las condiciones fisicoquímicas del suelo, el tipo de inoculo usado (en el caso de bacterias: esporas o células vegetativas y en el caso de los hongos: micelio, conidios, clamidosporas), tiempo de introducción del antagonista en el suelo, en relación con el tiempo de siembra entre otras (Hutson et al.,1998)
Han sido diferentes los factores que han impulsado un mayor desarrollo del control biológico en este campo; tal vez uno de los más importantes es la percepción que se tiene del impacto negativo en el medio ambiente que ocasionan los pesticidas y la calidad de los productos agrícolas para el consumo humano y animal. La relativa facilidad en el manejo de ciclos biológicos bajo condiciones controladas, la determinación de enemigos naturales y la cría masiva de estos, han sido factores que han permitido un mayor desarrollo en el control biológico de plagas (Duarte et al., 1996).
43 Resulta, por una parte, que la actividad de los organismos vivos es afectada sustancialmente por las condiciones ambientales, de tal forma, que el control que ejercen estos agentes pueden resultar inconsistentes cuando se trata de generalizar, resultados de investigaciones realizadas en un lugar determinado (Duarte et al., 1996).
El potencial del control biológico es muy grande y ofrece alternativas en el manejo de las enfermedades de las plantas. Son diversas las estrategias biológicas para el control de las enfermedades, las cuales se encuentran basadas en los siguientes puntos:
Reducción del inoculo del patógeno y de su actividad Protección de la superficie de la planta a la infección por el patógeno: raíces, hojas, frutos, semillas, heridas. Estimulo a la resistencia de la planta.
(Duarte et al., 1996).
El agente de biocontrol puede operar de forma primaria en el tejido del hospedante, iniciando por lo tanto una respuesta de resistencia en el hospedante (protección cruzada) tornándose antagonista, o conllevando a la perdida de virulencia al ocurrir anastomosis entre el patógeno y su línea avirulenta (hipovirulencia). Todas estas interacciones están influenciadas por el ambiente, y este factor puede tener un impacto en cuanto a determinar si el control biológico opera o no en un sistema (Duarte et al., 1996).
2.6.1. ORGANISMOS UTILES EN CONTROL BIOLOGICO
La mayoría de los agentes antagonistas utilizados en control biológico son saprofitos debido a su facilidad de adaptación al medio y a su alta capacidad de competencia por nutrientes frente a otros organismos. Dentro de este grupo de agentes de control biológico se encuentran varios tipos de organismos como protozoos, nematodos,
44 rotíferos, virus, bacterias y hongos. Dentro del grupo de los hongos se destacan el genero Trichoderma sp, el cual posee varias características que lo ubican como un buen agente antagonista de otros hongos fitopatógenos (Elias et al., 1984).
Dentro del genero Trichoderma se mencionan 11 especies caracterizadas por un crecimiento rápido y por poseer una esporulación abundante. Varios autores registran a las especies T. harzianum, T. hamatum, T. viride y T. koningii. Por su actividad antagonista sobre varios hongos patógenos, logrando disminuir enfermedades (Elias et al., 1984).
La actividad de estas especies varia de acuerdo a cada una de ellas y puede involucrar mecanismos de antibiosis por la producción de metabolitos volátiles y no volátiles, como ocurre con T. hamatu y T. viride. También se ha registrado la actividad parasitica de T. harzianum y T. koningii sobre R. solani, Sclerotium spp. y Pythium sp mediante la degradación y penetración del micelio de los hongos parásitos; dicha actividad es facilitada por la producción de enzimas como la β 1,3 glucanasa y la quitinasa, las cuales degradan ciertos polímetros como a quitina (Elias et al., 1984).
Trichoderma spp es un microorganismo cosmopolita que se encuentra en casi todos los suelos y otros habitats naturales, especialmente en aquellos ricos en materia orgánica. Trichoderma spp es considerado un colonizador secundario, dado si frecuente aislamiento a partir de materia orgánica en descomposición, también es frecuentemente aislado a partir de las superficies de las raíces de varias plantas, de madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patógenos (Hutson et al.,1998)
Se ha establecido que varias especies del genero Trichoderma incorporadas el suelo, presentan un buen grado de antagonismo sobre patógenos tales como R. solani, S. sclerotium, Sclerotium rolfsii, Pythium spp., Fusarium spp., causantes de enfermedades en diversos cultivos de clima frio, medio y calido. En todos los casos, el mayor éxito ha sido logrado con cepas y especies nativas de Trichoderma, ya que están adaptadas a las condiciones locales (Hutson et al.,1998).
45 2.6.2. MECANISMOS DE CONTROL BIOLOGICO
COMPETENCIA
La competencia es “la demanda activa en exceso de un abastecimiento inmediato de material o condiciones de parte de uno o mas organismo”. En el suelo, los microorganismos compiten casi que exclusivamente por sustrato: sin embargo la competencia también puede estar involucrada en ocupar los sitios de infección potenciales por los agentes de biocontrol (Duarte et al., 1996).
El principio básico involucrado en la competencia es que el patógeno debe ser privado de un nutriente especial para su proceso de infección y colonización. Por lo tanto, la investigación esta dirigida a determinar los factores para la germinación exitosa penetración por el patógeno en el patio de infección del hospedero. Los agentes de control biológico son usados para crear deficiencias de estos elementos esenciales. Factores hasta ahora encontrados, que son esencialmente potenciales son el nitrógeno, el carbono y recientemente, el hierro (Duarte et al., 1996).
Este tipo de control biológico es observado con F. solani, agente causal de la pudrición de la raíz del fríjol. El hongo sobrevive en el suelo mediante la producción de clamidosporas. El carbón y el nitrógeno, esenciales para la germinación y penetración del hospedero por el patógeno, son suministrados en los exudados del hospedero, o están presentes en el suelo. Al suministrar celulosa o un residuo de cultivo, por ejemplo el tamo de cebada, no se observan síntomas de pudrición de frijol. El mecanismo implicado es la competencia por nitrógeno (Duarte et al., 1996).
HIPERPARASITISMO
El hiperparasitismo y la predación representan una forma útil de antagonismo que consiste en el contacto directo entre el organismo parásito y el organismo patogeno; este fenómeno se a registrado por diversos autores donde se destaca la actividad de T. harzianum sobre Sclerotium sp y T. viride sobre R. solani (Gomez, 1996).
46 Un ejemplo que ilustra este mecanismo es Trichoderma spp el cual es bien conocido como un micoparásito de R. solani. Típicamente, sus hifas son atraídas hacia los talos de los hongos patógenos alrededor de las cuales se enroscan, ocasionando la desintegración de las células del hongo hospedero. Tal hiperparasitismo durante el monocultivo de un hospedero susceptible puede reducir las densidades de inóculo del patógeno hasta niveles indeterminables, por ejemplo para R. solani (Duarte et al., 1996).
ANTIBIOSIS
Es un proceso basado en la actividad de metabolitos producidos por algunos microorganismos los cuales disminuyen el desarrollo o la actividad metabólica de otros organismos, por ejemplo: T. viride posee propiedades antibióticas sobre algunos hongos mediante la producción de gliotoxinas y viridina (Gomez, 1996).
PROTECCION CRUZADA
En este caso, un agente de control biológico es inoculado en una planta hospedante que reconoce la presencia de un microorganismo extraño e inicia la respuesta de resistencia, la cual puede ser química y/o morfológica en su carácter. Una introducción subsecuente de un patógeno virulento encuentra que el hospedante ya esta “prevenido” y su resistencia aumenta (Duarte et al., 1996).Un ejemplo de este sistema es F. roseum el cual induce una pudrición en los tallos de clavel; el patógeno entra a través de heridas cuando los esquejes son tomados para la propagación a partir de las plantas madres. Los conidios de los patógenos germinan rápidamente e infectan el tejido herido. Cuando un aislamiento patogénico de F. roseum (o algunos otros hongos) es ubicado en la herida, los conidios del patógeno no germinan. El no patogénico en este caso, dispara una respuesta donde el hospedante produce un potente agente antifungoso (Duarte et al., 1996).
47 3. JUSTIFICACIÓN
Hace cincuenta años, la producción comercial de clavel se desarrollaba principalmente en Estados Unidos, Holanda y los países mediterráneos, pero a partir de los años 70 y 80 Colombia pasó a ser uno de los países con mayores índices de producción y exportación mundial.
Los cultivos de flores han enfrentado diversos problemas como la presencia de plagas y enfermedades causando daños irreparables en las plantas; así mismo, disminuyen la calidad del producto generando grandes perdidas en la industria florícola colombiana. Entre los principales agentes causantes de enfermedades en cultivos de clavel se encuentran: Pythium sp, R. solani, F. roseum, F. oxysporum, Sclerotinia sp, A. dianthi y C. echinulatum entre otros.
En el proceso de producción del clavel, la etapa de enraizamiento, es uno de los puntos críticos en cuanto al diagnostico, manejo y control de estas enfermedades. Esto se debe a que los esquejes portan el inoculo llevándolo hasta las áreas de producción, donde las plantas jóvenes o en el punto de floración desarrollan los síntomas característicos de cada enfermedad.
Teniendo en cuenta las grandes perdidas generadas en este proceso, la industria agroquímica en su búsqueda de eliminar los problemas causados por hongos en estos cultivos, han incrementado la frecuencia en la aplicación de fungicidas y como medida alterna, utilizan inapropiadamente mezclas de productos agroquímicos causando una alteración en los suelos. Debido al uso inapropiado en las dosis de diversos fungicidas, se ha generado una resistencia de los hongos fitopatógenos frente a diversos agroquímicos, que por cierto tiempo habían sido utilizados. Por tanto, surge la necesidad de evaluar diversos productos químicos o biológicos que tengan la capacidad de ejercer un efectivo control sobre los hongos patógenos sin causar inestabilidad en el suelo y medio ambiente, además de evitar sobre costos en control y manejo de las enfermedades en bancos de enraizamiento.
48 4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la eficacia de diez fungicidas en la inhibición “in vitro” de un grupo de hongos patógenos causantes de enfermedades en los bancos de enraizamiento en clavel.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Aislar e identificar hongos patógenos a partir del material vegetal proveniente de bancos de enraizamiento en clavel. Evaluar mediante diferentes técnicas de laboratorio la actividad inhibitoria de los productos seleccionados frente a un grupo de hongos patógenos en clavel. Establecer el nivel de inhibición que inducen los productos seleccionados sobre los hongos patógenos asociados a bancos de enraizamiento en clavel. Determinar la técnica in vitro mas apropiada para la evaluación de los fungicidas. Comprobar la acción fungistática y/o fungicida de los productos seleccionados.
49 5. MATERIALES Y METODOS
5.1. DISEÑO EXPERIMENTAL
Este estudio se realizo en las instalaciones del Laboratorio Dr. Calderón Asistencia Técnica Agrícola L.T.D.A. ubicado en la ciudad de Bogotá y en el Laboratorio de sanidad vegetal de Floramerica ubicado en el municipio de Cajica.
Las muestras se obtuvieron de de diferentes fincas de la sabana de Bogotá, tales como Carnation (Via Cota) y Flores de Serrezuela (Via Facatativa). Las pruebas se realizaron mediante un diseño completamente aleatorizado, como se indica a continuación:
Unidad experimental: cajas de petri. Factores ó variables independientes: Fungicidas, tratamientos, técnicas y replicas. Numero de tratamientos: Tres tratamientos correspondientes a las dosis evaluadas: T1 (Dosis Recomendada por la casa comercial), T2 (Dosis recomendada +25 %), T3 (Dosis recomendada - 25 %). Estas dosis se evaluaron para 10 productos en total, distribuidos de la siguiente manera: 9 químicos, uno biológico. Numero de replicas: Tres por cada tratamiento. Testigo Absoluto: Uno para cada cepa a tratar y uno para cada técnica. Variable dependiente: Halos de inhibición y % de inhibición (Achicanoy, 1981).
Efecto fungicida: Capacidad de un fungicida para inhibir la viabilidad del patógeno.
50 Efecto fungistático: Capacidad de un fungicida para inhibir la germinación de las esporas o el desarrollo inicial de un hongo, mientras permanezca en contacto continuo (Achicanoy, 1981).
5.2. AISLAMIENTO DE LOS HONGOS
Para los aislamientos de los hongos se utilizó agar PDA para: R. solani y Fusarium roseum y para el aislamiento de C. echinulatum y Alternaria sp se utilizó agar V8 especifico para la recuperación de estos microorganismos (Anexo 1).
Se recolectaron esquejes de clavel con síntomas característicos de enfermedades producidas por los hongos patógenos trabajados en bancos de enraizamiento (R. solani, F. roseum, A. dianthi, C. echinulatum) provenientes de diferentes cultivos de flores muestreados en la Sabana de Bogotá. A partir del material vegetal recolectado se realizó una desinfestacion de los tejidos con el fin de disminuir la carga saprofita y así aislar el agente patógeno de interés. Para el aislamiento de los hongos fitopatógenos se aplicaron dos métodos:
Cámara húmeda: se tomó parte del material vegetal recolectado y se introdujo en hipoclorito de sodio al 25% v/v por 5 minutos. Posteriormente realizó un lavado con agua destilada estéril, eliminando de esta forma el exceso de hipoclorito. A continuación se secó el material con papel absorbente estéril. Se tomó un algodón estéril humedecido con agua destilada estéril y se introdujo con las muestras desinfestadas en un recipiente plástico, con el fin de proporcionar las condiciones de humedad requeridas para el desarrollo de las estructuras reproductivas del hongo. Posteriormente el recipiente se sello con papel vinipel para evitar la contaminación de la muestra y mantener las condiciones de humedad necesarias que permitieran la esporulación del microorganismo en estudio (French et al., 1982)
51 Aislamiento en agar PDA y V8: Se realizaron cortes de aproximadamente 4mm de diámetro proveniente de plantas sintomáticas; se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 2,5% v/v por un tiempo de 5 minutos. Posteriormente se realizó un lavado con agua destilada estéril y se secó el material con papel absorbente estéril. En condiciones de esterilidad se introdujeron los bloques del material vegetal en agar PDA y agar V8 (Quintero, et al., 1997).
Los diferentes aislamientos se llevaron a incubar a 22 +/- 2 º C por un periodo de 8 días.
5.3. CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE LOS HONGOS
A partir de los aislamientos realizados, se determinó el género y especie observando las características macroscópicas y microscópicas sobre el medio de cultivo (PDA y V8). Los hongos se caracterizaron por la forma, tamaño y color en la superficie de la colonia y en el anverso de la caja de petri; igualmente la textura, aspecto y consistencia del micelio. Por otro lado se realizaron tinciones con azul de lactofenol y se observaron las características microscópicas de cada hongo. La caracterización taxonomica de las diversas cepas se realizó por medio de claves especializadas en hongos como las de Booth (1977), Barnett et al (1998) y Nelson (1983)
5.4. EVALUACIÓN DEL EFECTO FUNGICIDA Y FUNGISTATICO DE LOS FUNGICIDAS
La evaluación del efecto preventivo de los fungicidas, tuvo como finalidad verificar el efecto fungicida y/o fungistático que ejerce cada producto sobre los hongos evaluados Tabla 3..
52 Tabla 3. Fungicidas evaluados para cada cepa con sus respectivos tratamientos.
HONGO PRINCIPIO TRATAMIENTOS CONTROLADOR ACTIVO (DOSIS) PATOGENO (T1) (T2) (T3) Trichoderma Trichoderma spp 2 2.5 1.5 spp
Terrazol Etridiazol 1.5 1.875 1.125
F. roseum Difeconazole Difeconazole 0.6 0.75 0.45 Carboxin + Vitavax 1 1.25 0.75 Captan
Hidroxido de Kocide 1 1.25 0.75 cobre
Trichoderma Trichoderma spp 2 2.5 1.5 Alternaria spp dianthi Dithane Mancozeb 1.2 1.5 0.9 Cladosporium echinulatum Sportak Procloraz 0.6 0.75 0.45 Carbendazim Carbendazim 1 1.25 0.75
Trichoderma Trichoderma spp 2 2.5 1.5 spp
Metalaxyl + Ridomil gold 1.2 1.5 0.9 Mancozeb Rhizoctonia Carboxin + solani Pro-gro 1.2 1.5 0.9 Thiram
Terrazole Etridiazol 1.2 1.5 0.9
Cobre Kocide 1 1.25 0.75 maetalico
Fuente: El autor
53 5.5. INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO MICELIAL
Preparación de concentraciones de los fungicidas en agar PDA.
Para la preparación de las concentraciones se calcularon las cantidades necesarias de los fungicidas de acuerdo con los tratamientos seleccionados (Tabla 3). La solución de cada fungicida se preparo en agar PDA, teniendo en cuenta el volumen final de medio a preparar. Los tratamientos requeridos se expresaron en g/L para los fungicidas sólidos y en ml/L para los fungicidas líquidos (Quintero, 1997).
Mezcla del medio de cultivo más el fungicida:
Con el fin de evitar que las cajas con el medio mas fungicida se contaminaran, la mezcla se realizó en cámara de flujo laminar, adicionando lentamente la solución del fungicida al agar PDA ó V8 fundidos a 45 – 50 ºC, para evitar inactivar cualquier componente del principio activo del fungicida. Por ultimo se mezcló hasta lograr la homogenización completa, del medio más el fungicida (Díaz, 1986).
5.5.1. Método de Bloques de Agar
En el centro de las cajas de petri que contenían las respectivas dosis del producto químico incorporado al medio de cultivo, se colocó un bloque de PDA de 5 mm de diámetro con el crecimiento micelial del microorganismo ensayado, previamente incubado durante 7 días; las cajas de petri se mantuvieron a una temperatura de 22 +/- 2 ºC. (Achicanoy, 1991). Los testigos absolutos se inocularon sobre medios sin solución fungicida.
La inhibición del crecimiento radial se determinó con base en el diámetro del crecimiento radial (medido en mm) del hongo sin el efecto del fungicida, menos el
54 diámetro en mm del crecimiento del hongo influenciado por el fungicida, expresado en porcentaje, tal como se especifica en la siguiente formula:
% IM = CML – CMI x 100 CML
% IM: Porcentaje de inhibición crecimiento micelial
CML: Crecimiento micelial libre
CMI: Crecimiento micelial influenciado
(Patiño et al., 2001)
5.5.2. Prueba de acción fungicida o fungistático
Para evaluar el efecto fungicida o fungistático de las diferentes concentraciones del producto químico, se tomaron bloques de agar provenientes de las cajas donde se presento inhibición del microorganismo ensayado y se sembraron sobre medio de cultivo sin fungicida; las cajas se incubaron bajo condiciones similares al ensayo anterior (Patiño et al., 2001).
5.6. EVALUACION POR HALOS DE INHIBICION
5.6.1. Método de pozos
Preparación de la suspensión de esporas:
La suspensión de esporas se obtuvo a partir de un cultivo crecido de PDA (aproximadamente 7 días) de los hongos patógenos a evaluar. La remoción de esporas se realizó adicionando 5 mL de agua destilada estéril a cada una de las
55 cajas de petri; con ayuda de un rastrillo las esporas se removieron de la superficie del agar, obteniendo de esta forma la solución madre (Sharvelle, 1983)
A partir de esta solución, se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3, hasta obtener un recuento de 106 conidios/ mL, el recuento se realizo en cámara de Neubauer; para la evaluación de uso la siguiente formula:
Conidios / ml N DilucionDe LaCamara FactorDeLa Camara
Preparación de soluciones con los fungicidas.
Para la preparación de las soluciones se calcularon las cantidades necesarias de los fungicidas de acuerdo con las dosis seleccionadas. La solución de cada fungicida se preparo en agua destilada estéril, obteniendo un volumen final de 100 mL de solución de fungicida. Las dosis requeridas se expresaron en g/L para los fungicidas sólidos y en ml/L para los fungicidas líquidos (Quintero, 1997).
Montaje de La Técnica
Se realizó una siembra masiva de los hongos patógenos evaluados a partir de la solución de esporas (10-6esporas / mL). En cada caja, se colocaron pitillos de plástico de 1.0 cm de alto previamente esterilizados (cuidando de no tocar la base de la caja para evitar la difusión del fungicida por la base de la caja), a cada uno de estos se les adicionó 50µL de la concentración del fungicida a evaluar con micropipeta según el numero de concentraciones a evaluar; (DR + 25%, DR, DR – 25%).. En uno de los pozos se colocó agua destilada como control negativo. La incubación se realizó por 7 días a una temperatura de 22 +/- 2°C.
En el día 7 se midió el diámetro en mm del halo de inhibición de cada hongo para cada una de las concentraciones de fungicida evaluadas (Patiño et al., 2001).
56 5.6.2. Método de los discos de papel
Bajo condiciones de esterilidad en cámara de flujo laminar, se evaluaron tres tratamientos de cada fungicida (DR + 25%, DR, DR – 25%). Los sensidiscos se realizaron en papel filtro con un diámetro estándar de 0.5cm que luego se esterilizaron.
Se realizó una siembra masiva de la suspensión de esporas utilizada con anterioridad (106 esporas / mL) en agar PDA o V8. El mismo día de la siembra masiva se colocaron los sensidiscos (4 por caja) de los cuales 3 se inocularon con 10 µL con las dosis del fungicida correspondiente, y en el cuarto se colocó agua destilada como control negativo. La incubación se realizó por 7 días a una temperatura de 22 +/- 2°C, al séptimo día de incubación se observaron y se midieron los halos de inhibición. Estas pruebas se realizaron por triplicado para cada fungicida y para cada hongo.
5.7. ANALISIS ESTADISTICO
Para comparar los resultados obtenidos con las diferentes especies de hongos evaluados se realizo un ANOVA multifactorial, en el cual el halo de inhibición (HIMM ó HINIB) y el porcentaje de inhibición micelial (PINB), fueron tomados como las variables dependientes (Eje Y) y las técnicas, los fungicidas y los tratamientos como las variables independientes o factores (Eje X). Se trabajo con un rango de confianza del 95%.
Cuando el valor de F fue significativo para α<0.05 se realizaron pruebas de Tukey o de diferencia mínima significativa (LSD). Para estas se empleo el programa Statgraphics Plus 2.0 (Anexos 3, 4,5 y 6).
57 6. RESULTADOS
6.1. Aislamiento y caracterización macroscópica y microscópica de los hongos.
A partir del material vegetal recolectado en las diferentes fincas de la sabana de Bogotá, se aislaron en agar PDA 4 géneros de hongos patógenos para el cultivo de clavel. Estos géneros corresponden a las características macroscópicas y microscópicas reportadas por diversos autores (Booth, 1971; Barnett et al., 1998; Nelson, 1983). Para realizar la caracterización microscópica y macroscópica de Alternaria dianthi y Cladosporium echinulatum, fue necesario utilizar agar V8 por ser un medio enriquecido que favorece el desarrollo apropiado de estos microorganismos. En el caso de F. roseum y R. solani, se utilizó agar PDA (Quintero, et al., 1997).
Alternaria dianthi: El aislamiento en agar V8 presento las siguientes características macroscópicas: textura pulverulenta y vellosa de color café oscuro, borde regular. (Figura 8 A). A nivel microscópico, el hongo produce conidióforos demateaceos ramificados o individuales y septados. Los conidios son de color marrón oscuro, con forma elongada, ovoides, con septos transversales y frecuentemente también oblicuos o longitudinales, hifas de color café (Figura 8 B). (Patiño et al., 2001)
A B
Figura 8. Características macroscópicas y microscópicas de A. dianthi. (A) Colonia vellosa café oscura. (B) Conidias demateaceas y elongadas. Fuente: El autor.
58 Cladosporium echinulatum: Macroscópicamente las colonias son de color verde oliva a verde oscuro, rugosas, pulverulentas, cubiertas por un micelio bajo y velloso (Figura 9 A). Microscópicamente las hifas son demateaceas, septadas, presenta conidióforos ramificados de color café (Figura 9 B). (Patiño et al., 2001)
A B
Figura 9. Características macroscópicas y microscópicas de C. echinulatum. (A) Colonia rugosa verde oliva. (B) Conidias demateaceas y equinuladas. Fuente: El autor.
Fusarium roseum: Macroscópicamente las colonias son vellosas, algodonosas, con una pigmentación rosa en el centro que difunde a todo el cultivo. Las colonias pigmentadas tienen el centro rosa intenso, con zona marginal rosa pálido y bordes blancos. Reverso de color rosa-naranja intenso (Figura 10 A). Microscópicamente presentó conidióforos simples, cortos, tabicados, curvados y alargados (Figura 10 B) microconidias abundantes, monofialides alargadas; y en menor proporción macroconidias (Trujillo et, al. 2005).
59 A B
Figura 10. (A) Características macroscópicas y microscópicas de F. roseum (A) Colonia algodonosa de color rosado en los extremos y en los bordes blanco. (B) Fuente: El autor.
Rhizoctonia solani: Formó colonias de color pardo con producción de escaso micelio aéreo y esclerocios marrones (Fig 11 A). Microscópicamente posee hifas hialinas, septadas con ramificaciones en ángulo agudo; las cuales se ramifican ocasionalmente en ángulos de 90 grados (Fig 11 B). (CARDONA, et al., 2002.)
A B
Figura 11. Características macroscópicas y microscópicas de R. solani (A) Colonia rugosa blanca a parda con el tiempo. (B) Hifas septadas hialinas. Fuente: El autor.
Las caracterizaciones microscópicas y macroscópicas realizadas en el laboratorio fueron congruentes con la bibliografía (Barnett et al., 1998) (Gilman, 1963).
60 6.2. EVALUACION IN VITRO DE FUNGICIDAS
6.2.1. EVALUACION POR HALOS DE INHIBICIÓN
La finalidad de esta evaluación, fue determinar los tratamientos óptimos de los fungicidas evaluados para el control de los hongos fitopatógenos de mayor importancia en bancos de enraizamiento en clavel; estimados en la inhibición de los microorganismos patógenos.
Se utilizaron las técnicas de pozos y sensidiscos para A. dianthi, C. echinulatum, F. roseum y R. solani. Se partió de una suspensión de 10 6 conidios /mL a excepción de R. solani, ya que este carece de cuerpos fructíferos.
Alternaria dianthi
Para este hongo se evaluaron 4 fungicidas: Mancozeb, Procloraz, Carbendazim y Trichoderma spp. (Fitotripen).
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para A. dianthi, se determinó que no hubo diferencia significativa entre las técnicas empleadas (F= 0.01; n=1 ; P= 0.9259) ni para las replicas (F= 0.07; n= 2; P= 0.9291); mientras que para los fungicidas evaluados (F= 49.02; n= 3 P= 0.0000) y los tratamientos (F= 20.06; n= 2; P= 0.0000) se presentó diferencia estadísticamente significativa (Anexo 4).
A partir de la prueba Tukey, se encontraron tres comportamientos diferentes de los fungicidas, que presentaron los siguientes resultados: en el primer grupo el fungicida Carbendazim, no fue efectivo para A. dianthi, en el segundo grupo, Mancozeb y Procloraz los cuales inhibieron en menor cantidad el crecimiento micelial de A. dianthi. Por otro lado, Trichoderma spp. el cual se encuentra en el tercer grupo presentando el mayor halo de inhibición (Figura 13).
61 En la Figura 12 se muestran los halos de inhibición generados por el fungicida para las técnicas de pozos y sensidiscos; Igualmente se observa el control, el cual contiene agua destilada y donde no hay presencia de halo de inhibición.
FITOTRIPEN
A B
Figura 12. Halos de inhibición A. dianthi. A. Técnica de pozos para Procloraz.. B. Técnica de Sensidiscos para Trichoderma spp
Igualmente, se encontró tres comportamientos diferentes de tratamientos; en el primer grupo T3, en el segundo grupo T1 y en el tercer grupo T2; el tratamiento que mostró una efectividad mayor para el control de A. dianthi fue el T2 correspondiente a valores de 2.5 g/L de Trichoderma spp. (Figura 13).
62 TECNICA DE SENSIDISCOS A. dianthi T1 T2 T3 28,00
24,00 L A I
L 20,00 E C I M 16,00 N O I ) C
I 12,00 m B I m ( H
N 8,00 I
E D 4,00 S O L 0,00 A
H Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp FUNGICIDAS
Figura 13. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos en la evaluación de fungicidas contra A. dianthi.
Cladosporium echinulatum
Para este hongo se evaluaron 4 fungicidas: Mancozeb, Procloraz, Carbendazim y Trichoderma spp.
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para C. echinulatum, se determinó que hubo diferencia significativa entre las técnicas empleadas (F= 8.20; n=1 ; P= 0.0057), para los fungicidas evaluados (F= 99.76 ; n= 3 P= 0.0000) y los tratamientos (F= 31.48; n= 2; P= 0.0000) mientras que se no presentó diferencia estadísticamente significativa para las replicas (F= 0.30; n= 2; P= 0.7441) (Anexo 5).
A partir de la prueba tukey, se encontró que todos los fungicidas se comportaron de diferente manera, pues no se encontraron comportamientos homogéneos. Carbendazim, el cual no fue efectivo para C. echinulatum; Mancozeb, Trichoderma spp. y Procloraz, este último fue el que presento mejor inhibición de C. echinulatum, (Figura 14 y 15).
63 Figura 14. Halos de inhibición C. echinulatum, Técnica de pozos para Procloraz.
Igualmente, se encontró que todos los tratamientos se comportaron de diferente manera. Sin embargo, el tratamiento que mostró una efectividad mayor para el control de C. echinulatum fue el T2 correspondiente a valores 0.75g/L Procloraz. (Fig. 15)
TECNICA DE SENSIDISCOS C. echinulatum T1 T2 T3
30
25 L A I L
E 20 C I M
N 15 O I ) C I m B I m
( 10 H N I
E
D 5
S O L
A 0 H Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp FUNGICIDA
Figura 15. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos en la evaluación de fungicidas contra C. echinulatum.
64 Fusarium roseum
Para este hongo se evaluaron 5 fungicidas: Difeconazol, Etridiazole, Hidroxido de cobre, Captan + Carboxin y un producto biológico (Trichoderma spp.).
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para F. roseum, se determinó que no hubo diferencia significativa entre las técnicas empleadas (F= 1.57; n= 1; P= 0.2143) ni para las replicas (F= 0.08; n= 2; P= 0.9248); mientras que para los fungicidas evaluados (F= 86.49; n= 4; P= 0.00) y los tratamientos (F= 5.32; n= 2; P= 0.0068) se presento diferencia estadísticamente significativa (Anexo 3).
A partir de la prueba tukey, se encontró dos comportamientos diferentes de fungicidas; en el primer grupo hidroxido de cobre, difeconazol y etridiazole, los cuales no fueron efectivos para F. roseum. En el segundo grupo, Trichoderma spp. y Carboxin + Captan los cuales inhibieron el crecimiento micelial de F. roseum. Sin embargo como se muestra en las figuras 16, 17 y 18 carboxim + captan fue el que presentó un mayor halo de inhibición.
A B
Figura 16. Halos de inhibición F. roseum. A. Técnica de pozos para Carboxin + Captan B. Técnica de Pozos para Trichoderma spp.
65 Figura 17. Halos de inhibición F. roseum. Técnica de sensidiscos para Carboxin + Captan.
Igualmente, se encontró dos comportamientos diferentes de tratamientos; en el primer grupo T3 y T1. En el segundo grupo T1 y T2, el tratamiento que mostró una efectividad mayor para el control de F. roseum fue el T2 correspondiente a valores de 1.25 g/L de carboxin + captan y 2.5 g/L de Trichoderma spp. (Figura 18).
TECNICA HALOS DE INHIBICIÓN F. roseum T1 T2 T3 )
m 20 m ( 18 L A
I 16 L
E 14 C I 12 M
N 10 O I 8 C I B
I 6 H 4 N I
E 2 D 0 O L
A Difeconazol Etridiazol Hidroxido de Carboxin + Trichoderma
H cobre Captan spp FUNGICIDA
.
66 Figura 18. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra F. roseum.
Rhizoctonia solani
Para este hongo se evaluaron 5 fungicidas: Etridiazole, Hidroxido de cobre, Carboxin + Thiram, Metalaxil + Mancozeb y un producto biológico (Trichoderma spp.).
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para R. solani se determinó que hubo diferencia estadísticamente significativa entre las técnicas empleadas (F= 17.65; n= 1; P= 0.0001), los fungicidas evaluados (F= 217.40; n= 4; P= 0.0000) y los tratamientos (F= 23.78; n= 2; P= 0.0000) mientras que para las replicas no hubo diferencia significativa (F= 0.07; n= 2; P= 0.9294) (Anexo 6).
A partir de la prueba tukey, se encontró tres comportamientos diferentes de fungicidas; en el primer grupo Hidroxido de cobre y Etridiazol, los cuales no fueron efectivos para R. solani; en el segundo grupo, Carboxin + Thiram, el cual inhibió en menor proporción al patógeno en comparación con los productos del tercer grupo Metalaxil + Mancozeb y Trichoderma spp. que presentaron el mayor halo de inhibición (Figuras 19, 20, 21 y 22).
A B
Figura 19. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Sensidiscos. A. Metalaxil + Mancozeb. B. Carboxin + Thiram
67 Figura 20. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Sensidiscos para Trichoderma spp
Figura 21. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Pozos para Metalaxil + Mancozeb.
Se encontró que todos los tratamientos se comportaron de diferente manera, pues no se encontraron comportamientos homogéneos. Sin embargo, el tratamiento que mostró una efectividad mayor para el control de R. solani fue el T2 correspondiente a valores de 1.5 g/L de Metalaxil + Mancozeb y 2.5 g/L de Trichoderma spp. (Figura 22).
68 TECNICA DE SENSIDISCOS R. solani 25,00
N T1 T2 T3 O I ) C I 20,00 m B I m ( H L N I A
I 15,00 E L D E
C S I O
M 10,00
L 17 A H 5,00
0,00 Carboxin + Metalaxyl + Hidroxido de Etridiazol Trichoderma thiram Mancozeb Cobre spp
FUNGICIDA
Figura 22. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra R. solani.
6.2.2. INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO MICELIAL
Al evaluar el porcentaje de inhibición micelial, mediante la técnica de incorporación de los fungicidas al medio de cultivo y la siembra de los diferentes microorganismos en bloques de agar, se obtuvieron los siguientes resultados:
Alternaria dianthi
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para A. dianthi, se determinó que no hubo diferencias significativas entre las réplicas empleadas (F= 0,07; n= 2; P= 0.9331); mientras que para los fungicidas evaluados (F= 831.36; n= 3; P= 0.0000) y los tratamientos se presentó diferencia estadísticamente significativa (F= 9.15; n= 2; P= 0.0009) (Anexo 4).
69 A partir de la prueba Tukey, se encontraron tres comportamientos diferentes de fungicidas; en el primer grupo: Carbendazim, presentó el menor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial en el ensayo. En el segundo grupo: Procloraz, en el tercer grupo: Trichoderma spp. y Mancozeb presentaron altos porcentajes de inhibición micelial, siendo los que permitieron la mayor inhibición, pero al evaluar su acción como fungicida, se encontro que el único producto que presento tal comportamiento para A. dianthi fue Trichoderma spp., por el contrario los demás productos evaluados presentaron solamente una acción fungistática (Fig. 23 y 24).
TECNICA BLOQUES DE AGAR A. dianthi T1 T2 T3 100,00 90,00 L A
I 80,00 L
E 70,00 C I M 60,00 N O
I 50,00 C I
B 40,00 I H
N 30,00 I
E 20,00 D
% 10,00 0,00 Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp FUNGICIDAS
Figura 23. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra A. dianthi.
Igualmente al comparar los diferentes tratamientos se encontraron dos comportamientos diferentes de tratamientos; en el primer grupo T3 y T1. En el segundo grupo T2, el tratamiento que mostró un mayor porcentaje de inhibición micelial para el control de A. dianthi fue el T2 correspondiente a valores de 2.5 g/L de Trichoderma spp. y mancozeb 1.5 g/L (Figura 23)
70 Figura 24. Técnica de Bloques de agar para A. dianthi Frente a Trichoderma spp
Cladosporium echinulatum
Para esta técnica no fue necesario realizar análisis de varianza ANOVA, teniendo en cuenta que todos los fungicidas con sus respectivos tratamientos fueron efectivos para inhibir el crecimiento micelial de C. echinulatum y presentaron el mismo porcentaje de inhibición. Sin embargo, únicamente Trichoderma spp. presentó un efecto inhibitorio eficaz sobre el patógeno (Figura 25 y 26).
Figura 25. Técnica de Bloques de agar para C. echinulatum frente a Trichoderma spp
71 TECNICA DE BLOQUES DE AGAR Cladosporium echinulatum T1 T2 T3 100 90 80 N
O 70 I C I 60 B I
H 50 N I 40 E D
30 % 20 10 0 Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp FUNGICIDAS
Figura 26. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra C. echinulatum
Fusarium roseum
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para F. roseum, se determinó que no hubo diferencia significativa entre las réplicas empleadas (F= 0,00; n= 2; P= 0.9998); mientras que para los fungicidas evaluados (F= 17.60; n= 4; P= 0.0000) y los tratamientos se presentó diferencia estadísticamente significativa (F= 7.58; n= 2; P= 0.0018) (Anexo 3).
A partir de la prueba Tukey, se encontró dos comportamientos diferentes de fungicidas; en el primer grupo: Hidroxido de cobre, el cual presentó el menor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del ensayo. En el segundo grupo: Difeconazol, Etridiazole, Trichoderma spp. y Carboxin + Captan presentaron altos porcentajes de inhibición micelial, siendo los mejores Etridiazol y Trichoderma spp., presentando un comportamiento como fungistático. Sin embargo, el único producto que presento acción fungicida para F. roseum fue Trichoderma spp. (Fig. 27 y 28).
72 Figura 27. Técnica de Bloques de agar para F. roseum frente a Trichoderma spp
Igualmente se encontró dos comportamientos diferentes de tratamientos; en el primer grupo T3 y T1. En el segundo grupo T1 y T2, el tratamiento que mostró un mayor porcentaje de inhibición micelial para el control de F. roseum fue el T2 correspondiente a valores de 2.5 g/L de Trichoderma spp. y Etridiazol 1.875 g/L (Fig. 28).
TECNICA DE BLOQUES DE AGAR F. roseum T1 T2 T3 100,00
L 90,00 A I
L 80,00 E C I 70,00 M 60,00 N O I 50,00 C I
B 40,00 I
H 30,00 N I
E 20,00 D 10,00 % 0,00 Difeconazol Etridiazol Hidroxido Carboxin + Trichoderma de cobre Captan spp
FUNGICIDA
73 Figura 28. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra F. roseum. Rhizoctonia solani
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para F. roseum, se determinó que no hubo diferencia significativa entre las réplicas empleadas (F= 0,30; n= 2; P= 0.7408); mientras que para los fungicidas evaluados (F= 56.45; n= 4; P= 0.0000) y los tratamientos se presentó diferencia estadísticamente significativa (F= 3.72; n= 2; P= 0.0340) (Anexo 6).
A partir de la prueba Tukey, se encontró dos comportamientos diferentes de fungicidas; en el primer grupo: Hidroxido de cobre, el cual presentó el menor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del ensayo. En el segundo grupo: Etridiazol, Trichoderma spp., Metalaxil + Mancozeb y Carboxin + Thiram que presentaron altos porcentajes de inhibición micelial, Sin embargo, el único producto con acción fungicida para R. solani fue Trichoderma spp., a diferencia de los demás productos evaluados que presentaron acción fungistática (Fig 29 y 30)
Figura 29. Técnica de Bloques de agar para R. solani frente a Trichoderma spp.
Para la evaluación estadística de los tratamientos se realizó la prueba de rango múltiple LSD, debido a que los datos eran homogéneos. Igualmente se encontró dos comportamientos diferentes de tratamientos; en el primer grupo T3 y T1. En el segundo T2, el tratamiento que mostró un mayor porcentaje de inhibición micelial 74 para el control de R. solani fue el T2 correspondiente a valores de 1.5 g/L Etridiazol, 2.5 g/L Trichoderma spp., 1.5 g/L Metalaxil + Mancozeb y 1.5 g/L Carboxin + Thiram (Figura 30)
TECNICA DE BLOQUES DE AGAR R. solani T1 T2 T3
100,00
L 90,00 A I
L 80,00 E C
I 70,00 M 60,00 N O I 50,00 C I
B 40,00 I
H 30,00 N I
E 20,00 D 10,00 % 0,00 Carboxin + Metalaxyl + Cobre Etridiazol Trichoderma thiram Mancozeb metalico spp
FUNGICIDA
Figura 29. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra R. solani.
75 7. DISCUSIÓN
A partir del material vegetal muestreado, se observaron síntomas de las enfermedades que atacan el cultivo del clavel descritas anteriormente, los cuales concuerdan con los reportes bibliográficos consultados; sin embargo, fue necesario realizar posteriores muestreos debido a la dificultad del aislamiento primario de los patógenos. Esto se pudo deber a recientes aplicaciones de fungicidas en los bancos de enraizamiento de clavel muestreados.
La evaluación de la eficacia de los productos en campo tiene muchas interferencias y resulta más compleja; por lo que una primera evaluación in vitro siempre dirige hacia los productos más eficaces. Sin embargo, los ensayos in vitro sólo dan una estimación indirecta del valor práctico del producto por lo que deberá contrastarse este resultado con los obtenidos posteriormente en campo. Un producto que es eficaz in vitro no necesariamente lo será en campo pues en su actuación influyen factores como la degradabilidad, persistencia, etc. Sin embargo, si un producto no es útil in vitro difícilmente lo será en campo (González, 2005).
Con el fungicida carbendazim en las técnicas de sensidiscos y pozos no se encontró el efecto inhibitorio esperado ya que según reportes hechos por OMAR et al., 2006 (en el cual se utilizó la metodología de bloques de agar), mostraron la efectividad de este fungicida en diferentes hongos como consecuencia de su acción en la inhibición de síntesis de ergosterol y en la germinación de esporas del hongo. En la técnica de bloques de agar, carbendazim presentó menor inhibición en el crecimiento micelial que los demás productos evaluados, demostrando la ineficacia del producto para el control de A. dianthi.
Mancozeb, no presento una inhibición significativa en ninguno de los tratamientos para las técnicas de sensidiscos y pozos. En la técnica de bloques de agar se presento una mayor inhibición debido a que este es un fungicida multiacción, el cual
76 actúa inhibiendo enzimas importantes en el ciclo de Krebs impidiendo la producción de ATP, y la biosíntesis de acido ribonucleico (Tabares, 2002).
Para el fungicida procloraz, se presento una eficaz inhibición en las tres técnicas empleadas; esto se debe a que es un fungicida sistémico que actúa en la inhibición de síntesis de ergosterol (compuesto celular de gran importancia en la estructura de la membrana de diversos hongos). Al realizar las pruebas confirmatorias en la técnica de bloques, se comprobó la viabilidad del patógeno contrario a los reportes de Everett et al.,(1996) donde el fungicida afecto irreversiblemente el patógeno.
En el caso de C. echinulatum, los fungicidas evaluados mediante las técnicas de pozos y sensidiscos presentaron inhibición al igual que para A. dianthi, Sin embargo en la técnica de bloques de agar todos los fungicidas se comportaron de manera homogénea, presentando porcentajes de inhibición micelial eficaces para el control de C. echinulatum.
El producto compuesto por la mezcla de Carboxim + captan presento una eficaz inhibición en las tres técnicas para el control de F. roseum, ya que el primer compuesto es un fungicida sistémico que inhibe la enzima succínico deshidrogenasa (importante de la respiración mitocondrial), además actúa alterando la síntesis de compuestos esenciales como aminoácidos y enzimas (Agrios, 2004), Por otro lado, inhibe la respiración y germinación de las esporas (Martínez et al., 2008).
Los productos Etridiazol, difeconazol e hidróxido de cobre no presentaron inhibición en las técnicas de pozos y sensidiscos para el control de F. roseum, a diferencia de la técnica de bloques de agar donde los porcentajes de inhibición fueron eficaces a excepción del hidróxido de cobre. Esto se debió a que F. roseum es un patógeno ubicado en la corteza de la planta, por lo tanto el hidroxido de cobre, al ser un fungicida de contacto pudo disminuir su acción frente a este patógeno.
Para la técnica de bloques de agar Etridiazol y difeconazol, inhibieron eficazmente el crecimiento de F. roseum ya que al ser fungicidas sistémicos redujeron la germinación de esporas, inhibiendo así su crecimiento. Estos productos in vivo actúan inhibiendo el crecimiento subcuticular de la hifa patogénica que esta 77 infectando el tejido vegetal, evitando el desarrollo de los síntomas de la enfermedad (ASCOLFI, 1994).
La mezcla de metalaxyl + mancozeb actúa inhibiendo la síntesis de RNA del patógeno, mostrando su eficacia en las tres técnicas y todos los tratamientos para el control de R. solani. (Meyer et al., 2006).
Para la técnica de bloques se obtuvo una inhibición eficaz por parte de etridiazol, al igual que en los estudios realizados por Heungens et al., (2005), en donde el mecanismo de acción fue mencionado anteriormente.
La mezcla de Carboxin + thiram mostró en las tres técnicas inhibición de R. solani, este fungicida de acuerdo con Hutson, (1998), pudo inhibir la succinato deshidrogenasa, enzima de gran importancia en la respiración del hongo.
En el caso del hidróxido de cobre para la técnica de pozos y sensidiscos no se presentó inhibición del crecimiento de R. solani, a diferencia de la técnica de bloques donde se obtuvo inhibición.
De acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba ANOVA, se determinó que Trichoderma spp. fue el fungicida más efectivo para las tres técnicas evaluadas en el control de los hongos fitopatógenos estudiados. Por otro lado, de los 10 productos evaluados, Trichoderma spp. en sus tres tratamientos fue el único que presento mayor eficacia contra todos los hongos. Este producto esta compuesto por tres de las especies de Trichoderma, que han mostrado ser efectivas en el control de diversos patógenos por varios mecanismos como: Producción de enzimas extracelulares (celulasas, quitinasas, glucanasas, lipasas y proteasas) que degradan la pared celular (Howell, 2005); Aunque el principal mecanismo de acción es el micoparasitismo que también esta relacionado con la síntesis de quitinasas extracelulares donde se produce un enrollamiento, penetración y lisis celular total de las hifas del patógeno por la acción de las diferentes enzimas (Márquez, 2001).
Al no encontrarse diferencias estadísticamente significativas entre las técnicas de pozos y sensidiscos, se determino que la más apropiada para la evaluación in vitro de fungicidas fue la técnica de sensidiscos, debido a la facilidad en el montaje.
78 Con respecto a la técnica de bloques de agar, no se obtuvieron los resultados esperados, debido a que bajo esta técnica no se pudo evaluar el efecto fungicida y fungistático ya que se presentaron varias desventajas.
Las principales desventajas que presenta la técnica de bloques es no evaluar una concentración determinada de conidios, pues en los bloques de agar dicha concentración no es conocida, por lo tanto, existiría diferencia en cada una de las replicas.
Por otro lado, en esta técnica se pueden presentar resultados erróneos debido a que no se asegura el contacto directo del patógeno con el fungicida.
79 8. CONCLUSIONES
De acuerdo con los síntomas encontrados en las muestras tomadas en los bancos de enraizamiento se encontraron tanto en los tejidos foliares como en los basales las manifestaciones típicas de las enfermedades registradas, sin embargo se observa alguna dificultad para diferenciar las enfermedades ocasionadas por los hongos F. roseum y R. solani, ya que durante los primeros estados de desarrollo de la enfermedad los síntomas son semejantes.
Para el aislamiento de los microorganismos A. dianthi y C. echinulatum, se presentaron algunas dificultades, dada la lentitud para su crecimiento y la escasa esporulación en el medio de cultivo PDA, situación que fue diferente cuando se empleo el medio V-8.
Se encontró que el producto conocido comercialmente como Fitotripen, que esta formulado con base a tres especies del hongo Trichoderma fue el mas efectivo para el control de los hongos en todos sus tratamientos, pues fue el único producto que mostro actividad como controlador, lo cual representa un gran aporte para los productores de flores en el manejo de las principales enfermedades que se presentan en bancos de enraizamiento.
A pesar de que el hongo Trichoderma es un habitante común en suelo, que se registra como un buen biocontrolador de hongos como R. solani y Pythium sp., en trabajos recientes se observa que su acción también puede estar orientada al control de microorganismos de acción patogénica en los tejidos aéreos de las plantas, resultados similares a los encontrados en esta investigación, su efecto permitió inhibir el desarrollo de los hongos que se presentan en los tejidos foliares como A. dianthi y C. echinulatum.
De acuerdo con las evaluaciones realizadas se considera que el biocontrolador puede estar actuando mediante mecanismos como hiperparasitismo e inhibición por sustancias secretadas, que interfieren con el desarrollo de los hongos
80 evaluados, sin descartar que al entrar en contacto con los tejidos la planta pueda inducir algún mecanismo de resistencia.
Bajo la técnica de bloques de agar no es conveniente evaluar el producto compuesto por Trichoderma spp. teniendo en cuenta su rápido crecimiento en comparación con los patógenos evaluados, limitando los resultados esperados.
También se observo que con la dosis recomendadas por las casas formuladoras para los productos químicos ensayados, se inhibió el crecimiento de todos los microorganismos que con frecuencia se presentan en los esquejes durante el proceso de enraizamiento, sin embargo dada la presencia de fungicidas sistémicos, es probable que sea necesaria su confirmación mediante nuevas pruebas tanto de laboratorio como de campo.
Se determino que la técnica de sensidiscos fue la mas apropiada para evaluar la eficacia de fungicidas in vitro, pues en esta técnica se evalúa una concentración definida del patógeno (106 conidios/mL).
Se determino que los productos Procloraz, Carboxin + Captan y Metalaxyl + mancozeb fueron eficaces para el control de los hongos patógenos evaluados en este trabajo.
81 9. RECOMENDACIONES
Se recomienda adelantar estudios que permitan evaluar el comportamiento de de los productos utilizados en esta investigación, en los bancos de enraizamiento de los cultivos de flores de exportación o bajo condiciones de campo con sus respectivas pruebas de fitotoxicidad.
En necesario estudiar cuales mecanismos le permiten a Trichoderma spp. controlar los hongos que se presentan en los tejidos foliares, A. solani y C. echinulatum.
Se deben investigar los métodos y frecuencia de aplicación de Trichoderma spp., para el manejo de las enfermedades foliares.
Investigar si formulaciones con diferentes especies, cepas y aislamientos del hongo Trichoderma, tienen la capacidad de inhibir el desarrollo de microorganismos patogenos de plantas que se localicen en el sistema foliar de las plantas.
82 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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91 ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR PDA
Infusión de papa 4 g/L D(+) Glucosa 20g/L Agar agar 15g/L
Disolver 39 g por litro de agua y esterilizar en autoclave (15 min a 121°C). Para ajustar el pH a aproximadamente 3.5, incorporar una solución estéril de acido tartarico al 10% a razón de 14ml/L (Merck, 1999).
AGAR V8
Componentes para 1litro Jugo V8 20ml Carbonato de Calcio 0.3g Agar agar 2g Agua destilada 20ml
Esterilizar en autoclave por 15 minutos, 15 Lb de presión y 121ºC y servir el medio en cajas de petri (Rodríguez, 1999).
92 ANEXO 2
AZUL DE LACTOFENOL
Fenol 20g Glicerina 40ml Ácido láctico 20g Agua destilada 20ml Azul de algodón 0.05g
Se mezcla el ácido láctico con la glicerina en agua destilada, se agregan los cristales de fenol y se agita, se calienta al baño maría y se mezcla consistentemente hasta que desaparezcan los cristales y por ultimo se agrega el azul de algodón (Peña, et al. 2003).
93 ANEXO 3
ANOVAMULTIFACTORIAL PARA Fusarium roseum
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN
Source Sum of Squares Df Mean Square F P<0.05
MAIN EFFECTS A: DOSIS 114,689 2 57,3444 5,32 0,0068 B: FUNGICIDA 3731,07 4 932,767 86,49 0,0000 C: REPLICA 1,68889 2 0,844444 0,08 0,9248 D: TECNICA 16,9 1 16,9 1,57 0,2143
RESIDUAL 862,778 80 10,7847
TOTAL (CORRECTED) 4727,12 89
94 PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 % Tukey HSD FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 18 0,0 X DIFECONAZOL 18 0,0 X TERRAZOLE 18 0,0 X FITOTRIPEN 18 12,8889 X VITAVAX 18 13,3889 X
Contrast Difference +/- Limits
DIFECONAZOL - FITOTRIPEN *-12,8889 3,05513 DIFECONAZOL - KOCIDE 0,0 3,05513 DIFECONAZOL - TERRAZOLE 0,0 3,05513 DIFECONAZOL - VITAVAX *-13,3889 3,05513 FITOTRIPEN - KOCIDE *12,8889 3,05513 FITOTRIPEN - TERRAZOLE *12,8889 3,05513 FITOTRIPEN - VITAVAX -0,5 3,05513 KOCIDE - TERRAZOLE 0,0 3,05513 KOCIDE - VITAVAX *-13,3889 3,05513 TERRAZOLE - VITAVAX *-13,3889 3,05513 * denotes a statistically significant difference.
95 PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 30 4,13333 X T1 30 4,83333 XX T2 30 6,8 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 -1,96667 2,02502 T1 - T3 0,7 2,02502 T2 - T3 *2,66667 2,02502
* denotes a statistically significant difference.
ANALISIS DE VARIANZA PARA PORCENTAJES DE INIBICION
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS A:DOSIS 2815,1 2 1407,55 7,58 0,0018 B:FUNGICIDA 13074,8 4 3268,71 17,60 0,0000 C:REPLICA 0,0615148 2 0,0307574 0,00 0,9998
RESIDUAL 6685,18 36 185,7
TOTAL (CORRECTED) 22575,2 44
96 All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 15 70,9804 X T1 15 80,8627 XX T2 15 90,3529 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 -9,4902 12,1648 T1 - T3 9,88235 12,1648 T2 - T3 *19,3725 12,1648
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 9 49,1503 X VITAVAX 9 76,6013 X DIFECONAZOL 9 89,6732 X TERRAZOLE 9 94,1176 X 97 FITOTRIPEN 9 94,1176 X
Contrast Difference +/- Limits
DIFECONAZOL - FITOTRIPEN -4,44444 18,444 DIFECONAZOL - KOCIDE *40,5229 18,444 DIFECONAZOL - TERRAZOLE -4,44444 18,444 DIFECONAZOL - VITAVAX 13,0719 18,444 FITOTRIPEN - KOCIDE *44,9673 18,444 FITOTRIPEN - TERRAZOLE 0,0 18,444 FITOTRIPEN - VITAVAX 17,5163 18,444 KOCIDE - TERRAZOLE *-44,9673 18,444 KOCIDE - VITAVAX *-27,451 18,444 TERRAZOLE - VITAVAX 17,5163 18,444
* denotes a statistically significant difference.
98 Tukey
Tukey
99 ANEXO 4
ANOVA MULTIFACTORIAL PARA Alternaria dianthi
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS A:DOSIS 575,444 2 287,722 20,06 0,0000 B:FUNGICIDA 2109,04 3 703,014 49,02 0,0000 C:REPLICA 2,11111 2 1,05556 0,07 0,9291 D:TECNICA 0,125 1 0,125 0,01 0,9259
RESIDUAL 903,597 63 14,3428
TOTAL (CORRECTED) 3590,32 71
All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 24 3,54167 X T1 24 6,70833 X T2 24 10,4583 X
100 Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-3,75 2,62438 T1 - T3 *3,16667 2,62438 T2 - T3 *6,91667 2,62438
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
CARBENDAZIM 18 0,0 X DITHANE FMB 18 5,83333 X SPORTAK 18 6,61111 X FITOTRIPEN 18 15,1667 X
Contrast Difference +/- Limits
CARBENDAZIM - DITHANE FMB *-5,83333 3,33149 CARBENDAZIM - FITOTRIPEN *-15,1667 3,33149 CARBENDAZIM - SPORTAK *-6,61111 3,33149 DITHANE FMB - FITOTRIPEN *-9,33333 3,33149 DITHANE FMB - SPORTAK -0,777778 3,33149 FITOTRIPEN - SPORTAK *8,55556 3,33149
* denotes a statistically significant difference.
101 ANALISIS DE VARIANZA PARA PORCENTAJES DE INIBICION
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS A:DOSIS 222,81 2 111,405 9,15 0,0009 B:FUNGICIDA 30368,5 3 10122,8 831,36 0,0000 C:REPLICA 1,69132 2 0,845662 0,07 0,9331 RESIDUAL 340,935 28 12,1763
TOTAL (CORRECTED) 30934,0 35
All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T1 12 69,0928 X T3 12 69,3038 X T2 12 74,4726 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-5,37975 3,52577 T1 - T3 -0,21097 3,52577 T2 - T3 *5,16878 3,52577 * denotes a statistically significant difference.
102 PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
CARBENDAZIM 9 22,6442 X SPORTAK 9 73,8397 X DITHANE FMB 9 93,6709 X FITOTRIPEN 9 93,6709 X
Contrast Difference +/- Limits
CARBENDAZIM - DITHANE FMB *-71,0267 4,49211 CARBENDAZIM - FITOTRIPEN *-71,0267 4,49211 CARBENDAZIM - SPORTAK *-51,1955 4,49211 DITHANE FMB - FITOTRIPEN 0,0 4,49211 DITHANE FMB - SPORTAK *19,8312 4,49211 FITOTRIPEN - SPORTAK *19,8312 4,49211
* denotes a statistically significant difference.
103 104 ANEXO 5
ANOVA MULTIFACTORIAL PARA Cladosporium echinulatum
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS A:DOSIS 568,361 2 284,181 31,48 0,0000 B:FUNGICIDA 2701,82 3 900,606 99,76 0,0000 C:REPLICA 5,36111 2 2,68056 0,30 0,7441 D:TECNICA 74,0139 1 74,0139 8,20 0,0057
RESIDUAL 568,764 63 9,028
TOTAL (CORRECTED) 3918,32 71
All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 24 4,0 X T1 24 7,16667 X T2 24 10,875 X
105 Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-3,70833 2,08211 T1 - T3 *3,16667 2,08211 T2 - T3 *6,875 2,08211
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
CARBENDAZIM 18 0,0 X DITHANE FMB 18 3,55556 X FITOTRIPEN 18 9,77778 X SPORTAK 18 16,0556 X
Contrast Difference +/- Limits
CARBENDAZIM - DITHANE FMB *-3,55556 2,64312 CARBENDAZIM - FITOTRIPEN *-9,77778 2,64312 CARBENDAZIM - SPORTAK *-16,0556 2,64312 DITHANE FMB - FITOTRIPEN *-6,22222 2,64312 DITHANE FMB - SPORTAK *-12,5 2,64312 FITOTRIPEN - SPORTAK *-6,27778 2,64312
* denotes a statistically significant difference.
106 107 ANEXO 6
ANOVA MULTIFACTORIAL PARA Rhizoctonia solani
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS A:REPLICA 1,48889 2 0,744444 0,07 0,9294 B:TECNICA 179,211 1 179,211 17,65 0,0001 C:DOSIS 482,756 2 241,378 23,78 0,0000 D:FUNGICIDA 8828,04 4 2207,01 217,40 0,0000
RESIDUAL 812,156 80 10,1519
TOTAL (CORRECTED) 10303,7 89
All F-ratios are based on the residual mean square error.
108 PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 30 7,76667 X T1 30 10,8333 X T2 30 13,4333 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-2,6 1,96471 T1 - T3 *3,06667 1,96471 T2 - T3 *5,66667 1,96471
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
- Method: 95,0 percent Tukey HSD FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 18 0,0 X TERRAZOLE 18 0,0 X PROGRO 18 9,22222 X RIDOMIL 18 21,8333 X FITOTRIPEN 18 22,3333 X
109 Contrast Difference +/- Limits - FITOTRIPEN - KOCIDE *22,3333 2,96415 FITOTRIPEN - PROGRO *13,1111 2,96415 FITOTRIPEN - RIDOMIL 0,5 2,96415 FITOTRIPEN - TERRAZOLE *22,3333 2,96415 KOCIDE - PROGRO *-9,22222 2,96415 KOCIDE - RIDOMIL *-21,8333 2,96415 KOCIDE - TERRAZOLE 0,0 2,96415 PROGRO - RIDOMIL *-12,6111 2,96415 PROGRO - TERRAZOLE *9,22222 2,96415 RIDOMIL - TERRAZOLE *21,8333 2,96415
* denotes a statistically significant difference.
ANALISIS DE VARIANZA PARA PORCENTAJES DE INIBICION
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS A:DOSIS 231,927 2 115,964 3,72 0,0340 B:FUNGICIDA 7040,18 4 1760,05 56,45 0,0000 C:REPLICA 18,8662 2 9,43311 0,30 0,7408
RESIDUAL 1122,45 36 31,1791
TOTAL (CORRECTED) 8413,42 44
All F-ratios are based on the residual mean square error.
110 PRUEBA DE RANGO MULTIPLE LSD PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent LSD DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 15 84,8571 X T1 15 85,1429 X T2 15 89,8095 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-4,66667 4,13514 T1 - T3 0,285714 4,13514 T2 - T3 *4,95238 4,13514
* denotes a statistically significant difference.
111 PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 9 61,5873 X PROGRO 9 92,8571 X FITOTRIPEN 9 92,8571 X TERRAZOLE 9 92,8571 X RIDOMIL 9 92,8571 X Contrast Difference +/- Limits
FITOTRIPEN - KOCIDE *31,2698 7,55757 FITOTRIPEN - PROGRO 0,0 7,55757 FITOTRIPEN - RIDOMIL 0,0 7,55757 FITOTRIPEN - TERRAZOLE 0,0 7,55757 KOCIDE - PROGRO *-31,2698 7,55757 KOCIDE - RIDOMIL *-31,2698 7,55757 KOCIDE - TERRAZOLE *-31,2698 7,55757 PROGRO - RIDOMIL 0,0 7,55757 PROGRO - TERRAZOLE 0,0 7,55757 RIDOMIL - TERRAZOLE 0,0 7,55757
* denotes a statistically significant difference.
112 113