Alba Herráiz Yebes
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Molecular analysis of ovarian resorption induced by hydric stress in Blattella germanica Alba Herráiz Yebes DOCTORAL THESIS UPF / 2013 THESIS DIRECTORS Dr. Xavier Bellés and Dr. Maria Dolors Piulachs INSTITUT DE BIOLOGIA EVOLUTIVA (CSIC-Universitat Pompeu Fabra) Agradecimientos En primer lugar, quiero dar las gracias a mis dos directores, Xavier y Dolors, por haberme dado la oportunidad de hacer esta tesis, por haberme enseñado y acompañado durante todo el proceso, y por haber confiado en mí (a veces más que yo). También por haberme hecho sentir arropada desde el día en que llegué; saber que podía contar con vosotros para lo que fuera hizo más llevadero estar lejos de casa. También doy las gracias a todo el P64, pasado y presente, especialmente a Paula, Mercedes, Érica y Jesús, con los que he pasado más tiempo y de los que he aprendido muchísimo, tanto de Ciencia como de otras muchas cosas. No me olvido de los demás, Eva, Olga, Jia-Hsin, Raúl, Carlos, Naswha, Aníbal, Moysés, Carol y Guillem. De todos ellos me llevo un gran recuerdo. A Raúl y a Aníbal quiero agradecerles, además de los buenos ratos, el trabajo bioinformático, sin el cual esta tesis no habría sido posible. A Cristina Olivella le agradezco su pasión y dedicación, el que siempre me haya echado un cable cuando lo he necesitado y todas las risas que hemos compartido. También a los compañeros de otros laboratorios les agradezco su amabilidad y ayuda, y especialmente a Neus y Cristina Manjón les doy las gracias por haber hecho divertidísimas mis largas estancias en lupas. i A Jose Luis Maestro quiero agradecerle su buen talante, sus ganas de colaborar, sus sugerencias siempre acertadas y, sobre todo, su bondad intrínseca, que es muy reconfortante. Al equipo de administración, Anna, Rita, Emiliano y Blanca, les agradezco su calidez personal y su impecable eficiencia, que tanto han ayudado en los momentos buenos y en los no tan buenos. Doy las gracias a José Manuel Fortuño por toda la ayuda con el microscopio de barrido, y por el entusiasmo demostrado. Agradezco a Joan Cerdá y François Chauvigné que me enseñaran a trabajar con oocitos de Xenopus, y que me iniciaran en el curioso mundo de las acuaporinas. También quisiera recordar aquí a los alumnos de prácticas Jelle, Elena y Laura, de los que aprendí mucho y a los que espero haber enseñado algo. Agradezco a Casi300 haber hecho de un piso compartido un verdadero hogar, y la paciencia infinita que han tenido conmigo durante todo el proceso de escribir esta tesis. A Javi además le agradezco la ayuda que me sigue prestando en la distancia, y haberse convertido en un gran amigo. A todos los amigos les agradezco el apoyo e interés, y sobre todo, el que siempre hayan estado ahí, para aguantarme al teléfono los que ii están lejos o para tomarse unas cañas los que están cerca, cuando lo he necesitado. Quiero dar las gracias a mis padres por haberme instado a seguir mi camino, por haber apoyado todas las decisiones que he tomado, y por hacerme saber que si me equivoco, siempre puedo volver a empezar. También les agradezco los sabios consejos en momentos difíciles. A mi Germanito le agradezco todas las risas y todas las conversaciones serias, y espero ser un buen ejemplo para él. Agradezco a toda mi familia (tíos, primos, consortes…) que se hayan preocupado e interesado por este proyecto. Especialmente a mi tío Toni que ha seguido más de cerca mis altibajos. A él le debo la gran frase “La tesis es un estado de ánimo. Y no siempre es bueno”. Quiero recordar especialmente a mi yaya y a mi abu, que aunque no sabían qué era exactamente lo que hacía, siempre se sintieron orgullosas de mí, y sé que les habría encantado verme llegar hasta aquí. Por último, quiero dar las gracias a Edu por haber estado a mi lado durante este tiempo, por hacerme explicarle exactamente en qué consiste lo que hago, por no dejarme tirar la toalla cuando estuve tentada, por sentirse orgulloso de mí, y, resumiendo, por hacerme sentir que este trabajo es precioso e importante no sólo para los científicos. A todos, muchas gracias. iii Abstract In the present thesis we studied the effects of hydric stress in the ovary of the cockroach Blattella germanica. At morphological level, we described ovarian resorption induced by water deprivation. At a molecular level, we looked for markers differentially expressed under hydric stress. First, we focused on aquaporins given their role as water channel proteins. We cloned, sequenced and functionally characterised an aquaporin that transports water and urea. Then, we obtained a library of microRNAs (small non-coding RNAs that regulate gene expression post transcriptionally) present in the ovary under stress conditions. We analysed the differential expression of 13 of them and we observed that the majority were overexpressed under hydric stress. We selected miR-34-5p to perform a deeper study, including a study of their potential target mRNAs. Among the possible targets, we studied the function of Windei, a factor that resulted necessary for the trimethylation of lysine 9 in histone H3 and for chorion formation. Finally, we selected CARMER (an arginine methyltransferase) as hydric stress marker candidate. We assessed that it is overexpressed in response to hydric stress and that it is necessary for the dimethylation of arginine 17 in histone H3. v Resumen En esta tesis estudiamos los efectos del estrés hídrico en el ovario de la cucaracha Blattella germanica. A nivel morfológico describimos el proceso de reabsorción ovárica tras la privación de agua. A nivel molecular buscamos marcadores diferencialmente expresados en respuesta a este estrés. Primero nos centramos en las acuaporinas por su papel como proteínas que forman un canal transportador de agua. Clonamos, secuenciamos y caracterizamos funcionalmente una acuaporina que transporta agua y urea. Después obtuvimos una biblioteca de microRNAs (RNAs cortos no codificantes que regulan la expresión génica post- transcripcionalmente) presentes en el ovario en situación de estrés. Analizamos la expresión diferencial de 13 de ellos y observamos que la mayoría se sobreexpresaban en situación de estrés. Elegimos miR-34-5p para hacer un estudio más profundo, incluyendo un análisis de sus potenciales mRNA diana. De entre ellos, estudiamos la función de Windei y comprobamos que dicho factor es necesario para la trimetilación de la lisina 9 en la histona H3 y para la formación del corion. Por último, seleccionamos CARMER (una arginina methyltransferasa) como candidato a marcador de estrés hídrico. Comprobamos que CARMER se sobreexpresa en respuesta a estrés y que es necesario para la dimetilación de la arginina 17 en la histona H3. vii Preface The predoctoral fellowship awarded to the author of this PhD thesis was received from the International Laboratory on Global Change (LINCGlobal), an institution founded by the Spanish National Research Council (CSIC) and the Pontifical Catholic University of Chile (PUC). LINCGlobal is a multidisciplinary institution that aims to understand, predict and develop strategies to respond to the impact of Global Change on ecosystems. In this context, Global Change refers to the series of changes derived from the human activity in the fundamental processes that define the functioning of the biosphere. It includes the transformation of the Earth´s land surface and the derived effects on climate, biogeochemical cycles, and biodiversity. Changes in temperature, increase of UV radiation and lack of water are predictable consequences of global change that can be reproduced in the laboratory, allowing us to study its effects in selected organisms in a controlled environment. During the last 30 years, the group that received the candidate has been working on a number of aspects related to development and reproduction in a well-known insect model: the German cockroach, Blattella germanica, using molecular tools. Therefore, a great deal of information has been gathered on genomics and molecular physiology of this species. The first idea was, then, to start a research program using this model to study the early effects of water deprivation, and to identify molecular markers of this kind of ix stress that might serve as indicators of incipient water shortage in insects living in areas in danger of desertification. Briefly, the present work aims at laying the first foundations for the above research project. We have focused on the effects of water stress on ovarian maturation because it is a sensitive process, and the first one that the female aborts when facing adverse environmental conditions. Our approach has been to remove drinking water from the rearing jars of experimental animals, and then analyse the resulting effects upon ovarian maturation, at both morphological and molecular levels. x Abbreviations 20E 20-hydroxyecdysone AQP Aquaporin ar/R Aromatic/arginine ATF7IP Activating transcription factor 7 interacting-protein BIB Big Brain BLAST Basic Local Alignment Search Tool BME -mercaptoethanol cDNA Complementary DNA cRNA Capped RNA DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DEPC Diethylpyrocarbonate DNase Deoxyribonuclease DRIP Drosophila Integral Protein dsRNA double strand RNA EC Early chorion EST Expressed sequence tag FE Follicular epithelium GO Gene Ontology H3K9me3 Trimethylation of lysine 9 in histone H3 H3R17me2a Asymmetric dimethylation of arginine 17 in histone H3 HKMT Histone lysine methyltransferase LBO Length of basal oocyte LC Late chorion MBS Modified Barth's saline MC Mid chorion xi MIP Membrane Integral Protein miRNA MicroRNA ncRNA Non-coding RNA NPA Asparagine-proline-alanine nt Nucleotide ORF Open reading frame PBS Phosphate buffered saline PRIP Pyrocoelia rufa Integral Protein PRMT Protein arginine methyltransferase PTM Post translational modification qRT-PCR Quantitative real time PCR RACE Rapid amplification of cDNA ends RISC RNA-induced silencing complex RNAi RNA interference RNase Ribonuclease RF Resorbed follicles SD Standard deviation SDS Sodium dodecyl sulfate s.e.m Standard error of the mean SEM Scanning electron microscopy TM Transmembrane TRICT Tetramethylrhodamine isothiocyanate UTR Untranslated region xii Contents Agradecimientos ..................................................................