Influence Du Génotype De Porte-Greffe Dans La Signalisation Azotée Et Le Développement Du Greffon Chez La Vigne Noe Cochetel

Influence du génotype de porte-greffe dans la signalisation azotée et le développement du greffon chez la vigne Noe Cochetel

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Noe Cochetel. Influence du génotype de porte-greffe dans la signalisation azotée et le développe- ment du greffon chez la vigne. Biologie végétale. Université de Bordeaux, 2016. Français. NNT: 2016BORD0290. tel-01949305

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Année 2016 Thèse de doctorat

Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Bordeaux

École doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé Spécialité : Biologie végétale

Par Noé COCHETEL

Influence du génotype de porte-greffe dans la signalisation azotée et le développement du greffon chez la Vigne

Soutenue publiquement le 9 décembre 2016

Devant le jury constitué de : M. Alain GOJON Directeur de recherche, INRA Montpellier Rapporteur Mme. Catherine RAMEAU Directrice de recherche, INRA Versailles Rapporteur M. Pierre COUTOS-THEVENOT Professeur, Université de Poitiers Examinateur M. Michel HERNOULD Professeur, Université de Bordeaux Président

Sous la direction de : Virginie LAUVERGEAT, Maître de conférences, Université de Bordeaux.

Titre : Influence du génotype de porte-greffe dans la signalisation azotée et le développement du greffon chez la Vigne Résumé : Ce travail de recherche a eu pour objectif de caractériser l’influence du génotype de porte- greffe sur le développement du greffon notamment à travers l’étude des mécanismes relatifs à la signalisation azotée et hormonale. Dans ce contexte, deux porte-greffes, 1103 Paulsen (1103P) et Riparia Gloire de Montpellier (RGM), induisant respectivement une forte et faible vigueur du greffon, ont été étudiés. Une analyse du transcriptome racinaire a été effectuée chez des plants greffés impliquant ces deux génotypes dans un système split-root où la disponibilité en azote était hétérogène. Une réponse plus prononcée a été observée pour le génotype RGM, ainsi qu’une régulation temporelle différente entre les deux génotypes, notamment concernant des gènes clés de la réponse au nitrate intervenant dans la régulation de la croissance des racines ou dans la signalisation hormonale. D’un point de vue développemental, une régulation étroite de la production des racines latérales et des rameaux latéraux par la disponibilité en azote a été mise en évidence chez RGM. D’autre part, les propriétés intrinsèques de chaque porte-greffe semblent être conférées au greffon induisant notamment une ramification plus importante de celui-ci lorsque le porte-greffe 1103P est utilisé. La caractérisation fonctionnelle des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des strigolactones et la réalisation de bio-essais ont permis de mettre en évidence la production de composés de type strigolactones chez la Vigne. Ces travaux suggèrent aussi une balance contrastée entre les strigolactones et les cytokinines au sein des deux génotypes, corrélée à leur capacité de contrôle de la croissance du greffon. L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence une réponse transcriptomique et développementale à la disponibilité en azote toujours plus prononcée pour le génotype connu pour conférer le moins de vigueur au greffon, RGM. Mots clés : Azote, Porte-greffe, Strigolactones, Vigne.

Title: Rootstock genotype impact on nitrogen signalling and development of the scion in Grapevine Abstract: This work aimed to characterize the impact of the rootstock genotype on the scion development especially through the study of the mechanisms related to nitrogen and hormonal signalling. In that context, two rootstocks were studied, 1103 Paulsen (1103P) and Riparia Gloire de Montpellier (RGM), inducing high and low scion vigour, respectively. A transcriptomic analysis was performed on roots of grafted plants involving both genotypes, cultivated in a split-root system where the nitrogen availability was heterogeneous. A more pronounced response was observed for RGM together with a different temporal regulation between both rootstocks, in particular concerning the expression of key genes of the nitrate response involved in root growth regulation or in hormonal signalling. Concerning plant development, a clear impact of the nitrogen availability on the production of lateral roots and shoot branching was highlighted for RGM. Moreover, the intrinsic properties of each rootstock seemed to be conferred to the scion inducing especially a higher shoot branching when the rootstock 1103P was used. The functional characterization of the genes involved in the strigolactone biosynthesis pathway and bioassays highlighted the production of strigolactone-like compounds in Grapevine. These experiments suggest also a contrasted balance between strigolactones and cytokinins within each rootstock genotype, correlated with their ability to control the scion growth. Taking together, these results showed a pronounced transcriptomic and developmental response to nitrogen availability for the genotype conferring the lowest scion vigour, RGM. Keywords: Grapevine, Nitrogen, Rootstock, Strigolactones.

UMR 1287 Ecophysiologie et Génomique Fonctionnelle de la Vigne ISVV Bordeaux, 210 Chemin de Leysotte, 33882 Villenave d’Ornon cedex, France

Remerciements

Durant cette thèse j’ai eu la chance de rencontrer beaucoup de personnes et de découvrir de multiples façons de penser. Pressé et stressé durant ces trois années, je tiens à prendre ici le temps d’exprimer mes remerciements à toutes ces personnes qui ont rendu possible et dans de si bonnes conditions cet exercice si particulier que représente une thèse de doctorat.

Je tiens tout d’abord à remercier notre directeur d’Unité, Serge Delrot, pour son accueil dans ce laboratoire, ses conseils et d’avoir toujours fait son possible pour faciliter mon travail.

Je remercie également les membres du jury qui ont accepté de participer à la soutenance et en particulier les rapporteurs, Catherine Rameau et Alain Gojon, qui ont bien voulu lire et évaluer ce manuscrit.

Je me souviens…

J’étais en stage de Master au sein de l’UMR Biologie du Fruit et Pathologie et la vision que j’avais de mon avenir professionnel que ce soit à court ou à long terme était particulièrement vague. Choisir le parcours Recherche sous-entendait passer un concours et réaliser une thèse, deux choses qui m’apparaissaient abstraites et insurmontables. Puis un jour, entre deux cafés, Michel Hernould me dit « Bon alors, Noé, tu es prêt à te lancer dans la recherche ? ». Je ne saurai résumer ce grand Monsieur. Fin psychologue et toujours à l’écoute de ses étudiants, il a su me donner confiance en moi. A travers cette phrase peut être banale pour lui et grâce aux nombreux conseils qu’il a su me donner, j’ai décidé de me lancer dans cette aventure que représente la Recherche. A ce sujet, je tiens à vous remercier, Michel, pour votre capacité d’écoute et votre patience, pour les bons conseils que vous m’avez fourni et pour vos ressources inépuisables en blagues « scientifiques » qui nous ont toujours fait sourire Norbert et moi. Ce qui m’amène ainsi à parler d’un autre Monsieur de la même UMR, qui est d’ailleurs son doctorant, Norbert Bollier, que j’appellerai ici Luc pour plus « d’inconvention ». Cet étudiant de ma promotion représente sans conteste l’un des plus brillants futurs chercheurs que j’ai pu rencontrer. Toujours en avance sur les autres et doté d’une capacité de recul assez impressionnante, j’ai pu le côtoyer dès mon stage de Master puis tout le long de ma thèse. Je tiens donc à te dire un grand merci, Luc, pour avoir été un fidèle acolyte lors de la réalisation de certains « dark projects », un super binôme lors des repiquages hebdomadaires des cals de tomates transgéniques, pour les discussions plus ou moins philosophiques autour de ce

nombre incalculable de cafés que nous avons pu boire ensemble mais aussi pour tes conseils, ta lucidité et ta patience. Je remercie également tous les membres de cette équipe qui m’ont toujours accueilli dans les meilleures conditions que ce soit pour mes stages ou certaines expérimentations de ma thèse.

Une autre rencontre a bien entendu été décisive pour la réalisation de ce projet, la rencontre de ma directrice, Virginie Lauvergeat. Il me semble que dès le début nous nous sommes très bien entendus. Attentionnée, à l’écoute, patiente, je ne saurai évoquer toutes tes qualités qui m’ont permis de me sentir aussi bien tout au long de cette thèse. Phénotypage sans fin, voire même nocturne, expérimentations à faire le weekend, corrections d’articles, de présentations orales ou de manuscrit sans répit, tu as toujours été là pour moi. Tu as aussi été une amie avec qui on peut discuter de tout et de rien. Bien entendu, nos deux logiques bien distinctes nous ont amené à débattre au sujet de nombreuses choses mais je suis assez fier que cela ait toujours été constructif. Je te remercie donc énormément Virginie, pour tout ce que tu m’as apporté et pour ce souvenir intense et captivant que je retiendrai de ces trois années.

A mon arrivée dans l’UMR Ecophysiologie et Génomique Fonctionnelle de la Vigne, un petit groupe de personnes a grandement participé à mon intégration. Je tiens à dire un grand merci à ces anciens thésards du laboratoire, Julien, Éric, Landry et Pierre qui m’ont permis de « m’acclimater » très rapidement à cette nouvelle UMR et grâce à qui j’ai pu m’immiscer dans ce nouveau monde que représente la Vigne, notamment à travers la dégustation des produits dérivés de cette plante. Durant ces trois ans, j’ai aussi eu le plaisir de partager mon bureau avec une autre doctorante, Roberta. Avec toi, j’ai partagé de super moments qui nous ont permis de penser à autre chose que le travail. Nos après-midi guitare avec notre cher professeur Marc ou encore les dimanches midi où j’ai pu découvrir la cuisine latine et sicilienne chez Maria José sont des moments de détente qui ont été grandement appréciables. Je tiens donc à te dire un grand merci Roberta pour tous ces bons souvenirs. Je souhaite aussi remercier Maria José, pour son sourire permanent et sa gentillesse sans limite. Depuis, d’autres thésards ont fait leur arrivée au sein du laboratoire et je tiens à vous remercier, Eloïse et #Antoine, pour toute cette bonne humeur que vous générez dans notre grand bureau. Bien entendu, je remercie aussi énormément Isa, pour sa gentillesse, pour son aide si précieuse dans cette dernière ligne droite de thèse et sa patience face aux nombreuses blagues poétiques que mon jumeau #Antoine et moi sommes capables de générer en fin de journée.

Pour réaliser l’ensemble des travaux menés au cours de cette thèse, un soutien sans relâche m’a été fourni par une équipe technique réactive et disponible grâce à qui j’ai pu me lancer dans mes expérimentations en toute confiance. Je remercie donc tout le personnel technique de l’UMR, pour votre aide indispensable, votre disponibilité et vos bons conseils. C’est d’ailleurs durant la réalisation de ces expérimentations, nécessitant un grand nombre de personnes, que j’ai été fasciné par la capacité de mobilisation de cette UMR. Ainsi, durant ces périodes de prélèvements, une vingtaine de personnes, stagiaires, thésards, techniciens et chercheurs se sont retrouvées dans la même serre pour effectuer simultanément les nombreux arrosages et prélèvements essentiels à mes travaux. Je garde de très bons souvenirs de ces moments qui m’ont confirmé la chance que j’ai eue de vous côtoyer.

Je remercie chaleureusement l’équipe scientifique qui m’a entouré notamment Nathalie, Sarah, Pierre-François et Philippe V., pour leurs bons conseils et leur temps accordé en réponse à mes nombreuses questions. Un grand merci à Zhanwu pour ses remarques pertinentes, sa gentillesse et sa disponibilité vis-à-vis des différents travaux de ma thèse et notamment pour son enseignement efficace de l’utilisation du logiciel R.

Je remercie également Frédéric Escudié qui était à la plateforme Genotoul à Toulouse et Mindy S. Muñoz que j’ai rencontré lors de mon voyage au Chili, pour leur aide précieuse concernant l’analyse des résultats issus de la technologie RNAseq. Merci à Pierre Coutos- Thévenot pour son accueil et ses conseils concernant les cultures de cellules embryogènes. Je remercie aussi Jean-Bernard Pouvreau et son équipe pour leur accueil et leur disponibilité pour les bio-essais que j’ai réalisé à Nantes. Je souhaite également remercier Sandrine Ruffel pour ses conseils et son regard avisé quant aux expérimentations de type split-root. Merci aussi à Sandrine Bonhomme et Philippe Nacry pour leurs conseils durant mon comité de mi- thèse.

Je remercie tous les stagiaires de L2, L3, M1 et M2 qui m’ont aidé et qui ont grandement participé aux avancées des travaux de ma thèse.

Durant ces trois ans, je n’ai pas eu la chance d’être souvent aux côtés des personnes qui sont pourtant les plus chères à mes yeux. Je tiens à remercier affectueusement ma famille sur qui je peux toujours compter et qui n’a jamais remis en question mes choix. Je remercie également mes deux meilleurs amis, Nathan et Maxime, pour ces brefs moments où nous avons pu nous retrouver durant cette période et pour cette sensation de bien-être que je ressens en votre présence.

Abréviations 1103P Vitis berlandieri x Vitis rupestris cv. 1103 Paulsen 6PGDH 6-PhosphoGluconate Dehydrogenase ABA Abscisic Acid ABI2 ABA Insensitive 2 ACT2 Actin 2 AFB Auxin signaling F-Box protein AGL Agamous-like AMT AMmonium Transporter ANR1 Arabidopsis Nitrate Regulated 1 AP2/ERF APetala2/Ethylene Response Factor ARF8 Auxin Response Factor 8 AS Asparagine Synthetase At Arabidopsis thaliana bp base pair BRC1 Branched 1 BT2 BTB and TAZ domain protein 2 CCA1 Circadian Clock-Associated 1 CCD Carotenoid Cleavage Dioxygenase CEGMA Core Eukaryotic Genes Mapping Approach CEP C-terminally Encoded Peptide CEPR CEP Receptor cHATS constitutive High Affinity Transport System CHL Chlorate 1 CIPK CBL-Interacting Protein Kinase CLC Chloride Channels CLE CLAVATA3/ESR-related CLV1 CLAVATA1 CPSase CarbamoylPhosphate Synthase CS Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon cv cultivar CYP cytochrome P450 d dwarf dad decreased apical dominance DEG Differentially Expressed Gene EF1 Elongation Factor 1 gamma ELF Early Flowering FC1 Fine Culm 1 Fd Ferredoxin FDR False Discovery Rate FT Flowering Locus T G6PDH Glucose-6-P Dehydrogenase GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase GDH Glutamate Dehydrogenase GIEC Groupe d’experts Intergouvernemental sur l’Évolution du Climat GO Gene Ontology GOGAT Glutamine-2-oxoglutarate aminotransferase GS Glutamine Synthase GSR Glutamine synthetase HATS High Affinity Transport System htd high tillering dwarf

iHATS inducible High Affinity Transport System IPT3 Isopentenyltransferase 3 kME module eigengene-based connectivity LATS Low Affinity Transport System LB Lateral Branch LBD Lateral organ Boundary Domain LBO Lateral Branching Oxidoreductase LFC Log Fold Change LHY Late Elongated Hypocotyl Lj Lotus japonica LR Lateral roots MADS-box MCM1-Agamous-Deficiens-Serum response factor-box max more axillary growth MEP Methylammonium Permease miR miRNA Mt Medicago truncatula MTT Methylthiazoldiphenyl-tetrazolium NAC4 NAC domain containing protein 4 NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Dehydrogenase NAXT Nitrate excretion Transporter NIR Nitrite Reductase NLP7 Nin-Like Protein 7 NPF Nitrate transporter 1/Peptide transporter Family NR Nitrate Reductase NRG2 Nitrate Regulatory Gene 2 NRT Nitrate Transporter NUE Nitrogen Use Efficiency OPP Oxidative Pentose Phosphate PDR1 Pleiotropic Drug Resistance Protein 1 PN Pinot Noir PTR Peptide Transporter RGM Vitis riparia cv. Riparia Gloire de Montpellier Rh Rhesus rms ramosus RPKM Reads Per Kilo base per Million mapped reads SL Strigolactone Sl Solanum lycopersicum SLAC Slow Anion Channel SLAH Slow Anion Channel-Associated 1 Homologues SMXL Suppressor of More Axillary Growth 2-Like SPL9 Squamosa Promoter-binding-Like protein 9 SPX1 SPX domain-containing protein 1 TCP20 Teosinte branched 1/Cycloidea/Proliferatin cell factor1-20 TOM Topological Overlap Matrix TPR2 Topless-Related Protein 2 UBC21 Ubiquitin-conjugating enzyme 21 UPM1 Uroporphyrin-III C-methylase Vv Vitis vinifera WGCNA Weighted Gene Co-expression Network Analysis

Liste des figures

INTRODUCTION GENERALE

Figure 1. Principales caractéristiques recherchées lors de la sélection des porte-greffes (Warschefsky et al., 2015). Figure 2. Influence du porte-greffe sur la hauteur des pommiers (Washington State University). Figure 3. Exemples de molécules découvertes en utilisant la technique de greffage (Melnyk and Meyerowitz, 2015). Figure 4. Cycle de vie du phylloxéra (Wassilieff, 2015). Figure 5. Outils employés pour étudier la formation de la greffe (Melnyk and Meyerowitz, 2015). Figure 6. Schéma représentant les changements anatomiques et structuraux le long d’une racine de Vigne (Richards, 1983). Figure 7. Changement d’affinité de la protéine NPF6.3 pour le nitrate (Tsay, 2014). Figure 8. Localisation et fonction des transporteurs appartenant aux familles NPF et NRT2 chez Arabidopsis thaliana (O’Brien et al., 2016). Figure 9. Modèle synthétisant le rôle des transporteurs d’ammonium de type AMT1 dans l’absorption de l’ammonium de haute affinité (Yuan et al., 2007). Figure 10. Schéma synthétisant l’assimilation de l’azote au niveau foliaire (modifié d’après Arsova et al., 2010). Figure 11. Représentation schématique de deux réponses au signal nitrate dépendantes de NRT1.1 (NPF6.3 dans ce manuscrit) (Gojon et al., 2011). Figure 12. Représentation schématique de l’interaction entre l’azote et les phytohormones (acide abscissique, auxine et cytokinine) dans la régulation de l’absorption de l’azote (Kiba et al., 2011). Figure 13. Modèle de la signalisation systémique impliquée dans le signal azote (Ruffel et al., 2011). Figure 14. Schéma de synthèse des réponses moléculaires locales et systémiques en split-root chez Arabidopsis (O’Brien et al., 2016). Figure 15. Modèle du messager secondaire pour la levée de dormance des bourgeons axillaires (Domagalska and Leyser, 2011). Figure 16. Modèle du transport canalisé de l’auxine (Domagalska and Leyser, 2011). Figure 17. Représentation schématique des voies de biosynthèse et de signalisation des strigolactones avec les gènes identifiés chez quatre espèces modèles (encadré) (de Saint Germain et al., 2013a). Figure 18. Modèle schématique détaillant la dégradation de D53 par la régulation du complexe D14-SCFD3 via les strigolactones (Zhou et al., 2013). Figure 19. Modèle schématique du complexe de signalisation par les strigolactones intégrant D14 avec les protéines MAX2 et SMXL (Wang et al., 2015). Figure 20. Rôles des strigolactones dans le développement de la plante (Al-Babili and Bouwmeester, 2015).

Figure 21. Le contrôle du développement du greffon par le porte-greffe chez la Vigne : approches abordées lors de la thèse afin de déterminer les mécanismes impliqués chez deux porte-greffes connus pour influencer différemment le développement du greffon.

RESULTATS ET DISCUSSION

Chapitre 1 Figure 1. Split-root experiment in greenhouse. Figure 2. Gene ontology (GO) distribution of the de novo merged transcriptome. Figure 3. Classification of the de novo merged transcriptome into BIN code classes. Figure 4. Analysis of the differentially expressed genes (DEGs) in roots in response to heterogeneous N availability in the two scion/rootstock combinations. Figure 5. A core set of N-related genes was shared between CS/1103P and CS/RGM in response to heterogeneous N availability. Figure 6. In response to N availability, six times more genes were differentially expressed in CS/RGM compared to CS/1103P. Figure 7. Validation of expression profiles of N-related genes by qPCR. Figure 8. Module-trait relationships. Figure 9. Eigengene average expression. Figure S1. Length distribution of de novo assembled contigs. Figure S2. Top-hit species distribution of the merged final transcriptome. Figure S3. Multi-Dimensional Scaling plot of counts data from the different RNAseq samples. Figure S4. The few number of DEGs responding to N availability in CS/1103P involves mainly N-related genes. Figure S5. Functional categories distribution within DEGs.

Chapitre 2 Figure 1. Suivi de croissance in vitro de boutures de 1103P et RGM en condition de présence ou absence de source d’azote. Figure 2. Suivi de croissance en condition d’absence d’azote et transfert sur une gamme de concentrations d’azote. Figure 3. Suivi de l’architecture racinaire de boutures de 1103P et RGM cultivées sur boîtes de Pétri. Figure 4. Suivi d’expression génique dans les racines de boutures de 1103P et RGM cultivées in vitro sur gamme d’azote. Figure 5. Étude de profils d’expression au cours d’une expérimentation de type split-root réalisée en serre.

Chapitre 3 Figure 1. Genes encoding enzymes of the strigolactone biosynthetic pathway are differentially regulated in roots of CS/RGM in a split-root experiment. Figure 2. Functional characterization of grape SL-related genes. Figure 3. Experimental design of hydroponic cultures.

Figure 4. Responses of the two rootstock cuttings to P and N availability in hydroponic cultures. Figure 5. Root exudate activity on P. ramosa seed germination and gene expression profiling of PDR1 gene in the two rootstock cuttings cultivated hydroponically in response to P or N availability. Figure 6. Growth and branching parameters and root exudate activity on P. ramosa seed germination of the four reciprocal RGM and 1103P grafted combinations in response to P or N availability. Figure 7. 1103P rootstock developped more branches than RGM and this shoot branching difference is conferred to a CS scion. Figure 8. Responses of the CS/RGM and CS/1103P combinations to N availability in hydroponic cultures. Figure 9. Gene expression profiling of PDR1 gene in the two combinations CS/1103P and CS/RGM cultivated hydroponically in response to N availability. Figure S1. Images of representative plants of each combination harvested at the end of the P and N experiments. Figure S2. Images of representative plants of each genotype after one month and half in greenhouse and irrigated with HN solution (5 mM).

Liste des tableaux

INTRODUCTION

Tableau 1. Principales caractéristiques des porte-greffes utilisés dans le Sud-Ouest de la France (Institut Français de la Vigne et du Vin, http://www.vignevin.com/). Tableau 1. Classification des génotypes de porte-greffes en fonction de leur vigueur (modifié d’après Zhang et al., 2016).

RESULTATS ET DISCUSSION

Chapitre 1 Table 1. List of genes associated to N-metabolism and transport that were differentially expressed between LN and HN conditions in CS/1103P and/or CS/RGM at 3 and 24 hpt. Table S1. Read number before (raw) and after trimming (cleaned). Table S2. Summary table of the de novo assemblies. Table S3. List of the primers used for qPCR experiments. Table S4. Pairwise comparisons resulting from differential expression analysis performed using edgeR. Table S5. Gene module membership. Table S6. BIN Code enrichment for each WGCNA module.

Chapitre 2 Tableau 1. Composition du milieu McCown Woody Plant Medium. Tableau 2. Liste des amorces utilisées.

Chapitre 3 Table 1. List of growth and architectural variables of rootstock cuttings cultivated in greenhouse during 1 month and half in HN condition. Table 2. Comparison between LN and HN conditions for the growth and architectural variables of rootstock cuttings cultivated in greenhouse during 1 month and half under LN or HN irrigation. Table 3. List of growth and architectural variables of CS/1103P and CS/RGM plants cultivated in greenhouse during 1 month and half in HN condition. Table S1. List of genes highly correlated to the module "lightgreen". Table S2. List of the primers used for qPCR experiments. Table S3. List of growth and architectural variables of one year-old CS/1103P and CS/RGM plants cultivated in greenhouse.

Sommaire

Introduction générale ...... 1 I. La Vigne, une plante cultivée greffée ...... 3 I.1 - Le greffage ...... 3 I.2 – Les porte-greffes chez la Vigne ...... 4 II. Le développement de la Vigne greffée ...... 5 II.1 – La compatibilité entre greffon et porte-greffe ...... 5 II.2 – L’influence du porte-greffe sur le développement du greffon ...... 6 II.3 – Développement racinaire et nutrition hydrominérale ...... 8 II.4 – Interaction entre porte-greffe et greffon en réponse à l’environnement ...... 11 III. Le rôle de la nutrition azotée ...... 14 III.1 – Nutrition azotée ...... 14 III.2 – Régulation ...... 18 III.3 – L’azote en viticulture ...... 23 IV. Les strigolactones...... 27 IV.1 – La découverte des strigolactones ...... 27 IV.2 – Mode d’action des strigolactones sur la ramification ...... 28 IV.3 – Biosynthèse et signalisation ...... 29 IV.4 – Le contrôle du développement de la plante en réponse à l’environnement ...... 31 Problématique et stratégie adoptée ...... 33 Chapitre 1. La réponse transcriptomique racinaire à la disponibilité hétérogène en azote dépend du génotype de porte-greffe ...... 35 I. Introduction ...... 35 II. Article ...... 36 Title page ...... 36 Abstract ...... 38 Introduction ...... 39 Materials and methods ...... 41 Plant materials and split-root experiment ...... 41 RNA extraction, library preparation and sequencing ...... 42 Pre-processing of RNA sequencing data ...... 42 De novo assembly ...... 42 Functional annotation of de novo assembled transcriptome ...... 42 Quality evaluation ...... 43 Analysis of differential expression ...... 43 Network analysis ...... 43 Validation of RNA-seq analysis by qPCR ...... 44 Results ...... 44 De novo assembly and annotation of a root transcriptome from grafted Vitis plants ...... 44 A heterogeneous nitrate supply induces a larger modification in the root transcriptome of CS/RGM compared to CS/1103P ...... 45

Both combinations share a core set of genes differentially regulated in response to N variation ...... 46 The N treatment regulates gene expression in a rootstock dependent manner ...... 47 Genes encoding nitrate transporters and enzymes involved in N metabolism are highly regulated in CS/RGM grafted plants ...... 48 Weighted gene co-expression network analysis to identify hub genes in response to N availability .... 49 Discussion ...... 51 Heterogeneous nitrate supply modulates differently the root transcriptome in the two scion/rootstock combinations ...... 51 The transcriptional regulation of the ethylene pathway genes is shared between both combinations but at different time points ...... 53 Regulation of strigolactones synthesis appears as a RGM specific response ...... 54 Various circadian clock related genes are highly connected to modules associated to each rootstock genotype ...... 54 Conclusion...... 55 Acknowledgments ...... 56 References ...... 57 Supplementary Data ...... 61 III. Conclusion ...... 69 Chapitre 2. Régulation de la croissance et de la morphologie racinaire des porte-greffes en réponse à la disponibilité en azote ...... 71 I. Introduction ...... 71 II. Matériel et méthodes ...... 75 II.1 – Expérimentation Split-root ...... 75 II.2 – Préparation des explants/boutures pour les expérimentations in vitro ...... 75 II.3 – Expérimentation in vitro en condition de présence ou absence de source azotée dans le milieu nutritif ...... 76 II.4 – Expérimentation in vitro sur une gamme de concentrations en azote ...... 76 II.5 – Expérimentation in vitro sur boîtes de pétri ...... 76 II.6 – Suivi d’expression de gènes en qPCR...... 76 III – En réponse à la disponibilité en azote, les porte-greffes régulent différemment leur croissance racinaire . 78 III.1 – Résultats ...... 78 III.2 – Discussion ...... 80 IV – Les gènes impliqués dans la régulation développementale du système racinaire en réponse à la disponibilité en azote présentent des profils différents en fonction du porte-greffe ...... 81 IV.1 – Résultats ...... 81 IV.2 – Discussion ...... 84 V – Conclusion et perspectives ...... 91 Chapitre 3. Le rôle des strigolactones dans le contrôle du développement du greffon par le porte-greffe ...... 93 I. Introduction ...... 93 II. Article ...... 94 Title page ...... 94 Introduction ...... 95 Results ...... 98

SL-related gene expression is regulated in the roots of CS/RGM in response to N availability ...... 98 Functional characterization of grapevine SL-related genes ...... 98 Nutrient starvation induces a reduction of shoot growth together with an increase of SL-related gene expression and exudation of Orobanche seed germination inducible compounds ...... 100 Shoot and root derived signals are both integrated to control the shoot architecture behaviour ...... 102 Rootstock development in greenhouse ...... 103 Shoot branching pattern of the rootstock in response to nitrogen availability ...... 104 Scion branching is influenced by the rootstock genotype ...... 105 Discussion ...... 106 Scion branching is influenced by the rootstock genotype ...... 106 Strigolactones in grapevine rootstocks ...... 107 Regulation of the shoot architecture trough the interplay between roots and shoot derived signals 108 In response to nutrient starvation, both genotypes modulate their growth with distinct adaptive strategies ...... 109 Conclusion...... 110 Materials and methods ...... 110 Plant Materials and Growth Conditions ...... 110 Phenotypic analysis of growth and architectural parameters ...... 111 Gene expression analysis ...... 112 Root exudate collection and seed germination assays of Phelipanche ramosa ...... 112 Cloning of the full-length coding sequences of D27, CCD7 and CCD8 from both rootstock genotypes 113 Vector construction and Arabidopsis transformation ...... 113 Cell transformation and culture ...... 114 Acknowledgments ...... 114 References ...... 115 Supporting Information ...... 119 III. Conclusion ...... 123 Conclusion générale et perspectives ...... 126 Références bibliographiques ...... 131 Communications ...... 146

INTRODUCTION

Introduction générale

Au cœur des problématiques scientifiques actuelles, les prévisions de changement climatique sont réaffirmées à chaque rapport du groupe d’experts intergouvernemental sur l’évolution du climat (GIEC). L’impact de ce phénomène sur l’agriculture est non négligeable et sera d’autant plus important pour des cultures sensibles aux variations environnementales telle que la viticulture (Bock et al., 2013; Mozell and Thach, 2014). L’évolution des conditions climatiques a de réelles répercutions sur la physiologie de la Vigne entraînant conjointement, diminution de rendement et baisse de qualité des baies, et en conséquence des vins produits (van Leeuwen et al., 2004; Duchêne et al., 2010; Mira de Orduña, 2010; Fraga et al., 2016). Les enjeux inhérents à ce phénomène en constante évolution soulignent une réelle nécessité d’anticipation afin de proposer aux viticulteurs des solutions adaptées. Dans ce cadre, il est primordial de comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse adaptative de la Vigne face à un environnement fluctuant.

En Europe, depuis la fin du XIXème siècle, la Vigne est majoritairement cultivée greffée sur des porte-greffes d’origine nord-américaine assurant la tolérance au phylloxéra (Pouget, 2015). Les vignobles sont ainsi constitués de plantes hétérogreffées, réunissant un cépage choisi pour les qualités organoleptiques qu’il confère au vin produit et un porte-greffe sélectionné initialement pour son degré de résistance au parasite du sol. Par la suite, il a été montré que le porte-greffe est capable de moduler divers aspects développementaux du greffon (Gregory et al., 2013; Zhang et al., 2016). Parmi eux, la croissance végétative est un facteur essentiel dont le contrôle, permettant d’assurer une production de baies de qualité, est recherché par le viticulteur. Cet équilibre, nommé « Vine balance » par les anglophones, est un concept primordial en viticulture. Cependant, malgré leur importance, les mécanismes du déterminisme de l’allocation de la biomasse chez la Vigne en réponse à l’environnement demeurent à élucider.

Le porte-greffe, interface entre le sol et le greffon, est responsable de la nutrition hydrominérale de la plante. Les variations de disponibilité nutritive édaphique sont ainsi perçues et prélevées par cette partie de la plante greffée. Afin d’assurer une production de fruits optimale, le choix du génotype de porte-greffe est crucial et doit être adapté au terroir sur lequel il est implanté. Parmi les ressources du sol, l’azote est un élément essentiel pour la croissance de la plante et va notamment influencer le développement végétatif de celle-ci. 1

Figure 1. Principales caractéristiques recherchées lors de la sélection des porte-greffes (Warschefsky et al., 2015). Les porte-greffes employés dans l’agriculture pérenne (A) ont été sélectionnés à partir d’un pool de matériel génétique sauvage et utilisés (B) pour leur aptitude au greffage, (C) leur croissance racinaire, et (D) leur capacité de contrôle de la croissance du greffon.

Introduction générale

Dans les scénarios climatiques futurs, l’étude de sa disponibilité dans le sol apparaît cruciale (Webber et al., 2015). En viticulture, le raisonnement de la fertilisation azotée est d’ailleurs un paramètre complexe à gérer. Un apport en azote trop important engendrant une forte croissance de la Vigne au détriment de la qualité du fruit, le viticulteur doit modérer la dose d’intrant apportée sans induire pour autant une carence (Delas, 2010). Parmi les processus potentiels qui influencent le développement du greffon, la réponse du porte-greffe à la disponibilité nutritive, et plus particulièrement azotée, est donc un facteur majeur dont la compréhension représenterait une solution adaptative stratégique pour pallier les variations de l’environnement en viticulture.

Figure 2. Influence du porte-greffe sur la hauteur des pommiers (Washington State University).

Exemple de cinq types de porte-greffes de pommiers couramment utilisés aux États-Unis. Ce panel intègre les génotypes suivants : Budagovsky (Bud ou B), Cornell/Geneva (CG ou G), Malling (M) et Malling Merton (MM), Michigan Apple Rootstock Clones (MARK) et East Malling/Ashton Long (EMLA). Le nom de chaque porte-greffe correspond à son abréviation et son numéro de clone. La comparaison de la hauteur des arbres est mesurée en pourcentage de la taille d’un arbre non greffé.

Figure 3. Exemples de molécules découvertes en utilisant la technique de greffage (Melnyk and Meyerowitz, 2015). FT : Flowering Locus T ; sRNAs : small RNAs, SL : Strigolactones Introduction générale

I. LA VIGNE, UNE PLANTE CULTIVEE GREFFEE

I.1 - Le greffage

I.1.a – Intérêts agronomiques

Les références à la pratique du greffage apparurent dans la Bible et dans les textes anciens grecs, chinois et romains indiquant l’utilisation de ce procédé avant notre ère (Mudge et al., 2009). Par définition, le greffage est décrit comme l’union de deux parties de plante différentes, le greffon et le porte-greffe, en vue d’obtenir un seul individu. Aujourd’hui, cette pratique culturale s’est largement développée, souvent utilisée en agriculture et horticulture, on la retrouve au sein des vignobles, des vergers et des cultures en serre. Sa principale utilisation correspond à la multiplication végétative d’espèces difficiles à propager par voie asexuée permettant ainsi le clonage de greffons génétiquement identiques à l’espèce dont ils sont issus. La période de juvénilité des arbres fruitiers, nécessitant une longue attente avant leur première floraison, peut aussi être outrepassée par ce procédé en associant des greffons matures qui vont conserver leur capacité de fructification quel que soit l’âge du porte-greffe sur lequel ils sont placés (Figure 1, page précédente). Dans le cadre du contrôle de la croissance de ces arbres fruitiers, l’utilisation d’un panel de porte-greffes différents va permettre d’influencer la taille de la plante greffée pouvant varier de 2 à plus de 10 mètres de hauteur dans le cas des pommiers (Figure 2). Cette propriété, aussi utilisée chez d’autres espèces fruitières, va permettre d’augmenter le rendement et de faciliter les récoltes à travers l’utilisation de porte-greffes nanifiants. Le choix du porte-greffe peut aussi être effectué pour ses capacités de résistance aux stress biotiques ou abiotiques permettant ainsi la croissance d’une variété de greffon dans des conditions qui peuvent initialement lui être défavorables.

I.1.b – Un outil en biologie végétale

En plus de ses intérêts agronomiques, le greffage est très utile dans le domaine de la recherche végétale permettant l’étude des éléments mobiles à longue-distance tels que les protéines, les ARNs et les métabolites (Figure 3). Parmi les différents travaux menés dans cette voie, la caractérisation du signal permettant la floraison a été effectuée chez Arabidopsis et a permis l’identification du gène FLOWERING LOCUS T (FT) en tant que florigène (Corbesier et al., 2007). D’autres expériences de greffage ont souligné la présence d’un facteur capable de contrôler la ramification de la partie aérienne et ont permis d’identifier des mutants impliqués d’une

Figure 4. Cycle de vie du phylloxéra (Wassilieff, 2015). A la fin de l’été, les insectes mâles et femelles s’accouplent pour produire un œuf unique, l’œuf d’hiver. Au printemps suivant, l’éclosion de cet œuf donne naissance à un phylloxera aptère (sans aile) femelle qui va devenir soit gallicole (se développe sur les feuilles et forme des galles), soit radicicole (descend sur les racines). Que ce soit au niveau foliaire ou au niveau racinaire, les femelles vont pondre des œufs d’où sortent des larves qui après plusieurs mues se transforment en adultes à l’origine d’un nouveau cycle. En été, certaines femelles adultes subissent une mue supplémentaire à l’origine de phylloxeras ailés qui vont, suite à leur ponte, donner naissance à des mâles et des femelles. Ces derniers sont à l’origine de l’œuf d’hiver. Introduction générale part, dans la production de ce signal et d’autre part, dans la signalisation en aval aboutissant finalement à l’identification d’une nouvelle classe hormonale, les strigolactones (Gomez- Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008). Pour étudier la signalisation par les petits ARNs, le greffage a permis de mettre en évidence, par exemple chez le Tabac, la répression transcriptionnelle des gènes codant la nitrate et la nitrite réductases au niveau du greffon par un signal, vraisemblablement nucléique, envoyé par le porte-greffe (Palauqui et al., 1997). L’utilisation de cet outil apparaît aussi dans les études de la résistance systémique acquise au cours de laquelle la transmission de métabolites est un facteur clé permettant la protection d’un greffon sensible à un agent pathogène par le porte-greffe (Shah et al., 2014).

I.2 – Les porte-greffes chez la Vigne

I.2.a – L’histoire de la crise phylloxérique

« L’histoire de l’agriculture ne nous a conservé à aucun moment et pour aucune autre plante cultivée le souvenir d’une crise aussi grave que celle traversée par les vignes de l’ancien continent lorsqu’elles furent envahies par le phylloxéra. » Gustave Foex, 1900.

Pendant la seconde partie du XIXème siècle, la crise phylloxérique a bien failli provoquer la disparition de la totalité du vignoble européen. Détecté pour la première fois en France en 1863, le phylloxéra est un puceron ravageur engendrant la formation de galles et le jaunissement des feuilles de la vigne (Figure 4) mais surtout capable d’entraîner la mort du cep entier en seulement 3 ans lorsqu’il s’attaque aux racines. Suite à sa propagation fulgurante, c’est en 1868 que la société centrale d’agriculture de l’Hérault dépêcha trois experts, Gaston Bazille, Félix Sahut et Jean-Emile Planchon, reconnus dans les domaines de la biologie et de l’agriculture, pour résoudre ce problème (Pouget, 2015). La rédaction de leur rapport s’ensuivie de nombreuses expérimentations afin de lutter contre le parasite sans réel aboutissement. C’est alors qu’en 1875, revenu des Etats-Unis et aidé dans ses travaux par Jules Lichtenstein, Jean-Emile Planchon publia « Les Vignes américaines, leur culture, leur résistance au phylloxéra et leur avenir en Europe ». Depuis cet évènement, la Vigne est cultivée greffée sur des variétés de porte-greffe nord-américaines tolérantes au phylloxéra.

I.2.b – La viticulture de nos jours

Aujourd’hui, il est estimé qu’au niveau mondial, 80 à 85 % des vignes sont cultivées greffées (Smith, 2004). La majorité des variétés de porte-greffes utilisées sont issues de trois espèces

Figure 5. Outils employés pour étudier la formation de la greffe (Melnyk and Meyerowitz, 2015). A) Coloration au bleu de toluidine d’un point de greffe chez la tomate révélant la formation d’un cal et les nouvelles connexions vasculaires 75 jours après greffage. B, C) Plante greffée chez Arabidopsis thaliana 10 jours après greffage. Le triangle blanc représente le point de greffe. D) Imagerie confocale sur hypocotyle d’Arabidopsis. Le greffon exprime la GFP (Green Fluorescent Protein) et le porte-greffe exprime la RFP (Red Fluorescent Protein). E) Expression génique induite par le greffage spécifiquement au point de point de greffe. Le gène ARR5 (Arabidopsis Response Regulator 5) est impliqué dans la réponse aux cytokinines et son promoteur est fortement activé 8 jours après greffage dans l’hypocotyle chez Arabidopsis (pARR5:GFP greffé sur pARR5:GFP). Introduction générale différentes : Vitis riparia, Vitis rupestris et Vitis berlandieri (Galet, 1998). Le choix des deux espèces utilisées pour générer la plante greffée est devenu stratégique et implique la combinaison d’un porte-greffe permettant la tolérance au phylloxéra avec un cépage issu de l’espèce Vitis vinifera répondant aux exigences de la production du vin de la région viticole concernée. La sélection de ce porte-greffe apparaît d’autant plus importante au regard des capacités de celui-ci à influencer de nombreux paramètres supplémentaires. En effet, la partie racinaire de la plante greffée peut aussi permettre la tolérance de la plante aux nématodes mais également l’adaptation à d’autres types de stress tels que la salinité et l’acidité des sols, la pénurie ou l’excès d’eau ainsi que l’absorption des éléments minéraux (Pongracz, 1983; May, 1994).

II. LE DEVELOPPEMENT DE LA VIGNE GREFFEE

II.1 – La compatibilité entre greffon et porte-greffe

Plusieurs types de greffage peuvent être définis en fonction de l’origine génétique des deux parties de plante qui vont être associées. L’autogreffe correspond ainsi à l’association de deux parties de la même plante, l’homogreffe implique l’union d’éléments de la même espèce et enfin l’hétérogreffe, principe le plus couramment utilisé, permet de réunir deux génotypes différents. Indépendamment du procédé utilisé, le bon développement de la plante greffée repose tout d’abord sur la cohésion du greffon avec le porte-greffe. Au niveau du point de greffe, une couche nécrotique se forme et les cellules des tissus opposés adhèrent entre elles. La prolifération cellulaire au-dessus et en-dessous de la zone de greffage va alors aboutir à la formation d’une masse cellulaire nommée cal. Après différenciation des cellules de ce dernier, les tissus vasculaires vont se reformer permettant la connexion de la partie aérienne avec la partie racinaire (Pina and Errea, 2005). L’union des deux parties d’une plante greffée et la croissance de la combinaison qui en résulte ne sont cependant pas systématiques et dépendent notamment de la distance taxonomique des espèces utilisées. Ainsi, la probabilité de succès du greffage va être négativement influencée par l’écart génétique entre greffon et porte-greffe (Andrews and Marquez, 1993; Mudge et al., 2009). La compatibilité entre ces deux éléments et l’ensemble des mécanismes moléculaires inhérents à la formation de la greffe restent encore à élucider. Malgré son utilisation courante en arboriculture et viticulture, les travaux menés pour étudier les signaux impliqués lors d’un greffage ne permettent pas à ce jour de comprendre l’intégralité de ce processus complexe (Figure 5)

CA actif IPC Résistance Résistance Porte-greffe Type de sol adapté Remarques max (%) max sécheresse humidité Résistant aux nématodes méloïdogynes. Très qualitatif, bonne fructification. Précoce. A utiliser Tous les sols non calcaires, Riparia 6 5 Faible Forte davantage en forte densité. Le travail du sol est riches, frais. indispensable pour éviter que le système racinaire traçant ne se développe dans l’horizon de surface. Sols profonds argileux et 101-14 MG 9 10 Moyenne Moyenne Résistant aux nématodes méloïdogynes. Précoce. boulbènes acides. Sols fertiles, perméables et Faible en frais, convient aussi aux Bonne fructification. S'adapte bien à tous les cépages. 3309 C 11 10 sol Faible boulbènes, sables et sols Faible absorption du potassium. Tolérence élevée à superficiel silico-argileux. Eviter les sols l'acidité des sols. Incompatibilité avec le Chenin. lourds et compacts. Sols riches. Eviter les sols Eviter avec les cépages tardifs. Faible absorption du 420 A 20 40 Forte Faible argilo-calcaires compacts. potassium. Sols argileux et argileux- Très sensible aux nématodes méloidogynes et à la 161-49 C 25 60 Moyenne Faible calcaires perméables thyllose, surtout en sol humide avec une nutrition profonds et fertiles. azotée excessive. Production régulière. C’est le porte-greffe le plus Boulbènes acides, sols Gravesac 11 25 Bonne Moyenne tolérant à l'acidité. Vigueur importante dans les sols sableux ou sablo-graveleux. bien pourvus en eau. Sols calcaires, argilo- Craint l'asphyxie racinaire, est moins résistant au 41 B 40 60 Moyenne Faible calcaires peu profonds et phylloxera. Exige un sol neuf car très sensible aux secs. nématodes. Tardif. Faible absorption du potassium. Sensible à la carence magnésienne. Résistance aux S'adapte à tous types de sol nématodes méloïdogynes. Vigoureux en situation non Fercal >40 120 Moyenne Moyenne surtout les sols calcaires, chlorosante. C’est le porte-greffe le plus tolérant à la argilo-calcaires et profonds. chorose. Favorise la pourriture pédonculaire et le botrytis. Sensible Assimile très mal la magnésie. Très résistant aux l'année de S’adapte à tous types de sol, nématodes méloidogynes. Problème de compatibilité SO4 18-20 30 Forte la surtout les sols pauvres. avec le greffon (Syrah et SO4 clone 5), la tige est grêle. plantation Sensible à l'acidité. Retarde la maturité. Vigoureux en sols profonds. Craint les Graves, ou sables secs et S'enracine très bien. C’est le porte-greffe le plus 110 R 15 30 Très forte sous-sols maigres et dans les terrains résistant à la sécheresse. Il retarde la maturité. humides très chauds. Incompatibilité avec la Syrah. Fructification lente. Dégénère rapidement. Favorise la Rupestris du Lot 14 20 Forte Moyenne Sols maigres et caillouteux. coulure en sols riches et retarde la maturité. Craint l'asphyxie racinaire. Déconseillé en sols riches du fait de sa forte vigueur. Quelques problèmes 140 Ru 20-25 90 Forte Moyenne Sols calcaires. d’incompatibilité constatés sur la Négrette, la Syrah et le Fer Servadou. Humides et argileux-secs et Déconseillé pour la vigueur qu’il confère. Il possède un 1103 P 16 30 Forte Forte peu profonds -silico argileux système racinaire très développé. et argileux.

Tableau 1. Principales caractéristiques des porte-greffes utilisés dans le Sud-Ouest de la France (Institut Français de la Vigne et du Vin, http://www.vignevin.com/).

CA actif max : seuil de résistance au calcaire actif. IPC : indice de pouvoir chlorosant. Introduction générale

(Cookson and Ollat, 2013; Cookson et al., 2014; Goldschmidt, 2014; Gainza et al., 2015; Kumpers and Bishopp, 2015; Melnyk and Meyerowitz, 2015; Vršič et al., 2015).

II.2 – L’influence du porte-greffe sur le développement du greffon

Le plant de Vigne est majoritairement cultivé greffé impliquant l’association de deux génotypes différents. Le cépage (greffon) est choisi pour les qualités organoleptiques qu’il confère aux raisins et initialement, le porte-greffe était choisi pour ses propriétés de résistance face au phylloxéra. Depuis, plusieurs études ont mis en évidence de nombreuses caractéristiques conférées à la plante entière par le porte-greffe (Tableau 1) (Gregory et al., 2013).

II.2.a – Régulation de la croissance végétative

Le génotype de porte-greffe est connu pour sa forte influence sur la croissance du greffon. Définie en tant que vigueur conférée, la croissance de la partie aérienne est modulée par le porte-greffe, résultante de l’interaction entre les deux génotypes combinant ainsi la vigueur propre de chacun des partenaires du greffage (Rives, 1971; Ollat et al., 2003b). En viticulture, l’influence du porte-greffe sur ce paramètre est considéré comme un facteur crucial pour la gestion des vignobles (Jones et al., 2009).

Pour le viticulteur, un compromis doit être établi entre développement végétatif et reproducteur afin d’assurer un rendement maximum en baies de la qualité désirée. La recherche de cet équilibre est un concept primordial en viticulture (Howell, 2001; Skinkis and Vance, 2013; Jackson, 2014; Keller, 2015). Il est caractérisé par la mesure de la capacité de croissance de la vigne à travers le ratio entre rendement en fruits et croissance végétative. Au sein de cette équation, la capacité du génotype de porte-greffe à contrôler le développement du greffon est un paramètre important. Alors qu’une vigueur trop forte engendre une croissance végétative importante au détriment de la qualité du fruit à travers la concurrence pour les assimilats carbonés et azotés entre feuilles et baies (Kliewer and Dokoozlian, 2005), une vigueur plus faible se traduit par une meilleure alimentation trophique de celles-ci. Le choix du porte-greffe est donc crucial et par conséquent le viticulteur doit sélectionner un génotype conférant une vigueur assez importante assurant le rendement lors de la récolte tout en évitant les vigueurs trop fortes qui seraient défavorables à la production de baies de qualité.

Nom Parentage Vigueur

1103P rupestris x berlandieri Très vigoureux

140Ru rupestris x berlandieri Très vigoureux

196-17C vinifera x rupestris x riparia Très vigoureux

99R rupestris x berlandieri Très vigoureux

Dogridge rupestris x candicans = V. champini Très vigoureux

Ramsey rupestris x candicans = V. champini Très vigoureux

110R rupestris x berlandieri Vigoureux - Très vigoureux

5BB riparia x berlandieri Vigoureux - Très vigoureux

Rupestris du Lot rupestris Vigoureux - Très vigoureux

SO4 riparia x berlandieri Vigoureux - Très vigoureux

333EM berlandieri x vinifera Vigoureux

161-49 MGt riparia x berlandieri Moyen - Vigoureux

41B berlandieri x vinifera Moyen - Vigoureux

420A riparia x berlandieri Moyen - Vigoureux

44-53 rupestris x cordifilia x riparia Moyen - Vigoureux

Fercal berlandieri x vinifera Moyen - Vigoureux

3309C riparia x rupestris Moyen

101-14 MGt riparia x rupestris Faible – Moyen

Riparia Gloire de Montpellier riparia Faible

Tableau 2. Classification des génotypes de porte-greffes en fonction de leur vigueur (modifié d’après Zhang et al., 2016).

Introduction générale

Un grand nombre d’études a démontré l’influence du porte-greffe sur la croissance végétative du greffon (Tableau 2) (Ollat et al., 2003b; Zhang et al., 2016). Par exemple, Southey et Jooste (1991) ont étudié le cultivar « Colombard » greffé sur vingt-cinq porte-greffes différents pendant six ans et ont souligné des différences de rendement et de poids de rameaux en fonction de la combinaison effectuée. Un autre exemple représentatif conforte ces résultats et concerne des travaux réalisés sur une période de deux ans impliquant cette fois-ci le cultivar « Thompson seedless » greffé sur neuf porte-greffes différents. En effet, les auteurs concluent que la croissance de la partie aérienne est dépendante du génotype de porte-greffe (Nikolaou et al., 2000). Parmi la multitude de travaux qui arrivent aux mêmes conclusions, une autre étude peut être citée, menée en 2010 sur les variétés « Chardonnay » et « Pinot noir » greffées sur quatre porte-greffes différents, intégrant six saisons de récolte consécutives, et qui a permis de mettre en évidence des différences au niveau du poids des rameaux et ce, inversement corrélées à la qualité des baies (Wooldridge et al., 2010). L’influence du génotype de porte-greffe sur la croissance végétative du greffon a donc été largement établie. D’autre part, cet effet va se répercuter sur la production des baies et leur qualité.

II.2.b – Impact sur le rendement et la qualité de la baie

Conjointement à son effet sur le développement végétatif, les performances reproductives du greffon vont aussi être régulées par le porte-greffe. Les nombreux travaux réalisés sur la caractérisation de l’effet porte-greffe sur la croissance du greffon, soulignant une variabilité de croissance végétative en fonction de la combinaison, intègrent souvent en parallèle l’étude des paramètres rendement et qualité du fruit. Le porte-greffe va ainsi agir à différents niveaux, sur la reproductivité à travers le nombre de bourgeons et leur fertilité, mais aussi sur le nombre, la taille et la composition biochimique des baies. Généralement, la composante rendement est associée à une forte croissance du greffon conférée par le porte-greffe connu pour faire varier la fertilité, le poids de la baie et le nombre de baies (Keller et al., 2001; Main et al., 2002; Paranychianakis et al., 2004; Jones et al., 2009; Kidman et al., 2013). Concernant la composition biochimique du fruit, l’influence du porte-greffe est dépendante du contexte dans laquelle elle est étudiée (Zhang et al., 2016). De manière générale, les études sur la composition des baies mettent en évidence un effet du porte-greffe sur les teneurs en anthocyanes, l’acidité titrable, la concentration en sucres, le pH et la concentration en potassium (Walker et al., 1998; Ollat et al., 2003a; Gong et al., 2010; Kodur, 2011; Pulko et al.,

Figure 6. Schéma représentant les changements anatomiques et structuraux le long d’une racine de Vigne (Richards, 1983). A) Racine primaire blanche, épiderme intacte avec poils racinaires. B) Epiderme altéré donnant une apparence brune, hypoderme et endoderme subérisés. C) Altération corticale (brunissement) et dégénération de tous les tissus. D) Cortex altéré et épaississement de la stèle dû à la croissance secondaire. E) Stade lignifié, croissance secondaire. Introduction générale

2012; Jogaiah et al., 2013). Rendement et qualité de la baie sont deux facteurs directement liés cependant l’influence du porte-greffe sur ces composantes apparaît variable en fonction du contexte pédoclimatique et du cépage utilisé. Par ailleurs, certaines études soulignent l’importance du génotype du greffon sur le développement de la plante entière et montrent une nette prépondérance de l’effet greffon sur les variations éventuelles dues au porte-greffe (Tandonnet et al., 2010; Keller et al., 2012). Comme pour la régulation de la croissance végétative du greffon, l’ensemble de ces résultats met clairement en évidence le rôle déterminant du porte-greffe sur le rendement et la qualité de la baie et souligne son interdépendance avec l’environnement.

II.3 – Développement racinaire et nutrition hydrominérale

II.3.a – Croissance et architecture racinaires

Constituant la partie racinaire d’une plante greffée, le porte-greffe a de nombreuses fonctions comme l’ancrage de la plante dans le sol ainsi que l’absorption et la translocation des nutriments et de l’eau pour le greffon. Il représente aussi une zone de stockage des réserves ainsi qu’une source de régulateurs de croissance pour la plante entière (Richards, 1983). A partir de racines adventives (considérées comme primaires), le système racinaire va se complexifier via la formation d’une multitude de racines secondaires, tertiaires etc (Figure 6). Les capacités prospectives de ce système racinaire reposent sur sa croissance horizontale (racines rampantes) et verticale (racines plongeantes) dans le sol (Richards, 1983; Osmont et al., 2007). Chez un cep de vigne âgé, on retrouve donc des racines très ramifiées couvrant une large surface de prospection pour assurer le prélèvement des éléments nutritifs nécessaires à la croissance de la plante. La longueur totale de ce système racinaire peut dépasser les cent kilomètres avec une surface supérieure à cent mètres carrés (Keller, 2015). La variabilité génétique des porte-greffes utilisés est l’un des facteurs influençant le développement des racines cependant les variables environnementales telles que la structure et la composition du sol demeurent déterminantes dans la régulation de la prospection édaphique racinaire (Smart et al., 2006). L’influence de ces conditions édaphiques est connue pour être majoritairement portée sur l’architecture racinaire alors que le génotype de porte-greffe affecte plutôt les paramètres de densité (de Herralde et al., 2010; Ollat et al., 2016b). La capacité d’adaptation aux variables environnementales du porte-greffe est donc une base cruciale pour que la plante soit capable de prélever les éléments essentiels à son

Introduction générale développement. Afin d’assurer la croissance d’un pied de vigne, les capacités d’adaptation intrinsèques au porte-greffe doivent être en adéquation avec les conditions pédoclimatiques du terroir viticole sur lequel il est cultivé.

II.3.b – Nutrition hydrique et minérale

Le porte-greffe, interface entre le sol et le greffon, assure l’absorption de l’eau et des éléments minéraux indispensables au développement de la plante entière. Dans le contexte climatique actuel, la majorité des études menées sur la nutrition hydrique en fonction du porte-greffe sont réalisées dans un objectif de caractérisation de la tolérance à un déficit hydrique. Il a été montré qu’il existe une large variabilité de réponse face au stress hydrique en fonction du génotype considéré (Chaves et al., 2010) et que cette réponse est étroitement liée aux voies de biosynthèse et de signalisation de l’acide abscissique (Ferrandino and Lovisolo, 2014; Hopper et al., 2016; Rossdeutsch et al., 2016). Directement liée à la capacité d’absorption hydrique, l’alimentation minérale a elle aussi été le fruit de nombreuses études. Par exemple, en 1964, Cook et Lider ont montré que les contenus foliaires en nitrate, potassium et phosphore étaient influencés par le génotype de porte-greffe pour le même greffon. En menant des expérimentations de greffages réciproques, Pouget et Delas (1982) ont montré des variations de teneur en calcium, magnésium et potassium en fonction de la variété du porte-greffe. En 1989, Tangolar et Ergenoglu ont testé dix combinaisons différentes en faisant varier uniquement le génotype du porte-greffe et ils soulignèrent des variations de teneur en potassium, phosphore, calcium, magnésium, manganèse et zinc au niveau du greffon. Plus récemment, une étude confirma encore l’importance du choix du porte-greffe avec l’étude de la teneur de nombreux éléments minéraux dans deux combinaisons différentes impliquant le même greffon en interaction avec une variation de la disponibilité en azote (Lecourt et al., 2015). L’influence du porte-greffe sur la nutrition minérale du greffon a donc été largement mise en évidence dans des combinaisons impliquant de nombreuses variétés de porte-greffe et de greffon (Downton, 1977; Ruhl et al., 1988; Fardossi et al., 1992; Brancadoro et al., 1994; Csikasz-krizsics and Diofasi, 2008; Dalbo et al., 2011). Ces différences d’absorption au niveau racinaire et de distribution des nutriments dans la plante entière suggèrent des capacités d’absorption minérale contrastées en fonction du génotype de porte-greffe utilisé. A ce sujet, des auteurs proposent une capacité d’absorption « porte-greffe-dépendante » pour le

Introduction générale phosphore (Grant and Matthews, 1996), le potassium (Avenant et al., 1997; Mpelasoka et al., 2003) ou encore l’azote (Zerihun and Treeby, 2002).

II.3.c – Symbioses Mycorhiziennes

Dans un contexte où la disponibilité en ressources nutritives est fluctuante/limitante, les porte-greffes de Vigne sont capables de s’associer avec des organismes présents dans le sol. Parmi les microorganismes de la rhizosphère, la Vigne est connue pour ses associations mycorhiziennes arbusculaires (Possingham and Obbink, 1971), forme symbiotique terrestre la plus répandue (Fitter, 2005). Dans ce type de symbiose, l’hyphe du champignon pénètre à l’intérieur de la plante hôte, on parle alors d’endomycorhize. Cette relation mutualiste permet au champignon mycorhizien d’obtenir du carbone et autres substances organiques essentielles à partir de la plante tout en améliorant en retour les capacités d’absorption hydrique et minérale de celle-ci (Parniske, 2008; Field et al., 2015). De nombreuses études ont démontré que la croissance de la Vigne est fortement influencée par l’établissement de ces associations mycorhiziennes (Schreiner, 2005 et références incluses). A ce jour, les connaissances sur les capacités d’association mycorhizienne en fonction du génotype de porte-greffe sont peu renseignées. D’après le peu d’études réalisées en conditions contrôlées, en comparant différentes combinaisons sur des sols stériles ou inoculés, il semblerait que les variations de colonisations directement liées aux génotypes de porte-greffe soient relativement faibles (Linderman and Davis, 2001). D’autres expérimentations, réalisées cette fois-ci au vignoble, ont pu mettre en évidence des différences significatives en fonction du porte-greffe (Karagiannidis et al., 1997). Ces résultats indiquent donc que la capacité à former des symbioses mycorhiziennes varie en fonction du porte-greffe, mais le facteur qui contrôle la colonisation de ces racines reste à identifier pouvant être génotypique ou environnemental. En 2003, lors d’une comparaison de dix génotypes de porte-greffes en utilisant le même greffon, Schreiner souligne que l’effet du porte-greffe sur la capacité à former des mycorhizes est indirect (Schreiner, 2003). En effet, le degré de colonisation du système racinaire par les champignons mycorhiziens serait plutôt lié au potentiel de croissance conféré à la plante entière par le porte-greffe et serait donc majoritairement contrôlé par la demande nutritive du greffon en croissance.

Introduction générale

II.4 – Interaction entre porte-greffe et greffon en réponse à l’environnement

« in order to spend on one side, nature is forced to economise on the other side » (Goethe, cité par Darwin, 1859).

La croissance d’une plante est assurée par l’intégration coordonnée de signaux provenant de ses parties aérienne et racinaire. Tandis que la tige feuillée va permettre la nutrition carbonée à travers la photosynthèse, les racines vont, elles, fournir les ressources hydrominérales. D’après la définition de l’équilibre fonctionnel contrôlant l’allocation de la biomasse (Brouwer, 1963; Davidson, 1969; Thornley, 1972; Iwasa and Roughgarden, 1984; Poorter et al., 2012), la croissance de la partie aérienne ou racinaire de la plante va être régulée par le facteur le plus limitant dans son environnement (Sultan, 2000; Hermans et al., 2006). Chez la Vigne, majoritairement cultivée en hétérogreffe, ce processus de signalisation systémique est d’autant plus complexe car il implique une communication établie entre deux espèces différentes.

La contribution du porte-greffe en termes de nutrition hydrique et minérale dans une plante greffée est liée à la demande nutritive de la partie aérienne. Cette communication entre les deux parties de la plante greffée est modulée par les conditions environnementales. Cependant, les connaissances au niveau moléculaire sur les mécanismes de signalisation mis en place dans cette interaction porte-greffe/greffon sont plutôt restreintes chez la Vigne. Zhang et al. (2016) évoquent l’implication des signaux trophiques, les capacités d’absorption hydrique et minérale étant spécifiques de chaque porte-greffe mais précisent aussi que les résultats à ce sujet sont de nature variable. Ainsi, malgré une forte alimentation nutritive du greffon, le porte-greffe ne permet pas forcément d’augmenter la croissance de la plante ou son rendement. De plus, pour la même combinaison greffon/porte-greffe, le comportement développemental de la plante entière peut être différent voire opposé dans des conditions pédoclimatiques variables.

Parmi les signaux échangés entre la partie aérienne et la partie racinaire d’une plante greffée, les hormones sont des acteurs déterminants (Aloni et al., 2010). En plus de leurs rôles essentiels dans le développement de la plante, contrôlant croissance aérienne et racinaire, les hormones sont connues pour leur rôle dans la réponse à l’environnement (Santner and Estelle, 2009; Kudoyarova et al., 2015; Schaller et al., 2015; Yu et al., 2015; Verma et al., 2016). Ainsi,

Introduction générale des processus de signalisation à longue distance sont mis en place face aux variations pédoclimatiques, entre autre, en réponse à la disponibilité en azote (Krouk, 2016), au phosphore (Lin et al., 2014; Zhang et al., 2014b) mais aussi à la teneur en eau (Munemasa et al., 2015; Salazar et al., 2015). Chez la Vigne, des travaux ont permis de mettre en évidence l’importance de cette signalisation hormonale dans divers processus. Certains auteurs soulignent ainsi l’importance des hormones dès l’établissement de la greffe (Clemente Moreno et al., 2014; Cookson et al., 2014). D’autres travaux menés sur plusieurs combinaisons différentes ont montré que le contenu en cytokinines est corrélé à la croissance du greffon et au rendement (Skene and Antcliff, 1972; Nikolaou et al., 2000) et ainsi influencé par le génotype de porte-greffe. Différentes classes hormonales ont aussi été caractérisées pour leurs implications dans la maturation de la baie telles que l’éthylène et les auxines (Bottcher et al., 2013; Kuhn et al., 2014; Corso et al., 2016), la réponse au déficit hydrique notamment concernant l’acide abscissique (Hopper et al., 2016; Rattanakon et al., 2016; Rossdeutsch et al., 2016) ou encore la tolérance au froid impliquant l‘éthylène (Sun et al., 2016). Les signaux hormonaux échangés entre cépage et porte-greffe sont donc des acteurs cruciaux, capables d’influencer le développement de la plante entière et leur étude confirme le rôle clé des processus qui s’établissent lors d’une interaction inter-génotypique au sein d’une plante greffée. L’étude des mécanismes de signalisation hormonale reste cependant complexe notamment vis-à-vis de l’interconnexion des différentes classes hormonales.

Les éléments mobiles échangés entre greffon et porte-greffe intègrent aussi les ARNs qui ont été décrits comme molécules de signal à longue distance (Lucas et al., 2001). Yang et al. (2015) ont étudié ce type d’échange chez des plants de vigne greffés de manière réciproque en conditions in vitro âgés de quatre semaines ainsi que sur des combinaisons cultivées en champ dont le greffage avait été réalisé onze ans auparavant. Leurs résultats ont permis de mettre en évidence un ensemble de gènes, transmissibles entre greffon et porte-greffe et donc potentiellement explicatifs des phénomènes d’interaction qui affectent la productivité et l’adaptation de la Vigne greffée en fonction des cépages et des variétés de porte-greffe associés.

Afin d’assurer sa croissance dans un environnement fluctuant, le plant de vigne greffé doit donc coordonner un panel complexe d’éléments, échangés à longue distance, impliquant entre autre les acides nucléiques, des signaux trophiques et hormonaux mais intégrant aussi

Introduction générale les sucres (Lecourieux et al., 2014), les espèces réactives de l’oxygène (Carvalho et al., 2015) ou encore la signalisation calcique (Chen et al., 2013).

Introduction générale

III. LE ROLE DE LA NUTRITION AZOTEE

La disponibilité édaphique en nutriments est le facteur entraînant le plus de variations en termes d’allocation de biomasse (Poorter et al., 2012). Parmi ces éléments nutritifs, les ressources azotées ont un fort impact engendrant une augmentation du rapport racines/feuilles dans un contexte de faible disponibilité en azote (Hermans et al., 2006). Les plantes ont ainsi besoin de percevoir cette variabilité afin d’optimiser leur croissance et l’allocation de leur biomasse à travers la régulation du développement aérien et racinaire.

III.1 – Nutrition azotée

L’azote, élément fondamental de nombreuses molécules biologiques comme les acides aminés, les protéines et les acides nucléiques, est l’un des nutriments les plus importants pour la croissance et le développement des plantes. Bien qu’il puisse être présent sous forme organique, c’est en tant que nitrate, ammonium ou encore urée, formes inorganiques, qu’il est prédominant au sein des terres cultivées. Malgré une assimilation peu coûteuse en énergie comparée à celle du nitrate, la majorité des plantes présentes sur les terres agricoles ne sont pas adaptées à des sols où l’ammonium représente la source majeure d’azote. En effet, dans ces conditions elles développent des symptômes de toxicité telles que l’inhibition de l’absorption des cations, l’alcalinisation intracellulaire et l’acidification extracellulaire, des perturbations de l’activité photosynthétique et de l’homéostasie hormonale (Britto and Kronzucker, 2002; Esteban et al., 2016). D’autre part, contrairement à l’ammonium, le nitrate n’est pas adsorbé et est donc très mobile dans le sol (Miller et al., 2007). De ce fait, la disponibilité en azote du sol, via les nitrates, est très hétérogène et les plantes ont dû établir des stratégies adaptatives impliquant leur capacité d’absorption de l’azote, son assimilation et sa remobilisation pour répondre à cette contrainte.

III.1.a – L’absorption de l’azote

Le taux d’absorption du nitrate est la résultante de deux flux opposés impliquant l’influx de cette molécule de l’apoplasme vers le cytoplasme et l’efflux de celle-ci dans la direction opposée. Dans la littérature, la régulation de l’influx du nitrate est reconnue pour son rôle prépondérant dans le contrôle de l’absorption de cette molécule comparée au mécanisme impliquant son efflux (Touraine et al., 2001). Des études physiologiques réalisées sur l’absorption du nitrate ont permis de mettre en évidence trois classes de transporteurs

Figure 7. Changement d’affinité de la protéine NPF6.3 pour le nitrate (Tsay, 2014). a) Lorsque la teneur en nitrate est faible, NPF6.3 est phosphorylée ce qui lui confère une forte affinité pour ce nutriment. b) Lorsque le nitrate est abondant, NPF6.3 est un transporteur de faible affinité.

Figure 8. Localisation et fonction des transporteurs appartenant aux familles NPF et NRT2 chez Arabidopsis thaliana (O’Brien et al., 2016). En fonction de leur localisation, différentes fonctions sont attribuées à chaque transporteur : absorption racinaire (influx/efflux), transferts racine-xylème-phloème, accumulation dans la graine. Au niveau cellulaire, ces protéines sont localisées au niveau de la membrane plasmique à part pour NRT2.7 caractérisée par une localisation tonoplastique. cHATS : constitutive High-Affinity Transport System, iHATS : inducible High-Affinity Transport System. Introduction générale permettant aux plantes de pallier les variations en nitrate du sol (Aslam et al., 1992; Glass and Siddiqi, 1995). D’une part, le système de transport à haute affinité (HATS pour High Affinity Transport System) assure le prélèvement du nitrate lorsqu’il est présent en faible concentration (inférieure à 0,5 mM) et se divise en deux catégories : cHATS (constitutive HATS) et iHATS (inducible HATS). D’autre part, le système de transport à faible affinité (LATS pour Low Affinity Transport System), est effectif à partir d’une concentration extérieure de l’ordre du millimolaire (Crawford and Glass, 1998).

Les mécanismes sous-jacents à l’absorption du nitrate ont fait l’objet de nombreux travaux, notamment chez la plante modèle Arabidopsis thaliana et la caractérisation des acteurs impliqués est toujours d’actualité. A ce jour, quatre familles multigéniques de transporteurs de nitrate ont été identifiées (Krapp et al., 2014). La famille NPF (Nitrate transporter 1/Peptide transporter Family, selon la nouvelle nomenclature proposée par Léran et al. (2014) auparavant appelée NRT1/PTR), comporte 53 membres chez Arabidopsis correspondants à des transporteurs de type LATS à l’exception du transporteur à double affinité NPF6.3 dont l’activité dépend de son état de phosphorylation (NRT1.1 ; Figure 7) (Liu and Tsay, 2003; Tsay, 2014). A part NPF6.3, seuls les transporteurs NPF4.6 et NPF2.7 sont caractérisés pour leur rôle dans le flux de nitrate entre les racines de la plante et la rhizosphère, le premier intervenant dans l’influx et le deuxième impliqué dans son efflux vers le milieu extérieur (Huang et al., 1999; Segonzac et al., 2007). Tous les autres membres de la famille NPF semblent intervenir dans le transport interne du nitrate au sein de la plante, élégamment synthétisé par O’Brien et al. (2016)(Figure 8).

La famille NRT2, quant à elle, est constituée de transporteurs de type HATS et comporte sept membres chez Arabidopsis (Krapp et al., 2014). Sujets de nombreuses études, les gènes codant les transporteurs de cette famille ont pu être clonés chez plusieurs autres espèces telles que l’Orge (Trueman et al., 1996), le Soja (Amarasinghe et al., 1998), Nicotiana plumbaginifolia (Krapp et al., 1998), la Tomate (Ono et al., 2000), le Riz (Feng et al., 2011) ou encore chez Medicago truncatula (Pellizzaro et al., 2015). Au sein de cette famille protéique, NRT2.1 semble être le transporteur le plus important dans l’absorption du nitrate chez Arabidopsis thaliana (Cerezo et al., 2001; Filleur et al., 2001; Li et al., 2007) alors qu’à contrario, l’étude parallèle de NRT2.2 a révélé une faible contribution de ce dernier dans le transport du nitrate (Li et al., 2007). NRT2.4 a été caractérisé pour son rôle double, capable

Figure 9. Modèle synthétisant le rôle des transporteurs d’ammonium de type AMT1 dans l’absorption de l’ammonium de haute affinité (Yuan et al., 2007). Représentation schématique de la localisation tissulaire de AMT1;1, AMT1;3 et AMT1;5 (en rouge) et AMT1;2 (en bleu) en conditions de carence azotée. La proportion de l’influx d’ammonium dépendant de chaque transporteur est représentée par l’épaisseur des flèches. La voie symplastique est indiquée par des pointillés rouges, la voie apoplastique en jaune. rhizo, rhizodermis; co, cortex; endo, endodermis; peric, pericycle; xyl, xylem. Introduction générale de prélever le nitrate en condition de faible disponibilité pour ce nutriment, il participe aussi avec NRT2.5 au flux de nitrate vers le phloème (Kiba et al., 2012; Lezhneva et al., 2014). Bien que leur fonction chez la plante n’ait pas encore été déterminée, Kotur et al. (2012) montrent que NRT2.3 et NRT2.6 sont capables de transporter le nitrate dans des ovocytes de Xénope. Dans la même étude, ces auteurs soulignent l’importance de l’interaction protéique avec AtNAR2.1, qui fait partie de la famille NRT3, pour assurer l’activité des transporteurs NRT2 à l’exception de NRT2.7. L’intervention de ce partenaire protéique a aussi été observée pour d’autres espèces comme le Riz (Yan et al., 2011) et le Maïs (Lupini et al., 2016).

En plus des familles NPF et NRT2, deux autres classes de gènes codent des protéines membranaires capables de transporter le nitrate. Premièrement, au sein de la famille CLC (Chloride Channels) qui compte sept membres chez Arabidopsis, CLCa et CLCb sont caractérisés pour leur fonction en tant qu’échangeur nitrate/protons (De Angeli et al., 2006; von der Fecht-Bartenbach et al., 2010). D’autre part, au sein de la famille SLAC1/SLAH (Slow Anion Channel-Associated 1 Homologues), il a été observé que la co-expression avec une kinase de SLAC1 et SLAH3 dans des ovocytes de Xénope permet d’assurer le transport du nitrate (Lee et al., 2009; Geiger et al., 2011).

Malgré sa toxicité à forte concentration, les plantes utilisent aussi l’ammonium en tant que ressource azotée (Loqué and von Wiren, 2004; Miller and Cramer, 2005; Esteban et al., 2016). Les transporteurs impliqués dans l’absorption de l’ammonium appartiennent à la famille des AMT/MEP/Rh (Ammonium transporter/Methylammonium Permease/ Rhesus) (Ludewig et al., 2007). Cette superfamille comprend six isoformes chez Arabidopsis thaliana; cinq membres appartiennent à la famille des AMT alors qu’AMT2.1 est le seul membre de la famille MEP (von Wiren et al., 2000). L’absorption de l’ammonium est finement contrôlée par la localisation subcellulaire des transporteurs et par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-traductionnelle (Yuan et al., 2007)(Figure 9). L’étude des transporteurs d’ammonium a aussi été effectuée chez d’autres espèces telles que le Riz (Gaur et al., 2012), le Maïs (Gu et al., 2013) ou encore chez Lotus japonicus (Rogato et al., 2010). D’ailleurs, chez ce dernier, il semblerait que la protéine LjAMT1.3 joue le rôle de senseur modulant la croissance racinaire en fonction de la concentration en ammonium, caractéristique aussi observée chez Arabidopsis (Lima et al., 2010). Dernièrement, une étude

Figure 10. Schéma synthétisant l’assimilation de l’azote au niveau foliaire (modifié d’après Arsova et al., 2010). Le nitrate est réduit en nitrite par la nitrate reductase (NR). L’ammonium produit par la nitrite reductase (NIR) au niveau du plaste est incorporé en glutamine par la glutamine synthase (GS2). La source d’ammonium peut aussi être cytosolique impliquant une autre isoforme de la même enzyme (GS1). Introduction générale récente chez Medicago truncatula suggère que l’absorption de l’ammonium suivant sa concentration repose sur deux protéines, MtAMT1.1 et MtAMT2.1 (Straub et al., 2014).

Ainsi, les plantes doivent intégrer un ensemble de signaux environnementaux pour réguler leur croissance et font intervenir différentes voies d’absorption de l’azote qui agissent simultanément. Parmi celles-ci, l’azote peut aussi être prélevé sous forme d’acides aminés ou d’urée, mécanismes qui ne seront pas décrits ici (Kraiser et al., 2011).

III.1.b – L’assimilation

L’assimilation de l’azote peut avoir lieu dans les racines suite à son absorption ou dans les feuilles après translocation. Ce processus nécessite un ensemble complexe de réactions biochimiques qui représente l’une des réactions les plus coûteuses en énergie pour la plante. La première étape repose sur la réduction du nitrate en nitrite par la nitrate reductase (NR) suivie d’une seconde réaction, la conversion du nitrite en ammonium par la nitrite reductase (NIR) (Loulakakis et al., 2009) (Figure 10).

L’assimilation de l’ammonium est ensuite catalysée par la glutamine synthetase (GS) et la glutamate synthase, aussi connue sous le nom de glutamine-2-oxoglutarate aminotransferase (GOGAT), dans un cycle composé de deux réactions successives. Pour chacune de ces réactions, la plante possède deux formes pour chaque enzyme. Pour la glutamine synthase, les deux isoformes GS1 et GS2 diffèrent par leur localisation, dans le cytosol des cellules compagnes pour la première, dans les chloroplastes pour la seconde. Concernant la glutamate synthase, la première accepte les électrons du NADH (NADH-GOGAT) et est située dans les plastes de tissus non chlorophylliens. L’autre est appelée Fd-GOGAT et agit au sein des chloroplastes. En plus de ce cycle GS/GOGAT, trois autres enzymes peuvent participer à l’assimilation de l’ammonium : i) L’asparagine synthetase (AS) qui pourrait dans certaines conditions compenser une activité réduite de la GS ; ii) La carbamoylphosphate synthase (CPSase), capable d’utiliser l’ammonium pour former le carbamoylphosphate ; iii) Et dans certaines conditions de stress ou stades de développement particuliers, une voie alternative peut s’établir via la glutamate deshydrogenase (GDH) (Masclaux-Daubresse et al., 2010; Keller, 2015).

Introduction générale

III.1.c – La remobilisation

Les mécanismes de stockage et de remobilisation de l’azote sont essentiels à la survie des plantes annuelles et pérennes. Pour les plantes annuelles, ces processus sont cruciaux pour la production de graines assurant l’efficacité de leur germination et la survie des plantules. Durant la senescence, l’azote est donc remobilisé, principalement sous forme d’acides aminés, permettant le développement des graines (Okumoto and Pilot, 2011). Chez les plantes pérennes, la remobilisation de l’azote peut se diviser en deux phases. En automne, l’azote est remobilisé à partir des feuilles sénescentes pour un stockage hivernal dans le tronc. Ce stock azoté est alors utilisé au printemps assurant le développement des nouveaux organes avant que l’absorption racinaire prenne le relais (Masclaux-Daubresse et al., 2010). Qu’elles soient annuelles ou pérennes, l’utilisation et le stockage de l’azote sont donc des paramètres vitaux pour les plantes, assurant développement et reproduction, ils permettent à certaines espèces de vivre durant des années.

III.2 – Régulation

L’absorption et l’assimilation de l’azote sont des processus soumis à une constante régulation par la plante, non seulement face aux fluctuations environnementales (disponibilité en azote du sol) mais aussi en réponse à des signaux internes (statut azoté et carboné de la plante, remobilisation des réserves). La nutrition azotée de la plante fait ainsi intervenir différents mécanismes de signalisation, au niveau local racinaire par la perception et la transduction du signal azote, mais aussi systémique, permettant une réponse développementale coordonnée de la plante entière.

III.2.a – La réponse primaire au nitrate

La variation de disponibilité en nitrate dans le sol est connue pour engendrer une réponse de perception de la plante quasi instantanée au niveau des racines. Dans la littérature, plusieurs définitions non-exclusives de cette réponse primaire au nitrate coexistent (Medici and Krouk, 2014). Celles-ci soulignent notamment que la réponse induite est liée au nitrate lui-même et qu’elle se met en place presque immédiatement, dans un délai de moins de dix minutes après la variation de teneur en nutriment. De nombreux travaux ont été réalisés sur les voies de signalisation impliquées et ont permis de caractériser certains de ses acteurs.

Figure 11. Représentation schématique de deux réponses au signal nitrate dépendantes de NRT1.1 (NPF6.3 dans ce manuscrit) (Gojon et al., 2011). Partie haute : Répression de la croissance des racines latérales (LR) par NRT1.1 à faibles concentrations externes en nitrate. NRT1.1 a pour fonction de faciliter le transport de l’auxine hors des LR. L’augmentation de la teneur en nitrate inhibe progressivement ce transport, facilitant ainsi l’accumulation auxinique dans les LR et leur croissance. Les flèches bleues représentent les flux d’auxine. Partie basse : L’augmentation de la concentration en nitrate perçue par NRT1.1 engendre une augmentation de l’expression du gène NRT2.1. En teneur abondante, le nitrate inhibe la phosphorylation de NRT1.1 via CIPK23 (principe présenté en Figure 1). Introduction générale

Un des éléments important de cette réponse identifié à ce jour est la protéine NPF6.3 qui jouerait un rôle de transcepteur du nitrate (transporteur et senseur). Cette particularité a été démontrée chez le mutant chl1-9 pour lequel la fonction de transport du nitrate médiée par NPF6.3 est affectée mais sa capacité à induire les gènes de réponse au nitrate est maintenue (Ho et al., 2009). Dans la même étude, les auteurs ont proposé un modèle dans lequel le gène CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23) codant une protéine kinase jouerait un rôle crucial dans la réponse primaire au nitrate à travers la modulation de la double affinité du transporteur NPF6.3 par sa phosphorylation. Plus récemment, des études de cristallographie ont démontré les conséquences fonctionnelles et structurales de cette phosphorylation (Parker and Newstead, 2014). L’une d’elle implique l’induction de l’expression du gène NRT2.1 lorsque la concentration externe en nitrate est élevée (Gojon et al., 2011) (Figure 11). D’ailleurs, l’expression de ce dernier n’est pas induite uniquement par NPF6.3. En effet, d’autres acteurs ont été identifiés dont CIPK8 confirmant le rôle de cette famille de protéines kinases dans les mécanismes de perception du statut nutritif de la plante (Hu et al., 2009). Un autre inducteur de NRT2.1 particulièrement intéressant est NLP7 (Nin-Like Protein 7). En plus de cibler NRT2.1, ce facteur de transcription est capable de réguler d’autres gènes liés au nitrate dont NR1 (Nitrate Reductase 1) et NIR1 (Nitrite Reductase 1) (Marchive et al., 2013; Konishi and Yanagisawa, 2014). D’autre part, il a pu être mis en évidence que les facteurs de transcription LBD37/38/39 (Lateral Organ Boundary Domain 37/38/39) agissent en tant que répresseurs des réponses liées à la carence en azote lorsque la disponibilité pour ce nutriment est suffisante (Rubin et al., 2009). Enfin, basé sur une étude de modélisation prédictive du transcriptome de la plante en réponse au nitrate, le facteur de transcription SPL9 (Squamosa Promoter-binding-Like protein 9) a été mis en avant pour son rôle supposé dans le contrôle de la réponse primaire au nitrate (Krouk et al., 2010b). Dernièrement, des travaux récents sur la protéine NRG2 (Nitrate Regulatory Gene 2) en présence de nitrate et d’ammonium montrent qu’elle serait capable de réguler l’expression du gène NPF6.3 et qu’elle interagit physiquement avec NLP7, tous deux régulateurs positifs des gènes liés à l’assimilation de l’azote (Xu et al., 2016).

Cette cascade signalétique complexe régulant l’absorption et l’assimilation du nitrate prend aussi en compte des signaux internes informant sur le statut azoté de la plante et faire ainsi intervenir des signaux à longue distance.

Introduction générale

III.2.b – La réponse au signal nitrate à l’échelle de la plante entière

En parallèle à la perception de la concentration externe en nitrate, la plante intègre son statut azoté interne pour réguler son développement et son métabolisme. La signalisation azotée mise en jeu fait alors intervenir des signaux locaux et systémiques très étroitement connectés (Nacry et al., 2013; Krapp, 2015; O'Brien et al., 2016). Des études basées sur l’utilisation de système split-root ont d’ailleurs mis en évidence une induction génique spécifique à la réponse locale en nitrate et d’autres gènes dont l’expression est dirigée par la réponse systémique (Ruffel et al., 2011; Alvarez et al., 2012; Bouguyon et al., 2012). Le signal à longue distance ferait intervenir la partie aérienne de la plante pour répondre aux signaux locaux racinaires induits initialement (Ruffel et al., 2011; Li et al., 2014). Ces résultats soulignent l’existence de deux types de signalisation au sein de la plante, même dans un environnement homogène en azote. Ces signaux, comprenant le nitrate lui-même, régulent l’expression des gènes impliqués dans la synthèse des acides aminés, la transcription, le RNA processing et la biosynthèse des hormones (Krapp et al., 2014).

L’intégration du signal azote chez la plante fait partie des mécanismes qui contrôlent son développement. La réponse morphologique la plus marquée concerne la régulation de la croissance et de l’architecture du système racinaire afin d’assurer une acquisition en azote optimale en fonction de sa disponibilité (Nacry et al., 2013; Giehl and von Wiren, 2014). Dans un milieu présentant une teneur élevée en nitrate répartie de manière homogène, l’élongation des racines latérales (LR) est inhibée. Les acteurs impliqués dans le contrôle de la croissance des LR en réponse à l’azote ont fait l’objet de nombreuses études (O’Brien et al., 2016 et références incluses). Au sein de la voie de signalisation systémique mise en jeu, le micro-ARN167 et le gène ARF8 (Auxin Response Factor 8) seraient impliqués dans la régulation de l’initiation et de l’émergence des LR (Gifford et al., 2008). Dans une autre étude, des auteurs évoquent le rôle hypothétique de NLP7 dans le développement des LR en réponse à la disponibilité en nitrate par l’observation de mutants pour ce gène avec une densité de LR importante (Castaings et al., 2009).

La littérature concernant les réponses de la plante en condition de disponibilité hétérogène en azote est elle aussi très fournie. Lorsque la distribution de l’azote n’est pas uniforme, une augmentation localisée de la teneur en nitrate stimule la croissance des LR alors qu’une répression de l’activation des méristèmes de racines latérales est observée du côté où la

Figure 12. Représentation schématique de l’interaction entre l’azote et les phytohormones (acide abscissique, auxine et cytokinine) dans la régulation de l’absorption de l’azote (Kiba et al., 2011). La disponibilité en nitrate interagit avec la synthèse des cytokinines (AtIPT3), le transport d’auxine (NRT1.1; NPF6.3), la perception de l’auxine (AFB3) et la transduction du signal auxine (ARF8/miR167a) afin de réguler l’acquisition de l’azote. Les traits pleins représentent les interactions connues et les traits pointillés représentent les interactions présumées. ABA : acide abscissique, AUX : auxine, CK : cytokinine.

Figure 13. Modèle de la signalisation systémique impliquée dans le signal azote (Ruffel et al., 2011). Représentation de la signalisation systémique impliquant les gènes régulant le métabolisme du nitrate et le développement des racines latérales exposées à un environnement hétérogène en azote. Les auteurs proposent l’existence de plusieurs voies de signalisation systémique nécessaires à l’intégration de la disponibilité et de la demande azotée permettant la coordination des réponses racinaires dans un environnement hétérogène en azote : (i) voie de signalisation par un inducteur dépendant des cytokinines en réponse à la demande en azote (-N) (en rose), (ii) voie de répression de l’approvisionnement en azote (+N) dans un système de type split-root (en noir), et (iii) signalisation de la carence azotée, soit locale, soit systémique en condition témoin C.KCl et de manière indépendante des cytokinines (en bleu). Ces voies de signalisation systémique de l’approvisionnement et de la demande en azote agissent en association avec les signaux nitrate locaux (en rouge), pour contrôler le développement racinaire et coordonner la réponse de la plante entière face à la disponibilité en azote perçue. Introduction générale teneur en nutriment est la plus faible (Zhang et al., 1999; Remans et al., 2006a; Ruffel et al., 2011; Ruffel et al., 2016). NPF6.3, décrit précédemment pour son rôle de transcepteur aurait un rôle dans la régulation de la croissance des LR. En effet, ce transporteur serait capable de faciliter le flux auxinique contrôlant son transport basipétal et son accumulation dans les pointes des LR. Ainsi un modèle hypothétique a été proposé dans lequel la croissance des LR est stimulée par l’accumulation de l’auxine dans les apex racinaires en présence d’une quantité élevée de nitrate via l’inhibition de son transport par NPF6.3 (Gojon et al., 2011)(Figure 11). De plus, chez des plantes mutées pour ce gène, ajoutée à la diminution de la croissance des LR, l’expression du gène ANR1 (Arabidopsis Nitrate Regulated 1) est fortement réduite. Ce gène codant un facteur de transcription de la famille des MADS-box est impliqué dans la réponse locale au nitrate et serait soumis à une régulation en amont impliquant NPF6.3 (Gan et al., 2012; Li et al., 2014; Mounier et al., 2014). Toujours en lien avec l’auxine, une autre voie régulant la croissance racinaire liée au transcepteur NPF6.3 a été mise en évidence. Elle est contrôlée par le module microARN miR393 / récepteur d’auxine AFB3 (Auxin signaling F-box 3 protein) et implique le facteur de transcription NAC4 (NAC domain containing protein 4) (Vidal et al., 2013; Vidal et al., 2014). De manière intéressante, l’expression d’AFB3 et de NAC4 est indépendante de la quantité de nitrate. Cette voie de signalisation dépend donc de l’activité de transport de nitrate de NPF6.3 et représente une alternative à la voie impliquant sa phosphorylation (Vidal et al., 2014).

La régulation de la croissance des LR en réponse au nitrate ne fait pas intervenir que l’auxine. Une revue propose une représentation schématique de l’interaction entre phytohormones et azote (Kiba et al., 2011) (Figure 12). La complexité de réponse de la plante à la disponibilité en azote y est illustrée et les cytokinines semblent jouer un rôle important. En effet, ces phythormones permettraient l’intégration du statut azoté dans les feuilles (Ruffel et al., 2011). Elles agiraient donc au sein de la signalisation systémique caractéristique de la demande en azote (Figure 13). Le même article montre que les réponses de la plante face à une teneur en azote hétérogène dans un système de type split-root fait intervenir un signal systémique impliquant un relai racines/feuilles puis feuilles/racines. La réponse de la plante à la disponibilité en azote est donc étroitement connectée à la signalisation hormonale (Krouk, 2016), faisant intervenir les auxines et les cytokinines, mais aussi l’éthylène (Khan et al., 2015),

Introduction générale l’acide abscissique (Pellizzaro et al., 2014) ainsi que les strigolactones (leur rôle sera décrit ci- après dans le chapitre IV).

D’autre part, une étude récente met en avant un module de signalisation composé d’un complexe peptide-récepteur formé par CLE (CLAVATA3/ESR-related) et CLV1 (CLAVATA1) (Araya et al., 2014). Celui-ci serait capable de contrôler la croissance des LR dans un environnement de faible disponibilité en azote. De la même manière, d’autres auteurs évoquent cette fois le rôle de la famille peptidique CEP (C-terminally Encoded Peptide) dans l’acquisition compensatoire de l’azote au sein d’un système où la disponibilité nutritive est hétérogène (Tabata et al., 2014). Les CEP agiraient comme un signal racinaire perçu au niveau aérien par des CEPR (CEP Receptor) produisant un signal descendant à l’origine de la surexpression des gènes de transport du nitrate dans les racines. L’ensemble de ces résultats et ceux qui impliquent le module CLE/CLV1 soulignent l’importance des petites molécules comme les peptides dans cette signalisation à longue distance.

Par ailleurs, des travaux sur un facteur de transcription, TCP20 (Teosinte branched 1/Cycloidea/Proliferatin cell factor1-20), ont été réalisés (Guan et al., 2014). Les résultats obtenus indiquent que TCP20 ferait partie de la voie de signalisation systémique qui contrôle la croissance racinaire en réponse à la disponibilité en nitrate. On observe chez les mutants pour ce gène une suppression de la croissance préférentielle des LR dans la zone riche en azote lorsque la plante est cultivée dans des conditions où la distribution pour ce nutriment est hétérogène, cependant cette croissance n’est pas altérée au sein d’un environnement uniforme en nitrate. La croissance des LR dans leur système split-root est donc élevée, apparemment dépourvue d’un quelconque signal systémique, renforçant le rôle majeur de ce facteur de transcription au sein de cette voie signalétique.

Les mécanismes signalétiques mis en jeu par la plante en réponse à la distribution de l’azote dans le sol font donc intervenir un très grand nombre d’acteurs impliquant aussi les acides aminés comme la glutamine (Miller et al., 2008) ou encore le gène CCA1 (Circadian Clock- Associated 1) qui jouerait un rôle dans la régulation circadienne de l’assimilation azotée (Gutierrez et al., 2008). Par l’intégration de ces signaux, l’expression des transporteurs de nitrate va être régulée. Un des exemples illustrant clairement l’influence de la signalisation longue distance correspond à l’étude du transporteur NRT2.1. Grâce à des travaux utilisant le système split-root chez Arabidopsis thaliana, il a été démontré que l’expression du gène 22

Figure 14. Schéma de synthèse des réponses moléculaires locales et systémiques en split-root chez Arabidopsis (O’Brien et al., 2016). A) Signalisation systémique mise en place au niveau de la plante entière. B) Signalisation locale racinaire. CK (Cytokinines), IAA (acide indole 3-acétique), LR (Racine Latérale). Introduction générale

NRT2.1 serait réactivée du côté riche en azote lorsque la plante perçoit simultanément une faible disponibilité pour ce nutriment de l’autre côté de son système racinaire (Gansel et al., 2001).

En conclusion, il est important de souligner la nature complexe de ce processus permettant à la plante de s’adapter aux fluctuations environnementales de la disponibilité azotée et l’interconnexion des différentes voies de signalisation impliquées. Au sein de la plante, des signaux d’origine racinaire et aérienne vont être échangés modulant le développement racinaire. Grâce aux nombreux travaux réalisés, des modèles commencent à être proposés soulignant la diversité des acteurs intervenants et leur localisation dans la cascade signalétique mise en place (Figure 14) (O'Brien et al., 2016).

III.3 – L’azote en viticulture

III.3.a – Développement de la Vigne et fertilisation azotée

La Vigne est une plante pérenne cultivée pour ses baies. La disponibilité en azote au sein du vignoble est un paramètre crucial devant être intégré aux pratiques culturales afin d’assurer un rendement satisfaisant et une qualité optimale des fruits. Les effets de l’azote sur la physiologie de la Vigne ont été décrits dans divers ouvrages (Loulakakis et al., 2009; Keller, 2015). Les fluctuations environnementales agissant sur la distribution de l’azote édaphique peuvent contraindre la croissance végétative et la fructification de la Vigne. De plus, cette plante doit coordonner sa gestion de l’azote au cours des différentes saisons pour assurer sa pérennité.

Au cours du printemps, le développement des organes végétatifs et reproducteurs de la Vigne repose sur la remobilisation de ses réserves. Du débourrement jusqu’à la floraison, les ressources azotées accumulées au sein des parties pérennes de la plante (racines et tronc) la saison précédente vont être utilisées (Zapata et al., 2004). D’ailleurs, une disponibilité limitée en ressources azotées suite à un mauvais stockage au cours de l’année antérieure peut représenter un inconvénient lors du développement de la plante au printemps suivant et sur la production de fruits qui s’en suit (Keller, 2015). L’absorption de l’azote prend ensuite le relais jusqu’à représenter la moitié du contenu total en azote à la floraison et augmente jusqu’au stade véraison (Zapata et al., 2004). En fin de saison, les métabolites azotés sont

Introduction générale remobilisés à partir des protéines ou des acides nucléiques contenus dans les feuilles sénescentes pour être exportés et stockés (processus de résorption)(Keller, 2015).

Pour assurer l’ensemble de ces étapes et éviter un quelconque manque en azote dans le sol, la fertilisation est usuellement employée en viticulture. Cependant sa gestion demeure particulièrement complexe. En effet, un apport excessif de ce nutriment va accroître le développement de la plante et ainsi son rendement dans des proportions qui pourraient altérer la qualité des fruits produits (Delas, 2010). L’apport azoté doit donc être raisonné afin de correspondre à l’équilibre rendement/qualité recherché par le viticulteur. De plus, les techniques de fertilisation adoptées pour les plantes annuelles consistant à ajuster l’offre en fonction du potentiel du sol ne sont pas transposables au vignoble. En plus des difficultés techniques qui concernent l’analyse de la disponibilité nutritive des sols, le caractère pérenne de la Vigne implique la capacité de cette plante à accumuler et mobiliser des réserves. Les méthodes de raisonnement de la fertilisation de la Vigne doivent donc prendre en compte les contraintes de productivité, les variétés utilisées ainsi que le terroir sur lequel le vignoble est implanté (Delas, 2010). De manière générale, deux périodes de fertilisation sont préconisées. La première se situe entre le débourrement et la floraison et la seconde prend place après la récolte pour assurer la mise en réserve nécessaire à la croissance de l’année suivante (Conradie, 2004).

III.3.b – La nutrition azotée chez la Vigne

Les derniers travaux qui concernent le métabolisme azoté chez la Vigne ont été synthétisés par Loulakakis (2009). Le glutamate et la glutamine jouent un rôle majeur permettant d’assurer la croissance et le développement de la plante. Les auteurs soulignent dans leurs perspectives l’importance d’identifier les autres acteurs impliqués pour optimiser les conduites culturales et sélectionner des variétés dotées d’une forte efficience d’usage de l’azote (NUE).

D’autre part, les processus moléculaires impliqués dans l’absorption du nitrate chez la Vigne ont été peu étudiés et la plupart des connaissances sont inspirées d’analogies avec d’autres plantes mieux caractérisées telle qu’Arabidopsis thaliana (Cf. Chapitre III.2). Comme pour cette dernière, en présence d’une teneur élevée en azote homogène, la croissance des racines latérales chez la Vigne est inhibée. A l’inverse, un apport local en azote, sur un sol appauvri

Introduction générale pour ce nutriment, stimule la croissance racinaire dans la partie du sol nouvellement riche en azote afin d’augmenter son absorption (Forde, 2002; Keller, 2015).

Un paramètre primordial est aussi à prendre en compte dans l’étude de la nutrition azotée chez la Vigne : cette plante est majoritairement cultivée greffée. En plus des réponses développementales liées spécifiquement à l’azote, les mécanismes de communication mis en place entre les deux génotypes, porte-greffe et greffon, vont être importants notamment pour les processus de signalisation systémique. Le porte-greffe contrôle la croissance du greffon et sa physiologie incluant ses aspects quantitatifs et qualitatifs et lui confère aussi la résistance à des maladies et la tolérance face aux stress biotiques ou abiotiques (détaille dans le Chapitre II) (Ollat et al., 2003b; Tandonnet et al., 2010; Cookson et al., 2012; Gregory et al., 2013). Ainsi, le développement de la plante entière va dépendre très fortement du choix du génotype de porte-greffe (Zerihun and Treeby, 2002; Cookson and Ollat, 2013; Koepke and Dhingra, 2013; Cookson et al., 2014). Les mécanismes de reconnaissance et de compatibilité entre porte- greffe et greffon sont donc différents en fonction de la combinaison effectuée, ainsi que la capacité du porte-greffe en lui-même à utiliser l’azote, à s’adapter aux variations édaphiques pour ce nutriment et à développer son système racinaire en conséquence.

Des travaux de thèse ont été réalisés récemment pour comprendre le rôle de la nutrition azotée dans le contrôle de l’allocation de biomasse chez la Vigne (Lecourt, 2013). Il a été mis en évidence qu’en fonction du génotype de porte-greffe, l’efficacité d’absorption était différente cependant la quantité de nitrate absorbée restait identique. Il semblerait aussi que les stratégies de stockage soit génotype-dépendantes. De plus, face à une faible disponibilité en azote, des stratégies différentes de réponse ont été soulignées impliquant l’utilisation des réserves pour l’un des génotypes et l’augmentation de l’absorption pour l’autre. Parmi le peu de travaux réalisés au niveau moléculaire, Pii et al. (2013) ont montré une nette induction de l’expression des gènes VvNRT2.4a et VvNAR2.2 suite au transfert de plants cultivés en hydroponie d’une solution à faible teneur en azote dans une solution enrichie. Dans une autre étude, différentes combinaisons ont été étudiées et une augmentation de l’expression des gènes VvNRT1.3-like et VvNRT2.4-like a été mise en évidence toujours dans un contexte de réponse à un apport d’azote (Tomasi et al., 2015). Chez une partie des plantes de cette expérimentation qui ont présenté une très faible absorption du nitrate, une induction de l’expression du gène VvNAXT1, impliqué dans l’efflux de cette molécule, a été démontrée.

Introduction générale

Les variations de croissance observées suite au greffage du même greffon sur différents génotypes de porte-greffe pourraient donc être expliquées par une réponse à la disponibilité en azote spécifique à chaque génotype de porte-greffe. Les mécanismes impliqués dans ces variations développementales au sein d’une plante greffée ne sont pas encore connus et l’hypothèse selon laquelle la régulation de la nutrition azotée pourrait expliquer ces différences n’a jamais été vérifiée.

Introduction générale

IV. LES STRIGOLACTONES

Les hormones jouent un rôle crucial dans la croissance, le développement et les défenses de la plante. A ce jour, 10 classes de phytohormones ont pu être distinguées. De nombreux aspects de la signalisation hormonale, comme leur transport et leur voie de transduction, ont été bien caractérisés (Santner and Estelle, 2009 et références incluses). Cet ensemble d’hormones, à travers une action coordonnée, permet de contrôler le développement de la plante et ses réponses face à leur environnement. Chez la Vigne, ces molécules pourrait donc assurer un rôle majeur notamment vis-à-vis de la communication entre les deux génotypes gouvernant ainsi les réponses de la plante greffée face à aux modifications de son environnement. Parmi ces hormones, le rôle de l’acide abscissique a été mis en évidence sur le métabolisme secondaire et la qualité de la baie (Ferrandino and Lovisolo, 2014). Cette classe hormonale a aussi fait l’objet de nombreux travaux dans le cadre de l’étude des réponses au stress hydrique (Hopper et al., 2016; Rossdeutsch et al., 2016). D’autre part, il a été montré que la signalisation hormonale joue un rôle prépondérant dans le processus de maturation de la baie (Bottcher et al., 2013; Kuhn et al., 2014; Fortes et al., 2015; Corso et al., 2016). En plus de souligner le rôle des hormones, ces résultats mettent aussi en évidence l’importance du choix du génotype de porte-greffe. D’autres auteurs ont ainsi observé un contenu en cytokinines variable dans différents porte-greffes, corrélé au développement des bourgeons et des rameaux latéraux (Skene and Antcliff, 1972; Nikolaou et al., 2000). Les signaux hormonaux sont ainsi intégrés dans de nombreux processus, régulant le développement végétatif et reproducteur de la Vigne. Récemment, une nouvelle classe de phytohormones a été identifiée et pourrait être impliquée dans l’influence du génotype de porte-greffe sur le développement du greffon en réponse à son environnement : ce sont les strigolactones.

IV.1 – La découverte des strigolactones

Des travaux réalisés sur les interactions entre plantes hôtes et plantes parasites racinaires ont mis en évidence la nécessité de sécrétion de molécules stimulantes pour la germination des graines de plantes parasites telles que l’Orobanche (Vaucher, 1823). Depuis, de nombreuses études ont été réalisées sur la production de ces stimulants permettant la germination d’Orobanche et de Striga chez différentes espèces de plantes. C’est en 1966, à partir d’exsudats de Coton, que les premières molécules stimulantes ont été découvertes correspondant au strigol et au strigyl acetate (Cook et al., 1966). Par la suite, de nombreuses

Figure 15. Modèle du messager secondaire pour la levée de dormance des bourgeons axillaires (Domagalska and Leyser, 2011). Dans ce modèle, l’auxine régule la synthèse d’un messager secondaire régulateur de l’activité du bourgeon. a) L’auxine régule la production de cytokinines en réprimant le gène IPT (Isopentenyltransferase) inhibant la croissance des rameaux latéraux. b) L’auxine induit la voie de biosynthèse des strigolactones engendrant de la même façon une inhibition de l’émergence des bourgeons axillaires. Introduction générale autres molécules ont été identifiées chez d’autres espèces et Butler proposa de les nommer strigolactones en 1995 (Butler, 1995). La nature néfaste du développement de la plante parasite pour la plante hôte fut à l’origine de questionnements sur le rôle des strigolactones et il a donc été suggéré que ces composés pouvaient avoir d’autres fonctions capables d’outrepasser ces risques de parasitisme (Xie et al., 2010). L’un de ces rôles bénéfiques fut découvert lors de travaux réalisés sur les symbioses mycorhiziennes arbusculaires (Akiyama et al., 2005). Comme indiqué précédemment (partie II.3.c de ce manuscrit), l’établissement de ces symbioses est synergique pour la plante hôte et le champignon mycorhizien. Depuis de nombreux exemples ont confirmé le rôle des strigolactones dans le développement de ces symbioses (Bucher et al., 2014; Fusconi, 2014; Gutjahr, 2014; Lopez-Raez, 2016). Par ailleurs, la production de strigolactones est aussi observable chez Arabidopsis, plante non-hôte de mycorhizes à arbuscules suggérant l’implication potentielle de ces molécules dans d’autres processus chez la plante. En 2008, deux équipes indépendantes ont ainsi décrit les strigolactones comme une nouvelle classe hormonale régulatrice de la ramification de la partie aérienne d’une plante (Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008). Par la suite, de nombreuses fonctions ont été attribuées à ces hormones démontrant leur importance dans la croissance et le développement d’une plante (Leyser, 2008; Beveridge et al., 2009; Dun et al., 2009; Brewer et al., 2013; de Saint Germain et al., 2013a; Koltai and Beveridge, 2013; Ruyter-Spira et al., 2013; Waldie et al., 2014; Lopez-Obando et al., 2015; Matthys et al., 2016; Pandey et al., 2016; Zwanenburg et al., 2016).

IV.2 – Mode d’action des strigolactones sur la ramification

A ce jour, il existe deux modèles hypothétiques non exclusifs permettant d’expliquer le contrôle de la ramification de la partie aérienne d’une plante en intégrant les strigolactones, les auxines et les cytokinines (Domagalska and Leyser, 2011; Brewer et al., 2015; Rameau et al., 2015). Le modèle du messager secondaire implique un rôle prépondérant de l’auxine (Figure 15). Cette hormone permettrait ainsi de contrôler un signal provenant des racines et allant vers la partie aérienne qui en définitive régulerait l’émergence des rameaux secondaires (Sachs and Thimann 1967). Cette voie de signalisation implique donc le contrôle de la biosynthèse des cytokinines et des strigolactones par l’auxine (Brewer et al., 2009) et suggère un rôle direct des strigolactones sur la ramification. L’autre modèle est basé sur la canalisation de l’auxine (Crawford et al., 2010). L’export de l’auxine des bourgeons axillaires est un

Figure 16. Modèle du transport canalisé de l’auxine (Domagalska and Leyser, 2011). Dans ce modèle, les bourgeons axillaires agissent comme des sources d’auxine et la tige principale en tant que puits. Pour induire la levée de dormance, l’auxine doit être exportée des bourgeons et ce processus entre en compétition avec le transport polarisé de l’auxine dans la tige principale vers les racines (PAT : Polar Auxin Transort). Durant ce processus, les strigolactones réduisent le transport polarisé de l’auxine et inhibent l’accumulation des transporteurs PIN1 au niveau des membranes cellulaires ce qui augmente la compétition entre les bourgeons pour l’export de l’auxine vers l’organe puits commun, la tige.

Figure 17. Représentation schématique des voies de biosynthèse et de signalisation des strigolactones avec les gènes identifiés chez quatre espèces modèles (encadré) (de Saint Germain et al., 2013a). Introduction générale mécanisme essentiel pour la levée de dormance de ces derniers (Figure 16). Les strigolactones viendraient alors diminuer les capacités de transport de l’auxine limitant ainsi la levée de dormances des bourgeons axillaires et l’émergence de rameaux latéraux qui s’en suivrait. Dans ce second modèle, l’action des strigolactones est donc indirecte. Ces deux hypothèses différentes permettant d’intégrer les strigolactones dans le contrôle de la ramification de la tige feuillée d’une plante ont souvent été l’objet de discussions et pourraient être impliquées à des stades de développement différents (Dun et al., 2006; Domagalska and Leyser, 2011; Waldie et al., 2014; Rameau et al., 2015).

IV.3 – Biosynthèse et signalisation

Chez plusieurs espèces, les études menées sur la ramification de la partie aérienne a permis de mettre en évidence des mutants dont le degré de ramification était anormalement élevé et chez lesquels les hormones connues telles que les auxines et les cytokinines n’étaient pas à l’origine du phénotype. Entre autre, ce type de mutant a été retrouvé chez Arabidopsis : more axillary growth (max) (Ward and Leyser, 2004; McSteen and Leyser, 2005), le Riz : dwarf et high tillering dwarf (d/htd) (Ishikawa et al., 2005), le Pois : ramosus (rms) (Beveridge, 2000) ou encore le Pétunia : decreased apical dominance (dad) (Napoli, 1996; Napoli and Ruehle, 1996). Les séries d’expérimentations de greffage qui s’en suivirent ont permis d’identifier des gènes impliqués dans la synthèse et la réception d’un signal allant des racines vers la partie aérienne de la plante, influençant son degré de ramification. De plus, l’absence de strigolactones dans des mutants altérés pour la biosynthèse des caroténoïdes et la réduction de la quantité des strigolactones dans les exsudats de plantes traitées avec des inhibiteurs ciblant la même voie a permis de suggérer que les strigolactones étaient des dérivés de caroténoïdes (Matusova et al., 2005). Depuis, de nombreuses études ont permis de caractériser plusieurs acteurs des mécanismes de synthèse et de signalisation de cette voie hormonale (Figure 17) (Dun et al., 2009; Brewer et al., 2013; de Saint Germain et al., 2013a; Ruyter-Spira et al., 2013; Seto and Yamaguchi, 2014; Lopez-Obando et al., 2015). Le carlactone, précurseur direct des strigolactones, est un dérivé des caroténoïdes et est produit via une voie de biosynthèse qui comporte trois étapes catalysées respectivement par une isomerase D27 (Dwarf 27 chez le Riz) et deux dioxygénases CCD7 et CCD8 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 7/8). Les étapes de conversion en strigolactones à partir de ce carlactone sont moins connues. MAX1 (More Axillary Growth 1), membre de la famille des cytochromes P450, est l’un des seuls acteurs

Figure 18. Modèle schématique détaillant la dégradation de D53 par la régulation du complexe D14- SCFD3 via les strigolactones (Zhou et al., 2013). Les strigolactones induisent un changement de conformation de D14 pour le complexe SCFD3 et sa fixation à D53, induisant sa polyubiquitination. La protéine D53 est dégradée par le protéasome permettant l’expression des gènes de réponse aux strigolactones tel que FC1.

Figure 19. Modèle schématique du complexe de signalisation par les strigolactones intégrant D14 avec les protéines MAX2 et SMXL (Wang et al., 2015). En présence de strigolactones, la répression des gènes de réponse, tel que BRC1, est levée à travers la dégradation du complexe TPR2 et SMXL6/7/8. ASK, CUL1, RBX et E2 sont des composants du complexe d’ubiquitination. Introduction générale potentiels identifiés à ce jour (Booker et al., 2005). Chez le Riz, il a cependant été montré que deux homologues de MAX1 correspondant à des membres de la famille des enzymes CYP711 sont capables de catalyser deux étapes distinctes qui permettent la production d’Orobanchol (Zhang et al., 2014a). Par ailleurs, il semblerait que le gène LBO (Lateral Branching Oxidoreductase) code une oxidoréductase qui agirait aussi dans la synthèse des strigolactones, en aval de MAX1 chez Arabidopsis (Brewer et al., 2016). La nature de ces composés dérivés des caroténoïdes dépend de l’espèce considérée notamment en termes de structure chimique et peuvent être catégorisées en trois grandes classes : les strigolactones de type strigol, les strigolactones de type orobanchol et les composés dits « strigolactone-like » tel que le methyl carlactonoate, molécule retrouvée chez Arabidopsis (Xie et al., 2010; Al-Babili and Bouwmeester, 2015).

Concernant la voie de signalisation, différents modèles ont été proposés en fonction des effets physiologiques induits (Koltai, 2014). Chez le Riz, les strigolactones se fixeraient à une α/β hydrolase D14 (Dwarf 14) induisant un changement dans sa conformation (Figure 18) (Nakamura et al., 2013; Zhou et al., 2013). Ce processus va promouvoir l’interaction avec une protéine à F-box D3 (Dwarf 3) entraînant la dégradation par le protéasome de répresseurs de la voie de signalisation des strigolactones tel que D53 (Jiang et al., 2013; Zhou et al., 2013). L’ensemble de cette réaction induit alors l’expression des gènes de réponse aux strigolactones notamment FC1 (Fine Culm 1) chez le Riz, orthologue de BRC1 (Branched 1) chez Arabidopsis thaliana (Zhou et al., 2013). L’implication de ce dernier met en évidence l’un des rôles des strigolactones et leur interaction avec d’autres hormones, ici, en tant qu’antagoniste des cytokinines dans le développement des bourgeons axillaires (Dun et al., 2012). Plus récemment, chez Arabidopsis thaliana, il a été montré que la régulation de la ramification de la partie aérienne via la voie des strigolactones nécessitait trois protéines D53-like : SMXL6 (Suppressor of More Axillary Growth 2-Like 6), SMXL7 et SMXL8 (Figure 19) (Soundappan et al., 2015; Wang et al., 2015). Ces protéines forment des complexes avec la protéine à F-box MAX2 (More Axillary Growth 2, orthologue de D3 chez le riz) et TPR2 (Topless-Related Protein 2) et interagissent avec l’α/β hydrolase D14. Lorsque les strigolactones sont synthétisées, les protéines D53-like vont être dégradées permettant in fine l’inhibition de l’émergence des rameaux latéraux par l’induction de l’expression de BRC1 (Wang et al., 2015).

Figure 20. Rôles des strigolactones dans le développement de la plante (Al-Babili and Bouwmeester, 2015). Les strigolactones stimulent la croissance des entre-nœuds (a), accélèrent la sénescence foliaire (b), augmentent l’élongation des poils racinaires et la croissance des racines primaires (c), induisent la croissance secondaire (d), inhibent l’émergence des bourgeons axillaires (e) et la formation des racines adventives (f) et latérales (g).

Introduction générale

IV.4 – Le contrôle du développement de la plante en réponse à l’environnement

En plus de leur capacité à induire la germination de graines de plantes parasites et de stimuler la ramification des hyphes de champignons endomycorhiziens arbusculaires, les strigolactones assurent une multitude de rôles dans le développement de la plante (Al-Babili and Bouwmeester, 2015; Lopez-Obando et al., 2015; Borghi et al., 2016; Pandey et al., 2016; Zwanenburg et al., 2016) (Figure 20). Comme indiqué précédemment, les travaux qui ont permis d’étudier leur voie de biosynthèse et de signalisation ont clairement mis en évidence l’action inhibitrice de ces hormones sur l’émergence de rameaux latéraux. Cependant, l’action de cette voie hormonale au niveau de la partie aérienne ne se limite pas à cette unique fonction. En effet, il a été montré que les strigolactones agissent sur l’angle de ramification (Sang et al., 2014), la dentelure des feuilles (Lauressergues et al., 2015), l’élongation des entre- nœuds (de Saint Germain et al., 2013b), la sénescence des feuilles (Yamada et al., 2014; Ueda and Kusaba, 2015) ou encore la croissance secondaire (Agusti et al., 2011). D’autre part, ces hormones n’influencent pas seulement la partie aérienne de la plante. En effet, de nombreuses études ont montré que les strigolactones interviennent sur différents aspects du développement racinaire (Ruyter-Spira et al., 2011; Koltai and Beveridge, 2013; Rasmussen et al., 2013; Kapulnik and Koltai, 2014). Ainsi, il a été observé que ces hormones stimulent la croissance de la racine primaire et l’élongation des poils racinaires et, d’un autre côté, inhibent la formation des racines latérales et adventives. Les effets pléiotropes des strigolactones soulignent donc leur importance cruciale dans le développement et la croissance d’une plante.

Impliquée dans la communication avec la rhizosphère, capable de réguler le développement de la plante notamment son architecture aérienne et racinaire, l’induction de de la biosynthèse des strigolactones lors de stress abiotiques joue un rôle majeur (Kapulnik and Koltai, 2014; Pandey et al., 2016). La régulation de la production de strigolactones a déjà été suggérée en tant que stratégie adaptative de la plante face aux changements des conditions environnementales (Xie et al., 2010; Marzec et al., 2013). En réponse à des carences en azote ou en phosphore, les plantes adaptent la croissance de leur système racinaire et peuvent former des symbioses mycorhiziennes pour améliorer leur absorption nutritive. Dans des milieux carencés en phosphate, il a été montré chez plusieurs espèces que l’augmentation de la synthèse des strigolactones est corrélée à une diminution de la ramification de la partie aérienne de la plante et à une augmentation de la formation des racines latérales et de la

Introduction générale densité des poils absorbants (Brewer et al., 2013). La carence azotée entraîne aussi une exsudation plus élevée de strigolactones mais cela dépend de l’espèce étudiée (Yoneyama et al., 2012; Brewer et al., 2013). Par exemple, chez le Sorgho, une limitation de la disponibilité en azote ou en phosphore multiplie la production de 5-deoxystrigol par trente. Chez la Tomate (cv. M82) par contre, seule une carence en phosphore permet d’augmenter par cent la biosynthèse de ces hormones (Marzec et al., 2013). Les travaux récents de Yoneyama et al. (2012) suggèrent que l’effet d’une faible teneur en azote dans le sol sur la production de strigolactones passerait par la réduction de la quantité en phosphore dans la tige de la plante ce qui augmenterait, à terme, la synthèse de ces hormones. Enfin, des travaux récents ont été menés pour tenter de décrire les mécanismes de signalisation hormonale impliqués dans l’inhibition de la ramification chez Arabidopsis thaliana en condition carencée pour l’azote (de Jong et al., 2014). Les auteurs soulignent l’influence des strigolactones sur l’allocation de la biomasse et l’importance du réseau de signalisation systémique établit impliquant les strigolactones, l’auxine et les cytokinines. La disponibilité édaphique en nutriments n’est pas le seul stress abiotique impliquant les strigolactones. Des travaux menés sur le stress hydrique ont montré que le mutant max2 est hypersensible à ce type de stress impliquant une réponse moins marquée d’un ensemble de gènes dont l’expression est connue pour être régulée par ce genre de stress tels que les gènes liés à l’acide abscissique (Bu et al., 2014; Ha et al., 2014). De plus, d’autres publications ont permis de mettre en évidence la relation entre strigolactones et lumière. Chez plusieurs espèces, ce lien a pu être établit, avec par exemple une réduction de la teneur en chlorophylle et une diminution de l’expression des gènes impliqués dans la capture de la lumière chez un mutant de la voie de biosynthèse des strigolactones. L’application d’une strigolactone synthétique, le GR24, permet d’obtenir l’effet inverse, avec une augmentation de ces deux paramètres liés à la photosynthèse (Mayzlish- Gati et al., 2010). Par ailleurs, une augmentation de l’intensité lumineuse engendre une augmentation de l’expression du gène SlCCD7 (Koltai et al., 2011). Les strigolactones assurent donc la régulation de l’architecture de la plante en régulant sa croissance aérienne et racinaire en réponse à une large variété de stimuli externes.

Problématique et stratégie adoptée

Face aux changements environnementaux, les plantes ont développé des stratégies adaptatives pour assurer leur pérennité. La disponibilité nutritive édaphique représente une ressource indispensable pour le développement de la plante. Parmi les ressources nutritives essentielles, l’azote est un élément majeur influençant directement la croissance de la plante et l’allocation de sa biomasse. La Vigne, plante greffée, perçoit cet environnement édaphique à travers son porte-greffe et le génotype de ce dernier influence le développement de la plante entière tout en intégrant les signaux provenant du greffon. Ainsi, les variations de croissance observées au niveau de la partie aérienne dépendent fortement du porte-greffe sélectionné et des interactions établies avec le greffon. Dans un environnement où la disponibilité en azote est fluctuante, la réponse de la plante greffée est régie par les propriétés intrinsèques du porte-greffe mais aussi par les processus signalétiques établis entre les parties aérienne et racinaire. Cependant, les mécanismes physiologiques et moléculaires impliqués dans cette réponse développementale n’ont pas encore été identifiés.

Le travail présenté dans ce manuscrit a pour objectif d’étudier l’influence du génotype de porte-greffe sur le développement du greffon à travers une approche intégrée prenant en compte les paramètres physiologiques, hormonaux et moléculaires dans les parties aériennes et racinaires de la plante en réponse à des variations de disponibilité en azote du sol (Figure 21). Cette stratégie a pour principal objectif de caractériser le rôle de la signalisation azotée sur les variations de croissance de la Vigne greffée et l’importance du génotype de porte- greffe dans ce processus.

Durant de ce projet, une approche de type globale, décrite dans le chapitre 1, a été mise en place pour étudier les réponses à courts termes de deux génotypes de porte-greffes connus pour réguler de manière différentielle le développement du même cépage. Au cours de celle- ci, les mécanismes liés à la perception et à l’absorption de l’azote dans un environnement où sa disponibilité est hétérogène ont été étudiés. L’analyse des résultats a permis de mettre en évidence une reprogrammation du transcriptome plus prononcée pour le génotype de porte- greffe sur lequel la croissance du greffon est réduite. Cette approche a fait l’objet d’un premier article soumis dans Journal of Experimental Botany. En parallèle, afin de caractériser l’architecture racinaire des deux porte-greffes de l’étude, des suivis de croissance ont été réalisés en culture in vitro. Décrites dans le chapitre 2, ces

Introduction générale expérimentations ont permis de souligner la spécificité de chacun des génotypes quant à leur morphologie racinaire en réponse à des variations de disponibilité en azote. De plus, le suivi d’expression d’un ensemble de gènes sélectionnés a été effectué en réponse à des apports homogènes ou hétérogènes en azote pour mieux comprendre la nature des signaux moléculaires qui engendrent ces phénotypes contrastés.

Enfin, dans le chapitre 3, des expérimentations sur des pas de temps plus longs ont été réalisées afin d’étudier l’évolution de l’allocation de la biomasse en fonction du porte-greffe toujours en réponse à la disponibilité en azote. Durant cette démarche, l’étude de la voie des strigolactones a été envisagée afin d’élucider la contribution de ces hormones dans les différences d’architecture aérienne observées entre les génotypes de porte-greffes ou conférées au greffon par ces derniers. Cette dernière partie fait l’objet d’un deuxième article actuellement en préparation.

En conclusion, l’ensemble de ce projet vise à étudier :

A – Les capacités intrinsèques du porte-greffe sur les mécanismes de perception et de signalisation locale et systémique en réponse à la disponibilité en azote

B – Les mécanismes de régulation de la morphologie du système racinaire en réponse à la disponibilité en azote

C – Le rôle de la signalisation hormonale dans le développement et la communication racines- tige feuillée au sein de deux combinaisons greffon/porte-greffe différentes

RESULTATS ET DISCUSSION

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Chapitre 1. La réponse transcriptomique racinaire à la disponibilité hétérogène en azote dépend du génotype de porte-greffe

I. INTRODUCTION

Comme évoqué au cours de l’introduction générale de ce manuscrit, les processus physiologiques et moléculaires impliqués dans le contrôle du développement végétatif du greffon en fonction du porte-greffe demeurent à élucider.

Parmi les mécanismes potentiellement impliqués, il a été montré précédemment que les processus relatifs à la nutrition azotée participent au contrôle de la croissance du greffon par le porte-greffe (Lecourt, 2013). L’objectif du travail exposé dans ce chapitre a été d’étudier si deux génotypes de porte-greffes partagent les mêmes processus d’adaptation à des modifications d’apport azoté. Nous nous sommes focalisés sur l’étude transcriptomique des réponses au niveau racinaire de ces deux porte-greffes suite à un apport localisé en azote.

Ces deux génotypes sont caractérisés pour leur comportement contrasté concernant la croissance végétative qu’il confère au greffon, 1103 Paulsen induisant une forte vigueur du greffon au vignoble et Riparia Gloire de Montpellier limitant le développement de celui-ci. Ces deux porte-greffes ont été associés avec le même génotype de greffon, Cabernet Sauvignon, et un dispositif de double-greffage a été employé pour réaliser des expérimentations de type split-root. Afin d’acquérir une vision globale des réponses mises en place au niveau racinaire en réponse à un apport hétérogène en azote, une analyse transcriptomique a été réalisée sur des prélèvements de pointes racinaires effectués 3 et 24 heures après un apport azoté localisé.

L’analyse des résultats qui a fait l’objet de la rédaction de l’article présenté dans ce chapitre a permis de mettre en évidence des signatures transcriptomiques spécifiques à chacun des porte-greffes en réponse à la variation de teneur en azote dans le milieu extérieur. Les différences temporelles d’expression génique ainsi que l’implication de la signalisation hormonale y sont discutées. De manière globale, cette première approche souligne le rôle important des mécanismes de perception de la disponibilité en azote et de signalisation qui pourraient, in fine, contribuer de manière significative aux différences de régulation du développement du greffon observées en fonction du génotype de porte-greffe sélectionné.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

II. ARTICLE

Title page

Title: Low vigour grapevine rootstock induces pronounced root transcriptome reprogramming in response to nitrogen availability

Authors:

Noé Cochetel1, Frédéric Escudié2, Sarah Jane Cookson1, Zhanwu Dai1, Philippe Vivin1, Pierre- François Bert1, Mindy Stephania Muñoz3, Serge Delrot1, Christophe Klopp2, Nathalie Ollat1, Virginie Lauvergeat1*

1EGFV, Bordeaux Sciences Agro, INRA, Université de Bordeaux, 33140 Villenave d’Ornon, France

2Genotoul Bioinformatics Platform, UR875 Mathematics and Applied Informatics of Toulouse, INRA, Castanet-Tolosan, France.

3Pontificia Universidad Católica de Chile, Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Alameda 340, PO Box 114-D, Santiago, Chile

Emails: Noé Cochetel: [email protected]; Frédéric Escudié: [email protected]; Sarah Jane Cookson: [email protected]; Zhanwu Dai: [email protected]; Philippe Vivin: [email protected]; Pierre-François Bert: [email protected]; Mindy Stephania Muñoz: [email protected]; Serge Delrot: [email protected]; Nathalie Ollat: [email protected]; Christophe Klopp: [email protected]; Virginie Lauvergeat: [email protected].

*Corresponding author: email: [email protected]; tel: 33 5 57575933

Date of submission: 09/09/16 Number of tables: 1 Number of figures: 9; Figures 5, 6, 8 and 9 should be in colour in print; Figures 1 and 7 should be in colour online-only Word count: 6491 Supplementary data: 5 figures, 6 tables

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Title

Low vigour grapevine rootstock induces pronounced root transcriptome reprogramming in response to nitrogen availability

Running title

Transcriptomic responses to N supply in grafted grapevines

Highlight

In grafted grapevines, common and rootstock specific root transcriptome responses were characterised under different nitrogen regimes. Functional categories and potential hub genes involved in genotype-dependent responses were identified.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Abstract

In many fruit species including grapevine, grafting is used to improve scion productivity and quality, and to adapt the plant to environmental conditions. However, the mechanisms underlying the rootstock control of scion development are still poorly understood. The ability of rootstocks to regulate nitrogen (N) uptake and assimilation may contribute to this control. A split-root system was used to grow heterografted grapevines and to investigate the molecular responses to changes in nitrate availability of two rootstocks known to affect differently scion growth. RNAseq transcriptome profiling was performed on root samples collected 3 and 24 h after N supply. The results demonstrated a common response involving N-related genes, as well as a more pronounced transcriptomic reprogramming in genotype conferring the lowest scion growth. A weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) allowed the identification of co-regulated gene modules suggesting the role of nitrate transporter 2 family genes (NRT2) and some transcription factors as main actors controlling this genotype-dependent response to heterogeneous N supply. The relationship between nitrate, ethylene and strigolactone hormonal pathways was found to differ between both genotypes. This indicated that the genotypes responded differently to heterogeneous N availability and this may contribute to their contrasted effect on scion growth.

Key words grafted plants, grapevine, nitrate, RNAseq, rootstocks, split-root, transcriptome

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Introduction

Grafting is increasingly used to improve crop yield and to reduce disease susceptibility, in both fruit species and vegetable crops (Goldschmidt, 2014; Warschefsky et al., 2016). In addition to their contribution to improving root traits such as resistance to many soil borne pests, rootstocks also impact scion growth, biomass allocation and mineral nutrition resulting in differences of yield and fruit quality (May, 1992; Galet, 1998; Ollat et al., 2016). How rootstocks influence the development and productivity of the scion is an important trait to select rootstock genotypes in agriculture. Water and/or nutrient uptake and transport, hormonal regulation and long-distance signalling have been investigated to explain the control of the scion vegetative development by the rootstock in various species (reviewed by Albacete et al., 2015).

Nitrogen (N) nutrition is one of the major factors that influence plant growth. In aerobic soils, nitrate is the main source of N for most plants and represents an important regulator of biomass allocation acting not only as a nutrient but also as a signal (Crawford and Glass, 1998). As its concentration in the soil is heterogeneous, plants have evolved adaptive mechanisms of N sensing and signalling to utilize efficiently this resource involving local and systemic signals (O'Brien et al., 2016). During the last decade, global transcriptomic studies as well as the study of mutants allowed the identification of some components of the signalling pathways involved in nitrate responses. The primary nitrate response involves the transcriptional regulation of some genes within minutes after a change in local nitrate supply (Medici and Krouk, 2014). Among them, NPF6.3 encodes a dual affinity nitrate transporter which also acts as a nitrate sensor, controlling the transcriptional regulation of nitrate responsive genes such as NRT2.1 (Gojon et al., 2011). This response is modulated by phosphorylation/dephosphorylation events involving at least two members of the CBL-interacting protein kinase family, CIPK8 and CIPK23, the last one regulating the activity of NPF6.3 (Bouguyon et al., 2012), and protein phosphatase 2C family members, such as ABI2 (Léran et al., 2015). Transcription factors (LBD37/38/39, NLP7, SPL9 or NRG2) have been identified as regulators of genes encoding N- metabolism enzymes (NR and NIR) and nitrate transporters (Vidal et al., 2015; Xu et al., 2016).

Nitrate uptake and assimilation are not only affected by local, but also systemic signals coming from other parts of the plant, such as distant roots or shoots, to integrate the distribution of nitrate content in the soil with the nutritional and energy status of the plant (Nacry et al., 39

Résultats et Discussion – Chapitre 1

2013; Krapp, 2015; O'Brien et al., 2016). These signals, including nitrate itself, regulate the expression of genes involved in amino acid synthesis, transcription, RNA processing and hormonal biosynthesis (Krapp et al., 2014).

The root responses to nitrate content heterogeneity include morphological and physiological modifications allowing adaptive root foraging to ensure an optimal N uptake for plant growth. The effect of a heterogeneous N supply on previously N-deprived roots has been studied using split-root systems (Ruffel et al., 2011; Alvarez et al., 2012; Bouguyon et al., 2012). The results showed that the differential of root growth, which is characterized by a growth increase in N- rich patches and limitation in low N zones, are both controlled by local and systemic signals integrating systemic N-demand and systemic N supply signals. Some transcription factors involved in this regulation have been identified such as ANR1, a MADS-box transcription factor which induces lateral root (LR) growth in high N supplied roots (Gan et al., 2012; Mounier et al., 2014). NPF6.3, which acts upstream of ANR1, also plays an important role in the control of LR growth through the regulation of auxin export from LR primordia (Gojon et al., 2011). In addition to auxin, cytokinins, abscisic acid and ethylene hormonal pathways are also controlled by nitrate concentration and in turn regulate nitrate morphological and physiological responses (Kiba et al., 2011; Krouk, 2016).

Recently, the molecular networks controlling N responses in homogeneous or heterogeneous nitrate availability have been explored mostly in herbaceous species (Vidal et al., 2015; O'Brien et al., 2016). System biology approaches performed in Arabidopsis led to identification of some master regulators integrating systemic signals (Vidal et al., 2013a; Vidal et al., 2013b; Alvarez et al., 2014; Canales et al., 2014; Li et al., 2014). In contrast, there is very little information available about the global transcriptomic changes induced by N supply in woody species and even less in grafted perennial plants.

In grapevine, in relation with water uptake and root-to-shoot fluxes, mineral nutrition is influenced by the rootstock (Csikasz-krizsics and Diofasi, 2008; Dalbo et al., 2011). The rootstock genotype affects the N status of the grafted plant and in some cases this effect was correlated with the ability of the rootstock to control scion vigour (Nikolaou et al., 2000; Zerihun and Treeby, 2002). A recent study demonstrated that the rootstock control of scion growth was dependent on N supply and correlated with distinct root and leaf ionome profiles (Lecourt et al., 2015). 40

Résultats et Discussion – Chapitre 1

The aim of this work was to determine whether two grapevine rootstocks (Vitis riparia cv. Riparia Gloire de Montpellier (RGM) and V. berlandieri x V. rupestris hybrid cv. 1103 Paulsen (1103P)), known to affect differently scion growth (Lecourt et al., 2015; Zhang et al., 2016), differ in their nitrate perception and signalling in response to heterogeneous nitrate supply. These rootstocks were grafted with a scion of Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon (CS). Grafted plants were grown in a split-root system in low N conditions in both root compartments and submitted to 24 h of a localized N supply (in one compartment). A global transcriptomic analysis by RNAseq was conducted on roots collected 3 and 24 h post treatment (hpt). The results showed that for both rootstocks, N-related gene expression pattern was extensively regulated in response to a local N supply. Interestingly, CS/RGM presented many more DEGs (Differentially Expressed Genes) than CS/1103P and a WGCNA approach allowed the identification of N-related modules specific to the CS/RGM combination.

Materials and methods

Plant materials and split-root experiment

The two rootstock genotypes, RGM and 1103P, were both grafted with the scion genotype CS. A double-grafting system (Tandonnet et al., 2010) was used in order to obtain two root–one shoot plants. Grafted plants resembled an inverted “Y” (Fig. 1A). The combinations CS/RGM and CS/1103P were analysed. After callusing and rooting, grafted plants were cultivated in two sand-filled pots of 3 L capacity (one per root system) in a greenhouse and irrigated with a full nutrient solution (Cookson et al., 2012) for 24 d of acclimation (Fig. 1A). A low nitrate content (0.8 mM KNO3) nutrient solution, LN, was then applied for two weeks (0.8 mM KNO3,

0.57 mM K2HPO4, 0.69 mM MgSO4, 1.39 mM CaCl2, 0.8 mM K2SO4, 0.3 mM CaSO4, and micronutrients as described by Lecourt et al. (2015)). At 0 hpt, one side of the root system was irrigated with 1 L of 5 mM high nitrate solution (“HN roots”) and the second side was irrigated with LN solution (“LN roots”). The HN solution was complemented by adding KNO3 up to 5

+ mM, and adjusting K2SO4 and CaSO4 concentrations to equilibrate the K between LN and HN solutions. Root tips (the first 2 cm from the root cap) were harvested at 0, 3 and 24 h after application of the HN solution, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Three plants (biological replicates) of each combination were sampled at each time point, with two root samples per plant (LN and HN roots) for 3 and 24 hpt (Fig. 1B and 1C). 41

Résultats et Discussion – Chapitre 1

RNA extraction, library preparation and sequencing

Total RNAs were isolated from 30 samples (3 biological replicates per condition, the conditions are illustrated in Fig 1C), as described by Cookson et al. (2013). Total RNAs were sent to IGBMC Microarray and Sequencing Platform (Strasbourg, France) and their quality was further determined using an Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). The preparation of the libraries was performed by the platform using the TruSeq RNA Sample Prep Kit (Illumina Inc.). Libraries were sequenced with an Illumina HiSeq 2000 sequencer (Illumina Inc.) and 50-bp single reads were generated. The data have been deposited in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) under accession number PRJNA342391.

Pre-processing of RNA sequencing data

The quality checks were done with fastQC on the Galaxy website hosted on the Abims Bioinformatics Platform (Roscoff) (http://galaxy.sb-roscoff.fr). The raw reads were then filtered by the Genotoul Bioinformatics Platform (Toulouse) with a trimming of the low-quality reads with an average Phred score < 28 (Supplementary Table S1).

De novo assembly

De novo assembly was performed by the Genotoul Bioinformatics Platform using DRAP v1.3 (Cabau et al., 2016). This meta-assembler performed first an assembly with Trinity (Grabherr et al., 2011) or Oases (Schulz et al., 2012) in multi-kmers approach. After assembly compaction, poorly supported and misassembled transcripts were filtered out using a RPKM threshold of 1, 3 or 10 (Supplementary Table S2). Considering results of the different assemblies (Supplementary Table S2), the assembly with Oases multi-kmers and a RPKM threshold of 1 has been selected.

Functional annotation of de novo assembled transcriptome

The functional annotation was performed by the Genotoul Bioinformatics Platform with series of BLASTX against different protein databases from Ensembl hosted on Genotoul server. Contigs were post-filtered on reads alignment and the best-hit annotation was selected for each of them. GO Terms were predicted using Interproscan 5. All the data were available on a web interface RNAbrowse

Résultats et Discussion – Chapitre 1

(http://ngspipelines2.toulouse.inra.fr:9005/ngspipelines/#!/NGSpipelines/Vitis%20rupestris %20-%20RGMand1103P), which is described as a RNA-seq de novo assembly results browser (Mariette et al., 2014). The best annotation file was downloaded and a BIN Code assignment was performed using Mercator (Lohse et al., 2014). Enrichments of functional categories of the Mercator annotation in the significantly differentially expressed genes sets were tested for significance by Fisher exact tests with a Bonferroni correction for multiple tests using Mefisto version 0.23beta (http://www.usadellab.org).

Quality evaluation

To assess the reliability of the de novo assembled transcriptome, raw reads were aligned against it using the aligner BWA MEM (Li and Durbin, 2009). The completeness of the assembly was determined through the use of the Core Eukaryotic Genes Mapping Approach (CEGMA) (http://korflab.ucdavis.edu/Datasets/cegma/, accessed 2016 July 20)(Parra et al., 2009) which allows the comparison between the transcriptome and a dataset containing highly conserved annotated core proteins.

Analysis of differential expression

Raw counts were determined using BWA MEM and SAMTools (Li et al., 2009) generating an overall counts matrix. Then, the R package edgeR (Robinson et al., 2010) was used to identify differentially expressed genes using a stringent threshold: |LFC (Log Fold Change)| >1 and FDR (False Discovery Rate) <0.01.

Network analysis

A co-expression gene network was constructed using the WGCNA software package (v1.51) in R (Langfelder and Horvath, 2008) using all the libraries except those corresponding to time 0 hpt (24 libraries). In order to remove low-expressed contigs (reflecting noise), a filter was applied to keep only contigs that had at least 20 counts in 70% of the libraries. 45,358 contigs satisfying the above threshold were obtained and their counts data were transformed using the function varianceStabilizingTransformation of the package DESeq2 (Love et al., 2014). The resulting set of counts was used for the network construction and module detection using the function blockwiseModules. Briefly, an adjacency matrix was created by calculating the biweight mid-correlation raised to a power β of 8 (soft-threshold estimated with the pickSoftThreshold function) and the maxPoutliers parameter set to 0.05. The subsequent 43

Fig 1. Split-root experiment in greenhouse.

A) A scion was grafted on two rootstock cuttings of the same genotype. Both sides of the root system were grown in two separated pots (left). The arrow indicates the grafting point. Right, picture of a root system harvested during the experiment. B) The whole root system was supplied with the LN solution (0.8 mM nitrate) for 2 weeks. Root samples from 3 plants per combination were then harvested, corresponding to 0 hpt. At the same time, one side of the root system of ten other plants was supplied with one liter of the HN solution (5 mM nitrate). Root tip samples from each part of the root system (HN roots or LN roots, two root samples per plant) were harvested after 3 or 24 h after HN supply (3 and 24 hpt). C) Nomenclature of harvested samples. Three individual plants (biological replicates) were harvested per condition. CS: Cabernet Sauvignon; RGM: Riparia Gloire de Montpellier; 1103P: 1103 Paulsen. Résultats et Discussion – Chapitre 1

Topological Overlap Matrix (TOM) was used for the module detection using the DynamicTreecut algorithm with a minimal module size of 30 and a branch merge cut height of 0.25. The module eigengenes were used to evaluate the association between the 26 resulting modules and traits (genotype, treatment and time).

Validation of RNA-seq analysis by qPCR

Total RNAs were reverse transcribed into cDNA using the SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Quantitative real-time PCR reactions were performed using SYBR Green on an iCycler iQH (Bio-Rad), according to the procedure described by the supplier. Relative expression of the genes was calculated using the 2-Ct method (Livak and Schmittgen, 2001), and using the reference genes EF1 and GAPDH for normalization. Primer sequences are listed in Supplementary Table S3.

Results

De novo assembly and annotation of a root transcriptome from grafted Vitis plants

To obtain a comprehensive overview of the transcriptome changes in response to rootstock genotype and/or N supply, 30 cDNAs libraries were constructed from root tips of two scion/rootstock combinations, CS/1103P and CS/RGM, grown in a split-root system (Fig. 1). The sequencing was performed using an Illumina Hiseq 2000 sequencer and approximately 40 million of 50 bp single reads were obtained for each sample (Supplementary Table S1). More than 97% of the raw reads passed the quality evaluation based on a phred score threshold.

In grapevine, the reference genome is that of PN40024, a Vitis vinifera accession (Jaillon et al., 2007). Since the two rootstocks used in this study belong to different species of Vitis genus, relying on the reference genome may underestimate the variability among the genotypes and may not allow the identification of specific genes or isoforms. Therefore, a de novo assembly strategy was chosen in order to build the most comprehensive transcriptome allowing differential expression analysis between the two studied genotypes. Briefly, a total of 1.19 billion of cleaned reads from the 30 cDNAs libraries were assembled into contigs using Oases assembler, with a RPKM threshold of 1, which allowed the higher percentage of contigs showing protein assignments (Supplementary Table S2). A total of 51,250 contigs (47,519,774 bp) were generated with a N50 at 1481. The assembly generated a high number of transcripts

Biological process Cellular component Molecular function

Fig 2. Gene ontology (GO) distribution of the de novo merged transcriptome.

The distribution of the contigs among level 1 GO categories is shown: biological process, cellular component and molecular function, which was the category that contained the most of contigs of the assembled transcriptome.

Fig 3. Classification of the de novo merged transcriptome into BIN code classes.

The percentage of contigs annotated in each BIN code compared to the total number of annotations generated by Mercator is presented. The category number 35 “not assigned” was not shown and contained 44.7 % of the assignments. Résultats et Discussion – Chapitre 1 enriched for smaller size contigs (51.73% of contigs were in the size range 201-599 bp; Supplementary Figure S1).

To assign putative gene function and annotations of all the assembled contigs, BLASTX alignment was performed against protein databases such as Swissprot, Refseq and several Genotoul bioinformatics platform intern databases of different species, including Medicago truncatula, Theobroma cacao, Populus trichocarpa, Arabidopsis thaliana, Prunus persica and Vitis vinifera, using a cut-off E-value of 1e-5. The best hit for each contig was selected and they were further categorized by Gene Ontology (GO) functional annotation (Fig. 2). Among the 51,250 contigs, 17,683 were associated to at least one GO category, generating 48,257 GO annotations. Furthermore, the BLASTX series provided insights into the taxonomic distribution of the transcripts with, as expected, more than 75% of contigs with top hits to sequences from Vitis vinifera (Supplementary Figure S2). This species distribution suggested that the assembly and annotation of this Vitis root transcriptome were correct and reliable. To complete this annotation process, Mercator, another classification tool for next-generation sequencing data (Lohse et al., 2014), was used to assign BIN codes. 56,268 annotations were generated corresponding to 51,012 contigs covering almost all the transcriptome (Fig. 3).

In order to examine the RNAseq reads representation of the transcriptome, reads were mapped back to the de novo assembly and showed more than 90% of mapping for all the samples (data not shown). Finally, completeness of the de novo assembled transcriptome was evaluated by comparison of its 51,250 contigs with a set of highly conserved core proteins using the CEGMA pipeline (Parra et al., 2009) allowing the identification of 98.39% of the 248 CEGs (Core Eukaryotic Genes) contained in this core dataset.

A heterogeneous nitrate supply induces a larger modification in the root transcriptome of CS/RGM compared to CS/1103P

To study the transcriptional response of the two scion/rootstock combinations to a local change in soil nitrate availability, the RNAseq count data for each sample were first represented in a multi-dimensional scaling plot view (Supplementary Fig. S3). This representation showed a clear clustering of the samples depending on the rootstock genotype and the N treatment. Moreover, the separation between LN roots and HN roots transcriptomes was more pronounced for the combination CS/RGM than that of CS/1103P.

Fig 4. Analysis of the differentially expressed genes (DEGs) in roots in response to heterogeneous N availability in the two scion/rootstock combinations.

Venn diagrams show the number of transcripts that were up- (bold) and down- (grey) regulated in HN roots compared to LN roots at 3 and 24 hpt in CS/1103P plants (A) and CS/RGM plants (B). In B), in addition to the 1369 contigs differentially expressed, three contigs were duplicated since they follow a different regulation pattern (i.e. up- or down-regulated) between 3 and 24 hpt.

A C HN3 vs LN3 HN24 vs LN24

104 0 1 7 0 3

up 105 down 10

B Bin BinName Contingency Pvalue Adj.Pvalue 17 hormone metabolism 28 914 144 50164 1.75E-18 1.70E-16 17.5 hormone metabolism.ethylene 23 151 149 50927 5.06E-30 4.91E-28 17.5.2 hormone metabolism.ethylene.signal transduction 23 57 149 51021 1.56E-38 1.51E-36 12 N-metabolism 6 49 166 51029 3.31E-08 3.21E-06 12.2.2 N-metabolism.ammonia metabolism.glutamine synthetase 3 21 169 51057 7.14E-05 6.92E-03 12.1 N-metabolism.nitrate metabolism 3 1 169 51077 1.48E-07 1.44E-05 12.1.2 N-metabolism.nitrate metabolism.nitrite reductase 2 0 170 51078 1.12E-05 1.09E-03 7 OPP 9 50 163 51028 4.76E-13 4.61E-11 7.3 OPP.electron transfer 6 6 166 51072 1.19E-12 1.15E-10 7.1 OPP.oxidative PP 3 22 169 51056 8.09E-05 7.85E-03 7.1.1 OPP.oxidative PP.G6PD 3 12 169 51066 1.64E-05 1.59E-03 27.3.5 RNA.regulation of transcription.ARR 7 23 165 51055 8.09E-12 7.85E-10 27.3.20 RNA.regulation of transcription.G2-like transcription factor family, GARP 4 49 168 51029 3.15E-05 3.06E-03 19 tetrapyrrole synthesis 5 61 167 51017 3.04E-06 2.95E-04 19.3 tetrapyrrole synthesis.uroporphyrin-III C-methyltransferase 5 0 167 51078 4.02E-13 3.90E-11 34.4 transport.nitrate 8 14 164 51064 4.19E-15 4.07E-13 Fig 5. A core set of N-related genes was shared between CS/1103P and CS/RGM in response to heterogeneous N availability.

A) Venn diagram of the common DEGs following the same expression pattern at 3 and 24 hpt in both rootstock genotypes (up- regulation is represented in orange colour and down-regulation in purple). B) BINs enriched in the list of common DEGs (n=172). Contingency gives the number of genes (i) in the BIN in the input list, (ii) in the background, (iii) not in the BIN in input list, and (iv) not in the background. P-values were adjusted with Bonferroni. Values were filtered with an adjusted P-value threshold <0.01 and an enrichment >1. C) Hierarchical clustering of the transcripts and the different conditions (i.e. Genotype x Treatment x Harvesting time) in a heatmap presenting the expression pattern of each DEGs (raws) within the different conditions (columns). The harvesting time 0 hpt was excluded during the hierarchical clustering process. Expression values are RPKM log2- transformed with up-regulation to down-regulation varying from orange to purple colour. Transcript clusters were extracted using the gene hierarchical clustering tree. The x-axis represents the harvesting time (in hpt), y-axis represents the mean- centered RPKM log2-transformed values. Dark colours were used to represent CS/1103P and light colours for CS/RGM. HN and LN conditions were drawn in solid and dashed lines, respectively. Mean ± SE was represented in black and grey colour for CS/1103P and CS/RGM, respectively. Résultats et Discussion – Chapitre 1

Differentially expressed genes (DEGs) were then identified by comparing LN and HN roots at 3 or 24 hpt for the two combinations, with the threshold of an absolute value of LFC >1 and a FDR <0.01 (Supplementary Table S4). As shown in Fig. 4, the number of DEGs in response to high local N treatment was very different in the two combinations. CS/RGM exhibited a number of DEGs much higher (1369 DEGs in total, Fig. 4B) than CS/1103P (212 DEGs) (Fig. 4A). In CS/1103P, the majority of DEGs (205) was found at 3 hpt, and 132 of them were up- regulated in HN roots compared to LN roots. In the combination CS/RGM, most of the DEGs at 3 hpt (81 %) were up-regulated in HN roots, while the majority of the DEGs found at 24 hpt (76%) were down-regulated.

Comparing the aforementioned DEGs lists allowed the identification of 172 common DEGs between CS/1103P and CS/RGM (Supplementary Table S4), among which 115 transcripts exhibited the same response direction to HN in both combinations (Fig. 5A). At 24 hpt, only four transcripts shared a common pattern, one being up-regulated and three down-regulated. Most of the DEGs (54%) found in the CS/1103P were in fact common to those in the CS/RGM combination. However, CS/RGM possessed a higher number of genotype-specific DEGs, and only 8% of the total number of DEGs of this combination was shared with CS/1103P.

Both combinations share a core set of genes differentially regulated in response to N variation

The 172 common DEGs shared between both rootstock genotypes were mainly associated with N-related functional categories (Fig. 5B). In both combinations, the HN treatment altered the expression of genes linked to N metabolism and transport, OPP (Oxidative Pentose Phosphate), tetrapyrrole synthesis and RNA regulation as shown by the enrichment analysis (Fig. 5B). A double hierarchical clustering performed on these common DEGs highlighted two major clusters for samples and three major clusters for gene expression profiles. The two clusters for samples were mainly separated by the N conditions for both genotypes (Fig. 5C). Regarding the transcript expression profiles, most of the genes associated with N-metabolism functional categories were present in cluster 1 (Fig. 5C), showing an up-regulation in HN roots compared to LN roots at 3 hpt. The 15 transcripts of cluster 2 were also induced in HN roots only at 3 hpt in both genotypes. However, these transcripts were more highly expressed in CS/1103P compared to CS/RGM. Lastly, cluster 3 contained 63 transcripts and most of them encode putative proteins associated with ethylene hormone metabolism, a functional category that showed a significant enrichment (Fig. 5B). Interestingly, this cluster contained 46

A Bin BinName Contingency Pvalue Adj.Pvalue (Bonf.) 5 fermentation 18 22 1351 49859 2.79E-18 1.10E-15 5.3 fermentation.ADH 13 4 1356 49877 7.19E-18 2.82E-15 5.2 fermentation.PDC 5 3 1364 49878 7.07E-07 2.77E-04 17 hormone metabolism 83 859 1286 49022 3.42E-21 1.34E-18 17.5 hormone metabolism.ethylene 45 129 1324 49752 3.09E-31 1.21E-28 17.5.3 hormone metabolism.ethylene.induced-regulated-responsive-activated 8 30 1361 49851 6.09E-06 2.39E-03 17.5.2 hormone metabolism.ethylene.signal transduction 37 43 1332 49838 1.09E-36 4.26E-34 17.6 hormone metabolism.gibberelin 12 69 1357 49812 1.63E-06 6.38E-04 17.6.1.11 hormone metabolism.gibberelin.synthesis-degradation.GA20 oxidase 4 1 1365 49880 2.48E-06 9.72E-04 26 misc 92 1858 1277 48023 1.92E-07 7.53E-05 12 N-metabolism 20 35 1349 49846 6.21E-18 2.43E-15 12.2 N-metabolism.ammonia metabolism 16 19 1353 49862 1.55E-16 6.09E-14 12.2.2 N-metabolism.ammonia metabolism.glutamine synthetase 14 10 1355 49871 1.35E-16 5.29E-14 12.1 N-metabolism.nitrate metabolism 4 0 1365 49881 5.07E-07 1.99E-04 7 OPP 13 46 1356 49835 4.31E-09 1.69E-06 7.3 OPP.electron transfer 8 4 1361 49877 1.14E-10 4.48E-08 29.5.11.4.3.1 protein.degradation.ubiquitin.E3.SCF.SKP 10 43 1359 49838 1.23E-06 4.82E-04 27.3.3 RNA.regulation of transcription.AP2/EREBP. APETALA2/Ethylene-responsive element binding protein family 12 65 1357 49816 9.33E-07 3.66E-04 27.3.5 RNA.regulation of transcription.ARR 12 18 1357 49863 6.98E-12 2.74E-09 27.3.20 RNA.regulation of transcription.G2-like transcription factor family. GARP 9 44 1360 49837 1.04E-05 4.07E-03 16.8.5 secondary metabolism.flavonoids.isoflavones 7 17 1362 49864 2.22E-06 8.70E-04 16.8.5.1 secondary metabolism.flavonoids.isoflavones.isoflavone reductase 7 17 1362 49864 2.22E-06 8.70E-04 30.2.22 signalling.receptor kinases.proline extensin like 6 17 1363 49864 2.46E-05 9.62E-03 20.2 stress.abiotic 44 618 1325 49263 5.98E-08 2.35E-05 20.2.4 stress.abiotic.touch/wounding 17 22 1352 49859 4.77E-17 1.87E-14 8.3 TCA / org transformation.carbonic anhydrases 7 11 1362 49870 2.35E-07 9.21E-05 19.3 tetrapyrrole synthesis.uroporphyrin-III C-methyltransferase 5 0 1364 49881 1.35E-08 5.29E-06 34 transport 77 1604 1292 48277 6.75E-06 2.64E-03 34.4 transport.nitrate 14 8 1355 49873 2.31E-17 9.06E-15

Fig 6. In response to N availability, six times more genes were differentially expressed in CS/RGM compared to CS/1103P.

A) Enrichment analysis of the DEGs from CS/RGM (n=1369). Contingency gives the number of genes (i) in the BIN in the input list, (ii) in the background, (iii) not in the BIN in input list, and (iv) not in the background. P-values were adjusted with Bonferroni. Values were filtered with an adjusted P-value threshold <0.01 and an enrichment >1. B) Hierarchical clustering of the transcripts and the different conditions (i.e. Genotype x Treatment x Harvesting time) in a heatmap presenting the expression pattern of each DEGs (raws) within the different samples (columns). The harvesting time 0 hpt was excluded during the hierarchical clustering process. Expression values are RPKM log2-transformed with up-regulation to down-regulation varying from orange to purple colour. Transcript clusters were extracted using the gene hierarchical clustering tree. The x-axis represents the harvesting time (in hpt), y-axis represents the mean-centered RPKM log2-transformed values. HN and LN conditions were drawn using solid and dashed lines, respectively. Mean ± SE was represented in red colour. Résultats et Discussion – Chapitre 1

57 transcripts that showed a different regulation pattern in response to N treatment between the two combinations (i.e. they were not presented in the Venn diagram Fig. 5A). In CS/1103P, these transcripts were down-regulated only at 3 hpt after the HN treatment, while they were differentially regulated specifically at 24 hpt in CS/RGM between LN and HN roots.

The N treatment regulates gene expression in a rootstock dependent manner

In addition to the common DEGs (172), each scion/rootstock combination possessed a specific set of DEGs, since 212 and 1369 transcripts were found to be differentially expressed in CS/1103P and CS/RGM, respectively (Fig. 4A and B). The enriched functional categories present in the total list of DEGs in response to the N treatment at 3 and 24 hpt in CS/1103P (Supplementary Figure S4A) were almost the same than those found for the common DEGs (Fig. 5A). Among the 40 DEGs specific to CS/1103P, 25 were annotated as “not assigned”, and the others were present in clusters 1 and 2 (8 and 7 DEGs respectively). They were associated to different functional categories such as cell wall, miscellaneous and development. Two ERF/AP2 transcription factors were identified and belong to cluster 1 (Supplementary Table S4 and Figure S4B).

In CS/RGM, the enrichment analysis performed with all the DEGs showed functional categories that were not significantly enriched neither in the common list of DEGs nor in the CS/1103P DEGs (Fig. 6A). Categories related to abiotic stress, fermentation, secondary metabolism (flavonoids) and gibberellin metabolism were among them (Fig. 6A and Supplementary Figure S5A and B). The hierarchical clustering of the 1369 DEGs allowed the identification of nine clusters (Fig. 6B). Genes related to fermentation and secondary metabolism were present in cluster 4, following the same pattern as N-related genes which were up-regulated at 3 hpt in HN roots. Cluster 1 transcripts showed a decrease of expression at 3 hpt in the LN roots and were mainly linked to regulation of transcription. NPF6.3 was assigned to this cluster. Cluster 6 contains 40% of the DEGs and was related to hormone metabolism (mainly ethylene and gibberellin), RNA regulation of transcription and signalling. Several gibberellin metabolism- associated genes were also included in cluster 8. The remaining 14% of CS/RGM DEGs were separated into five clusters and most of them were not assigned.

Both rootstock genotypes regulated hormone metabolism genes in response to N treatment, but with some differences. The distribution of all the functional categories within the DEGs set

Table 1. List of genes associated to N-metabolism and transport that were differentially expressed between LN and HN conditions in CS/1103P and/or CS/RGM at 3 and 24 hpt.

CS/1103P CS/RGM HN vs LN HN vs LN HN vs LN HN vs LN Name Function Contig name CRIBI accession v1 3 hpt 24 hpt 3 hpt 24 hpt 6-phosphogluconate 6PGDH mix_LOC100241717 VIT_02s0025g00900 0.91 0.5 1.85 1.04 dehydrogenase AMT3.1 Ammonium Transporter 3.1 mix_LOC100252515 VIT_07s0031g02950 -0.97 0 -1.3 -2.31 AMT3.3 Ammonium Transporter 3.3 mix_LOC100248822.2.2 VIT_08s0058g00140 -0.58 0 -1.1 -1.46 NR Nitrate reductase mix_LOC100264320 VIT_18s0001g03910 1.21 0 2.02 0.84 mix_contig_09056 VIT_03s0063g00370 1.24 0 2.39 1.42 NIR1 Nitrite reductase 1 mix_contig_10888 VIT_03s0063g00370 1.37 0.66 2.5 1.45 GLT1 Glutamate Synthase mix_LOC100246868 VIT_16s0098g00290 0.69 0.84 1.48 1.32 mix_contig_00751 VIT_05s0020g02480 1.09 0 1.83 0.93 GS2 Glutamine Synthetase mix_LOC100261413.1.2 VIT_05s0020g02480 1.05 0 1.82 0.91 mix_LOC100261413.2.2 VIT_05s0020g02480 1.03 0 1.96 0.92 mix_contig_00892 VIT_14s0006g00350 0.72 0.63 1.2 0.55 mix_contig_01347 VIT_17s0000g01910 0.69 0.58 1.06 0 mix_contig_02263 VIT_14s0006g00350 0.72 0.64 1.21 0.57 mix_contig_02304 VIT_14s0006g00350 0.7 0 1.28 0.6 mix_contig_06858 VIT_14s0006g00350 0.7 0.6 1.14 0 mix_GLNA2.1.7 VIT_14s0006g00350 0.84 0 1.4 0 GSR Glutamate Synthase mix_GLNA2.2.7 VIT_14s0006g00350 0.69 0.59 1.26 0.63 mix_GLNA2.3.7 VIT_14s0006g00350 0.69 0.61 1.3 0.6 mix_GLNA2.4.7 VIT_14s0006g00350 0.72 0.61 1.2 0 mix_GLNA2.5.7 VIT_15s0024g01530 0.69 0.57 1.17 0.56 mix_GLNA2.6.7 VIT_14s0006g00350 0.78 0.64 1.16 0 mix_GLNA2.7.7 VIT_14s0006g00350 0.74 0.61 1.26 0.58 mix_LOC100261250.1.3 VIT_07s0129g00330 0.94 0.64 1.51 1.05 LOB domain-containing LBD39 mix_LOC100261250.2.3 VIT_07s0129g00330 0.62 0 1.13 0.65 protein 39 mix_LOC100261250.3.3 VIT_07s0129g00330 0.74 0 1.27 0.79 NPF2.13 NRT1/PTR FAMILY 2.13 mix_LOC100250071 VIT_01s0026g01490 -0.58 0 -1.77 -3.03 NPF3.1 NRT1/PTR FAMILY 3.1 mix_LOC100250961 VIT_01s0011g03400 0 0 -1.07 0 NPF4.5 NRT1/PTR FAMILY 4.5 mix_contig_05016 VIT_18s0001g11280 0 -0.54 0 -1.39 mix_contig_00176 VIT_02s0154g00260 0.63 0.78 1.05 1.45 NPF6.3 NRT1/PTR FAMILY 6.3 mix_contig_09300 VIT_02s0154g00260 0.84 0 1.41 1.51 mix_contig_00726 VIT_06s0061g00320 1.29 0.97 2.23 0.95 NRT2.4a Nitrate transporter 2.4a mix_contig_09409 VIT_06s0061g00320 1.34 0.95 2.28 1 mix_LOC100241340 VIT_06s0061g00320 1.31 0.95 2.25 0.93 mix_LOC100263699.1.2 VIT_08s0040g01500 1.4 0.87 2.27 0.89 NRT2.4b Nitrate transporter 2.4b mix_LOC100263699.2.2 VIT_08s0040g01500 1.66 0 2.18 0 NRT2.5 Nitrate transporter 2.5 mix_LOC100260250 VIT_01s0127g00070 0.5 -0.51 1.08 -0.69 mix_contig_00610 VIT_17s0000g09470 1.32 0.88 1.97 1.02 mix_LOC100258771.1.2 VIT_17s0000g09470 1.12 0.75 1.8 0.99 NRT3.1 Nitrate transporter 3.1 mix_LOC100258771.2.2 VIT_17s0000g09470 1.3 0.96 1.95 1.04 mix_NAR21 VIT_17s0000g09470 1.33 0.94 1.94 1.03 mix_CICLE_v10031826mg VIT_13s0064g01470 1.46 0.71 2.35 0.92 mix_LOC100852901.1.4 VIT_13s0064g01470 1.52 0.69 2.39 0.99 UPM1 Uroporphyrin methylase 1 mix_LOC100852901.2.4 VIT_13s0064g01470 1.49 0 2.36 0.92 mix_LOC100852901.3.4 VIT_13s0064g01470 1.33 0 2.31 0.84 mix_LOC100852901.4.4 VIT_13s0064g01470 1.54 0 2.37 0.9

The gene names have been associated to each contig according to the CRIBI annotation v1. LFC values are indicated for each contig and condition. When the differential expression between HN and LN roots at a given time post-treatment were significant (LFC |(Log Fold Change)| >1; and FDR (False Discovery Rate) <0.01), the numbers have been highlighted in grey; bold numbers indicate when genes were found to be up-regulated in HN root side compared to LN side and numbers have been italicized when genes were down-regulated. Résultats et Discussion – Chapitre 1 at 3 hpt in each combination (Supplementary Figure S5A and B) showed that this category was over-represented only for CS/1103P and contained 14% of the DEGs in that combination while it is represented by only 2.7% of the DEGs in CS/RGM. In both combinations most of the genes related to this category were down-regulated in HN compared to LN roots.

Taking together, these results highlighted that RGM differs from 1103P in response to a heterogeneous N supply with a higher number of genes involved and a specific pattern of expression for genes involved in hormonal or secondary metabolism pathways.

Genes encoding nitrate transporters and enzymes involved in N metabolism are highly regulated in CS/RGM grafted plants

In order to understand the differences between the two rootstock genotypes in their response to changes in N availability, a focus was made on the expression pattern of genes involved in N nutrition (absorption, metabolism, transport and signalling). Among the genes known to be regulated by nitrate in several species, transcripts corresponding to 18 genes were found to be up- or down-regulated in response to heterogeneous nitrate supply in at least one condition (Table 1). Genes encoding nitrate assimilation-related enzymes such as nitrate and nitrite reductases (NR and NIR respectively), glutamine synthetase (GS2), and uroporphyrin-III C-methylase (UPM1), and nitrate transporters NRT2.4 (NRT2.4a and NRT2.4b) and NRT3 were significantly up-regulated in HN compared to LN roots. For each of the transcripts corresponding to these genes, the LFC value was higher in CS/RGM than in CS/1103P (Supplementary Table S4). CS/RGM was more affected by the N availability modification as the transcripts corresponding to these 18 genes were all significantly differentially expressed only in this combination while only seven of them exhibited a |LFC| >1 (and a FDR <0.01) in CS/1103P. CS/RGM specific responsive transcripts encoded the nitrate transporter NRT2.5 and NPF transporters like NPF6.3, the cytosolic isoform of the glutamine synthetase (GSR), and 6- phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH). Some genes were down-regulated in HN roots compared to LN roots specifically in CS/RGM (AMT, NPF2.13, NPF3.1 and NPF4.5).

The expression profiles of seven genes with contrasted patterns were verified by qPCR. NR, NIR, NPF6.3, NRT2.4a, NRT2.4b, NRT3 and GS2 were differentially expressed in both combinations following the same pattern of expression ratio between HN and LN conditions (Fig. 7). The ratio of transcript abundance between HN and LN roots was between 1.79 to 6.74

Fig 7. Validation of expression profiles of N-related genes by qPCR.

Left panel. Relative expression profiles quantified using qPCR. Transcript levels are indicated relative to reference genes EF1 (VIT_12s0035g01130) and GAPDH (VIT_17s0000g10430). CS/1103P and CS/RGM are represented in black and grey, respectively. The HN and LN conditions are shown using solid and dashed lines, respectively. Significant differences between conditions at each time point are indicated as *(P<0.05) and **(P<0.01) according to Student’s t-test. Right panel. Pearson correlation of the expression values obtained in qPCR (x-axis) and in RNAseq (RPKM in y-axis). Correlation coefficient and P-value (Bonferroni adjusted) are presented in the grey box. Résultats et Discussion – Chapitre 1 fold depending on the gene and was higher in CS/RGM (average ratio = 2.36) than in CS/1103P (average ratio = 1.75). The pairwise correlation tests between RPKM values from RNAseq data and qPCR data showed a strong correlation indicating that the two methods gave very similar profiles (Pearson test)(Fig. 7).

Weighted gene co-expression network analysis to identify hub genes in response to N availability

A gene co-expression network analysis was conducted using the WGCNA R package (Langfelder and Horvath, 2008) to describe the correlation patterns among genes across the different samples. This approach was used to define clusters of highly correlated genes (modules). Including the grey module (which contained the unconnected genes), 26 modules were found and analysed for their association with each experimental trait (correlation with genotype, N condition or time) (Fig. 8). Then, a kME value (module eigengene-based connectivity) was calculated for each transcript to every module (Supplementary Table S5). For each module eigengene, highly correlated transcripts were filtered with a correlation coefficient > 0.80 and a P-value <0.01. The first 100 transcripts were selected to perform an enrichment analysis using mefisto and the resulting enriched categories were summarized in Supplementary Table S6. The genes corresponding to the transcripts which showed the highest correlation coefficient (>0.9) with the module eigengene were considered as potential hub genes.

Regarding N treatment, modules “greenyellow” and “purple” showed the highest correlation value with the HN condition and the lowest P-value (Fig. 8). The module “greenyellow” included transcripts up-regulated in the HN roots in both combinations (Fig. 9A) and functional categories were found to be linked to the N response including nitrate metabolism and transport related categories but also OPP electron transfer and tetrapyrrole synthesis. Most of the nitrate-related genes were found in this module (6PGDH, GS2, NR, NIR and LBD39) and some of the corresponding transcripts showed a high connectivity with the eigengene (kME>0.8, Supplementary Table S5). TGA1, TGA4 and two-component response regulator ARR9 encoding genes were identified with a kME value above 0.9 in this module. In Arabidopsis, TGA1 and TGA4 transcription factors are nitrate inducible in roots and regulate many genes including nitrate transporters such as AtNRT2.1 and AtNRT2.2 (Alvarez et al., 2014).

Fig 8. Module-trait relationships.

Experimental traits correspond to each column and their association with each module eigengene (rows) was represented by a correlation coefficient and P-value within parenthesis. The colour of the cell indicates the correlation coefficient between the traits: red indicates a high positive correlation and green a high negative correlation. In the left panel, the number of contigs included in each module is presented in parenthesis.

A B

Fig 9. Eigengene average expression.

For the selected modules, A) "greenyellow" and B) "purple", samples are represented in columns.

Values used for the eigengene average expression in the barplot (upper panel) come from the top100 associated contigs according to the module membership value (kME). These values are those presented in rows on the heatmaps (orange colour is for a high expression and purple for a low expression). Résultats et Discussion – Chapitre 1

The module “purple” correlated positively with the HN condition and with RGM genotype (Fig. 9B). The most enriched categories were linked to nitrate transport and ammonia metabolism (Supplementary Table S5). N-related transcripts were present in this module, such as GLT1, NRT2.4a and NPF6.3. The top hub gene of the module “purple” (with the highest kME value) encodes a BTB/POZ and TAZ domain-containing protein 1-like. Genes encoding TGA1, ERF and LBD38/39 transcription factors, as well as CBL-interacting protein kinases were also found as potential hub genes in this module.

Three modules, “lightyellow”, “pink” and “lightgreen” were found to be associated with the LN treatment. The first two shared the ethylene functional category, the module “lightyellow” contained also cell wall associated genes and the module “pink”, some genes linked to RNA regulation. The module “lightgreen”, contained genes related to a hormone class described in bincode as “abscisic acid synthesis-degradation” which corresponds actually to the strigolactones pathway. These genes encode CCD7 (carotenoid cleavage dioxygenase 7), CCD8 (carotenoid cleavage dioxygenase 8) and MAX1 (more axillary growth 1). Putative orthologues of the PDR1 (Pleiotropic Drug Resistance Protein 1) gene encoding a strigolactone transporter (Kretzschmar et al., 2012; Sasse et al., 2015) were also included. The corresponding transcripts belong to the CS/RGM cluster 6 (Fig 6B), indicating that these genes showed a significant increase in their transcript level in the LN roots compared to the HN roots, only in CS/RGM.

Modules “blue” and “turquoise” were associated to RGM and 1103P, respectively. They contained genes whose expression pattern was correlated to one genotype whatever the treatment or the time. Many highly connected genes were related to biotic stresses in both modules. A LHY encoding transcript was found positively connected to the module “blue” (kME value 0.98) while it was negatively connected to the module “turquoise”. Conversely, a ELF4-like gene was highly positively connected to module “turquoise” and negatively to module “blue”. LHY and ELF4 are both required for circadian clock function in Arabidopsis (Kikis et al., 2005). These results suggested that some genes involved in the circadian clock regulation of plant growth might be differentially regulated in the two rootstock genotypes.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Discussion

To understand the molecular mechanisms involved in the rootstock control of scion growth, the present study focused on two rootstock genotypes, RGM and 1103P, known to induce a contrasted scion growth for the grape cultivar CS. Grafted plants were placed in a heterogeneous N availability condition during a split-root experiment and root transcriptomic analyses were performed. As this experimental design tended to mimic the natural conditions where the N availability is fluctuating, plants sensed both low and high N content, and gene expression was regulated in response to local and systemic signals (Li et al., 2014). The transcriptomic responses were investigated at 3 hpt in order to detect the changes due to rapid regulation in response to a local change of N supply whereas the response to systemic N-signalling integrating whole plant functioning appears at later time-points (Ruffel et al., 2011; Li et al., 2014), and was expected at 24 hpt.

Heterogeneous nitrate supply modulates differently the root transcriptome in the two scion/rootstock combinations

The differential analysis of transcript levels between HN and LN roots at 3 and 24 hpt highlighted that gene expression was more profoundly impacted in CS/RGM by the difference in nitrate availability than in CS/1103P. In addition, a WGCNA analysis defined modules containing genes for which the expression profiles were associated to the different experimental traits and identified genes that could act as a hub in more than one module.

A common set of genes exhibiting the same transcriptional regulation in both genotypes, i.e. an up- or a down-regulation in HN roots compared to LN roots, was identified. Involved in N uptake and assimilation, these N-responsive genes (NRT2.4a, NR, NIR…) are specific key actors of the systemic N-signalling in Arabidopsis thaliana and Medicago truncatula (Li et al., 2014).

Other known actors responded to the N availability in both genotypes and were found to be included in the “greenyellow” module, which correlated positively with HN treatment. The OPP pathway represented the most significantly enriched category. In this category, the glucose-6-P dehydrogenase (G6PDH) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH) encoding genes were previously shown to be induced by high nitrate (Wang et al., 2003; Lejay et al., 2008). The OPP electron transfer related genes correspond to the ferredoxin precursors essential for the NIR. Furthermore, the nitrite reduction catalysed by the NIR needs a siroheme

Résultats et Discussion – Chapitre 1 as binding site for the nitrite. UPM1 is involved in the siroheme production (Tanaka and Tanaka, 2007) via the tetrapyrrole biosynthesis pathway which corresponds to another category that is significantly enriched in the same module “greenyellow”. TGA1 and TGA4 encoding genes were highly connected to this module eigengene suggesting that they might be key regulators of the core N response in grapevine roots. In Arabidopsis, TGA1/TGA4 transcription factors may function in the same nitrate-signalling pathway of NRT2.1/NRT2.2 to regulate lateral root density (Alvarez et al., 2014).

Interestingly, the module “purple” correlated positively with HN treatment and RGM rootstock genotype. N-related genes were also present in this module, such as GLT1, NRT2.4a and NPF6.3. These genes were significantly up-regulated in RGM in HN roots compared to LN roots at 3 hpt. They were also up-regulated in 1103P although the level of transcripts (as well for RNAseq as for qPCR data) and the LFC values were lower in CS/1103P than in CS/RGM. Thus this specific RGM response could be attributed either to genes not responding or genes showing a weaker induction in 1103P.

Although NRT2.4a was up-regulated in HN roots in 1103P, it was found in this RGM specific module. In grapevine, among the four genes belonging to the NRT2 family, two encode proteins showing a high similarity to Arabidopsis AtNRT2.4/AtNRT2.2/AtNRT2.1 protein clade. These nitrate transporters function as two-component high-affinity nitrate transporters influx in Arabidopsis, and form a tetrameric protein complex with AtNAR2.1 (also named AtNRT3.1 or WR3) (Kotur et al., 2012). The corresponding grapevine genes have been named NRT2.4a and NRT2.4b and their expression has been previously shown to be affected by nitrate supply (Pii et al., 2014; Tomasi et al., 2015). Interestingly, NRT2.4a responded differently depending on the root system side and exhibited the same expression profile as NRT3.1. In Arabidopsis, NRT2.1 is submitted to both local and systemic regulations and has been shown to regulate LR development (Little et al., 2005; Remans et al., 2006), while AtNRT2.4 is induced by nitrate starvation and involved in the uptake of nitrate in low N conditions (Okamoto et al., 2003; Kiba et al., 2012). Our results suggest that grapevine NRT2.4a may be an AtNRT2.1 orthologous gene and may play an important role in the response to nitrate heterogeneous responses.

The top hub gene of the module “purple” encodes a BTB/POZ and TAZ domain-containing protein 1-like. Using a systems biology approach, Araus et al. (2016) recently identified BT2, 52

Résultats et Discussion – Chapitre 1 a BTB/POZ and TAZ domain protein encoding gene, as the most central and connected gene in an Arabidopsis N use efficiency (NUE) network. They suggested that BT gene family members act as negative regulators of nitrate uptake and NUE in plants. In our study, this gene appeared as a hub gene in a module correlated with the rootstock genotype that confers the lower scion growth. The present results cannot demonstrate a role of BT genes in grapevine in response to N availability; however they are interesting candidates for future research on NUE control by the rootstock.

The transcription factor gene TCP20 plays a key role in the systemic signalling pathway that directs root foraging in heterogeneous N availability (Guan et al., 2014). Interestingly, a gene encoding a homologue of AtTCP20 was identified in the module “blue”. This module was uncorrelated to nitrate treatment, which is consistent with the fact that in Arabidopsis this gene is not nitrate inducible (Wang et al., 2003; Wang et al., 2004). However, the module “blue” was strictly positively correlated with RGM suggesting that this transcription factor represents an important actor for further characterization of the rootstock genotype influence on the systemic signalling in response to N availability.

The transcriptional regulation of the ethylene pathway genes is shared between both combinations but at different time points

Genes belonging to the ethylene-related functional category were significantly over- represented in the DEGs between LN and HN roots in both genotypes, but with a time dependent expression pattern. Most of these genes encode members of the apetala2/ethylene response factor (AP2/ERF-TF) super family. A recent study showed that their expression was regulated by N availability (Zhao et al., 2015). The interaction between ethylene and N affects several physiological processes such as root architecture (Khan et al., 2015). In addition, in Arabidopsis, ethylene regulates some nitrate transporters such as NPF6.3 and NRT2.1 (Tian et al., 2009). In this study, ERF genes were found in different WGCNA modules associated with the LN treatment. The ethylene functional category was enriched in the “pink” module, which was associated with the RGM genotype suggesting that ethylene response is strongly involved in RGM N response. These results highlighted a contrasted N response between the rootstocks implying a different regulation between hormonal pathways and N content.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Regulation of strigolactones synthesis appears as a RGM specific response

Several genes putatively involved in strigolactone biosynthesis were identified in the module “lightgreen”, which was positively associated with LN treatment. These genes were significantly up-regulated in LN roots compared to HN ones only in CS/RGM. Strigolactones are a recently identified group of plant hormones known to regulate the plant development and architecture in response to the environment and particularly phosphorus and N availability (Xie et al., 2010). They are produced and exuded from the roots where they enhance hyphal branching of the symbiotic arbuscular mycorrhizal fungi (Gutjahr, 2014). They are also involved in repression of shoot branching and regulation of primary-root growth and LR formation (Waldie et al., 2014; Lopez-Obando et al., 2015). This latter role is dependent on nutrient availability (Marzec et al., 2013; Pandey et al., 2016). We showed here that genes involved in strigolactones pathway are regulated in response to heterogeneous N availability in grapevine in a genotype dependent manner. Interestingly, their expression was modulated in the rootstock that is known to confer the lower scion vigour (RGM), particularly when plants are facing N limiting availability (Lecourt et al., 2015).

Various circadian clock related genes are highly connected to modules associated to each rootstock genotype

Circadian clock regulates many aspects of plant biology including primary metabolism, hormone signalling, responses to biotic and abiotic stresses, and plant development. The mechanisms of the plant circadian clock involve multiple interlocked transcriptional feedback loops (Greenham and McClung, 2015). CCA1 and LHY encode MYB transcription factors, which are components of a negative feedback loop at the centre of the Arabidopsis circadian clock. CCA1/LHY may be involved in a morning loop and ELF3 and ELF4 are members of an evening loop (McClung, 2014). It has been suggested that in roots the circadian clock orchestrates diurnal carbon allocation and growth (Yazdanbakhsh et al., 2011). Here, we showed that some components of the circadian transcriptional feedback loops followed different expression pattern in the roots of the two rootstocks and that two of these genes (ELF4 and LHY) may be hub genes conversely connected to modules associated to each genotype. This result suggests that circadian clock related genes and thus control of metabolism and development are differentially regulated in both genotypes.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Conclusion

This comparative global transcriptomic analysis in roots of grafted grapevines showed that the two studied rootstocks responded differently to heterogeneous N availability. In addition to a core N response common to both genotypes, these results highlighted unexpectedly that the transcriptomic response was enhanced in the rootstock conferring the lower scion vigour, RGM. The difference between both genotypes was even more pronounced at 24 hpt and involved genes related to hormonal pathways such as ethylene and strigolactones. These results suggest the involvement of N nutrition in the control of grafted scion vigour since two rootstocks differing in this developmental trait presented a genotype-specific transcriptomic signature. They also showed a difference in the timeframe at which systemic response occurred in response to N heterogeneity and this may originate from the integration of different metabolic signals from the whole plant. In addition to the differential gene expression analysis, a WGCNA analysis provided insights into the gene networks and the hub genes connected to genotype-specific modules. These hub genes are interesting candidates for further investigations devoted to the control of the scion vigour by the rootstock and the NUE control in grapevine.

Supplementary Data

Figure S1: Length distribution of de novo assembled contigs

Figure S2: Top-hit species distribution of the merged final transcriptome

Figure S3: Multi-Dimensional Scaling plot of counts data from the different RNAseq samples

Figure S4: The few number of DEGs responding to N availability in CS/1103P involves mainly N-related genes

Figure S5: Functional categories distribution within DEGs

Table S1. Read number before (raw) and after trimming (cleaned)

Table S2. Summary table of the de novo assemblies

Table S3. List of the primers used for qPCR experiments 55

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Table S4: Pairwise comparisons resulting from differential expression analysis performed using edgeR

Table S5: Gene module membership

Table S6: BIN Code enrichment for each WGCNA module Acknowledgments

We thank the staff of the laboratory for their technical assistance. This work was supported by grants from the ‘Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux’ (CIVB) (contract no. 28325) and FranceAgriMer, the ECOS Sud program (contract no. C11B01) and the French Ministry of Research and Higher Education.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

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Résultats et Discussion – Chapitre 1

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Résultats et Discussion – Chapitre 1

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Résultats et Discussion – Chapitre 1

Supplementary Data

Supplementary Figure S1. Length distribution of de novo assembled contigs.

Values are comprised between 201 and 15,529 bp; and contigs from 201 to 599 bp represent half of the whole transcriptome.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Supplementary Figure S2. Top-hit species distribution of the merged final transcriptome. The 20 most represented species in the transcriptome annotation are presented.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

CS/1103P CS/RGM

LN0 LN3 HN3 LN24 HN24

Supplementary Figure S3. Multi-Dimensional Scaling plot of counts data from the different RNAseq samples.

Each condition is represented by three biological replicates with different colors for each time and N treatment. The combination CS/1103P is indicated using triangles and CS/RGM using squares.

A Résultats et Discussion – Chapitre 1 Bin BinName Contingency Pvalue Adj.Pvalue (Bonf.) 17 hormone metabolism 29 913 183 50125 5.56E-17 5.95E-15 17.5 hormone metabolism.ethylene 24 150 188 50888 1.75E-29 1.87E-27 17.5.2 hormone metabolism.ethylene.signal transduction 24 56 188 50982 2.18E-38 2.33E-36 12 N-metabolism 6 49 206 50989 1.14E-07 1.22E-05 12.1 N-metabolism.nitrate metabolism 3 1 209 51037 2.78E-07 2.98E-05 12.1.2 N-metabolism.nitrate metabolism.nitrite reductase 2 0 210 51038 1.70E-05 1.82E-03 7 OPP 9 50 203 50988 3.14E-12 3.36E-10 7.3 OPP.electron transfer 6 6 206 51032 4.22E-12 4.52E-10 7.1.1 OPP.oxidative PP.G6PD 3 12 209 51026 3.06E-05 3.28E-03 27.3.5 RNA.regulation of transcription.ARR 7 23 205 51015 3.52E-11 3.77E-09 27.3.20 RNA.regulation of transcription.G2-like transcription factor family. GARP 4 49 208 50989 7.11E-05 7.61E-03 19 tetrapyrrole synthesis 5 61 207 50977 8.41E-06 9.00E-04 19.3 tetrapyrrole synthesis.uroporphyrin-III C-methyltransferase 5 0 207 51038 1.16E-12 1.24E-10 34.4 transport.nitrate 8 14 204 51024 2.28E-14 2.44E-12

Supplementary Figure S4. The few number of DEGs responding to N availability in CS/1103P involves mainly N-related genes.

A) Enrichment analysis of the DEGs from CS/1103P (n=212). Contingency gives the number of genes (i) in the BIN in the input list, (ii) in the background, (iii) not in the BIN in input list, and (iv) not in the background. P-values were adjusted with Bonferroni. Values were filtered with an adjusted P-value threshold <0.01 and an enrichment >1. B) Hierarchical clustering of the transcripts and the different conditions (i.e. Genotype x Treatment x Harvesting time) in a heatmap presenting the expression pattern of each DEGs (raws) within the different samples (columns). The harvesting time 0 hpt was excluded during

the hierarchical clustering process. Expression values are RPKM log2-transformed with up-regulation to down-regulation varying from orange to purple color. Transcript clusters were extracted using the gene hierarchical clustering tree. The x-axis64

represents the harvesting time (in hpt), y-axis represents the mean-centered RPKM log2-transformed values. HN and LN conditions were drawn in solid and dashed lines, respectively. Mean ± SE was represented in red color.

Résultats et Discussion – Chapitre 1 A B

Supplementary Figure S5. Functional categories distribution within DEGs.

Histograms show the functional categories attributed to DEGs from contrasts between HN and LN-irrigated roots at 3 hpt in CS/1103P (A), CS/RGM (B) and at 24 hpt in CS/RGM only (C). Asterisks represent significative enrichment resulting of a mefisto analysis with an adjusted P-value (Bonferroni) < 0.01. 65

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Sample Name Raw reads Cleaned reads Filtered (%) PFB-56_20_S2 P-LN0.1 44022375 43367351 1.49 PFB-57_6_S1 P-LN0.2 38152919 37876907 0.72 PFB-58_12_S1 P-LN0.3 33703044 33450549 0.75 PFB-29_22_S1 P-LN3.1 42601769 41923422 1.59 PFB-31_11_S2 P-LN3.2 32059193 31565788 1.54

PFB-36_25_S2 P-LN3.3 36641969 36073755 1.55 PFB-30_10_S1 P-HN3.1 42260609 41587058 1.59 PFB-35_15_S2 P-HN3.2 34314981 33797028 1.51 PFB-37_7_S1 P-HN3.3 38166051 37489125 1.77 PFB-41_1_S1 P-LN24.1 40729211 40006233 1.78 PFB-43_23_S2 P-LN24.2 40366903 39696276 1.66 PFB-48_19_S2 P-LN24.3 39746879 38920801 2.08 PFB-42_13_S1 P-HN24.1 40898469 40175340 1.77 PFB-47_12_S2 P-HN24.2 42133688 41323911 1.92 PFB-49_9_S1 P-HN24.3 37070521 36641692 1.16 PFB-53_2_S1 R-LN0.1 36326877 35866299 1.27

PFB-54_16_S1 R-LN0.2 47255815 46613390 1.36 PFB-55_18_S2 R-LN0.3 44216349 43660318 1.26 PFB-29_22_S1 R-LN3.1 42601769 41923422 1.59

PFB-31_11_S2 R-LN3.2 32059193 31565788 1.54 PFB-36_25_S2 R-LN3.3 36641969 36073755 1.55 PFB-33_3_S1 R-HN3.1 44614433 43981469 1.42 PFB-38_4_S1 R-HN3.2 38706051 38067161 1.65 PFB-40_11_S2 R-HN3.3 41161470 40505828 1.59 PFB-44_7_S2 R-LN24.1 39427555 38666683 1.93 PFB-46_6_S1 R-LN24.2 44895875 43964087 2.08 PFB-51_14_S2 R-LN24.3 35281333 34863971 1.18 PFB-45_5_S1 R-HN24.1 41343213 40285076 2.56 PFB-50_2_S1 R-HN24.2 52795478 52172562 1.18 PFB-52_16_S2 R-HN24.3 44618538 44012991 1.36

Supplementary Table S1. Read number before (raw) and after trimming (cleaned).

The sample names contain a letter depending on each rootstock genotype; P: CS/1103P, R: CS/RGM, followed by HN/LN; HN: High Nitrate solution, LN: Low Nitrate solution; the harvesting time and the number of the replicate are separated by a dot.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Lg lower Lg upper Nb prot aligned Nb contig Assembly Nb seq N50 L50 Lg sum Lg min Lg mean Lg median Lg max % re-mapping quartile quartile (80%/80%) with prot(s) oases_rpkm01 51250 1481 9820 47 519 774 201 328 927.22 576 1218 15529 89.73 17950 15001 oases_rpkm03 44050 1594 8469 43 041 069 201 324 977.10 604 1330 15529 89.33 17600 14555 oases_rpkm10 20853 1943 4510 26 571 035 202 378 1274.21 984 1799 15529 83.96 13722 10636 trinity_rpkm01 71430 1253 12263 53 429 994 201 269 748.00 416 895 15529 88.66 17458 15086 trinity_rpkm03 55962 1440 9711 46 137 723 201 270 824.45 445 1072 15529 88.09 17068 14484 trinity_rpkm10 21431 1869 4469 25 480 402 201 337 1188.95 868 1697 15529 81.84 13094 10293

Supplementary Table S2. Summary table of the de novo assemblies. Each assembler, Oases and Trinity, was used with three different RPKM parameters 1; 3 and 10. Nb seq is the total contigs number obtained, N50 is defined as the largest entity E such that at least half of the total size of the entities is contained in entities larger than

E and L50 is the number of scaffolds that accounts for more than 50% of the genome assembly. Data on contig length (Lg) include the sum of all contig lengths (Lg sum), the minimum length (Lg min), lower quartile, mean, median, upper quartile and the maximum length (Lg max). Reads were mapped back to the different assemblies using BWA (% re-mapping) (Li and Durbin, 2009). Protein alignment

was performed by BLAT (Kent, 2002) and counted if the protein coverage is upper than 80% and/or with an identity upper than 80%. The number of contigs with protein(s) was determined in the same way by counting contigs with one or more protein associated after the filtering process (coverage and/or identity of 80%).

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Accession number Gene name Function Forward primer (5’-3’) Reverse primer (5’-3’) VIT_05s0020g02480 GS Glutamine synthetase CTGTCTCCCTTGCTCCCTCTC GGAGTCACTGGAAATGGGTTGAAC VIT_18s0001g03910 NR Nitrate reductase GCTGGTGTTCTGAATGATGGAG AAGACGACGCTAGGAGAGAAG VIT_03s0063g00370 NIR Nitrite reductase CTTGCCGAGGAAGTGGAATGTG GCATGTACGCCAGATCATTGATGT VIT_02s0154g00260 NPF6.3 NRT1/PTR Family 6.3 CAGTTCTTATTGGTGGGTGC CCCTAATGAAAGTGTGCTCAAA VIT_06s0061g00320 NRT2.4a Nitrate transporter 2.4a CCTCCCACCTTCAAAGGA CATGGGATGGTGTAGAGTTGG VIT_08s0040g01500 NRT2.4b Nitrate transporter 2.4b AGGTGGGAACTTCGGATC TCTTTGGAGGGCGGTAGC VIT_17s0000g09470 NRT3 Nitrate transporter 3 CTTGACATTGCTGCCGTTTG GGAAACAGTCATAGTGGCTAACTT VIT_17s0000g10430 GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase CCACAGACTTCATCGGTGACA TTCTCGTTGAGGGCTATTCCA VIT_12s0035g01130 EF1γ Elongation factor 1 gamma CAAGAGAAACCATCCCTAGCTG TCAATCTGTCTAGGAAAGGAAG

Supplementary Table S3. List of the primers used for qPCR experiments.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

III. CONCLUSION

L’ensemble des résultats acquis grâce à cette approche globale de transcriptomique a permis de visualiser les différences de régulation qui se mettent en place chez les deux porte-greffes en réponse à la disponibilité hétérogène en azote. Cependant, le dispositif expérimental utilisé ne permet pas de distinguer les signaux locaux des signaux systémiques mis en jeu au cours de cette réponse. Ainsi les résultats obtenus, notamment au bout de 24 heures, impliquent l’intégration des signaux envoyés par les deux côtés du système racinaire comprenant aussi le statut azoté de la plante et donc les signaux envoyés par le greffon. Afin de caractériser avec plus de précision ces processus signalétiques, une autre expérimentation a par la suite été mise en place, intégrant dans le dispositif expérimental, des témoins dits « homogènes », irrigués des deux côtés avec la même solution nutritive, LN ou HN, comme décrits chez Arabidopsis (Ruffel et al., 2011). Les échantillons issus de cette seconde expérimentation pourront être utilisés pour étudier la nature des signaux qui régulent l’expression des gènes relatifs à l’azote chez les deux porte-greffes. D’autre part, il serait intéressant de coupler les résultats de cette approche transcriptomique avec des données physiologiques. Pour ce faire, il serait nécessaire de reproduire l’expérimentation sur un pas de temps plus long afin d’étudier les répercussions de la reprogrammation transcriptomique de chaque porte-greffe sur leur capacité d’absorption d’azote notamment en utilisant le marquage au 15N et en effectuant des dosages d’azote pour estimer le contenu en réserves spécifiques à chaque porte-greffe au début de l’expérimentation.

De manière intéressante, il est aussi apparu que la régulation des gènes impliqués dans différentes voies hormonales dépende du porte-greffe. La signalisation par les hormones est connue pour être un processus majeur dans les mécanismes de réponse au signal nitrate (Krouk, 2016). Lors de la seconde expérimentation qui intègre les témoins homogènes, des prélèvements des différents organes des plantes ont été réalisés et seront utilisés pour effectuer des dosages hormonaux. De plus, même si le génotype de greffon est identique, sa réponse face aux signaux envoyés par 1103P ou RGM est potentiellement différente. Il serait donc aussi intéressant de suivre l’expression de certains gènes notamment impliqués dans l’assimilation de l’azote au niveau de la partie aérienne mais aussi ceux relatifs aux hormones, représentant des signaux mobiles capables de réguler l’expression des transporteurs d’azote au niveau racinaire.

Résultats et Discussion – Chapitre 1

Les petits ARNs, les gènes non codant ainsi que les peptides « hormones » représentent aussi des régulateurs importants dans la signalisation azotée chez les plantes modèles et seraient donc des acteurs potentiellement intéressant à étudier. A ce sujet, l’analyse des petits ARNs est un sujet en cours d’étude. Une approche de miRNAseq a été réalisée sur des prélèvements de feuilles, de racines et de pointes racinaires issues de plantes greffées CS/CS, CS/1103P et CS/RGM (Sarah J. Cookson et Pierre-François Bert, en cours). L’analyse des résultats permettra d’identifier et d’estimer l’abondance de ces composants en fonction du porte-greffe sur les différentes combinaisons. Par ailleurs, une base de données intégrant la distribution spatio- temporelle des miARNs a été récemment générée (Belli Kullan et al., 2015), ce qui facilitera leur étude lors de futures investigations.

La régulation des gènes relatifs à la nutrition azotée est aussi connue pour être étroitement liée au rythme circadien de la plante ce qui ajoute encore un degré de complexité vis-à-vis de l’étude de leur expression (Gutierrez et al., 2008; Haydon et al., 2015). Cette rythmicité a aussi une influence sur la croissance racinaire (Voss et al., 2015). Ce trait développemental adaptatif est d’ailleurs finement régulé pour pallier les variations de disponibilité édaphique en azote (Gojon et al., 2009; Nacry et al., 2013). Cette caractéristique implique la modulation du développement des racines pour assurer la croissance de la plante à travers l’absorption des nutriments nécessaires. Au vu des résultats obtenus dans ce premier chapitre, la perception de la teneur en azote présente dans le sol engendre des réponses différentes en fonction du porte-greffe et pourrait ainsi impliquer, sur un pas de temps plus long, une régulation différente de la croissance de leur système racinaire. Différentes expérimentations ont alors été mises en œuvre pour étudier ce trait développemental et sont décrites dans le chapitre 2.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

Chapitre 2. Régulation de la croissance et de la morphologie racinaire des porte- greffes en réponse à la disponibilité en azote

I. INTRODUCTION

En réponse aux variations des conditions environnementales, les plantes ont développé des stratégies adaptatives afin d’assurer leur survie. Parmi les fluctuations du milieu dans lequel les plantes évoluent, la variation de disponibilité en nutriments est un facteur qui a de sévères répercutions sur la croissance de la plante (Poorter et al., 2012). Parmi les éléments minéraux essentiels, l’azote est l’un des plus importants, représentant une base fondamentale pour la synthèse de nombreuses molécules biologiques. La disponibilité de ce nutriment est très

- fluctuante notamment sous forme de nitrate, NO3 , forme non adsorbée dans le sol (Miller et al., 2007). Afin d’assurer leur nutrition azotée, et plus particulièrement l’absorption de cet élément malgré la variabilité de sa concentration dans le sol, les plantes ont développé des stratégies développementales adaptatives notamment à travers la régulation de la croissance de leur système racinaire.

Chez de nombreuses espèces, lorsqu’une teneur élevée en nitrate est disponible dans le milieu de manière homogène, l’élongation des racines latérales (LR) est réprimée (Nacry et al., 2013). Chez Arabidopsis, les phénotypes racinaires en réponse à la disponibilité en azote sont bien caractérisés. Comparée à un milieu dont la teneur en azote est suffisante, une plus faible disponibilité pour ce nutriment est connue pour accroitre la longueur des racines principales et latérales (Giehl and von Wiren, 2014). Cependant, lorsque cette diminution est excessive, l’élongation des racines se retrouve inhibée (Gruber et al., 2013).

Toujours chez Arabidopsis, il a clairement été démontré que la disponibilité locale en nitrate affecte la croissance des LR. En effet, les études menées en système « split-root » sur boîte de gélose ont mis en évidence qu’un apport local en nitrate au niveau d’un côté du système racinaire élicite la croissance préférentielle des LR dans cette zone nouvellement enrichie pour ce nutriment (Zhang and Forde, 2000). De plus, ce phénotype est conservé chez un mutant

- pour la nitrate réductase soulignant l’importance du signal NO3 lui-même plutôt que les métabolites produits en aval (Zhang and Forde, 1998). Il a aussi été montré que la distribution hétérogène du nitrate dans le milieu a un effet répresseur sur la prolifération des LR dans la partie appauvrie pour ce nutriment.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

L’ensemble de ces réponses développementales ont été l’objet de nombreuses études vis-à- vis des systèmes de signalisation mis en jeu par la plante que ce soit au niveau local ou au niveau systémique. Ces différents travaux ont permis d’identifier plusieurs gènes impliqués dans la régulation du développement racinaire en réponse à l’azote, synthétisés dans les revues de Vidal et al. (2015) et O’brien et al. (2016) . Parmi eux, des gènes régulateurs majeurs ont pu être mis en évidence tel que BT2 qui agirait comme un régulateur négatif des gènes impliqués dans l’absorption de l’azote (Araus et al., 2016) ou encore TCP20 qui jouerait un rôle important dans les mécanismes de signalisation systémique qui contrôlent la prolifération racinaire en fonction de la disponibilité en nitrate (Guan et al., 2014). Parmi les NRTs, il a été montré que certains sont capables, indépendamment de leur fonction dans le transport de l’azote, d’assurer un rôle dans la régulation du développement racinaire. Ainsi, le rôle de NRT2.1 a été mis en évidence dans la régulation de l’initiation des LR en fonction de la teneur en nitrate (Little et al., 2005; Remans et al., 2006b). D’autre part, il a été montré que NPF6.3 est capable d’induire l’expression d’ANR1 ce qui permet de promouvoir in fine la croissance des LR dans la condition d’un apport localisé en azote (Remans et al., 2006a; Mounier et al., 2014). A contrario, dans le côté du système racinaire appauvri pour ce nutriment, NPF6.3 à travers sa capacité de transport d’auxine, va empêcher l’accumulation de cette hormone et ainsi bloquer le développement des LR (Krouk et al., 2010a; Gojon et al., 2011). Il existe donc un lien étroit entre la régulation du développement des LR en réponse à la disponibilité en nitrate et la signalisation par les auxines. En 2008, Gifford et al. ont d’ailleurs montré qu’un apport en azote réprime le microARN miR167 ce qui permet l’accumulation des transcrits correspondants au facteur de transcription ARF8 impliqué dans la voie de signalisation des auxines. Ce processus permet de moduler l’équilibre entre l’initiation et l’émergence des LR en réponse à la teneur en azote. Concernant la même classe hormonale, d’autres travaux ont mis en évidence l’importance du module miR393/AFB3 (Vidal et al., 2010). L’induction de l’expression d’AFB3 par le nitrate permettrait ainsi de réguler le développement du système racinaire et le microARN miR393, en réponse aux signaux azotés produits après assimilation de cet élément nutritif, agirait dans une boucle de rétrocontrôle négatif pour réguler l’accumulation des transcrits d’AFB3. En plus des auxines, l’importance d’autres classes hormonales a été mise en évidence. Parmi elles, les cytokinines semblent jouer une multitude de rôles. Parmi les gènes codant les isopentenyl transférases qui assurent leur biosynthèse, l’expression du gène IPT3 est induite spécifiquement par le nitrate (Takei et al., 2004). Ces

Résultats et Discussion – Chapitre 2 hormones peuvent agir comme messagers à longue-distance des racines vers la tige feuillée de l’apport en azote (Sakakibara et al., 2006; Ruffel et al., 2011; Ruffel et al., 2016) et jouent aussi le rôle d’un signal de satiété régulant ainsi négativement l’expression des transporteurs de nitrate (Kiba et al., 2011). De plus, il a été montré que les cytokinines répriment l’initiation des LR (Laplaze et al., 2007) et qu’elles pourraient jouer un rôle clé dans la régulation du développement racinaire en réponse à la signalisation systémique (Ruffel et al., 2016). D’autres voies hormonales sont aussi impliquées telles que la voie de l’éthylène ou de l’acide jasmonique mais elles ne seront pas décrites ici.

Étroitement connectées à la voie des cytokinines, les strigolactones jouent aussi un rôle important dans le développement des LR (Jiang et al., 2016). Leur biosynthèse est connue pour être stimulée par les stress abiotiques notamment les conditions limitantes en phosphore et en azote (Marzec et al., 2013). De manière intéressante, il semblerait que leur action sur le développement des LR dépende de la teneur en nutriments du milieu. Pour le moment, seuls des travaux sur la disponibilité en phosphore ont été réalisés. Ainsi, en conditions de teneur en phosphore suffisante, les strigolactones répriment le développement des LR alors qu’un effet opposé est observé lorsque la teneur de cet élément devient limitante (Kapulnik et al., 2011; Ruyter-Spira et al., 2011; Kapulnik and Koltai, 2014).

Dans le contexte des plantes cultivées greffées, les propriétés propres aux différents génotypes de porte-greffes ainsi que la signalisation établie avec le greffon permettent de moduler la croissance du système racinaire en fonction de la disponibilité nutritive édaphique. Des réponses adaptatives de régulation de la morphologie racinaire, dépendantes du génotype du porte-greffe, ont, par exemple, été observées chez le Citronnier en réponse à la disponibilité en nitrate (Sorgona et al., 2007). Chez la Vigne, les capacités de modulation de la croissance racinaire du porte-greffe en fonction de la teneur en nutriments dans le sol, notamment en fonction du contenu en azote, pourraient contribuer de manière significative aux différences de croissance de la plante entière greffée notamment au regard des résultats obtenus dans le chapitre précédent. En effet, la réponse transcriptomique contrastée observée entre CS/1103P et CS/RGM pourrait impliquer a posteriori des différences de régulation du développement racinaire en réponse à la disponibilité en azote. Ainsi, au cours de cette étude complémentaire, nous avons utilisé à nouveau les porte-greffes 1103P et RGM, qui sont connus pour réguler différemment la croissance du greffon. Afin d’étudier la

Résultats et Discussion – Chapitre 2 régulation de la croissance de leur système racinaire, des expérimentations en culture in vitro ont été menées. De plus, une nouvelle expérimentation de type split-root a été réalisée avec les combinaisons CS/1103P et CS/RGM incluant des plantes témoins en condition homogène afin d’étudier les gènes connus pour répondre de manière locale et systémique à l’apport en azote. En plus de présenter des différences de régulation de la production de LR en réponse à des modifications de disponibilité en azote dans le milieu de culture et d’inclinaison du système racinaire, il a pu être montré que l’expression de certains gènes connus pour leur implication dans la régulation du développement des LR en réponse à l’azote suivent un profil dépendant du génotype.

Macro éléments mg/l mM

CaCl2 72,5 0,65

Ca(NO3)2, 4H2O 471,26 2,35

KH2PO4 170 1,25

K2SO4 990 5,68

MgSO4 180,54 1,5

NH4NO3 400 5

Micro éléments mg/l µM

CuSO4, 5H2O 0,25 1 FeNaEDTA 36,7 100

H3BO3 6,2 100,27

MnSO4, H2O 22,3 131,94

Na2MoO4, 2H2O 0,25 1,03

ZnSO4, 7H2O 8,6 29,91

Vitamines mg/l µM Glycine 2 26,64 myo-Inositol 100 554,94 Acide nicotinique 0,5 4,06 Pyridoxine HCl 0,5 2,43 Thiamine HCl 1 2,96

Tableau 1. Composition du milieu McCown Woody Plant Medium.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

II. MATERIEL ET METHODES

II.1 – Expérimentation Split-root

Pour l’expérimentation split-root, des greffons issus du génotype Cabernet Sauvignon (CS) ont été greffés sur 1103P ou RGM pour générer les combinaisons CS/1103P et CS/RGM. Un système de double-greffage a été utilisé (Tandonnet et al., 2010) afin d’obtenir des plants avec deux parties racinaires et une partie aérienne. Après apparition de cals et enracinement, les plants greffés ont été cultivés dans du sable contenu dans deux pots de 3 L (avec un système racinaire par pot) en serre et irrigués avec une solution nutritive complète (Cookson et al., 2012) pendant 24 jours d’acclimatation. Une solution avec une faible concentration en nitrate

(0,8 mM KNO3), appelée LN, a été appliquée durant deux semaines (0,8 mM KNO3;

0,57 mM K2HPO4 ; 0,69 mM MgSO4; 1,39 mM CaCl2; 0,8 mM K2SO4 ; 0,3 mM CaSO4 et micro- éléments comme décrit par Lecourt et al. (2015)). A 0 heures post-traitement (hpt)(à 8h du matin), un côté du système racinaire a été irrigué avec 1 L d’une solution riche en nitrate nommée HN et le second côté a été irrigué avec la solution LN. La solution HN a été complémentée en ajoutant du KNO3 à 5 mM et en ajustant les concentrations de K2SO4 et de

+ CaSO4 pour équilibrer les ions K entre les solutions LN et HN. Les pointes racinaires ont été prélevées à 0, 3 et 24 hpt après application de la solution HN, immédiatement transférées dans de l’azote liquide puis stockées à -80°C. Trois plants (réplicas biologiques) par combinaison ont été récoltés pour chaque temps de prélèvement, avec deux échantillons de racines par plante (LN et HN) pour les temps 3 et 24 hpt. Pour les plants en condition homogène, un échantillon de racines provenant des deux côtés du système racinaire a été prélevé pour chaque temps.

II.2 – Préparation des explants/boutures pour les expérimentations in vitro

Pour chaque expérimentation in vitro, des boutures des génotypes RGM (Riparia Gloire de Montpellier) et 1103P (1103 Paulsen) ont été mis à raciner pendant dix jours dans des tubes contenant du milieu McCown Woody Plant Medium (Lloyd and McCown, 1980) (Tableau 1) supplémenté avec 1,5% de saccharose ; 0,27 µM d’acide naphtalène acétique (ANA) ; 0,7% d’agar et avec un pH ajusté à 5,8 en utilisant du KOH 1M. Ces plants ont été cultivés en chambre de culture à 25°C avec une photopériode de 16h de jour et 8h de nuit ainsi qu’une densité de flux photonique photosynthétique de 55 µmol.m-2.s-1.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

II.3 – Expérimentation in vitro en condition de présence ou absence de source azotée dans le milieu nutritif

Les plants ont été transférés dans des tubes contenant du milieu McCown « fait-maison » non supplémenté d’ANA, soit identique au milieu commercial appelé « HN » contenant 15 mM d’azote (5 mM NH4NO3 et 2,5 mM Ca(NO3)2), soit sans aucune source d’azote (0 mM NH4NO3 et 0mM Ca(NO3)2) appelé « LN ». Le contenu en calcium a été ajusté en ajoutant du CaCl2. Le suivi phénotypique caractérisé par le dénombrement de racines principales, de racines latérales, de feuilles et la mesure de la hauteur de la partie aérienne de l’explant a été réalisé durant une période de 33 jours.

II.4 – Expérimentation in vitro sur une gamme de concentrations en azote

Les plants ont été transférés dans le milieu McCown « fait-maison » dépourvu d’azote (LN) et cultivés pendant deux semaines. Le suivi phénotypique, réalisé sur les mêmes variables que l’expérimentation réalisée en présence (HN) ou en absence d’azote (LN), a été effectué tous les deux jours. Après ces 14 jours, les plants ont été transférés sur une gamme de milieux élaborés à partir du McCown contenant les concentrations d’azote suivantes : 0 ; 0,25 ; 1 ; 3 ; 6 et 15 mM et une quantité d’agar de 0,3% permettant ainsi leur transfert. Les points de la gamme 0 et 15 mM correspondent respectivement aux conditions LN et HN. Une première série de plants a permis de réaliser des prélèvements racinaires trois heures après le transfert sur la gamme. Une deuxième série de plants a été cultivée sur ces différents milieux afin d’en effectuer la caractérisation phénotypique deux semaines plus tard.

II.5 – Expérimentation in vitro sur boîtes de pétri

Un suivi de croissance a été réalisé sur boîtes de pétri contenant du milieu solide élaboré à partir de la composition du milieu Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 1962) contenant 50 mM d’azote (NH4NO3) et 0,7% d’agar. Les racines principales et latérales ont été dénombrées et mesurées le jour du transfert sur boîte, puis 3, 5, 7 et 10 jours après. L’analyse des données a été réalisée en utilisant le logiciel de traitement d’images RootSnap (CID Bio- Science Inc., Camas, WA, USA).

II.6 – Suivi d’expression de gènes en qPCR

Les ARNs totaux ont été extraits comme décrit par Cookson et al. (2013) et retro-transcrits en ADNc en utilisant le kit SuperScript III First-Strand Synthesis System pour RT-PCR (Invitrogen).

Numéro d’accession Nom Amorce sens (5’-3’) Amorce antisens (5’-3’) VIT_05s0020g02480 GS CTGTCTCCCTTGCTCCCTCTC GGAGTCACTGGAAATGGGTTGAAC VIT_18s0001g03910 NR GCTGGTGTTCTGAATGATGGAG AAGACGACGCTAGGAGAGAAG VIT_03s0063g00370 NIR CTTGCCGAGGAAGTGGAATGTG GCATGTACGCCAGATCATTGATGT VIT_02s0154g00260 NPF6.3 CAGTTCTTATTGGTGGGTGC CCCTAATGAAAGTGTGCTCAAA VIT_06s0061g00320 NRT2.4a CCTCCCACCTTCAAAGGA CATGGGATGGTGTAGAGTTGG VIT_08s0040g01500 NRT2.4b AGGTGGGAACTTCGGATC TCTTTGGAGGGCGGTAGC VIT_17s0000g09470 NRT3 CTTGACATTGCTGCCGTTTG GGAAACAGTCATAGTGGCTAACTT VIT_14s0068g01690 TCP20 AGCTTCCTGGTTTGGAGCTG TGCCCCATCTGCTGGTAAATC VIT_17s0000g09790 BT2 GGTGAGGATGCAAGGTGGAA GATCCAGGGTCTGTCTTGGC VIT_18s0001g07900 ANR1 TGGAAAGCTCTATGATTACGCAAG CGTTGCCAGAACTTGACTTC VIT_07s0104g00270 IPT3 GAATCAATCCTCGGTCGAGG AGCACTCGTACCGGGACC VIT_14s0068g01330 AFB3 ACGTGTTCGACTTCCTGA GCCTGCTCCATTTCTCCA VIT_04s0079g00160 ARF8 CTTCAAGACTCGCCACTC TCACATCAGCATCACACC VIT_04s0008g01100 MAX1 GAGCCATCAAACGACATCCATGA CCTGAACCCTTAATCCAACGACT VIT_17s0000g10430 GAPDH CCACAGACTTCATCGGTGACA TTCTCGTTGAGGGCTATTCCA VIT_12s0035g01130 EF1γ CAAGAGAAACCATCCCTAGCTG TCAATCTGTCTAGGAAAGGAAG

Tableau 2. Liste des amorces utilisées.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

Les PCR quantitatives en temps réel ont été réalisées en utilisant du SYBR Green avec un iCycler iQH (Bio-Rad) en suivant les recommandations du fournisseur. L’expression relative des gènes a été calculée en utilisant la méthode 2-Ct (Livak and Schmittgen, 2001) avec comme gènes de références EF1 et GAPDH. La séquence du gène la plus proche du gène AtAFB3 chez la Vigne a été utilisée pour dessiner les amorces, il est annoté en tant qu’AFB2 (VIT_14s0068g01330). Pour l’homologue d’AtANR1 chez la Vigne, la recherche par BLASTX a donné deux séquences correspondantes. L’une d’elle, VIT_18s0001g07900, semble correspondre à la séquence pleine longueur d’ANR1 avec une séquence d’acides aminés déduite présentant 75,7% de similarité avec AtANR1 mais elle partage aussi beaucoup de similarités avec d’autres Agamous-like tels que AtAGL16 (79,4%), AtAGL21 (79,3%) et AtAGL17 (76,2%). L’autre séquence nucléotidique, VIT_03s0097g00160, semble correspondre à une séquence partielle d’ANR1 dont la séquence protéique déduite de 66 acides aminés présente une forte similarité (92,4%) avec le début de la séquence d’ANR1. Pour le suivi d’expression de gènes, les amorces ont été choisies pour être spécifiques à VIT_18s0001g07900. Les séquences des amorces sont listées dans le tableau 2.

Figure 1. Suivi de croissance in vitro de boutures de 1103P et RGM en condition de présence ou absence de source d’azote. A. Hauteur de la plante; B. Nombre de feuilles; C. Nombre de racines principales; D. Nombre de racines latérales des boutures de 1103P et RGM enregistrées durant 33 jours de culture en présence ou en absence d’azote. Les données représentent la moyenne ± erreur standard; n = 10. Pour le dernier temps de phénotypage, les lettres indiquent les differences significatives entre traitements (i.e. condition x genotype) determinées avec un test de comparaison multiple après un Kruskal-Wallis.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

III – EN REPONSE A LA DISPONIBILITE EN AZOTE, LES PORTE-GREFFES REGULENT DIFFEREMMENT LEUR

CROISSANCE RACINAIRE

III.1 – Résultats

III.1.a – Suivi de croissance avec ou sans source d’azote dans le milieu de culture

Des boutures racinées de 1103P et RGM ont été transférées dans des tubes de milieu élaboré à partir de la composition du McCown Woody Plant Medium contenant (HN, soit 15 mM de N) ou non (LN, soit 0 mM de N) de l’azote et cultivées durant 33 jours. Les boutures cultivées en condition HN ont atteint une hauteur d’environ 7 cm avec des plants présentant 6 feuilles en moyenne (Figure 1, A et B). Les plants en condition LN ont arrêté leur croissance aérienne au bout d’une semaine de culture chez les deux génotypes et atteint au maximum 2,5 cm. Le nombre de racines principales, plus élevé pour RGM que pour 1103P, n’a pas évolué au cours du temps quelle que soit la condition (Figure 1C). De manière intéressante, le développement des LR a été très différent entre les deux génotypes. Chez 1103P, le développement des LR a été favorisé vis-à-vis des racines principales, ce génotype présentant ainsi un nombre de LR plus élevé que RGM jusqu’à deux fois supérieur au bout de 33 jours de culture en condition LN (Figure 1D). D’autre part, il semblerait que la disponibilité en azote n’ait pas affecté le développement des LR chez 1103P avec environ 25 LR produites à la fin de l’expérimentation quelle que soit la condition azotée. Chez RGM, aucune LR ne s’est développée lors de la première semaine de culture. C’est finalement lors du 14ème jour de phénotypage que l’apparition des LR a pu être observée et ce, spécifiquement en condition LN. En fin d’expérimentation, RGM a produit des LR exclusivement dans ce milieu, la condition HN semblant inhiber ce processus. Ainsi, face à une variation de disponibilité en azote, cette expérimentation montre un développement racinaire dépendant du porte-greffe.

III.1.b – Suivi de croissance racinaire sur différentes concentrations d’azote

Comme observé lors de l’expérimentation précédente, avec une concentration de 15 mM d’azote, les deux génotypes de porte-greffe cultivés en boutures ont présenté des profils de développement racinaire différents. Pour étudier si ces réponses sont dépendantes de la concentration en azote, une gamme de concentrations a été effectuée. De plus, pour pallier une éventuelle différence en termes de réserves entre les deux génotypes, les plants ont tout d’abord été cultivés sans source d’azote pendant deux semaines. Après ces 14 premiers jours

Figure 2. Suivi de croissance en condition d’absence d’azote et transfert sur une gamme de concentrations d’azote. A. Hauteur de la plante; B. Nombre de feuilles; C. Nombre de racines principales; D. Nombre de racines latérales des boutures de 1103P et RGM enregistrées durant 14 jours de culture en absence d’azote. Les données représentent la moyenne ± erreur standard; n = 80. Panneau de droite. Les données de phénotypage des boutures de 1103P et RGM (E, F, G et H) ont été enregistrées après 14 jours (absence d’azote) et 28 jours de culture (2 semaines après transfert sur des milieux contenant différentes concentrations d’azote). Les données représentent la moyenne ± erreur standard; n = 5.

Résultats et Discussion – Chapitre 2 de croissance, les plants ont présenté des phénotypes identiques (Figure 2, Panneau de gauche) à ceux observés après la même durée de culture lors de la première expérimentation en condition LN, RGM présentant un nombre de racines plus important que 1103P et un nombre de LR 3 fois plus faible (Figure 2, C et D). Les plants ont ensuite été transférés sur des milieux contenant différentes concentrations d’azote 0 ; 0,25 ; 1 ; 3 ; 6 et 15 mM. Après 2 semaines de culture sur ces différents milieux, il semblerait que les plants issus du génotype RGM aient eu une meilleure capacité à croître en condition de faible disponibilité en azote avec une augmentation de la taille de l’explant et un nombre de feuilles plus élevé même avec un milieu contenant 0,25 mM d’azote (Figure 2, E et F). Après 28 jours de culture, le nombre de racines principales a été plus important pour RGM que pour 1103P (Figure 2G). D’autre part, le profil de développement des racines observé lors de la première expérimentation est confirmé, avec plus de 35 LR présentes chez 1103P quelle que soit la concentration en azote du milieu (Figure 2H). Chez RGM, il semblerait que le transfert des plants avec une concentration en azote à partir de 3 mM ait bloqué la production de LR (Figure 2H). Par ailleurs, le nombre « élevé » de LR à 6 mM vient principalement de la sélection des plants, présentant un nombre de LR important, lors du transfert. Les résultats de cette seconde expérimentation confirment les observations antérieures, 1103P produit un nombre élevé de LR comparé à RGM, et ce, indépendamment de la disponibilité en azote alors qu’une forte teneur en azote semble inhiber ce développement chez RGM.

III.1.c – 1103P et RGM présentent deux architectures racinaires distinctes

Afin de suivre plus précisément l’architecture racinaire et son développement, des boutures ont été mises à raciner en boites de pétri. Après 10 jours de culture en condition de forte teneur en azote, aucune différence significative n’a pu être observée concernant le nombre et la longueur des racines principales entre les deux génotypes (Figure 3, A et B). Cependant, concernant les LR, leur nombre par racine principale ainsi que leur longueur relative à celle des racines principales ont été significativement plus élevés pour 1103P par rapport à RGM (Figure 3, E et F). Ainsi, dans ce système de culture, les racines principales des deux porte- greffes se sont développées jusqu’à atteindre environ 7 cm au bout de 10 jours. Le développement racinaire de 1103P a conservé un profil particulier produisant continuellement des LR. L’analyse des images a aussi permis de mettre en évidence une

G H

1103P RGM

Figure 3. Suivi de l’architecture racinaire de boutures de 1103P et RGM cultivées sur boîtes de Pétri. Les plants ont été cultivés pendant 10 jours sur boîte de Pétri et leur système racinaire a été scanné tous les 2 jours durant cette période. A. Nombre de racines principales, B. Longueur de racines principales, C. Nombre de racines latérales, D. Longueur de racines latérales, E. Nombre de racines latérales par nombre de racines principales, F. Longueur de racines latérales par centimètre de racines principales au bout de 10 jours de culture avec la moyenne ± erreur standard; n = 3. Les astérisques illustrent les différences significatives obtenues avec un test de Student ***(P < 0,001). Photos représentatives des génotypes 1103P (G) et RGM (H) au bout de 5 jours de culture.

Résultats et Discussion – Chapitre 2 différence d’inclinaison des racines principales, 1103P présentant un système « plongeant » contrairement à RGM dont les racines sont plutôt « rampantes » (Figure 3, G et H).

III.2 – Discussion

La régulation de la croissance et la morphologie du système racinaire fait partie des mécanismes adaptatifs de réponse à la disponibilité édaphique en azote. Il a été observé que les deux porte-greffes de l’étude ont un comportement très distinct concernant ce paramètre. Alors que le génotype RGM semble réguler l’architecture de son système racinaire en fonction de la disponibilité en azote, l’analyse des résultats suggère que 1103P ne présente pas cette caractéristique. Lorsque le contenu en azote du sol est limitant, la croissance des LR a été induite pour RGM alors qu’une production continue a été observée chez 1103P. Ces observations sont en concordance avec les résultats présentés dans le chapitre 1. Lorsque la disponibilité en azote varie, la reprogrammation du transcriptome du porte-greffe RGM a été beaucoup plus prononcée que chez 1103P. Cette réponse pourrait ainsi impliquer a posteriori, une régulation de la croissance de son système racinaire alors que la ramification du système racinaire de 1103P semble ne pas être influencée par la concentration externe en azote. De plus, l’aspect rampant des racines de RGM suggère la nécessité de production de LR afin d’augmenter et d’agrandir sa surface de prospection pour l’acquisition des ressources azotées. Chez Arabidopsis, la littérature montre que la prolifération des LR en conditions d’apport homogène en azote est induite lorsque le contenu pour ce nutriment est limitant (Gruber et al., 2013; Nacry et al., 2013; Giehl and von Wiren, 2014). L’étude des acteurs impliqués dans cette réponse pourrait permettre de mieux comprendre les deux stratégies de croissance racinaire adoptées par 1103P et RGM. Dans cet objectif, il apparaît intéressant d’étudier l’expression de gènes connus pour leur rôle dans la régulation du développement racinaire en réponse à la disponibilité en azote.

Figure 4. Suivi d’expression génique dans les racines de boutures de 1103P et RGM cultivées in vitro sur gamme d’azote. Lors du transfert des plants sur les différents points de la gamme d’azote, des racines des porte-greffes 1103P et RGM ont été prélevées au bout de 3 heures. Les profils d’expression des gènes NIR (A), NRT2.4a (B), NRT3 (C), NPF6.3 (D), ANR1 (E), IPT3 (F), AFB3 (G), ARF8 (H), MAX1 (I), TCP20 (J) et BT2 (K) ont été suivis. Les données d’expression sont représentées en relatif par rapport aux gènes de référence EF1γ et GAPDH, moyenne ± erreur standard; n = 3.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

IV – LES GENES IMPLIQUES DANS LA REGULATION DEVELOPPEMENTALE DU SYSTEME RACINAIRE EN

REPONSE A LA DISPONIBILITE EN AZOTE PRESENTENT DES PROFILS DIFFERENTS EN FONCTION DU PORTE-

GREFFE

IV.1 – Résultats

IV.1.a – Suivi d’expression génique lors du transfert sur gamme de concentrations d’azote

Après 14 jours de culture en condition LN, des plants des génotypes 1103P et RGM ont été transférés sur une gamme composée de plusieurs concentrations en azote (NH4NO3 et

Ca(NO3)2) et un suivi d’expression de gènes a été réalisé sur des racines prélevées 3 heures après le transfert. Chez les deux génotypes, l’expression du gène NIR a augmenté de manière proportionnelle à la quantité d’azote dans le milieu entre 0 et 1 mM, puis son expression semble atteindre un plateau lorsque la concentration dépasse les 3 mM (Figure 4A). L’expression du gène NPF6.3 a suivi un profil similaire (Figure 4D) tandis que l’induction de l’expression du gène NRT3 a augmenté chez les deux génotypes jusqu’à 15 mM (Figure 4C). De manière intéressante, les valeurs d’expression relative qui semblaient être plutôt similaires entre les deux génotypes pour ces 3 gènes, sont plus élevées chez RGM par rapport à 1103P pour le gène NRT2.4a (Figure 4B). L’expression de l’homologue d’ANR1 chez la Vigne ne semble pas avoir été affectée par la concentration en azote et le taux de transcrits a été supérieur chez 1103P par rapport à RGM quelle que soit la concentration (Figure 4E). Des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des cytokinines (IPT3) et de signalisation des auxines (AFB3 et ARF8) ont aussi été étudiés. Pour ces trois gènes, les valeurs d’expression ont été plus élevées pour le génotype 1103P cependant aucune influence de la teneur en azote n’a pu être observée pour ce porte-greffe (Figure 4, F-H). De manière intéressante, chez RGM, les profils d’expression des gènes IPT3 et ARF8 ont été retrouvés positivement corrélés à l’augmentation de la teneur en azote (Figure 4, F et H). Pour la voie des strigolactones, le suivi d’expression du gène MAX1, acteur intervenant dans l’une des dernières étapes de la voie de la biosynthèse de ces hormones, a été réalisé. Suite aux 14 jours de culture en condition LN, son expression relative a été retrouvée environ 6 fois plus importante chez RGM que chez 1103P (données non présentées). Après le transfert sur les différents points de la gamme, le taux de ses transcrits a diminué et reste plus élevé chez RGM que chez 1103P. Chez RGM, l’expression de MAX1 est globalement plus importante à faible concentration (entre 0 et 1 mM) qu’à forte teneur en N (Figure 4I). En ce qui concerne le niveau d’expression de TCP20, il

Figure 5. Étude de profils d’expression au cours d’une expérimentation de type split-root réalisée en serre. Les profils d’expression des gènes NIR (A), NRT2.4a (B), NRT3 (C), NPF6.3 (D), ANR1 (E), IPT3 (F), AFB3

(G), ARF8 (H), MAX1 (I), TCP20 (J) et BT2 (K) ont été suivis dans les pointes racinaires provenant de CS/1103P ou CS/RGM soumises à un apport homogène en azote C.LN et C.HN ou un apport hétérogène Sp.LN et Sp.HN. Les données d’expression sont représentées en relatif par rapport aux gènes de référence EF1γ et GAPDH, moyenne ± erreur standard; n = 3.

Résultats et Discussion – Chapitre 2 n’a pas été influencé par la teneur en azote ni par le génotype (Figure 4J), alors que l’augmentation de l’accumulation des transcrits du gène BT2 a pu être positivement corrélée à la disponibilité en azote chez les deux génotypes (Figure 4K). Ainsi, alors qu’une réponse commune à la disponibilité en azote semble être partagée chez les deux génotypes, certaines spécificités notamment concernant les gènes impliqués dans la signalisation hormonale ont pu être observées chez RGM uniquement.

IV.1.b – Suivi d’expression en réponse à une disponibilité hétérogène en azote

Une expérimentation de type split-root a été menée en serre en utilisant des plants greffés. Après acclimatation, les combinaisons CS/1103P et CS/RGM ont été soumises à un apport hétérogène en azote avec l’ajout d’une solution enrichie en nitrate HN à 5 mM d’un côté du système racinaire (Sp.HN) en parallèle d’une irrigation avec une solution contenant peu de nitrate LN à 0,8 mM de l’autre côté (Sp.LN). Des témoins ont aussi été intégrés à l’étude, avec un apport homogène des deux côtés du système soit avec la solution HN (C.HN), soit avec la solution LN (C.LN). Afin d’effectuer les suivis d’expression de gènes, des prélèvements de pointes racinaires ont été effectués 0 ; 0,5 ; 3 et 24 heures post-traitement.

Comme observé lors de l’étude du transcriptome des deux génotypes en réponse à une distribution hétérogène en azote (Chapitre 1), l’expression du gène codant la NIR a été plus élevée dans les racines en condition Sp.HN par rapport à Sp.LN dans les deux combinaisons (Figure 5A). De manière surprenante, en condition homogène, ce gène a été exprimé quelle que soit la condition (i.e. C.LN ou C.HN) à un niveau équivalent à la condition Sp.HN. Ceci laisse penser que son expression a été réprimée du côté Sp.LN lors de l’apport hétérogène.

L’expression des gènes NRT2.4a et NRT3 a été spécifiquement induite par l’apport hétérogène en azote par rapport aux conditions C.LN et C.HN et ce, dès 3 hpt chez CS/RGM et à 24 hpt chez les deux génotypes (Figure 5, B et C).

L’expression du gène NPF6.3 a été induite par un apport hétérogène en azote chez les deux génotypes, dès 3 hpt pour CS/RGM et après 24 heures pour CS/1103P (Figure 5D). Contrairement aux résultats obtenus lors des essais de split-root du chapitre 1, le différentiel observé entre Sp.HN et Sp.LN n’est pas significatif. L’apport homogène C.HN n’a engendré l’induction de ce gène que chez CS/RGM (Figure 5D).

Résultats et Discussion – Chapitre 2

Chez CS/1103P, une augmentation du taux de transcrits correspondant ANR1 a été observée au bout de 0,5 et 3 heures après traitement dans les conditions C.LN et Sp.HN (Figure 5E). Après 24 heures de traitement, l’expression de ce gène est restée plus importante dans les racines des plants en condition d’apport hétérogène que dans celles en condition homogène. Chez CS/RGM, l’expression d’ANR1 a été plus forte en condition hétérogène de disponibilité en azote au bout de 0,5 et 3 heures par comparaison aux conditions homogènes.

Les gènes codant des protéines impliquées dans les voies des cytokinines ou de la signalisation en réponse à l’auxine tels que IPT3, AFB3 et ARF8, ont été plus fortement exprimés chez CS/1103P par rapport à CS/RGM (Figure 5,F-H), comme cela a été observé précédemment en culture in vitro (Figure 4F-H). Il est intéressant de noter que le gène IPT3 semble avoir été régulé négativement en condition Sp.LN chez les deux génotypes avec un établissement de cette répression plus précoce chez CS/RGM, dès 3 hpt (Figure 5F). Ce profil semble d’ailleurs avoir été conservé concernant CS/RGM pour les gènes AFB3 et ARF8 (Figure 5, G et H). Pour la combinaison CS/1103P, il semblerait que seules les conditions d’apport homogène en azote aient permis d’induire l’expression de ces deux gènes. Ainsi à 3 hpt, les taux de transcrits sont beaucoup plus faibles des deux côtés des plants soumis à un apport hétérogène (Sp.LN et Sp.HN) par rapport aux témoins C.LN et C.HN. A 24 hpt, une accumulation prononcée des transcrits des gènes AFB3 et ARF8 a été retrouvée en conditions C.HN chez CS/1103P et est restée aussi plus importante en C.LN par rapport aux plants soumis à l’apport hétérogène.

Le suivi d’expression du gène MAX1 a permis de mettre en évidence une plus forte accumulation de transcrits dans les racines de CS/RGM par rapport à CS/1103P quelle que soit la condition observée (Figure 5I), confirmant les résultats précédents. Une légère augmentation du taux de transcrits a eu lieu à 0,5 hpt en condition hétérogène et ce, quel que soit le côté, Sp.LN et Sp.HN, chez les deux génotypes. Au bout de 24 hpt, l’expression de ce gène est plus faible en conditions Sp.HN et C.HN chez CS/1103P et CS/RGM par rapport aux conditions limitées en azote (Sp.LN et C.LN).

En ce qui concerne le profil d’expression de TCP20, son niveau d’expression est resté relativement stable quelle que soit la condition, ce qui est concordant avec les résultats précédents (Figure 5J). Une plus faible expression a été observée chez CS/1103P à 0 hpt par rapport à CS/RGM, mais elle doit être confirmée.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

A propos du gène BT2, un fort taux d’induction a été observé quelle que soit la condition ou le génotype au bout de 3 heures de traitement, puis, après 24 heures, les niveaux de transcrits ont diminué pour les conditions C.LN et Sp.LN comparés aux échantillons provenant de racines irriguées avec la solution HN (Figure 5K). Bien que ce gène ait été suggéré comme un gène central dans un module associé à la réponse de CS/RGM à l’apport hétérogène en azote, aucune différence n’a pu être mise en évidence entre les deux génotypes lors de cette expérimentation. Le profil d’expression a été particulièrement bien conservé dans les deux combinaisons que ce soit en termes de temps d’induction ou de niveau d’expression.

IV.2 – Discussion

Les différences de croissance racinaire observées précédemment pourraient être la conséquence d’une régulation locale différente en réponse à la disponibilité en azote. Ainsi, en fonction du porte-greffe, les signaux de réponse à la disponibilité en azote peuvent différer et engendrer une réponse systémique contrastée.

Pour étudier les réponses des deux génotypes à différentes concentrations en azote, les profils d’expression d’un ensemble de gènes ont été suivis sur des racines de plantes issues de culture in vitro après transfert sur des milieux présentant des concentrations d’azote de 0 à 15 mM. Cette expérimentation a mis en évidence, chez les deux génotypes de porte-greffe, un seuil de concentration en N (3 mM) à partir duquel une réponse maximale est observée à travers le suivi d’expression du gène NIR. De manière intéressante, ce seuil de concentration semble aussi s’appliquer pour l’expression du gène NRT2.4a mais ce, uniquement chez RGM. En concordance avec les résultats obtenus dans le chapitre 1, l’induction de ce gène est plus forte chez ce génotype 3 heures après traitement. De plus, ces résultats suggèrent que NRT2.4a chez la Vigne suivrait plutôt un profil similaire à NRT2.1 d’Arabidopsis. Sachant que ce dernier, indépendamment de son rôle dans la réponse au nitrate, est aussi capable de contrôler le développement des LR (Little et al., 2005; Remans et al., 2006b), il serait très intéressant d’effectuer des expérimentations supplémentaires pour caractériser sa fonction chez la Vigne. Ce gène pourrait assurer un rôle majeur dans les différences de développement racinaire observées chez les deux génotypes de porte-greffe en réponse à la disponibilité en azote et son induction préférentielle chez RGM en présence d’une forte teneur en azote pourrait être à l’origine de la répression du développement de ses LR. En ce qui concerne les gènes liés aux hormones, IPT3 a été étudié durant cette expérimentation et un profil particulier a pu être

Résultats et Discussion – Chapitre 2 observé. En effet, l’induction de son expression est corrélée à l’augmentation de la teneur en azote uniquement chez RGM. Sachant que ce gène a été suggéré comme intégrateur du statut nutritif de la plante (Kiba et al., 2011), les résultats de la présente étude suggèrent que la période de carence qui a précédé le transfert sur gamme d’azote aurait plus particulièrement affecté le contenu en azote des plantules du génotype RGM que celui des plants de 1103P. Afin de mettre en évidence des éventuelles différences de contenus en cytokinines chez les deux génotypes, il serait intéressant d’en effectuer le dosage en parallèle d’un dosage de l’azote total contenu dans ces plantes. De plus, ces hormones ont une influence négative sur le développement des LR (Laplaze et al., 2007) et pourraient ainsi participer aux phénotypes contrastés de développement racinaire observés entre les deux porte-greffes. D’autre part, concernant la voie des auxines, il a été observé que l’expression du gène ARF8 a aussi suivi une induction d’expression proportionnelle à la concentration en azote chez RGM. Ce résultat est concordant avec ce qui est observé chez Arabidopsis. En effet, la glutamine ou les métabolites produits en aval inhibent l’accumulation du microARN miR167a, ce qui in fine, permet la levée d’inhibition d’ARF8 (Gifford et al., 2008). Encore une fois, c’est en corrélation avec l’augmentation de la teneur en azote du milieu que l’expression de ce gène augmente chez RGM. Enfin, concernant la voie des strigolactones, il semblerait que l’expression du gène MAX1, impliqué dans la voie de biosynthèse de ces hormones, soit plus élevée chez RGM par rapport à 1103P cependant la corrélation de cette expression avec la concentration en azote du milieu reste à confirmer.

L’influence directe de la concentration du milieu avec la réponse de RGM suggère que son niveau de réserves azotées ou l’utilisation de celles-ci sont réduits par rapport à 1103P. Ceci sous-entendrait une utilisation directe des ressources azotées du milieu par RGM à défaut de ses réserves impliquant alors une modification d’expression des gènes impliqués plus importante. L’ensemble de ces résultats a permis de souligner la présence d’acteurs hormonaux agissant de manière spécifique au génotype et ou à la teneur en azote. En culture in vitro, les résultats dépendants de chaque porte-greffe confirment l’importance du génotype sélectionné dans la régulation du développement du système racinaire ce qui, dans une plante greffée, pourrait assurer un rôle crucial dans le contrôle de la croissance du greffon en réponse à la disponibilité en azote.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

Pour mieux comprendre les répercussions que ces différences au niveau local ont sur la signalisation systémique mise en place par la plante en réponse à la disponibilité en azote et pour prendre en compte l’influence du contenu en réserves, une expérimentation de type split-root avec des plantes plus âgées a été réalisée. L’utilisation de ce système apparaît judicieuse car il permet d’identifier les acteurs spécifiquement impliqués dans la signalisation locale et/ou systémique. Dans notre cas, l’étude des acteurs déjà connus a été envisagée afin de mettre en évidence des différences éventuelles de leur régulation au cours de la perception des ressources azotées par les deux porte-greffes de l’étude.

La réponse de la plante à la disponibilité en nitrate fait intervenir des mécanismes de signalisation locale et systémique impliquant une régulation spatio-temporelle des gènes impliqués. Sur un pas de temps très court, de l’ordre de la minute, de nombreuses réponses sont déjà observables au niveau local chez Arabidopsis (Medici and Krouk, 2014). Ainsi, le premier temps de prélèvement utilisé lors des suivis d’expression de gènes qui ont été réalisés au cours de l’expérimentation en split-root au bout de 3 heures après traitement, suggère la coexistence de deux types de signaux. Les signaux locaux envoyés par les racines traduisant l’information à la partie aérienne quant à la teneur en azote présente dans le milieu extérieur et les signaux systémiques envoyés aux racines par la tige feuillée, régulant les gènes au niveau racinaire après intégration du statut azoté de la plante. Cependant, toujours chez Arabidopsis, des travaux ont pu montrer qu’au bout de 2 heures de traitement dans le cadre d’une expérimentation de type split-root, ce sont plutôt les signaux locaux qui sont présents puis après 8 heures, la signalisation systémique prédomine (Li et al., 2014).

Les profils d’expression de gènes dits « sentinelles » ont été suivis. Ces gènes sont connus dans la littérature pour être régulés de manière locale mais aussi par des signaux systémiques relatifs à l’azote (Ruffel et al., 2008; Ruffel et al., 2011). De manière intéressante, l’expression du gène NIR a suivi un profil quasi identique à celui observé durant l’expérimentation de split- root menée dans le chapitre 1. Les témoins ajoutés à cette expérimentation ont aussi permis d’illustrer la spécificité de réponse à l’apport hétérogène. De plus, de manière surprenante, les réponses en conditions C.LN et C.HN ont été similaires suggérant qu’un apport d’azote sous forme de nitrate à 0,8 mM est suffisant pour induire l’expression de ce gène dans la condition C.LN. Cependant en condition hétérogène, le différentiel de concentrations entre les solutions

Résultats et Discussion – Chapitre 2

LN et HN a tout de même permis d’observer une nette différence soulignant une réponse spécifique à l’apport localisé de nitrate.

Le gène NRT2.1 fait aussi partie des gènes dits « sentinelles ». Son profil d’expression est connu pour être similaire à celui du gène NRT3.1 (Krouk et al., 2006). Dans le chapitre 1, il a été suggéré d’après son profil d’expression que le gène NRT2.4a pourrait être un homologue d’AtNRT2.1. Lorsque la teneur en nitrate varie, l’expression des gènes NRT2.4a et NRT3 suivent effectivement des profils similaires lors du split-root. De plus, la régulation plus précoce de ces gènes en conditions hétérogènes chez CS/RGM confirme aussi l’hypothèse selon laquelle les deux génotypes répondraient à la disponibilité en azote sur des pas de temps différents.

La réponse à la disponibilité en nitrate est connue pour faire intervenir la signalisation hormonale (Krouk, 2016). Parmi les nombreux acteurs connus, les cytokinines ont été mises en avant pour leur rôle en tant que messager du signal nitrate capable de contrôler la croissance aérienne (Takei et al., 2004; Rahayu et al., 2005; Sakakibara et al., 2006), régulatrices du transport et de l’assimilation du nitrate et plus récemment pour leur implication dans la signalisation systémique des racines vers la tige feuillée lorsque la plante perçoit une disponibilité en nitrate hétérogène (Ruffel et al., 2016). Le suivi d’expression du gène IPT3, impliqué dans la biosynthèse des cytokinines, a permis de mettre en évidence une réponse dépendante du génotype. L’induction de son expression par rapport au début de l’expérimentation (0 hpt) beaucoup plus prononcée dans la combinaison impliquant le porte- greffe 1103P suggère un rôle important de cette voie hormonale chez ce génotype. Cependant, la multitude de rôles attribuée aux cytokinines dans les racines ne permet pas de conclure que cette différence de réponse provient uniquement de la perception de la disponibilité en nitrate. Aussi, il est important de noter, malgré la différence de valeurs d’expression relative, que les deux génotypes ont présenté des profils similaires 24 heures après traitement. Contrairement à IPT3, l’expression de MAX1, comme pour l’expérimentation sur gamme d’azote, a été beaucoup plus prononcée chez le porte-greffe RGM. Malgré ce différentiel, un profil similaire a pu être constaté entre les deux génotypes avec une répression plus prononcée de son expression au bout de 24 heures de traitement en condition non-limitante d’azote. De manière intéressante, ces résultats suggèrent que le ratio de production entre les cytokinines et les strigolactones est dépendant du porte-greffe, tout

Résultats et Discussion – Chapitre 2 du moins l’expression des gènes impliqués dans leur biosynthèse semble être régulée de manière opposée. Cependant, il demeure encore une fois difficile d’interpréter ces résultats préliminaires sans avoir de données quantitatives à l’appui.

La voie des auxines a aussi été abordée au cours de ces travaux à travers le suivi d’expression des gènes AFB3 et ARF8. Ces deux gènes sont connus pour réguler le développement du système racinaire notamment des LR en réponse à la disponibilité édaphique en azote (Gifford et al., 2008; Vidal et al., 2010). Comme pour IPT3, le gène AFB3 semble avoir été induit de manière plus prononcée dans les racines de la combinaison CS/1103P alors que le gène ARF8 ne semble pas avoir suivi de profil dépendant du génotype. Ainsi, même s’il est difficile de s’exprimer sur le rôle de ces gènes dans la réponse à la disponibilité en nitrate chez la Vigne, cette étude préliminaire a permis de mettre en évidence que leur niveau d’expression dépend du génotype de porte-greffe.

Au vu des résultats de transcriptomique obtenus dans le chapitre 1, nous avons aussi décidé de suivre deux gènes régulateurs majeurs, BT2 et TCP20. Dans des travaux précédents, il a été montré qu’en fonction du porte-greffe, l’efficacité d’utilisation de l’azote (NUE) de plants greffés était modifiée (Lecourt, 2013). Dans ce contexte, CS/1103P aurait la capacité d’augmenter de manière plus prononcée sa NUE au cours d’une diminution de la disponibilité azotée comparé à CS/RGM. Au regard du rôle de BT2 mis en évidence récemment (Araus et al., 2016), il apparaît ainsi possible que ce gène soit régulé différentiellement dans les deux porte-greffes. Que ce soit en culture in vitro lors d’un transfert sur une gamme de concentrations d’azote ou en serre lors d’une expérimentation de type split-root, il a été observé que l’expression du gène BT2 était positivement et étroitement corrélée à la teneur en azote. Cependant, cette réponse n’a pas semblé être différente entre les deux génotypes de porte-greffes 1103P et RGM en culture in vitro ou entre les deux combinaisons CS/1103P et CS/RGM en serre. L’étude qui a permis de mettre en évidence les différences de NUE dépendantes du porte-greffe a été réalisée sur des plantes cultivées pendant 30 jours en conditions contrastées pour la teneur en azote. Ceci suggère que l’absence de différence d’expression du gène BT2 entre les deux porte-greffes de notre étude pourrait provenir de la différence de pas de temps de l’expérimentation. A ce sujet, Araus et al. (2016) ont montré que l’influence de BT2 (et son homologue BT1) sur la NUE est dépendante du stade de développement de la plante. De par la nature pérenne de la Vigne, la contribution de BT2 dans

Résultats et Discussion – Chapitre 2 la régulation de l’absorption de l’azote pourrait s’exprimer différemment par rapport à une plante annuelle. D’autre part, les paramètres de NUE entre ces deux études n’ont pas été calculés de la même manière et il apparaît donc difficile de les comparer. Par ailleurs, même si cet aspect n’a pas été abordé dans l’article d’Araus et al. (2016), il semblerait d’après leur résultat que BT1 et BT2 jouent un rôle important dans le contrôle de la croissance racinaire étant donné que le mutant bt1/bt2 présente un nombre de LR beaucoup plus élevé que le témoin Col-0 x Ler. Les résultats obtenus au cours de la présente étude semblent donc être cohérents avec ce phénotype, une augmentation d’expression de BT2 corrélée avec la teneur en azote du milieu en culture in vitro suggère une inhibition graduelle de la prolifération des LR. Cependant, le nombre important de LR pour 1103P quelle que soit la concentration d’azote en culture in vitro suggère que son action sur ce processus développemental est plutôt indirecte.

Afin d’assurer leur croissance et leur survie pendant plusieurs années, les plants de Vigne greffés développent un système racinaire ramifié couvrant une large surface de prospection (Richards, 1983; Keller, 2015). Pour garantir un développement optimal de la plante entière, le développement de ces organes souterrains est régulé par des mécanismes de signalisation systémique qui prennent en compte le statut nutritif de la plante entière. En réponse à la disponibilité en nitrate, Guan et al. (2014) ont montré que le facteur de transcription TCP20 joue un rôle majeur dans les mécanismes de signalisation systémique qui dirige la prolifération préférentielle du système racinaire. En effet, il serait impliqué dans le développement des LR dans le côté du système racinaire qui perçoit une forte teneur en nitrate dans des conditions où le système racinaire perçoit aussi une concentration faible pour ce nutriment (split-root). Sachant que 1103P produit des LR en culture in vitro indépendamment de la teneur en azote contrairement à RGM, il est concevable que la régulation de ce gène soit différente entre ces deux génotypes. Son expression a été suivie dans les deux génotypes de porte-greffe lors du transfert sur gamme d’azote. Il a été observé, en concordance avec littérature, que son expression n’est pas influencée par la concentration d’azote cependant aucune différence n’a pu être observée en comparant les génotypes. Dans l’expérimentation de type split-root, en comparaison à son expression avant traitement (0 hpt), son expression a été induite chez CS/1103P alors qu’elle est restée stable voire réprimée chez CS/RGM. Pour compléter ces

Résultats et Discussion – Chapitre 2 résultats, il serait intéressant d’étudier l’expression de ce gène dans la partie aérienne de la plante.

Pour le gène ANR1, deux gènes homologues potentiels chez la Vigne ont été identifiés en utilisant la séquence protéique d’Arabidopsis. Le suivi d’expression a été réalisé en utilisant des amorces qui ciblent l’un de ces deux homologues, VIT_18s0001g07900. Contrairement à ce qui a pu être observé chez Arabidopsis (Zhang and Forde, 1998), l’expression de l’homologue d’ANR1 chez la Vigne ne semble pas être influencée par la disponibilité en azote chez les deux génotypes de porte-greffe. Des amorces consensus permettant d’amplifier les ADNc des deux gènes ont donné les mêmes résultats. Ceci suggère une fonction potentiellement différente de l’homologue d’ANR1 chez la Vigne et/ou une régulation transcriptionnelle qui n’est pas similaire entre la Vigne et Arabidopsis, ou que les conditions expérimentales n’ont pas permis de mettre en évidence des variations d’expression attendues.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

V – CONCLUSION ET PERSPECTIVES

L’étude architecturale racinaire et les suivis d’expression de gènes abordés au cours de ce chapitre ont permis de mettre en évidence des réponses contrastées en fonction du génotype de porte-greffe. L’étude de ces gènes a permis de valider les résultats observés au cours du chapitre 1 et d’ajouter de nouvelles hypothèses vis-à-vis des mécanismes de régulation impliqués dans le contrôle de la croissance du greffon en fonction du porte-greffe notamment en ce qui concerne la signalisation hormonale. En effet, les deux génotypes de l’étude semblent réguler différemment les gènes liés aux auxines et aux cytokinines. De plus, il semblerait que la régulation du développement des LR soit dépendante du génotype. Pour mieux comprendre ces observations, il serait intéressant d’effectuer d’autres séries d’expérimentations en culture in vitro impliquant des systèmes split-root. L’utilisation de plantes greffées devra aussi faire l’objet d’études supplémentaires notamment pour caractériser l’influence du greffon sur le développement racinaire du porte-greffe. L’interprétation des suivis de profils d’expression a permis de mettre en évidence des résultats intéressants mais d’autres expérimentations sont nécessaires car pour le moment, il apparaît complexe de comparer les combinaisons de l’expérimentation de type split-root réalisée en serre avec comme source d’azote du nitrate seul avec les boutures issus de culture in vitro nourris avec du nitrate et de l’ammonium. De plus, les contenus en réserves azotées des plants entre ces deux expérimentations sont certainement différents. Concernant les suivis d’expression de gènes, cette étude ne représente qu’une approche préliminaire. Pour des gènes tels que BT2 ou TCP20, les suivis d’expression au niveau racinaire doivent être complétés par une étude au sein de la partie aérienne étant donné que ces gènes sont impliqués dans l’intégration du signal azote de la plante entière. De plus, l’expression des gènes de l’étude, notamment concernant les hormones, n’est pas forcément directement liée à l’activité des protéines qu’ils codent. La nécessité des dosages hormonaux est donc primordiale. Enfin, pour avoir une vision globale des réponses de 1103P et RGM en réponse à la disponibilité en azote, des expérimentations de marquages au 15N devront être envisagées.

Concernant les différentes sources d’azote, il apparaît primordial d’élucider les capacités des deux porte-greffes quant à leur utilisation. Dans un contexte de culture au vignoble, les plants de Vigne sont en contact avec ces deux formes d’azote et présentent peut être des capacités intrinsèques différentes d’absorption de ces ressources azotées.

Résultats et Discussion – Chapitre 2

En conclusion, la réponse à la disponibilité en nutriments au niveau racinaire et la régulation du développement de la plante entière qui s’en suit évoque clairement l’intérêt majeur de l’étude de la signalisation hormonale chez les porte-greffes. Parmi ces hormones, une étude plus approfondie des résultats obtenus au cours du chapitre 1 a permis de mettre en évidence, en concordance avec les résultats présentés dans ce chapitre, l’induction spécifique d’une classe hormonale chez CS/RGM en réponse à la faible teneur en azote, les strigolactones, qui font l’objet d’une investigation plus approfondie dans le chapitre suivant.

Résultats et Discussion – Chapitre 3

Chapitre 3. Le rôle des strigolactones dans le contrôle du développement du greffon par le porte-greffe

I. INTRODUCTION

Tout d’abord mises en évidence pour leur rôle en tant que stimulants de la germination d’Orobanche et de Striga chez différentes espèces, il a ensuite été démontré que les strigolactones sont capables d’assurer de multiples rôles dans le développement d’une plante. Leur implication dans l’établissement des symbioses mycorhiziennes et leur capacité de régulation de la croissance racinaire et aérienne font des acteurs de cette classe hormonale des candidats très intéressants dans le cadre de l’étude du contrôle du développement du greffon par le porte-greffe chez la Vigne. De plus, la régulation de leur biosynthèse par la disponibilité en nutriments dans le sol, notamment la limitation du contenu en azote, souligne l’intérêt de leur étude. Les résultats obtenus au cours du chapitre 1 ont d’ailleurs permis de mettre en évidence que la régulation de cette voie hormonale au niveau racinaire était différente chez les combinaisons CS/1103P et CS/RGM en réponse à une disponibilité hétérogène en nitrate.

L’étude des strigolactones chez la Vigne a donc été entreprise et est présentée dans ce dernier chapitre. Le contenu de celui-ci correspond à un article que nous souhaitons soumettre à Plant, Cell & Environment et qui est en cours de préparation. En effet, certaines expérimentations sont encore en cours. Les expérimentations concernant les cultures cellulaires que ce soit le suivi d’expression génique ou les bio-essais avec les graines de plantes parasites ont été répétées afin de valider les résultats déjà obtenus. Les prélèvements d’exsudats racinaires issus de la dernière série d’hydroponie, concernant les combinaisons CS/1103P et CS/RGM en réponse à la disponibilité en azote, ont eux aussi été récemment déposés sur plaques pour tester leur capacité à induire la germination de Phelipanche ramosa. De plus, ces prélèvements d’exsudats ont été dilués en série pour évaluer l’aspect quantitatif de la production de strigolactones éventuelles en fonction du porte-greffe utilisé.

Le résumé de l’article, qui doit être complété, n’a donc pas été présenté car de nombreux résultats sont encore en cours d’acquisition.

Résultats et Discussion – Chapitre 3

II. ARTICLE

Title page

Title: Role of strigolactones in the control of the shoot branching in grafted grapevine

Running title: strigolactones in grafted grapevines

Noé Cochetel1, Eloïse Météier4, Isabelle Merlin-Bussy1, Cyril Hévin1, Jean-Bernard Pouvreau2, Pierre Coutos-Thévenot3, Philippe Vivin1, Sarah Jane Cookson1, Nathalie Ollat1, Virginie Lauvergeat1*

1EGFV, Bordeaux Sciences Agro, INRA, Université de Bordeaux, 33140 Villenave d’Ornon, France

2LBPV, Laboratoire de Biologie et de Pathologie Végétales EA 1157, SFR 4207 QUASAV, Nantes University, 44322 Nantes, France

3SEVE, Laboratoire Ecologie et Biologie des Interactions, UMR CNRS 7267, Université de Poitiers, Poitiers, France 4Laboratoire Vigne Biotechnologie et Environnement EA 3991, 68000 Colmar, France

Emails: Noé Cochetel: [email protected]; Eloïse Météier: [email protected]; Isabelle Merlin-Bussy: [email protected]; Cyril Hévin: [email protected]; Jean- Bernard Pouvreau: [email protected]; Pierre Coutos-Thévenot: [email protected]; Philippe Vivin: [email protected]; Sarah Jane Cookson: [email protected]; Nathalie Ollat: [email protected]; Virginie Lauvergeat: [email protected]

Correspondence: Virginie Lauvergeat, EGFV, ISVV, 210 Chemin de Leysotte 33140 Villenave d’Ornon, France, e-mail: [email protected]

Résultats et Discussion – Chapitre 3

Introduction

Since they are sessile organisms, plants evolved several mechanisms in order to survive under environmental changes. Their high plasticity degree allows them to adjust their development in response to biotic and abiotic stresses. The control of the shoot branching is a representative example of such adaptive strategies. While their basic body plan was already established during the embryogenesis, their architecture and particularly the branching pattern can be adjusted in response to the environmental variations.

In grapevine, such as in other species which are cultivated grafted, these adaptive responses result from the communication between two different genotypes, the scion and the rootstock. Grafting is a practice commonly used in arboriculture and viticulture, and more than 70 woody perennial crops are propagated using that technique (Warschefsky et al., 2016). Added to its ability to cope with the soil environment constraints such as biotic and abiotic stresses, the rootstock genotype is selected for its influence on several agronomical traits such as dwarfing, precocity, productivity and fruit quality. Despite its worldwide utilization, the effect of the rootstock diversity and the molecular signalling occurring during the modulation of scion growth remains unclear. For example, in apple fruit trees, how dwarfing rootstocks modify the scion growth and particularly its architecture remains to be elucidate (Webster, 2002). Evidences suggest a complex interplay between hydraulic, nutritive and hormonal signals (Koepke and Dhingra, 2013; Tworkoski and Fazio, 2015). The use of rootstocks in viticulture is as much complex since to ensure an optimal balance between vegetative growth and berry quality, vine growers have to select the best scion-rootstock combination. Since the search of this equilibrium is a core concept in viticulture, many studies are performed to elucidate the communication established between the scion and the rootstock. It is well known that depending on the rootstock genotype, the scion vegetative growth is impacted (Ollat et al., 2003; Zhang et al., 2016). However the mechanisms involved in such control of scion growth by the rootstock are still unknown. To ensure a harmonious growth of the whole plant, signals are exchanged between the aerial and the underground parts of the grafted grapevine taking into account the actual nutrient status of the whole plant and the perception of the external resources availability. Among the putative mechanisms which could explain a rootstock- dependent control of the scion growth in response to nutrient availability, hormone long distance signalling appears to be a major factor. Indeed, it has been previously showed that

Résultats et Discussion – Chapitre 3 the rootstocks can modulate several developmental traits in grafted grapevine such as the rate of ripening through the auxin pathway (Corso et al., 2016), many growth parameters via cytokinins (Nikolaou et al., 2000) or ABA-mediated responses to water deficit (Rossdeutsch et al., 2016). Thus, hormones represent graft-transmissible key players that potentially control differently the scion development depending on the rootstock genotype.

The control of the scion growth by the rootstock, often called conferred vigour, has been generally evaluated using pruning wood weight in the vineyard or by the shoot dry weight within controlled experimentations in which only one main stem was kept for the scion (Rives, 2000). So far, Vitis riparia cv. Riparia Gloire de Montpellier (RGM) and Vitis berlandieri x Vitis rupestris cv. 1103 Paulsen (1103P) rootstocks are known for their contrasted regulation of this vigour rating (Zhang et al., 2016). Based on this characteristic, it appears that 1103P allows a strong growth of the scion while RGM tends to limit its development. However, this statement is tightly dependent on how vigour rate is assessed and does not inform about the scion architecture and its development.

To investigate the mechanisms underlying the control of the scion growth by the rootstocks, we previously determined the root transcriptomic responses of two grapevine rootstocks (1103P and RGM), grafted with a same scion genotype, to a heterogeneous nitrogen (N) availability using a split-root system (Cochetel et al., submitted). Several co-regulated gene modules (clusters) were identified using a weighted gene co-expression network analysis (WGCNA). Some genes belonging to the strigolactone (SL) biosynthesis pathway were found in a module associated to the low nitrate treatment and they were more differentially expressed in the rootstock genotype conferring the lower scion growth. These results suggested a different regulation of the SL pathway in both genotypes in response to N availability.

SLs are known to be involved in several processes controlling plant development such as axillary bud outgrowth, internode elongation and regulation of the root architecture in response to the nutrient availability (Xie et al., 2010; Marzec et al., 2013; Waldie et al., 2014; Lopez-Obando et al., 2015; Pandey et al., 2016). They are mainly synthetized in the roots for a local action and move acropetally to control the shoot development in response to environmental conditions. As rootstock genotype constitutes the root system within a grafted plant, difference in SL biosynthesis and/or transport could contribute to the control of the 96

Résultats et Discussion – Chapitre 3 scion growth by the rootstock. To our knowledge, these molecules were not identified in grapevine yet, however, orthologues of genes encoding proteins involved in SL biosynthesis and signalling are actually present in the sequenced genome PN40024 (Vitis vinifera) (Jaillon et al., 2007) such as VvCCD7, VvCCD8 and VvMAX1 (Young et al., 2012) and corresponding contigs were found in 1103P and RGM transcriptomes (Cochetel et al., submitted).

The aims of the present study were i) to characterize the growth and architecture of the scion when grafted on the two genotypes, ii) to determine if the SLs could be involved in the rootstock-dependent processes that regulate the scion development in grapevine. Rootstock genotypes conferring low and high vigour (RGM and 1103P, respectively) were grown own- rooted or grafted in hydroponic cultures and in greenhouse and the phenotypic characterization of the growth parameters and shoot architecture was performed. These plants were submitted to different concentrations of N or phosphorus (P) supply and their developmental and root gene expression responses were analysed. Root exudate collections were also performed when plants were cultivated hydroponically. The results showed that both rootstocks exhibited different shoot architectures and regulated differently their growth depending on N availability. Expression of SL-related genes in roots and exudation of compounds able to induce germination of Orobanche seeds were regulated by P and N availability in both rootstocks genotypes. Grafting experiments suggested that signals derived from roots were partly responsible of this aerial phenotype.

Figure 1. Genes encoding enzymes of the strigolactone biosynthetic pathway are differentially regulated in roots of CS/RGM in a split-root experiment. Transcript levels are presented as heatmaps of mean values of RPKM for each condition as described in the map (bottom-left), n = 3 for each cell of the map. Three plants of each combination, CS/1103P or CS/RGM, were sampled at each time point, with two root samples per plant (LN and HN roots) for 3 and 24 hpt. Mean values of normalized expression ± SE obtained using qPCR were presented for CCD7, CCD8 and MAX1 genes, n = 3 biological replicates. PSY: PHYTOENE SYNTHASE, PDS: PHYTOENE DESATURASE, Z-ISO: ZETA-CAROTENE ISOMERASE, ZDS: ZETA-CAROTENE DESATURASE, Crt-ISO: PROLYCOPENE ISOMERASE, LCY-β: LYCOPENE BETA-CYCLASE, D27: DWARF27 (BETA-CAROTENE ISOMERASE), CCD7: CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 7 (9-CIS-BETA- CAROTENE 9',10'-CLEAVING DIOXYGENASE), CCD8: CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8 (ALL-TRANS-10'- APO-BETA-CAROTENAL 13,14-CLEAVING DIOXYGENASE), MAX1: MORE AXILLARY BRANCHES 1 (CYP711A1), LBO: LATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE, PDR1: PLEIOTROPIC DRUG RESISTANCE 1. Corresponding accession numbers are indicated in Supplementary Table S1. Résultats et Discussion – Chapitre 3

Results

SL-related gene expression is regulated in the roots of CS/RGM in response to N availability

A recent root transcriptomic study focused on the response of two rootstocks, 1103P and RGM, grafted with the same scion cultivar, Cabernet Sauvignon (CS), facing a heterogeneous N availability, highlighted a genotype-specific transcriptomic signature (Cochetel et al., submitted). In this split-root experiment, a differential expression analysis was performed

- between root side irrigated with a low N solution, LN (0.8 mM NO3 ; “LN roots”) and root side

- supplied with a solution containing a higher level of the same nutrient, HN (5 mM NO3 ; “HN roots”) at 3 and 24 hours post-treatment (i.e. addition of the HN solution on one root side). Interestingly, a weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) of these data identified a module eigengene (module “lightgreen”) positively associated to the LN roots (Cochetel et al., submitted). Some genes assigned to functional categories related to terpenoid, carotenoid and abscisic acid (ABA) metabolisms were present in this module and have been identified as genes encoding enzymes putatively involved in the biosynthesis of SLs.

A detailed analysis focused on SL-related genes was performed and RNAseq data were reported for these genes on Fig. 1. Interestingly, 12 genes putatively involved in the biosynthetic pathway of the SL precursor β-carotene and the SL compounds were found within the set of 385 genes showing a high correlation to this module (module membership value >0.7 and P-value <1.10-5) (Supporting Information Table S1). These genes were significantly differentially expressed only in CS/RGM with a higher transcript accumulation at 24 hpt in the LN roots compared to the HN roots (Fig. 1). These results were confirmed by qPCR experiments as CCD7, CCD8 and MAX1 genes showed a higher transcript level in the LN roots compared to the HN roots in RGM at 24 hpt (Fig. 1). Thus, the analysis of this specific module from an RNAseq experiment performed on CS/1103P and CS/RGM showed that SL-related genes were differentially regulated in roots submitted to an N heterogeneous availability in a genotype- dependent manner.

Functional characterization of grapevine SL-related genes

Even if orthologues of genes encoding proteins involved in SL synthesis, such as VvCCD7 and VvCCD8, have been previously identified in Pinot Noir grapevine genome (Young et al., 2012), they have never been functionally characterized in grapevine. The corresponding coding

A B

35S::CCD7 35S::CCD8 35S::CCD7 35S::CCD8 #4 #5 #1 #2 #4 #5 #1 #2

35S::CCD7 35S::CCD8 35S::CCD7 35S::CCD8 #4 #5 #1 #2 #4 #5 #1 #2 C

WT max3-11 35S ::CCD7 max4-1 35S ::CCD8 #4 #5 #1 #2

5 cm D

E F

Figure 2

Résultats et Discussion – Chapitre 3 sequences were cloned from cDNA obtained from root RNAs of both RGM and 1103P genotypes. Each sequence showed more than 97% identity to the corresponding Vitis vinifera sequences at nucleotidic level and more than 98% of identity at the amino acid level. Vitis amino acid sequences deduced from cDNA sequences exhibited around 60% of identity and 75% of similarity with Arabidopsis AtMAX3 and AtMAX4 proteins (data not shown).

To confirm whether these sequences encode proteins with similar function than those characterized in Arabidopsis, max3-11 and max4-1 knock-out mutants were complemented with the corresponding RGM sequences under the control of 35S promoter. The transcript levels of endogenous AtMAX3 or AtMAX4 and corresponding transgenes were confirmed by qPCR (Fig. 2A). Phenotypic analysis of two independent lines for each transformation compared to Col-0 and mutant lines showed that overexpression of RGM CCD7 or CCD8 in the corresponding mutant genetic background reverted as least partly the max3 or max4 phenotype (Fig. 2C). While both mutants genotype presented a significantly higher number of primary rosette (RI) and primary cauline (CI) branches compared to the WT (Fig. 2B), the transgenic lines followed a branching behaviour more similar to the WT. These phenotypes were correlated to the expression level of the transgene.

In parallel, the expression pattern of SL biosynthesis and signalling pathway genes was investigated in grafted grapevines cultivated in greenhouse (Fig. 2D). As expected, D27, CCD7, CCD8, MAX1 and PDR1 presented a higher expression in the roots than in stems and leaves. For the signalling pathway, it seemed that transcripts of the MAX2 putative orthologue were accumulated also in the roots while, D14 and BRC1 transcripts were accumulated preferentially in the aerial part of the plant.

Figure 2. Functional characterization of grape SL-related genes. A, B and C, Complementation of Arabidopsis max3-11 and max4-1 mutants with grape 35S::CCD7 or 35S::CCD8 genes, respectively. A, Quantification of endogenous (AtMAX3 or AtMAX4) and transgene (CCD7 or CCD8) transcript levels in WT (Col-0), mutants and two independent transgenic lines in corresponding mutant background. Data represent RT-qPCR results from RNA isolated from roots of 40 day-old seedlings. Means ± SE, n=3 (biological replicates). B, Number of primary rosette branches (RI) and primary cauline branches (CI) of Col-0, max3-11, max4-1 and transgenic lines. Data are presented as means ± SE; n = 10 (biological replicates). Letters indicate significant differences between genotypes as determined using a multiple comparison test after Kruskal-Wallis. C, Shoot branching phenotypes of Col-0, mutants and transgenic lines. D, Expression profiles of genes involved in SL biosynthesis (D27, CCD7, CCD8, MAX1), transport (PDR1) and signalling pathway (D14, MAX2, BRC1) in different organs of 3 month-old CS/1103P and CS/RGM plants cultivated in greenhouse with a low N content solution - (0.8 mM NO3 ). RT, root tips, R, roots, S, stem, L, leaves. Mean relative expression (qPCR) ± SE, n = 3 (biological replicates). E and F, Overexpression of grape D27, CCD7 and CCD8 genes in 41B suspension cells. E, Transcript levels of endogenous and transgenes in control and 35S::D27//35S::CCD7//35S::CCD8 transgenic cells (named triple OE). Means ± SE, n=3 (technical replicates). F, Extracellular medium activity of control and transgenic cell suspensions (triple OE) on P. ramosa seed germination. The absorbance results were normalized by subtracted each value by the negative control. Data are represented in percentage relative to the positive control GR24 ± SE; n = 9 (3 biological replicates repeated 3 times).

Figure 3. Experimental design of hydroponic cultures.

Acclimated plants were grown hydroponically with a full nutrient solution (1.25 mM P and 15 mM N (HP)) during one week and transferred in a new solution which did not contain any source of phosphorus (0P) (0 mM P and 15 mM N). Then, one week later, plants were divided in two groups, group 1 corresponding to plants were transferred in HP solution and the plants corresponding to the group 2 were maintained in the 0P solution. For gene expression profiling, root samples were harvested at 0, 3, 12, 24 and 48 hpt (right arrows) from the 7th (Week 1) and the 14th day (Week 2) for both groups. The phenotypic characterization was performed the 7th, 14th and the last day of the experiment (up triangles). Root exudates were collected the 16th day of the experiment (down triangles). The same experimental design was used for nitrogen (N) experiments. The HN solution was the same as the HP solution and the 0N solution does not contain any source of nitrogen (1.25 mM P and 0 mM N).

Résultats et Discussion – Chapitre 3

To confirm the functional homology of the grapevine genes involved in the SL biosynthesis pathway, over-expression experiments were performed in grapevine suspension cells transformed with a unique construction containing 35S::D27, 35S::CCD7 and 35S::CCD8. After stabilization of the cell cultures, bioassays were performed to elucidate the potential ability of the compounds secreted in the external medium by the cells to trigger the germination of SL-inducible parasitic plants. As shown in (Fig. 2F), the extracellular medium of the cells overexpressing the three genes (Fig. 2E) presented a clear induction of the P. ramosa seed germination compared to those of the cells transformed with the empty vector (control). In conclusion, the results demonstrated that the SL-related gene orthologues in grapevine seemed to encode enzymes that are involved in the SL biosynthesis pathway and that they could ensure the production of this hormone.

Nutrient starvation induces a reduction of shoot growth together with an increase of SL-related gene expression and exudation of Orobanche seed germination inducible compounds

In order to better understand the role of the SLs in the grapevine rootstocks in response to nutrient availability, cuttings of 1103P and RGM were grown in hydroponic cultures and submitted to P or N starvation (Fig. 3). P starvation was largely described in literature for several species to reduce plant growth together with a decrease in shoot branching and an enhancement of SL biosynthesis.

In several species such as Arabidopsis thaliana and Oryza sativa, SPX1 gene is known to be regulated by the P starvation (Duan et al., 2008; Wang et al., 2009). For both genotypes, as expected, the transfer from HP to 0P solution during the week 1 triggered the induction of SPX1 gene expression (Fig. 4A) and conversely, the SPX1 transcript amount was strongly decreased in plants re-transferred to the HP solution (Group 1) (Fig. 4A). In parallel, CCD7, CCD8 and MAX1 followed the same expression pattern with a continuous increase in transcript level from week 1 to week 2 and a decrease due to P re-supply during week 2 (Fig. 4A). Growing parameters were evaluated five weeks after the beginning of the hydroponic culture. When comparing both genotypes from group 1, no significant difference could be observed neither for root nor for shoot fresh weights (FW) resulting in plants with the same total FW (Fig. 4, B-D). However, the developmental pattern to reach this same whole plant weight was not similar in both genotypes. While RGM developed higher stem (Fig. 4E) and leaf FW (data

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P treatment N treatment

Week 1 Week 2 Week 1 Week 2 A H

CCD7 CCD7

CCD8 CCD8

MAX1 MAX1

NIR

SPX1

P treatment HP 0P N treatment HN 0N

B E I L

C F J M

D G K N

Figure 4 Résultats et Discussion – Chapitre 3 not shown), 1103P grew more lateral branches (LB) in terms of number and fresh weight (Fig. 4, F and G). Beside this difference observed in non-limiting condition, the 0P solution (Group 2) reduced plant growth for both genotypes. This effect was more pronounced in RGM which decreased his whole plant FW of around 3.5 times while the growth of 1103P was reduced only 1.8 times (Fig. 4D). Furthermore, when comparing plants from groups 1 and 2, the LB production was totally abolished for RGM in the 0P condition while the decrease observed for 1103P reached a LB number and weight similar to RGM when it was cultivated in HP condition (Fig. 4, F and G). Taking together, these results showed that P availability impacts the expression of genes involved in the SL biosynthesis pathway in both rootstocks. Furthermore, even if no difference could be observed concerning the expression profiles, 1103P and RGM showed contrasted developmental features especially concerning the LB production.

To decipher if this response could be observed by modifying the N availability, a second hydroponic batch was performed following the same experimental design except that the two different solutions corresponded to a 0N solution (without N) and a HN solution (15 mM N). As expected, the transfer of plants during the second week in HN solution triggered a clear induction of the nitrite reductase encoding gene (NIR)(Fig. 4H). Moreover, CCD7, CCD8 and MAX1 expression was induced after the transfer in 0N solution. Interestingly, a continuous increase in SL biosynthesis gene expression was observed in week 2 for group 2 plants particularly in 1103P whereas in RGM the maximum of expression seemed to occur during the week 1. 1103P and RGM reduced their growth in N-limiting condition (Fig. 4, I-K).

Figure 4. Responses of the two rootstock cuttings to P and N availability in hydroponic cultures. A-G, Responses to P availability. A, Transcript levels of SL-related and SPX1 genes in roots of 1103P (red) and RGM (blue) cuttings during the weeks 1 and 2 of P treatment. Dashed lines represent samples from 0P plants and solid lines correspond to HP re-supplied plants. Normalized expression values were presented in fold induction compared to the beginning of the treatment (0 hpt Week 1). Means ± SE, n=3 (biological replicates). Asterisks represent significant difference between 0P and HP conditions for each genotype using Student test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). B-G, Fresh weights of the different organ compartments were measured at 35 days after P treatments. Lateral branches (LB) fresh weight per shoot fresh weight (G) were calculated. Data are presented as the mean ± SE; n=15 (biological replicates). Letters indicate significant differences between treatments (i.e. condition x genotype) using a multiple comparison test after Kruskal-Wallis. H-N, Responses to N availability. H, Transcript levels of SL-related and NIR genes in roots of 1103P (red) and RGM (blue) cuttings during the weeks 1 and 2 of N treatment. Dashed lines represent samples from 0N plants and solid lines correspond to HN re-supplied plants. Normalized expression values were represented in fold induction compared to the beginning of the treatment (0 hpt Week 1). Means ± SE, n=3 (biological replicates). Asterisks represent significant difference between 0N and HN conditions for each genotype using Student test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). I-N, Fresh weights of the different organ compartments were measured at 35 days after N treatments. Lateral branches (LB) fresh weight per shoot fresh weight (G) were calculated. Data are presented as the mean ± SE; n=15 (biological replicates). Letters indicate significant differences between treatments (i.e. condition x genotype) using a multiple comparison test after Kruskal-Wallis.

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P treatment

Week 1 Week 2

B C

PDR1

N treatment Week 1 Week 2 D E

PDR1

Figure 5. Root exudate activity on P. ramosa seed germination and gene expression profiling of PDR1 gene in the two rootstock cuttings cultivated hydroponically in response to P or N availability.

A, Root exudates were collected during the second week of culture from group 1 and group 2 plants. Absorbance results are presented in percentage relative to the positive control GR24. Data are means ± SE, n=15 (5 biological replicates repeated three times). B and C, PDR1 transcript level in roots during the weeks 1 and 2 of P treatment and N treatment, respectively. Dashed lines represent samples from

0P/0N plants and solid lines correspond to HP/HN supplied plants. Red and blue colors are attributed to 1103P and RGM, respectively. Normalized expression values were presented in fold induction compared to the beginning of the treatment (0 hpt Week 1). Means ± SE, n=3 (biological replicates). Asterisks represent significant difference between 0P/HP or 0N/HN conditions for each genotype using

Student test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001).

Résultats et Discussion – Chapitre 3

Concerning the LB outgrowth, the N starvation seemed to be more stringent than P with a strong inhibition of the LB production for both genotypes (Fig. 4, M and N). Thus, these results showed that P and N deficiencies strongly impacted the shoot architecture of both rootstocks and that RGM and 1103P have distinct shoot architecture.

To validate the putative SL production in both genotypes under nutrient starvation, exudates were collected during each hydroponic culture. As shown in Fig. 5A, exudates collected during the P starvation were able to induce the seed germination of the parasitic plant P. ramosa. The expression of PDR1, which was shown to be involved in the SL transport in Petunia (Kretzschmar et al., 2012; Sasse et al., 2015) was analysed to decipher whether its profile could be correlated to the exudation patterns. The transcript level of PDR1 increased during the second week in both genotypes while the full nutrient solution (HP) triggered the repression of its expression (Fig. 5B). Concerning the experiment on N availability, no absorbance could be detected during the germination assays probably due to an experimental issue. All these results showed that for both genotypes, P or N nutrient deficiency, seemed to trigger SL production and this could be correlated with the LB growth inhibition of 1103P and RGM cuttings when they were cultivated in starvation conditions.

Shoot and root derived signals are both integrated to control the shoot architecture behaviour

To gain insights in the respective role of the root or shoot derived signals on the control of the shoot architecture and growth, reciprocal grafted plants were produced, resulting in four distinct combinations: RGM/RGM, RGM/1103P, 1103P/1103P and 1103P/RGM. These plants were cultivated hydroponically as for the cuttings, and submitted to similar P and N treatments. When RGM was used as a scion, fresh weights of homografts were higher than those of RGM/1103P heterografts whatever the condition (Fig. 6A and E). Even if the plant FW were not the same, RGM cuttings and RGM/RGM homografts produced the same amount of LB per shoot FW in HP or HN conditions and totally abolished the LB development during starvations (0P or 0N)(Fig. 6, D and H; Supporting Information Fig. S1). Interestingly, the use of 1103P as rootstock affected these developmental traits as the number of stems and LB was modified (Fig. 6, B, F, C and G). RGM grafted upon 1103P tended to grow more than one main stem or developed more LB resulting in a bushier phenotype compared to RGM/RGM homografts. However, the disjunction between LB and stem number was often exclusive resulting in no significant difference when comparing the average values of these variables 102

Scion RGM Scion 1103P

P treatment HP 0P N treatment HN 0N P treatment HP 0P N treatment HN 0N A E I M

B F J N

C G K O

D H L P

Figure 6. Growth and branching parameters and root exudate activity on P. ramosa seed germination of the four reciprocal RGM and 1103P grafted combinations in response to P or N availability.

A-H, Combinations involving RGM as a scion during the P treatment (A-D) and the N treatment (E-H). I-P, Combinations involving 1103P as a scion during the P treatment (I-L) and the N treatment (M-P). Data are presented as the mean ± SE; n=10. Letters indicate significant differences between treatments (i.e. condition x genotype) as determined using a multiple comparison test after Kruskal-Wallis. Q, Germination assays of the four reciprocal grafted combinations in response to P or N availability. Root exudates were collected during the second week of culture from group 1 and group 2 plants. Absorbance results are presented in percentage relative to the positive control GR24. Data are means ± SE, n=15 (5 biological replicates repeated three times).

Résultats et Discussion – Chapitre 3 between RGM/1103P and RGM/RGM. During this reciprocal grafting experiment, root exudates were also collected and seemed to confirm these results with a higher putative production of SL for RGM/RGM than for RGM/1103P (Fig. 6Q). Concerning the 1103P/1103P and 1103P/RGM combinations, no difference could be observed for the growth parameters whatever the condition (Fig. 6, I and M; Supporting Information Fig. S1). The number and FW of LB were similar to 1103P cuttings or even higher (Fig. 6, K, O, L and P). Lastly, the germination assays showed similar results whatever the combination (Fig. 6Q).

Taken together, these results highlighted distinct contribution of the shoot or the root parts in the control of the whole plant development. Then, 1103P used as rootstock induced higher LB growth to RGM scion than RGM grafted on itself in whatever the nutrient condition, while when it was used as scion it seemed to conserve its own bushy phenotype independently on the rootstock.

Rootstock development in greenhouse

In order to confirm the differences of developmental patterns between both genotypes in conditions which are more similar to the field, cuttings of the two rootstocks were cultivated in greenhouse and irrigated during one month and half with a solution containing 5 mM of nitrogen, called HN. During this last period of culture, plants from both genotypes showed a significant increase in their root and shoot dry weights (DW) (data not shown) with a relative growth rate of the total plant DW relatively similar between both genotypes; 0.012 for RGM and 0.015 for 1103P. Furthermore, relative to their total main stem length, the total LB length was higher for 1103P with an average value of 3.4 cm.cm-1 while for RGM, the main stem growth was found to be promoted compared to the LB development with only 0.89 cm of LB per cm of main stem (Table 1). This contrasted branching pattern could be explained by two major developmental features. First, there was a higher development of LB II per LB I node, with around 4.5 times more LB II for 1103P than RGM for the same node number. Secondly, since the outgrowth rate of LB I per node was similar between both genotypes, the higher number of LB in 1103P was mainly due to a higher number of nodes than in RGM (Table 1) while at the beginning of the experiment this node number was identical (data not shown). Furthermore, for the same plant DW or shoot DW, 1103P presented more than 3 times more LB than RGM even at the beginning or at the end of the experiment. Lastly, since RGM grew

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Table 1. List of growth and architectural variables of rootstock cuttings cultivated in greenhouse during 1 month and half in HN condition.

Statistical 1103P RGM Growth parameters significance Root DW (g) 4.31 ± 1.09 11.68 ± 1.60 ** Trunk DW (g) 9.47 ± 1.41 13.12 ± 1.74 ns Shoot DW (g) 29.52 ± 3.06 48.80 ± 3.55 *** Plant DW (g) 42.46 ± 5.13 74.75 ± 4.99 *** Leaf number 147.20 ± 21.77 74.40 ± 6.80 ** Leaf surface (cm²) 5078.26 ± 224.23 5636.70 ± 544.88 ns

Branching parameters Total main stem length (cm) 221.43 ± 33.65 275.47 ± 33.82 ns Main stem number 1.60 ± 0.27 1.40 ± 0.16 ns Node number 40.30 ± 6.16 32.80 ± 4.30 ns Internode length (cm) 5.42 ± 0.36 8.20 ± 0.40 *** Node number/Total main stem length (cm-1) 0.19 ± 0.01 0.12 ± 0.01 *** Total LB number 39.40 ± 2.91 16.50 ± 1.89 *** Total LB length (cm) 600.89 ± 49.52 203.39 ± 18.41 *** LB I number/Node number 0.49 ± 0.04 0.46 ± 0.04 ns LB II number/LB I node number 0.18 ± 0.03 0.04 ± 0.02 *** Total LB length/Total main stem length (cm.cm-1) 3.40 ± 0.56 0.89 ± 0.18 ***

Data are represented as means ± SE, n = 10. For each variable, asterisks indicate significant differences between both genotypes as determined with Student test (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001), ns: not significant. For the variable Main stem number a Fisher test was used and for the LB I number/Node number and LB II number/LB I node number a Chi-square test was used. DW: Dry Weight; LB: Lateral Branches.

Figure 7. 1103P rootstock developped more branches than RGM and this shoot branching difference is conferred to a CS scion. Schematic representation of mean shoot architecture (without leaves) of 1103P and RGM cuttings cultivated in greenhouse and evaluated after one month and half under irrigation with LN or HN nutritive solution. Representative CS shoot architecture was also presented when grafted upon 1103P or RGM and cultivated under HN supply. The stems which grew directly from the scion wood were called « main stems ». The nodes and lenght of each internode along these main stems were represented. Lateral branches less than 4 cm in lenght were indicated using an arrow in grafted plants. Résultats et Discussion – Chapitre 3 longer internodes, there was no significant difference in the main stem length between both rootstocks (Table 1).

In accordance with the conclusion drawn for the hydroponic culture, these results clearly indicated that both rootstocks followed specific developmental strategies implying a promoting of the LB growth for 1103P to the detriment of its main stem development resulting in a bushier aerial architecture than RGM (Supporting Information Fig. S2 and Figure 7).

Shoot branching pattern of the rootstock in response to nitrogen availability

To study how both rootstocks modulate their growth in response to N availability, another set of plants was cultivated in parallel of the HN-irrigated ones described above, but irrigated with a low N solution called LN (0.8 mM). The effect of the N treatment on the plant N content was validated by N tester measurements by comparison with the HN irrigated plants (HN plants)

- (Table 2). In response to the low NO3 concentration, both rootstocks presented a smaller leaf surface compared to the HN plants, however a significant decrease of the shoot DW was only observed for RGM. Concerning their shoot architecture it appeared that the rootstocks 1103P and RGM followed two contrasted developmental behaviours in response to the N treatment. After LN irrigation, neither the stem length of RGM nor its node number were impacted whereas the growth of its LB was significantly decreased resulting in a two times reduction of the LB length per cm of main stem (Table 2). At the opposite, the effect of the LN treatment on 1103P resulted to plants with shorter main stems with smaller internodes than 1103P HN plants (Table 2). Furthermore, no difference could be observed between HN and LN conditions concerning the emergence rate of LB I per node for 1103P resulting in an opposite branching pattern when 1103P and RGM are compared. Indeed, the HN/LN ratio obtained for the variable “Total LB length/Total main stem length” was around 2.2 for RGM while 1103P did not follow this pattern, with an inverse ratio of 0.7 meaning that in LN condition, the LB length per cm of main stem seemed to be higher compared to the HN condition. Taken together, these results showed that the regulation of the growth of the aerial part and particularly the branching pattern in response to N availability was different between both rootstock genotypes. The shoot development of RGM seemed to be controlled through the regulation of its LB growth while for 1103P, the low N condition rather modulated its stem development (Figure 7).

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Tableau 2

Tablea

Table 2. Comparison between LN and HN conditions for the growth and architectural variables of rootstock cuttings cultivated in greenhouse during 1 month and half under LN or HN irrigation. 1103P RGM Statistical Statistical LN HN HN/LN LN HN HN/LN Growth parameters significance significance N Tester 198.60 ± 19.25 286.40 ± 5.15 1,44 * 247.33 ± 2.60 313.80 ± 21.11 1,27 * Root DW (g) 3.61 ± 0.73 4.31 ± 1.09 1,19 ns 13.72 ± 1.77 11.68 ± 1.60 0,85 ns Trunk DW (g) 10.81 ± 1.72 9.47 ± 1.41 0,88 ns 9.14 ± 0.73 13.12 ± 1.74 1,44 ns Shoot DW (g) 21.19 ± 2.54 29.52 ± 3.06 1,39 ns 37.69 ± 2.39 48.80 ± 3.55 1,29 * Plant DW (g) 35.61 ± 4.23 42.46 ± 5.13 1,19 ns 61.53 ± 3.56 74.75 ± 4.99 1,21 ns Leaf number 125.30 ± 7.61 147.20 ± 21.77 1,17 ns 57.00 ± 6.20 74.40 ± 6.80 1,31 ns Leaf surface (cm²) 3581.49 ± 397.50 5078.26 ± 224.23 1,42 ** 4067.81 ± 367.01 5636.70 ± 544.88 1,39 *

Branching parameters Total main stem length (cm) 139.19 ± 28.05 221.43 ± 33.65 1,59 ns 267.67 ± 22.03 275.47 ± 33.82 1,03 ns Main stem number 1.50 ± 0.22 1.60 ± 0.27 1,07 ns 1.25 ± 0.16 1.40 ± 0.16 1,12 ns Node number 30.50 ± 5.20 40.30 ± 6.16 1,32 ns 32.62 ± 3.75 32.80 ± 4.30 1,01 ns Internode length (cm) 4.20 ± 0.37 5.42 ± 0.36 1,29 * 8.24 ± 0.46 8.20 ± 0.40 1,00 ns Node number/Total main stem length (cm-1) 0.25 ± 0.02 0.19 ± 0.01 0,76 ns 0.12 ± 0.01 0.12 ± 0.01 1,00 ns Total LB number 28.90 ± 3.63 39.40 ± 2.91 1,36 ns 11.00 ± 2.08 16.50 ± 1.89 1,50 ns Total LB length (cm) 490.36 ± 66.25 600.89 ± 49.52 1,23 ns 98.45 ± 16.13 203.39 ± 18.41 2,07 *** LB I number/Node number 0.44 ± 0.05 0.49 ± 0.04 1,12 ns 0.34 ± 0.06 0.46 ± 0.04 1,36 *** LB II number/LB I node number 0.19 ± 0.03 0.18 ± 0.03 0,93 ns 0.02 ± 0.01 0.04 ± 0.02 1,81 ns Total LB length/Total main stem length (cm.cm-1) 4.88 ± 0.98 3.40 ± 0.56 0,70 ns 0.41 ± 0.09 0.89 ± 0.18 2,19 *

Data are represented as means ± SE, n = 10. For each variable, asterisks indicate significant differences between both genotypes as determined with Wilcoxon test (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001), ns: not significant. For the variable Main stem number a Fisher test was used and for the LB I number/Node number and LB II number/LB I node number a Chi-square test was used. DW: Dry Weight; LB: Lateral Branches.

Table 3. List of growth and architectural variables of CS/1103P and CS/RGM plants cultivated in greenhouse during 1 month and half in HN condition.

Statistical CS/1103P CS/RGM Growth parameters significance Root DW (g) 10.61 ± 1.39 11.33 ± 1.03 ns Trunk DW (g) 14.30 ± 1.20 9.39 ± 0.52 *** Shoot DW (g) 28.87 ± 1.75 27.37 ± 2.05 ns Plant DW (g) 57.45 ± 3.81 52.27 ± 3.04 ns Leaf number 99.87 ± 4.82 82.33 ± 3.62 ** Leaf surface (cm²) 3685.60 ± 176.87 3337.16 ± 154.54 ns

Branching parameters Total main stem length (cm) 215.10 ± 11.95 177.84 ± 14.70 ns Main stem number 2.14 ± 0.21 1.40 ± 0.13 * Node number 52.93 ± 3.39 39.87 ± 3.22 ** Internode length (cm) 4.04 ± 0.13 4.37 ± 0.15 ns Node number/Total main stem length (cm-1) 0.25 ± 0.01 0.23 ± 0.01 ns LB I number 13.00 ± 1.01 7.00 ± 1.00 *** LB I length (cm) 56.61 ± 11.81 50.67 ± 11.44 ns LB I number/Node number 0.26 ± 0.02 0.19 ± 0.03 ** LB I length/Total main stem length (cm.cm-1) 0.28 ± 0.07 0.35 ± 0.09 ns

Data are represented as means ± SE, n = 15. For each variable, asterisks indicate significant differences between both genotypes as determined with Student test (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001), ns: not significant. For the variable Main stem number a Fisher test was used and for the LB I number/Node number a Chi-square test was used. DW: Dry Weight; LB: Lateral Branches.

Résultats et Discussion – Chapitre 3

Scion branching is influenced by the rootstock genotype

As mentioned above, 1103P is known to confer a higher vigour to the CS scion than RGM. To better characterize the putative developmental processes which could explain the differential regulation of the CS scion growth by both rootstocks, grafted plants of CS upon RGM (CS/RGM) or 1103P (CS/1103P) were cultivated in greenhouse for one month and half irrigated with a solution containing 5 mM of nitrogen called HN. Comparison of several parameters, such as shoot DW, leaf surface and number and main stem length, showed that CS/1103P plants had a higher relative growth rate (0.017) than CS/RGM plants (0.010) during this period of culture (data not shown). At the end of the experiment, the parameters which concern scion growth were not found to be significantly different depending on the rootstock genotype except the number of leaves (Table 3). Regarding to their shoot architecture, CS grafted upon 1103P appeared more branched with a total number of LB and main stems higher than grafted upon RGM (Table 3 and Figure 7). This result seemed to come from differences in axillary growth rate of both LB I (LB I number/node number). Despite this observation, no difference was found concerning the total length of LB mainly due to the biological variability. These data suggested that the scion architecture in each combination, grown in nutrient non-limiting conditions, depends on the rootstock genotype whereas the global growth in terms of dry weight tends to be similar. The phenotypic characterization of another set of one year-old grafted plants performed the next summer showed a clear conservation of the two distinct developmental behaviours between the two combinations or with even more pronounced differences (Supporting Information Table S3).

The same combinations (CS/1103P and CS/RGM) were cultivated in hydroponics and submitted to the N treatment described above, to confirm the greenhouse results and to investigate the SL responses. For both combinations, the absence of N in the nutritive solution triggered a high transcript accumulation for CCD7, CCD8 and MAX1 with a stronger induction when RGM was used as rootstock during week 1 and especially for CCD8 and MAX1 genes during week 2 (Fig. 8A). Regarding the fresh weight values of both combinations, the N starvation triggered a clear inhibition of plant growth with lower plant biomass in 0N condition (Fig. 8D). Moreover, it seemed that the root development of RGM was less affected by the N- limiting content than for 1103P (Fig. 8B). In HN or 0N condition, CS grafted upon 1103P presented more LB I number/node of the main stem and a higher LB I FW compared to the

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N treatment

Week 1 Week 2 N treatment HN 0N A B E

CCD7

F C

CCD8

MAX1 D H

NIR

Figure 8. Responses of the CS/RGM and CS/1103P combinations to N availability in hydroponic cultures.

A, Transcript levels of SL-related and NIR genes in roots of 1103P (red) and RGM (blue) cuttings during the weeks 1 and 2 of treatment. Dashed lines represent samples from 0N plants and solid lines correspond to HN re-supplied plants. Normalized expression values were represented in fold induction compared to the beginning of the treatment (0 hpt). Means ± SE, n=3 (biological replicates). Asterisks represent significant difference between 0N and HN conditions for each genotype using Student test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). B-G, Fresh weights of the different organ compartments were measured at 35 days after N treatments. Lateral branches (LB) fresh weight per shoot fresh weight (G) were calculated. Data are presented as the mean ± SE; n=11 or 12 (biological replicates). Letters indicate significant differences between treatments (i.e. condition x genotype) with a multiple comparison test after Kruskal-Wallis.

Figure 9. Gene expression profiling of PDR1 gene in the N treatment two combinations CS/1103P and CS/RGM cultivated hydroponically in response to N availability. Week 1 Week 2 A B A and B, Expression profiles of PDR1 during the weeks 1 and 2 of N treatment. Dashed lines represent samples from 0N plants and solid lines correspond to HN supplied plants. Red and blue colors are attributed to CS/1103P and CS/RGM, respectively. Normalized expression

PDR1 values were presented in fold induction compared to the beginning of the treatment (0 hpt Week 1). Means ± SE, n=3 (biological replicates). Asterisks represent significant difference between 0N/HN conditions for each genotype using Student test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001).

Résultats et Discussion – Chapitre 3 shoot FW which was in accordance with the results of the above section. Lastly, in both rootstock genotypes, expression of PDR1 decreased until 3 hpt during the week 2 and increased until 48 hpt in the 0N condition, while the N-resupply totally repressed its expression (Fig. 9A and B). As for CCD8 and MAX1, expression of PDR1 showed a fold induction higher in the roots of CS/RGM than those of CS/1103P. Taking together, these data confirmed the observations drawn from the results of the greenhouse experiment, where CS grafted upon 1103P presented a shoot branching more pronounced than in combination with RGM.

Discussion

Even if it is a long time that grape rootstocks are known to influence scion vegetative growth, the mechanisms involved in the control of scion development depending on nutrient availability are not well defined. In that work, we investigated the developmental strategies and the putative role of SLs in the control of scion architecture and growth in hydroponics and greenhouse experiments using either own-rooted or several combinations of grafted plants submitted to different levels of N and P availability.

Scion branching is influenced by the rootstock genotype

When 1103P and RGM were cultivated as own-rooted plants, either in greenhouse or in hydroponics, the shoot architecture between both rootstock genotypes was highly contrasted, 1103P developing a strong branching pattern with more LB number and length, compared to RGM which favoured the growth of the main stem. Interestingly, phenotypic analysis of CS/1103P and CS/RGM showed that whatever the culture conditions the two rootstock genotypes modulated differently the architecture of the same scion cultivar. 1103P known to confer a high vigour to the scion, promoted the axillary growth whether for the number of lateral branches or for the number of main stems of CS scion compared to RGM. This difference could contribute to the higher pruning wood weight of a combination involving 1103P as rootstock, which in turn, characterize this genotype as a high vigour conferring rootstock (Zhang et al., 2016). These results highlight the diversity of the intrinsic rootstock properties and the importance of the roots derived signals to control the scion architecture within a grafted plant. It is well established that hormones play an important role through the systemic regulation of growth within a grafted plant (Aloni et al., 2010). It has been already shown that an extensive transcriptomic re-programming occurred when the same scion was

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Résultats et Discussion – Chapitre 3 grafted onto different grapevine rootstocks and highlighted the critical role of the hormone signalling (Cookson and Ollat, 2013; Corso et al., 2016; Hopper et al., 2016). Since a long time, grapevine rootstocks were characterized for their genotype specific hormone production and authors highlighted the primordial role of that root-derived signals to control the scion growth (Skene and Antcliff, 1972). Nikolaou et al. (2000) showed that cytokinin content delivered from the roots is dependent on the rootstock and can modulate bud burst and shoot elongation. Van Hooijdon et al. (2011) proposed that the apple dwarfing rootstocks could reduce the basipetal transport of auxin to the roots which in turn, decrease the cytokinin and gibberellin transport from roots to the scion. All of these results clearly demonstrated the importance of the hormone signalling in the rootstock control of the scion growth and suggested also that other actors than the already well-known crosstalk between auxin and cytokinin, could contribute to the regulation of the scion architecture (Van Hooijdonk et al., 2009; Aloni et al., 2010; Van Hooijdonk et al., 2011).

Strigolactones in grapevine rootstocks

Previous results obtained when grafted plants were cultivated in N heterogeneous availability condition highlighted a specific hormonal class that responded in a rootstock genotype dependent manner, the SLs (Cochetel et al., submitted). These hormones are known to regulate several developmental traits such as internode elongation, root architecture and axillary bud outgrowth (Al-Babili and Bouwmeester, 2015; Lopez-Obando et al., 2015) and their biosynthesis is known to be regulated by nutrient availability and several other environmental cues (Pandey et al., 2016). As for Arabidopsis (Turnbull et al., 2002) and Pea (Johnson et al., 2006; Beveridge et al., 2009), the expression pattern of D27, CCD7, CCD8 and MAX1 suggested that the SL biosynthesis may occur mainly in the roots in grapevine. Interestingly, the transcript levels of most SL biosynthesis genes were higher in roots of RGM than in 1103P ones when plants were cultivated in low nitrate condition. Thus, regarding the diversity of the rootstock genotypes, the production and the downstream signalling of these hormones could be different and may contribute to the distinct scion developmental pattern depending of the rootstock. For both genotypes, the inductive conditions such as P or N deprivation in hydroponic cultures triggered the production of exudates able to induce the germination of SL inducible parasitic plant seeds. Furthermore, the expression of the genes encoding enzymes of the SLs biosynthesis pathway was found to be highly induced in P and N

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Résultats et Discussion – Chapitre 3 limiting conditions as well as for the homologue of PDR1, which has been suggested to play a major role in SL exudation (Kretzschmar et al., 2012; Sasse et al., 2015). In addition, complementation experiments in Arabidopsis supported that SLs could play similar function in grapevine. Overexpression of three genes of this putative biosynthetic pathway in grape cells demonstrated that it allowed the induction of compounds able to stimulate SL-inducible germination of Orobanche seeds. These results showed that both rootstocks are able to produce putative SLs, but the identification of specific SL-compounds and their endogenous levels remains to be done in order to identify a potential difference between both genotypes.

Regulation of the shoot architecture trough the interplay between roots and shoot derived signals

Reciprocal grafting is a commonly used technique to decipher the respective role of shoot and roots derived signals in the regulation of the plant development. This approach was widely used to decipher the relationship between each actor of the SL pathway (Napoli, 1996; Foo et al., 2001; Turnbull et al., 2002; Beveridge et al., 2009). In our study, we used this strategy to better understand the source of the signals governing the scion architecture. During this reciprocal grafting of RGM upon 1103P and vice versa, a striking difference was observed concerning the branching degree of the shoot part and this seemed to be influenced by both scion and rootstock genotypes. The high axillary growth rate of the aerial part when 1103P was used as a scion whatever the rootstock genotype highlighted the importance of the intrinsic properties of the scion genotype. This suggested that putative repressing signals of shoot branching moving from RGM roots were not sufficient to repress the lateral branching of 1103P/RGM combination. Its high branching pattern could also suggest that 1103P lacks the downstream actors necessary for the signal reception/signalling of such an inhibitory pathway or produces another signal that overrides the branching repression signalling or that inhibits this pathway by a feedback loop repression. Furthermore, observations made on the RGM/1103P combination tended to confirm this hypothesis. When grafted upon 1103P, RGM scion was found to be more branched (in terms of LB or main stem number) than when grafted upon itself and presented a bushier aspect. This observation argues in favour of the hypothesis where 1103P produced less putative branching inhibitors such as SLs than RGM. However, even if the rootstock genotype influenced the branching degree of the scion, RGM scion remained much less branched than an 1103P scion. Observations made on reciprocal grafted

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Résultats et Discussion – Chapitre 3 plants between these two distinct genotypes were the result of a competition between their high and their low branching traits triggering intermediate branching phenotypes instead of a clear response pattern observed between CS/1103P and CS/RGM. These results suggested that the putative inhibiting effect of the SLs on scion branching is not sufficient to totally explain the control of the axillary bud outgrowth and highlighted the importance of the interaction with other molecular actors. As for several species, it is the balance established between these diverse branching regulators that governs the harmonious development of the shoot (Rameau et al., 2015; Teichmann and Muhr, 2015).

In response to nutrient starvation, both genotypes modulate their growth with distinct adaptive strategies

Since nutrient sensing plays a crucial role in the regulation of the shoot branching, the responses to changes of N or P availability were analysed. In hydroponics, even for cuttings or for grafted plants, RGM triggered a low degree of ramification to the aerial part and abolished the LB production in low nutrient conditions. 1103P also presented this behaviour but there were still some LB which have grown during N or P starvation. In such conditions, the absence of N or P source in the nutritive medium strongly inhibited the axillary growth for both genotypes and surprisingly, 1103P remained able to produce some LB. These phenotypes were confirmed in greenhouse experiments using cuttings obtained from wood harvested in the vineyard during the previous winter and cultivated under condition closest to the field. Interestingly, the two rootstocks conserved their distinct branching patterns and modulated their shoot growth in two different ways. When the nitrogen content was low, RGM rather reduced its LB production while 1103P controlled its stem development without affecting its axillary growth rate. These results were concordant with a putative difference on SL signalling/production between both rootstock genotypes. Following this hypothesis, RGM, through the SL pathway activation, would reduce its LB number and maintained its internode elongation compared to 1103P, since, added to their branching inhibition role, SLs are also known to stimulate this developmental trait in several species (de Saint Germain et al., 2013; Lauressergues et al., 2015). Regarding to our previous observations, these results confirmed the difference of developmental patterns of both genotypes and highlighted rootstock- dependent adaptive strategies to cope with nutrient content modifications. These two distinct patterns of shoot growth regulation could come from a different perception/sensing of the

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Résultats et Discussion – Chapitre 3 nutrient availability which represents a primordial process in the hormonal control of the shoot architecture (Domagalska and Leyser, 2011). In addition, since these plants are perennial, the nutrient storage capacities of these two genotypes could also play a decisive role for their shoot development (Richards, 1983; Zapata et al., 2004; Keller, 2015).

Conclusion

In vineyard, the control of the scion growth is the result of a complex signalling established between two different genotypes. This work showed that the two rootstocks were able to modulate distinctively the scion architecture resulting in two different branching behaviours. Among the putative signals that could govern the scion development depending on the rootstock, hormones represent interesting candidates. Our results suggest that both genotypes produce SLs and may involve different crosstalk with other hormones such as cytokinin, auxin as well as gibberellin to finally regulate the whole plant growth involving a systemic regulation via both shoot and roots derived signals.

Materials and methods

Plant Materials and Growth Conditions

The grapevine plants were either rootstock rooted cuttings or grafted plants. The scion genotype was Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon (CS). The two rootstock genotypes were Vitis riparia cv. Riparia Gloire de Montpellier (RGM) and Vitis rupestris x berlandieri hybrid cv. 1103 Paulsen (1103P).

For greenhouse experiments, CS was grafted on 1103P or RGM (CS/1103P and CS/RGM, respectively), and cuttings of 1103P and RGM were rooted, on April 2015. After callusing and/or rooting, plants were transferred in sand-filled pots in a greenhouse and irrigated during 50 days with a full nutrient solution (Cookson et al., 2012). At the end of the acclimation period, a low nitrate content (0.8 mM KNO3, called LN solution) nutritive solution was applied for ten days (0.8 mM KNO3, 0.57 mM K2HPO4, 0.69 mM MgSO4, 1.39 mM CaCl2,

0.8 mM K2SO4, 0.3 mM CaSO4, and micronutrients as described by Lecourt et al. (2015)). At the end of this period (time 0, named LN0), plants were separated in two groups. One half of the plants was watered with 1L of a 5 mM nitrate solution, called HN, to fully replace the LN residual solution in the pots, and the other one with 1L of LN solution. Plants were then continuously irrigated with the appropriate solution during one month and half. For the gene 110

Résultats et Discussion – Chapitre 3 expression pattern analysis, leaves, stem, roots and root tips were collected from CS/1103P and CS/RGM grafted plants cultivated for 3 months in sand-filled pots in greenhouse and irrigated with the LN solution.

For hydroponic culture, plants were propagated in vitro on McCown Woody Plant Medium (Duchefa) supplemented with 1.5% of sucrose, 0.27 µM of 1-naphthalene acetic acid and 0.7% agar in a growth room at 25°C/20°C under a photoperiod of 16h/8h light/dark with a light intensity of 55 µmol photons s-1 m-2. One month-old plantlets were acclimated on perlite substrate and irrigated with tap water during one more month. For the P experiment, plants were then transferred in hydroponic jars containing 8L of a McCown-derived nutritive solution deprived of vitamins and with 1.25 mM of KH2PO4 (HP) (20 plants of the same genotype per jar) during one week. Then plants were transferred into no phosphate solution (0P) for one other week. After this second week of hydroponic culture, plants were separated into two groups: group 1 containing plants transferred in HP condition and group 2 corresponding to plants grown in 0P condition (Fig. 2). For gene expression, root samples were collected at 0, 3, 12, 24 and 48 hpt after the first transfer in the 0P solution and at the same time points after the group repartition. The nutritive solution was replaced three times per week. For the measure of growth and branching, plants were harvested after 31 days of culture. For the nitrogen experiment, the experimental design was the same (Fig. 2). The nutritive solutions were the following: the full solution, HN, contained 10 mM of NH4NO3 and 5 mM of Ca(NO3)2,

2+ 4H2O; the solution without any source of nitrogen, called 0N. For this later, Ca was adjusted by adding CaCl2.

Seeds of Arabidopsis max3-11 and max4-1 lines were kindly provided by Sandrine Bonhomme (IJPB, INRA). After sterilization, seeds of mutants, Col-0 and transgenic lines of each genotype transformed with construction allowing the overexpression of either grapevine CCD7 or CCD8 were sowed on MS 1/2 medium (Murashige and Skoog, 1962) complemented with the adequate antibiotic selection. After 10 days, plantlets were transferred in a growth room with a temperature of 22°C day/18°C night and a photoperiod of 16h light/8h dark.

Phenotypic analysis of growth and architectural parameters

For greenhouse experiments, at 0 hpt and one month and half after continuous irrigation with either LN or HN solution, from 10 to 15 plants were analysed. N status was evaluated using

111

Résultats et Discussion – Chapitre 3

Yara N-Tester®. The architecture of the shoot was analysed: the size of each internode of the primary stem was measured, the length and the position of each primary lateral branches were reported. The number and size of second lateral branches were also noted when present. The number of leaves and the total leaf surface was measured for each plant. Roots, trunk, leaves and stems (including petioles) were separated and weighted after drying at 70°C during three days. Relative growth rate was calculated as described by Hoffman and Poorter (2002).

During hydroponic experiments, at different time points indicated in Fig. 2, plants were harvested, the number of lateral branches were counted and the fresh weight of roots, lateral branches and total shoots were measured.

For Arabidopsis complementation, after one month of culture in growth room, the number of primary rosette branches (RI) and primary cauline branches (CI) was counted. Ten individual plants per genotype were used.

Gene expression analysis

Total RNAs were isolated from root samples as described by Cookson et al. (2013). Total RNAs were reverse transcribed into cDNA using the SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Quantitative real-time PCR reactions were performed using SYBR Green on an iCycler iQH (Bio-Rad), according to the procedure described by the supplier. Relative expression of the genes was calculated using the 2-Ct method (Livak and Schmittgen, 2001), and using the reference genes EF1 and GAPDH for normalization in grapevine, and ACT2 and UBC21 in Arabidopsis. Primer sequences are listed in Supporting Information Table S2.

Root exudate collection and seed germination assays of Phelipanche ramosa

During hydroponics, root exudates were collected at different time-points (Fig. 2). Five plants from each condition were transferred into 50 mL tubes covered with an aluminium foil and containing the same nutritive solution, i.e. the one where they came from, and incubated for five hours in the growth room. Concerning the cell culture, 1 mL of the liquid nutritive medium was collected two days after its renewing. Then, exudates were filtered (0.2 µm filters) and stored at 4°C in the dark. Seed germination of Phelipanche ramosa L. Pomel was measured using methylthiazoldiphenyl-tetrazolium (MTT) assays as described in Pouvreau et al. (2015)

112

Résultats et Discussion – Chapitre 3 at the LBPV laboratory (Nantes, France). The positive control GR24 was used at a concentration of 1.10-7 M and allowed 62-70% of seed germination within all the experiments (except the experiment on cuttings in response to N with only 46%).

Cloning of the full-length coding sequences of D27, CCD7 and CCD8 from both rootstock genotypes

Putative D27, CCD7 and CCD8 homologues were identified using a BlastX search using the Arabidopsis corresponding full protein sequence as query against the grapevine Pinot Noir genome on CRIBI (http://genomes.cribi.unipd.it/grape/). Gene-specific primers were designed based on these Vitis vinifera sequences to amplify the full-length coding sequence of D27 (VIT_00s0179g00330), CCD7 (VIT_15s0021g02190) and CCD8 (VIT_04s0008g03380) using cDNA derived from RNA isolated from roots of both 1103P and RGM (Primers listed in Supporting Information Table S2). PCR fragments obtained with the Phusion high-fidelity DNA polymerase were cloned using pGEM®-T easy vector system (Promega), before sequencing (GATC Biotech). The sequences has been deposited in the GenBank database under accession no. KX865167, KX865168, KX865169, KX904934, for RGM CCD7 and CCD8; and 1103P CCD7 and CCD8; respectively. For D27, the RGM cDNA sequence chosen for vector construction showed 100% identity with the sequence from Pinot Noir.

Vector construction and Arabidopsis transformation

For complementation experiments of Arabidopsis max3-11 mutant, RGM CCD7 cDNA was cloned into the ph7WG2D.1 plasmid (Karimi et al., 2002) using the Gateway system (Invitrogen) and inserted into One Shot® ccdB Survival™ 2 T1R competent cells. For complementation of Arabidopsis max4-1 mutant, a construction containing NPTII gene and RGM CCD8 coding sequence under control of CaMV35S promoter was generated using Goldenbraid 2.0 into a pDGB2Ω1 binary vector (Sarrion-Perdigones et al., 2013). Before plant transformation, each plasmid was sequenced and inserted in GV3101 Agrobacterium tumefaciens strain. Then, Col-0 (Columbia), max3-11 and max4-1 transformed by floral dip method (Clough and Bent, 1998) using adequate Agrobacterium suspensions. Transgenic plants were selected by sowing seeds on MS media containing hygromycine and kanamycine for CCD7 and CCD8 overexpression, respectively. Five and two independent transgenic lines for max3 and max4 respectively, were used for further studies. For each line, the presence of

113

Résultats et Discussion – Chapitre 3 the transgene was verified by PCR on gDNA using the primers listed in Supporting Information Table S2.

Cell transformation and culture

The three RGM cDNA of D27, CCD7 and CCD8 were each subcloned under the constitutive CaMV35S promoter in a cassette containing the NPTII gene using Goldenbraid 2.0 methodology. The resulting plasmid pDGB2α1 was introduced intro the EHA105 Agrobacterium tumefaciens strain which was used to transform embryogenic cells derived from the 41B rootstock (Vitis vinifera cv Chasselas x Vitis Berlandieri). They were maintained and transformed according to Coutos-Thevenot et al. (2001). Control cells have been generated by transformation with the empty pDGB2α1 containing only the NPTII gene.

Acknowledgments

We would like to thank Sandrine Bonhomme for providing us the seeds of Arabidopsis mutant lines, and Professor Michel Hernould for helpful scientific discussions. We thank the staff of the laboratory for their technical assistance during greenhouse experimentations. This work was supported by grants from the ‘Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux’ (CIVB) (contract no. 28325), from the French National Research Agency (ANR) in the frame of the Investments for the future Programme, within the Cluster of Excellence COTE (ANR-10-LABX- 45) and the French Ministry of Research and Higher Education (Noé Cochetel’s PhD fellowship).

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Résultats et Discussion – Chapitre 3

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Résultats et Discussion – Chapitre 3

Supporting Information

Figure S1. Images of representative plants of each combination harvested at the end of the P and N experiments.

Figure S2. Images of representative plants of each genotype after one month and half in greenhouse and irrigated with HN solution (5 mM).

Table S1. List of genes highly correlated to the module "lightgreen".

Table S2. List of the primers used for qPCR experiments.

Table S3. List of growth and architectural variables of one year-old CS/1103P and CS/RGM plants cultivated in greenhouse.

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Résultats et Discussion – Chapitre 3

Supporting Information

Figure S1. Images of representative plants of each combination harvested at the end of the P and N experiments.

Plant were cultivated in hydroponic culture and harvested 21 days after the transfer in 0P/0N or HP/HN conditions. 119

Résultats et Discussion – Chapitre 3

1103P RGM

Figure S2. Images of representative plants of each genotype after one month and half in greenhouse and irrigated with HN solution (5 mM).

For both genotypes, whole plants have been photographed (left) or only shoots without leaves (right).

Tableau 4

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Résultats et Discussion – Chapitre 3

Table S2. List of the primers used for qPCR experiments. Accession number Gene name Function Forward primer (5’-3’) Reverse primer (5’-3’) VIT_03s0063g00370 NIR Nitrite reductase CTTGCCGAGGAAGTGGAATGTG GCATGTACGCCAGATCATTGATGT VIT_11s0016g05330 SPX1 SPX domain-containing protein 1 ATTGCGGGCTCTGAAGGAAA TTGAAGAGGTGGCAAGGAGA VIT_00s0179g00330 D27 Dwarf 27 TGGTCAAGATCCTCCAGGGG CAGATGGAGCAATTCACAGAGTG VIT_15s0021g02190 CCD7 Carotenoid cleavage dioxygenase 7 GGAGAGATTGATGCACTTGTAGC CCAAAAGCCATGAAATCCAA VIT_04s0008g03380 CCD8 Carotenoid cleavage dioxygenase 8 CTGTGCCCTCGGAACCATTA CCCCCTTGCGATCTCTTCAA VIT_04s0008g01100 MAX1 More axillary branches 1 GAGCCATCAAACGACATCCATGA CCTGAACCCTTAATCCAACGACT VIT_12s0028g02140 MAX2 More axillary branches 2 ATTGCACCCAAAAAGACAGG GGTGTGACAATGTGCTCTCG VIT_18s0001g09140 D14 Dwarf 14 GTCAATGCCACGTGTATCTGC TTTGCCAGGTGTCAACATCGC VIT_17s0000g04180 BRC1 Branched 1 GCAAGCAGTGGAGCCCATC AGCCTGGAAATTGAGGCTCTTG VIT_04s0008g04790 PDR1 Pleiotropic drug resistance 1 AAGGGCATTCAACTTCCAAAAAAGA TCTAGTAGCTGTAGATTCAAAAGGA VIT_17s0000g10430 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase CCACAGACTTCATCGGTGACA TTCTCGTTGAGGGCTATTCCA VIT_12s0035g01130 EF1γ Elongation factor 1 gamma CAAGAGAAACCATCCCTAGCTG TCAATCTGTCTAGGAAAGGAAG

Cloning VIT_00s0179g00330 D27 Dwarf 27 CTCTGTATCAGATACATGGATG CATGTCTAGACCCTCCTTCC VIT_15s0021g02190 CCD7 Carotenoid cleavage dioxygenase 7 CCAAGGTCCAACTATGCAGC ATGTACAAATTAACCTACTCTTTGGG VIT_04s0008g03380 CCD8 Carotenoid cleavage dioxygenase 8 ATATCGTACTCATCTTTAATGGC CCAGAAGTCTCTACAAATGCTTC

Arabidopsis transformation AT2G44990 AtMAX3 More axillary branches 3 TATGCGGTTTCGGTGGAGAG GACACGACCGCATCGGATT AT4G32810 AtMAX4 More axillary branches 4 GGTTGCTGGATCCCCAAAGA ACAAAACCTGCACAGAGGGTA VIT_15s0021g02190 CCD7 Carotenoid cleavage dioxygenase 7 CGACCTTGCCACATTTTCCG GGGCTCACCTATGAACCTCC VIT_04s0008g03380 CCD8 Carotenoid cleavage dioxygenase 8 CTGTGCCCTCGGAACCATTA TTCCCCCTTGCGATCTCTTC AT5G25760 AtUBC21 Ubiquitin-conjugating enzyme 21 TAGCATTGATGGCTCATCCT GGCGAGGCGTGTATACATTT AT3G18780 AtACT2 Actin 2 GCACCACCTGAAAGGAAGTACA CGATTCCTGGACCTGCCTCATC

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Résultats et Discussion – Chapitre 3

Table S3. List of growth and architectural variables of one year-old CS/1103P and CS/RGM plants cultivated in greenhouse.

Statistical CS/1103P CS/RGM Growth parameters significance Root DW (g) 13.78 ± 1.93 15.87 ± 3.44 ns Trunk DW (g) 16.48 ± 1.41 14.36 ± 1.53 ns Shoot DW (g) 30.39 ± 2.64 28.66 ± 5.03 ns Plant DW (g) 89.92 ± 7.84 87.21 ± 14.47 ns

Branching parameters Total main stem length (cm) 215.70 ± 16.57 185.90 ± 20.33 ns Main stem number 2.80 ± 0.36 2.70 ± 0.15 ns Node number 33.40 ± 2.92 36.00 ± 2.35 ns Internode length (cm) 6.42 ± 0.42 4.89 ± 0.29 ** Node number/Total main stem length (cm-1) 0.16 ± 0.01 0.21 ± 0.01 ** LB I number 9.30 ± 0.62 5.00 ± 1.39 * LB I length (cm) 13.37 ± 1.90 4.67 ± 1.42 ** LB I number/Node number 0.30 ± 0.04 0.13 ± 0.04 *** LB I length/Total main stem length (cm.cm-1) 0.07 ± 0.01 0.02 ± 0.01 **

CS was grafted upon 1103P or RGM on April 2015. Grafted plants were grown in greenhouse and irrigated with HN solution. In November, they have been pruned and leaved in greenhouse, irrigated with tap water until May and then irrigated with HN solution until being phenotyped (June 2016). Data are represented as means ± SE, n = 10. For each variable, asterisks indicate significant differences between both genotypes as determined with Student test (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001), ns: not significant. For the variable Main stem number a Fisher test was used and for the LB I number/Node number a Chi-square test was used. DW: Dry Weight; LB: Lateral Branches.

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Résultats et Discussion – Chapitre 3

III. CONCLUSION

Afin de mieux comprendre la contribution de la production de strigolactones par le porte- greffe dans le contrôle de la croissance végétative du greffon, une expérimentation d’hydroponie impliquant le greffon CS et les porte-greffes 1103P et RGM a été réalisée en faisant varier la teneur en azote dans le milieu de culture. Les données de phénotypage et de suivi d’expression de gènes seront complétées par des bio-essais actuellement en cours de réalisation. Afin d’étudier l’aspect quantitatif de la production de strigolactones en fonction des différentes conditions étudiées, les échantillons d’exsudats ont été soumis à des dilutions successives lors des tests de germination.

La surexpression des gènes de la voie de biosynthèse des strigolactones D27, CCD7 et CCD8 dans les cellules embryogènes de Vigne permettent aussi d’obtenir des résultats positifs lors des bio-essais avec les graines de plantes parasites. Ce milieu nutritif contenant les exsudats cellulaires ainsi que plusieurs échantillons d’exsudats provenant des cultures hydroponiques seront purifiés et envoyés au Pr Colin Turnbull au Collège Impérial de Londres afin d’identifier la présence de strigolactones déjà connues dans un objectif ultérieur de quantification.

Les résultats obtenus au cours de ces travaux notamment concernant les phénotypes des greffons lors des greffages réciproques évoquent l’importance de la balance entre les différentes hormones qui régit l’architecture aérienne. Pour mieux comprendre l’influence des deux porte-greffes de l’étude, en plus des racines, des prélèvements de tiges et de nœuds ont été réalisés durant les différentes expérimentations et feront l’objet de dosages hormonaux. Afin de compléter les résultats obtenus lors des expérimentations de ces greffes réciproques, les photographies réalisées lors des différentes séries de phénotypage permettront d’analyser le nombre de nœuds et la taille de la tige principale. L’obtention de données telles que le pourcentage d’émergence de rameaux latéraux par nœud et l’influence des différentes combinaisons sur la longueur des entre-nœuds permettra de conclure avec plus de précision sur les différents phénotypes résultant de l’interaction entre les greffons et les porte-greffes utilisés au cours de l’étude.

D’autre part, ces expérimentations ont été réalisées grâce à l’obtention de plants multipliés en culture in vitro. L’origine de l’explant qui a fourni le greffon ou le porte-greffe pourrait aussi faire l’objet d’études supplémentaires. En effet, pour des questions pratiques, le même plant

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Résultats et Discussion – Chapitre 3 de Vigne a été utilisé pour fournir entre 5 et 7 explants qui sont devenus greffon ou porte- greffe. Cette méthode sous-entend que les différents explants fournis à partir de la même plante n’étaient pas initialement soumis à la même régulation suggérant ainsi une diversité de leur contenu hormonal et/ou de leur stade de développement en fonction de leur position d’origine sur la plante mère. Cette caractéristique pourrait ainsi contribuer à expliquer la forte variabilité biologique observée au cours des séries de phénotypage et devrait faire l’objet d’une nouvelle étude.

Par ailleurs, ces différents travaux ont été menés dans l’objectif de mieux comprendre la différence de vigueur conférée au greffon par deux porte-greffes caractérisés pour leur différence sur ce paramètre. Cette observation provient majoritairement de données de poids de bois de taille obtenues chaque année sur des pieds de vigne âgés. Ainsi, il serait très intéressant de suivre sur du plus long terme la croissance d’un greffon sur ces deux porte- greffes en appliquant ou non la contrainte de rognage utilisée dans les pratiques culturales viticoles. Malgré la difficulté du suivi phénotypique d’une telle expérimentation sur une longue durée, la compréhension de l’effet du rognage sur l’architecture aérienne demeure primordiale notamment vis-à-vis de la régulation hormonale qui se met en place en réponse à un tel procédé.

D’autre part, les interactions du plant de vigne greffé avec la rhizosphère est un paramètre essentiel à prendre en considération. En plus des variations du contenu hydrominéral du sol au sein du vignoble, le cep de vigne est en contact avec une multitude de micro-organismes. A ce sujet, la Vigne est connue pour s’associer avec des champignons mycorhiziens. L’analyse de la diversité génétique des porte-greffes quant à la formation de ces associations permettrait de mieux comprendre leurs caractéristiques adaptatives si différentes et renforce l’importance de l’étude de la production des strigolactones, connues pour être impliquées dans la formation de ces symbioses.

Dernièrement, l’ensemble des réponses moléculaires et développementales qui ont été observées durant les différentes séries d’expérimentations hydroponiques et en serre reflètent une conséquence des processus de signalisation systémique mis en place par la plante pour répondre aux fluctuations de son environnement tout en intégrant son propre statut nutritif. De par sa nature pérenne, les réserves nutritives mises en place chez la Vigne sont essentielles pour assurer son bon développement. Il serait ainsi intéressant d’effectuer 124

Résultats et Discussion – Chapitre 3 un dosage des éléments minéraux contenus dans les parties racinaires et aériennes sur les échantillons prévus à cet effet provenant des différentes expérimentations.

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CONCLUSION GENERALE

ET PERSPECTIVES

Conclusion générale et perspectives

Ce projet de thèse a été réalisé dans l’objectif de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et physiologiques impliqués dans le contrôle de la croissance du greffon chez la Vigne. L’ensemble de la démarche entreprise s’intègre dans l’effort mené par l’équipe « Plante greffée » qui vise à élucider les processus qui régissent la croissance d’une plante greffée et son interaction avec l’environnement.

Les particularités de la plante utilisée, la Vigne, plante pérenne greffée, complexifie l’étude de sa physiologie mais représentent néanmoins l’opportunité d’étudier les mécanismes de communication entre parties aérienne et racinaire. Afin de mieux comprendre la nature des signaux échangés entre les deux parties d’une plante greffée, deux porte-greffes ont été sélectionnés pour leur capacité contrastée à contrôler la croissance du greffon. Alors que 1103 Paulsen (1103P) est connu pour induire un fort développement végétatif du greffon, le porte- greffe Riparia Gloire de Montpellier (RGM) limite cette croissance (Zhang et al., 2016). De nombreux signaux pourraient expliquer cette différence notamment les flux hydrominéraux et la signalisation hormonale (Ollat et al., 2003b; Ollat et al., 2016a). En effet, les différences de développement du même génotype de greffon placé sur différents porte-greffes soulignent le rôle primordial des signaux envoyés par la partie racinaire de la plante greffée. Lors de cette étude, les réponses à des modifications de la disponibilité en azote ont plus particulièrement été étudiées. L’importance de ce nutriment dans la croissance d’une plante et sa disponibilité hétérogène au sein du vignoble pourrait contribuer de manière significative aux différences de croissance observée en fonction du porte-greffe selon leur capacité de perception/signalisation, d’absorption et d’utilisation de cet élément nutritif.

Afin d’avoir une vision globale de la réponse de la plante suite à la perception d’un contenu azoté hétérogène du sol, une approche globale de transcriptomique a été réalisée sur des échantillons racinaires provenant d’une expérimentation de type split-root. Durant celle-ci, les plantes ont été soumises à un apport localisé en azote. De manière intéressante, le choix des génotypes de porte-greffe de cette étude a permis de mettre en évidence une nette différence de réponse que ce soit au niveau du nombre de gènes différentiellement exprimés mais aussi concernant leur timing d’induction. De nombreux parallèles ont pu être effectués avec la plante modèle Arabidopsis thaliana pour laquelle ce type d’expérimentation a déjà été bien caractérisé (Ruffel et al., 2011). Les connaissances issues de cette espèce ont donc permis 126

Conclusion générale et perspectives de valider la représentativité des résultats obtenus et la fiabilité du dispositif expérimental qui représente une première chez la Vigne pour l’étude de la disponibilité en nitrate. Comme discuté dans le chapitre 1, il semblerait que des différences de signalisation hormonale jouent un rôle primordial dans les réponses établies au sein des deux combinaisons. De plus, l’étroit lien qui existe entre ces réponses et l’horloge circadienne de la plante est aussi un paramètre majeur qui a été retrouvé différemment régulé chez les deux porte-greffes. Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et coupler ces réponses au statut physiologique de la plante, une seconde expérimentation utilisant le même dispositif a été réalisée. Au cours de celle-ci, des témoins dits « homogènes » permettront de distinguer les signaux locaux et systémiques impliqués chez les deux porte-greffes en réponse à la disponibilité en nitrate. De plus, les différents organes prélevés feront l’objet de dosages afin de caractériser le statut nutritif et hormonal des plants et ils permettront aussi de suivre l’influence de la reprogrammation transcriptomique racinaire sur les réponses mises en place par le greffon.

La perception de l’hétérogénéité du contenu en nitrate dans le sol par la plante influence son développement notamment sa morphologie racinaire (Zhang et al., 1999; Zhang and Forde, 2000). Les profils d’expression de gènes clés précédemment identifiés chez Arabidopsis mais également ceux issus de l’analyse transcriptomique effectuée chez les combinaisons de plants de vigne greffés (Chapitre 1) ont été suivis sur les prélèvements de la seconde expérimentation de split-root et discutés dans le chapitre 2. De plus, afin d’analyser la croissance racinaire, de nombreux systèmes de culture in vitro ont dû être mis en place. Les résultats obtenus ont mis en évidence que l’architecture racinaire est spécifique à chaque porte-greffe. Ce processus développemental, essentiel pour assurer le prélèvement des éléments nutritifs du sol s’intègre aussi parmi les mécanismes qui peuvent expliquer les différences de croissance conférées par le porte-greffe au greffon. En concordance avec les conclusions tirées du chapitre 1, en plus d’induire une réponse transcriptomique plus prononcée, la disponibilité en azote semble avoir une influence beaucoup plus marquée pour le génotype RGM sur la morphologie de son système racinaire notamment concernant la croissance de ses racines latérales. Même si ces différentes expérimentations n’ont pas été effectuées dans les mêmes conditions, le génotype RGM a toujours présenté des réponses moléculaires et physiologiques plus prononcées lorsque la disponibilité nutritive est modifiée. De plus, les acteurs impliqués dans la signalisation hormonale semblent y jouer un rôle clé.

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Conclusion générale et perspectives

Parmi les signaux régulateurs assurant la croissance harmonieuse de la plante greffée en réponse à son environnement, les hormones jouent un rôle majeur (Aloni et al., 2010; Tworkoski and Fazio, 2015). En réponse à la disponibilité en azote, de nombreuses classes hormonales sont impliquées (Krouk, 2016). L’analyse des données transcriptomiques du chapitre 1 a notamment permis de souligner la spécificité de réponse d’une classe hormonale en particulier. Les gènes impliqués dans la voie des strigolactones semblent effectivement être induits de manière « génotype spécifique ». La caractérisation du rôle de ces hormones a été réalisée pour étudier leur contribution dans le contrôle de la croissance végétative du greffon par le porte-greffe en réponse à la disponibilité en azote au cours du chapitre 3. Les expérimentations réalisées dans cette dernière partie des résultats ont clairement illustré que les deux génotypes de l’étude présentent des propriétés intrinsèques différentes vis-à-vis du développement de leur partie aérienne. Lorsqu’ils sont utilisés en tant que porte-greffe, ces caractéristiques propres à chaque génotype influencent la morphologie du greffon. Pour compléter cette étude, il est nécessaire d’évaluer de façon plus précise les teneurs en strigolactones produites par chaque porte-greffe mais aussi de les quantifier dans les différents organes de la plante ainsi que d’identifier le type de strigolactones produites.

La vision de l’ensemble de ces résultats souligne l’influence de la diversité des capacités des porte-greffes vis-à-vis de la nutrition azotée contribuant aux différences de contrôle de la croissance du greffon. Les conclusions issues des différents chapitres confirment l’intérêt de l’étude de ces processus pour mieux comprendre la croissance d’une plante greffée. Cette étude ne représente cependant qu’un début dans la compréhension de ces mécanismes. La complexité de la plante modèle utilisée notamment sa nature pérenne et les limites rencontrées lors des essais de transgénèse sont des facteurs limitants qui nécessitent la mise au point d’expérimentations adaptées. Cependant, les efforts menés dans cette voie sont encourageants et permettent d’obtenir des résultats comparables à d’autres espèces modèles.

Ainsi, la pérennité de la Vigne implique des stratégies spécifiques pour assurer la croissance de la plante sur une longue période. Le processus de mise en réserves représente d’ailleurs un facteur clé pour la survie de la plante. Ce mécanisme a été étudié chez RGM et 1103P dans une étude précédente (Lecourt, 2013). Les principales conclusions de ces travaux impliquant l’utilisation de marquage isotopique au 15N évoquent la forte implication des réserves azotées

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Conclusion générale et perspectives

(acides aminés) dans l’établissement des différences de croissance conférée par les porte- greffes. Ainsi, en plus des mécanismes liés à la régulation de la perception et de l’absorption de l’azote, les porte-greffes ont aussi une influence significative sur l’établissement et l’utilisation des réserves pour ce nutriment. Pour étudier ces mécanismes, des expérimentations sur des temps plus longs avaient été entreprises permettant d’évaluer l’absorption et la remobilisation des réserves en réponses à la disponibilité en azote (Lecourt, 2013). Ainsi pour avoir une vision globale des mécanismes mis en jeu par la plante dans ce processus, les études sur temps courts permettent dans un premier temps de caractériser les processus de perception et de signalisation qui se mettent en place rapidement après un changement de teneur en azote. Par la suite, il faudrait avoir des plants cultivés dans les mêmes conditions pour intégrer l’influence de la reprogrammation transcriptomique à courts termes sur les processus physiologiques qui s’établissent en aval. Encore une fois, la mise en place d’un tel dispositif demeure complexe notamment vis-à-vis de la surface d’expérimentation nécessaire et des ressources demandées pour l’entreprendre.

Les besoins en azote de la plante sont directement liés à son stade de développement. Les expérimentations menées en serre impliquent l’utilisation de matériel végétal prélevé l’année précédente et mis en culture l’année de l’étude. Les résultats obtenus reflètent donc les processus mis en place par la plante au début de son développement et représentent un aperçu à courts termes des stratégies mises en jeu par celle-ci en réponse à son environnement. Cette vision précoce de l’influence des porte-greffes sur la physiologie du greffon ne permet pas toujours d’observer des différences très prononcées sur la croissance de celui-ci (Cookson et al., 2012). Pour étudier les répercussions de cette adaptation, il apparaît réellement nécessaire de prolonger ces études sur des périodes plus longues. En effet, comme il a été montré dans le chapitre 3, l’influence du génotype de porte-greffe sur l’architecture du greffon en réponse à la disponibilité en azote est encore plus prononcée sur des plants âgés d’un an. D’autre part, la provenance des bois utilisés peut aussi représenter un facteur discriminant les porte-greffes. Les capacités intrinsèques de chaque génotype et leur stratégie propre d’utilisation de l’azote suggèrent des différences de contenu azoté sous forme de réserves. Par ailleurs, les cépages de Vigne ne permettent la production de baies qu’à partir de 3 ans minimum après leur greffage. Cette production fructifère est connue pour moduler l’allocation de l’azote mais aussi les flux de carbone au sein de la plante. Pour

129

Conclusion générale et perspectives compléter cette étude, il serait ainsi intéressant de réaliser des expérimentations de greffage en utilisant les mêmes génotypes associés à des greffons fructifères.

Au cours des expérimentations réalisées en serre, les plants étaient cultivés en pots et soumis à une fertirrigation quotidienne. En fin de culture, lors de la caractérisation phénotypique des différentes conditions, les systèmes racinaires avaient déjà largement conquis tout le milieu disponible. Pour caractériser les capacités de prospection racinaire respective à chaque porte- greffe, des expérimentations en rhizotrons sont actuellement en cours d’optimisation permettant de suivre de manière non destructive le développement racinaire. De plus, ce type de dispositif permettra aussi d’étudier l’influence d’une disponibilité hétérogène en azote en utilisant des split-rhizotrons. Ce type d’approche pourra aussi se réaliser en culture in vitro, condition dans laquelle le contenu nutritif du milieu est finement contrôlé. Ce système apparaît d’ailleurs intéressant pour caractériser l’influence de la source d’azote sur la croissance des porte-greffes étudiés.

L’ensemble de ces résultats associé aux données issues de la bibliographie souligne la complexité de l’étude des mécanismes assurant la croissance d’une plante pérenne greffée. Leur compréhension demeure cependant essentielle pour assurer la viticulture de demain à travers l’identification des acteurs qui régulent l’équilibre entre la croissance végétative et la production de baies de qualité dans un environnement en plein changement. L’obtention de ces données est d’autant plus importante qu’elles peuvent être transposées aux nombreuses autres espèces fruitières pérennes qui sont cultivées greffées.

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Lecourt J, Cookson SJ, Tandonnet JP, Claverie E, Cochetel N, Ollat N, Vivin P, Lauvergeat V (2013) Understanding scion development in grapevine: how do rootstocks contribute to nitrogen uptake and signaling? Nitrogen 2013, Puerto Varas (Chili).

POSTERS

Cochetel N, Escudie F, Cookson SJ, Dai Z, Vivin P, Bert PF, Muñoz MS, Delrot S, Ollat N, Klopp C, Lauvergeat V (2016) The transcriptomic responses of grafted grapevines to heterogeneous nitrogen availability are rootstock genotype dependent. Nitrogen 2016, Montpellier (France).

Cochetel N, Escudie F, Cookson SJ, Dai Z, Vivin P, Bert PF, Muñoz MS, Delrot S, Ollat N, Klopp C, Lauvergeat V (2016) Responses to heterogeneous N supply in grafted plants: transcriptome characterization of two grapevine rootstock genotypes. Congrès annuel de l’école doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé, Bordeaux (France).

Cochetel N, Cookson SJ, Vivin P, Muñoz MS, Bert PF, Delrot S, Ollat N, Klopp C, Lauvergeat V (2014) RNAseq transcriptome profiling of two Grapevine rootstock genotypes highlights a contrasted response to heterogeneous N availability. Congrès annuel de l’école doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé, Bordeaux (France).

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