In-Vitro-Einflüsse Auf Die Aktivität Von Invertasen, Suche Nach Neuen

Untersuchungen zur Regulation der Invertaseaktivität und zu Invertaseinhibitoren aus Pflanzenextrakten

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades der

Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Barbara Schäfer

Haßfurt

Würzburg 2012

Eingereicht am: ______

Mitglieder der Prüfungskommission:

Vorsitzender: ______

1. Gutachter: ______

2. Gutachter: ______

Tag des Promotionskolloquiums: ______

Doktorurkunde ausgehändigt am: ______3 Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...... 3 Abkürzungsverzeichnis ...... 7 Zusammenfassung...... 9 Summary ...... 10 1. Einleitung ...... 11 1.1. Invertasen, Enzyme des Kohlenhydratmetabolismus ...... 11 1.1.1. Pflanzliche Invertasen ...... 12 1.1.1.1. Saure pflanzliche Invertasen ...... 12 1.1.1.1.1. Zellwandgebundene Invertasen ...... 15 1.1.1.1.2. Vakuoläre Invertasen ...... 16 1.1.1.2. Neutrale / alkalische Invertasen ...... 16 1.1.2. Hefeinvertase ...... 18 1.1.3. Humane Sucrase-Isomaltase ...... 19 1.2. Hemmung der Invertaseaktivität ...... 21 1.2.1. Proteinogene pflanzliche Invertaseinhibitoren ...... 22 1.2.1.1. Struktur der proteinogenen Invertaseinhibitoren ...... 22 1.2.1.2. Beeinflussung der inhibitorischen Aktivität, Wirkspektrum ...... 23 1.2.1.3. Physiologische Rolle der proteinogenen Invertaseinhibitoren ...... 24 1.2.2. Chemische Invertaseinhibitoren ...... 25 1.2.2.1. Iminozucker und Thiozucker ...... 26 1.2.2.2. Cyclohexenverbindungen ...... 29 1.2.2.3. Nicht-glykosidische Verbindungen ...... 30 1.2.2.4. Zucker und Zuckerverbindungen ...... 30 1.3. Diabetes mellitus ...... 31 1.3.1. Krankheitsbild ...... 32 1.3.2. Behandlung ...... 33 1.4. Pflanzliche Medizin ...... 34 1.4.1. Einsatz pflanzlicher Medizin in der Diabetestherapie ...... 35 1.4.2. Traditionelle Chinesische Medizin ...... 36 1.5. Die Hefe Pichia pastoris als eukaryotisches Expressionssystem ...... 37 1.6. Zielsetzung der Arbeit ...... 38 2. Ergebnisse ...... 40 2.1. Aufarbeitung der Invertasen, Festlegung der Versuchsbedingungen ...... 40 2.1.1. Herstellung der verwendeten Invertasepräparationen ...... 40 2.1.1.1. Heterologe Expression der humanen Sucrase in P. pastoris ...... 41 2.1.1.1.1. Überprüfung des Transformationserfolges ...... 43 2.1.1.1.2. Anzucht der Hefeklone zur Expression der humanen Sucrase ...... 43 2.1.1.1.3. Aufreinigung der humanen Sucrase aus dem Zelllysat ...... 44 2.1.1.2. Heterologe Expression pflanzlicher Enzyme ...... 45 2.1.1.3. Selektion auf Agarplatten mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle ...... 45 2.1.1.4. Gewinnung pflanzlicher Extrakte ...... 46 2.1.2. Messungen zur pH-Wert-Abhängigkeit der Invertaseaktivität ...... 47 2.1.3. Messungen zur Temperaturabhängigkeit der Invertaseaktivität ...... 49 2.1.4. Ermittlung der optimalen Saccharosemenge, Bestimmung der

Enzymparameter Km und vmax ...... 50 2.2. Beeinflussung der Invertaseaktivität durch verschiedene Salze ...... 53 2.2.1. Beeinflussung der Invertaseaktivität durch Metallionen ...... 53 2.2.2. Beeinflussung der Invertaseaktivität durch Natriumchlorid ...... 55 2.3. Einfluss von Inhibitoren auf die Invertaseaktivität ...... 56 2.3.1. Herstellung von Inhibitorpräparationen...... 57 2.3.1.1. Heterologe Expression proteinogener Inhibitoren ...... 57 2.3.1.1.1. Heterologe Expression in P. pastoris ...... 57 4 Inhaltsverzeichnis

2.3.1.1.2. Überprüfung der heterologen Expression in P. pastoris, Aufreinigung des proteinogenen Inhibitors ...... 58 2.3.1.1.3. Heterologe Expression in N. benthamiana, Aufreinigung der Inhibitoren ...... 59 2.3.1.2. Herstellung von Thiofructosiden ...... 60 2.3.2. Einfluss von Inhibitoren auf die Aktivität pflanzlicher Invertasen ...... 62 2.3.2.1. Beeinflussung durch chemische Invertaseinhibitoren ...... 62 2.3.2.1.1. Beeinflussung durch Zugabe von Einzelsubstanzen ...... 63 2.3.2.1.2. Beeinflussung durch Kombinationen aus verschiedenen Hemmstoffen ...... 72 2.3.2.2. Beeinflussung durch proteinogene Invertaseinhibitoren ...... 73 2.3.3. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Aktivität der humanen Sucrase ...... 75 2.3.3.1. Beeinflussung durch chemische Invertaseinhibitoren ...... 75 2.3.3.1.1. Beeinflussung durch Zugabe von Einzelsubstanzen ...... 75 2.3.3.1.2. Beeinflussung durch Kombinationen aus verschiedenen Hemmstoffen ...... 77 2.3.3.2. Beeinflussung durch proteinogene Invertaseinhibitoren ...... 77 2.3.4. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Aktivität der Hefeinvertase ...... 78 2.3.4.1. Beeinflussung durch chemische Invertaseinhibitoren ...... 78 2.3.4.2. Beeinflussung durch proteinogene Invertaseinhibitoren ...... 80 2.4. Suche nach neuen Invertaseinhibitoren ...... 81 2.4.1. Literaturrecherche ...... 81 2.4.2. Für Hemmtests verwendete Pflanzenextrakte ...... 82 2.4.2.1. Herstellung von Extrakten mittels sukzessiver Extraktion ...... 83 2.4.2.2. Herstellung wässriger Extrakte aus Suspensionkulturen und frischem Pflanzenmaterial ...... 84 2.4.2.3. TCM-Extrakte ...... 85 2.4.3. Invertasetests mit verschiedenen Extrakten als potentielle Hemmstoffe ...... 85 2.4.3.1. Ergebnisse der Messungen der extrazelluläreren Invertase aus C. rubrum Zellkulturen ...... 85 2.4.3.2. Ergebnisse der Messungen der humanen Sucrase ...... 89 2.4.3.3. Ergebnisse der Messungen der Hefeinvertase ...... 91 2.4.3.4. Übersicht der Extrakte, die eine Hemmung herbeiführten ...... 93 3. Diskussion ...... 95 3.1. Heterologe Expression der humanen Sucrase in P. pastoris ...... 95 3.2. In vitro untersuchte Einflüsse auf Invertasen ...... 96 3.3. Unterschiede der heterolog exprimierten Invertasen CIN1 und CIN1(P/V) ...... 99 3.4. Proteinogene Invertaseinhibitoren ...... 101 3.4.1. Proteinogene Invertaseinhibitoren hemmen verschiedene Invertasen ...... 101 3.4.2. Glykosilierte Invertaseinhibitoren hemmen pflanzliche Invertase nicht ...... 103 3.5. Unterschiedlich starke Beeinflussung von Invertasen durch verschiedene Inhibitoren ...... 103 3.5.1. Getestete Iminozucker unterscheiden sich stark in ihrem Hemmspektrum ...... 103 3.5.2. Acarbose als Inhibitor der α-Amylase und der Sucrase hemmt auch pflanzliche Invertasen ...... 105 3.5.3. Fructose beeinflusst die Aktivität der Invertasen unterschiedlich, ebenso L- Arabinose und D-Xylose ...... 106 3.5.4. Einfache Stickstoffverbindungen hemmen Invertasen ...... 107 3.5.5. Kombinationen verschiedener Hemmstoffe am gleichen Enzym führen nicht zu einer verstärkten Hemmung ...... 108 3.6. Screening nach neuen Invertaseinhibitoren ...... 108 3.7. Pflanzen als Bestandteil der Diabetestherapie ...... 113 3.8. Ausblick ...... 115 5 Inhaltsverzeichnis

4. Materialien und Methoden ...... 118 4.1. Materialien ...... 118 4.1.1. Chemikalien und Enzyme ...... 118 4.1.2. Nährmedien ...... 119 4.1.2.1. Bakterienmedien ...... 119 4.1.2.2. Pilzmedien ...... 119 4.1.2.3. Zellkulturmedien, Pflanzenmedien ...... 120 4.1.3. Puffer und Lösungen ...... 120 4.1.3.1. Puffer und Lösungen für molekularbiologische Arbeiten ...... 120 4.1.3.2. Puffer und Lösungen für proteinchemische Arbeiten ...... 120 4.1.3.3. Puffer und Lösungen für analytische Arbeiten ...... 121 4.1.3.4. Puffer und Lösungen für die Arbeit mit Extrakten ...... 122 4.1.3.5. Sonstige Puffer und Lösungen ...... 122 4.1.4. Verwendete Organismen und Plasmide ...... 122 4.1.4.1. Bakterien ...... 122 4.1.4.2. Pilze ...... 123 4.1.4.3. Zellkulturen ...... 123 4.1.4.4. Pflanzen ...... 124 4.1.4.5. Plasmide ...... 124 4.1.5. Geräte ...... 124 4.1.6. Computerprogramme, Webseiten ...... 125 4.2. Methoden ...... 125 4.2.1. Molekularbiologische Methoden ...... 125 4.2.1.1. Molekularbiologische Methoden für die Arbeit mit DNA ...... 125 4.2.1.1.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...... 125 4.2.1.1.2. Overlap Extension PCR ...... 127 4.2.1.1.3. Spaltung von DNA mittels Restriktionsenzymen ...... 128 4.2.1.1.4. Dephosphorylierung mittels CIAP ...... 128 4.2.1.1.5. Agarosegelelektrophorese ...... 128 4.2.1.1.6. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ...... 129 4.2.1.1.7. Ligation von DNA-Fragmenten ...... 129 4.2.1.2. Molekularbiologische Methoden für die Arbeit mit Bakterien ...... 129 4.2.1.2.1. Herstellung chemisch kompetenter Bakterienzellen ...... 129 4.2.1.2.2. Transformation von Bakterienzellen ...... 129 4.2.1.2.3. Plasmid-DNA-Isolierung aus Bakterienzellen ...... 130 4.2.1.2.4. Aufschluss von Bakterienzellen ...... 130 4.2.1.3. Molekularbiologische Methoden für die Arbeit mit Hefen ...... 130 4.2.1.3.1. Transformation von Hefezellen, LiAc – Methode ...... 130 4.2.1.3.2. Transformation von Hefezellen, Elektroporation ...... 131 4.2.1.3.3. Transformation von Hefezellen, condensed method ...... 131 4.2.1.3.4. Colony Screening von transformierten Hefezellen ...... 131 4.2.1.3.5. Isolierung genomischer DNA aus Hefezellen ...... 131 4.2.1.3.6. Glasperlenaufschluss von Hefezellen ...... 132 4.2.2. Proteinchemische Methoden ...... 132 4.2.2.1.1. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford ...... 132 4.2.2.1.2. SDS-PAGE ...... 132 4.2.2.1.3. Natives Gel ...... 133 4.2.2.1.4. Silberfärbung ...... 133 4.2.2.1.5. Coomassie-Färbung ...... 133 4.2.2.1.6. Glykoproteinfärbung mit Alcianblau ...... 133 4.2.2.1.7. Aktivitätsfärbung nach nativem Gel – Nachweis einer Invertase ...... 134 4.2.2.1.8. Invertaseaktivitätstest ...... 134 4.2.2.1.9. Verdau mit Endoglycosidase H (Endo H) ...... 134 6 Inhaltsverzeichnis

4.2.2.1.10. Aufreinigung mittels Fällung ...... 135 4.2.2.1.11. Größenauftrennung mittels Amicon Ultra ...... 135 4.2.2.1.12. Aufreinigung mittels Ionenaustauschersäule ...... 135 4.2.2.1.13. Affinitätstaufreinigung im batch-Verfahren...... 136 4.2.3. Analytische Methoden ...... 136 4.2.3.1.1. Bestimmung der Glucosemenge mittels GOD-POD ...... 136 4.2.3.1.2. Bestimmung der Invertaseaktivität mittels radioaktiv markierter Saccharose ...... 136 4.2.3.1.3. Auftrennung mittels Dünnschichtchromatographie ...... 137 4.2.4. Anzuchtmethoden ...... 137 4.2.4.1. Anzucht von Bakterien und Pilzen ...... 137 4.2.4.1.1. Escherichia coli ...... 137 4.2.4.1.2. Saccharomyces cerevisiae ...... 137 4.2.4.1.3. Pichia pastoris ...... 137 4.2.4.2. Anzucht von Suspensionskulturen ...... 138 4.2.4.2.1. Heterotrophe Kulturen ...... 138 4.2.4.2.2. Autotrophe Kulturen ...... 138 4.2.4.2.3. Elicitieren der Kulturen ...... 139 4.2.5. Extraktherstellung ...... 139 4.2.5.1. Proteinextrakte aus pflanzlichem Material ...... 139 4.2.5.1.1. Extrazelluläre Invertase von C. rubrum ...... 139 4.2.5.1.2. Proteinextrakte aus Pflanzen ...... 139 4.2.5.2. Pflanzenextrakte zur Inhibitortestung ...... 140 4.2.5.2.1. Extrakte aus Suspensionszellkulturen ...... 140 4.2.5.2.2. Ethanolischer Extrakt ...... 140 4.2.5.2.3. Fraktionierte Extrahierung ...... 141 4.2.6. sonstige Methoden ...... 141 4.2.6.1. Sterilisation von Samen ...... 141 4.2.6.2. Infiltration von N. benthamiana mit A. tumefaciens zur heterologen Expression von Inhibitorproteinen ...... 141 4.2.6.3. Farbnachweis für Agrobakterien ...... 141 4.2.6.4. Herstellung von Thiofructosiden ...... 142 4.2.6.5. Herstellung der Elicitorlösungen ...... 142 5. Literaturverzeichnis ...... 143 6. Anhang ...... 179 6.1. Klonierungsschemata ...... 179 6.2. Liste der verwendeten Extrakte...... 189 6.3. Zusätzliche Angaben zur Temperaturabhängigkeit, pH-Abhängigkeit und Hemmung durch proteinogene Invertaseinhibitoren ...... 196 6.4. Ergebnisse der durchgeführten Hemmtests mit den Extrakten ...... 199 6.5. Zusätzliche Angaben zu Material und Methoden ...... 207 6.6. Liste mit Pflanzen, die in der Diabetestherapie eingesetzt werden; Ergebnis der Literaturrecherche ...... 209 Publikationen ...... 231 Lebenslauf ...... 232 Danksagung ...... 233 Ehrenwörtliche Erklärung ...... 234

7 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1-SST Sucrose:Sucrose-1-fructosyltransferase 2,4-D 2,4-Dichlorphenoxysäure ABA abscisic acid, Abscisinsäure ABTS Diammoniumsalz der 2,2´-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) AcOH / Ac Essigsäure / Acetat AOX Alkoholoxidase APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosintriphosphat BMD buffered minimal dextrose medium, gepuffertes Minimalmedium mit Glucose BMGY buffered complex glycerol medium, gepuffertes Komplexmedium mit Glycerin BMMY buffered complex methanol medium, gepuffertes Komplexmedium mit Methanol BMS buffered minimal sucrose medium, gepuffertes Minimalmedium mit Saccharose bp Basenpaare BSA bovine serum albumin, Rinderalbumin CBB Coomassie Brilliant Blau cDNA komplementäre DNA Ci Curie CIAP Calf-Intestine-Alkaline-Phosphatase, alkalische Phosphatase aus dem Kalbsdarm CM Carboxymethyl Con A Concanavalin A conc konzentriert cr crude, roh C. rubrum Chenopodium rubrum CIF zellwandgebundene Isoform cw cell wall (bound), an die Zellwand gebunden cw-INV zellwandgebundene Invertase DC Dünnschichtchromatographie DCM Dichlormethan DEPC Diethylenpyrocarbonat DMDP 2,5-Dihydroxymethyl-3,4-dihydroxypyrrolidin; auch 2,5-Dideoxy-2,4-imino-D-mannitol DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonucleinsäure DNJ 1-Deoxynoijrimycin DPP4 Dipeptidyl-Peptidase 4 DTT Dithiothreitol EC Enzymnomenklatur nach International Union of Biochemistry EDTA Ethylendiamintetraacetat E-FOL Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Endo H Endoglycosidase H EtOH Ethanol Ex Extrakt FEH Fructanexohydrolase Fru Fructose FT Fructosyltransferase g Erdbeschleunigung GAP Glycerinaldehyd-3-Phophat GH Glycosylhydrolasen Glc Glucose GLP-1 Glucagon-like Peptide 1, Glukagon-ähnliches Peptid 1 GOD Glucoseoxidase GRIN Germplasm Resources Information Network, Datenbank HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

IC50 mittlere inhibitorische Konzentration InvInh Invertaseinhibitor IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid IUB International Union of Biochemistry Kap. Kapitel kDa Kilo-Dalton

Km Michaeliskonstante

K-PO4 Kaliumphosphat, Mischung aus K2HPO4 und KH2PO4 LS Linsmaier & Skoog M Molarität MeOH Methanol MES 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure MGA Maltase-Glucoamylase 8 Abkürzungsverzeichnis

MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure mRNA messenger-RNA, Boten-RNA MS Murashige & Skoog ms Millisekunden na-INV neutrale / alkalische Invertasen nm Nanometer

Na-PO4 Natriumphosphat, Mischung aus Na2HPO4 und NaH2PO4

OD600 Optische Dichte bei 600 nm PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion PEG Polyethylenglycol pI Isoelektrischer Punkt PMEI Pectinmethylesteraseinhibitor PMSF Phenylmethylsulfonfluorid POD Peroxidase PPAR Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren P. pastoris Pichia pastoris rpm rounds per minute, Drehungen pro Minute RT Raumtemperatur S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDS sodium dodecylsulfate, Natriumdodecylsulfat SGLT2 sodium dependent glucose transporter2, natriumabhängiger-Glucosetransporter 2 Suc sucrose, Saccharose Susy Sucrose-Synthase TCM Traditionelle Chinesische Medizin TEMED Tetramethylethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol UDP Uridinphosphat ÜN über Nacht UV Ultraviolett vac-INV vakuoläre Invertase VI Vorinkubation bzw. vakuoläre Invertase VIF vakuoläre Isoform

vmax maximale Geschwindigkeit Vol Volumen YNB yeast nitrogen base, Hefe-Minimalmedium YPD yeast extract peptone dextrose medium, Hefe-Vollmedium mit Glucose YPG yeast extract peptone glycerol medium, Hefe-Vollmedium mit Glycerin YPM yeast extract peptone methanol medium, Hefe-Vollmedium mit Methanol

9 Zusammenfassung

Zusammenfassung

Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewe- sen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energieträger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden Überblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt.

Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielfältige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen in der Aktivität durch verschiedene Einflüsse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen.

Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorgängen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase- Isomaltase aus dem Dünndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden.

Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkstärke verschiedener Inhibi- toren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer

Struktur zueinander sehr ähnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivität. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol führt

teilweise zu einer erhöhten Invertaseaktivität und Calystegin B2 verfügt nur über ein be- schränktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivität. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegenüber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat.

Für die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchge- führt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten könnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde größtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgeführt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten. 10 Summary

Summary

The cleavage of different sugars is a fundamental process in all living organisms. In this the- sis, enzymes which cleave sucrose – an important messenger molecule and energy carrier - in glucose and fructose were analyzed. It shows a broad overview of sucrose cleaving enzymes, which for the first time, combines α-glucosidases and β-fructofuranosidases and their inhibitors.

Invertases (β-fructofuranosidases, fructose split-off) play a pivotal role in plant metabolism and are regulated in varied manners. Investigations about the changes in activities of different invertase preparations by different influences were done in vitro. It could be shown that temperature optimum of invertases is impressingly high. The behavior of alkaline / neutral invertase differentiates in many tests from that of others invertases.

Also in animals and human beings, sucrose cleaving enzymes, named α-glucosidase or sucrase (glucose split-off), are part of important processes like glycosilation of proteins or digestion. The human sucrase-isomaltase from small intestine is a target in diabetes therapy. As an active subunit the sucrase could be expressed in the yeast Pichia pastoris for the first time.

Aside from the enzymes, the spectrum of activity and the potency of different invertase inhibitors were analyzed. It could be shown that acarbose, which is used in diabetes therapy, can

also inhibit plant invertases. DMDP, miglitol and calystegine B2, structurally similar imino sugars, differ extensively in their potency. DMDP is the most potent inhibitor, Miglitol partly

increases invertase activity and calystegin B2 inhibits only some enzymes. Proteinaceous invertase inhibitors inhibit humane sucrase and yeast invertase as well as plant invertases; in P. pastoris expressed and glycosylated inhibitors showed no potency. As the only inhibitor, miglitol could selectively inhibit the alkaline / neutral invertase, inhibition occured at concentra- tions 1000 times lower than with other invertases.

The search for new invertase inhibitors comprised a screening of different extracts and a literature research dealing with plants in diabetic therapy and plant derived glucosidase inhibitors. A large number of plants with potential active ingredients were investigated. The screening for new invertase inhibitors was mainly conducted with extracts of plants from traditional chinese medicine. As result, inhibitory extracts were found which should be further investigated.

11 Einleitung

1. Einleitung

1.1. Invertasen, Enzyme des Kohlenhydratmetabolismus Unter Kohlenhydraten versteht man Monosaccharide, ihre Verbindungen und Derivate. Sie dienen Organismen zuallererst als Energiequelle. Durch den Abbau von Kohlenhydraten, meist in Form der Glucose, wird Energie gewonnen, die zum Aufbau von Molekülen und zum Ablauf von Stoffwechselvorgängen benötigt wird. In Pflanzen entsteht Glucose durch Photosynthese,

also durch CO2-Assimilation durch Licht unter Mitwirkung des Chlorophylls. Mit Ausnahme einiger Mikroorganismen, die auch Photosynthese betreiben können, sind die anderen Lebewe- sen bezüglich der Zuckerverbindungen heterotroph, was bedeutet, dass sie diese über ihre Nahrung aufnehmen müssen (Christen und Vögtle, 1998).

Die Einteilung der Kohlenhydrate erfolgt nach der Zahl ihrer Bausteine. Neben Monosacchariden gibt es Oligosaccharide (Kondensationsprodukte aus 2-9 Monosacchariden) und Polysaccharide. Zu diesen gehören wichtige Reservestoffe wie Stärke und Glykogen, die aus Glucose aufgebaut sind, auch Fructane aus Fructoseeinheiten, wie das Inulin, werden in Pflanzen gelagert. Saccharose ist ein wichtiger Transport- und Lagerzucker in Pflanzen. Es handelt sich dabei um ein Disaccharid aus Glucose und Fructose, die miteinander glykosidisch verknüpft sind. Die Glucose liegt dabei in der α-Form vor, die Fructose in der β-Form (Abb. 1- 1).

Abbildung 1-1: Saccharose, Disaccharid aus α-Glucose und β-Fructose

Die klassischerweise als Invertasen bezeichneten β-Fructofuranosidasen (EC 3.2.1.26) kommen in Bakterien, Pilzen und Pflanzen vor. Sie spalten die β-glykosidisch gebundene Fructose der Saccharose ab. α-Glucosidasen (EC 3.2.1.48), die die α-glykosisch gebundene Glucose abspal- ten, finden sich auch in Tieren und Menschen. Sie werden in der Literatur nicht als Invertasen beschrieben, sondern als Sucrasen (vom englischen sucrose für Saccharose) oder α- Glucosidasen. Eine Ausnahme bilden Insekten, da auch hier β-Fructofuranosidasen entdeckt wurden (Santos und Terra, 1986; Carneiro et al., 2004; Daimon et al., 2008). Im Rahmen dieser Arbeit werden alle getesteten Enzyme (β-Fructofuranosidasen und α-Glucosidasen) als Invertasen bezeichnet.

Diese Einteilung und die Bezeichnung nach der IUB Enzymnomenklatur (EC 3.2.1.26 und 48; http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/) richtet sich nur nach der Art der katalysier- ten Reaktion (hier: Hydrolyse von O-glykosidischen Verbindungen) und dem Substrat bzw. dem molekularen Mechanismus. Sie spiegelt jedoch nicht die evolutionäre Entwicklung wieder 12 Einleitung

bzw. stößt bei Enzymen mit mehreren Substraten an ihre Grenzen. Daher wurde für die über- geordnete Gruppe der Glycosylhydrolasen, zu denen die zuckerspaltenden Enzyme gehören, eine weitere Klassifizierung eingeführt, die Familien aufgrund der Aminosäuresequenzen defi- niert (Henrissat, 1991). Familien, die sich zusätzlich in der besser erhaltenen dreidimensionalen Struktur mehr ähneln als in ihrer Aminosäuresequenz, werden darüberhinaus zu Clans zusammengeschlossen.

1.1.1. Pflanzliche Invertasen Photosynthese findet in den Chloroplasten der Mesophyllzellen grüner Blätter statt. Diese werden als source-Gewebe bezeichnet, wenn sie mehr Kohlenstoff, also Energie herstellen als sie selbst benötigen. Sink-Gewebe, wie Wurzeln, junge Blätter, Blüten und Früchte, muss über das Phloem Kohlenstoff aufnehmen. In vielen Pflanzen ist die Haupttransportform hier- für Saccharose. Saccharose wird aus dem Phloem entladen und kann entweder über symplastische Verbindungen transportiert und anschließend in der Zelle verwertet oder in den Apoplasten transportiert werden. Im Apoplast kann Saccharose von Invertasen gespalten und als Hexosen in die Zelle transportiert werden oder intakt über Transporter in die Zelle gelangen. In der Zelle wiederum kann Saccharose im Cytoplasma gespalten oder in der Vakuole gelagert werden. Auch in der Vakuole befinden sich Invertasen (Roitsch und Gonzalez, 2004).

In höheren Pflanzen kommen mehrere Formen der Invertasen vor. Sie werden nach verschiedenen Kriterien aufgeteilt, etwa dem pH-Optimum oder der Lokalisation in der Zelle. Saure Invertasen werden in zellwandgebundene (cw-INV) und vakuoläre (vac-INV) Invertasen unterteilt, neutrale bzw. alkalische Invertasen (na-INV) liegen im Cytosol und verschiedenen Zell- organellen vor.

Neben den Invertasen gibt es in Pflanzen ein weiteres Enzym, das Saccharose spaltet, die Sucrose-Synthase (Susy). Die Spaltung der Saccharose erfolgt hier im Gegensatz zur Invertase reversibel, es entstehen Fructose und UDP-Glucose (Koch, 2004).

1.1.1.1. Saure pflanzliche Invertasen Saure pflanzliche Invertasen gehören zur Familie 32 der Glycosylhydrolasen (GH 32). In dieser Familie befinden sich neben sauren Invertasen aus Pflanzen, Pilzen und Bakterien auch Inulinasen und Levanasen, außerdem alle pflanzlichen Enzyme des Fructanmetabolismus. Aufgrund einer hohen strukturellen Ähnlichkeit werden GH 32 mit GH 68 zum Clan GH-J zusammengefasst. GH 68 umfasst hauptsächlich bakterielle Levansucrasen und Inulosucrasen.

Die dreidimensionale Struktur der genannten Enzyme besteht aus einer gemeinsamen β- Propeller-Domäne mit fünf Flügeln aus β-Faltblättern. In der Mitte befindet sich das negativ geladene aktive Zentrum (Abb. 1-2). Enzyme der GH 32-Familie besitzen darüberhinaus eine zweite C-terminale Domäne, die aus antiparallelen β-Faltblättern besteht, die wie ein Sand- wich geformt sind (Lammens et al., 2009).

In der Aminosäuresequenz gibt es drei konservierte Motive (Angabe im Einbuchstabencode): WMNDPNG, WECP/VD und RDP. Das WMNDPNG-Motiv wird auch als β-Fructosidase-Motiv oder 13 Einleitung

sucrose-binding box bezeichnet. Die drei Aminosäuren DPN werden durch ein Miniexon aus neun Basen codiert (Xu et al., 1995). Durch den Austausch einer einzigen Aminosäure kann das pH-Optimum und die Substratspezifität einer Invertase geändert werden. Ist im WECP/VD- Motiv ein Prolin, wie bei den cw-INV, so ist das pH-Optimum saurer und Raffinose wird besser abgebaut im Vergleich zu vac-INV, die an dieser Position ein Valin besitzen (Goetz und Roitsch, 1999).

Abbildung 1-2: Dreidimensionale Struktur der AtcwINV1 (At3g13790): A: Dreidimensionale Darstellung der Invertase. In rot sind die drei Glykosilierungsstellen Asn116, Asn143 und Asn299 zu sehen, die Zuckerketten sind orange abgebildet. Die drei konservierten Aminosäuren Asp23, Asp143 und Glu203 sind blau hervorgehoben. B: Schematische Dar- stellung der räumlichen Struktur: β-Faltblätter sind als Pfeile, α-Helices als Zylinder dargestellt. Die Glykosilierungsstellen sind mit Sternen gekennzeichnet. (nach Verhaest et al., 2006)

Abbildung 1-3: Reaktionsmechanismus der Saccharosespaltung am Beispiel der AtcwINV1: A: Nucleophiler Angriff, Bildung des Übergangzustandes. B: Basenkatalysierte Hydrolyse durch das Akzeptormolekül Wasser. D23 reagiert als Nucleophil, E203 als Säure/Base-Katalysator. (Lammens et al., 2008)

Jedes dieser drei konservierten Motive besitzt eine saure Aminosäure, zwei Asparaginsäuren und eine Glutamatsäure, die im aktiven Zentrum liegen (Pons et al., 2004). Die Asparaginsäu- re aus der sucrose-binding box agiert als Nucleophil (Reddy und Maley, 1990), die Glutamatsäure (EC-Motiv) als Säure/Base-Katalysator (Reddy und Maley, 1996). Die zweite Asparaginsäure dient wohl als Stabilisator des Übergangszustandes (Meng und Futterer, 2008). Der Reaktionsmechanismus ist eine nucleophile Substitution, die in zwei Schritten abläuft 14 Einleitung

(Abb. 1-3). Dabei bleibt die anomere Konfiguration am Kohlenstoff erhalten (Alberto et al., 2004). Bei der Glykosilierung greift das Nucleophil das Substrat an, es bildet sich ein Über- gangszustand (steady state), in dem das Substrat kovalent an das Enzym gebunden ist. Der Säure/Base-Katalysator aktiviert das Akzeptormolekül, dieses hydrolysiert die Bindung zwischen Substrat und Enzym (Deglykosilierung) (Lammens et al., 2008).

Neben den für GH32 genannten konservierten Motiven in der Aminosäuresequenz gibt es weitere konservierte Aminosäuren bei den sauren Invertasen. Abbildung 1-4 zeigt die Aminosäuresequenzen verschiedener höherer Pflanzen an 13 gut konservierten Stellen. Es ist zu sehen, dass es neben Prolin/Valin noch vier weitere Aminosäuren gibt, die in der Regel bei cw-INV und vac-INV unterschiedlich sind (Ji et al., 2005).

Abbildung 1-4: Vergleich von 13 konservierten Bereichen in der Aminosäuresequenz von Invertasen höherer Pflanzen. Die Boxen weisen auf Aminosäuren hin, die sich bei cw-INV (hier als CIN bezeichnet) und vac-INV unterscheiden. Pfeile zeigen konservierte Aminosäuren des aktiven Zentrums. Die Motive 3, 4, 5, 10 und 11 befinden sich in oder bei den β-Faltblättern der Propellerdomäne. Die Zahlen geben die Aminosäuresequenz von OsVIN2 an. (nach Ji et al., 2005)

Saure Invertasen sind im Periplasma der Bakterien bzw. extrazellulär bei Pilzen bekannt. Es wird vermutet, dass vakuoläre Invertasen durch Mutationen der extrazellulären Invertasen entstanden sind (Unger et al., 1994; Ji et al., 2005). Diese fanden auch in der Signalsequenz statt, was zu einer anderen Lokalisation in der Zelle führte. Veränderungen des Erbgutes fanden bei den sauren Invertasen allgemein in hoher Zahl durch Genduplikationen und Genver- luste statt, was die meist große Anzahl an Isoformen der sauren Invertasen, v.a. der cw-INV, erklärt (Ji et al., 2005; Francki et al., 2006). 15 Einleitung

Wie schon erwähnt sind saure Invertasen in Pflanzen Glykoproteine. Dadurch sind sie besonders stabil und werden langsamer abgebaut (Yamaguchi, 2002; Pagny et al., 2003). In den meisten Geweben sind sie gegenüber den na-INV die aktivere Form. Für eine schnelle Inakti- vierung gibt es in Pflanzen proteinogene Invertaseinhibitoren, die in der Vakuole und im Apoplasten vorkommen (Kap. 1.2.2.). Als β-Fructofuranosidasen können sie nicht nur Saccha- rose, sondern auch Raffinose oder Stachyose hydrolisieren (Roitsch und Gonzalez, 2004).

1.1.1.1.1. Zellwandgebundene Invertasen Im Apoplasten finden sich saure Invertasen, die über ionische Wechselwirkungen an die Zell- wand gebunden sind. Ihr isoelektrischer Punkt (pI) liegt im basischen Bereich - im Gegensatz zu vakuolären Invertasen, deren pI neutral ist. Putative cw-INV mit einem niedrigerem pI in Arabidopsis wurden als Fructanexohydrolasen (FEH) identifiziert (De Coninck et al., 2005). FEHs bauen Fructane ab, können aber Saccharose nicht hydrolysieren, welche als Inhibitor agieren kann (Van den Ende et al., 2009). FEHs und cw-INV haben eine größere Homologie zueinander als zu vacINV oder Fructosyltransferasen (FT) (Van den Ende et al., 2000), etwa kann der Austausch einer Aminosäure eine cw-INV in eine FEH verwandeln (Le Roy et al., 2007).

Die wichtigste Aufgabe der cw-INV ist die Versorgung des Gewebes mit Kohlenhydraten. Bei sich entwickelndem Gewebe, etwa bei wachsenden Bambussprossen wurde eine sehr hohe cw- INV-Aktivität nachgewiesen (Hsieh et al., 2006). Von Bedeutung ist die cw-INV besonders bei symplastisch isoliertem Gewebe, wie Pollen oder Embryonen. Hier sind die Zellen auf die Kohlenstoffaufnahme über den Apoplasten angewiesen (Zhang et al., 2001). Durch Wasser- mangel kommt es zu einer Hemmung der Invertasen, was zum Absterben der Ovarien, etwa von Mais führt (McLaughlin und Boyer, 2004; Boyer und McLaughlin, 2007). Durch gentechnisch reduzierte Aktivität der cw-INV konnte ein Abbruch der Pollenentwicklung herbeigeführt werden, was zur Sterilität des Pollens in Tabak und Tomate führte (Goetz et al., 2001; Proels et al., 2006).

Die Regulation der cw-INV wird durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren beeinflusst. Eine Induktion der Expression konnte durch Kohlenhydrate, v.a. Glucose nachgewiesen werden (Roitsch et al., 1995; Godt und Roitsch, 1997). Durch diesen positiven Feedback-Mechanismus können dem Gewebe mehr Kohlenhydrate zur Verfügung gestellt werden. Auch viele Pflan- zenhormone induzieren die Aktivität der cw-INV. In den meisten Fällen kann dies mit einem erhöhten Energiebedarf des wachsenden Gewebes in Verbindung gebracht werden. Gesteiger- te Aktivität der cw-INV konnte für Gibberelinsäure, Auxin, Cytokinine, Brassinosteroide und Abscisinsäure gezeigt werden, nur bei Ethylen wird die Expression herunterreguliert (Roitsch et al., 2003). Auch durch Verwundungen und Pathogeninfektionen steigt der Energiebedarf des betroffenen Gewebes, es erhält sink-Status, Kohlenhydrate müssen importiert werden, eine Aktivierung der cw-INV kann festgestellt werden (Fotopoulos et al., 2003; Berger et al., 2004). 16 Einleitung

Bei den cw-INV handelt es sich um eine Gruppe mit vielen Mitgliedern, so wurden in Reis neun cw-INV gefunden, in Arabidopsis vier (De Coninck et al., 2005; Ji et al., 2005). Die einzelnen Gene der cw-INV-Familie einer Pflanze werden gewebespezifisch exprimiert (Godt und Roitsch, 1997), dies kann für gentechnische Anwendungen der entsprechenden Promotoren genutzt werden (Hirsche et al., 2009).

1.1.1.1.2. Vakuoläre Invertasen Die Sequenzen von vakuolären Invertasen und Fructosyltransferasen zeigen eine hohe Homo- logie. Es wird vermutet, dass sich Fructan-metabolisierende Enzyme aus den Invertasen entwickelt haben (Vijn und Smeekens, 1999). Auch hier kann durch die Mutation weniger Amino- säuren eine Invertase in eine Sucrose:Sucrose-1-Fructosyltransferase (1-SST) umgewandelt werden (Schroeven et al., 2008).

Die Gruppe der vac-INV besteht meist aus zwei Genen, etwa in Arabidopsis (Haouazine- Takvorian et al., 1997), Reis (Ji et al., 2005) oder Süßkartoffel (Wang et al., 2005).

Wie auch die cw-INV sind vakuoläre Invertasen wichtig für die Kohlenstoffzufuhr und für das Zucker-signaling, besonders bei wachsenden Geweben mit sink-Status (Koch, 2004). Durch die Spaltung der Saccharose in der Vakuole wird osmotischer Druck aufgebaut. Dies kann zu einem Wachstum der Zelle führen; eine hohe Aktivität konnte etwa für einige Tage nach der Befruchtung bei Maiskörnern (Thévenot et al., 2005) oder an den Wurzelspitzen von Mais (Du- ke et al., 1991) nachgewiesen werden.

Die Aktivität der vac-INV wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst: Zucker, Hormone biotische Faktoren oder äußere Reize wie Schwerkraft, Trockenheit oder Kältereiz (Koch, 2004). Eine Erhöhung der Aktivität der vac-INV in Arabidopsis konnte für eine Infektion mit einem virulenten Pseudomonas-Stamm gezeigt werden, nicht jedoch mit einem avirulenten (Bonfig et al., 2006).

Für vac-INV wurden einige posttranskriptionale Regulationsmechanismen entdeckt, etwa die Speicherung der Invertasen in sog. precursor protease vesicles, quasi Speicherorgane, die mit der Vakuole verschmelzen können. Auch Kinasen sind bei der Regulation von Invertasen beteiligt (Huang et al., 2007).

1.1.1.2. Neutrale / alkalische Invertasen Im Gegensatz zu den anderen pflanzlichen Invertasen sind na-INV in GH-Familie 100 eingeordnet. Damit bilden sie eine eigene Familie und sind keine β-Fructofuranosidasen. Sie gehören zur Superfamilie der „6 helical hairpin hydrolyses“, die als gemeinsame Struktur sechs haar- nadelförmige α-Helices aufweisen. Zu dieser Superfamilie gehören u.a. auch Trehalasen und α-Mannosidasen. Der Reaktionsmechanismus der na-INV ist unbekannt, allerdings ist der in der Superfamilie vorherrschende Mechanismus invertierend.

Neutrale und alkalische Invertasen hydrolisieren nur Saccharose, keine weiteren Substrate der β-Fructofuranosidasen oder der α-Glucosidasen. Für einen Großteil der bekannten na-INV konnte eine Hemmung durch Tris und Produkthemmung gezeigt werden (Chen und Black, 17 Einleitung

1992; Ross et al., 1996; Gallagher und Pollock, 1998). Das pH-Optimum dieser Invertasen liegt entweder im Neutralen oder Alkalischen, allerdings kann dies aus der Sequenz nicht vorherge- sagt werden (Ji et al., 2005).

Abbildung 1-5: Phylogenetisches Dendrogramm der na-INV aus Arabidopsis und Reis. Die Sequenz der alkalischen Invertase aus Anabaena AJ491788 dient als Vergleichssequenz. Die Anzahl der Exons ist für jedes Gen dargestellt, die Kästen geben die wahrscheinlichen Invertasen eines letzten gemeinsamen Vorfahrens von Arabidopsis und Reis mit der jeweiligen Exonanzahl an (nach Ji et al., 2005).

Na-INV kommen nur in Cyanobakterien und Pflanzen vor, es wird vermutet, dass der Ursprung der pflanzlichen Invertasen in Cyanobakterien liegt, die sich im Rahmen der Endosymbiose zu Chloro-plasten entwickelt haben. Für Invertasen aus Anabaena konnte gezeigt werden, dass Aminosäuren mit Thiolgruppen für die Aktivität notwendig sind (Vargas et al., 2003). Die Gruppe der na-INV umfasst in den meisten Pflanzen eine große Anzahl an Genen, so wurden für Reis acht (Ji et al., 2005), für Weintrauben und Arabidopsis je neun (Vargas et al., 2003; Nonis et al., 2008) und für Pappel 16 (Bocock et al., 2008) na-INV beschrieben. Durch das Vergleichen der Sequenzen und der Intron/Exon-Struktur konnten diese jeweils in α- und β- Gruppen aufgeteilt werden (Abb. 1-5). Diese Aufteilung fand wahrscheinlich schon vor der Spaltung in ein- und zweikeimblättrige Pflanzen statt. Die Lokalisation der Mitglieder der α- Gruppe wird in den Mitochondrien und Chloroplasten vermutet, die der β-Gruppe im Cytosol (Ji et al., 2005; Nonis et al., 2008). Die Aktivität einer neutralen Invertase in Mitochondrien und Zuckertransporter konnte nachgewiesen werden (Szarka et al., 2008). Die Lokalisation 18 Einleitung

zweier Invertasen aus Reis in Zellorganellen konnte durch GFP-Fusionsproteine nachgewiesen werden (Murayama und Handa, 2007).

In ausgebildeten Weizenblättern wird die Expression einer alkalischen Invertase durch osmoti- schen Stress und Kältestress induziert (Vargas et al., 2007), für Arabidopsis wurde die Bedeu- tung der na-INV für die Stärkeeinlagerung in Blättern gezeigt (Vargas et al., 2008). Im Pfirsich ist eine neutrale Invertase wichtig für Fruchtwachstum und -reifung (Nonis et al., 2007). Mit Arabidopsis-Knockout-Pflanzen konnte die Wichtigkeit zweier na-INV, die hauptsächlich in Wurzeln exprimiert werden, für ein normales Wachstum nachgewiesen werden (Barratt et al., 2009). Dies entspricht auch den Ergebnissen, dass eine neutrale Invertase durch eine Phosphatidylinositolmonophosphat-Kinase negativ reguliert wird, was zu einem verringerten Wurzellängenwachstum geführt hat (Lou et al., 2007; Qi et al., 2007).

1.1.2. Hefeinvertase Historisch leitet sich der Begriff Invertase von der Beobachtung ab, dass ein Ferment aus Hefe die Polarisation einer Saccharoselösung von rechtsdrehend zu linksdrehend ändern kann. Die- ses Ferment wurde Ende des 19. Jahrhunderts Invertin genannt. Dabei handelte es sich um eine Hefepräparation, die Invertase enthielt. Das entstehende Zuckergemisch, Fructose und Glucose zu gleichen Teilen, wird daher auch Invertzucker genannt. Michaelis und Menten ar- beiteten mit Invertin um dessen Kinetik zu untersuchen (Michaelis und Menten, 1913). Später wurde der Begriff Invertase allgemein für saccharosespaltende Enzyme verwendet. Heute ist Hefeinvertase als E1103 als Zusatzstoff zum Weichhalten von Süßigkeiten zugelassen; die Spaltung der Saccharose verhindert deren Auskristallisieren und Fructose wirkt darüberhinaus hygroskopisch.

Wie auch die sauren Invertasen aus Pflanzen sind Invertasen aus Hefen Mitglieder der GH 32- Familie. In S. cerevisiae sind sechs Gene für Invertase bekannt, Suc 1-5 und 7. Diese werden je nach Stamm unterschiedlich exprimiert, auch ihre Genloci unterscheiden sich stark (Carl- son, 1987). Die Aktivität der exprimierten Invertasen korreliert mit der mRNA-Menge, die unterschiedlich starke Exprimierung ist wohl hauptsächlich auf minimale Unterschiede in den Promotorregionen zurückzuführen (del Castillo Agudo et al., 1992; Gozalbo und del Castillo Agudo, 1994).

In Hefen gibt es sekretierte, glykosilierte und intrazelluläre, nicht-glykosilierte Formen der Invertase. Dabei handelt es sich allerdings nicht um unterschiedliche Gene, sondern das gleiche Gen verfügt über mehrere Startstellen für die Transkription, so dass unterschiedlich lange mRNAs mit oder ohne Signalsequenz gebildet werden (Perlman et al., 1982; Carlson et al., 1983). Es konnte gezeigt werden, dass das Invertasegen immer exprimiert wird, es allerdings von der verfügbaren Glucose abhängig ist, ob das Protein sekretiert wird (Carlson und Botstein, 1982). Sowohl für die mRNA-Menge als auch für die Aktivität der Invertase konnte eine Abhängigkeit von der Glucosemenge im Medium gezeigt werden (Mormeneo und Sentandreu, 1982). 19 Einleitung

Ist ausreichend Glucose zur Energiegewinnung der Hefezelle verfügbar, findet die sog. Gluco- se-Repression statt. Neben einer Reihe anderen Proteine werden dann auch Enzyme, die für die Verwertung alternativer Kohlenstoffquellen notwendig wären, etwa den Abbau von Sac- charose, Maltose und Galactose, nicht exprimiert (Trumbly, 1992). Die Transkription der Invertase kann nicht durch Saccharose oder Raffinose induziert werden (Carlson, 1987). Für Flüssigkulturen konnte ein Grenzwert für die Repression ermittelt werden (Herwig et al., 2001). Hefezellen bevorzugen Monosaccharide als Energielieferanten, können aber ihren Stoffwechsel auf andere Energiequellen umstellen; an dieser Glucose-regulierten Genexpres- sion, die auch die Proteinmenge der sekretierten Hefeinvertase regelt, sind verschiedene Signalwege beteiligt (Carlson, 1998). Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Ex- pression der Invertase auch einer Stickstoff-Regulation unterliegen könnte (Silveira et al., 2000).

1.1.3. Humane Sucrase-Isomaltase Die humane Sucrase-Isomaltase (SI) ist ein Enzym mit zwei aktiven Untereinheiten und gehört zur GH-Familie 31. Zu dieser Familie zählen eine große Anzahl Glucose- und Xylose- abspaltender Enzyme aus Bakterien, Hefen, Pflanzen, Tiere und Menschen. Diese Familie wird noch ein vier Untergruppen aufgeteilt (Tab. 1-1).

Tabelle 1-1: Untergruppen der GH-Familie 31: Motive der Untergruppen rund um das Nucleophil (*). Für Untergruppe 1 wurden nur charakterisierte Enzyme verwendet, für Untergruppe 2 wurden drei nicht-charakterisierte, für Unter- gruppe 3 sechs und sieben für Untergruppe 4 verwendet. Taxonomische Gruppen, aus denen nur nicht- charakterisierte Sequenzen verwendet wurden, sind in grau angegeben. (nach Ernst et al., 2006)

Unter- Verbreitung Motiv in nucleophiler Region Enzymaktivität gruppe

Pflanzen α-Glucosidase 1 Tiere, Pilze Glucoamylase Bakterien Sucrase-Isomaltase Archaeen α-Xylosidase

Algen 2 Pilze α-1,4-Glucanlyase Cyanobakterien

Archaeen α-Xylosidase 3 Bakterien

Bakterien 4 α-Xylosidase Pilze

Die Sucrase-Untereinheit spaltet α-1,2- und α-1,4-glykosidische Verbindungen wie Saccharose und Maltose, die Isomaltase-Untereinheit vor allem α-1,6-glykosidische Verbindungen wie Isomaltose (Galand, 1989). Im Menschen übernimmt die Sucrase-Isomaltase 80 % der neutralen Maltaseaktivität, alle neutrale Sucraseaktivität und fast alle Isomaltaseaktivität; die restliche Maltase wird von der Maltase-Glucoamylase gespalten (Nichols et al., 2003). 20 Einleitung

Die SI, eine menschliche lysosomale α-Glucosidase und eine Glucoamylase aus Schwanniomyces occidentalis weisen eine hohe Homologie zueinander auf, ein gemeinsames Ahnen-Gen wird vermutet (Naim et al., 1991). Neben der SI und der lysosomalen α- Glucosidase gehören noch die Glucosidase II aus dem Endoplasmatischen Reticulum, eine neutrale α-Glucosidase und die Maltase-Glucoamylase (MGA) des Menschen zur GH 31-Familie (Hirschhorn et al., 2002). MGA und SI weisen neben ihrer Homologie sogar eine ähnliche Exon- Struktur auf, in ihrer Aktivität ergänzen sich die beiden Enzyme (Nichols et al., 1998; Nichols et al., 2003). Für ihre Entstehung wird die Verdopplung eines schon duplizierten Genes angenommen, die C- und N-terminalen Enden weisen zueinander eine höhere Homologie auf als die beiden Domänen der Enzyme selbst (Sim et al., 2008).

Die Struktur der Enzyme ist ein (β/α)8-Zylinder (Jespersen et al., 1993), als Beispiel ist in Abb. 1-6 die N-terminale Untereinheit der menschlichen MGA abgebildet.

Abbildung 1-6: Dreidimensionale Struktur der N-terminalen Domäne der menschlichen MGA. Die einzelnen Abschnitte des Proteins sind wie folgt farblich unterschieden: hellblau: Trefoil Typ-P-Domäne; gelb: N-terminales β-Sandwich;

rot: katalytischer (β/α)8-Zylinder mit zwei integrierten Schleifen (lila und orange); blau und grün: proximales und distales C-terminales β-Sandwich (Sim et al., 2008).

Der Reaktionsmechanismus ist dem der Enzyme der GH-Familie 32 vergleichbar, allerdings sind sowohl das Nucleophil als auch der Säure/Base-Katalysator eine Asparaginsäure (Quaroni et al., 1974; Braun et al., 1977; Hermans et al., 1991; Okuyama et al., 2001). Das Nucleophil liegt in dem Motiv WIDMNE (Ernst et al., 2006), die Konfiguration des Substrates bleibt bei der Reaktion erhalten (Zagalak und Curtius, 1975).

Die Sucrase-Isomaltase kommt in den Enterocyten des Dünndarms vor. Das Enzym wird in das Darmlumen sekretiert, die Isomaltaseeinheit ist über einen Membrananker an die Zelle gebunden, die Sucraseeinheit über Wechselwirkungen an die Isomaltaseeinheit (Conklin et al., 1975; Semenza et al., 1983). Die Diskussion, ob die beiden Einheiten ein Enzym sind oder zwei einzelne (Conklin et al., 1975) konnte mit der Aufklärung der Gensequenz für das Enzym be- 21 Einleitung

endet werden (Chantret et al., 1992). Das Enzym wird als eine Polypeptidkette gebildet (pro- SI) und erst im Darm durch pankreatische Protease in die zwei Untereinheiten gespalten (Semenza et al., 1983). Das Protein ist sowohl N- als auch O-glykosiliert, die Glykosilierung ist mannosereich und komplex, jedoch ohne Sialinsäure (Naim et al., 1988). Darüberhinaus ist das Enzym intrazellulär phosphoryliert (Keller et al., 1995).

Im Menschen ist die SI schon ab der Geburt voll aktiv (Auricchio et al., 1965), in Ratten und Kaninchen jedoch entwickelt sich die Aktivität erst noch, in Wiederkäuern gibt es das Enzym nicht (Galand, 1989). Für Zellkulturen wurde gezeigt, dass die Aktivität der SI transkriptionell und post-transkriptionell reguliert wird, etwa über Wachstumsfaktoren (Beaulieu und Quaroni, 1991). Auch die Zucker in der Nahrung haben Einfluss auf die Aktivität der SI, bei Glucoseaufnahme ist die Aktivität geringer als nach Aufnahme von Saccharose oder Fructose (Rosenzweig und Herman, 1968). In Ratten konnte eine gesteigerte Aktivität nach Saccharosegabe gezeigt werden, nicht jedoch nach Lactosegabe (Goda et al., 1985). In späte- ren Versuchen konnte bei gesteigerter Aktivität auch eine gesteigerte mRNA-Menge nachgewiesen werden (Broyart et al., 1990). In Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Zellen, die in einem Glucosemedium wachsen, nicht polar ausdifferenzieren und keine SI-Aktivität aufweisen, Glucose kann die Aktivität der SI reprimieren (Rousset et al., 1985; Zweibaum et al., 1985). Dies geschieht durch transkriptionelle Regulation (Rodolosse et al., 1996). Auch weist die Aktivität der SI in Ratten eine Abhängigkeit von der Tageszeit auf (Saito et al., 1980).

Die Aktivität der Disaccharidasen im Darm ist bei Diabetes mellitus erhöht (Tandon et al., 1975). Im Rattenmodell wurde dies sowohl für Diabetes mellitus Typ 1 als auch Typ 2 gezeigt. Insgesamt kann mehr Glucose als bei Gesundheit aufgenommen werden, durch Gabe von Insu- lin nahm die Aktivität wieder ab (Takenoshita et al., 1998; Martinez et al., 2003). Auch die Zahl der Glucosetransporter im Darm ist erhöht (Dyer et al., 2002). Die congenitale Sacchara- se-Isomaltase-Defizienz ist eine genetisch bedingte Krankheit, bei der das Enzym eine (stark) eingeschränkte Aktivität aufweist (Dahlqvist und Semenza, 1985; Moolenaar et al., 1997).

1.2. Hemmung der Invertaseaktivität Die Regulation der Invertaseaktivität findet auf vielfältige Art und Weise statt. Da durch Invertasen nicht nur Einfachzucker als Energiequelle zur Verfügung gestellt werden, sondern sie auch an wichtigen Signalwegen beteiligt sind, ist ihre Regulation von großer Bedeutung. Bereits die Bildung der Enzyme ist abhängig von verschiedenen Faktoren, die Geschwindigkeit des Abbaus ist wird bestimmt durch die Stabilität der Invertase. Neben äußeren Einflüssen wie Temperatur oder pH-Wert, die die Invertaseaktivität beein- trächtigen, können auch verschiedene Salze diese verstärken oder hemmen. Pflanzen haben die Möglichkeit, die Aktivität durch Inhibitorproteine zu regulieren.

Die Hemmung und damit Regulierung der Invertaseaktivität ist eine Möglichkeit, um Zusam- menhänge in planta zu untersuchen, an denen Invertasen beteiligt sind. So können zum Bei- spiel mit der Hemmung bestimmter Invertaseisoformen männlich sterile Pflanzen generiert werden (Goetz et al., 2001; Hirsche et al., 2009). Invertaseinhibitoren könnten dazu dienen, 22 Einleitung

die Regulation des Kohlenhydratmetabolismus während Pathogeninfektionen besser zu untersuchen und grundlegende Mechanismen aufzuklären (Bonfig, 2008).

Auch für die biotechnologische Anwendung könnte die spezifische Hemmung von Invertasen, die den kälteinduzierten Stärkeabbau in gelagerten Kartoffeln verringern kann, interessant sein (Greiner et al., 1999).

Die Hemmung stärkeabbauender Enzyme durch α-Glucosidasehemmstoffe ist in der Diabetestherapie eine Option, um Blutzuckerspitzen nach dem Essen zu vermeiden (Truscheit et al., 1981).

1.2.1. Proteinogene pflanzliche Invertaseinhibitoren Der erste endogene pflanzliche Invertaseinhibitor wurde in Kartoffelknollen entdeckt (Schwimmer et al., 1961). Daraufhin wurden Inhibitoren in weiteren pflanzlichen Speicheror- ganen beschrieben wie Rote Beete, Zuckerrübe und Süßkartoffel (Pressey, 1968b), außerdem im Maisendosperm (Jaynes und Nelson, 1971) und in Tomatenfrüchten (Pressey, 1994). Darü- berhinaus wurde ein Inhibitor in einer Tabak-Zellkultur entdeckt (Weil et al., 1994; Weil und Rausch, 1994), die Präsenz in weiteren Zellkulturen wie C. rubrum oder Karotte wird vermutet (Greiner et al., 2000). Ein apoplastischer Inhibitor aus Tabak wurde erfolgreich kloniert (Greiner et al., 1998) und dank der bekannten Gensequenz konnte mittels Sequenzvergleich nach weiteren Inhibitoren gesucht werden (Greiner et al., 2000; Reca et al., 2008). Mittler- weile wurde für viele Pflanzen die Existenz von Invertaseinhibitoren beschrieben (Sayago et al., 2001; Kusch et al., 2009).

1.2.1.1. Struktur der proteinogenen Invertaseinhibitoren Die nicht-kompetitiv hemmenden Invertaseinhibitoren haben eine molekulare Masse von ca. 15 – 23 kDa (Rausch und Greiner, 2004). Schon kurz nach der Entdeckung der Inhibitoren wurde vermutet, dass es sich um Proteine mit Disulfidbrücken handelt (Pressey, 1967), die Be- schreibung der N-terminalen Struktur gelang erstmals in den 1990er Jahren (Pressey, 1994; Weil et al., 1994). Mit der Aufklärung der Struktur eines Pectinmethylesteraseinhibitors wurde die Ähnlichkeit der beiden funktionell unterschiedlichen Inhibitorklassen sichtbar (Camardella et al., 2000). Beide Proteinklassen bestehen aus einem monomeren nicht-glykosilierten Prote- in, besitzen eine ähnliche molekulare Masse, eine Struktur aus α-Helices und zwei Disuldifbrücken, die zu einer hohen Stabilität beitragen und von vier Cysteinresten gebildet werden, die in allen bisher gefundenen Proteinen konserviert sind (Scognamiglio et al., 2003). Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass ein zellwandassoziierter Invertaseinhibitor aus Tabak aus einem asymmetrischen Bündel aus vier α-Helices mit einer N-terminalen Verlänge- rung besteht (Abb. 1-7). Diese ist ungewöhnlich, aber für die Stabilität des Proteins von gro- ßer Bedeutung (Hothorn et al., 2004a). Die Strukturaufklärung eines PME-Inhibitors aus Arabidopsis zeigte auch ein Bündel aus vier α-Helices mit N-terminaler Verlängerung; diese Strukturähnlichkeit ist höher als sie bei einer Sequenzhomologie von nur 20 % zu erwarten gewesen wäre. 23 Einleitung

Eine bekannte Sequenz gibt keinen Aufschluss, ob das Protein ein Invertaseinhibitor oder ein PMEI ist (Hothorn et al., 2004b). Beide Proteinklassen werden in der Familie der PMEI- verwandeten Proteine (PMEI-related proteins, PMEI-RP) zusammengefasst (Link et al., 2004) bzw. in der Pfam-Familie PF04043 (Finn et al., 2010). Ein Sequenzvergleich, der mit 19 Se- quenzen (möglicher) Invertaseinhibitoren oder PMEI durchgeführt wurde, zeigte zwei Haupt- gruppen auf (InvInh und PMEI), die InvInh-Gruppe wiederrum war unterteilt in vier Gruppen. Mit einer größeren Anzahl an Sequenzen ist evtl. auch die Vorhersage der Lokalisation in planta möglich. Ein weiteres mögliches Unterscheidungsmerkmal zu PME-Inhibitoren ist, dass nur die Gensequenzen für Invertaseinhibitoren über Introns verfügten (Reca et al., 2008).

Abbildung 1-7: Struktur des in der Zellwand lokalisierten Invertaseinhibitors NtCIF aus Nicotiana tabacum. Zu sehen ist das Bündel aus vier α-Helices aus zwei Blickwinkeln. In hellblau ist die N-terminale Verlängerung, in gelb sind Disulfidbrücken dargestellt (Hothorn et al., 2004a).

1.2.1.2. Beeinflussung der inhibitorischen Aktivität, Wirkspektrum Die inhibitorische Aktivität der proteinogenen Inhibitoren ist durch verschiedene Faktoren beeinflussbar. Für eine Mehrheit an Inhibitoren ist beschrieben, dass diese vom pH-Wert ab- hängig und im Sauren ausgeprägter ist (Pressey, 1967; Jaynes und Nelson, 1971; Anderson et al., 1980; Weil und Rausch, 1994; Sayago et al., 2001). Für viele Invertasen wird ein Schutz durch Saccharose beschrieben, weshalb eine Vorinkubation ohne Saccharose empfohlen wird. Diese Angaben schwanken allerdings zwischen 1 Tag bei 4 °C, 1 h bei 37 °C oder 10 min bei 37 °C (Jaynes und Nelson, 1971; Bracho und Whitaker, 1990b). Es wurde auch ein Unterschied zwischen vakuolären und apoplastischen Invertasen festgestellt, da nur die apoplastische Invertase durch Saccharose geschützt war (Sander et al., 1996). Ionische Wechselwirkungen durch verschiedene Salze können die Hemmaktivität beeinflussen. Je mehr Ionen vorhanden sind, desto geringer ist die Hemmung, weshalb eine ionische Wechselwirkung zwischen Invertase und Inhibitor vermutet wird (Jaynes und Nelson, 1971; Bracho und Whitaker, 1990a; Weil et al., 1994).

Untersuchungen mit einem Inhibitor aus Kartoffelknollen weisen darauf hin, dass die Kom- plexbildung von Enzym und Inhibitor in zwei Schritten abläuft (Bracho und Whitaker, 1990a). 24 Einleitung

Es wird angenommen, dass sich zuerst ein einfacher, reversibler Komplex bildet, der sich in einen Komplex umwandelt, für den die Inhibitorkonstante 30 x kleiner ist als für den zuerst gebildeten, also der Inhibitor die Invertase besser hemmt. Diese These wird durch Ergebnisse mit dem apoplastischen Inhibitor aus Tabak unterstützt, für den gezeigt wurde, dass er in Suspensionskultur zusammen mit der apoplastischen Invertase als Komplex vorliegt. Eine Hemmung der Invertaseaktivität tritt erst auf, wenn die Saccharosekonzentration unter einen Schwellenwert sinkt (Krausgrill et al., 1998). Weitere Faktoren für die Bildung des zweiten Komplexes sind noch nicht bekannt.

Die beschriebenen Wirkspektren der Inhibitoren sind uneinheitlich. Für Inhibitoren aus Kartof- fel, Roter Beete, Zuckerrübe und Süßkartoffel wurde gezeigt, dass sie verschiedene pflanzliche Invertasen hemmen, wenn auch mit unterschiedlicher Intensität, nicht jedoch Invertasen aus Pilzen (Pressey, 1968b). Für Inhibitoren aus Tamarillofrüchten und Kartoffeln wurde jedoch von einer anderen Arbeitsgruppe gezeigt, dass keine Spezifität der gehemmten Enzyme erkennbar war (Isla et al., 2002). In weiteren Untersuchunge wurden Invertasen aus Pflanzen und Pilzen gehemmt, darüberhinaus auch Zellwand-abbauende Enzyme wie Pectinasen und Polygalacturonasen. Auch eine antibakterielle Wirkung konnte gezeigt werden (Isla et al., 2002). Neuere Untersuchungen weisen eher auf eine Spezifität der Inhibitoren hin, da gezeigt wurde, dass Invertasen gehemmt werden, nicht jedoch Fructan-metabolisierende Enzyme, die mit Invertasen hohe strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen (Kusch et al., 2009).

1.2.1.3. Physiologische Rolle der proteinogenen Invertaseinhibitoren Hohe Transkriptwerte für den apoplastischen Invertaseinhibitor aus Tabak wurden vor allem in Fortpflanzungsorganen und in alternden Blättern gefunden (Greiner et al., 1998), bei To- mate und Arabidopsis auch in den Blüten (Link et al., 2004; Reca et al., 2008). Die vakuoläre Isoform des Inhibitors wird dagegen verstärkt in Wurzeln exprimiert (Lauer, 2006).

Die vermutete physiologische Wirkung der proteinogenen Invertaseinhibitoren liegt in der schnellen Inaktivierung der Invertasen (Rausch und Greiner, 2004). Der metabolische Wechsel von „hohe Hexose- / niedrige Saccharose-Konzentration“ zu „niedrige Hexose- / hohe Saccha- rose-Konzentration“ benötigt eine effiziente Ausschaltung der Invertasen. Diese könnte unter anderem durch die Inhibitorproteine erfolgen. Neuere Untersuchungen mit einem apoplastischen Inhibitor aus Tomate lassen vermuten, dass die Inhibitoren für eine kontrol- lierte und optimierte Nährstoffverteilung während der Pflanzenentwicklung verantwortlich sind: aus alten Blättern etwa sollen Stickstoff und Kohlenstoff recycelt werden; bei der Sa- menentwicklung ist eine gleichmäßige Versorgung wichtig (Jin et al., 2009; Ruan et al., 2009). Durch die Downregulierung des Inhibitors kann die ABA-induzierte Blattalterung gestoppt werden, so dass die Zuckersignale aus dem Apoplasten upstream der ABA- und Cytokinin-vermittelten Blattalterung vermutet werden.

Für Kartoffelknollen konnte gezeigt werden, dass das Zusammenspiel von Invertase und Inhi- bitor temperaturabhängig und reversibel ist (Pressey und Shaw, 1966). Dieses hatte einen 25 Einleitung

regulativen Effekt auf die Hexosekonzentration, für die eine schützende Funktion bei Frost angenommen wird.

1.2.2. Chemische Invertaseinhibitoren Die hohe strukturelle Ähnlichkeit von Substraten und ein ähnlicher Reaktionsmechanismus der Glycosidasen führen dazu, dass Hemmstoffe meist wenig selektiv sind. Daher werden im Fol- genden nicht nur Invertaseinhibitoren, sondern allgemein Hemmstoffe von Glycosidasen beschrieben.

Glycosidasen sind in der Natur weit verbreitet und an vielen wichtigen biologischen Prozessen beteiligt. Die Möglichkeit, diese zu modifizieren oder zu inhibieren, macht ihre Hemmstoffe daher für viele Anwendungen interessant. Die wissenschaftliche Bedeutung von Glycosidasehemmstoffen hat sich von Werkzeugen zur Untersuchung des aktiven Zentrums verschiedener Enzyme und der Glycoproteinbiosynthese zum besseren Verständnis hin zur Untersuchung der möglichen Anwendung in der Therapie verschiedener Krankheiten wie AIDS oder Krebs gewandelt (Fuhrmann et al., 1985; Legler, 1987; Jacob, 1995).

Abbildung 1-8: Strukturen verschiedener chemischer Glycosidaseinhibitoren bzw. deren Grundstruktur: 1 β-D-

Fructose 2 D-DMDP 3 L-DMDP 4 Alexin 5 Salacinol 6 α-D-Glucose 7 1-Deoxynoijrimycin 8 Miglitol 9 Calystegin A3

10 Calystegin B2 11 Calystegin C3 12 Swainsonin 13 Castanospermin 14 Valienamin 15 Conduritol A 16 Thiofructosid 17 Pyridoxin 18 Anilin 19 Tris

Die Stoffklasse, die derzeit am meisten Beachtung findet, sind die Iminozucker oder auch polyhydroxilierten Alkaloide. In Abbildung 1-8 werden neben den Strukturen der β-Fructose und der α-Glucose verschiedene chemische Invertaseinhibitoren gezeigt, auf die im Folgenden 26 Einleitung

noch näher eingegangen wird. Invertaseinhibitoren konnten aus Pflanzen, Schwämmen, Pilzen und Bakterien isoliert werden, ihre physiologische Funktion ist jedoch unklar. Für Calystegine wird angenommen, dass sie als Fraßschutz wirken könnten (Dräger et al., 1995; Asano et al., 2001a).

1.2.2.1. Iminozucker und Thiozucker Durch Zufall wurde entdeckt, dass das Lacton der Gluconsäure ein guter Hemmstoff von Glycosidasen ist (Ezaki, 1940; Horikoshi, 1942). Es wurde vermutet, dass diese Hemmung auf der strukturellen Ähnlichkeit zu einem Glycosyl-Oxocarboniumion beruht, das als Intermediat der enzymatischen Reaktion vorliegt (Leaback, 1968). Auch Glycosylamine, basische Zucker- analoga mit einer protonierbaren Aminogruppe außerhalb des Ringgerüstes, sind gute Hemm- stoffe von Glycosidasen (Lai und Axelrod, 1973; Legler, 1978). Durch eine spontane Hydrolyse der Verbindungen entstehen α- und β-Anomere, die jedoch unterschiedlich stark an das zu hemmende Enzym binden (Legler, 1990). Die Strukturähnlichkeit zu den Substraten, die auch bei Iminozuckern vorliegt, führte dazu, dass Iminozucker als Inhibitoren von Glycosidasen getestet wurden und inhibitorische Aktivität festgestellt wurde (Claeyssens und De Bruyne, 1965).

Iminozucker, die auch Azazucker genannt werden, sind eine in der Natur weit verbreitete Stoffgruppe. Sie werden nach ihrer Ringstruktur in unterschiedliche Klassen eingeteilt: Piperidine, Pyrrolidine, Indolizidine, Pyrrolizidine und Nortropane (Asano et al., 2000). Es handelt sich um zuckerähnliche Stoffe, der bei Zuckern übliche Sauerstoff im Ring ist durch einen Stickstoff ersetzt. Sie sind Analoga der natürlichen Substrate der zu hemmenden Enzy- me, sogenannte „mimics“.

Iminozucker inhibieren ein weites Spektrum an Glycosidasen. Sie werde als Therapeutika für die Diabetestherapie, als antivirale Stoffe oder als Chaperone bei lysosomalen Speicherkrank- heiten getestet (Asano, 2003). Auch in der Krebstherapie, als Immunstimulanz oder als Thera- pie gegen humanpathogene Mikroorganismen fanden Untersuchungen statt (Watson et al., 2001). Darüberhinaus wurden Effekte auf Insekten und Mobilitätshemmung bei Fadenwürmern beschrieben (Simmonds et al., 2004).

Als basische Zuckeranaloga haben Iminozucker eine Ähnlichkeit zu den Substraten der Glycosidasen während des Übergangszustandes (Legler, 2004). Sie können in unterschiedlichen Orientierungen an die Enzyme binden, was ein breites Wirkspektrum ermöglicht (Stütz, 2004). Es konnte allerdings gezeigt werden, dass Castanospermin und 1-Deoxynoijrimycin (DNJ) zwar β-Glucosidasen inhibieren, jedoch nicht als Analoga während des Übergangszu- standes binden (Withers et al., 2004). Auch konnte ein großer Unterschied zwischen der Wirkweise der einzelnen Enantiomere fest-

gestellt werden. So konnte z. B. für L-DMDP (2,5-Dihydroxymethyl 3,4-dihydroxypyrrolidin) gezeigt werden, dass es ein potenterer und spezifischerer Hemmstoff von α-Glucosidasen ist

als das D-DMDP (Yu et al., 2004). Allgemein verhält es sich so, dass L-Enantiomere nicht kom- 27 Einleitung

petitive, D-Enantiomere kompetitive Hemmstoffe sind; auch die Wirkspektren unterscheiden sich stark (Asano et al., 2005; Minami et al., 2008).

Bereits 1966 wurde Noijrimycin, ein Iminozucker mit Piperidinstruktur, als Antibiotikum beschrieben. Strukturaufklärung, Synthese und die Reduktion zu 1-Deoxynoijrimycin (DNJ) erfolgten kurze Zeit später (Inouye et al., 1968), allerdings ist die Verbindung aufgrund der Hydroxylgruppe an C1 instabil. Aufgrund der Strukturähnlichkeit zu Zucker wurde die Verbin- dung als Glucosidaseinhibitor getestet und festgestellt, dass sie ein potenter Inhibitor ist (Niwa et al., 1970). DNJ wurde auch in den Wurzeln des Maulbeerbaums gefunden und Moralin genannt, außerdem wurden N-Methylderivate und Glykoside gefunden (Asano et al., 1994b; Asano et al., 1994a). Weitere Iminozucker mit Piperidingrundgerüst wie z.B. Fagomin (1,2-Dideoxynoirimycin) aus japanischem Buchweizen (Koyama und Sakamura, 1974) wurden isoliert und untersucht. Dar- überhinaus wurden die Hemmeigenschaften durch Derivatisierung verbessert oder die Spezifi- tät beeinflusst (Godin et al., 2004; Rawlings et al., 2009). Miglitol, ein Derivat von DNJ wurde erstmals 1985 als Glycosidasehemmstoff beschrieben und wird in der Diabtetestherapie eingesetzt (Lembcke et al., 1985; Joubert et al., 1986).

1976 wurde DMDP, ein Pyrrolidinderivat, aus den Blättern von Derris eliptica isoliert (Welter et al., 1976). DMDP und Derivate wurden in vielen weiteren Pflanzen und auch in Mikroorga- nismen entdeckt (Watanabe et al., 1995; Wrodnigg, 2002). Obwohl die Verbindung strukturel-

le Ähnlichkeit zu einer β-D-Fructofuranose zeigt, werden auch Glucosidasen und eine Vielzahl weiterer Enzyme gehemmt (Wrodnigg, 2002). Auch dient DMDP als Ausgangssubstanz auf der Suche nach besseren und spezifischeren Inhibitoren (Hermetter et al., 2001; Wrodnigg et al., 2001).

Die bicyclische Grundstruktur der Indolizidine besteht aus einem 5- und einem 6-Ring, die über einen gemeinsamen Stickstoff verfügen. Die beiden wichtigsten Vertreter dieser Gruppe sind Swainsonin und Castanospermin. Swainsonin wurde aus Swainsona canescens isoliert, Castanospermin aus den Samen von Castanospermum australe (Colegate et al., 1979; Hohenschutz et al., 1981). Bei beiden Pflanzen war ihre Giftigkeit aufgefallen, die bei Nutz- vieh Krankheiten mit den Anzeichen von lysosomalen Speicherkrankheiten ausgelöst hat (Dorling et al., 1978). Swainsonin konnte als Hemmstoff lysosomaler Mannosidasen, Castanospermin als Hemmstoff lysosomaler Glucosidasen identifiziert werden (Dorling et al., 1980; Watson et al., 2001). Aufgrund der Anordnung der Hydroxylgruppen kann Castanospermin als bicyclisches Derivat von DNJ verstanden werden. Für Castanospermin konnte gezeigt werden, dass es Sucrase und Isomaltase aus dem Dünndarm der Ratte hemmt (Danzin und Ehrhard, 1987).

Bei Pyrrolizidinen besteht die Grundstruktur aus zwei 5-Ringen, die über einen gemeinsamen Stickstoff verfügen. Alexin wurde aus Alexa leiopetala, Australin aus C. australe isoliert (Molyneux et al., 1988; Nash et al., 1988). Die Substanzen sind Epimere, Australin kann als eine ringverkleinerte Form von Castanospermin bzw. als Derivat von DMDP angesehen werden 28 Einleitung

(Asano et al., 2000). Auch aus Pflanzen der Hyacinthaceae konnten Pyrrolidin- und Pyrrolizidinalkaloide isoliert werden, die verschiedene Glycosidasen hemmen (Kato et al., 1999; Kato et al., 2007).

Calystegine sind Nortropanalkaloide mit drei bis fünf Hydroxylgruppen. Im Gegensatz zu den vorherigen Bicylcen befindet sich der Stickstoff nur im Piperidinring. An der C1-Position befindet sich eine Hydroxylgruppe, so dass eine Aminoketalfunktion enthalten ist (Asano et al., 2000). Calystegine wurden erstmals als sekundäre Pflanzenmetabolite in den Wurzeln von Calystegia sepium erwähnt (Tepfer et al., 1988), kurz darauf wurde ihre inhibitorische Aktivi- tät beschrieben (Molyneux et al., 1993). Die Einteilung in Calystegine A bis C erfolgt nach der Anzahl der Hydroxylgruppen, Calystegin N hat an C1 eine Aminogruppe anstelle der Hydro- xylgruppe (Asano et al., 1996a; Dräger, 2004); insgesamt wurde eine große Anzahl an Calysteginen und deren Derivaten entdeckt (Asano et al., 1995; Asano et al., 1997a; Asano et al., 2001a). Calystegine wurden in den Familien der Solanaceae, Convolvulaceae und Moraceae gefunden, aber nicht in Monokotyledonen, Pilzen oder Mikroorganismen. Calystegin

B2 kommt am häufigsten vor, der Gehalt an Calysteginen innerhalb einer Pflanze schwankt stark und ist am höchsten in jungen Blättern (Dräger et al., 1995; Dräger, 2004). α-/ β- Glucosidasen, α-/ β- Galactosidasen und Trehalase werden unterschiedlich stark gehemmt, α- / β- Mannosidasen jedoch nicht. Die Stärke der Hemmung und die Art der gehemmten Enzyme stehen in Beziehung zur Struktur des Hemmstoffes (Asano et al., 1995; Asano et al., 1997a; García-Moreno et al., 2004). Auch pflanzliche Invertasen werden gehemmt, nicht jedoch Invertasen bzw. α-Glucosidasen aus Pilzen (Asano et al., 1995; Höke und Dräger, 2004). Durch Glykosilierung geht die inhibitorische Aktivität fast gänzlich verloren (Asano et al., 1997b). Untersuchungen mit Calysteginen konnten noch keine definierte Aussage zur Toxizität bzw. zum Beitrag zur Toxizität liefern (Asano et al., 1997c; Stegelmeier et al., 2008). Neben Calysteginen wurden auch Nortropane mit nur zwei Hydroxylgruppen isoliert. Diese besitzen am Brückenkohlenstoff keine Hydroxylgruppe, evtl. entstehen sie als Nebenprodukt bei der Calysteginsynthese über den Tropanalkaloidbiosyntheseweg (Asano et al., 2001b; Scholl et al., 2001).

Neben den Iminozuckern gibt es noch die Klasse der Thiozucker, die anstelle des Sauerstoffs bzw. des Stickstoffs über ein Schwefelatom im Ringgerüst verfügen und als Inhibitoren wirken, Beispiele sind Salacinol und Kotalanol, die aus Salacia reticulata isoliert wurden (Yoshikawa et al., 1997; Yoshikawa et al., 1998a).

29 Einleitung

1.2.2.2. Cyclohexenverbindungen Als wichtigster Vertreter kann hier Acarbose genannt werden, ein Pseudotetrasaccharid, das aus Bakterien der Gattung Actinoplanes gewonnen wird (Schmidt et al., 1977). Es handelt sich um ein mehrfach hydroxiliertes Cyclohexen, das über eine 4-Amino-4,6-dideoxyglucose an zwei weitere Glucosereste gebunden ist (Caspary und Graf, 1979). Die Grundstruktur ist das Valienamin, das auch eine Grundstruktur der Validamycine ist, die antibiotisch wirken (Dong

et al., 2001). Weitere Vertreter dieser sog. C7N-Aminocyclitol-Familie, die aus Bakterien der Ordnung Actinomycetales gewonnen werden, könnten für biomedizinische und landwirtschaft- liche Anwendungen genutzt werden (Wehmeier und Piepersberg, 2004; Hyun et al., 2005).

Acarbose ist ein effizienter Hemmstoff der Sucrase und des Stärkeabbaus, die Hemmung der Sucrase ist kompetitiv, Trehalase und Lactase wurden nicht gehemmt (Puls et al., 1977; Schmidt et al., 1977; Caspary und Graf, 1979). In Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Acarbose als steady state-mimic bindet, was wohl durch den Kohlenstoff in sp2- Hybridisierung begünstigt wird (Withers et al., 2004). Die Bindung von Acarbose an die Sucrase erfolgt langsam, es wird vermutet, dass sich die Struktur der Sucrase verändert (Hanozet et al., 1981). In vielen klinischen Studien wurde die Wirksamkeit in der Diabetestherapie belegt. Sowohl bei der Monotherapie als auch zusammen mit Sulfonylharnstoffen, Metformin oder Insulin konnte

bei Typ II Diabetes der postprandiale Blutzuckerspiegel gesenkt, als auch der HbA1c-Wert verbessert werden (Madar, 1989; Coniff et al., 1995; Josse, 1995; Coniff und Krol, 1997; Lam et al., 1998). Die häufigsten Nebenwirkungen waren gastrointestinale Beschwerden (Holman et al., 1999). Allerdings wurden weder Komplikationen noch Langzeitentwicklungen näher untersucht (Scheen, 1998). Neuere Untersuchungen gehen von einem positiven Effekt von Acarbose auf makrovaskuläre Komplikationen aus (Shimabukuro et al., 2006). In Einzelfällen trat akute Lebertoxizität auf (Carrascosa et al., 1997). Untersuchungen zu Kosten und Nutzen legen nahe, dass Acarbose v. a. bei noch nicht ausgebildetem Diabetes mellitus eingesetzt werden sollte, um dessen Entstehung zu verhindern und Folgekosten zu vermeiden (Josse et al., 2006).

Auch Voglibose, ebenso wie Acarbose ein Derivat des Valienamins, wird als Antidiabetikum verwendet (Yasuda et al., 2003; Kawamori et al., 2009).

Die Verbindungen CKD-711 und CKD-711a, gewonnen aus Streptomyces sp. CK-4416, sind Epo-

xid-Verbindungen einer C7N Aminocyclitol-Einheit, die mit drei Glucosemolekülen verknüpft ist (Chang et al., 2002; Kim et al., 2002). Es konnte gezeigt werden, dass beide Verbindungen sowohl in vitro Maltase und Sucrase hemmen, als auch in Tierversuchen postprandiale Blutzu- ckerwerte senken konnten (Kwon et al., 2002).

Conduritole sind Cyclohexenverbindungen mit vier Hydroxylgruppen, die Diastereomere wurden von A bis F durchbenannt, ihre Epoxide und Derivate wie Amin- oder Bromverbindungen sind als Glycosidaseinhibitoren bekannt. Nur die beiden Conduritole A und F kommen in der Natur vor (Gültekin et al., 2004; Borges de Melo et al., 2006; Wei et al., 2008). 30 Einleitung

1.2.2.3. Nicht-glykosidische Verbindungen Das Ethanolaminderivat 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris(hydroxymethyl)- amino-methan, kurz Tris genannt) wird als Hemmstoff für viele alkalische Invertasen genannt (Morell und Copeland, 1984; Chen und Black, 1992; Van den Ende und Van Laere, 1995; Ross et al., 1996; Gallagher und Pollock, 1998). Auch Verdauungsenzyme, Trehalase und α- Glucosidase werden gehemmt (Larner und Gillespie, 1956; Jorgensen und Jorgensen, 1967; Semenza und von Balthazar, 1974; Chen et al., 1987). Versuche zur Inhibierung der Sucrase im Dünndarm wurden mit Versuchspersonen durchgeführt, allerdings wurde Tris als Therapeu- tikum aufgrund der benötigten hohen Dosen und des schlechten Geschmacks verworfen (Puls und Keup, 1975). Bei vergleichenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Tris unter den Ethanolaminderivaten der stärkste Inhibitor der Sucrase ist (Kano et al., 1996)

Das aliphatische Amin Anilin wird vor allem als nicht-kompetitiver Inhibitor von Invertasen aus Pilzen beschrieben (Suomalainen et al., 1961; Trevithick und Metzenberg, 1964). Auch Invertase aus Bakterien wird von Anilin gehemmt, pflanzliche Invertasen eher schlecht (Pressey, 1968a; Pressey und Avants, 1980; Ishimoto und Nakamura, 1997).

Das polyhydroxylierte Pyridinderivat Pyridoxin wird als Inhibitor für pflanzliche Invertasen und Invertasen aus Pilzen beschrieben. Die Hemmung ist reversibel und nicht-kompetitiv (Pressey, 1968a; Krishnan et al., 1985). Der Sauerstoffsubstituent an Position 4 ist für die Hemmung essentiell, da Pyridoxamin fast keine Hemmwirkung besitzt. Pyridoxalphosphat wird als Inhibitor von alkalischen / neutralen Invertasen beschrieben (Chen und Black, 1992; Van den Ende und Van Laere, 1995).

Darüberhinaus wird für eine Vielzahl weiterer Verbindungen die Hemmung verschiedener Glycosidasen beschrieben: Berberin für Disaccharidasen aus Caco-2-Zellen (Pan et al., 2003), Zimtsäurederivate für α-Glucosidase und α-Amylase (Adisakwattana et al., 2009) und strukturell sehr unterschiedliche Verbindungen wie Tetrachlorphthalimidinderivate (Sou et al., 2000), Bisamide (Niwa et al., 2003), Isoquinolinalkaloide, sog. Schulzeine aus dem Schwamm Penares schulzei (Takada et al., 2004), zu diesen strukturell ähnliche Penarolid-Sulfate (Nakao et al., 2000), ebenso aus Schwämmen isolierte Polyacetylenverbindungen wie Callyspongiasäure (Nakao et al., 2002) und ein Trihydroxyflavon, genannt Baicalein aus Origa- num majorana (Kawabata et al., 2003; Gao et al., 2004) für α-Glucosidasen.

1.2.2.4. Zucker und Zuckerverbindungen Für eine große Anzahl an Invertasen wird Produkthemmung durch Fructose oder Glucose beschrieben; Fructose zeigt kompetitive Hemmung, Glucose jedoch nicht-kompetitive (Sampietro et al., 1980; Isla et al., 1995; Lee und Sturm, 1996; Sayago et al., 2002).

Untersuchungen mit Disaccharidasen aus dem Dünndarm der Ratte ergaben, dass Zuckeralko-

hole die Sucraseaktivität nicht hemmen können, L-Arabinose, D-Xylose und D-Ribose jedoch

das Enzym hemmen (Asano et al., 1996b). Für L-Arabinose erfolgt die Hemmung unkompetitiv (Seri et al., 1996), Amylasen werden nicht gehemmt (Preuss et al., 2007a), aber es gibt auch

positive Auswirkungen auf den Fettstoffwechsel (Osaki et al., 2001). D-Xylose hemmt Sucrase 31 Einleitung

unkompetitiv (Asano et al., 1996b), die Wirkdauer beträgt weniger als eine Stunde (Matsuura und Ichikawa, 1997). Xylose wird im Gegensatz zu Arabinose stärker resorbiert, was die Gabe von höheren Dosen erfordert (Seri et al., 1996).

Auch für Disaccharide wurde eine Hemmung der Aktivität von α-Glucosidasen gezeigt (Ugalde et al., 1980; Matsuura et al., 2002). Hierbei handelt es sich um Verbindungen aus zwei Glucoseeinheiten, die jeweils unterschiedlich verknüpft sind. Kojibiose, isoliert aus Sake (Sa- to und Aso, 1957) ist α-1,2-glykosidisch verknüpft, Nigerose, durch saure Hydrolyse von Aminopektin gewonnen (Peat et al., 1957), ist α-1,3-glykosidisch verknüpft und Trehalose, isoliert aus Bittermelonensamen oder dem Klapperschwamm (Matsuura et al., 2002), ist α- 1,1-glykosidisch verknüpft.

Nicht nur Disaccharide, auch Polysaccharide wirken inhibitorisch auf die Aktivität von α- Glucosidasen (Chen et al., 2009).

Thiofructoside sind das Produkt der Reaktion von Saccharose und 2-Mercaptoethanol, kataly- siert von einer β-Fructofuranosidase aus Pilzen (Nakano et al., 2000). Dabei entsteht sowohl das O-Fructosid als auch das S-Fructosid. Für das S-Fructosid konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von α-Glucosidasen und β-Fructofuranosidasen gehemmt wird, das O-Fructosid wird wieder gespalten (Kiso et al., 2003).

1.3. Diabetes mellitus Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselkrankheit, die weltweit immer größere Bedeutung er- langt. Schon 1989 wurde von der WHO ein Beschluss verabschiedet, der sich mit der Präventi- on und der Behandlung des Diabetes mellitus befasst (WHA42.36). Auch die St. Vincent- Deklaration hat zum Ziel die Spätfolgen des Diabetes zu verringern (1989). Dennoch hat sich die Krankheit immer weiter ausgebreitet und diese Tendenz wird sich in den nächsten Jahren fortsetzten (Abb. 1-9).

Große Probleme sind u. a. verstärkte Nahrungsaufnahme und Bewegungsmangel, die zu Fett- leibigkeit führen und damit die Wahrscheinlichkeit für eine Erkrankung an Diabetes erhöhen. Auch in Deutschland ist Diabetes mellitus ein großes gesundheitliches Problem. 5 % der Bevöl- kerung sind betroffen, allerdings geht man davon aus, dass die Dunkelziffer höher liegt (Schulz et al., 2005). 32 Einleitung

Abbildung 1-9: Geschätzte Verbreitung des Diabetes mellitus. A: Verbreitung 2010; B: Verbreitung 2030; www.diabetesatlas.org

1.3.1. Krankheitsbild Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselkrankheit, die durch das absolute bzw. relative Fehlen von Insulin gekennzeichnet ist. Klinische Merkmale sind eine symptomatische Glucoseintoleranz sowie Veränderungen im Eiweiß- und Lipidstoffwechsel (Mutschler et al., 2001).

Ein absoluter Insulinmangel liegt bei einer Zerstörung der Inselzellen vor, so dass kein Insulin mehr sezerniert werden kann, man spricht von Diabetes mellitus Typ 1. Die Insulinsubstitution ist unumgänglich. Bei einem relativen Mangel kann die Insulinproduktion den Erfordernissen nicht angepasst werden, es liegt der Diabetes mellitus Typ 2 vor. Bei der Entstehung des Dia- betes sind genetische und exogene Faktoren beteiligt. Eine Vorstufe des Typ 2 Diabetes ist häufig das sog. metabolische Syndrom: Hyperinsulinismus, Hypertonie, Hyperlipoproteinämie und Adipositas.

Insulin ist ein Peptidhormon, das aus den β-Zellen der Nebennierenrinde sekretiert wird. Es hat vielfältige Wirkungen, die wichtigste ist die Einstellung des Blutglucosespiegels. Verein- facht kann gesagt werden, dass Prozesse, die Glucose aus dem Blut aufnehmen, verstärkt und gegenläufige Prozesse gehemmt werden. Die Freisetzung des Insulin aus den β-Zellen erfolgt 33 Einleitung

glucoseabhängig. Daran sind eine Hexokinase und Ionenkanäle beteiligt, die Targets für die Diabetesbehandlung darstellen. Auch Inkretine, insulinotrope Hormone aus dem Magen-Darm- Trakt, greifen bei Anwesenheit von Glucose positiv in diese Kaskade ein (Blume et al., 2010).

Der durch Diabetes bedingte stark schwankende und erhöhte Blutglucosespiegel führt zu Fol- gekomplikationen, die als diabetische Spätfolgen bezeichnet werden. Ursache ist die nichten- zymatische Glykosilierung körpereigener Eiweiße, die zu Struktur- und Funktionsveränderun-

gen führt. Auch Hämoglobin wird glykosiliert; der sog. HbA1c-Wert dient als Messparameter für eine langfristige Blutzuckereinstellung. Die Spätfolgen des Diabetes mellitus sind vielfältig. Häufig treten Gefäßschäden auf, die in Mikroangiopathien (etwa Schädigungen der Netzhaut oder der Niere) und Makro-angiopathien (ähnlich der Artiosklerose) unterteilt werden. Auch Neuropathien mit vorwiegend sensorischen Symptomen können auftreten, ebenso verschiedene Erkrankungen der Haut.

1.3.2. Behandlung Das Behandlungsziel eines Diabetes mellitus ist die Normalisierung des Blutzuckerspiegels, um Symptome der Krankheit zu beseitigen, unerwünschte Wirkungen zu vermeiden, damit Spät- schäden zu verringern und letztendlich eine Verlängerung der Lebensdauer zu erreichen.

Die Behandlung eines Typ 1 Diabetes erfolgt in der Regel mit einer Insulintherapie (vgl. Leitli- nie der Deutschen Diabetes Gesellschaft, http://www.deutsche-diabetes- gesellschaft.de/redaktion/mitteilungen/leitlinien/EBL_Dm_Typ1_Update_2007.pdf). Die Leit- linie der Deutschen Diabetes Gesellschaft zur Therapie des Typ 2 sieht mehrere Behandlungs- möglichkeiten vor, je nach Schwere der Symptome und dem Ansprechen auf die Behandlung; grundlegend für die Therapie ist die Schulung des Patienten, die Umstellung der Ernährung und regelmäßige körperliche Bewegung (Matthaei et al., 2009).

Die Energiezufuhr des Diabetikers sollte wie bei Gesunden zu 15 % aus Eiweiß, 55 % aus Koh- lenhydraten und 30 % aus Fett zusammengesetzt sein. Hier ist bei richtigem Umgang der Koh- lenhydratanteil am harmlosesten, da bei höheren Anteilen von Eiweiß und Fett Spätfolgen wie eine Nephropathie oder Gefäßschäden verstärkt werden könnten (Zutschke, 2005). Ballast- stoffe sind wichtig für eine verzögerte Glucoseaufnahme nach dem Essen, v. a. lösliche Bal- laststoffe wie Guarkernmehl, Pektine, Inulin bzw. Nahrungsmittel wie Hülsenfrüchte, Hafer- flocken oder Obst (Müller, 2002). Guarkernmehl wird aus dem Samen der Guarbohne (Cyamopsis tetragonoloba) gewonnen, das darin enthaltene Galactomannan besitzt starkes Quellvermögen und verzögert dadurch die Magenentleerung, die Glucose-Absorption wird durch eine Verdickung der Diffusionsschicht auf der Mukosa gehemmt und auch die Cholesterol-Rückresorption wird durch die Adsorption von Gallensäuren reduziert (Roth und Fenner, 2000).

Als initiale medikamentöse Behandlung wird Metformin, ein Biguanid, empfohlen. Die Senkung des Blutzuckerspiegels wird durch eine Verminderung der Insulinresistenz erreicht, Insulin wird nicht freigesetzt. Es erfolgt keine Gewichtszunahme, allerdings wird die Gefahr einer Lactatazidose erhöht (Neye, 2002a). 34 Einleitung

α-Glucosidaseinhibitoren reduzieren die Menge des aufgenommenen Zuckers durch Hemmung von Di- und Oligosaccharidasen im Darm. In Deutschland sind Acarbose und Miglitol zugelassen. Die Dosierung sollte einschleichend erfolgen um gastrointestinale Beschwerden zu vermeiden. Meist werden α-Glucosidaseinhibitoren mit anderen Medikamenten kombiniert. Ne- ben einer leichten Senkung des basalen Blutzuckerwertes werden vor allem Spitzen im postprandialen Blutzuckerspiegel vermieden, der in Studien als Marker für Spätkomplikationen verwendet wird (Neye, 2002b).

Als Insulin-Sensitizer werden die Glitazone Rosiglitazon und Pioglitazon bezeichnet. Sie sind selektive Agonisten des PPARγ-Rezeptors (peroxisomal proliferator activated receptor γ) im Zellkern und vermindern die Insulinresistenz. Es erfolgt keine vermehrte Insulinfreisetzung, die Gefahr einer Hypoglykämie ist gering, allerdings führt die Therapie häufig zu einer Ge- wichtszunahme (Verspohl und Weiland, 2002).

Insulinotrope Antidiabetika setzen durch eine Hemmung der ATP-regulierten Kaliumkanäle in der Plasmamembran der β-Zellen verstärkt Insulin frei. Die Gefahr einer Hypoglykämie ist hoch, auch führt die Therapie zu einer Gewichtszunahme. Zu dieser Gruppe gehören neben den Sulfonylharnstoffen (wie Glibenclamid) auch die Glinide Repaglinid und Nateglinid. Diese haben einen raschen Wirkeintritt und eine kurze Wirkdauer, daher ist die Gefahr einer Hypo- glykämie gesenkt (Mark, 2002).

Neuere Stoffklassen der Antidiabetika sind DPP4-Inhibitoren und GLP-1-Mimetika, die über das Inkretinsystem wirken; die Insulinsekretion wird glucoseabhängig stimuliert (Gallwitz, 2010; Ritzel, 2010).

Wenn der Zielwert einer Therapie ohne Insulin nicht erreicht werden kann, besteht die Mög- lichkeit einer Insulintherapie. Hier stehen neben Normalinsulin auch modifizierte Insuline mit veränderter Wirksamkeitsdauer zur Verfügung (Matthaei et al., 2009). Neue Wirkstoffklassen in der Entwicklung sind neben SGLT2-Inhibitoren, die die Ausscheidung von Glucose über den Urin fördern, auch Glucokinase-Aktivatoren, die in den β-Zellen die Insulinsekretion anregen. Auch Inhibitoren der 11β-Hydroxysteroid-dehydrogenase 1, die Cortison in Cortisol umwandelt, führen zu einer Senkung des Blutzuckerspiegels und einer verminderten Insulinresistenz (Steri und Schubert-Zsilavecz, 2010).

1.4. Pflanzliche Medizin Pflanzliche Medizin, zu einem geringen Teil auch tierische und mineralische, war bis vor wenigen Jahrhunderten die einzig zugängliche. Auch heute noch ist sie das aus finanziellen Gründen für einen Großteil der Weltbevölkerung (Duke, 1990). Erst mit chemischen Methoden und einer wissenschaftlichen Betrachtungsweise entwickelte sich die Medizin einzelner Wirk- stoffe. Die Isolierung der wirksamen Substanzen aus Heilpflanzen verringerte die Gefahr einer falschen Dosierung, aus Pflanzen isolierte Substanzen wie Morphin, Atropin oder Herzglykosi- de sind heute noch in Gebrauch (Urban et al., 2001). Auch viele andere Medikamente oder deren Leitstrukturen sind pflanzlichen Ursprungs, der Anteil ist vor allem bei Medikamenten in die Krebstherapie sehr hoch (Hostettmann et al., 2000; Newman und Cragg, 2007). 35 Einleitung

Im Gegensatz zu diesen isoliert verwendeten Stoffen sind Phytopharmaka Arzneimittel, die Stoffgemische aus der Pflanze enthalten. Die wirksame Komponente ist häufig nicht bekannt (Urban et al., 2001). In den letzten Jahrzehnten ist das Interesse an pflanzlichen beziehungs- weise alternativen Heilmitteln gestiegen. Auch immer mehr Regierungen unterstützen die Erforschung und Sicherung traditioneller Heilmethoden und Arzneien (Duke, 1990; Jayaraman, 2006).

1.4.1. Einsatz pflanzlicher Medizin in der Diabetestherapie Vor der Entdeckung des Insulin wurde Diabetes mellitus in Europa mit mehr als 100 verschiedenen Mitteln behandelt. Häufig verwendet wurden Alkaloide wie Opium oder Extrakte aus Atropa belladonna, aber auch Salicylate und Präparationen aus Samen oder Rinde des Jambulbaumes (Syzigium cumini) (Helmstädter, 2007). Im Mittelalter wurden Symtome des Diabetes mellitus behandelt ohne diesen als Krankheit zu bezeichnen, verwendet wurden etwa Aloe vera und Zimt (Cinnamomum cassia) (Riddle, 2004).

Heutzutage wird die pflanzliche Medizin in der Diabetesmedizin vor allem additiv angewendet. Allerdings sind die Belege zur Wirksamkeit bei einem Großteil der Studien nicht einwand- frei, weitere Untersuchungen und Studien wurden gefordert (Yeh et al., 2003). Die Wirkweise der pflanzlichen Extrakte ist unterschiedlich. Zum einen kann die Nahrungsaufnahme beeinflusst werden (Quellmittel, α-Glucosidasehemmstoffe), häufig werden aber auch die Steige- rung der Insulinsekretion, eine verbesserte Insulinwirkung oder eine Beeinflussung von Glucoseverbrauch bzw. –synthese beschrieben.

Wie schon erwähnt kann Guarkernmehl in der Diabetestherapie zum Einsatz kommen, um die Aufnahme der Nahrung aus dem Darm zu verzögern. Darüberhinaus gibt es eine Reihe weiterer Pflanzen, deren verschiedene Präparate auf dem Markt angeboten werden, dazu gehören Bittermelone (Momordia charantia), Zimt (Cinnamomum verum, Cinnamomum aromaticum), Bockshornkleesamen (Trigonella foenum-graecum), Copalchi-Rinde (Hintonia latiflora), Floh- samen (Plantago afra), Ginseng-Wurzel (Panax ginseng), Merasingi-Blätter (Gymnema sylvestre) und der Nopal-Kaktus (Opuntia streptacantha). Die Daten zu den einzelnen Drogen sind allerdings meist lückenhaft und zum Teil widersprüchlich (Liebl und Martin, 2005). Die meisten der genannten Pflanzen wie etwa Bittermelone oder Bockshornkleesamen werden in vielen Kulturen traditionell gegen Diabetes eingesetzt.

Eine große Anzahl an Pflanzen wird auf ihre Wirksamkeit gegen Diabetes mellitus untersucht. Diabetes wird in der Zukunft eine der am meisten verbreiteten Krankheiten sein, neue Medi- kamente bzw. eine verbesserte prophylaktische Behandlung sind daher notwendig. Die traditionelle Medizin ist hier eine wichtige Quelle (Verpoorte, 2008). Dies belegen auch viele Ver- öffentlichungen, die sich mit traditioneller Medizin befassen, einige davon mit dem Schwer- punkt der Behandlung des Diabetes mellitus, andere mit dem Ziel, das traditionelle Wissen der untersuchten Region zu erhalten.

Eine blutzuckersenkende Wirkung wird für viele Pflanzen in nur einer Veröffentlichung genannt bzw. nur in Veröffentlichungen eines Labors. Zu anderen gibt es zwar mehrere Studien, 36 Einleitung

diese jedoch können die Wirksamkeit nicht wissenschaftlich fundiert belegen (etwa falsches Studiendesign oder eine zu geringe Zahl an Probanden; Literaturangaben siehe Liste im An- hang).

Einige Pflanzen werden in der Literatur wiederholt für die Therapie des Diabetes mellitus genannt, darunter sind der Madjobaum (Aegle marmelos), die Zwiebel (Allium cepa), der Knoblauch (Allium sativum), die Echte Aloe (Aloe vera), der Niembaum (Azadirachta indica), der Behaarte Zweizahn (Bidens pilosa), die Hiobsträne (Coix lacryma-jobi), die Japanische Wollmispel (Eriobotrya japonica), der Blaue Eukalyptus (Eucalyptus globulus), die Mango (Mangifera indica), die Bittermelone (Momordica charantia), die Weiße Maulbeere (Morus alba) und die Große Brennnessel (Urtica dioica) (Karunanayake et al., 1984; Swanston-Flatt et al., 1990; Girón et al., 1991; Roman-Ramos et al., 1991; Roman-Ramos et al., 1992b; Alarcon- Aguilara et al., 1998; Grover et al., 2002a; Jia et al., 2003; Kar et al., 2003; Li et al., 2004a; Kotowaroo et al., 2006; Lans, 2006; Otoom et al., 2006; Kültür, 2007; Modak et al., 2007; Dieye et al., 2008; Hui et al., 2009).

Häufig werden die Pflanzen nicht nur zur Behandlung des Diabetes mellitus, sondern allgemein zur Behandlung der Symptome des metabolischen Syndroms verwendet (Anderson, 2008; Yin et al., 2008; Ramadan et al., 2009). Für einen Großteil der Pflanzen wird neben blutzu- ckersenkenden Effekten auch eine antioxidative oder blutfettsenkende Wirkung beschrieben, wie etwa Extrakte aus Grapefruit (Citrus paradisi), der Weißen Maulbeere (Morus alba), Sen- na (Cassia auriculata, syn. Senna auriculata), dem Madjobaum (Aegle marmelos) und dem Jambulbaum (Syzigium cumini) (El-Beshbishy et al., 2006; Kesari et al., 2006; Adeneye, 2008b; Sharma et al., 2008; Gupta et al., 2009b), um nur eine kleine Auswahl zu nennen.

1.4.2. Traditionelle Chinesische Medizin Traditionelle Medizin findet sich in allen Kulturen. In vielen wird das Wissen nur mündlich überliefert, einige sind hingegen gut dokumentiert. Zu diesen gehört neben der Heilkunde der alten Ägypter, von denen wissenschaftliche Papyri überliefert sind (Ebers, 1875), und den drei Hauptsystemen der indischen Medizin Ayurveda, Siddha und Unani (Jayaraman, 2006) vor allem die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM). Diese wird heute noch von einem Großteil der chinesischen Bevölkerung praktiziert. Es handelt sich um eine empirische Wissenschaft, das Wissen wurde in mehr als 4000 Jahren Erfahrung gesammelt (Leung, 1990).

Die TCM beruht auf fünf Säulen der Behandlung: Arzneimitteltherapie, Akkupunktur, Massage- techniken, Bewegungsübungen (z. B. Tai-Chi) und Diätetik. Das Ziel besteht darin, die Le- bensenergie des Menschen (das Qi) ins Gleichgewicht zu bringen. Das Qi ist die Lebenseng- erie, die alles durchströmt. Sie besteht aus zwei gegensätzlichen, sich ergänzenden Seiten, dem Yin und dem Yang. Der Mensch ist dann gesund, wenn diese zueinander in einem harmo- nischen Verhältnis stehen (Hohmann, 2008). Dieses Verhältnis wird nach den fünf Elementen Holz, Feuer, Erde, Metall und Wasser eingeordnet. Diese interagieren miteinander und reprä- sentieren verschiedene Aspekte der TCM wie Organe, Geschmäcker oder Gefühle (Lukman et al., 2007). 37 Einleitung

Da die TCM auf ganzheitlichen und umfassenden Prinzipien aufbaut, ist bei der Anamnese der ganze Mensch von Bedeutung. Der Puls und die Beschaffenheit der Zunge sind ebenso wichtig wie Appetit, Verdauung, Schlaf und Temperaturempfinden.

Die Arzneimittel sind meist pflanzlich und bestehen aus mehreren, häufig auch über 20 Ein- zelbestandteilen. Es gibt eine Hauptkomponente, zusätzliche Komponenten sollen deren Wir- kung unterstützen oder Nebenwirkungen abschwächen (Hohmann, 2008). 1977 wurde eine Enzyklopädie der chinesischen Planta Medica verfasst, die 5767 Drogen umfasst, über 4800 davon sind pflanzlich (Leung, 1990).

Die Bedeutung der TCM im Westen ist in den letzten Jahren stark gewachsen. Die chinesische Regierung hat ein großes Interesse daran, die Wirksamkeit der TCM nach schulmedizinischen Methoden zu belegen. Dazu gehören Qualität und Sicherheit der verwendeten Pflanzen (Wang et al., 2009). Ein großes Problem ist allerdings, dass aufgrund des weltweit wachsenden Be- darfs an chinesischen Pflanzen (Liu et al., 2009b) diese zum Teil gefährdet sind. In einem Pilotprojekt wird der Anbau chinesischer Heilpflanzen in Deutschland getestet (Biermann, 2008).

In der TCM gibt es viele Zubereitungen, die für die Behandlung des Diabetes mellitus, genannt „Xiao-ke“ eingesetzt werden. Allerdings ist auch hier der Wirkmechanismus noch unbekannt (Jia et al., 2003; Li et al., 2004a; Hui et al., 2009). Diabetes mellitus wird als Folge von Über- gewicht angesehen, was wiederum Folge von zu viel Essen ist; der Name setzt sich zusammen aus Xiao (Gewichtsverlust) und ke (durstig). Der Yin-Mangel bei Diabetes mellitus drückt sich durch zu viel Trockenheit und Hitze aus, was durch das Ersetzen von Flüssigkeit und die Weg- nahme von Feuer therapiert werden soll. Dabei kommt eine personalisierte Medikation zum Einsatz (Yin et al., 2008)

1.5. Die Hefe Pichia pastoris als eukaryotisches Expressionssystem In Pichia pastoris (P. pastoris) wurden eine Vielzahl von pflanzlichen Invertasen und Enzymen des Fructanmetabolismus exprimiert um diese zu charakterisieren (Hochstrasser et al., 1998; Huang et al., 2003; Chalmers et al., 2005; Yamada et al., 2007; Canam et al., 2008). Daher wurde dieses Expressionssystem für die Expression der humanen Sucrase im Rahmen dieser Arbeit ausgewählt.

Nur wenige Hefen, wie einige Vertreter der Gattungen Hansenula, Candida, Pichia und Torulopsis, können Methanol als Energiequelle nutzen (Hazeu et al., 1972; Lee und Komagata, 1980). Die Verwertung des Methanol in den verschiedenen Gattungen erfolgt auf ähnlichen Wegen; für P. pastoris wurde ein Gen für eine Alkoholoxidase (AOX) enteckt, das mit Metha- nol als einziger Kohlenstoffquelle induzierbar ist (Ellis et al., 1985). Methanolverwertende Hefen wurden v.a. Anfang der 1970er Jahre als alternative Proteinquelle für die Tiernahrung untersucht (Macauley-Patrick et al., 2005), später etablierte sich P. pastoris sowohl als Mo- dellorganismus für Eukaroynten als auch als Produktionssystem für rekombinante Proteine. 38 Einleitung

Mit einer Mutante von P. pastoris wurde ein System für Transformationen etabliert, das im Gegensatz zu S. cerevisiae stabilere und schneller wachsende Klone generiert, auch die Integ- ration der DNA ins Genom erfolgt häufiger (Cregg et al., 1985). Kurze Zeit später wurden Vek- toren mit Kon-trollregionen der AOX entwickelt, Fremdprotein konnte erfolgreich exprimiert werden (Tschopp et al., 1987a). Der AOX1-Promotor ist streng reguliert und wird effizient transkribiert, große Mengen an Fremdprotein konnten gewonnen werden, ebenso konnten mit P. pastoris hohe Zelldichten erreicht werden (Cregg et al., 1987).

Mit P. pastoris konnten auch sekretierte Proteine produziert werden, die Glykosilierung unterschied sich jedoch von der in S. cerevisiae (Tschopp et al., 1987b; Paifer et al., 1994). Die

Zuckerketten variieren in ihrer Länge, vorherrschend sind Man8GlcNAc2 und Man9GlcNAc2. Es finden sich keine endständigen α-1,3-Verknüpfungen und auch keine Hyperglykosilierungen, die typisch für S. cerevisiae sind (Trimble et al., 1991; Montesino et al., 1998).

Mittlerweile gibt es viele verschiedene Stämme, Promotoren und Selektionsmarker, die eingesetzt werden können. Auch in der Anzucht und Transformation hat es viele Weiterentwicklun- gen gegeben. Das Spektrum exprimierter Proteine reicht von Toxinfragmenten über Wachs- tumsfaktoren zu Serumalbumin und verschiedensten Enzymen (Cregg et al., 1993; Cereghino und Cregg, 2000; Gellissen, 2000; Macauley-Patrick et al., 2005).

Vorteile gegenüber Prokaryoten sind die Glykosylierung und die größere Ausbeute. Auch die erleichterte Aufreinigung der sekretierten Enzyme durch eine geringe Anzahl an weiteren Proteinen im Medium zählt dazu.

1.6. Zielsetzung der Arbeit Zu einem besseren Verständnis verschiedener Prozesse in Pflanzen ist die Regulierung der Invertasen von großer Bedeutung. Untersuchungen zur Beteiligung der verschiedenen Invertaseisoformen bei Pathogenabwehr, Signalweiterleitung, Kohlenhydratverteilung, Sa- menkeimung oder Fruchtreifung können durch die gezielte Hemmung der Invertasen unter- stützt werden. Gerade die noch wenig untersuchte Familie der neutralen / alkalischen Invertasen ist hier ein interessantes Target. Für eine gezielte Hemmung ist jedoch das Wissen um selektive Inhibitoren notwendig. Daher gilt es zu klären, wie sich bekannte Invertaseinhibitoren bei unterschiedlichen Invertasen verhalten. Im Rahmen dieser Arbeit sollen verschiedene pflanzliche Enzyme gewonnen werden, um mit diesen Hemmversuche mit bekannten Invertaseinhibitoren durchzuführen. Eine Invertase aus S. cerevisiae dient als Ver- gleichsenzym einer Hefe. Darüberhinaus werden die verwendeten Invertasen in vitro charak- terisiert und der Einfluss nicht-spezifischer Faktoren untersucht.

Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die mittlerweile weltweit zu einer der am weitverbreitesten Krankheiten zählt. Ein Behandlungansatz ist die Hemmung von zuckerspaltenden Enzymen, darunter auch eine Sucrase, die im Dünndarm lokalisiert ist. Ziel dieser Arbeit ist die heterologe Expression dieser Sucrase in P. pastoris. Ebenso wie die pflanzlichen Invertasen gilt es, die humane Sucrase in vitro zu charakterisieren und Hemmtests durchzu- führen. 39 Einleitung

Als eine hemmende Substanz sollen Thiofructoside im Labor selbst hergestellt werden. Neben chemischen Invertaseinhibitoren gibt es in Pflanzen Proteine, die Invertasen hemmen. Auch einige dieser Proteine sollen rekombinant exprimiert werden, um in Hemmtests zu untersuchen, ob die Inhibitorproteine die verschiedenen Invertasen hemmen bzw. unterschiedliche Wirkspektren aufweisen.

Wie bereits erwähnt, können Invertaseinhibitoren in der Diabetestherapie eingesetzt werden. Traditionell werden Pflanzen oder Zubereitungen aus Pflanzen in vielen Ländern gegen Diabe- tes mellitus eingesetzt. Um eine umfassende Sammlung dieser Pflanzen zu erstellen und diejenigen zu identifizieren, die von ihrer Wirkweise her auf Invertaseinhibitoren als Inhaltsstoff schließen lassen, wird eine Literaturrecherche durchgeführt. Für die Suche nach neuen Invertaseinhibitoren sollen Pflanzenextrakte auf ihre inhibitorische Aktivität hin gescreent werden. Dazu werden Extrakten aus Suspensionskulturen verschiedener Pflanzen, die mit unterschiedlichen Substanzen behandelt wurden, um Abwehrmechanis- men in den Zellen auszulösen, verwendet. Darüberhinaus werden Extrakte von Pflanzen aus der Traditionellen Chinesichen Medizin und Extrakte verschiedener Pflanzen aus der Literatur- recherche verwendet. Als Enzyme für das Screening werden die humane Sucrase, eine pflanzliche Invertase und die Hefeinvertase eingesetzt.

40 Ergebnisse

2. Ergebnisse Zuerst werden allgemeine Ergebnisse zu Invertasenn und zu Invertaseinhibitoren präsentiert. Es folgen die Ergebnisse der Hemmtests mit den bekannten Invertaseinhibitoren. Daran an- schließend findet sich das Kapitel zur Suche nach neuen Invertaseinhibitoren, unterteilt in die Literaturrecherche, die Herstellung der verwendeten Extrakte und die Ergebnisse der Hemm- tests. Falls nicht anderes angegeben, wurde mindestens eine Dreifach-Bestimmung durchge- führt. Die Standardabweichungen wurden in Abbildungen teilweise für eine bessere Übersicht- lichkeit und Erkennbarkeit weggelassen. Bei Hemmtests wurden nicht die Mittelwerte und

Standardabweichungen der einzelnen Messwerte, sondern der IC50-Werte angegeben. Für die Bestimmung der pH- und Temperaturoptima wurde mit einem Überschuss an Saccharose gearbeitet. Wenn nicht anders angegeben, wird die Aktivität der Invertasen über die Menge der freigesetzten Glucose mittels des GOD-POD-Reagenz bestimmt (Huggett und Nixon, 1957).

2.1. Aufarbeitung der Invertasen, Festlegung der Versuchsbedingungen

2.1.1. Herstellung der verwendeten Invertasepräparationen Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde mit einer Vielzahl an Invertasepräparationen gearbeitet, die auf verschiedene Art und Weise gewonnen wurden (Tab. 2-1).

Tabelle 2-1: Übersicht über die verwendeten Invertasepräparationen, ihre Abkürzung (Abk.) im Rahmen dieser Arbeit und ihre Gewinnung. Für Invertasen, die bereits veröffentlicht wurden, wurden diese Namen verwendet. Für die anderen pflanzlichen Präparationen wurden Namen gebildet: Planzenname, Cw (zellwandgebundene Invertasen) bzw. Cr (Rohextrakt, lösliche Invertasen), IN (Invertase) bzw. Ex (Extrakt)

Invertasepräparation Abk. Gewinnung Hefeinvertase HI gekauft, in Puffer gelöst von Zelloberfläche gewa- extrazelluläre Invertase aus C. rubrum CrCwIN schen (Suspensionskultur) extrazelluläre Invertase aus C. rubrum CIN1 heterolog in S. cerevisiae extrazelluläre Invertase aus C. rubrum mit CIN1(P/V) heterolog in S. cerevisiae Punktmutation 238 P/V zellwandgebundener Extrakt aus A. thaliana AtCwEx frische Pflanzen zellwandgebundener Extrakt aus B. vulgaris BvCwEx frische Pflanzen zellwandgebundener Extrakt aus B. napus BnCwEx frische Pflanzen zellwandgebundener Extrakt aus N. tabacum NtCwEx frische Pflanzen zellwandgebundener Extrakt aus S. lycopersicum SlCwEx frische Pflanzen vakuoläre Invertase aus T. aestivum TaVIN2 heterolog in P. pastoris Rohextrakt aus A. thaliana AtCrEx frische Pflanzen Rohextrakt aus B. vulgaris BvCrEx frische Pflanzen Rohextrakt aus B. napus BnCrEx frische Pflanzen Rohextrakt aus N. tabacum NtCrEx frische Pflanzen

41 Ergebnisse

Invertasepräparation Abk. Gewinnung Rohextrakt aus S. lycopersicum SlCrEx frische Pflanzen alkalische / neutrale Invertase aus L. Suc22 heterolog in E. coli temulentum humane Sucrase hS heterolog in P. pastoris

2.1.1.1. Heterologe Expression der humanen Sucrase in P. pastoris Um mögliche Invertaseinhibitoren auf ihre Aktivität im Rahmen einer Diabetestherapie zu untersuchen, ist ein Testsystem notwendig. Dazu soll die menschliche Sucrase aus dem Dünn- darm in P pastoris exprimiert werden, um ausreichend Enzym für Versuche zur Verfügung zu haben.

Für die geplanten Untersuchungen war die Isomaltaseuntereinheit der Sucrase-Isomaltase nicht von Bedeutung, da primär mit Saccharose als Substrat gearbeitet wurde. Diese wird von der Isomaltaseuntereinheit nicht gespalten. Ein Vorteil, nur die cDNA der Sucraseuntereinheit zu verwenden, lag in der leichteren Handhabbarkeit des erheblich kürzeren DNA-Stückes. Die Arbeiten erfolgten mit gängigen molekularbiologischen Verfahren. Die Transformationen wurden zunächst nach der Lithiumacetatmethode durchgeführt, aufgrund des geringen Transfor- mationserfolges wurde auf Elektroporation umgestellt (Übersicht Tab. 2-2).

Ziel der Arbeit war es, ein Konstrukt zu erhalten, das eine leichte Gewinnung und Aufreinigung der humanen Sucrase sicherstellt. Für die Klonierung wurde das Plasmid pPICZ A verwendet, das durch die Bildung eines Fusionsproteins mit sechs zusätzlichen Histidinresten (his-tag) eine schnelle Aufreinigung der Sucrase ermöglicht. Die cDNA der humanen Sucrase wurde mit den Primern S forward / hSIIrev aus dem Plasmid pSG8-SI gewonnen, das von Prof. Naim (Tierische Hochschule Hannover) zur Verfügung gestellt wurde. Das Konstrukt wurde pPhSH genannt.

Zur Generierung des Plasmides pPhS wurde die DNA der humanen Sucrase mit den Primern S forward / S revers mittels PCR aus dem Plasmid pSG8-SI gewonnen und auch in das Plasmid pPICZ A kloniert. Mit diesem Primerpaar allerdings hatte die Sequenz der Sucrase ein STOP- Codon, so dass das entstehende Protein über keine tag-Funktion verfügte, was eine Aufreinigung erschwerte. Auch eine Glykosilierung des Proteins, das nicht sekretiert wurde, fand nicht statt

Um die Vorteile des Expressionssystems P. pastoris nutzen zu können, wurde die cDNA der Signalsequenz des Suc2-Gens aus S. cerevisiae vor die cDNA der humanen Sucrase in das Plasmid pPhSH eingefügt, was zu dem neuen Plasmiden pPShSH führte. Die Signalsequenz führt zur Sekretion des Proteins ins Medium, was den Aufschluss der Zellen unnötig macht. Auch eine Glykosilierung des Proteins wird durch die Sekretion ermöglicht. Dies ist ein weiterer Vorteil, da das menschliche Enzym aus dem Dünndarm glykosiliert ist.

42 Ergebnisse

Tabelle 2-2: Übersicht über die Konstrukte zur heterologen Expression der humanen Sucrase in P. pastoris und die transgenen Hefeklone

verwendetes Signal- Transformations- P. pastoris- Anzahl positiver Nachweis mittels PCR Invertase- Konstrukt tag Plasmid sequenz methode Stamm Kolonien Gen Anzahl Aktivität Resistenz 3 pPhS pPICZ A nein nein LiAc GS 115 3 ja Sucrase 3 Resistenz 9 Elektroporation GS 115 12 nein Sucrase 6 condensed Mut S > 40 nicht durchgeführt nein

pPhSH pPICZ A nein his-tag LiAc GS 115 0 Resistenz 2 LiAc GS 115 2 nein Sucrase 2 LiAc GS 115 10 Resistenz 0 nein

Elektroporation GS 115 96 Resistenz 20 von 50 nein

pPShSH pPICZ A ja his LiAc GS 115 0 Resistenz 1 LiAc GS 115 2 nein Sucrase 1 LiAc GS 115 2 Resistenz 0 nein

Elektroporation GS 115 100 Resistenz 67 nein

Elektroporation GS 115 50 Resistenz 23 nein

condensed Mut S 0 nein

pPαhS pPT4 ja nein condensed Mut S > 300 nicht durchgeführt nein 43 Ergebnisse

In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Glieder (Technische Universität (TU) Graz) wurde ein weiteres Konstrukt, pPαhS, generiert. Hierzu wurde ein in dieser Arbeitsgruppe bewährtes System auf die humane Sucrase übertragen. In separaten PCRs wurden zuerst die humane Sucrase (aus pPhS) und ein alpha-Faktor vervielfältigt. Diese beiden DNA-Stücke konnten mittels Overlap Extension-PCR zusammengefügt und in das Plasmid pPT4 ligiert werden. Auch dieses Konstrukt führt zu einem glykosiliertem Protein im Medium.

2.1.1.1.1. Überprüfung des Transformationserfolges Bei der Transformation von P. pastoris wird das Plasmid in das Hefegenom integriert. Um den Transformationserfolg zu überprüfen, sollte genomische DNA aus den Hefen gewonnen und mittels PCR untersucht werden. Die Gewinnung der genomischen DNA gestaltete sich als schwierig, es konnte jedoch eine PCR etabliert werden, für die intakte Hefezellen als Templa- te eingesetzt wurden; im Denaturierungsschritt werden die Zellen zerstört und somit die DNA freigesetzt. Zur Überprüfung dieser Methode wurde sie zuerst mit Primern, die für hefeeigene Proteine generiert wurden, durchgeführt.

Der Transformationserfolg wurde entweder auf das Vorhandensein des Resistenzgens Sh ble (Streptoalloteichus hindustanus) für Zeocin oder des Sucrasegens hin untersucht. Als Primer wurden die Paare Zeofor / Zeorev bzw. SSeqforward / SSeqrevers verwendet.

Die Ergebnisse der PCR-Untersuchungen sind in Tabelle 2-2 zusammengefasst. Für viele Klone der Konstrukte pPhS, pPhSH und pPShSH konnte das Resistenzgen bzw. das Gen der humanen Sucrase nachgewiesen werden.

2.1.1.1.2. Anzucht der Hefeklone zur Expression der humanen Sucrase Für die Überprüfung der heterologen Expression von Proteinen in P. pastoris wurden zuerst verschiedene Medien für die Anzucht getestet. In ersten Anzuchtsversuchen wurde Hefevoll- medium mit Methanol anstelle von Glucose für die Induktion der Proteinsynthese verwendet. In vergleichenden Anzuchtsversuchen wurde dieses einem gepufferten Vollmedium gegen- übergestellt, es konnten allerdings keine Unterschiede festgestellt werden. In der Zusammen- arbeit mit der Arbeitsgruppe Glieder wurde ein gepuffertes Minimalmedium verwendet.

Die Klone wurden für 72 h in einem Glucosemedium bzw. Glycerolmedium angezogen. Die Induktion erfolgte durch Zugabe von Methanol bzw. Abzentrifugation und Resuspendierung in einem Methanolmedium. Den Zellen waren über einen Zeitraum von 72 – 96 h in Methanolmedium, alle 24 h wurde der Kultur frisches Methanol zugegeben.

Mit drei positiven Klonen der humanen Sucrase des Konstruktes pPhS konnte eine induzierte Aktivität nach Zugabe von Methanol festgestellt werden. Dieses Ergebnis konnte mit keinem Klon der anderen Konstrukte erreicht werden. Daher wurde für alle Aktivitätstests die humane Sucrase verwendet, die mit dem Konstrukt pPhS gewonnen werden konnte. 44 Ergebnisse

2.1.1.1.3. Aufreinigung der humanen Sucrase aus dem Zelllysat Da mit dem Konstrukt pPhS weder eine Sekretion der Sucrase in das Medium stattfindet, noch das Protein über ein tag verfügt, müssen die Hefezellen nach der Induktionsphase geerntet und aufgeschlossen werden. Anschließend muss die Sucrase aufgereinigt werden, um den An- teil an Fremdprotein zu verringern, welches das Testsystem stören könnte.

Für eine erste Aufreinigung der humanen Sucrase aus dem Zellaufschluss der Hefezellen wurden verschiedene Fällungsreagenzien (Ammoniumsulfat, Aceton und PEG) getestet, allerdings führte keines der Reagenzien zu dem gewünschten Ergebnis. Zum einen konnte die Aktivität nicht in einer Fraktion konzentriert werden, zum anderen ging bei den Fällungen der Großteil der Aktivität verloren.

Eine Teilaufreinigung der verwendeten Invertasepräparation erfolgte durch Ultrazen- trifugation und einer Anionenaustauscherchromatographie. Zuerst wurde der Rohextrakt nach dem Zellaufschluss ultrazentrifugiert. Die weitere Aufreinigung erfolgte über eine Resource Q-Säule von Amersham Pharmacia Biotech an einem Äkta-Prime-System. Über ionische Wech- selwirkungen wurde die humane Sucrase an die Säule gebunden, die Elution erfolgte mittels eines Salzgradienten. Proteingehalt und Aktivität (nach Dialyse) der Fraktionen wurden bestimmt. Abbildung 2-1 zeigt anhand eines Beispiels die spezifische Aktivität und Gesamtaktivi- tät verschiedener Fraktionen nach der Chromatographie. Fraktionen mit mehr als 4 % der Gesamtaktivität wurden vereinigt und für weitere Messungen verwendet. Im genannten Bei- spiel waren nach der Aufreinigung noch ca. 60 % der Gesamtaktivität erhalten.

Auch wenn keine Aktivität der Klone feststellbar war, wurden Aufreinigungsversuche mittels Nickelaffinitätssäulen von Extrakten PCR-positiver Klone der Konstrukte pPhSH und pPShSH durchgeführt. Jedoch war bei Proteingelen mit verschiedenen Färbungen keine eindeutige Bande im Eluat zu erkennen, was vermuten lässt, dass kein Protein gebildet wurde.

Abbildung 2-1: Spezifische Aktivität (spez A; µg Glucose / µL*min*g Protein) und Gesamtaktivität (Gesamta. bzw. GA; µg Glucose / min) der humanen Sucrase nach der partiellen Aufreinigung mittels Anionenaustauscher- chromatographie. hS: Rohextrakt aus mit pPhS transformierten P. pastoris-Zellen, Ü: Überstand nach Ultrazentrifugation, 12-24: Fraktionen der Chromatographie 45 Ergebnisse

2.1.1.2. Heterologe Expression pflanzlicher Enzyme Für die Expression pflanzlicher Enzyme wurden verschiedene Expressionssysteme verwendet.

Die Konstrukte für die heterologe Expression der extrazellulären Invertase aus C. rubrum CIN1 und der mutierten Variante CIN1(P/V) für die Transformation in S. cerevisiae wurden bereits von Marc Goetz hergestellt (Goetz und Roitsch, 1999). Die Klone wurden in einem Minimalme- dium angezogen und nach 24 h geerntet. Da die Proteine intrazellulär vorlagen, wurden die Hefezellen aufgeschlossen. Der Rohextrakt wurde mittels Kationenaustauscherchromatogra- phie aufgereinigt. Die Chromatographie wurde mit einer selbst gepackten CM-Sepharose-Säule und Puffern mit pH 9 durchgeführt. Bei diesem pH-Wert liegen die beiden Invertasen positiv geladen vor und werden an die Matrix gebunden. Die Elution erfolgte mit einem Salzgradien- ten. Wie bei der humanen Sucrase wurden sowohl Proteingehalt als auch Aktivität der Frakti- onen (nach Dialyse) bestimmt und Fraktionen mit Invertaseaktivität zur Weiterarbeit vereinigt. Die Invertasen sind nicht glykosiliert, da sie nicht sekretiert wurden. Eine wiederholte Chromatographie führte zu keiner Verbesserung der Aufreinigung, eine Aufkonzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung war nicht erfolgreich.

Ein Klon zur heterologen Expression einer vakuolären Invertase TaVIN2 aus Triticum aestivum (Poaceae) in P. pastoris wurde von Prof. Van den Ende (K.U. Leuven, Belgien) zur Verfügung gestellt (Ji et al., 2007; Schroeven et al., 2008). Die Anzucht erfolgte im gepuffertem Mini- malmedium, der Überstand der Zellen wurde nach 96 h Induktion mit Methanol geerntet. Für die Tests wurde der Überstand direkt verwendet.

Ein Klon zur heterologen Expression einer alkalischen / neutralen Invertase, Suc22, aus Lolium temulentum (Poaceae) in E. coli wurde von Dr. Gallagher (Aberystwyth University, Großbritannien) zur Verfügung gestellt (Gallagher und Pollock, 1998). Die Induktion erfolgte mit IPTG. Die geernteten Zellen wurden mittels Ultraschall aufgeschlossen und der Rohextrakt ohne Aufreinigung direkt für die Versuche verwendet.

2.1.1.3. Selektion auf Agarplatten mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle Die verwendeten Stämme der Hefe P. pastoris verfügen über keine eigene Invertaseaktivität. Auf Agarplatten mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen die Stämme daher sehr langsam. Durch die Transformation mit einer Invertase, die sekretiert wird, wird ein schnelle- res Wachstum erreicht, positive Klone wachsen schneller als nicht-transformierte (Sreekrishna et al., 1987).

Für die Stämme GS 115, Mut S und X-33 konnte gezeigt werden, dass diese auf Platten mit Saccharosemedium sehr langsam wachsen. Klone mit vakuolären Invertasen aus Bambus (zur Verfügung gestellt von Dr. Wang, Taiwan University) bzw. aus Weizen zeigten ein deutlich verbessertes Wachstum (Abb. 2-2).

Durch Transformation mit pPShSH bzw. pPαhS erhaltene Klone wurden auf Platten mit Sac- charose als Kohlenstoffquelle ausgestrichen, allerdings waren keine positiven Klone zu sehen. Um auszuschließen, dass die Methanolinduzierbarkeit bzw. der höhere pH-Wert hinderlich 46 Ergebnisse

sind, wurde ein Konstrukt der CIN1 hergestellt, das über einen GAP-Promotor und den α- Faktor verfügt. Somit sollte das Enzym konstitutiv gebildet und sekretiert werden. Dennoch konnten bei wiederholten Transfomationen keine positiven Klone auf Platten mit Saccharosemedium detektiert werden.

Abbildung 2-2: Wachstumsversuch mit verschiedenen P. pastoris-Stämmen und –Klonen auf Saccharosemedium: Gutes Wachstum zeigen Klone mit vakuolärer Invertase aus Bambus (VI B) und Weizen (VI Ta). Schlecht gewachsen sind hingegen die nicht-transformierten P. pastoris-Stämme Mut S, GS 115 (G: ursprünglich von TU Graz; W: ursprüng- lich von Uni Würzburg) und X-33.

2.1.1.4. Gewinnung pflanzlicher Extrakte Die Herstellung der Rohextrakte (crude, CrEx) und zellwandgebundener Extrakte (cellwall, CwEx) aus den Pflanzen Arabidopsis thaliana (At; Brassicaceae), Beta vulgaris (Bv; Chenopodiaceae), Brassica napus (Bn; Brassicaceae), Nicotiana tabacum (Nt; Solanaceae) und Solanum lycopersicum (Sl; Solanaceae) erfolgte nach einer im Labor gängigen Methode. Die verwendeten Blätter der Pflanzen waren unverwundet und ca. 4-5 Wochen alt, um durch den sink-Status eine höhere Invertaseaktivität zu gewährleisten. Rohextrakte enthalten vakuoläre und neutrale / alkalische Invertasen, die in der Pflanze ungebunden vorliegen und bei einem Aufschluss in Lösung gelangen. In der Regel ist die im Extrakt gemessene Aktivität die der vakuolären Invertase, die Aktivität der alkalischen / neutralen Invertase ist in Blättern hingegen sehr gering und somit zu vernachlässigen. Der zellwandgebundene Extrakt enthält die extrazellulären Invertasen, die über ionische Wechselwirkungen an die Zellwand gebunden vorliegen und durch die hohe Salzkonzentration abgelöst werden.

Von autotrophen Suspensionskulturen von C. rubrum (Chenopodiaceae; Hüsemann, 1981) wurde eine extrazelluläre Invertase (CrCwIN) gewonnen. Für diese Suspensionskulturzellen ist bisher nur eine extrazelluläre Invertase mit hoher Aktivität beschrieben (Roitsch et al., 1995; Ehneß und Roitsch, 1997), so dass man davon ausgehen kann, dass die getestete Aktivität nur von einem Enzym stammt. In einem ersten Ansatz wurde versucht, die Zellen in eine Säule zu 47 Ergebnisse

füllen und das Enzym mit einem Salzgradienten abzuspülen. Da allerdings die Säule verstopfte und kein Durchfluss stattfand, wurde ein batch-Verfahren angewandt. Die gewaschenen Zel- len wurden mit einer Salzlösung versetzt und inkubiert, das aktive Enzym wurde von der Oberfläche gelöst. Nach Filtration und Dialyse konnte die Lösung direkt für Versuche verwendet werden.

2.1.2. Messungen zur pH-Wert-Abhängigkeit der Invertaseaktivität Wie bei allen Enzymen ist auch die Aktivität der Invertasen vom pH-Wert ihrer Umgebung abhängig. Die Isoformen der Invertasen selbst verfügen über unterschiedliche pH-Optima. In einem ersten Schritt sollte die pH-Abhänigkeit der verwendeten Enzyme getestet werden. Hierfür wurde ein Citrat-Phosphat-Puffer über den gesamten Messbereich von pH 2,7 bis pH 7,8 verwendet. Damit sollen Einflüsse der verschiedenen Puffersubstanzen auf die Aktivität der Enzyme selbst vermieden werden, die z.B. bei Vorversuchen mit der humanen Sucrase festgestellt wurden. Es wurden mindestens drei Messreihen pro Extrakt durchgeführt. Der jeweils höchste Wert einer Messung wurde gleich 100 % gesetzt, die Aktivität der anderen Werte wurde dazu prozentual angegeben. So wurden Schwankungen der Messungen ausgegli- chen. Bei niedrigen pH-Werten war die saure, nicht-enzymatische Hydrolyse der Saccharose vor allem bei längeren Reaktionszeiten zu beobachten, dies war im Besonderen bei der vakuolären Invertase aus Weizen, der alkalischen Invertase aus L. temulentum und der humanen Sucrase zu sehen. Die Messungen über den gesamten pH-Bereich wurden in einem Volu- men von 50 µL gleichzeitig in Mikrotiterplatten durchgeführt um gleiche Bedingungen für alle Messwerte zu gewährleisten. Ein Teil der Messungen wurde von Christian Lang (Pharmazie- praktikant) durchgeführt. Die Mittelwerte mit Standardabweichung sind im Anhang unter 6.3. aufgelistet.

Wie in Abbildung 2-3 zu sehen ist, liegt der optimale Bereich für die sauren pflanzlichen Invertasen bei pH 3 bis pH 5,5. Nur für CrCwIN und CIN1 wurden pH-Optima unter pH 4 gemessen, die meisten der Extrakte zeigten die höchste Aktivität um pH 4,5 – 5. Das veränderte pH-Optimum der CIN1 durch die Punktmutation konnte bestätigt werden (shift von pH 3,3 zu pH 4,5 bei CIN1(P/V)). Allerdings ist nicht bei allen Pflanzenextrakten ein saureres pH- Optimum der zellwandgebundenen Invertase gegenüber der vakuolären Invertase zu erkennen. Die Aktivität der alkalischen / neutralen Invertase ist bei pH 6,6 am höchsten, ähnliches gilt für die humane Sucrase. Die Hefeinvertase zeigt eine hohe Aktivität über einen breiten pH-Bereich.

Die hohe Aktivität der Brassicaceae-Extrakte im neutralen Bereich lässt vermuten, dass neben der vakuolären Invertase auch eine neutrale bzw. alkalische Invertase über eine höhere Akti- vität verfügt. Um dies zu überprüfen, wurden Rohextrakte von Arabidopsis und Raps mit Con A aufgereinigt. Bei dieser Methode werden Proteine mit Zuckerketten an das Lectin Con A gebunden, nicht-glykosilierte Proteine bleiben in Lösung. So werden saure Invertasen aus dem Extrakt entfernt. Nach zweimaliger Behandlung waren keine glykosilierten Invertasen im Ex- trakt mehr vorhanden. Aktivitätstest über den Bereich von pH 5,1 – 7,2 zeigten jedoch keine 48 Ergebnisse

bzw. nur geringe Aktivität im gereinigten Extrakt. Für Arabidopsis lässt sich daher sagen, dass keine neutrale Invertase zur Aktivität beiträgt, bei Raps kann eine neutrale Invertase für bis zu 20 % der Aktivität bei pH 7 verantwortlich sein (Tab. 2-3).

Abbildung 2-3: Ergebnisse der Messungen zur pH-Wert-Abhängigkeit der Enzymaktivität. Dargestellt ist die Aktivi- tätsänderung der Enzyme in Abhängigkeit vom pH-Wert in Prozent. Für die Invertasepräparationen wurden die Abkür- zungen wie in Tabelle 2-1 angegeben verwendet. Zur besseren Übersichtlichkeit wurden die Ergebnisse in vier Dar- stellungen wiedergegeben. A: Brassicaceae (Arabidopsis und Raps), B: Solanaceae (Tabak und Tomate), C: Chenopodiaceae (Zuckerrübe und C. rubrum mit heterolog exprimierten Enzymen), D: heterolog exprimierte En- zyme (humane Sucrase, vakuoläre und alkalische / neutrale Invertase) und Hefeinvertase

Tabelle 2-3: Messung der Invertaseaktivität der Brassicaceae-Rohextrakte nach Con A-Aufreinigung. Ü steht für den Überstand nach der Aufreinigung. Angegeben ist die Aktivität in Prozent. 100 % ist die höchste jeweils gemessene Aktivität des Rohextraktes.

pH 5,1 5,4 5,7 6,0 6,3 6,6 6,9 7,2 AtCrEx 100 98 90 87 72 61 42 30 AtCrEx Ü 4 3 2 2 3 2 2 2 BnCrEx 89 100 93 86 78 50 55 42 BnCrEx Ü 8 10 11 10 10 10 9 8

49 Ergebnisse

Als Ergebnis der Messungen zur pH-Wert-Abhängigkeit wurde festgelegt, dass für die alkalische / neutrale Invertase und die humane Sucrase ein Natriumphosphatpuffer pH 7 und für die anderen Enzyme ein Natriumphosphat / Citronensäure-Puffer pH 4,5 verwendet wird.

2.1.3. Messungen zur Temperaturabhängigkeit der Invertaseaktivität Neben der Abhängigkeit der Aktivität vom pH-Wert ist auch der Einfluss der Temperatur von großer Bedeutung. Daher sollte für alle verwendeten Enzyme die optimale Temperatur ermittelt werden. Die in der Arbeitsgruppe für Invertasetests verwendete Temperatur war 26 °C. Nach Vorversuchen mit einzelnen Proben in verschiedenen Inkubatoren, wurden die Messun- gen in PCR-Cyclern mit einem Volumen von 50 µL durchgeführt. So sollten Fehler bei der Handhabung verschiedener Inkubatoren und Fehler durch die Zeitverschiebung bei der Arbeit mit mehreren Geräten gleichzeitig vermieden werden. Die Temperaturgradienten beliefen sich über 20 bis 60 °C bzw. über 30 - 70 °C, je nach verwendetem PCR-Gerät.

Abbildung 2-4: : Ergebnisse der Messungen zur Temperatur-Abhängigkeit der Enzymaktivität. Dargestellt ist die Aktivitätsänderung der Enzyme in Abhängigkeit von der Temperatur in Prozent. Für die Invertasepräparationen wurden die Abkürzungen wie in Tabelle 2-1 angegeben verwendet. Zur besseren Übersichtlichkeit wurden die Ergebnisse in vier Darstellungen wiedergegeben. A: Brassicaceae (Arabidopsis und Raps), B: Solanaceae (Tabak und Tomate), C: Chenopodiaceae (Zuckerrübe und C. rubrum mit heterolog exprimierten Enzymen), D: heterolog exprimierte En- zyme (humane Sucrase, vakuoläre und alkalische / neutrale Invertase) und Hefeinvertase 50 Ergebnisse

Wie schon bei den Messungen mit pH-Gradienten wurde die höchste Aktivität gleich 100 % gesetzt, die anderen Aktivitäten dazu prozentual angegeben. Pro Enzym wurden mindestens drei Messreihen durchgeführt. Die saure nicht-enzymatische Hydrolyse der Saccharose wurde vor allem durch hohe Temperaturen und eine lange Reaktionsdauer begünstigt. Dies zeigte sich bei Messungen mit der vakuolären Invertase und bei einigen Pflanzenextrakten. Die Mit- telwerte mit Standardabweichung sind im Anhang unter 6.3. aufgelistet.

Die optimale Temperatur der einzelnen Invertasen lag viel höher als erwartet (Abb. 2-4). Die bisherige Arbeitstemperatur von 26 °C für die Invertasen war somit suboptimal gewählt. Dies gilt nicht für die menschliche Sucrase, die bei allen getesteten Temperaturen aktiv war. Die Hefeinvertase zeigte ein Optimum bei über 50 °C, war aber auch bei niedrigeren Temperatu- ren aktiv. Die alkalische / neutrale Invertase zeigte das niedrigste Optimum bei ca. 35 – 40 °C. Mit einer Temperatur von ca. 40 – 50 °C zeigten die Brassicaceae ein niedrigeres Optimum gegenüber den Solanaceae, deren Optimum bei etwa 50 °C lag. Dies entsprach auch den Wer- ten der Präparationen aus Zuckerrübe. Die Invertasen aus C. rubrum hingegen lagen im Be- reich der Brassicaceae, ebenso wie die vakuoläre Invertase aus Weizen.

Ein Teil der Messungen wurde von Christian Lang durchgeführt. Für die weiteren Messungen wurde eine Temperatur von 37 °C für alle Invertasepräparationen festgelegt. Bei 37 °C ist die Aktivität ausreichend hoch und der Flüssigkeitsverlust akzeptabel.

2.1.4. Ermittlung der optimalen Saccharosemenge, Bestimmung der Enzympara-

meter Km und vmax Zur Ermittlung der optimalen Saccharosemenge wurden für die Invertasetests Saccharose- konzentrationen von 1 – 100 mM Saccharose verwendet. Für die bisher durchgeführten Invertasetests wurde mit einem Überschuss an Saccharose gearbeitet, für die Hemmtests jedoch sollten drei, auch limitierende Saccharosekonzentrationen eingesetzt werden, um evtl. den Hemmtyp der Reaktion bestimmen zu können.

vmax gibt die maximale Umsatzgeschwindigkeit bei hoher Substratkonzentration an. Dies gilt

allerdings nur, wenn eine Sättigung des Enzyms möglich ist. Die Michaeliskonstante km gibt die Substratkonzentration an, bei der das Enzym zur Hälfte gesättigt ist. Dies entspricht der Sub-

stratkonzentration bei vmax/2.

Die Bestimmung der Enzymparameter Km und vmax wurde mit den erhaltenen Messdaten durchgeführt. Zum einen wurden dafür die Formeln nach Lineweaver-Burk verwendet, zum anderen die Formeln nach Hanes (Ergebnisse siehe Tab. 2-4). Die Linearisierung nach Hanes hat den Vorteil, dass die Messpunkte nicht wie bei der doppelt-reziproken Auftragung ge- staucht werden (Bisswanger, 1994).

Bei der Auswertung führte teilweise die Bestimmung nach Lineweaver-Burk, teilweise die Bestimmung nach Hanes zu weniger schwankenden Werten. Die Zahlenwerte für die maximale Umsatzgeschwindigkeit und die Michaeliskonstante unterschieden sich teilweise stark. Es kann 51 Ergebnisse

keine Aussage getroffen werden, welche Methode die bessere ist. Daher sind auch die Ergeb-

nisse beider Methoden angegeben (Tab. 2-4).

Abbildung 2-5 zeigt zur Veranschaulichung die Diagramme zur Bestimmung der Parameter der heterolog exprimierten extrazellulären Invertase aus C. rubrum. Das Michaelis-Menten- Diagramm zeigt, dass die Reaktion sättigbar ist. Im Lineweaver-Burk-Diagramm wird die Linearisierung durch doppelt-reziproke Auftragung erreicht, die Werte stauchen sich jedoch stark in der linken Hälfte der Geraden. Im Hanes-Diagramm wird die Saccharosekonzentration gegen den Dividenden aus Saccharosekonzentration geteilt durch die Geschwindigkeit aufgetragen, was auch zu einer Linearisierung, jedoch nicht zu einer so ausgeprägten Stauchung der Werte führt.

Abbildung 2-5: Diagramme zur Bestimmung der Enzymparameter km und vmax. A: Michaelis-Menten-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm (doppelt reziproke Auftragung), C: Hanes-Diagramm, D: Tabelle mit Angaben zur

Bestimmung von km und vmax durch linearisierte Auftragung nach Lineweaver-Burk oder Hanes.

Die Hefeinvertase zeigt die höchste Aktivität, gefolgt von den extrazellulären Invertasen aus C. rubrum. Die mutierte Form ist weit weniger aktiv als das originäre Enzym. Die Michaelis- konstanten für die C. rubrum-Enzyme liegen zwischen 0,5 und 1 mM Saccharose. Die Konstan- ten der Zellwand-Extrakte liegen zwischen 1 und etwas über 10 mM Saccharose, die der Roh- extrakte in einem ähnlichen Bereich zwischen 4 und 12 mM Saccharose. Bei etwa 10 mM Sac- charose liegt auch die Konstante der Hefeinvertase. Die Werte für die alkalische / neutrale Invertase und die humane Sucrase sind größer, zwischen 20 und 40 mM. Die maximalen Ge- 52 Ergebnisse

schwindigkeiten der meisten Invertaseprä-parationen liegen im Bereich zwischen 10 und 100 nmol Glucose / µL * min * g Protein. Die Angaben zur Geschwindigkeit der Reaktion sind nur teilweise aussagekräftige Werte, da, bis auf die Hefeinvertase, nicht mit reinen Enzymen, sondern mit Extrakten gearbeitet wurde. Diese enthalten eine Vielzahl von Proteinen, die in der Gesamtproteinmenge des Extraktes, auf die die Werte bezogen sind, integriert sind. So- mit lassen sich diese Werte nur teilweise miteinander vergleichen.

Tabelle 2-4: Parameter km und vmax der verwendeten Invertasepräparationen. Bestimmung durch Linearisierung nach

Lineweaver-Burk bzw. Hanes. vmax steht für die maximale Umsatzgeschwindigkeit bei hoher Substratkonzentration

(wenn eine Sättigung des Enzyms möglich ist), km steht für die Michaliskonstante (der Wert der Substratkonzentrati-

on, bei der eine Halbsättigung des Enzyms vorliegt, also bei vmax/2). km ist in mM Saccharose angegeben, vmax in nmol Glucose / µL * min * g Protein. In der letzten Spalte sind die verwendeten Saccahrosekonzentrationen für die jeweiligen Enzyme angegeben.

Enzym Lineweaver-Burk Hanes mM Suc

vmax km vmax km 660282 12,3 584553 9,5 HI 0,5-100 ±204337 ±4,5 ±240816 ±5,2 CrCwIN 6164 0,711 5587 0,616 0,03-10 Extrakt 1 ±399 ±0,037 ±406 ±0,021 CrCwIN 1451 0,512 1960 0,984 0,03-10 Extrakt 2 ±185 ±0,075 ±171 ±0,337 CrCwIN 3808 0,611 3774 0,800 0,03-10 Gesamt ±2596 ±0,121 ±2006 ±0,293 1168 0,625 971 0,516 CIN1 0,03-10 ±159 ±0,133 ±56 ±0,042 52,1 0,434 51,0 0,423 CIN1(P/V) 0,03-10 ±9,3 ±0,112 ±6,3 ±0,105 101,7 2,8 123,2 6,2 AtCwEx 1-100 ±9,0 ±0,2 ±10,5 ±0,2 12,3 10,0 13,8 12,0 BnCwEx 1-100 ±4,5 ±4,7 ±5,9 ±3,6 91,1 3,0 95,4 4,0 BvCwEx 1-100 ±15,3 ±2,6 ±27,9 ±0,6 62,3 1,5 67,8 2,0 NtCwEx 1-100 ±11,9 ±0,9 ±12,3 ±1,1 36,8 2,0 41,0 4,0 SlCwEx 1-100 ±1,4 ±0,5 ±2,3 ±0,4 83,5 12,5 113,5 22,7 TaVIN2 1-100 ±46,7 ±13,0 ±68,8 ±21,9 81,5 11,4 70,5 7,9 AtCrEx 1-100 ±30,7 ±8,7 ±17,1 ±4,2 11,6 7,2 11,7 8,1 BnCrEx 1-100 ±3,4 ±4,5 ±1,9 ±2,1 20,5 4,3 21,5 6,2 BvCrEx 1-100 ±5,7 ±0,3 ±6,7 ±0,7 53,3 5,8 44,6 3,8 NtCrEx 1-100 ±10,6 ±3,7 ±3,4 ±1,5 8,1 12,2 6,9 11,9 SlCrEx 1-100 ±3,4 ±0,4 ±1,5 ±5,3 26,9 22,2 29,8 29,2 Suc22 10-100 ±0,9 ±2,1 ±1,4 ±2,9 44,4 20,8 78,5 36,4 hS 1-100 ±32,4 ±3,9 ±49,0 ±5,4 53 Ergebnisse

Die Messungen wurden mit einem Volumen von 50 µL in Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Werte einer Platte waren in sich stimmig, allerdings traten teilweise sehr große Schwankun- gen von Platte zu Platte auf. Diese konnten auch durch die Verwendung eines Mastermixes nicht vermieden werden. So erklären sich die teilweise sehr hohen Standardabweichungen der Messungen (siehe Tab. 2-4), v.a. bei der humanen Sucrase und der vakuolären Invertase. Auch muss man bedenken, dass es sich um keine zur Homogenität aufgereinigten Proteine gehandelt hat. Bei einigen Invertasepräparationen wurde mit verschiedenen Extrakten gearbeitet. Zeigten diese stark unterschiedliches Verhalten, wurden die Parameter der jeweiligen Extrak- te angegeben, aber auch die Berechnungen über alle Messwerte zusammen (CrCwIN). Ein Teil der Messungen wurde von Christian Lang durchgeführt.

2.2. Beeinflussung der Invertaseaktivität durch verschiedene Salze

2.2.1. Beeinflussung der Invertaseaktivität durch Metallionen Für eine Vielzahl von Enzymen wird eine Beeinflussung der Aktivität durch Metallionen, v.a. von Schwermetallen beschrieben. Die Metallionen können wichtige Gruppen im aktiven Zent- rum verändern bzw. komplexieren oder aber auch Cofaktoren verdrängen.

Für die Bestimmung der Höhe der Beeinflussung wurden zwei Messungen durchgeführt. Zum einen wurde die Aktivität der Invertasepräparationen ohne Zusätze bestimmt, zum anderen die Aktivität nach Zugabe der Salzlösungen. Die Veränderung der Aktivität zum Standard ohne Zusätze wurde in Prozent angegeben. Folgende Salze wurden in einer Konzentration von je 1

mM verwendet: Calciumchlorid CaCl2, Kupferchlorid CuCl2, Kupfersulfat CuSO4, Eisensulfat

FeSO4, Manganchlorid MnCl2, Nickelsulfat NiSO4, Rubidiumchlorid RbCl und Zinkchlorid ZnCl2.

Die Beeinflussung der Aktivität durch die Metallionen ist sehr unterschiedlich (Abb. 2-6). Ne- ben Hemmungen kam es bei manchen Enzymen auch zu einer erhöhten Aktivität.

Die größten Abweichungen wurden bei der alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum beobachtet. Die verwendeten Schwermetalle führten zu einer Hemmung der Aktivität von 80 % oder mehr. Die Zugabe der Salzlösungen führte bei der Hefeinvertase zu keiner Änderung der Aktivität. Die humane Sucrase zeigte eine erhöhte Aktivität durch die Zugabe von Eisensulfat. Alle pflanzlichen Invertasepräparationen zeigten eine Hemmung durch Manganchlorid, diese war jedoch unterschiedlich stark ausgeprägt.

Die Kupfersalze hatten eine tendenziell hemmende Wirkung auf die pflanzlichen Enzyme, eine Ausnahme bildet hier die Kombination Kupferchlorid mit CIN1. Allerdings ist die Standardab- weichung sehr hoch, so dass keine klare Aussage getroffen werden kann. Eine Besonderheit zeichnet die Rohextrakte von Arabidopsis und Tomate aus. Es wurden unterschiedliche Ex- trakte für die Messungen verwendet, die mit einigen Salzlösungen zu verschiedenen Ergebnis- sen führten. Dies ist evtl. auf eine unterschiedliche Zusammensetzung der Extrakte mit verschiedenen Invertasen zurückzuführen. So zeigte ein Tomatenrohextrakt eine Hemmung durch Calcium und Eisen und eine Aktivierung durch Rubidium, ein zweiter zeigte keine dieser Be- einflussungen. Bei Arabidopsis wurde einer der Rohextrakte durch Kupfer gehemmt und durch 54 Ergebnisse

Eisen aktiviert, ein zweiter wurde durch Mangan gehemmt, allerdings weder von Kupfer noch Eisen beeinflusst.

Die Edelmetalle Silber und Quecksilber stören die Enzyme zur Bestimmung der Glucosemenge, Glucoseoxidase und Peroxidase. Daher war es nicht möglich, die Beeinflussung durch diese Metalle mit dem klassischen Test durchzuführen.

Abbildung 2-6: Ergebnisse der Messungen zur Beeinflussung der Invertaseaktivität durch verschiedene Metallionen.

Verwendet wurden in einer Endkonzentration von je 1 mM Lösungen folgender Salze: CaCl2, CuCl2, CuSO4, FeSO4,

MnCl2, NiSO4, RbCl und ZnCl2. Dargestellt ist die Aktivitätsänderung der Invertasepräparationen durch Zugabe der Salzlösungen in Prozent. Für die Invertasepräparationen wurden die Abkürzungen wie in Tabelle 2-1 angegeben verwendet. Zur besseren Übersichtlichkeit wurden die Ergebnisse in vier Darstellungen wiedergegeben. A: Brassicaceae (Arabidopsis und Raps), B: Solanaceae (Tabak und Tomate), C: Chenopodiaceae (Zuckerrübe und C. rubrum mit heterolog exprimierten Enzymen), D: heterolog exprimierte Enzyme (humane Sucrase, vakuoläre und alkalische / neutrale Invertase) und Hefeinvertase

Für die Invertasepräparationen aus C. rubrum konnte jedoch mit einer anderen Methode ein Hemmtest durchgeführt werden. Dazu wurde radioaktiv markierte Saccharose als Substrat verwendet. Die Trennung der Zucker erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Diese

Methode funktioniert sehr gut mit Enzymen, die einen niedrigen km-Wert haben, da nur eine sehr kleine Konzentration an Saccharose verwendet wird. Abbildung 2-7 zeigt, dass durch die Zugabe von Silberchlorid die Aktivität aller drei Enzyme komplett gehemmt wurde. Zwischen den Invertasepräparationen ist kein Unterschied zu sehen. Auch durch Quecksilberchlorid 55 Ergebnisse

wurde eine komplette Hemmung von CrCwIN und CIN1(P/V) beobachtet, allerdings ist bei CIN1 eine Restaktivität zu sehen.

Abbildung 2-7: Beeinflussung der Aktivität der verschiedenen C. rubrum-Lösungen durch die Zugabe von Silber- oder Quecksilberchlorid. Die Salze wurden in einer Endkonzentration von 1 mM verwendet. A: extrazelluläre Invertase von Suspensionszellkulturen (CrCwIN), B: CIN1, rekombinant aus S. cerevisiase, C: CIN1(P/V), rekombinant aus S. cerevisiae, S: Saccharosekontrolle ohne Enzym. Die Invertasetests wurden mit radioaktiv markierter Saccharose durchgeführt, je 1 µL der Reaktionsansätze wurde auf eine DC-Platte aufgetragen und entwickelt. Zu sehen ist das radioaktiv markierte Signal der Zucker.

2.2.2. Beeinflussung der Invertaseaktivität durch Natriumchlorid Die Aktivität von Enzymen kann auch durch hohe Salzkonzentrationen beeinflusst werden. Daher wurden Messungen mit und ohne 400 mM NaCl in der Reaktionslösung durchgeführt. Wie in Abbildung 2-8 zu sehen ist führte dies bei einem Teil der Enzyme zu einer verringerten, selten zu einer erhöhten Aktivität. Die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum zeigte als einzige eine deutlich erhöhte Aktivität. Auch der Rohextrakt aus Tomate tendierte zu einer erhöh- ten Aktivität. Einige Enzyme werden nicht in ihrer Aktivität beeinflusst, etwa die humane Sucrase, die Zuckerrübenextrakte und der zellwandgebundene Extrakt aus Tabak. Die anderen Invertasepräparationen zeigen eine unterschiedlich starke Hemmung der Aktivität, v. a. die alkalische Invertase, die mutierte Invertase aus C. rubrum und die vakuoläre Invertase aus Weizen werden stark gehemmt.

Beeinflussung der Aktivität durch 400 mM NaCl

100

50 0

-50 Aktivität [%] Aktivität -100

Abbildung 2-8: Beeinflussung der Aktivität der Invertasepräparationen durch die Zugabe von 400 mM NaCl. Darge- stellt ist die Aktivitätsänderung der Invertasepräparationen durch Zugabe der Salzlösung (400 mM Endkonzentration) in Prozent mit Standardabweichung. Für die Invertasepräparationen wurden die Abkürzungen wie in Tabelle 2-1 angegeben verwendet. 56 Ergebnisse

2.3. Einfluss von Inhibitoren auf die Invertaseaktivität Die Aktivität der Invertasen kann durch verschiedene chemische Verbindungen, die als Inhibi- toren bekannt sind, beeinflusst werden. Daher sollte der Einfluss verschiedener Inhibitoren auf verschiedene Invertasepräparationen getestet werden. Dazu wurden neben den schon erwähnten Invertasepräparationen auch verschiedene Inhibitoren benötigt. Im Folgenden wird zuerst auf die Herstellung verschiedener Inhibitorpräparationen eingegangen. Dabei handelt es sich zum einen um proteinogene Inhibitoren, die heterolog exprimiert werden sollten. Dies geschah mit zwei unterschiedlichen Expressionssystemen. Zusätzlich zu diesen pflanzlichen Inhibitoren sollten Thiofructoside synthetisiert werden. Desweiteren wurden verschiedene chemische Inhibitoren verwendet. Für die Hemmversuche mit Einzelsubstanzen wurde nur der

aus den gezeigten Werten errechnete IC50-Wert mit Standardabweichung angegeben, nicht die Standardabweichungen der einzelnen Messwerte.

Alle Inhibitortests wurden mit einer Vorinkubation durchgeführt. Die Ergebnisse werden nach Enzymen unterteilt abgebildet.

Abbildung 2-9: Vergleich der Mittelwerte verschiedener Hemmtests mit (m, jeweils links) und ohne (o, jeweils rechts) Vorinkubation. Hemmtests wurden durchgeführt mit einem Rohextrakt aus Arabidopsis (AtCrEx) bzw. einer extrazellulären Invertase aus C. rubrum (CrCwIN) und den Inhibitoren Acarbose (Ac) bzw. DMDP. Angegeben sind die Mittelwerte der Aktivitätsabweichung in %, die Standardabweichung (Stdabw.) und der 1,96fache Wert der Standard- abweichung. 57 Ergebnisse

Vorinkubation bedeutet, dass das Enzym und der Inhibitor im Puffer bei 37 °C für 10 min inkubiert wurden und dann erst die Saccharose zugefügt wurde. Dies soll verhindern, dass die Aktivität des Enzyms durch die Saccharose vor dem Inhibitor geschützt wird. Die Datenlage zu dieser Schutzfunktion der Saccharose ist uneinheitlich. Beschrieben wird sie für proteinogene Inhibitoren, etwa dass die Hemmung durch Saccharose verzögert wird (Anderson et al., 1980; Greiner, 1999). Auch bei Hemmtests mit pflanzlichen Extrakten konnten Unterschiede festgestellt werden (Ali et al., 2006). Aus der Literatur kann geschlossen werden, dass die Schutz- funktion von Enzym und Inhibitor abhängig ist (Sander et al., 1996). Für durchgeführte Ver- gleiche mit und ohne Vorinkubation des Rohextraktes aus Arabidopsis und der extrazellulären Invertase aus C. rubrum mit Acarbose und DMDP konnte mittels t-Test kein signifikanter Un- terschied ermittelt werden (Abb. 2-9).

In der Abbildung sind die Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben. Die Balken kenn- zeichnen einen Bereich von 1,96 * Standardabweichung. Dies entspricht bei einer Normalver- teilung dem Bereich, in dem 95 % aller Werte liegen. Überschneiden sich diese Bereiche zweier verschiedener, zu vergleichender Messreihen, so sind diese mit p < 0,05 voneinander nicht signifikant verschieden. Dies trifft für alle durchgeführten Untersuchungen zu. Um jedoch auszuschließen, dass die Saccharose eine Wirkung auf die Hemmung hat, wurde der Vorinku- bationsschritt beibehalten.

2.3.1. Herstellung von Inhibitorpräparationen Teilweise wurden die verwendeten Inhibitoren selbst hergestellt. Wie bereits erwähnt, handelt es sich dabei um rekombinant zu exprimierende, proteinogene Inhibitoren und um Thiofructoside, die im Labor synthetisiert wurden.

2.3.1.1. Heterologe Expression proteinogener Inhibitoren In der Arbeitsgruppe vorgenommene Versuche, proteinogene Inhibitoren aus Arabidopsis in E. coli rekombinant herzustellen, schlugen fehl. Daher wurde versucht, einen proteinogenen Inhibitor aus Arabidopsis in P. pastoris zu exprimieren. Dies führte allerdings nicht zu den gewünschten Ergebnissen, so dass die Inhibitoren für Aktivitätstests mit Konstrukten zur Ex- pression in Nicotiana benthamiana hergestellt wurden.

2.3.1.1.1. Heterologe Expression in P. pastoris Zur heterologen Expression des Invertaseinhibitors 2 aus Arabidopsis thaliana (At5g64620), AtC/VIF 2, in P. pastoris wurden verschiedene Konstrukte hergestellt. Auch mit den Inhibitorkonstrukten traten, ähnlich wie bei der humanen Sucrase, bei der Transformation der Hefezellen verstärkt Probleme auf.

In einem ersten Versuch wurde das Konstrukt pPI2 hergestellt. Dazu wurde aus dem Plasmid pATCI (von Jörg Hirsche zur Verfügung gestellt) die cDNA für AtC/VIF 2 mittels PCR gewonnen. Über EcoRI-Schnittstellen wurde diese in das Plasmid pPICZ A kloniert. Die cDNA des Inhibitors verfügt über ein Stop-Codon, so dass das resultierende Protein ohne his-tag gebildet wurde. 58 Ergebnisse

Für ein zweites Konstrukt wurde sowohl das Stop-Codon entfernt als auch das Lesemuster am Ende der cDNA angepasst, so dass ein Fusionsprotein entstand. Die cDNA des Inhibitors wurde erneut durch PCR aus dem Plasmid pATCI gewonnen, jedoch mit dem Primerpaar Atcwinh3 / I2rev. Über EcoRI und NotI-Schnittstellen erfolgte die Klonierung in pPICZ A. Das Konstrukt wurde pPI2B genannt.

Ein drittes Konstrukt, pPI2M ist dem zweiten Konstrukt sehr ähnlich. Der Unterschied besteht darin, dass zwischen der EcoRI-Schnittstelle und dem Startcodon des Inhibitors sechs zusätzli- che Basen liegen.

Auch für das Inhibitorprotein wurden in Kooperation mit der AG Glieder (TU Graz) neue Kon- strukte, pPαI2 und pPhtI2, entwickelt. Für diese wurde das Plasmid pPT4 anstelle von pPICZ A verwendet, mit der Methode der Overlap-Extension-PCR wurden die DNA-Stücke miteinander verbunden.

Das Konstrukt pPαI2 verfügt über den α-Faktor für die Sekretion des Proteins ins Medium. Dies erleichtert die Aufreinigung, allerdings führt es auch zur Glykosilierung des Proteins. Proteinogene Invertaseinhibitoren sind im Regelfall nicht glykosiliert. Für die PCR zur Verviel- fältigung der Inhibitor-DNA wurden die Primer alphaInh2fw und Inh2Notrv verwendet.

Das Konstrukt pPhtI2 wurde entwickelt, um eine Störung der Proteinaktivität durch ein his-tag am C-terminalen Ende des Proteins auszuschließen. Daher wurde ein his-tag am N-terminalen Endes des Proteins mittels Overlap-Extension-PCR angebracht. Für die PCR wurden die Primer In2intrecofw und Inh2Notrv verwendet. Eine Sekretion des Fusionsproteins erfolgt nicht, ein Aufschluss der Zellen ist notwendig.

2.3.1.1.2. Überprüfung der heterologen Expression in P. pastoris, Aufreinigung des proteinogenen Inhibitors Wie auch für die Klone der humanen Sucrase wurden die Klone für das Inhibitorprotein AtC/VIF2 für 72 h in einem Glucosemedium bzw. Glycerolmedium angezogen. Die Induktion erfolgte durch Zugabe von Methanol bzw. Abzentrifugation und Resuspendierung in einem Methanolmedium. Die Zellen wuchsen über einen Zeitraum von 72 h in Methanolmedium, alle 24 h wurde der Kultur frisches Methanol zugegeben.

Für die P. pastoris-Klone mit Inhibitorkonstrukten (ohne die Konstrukte in Zusammenarbeit mit der AG Glieder) wurde mittels PCR ein Nachweis auf das Inhibitorgen bzw. auf das Resis- tenzgen durchgeführt. Allerdings waren die Ergebnisse nicht für alle getesteten Klone eindeutig, der Anteil der negativen, nicht-transformierten Klone lag sehr hoch.

Verschiedene Versuche, den Rohextrakt von Klonen der Konstrukte pPI2B, pPI2M und pPhtI2 mittels Affinitätsaufreinigung zu Nickel zu reinigen und aufzukonzentrieren, waren nicht erfolgreich. Auf Proteingelen konnte keine eindeutige Bande identifiziert werden.

Für Klone des Konstruktes pPαI2 konnte im Medium eindeutig eine Bande auf dem Proteingel identifiziert werden, die erst nach Induktion durch Methanol kräftig zu sehen war (Abb. 2-10 A, B). Mittels Alcianblaufärbung konnte gezeigt werden, dass das Inhibitorprotein stark 59 Ergebnisse

glykosiliert war. Dies entspricht nicht dem natürlichen Zustand und könnte ein Grund dafür sein, dass keine inhibitorische Aktivität festgestellt werden konnte. Der Abverdau der Zucker- ketten mittels Endo H führte zwar zu einem nicht-glykosilierten Protein (Abb. 2-10 C, klar erkennbare, Coomassie-gefärbte Bande), inhibitorische Aktivität war jedoch auch nach Ent- fernen der Zuckerketten nicht feststellbar. Der Verdau mit Endo H muss ohne die Zugabe von DTT erfolgen, da ansonsten das Inhibitorprotein vollständig denaturiert und somit sicher inaktiviert wird.

Abbildung 2-10: Proteingele mit aufkonzentriertem Medium der Kulturen von P. pastoris Mut S (S) (nicht transfor- mierter Stamm als Kontrolle) und Klonen mit dem Konstrukt pPαI2 (43 und 58). Als Kontrolle für die Alcianfärbung wurde nicht-glykosilierte Hefeinvertase (HI) aufgetragen, Ma: Marker. A: Natives Gel, 1: Alcianfärbung, 2: Coomassiefärbung; B: SDS-PAGE, 1: Alcianfärbung, 2: Coomassiefärbung; C: SDS-PAGE, Coomassiefärbung, Proben nach Endo H-Verdau. In den Abb. A und B ist das glykosilierte Protein nur verschmiert zu sehen, in Abb. C nach dem Abverdau der Zuckerketten als gut sichtbare Bande.

Einige Klone der Konstrukte pPhtI2 und pPI2M zeigten in ersten Versuchen eine mögliche inhibitorische Aktivität. Da jedoch nicht absehbar war, ob die Weiterarbeit an der heterologen Expression in P. pastoris erfolgreich verlaufen würde, wurden stattdessen verschiedene Inhibitorproteine heterolog in Nicotiana benthamiana exprimiert.

2.3.1.1.3. Heterologe Expression in N. benthamiana, Aufreinigung der Inhibitoren Die Konstrukte für die heterologe Expression verschiedener Inhibitorproteine aus Tabak, Arabidopsis und Zuckerrübe wurden von Dr. Steffen Greiner (Heidelberg) zur Verfügung gestellt. Die Transformation der Konstrukte in E. coli DH5α und danach in A. tumefaciens C58C1 60 Ergebnisse

erfolgte nach Standardmethoden. Die Infiltration einer Suspension von Agrobakterien in die Blätter von Nicotiana benthamiana zur temporären Expression des Inhibitorproteins erfolgte nach den Angaben von Dr. Greiner (Kusch et al., 2009). Zur Gewinnung der Inhibitorproteine wurden die infiltrierten Blätter nach 48 h geerntet und ein Rohextrakt hergestellt. Um den Extrakt partiell aufzureinigen und v.a. die Invertasen aus N. benthamiana zu entfernen, wurde eine Affinitätsreinigung mittels Con A durchgeführt. Dabei binden die Zuckerketten von glykosilierten Proteinen an das Lectin Con A und können so von nicht-glykosilierten Bestand- teilen des Extraktes, wie den Inhibitorproteinen, abgetrennt werden. Nach dieser Aufreinigung war in den Extrakten keine Invertaseaktivität mehr feststellbar. Bei Gabe des aufgereinigten N. benthamiana-Rohextraktes zu Invertasepräparationen konnte eine Inhibie- rung der Invertaseaktivität gemessen werden.

Inhibitorpräparationen folgender Proteine wurden hergestellt: NtCIF, zellwandgebundener Inhibitor aus N. tabacum; NtVIF, vakuolärer Inhibitor aus N. tabacum, zwei Inhibitoren aus Arabidopsis AtC/VIF 1 und 2 und ein Inhibitor aus der Zuckerrübe BvC/VIF.

2.3.1.2. Herstellung von Thiofructosiden Thiofructoside sind eine Verbindung aus Fructose und Mercaptoethanol. Bei der Spaltung von Saccharose durch eine β-Fructofuranosidase wird der Fructoserest auf ein Akzeptormolekül übertragen. Dies ist in der Regel Wasser, bei Zugabe von Mercaptoethanol kann aber auch dieser als Aktzeptormolekül reagieren. So entstehen O- und S-Fructoside, von denen das O- Fructosid wieder gespalten werden kann, das S-Fructosid jedoch nicht. So wirkt es als Inhibi- tor des Enzyms, da es in Konkurrenz zum Substrat tritt.

Die Herstellung erfolgte nach Angaben von Prof. Nakano (Osaka, Japan). Die Synthese erfolgte mit einer Invertase aus Hefe, die Aufreinigung mit einer selbst gepackten Aktivkohlesäule an einer Äkta Prime. Die einzelnen Fraktionen der Chromatographie wurden auf Dünnschichtplat- ten aufgetragen, diese entwickelt und die Bestandteile mit Methanol-Schwefelsäure- Sprühreagenz detektiert. Trotz der zweimaligen Aufreinigung über eine Aktivkohlesäule war die Verunreinigung mit Glucose sehr hoch, Invertasetests und Glucosemessungen mit der Thiofructosidlösung waren nicht möglich. In Abbildung 2-11 verdeutlichen einige Messungen die falsch positiven Ergebnisse durch die hohen Glucosemengen in der Thiofructosidlösung. Der gemessene Kontrollwert der Thiofructosidlösung war teilweise höher als die gemessene Aktivität der Invertasepräparation. Somit verfälscht der Kontrollwert die Messungen, was u.a. dazu führen kann, dass mehr scheinbarer Hemmstoff zu weniger Hemmung führt. Falls aktives Thiofructosid synthetisiert wurde, wird die Aktivität durch die Glucosemenge überlagert.

Nach einigen Ansätzen, bei denen das Endprodukt immer noch eine zu hohe Glucosekonzentration aufwies, wurde das Protokoll variiert. Die Mengen an Saccharose, Mercaptoethanol und Enzym wurden verändert, ebenso die Dauer der Reaktion. Auch wurden Invertasen aus S. cerevisiae und Candida utilis eingesetzt. Es stellte sich heraus, dass die Menge an Mercaptoethanol nicht erhöht werden kann, jedoch wurde mehr Enzym eingesetzt und die Saccharosekonzentration gesenkt. Auch wurde zusätzlich zur Chromatographie über 61 Ergebnisse

die Aktivkohlesäule ein Reinigungsschritt eingeführt. Die Fraktionen mit Thiofructosiden wurden am Rotationsverdampfer eingeengt und anschließend vollständig auf eine DC-Platte aufgetragen. Die Thiofructosid-Bande wurde anschließend abgekratzt und die Substanz aus dem Kieselgel extrahiert. So konnte der Glucosegehalt des Endproduktes reduziert werden, allerdings war es nicht möglich ein Produkt zu erhalten, das über einen längeren Zeitraum stabil war. Direkt nach der Herstellung konnten Invertasetests durchgeführt werden und die Ergeb- nisse ließen auf eine starke Hemmung schließen, nach kurzer Lagerung war jedoch keine Hemmung mehr zu sehen und es wurde eine große Glucosemenge detektiert.

Abbildung 2-11: I) Schematische Darstellung einer entwickelten Dünnschichtchromatographie mit Thiofructosidlösung nach einer Aufreinigung über Aktivkohle. A: Lauffront, B: Auftragelinie, 1: Zone unterhalb der Lauffront, 2: weitere Zone, leichte Farbentwicklung, 3: Zone mit stärkerer Farbentwicklung, 4 und 5: untere Zonen mit starker Farbent- wicklung, hoher Anteil an Zuckern, die noch nicht vollständig durch die Chromatographie entfernt sind. Silicagel mit den Zonen 1-5 wurde abgekratzt und für Untersuchungen extrahiert. II) Rechnerische Hemmung (3fach Bestimmung, Kontrollwert ohne Saccharosezugabe wird vom Mittelwert abgezogen) der extrazellulären Invertase aus C. rubrum durch die Stoffe, die aus den in I) beschrifteten Zonen extrahiert wurden. Die „Hemmung“ bei 4 und 5 kommt durch den hohen Zuckergehalt der Lösungen zustande. Der Kontrollwert ist höher als der Mittelwert der Messungen, so dass anscheinend eine Hemmung zustande kommt. III) Rechnerische Hemmung der extrazellulären Invertase aus C. rubrum durch unterschiedlich große Mengen an Thiofructosidlösung. Auch hier führt der hohe Glucosegehalt zu falschen Ergebnissen.

Trotz der Optimierung des Herstellungsprotokolls der Thiofructoside konnte kein stabiles Pro- dukt gewonnen werden, das verlässlich für Invertasetests verwendet werden konnte. So war es nicht möglich, die Hemmwirkung der Thiofructoside auf verschiedene Invertase- präparationen zu testen. 62 Ergebnisse

2.3.2. Einfluss von Inhibitoren auf die Aktivität pflanzlicher Invertasen Für die Invertasetests mit verschiedenen Inhibitoren wurden die in Tabelle 2-5 genannten Parameter für die jeweiligen Invertasepräparationen gewählt.

Allgemein werden die in Tabelle 2-1 angegebenen Abkürzungen verwendet, zur besseren Übersichtlichkeit werden die Ergebnisse bei Bedarf in mehreren Darstellungen wiedergegeben. Von der Einteilung A: Brassicaceae Arabidopsis und Raps, B: Solanaceae Tabak und To- mate, C: Chenopodiaceae Zuckerrübe und C. rubrum mit heterolog exprimierten Enzymen, D: vakuoläre Invertase aus T. aestivum und alkalische / neutrale Invertase aus L. temulentum wird abgewichen, wenn es die Daten erforderlich machen; Abweichungen werden beschrieben. Die Daten sind angegeben für Hemmtests, die mit 0,7 mM, 7 mM oder 50 mM Saccharose durchgeführt wurden.

Tabelle 2-5: Übersicht über gewählten Parameter für die jeweiligen Invertasepräparationen. Es wurde darauf geach- tet, dass die erhaltenen Messwerte jeweils gut im linearen Bereich der Kalibriergerade lagen.

Enzym pH-Wert Saccharose-Konz. [mM] Dauer [min] Temp. [°C] CrCwIN 4,5 0,4 / 0,7 / 1 45 37 CIN1 4,5 0,4 / 0,7 / 1 90 37 CIN1(P/V) 4,5 0,4 / 0,7 / 1 90 37 AtCwEx 4,5 2 / 4 / 7 / 10 60 37 BvCwEx 4,5 4 / 7 / 10 45 37 BnCwEx 4,5 2 / 4 / 7 / 10 60 37 NtCwEx 4,5 4 / 7 / 10 60 37 SlCwEx 4,5 2 / 4 / 7 / 10 60 37 TaVIN2 4,5 30 / 50 / 100 60 37 AtCrEx 4,5 4 / 7 / 10 30 37 BvCrEx 4,5 4 / 7 / 10 45 37 BnCrEx 4,5 2 / 4 / 7 / 10 60 37 NtCrEx 4,5 4 / 7 / 10 45 37 SlCrEx 4,5 2 / 4 / 7 45 37 Suc22 7,0 30 / 50 / 100 45 37

2.3.2.1. Beeinflussung durch chemische Invertaseinhibitoren Wie bereits in der Einleitung dargestellt, beeinflusst eine Vielzahl an Substanzen die Aktivität von Invertasen. Der Einfluss verschiedener Stoffe auf die Aktivität pflanzlicher Invertase wurde untersucht. Zum eine wurden Hemmtestes mit den Einzelsubstanzen Acarbose, Miglitol,

DMDP, Calystegin B2, Fructose, Arabinose, Xylose, Tris, Anilin, Pyridoxin und Imidazol durch- geführt. Zum anderen wurden an zwei Enzymen verschiedene Kombinationen dieser Stoffe getestet. Um mit der teilweise begrenzten Menge an Inhibitorsubstanz sparsam umzugehen, wurden nicht immer alle Invertasen mit allen Konzentrationen vermessen.

63 Ergebnisse

2.3.2.1.1. Beeinflussung durch Zugabe von Einzelsubstanzen Der α-Glucosidasehemmstoff Acarbose wurde mit allen pflanzlichen Enzymen vermessen.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 2-12 dargestellt, die IC50-Werte in Tabelle 2-6. Bei einem

IC50-Wert handelt es sich um die mittlere inhibitorische Konzentration, d.h. die Konzentration

eines Inhibitors, die notwendig ist, um eine 50 %ige Hemmung in vitro zu beobachten. IC50- Werte sind immer auch von der verwendeten Substratkonzentration abhängig.

Bei allen pflanzlichen Invertasepräparationen konnte eine Hemmung festgestellt werden. Es gab keine Unterschiede zwischen zellwandgebundenen und vakuolären Invertasen, auch keine zwischen den verschiedenen Pflanzenfamilien. Die Hemmung der vakuolären Invertase war schwach. Für die Pflanzenextrakte kann man sagen, dass eine nennenswerte Hemmung erst ab 10 mM Acarbose zu beobachten ist.

Abbildung 2-12: Änderung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von Acarbose in verschiedenen Konzentrationen.

Die IC50-Werte liegen in einem Bereich von 5-50 mM Acarbose. Die niedrigsten Werte sind die der C. rubrum-Enzyme und des zellwandgebundenen Extraktes aus Arabidopsis, die höchsten Werte hingegen die der vakuolären Invertase aus Weizen und der zellwandgebundene Extrakt aus Tabak. 64 Ergebnisse

Tabelle 2-6: IC50-Werte in mM Acarbose für die getesteten Invertasepräparationen bei entsprechender Saccharosekonzentration. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung.

mM Suc Präparation 0,4 0,7 1 2 4 7 10 30 50 100 19,8 24,0 34,5 AtCrEx ±2,0 ±0,9 ±7,0 12,0 15,1 16,9 BnCrEx ±1,4 ±0,8 ±1,0 6,5 9,2 10,7 AtCwEx ±0,6 ±0,8 ±1,5 14,7 16,4 18,5 BnCwEx ±1,8 ±1,5 ±1,9 28,0 34,2 37,3 NtCrEx ±4,2 ±19,4 ±13,0 13,4 22,7 19,1 SlCrEx ±3,0 ±2,5 ±3,0 30,9 42,1 37,8 NtCwEx ±11,2 ±26,6 ±12,7 21,9 18,3 20,0 SlCwEx ±2,0 ±1,5 ±1,9 17,5 29,9 26,4 BvCrEx ±1,0 ±12,2 ±4,1 30,8 26,8 37,5 BvCwEx ±15,2 ±6,6 ±16,5 8,3 9,8 10,9 CrCwIN ±4,9 ±3,4 ±5,2 7,6 13,2 10,6 CIN1 ±3,0 ±6,2 ±5,8 4,5 6,0 6,6 CIN1(P/V) ±0,3 ±0,8 ±0,7 31,4 46,8 39,7 TaVIN2 ±0,0 ±9,9 ±4,2 14,9 17,6 19,3 Suc22 ±1,6 ±3,1 ±4,5

Desweiteren wurde der α-Glucosidasehemmstoff Miglitol auch mit allen pflanzlichen

Invertasepräparationen vermessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2-13, die IC50-Werte in Tabelle 2-7 wiedergegeben. Im Gegensatz zur Acarbose sind zwischen den verschiedenen Invertasepräparationen große Unterschiede zu sehen. Die alkalische / neutrale Invertase ist schon bei viel niedrigeren Kon-

zentrationen gehemmt als die anderen Enzyme, die IC50-Werte liegen im µM-Bereich. Auch die Extrakte der Brassicaceae unterscheiden sich deutlich. Hier tritt eine Hemmung – falls über- haupt – nur bei sehr hohen Miglitolkonzentrationen auf. Dementsprechend war die Bestim-

mung der IC50-Werte nur teilweise möglich. Bei fast allen Pflanzenextrakten führten niedrige Miglitolkonzentration zu einer höheren Aktivität der Enzyme. Dies konnte bei den C. rubrum- Extrakten jedoch nicht beobachtet werden. 65 Ergebnisse

Abbildung 2-13: : Änderung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von Miglitol in verschiedenen Konzentrationen. Die Darstellung der Ergebnisse der vakuolären Invertase wurde nach Abb. C verscho- ben, da die Abbildung der Ergebnisse der alkalischen / neutralen Invertase eine andere Skalierung erforderte.

Die IC50-Werte für Miglitol liegen weiter gestreut als die für Acarbose. Für die alkalische / neutrale Invertase liegt er bei etwa 5 – 20 µM, für die Brassicaceae – falls er bestimmt werden konnte – liegt er weit über 100 mM und für die restlichen Enzyme zwischen 15 und 100 mM gestreut, auch hier sind die Werte der C. rubrum-Enzyme unter den niedrigsten.

Tabelle 2-7: IC50-Werte in mM Miglitol für die getesteten Invertasepräparationen bei entsprechender Saccharosekonzentration. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung. Mit den Daten von AtCrEx und AtCwEx konnte keine Standardabweichung berechnet werden.

mM Suc Präparation 0,4 0,7 1 2 4 7 10 30 50 100 AtCrEx 177,3 138,3 159,1 168,2 128,6 158,8 BnCrEx ±24,7 ±23,3 ±14,1 AtCwEx 143,5 126,2 111,7 BnCwEx n.d. n.d. n.d. 50,6 43,5 42,0 NtCrEx ±10,8 ±8,0 ±5,9 54,0 39,1 51,6 SlCrEx ±7,7 ±3,2 ±3,2 66 Ergebnisse

54,6 49,5 49,7 NtCwEx ±3,9 ±11,8 ±7,5 37,7 31,8 30,6 SlCwEx ±5,4 ±1,8 ±4,0 74,8 72,2 70,4 BvCrEx ±3,4 ±15,8 ±8,8 67,5 62,1 62,4 BvCwEx ±8,8 ±10,4 ±5,0 CrCwIN 21,7 18,7 13,4 ±6,0 ±2,0 ±1,1 CIN1 27,2 23,7 23,3 ±13,7 ±8,1 ±13,4 CIN1(P/V) 38,0 37,3 35,1 ±0,6 ±1,0 ±12,7 TaVIN2 95,4 96,1 94,7 ±35,3 ±37,0 ±25,4 Suc22 0,004 0,008 0,016 ±0,001 ±0,002 ±0,005

Messungen mit allen pflanzlichen Invertasepräparationen wurden auch mit dem Iminozucker DMDP durchgeführt. Dieser gehört zur Stoffklasse der Piperidine. DMDP wurde von Prof.

Fernández (Universität Sevilla, Spanien) zur Verfügung gestellt. Ergebnisse und IC50-Werte sind in Abbildung 2-14 und Tabelle 2-8 dargestellt. DMDP ist ein besserer Inhibitor der pflanzlichen Enzyme, die verwendete Konzentration war um zwei bis drei Zehnerpotenzen niedriger als bei Acarbose oder Miglitol.

Bei allen Enzymen war eine klare Hemmung zu sehen. Auch niedrige Konzentrationen führten zu einer erkennbaren Hemmung, eine Steigerung der Aktivität trat nicht ein. Die Hemmung der Enzyme der Chenopodiaceae-Extrakte nahm mit der Konzentration des DMDP stärker zu als die der anderen Invertasepräparationen. Die Hemmung der alkalischen / neutralen Invertase war der der anderen vergleichbar.

Mit steigender Saccharosekonzentration steigen auch die IC50-Werte deutlich an. Diese lagen im Bereich von 0,02 bis 1 mM. Die höchsten Werte zeigte die vakuoläre Invertase, die niedrigsten wiederum die Chenopodiaceae-Extrakte und der Rohextrakt aus Tomate.

Tabelle 2-8: IC50-Werte in mM DMDP für die getesteten Invertasepräparationen bei entsprechender Saccharosekonzentration. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung.

mM Suc Präparation 0,4 0,7 1 2 4 7 10 30 50 100 0,198 0,328 0,437 AtCrEx ±0,035 ±0,058 ±0,127 0,188 0,208 0,308 BnCrEx ±0,032 ±0,058 ±0,127 0,088 0,135 0,216 AtCwEx ±0,005 ±0,012 ±0,030 0,200 0,250 0,230 BnCwEx ±0,082 ±0,088 ±0,103 0,093 0,100 0,171 NtCrEx ±0,026 ±0,032 ±0,050 0,043 0,087 0,096 SlCrEx ±0,008 ±0,021 ±0,024 0,171 0,374 0,360 NtCwEx ±0,025 ±0,005 ±0,138 0,071 0,111 0,095 SlCwEx ±0,008 ±0,016 ±0,028 67 Ergebnisse

BvCrEx 0,062 0,127 0,154 ±0,007 ±0,010 ±0,044 BvCwEx 0,083 0,153 0,135 ±0,013 ±0,034 ±0,028 CrCwIN 0,032 0,032 0,041 ±0,024 ±0,010 ±0,015 CIN1 0,024 0,028 0,028 ±0,008 ±0,004 ±0,007 CIN1(P/V) 0,038 0,058 0,067 ±0,006 ±0,012 ±0,015 TaINV2 0,531 0,612 0,925 ±0,232 ±0,231 ±0,335 Suc22 0,122 0,198 0,304 ±0,012 ±0,103 ±0,091

Abbildung 2-14: Änderung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von DMDP in verschiedenen Konzentrationen.

68 Ergebnisse

Von Prof. Dräger (Universität Halle-Wittenberg) wurde das Calystegin B2 zur Verfügung gestellt. Es handelte sich um eine kleine Menge an Substanz, so dass die Anzahl der durchge- führten Messungen begrenzt war. Die Ergebnisse der Messungen sind in Abbildung 2-15 zu sehen.

Es ist deutlich erkennbar, dass eine klare Hemmung nur bei wenigen Extrakten aufgetreten ist. Die C. rubrum-Extrakte wurden alle drei gehemmt, allerdings der Extrakt des mutierten

Enzyms deutlich schlechter als die beiden extrazellulären Invertasen. Die IC50-Werte für CrCwIN und CIN1 betrugen 8,0 ± 1,8 mM bzw. 9,6 ± 0,6 mM, der des mutierten Enzyms dage-

gen 29,4 ± 10,9 mM Calystegin B2. Eine Hemmung konnte darüberhinaus nur bei zwei weiteren Extrakten beobachtet werden, dem Rohextrakt aus Raps und dem zellwandgebundenen Ex-

trakt aus Arabidopsis. Für letzteren konnte ein IC50-Wert von 21,5 ± 8,6 mM Calystegin B2 errechnet werden.

Abbildung 2-15: Änderung der Enzymaktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von

Calystegin B2 in verschiedenen Konzentrationen.

69 Ergebnisse

Fructose, ein Produkt der Reaktion der Invertasen, wird häufig als Hemmstoff beschrieben, v.a. bei alkalischen / neutralen Invertasen. Wie in Abbildung 2-16 gut zu sehen ist, werden fast alle Enzyme bei hohen Fructosekonzentrationen um 20 – 30 % in ihrer Aktivität gehemmt. Ausnahmen hiervon bilden die C. rubrum-Enzyme, der zellwandgebundene Extrakt aus Arabidopsis und die alkalische /neutrale Invertase, die stärker gehemmt wurden. Die Hem- mung der vakuolären Invertase aus Weizen war weniger ausgeprägt, allerdings schwankten die Messwerte stark.

Abbildung 2-16: Änderung der Enzymaktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von Fructose in verschiedenen Konzentrationen.

In Tabelle 2-9 sind die IC50-Werte aufgelistet, die ermittelt werden konnten. Vor allem bei den heterolog exprimierten C. rubrum-Enzymen schwanken die Werte stark. Dennoch ist deutlich zu erkennen, dass das von Suspensionszellen gewonnene Enzym mit niedrigeren Kon- zentrationen zu hemmen ist. Auch die alkalische / neutrale Invertase wird mit niedrigeren Fructosekonzentrationen stärker gehemmt als die anderen getesteten Enzyme.

70 Ergebnisse

Tabelle 2-9: IC50-Werte in mM Fructose für die getesteten Invertasepräparationen bei entsprechender Saccharosekonzentration. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung.

mM Suc Präparation 0,4 0,7 1 30 50 100 11,4 22,4 28,3 CrCwIN ±2,3 ±4,3 ±3,5 40,5 62,4 122,1 CIN1 ±15,5 ±34,5 ±70,7 29,4 130,9 106,3 CIN1(P/V) ±18,2 ±34,5 ±60,5 30,8 52,0 69,5 LtVIN2 ±4,1 ±15,8 ±15,9

Die folgenden Hemmstoffe wurden nur mit einer geringeren Anzahl an Invertasen vermessen. Bei diesen Stoffen handelt es sich um der Fructose ähnliche Zucker oder einfacherere Stick- stoffverbindungen, die teilweise in der Literatur als Invertaseinhibitoren beschrieben werden. Da die Stoffe meist in hohen Konzentrationen eingesetzt werden mussten bzw. gesundheitsge- fährdend sind oder nur ein geringes Wirkspektrum aufwiesen, wurden sie nicht mit allen Invertasepräparationen getestet. Für die pflanzlichen Enzyme wurden in der Regel nur die extrazelluläre Invertase der C. rubrum-Suspensionszellen und die alkalische / neutrale Invertase aus L. temulentum verwendet. Die Zucker L-Arabinose und D-Xylose wurden als Sucraseinhibitoren beschrieben (Seri et al., 1996). Bei der alkalischen / neutralen Invertase konnte keine Hemmung festgestellt werden (Abb. 2-17). Die extrazelluläre Invertase konnte von Arabinose gut, von Xylose leicht gehemmt werden, allerdings erst bei hohen Konzentrationen.

Abbildung 2-17: Änderung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von L-Arabinose

(A) oder D-Xylose (B) in verschiedenen Konzentrationen. 71 Ergebnisse

Auch Tris und Anilin wurden in der Literatur bereits als Sucrase- bzw. Invertaseinhibitoren beschrieben (Suomalainen et al., 1961; Puls und Keup, 1975; Chen und Black, 1992). Die Tris- Lösung wurde vor Gebrauch auf den benötigten pH-Wert eingestellt, so dass eine mögliche Änderung der Aktivität nicht auf pH-Effekte zurückzuführen ist. Die alkalische / neutrale Invertase wurde von Tris stark gehemmt, nicht jedoch die extrazelluläre Invertase (Abb. 2- 18). Es wurden weitere Messungen mit den beiden anderen C. rubrum-Enzymen durchgeführt; diese bestätigten, dass saure pflanzliche Invertasen nicht durch Tris gehemmt werden, alkalische / neutrale jedoch schon. Durch Anilin wurden beide Enzymaktivitäten stark gehemmt, der Hemmverlauf jedoch unterscheidet sich. Für die alkalische / neutrale Invertase konnte

für Anilin kein IC50-Wert errechnet werden, für die extrazelluläre Invertase sind die Werte für 0,4, 0,7 und 1 mM Saccharose folgende: 15,8 ± 0,9 mM, 14,2 ± 1,2 mM und 19,3 ± 2,3 mM

Anilin. Die IC50-Werte für die alkalische / neutrale Invertase und Tris lauten für 30, 50 und 100 mM Saccharose: 0,40 ± 0,09 mM, 0,66 ± 0,08 mM und 1,38 ± 0,19 mM Tris.

Abbildung 2-18: Änderung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von Tris (A) oder Anilin (B) in verschiedenen Konzentrationen.

Pyridoxin und seine Derivate werden in der Literatur als Invertasehemmstoffe beschrieben (Pressey, 1968a). Bei der Proteinaufreinigung mit Nickelaffinitätssäulen wurde festgestellt, dass Fraktionen mit Elutionspuffer, der Imidazol enthält, eine geringere Aktivität aufwiesen. Aus diesem Grund wurden Hemmtests mit Imidazol durchgeführt um zu klären, ob die Hem- mung auf Imidazol zurückzuführen ist. Erste Voruntersuchungen mit Imidazol, für die der pH- Wert der Lösung noch nicht eingestellt war, führten zu Ergebnissen mit scheinbar hoher Hemmung durch Imidazol. Mit der Anpassung des pH-Wertes konnte die Beeinflussung durch die Veränderung des pH-Wertes ausgeschlossen werden.

Wie in Abbildung 2-19 zu sehen ist, werden beide untersuchten Enzyme durch Pyridoxin und Imidazol gehemmt. Die Hemmung der alkalischen / neutralen Invertase durch Pyridoxin ist nur leicht (max. 30 %), die der extrazellulären Invertase stärker (über 40 %). Messungen mit einer höheren Konzentration an Pyridoxin wurden nicht durchgeführt, da Pyridoxin mit dem Farbstoff ABTS, der in der GOD-POD-Lösung zur Bestimmung der Glucosemenge benutzt wird, interagierte und höhere Konzentrationen das Testsystem störten. Imidazol hemmt beide En- 72 Ergebnisse

zyme zu etwa 50 % bei höheren Konzentrationen. IC50-Werte konnten für keine der beiden Substanzen ermittelt werden.

Abbildung 2-19: Änderung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe von Pyridoxin (A) oder Imidazol (B) in verschiedenen Konzentrationen.

2.3.2.1.2. Beeinflussung durch Kombinationen aus verschiedenen Hemmstoffen Mit dem Rohextrakt aus Arabidopsis und der extrazellulären Invertase aus C. rubrum wurden weitere Versuche durchgeführt um festzustellen, ob durch die gleichzeitige Verwendung von zwei Inhibitoren synergistische Effekte erzielt werden können.

Der Rohextrakt aus Arabidopsis wurde mit 0,1 mM DMDP, 10 mM Acarbose und einer Mischung aus beiden vermessen. Die Hemmung durch DMDP betrug 20 ± 3 % im Durchschnitt, die durch Acarbose 14 ± 6 %. Die gemessene Hemmung beider Substanzen in Kombination war 33 ± 8 %, die rechnerisch summierte liegt bei 34 ± 7 %. Dies entspricht der Summe, zeigt jedoch keinen synergistischen Effekt.

Die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum wurde mit 0,01 mM DMDP, 10 mM Acarbose, 10 mM Anilin und 10 mM Miglitol vermessen. Verschiedene Kombinationen dieser Hemmstoffe wurden getestet. Wie die Daten aus Tabelle 2-10 zeigen, konnte kein synergistischer Effekt beobachtet werden, die Hemmung durch die Kombinationen war sogar niedriger als die rechnerisch ermittelte Hemmung gewesen wäre.

Tabelle 2-10: Prozentuale Abweichung der Aktivität der extrazellulären Invertase durch einzelne Inhibitoren oder Kombinationen aus diesen. Verwendet wurden: 0,01 mM DMDP (D), 10 mM Acarbose (Ac), 10 mM Anilin (An) und 10 mM Miglitol (M). Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung. Die Angabe zur rechnerischen Hemmung ist jeweils die Summe der Hemmungen der beiden Einzelsubstanzen.

Inhibitor(en) D Ac An M D + Ac D + An D + M Ac + M gemessene -43 -48 -38 -39 -65 -59 -66 -54 Hemmung ±4 ±11 ±7 ±9 ±6 ±4 ±2 ±21 rechnerische -91 -81 -82 -87 Hemmung 73 Ergebnisse

2.3.2.2. Beeinflussung durch proteinogene Invertaseinhibitoren Neben chemischen Substanzen wurde auch die Hemmung durch proteinogene Invertaseinhibitoren von verschiedenen Invertasepräparationen untersucht. Dazu wurden Roh- extrakte aus N. bentha-miana-Pflanzen verwendet, in denen durch Agrobakterientransforma- tion heterolog Inhibitorproteine exprimiert wurden. Diese Extrakte wurden mittels Con A- Affinität aufgereinigt, um glykosilierte Proteine aus dem Extrakt zu entfernen. Verwendet wurden ein extrazellulärer und ein vakuolärer Inhibitor aus N. tabacum, zwei Inhibitoren aus Arabidopsis und einer aus der Zuckerrübe. Der Gesamtproteingehalt der Extrakte wurde bestimmt und Hemmtests mit jeweils 4 bzw. 7 µg Gesamtprotein durchgeführt. Durch Invertasetests wurde festgestellt, dass die Extrakte selbst über keine eigene Invertaseaktivität mehr verfügten. Bei den Messungen hat sich gezeigt, dass die Hemmung durch die Extrakte sehr unterschiedlich ausfällt. Bei einigen Invertasepräparationen führte dies dazu, dass bei einem Inhibitionstest einmal sehr hohe Hemmung auftreten konnte, mit einem anderen Inhibitorextrakt jedoch bei einer anderen Messung keine oder nur eine sehr geringe Hemmung auftrat. Dies führte zu teilweise sehr hohen Standardabweichungen.

Die Inhibitoren aus Arabidopsis zeigten in Vorversuchen nur eine geringe Hemmung. Daher wurden sie auch nur mit wenigen Enzymen vermessen. Wie auch in den Vorversuchen war die Hemmung, falls überhaupt vorhanden, schwach (Abb. 2-20). AtC/VIF1 konnte beim zellwandgebundenen Extrakt aus Arabidopsis, bei der heterolog exprimierten extrazellulären Invertase aus C. rubrum und bei der vakuolären Invertase keine Hemmung erzielen. Dasselbe gilt für AtC/VIF2. Die Hemmung des Rohextraktes aus Arabidopsis war durch AtC/VIF2 etwas ausge- prägter, die Hemmung der alkalischen / neutralen Invertase hingegen mit AtC/VIF1. Auch die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum wurde von AtC/VIF1 etwas gehemmt, nicht jedoch von AtC/VIF2.

Eine Hemmung durch proteinogene Inhibitoren aus Tabak und Zuckerrübe konnte bei allen Enzymen außer der heterolog exprimierten extrazellulären Invertase aus C. rubrum beobachtet werden (Abb. 2-21). Die vakuoläre Invertase aus Weizen wurde nur von dem Inhibitor aus Zuckerrübe gehemmt. Ein Vergleich der Inhibitoren miteinander kann nicht durchgeführt werden, da keine Aussage über die Konzentration der einzelnen Inhibitoren in den Extrakten getroffen werden kann. Allgemein war die Hemmung durch die zellwandgebundene Isoform des Tabakinhibitors und dem Inhibitor aus Zuckerrübe stärker als die des vakuolären Tabakinhibi- tors. Für diese beiden Inhibitoren konnte auch eine mengenabhängige Tendenz der Hemmung erkannt werden. Die Messungen mit 7 µg Gesamtprotein des Extraktes mit vakuolärem Tabak- inhibitor führten zu keiner gesteigerten Hemmung im Vergleich zu 4 µg Gesamtprotein.

Die Ergebnisse der Messungen schwanken sehr stark. Dies könnte daran liegen, dass mit verschiedenen Lösungen eines Inhibitors gearbeitet wurde, in denen die Konzentrationen der Inhibitorproteine unterschiedlich hoch waren. Allerdings entsprechen sich einige Messwerte auch dann nicht, wenn die gleiche Inhibitorlösung verwendet und nur die Saccharosemenge variiert wurde. Die Mittelwerte der Messungen mit den Standardabweichungen sind im Anhang unter 6.3. für alle drei Sucrosekonzentrationen aufgelistet. 74 Ergebnisse

Abbildung 2-20: Änderung der Aktivität einiger pflanzlicher Invertasepräparationen durch die Zugabe unterschiedlicher Mengen an Lösung mit proteinogenen Inhibitoren. 1: AtC/VIF1, 2: AtC/VIF2, a: 4 µg Gesamtprotein, b: 7 µg Gesamtprotein

Abbildung 2-21: Änderung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch die Zugabe unterschiedlicher Mengen an Lösung mit proteinogenen Inhibitoren. 1: NtCIF, 2: NtVIF, 3: BvC/VIF, a 4: µg Gesamtprotein, b: 7 µg Gesamtprotein 75 Ergebnisse

2.3.3. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Aktivität der humanen Sucrase Für Hemmtests mit der humanen Sucrase wurde ein Phosphatpuffer pH 7,0 verwendet. Die Reaktionsansätze wurden 10 min ohne Saccharose inkubiert, die Reaktion mit Saccharose für 45 min. Verwendet wurden Saccharosekonzentrationen von 30, 50 und 100 mM, im Ausnahme- fall 10 mM anstatt 100 mM.

2.3.3.1. Beeinflussung durch chemische Invertaseinhibitoren Wie auch bei den pflanzlichen Invertasen wurde eine Vielzahl an Substanzen untersucht, ob und wie stark sie die humane Sucrase hemmen. Es wurden Hemmtestes mit den Einzelsub-

stanzen Acarbose, Miglitol, DMDP, Calystegin B2, Fructose, Arabinose, Xylose, Tris, Anilin, Pyridoxin und Imidazol durchgeführt, darüberhinaus wurde mit verschiedenen Kombinationen dieser Stoffe getestet, ob die Gabe von zwei Stoffen gleichzeitig die Hemmung des Enzymes verstärkt. Zur besseren Übersichtlichkeit wurden Acarbose, Miglitol und DMDP zu einer Abbil- dung zusammengefasst, die übrigen Hemmstoffe in einer zweiten Abbildung.

2.3.3.1.1. Beeinflussung durch Zugabe von Einzelsubstanzen Acarbose hemmt die Aktivität der humanen Sucrase. Dies war zwar zu erwarten, da Acarbose als α-Glucosidasehemmstoff in der Diabetestherapie eingesetzt wird. Jedoch entspricht die verwendete rekombinante Sucrase nicht exakt dem ursprünglichen Enzym, da es nur aus einer Untereinheit der Sucrase-Isomaltase besteht und nicht glykosiliert ist. Acarbose hemmt auch

in kleinen Konzentrationen und bewirkt keine erhöhte Aktivität (Abb. 2-22). Der IC50-Wert liegt ca. bei 12-16 mM Acarbose.

Das Auffallende an der Hemmung mit Miglitol ist, dass diese schon bei einer niedrigen Miglitolkonzentration hoch ist, bei einer Verdreifachung der Miglitolmenge die Hemmung aber

nur um weitere 10 – 20 % zunimmt (Abb. 2-22). Die IC50-Werte liegen daher auch höher, für 10 mM und 30 mM bei 75 mM Miglitol, für 50 mM bei 110 mM Miglitol.

Die Hemmung durch DMDP ist schon bei niedrigen Konzentrationen stark ausgeprägt und

nimmt mit erhöhter Konzentration stark zu (Abb. 2-22). Die IC50-Werte liegen um die 100 µM DMDP. Damit ist DMDP der stärkste getestete Inhibitor der humanen Sucrase.

Calystegin B2 hemmt die humane Sucrase in den untersuchten Konzentrationen nicht (Abb. 2- 23). Calystegine werden v.a. als Hemmstoffe verschiedener Mannosidasen, Trehalasen und Glucosidasen beschrieben, die Untereinheiten der Sucrase-Isomaltase werden dabei nicht gehemmt.

Fructose hemmt die Aktivität ab ca. 50 mM zu 20 %, eine höhere Hemmung wird auch mit

100 mM nicht erreicht. Ähnliches gilt für L-Arabinose, allerdings fällt die Hemmung nicht so

hoch aus. D-Xylose hingegen hemmt die humane Sucrase bis zu 40 %, auch dies kaum verän- dert über die Konzentratiosspanne von 50 – 100 mM (Abb. 2-23). 76 Ergebnisse

Abbildung 2-22: Änderung der Aktivität der humanen Sucrase durch die Zugabe von Acarbose (A), Miglitol (B) und

DMDP (C) in unterschiedlichen Konzentrationen. D zeigt eine Tabelle mit den IC50-Werten von Acarbose, Miglitol und DMDP in Abhängigkeit der verwendeten Saccharosekonzentration mit Standardabweichungen.

Abbildung 2-23: Änderung der Aktivität der humanen Sucrase durch die Zugabe verschiedener Hemmstoffe: A:

Calystegin B2 und Pyridoxin B: Fructose, L-Arabinose, D-Xylose, Tris, Anilin und Imidazol. Gezeigt sind die Werte für 50 mM Suc.

77 Ergebnisse

Tris ist ein guter Hemmstoff des Enzyms (Abb. 2-23). Bei 100 mM beträgt die Hemmung etwa

70 %. Auch niedrigere Konzentrationen hemmen die humane Sucrase deutlich. Die IC50-Werte sind 25,7 ± 15,4 mM für 30 mM Saccharose, 26,4 ± 14,9 mM für 50 mM Saccharose und 27,4 ± 3,0 mM Tris für 100 mM Saccharose.

Auch Anilin beeinflusst das Enzym, die Hemmung nimmt stark mit der Konzentration des Hemmstoffs zu, vor allem beim Sprung von 50 auf 100 mM. Pyridoxin hingegen zeigt nur eine maximale Hemmung von ca. 25 % bei der höchsten untersuchten Konzentration. Die Inhibie- rung durch Imidazol erreicht maximal 30 %, allerdings erst bei einer Konzentration von 100 mM – im Gegensatz zu Pyridoxin mit 5 mM (Abb. 2-23).

2.3.3.1.2. Beeinflussung durch Kombinationen aus verschiedenen Hemmstoffen Die humane Sucrase wurde mit 0,05 mM DMDP, 5 mM Acarbose, 10 mM Miglitol, 20 mM Tris und verschiedenen Kombinationen aus diesen vermessen. Die aus den Aktivitätsmessungen ermittelten Hemmungen sind in Tabelle 2-11 aufgelistet. Die rechnerischen Hemmungen wurden aus den jeweiligen Einzelmessungen errechnet. Diese sind durchgehend höher als die tatsächliche Hemmung. Somit wurde kein synergetischer Effekt festgestellt, im Gegenteil, die Hemmung fiel durchgehend geringer aus als erwartet.

Tabelle 2-11: Prozentuale Abweichung der Aktivität der humanen Sucrase durch einzelne Inhibitoren oder Kombina- tionen aus diesen. Verwendet wurden: 0,05 mM DMDP (D), 5 mM Acarbose (A), 10 mM Miglitol (M) und 20 mM Tris (T). Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung. Die Angabe zur rechnerischen Hemmung ist jeweils die Summe der Hemmungen der beiden Einzelsubstanzen.

Inhibitor(en) D A M T D + A D + M D + T A + M A + T M + T gemessene -29 -20 -15 -28 -35 -33 -43 -21 -30 -26 Hemmung ±4 ±3 ±8 ±5 ±4 ±7 ±4 ±10 ±7 ±7 rechnerische -49 -44 -57 -35 -48 -43 Hemmung

2.3.3.2. Beeinflussung durch proteinogene Invertaseinhibitoren Die Angaben über die Spezifität der proteinogenen Invertaseinhibitoren in der Literatur sind uneinheitlich. Um zu untersuchen, ob neben pflanzlichen β-Fructofuranosidasen auch α- Glucosidasen gehemmt werden, wurden Hemmtests mit der rekombinanten humanen Sucrase durchgeführt. Dazu wurden die Inhibitorlösungen verwendet, die schon bei den pflanzlichen Invertasen beschrieben wurden (Kap. 2.3.2.2.).

Wie in Abbildung 2-24 dargestellt, bewirkt der proteinogene Inhibitor aus der Zuckerrübe eine eindeutige und konzentrationsabhängige Hemmung der humanen Sucrase. Auch NtCIF zeigt eine mengenabhängige Hemmung, allerdings ist diese nicht stark ausgeprägt und weist teilweise eine hohe Standardabweichungen auf. Die Hemmung durch NtVIF ist am geringsten, aber die Messungen mit den pflanzlichen Invertasepräparationen haben schon gezeigt, dass die Hemmung dieser Inhibitorlösung wohl weniger ausgeprägt ist als die der beiden anderen (Kap. 2.3.2.2.). Auffällig ist, dass die Hemmung bei 10 mM Saccharose stets am ausgeprägtes- ten ist.

78 Ergebnisse

Abbildung 2-24: Änderung der Aktivität der humanen Sucrase durch die Zugabe unterschiedlicher Mengen an Lösun- gen mit proteinogenen Inhibitoren. 1: NtCIF, 2: NtVIF, 3: BvC/VIF, a: 4 µg Gesamtprotein, b: 7 µg Gesamtprotein.

2.3.4. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Aktivität der Hefeinvertase Für Hemmtests mit der Hefeinvertase wurde ein Phophat-Citrat-Puffer pH 4,5 verwendet. Der Reaktionsansatz wurde 30 min inkubiert, die verwendeten Saccharosekonzentrationen waren 2, 4 und 7 mM.

2.3.4.1. Beeinflussung durch chemische Invertaseinhibitoren Auch bei diesem Enzym wurden Inhibitortests mit den Substanzen Acarbose, Miglitol, DMDP,

Calystegin B2, Fructose, Arabinose, Xylose, Tris, Anilin, Pyridoxin und Imidazol durchgeführt. Zur besseren Übersichtlichkeit wurden Acarbose, Miglitol und DMDP zu einer Abbildung zusammengefasst, die übrigen Hemmstoffe in einer zweiten Abbildung.

Mit 30 mM Acarbose wird eine Hemmung von bis zu 50 % erreicht (Abb. 2-25). Bei hohen Sac- charose- und niedrigen Acarbosekonzentrationen kommt es zu einer leicht erhöhten Enzymak-

tivität. Die IC50-Werte liegen in einem Bereich von 30 – 60 mM Acarbose.

Durch Miglitol wird die Hefeinvertase deutlich gehemmt. Es kommt auch in niedriger Konzent- ration zu keiner Aktivierung des Enzyms wie dies bei pflanzlichen Invertasen geschehen ist (Kap. 2.3.2.1.1.). Die Hemmung unterscheidet sich kaum bei den verschiedenen

Saccharosekonzentrationen, die IC50-Werte liegen um die 50 mM Miglitol (Abb. 2-25).

DMDP ist der aktivste Hemmstoff der Hefeinvertase. Es wird eine Hemmung bis zu 100 % gemessen, allerdings sind die verwendeten Konzentrationen etwas höher als bei den zuvor ge-

testeten Invertasepräparationen (Abb. 2-25). Daher liegen auch die IC50-Werte höher, zwischen 0,5 und 1,2 mM DMDP.

Calystegin B2 hemmt die Aktivität der Hefeinvertase nicht, im Gegenteil, diese nimmt zu (Abb. 2-26).

79 Ergebnisse

Abbildung 2-25: Änderung der Aktivität der getesteten Hefeinvertase durch die Zugabe von Acarbose (A), Miglitol (B)

und DMDP (C) in unterschiedlichen Konzentrationen. D zeigt eine Tabelle mit den IC50-Werten (mit Standardabwei- chung) von Acarbose, Miglitol und DMDP in Abhängigkeit der verwendeten Saccharosekonzentration.

Abbildung 2-26: Änderung der Aktivität der humanen Sucrase durch die Zugabe verschiedener Hemmstoffe:

A: Calystegin B2 und Pyridoxin, B: Fructose, L-Arabinose, D-Xylose, Tris, Anilin und Imidazol. Gezeigt sind die Werte für 4 mM Suc. 80 Ergebnisse

Calystegin B2 hemmt die Aktivität der Hefeinvertase nicht, im Gegenteil, diese nimmt zu (Abb. 2-26).

Die Hemmkurven von Fructose, L-Arabinose und D-Xylose liegen nahe beieinander. Ab ca. 50 mM wird eine Hemmung von 10 % erreicht, bei 100 mM und 150 mM liegt diese zwischen 20 und 40 %, die Hemmung durch Xylose ist am stärksten (Abb. 2-26).

Die getestete Hefeinvertase wird durch Tris nicht gehemmt. Anilin jedoch hemmt das Enzym

schon ab 5 mM um 40 %. Die errechneten IC50-Werte sind 17,4 ± 11,1 mM für 2 mM Saccharose, 9,2 ± 5,9 mM für 4 mM Saccharose und 6,4 ± 2,7 mM Anilin für 7 mM Saccharose (Abb. 2-26).

Auch Pyridoxin hemmt die Hefeinvertase, in den getesteten Konzentrationen, maximal bis zu 40 %. Imidazol ist jedoch ein eher schlechter Hemmstoff, die maximale Hemmung bei 100 mM beträgt etwa 20 % (Abb. 2-26).

2.3.4.2. Beeinflussung durch proteinogene Invertaseinhibitoren Wie bereits in Kapitel 1.2.1.2. erwähnt, ist das Hemmspektrum der proteinogenen Invertaseinhibtoren in der Literatur nicht geklärt. Daher wurden Hemmtests mit den bereits beschriebenen Inhibitorlösungen durchgeführt.

Wie in Abbildung 2-27 zu sehen, ist keine eindeutige Hemmung der Hefeinvertase durch die verschiedenen Inhibitorproteine erkennbar. Die Standardabweichungen sind sehr hoch, v. a. bei den Messungen mit niedriger Saccharosekonzentration. Beachtet man diese jedoch nicht, kann man sagen, dass mit NtCIF eine mengenabhängige Hemmung von bis zu 70 % zu erkennen ist. Der Inhibitor aus der Zuckerrübe wirkt im Vergleich zu einem Großteil der anderen getesteten Invertasepräparationen schlechter.

Abbildung 2-27: Änderung der Aktivität der Hefeinvertase durch die Zugabe unterschiedlicher Mengen an Lösungen mit proteinogenen Inhibitoren. 1: NtCIF, 2: NtVIF, 3: BvC/VIF, a: 4 µg Gesamtprotein, b: 7 µg Gesamtprotein.

81 Ergebnisse

2.4. Suche nach neuen Invertaseinhibitoren

2.4.1. Literaturrecherche Neben den Messungen zur Beeinflussung verschiedener Invertasepräparationen durch unterschiedliche Faktoren oder Stoffe wurde nach neuen Invertaseinhibitoren gesucht. Dazu wurde zuerst eine ausführliche Literaturrecherche durchgeführt. Diese befasste sich mit Pflanzen, die traditionell in der Diabetestherapie eingesetzt werden und darüberhinaus mit Artikeln zu α-Glucosidasehemmstoffen, die aus Pflanzen gewonnen wurden. Für die Therapie genannte Tiere, Pilze (etwa der Shiitakepilz, Lentinus edodes), Flechten und Muscheln wurden nicht berücksichtigt. Die Literatursuche wurde mittels Pubmed durchgeführt. Konnten dort keine Ergebnisse gefunden werden, wurden andere Suchmaschinen verwendet. Die wissenschaftlichen Namen der Pflanzen wurden über das Germplasm Resources Information Network (GRIN), einer Datenbank des United States Department of Agriculture abgeklärt; allerdings waren nicht alle Pflanzen dort gelistet. Pflanzliche Extrakte als Inhibitoren der β- Fructofuranosidasen werden in der Literatur in Bezug auf proteinogene Inhibitoren beschrieben, nicht auf chemische; daher lag der Schwerpunkt der Recherche auf der Hemmung von α- Glucosidasen.

Literatur zu traditionell in der Diabetestherapie verwendeten Pflanzen findet sich vor allem aus Indien, aber auch aus China, Afrika, Süd- und Mittelamerika. Gerade in den letzten Jahren wurden verstärkt Artikel veröffentlicht. Die Auswertung erfolgte größtenteils anhand der ab- stracts, da zum Einen kein Zugriff auf eine Teil der Artikel möglich war, zum Anderen ein Großteil (v.a. Artikel aus China und Süd- und Mittelamerika) nicht in englisch verfasst war, sondern etwa in chinesisch oder spanisch. Berücksichtigt wurde nur Literatur, die eine Ver- besserung der Blutglucosewerte in den Versuchen feststellte. Studien, die andere diabetesrelevante Parameter untersuchten, aber nicht auf die Blutglucosewerte eingingen, wurden nicht berücksichtigt. Für einen Großteil der Pflanzen wurden neben einer Beeinflus- sung der Blutglucosewerte auch antioxidative Eigenschaften festgestellt, darüberhinaus häufig positive Auswirkungen auf verschiedene Blutfettwerte. Gerade afrikanische Pflanzen wurden jedoch nicht auf ihre Wirkung gegen Diabetes hin untersucht, sondern verstärkt nach Inhalts- stoffen gegen Malaria, Würmer, Infektionen, Durchfall oder Hauterkrankungen (Hostettmann et al., 2000).

In einem ersten Schritt wurden Artikel gesucht, die direkt zu Pflanzen mit α- Glucosidasehemm-stoffen veröffentlicht wurden. Die Suche nach traditionell in der Diabetestherapie verwendeten Pflanzen führte meist zu ethnomedizinischen Artikeln, für die in bestimmten Gebieten oder bei definierten Volksgruppen das Wissen zur verwendeten Volksmedizin erfragt und veröffentlicht wurde. Nach Artikeln zu den dort genannten Pflanzen wurde dann in einem weiteren Schritt gesucht. Für einige Länder, etwa Indien, China oder Mexiko, gab es bereits Veröffentlichungen zu explizit in der Diabetestherapie verwendeter traditioneller Medizin, was die Suche erleichterte. 82 Ergebnisse

Als Grundlage zur Erstellung einer Liste von Pflanzen dienten Untersuchungen zu medizinisch genutzten Pflanzen aus Ägypten (Mansour et al., 2002), Äthiopien (Giday et al., 2007), Brasi- lien (Novaes et al., 2001), China (Jia et al., 2003; Li et al., 2004a; Xi et al., 2008; Hui et al., 2009), Europa (Helmstädter, 2007), Großbritannien (Swanston-Flatt et al., 1989a), Guatemala (Girón et al., 1991), Indien (Grover et al., 2002a; Kar et al., 2003; Modak et al., 2007), Israel (Yaniv et al., 1987), Italien (Guarrera, 2005), Jordanien (Otoom et al., 2006; Aburjai et al., 2007; Al-Qura'n, 2009), Libanon (Loizzo et al., 2008), Malaysia (Ali et al., 2006), Marokko (Ziyyat et al., 1997; Tahraoui et al., 2007), Mauritius (Kotowaroo et al., 2006), Mexiko (Ro- man-Ramos et al., 1992b; Alarcon-Aguilara et al., 1998; Alarcon-Aguilar et al., 2002a), Nige- ria (Gbolade, 2009), Pakistan (Arayne et al., 2007), Peru (Pinto Mda et al., 2009), Senegal (Dieye et al., 2008), Sri Lanka (Karunanayake et al., 1984; Fernando et al., 1990; Abesundara et al., 2004), Südafrika (Thring und Weitz, 2006; van de Venter et al., 2008), Trinidad und Tobago (Lans, 2006), Türkei (Uzun et al., 2004; Kültür, 2007) und Vietnam (Hoa et al., 2009). Darüberhinaus teilweise länderunabhängige Veröffentlichungen zu Wirkuntersuchungen mit mehreren Pflanzen (Swanston-Flatt et al., 1989a, 1990; Roman-Ramos et al., 1991; Roman- Ramos et al., 1992a; Roman-Ramos et al., 1995; Alarcon-Aguilar et al., 1997; Choi et al., 2000; Jelodar et al., 2005; Önal et al., 2005; Jung et al., 2006; Musabayane et al., 2006; Narendhirakannan et al., 2006; Jelodar et al., 2007; Andrade-Cetto et al., 2008a; Bhat et al., 2008; Parmar und Kar, 2008a, b) bzw. Reviews (Yeh et al., 2003; Saxena und Vikram, 2004; Andrade-Cetto und Heinrich, 2005; Srinivasan, 2005; Cefalu et al., 2008; Yin et al., 2008; Nahas und Moher, 2009) und zusätzlich Bücher über traditionell verwendete Pflanzen in Afrika (Kokwaro, 1993; Neuwinger, 1996) und pflanzliche Zubereitungen gegen Diabetes (Pari et al., 2001; Petlevski et al., 2001; Babu und Mainzen Prince, 2004; Riddle, 2004; Mutalik et al., 2005; Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007; Said et al., 2008; Patel et al., 2009). Die Liste mit über 500 Pflanzen, die keinen Anspruch auf Vollständigkeit erhebt, findet sich im Anhang (Kap. 6.6.).

2.4.2. Für Hemmtests verwendete Pflanzenextrakte Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen wurden verschiedene Pflanzenex- trakte hergestellt. Aus getrocknetem Pflanzenmaterial wurden für Vorversuche Extrakte mit 70 % igem Ethanol unter Rückfluss hergestellt, für die Versuche selbst wurde eine sukzessive Extraktion mit verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt. Aus frischem Material wurden wässrige Extrakte hergestellt.

Verwendet wurden Pflanzen, die ohne großen Aufwand im Botanischen Garten Würzburg gesammelt, von Partnern zur Verfügung gestellt oder gekauft werden konnten.

Neben den selbst hergestellten Extrakten wurde auch eine große Anzahl an Extrakten von Pflanzen der Traditionellen Chinesischen Medizin verwendet, die von Prof. Bauer (Karl- Franzens-Universität Graz, Österreich, Uni Graz) und Joanneum Research (Innovations- und Technologieunternehmen Graz, Österreich) zur Verfügung gestellt wurden. 83 Ergebnisse

2.4.2.1. Herstellung von Extrakten mittels sukzessiver Extraktion Für die Herstellung der Pflanzenextrakte mittels sukzessiver Extraktion wurden die verwendeten getrockneten Pflanzen fein vermahlen. Die Extraktion erfolgte mit einem accelerated solvent extraction-System (ASE, Dionex), zuerst mit n-Hexan, dann Dichlormethan, Methanol und Wasser. Die erhaltenen Extrakte wurden zur Trockene eingeengt und für die Versuche in DMSO bzw. Wasser gelöst.

In Tabelle 2-12 sind die verwendeten Pflanzen mit der Ausbeute der einzelnen Extrakte auf- geführt. Genannt ist der lateinische und deutsche Name bzw. die Bezeichnung unter der das Produkt bzw. die Pflanze bekannt ist. Die Unterteilung mit römischen Zahlen bezieht sich auf unterschiedliche Bezugsquellen.

Tabelle 2-12: Aufstellung der verwendeten Pflanzen für die sukzessive Extraktion (lateinischer und deutscher Name) mit Drogenbezeichnung, Abkürzung und prozentualer Ausbeute (g/g) der einzelnen Extrakte.

Bezeichung Ausbeute [%]

lateinisch deutsch Droge Abk. Hexan DCM MeOH H2O Wüstendattel, Balanites aegyptiacus Samen Ba 2,84 0,63 41,75 7,95 Zachunbaum Anattostrauch, Bixa orellana Samen Bo 0,64 10,85 10,28 3,57 Urucum Sameva / Cleome droserifolia Kraut Cd 1,75 4,38 19,64 25,92 Samwa Cucurbita pepo Kürbis Samen Cp 44,30 1,22 4,33 6,42 Euterpe oleracea Kohlpalme, Acai Frucht Eo 0,71 0,30 6,61 2,83 Eleutherococcus Sibirischer Blätter Ese 2,86 1,99 20,87 21,44 senticosus Ginseng Eleutherococcus Siebolds Blätter Esi 1,24 2,14 34,91 23,47 sieboldianus Fingeraralie Ginkgo biloba Ginkgo Blätter Gb 6,10 2,89 26,90 13,83 Japanischer Hovenia dulcis Blätter Hd 0,25 1,43 19,46 5,84 Rosinenbaum Ilex paraguariensis Matestrauch Blätter Ip 0,20 0,26 34,73 32,87 Lupinus termis I Weiße Lupine Samen Lt I 8,33 0,99 8,45 12,41 Lupinus termis II Weiße Lupine Samen Lt II 8,95 0,97 10,41 15,30 Momordica charantia Bittermelone Frucht Mc 0,79 0,68 14,42 30,32 Momordica charantia Bittermelone Frucht Mcg 0,14 0,83 22,33 17,22 gefriergetrocknet Momordica charantia Bittermelone Frucht Mco 0,13 0,61 12,78 42,68 orange / reif Manihot esculenta Maniok Mehl Me 0,08 0,07 0,27 8,82 Antillenkirsche, Malpighia glabra Frucht Mg 0,11 0,12 24,43 20,95 Acerola Nigella sativa I Schwarzkümmel Samen Ns I 35,65 1,17 11,55 10,60 Nigella sativa II Schwarzkümmel Samen Ns II 35,13 1,19 10,85 12,98 Opuntia ficus-indica / Flach- Nopal Op 0,39 0,37 10,72 2,69 streptacantha spross Peumus boldus Boldo Blätter Pb 0,18 0,22 26,72 60,94 Paullinia cupana Guaraná Samen Pc 1,11 0,15 24,04 46,75 84 Ergebnisse

Bezeichung Ausbeute [%]

lateinisch deutsch Droge Abk. Hexan DCM MeOH H2O Punica granatum I Granatapfel Frucht Pg I 5,92 0,43 59,23 15,97 Punica granatum II Granatapfel Frucht Pg II 27,86 0,94 10,61 9,66 Punica granatum III Granatapfel Frucht Pg III 3,57 0,44 79,84 16,21 Wickenblättriger Sophora davidii Blätter Sd 1,21 1,54 28,53 8,15 Schnurbaum Japanischer Sophora japonica Blätter Sj 0,47 1,28 21,79 9,39 Scnurbaum Trigonella foenum- Bockshornklee Samen Tf I 4,00 1,17 14,39 6,62 graecum I Trigonella foenum- Bockshornklee Samen Tf II 4,86 1,08 15,31 4,89 graecum II Taraxacum officinale Löwenzahn Kraut To 3,61 1,26 19,13 23,80 Viscum album Mistel Kraut Va 7,90 2,64 22,62 13,30

2.4.2.2. Herstellung wässriger Extrakte aus Suspensionkulturen und frischem Pflan- zenmaterial Allgemein wurden die wässrigen Extrakte aus frischem Pflanzenmaterial hergestellt. Die Ex- traktion erfolgte mit wässrigen Puffern bei 4 °C. Diese Methode gewährleistet die Funktionali- tät der extrahierten Proteine.

Extrakte aus frischem Pflanzenmaterial wurden aus der Frucht der Bittermelone (Momordia charantia) und den Blättern von Bockshornklee (Trigonella foenum-graecum) gewonnen. Cleome droserifolia konnte unter verschiedenen Anzuchtmehtoden leider nicht in ausreichen- der Menge als Frischpflanze gewonnen werden. Rohextrakte und zellwandgebundene Extrakte wurden nach der bereits in Kap. 2.1.1.4. geschilderten Methode der Extraktgewinnung hergestellt.

Desweiteren wurden neun verschiedene Suspensionskulturen je drei Mal unabhängig voneinander angezogen und mit neun verschiedenen Elicitoren behandelt (Kap. 4.2.4.2.3.). Bei den Suspensionskulturen handelt es sich um Zellen von Arabidopsis thaliana autotroph (At a), Arabidopsis thaliana mixotroph (At m), Chenopodium rubrum autotroph (Cr), Solanum lycopersicon autotroph (Sl a), Solanum lycopersicon heterotroph (Sl h), Petroselinum crispum heterotroph (Pc), Nicotiana tabacum BY2 heterotroph (BY2), Eschscholtzia californica AST heterotroph (AST) und Gypsophila arabica heterotroph (Ga). Elicitoren sind Stoffe, die Ab- wehrmechanismen der Pflanzenzellen auslösen. Als endogene Elicitoren wurden Methyljasmonat, Salicylsäure, Polygalacturonsäure und Acetylsalicylsäure, als exogene Chitosan, E-FOL, A. brassicicola, P. syringae Avr RPM1 und P. syringae DC3000 verwendet. Aus jeder Probe wurden drei verschiedene Fraktionen gewonnen, das Medium, der Rohextrakt und der zellwandgebundene Extrakt. Die Herstellung der Extrakte erfolgte wie unter Kap. 4.2.5.1.2. beschrieben. Für das Screening wurden das Medium und der Rohextrakt verwendet. Bei einigen Extrakten war aufgrund des hohen Glucosegehalts eine Dialyse notwendig, so dass eine mögliche Hemmung durch diese Extrakte nicht durch niedermolekulare Stoffe erfolgen 85 Ergebnisse

kann. Bei erhöhter Invertaseaktivität des Extraktes wurde dieser für 5 min auf 95 °C erhitzt um die Invertase zu inaktivieren.

2.4.2.3. TCM-Extrakte Eine große Anzahl an Extrakten von Pflanzen bzw. Pflanzenteilen, die in der Traditionellen Chinesichen Medizin verwendet werden, wurden im Rahmen verschiedener Doktorarbeiten am Lehrstuhl für Pharmakognosie der Uni Graz hergestellt. Bei den Indikationen, für die die Pflanzen ausgewählt wurden, lag dabei ein Schwerpunkt auf Entzündung und Krebs. Da bei der Literaturrecherche für eine große Anzahl von Pflanzen sowohl zuckersenkende als auch antiinflammatorische Wirkungen (Ojewole, 2004a; Nishiyama et al., 2005; Ojewole, 2005c, a, 2006; Liu et al., 2007; Panchabhai et al., 2008; Xiang et al., 2008) beschrieben wurden bzw. das Testsystem so weit optimiert war, dass eine größere Anzahl an Tests durchgeführt werden konnte, wurden alle zur Verfügung gestellten Extrakte für das Screening eingesetzt.

Dabei handelte es sich um 105 Extrakte vom Lehrstuhl für Pharmakognosie, die von 77 verschiedenen Pflanzen stammten, und um 169 Extrakte von Joanneum Research, die von 74 verschiedenen Pflanzen gewonnen wurden. Die Extrakte aus dem Labor von Prof. Bauer wurden mit Dichlormethan und Methanol extrahiert, die Extrakte von Joanneum Research mit Petrolether, Ethylacetat, Methanol, Hexan oder Wasser.

Eine Übersicht der Pflanzen, Pflanzenteile und Extraktionsmittel mit den zugeordneten internen Bezeichnungen findet sich im Anhang (Kap. 6.2.).

2.4.3. Invertasetests mit verschiedenen Extrakten als potentielle Hemmstoffe Verschiedene Screenings wurden mit der extrazellulären Invertase aus C. rubrum, der humanen Sucrase und der Hefeinvertase durchgeführt. Bei den sukzessiv hergestellten Extrakten und diejenigen von Pflanzen aus der TCM handelt es sich insgesamt um 398 Extrakte, die mit allen drei Invertasen getestet wurden.

2.4.3.1. Ergebnisse der Messungen der extrazelluläreren Invertase aus C. rubrum Zellkulturen Erste Messungen wurden mit den erhaltenen Extrakten der Suspensionskulturen durchgeführt. Jeder unabhängig voneinander durchgeführte Versuch wurde vermessen und anschließend wurden Mittelwerte gebildet. Die Messungen wurden mit einer Saccharosekonzentration von 10 mM durchgeführt; die Saccharose wurde nach 10 min Vorinkubation bei 37 °C zur Reakti- onslösung gegeben. Die Ergebnisse dieser Messungen zeigten keine Hemmung der Aktivität, es wurde häufig eine Steigerung der Aktivität beobachtet.

Die obere Hälfte der Tabelle 2-13 zeigt die Ergebnisse der Messungen mit den Extrakten aus der Mediumsfraktion, entsprechend dem Extrazellularraum. Hier würden sich Inhibitoren der extrazellulären Invertase befinden. Da extrazelluläre Invertasen durch Pathogenbefall i. d. R. aktiver werden (Berger et al., 2004), wäre eine Hemmung durch die unbehandelte Kontrolle am wahrscheinlichsten. Aus den Daten ist jedoch zu sehen, dass mit keinem Extrakt eine nen- 86 Ergebnisse

nenswerte Hemmung erfolgt ist. Die Daten von G. arabica lassen sich durch einen Versuch erklären, in dem eine starke Hemmung aufgetreten ist, die aber evtl. auf eine Verunreinigung der Proben zurückzuführen ist, da diese alle stark schäumten.

In der unteren Hälfte der Tabelle 2-13 sind die Daten für die Rohextrakt-Fraktion aufgelistet. Hier ist kaum eine Beeinflussung der Aktivität zu beobachten. Die Proben von C. rubrum zeigen eine Hemmung der Aktivität, allerdings auch hohe Standardabweichungen von fast den gleichen Werten.

Tabelle 2-13: Prozentuale Abweichung der Aktivität von CrCwIN durch Extrakte aus Suspensionskulturen, Medium und Rohextrakt. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Messungen. Als Zellkulturen wurden verwendet: A. thaliana autotroph (At a), mixitroph (At m), C. rubrum autotroph (Cr), S. lycopersicon autotroph (Sl a), heterotroph (Sl h), P. crispum heterotroph (Pc), N. tabacum BY2 heterotroph (BY2), E. californica AST heterotroph (AST) und G. arabica heterotroph (Ga). Bei Bedarf wurden die Extrakte für 5 min auf 95 °C erhitzt (e) bzw. dialysiert (d). Die Spalten geben die verschieden elicitierten Proben an: 1 Chitosan, 2 E-FOL, 3 A. brassicicola, 4 P. syringae Avr RPM1, 5 P. syringae DC3000, 6 Methyljasmonat, 7 Salicylsäure, 8 Polygalacturonsäure, 9 Acetylsalicylsäure, 10 unbehandelte Kontrolle

Medium 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 14 ± -3 ± 18 ± -2 ± -4 ± At a 5 ± 23 5 ± 20 -5 ± 9 -1 ± 8 8 ± 14 23 15 34 18 22 16 ± 16 ± 22 ± 27 ± -42 12 ± 25 ± At m 16 ± 7 13 ± 3 -1 ± 7 10 12 12 20 ± 97 13 17 -22 -16 ± -18 -14 ± -7 ± -11 -15 ± -11 ± Cr -6 ± 4 -8 ± 5 ± 30 5 ± 13 2 10 ± 10 9 4 -4 ± -6 ± -15 18 ± 13 ± 14 ± -1 ± 11 ± Sl a 5 ± 15 9 ± 24 15 22 ± 42 25 18 19 12 13 -1 ± -6 ± -19 ± -9 ± -14 ± -13 -19 -16 ± Sl h / d -8 ± 7 -9 ± 8 12 16 6 13 9 ± 10 ± 10 7 10 ± 10 ± -11 19 ± 13 ± 16 ± 12 ± 11 ± 18 ± Pc 9 ± 14 11 15 ± 38 15 14 14 14 14 14 32 ± 62 ± 54 ± 37 ± 24 ± 33 ± 51 ± BY2 / e 21 ± 7 16 ± 7 24 ± 9 15 28 18 17 23 10 28 -13 14 ± -8 ± 19 ± 12 ± AST / d 8 ± 6 16 ± 7 23 ± 7 9 ± 15 9 ± 16 ± 27 25 31 21 24 -33 -27 -36 -30 -26 -46 -37 -39 -35 -30 Ga / d ± 55 ± 48 ± 51 ± 59 ± 58 ± 43 ± 49 ± 48 ± 50 ± 55 Rohextrakt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -4 ± -1 ± -2 ± -1 ± At a 5 ± 4 4 ± 8 4 ± 5 0 ± 7 6 ± 14 3 ± 15 30 13 10 24 -9 ± -4 ± -5 ± -20 -13 ± At m 3 ± 4 4 ± 25 -2 ± 9 2 ± 8 2 ± 20 11 19 28 ± 15 9 -21 -31 -18 -20 -10 ± -22 ± -25 -26 -31 -25 Cr ± 20 ± 20 ± 19 ± 19 8 6 ± 14 ± 13 ± 26 ± 23 -2 ± -7 ± -12 -1 ± -8 ± -15 -6 ± Sl a -1 ± 7 0 ± 20 3 ± 13 18 14 ± 12 15 13 ± 5 11 -1 ± Sl h / d -1 ± 3 -7 ± 3 -8 ± 6 -2 ± 9 5 ± 16 1 ± 9 3 ± 6 -5 ± 7 -3 ± 6 11 11 ± Pc / d 2 ± 8 2 ± 7 0 ± 2 9 ± 9 16 ± 5 18 ± 7 8 ± 9 8 ± 8 13 ± 6 10 -18 -13 ± BY2 14 ± 6 2 ± 3 -2 ± 4 8 ± 2 -8 ± 5 -1 ± 7 -3 ± 8 4 ± 11 ± 36 6 -21 ± -16 ± -17 ± -15 ± -13 -22 ± -25 ± -28 ± -20 ± AST / d -9 ± 7 9 6 5 7 ± 11 9 9 7 5 -10 ± -9 ± -5 ± -12 -13 -13 -13 ± Ga / d -5 ± 2 -9 ± 7 -6 ± 8 9 11 10 ± 13 ± 11 ± 10 7 87 Ergebnisse

Mit wässrigen Extrakten aus den Früchten der Bittermelone und aus Blättern des Bockshorn- klees wurden Hemmtests mit der extrazellulären Invertase aus C. rubrum durchgeführt. Da die Extrakte selbst eine Invertaseaktivität aufwiesen, wurden diese 5 min lang auf 95 °C erhitzt, um die Invertasen zu deaktivieren. Ein Teil der Extrakte wurde dann dialysiert, um zu sehen, ob ein Unterschied zwischen dialysiertem und nicht-dialysiertem Extrakt zu erkennen ist. Abbildung 2-28 zeigt die Ergebnisse der Messungen. Im Rohextrakt von Momordica charantia war noch eine große Menge Glucose enthalten, die das Ergebnis positiv verfälschte, was durch die Dialyse korrigiert wurde.

Abbildung 2-28: Aktivitätsänderung der extrazellulären Invertase aus C. rubrum durch verschiedene wässrige Extrak- te. Mc: Momordica charantia, CrEx: Rohextrakt, CrEx d: dialysierter Rohextrakt, CwEx: zellwandgebundener Extrakt, Tf: Trigonella foenum-graecum

Wiederholte Messungen mit den Extrakten, nachdem diese für längere Zeit bei -20 °C gelagert wurden, konnten die Ergebnisse nicht reproduzieren. Daher wurden auch keine Messungen mit anderen Invertasen durchgeführt. Es wird vermutet, dass die aktiven Komponenten nicht la- gerfähig sind. Eine Wiederholung der Tests mit frischen Extrakten ist notwendig, wurde aber im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt.

Die sukzessiv hergestellten Extrakte und die TCM-Extrakte wurden mit einer Endkonzentration von 20 µg / mL für das Screening eingesetzt. Insgesamt wurden 398 Extrakte getestet, die von 173 verschiedenen Pflanzen bzw. Pflanzenteilen gewonnen wurden. Die komplette Aufstellung der Ergebnisse ist in Kapitel 6.4. zu sehen.

Ein erster Durchgang der Messungen wurde mit 10 min Vorinkubation durchgeführt, ein zweiter ohne. Da keine entscheidenden Unterschiede festgestellt werden konnten, wurde ohne Vorinkubation weitergearbeitet. Nach drei Durchgängen wurden die Extrakte ausgewählt, die eine Hemmung von mind. 20 % zeigten bzw. Extrakte, die mit Vorinkubation eine hohe Hem- mung aufwiesen. Diese wurden erneut vermessen und die besten fünf Extrakte bestimmt (Abb. 2-29). 88 Ergebnisse

Dabei handelt es sich um einen Methanolextrakt von Stängeln von Spatholobus suberrectus, einen Ethylacetatextrakt der Samenschale von Bischofia javanica, einen Methanolextrakt der Rinde von Cinnamomum cassia, einen Methanolextrakt von Blättern und Ästen von Pistacia weinmannifolia und einen Dichlormethanextrakt des Krautes von Verbena officinalis. Neben der Änderung der Aktivität der Invertase wurde auch bestimmt, ob der Extrakt die Reaktion des GOD-POD-Reagenz verändert. Angegeben ist die prozentuale Änderung der Messung einer definierten Glucosemenge. Der Großteil der Extrakte beeinflusst auch die Enzyme in der Rea- genzlösung, jedoch ist die Hemmung der Invertase größer als die Beeinflussung der Methode. Die Messungen wurden von Christian Lang durchgeführt.

Abbildung 2-29: Aktivitätsänderung der extrazellulären Invertase aus C. rubrum durch verschiedene Extrakte. A: Vorauswahl an Extrakten, Angabe der Aktivtätsänderung und der durch den Extrakt veränderten gemessenen Glucosemenge (mit Standardabweichungen) und der internen Bezeichung der Extrakte (siehe Kapitel 6.2.), B: Aus- wahl der fünf besten Extrakte, C: Übersicht über die fünf besten Extrakte: Pflanze, Pflanzenteil und Extraktionsmit- tel.

Die Hemmung durch die fünf besten Extrakte sollte mit einer zweiten Methode überprüft werden. Dazu wurde wie bei den Messungen zur Untersuchung der Einflüsse von Quecksilber und Silber mit radioaktiv markierter Saccharose gearbeitet (Kap. 2.2.1.). In Abbildung 2-30 sind Ergebnisse dieses Tests zu sehen. Glucose und Fructose laufen weiter als Saccharose. Je 89 Ergebnisse

kleiner und schwächer der untere Spot ausfällt, desto mehr Saccharose wurde durch das En- zym gespalten. Die Intensität der Spots kann ausgewertet werden. So lässt sich berechnen, dass der Saccharosespot durch die zugefügten Extrakte größer geworden ist, was einer Hem- mung entspricht. Dies lässt sich nicht exakt mit der mit dem GOD-POD-Reagenz erlangten Hemmung vergleichen, allerdings zeigen beide Testsysteme eine Hemmung des Enzyms an. In Tabelle 2-14 sind die Ergebnisse gegenübergestellt. Zum Einen die Zunahme der Intensität des Saccharosespots, zum Anderen die Differenz aus der Hemmung der Enzymaktivität und der Beeinflussung der Glucosebestimmung durch den Extrakt.

Abbildung 2-30: Beeinflussung der Aktivität der extrazellulären Invertase aus C. rubrum durch die Zugabe verschiedener Extrakte. Diese wurden in einer Endkonzentration von 20 µg / mL verwendet. S: Saccharosekontrolle ohne Enzym, CrCwEx: extrazelluläre Invertase von Suspensionszellkulturen, 1 Spatholobus suberrectus, 2 Bischofia javanica, 3 Cinnamomum cassia, 4 Pistacia weinmannifolia, 5 Verbena officinalis (mit 10 min Vorinkubation). Die Invertasetests wurden mit radioaktiv markierter Saccharose durchgeführt, je 1 µL der Reaktionsansätze wurde auf eine DC-Platte aufgetragen und entwickelt. Zu sehen ist das radioaktiv markierte Signal der Zucker.

Tabelle 2-14: Ergebnisse mit den beiden verwendeten Testsysteme zur Beeinflussung der Invertaseaktivität durch die fünf besten Extrakte. In der ersten Zeile ist die Zunahme der Intensität des Saccharosespots in Prozent angegeben, in der zweiten Zeile die Differenz aus der Hemmung der Invertaseaktivität und der prozentualen Abweichung der Mes- sung einer definierten Glucosemenge in Anwesenheit des Extraktes.

Spatholobus Bischofia Cinnamomum Pistacia Verbena

suberrectus javanica cassia weinmannifolia officinalis Intensität des + 23 % + 17 % + 43 % + 37 % + 86 % Saccharosespots „Aktivität – -30 % -26 % -31 % -30 % - 22 % Glucose“

2.4.3.2. Ergebnisse der Messungen der humanen Sucrase Die Ergebnisse der Messungen mit den Extrakten aus Suspensionskulturen zeigten keine klare Hemmung, weder der extrazellulären Invertase (Kap. 2.4.3.1.) noch der Hefeinvertase (Kap. 2.4.3.3.). Daher wurde darauf verzichtet, diese Extrakte mit der humanen Sucrase zu vermessen. 90 Ergebnisse

Die sukzessiv selbsthergestellte Extrakte und die zur Verfügung gestellten TCM-Extrakte wurden darauf getestet, ob sie die Aktivität der humanen Sucrase beeinflussen. Die Messungen wurden mit 50 mM Saccharose und ohne Vorinkubation durchgeführt. Nach drei Durchgängen wurden die Extrakte bestimmt, die eine Reduzierung der Aktivität um mindestens 20 % be- wirkten. Die Ergebnisse dieser Messungen finden sich im Anhang (Kap. 6.4.). Die besten Ex- trakte sind in Abbildung 2-31 zu sehen. Aus diesen wurden wiederum die besten fünf bestimmt und erneut vermessen. Die Hemmung als Differenz zwischen Abweichung der Aktivität und der Glucosemenge ist in Klammern angegeben. Dabei handelt es sich um einen Methanolextrakt der Stängel von Sargentadoxa cuenata (-31 %), einen Methanolextrakt der Blüten von Sophora japonica (-36 %), einen Methanolextrakt der Stängel von Spatholobus suberrectus (-43 %), einen Methanolextrakt der Rinde von Cinnamomum cassia (- 39 %) und einen Methanolextrakt der Blätter und Äste von Pistacia weinmannifolia (-38 %). Die Messun- gen wurden größtenteils von Christian Lang durchgeführt.

Abbildung 2-31: Aktivitätsänderung der humanen Sucrase durch verschiedene Extrakte. A: Vorauswahl an Extrakten, Angaben der Aktivtätsänderung und der durch den Extrakt veränderten gemessenen Glucosemenge (mit Standardab- weichungen) und der internen Bezeichung der Extrakte (siehe Kapitel 6.2.), B: Auswahl der fünf besten Extrakte, C: Übersicht über die fünf besten Extrakte: Pflanze, Pflanzenteil und Extraktionsmittel. 91 Ergebnisse

2.4.3.3. Ergebnisse der Messungen der Hefeinvertase Wie mit der extrazellulären Invertase aus C. rubrum wurden die Extrakte aus den Suspensi- onskulturversuchen auch mit der Hefeinvertase vermessen. Die Messungen fanden ebenfalls mit 10 mM Saccharose und einer Vorinkubation von 10 min bei 37 °C statt. Auch hier schwanken die gemessenen Werte sehr stark, eine Hemmung ist eher nicht zu beobachten.

Tabelle 2-15: Prozentuale Abweichung der Aktivität der Hefeinvertase durch Extrakte aus Suspensionskulturen, Medium und Rohextrakt. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Messungen. Als Zellkulturen wurden verwendet: A. thaliana autotroph (At a), mixitroph (At m), C. rubrum autotroph (Cr), S. lycopersicon autotroph (Sl a), heterotroph (Sl h), P. crispum heterotroph (Pc), N. tabacum BY2 heterotroph (BY2), E. californica AST heterotroph (AST) und G. arabica heterotroph (Ga). Bei Bedarf wurden die Extrakte für 5 min auf 95 °C erhitzt (e) bzw. dialysiert (d). Die Spalten geben die verschieden elicitierten Proben an: 1 Chitosan, 2 E-FOL, 3 A. brassicicola, 4 P. syringae Avr RPM1, 5 P. syringae DC3000, 6 Methyljasmonat, 7 Salicylsäure, 8 Polygalacturonsäure, 9 Acetylsalicylsäure, 10 unbehandelte Kontrolle

Medium 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -8 ± -20 -7 ± At a -5 ± 6 5 ± 15 0 ± 5 -8 ± 4 -2 ± 9 -3 ± 5 8 ± 11 17 ± 42 14 17 ± 21 ± 14 ± 14 ± 26 ± At m 6 ± 25 3 ± 33 2 ± 33 0 ± 34 9 ± 10 30 29 27 20 39 -23 -27 -32 -27 -20 -25 -26 -28 -33 -18 Cr ± 24 ± 11 ± 22 ± 19 ± 21 ± 20 ± 22 ± 20 ± 21 ± 18 -13 -10 ± -6 ± -4 ± -1 ± -6 ± -12 ± -19 -2 ± Sl a -5 ± 7 ± 16 8 12 13 17 11 8 ± 19 22 Sl h / d -2 ± 1 -8 ± 3 -8 ± 5 -4 ± 3 0 ± 3 -4 ± 2 -4 ± 3 -6 ± 1 -3 ± 1 2 ± 5 -12 ± -9 ± -6 ± -13 -17 -27 ± -12 ± Pc -3 ± 1 -7 ± 5 -3 ± 5 4 22 26 ± 24 ± 22 6 5 -21 -22 -18 -4 ± -16 -11 -13 ± -31 BY2 / e -3 ± 9 -2 ± 8 ± 11 ± 16 ± 29 12 ± 22 ± 5 7 ± 46 -15 -11 -12 -3 ± AST / d -7 ± 9 2 ± 5 4 ± 4 -5 ± 8 -4 ± 6 -8 ± 9 ± 18 ± 13 ± 20 10 -31 -21 -36 -36 -34 -45 -39 -42 -42 -33 Ga / d ± 56 ± 24 ± 50 ± 52 ± 52 ± 45 ± 39 ± 42 ± 37 ± 42 Rohextrakt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ± 13 ± 10 ± 13 ± At a 0 ± 12 5 ± 14 6 ± 16 9 ± 16 7 ± 15 5 ± 21 19 20 24 18 -18 -3 ± -12 -1 ± At m 0 ± 24 -6 ± 9 0 ± 26 3 ± 34 2 ± 31 4 ± 13 ± 41 33 ± 39 38 -18 -19 -12 -40 -13 -13 -11 -12 -19 -15 Cr ± 23 ± 22 ± 24 ± 42 ± 23 ± 25 ± 26 ± 21 ± 25 ± 30 -2 ± 29 ± 29 ± 34 ± 45 ± 40 ± 41 ± 53 ± Sl a -6 ± 5 -8 ± 3 11 38 52 58 69 67 57 66 -5 ± -8 ± -11 ± -10 ± Sl h / d -4 ± 3 -8 ± 8 -7 ± 8 -9 ± 7 -6 ± 6 -3 ± 4 13 12 8 7 -10 ± -7 ± Pc / d -1 ± 3 -4 ± 5 -3 ± 5 -6 ± 9 -5 ± 2 -7 ± 7 -4 ± 4 3 ± 4 8 12 -3 ± -1 ± -17 ± -9 ± -5 ± -9 ± 10 ± BY2 -3 ± 3 -6 ± 6 1 ± 17 11 13 9 25 28 23 26 -10 -12 ± -14 ± -16 ± -16 -18 -12 -6 ± AST / d -1 ± 2 -4 ± 7 ± 12 6 4 8 ± 12 ± 12 ± 12 15 -11 ± -8 ± -4 ± Ga / d 1 ± 4 -1 ± 1 0 ± 6 4 ± 12 5 ± 12 -1 ± 5 -9 ± 4 4 14 12

92 Ergebnisse

Die obere Hälfte der Tabelle 2-15 zeigt die Aktivitätsabweichung durch Zugabe der Medium- Extrakte, die untere Hälfte die Abweichung durch Zugabe der Rohextrakte. Bei den Werten, die auf eine Hemmung hindeuten, ist die Standardabweichung meist jedoch mindestens so groß wie die Hemmung selbst. Durch die Zugabe einiger Extrakte konnte eine gesteigerte Aktivität gemessen werden.

Das Screening der selbsthergestellten Extrakte und der TCM-Extrakte wurde auch mit der Hefeinvertase durchgeführt. Allerdings konnten weit weniger Extrakte als bei den beiden anderen Invertasen das Enzym hemmen. Daher wurden einige der Extrakte zusätzlich mit einer Endkonzentration von 0,2 mg / mL vermessen, was einer 10fach stärkeren Konzentrati- on entspricht. In dieser Konzentration beeinflusste jedoch ein Großteil der Extrakte das GOD- POD-Reagenz sehr stark, was daran zu erkennen ist, dass auch die Abweichung bei der Mes- sung des Glucosewertes sehr groß war. Die Messungen wurden meist in einfacher Ausführung durchgeführt, die Ergebnisse sind im Anhang (Kap. 6.4.) zu sehen. Die Messungen wurden größtenteils von Christian Lang durchgeführt.

Abbildung 2-32: Aktivitätsänderung der Hefeinvertase durch verschiedene Extrakte. Angaben der Aktivtätsänderung und der durch den Extrakt veränderten gemessenen Glucosemenge (mit Standardabweichungen). Angegeben sind die internen Bezeichnungen der Extrakte und die verwendete Verdünnung (1:100: 0,02 mg / mL; 1:10: 0,2 mg / mL).

In Abbildung 2-32 ist eine Auswahl von Extrakten zu sehen, die eine verringerte Aktivität der Hefeinvertase zur Folge hatten. Diese ist jedoch in der Mehrheit der Fälle auf eine Beeinflus- sung des GOD-POD-Reagenz zurückzuführen (Abweichung bei der Messung der definierten Glucosemenge), so dass man bei nur drei Extrakten wirklich von einer Hemmung sprechen kann (Messung der definierten Glucosemenge weniger stark beeinflusst). Dabei handelt es sich um einen Hexan- und einen Methanolextrakt aus Blättern von Hovenia dulcis und um einen Methanolextrakt aus Blättern von Sophora davidii. Die Hemmung der Aktivität ohne Berück- sichtigung der Abweichung der Glucosewerte durch den jeweiligen Extrakt liegt bei ca. 20 %, bei dem Extrakt von Sophora davidii kann keine Aussage dazu getroffen werden, da die Werte 93 Ergebnisse

des Glucosevergleiches sehr stark ins Positive abweichen, also viel mehr Glucose gemessen wurde als tatsächlich verhanden war.

2.4.3.4. Übersicht der Extrakte, die eine Hemmung herbeiführten Wie in Tabelle 2-16 zu sehen ist, führte eine Vielzahl an Extrakten zu Hemmungen über 20 %. Einige konnten mehrere Invertasen hemmen, etwa Extrakte von Buddleja officinalis, Sophora japonica, Spatholobus suberrectus, Arctium lappa, Bischofia javanica, Cinnamomum cassia, Pistacia weinmannifolia, Rheum officinale oder Paullinia cupana. Leider war es nicht mög- lich, die Identität der Pflanzen, die mit „vorläufige Speziesnummer 904 und 905“ bezeichnet wurden, in Erfahrung zu bringen.

Tabelle 2-16: Aufstellung der Extrakte, die zu einer Hemmung von mindestens 20 % einer der Invertasen geführt haben. Aufgeführt sind der Pflanzenname, die interne Bezeichung und die Änderung der Aktivität bzw. des gemessenen Glucosewertes in Prozent für die jeweilige Invertase. VI: Hemmtests wurden mit Vorinkubation durchgeführt. 0,2 mg/mL: Extrakte wurden 10fach konzentrierter eingesetzt als bei anderen Hemmtests. Die je fünf best hemmenden Extrakte von CrCwIN und hS und die drei hemmenden Extrakte von HI sind fett hervorbgehoben. interne Pflanzenname CrCwIN hS HI Änderung [%] Akt. / Glc Bez: Artemisia scoparia B14 X CrCwIN -22 ± 8 / -9 ± 4 Benincasa species B20 X hS -23 ± 59 / -9 ± 13 Buddleja officinalis B22 X X CrCwIN -23 ± 8 / -10 ± 3 hS -30 ± 10 / -10 ± 2

Forsythia suspensa B38 X X CrCwIN -32 ± 14 / -15 ± 2 hS -32 ± 9 / -14 ± 4

Ligusticum chuanxiong B47 X CrCwIN -17 ± 13 / -8 ± 6 Paeonia rubra B60 X X CrCwIN -30 ± 8 / -15 ± 4 hS -35 ± 8 / -7 ± 13

Salvia miltiorrhiza B71 X hS -25 ± 19 / -7 ± 4 Santalum album B72 X hS -25 ± 39 / -3 ± 4 Sargentodoxa cuenata B75 X hS -46 ± 20 / -15 ± 7 Scutellaria baicalensis B78 X X CrCwIN -18 ± 21 / -16 ± 8 (VI) hS -21 ± 14 / -16 ± 4

Scutellaria baicalensis B79 X CrCwIN -24 ± 11 / -12 ± 6 Sophora japonica B81 X X CrCwIN -34 ± 9 / -17 ± 4 hS -49 ± 13 / -14 ± 3

Spatholobus suberrectus B82 X X X CrCwIN -56 ± 11 / -27 ± 7 hS -59 ± 18 / -16 ± 9

HI -32 ± 16 / -24 ± 19

Terminalia immaturus B85 X hS -20 ± 5 / -8 ± 4 Verbena officinalis B93 X CrCwIN -27 ± 15 / -5 ± 5 (VI) Zingiberis officinale B102 X X CrCwIN -26 ± 16 / -18 ± 8 (VI) hS -62 ± 26 / -17 ± 6

Zingiber officinale B103 X hS -25 ± 24 / -13 ± 7 94 Ergebnisse

Arctium lappa J8 X X CrCwIN -36 ± 15 / -12 ± 9 hS -39 ± 7 / -16 ± 3

Bischofia javanica Blume J18 X X CrCwIN -37 ± 16 / -11 ± 7 hS -43 ± 3 / -10 ± 3

Caesalpinia sappan J26 X X CrCwIN -20 ± 10 / -4 ± 10 hS -21 ± 6 / -10 ± 2

Cinchona succirubra J35 X hS -31 ± 8 / -10 ± 3 Cinnamomum cassia J37 X X CrCwIN -50 ± 12 / -19 ± 6 hS -53 ± 20 / -14 ± 11

Curcuma longa J58 X hS -21 ± 5 / -16 ± 2 Paraboea rufescens J108 X X CrCwIN -21 ± 10 / -3 ± 10 hS -25 ± 2 / -10 ± 7

Pistacia weinmannifolia J117 X X CrCwIN -47 ± 16 / -18 ± 8 hS -52 ± 16 / -14 ± 8

Polygonum multiflorum J121 X hS -35 ± 6 / -12 ± 3 Pristimera cambodiana J125 X hS -26 ± 4 / -15 ± 4 Prunella vulgaris J127 X hS -20 ± 2 / -10 ± 3 Quisqualis indica J131 X X CrCwIN -18 ± 12 / -6 ± 5 hS -30 ± 5 / -6 ± 4

Rheum officinale J133 X X CrCwIN -30 ± 14 / -15 ± 8 hS -39 ± 10 / -12 ± 7

Vorläufige Spezies- J146 X hS -37 ± 62 / -6 ± 3 nummer 904 Vorläufige Spezies- J148 X hS -31 ± 5 / -12 ± 3 nummer 905 Eleutherococcus E18 X HI -33 ± 6 / -26 ± 4 (0,2 mg/mL) senticosus Hovenia dulcis E25 X HI -21 ± 11 / -1 ± 8 (0,2 mg/mL) Hovenia dulcis E27 X HI -26 ± 10 / -9 ± 11 (0,2 mg/mL) Ilex paraguariensis E30 X X X CrCwIN -33 ± 19 / -11 ± 10 hS -40 ± 6 / 59 ± 10

HI -83 ± 11 / -83 ± 7 (0,2 mg/mL)

Ilex paraguariensis R10 X CrCwIN -22 ± 16 / -12 ± 7 Viscum album E37 X CrCwIN -16 ± 23 / -4 ± 6 (VI) Paullinia cupana R22 X X CrCwIN -22 ± 17 / -11 ± 6 hS -34 ± 7 / -9 ± 4

Paullinia cupana E68 X X X CrCwIN -28 ± 14 / -15 ± 8 hS -40 ± 10 / -12 ± 4

HI -79 ± 15 / -82 ± 5 (0,2 mg/mL)

Punica granatum E78 X HI -25 ± 15 / 65 ± 15 (0,2 mg/mL) Tarxacum officinale R28 X hS -23 ± 8 / -5 ± 6

95 Diskussion

3. Diskussion Im Folgenden werden zuerst Ergebnisse zur Aktivität der Invertasen diskutiert, anschließend diejenigen zur Aktivität der Inhibitoren und zuletzt Ergebnisse zur Literaturrecherche und zum Screening. In der Diskussion werden Schwerpunkte auf einzelne Ergebnisse gelegt. Zum Einen die erfolgreich durchgeführte heterologe Expression der humanen Sucrase, die Besonderheit der getesteten alkalischen / neutralen Invertase und die Unterschiede zwischen den sich nur durch eine Aminosäure unterscheidenden heterolog exprimierten Enzymen CIN1 und CIN1 (P/V). Zum Anderen werden die Besonderheiten bei den getesteten Invertaseinhibitoren hervorgehoben: das breite Hemmspektrum der proteinogenen Inhibitoren, die Hemmung pflanzlicher Invertasen durch Acarbose, ebenso die erfolgreiche oder nicht-erfolgreiche Hemmung durch Stickstoff- oder Zuckerverbindungen. Darauf folgt die Diskussion zu Ergebnissen des Screenings nach neuen Invertaseinhibitoren – mit einem Schwerpunkt auf dem Vergleich mit der Literatur zur humanen Sucrase. Den Ab- schluss bildet die Diskussion zu Pflanzen als Bestandteil der Diabetestherapie, hier wiederum mit dem Schwerpunkt der Glucosidasehemmstoffe. Der Ausblick zeigt das weite Spektrum für tiefergehende bzw. angrenzende Felder in der For- schung mit Invertasen und deren Inhibitoren oder deren Anwendungen.

3.1. Heterologe Expression der humanen Sucrase in P. pastoris Das System P. pastoris wurde bereits für die heterologe Expression einer Vielzahl von pflanzlichen Enyzmen verwendet (Hochstrasser et al., 1998; Huang et al., 2003; Chalmers et al., 2005; Yamada et al., 2007; Canam et al., 2008). Daher wurde es auch für die Expression der humanen Sucrase und weiterer pflanzlicher Proteine ausgewählt. Für die verschiedenen Pro- teine wurde jeweils eine Vielzahl an Konstrukten hergestellt, um funktionierende und leicht aufzureinigende Produkte zu erhalten.

In vielen Arbeiten, die in der Literatur zur humanen Sucrase-Isomaltase zu finden sind, erkun- den die Autoren den Sekretionsprozess tierischer Zellen; das Enzym dient als Beispielprotein für ein sekretiertes Protein (Moolenaar et al., 1997; Ritz, 2002; Delacour et al., 2006; Alfalah et al., 2009). Somit finden sich kaum Arbeiten, deren Autoren die humane Sucrase-Isomaltase selbst erforschen. Die veröffentlichten Artikel sind meist einige Jahrzehnte alt (Cummins et al., 1968; Rosenzweig und Herman, 1968; Asp und Dahlqvist, 1973; Braun et al., 1975; Conklin et al., 1975; Puls und Keup, 1975; Zagalak und Curtius, 1975; Semenza et al., 1983; Semenza et al., 1984; Naim et al., 1988). Eine heterologe Expression der separaten aktiven Unterein- heiten der humanen Sucrase-Isomaltase in Hefezellen wurde noch nicht veröffentlicht.

Für die Maltase-Glucoamylase, die strukturell der humanen Sucrase sehr ähnlich ist, wurde in der Literatur eine Expression der separaten Untereinheiten in E. coli beschrieben (Nichols et al., 1998). Ziel dieser Klonierung war es allerdings nicht, aktive Proteine zu exprimieren. Bei Untersuchungen zur Faltung und Sekretion der Sucrase-Isomaltase als Protein aus einer Polypeptidkette, wurden die isolierte Sucrase- und die isolierte Isomaltaseuntereinheit tran- 96 Diskussion

sient in einer Zelllinie gebildet. Dabei wurde gezeigt, dass die Sucraseuntereinheit sich eigen- ständig falten kann und nach der Sekretion aktiv ist (Jacob et al., 2002).

Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit einem der hergestellten Konstrukte, pPhS, aktive P. pastoris-Klone erhalten werden. Die Bildung der aktiven Untereinheit der humanen Sucrase war durch Methanolzugabe ins Medium dieser Klone induzierbar. Die in Versuchen gemessene Substratspezifität einer α-Glucosidase (Spaltung von Sucrose und Maltose, nicht jedoch von Raffinose) stimmte mit den Literaturangaben überein (Zagalak und Curtius, 1975). Auch die Michaeliskonstante von etwa 20 mM Sucrose (Bestimmung nach Linewaever-Burk) entsprach den Literaturangaben zur Sucrase aus dem menschlichen Dünndarm (Conklin et al., 1975).

Die Arbeit mit der Hefe P. pastoris gestaltete sich insgesamt schwierig. Häufig war unklar, ob verwendete Methoden nicht funktionierten, da die Arbeit mit P. pastoris neu in die Arbeits- gruppe eingeführt wurde, oder es ein Problem mit dem Konstrukt bzw. Klon gab bzw. dieser negativ war. Die in der Literatur vorhandenen Protokolle für S. cerevisiae lassen sich nur be- dingt auf P. pastoris übertragen. Die Transformation mit Lithiumchlorid etwa resultiert bei P. pastoris in einer sehr niedrigen Transformationsrate, auch wird für Transformationen in P. pastoris eine viel größere Menge an DNA benötigt. Da bei P. pastoris die Plasmid-DNA in das Hefegenom integriert wird, ist es nicht möglich, Plasmid-DNA zur Überprüfung einer positiven Transformation aus den Klonen zu isolieren.

Nach erfolgreicher Transformation und dem Nachweis der Fremd-DNA konnte darüberhinaus nur selten eine Produktion des gewünschten Proteins erreicht werden. In transformierten Klonen konnte auf DNA-Ebene das Fremdgen nachgewiesen werden, allerdings nicht auf Pro- teinebene. Mit nur wenigen Ausnahmen konnte keine Aktivität festgestellt bzw. auf Protein- gelen keine Bande klar zugeordnet werden.

Dies alles trifft nicht nur auf die Arbeit mit der humanen Sucrase zu, sondern auch auf die proteinogenen Inhibitoren und CIN1, die in P. pastoris exprimiert werden sollten. Trotz aller Probleme ist es dennoch gelungen, die humane Sucrase als aktive Untereinheit in Hefezellen zu exprimieren. In ihrem Verhalten entspricht sie den Angaben in der Literatur, auch wenn das Enzym nicht glykosiliert ist.

3.2. In vitro untersuchte Einflüsse auf Invertasen Getestete Invertasen besitzen überraschend hohe Temperaturoptima Die Temperaturoptima der getesteten Invertasepräparationen lagen höher als erwartet. Die in der Arbeitsgruppe gängige Temperatur für einen Invertasetest lag bei 26 °C (Bonfig, 2008). In anderen Arbeitsgruppen wurden die Invertasetests bei 25 °C (Chen und Black, 1992; Verdelhan des Molles et al., 1999), 27 °C (Nagaraj et al., 2005), 30 °C (Canam et al., 2008; Schroeven et al., 2008; Vargas et al., 2008) oder 37 °C (Sturm und Chrispeels, 1990; Fu et al., 2003; Qi et al., 2007) durchgeführt. Allerdings wurden meist nur das pH-Optimum und die Michaeliskonstante der Invertasen ermittelt, nicht das Temperaturoptimum. Eine Bestimmung der Temperaturoptima für pflanzliche Invertasen erfolgte erst in neueren Veröffentlichungen (Fu et al., 2003; Huang et al., 2003; Canam et al., 2008), die Optima von 40 und 45 °C ent- 97 Diskussion

sprechen in etwa denen, die auch in dieser Arbeit beschrieben wurden. Dies gilt auch für eine saure Invertase aus der Honigmelone, die ein Temperaturoptimum von 50 °C hat (Ranwala et al., 1991). Für eine vakuoläre Invertase aus Zuckerrohr wurde ein Optimum von 55 °C ermittelt, was eher den Optima von Invertasen aus Pilzen entspricht (Bhatti et al., 2006; Hussain et al., 2009; Linde et al., 2009). Da die sauren pflanzlichen Invertasen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit Invertasen aus Pilzen und Bakterien gemein haben (Ji et al., 2005), ist es allerdings auch naheliegend, dass die Temperaturoptima ähnlich sind. Für bakterielle Enzyme liegen die Temperaturoptima in einem weiten Spektrum, dieses reicht von 37°C, etwa bei Invertasen von Bakterien der Gattung Bifidobakterium (Warchol et al., 2002; Ryan et al., 2005) bis zu fast 100 °C bei thermophilen Bakterien wie Thermotoga (Liebl et al., 1998; Dipasquale et al., 2009). Auch die Optima von Fructosyltransferasen liegen in einem weiten Bereich von 40 °C bis 75 °C (Ozimek et al., 2005; Hernalsteens und Maugeri, 2008), das Tem- peraturoptimum einer Levanase, die auch zur GH-Familie 32 zählt, liegt bei 30 °C (Menendez et al., 2002). Auffällig ist, dass bei Temperaturen nur knapp oberhalb des Optimums die Akti- vität der meisten Invertasen stark abfällt, der Aktivitätsanstieg unterhalb des Optimums jedoch langsam erfolgt.

Die alkalische / neutrale Invertase zeigt als einziges getestetes Enzym ein Temperaturopti- mum bei etwa 35 - 40 °C. Für eine saure und eine alkalische Invertase aus der Erbse wurde ein einheitliches Temperaturoptimum von 37 °C bestimmt (Kim et al., 2010). Die Invertasen von C. rubrum und Zuckerrübe verhalten sich unterschiedlich, allerdings ist auch die Einor- dung der Betoideae zu den Chenopodiaceae nicht eindeutig geklärt (Kadereit et al., 2003; Olvera et al., 2008).

pH-Optima der Brassicaceae-Extrakte erstrecken sich weit in den neutralen Bereich hinein Die pH-Optima der einzelnen Invertasepräparationen liegen in den zu erwartenden Bereichen. Die in der Literatur beschriebenen Bereiche der pH-Optima der extrazellulären (pH 3,5 – 5,0) und vakuolären (pH 5,0 – 5,5) Invertasen treffen zwar meist zu (Roitsch und Gonzalez, 2004), allerdings liegen die Optima der extrazellulären Invertasen kaum in einem saureren Bereich als die der vakuolären.

Vor allem bei den Extrakten der Brassicaceae, Raps und Arabidopsis fällt auf, dass die Kurven, die die pH-Abhängigkeit der Invertasepräparationen darstellen, auch im neutralen Bereich eine hohe Aktivität aufweisen. Mit weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass neutrale / alkalische Invertasen in Arabidopsis nicht und in Raps bis zu 20 % der Aktivität des Rohextraktes bei pH 7 beitragen können. Für Arabidopsis sind elf Gene bekannt, die bei einer Sequenzanalyse als mögliche Kandidaten für neutrale / alkalische Invertasen beschrieben wurden (Vargas et al., 2003), Gennummern für neun davon sind mittlerweile bekannt (Qi et al., 2007). Für Arabidopsis kann gesagt werden, dass die Expression der alkalischen / neutralen Invertasen in den Blättern sehr schwach bzw. nicht vorhanden ist (Expressionsanalyse mit Genevestigator siehe Abbildung 3-1: young rosette und developed rosette), was auch erklären würde, dass im Rohextrakt aus Blättern keine Aktivität einer neutralen / alkalischen Invertase festgestellt werden konnte. 98 Diskussion

Abbildung 3-1: In silico-Expressionsanalyse von neun mutmaßlichen alkalischen / neutralen Invertasen aus Arabidopsis thaliana mit Hilfe des Tools „genevestigator“ (Zimmermann et al., 2005). Je stärker die Färbung desto höher ist die Expression des entsprechenden Gens im jeweiligen Gewebe.

Für Raps liegen keine derartigen Daten vor; der Familie GH100 sind zwar zwei Proteine aus Raps zugeordnet, diese werden allerdings nur als „unnamed protein product“ bezeichnet.

Die getestete alkalische / neutrale Invertase unterschiedet sich deutlich von den anderen Invertasen Bei einem Großteil der Tests war auffällig, dass sich die alkalische / neutrale Invertase aus Lolium temulentum abweichend von den übrigen untersuchten Invertasepräparationen verhalten hat.

Aus der Literatur ist bekannt, dass sich das Verhalten der alkalischen / neutralen Invertasen von dem anderer pflanzlicher Invertasen unterscheidet. Die Daten sind nicht immer einheit- lich, aber eine Hemmung durch Kupferionen bzw. Zinkionen wurde bereits für alkalische / neutrale Invertasen beschrieben (Van den Ende und Van Laere, 1995; Lee und Sturm, 1996; Vargas et al., 2007), ebenso eine Hemmung durch Tris (Chen und Black, 1992; Van den Ende und Van Laere, 1995; Lee und Sturm, 1996; Ross et al., 1996; Gallagher und Pollock, 1998; Vargas et al., 2007) und für neutrale und alkalische Invertasen aus der Karotte eine Inhibie- rung durch hohe Konzentrationen an Ammoniumionen (Lee und Sturm, 1996). In der Erbse wurde für die alkalische Invertase eine stärkere Hemmung durch eine Kupferlösung ermittelt als für eine vakuoläre Isoform (Kim et al., 2010).

Eine sehr starke Hemmung von über 80 % durch eine hohe Konzentration an NaCl trat nur bei Suc22 auf. Der Großteil der Invertasepräparationen wurde jedoch kaum beeinflusst. Auch die humane Sucrase wurde kaum in ihrer Aktivität beeinflusst, eine Aktivierung durch Natriumio- nen, wie sie für die menschliche Sucrase bzw. die aus Kaninchen beschrieben wurde, findet wohl nur mit geringeren Konzentrationen statt (Semenza et al., 1964; Kolínská und Semenza, 1967; Zagalak und Curtius, 1975).

Die berechnete Michaeliskonstante der untersuchten alkalischen / neutralen Invertase lag höher als die von Gallagher publizierte (Gallagher und Pollock, 1998). Im Allgemeinen kann man sagen, dass die Michaeliskonstanten der alkalischen / neutralen Invertasen zwischen 10 99 Diskussion

und 20 mM Sucrose liegen (Lee und Sturm, 1996). Die Werte der sauren Invertasen sind meist niedriger (Hashizume et al., 2003; Huang et al., 2003; Hsieh et al., 2006; Le Roy et al., 2007; Canam et al., 2008); dies traf für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen zu. Auch die Ergebnisse mit Invertasen aus der Erbse bestätigen diese Tendenz, allerdings liegt hier die Michaeliskonstante der alkalischen Invertase mit 38,6 mM Sucrose höher als bei den zuvor veröffentlichten Enzymen (Kim et al., 2010).

Der größte Unterschied im Verhalten der alkalischen / neutralen Invertase trat bei den

Hemmtests mit Miglitol auf. Hier lagen die errechneten IC50-Werte um den Faktor 1000 niedriger als bei den anderen Invertasepräparationen, die alkalische / neutrale Invertase war schon bei einer Konzentrationen von 0,1 mM Miglitol zu fast 100 % gehemmt, andere pflanzliche Invertasen wurden nicht so stark gehemmt oder nur durch Konzentrationen, die weit über 100 mM Miglitol lagen. Dies war im Rahmen der Arbeit die einzige Hemmung, die als selektiv bezeichnet werden kann. Evtl. ist dies auf den tertiären Stickstoff des Miglitol zurückzuführen, das als einzige gesteste Substanz über eine Seitenkette am Stickstoff verfügt.

Die Vermutung, dass das abweichende Verhalten mit der Zugehörigkeit von L. temulentum zu den Poaceae zu erklären ist, ist unwahrscheinlich. Träfe dies zu, müssten die Werte der vakuolären Invertase aus Weizen (Poaceae) ähnlich sein. Auch bei Untersuchungen einer sauren und einer alkalischen Invertase aus der Erbse traten große Unterschiede zwischen beiden Invertasen auf (Kim et al., 2010). Wie bereits in der Einleitung dargelegt, sind alkalische / neutrale Invertasen wenig erforscht. Sowohl Sequenzvergleiche als auch die Substratspezifität legen nahe, dass es sich weder um β-Fructofuranosidasen, noch um α-Glucosidasen handelt. Somit bilden die alkalischen / neutralen Invertasen eine eigene neue Gruppe, wodurch das abweichende Verhalten erklärt werden kann.

3.3. Unterschiede der heterolog exprimierten Invertasen CIN1 und CIN1(P/V) Die Invertasen CIN1 und CIN(P/V) unterscheiden sich in einer Aminosäure an Position 238. Die Konstrukte zur Expression dieser beiden Invertasen in S. cervevisiae wurden von M. Goetz hergestellt; die Beobachtung, dass sich extrazelluläre und vakuoläre Invertasen in dieser Ami- nosäure im Bereich des WECP/VD-Motivs unterscheiden, wurde näher untersucht.

Abbildung 3-2: Strukturen der proteinogenen Aminosäuren L-Prolin und L-Valin 100 Diskussion

Es konnte beobachtet werden, dass die Substitution des Prolins durch ein Valin sowohl eine Verschiebung des pH-Optimums von 3,8 auf 4,4 zur Folge hatte, als auch eine verminderte Affinität zu Raffinose (Goetz und Roitsch, 1999). Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob weitere Unterschiede im Verhalten der beiden Invertasen vorhanden sind.

Prolin und Valin sind unpolare Aminosäuren mit Nebenketten aus Kohlenwasserstoff (Abb. 3- 2). Prolin weist als Besonderheit auf, dass die Aminogruppe als sekundäres Amin vorliegt. Daher können Wasserstoffbrückenbindungen nicht in dem Maß aufgebaut werden wie bei anderen Aminosäuren. Prolin führt so in Proteinen häufig zu einem Bruch in der Sekundärstruk- tur, einer Unterbrechung der α-Helix oder des β-Faltblattes, und damit zur Beeinflussung der Proteinstruktur. Der Isoelektrische Punkt von Prolin liegt bei 6,30, der von Valin bei 5,96. Valin nimmt ein etwas größeres Volumen ein, das Van-der-Waals-Volumen beträgt 105, das von Prolin 90. Die Invertasen zeigten bei der Mehrzahl der Messungen unterschiedliches Ver- halten (Tab. 3-1).

Tabelle 3-1: Ergebnisse der Messungen mit den Invertasen CIN1 und CIN1(P/V). Die Einheiten entsprechen denen, die bei den jeweiligen Messungen im Ergebnisteil genannt wurden.

CIN1 CIN1(P/V)

Lineweaver-Burk Hanes Lineweaver-Burk Hanes 1168 971 52,1 51,0 v max ±159 ±56 ±9,3 ±6,3 0,625 0,516 0,434 0,423 k m ±0,133 ±0,042 ±0,112 ±0,105

pH-Optimum 3,3 4,5 Temperatur- 42 °C ( bis 47 °C) 42 °C, dann steiler Abfall Optimum

0,4 M NaCl -8 ± 11 -54 ± 13

1 mM CuCl2 44 ± 42 -22 ± 35

1 mM CuSO4 0 ± 4 -15 ± 27

1 mM FeSO4 9 ± 10 -11 ± 21

proteinogene keine Hemmung, erhöhte Aktivität Hemmung Inhibitoren

Tris leichte Hemmung leichte Hemmung

IC50-Werte

mM Suc 0,4 0,7 1 0,4 0,7 1

Fructose 23 ± 16 62 ± 35 122 ± 71 29 ± 18 131 ± 35 106 ± 61 0,024 0,028 0,028 0,038 0,058 0,067 DMDP ± 0,008 ± 0,004 ± 0,007 ± 0,006 ± 0,012 ± 0,015

Calystegin B2 6,9 ± 0,6 29,4 ± 10,9

Miglitol 27,2 ± 13,7 23,7 ± 8,1 23,3 ± 13,4 38,0 ± 0,6 37,3 ± 1,0 35,1 ± 12,7

Acarbose 7,6 ± 3,0 13,2 ± 6,2 10,6 ± 5,8 4,5 ± 0,3 6,0 ± 0,8 6,6 ± 0,7 101 Diskussion

Auffallend ist der große Unterschied in der maximalen Geschwindigkeit, der laut Literatur nicht vorhanden sein sollte (Goetz und Roitsch, 1999). Für CIN1(P/V) wurde ein erhöhtes pH- Optimum ermittelt, was den Literaturangaben entspricht, auch wenn die Literaturwerte selbst nicht erreicht wurden (Goetz und Roitsch, 1999). Die Temperaturoptima entsprachen sich, allerdings wurde bei der mutierten Variante ein schnellerer Aktivitätsabfall beobachtet. Bei den verschiedenen Einflüssen durch Salze fiel auf, dass CIN1 weit weniger durch hohe NaCl-Konzentrationen gehemmt wurde. Ebenso wurde CIN1(P/V) durch Kupfer- und Eisensalz stärker negativ in seiner Aktivität beeinflusst als CIN1. Durch den Einbau eines Prolins anstelle eines Valins ist die Aminosäurekette weniger flexibel. Dies ist eventuell der Grund dafür, dass die Aktivität von CIN1(P/V) leichter durch äußere Einflüsse negativ beeinflusst wird als die Aktivität von CIN1.

Mit proteinogenen Inhibitoren konnte bei CIN1 keine Hemmung erzielt werden, bei CIN1(P/V) und bei der Wildtyp-Invertase jedoch schon. Dies lässt sich anhand der vorliegenden Daten nicht erklären.

Die Hemmung durch Fructose und Tris war bei beiden Invertasen vergleichbar, jedoch nicht

stark ausgeprägt. Von den getesteteten Iminozuckern DMDP, Calystegin B2 und Miglitol war jeweils eine höhere Konzentration notwendig, um bei CIN1(P/V) die gleiche Hemmung zu erzielen wie bei CIN1. Mit Acarbose jedoch verhielt es sich umgekehrt.

Bei der Beeinflussung durch Kupfer- und Eisensalze muss eher von einer Tendenz gesprochen werden als von einem deutlichen Unterschied. Ebenso verhält es sich bei Miglitol und Acarbose: eine Differenz in den Werten ist vorhanden, allerdings sind die Standardabweichun-

gen hoch. Bei DMDP jedoch unterscheiden sich die IC50-Werte um das 1½ bis 2fache, bei

Calystegin B2 sogar um das 4fache. Die Ursache für diese großen Unterschiede muss in der Struktur der Invertasen, speziell in der des aktiven Zentrums liegen. Um diese jedoch ausreichend diskutieren zu können, müsste die dreidimensionlale Struktur der Invertasen bekannt sein. Untersuchungen zur dreidimensionalen Struktur der Invertasen wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt.

3.4. Proteinogene Invertaseinhibitoren

3.4.1. Proteinogene Invertaseinhibitoren hemmen verschiedene Invertasen Proteinogene Invertaseinhibitoren sind schon seit vielen Jahrzehnten bekannt (Schwimmer et al., 1961). Die Angaben zur Spezifität der Inhibitoren sind allerdings sehr unterschiedlich. So wurde etwa für Inhibitorproteine aus Tabak beschrieben, dass diese Invertasen aus Pilzen nicht hemmen (Rausch und Greiner, 2004), Inhibitoren aus Kartoffel und Tamarillofrüchten jedoch schon (Isla et al., 2002). Ältere Literatur zu Inhibitoren aus der Kartoffel beschreibt jedoch keine Hemmung der Hefeinvertase; die Hemmung von Invertasen aus verschiedenen Pflanzen und Geweben durch den Inhibitor unterscheidet sich teils stark (Pressey, 1967, 1968b; Jaynes und Nelson, 1971). 102 Diskussion

Die verwendeten Inhibitoren wurden heterolog in N. benthamiana exprimiert, die Konstrukte und das Protokoll wurden von Dr. Greiner (Universität Heidelberg) zur Verfügung gestellt (Kusch et al., 2009). Ein Nachweis auf die Inhibitoren bzw. eine Einstellung auf eine bestimmte Inhibitormenge wurden nicht durchgeführt. Stattdessen wurde mit definierten Proteinmen- gen (4 und 7 µg) gearbeitet. Dadurch waren zwar die Inhibitoren untereinander in ihrer Inten- sität nicht vergleichbar, die hohe Inhomogenität der Messungen und die damit verbundene hohe Streuung der Ergebnisse kann dadurch jedoch nicht erklärt werden.

Bei den durchgeführten Messungen mit Inhibitoren aus Tabak, Zuckerrübe und Arabidopsis gab es keine Hinweise, dass die Invertasen der jeweiligen Pflanzen stärker gehemmt wären als die Invertasen anderer Pflanzen. Die Hemmtests mit der humanen Sucrase zeigten eindeutig, dass deren Aktivität durch die Inhibitorproteine verringert wird. Am deutlichsten war dies bei dem Inhibitor aus der Zucker- rübe. Eine Hemmung der humanen Sucrase durch Inhibitorproteine wird in der Literatur nicht beschrieben, allerdings wurden Inhibitorproteine für Glucosidasen entdeckt (Boonmee et al., 2007; Tiengburanatam et al., 2010). Auch die Messungen mit der Hefeinvertase zeigten eindeutig eine Hemmung. Mit 2 mM Sac- charose wurde jedoch keine Hemmung erzielt, was weder durch die Menge an Saccharose noch durch die Methode und Handhabung zu erklären ist, da für jede Messung ein Mastermix für alle drei Saccharosekonzentrationen verwendet wurde und die Messungen gleichzeitig unter identischen Bedingungen durchgeführt wurden. Die Hemmung der Hefeinvertase durch NtCIF um 50 % widerspricht den veröffentlichten Ergebnissen von etwa 10 % Hemmung (Grei- ner et al., 1998). Auch die alkalische / neutrale Invertase wurde von den verschiedenen Inhibitorproteinen gehemmt. Auffällig ist, dass eine eindeutige Hemmung mit Inhibitoren aus Arabidopsis nur mit der alkalischen / neutralen Invertase gemessen werden konnte, der Rohextrakt aus Arabidopsis wurde gering gehemmt, ebenso die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum durch AtC/VIF1. Die anderen drei getesteten Invertasepräparationen wurden nicht gehemmt.

Nur bei einem Teil der Hemmtests konnte eine Abhängigkeit von der eingesetzten Menge an Protein festgestellt werden. Um weitere Aussagen über die Spezifität der Inhibitoren oder ihre Wirkstärke im Vergleich treffen zu können, müssten die Tests mit zur Homogenität aufgereinigten Präparationen wiederholt werden. Sicher ist, dass die Inhibitorproteine neben den sauren Invertasen auch die alkalische / neutrale Invertase und die humane Sucrase gehemmt haben, die sich in ihrem Aufbau stark von diesen unterscheiden. Ebenso wurde die getestete Hefeinvertase gehemmt, die den sauren Invertasen strukturell ähnlicher ist. Dass dies jedoch keine Garantie darstellt zeigen die publizierten Ergebnisse mit Enzymen des Fructanstoffwechsels, die nicht durch die Inhibitorproteine gehemmt wurden (Kusch et al., 2009). 103 Diskussion

3.4.2. Glykosilierte Invertaseinhibitoren hemmen pflanzliche Invertase nicht Das Inhibitorproteine AtC/VIF2 aus A. thaliana sollte heterolog in P. pastoris exprimiert werden, allerdings ist es nicht gelungen, eine aktive Form zu isolieren. Mit dem Konstrukt pPαI2 konnten Klone gewonnen werden, die das Inhibitorprotein bildeten und sekretierten. Dabei wurde das Protein jedoch glykosiliert, da AtC/VIF1 über mögliche Glykosilierungsstellen ver- fügt. Hemmtests mit dem glykosiliertem Protein zeigten keine reduzierte Aktivität des Rohex- traktes aus Arabidopsis. Dies könnte entweder an der Glykosilierung selbst, die die Ausbildung eines Invertase-Inhibitor-Komplexes sterisch behindern könnte, oder einer falschen Tertiärstruktur des Inhibitorproteins liegen.

Bisher wurde nur die heterologe Expression eines Inhibitors aus der Tomate, der über keine mögliche Glykosilierungsstelle verfügt, erfolgreich für P. pastoris beschrieben (Reca et al., 2008). AtC/VIF1 und 2 verfügen beide über mögliche Glykosilierungsstellen, so dass man bei einer Sekretion von AtC/VIF 2 in P. pastoris auch eine Glykosilierung erwarten müsste.

Nach der Deglykosilierung des aus P. pastoris gewonnenen Inhibitorproteins AtC/VIF1 mit En- do H konnte dieses einen Arabidopsis-Rohextrakt nicht hemmen. Dies könnte an einer zu star- ken Verdünnung der Inhibitorpräparation liegen. Möglich wäre aber auch, dass der N-Acetyl- Glucosaminrest, der nach einer Behandlung mit Endo H am Inhibitorprotein verbleibt, eine sterische Behinderung des Inhibitorproteins dartellt, so dass der Inhibitor-Invertase-Komplex nicht gebildet werden kann. Eine weitere Erklärung könnte eine falsche Struktur des Proteins sein: für die Aktivität der Inhibitorproteine sind ausgebildete Disulfidbrücken von größter Bedeutung (Link et al., 2004). Durch die Glykosilierung könnte die Ausbildung der Disulfidbrücken, die essentiell für die Funktionalität des Inhibitors sind, gestört worden sein, so dass es auch nach der Deglykosilierung aufgrund falsch oder nicht gebildeter Disulfidbrücken zu keiner Hemmung von Invertasen kommt.

3.5. Unterschiedlich starke Beeinflussung von Invertasen durch verschiedene Inhibitoren Die getesteten Invertasepräparationen aus verschiedenen Pflanzen zeigten in ihrem Verhalten eher eine Unterscheidung nach den einzelnen Pflanzen bzw. Pflanzenfamilien als nach vakuolären oder zellwandgebundenen Invertasen.

3.5.1. Getestete Iminozucker unterscheiden sich stark in ihrem Hemmspektrum Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Hemmung durch drei Iminozucker auf verschiedene Invertasepräparationen getestet. Dabei wiesen die Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin

B2 eine sich stark ähnelnde Grundstruktur auf. Bei DMDP handelt es sich um einen Fünfring, bei den beiden anderen um Sechsringe mit unterschiedlichen Substituenten. Alle drei Molekü- le besitzen vier Hydroxylgruppen. Diese liegen teilweise in identischer Konformation vor, bei den nicht-identischen sind Methylengruppen eingefügt. Allen drei Molekülen sind die beiden Hydroxylgruppen mit gleichem Abstand zum Stickstoffatom gemein. DMDP und Miglitol stim- men darüberhinaus in der dazwischenliegenden Methylenhydroxygruppe überein. Miglitol und 104 Diskussion

Calystegin B2 haben beide einen Sechsring als Grundgerüst und die vierte Hydroxygruppe in gleicher Position. In Abbildung 3-3 sind die drei Iminozucker dargestellt, Umrandungen machen auf strukturelle Übereinstimmungen aufmerksam.

Aufgrund dieser hohen strukturellen Ähnlichkeit ist die unterschiedliche Hemmaktivität der Verbindungen sehr erstaunlich.

DMDP ist die potenteste der getesteten Substanzen, die IC50-Werte liegen in einem Bereich von 0,02 bis 1,2 mM. Dabei war die Hemmung der Hefeinvertase am geringsten, bei den übri- gen getesteten Invertasen gab es kaum Unterschiede.

Für Miglitol lagen die ermittelten IC50-Werte im Bereich von 15 – 110 mM, eine Ausnahme hiervon bildete die alkalische / neutrale Invertase, die schon durch Konzentrationen um den Faktor 1000 niedriger in gleicher Weise bzw. besser gehemmt wurde. Bei einer Großzahl der pflanzlichen Invertasepräparationen führte Miglitol hingegen zu keiner bzw. fast keiner Hem- mung, v.a. bei Präparationen der Brassicaceae. In niedrigen Konzentrationen war stattdessen eine erhöhte Aktivität festgestellt worden.

Abbildung 3-3: Iminozucker mit strukturellen Übereinstimmungen: DMDP, Miglitol und Calystegin B2. Die jeweiligen Übersteinstimmungen sind durch Umrahmungen hervorgehoben.

Calystegin B2 zeigte nur bei fünf der getesteten Invertasepräparationen eine Hemmung, die – verglichen mit den Hemmungen durch die anderen Iminozucker – nicht sehr ausgeprägt war. Bei den gehemmten Extrakten handelt es sich um die drei C. rubrum-Präparationen und zwei Brassicaceae-Präparationen. Hefeinvertase und humane Sucrase wurden nicht gehemmt.

Gerade bei den Brassicaceae-Extrakten, von denen zwei durch Calystegin B2 gehemmt wurden, zeigte Miglitol keine Hemmung, in den vergleichbaren Konzentrationen gar eine Aktivie-

rung der Enzyme. Strukturell unterscheiden sich Miglitol und Calystegin B2 u.a. durch ver-

schiedene Seitenketten, die bei Calystegin B2 durch die Ringstruktur starrer vorliegen, was verstärkt zu einer sterischen Behinderung führen könnte. Miglitol hingegen verfügt über einen tertiären Stickstoff, der kein freies Wasserstoffatom für Wasserstoffbrückenbingungen zur Verfügung stellen kann, was sich evtl. negativ auf die Hemmaktivität auswirken kann. 105 Diskussion

Die vergleichsweise starke inhibitorische Aktivität von DMDP kann auf mehrere Eigenschaften zurückzuführen sein, u.a. wird das Molekül nicht durch lange oder starre Seitenketten behin- dert. Im Gegensatz zu Miglitol verfügt DMDP über einen sekundären Stickstoff, der nicht durch eine Seitenkette abgeschirmt wird. Außerdem erhöhen die Methylengruppen und die 5-Ring- Struktur die Ähnlichkeit zu Fructose.

3.5.2. Acarbose als Inhibitor der α-Amylase und der Sucrase hemmt auch pflanzliche Invertasen Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, ist als α-Glucosidasehemmstoff in der Diabetestherapie bekannt (Puls et al., 1977; Schmidt et al., 1977). In der Arbeitsgruppe wurde bereits mit Acarbose als Hemmstoff für pflanzliche Invertasen gearbeitet, allerdings ohne in vitro die Hemmung auf verschiedene pflanzliche Invertasen zu untersuchen (Bonfig, 2008).

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde in vitro die Hemmung verschiedener Invertasen

durch Acarbose untersucht. Für alle Invertasen liegen die IC50-Werte in einem Bereich von 5 – 60 mM Acarbose. Dabei ist die Hemmung einiger pflanzlicher Enzyme wie etwa der Invertasen aus C. rubrum mindestens genauso ausgeprägt wie die der humanen Sucrase. Auch die Hefeinvertase wird durch das Pseudotetrasaccharid gehemmt. Auffällig hierbei war, dass bei niedrigen Sucrosekonzentrationen die Aktivität der Hefeinvertase geringfügig zunahm anstatt gehemmt zu werden.

Es konnte gezeigt werden, dass durch die Gabe von Acarbose die Aktivität von Invertasen erheblich verringert wird. Eine Konzentration von 30 mM Acarbose war in der Regel ausreichend um eine Hemmung von mindestens 50 % zu erhalten. Einzig Tabakextrakte zeigten eine geringere Hemmung von nur etwa 45 %.

Abbildung 3-4: Struktur von Acarbose: Pseudotetrasaccharid bestehend aus einem Valienaminrest, an den über eine 4-Amino-4,6-dideoxyglucose zwei weitere Glucosereste angehängt sind (Wehmeier und Piepersberg, 2004)

Im Vergleich zu den Iminozuckern liegt bei Acarbose der Stickstoff außerhalb des Ringgerüstes (Abb. 3-4). Eine weitere Besonderheit ist die Doppelbindung im Sechsring. Diese strukturellen Unterschiede zwischen Acarbose und Miglitol wirken sich wohl auf die Hemmung pflanzlicher Invertasen stärker aus als auf die Hemmung der humanen Sucrase. Beide Substanzen sind gute Hemmstoffe der Sucrase und werden als α-Glucosidasehemmstoffe in der Diabetestherapie 106 Diskussion

eingesetzt. Acarbose jedoch hemmt pflanzliche Invertasen besser als Miglitol – mit Ausnahme der getesteten alkalischen / neutralen Invertase.

3.5.3. Fructose beeinflusst die Aktivität der Invertasen unterschiedlich, ebenso L-

Arabinose und D-Xylose Produkthemmung durch Fructose und auch durch Glucose ist für eine Vielzahl von Invertasen beschrieben. Dabei erfolgt die Hemmung durch Fructose kompetitiv, die Hemmung durch Glucose nicht-kompetitiv. Dies gilt sowohl für alkalische / neutrale Invertasen (Van den Ende und Van Laere, 1995; Lee und Sturm, 1996; Ross et al., 1996; Gallagher und Pollock, 1998; Vargas et al., 2003) als auch für saure Invertasen, wobei es zu diesen nur wenige Veröffentli- chungen gibt (Isla et al., 1999; Sturm, 1999; Sayago et al., 2002). Für Pilze wird die Hemmung einer Invertase aus Neurospora beschrieben, jedoch konnte der Hemmtyp nicht ermittelt werden (Trevithick und Metzenberg, 1964). Die Sucrase aus der Ratte wird kaum durch Fruc- tose gehemmt, der Hemmtyp ist nicht-kompetitiv (Asano et al., 1996b).

In der vorliegenden Arbeit wurde nur die Hemmung durch Fructose getestet. Bei einigen Invertasepräparationen kam es bei geringen Fructosekonzentrationen zu einer leicht erhöhten Aktivität, andere Invertasen wurden gehemmt. Dies waren die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum und die alkalische / neutrale Invertase aus Lolium. Nur die heterolog exprimierte Invertase aus Weizen wurde nicht gehemmt. Die Hemmung der humanen Sucrase war nur leicht (20 % bei 100 mM Fructose), vergleichbar die der Hefeinvertase. Damit unterschieden sie sich nicht stark vom Großteil der pflanzlichen Invertasen. Die meisten der getesteten Invertasen wurden durch eine große Menge an Fructose nur leicht gehemmt, Fructose ist also kein guter Inhibitor.

Abbildung 3-5: Strukturen der Zucker D-Fructose, L-Arabinose und D-Xylose. Arabinose und Xylose unterscheiden sich nur in der Anordnung der Hydroxylgruppen. Fructose hingegen verfügt über ein Kohlenstoffatom und eine Hydroxylg- ruppe mehr.

Da die Hemmung durch Fructose nur gering war, wurden die Zucker Arabinose und Xylose mit

einer geringeren Anzahl an Invertasen getestet. L-Arabinose und D-Xylose unterscheiden sich kaum in ihrer Struktur (Abb. 3-5). Die alkalische / neutrale Invertase wurde weder von 107 Diskussion

Arabinose noch Xylose gehemmt, das Ergebnis steht dem mit Fructose als Inhibitor entgegen. Bei der extrazellulären Invertase aus C. rubrum ist ein großer Unterschied zwischen Arabinose (starke Hemmung) und Xylose (leicht Hemmung) zu erkennen, die Hemmung durch Fructose wird durch keinen der beiden Zucker erreicht. Die humane Sucrase wurde entgegen den Lite- raturangaben von beiden Zuckern nur leicht gehemmt (Asano et al., 1996b; Seri et al., 1996; Matsuura und Ichikawa, 1997), die Hemmung durch Xylose war am größten, die durch Fructo- se etwas stärker als die durch Arabinose. Die Hemmung der Hefeinvertase durch Arabinose war der durch Fructose vergleichbar, die durch Xylose war stärker.

Arabinose und Xylose sind bei den meisten Invertasen schlechtere Inhibitoren als Fructose. Die Literaturangaben konnten nicht bestätigt werden. Damit sind sie aufgrund der hohen be- nötigten Konzentrationen und der geringen Hemmung keine interessanten Inhibitoren.

3.5.4. Einfache Stickstoffverbindungen hemmen Invertasen Die einfachen Stickstoffverbindungen Tris, Pyridoxin, Anilin und Imidazol wurden mit einer geringen Zahl von Invertasen auf ihre Hemmaktivität hin untersucht. Zum einen war aus der Literatur bekannt, dass bei Tris hohe Konzentrationen notwendig sind (Puls und Keup, 1975), bei Pyridoxin trat eine Beeinträchtigung des Testsystems auf und aufgrund der Giftigkeit von Anilin wurde nur eine begrenzte Anzahl an Messungen durchgeführt. Die Beobachtung, dass der Elutionspuffer für die Nickelaffinitätschromatographie die Invertaseaktivität hemmen konnte, führte dazu, dass auch Imidazol auf seine Hemmaktivität hin untersucht wurde.

Tris konnte die alkalische / neutrale Invertase und die menschliche Sucrase hemmen, nicht jedoch die Hefeinvertase oder die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum. Diese Ergebnisse bestätigten die Angaben aus der Literatur, dass Sucrasen und alkalische / neutrale Invertasen gehemmt werden (Puls und Keup, 1975; Morell und Copeland, 1984; Vasseur et al., 1990; Chen und Black, 1992; Kano et al., 1996; Ross et al., 1996), die Hemmung der Sucrase- Isomaltase erfolgt dabei kompetitiv (Kolínská und Semenza, 1967). Zu sauren pflanzlichen Invertasen konnte keine Literatur gefunden werden, aber die Ergebnisse zeigen, dass Tris kein Inhibitor der getesteten β-Fructofuranosidasen ist. Bei Tests mit verschiedenen Hefeenzymen wurde gezeigt, dass nur eine Invertase bei geringen Konzentrationen an Tris stark gehemmt wird (Suomalainen et al., 1961).

Die Hemmtests mit Pyridoxin wurden nur mit geringen Konzentrationen durchgeführt, bei höheren Konzentrationen war die Beeinflussung des GOD-POD-Reagenz durch Pyridoxin zu stark. Bei der Hemmung der vier Invertasen fallen keine Besonderheiten auf, in der Literatur wird Pyridoxal bzw. Pyridoxalphosphat als Hemmstoff von Hefeinvertasen, sauren und neutralen Invertasen beschrieben, die Hemmung durch Pyridoxin ist schwächer als die durch Pyridoxalphosphat (Pressey, 1968a; Obenland et al., 1993; Van den Ende und Van Laere, 1995). Die Ergebnisse zeigen, dass Pyridoxin als Inhibitor nicht interessant ist, zum einen gibt es keinen großen Unterschied zwischen den Enzymen, zum anderen gibt es laut Literatur De- rivate, die in ihrer Hemmaktivität besser sind. 108 Diskussion

Anilin hemmt alle getesteten Invertasen, die humane Sucrase und die alkalische / neutrale Invertase am schlechtesten. Der Anstieg der Hemmung bei einer Konzentrationssteigerung von 50 auf 100 mM Anilin ist groß. Anilin wurde schon in der Literatur als potenter Inhibitor von Invertase aus Pilzen mit nicht-kompetitivem Hemmtyp beschrieben, die Inhibierung von pflanzlichen sauren Invertasen ist weniger stark (Tracey, 1963; Trevithick und Metzenberg, 1964; Pressey, 1968a; Ishimoto und Nakamura, 1997). Da Anilin giftig ist, sollte die Verwen- dung gering gehalten werden.

Imidazol ist in der Literatur bisher als Hemmstoff der Maltase und der Isomaltase beschrieben (Larner und Gillespie, 1956).Die Hemmung durch Imidazol für die beiden pflanzlichen Invertasen ist vergleichbar, die humane Sucrase und die Hefeinvertase werden schlechter gehemmt. Auch hier gibt es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Enzymen, hohe Konzentrationen für die Hemmung sind notwendig. Bei den Hemmtests mit Imidazol wird besonders deutlich, dass der Einfluss durch eine Änderung des pH-Wertes größer sein kann als die Hemmung durch den Stoff selbst.

Die getesteten einfachen Stickstoffverbindungen hemmen zwar den Großteil der getesteten Invertasen, allerdings sind meist hohe Konzentrationen notwendig oder aber bessere Alterna- tiven, etwa in Form von Derivaten oder weniger giftig, stehen zur Verfügung. Somit sind diese Verbindungen weder für den Einsatz im Labor noch für eine mögliche Therapieanwendung interessant.

3.5.5. Kombinationen verschiedener Hemmstoffe am gleichen Enzym führen nicht zu einer verstärkten Hemmung Bei im Rahmen der Arbeit durchgeführten Messungen hat sich eine Kombination zweier Wirk- stoffe, die am gleichen Enzym wirken, als nicht effektiv herausgestellt. Weder bei den getesteten pflanzlichen Invertasen noch bei der humanen Sucrase wurde mit den kombinierten Inhibitoren eine verstärkte Hemmung beobachtet, im Gegenteil war die Hemmung geringer als die Summe der beiden Einzelhemmungen.

Die Kombination aus zwei Wirkstoffen könnte dann sinnvoll sein, wenn die Hemmstoffe unterschiedliche Targets haben, wie das für Acarbose (starke Hemmung der α-Amylase) und Voglibose (starke Hemmung der Disaccharidasen) vermutet wurde (Fujisawa et al., 2005). Eine Kombination aus Isoferulasäure und Acarbose zeigte eine verstärkte Hemmung der Sucrase aus Ratten (Adisakwattana et al., 2009).

3.6. Screening nach neuen Invertaseinhibitoren Für das Screening nach neuen Invertaseinhibitoren wurden Extrakte von Pflanzen aus der TCM eingesetzt, darüberhinaus selbsthergestellte Extrakte aus Pflanzen, die als Kandidaten aus der Literaturrecherche ausgewählt bzw. für Tests zur Verfügung gestellt wurden.

Unter den etwa 270 Pflanzen, deren Extrakte für das Screening eingesetzt wurden, wurden 60 auch in der Literaturrecherche genannt. Von diesen 60 trat bei 15 eine mindestens leichte 109 Diskussion

Hemmung der humanen Sucrase auf. Wiederum für acht dieser 60 Extrakte lagen noch keine Angaben über eine mögliche Hemmung von α-Glucosidasen oder α-Amylasen vor. Bei Cocculus trilobus trat eine schwache Hemmung ein, wie es auch in der Literatur angegeben war (Nishioka et al., 1998). Bei Cinnamomum cassia, Rheum officinale, Scutellaria baicalensis, Taraxacum officinale und Zingiber officinale trat eine Hemmung der humanen Sucrase ein, wie sie auch in der Literatur beschrieben war (Literaturangaben siehe Tab. 3-2). Bei Paeonia lactiflora trat nur eine leichte Hemmung der Sucrase auf, anders als in der Lite- ratur beschrieben (Nishioka et al., 1998). Eine Hemmung konnte bei folgenden Pflanzen nicht beobachtet werden, obwohl in der Litera- tur von einer α-Glucosidasehemmung berichtet wurde: Andrographia paniculata, Gastrodia sp., Momordica charantia, Tribulus terrestris und Viscum album; ein Extrakt von Viscum album konnte jedoch die pflanzliche Invertase aus C. rubrum etwas hemmen. Auch keine Hem- mung konnte bei Extrakten aus Astragalus membranaceus, Bupleurum chinense, Carthamus tinctorius, Prunus persica und Rehmannia glutinosa beobachtete werden, die in der Literatur als leichte Hemmstoffe beschrieben wurden. Für Gardenia jasminoides, Panax ginseng und Pinellia ternata konnte bestätigt werden, dass sie die humane Sucrase nicht hemmen. Extrak- te aus Caesalpinia sappan und Prunella vulgaris hemmten die Aktivität der humanen Sucrase leicht, Arctium lappa, Ilex paraguariensis, Paullinia cupana und Polygonum multiflorum konnten die humane Sucrase stärker hemmen; für keine dieser Pflanzen war eine mögliche Hemmung in der Literatur beschrieben.

Unter den acht Pflanzen, die bei den getesteten Invertasen die höchsten Hemmungen verur- sacht haben, waren fünf, zu denen keine Veröffentlichungen im Zusammenhang mit einer Blutzuckersenkung gefunden wurden. Für zwei dieser acht Extrakte, Cinnamomum cassia und Hovenia dulcis, wurde eine Verwendung in der Diabetestherapie diskutiert. Darüberhinaus wurde für Cinnamomum cassia eine schwache α-Glucosidasehemmung, allerdings ohne einen Einfluss des Extraktes auf die Methode ausschließen zu können, und für Sophora japonica eine Disaccharidasehemmung beschrieben; diese allerdings für einen Wurzelextrakt von Sophora sp. ohne eine genauere Definition der verwendeten Pflanze. Wichtig ist hier jedoch, dass nur ein Extrakt aus der Wurzel diese Wirkung zeigte, ein Extrakt aus der Blüte zeigte laut Litera- tur Aktivität als Radikalfänger. Im Rahmen der Messungen zeigten die Blattextrakte von Sophora japonica keine Aktivität, ein Blütenextrakt bewirkte eine Hemmung der humanen Sucrase. Wurzelextrakte von Rheum officinale und Scutellaria baicalensis zeigten in Versu- chen eine Hemmung der humanen Sucrase. In der Literatur war für beide Pflanzen eine α- Glucosidasehemmung beschrieben, wobei bei Rheum officinale eher eine Beeinflussung der Glucoseoxidase, also eine Verfälschung des Ergebnisses durch Störung der Methode, vermutet wurde. Dies konnte bei den im Rahmen der Arbeit durchgeführten Hemmtests durch die Be- stimmung der mit dem Extrakt gemischten Glucosemenge ausgeschlossen werden. Auch der methanolische Rindenextrakt von Cinnamomum cassia konnte die humane Sucrase hemmen und war einer der fünf besten Extrakte, sowohl bei der Hemmung der humanen Sucrase, als auch bei der pflanzlichen Invertase; laut Literatur führte ein methanolischer Extrakt zu einer schwachen Hemmung von α-Glucosidasen. 110 Diskussion

Wie bereits erwähnt wurde eine Vielzahl der Pflanzen, die eine Hemmung von mindestens 20 % herbeiführten, auch schon im Rahmen der Literaturrecherche genannt. Ein Großteil der Pflanzen führt nicht nur zu einer Verbesserung der Blutzuckerwerte, sondern besitzt etwa antioxidative Wirkung oder verbessert Parameter, die im Rahmen des Diabetes mellitus negativ beeinflusst sind. Tabelle 3-2 gibt einen Überblick über diese Pflanzen mit ihren in der Lite- ratur beschriebenen Wirkungen.

Tabelle 3-2: Auflistung der Pflanzen, die bei den Hemmtests eine mehr als 20 %ige Hemmung der extrazellulären Invertase aus C. rubrum, der humanen Sucrase und / oder der Hefeinvertase erzielten. Zu den jeweiligen Pflanzen ist die in der Literatur beschriebene Wirkung angegeben, Nennungen zu Enzymhemmungen sind fett hervorgehoben.

Pflanzenname interne Bez: beschriebene Wirkung antidiabetisch, auch Verschlechterung des Diabetes (Swanston-Flatt et al., 1989b; Xu et Arctium lappa1 J8 al., 2008), zur Diabetestherapie eingesetzt (Li et al., 2004a) antimikrobielle Wirkung des essentiellen Öls Artemisia scoparia B14 (Cha et al., 2005) keine blutzuckersenkende Wirkung (Chandrasekar et al., 1989), allerdings wirksam gegen Entzündungen und Geschwüre, auch Benincasa sp B20 bei diabetischen Spätfolgen, in Korea gegen Diabetes verwendet (Grover et al., 2001; Huang et al., 2004; Lee et al., 2005; Moon et al., 2009) antimikrobiell, enthält Hemmstoffe der Bischofia javanica Blume J18 Topoisomerase II (Khan et al., 2001; Wada und Tanaka, 2005) antioxidative und antiinflammatorische Wir- Buddleja officinalis B22 kung (Piao et al., 2003; Lee et al., 2008; Lee et al., 2010c) zur Diabetestherapie eingesetzt (Li et al., 2004a), antioxidativ und antiinflammatorisch Caesalpinia sappan1 J26 (Washiyama et al., 2009; Lee et al., 2010b; Lee et al., 2010a) gegen Malaria verwendet (Andrade-Neto et al., Cinchona succirubra J35 2003) viele Untersuchungen, Daten nicht eindeutig; Steigerung der Insulinsensitivität, Senkung des HbA1c-Wertes (Jia et al., 2003; Verspohl et al., 2005; Kim et al., 2006; Kwon et al., 2006; Mang et al., 2006; Suppapitiporn und Kanpaksi, 2006; Vanschoonbeek et al., 2006; Blevins et Cinnamomum cassia1 J37 al., 2007; Pham et al., 2007; Solomon und Blannin, 2007; Anderson, 2008; Crawford, 2009; Jitomir und Willoughby, 2009; Kirkham et al., 2009; Solomon und Blannin, 2009), schwache α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998)

1 auch bei Literaturrecherche genannt 111 Diskussion

blutzuckersenkend, Bestandteil von verschiedenen Zubereitungen gegen Diabetes (Hyponidd, Dianex, Dihar, Ilogen-Excel) (Babu und Mainzen Prince, 2004; Saxena und Vikram, Curcuma longa1 J58 2004; Kuroda et al., 2005; Mutalik et al., 2005; Nishiyama et al., 2005; Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007; Pari et al., 2008; Cheng et al., 2009; Patel et al., 2009) blutzuckersenkend (Niu et al., 2007; Liu et al., Eleutherococcus senticosus11 E18 2008; Niu et al., 2008) antioxidative und antiinflammatorische Wir- Forsythia suspensa1 B38 kung (Dai et al., 2009; Lu et al., 2010), antidiabetisch (Jia et al., 2003) blutzuckersenkend (Ji et al., 2002; Hyun et Hovenia dulcis1 E25, E27 al., 2010) zur Gewichtsreduzierung (Andersen und Fogh, Ilex paraguariensis1 E30, R10 2001; Oliveira et al., 2008; Pang et al., 2008; Arcari et al., 2009; Hui et al., 2009) positive Auswirkungen auf Blutfettwerte und Paeonia rubra B60 Arteriosklerose (Xu et al., 2007) Paraboea rufescens J108 keine Literatur zur Gewichtsreduzierung (Andersen und Fogh, Paullinia cupana1 R22, E68 2001; Hui et al., 2009) Pistacia weinmannifolia J117 antioxidativ (Zhao et al., 2005b) antidiabetisch (Jia et al., 2003), antiviral (Lin Polygonum multiflorum1 J121 et al., 2010) Pristimera cambodiana J125 keine Literatur zur Diabetestherapie eingesetzt (Li et al., Prunella vulgaris1 J127 2004a), unterstützt die Wirkung von Insulin (Zheng et al., 2007b) Extrakt gegen Diabetes wirksam (Jafri et al., 2000; Saxena und Vikram, 2004; Katz et al., 2007; Parmar und Kar, 2007, 2008a; Bagri et al., 2009), Punica granatum1 E78 Insulinsensitivität steigt, oxidativer Stress reduziert (Jurenka, 2008), Wirkung evtl. über PPARα und γ (Li et al., 2008b), α-Amylase- hemmung (Prashanth et al., 2001b), Samen nicht wirksam (Jelodar et al., 2007) Quisqualis indica J131 gegen Krebs (Efferth et al., 2008) zur Diabetestherapie eingesetzt (Li et al., Rheum officinale1 J133 2004a), α-Glucosidaseinhibitor (Nishioka et al., 1998) schützt vor Diabetesspätfolgen, keine Auswir- kungen auf Glucosewerte (Liu et al., 2005; Yue Salvia miltiorrhiza1 B71 et al., 2006), in Diabetestherapie verwendet (Li et al., 2004a) traditionell bei Erkrankungen der Niere und der Harnwege, antioxidativ und antimikrobiell Santalum album B72 (Scartezzini und Speroni, 2000; Luo et al., 2007; Ballabh et al., 2008) Sargentodoxa cuneata B75 antimikrobiell (Li et al., 2005; Li et al., 2006) α-Glucosidaseinhibitor; nicht aktiv, wenn Scutellaria baicalensis1 B78, B79 nicht oral verabreicht (Nishioka et al., 1998; Waisundara et al., 2008a; Xie et al., 2009)

1 auch bei Literaturrecherche genannt 112 Diskussion

Radikalfänger, Disaccharidasehemmung (Shi Sophora japonica1 B81 et al., 1998; Jung et al., 2006) antioxidativ und antiinflammatorisch (Li et al., Spatholobus suberrectus B82 2003c; Liao et al., 2008) α-Glucosidasehemmung (Önal et al., 2005), blutzuckersenkend Einzelfallbericht (Goksu et Taraxacum officinale1 R28 al., 2010), kein Einfluss (Swanston-Flatt et al., 1989b), Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) Terminalia immaturus B85 keine Literatur antioxidativ und antiinflammatorisch (Deepak Verbena officinalis B93 und Handa, 2000; Casanova et al., 2008) α-Glucosidasehemmung (Önal et al., 2005), Viscum album1 E37 blutzuckersenkend (Orhan et al., 2005); kein Effekt (Swanston-Flatt et al., 1989a) Vorläufige Speziesnummer 904 J146 ? Vorläufige Speziesnummer 905 J148 ? antidiabetisch (Kar et al., 2003; Akhani et al., 2004; Al-Amin et al., 2006; Ojewole, 2006; Zingiber officinale1 B102, B103 Islam und Choi, 2008), α-Glucosidase- hemmung (Nishioka et al., 1998)

Moleküle, die Invertasen hemmen, sind in der Regel klein und hydrophil. Da diese in Methanol gut löslich sind, nicht jedoch in Hexan, ist der hohe Anteil der aktiven Methanolextrakte im Gegensatz zu Hexanextrakten erklärbar.

Mehr als zehn der positiv getesteten Pflanzen wurden nicht im Zusammenhang mit Diabetes in der Literatur genannt. Häufig konnte eine antioxidative, antiinflammatorische oder die Wir- kung gegen Krankheitserreger festgestellt werden. Die häufigsten Studien mit Pflanzen be- schäftigen sich mit diesen Eigenschaften, so dass es nicht erstaunlich ist, wenn Daten dazu vorliegen, nicht aber gegen Diabetes. Dies schließt eine Wirksamkeit der genannten Pflanzen nicht aus, es weist nur darauf hin, dass es noch keine Studien zu dieser möglichen Wirkung der Pflanze gegeben hat. Der Großteil der in der Literaturrecherche genannten und getesteten Extrakte zeigte keine Hemmung der eingesetzten Invertasen. Daher bietet die Literaturrecherche nur einen An- haltspunkt auf der Suche nach Pflanzen, die sich für ein Screening eignen.

Von 36 Pflanzen, deren Extrakte eine Hemmung von über 20 % bei mindestens einer der drei Invertasen zeigten, hemmten 17 Pflanzen mehr als eine Invertase. Von den Pflanzen, die die humane Sucrase gehemmt haben und die auch in der Literatur schon als α-Glucosidase- inhibitoren beschrieben sind, hemmten Sophora japonica, Cinnamomum cassia, Rheum officinale und Scutellaria baicalensis auch die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum, allerdings nicht die Hefeinvertase.

Auffällig bei den Ergebnissen war, dass sowohl die humane Sucrase als auch die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum durch die gleichen 18 Extrakte gehemmt wurden, wohingegen die

1 auch bei Literaturrecherche genannt 113 Diskussion

Hefeinvertase, die an sich fast nicht gehemmt wurde, nur in drei Extrakten mit den beiden anderen Enzymen übereingestimmt hat. Somit scheint die Ähnlichkeit der Enzyme zueinander, die extrazelluläre Invertase aus C. rubrum und die Hefeinvertase gehören beide zur GH-32- Familie, nichts über das mögliche Ausmaß der Hemmung auszusagen.

3.7. Pflanzen als Bestandteil der Diabetestherapie Die Behandlung vieler Krankheiten wird in einem Großteil der Welt mit pflanzlicher Medizin zumindest teilweise praktiziert, da sie günstiger ist und leichter zur Verfügung steht als definierte Medikamente. Dies gilt auch für Diabetes mellitus, der in vielen Ländern traditionell behandelt wird bzw. pflanzliche Medizin als zusätzliche Therapie von den Patienten ge- wünscht wird (Egede et al., 2002; Yeh et al., 2002; Chang et al., 2007).

Die Literatur zu Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. als Glucosidasehemmstoffe ist sehr umfangreich. Die Liste im Anhang mit über 500 Pflanzen gibt einen Einblick, erhebt aber keinen Anspruch auf Vollständigkeit und bezieht nur Pflanzen ein, die in der Literatur genannt wurden und auf den Blutzuckerspiegel wirken. Weitere Untersuchungen wie etwa antioxidative Wirkung oder Auswirkungen auf andere Blutparameter, einzelne Zelltypen oder Enzyme wurden nicht berücksichtigt. Etwa 70 der 500 Pflanzen werden als α- Glucosidaseinhibitoren bzw. als α-Amylaseinhibitoren beschrieben.

Zu Pflanzen, von denen schon seit langem bekannt ist, dass sie gegen Diabetes verwendet werden und die darüberhinaus in vielen Ländern heimisch sind, gibt es meist viel Literatur. Allerdings sind die Ergebnisse der verschiedenen Tests und Untersuchungen dann sehr wider- sprüchlich. Gute Beispiele hierfür sind etwa Zwiebel (Allium cepa), Knoblauch (Allium sativa), Bittermelone (Momordica charantia) oder Zimt (Cinnamomum cassia). Auffällig sind darüber- hinaus Veröffentlichungen zu Pflanzen, die nur von einem einzigen Labor getestet wurden und zu denen es auch keine weitere Literatur im Zusammenhang mit Diabetes gibt, etwa Asteracanthus longifolia, Guaiacum coulteri, Malmea depressa, Scoporia dulis oder Tinospora crispa, oder einzelne Arbeitsgruppen, die regelmäßig Ergebnisse zu einzelnen Pflanzen veröf- fentlichen, etwa Ojewole / Musabayane (Südafrika), Hikino / Konno (Japan) oder Andrade- Cetto (Mexiko). Literaturangaben finden sich bei den jeweiligen Pflanzen (Liste Kap. 6.6) bzw. direkt in der Literaturliste.

Auch kommt es vor, dass der wissenschaftliche Name der Pflanzen nicht richtig angegeben ist oder nur die verwendete Droge genannt wird. So gibt es Veröffentlichungen eines Labors zu Brickellia veronicaefolia, die Pflanze jedoch heißt korrekt Brickellia veronicifolia, ein weiteres Beispiel ist Aralia elta anstelle von Aralia elata. Bei einem Screening nach Inhibitoren für α-Glucosidasen werden nur die verwendeten Drogen genannt, etwa Gastrodiae Rhizoma oder Dictamni Radicis Cortex, der Pflanzenname wird nicht erwähnt (Choi et al., 2000).

Ein Großteil der Pflanzen, die in der Diabetestherapie angewendet werden, sind Gewürze, Gemüse oder Obst (Roman-Ramos et al., 1995; Platel und Srinivasan, 1997; Srinivasan, 2005). Daher sind zum Beispiel auch viele Vertreter der Gattung der Schmetterlingsblütler vertreten; für einige Inhaltsstoffe wie Rosmarinsäure und andere phenolische bzw. terpenoide Kompo- 114 Diskussion

nenten konnte die Hemmung von Amylasen bzw. Glucosidasen nachgewiesen werden (Miyaza- ki et al., 2003; McCue und Shetty, 2004; Gao et al., 2008b; Adisakwattana et al., 2009). Auch Kürbisgewächse stellen eine große Gruppe (Chandrasekar et al., 1989), allerdings konnten keine wirksamen Inhaltsstoffe gefunden werden.

Die Mehrzahl der zitierten Studien entspricht darüberhinaus nicht den aktuellen wissenschaftlichen Anforderungen, was auch in Metastudien immer wieder als Hauptproblem genannt wird (Liu et al., 2007; Ooi et al., 2010). Eine wirkliche Aussage über die Wirksamkeit der Pflanzen ist kaum möglich. Für einige Pflanzen gibt es viele Studien, die teilweise eine Wirksamkeit belegen, teilweise aber auch nicht. Hier ist von Nachteil, dass die Inhaltsstoffe der verwendeten Pflanzen nicht bestimmt werden. Da auch nichts über das Alter der verwendeten Pflan- zen, deren Anbaugebiet, Erntezeitpunkt oder die Sorte bekannt ist, können die uneinheitli- chen Ergebnisse eventuell auf unterschiedliche Inhaltsstoffe bzw. deren unterschiedliche Mengenverhältnisse zurückgeführt werden.

In vielen Studien wird die blutzuckersenkende Wirkung der Pflanzen auf mögliche Wirkmecha- nismen hin untersucht. Häufig ist von einer verzögerten Glucoseaufnahme aus dem Darm die Rede. Diese kann zum einen durch mechanische Hinderung durch gequollene Ballaststoffe, die Hemmung von Verdauungsenzymen, Hemmung des aktiven Glucosetransportes oder eine ver- änderte Darmmobilität bewirkt werden. Auch die verstärkte Ausschüttung von Insulin aus β- Zellen, eine gesteigerte Insulinwirkung (verstärkte Glucoseaufnahme ins Gewebe, veränderter Lebermetabolismus) oder die Verminderung der Insulinresistenz über eine agonistische Wir- kung am PPARγ-Rezeptor werden diskutiert.

Die Wirksamkeit der meisten Pflanzen ist zwar nicht zweifelsfrei belegt, dennoch werden diese von vielen betroffenen Patienten eingenommen, wenn nicht als alleinige, dann doch als unterstützende Therapie. Dabei sind pflanzliche Präparate ein wichtiger Bestandteil komple- mentärer und alternativer Medizin, zu der außerdem Nahrungsergänzungsmittel, Ernährungs- vorschriften, spirituelle Handlungen oder auch Entspannungstechniken gehören (Chang et al., 2007). Akteure im Gesundheitswesen müssen sich über chemische Inhaltsstoffe, den ange- nommenen Wirkmechanismus, Neben- und Wechselwirkungen der pflanzlichen Medizin infor- mieren und mögliche Neben- und Wechselwirkungen den Patienten mitteilen (Chang et al., 2007; Shane-McWhorter, 2009). Die Einnahme von Bittermelone etwa sollte bei einer bekannten Allergie gegen Kürbisgewächse unterlassen werden, ebenso sollten Schwangere Bitterme- lonenpräparate nicht einnehmen, da diese zu einer Fehlgeburt führen könnten (Campbell, 2010). Auch kann die Einnahme ohne Wissen des Arztes zu falschen Einschätzungen der Schwere der Erkrankung führen (Cicero et al., 2004). In vielen Studien konnte gezeigt werden, dass sich pflanzliche Präparate positiv auf viele durch Diabetes mellitus verschlechterte Parameter auswirken und damit pharmakologisch aktiv sind. Für einen zukünftig vermehrten Einsatz dieser Mittel bei einer Großzahl von Pati- enten ist es jedoch unabdingbar verstärkt Informationen über Sicherheit und Effektivität der Präparate durch Studien zu gewinnen (Tackett und Jones, 2009). 115 Diskussion

3.8. Ausblick Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein großer Bogen geschlagen von den Enzymeigenschaften verschiedener Invertasen über diverse Möglichkeiten ihre Aktivität zu beeinflussen bis hin zur speziellen Anwendung von Invertaseinhibitoren in der Diabetestherapie und der Suche nach Inhibitoren in verschiedenen Pflanzenextrakten bzw. in der Literatur zu Pflanzen, die traditionell gegen Diabetes mellitus verwendet werden. Dieser Blickwinkel, der die Forschung zu α- Glucosidasen und β-Fructofuranosidasen zusammenfasst und diese unter vielfältigen Aspekten beleuchtet, bietet für weiterführende und vertiefende Forschung viele Ansatzpunkte.

Heterologe Expression der humanen Sucrase in P. pastoris Die Arbeit mit P. pastoris gestaltete sich als schwieriger als im Vorfeld angenommen. Es konnte eine aktive Untereinheit der humanen Sucrase exprimiert werden, für weitere Versuche wäre es jedoch wünschenswert mit einem Konstrukt zu arbeiten, das sowohl eine Auf- reinigung der Sucrase ermöglicht als auch - dem urspünglichen Zustand entsprechend – glykosiliert ist. Für neue Konstrukte sollte in Betracht gezogen werden, dass drei Positionen vor dem Startcodon ein Adenin eingefügt wird (Kozak, 1986, 1987). Auch eine Anpassung des Codon-Usage kann zu besseren Ergebnissen führen (Shumiao et al., 2010). Darüberhinaus könnten die verwendeten Methoden optimiert werden, da inzwischen Methoden speziell für P. pastoris in Nachschlagewerken veröffentlicht werden bzw. neuartige Medien wie Videojour- nals bessere Einblicke in die Methoden geben können (Cregg et al., 2009; Weidner et al., 2010). Weiterführende Schritte könnten die Verwendung eines P. pastoris-Stammes sein, der N-Glykosilierungen nach humanem Muster durchführt (De Schutter et al., 2009) oder die Op- timierung der weiteren Einflüsse auf den verwendeten Promotor, etwa den AOX1-Promotor (Xuan et al., 2009). Auch bleibt abzuklären, ob mit den bisher verwendeten Konstrukten die humane Sucrase nicht gebildet oder aber gebildet und wieder abgebaut wurde. Störend kann sich hier auch das wiederholte Start-Codon im Konstrukt pPShSH auswirken (Kozak, 1996).

Proteinogene Invertaseinhibitoren Die Hemmtests mit proteinogenen Invertaseinhibitoren aus Tabak, Zuckerrübe und Arabidopsis wurden nur auf die eingesetzte Gesamtproteinmenge bezogen durchgeführt. Da es sich um Rohextrakte aus Tabakpflanzen gehandelt hat, ist davon auszugehen, dass die tat- sächliche Menge an Inhibitorprotein in den einzelnen Extrakten unterschiedlich groß war. Um Aussagen über die unterschiedlich starke Hemmkraft der Inhibitoren treffen zu können, müs- sen diese zur Homogenität aufgereinigt werden, so dass die Konzentration bestimmt und in die Rechnungen einbezogen werden kann. Dies ist auch v.a. für die Inhibitoren aus Arabidopsis von Bedeutung, da diese Extrakte eine deutlich schlechtere Hemmung gezeigt haben. Hier stellt sich die Frage, ob die Inhibitoren selbst schlechter wirken als die anderer Spezies oder das Expressionssystem für diese Proteine weniger geeignet ist.

Die heterologe Expression der Invertaseinhibitoren aus Arabidopsis thaliana in P. pastoris wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht weiterverfolgt. Eine Strukturaufklärung des glykosilierten Inhibitorproteins von AtC/VIF2 könnte Auskunft darüber geben, ob falsch oder nicht geknüpfte Disulfidbrücken ein Grund für die Inaktivität des Proteins sind. 116 Diskussion

Temperaturoptima verschiedener Invertaseisoformen Die getesteten Invertasepräparationen zeigten ein Temperaturoptimum von 40 – 50 °C. Für Hefeinvertase ist bekannt, dass sie ein hohes Temperaturoptimum von über 50 °C besitzen (Bhatti et al., 2006). Innerhalb der Hefen gibt es unterschiedliche Ausprägungen, so sind He- fen mit thermophilen Invertasen bekannt (Linde et al., 2009). Auch für Bakterien sind sucrosespaltende Enzyme mit hohen Temperaturoptima bekannt (Hernalsteens und Maugeri, 2008), ebenso mit niedrigeren (de la Vega et al., 1991; Cuezzo de Gines et al., 2000). Hier stellt sich die Frage, ob es auch bei pflanzlichen sauren Invertasen Anpassungen des Tempera- turoptimums an die Umgebung gibt. Die Abweichungen der Optima der Invertasen der getesteten Pflanzen waren nicht sehr groß, es handelte sich jedoch auch nur um solche, die v.a. in den gemäßigten Breiten vorkommen. Untersuchungen der Temperaturoptima von Arten, die sich als Organismus an extremere Umweltbedingungen angepasst haben, wie etwa Anpassung an Kälte oder Hitze, könnten zeigen, ob die Optima der Invertasen erhalten blieben oder, wie etwa bei thermophilen Bakterien, an die Umweltbedingungen angepasst wurden.

Suche nach spezifischen Invertaseinhibitoren Die getesteten Invertaseinhibitoren zeigten zum Teil spezifisches Hemmverhalten, zum Teil wurden alle verwendeten Invertasen gehemmt. Gerade bei den verwendeten β- Fructofuranosidasen wurde die Hemmung v.a. durch die Art der Pflanze beeinflusst, kaum durch die Isoform der Invertase. Für die Grundlagenforschung wäre es jedoch von Vorteil, die verschiedenen Isoformen der β-Fructofuranosidasen aus Pflanzen bzw. aus Pilzen spezifisch zu hemmen. Hier gilt es nach weiteren Inhibitoren zu suchen, deren Hemmstärke durch die Art der Invertase und nicht des Organismus bestimmt wird. Somit können Erkenntnisse über das Zusammenspiel der Invertaseisoformen erhalten werden bzw. durch gezieltes Ausschalten einer Isoform kann deren physiologische Bedeutung besser verstanden werden. Auch eine spezifische Hemmung der Hefeinvertase wäre nützlich, da Hefeinvertasen in männlich sterilen Pflanzen zur Wiederherstellung der Fertilität eingesetzt werden können und eine spezifische Hemmung zur Überprüfung der Methode herangezogen werden könnte (Engelke et al., 2010).

Weiterarbeit mit den Ergebnissen des durchgeführten Screenings Um die Ergebnisse des Screenings zu überprüfen könnten verschiedene Methoden eingesetzt werden. So können Zucker mittels hochauflösender Anionenaustauscherchromatographie aufgetrennt und mit gepulster Amperometrie detektiert werden, was als alternative Methode zur Bestimmung der Glucosemenge mittels GOP-POD eingesetzt werden kann (Lasseur et al., 2009). Diese Methode hat den Vorteil, dass redox-aktive Substanzen die Detektion nicht stö- ren können. Alternativ kann mit einer Dünnschichtchromatographie ein Extrakt auf die Hem- mung von α- oder β-Glucosidasen untersucht werden. Dazu müssen die jeweiligen Substrate eingesetzt werden, eine Hemmung ist anhand der fehlenden Farbentwicklung zu erkennen (Simoes-Pires et al., 2009).

Extrakte, die im Rahmen dieser Arbeit die Aktivität der humanen Sucrase bzw. die der extra- zellulären Invertase aus C. rubrum hemmen konnten, sollten auf ihre wirksamen Komponen- ten hin untersucht werden. Nach einer Isolierung der Substanzen könnten diese direkt im 117 Diskussion

Tierversuch eingesetzt werden und somit die Wirksamkeit direkt bestimmt werden. Allerdings ist zu beachten, dass die Wirkung häufig durch ein Zusammenspiel verschiedener Substanzen erreicht wird und nicht nur durch einen einzelnen Inhaltsstoff.

Durchführung weiterer Hemmtests zur Suche nach neuen Invertaseinhibitoren Für diese Arbeit wurde Literatur zu Pflanzen, die in der Diabetestherapie eingesetzt werden, recherchiert. Nur 60 der über 500 in dieser Sammlung genannten Pflanzen wurden im durch- geführten Screening auf eine mögliche Hemmwirkung hin untersucht. Von 74 Pflanzen, für die eine α-Glucosidasen- oder α-Amylaseninhibition beschrieben ist bzw. die einen proteinogenen Inhibitor enthalten könnten, wurden erst 13 untersucht. Für weitere Hemmtests wären die Pflanzen gute Kandidaten, die als Inhibitoren beschrieben sind, aber noch nicht untersucht werden konnten, z.B. Extrakte von Curcuma longa, Jatropha curcas, Pueria lobata oder Trichosanthes kirilowii. Extrakte dieser Pflanzen wurden in der vorliegenden Arbeit getestet, allerdings wurden diese aus Pflanzenteilen gewonnen, für die in der Literatur keine Wirkung beschrieben ist. Neben der Untersuchung weiterer Pflanzen wäre eine Ausdehung des zu testenden Materials auf marine Lebewesen möglich. Wie in der Einleitung erwähnt, wurden Glucosidase- hemmstoffe bereits aus Schwämmen isoliert (Nakao et al., 2000; Nakao et al., 2002; Takada et al., 2004). Auch Muscheln werden für die Behandlung des Diabetes mellitus genannt (Li et al., 2004a). Neben marinen Lebewesen könnten auch Pilze einbezogen werden (Hikino et al., 1985b; Choi et al., 2000; Li et al., 2004a).

Weiterführende Ansätze Die in der Arbeit mit Invertasen und Invertaseinhibitoren gewonnen Erkenntnisse bilden einen Wissensgrundstock für Arbeiten auch in anderen Feldern. Der Kohlenhydratstoffwechsel beeinflusst den Organismus der Pflanze in allen Bereichen. So können die Ergebnisse aus gen- technischen Ansätzen auf nicht-gentechnische Ansätze übertragen werden, etwa auf Untersu- chungen des Kohlenhydratstoffwechsels bzw. des Kohlenhydratstatus, die eine Prädisposition für die Bildung von doppelhaploiden Pflanzen bzw. eine Effiezienzerhöhung bei deren Bildung bewirken können. Dies ist vor allem in der klassischen Züchtung von Bedeutung.

Der rotbraune Reismehlkäfer (Tribolium castaneum) ist ein Vorratsschädling, dessen Erbgut sequenziert ist und der sich als allgemeiner Modellorganismus neben Drosophila etabliert hat, auch für Tests zur Schädlingsbekämpfung. Bei Untersuchungen mit Pflanzenextrakten konnten diese das Wachstum und die Vermehrung von Tribolium castaneum verhindern, dabei konnte eine Hemmung der α-Amylaseaktivität im Larvenstadium festgestellt werden (Jbilou et al., 2008). Da die Übergänge zwischen α-Amylaseinhibitoren, α-Glucosidaseinhibitoren und Hemmstoffen der β-Fructofuranosidasen fließend sind, eröffnet sich damit ein neues Feld für den Einsatz von Invertaseinhibitoren aus Pflanzen als Insektizide. Weitere Untersuchungen könnten Klarheit darüber bringen, ob auch die in einigen Insekten vorhandenen β-Fructofuranosidasen (Santos und Terra, 1986; Carneiro et al., 2004; Daimon et al., 2008) gehemmt werden oder nicht. 118 Materialien und Methoden

4. Materialien und Methoden

4.1. Materialien

4.1.1. Chemikalien und Enzyme

Chemikalien und Kits wurden, sofern es nicht anders angegeben ist, von folgenden Firmen bezogen: Amersham (Buckinghamshire, UK), AppliChem (Darmstadt), Diagonal (Münster), Macherey-Nagel (Düren), Merck (Darmstadt), Promega (Mannheim), Qiagen (Hilden), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Sigma-Aldrich (Taufkirchen).

MS- und LS-Fertigmedien und das Antibiotikum Zeocin wurden von der Firma Duchefa (Haar- lem, NL) bezogen.

DNA-Polymerase (Taq) wurde bei Segenetic (Borken), Endo H und Phusion High Fidelity DNA- Polymerase bei New England Biolabs (Frankfurt) gekauft, alle weiteren Enzyme, die moleku- larbiologisch verwendet wurden, wurden bei der Firma Fermentas (St. Leon-Roth) bezogen.

Miglitol wurde von der Firma Novartis (Frankfurt) bezogen.

DMDP wurde von Prof. García Fernández (Universität Sevilla, Spanien) zur Verfügung gestellt.

Calystegin B2 wurden von Prof. Dräger (Universität Halle-Wittenberg) zur Verfügung gestellt.

Plasmide mit der cDNA der humanen Isomaltase-Sucrase wurden von Prof. Naim (Tierische Hochschule, Hannover) zur Verfügung gestellt.

Ein Klon mit der alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum wurde von Dr. Gal- lagher (Universität Aberystwyth, Großbritannien) zur Verfügung gestellt.

Ein Klon zur heterologen Expression einer vakuolären Invertase aus Triticum aestivum wurden von Prof. van den Ende (Universität Leuven, Belgien) zur Verfügung gestellt, ein Klon mit einer vakuolären Invertase aus Bambusa oldhamii von Dr. Wang (National Taiwan University, Taiwan).

Das Plasmid pPT4 und die Sequenz des alpha-Faktors wurden von ao. Prof. Glieder (TU Graz, Österreich) zur Verfügung gestellt, ebenso der P. pastoris-Stamm X-33.

Der Stamm C58C1 des Agrobakterium tumefaciens und die Konstrukte für die heterologe Ex- pression von Invertase-Inhibitoren aus Tabak, Arabidopsis und Zuckerrübe wurden von Dr. Greiner (Universität Heidelberg) zur Verfügung gestellt.

Extrakte von Pflanzen der Traditionellen Chinesischen Medizin wurden von Prof. Bauer (Karl- Franzens-Universität Graz, Österreich) und Joanneum Research (Graz, Österreich) zur Verfü- gung gestellt. 119 Materialien und Methoden

4.1.2. Nährmedien Alle Medien wurden bei 121 °C und 2 bar für 30 min autoklaviert. Hitzeempfindliche Kompo- nenten (Antibiotika, Aminosäuren und Biotin) wurden sterilfiltriert und nach dem Abkühlen hinzugefügt, Glucose wurde separat autoklaviert und nach dem Abkühlen beigemischt. Antibi- otika wurden den Resistenzen der Klone entsprechend verwendet.

Für Festmedien wurden 1,5 – 2 % Bacto-Agar vor dem Autoklavieren hinzugefügt.

4.1.2.1. Bakterienmedien Agrobakterien-Testmedium: 1 % Lactose, 0,1 % Hefeextrakt LB-Medium: 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl  pH 7,0 LB-Medium low salt: 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl  pH 7,0 YEB-Medium: 0,5 % Fleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,1 % Hefeextrakt,

0,5 % Saccharose, 0,05 % MgSO4  pH 7,2 Antibiotika: Ampicillin 50 oder 100 mg/L, Carbenicillin 50 mg/L, Kanamycin 50 mg/L, Rifampicin 50 mg/L, Spectinomycin 50 mg/L, Tetracyclin 10 mg/L, Zeocin 25 mg/L Endkon- zentration

4.1.2.2. Pilzmedien -5 BMD1% 0,2 M K-PO4-Puffer, pH 6, 1,34 % YNB, 4 x 10 % Biotin, 1 % Glucose

-5 BMD 0,2 M Na-PO4-Puffer, pH 4,5 / 6, 1,34 % YNB, 4 x 10 % Biotin, 1 % Glucose

BMGY 0,1 M K-PO4-Puffer, pH 6, 1,34 % YNB, 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 4 x 10-5 % Biotin, 1 % Glycerin

-5 BMM2 0,2 M K-PO4-Puffer, pH 6, 1,34 % YNB, 1 % MeOH, 4 x 10 % Biotin

-5 BMM10 0,2 M K-PO4-Puffer, pH 6, 1,34 % YNB, 5 % MeOH, 4 x 10 % Biotin

BMMY 0,1 M K-PO4-Puffer, pH 6, 1,34 % YNB, 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 4 x 10-5 % Biotin, 0,5 % MeOH

-5 BMS 0,2 M Na-PO4-Puffer, pH 4,5 / 6, 1,34 % YNB, 4 x 10 % Biotin,1 % Saccharose YPD 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glucose YPG 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1 % Glycerin YPM 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 0,5 - 5 % MeOH YNB 0,67 % YNB, 2 % Glucose PDA 3,9 % Potato Dextrose Agar Zusätze: Histidin 20 mg/L, Leucin 60 mg/L, Zeocin 100 mg/L Endkonzentration Ergänzung des Namens mit „H“: 0,004 % Histidin für GS115

120 Materialien und Methoden

4.1.2.3. Zellkulturmedien, Pflanzenmedien Zellkultur: Arabidopsis thaliana: mixotroph: 0,32 % MS 210, 1 x 10-4 % 2,4-Dichlor- phenoxysäure (2,4-D), 2 % Suc  pH 5,7 autotroph: 0,32 % MS 210, 1 x 10-4 % 2,4-D  pH 5,7 Chenopodium rubrum: 0,43 % MS 221  pH 5,7 Eschscholtzia californica AST: 4,6 % LS, 4 x 10-5 % 2,4-D, 3 % Suc  pH 6,0 Gypsophila arabica: 4,6 % LS, 4 x 10-5 % 2,4-D, 3 % Suc  pH 6,0 Solanum lycopersicum: autotroph: 0,441 % MS 222, 2 x 10-6 % 2,4-D  pH 5,7

heterotroph: 0,441 % MS 222, 0,017 % KH2PO4, 1 x 10-5 % 2,4-D, 2 x 10-6 % Kinetin, 3 % Suc  pH 6,0 Nicotiana tabacum BY2: 0,43 % MS 221, 0,2 % MES, 0,001 % Inosit, 0,02 % -4 -5 KH2PO4, 1 x 10 % Thiamin, 2 x 10 % 2,4-D, 3 % Suc  pH 5,8 Petrosilium crispum: 0,32 % MS 210, 1 x 10-4 % 2,4-D, 2 % Suc  pH 5,5 Festmedium: Cleome droserifolia: 0,32 % MS 210, 1 x 10-4 % 2,4-D, 0,3 % Gelrite  pH 5,7

4.1.3. Puffer und Lösungen

4.1.3.1. Puffer und Lösungen für molekularbiologische Arbeiten

Aufschlusspuffer I 20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 % Glycerin, 1 mM DTT, 0,3 M Ammoniumsulfat, 1 mM PMSF Aufschlusspuffer II 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl

Aufschlusspuffer III 50 mM NaPO4 pH7,4, 1 mM PMSF, 1mM EDTA, 5 % Glycerin BEDS-Lösung 10 mM Bicin-NaOH, pH 8,3, 3 % (v/v) Ethylenglykol, 5 % (v/v) DMSO, 1 M Sorbitol DNA-Auftragepuffer 10X 0,3 % Orange G, 60 % Glycerin, 20 mM EDTA LiAc / TE 100 mM LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA  pH 8,0 PEG-Lösung 40 % PEG 4000, 100 mM LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA  pH 8,0 PCI 25 Teile Phenol, 24 Teile Chloroform, 1 Teil Isoamylalkohol, 1 % 8-Hydroxychinolin

TBE 5X 5,6 % Tris-HCl, 2,75 % H3BO3, 0,465 % EDTA  pH 8,3 TE+RNase 98 µL TE, 2 µL RNase TENS 9,4 mM Tris-HCl, 0,94 mM EDTA, 0,5 % SDS, 0,1 M NaOH

4.1.3.2. Puffer und Lösungen für proteinchemische Arbeiten Bradford-Reagenz 0,01 % CBB G-250, 5 % EtOH, 10 % Phosphorsäure conc. SDS-PAGE – Lösungen: Laufpuffer 0,3 % Tris, 1,44 % Glycin, 0,1 % SDS 121 Materialien und Methoden

Sammelgel 5 % Acrylamidmischung, 130 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 % SDS, 0,1 % APS, 0,1 % TEMED Trenngel, 8 % 8 % Acrylamidmischung, 390 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,1 % SDS, 0,1 % APS, 0,06 % TEMED Trenngel, 15 % 15 % Acrylamidmischung, 390 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,1 % SDS, 0,1 % APS, 0,04 % TEMED Proteinauftragepuffer 10X 160 mM Tris-HCl pH 6,8, 28 % Glycerin, 3 % SDS, 10 mM DTT, 0,05 % Bromphenolblau Natives Gel – Lösungen Auftragepuffer 50 % Glycerin, 0,05 % Bromphenolblau, 0,3 M Tris-HCl pH 6,8 Laufpuffer 0,3 % Tris, 1,44 % Glycin Silberfärbung – Lösungen: Fixierlösung 0,4 M Na-Ac, 0,5 % AcOH, 30 % EtOH, 0,5 % Glutaraldehyd,

0,1 % Na2S2O3

-4 Silberlösung 0,1 % AgNO3, 1 x 10 % Formaldehyd

Entwicklungslösung 0,015 % Formaldehyd, 2,5 % Na2CO3 Coomassie-Färbelösung 0,008 % CBB G-250, 35 mM HCl Aktivitätsfärbung – Lösungen: Saccharoselösung 4,5 % Saccharose, 0,05 M Na-Ac pH 4,5 Färbelösung 0,1 % 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, 0,5 M NaOH Puffer für die Kationenaustauscherchromatographie: Puffer 25 mM Tris-HCl pH 9,0, 1 mM PMSF, 0,1 mM Benzamidin Elutionspuffer 25 mM Tris-HCl pH 9,0, 1 mM PMSF, 0,1 mM Benzamidin, 1 M NaCl Puffer für die Anionenaustauscherchromatographie:

Puffer 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 % Glycerin, 20 mM β-Glycerophosphat, 10 mM NaF

Elutionspuffer 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 % Glycerin, 1 M NaCl Puffer für die Con A-Affinitätsaufreinigung:

Puffer 50 mM Na-Ac pH 6,8, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 1 mM PMSF

Elutionspuffer 50 mM Na-Ac pH 6,8, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 1 mM PMSF, 15 % Methyl-α-D-glucopyranosid Puffer für die his-tag-Affinitätsaufreinigung:

Puffer 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaOH  pH 8

Elutionspuffer 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaOH, 250 mM Imidazol pH 8

4.1.3.3. Puffer und Lösungen für analytische Arbeiten

GOD-POD-Reagenz 0,1 M K-PO4 pH 7,0, 0,8 u/mL POD, 10 u/mL GOD, 0,08 % ABTS Fließmittel für DC 3 Teile Ethylacetat, 1 Teil Essigsäure, 1 Teil Wasser Sprühreagenz 1 Teil Schwefelsäure conc.,1 Teil Methanol 122 Materialien und Methoden

4.1.3.4. Puffer und Lösungen für die Arbeit mit Extrakten

Homogenisationspuffer 200 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 2 % Glycerin, 0,1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin

Hochsalzpuffer 200 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 15 mM EDTA, 2 % Glycerin, 0,1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 1 M NaCl

Phosphatpuffer 10 mM Na2HPO4, 15 mM NaH2PO4  pH 7,0

Salzpuffer 10 mM Na2HPO4, 15 mM NaH2PO4, 15 mM EDTA, 1M NaCl  pH 7,0

4.1.3.5. Sonstige Puffer und Lösungen

Benedicts-Reagenz I) 173 g Na-Citrat, 100 g Na2CO3 in 700 mL Wasser lösen

II) 17,2 g CuSO4 in 200 mL Wasser lösen III) beide Lösungen mischen, auf 1 L mit Wasser auffüllen MES-Puffer 5 mM MES pH 5,6, 10 mM MgCl2, 150 µM Acetosyringon Sterilisationslösung für Samen: 1,2 % NaOCl, 0,1 % Tween 20 TE 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA  pH 8,0

4.1.4. Verwendete Organismen und Plasmide

4.1.4.1. Bakterien Escherichia coli DH5α Der Stamm E. coli DH5α wurde für die Klonierungsarbeit verwendet. Dafür wurden die Bakte- rien entweder auf LB-Agarplatten im Wärmeschrank oder in LB-Flüssigmedium im Schüttler bei 37 °C, bei Bedarf mit dem entsprechenden Antibiotikum, angezogen.

Escherichia coli Solar Ein Klon mit der alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum wurde zur Protein- expression verwendet (Resistenz gegenüber Ampicillin 50 mg/L). Die Anzucht erfolgte bei 37 °C mit LB-Medium.

Pseudomonas syringe pv tomato Die beiden Stämme Pseudomonas syringe pv tomato DC3000 und DC3000avrRPM1 wurden als Elicitoren verwendet. Der DC3000 Stamm ist virulent (Resistenz gegenüber Rifampicin 50 mg/L), der DC3000avrRPM1 Stamm hingegen ist avirulent (Resistenz gegenüber Rifampicin 50 mg/L und Tetracyclin 10 mg/L). Die Anzucht erfolgte bei 28 °C auf den entsprechenden LB-Platten bzw. im LB-Flüssigmedium.

Agrobacterium tumefaciens C58C1 Der A. tumefaciens Stamm C58C1 (Resistenz gegenüber Rifampicin 50 mg/L und Carbenicillin 50 mg/L) wurde für die transiente Transformation von N. benthamiana Pflanzen verwendet. Die Anzucht erfolgte bei 28 °C in YEB-Flüssigmedium oder auf YEB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika. 123 Materialien und Methoden

4.1.4.2. Pilze Die Anzucht aller genannten Hefestämme erfolgte bei 28 – 30 °C auf den entsprechenden Platten oder im Flüssigmedium.

Saccharomyces cerevisiae SEY21.02 Dieser Invertase-inaktive Stamm wurde für die heterologe Expression von pflanzlichen Enzy- men verwendet. Die Kultivierung erfolgte entweder in Minimalmedium oder Vollmedium. Der Stamm SEY21.02 verfügt über Auxotrophiemarker für die Aminosäuren Histidin, Lysin und Uracil.

Pichia pastoris GS115 Dieser Hefestamm wurde für die heterologe Expression der humanen Sucrase verwendet. Die- ser Stamm ist Histidin-defizient.

Pichia pastoris Mut S Dieser Hefestamm wurde für die heterologe Expression der humanen Sucrase und eines Invertase-Inhibitorproteins aus A. thaliana verwendet. Der AOX 1 – Promotor für die Synthese der Alkohol-oxidase ist inaktiv, so dass der Stamm nur über den AOX 2 - Promotor verfügt, der eine geringere Aktivität hat, so dass der Stamm auf Methanolmedium langsam wächst und der Verbrauch an Methanol geringer ist.

Pichia pastoris X-33 Bei diesem Hefestamm handelt es sich um einen Wildtyp-Stamm. Es wurden Klone zur Prote- inexpression der vakuolären Invertase aus Triticum aestivum und einer vakuolären Invertase aus Bambus verwendet (bei beiden Resistenz gegenüber Zeocin 100 mg/L).

Alternaria brassicicola Der Stamm A. brassicicola MUCL 20297 wurde als Elicitor verwendet. Die Anzucht erfolgte auf PDA-Platten.

E-FOL Der Pilz Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici wurde als Elicitor verwendet.

4.1.4.3. Zellkulturen Folgende pflanzliche Zellkulturen wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet. Die Anzucht erfolgte bei 26 °C in Flüssigkultur.

autotroph mixotroph heterotroph Arabidopsis thaliana X X Chenopodium rubrum X Eschscholtzia californica AST X Gypsophila arabica X Solanum esculentum X X Nicotiana tabacum BY2 X Petroselinum crispum X

124 Materialien und Methoden

4.1.4.4. Pflanzen Pflanzen zur Gewinnung von Invertase-Extrakten: Arabidopsis thaliana Beta vulgaris Brassica napus Nicotiana benthamiana Nicotiana tabacum Solanum lycopersicum

Pflanzen zur Expression proteinogener Invertaseinhibitoren: Nicotiana benthamiana

Die Anzucht der Pflanzen erfolgte im Gewächshaus, die Arabidopsis-Pflanzen wurden in Kli- maschränken unter Kurztagbedingungen angezogen.

Für die Gewinnung von Pflanzenextrakten zur Suche nach möglichen Inhibitoren wurden Cleome droserifolia, Trigonella foenum-graecum und Lupinus termis angezogen, die anderen getesteten Pflanzen und Pflanzenteile wurden entweder im Botanischen Garten Würzburg gesammelt oder gekauft.

4.1.4.5. Plasmide pJet (Fermentas, St. Leon-Roth) Dieser linearisierte Klonierungvektor wurde zur Klonierung von DNA-Fragmenten verwendet. Er ist 3128 bp groß und besitzt blunt ends. Das letale Gen eco47IR soll verhindern, dass falsch-positive Kolonien auf den Selektivplatten mit Ampicillin wachsen.

pPICZ A (Invitrogen, Carlsbad, USA) Dieser Expressionsvektor wurde für die Arbeit mit dem P. pastoris Stamm GS115 verwendet. Dieser Vektor verfügt über einen AOX1-Promotor und eine Zeocin-Resistenz. Am C-terminalen Ende können ein c-myc-Epitop-tag und ein Polyhistidin-tag an das Protein angehängt werden.

pPT4 (Arbeitsgruppe Glieder, TU Graz, Österreich) Dieses Plasmid wurde für die Arbeit mit dem P. pastoris Stamm MutS verwendet. Die Protein- biosynthese unterliegt dem AOX1 - Promotor, die Selektion erfolgt über Zeocin.

pPT4-GAP (Arbeitsgruppe Glieder, TU Graz, Österreich) Dieses Plasmid wurde für die Arbeit mit dem P. pastoris Stamm MutS verwendet. Die Protein- biosynthese unterliegt dem GAP - Promotor, die Selektion erfolgt über Zeocin.

4.1.5. Geräte Es wurden übliche Laborgeräte der Marken Beckmann Coultier (Brea, USA), Binder (Tuttlin- gen), Biometra (Göttingen), Eppendorf (Hamburg), Hettich (Tuttlingen) und Sartorius (Göttin- gen) verwendet.

Spezielle Geräte: Accelerated Solvent Extraction System 200 Dionex (Sunnyvale, USA) Äkta-Prime GE Healthcare (Piscataway, USA) Analysenmühle A-10 Janke + Kunkel (Staufen) Elektroporator Eppendorf (Hamburg) BioRad (München) 125 Materialien und Methoden

Multiskan EX Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA) Phosphorimager Typhoon 9400 GE Healthcare (Piscataway, USA)

4.1.6. Computerprogramme, Webseiten Adobe Reader 8.0 (Adobe Systems, San Jose, USA) Endnote X1 (Thomson Reuters, Philadelphia, USA) Geneious 5.0 (Biomatters Ltd., Aukland, NZ) GNU Image Manipulation Program (The GIMP Team, www.gimp.org) Microsoft Office 2007 (Microsoft Cooperation, Redmond, USA) Statistica 6.0 (StatSoft, Tulsa, USA) Vector NTI 10 (Invitrogen, Carlsbad, USA)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.cazy.org http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ http://pfam.sanger.ac.uk http://www.genevestigator.com http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/querce.pl

4.2. Methoden

4.2.1. Molekularbiologische Methoden

4.2.1.1. Molekularbiologische Methoden für die Arbeit mit DNA

4.2.1.1.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Amplifikation von DNA-Fragmenten wurde mittels PCR durchgeführt. Zum einen wurden Genfragmente für den Nachweis einer erfolgreichen Transformation vervielfältigt, zum anderen vollständige cDNA von Genen für die heterologe Expression. Die benötigten Primer wurden mit dem Programm Vector NTI designt, als Enzyme wurden die Polymerasen Taq (aus Thermus aquaticus), Pfu (aus Pyrococcus furiosus) und Phusion verwendet. Die Pfu-Polymerase enthält im Gegensatz zur Taq-Polymerase eine 3´-5´-Exonucleaseaktivität und kann falsch eingebaute Nucleotide entfernen, allerdings ist ihre Prozessivität niedriger, so dass sie für das gleiche DNA-Fragment mehr Zeit benötigt. Die Phusion-Polymerase arbeitet schneller als die taq- Polymerase und genauer als die Pfu-Polymerase.

Mit dem Reaktionsansatz wurde für die Auftrennung der DNA-Fragmente und um die erfolgreiche Amplifikation zu überprüfen, eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt.

126 Materialien und Methoden

Reaktionsansatz I: Taq-Polymerase Reaktionsansatz II: Pfu-Polymerase

DNA (Matrize) 1 – 100 ng DNA (Matrize) 1 – 100 ng Primer for (10 pmol/µL) 1 µL Primer for (10 pmol/µL) 1 µL Primer rev (10 pmol/µL) 1 µL Primer rev (10 pmol/µL) 1 µL dNTP-Mix (je 10 mM) 1 µL dNTP-Mix (je 10 mM) 1 µL Taq (0,5 U/µL) 1 µL Pfu (5 U/µL) 1 µL 10X Puffer 2,5 µL 10X Puffer 2,5 µL

H2O ad 25 µL H2O ad 25 µL

PCR-Programm: Anfangsdenaturierung 3 – 5 min 95 °C Denaturierung 30 s 95 °C Annealing 30 s 30 – 35 x Elongation 30 s – 3 min 72 °C Finale Extension 5 min 72 °C

Bei der Verwendung der pfu-Polymerase wurde die Elongationszeit verdoppelt. Verwendete Primer:

Restriktions- Primername Sequenz (5´ 3´) schnittstelle GAG AAG AGA GAG GCC GAA GCT GCT alphaCIN1fw TCC TAT AAG TTA CCA AAA CA CTC GAG AAG AGA GAG GCC GAA GCT alphaInh2fw1 AAA TCC AAC ACA ACA ACA ATA ATC G AGC TTC GGC CTC TCT CTT CTC GAG alpha_rv2 AGA G CGA GAA GAG AGA GGC CGA AGC TAT alphasucf1 AAA GTT ACC TTC TGA CCC CAT C TT TGC GGC CGC TTA AGC AAT AGA AGC CIN1Notrv NotI TTT CT DAS_for CCT GTA CGC TGC SCC AGC

DAS_rev GCG TAT CTC TCC CAN CCG AAA GAA TTC AAC GAT GAG ATT CCC ATC ecoalphafw1 EcoRI TAT TTT C Histag_rev TGG CAT TCT GAC ATC CTC TT

hSHtag_for ACT CCT GTC AAT GCA GTT AC

hSIIrev CTC GAG TCT GAC CAG TTG ATT TCT ATT XhoI TTT GCG GCC GCT TAT TCA ACA AGG Inh2Notrv1 NotI CGA TC AAA GAA TTC AAC GAT GCA TCA TCA CCA In2intrecofw1 TCA CCA CAA ATC CAA CAC AAC AAC AAT AAT C

1 entwickelt von Claudia Ruth (AG Glieder, TU Graz)

2 von der AG Glieder, TU Graz zur Verfügung gestellt 127 Materialien und Methoden

I2for GAA TTC ATG GCT TCT TCT CTC ATC TTC EcoRI

I2rev GCG GCC GCT TTC AAC AAG GCG ATC AA NotI

Inhtag_for TAC AAG ATT GCT CCG AGA AG

PARS_for TCG AAC ATA GTC CGT CCC

PARS_rev TCG ATG TCG ACT CAA CCT TAT CTC GAG AAT TCA TGA TAA AGT S forward XhoI, EcoRI TAC CTT CTG ACC ATA CTC GAG AAT TCT CAT GAC CAG S reverse XhoI, EcoRI TTG ATT TC SSeqforward TGA CTA CAT GGA AAG GCA GC

SSeqreverse GAT AAC AGT GCC ACC ATT AG

SSeq3 ACA GTT GGA GGG ATC TTG GA TTT GCG GCC GCT TAT GC CAG TTG ATT sucnotrv1 NotI TCT ATT GG TGA GAA TTC ATG CTT TTG CAA GCT TTC SUC2SS_for EcoRI C AGC GAA TTC CAT TGA TGC AGA TAT TTT SUC2SS_rev EcoRI G SUC2SS_Seq ACT TTC ATA ATT GCG ACT GG

TRP1_for CGT CTT CCC TAT TCC TGG

TRP1_rev TCG AAA CCA TGA GTG TGG

Zeofor AAG TTG ACC AGT GCC GTT CC

Zeorev TCA GTC CTG CTC CTC GGC C

Die Primer wurden von den Firmen Biomers (Ulm), Metabion (Martinsried) und Invitrogen (Car- lsbad, USA) bezogen.

4.2.1.1.2. Overlap Extension PCR Mittels der Overlap Extension PCR werden Genfragmente miteinander verknüpft. Diese Me- thode wurde für die Konstrukte mit dem Plasmid pPT4 bzw. pPT4-GAP für die Transformation von P. pastoris verwendet. Bei einer ersten PCR werden zwei DNA-Stücke, die mindestens mit 15 bp überlappen, zueinander gegeben. Während des Annealing lagern sich die zwei Stücke übereinander und die Polymerase arbeitet jeweils von der Mitte ausgehend. So entsteht ein DNA-Stück, das aus den beiden eingesetzten Strängen entsteht und in der Mitte das überlappende Stück enthält. In einer zweiten PCR werden nun Primer, die das neue Stück an den beiden Seiten begrenzen, zugegeben und das gesamte Stück vervielfältigt.

1 entwickelt von Claudia Ruth (AG Glieder, TU Graz) 128 Materialien und Methoden

Der Reaktionsansatz wurde nach erfolgter PCR auf ein Agarosegel aufgetragen und die benö- tigten Fragmente wieder aus dem Gel eluiert. Reaktionsansatz I Reaktionsansatz II

DNA I 1 – 100 ng DNA (Ansatz I) komplett DNA II 1 – 100 ng Primer for (10 pmol/µL) 1 µL dNTP-Mix (je 10 mM) 1 µL Primer rev (10 pmol/µL) 1 µL Phusion (2 U/µL) 0,3 µL dNTP-Mix (je 10 mM) 1 µL 5X Puffer 10 µL Phusion (2 U/µL) 0,3 µL

H2O ad 50 µL 5X Puffer 5 µL

H2O ad 70 µL

PCR-Programm I:

Anfangsdenaturierung 30 s 95 °C Denaturierung 10 s 95 °C Annealing 20 s 58 °C 20 x Elongation 15 s – 1 min 30 s 72 °C Finale Extension 3 min 72 °C

PCR-Programm II: Anfangsdenaturierung 30 s 95 °C Denaturierung 10 s 95 °C Annealing 20 s 58 °C Elongation 15 s – 1 min 30 s 72 °C 25 x Finale Extension 3 min 72 °C

4.2.1.1.3. Spaltung von DNA mittels Restriktionsenzymen Mittels Typ II - Restriktionsendonucleasen wurden Plasmide und DNA-Stücke für die Klonierung auf- bzw. in Stücke geschnitten. Dazu wurden auf die Enzyme abgestimmte Puffer verwendet. Die Re-striktion wurde in einem Volumen von 20 µL bis 100 µL bei der dem Enzym entsprechenden Temperatur (meist 37 °C) für 3h bis ÜN durchgeführt. Es wurde die der DNA-Menge entsprechende Menge an Enzym verwendet.

4.2.1.1.4. Dephosphorylierung mittels CIAP Wurde für eine Ligation DNA mit nur einem Restriktionsenzym verwendet, wurde das aufge- schnittene Plasmid am 5´-Ende dephosphoryliert, um einen Ringschluss des leeren Plasmids zu verhindern. Dazu wurden 0,5 – 15 µg des Plasmids mit Calf-Intestine-Alkaline-Phosphatase (CIAP) im entsprechenden Puffer in einem Ansatz von 30 – 50 µL für 15 min auf 37 °C erhitzt, das Enzym für 15 min bei 65 °C inaktiviert, erneut 1 u CIAP zugegeben und wiederum für 15 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und die benötigten Fragmente aus dem Gel eluiert.

4.2.1.1.5. Agarosegelelektrophorese Die Agarosegelelektrophorese dient dazu, DNA-Stücke nach ihrer Größe aufzutrennen und mittels Ethidiumbromid und UV-Licht sichtbar zu machen. 129 Materialien und Methoden

Dazu wurden je nach Größe des Fragments 0,8 – 2 % ige Gele mit TBE-Puffer verwendet. Dafür wurde die entsprechende Menge an Acarbose mit TBE-Puffer versetzt und in der Mikrowelle erhitzt bis die Agarose gelöst war. Nach kurzem Abkühlen wurde Ethidiumbromid zugegeben und das Gel in einen Gelträger gegossen. Das Gel wurde in eine Laufkammer mit TBE-Puffer gelegt, die mit DNA-Ladepuffer versetzten Proben aufgetragen. Bei einer Spannung von 100 V – 120 V wurden die DNA-Fragmente im elektrischen Feld aufgetrennt und das Gel anschließend unter UV-Licht betrachtet.

4.2.1.1.6. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Zur Weiterarbeit mit den DNA-Fragmenten wurden diese mit einem Skalpell unter UV-Licht aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Die Elution der DNA erfolgte nach Herstellerangaben mit den Kits NucleoSpin Extract II (Machery und Nagel), Wizard® SV Gel and PCR Glean-Up System (Promega) und QIAEX II Gel Extraction Kit. Die DNA wurde in einem Volumen von 20 – 50 µL eluiert.

4.2.1.1.7. Ligation von DNA-Fragmenten Mit T4-Ligase werden DNA-Fragmente kovalent miteinander verbunden. Dazu wurden in einem 10 µL-Ansatz im entsprechenden Puffer 50 ng Plasmid-DNA mit der dreifachen equimolaren Menge an Insert und 2 u (sticky ends) bzw. 5 u (blunt ends) T4-Ligase versetzt. Die Ligation wurde entweder für 2 h bei 22 °C oder ÜN bei 16 °C durchgeführt. Der komplette Ligationsansatz wurde für die Transformation in E. coli verwendet.

4.2.1.2. Molekularbiologische Methoden für die Arbeit mit Bakterien

4.2.1.2.1. Herstellung chemisch kompetenter Bakterienzellen Für die Klonierungsarbeiten im Rahmen dieser Arbeit wurden E. coli von Typ DH5α verwendet. Für kompetente Zellen wurde aus einer ÜN-Kultur eine 50 mL-Kultur angeimpft, die bei einer

OD600 von 0,35 abgeerntet wurde. Nach 10 min auf Eis wurden die Zellen abzentrifugiert und

in 30 mL eiskaltem Puffer (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) resuspendiert. Dieser wurde wiederum

abzentrifugiert und das Pellet in 2 mL eiskaltem 100 mM CaCl2 resuspendiert. Die Lösung blieb für 3 - 24 h auf Eis stehen, dann wurden 70 µL DMSO zugegeben, 15 min auf Eis inkubiert. Erneut wurden 70 µL DMSO zugegeben. Die Zellen konnten nun für die Transformation verwendet werden. Für die Lagerung bei -80 °C wurde noch Glycerin (Endkonzentration 10 %) zugegeben und zu 100 µL in vorgekühlte Gefäße aliquotiert.

4.2.1.2.2. Transformation von Bakterienzellen 100 µL kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut, das zu transformierende Plasmid dazu pipettiert und vorsichtig gemischt, dann der Ansatz für 30 min auf Eis inkubiert. Die Aufnah- me der DNA geschah durch einen Hitzeschock bei 42 °C für 60 s. Danach wurde der Ansatz für weitere 2 min auf Eis belassen. Es wurden 900 µL LB-Medium zugegeben und 1 h bei 37 °C geschüttelt. Anschließend wurden die Bakterien auf Selektionsplatten mit dem entsprechen- 130 Materialien und Methoden

den Antibiotikum ÜN inkubiert. Der Nachweis der erfolgten Transformation erfolgte über die Reisolation der Plasmid-DNA und anschließender Restriktion.

4.2.1.2.3. Plasmid-DNA-Isolierung aus Bakterienzellen Schnell-Mini-Prep 3 mL einer ÜN-Kultur wurden abzentrifugiert, der Überstand verworfen. Das Pellet wurde resuspendiert und mit 300 µL TENS invertiert, nach 3 min wurden 150 µL 3 M Na-Ac pH 5,2 zugegeben und gut gemischt. Nach dem Abzentrifugieren wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 600 µL Isopropanol versetzt. Die Mischung wurde gut gevortext und 5 min auf Eis inkubiert, dann abzentrifugiert. Das Pellet wurde zwei Mal mit 500 µL EtOH 70 % gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet, anschließend in 20 µL TE+RNase resuspendiert.

Plasmid-Midipreparation Die Präparation größerer Mengen hochreiner Plasmid-DNA aus 200 mL – 400 mL Bakterienkul- tur erfolgte nach Herstellerangaben mit dem MIDI-Kit Nucleo-Bond®-PC 100 (Macherey-Nagel). Die Elution der DNA erfolgte in 50 – 100 µL.

4.2.1.2.4. Aufschluss von Bakterienzellen Zur Weiterarbeit mit in Bakterien exprimiertem Protein wurden die Bakterien mittels Ultra- schall aufgeschlossen.

Die induzierte Bakteriensuspension wurde abzentrifugiert, der Überstand verworfen. Das Pel- let wurde zwei Mal mit Wasser gewaschen, danach in einem Fünftel des ursprünglichen Volu- mens an Aufschlusspuffer III gelöst. Die Zellen wurden mit einem Ultraschallstab aufgeschlossen, das Pellet wurde nach dem Zentrifugieren verworfen.

4.2.1.3. Molekularbiologische Methoden für die Arbeit mit Hefen

4.2.1.3.1. Transformation von Hefezellen, LiAc – Methode Im Rahmen der Arbeit wurde mit S. cerevisiae und P. pastoris gearbeitet. Die LiAc-Methode wurde vorwiegend für S. cerevisiae verwendet. Pro Transformation werden 2 mL der Zellkul- tur benötigt (Gietz et al., 1992).

Eine ÜN-Kultur in YPD wurde bei einer OD600 von 0,5 geerntet. Das Pellet wurde mit Wasser und LiAc/TE gewaschen und in LiAc/TE aufgenommen. Die zu transformierende DNA (ca. 1 µg), Lachssperma-DNA und PEG-Lösung wurden zugegeben und alles vorsichtig vermischt. Der Ansatz wurde für 30 min bei 30 °C und für 15 min bei 42 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und in Wasser aufgenommen. Diese Suspension wurde auf die Selektionsplatten ausgebracht und diese für mindestens zwei Tage bei 28 °C inkubiert.

Der Nachweis der positiven Klone erfolgte für S. cerevisiae mittels Reisolation der Plasmid- DNA, bei P. pastoris mittels Colony Screening bzw. Aktivitätstest. 131 Materialien und Methoden

4.2.1.3.2. Transformation von Hefezellen, Elektroporation Für die Elektroporation wurde nach Protokollen gearbeitet, die von der Eppendorf AG unter www.eppendorf.com zur Verfügung gestellt wurden.

Transformation von S. cerevisiae (Sclafani, 2001)

Für die Transformation wurden 100 mL einer Kultur in YPD bei einer OD600 von 1,3 – 1,5 geerntet. Das Pellet wurde mehrfach mit Wasser und 1 M Sorbitol gewaschen und anschließend in 180 µL 1 M Sorbitol resuspendiert. Zu 65 µL dieser Suspension wurde die DNA (100 ng in max. 5 µL) gegeben, die Mischung wurde für 5 min auf Eis inkubiert und elektroporiert. 1 M Sorbitol wurde zu den Zellen gegeben und diese auf Selektionsmedium mit 1 M Sorbitol ausplattiert. Die Inkubation der Platten erfolgte für 2 Tage bei 28 °C.

Transformation von P. pastoris (von Allmen, 2004)

Für die Transformation wurden 250 mL einer Kultur in YPD bei einer OD600 von 1,0 – 1,3 geerntet. Das Pellet wurde mehrfach mit Wasser und 1 M Sorbitol gewaschen und anschließend in 500 µL 1 M Sorbitol resuspendiert. Zu 80 µL dieser Suspension wurde die DNA (5-10 µg in max. 10 µL) gegeben, die Mischung wurde für 5 min auf Eis inkubiert und elektroporiert. 1 M Sorbitol wurde zu den Zellen gegeben und die Suspension für 2 h bei 30 °C leicht geschüttelt. Die Suspension wurde auf Selektionsplatten mit 1 M Sorbitol ausgebracht und für mind. zwei Tage bei 28 °C inkubiert.

4.2.1.3.3. Transformation von Hefezellen, condensed method Diese Methode vereint Vorteile der Elektroporation und der chemischen Methode (Lin- Cereghino et al., 2005).

Für die Transformation wurden 50 mL einer Kultur in YPD bei einer OD600 von 0,8 – 1,0 geerntet. Das Pellet wurde in BEDS-Lösung und 0,1 M DTT resuspendiert und inkubiert, abschlie- ßend in 1 mL BEDS-Lösung resuspendiert. Zu 80 µL dieser Suspension wurde die DNA (1-2 µg in max. 20 µL) gegeben und die Mischung für 15 min auf Eis inkubiert und elektroporiert. 1 M Sorbitol wurde zu den Zellen gegeben und diese für 2 h bei 30 °C inkubiert. Die Suspension wurde auf Selektionsplatten ausgebracht und für mind. zwei Tage bei 28 °C inkubiert.

4.2.1.3.4. Colony Screening von transformierten Hefezellen Um eine erfolgreiche Transformation der Hefezellen zu überprüfen, wurde ein Colony Scree- ning mit den Klonen durchgeführt. Dazu wurde etwas Hefekultur von der Platte genommen und in 50 µL sterilem Wasser resuspendiert. 2 µL dieser Zellsuspension wurden direkt für die PCR eingesetzt.

4.2.1.3.5. Isolierung genomischer DNA aus Hefezellen Um eine erfolgreiche Transformation der Hefezellen zu überprüfen, wurden die Zellen aufgeschlossen und genomische DNA isoliert (Ausubel et al., 2002).

Dazu wurden 10 mL einer ÜN-Kultur geernet, das Pellet gewaschen und mit Aufschlusspuffer I, Glasperlen und PCI versetzt, diese Mischung wurde für 3 min maximal gevortext. TE-Lösung 132 Materialien und Methoden

wurde zugegeben und alles abzentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt und die DNA mit Ethanol gefällt. Das getrocknete Pellet wurde in TE gelöst und RNase zugegeben, nach 5 min Inkubation bei 37 °C wurde mit Ammoniumacetat und EtOH erneut die DNA gefällt und anschließend das getrocknete Pellet in 10 mM Tris-HCl pH 8 aufgenommen.

Die gewonnene DNA wurde direkt für eine PCR verwendet.

4.2.1.3.6. Glasperlenaufschluss von Hefezellen Zur Weiterarbeit mit in Hefe exprimiertem Protein wurden die Hefezellen mittels Glasperlen aufgeschlossen.

Die Hefekultur wurde zentrifugiert und das Nassgewicht des Pellets bestimmt. Anschließend wurde das Pellet zwei Mal mit Wasser gewaschen. Das Pellet wurde in Aufschlusspuffer resuspendiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Der auf Eis aufgetauten Suspension wurde erneut Aufschlusspuffer und zusätzlich Glasperlen zugegeben. Nun wurde acht Mal für 30 s maximal gevortext, um die Zellen aufzuschließen. Nach dem Zentrifugieren wurde das Pellet mit Aufschlusspuffer gewaschen und die Überstände für die Weiterarbeit vereinigt. Bei Bedarf wurde der Extrakt im Anschluss dialysiert oder aufgereinigt.

Zuerst wurde mit Aufschlusspuffer II gearbeitet, da dieser jedoch schäumte und die weitere Arbeit beeinträchtigte, wurde statt diesem Aufschlusspuffer III verwendet.

4.2.2. Proteinchemische Methoden

4.2.2.1.1. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die Methode nach Bradford (Bradford, 1976) verwendet. Dazu wurde eine Verdünnung der zu messenden Probe mit 150 µL Bradford- Reagenz versetzt und die Absorption bei 620 nm vermessen. Anhand einer Kalibriergeraden mit BSA wurde die Proteinmenge bestimmt.

4.2.2.1.2. SDS-PAGE Die SDS-PAGE dient dazu, Proteine nach ihrer Größe aufzutrennen und mittels verschiedener Färbungen sichtbar zu machen.

Es wurde mit diskontinuierlichen Proteingelen gearbeitet (Laemmli, 1970). Zuerst wurde das Trenngel gegossen, wenn dieses ausgehärtet war, das Sammelgel mit den Auftragetaschen. Die Proben wurden mit dem Probepuffer versetzt und 10 min auf 95 °C erhitzt. Dies bewirkte eine Denaturierung der Proteine und eine gleichmäßig verteilte, negative Ladung. Nach dem Auftragen der Proben wurde eine elektrische Spannung angelegt, so dass die Proteine im elektrischen Feld zuerst im Sammelgel aufkonzentriert und im Trenngel nach ihrer Größe aufgetrennt wurden. Anschließend wurden die Proteinbanden auf den Gelen mit Coomassie-, Alcianblau- oder Silberfärbung sichtbar gemacht. Anhand eines Markers, der auf das Gel aufgetragen wurde, ist es möglich, die Größe der Proteine zu bestimmen. 133 Materialien und Methoden

4.2.2.1.3. Natives Gel Native Gele wurden verwendet, wenn nach der Auftrennung der Proteinextrakte Aktivitäts- tests mit diesen durchgeführt werden sollten, z. B. ein Invertaseaktivitätstest. Invertasen wären nach einer Denaturierung nicht mehr aktiv, weshalb eine klassische SDS-PAGE nicht durchgeführt werden kann. Allerdings werden die Proteine bei einem nativen Gel nicht nur nach ihrer Größe, sondern auch nach ihrer Ladung aufgetrennt. Somit kann keine Aussage über die Größe des Proteins getroffen werden.

Die Vorgehensweise entspricht der bei einer SDS-PAGE, allerdings wird den Puffern kein SDS zugegeben und der Denaturierungsschritt vor dem Probenauftragen entfällt.

4.2.2.1.4. Silberfärbung Das SDS-PAGE-Gel wurde nach der Elektrophorese für 15 min in eine Lösung mit 30 % Ethanol und 10 % Essigsäure gegeben. Anschließend wurde es für 30 min in der Fixierlösung geschwenkt, dann zwei Mal für 10 min in Wasser gewaschen. Für weitere 45 min wurde das Gel in einer Silberlösung bewegt, anschließend erneut mit Wasser gewaschen. Nun wurde das Gel so lange in die Entwicklungslösung gegeben, bis Banden sichtbar wurden. Die Reaktion wurde in einer 5 %igen Essigsäurelösung gestoppt. Anschließend wurde das Gel mit Wasser gewaschen und bis zum Trocknen oder Ein-scannen in 5 %iger Glycerinlösung aufbewahrt.

4.2.2.1.5. Coomassie-Färbung Es wurde nach einem Protokoll aus dem „Laborjournal“ gearbeitet (Besir, 2008).

Das SDS-PAGE-Gel bzw. das native Gel wurde direkt nach der Elektrophorese drei Mal mit H2O gewaschen. Dafür wurde das Gel mit dem Wasser zuerst für 30 s in der Mikrowelle erhitzt, dann für fünf Minuten darin geschwenkt. Anschließend wurde das Gel in die Coomassie- Färbelösung gegeben bis sich gut sichtbare Banden entwickelten. Bei Bedarf wurde zum Ent-

färben des Hintergrunds erneut mit H2O gewaschen.

4.2.2.1.6. Glykoproteinfärbung mit Alcianblau Um Glykoproteine anzufärben wurde eine Methode mit Alcianblau verwendet, bei der die oxidierten Zuckerketten angefärbt werden (Wardi und Allen, 1972; Wardi und Michos, 1972).

Das SDS-PAGE-Gel bzw. das native Gel wurde nach der Elektrophorese nacheinander in fol- genenden Lösungen geschwenkt; dazwischen wurde es jeweils mit Wasser abgespült:

30 min 12,5 % Trichloressigsäure 50 min 1 % Periodsäure in 3 %iger Essigsäure 30 min 0,5 % Kaliummetabisulfit mind. 4 h 0,5 % Alcianblau in 3 %iger Essigsäure Das Gel wurde nach den Färbeschritten in 3 %iger Essigsäure entfärbt. 134 Materialien und Methoden

4.2.2.1.7. Aktivitätsfärbung nach nativem Gel – Nachweis einer Invertase Um die Invertaseaktivität nach der Auftrennung der Proben zu bestimmen, wurde das native Gel für 15 min bei 37 °C in eine Saccharoselösung gegeben. Anschließend wurde drei Mal mit Wasser gewaschen und das Gel bei 80 °C bis zur Farbentwicklung in der Färbelösung geschwenkt. Das Gel wurde für 5 min bei RT in 10 % iger Essigsäure geschwenkt und damit die Reaktion gestoppt.

Die Farbe entsteht durch die im Alkalischen stattfindende Reduktion des farblosen Tetrazolium-Kations zum unlöslichen, farbigen Formazan durch Fructose und Glucose, die im Gegensatz zu Saccharose reduzierend sind (Gabriel und Wang, 1969). Somit kann die Aktivität einer Invertase nachgewiesen werden.

4.2.2.1.8. Invertaseaktivitätstest Zum Testen der Aktivität von verschiedenen Invertasen wurden verschiedene Enzyme bzw. Extrakte bei einem adäquaten pH-Wert und einer passenden Saccharosekonzentration für 30 – 90 min inkubiert. Die dabei freigesetzte Glucose wurde anschließend mittels GOD-POD-Test bestimmt und die Aktivität berechnet.

Für die Bestimmung des optimalen pH-Wertes wurde eine Pufferreihe aus Dinatriumhydrogenphosphat und Citronensäure von pH 2,7 - 7,8 gewählt (McIlvain, 1921).

Anschließend wurde mit einem Na2HPO4/Citratpuffer pH 4,5 bzw. einem Na-PO4-Puffer pH 7,0 gearbeitet.

Für die Bestimmung der optimalen Temperatur wird ein Gradient von 20 °C – 60 °C bzw. von 30 °C – 70 °C in PCR-Cyclern verwendet. Die Invertasetests wurden danach bei 37 °C durchge- führt.

Für die Bestimmung der Enzymparameter vmax und Km wurden verschiedene Saccharosekonzentrationen für die Tests eingesetzt und diese anschließend in einem Lineweaver-Burk-Diagramm (Lineweaver und Burk, 1934; Dixon, 1953) bzw. einem Hanes- Diagramm zur Auswertung aufgetragen (Bisswanger, 1994).

Zum Testen der inhibitorischen Aktivität eines Hemmstoffes bzw. eines möglichen Hemmstof- fes oder Pflanzenextraktes wurde zu dem o. g. Reaktionsansatz noch die jeweils zu testende Lösung dazugegeben. Da die Möglichkeit besteht, dass Saccharose eine schützende Wirkung vor der hemmenden Substanz aufweist, wurde der Reaktionsansatz ohne Saccharose für 10 min vorinkubiert und erst anschließend die Saccharose zugegeben.

4.2.2.1.9. Verdau mit Endoglycosidase H (Endo H) Der Verdau von Glykoproteinen mit Endo H bewirkt, dass Glykosilierungen vom High-mannose- und Hybrid-Typ vom Protein abgespalten werden, ein N-Acetyl-glucosaminrest bleibt am Pro- tein gebunden.

Die Inkubation erfolgte nach den Herstellerangaben von New England Biolabs. 135 Materialien und Methoden

4.2.2.1.10. Aufreinigung mittels Fällung Die Fällung mit verschiedenen chemischen Komponenten ist eine weit verbreitete Methode, um einen Proteinrohextrakt in einem ersten Schritt aufzureinigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Fällungsreagenzien getestet. Die angewandte Methode war für alle Rea- genzien gleich. Als Fällungsreagenzien wurden Ammoniumsulfat (pulverisiert), Aceton (-20 °C vorgekühlt) und PEG 6000 (pulverisiert) verwendet. Für die Bestimmung der benötigten Ammoniumsulfatmenge wurde mit einer Konzentrationstabelle gearbeitet (Pingoud und Urbanke, 1997).

Unter Rühren wurde das jeweilige Reagenz portionsweise zum gekühlten Extrakt gegeben bis die gewünschte Konzentration erreicht war. Nach dem Abzentrifugieren wurde das Pellet in einem adäquaten Puffer gelöst und bei Bedarf dialysiert. Sollte eine fraktionierte Fällung durchgeführt werden, wurden die genannten Schritte entsprechend oft mit den jeweiligen Konzentrationen wiederholt.

4.2.2.1.11. Größenauftrennung mittels Amicon Ultra Um eine Auftrennung des Proteinextraktes nach Größe zu erreichen, wurde mit Centricons der Firma Millipore (Billerica, USA) gearbeitet. Dies erfolgte nach dem Protokoll der Firma. Verwendet wurden Filter mit einem Cut-Off von 10 kDa und 30 kDa.

4.2.2.1.12. Aufreinigung mittels Ionenaustauschersäule Um ein Proteingemisch aufzureinigen kann mit einer Ionenaustauschersäule gearbeitet werden. Dies bietet sich vor allem an, falls das gewünschte Protein über besondere Eigenschaften verfügt, die eine größere Menge weiterer Proteine in den gleichen Fraktionen ausschließt. Bei der Aufreinigung wird mit einem pH-Wert gearbeitet, bei dem das Protein mit der gewünsch- ten Ladung vorliegt. Der zu reinigende Extrakt wird auf die Ionenaustauschersäule aufgegeben und diese gespült. Die Elution erfolgt mit einer hohen Salzkonzentration.

Die Fraktionen wurden nach einer Dialyse auf ihre Aktivität hin untersucht und diejenigen mit hoher Aktivität vereinigt. Für die Aufreinigung wurde ein Äkta-Prime-System verwendet, als Anionen-austauschersäule eine Resource Q-Säule von Amersham Pharmacia Biotech (Mün- chen), für die Kationenaustauschersäule wurde CM-Sepharose als Säulenmaterial gewählt.

Die Anionenaustauschersäule und ein Puffer pH 7,5 wurden für die Aufreinigung der humanen Sucrase verwendet.

Die Kationenaustauschersäule wurde für die Aufreinigung der extrazellulären Invertase aus C. rubrum eingesetzt, für den Puffer wurde pH 9 gewählt.

Die Angaben zu den verwendeten Chromatographieprogrammen finden sich im Anhang (Kap. 6.5.). 136 Materialien und Methoden

4.2.2.1.13. Affinitätstaufreinigung im batch-Verfahren Bei der Affinitätsaufreinigung im batch-Verfahren wird der aufzureinigende Proteinextrakt auf eine Matrix gegeben, die über bestimmte Gruppen einen Teil der Proteine bindet. Nach mehreren Waschschritten können diese Proteine mit einem Elutionspuffer wieder gelöst werden.

Nach dem Äquilibrieren der Matrix mit dem entsprechenden Puffer wurde der jeweilige Prote- inextrakt mit der Matrix vorsichtig gemischt und inkubiert. Die Proben wurden vorsichtig abzentrifugiert und drei Mal mit Puffer gewaschen. Im Anschluss wurde zwei Mal mit Elutionspuffer eluiert.

Die Affinitätsaufreinigung mittels an eine Sepharose-Matrix gebundenem Concanavalin A (Con A) dient dazu, Glykoproteine von nicht-glykosilierten Proteinen zu trennen. Dies ist möglich,

da das Lectin Con A aus Canavalia ensiformis Kohlenhydrate, v.a. α-D-Glucose bindet, so dass Glykoproteine komplexiert werden und nicht-glykosilierte Proteine im Überstand verbleiben. Durch einen Puffer mit hohem Zuckergehalt können die komplexierten Proteine eluiert werden.

Mit einer Matrix, an der Nickelionen gebunden sind, können Proteine aufgereinigt werden, die über ein his-tag verfügen. Die Imidazolringe der sechs zusätzlichen Histidinreste des Fusionproteins komplexieren mit den Nickelionen. Durch einen Puffer mit hohem Imidazolgehalt können die Proteine eluiert werden.

4.2.3. Analytische Methoden

4.2.3.1.1. Bestimmung der Glucosemenge mittels GOD-POD Mittels einer gekoppelten Reaktion der Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidase und eines Redoxfarbstoffes kann der Gehalt an freier Glucose mit einem photometrischen Verfahren schnell und einfach bestimmt werden (Huggett und Nixon, 1957). Das Reagenz wird mit ABTS anstelle von O-Dianisidin verwendet.

Um den Gehalt an freier Glucose zu messen, die zuvor durch die Reaktion einer Invertase aus Saccharose freigesetzt wurde, wurden 50 µL der zu testenden Lösung mit 200 µL GOD-POD- Reagenz gemischt und für 6 – 10 min bei RT inkubiert. Als Kalibriergerade wurden verschiedene Glucosekonzentrationen von 0 – 50 nM verwendet. Die durch den Redoxfarbstoff ABTS entstandene grüne Farbe wurde bei 405 nm vermessen.

4.2.3.1.2. Bestimmung der Invertaseaktivität mittels radioaktiv markierter Saccharo- se Als Alternative zur Bestimmung der bei einem Invertasetest freigesetzten Glucosemenge mittels GOD-POD-Reaktion, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Test mit radioaktiv markierter Saccharose (14C) entwickelt, bei dem die Detektion der Glucose mittels Dünnschichtchroma- tographie und Bestimmung der radioaktiven Menge erfolgte.

Die Invertasetests wurden in einem verkleinerten Maßstab von 5 - 10 µL durchgeführt, pro Ansatz wurde eine Menge von ca. 0,02 µCi verwendet. Nach der Reaktion wurde 1 µL des 137 Materialien und Methoden

Reaktionsansatzes auf eine DC-Platte aufgetragen und diese entwickelt. Die Intensität der Radioaktivität der verbliebenen Saccharose wurde bestimmt und diese ausgewertet.

4.2.3.1.3. Auftrennung mittels Dünnschichtchromatographie Die Methode der Dünnschichtchromatographie wurde zur Kontrolle bei der Synthese der Thiofructoside und zur Detektion der Glucose nach einem Invertasetest mit radioaktiver Sac- charose angewandt.

Die Proben wurden punktförmig auf die DC-Platten aufgetragen und diese im entsprechenden Fließmittel entwickelt.

Für die Detektion der Substanzen bei der Thiofructosidherstellung wurden die DC-Platten anschließend mit einem Sprühreagenz bei 180 °C so lange entwickelt bis eine Verfärbung der Substanz-flecken auftrat.

4.2.4. Anzuchtmethoden

4.2.4.1. Anzucht von Bakterien und Pilzen

4.2.4.1.1. Escherichia coli Zur Proteinexpression wurden die Bakterien über Nacht in einer Vorkultur angezogen. Mit dieser wurde die Hauptkultur im Verhältnis 1:100 angeimpft und zum Weiterwachsen bei

30 °C geschüttelt. Bei einer OD600 von 0,5 wurden die Zellen mit IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert und nach 2 h Inkubation geerntet (Gallagher und Pollock, 1998).

4.2.4.1.2. Saccharomyces cerevisiae Zur Proteinexpression wurden die Klone in YNB, das mit den Aminosäuren Histidin und Leucin versetzt war, in einer Vorkultur über Nacht angezogen. Mit dieser wurde die Hauptkultur angeimpft und diese für 24 h geschüttelt. Anschließend wurden die Zellen abgeerntet und mit Glasperlen aufgeschlossen.

4.2.4.1.3. Pichia pastoris Zur Proteinexpression wurden verschiedene Medien verwendet. Der AOX-Promotor ist methanolinduzierbar, so dass allen Methoden gleich ist, für die Expression ein Methanolmedium zu verwenden. Für alle Anzuchten wurden Schikanekolben verwendet, da P. pastoris in diesen besser wächst und mehr Protein produziert (Villatte et al., 2001).

Schnellanzucht: Zu Beginn der Arbeit mit P. pastoris wurde das Protokoll für Bäckerhefe etwas umgewandelt. Die Vorkultur wurde in YPD angezogen, die Hauptkultur für 24 h in YPM mit 5 % MeOH ge- schüttelt.

138 Materialien und Methoden

Anzucht nach Invitrogen: Den Herstellerangaben folgend wurde die Hefe für 72 h in BMGY angezogen, abzentrifugiert und das Pellet in BMMY gelöst. Die weitere Anzucht der Hefe erfolgte für 72 – 96 h. Alle 24 h wurde Methanol in einer Endkonzentration von 0,5 % hinzugefügt. Nach den gleichen Angaben wurde auch mit YPG und YPM 0,5 % gearbeitet (nach Li et al., 2003a).

Anzucht AG Glieder, TU Graz, Österreich: Die Hefe wurde für 72 h in BMD1% vorgezogen, anschließend wurde mit BMM10 induziert. Um die Methanolkonzentration auf 0,5 % zu halten, wurde alle 24 h Methanol ergänzt. Die Zellen bzw. das Medium wurden nach 72 – 96 h geerntet.

Anzucht in tiefen Mikrotiterplatten (Weis et al., 2004): Die Klone wurden in 300 µL BMD1% resuspendiert und für 72 h angezogen. Anschließend wurden sie mit je 250 µL BMM2 induziert und für weitere 72 h geschüttelt. Alle 24 h wurden 50 µL BMM10 zugegeben, um die Methanolkonzentration zu erhalten.

Selektionsanzucht auf Saccharoseplatten (Sreekrishna et al., 1987) Die Hefe P. pastoris selbst verfügt über keine Invertaseaktivität. Soll eine Invertase rekombinant hergestellt werden, kann das Enzym selbst als Selektionsmarker fungieren, wenn die zu testenden Klone auf Minimalmedium mit Saccharose ausgestrichen werden. Nur diejenigen Klone, die das Fremdprotein bilden, sollten auf dem Medium wachsen. Als Medium wurde BMS und als Kontrolle BMD verwendet. Die zu testenden Klone wurden zusammen mit einer Kontrolle (Stamm oder Stamm mit Leervektor) auf die Platten ausgestrichen und bei 28 °C inkubiert. Ein Klon wurde als positiv bezeichnet, wenn sein Wachstum normal verlief und nicht um mehrere Tage verzögert war.

4.2.4.2. Anzucht von Suspensionskulturen

4.2.4.2.1. Heterotrophe Kulturen Die Anzucht der heterotrophen Kulturen erfolgte in Kolben, die mit Zellulosestopfen und Alu- folie verschlossen waren.

Frisches Medium wurde mit einer adäquaten Menge bestehender Suspensionskultur angeimpft. Die Kultur wurde entweder innerhalb einer Woche für einen Versuch verwendet oder nach einer Woche in frisches Medium umgesetzt.

4.2.4.2.2. Autotrophe Kulturen Die Anzucht der autotrophen Kulturen erfolgte in speziellen Glasgefäßen. In einem unteren

Kolben war 2 M Carbonatpuffer vorgelegt, der eine CO2-reiche Atmosphäre schaffen sollte. Darauf wurde mit einem Verbindungsstück mit Schliff ein weiterer Kolben befestigt, in dem sich die autotrophe Zellkultur befand. Dieser Kolben wurde mit Alufolie und Parafilm verschlossen. 139 Materialien und Methoden

Frisches Medium wurde mit einer adäquaten Menge alter Suspensionskultur angeimpft. Die Kultur wurde – je nach Art – nach 2-3 Wochen in frisches Medium umgesetzt oder für einen Versuch verwendet, der nach 2-3 Wochen abgeschlossen war.

4.2.4.2.3. Elicitieren der Kulturen Die Kulturen, die elicitiert werden sollten, wurden drei Tage vor dem Umsetzen zuerst in einem großen Kolben vereinigt und dann in benötigter Menge auf die Kolben aufgeteilt. Nach einem Ruhetag wurden die Elicitoren nach Kap. 4.2.5.2.1. den Kulturen zugefügt und für zwei Tage inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen geerntet und aufgearbeitet.

4.2.5. Extraktherstellung

4.2.5.1. Proteinextrakte aus pflanzlichem Material

4.2.5.1.1. Extrazelluläre Invertase von C. rubrum Um die extrazelluläre Invertase von C. rubrum – Zellen zu gewinnen, wurde diese mit einer Salzlösung von der Oberfläche der Suspensionskulturzellen abgewaschen (Vitali et al., 2006).

Die Zellen von drei Suspensionskulturen wurden filtriert und mit Wasser gewaschen. Anschlie- ßend wurden sie für mindestens 30 min mit einer 0,5 M NaCl-Lösung bei 4 °C versetzt und gelegentlich umgerührt. Nach einer erneuten Filtration wurde das Filtrat, in dem sich die extrazelluläre Invertase befand, dialysiert und anschließend mit Glycerin bis zu einer Kon- zentration von 5 % versetzt.

4.2.5.1.2. Proteinextrakte aus Pflanzen Um pflanzliche Extrakte mit Invertaseaktivität zu gewinnen, wurde das Pflanzenmaterial geerntet, in flüssigem Stickstoff gemörsert und mit einem Homogenisationspuffer extrahiert. Der so entstandene Extrakt ist der sogenannte Rohextrakt (crude extract, CrEx), in dem als aktive Invertase die vakuoläre Invertase zu finden ist. Die Zellreste wurden noch mit einem Hochsalzpuffer extrahiert. So wurden die zellwandgebundenen Invertasen gelöst, was zu dem sogenannten zellwandgebundenen Extrakt (cellwall-bound extract, CwEx) führte.

Das Pflanzenmaterial wurde fein gemörsert und im Verhältnis 0,5 g Frischgewicht: 1 mL Puf- fer im Homogenisationspuffer suspendiert. Die Proben wurden bei 4 °C für 30 min geschüttelt und anschließend abzentrifugiert. Nachdem das Pellet zwei Mal mit Wasser gewaschen wurde, wurde es im Hochsalzpuffer resuspendiert und über Nacht geschüttelt, dann abzentrifugiert. Die Extrakte wurden nach dem Zentrifugieren jeweils dialysiert bevor sie für Invertasetests verwendet wurden.

Nach dem gleichen Protokoll wurden die Extrakte mit proteinogenen Inhibitoren aus Nicotiana benthamiana-Blättern gewonnen. 140 Materialien und Methoden

4.2.5.2. Pflanzenextrakte zur Inhibitortestung

4.2.5.2.1. Extrakte aus Suspensionszellkulturen Für ein Screening von Suspensionszellkulturen wurden diese mit verschiedenen Elicitoren behandelt und geerntet. Zum Testen wurden zwei verschiedene Extrakte verwendet: zum einen das Medium, in dem die Zellen gewachsen sind und zum anderen der Rohextrakt aus den Zel- len. Der zellwandgebundene Extrakt wurde hergestellt, aber nicht vermessen.

Für das Screening wurden folgende Elicitoren in den angegebenen Konzentrationen verwendet:

verwendeter Elicitor Endkonzentration 1 Chitosan 0,0005 % 2 E-FOL (Fusarium oxysporium lycopersici) 1,5 µg/mL 1 µL/mL getötete Sporensuspension 3 Alternaria brassicicola (5 x 105 Sporen / mL) 2 µL/mL getötete Bakteriensuspension 4 Pseudomonas syringae Avr RPM1 (OD600 = 0,2) 2 µL/mL getötete Bakteriensuspension 5 Pseudomonas syringae DC3000 (OD600 = 0,2) 6 Methyljasmonat 100 µM 7 Salicylsäure 50 µM 8 Polygalacturonsäure 0,0002 % 9 Acetylsalicylsäure 50 µM 10 Kontrolle ohne Zugabe

Die Elicitoren wurden den Zellkulturen für zwei Tage zugefügt, anschließend wurden die Zel- len abfiltriert.

Das Medium wurde gefroren und in einem Gefriertrockner getrocknet, in 10 mL Wasser gelöst und bis zu den Messungen bei -20 °C gelagert.

Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff gemörsert und im Verhältnis 5 g Frischgewicht: 10 mL Puffer in einem Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert und für 30 min geschüttelt. Nach dem Abzentrifugieren wurde der Überstand mit einem Amicon Ultra (Kap. 4.2.2.1.11.) wei- terverarbeitet, um Proteine mit einer Masse von mehr als 30 kDa, also auch Invertasen, abzu- trennen. Der Durchfluss < 30 kDa wurde bis zu den Messungen bei -20 °C gelagert.

Das Pellet wurde mit einem Salzpuffer versetzt, über Nacht geschüttelt, nach dem Zentrifu- gieren dialysiert und bei -20 °C gelagert.

4.2.5.2.2. Ethanolischer Extrakt Das getrocknete Pflanzenmaterial wurde fein gemahlen und anschließend im Verhältnis 0,5 g Droge auf 25 mL Ethanol 70 % für 30 min unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Filtrieren wurde der Extrakt am Rotationsverdampfer getrocknet und im Verhältnis 0,5 g Droge: 1 mL Lö- sungsmittel in Ethanol 70 % gelöst. 141 Materialien und Methoden

4.2.5.2.3. Fraktionierte Extrahierung Die fraktionierte Extrahierung wird mit dem Accelerated Solvent Extraction System 200 (ASE) von Dionex durchgeführt. Dazu wurde von jeder Droge 1 g mit der Analysenmühle pulverisier- tes Material abgewogen und mit 0,2 g Diatomenerde vermengt. Diese Mischung wurde in die Extraktionszellen gefüllt und mit Seesand bedeckt. Die Extraktion erfolgte zuerst mit Hexan, dann mit Dichlormethan, Methanol und abschließend mit Wasser. Die erhaltenen Extrakte wurden bis zur Trockene eingeengt und die Ausbeute bestimmt. Bei Bedarf wurden die Ex-

trakte in DMSO bzw. H2O gelöst. Angaben zu den durchgeführten Programmen finden sich im Anhang (Kap. 6.5.).

4.2.6. sonstige Methoden

4.2.6.1. Sterilisation von Samen Die Samen wurden für 90 s mit 70 % EtOH gewaschen, dann für 15 min in die Sterilisationslö- sung gegeben, anschließend drei Mal mit sterilem Wasser gewaschen, auf das Aussaatmedium aufgetragen und die Samen gleichmäßig verteilt.

4.2.6.2. Infiltration von N. benthamiana mit A. tumefaciens zur heterologen Expres- sion von Inhibitorproteinen Folgende Konstrukte wurden von Dr. Greiner (Heidelberg) zur Verfügung gestellt:

Inhibitor verwendetes Plasmid Resistenz NtCIF pBINAR Kanamycin NtVIF pBINAR Kanamycin BvC/VIF pK2GW7 Spectinomycin AtC/VIF1 pMD32 Kanamycin AtC/VIF2 pMD32 Kanamycin

Für die Infiltration wurden die transformierten A. tumefaciens-Kulturen ÜN in YEB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika angezogen. Die Zellen wurden geerntet und in MES-Puffer

auf eine OD600 = 1 eingestellt. Nach einer Stunde Inkubation im Dunklen bei RT wurden die N. benthamiana-Blätter mit der Suspension auf der Unterseite infiltriert. Dies wurde wiederholt bis das ganze Blatt infiltriert war. Nach 48 h Inkubation wurden die Blätter geerntet und ein Rohextrakt hergestellt.

4.2.6.3. Farbnachweis für Agrobakterien Die zu testenden Klone wurden auf Agrobakterien-Testplatten ausgestrichen und so lange inkubiert bis die Kolonien dicht gewachsen waren. Die Platten wurden mit Benedicts-Reagenz (Benedict, 1909) überschichtet und bei RT stehen gelassen. Nach ca. 1 h sollte bei positiven Kolonien eine orange-rote Färbung auftreten, bei negativen Kolonien blieb die türkise Farbe erhalten. 142 Materialien und Methoden

4.2.6.4. Herstellung von Thiofructosiden Die Herstellung von Thiofructosiden erfolgte nach einem Protokoll von Dr. Nakano (Osaka, Japan) (Nakano et al., 2000; Kiso et al., 2003).

Für die Synthese wurden 2,5 M Saccharose, 2,0 M 2-Mercaptoethanol und 60 units/mL der Invertase aus S. cerevisiae in 50 mM Acetatpuffer pH 5,5 gelöst und gemischt. Die Mischung wurde 20 h lang auf 40 °C erwärmt. Anschließend wurde die Lösung unter der mehrmaligen Zugabe von Wasser und Methanol am Rotationsverdampfer eingeengt, um überschüssiges Mercaptoethanol zu entfernen. Eine erste Aufreinigung erfolgte über eine Aktivkohlesäule mit Ethanolgradienten (stufenlos 0 auf50 %). Durch das Waschen mit Wasser werden die restlichen Zucker weggespült. Mercaptoethanol wird an die Kohle gebunden und somit auf der Säule bleiben und die Thiofructoside werden mit einer erhöhten Ethanolkonzentration eluiert. Mit- tels Dünnschichtchromatographie wurden die Fraktionen ermittelt, die möglicherweise Thiofructoside enthielten. Diese wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer eingeengt und abermals über die Säule gereinigt. Die Detektion erfolgte wiederum mittels DC. Die Fraktio- nen wurden getestet und gefriergetrocknet. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C. Die Angaben zu den Chromatographieprogrammen finden sich im Anhang (Kap. 6.5.).

4.2.6.5. Herstellung der Elicitorlösungen Chitosan 90 mg Chitosan wurden in 30 mL 30 mM Essigsäure gelöst und anschließend in flüssigen Stick- stoff gegeben. Die durchgefrorene Probe wurde im Gefriertrockner getrocknet, in 30 mL sterilem Wasser gelöst und bei -20 °C gelagert.

Alternaria brassicicola Auf eine Platte mit sporendem Pilz wurde Wasser gegeben und der Pilz vorsichtig vom Agar gelöst. Über eine Mullbinde wurde die Suspension sorgfältig in ein Gefäß umgefüllt. Von der Suspension wurden 50 µL in eine Zählkammer gegeben und die Sporen gezählt. Die Suspension wurde auf 5x105 Sporen/mL eingestellt, anschließend autoklaviert und bei -20 °C gelagert.

Pseudomonas syringae Die Bakterien wurden in einer Vorkultur über Nacht angezogen, die Hauptkultur wurde angeimpft und für für ca. 4 - 6 h inkubiert. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und das Pel-

let in 10 mM MgCl2 gelöst. Die OD600 wurde auf 0,2 eingestellt, die Bakteriensuspension an- schließend autoklaviert und bei -20 °C gelagert. 143 Literaturverzeichnis

5. Literaturverzeichnis

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179 Anhang

6. Anhang

6.1. Klonierungsschemata Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPhS

180 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPhSH

181 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPShSH

182 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPαhS

183 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPαCIN1-GAP

184 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPI2

185 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPI2B

186 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPI2M

187 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPαI2

188 Anhang

Schematische Darstellung der Klonierung des Konstrukts pPhtI2

189 Anhang

6.2. Liste der verwendeten Extrakte

Tabelle 6-1: Liste der für das Screening verwendeten Extrakte: Extrakte zur Verfügung gestellt von Prof. Bauer und Joanneum Research und selbsthergestellte Extrakte mittels suckzessiver Extraktion. Angegeben sind der lateinische Name, der verwendete Pflanzenteil, das Extraktionsmittel und die interne Bezeichung (soweit bekannt).

Achyranthis bidentata Radix Methanol B1 Aconitum carmichaelii Radix Dichlormethan B2 Aconitum carmichaelii Radix Methanol B3 Acorus tatarinowii Rhizom Dichlormethan B4 Acorus tatarinowii Rhizom Methanol B5 Akebia species Caulis Methanol B6 Allium macrostemon Bulbus Dichlormethan B7 Androgaphis paniculata Herba Dichlormethan B8 Androgaphis paniculata Herba Methanol B9 Angelica sinensis Radix Methanol B10 Aquilaria sinensis Lignum Dichlormethan B11 Aristolochia debelis Fructus Dichlormethan B12 Artemisia scoparia Herba Dichlormethan B13 Artemisia scoparia Herba Methanol B14 Asari species Radix+Rhizom Dichlormethan B15 Asari species Radix+Rhizom Methanol B16 Astragalus membranaceus Radix Dichlormethan B17 Astragalus membranaceus Radix Methanol B18 Belmandae christinae Rhizom Dichlormethan B19 Benincasa species Semen Dichlormethan B20 Broussonetia papyfera Fructus Dichlormethan B21 Buddleja officinalis Flos Methanol B22 Bupleurum chinense Radix Methanol B23 Callicarpa bodinieri Folium Dichlormethan B24 Carthamus tinctorius Flos Dichlormethan B25 Carthamus tinctorius Flos Methanol B26 Cassia species Semen Dichlormethan B27 Cassia species Semen Methanol B28 Chaenomeles speciosa Fructus Dichlormethan B29 Choerospondias axillaris Fructus Dichlormethan B30 Chrysanthemus indici Flos Dichlormethan B31 Cimicifuga species Radix Dichlormethan B32 Codonopsis pilosula Radix Methanol B33 Cordalis yanhusuo Rhizom Methanol B34 Crataegus pinnatifida Fructus Methanol B35 Cynanchum paniculatum Radix Dichlormethan B36 Evodia rutaecarpa Fructus Dichlormethan B37 Forsythia suspesa Fructus Methanol B38 Gardenia jasminoides Fructus Dichlormethan B39 Gardenia jasminoides Fructus Methanol B40 Gastrodia elata Radix Dichlormethan B41 Gastrodia elata Radix Methanol B42 Gentiana macrophylla Radix Dichlormethan B43 Gentiana macrophylla Radix Methanol B44 Isatidis indigotica Radix Methanol B45 Leonurus japonicus Fructus Methanol B46 Ligusticum chuanxiong Radix Methanol B47 Lindera aggregata Radix Dichlormethan B48 Lonicera japonica Caulis Methanol B49 Lysimachia christinae Herba Dichlormethan B50 Magnolia biondii Flos Dichlormethan B51 Melia toosendan Fructus Dichlormethan B52 Melia toosendan Fructus Methanol B53 Notoperygium species Radix+Rhizom Dichlormethan B54 190 Anhang

Notoperygium species Radix+Rhizom Methanol B55 Ophiopogonis japonicus Radix Methanol B56 Paeonia lactiflora Rhizom Dichlormethan B57 Paeonia lactiflora Rhizom Methanol B58 Paeonia rubra Radix Dichlormethan B59 Paeonia rubra Radix Methanol B60 Panax notoginseng Radix Dichlormethan B61 Panax notoginseng Radix Methanol B62 Platicodon gradiflorum Radix Methanol B63 Polygonatum odoratum Radix Dichlormethan B64 Polygonatum odoratum Radix Methanol B65 Polygonum multiflorum praep. Radix Methanol B66 Prunella vulgaris Herba Dichlormethan B67 Prunus persica Semen Dichlormethan B68 Prunus persica Semen Methanol B69 Rhemania glutinosa Radix Methanol B70 Salvia miltiorrhiza Radix Methanol B71 Santalum album Lignum Dichlormethan B72 Santalum album Lignum Methanol B73 Saposhnikova divaricata Radix Dichlormethan B74 Sargentodaxa cuenata Caulis Methanol B75 Schisandra chinensis Fructus Dichlormethan B76 Schisandra chinensis Fructus Methanol B77 Scutellaria baicalensis Radix Dichlormethan B78 Scutellaria baicalensis Radix Methanol B79 Sophora japonica Flos Dichlormethan B80 Sophora japonica Flos Methanol B81 Spatholobus suberrectus Caulis Methanol B82 Stephania tetranda Radix Dichlormethan B83 Stephania tetranda Radix Methanol B84 Terminalia immaturus Fructus Methanol B85 Thiaspi arvense Herba Dichlormethan B86 Thypha species Pollen Dichlormethan B87 Thypha species Pollen Methanol B88 Trichosanthis species Radix Methanol B89 Typhonium giganteum Rhizom Methanol B90 Vaccaria segetalis Semen Dichlormethan B91 Vaccaria segetalis Semen Methanol B92 Verbena officinalis Herba Dichlormethan B93 Verbena officinalis Herba Methanol B94 Victis trifolia Fructus Methanol B95 Vioala yedoensis Herba Dichlormethan B96 Vioala yedoensis Herba Methanol B97 Xanthium sibiricum praep. Fructus Dichlormethan B98 Xanthium sibiricum praep. Fructus Methanol B99 Zanthoxylum species Pocos Dichlormethan B100 Zanthoxylum species Pocos Methanol B101 Zingiberis officinalis Radix Dichlormethan B102 Zingiberis officinalis Radix Methanol B103 Ziziphus spinosa Semen Dichlormethan B104 Ziziphus spinosa Semen Methanol B105 Agastache rugosa Stängel, Äste Petrolether J1 Agastache rugosa Stängel, Äste MeOH J2 Anemarrhena aspheloides Wurzel Petrolether J3 Anemarrhena aspheloides Wurzel MeOH J4 Angelica anomalia Wurzel Petrolether J5 Angelica anomalia Wurzel MeOH J6 Arctium lappa Samen, Kerne Petrolether J7 Arctium lappa Samen, Kerne MeOH J8 Aristolochia contorta Früchte Petrolether J9 191 Anhang

Aristolochia contorta Früchte MeOH J10 Arnebia euchroma Rinde MeOH J11 Asparagus cochinensis Rhizom Ethylacetat J12 Asparagus cochinensis Rhizom MeOH J13 Asparagus officinalis Rhizom MeOH J14 Belamcanda chinensis Wurzel Petrolether J15 Belamcanda chinensis Wurzel MeOH J16 Bischofia javanica Blume Samenschalen Petrolether J17 Bischofia javanica Blume Samenschalen Ethylacetat J18 Bischofia javanica Blume Samenschalen MeOH J19 Bischofia javanica Blume Samenschalen Wasser J20 Bryophyllum pinnatum ganze Pflanze Petrolether J21 Bryophyllum pinnatum ganze Pflanze MeOH J22 Bulbophyllum shwaliana ganze Pflanze Petrolether J23 Bulbophyllum shwaliana ganze Pflanze MeOH J24 Caesalpinia sappan Blätter u. Äste MeOH J25 Caesalpinia sappan Blätter u. Äste Wasser J26 Cantharides Samen, Kerne Hexan J27 Cantharides Samen, Kerne MeOH J28 Chrysanthemum morifolium Ramat Blüten Petrolether J29 Chrysanthemum morifolium Ramat Blüten MeOH J30 Cimicifuga ? unbekannt unbekannt J31 Cimicifuga heracleifolia Wurzel Petrolether J32 Cimicifuga heracleifolia Wurzel MeOH J33 Cinchona succirubra Rinde Petrolether J34 Cinchona succirubra Rinde MeOH J35 Cinnamomum cassia Rinde Petrolether J36 Cinnamomum cassia Rinde MeOH J37 Clematis chinensis Wurzel Petrolether J38 Clematis chinensis Wurzel MeOH J39 Clematis meyeriana oberirdische Teile Petrolether J40 Clematis meyeriana oberirdische Teile MeOH J41 Cocculus trilobus Wurzel Petrolether J42 Cocculus trilobus Wurzel MeOH J43 Codonopsis nervosa Wurzel Petrolether J44 Codonopsis nervosa Wurzel Ethylacetat J45 Codonopsis nervosa Wurzel MeOH J46 Coix lacryma-jobi Samen, Kerne Petrolether J47 Coix lacryma-jobi Samen, Kerne MeOH J48 Cornus officinalis Früchte Petrolether J49 Cornus officinalis Früchte MeOH J50 Crocus sativus L. Blüten Petrolether J51 Crocus sativus L. Blüten MeOH J52 Crotalaria assamica Stängel, Äste Petrolether J53 Crotalaria assamica Stängel, Äste MeOH J54 Crotalaria assamica Samen u. Samenschalen Petrolether J55 Crotalaria assamica Samen u. Samenschalen MeOH J56 Curcuma longa Früchte Hexan J57 Curcuma longa Früchte MeOH J58 Cuscuta chinensis oberirdische Teile Petrolether J59 Cuscuta chinensis oberirdische Teile MeOH J60 Cuscuta chinensis Samen, Kerne Petrolether J61 Cuscuta chinensis Samen, Kerne MeOH J62 Cycas revoluta Blätter Petrolether J63 Cycas revoluta Blätter MeOH J64 Eleutherococcus senticosus Rinde Petrolether J65 Eleutherococcus senticosus Rinde MeOH J66 Eleutherococcus senticosus Rinde Wasser J67 Epipremnum pinnatum Blätter MeOH J68 Euphorbia antiquorum Stängel, Äste Petrolether J69 192 Anhang

Euphorbia antiquorum Stängel, Äste MeOH J70 Fritillaria verticillata Rhizom Petrolether J71 Fritillaria verticillata Rhizom Ethylacetat J72 Fritillaria verticillata Rhizom MeOH J73 Gardenia jasminoides Früchte Petrolether J74 Gardenia jasminoides Früchte MeOH J75 Glycyrrhiza uralensis ganze Pflanze MeOH J76 Hedyotis diffusa ganze Pflanze Petrolether J77 Hedyotis diffusa ganze Pflanze MeOH J78 Hydnocarpus anthelmintica Samen, Kerne Petrolether J79 Hydnocarpus anthelmintica Samenschalen Petrolether J80 Hydnocarpus anthelmintica Samen, Kerne Ethylacetat J81 Hydnocarpus anthelmintica Samenschalen Ethylacetat J82 Hydnocarpus anthelmintica Samen, Kerne MeOH J83 Isatis tinctoria Wurzel Petrolether J84 Isatis tinctoria Wurzel MeOH J85 Jatropha curcas Samen u. Samenschalen Petrolether J86 Jatropha curcas Samen u. Samenschalen Ethylacetat J87 Jatropha curcas Samen u. Samenschalen MeOH J88 Jatropha curcas Samen u. Samenschalen Wasser J89 Jatropha curcas Samen u. Samenschalen Petrolether J90 Jatropha curcas Samen u. Samenschalen MeOH J91 Laggera pterodonta Blätter u. Äste Petrolether J92 Laggera pterodonta Blätter u. Äste Ethylacetat J93 Laggera pterodonta Blätter u. Äste MeOH J94 Lobelia chinensis ganze Pflanze Petrolether J95 Lobelia chinensis ganze Pflanze Ethylacetat J96 Lobelia chinensis ganze Pflanze MeOH J97 Lobelia chinensis ganze Pflanze Wasser J98 Lonicera japonica Stängel, Äste Petrolether J99 Lonicera japonica Stängel, Äste MeOH J100 Lysionatus austrolis C. Y. Wu Blätter u. Äste Petrolether J101 Lysionatus austrolis C. Y. Wu Blätter u. Äste MeOH J102 Momordica charantia Fruchtschalen MeOH J103 Momordica charantia Fruchtschalen Hexan J104 Momordica charantia Fruchtschalen MeOH J105 Panax ginseng C. A. Mey. cv Wurzel u. Äste MeOH J106 Yuansheng Paraboea rufescens ganze Pflanze Petrolether J107 Paraboea rufescens ganze Pflanze MeOH J108 Phryrium capitatum Blätter u. Äste Petrolether J109 Phryrium capitatum Blätter u. Äste MeOH J110 Pilea platanifolia ganze Pflanze Petrolether J111 Pilea platanifolia ganze Pflanze MeOH J112 Pinellia ternata Rhizom Petrolether J113 Pinellia ternata Rhizom Ethylacetat J114 Pinellia ternata Rhizom MeOH J115 Pistacia weinmannifolia Blätter u. Äste Petrolether J116 Pistacia weinmannifolia Blätter u. Äste MeOH J117 Plantago asiatica ganze Pflanze Petrolether J118 Plantago asiatica ganze Pflanze MeOH J119 Polygonum multiflorum Rhizom Petrolether J120 Polygonum multiflorum Rhizom MeOH J121 Portulaca oleracea ganze Pflanze Petrolether J122 Portulaca oleracea ganze Pflanze MeOH J123 Pristimera cambodiana Samen u. Samenschalen Petrolether J124 Pristimera cambodiana Samen u. Samenschalen MeOH J125 Prunella vulgaris ganze Pflanze Petrolether J126 Prunella vulgaris ganze Pflanze MeOH J127 Pueralia lobata oberirdische Teile MeOH J128 193 Anhang

Quisqualis indica Blätter u. Äste Petrolether J129 Quisqualis indica Blätter u. Äste Ethylacetat J130 Quisqualis indica Blätter u. Äste MeOH J131 Rheum officinale Wurzel Petrolether J132 Rheum officinale Wurzel MeOH J133 Ricinus communis Samen, Kerne Petrolether J134 Ricinus communis Samen, Kerne MeOH J135 Saussurea lappa Wurzel MeOH J136 Senecio scandens Stängel, Äste Petrolether J137 Senecio scandens Stängel, Äste MeOH J138 Trichosanthes kirilowii Knospen Hexan J139 Trichosanthes kirilowii Knospen MeOH J140 Verbena officinalis (?) Blätter u. Äste Petrolether J141 Verbena officinalis (?) Blätter u. Äste MeOH J142 Vorläufige Speziesnummer 901 Blätter u. Äste Petrolether J143 Vorläufige Speziesnummer 901 Blätter u. Äste MeOH J144 Vorläufige Speziesnummer 904 ganze Pflanze Petrolether J145 Vorläufige Speziesnummer 904 ganze Pflanze MeOH J146 Vorläufige Speziesnummer 905 ganze Pflanze Petrolether J147 Vorläufige Speziesnummer 905 ganze Pflanze MeOH J148 Zanthoxylum nitidum Stängel, Äste Petrolether J149 Zanthoxylum nitidum Stängel, Äste Ethylacetat J150 Zanthoxylum nitidum Stängel, Äste MeOH J151 Angelica dahurica 2_1; 12 LFL, Ernte 2003 R33

Angelica dahurica 2_2; 12 LFL, Ernte 2003 R34

Angelica dahurica 2_3; 12 LFL, Ernte 2003 R35

Angelica dahurica 2_1; 19 LBP, 007-01-01- Wurzel R36 0-00 (Stefan) Angelica dahurica 2_2; 19 LBP, 007-01-01- Wurzel R37 0-00 (Stefan) Angelica dahurica 2_3; 19 LBP, 007-01-01- Wurzel R38 0-00 (Stefan) Bupleurum falcatum 2_1;  leer  26.08.07: 26.08.09, 197 Bupleuri Wurzel R39

radix (Chaihu) Bupleurum falcatum 2_1;  leer  26.08.07: 26.08.09, 197 Bupleuri radix Wurzel R40 (Chaihu) Bupleurum falcatum 2_1;  leer  26.08.07: 26.08.09, 197 Bupleuri radix Wurzel R41 (Chaihu) Leonurus heterophyllus 2_1; 2 LBP, 001- oberirdische Teile R42 08-01-0-00 (Stefan) Leonurus heterophyllus 2_2; 2 LBP, 001- oberirdische Teile R43 08-01-0-00 (Stefan) Leonurus heterophyllus 2_3; 2 LBP, 001- oberirdische Teile R44 08-01-0-00 (Stefan) Leonurus sibiricus 2_1; 1205, Ernte 2002 R45

Leonurus sibiricus 2_2; 1205, Ernte 2002 R46

Leonurus sibiricus 2_3; 1205, Ernte 2002 R47

Tribulus terrestris 2_1; 3 LBP, 003-12-01- Früchte R48 0-00 (Stefan) Tribulus terrestris 2_2; 3 LBP, 003-12-01- Früchte R49 0-00 (Stefan) Tribulus terrestris 2_3; 3 LBP, 003-12-01- Früchte R50 0-00 (Stefan) Balanites aegypticus Semen Hexan E1 Balanites aegypticus Samen DCM E2 Balanites aegypticus Samen MeOH E3 Balanites aegypticus Samen Wasser R1 Bixa orellana Samen Hexan E4 Bixa orellana Samen DCM E5 Bixa orellana Samen MeOH E6 Bixa orellana Samen Wasser R2 Cleome droserifolia Kraut Hexan E7 194 Anhang

Cleome droserifolia Kraut DCM E8 Cleome droserifolia Kraut MeOH E9 Cleome droserifolia Kraut Wasser R3 Cucurbita pepo Samen Hexan E10 Cucurbita pepo Samen DCM E11 Cucurbita pepo Samen MeOH E12 Cucurbita pepo Samen Wasser R4 Eleutherococcus senticosus Blätter Hexan E16 Eleutherococcus senticosus Blätter DCM E17 Eleutherococcus senticosus Blätter MeOH E18 Eleutherococcus senticosus Blätter Wasser R6 Eleutherococcus sieboldensis Blätter Hexan E19 Eleutherococcus sieboldensis Blätter DCM E20 Eleutherococcus sieboldensis Blätter MeOH E21 Eleutherococcus sieboldensis Blätter Wasser R7 Euterpe oleracea Frucht Hexan E13 Euterpe oleracea Frucht DCM E14 Euterpe oleracea Frucht MeOH E15 Euterpe oleracea Frucht Wasser R5 Gingko biloba Blätter Hexan E22 Gingko biloba Blätter DCM E23 Gingko biloba Blätter MeOH E24 Gingko biloba Blätter Wasser R8 Hovenia dulcis Blätter Hexan E25 Hovenia dulcis Blätter DCM E26 Hovenia dulcis Blätter MeOH E27 Hovenia dulcis Blätter Wasser R9 Ilex paraguarensis Blätter DCM E29 Ilex paraguariensis Blätter Hexan E28 Ilex paraguariensis Blätter MeOH E30 Ilex paraguariensis Blätter Wasser R10 Lupinus termis I Samen Hexan E31 Lupinus termis I Samen DCM E32 Lupinus termis I Samen MeOH E33 Lupinus termis I Samen Wasser R11 Lupinus termis II Samen Hexan E34 Lupinus termis II Samen DCM E35 Lupinus termis II Samen MeOH E36 Lupinus termis II Samen Wasser R12 Malpighia glabra Frucht Hexan E50 Malpighia glabra Frucht DCM E51 Malpighia glabra Frucht MeOH E52 Malpighia glabra Frucht Wasser R17 Manihot esculenta Mehl Hexan E47 Manihot esculenta Mehl DCM E48 Manihot esculenta Mehl MeOH E49 Manihot esculenta Mehl Wasser R16 Momordia charantia g Frucht MeOH E43 Momordia charantia g Frucht Wasser R14 Momordica charantia Frucht Hexan E38 Momordica charantia Frucht DCM E39 Momordica charantia Frucht MeOH E40 Momordica charantia Frucht Wasser R13 Momordica charantia g Frucht Hexan E41 Momordica charantia g Frucht DCM E42 Momordica charantia o Frucht Hexan E44 Momordica charantia o Frucht DCM E45 Momordica charantia o Frucht MeOH E46 Momordica charantia o Frucht Wasser R15 Nigella sativa I Samen Hexan E53 195 Anhang

Nigella sativa I Samen DCM E54 Nigella sativa I Samen MeOH E55 Nigella sativa I Samen Wasser R18 Nigella sativa II Samen Hexan E57 Nigella sativa II Samen DCM E58 Nigella sativa II Samen MeOH E59 Nigella sativa II Samen Wasser R19 Opuntia streptacantha Spross Hexan E60 Opuntia streptacantha Spross DCM E61 Opuntia streptacantha Spross MeOH E62 Opuntia streptacantha Spross Wasser R20 Paullinia cupana Samen Hexan E66 Paullinia cupana Samen DCM E67 Paullinia cupana Samen MeOH E68 Paullinia cupana Samen Wasser R22 Peumus boldus Blätter Hexan E63 Peumus boldus Blätter DCM E64 Peumus boldus Blätter MeOH E65 Peumus boldus Blätter Wasser R21 Punica granatum I Frucht Hexan E69 Punica granatum I Frucht DCM E70 Punica granatum I Frucht MeOH E71 Punica granatum I Frucht Wasser R23 Punica granatum II Frucht Hexan E72 Punica granatum II Frucht DCM E73 Punica granatum II Frucht MeOH E74 Punica granatum II Frucht Wasser R24 Punica granatum III Frucht Hexan E76 Punica granatum III Frucht DCM E77 Punica granatum III Frucht MeOH E78 Punica granatum III Frucht Wasser R25 Sophora davidii Blätter Hexan E79 Sophora davidii Blätter DCM E80 Sophora davidii Blätter MeOH E81 Sophora davidii Blätter Wasser R26 Sophora japonica Blätter Hexan E82 Sophora japonica Blätter DCM E83 Sophora japonica Blätter MeOH E84 Sophora japonica Blätter Wasser R27 Taraxacum officinale Kraut Hexan E91 Taraxacum officinale Kraut DCM E92 Taraxacum officinale Kraut MeOH E93 Taraxacum officinale Kraut Wasser R30 Trigonella foenum-graecum I Samen Hexan E85 Trigonella foenum-graecum I Samen DCM E86 Trigonella foenum-graecum I Samen MeOH E87 Trigonella foenum-graecum I Samen Wasser R28 Trigonella foenum-graecum II Samen Hexan E88 Trigonella foenum-graecum II Samen DCM E89 Trigonella foenum-graecum II Samen MeOH E90 Trigonella foenum-graecum II Samen Wasser R29 Viscum album Kraut Hexan E37 Viscum album Kraut DCM E56 Viscum album Kraut MeOH E75 Viscum album Kraut Wasser R31

196 Anhang

6.3. Zusätzliche Angaben zur Temperaturabhängigkeit, pH-Abhängigkeit und Hemmung durch proteinogene Invertaseinhibitoren

Tabelle 6-2: Mittelwerte der Messungen zur Temperatur-Abhängigkeit mit Standardabweichung. Angegeben sind die Mittelwerte der Messungen (mindestens drei Wiederholungen) in Prozent mit Standardabweichung. Die Abkürzungen wurden wie in Tabelle 2-1 angegeben verwendet.

°C 31 34 39 44 48 50 53 58 64 68 AtCrEx 64 ± 2 76 ± 5 94 ± 2 100 ± 0 81 ± 1 66 ± 6 41 ± 4 17 ± 2 13 ± 1 14 ± 2 BnCrEx 53 ± 13 67 ± 8 83 ± 6 100 ± 0 82 ± 7 68 ± 7 32 ± 25 11 ± 7 10 ± 4 15 ± 1 AtCwEx 55 ± 10 65 ± 11 92 ± 8 98 ± 3 82 ± 16 65 ± 14 30 ± 8 18 ± 10 26 ± 18 33 ± 23 BnCwEx 61 ± 16 79 ± 10 93 ± 8 87 ± 16 71 ± 21 54 ± 23 34 ± 8 42 ± 22 56 ± 21 58 ± 37 NtCrEx 47 ± 18 56 ± 16 69 ± 14 84 ± 6 95 ± 2 100 ± 0 94 ± 0 78 ± 0 58 ± 4 24 ± 2 SlCrEx 35 ± 21 42 ± 17 65 ± 16 88 ± 8 99 ± 1 98 ± 2 89 ± 3 26 ± 9 5 ± 9 8 ± 7 NtCwEx 59 ± 3 70 ± 1 86 ± 2 99 ± 1 100 ± 1 97 ± 1 90 ± 3 57 ± 1 32 ± 0 16 ± 1 SlCwEx 39 ± 9 43 ± 7 71 ± 5 94 ± 1 98 ± 2 99 ± 3 69 ± 17 25 ± 12 20 ± 4 28 ± 4 BvCrEx 53 ± 19 60 ± 18 79 ± 15 92 ± 8 96 ± 1 96 ± 6 79 ± 14 40 ± 26 25 ± 28 24 ± 29 BvCwEx 57 ± 13 63 ± 16 82 ± 9 96 ± 4 96 ± 4 98 ± 3 81 ± 11 38 ± 16 20 ± 7 20 ± 5 °C 20 24 28 33 38 42 47 52 56 60 CrCwIN 27 ± 1 34 ± 1 43 ± 2 61 ± 5 85 ± 6 100 ± 0 88 ± 9 32 ± 3 14 ± 2 9 ± 1 CIN1 27 ± 2 32 ± 3 43 ± 2 59 ± 4 80 ± 4 99 ± 2 98 ± 2 31 ± 6 12 ± 4 7 ± 1 CIN1(P/V) 24 ± 3 33 ± 3 48 ± 4 64 ± 6 86 ± 5 100 ± 0 41 ± 1 13 ± 3 9 ± 2 4 ± 4 hS 100 ± 5 98 ± 1 99 ± 2 99 ± 4 98 ± 3 92 ± 4 94 ± 4 93 ± 1 89 ± 3 89 ± 4 HI 60 ± 4 60 ± 3 67 ± 1 78 ± 1 90 ± 5 92 ± 5 99 ± 1 100 ± 2 88± 4 62 ± 1 °C 31 34 39 44 48 50 53 58 64 68 253 ± 423 ± TaVIN2 83 ± 2 93 ± 2 100 ± 0 68 ± 4 67 ± 3 74 ± 2 87 ± 3 149 ± 5 20 45 Suc22 93 ± 6 100 ± 1 98 ± 1 88 ± 1 70 ± 1 64 ± 4 51 ± 1 17 ± 1 8 ± 2 11 ± 2

197 Anhang

Tabelle 6-3: Mittelwerte der Messungen zur pH-Abhängigkeit mit Standardabweichung. Angegeben sind die Mittelwerte der Messungen (mindestens drei Wiederholungen) in Prozent mit Standardab- weichung. Die Abkürzungen wurden wie in Tabelle 2-1 angegeben verwendet. pH-Wert 2,7 3,0 3,3 3,6 3,9 4,2 4,5 4,8 5,1 5,4 5,7 6,0 6,3 6,6 6,9 7,2 7,5 7,8 8 12 21 33 48 59 71 83 97 98 94 91 81 71 55 39 26 17 AtCrEx ± 2 ± 2 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 5 ± 3 ± 4 ± 3 ± 4 ± 6 ± 5 ± 4 ± 4 ± 5 ± 4 ± 4 4 4 12 28 44 57 70 82 95 94 91 84 74 65 50 32 19 9 BnCrEx ± 3 ± 3 ± 8 ± 9 ± 13 ± 13 ± 9 ± 8 ± 10 ± 4 ± 8 ± 11 ± 13 ± 12 ± 14 ± 12 ± 10 ± 8 25 31 41 54 73 77 85 90 99 90 81 71 63 52 38 28 19 13 AtCwEx ± 7 ± 6 ± 5 ± 7 ± 13 ± 6 ± 9 ± 7 ± 2 ± 7 ± 8 ± 10 ± 11 ± 9 ± 9 ± 8 ± 8 ± 7 18 16 20 34 49 64 76 86 98 95 89 83 75 64 47 32 22 12 BnCwEx ± 9 ± 7 ± 8 ± 13 ± 14 ± 9 ± 6 ± 3 ± 4 ± 5 ± 7 ± 10 ± 9 ± 9 ± 8 ± 12 ± 8 ± 8 35 42 52 64 78 89 100 97 87 77 62 48 33 23 15 9 5 3 NtCrEx ± 2 ± 2 ± 2 ± 3 ± 1 ± 5 ± 0 ± 1 ± 6 ± 4 ± 3 ± 2 ± 4 ± 2 ± 1 ± 2 ± 1 ± 0 22 29 45 56 69 77 82 95 97 75 60 43 28 20 9 4 2 1 SlCrEx ± 6 ± 9 ± 10 ± 11 ± 11 ± 10 ± 9 ± 5 ± 9 ± 10 ± 6 ± 5 ± 5 ± 7 ± 4 ± 3 ± 1 ± 1 32 35 46 60 83 88 97 99 96 89 73 60 47 36 23 21 15 11 NtCwEx ± 4 ± 6 ± 3 ± 3 ± 4 ± 4 ± 3 ± 1 ± 5 ± 7 ± 4 ± 4 ± 3 ± 2 ± 2 ± 1 ± 2 ± 2 49 48 59 69 85 89 91 96 99 86 65 49 38 28 19 9 7 6 SlCwEx ± 9 ± 11 ± 11 ± 9 ± 8 ± 7 ± 5 ± 10 ± 2 ± 9 ± 6 ± 5 ± 6 ± 3 ± 5 ± 4 ± 4 ± 3 18 26 35 49 63 69 82 90 100 81 62 43 23 14 4 1 1 0 BvCrEx ± 4 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 5 ± 2 ± 0 ± 3 ± 2 ± 3 ± 5 ± 3 ± 1 ± 1 ± 2 ± 2 43 47 53 66 75 82 91 91 100 85 66 50 35 26 14 6 2 1 BvCwEx ± 3 ± 5 ± 6 ± 3 ± 2 ± 3 ± 3 ± 1 ± 0 ± 1 ± 2 ± 3 ± 3 ± 2 ± 5 ± 2 ± 1 ± 2 83 85 90 95 100 92 87 62 45 31 21 17 12 10 9 9 8 8 CrCwIN ± 5 ± 8 ± 3 ± 4 ± 0 ± 6 ± 2 ± 2 ± 6 ± 7 ± 9 ± 10 ± 9 ± 8 ± 9 ± 8 ± 8 ± 8 92 97 99 98 89 77 64 43 26 17 11 9 8 5 4 4 3 2 CIN1 ± 7 ± 2 ± 3 ± 4 ± 1 ± 2 ± 1 ± 2 ± 3 ± 4 ± 4 ± 2 ± 1 ± 3 ± 1 ± 0 ± 2 ± 2 73 78 84 91 94 89 97 85 74 61 50 42 37 31 25 31 30 23 CIN1(P/V) ± 3 ± 1 ± 5 ± 7 ± 7 ± 7 ± 5 ± 2 ± 2 ± 2 ± 5 ± 6 ± 5 ± 5 ± 5 ± 7 ± 8 ± 6 65 60 55 54 55 55 59 57 64 81 86 96 96 96 92 96 87 79 hS ± 27 ± 32 ± 32 ± 36 ± 34 ± 36 ± 40 ± 41 ± 27 ± 11 ± 8 ± 4 ± 3 ± 2 ± 1 ± 7 ± 11 ± 20 32 49 52 64 77 84 93 94 96 97 97 99 91 81 71 58 45 35 HI ± 3 ± 1 ± 2 ± 2 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 1 ± 2 ± 2 ± 1 ± 3 ± 1 ± 2 ± 2 ± 2 144 105 74 72 87 92 98 92 98 86 88 76 66 55 43 32 26 32 TaVIN2 ± 45 ± 41 ± 31 ± 21 ± 14 ± 5 ± 4 ± 7 ± 2 ± 6 ± 8 ± 24 ± 19 ± 14 ± 12 ± 9 ± 8 ± 8 39 23 15 10 7 6 4 6 10 36 88 92 99 100 93 80 64 51 Suc22 ± 3 ± 2 ± 2 ± 0 ± 1 ± 0 ± 0 ± 2 ± 2 ± 2 ± 6 ± 3 ± 2 ± 0 ± 3 ± 3 ± 3 ± 2

198 Anhang

Tabelle 6-4: Prozentuale Abweichung der Aktivität der pflanzlichen Invertasepräparationen durch Extrakte mit proteinogenen Inhibitoren. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Messungen mit genannter Saccharosekonzentration. Verwendete Inhibitorlösungen waren Rohextrakte aus N. benthamiana mit AtC/VIF1, AtC/VIF2, BvC/VIF, NtCIF und NtVIF, davon wurden jeweils 4 und 7 µg Gesamtprotein für die Hemmtests eingesetzt.

4 mM Suc 7 mM Suc 10 mM Suc Gesamtprotein 4 µg 7 µg 4 µg 7 µg 4 µg 7 µg AtC/VIF1 -6 ± 8 -15 ± 4 -7 ± 4 -7 ± 2 -4 ± 1 -1 ± 5 AtC/VIF2 -18 ± 3 -27 ± 5 -14 ± 2 -20 ± 3 -2 ± 5 -3 ± 4 AtCrEx BvC/VIF -26 ± 16 -40 ± 26 -21 ± 16 -36 ± 27 -13 ± 19 -27 ± 22 NtCIF -57 ± 35 -65 ± 30 -50 ± 43 -64 ± 31 -46 ± 44 -52 ± 41 NtVIF -18 ± 5 -19 ± 5 -25 ± 11 -31 ± 14 4 ± 9 -31 ± 14 BvC/VIF -39 ± 36 -34 ± 60 -31 ± 48 -50 ± 45 -27 ± 38 -45 ± 41 BnCrEx NtCIF -28 ± 69 -62 ± 38 -55 ± 28 -79 ± 21 -52 ± 38 -59 ± 37 NtVIF 0 ± 56 -3 ±80 -35 ± 24 -36 ± 27 -21 ± 32 -37 ± 32 2 mM Suc 4 mM Suc 7 mM Suc AtC/VIF1 51 ± 32 49 ± 20 32 ± 18 62 ± 32 56 ± 30 69 ± 39 AtC/VIF2 32 ± 30 32 ± 17 41 ± 18 48 ± 14 38 ± 33 50 ± 24 AtCwEx BvC/VIF -31 ± 24 -56 ± 32 -19 ± 32 -44 ± 38 -24 ± 19 -47 ± 28 NtCIF -61 ± 31 -80 ± 17 -57 ± 29 -72 ± 21 -54 ± 29 -63 ± 26 NtVIF -34 ± 10 -39 ± 15 -24 ± 15 -35 ± 24 -16 ± 4 -22 ± 9 4 mM Suc 7 mM Suc 10 mM Suc BvC/VIF -32 ± 48 -40 ± 44 -38 ± 36 -44 ± 39 -26 ± 41 -42 ± 41 BnCwEx NtCIF -57 ± 37 -67 ± 24 -52 ± 42 -59 ± 43 -56 ± 37 -57 ± 38 NtVIF -16 ± 39 -40 ±78 -27 ± 21 -30 ± 38 -4 ± 30 -12 ± 41 BvC/VIF -25 ± 21 -32 ± 30 -21 ± 24 -26 ± 19 -20 ± 24 -32 ± 27 NtCrEx NtCIF -44 ± 37 -44 ± 45 -37 ± 37 -51 ± 31 -42 ± 39 -44 ± 40 NtVIF -4 ± 29 -9 ±26 -16 ± 4 -15 ± 6 -5 ± 21 -3 ± 14 2 mM Suc 4 mM Suc 7 mM Suc BvC/VIF -15 ± 8 -20 ± 25 -8 ± 17 -10 ± 11 -24 ± 5 -27 ± 2 SlCrEx NtCIF -35 ± 4 -34 ± 17 -36 ± 19 -59 ± 22 -44 ± 22 -49 ± 13 NtVIF 0 ± 11 17 ± 22 -27 ± 20 -21 ± 24 2 ± 1 8 ± 3 4 mM Suc 7 mM Suc 10 mM Suc BvC/VIF -26 ± 9 -38 ± 14 -11 ± 15 -16 ± 21 -15 ± 19 -22 ± 21 NtCwEx NtCIF -48 ± 18 -40 ± 29 -12 ± 40 -40 ± 34 -32 ± 29 -12 ± 70 NtVIF -11 ± 21 -13 ±26 -16 ± 32 -12 ± 70 34 ± 52 49 ± 26 BvC/VIF -13 ± 27 -41 ± 21 -9 ± 24 -41 ± 22 -10 ± 26 -34 ± 28 SlCwEx NtCIF -44 ± 25 -67 ± 17 -41 ± 22 -60 ± 22 -38 ± 27 -48 ± 32 NtVIF -21 ± 17 -28 ±23 -11 ± 24 -20 ± 27 4 ± 17 -2 ± 25 BvC/VIF -33 ± 18 -44 ± 26 -25± 24 -33 ± 37 -20 ± 25 -34 ± 32 BvCrEx NtCIF -39 ± 40 -42 ± 46 -30 ± 41 -61 ± 26 -40 ± 37 -44 ± 46 NtVIF 2 ± 37 4 ± 37 -19 ± 10 -16 ± 20 2 ± 36 28 ± 26 BvC/VIF -25 ± 23 -47 ± 29 -21 ± 23 -34 ± 35 -20 ± 28 -39 ± 32 BvCrEx NtCIF -39 ± 37 -26 ± 73 -28 ± 43 -46 ± 39 -40 ± 36 -23 ± 60 NtVIF -28 ± 13 10 ± 34 -4 ± 22 -7 ± 4 -15 ± 27 48 ± 65 0,4 mM Suc 0,7 mM Suc 1 mM Suc AtC/VIF1 -12 ± 20 -20 ± 16 -11 ± 2 -18 ± 4 0 ± 7 -6 ± 6 AtC/VIF2 1 ± 11 1 ± 14 6 ± 8 -2 ± 24 0 ± 8 3 ± 10 CrCwIN BvC/VIF 7 ± 14 8 ± 33 -6 ± 18 -3 ± 14 8 ± 23 -16 ± 44 NtCIF 9 ± 22 10 ± 21 2 ± 25 -57 ± 34 3 ± 26 -7 ± 21 NtVIF 11 ± 38 12 ± 30 -28 ± 9 -16 ± 14 25 ± 37 22 ± 40 199 Anhang

AtC/VIF1 94 ± 43 65 ± 54 97 ± 94 48 ± 70 69 ± 41 44 ± 39 AtC/VIF2 87 ± 39 76 ± 33 109 ± 89 104 ± 95 75 ± 38 76 ± 46 CIN1 BvC/VIF 39 ± 59 23 ± 61 66 ± 73 53 ± 65 98 ± 100 68 ± 86 NtCIF 34± 56 19 ± 45 77 ± 69 39 ± 31 61 ± 61 43 ± 48 NtVIF 42 ± 65 35 ± 51 29 ± 45 28 ± 58 70 ± 65 95 ± 89 BvC/VIF 3 ± 47 -37 ± 33 -8 ± 32 -28 ± 44 -4 ± 34 -47 ± 23 CIN1(P/V) NtCIF -25 ± 27 -34 ± 12 -23 ± 33 -43 ± 10 -33 ± 18 -29 ± 15 NtVIF -15 ± 34 -10 ± 43 -34 ± 12 -29 ± 32 1 ± 37 29 ± 39 30 mM Suc 50 mM Suc 100 mM Suc AtC/VIF1 150 ± 151 215 ± 190 87 ± 48 202 ± 143 82 ± 47 158 ± 102 AtC/VIF2 82 ± 67 162 ± 113 68 ± 28 148 ± 18 43 ± 32 120 ± 22 TaVIN2 BvC/VIF -3 ± 7 -17 ± 2 -5 ± 3 -17 ± 11 -5 ± 18 -19 ± 21 NtCIF 20 ± 23 34 ± 56 22 ± 16 46 ± 33 21 ± 43 28 ± 54 NtVIF 22 ± 45 17 ± 59 26 ± 31 14 ± 23 25 ± 48 19 ± 68 AtC/VIF1 -15 ± 9 -32 ± 8 -25 ± 4 -43 ± 8 -23 ± 13 -33 ± 11 AtC/VIF2 -20 ± 5 -24 ± 12 -13 ± 13 -21 ± 15 -21 ± 10 -26 ± 18 Suc22 BvC/VIF -43 ± 10 -63 ± 10 -31 ± 5 -52 ± 8 -24 ± 19 -59 ± 8 NtCIF -40 ± 13 -60 ± 7 -43 ± 1 -57 ± 14 -34 ± 10 -49 ± 11 NtVIF -25 ± 18 -30 ± 9 -26 ± 11 -27 ± 7 -16 ± 10 -25 ± 4

6.4. Ergebnisse der durchgeführten Hemmtests mit den Extrakten

Tabelle 6-5: Ergebnisse der mit CrCwIN durchgeführten Messungen. Angegeben ist die prozentuale Abweichung der Messung mit Extrakt zur Messung ohne Extrakt (Akt.: Aktivität) bzw. die gemessene Abweichung von einer bestimmten Glucosemenge (Glc: Glucose). Die Zahlen stellen Mittelwerte dreier Messungen mit Standardabweichung dar. Die Abkürzungen der getesteten Extrakte werden wie unter 6.2. aufgezählt verwendet.

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 -8 -7 -13 -5 -13 -2 -3 -12 -8 -23 2 -1 -11 -24 -4 Akt. ± 7 ± 6 ± 8 ± 18 ± 13 ± 12 ± 9 ± 10 ± 12 ± 6 ± 13 ± 19 ± 23 ± 10 ± 11 -2 -6 -4 -4 -2 -4 -5 -5 -7 -4 -3 -6 -4 -8 -6 Glc ± 1 ± 4 ± 6 ± 4 ± 8 ± 2 ± 3 ± 3 ± 4 ± 2 ± 2 ± 4 ± 7 ± 3 ± 5 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 -7 -5 -15 -11 -20 -6 -28 -9 -13 -3 -9 -4 -9 2 4 Akt. ± 12 ± 18 ± 4 ± 10 ± 4 ± 11 ± 8 ± 7 ± 24 ± 16 ± 3 ± 7 ± 10 ± 8 ± 1 -6 -5 -4 -10 -3 4 -5 -1 -6 2 3 4 -1 3 4 Glc ± 2 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 7 ± 3 ± 7 ± 6 ± 4 ± 5 ± 3 ± 3 ± 4 ± 4 B31 B32 B33 B34 B35 B36 B37 B38 B39 B40 B41 B42 B43 B44 B45 -2 0 -10 -7 -8 -2 -6 -35 -10 -5 -3 -6 -5 -5 -8 Akt. ± 6 ± 12 ± 7 ± 3 ± 9 ± 10 ± 6 ± 17 ± 6 ± 9 ± 26 ± 11 ± 19 ± 16 ± 20 -6 -6 -6 -7 -14 -7 -11 -15 -3 -6 -6 -7 -5 -7 5 Glc ± 2 ± 3 ± 2 ± 1 ± 12 ± 1 ± 10 ± 2 ± 1 ± 2 ± 10 ± 6 ± 3 ± 7 ± 3 B46 B47 B48 B49 B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 B60 -9 -22 25 -1 14 -2 -2 -13 13 -14 -10 -5 -3 -3 -28 Akt. ± 15 ± 18 ± 20 ± 18 ± 12 ± 10 ± 21 ± 5 ± 26 ± 13 ± 4 ± 12 ± 20 ± 21 ± 2 -6 -7 -8 -3 -1 -7 -5 -2 -3 -3 -3 -15 -8 -8 -14 Glc ± 8 ± 3 ± 3 ± 2 ± 7 ± 5 ± 3 ± 7 ± 4 ± 7 ± 2 ± 12 ± 5 ± 5 ± 7 B61 B62 B63 B64 B65 B66 B67 B68 B69 B70 B71 B72 B73 B74 B75 -2 9 -6 -4 -10 -11 -8 -8 -2 1 -13 7 4 -3 -18 Akt. ± 8 ± 4 ± 5 ± 9 ± 9 ± 9 ± 19 ± 12 ± 8 ± 11 ± 11 ± 12 ± 9 ± 22 ± 8 1 -2 -5 -2 -4 -3 -3 -1 -3 0 -9 -5 -13 -2 -18 Glc ± 8 ± 2 ± 4 ± 4 ± 4 ± 3 ± 6 ± 4 ± 6 ± 6 ± 5 ± 6 ± 4 ± 5 ± 4

200 Anhang

B76 B77 B78 B79 B80 B81 B82 B83 B84 B85 B86 B87 B88 B89 B90 -11 -17 -25 -22 -5 -25 -40 0 7 -1 14 18 23 55 36 Akt. ± 15 ± 14 ± 30 ± 18 ± 43 ± 17 ± 38 ± 12 ± 14 ± 9 ± 9 ± 13 ± 25 ± 44 ± 45 -6 -4 -15 -13 -7 -17 -24 -6 -3 -8 18 -1 -4 -3 -3 Glc ± 4 ± 4 ± 10 ± 7 ± 8 ± 6 ± 14 ± 9 ± 7 ± 4 ± 28 ± 4 ± 3 ± 6 ± 5 B91 B92 B93 B94 B95 B96 B97 B98 B99 B100 B101 B102 B103 B104 B105 -5 3 -24 -4 -4 1 0 -1 -11 14 -18 -33 -10 -11 -2 Akt. ± 5 ± 7 ± 24 ± 3 ± 4 ± 8 ± 2 ± 7 ± 4 ± 13 ± 6 ± 14 ± 15 ± 10 ± 15 -1 -5 -5 -6 -11 -4 -4 -35 -6 0 -16 -18 -11 -8 -6 Glc ± 10 ± 7 ± 4 ± 4 ± 5 ± 7 ± 5 ± 59 ± 8 ± 8 ± 1 ± 3 ± 5 ± 3 ± 1 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 -10 -9 -9 6 -6 -13 -6 -38 -5 3 -5 -6 -5 -7 1 Akt. ± 17 ± 5 ± 6 ± 9 ± 15 ± 10 ± 16 ± 15 ± 14 ± 18 ± 6 ± 5 ± 2 ± 5 ± 9 -5 -6 -5 -4 -6 -6 -5 -18 -4 -3 -7 -2 -2 2 -2 Glc ± 4 ± 5 ± 2 ± 3 ± 2 ± 1 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 5 ± 0 ± 3 ± 1 ± 4 J16 J17 J18 J19 J20 J21 J22 J23 J24 J25 J26 J27 J28 J29 J30 -12 -8 -50 -16 -8 -7 -7 -5 -5 -1 -20 -2 -1 -5 7 Akt. ± 6 ± 6 ± 8 ± 7 ± 9 ± 1 ± 2 ± 2 ± 8 ± 9 ± 10 ± 1 ± 15 ± 10 ± 29 -2 -1 -13 -7 -2 -4 -9 -6 -7 -7 -6 -2 -6 -5 -7 Glc ± 1 ± 3 ± 2 ± 3 ± 5 ± 4 ± 3 ± 5 ± 5 ± 3 ± 12 ± 7 ± 8 ± 7 ± 7 J31 J32 J33 J34 J35 J36 J37 J38 J39 J40 J41 J42 J43 J44 J45 -2 -1 -3 4 -12 -4 -38 -7 -4 14 -3 9 -3 3 10 Akt. ± 5 ± 4 ± 3 ± 1 ± 17 ± 7 ± 31 ± 15 ± 1 ± 19 ± 2 ± 12 ± 8 ± 16 ± 21 0 0 -2 1 -7 0 -13 -2 -2 0 -4 -2 -39 -3 -4 Glc ± 5 ± 6 ± 4 ± 5 ± 2 ± 9 ± 7 ± 3 ± 5 ± 4 ± 3 ± 3 ± 51 ± 4 ± 3 J46 J47 J48 J49 J50 J51 J52 J53 J54 J55 J56 J57 J58 J59 J60 6 10 7 22 16 1 4 5 2 4 2 0 -9 5 19 Akt. ± 21 ± 23 ± 20 ± 19 ± 23 ± 5 ± 9 ± 4 ± 5 ± 7 ± 10 ± 6 ± 30 ± 10 ± 22 -1 -3 -4 -4 -5 -2 -4 -1 -3 -1 -6 -6 -14 -2 -7 Glc ± 8 ± 4 ± 3 ± 4 ± 5 ± 1 ± 4 ± 3 ± 2 ± 1 ± 3 ± 2 ± 4 ± 1 ± 1 J61 J62 J63 J64 J65 J66 J67 J68 J69 J70 J71 J72 J73 J74 J75 -1 -8 3 16 6 8 -5 5 4 12 1 -1 0 -4 -5 Akt. ± 3 ± 16 ± 14 ± 23 ± 18 ± 19 ± 7 ± 5 ± 9 ± 19 ± 3 ± 5 ± 7 ± 5 ± 7 -3 -5 -4 -5 -4 -6 -6 -4 -5 -4 2 0 2 3 -1 Glc ± 2 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 5 ± 3 ± 5 ± 1 ± 3 ± 1 ± 1 ± 0 ± 2 ± 2 J76 J77 J78 J79 J80 J81 J82 J83 J84 J85 J86 J87 J88 J89 J90 -5 -2 -6 -5 0 -8 5 -2 5 -7 -3 -5 -5 -3 0 Akt. ± 5 ± 4 ± 2 ± 3 ± 6 ± 2 ± 9 ± 3 ± 4 ± 4 ± 5 ± 7 ± 6 ± 6 ± 4 0 0 -1 1 0 -2 -7 -1 -3 -6 -4 -5 -6 -5 -3 Glc ± 1 ± 4 ± 4 ± 4 ± 2 ± 5 ± 10 ± 8 ± 9 ± 5 ± 5 ± 3 ± 8 ± 4 ± 8 J91 J92 J93 J94 J95 J96 J97 J98 J99 J100 J101 J102 J103 J104 J105 -4 -3 -14 0 1 -4 1 9 4 -2 -10 -8 -4 0 6 Akt. ± 3 ± 5 ± 4 ± 1 ± 10 ± 9 ± 13 ± 15 ± 4 ± 15 ± 4 ± 8 ± 8 ± 6 ± 13 -2 -3 -5 -1 -4 -4 -4 -5 -3 -9 -3 -6 -5 -2 0 Glc ± 4 ± 4 ± 6 ± 7 ± 4 ± 6 ± 3 ± 4 ± 5 ± 7 ± 4 ± 5 ± 1 ± 2 ± 2 J106 J107 J108 J109 J110 J111 J112 J113 J114 J115 J116 J117 J118 J119 J120 15 -5 -21 4 7 -5 -2 4 -4 1 -9 -40 -7 -5 5 Akt. ± 16 ± 8 ± 2 ± 7 ± 6 ± 3 ± 6 ± 6 ± 2 ± 2 ± 8 ± 3 ± 3 ± 6 ± 6 -9 -13 -6 -1 3 1 -2 -1 -2 -2 -3 -18 -4 -3 -1 Glc ± 8 ± 15 ± 3 ± 4 ± 2 ± 2 ± 2 ± 4 ± 3 ± 1 ± 4 ± 4 ± 3 ± 3 ± 4 J121 J122 J123 J124 J125 J126 J127 J128 J129 J130 J131 J132 J133 J134 J135 -7 9 2 12 -13 -5 -18 1 -5 -6 -17 -4 -30 -3 -3 Akt. ± 11 ± 11 ± 6 ± 5 ± 7 ± 4 ± 9 ± 17 ± 8 ± 8 ± 10 ± 2 ± 9 ± 7 ± 13 -5 0 -2 0 -8 -1 -6 -4 -2 -1 -8 -6 -11 -1 -3 Glc ± 2 ± 1 ± 3 ± 2 ± 3 ± 4 ± 3 ± 2 ± 1 ± 3 ± 4 ± 7 ± 8 ± 9 ± 5 J136 J137 J138 J139 J140 J141 J142 J143 J144 J145 J146 J147 J148 J149 J150 -4 -4 -7 3 12 9 2 3 4 6 -4 -4 3 3 11 Akt. ± 5 ± 7 ± 10 ± 11 ± 14 ±63 ± 3 ± 2 ± 9 ± 6 ± 4 ± 2 ± 31 ± 12 ± 20 -2 -2 -4 -2 -6 -2 -2 1 -3 -3 -5 -3 -11 -4 -6 Glc ± 6 ± 6 ± 3 ± 4 ± 9 ± 5 ± 2 ± 2 ± 2 ± 5 ± 10 ± 3 ± 2 ± 2 ± 3

201 Anhang

J151 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 14 -2 0 -6 10 -18 -19 -25 -5 -15 -33 12 10 -14 -14 Akt. ± 25 ± 6 ± 5 ± 2 ± 13 ± 6 ± 4 ± 5 ± 9 ± 1 ± 3 ± 17 ± 14 ± 9 ± 14 -2 -3 -8 -4 -6 -10 -10 -11 -11 -13 -16 -3 -4 -4 -2 Glc ± 8 ± 3 ± 5 ± 5 ± 3 ± 5 ± 6 ± 4 ± 3 ± 1 ± 6 ± 4 ± 3 ± 4 ± 7 R15 R16 R17 R18 R19 R20 R21 R22 R23 R24 R25 R26 R27 R28 R29 -5 -5 -8 7 11 -3 -3 -34 1 3 2 -7 -1 -20 18 Akt. ± 3 ± 3 ± 4 ± 13 ± 18 ± 11 ± 9 ± 6 ± 10 ± 16 ± 8 ± 9 ± 8 ± 3 ± 27 -4 -4 -8 -5 -5 -2 -5 -13 1 -3 3 -4 -3 -9 -5 Glc ± 5 ± 4 ± 3 ± 5 ± 5 ± 8 ± 5 ± 3 ± 4 ± 3 ± 4 ± 3 ± 3 ± 4 ± 2 R30 R31 R33 R34 R35 R36 R37 R38 R39 R40 R41 R42 R43 R44 19 -5 -7 -2 -9 -2 0 0 13 21 11 0 0 -6 Akt. ± 27 ± 2 ± 1 ± 7 ± 6 ± 5 ± 10 ± 9 ± 12 ± 19 ± 23 ± 5 ± 9 ± 8 -6 -3 -2 -4 -2 0 -2 0 0 1 -3 -2 -5 -5 Glc ± 5 ± 1 ± 5 ± 4 ± 6 ± 6 ± 7 ± 6 ± 5 ± 5 ± 3 ± 2 ± 3 ± 2 R45 R46 R47 R48 R49 R30 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 -5 5 -1 2 8 21 -14 -2 4 0 14 16 -1 -2 -15 Akt. ± 5 ± 17 ± 9 ± 6 ± 8 ± 14 ± 9 ± 3 ± 10 ± 4 ± 7 ± 12 ± 3 ± 11 ± 6 -3 -2 -2 -13 -6 0 -1 -1 0 -5 -3 -5 -6 -6 -7 Glc ± 2 ± 2 ± 2 ± 16 ± 0 ± 4 ± 3 ± 6 ± 7 ± 2 ± 8 ± 4 ± 4 ± 5 ± 5 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 -15 3 -16 -10 -1 -12 -13 -1 5 -11 1 10 17 0 7 Akt. ± 17 ± 14 ± 7 ± 15 ± 16 ± 13 ± 11 ± 26 ± 6 ± 12 ± 23 ± 10 ± 29 ± 19 ± 17 -5 -5 -6 -8 -6 -9 -5 -6 -8 -6 -3 -3 -2 -1 -2 Glc ± 4 ± 2 ± 2 ± 7 ± 1 ± 2 ± 4 ± 5 ± 4 ± 4 ± 3 ± 1 ± 1 ± 1 ± 2 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 -13 -12 -8 -9 -11 -35 -13 24 -10 -13 8 -8 -22 -7 -2 Akt. ± 7 ± 21 ± 3 ± 6 ± 14 ± 31 ± 7 ± 16 ± 2 ± 10 ± 12 ± 4 ± 16 ± 21 ± 26 -1 -1 -5 -2 -1 -8 -5 -3 -1 0 -6 -3 -4 -4 -5 Glc ± 4 ± 1 ± 3 ± 2 ± 1 ± 1 ± 5 ± 3 ± 1 ± 1 ± 6 ± 4 ± 5 ± 4 ± 7 E40 E41 E42 E43 E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 -2 -8 -2 -2 -3 6 -4 -18 -12 -10 -17 -6 -4 0 4 Akt. ± 21 ± 24 ± 23 ± 17 ± 21 ± 13 ± 19 ± 9 ± 1 ± 12 ± 8 ± 6 ± 1 ± 15 ± 11 0 -4 -4 -8 -2 -3 -2 -4 -4 -4 -5 -2 -2 0 0 Glc ± 6 ± 6 ± 7 ± 14 ± 6 ± 5 ± 8 ± 6 ± 8 ± 4 ± 4 ± 2 ± 2 ± 4 ± 2 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 20 -2 -1 2 15 4 -5 -5 -6 -5 -10 -8 -14 -26 -18 Akt. ± 9 ± 18 ± 13 ± 17 ± 8 ± 5 ± 10 ± 3 ± 5 ± 5 ± 14 ± 7 ± 14 ± 16 ± 13 -4 -2 -1 -2 -4 -2 -6 -5 -4 -2 -10 -5 -3 -15 -9 Glc ± 3 ± 3 ± 3 ± 6 ± 4 ± 4 ± 4 ± 0 ± 2 ± 2 ± 2 ± 1 ± 3 ± 3 ± 3 E70 E71 E72 E73 E74 E75 E76 E77 E78 E79 E80 E81 E82 E83 E84 0 -4 -13 -4 -4 -9 -12 -9 -3 -10 -8 -6 -13 -20 -11 Akt. ± 11 ± 4 ± 10 ± 6 ± 7 ± 16 ± 13 ± 13 ± 9 ± 6 ± 4 ± 9 ± 10 ± 17 ± 7 -6 1 -6 -7 -4 -7 -7 -6 0 -5 0 -3 -1 -3 -1 Glc ± 4 ± 4 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 2 ± 2 ± 3 ± 1 ± 4 ± 2 ± 3 ± 4 ± 4 E85 E86 E87 E88 E89 E90 E91 E92 E93 -13 -10 5 -13 0 10 -23 -20 -9 Akt. ± 5 ± 6 ± 16 ± 16 ± 11 ± 6 ± 17 ± 15 ± 10 1 -2 -2 -5 -4 0 -6 -5 0 Glc ± 3 ± 4 ± 9 ± 7 ± 4 ± 1 ± 4 ± 3 ± 6

202 Anhang

Tabelle 6-6: Ergebnisse der mit der humanen Sucrase durchgeführten Messungen. Angegeben ist die prozentuale Abweichung der Messung mit Extrakt zur Messung ohne Extrakt (Akt.: Aktivität) bzw. die gemessene Abweichung von einer bestimmten Glucosemenge (Glc: Glucose). Die Zahlen stellen Mittelwerte dreier Messungen mit Standardabwei- chung dar. Die Abkürzungen der getesteten Extrakte werden wie unter 6.2. aufgezählt verwendet.

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 -2 -10 -8 -7 -5 -10 -8 -12 -11 -8 -1 3 1 -6 0 Akt. ± 2 ± 13 ± 8 ± 8 ± 3 ± 5 ± 1 ± 7 ± 10 ± 7 ± 5 ± 6 ± 13 ± 10 ± 6 -4 -7 -6 -5 -8 -4 -6 -9 -11 -4 -6 -4 0 -5 -5 Glc ± 4 ± 4 ± 7 ± 3 ± 2 ± 4 ± 5 ± 10 ± 11 ± 15 ± 2 ± 2 ± 8 ± 7 ± 4 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 2 3 1 -5 -23 -7 -30 -9 -5 -4 -4 -1 -8 4 -4 Akt. ± 9 ± 9 ± 14 ± 14 ± 59 ± 6 ± 10 ± 9 ± 2 ± 3 ± 0 ± 1 ± 3 ± 4 ± 13 -4 -4 -8 -11 -9 -2 -9 -2 1 0 1 -3 -2 3 0 Glc ± 4 ± 2 ± 3 ± 6 ± 13 ± 2 ± 2 ± 3 ± 3 ± 2 ± 3 ± 5 ± 3 ± 1 ± 6 B31 B32 B33 B34 B35 B36 B37 B38 B39 B40 B41 B42 B43 B44 B45 0 0 -4 -6 10 -7 -6 -32 -18 -4 1 -4 -3 0 -2 Akt. ± 5 ± 5 ± 3 ± 1 ± 4 ± 2 ± 4 ± 9 ± 15 ± 1 ± 3 ± 3 ± 1 ± 4 ± 2 -4 -2 -2 -3 -6 -8 -7 -14 -5 -6 -2 -3 -3 -1 -2 Glc ± 2 ± 7 ± 4 ± 5 ± 4 ± 3 ± 5 ± 4 ± 5 ± 5 ± 1 ± 2 ± 1 ± 1 ± 1 B46 B47 B48 B49 B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 B60 -3 0 0 -2 -2 -6 0 -1 -1 1 0 4 -17 -4 -35 Akt. ± 3 ± 2 ± 6 ± 2 ± 7 ± 12 ± 6 ± 5 ± 7 ± 2 ± 6 ± 9 ± 7 ± 7 ± 8 -5 -4 -4 -2 -2 0 0 2 3 2 -2 1 -4 -1 -7 Glc ± 2 ± 2 ± 2 ± 4 ± 2 ± 10 ± 10 ± 11 ± 14 ± 10 ± 7 ± 13 ± 10 ± 12 ± 13 B61 B62 B63 B64 B65 B66 B67 B68 B69 B70 B71 B72 B73 B74 B75 -4 -2 -6 -3 -3 -5 1 -5 -4 -1 -25 -25 -19 1 -62 Akt. ± 3 ± 6 ± 4 ± 2 ± 4 ± 3 ± 6 ± 9 ± 3 ± 3 ± 19 ± 39 ± 4 ± 6 ± 23 -2 -2 -1 -1 -2 -3 0 0 2 3 -7 -2 -9 -3 -21 Glc ± 9 ± 6 ± 8 ± 7 ± 6 ± 8 ± 11 ± 7 ± 10 ± 8 ± 4 ± 4 ± 3 ± 2 ± 2 B76 B77 B78 B79 B80 B81 B82 B83 B84 B85 B86 B87 B88 B89 B90 -4 -2 -21 -12 8 -62 -77 -6 -4 -20 -1 -6 -2 -1 -2 Akt. ± 6 ± 11 ± 14 ± 12 ± 11 ± 5 ± 6 ± 3 ± 4 ± 5 ± 4 ± 8 ± 6 ± 13 ± 12 -3 -7 -15 -9 0 -67 -25 -4 -5 -8 -5 -5 -5 -4 -3 Glc ± 3 ± 5 ± 4 ± 4 ± 2 ± 3 ± 2 ± 4 ± 4 ± 4 ± 4 ± 2 ± 3 ± 4 ± 4 B91 B92 B93 B94 B95 B96 B97 B98 B99 B100 B101 B102 B103 B104 B105 0 2 -4 -6 -12 1 7 10 -5 16 -9 -25 -25 1 9 Akt. ± 5 ± 6 ± 5 ± 8 ± 8 ± 9 ± 9 ± 15 ± 11 ± 16 ± 28 ± 26 ± 24 ± 26 ± 37 -2 -5 -5 -7 -9 0 -1 -3 -5 0 -16 -17 -13 -8 -5 Glc ± 5 ± 8 ± 5 ± 4 ± 5 ± 1 ± 4 ± 2 ± 4 ± 5 ± 8 ± 6 ± 7 ± 8 ± 8 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 2 -8 -6 -5 2 -5 -2 -39 3 5 -9 -2 -1 2 -2 Akt. ± 4 ± 5 ± 3 ± 3 ± 1 ± 6 ± 8 ± 7 ± 3 ± 6 ± 1 ± 2 ± 6 ± 2 ± 5 -4 -6 -7 -7 -6 -6 -6 -16 -6 -3 -4 -1 0 0 -2 Glc ± 3 ± 4 ± 2 ± 2 ± 2 ± 3 ± 5 ± 3 ± 2 ± 1 ± 2 ± 2 ± 3 ± 1 ± 3 J16 J17 J18 J19 J20 J21 J22 J23 J24 J25 J26 J27 J28 J29 J30 -3 3 -43 -17 0 0 0 -1 -7 -2 -21 -3 3 11 4 Akt. ± 5 ± 2 ± 3 ± 4 ± 6 ± 4 ± 3 ± 4 ± 4 ± 2 ± 6 ± 3 ± 4 ± 2 ± 6 -4 -1 -11 -5 0 -3 -4 -3 -6 -5 -10 -2 -4 -3 -1 Glc ± 2 ± 3 ± 3 ± 4 ± 2 ± 1 ± 3 ± 2 ± 3 ± 3 ± 2 ± 4 ± 3 ± 2 ± 5 J31 J32 J33 J34 J35 J36 J37 J38 J39 J40 J41 J42 J43 J44 J45 1 -2 -7 0 -31 0 -71 -6 0 6 -10 -1 -18 -3 -4 Akt. ± 7 ± 14 ± 11 ± 6 ± 8 ± 12 ± 17 ± 9 ± 11 ± 9 ± 1 ± 4 ± 1 ± 4 ± 5 -3 -1 -2 -2 -10 -5 -24 -4 -4 -2 -6 -6 -10 -4 -6 Glc ± 1 ± 1 ± 2 ± 3 ± 3 ± 2 ± 8 ± 2 ± 1 ± 2 ± 7 ± 8 ± 4 ± 7 ± 6

203 Anhang

J46 J47 J48 J49 J50 J51 J52 J53 J54 J55 J56 J57 J58 J59 J60 0 2 1 3 0 1 -3 0 -7 3 -8 -13 20 -4 -11 Akt. ± 3 ± 6 ± 2 ± 3 ± 4 ± 7 ± 7 ± 5 ± 5 ± 8 ± 7 ± 3 ± 5 ± 10 ± 4 -6 -4 -6 -4 -2 -4 -8 -5 -10 -7 -11 -7 -16 -9 -10 Glc ± 6 ± 7 ± 6 ± 8 ± 5 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 1 ± 2 ± 2 ± 2 ± 4 ± 2 J61 J62 J63 J64 J65 J66 J67 J68 J69 J70 J71 J72 J73 J74 J75 -2 -14 0 -7 1 -3 -7 1 2 -2 -1 2 -1 -1 -6 Akt. ± 4 ± 5 ± 4 ± 6 ± 7 ± 6 ± 12 ± 11 ± 8 ± 19 ± 2 ± 1 ± 1 ± 1 ± 3 -5 -13 -7 -9 -7 -7 -7 -6 -7 -6 -3 -2 -2 -1 -4 Glc ± 3 ± 3 ± 2 ± 1 ± 1 ± 0 ± 2 ± 3 ± 3 ± 4 ± 2 ± 4 ± 3 ± 4 ± 4 J76 J77 J78 J79 J80 J81 J82 J83 J84 J85 J86 J87 J88 J89 J90 -3 1 -3 0 1 3 -5 -1 -1 -3 -3 -9 -6 -1 -1 Akt. ± 3 ± 3 ± 2 ± 6 ± 7 ± 6 ± 4 ± 5 ± 3 ± 6 ± 1 ± 5 ± 7 ± 4 ± 1 -6 -3 -5 -4 -2 -2 -7 -5 -8 -8 -10 -9 -9 -7 -7 Glc ± 4 ± 3 ± 4 ± 3 ± 4 ± 5 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 3 ± 2 ± 3 ± 1 J91 J92 J93 J94 J95 J96 J97 J98 J99 J100 J101 J102 J103 J104 J105 -1 -3 -18 -2 -4 -7 -7 -3 -5 -12 -9 -14 -15 -5 -7 Akt. ± 3 ± 3 ± 2 ± 5 ± 2 ± 2 ± 6 ± 6 ± 4 ± 2 ± 6 ± 2 ± 4 ± 7 ± 4 -2 -3 -5 -5 -5 -7 -7 -6 -5 -7 -5 -5 -8 -3 -5 Glc ± 1 ± 3 ± 3 ± 4 ± 5 ± 2 ± 2 ± 3 ± 4 ± 2 ± 4 ± 7 ± 6 ± 6 ± 6 J106 J107 J108 J109 J110 J111 J112 J113 J114 J115 J116 J117 J118 J119 J120 -5 -4 -25 -10 -3 0 -2 -6 -9 -3 -5 -67 -6 -13 -3 Akt. ± 10 ± 5 ± 2 ± 9 ± 3 ± 3 ± 2 ± 5 ± 3 ± 3 ± 5 ± 6 ± 11 ± 6 ± 7 -4 -6 -10 -9 -6 -3 -7 -6 -7 -6 -9 -21 -8 -11 -9 Glc ± 10 ± 6 ± 7 ± 4 ± 7 ± 5 ± 3 ± 2 ± 3 ± 2 ± 2 ± 2 ± 2 ± 4 ± 9 J121 J122 J123 J124 J125 J126 J127 J128 J129 J130 J131 J132 J133 J134 J135 -35 -3 -6 -2 -26 -2 -20 -6 -9 -5 -30 -13 -39 -6 -13 Akt. ± 6 ± 1 ± 2 ± 4 ± 4 ± 7 ± 2 ± 7 ± 9 ± 8 ± 5 ± 10 ± 10 ± 9 ± 10 -12 -6 -8 -6 -15 -8 -10 -7 -7 -8 -6 -2 -12 -3 -4 Glc ± 3 ± 3 ± 5 ± 6 ± 4 ± 3 ± 3 ± 6 ± 4 ± 2 ± 4 ± 8 ± 7 ± 6 ± 5 J136 J137 J138 J139 J140 J141 J142 J143 J144 J145 J146 J147 J148 J149 J150 -9 -7 -12 -16 -11 -4 -13 -4 -9 -2 -37 -2 -31 -4 -17 Akt. ± 9 ± 11 ± 10 ± 15 ± 10 ±2 ± 4 ± 3 ± 1 ± 1 ± 62 ± 1 ± 5 ± 4 ± 6 -1 -3 -6 -8 -7 -3 -8 -5 -6 -5 -6 -8 -12 -10 -13 Glc ± 4 ± 4 ± 4 ± 7 ± 8 ± 4 ± 6 ± 3 ± 6 ± 4 ± 3 ± 6 ± 3 ± 7 ± 6 J151 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 -6 3 3 3 4 -9 -9 -15 1 3 -12 4 3 8 5 Akt. ± 3 ± 4 ± 4 ± 5 ± 4 ± 9 ± 3 ± 4 ± 2 ± 5 ± 7 ± 4 ± 5 ± 8 ± 6 4 -3 -5 -3 -3 -5 -4 -7 -2 -4 -4 -2 -6 -2 -1 Glc ± 6 ± 6 ± 4 ± 3 ± 5 ± 4 ± 5 ± 9 ± 5 ± 6 ± 7 ± 4 ± 5 ± 2 ± 4 R15 R16 R17 R18 R19 R20 R21 R22 R23 R24 R25 R26 R27 R28 R29 0 9 8 5 8 16 -13 -34 -1 -2 -4 -3 -8 -23 -4 Akt. ± 12 ± 11 ± 10 ± 9 ± 9 ± 12 ± 2 ± 7 ± 7 ± 3 ± 4 ± 4 ± 6 ± 8 ± 2 -2 -2 -1 -3 -4 0 -5 -9 -1 -4 -5 -1 -3 -5 -6 Glc ± 2 ± 4 ± 5 ± 4 ± 2 ± 3 ± 5 ± 4 ± 6 ± 5 ± 7 ± 6 ± 6 ± 6 ± 5 R30 R31 R33 R34 R35 R36 R37 R38 R39 R40 R41 R42 R43 R44 -1 -1 -4 -2 -2 -5 -6 -5 -3 -3 -3 0 -13 -8 Akt. ± 3 ± 5 ± 2 ± 2 ± 1 ± 4 ± 3 ± 4 ± 3 ± 2 ± 5 ± 6 ± 27 ± 6 -5 -2 0 -3 -3 -4 -2 -3 -3 -5 -3 -4 -7 -8 Glc ± 6 ± 4 ± 5 ± 4 ± 4 ± 3 ± 5 ± 4 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 3 R45 R46 R47 R48 R49 R30 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 2 1 -5 1 3 3 -1 -2 -6 -6 -7 -1 -17 0 -2 Akt. ± 5 ± 3 ± 3 ± 7 ± 6 ± 3 ± 1 ± 7 ± 8 ± 1 ± 4 ± 6 ± 24 ± 9 ± 5 -4 -6 -7 -5 -7 -4 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -3 -2 -3 Glc ± 2 ± 2 ± 2 ± 2 ± 4 ± 3 ± 0 ± 3 ± 5 ± 2 ± 6 ± 3 ± 4 ± 3 ± 3 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 9 5 0 -1 -2 -12 0 1 -3 7 15 -9 -1 -1 -5 Akt. ± 6 ± 3 ± 2 ± 3 ± 3 ± 3 ± 3 ± 2 ± 6 ± 7 ± 1 ± 1 ± 6 ± 7 ± 7 -3 -1 -6 3 -1 -4 0 2 -2 1 2 -4 -3 -2 -3 Glc ± 5 ± 5 ± 5 ± 10 ± 6 ± 5 ± 8 ± 9 ± 8 ± 8 ± 8 ± 6 ± 5 ± 6 ± 8

204 Anhang

E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 1 2 -15 -1 3 -40 -2 1 2 -3 1 5 5 3 6 Akt. ± 13 ± 9 ± 9 ± 8 ± 13 ± 6 ± 2 ± 2 ± 4 ± 5 ± 2 ± 5 ± 2 ± 13 ± 9 -1 -4 -6 -3 -3 -5 -2 -5 -1 -1 -3 -5 -3 -3 -4 Glc ± 8 ± 6 ± 4 ± 5 ± 8 ± 9 ± 2 ± 1 ± 3 ± 2 ± 2 ± 2 ± 1 ± 2 ± 1 E40 E41 E42 E43 E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 7 0 -2 -3 -2 -2 -2 -4 0 -2 3 1 -1 1 -2 Akt. ± 5 ± 3 ± 3 ± 3 ± 4 ± 7 ± 1 ± 2 ± 2 ± 3 ± 5 ± 6 ± 7 ± 7 ± 10 -2 0 1 1 0 0 0 0 0 1 5 -2 -3 -3 -3 Glc ± 2 ± 5 ± 2 ± 4 ± 4 ± 3 ± 3 ± 4 ± 4 ± 3 ± 4 ± 1 ± 3 ± 2 ± 3 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 -1 0 -4 -4 -1 -4 2 -1 -4 -1 -14 2 2 -40 -1 Akt. ± 9 ± 13 ± 14 ± 18 ± 16 ± 18 ± 2 ± 3 ± 2 ± 1 ± 4 ± 3 ± 2 ± 10 ± 2 -3 -6 -8 -10 -10 -4 -2 -3 -4 -4 -7 -2 -2 -12 -3 Glc ± 2 ± 2 ± 4 ± 3 ± 3 ± 5 ± 2 ± 3 ± 2 ± 4 ± 3 ± 4 ± 4 ± 4 ± 4 E70 E71 E72 E73 E74 E75 E76 E77 E78 E79 E80 E81 E82 E83 E84 4 -2 -2 -5 -5 -8 -1 0 5 3 8 -5 -6 -4 -11 Akt. ± 3 ± 4 ± 1 ± 3 ± 0 ± 1 ± 5 ± 6 ± 3 ± 2 ± 4 ± 7 ± 11 ± 10 ± 2 0 5 -1 -1 1 -2 -6 0 6 0 3 -6 -3 -2 -4 Glc ± 5 ± 2 ± 1 ± 2 ± 4 ± 4 ± 4 ± 2 ± 4 ± 3 ± 2 ± 4 ± 6 ± 6 ± 6 E85 E86 E87 E88 E89 E90 E91 E92 E93 -5 0 -5 -6 -13 -7 -4 -1 6 Akt. ± 6 ± 6 ± 5 ± 1 ± 4 ± 2 ± 9 ± 6 ± 7 -1 -1 -7 -9 -9 -5 1 2 5 Glc ± 7 ± 5 ± 2 ± 10 ± 11 ± 12 ± 7 ± 6 ± 9

Tabelle 6-7: Ergebnisse der mit der Hefeinvertase durchgeführten Messungen. Angegeben ist die prozentuale Abwei- chung der Messung mit Extrakt zur Messung ohne Extrakt (Akt.: Aktivität) bzw. die gemessene Abweichung von einer bestimmten Glucosemenge (Glc: Glucose). Die Zahlen sind die Ergebnisse einzelner Messungen. Für Extrakte, die wiederholt vermessen wurden, sind Mittelwert und Standardabweichung angegeben. Die Abkürzungen der getesteten Extrakte werden wie unter 6.2. aufgezählt verwendet. Die Extrakte wurden mit einer Endkonzentration von 0,02 mg / mL verwendet.

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 Akt. -5 -7 -7 -6 -1 -8 -6 -7 4 9 -5 -6 -6 -5 -8 Glc -4 -11 -11 -10 -8 -14 -12 -12 -11 -12 -1 2 4 0 69 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 Akt. -1 -3 -7 0 0 ± 2 1 -4 -3 -2 2 3 2 -2 0 0 ± 4 -3 ± -6 ± Glc -3 2 2 -3 4 -7 -7 -5 -11 -7 -7 -10 -6 -13 3 B31 B32 B33 B34 B35 B36 B37 B38 B39 B40 B41 B42 B43 B44 B45 14 -5 -11 Akt. -9 -9 -8 -7 -12 -11 -1 1 -3 -5 -3 -1 ± 28 ± 3 ± 3 -2 ± -8 Glc -1 -5 1 ± 4 0 -6 3 4 -6 -2 5 -1 3 -1 1 ± 11 B46 B47 B48 B49 B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 B60 Akt. -4 -8 -3 -3 12 -7 -6 -10 -6 -3 -6 -3 -7 -2 -12 Glc -3 7 -4 1 -1 -2 0 -1 -2 0 -2 -4 -4 -5 -11 B61 B62 B63 B64 B65 B66 B67 B68 B69 B70 B71 B72 B73 B74 B75 -3 -7 -7 -5 -3 -3 -5 -5 -3 -1 -1 -5 -5 -7 -5 Akt. ± 7 ± 8 ± 8 ± 8 ± 10 ± 10 ± 8 ± 11 ± 11 ± 8 ± 0 ± 9 ± 7 ± 13 ± 4 -2 2 -1 -2 0 1 -3 -1 -1 -1 0 -4 -7 -7 -7 Glc ± 5 ± 5 ± 3 ± 3 ± 4 ± 5 ± 5 ± 6 ± 5 ± 7 ± 11 ± 2 ± 13 ± 3 ± 13 B76 B77 B78 B79 B80 B81 B82 B83 B84 B85 B86 B87 B88 B89 B90 -7 -4 -7 -9 -6 -14 -25 Akt. ± 13 ± 7 ± 6 ± 18 ± 13 ± 15 ± 44 -4 -4 -5 1 -2 4 -2 6 -11 -3 -6 -11 -6 -16 -3 Glc ± 3 ± 5 ± 1 ± 5 ± 3 ± 8 ± 35 -5 -12 -8 -9 -6 -4 -10 -6

205 Anhang

B91 B92 B93 B94 B95 B96 B97 B98 B99 B100 B101 B102 B103 B104 B105 -1 ± 4 Akt. -11 18 -7 ± 23 -9 -3 -5 -7 -11 3 -7 -10 -7 -6 2 -8 -8 Glc -13 ± 4 -8 ± 5 -14 -2 -1 -6 -8 -4 -14 -14 -10 -8 -4 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 -2 ± -7 ± -4 ± -9 ± -8 ± -8 ± -8 ± -7 ± -3 ± -3 ± Akt. 0 3 0 1 0 ± 7 0 1 0 2 -8 0 0 0 1 4 -7 -5 -9 -7 ± -19 -7 -7 -3 0 -2 -6 Glc -5 ± 0 -11 -9 ± 3 ± 1 3 ± 1 ± 3 -10 ± 1 ± 1 ± 3 ± 2 ± 4 J16 J17 J18 J19 J20 J21 J22 J23 J24 J25 J26 J27 J28 J29 J30 -5 -4 -12 -4 -1 -7 -4 -10 Akt. ± 1 ± 0 ± 6 ± 6 ± 15 -4 -9 -7 -6 -2 -8 -6 ± 5 ± 1 ± 5 -4 1 -14 -4 -2 -4 -6 -6 Glc ± 4 ± 4 ± 2 ± 3 ± 5 -13 -11 -11 -12 -12 -12 -8 ± 3 ± 0 ± 1 J31 J32 J33 J34 J35 J36 J37 J38 J39 J40 J41 J42 J43 J44 J45 -8 -13 -10 -5 -6 -8 -3 1 Akt. -5 -4 -6 -7 ± 7 -6 ± 9 ± 1 -8 -2 ± 3 ± 5 ± 5 ± 4 ± 1 -11 18 -7 -9 -8 -14 -6 -10 Glc 0 0 2 5 ± 1 3 ± 3 ± 3 -2 1 ± 3 ± 1 ± 1 ± 1 ± 0 J46 J47 J48 J49 J50 J51 J52 J53 J54 J55 J56 J57 J58 J59 J60 -2 1 1 0 8 -13 Akt. ± 0 ± 4 ± 1 ± 3 ± 2 -3 -4 -3 -2 -1 -2 -3 ± 3 -2 -4 -7 -9 -9 -5 -1 -16 Glc ± 5 ± 1 ± 0 ± 2 ± 3 -1 -5 -3 -3 -3 -7 -8 ± 3 -3 -4 J61 J62 J63 J64 J65 J66 J67 J68 J69 J70 J71 J72 J73 J74 J75 -7 -11 Akt. -4 ± 1 -5 -8 -9 -9 ± 1 -7 -3 8 8 -4 -4 -6 -7 -6 ± -6 ± Glc 1 5 4 3 -1 0 3 -5 -3 0 15 -3 -1 0 -6 J76 J77 J78 J79 J80 J81 J82 J83 J84 J85 J86 J87 J88 J89 J90 Akt. -5 -6 -4 -4 -6 -6 -9 -8 -1 2 -3 -7 -5 -4 0 Glc -4 -5 -6 -3 -2 -2 -6 -7 -5 -3 -6 -7 -3 -5 -5 J91 J92 J93 J94 J95 J96 J97 J98 J99 J100 J101 J102 J103 J104 J105 Akt. -6 -5 -9 -4 -1 -6 -4 -5 -3 -5 -10 -6 -8 -4 -3 Glc -3 -4 -11 -2 -5 -5 -5 -3 -1 -4 -12 -13 -17 -9 -10 J106 J107 J108 J109 J110 J111 J112 J113 J114 J115 J116 J117 J118 J119 J120 Akt. -9 -7 -16 -10 -4 -7 -9 -9 -8 -7 -5 -24 -5 -5 1 Glc -4 -10 -11 -10 -5 2 2 2 -15 4 5 -21 -6 1 0 J121 J122 J123 J124 J125 J126 J127 J128 J129 J130 J131 J132 J133 J134 J135 Akt. -11 -5 -5 -4 -13 -5 -9 -4 -1 4 -10 -6 -19 -5 -6 Glc -11 -1 -3 -5 -12 -3 -12 -4 -3 -3 -9 1 -13 4 -2 J136 J137 J138 J139 J140 J141 J142 J143 J144 J145 J146 J147 J148 J149 J150 Akt. -7 -2 -5 -5 0 -2 1 3 4 7 5 3 -1 3 5 Glc -3 4 2 6 5 -4 -2 2 1 -2 2 -3 -10 -5 -9 J151 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 -3 -8 -5 -2 -7 -7 -7 -4 -2 2 -2 -1 -2 -3 Akt. 0 ± 3 ± 8 ± 3 ± 4 ± 3 ± 5 ± 7 ± 4 ± 4 ± 2 ± 2 ± 4 ± 2 ± 2 -5 -5 -5 -3 -8 -9 -7 -4 -5 -6 -1 -3 0 0 Glc 6 ± 2 ± 3 ± 4 ± 6 ± 4 ± 5 ± 5 ± 7 ± 10 ± 7 ± 4 ± 1 ± 2 ± 5 R15 R16 R17 R18 R19 R20 R21 R22 R23 R24 R25 R26 R27 R28 R29 1 -1 -1 1 2 9 -7 -14 -10 -10 -8 -11 -9 -13 -9 Akt. ± 3 ± 5 ± 7 ± 5 ± 5 ± 6 ± 2 ± 3 ± 5 ± 3 ± 7 ± 5 ± 6 ± 6 ± 5 -2 -2 -3 1 0 2 -4 -12 -5 -5 1 -4 -3 -9 -5 Glc ± 2 ± 6 ± 1 ± 2 ± 5 ± 4 ± 3 ± 3 ± 4 ± 3 ± 4 ± 2 ± 3 ± 1 ± 5 R30 R31 R33 R34 R35 R36 R37 R38 R39 R40 R41 R42 R43 R44 -2 0 -4 -6 -6 -5 -6 -3 -4 1 -9 -10 -13 -12 Akt. ± 8 ± 2 ± 2 ± 1 ± 2 ± 5 ± 3 ± 1 ± 3 ± 6 ± 1 ± 3 ± 3 ± 5 -2 10 11 13 12 10 10 8 11 13 -7 -7 -7 -7 Glc ± 2 ± 17 ± 15 ± 14 ± 14 ± 18 ± 17 ± 17 ± 16 ± 14 ± 3 ± 4 ± 2 ± 3 R45 R46 R47 R48 R49 R30 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 -10 -11 -12 -10 -10 -3 Akt. ± 8 ± 5 ± 4 ± 6 ± 8 ± 11 22 26 0 -5 -5 -6 1 -3 -4 -6 -5 -4 -5 -5 -3 Glc ± 1 ± 2 ± 3 ± 2 ± 2 ± 1 -6 -6 -3 -3 -4 -6 -8 -11 -12

206 Anhang

E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 Akt. 0 2 1 -3 2 0 -3 5 -3 0 11 -14 -7 -4 -6 Glc -9 -3 -1 -5 -5 -8 -1 -3 -5 -2 0 -11 -10 -5 -6 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 Akt. -7 -5 -5 -6 2 -4 -1 2 0 3 5 -5 7 3 3 Glc -7 -4 -12 -9 -12 -7 -3 -5 -3 1 -2 -11 -6 1 -2 E40 E41 E42 E43 E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 Akt. 3 -3 -3 -4 -3 5 -8 1 0 0 5 -6 -1 -1 -5 Glc -7 -6 -8 -7 -6 -8 -7 -26 -9 -13 -10 -5 -5 -8 -5 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 Akt. 1 -6 -1 1 -2 1 4 -3 2 5 1 0 3 0 5 Glc -5 -5 -5 -5 -41 -2 0 -8 -8 -5 -14 -4 -3 -10 -6 E70 E71 E72 E73 E74 E75 E76 E77 E78 E79 E80 E81 E82 E83 E84 Akt. 3 2 3 1 0 2 3 5 2 7 11 1 -4 4 -2 Glc -5 3 -4 -1 -3 -10 -4 -8 -9 -9 -11 -2 -6 -7 -11 E85 E86 E87 E88 E89 E90 E91 E92 E93 Akt. 8 -3 1 -8 -12 -1 -8 -5 -2 Glc -10 -8 -6 -11 -7 -2 -2 -9 -1

Tabelle 6-8: Ergebnisse der mit der Hefeinvertase durchgeführten Messungen. Angegeben ist die prozentuale Abwei- chung der Messung mit Extrakt zur Messung ohne Extrakt (Akt.: Aktivität) bzw. die gemessene Abweichung von einer bestimmten Glucosemenge (Glc: Glucose). Die Zahlen sind die Ergebnisse einzelner Messungen. Die Abkürzungen der getesteten Extrakte werden wie unter 6.2. aufgezählt verwendet. Die Extrakte wurden mit einer Endkonzentration von 0,2 mg / mL verwendet.

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 Akt. -24 -28 -9 -19 -25 -27 -16 -19 -22 -7 -19 -10 -15 -37 -16 Glc -2 17 12 6 -10 9 7 5 13 7 -5 -6 -5 -33 -22 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 Akt. -10 -16 -6 -49 -6 -6 -64 -24 -12 -6 -10 -5 -23 22 -2 Glc 24 -11 -2 -40 -5 -10 -66 -21 -2 -8 -4 -12 -35 -14 -16 B31 B32 B33 B34 B35 B36 B37 B38 B39 B40 B41 B42 B43 B44 B45 Akt. -17 -26 -15 -16 -14 -17 -28 -76 -21 -30 -10 -26 -12 -17 -12 Glc -12 -17 12 3 8 -13 -10 -78 -15 -33 -7 28 -8 11 6 B46 B47 B48 B49 B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 B60 Akt. -13 -36 -15 -18 -7 -18 -26 -23 -27 -19 -17 -18 -29 -58 -91 Glc -17 28 -21 11 -13 -5 -8 23 -7 10 3 -6 -39 -34 -97 B61 B62 B63 B64 B65 B66 B67 B68 B69 B70 B71 B72 B73 B74 B75 Akt. -16 -17 -9 -22 -13 -18 -18 -15 -14 -2 -43 -21 -68 -11 -97 Glc -3 2 3 -9 7 11 -5 -5 7 6 -32 -8 -73 -6 -100 B76 B77 B78 B79 B80 B81 B82 B83 B84 B85 B86 B87 B88 B89 B90 Akt. -14 -15 -69 -46 -11 -68 -99 -20 -52 -98 -12 -12 -14 -7 3 Glc -12 -12 -70 -44 -15 -60 -103 -13 -42 -102 -7 -7 -13 15 -7 B91 B92 B93 B94 B95 B96 B97 B98 B99 B100 B101 B102 B103 B104 B105 Akt. ---1 -22 -14 -19 -59 -13 -11 -12 -57 -5 -64 -77 -25 -17 -24 Glc ---1 -16 -10 -19 -60 -6 5 -10 -54 -6 -61 -76 -11 -15 -19 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 Akt. -10 -12 -15 -24 -22 -24 -8 -11 -22 2 -11 -18 -15 -16 -45 Glc -8 -10 2 -12 8 -12 -6 -11 -21 -9 -3 -4 -7 -9 -41 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 Akt. -11 ---1 -36 -16 -5 -30 -21 -16 -30 -42 -15 -44 -11 -18 -89 Glc -1 ---1 -27 -9 -7 -21 -3 -3 -26 3 1 -33 -2 -9 -76 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 E40 E41 E42 E43 E44 E45 Akt. -14 -12 -17 -14 -16 -15 -16 -13 -13 -2 -11 -13 -17 -12 -13 Glc 18 -1 -5 1 -1 -5 -3 -6 -3 -5 10 3 27 4 1 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 E55 E56 E57 E58 E59 E60

1 kein Ergebnis, da Messung nur einfach durchgeführt wurde und aufgrund eines Pipettierfehlers keine Farbreaktion stattfand 207 Anhang

Akt. -10 -10 -5 -6 -4 -20 -12 -8 -5 -2 -16 -6 -13 -29 -13 Glc 16 -2 -5 -3 -7 -9 0 -9 -4 -12 -13 -7 -9 -17 -7

E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 E70 E71 E72 E73 E74 E75 Akt. -9 -8 -12 -5 -22 -3 -1 -47 -3 3 -21 -13 -11 -12 -14 Glc -8 5 -24 -12 -36 -7 -7 -74 -5 -9 30 -5 -9 -7 -21 E76 E77 E78 E79 E80 E81 E82 E83 E84 E85 E86 E87 E88 E89 E90 Akt. -8 -13 -35 -10 -14 15 19 7 -22 17 16 12 12 17 22 Glc -6 -8 41 -2 -7 -13 -7 -13 -25 -9 -7 -8 -10 -11 -10 E91 E92 E93 Akt. 1 -12 1 Glc -16 -9 -9

6.5. Zusätzliche Angaben zu Material und Methoden Angaben zu den verwendeten Chromatographieprogrammen, verwendet wurde jeweils ein Äkta-Prime System

Aufreinigung der humanen Sucrase, Anionenaustauscherchromatographie Angaben für eine Probenmenge von 10 mL break point mL conc % B flow mL/min mL fraction 0 0 10 0 Load 30 0 5 0 Inject 50 0 10 0 Load 80 0 2 2 Load 160 50 10 2 Load 189,9 50 10 0 Load 190 0 10 0 Load 220 0 10 0 Load 230 0 10 0 Load

Aufreinigung von CIN1 und CIN1(P/V), Kationenaustauscherchromatographie Angaben für eine Probenmenge von 10 mL break point mL conc% B flow mL/min mL fraction 0 0 3 0 Load 60 0 1 0 Inject 80 0 3 10 Load 140 0 1 2 Load 170 100 3 2 Load 180 100 3 10 Load 199,9 0 3 0 Load 200 0 3 0 Waste 220 0 3 0 Load 260 0 3 Load

208 Anhang

Angaben zu den Programmen der ASE 200 zur fraktionierten Extrahierung Einstellungen der durchgeführten Programme:

Preheat 0 Flush 40 % Pressure 68,9 bar Heat 5 min Purge 60 s Temperature siehe unten Static 5 min Cylces 3 Solvent 100 %

Verwendete Temperaturen: n-Hexan 72 °C Dichlormethan 44 °C Methanol 68 °C Wasser 102 °C

Thiofructoside Angaben zum 1. Chromatographiedurchgang, Probenaufgabe von Hand; Äkta-Prime System break point mL conc % B flow mL/min mL fraction 0 0 5 10 Load 50 0 5 0 Load 470 0 5 10 Load 500 0 2 10 Load 1200 80 5 10 Load 1250 80 5 0 Load 1700 0 5 0 Load

Angaben zum 2. Chromatographiedurchgang, Probenaufgabe von Hand¸ Äkta-Prime System break point mL conc % B flow mL/min mL fraction 0 0 5 10 Load 50 0 2 10 Load 550 80 5 10 Load 600 80 5 10 Load 800 80 5 0 Load 801 0 5 0 Load 1500 0 5 0 Load

209 Anhang

6.6. Liste mit Pflanzen, die in der Diabetestherapie eingesetzt werden; Ergebnis der Literaturrecherche

Tabelle 6-9: Liste der in der (traditionellen) Diabetestherapie eingesetzte Pflanzen. Angegeben sind der lateinische Name der Pflanze, die verwendeten Pflanzenteile, Aussagen über den Namen der Pflanze nach GRIN (ja: in GRIN geführt, nein: nicht in GRIN geführt oder Angabe des Namens, unter dem die Pflanze in GRIN geführt wird), untersuchte Wirkung in Bezug auf Diabetes mellitus bzw. nähere Angaben, Literaturangaben. Zu den Pflanzen in einer kleineren Schriftgröße wurde keine Literatur gefunden, dass sie in der Diabetestherapie eingesetzt werden bzw. die Literatur- angaben sprachen von einer Unwirksamkeit; Pflanzen, die in fetter Schrift dargestellt sind, sind für weitere Untersuchungen zur Hemmung von Invertasen besonders geeignet.

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Abies pindrow ja gesteigerte Insulinproduktion (Hussain et al., 2004)

Abrus precatorius Blätter, Samen ja Acacia arabica Samen, Blätter Acacia nilotica hypoglykämischer Effekt bei Diabetes in Kaninchen (Wadood et al., 1989; Modak et al., 2007) Eleutherococcus Acanthopanax senticosus Wurzel, Blätter siehe E. senticosus senticosus Achillea fragrantissima Kraut nein Achillea millefolium Kraut ja Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) Achyranthes bidentata Wurzel ja Aconitum carmichaelii Wurzel ja antihyperglykämisch (Konno et al., 1985e; Liou et al., 2006) Leptolobium hypoglykämisch (Andrade-Cetto und Wiedenfeld, 2004), Hemmung der Maltase (Andrade-Cetto et al., Acosmium panamense Rinde panamense 2008a) blutzuckersenkend in verschiedenen Tierversuchen (Karunanayake et al., 1984; Ponnachan et al., 1993; Blätter, Wurzel- Sachdewa et al., 2001b; Kamalakkanan et al., 2003; Kamalakkannan und Prince, 2003; Kar et al., 2003; Aegle marmelos ja Sabu und Kuttan, 2004; Saxena und Vikram, 2004; Upadhya et al., 2004; Kesari et al., 2006; rinde, Früchte Narendhirakannan et al., 2006; Narender et al., 2007), α-Glucosidase-Hemmung (Phuwapraisirisan et al., 2008); Bestandteil von Dianex (Mutalik et al., 2005) Aframomum melegueta Blätter ja Agarista mexicana Blätter nein hypoglykämisch (Perez und Vargas, 2002) Ageratum conyzoides Blätter ja blutzuckersenkend (Nyunai et al., 2009) Agrimonia eupatoria ja verzögert Diabetesentwicklung (Swanston-Flatt et al., 1990), unwirksam (Jung et al., 2006)

Agrimonia pilosa Kraut ja keine Aktivität (Jung et al., 2006) Spross, Blätter, Ajuga iva ja blutzuckersenkend (El Hilaly und Lyoussi, 2002; El-Hilaly et al., 2007) Kraut Alchemilla vulgaris Blätter Alchemilla xanthochlora Alchornea cordifolia Blätter ja Alisma orientale Rhizom Alisma plantago-aquatica 210 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur senkt Blutzucker (Mathew und Augusti, 1975; Roman-Ramos et al., 1995; Campos et al., 2003; El- Allium cepa Zwiebel ja Demerdash et al., 2005; Bang et al., 2009), auch gegenläufige Studien (Jelodar et al., 2005; Islam et al., 2008), evtl. spezielle Aminosäuren wirksam (Kumari et al., 1995) Wirksamkeit nicht sicher belegt, evtl. insulinotrop (Roman-Ramos et al., 1995; Jelodar et al., 2005; Liu et Zwiebel, Samen ja Allium sativum al., 2007; Cefalu et al., 2008; Chandra et al., 2008; Islam und Choi, 2008; Kook et al., 2009) evtl. wirksam (Ajabnoor, 1990; Roman-Ramos et al., 1991; Vogler und Ernst, 1999; Okyar et al., 2001; Aloe vera gum, Blätter ja Rajasekaran et al., 2004; Tanaka et al., 2006; Modak et al., 2007; Cefalu et al., 2008; Kim et al., 2009) auch Aloe barbadensis Aloysia tripylla Blätter Aloysia citrodora Alstonia boonei Blätter ja Alstonia congensis Wurzel nein Ammi visnaga Samen ja hypoglykämisch (Jouad et al., 2002a) Ammoides pusilla nein blutzuckersenkend (Bnouham et al., 2007; Bnouham et al., 2010)

Amorphophallus spp ja

Blätter, Trieb, hyperglykämisch (Kamtchouing et al., 1998; Ojewole, 2003a; Alexander-Lindo et al., 2004), α- Anacardium occidentale ja Rinde Amylasehemmung mit Vorinkubation (Ali et al., 2006) Ananas comosus Frucht ja Anchomanes difformis Knolle ja Anchusa italica Blüten, Wurzel Anchusa azurea blutzuckersenkend (Borhanuddin et al., 1994; Zhang und Tan, 2000b, a; Yu et al., 2003; Husen et al., 2004; Andrographia paniculata Kraut, Blätter ja Reyes et al., 2006), α-Glucosidase- und α-Amylasehemmung (Subramanian et al., 2008), Bestandteil von Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007) Anemarrhena senkt Blutzuckerspiegel, Mangiferin als aktive Substanz (Miura et al., 1997; Ichiki et al., 1998; Miura et al., Rhizom ja asphodeloides 2001b; Miura et al., 2001a; Hoa et al., 2009) Angelica acutiloba Wurzel ja schwache α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Angelica sinensis Wurzel ja Anisodus tanguticus ja

Blätter, Frucht- blutzuckersenkend (Shirwaikar et al., 2004; Gupta et al., 2005a; Gupta et al., 2005b; Kaleem et al., 2006a; Annona squamosa ja fleisch Panda und Kar, 2007; Kaleem et al., 2008) Anogeissus leiocarpa Blätter, Rinde ja Anthocleista djalonensis Wurzel, Blätter nein Antigonon leptopus Rebe ja Aphanes arvensis Alchemilla arvensis

Aralia decaisneana Rinde nein blutzuckersenkend, auch nach Sucrosegabe (Yoshikawa et al., 1994; Yoshikawa et al., 1995b; Yoshikawa et Rinde ja Aralia elata al., 1996a) Aralia taibaiensis Wurzelrinde nein Verhinderung der Glykosilierung durch Saponine (Xi et al., 2010) 211 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Arbutus unedo Blätter, Wurzel ja blutzuckersenkend (Bnouham et al., 2007; Bnouham et al., 2010) Arctium lappa Früchte ja antidiabetisch (Xu et al., 2008), Verschlechterung (Swanston-Flatt et al., 1989b) Arctostaphylos uva-ursi Blätter ja kein Einfluss auf Blutzuckerwerte (Swanston-Flatt et al., 1989a) Areca catechu ja eher Verschlechterung

Aristolochia baetica nein evtl. α-Amylasehemmung (Jbilou et al., 2008)

Arocomia mexicana Wurzel nein blutzuckersenkend (Perez et al., 1997; Andrade-Cetto und Heinrich, 2005) Artemisia absinthium Blätter ja Artemisia afra Blätter ja blutzuckersenkung, Mechanismus untersucht (Ribnicky et al., 2006; Cefalu et al., 2008; Wang et al., 2008; Blätter ja Artemisia dracunculus Ribnicky et al., 2009), Blutzuckerwerte unverändert (Swanston-Flatt et al., 1989a) Knospe (flowering blutzuckersenkend (Al-Waili, 1986; Twaij und Al-Badr, 1988; al-Khazraji et al., 1993; al-Shamaony et al., Artemisia herba-alba ja tops) 1994; Marrif et al., 1995; Hamza et al., 2010) Artemisia mexicana Pflanze Artemisia ludoviciana nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Artemisia pallens Kraut ja blutzuckersenkend (Subramoniam et al., 1996) Artemisia roxburghiana nein gesteigerte Insulinproduktion (Hussain et al., 2004)

Artocarpus heterophyllus Blätter ja α-Amylase-Inhibitor, hypoglykämisch (Fernando et al., 1990; Kotowaroo et al., 2006) Asarum europaeum ja

Asparagus cochinchinensis Wurzel ja Asparagus officinalis Wurzel ja Asperula glomerata Kraut nein leichte Hemmung von α-Glucosidase und α-Amylase (Loizzo et al., 2008) Hygrophila Asteracantha longifolia Pflanze blutzuckersenkend (Fernando et al., 1989; Fernando et al., 1991) auriculata Astianthus viminalis Blätter ja hypoglykämisch (Perez Gutierrez et al., 2009), nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Polysaccharide als Insulinsensitizer (Mao et al., 2009; Liu et al., 2010), Steigerung der Wurzel ja Astragalus membranaceus Adiponectinproduktion (Xu et al., 2009), kaum α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Atractylodes chinensis Rhizom Atractylodes lancea schwache α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Atractylodes japonica Rhizom ja hypoglykämisch (Konno et al., 1985d) Atractylodes macrocephala Rhizom, Wurzel ja Blutzuckersenkung bei Diabetes in Ratten durch Polysaccharide (Shan und Tian, 2003) Atriplex halimus Blätter ja Bestandteil von Glucolevel (Said et al., 2008) Atropa belladonna ja enthält Calystegine (Bekkouche et al., 2001)

α-Amylasehemmung mit Vorinkubation (Ali et al., 2006), blutzuckersenkend (Pushparaj et al., 2000; Blätter ja Averrhoa bilimbi Pushparaj et al., 2001; Tan et al., 2005) 212 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur blutzuckersenkend, wohl durch verbesserte Glucoseaufnahme, Hemmung von Disaccharidasen (Chattopadhyay, 1996; Khosla et al., 2000; Halim, 2003; Kar et al., 2003; Gupta et al., 2004; Saxena und Azadirachta indica Blätter, Samen ja Vikram, 2004; Waheed et al., 2006; Modak et al., 2007; Chandra et al., 2008; Bhat et al., 2009), keine α- Amylasehemmung (Kotowaroo et al., 2006; Bhat et al., 2008); Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dianex (Mutalik et al., 2005), Dihar (Patel et al., 2009), Diamed (Pari et al., 2001) Balanites aegyptiacus Rinde, Früchte ja antidiabetisch (Kamel et al., 1991) Bauhinia divaricata ja hypoglykämisch (Roman Ramos et al., 1992b)

blutzuckersenkend; nicht wirksam, wenn nur Glucose als Nahrung (Pepato et al., 2002; Silva et al., 2002; Blätter ja Bauhinia forficata de Sousa et al., 2004; Lino Cde et al., 2004) Bauhinia variegata Blätter ja gesteigerte Insulinproduktion (Hussain et al., 2004; Frankish et al., 2010) Bergenia himalacia nein gesteigerte Insulinproduktion (Hussain et al., 2004)

Beta vulgaris Wurzel ja Bidens alba Zweige, Blätter ja Zweige, Blätter, Bidens pilosa ja Wirkung wohl über Insulinfreisetzung (Alarcon-Aguilar et al., 2002a; Chien et al., 2009; Hsu et al., 2009) Samen Biophytum sensitivum Blätter ja insulinotrop, hypoglykämisch (Puri und Baral, 1998; Puri, 2001) je nach Verwendung Senkung des Blutzuckerspiegels oder Anstieg (Morrison et al., 1987; Morrison et al., Blätter, Wurzel ja Bixa orellana 1991; Russell et al., 2005; Russell et al., 2008) Blighia sapida Blätter, Früchte ja blutzuckersenkend, toxisch (Hassall und Reyle, 1955; Feng und Patrick, 1958) Boerhavia diffusa ja antidiabetisch (Pari und Amarnath Satheesh, 2004)

Bombax ceiba Blätter ja Bontia daphnoides Blätter ja Boscia senegalensis Blätter, Wurzel ja antidiabetisch, u.a. α-Glucosidasehemmung und D-Pinitol (Bates et al., 2000; Bhat et al., 2008; Geethan Bougainvillea spectabilis ja und Prince, 2008; Bhat et al., 2009) Brachylaena discolor Blätter, Wurzel, Spross nein hypoglykämsich (Khan et al., 1995), verzögert Diabetesentwicklung, nicht signifikant (Grover et al., 2003; Samen ja Brassica juncea Yadav et al., 2004) Brassica nigra Samen ja blutzuckersenkend (Anand et al., 2007; Anand et al., 2009) Blätter, Blüten- Gemüsekohl, verschiedene Varietäten untersucht: Blütenstand Blumenkohl antihyperglykämisch (Roman- Brassica oleracea ja stand Ramos et al., 1995) hypoglykämisch, Flavon isoliert (Perez-Gutierrez et al., 1998; Perez et al., 2000b; Palacios-Espinosa et al., Blätter ja Brickellia veronicifolia 2008) Bridelia micrantha Rinde ja Bryophyllum pinnatum Blätter Kalanchoe pinnata blutzuckersenkend (Ojewole, 2005b) Buddleja americana ja hypoglykämisch (Roman Ramos et al., 1992b)

213 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Bupleurum chinense Wurzel ja schwache α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Blüten, Blätter, blutzuckersenkend (Somani et al., 2006; Bavarva und Narasimhacharya, 2008; Panda et al., 2009b; Sharma Butea monosperma ja Rinde, Samen und Garg, 2009; Sharmna und Garg, 2009) Caesalpinia bonducella Samen Caesalpinia bonduc blutzuckersenkend (Sharma et al., 1997; Chakrabarti et al., 2005; Kannur et al., 2006; Modak et al., 2007) Caesalpinia sappan ja

Cajanus cajan Samen ja Calamintha origanifolia Spross nein Hemmung von α-Glucosidase und α-Amylase (Loizzo et al., 2008) Calea zacatechichi Calea ternifolia hypoglykämisch (Roman Ramos et al., 1992b)

Calpurnia aurea Blätter, Samen ja grüner Tee hypoglykämisch und antihyperglykämisch v.a. durch Catechinderivate (Tsuneki et al., 2004; Thielecke und Boschmann, 2009; Li et al., 2010; Roghani und Baluchnejadmojarad, 2010), diese sollten Camellia sinensis ja nicht aus dem Darm aufgenommen werden (Park et al., 2009a); auch schwarzer Tee (Gomes et al., 1995; Ramadan et al., 2009); schwache bzw. keine Wirkung (Mackenzie et al., 2007; Juskiewicz et al., 2008; Nahas und Moher, 2009) Cannabis sativa Blätter ja Capparis decidua Früchte ja antidiabetisch (Sharma et al., 2010) Capparis spinosa Früchte ja blutzuckersenkend (Eddouks et al., 2004) Carduus acanthoides Kraut ja Carduus nutans Kraut ja Carica papaya Früchte ja fermentiert blutzuckersenkend (Danese et al., 2006) Carthamus tinctorius Blüten ja kaum α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Carum carvi Samen ja blutzuckersenkend (Eddouks et al., 2004) Casearia esculenta Wurzel nein blutzuckersenkend (Prakasam et al., 2002, 2003b, a; Chandramohan et al., 2008) Cassia alata Blätter Senna alata antihyperglykämisch (Palanichamy et al., 1988) blutzuckersenkend (Pari und Latha, 2002; Latha und Pari, 2003; Surana et al., 2008; Gupta et al., 2009b; Cassia auriculata Blüten, Blätter Senna auriculata Gupta et al., 2009a), Maltasehemmung(Abesundara et al., 2004); Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dianex (Mutalik et al., 2005), Diamed (Pari et al., 2001) Cassia occidentalis Senna, Blätter Senna occidentalis kein Einfluss auf Blutzuckerwerte (Swanston-Flatt et al., 1989a) Cassia sieberiana Blätter, Wurzel, Frucht ja Blätter, Wurzel, blutzuckersenkend (Al-Habori und Al-Mamary, 2004; Mahmood und Lindequist, 2008), nicht blutzuckersen- Catha edulis ja Spross kend (Saif-Ali et al., 2003; Dallak et al., 2010) blutzuckersenkende Wirkung, v.a. der Saft der frischen Blätter (Chattopadhyay, 1999; Singh et al., 2001; Blätter, Zweige ja Catharanthus roseus Nammi et al., 2003; Ahmed et al., 2007; Islam et al., 2009),keine Wirkung (Swanston-Flatt et al., 1989b) 214 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Glucoseaufnahme gesteigert, verringerte Glucoseproduktion, evtl. Maltasehemmung (Andrade-Cetto und Cecropia obtusifolia Blätter ja Wiedenfeld, 2001; Herrera-Arellano et al., 2004; Nicasio et al., 2005; Revilla-Monsalve et al., 2007; Alonso- Castro et al., 2008; Andrade-Cetto et al., 2008a; Andrade-Cetto und Vazquez, 2010) Centaurea iberica ja gesteigerte Insulinproduktion (Hussain et al., 2004)

Centaurium Centaurium umbellatum Kraut Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001), siehe Erythrea centaurium erythraea Ceratonia siliqua Samen ja Chelidonium majus Blätter ja nicht aktiv (Swanston-Flatt et al., 1990) Chenopodium ambrosioides Blätter, Blüten Dysphania ambrosioides Chironia baccifera Pflanze ja Chrysophyllum cainito Blätter ja blutzuckersenkend, toxisch (N´Guessan et al., 2009) Cichorium intybus Wurzel ja blutzuckersenkend (Pushparaj et al., 2007), Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) Wirkung durch Steigerung der Insulinsensitivität angenommen (Anderson, 2008; Jitomir und Willoughby, 2009),auch Senkung des HbA1c-Wertes (Crawford, 2009) allerdings häufig ohne Effekt bzw. Effekt von Aus- Cinnamomum wahl der Probanden bzw. des Testsystems abhängig (Verspohl et al., 2005; Kim et al., 2006; Kwon et al., Cinnamomum cassia Rinde aromaticum 2006; Mang et al., 2006; Suppapitiporn und Kanpaksi, 2006; Vanschoonbeek et al., 2006; Blevins et al., 2007; Dugoua et al., 2007; Pham et al., 2007; Solomon und Blannin, 2007; Kirkham et al., 2009; Solomon und Blannin, 2009), schwache α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) schwacher hypoglykämischer Effekt (Kar et al., 2003), kein Effekt auf Blutzuckerwerte (Swanston-Flatt et Blätter, Wurzel ja Cinnamomum tamala al., 1989a) Cinnamomum verum Rinde ja keine Literatur zu C. verum gefunden, da i.d.R. C. cassia verwendet wird Cirsium pascuarense nein blutzuckersenkend (Perez Gutierrez et al., 2001; Andrade-Cetto und Heinrich, 2005)

Cissampelos capensis Blätter nein Cissus sicyoides Blätter, Spross Cissus verticillata blutzuckersenkend (Pepato et al., 2003; Viana et al., 2004; Salgado et al., 2009) Citrullus colocynthis Früchte ja blutzuckersenkend (Abdel-Hassan et al., 2000; Huseini et al., 2009) Citrullus lanatus Samen ja Citrullus vulgaris Fruchtschale Citrullus lanatus antihyperglykämisch (Parmar und Kar, 2008b) Citrus aurantiifolia Früchte ja Citrus aurantium Pflanze ja nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Citrus paradisi Samen ja hypoglykämisch (Adeneye, 2008a, b) Clausena anisata Wurzel ja blutzuckersenkend (Ojewole, 2002) Clematis chinensis Wurzel ja Cleome droserifolia Blätter nein hypoglykämisch (Nicola et al., 1996) Cnidoscolus multilobus Blätter nein nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) 215 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Früchte, Blätter, blutzuckersenkend, verschiedene Wirkmechanismen untersucht (Azad Khan et al., 1979; Hossain et al., Coccinia indica Coccinia grandis 1992; Kumar et al., 1993; Shibib et al., 1993; Kamble et al., 1998; Kar et al., 2003; Saxena und Vikram, Kraut 2004; Mallick et al., 2007; Cefalu et al., 2008) Cocculus pendulus Wurzel nein Cocculus Cocculus trilobus Rhizom schwache α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) orbiculatus Cocos nucifera Frucht ja blutzuckersenkend (Sindurani und Rajamohan, 2000) Codonopsis pilosula Wurzel ja Coix lacryma-jobi Samen, Blätter ja hypoglykämisch (Takahashi et al., 1986; Roman-Ramos et al., 1995; Yeh et al., 2006) Colocasia esculenta Knolle ja α-Amylaseinhibitor (Rao et al., 1967; Rekha und Padmaja, 2002) Combretum micranthum Blätter ja blutzuckersenkend (Chika und Bello, 2010) blutzuckersenkend, α-Glucosidasehemmung (Kim et al., 1999; Youn et al., 2004; Wang et al., 2007b; Kraut ja Commelina communis Shibano et al., 2008) Commiphora opobalsamum Commiphora gileadensis

Convallaria majalis Blätter ja nicht aktiv (Swanston-Flatt et al., 1990) Conyza scabrida Blätter nein Rhizom, Wurzel, hypoglykämisch, Berberin als aktive Substanz vermutet (Yuan et al., 2006; Hui et al., 2009), fast keine α- Coptis chinensis ja Blütenstand Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Coptis deltoidea Rhizom ja Corchorus olitorius Blätter ja durch Ballaststoffe Glucoseaufnahme im Darm verzögert (Innami et al., 2005) verzögert Diabetesentwicklung (Swanston-Flatt et al., 1990), mehrere Wirkmechanismen (Gray und Flatt, Samen ja Coriandrum sativum 1999; Eidi et al., 2009b), Blätter nicht aktiv (Jelodar et al., 2007) Cornus officinalis Früchte ja antihyperglykämisch (Yamabe et al., 2007) Bestandteil von Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007), blutzuckersenkend (Shirwaikar et Spross ja Coscium fenestratum al., 2005) Cotinus coggygria Blätter ja Crataegus cuneata Früchte ja keine α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Crataegus gracilior Crataegus pubescens hypoglykämisch (Roman Ramos et al., 1992b) oder mexicana Crinum jagus Zwiebel ja Crocus sativus ja

Croton lobatus Früchte Astraea lobata Crudia klainei Blätter nein Cucumeropsis mannii Samen ja Cucumis melo Fruchtschale ja antihyperglykämisch (Parmar und Kar, 2008b) 216 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Cucumis sativus Frucht ja blutzuckersenkend (Roman-Ramos et al., 1995), keine Wirkung (Chandrasekar et al., 1989) Trieb, Wurzel, antihyperglykämisch und hypoglykämisch (Roman-Ramos et al., 1991; Roman-Ramos et al., 1995; Acosta- Cucurbita ficifolia ja Früchte, Saft Patino et al., 2001; Alarcon-Aguilar et al., 2002b; Xia und Wang, 2006a, b) Cucurbita moschata Samen ja Cuminum cyminum Samen ja antihyperglykämisch und hypoglykämisch (Roman-Ramos et al., 1995; Jagtap und Patil, 2010) blutzuckersenkend, Wirkung u.a. durch Curcumin; gesteigerte Glucoseaufnahme und Aktivierung von PPARγ als Wirkmechanismen (Saxena und Vikram, 2004; Kuroda et al., 2005; Nishiyama et al., 2005; Pari et al., Rhizom ja Curcuma longa 2008; Cheng et al., 2009) ; Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dianex (Mutalik et al., 2005), Dihar (Patel et al., 2009), Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007) Cuscuta chinensis Samen ja Cydonia oblonga Früchte ja Cymbopogon citratus Früchte, Blätter ja blutzuckersenkend (Adeneye und Agbaje, 2007) Cymbopogon Cymbopogon proximus Pflanze hypoglykämisch (Mansour et al., 2002) schoenanthus Cynara cardunculus Wurzel ja Cynodon dactylon Pflanze ja blutzuckersenkend (Roman Ramos et al., 1992b; Singh et al., 2007; Jarald et al., 2008; Rai et al., 2009b) Cyperus rotundus ja blutzuckersenkend (Raut und Gaikwad, 2006)

Daphne gnidium Rinde, Blätter ja Dendrobium chrysanthum Kraut ja Dendrobium loddigesii Kraut ja Dendrobium nobile Kraut ja Dendrocalamus hamiltonii Blätter ja hypoglykämisch (Kar et al., 2003) Dichapetalum toxicarium Blätter nein Dictamnus sp. Wurzelrinde ja Sucrasehemmung (Choi et al., 2000) Dioscorea batatas Knolle Dioscorea polystachya keine α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Dioscorea dumetorum Knolle ja blutzuckersenkend (Undie und Akubue, 1986; Iwu et al., 1990b) Dioscorea japonica Wurzel ja hypoglykämisch (Hikino et al., 1986c) Dioscorea opposita Rhizom nein Diospyros digyna Blätter ja Diospyros ssp oder Diospyros peregrina Früchte blutzuckersenkend (Dewanjee et al., 2009a; Dewanjee et al., 2009b) malabarica Eleutherococcus senticosus Wurzel, Blätter ja blutzuckersenkend (Hikino et al., 1986a; Sui et al., 1994; Niu et al., 2008);siehe auch P. ginseng Elytropappus rhinocerotis Blätter ja 217 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Embelia ribes Samen ja blutzuckersenkend (Bhandari und Ansari, 2008), Hemmung der α-Amylase (Prashanth et al., 2001a) Phyllanthus Emblica officinalis Früchte siehe Phyllanthus emblica emblica blutzuckersenkend, Wirkmechanismen diskutiert (Vijayvargia et al., 2000; Maroo et al., 2002; Murali et al., Enicostemma Enicostemma littorale 2002; Maroo et al., 2003; Upadhyay und Goyal, 2004; Srinivasan et al., 2005; Vasu et al., 2005; axillare Vishwakarma et al., 2010) ; Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dihar (Patel et al., 2009) Ephedra distachya Kraut ja hypoglykämisch (Konno et al., 1985b) Ephedra equisetina Spross ja α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Ephedra sinica Kraut ja Ephemarantha fimbriata Kraut nein Epidendrum mosenii nein blutzuckersenkend (Novaes et al., 2001)

Epimedium brevicornu Kraut ja Epimedium sagittatum Kraut ja Spross mit Blät- hypoglykämisch (Andrade Cetto et al., 2000; Revilla et al., 2002), keine Maltasehemmung (Andrade-Cetto Equisetum myriochaetum nein tern et al., 2008a) hypoglykämisch und antihyperglykämisch (De Tommasi et al., 1991; Roman-Ramos et al., 1991; Li et al., Blätter, Samen ja Eriobotrya japonica 2007; Chen et al., 2008a; Tanaka et al., 2008; Lu et al., 2009b; Lu et al., 2009a; Tamaya et al., 2010) Eryngium creticum Blätter ja Centaurium Hemmung von α-Glucosidase und α-Amylase (Jbilou et al., 2008; Loizzo et al., 2008), blutzuckersenkend Erythraea centaurium Kraut erythraea (Hamza et al., 2010) verzögert Diabetesentwicklung (Swanston-Flatt et al., 1990), antihyperglykämisch (Gray und Flatt, 1998), Blätter ja Eucalyptus globulus nicht wirksam (Roman Ramos et al., 1992b) Eugenia jambolana Samen Syzygium cumini siehe Syzygium cumini Eugenia uniflora Blätter ja blutzuckersenkend, evtl. Sucrasehemmung (Arai et al., 1999) Euonymus alatus Blätter ja Extrakt wirksam, u.a. durch α-Glucosidasehemmung (Park et al., 2005; Lee et al., 2007) Euphorbia helioscopia ja gesteigerte Insulinproduktion (Hussain et al., 2004)

Euphorbia preslii Pflanze nein nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Euphorbia prostrata Pflanze ja antihyperglykämisch (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Exostema caribaeum Rinde nein antihyperglykämisch (Guerrero-Analco et al., 2007), nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Eysenhardtia polystachya Spross ja nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Fagopyrum cymosum Samen Fagopyrum dibotrya Ficus asperifolia Blätter nein 218 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur blutzuckersenkend, verschiedene Substanzen isoliert (Augusti, 1975; Achrekar et al., 1991; Cherian et al., Ficus benghalensis Rinde, Luftwurzel ja 1992; Cherian und Augusti, 1993; Geetha et al., 1994; Kumar und Augusti, 1994; Singh et al., 2009a; Singh et al., 2009b) Ficus carica Blätter, Früchte ja blutzuckersenkend (Serraclara et al., 1998) blutzuckersenkend (Akhtar und Qureshi, 1988; Bhaskara Rao et al., 2002; Kar et al., 2003; Jahan et al., Wurzel Ficus racemosa Ficus glomerata 2009; Narender et al., 2009; Ahmed und Urooj, 2010) Ficus thonningii Rinde ja blutzuckersenkend (Musabayane et al., 2006; Musabayane et al., 2007) Ficus vogelii Blätter Ficus lutea Filipendula ulmaria Blätter ja kein Einfluss auf Blutglucosewerte (Swanston-Flatt et al., 1989a) Foeniculum vulgare Samen ja Forsythia suspensa ja

Fraxinus angustifolia Blätter, Früchte nein Fraxinus exelsior ja blutzuckersenkend (Eddouks und Maghrani, 2004; Maghrani et al., 2004; Visen et al., 2009)

Galium aparine ja

blutzuckersenkend, α-Glucosidasehemmung (Iwu et al., 1990a; Adaramoye und Adeyemi, 2006; Antia et al., Samen ja Garcinia kola 2010) Iridoidglykoside blutzuckersenkend (Miura et al., 1996), keine α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., Früchte ja Gardenia jasminoides 1998) Gardenia ternifolia Blätter ja Gastrodia sp. Rhizom ja Sucrasehemmung (Choi et al., 2000) Gentiana lutea ja

Globimetula capulata Blätter nein blutzuckersenkend (Ojewole und Adewole, 2007) Globularia alypum Blätter nein blutzuckersenkend (Skim et al., 1999; Jouad et al., 2002b) Glycine max Samen, Früchte ja nicht aktiv (Swanston-Flatt et al., 1990), geringe Wurzel ja Glycyrrhiza glabra α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Glyphaea brevis Blätter nein Grifola frondosa nein Trehalose als α-Glucosidasehemmstoff (Matsuura et al., 2002)

Guaiacum coulteri ja hypoglykämisch (Roman Ramos et al., 1992b; Roman Ramos et al., 1992a)

antihyperglykämisch (Alarcon-Aguilara et al., 1998), evtl. über gesteigerte Glucoseaufnahme (Alonso-Castro Blätter ja Guazuma ulmifolia und Salazar-Olivo, 2008) Guiera senegalensis Blätter, Wurzel ja Gymnema inodorum Blätter nein Verzögerung der Glucoseaufnahme aus dem Darm (Shimizu et al., 1997a) Gymnema montanum Blätter nein antidiabetische Wirkung (Ananthan et al., 2003) 219 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur viele Studien über Wirkmechanismen und aktive Komponenten, keine eindeutigen Ergebnisse (Baskaran et al., 1990; Shanmugasundaram et al., 1990; Shimizu et al., 1997b; Chattopadhyay, 1999; Persaud et al., Gymnema sylvestre Blätter ja 1999; Kanetkar et al., 2007; Leach, 2007; Preuss et al., 2007a, b; Cefalu et al., 2008; Snigur et al., 2008; Wei et al., 2008; Daisy et al., 2009; Liu et al., 2009a; Nahas und Moher, 2009; Yadav et al., 2010); Bestand- teil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dianex (Mutalik et al., 2005), Dihar (Patel et al., 2009) Gynostemma pentaphyllum Triebe, Blätter ja hypoglykämisch (Hoa et al., 2009; Huyen et al., 2010) Hedera helix Blätter, Triebe ja Hemidesmus indicus Wurzel ja antidiabetisch (Gayathri und Kannabiran, 2008) blutzuckersenkend, α-Amylasehemmung (Sachdewa und Khemani, 1999; Sachdewa et al., 2001a; Sachdewa Blüten, Blätter ja Hibiscus rosa-sinensis et al., 2001b; Sachdewa und Khemani, 2003; Preuss et al., 2007a, b) Hibiscus sabdariffa Blätter, Früchte ja α-Amylasehemmung (Hansawasdi et al., 2000) Hintonia latiflora Rinde, Blätter ja blutzuckersenkend (Korec et al., 2000; Guerrero-Analco et al., 2007; Cristians et al., 2009) Hintonia standleyana Rinde, Blätter Hintonia latiflora siehe Hintonia latiflora Holarrhena Holarrhena antidysenterica Rinde geringe α-Glucosidasehemmung (Prashanth et al., 2001c) pubescens durch Ballaststoffe verbesserte Glucosewerte (Vaaler et al., 1980; Naismith et al., 1991; Liljeberg et al., Früchte ja Hordeum vulgare 1996; Li et al., 2003b) Hovenia dulcis Blätter, Früchte ja blutzuckersenkend (Ji et al., 2002; Hyun et al., 2010) Hydrastis canadensis Wurzel ja kein Einfluss auf Blutglucosewerte (Swanston-Flatt et al., 1989a) Hypericum perforatum Kraut, Blüten ja Hyssopus officinalis Blätter ja Disaccharidasehemmung (Miyazaki et al., 2003; Loizzo et al., 2008) blutzuckersenkend (Alarcon-Aguilar et al., 2005; Andrade-Cetto und Heinrich, 2005; Hernandez-Galicia et Wurzel ja Ibervillea sonorae al., 2007) Icacina trichantha Blätter, Knolle nein Ilex paraguariensis Blätter ja keine signifikante Verbesserung (Oliveira et al., 2008) Inula viscosa Blätter Dittrichia viscosa hypoglykämisch (Zeggwagh et al., 2006) blutzuckersenkend, Reduzierung der Insulinresistenz (Kusano et al., 2001; Ludvik et al., 2002; Ludvik et al., Knolle ja Ipomoea batatas 2003; Ludvik et al., 2004) Jatropha curcas Blätter ja Jatropha dioica Wurzel ja nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) antihyperglykämisch (Jelodar et al., 2007; Asgary et al., 2008; Dzhafarova et al., 2009), Bestandteil von Blätter ja Juglans regia Glucolevel (Said et al., 2008) Juniperus chinensis Beeren ja blutzuckersenkend (Ju et al., 2008) verzögert Diabetesentwicklung (Swanston-Flatt et al., 1990), blutzuckersenkend (Sanchez de Medina et al., Beeren ja Juniperus communis 1994), Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) Khaya ivorensis Rinde ja 220 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Khaya senegalensis Rinde ja Lactuca sativa (var. romana) Blätter ja keine Wirkung (Roman-Ramos et al., 1995) Lagerstroemia speciosa Blätter, Triebe ja hypoglykämisch, α-Glucosidasehemmung (Ali et al., 2006; Takagi et al., 2008; Hou et al., 2009) Lantana camara Blätter ja Laportea aestuans Blätter ja Launaea arborescens nein evtl. α-Amylasehemmung (Jbilou et al., 2008)

Laurus nobilis Blätter ja blutzuckersenkend (Khan et al., 2009) Lavandula dentata Blüten ja Lavandula officinalis Blätter, Pflanze Lavandula angustifolia Lavandula stoechas Blüten, Blätter ja Lawsonia inermis Blätter ja blutzuckersenkend (Arayne et al., 2007), geringe α-Glucosidasehemmung (Prashanth et al., 2001c) Lens culinaris Samen ja Leonotis leonurus Blätter, Blüten ja hypoglykämisch (Ojewole, 2005a) antihyperglykämisch (Roman-Ramos et al., 1991; Alarcon-Aguilara et al., 1998), Insulin bzw. Pankreasfunk- Blüten nein Lepechinia caulescens tion notwendig (Roman Ramos et al., 1992a) Lepidium sativum Samen ja blutzuckersenkend (Eddouks et al., 2005) Ligusticum Rhizom ja Ligustrum lucidum Früchte ja blutzuckersenkend (Gao et al., 2007; Gao et al., 2009b) Linum tenuifolium Kraut ja Linum usitatissimum Samen ja α-Glucosidasehemmung (Bhat et al., 2008), verbessert Glucosewerte (Pan et al., 2007; Thakur et al., 2009) Litchi chinensis Samen ja Lithospermum Wurzel ja hypoglykämisch (Konno et al., 1985a) erythrorhizon Lonicera japonica Blüten ja Loranthus bangwensis Blätter ja blutzuckersenkend, von Wirtspflanze abhängig (Obatomi et al., 1994) Loranthus micranthus Blätter nein blutzuckersenkend, von Wirtspflanze abhängig antihyperglykämisch, nur Ballaststoffe nicht wirksam (Feldman et al., 1995; Mansour et al., 2002; Knecht et Samen ja Lupinus albus / termis al., 2006), hypoglykämisch (Mishkinsky et al., 1974) Früchte, Wurzel- Lycium barbarum ja hypoglykämisch (Luo et al., 2004; Zhao et al., 2005a) rinde Macaranga barteri Blätter nein hypoglykämisch (Andrade-Cetto et al., 2005; Andrade-Cetto et al., 2008b), Maltasehemmung (Andrade- Wurzelrinde ja Malmea depressa Cetto et al., 2008a) Malus sylvestris Früchte, Blätter ja 221 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Samen, Früchte, antihyperglykämisch, Wirkung evtl. über gehemmte Glucoseaufnahme (Aderibigbe et al., 1999, 2001; Mangifera indica ja Muruganandan et al., 2005; Ojewole, 2005c; Parmar und Kar, 2008b), α-Amylasehemmung (Prashanth et Blätter, Rinde al., 2001b), α-Glucosidasehemmung (Prashanth et al., 2001c), nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Marrubium radiatus Kraut nein Hemmung von α-Glucosidase und α-Amylase (Loizzo et al., 2008) Marrubium vulgare Blätter ja hypoglykämisch (Roman Ramos et al., 1992b; Novaes et al., 2001; Herrera-Arellano et al., 2004) Matricaria aurea Blätter ja verzögert Diabetesentwicklung (Swanston-Flatt et al., 1990), mehrere Wirkmechanismen (Gray und Flatt, Blätter ja Medicago sativa 1997) Melia azadirachta Azadirachta indica siehe Azadirachta indica

Kraut, ätherisches Melissa officinalis ja blutzuckersenkend (Chung et al., 2010), α-Amylasehemmung (McCue und Shetty, 2004) Öl Memecylon umbellatum Blätter ja blutzuckersenkend (Amalraj und Ignacimuthu, 1998) Mentha pulegium Blätter, Spross ja Mentha x piperita Pflanze ja nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Bestandteil von Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007), blutzuckersenkend (Amalraj und Blätter ja Mimosa pudica Ignacimuthu, 2002) Momordica balsamina Spross, Blüte ja Reviews mit keinem eindeutigem Ergebnis, Steigerung der Insulinsekretion und Wirkung über Lebermetabo- lismus vermutet, Polypeptid P (Karunanayake et al., 1984; Chandrasekar et al., 1989; Shibib et al., 1993; Früchte (unreif), Rathi et al., 2002; Kar et al., 2003; Saxena und Vikram, 2004; Ojewole et al., 2006; Modak et al., 2007; Cefalu et al., 2008; Chandra et al., 2008; Yin et al., 2008; Leung et al., 2009; Nahas und Moher, 2009; Samen, Kraut, ja Momordica charantia Vijayalakshmi et al., 2009; Ooi et al., 2010; Yadav et al., 2010), keine Hemmung der Sucrase (Kumar Shetty Rebe et al., 2005), Trehalose als α-Glucosidasehemmstoff (Matsuura et al., 2002); Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dianex (Mutalik et al., 2005), Dihar (Patel et al., 2009), Diamed (Pari et al., 2001) antihyperglykämisch, 17 kDa-Protein isoliert (Rao et al., 1999; Rao et al., 2001; Kameswararao et al., 2003; Früchte ja Momordica cymbalaria Rajasekhar et al., 2010) Momordica foetida Pflanze ja Monstera deliciosa nein gesteigerte Insulinproduktion (Hussain et al., 2004)

Morinda lucida Blätter ja blutzuckersenkend (Olajide et al., 1999) Rinde, Blätter, Moringa oleifera ja blutzuckersenkend (Kar et al., 2003; Ndong et al., 2007; Jaiswal et al., 2009) Wurzel blutzuckersenkend, Hemmung von Glucosidasen nachgewiesen (Hikino et al., 1985a; Asano et al., 1994b; Blätter, Latex, Asano et al., 1994a; Asano et al., 2001a; Kusano et al., 2002; Miyahara et al., 2004; Singab et al., 2005; El- Morus alba Wurzelrinde, ja Beshbishy et al., 2006; Hansawasdi und Kawabata, 2006; Musabayane et al., 2006; Oku et al., 2006; Kimura Zweige, Früchte et al., 2007; Naowaboot et al., 2009; Park et al., 2009b; Zhang et al., 2009), keine gesteigerte Insulinsekre- tion (Hussain et al., 2004) Morus nigra Blätter ja Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) 222 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Mucuna pruriens / prurita Samen ja hypoglykämisch (Akhtar et al., 1990; Rathi et al., 2002; Bhaskar et al., 2008) blutzuckersenkend, verschiedene Wirkmechanismen ,(Khan et al., 1995; Yadav et al., 2002; Vinuthan et al., 2004; Kesari et al., 2005; Arulselvan et al., 2006; Narendhirakannan et al., 2006; Xie et al., 2006; Kesari et Blätter Bergera koenigii Murraya koenigii al., 2007; Lawal et al., 2008) α-Glucosidasehemmung (Bhat et al., 2008), keine signifikante Verbesserung (Grover et al., 2003; Yadav et al., 2004) Musa nana Saft Musa acuminata Fruchtschale, antidiabetisch (Usha et al., 1989; Ojewole und Adewunmi, 2003; Mallick et al., 2007; Panda et al., 2009a), Wurzel, Trieb, ja Musa x paradisiaca blutzuckersteigernd (Parmar und Kar, 2008a; Rai et al., 2009b) grüne Frucht antihyperglykämisch (Alarcon-Aguilara et al., 1998; Pari und Maheswari, 1999; Pari und Umamaheswari, Blüten Musa x paradisiaca Musa x sapientum 2000; Dhanabal et al., 2005), antioxidativ Myrcia multiflora Blätter ja blutzuckersenkend, Glucosidasehemmung (Yoshikawa et al., 1998b) Myrcia uniflora Blätter nein blutzuckersenkend, nicht wirksam als Infusion (Russo et al., 1990; Pepato et al., 1993) Myrtus communis Blätter, Öl ja α-Glucosidasehemmung (Önal et al., 2005), blutzuckersenkend (Elfellah et al., 1984; Sepici et al., 2004) Nardostachys jatamansi Valeriana jatamansi

Blutzuckersenkung, auch durch Spurenelemente in der Asche der Samen (Mukherjee et al., 1997; Mani et Rhizom ja Nelumbo nucifera al., 2010) Neocarya macrophylla Blätter, Rinde, Früchte ja Nerium oleander / Blätter Nerium oleander blutzuckersenkend, α-Glucosidasehemmung (Ishikawa et al., 2007) indicum Neurolaena lobata Blätter ja Nicotiana tabacum Blätter ja proteinogene Invertaseinhibitoren (Rausch und Greiner, 2004) verschiedene Wirkmechanismen werden diskutiert (Meral et al., 2001; El-Dakhakhny et al., 2002; Kanter et Nigella sativa Samen, Öl ja al., 2003; Fararh et al., 2004; Rchid et al., 2004; Kaleem et al., 2006b; Meddah et al., 2009; Benhaddou- Andaloussi et al., 2010) Ocimum gratissimum Blätter ja blutzuckersenkend (Aguiyi et al., 2000; Egesie et al., 2006) Blätter, Ocimum blutzuckersenkend, verschiedene Mechanismen untersucht (Chattopadhyay, 1999; Kar et al., 2003; Grover Ocimum sanctum et al., 2005; Hannan et al., 2006a; Narendhirakannan et al., 2006; Modak et al., 2007; Chandra et al., inflorescense tenuiflorum 2008), Hemmung von α-Glucosidasen (Bhat et al., 2008) Oenothera erythrosepala Oenothera glazioviana

blutzuckersenkend, antioxidativ (Bennani-Kabchi et al., 1999; Bennani-Kabchi et al., 2000; Al-Azzawie und Olea europaea Blätter ja Alhamdani, 2006; Sato et al., 2007; Eidi et al., 2009a), nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998), Bestand- teil von Glucolevel (Said et al., 2008) Ophiopogon japonicus Wurzel, Knolle ja Polysaccharide hypoglykämisch (Alarcon-Aguilar et al., 2003),blutzuckersenkend (Rodriguez-Fragoso et al., Opuntia ficus-indica Spross ja 2008), nicht aktiv (Frati-Munari et al., 1989c; Frati Munari et al., 1992; Alarcon-Aguilara et al., 1998; Car- denas Medellin et al., 1998) 223 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur hypoglykämisch und antihyperglykämisch, evtl. durch Polysaccharide (Ibanez-Camacho und Roman-Ramos, Spross (Saft oder 1979; Frati-Munari et al., 1989a; Frati-Munari et al., 1989b; Frati-Munari et al., 1990; Frati-Munari et al., Opuntia streptacantha ja gekocht) 1991b; Frati-Munari et al., 1991a; Roman-Ramos et al., 1991; Roman-Ramos et al., 1995; Alarcon-Aguilar et al., 2003; Cefalu et al., 2008; Rodriguez-Fragoso et al., 2008) Origanum compactum Blätter ja Origanum majorana Blätter ja 6-Hydroxyflavonoide als α-Glucosidaseinhibitoren (Kawabata et al., 2003), Origanum onites Blätter ja Origanum syriacum Blätter ja α-Amylasehemmung (McCue et al., 2004; McCue und Shetty, 2004), blutzuckersenkend (Lemhadri et al., Origanum vulgare ja 2004) Oryza sativa Wurzel, Kleie ja hypoglykämisch, Phenolsäuren aktiv (Hikino et al., 1986b; Hikino et al., 1988; Jung et al., 2007) Oxytenanthera abyssinica Blätter ja Paeonia lactiflora Wurzel, Spross ja blutzuckersenkend durch Glykoside (Hsu et al., 1997), α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) α-Glucosidaseinhibitor (Nishioka et al., 1998), blutzuckersenkend (Lau et al., 2007), Radikalfänger (Jung et Rinde ja Paeonia suffruticosa al., 2006) Paeonia veitchii Wurzel ja Reviews mit keinem eindeutigem Ergebnis, in einigen Studien hypoglykämisch (Konno et al., 1984; Konno et al., 1985c; Oshima et al., 1985; Vogler et al., 1999; Yan et al., 2003; Cho et al., 2006; Cefalu et al., 2008; Beeren,Wurzel ja Panax ginseng Xiang et al., 2008; Yin et al., 2008), Ginsenosid antidiabetisch (Xie et al., 2005), keine α- Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Panax japonicus Beeren ja siehe P. ginseng Wirkung durch Saponine angenommen (Gong et al., 1991; Chen et al., 2008b; Yang et al., 2009; Yang et al., Wurzel ja Panax notoginseng 2010) Panax quinquefolius Wurzel, Beeren ja siehe P. ginseng Blätter, fermen- Parkia biglobosa ja blutzuckersenkend (Odetola et al., 2006) tierter Samen Parkia speciosa Samen ja α-Amylasehemmung mit Vorinkubation (Ali et al., 2006) Parmentiera hypoglykämisch (Perez-Gutierrez et al., 1998; Perez et al., 2000a), nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., Parmentiera edulis Frucht aculeata 1998) Paronychia argentea Blätter ja nicht wirksam (Afifi et al., 2005) Paullinia cupana Samen ja YGD unterstützend zum Abnehmen (Andersen und Fogh, 2001) Pavonia schiedeana nein nicht aktiv (Roman Ramos et al., 1992b)

Peganum harmala Samen ja α-Amylasehemmung (Jbilou et al., 2008) Pelvetia babingtonii Alge nein α-Glucosidasehemmung (Ohta et al., 2002) Peperomia pellucida Blätter ja 224 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Samen und Blätter aktiv (Brai et al., 2007; Gondwe et al., 2008b; Edem et al., 2009), Samen nicht aktiv Samen ja Persea americana (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Petroselinum crispum Blätter ja blutzuckersenkend (Yanardağ et al., 2003) Phalaris paradoxa Samen ja Pharbitis nil rote Blüten Ipomoea nil hemmt Maltase, nicht Sucrase (Matsui et al., 2001b, a) hypoglykämisch und antihyperglykämisch durch proteinogenen und glykosilierten α-Amylase-Inhibitor und Phaseolus vulgaris Schote, Bohne ja Ballaststoffe (Roman-Ramos et al., 1991; Roman-Ramos et al., 1995; Tormo et al., 2006; Zhang et al., 2007; Obiro et al., 2008; Preuss, 2009; Helmstädter, 2010) Phellodendron amurense Rinde ja Phellodendron chinense Rinde ja Phoenix dactylifera Blätter, Früchte ja Phragmites communis Rhizom Phragmites australis Kraut, Blätter, blutzuckersenkend (Srividya und Periwal, 1995; Raphael et al., 2002; Adeneye et al., 2006; Modak et al., Phyllanthus amarus ja Samen 2007), α-Amylasehemmung (Ali et al., 2006), evtl. längere Einnahmedauer notwendig (Moshi et al., 2001) α-Glucosidaseinhibitor (Abesundara et al., 2004), hypoglykämisch (Modak et al., 2007);Bestandteil von Früchte ja Phyllanthus emblica Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dihar (Patel et al., 2009) Phyllanthus Pflanze ja α-Amylaseinhibitor (Prashanth et al., 2001a) maderaspatensis Phyllanthus niruri ja

Phyllanthus urinaria ja blutzuckersenkend (Higashino et al., 1992)

Physalis philadelphica ja nicht aktiv (Roman Ramos et al., 1992b)

blutzuckersenkend (Inya-Agha et al., 2006; Okonta und Aguwa, 2007; Ajao et al., 2009), nicht blutzucker- Samen ja Picralima nitida senkend (Igboasoiyi et al., 2007) Picrorhiza kurrooa ja

Pinellia ternata Rhizom, Knolle, Frucht ja keine α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Pinus densiflora Rinde ja α-Glucosidaseinhibitor (Kim et al., 2004) Pistacia lentiscus ja

Pistacia palaestina Triebe, Blätter, Wurzel Pinellia ternata siehe Pinellia ternata Archidendron Pithecellobium jiringa Samen, Perikarp α-Amylasehemmung mit Vorinkubation (Ali et al., 2006) jiringa Plantago afra ja

verzögert Glucoseaufnahme durch hohen Anteil an Ballaststoffen, keine Disaccharidasehemmung (Leng- Schoten Plantago ovata Plantago isphagul Peschlow, 1989; Ziai et al., 2005; Hannan et al., 2006b; Salas-Salvado et al., 2008) Plantago major Blätter ja Platycodon grandiflorus Wurzel ja blutzuckersenkend (Zheng et al., 2007a) 225 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur blutzuckersenkend wenn Insulin anwesend, Wirkstoffe isoliert (Kako et al., 1995; Yoshikawa et al., 1995a; Wurzel, Rhizom ja Polygala senega Kako et al., 1996; Yoshikawa et al., 1996b; Kako et al., 1997) Polygala tenuifolia Wurzelrinde, Wurzel ja Polygonatum odoratum Rhizom ja blutzuckersenkende Wirkung (Choi und Park, 2002; Shu et al., 2009) Polygonatum sibiricum Rhizom ja Polygonum cuspidatum Rhixom Fallopia japonica Polygonum multiflorum Wurzel Fallopia multiflora Pouteria lucuma Früchte ja Premna integrifolia Blätter Premna serratifolia hypoglykämisch (Kar et al., 2003) Prosopis farcta Wurzel ja Prosopis pallida Früchte ja Prunella vulgaris ja unterstützt die Wirkung von Insulin(Zheng et al., 2007b)

Prunus amygdalus Samen Prunus dulcis Prunus armeniaca Samen ja keine α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Prunus divaricata Früchte Prunus cerasifera Prunus dulcis Samen ja Prunus persica Samen ja geringe α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Prunus spinosa Früchte ja hypoglykämisch, Sesquiterpene und Polysaccharide (Inman et al., 1999; Alarcon-Aguilar et al., 2000b; Wurzel, Rhizom ja Psacalium decompositum Alarcon-Aguilar et al., 2000a; Campos et al., 2009) hypoglykämisch, Insulin bzw. Pankreasfunktion notwendig (Roman Ramos et al., 1992a; Alarcon-Aguilar et Wurzel nein Psacalium peltatum al., 1997; Alarcon-Aguilar et al., 2002a; Contreras-Weber et al., 2002; Contreras et al., 2005) hypoglykämisch, u.a. durch α-Glucosidasehemmung (Ojewole, 2005d; Wang et al., 2007a; Deguchi und Psidium guajava Blätter, Wurzel ja Miyazaki, 2010), Frucht zeigt keine Aktivität (Roman-Ramos et al., 1995), unreife Fruchtschale schon(Rai et al., 2009a) Pteridium aquilinum ja evtl. α-Amylasehemmung (Jbilou et al., 2008)

verschiedene Wirkmechanismen diskutiert (Manickam et al., 1997; Grover et al., 2002b; Kar et al., 2003; Abesundara et al., 2004; Saxena und Vikram, 2004; Anandharajan et al., 2005; Grover et al., 2005; Modak Holz, Latex ja Pterocarpus marsupium et al., 2007), α-Glucosidasehemmung (Abesundara et al., 2004); Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004) Ptychotis verticillata Kraut nein blutzuckersenkende Wirkung durch ein Isoflavon (Hsu et al., 2003; Chen et al., 2004), keine α- Wurzel Pueraria montana Pueraria lobata Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Extrakt wirksam (Jafri et al., 2000; Saxena und Vikram, 2004; Katz et al., 2007; Parmar und Kar, 2007, 2008a; Bagri et al., 2009), Insulinsenstivität steigt , oxidativer Stress reduziert (Jurenka, 2008), evtl. über Blüten, Perikarp ja Punica granatum PPARα und γ (Li et al., 2008b), α-Amylasehemmung (Prashanth et al., 2001b), Samen nicht wirksam (Jelodar et al., 2007) Pyrus elaeagrifolia Früchte ja 226 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Quassia amara Blätter ja Randia echinocarpa Früchte nein nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Raphanus raphanistrum ja evtl. α-Amylasehemmung (Jbilou et al., 2008)

Rauvolfia tetraphylla Blätter ja nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Rauvolfia vomitoria Blätter, Wurzel ja Wirkung durch Oligo- und Polysaccharide bei bestimmten Hyperglucose-Formen (Kiho et al., 1992; Miura et al., 1997; Zhang et al., 2004a; Zhang et al., 2004b), Insulinresistenz verbessert (Lv et al., 2007), keine Wurzel, Zwiebel ja Rehmannia glutinosa Aktivität des ethanolischen Extraktes (Waisundara et al., 2008b), geringe α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Retama sphaerocarpa Wurzel ja Rheedia gardneriana Garcinia macrophylla nicht aktiv (Novaes et al., 2001)

Rheum officinale Wurzel, Rhizom ja α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Rheum palmatum Wurzel, Rhizom ja Rheum rhabarbarum Blätter ja Rheum tanguticum Wurzel, Rhizom Rheum palmatum Rhizophora mangle Spross ja antihyperglykämisch (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Rhodiola sachalines Wurzel nein Polysaccharide zeigen hypoglykämische Wirkung (Cheng et al., 1993; Chem et al., 1996; Gao et al., 2009a) Rhus chinensis Galle ja α-Glucosidaseinhibitor (Shim et al., 2003) Toxicodendrum Rhus verniciflua blutzuckersenkend (Jung et al., 2006) vernicifluum Ricinus communis Wurzel ja blutzuckersenkend (Shokeen et al., 2008) Rosmarinus officinalis Blätter ja blutzuckersenkend (Bakirel et al., 2008) Rubia cordifolia Wurzel ja blutzuckersenkend (Patil et al., 2006), α-Glucosidasehemmung (Kang et al., 2009) Rubus fruticosus Blätter Rubus plicatus nicht aktiv (Swanston-Flatt et al., 1990), hypoglykämisch (Alonso et al., 1980; Jouad et al., 2002b) Rubus imperialis ja blutzuckersenkend (Novaes et al., 2001; Kanegusuku et al., 2002)

Ruta chalepensis Blätter ja Ruta graveolens Blätter ja Ruta montana Kraut nein Saccharum officinarum Wurzel, Blätter ja α-Glucosidaseinhibitor, blutzuckersenkend (Krishnakumar et al., 1999; Matsuda et al., 1999; Li et al., Salacia oblonga Wurzelrinde nein 2004b; Collene et al., 2005; Heacock et al., 2005; Williams et al., 2007; Minami et al., 2008), Bestandteil von Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007) Wurzelrinde, hypoglykämisch (Karunanayake et al., 1984; Li et al., 2008a; Im et al., 2009; Yoshino et al., 2009), α- Salacia reticulata nein Blätter Glucosidaseinhibitor (Yoshikawa et al., 1997; Yoshikawa et al., 1998a) 227 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Salpianthus macrodontus Wurzel ja hypoglykämisch (Roman-Ramos et al., 1991), nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Salvia acetabulosa Kraut nein Hemmung von α-Glucosidase und α-Amylase (Loizzo et al., 2008) Salvia fruticosa Blätter ja hypoglykämisch durch verminderte Glucoseaufnahme im Darm (Perfumi et al., 1991) Salvia miltiorrhiza Wurzel ja hypoglykämisch, wohl über Gluconeogenese (Alarcon-Aguilar et al., 2002a; Eidi et al., 2005; Lima et al., Blätter ja Salvia officinalis 2006) Wurzel, Pflanze, Sarcopoterium spinosum ja Insulin-ähnlich (Smirin et al., 2010) Früchte Satureja thymbra Blätter nein schwache Hemmung von α-Glucosidase und α-Amylase (Loizzo et al., 2008) Schisandra chinensis Früchte ja Blätter, Rinde, blutzuckersenkend, gesteigerte Insulinsekretion (Ojewole, 2003b, 2004b; Dimo et al., 2007; Gondwe et al., Sclerocarya birrea ja Spross 2008a; Makom Ndifossap et al., 2010) Scoparia dulcis Blätter ja blutzuckersenkend (Pari und Venkateswaran, 2002; Latha und Pari, 2004; Latha et al., 2009) Scrophularia buergeriana Wurzel ja α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Scrophularia ningpoensis Wurzel ja α-Glucosidaseinhibitor (Nishioka et al., 1998), nicht aktiv wenn nicht oral verabreicht (Waisundara et al., Wurzel ja Scutellaria baicalensis 2008a; Xie et al., 2009) Securidaca longipedunculata Wurzel, Zweige ja Sena skinneri Blätter nein nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Senecio biafrae Wurzel nein Senna podocarpa Früchte ja Serjania triquetra Triebe nein nicht aktiv (Alarcon-Aguilara et al., 1998) Sesamum indicum Samen ja blutzuckersenkend, wohl Glucoseaufnahem verzögert (Takeuchi et al., 2001) Sesbenia aegyptiaca Blätter Sesbania sesban hypoglykämisch (Kar et al., 2003) Silybum marianum Samen, Kraut ja blutzuckersenkend (Maghrani et al., 2004; Huseini et al., 2006) Sinomenium acutum Wurzel ja Solanum aethiopicum Blätter ja Solanum incanum Frucht ja blutzuckersenkend (Musabayane et al., 2006) Solanum verbascifolium nein

Styphnolobium Sophora japonica Blüte Radikalfänger (Jung et al., 2006) japonicum Sophora ssp Wurzel ja Disaccharidasehemmung (Shi et al., 1998) Sorbus torminalis Blätter ja 228 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Sorghum caudatum Stiel Sorghum bicolor Sorghum vulgare Samen Sorghum bicolor Spathodea campanulata Rinde ja blutzuckersenkend (Niyonzima et al., 1999) Spinacia oleracea Blätter ja blutzuckersenkend (Roman-Ramos et al., 1995) Spiranthes acaulis nein

Stephania tetrandra Wurzel ja blutzuckersenkend (Tsutsumi et al., 2003; Ma et al., 2007) Extrakt bzw. Steviosid aktiv (Jeppesen et al., 2003; Gregersen et al., 2004; Raskovic et al., 2004; Chen et Blätter ja Stevia rebaudiana al., 2005; Barriocanal et al., 2008), Rebaudiosid A nicht wirksam (Dyrskog et al., 2005) Strychnos potatorum ja Bestandteil von Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007)

Lessertia Sutherlandia frutescens Blätter, Triebe antidiabetisch (Ojewole, 2004a; Chadwick et al., 2007) frutescens blutzuckersenkend (Chandrasekar et al., 1990; Saxena et al., 1993; Kar et al., 2003), schwache α- Pflanze ja Swertia chirayita Glucosidasehemmung (Prashanth et al., 2001c) α-Glucosidasehemmung (Bhat et al., 2008; Karthic et al., 2008), blutzuckersenkend (Achrekar et al., 1991; Prince et al., 1998; Grover et al., 2000; Kar et al., 2003; Sharma et al., 2006; Modak et al., 2007; Helm- Syzigium cumini Samen, Blätter ja städter, 2008; Sharma et al., 2008; Panda et al., 2009a); Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dianex (Mutalik et al., 2005), Dihar (Patel et al., 2009) auch Eugenia jambolana, Syzigium jambolana Syzygium alternifolium Samen nein blutzuckersenkend (Rao und Rao, 2001; Kasetti et al., 2010) Syzygium aromaticum Blätter, Früchte ja Syzygium cordatum Blätter ja blutzuckersenkend (Musabayane et al., 2005) Syzygium guineense Samen ja Blätter, Wurzel, Tamarindus indica ja blutzuckersenkend (Maiti et al., 2004; Maiti et al., 2005) Rinde, Früchte Tapinanthus nyasicus Blätter nein blutzuckersenkend (Musabayane et al., 2006) α-Glucosidasehemmung (Önal et al., 2005), blutzuckersenkend Einzelfallbericht (Goksu et al., 2010), kein Wurzel, Blätter ja Taraxacum officinale Einfluss (Swanston-Flatt et al., 1989b), Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) gesteigerte Glucoseaufnahme in Zellen und α-Glucosidasehemmung als Wirkprinzipien angenommen (Ro- Rinde ja Tecoma stans man-Ramos et al., 1991; Aguilar-Santamaria et al., 2009; Alonso-Castro et al., 2010) Terminalia avicennoides Blätter nein Terminalia bellirica Früchte ja blutzuckersenkend (Kar et al., 2003; Sabu und Kuttan, 2009) Terminalia chebula Früchte, Samen ja blutzuckersenkend (Rao und Nammi, 2006; Murali et al., 2007), α-Glucosidasehemmung (Gao et al., 2008a) Terminalia sericea Rinde ja Wurzelextrakt nicht aktiv (Moshi und Mbwambo, 2005) Tetraclinis articulata Blätter ja Tetrapleura tetraptera Früchte ja blutzuckersenkend (Ojewole und Adewunmi, 2004) 229 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur hypoglykämisch, evtl. durch gesteigerte Glucoseaufnahme (Roman-Ramos et al., 1991; Alonso-Castro et al., Teucrium cubense ja 2010) Teucrium polium Blätter, Kraut ja hypoglykämisch, aber hepatotoxisch (Shahraki et al., 2007), nicht wirksam (Afifi et al., 2005) Thymelaea hirsuta nein blutzuckersenkend (Bnouham et al., 2007; Bnouham et al., 2010)

Thymelaea tartonraira Blätter nein Thymus longicaulis Kraut ja Thymus satureioides Blätter, Blüten nein Thymus vulgaris Blätter ja Tilia cordata ja

blutzuckersenkend (Grover et al., 2000; Stanely et al., 2000; Kar et al., 2003; Stanely Mainzen Prince und Menon, 2003; Saxena und Vikram, 2004; Panchabhai et al., 2008), α-Glucosidasehemmung (Chougale et al., Wurzel, Triebe ja Tinospora cordifolia 2009); Bestandteil von Hyponidd (Babu und Mainzen Prince, 2004), Dihar (Patel et al., 2009), Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007) Tinospora crispa Triebe ja blutzuckersenkend (Noor und Ashcroft, 1989; Noor et al., 1989) Tithonia diversifolia Kraut ja blutzuckersenkend (Miura et al., 2002; Miura et al., 2005) Tournefortia hirsutissima Spross ja antihyperglykämisch (Alarcon-Aguilara et al., 1998; Andrade-Cetto et al., 2007) Tragia involucrata Pflanze ja hypoglykämisch (Kar et al., 2003) Blutzuckersenkung, wohl durch Saponine, auch Sucrasehemmung (Li et al., 2002; Zhang et al., 2006; El- Kraut, Früchte ja Tribulus terrestris Tantawy und Hassanin, 2007) Trichilia roka Wurzel Trichilia emetica Trichosanthes cucumerina Samen ja hypoglykämisch (Kar et al., 2003; Kirana und Srinivasan, 2008) Trichosanthes kirilowii Wurzel ja hypoglykämisch (Hikino et al., 1989) Tridax procumbens Blätter ja blutzuckersenkend (Pareek et al., 2009) antihyperglykämisch, verschiedene Wirkweisen, wohl Steigerung der Insulinsekretion bzw. verzögerte Auf- nahme (Abdel-Barry et al., 1997; Alarcon-Aguilara et al., 1998; Saxena und Vikram, 2004; Hannan et al., Samen, Blätter ja Trigonella foenum-graecum 2007; Cefalu et al., 2008; Mowla et al., 2009), teilweise nicht wirksam in Studien (Jelodar et al., 2005; Nahas und Moher, 2009) Turnera diffusa Blätter ja antihyperglykämisch (Alarcon-Aguilara et al., 1998), nicht aktiv (Alarcon-Aguilar et al., 2002a) Tussilago farfara Knospen ja Maltasehemmung (Gao et al., 2008b) aktiv durch Glucosidasehemmung und gesteigerte Insulinsekretion (Bnouham et al., 2003; Farzami et al., Blätter, Kraut, 2003; Önal et al., 2005; Golalipour und Khori, 2007; Simoes-Pires et al., 2009; Bnouham et al., 2010), nicht Urtica dioica ja Wurzel aktiv (Roman Ramos et al., 1992b), Verschlechterung (Swanston-Flatt et al., 1989b), Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001), Glucolevel (Said et al., 2008) Uvaria afzelii Wurzel nein Uvaria chamae Wurzel ja 230 Anhang

Pflanzenname Pflanzenteil GRIN Wirkung, Literatur Vaccinium myrtillus Beeren, Blätter ja blutzuckersenkend (Takikawa et al., 2010), Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) Valeriana officinalis Wurzel ja Bestandteil von Antidiabetis (Petlevski et al., 2001) Vangueria madagascariensis Blätter ja Verbesina persicifolia ja blutzuckersenkend (Andrade-Cetto und Heinrich, 2005)

Gymnanthemum Vernonia amygdalina Blätter amygdalinum Vernonia spp Blätter, Samen ja blutzuckersenkend (Sy et al., 2004; Sy et al., 2005; Fatima et al., 2010) Chrysopogon Vetiveria zizanioides Bestandteil von Ilogen-Excel (Umamaheswari und Mainzen Prince, 2007) zizanioides Vigna angularis Bohnen ja blutzuckersenkend (Itoh et al., 2004; Itoh et al., 2009) Vigna unguiculata Samen ja blutzuckersenkend (Rotimi et al., 2010) Vinca major Blätter, Wurzel, Spross ja Catharanthus Vinca rosea Blätter siehe Catharanthus roseus roseus α-Glucosidasehemmung (Önal et al., 2005), blutzuckersenkend (Orhan et al., 2005); kein Effekt (Swanston- Blätter ja Viscum album Flatt et al., 1989a) Vitis vinifera Blätter ja blutzuckersenkend (Orhan et al., 2006) Blätter, Wurzeln, Wedelia paludosa nein blutzuckersenkend (Bresciani et al., 2004) Blüten, Triebe hypoglykämisch (Andallu und Radhika, 2000; Udayakumar et al., 2009), Bestandteil von Dianex (Mutalik et Wurzel, Blätter ja Withania somnifera al., 2005) Xanthium sibiricum Früchte ja Xylopia aethiopica Samen ja antihyperglykämisch, Wirkung evtl. über Ballaststoffe, keine α-Amylase-Hemmung (Hanai et al., 1997; Stigma / styles ja Zea mays Kendall et al., 2008; Ranilla et al., 2009) antidiabetisch (Akhani et al., 2004; Al-Amin et al., 2006; Ojewole, 2006; Islam und Choi, 2008), α- Rhizom ja Zingiber officinale Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Ziziphus lotus Früchte, Blätter ja Blätter, Wurzel, Ziziphus mauritiana ja blutzuckersenkend (Cisse et al., 2000), keine α-Glucosidasehemmung (Nishioka et al., 1998) Rinde, Früchte Zygophyllum coccineum Früchte Tetraena coccinea hypoglykämisch (Mansour et al., 2002) Zygophyllum gaetulum Blätter, Spross nein blutzuckersenkend (Jaouhari et al., 1999; Skim et al., 1999; Jaouhari et al., 2000)

231 Publikationen

Publikationen

Poster:

Barbara Schäfer und Thomas Roitsch. „Characterization of Invertase Inhibitors as tool in basic research and therapy” DPhG-Doktorandentagung 2009, Pichlarn, Österreich, 18.11. – 21.11.2009

232 Lebenslauf

Lebenslauf

Schulausbildung / Hochschulstudium

seit 05 2006 Promotion bei Prof. Roitsch, Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie, Julius-Maximilians-Universität, Würzburg, gefördert durch die Hanns-Seidel-Stiftung 12 2005 3. Staatsexamen, Approbation 10 2004 2. Staatsexamen 08 2002 1. Staatsexamen 10 2000 - 10 2004 Studium der Pharmazie an der Julius-Maximilians-Universität, Würzburg 1990 - 1999 E.T.A.-Hoffmann-Gymnasium, Bamberg 1986 - 1990 Grundschule Zeil am Main

Praktika / Berufstätigkeit

ab 01 2012 Leitung der Qualitätskontrolle, Dronania, Bad Wörishofen 10 2010 – 12 2011 Assistentin der Leitung der Herstellung, Dronania, Bad Wörishofen 12 2005 - 04 2006 Mitarbeit als wissenschaftliche Hilfskraft bei Prof. Roitsch, Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie, Julius-Maximilians- Universität, Würzburg 05 2005 - 10 2005 2. Hälfte des praktischen Jahres in der Apotheke Gartenstadt, Schweinfurt 11 2004 - 04 2005 1. Hälfte des praktischen Jahres bei Merck KGaA, Darmstadt in der Abteilung Pharmazeutische Entwicklung: Mitarbeit bei der Einführung und Qualifizierung eines neuen Wägesystems 08 2001 4 Wochen Famulatur in der Apotheke des Leopoldina- Krankenhauses, Schweinfurt 03 2001 4 Wochen Famulatur in der Hasen-Apotheke, Haßfurt

233 Danksagung

Danksagung

An dieser Stelle danke ich allen herzlich, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt:

Herrn Prof. Roitsch für die Überlassung des Themas und die Unterstützung bei der Durchfüh- rung der Arbeit

Herrn ao. Prof. Glieder (TU Graz) für die Bereitstellung eines temporären Arbeitsplatzes an der TU Graz und die Hilfestellung bei der Arbeit mit Pichia pastoris, ebenso für die Bereitstel- lung verschiedener P. pastoris- Stämme und -Pasmide

Herrn Prof. Bauer ( Universität Graz) für die Bereitstellung der TCM-Extrakte und die Benut- zung des Accelerated Solvent Extraction System 200

Frau Prof. Dräger (Universität Halle-Wittenberg) für die Bereitstellung der Calystegine, Herrn Prof. García Fernández für die Bereitstellung des DMDP, Herrn Prof. Naim (TiHo Hannover) für die Bereitstellung der cDNA der humanen Sucrase, Herrn Dr. Gallagher (Universität Aberystwyth) für die Bereitstellung eines Klons einer neutralen / alkalischen Invertase, Herrn Prof. van den Ende (Universität Leuven) für die Bereitstellung eines Klons einer vakuolären Invertase, ebenso Herrn Dr. Wang (National Taiwan University) für die Bereitstellung eines Klons einer vakuolären Invertase, Herrn Dr. Greiner (Universität Heidelberg) für die Bereit- stellung eines Agrobakterium-Stammes mit Plasmiden für die heterologe Expression proteinogener Invertaseinhibitoren, Joanneum Research (Graz) für die Bereitstellung von TCM-Extrakten

Herrn Prof. Müller und Frau Dr. Berger für Hilfestellung und Anregungen, ebenso Herrn Prof. Stütz und Frau Dr. Wrodnigg

den Mitarbeitenden der Arbeitgruppen von Prof. T. Roitsch, Prof. M. Müller, Prof. R. Bauer und ao. Prof. A. Glieder für die vielen Hilfestellungen und das gute Arbeitsklima

der Hanns-Seidel-Stiftung für die finanzielle Förderung dieser Arbeit

und allen, die mich während der Enstehung dieser Arbeit immer wieder in vielerlei Hinsicht unterstützt haben!

234 Ehrenwörtliche Erklärung

Ehrenwörtliche Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig angefertigt und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.

Diese Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch zu keinem anderen Prüfungsverfah- ren vorgelegt.

Ich erkläre, dass ich bisher keine akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht habe.

Augsburg, den ______

Barbara Schäfer