Relaciones Filogenéticas de especies del género Passiflora (Passifloraceae) con énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP y PCR-RFLP
JUAN DAVID VARGAS ALONSO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título
BIOLOGO
GUSTAVO GONGORA F. Director
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA Santafé de Bogotá, D.C. Noviembre del 2000 Relaciones Filogenéticas de especies del género Passiflora (Passifloraceae) con énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP y PCR-RFLP
JUAN DAVID VARGAS ALONSO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA, D.C. NOVIEMBRE 2000
Relaciones Filogenéticas de especies del género Passiflora (Passifloraceae) con énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP y PCR-RFLP JUAN DAVID VARGAS ALONSO
DIRECTOR ______GUSTAVO A. GONGORA F.
JURADO ______DIANA ALVAREZ
JURADO ______JOSE SALVADOR MONTAÑA
DECANO ACADEMICO ______DR. CARLOS CORREDOR
DIRECTORA DE CARRERA ______LUZ MERCEDES SANTAMARIA DEDICATORIA
A mi familia por su compañía y apoyo... AGRADECIMIENTOS
A la Unidad de Biotecnología por acogerme en su grupo
A mi director de tesis por su constante guía y apoyo en el desarrollo del trabajo
A Ursula y Carolina por su amistad incondicional.
A mi madre y a mi hermano Luis Miguel por darme su apoyo en todo momento.
A la energía superior.....
vi NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No. 13 de Julio de 1946: “ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus Tesis de Grado”. RESUMEN
Se presentan los resultados de la utilización de los marcadores PCR-RFLP de cpDNA, PCR-RFLP de mtDNA y RFLP de cpDNA sobre 55 accesiones pertenecientes al género Passiflora, con el fin de realizar una propuesta sobre las posibles relaciones filogenéticas entre las especies.
El árbol resultante de la utilización del marcador RFLP de cpDNA fue el que mas concordancia presentó con los arreglos realizados, previamente por otros investigadores, a partir de caracteres morfológicos.
En el genoma mitocondrial se logro establecer la presencia de una mutación de tipo deleción en la especie P. caerulea, en el intrón ubicado entre los exones B y C del gen nad 1, la cual incidió de forma drástica en la ubicación de la misma en el
árbol y modifico en gran medida las relaciones establecidas entre las otras especies, en particular las pertenecientes a los subgéneros Passiflora, Decaloba y
Astrophea.
Las especies del subgénero Decaloba se agruparon siempre juntas en los tres tipos de marcadores, lo que indicó que existen suficientes diferencias a nivel molecular que permite su separación del resto de especies del género Passiflora analizadas. P. arborea (subgénero Astrophea) fue la especie que se estableció mas distante del resto de especies analizadas, lo cual concuerda con las diferencias a nivel morfológico entre esta y el resto de especies del género. TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEORICO 3
2.1. Ubicación Taxonómica del Orden Passiflorales 3 2.1.1 Tratamiento Taxonómico 3 2.1.2. Descripción Taxonómica 3 2.1.3. Distribución 4 2.2. Ubicación Taxonómica de la Familia Passifloraceae 4 2.2.1. Tratamiento Taxonómico 4 2.2.2. Descripción Taxonómica 5 2.2.3. Distribución General 6 2.2.4. Distribución en Colombia 7 2.3. Ubicación Taxonómica del Género Passiflora 8 2.3.1. Tratamiento Taxonómico 8 2.3.2. Descripción Taxonómica 8 2.3.3. Distribución General 9 2.3.4. Distribución en Colombia 9 2.4 Especies Involucradas en el Estudio 10 2.4.1. Subgénero Tacsonia 10 2.4.1.1. Passiflora pinatistipula Cav. 10 2.4.1.1.1. Descripción 10 2.4.1.1.2. Distribución 11 2.4.1.2. Passiflora cumbalensis (Karsten) 12 2.4.1.2.1. Descripción 12 2.4.1.2.2. Distribución 13 2.4.1.3. Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey. 13 2.4.1.3.1. Descripción 13 2.4.1.3.2. Distribución 14 2.4.1.4. Passiflora mixta L.. 15 2.4.1.4.1. Descripción 15 2.4.1.4.2. Distribución 16 2.4.1.5. Passiflora mathewsii (Mast.) Killip. 17 2.4.1.5.1. Descripción 17 2.4.1.5.2. Distribución 17 2.4.1.6. Passiflora tripartita (Juss.) 18 2.4.1.6.1. Descripción 18 2.4.1.6.2. Distribución 18 2.4.1.7. Passiflora antioquensis Karst. 19 2.4.1.7.1. Descripción 19 2.4.1.7.2. Distribución 19 2.4.1.8. Passiflora tenerifensis L..Escobar 20 2.4.1.8.1 Descripción 20
vii 2.4.1.8.2. Distribución 21 2.4.2 Subgénero Passiflora 21 2.4.2.1. Passiflora caerulea L. 21 2.4.2.1.1. Descripción 21 2.4.2.1.2. Distribución 22 2.4.2.2. Passiflora tiliifoliae L.. 22 2.4.2.2.1. Descripción 22 2.4.2.2.2. Distribución 23 2.4.2.3. Passiflora ligularis Juss. 24 2.4.2.3.1. Descripción 24 2.4.2.3.2. Distribución 25 2.4.2.4. Passiflora maliformis L. 25 2.4.2.4.1. Descripción 25 2.4.2.4.2. Distribución 26 2.4.2.5. Passiflora edulis Sims. 26 2.4.2.5.1. Descripción 27 2.4.2.5.2. Distribución 28 2.4.2.6. Passiflora quadrangularis L. 28 2.4.2.6.1. Descripción 28 2.4.2.6.2. Distribución 29 2.4.3. Subgénero Manicata 30 2.4.3.1. Passiflora manicata Juss. 30 2.4.3.1.1. Descripción 30 2.4.3.1.2. Distribución 31 2.4.4. Subgénero Decaloba 31 2.4.4.1. Passiflora biflora Lam. 31 2.4.4.1.1. Descripción 31 2.4.4.1.2. Distribución 32 2.4.4.2. Passiflora adenopoda DC. 33 2.4.4.2.1. Descripción 33 2.4.4.2.2. Distribución 34 2.4.4.3. Passiflora cuspidifolia Harns. 34 2.4.4.3.1. Descripción 34 2.4.4.3.2. Distribución 35 2.4.4.4. Passiflora bicuspidata (Karst.) 35 2.4.4.4.1. Descripción 35 2.4.4.4.2. Distribución 36 2.4.4.5. Passiflora bogotensis Benth. 36 2.4.4.5.1. Descripción 36 2.4.4.5.2. Distribución 37 2.4.5. Subgénero Astrophea 38 2.4.5.1. Passiflora arborea Spreng. 38 2.4.5.1.1. Descripción 38 2.4.5.1.2. Distribución 39 2.4.6. Subgénero Dysosmia 39
viii 2.4.6.1. Passiflora foetida L. 39 2.4.6.1.1. Descripción 39 2.4.6.1.2. Distribución 40 2.5. Importancia Económica del Género Passiflora 40 2.5.1. Importancia Agronómica 40 2.5.2. Importancia Farmacéutica 42 2.5.3. Importancia Ornamental 44 2.5.4. Importancia Ecológica 44 2.6. Estudios Filogenéticos 46 2.6.1. Estudios Morfológicos 46 2.6.2. Estudios Morfológicos en Passiflora 47 2.6.3. Estudios Moleculares 47 2.6.3.1. Estudios Moleculares en Passiflora 49 2.6.3.2. Marcadores Moleculares 49 2.6.3.2.1. En estudios evolutivos y Sistemáticos 49 2.6.3.2.2. En estudios Agronómicos 52 2.6.3.2.3. En estudios Ecológicos 54 2.7. Marcadores Moleculares usados en el Estudio 55 2.7.1. RFLP 55 2.7.2. PCR-RFLP 56 2.8. Genoma de Plantas 58 2.8.1. Cloroplasto 58 2.8.1.1. Génesis del Organelo 58 2.8.1.2. Genética del Cloroplasto 59 2.8.1.3.Estructura y Función del Genoma 60 2.8.1.4. Utilidad del Genoma en Estudios Filogenéticos 61 2.8.2. Mitocondria 63 2.8.2.1. Génesis del Organelo 63 2.8.2.2. Genética de la Mitocondria 63 2.8.2.3. Estructura y función del Genoma 64 2.8.2.4. Utilidad del Genoma en Estudios Filogenéticos 65
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 67
4. OBJETIVOS 69
4.1. Objetivos Generales 69 4.2. Objetivos Específicos 69
5. MATERIALES Y METODOS 71
5.1. Tipo de Estudio 71 5.2. Población de Estudio y Muestra 71 5.2.1. Población de Estudio 71
ix 5.2.2. Muestra 71
5.3. Material Vegetal 72
5.4. Aislamiento de DNA de las Accesiones 74 5.4.1. Protocolo de Extracción de DNA Mediante Maxi-Prep 74 5.5. Cuantificación 76 5.6. Ampliación de Fragmentos de cpDNA y mtDNA 77
5.6.1. Componentes de la reacción de amplificación 78 5.6.2. Ajuste de la concentración de enzima Taq
polimerasa y MgCl2 en la especie Modelo P. edilis. 79 5.6.3. Ciclos y componentes utilizados en el proceso de amplificación 80 5.7. Determinación del Tamaño de los Fragmentos 81 5.8. Amplificación, Visualización y Cuantificación de los Fragmentos de cpDNA Y mtDNA. 82 5.9. Digestión de los Fragmentos Amplificados de mtDNA y cpDNA 82 5.9.1. Condiciones de Digestión 83 5.9.2. Determinación de la Eficiencia en la Digestión de los Productos Amplificados 83 5.9.3. Ajuste de la concentración de Fragmentos Digeridos de cpDNA y mtDNA 84 5.9.4. Visualización del Patrón de Bandas Obtenido de la Digestión de los Fragmentos de cpDNA y mtDNA 84 5.10. Digestión de DNA Total para RFLP 85 5.10.1. Electroforesis para la Visualización de las Digestiones 85 5.11. Marcaje de la Sonda con Digoxigenina 86 5.12. Transferencia de los Geles de Agarosa a la Membrana de Nylon 88 5.13. Hibridación 89 5.14. Detección 89 5.15. Revelado de las Autoradiografias 89 5.16. Relaciones Filogenéticas 90 5.16.1. Construcción de Matrices de Presencia-Ausencia 93 5.16.2. Construcción de Matrices de Similitud 93 5.16.3. Construcción de Dendrogramas 94
6. RESULTADOS 97
6.1. Aislamiento de DNA de las Accesiones 97 6.1.1. Aislamiento de DNA a partir del Protocolo de Maxi-Prep 97 6.1.2. Aislamiento de DNA a partir del Protocolo de Mini-Prep 97 6.2. Amplificación de Fragmentos de cpDNA Y mtDNA 98
x 6.3. Digestión de los Fragmentos Amplificados cpDNA y mtDNA 102 6.4. Digestión de DNA Total 103 6.5. Marcaje de la Sonda con Digoxigenina 104 6.6 Hibirdización con la sonda mixta. 105 6.7. Relaciones Filogenéticas 107 6.7.1. Matrices-Presencia/Ausencia 107 6.7.2. Matrices de Similitud 107 6.7.3. Dendrogramas 111 6.7.3.1. PCR-RFLP cpDNA 111 6.7.3.2. PCR-RFLP mtDNA 112 6.7.3.3. RFLP cp DNA 113
7. DISCUSIÓN 117
7.1. Aislamiento de DNA 117 7.2. Amplificación de fragmentos de cpDNA y mtDNA 117 7.3. Digestión de los fragmentos amplificados de cpDNA 122 7.4. Digestión de los fragmentos amplificados de mtDNA 123 7.5. Digestión de DNA total 125 7.6. Hibridización con la sonda mixta y generación del polimorfismo de los fragmentos de restricción 126 7.7. Árbol resultante del marcador PCR-RFLP de cpDNA utilizando en coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA. 128 7.8. Árbol resultante del marcador PCR-RFLP de mtDNA utilizando en coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA. 130 7.9. Árbol resultante del marcador RFLP de cpDNA utilizando en coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA. 133
8. CONCLUSIONES 137
9. RECOMENDACIONES 141
10. BIBLIOGRAFÍA 143
ANEXOS 153
xi ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Fig. 1. Ubicación de los sitios de recolección de las muestras, 72 A. Tenerife, Valle del Cauca. B. Santafé de Bogotá. Fig. 2. Aislamiento de las muestras mediante el protocolode maxi-prep. 98 Fig. 3. Tamaño de los fragmentos amplificados. 100
Fig. 4. Amplificación del fragmento N1B-N1C de mtDNA. 100
Fig. 5. Digestión del fragmento PC1-PC2 de cpDNA con la enzima Hinf I. 102 Fig. 6. Fragmentos amplificados marcados de cpDNA. 104
Fig. 7. Autoradiografías resultantes de la hibridización con la sonda mixta de cpDNA. (A) muestras 1-14 105
Fig. 8. Autoradiografías resultantes de la hibridización con la sonda mixta de cpDNA. (A) muestras 15-28 (B) muestras 29-42 y (C) muestras 43-56 Fig. 9. Fenograma realizado a partir del coeficiente de Jaccard con el algoritmo UPGMA para PCR-RFLP mtDNA. 114
Fig. 10. Fenograma realizado a partir del coeficiente de Jaccard con el algoritmo UPGMA para PCR-RFLP cpDNA. 115
xii Fig. 11. Fenograma realizado a partir del coeficiente de Jaccard con el algoritmo UPGMA para RFLP cpDNA. 116
xiii INDICE DE TABLAS Págs.
Tabla 1. Accesiones seleccionadas de las colecciones de campo. 73
Tabla 2. Listado de primers utilizados para la amplificación de cpDNA y mtDNA. 78
Tabla 3. Secuencia de los primers utilizados. 78
Tabla 4. Diferentes volúmenes evaluados de la enzima Taq polimerasa en la especie modelo P. edulis. 79
Tabla 5. Diferentes volúmenes evaluados de MgCl2 en la especie modelo P. edulis. 80
Tabla 6. Temperaturas de Anneling de los fragmentos de cpDNA y mtDNA amplificados. 81
Tabla 7. Enzimas utilizadas en la digestión de los fragmentos de cpDNA y mtDNA amplificados. 83
Tabla 8. Proporciones recomendadas por el fabricante para la digestión de fragmentos amplificados. 83 Tabla 9. Condiciones para la digestión de DNA total. 85
Tabla 10. Fragmentos marcados y condiciones de amplificación. 87
Tabla 11. Especies utilizadas para la construcción de la matriz de presencia/ausencia de PCR-RFLP de cpDNA. 90
xiv Tabla 12. Especies utilizadas para la construcción de la matriz de presencia/ausencia de PCR-RFLP de mtDNA. 91
Tabla 13. Especies utilizadas para la construcción de la matriz de presencia/ausencia para el marcador RFLP con sondas de cpDNA. 92
Tabla No 14. Volumen de MgCl2 adicionado para cada fragmento amplificado. 99
Tabla No 15. Tamaño de los fragmentos amplificados. 99
Tabla No 16. Tamaño de los fragmentos utilizados como sondas en la Amplificación. 105
Tabla No 17. Matriz de similitud obtenida a partir del coeficiente de Jaccard para PCR-RFLP cpDNA. 108
Tabla No. 18 Matriz de similitud obtenida a partir del coeficiente de Jaccard para PCR-RFLP mtDNA. 109
Tabla No. 19 Matriz de similitud obtenida a partir del coeficiente de Jaccard para RFLP cpDNA. 110
xv LISTA DE ANEXOS Págs. Anexo 1. Protocolo de Extracción de DNA mediante Mini-prep 153 Anexo 2. Cuantificación del aislamiento mediantes el protocolo de maxi-prep. 154 Anexo 3. Cuantificación del aislamiento mediante el protocolo de mini-prep. 155 Anexo 4. Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de cpDNA PC1-PC2. 156 Anexo 5. Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de cpDNA TS1-TS2. 157
Anexo 6. Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de mtDNA N41-N42. 158 Anexo 7. Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de mtDNA N1B-N1C. 159 Anexo 8. Digestión del fragmento PC1-PC2. 160 Anexo 9. Digestión del fragmento TS1-TS2. 161 Anexo 10. Digestión del fragmento N41-N42. 162 Anexo 11. Digestión del fragmento N1B-N1C. 164 Anexo 12. Modelo de digestión de las muestras con la enzima Dra I 166 Anexo 13. Matriz binaria de Presencia / Ausencia obtenida del análisis PCR-RFLP de cpDNA 167
Anexo 14. Matriz binaria de Presencia / Ausencia obtenida del análisis PCR-RFLP de mtDNA 168
Anexo 15. Matriz binaria de Presencia / Ausencia obtenida del análisis RFLP de cpDNA 169
xvi 1. INTRODUCCIÓN
La familia Passifloraceae está constituida por numerosas especies ampliamente distribuidas y nativas de regiones tropicales y subtropicales. En el nuevo mundo existen cinco géneros, dos de los cuales se encuentran en Colombia, siendo el género Passiflora el mayormente representado, con 400-500 especies a nivel mundial, y aproximadamente 115 especies en el país, distribuidas por casi todos los pisos térmicos. Algunas de las especies han adquirido gran importancia agronómica, alimenticia y farmacéutica, convirtiendo al género Passiflora en un recurso genético de gran importancia para los países de la región Andina. De ahí el conjunto de trabajos de caracterización morfológica y molecular que se vienen realizando con el fin de evaluar la diversidad genética, inter e intraespecÍfica, y determinar la incidencia de procesos de erosión genética que vienen siendo reportados en la literatura; debido entre otros, a los mecanismos de cultivo y comercialización.
Pese a todo lo anterior, en la literatura es frecuente encontrar dificultades al momento de su clasificación y ubicación taxonómica, hecho que no solo incluye al género sino que a su vez en algunos casos involucra la misma ubicación de la familia en diferentes órdenes. La gran mayoría de diferencias se han presentado en estudios que utilizan los caracteres morfológicos; lo cual está claramente enunciado en trabajos clásicos como los de Killip (1938), Holm-Nielsen et al.
(1988), Mac Dougal (1994) y la monografía de la familia para Colombia propuesta por Escobar (1988). Adicionalmente y en menor proporción, se han realizado
1 trabajos moleculares que aunque con información preliminar, por el número reducido de especies que involucran, permiten visualizar las posibilidades de la implementación de marcadores moleculares como una herramienta nueva, que puede nutrir el panorama ya existente. El propósito de este estudio fue precisamente, aumentar el número de especies analizadas y a su vez implementar una metodología innovadora, utilizando sondas homologas para el caso del marcador RFLP y la digestión de fragmentos amplificados vía PCR.
El presente trabajo aporta datos moleculares de las relaciones filogenéticas de 56 accesiones pertenecientes a 22 especies diferentes del género Passiflora, y en particular las existentes entre algunas del subgénero Tacsonia, a partir de la determinación de los polimorfimos obtenidos de dos regiones amplificadas de mtDNA y cpDNA implementando los marcadores PCR-RFLP y RFLP, para de esta forma sumarse a los esfuerzos que desde otras áreas de la sistemática se vienen desarrollando y contribuir concretamente con el proyecto: Preservación in vitro y caracterización molecular de Passiflora, iniciado por la Unidad de Biotecnología
Vegetal – Pontificia Universidad Javeriana.
2 2. MARCO TEORICO
2.1. Ubicación Taxonómica del Orden Passiflorales (Takhtajan
1997).
Clase MAGNOLIOPSIDA
Subclase DILLENIDAE
Super-Orden VIOLANAE
Orden Passiflorales
Familia PASSIFLORACEAE
Tribu Passiflorieae
Género Passiflora
2.1.1. Tratamiento Taxonómico
Se adoptó la clasificación del orden propuesta por Dumortier (1829).
2.1.2. Descripción Taxonómica
Mayoritariamente herbáceas, algunas trepadoras, menos recurrentes árboles y arbustos. Traqueidas usualmente con una perforación simple. Nódulos triloculares.
Hojas alternas, simples o raramente compuestas, mayoritariamente estipuladas.
Flores bisexuales, menos frecuentes unisexuadas, actinomorfas, pentámeras en la
3 mayoría de los casos. Pétalos y sépalos libres o más o menos cognados. Estambres en igual número que pétalos o más; anteras tetra-esporoginadas, con apertura longitudinal. Capa celular que recubre la célula madre de tipo secretor.
Microsporogénesis simultánea. Granos de polen de 2 celdas, tricolporados y hasta
10 - 12 colporos, generalmente reticulados. Ginoecio generalmente de 3 a 5 carpelos, ovario súpero, unilocular, comunmente con numerosos óvulos en placentas aprietales. Endospermo nuclear. Frutos generalmente en bayas o cápsulas. Semillas usualmente con embrión grande (Takhtajan 1997).
2.1.3. Distribución
Este orden es cosmopolita (Taktajan 1997).
2.2. Ubicación Taxonómica de la Familia Passifloraceae
2.2.1. Tratamiento Taxonómico
A. L. de Jussieu ex Kunth in Humboldt, Bonpland & kunth, Nov. Gen. Sp. 2: 126.
(1817); nom. Cons.; Ann. Mus Hist. Nat. 6: 102-116. (1805) – de Candolle, Prodr.
Part. III 2: 321-338 (1828) - Masters. M. T., Trans. Linn Soc. London 27:593-645
(1871); Masters, M. T. in Martius, Fl. Bras. 13(1): 530-654 (1872). – Harms, H. in
Engler & Prantl. Nat. Pflanzenfam. Ed. 2, 21:495-507 (1925). – Killip, E. P., Publ.
4 Field Mus. Nat Hist., Bot. Ser. 19: 1-613 (1938). - de Wilde. W. J. J. O., Blumea
19:99-104 (1971); 20:227-250 (1972) (Escobar 1988 y Holm-Nielsen et al.1988).
2.2.2. Descripción Taxonómica
Enredaderas herbáceas o lianas leñosas con zarcillos axilares, menos comunes arbustos o árboles. Hojas alternas, pecioladas; con estípulas de formas diversas, caducas o persistentes; peciolos sin glándulas o de 1-12, casi siempre en pares; hojas basifijas o peltadas, enteras o de 2-7 lóbulos palmeares, raramente compuestas, con o sin ocelos. Inflorecencias axilares cimosas, raramente racemosas, de uno a varios florecimientos. Flores perfectas, o raramente unisexuales y plantas dióicas, actinomórficas, hipogineo aplanado. 3 – 8 sépalos separados o unidos en la base, imbrincados. Pétalos en igual número que sépalos, raramente ausentes, libres o unidos en la base. Corona extraestaminal de una a varias series de filamentos, membranosos o escamosos situados en el hipantio, glabro o pubesente. Nectarios extra y/o intra estaminales, de origen estaminoidal, normalmente presentes y de aparición anual, principalmente con androginóforos, raramente unidos formando una copa circundante al ovario; anteras dorsifijas, de
2 celdas. Ovario de 2 - 5 carpelos, unilocular con placentas parentales; estilo en igual proporción que carpelos, principalmente separados o un poco unidos en la base, raramente solitarios. Frutos en baya, o algunas veces en cápsula abierta en
3-4 valvas. Semillas pocas o muchas, mas o menos comprimidas, embrión largo, endospermo aceitoso y nuclear en formación (Holm-Nielsen et al.1988).
5 2.2.3. Distribución General
La distribución de la familia Passifloraceae es casi exclusivamente tropical y subtropical, la mayoría de sus especies habitan en Africa y Magadascar. Sólo cinco de sus 22 géneros se encuentran representados en el nuevo mundo (Escobar, 1991).
El género Ancistrothyrsus, con dos especies descritas hasta el momento, se encuentra en los bosques amazónicos de Perú y Brasil. El género Mitostemma, con tres especies, también está restringido a los bosques de la amazonía en Brasil,
Venezuela y Perú (Escobar, 1988). El género Tetrastylis fue establecido con una sola especie brasilera, aunque en la actualidad no es muy clara su existencia, ya que en trabajos recientes, como MacDougal (1983), basándose en evidencias morfológicas y palinológicas, incluyó ésta especie y otra previamente incluida por
Killip (1926). El género Passiflora se encuentra desde el nivel del mar hasta las montañas altas del Ecuador. Existen a su vez reportes de especies encontradas desde la parte sur-central de los Estados Unidos hasta Argentina (Woodson et al.
1958).
2.2.4. Distribución en Colombia
La familia Passifloraceae posee una distribución amplia, especialmente el género
Passiflora, que cuenta con un número aproximado de 115 especies, siendo
Colombia el país con mayor diversidad en el mundo (Escobar 1991). Trabajos como los de Killip (1960), Uribe (1972), Holm-Nielsen (1974), Barriga (1975), Escobar
6 (1991) y Holm-Nielsen et al. (1988) mencionan la alta diversidad encontrada en la amazonía colombiana y en la región del Chocó.
Según Escobar (1991), la elevada diversidad de especies se debe principalmente a la alta variedad de hábitats y climas, ya que en Colombia se encuentran desde el nivel del mar hasta la nieve perpetua, y desde zonas desérticas hasta el bosque pluvial. La evolución de este grupo se vió influenciada por la presencia de tres cordilleras, ya que la gran cantidad de sitios aislados, por altura y posición geográfica, posibilitó procesos de especiación.
Otro género presente en Colombia es Dilkea, cuyas especies reportadas se encuentran al sur-oriente de la amazonía (Escobar 1988).
2.3. Ubicación Taxonómica del Género Passiflora
2.3.1. Tratamiento Taxonómico
7 Linnaeus, Sp. Pl. 955. 1753; Cavanilles, Dissertationes 10:439-463, 1790; Jussieu,
Ann. Mus. Hist. Nat. 6 (1):102-106, (2): 388-396, 1805; De Candolle, Prodromus III,
2:321-338. 1828; Masters, trans. Linn Soc. 27:619-625. 1871; Masters, en Martius
Flora Brasiliensis 13 (1):531-627. 1873; Triana & Plachon, Ann. Sci. Nat V Bot. 17:
121-186. 1873; Harms, en Engler & Prantl, Die Naturlichen Pflanzenfamilien 3
(6a):69-92, 1894; Killip, Field Mus. Publ. Bot 19: 1-613, 1938; Wilde, Blumea 19
(1): 99-104, 1971; Wilde, Meded. Landbouwhogesschool Wageningen 1-281, 1971.
(Escobar 1988).
8 2.3.2. Descripción Taxonómica
Lianas o enredaderas herbáceas con zarcillos axilares o árboles. Hojas alternas, simples o compuestas, pecioladas (generalmente con nectarios extraflorales sobre la lámina o superficie adaxial del pecíolo). Inflorecencias axilares simples u ocasionalmente compuestas; 3 brácteas grandes y foliáceas en la base del hipanto o pequeñas y esparcidas sobre el pedúnculo; flores hermafroditas, regulares; prefloración quincuncial; 5 sépalos; 5 pétalos, alternos con los sépalos (a veces ausentes); corona de una a varias series de filamentos o tubérculos libres (a veces reducida a una banda de color) o con filamentos unidos en un tubo; opérculo por debajo de la corona (a veces ausente), limen cerca de la base del ginóforo o ausente; 5 estambres monadelfos en las bases, encerrando el ginóforo, con anteras dorsifijas, versátiles, con dos tecas; ovario esférico, ovoide o fusiforme, estipitado
(sésil en tres especies), estilo con tres divisiones (raramente 4), orbiculares o reniformes; fruto en baya (raras veces en cápsula), esférica, ovoide-obovoide u oblongo, con 3 placentas parietales (4 placentas en 2 especies), semillas reticuladas, o con estriaciones transversales, con arilo translúcido (Escobar 1988).
2.3.3. Distribución General
Su distribución es generalmente tropical, encontrándose la mayoría de las especies del género en Sur América (aprox. 360 spp.) y África (Killip 1938).
9 2.3.4. Distribución en Colombia
Existen reportes de la presencia de especies pertenecientes al género en las tres cordilleras, en particular en la oriental y la central, en alturas que oscilan entre los 2000 y 3000 msnm. Los departamentos del Valle del Cauca, Nariño, Antioquia,
Caldas, Santander, Boyacá, Cundinamarca y Cauca, mantienen los principales cultivos comerciales de algunas especies en los tres últimos años (Escobar 1988).
2.4. Especies Seleccionadas para el Estudio
2.4.1. Subgénero Tacsonia
10 2.4.1.1. Passiflora pinnatistipula Cav.
2.4.1.1.1. Descripción
11 Plantas pubescentes, excepto en el haz de láminas foliares; partes interiores de las flores con tricomas densos, blancos, crespos, entrelazados, de 0,2 mm de largo.
Tallos angulados, estriados, densamente pubescentes en partes más jóvenes, pero glabros en partes maduras. Láminas foliares ampliamente ovadas, divididas en tres lóbulos lanceolados, (4.0-) 7.7 (-11) cm de largo, (3.5-) 8.1 (-14.0) cm de ancho, con ápice agudo, ligeramente acorazonadas a redondeadas en la base, aserrada- glandulares en las márgenes, coriáceas, rugosas, verde brillante en el haz y densamente pubescentes en el envés; pecíolos muy pubescentes, generalmente con 5 nectarios pequeños parcialmente ocultados por el indumento; estípulas divididas en segmentos filiformes palmeados, escasamente pubescentes en secciones jóvenes. Pedúnculos delgados; brácteas ovadas, agudas a redondeadas en el ápice, redondeadas en la base, ligeramente glandular-laceradas en las márgenes, glabras o ligeramente pubescentes en la superficie adaxial, densamente pubescentes en la superficie abaxial. Flores péndulas; hipantios cilíndricos, ligeramente dilatados en la base, densamente blanco-pubescentes abaxialmente, blancos adaxialmente; sépalos oblongos sobre base ancha, redondeados en el
ápice, densamente blanco-pubescentes abaxialmente, rosado pálido y glabros adaxialmente; pétalos subigales a los sépalos, color rosado-lavanda; partes libres del cáliz campanuladas; corona de una o dos series, filamentosa, la serie exterior color violeta, la serie interior irregular, blanca o violeta; ovarios piriformes. Frutos esféricos, generalmente de 5 cm de diámetro, pericarpio frágil, verdoso hacia la base, volviéndose amarillo hacia el ápice. Semillas obovoides, comprimidas lateralmente, oblicuas, obtusas y mucronadas en el ápice, redondeadas en la base,
12 con reticulaciones poco profundas en ambas superficies, brillantes, color café oscuro al madurar; arilos suculentos, blancogrisosos, comestibles (Killip 1938).
2.4.1.1.2. Distribución
Región Andina; cultivada desde el Sur de Chile hasta el Norte de Colombia, creciendo entre 2200 y 3650 metros de altura. El origen geográfico de la sección es probablemente la región Andina de Bolivia y el sur del Perú (Killip 1938).
2.4.1.2. Passiflora cumbalensis (Karsten)
2.4.1.2.1. Descripción
Plantas glabras (en las variedades colombianas), excepto la superficie interior de las brácteas. Tallos angulares, estriados, volviéndose teretes. Hojas trilobuladas; láminas foliares ovadas a deltoides, 2.6 – 14.5 cm de largo, 3.5 – 16.3 cm de ancho, divididas en tres lóbulos ovados a lanceolados, obtusas, agudas o acuminadas en el
ápice, acorazonadas o redondeadas en la base, glandular-aserradas en las márgenes, coriáceas; pecíolos con 2 – 4 nectarios esféricos en la mitad apical de la superficie adaxial; estípulas reniformes, generalmente convexas lateralmente, acuminadas, frecuentemente aristadas en el ápice, oblicuas en la base, glandular- aserradas en las márgenes, coriáceas. Pedúnculos delgados; brácteas ovadas a oblongas, connatas en la base hasta 1/2 – 4/5 su longitud; brácteas agudas en el
ápice, cuneadas en la base, enteras en las márgenes, subcoriáceas. Flores péndulas, glabras; hipantios ligeramente dilatados en la base, ápice color morado,
13 azul, violeta, magenta, rosado o verde en superficie abaxial, blancos en supericie adaxial; sépalos oblongos sobre base ancha, volviéndose más angostos en el ápice, con arista subapical, de aproximadamente 2 m de largo en la superficie abaxial, ligeramente coriáceos, color rosado-violeta, rosado, magenta o rosado- amarillento; pétalos subyugales a los sépalos, estrechándose en la base, de igual color que los sépalos; pétalos y sépalos ampliamente campanulados en antesis; corona en una serie, dentada o tuberculada, generalmente con dientes blancos, ocasionalmente reducidos a una banda morada poco prominente; ovario fusiforme.
Frutos obovoides, 5.5 – 9.2 cm de largo, 1.6 – 4.5 cm de ancho (prensados), con pericarpio blando; color rojizo; semillas obovoides, con arilo color naranja, suculento, comestible (Killip 1938).
2.4.1.2.2. Distribución
Todas las variedades de esta especie se encuentran distribuidas desde el Norte de
Colombia hasta el departamento de Huánuco en el Perú, en bosques húmedos entre 1800 y 4100 metros de altura (Killip 1938).
2.4.1.3. Passiflora mollissima (H. B. K.) Bailey.
2.4.1.3.1. Descripción
14 Plantas pubescentes con tricomas rectos u ondulados, transparentes, amarillo- verdosos o incoloros. Tallos generalmente teretes, estriados. Hojas obovadas,
(5.3-) 8.3 (-17.0) cm de largo, (7.0-) 10.0 (-25.0) cm de ancho, partidas en tres lóbulos ovados, agudas en el ápice, acorazonadas en la base, glandular-aserradas en las márgenes, coriáceas, generalmente pubescentes en ambas superficies; pecíolos con 6 – 14 nectarios subsésiles repartidos sobre la superficie adaxial; estípulas reniformes, acuminadas y aristadas en el ápice, oblicuas en la base.
Pedúnculos delgados; brácteas ovadas u oblongas, unidas 1/3 – 4/5 su longitud, formando un tubo sobre el hipantio, brácteas agudas en el ápice, redondeadas o cuneadas en la base. Flores péndulas, hipantios cilíndricos, generalmente glabros, verdes, volviéndose color rosado hacia el ápice en la superficie abaxial, blancos en la superficie adaxial; sépalos ovados a oblongos sobre base ancha, generalmente glabros, con arista subapical generalmente de 2 mm de largo, color rozado pálido o magenta; pétalos subiguales a los sépalos, estrechándose en la base, de igual color que los sépalos; corona en una serie, generalmente dentada a tuberculada, blanca o morada; ovarios oblongos, muy pubescentes con tricomas rectos. Frutos oblongos u obovoides, con pericarpio coriáceo o blando, amarillo al madurar; semillas obovadas, con arilo anaranjado, suculento, comestible (Holm-Nielsen et al. 1988).
2.4.1.3.2. Distribución
Se cultiva en los Andes desde Venezuela hasta Bolivia a alturas entre 2600 – 3630 metros. También ha sido introducida a México, Nueva Zelanda, Nueva Guinea,
India, Sri Lanka y Kenya (Holm-Nielsen et al. 1988).
15 2.4.1.4. Passiflora mixta L.
2.4.1.4.1. Descripción
Plantas glabras o pubescentes, con tricomas rectos u ondulados, transparentes, blancuzcos o amarillentos. Tallos angulados, estriados. Hojas trilobuladas, (3.5-)
6.5 (-12.0) cm de largo, (5.0-) 9.5 (-18.5) cm de ancho, agudas en el ápice, redondeadas en la base, aserradas en las márgenes, con lóbulos ovados, oblongos o lanceoladas; lóbulos laterales generalmente divergentes del lóbulo central por 45 –
65°, membranáceas a coriáceas, glabras en el haz, glabras o pubescentes en el envés, ocasionalmente con tricomas afelpados; pecíolos con 4 - 10 nectarios subsésiles o elongados, sobre la superficie adaxial; estípulas reniformes, generalmente abrazando el tallo, acuminadas o agudas en el ápice, cuneadas a redondeadas en la base, glabras o pubescentes abaxialmente, densamente pubescentes adaxialmente. Flores erectas u horizontales; hipantios cilíndricos o estrechados hacia la base, verdes, volviéndose rosados hacia el ápice, glabros o pubescentes abaxialmente, blancos y glabros adaxialmente; sépalos oblongos sobre base ancha, estrechándose hacia el ápice, glabros o pubescentes abaxialmente, con arista subapical generalmente de 3 mm de largo, generalmente color rosado- amarillo, ocasionalmente rosado o rojizo, volviéndose color crema hacia la base en la superficie adaxial en algunos especimenes; pétalos subiguales a los sépalos, algo más anchos, estrechándose hacia la base, de color similar al de los sépalos; corona en una serie, reducida a tubérculos o dentada, generalmente morada, o infrecuentemente en dos series, raramente con una serie adicional de filamentos
16 blancos hasta 2 mm de largo hacia la base del hipantio; ovario fusiforme u oblonglo, glabro o densamente pubescente. Frutos obovoides u oblongos, 4.0 – 7.2 cm de largo, 2.0 – 3.5 cm de ancho (prensados) con pericarpio fuertemente coriáceo, verde al madurar; semillas obovadas, con arilo poco suculento de color amarillento o naranja claro (Killip 1938).
2.4.1.4.2. Distribución
Se distribuye en los Andes, desde el estado de Aragua en Venezuela hasta el departamento del Cauca en la cordillera oriental de Colombia, y en la cordillera central de Colombia y Ecuador, hasta la provincia de Azuay, a alturas entre 1700 y
3700 metros. También existen pequeñas poblaciones en el Perú y en Bolivia. Las plantas toleran perturbaciones del hábitat y se encuentran al borde de potreros y arados.
Es una especie que se encuentra en poblaciones grandes, tolera condiciones más secas y calientes que sus congéneres y forma híbridos naturales con facilidad (Killip
1938).
2.4.1.5. Passiflora mathewsii (Mast.) Killip.
2.4.1.5.1. Descripción
17 Plantas de tallo cilíndrico, tomentoso; estípulas estrechamente lineales, de 2.5 a 3 mm de longitud; peciolos de 1 cm de longitud, con seis glándulas; hojas de 5 a 6 cm, de largo, con un nervio a lo largo del medio de 3.5 a 4 cm de longitud, y con nervios laterales de 4 a 6 cm, cuneados en la base, serrulados, coriaceos, glabros por encima y densamente tomentosos por debajo; pedúnculos de 1.5 a 2 cm de longitud, agudos, articulados cerca del ápice; brácteas de 2.5 cm de longitud, tomentosas, con las porciones libres lanceoladas, y agudas; flores de color rosa; cáliz cilíndrico, de 4 cm de longitud, tomentoso de color púrpura, sépalos oblongos, de 2 a 2.5 cm de longitud, de 7 a 8 mm de ancho, obtuso; pétalos similares a los sépalos; corona tuberculada, los tuberculos de 1 a 1.5 mm de longitud; opérculo levemente recurvado en el margen; ginóforo densamente piloso
(Killip 1938).
2.4.1.5.2. Distribución
Esta especie se ha reportado únicamente en Perú (Killip 1938).
2.4.1.6 . Passiflora tripartita Juss.
2.4.1.6.1. Descripción
18 Plantas de tallo cilíndrico, con pelos curvados y de color gris; estípulas subreniformes, de 6 a 8 mm de longitud, y de 3 a 4 mm de ancho, con aristas, y dientes; peciolos de 2.5 cm de longitud, con 8 a 12 glándulas sésiles, o algunas veces sin glándulas; hojas de 6 a 8 cm de longitud, y de 8 a 12 cm de ancho, con tres lóbulos de 1 cm aproximadamente por encima de la base, truncado en la base, pilosos de color grisaceo en ambas superficies, en especial en los nervios y venas; pedúnculos de 2.5 a 4 cm de longitud; brácteas de 2.5 a 3.0 cm de longitud, tomentosos; flores de color rosado; cáliz tubular cilíndrico, de 9 a 10 cm de longitud, de 1 cm de ancho aproximadamente, glabro; sépalos oblongos, de 3 cm de largo, y 0.8 a 1 cm de ancho, obtusos, con aristas dorsales justo por debajo del
ápice; pétalos más o menos iguales a los sépalos, obtusos; corona reducida a un anillo inconspicuo, crenulado hacia el margen; opérculo dependiente, recurvado hacia el margen, subentero; ovario estrechamente ovoide, tomentoso (Killip,
1938).
2.4.1.6.2. Distribución
Esta especie se encuentra principalmente en Ecuador y Perú (Killip 1938).
2.4.1.7. Passiflora antioquensis Karst.
2.4.1.7.1. Descripción
19 Plantas de tallo cilíndrico; estípulas de 5 a 7 mm de longitud; peciolos de 4 cm de longitud, gruesos; hojas dimórficas, sin lóbulos, ovadas, ovado-lanceoladas, o lanceoladas, de 7 a 15 cm de longitud y de 3.5 a 8 cm de ancho, o a veces tres lóbulos redondeados o subcordados en la base, serrados, puberulentos sobre los nervios y las venas, densamente pilosos sobre los nervios y levemente tomentosos; flores de color rosado y rojo; el tubo del cáliz cilíndrico, de 2.5 a 4 cm de longitud, glabro; sépalos oblongos; pétalos similares a los sépalos, obtusos; corona en tres series, la externa variando de tuberculada a filamentosa (filamentos delgados de 5 mm de longitud), la tercera serie se encuentra a 1 cm de la base del tubo, filamentosa, los filamentos tienen de 4 a 6 mm de longitud; opérculo membranoso, con el margen recurvado, denticulado o casi entero; ovario estrechamente elipsoidal, glabro o piloso (Killip 1938).
2.4.1.7.2. Distribución
De acuerdo con Killip (1938), ésta especie se encuentra en Colombia, en los departamentos de Antioquia, Cundinamarca, Boyacá, Caldas, Tolima y Cauca.
2.4.1.8. Pasiflora tenerifensis L. Escobar
2.4.1.8.1. Descripción
20 Plantas pubescentes, excepto en parte interior de las flores, con tricomas ondulados, amarillentos. Tallos subangulares, estriados, volviéndose teretes.
Láminas foliares ovadas, 7.1 – 10.5 cm de largo, 3.8 – 6.0 cm de ancho, acuminadas a agudas en el ápice, redondeadas a ligeramente acorazonadas en la base, profundamente aserradas en las márgenes, coriáceas, muy pubescentes en el envés, escasamente pubescentes en el haz; pecíolos con 4 – 8 nectarios oscuros ocultos por el indumento; estípulas linear-lanceoladas, generalmente de 1 cm de largo. Pedúnculos delgados; brácteas lanceoladas, acuminadas en el ápice, cuneadas en la base, laceradas y glandulares en las márgenes. Flores péndulas; hipantios cilíndricos, dilatados en la base, muy coriáceas, color morado oscuro en la superficie adaxial, verde en la superficie abaxial; sépalos rosados; pétalos subyúgales a los sépalos, rosados; corona en una serie, irregularmente dentado, color morado. Fruto de 9 cm de largo y 5.5 cm de ancho, por lo general; semillas obovadas, con testa reticulada, color café oscuro al madurar; arilos amarillentos
(Escobar 1991).
2.4.1.8.2. Distribución
Sólo se conoce de la cordillera central en el departamento del Valle, a alturas entre 2800 y 3060 metros (Escobar 1991).
21 2.4.2. Subgénero Passiflora
2.4.2.1. Passiflora caerulea L.
2.4.2.1.1. Descripción
Planta glabra y frecuentemente glauca; tallo subangular, estriado o acanalado; estípulas semi-ovaladas, subreniformes, de 1 a 2 cm de largo y 0,5 a 1 cm de ancho, aristadas, rara vez dentadas; pecíolos 1,5 a 4cm de largo, usualmente con 2 a 4 glándulas; hojas palmeadas con 5 lóbulos (ocasionalmente 3, 7 o 9), hasta 10 cm de longitud y 0,5 a 2,5 de ancho, obtusos, ocasionalmente agudos, enteros; pedúnculos de 3 a 7 cm de largo, delgados y erectos; brácteas anchas y ovaladas,
1,5 a 2,5 cm de largo y 1 a 1,5 de ancho, redondeadas en el ápice, con nacimiento cercano a la base de las flores, delgadas, membranosas, color verde claro; flores hasta de 10 cm de ancho; cáliz en forma de copa; sépalos de lanceolados a oblongos, 1,5 a 2 cm de largo y 1 a 1,5 cm de ancho, obtusos, subcoriáceos; pétalos oblongos, 1,5 a 2,5 de largo y 1 a 1,5 de ancho, obtusos, membranosos, blancos o rosados; filamentos de la corona en 4 series, siendo los de la serie externa entre la mitad de largos o igual que los pétalos, filiformes, radiados, azules en el ápice, blancos en el medio, violeta en la base; filamentos de la serie interna de 1 a 2 mm de largo, erectos, blancos, violeta en su ápice; opérculo membranoso hasta 1/3 de su longitud, blanco, filamentoso en su porción superior; nectario carnoso, borde violeta oscuro; ovario ovoide o subgloboso; fruto ovoide o subgloboso, aproximadamente 6 cm de largo y 4 cm de diámetro, color naranja o
22 amarillo; semillas de 5 mm de longitud y 3,5 a 4 mm de ancho aproximadamente, toscamente reticuladas (Killip 1938).
2.4.2.1.2. Distribución
Se encuentra desde el sur de Brasil hasta Argentina; tambien se cultiva en México,
Guyana Británica y parte occidental de Suramérica, entre otras partes del mundo.
2.4.2.2. Passiflora tiliifoliae L.
2.4.2.2.1. Descripción
Plantas glabras, de tallo cilíndrico; con estípulas ovado-lanceoladas a oblongo- lanceoladas, de 1 a 2 cm de longitud a 0.5 a 1.5 cm de ancho, acuminado, oblicuo en la base, entero o serrado, de color verde a rojizo en estado seco; peciolos de
2.5 a 7 cm de longitud, con 2 a 4 glándulas de 1 a 2 mm de longitud; hojas ovadas, de 10 a 25 cm de longitud y de 8 a 18 cm de ancho, abruptamente acuminadas, muy cordadas en la base, enteras, membranosas; pedúnculo de 2 a 3 cm de longitud; brácteas ovadas de 2 cm de longitud y 1.5 cm de ancho, obtusas o agudas en el ápice, glabras; flores de 8 cm de ancho; sépalos oblongos de 5 a 7 mm de ancho, obtusas, cóncavas, la quilla terminando en una arista delgada; pétalos oblongos, más o menos iguales a los sépalos; corona con varias series de filamentos, las dos filas externas de filamentos cilíndricos, tan largos como la
23 mitad de la longitud de los pétalos, las tres filas interiores escasamente de 3 mm de longitud, opérculo membranoso, incurvado, entero en el margen; ovario ovoide, fruto ovoide, de alrededor de 6 cm de diámetro (Killip 1938).
2.4.2.2.2. Distribución
De acuerdo con Killip (1938), ésta especie se encuentra en las montañas de
Colombia y Perú entre los 1500 y los 2500 metros de altitud.
2.4.2.3. Passiflora ligularis Juss.
2.4.2.3.1. Descripción
Planta glabra en su totalidad; tallo terete; estípulas ovadas a lanceoladas, de 1 a
2,5 cm de largo y 0,8 a 1,2 cm de ancho, acuminadas y angostas en su base, enteras o aserradas; pecíolos de 4 a 10 cm de largo, con 4 a 6 glándulas filiformes de 3 a 10 mm de largo; hojas anchas y ovadas, de 8-15 cm de largo y 6-13 cm de ancho, bruscamente acuminadas, muy cordadas, enteras, membranosas; pedúnculos sencillos o en pares, de 2-4 cm de largo; brácteas de 2- 3,5 cm de largo y 1- 1,5 cm de ancho, connatos en 1/5 a 1/3 de su longitud, sus partes libres son
24 ovadas, lanceoladas, agudas, enteras, glabras; flores de 6 a 9 cm, anchas; cáliz corto y campanulado; sépalos ovados a oblongos, 2,5 a 3,5 cm de longitud y 1 a 1,5 cm de ancho, acuminados, verdes en su exterior y blancos al interior; pétalos oblongos, cerca de 3 cm de longitud, 0,8 a 1 cm de ancho, blancos o rosado claro; corona con 5-7 filas, los filamentos de las 2 filas externas, tan largos como los pétalos, radiados, teretes, azul en el àpice y con bandas blancas y rojo-violeta en la porción inferior, las filas internas muy cercanas y de filamentos escasamente de
2 mm de largo, dilatados en la mitad superior; opérculo membranoso, levemente curvado, finamente denticulado, blanco y rojo-púrpura en el márgen; ovario ovoide; fruto ovoide, de 6-8 cm de largo y 4-5 cm de diámetro, el pericarpio amarillo o violeta, pulpa blanca, comestible; semillas angostas, de 6 mm de longitud y 4mm de ancho, ápice con un minúsculo tridente (Killip 1938).
2.4.2.3.2. Distribución
Se encuentra en la parte central de México, Venezuela, zona sur-central del Perú y occidente de Bolivia, entre 1000 y 3000 metros de altitud. Es un cultivo frecuente en Centroamérica y occidente de Suramérica (Killip 1938).
2.4.2.4. Passiflora maliformis L.
2.4.2.4.1. Descripción
25 Plantas glabras o finamente pilosas; tallo cilíndrico; estípulas estrechamente linelaes o lanceoladas, de 9 a 15 mm de longitud y de 1 a 2 mm de ancho, enteras o aserradas; peciolos de 1.5 a 5 cm de longitud, con dos glándulas, subsésiles; hojas ovadas, ovado-lanceoladas y a veces orbiculo-ovadas, de 6 a 12 cm de longitud y 4 a 10 cm de ancho, agudas o acuminadas en el ápice, redondeadas, truncadas o finamente serradas, membranosas; pedúnculos de 5 cm de longitud; brácteas ampliamente ovadas, de 4 a 6 cm de longitud y 3.5 a 4.5 cm de ancho, unidas desde la base, membranosas, envolviendo completamente al botón; el tubo del cáliz es campanulado, de 1 cm de longitud, y 1.3 cm de ancho; sépalos oblongos a oblongo-lanceolados, de 4 cm de longitud y 1.5 cm de ancho, carnosos, de color verde; pétalos lineal-lanceolados, de 3 cm de longitud y 5 mm de ancho, de color verde, con manchas de color rojo y púrpura oscuro; corona de varias series, las 2 filas externas de filamentos de color blanco, la fila más externa cilíndrica de 1.5 cm de longitud, la segunda de 3 cm de longitud, las siguientes series se componen de diminutos tubérculos, de color verde a púrpura; opérculo membranoso, horizontal, de margen recurvado, de color verde pálido, denticulado; anillo del néctar horizontal, con el margen entero; opérculo en forma de cúpula, de 6 mm de altura; ovario oblongo o subgluboso, glabro; fruto globoso, de 3.5 a 4 cm de diámetro, de color verde a verde-naranja, pericarpo muy duro; semillas oblongas de 5 a 6 mm de longitud y 4 mm de ancho, reticuladas, de color gris (Killip 1938).
2.4.2.4.2. Distribución
26 Se distribuye en el trópico, en las Antillas, en países como Cuba, Haití, República
Dominicana, Haití, Jamaica, Puerto Rico, Venezuela, Colombia, y el norte de
Ecuador. En Colombia se encuentra en los departamentos de Santander, Nariño,
Cundinamarca, Tolima, Antioquia, Caldas, Valle, Risaralda, y Cauca (Killip 1938).
2.4.2.5. Passiflora edulis Sims.
2.4.2.5.1. Descripción
Planta esencialmente glabra (excepto el ovario), raramente pilosa; estípulas de aprox. 1 cm de largo, 1mm de ancho, enteras o finamente aserradas; peciolos hasta 4 cm de largos, biglandulares en el ápice, con glándulas sésiles; hojas de 5-
11 cm de largo, 4-10 cm ancho, trilobadas, redondeadas o levemente cordadas en la base, aserradas, subcoriáceas, brillantes; pedúnculos hasta 6 cm de largos; brácteas ovadas, de 2-2,5 cm de largas, 1-1,5 cm de anchas, obtusas o agudas en el ápice, agudamente aserradas, pectinadas; flores hasta 7 cm ancho; sépalos oblongos, de 3-3,5 cm de largo, cerca de 1cm de ancho, verdes en el exterior y blancos en el interior; pétalos oblongos, de 2,5-3 cm largos y de 5-7 mm de ancho, obtusos, blancos; filamentos de la corona en 4 o 5 series, las dos series externas filiformes o linguliformes, 1,5-2,5 cm de largo (no más cortos de 0,5mm), ápice blanco y base púrpura, los de las siguientes series de 2-2,5 mm de largos; interior del tubo, entre corona y opérculo, de superficie suave o finamente tuberculada; opérculo membranoso, curvo, entero o crenulado; ovario ovoide o globoso, ceroso
27 y tomentoso o glabro; fruto ovoide o globoso, de 4-5 cm en diámetro, amarillo, amarillo-verdoso o en tonos púrpuras; semillas ovales, de 5-6 mm de largo y 3-4 mm de ancho, reticulación muy fina (Killip 1938).
2.4.2.5.2. Distribución
Ampliamente distribuida en Brasil. También presente en Paraguay, Argentina, algunas islas, Centroamérica, Venezuela, Ecuador y extensamente cultivada en
Hawai y Australia (Killip 1938).
2.4.2.6. Passiflora quadrangularis L.
2.4.2.6.1. Descripción
Plantas glabras; con tallos gruesos, de 4 ángulos, éstos conspicuamente alados; estípulas ovadas a ovado lanceolados, de 2 a 3.5 cm de longitud y de 1 a 2 cm de ancho, agudas en el ápice y estrechas en la base, enteras o levemente aserradas; peciolos de 2 a 5 cm de longitud, gruesos, acanalados, con 6 glándulas, las glándulas dispuestas en pares, casi sésiles; hojas enteras, ampliamente ovadas a ovado oblongas, de 10 a 20 cm de longitud y de 8 a 15 cm de ancho, abruptamente acuminadas, redondeadas, subtruncadas, con margen entero; pedúnculos de 1.5 a
3 cm de longitud, de tres ángulos; brácteas ovadas, de 3 a 5.5 cm de longitud y 1.5
28 a 4 cm de ancho, agudas, enteras o aserradas hacia la base; flores de 12 cm de ancho; cáliz campanulado; sépalos ovados a ovado oblongos, de 3 a 4 cm de longitud y de 1 a 2 cm de ancho, obtuso, plano de color blanco; corona de cinco series, las dos externas filamentosas (filamentos de 6 cm de longitud, más o menos iguales a los sépalos, cilíndricos, radiados, de color rojizo púrpura y blanco en la base, azul en la mitad y en la mitad superior de color rosado), la serie interna membranosa, de 3 a 7 mm de longitud; opérculo membranoso, de 4 a 6 mm de longitud, inclinados hacia adentro, denticulados, de color blanco y rojizo púrpura en el margen; limen anular, carnoso; ginóforo grueso; ovario ovoide; fruto oblongo- ovoide, 20 a 30 cm de longitud y 12 a 15 cm de ancho, cilíndrico acanalado; semillas suborbiculares, de 7 a 10 mm longitud a 5 a 8.5 mm de ancho, muy planas, reticuladas en el centro de cada cara, con margen estriado (Killip
1938).
2.4.2.6.2. Distribución
De acuerdo con Killip (1938), esta especie se encuentra en Jamaica, México,
Guatemala, Salvador, Nicaragua, Costa Rica, Panamá, Bahamas, Cuba, Haití,
República Dominicana, Venezuela, Colombia, Ecuador, Perú , Bolivia y Brasil
(Killip 1938).
29 2.4.3. Subgénero Manicata
2.4.3.1. Passiflora manicata Juss.
2.4.3.1.1. Descripción
Plantas de tallo grueso, angulado, glabro; estípulas semiovadas, de 1.5 a 2 cm de longitud, y de 0.8 a 1 cm de ancho, muy dentado; peciolos de 5 cm de longitud, con 4 a 10 glándulas a veces sésiles; hojas de 4 a 8 cm de longitud y de 5 a 9 cm de ancho, con tres lóbulos, de 2 a 5 cm de ancho, obtusas, redondeadas o subcordadas en la base, serradas, glabras o pilosas por encima, y tomentosas por debajo; pedúnculos de 7 cm de longitud; brácteas libres o unidas hacia la base, ovadas, de 2 a 3 cm de longitud y de 1 a 1.5 cm de ancho, agudas, enteras o serradas; cáliz tubular de 1.5 a 2 cm de longitud y de 0.8 cm a 1 cm de diámetro, de color verde; sépalos oblongo-lanceolados, de 3 a 3.5 cm de longitud y de 6 a 7 mm de ancho, obtusos, de color verde; pétalos oblongos, obtusos; corona compuesta de 3 a 4 series, la segunda y la tercera serie filamentosas, los filamentos de 2 a 4 mm de longitud, de color azul, las siguientes series tuberculadas, de 0.5 mm de longitud, las series internas de 4 mm de longitud; opérculo de 7 mm de longitud, de color blanco, dependiente, con margen reticulado; limen membranoso, erecto, de 3 a 4 mm de alto, lobulado; ovario
30 obovoide, glabro; fruto ovoide o subesfèrico, de 3.5 a 5 cm de longitud y de 2.5 a
3.5 cm de ancho, de color verde oscuro, glabro; semillas ovadas, de 5 mm de longitud y 3 mm de ancho, de color negro en su madurez (Killip 1938).
2.4.3.1.2. Distribución
Esta especie se distribuye en el Oriente de Venezuela, en las Cordilleras Central y
Oriental y en el norte de Perú y Ecuador, entre los 1.500 y los 2.500 m de altitud.
En Colombia se encuentra en los departamentos de Santander, Cundinamarca,
Boyacá, Tolima, Quindio, Caldas, Cauca y Nariño (Killip 1938).
2.4.4. Subgénero Decaloba
2.4.4.1. Passiflora biflora Lam.
2.4.4.1.1. Descripción
Plantas con tallos angulados, fuertemente acanalados, de color verde o púrpura, glabro; estípulas estrechamente lineales subuladas o setáceas, de 1.5 a 3 mm de longitud; peciolos de 0.5 a 1 cm de longitud, sin glándulas, glabras; hojas extremadamente variables, lineales hasta oblongas o suborbiculares, con un rango entre 0.8 cm de longitud y 8 cm de ancho hasta 10 cm de longitud y 10 cm de
31 ancho, a veces bilobuladas con un tercer lobulo acuminado o redondeado, usualmente apiculado, lanceolado u ovado, truncado, con tres nervios, venación reticulada, glabras por encima, glabras o pilosas por debajo, oceladas, con cuatro pares de ocelos, coriáceas o subcoriáceas; pedúnculos en pares, de 1 a 1.2 cm de longitud, levemente articulados por encima de la mitad; brácteas setáceas, de 2 mm de longitud; flores de 2.5 a 3.5 cm de ancho; sépalos ovado lanceolados, de 9 a 12 mm de longitud y 5 a 7 mm de ancho, obtusos, de color verde, glabros; pétalos de 8 mm de longitud y 5 mm de ancho, de color blanco, filamentos de la corona en dos series, la exterior con tres ángulos, dilatada cerca de la mitad, de 7 mm de longitud, de color amarillo; la serie interior filiforme, de 5 mm de longitud, opérculo membranoso, plegado, con el margen incurvado; limen anular; ginóforo de 5 a 8 mm de largo; ovario subgloboso a ovoide, glabro o densamente tomentoso; fruto globoso o subgloboso, de 1 a 2 cm de diámetro, glabro a piloso; semillas obovoides, de 2.5 a 3 mm de longitud, y 2.5 mm de ancho (Killip 1938).
2.4.4.1.2. Distribución
Esta especie se distribuye en América Central en países como México, Guatemala,
Nicaragua, Salvador, Honduras, Panama, Bahamas, Colombia, Venezuela y
Ecuador, desde el nivel del mar hasta los 1500 m.s.n.m. en Colombia, se encuentra en los departamentos de Bolivar, Magdalena, Santander, Cundinamarca, Tolima,
Valle y Nariño (Killip 1938).
32 2.4.4.2. Passiflora adenopoda DC.
2.4.4.2.1. Descripción
Plantas con tallo angulado, glabro; estípulas semiorbiculares, de 1 cm de longitud y 1.5 cm de ancho, enteras o con cúspides dentadas; peciolos de 3 a 5 cm de longitud, densamente pubescentes, con dos glándulas de 2 a 4 mm de diámetro; hojas de 7 a 12 cm de longitud y de 8 a 15 cm de ancho, con 3 a 5 lóbulos, con 3 -
5 nervios, enteras o denticuladas; pedúnculos solitarios o en pares, de 2 - 2.5 cm de longitud; tres brácteas ubicadas en la mitad del pedúnculo, lanceoladas u oblongas, de 7 a 10 mm de longitud y de 4 a 6 mm de ancho; flores de 2 a 7 cm de ancho; sépalos oblongo- lanceolados de 2 a 4 cm de longitud, y de 1 cm de ancho, obtuso, terminando en un cuerno de 1 cm de longitud, de color gris, blanco o amarillento; pétalos lineales o lanceolados, de 1 a 1.2 cm de longitud y 0.5 mm de ancho; filamentos de la corona en un serie, filiformes, de 1.5 a 1.8 cm de longitud, de color blanco, con bandas púrpuras; opérculo membranoso, plegado, con el margen incurvado; limen anular, de 1 mm de alto; ovario subgloboso u oblongo, densamente tomentoso, de color café; fruto globoso, de 2 a 2.5 cm de diámetro; semillas obcordadas, muy aplanadas, estrechas en la base, de 6 mm de longitud , 4 mm de ancho y 1 mm de espesor, reticulado (Killip 1938).
2.4.4.2.2. Distribución
33 Esta especie, se distribuye en Centro y Sur América, en países como México,
Guatemala, Costa Rica, Panamá, Venezuela, Colombia y Perú. En Colombia, se encuentra en los departamentos de Magdalena (Santa Marta), Boyacá, Tolima,
Antioquia y Caldas (Killip 1938).
2.4.4.3. Passiflora cuspidifolia Harns.
2.4.4.3.1. Descripción
Plantas subglabras o pilosas; con tallo angular y comprimido; estípulas de 2 a 3 mm de longitud; peciolos de 1.5 cm de longitud, sin glándulas, hojas ovadas a oblongas, de 7 a 15 cm de longitud, de 3 a 7 cm de ancho, con borde entero, con tres nervios, subcoriáceas; pedúnculos solitarios o en pares, delgados, de 1.5 a 3.5 cm de longitud, bracteas lineares o variables, de 2 a 3 mm de longitud, persistentes; flores de 3 cm de longitud, ancho; sépalos oblongos de 1.5 cm de longitud, de 3 a 4 mm de ancho; pétalos más pequeños que los sépalos; filamentos de la corona en dos series, los exteriores estrechamente linguliformes, estrechos en el ápice, de 4 mm de longitud, erectos, los filamentos internos filiformes, de 3 mm de longitud; opérculo denticulado, anillo del néctar anular, limen anular; ovario subgloboso, piloso; fruto globoso, de 1 cm de diámetro (Killip 1938).
2.4.4.3.2. Distribución
34 En Colombia, ésta especie se encuentra en la cordillera Oriental, en los departamentos de Santander y Boyacá., entre los 1.500 y los 2.500 m.s.n.m (Killip
1938).
2.4.4.4. Passiflora bicuspidata Karst.
2.4.4.4.1. Descripción
Plantas con tallo angular, longitudinalmente acanalado, glabro o piloso; estípulas setáceas, de 2 a 3 mm de longitud; peciolos de 1.5 cm de longitud, delgados, sin glándulas; hojas cuneadas y oblongas, de 4 a 8 cm de longitud, y de 1 a 2.5 cm de ancho, con dos lóbulos en el ápice, con tres nervios prominentes, con venación reticulada, oceladas, subcoriáceas, glabras; pedúnculos solitarios o en pares, de 2 cm de longitud, delgados, articulados cerca del ápice; brácteas setáceas, de 3 a 4 mm de longitud, sobre la mitad superior del pedúnculo; flores de color rojizo, café o rosado-púrpura; cáliz cilíndrico, de 2.5 a 4 cm de longitud y 2.5 a 6 mm de ancho, dilatado en la base, de 1 cm de ancho, obtuso; pétalos lineales, de 0.8 a 1 cm de longitud y 3 a 4 mm de ancho; filamentos de la corona filiformes, de 3 a 4 mm de longitud, muy delgados, dispuestos en una sola serie; opérculo membranoso, de 4 a 5 mm de longitud, sobre la base del tubo, erecto; sin limen, ovario ovoide, glabro; fruto subgloboso (Killip 1938).
35 2.4.4.4.2. Distribución
En Colombia se distribuye sobre la cordillera central y oriental, entre los 2300 y los
3.300 metros de altitud, en Santander y Cundinamarca principalmente (Killip
1938).
2.4.4.5. Passiflora bogotensis Benth.
2.4.4.5.1. Descripción
Plantas ferruginosas-vellosas, a densamente vellosas; tallos angulados; estípulas setáceas, de 4 a 5 mm de longitud, deciduas; peciolos de 6 a 10 mm de longitud, sin glándulas; hojas oblongas, ocasionalmente triangular-ovadas a casi ovadas, de 4 a 9 cm de longitud, y de 3 a 4.5 cm de ancho, ampliamente bilobuladas en ápice truncado, ocasionalmente con un lóbulo pequeño intermedio o subentero, redondeado, con tres nervios conspicuos, subcoriáceas, tomentosas o casi glabras; pedúnculos solitarios o en pares, de 3 o más cm de longitud; brácteas setáceas, de
3 a 5 mm de longitud, púrpuras; flores de 4 cm de ancho, sépalos estrechamente lanceolado- oblongos, de 1 a 1.5 cm de longitud, alrededor 5 mm de ancho en la base, obtusos, verdes o púrpuras; pétalos lineal-oblongos, de 0.6 a 0.8 cm de largo, obtusos, blancos; los filamentos de la corona en dos series, los filamentos externos estrechamente linguliformes, de 4 a 5 mm de longitud, subangulares, dilatados en un apice capitado, de color amarillo-verde, con bandas púrpuras, los
36 filamentos internos filiformes de 2 a 3 mm de longitud, subcapitados, de color verde; opérculo fuertemente plegado, denticulado, de color verde; ovario globoso, densamente pilosos, de color blanco; fruto globoso, de 1 a 1.5 cm de diámetro; semillas ovadas o cuneado-obovadas, alrededor de 3 mm de longitud, y 2 mm de ancho (Killip 1938).
2.4.4.5.2. Distribución
En Colombia se encuentra a lo largo de la cordillera oriental, entre los 2000 y 3000 m.s.n.m, en Cundinamarca, Magdalena, Santander y Boyacá (Killip 1938).
2.4.5. Subgénero Astrophea
2.4.5.1. Passiflora arborea Spreng.
2.4.5.1.1. Descripción
Planta arbórea, de 6 a 10 metros de altura; corteza suave, verde; ramas alternas, teretes, glabras, las juveniles color café-rojizas; peciolos de 2-3 cm de largo; hojas oblongas u ovadas-oblongas, 10-30 cm de largo, 5-15 cm de ancho, agudas o abruptamente acuminadas en su ápice, redondeadas o subcuneadas en la base, con
37 nervaduras prominentes en la superficie inferior, membranosas o subcoriáceas, glabras, raramente hirsutas en superficie inferior; nervadura principal biglandular en la base inferior, cara superior brillante; pedúnculos hasta 6 cm de largo, simples o subdivididos; cáliz cilíndrico, campanulado, de 7-10 cm de largo y 4-5 mm de ancho; sépalos lineal-oblongos, 2-3 cm de largo, hasta 1,2 cm de ancho, obtuso; pétalos similares y subiguales a los sépalos; filamentos de la corona amarillos, en tres series, la externa de 1-1,5 cm de largo, lateralmente comprimidos, radiados y dilatados en la mitad o mitad superior, con ápice delgado, filiforme; los filamentos internos en dos series, subiguales, angostos y lineares, de
1-1,5 mm de largo; opérculo con nacimiento 5 mm debajo de la corona, erecto,
1,5 mm de alto; ovario angosto y ovoide, tomentoso; fruto ovoide, de 3,5-4 cm de largo y 2-2,5 cm de ancho; semillas amarillentas y ovadas, de aproximadamente 6 mm de largo y 3 mm de ancho (Killip 1938).
2.4.5.1.2. Distribución
En Colombia se conoce solamente de sitios muy distantes entre sí, Valle del Cauca y Cundinamarca (Killip 1938).
2.4.6. Subgénro Dysosmia
38 2.4.6.1. Pasiflora foetida L.
2.4.6.1.1. Descripción
Planta leve o fuertemente pegajosa; tallo hirsuto, pilosidad esparcida, amarillenta y/o con tonos cafés, cuya longitud oscila por encima de 1,5 mm; hojas con lóbulos laterales frecuentemente reducidos, y pilosidad densa o esparcida en ambas superficies; brácteas de 2 a 3 cm de longitud, con dos o tres divisiones; ovario hirsuto, con vellosidad blanca o café; fruto de 2 a 2,5 cm de diámetro, amarillo, con pilosidad rara vez densa (Killip 1938).
2.4.6.1.2. Distribución
Se encuentra en Puerto Rico, Jamaica, Antillas menores, siendo muy ampliamente distribuida en Suramérica (Killip 1938).
2.5. Importancia del Género Passiflora
2.5.1. Importancia Agronómica
A pesar de la importancia de la productividad de cultivos para el desarrollo de países con gran potencial agrícola, las especies vegetales nativas de los países andinos son subutilizadas o poco conocidas, pero promisorias ya que poseen
39 potencial económico a corto, mediano y largo plazo, como es el caso del género
Passiflora (Guerrero et al. 1990).
Según Mazzani et al. (1999), el género Passiflora posee una serie de especies de importancia actual y potencial desde el punto de vista agrícola, existiendo una gran diversidad tanto inter como intraespecífica, muy útil para el desarrollo de especies cultivadas y promisorias. Passiflora contiene más de veinte especies con frutos comestibles, de las cuales la mitad son sembradas sólo por sus frutos, y de las mismas sólo cinco son cultivadas comercialmente, bien a escala mundial y/o regional (P. edulis, P. quadrangularis, P. ligularis, P. laurifolia y P. mollisima)
(Martín & Nakasone, 1970, Pérez 1996, Mazzani et al., 1999, Fajardo et al. 1998).
Algunas especies son cultivadas como ornamentales, tanto por sus flores como por sus frutos, en los trópicos y en condiciones de invernadero. Otras especies han sido explotadas para otros fines, como cultivos de cobertura, para prevenir la erosión y como control de malezas (Zeven & de Wet 1982, Purseglove 1986 – citados en
Mazzani et al. 1999). Adicionalmente, gran número de híbridos naturales entre especies del género Passiflora son conocidos, siendo la hibridación de importancia actual y futura para aumentar la variabilidad de las especies comerciales, mejorar hacia la resistencia a enfermedades y plagas y encontrar tipos con nuevos sabores y aromas (Dornelas et al. 1996 - citado en Mazzani et al. 1999).
40 Colombia, al contar con una gran disponibilidad de terrenos subutilizados y una variedad tan amplia de climas y diferentes niveles altitudinales, posee un enorme potencial para el aumento de la producción de frutales (Toro & Hernández 1991).
Los cultivos de pasifloras en Colombia se estiman en más de 10.000 hectáreas, cuya producción representa una fuente importante de divisas para el país (Góngora et al. 1994).
En la actualidad entidades como CORPOICA se encuentran desarrollando programas que propenden el aumento de la producción, permitiendo a los cultivadores apropiarse de nueva tecnología que le permita garantizar la rentabilidad de la producción durante todo el año (Toro & Hernández 1991).
En este esfuerzo, las pasifloras se han visto beneficiadas con un aumento en la producción, que en el año 1979 era de 13.600 kg/hectárea, a casi 30.000 kg/hectárea en el año 1999 para el maracuyá (Passiflora edulis). Similar comportamiento se presenta en el cultivo de curuba (Passiflora mollissima) y granadilla (Passiflora ligularis), de manera adicional reportes en cuanto al aumento en la producción de badea (Passiflora quadrangularis) han sido publicados.
2.5.2. Importancia Farmacéutica
41 En el siglo IX, un grupo de terapeutas, los Eclécticos, adoptaron las pasifloras como importantes remedios en casos de insomnio, nerviosismo, epilepsia, y tosferina.
(Castello & Clapes 1989). También prescribían el jugo de la hoja de la pasiflora vía tópica para quemaduras, heridas, y dolor de muelas (Geppert & Waszkiewicz
1985).
Nuestros indígenas también utilizaban las hojas como diaforéticas, diuréticas, analgésicas y antídoto contra venenos y mordeduras de serpientes (Van Ginkel
1997).
A finales del siglo XIX se empezó a usar como sedante en los Estados Unidos, llegando a Europa durante la primera guerra mundial, cuando se usó para el tratamiento de la angustia de guerra. Para uso terapéutico en Europa, la pasiflora oficinal es una droga sedante y antiespasmódica, que a partir de los años treinta entra en el grupo de los tranquilizantes altamente formulados (Van Ginkel 1997).
A partir de los años cuarenta se han determinado otras actividades de algunos compuestos presentes en las pasifloras, la BHP (British Herbal Pharmacopoeia) menciona que además de las ya conocidas actividades como sedante, espasmolítico, tranquilizante y neorutónico, posee actividad hipnótica y anodina.
Así mismo, Duke (1988) menciona propiedades cianogénicas, narcóticas y soporíferas y Perry et al. (1991) mencionan efectos sedativos, antiespasmódicos y antibacteriales.
42 Actualmente, se sabe que algunas especies como P. foetida, P. coriacea y P. quadrangularis presentan propiedades medicinales y P. incarnata y P. caerulea contienen el principio activo passiflorina, del cual se obtiene un producto farmacéutico que actúa como calmante nervioso (García 1975 - citado en Mazzani et al. 1999, Lutomsky 1975, Turkoz 1994).
2.5.3. Importancia Ornamental
Todas las pasifloras poseen flores exóticas, las cuales son de fácil manejo y cultivo, tanto en exteriores como invernaderos en climas favorables. Existen dos tipos bien definidos, aquellas que pertenecen al trópico y las del subtrópico
(Vanderplank 1996 – citado en Mazzani et al. 1999). Existe en la actualidad una
Sociedad (Passiflora Society International) encargada de la venta y distribución de semillas aptas para el cultivo a nivel ornamental que tiene afiliados en todo el mundo permitiendo así la adquisición tanto de especies nuevas silvestres, como la comercialización de variedades desarrolladas a partir del cruce inter-específico para la obtención de híbridos. Existen aproximadamente 1000 híbridos comercialmente activos (Página Web - Passifloras of the World/ Passion Fruits).
2.5.4. Importancia Ecológica
Diferentes investigadores han reportando que algunas especies del género tiene su centro de origen en la región andina y algunas en particular en el territorio
43 nacional, por tal razón, se han incrementado el numero de trabajos de caracterización tanto morfológica como molecular con el fin de establecer posibles nuevas especies y/o determinar la variabilidad en las ya reportadas.
Las pasifloras han sido fuente de diferentes estudios que pretenden determinar tipos de evolución compartida entre planta y predador (Ehrlich & Raven 1964). Las relaciones evolutivas recíprocas entre las mariposas del género Heliconius y algunas especies del género Passiflora han permitido examinar, sobre la base de un extenso modelo de supervivencia, las relaciones que actúan sobre la utilización de la planta y todos aquellos eventos que implican la escogencia del recurso trófico.
Aspectos como la evolución de metabolitos secundarios como respuesta a la acción ejercida por fitófagos, y cómo éstos a su vez, han modificado su metabolismo para tolerar dichas sustancias, demuestran, en opinión de algunos investigadores, pistas claras sobre el desarrollo evolutivo común de estas especies. Es además fuente importante de información para la reconstrucción de las relaciones filogenéticas de cada grupo. Por otra parte, la generación de modelos de coevolución permite la formulación de hipótesis que permitan entender y predecir el curso que esta comunidad va a seguir, para planes de manejo más adecuados (Woodruff et al.
1975).
44 2.6. Estudios Filogenéticos
2.6.1. Estudios Morfológicos
Estos proveen la gran mayoría de caracteres usados para identificar plantas de manera práctica y rápida, y muchos a su vez, son usados para formular hipótesis sobre las relaciones filogenéticas de dichos organismos (Takhtajan 1997).
Este tipo de caracteres ha sido utilizado con mucha anterioridad a los caracteres anatómicos o moleculares, y han constituido la fuente primordial de evidencias taxonómicas desde el comienzo de la sistemática como disciplina formal (Avise
1994).
Los caracteres morfológicos son fáciles de observar y descubrir con la implementación de claves y descripciones (Cronquist 1981, Takhtajan,1997, Judd et al. 1999), y aquellos que permiten inferir o evidenciar información filogenética se encuentran tanto en las estructuras vegetativas como reproductivas de cada planta (Taktajan 1997).
Los caracteres vegetativos se utilizaron, en un principio, para realizar las divisiones en niveles jerárquicos mayores, como clases y divisiones, pero para el caso de las angiospermas, las estructuras reproductivas fueron y siguen siendo, la
45 fuente primordial de información para la dilucidación de filogenias de grupos (Judd et al. 1999).
2.6.2. Estudios Morfológicos en Passiflora
Para el caso particular de las pasifloras, la mayoría de los trabajos de clasificación se basan en caracteres morfológicos, los cuales muestran una ordenación sistemática preliminar del grupo. Killip (1938) elaboró el trabajo más extenso que sobre la familia se conoce, analizando principalmente características florales.
Otros autores han realizado aproximaciones, no tan profundas como es el caso de
Holm-Nielsen (1974), para la flora del Ecuador, Mc Dougal (1983, 1994), donde se revisan las especies presentes en el género Decaloba, y Escobar (1988, 1991), quien se refirió casi de manera exclusiva al género, con énfasis en el subgénero
Tacsonia, para el cual también realizó estudios palinológicos.
2.6.3. Estudios Moleculares
46 Uno de los avances más importantes para la resolución de problemas en el área de la sistemática, durante la última década, ha sido la aplicación de datos provenientes del material genético DNA y RNA (Avise 1994, Doyle 1992). La filogenia molecular, como término, fue acotado por algunos investigadores para explicar el tipo de fuentes de información de la cual provenían los datos con los cuales ellos inferían las relaciones filogenéticas de los grupos (Hillis 1987, 1990).
En todos los casos la información se obtenía de macromoléculas como proteínas,
RNA o DNA (Judd 1999).
Los datos moleculares han revolucionado la visión de las relaciones filogenéticas, ya que sus proponentes, desde el principio proclamaron a estos datos como los más acordes para reflejar acertadas y fidedignas filogenias de los grupos, comparativamente con las obtenidas a partir de caracteres morfológicos, ya que los primeros se extraen desde el propio nivel molecular y por ende se consideran menos viciados; con menor incidencia de paralelismos y convergencias (Hillis
19987, 1990).
Son diversos los estudios que se han realizado en sistemática molecular. Entre los trabajos realizados se encuentran los de Baldwin (1992), quien estableció las relaciones filogenéticas de algunas especies de la familia Compositae, a partir de la secuenciación de la región interna de trascripción (ITS) 18-26S; Cantrell &
Hamlin (1997) analizaron las relaciones filogenéticas en la familia Hyaloscyphaceae a partir de la secuenciación del espaciador intergénico 5.8S de ribosoma; Kanzaki
47 et al. (1997) determinaron las relaciones filogenéticas de nueve especies del género Artocarpus mediante PCR-RFLP de regiones amplificadas de cpDNA;
Yonemori et al. (1998) trabajando con PCR-RFLP analizaron las relaciones filogenéticas de 17 especies del género Dyospyros, de regiones amplificadas de cpDNA.
2.6.3.1. Estudios Moleculares en Passiflora
Existen muy pocos trabajos que establezcan filogenias a partir de caracteres moleculares en Passiflora. Do et al. (1992), revisaron las relaciones existentes entre P. edulis, híbridos de ésta especie y otras especies relacionadas, utilizando
RFLPs; Fajardo et al. (1998) analizaron la variación genética existente entre algunas especies del género Passiflora utilizando RAPDs; Sanchez et al. (1999) también analizaron la variabilidad de algunas especies del género Passiflora utilizando RFLPs con sondas heterólogas. Góngora, et al. (2000) muestran las relaciones filogenéticas de algunas especies del género Passiflora a partir de PCR-
RFLPs de cpDNA, mtDNA y rDNA. Góngora & Rodríguez (2000) analizaron las relaciones existentes entre algunas especies del género Passiflora con RFLP, siendo los primeros en utilizar de sondas homólogas para dicha comparación.
2.6.3.2. Importancia de los Marcadores Moleculares
48 2.6.3.2.1. En estudios Evolutivos y Sistemáticos
Desde mitad del siglo, el campo evolutivo molecular ha estado dominado por una serie de controversias acerca de la naturaleza e importancia evolutiva de la variación genética. Inicialmente, a causa del desmesurado uso de algunas herramientas moleculares, éstas fueron poco aceptadas, y solo con algunas notables excepciones, la gran mayoría de aplicaciones para los marcadores moleculares en áreas concernientes a taxonomía, sistemática y filogenia, resultaron en información de poca importancia. Ha sido en los últimos años que los análisis filogenético-moleculares per se comenzaron a asumir el apropiado estatus de disciplina científica esencial (Avise 1994).
Avances en la sistemática molecular se han venido presentando de manera recurrente, avanzando mediante el desarrollo de nuevas metodologías de laboratorio. La primera aproximación molecular utilizada ampliamente en este campo fue la electroforesis de proteínas que fue aplicada a sistemas de isoenzimas y alozimas. Dicha metodología fue introducida a mediados de los 60s, y por los 10 años siguientes dominó todo el espectro de la sistemática molecular (Buth 1984).
Otra técnica ampliamente utilizada en sistemática molecular, conocida con las siglas RFLP (Restriction Fragment Lehgth Polymorfhism) con DNA, involucra el
49 análisis de los polimorfismos presentes en el tamaño de los fragmentos de restricción.
Aproximaciones a partir del DNA mitocondrial dominaron en los años 70s y 80s, siendo ampliamente utilizadas en estudios con animales (Moritz et al. 1987).
En plantas, el sistema más implementado fue a partir de DNA de cloroplasto, ya que a diferencia de los animales, las mitocondrias presentaban dificultades de diversa índole (mayor tamaño, tasa de sustitución menor que la del cloroplasto), haciendo por ende mucho más atractivo el trabajo con este material (Palmer 1986,
1987, 1994).
En la actualidad, el trabajo con el marcador RFLP de regiones de DNA de cloroplasto y DNA mitocondrial, sigue siendo válido, reflejado por el alto número de publicaciones. A mediados de los 80s, otra serie de análisis con RFLPs fueron aplicadas a las regiones hipervariables del DNA nuclear, que utilizadas como herramientas de diagnóstico tomaron el nombre de “huella dactilar” o metodología del “fingerprinting” (Kirby 1990).
La creciente utilización de herramientas moleculares se incentivó aun más con la introducción en el ámbito científico de la reacción en cadena de la DNA polimerasa, más conocida con las siglas PCR, utilizada para la amplificación in vitro de fragmentos de DNA (Innis et al. 1995). Posterior a la incorporación de la
50 PCR se dió un avance importante en el diseño de nuevos cebadores o primers, que fortaleció las metodologías de secuenciación (Avise 1994).
A partir de los marcadores que utilizaban la PCR, se incrementó el acceso directo de la información filogenética, contenida en las secuencias de DNA nuclear y citoplasmático. Más aún, la PCR permitió la amplificación particular de segmentos, a partir de una cantidad mínima de tejido inicial de fósiles, bien preservados, lo que indica una aplicación aun más relevante en el esclarecimiento de las relaciones de algunos grupos.
2.6.3.2.2. En estudios Agronómicos
El mejoramiento genético de plantas a partir de la selección direccionada o artificial pretende tener incidencia en la promoción de algunos caracteres, distinguiéndose por tal motivo de la selección natural que favorece caracteres de forma aleatoria. Tal efecto direccionador podría llegar a tener incidencia en procesos de erosión genética teniendo un impacto negativo en el ámbito económico (Staub 1996). Las estrategias de selección denominadas “MAS”
(Markers-Assisted-Selection), proveen un excelente potencial en el proceso de selección, reduciendo no solo el impacto sobre las poblaciones naturales sino también reduciendo los costos al disminuir las poblaciones involucradas de manera temprana en cada estudio.
51 En la totalidad de los casos, los sistemas de mejoramiento asistido por marcadores dependerán de los objetivos del proyecto a desarrollar, de la estructura de la población, la diversidad genómica de las especies involucradas en la investigación, la accesibilidad a un sistema de marcadores, tiempo destinado para el análisis y el costo por unidad de información (Staub 1996). Cada marcador tiene sus ventajas y desventajas, por tal razón es de vital importancia evaluar la efectividad y utilidad del sistema antes de implementarlo (Hillis 1990) .
Un aspecto importante es el polimorfismo, ya que en algunos casos, poblaciones que no presentan un grado de detección de polimorfismo amplio para un tipo de marcador sí lo tienen para otro; esto ha ocurrido en casos particulares con RFLP y
RAPD (Nodari et al. 1993).
Marcadores como RFLP y RAPD, que en los 80s se utilizaban con gran intensidad en la selección asistida por marcadores, ahora están siendo reemplazados por AFLP y
QTL, que tienen un grado de detección mucho mas amplio, no obstante, el costo de dichos marcadores es muy elevado imposibilitando su uso generalizado (Hughes
1996).
La utilización de marcadores moleculares como herramienta de selección sigue en proceso de desarrollo y actualización, siendo frecuentes los avances y la generación de nuevos sistemas que den soluciones a problemas crecientes, como la carencia de alimentos (Staub 1996). Por tal razón, se han intensificado procesos de
52 mejoramiento genético, sistemas de conservación de germoplasma e identificación de caracteres de interés comercial.
2.6.3.2.3. En estudios Ecológicos
El término “diversidad genética” hace referencia a un conjunto amplio de elementos, sin que aun exista consenso general sobre la totalidad de categorías que abarca. Los sistemas moleculares aportan constantemente nueva información que permite abordar de forma más clara la actual concepción de este tema (Karp et al. 1996).
Las aproximaciones tradicionales que pretenden determinar la diversidad en plantas raramente tienen la habilidad de resolver diferencias en caracteres morfológicos (Takhtajan 1997). La cantidad de caracteres posibles pueden incrementarse mediante la utilización del microscopio electrónico o ensayos bioquímicos y fitoquímicos. Aunque estas aproximaciones son extremamente poderosas, existe una nueva corriente de nuevos caracteres emergiendo a partir de las técnicas que involucran marcadores moleculares (Palmer 1990, 1994; Soltis
1992 & Avise 1994).
Estudios con marcadores moleculares complementan el conocimiento previo que se tenga de algún grupo de especies, ya que aportan información más precisa sobre su
53 variabilidad y las posibles relaciones existentes entre ellas, permitiendo enfocar estrategias más sólidas de manejo y conservación de la diversidad en un sitio dado.
Adicionalmente, las pruebas moleculares revelan una gran cantidad de caracteres, como por ejemplo, las variaciones en secuencias cuando se analizan los nucleótidos que las conforman (Judd et al. 1999).
A pesar del amplio potencial que las herramientas moleculares poseen, es necesaria la interacción con otras disciplinas que permitan mesurar y decantar los datos arrojados mediante estudios moleculares, para de esta forma corregir algunos errores que se presentan en la estimación de algunos valores de biodiversidad (Karp et al. 1996).
2.7. Marcadores Moleculares Usados en el Estudio
2.7.1 RFLP
El descubrimiento de las enzimas de restricción por Linn & Arber en el año 1968 causó una revolución en la biología molecular. Cientos de enzimas desde ese instante han sido aisladas y caracterizadas. (Avise 1994).
Todos los análisis con RFLP involucran corte del DNA por una o varias endonucleasas de restricción, visualizándose los fragmentos resultantes en una electroforesis, de acuerdo a su peso molecular (Ausubel 1995). En los laboratorios
54 de biología molecular, las enzimas tienen una amplia utilización en ensayos de determinación de polimorfismos a partir de la comparación del tamaño de los fragmentos obtenidos (Grierson 1991).
La técnica que utiliza marcadores RFLP constituye una herramienta poderosa para estudiar la genética y sistemática en muchos grupos de plantas. Desde hace algunos años ha ganado importancia en cultivos vegetales como una herramienta de diagnóstico, ya que estos marcadores no están sujetos a las variaciones microambientales, pueden ser identificados en tejidos en varios estados de crecimiento, y pocas cantidades de éstos son suficientes para estandarizar técnicas en laboratorio (Hughes 1996). Adicionalmente, aportan más caracteres para el análisis que datos bioquímicos y citológicos (Jacob et al. 1995) y son de alta confiabilidad (Memorias, Curso Teórico práctico “Métodos de Análisis Molecular como herramienta en la investigación Agrícola” 1997).
2.7.2. PCR-RFLP
El principio de este marcador, como su nombre lo indica, involucra tanto elementos de la reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR) y RFLP.
El principio de la PCR es simple; se basa en la función de copia de una enzima;
DNA polimerasa, que es capaz de sintetizar y duplicar moléculas de DNA de una hebra de DNA blanco. El producto duplicado del DNA blanco original, vendría a
55 cumplir la función de molde para el siguiente ciclo de duplicación. Repeticiones en el proceso de duplicación traen consigo una multiplicación exponencial y un incremento en el DNA amplificado acumulado (Innis et al. 1995).
El DNA blanco es definido por el reconocimiento de los primers a la hebra molde.
Los primers son pequeños fragmentos de DNA (10 a 20 bp) que poseen una secuencia complementaria a la presente en el DNA blanco. Es posible amplificar cualquier región del DNA blanco si se seleccionan primers con secuencias especificas conocidas que flanqueen por los dos extremos (Arheim et al. 1990, Wu et al. 1991, Karp et al. 1997).
Teniendo fragmentos amplificados vía PCR en el marcador PCR-RFLP se prosigue con una digestión con enzimas de restricción. Este proceso de digestión permite fraccionar el DNA amplificado en diferentes fragmentos con diferentes tamaños y pesos moleculares que serán visualizados en una electroforesis como un patrón de diferentes tamaños de bandas, lo cual permitirá de una forma ágil, rápida y sencilla la comparación de varios individuos o especies (Innis et al. 1995).
Algunos investigadores que han optado por este marcador han sido
Kanzaki et al. (1997), Hughes & Petersen (1997), Isshiki et al. (1998), Niikura et al.
(1998), Cipriani et al. (1998), Yoneromi et al. (1998) y Parducci & Szmidt (1999).
2.8. Genoma de Plantas
56 2.8.1. Cloroplasto
2.8.1.1. Génesis del Organelo
Los cloroplastos se originaron a partir de procariontes fotosintéticos de vida libre, lo cual se confirmó con el descubrimiento de Lewis en los años 60, quien identificó el posible ancestro en el lago de Loosdrecht, Holanda, al que denominó
Prochlorophyta. Este procloron (como después seria reconocido) era un procarionte fotosintetizador, con los dos tipos de clorofila (a y b) presentes en los cloroplastos de las plantas actuales (Walsby 1986).
Actualmente se ha demostrado que el cloroplasto tiene un aparato completo para la replicación y expresión de los plastomas, incluyendo polimerasas de DNA y RNA, ribosomal, tRNA, tRNA sintetasa. Sin embargo, el tamaño de los plastomas es insuficiente para codificar todas las proteínas que sabemos se localizan en los cloroplastos. Está claro que los cloroplastos no son organelos genéticamente autónomos, ya que dependen del genoma nuclear para la determinación de muchas de sus funciones. Si se acepta la teoría endosimbiótica propuesta por Linn Margulis en 1970, se podría suponer que durante el curso de la evolución estos genes del cloroplasto se han transferido al núcleo.
2.8.1.2. Genética del cloroplasto
57 Los estudios modernos de la genética empezaron realmente iniciando el presente siglo, cuando se comprendieron los alcances de los análisis Mendelianos sobre la herencia de los caracteres de las plantas(Margulis 1970).
La inmensa mayoría de los genes nucleares en las plantas siguen las reglas de la herencia Mendeliana, a excepción de aquellos genes que poseen fenómenos de ligación al sexo; sin embargo, se ha observado que la herencia de ciertos caracteres, entre los que se incluyen algunos relacionados con el desarrollo de los cloroplastos, sigue un modelo diferente, conocido como herencia citoplasmática, uniparental o maternal; donde los genes de un carácter concreto son únicamente transmitidos por la hembra(Margulis 1970).
La explicación de la herencia citoplasmática , es que la hembra contribuye aportando parte del citoplasma, además de un núcleo haploide, mientras que el macho contribuye principalmente con el material nuclear, consecuentemente, los genes de los plastidios y mitocondrias se transmiten solos a través de la línea femenina (Margulis 1970).
El tipo de transmisión de información por línea materna, asegura la exclusión de mutaciones de índole segregativo, vía recombinación; contrario a lo que ocurre con el DNA nuclear (Soltis 1992).
2.8.1.3. Estructura y función de genoma
58 La existencia de DNA al interior de los cloroplastos fue demostrada por primera vez por Ris y Plaut en 1962. Estos investigadores observaron fibrillas en micrografías electrónicas de cloroplasto que pudieron extraerse mediante un tratamiento con desoxirribonucleasa. Más recientemente se han visualizado copias del genoma del plastidio por microscopía de luz, utilizando colorantes fluorescentes unidos al DNA.
Las moléculas de DNA están unidas a las membranas de los cloroplastos pero se extienden dentro del estroma donde forman nucleoides (Grierson 1991).
El genoma de las angiospermas varia en tamaño, estructura y contenido génico en todas las especies (Palmer 1987).
El cromosoma circular del cloroplasto típico se encuentra en un rango que oscila entre 120 y 217 kb. Dichas variaciones de tamaño están asociadas con las secuencias repetidas invertidas, las cuales dividen el genoma en dos regiones, una de copia sencilla larga y otra de copia sencilla corta. Reportes de algunos autores con relación al tamaño reducido del genoma, en algunas especies, indican que las diferencias de tamaño están dadas por la desaparición de una de las secuencias invertidas repetidas (Palmer 1994).
Los cambios en la complejidad del genoma ocurren principalmente por las mutaciones. Para el caso del DNA del cloroplasto, se han evidenciado dos tipos, las sustituciones nucleotídicas y los rearreglos. Los principales rearreglos en el
59 cromosoma del cloroplasto incluyen inversiones, inserciones, deleciones de regiones no codificantes (Soltis 1992).
En muchas especies el DNA contiene una densidad aproximada de 1.697 g- ml-1 en cloruro de cesio, que corresponde a 37% G+C, pero los valores oscilan entre el 36% y el 40% en diferentes especies. Este aspecto permite realizar separaciones por densidad con el DNA nuclear a partir de una centrifugación isopícnica (Grierson
1991).
2.8.1.4. Utilidad del genoma en estudios filogenéticos
En la década pasada se presentó una expansión en el número de trabajos que utilizaban marcadores moleculares para la estimación de relaciones filogenéticas, y gran parte de la variación, a partir de la cual se estimaron dichas filogenias, provinieron principalmente de genomas de cloroplastos (Palmer et al. 1988).
La determinación de la secuencia completa de cuatro plantas terrestres, aporta una excelente herramienta comparativa de la estructura y contenido génico de los genomas de cloroplastos, ya que al ser determinadas las secuencias de otras nuevas especies se podrá, a partir de una comparación relativamente simple, determinar el grado de parentesco entre las especies (Shinozaki et al. 1986).
60 Existe suficiente variación en la tasa de substitución de diferentes partes del genoma, que permiten la interpretación de diferentes categorías taxonómicas, permitiendo comparar al nivel de ordenes, familias, géneros y hasta especies
(Doyle 1993).
En la mayoría de los análisis de restricción con DNA de cloroplasto, la variación en la información ocurre en las regiones no codificantes, lo que influye en la gran utilidad que poseen estas regiones para la reconstrucción de las relaciones entre grupos puesto que involucra un conjunto mayor de variaciones los que permite establecer, con mayor claridad, las relaciones o las diferencias (Wallace et al.
1990).
2.8.2. Mitocondria
2.8.2.1. Génesis del Organelo
Existen diversas pruebas que van desde la comparación de estructuras microscópicas, comparaciones de fisiología, bioquímica y genética molecular que confirman la idea de que la mitocondria se originó a partir de una relación endosimbiótica entre un organismo procariótico y una célula nucleada; lo que dió lugar a la aparición de los organismos eucariotas. Esta explicación no varia mucho
61 de la propuesta para explicar el origen de los cloroplastos, puede hacerse compatible si se tiene en cuenta que en el transcurso de la evolución muchos genes se han transferido desde las mitocondrias hacia el núcleo (Grierson 1991).
2.8.2.2. Genética de la Mitocondria
Sobre un conjunto amplio de genes nucleares de plantas, las leyes de Mendel se acomodan bastante bien, no obstante, se ha comprobado por ejemplo, que el tipo de transmisión de la herencia de ciertos caracteres, como algunos relacionados con proteínas de extrema importancia en la función de la mitocondria, se adscriben a un patrón diferente, conocido como herencia citoplasmática maternal; en la cual los genes que codifican cierta característica particular son únicamente aportados por la hembra. Una posible explicación a este tipo de herencia es que en el proceso de conformación del cigoto, la célula femenina aporta la totalidad de su citoplasma, además de un núcleo haploide, en tanto que la célula masculina contribuye únicamente con el material nuclear. Por esta razón los genes incluidos tanto en las mitocondrias como en los cloroplastos y otros plastidios, se transfiersn solo a través de la línea materna (Margulis 1970).
2.8.2.3. Estructura y función del genoma
62 El genoma de las mitocondrias en las plantas superiores difiere ampliamente en estructura, tamaño y diversidad, comparado con sus similares en hongos y animales (Sederoff 1987).
Este genoma es generalmente circular y de doble cadena. Su tamaño en pares de bases oscila entre 200 a 2400 kilobases; estas variaciones tan dramáticas en el tamaño de algunos genomas de plantas superiores han sido estudiados por diferentes investigadores, que argumentan como posibles explicaciones: secuencias repetidas, duplicación de genes, gran cantidad de regiones no codificantes, gran tamaño en los mismos genes que se expresan, o DNA exógeno
(Bendich 1985, Sederoff 1987, Grierson 1991, Rigaa et al.1997, Tsumura & Suyama
1998).
En el genoma de las mitocondrias se ha comprobado la presencia de DNA exógeno de cloroplasto. Cerca de 16 kilobases de material de cpDNA fue encontrado en el genoma de mitocondria en maíz; este segmento posee secuencias que codifican para varios tRNAs y para el gen ribosomal 16S (Lonsdale 1984, Hughes 1996).
2.8.2.4. Utilidad del genoma en estudios filogenéticos
De los tres tipos de DNA presentes en las plantas el mtDNA es el que presenta menor tasa de sustitución, por tal razón, muchos investigadores lo han utilizado para la reconstrucción de relaciones filogénticas (Avise 1991).
63 El DNA mitocondrial contiene fracciones subgenómicas o re-arreglos de moléculas de DNA que no son en su totalidad componentes propios del genoma de la mitocondria. Este hecho se relaciona con la rapidez con que el genoma puede variar en estructura y tamaño. La replicación diferencial de los fragmentos exógenos, que pueden generar una alta diversidad y valiosa información en algunas especies (Sederoff 1987, Hughes 1996).
La gran mayoría de los rearreglos que se presentan en regiones codificantes, son eliminados por la selección natural como mutaciones deletéreas. Cambios menos dramáticos como la substitución de nucleótidos, que no alteran, en la mayoría de los casos, la secuencia de la proteína o péptido, constituyen el más grande mecanismo de divergencia en regiones codificantes. Varios genes mitocondriales han sido secuenciados en diferentes especies de plantas, y estos datos proveen una extensa visión de los eventos mutacionales en estas secuencias funcionales y son a su vez base de información en estudios filogenéticos (Avise 1991).
Variaciones en el polimorfismo presente en los tamaño de los fragmentos de restricción fueron detectados al analizar fragmentos clonados de mtDNA, en diferentes especies demostrando una vez más la alta tasa de rearreglos que presenta este DNA; de manera adicional, se ha podido determinar que esta variación se presenta entre especies del mismo género (Sederoff 1987).
64 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
La familia Passifloraceae, constituida por un gran número de especies ampliamente distribuidas en regiones tropicales y subtropicales, se encuentra representada en nuestro país principalmente por el género Passiflora (Escobar
1988, Heywood 1993).
En Colombia existen aproximadamente 115 especies del género distribuidas en casi todos los pisos térmicos (Escobar 1988), siendo algunas como P. edulis, P. ligularis,
P. mollissima y P. quadrangularis comúnmente cultivadas en diferentes departamentos con el fin de comercializar sus frutos (O.I.E 2000).
Pese a su generalizada utilización, la clasificación de este grupo ha presentado una gran cantidad de inconvenientes ya que no ha existido unanimidad en la ubicación de las especies en los diferentes jerarquías taxonómicas.
El conocimiento actual de las pasifloras se centra en la relación existente entre las diferentes especies, con base en sus caracteres morfológicos. Otros aspectos como los ecológicos, moleculares y evolutivos han sido poco estudiados (Villacis et al.
1998).
67 Con la intención de aportar nueva información, el presente trabajo busco elaborar propuestas de las posibles relaciones filogenéticas de algunas especies del género
Passiflora, a partir de marcadores moleculares PCR-RFLP y RFLP, los cuales son por primera vez utilizados con un conjunto tan amplio de especies .
Esta información generada a partir de los caracteres moleculares complementará la obtenida de caracteres morfológicos (de estas mismas accesiones), estudio que se está realizando actualmente en la colección de campo en Tenerife, Valle del
Cauca por parte de investigadores de CIRAD-FHLOR / IPGRI. Estas dos investigaciones se realizan en el marco del proyecto “Preservación in vitro y caracterización molecular”, financiado por Colciencias.
Adicionalmente esta nueva información recogida de caracteres moleculares, podrá servir como base en estrategias de manejo y conservación de colecciones de germoplasma, ya que dará nuevas luces sobre la variabilidad interespecífica de algunas especies del género.
68 4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Establecer propuestas sobre las posibles relaciones filogenéticas de especies del género Passiflora a partir de PCR-RFLP y RFLP de regiones de DNA mitocondrial y de cloroplasto.
4.2. Objetivos específicos
• Detectar diferentes secuencias específicas de cpDNA y mtDNA en las especies
seleccionadas.
• Realizar el marcador RFLP sobre el DNA total y DNA amplificado de cpDNA y
mtDNA.
• Determinar las posibles relaciones filogenéticas con los datos moleculares
obtenidos y compararlos con estudios previamente realizados.
69 5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Tipo de Estudio
Este trabajo fue de tipo descriptivo - analítico ya que a la vez que se describieron algunas características o variables propias del grupo de especies que se estudió la variación interespecífica de sus genomas, estas fueron comparadas para elaborar algunas propuestas de su filogenia.
5.2. Población de estudio y muestra
5.2.1. Población de Estudio
Especies del género Passiflora presentes en regiones tropicales y subtropicales.
5.2.2. Muestra
55 accesiones pertenecientes al género Passiflora presente en las colecciones de campo del
Intenational Plant Genetic Resources Institute CIRAD-FHLOR/IPGRI, situado en Tenerife,
Valle del Cauca y la colección de la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia
Universidad Javeriana.. Una accesión perteneciente al género Carica colectada en el campus de la P. U. J. que se utilizó como grupo ajeno.
1 5.3. Material Vegetal
Algunas de las especies establecidas en la colección del IPGRI provienen de otras localidades del país e incluso de otros países de Sur América, estas se listan en la Tabla No. l. La ubicación de los sitios de recolección se muestra en la figura No.1
A B
Figura No. 1 Ubicación de los sitios de recolección de las muestras (A) Tenerife, Valle del Cauca y (B) Santafé de Bogotá.
2 Tabla No.1. Accesiones seleccionadas de las colecciones de campo.
Número de Especie Subgéneros Dato de Localidad Campo 41 Passiflora arborea Subgénero Astrophea Cali (V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 42 Passiflora arborea Subgénero Astrophea Cali (V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 32 Passiflora biflora Subgénero Decaloba Tenerife (V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 35 Passiflora adenopoda Subgénero Decaloba Quindío – COLOMBIA (IPGRI) 45 Passiflora cuspidifolia Subgénero Decaloba Colección PUJ 46 Passiflora bicuspidata Subgénero Decaloba Colección PUJ 47 Passiflora bogotensis Subgénero Decaloba Colección PUJ 56 Passiflora bogotensis Subgénero Decaloba Colección PUJ 48 Passiflora foetida Subgénero Dysosmia Colección PUJ 18 Passiflora manicata Subgénero Manicata Baños ECUADOR (IPGRI) 19 Passiflora manicata Subgénero Manicata Barragán (V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 30 Passiflora manicata Subgénero Manicata Nuevo Colon (Boyacá) – Colombia (IPGRI) 55 Passiflora manicata Subgénero Manicata Colección PUJ 33 Passiflora maliformis Subgénero Passiflora Salento (Quindío) – COLOMBIA (IPGRI) 34 Passiflora edulis Subgénero Passiflora El silencio (Quindío) – Colombia (IPGRI) 43 Passiflora edulis Subgénero Passiflora Colección PUJ 44 Passiflora edulis Subgénero Passiflora Colección PUJ 49 Passiflora caerulea Subgénero Passiflora Colección PUJ 50 Passiflora quadrangularis Subgénero Passiflora Colección PUJ 51 Passiflora tiliifoliae Subgénero Passiflora Colección PUJ 52 Passiflora ligularis Subgénero Passiflora Colección PUJ 53 Passiflora maliformis Subgénero Passiflora Colección PUJ 1 "luzmarina” Subgénero Tacsonia Loja (Loja) – ECUADOR (IPGRI) 2 Passiflora mathewsii Subgénero Tacsonia Santiago (Loja) – ECUADOR (IPGRI) 3 Passiflora cumbalensis Subgénero Tacsonia Colección UTA- ECUADOR (IPGRI) 4 Passiflora mollissima Subgénero Tacsonia El Zumbador (Tachira) – VENEZUELA (IPGRI) 5 Passiflora india Subgénero Tacsonia Pueblo Hondo (Tachira) – VENEZUELA (IPGRI) 6 Passiflora mollissima Subgénero Tacsonia Tenerife (V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 7 Passiflora india Subgénero Tacsonia Tenerife(V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 8 Passiflora mollissima Subgénero Tacsonia Umbita (Boyacá) – COLOMBIA (IPGRI) 9 Passiflora mixta Subgénero Tacsonia Tenerife(V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 10 Passiflora mixta Subgénero Tacsonia Tenerife (V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 11 Passiflora pinnatistipula Subgénero Tacsonia Colección UTA- ECUADOR (IPGRI) 12 Passiflora tenerifensis Subgénero Tacsonia Tenerife (V. Del Cauca) – COLOMBIA (IPGRI) 13 Passiflora pinnatistipula Subgénero Tacsonia Huanuco – PERU (IPGRI) 14 Passiflora manicata Subgénero Tacsonia Malaga- (Stder) – COLOMBIA (IPGRI) 15 Passiflora pinnatistipula Subgénero Tacsonia Nuevo Colón, (Boyaca)-COLOMBIA (IPGRI) 16 Passiflora mollissima Subgénero Tacsonia Cuzco PERU (IPGRI) 17 Passiflora mixta Subgénero Tacsonia Cerrito, (Santander) – COLOMBIA (IPGRI) 20 Passiflora antioquensis Subgénero Tacsonia Sta. Rosa ( Antioquia) – COLOMBIA (IPGRI) 21 Passiflora mixta Subgénero Tacsonia Colección UTA- ECUADOR (IPGRI) 22 Passiflora india Subgénero Tacsonia Huanuco PERU (IPGRI) 23 Passiflora india Subgénero Tacsonia Loja (Loja) – ECUADOR (IPGRI) 24 Passiflora india Subgénero Tacsonia Obonuco (Nariño) – COLOMBIA (IPGRI) 25 Passiflora mixta Subgénero Tacsonia Baños ECUADOR (IPGRI) 26 Passiflora india Subgénero Tacsonia Pueblo Hondo (Tachira) – VENEZUELA (IPGRI) 27 Passiflora india Subgénero Tacsonia Sumapaz (Cundinamarca) –COLOMBIA (IPGRI) 28 Passiflora india Subgénero Tacsonia Sumapaz (Cundinamarca) –COLOMBIA (IPGRI) 29 Passiflora tripartita Subgénero Tacsonia Colección UTA- ECUADOR (IPGRI) 31 Passiflora pinnatistipula Subgénero Tacsonia Nuevo Colon (Boyacá) – COLOMBIA (IPGRI) 54 Carica Pubecens Grupo Ajeno Campus PUJ
3 5.4. Aislamiento de DNA de las accesiones
El aislamiento del DNA total se realizó siguiendo el protocolo propuesto por Doyle & Doyle
(1990), con algunas modificaciones, y en algunos casos, dependiendo la cantidad de material foliar colectado, se implementó el propuesto por Góngora & Hodson (1996).
5.4.1. Protocolo de extracción de DNA mediante Maxi-Prep (Doyle & Doyle 1989) con modificaciones:
1. Agregar 7.5 ml de Buffer de extracción en tubos de 50ml de polipropileno graduados.
2. Pesar 1 gramo de tejido foliar fresco y llevar a un congelador a –70 °C durante 45
minutos, cumplido el tiempo se coloca el material vegetal en un mortero y se procede a
macerar adicionando poco a poco el buffer de extracción.
3. Calentar la mezcla por 30 minutos a 60°C.
4. Adicionar 7.5 ml de cloroformo-alcohol Isoamílico.
5. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos.
4 6. Transferir a un tubo de polipropileno graduado de 15 ml la fase acuosa y adicionar 2/3 de
volumen de isopropanol frío. Mezclar suavemente durante 2 minutos a temperatura
ambiente
7. Centrifugar a 4500 rpm por 15 minutos.
8. Desechar el sobrenadante, agregar 10 ml de buffer de lavado y mezclar suavemente por
15 minutos a temperatura ambiente.
9. Centrifugar a 4500 rpm por 15 minutos.
10. Desechar el sobrenadante y dejar secar el pellet a temperatura ambiente.
11. Resuspender el DNA en 1 ml de TE y adicionar 1 µl de RNAasa [10 ug/ml] e incubar
por 30 minutos a 37 °C.
12. Adicionar dos volúmenes de TE, 1 ml de acetato de amonio 10 M y 2.5 volúmenes de
etanol absoluto y mezclar por 5 minutos a temperatura ambiente.
13. Centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos.
14. Desechar el sobrenadante y adicionar 1 ml de agua bidestilada, desionizada y
autoclavada.
5 El protocolo de mini- prep. se presenta en el Anexo No 1.
5.5. Cuantificación
La cuantificación para la verificación tanto de la cantidad y calidad del aislamiento se realizo mediante electroforesis horizontal. La agarosa utilizada fue Seakem LE agarose (Ref: No.
50001) a una concentración del 0.8 % en buffer de corrido TAE (Sambrook et al.1989). La cuantificación del DNA se utilizó el marcador Low Mass Ladder de GIBCO (Ref: 10068-
013), el cual se basa en la comparación de la intensidad de coloración de la banda de la muestra con el patrón de intensidad que presenta este marcador 100, 60, 40, 20,10 y 5 ng/µl .
Se determinó cualitativamente la cantidad de DNA en ng/µl en un µl de muestra. En cada bolsillo se adicionaron 4ul de muestra y 1ul de buffer de carga. El buffer de carga utilizado correspondió al propuesto por Sambrook et al. (1989).
El corrido de las muestras se realizó en cámaras de electroforesis horizontal de marca
KODAK (Ref:Biomax MP1015, HR2025 y QS710). Los geles se dejaron correr por 5 minutos a 80 voltios, para permitir que la muestras alojadas en los bolsillos penetraran en el gel y posteriormente se disminuyo a 60 voltios por hora y media .
5.5.1 Visualización y Cuantificación
6 Se realizó la tinción del geles con bromuro de etidio al 0.5µl/ml (Sambrook et al.1989) durante 30 minutos. Los geles se lavaron con abundante agua para eliminar los excesos de bromuro y se llevaron al transiluminador para su visualización. Se tomaron fotografías digitales de los geles para la comparación de cada una de las bandas de las muestras con el patrón de intensidad generado por el marcador de masa.
Posterior a la cuatificación se procedió a la concentración de las muestras obtenidas por el protocolo propuesto para tal fin por (Sambrook et al. 1989).
5.6. Amplificación de fragmentos de cpDNA y mtDNA
Las amplificaciones se realizaron siguiendo los protocolos propuestos por Taberlet et al.
(1991), Baldwin (1992), Demesure et al. (1995), con algunas modificaciones propuestas por
Góngora et al. (2000) y Varón (2000). Estas modificaciones se efectuaron principalmente en el cambio de las concentraciones de algunos componentes presentes en el coctel de amplificación y las temperaturas y tiempos involucrados en los ciclos. No obstante, se realizaron nuevas pruebas de optimización de las condiciones de amplificación evaluando diferentes volúmenes de la enzima Taq polimerasa y MgCl2. El volumen total de cada reacción de amplificación fue de 25 ul.
5.6.1. Componenetes de la reacción de amplificación.
7 Para realizar la amplificación de las regiones de cpDNA y mtDNA se utilizaron los primers listados en las Tablas No. 2 y 3. La concentración adicionada en el coctel de amplificación para cada uno de los primers fue de 1uM, según lo propuesto por Góngora et al. (2000).
Tabla No. 2 Listado de primers utilizados para la amplificación de cpDNA y mtDNA. Pares de DNA que Región Específica Tipo de Región Primers Amplifica PC1 – PC2 Cloroplasto psbC ( psII 44kd protein) - trnS (tRNA-Ser (UGA)) Espaciador intergénico TS1 – TS2 Cloroplasto trnS (tRNA – Ser) – trnfM (tRNA – fMet (CAU)) Espaciador intergénico N41 – N42 Mitocondria nad1 exon B – nad2 exon C Intrón N1B – N1C Mitocondria nad 4 exon 1 – nad4 exon 2 Intrón
Tabla No. 3 Secuencia de los Primers utilizados. Pares de Primer Secuencia de cada par de Primers 5´-GGTCGTGACCAAGAAACCAC-3´ PC1 – PC2 5´-GGTTCGAATCCCTCTCTCTC-3´ 5´-GAGAGAGAGGCATTCGAACC-3´ TS1 – TS2 5’-CATAACCTTGAGGTCACGGG-3´ 5´-CAGTGGGTTGGTCTGGTATG-3´ N41 – N42 5´-TCATATGGGCTACTGAGGAG-3´ 5´-GCATTACGATCTGCAGCTCA-3´ N1B – NIC 5´-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3´
Se utilizó la enzima DNA Taq polymerasa de PROMEGA (Ref: M1865). Los desoxirribonucleótidos utilizados en las reacciones de PCR fueron de Advanced
Biotechnologies (Ref: NoAB-0315). La concentración adicionada en el coctel de amplificación fue de 200uM para cada uno; siguiendo lo propuesto por Varón (2000). Se utilizó el MgCl2,de marca SIGMA (Ref: M1028).
8 5.6.2. Ajuste de la concentración de enzima Taq polimerasa y de MgCl2 adicionados en el coctel de amplificación evaluados en la especie modelo P. edulis.
Las modificaciones realizadas sobre el volumen adicionado de Taq polimerasa y MgCl2 en la especie modelo P. edulis aparecen en las tablas No. 4 y 5 .
Tabla No. 4 Diferentes volúmenes evaluados de la enzima Taq polimerasa en la especie modelo P. edulis. Elementos de la Volumen Volumen Volumen Volumen reacción DNA 1µl 1µl 1µl 1µl Buffer 2.5µl 2.5µl 2.5µl 2.5µl
MgCl2 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl DNTP 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl Primer A 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl Prim1er B 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl Enzima 0.1 µl 0.15 µl 0.2 µl 0.5 µl
H2O 13.90 µl 13.85 µl 13.80 µl 13.40 µl
Tabla No. 5 Diferentes volúmenes evaluados de MgCl2 en la especie modelo P. edulis
Elementos por Volumen Volumen Volumen Volumen reacción DNA 1µl 1µl 1µl 1µl Buffer 2.5µl 2.5µl 2.5µl 2.5µl
MgCl2 2 µl 1 µl 4 µl 1.5 µl DNTP 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl Primer A 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl Prim1er B 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl Enzima 0.1 µl 0.1 µl 0.1 µl 0.1 µl
H2O 13.9 µl 14.9 µl 11.9 µl 13.4 µl
9 5.6.3. Ciclos de amplificación Componentes utilizados en el proceso de amplificación.
Para los tiempos y las temperaturas utilizadas en el proceso de amplificación se siguieron las recomendadas por Taberlet et al. (1991), Demesure et al. (1995) y Góngora et al. (2000), para cada uno de fragmentos amplificados.
1. Predenaturación:, 94°C por 4 minutos, (Demesure et al. 1995) esto solo una vez antes del comienzo de los ciclos.
2. Denaturación: 92°C por 1 minuto en cada ciclo (Góngora et al. 2000)
3. Anneling: Las temperaturas utilizadas para cada fragmento se presentan en la tabla No. 6 y corresponden a las propuestas por Góngora et al. (2000) .
Tabla No. 6 Temperaturas de Anneling de los fragmentos de cpDNA y mtDNA amplificados.
Fragmento T° de Anneling PC1-PC2 57 °C TS1-TS2 62 °C N41-N42 60 °C N1B-N1C 62 °C
4. Elongación: 72 °C por 4 minutos en cada ciclo (Demesure et al.1985).
5. Elongación final: 72°C por 10 minutos despues de la culminación de los ciclos (Demesure et al.1985).
Número de Ciclos: Para el número de ciclos utilizados se siguió lo sugerido por Góngora et al. (2000) y fue de 30 ciclos por reacción
10 5.7. Determinación del tamaño de los fragmentos
La determinación del tamaño aproximado de cada fragmento se realizó en la especie modelo
P. edulis mediante una regresión lineal simple. Para tal fin se utilizó un marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder de GIBCO (Ref: 15628-019 Gibco BRL) y otro de 100 bp DNA ladder Gibco (Ref: 10380-012).
5. 8. Amplificación, visualización y cuantificación de los fragmentos de cpDNA y mtDNA
Para la determinar la eficiencia en la amplificación ésta se realizó mediante electroforesis horizontal en un gel de 1.0 %. El buffer de carga y el buffer de corrido conservaron las mismas proporciones que los utilizados en el aislamiento. El volumen de muestra cargada fue de 4ul y 1ul de buffer de carga. El tiempo de corrido fue de 2 horas a 60 voltios, en la camara de electroforesis horizontal Ref:Biomax MP1015.
La tinción se realizó de igual forma que para la visualización de los aislamientos; el tiempo fue de 40 minutos. Se tomaron fotografías digitales para la comparación de cada una de las bandas, de las muestras, con el patrón generado por el marcador de masa.
11 Para la cuantificación se realizó la comparación de las bandas de las muestras con el patrón de intensidad del marcador de masa Low Mass Ladder de GIBCO, cuya referencia ya fue citada.
5.9. Digestión de los fragmentos amplificados de cpDNA y mtDNA
Las enzimas utilizadas para la digestión se presentan en la tabla No. 7 y corresponden a las propuestas por Varón (2000) como las más eficientes por el gran número de bandas y por el gran nivel de polimorfismo generado en los fragmentos de cpDNA y mtDNA analizados.
Tabla No. 7 Enzimas utilizadas en la digestión de los fragmentos de cpDNA y mtDNA amplificados Enzima Tamaño Sitio Ubicación de Corte Cfo I 4 GCG⇓C Hae III 4 GG⇓CC Hinf I 5 G⇓ANTC Hpa II 4 C⇓CGG Rsa I 4 GT⇓AC Taq I 4 T⇓CGA 5.9.1. Condiciones de digestión
Las condiciones de digestión de los amplificados correspondieron a las recomendadas por el fabricante y se presentan en la tabla No. 8. Las muestras fueron Incubadas por 16 horas a 37 °
C.
Tabla No. 8 Proporciones recomendadas por el fabricante para la digestión de fragmentos amplificados . Componentes Concentración final Volumen DNA 200ng Variable Buffer 1 X 1/10 Espermidina 1mM 1/10 Enzima 1 U/ reacción Variable
H20 Hasta completar 30µl
12 5.9.2. Determinación de la eficiencia en la digestión de los productos amplificados.
Se colocaron 4ul de cada muestra y 1ul de buffer de carga en geles 2.5 % de agarosa. Estos se corrieron durante 3 horas a 60 voltios, en la cámara de electroforesis horizontal
Ref:Biomax MP1015.
El tiempo de tinción fue de 50 minutos en bromuro de etidio. Se tomaron fotografías de los geles para determinar presencia o ausencia de fragmentos de restricción.
5.9.3. Ajuste de la concentración de los fragmentos digeridos de cpDNA y mtDNA
Para la concentración de las muestras se utilizó el protocolo de Sambrook et al.(1989).
5.9.4. Visualización del patrón de bandas obtenido de la digestión de los fragmentos de cpDNA y mtDNA.
El total de las muestras concentradas fueron nuevamente corridas en geles de 2.5 % de agarosa, por 3 horas y media a 60 voltios.
El tiempo de tinción fue de 50 minutos en bromuro de etidio. Se lavaron los geles por 15 minutos con agua destilada y se tomaron fotografías que permitieron evidenciar en detalle la presencia o ausencia de bandas en las muestras.
13 5.10. Digestiones de DNA total para RFLP
Las condiciones de digestión del DNA total se consignan en la tabla No.9 y correspondieron a las recomendadas por el fabricante.
La enzima de restricción utilizada para realizar la digestión del DNA total fue Dra I de
SIGMA (Ref: Molecular Biolog B-1030), con su buffer acompañante, sugerida por Góngora
& Rodriguez (2000) como eficiente en la generación de fragmentos polimórficos.
Se utilizó la espermidina SIGMA (Ref. S-0266). Las muestras fueron incubadas por 16 horas a 37 °C.
Tabla No. 9 Condiciones para la digestión de DNA total
Componentes Concentración final Volumen DNA 1 ug Variable Buffer 1 X 1/10 Espermidina 1mM 1/10 Enzima 5 U/ reacción Variable
H20 Hasta completar 30µl
5.10.1. Electroforesis para la visualización de las digestiones
Se colocaron 4ul de muestra y 1ul de buffer de cada especie en geles de 0.8%, en cámaras de electroforesis horizontal cuyas referencias ya fueron citadas. Las muestras se dejaron correr por 4 horas - 50 voltios.
14 El tiempo de tinción fue de 40 minutos en bromuro de etidio. Se tomaron fotografías que permitieron evidenciar la eficiencia de la digestión.
Determinada la eficiencia en la digestión, se procedió a la concentración de las muestras siguiendo el protocolo de Sambrook et al. (1989). Las muestras fueron resuspendidas en 10ul de agua.
A los 10ul de muestra se les adicionó 2ul de buffer de carga y se procedió a correrlas nuevamente en un gel de agarosa al 0.8%, por 4 horas a 50 voltios. Se tiñeron nuevamente en bromuro de etidio y se lavaron por 15 minutos en agua destilada. Se tomaron fotografías digitales del resultado de las digestiones y se procedió a la transferencia como se describe más adelante.
5.11. Marcaje de la sonda mixta con digoxigenina
Este procedimiento presenta las mismas características que un PCR convencional, con la excepción de que se utilizan dNTPs marcados con digoxigenina.
La mezcla que se utilizó para el marcaje directo de productos de amplificación fue la recomendada por el fabricante del Kit de marcaje PCR DIG-11-dUTP (BOEHRINGER
MANNHEIM ). La concentración final adicionada de los dNTP´s fue de 200 µM; ésta contenía: 2mM dATP, dCTP, dGTP /1.9 mM dTTP, 0.1 mM de digoxigenina –11dUTP
(DIG-11-dUTP).
15 Esta mezcla de dNTP´s se adicionó directamente al coctel de PCR y los nucleótidos marcados con digoxigenina (DIG) fueron incorporados dentro de los productos de amplificación.
La concentración de los otros elementos propios de la reacción de amplificación permanecieron sin modificación a los ya explicados anteriormente. Se utilizó el DNA de la especie modelo P. edulis para la amplificación de los fragmentos de cpDNA en una concentración de 50 ng/ul.
Los fragmentos marcados y las condiciones de amplificación aparecen en la tabla No. 10 y corresponden a las propuestas por Góngora & Rodríguez (2000).
Tabla No. 10 Fragmentos marcados y condiciones de amplificación
Primers Región Especifica T° Anneling J1-J2 Espaciador trnT-trnL 55 °C J3-J4 Intrón Exón trnL 55 °C J5-J6 Espaciador trnL-trnF 55 °C TS1-TS2 trnS (tRNA – Ser) – trnfM (tRNA – fMet (CAU)) 62 °C TT1-TT2 trnS (tRNA-Ser (GGA)) – trnT (tRNA-Thr (UGU)) 57.5 °C PC1-PC2 PsbC ( psII 44kd protein) - trnS (tRNA-Ser (UGA)) 57 °C
Para la cuantificación de la eficiencia del marcaje se sirvieron 4ul de muestra y 1ul de buffer de carga, en un gel de 0.8% de agarosa por 20 horas a 60 voltios.
Para la visualización se procedió a la tinción del gel con bromuro de etidio al 0.5µl/ml, se lavó con agua destilada por 15 minutos y se comparó la intensidad de la banda con el patrón de intensidad generado por el marcador de masa Low Mass Ladder.
Se tomó una fotografía digital de los fragmentos marcados para determinar la eficiencia de la amplificación como para estimar el tamaño promedio de los fragmentos marcados.
16 La estimación del tamaño de las sondas se realizó mediante regresión lineal, como se indicó anteriormente para el caso de los fragmentos amplificados de cpDNA y mtDNA.
Cada uno de los fragmentos amplificados marcados fueron juntados en proporciones iguales para la generación de la sonda mixta que se utilizo en el volumen que posteriormente se describe.
5.12. Transferencia de los geles de agarosa a la membrana de nylon
Para la transferencia se siguió la metodología propuesta en el manual de Sambrook et al
(1989). El DNA que se transfirió fue el DNA total digerido con Dra I.
5.13. Hibridación
Para la hibridización se siguió el protocolo propuesto por el fabricante del Kit DIG PCR labelling system Boehringer Mannhein (1995).
5.14. Detección
Para la detección se siguió el protocolo propuesto por el fabricante del Kit DIG PCR labelling system Boehringer Mannhein (1995).
5.15. Revelado de las autoradiografías
17 Se utilizaron dos tipos de películas al XAR y XLS de KODAK. Los tiempos de exposición para la película XAR ½ hora,1 horas y 2 horas, en tanto que para la película XLS fueron 2 horas, 4 horas y 16 horas.
Aunque los tiempos de exposición fueron diferentes, los tiempos del revelado fueron los mismos en todos los casos, 1 Minuto en el Revelador GBX de Kodak, 30 segundos en el
Bloqueador (Acido Acético al 28%) y 4 Minutos en el fijador GBX Kodak
5.16. Relaciones Filogenéticas
Las especies utilizadas para el análisis de las relaciones filogenéticas para PCR-RFLP cpDNA, RFLP cpDNA y PCR-RFLP mtDNA se presentan en las tablas No. 11, 12 y 13 respectivamente.
18 Tabla No. 11 Especies utilizadas para la construcción de la matriz de presencia /ausencia de PCR- RFLP de cpDNA (40 Accesiones).
Número en la Número de campo Nombre dela Especie Sub-género matriz 2 1 P mathewsii Tacsonia 3 2 P cumbalensis Tacsonia 5 3 P india Tacsonia 6 4 P mollissima Tacsonia 7 5 P india Tacsonia 8 6 P mollissima Tacsonia 9 7 P mixta Tacsonia 10 8 P mixta Tacsonia 12 9 P tenerifensis Tacsonia 13 10 P pinnatistipula Tacsonia 14 11 P manicata Manicata 15 12 P pinnatistipula Tacsonia 17 13 P mixta Tacsonia 18 14 P manicata Manicata 19 15 P manicata Manicata 21 16 P mixta Tacsonia 22 17 P india Tacsonia 23 18 P india Tacsonia 24 19 P india Tacsonia 25 20 P mixta Tacsonia 26 21 P india Tacsonia 31 22 P pinnatistipula Tacsonia 32 23 P biflora Decaloba 33 24 P maliformis Passiflora 35 25 P adenopoda Decaloba 36 26 P tiliifoliae Passiflora 37 27 P ligularis Passiflora 38 28 P edulis Passiflora 40 29 P tiliifoliae Passiflora 41 30 P.arborea Astrophea 42 31 P arborea Astrophea 43 32 P edulis Passiflora 44 33 P edulis Passiflora 45 34 P. cuspidifolia Decaloba 46 35 P. bicuspidata Decaloba 47 36 P. bogotensis Decaloba 48 37 P. foetida Dysosmia 49 38 P. caerulea Passiflora 50 39 P. quadrangularis Passiflora 51 40 P. tiliifoliae Passiflora
Tabla No. 12 Especies utilizadas para la construcción de la matriz de presencia /ausencia de PCR- RFLP de mtDNA (36 Accesiones).
19 Número de Número en la Nombre de la Sub-género campo matriz Especie 3 1 P cumbalensis Tacsonia 4 2 P mollissima Tacsonia 6 3 P mollissima Tacsonia 7 4 P india Tacsonia 8 5 P mollissima Tacsonia 9 6 P mixta Tacsonia 10 7 P mixta Tacsonia 12 8 P tenerifensis Tacsonia 13 9 P pinnatistipula Tacsonia 15 10 P pinnatistipula Tacsonia 16 11 P mollissima Tacsonia 17 12 P mixta Tacsonia 18 13 P manicata Manicata 21 14 P mixta Tacsonia 23 15 P india Tacsonia 25 16 P mixta Tacsonia 26 17 P india Tacsonia 28 18 P india Tacsonia 32 19 P biflora Decaloba 33 20 P maliformis Passiflora 34 21 P edulis Passiflora 35 22 P adenopoda Decaloba 36 23 P tiliifoliae Passiflora 37 24 P ligularis Passiflora 38 25 P edulis Passiflora 39 26 P ligularis Passiflora 40 27 P tiliifoliae Passiflora 42 28 P arborea Astrophea 43 29 P edulis Passiflora 44 30 P edulis Passiflora 45 31 P cuspidifolia Decaloba 46 32 P bicuspidata Decaloba 47 33 P bogotensis Decaloba 49 34 P caerulea Passiflora 50 35 P quadrangularis Passiflora 51 36 P tiliifoliae Passiflora
Tabla No. 13 Especies utilizadas para la construcción de la matriz de presencia / ausencia para el marcador RFLP de sondas de cpDNA (Accesiones 48).
Número de Número en la Nombre de la Especie Sub-género
20 campo matriz 3 1 P cumbalensis Tacsonia 4 2 P mollissima Tacsonia 5 3 P india Tacsonia 6 4 P mollissima Tacsonia 7 5 P india Tacsonia 8 6 P mollissima Tacsonia 9 7 P mixta Tacsonia 10 8 P mixta Tacsonia 11 9 P pinnatistipula Tacsonia 12 10 P tenerifensis Tacsonia 13 11 P pinnatistipula Tacsonia 14 12 P manicata Manicata 15 13 P pinnatistipula Tacsonia 16 14 P mollissima Tacsonia 17 15 P mixta Tacsonia 18 16 P manicata Manicata 19 17 P manicata Manicata 21 18 P mixta Tacsonia 23 19 P india Tacsonia 24 20 P india Tacsonia 25 21 P mixta Tacsonia 26 22 P india Tacsonia 27 23 P india Tacsonia 28 24 P india Tacsonia 29 25 P tripartita Tacsonia 30 26 P manicata Manicata 31 27 P pinnatistipula Tacsonia 32 28 P biflora Decaloba 33 29 P maliformis Passiflora 34 30 P edulis Passiflora 35 31 P adenopoda Decaloba 37 32 P ligularis Passiflora 38 33 P edulis Passiflora 40 34 P tiliifoliae Passiflora 41 35 P arborea Astrophea 42 36 P arborea Astrophea 43 37 P edulis Passiflora 44 38 P edulis Passiflora 45 39 P cuspidifolia Decaloba 47 40 P bogotensis Decaloba 49 41 P caerulea Passiflora 50 42 P quadrangularis Passiflora 51 43 P tiliifoliae Passiflora 52 44 P ligularis Passiflora 53 45 P maliformis Passiflora 54 46 Carica sp. Grupo Ajeno 55 47 P manicata Manicata 56 48 P bogotensis Decaloba
Para la determinación de las relaciones filogenéticas fue necesaria la generación de matrices y dendrogramas, a partir de los patrones de los fragmentos de restricción.
21 5.16.1. Construcción de matrices de presencia/ausencia
Para la construcción de las matrices a partir de los polimorfismos encontrados en los fragmentos de restricción, para los dos marcadores utilizados, la presencia del fragmento de restricción se codificó como 1 (uno) y la ausencia como 0 (cero).
5.16.2. Construcción de matrices de similitud
Para la generación de las matrices de similitud se introdujeron las matrices
presencia / ausencia resultantes del programa NTSYS - versión 1.60. En este programa se seleccionó el coeficiente de Jaccard presente en la opción qualitative. Este coeficiente viene dado por la fórmula:
B Σ Min (s i , t i)
i = 1 sim = 100 x B B
22 Σ Σ (s i + t i) - Min (s i , t i)
i = 1 i = 1
dist = 100 - sim
Si = Bandas presentes en la muestra S
Ti = Bandas presentes en la muestra T
5.16.3. Construcción de dendrogramas
Para la obtención de los dendrogramas se utilizaron las matrices de similitud resultantes de la implementación del coeficiente de Jaccard . Se escogió el algoritmo UPGMA (Unweighted
Pair Group Method with Arithmetic means) para realizar la agrupación, por ser éste el más comúnmente empleado para determinar las relaciones entre grupos taxonómicos, de acuerdo con el promedio de distancia genética.
Adicionalmente a sido el mas utilizado en los trabajos previos con Passiflora.
Este algoritmo es principalmente utilizado para analizar la relaciones interespecíficas de poblaciones, de acuerdo con el patrón de bandas que presentan. Las especies más relacionadas son las que más bandas comunes comparten y conforman clados definidos en los
árboles (Page & Holmes 1998).
La construcción de los cladogramas resultantes del análisis de agrupación UPGMA se corrieron en la opción SAHN clustering del programa NTSYS.
23 Para obtener el modo gráfico se introdujo la matriz resultante del procedimiento anterior en la opción Tree Display.
24 6. RESULTADOS
6.1. Aislamiento de DNA de las accesiones
Se obtuvieron diferentes concentraciones y calidades de DNA adecuadas en la mayoría de las accesiones, implementando los protocolos de mini-prep y maxi-prep.
6.1.1. Aislamiento de DNA a partir del protocolo de Maxi-prep.
Los valores de la cuantificación se presentan en el Anexo No. 2. y se observan en la Figura
No.2
6.1.2. Aislamiento de DNA a partir del protocolo de Mini-prep.
Los valores de la cuantificación aparecen en el Anexo No. 3.
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 m
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 m Figura No.2 Aislamiento de las muestras mediante el protocolo de Maxi-prep. (m)=marcador de masa 100, 60,40,20,10,5 ng/ul
6.2. Amplificación de fragmentos de cpDNA y mtDNA
97 Los ensayos realizados en la especie modelo P. edulis (modificando los volúmenes de Taq polimerasa adicionados al coctel de amplificación) evidenciaron que el volumen adecuado para la obtención de condiciones optimas de amplificación fue de 0.15 ul [0.5 unidades]. Los valores superiores a este volumen presentaron amplificaciones inespecíficas, en tanto los menores no presentaban una reproducibilidad adecuada.
En el mismo orden, el volumen óptimo de MgCl2 adicionado varió con relación al fragmento amplificado. Estos valores son presentados en la Tabla No. 14.
Tabla No. 14 Volumen de MgCl2 adicionado para cada fragmento amplificado.
Fragmento Volumen de MgCl2 Adicionado Concentración PC1-PC2 2ul 2 mM TS1-TS2 1ul 1 mM N41-N42 1ul 1 mM N1B-N1C 1ul 1 mM
Tomando en cuenta las condiciones óptimas de amplificación, se determinaron los tamaños aproximados de los fragmentos en la especie modelo mediante regresión lineal, los cuales se presentan en la Tabla No. 15 y en la figura No.3.
Tabla No. 15 Tamaños de los fragmentos amplificados.
Fragmentos Amplificados Tamaños bp PC1-PC2 1568 bp TS1-TS2 1319 bp N41-N42 1790 bp N1B-N1C 2276 bp
98
Figura No. 3 Tamaños de los fragmentos amplificados.
Con los datos obtenidos de la optimización se procedió a la amplificación todas las muestras.
Los resultados encontrados para los fragmentos de cpDNA (PC1-PC2, TS1-TS2) y de mtDNA (N4-N42, N1B-N1C) se presentan en los Anexo 4, 5, 6 y 7. Los resultados de la amplificación del fragmento se presentan en la figura No. 4
Figura No. 4 Amplificación del Fragmento N1B-N1C de mtDNA.
Se observó una eficiencia aceptable en la amplificación para la mayoría de las especies analizadas en cada uno de los fragmentos. No obstante, las muestras P. india (5), P. pinnatistipula (11), P. mixta (21), P. india (28), P. tripartita (29) y P. ligularis (39) no amplificaron en el fragmento PC1-PC2. Un caso parecido se encontró en el fragmento Ts1-
Ts2, donde las muestras P. india (5), P. mixta (9), P. pinnatistipula (11), P. india (22), P.
99 india (27), P. india (28), P. tripartita (29), P. manicata (30), P. ligularis (39), P. foetida
(48), P. ligularis (52), Carica sp. (54) y P. bogotensis (56) tampoco amplificaron.
En el fragmento N41-N42 la ausencia de amplificación ocurrió en P. mathewsii (2), P. india
(5), P. india (7), P. pinnatistipula (11), P. india (22), P. mixta (25), P. biflora (32) y P. bogotensis (56).
Por último, para el fragmento N1B-N1C las muestras que no presentaron amplificación fueron “luzmarina” (1), P. mathewsii (2), P. india (5), P. pinnatistipula (11), P. manicata
(14), P. manicata (18), P. india (22), P. mixta (25), P. tripartita (29), P. manicata (30), P. ligularis (39), P. ligularis (52) y P. bogotensis (56).
Adicionalmente, en la muestra P. caerulea (49) se observó una disminución en el tamaño del amplificado indicando esto una mutación de tipo deleción en esta especie que tuvo incidencia en el análisis posterior de agrupación.
6.3. Digestión de los fragmentos amplificados cpDNA y mtDNA
Las fotografías de las bandas resultantes de la digestión de los productos amplificados de cpDNA y mtDNA se observan en la Figura No. 5 y el restante en los Anexos No. 8, 9, 10 y
11.
100 mp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 mp 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 pm 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 pm
Figura No. 5 Digestión del fragmento PC1-PC2 con la enzima Hinf I
Las digestiones realizadas con la enzima Taq I y Hpa II no presentaron una digestión
aceptable para el fragmento PC1-PC2. El mismo caso se observó, en el fragmento TS1-TS2
para las digestiones con las enzimas Cfo I, Hae III y Taq I. De manera similar, se encontraron
deficiencias en los resultados para mtDNA con la enzima Hpa II en el fragmento N41-N42.
Tales diferencias, se basaron principalmente en la dificultad para identificar bandas visibles y
claras. Por esta razón, no se tuvieron en cuenta para la construcción de las matrices de
presencia/ausencia.
Adicionalmente, las muestras que no fueron digeridas por todas las enzimas evaluadas en uno
o ambos fragmentos se excluyeron del análisis.
En las muestras que presentaron digestión parcial, evidenciada por la presencia del fragmento
amplificado y un exagerado número de fragmentos de digestión, cuya suma superaba el
tamaño del fragmento amplificado sin digerir, se procedió a realizar el descuento en la
101 tabulación de las bandas de mayor tamaño, por ser estas artefactos propios de una digestión incompleta.
6.4. Digestión de DNA total
El modelo de digestión realizado para las 56 accesiones con la enzima Dra I se presenta en la
Anexo No. 9. Las especies “Luz Marina” (1) y P. mollissima (4) no presentaron el barrido característico de las digestiones de DNA total.
En conjunto, las muestras presentaron una adecuada intensidad y un barrido constante.
6.5. Marcaje de la sonda con digoxigenina
La eficiencia en la amplificación de las sondas marcadas fue adecuada, oscilando entre valores de 40 – 60 ng/ul (Figura No. 6). Los tamaños aproximados (estimados en la especie modelo P.edulis) de las sondas amplificadas se presentan en la tabla No. 16.
102 Figura No 6 Fragmentos amplificados marcados de cpDNA
Tabla No.16 Tamaño de los fragmentos utilizados como sondas en la amplificación.
Fragmentos Tamaño en bp J1-J2 510 J3-J4 569 J5-J6 279 TS1-TS2 1319 TT1-TT2 1333 PC1-PC2 1568
6.6. Hibridización con la sonda mixta
Los resultados de la hibridización de la hibridización realizada con la sonda mixta de cpNA sobre la digestión de DNA total realizada con la enzima Dra I, se presentan en la figura No. 7 y 8.
Figura No 7 Autoradiografías resultantes de la hibridización con la sonda mixta de cpDNA. (A) Muestras 1-14
103 A
B
C
Figura No 8 Autoradiografias resultantes de la hibridización con la sonda mixta de cpDNA. (A) Muestras 15-28 (B) Muestras 29-42 (C) Muestras 43-56
104 6.7. Relaciones filogenéticas
6.7.1. Matrices - Presencia / Ausencia
Las matrices presencia / ausencia obtenidas a partir del polimorfismo de los fragmentos de restricción, con cada uno de los marcadores utilizados, se presentan en los Anexos No. 13, 14 y 15.
6.7.2. Matrices de similitud
Los valores obtenidos en las matrices de similitud para el marcador cpDNA PCR-RFLP oscilaron entre 0.241 – 1.000. (Tabla No. 17)
Los valores obtenidos en las matrices de similitud para el marcador mtDNA PCR-RFLP oscilaron entre 0.534 – 1.000. (Tabla No. 18)
Los valores obtenidos en las matrices de similitud para el marcador cpDNA RFLP oscilaron entre 0.00 – 1.000. Presentándose el menor valor en la especie del grupo ajeno Carica pubecens (Tabla No. 19)
105 Tabla No. 17 Matriz de similitud obtenida a partir del coeficiente de Jaccard para PCR – RFLP cpDNA
2 3 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 17 18 19 21 22 23 24 25 26 31 32 33 35 36 37 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 P. mathewsii 2 1.000 P. cumbalensis 3 1.000 1.000 P. india 5 0.904 0.904 1.000 P. mollissima 6 0.950 0.950 0.952 1.000 P. india 7 0.950 0.950 0.952 1.000 1.000 P. mollissima 8 0.950 0.950 0.952 1.000 1.000 1.000 P. mixta 9 1.000 1.000 0.904 0.950 0.950 0.950 1.000 P. mixta 10 1.000 1.000 0.904 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 P. tenerifensis 12 0.950 0.950 0.952 0.904 0.904 0.904 0.950 0.950 1.000 P. pinnatistipula 13 0.950 0.950 0.863 0.904 0.904 0.904 0.950 0.950 0.904 1.000 P. manicata 14 1.000 1.000 0.904 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 0.950 0.950 1.000 P. pinnatistipula 15 0.950 0.950 0.863 0.904 0.904 0.904 0.950 0.950 0.904 1.000 0.950 1.000 P. mixta 17 1.000 1.000 0.904 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 0.950 0.950 1.000 0.950 1.000 P. manicata 18 1.000 1.000 0.904 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 0.950 0.950 1.000 0.950 1.000 1.000 P. manicata 19 1.000 1.000 0.904 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 0.950 0.950 1.000 0.950 1.000 1.000 1.000 P. mixta 21 1.000 1.000 0.904 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 0.950 0.950 1.000 0.950 1.000 1.000 1.000 1.000 P. india 22 0.950 0.950 0.952 1.000 1.000 1.000 0.950 0.950 0.904 0.904 0.950 0.904 0.950 0.950 0.950 0.950 1.000 P. india 23 0.950 0.950 0.952 1.000 1.000 1.000 0.950 0.950 0.904 0.904 0.950 0.904 0.950 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 P. india 24 0.950 0.950 0.952 1.000 1.000 1.000 0.950 0.950 0.904 0.904 0.950 0.904 0.950 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 1.000 P. mixta 25 0.950 0.950 0.952 1.000 1.000 1.000 0.950 0.950 0.904 0.904 0.950 0.904 0.950 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 1.000 1.000 P. india 26 0.950 0.950 0.952 1.000 1.000 1.000 0.950 0.950 0.904 0.904 0.950 0.904 0.950 0.950 0.950 0.950 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 P. pinnatistipula 31 0.950 0.950 0.863 0.904 0.904 0.904 0.950 0.950 0.904 1.000 0.950 1.000 0.950 0.950 0.950 0.950 0.904 0.904 0.904 0.904 0.904 1.000 P. biflora 32 0.464 0.464 0.433 0.448 0.448 0.448 0.464 0.464 0.448 0.500 0.464 0.500 0.464 0.464 0.464 0.464 0.448 0.448 0.448 0.448 0.448 0.500 1.000 P. maliformis 33 0.695 0.695 0.640 0.666 0.666 0.666 0.695 0.695 0.666 0.739 0.695 0.739 0.695 0.695 0.695 0.695 0.666 0.666 0.666 0.666 0.666 0.739 0.555 1.000 P. adenopoda 35 0.464 0.464 0.433 0.448 0.448 0.448 0.464 0.464 0.448 0.500 0.464 0.500 0.464 0.464 0.464 0.464 0.448 0.448 0.448 0.448 0.448 0.500 1.000 0.555 1.000 P. tiliifoliae 36 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 1.000 P. ligularis 37 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 1.000 1.000 P. edulis 38 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 1.000 1.000 1.000 P. tiliifoliae 40 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 1.000 1.000 1.000 1.000 P. arborea 41 0.360 0.360 0.333 0.346 0.346 0.346 0.360 0.360 0.346 0.346 0.360 0.346 0.360 0.360 0.360 0.360 0.346 0.346 0.346 0.346 0.346 0.346 0.370 0.346 0.370 0.333 0.333 0.333 0.333 1.000 P. arborea 42 0.360 0.360 0.333 0.346 0.346 0.346 0.360 0.360 0.346 0.346 0.360 0.346 0.360 0.360 0.360 0.360 0.346 0.346 0.346 0.346 0.346 0.346 0.370 0.346 0.370 0.333 0.333 0.333 0.333 1.000 1.000 P. edulis 43 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 1.000 1.000 1.000 1.000 0.333 0.333 1.000 P. edulis 44 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 1.000 1.000 1.000 1.000 0.333 0.333 1.000 1.000 P. cuspidifolia 45 0.464 0.464 0.433 0.448 0.448 0.448 0.464 0.464 0.448 0.500 0.464 0.500 0.464 0.464 0.464 0.464 0.448 0.448 0.448 0.448 0.448 0.500 0.913 0.555 0.913 0.535 0.535 0.535 0.535 0.423 0.423 0.535 0.535 1.000 P. bicuspidata 46 0.464 0.464 0.433 0.448 0.448 0.448 0.464 0.464 0.448 0.500 0.464 0.500 0.464 0.464 0.464 0.464 0.448 0.448 0.448 0.448 0.448 0.500 0.913 0.555 0.913 0.535 0.535 0.535 0.535 0.423 0.423 0.535 0.535 1.000 1.000 P. bogotensis 47 0.464 0.464 0.433 0.448 0.448 0.448 0.464 0.464 0.448 0.500 0.464 0.500 0.464 0.464 0.464 0.464 0.448 0.448 0.448 0.448 0.448 0.500 0.913 0.555 0.913 0.535 0.535 0.535 0.535 0.423 0.423 0.535 0.535 1.000 1.000 1.000 P. foetida 48 0.695 1.000 0.695 0.640 0.666 0.666 0.666 0.695 0.695 0.666 0.739 0.695 0.739 0.695 0.695 0.695 0.695 0.666 0.666 0.666 0.666 0.666 0.739 0.555 1.000 0.555 0.952 0.952 0.952 0.952 0.346 0.346 0.952 0.952 0.555 0.555 1.000 P. caerulea 49 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 0.909 0.909 0.909 0.952 1.000 0.538 0.538 0.500 0.518 0.518 0.518 0.538 1.000 P. quadrangularis 50 0.909 0.333 0.333 0.909 0.909 0.535 0.535 0.538 0.518 0.576 0.538 0.576 0.538 0.538 0.538 0.538 0.518 0.518 0.518 0.518 0.518 0.576 0.433 0.782 0.433 0.750 0.750 0.750 0.750 0.241 0.241 0.750 0.750 0.433 0.433 0.433 0.782 0.826 1.000 P. tiliifoliae 51 0.666 0.666 0.615 0.640 0.640 0.640 0.666 0.666 0.640 0.708 0.666 0.708 0.666 0.666 0.666 0.666 0.640 0.640 0.640 0.640 0.640 0.708 0.535 0.952 0.535 1.000 1.000 1.000 1.000 0.333 0.333 1.000 1.000 0.535 0.535 1.000 0.952 0.909 0.750 1.000
108 Tabla No. 18 Matriz de similitud obtenida a partir del coeficiente de Jaccard para PCR – RFLP mtDNA
Especies 3 4 6 7 8 9 10 12 13 15 16 17 18 21 23 25 26 28 32 33 34 35 36 37 38 39 40 42 43 44 45 46 47 49 50 51 P. cumbalensis 3 1.000 P. mollissima 4 0.955 1.000 P. mollissima 6 0.955 1.000 1.000 P. india 7 0.955 1.000 1.000 1.000 P. mollissima 8 0.955 1.000 1.000 1.000 1.000 P. mixta 9 1.000 0.955 0.955 0.955 0.955 1.000 P. mixta 10 1.000 0.955 0.955 0.955 0.955 1.000 1.000 P. tenerifensis 12 1.000 0.955 0.955 0.955 0.955 1.000 1.000 1.000 P. pinnatistipula 13 0.893 0.857 0.857 0.857 0.857 0.893 0.893 0.893 1.000 P. pinnatistipula 15 0.893 0.857 0.857 0.857 0.857 0.893 0.893 0.893 1.000 1.000 P. mollissima 16 0.955 1.000 1.000 1.000 1.000 0.955 0.955 0.955 0.857 0.857 1.000 P. mixta 17 1.000 0.955 0.955 0.955 0.955 1.000 1.000 1.000 0.893 0.893 0.955 1.000 P. manicata 18 0.977 0.934 0.934 0.934 0.934 0.977 0.977 0.977 0.875 0.875 0.934 0.977 1.000 P. mixta 21 1.000 0.955 0.955 0.955 0.955 1.000 1.000 1.000 0.893 0.893 0.955 1.000 0.977 1.000 P. india 23 0.955 1.000 1.000 1.000 1.000 0.955 0.955 0.955 0.857 0.857 1.000 0.955 0.934 0.955 1.000 P. mixta 25 1.000 0.955 0.955 0.955 0.955 1.000 1.000 1.000 0.893 0.893 0.955 1.000 0.977 1.000 0.955 1.000 P. india 26 0.955 1.000 1.000 1.000 1.000 0.955 0.955 0.955 0.857 0.857 1.000 0.955 0.936 0.955 1.000 0.955 1.000 P. india 28 0.955 1.000 1.000 1.000 1.000 0.955 0.955 0.955 0.857 0.857 1.000 0.955 0.934 0.955 1.000 0.955 1.000 1.000 P. biflora 32 0.625 0.603 0.603 0.603 0.603 0.625 0.625 0.625 0.709 0.709 0.603 0.625 0.614 0.625 0.603 0.625 0.603 0.603 1.000 P. maliformis 33 0.672 0.649 0.649 0.649 0.649 0.672 0.672 0.672 0.759 0.759 0.649 0.672 0.660 0.672 0.649 0.672 0.649 0.649 0.901 1.000 P. edulis 34 0.672 0.649 0.649 0.649 0.649 0.672 0.672 0.672 0.759 0.759 0.649 0.672 0.663 0.672 0.649 0.672 0.649 0.649 0.901 1.000 1.000 P. adenopoda35 0.625 0.603 0.603 0.603 0.603 0.625 0.625 0.625 0.709 0.709 0.603 0.625 0.614 0.625 0.603 0.625 0.603 0.603 1.000 0.901 0.901 1.000 P. tiliifoliae 36 0.642 0.620 0.620 0.620 0.620 0.642 0.641 0.642 0.727 0.727 0.620 0.642 0.631 0.642 0.620 0.642 0.620 0.620 0.940 0.921 0.921 0.940 1.000 P. ligularis 37 0.642 0.620 0.620 0.620 0.620 0.642 0.642 0.642 0.727 0.727 0.620 0.642 0.631 0.642 0.620 0.642 0.620 0.620 0.940 0.921 0.921 0.940 1.000 1.000 P. edulis 38 0.672 0.649 0.649 0.649 0.649 0.672 0.672 0.672 0.759 0.759 0.649 0.672 0.660 0.672 0.649 0.672 0.649 0.649 0.901 1.000 1.000 0.901 0.921 0.921 1.000 P. ligularis 39 0.642 0.620 0.620 0.620 0.620 0.642 0.642 0.642 0.727 0.727 0.620 0.642 0.631 0.642 0.620 0.642 0.620 0.620 0.940 0.921 0.921 0.940 1.000 1.000 0.921 1.000 P. tiliifoliae 40 0.642 0.620 0.620 0.620 0.620 0.642 0.642 0.642 0.727 0.727 0.620 0.642 0.631 0.642 0.620 0.642 0.620 0.620 0.940 0.921 0.921 0.940 1.000 1.000 0.921 1.000 1.000 P. arborea 42 0.593 0.573 0.573 0.573 0.573 0.593 0.593 0.593 0.672 0.672 0.573 0.593 0.610 0.593 0.573 0.593 0.573 0.573 0.941 0.851 0.851 0.941 0.886 0.886 0.851 0.886 0.886 1.000 P. edulis 43 0.672 0.649 0.649 0.649 0.649 0.672 0.672 0.672 0.759 0.759 0.649 0.672 0.660 0.672 0.649 0.672 0.649 0.649 0.901 1.000 1.000 0.901 0.921 0.921 1.000 0.921 0.921 0.851 1.000 P. edulis 44 0.672 0.649 0.649 0.649 0.649 0.672 0.672 0.672 0.759 0.759 0.649 0.672 0.660 0.672 0.649 0.672 0.649 0.649 0.901 1.000 1.000 0.901 0.921 0.921 1.000 0.921 0.921 0.851 1.000 1.000 P. cuspidifolia 45 0.614 0.593 0.593 0.593 0.593 0.614 0.614 0.614 0.696 0.696 0.593 0.614 0.631 0.614 0.593 0.614 0.593 0.593 0.979 0.884 0.884 0.979 0.921 0.921 0.884 0.921 0.921 0.960 0.884 0.884 1.000 P. bicuspidate 46 0.614 0.593 0.593 0.593 0.593 0.614 0.614 0.614 0.696 0.696 0.593 0.614 0.631 0.614 0.593 0.614 0.593 0.593 0.979 0.884 0.884 0.979 0.921 0.921 0.884 0.921 0.921 0.960 0.884 0.884 1.000 1.000 P. bogotensis 47 0.614 0.593 0.593 0.593 0.593 0.614 0.614 0.614 0.696 0.696 0.593 0.614 0.631 0.614 0.593 0.614 0.593 0.593 0.979 0.884 0.884 0.979 0.921 0.926 0.884 0.921 0.921 0.960 0.884 0.884 1.000 1.000 1.000 P. caerulea 49 0.553 0.534 0.534 0.534 0.534 0.553 0.553 0.553 0.578 0.578 0.534 0.553 0.543 0.553 0.534 0.553 0.534 0.534 0.642 0.631 0.631 0.642 0.660 0.660 0.631 0.660 0.660 0.637 0.631 0.631 0.631 0.631 0.631 1.000 P. quadrangularis 50 0.672 0.649 0.649 0.649 0.649 0.672 0.672 0.672 0.759 0.759 0.649 0.672 0.660 0.672 0.649 0.672 0.649 0.649 0.901 1.000 1.000 0.901 0.921 0.921 1.000 0.921 0.921 0.851 1.000 1.000 0.884 0.884 0.884 0.631 1.000 P. tiliifoliae 51 0.642 0.620 0.620 0.620 0.620 0.642 0.642 0.642 0.727 0.727 0.620 0.642 0.631 0.642 0.620 0.642 0.620 0.620 0.940 0.921 0.921 0.940 1.000 1.000 0.921 1.000 1.000 0.886 0.921 0.921 0.926 0.921 0.921 0.660 0.921 1.000
109 Tabla No. 19 Matriz de similitud obtenida a partir del coeficiente de Jaccard para RFLP cpDNA 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 23 24 25 26 26 28 29 30 31 32 33 34 35 37 38 40 41 42 43 44 45 47 49 50 51 52 53 54 55 56 P. cumbalensis 3 1.000 P. mollissima 4 0.625 1.000 P. india 5 0.500 0.800 1.000 P. mollissima 6 0.625 1.000 0.800 1.000 P. india 7 0.500 0.800 1.000 0.800 1.000 P. mollissima 8 0.625 1.000 0.800 1.000 0.800 1.000 P. mixta 9 0.625 0.777 0.636 0.777 0.636 0.777 1.000 P. mixta 10 0.625 0.777 0.636 0.777 0.636 0.777 1.000 1.000 P. pinnatistipula 11 0.222 0.272 0.333 0.272 0.333 0.272 0.400 0.400 1.000 P. tenerifensis 12 0.714 0.666 0.545 0.666 0.545 0.666 0.666 0.666 0.300 1.000 P. pinnatistipula 13 0.222 0.272 0.333 0.272 0.333 0.272 0.400 0.400 1.000 0.300 1.000 P. manicata 14 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 1.000 P. pinnatistipula 15 0.222 0.272 0.333 0.272 0.333 0.272 0.400 0.400 1.000 0.300 1.000 0.200 1.000 P. mollissima 16 0.625 1.000 0.800 1.000 0.800 1.000 0.777 0.777 0.272 0.666 0.272 0.272 0.272 1.000 P. mixta 17 0.625 0.777 0.636 0.777 0.636 0.777 1.000 1.000 0.400 0.666 0.400 0.272 0.400 0.777 1.000 P. manicata 18 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 1.000 0.200 0.272 0.272 1.000 P. manicata 19 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 1.000 0.200 0.272 0.272 1.000 1.000 P. mixta 21 0.625 0.777 0.636 0.777 0.636 0.777 1.000 1.000 0.400 0.666 0.400 0.272 0.400 0.777 1.000 0.272 0.272 1.000 P. india 23 0.500 0.800 1.000 0.800 1.000 0.800 0.636 0.636 0.333 0.545 0.333 0.230 0.333 0.800 0.636 0.230 0.230 0.636 1.000 P. india 24 0.500 0.800 1.000 0.800 1.000 0.800 0.636 0.636 0.333 0.545 0.333 0.230 0.333 0.800 0.636 0.230 0.230 0.636 1.000 1.000 P. mixta 25 0.625 0.777 0.636 0.777 0.636 0.777 1.000 1.000 0.400 0.666 0.400 0.272 0.400 0.777 1.000 0.272 0.272 1.000 0.636 0.636 1.000 P. india 26 0.500 0.800 1.000 0.800 1.000 0.800 0.636 0.636 0.333 0.545 0.333 0.230 0.333 0.800 0.636 0.230 0.230 0.636 1.000 1.000 0.636 1.000 P. india 27 0.500 0.800 1.000 0.800 1.000 0.800 0.636 0.636 0.333 0.545 0.333 0.230 0.333 0.800 0.636 0.230 0.230 0.636 1.000 1.000 0.636 1.000 1.000 P. india 28 0.500 0.800 1.000 0.800 1.000 0.800 0.636 0.636 0.333 0.545 0.333 0.230 0.333 0.800 0.636 0.230 0.230 0.636 1.000 1.000 0.636 1.000 1.000 1.000 P. tripartita 29 0.714 0.875 0.700 0.875 0.700 0.875 0.875 0.875 0.300 0.75 0.300 0.300 0.300 0.875 0.875 0.300 0.300 0.875 0.700 0.700 0.875 0.700 0.700 0.700 1.000 P. manicata 30 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.30 0.200 1.000 0.200 0.272 0.272 1.000 1.000 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 1.000 P. pinnatistipula 31 0.222 0.272 0.333 0.272 0.333 0.272 0.400 0.400 1.000 0.300 1.000 0.200 1.000 0.272 0.400 0.200 0.200 0.400 0.333 0.333 0.400 0.333 0.333 0.333 0.300 0.200 1.000 P. biflora 32 0.100 0.076 0.066 0.076 0.066 0.076 0.076 0.076 0.090 0.083 0.090 0.090 0.090 0.076 0.076 0.090 0.090 0.076 0.066 0.066 0.076 0.066 0.066 0.066 0.083 0.090 0.090 1.000 P. maliformis 33 0.500 0.333 0.272 0.333 0.272 0.333 0.333 0.333 0.250 0.375 0.250 0.428 0.250 0.333 0.333 0.428 0.428 0.333 0.272 0.272 0.333 0.272 0.272 0.272 0.375 0.428 0.250 0.111 1.000 P. edulis 34 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 1.000 P. adenopoda 35 0.142 0.100 0.083 0.100 0.083 0.100 0.100 0.100 0.125 0.111 0.125 0.125 0.125 0.100 0.100 0.125 0.125 0.100 0.083 0.083 0.100 0.083 0.083 0.083 0.111 0.125 0.125 0.285 0.166 0.285 1.000 P. Ligularis 37 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 0.714 0.125 1.000 P. edulis 38 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 1.000 0.285 0.714 1.000 P. tiliifoliae 40 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 0.714 0.125 1.000 0.714 1.000 P. arborea 41 0.125 0.090 0.076 0.090 0.076 0.090 0.090 0.090 0.111 0.100 0.111 0.111 0.111 0.090 0.090 0.111 0.111 0.090 0.076 0.076 0.090 0.076 0.076 0.076 0.100 0.111 0.111 0.111 0.142 0.111 0.166 0.111 0.111 0.111 1.000 P. arborea 42 0.125 0.090 0.076 0.090 0.076 0.090 0.090 0.090 0.111 0.100 0.111 0.111 0.111 0.090 0.090 0.111 0.111 0.090 0.076 0.076 0.090 0.076 0.076 0.076 0.100 0.111 0.111 0.111 0.142 0.111 0.166 0.111 0.111 0.111 1.000 1.000 P. edulis 43 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 1.000 0.285 0.714 1.000 0.714 0.111 0.111 1.000 P. edulis 44 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 1.000 0.285 0.714 1.000 0.714 0.111 0.111 1.000 1.000 P. cuspidifolia 45 0.111 0.083 0.071 0.083 0.071 0.083 0.083 0.083 0.100 0.090 0.100 0.100 0.100 0.083 0.083 0.100 0.100 0.083 0.071 0.071 0.083 0.071 0.071 0.071 0.090 0.100 0.100 0.833 0.125 0.100 0.333 0.100 0.100 0.100 0.125 0.125 0.100 0.100 1.000 P. bogotensis 47 0.111 0.083 0.071 0.083 0.071 0.083 0.083 0.083 0.100 0.090 0.100 0.100 0.100 0.083 0.083 0.100 0.100 0.083 0.071 0.071 0.083 0.071 0.071 0.071 0.090 0.100 0.100 0.833 0.125 0.100 0.333 0.100 0.100 0.100 0.125 0.125 0.100 0.100 0.666 1.000 P. caerulea 49 0.428 0.300 0.250 0.300 0.250 0.300 0.300 0.300 0.222 0.333 0.222 0.375 0.222 0.300 0.300 0.375 0.375 0.300 0.250 0.250 0.300 0.250 0.250 0.250 0.333 0.375 0.222 0.100 0.800 0.833 0.333 0.571 0.833 0.571 0.125 0.125 0.833 0.833 0.111 0.111 1.000 P. quadrangularis 0.428 0.300 0.250 0.300 0.250 0.300 0.300 0.300 0.222 0.333 0.222 0.375 0.222 0.300 0.300 0.375 0.375 0.300 0.250 0.250 0.300 0.250 0.250 0.250 0.333 0.375 0.222 0.100 0.800 0.833 0.333 0.571 0.833 0.571 0.125 0.125 0.833 0.833 0.111 0.111 1.000 1.000 P. tiilifoliae 51 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 0.714 0.125 1.000 0.714 1.000 0.111 0.111 0.714 0.714 0.100 0.100 0.571 0.571 1.000 P. ligularis 52 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 0.500 0.200 0.272 0.272 0.500 0.500 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 0.500 0.200 0.090 0.666 0.714 0.125 1.000 0.714 1.000 0.111 0.111 0.714 0.714 0.100 0.100 0.571 0.571 1.000 1.000 P. maliformis 53 0.500 0.333 0.272 0.333 0.272 0.333 0.333 0.333 0.250 0.375 0.250 0.428 0.250 0.333 0.333 0.428 0.428 0.333 0.272 0.272 0.333 0.272 0.272 0.272 0.375 0.428 0.250 0.111 1.000 0.666 0.166 0.666 0.666 0.666 0.142 0.142 0.666 0.666 0.125 0.125 0.800 0.800 0.666 0.666 1.000 Carica sp. 54 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.142 0.142 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000 P. manicata 55 0.375 0.272 0.230 0.272 0.230 0.272 0.272 0.272 0.200 0.300 0.200 1.000 0.200 0.272 0.272 1.000 1.000 0.272 0.230 0.230 0.272 0.230 0.230 0.230 0.300 1.000 0.200 0.090 0.428 0.500 0.125 0.500 0.500 0.500 0.111 0.111 0.500 0.500 0.100 0.100 0.375 0.375 0.500 0.500 0.428 0.000 1.000 P. bogotensis 56 0.111 0.083 0.071 0.083 0.071 0.083 0.083 0.083 0.100 0.090 0.100 0.100 0.100 0.083 0.083 0.100 0.100 0.083 0.071 0.071 0.083 0.071 0.071 0.071 0.090 0.100 0.100 0.833 0.125 0.100 0.333 0.100 0.100 0.100 0.125 0.125 0.100 0.100 0.666 1.000 0.111 0.111 0.100 0.100 0.125 0.000 0.100 1.000
110 6.7.3. Dendrogramas
Los árboles generados a partir de las relaciones filogenéticas obtenidas de la utilización del coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA se presentan en las figuras No. 9, 10 y 11.
6.7.3.1. PCR-RFLP cpDNA
En el árbol resultante a partir de la digestión de los fragmentos amplificados de cpDNA se observaron cuatro agrupaciones. En la primera, se relacionan las especies de los subgéneros Tacsonia y Manicata, presentando los individuos de P. manicata una relación más estrecha con los individuos de P. mixta, P. cumbalensis y P. mathewsii, que con las restantes especies del subgénero.
La segunda agrupación está constituida por los subgéneros Passiflora y Dysosmia. En este grupo se pudo observar que la especie P. foetida (subgénero Dysosmia) se ubicó más cerca a la especie P. maliformis que al resto de las especies de subgénero Passiflora.
Las especies del subgénero Decaloba conformaron la tercera agrupación.
Por último, se encuentran los individuos de P. arborea (41) y P. arborea (42), pertenecientes al subgénero Astrophea. Estos dos individuos presentaron los menores valores de similitud, y por esta misma razón se ubicaron más distantes del resto de las especies en el árbol.
6.7.3.2. PCR-RFLP mtDNA
En el árbol resultante de la digestión de los productos amplificados de mtDNA se observaron tres ramificaciones principales. En la primera, se agruparon de forma similar a lo encontrado en árbol PCR-RFLP de cpDNA, en el cual se juntaron los subgéneros Tacsonia y Manicata.
111 La segunda ramificación involucró los subgéneros Decaloba, Astrophea y Passiflora. En contraste con lo observado en el árbol anterior, el subgénero Astrophea, no se encuentra distanciado tan drásticamente del resto de subgéneros, mas aun establece una relación cercana con el subgénero Decaloba; siendo un poco mas distante su relación con el subgénero Passiflora.
Finalmente, la tercera ramificación corresponde a la especie P. caerulea (subgénero Passiflora), siendo la más distante del conjunto de especies involucradas en este análisis.
6.7.3.3. RFLP cpDNA.
En el árbol obtenido del análisis con cpDNA RFLP se evidenció una relación de las especies de acuerdo al subgénero al que pertenecen.
Por primera vez, el subgénero Manicata se agrupó de manera independiente, pero más relacionado con el subgénero Passiflora que con el subgénero Tacsonia, siendo esta situación contrastante con lo observado en los dos árboles anteriores.
Las especies del subgénero Decaloba conformaron una ramificación bien diferenciada y distante de las especies del subgénero Passiflora, con las cuales se habían relacionado más estrechamente en los árboles anteriores.
Al igual que en el árbol de PCR-RFLP cpDNA, los individuos P. arborea (41) y P. arborea (42) fueron las más distantes de todo el conjunto de especies analizadas y se ubicaron más cerca de la especie del grupo ajeno.
112 + Tacsonia + Manicata + Passiflora+ Decaloba + Astrophea
Figura No. 9 Fenograma realizado a partir del coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA para PCR – RFLP mtDNA
+ Tacsonia + Manicata + Passiflora+ Decaloba + Astrophea +Grupo Ajeno 113 Figura No. 11 Fenograma realizado a partir del coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA para Figura No.10RFLP deFenograma cpDNA realizado+ Tacsonia a partir+ delM anicatacoeficiente+ dePassiflora Jaccard y +el Dysosmiaalgoritmo UPGMA para PCR – RFLP cpDNA + Decaloba + Astrophea 7. DISCUSION
7.1. Aislamiento de DNA
Los aislamientos realizados por el protocolo de Maxi-prep presentaron una mejor eficiencia en cuanto a la concentración de DNA, comparativamente con los resultados obtenidos de la utilización del protocolo de Mini-prep.
Las características del DNA obtenido por la técnica de maxi-prep, en la mayoría de las muestras, presentó un comportamiento mucho mejor al momento de realizar las amplificaciones y digestiones, indicando una remoción exitosa de carbohidratos, compuestos fenólicos y otros contaminantes que tienen una incidencia negativa al utilizar este DNA en posteriores reacciones de PCR o digestiones (Sambrook et al. 1989).
7.2. Amplificación de Fragmentos de cpDNA y mtDNA
Las pruebas de optimización realizadas sobre el volumen adicionado de enzima
DNA Taq polimerasa y MgCl2 en el coctel de amplificación fue de extrema importancia para lograr una buena especificidad en el proceso de amplificación.
117 Investigadores como Kwok & Higuchi (1989), Arheim et al.(1990), Saiki (1991),
Bolch (1991), Wu et al. (1991), Demesure et al. (1995) e Innis et al. (1995) han reportado que la eficiencia de la amplificación está dada por la precisión en la concentración adicionada de los elementos propios en el coctel de amplificación, y
que particularmente, el volumen adicionado de enzima y MgCl2 son fundamentales para la buena y precisa amplificación de los fragmentos deseados.
Excesos en la adición de enzima traen consigo la generación de fragmentos inespecíficos, y por otra parte, la adición en menor proporción de la misma da como resultado una baja o nula eficiencia en la amplificación (Saiki 1991).
De acuerdo con Innis et al. (1995) la optimización de las concentraciones de MgCl2 es fundamental, puesto que de ella dependen el `anneling´ de los primer a la cadena de DNA blanco, la aparición de productos inespecíficos y la eficiencia y fidelidad de la enzima en su labor de síntesis.
La amplificación de los fragmentos de cpDNA y mtDNA fue en la mayoría de las especies buena. Sin embargo, en las especies como P. india (5), P. pinnatistipula
(11), P. india (22), P. tripartita (29), P. manicata (30), y P. edulis (39), no se presentó amplificación, lo cual permite sugerir la presencia de elementos contaminantes, ajenos al DNA, que influenciaron de forma negativa la reacción y no permitieron que estas fueran tenidas en cuenta en el análisis de agrupamiento.
118 El 89 % de las muestras presentaron una amplificación del fragmento de cpDNA
PC1-PC2, en la cual el tamaño promedio de los fragmentos fue constante en todas las muestras (1568bp, tamaño estimado por regresión lineal en la especie modelo
P. edulis). Los valores en la cuantificación oscilaron entre 30-60 ng/ul. Este resultado concuerda con los obtenidos por Varón (2000), quien al evaluar un conjunto de 12 pares de primers que amplificaban regiones de cpDNA, pudo determinar una eficiencia en la amplificación superior al 90% para este fragmento.
Adicionalmente, en el mismo estudio, no se reportaron variaciones interespecíficas en tamaño, a partir de las 11 especies de Passiflora analizadas.
En el fragmento de cpDNA TS1-TS2 el 77% de las muestras presentaron una amplificación positiva. Los tamaños obtenidos en las diferentes muestras no presentaron variaciones interespecificas ni intraespecificas, de manera similar a lo sucedido con el otro fragmento amplificado de cpDNA. Su valor, en todas las especies, estuvo cercano a los 1319 bp (estimado en la especie modelo). Los valores de la cuantificación oscilaron entre 20-30 ng/ul, menores comparativamente con los obtenidos con el otro fragmento amplificado de cpDNA.
Varón (2000) reportó problemas con la amplificación de este fragmento en 3 de las
11 especies evaluadas. Una posible explicación a la baja eficiencia en la amplificación de este fragmento pudo estar relacionada con la presencia de inhibidores (carbohidratos, proteínas y Compuestos fenólicos) en las muestras como ha sido reportado en trabajos anteriores por Arnheim et al.(1990) e Innis
(1995).
119 El 86% de las muestras presentó una amplificación adecuada del fragmento mitocondrial N41-N42 y al igual que en PC1-PC2 y TS1-TS2 no se evidenciaron variaciones en el tamaño de los fragmentos (2276 bp establecido en la especie modelo P. edulis). El valor promedio de la cuantificación para N41-N42 osciló entre 40-60 ng/ul, siendo el valor más alto en todas las amplificaciones.
Para el fragmento mitocondrial N1B-N1C el 77% de las muestras amplificaron. De manera contrastante a lo observado con los otros tres fragmentos, los tamaños de los productos amplificados variaron en las especies P. mollisima (4), P. pinnatitistipula (13), P. pinnatistipula (15), P. manicata (19), P. india (21) y P. caerulea (49). Las cinco primeras especies presentaron un aumento en su tamaño, al ser comparado con el valor establecido en la especie modelo P. edulis de 1790 bp (Figura No. 4).
Dicha variación presente en estos cinco individuos no modificó el patrón de bandas generado posteriormente al ser digerido el fragmento con las enzimas de restricción, como se discutirá mas adelante.
Por otro lado, la especie P. caerulea presentó una disminución en el tamaño de
N1B-N1C, al ser comparada con el establecido para la especie modelo, dicha variación en el tamaño sí tuvo una incidencia drástica en los resultados de los patrones de bandas generados en la digestión, lo que la ubicó como la más distante en la agrupación generada a partir del algoritmo UPGMA (Figura No. 9).
120 Esta variación de P. caerulea en N1B-N1C ya había sido reportada por Varón
(2000), situación que indicaría que dicha deleción fue un evento propio de esta especie, y que no está en concordancia con las modificaciones en secuencia graduales (sustituciones nucleotídicas) presentes en el resto de las especies del género Passiflora analizadas.
Sederoff (1987) afirma que aunque el genoma de mitocondria es comparativamente menos variable que el de cloroplasto, la gran mayoría de mutaciones (deleciones o inserciones) se presentan en regiones no codificantes, lo cual ha implicado algunas dificultades en la utilización de mtDNA en trabajos filogenéticos, ya que mutaciones presentes en individuos o especies particulares podrían desvirtuar la información obtenida de los árboles.
7.3. Digestión de los Fragmentos amplificados de cpDNA
El fragmento PC1-PC2 de cpDNA fue digerido por las seis enzimas, aunque las enzimas Taq I y Hpa II no fueron tenidas en cuenta para la construcción de la matriz binaria, de presencia /ausencia, ya que su patrón de bandas no fue identificable en algunas de las muestras.
Las otras enzimas, Hinf I, Cfo I, Hae III y Rsa I, presentaron actividad en la mayoría de las especies. Las enzimas con mayor número de fragmentos fueron Hinf I, Cfo I, con seis cada una, en tanto que Hae III, fue la que menos fragmentos generó (solo
3). En cuanto al nivel de polimorfismo generado por este grupo de enzimas, Hinf I
121 fue la que presentó el patrón de bandas más polimórfico en las muestras; hecho que ya había sido reportado con anterioridad por Varón (2000), quien de un conjunto de 30 enzimas evaluadas, indicó que esta enzima presentaba el segundo valor más alto de polimorfismo, superior al 85 %.
Kansaki et al. (1997), Isshiki et al. (1998), Cipriani et al. (1998) y Parducci &
Szmidt (1999) trabajando con PCR-RFLP de cpDNA, reportaron un buen comportamiento de la enzima Hinf I en la generación de patrones polimorficos.
En el otro fragmento TS1-TS2 de cpDNA, las enzimas Cfo I, Hae III y Taq I, presentaron dificultad, al no ser posible la identificación del patrón de bandas en las muestras, por lo cual también fueron excluidas de la construcción de la matriz binaria. De igual forma que lo observado en PC1-PC2, los mayores valores de polimorfismo los presentó la enzima Hinf I; en tanto que los menores valores, los presentó la enzima Hpa II.
Al igual que lo reportado por Varón (2000), las enzimas Hinf I y Rsa I permitieron identificar un patrón de bandas muy diferente en las especies del subgénero
Decaloba; lo cual implicó una separación bien definida de este grupo en el árbol resultante del análisis filogenético.
7.4. Digestión de los Fragmentos amplificados de mtDNA
122 En el fragmento N41-N42 de mtDNA amplificado, la enzima Hpa II presentó dificultades para la digestión, por tanto, no fue tenida cuenta para la construcción de la matriz binaria.
En concordancia con lo reportado por Sederoff (1987), con relación a la baja variabilidad del genoma mitocondrial, los valores de polimorfismo en los fragmentos amplificados de mtDNA fueron mucho menores a los observados en los fragmentos de cpDNA.
La enzima Rsa I, fue la que más fragmentos de restricción generó, similar a lo reportado por Varón (2000) para el mismo fragmento.
El patrón de bandas generado por las enzimas Cfo I, Hae III y Taq I fue muy poco variable, lo cual no permitió la separación de las especies en el dendrograma resultante, tanto en el ligamento simple, completo y UPGMA.
El fragmento mitocondrial N1B-N1C fue el único, de los cuatro analizados, en el que se presentó digestión con las seis enzimas analizadas, lo cual trajo como resultado un mayor número de fragmentos analizados (68) en la matriz binaria. La matriz se generó a partir de la suma de los fragmentos obtenidos en la digestión de
N41-N42 y N1B-N1C. Sin embargo, en los fragmentos analizados fue recurrente la baja variabilidad, característica ya antes citada como común en ese genoma.
De forma similar a lo sucedido en el fragmento N41- N42, la enzima Rsa I fue la que mayor cantidad de fragmentos generó; en tanto, que la enzima Cfo I obtuvo el
123 menor número. Resultados que apoyan lo reportado por Varón (2000), quien determinó el carácter monomórfico y bajo número de fragmentos generados por la enzima Cfo I para N1B-N1C.
Para todas las enzimas P. caerulea presentó un patrón atípico al encontrado en las demás especies del subgénero Passiflora, y en general al resto de especies, lo que está directamente relacionado con la mutación presente en el fragmento N1B-N1C.
Esta situación tuvo una incidencia notable en la forma que presentó el árbol generado de la digestión de los fragmentos amplificados de mtDNA.
Las otras cinco individuos que presentaron una variación en el tamaño en N1B-N1C al momento de la digestión no presentaron variaciones evidenciables en el patrón de bandas. Posiblemente relacionado con el hecho de que tal variación no sobrepaso los cincuenta pares de bases en tanto que la variación presente en P. caerulea involucro un número mucho mayor de pares de bases.
7.5. Digestión de DNA total
Los resultados obtenidos de la digestión del DNA total con la enzima Dra I fueron eficientes, puesto que presentaron un barrido continuo e intenso en casi todas las muestras, con excepción de las especies “luzmarina” (1) y P. mollisima (4); en la primera especie influyó seguramente la poca cantidad de material con que se contó en el momento de la extracción, impidiendo realizar el aislamiento por el
124 protocolo de maxi-prep, y para la segunda especie, la dificultad pudo estar relacionada con impuresas presentes en la muestra que permitiron una actividad de la enzima.
Otros autores como Mes & Hart (1996), Kiss (1997), Yonemori et al. (1998) han utilizado esta enzima con total éxito en digestiones de DNA total de plantas.
Sambrook et al. (1989) afirman que enzimas que poseen sitios de reconocimiento de seis nucleótidos, como Dra I, realizan un corte mucho más conveniente del DNA total, puesto que los fragmentos generados de la digestión se distribuyen de manera homogénea a lo largo de todo el barrido, permitiendo así la visualización de polimorfismos al ser hibridizados con sondas.
No obstante, aunque en apariencia el resto de especies presentó el barrido característico del proceso de digestión de DNA total, algunas especies al momento de la hibridización presentaron inconvenientes al no ser reconocidas por la sonda mixta marcada, posiblemente relacionado con inhibidores presentes en las muestras lo cual ha sido reportado por Ausbel (1992) y Csaikl et al. (1998).
7.6. Hibridización con la sonda mixta y generación del polimorfismo de los fragmentos de restricción
125 La construcción de una sonda mixta aseguró la detección de un mayor número de fragmentos de restricción, que cuando se trabajó con sondas independientes; esto concuerda con los resultados obtenidos por Góngora & Rodríguez (2000). Una hibridización de este tipo reduce el tiempo empleado y el costo de hacerlo en forma individual, evitando además el daño de las membranas con recurrentes rehibridizaciones.
Trabajos realizados por Góngora & Rodríguez (2000), en los que se evaluaron los patrones generados de la hibridización con sondas marcadas vía PCR de cpDNA sobre DNA total digerido y DNA de cloroplasto digerido (con Dra I en ambos casos), permitieron establecer un patrón de polimorfismo diferente entre los dos, presentándose un mayor numero de fragmentos donde se utilizaron digestiones de
DNA total. Estos resultados son bien importantes puesto que indicarían que fragmentos que solo deberían hibridizar el cpDNA al que corresponda la sonda, se estarían hibridizando en sitios diferentes del genoma nuclear o mitocondrial. Este efecto inesperado puede constituir una ventaja ya que se observa mayor información del genoma, más aun cuando se utilizan en la hibridización sondas homólogas.
Los patrones generados de la hibridización con la sonda mixta marcada de cpDNA dieron como resultado un conjunto de 32 fragmentos. Estos fueron suficientes para la separación de los grupos en subgéneros bien definidos y concordantes en la mayoría de los casos con los reportados a partir de caracteres morfológicos.
126 7.7. Arbol resultante del marcador PCR-RFLP cpDNA utilizando el coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA
La utilización de los diferentes algoritmos no presentaron variaciones drásticas en la ubicación del conjunto de accesiones analizadas.
La ubicación de las especies en el árbol (coeficiente de Jaccard y algoritmo
UPGMA) permite afirmar que este marcador generó agrupaciones que concuerdan en gran medida con lo propuesto en el trabajo de Killip (1938), a partir de caracteres morfológicos al nivel de subgéneros.
En una primera ramificación se agruparon todas las especies del subgénero
Tacsonia y los individuos de P. manicata pertenecientes al subgénero Manicata.
Estos individuos de P. manicata aparecen más cercanos a los individuos de P. mixta, P.cumbalensis y P. mathewsii que al resto de especies del subgénero
Tacsonia, una relación mas esctrecha entre P. manicata y P.mixta ya se había evidenciado por Villacís et al. (1998) cuando analizaron un conjunto de especies del Subgénero Tacsonia y del subgénero Manicata a partir de caracteres morfológicos. No obstante, en el mismo Villacís estudio se indica la separación clara existente entre estos dos subgéneros, situación que no se evidenció de forma clara en este árbol.
127 En esta primera ramificación existen otros subgrupos en los cuales se agrupan los individuos de P. mollissima y P. india, relación que ya había sido reportada por
Fajardo et al. (1998), quienes trabajando con RAPDs evidenciaron la misma agrupación de estas dos especies.
Los individuos (13), (15) y (31) de P. pinnatistipula conformaron un subgrupo independiente del resto de las especies del subgénero, posiblemente relacionado con el hecho de pertenecer a la sección Pogendorffia que difiere del resto de especies.
La segunda gran ramificación agrupa las especies pertenecientes al subgénero
Passiflora y P. foetida, representante del subgénero Dysosmia. Esta relación ya había sido reportada por Varón (2000), quien al analizar los polimorfismos presentes en la digestión de fragmentos de cpDNA, había evidenciado la agrupación de estos dos subgéneros.
Una tercera ramificación agrupó a las especies pertenecientes al subgénero
Decaloba, las cuales se ubicaron muy lejanas al resto de las otras especies evaluadas. Esto está relacionado al patrón diferencial que presentaron con relación a las demás especies, al ser cortado el fragmento TS1-TS2 con las enzimas
Hinf I y Rsa I, como antes ya había sido mencionado.
Los individuos (41) y (42) de P. arborea se agruparon más distantes del resto de las especies analizadas en este estudio, lo cual apoya lo propuesto por Killip
128 (1938), cuado afirma que esta especie fue de las primeras que se separó del resto de especies que conforman el género Passiflora, ya que aun conserva caracteres ancestrales, tales como su hábito arbóreo, solo presente en dos especies ubicadas en el mismo subgénero Astrophea.
7.8. Arbol resultante del marcador PCR-RFLP de mtDNA utilizando el coeficiente de Jaccard y el algoritmo UPGMA
No se presento diferencias significativas en la ubicación que presentaron las especies utilizando los diferentes algoritmos.
La representación gráfica obtenida con el algoritmo UPGMA y el índice de Jaccard a partir de PCR-RFLP de mtDNA, presentó una ubicación de los grupos diferente a la obtenida con el árbol de cpDNA a partir de PCR-RFLP, no obstante, se repitió el patrón de agrupación de las especies según el subgénero al que corresponden.
Esta variación estuvo directamente relacionada con la mutación, de tipo deleción, presente en la especie P. caerulea, la cual incidió de manera drástica en la ubicación de la misma (siendo la más distante en el árbol) y modificando la relación existente entre las demás especies del subgénero Passiflora y el resto de especies.
129 En términos generales las especies del subgénero Tacsonia se ubicaron en una misma ramificación, acompañadas de la especie P. manicata (subgénero
Manicata), aunque ésta presentó una relación un poco más distante con los individuos de P. mixta, P. tenerifensis y P. cumbalensis, en comparación a lo observado en el árbol anterior.
Nuevamente, los individuos de P. india y P. mollissima conservaron una más estrecha relación, hecho que concuerda con los árboles obtenidos por Fajardo et al. (1998) y Sánchez et al. (1999).
P. pinnatistipula siguió agrupándose de manera independiente y mas distante del resto de las especies del subgénero, lo cual ya había sido referenciado en el estudio de Villacís et al. (1998), en el cual ésta especie se ubico más distante de las especies del subgénero Tacsonia por ellos analizadas.
En la segunda ramificación las especies del subgénero Decaloba siguieron agrupándose de manera mas estrecha entre sí, de forma similar a lo ocurrido en el
árbol de cpDNA PCR-RFLP; pero disminuyendo la distancia con relación a la agrupación establecida con los subgéneros Astrophea y Passiflora. Esta agrupación, independiente de Decaloba, reafirmaría que este grupo posee características bien particulares que lo desligan del resto de las especies del género Passiflora. Varón
(2000) observó esta misma relación estrecha en un número menor de especies utilizando el mismo marcador.
130 P. arborea (subgénero Astrophea) fue la que más varió en su ubicación con relación a la posición que presentó en el árbol anterior, aunque siguió estando más cercana a las especies del subgénero Decaloba, la distancia en la que se relaciona disminuyó drásticamente.
Esta ubicación de P. arborea hace dudar de la eficacia de este marcador en la separación de las especies de este género, ya que las diferencias de esta especie con el resto de especies a nivel morfológico son evidentes y adicionalmente, en los otros dos árboles ésta se ubicó muy distante del resto.
Dificultades en la utilización de mtDNA para establecer relaciones filogenéticas ya habían sido reportadas para otras especies vegetales, ya que la poca variabilidad reportada en este genoma no permite una definición clara de grupos cercanos utilizando RFLP (Palmer 1994).
Las especies del subgénero Passiflora con excepción de P. caerulea siguieron conformando un grupo estrechamente relacionado. Las especies P ligularis y P. tiliifoliae, pertenecientes a la sección Tillaefoliae, establecieron una relación más estrecha entre si que con el resto de las especies del subgénero, no obstante, P. maliformis, perteneciente a la misma sección, se separó de estas dos; situación que ya había sido reportada por Varón (2000), quien encontró que P. maliformis y
P. quadrangularis presentaron un relación más estrecha en entre si, siendo estas pertenecientes a dos secciones diferentes .
131 7.9. Arbol resultante del marcador RFLP de cpDNA utilizando el coeficiente de
Jaccard y el algoritmo UPGMA
De igual forma a lo observado en los otros dos marcadores no se presentaron diferencias entre los árboles generados a partir de los algoritmo Simple, completo y UPGMA.
El árbol obtenido del análisis de los RFLPs de cpDNA con el acoeficiente de Jaccard y algoritmo UPGMA fue el más completo, no solo por el mayor número de especies analizadas, sino que a su vez presenta las variaciones existentes en una porción mayor del genoma, no restringiéndose a las presentes solo en pequeños fragmentos.
La ubicación de los subgéneros permaneció relativamente cercana a los obtenidos con PCR-RFLP de cpDNA, no obstante, se observaron algunas variaciones.
Las especies del subgénero Tacsonia se agruparon nuevamente mas relacionadas entre sí, pero no establecieron tal grado de cercanía, observado en los árboles anteriores, con el subgénero Manicata.
132 P. mollissima, que en los dos árboles anteriores se mostró más cercana con P. india, se distancia y establece una agrupación más cercana con P. tripartita; lo cual confirmaría lo observado por Villacís et al. (1998), quienes encontraron una separación bien clara entre P. mollissima y P. india, especies consideradas como iguales hasta el momento.
No obstante, estos datos se contradicen con los obtenidos por Fajardo et al.
(1998) y Sánchez et al. (1999), quienes encontraron a estas dos especies en todos los casos más relacionadas. Esta contradicción puede estar influenciada en el primer caso, por la utilización de otro tipo de marcador RAPD y en el segundo, por la utilización de sondas heterólogas
Los individuos de P. pinnatistipula siguieron conformando una agrupación más estrecha entre sí y más separada del resto de especies de este subgénero, situación que se presentó de manera reiterativa en los tres árboles y también fue reportada por Fajardo et al. (1998), Villacís et al. (1998) y Sánchez et al. (1999).
133 Los individuos de P. manicata (subgénero Manicata), que habían estado más relacionados con el subgénero Tacsonia, se ubicaron de forma independiente pero esta vez más cerca del subgénero Passiflora. Lo anterior concuerda con lo reportado por Villacis et al. (1998), quienes a partir de caracteres morfológicos encontraron diferencias significativas entre las especies del subgénero Tacsonia y
Manicata; lo cual situó a éste último distante en el análisis de componentes principales, sin embargo, es importante aclarar que en su estudio Villacis no se analizó especies del subgénero Passiflora, lo que impide realizar comparaciones entre la similitud o distancia de estos dos subgéneros.
De igual forma en los estudios que han utilizado marcadores moleculares en
Passiflora, como el de Do et al. (1992), Fajardo et al. (1998), Sánchez et al.
(1999), Rodríguez & Góngora (2000) y Varón (2000), no se incluyó al subgénero
Manicata, por tanto, la información obtenida en este trabajo es la primera que se tiene de las relaciones entre este subgénero con otros subgéneros.
Las especies pertenecientes al subgénero Passiflora establecen una estrecha relación entre sí, incluyendo a P. caerulea. Las especies P. ligularis y P. tiliifoliae tuvieron una relación mas cercana, situación que ya se había presentado en el
árbol de PCR-RFLP de mtDNA, y que estaba relacionado con la inclusión de estas especies en la misma sección, no obstante, la separación de P. maliformis fue reiterativa. Como se dijo anteriormente, este comportamiento de P. maliformis ya había sido reportado por Varón (2000), aunque contrasta con lo encontrado por
Fajardo et al. (1998) y Sánchez et al. (1999), quienes si encontraron una estrecha
134 relación entre P. maliformis y P. ligularis, pero no analizaron en sus respectivos estudios la especie P.tillifoilae.
Para esclarecer la ubicación de la especie P. maliformis y su relación con las demás especies de la sección Tillafoliae, sería recomendable analizar más individuos de P. maliformis y comparar su comportamiento con otras especies de
Tillafoliae, para determinar si este tipo de separación corresponde a una circunstancia de los dos individuos involucrados en el estudio o a una característica particular de la especie.
Nuevamente, las especies del subgénero Decaloba evaluadas presentaron una relación más estrecha entre sí; situación que no se modificó en los tres árboles y que reitera que sus características moleculares son lo suficientemente distinguibles para realizar una separación exitosa de este subgénero.
El subgénero Astrophea, representado por dos individuos de P. arborea, fue el más distante, situación que se esperaba por las diferencias que a nivel morfológico estas especies presentan con el resto de especies del género.
En la ramificación más lejana se ubicó la especie del grupo ajeno Carica pubecens, como era de esperarse; sin embargo, ésta se relacionó con los dos individuos del subgénero Astrophea, lo que indicaría la estrecha relación de los ordenes
CARICALES y PASSIFLORALES (Takhtajan 1997).
135 8. CONCLUSIONES
•Con los marcadores utilizados en este trabajo se pudo evidenciar, en la mayoría de los casos, la clara conformación de grupos bien definidos por los diferentes subgéneros.
•La información recogida del marcador RFLP de cpDNA fue la mas completa no solo por el mayor número de accesiones analizadas, sino también, por que las relaciones que se establecieron entre las especies correspondieron de forma mas clara con lo propuesto en otros trabajos realizados con antelación en Passiflora.
•La implementación de la sonda mixta marcada homologa de cpDNA generó un número de fragmentos suficientes para establecer las relaciones entre las especies evaluadas. Permitiendo adicionalmente una reducción en el tiempo y los costos invertidos en el proceso de hibridización
•Las relaciones obtenidas del análisis de mtDNA PCR-RFLP fueron las que mas discrepancias presentaron con las obtenidas de caracteres morfológicos y moleculares de otros trabajos, posiblemente relacionado con la deleción presente en P. caerulea la cual tuvo una incidencia drástica en la conformación que asumió el árbol.
•Las especies del subgénero Tacsonia establecieron una relación más estrecha con las especies del subgénero Manicata con los marcadores PCR-RFLP de cpDNA y
137 mtDNA, no obstante, al analizar una porción más amplia del genoma con el marcador RFLP de cpDNA tal relación no se mantuvo.
•La agrupación establecida por las especies del subgénero Passiflora también se mantuvo independiente de las demás especies del género analizadas. Sin embargo, las relaciones internas entre ellas (diferentes secciones) no se encuentra del todo esclarecido
•El subgénero Decaloba presentó características particulares en todos los marcadores, situación que permitió la agrupación siempre constante de las especies analizadas.
•Los individuos de P. arborea (subgénero Astrophea) fueron los que se establecieron más distantes del resto de las especies del género Passiflora lo cual ratifica que las características morfológicas (hábito arbóreo) si tienen una relación con la información molecular.
•No se presentó variaciones interespecíficas en el tamaño de los fragmentos PC1-
PC2 y TS1 - TS2 de cpDNA y N41-N41 de mtDNA en las muestras al ser comprado con el obtenido en la especie modelo P. edulis.
•En el fragmento N1B-N1C si se evidenciaron variaciones en el tamaño del fragmento en varias especies, la deleción presente en P.caerulea incidió
138 drásticamente en la ubicación que presentó esta especies en el árbol resultante de
PCR-RFLP de mtDNA.
•En la digestión de los fragmentos de mtDNA la enzima Rsa I fue la que presentó un mayor número de fragmentos polimórficos.
•El protocolo de maxi-prep, de los dos evaluados, fue el que mostró una mayor eficiencia en la cuantificación y adicionalmente el DNA obtenido de este fue el que menos inconvenientes presentó al ser utilizado en amplificaciones y digestiones.
Este protocolo demostró ser eficiente cuando se cuenta con suficiente material vegetal y tiempo para su realización. La utilización del protocolo de mini-prep es recomendable cuando se necesita aislar el DNA una gran cantidad de muestras en un corto tiempo y/o cuando no se dispone de gran cantidad de material vegetal.
•La comparación de los resultados obtenidos de este estudio y los que desarrollan por los investigadores de CIRAD/FLHOR - IPGRI, sobre el mismo conjunto de especies, permitirá realizar una aproximación mucho mas concreta de las relaciones filogenéticas.
139 9. RECOMENDACIONES
•Comparar los resultados moleculares obtenidos en este estudio con los generados a partir de caracteres morfologicos que se vienen realizando con las mismas especies por los investigadores de CIRAD/FHLOR-IPGRI, para de esta forma complentar la información.
•Evaluar más individuos de la especie P. caerulea con el fin de establecer si la deleción observada en el fragmento mitocondrial N1B-N1C corresponde a una característica propia del ancestro de la especie o es un evento propio del genotipo analizado.
•Evaluar más individuos de la espcie P. maliformis para confirmar la separación de los individuos de P. ligularis y P. tiliifoliae pertenecientes a la sección Tilliafoliae.
•Utilizar especies pertenecientes a otros subgéneros que permitan establecer nuevas relaciones.
140 10. BIBLIOGRAFIA
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151 ANEXO No 1.
Protocolo de extracción de DNA mediante Mini-Prep (Góngora & Hodson 1996):
1. Colectar 20mg de tejido foliar fresco haciendo presión con la tapa de un tubo eppendorf de 1500µl. 2. Macerar el tejido durante 15 segundos en 100µl de buffer de extracción . 3. Adicionar 300µl de buffer de extracción y continuar macerando 4. Llevar al vortex por 5 segundos. 5. Centrifugar por 10 minutos a 11800 rpm. 6. Transferir 300µl del sobrenadante a otro tubo y adicionar 300µl de isopropanol. 7. Incubar a temperatura ambiente por 5 – 10 minutos. 8. Centrifugar por 5 minutos a 11800 rpm 9. Desechar el sobrenadante y adicionar 500µl de etanol 70% y mezclar suavemente. 10. Desechar el sobrenadante, adicionar 50 µl de TE o Agua bidestilada, desionizada y autoclavada.
153 Anexo No. 2
Cuantificación del aislamiento mediante el Protocolo de Maxi-prep.
No. de Campo Nombre de la Especie Peso Muestra / g Eficiencia del asilamiento en ng/ul 1 ″ luzmarina″ 0 0 2 P mathewsii 0 0 3 P cumbalensis 1 10 4 P mollissima 1 20 5 P india 1 30 6 P mollissima 1 30 7 P india 1 20 8 P mollissima 1 20 9 P mixta 1 40 10 P mixta 1 60 11 P pinnatistipula 1 60 12 P tenerifensis 1 40 13 P pinnatistipula 1 40 14 P manicata 1 40 15 P pinnatistipula 1 10 16 P mollissima 1 40 17 P mixta 1 60 18 P manicata 1 10 19 P manicata 1 60 20 P antioquensis 1 20 21 P mixta 1 100 22 P india 1 60 23 P india 1 30 24 P india 1 10 25 P mixta 1 100 26 P india 1 60 27 P india 1 40 28 P india 1 40 29 P tripartita 1 40 30 P manicata 1 30 31 P pinnatistipula 1 30 32 P biflora 1 30 33 P maliformis 1 10 34 P edulis 1 40 35 P adenopoda 1 60 36 P tiliifoliae 1 10 37 P ligularis 1 10 38 P edulis 1 30 39 P ligularis 1 40 40 P tiliifoliae 1 60 41 P arbprea 1 30 42 P arborea 1 60 43 P edulis 1 60 44 P edulis 1 60 45 P. cuspidifolia 1 40 46 P. bicuspidata 1 40 47 P. bogotensis 1 100 48 P. foetida 1 5 49 P. caerulea 1 60 50 P. quadrangularis 1 60 51 P. tiliifoliae 1 30 52 P. ligularis 1 100 53 P. maliformis 1 60 54 Carica sp 1 60 55 P. manicata 1 20 56 P. bogotensis 1 40
ul: microlitros; ng:: nanogramos; g: gramos.
Anexo No. 3
154 Cuantificación del aislamiento mediante el Protocolo de Mini-prep.
No. De Campo Nombre de la Especie Peso muestra/ mg Eficiencia del asilamiento en ng/ul 1 ″ luzmarina″ 0,8 4 2 P mathewsii 18 8 3 P cumbalensis 20 10 4 P mollissima 20 1 5 P india 20 10 6 P mollissima 20 10 7 P india 20 20 8 P mollissima 20 40 9 P mixta 20 40 10 P mixta 20 40 11 P pinnatistipula 20 10 12 P tenerifensis 20 10 13 P pinnatistipula 20 20 14 P manicata 20 60 15 P pinatistipula 20 40 16 P mollissima 20 4 17 P mixta 20 10 18 P manicata 20 0 19 P manicata 20 10 20 P antioquensis 20 10 21 P mixta 20 10 22 P india 20 0 23 P india 20 20 24 P india 20 10 25 P mixta 20 10 26 P india 20 10 27 P india 20 10 28 P india 20 10 29 P tripartita 20 40 30 P manicata 20 40 31 P pinnatistipula 20 4 32 P biflora 20 40 33 P maliformis 20 60 34 P edulis 20 2 35 P adenopoda 20 20 36 P tiliifoliae 20 4 37 P ligularis 20 20 38 P edulis 20 60 39 P ligularis 20 60 40 P tiliifoliae 20 10 41 P arbprea 20 10 42 P arborea 20 10 43 P edulis 20 10 44 P edulis 20 60 45 P. cuspidifolia 20 60 46 P. bicuspidata 20 4 47 P. bogotensis 20 4 48 P. foetida 20 4 49 P. caerulea 20 4 50 P. quadrangularis 20 4 51 P. tiliifoliae 20 10 52 P. ligularis 20 4 53 P. maliformis 20 20 54 Carica sp 20 20 55 P. manicata 20 4 56 P. bogotensis 20 4 ul: microlitros; ng:: nanogramos; mg: miligramos.
155 Anexo No. 4 Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de cpDNA PC1-PC2
No. De Campo Nombre de la Especie Eficiencia de la Amplificación en ng/ul 1 ″ luzmarina″ 40 2 P mathewsii 40 3 P cumbalensis 20 4 P mollissima 10 5 P india 0 6 P mollissima 40 7 P india 40 8 P mollissima 40 9 P mixta 60 10 P mixta 20 11 P pinnatistipula 0 12 P tenerifensis 40 13 P pinnatistipula 40 14 P manicata 40 15 P pinnatistipula 10 16 P mollissima 20 17 P mixta 40 18 P manicata 40 19 P manicata 10 20 P antioquensis 20 21 P mixta 0 22 P india 40 23 P india 10 24 P india 40 25 P mixta 10 26 P india 20 27 P india 10 28 P india 0 29 P tripartita 0 30 P manicata 10 31 P pinnatistipula 40 32 P biflora 40 33 P maliformis 40 34 P edulis 10 35 P adenopoda 20 36 P tiliifoliae 10 37 P ligularis 20 38 P edulis 60 39 P ligularis 0 40 P tiliifoliae 40 41 P arbprea 40 42 P arborea 40 43 P edulis 60 44 P edulis 60 45 P. cuspidifolia 60 46 P. bicuspidata 60 47 P. bogotensis 100 48 P. foetida 100 49 P. caerulea 60 50 P. quadrangularis 40 51 P. tiliifoliae 100 52 P. ligularis 20 53 P. maliformis 60 54 Carica sp 60 55 P. manicata 20 56 P. bogotensis 40
156 Anexo No. 5
Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de cpDNA TS1-TS2
No. De Campo Nombre de la Especie Eficiencia de la Amplificación en ng/ul 1 ″ luzmarina″ 10 2 P mathewsii 20 3 P cumbalensis 10 4 P mollissima 10 5 P india 0 6 P mollissima 40 7 P india 40 8 P mollissima 40 9 P mixta 0 10 P mixta 40 11 P pinnatistipula 0 12 P tenerifensis 40 13 P pinnatistipula 60 14 P manicata 10 15 P pinnatistipula 20 16 P mollissima 10 17 P mixta 10 18 P manicata 20 19 P manicata 40 20 P antioquensis 10 21 P mixta 20 22 P india 0 23 P india 40 24 P india 20 25 P mixta 20 26 P india 20 27 P india 0 28 P india 0 29 P tripartita 0 30 P manicata 0 31 P pinnatistipula 40 32 P biflora 40 33 P maliformis 40 34 P edulis 10 35 P adenopoda 20 36 P tiliifoliae 10 37 P ligularis 40 38 P edulis 60 39 P ligularis 0 40 P tiliifoliae 20 41 P arbprea 10 42 P arborea 10 43 P edulis 10 44 P edulis 60 45 P. cuspidifolia 60 46 P. bicuspidata 60 47 P. bogotensis 100 48 P. foetida 0 49 P. caerulea 20 50 P. quadrangularis 20 51 P. tiliifoliae 40 52 P. ligularis 0 53 P. maliformis 60 54 Carica sp 0 55 P. manicata 10 56 P. bogotensis 0
157 Anexo No 6 Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de mtDNA N41-N42
No. De Campo Nombre de la Especie Eficiencia de la Amplificación en ng/ul 1 ″ luzmarina″ 40 2 P mathewsii 0 3 P cumbalensis 20 4 P mollissima 20 5 P india 0 6 P mollissima 40 7 P india 0 8 P mollissima 40 9 P mixta 60 10 P mixta 60 11 P pinnatistipula 0 12 P tenerifensis 60 13 P pinnatistipula 100 14 P manicata 100 15 P pinnatistipula 100 16 P mollissima 60 17 P mixta 20 18 P manicata 100 19 P manicata 100 20 P antioquensis 20 21 P mixta 60 22 P india 0 23 P india 40 24 P india 40 25 P mixta 0 26 P india 20 27 P india 40 28 P india 10 29 P tripartita 10 30 P manicata 40 31 P pinnatistipula 100 32 P biflora 0 33 P maliformis 100 34 P edulis 40 35 P adenopoda 60 36 P tiliifoliae 30 37 P ligularis 60 38 P edulis 100 39 P ligularis 40 40 P tiliifoliae 60 41 P arbprea 60 42 P arborea 60 43 P edulis 60 44 P edulis 100 45 P. cuspidifolia 100 46 P. bicuspidata 100 47 P. bogotensis 100 48 P. foetida 100 49 P. caerulea 100 50 P. quadrangularis 100 51 P. tiliifoliae 100 52 P. ligularis 30 53 P. maliformis 100 54 Carica sp 100 55 P. manicata 60 56 P. bogotensis 0
158 Anexo No. 7
Cuantificación de la Amplificación realizada en el fragmento de mtDNA N1B-N1C
No. De Campo Nombre de la Especie Eficiencia de la Amplificación en ng/ul 1 ″ luzmarina″ 0 2 P mathewsii 0 3 P cumbalensis 10 4 P mollissima 20 5 P india 0 6 P mollissima 40 7 P india 40 8 P mollissima 40 9 P mixta 40 10 P mixta 60 11 P pinnatistipula 0 12 P tenerifensis 60 13 P pinnatistipula 20 14 P manicata 0 15 P pinnatistipula 40 16 P mollissima 20 17 P mixta 20 18 P manicata 0 19 P manicata 10 20 P antioquensis 40 21 P mixta 20 22 P india 0 23 P india 10 24 P india 40 25 P mixta 0 26 P india 40 27 P india 20 28 P india 10 29 P tripartita 0 30 P manicata 0 31 P pinnatistipula 10 32 P biflora 20 33 P maliformis 40 34 P edulis 40 35 P adenopoda 40 36 P tiliifoliae 40 37 P ligularis 20 38 P edulis 40 39 P ligularis 0 40 P tiliifoliae 40 41 P arbprea 40 42 P arborea 100 43 P edulis 100 44 P edulis 100 45 P. cuspidifolia 100 46 P. bicuspidata 100 47 P. bogotensis 60 48 P. foetida 40 49 P. caerulea 60 50 P. quadrangularis 60 51 P. tiliifoliae 60 52 P. ligularis 0 53 P. maliformis 40 54 Carica sp 40 55 P. manicata 10 56 P. bogotensis 0
159 Anexo No 8 Digestión del Fragmento PC1-PC2 m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m
(A) m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (B)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 m
m 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 (C)
(A) Digestión del Fragmento PC1-PC2 con la enzima Hae III(B), Digestión del Fragmento PC1-PC2 con la enzima Cfo I y (C) Digestión del Fragmento PC1- PC2 con la enzima Rsa I m= 100bp ladder
160 Anexo No 9 Digestión del Fragmento TS1-TS2
m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (A) m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (B)
m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 1 5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (C)
(A) Digestion del Fragmento TS1-TS2 con la enzima Hinf I, (B) Digestion del Fragmento TS1-TS2 con la enzima Hpa II y (C) Digestion del Fragmento TS1- TS2 con la enzima Rsa I.
161 m= 100bp Ladder
Anexo No 10 Digestión del Fragmento N41-N42
m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 m 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 m 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (A) m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 1 5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (B)
m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 1 5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m
(C)
162 (A) Digestion del Fragmento N41-N42 con la enzima Hinf I, (B)Digestion del Fragmento N41-N42 con la enzima Hae III y (C) Digestion del Fragmento N41- N42 con la enzima Cfo I m= 100bp ladder
m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 1 5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m
D) m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m m
(E) (D) Digestion del Fragmento N41-N42 con la enzima Rsa I y (E) Digestion del Fragmento N41-N42 con la enzima Taq I
m= 100 bp ladeer
163 Anexo No 11 Digestión del Fragmento N1B-N1C
m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (A) m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (B) m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m
(C)
(A) Digestion del Fragmento N1B-N1C con la enzima Hinf I, (B) Digestion del Fragmento N1B-N1C con la enzima Hae III y (C) Digestion del Fragmento N1B-N1C con la enzima Cfo I m= 100bp ladder
164 m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m (D)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6 m
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m
(E) m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 m 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2 6
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 m 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 m
(F)
(D) Digestion del Fragmento N1B-N1C con la enzima Rsa I, (E) Digestion del Fragmento N1B-N1C con la enzima Taq I y (F) Digestion del Fragmento N1B-N1C con la enzima Hpa II m= 100bp ladder
165 ANEXO No 12.
Modelo de digestión de las muestras con la enzima Dra I
M1 M2 MUESTRAS
(M1) = λ digerido con Hind III / Eco RI
(M2) = Marcador de 1 Kb
166 ANEXO No. 13
Matriz binaria de Presencia / Ausencia obtenida del análisis PCR-RFLP de cpDNA
Presencia / Ausencia de Bandas P. mathewsii 2 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. cumbalensis 3 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. india 5 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 P. mollissima 6 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. india 7 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. mollissima 8 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. mixta 9 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. mixta 10 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. tenerifensis 12 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 P. pinnatistipula 13 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. manicata 14 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. pinnatistipula 15 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. mixta 17 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. manicata 18 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. manicata 19 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. mixta 21 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. india 22 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. india 23 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. india 24 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. mixta 25 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. india 26 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 P. pinnatistipula 31 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. biflora 32 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 P. maliformis 33 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. adenopoda 35 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 P. tiliifoliae 36 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 P. ligularis 37 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 P. edulis 38 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 P. tiliifoliae 40 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 P. arborea 41 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 P. arborea 42 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 P. edulis 43 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 P. edulis 44 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 P. cuspidifolia 45 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 P. bicuspidata 46 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 P. bogotensis 47 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 P. foetida 48 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. caerulea 49 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 P. quadrangularis 50 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 P. tiliifoliae 51 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0
167 ANEXO No. 14
Matriz binaria de Presencia / Ausencia obtenida del análisis PCR-RFLP de mtDNA
P. cumbalensis 3 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mollissima 4 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mollissima 6 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. india 7 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mollissima 8 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mixta 9 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mixta 10 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. tenerifensis 12 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. pinnatistipula 13 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 P. pinnatistipula 15 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 P. mollissima 16 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mixta 17 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. manicata 18 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mixta 21 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. india 23 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. mixta 25 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. india 26 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. india 28 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 P. biflora 32 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 P. maliformis 33 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 P. edulis 34 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 P. adenopoda35 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 P. tiliifoliae 36 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 P. ligularis 37 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 P. edulis 38 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 P. ligularis 39 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 P. tiliifoliae 40 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 P. arborea 42 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 P. edulis 43 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 P. edulis 44 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 P. cuspidifolia 45 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 P. bicuspidate 46 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 P. bogotensis 47 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 P. caerulea 49 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 P. quadrangularis 50 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 P. tiliifoliae 51 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0
168
ANEXO No.15
Matriz binaria de Presencia / Ausencia obtenida del análisis RFLP cpDNA
P. cumbalensis 3 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mollissima 4 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. india 5 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mollissima 6 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. india 7 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mollissima 8 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mixta 9 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mixta 10 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. pinnatistipula 11 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 P. tenerifensis 12 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. pinnatistipula 13 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 P. manicata 14 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. pinnatistipula 15 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 P. mollissima 16 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mixta 17 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. manicata 18 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. manicata 19 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mixta 21 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. india 23 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. india 24 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. mixta 25 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. india 26 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. india 27 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. india 28 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. tripartita 29 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. manicata 30 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. pinnatistipula 31 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 P. biflora 32 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 P. maliformis 33 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. edulis 34 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. adenopoda 35 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 P. Ligularis 37 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. edulis 38 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. tiliifoliae 40 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. arborea 41 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 P. arborea 42 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 P. edulis 43 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. edulis 44 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. cuspidifolia 45 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 P. bogotensis 47 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 P. caerulea 49 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. quadrangularis 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. tiilifoliae 51 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. ligularis 52 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. maliformis 53 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Carica sp. 54 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 P. manicata 55 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 P. bogotensis 56 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0
168 Relaciones Filogenéticas de especies del género Passiflora (PASSIFLORACEAE) con énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP y PCR-RFLP
Juan David Vargas Alonso
Director Gustavo Góngora Unidad de Biotecnología Vegetal Pontificia Universidad Javeriana INTRODUCCION MARCO TEORICO Ubicación Taxonómica
Clase MAGNOLIOPSIDA Subclase DILLENIDAE Super-Orden VIOLANAE Orden Passiflorales Familia PASSIFLORACEAE Tribu Passiflorieae Género Passiflora
(Takhtajan1997). Género: Passiflora
Subgénero: Passiflora Especies: P. edulis, P. maliformis, P. caerulea, P. quadrangularis,P. tiliifoliae, P. ligularis.
Subgénero: Tacsonia Especies: P. mollisima, P. mathewsii, P. india, P. mixta, P. pinnatistipula, P. tenerifensis, P. antioquensis, P. tripartita, ¨luzmarina¨ P. cumbalensis. Subgénero: Decaloba Especies: P. biflora, P. bicuspidata, P. cuspidifolia, P. bogotensis, P. adenopoda
Subgénero: Manicata Especie: P. manicata
Subgénero: Dysosmia Especie: P. foetida
Subgénero: Astrophea Especie: P. arborea Importancia del género Passiflora
Agronómica
Farmacéutica
Ornamental
Ecológica
Estudios a partir de caracteres morfológicos en Passiflora
Antecedentes Killip 1938
Holm Nielsen 1974, 1988.
Mac Dougal 1983, 1993.
Escobar 1988, 1991
Villacis et al. (1998) Estudios a partir de caracteres moleculares en Passiflora
Antecedentes Do et al. (1992)
Fajardo et al. (1998)
Sánchez et al. (1999)
Varón (2000)
Rodríguez & Góngora (2000) Genomas de la Planta
DNA Nuclear
DNA de Cloroplasto
DNA Mitocondrial DNA de Cloroplasto
• Consiste en un cromosoma circular de 120 a 217 kb • Presencia de dos regiones invertidas. • El genoma de cloroplasto varia en tamaño, estructura y contenido génico en la mayoría de las espcies. • Las modificaciones presentes en este genoma se han encontrado relacionadas con la sustituciones nucleotidicas y reareglos. • La mas alta tasa de sustitución nucleotidica de los tres genomas de plantas. • Es el DNA más utilizado en la literatura en trabajos de sistemática molecular. • Determinación de la secuencia completa del genoma en por lo menos cuatro espcies. DNA Mitocondrial
• Genoma circular de doble cadena de 200 a 2400 kb, dichas variaciones tan drásticas en el tamaño, estan dadas principalmente por la gran cantidad de regiones repetidas no codificantes y la presencia de DNA exógeno. • De los tres diferentes tipos de DNA presentes en las plantas presenta los menores valores de sustitución nucleotídica. • Algunos investigadores han reportado la presencia de secuencias de cpDNA • Una alta tasa de rearreglos que involucran grandes porciones del genoma JUSTIFICACION Problema de Investigación
¿ Cuales son las relaciones filogeneticos obtenidas de la utilizacion de los marcadores moleculares RFLP y PCR RFLP y cual es la relación que establecen con las obtenidas a partir de caracteres morfológicos? • Dificultades en la ubicación taxonomica de algunas espcies, he incluso de la misma familia. • El conocimiento actual de la Passifloras se centra en la información generada con base en los caracteres morfológicos. • Aportar nueva información sobre la posibles relaciones filogenéticas apartir de marcadores moleculares PCR- RFLP y RFLP. • Integrar esta información con la obtenida en los trabajos que se vienen realizando, sobre las mismas espcies, por investigadores de CIRAD-FHLOR/IPGRI a partir de caracteres morfológicos. • Información básica para la generación de estrategias de manejo y conservación de colecciones de germoplasma. OBJETIVOS General
Establecer las relaciones filogenéticas de especies del género Passiflora a partir de PCR-RFLP y RFLP de regiones de DNA mitocondrial y de cloroplasto Especificos
Seleccionar especies del género Passiflora que se encuentran en colecciones de germoplasma ya establecidas y realizar el aislamiento de DNA total a partir de tejido foliar.
Amplificar diferentes secuencias específicas de cpDNA y mtDNA en las especies seleccionadas y digerirlas con enzimas de restricción.
Digerir el DNA total e hibridizarlo con sondas homólogas de Passiflora.
Determinar las relaciones filogenéticas con los datos moleculares obtenidos y compararlos con estudios previamente realizados. MATERIALES Y METODOS Tipo de Estudio
Población de Estudio y Muestra
Material Vegetal A B ubicación de los sitios de recolección de las muestras (A) Tenerife, Valle del Cauca y (B) Santafé de Bogotá. Aislamiento del DNA
• Protocolo de Maxi- prep (Doyle & Doyle 1990)
• Protocolo de Mini-prep (Góngora & Hodson 1996) PCR-RFLP ThThee PPoollymerymerasease ChaChainin ReaReacctiontion PCRPCR
Región especifica del DNA
Macerar la muestra Muestra de Tejido y extraer el DNA Amplificación de la región Foliar en el termociclador
Visualización de los fragmentos amplificados en un gel de agarosa (una copia sencilla y limpia debera ser obtenida por reacción) Muchas copias de la región especifica Amplificación de las regiones de cpDNA y mtDNA
• Se realizaron siguiendo los protocolos propuestos por Taberlet (1991), Demesure (1995) y Varón (2000).
• Regiones Amplificadas
• Componentes de la reacción
• Ciclos de Amplificación Regiones amplificadas de cpDNA y mtDNA
P rim e r D N A q u e R e g ió n E s p e c ífic a A m p lific a
P C 1 -P C 2 C lo ro p la s to p s b C (p s II 4 4 k d P ro te in )-trn S (tR N A -S e r (U G A )) T S 1 -T S 2 C lo ro p la s to trn S (tR N A -S e r)-trn fM (tR N A - fM e t(C A U )) N 4 1 -N 4 2 M ito c o n d ria n a d 4 E x o n 1 - n a d 4 E x o n 2 N 1 B -N 1 C M ito c o n d ria n a d 1 E x o n B - n a d 1 E x o n C
Componentes de la reacción de Amplificación
Componentes PC1-PC2 TS1-TS2 N41-N42 N1B-N1C
DNA 1ul 1ul 1ul 1ul Buffer 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul
MgCl2 2 ul 1ul 1ul 1ul dNTPs 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul Primer A 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul Primer B 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul Enzima 0,15ul 0,15ul 0,15ul 0,15ul
H2O 13.85 ul 14.85ul 14.85ul 14.85ul Ciclos de Amplificación
Predenaturación: 4 minutos a 94ºC Denaturación: 1 minuto a 94ºC X 30 ciclos Anneling: PC1-PC2 57ºC, TS1-TS2 62ºC, N41-N42 60ºC y N1B-N1C 62ºC 1 minuto X 30 ciclos Síntesis: 4 minutos a 72ºC X 30 ciclos Síntesis Final: 10 minutos a 72ºC Digestión de los fragmentos amplificados de cpDNA y mtDNA
E n z im a S itio d e R e c o n o c im ie n to C fo I G C G C H a e III G G C C H in f I G A N T C H p a II C C G G R s a I G T A C T a q I T C G A
PPCR-RFLPCR-RFLP
Producto de PCR Digestión con enzimas de Visualización de los fragmentos restricción en un gel de agarosa
10100100101 10010100000 10000000000 10001111100
Construcción de la matriz Construcción del de presencia / ausencia Electroforegrama RFLP Digestión del DNA total para el marcador RFLP
Las digestiones del DNA total de las muestras se realizó con la enzima Dra I, para las condiciones propias del proceso de digestión se siguieron las recomendadas por el fabricante. Marcaje de la Sonda Mixta Los fragmentos utilizados como sondas fueron marcados con digoxigenina vía PCR
Primers Región Especifica Tº Anneling J1-J2 Espaciador trnT (UGU) –trnL (UAA) 55 °C J3-J4 Intrón trnL (UAA) 55 °C J5-J6 Espaciador trnL (UAA) –trnF (GAA) 55 °C TS1-TS2 trnS (tRNA – Ser(UGA)) – trnfM (tRNA – 62 °C fMet (CAU)) TT1-TT2 trnS (tRNA-Ser (GGA)) – trnT (tRNA-Thr 57.5 °C (UGU)) PC1-PC2 psbC (psII 44kd protein) - trnS (tRNA-Ser 57 °C (UGA)) Restriction Fragment Length Polymorphisms RFLP
DNA digerido Southern Blot DNA extraído Transferencia Muestra foliar con la Dra I Separación de los fragmentos en gel de agarosa
10100100101 10010100000 10000000000 Hibridizar la 10001111100 membrana de nylon Con la sonda mixta Revelar la autoradiografía Construcción de la matriz Construcción del y visualizar los Electroforegrama de presencia/ausencia fragmentos generados Relaciones Filogenéticas
• La presencia o ausencia de fragmento de restricción se codificaron como 1 y 0 respectivamente.
• Las matrices de similitud se obtuvieron mediante la utilización del coeficiente de Jaccard.
• Para la obtención de los dendrogramas se utilizó el algoritmo UPGMA. RESULTADOS Y DISCUSIONES Aislamiento de las Accesiones
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 m
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 m Amplificación de los fragmentos de cpDNA PC1-PC2 89% (1568 bp) 30-60ng/ul TS1-TS2 77% (1319 bp) 20-30ng/ul N41-N42 86% (2276 bp) 40-60 ng/ul N1B-N1C 77% (1790 bp) 30 –40 ng/ul Digestión de los fragamentos amplificados de cpDNA y mtDNA
• PC1-PC2 Hinf I, Cfo I, Hae III y Rsa I • TS1-TS2 Hinf I, Hpa II y Rsa I • N41-N42 Hinf I, Cfo I, Hae III, Rsa I y Taq I. • N1B-N1C Hinf I, Cfo I, Hpa II, Hae III, Rsa I y Taq I.
mp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 mp 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 pm 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 pm Hibridización con la sonda mixta y generación de los fragmentos de restricción CONCLUSIONES • Con los marcadores utilizados en este trabajo se pudo evidenciar, en la mayoría de los casos, la clara conformación de grupos bien definidos en diferentes subgéneros.
• La información recogida del marcador RFLP de cpDNA fue la mas completa no solo por el mayor número de accesiones analizadas, sino también, por que las relaciones que se establecieron entre las especies correspondieron de forma mas clara con lo propuesto en otros trabajos realizados con antelación en Passiflora • La implementación de la sonda homologa mixta de cpDNA generó un número de fragmentos suficientes para establecer las relaciones entre las especies evaluadas, permitiendo una reducción en el tiempo y los costos invertidos en el proceso de hibridización
• Las relaciones obtenidas del análisis de mtDNA PCR- RFLP fueron las que mas discrepancias presentaron con las obtenidas de caracteres morfológicos y moleculares de otros trabajos, posiblemente relacionado con la deleción presente en P. caerulea la cual tuvo una incidencia drástica en la conformación que asumió el árbol. • Las especies del subgénero Tacsonia establecieron una relación más estrecha con las especies del subgénero Manicata con los marcadores PCR-RFLP de cpDNA y mtDNA, no obstante, al analizar una porción más amplia del genoma con el marcador RFLP de cpDNA tal relación no se mantuvo.
• La agrupación establecida por las especies del subgénero Passiflora se mantuvo independiente de las demás especies del género analizadas. Sin embargo, las relaciones internas entre ellas (diferentes secciones) no se encuentran del todo esclarecidas • El subgénero Decaloba presentó características moleculares particulares en todos los marcadores, situación que permitió la agrupación siempre constante de las especies analizadas.
• Los individuos de P. arborea (subgénero Astrophea) fueron los que se establecieron más distantes del resto de las especies del género Passiflora lo cual confirman que las características morfológicas (hábito arbóreo) si tienen una relación con la información molecular. • No se presentó variaciones interespecíficas en el tamaño de los fragmentos PC1-PC2 y TS1 - TS2 de cpDNA y N41-N41 de mtDNA en las muestras al ser comprado con el obtenido en la especie modelo P. edulis.
• En el fragmento N1B-N1C si se evidenciaron variaciones en el tamaño del fragmento en varias especies, la deleción presente en P.caerulea incidió drásticamente en la ubicación que presentó esta especies en el árbol resultante de PCR-RFLP de mtDNA. • La comparación de los resultadosobtenidos de este estudio y los quedesarrollan por investigadores de CIRAD/FLHOR - IPGRI, sobre el mismo conjunto de especies, permitirá realizar una aproximación mucho mas concreta de las relaciones filogenéticas del género. RERECCOMOMEENNDACDACIIONEONESS • Comparar los resultados moleculares obtenidos en este estudio con los generados a partir de caracteres morfologicos que se vienen realizando con las mismas especies por los investigadores de CIRAD/FHLOR-IPGRI, para de esta forma complentar la información.
• Evaluar más individuos de la especie P. caerulea con el fin de establecer si la deleción observada en el fragmento mitocondrial N1B-N1C corresponde a una característica propia del ancestro de la especie o es un evento propio del genotipo analizado. • Evaluar más individuos de la espcie P. maliformis para confirmar la separación de los individuos de P. ligularis y P. tiliifoliae pertenecientes a la sección Tilliafoliae.
• Utilizar especies pertenecientes a otros subgéneros que permitan establecer nuevas relaciones. AGRADECIMIENTOS