Relaciones Filogenéticas de especies del género Passiflora (Passifloraceae) con énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP y PCR-RFLP JUAN DAVID VARGAS ALONSO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título BIOLOGO GUSTAVO GONGORA F. Director PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA Santafé de Bogotá, D.C. Noviembre del 2000 Relaciones Filogenéticas de especies del género Passiflora (Passifloraceae) con énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP y PCR-RFLP JUAN DAVID VARGAS ALONSO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA, D.C. NOVIEMBRE 2000 Relaciones Filogenéticas de especies del género Passiflora (Passifloraceae) con énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP y PCR-RFLP JUAN DAVID VARGAS ALONSO DIRECTOR ____________________________________ GUSTAVO A. GONGORA F. JURADO ____________________________________ DIANA ALVAREZ JURADO ____________________________________ JOSE SALVADOR MONTAÑA DECANO ACADEMICO ____________________________________ DR. CARLOS CORREDOR DIRECTORA DE CARRERA ____________________________________ LUZ MERCEDES SANTAMARIA DEDICATORIA A mi familia por su compañía y apoyo... AGRADECIMIENTOS A la Unidad de Biotecnología por acogerme en su grupo A mi director de tesis por su constante guía y apoyo en el desarrollo del trabajo A Ursula y Carolina por su amistad incondicional. A mi madre y a mi hermano Luis Miguel por darme su apoyo en todo momento. A la energía superior..... vi NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución No. 13 de Julio de 1946: “ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus Tesis de Grado”. RESUMEN Se presentan los resultados de la utilización de los marcadores PCR-RFLP de cpDNA, PCR-RFLP de mtDNA y RFLP de cpDNA sobre 55 accesiones pertenecientes al género Passiflora, con el fin de realizar una propuesta sobre las posibles relaciones filogenéticas entre las especies. El árbol resultante de la utilización del marcador RFLP de cpDNA fue el que mas concordancia presentó con los arreglos realizados, previamente por otros investigadores, a partir de caracteres morfológicos. En el genoma mitocondrial se logro establecer la presencia de una mutación de tipo deleción en la especie P. caerulea, en el intrón ubicado entre los exones B y C del gen nad 1, la cual incidió de forma drástica en la ubicación de la misma en el árbol y modifico en gran medida las relaciones establecidas entre las otras especies, en particular las pertenecientes a los subgéneros Passiflora, Decaloba y Astrophea. Las especies del subgénero Decaloba se agruparon siempre juntas en los tres tipos de marcadores, lo que indicó que existen suficientes diferencias a nivel molecular que permite su separación del resto de especies del género Passiflora analizadas. P. arborea (subgénero Astrophea) fue la especie que se estableció mas distante del resto de especies analizadas, lo cual concuerda con las diferencias a nivel morfológico entre esta y el resto de especies del género. TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 1 2. MARCO TEORICO 3 2.1. Ubicación Taxonómica del Orden Passiflorales 3 2.1.1 Tratamiento Taxonómico 3 2.1.2. Descripción Taxonómica 3 2.1.3. Distribución 4 2.2. Ubicación Taxonómica de la Familia Passifloraceae 4 2.2.1. Tratamiento Taxonómico 4 2.2.2. Descripción Taxonómica 5 2.2.3. Distribución General 6 2.2.4. Distribución en Colombia 7 2.3. Ubicación Taxonómica del Género Passiflora 8 2.3.1. Tratamiento Taxonómico 8 2.3.2. Descripción Taxonómica 8 2.3.3. Distribución General 9 2.3.4. Distribución en Colombia 9 2.4 Especies Involucradas en el Estudio 10 2.4.1. Subgénero Tacsonia 10 2.4.1.1. Passiflora pinatistipula Cav. 10 2.4.1.1.1. Descripción 10 2.4.1.1.2. Distribución 11 2.4.1.2. Passiflora cumbalensis (Karsten) 12 2.4.1.2.1. Descripción 12 2.4.1.2.2. Distribución 13 2.4.1.3. Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey. 13 2.4.1.3.1. Descripción 13 2.4.1.3.2. Distribución 14 2.4.1.4. Passiflora mixta L.. 15 2.4.1.4.1. Descripción 15 2.4.1.4.2. Distribución 16 2.4.1.5. Passiflora mathewsii (Mast.) Killip. 17 2.4.1.5.1. Descripción 17 2.4.1.5.2. Distribución 17 2.4.1.6. Passiflora tripartita (Juss.) 18 2.4.1.6.1. Descripción 18 2.4.1.6.2. Distribución 18 2.4.1.7. Passiflora antioquensis Karst. 19 2.4.1.7.1. Descripción 19 2.4.1.7.2. Distribución 19 2.4.1.8. Passiflora tenerifensis L..Escobar 20 2.4.1.8.1 Descripción 20 vii 2.4.1.8.2. Distribución 21 2.4.2 Subgénero Passiflora 21 2.4.2.1. Passiflora caerulea L. 21 2.4.2.1.1. Descripción 21 2.4.2.1.2. Distribución 22 2.4.2.2. Passiflora tiliifoliae L.. 22 2.4.2.2.1. Descripción 22 2.4.2.2.2. Distribución 23 2.4.2.3. Passiflora ligularis Juss. 24 2.4.2.3.1. Descripción 24 2.4.2.3.2. Distribución 25 2.4.2.4. Passiflora maliformis L. 25 2.4.2.4.1. Descripción 25 2.4.2.4.2. Distribución 26 2.4.2.5. Passiflora edulis Sims. 26 2.4.2.5.1. Descripción 27 2.4.2.5.2. Distribución 28 2.4.2.6. Passiflora quadrangularis L. 28 2.4.2.6.1. Descripción 28 2.4.2.6.2. Distribución 29 2.4.3. Subgénero Manicata 30 2.4.3.1. Passiflora manicata Juss. 30 2.4.3.1.1. Descripción 30 2.4.3.1.2. Distribución 31 2.4.4. Subgénero Decaloba 31 2.4.4.1. Passiflora biflora Lam. 31 2.4.4.1.1. Descripción 31 2.4.4.1.2. Distribución 32 2.4.4.2. Passiflora adenopoda DC. 33 2.4.4.2.1. Descripción 33 2.4.4.2.2. Distribución 34 2.4.4.3. Passiflora cuspidifolia Harns. 34 2.4.4.3.1. Descripción 34 2.4.4.3.2. Distribución 35 2.4.4.4. Passiflora bicuspidata (Karst.) 35 2.4.4.4.1. Descripción 35 2.4.4.4.2. Distribución 36 2.4.4.5. Passiflora bogotensis Benth. 36 2.4.4.5.1. Descripción 36 2.4.4.5.2. Distribución 37 2.4.5. Subgénero Astrophea 38 2.4.5.1. Passiflora arborea Spreng. 38 2.4.5.1.1. Descripción 38 2.4.5.1.2. Distribución 39 2.4.6. Subgénero Dysosmia 39 viii 2.4.6.1. Passiflora foetida L. 39 2.4.6.1.1. Descripción 39 2.4.6.1.2. Distribución 40 2.5. Importancia Económica del Género Passiflora 40 2.5.1. Importancia Agronómica 40 2.5.2. Importancia Farmacéutica 42 2.5.3. Importancia Ornamental 44 2.5.4. Importancia Ecológica 44 2.6. Estudios Filogenéticos 46 2.6.1. Estudios Morfológicos 46 2.6.2. Estudios Morfológicos en Passiflora 47 2.6.3. Estudios Moleculares 47 2.6.3.1. Estudios Moleculares en Passiflora 49 2.6.3.2. Marcadores Moleculares 49 2.6.3.2.1. En estudios evolutivos y Sistemáticos 49 2.6.3.2.2. En estudios Agronómicos 52 2.6.3.2.3. En estudios Ecológicos 54 2.7. Marcadores Moleculares usados en el Estudio 55 2.7.1. RFLP 55 2.7.2. PCR-RFLP 56 2.8. Genoma de Plantas 58 2.8.1. Cloroplasto 58 2.8.1.1. Génesis del Organelo 58 2.8.1.2. Genética del Cloroplasto 59 2.8.1.3.Estructura y Función del Genoma 60 2.8.1.4. Utilidad del Genoma en Estudios Filogenéticos 61 2.8.2. Mitocondria 63 2.8.2.1. Génesis del Organelo 63 2.8.2.2. Genética de la Mitocondria 63 2.8.2.3. Estructura y función del Genoma 64 2.8.2.4. Utilidad del Genoma en Estudios Filogenéticos 65 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 67 4. OBJETIVOS 69 4.1. Objetivos Generales 69 4.2. Objetivos Específicos 69 5. MATERIALES Y METODOS 71 5.1. Tipo de Estudio 71 5.2. Población de Estudio y Muestra 71 5.2.1. Población de Estudio 71 ix 5.2.2. Muestra 71 5.3. Material Vegetal 72 5.4. Aislamiento de DNA de las Accesiones 74 5.4.1. Protocolo de Extracción de DNA Mediante Maxi-Prep 74 5.5. Cuantificación 76 5.6. Ampliación de Fragmentos de cpDNA y mtDNA 77 5.6.1. Componentes de la reacción de amplificación 78 5.6.2. Ajuste de la concentración de enzima Taq polimerasa y MgCl2 en la especie Modelo P. edilis. 79 5.6.3. Ciclos y componentes utilizados en el proceso de amplificación 80 5.7. Determinación del Tamaño de los Fragmentos 81 5.8. Amplificación, Visualización y Cuantificación de los Fragmentos de cpDNA Y mtDNA. 82 5.9. Digestión de los Fragmentos Amplificados de mtDNA y cpDNA 82 5.9.1. Condiciones de Digestión 83 5.9.2. Determinación de la Eficiencia en la Digestión de los Productos Amplificados 83 5.9.3. Ajuste de la concentración de Fragmentos Digeridos de cpDNA y mtDNA 84 5.9.4. Visualización del Patrón de Bandas Obtenido de la Digestión de los Fragmentos de cpDNA y mtDNA 84 5.10. Digestión de DNA Total para RFLP 85 5.10.1. Electroforesis para la Visualización de las Digestiones 85 5.11. Marcaje de la Sonda con Digoxigenina 86 5.12. Transferencia de los Geles de Agarosa a la Membrana de Nylon 88 5.13. Hibridación 89 5.14. Detección 89 5.15. Revelado de las Autoradiografias 89 5.16.