Community Composition and Interactions of Biofilm Bacteria on Submerged Freshwater Macrophytes
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Community composition and interactions of biofilm bacteria on submerged freshwater macrophytes Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der Universität Konstanz Mathematische-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie vorgelegt von Melanie Hempel Konstanz, April 2008 Tag der mündlichen Prüfung: 06. Oktober 2008 Referent: PD Dr. Elisabeth Groß Referent: PD Dr. Hans-Peter Grossart Referent: Prof. Dr. B. Schink Success consists of going from failure to failure without loss of enthusiasm. Winston Churchill (1874-1965) Table of Contents Abbreviations i Summary in German – deutsche Zusammenfassung iii Summary in English – englische Zusammenfassung vii I General Introduction 1 II Epiphytic bacterial community composition on two common submerged macrophytes in brackish water and freshwater Abstract 21 Introduction 22 Material & Methods 25 Results 28 Discussion 34 III Bacterial community composition of biofilms on two submerged macrophytes and an artificial surface in Lake Constance Abstract 43 Introduction 44 Material & Methods 47 Results 51 Discussion 60 Supplementary 64 IV Spatio-temporal dynamics of the bacterial biofilm on two freshwater macrophytes and an artificial substrate in Lower Lake Constance Abstract 69 Introduction 70 Material & Methods 72 Results 75 Discussion 85 V Impact of the polyphenol degrading bacterium Matsuebacter sp. FB25 on the growth of Acentria ephemrella larvae Abstract 95 Introduction 96 Material & Methods 98 Results 100 Discussion 107 VI Single- and multispecies biofilm formation of tannin degrading bacteria on an aquatic macrophyte Abstract 115 Introduction 116 Material & Methods 118 Results 121 Discussion 125 VII General Discussion and Perspectives 129 VIII References 139 Record of Achievement 159 List of Publications 161 Acknowledgement – Danksagung 165 Curriculum vitae 167 ABBREVIATIONS AFDM Ash free dry mass ANOVA Analysis of variance BCC Bacterial community composition BLAST Basic local alignment search tool CFB Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroidetes CLSM Confocal laser scanning microscopy DAPI 4ʹ,6–Diamidino–2–phenylindol DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis dm Dry mass DNA Deoxyribonucleic acid DOC Dissolved organic carbon DOM Dissolved organic matter EPS Exopolysaccharide FA Formamide FISH Fluorescence in situ hybridization GIS Geographic information system HPLC High performance liquid chromatography IGKB Internationale Gewässerschutzkommission für den Bodensee MICRO-FISH Microautoradiography combined with FISH NaPPi Sodium pyrophosphate NMDS Non metric dimensional scaling OD600nm Optical density at 600 nm PCR Polymerase chain reaction PVPP Polyvinylpolypyrrolidon RFLP Restriction fragment length polymorphism rRNA Ribosomal ribonucleic acid SB Schaproder Bodden SD Standard deviation SDS-PAGE Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEM Scanning electron microscope TEP Transparent exopolymer particles UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean i ii ZUSAMMENFASSUNG Ziel dieser Arbeit war es, die bakterielle Biofilmgemeinschaft auf aquatischen Oberflächen, insbesondere von submersen Makrophyten, zu untersuchen. Im Mittelpunkt standen dabei die Zusammensetzung und Sukzession des bakteriellen Biofilms, der mögliche Einfluss von Umweltfaktoren, Habitat und der Pflanzen (Substrat) auf den Biofilm und die Interaktionen einzelner Isolate untereinander und mit aquatischen Herbivoren. In der Litoralzone von Seen bieten Makrophyten eine große Oberfläche zur Besiedlung von Bakterien und Algen. Zwischen Pflanzen und Epiphyten finden häufig Interaktionen statt, die für beide Seiten positiv oder auch negativ sein können. Interaktionen zwischen Pflanzen und epiphytischen Biofilm können z.B. durch Oberflächenveränderungen oder ausgeschiedene organische Substanzen stattfinden. Besonders Sekundärstoffe von Pflanzen (z.B. Phenole) sind bekannt dafür, dass sie andere Phototrophe oder Mikroorgansimen beeinflussen können. Ich erwartete, dass das phenolreiche Tausendblatt Myriophyllum spicatum L. eine andere Biofilmzusammensetzung hat als das Laichkraut Potamogeton perfoliatus, die Armleuchteralge Chara aspera oder künstliche Substrate (Plastikstreifen). Myriophyllum spicatum scheidet algizide und bakterizide Polyphenole aus, während einige Chara-Arten algizid wirkende zyklische Thiane produzieren. Für Potamogeton perfoliatus ist nicht bekannt, dass es Polyphenole synthetisiert und Bakterien oder Algen im Wachstum hemmt. Da M. spicatum zudem einen deutlichen Gradient von Makronährstoffen und Polyphenolen von den jungen Apikalmeristemen zu den älteren Blättern hinweg aufweist, war ein weiterer Aspekt dieser Arbeit, den Einfluss des Blattalters der Pflanzen auf die Biofilmzusammensetzung zu untersuchen. Chara aspera und M. spicatum kommen sowohl im Bodensee (Süßwasser) als auch im Schaproder Bodden (Brackwasser) vor. Daher haben wir die bakterielle Biofilmzusammensetzung auf beiden Pflanzen in beiden Habitaten verglichen. Alle Biofilmanalysen dieser Arbeit sind mit molekularen Methoden wie FISH iii (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) und im Bodensee ergänzend mit DGGE (Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese) und der Erstellung einer Klonbibliothek durchgeführt worden. Durch die Kombination mehrerer Methoden wurden die erhaltenen Ergebnisse bestätigt und eventuelle Schwachstellen einer Methode ausgeglichen. Alle Untersuchungen des bakteriellen Biofilms lassen darauf schließen, dass die Biofilme auf den jeweiligen Substraten von Bakterien der CFB-Gruppe dominiert waren. Alpha- und Betaproteobakterien waren am zweithäufigsten, während Planktomyceten fast nur auf C. aspera im Schaproder Bodden gefunden wurden. Wir konnten einen deutlichen Einfluss des Habitats und des Substrates auf Planktomyceten nachweisen, während CFB-Bakterien eher durch die Pflanze und das Blattalter beeinflusst wurden. Beim Vergleich des Biofilms auf M. spicatum mit dem auf P. perfoliatus und Plastikstreifen wurde deutlich, dass die Jahreszeit keinen Einfluss auf die Zusammensetzung des bakteriellen Biofilms hat. Umweltfaktoren wie Wasserstand und –temperatur, Leitfähigkeit, pH und der Kohlenstoff- und Gesamtpolyphenolgehalt der Pflanze haben hingegen einen Einfluss. Die bakterielle Biofilmgemeinschaft auf P. perfoliatus und den Plastikstreifen ähnelte einander mehr als diejenige auf M. spicatum. Alle Ergebnisse aus den Analysen der Biofilmgemeinschaften deuten darauf hin, dass gerade Apikalmeristeme von M. spicatum einen sehr heterogenen und speziellen Biofilm haben. Wir vermuten, dass dies mit dem erhöhten Polyphenolgehalt in diesen Abschnitten zusammenhängt. Die Ergebnisse der Klonbibliothek bestätigen dies, und laut den Sequenzvergleichen mit GenBank liegen viele dieser Biofilmbakterien auch größtenteils noch nicht in Kultur vor. Wir konnten drei Isolate aus dem Biofilm (Pantoea agglomerans & Agrobacterium vitis) und dem Umgebungswasser (Matsuebacter sp.) von M. spicatum isolieren, die iv Polyphenole abbauen können. Mit einem eigens entwickelten Versuchsaufbau haben wir untersucht, ob diese Isolate axenische M. spicatum besiedeln können. Da Epiphyten zwangsläufig von Herbivoren aufgenommen werden, können diese so deren Verdauung und Darmflora beeinflussen. In Fütterungsexperimenten testete ich, ob das polyphenolabbauende Bakterium Matsuebacter sp. einen Einfluss auf das Larvenwachstum des Wasserzünslers Acentria ephemerella (DENIS & SCHIFFERMÜLLER) hat. Das Wachstum der Larven wurde im Vergleich zu axenischem M. spicatum weder negativ noch positiv beeinflusst, wenn sie mit Matsuebacter sp. besiedeltem M. spicatum gefüttert wurden. Daraus schließen wir, dass Matsuebacter sp. weder als zusätzliche Nährstoffquelle dient, noch die vorhandene Darmflora der Larve beeinflusst oder nennenswert die Polyphenole verändert hat. Während der Einfluss von Matsuebacter sp. auf das Larvenwachstum vernachlässigbar war, ist es uns gelungen, eine dichte und schnelle Biofilmbildung dieses Bakteriums auf axenischem M. spicatum zu zeigen. Dadurch wird die Biofilmbildung des landwirtschaftlich genutzten „Biocontrollers“ P. agglomerans gehemmt und diejenige des Pflanzenpathogens A. vitis verstärkt. Mit dieser Arbeit ist es mir gelungen, einen Beitrag zu dem bisher recht spärlichen Wissen über bakterielle Biofilm auf aquatischen Pflanzen zu leisten, weiterhin die Interaktionen einzelner Bakterien miteinander zu beleuchten und auch den Bogen zu höheren trophischen Ebenen zu spannen. Einzelne Bakteriengruppen werden offensichtlich von dem jeweiligen Substrat und Habitat beeinflusst, während für ganze Bakteriengemeinschaften auch Umweltparameter wie Wasserstand und– temperatur und Leitfähigkeit, aber auch der Kohlenstoffgehalt und Gesamtphenolgehalt der Pflanzen von Bedeutung sind. v vi SUMMARY The aim of my PhD thesis was to investigate the bacterial biofilm community composition (BCC), especially on submerged macrophytes. The special interest was the composition and succession of the heterotrophic biofilm and possible influences such as environmental factors, habitat and plants (substrate) on the biofilm and the interaction of isolates with each other and with aquatic herbivores. On the littoral zones of lakes, macrophytes offer a large area for colonization of bacteria and algae. Interactions between plant and epiphytes are frequent and can be positive and negative for both sides. Interactions between macrophytes and epiphytic biofilm can be mediated by structural changes of the surface or by exuded organic compounds. Especially secondary metabolites