Dizertační Práce

PÍRODOVDECKÁ FAKULTA

Dizertační práce

MARKÉTA WAYHELOVÁ Brno 2019

PÍRODOVDECKÁ FAKULTA

Analýza patogenních genetických variant u dtí s mentálními retardacemi pomocí metod komparativní genomové hybridizace na mikročipech (array-CGH) a sekvenování "nové generace" (NGS)

Dizertační práce

MARKÉTA WAYHELOVÁ

Vedoucí práce: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.

Ústav experimentální biologie

Brno 2019

Bibliografický záznam

Autorka: Markéta Wayhelová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Analýza patogenních genetických variant u dětí s mentálními retardacemi pomocí metod komparativní genomové hybridizace na mikročipech (array-CGH) a sekvenování "nové generace" (NGS)

Studijní program: Molekulární a buněčná biologie a genetika

Vedoucí práce: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.

Akademický rok: 2019/2020

Počet stran: 164 + 19

Klíčová slova: Poruchy intelektuálního vývoje; array-CGH; varianty v počtu kopií; sekvenování „nové generace“; sekvenční varianty

Bibliographic entry

Author: Markéta Wayhelová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Název práce: The analysis of pathogenic genetic variants in children with disorders of intellectual development using methods of array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) and „next-generation“ sequencing (NGS)

Degree programme: Molecular and cell biology and genetics

Supervisor: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.

Academic Year: 2019/2020

Number of pages: 164 + 19

Keywords: Disorders of intellectual development; array-CGH; copy-number variations; „next-generation“ sequencing; sequence variants

Abstrakt

Poruchy intelektuálního vývoje (disorders of intellectual development, DID) se svojí průměrnou prevalencí u 1-3 % populace představují jedno z nejzávažnějších témat v oblasti zdravotní péče a každodenního života lidské společnosti. DID zahrnují soubor geneticky a fenotypově různorodých onemocnění s nástupem obvykle již v raném dětském věku, jež negativně ovlivňují život postiženého jedince ve všech aspektech života. I přes rozvinutý systém zdravotní a sociální péče o postižené jedince a jejich rodiny dosud ve většině případů zůstává neobjasněna příčina manifestace DID a asociovaných onemocnění. Celogenomové analýzy u jedinců s DID prokázaly klíčový význam genetických variant v v patogenezi DID a dalších neurovývojových onemocnění. Identifikace genetických příčin DID je podmíněna vývojem efektivního molekulárně diagnostického algoritmu, jež v sobě zahrnuje cytogenetické, molekulárně cytogenetické a molekulárně genetické metody. Metoda komparativní genomové hybridzace na DNA mikročipech (array-CGH) představuje současný „zlatý standard“ pro identifikaci patogenních submikroskopických přestaveb chromosomů (copy-number variations, CNVs). Do studie bylo vybráno 724 dětí s DID a dalšími neurovývojovými poruchami vyšetřených na Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno bylo v letech 2011-2018. Metodou array-CGH byla objasněna genetická příčina uvedených patologií u 17,3 % dětí ve formě patogenních přestaveb chromosomů různého rozsahu. V 5,9 % případů byl upřesněn cytogenetický nález a u 12,3 % dětí s normálním karyotypem či s karyotypem s nálezem balancované chromosomové přestavby byla detekována alespoň 1 patogenní/pravděpodobně patogenní CNV (32 případů rekurentních mikrodelecí, 13 případů rekurentních mikroduplikací, 24 non-rekurentních mikrodelecí a 7 non-rekurentních mikroduplikací, 8 nálezů dvou klinicky významných CNVs). Dále byly v 5 % případů identifikovány varianty s nejasným vlivem na fenotyp a v 7,7 % případů byly nalezené strukturní varianty chromosomů klasifikovány jako pravděpodobně benigní. Jednotlivé varianty v daných skupinách byly dále charakterizovány z hlediska jejich původu, rozsahu a genového obsahu a získaná data byla statisticky zpracována. Byly prokázány významné rozdíly mezi velikostmi variant jednotlivých klasifikačních skupin. Další analýzou patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs byla zjištěna vyšší četnost mikrodelecí oproti mikroduplikacím a také vyšší četnost de novo mikrodelecí oproti de novo mikroduplikacím, avšak nebyl nalezen významný rozdíl mezi jejich velikostmi. Na základě výsledků vyšetření karyotypu a array-CGH bylo v letech 2015-2018 vyšetřeno metodou cíleného sekvenování „nové generace“ (NGS) 35 dětí bez nálezu 4 patogenních přestaveb chromosomů, přičemž v rámci volby optimálního vyšetřovacího postupu byli současně s 19 dětmi vyšetřeni i jejich rodiče (trio-based NGS) a ve zbylých 16 případech bylo zvoleno Sangerovo sekvenování pro přímou verifikaci patogenní/pravděpodobně patogenních sekvenčních variant u rodičů. Pro strategii cíleného NGS byl vybrán komerční design ClearSeq Inherited Disease (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) pokrývající převážně kódující oblasti 2742 genů popsaných v patogenezi lidských vrozených onemocnění. Přístupem cíleného NGS byla identifikována příčina manifestace DID a asociovaných patologií u 25,7 % dětí (9/35), přičemž byly detekovány patogenní/pravděpodobně patogenní sekvenční varianty původu de novo v genech MED13L, ASXL3, SCN2A, TUBB3, ve stavu složené heterozygotnosti v genech TSEN54, SLC6A19 a familiální X-vázaná sekvenční varianta v genu IQSEC2 a homozygotní sekvenční varianta v genu BTD. Výsledky vyšetření metodami array-CGH, NGS a příslušných verifikací byly korelovány s fenotypem daných jedinců a předány ošetřujícícm lékařům pro účely genetického poradenství. V průběhu řešení disertační práce byla prokázána efektivita molekulárně diagnostického algoritmu a návaznost použitých metodik. Současně však s nárůstem detekce nových genetických variant jsou spojeny vyšší nároky na erudovanost kvalifikovaných pracovníků a vývoj bioinformatických sérií programů. V neposlední řadě je oblast genomických analýz spojena s právními a etickými aspekty, jež je třeba uvažovat v souladu s efektivním využití získaných informací, jejich interpretací vyšetřovaným jedincům a ochranou genomických dat před zneužitím.

Abstract

Disorders of intellectual development and their average worldwide prevalence 1-3 % represent one of the most serious topics in the field of healthcare and everyday life of human society. They encompass a group of genetically and phenotypically heterogeneous diseases with an early onset, which negatively impact the quality of life of affected individuals. Despite the developed system of healthcare and social care for affected individuals and their families most of them do not obtain the molecular diagnosis to elucidate the cause of manifestation of DID and associated diseases. Genomic analyses in individuals with DID proved the key impact of genetic variants in the pathogenesis of DID and other neurodevelopmental disorders. The identification of genetic causes of DID is conditioned by the development of effective molecular diagnostic algorithm, including cytogenetic, molecular-cytogenetic and molecular-genetic approaches. The method of comparative genomic hybridisation on DNA microarrays (array-CGH) represents a current „gold standard“ for the identification of causative chromosomal copy- number variations (CNVs). Our study included 724 children with DID and other neurodevelopmental disorders examined at the Department of Medical Genetics of University Hospital Brno in the period from 2011 to 2018. We identified the genetic cause of mentioned pathologies in 17.3% of children in the form of chromosomal rearrangements of various sizes. In 5.9% of cases the karyotype abnormalities were specified and in 12.3% of children with normal karyotype or with karyotype carrying balanced chromosomal rearrangements we identified at least 1 causative CNV (32 cases of recurrent microdeletions, 13 cases of recurrent microduplications, 24 cases of non-recurrent microdeletions, 7 cases of nonrecurrent microduplications and 8 findings of two clinically relevant CNVs). We also detected variants of unclear significance in 5% of cases and the structural chromosomal variants were classified as likely benign in 7.7% of cases. The particular variants in the classification groups were subsequently characterized in aspects of their origin, size and gene content and the data were statistically evaluated. We proved the significant differences between the CNV sizes of particular classification groups. Further analysis of causative CNVs showed the higher frequency of microdeletions than microduplications and higher frequency of de novo microdeletions than de novo microduplications. Nevertheless the significant differences between their sizes were not found.

Based on the results of analyses of karyotype and array-CGH 35 children without pathogenic chromosomal rearrangements were examined using targeted „next-generation“ sequencing (NGS) in the period from 2015 to 2018. To find the optimal strategy, trio-based NGS with 19 children and their parents was selected as an approach for one part of the project. The remaining 16 children were examined using targeted NGS and causative sequence variants were verified in them and their parents by Sanger sequencing. We used commercial capture design ClearSeq Inherited Disease (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) targeted to predominantly coding regions of 2742 genes involved in the pathogenesis of human inherited diseases. We identified the genetic cause of the pathological phenotype of DID and associated pathologies in 25.7% of children (9/35). We detected causative sequence variants of de novo origin in the MED13L, ASXL3, SCN2A, TUBB3 genes, compound heterozygous variants in the TSEN54 and SLC6A19 genes and finally, familial X- linked sequence variant in the IQSEC2 gene and homozygous sequence variant in the BTD gene were identified. The results of array-CGH, NGS and verification analyses were correlated with the pathological phenotypes of given individuals and presented to attending physicians for the purpose of genetic counselling. In the course of this thesis solution we proved the efficiency of the molecular diagnostic algorithm and the link-up of utilized methods. The increase of detection of novel genetic variants is linked together with the higher requirements to the research experts and the development of effective bioinformatic pipelines. Last but not least the field of genomic analyses is linked to judical and ethical aspects which are required to be considered for the optimal and effective utility of information and their interpretation to tested individuals and their families and to prevent the misuse of genomic data.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli, doc. RNDr. Petru Kuglíkovi, CSc., za odborné vedení mojí vědecké práce a její odborné konzultace během mého studia na Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity. Dále bych chtěla poděkovat všem svým současným a bývalým kolegům z Integrovaných laboratoří molekulární cytogenetiky a Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno za příjemnou spolupráci, vytvoření motivující atmosféry a přátelského pracovního prostředí a za poskytnutí možnosti profesního rozvoje. Zde bych rovněž ráda vyjádřila své díky Mgr. Janu Oppeltovi, Ph.D. (toho času CEITEC MU) za precizní bioinformatické zpracování sekvenačních dat, cenné rady pro jejich analýzu a pomoc se sepsáním a korekturou části týkající se zpracování NGS dat, Mgr. Filipu Pardymu za pomoc s obsluhou přístrojů na pracovišti Core Facility Genomics (CEITEC MU) a doc. Mgr. Janu Lochmanovi, Ph.D. (Ústav biochemie PřF MU) za provedení kapilární elektroforézy na přístroji ABI 3130 firmy Elisabeth Pharmacon. Poděkování patří rovněž mé rodině a přátelům za veškerou podporu během mých studií, čímž významně přispěli k jejich zdárnému dokončení.

Tato disertační práce byla podpořena čtyřmi projekty institucionální podpory Fakultní nemocnice Brno v letech 2015-2017 (FNBr 65269705) a pěti programy Grantové agentury Masarykovy univerzity – Specifický výzkum – Studentské výzkumné projekty „Podpora výzkumné činnosti studentů molekulární biologie a genetiky“ (MUNI/A/1394/2014, MUNI/A/0967/2015, MUNI/A/0877/2016, MUNI/A/0824/2017, MUNI/A/0958/2018)

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svou disertační práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Text práce jsem vypracovala podle pravidel a zodpovídám za jeho jazykovou správnost.

Brno, 17. 9. 2019 ......

Markéta Wayhelová

Originální publikace a vymezení podílu autora dizertační práce

Práce vychází ze dvou publikací autorky dizertace (Markéta Wayhelová, MW).

Článek 1 (Annex 1 k této dizertační práci)

Wayhelova M, Oppelt J, Smetana J, Hladilkova E, Filkova H, Makaturova E, Nikolova P, Beharka R, Gaillyova R, Kuglik P. Novel de novo frameshift variant in the ASXL3 gene in a child with microcephaly and global developmental delay. Mol Med Rep. 2019, vol. 20, no. 1, pp. 505-12. ISSN 1791-2997. doi: 10.3892/mmr.2019.10303.

IF (2018) = 1,851 Autorský podíl 70 %

MW se podílela na přípravě designu experimentů, laboratorním zpracování vzorků a analýze dat popsaných v uvedené práci. Připravila draft rukopisu a zfinalizovala text po připomínkách spoluautorů.

Článek 2 (Annex 2 k této dizertační práci)

Wayhelova M, Smetana J, Vallova V, Hladilkova E, Filkova H, Hanakova M, Vilemova M, Nikolova P, Gromesova B, Gaillyova R, Kuglik P. The clinical benefit of array-based comparative genomic hybridization for detection of copy number variants in Czech children with intellectual disability and developmental delay. BMC Med Genomics. 2019, vol. 12, no. 1, 99:111. ISSN 1755-8794. doi: 10.1186/s12920-019-0559-7.

IF (2018) = 2,568 Autorský podíl 70 %

MW samostatně připravila designu experimentu, podílela se na laboratorním zpracování vzorků a analýze dat popsaných v uvedené práci. Podílela se na přípravě draftu rukopisu a zfinalizovala text po připomínkách spoluautorů.

Další prvoautorské publikace v časopise s IF, nevztahující se k obsahu dizertační práce

Wayhelova M, Mikulasova A, Smetana J, Vallova V, Blazkova D, Filkova H, Moukova L, Kuglik P. Detection of oncogenic mutations in cervical carcinoma using method High Resolution Melting (HRM). Neoplasma. 2016, vol. 63, no. 5, pp. 779-88. doi: 10.4149/neo_2016_516. Autorský podíl 70 % IF (2018) = 1,771

MW se podílela na přípravě designu experimentu, podílela se na laboratorním zpracování vzorků a analýze dat popsaných v uvedené práci. Podílela se na přípravě draftu rukopisu a zfinalizovala text po připomínkách spoluautorů.

Obsah

Úvod ...... 16 1. Přehled problematiky ...... 17 1.1. Epidemiologie ...... 19 1.2. Příčiny DID ...... 20 1.2.1. Negenetické faktory...... 20 1.2.2. Genetické faktory ...... 21 1.2.2.1. Variabilita v počtu kopií ...... 22 1.2.2.2. Změny primární struktury DNA ...... 27 1.2.2.3. Nemendelistická dědičnost ...... 31 1.3. Metodické přístupy analýzy genomu jedinců s DID ...... 35 1.3.1. Cytogenetické vyšetření ...... 35 1.3.2. Metody molekulární cytogenetiky ...... 36 1.3.3. Metoda sekvenování „nové generace“ (NGS) ...... 40 2. Cíle disertační práce ...... 49 3. Soubor pacientů a metody ...... 50 3.1. Klinická charakteristika pacientů ...... 50 3.2. Metody ...... 52 4. Výsledky ...... 59 4.1. Identifikace vzácných submikroskopických přestaveb chromosomů (CNVs) metodou komparativní genomové hybridizace na DNA mikročipech (array-CGH) a stanovení jejich klinického významu v souboru 724 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými onemocněními vyšetřených na OLG FN Brno v letech 2011-2018 ..... 59 4.2. Analýza detekovaných CNVs u dětí s DID, PAS a asociovanými onemocněními ...... 75 4.3. Identifikace vzácných sekvenčních variant v souboru 35 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV metodou cíleného sekvenování „nové generace“ (NGS) vyšetřených na OLG FN Brno v letech 2015-2018 ...... 80 4.3.1. Kvalitativní analýza dat ...... 84 4.3.2. Statistika sekvenčních variant ...... 85 4.4. Analýza patogenních sekvenčních variant detekovaných metodou cíleného NGS a stanovení jejich významu v patogenezi DID, PAS a asociovaných onemocnění .... 86 4.4.1. Další nálezy sekvenčních variant s potenciálním klinickým významem ...... 99 4.4.1.1. Sekvenční varianty nejasného významu ...... 99

4.4.1.2. Identifikace patogenních variant v heterozygotním stavu spojených s AR onemocněními pomocí „trio-based“ NGS ...... 100 5. Diskuze ...... 102 Závěr ...... 127 Přehled literatury ...... 128 Seznam obrázků ...... 157 Seznam tabulek ...... 159 Seznam publikací a konferenčních příspěvků ...... 160 Seznam příloh ...... 164

Seznam zkratek

AAIDD American Association on Intellectual and Developmental Disabilities; Americká asociace pro intelektuální a vývojová postižení ACMG American College of Medical Genetics and Genomics; Americká společnost lékařské genetiky a genomiky AD autosomálně dominantní ADHD attention deficit hyperactivity disorder; porucha pozornosti s hyperaktivitou AMK aminokyselina AR autosomálně recesivní ARF ADP ribosylation factor; adenosin-difosfát-ribosylační faktor array-CGH array-comparative genomic hybridization; komparativní genomová hybridizace na DNA mikročipech BQSR Base Quality Score Recalibration; rekalibrace hodnoty kvality báze BRS Bainbridge-Ropers syndrome; Bainbridge-Ropersův syndrom cnnLOH copy-number neutral loss of heterozygosity; ztráta heterozygotnosti bez ztráty počtu kopií CNS centrální nervová soustava CNV copy-number variation; varianta v počtu kopií

Ct cycle threshold; cyklus, v němž došlo k překročení prahové hodnoty dbSNP Single Nucleotide Polymorphism Database; databáze jednonukleotidových polymorfismů DECIPHER DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources (databáze genomických variant) DGS DiGeorge syndrome; DiGeorgův syndrom DID disorders of intellectual development; poruchy intelektuálního vývoje DNA deoxyribonucleic acid; deoxyribonukleotidová kyselina DSM Diagnostic and Statistical manual Of Mental Disorders; Diagnostický a statistický manuál duševních poruch ERH enhancer of rudimentary homolog („housekeepingový“ gen) ExAc The Exome Aggegation Consortium; databáze společenství shromažďující a harmonizující výstupy exomových sekvenačních dat FISH fluorescence in situ hybridization; fluorescenční in situ hybridizace FoSTeS fork stalling and template switching; blokování replikační vidlice a změna templátového vlákna 13

GATK GenomeAnalysisToolKit (bioinformatický nástroj pro zpracování sekvenačních dat) GEF guanine nucleotide exchange factor; faktor pro výměnu guaninu GoF gain-of-function; zisk funkce GWAS genome-wide association study; celogenomová asociační studie HGVS Human Genome Variation Society; Společnost variability lidského genomu ICD International classification of disease and related health problems; Mezinárodní klasifikace nemocí a souvisejících zdravotních problémů IGV Integrative Genomics Viewer; prohlížeč genomických dat LCR low-copy repeats; repetice o nízkém počtu kopií LoF loss-of-function; ztráta funkce MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification MRI magnetic resonance imaging; zobrazovací metoda magnetické resonance mtDNA mitochondrial DNA; mitochondriální deoxyribonukleotidová kyselina MZ monozygotický NAHR non-allelic homologous recombination; nealelická homologní rekombinace NGS „next-generation“ sequencing; sekvenování „nové generace“ NHEJ non-homologous end joining; nehomologické spojování konců NMD nonsense-mediated mRNA decay; degradace molekul mRNA obsahujících předčasně zařazený terminační kodon OLG Oddělení lékařské genetiky OMIM Online Mendelian Inheritance in Man (databáze) PAS poruchy autistického spektra PCH pontocerebellar hypoplasia; pontocerebellární hypoplázie PolyPhen-2 Polymorphism Phenotyping v2; fenotypování polymorfismů (in silico predikce vlivu substitucí aminokyselin na funkci proteinu) PROVEAN Protein Variation Effect Analyzer; analyzátor efektu proteinových variant PTC premature terminantion codon; předčasné zařezení terminačního kodonu PTV protein-truncation variant; varianta zkracující délku proteinu QF-PCR quantitative fluorescence polymerase chain reaction; kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce qPCR quatitative polymerase chain reaction; relativní kvantifikace pomocí polymerázové řetězové reakce RNA ribonucleic acid; ribonukleotidová kyselina

RV replikační vidlice SIFT sorting intolerant from tolerant; třídění netolerovaných variant od tolerovaných (in silico predikce vlivu substituce aminokyselin na funkci proteinu) SNP single-nucleotide polymorphism; jednodukleotidový polymorfismus SNV single-nucleotide variant; jednonukleotidová varianta TAD topologically associated domain; topologicky asociovaná doména TNR trinukleotidové repetice VCFS velo-cardio-facial syndrome; velokardiofaciální syndrom VOUS variant of unclear signifikance; varianta nejasného významu VSV vrozená srdeční vada VVV vrozené vývojové vady WGS whole-genome sequencing; celogenomové sekvenování WES whole-exome sequencing; celoexomové sekvenování XCI X chromosome inactivation; inaktivace chromosomu X XL-DID X-linked disorder of intellectual development; X-vázaná porucha intelektuálních funkcí

Úvod Život jedince s neurovývojovou poruchou je výrazně omezen ve všech svých aspektech, zahrnující schopnosti vzdělávat se, učit se novým dovednostem, navazovat a udržovat mezilidské vztahy. Vzhledem ke svému časnému nástupu v raném dětství tato onemocnění významně ovlivňují celý individuální vývoj pacienta, jeho rodiny a tím nepřímo rovněž fungování celé společnosti. I přes neustálý pokrok ve výzkumu a vývoji léčebných a podpůrných prostředků neurovývojová onemocnění provázejí celý život jedince a poskytovaná pomoc pouze zmírňuje jejich negativní dopady. Současné trendy výzkumu jsou zaměřeny na prohloubení znalostí o etiopatogenezi neurovývojových poruch, zejména rozpoznání a pochopení molekulárních mechanismů daných onemocnění. Moderní metody analýzy genomu zcela zásadně přispěly k identifikaci genetických variant na různých úrovních genetické informace a odhalily nové cesty vedoucí k vývoji nových terapeutických prostředků. Stejně jako v mnoha dalších výzkumných oblastech zabývajících se strukturní a sekvenční variabilitou lidského genomu ve vztahu k patologiím, i zde množství a komplexita získaných informací předčily současné limity lidského poznání v dané oblasti a přinesly s sebou nejen mnoho odpovědí, ale snad i více otázek a nových podnětů k dalšímu výzkumu. Je proto tedy jisté, že pro budoucnost výzkumu etiologie neurovývojových onemocnění je nezbytná multioborová spolupráce lékařských specialistů, výzkumných pracovníků, bioinformatických týmů a svou nezastupitelnou roli zde budou mít jistě i odborníci analyzující právní a etické aspekty biomedicínského výzkumu. Potenciál základního a aplikovaného výzkumu spočívá ve vývoji efektivních terapeutik a léčebných strategií. Efektivní využití moderních genomických analýz a navazující intenzivní spolupráce uvedených odborníků proto přispívají ke zvýšení kvality života jedince s neurovývojovou poruchou či jiným onemocněním s nepříznivou prognózou a jeho rodiny.

1. Přehled problematiky Inteligence je duševní charakteristika jedince, která zahrnuje schopnost porozumění a řešení problémů, abstraktní myšlení, pochopení komplexních představ, schopnosti efektivního učení a učení na základě zkušenosti (Shogren and Turnbull, 2010). Starší definice charakterizují intelektuální opoždění jako stav významného snížení kognitivních funkcí, který je možné stanovit na základě standardizovaného měření inteligence, a rovněž stav významného snížení funkčních a adaptivních schopností, jež zahrnují vykonávání každodenních činností přiměřených věku jedince. Míru intelektuálního opoždění lze klasifikovat podle několika různých systémů, v nichž jsou zohledněna různá kritéria. Stavy intelektuálního opoždění byly zahrnuty v Mezinárodní klasifikaci nemocí a souvisejících zdravotních problémů (International Classification of Disease and Related Health Problems, ICD) a v Diagnostickém a statistickém manuálu duševních poruch (Diagnostic and Statistical manual Of Mental Disorders, DSM) již od jejich prvních vydání. Oba systémy klasifikují intelektuální opoždění do několika stupňů závažnosti dle míry podpory od okolí, která je vyžadována v každodenním životě postiženého jedince. Během let doznaly označení, definice a klasifikace jednotlivých stupňů mnoha změn, až se ustálily do současných podob v systémech ICD-11 a DSM-5. V současném vydání ICD-11 bylo dřívější označení „mentální retardace“ nahrazeno označením „poruchy intelektuálního vývoje“ (disorders of intellectual development, DID). DID jsou zde rovněž uvažovány více v pojetí zdravotního stavu než neschopnosti. Dle definice představují skupinu etiologicky heterogenních stavů, které mají svůj původ ve vývojovém období života jedince. Jejich základní charakteristikou je významné snížení intelektuálních funkcí a adaptivního chování pod hranicí dvou či více směrodatných odchylek od průměru, který byl stanoven na základě standardizovaných testů. V případě absence těchto testů diagnóza DID vyžaduje vysokou spolehlivost klinického vyšetření vycházejících z objektivních a vhodných ukazatelů chování (Tassé et al., 2013; Girimaji and Pradeep, 2018). Systém DSM-5 definuje DID jako poruchy nervového vývoje, které začínají v dětství a jež jsou charakterizovány poruchami intelektu a obtížemi v mezilidských vztazích, společenských a praktických oblastech života. Pro diagnózu DID musí být přitom splněna následující tři kritéria: 1) deficity v intelektuálních funkcích potvrzené klinickým vyšetřením a individualizovaným standardním IQ testem; 2) deficity v adaptivních funkcích, které vybočují z vývojových a sociokulturních standardů pro dosažení nezávislosti jedince a ze schopnosti společenské odpovědnosti; 3) nástup těchto deficitů během dětství. 17

Na základě klinické manifestace jsou stupně závažnosti DID klasifikovány do čtyř skupin, přičemž se nyní posuzují spíše dovednosti jedince než hodnota IQ (tab. 1).

kategorie pibližné kritéria kritéria DSM-V kritéria AAIDD * závažnosti zastoupení DSM-IV (dle samostatnosti (dle míry pípadů DID (dle IQ) v denních aktivitách) samostatnosti) mírná 85 % IQ 50-69 nezávislý život s minimální občasná pomoc během pomocí stavů nejistoty stedn 10 % IQ 36-49 nezávislý život možný pouze omezená podpora závažná s větší mírou pomoci (např. v každodenních pečovatelské skupiny) činnostech tžká 3 % IQ 20-35 denní asistence při významná pomoc sebeobsluze, dohled nad v každodenních bezpečností činnostech hluboká 1,5 % IQ < 20 nepřetržitá péče trvalá pomoc ve všech aspektech každodenního života

Tabulka 1: Klasifikace závažnosti DID podle různých klasifikačních kritérií. Zpracováno dle https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK332877/. * AAIDD = American Association on Intellectual and Developmental Disabilities

Kromě klasifikace DID na základě výše uvedených kritérií lze rozlišit nesyndromické a syndromické formy DID, přičemž syndromické formy DID se obvykle nemanifestují jako jediná patotogie ve fenotypu pacientů, ale často se vyskytují v kombinaci s poruchami autistického spektra (PAS), senzorickými poruchami či dalšími neurovývojovými či neuropsychiatrickými poruchami, vrozenými vývojovými vadami (VVV) či faciální stigmatizací (Matson and Cervantes, 2013; Lee et al., 2018). PAS se řadí mezi vývojové poruchy, jež se projevují změnami v sociálních interakcích a komunikaci a restriktivními, repetitivními zájmy a stereotypiemi v chování (Lipsker et al., 2018). Do diagnostických kritérií se dle recentních studií rovněž zahrnují pozměněné senzorické vnímání a senzorické schopnosti (Doernberg and Hollander, 2016). Na základě epidemiologických studií lze pozorovat vzrůstající trend prevalence PAS. Tento jev lze vysvětlit lepší úrovní klinické diagnostiky a odborné edukace specialistů, kdy dětští pacienti s PAS nejsou již řazeni do skupin DID či jiných skupin neurovývojových poruch (Shattuck, 2006). Dalším faktorem přispívajícím k celosvětovému nárůstu prevalence PAS je obecně větší povědomí o této problematice v populaci (King and Bearman, 2009). Na základě současných studií je prevalence PAS odhadována na přibližně 1,5-2 % v populaci osmiletých dětí, neboť nejlépe odráží celkovou prevalenci PAS mezi dětmi různého věku (Durkin et al.,

2015). Ve skupině dětí s DID je pozorována vyšší prevalence dětí s PAS (4-60 %). Překryv prevalence DID a PAS a PAS a senzorických poruch je vysvětlován stejnými či podobnými molekulárními mechanismy, nebo podobnými fenotypovými projevy zakládajícími se na odlišných molekulárních mechanismech (Matson and Shoemaker, 2009).

1.1. Epidemiologie Obecně se prevalence DID udává mezi 1-3 %, avšak byly pozorovány významné rozdíly v různých geografických oblastech (Battaglia and Carey, 2003; Olusanya et al., 2018). Na spodní hranici prevalence se nachází převážně ekonomicky vyspělé země, kdežto vyšší prevalence byla pozorována v zemích jihozápadní a jižní Asie a na většině území Afriky s výjimkou zemí jižní Afriky (obr. 1). Významná variabilita v prevalenci je pozorována zejména v případech mírné DID, zatímco prevalence těžké a hluboké DID dosahuje celosvětově srovnatelných hodnot do 0,5 % (Maulik et al., 2011; Olusanya et al., 2018).

Obrázek 1: Světová prevalence DID na 100 000 dětí mladších 5 let. Barevně jsou odlišeny oblasti s nízkou prevalencí DID (modrá až světle zelená) od oblastí s vysokou prevalencí DID (žlutá až červená) (Olusanya et al., 2018; upraveno).

1.2. Příčiny DID

Etiologie DID a asociovaných onemocnění se významně odráží v heterogenitě a závažnosti klinických příznaků. Stanovení příčiny DID u každého postiženého jedince je základním předpokladem pro podpůrnou léčbu kompenzující zdravotní potíže pacienta, pro genetické poradenství v případě plánovaného rodičovství, stejně tak pro základní přehled o zdravotním stavu obyvatelstva a zavedení a vhodné uplatňování preventivních programů. K hlavním rizikovým negenetickým faktorům pro DID a asociované poruchy vývoje patří faktory přímo související s postiženým jedincem: mužské pohlaví, věk matky nad 30 let, vícečetná gravidita, vyšší parita, nízká porodní hmotnost, malý obvod hlavy, předčasný porod, deficit stopových prvků během gravidity, poranění mozku a podvýživa. Nepřímé faktory zvyšující riziko vývojových poruch zahrnují nízkou vzdělanost rodičů, špatný psychický stav matky, nízký socioekonomický status a nepřiměřenou stimulaci jedince během raného vývoje. Působení negenetických rizikových faktorů je tedy vždy nutné zohlednit při hledání příčin DID.

1.2.1. Negenetické faktory Mnoho rizikových negenetických faktorů může být při jejich včasné identifikaci eliminováno a kompenzováno. Patří sem zejména prenatální rizika ovlivňující fyziologický průběh gravidity, perinatální rizika spojena s průběhem porodu a postnatální poranění centrální nervové soustavy (CNS). Metaanalýzou rizikových faktorů byly jako významné rizikové faktory pro DID vyhodnoceny pokročilý věk matky nad 35 let, příslušnost matky k afroamerické a africké populaci, nízká úroveň vzdělání matky, třetí a vyšší parita, abusus alkoholu matky v graviditě, epilepsie matky, předčasný porod, mužské pohlaví a nízká porodní hmotnost (Huang et al., 2016). Plod je během intrauterinního vývoje vystaven četným změnám zdravotního stavu matky a její expozici environmentálním faktorům, přičemž významný negativní vliv na vývoj nervového systému byl prokázán při expozici toxickým látkám (tabák, alkohol) a také v případě metabolického onemocnění matky (diabetes). Kromě pozitivní korelace pokročilého věku matky v době početí nelze zanedbat rovněž vliv pokročilého věku otce. Recentní studie prokázaly pozitivní korelace mezi rostoucím věkem rodičů v době početí a rizikem rozvoje DID, PAS a psychiatrických onemocnění (Janecka et al., 2017). Z perinatálních rizikových faktorů pro DID byl vyhodnocen jako významný předčasný porod před ukončeným 37. týdnem gravidity a nejnovější studie také poukazují na nepříznivý vliv gravidity trvající déle než 42 týdnů (Heuvelman et al., 2018). S předčasným porodem rovněž souvisí vyšší pravděpodobnost nezralosti novorozence a jeho nízká porodní

20 hmotnost jako významný rizikový faktor v neonatálním období vývoje. DID je diagnostikována v přibližně 30 % případů častěji u chlapců než u dívek, avšak tento poměr klesá s rostoucí závažností DID (Lai et al., 2013; Friedman et al., 2018), v případě PAS je tento rozdíl významnější, přibližně 4:1 s převažujícím podílem chlapců (Baio et al., 2018). V rámci uvedené multicentrické studie se rovněž ukázala souvislost mezi PAS a DID, přibližně u 30 % chlapců a 35 % dívek byl prokázán současný výskyt těchto vývojových poruch. Souhrnná data zaznamenala celkově 31 % dětí s PAS a DID (IQ < 70) a dalších 25 % dětí s PAS se z hlediska intelektuálních funkcí pohybovalo na rozhraní normy a DID (IQ 71- 85).

1.2.2. Genetické faktory Genetické faktory představují hlavní příčinu manifestace klinických příznaků DID až u 60 % případů DID, přičemž proporce případů s genetickou podstatou DID narůstá se závažností manifestace klinických příznaků, respektive se stupněm DID (Kaufman et al., 2010; Gilissen et al., 2014). Současné studie prokazují významnou genetickou heterogenitu v patogenezi DID, která zahrnuje široké spektrum početních i strukturních změn chromosomů detekovatelných metodami klasické cytogenetiky, variant v počtu kopií (copy-number variations, CNVs), změn v sekvenci DNA či poruch regulace genové exprese. Vrozené chromosomové aberace byly detekovány u pacientů s DID s vysokou heterogenitou v prevalenci a typech jednotlivých aberací. Frekvence chromosomových aberací se výrazně mění v závislosti na vývojovém období jedince. V prenatálním období představují vrozené chromosomové aberace příčinu 50-60 % předčasně ukončených gravidit v prvním trimestru, avšak u živě narozených dětí se tento počet snižuje pod 1 % (Nielsen and Sillesen, 1975; Mau et al., 1997). Trisomie autosomů slučitelné s postnatálním životem jedince a aneuploidie gonosomů se téměř vždy manifestují určitým poklesem v intelektuálních schopnostech jedince. Trisomie chromosomu 21 je nejčastější genetickou příčinou DID, je detekována u přibližně 10 % všech jedinců s DID (Dolk et al., 2005; Rauch et al., 2006; Rodrigues et al., 2019). Při vyloučení aneuploidií chromosomů lze cytogenetickým vyšetřením karyotypu jedinců s DID stanovit kauzální chromosomovou přestavbu přibližně ve 3 % případů (Shevell et al., 2003; Miller et al., 2010). Již v 30. letech 20. století byla prokázána jasná korelace mezi trisomií chromosomu 21 a vyššího věku matky (Penrose, 2009). Obecné riziko výskytu aneuploidií u klinicky rozpoznaných gravidit významně vzrůstá s věkem matky až k více než 30% riziku u žen starších 40 let (Hassold and Hunt, 2001; Kutteh, 2015). Aneuploidie chromosomů jsou přímým následkem poruchy jejich segregace vlivem změněné dynamiky mikrotubulů dělicího 21 vřeténka během meiózy. Většina aneuploidií chromosomů je spojena s letalitou plodu, avšak i u většiny viabilních jedinců s trisomiemi lze pozorovat závažné DID a asociované VVV (Chiang et al., 2012). I přes existující důkazy o tvorbě gamet disomických pro určité chromosomy (1, 9, 18, 21, X a Y) u mužů vyššího věku nebyla dosud jednoznačně nalezena korelace mezi vyšším věkem otců a vyšším rizikem aneuploidií u jejich potomků (Fonseka and Griffin, 2011; Donate et al., 2016). Klíčový pokrok v identifikaci strukturních genomových variant významných v patogenezi DID a asociovaných abnormalit byl zaznamenán zejména s nástupem metod molekulární cytogenetiky. Tyto technologie vedly k rozšíření poznatků o etiopatogenezi DID na molekulární úrovni a k identifikaci strukturních variant genomu, zejména kryptických mikrodelecí a mikroduplikací, jako zdroje přirozené variability v populaci a genetické diverzity mezi jedinci či jako zdroje klinické manifestace odchylek nad rámec přirozené fenotypové variability.

1.2.2.1. Variabilita v počtu kopií

Varianty v počtu kopií (CNVs) představují oblasti zisků a ztrát genetického materiálu genomu u jedinců v populaci a jsou zastoupeny segmenty DNA většími než 1 kb, jež jsou přítomny ve změněném počtu kopií oproti referenčnímu genomu (Redon et al., 2006). Mohou mít jednoduchou strukturu (tandemové duplikace), nebo naopak mohou zahrnovat komplexní kvantitativní změny homologních sekvencí na mnoha místech genomu. Rozvoj nových technologií analýzy genomu, zejména celogenomového sekvenování (WGS), je spojen se zvýšením citlivosti detekce CNVs menšího rozsahu. Současné definice proto specifikují CNVs jako segmenty DNA větší než 50 bp (Nowakowska, 2017). V lidském genomu se v důsledku jeho specifické architektury vyskytuje přibližně 1500 „hotspot“ oblasti CNVs > 1kb, pokrývající přibližně 12 % jeho velikosti (celkově 360 Mb) (Redon et al., 2006). CNVs zahrnují stovky genů, oblasti asociované s onemocněními, funkční elementy a oblasti repetitivních sekvencí o nízkém počtu kopií (low-copy repeats, LCR), označované také jako segmentální duplikace. CNVs běžně segregují v populaci, avšak u konkrétního jedince mohou také vznikat de novo. Rozsáhlé CNVs vznikají velmi vzácně (0,01-0,02 událostí na jednu generaci), avšak poté se významně podílejí na patogenezi závažných neurovývojových poruch a vývojových vad s časným nástupem v důsledku abnormálního počtu kopií genů a změn v genové expresi. Přítomnost CNVs s klinickým významem je příčinou tzv. „genomových onemocnění“ („genomic disorders“) (Acuna- Hidalgo et al., 2016; Harel and Lupski, 2018). Jejich molekulární patogeneze spočívá

22 zejména v přestavbách genomu v důsledku specifické architektury genomu, jež vede k jeho nestabilitě (Lupski, 2009).

Mechanismy vzniku CNVs Dle mechanismu vzniku lze rozlišit dvě skupiny CNVs: rekurentní a non-rekurentní. Rekurentní CNVs primárně vznikají mechanismem nealelické homologní rekombinace (NAHR) během meiózy mezi LCR v přímé orientaci, které jsou paralogními segmenty se sekvenční identitou > 95 % a délce 10-400 kb (Stankiewicz and Lupski, 2002; Hastings et al., 2009). Pro každou takovou oblast mohou vznikat reciproké přestavby, tedy mikrodelece a mikroduplikace zasahující stejnou oblast genomu. Tento model je prokázán přítomností míst zlomu ve stejné či podobné oblasti genomu u skupin pacientů s rekurentními CNVs pomocí celogenomových analýz s vysokým rozlišením (array-CGH, WGS) (Ritz et al., 2011). Oproti tomu non-rekurentní CNVs se vyskytují v oblastech genomu s velmi nízkým stupněm homologie (2-15 bp), který není dostatečný pro procesy homologní rekombinace, a proto se zde uplatňují procesy zejména nehohomologického spojování konců (non-homologous end joining, NHEJ) či procesy blokování replikační vidlice a změny templátového vlákna během replikace DNA (fork stalling and template switching, FoSTeS) (Lee et al., 2007; Gu et al., 2008; Hastings et al., 2009; Liu et al., 2012). Vznikající přestavby chromosomů mají typicky komplexní charakter a vyznačují se krátkými inzertovanými sekvencemi na místě spojů. V oblastech non-rekurentních CNVs můžeme vzhledem k jejich komplexitě nacházet duplikované či triplikované sekvence, inverze a delece. Vzhledem k obecné vysoké komplexitě lidského genomu a výskytu fragilních míst se mohou mechanismy NHEJ a FoSTes dle Weise et al. (2012) vzácně podílet rovněž na vzniku rekurentních přestaveb. Srovnání základních mechanismů vzniku CNVs je schematicky znázorněno na obr. 2 (Gu et al., 2008; upraveno).

Obrázek 2: Srovnání základních mechanismů vzniku CNVs. Zleva: intrachromatidová NAHR mezi LCRs přímé orientace, vedoucí k deleci/duplikaci částí LCRs a sekvenci mezi nimi. Uprostřed: Dvouřetězcové zlomy DNA mezi dvěma nehomologickými sekvencemi. Mechanismem NHEJ jsou upraveny a znovuspojeny konce zlomů, což vede k deleci úseku DNA mezi místy zlomů. Vpravo: Komplexní delece dvou oblastí DNA v důsledku mechanismu FoSTeS. Prázdné trojúhelníky označují oblasti mikrohomologie (2-5 bp) mezi modře a červeně značenou sekvencí DNA. Černé trojúhelníky označují oblasti mikrohomologie mezi červeně a zeleně značenou sekvencí DNA. Replikační vidlice (RV) ze dvou sousedících sekvencí jsou znázorněny stejnou barvou jako výchozí sekvence. RV se vmezeří do sousedící sekvence prostřednictvím mikrohomologie a replikační vidlici v dané sekvenci použije jako templát. Následkem jsou delece fragmentů, které jsou obklopené oblastmi mikrohomologie (Gu et al., 2008; upraveno).

Celogenomové analýzy zaznamenaly poněkud kontroverzní a ne zcela jednoznačné závěry z hlediska parentálního původu de novo CNVs. Studie Ma et al. (2017) prokázala významný rozdíl v distribuci de novo CNVs z hlediska jejich parentálního původu a typu CNVs, kdy byl zaznamenán významně vyšší podíl de novo mikrodelecí lokalizovaných na paternálním chromosomu, kdežto de novo mikroduplikace se významně častěji týkaly lokusů na chromosomech maternálního původu. V této studii byly však významně méně zastoupeny mikroduplikace pravděpodobně kvůli nekompletní penetranci a variabilní expresivitě. Dřívější studie Hehir-Kwa et al. (2011) lokalizovala většinu de novo CNVs na paternální chromosom, a to navíc bez ohledu na jejich typ či velikost. Další analýza v rámci uvedené studie prokázala souvislost vyššího věku otců a výskytem non-rekurentních CNVs. Tento fakt lze vysvětlit vyšším počtem buněčných dělení spermatogonií, což zvyšuje riziko chyb a jejich nedostatečné reparace během replikace DNA. V případech zděděných CNVs byla pozorována 2x vyšší frekvence CNVs maternálního původu bez ohledu na jejich typ (Liehr et al., 2018).

Klinický význam CNV a efekt genové dávky Citlivost jednotlivých genů k počtu svých kopií je významným kritériem určujícím míru patogenity dané CNV. Klinicky významné CNVs obvykle obsahují geny citlivé na počet svých kopií, respektive velký počet těchto genů. Geny citlivé na počet svých kopií jsou obvykle evolučně konzervované z hlediska počtu svých kopií a primární struktury a podílí se na vývojových procesech. CNVs bez klinického významu obvykle jsou chudé na geny nebo obsahují geny s variabilním počtem kopií a nízkou evoluční konzervovaností (Rice and McLysaght, 2017). S tímto faktem lze také korelovat velikost CNV a míru její patogenity. Identifikace rozsáhlé CNV je obvykle spojena s patogenním vlivem na fenotyp jedince z důvodu větší pravděpodobnosti výskytu genů citlivých na počet svých kopií, respektive vyššího počtu těchto genů v dané CNV. Citlivost na genovou dávku lze klasifikovat do několika skupin podle efektu, který vyvolá abnormální počet kopií daného genu. Haploinsuficience charakterizuje situaci, kdy jedna funkční alela genu (hemizygotní stav) není schopna zajistit dostatečné množství genového produktu (Veitia, 2002). Dle výsledků studií genetické variability bylo identifikováno více než 3000 lidských genů, které vykazují haploinsuficienci při ztrátě jedné alely, tzv. „geny netolerující ztrátu funkce“ (loss-of- function-intolerant genes, LoF-intolerant genes), přičemž více než 70 % z nich nebylo do té doby identifikováno v souvislosti s lidskými onemocněními (Lek et al, 2016). Heterozygotní varianta spojená s LoF tedy nemusí vždy korelovat s letalitou či patologickými stavy, avšak může přinášet například reprodukční nevýhodu. Oproti tomu nadbytečná kopie genu je vzácněji spojena s patologickými stavy. V důsledku nadbytečné kopie genu může nadbytečné množství genového produktu agregovat nebo interagovat s nesprávnými biomolekulami s nižší afinitou než v případě normálního stavu počtu kopií (Ross and Poirier, 2004; Vavouri et al., 2009). Triplosenzitivita není jediným vysvětlením patogenního efektu duplikací, resp. mikroduplikací. Duplikace většího rozsahu a větší počet genů v dané oblasti duplikace korelují s mírou patogenity, stejně tak patogenita duplikací může spočívat v poruchách genové exprese či disrupce genů v místech zlomů DNA. Míra patogenity může být rovněž ovlivněna orientací duplikovaného segmentu a jeho lokalizací v genomu (Newman et al., 2015). Většina mikroduplikací (> 80 %) vykazuje tandemovou organizaci a přímou orientaci, v menší míře bývají zastoupeny komplexní přestavby zahrnující triplikace, obrácené duplikace, inzerční translokace a další duplikace neznámé struktury. Místa zlomů jsou obvykle unikátní pro každého jedince s danou CNV, identitu míst zlomů u nepříbuzných jedinců lze pozorovat v případě CNVs představujících populační polymorfismy.

Z hlediska klinické praxe každá CNV vyžaduje interpretaci vedoucí k posouzení genotypově-fenotypové korelace. V procesu stanovení klinického významu daných CNVs by měla být zohledněna klasifikační kritéria klinického významu CNVs dle doporučení Buysse et al. (2009), která v sobě zahrnují: 1) identifikaci známých CNVs spojených s rekurentními mikrodelečními a mikroduplikačními syndromy na základě informací v databázích genomických variant (např. DECIPHER - Firth et al., 2009) a identifikaci známých oblastí spojených s DID a asociovanými VVV dle charakteru genů lokalizovaných v CNVs (databáze OMIM - Hamosh et al., 2002), 2) odlišení běžných polymorfních CNVs od vzácných CNVs na základě informací z databází genomových variant či interní databáze dané laboratoře, 3) stanovení původu nepolymorfních CNVs na základě vyšetření rodičů daného pacienta. S ohledem na interpretaci CNVs ve smyslu korelace genotypu s fenotypem jedince je nezbytné posuzovat míru patogenity dané CNV s informacemi o jejich původu. CNVs mohou být u vyšetřovaného jedince původu de novo, nebo mohou být zděděny od rodiče. Při potvrzení familiální segregace CNV je třeba znát osobní anamnézu rodiče, eventuálně širší rodinnou anamnézu v případě výskytu CNV u dalších příbuzných. Při zohlednění výše uvedených kritérií a dle doporučení pro systematickou klasifikaci jsou poté CNVs zařazeny do klasifikačních skupin dle svého klinického významu. Dle výsledků rozsáhlých studií bylo publikováno několik systémů klasifikace do různého počtu tříd, přičemž se vychází z modelu navrženého ve studii Buysse et al. (2009). V roce 2019 byla vydána „European guidelines for constitutional cytogenomic analysis“, kde je navržena klasifikace CNVs do pěti skupin na základě rozdílů v četnosti jejich výskytu v populaci a postiženými jedinci (Nowakowska, 2017; Silva et al., 2019):

1) Benigní CNVs: frekvence daných CNVs u jedinců s patologickým fenotypem se shoduje s populační frekvencí, jsou opakovaně detekovány u jedinců s normálním fenotypem 2) Pravděpodobně benigní CNVs: neobsahují geny, ale jejich velikost překračuje hodnotu pro reportování 3) Varianty nejasného významu (variant of unclear significance, VOUS): obsahují geny s neznámou citlivostí na počet kopií („dosage sensitivity“), není zcela objasněn jejich funkční význam. CNVs klasifikovány jako VOUS mohou být přeřazeny do kategorií benigní či patogenní s ohledem na aktuální informace z relevantní vědecké literatury (Vermeesch et al., 2012; Westerfield et al., 2014).

4) Pravděpodobně patogenní CNVs: daná CNV byla detekována u pacienta s podobným fenotypem, nebo gen lokalizovaný uvnitř CNV kóduje produkt s funkcí vztahující se k fenotypu vyšetřovaného jedince 5) Patogenní CNVs: patogenita CNV je doložena její přítomností u jedinců s patologickým fenotypem. Patří sem rovněž CNVs s neúplnou penetrancí a variabilní expresivitou.

Rozsáhlé studie prokázaly přibližně 15-20% podíl klinicky významných CNVs na patogenezi DID a asociovaných VVV (Miller et al., 2010). Intepretace nálezu CNVs by vždy měla probíhat dle výše uvedených kritérií. S rostoucími poznatky je doporučeno informace o vzácných CNVs zpřístupnit prostřednictvím veřejných databází genomových variant (Nowakowska, 2017).

1.2.2.2. Změny primární struktury DNA

Významný zdroj variability lidského genomu mezi jednotlivci v populaci představují změny na úrovni sekvence DNA. V genetické informaci přenášené napříč generacemi skrze gamety vznikají během gametogeneze nebo postzygoticky během embryogeneze nové varianty měnící sekvenci DNA, z nichž některé mají potenciál měnit strukturu a funkci genových produktů či genovou expresi. Sekvenční varianty vznikající v buňkách zárodečných tkání mohou být přeneseny do dalších generací. Nové sekvenční varianty v DNA somatických buněk mohou být příčinou vzácných onemocnění postihujících specifické tkáně či se podílet na nádorové transformaci (Erickson, 2003; Luzzatto, 2011). Projekt 1000 Genomes charakterizoval variabilitu lidského genomu prostřednictvím WGS, WES a genotypizace pomocí mikročipů analýzou DNA více než 2 500 jedinců z 26 populací (1000 Genomes Project Consortium et al., 2015). Bylo popsáno více než 88 milionů variant, zahrnující 84,7 milionů jednonukleotidových polymorfismů (single-nucleotide polymorphism, SNP), 3,6 milionů krátkých insercí či delecí (indel) a 60 000 strukturních variant. Průměrný lidský genom se odlišuje až na 5 milionech nukleotidových pozicích oproti referenční sekvenci. Většina této variability má charakter polymorfismů a je sdílena s více než 0,5 % jedinců v populaci. Avšak v lidském genomu se rovněž nachází průměrně až 200 000 vzácných variant s frekvencí výskytu menší než 0,5 % v populaci. Frekvence vzniku de novo jednonukleotidových variant (single-nucleotide variant, SNV) je odhadována na 1-1,8×10-8 na nukleotid a jednu generaci, což v přepočtu znamená 44-82 de novo SNVs v genomu každého jedince, z toho 1 až 2 SNVs zasahují kódující

27 sekvence (Acuna-Hidalgo et al., 2016; Goldmann et al., 2016). Varianty v sekvenci DNA, jež se projeví příznivým působením na fenotyp jedince, se propagují přenosem napříč generacemi, kdežto varianty se škodlivým vlivem na zdraví či reprodukci podstupují purifikující selekci, čímž je omezen jejich přenos do další generace potomstva (Hurst, 2009; Fu and Akey, 2013). Zisk či ztráta určité vlastnosti znaku u jedince se může projevit formou patologie, avšak na úrovni populací je hnací silou evoluce druhů. Přínos celogenomových „trio-based“ analýz (jedinec s DID a jeho rodiče) spočívá rovněž v bližší charakteristice de novo variant, zejména ve stanovení rodičovského původu (lokalizace na maternální, či paternální alele), resp. zárodečného či postzygotického původu. Přibližně 80 % zárodečných variant je lokalizováno na alele paternálního původu, přičemž jako hlavní rizikový faktor pro zvýšený počet de novo patogenních sekvenčních variant u potomstva je považován vyšší věk otce při početí (Neale et al., 2012; Acuna-Hidalgo et al., 2016). Spermatogonie podstupují buněčná dělení v průběhu celého života, tím dochází k progresivní akumulaci patogenních sekvenčních variant během replikace DNA a současně klesá efektivita mechanismů opravujících nereplikativní poškození DNA. Studie 78 islandských rodin navíc prokázala, že se vzrůstajícím věkem otce se každoročně lineárně zvyšuje počet o 2 de novo patogenní sekvenční varianty u nově počatých dětí, respektive se zdvojnásobuje počet de novo patogenních sekvenčních variant paternálního původu každých 16,5 roku (Kong et al., 2012). Další studie tyto poznatky potvrdily analýzou věkově odlišných skupin rodičů. Bylo prokázáno, že děti otců starších 40 let v době početí nesou ve svém genomu skoro dvojnásobný počet de novo patogenních sekvenčních variant paternálního původu než děti otců mladších o 20 let. Studie Wong et al. (2016) a Girard et al. (2016) tyto korelace rozšířily o menší, avšak rovněž významný vliv vyššího věku matky při početí potomka. Výskyt de novo patogenních sekvenčních variant maternálního původu vykazuje spíše exponenciální růst se vzrůstajícím věkem matky. Tento jev může být dle závěrů studie Wong et al. (2016) následkem vyšší citlivosti maternálních zárodečných buněk k akumulaci spontánních patogenních sekvenčních variant během života, rovněž zygoty pocházející ze zárodečných buněk matek vyššího věku mohou vykazovat vyšší rychlost tvorby nových variant. Předchozím studiem myších oocytů byl také prokázán vyšší počet buněčných dělení během oogeneze až do tvorby zygoty u starších matek (Reizel et al., 2012). Recentní komplexní studie Gao et al. (2019) odhalila, že významný podíl zárodečných patogenních sekvenčních variant není důsledkem pouze poruch replikace při spermatogenezi, ale také metabolických procesů při buněčném dělení a neopravených lézí DNA. Daná studie zabývající se vznikem de novo patogenních sekvenčních variant též prokázala nevýznamný

28 efekt reprodukčního věku na poměr variant paternálního či maternálního původu a na jejich vzrůstající počty. Také navíc naznačila vliv věku matky na počet patogenních sekvenčních variant postzygotického původu v obou rodičovských genomech. Na základě poznatků v dané studii lze uvažovat vliv věku matky na mutagenezi během raného embryonálního vývoje potomka. Tyto poznatky se významně odlišují od vlivu vyššího věku rodičů na vyšší riziko přítomnosti aneuploidií a vzácných CNVs u potomstva pravděpodobně z důvodu jiného mechanismu vzniku. Recentní studie dokumentují rostoucí význam sekvenčních variant postzygotického původu v patogenezi PAS (Pieras et al., 2011; Alonso-Gonzalez et al., 2018). Vznikají během mitotických dělení buněk embrya a v těle jedince určitý podíl buněk poté nese danou sekvenční variantu (Biesecker and Spinner, 2013), přičemž vývojové období a zasažené buněčné linie mohou implikovat závažnost postižení. Význam mosaicistních sekvenčních variant byl rovněž prokázán v patogenezi dalších neurovývojových poruch (epilepsie, malformace mozkové kůry, RASopatie) (Alonso-Gonzalez et al., 2018).

Mechanismy vzniku sekvenčních variant Oproti vzniku CNVs během meiózy vlivem procesů NAHR, NHEJ či během replikace DNA procesem FoSTeS je původ většiny SNVs či indelů (insercí/delecí) následkem chyb během replikace DNA a nedostatečné kapacity opravných mechanismů. Replikace DNA je katalyzována DNA polymerázami a s vysokou přesností jedné chyby na 104-105 bp (Ségurel et al., 2014), přičemž korektorská aktivita („proofreading“) obou enzymů kontroluje správnost zařazení jednotlivých bází dle komplementarity. Chyby v replikaci DNA jsou opravovány vysoce efektivním procesem „mismatch“ reparací, což vysvětluje nízkou frekvenci výskytu de novo sekvenčních variant (1-1,8×10-8/nukleotid/generace) oproti uvedené chybovosti procesu replikace DNA. Na vzniku de novo sekvenčních variant se také podílí zařazení poškozených nukleotidů během replikace s následným chybným párováním a substitucemi bází (Maki, 2002). Během života je lidský organismus vystaven působení agens s mutagenním potenciálem. Vznikající patogenní sekvenční varianty jsou opravovány odlišnými procesy před samotnou replikací DNA, a to zejména mechanismy nukleotidové a bázové excizní reparace. V případě nedostatečné reparace mohou jednotlivé buňky podléhat buněčné smrti (Gao et al., 2016). Přesnost procesů reparace a replikace DNA je nižší v oblastech genomu s vyšší diversitou a navíc byly sekvenční varianty detekovány v oblastech s místy zlomu typickými pro CNVs, což poukazuje na potenciál sekvenčních variant výrazně ovlivňovat a

29 kumulovat vznik dalších variant na úrovni sekvence DNA či variant měnících strukturu chromosomů (Conrad et al., 2010).

Klinický význam sekvenčních variant DNA v patogenezi DID a PAS Přístupy celogenomových analýz (WGS, array-CGH) a celoexomového sekvenování (WES) bylo identifikováno více než 2000 genů s významem v patogenezi DID a asociovaných VVV, přičemž jsou zde zahrnuty geny s prokázaným významem v patogenezi DID a rovněž kandidátní geny. Komplexní informace o genech popsaných v patogenezi DID jsou integrovány v databázích, například v databázi SysID, jež je spravována nizozemským výzkumným univerzitním centrem Radboudumc a jeho odděleními CMBI a Human Genetics Nijmegen a výzkumným konsorciem GENCODYS (https://sysid.cmbi.umcn.nl/, Kochinke et al., 2016). Dle aktualizace ze dne 5. srpna 2019 je v této databázi uvedeno 1257 genů popsaných v patogenezi DID a 1141 kandidátních genů. Jedná se o protein-kódující geny, geny pro nekódující RNA (miRNA a RNA složky endonukleázy uplatňující se v biogenezi mitochondriální RNA) a pro mitochondriální tRNA. Jejich funkční kategorizace a objasnění procesů, v nichž jsou zapojeny, poskytuje zásadní informace pro identifikaci a popis buněčných a molekulárních mechanismů nejen u genů se známých významem v patogenezi DID, ale rovněž u kandidátních genů. Bylo popsáno několik tříd biomolekul účastnících se různých esenciálních buněčných procesů, jimiž je řízena a regulována morfologie neuronů a jejich vzájemná komunikace a interakce. Biomolekulární komplexy jsou lokalizovány na synapsích a z hlediska jejich funkce a podle procesů, jichž se účastní, je lze rozdělit do tříd: 1) morfologie neuronů, synaptická plasticita a kognitivní poruchy, 2) regulace dynamiky cytoskeletu, 3) cyklování presynaptických veziklů a exocytóza, 4) regulace translace, degradace proteinů a turnover, 5) molekuly buněčných adhezí v procesech signalizace přes synapse (Srivastava and Schwartz, 2014). Geny s klinickým významem v patogenezi DID a PAS jsou zapojeny v mnoha fyziologických procesech vývoje CNS a jejích efektorových funkcích. Mnohé rovněž propojují jednotlivé signální dráhy, což může modifikovat jednotlivé neuronální funkce. Porozumění uvedeným drahám a z nich se odvíjejícím buněčným a molekulárním mechanismům vývoje a funkce CNS může představovat první krok ve vývoji potenciálních terapeutických přístupů zlepšujících kvalitu života pacientů s DID a asociovanými VVV, což nastínily nedávné studie na modelových systémech (Picker and Walsh, 2013).

1.2.2.3. Nemendelistická dědičnost

Nemendelistická segregace onemocnění v rodinách a různá míra klinické manifestace fenotypových projevů spolu s jejich variabilitou představují komplikace v klinické i molekulární diagnostice DID. Klinickou interpretaci asociovaných genetických variant ve vztahu k fenotypu jedince komplikují zejména model multifaktoriální dědičnosti, mitochondriální dědičnost, genomový imprinting a expanze trinukleotidových repetic.

Model multifaktoriální dědičnosti Částečné vysvětlení nemendelistické segregace onemocnění v rodinách s sebou přinesl model „dvou zásahů“, respektive model „více zásahů“, který uvažuje vlivy nekompletní penetrance a variabilní expresivity detekovaných variant a fenotypový projev onemocnění podmiňuje přítomností nejméně dvou událostí. Tyto události mohou mít charakter genetických variant i environmentálních faktorů (Girirajan et al., 2010; Girirajan and Eichler, 2010; Girirajan et al., 2012; Karaca et al., 2018). V souvislosti s uvedeným modelem byla identifikována skupina rekurentních CNVs označována jako rizikové lokusy („susceptibility locus“ nebo „risk locus“). Vyznačují se nízkou mírou penetrance a pro jejich klinickou manifestaci ve formě pozměněných intelektuálních funkcí či chování u daného jedince je nutná přítomnost minimálně jednoho dalšího zásahu ve formě rozsáhlé CNV (> 500 kb) či sekvenční varianty v genu vztahujícím se k fenotypu jedince nebo environmentálního vlivu působícího na fenotyp. Fenotypová variabilita jedinců nesoucí rekurentní CNVs může být vysvětlena nejméně dalšími třemi modely: 1) fenotypový projev recesivní patogenní sekvenční varianty v lokusu s mikrodelecí, 2) SNV v regulační oblasti CNV ovlivňující expresi genů uvnitř daného lokusu, 3) různé velikosti CNVs vedoucí k odlišným fenotypovým projevům, 4) genomový imprinting v oblasti mikrodelece (obr. 3).

Obrázek 3: Příčiny fenotypové variability u jedinců s rekurentními patogenními CNVs. A) Přítomnost recesivní sekvenční varianty na druhé alele v lokusu s mikrodelecí, B) sekvenční varianta v regulační oblasti genu uvnitř CNV (zde mikrodelece), C) různá velikost CNVs s různými fenotypovými projevy, D) genomový imprinting v oblasti mikrodelece, e) klasický model dvou zásahů (Girirajan and Eichler, 2010; upraveno).

Mitochondriální onemocnění Aktivita mitochondrií hraje hlavní úlohu v neurogenezi a synaptické plasticitě, kdy představují hlavní zdroj energie za spotřeby kyslíku. Energie ve formě ATP je spotřebována na tvorbu aktinového cytoskeletu při tvorbě růstového konusu u axonů, při sestavování presynaptických kompartmentů, tvorbě membránového potenciálu, recyklaci synaptických vezikulů, endocytóze a mnoha dalších buněčných procesech. Deficit energie a oxidativní stres, tj. produkce reaktivních kyslíkových radikálů, s dopadem na intelektuální funkce jedince patří k významným příčinám neurovývojových poruch včetně DID (Valenti et al., 2014). Mimo snížení intelektuální funkcí se nedostatek energie vlivem dysfunkce mitochondrií projevuje rovněž hypotonií, poruchami koordinace pohybu, kardiomyopatiemi či laktátovou acidózou. Z tkání jsou postiženy zejména tkáně s vysokou spotřebou kyslíku a vysokou metabolickou aktivitou (CNS, srdce, svalstvo, ledviny). Kvantitativní molekulárně genetické analýzy prokázaly abnormální počet kopií mitochondriální DNA (mtDNA) u jedinců s DID a PAS. Pomocí přístupu hlubokého NGS cíleného na mtDNA byly detekovány putativní patogenní sekvenční varianty u více než 25 %

32 jedinců s PAS a více než 30 % jedinců s DID při úrovni heteroplazmie vyšší než 60 % (Valiente-Pallejà et al., 2018). Recentní studie na experimentálních modelech prokázaly silnou asociaci mitochondriálních dysfunkcí s patogenezí Downova syndromu (Helguera et al., 2013). Jsou spojeny zejména s vysokým oxidativním stresem v důsledku nadprodukce reaktivních kyslíkových radikálů (Valenti et al., 2011). Význam dysfunkce mitochondriálních aktivit byl rovněž prokázán v patogenezi Rettova syndromu, syndromu fragilního X a u PAS. Etiologie PAS se vyznačuje výraznou mírou heterogenity na úrovni genetických variant a s tím související variabilitou manifestace klinických příznaků. U některých jedinců s PAS byly pozorovány metabolické poruchy v důsledku dysfunkce mitochondrií, související s abnormálními hladinami laktátu, pyruvátu, alaninu či kyseliny močové. Identifikace podskupin pacientů PAS s kombinovaným postižením je zásadní pro volbu optimální terapie v rámci diferenciální diagnostiky (Frye et al., 2013).

Genomový imprinting Genomový imprinting představuje unikátní způsob epigenetické regulace u živočichů a vyšších rostlin. Svými mechanismy vede k preferenční parentálně-specifické monoalelické expresi genů během vývoje CNS a jejich funkcí v postnatálním období života. V postnatálním období života se genomový imprinting uplatňuje v základních procesech přenosu signálu přes synapse, v synaptické plasticitě, řízení energetické rovnováhy a metabolismu a také ve vyšších funkcích CNS zahrnujících emoční a sociální chování a kognitivní funkce (Perez et al., 2016). Z hlediska vyšších funkcí se produkty genů exprimované ze své paternální alely dále účastní procesů regulace dospívání, reprodukčního a mateřského chování, kdežto genové produkty exprimované z maternální alely hrají klíčovou úlohu v pozitivní a negativní regulaci emočního chování či kognitivních schopností. Dysregulace exprese genů podléhajících genomovému imprintingu jsou následkem absence funkční neimprintované kopie genu, duplikací imprintované oblasti, uniparentální disomie či změn v epigenetických značkách (Eggermann et al., 2015). V současnosti je známo jen kolem deseti syndromických poruch imprintingu spojených s DID, avšak již více než 200 známých či kandidátních genů, jejichž exprese je regulována genomovým imprintingem (Mayo et al., 2015). Pro svoji významnou klinickou závažnost jsou dané neurovývojové poruchy předmětem vývoje terapeutických postupů ve smyslu reaktivace exprese reprimované alely (Perez et al., 2016).

Expanze trinukleotidových repetic Přítomnost nestabilních trinukleotidových repetic (TNR) spojená s jejich abnormální expanzí je popisována jako kauzální genetická varianta více než 20 neurologických onemocnění či vývojových poruch. Jako první onemocnění v této kategorii byl popsán syndrom fragilního X. Jeho frekvence je odhadována kolem 1:4000-1:5000 u mužů a po trisomii chromosomu 21 je u nich druhou nejčastější příčinou DID (Hunter et al., 2014). Expanze TNR spojené s patologiemi se vyskytují v kódujících i nekódujících oblastech kauzálních genů a narušují regulaci jejich genové exprese. Počet TNR se dynamicky mění v závislosti na lokalizaci vně či uvnitř kódující oblasti (McMurray, 2010). TNR uvnitř kódujících sekvencí se stávají nestabilními při počtu kolem 29-35 a jejich počet se mění o méně než 10 TNR v další generaci do stavu premutace či plné mutace. Familiální přenos TNR v nekódujících oblastech genu je iniciován od stavu premutace TNR a narůstá až o 100-10 000 TNR za generaci. Po překročení mezní hodnoty narůstá pravděpodobnost expanze a další nestability. V případě dynamického přenosu TNR do další generace asociovaná onemocnění vykazují dřívější a závažnejší klinickou manifestaci, tzv. genetickou anticipaci (Wells, 1996). Na funkční úrovni se TNR poté projevují ziskem či ztrátou funkce daných proteinů (Budworth and McMurray, 2013; Nelson et al., 2013).

1.3. Metodické přístupy analýzy genomu jedinců s DID

Metody genetické analýzy se staly standardním přístupem pro vyšetření dětí s idiopatickými DID a asociovanými VVV. Identifikace příčinné souvislosti mezi genetickým založením jedince a jeho fenotypem vykazujícím patologické znaky umožňuje stanovení diagnózy na molekulární úrovni až u 50-60 % jedinců s DID. Současné studie prokazují významnou genetickou heterogenitu v patogenezi DID, která zahrnuje široké spektrum početních i strukturních změn chromosomů detekovatelných metodami klasické cytogenetiky, submikroskopických přestaveb chromosomů typu CNVs, změn na úrovni sekvence DNA či poruch regulace genové exprese (Durkin, 2002). Před nástupem metod pro komplexní analýzu genomu existovaly značné rozdíly v epidemiologických datech, které byly způsobeny variabilitou zkoumaných populací, metodami klinické diagnostiky a klasifikace, dostupností technologií pro analýzu genomu a jejich vhodným využitím. Postižení jedinci obvykle podstupují široké spektrum klinických vyšetření na úrovni multioborové spolupráce.

1.3.1. Cytogenetické vyšetření

Pro pacienty s klinickým obrazem, který odpovídá specifickému syndromu spojenému se známou chromosomovou abnormalitou, se metody klasické cytogenetiky či analýzy přestaveb chromosomů metodami fluorescenční in situ hybridizace (fluorescence in situ hydridization, FISH) a MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) staly základním genetickým vyšetřením. Cytogenetické vyšetření karyotypu metodou G-pruhování s citlivostí přibližně 5-10 Mb umožňuje vizualizaci chromosomů za účelem detekce změn v počtu a struktuře chromosomů. Před nástupem technologií celogenomového screeningu nebalancovaných submikroskopických chromosomových přestaveb představovalo vyšetření karyotypu po několik desítek let test první volby, avšak s nízkým diagnostickým záchytem 3-4 % při vyloučení známých syndromů spojenými s aneuploidemi chromosomů (Miller et al., 2010). Dle doporučení uvedeného v uvedené studii by vyšetření karyotypu mělo být vyhrazeno primárně pro pacienty s vysoce suspektními syndromy spojenými s aneuploidiemi chromosomů, dále pro pacienty s familiálním výskytem přestaveb chromosomů a s anamnézou opakovaných abortů.

1.3.2. Metody molekulární cytogenetiky

1.3.2.1. Metoda FISH Metoda FISH je založena na principu hybridizace fluorescenčně značené DNA sondy k cílovému místu na cytogenetickém preparátu (Volpi and Bridger, 2008). Pro tento účel se používají komerčně dostupné sondy pro rutinní diagnostiku či sondy vyráběné dle specifikace. Sondu zde představuje oblast DNA komplementární k cílovému místu na cytogenetickém preparátu, které je značena fluorescenční značkou. Vyšetřovaným materiálem jsou interfázní jádra nebo chromosomy v metafázi na cytogenetickém preparátu. Uplatnění metody FISH v molekulární diagnostice DID spočívá v potvrzení či vyloučení diagnosy suspektního rekurentního mikrodelečního syndromu a k detekci submikroskopických přestaveb subtelomerických oblastí chromosomů. Oblasti subtelomer se vyznačují vysokou hustotou genů, jejich submikroskopické přestavby se vyskytují přibližně u 7-10 % jedinců s DID a asociovanými abnormalitami (Dawson et al., 2002). V návaznosti na cytogenetické vyšetření karyotypu se metoda FISH rutinně využívá k potvrzení či upřesnění cytogenetických nálezů strukturních či početních změn chromosomů (translokací a aneuploidií) a v neposlední řadě pro určení stupně mozaicismu pro danou chromosomovou aberaci (Ratan et al., 2017). Kromě potvrzení cytogenetických nálezů ji lze použít pro potvrzení nálezů aneuploidií detekovaných metodou kvantitativní fluorescenční polymerázové řetězové reakce (quantitative fluorescence polymerase chain reaction; QF-PCR), zejména v případech selhání kultivace buněk pro cytogenetické vyšetření karyotypu nebo při časové tísni. Výhoda metody FISH spočívá v rychlosti vyšetření, kdy výsledek vyšetření může být znám již za několik hodin od přijetí požadavku, a v jednoduchém hodnocení nálezů při standardní kvalitě cytogenetických preparátů. Mezi hlavní nevýhody se řadí omezené využití pouze pro definované případy kryptických přestaveb chromosomů, nemožnost detekce tandemových mikroduplikací a v případě strukturních změn chromosomů nemožnost přesného určení jejich rozsahu spolu se zasaženými geny. Metoda celochromosomové FISH je limitována velikostí přestaveb (> 5-10 Mb) a také využitelností pouze na metafázních chromosomech.

1.3.2.2. Metoda MLPA Metoda MLPA je semikvantitativní metoda vycházející z principu PCR. Její princip spočívá v ligaci dvou těsně přiléhajících sond a jejich následné amplifikaci. Nejčastěji nachází své uplatnění v detekci rekurentních mikrodelečních a mikroduplikačních syndromů, CNVs v subtelomerických oblastech chromosomů a při stanovení metylačního stavu u onemocnění

36 spojených s poruchou genomového imprintingu, v detekci aneuploidií a SNPs (Kirchhoff et al., 2007). Pro každou aplikaci je nyní dostupných několik sad podle požadovaných vyšetření. Při standardní kvalitě výstupů analýzy musí být následně všechny výsledky hodnoceny vzhledem ke kontrolním vzorkům a vzájemně mezi sebou pro vyloučení variability v rámci jedné analýzy. Výhodou analýz metodou MLPA je rychlý screening vybraných oblastí genomu vyžadující malé množství DNA. Vzhledem k omezenému množství sond v rámci jedné analýzy nelze v případě verifikace CNV určit její přesný rozsah ani zasažené geny. Metodou MLPA rovněž nelze detekovat změny mimo oblasti vymezené sondami, balancované přestavby ani mozaicismus. Spolehlivost výsledků metody MLPA snižují vzorky DNA o nízké kvalitě a jejich nepřesná kvantifikace, nevhodné kontrolní vzorky a technologické artefakty. Samotnými analýzami subtelomerických oblastí metodami FISH či MLPA jako metodami první volby lze objasnit genetickou příčinu DID a asociovaných VVV u přibližně 5-6 % dětí (Kirchhoff et al. 2007), při kombinací vyšetření karyotypu a cíleného screeningu specifických oblastí chromosomů metodami molekulární cytogenetiky lze identifikovat chromosomové abnormality u přibližně 8-10 % dětí s DID (De Vries et al., 2003; Lam et al., 2006).

1.3.2.3. Metoda array-CGH Využití metody array-CGH pro celogenomový screening nebalancovaných submikroskopických přestaveb chromosomů znamenalo revoluční krok v molekulárně diagnostickém algoritmu pro vyšetřování dětí s idiopatickými DID (Solinas-Toldo et al., 1997; Thuresson et al., 2007). V současnosti představuje metodu první volby a v mnoha laboratořích již zcela nahradila cytogenetické vyšetření karyotypu (Battaglia et al., 2013). Zavedení technologie array-CGH způsobilo přelom v molekulární diagnostice pacientů s DID a přispělo k identifikaci širokého spektra patogenních mikrodelecí a mikroduplikací (Di Gregorio et al., 2014). Metoda array-CGH je založena na kvantitativním srovnání dvou odlišně značených vzorků genomové DNA vyšetřovaných buněk a referenční genomové DNA. Oba vzorky DNA jsou kohybridizovány na pevný podklad mikročipu. Mikročip představuje obvykle mikroskopické sklo se speciální povrchovou úpravou, na němž jsou imobilizovány DNA fragmenty. Současné technologie výroby DNA mikročipů využívají zejména oligonukleotidové fragmenty (Lucito et al., 2003). Rozlišení mikročipu je dáno pouze velikostí daných fragmentů DNA a hustotou pokrytí genomu těmito fragmenty. Dle „European guidelines for constitutional cytogenomic analysis“ (Silva et al., 2019) je doporučeno využívat DNA mikročipové platformy s rozlišením 200-400 kb pro účely 37 postnatální diagnostiky, respektive 400-600 kb pro účely prenatální cytogenetiky. Tyto požadavky splňují DNA mikročipy pokryté nejméně 60 000 oligonukleotidovými sondami. Rozvoj technologie obohatil DNA mikročipové platformy o detekci oblastí genomu se ztrátou heterozygotnosti bez ztráty počtu kopií (copy-number neutral loss of heterozygosity, cnnLOH). Pro detekci cnnLOH se využívá přítomnosti SNPs v konkrétních oblastech genomu. Informace o genotypu daných SNPs v testované DNA jsou následně vyhodnoceny v rámci softwarového zpracování dat společně s informacemi o CNVs. Detekce cnnLOH nachází uplatnění při screeningu uniparentální disomie celých chromosomomů nebo jejich částí. V případech SNP analýzy pacienta a jeho rodičů lze rovněž identifikovat parentální původ de novo CNV. Znalost o oblastech cnnLOH v případech familiálního výskytu příbuzenských svazků umožňuje vytipovat geny spojené s autosomálně recesivními onemocněními pro další molekulárně genetické analýzy sloužící k identifikaci patogenní sekvenční varianty. Dle uvedených doporučení a studií by měl být nález cnnLOH reportován v případě velikosti 5-10 Mb nebo pokud oblast cnnLOH zasahuje více než 1 % genomu vyjma gonosomů (de Leeuw et al., 2011; D’Amours et al., 2014; Silva et al., 2019). Další výhoda array-CGH spočívá v detekci mozaicismu až na úroveň 10% zastoupení CNVs ve vzorku testované DNA (Hoang et al., 2011). Současná detekce nebalancovaných CNVs a oblastí cnnLOH v rámci jedné analýzy celého genomu objasnila klinický význam mnoha chromosomových přestaveb, což podtrhuje její význam v identifikaci nových kandidátních lokusů významných v patogenezi DID. Rozsáhlé multicentrické studie prokazují významné zvýšení diagnostického záchytu na 10-25 % u dětí s DID s normálním karyotypem (Thuresson et al., 2007; Miller et al, 2010; Schaaf et al., 2011). V mnoha ohledech metoda array-CGH předčila rovněž cílené molekulárně cytogenetické metody FISH a MLPA a stala se metodou první volby pro vyšetření dětských pacientů s normálním karyotypem a konfirmační metodou u dětských pacientů s abnormálním karyotypem s nebalancovanými přestavbami chromosomů, která splňuje požadavky na robustnost, finanční výhody a diagnostickou efektivitu. Přes značný pokrok v rozvoji citlivých analýz genomu a jejich zavedení do molekulární diagnostiky přibližně u 50 % případů dětí s DID zůstává neobjasněna jejich genetická podstata (Leonard and Wen, 2002; Kaufman et al., 2010). Tato skutečnost znamená velkou výzvu a příležitost pro výzkum genetických příčin DID na úrovni sekvence DNA a hledání kandidátních lokusů významných v patogenezi těchto onemocnění. Pomocí metody WES byla objasněna molekulární podstata u přibližně 50 % dětí se závažnou DID

38 prostřednictvím identifikace de novo variant ve známých či kandidátních genech pro tyto patologické stavy (Wieczorek, 2018; Wright et al., 2018). Nezbytný krok v molekulárně diagnostickém algoritmu představují konfirmační analýzy nálezů daných submikroskopických chromosomových přestaveb u pacienta a jeho rodičů, které potvrzují diagnózu na molekulární úrovni a upřesňují její kauzalitu. V tomto kroku nachází své uplatnění cílené metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH), MLPA a metoda relativní kvantifikace pomocí polymerázové řetězové reakce (quantitative polymerase chain reaction, qPCR). V návaznosti na vyšetření metodou array-CGH je využití metody FISH omezeno na případy cytogeneticky detekovatelných či kryptických translokací chromosomů, rekurentních mikrodelečních syndromů, respektivě obecně spektrem dostupných sond pro dané chromosomové přestavby. V případě metody MLPA jako konfirmační metody pro detekci CNV u pacienta a jeho rodičů je vyšetření omezeno na oblasti genomu, pro nějž jsou k dispozici diagnostické sady. Metoda qPCR překonává svými možnostmi limitace metod FISH a MLPA spočívající v omezeném spektru CNVs, které mohou být těmito metodami verifikovány, a současně představuje jejich časově a finančně efektivní alternativu (Yu et al., 2009; Wang et al., 2013). Oproti metodě FISH nevyžaduje přípravu cytogenetických preparátů a překonává její omezení kvantitativní analýzy tandemových mikroduplikací. Ve srovnání s metodou MLPA jsou jejími přednostmi zejména finanční nenáročnost. Metoda qPCR je založena na semikvantitvní analýze vybraných oblastí genomu vymezených DNA primery dle specifické lokalizace verifikovaných CNVs. V průběhu exponenciální amplifikace molekul produktu PCR jsou do nich interkalovány molekuly fluorescenčního cyaninového barviva SYBR Green, čímž narůstá míra fluorescence, která je detekována pomocí optických čidel v reálném čase.

Z průběhu amplifikačních křivek a hodnot threshold cyklů (cycle threshold, Ct) je vypočítána hodnota R a dle jejích hodnot je stanovena ztráta sekvence DNA (< 0,7), resp. zisk sekvence DNA (> 1,3) v oblasti vymezené DNA primery. Přednosti této metody ji předurčují k rutinnímu využití v rámci verifikace nálezů CNVs a stanovení jejich původu.

1.3.3. Metoda sekvenování „nové generace“ (NGS) Od svých počátků na přelomu 20. a 21. století znamenal rozvoj metod sekvenování „nové generace“ (Next Generation Sequencing, NGS) zásadní pokrok ve studiu variability lidského genomu a brzy nato metody NGS rozšířily molekulárně diagnostický algoritmus vyšetřování dětí s DID o paralelní analýzu sekvence DNA mnoha oblastí genomu v rámci jednoho vyšetření. Technologický a diagnostický pokrok metod NGS spočívá v detekci variant na úrovni sekvence DNA při rozlišení až na jeden nukleotid, což mimo jiné vedlo ke změně pojetí definice CNVs jako strukturních změn genomu větších než 50 bp (Hehir-Kwa et al., 2015; Nowakowska, 2017). Právě v omezené spolehlivosti detekce CNVs menších než 50 bp tkví jedna z hlavních limitací využití NGS jako technologie pro univerzální komplexní analýzu genomu, a proto je doporučováno využití dalších molekulárně genetických metod, čímž rostou finanční, časové a personální požadavky (Kerkhof et al., 2017). Zmíněné pokroky znamenaly významné rozšíření poznatků o molekulární patogenezi DID, neboť přispěly k identifikaci nových kandidátních genů či oblastí nekódující DNA s potenciálním klinickým významem. Současné studie popisují více než 650 genů spojených s autosomálně dominantní (AD) DID a recentní odhady uvažují ještě minimálně o dalších 350 genech (Wieczorek, 2018). Významnou část již identifikovaných genů tvoří geny popsané v patogenezi syndromických forem DID, avšak pomocí přístupů NGS byly identifikovány rovněž v případech mírné a nesyndromické DID. V případech autosomálně recesivní (AR) DID je počet známých a kandidátních genů odhadován na přibližně 2000 (Jamra, 2018). Klíčovou strategii pro identifikaci genů asociovaných s AR DID představuje WES u populací s vysokou četností příbuzenských svazků, jež jsou frekventované v zejména zemích jihozápadní a jižní Asie (Mir and Kuchay, 2019). Recentní „trio-based“ analýza metodou WES (trio-WES) realizovaná u 100 rodin s příbuzenskými sňatky potvrdila uvedené poznatky o epidemiologii a etiologii AR DID (Kahrizi et al., 2019). Patogenní sekvenční varianty byly detekovány v 61 % případů včetně detekce variant v genech dosud nepopsaných v patogenezi DID, z toho 72 % patogenních variant bylo identifikováno v homozygotní, respektive hemizygotní sestavě pro X-vázanou DID (X-linked DID, XL-DID) a u 28 % z nich byl prokázán původ de novo. Uvedená studie rovněž prokázala, že s rostoucí proporcí příbuzenských svazků v populaci stoupá riziko DID s genetickou příčinou až na trojnásobek oproti riziku DID v populacích s nízkou frekvencí konsanguinity. V patogenezi XL-DID bylo dosud popsáno 141 genů (Wieczorek, 2018; Jamra, 2018). Identifikace nových kandidátních genů s XL-DID je podmíněna precizní diferenciální

40 diagnostikou syndromů při primární genetické konzultaci u chlapců s DID bez ohledu na rodinnou anamnézu a familiální výskyt DID, neboť většina XL-DID a asociovaných VVV se vyskytují jako vzácné a izolované případy (Neri et al., 2018). Uvedená recentní studie rovněž poukazuje na význam duplikací X-vázaných genů v patogenezi DID. Fenotypový projev přitom může být stejný či velmi podobný jako v případech jejich delecí, nebo naopak zcela odlišný. Ve vzácných případech lze rovněž pozorovat pouze částečnou podobnost s fenotypovými projevy delecí daných genů nebo genové duplikace známých XL-DID genů nemusí být příčinou DID.

1.3.3.1. Přístupy NGS Princip technologie NGS využívá jednotlivé či klonálně amplifikované molekuly DNA, která jsou paralelně sekvenovány na vysokokapacitních sekvenátorech. V klinické diagnostice se uplatňují tři různé přístupy pro identifikaci sekvenčních variant, resp. CNVs: cílené NGS specifických panelů genů asociovaných s patologiemi, WES a WGS. Pro výzkumné účely se rovněž uplatňují přístupy sekvenování „třetí generace“ využívající technologie PacBio či Nanopore, založených na dlouhých čteních, a technologie Bionano mapping (van Dijk et al., 2018). Účelem NGS panelů genů je identifikace patogenních variant v genech s klinickým významem v patogenezi daného onemocnění, pro něž je panel genů navržen. Jeho omezená velikost umožňuje hlubší hloubku čtení a tím vyšší analytickou senzitivitu a specificitu. Hlubší pokrytí současně zvyšuje spolehlivost analýzy a pravděpodobnost detekce mosaicismu, resp. heterogenity za účelem detekce patogenních variant v mtDNA či ve vzorcích nádorových buněk (Gajecka, 2018). Cílené NGS genů s klinickým významem v daném onemocnění rovněž usnadňuje interpretaci variant ve vztahu genotypově-fenotypové korelace. Z technického hlediska lze díky omezené, definované velikosti panelu realizovat paralelní analýzu více vzorků současně na stolních sekvenátorech a zpracování a uložení dat rovněž nevyžaduje velkou výpočetní kapacitu. WES umožňuje detekci sekvenčních variant v kódujících oblastech genomu. Kódující oblasti reprezentují jen 1-2 % velikosti genomu, avšak je v nich kumulováno přibližně 85 % všech známých patogenních sekvenčních variant (Majewski et al., 2011). Pomocí současných technologických postupů přípravy knihoven DNA fragmentů je možné dosáhnout pokrytí přibližně 95 % velikosti exomu, oblasti s vysokou komplexitou stále nedosahují pokrytí dostatečného pro sekvenaci a spolehlivou identifikaci variant (Cirulli et al., 2010). WES je rovněž vhodným přístupem pro identifikaci nových kandidátních genů s potenciálním klinickým významem v patogenezi geneticky heterogenních onemocnění, kam se řadí i DID. 41

Klinická interpretace variant detekovaných WES vyžaduje spolupráci mezi výzkumnými a diagnostickými laboratořemi (Rehm et al., 2013). Oproti NGS panelů genů dosahuje WES obvykle také nižší hloubky pokrytí, a proto je v případě neoptimálního pokrytí vhodné použít Sangerovo sekvenování k eliminaci falešně pozitivních nálezů variant. Přínos WGS spočívá v identifikaci sekvenčních i strukturních variant genomu v jeho kódujících i nekódujících oblastech. Kvůli komplexitě lidského genomu a nedostatku informací o klinickém významu variant v nekódujících oblastech většiny genomu jsou obvykle prioritně analyzovány a interpretovány varianty v kódujících oblastech a následně v oblastech regulující expresi klinicky významných genů (Rehm et al., 2013). Kromě detekce sekvenčních variant lze spolehlivě detekovat strukturní varianty či CNVs. Vzhledem k vysokým finančním nákladům, náročnosti na pokročilou bioinformatickou analýzu dat a interpretaci variant se však WGS využívá v rámci molekulární diagnostiky jen velmi sporadicky a zatím zůstává technologií uplatňující se převážně v oblasti výzkumu (Chrystoja and Diamandis, 2014).

1.3.3.2. NGS v molekulární diagnostice DID V návaznosti na znalost genů asociovaných s DID se proto nabízí vývoj panelů genů pro cílené NGS s předpokladem vysoké diagnostické efektivity jako první diagnostický test, přesto se však nyní mnohem více uplatňuje přístup trio-WES s diagnostickým záchytem de novo patogenních sekvenčních variant mezi 20 až 60 % (Wieczorek, 2018). Cílený design pro detekci variant v exomech společně s NGS založeném na čtení fragmentů < 300 bp při pokrytí > 30x oblastí zájmu předurčuje WES k rutinnímu a finančně efektivnímu využití v molekulární diagnostice. V současnosti brání jejímu rutinnímu využití vysoké finanční náklady a požadavky komplexní bioinformatické analýzy dat (Pfundt et al., 2017). Pro zavedení NGS do klinické praxe byla navržena kritéria kvality NGS dat týkající se mapování, analýzy pokrytí (coverage) a vyvolání variant a posléze vypracována doporučení vzhledem k reportování a interpretaci variant (Matthijs et al., 2016). Implementace metod NGS do rutinní molekulární diagnostiky s sebou přináší možnost snížení množství analýz genomu nezbytných k potvrzení diagnózy na molekulární úrovni, a tím zjednodušení a zefektivnění molekulárně diagnostického algoritmu. Na Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno (OLG FN Brno) bylo v rámci výzkumných studií molekuární podstaty DID, PAS a asociovaných VVV zařazeno cílené NGS jako nový molekulárně diagnostický přístup po vyšetření metodou array-CGH (obr. 4).

Obrázek 4: Diagnostický algoritmus vyšetření dětí s DID, PAS a asociovanými VVV na OLG FN Brno. Schéma prezentuje návaznost jednotlivých vyšetření, rovněž jsou uvedeny diagnostické záchyty daných metod na základě relevantní literatury.

1.3.3.3. Interpretace sekvenčních variant Spolehlivá interpretace sekvenčních variant by měla být vždy podpořena správnou laboratorní praxí z hlediska praktických zkušeností s metodami NGS a spolupráci s klinickými genetiky, jež spočívá v kritickém zhodnocení korelace detekované sekvenční varianty s fenotypem jedince. V roce 2013 vydala American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) klinické laboratorní standardy pro NGS (Rehm et al., 2013). Všechny varianty v genech asociovaných s patologiemi by měly být vyhodnoceny a klasifikovány podle standardů vydaných ACMG (Richards et al., 2015). Uvedená doporučení zajišťují transparentnost a konzistenci v interpretaci variant. Popisují detailní algoritmus hodnocení variant prostřednictvím dvou sad kritérií, zvlášť pro patogenní či pravděpodobně patogenní varianty (tab. 2) a pro benigní či pravděpodobně benigní varianty (tab. 3). Každé kritérium patogenity je hodnoceno podle svého významu jako „velmi silné“, „silné“, „středně silné“ nebo „podpůrné“ a každé kritérium pro benigní varianty je klasifikováno jako „nezávislé“, „silné“ nebo „podpůrné“. Mezi kritéria pro klasifikaci variant patří populační frekvence, počítačové analýzy a in silico predikce, funkční analýzy, segregace varianty s onemocněním, původ de novo, alelismus a další kritéria zahrnující informace z databází či literatury. Dle jejich vzájemné kombinace lze jednotlivé sekvenční varianty klasifikovat do skupin „patogenní“, „pravděpodobně patogenní“, „benigní“ a „pravděpodobně benigní“ (tab. 4). Pravidla a jejich kombinace se vztahují ke všem typům dat, zahrnující výzkumná data, data publikovaná ve vědecké literatuře, data z veřejných databází (např. ClinVar - Landrum et al., 2016) či z interní databáze dané laboratoře. Rovněž je přípustná flexibilita v rámci klinické intrepretace variant, která je však podmíněna kritickým komplexním hodnocením jednotlivých důkazů patogenity či benigního vlivu.

Kritéria klasifikae patogeíh variat Veli silé důkaz patogeit Pathogei Ver Strog, PVS PVS1 ulová vaiata v genu, kde LoF je záý ehaise oeoěí Silé důkaz patogeit Pathogei Strog, PS PS1 stejá záěa aiokseli popsáa jako patogeí, ez ohledu a záěu ukleotidů PS2 de novo vaiata u paieta, jedá se o izolovaý případ v odiě potvrzena maternita i paternita) PS3 in vitro nebo in vivo studie potvzují patogeí efekt a ge eo jeho podukt PS4 pevalee vaiat u postižeýh jediů je výzaě zvýšea opoti pevalei u kontrol  Relativí iziko eo odds atio >  Velmi vzáé vaiat se vsktují u epříuzýh jediů se stejý feotpe a evsktují se u kotol ožé uvažovat také jako PM Středě silé důkaz patogeit Pathogei Moderate, PM PM1 uístěí v utačí „hotspot“ a/nebo v doéě s klíčový fukčí výzae apř. aktiví ísto ezu ez eigí vaiat PM2 eí přítoa u kotol v případě eesiví vaiat v ízké fekvei v dataázíh Exome Sequencing Project, 1000 Genomes nebo ExAc PM3 po eesiví vaiat je utá přítoost in trans s patogeí vaiatou PM4 zěa délk poteiu ez zě čteího áe v oblasti bez repetic nebo varianta „stop-loss“ PM5 ová „issese“ vaiata v pozii aiokseli, kde již la dříve popsáa patogeí „issese“ vaiata PM6 varianta detekováa de novo, ez potvzeí paetit Podpůré důkaz patogeit Pathogei suPportig, PP PP1 segregace s oeoěí u víe postižeýh jediů v odiě, ge je popisová v souvislosti s oeoěí  S aůstajíí počte postižeýh jediů lze uvažovat jako PM PP2 „issese“ vaiata v genu s ízkou fekveí eigíh „issese“ vaiat, „issese“ vaiat jsou záý ehaise oeoěí PP3 oho počítačovýh aalýz a in silico pedikčíh pogaů potvzuje škodlivý efekt a ge či jeho podukt PP4 feotp paieta eo odiý výskt je veli speifiký po oeoěí s jedou geetikou příčiou PP5 dataáze či liteatua potvzují vaiatu jako patogeí, ale laoatoí aalýz euožňují posktout ezávislý ojektiví důkaz

Tabulka 2: Soubor kritérií pro klasifikaci patogenních variant. Číslování u jednotlivých skupin důkazů neznamená vzestupný či sestupný význam pro klasifikaci analyzované varianty (Richards et al., 2015; upraveno).

Kritéria klasifikae eigíh variat Nezávislé důkaz eigího vlivu Beig Aloe, BA BA1 frekvence alely je > 5% v dataázíh Eoe Seueig Pojet, Geoes eo ExAc Silé důkaz eigího vlivu Beig Strog, BS BS1 fekvee alel je všší ež očekávaá v případě eoi BS2 varianta pozoováa u zdavého dospělého jedie v případě AR hoozgotí sestava, AD heteozgotí sestava či X-vázaé heizgotí stav eoi, kd je daá alela plě peetatí v aé odoí života BS3 in vitro nebo in vivo studie epokázal patogeí efekt a fuki poteiu eo sestřih geu BS4 eí pozoováa segegae u postižeýh čleů odi Podpůré důkaz eigího vliv Beig suPportig, BP BP1 „issese“ vaiata v geu, kde jsou za patogeí považová piáě vaiat ovlivňujíí délku poteiu BP2 detekováa v aleliké fázi trans s patogeí vaiatou po plě peetatí doiatí oeoěí detekováa v aleliké fázi cis s patogeí vaiatou ez ohledu a původ BP3 zěa délk poteiu ez zě čteího áe v oblasti repeti ez záé fuke BP4 oho počítačovýh aalýz a in silico pedikčíh pogaů epotvzuje škodlivý efekt a ge či jeho podukt BP5 varianta nalezena v případě s alteativí olekuláí podstatou oeoěí BP6 dataáze či liteatua potvzují vaiatu jako eigí, ale laoatoí aalýz euožňují posktout ezávislý ojektiví důkaz BP7 soí vaiata v případě, že pedikčí poga epokázal vliv a kosezuálí sestřihovou sekvei, evtváří se ové sestřihové ísto a daá nukleotidová pozie eí evolučě kozevovaá

Tabulka 3: Soubor kritérií pro klasifikaci benigních variant. Číslování u jednotlivých skupin důkazů neznamená vzestupný či sestupný význam pro klasifikaci analyzované varianty (Richards et al., 2015; upraveno).

Pravidla koiae kritérií pro klasifikai sekvečíh variat Patogeí 1. PVS1 a ≥ PS PS–PS4) nebo ≥ PM PM–PM6) nebo 1 PM (PM1–PM6) a 1 PP (PP1–PP5) nebo ≥ PP PP–PP5) 2. ≥ PS PS–PS4) nebo 3. PS (PS1–PS4) a a. ≥ PM PM–PM6) nebo b. 2 PM (PM1–PM6) a ≥ PP PP–PP5) nebo c. 1 PM (PM1–PM6) a ≥ PP PP–PP5) Pravděpodoě patogeí 1. 1 PVS (PVS1) a 1 PM (PM1–PM6) nebo 2. 1 PS (PS1–PS4) a 1–2 PM (PM1–PM6) nebo 3. 1 PS (PS1–PS4) a ≥ PP PP–PP5) nebo 4. ≥ PM PM–PM6) nebo 5. 2 PM (PM1–PM6) a ≥ PP PP–PP5) nebo 6. 1 PM (PM1–PM6) a ≥ PP PP–PP5) Beigí 1. 1 BA (BA1) nebo 2. ≥ BS BS–BS4) Pravděpodoě eigí 1. 1 BS (BS1–BS4) a 1 BP (BP1–BP7) nebo 2. ≥ BP BP–BP7)

Tabulka 4: Pravidla kombinace kritérií pro klasifikaci sekvenčních variant. Kombinace daných kritérií vychází z kritérií pro klasifikaci patogenních, respektive benigních variant. Richards et al., 2015; upraveno.

Pokud varianta nesplňuje kritéria pro klasifikaci do jedné z uvedených čtyř skupin, poté spadá do kategorie VOUS. Přítomnost VOUS by neměla být relevantní při interpretaci klinickým genetikem a v následném genetickém poradenství. S narůstajícími znalostmi o patogenezi daného onemocnění, počtem detekovaných variant a populačními studiemi frekvencí variant je přípustná reanalýza variant, zejména kategorie VOUS a případné upřesnění klasifikace (Wenger et al., 2017). Uvedené kroky vyžadují kooperaci mezi laboratorními pracovníky a indikujícími lékaři a vždy je nezbytná informovanost vyšetřovaných jedinců o této skutečnosti. Kromě již zmíněných vysokých finančních nároků a nutnosti pokročilých bioinformatických algoritmů pro zpracování dat s sebou nesou technologie WES a WGS možnost detekce náhodných variant, které mohou být ve formě heterozygotních variant pro onemocnění s AR dědičností, nebo se mohou vztahovat k onemocněním s pozdním nástupem fenotypových projevů či se může jednat o varianty bez relevance k primární indikaci (Di Resta et al., 2018). V těchto případech je nutno tyto varianty posuzovat vždy vzhledem 47 k rodinné anamnéze, jejich frekvenci v populaci a přínosu informace o jejich přítomnosti pro testovaného jedince. Interpretace náhodných variant by měla být vždy realizována v rámci genetického poradenství dle doporučení pro interpretaci náhodných variant (Green et al., 2013; Kalia et al., 2017).

2. Cíle disertační práce

1) Identifikace vzácných submikroskopických přestaveb chromosomů (CNVs) metodou komparativní genomové hybridizace na DNA mikročipech (array-CGH) a stanovení jejich klinického významu v souboru 724 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými onemocněními vyšetřených na OLG FN Brno v letech 2011-2018

2) Analýza detekovaných CNVs u dětí s DID, PAS a asociovanými onemocněními

3) Identifikace vzácných sekvenčních variant v souboru 35 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV metodou cíleného sekvenování „nové generace“ (NGS) vyšetřených na OLG FN Brno v letech 2015-2018

4) Analýza patogenních sekvenčních variant detekovaných metodou cíleného NGS a stanovení jejich významu v patogenezi DID, PAS a asociovaných onemocnění

3. Soubor pacientů a metody 3.1. Klinická charakteristika pacientů Do naší studie bylo zahrnuto 724 dětských pacientů (293 dívek a 431 chlapců) s DID a PAS a asociovanými VVV, zahrnující celkové vývojové opoždění, vrozené srdeční vady, epilepsii a další vývojové vady včetně faciální stigmatizace, kteří byli vyšetřeni v průběhu osmi let (2011-2018) na Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno (tab. 5). Pacienti podstoupili vyšetření karyotypu metodou G-pruhování. V případech normálního karyotypu, karyotypu s balancovanou přestavbou de novo či v případech nebalancových přestaveb chromosomů bylo indikováno vyšetření metodou array-CGH.

vrozené vrozené vývojové pohlaví počet DID PAS vývojové srdeční epilepsie opoždní vady vady 65,5 % 21,1 % 87,7 % 78,5 % 18,8 % 17,4 % dívky 293 (192/293) (62/293) (257/293) (230/293) (55/293) (51/293)

61,7 % 37,4 % 86,1 % 72,9 % 12,3 % 15,5 % chlapci 431 (266/431) (161/431) (371/431) (314/431) (53/431) (67/431)

63,3 % 30,8 % 86,7 % 75,1 % 14,9 % 16,3 % celkem 724 (458/724) (223/724) (628/724) (544/724) (108/724) (118/724)

Tabulka 5: Klinická charakteristika souboru 724 dětí s DID a asociovanými VVV.

Průměrný věk dětských pacientů v době vyšetření metodou array-CGH dosahoval 5,8 let (0-18 let). Věkové rozložení dětských pacientů v době vyšetření metodou array-CGH je uvedeno na obr. 5.

8,4% 4,8% 9,0% 23,6%

28,9%

25,3%

. rok života 1-3 roky 4-6 let 7-11 let 12-15 let 16-18 let

Obrázek 5: Věkové rozložení dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV v době vyšetření metodou array-CGH.

Do první fáze pilotního projektu NGS využívající komerční design panelu genů (roky 2015-2016) bylo vybráno 16 dětí s normálním karyotypem a bez nálezu patogenní CNV

50 metodou array-CGH. Do dalších fází projektu (roky 2016-2018) bylo vybráno 14 rodin. Každá rodina zahrnovala alespoň jednoho dětského pacienta s DID a asociovanými VVV a oba klinicky zdravé rodiče. V 5 rodinách byly vyšetřeny 2 děti s podobnou manifestací patologického fenotypu, tedy v rámci 14 rodin bylo vyšetřeno 19 dětí. V průběhu celého čtyřletého projektu (2015-2018) bylo metodou cíleného NGS vyšetřeno 35 dětí s DID a asociovanými VVV.

3.2. Metody Před zahájením genetických vyšetření podstoupili dětští pacienti spolu se svými rodiči vstupní genetické poradenství, rodiče poté podepsali informovaný souhlas OLG FN Brno. Pro účely genetických vyšetření všichni dětští pacienti a jejich rodiče a další rodinní příslušníci v indikovaných případech podstoupili odběr periferní krve. Pro účely molekulárně cytogenetických a molekulárně genetických vyšetření byla izolována genomová DNA z 1 ml periferní krve odebrané do zkumavky s přídavkem EDTA pomocí automatického izolátoru MagNa Pure LC2.0 podle postupu uvedeném v pracovní instrukci Pi-OLG-2 „Automatická izolace DNA přístrojem MagNA Pure LC2.0“. U všech vzorků byla zhodnocena kvalita a kvantita pomocí Spectrophotometer DS-11 FX (DeNovix, Wilmington, DE, USA) a Qubit® 2.0 Fluorometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Po izolaci DNA byly jednotlivé vzorky DNA uloženy v -20 °C.

3.2.1. Cytogenetické vyšetření karyotypu Pro cytogenetická vyšetření karyotypu byly cca 3 ml periferní krve odebrány do zkumavky s 0,4 ml heparinu a zpracovány podle postupu ve Standardním operačním postupu (SOP) A C1 OLG FN Brno „Vyšetření konstitučního karyotypu“. Cytogenetická vyšetření byla realizována v Laboratoři postnatální cytogenetiky OLG FN Brno. Cytogenetické preparáty byly hodnoceny při rozlišení 400-550 pruhů a výsledky reportovány podle nomenklatury ISCN (Seabright, 1971; Silva et al., 2019).

3.2.2. Array-CGH Celogenomový screening nebalancovaných chromosomových přestaveb byl realizován s využitím různých platforem DNA mikročipů: SurePrint Human 180K CGH+SNP Microarray, SurePrint Human 180K CGH Microarray, SurePrint Human 60K CGH Microarray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) a Cytosure ISCA 4X180K UPD array (Oxford Gene Technology, Oxfordshire, Spojené království) dle doporučení uvedených výrobců. Široké spektrum použitých DNA mikročipových platforem bylo dáno zejména technologickým vývojem metody, množstvím požadavků na vyšetření a doporučeními uvedenými v průběžně aktualizovaných mezinárodních metodických pokynech. Nejméně 0,5 až 1,5 μg vyšetřované DNA pacienta (nejméně 0,5 μg DNA pro platformu 60K) a ekvivalentní množství DNA reference (Agilent Technologies nebo Promega Corporation, Madison, WI, USA) bylo štěpeno restrikčními enzymy AluI a RsaI. Poté byly vzorky DNA pacienta a reference odlišně značeny fluorochromy Cy3-dUTP a Cy5-dUTP. Po purifikaci byl

52 na základě množství barviva a úrovně značení smíchán vzorek DNA pacienta s DNA reference a společně byly hybridizovány na DNA mikročip. Po přibližně 24hodinové hybridizaci a následném odmytí nenavázaných či nespecificky navázaných sond byly DNA mikročipy skenovány na DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). Data byla extrahována pomocí aktuální verze software Agilent Feature Extraction software a Agilent Cytogenomics a vizualizována pomocí software Agilent Genomic Workbench a Agilent Cytogenomics. Přítomnost CNVs/cnnLOH byla hodnocena s nastavením algoritmu ADM-2 s filtry pro detekci CNVs o minimální velikosti 200 kb a celkovým log2 ratio 0,25, minimální velikost filtru pro oblasti cnnLOH byla nastavena na > 5 Mb v případě CGH+SNP mikročipové platformy. Genomové pozice jednotlivých CNVs a oblastí cnnLOH byly stanoveny dle lidské referenční sekvence genomu GRCh37/hg19 nebo GRCh36/hg18 dle použité mikročipové platformy. Data z analýz array-CGH jsou uložena v databázi Array Express (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) pod přístupovými kódy E-MTAB-6685, E- MTAB-6733, E-MTAB-6731, E-MTAB-6734, E-MTAB-6735, E-MTAB-7696, E-MTAB- 8044.

3.2.3. Konfirmační analýzy Konfirmační analýzy přítomnosti CNVs u probanda a rodinných příslušníků byly indikovány pro stanovení jejich původu de novo/zděděno, a to dle dostupnosti biologického materiálu a výpovědní hodnoty jednotlivých typů vyšetření. Konfirmační analýzy metodami FISH či MLPA byly využity ve vybraných případech ověření rekurentních patogenních mikrodelecí či subtelomerických přestaveb chromosomů (Lam et al., 2006; Ravnan et al., 2006; Kirchhoff et al., 2007; Ratan et al., 2017). Analýzy metodou FISH byly realizovány na cytogenetických preparátech metafázních chromosomů pomocí komerčně dostupných DNA sond na základě typu ověřované chromosomové přestavby dle doporučení výrobce, tj. celochromosomové DNA sondy (Cambio, Cambridge, Spojené království nebo Kreatech, Leica Biosystems, Wetzlar, Německo), subtelomerické DNA sondy (Vysis ToTelVysion, Abbott Molecular, Chicago, IL, USA) či DNA sondy pro detekci mikrodelecí (Cytocell, Cambridge, Spojené království). Preparáty byly hodnoceny fluorescenčním mikroskopem Olympus BX 60 a BX 61 (Shinjuku, Tokio, Japonsko) a jejich obrazy byly snímány kamerou Vosskuhler CCD-1300D (National Instruments, Austin, TX, USA). Pro analýzu obrazu byl využit software LUCIA CytogeneticsTM FISH (Laboratory Imaging, Praha, Česká republika). Vyšetření metodou MLPA byla provedena pomocí komerčních diagnostických sad SALSA MLPA P245 Microdeletion Syndromes, P297

Microdeletion Syndromes, P250 DiGeorge dle doporučení výrobce a výstupy byly hodnoceny pomocí software Coffalyser (vše MRC Holland, Amsterdam, Netherlands). Pro analýzy metodou relativní qPCR byly využity dva páry DNA primerů, jež byly navrženy pro detekci zisku a ztrát genetického materiálu v oblasti CNV a do kontrolní oblasti mimo oblast CNV na stejném chromosomovém raménku. Jako endogenní kontrola sloužila kvantifikace DNA uvnitř housekeepingového genu ERH (enhancer of rudimentary homolog). Cílové oblasti DNA byly amplifikovány za kontinuální inkorporace fluorescenčního barviva pomocí ready-to-use diagnostické komerční směsi Power SYBRTM Green PCR Master Mix

(ThermoFisher Scientific) dle doporučení výrobce. Následně byly odečteny hodnoty Ct pro gen ERH a pro každou testovanou oblast DNA a vypočítány hodnoty R. Hodnoty R< 0,7 a R > 1,3 byly stanoveny jako cut-off pro potvrzení ztráty, resp. zisku genetického materiálu v testované oblasti (Wang et al., 2013). DNA primery byly navrženy pomocí programů Primer3 (Untergasser et al., 2012), PrimerBlast (Ye et al., 2012), UCSC In-Silico PCR (Kuhn et al., 2013) a OligoAnalyzer 3.1 (Owczarzy et al., 2008) a poté byly syntetizovány dle specifikace prostřednictvím komerční služby (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA). Metoda qPCR pro verifikaci nálezů CNVs byla na OLG FN Brno zavedena v rámci řešení diplomové práce Mgr. Heleny Peschelové (Janyšková, 2016).

3.2.4. Cílené NGS Příprava knihoven NGS a sekvenační běh byl realizován za přístrojové spolupráce s Core Facility Genomics, CEITEC, Masarykova univerzita. Knihovny fragmentů DNA pro cílené NGS byly připraveny pomocí komerčně dostupné sady SureSelectXT Target Enrichment System dle doporučení výrobce (Agilent Technologies). Pro přípravu knihoven byla využita genomová DNA o vstupním množství 200 ng, která byla posléze štěpena pomocí sonikátoru Covaris E-Series (Covaris, Woburn, MA, USA) na fragmenty o velikosti 150-200 bp. Jednotlivé fragmenty vzorků DNA byly zpracovány dle doporučení výrobce zpracovaných v postupu SureSelectXT Target Enrichment for Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing Library (Agilent Technologies) (obr. 6).

Obrázek 6: Schéma získání oblastí zájmu pomocí systému SureSelect Target Enrichment (převzato z Agilent Technologies, www.agilent.com; upraveno).

Fragmenty oblastí zájmu v genomové DNA byly získány pomocí RNA oligonukleotidových „baits“ v komerčním designu ClearSeq Inherited DiseaseXT. Tento design zahrnuje převážně kódující oblasti 2742 genů, které byly popsány v patogenezi lidských vrozených onemocnění. Produktový leták je přiložen jako příloha 1, seznam genů je uveden v příloze 2. Před zahájením sekvenačního běhu byly jednotlivé knihovny DNA zkontrolovány z hlediska kvality pomocí Agilent 2200 TapeStation a kvantifikovány pomocí Qubit 2.0 Fluorimeter (ThermoFischer Scientific). Knihovny DNA jednotlivých vzorků byly smíchány v ekvimolárním množství a sekvenovány na sekvenátorech Illumina MiSeq a NextSeq500 v závislosti na počtu vzorků zpracovaných pro jeden sekvenační běh. Jednotlivé sekvenační běhy byly nastaveny podle doporučení výrobce sekvenátorů (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Sekvenátory Illumina pracují na principu sekvenování syntézou (SBS, sequencing-by-synthesis) (Bentley et al., 2008).

3.2.4.1. Zpracování NGS dat Zpracování sekvenačních dat a kontrolu jejich kvality pomocí bioinformatických programů provedl Mgr. Jan Oppelt, Ph.D. (Centrální laboratoř Bioinformatika, Centrum molekulární medicíny, CEITEC) dle postupu detailněji popsaného v publikaci Wayhelova et al. (2019). Ve stručnosti: kvalita sekvenačních dat byla zkontrolována pomocí FastQC (v0.11.5) (Andrews, 2010) s následným hodnocením přítomnosti adaptérů s využitím programů minion a swan (balíček Kraken, v15-065) (Davis et al., 2013). Úpravy před zpracováním souborů sekvenačních dat byly provedeny pomocí nástroje Cutadapt (v1.11) zahrnující odstranění konců s nízkou kvalitou (Phred skóre < 5) (Martin, 2011). Poté byly odstraněny adaptéry z obou konců jednotlivých čtení. Po těchto krocích byla odstraněna velmi krátká (< 35 bp) a nespárovaná čtení. Takto upravená sekvenanční čtení byla mapována na sekvenci lidského genomu hg19 (hg19, UCSC Genome FTP http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/) (Lander et al., 2001; Speir et al., 2016) pomocí nástroje BWA aln/sampe (v0.7.15) (Li and Durbin, 2009). Mapovaná čtení byla dale zpracována pomocí nástroje Stampy (v1.029) (Lunter and Goodson, 2011). Výsledné soubory ve formátu .bam byly procházeny a kontrolovány pomocí Samtools (v1.3) (Li et al., 2009). PCR duplikáty byly označeny a odstraněny pomocí nástroje Picard (v2.10) (vydání v roce 2016, http://broadinstitute.github.io/picard/). Poté byly soubory ve formátu .bam znovu přiloženy pro detekci a kontrolu indelů pomocí nástroje GenomeAnalysisToolKit (GATK) (v3.6) (McKenna et al., 2010). Rekalibrace hodnoty kvality báze (Base Quality Score Recalibration; BQSR) byla provedena pomocí GATK. Databáze jednonukleotidových polymorfismů dbSNP (v147) byla použita jako referenční soubor známých variant. Pokrytí cílených oblastí genomu bylo zkontrolováno pomocí bedtools (v2.23.0) (Quinlan and Hall, 2010). Další parametry kvality a statistika detekovaných variant byly získány pomocí Picard. Primární nalezení variant bylo provedeno pomocí programu VarScan2 (v2.4.2) se základním nastavením s výjimkou minimální frekvence variant 0,2 a p-hodnoty 0,05 (Koboldt et al., 2012). Pomocí programu snpSift (v4.2) byl k variantám přiřazen identifikátor dbSNP, pokud byly nalezeny v uvedené databázi (Cingolani et al., 2012a). Poté byly primární varianty filtrovány opět pomocí programu VarScan2 se základním nastavením s výjimkou nastavení minimální p-hodnoty 0,05. Z variant byly odstraněny SNVs lokalizované v blízkosti indelů. Pomocí programu snpEff (Cingolani et al., 2012b) byly k filtrovaným variantám přiřazeny efekty variant a anotace z databází ClinVar (Landrum et al., 2016) a dbSNP. Po dalším filtrování variant pomocí programů vcftools (v0.1.15) (Danecek et al., 2011) a bedtools (v1.3) byl získán finální soubor obsahující varianty v cílových oblastech genomu,

56 respektive v genech zájmu. Další analýzy byly provedeny pomocí R (v3.3.1) (R Development Core Team, 2016) s knihovnami data.table (v1.9.6) (Dowle and Srinivasan, 2017) a s nástrojem VariantAnnotation (Obenchain et al., 2014).

3.2.4.2. Analýza variant Následná analýza variant probíhala prostřednictvím filtrování variant dle jejich efektu, původu a dalších parametrů, jež jim byly přiřazeny během bioinformatickém zpracování (Cingolani et al., 2012b). V rámci dalších analýz byly preferenčně vybírány exonové varianty s efektem „high“ a „moderate“ a současně varianty s četností výskytu < 5 % na základě informací z databází. Klinicky relevantní varianty korelující s fenotypem jedince byly dále klasifikovány dle doporučení ACMG (Richards et al. 2015). Během analýzy byly využívány dostupné detailní informace v databázích OMIM (Hamosh et al., 2002), ClinVar (Landrum et al., 2016), dbSNP (Sherry et al., 2001), UniProtKB/Swiss-Prot (UniProt Consortium, 2008), The Exome Aggregation Consortium (ExAc) (Lek et al., 2016), ClinGen (Rehm et al., 2015) a relevantní vědecké literatuře, které se týkaly zejména funkčních vlastností genů nesoucích danou variantu, asociovaných patologií, dosud publikovaných případů jedinců nesoucí stejnou variantu a populační frekvence. Následně byly klinicky relevantní varianty manuálně zkontrolovány a vizualizovány pomocí programu Integrative Genomics Viewer (IGV) (verze 2.3.82) (Robinson et al., 2011). Poté byly analyzovány z hlediska strukturního a funkčního vlivu na genový produkt pomocí in silico predikčních nástrojů Protein Variation Effect Analyzer (PROVEAN) (Choi et al., 2012) Polymorphism Phenotyping v2 (PolyPhen-2) (Adzhubei et al., 2010) a MutationTaster2 (Schwarz et al., 2014). Pro celkovou interpretaci nálezů byly používány aplikace gene.iobio.io (http://gene.iobio.io) integrované s databázemi a in silico predikčními nástroji a webová platforma VarSome integrující data z více než 30 databází a in silico predikčních programů (Kopanos et al., 2019). Klasifikace variant ve webové platformě VarSome zohledňuje kritéria ACMG a do ní vložené informace o pacientovi a jeho fenotypu. Data z NGS analýz jsou uložena ve formátech .fastq a .bam v databázi Array Express (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) pod přístupovým kódem E- MTAB-8041.

3.2.5. Sangerovo sekvenování Každá varianta relevantní k patologickému fenotypu daného pacienta byla verifikována nezávislou analýzou pomocí metody Sangerova sekvenování u daných pacientů a jejich rodičů, eventuálně u dalších rodinných příslušníků dle indikace ošetřujícího lékaře. DNA primery byly designovány pomocí programů Primer3, PrimerBlast, UCSC In-Silico 57

PCR a OligoAnalyzer 3.1 a byly syntetizovány dle specifikace prostřednictvím komerční služby (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA). Seznam primerů pro verifikaci sekvenčních variant Sangerovým sekvenováním je uveden v příloze 3. Jednotlivé PCR byly provedeny pomocí komerční sady GoTaq® Flexi DNA Polymerase (Promega) dle podmínek doporučených výrobcem. Produkty PCR byly enzymaticky purifikovány pomocí Exonuclease I a FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase dle protokolu “PCR Product Clean-Up Prior to Sequencing“ (ThermoFisher Scientific). Specifita primerů byla posléze kontrolována 1,2% agarózovou elektroforézou. Knihovny ssDNA fragmentů pro Sangerovo sekvenování byly připraveny z purifikovaných PCR produktů dle doporučení výrobce komerční sady BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher Scientific) a poté sekvenovány na DNA sekvenátoru ABI 3130 (ThermoFisher Scientific) jako komerční služba firmy Elisabeth Pharmacon (Brno, Česká republika). Chromatogramy ve formátu .ab1 byly vyhodnoceny pomocí software Sequencher verze 5.1 (www.genecodes.com; Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA) a jsou uloženy na uložišti digitálních dat Figshare (doi: 10.6084/m9.figshare.8208542).

4. Výsledky

4.1. Identifikace vzácných submikroskopických přestaveb chromosomů (CNVs) metodou komparativní genomové hybridizace na DNA mikročipech (array-CGH) a stanovení jejich klinického významu v souboru 724 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými onemocněními vyšetřených na OLG FN Brno v letech 2011- 2018

4.1.1. Vliv věku rodičů na riziko narození dítěte s DID Soubor pacientů OLG FN Brno zařazených do studie zahrnuje 724 dětí s DID, PAS a asociovanými VVV (0-18 let) narozených v letech 1995-2018 zejména v Jihomoravském kraji, méně pak ve Zlínském a Olomouckém kraji a Kraji Vysočina a zbylých částech ČR, a jejich rodiče. V rámci charakterizace souboru dětských pacientů OLG FN Brno s diagnózami DID, PAS a asociované VVV byla rovněž analyzována data o věku rodičů v době narození dítěte. Pokročilý věk rodičů při početí (> 35 let) je spojen s vyšším rizikem narození dítěte s DID, PAS či dalších neurovývojových onemocnění (Huang et al., 2016; Janecka et al., 2017). Z údajů ze zdravotnické dokumentace byla získána data o věku 650 matek a 620 otců a byla srovnána s průměrným věkem rodičů v době narození dítěte v Jihomoravském kraji (JmK) v daném roce za období 2000-2018 (zdroj: Český statistický úřad, Krajská správa ČSÚ v Brně, https://www.czso.cz/csu/xb/vek-rodicu-v-jihomoravskem-kraji-v-roce-2018, přístup dne 5.9.2019). Průměrný věk matek v době narození svého potomka, tj. probanda v našem souboru, dosahoval 29,8 let (17-47 let) a průměrný věk otců potom 33,2 let (18-58 let). Pro jednotlivé roky byl dále vypočítán medián věku a průměrný věk matky a otce dítěte v našem souboru (příloha 4). Průměrný věk byl následně vizualizován společně s průměrným věkem matek a otců, kterým se v daném roce narodil potomek v JmK. V rámci hodnocených dat lze pozorovat stoupající trend věku rodičů v našem souboru i v rámci JmK, přestože v našem souboru je tento trend ovlivněn počtem analyzovaných hodnot (obr. 7). Celkově nelze statisticky prokázat významný rozdíl mezi průměrným věkem rodičů v době narození dítěte s DID a asociovanými VVV ve studovaném souboru a průměrným věkem rodičů dětí narozených v JmK ve srovnávaném období (pro použití neparametrického jednovýběrového Wilcoxonova testu nejsou k dispozici mediány věku rodičů z JmK pro jednotlivé roky).

průěrý věk rodičů při arozeí dítěte

38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 průěrý věk atk/ote roe v arozeí dítětě 22 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007 2009 2011 2013 2015 2017 rok arozeí dítěte

věk atk JK věk ote JK věk atk souo věk ote souo

Obrázek 7: Vývoj průměrného věku rodičů v době narození dítěte v JmK (2000-2018) a v našem souboru (1995-2018). Zdroj dat pro JmK: Český statistický úřad, Krajská správa ČSÚ v Brně.

4.1.2. Výsledky vyšetření metodou array-CGH u souboru 724 dětí s DID, PAS a asociovanými VVV V souboru 724 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV byly metodou array-CGH nalezeny nepolymorfní CNVs a oblasti cnnLOH u 30 % pacientů (217/724). V 17,3 % případů byly nalezeny patogenní/pravděpodobně patogenní CNVs či patogenní chromosomové aberace (125/724), v 5 % případů (36/724) byly detekovány VOUS zahrnující případy markerových chromosomů v mozaice, CNVs nejasného významu a oblasti cnnLOH a v 7,7 % případů (56/724) byly CNVs klasifikovány jako pravděpodobně benigní (obr. 8).

patogeí hroosoové aberace/CNVs 125; 17,3% 36; 5,0% VOUS arkerové 56; 7,7% chromosomy v mozaice + CNVs + cnnLOH) 507; 70,0% pravděpodoě eigí CNVs

ez álezu epolorfí CNV/cnnLOH

Obrázek 8: Přehled zastoupení jednotlivých kategorií nálezů detekovaných metodou array-CGH u souboru 724 dětí s DID, PAS a asociovanými VVV. Pro jednolivé kategorie je uveden počet případů a procentuální zastoupení daných případů z celkového počtu případů.

4.1.3. Nálezy v karyotypu u dětí s DID, PAS a asociovanými VVV a jejich upřesnění metodou array-CGH

Mezi všemi případy 5,9 % pacientů (43/724) mělo ve svém karyotypu cytogenetický nález abnormální konstituce gonosomů či nebalancované chromosomové přestavby a metoda array-CGH potvrdila a blíže specifikovala tyto nálezy ve 100 % případů (43/43) (příloha 5). Metodou array-CGH bylo vyšetřeno 11 pacientů s nálezem derivovaného chromosomu bez bližší specifikace přestavby, 9 pacientů s nálezem derivovaného chromosomu ve formě translokace, 5 pacientů s parciální delecí daného chromosomu, 2 pacienti s nálezem parciální duplikace daného chromosomu, 4 pacienti s nálezem ring chromosomu, 2 pacienti s nálezem dicentrického chromosomu, 2 pacienti s nálezem markerového chromosomu v mozaice (klasifikovány jako VOUS). Vyšetření metodou array-CGH bylo rovněž indikováno u 6 61 pacientů s aneuploidiemi gonosomů a u 2 dívek s karyotypem 46,XY, neboť daný cytogenetický nález nekoreloval se závažností fenotypových projevů u daných pacientů. Kombinace cytogenetického vyšetření karyotypu a array-CGH představuje efektivní přístup v diagnostickém algoritmu při vyšetřování dětí s DID, PAS a VVV. V případech nebalancovaných strukturních chromosomových aberací slouží k identifikaci míst zlomů, určení genového obsahu uvnitř dané aberace pro specifikaci korelace genotypu s fenotypem a k určení její velikosti.

4.1.3. Patogenní a pravděpodobně patogenní CNVs

U 12,3 % (84/681) pacientů s normálním karyotypem či s karyotypem nesoucím cytogeneticky balancovanou chromosomovou přestavbu byly metodou array-CGH detekovány submikroskopické patogenní či pravděpodobně patogenní CNVs. V 76 případech byla nalezena 1 patogenní či pravděpodobně patogenní CNV a v 8 případech byly nalezeny 2 submikroskopické CNVs s klinickým významem.

4.1.3.1. Nálezy jedné patogenní/pravděpodobně patogenní CNV

Skupina 76 pacientů s nálezem 1 klinicky relevantní CNV zahrnovala 45 případů rekurentních CNVs, z toho 32 případů mikrodelečních a 13 případů mikroduplikačních syndromů (tab. 6). Zbylých 31 případů představovala non-rekurentní CNVs, zastoupena 24 mikrodelecemi a 7 mikroduplikacemi (tab. 7).

Souhr rekuretíh ikrodeleí pacient pohlaví věk Výsledek aa-CGH Velikost původ (kb) mikrodelece oblasti 1q21.1-q21.2 194 M 7 arr[hg19] 1q21.1q21.2(145042982_147824207)x1 2 781 - 276 M 6 arr[hg19] 1q21.1q21.2(146506310_147824207)x1 1 318 - 504 M 0 arr[hg19] 1q21.1q21.2(146564743_147786706)x1 1 222 - mikrodelece oblasti 1q43-q44 123 F 1 arr[hg19] 1q43q44(240983677_245665521)x1 4 682 de novo 205 F 9 arr[hg19] 1q43q44(242807686_244541781)x1 1 734 - 293 F 13 arr[hg19] 1q43q44(242512907_247380623)x1 4 868 de novo mikrodelece oblasti 7q11.23 54 F 3 arr[hg19] 7q11.23(72726572_74133332)x1 1 407 - mikrodelece oblasti 15q11.1-q13.1 43 F 16 arr[hg19] 15q11.1q13.1(20323683_28795693)x1 8 472 de novo mikrodelece oblasti 15q11.2 321 F 4 arr[hg19] 15q11.2(22304596_23179948)x1 875 mat 441 F 2 arr[hg19] 15q11.2(22765628_23208901)x1 443 mat 473 M 8 arr[hg19] 15q11.2(22784523_23179948)x1 395 mat 676 F 1 arr[hg19] 15q11.2(22784523_23179948)x1 395 pat 662 F 1 arr[hg19] 15q11.2(22784523_23179948)x1 395 - mikrodelece oblasti 15q13.2-q13.3 461 F 5 arr[hg19] 15q13.2q13.3(31014508_32914140)x1 1 900 de novo mikrodelece oblasti 16p13.11 342 M 10 arr[hg19] 16p13.11(14968855_16292235)x1 1 323 mat mikrodelece oblasti 16p12.2 246 M 7 arr[hg19] 16p12.2(21951379_22407931)x1 457 - mikrodelece oblasti 16p11.2 284 F 4 arr[hg19] 16p11.2(29652999_30198600)x1 546 de novo 211 M 9 arr[hg19] 16p11.2(29664529_30198600)x1 534 - 361 M 3 arr[hg19] 16p11.2(29673954_30198600)x1 525 de novo mikrodelece oblasti 17p11.2 345 M 5 arr[hg19] 17p11.2(16757564_20157423)x1 3 400 de novo mikrodelece oblasti 17q11.2 630 M 6 arr[hg19] 17q11.2(29024352_30326958)x1 1 303 - mikrodelece oblasti 17q12 422 M 2 arr[hg19] 17q12(34817422_36168104)x1 1 351 de novo

Pokračování tabulky na následující straně 63

mikrodelece oblasti 22q11.21 328 F 0 arr[hg19] 22q11.21(18894835_21440514)x1 2 546 - 537 F 12 arr[hg19] 22q11.21(18919942_20311763)x1 1 392 mat 479 F 6 arr[hg19] 22q11.21(18919942_21440514)x1 2 521 de novo 706 M 6 arr[hg19] 22q11.21(18919942_21440514)x1 2 521 de novo 730 F 10 arr[hg19] 22q11.21(18919942_21440514)0x1 2 521 - 677 F 3 arr[hg19] 22q11.21(18919942_21440514)x1 2 521 de novo 107 M 2 arr[hg19] 22q11.21q11.22(21025654_22467751)x1 1 442 de novo 164 M 12 arr[hg19] 22q11.21q11.22(21505358_22934453)x1 1 429 - mikrodelece oblasti 22q13.31-q13.33 371 F 8 arr[hg19] 22q13.31q13.33(47865880_51178264)x1 3 312 - mikrodelece oblasti Xp22.31 685 M 4 arr[hg19] Xp22.31(6552712_8115153)x0 1 562 mat Souhr rekuretíh ikroduplikaí pacient pohlaví věk Výsledek aa-CGH Velikost původ (kb) mikroduplikace oblasti 1q21.1-q21.2 109 M 2 arr[hg19] 1q21.1q21.2(146155959_147824207)x3 1 668 - 189 F 9 arr[hg19] 1q21.1q21.2(145740598_149243967)x3 3 503 - mikroduplikace oblasti 15q11.2-q13.1 154 F 4 arr[hg19]15q11.2q13.1(23689774_28559402)x3 4 870 mat 381 M 17 arr[hg19] 15q11.2q13.1(23813289_28525460)x3 4 712 - 411 M 13 arr[hg19] 15q11.2q13.1(23739358_28525460)x3 4 786 pat mikroduplikace oblasti 16p11.2 186 M 2 arr[hg19] 16p11.2(29652999_30197341)x3 544 de novo 545 M 16 arr[hg19] 16p11.2(29673954_30198600)x3 525 pat mikroduplikace oblasti 17q11.2 265 F 7 arr[hg19] 17q11.2(28926812_30362413)x3 1 436 - 372 M 5 arr[hg19] 17q11.2(29024352_30326958)x3 1 303 - mikroduplikace oblasti 17q12 59 M 4 arr[hg19] 17q12(34611352_36248918)x3 1 638 - mikroduplikace oblasti 22q11.21 285 M 1 arr[hg19] 22q11.21(18641409_21464119)x3 2 823 mat 128 F 1 arr[hg19] 22q11.21(18894835_21809009)x3 2 914 pat 445 M 7 arr[hg19] 22q11.21(20754422_21801661)x3 1 047 de novo

Tabulka 6: Nálezy rekurentních mikrodelecí a mikroduplikací. F – female (žena), M - male (muž), mat – maternální, pat – paternální. Pomlčka (-) značí nedořešený případ z hlediska stanovení původu daných CNVs. Skupiny pacientů s nálezem stejného rekurentního CNV jsou označeny jeho názvem.

Souhrn non-rekuretíh ikrodeleí pacient pohlaví věk Výsledek aa-CGH Velikost původ (kb) 297 M 4 arr[hg19] 1p22.2p22.1(91236275_92945641)x1 1 709 de novo 70 F 0 arr[hg19] 1q23.3q24.2(161052711_167244113)x1 6 191 − 262 F 1 arr[hg19] 1q44(244662372_245634397)x1 972 de novo 199 M 0 arr[hg19] 2p11.2p11.1(87880812_91805166)x1 3 924 de novo 592 F 2 arr[hg19] 2q24.2q24.3(160099240_165647340)x1 5 548 de novo 25* F 18 arr[hg18] 2q37.3(241193970_242717067)x1 1 523 mat 27* M 14 arr[hg18] 2q37.3(241193970_242717067)x1 1 523 mat 56 F 4 arr[hg19] 5q14.3q15(86817800_92661343)x1 5 844 − 490 M 5 arr[hg19] 6q15q16.1(93007777_95148784)x1 2 141 − 323 F 8 arr[hg19] 7p14.3p14.2(30845668_35791265)x1 4 946 de novo 5 F 7 arr[hg19] 7q11.23q21.11(74144422_77809560)x1 3 665 de novo 171 F 13 arr[hg19] 8p23.3p23.1(176814_10286016)x1 10 109 − 352 M 1 arr[hg19] 9p24.3p24.1(204193_6996331)x1 6 792 − 111 F 2 arr[hg19] 9q22.32q31.1(97428395_103627727)x1 6 199 de novo 500 F 0 arr[hg19] 10p15.3p15.1(148206_6247262)x1 6 099 de novo 497 F 0 arr[hg19] 11q24.2q25(124937670_134615686)x1 9 678 de novo 691 M 0 arr[hg19] 11q24.1q25(122528307_134868407)x1 12 340 de novo 334 F 4 arr[hg19] 12p13.2p12.3(11787045_16732343)x1 4 945 de novo 42 M 1 arr[hg19] 14q23.1q23.2(59588427_63237193)x1 3 649 de novo 327 M 4 arr[hg19] 14q32.33(105394910_107278770)x1 1 884 pat 487 M 4 arr[hg19] 18p11.32p11.31(14316_6395506)x1 6 381 mat 687 F 2 arr[hg19] 19p13.2(12660681_13352580)x1 692 de novo 243 F 5 arr[hg19] 21q22.3(44848305_48090317)x1 3 242 pat 172 F 3 arr[hg19] 22q12.3q13.1(37381610_39050040)x1 1 668 de novo Souhrn non-rekuretíh ikroduplikaí pacient pohlaví věk Výsledek aa-CGH Velikost původ (kb) 23A F 3 arr[hg18] 1p36.11p35.3(27435248_29078029)x3 1 643 de novo 212 F 5 arr[hg19] 2q11.1q11.2(96755045_98021592)x3 1 267 mat 348 F 11 arr[hg19] 5q31.1(131995938_135423431)x3 3 427 − 723 F 9 arr[hg19] 5q35.2q35.3(176409575_176904798)x3 495 de novo 114 M 8 arr[hg19] 8q24.13(124982301_126102049)x3 1 120 mat 141 M 7 arr[hg19] 9q21.11q21.12(70984481_73358436)x3 2 374 − 147 M 10 arr[hg19] 16p13.12p12.3(14762239_18162167)x3 3 400 pat

Tabulka 7: Nálezy non-rekurentních mikrodelecí a mikroduplikací. F – female (žena), M - male (muž), mat – maternální, pat – paternální. Pomlčka (-) značí nedořešený případ z hlediska stanovení původu daných CNVs.

Klinický význam CNVs detekovaných metodou array-CGH - vybrané kazuistiky

Familiální rekurentní mikroduplikace oblasti 15q11.2-q13.1 Rekurentní mikroduplikace 15q11.2-q13.1 je lokalizována v lokusu podléhajícím genomovému imprintingu. Vyznačuje se rozdílnou mírou penetrance pro DID, PAS a asociované VVV v závislosti na svém parentálním původu – pro mikroduplikace maternálního původu  50 %, pro mikroduplikace paternálního původu  21 % (Isles et al., 2016). Tento jev byl sledován ve dvou rodinách (probandka 154, proband 411), v další rodině (proband 381) nebyl stanoven původ dané CNV. Rekurentní mikroduplikace oblasti 15q11.2-q13.1 byla identifikována u tří dětí (probandka 154 a probandi 381 a 411). Velikost těchto CNVs u jednotlivých případů byla srovnatelná a lišila se jen vlivem použitých různých platforem DNA mikročipů. Překryv v oblasti chr15:23813289-28525460 zahrnuje 19 OMIM genů včetně sedmi se vztahem k patologiím (MAGEL2, NDN, SNRPN, UBE3A, GABRB3, OCA2, HERC2). Rovněž manifestace fenotypových projevů byl podobná mezi jednotlivými pacienty (DID a PAS). Za účelem stanovení původu CNV u probanda 381 byly vyšetřeny pouze jeho matka a sestra, obě bez nálezu dané CNV, DNA otce nebyla k dispozici z důvodu přerušení kontaktu s rodinou. V rámci studie familiální segregace CNV byli vyšetřeni další rodinní příslušníci probandky 154 a probanda 411. U probandky 154 a jejího bratra byl diagnostikován nízkofunkční autismus, opožděný psychomotorický vývoj a u probandky 154 navíc faciální stigmatizace. Ostatní členové rodiny nevykazují žádné specifické patologie (obr. 9).

Obrázek 9: Rodokmen rodiny probandky 154 s mikroduplikací oblasti 15q11.2-q13.1 (4,87 Mb) a její familiální segregace. Modře jsou vyznačeni všichni rodinní příslušníci s mikroduplikací oblasti 15q11.2-q13.1 a tmavě modrou jsou vyznačeni členové rodiny nesoucí danou CNV (probandka a její bratr) s manifestací patologického fenotypu.

U probanda 411 a jeho obou sourozenců byly zaznamenány patologické fenotypové znaky. U probanda byly pozorovány PAS, DID, ADHD (porucha pozornosti s hyperaktivitou) a další poruchy chování, u jeho sestry psychiatrické potíže (úzkosti, porucha příjmu potravy) a lehká DID. Bratr vykazuje podobný fenotyp jako proband (ADHD, autistické rysy) a navíc dyslexii a dysgrafii. U jejich otce se manifestuje lehká DID (obr. 10).

Obrázek 10: Rodokmen rodiny probanda 411 s mikroduplikací oblasti 15q11.2-q13.1 (4,79 Mb) a její familiální segregace. Tmavomodře jsou vyznačeni členové rodiny nesoucí dané CNV s manifestací patologického fenotypu.

Non-rekurentní mikrodelece oblasti 12p12.3-p13.2 Nálezy non-rekurentních patogenních a pravděpodobně patogenních CNVs s sebou nesou potenciál pro upřesnění funkce genů významných v patogenezi DID a identifikaci nových kandidátních lokusů významných v patogenezi DID a asociovaných VVV. Stanovení klinického významu vzácné non-rekurentní mikrodelece je prezentováno příkladem mikrodelece oblasti 12p12.3-p13.2. Mikrodelece oblasti 12p12.3-p13.2 (4,95 Mb) byla identifikována u probandky 334 s DID, cystou na mozku, celkovým opožděním vývoje, těžkými vrozenými vadami zraku a sluchu, opožděnou řečí, faciální stigmatizací a abnormalitami prstů horních končetin. V oblasti CNV se nachází 29 OMIM genů, z toho 10 je popisováno jako klinicky významných. Z těchto genů byl identifikován gen GRIN2B, jehož heterozygotní delece může vysvětlit uvedené patologie u probandky. Haploinsuficience genu GRIN2B byla popsána jako příčinný mechanismus rozvoje rané infantilní epileptické encefalopatie typu 27 a intelektuálního deficitu typu 6 (OMIM *138252; Platzer et al., 2017). Tyto skutečnosti jsou dále podpořeny informacemi z databáze DECIPHER. Jsou zde uvedeni pacienti (248992, 67

283877, 265295) s de novo parciálními heterozygotními delecemi daného genu. U daných pacientů se manifestují obdobné patologie jako u naší probandky (PAS, svalová hypotonie, intelektuální opoždění, klinodaktylie malíčku, opožděná řeč, skvrny café-au-lait). Profil array- CGH probandky 334 s mikrodelecí oblasti 12p12.3-p13.2 je prezentován na obr. 11.

Obrázek 11: Profil array-CGH chromosomu 12 s non-rekurentní mikrodelecí oblasti p12.3-p13.2 (4,95 Mb). Vlevo je zobrazen chromosom 12, vpravo poté detail oblasti mikrodelece. Obrázek je výstupem programu Agilent Genomic Workbench (Agilent Technologies).

Non-rekurentní mikroduplikace oblasti 5q35.2-q35.3 Jako příklad další vzácné non-rekurentní CNV je zde prezentována mikroduplikace oblasti 5q35.2-q35.3 u probandky 723. Probandka vykazuje mírně dysproporční somatickou retardaci, modré skléry, trpí atopickým ekzémem a alergiemi na kravské mléko. Cytogenetickým vyšetřením karyotypu byla detekována de novo balancovaná translokace t(2;5)(q21;p15.3). Následnými vyšetřeními metodami array-CGH a qPCR byla detekována de novo mikroduplikace oblasti 5q35.2-q35.3 (495 kb). V ní se nachází 15 OMIM genů, včetně 4 klinicky významných (FGFR4, NSD1, SLC34A1, F12). Byla nalezena příčinná souvislost mezi mikroduplikací genu NSD1 a růstovou retardací a mikrocefalií (Dikow et al. 2013; Rosenfeld et al., 2013a; Reis et al., 2017). Navíc vzhledem k nálezu de novo translokace

68 t(2;5)(q21;p15.3) nelze vyloučit ani její vliv na fenotyp probandky. Profil array-CGH probandky 723 s mikroduplikací oblasti 5q35.2-q35.3 je prezentován na obr. 12.

Obrázek 12: Profil array-CGH chromosomu 5 s non-rekurentní mikroduplikací oblasti q35.2-q35.3 (495 kb). Vlevo je zobrazen chromosom 5, vpravo poté detail oblasti mikroduplikace. Obrázek je výstupem programu Agilent Genomic Workbench (Agilent Technologies).

4.1.3.2. Nálezy dvou patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs V deseti případech byly metodou array-CGH detekovány dvě klinicky významné chromosomové abnormality. U 7 dětí s normálním karyotypem byly detekovány dvě strukturně nezávislé submikroskopické CNVs, v 1 případě pacienta s normálním karyotypem byly detekovány dvě submikroskopické CNVs jako následek kryptické nebalancované translokace paternálního původu (tab. 8). U pacientky 658 byla detekována rekurentní mikrodelece oblasti 13q12.12 paternálního původu současně s mikroduplikací oblasti 13q21.31 maternálního původu s nejasnou korelací s fenotypem probandky. Dle studie Girirajan et al. (2012) současný nález rekurentní klinicky významné CNV a další rozsáhlé CNV (> 500 kb) je spojen s vyšší pravděpodobností manifestace patologií.

Výsledek arra-CGH Velikost (kb) původ

věk pacient pacient pohlaví 151 M 9 arr[hg19] 2q12.1q12.3(104231457_107642735)x3, 3 411 (dup); - 2q13(111408390_113210531)x3 1 802 (dup) 274 M 10 arr[hg19] 2q23.1q23.3(149208724_154131140)x1, 4 922 (del); - 7q21.12q21.13(88118032_89799946)x3 1 682 (dup) 21 M 5 arr[hg18] 4q12q13.1(55663065_66340030)x1, 10 677 (del); mat; 9q21.1(79468507_80281960)x1 813 (del) mat 451 F 3 arr[hg19] 10q26.2q26.3(129173842_135404523)x1 6 231 (del); de novo; , 11p15.1p14.3(17190929_23857589)x3 6 667 (dup) mat 604 F 1 arr[hg19] 10p15.3p15.1(148206_6277210)x1, 6 129 (del); de novo; 15q13.2q13.3(31014508_32510863)x1 1 496(del) de novo 380* M 2 arr[hg19] 7q36.1q36.3(152261467_159088636)x1, 6 827 (del); pat 12p13.33p13.31(230421_6554132)x3 6 324 (dup)

680 F 16 arr[hg19] 1q21.1(145413388_145747269)x3, 334 (dup); - 1q21.1q21.2(146347096_147786706)x1 1 440 (del) 658 F 0 arr[hg19] 13q12.12(23566962_24910743)x1, 1 344 (del); pat; mat ** 13q21.31(64424570_65615526)x3 1 191 (dup)

Tabulka 8: Nálezy dvou submikroskopických CNVs. F – female (žena), M - male (muž), mat – maternální, pat – paternální. Pomlčka (-) značí nedořešený případ z hlediska stanovení původu daných CNVs. * označuje pacienta s nálezy dvou CNVs v důsledku kryptické nebalancované translokace paternálního původu, ** označuje pacientku s nálezem rekurentní klinicky významné CNV a rozsáhlé CNVs nejasným klinickým významem.

Ve zbývajících dvou případech pacientů s abnormálním karyotypem (probandka 430 s karyotypem 46,XY a proband 714 s karyotypem 47,XXY) byly metodou array-CGH odhaleny další submikroskopické CNVs (viz příloha 5).

Probandka 430 s karyotypem 46,XY byla vyšetřena metodou array-CGH s přídatnými nálezy terminální mikrodelece oblasti 9p23-p24.2 (9, 83 Mb) a terminální mikroduplikace oblasti 16q23.3-q24.3 (8, 16 Mb), oba nálezy jsou na hranici rozlišení metodou klasické cytogenetiky. U probandčiny matky bylo provedeno vyšetření karyotypu s nálezem 46,XX. Vyšetření otce nebylo realizováno z důvodu přerušení kontaktu s rodinou, proto dosud nebyl objasněn původ těchto přestaveb u probandky. Proband 714 s karyotypem 47,XXY (Klinefelterův syndrom) byl vyšetřen metodou array-CGH z důvodu závažnější klinické manifestace fenotypu (nerovnoměrný vývoj, stigmatizace, lehké opoždění psychomotorického vývoje), jež není zcela typická pro jedince s Klinefelterovým syndromem. Kromě této aneuploidie gonosomů u něj byla detekována de novo mikrodelece oblasti 7q11.23 (1, 61 Mb), která je spojena s diagnózou Williams- Beurenova syndromu (OMIM #194050). Lokalizace jednotlivých klinicky významných rekurentních a non-rekurentních CNVs a také všech CNVs z případů se dvěma nálezy na jednotlivých chromosomech je graficky zpracována na obr. 13.

Obrázek 13: Chromosomální lokalizace submikroskopických klinicky významných CNVs. Nalevo od jednotlivých ideogramů chromosomů jsou zakresleny mikrodelece – rekurentní (červeně), non-rekurentní (fialově), mikrodelece z případů s více patogenními nálezy (světle modře). Napravo od jednotlivých ideogramů chromosomů jsou zakresleny mikroduplikace – rekurentní (zeleně), non-rekurentní (modře), mikroduplikace u případů s více nálezy klinicky významných CNVs (oranžově).

4.1.4. Varianty nejasného významu V souboru pacientů byly dále detekovány VOUS v 5 % všech případů (36/724). Do této skupiny byly zahrnuty 2 případy pacientů s markerovými chromosomy v mozaice, 26 případů CNVs nejasného významu a 8 případů oblastí cnnLOH s klinickou relevancí (> 5 Mb). Seznam případů s nálezy VOUS a oblastí cnnLOH je uveden v příloze 6 a 7.

4.1.4.1. Markerové chromosomy v mozaice U probandky 575 byl cytogenetickým vyšetřením karyotypu detekován markerový chromosom neznámého původu v 50 % hodnocených mitóz (15/30). Metodou array-CGH byl tento nález potvrzen a současně byl odhalen jeho původ z chromosomové oblasti 2q11.1- q12.1 (9,4 Mb bez centromery). Probandka vykazuje pouze mírnou somatickou retardaci, její psychomotorický vývoj se jevil v době vyšetření jako normální vzhledem k věku (12 let). U probanda 463 cytogenetické vyšetření karyotypu identifikovalo markerový chromosom derivovaný z chromosomu 21 v 60% mozaice (6/10 mitóz). Metodou array-CGH byl tento nález specifikován z hlediska rozsahu na oblast 21q11.2-q21.1 (6 Mb bez centromery). Stejný nález markerového chromosomu v mozaice byl detekován rovněž u probandovy matky. Probandův psychomotorický vývoj se jeví přiměřený věku (12 let v době vyšetření), je pozorována pouze mírná somatická retardace.

4.1.4.2. CNVs nejasného významu Na rozdíl od klinicky relevantních CNVs byly CNVs nejasného významu chudé na geny spojené s patologiemi. Spolu s nálezem VOUS u pacientky 658 (současný nález klinicky významné rekurentní mikrodelece a rozsáhlé VOUS) bylo detekováno 31 strukturních submikroskopických VOUS u 27 pacientů: v 35,5 % strukturních VOUS (11/31) nebyl nalezen žádný klinicky relevantní gen, 54,8 % těchto CNVs (17/31) vykazovalo přítomnost 1 nebo 2 genů s klinickým významem v patogenezi chorob odlišných od patologií pozorovaných u našich pacientů, resp. jejich zvýšená dávka pravděpodobně nevysvětluje patologický fenotyp pacientů. V 9,7 % CNVs (3/31) bylo nalezeno 5 klinicky významných genů, avšak dostupnými vyšetřeními, ani na základě informací z relevantní literatury nebylo možné jednoznačně potvrdit či vyloučit vliv těchto CNVs na fenotyp našich pacientů. Průměrná velikost těchto CNVs dosahovala 796 kb (224 kb až 3,24 Mb) a medián jejich velikosti přibližně 534 kb. Mikroduplikace byly přibližně 5krát četnější než mikrodelece (26:5).

4.1.4.3. Oblasti ztráty heterozygotnosti bez ztráty počtu kopií (cnnLOH) Pomocí DNA mikročipových platforem CGH+SNP bylo identifikováno 8 dětí s nálezem rozsáhlých oblastí cnnLOH klinického významu (> 5 Mb). Ve dvou případech byla detekována jedna oblast cnnLOH (proband 16 a 247). Ve zbylých 6 případech byla detekována více než 1 oblast cnnLOH, přičemž tyto děti pocházely z rodin s historií příbuzenských svazků. Znalost výskytu příbuzenských svazků a následná detekce oblastí cnnLOH s geny významnými v patogenezi recesivních onemocnění poskytují klíčové informace pro následné analýzy sekvenačními technikami vedoucí k identifikaci homozygotních sekvenčních variant s klinickým významem. Tyto analýzy byly realizovány v rámci studií využívajících metodu cíleného NGS nebo metodu Sangerova sekvenování zaměřenou na klinicky relevantní geny v oblastech cnnLOH.

4.1.5. Pravděpodobně benigní CNVs V 7,7 % případů (56/724) byly detekované CNVs klasifikovány jako pravděpodobně benigní. Celkově bylo v uvedených 56 případech identifikováno 63 pravděpodobně benigních CNVs chudých na geny, v 68 % CNVs (43/63) se nenacházel žádný klinicky významný gen, 30 % CNVs obsahovalo 1 nebo 2 klinicky významné geny (19/63) a v jedné CNV byly detekovány 3 klinicky významné geny. V případech přítomnosti klinicky významných genů nevysvětlovala abnormální genová dávka (zisk či ztráta kopie genu) patologický fenotyp daných pacientů. Průměrná velikost pravděpodobně benigních CNVs dosahovala 457 kb (201 kb až 1,47 Mb) a medián jejich velikosti na přibližně 374 kb. Frekvence nálezu pravděpodobně benigních mikroduplikací byla 2,5krát vyšší než v případě mikrodelecí (45:18). Seznam případů s nálezy pravděpodobně benigních CNVs je uveden v příloze 8.

4.2. Analýza detekovaných CNVs u dětí s DID, PAS a asociovanými onemocněními

Podrobnou analýzou patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs byl nalezen statisticky významný rozdíl mezi počtem mikrodelecí a mikroduplikací (67 vs. 27, p < 0,0001). Byla zaznamenána téměř 2,5krát vyšší četnost mikrodelecí (67/94) ve srovnání s mikroduplikacemi (27/94), avšak nebyl nalezen významný rozdíl v jejich velikosti (p > 0,5) (tab. 9). Data byla hodnocena χ2 testem dobré shody a oboustranným Mann-Whitneyovým U testem na hladině významnosti 5 % (Jeremy Stangroom. P value from Chi-square Calculator. https://www.socscistatistics.com/pvalues/chidistribution.aspx, přístup 1.7.2019; Jeremy Stangroom. Mann-Whitney U Test Calculator. Social Science Statistics. https://www.socscistatistics.com/tests/mannwhitney/default2.aspx, přístup 1.7.2019; Marx et al., 2016). U nálezů CNVs objasněných z hlediska původu byla pozorována významně vyšší četnost de novo mikrodelecí (44,8 %) ve srovnání s de novo mikroduplikacemi (14,8 %), a to přibližně trojnásobně. Do analýzy byly zahrnuty rekurentní a non-rekurentní CNVs a rovněž patogenní/pravděpodobně patogenní CNVs z případů se dvěma nálezy (včetně CNVs detekovaných u probandky.430 a probanda 714).

průěrá mediá iiálí aiálí de fam. eurč. velikost velikosti velikost velikost novo (kb) (kb) (kb) (kb) mikrodelece 3 359 2 141 395 12 340 44,8 % 23,9 % 31,3 % (30/67) (16/67) (21/67) mikroduplikace 2 736 1 802 334 8 156 14,8 % 37,0 % 48,2 % (4/27) (10/27) (13/27)

Tabulka 9: Srovnání rozsahu a původu patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs. Velikostní charakteristiky CNVs jsou pro přehled zaokrouhleny a uvedeny v kb.

V tabulce 10 jsou prezentovány velikostní charakteristiky jednotlivých klasifikačních skupin CNVs včetně jejich původu na základě vyšetření rodičů daných jedinců. V případě neurčeného původu nebyla dosud indikována vyšetření rodičů nebo pro konfirmační analýzy byl k dispozici vzorek DNA pouze od jednoho rodiče a jeho vyšetřením nebyl odhalen původ dané CNV. Na případech CNVs s objasněným původem lze pozorovat nejvyšší četnost de novo CNVs v kategorii patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs (36,2 %) ve srovnání s ostatními kategoriemi CNVs (VOUS – 9,7 %, pravděpodobně benigní CNVs – 1,6 %). V kategorii pravděpodobně benigních CNVs byl ve více než 90 % případů prokázán jejich 75 familiální původ. Rovněž ve skupině VOUS lze pozorovat vyšší výskyt familiálních CNVs oproti de novo CNVs, v této skupině však dosud u více než 61 % CNVs (19/31) dosud nebyl objasněn jejich původ, který by mohl ve specifických případech vést k upřesnění jejich vlivu na fenotyp daného jedince. Do skupiny VOUS byla zahrnuta VOUS detekovaná u probandky 658 se dvěma nálezy (rekurentní patogenní CNV a rozsáhlá VOUS). klasifikačí ediá průěr minimum maximum původ CNVs skupina (kb) (kb) (kb) (kb) de novo zděděo eurčeo CNVs P/LP 2 021 3 180 334 12 340 36,2 % 27,6 % 36,2 % (34/94) (26/94) (34/94) VOUS 534 796 224 3 238 9,7 % 29,0 % 61,3 % (3/31) (9/31) (19/31) LB 374 457 201 1 469 1,6 % 90,5 % 7,9 % (1/63) (57/63) (5/63)

Tabulka 10: Srovnání velikostních charakteristik submikroskopických CNVs a přehled jejich původu na základě vyšetření rodičů daných jedinců. Velikostní charakteristiky CNVs jsou pro přehled zaokrouhleny a uvedeny v kb. Zkratky: P/LP – pathogenic/likely pathogenic (patogenní/pravděpodobně patogenní), VOUS – varianta nejasného významu, LB – likely benign (pravděpodobně benigní)

Na základě srovnání velikostních charakteristik CNVs (v kb) mezi jednotlivými klasifikačními kategoriemi byly nalezeny statisticky významné rozdíly v jejich velikostech. Kategorie patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs vykazovala statisticky významný rozdíl oproti oběma dalším kategoriím (VOUS, pravděpodobně benigní CNVs). Mezi kategoriemi VOUS a pravděpodobně benigními CNVs byl rovněž pozorován statisticky významný rozdíl. Data byla hodnocena oboustranným Mann-Whitneyovým U testem na hladině významnosti 5 %. Výstupy ze statistické analýzy jsou prezentovány v tabulce 11.

třída CNVs

P/LP VOUS LB P/LP - p < 0,00001 p < 0,00001 VOUS p < 0,00001 - p < 0,009

třída CNVs třída LB p < 0,00001 p < 0,009 -

Tabulka 11: Statistické srovnání velikostí CNVs mezi jednotlivými klasifikačními skupinami. Zkratky: P/LP – pathogenic/likely pathogenic (patogenní/pravděpodobně patogenní), VOUS – varianta nejasného významu, LB – likely benign (pravděpodobně benigní)

Z analýzy velikostí jednotlivých CNVs v závislosti na jejich klinickém významu vyplývá, že 83 % (78/94) patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs bylo větších než 1 Mb, resp. polovina této skupiny CNVs byla větších než 2,5 Mb. Oproti tomu 97 % (61/63) pravděpodobně benigních CNVs bylo menších než 1 Mb, respektive více než 63 % (40/63) těchto CNVs bylo menší než 500 kb. Přibližně 81 % (25/31) CNVs nejasného významu bylo menších než 1 Mb. Tato skupina CNVs byla významně heterogenní: 42 % (13/31) dosahovalo velikosti mezi 0,2-0,5 Mb a 39 % (12/31) dosahovalo velikosti 0,5-1 Mb. Významně heterogenní z hlediska velikosti byly rovněž patogenní/pravděpodobně patogenní CNVs, avšak tuto heterogenitu lze pozorovat až při velikosti CNVs nad 1 Mb, kam spadá 83 % této skupiny CNVs. Detailní znázornění vztahu velikosti CNVs a jejich klinického významu je prezentováno na obrázku 14.

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

P/LP 0,5 VOUS 0,4 LB 0,3

0,2

0,1

podíl jedotlivýh klasifikačíh skupi CNVs skupi klasifikačíh jedotlivýh podíl 0,0 0,2-0,5 0,5-1,0 1,0-2,5 2,5-5 > 5 rozsah velikosti CNVs (Mb)

Obrázek 14: Vztah mezi velikostmi CNVs a jejich klinickým významem. Součet hodnot pro jednotlivé kategorie CNVs dosahuje vždy 100 % napříč všemi skupinami rozsahů velikostí. Zkratky: P/LP – pathogenic/likely pathogenic (patogenní/pravděpodobně patogenní), VOUS – varianta nejasného významu, LB – likely benign (pravděpodobně benigní). Nerovnoměrné intervaly velikostí CNVs byly zvoleny za účelem vizualizace významných souvislostí velikosti CNV a klasifikační skupiny CNV.

Ve skupině CNVs o velikosti 0,2-0,5 Mb jsou ve 2/3 případů (40/60) zastoupeny pravděpodobně benigní CNVs, oproti tomu ve skupině CNVs o velikosti 1,0-2,5 Mb jsou

77 v přibližně 84 % (31/37) zastoupeny patogenní/pravděpodobně patogenní CNVs a tento podíl se zvyšuje se zvyšující se velikostí CNVs (obr. 15).

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5 P/LP

0,4 VOUS LB 0,3

0,2

0,1 podíl jedotlivýh klasifikačíh skupi CNVs skupi klasifikačíh jedotlivýh podíl 0,0 0,2-0,5 0,5-1,0 1,0-2,5 2,5-5 > 5 rozsah velikosti CNVs (Mb)

Obrázek 15: Vztah mezi klinickým významem a velikostmi CNVs. Součet zastoupených jednotlivých typů CNVs dosahuje vždy 100 % v daném rozsahu velikosti. Zkratky: P/LP – pathogenic/likely pathogenic (patogenní/pravděpodobně patogenní), VOUS – varianta nejasného významu, LB – likely benign (pravděpodobně benigní). Nerovnoměrné intervaly velikostí CNVs byly zvoleny za účelem vizualizace významných souvislostí velikosti CNV a klasifikační skupiny CNV.

CNVs v rámci jednotlivých kategorií klinického významu byly dále hodnoceny z hlediska srovnání velikostí mikrodelecí a mikroduplikací (v kb). V žádné z hodnocených klasifikačních skupin CNVs nebyl nalezen statisticky významný rozdíl mezi velikostmi mikrodelecí a mikroduplikací. Data byla hodnocena oboustranným Mann-Whitneyovým U testem na hladině významnosti 5 % (tab. 12).

klasifikačí skupia CNVs počet průěrá ediá p velikost (kb) velikosti (kb) P/LP mikrodelece 67 3 359 2 141 > 0,5 mikroduplikace 27 2 736 1 802 VOUS mikrodelece 5 844 410 * mikroduplikace 26 786 536 LB mikrodelece 18 465 329 > 0,4 mikroduplikace 45 454 394

Tabulka 12: Srovnání velikosti mikrodelecí a mikroduplikací v jednotlivých kategoriích CNVs podle klinické významnosti. Data byla hodnocena Mann-Whitneyovým U testem na hladině významnosti 5 %. Zkratky: P/LP – pathogenic/likely pathogenic (patogenní/pravděpodobně patogenní), VOUS (varianta nejasného významu), LB – likely benign (pravděpodobně benigní). Hodnoty průměrné velikosti a mediánu velikosti jsou pro přehled zaokrouhleny a uvedeny v kb. * Ve skupině VOUS nebyla data statisticky hodnocena z důvodu nízkého počtu mikrodelecí.

4.3. Identifikace vzácných sekvenčních variant v souboru 35 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV metodou cíleného sekvenování „nové generace“ (NGS) vyšetřených na OLG FN Brno v letech 2015-2018

Výsledky celogenomového screeningu nebalancovaných chromosomových aberací se staly východiskem pro analýzy sekvenčních variant metodou cíleného sekvenování „nové generace“ (NGS). Pro tento účel byl využit komerční panel genů „ClearSeq Inherited Disease“ (Agilent Technologies) zahrnující převážně kódující oblasti 2742 genů popsaných v patogenezi lidských vrozených onemocnění. V letech 2015-2018 byly realizovány dva odlišné přístupy těchto analýz. V první části analýz v letech 2015-2016 bylo metodou cíleného NGS vyšetřeno 16 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV. Identifikované varianty s potenciálním klinickým významem byly následně ověřovány metodou cíleného Sangerova sekvenování u daných dětských pacientů a jejich rodičů. Na základě nových trendů a pokroků prezentovaných v odborné vědecké literatuře byl ve druhé části analýz uplaňován „trio-based“ přístup zahrnující společnou NGS analýzu dětských pacientů a jejich rodičů, eventuálně sourozenců. Nález patogenních/pravděpodobně patogenních sekvenčních variant byl následně verifikován u daných dětských pacientů a jejich rodičů nezávislou metodou cíleného Sangerova sekvenování. Do první části analýz bylo vybráno 16 dětských pacientů (7 dívek a 9 chlapců) s normálním karyotypem a bez nálezu patogenní/pravděpodobně patogenní CNV na základě vyšetření metodou array-CGH. V daném souboru byly metodou array-CGH identifikovány pravděpodobně benigní CNVs u 4 dětí (proband 52, 101, 153 a probandka 201), u 1 chlapce (proband 233) byla detekována CNV nejasného významu. Metodou cíleného NGS a následnou konfirmační analýzou Sangerovým sekvenováním byly identifikovány patogenní/pravděpodobně patogenní sekvenční varianty u 31,3 % (5/16) dětí, a to v genech MED13L, ASXL3, TSEN54 a SCN2A (2 odlišné sekvenční varianty u dvou dětí), u dalšího probanda (143) byla v genu GUCA1A detekována varianta nejasného významu. Všechny uvedené geny již byly popsány v databázích a relevantní literatuře jako významné v patogenezi DID či VVV. Ve třech případech patogenních/pravděpodobně patogenních variant se jedná o varianty v daných genech dosud nepopsané (2 varianty původu de novo, 1 varianta ve stavu složené heterozygotnosti se známou klinicky významnou variantou), ve zbylých případech se jedná o známé patogenní varianty detekované již dříve u jedinců, u nichž se manifestují podobné fenotypové projevy jako u našich pacientů. V případě varianty v genu GUCA1A byl prokázán její paternální původ, avšak u otce probanda se nemanifestuje 80

žádná významná patologie. Na základě informací z databází, in silico predikcí a literatury nelze jednoznačně prokázat vliv na fenotyp probanda.

Do druhé části analýz bylo vybráno 14 rodin s 19 dětmi (9 dívek a 10 chlapců), z toho 9 rodin s 1 dítětem a 5 rodin se 2 dětmi. V daném souboru bylo metodou array-CGH vyšetřeno 14 dětí, zbylých 5 dětí bylo zařaženo do NGS analýz jako sourozenci s patologickým fenotypem. Z uvedených 14 dětí měly 2 děti (proband 99, probandka 178) nález balancované translokace a metodou array-CGH nebyla nalezena CNV v suspektních místech zlomu. U probandky 178 bylo navíc identifikováno pravděpodobně benigní CNV, u probanda 38 bylo detekováno CNV nejasného významu. U probanda 118 a probandky 162 byly detekovány mnohočetné oblasti rozsáhlých cnnLOH jako důsledek příbuzenských svazků v daných rodinách. NGS analýzy 5 rodin z uvedeného souboru byly realizovány rovněž v rámci diplomové práce Mgr. Hany Poláčkové, avšak analýzy sekvenačních dat, jejich verifikace, interpretace a následná diskuze probíhaly nezávisle (Poláčková, 2019). Metodou cíleného NGS a následnou konfirmační analýzou Sangerovým sekvenováním byly identifikovány patogenní/pravděpodobně patogenní sekvenční varianty u 21,1 % (4/19) dětí, u další probandky byla detekována de novo sekvenční varianta s nejasným vlivem na její fenotyp. Patogenní/pravděpodobně patogenní sekvenční varianty byly detekovány v genech IQSEC2, BTD, SLC6A19 a TUBB3, varianta nejasného významu byla detekována v genu CACNA1H. Všechny uvedené geny již byly popsány v databázích a relevantní literatuře jako významné v patogenezi DID či VVV. U dvou bratrů byla v genu IQSEC2 detekována dosud nepopsaná sekvenční deleční varianta maternálního původu. V případě nálezu de novo varianty v genu CACNA1H nelze blíže specifikovat její klinický význam z důvodu nedostatku informací z relevantní literatury a databází a nejasné korelace s fenotypem dané probandky.

Celkový diagnostický záchyt patogenních/pravděpodobně patogenních sekvenčních variant metodou cíleného NGS za využití komerčního panelu genů v našem souboru pacientů je 25,7 % (9/35). Přehled patogenních/pravděpodobně patogenních sekvenčních variant včetně původu je uveden v tabulce 13. Zápis sekvenčních variant je prezentován dle doporučené nomenklatury Společnosti variability lidského genomu (HGVS, Human Genome Variation Society) (den Dunnen et al., 2016), vzhledem k mapování sekvenačních dat na lidský genom hg19 jsou i jednotlivé chromosomové nukleotidové pozice sekvenčních variant vztaženy k této verzi genomu (v tabulce i dále v textu).

proband pohlaví arozeí gen zápis pozie variat dle oeklatur HGVS 6 hrooso, traskript, protei původ 64* M 2004 MED13L NC_000012.11:g.[116446799_116446802delCTGT];[116446799_116446802=] de novo NM_015335.4:c.[(1416_1419delACAG)];[(1416_1419=)]

NP_056150.1:p.[(Q473Kfs*11)];[Q473=)] klasifikačí kitéia ACMG PVS1, PS2, PM2, PP4 196* F 2013 ASXL3 NC_000018.9:g.[31320374delT];[31320374=] de novo NM_030632.1:c.[(3006delT)];[(3006=)]

NP_085135.1:p.[(R1004Efs*21)];[(R1004=)] klasifikačí kitéia ACMG PVS1, PS2, PM2, PP5, BP4 201 F 2014 SCN2A NC_000002.11:g.[166243337A>G];[166243337=] de novo NM_001040142.1:c.[(4633A>G)];[(4633=)]

NP_001035232.1:p.[(M1545V)];[(M1545=)] klasifikačí kitéia ACMG PS2, PM2, PP2, PP3, PP5 233 M 2007 SCN2A NC_000002.11:g.[166166923C>T];[166166923=] de novo NM_001040142.1:c.[(788C>T)];[(788=)]

NP_001035232.1:p.[(A263V)];[A263=)] klasifikačí kitéia ACMG PS2, PM2, PP2, PP3, PP5 282* F 2016 TSEN54 NC_000017.10:g.[73512699T>G;73512930C>G];[73518081G>T]

NM_207346.2:c.[(56+2T>G);(160C>G)];[(919G>T)] ipaetálí složeý klasifikačí kitéia ACMG PVS1, PM2, PM3, PP3 (pro c.56+2T>G) heterozygot) klasifikačí kitéia ACMG PM2, PM3 (pro c.160C>G) klasifikačí kitéia ACMG PM3, PP3, PP5 (pro c.919G>T)

Pokračování tabulky 13 na následující straně včetně legendy.

proband pohlaví arozeí gen zápis pozie variat dle oeklatur HGVS 2016 (chromosom, transkript, protein) původ 14* M 2010 IQSEC2 NC_000023.10:g.[53279944_53279945delTC];[0] ateálí 14_B1* M 2017 NM_001111125.2:c.[(1813_1814delGA)];[0]

NP_001104595.1:p.[(D605Pfs*3)];[0] klasifikačí kitéia ACMG PVS1, PM2, PP1 BTD NC_000003.11:g.[15686693G>C];[15686693G>C] ipaetálí

NM_000060.2:c.[(1330G>C)];[(1330G>C)]

NP_000051.1:p.[(D444H)];[(D444H)] klasifikačí kitéia ACMG PP3, PP4, PP5 414 M 2012 SLC6A19 NC_000005.9:g.[1212453G>A];[1216726C>T] ipaetálí NM_001003841.2:c.[(517G>A)];[(941C>T)] složeý NP_001003841.1:p.[(D173N)];[(S314L)] heterozygot) klasifikačí kitéia ACMG PP3, PP5 (pro c.517G>A) klasifikačí kitéia ACMG PM2, PM3, PP3 (pro c.941C>T) 621 M 2010 TUBB3 NC_000016.9:g.[90002087G>A];[90002087=] de novo NM_006086.3:c.[(1228G>A)];[(1228=)]

NP_006077.2:p.[(E410K)];[(E410=)] klasifikačí kitéia ACMG PS2, PM1, PP3, PP5

Tabulka 13: Přehled patogenních či pravděpodobně patogenních sekvenčních variant detekovaných metodou cíleného NGS v souboru 35 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV. Zápis je uveden dle doporučené nomenklatury HGVS na úrovni chromosomu, transkriptu a proteinu. U probandky 282 není uveden zápis na proteinové úrovni z důvodu nálezu putativní sestřihové varianty v intronu. Uvedená klasifikační kritéria ACMG vychází z informací na webové platformy VarSome, přičemž oproti základnímu nastavení byly uplatněny znalosti o původu variant (kritérium PS2), pozici in trans s patogenní variantou u recesivních onemocnění (kritérium PM3) a specifitě probandova fenotypu (kritérium PP4). Zkratky: F – female (žena), M – male (muž). * za číslem označuje sekvenční varianty dosud nepopsané v databázích či odborné literatuře.

4.3.1. Kvalitativní analýza dat V rámci zpracování základních sekvenačních dat z vysokokapacitnách sekvenátorů MiSeq a NextSeq 500 byly provedeny analýzy kontroly kvality, hodnotící kvalitu mapování čtení na cílové oblasti (targets) a hloubku pokrytí. Analýza byla provedena pomocí programu Picard pro každý sekvenační běh. U většiny vzorků bylo dosaženo požadované optimální kvality pokrytí dle doporučení výrobce reagencií a komerčního panelu genů (Agilent Technologies); ≥ 90 % bazí bylo pokryto 20-30x, u většiny vzorků DNA bylo > 95 % bazí pokryto 30x. Příklad výstupu analýzy je prezentován na obrázku 16.

Obrázek 16: Příklad kontroly kvality sekvenačních dat po jejich zpracování a mapování na referenční genom hg19. Analýza byla provedena pomocí programu Picard. V legendě jsou uvedena označení jednotlivých vzorků DNA dle jejich laboratorního čísla.

4.3.2. Statistika sekvenčních variant Metodou cíleného NGS bylo celkově analyzováno 63 jedinců, u každého jedince bylo průměrně detekováno 19 852 sekvenčních variant (minimum 15 992, maximum 22 000) zahrnující SNVs, krátké inzerce a delece. Statistickou analýzou pro data ze 14 rodin nebyl nalezen významný rozdíl mezi celkovým počtem variant detekovaných u dětí a u jejich rodičů (p > 0,05), ani v žádném dalším testovaném typu sekvenční varianty bez ohledu na analýzu zahrnující oba rodiče nebo každého rodiče zvlášť. Nejmenší počet variant byl detekován u probanda 14, kterému byl v době odběru biologického materiálu 1 rok (rok odběru 2011), nejvíce variant bylo detekováno u otce probanda 621, jemuž bylo v době odběru biologického materiálu 43 let (rok odběru 2011). Data byla hodnocena oboustranným Mann-Whitneyovým U testem na hladině významnosti 5 %. Srovnání počtu sekvenčních variant identifikovaných v „trio-based“ analýzách je prezentováno na obrázku 17.

22000

21000

20000

19000

18000 počet sekvečíh variat sekvečíh počet

číslo všetřovaého jedie proband matka otec

Obrázek 17: Srovnání celkového počtu sekvenčních variant v rámci rodinných („trio- based“) analýz. V každém triu je ukázáno srovnání počtu detekovaných sekvenčních variant u probanda, matky a otce. V případě rodin s více dětmi je analýza provedena pro každé dítě zvlášť. Označení „S“ nebo „B“ představuje sestru nebo bratra jedince s daným číselným označením.

4.4. Analýza patogenních sekvenčních variant detekovaných metodou cíleného NGS a stanovení jejich významu v patogenezi DID, PAS a asociovaných onemocnění

V souboru 35 pacientů byly nalezeny patogenní či pravděpodobně patogenní sekvenční varianty u 9 dětských pacientů (25,7 %). Nálezy byly manuálně zkontrolovány a vizualizovány pomocí programu IGV 2.3.82, webové aplikace gene.iobio.io a byla provedena in silico predikce pomocí online bioinformatických programů. Pro účely stanovení korelace genotypu s fenotypem byla využita relevantní odborná literatura a výše uvedené online databáze genetických variant. Přítomnost daných klinicky významných variant byla verifikována nezávislou analýzou Sangerova sekvenování u probanda, rodičů a eventuálně dalších příbuzných dle indikace ošetřujícího lékaře. V následující části budou popsány jednotlivé kazuistiky s nálezy patogenních/pravděpodobně patogenních sekvenčních variant. Popis zahrnuje klinická data a výsledky cytogenetického vyšetření karyotypu, array-CGH, cíleného NGS a verifikaci nálezu. Vizualizace nálezu sekvenčních variant pomocí programu IGV 2.3.82 a webové aplikace gene.iobio.io je prezentována na dvou vybraných kazuistikách. Verifikace nálezu metodou Sangerova sekvenování je dokumentována obrázkem ze software Sequencher verze 5.1 u každé popisované kazuistiky.

Proband 64 Klinická data: jedná se o chlapce (*2004) s těžkou DID, závažným celkovým opožděním vývoje zahrnující neobratnou řeč a chůzi, výraznou faciální stigmatizací, kloubní hypermobilitou a lehkou nedoslýchavostí. Jeho rodiče (matka *1978, otec *1975) jsou zdraví, v další rodinné anamnéze se rovněž nevyskytují patologie, jež by mohly vysvětlit fenotyp probanda. Proband má normální mužský karyotyp a metodou array-CGH nebyly nalezeny žádné submikroskopické přestavby chromosomů v rámci rozlišení metody. Metodou cíleného NGS byla nalezena heterozygotní delece 4 bp v kódující oblasti genu MED13L (12q24.21, OMIM *608771) v exonu 10, která se nachází v pozici chr12:116446799-116446802. Uvedená varianta nebyla dosud popsána v žádné relevantní databázi ani odborné literatuře. Způsobuje frameshift p.Q473Kfs*11 na proteinové úrovni a předčasné zařazení terminačního kodonu (PTC, premature termination codon) se poté nachází na aminokyselinové (AMK) pozici 483. Dle in silico predikce v programu MutationTaster je produkci zkráceného nefunkčního proteinu bráněno procesem nonsense-mediated mRNA decay (NMD). V databázi ExAc je popsáno 496 „missense“ variant a 2 LoF, přičemž gen MED13L je dle 86 této databáze genem netolerující varianty spojené se ztrátou funkce. Dle informací v databázi ClinGen je haploinsuficience genu MED13L považována za patogenní mechanismus. Metodou Sangerova sekvenování byl u probanda 64 prokázán de novo původ varianty p.Q473Kfs*11 (obr. 18).

Obrázek 18: Verifikace deleční sekvenční varianty v genu MED13L u probanda 64 a jeho rodičů metodou Sangerova sekvenování. U probanda 64 byla prokázána de novo heterozygotní 4-bp delece (CTGT, zde ACAG z důvodu sekvenace komplementárního vlákna) v kódující oblasti genu MED13L (červený rámeček).

Probandka 196 Klinická data: jedná se o dívku (*2013) se závažným celkovým opožděním vývoje, mikrocefalií, suspektní PAS na základě stereotypie v chování, absencí řeči a výraznou hypotonií. Její rodiče (oba *1981) jsou zdraví. Probandka pochází z dvojčetné gravidity, její bratr-dvojče je zdravý. Starší bratr (*2012) má mírný hypertelorismus, epicanty a rozštěp rtu. Probandka má normální ženský karyotyp a metodou array-CGH nebyly nalezeny žádné submikroskopické CNVs v rámci rozlišení metody. Metodou cíleného NGS byla nalezena delece 1 bp v kódující oblasti genu ASXL3 (18q12.1, OMIM *615115) v exonu 11, která se nachází v pozici chr18:31320374. Uvedený případ byl podrobně popsán v publikaci Wayhelova et al. (2019). Na proteinové úrovni vede k frameshiftu p.R1004Efs*21 s výskytem PTC na pozici 1024, přičemž vzniku zkráceného proteinu může zamezit proces NMD (dle výsledku in silico predikčního programu MutationTaster2 a webové platformy VarSome). V databázi ExAc je pro gen ASXL3 popsáno 671 „missense“ variant a 3 varianty LoF, přičemž varianty LoF nejsou tolerovány. V databázi ClinGen je haploinsuficience genu ASXL3 popsána jako mechanismus uplatňující se v asociovaných patologiích. Metodou

Sangerova sekvenování byl u probandky 196 prokázán de novo původ varianty p.R1004Efs*21 (obr. 19).

Obrázek 19: Verifikace deleční sekvenční varianty v genu ASXL3 u probandky 196 a jejích rodičů metodou Sangerova sekvenování. U probandky 196 byla prokázána de novo heterozygotní 1-bp delece (T) v kódující oblasti genu ASXL3 (červený rámeček).

Probandka 201 Klinická data: jedná se o dívku (*2014) s časnou myoklonickou epileptickou encefalopatií špatně reagující na léčbu. V klinickém obraze je rovněž patrná těžká DID, axiální hypotonie, končetinová spasticita a faciální stigmatizace. Její rodiče (matka *1988, otec *1987) jsou zdraví, v rodinné anamnéze nejsou uvedeny žádné patologie, jež by mohly vysvětlit patologický fenotyp probandky. Probandka má normální ženský karyotyp. Metodou array- CGH byla detekována mikroduplikace oblasti 1p36.32 maternálního původu, která vzhledem ke svému genovému obsahu pravděpodobně není příčinou patologického fenotypu probandky. Metodou cíleného NGS byla nalezena SNV v kódující oblasti genu SCN2A (2q24.3, OMIM *182390) v exonu 26, která se nachází v pozici chr2:166243337. Důsledkem této SNV je záměna AMK v pozici p.M1545V (obr. 20-22).

Obrázek 20: Vizualizace heterozygotní sekvenční varianty A>G na chromosomu 2 v pozici chr2:166243337 genu SCN2A v programu IGV 2.3.82. Šedé linie představují jednotlivá mapování readů do dané oblasti, vyznačena je heterozygotní záměna A>G.

Obrázek 21: Vizualizace sekvenční varianty A>G na chromosomu 2 v pozici chr2:166243337 (gen SCN2A) ve webové aplikaci gene.iobio. V tabulce jsou prezentovány jednotlivé varianty nalezené v daném genu u probandky 201 a jsou seřazeny podle kauzality od nejzávažnější po nejméně závažnou (dle informací z databází a in silico predikcí, jež jsou integrovány v rámci této aplikace). Patogenní sekvenční varianta vedoucí k záměně AMK p.M1545V je uvedena jako nejzávažnější a je vyznačena modrým rámečkem vlevo nahoře. Ve střední části obrázku jsou prezentovány patogenní a pravděpodobně patogenní sekvenční varianty v genu SCN2A z databáze ClinVar. Ve spodní části obrázku je vizualizován gen SCN2A s nálezy sekvenčních variant u probandky 201. Patogenní sekvenční varianta vedoucí k záměně AMK p.M1545V je vyznačena modrým kroužkem.

Obrázek 22: Interpretace patogenní varianty p.M1545V v genu SCN2A ve webové aplikaci gene.iobio.io. Prokliknutím v tabulce z předchozího obrázku jsou k dispozici informace o vybrané sekvenční variantě (v daném případě se jedná o patogenní variantu) s možnostmi prokliknutí do dalších online databází genomových variant.

Dostupné databáze a webové aplikace (ClinVar, dbSNP pod identifikátorem rs796053150, VarSome) a odborná literatura tuto variantu klasifikují jako pravděpodobně

90 patogenní. Metodou Sangerova sekvenování byl u probandky 201 prokázán de novo původ varianty p.M1545V (obr. 23).

Obrázek 23: Verifikace SNV v genu SCN2A u probandky 201 a jejích rodičů metodou Sangerova sekvenování. U probandky 201 byla prokázána de novo heterozygotní substituce (A>G, zde T>C z důvodu sekvenace komplementárního vlákna) v kódující oblasti genu SCN2A (červený rámeček).

Proband 233 Klinická data: jedná se o chlapce (*2007) s časnou myoklonickou epileptickou encefalopatií. V klinickém obraze je rovněž patrná těžká DID, absence řeči, strabismus, spasticita končetin a lehká atypie dermatoglyfů na horních končetinách. Jeho rodiče (oba *1977) jsou zdraví. Otec prodělal operaci CNS z důvodu odstranění arteriovenosní malformace, nyní je bez potíží. V rodinné anamnéze nejsou uvedeny žádné další patologie, jež by mohly vysvětlit patologický fenotyp probanda. Proband má normální mužský karyotyp. Metodou array-CGH byla detekována de novo mikroduplikace oblasti 18q21.32, klasifikovaná jako VOUS. Metodou cíleného NGS byla nalezena SNV v kódující oblasti genu SCN2A (2q24.3, OMIM *182390) v exonu 7, která se nachází v pozici chr2:166166923. Vlivem substituce C>T v uvedené pozici dochází k záměně AMK p.A263V. V dostupných databázích (ClinVar, dbSNP pod identifikátorem rs387906686) a v odborné literatuře je uvedená varianta klasifikována jako patogenní. Metodou Sangerova sekvenování byl u probanda 233 prokázán de novo původ varianty p.A263V (obr. 24).

Obrázek 24: Verifikace SNV v genu SCN2A u probanda 233 a jeho rodičů metodou Sangerova sekvenování. U probanda 233 byla prokázána de novo heterozygotní substituce (C>T) v kódující oblasti genu SCN2A (červený rámeček).

Probandka 282 Klinická data: jedná se o dívku (*2016) s mikrocefalií, faciální stigmatizací, svalovou hypertonií a atypickým držením končetin. Pomocí zobrazovacích metod byla identifikována těžká dysplazie prodloužené míchy, mesencefala, mozečku, bazálních ganglií. Probandka je z 3. gravidity, předchozí gravidity skončily spontánním abortem v 1. trimestru. Její rodiče (matka *1984, otec *1978) jsou zdraví. V rodinné anamnéze nejsou uvedeny žádné další patologie. Probandka má normální ženský karyotyp a metodou array-CGH nebyly nalezeny žádné submikroskopické CNVs v rámci rozlišení metody. Metodou cíleného NGS byly nalezeny SNVs s potenciálním klinickým významem v kódující oblasti genu TSEN54 (17q25.1, OMIM *608755), které se nachází v pozicích chr17:73512930 (c.160C>G, exon 2) a chr17:73518081 (c.919G>T, exon 8). Dále byla nalezena intronová sekvenční varianta v pozici chr17:73512699 na rozhraní exonu 1 a intronu 1. Uvedené kódující SNVs vedou k AMK substitucím p.R54G, respektive p.A307S. Varianta p.R54G dosud nebyla popsána v žádné relevantní databázi ani odborné literatuře. Dle výstupů in silico predikčních nástrojů ji lze klasifikovat jako variantu nejasného významu, funkční in silico predikční programy SIFT („sorting intolerant from tolerant“) (Ng and Henikoff, 2001) a PROVEAN ji klasifikují jako škodlivou („damaging“). Varianta p.A307S je v dostupných databázích (ClinVar, dbSNP pod identifikátorem rs113994152) a relevantní literatuře klasifikována jako patogenní, resp. pravděpodobně patogenní. Intronová SNV c.56+2T>G se nachází na donorovém místě sestřihu a ve vazbě s variantou c.160C>G na maternální alele. Putativní sestřihovou

92 intronovou SNV lze na základě komplexních informací z webového rozhraní VarSome klasifikovat jako patogenní variantu. V databázi ClinGen je popsáno spojení genu TSEN54 s AR patologiemi postihující strukturu a funkce CNS. Metodou Sangerova sekvenování byla u probandky 282 prokázána lokalizace SNVs c.56+2T>G a c.160C>G na maternální alele a jejich výskyt in trans vzhledem k SNV c.919G>T paternálního původu (obr. 25).

Obrázek 25: Verifikace SNVs v genu TSEN54 u probandky 282 a jejích rodičů metodou Sangerova sekvenování. U probandky 282 byly prokázány heterozygotní substituce T>G v pozici chr17:73512699 (chromatogram 1) a C>G v pozici chr17:73512930 (zde G>C z důvodu sekvenace komplementárního vlákna; chromatogram 2) maternálního původu a G>T paternálního původu v pozici chr17:73518081 v kódující oblasti genu TSEN54 (chromatogram 3). Jednotlivé SNVs jsou označeny červenými rámečky.

Probandi 14 a 14_B1 Klinická data: jedná se o bratry (*2010 a *2017) se závažnou DID a celkovým opožděním vývoje. U probanda 14 se od 8 let manifestuje epilepsie. Psychmotoricky se projevuje na úrovni 1 roku věku, vykazuje autistické znaky (obtížné navázaní očního kontaktu, stereotypní pohyby), je zcela nesoběstačný. U probanda 14_B1 se od narození projevuje závažné opoždění pschomotorického vývoje, hypotonie a strabismus. Infantilní spasmy pozorované již

93 od narození rychle progredovaly do závažné epileptické encefalopatie s částečnou odpovědí na léčbu. U obou bratrů byl prokázán parciální deficit biotinidázy, který nemá etiologickou souvislost s onemocněním a je medicínsky kompenzován, avšak bez významného pozitivního vlivu na fenotyp bratrů. Jejich bratr 14_B2 (*2013) vykazuje normální intelekt přiměřený věku, na obou horních končetinách má syndaktilii ukazováčku a prostředníčku. Stejně jako u jeho bratrů byl u něj prokázán parciální deficit biotinidázy, v současnosti je bez léčby. Rodiče (matka *1979, otec *1980) jsou zdraví, otec je dyslektik a dysgrafik. U matky a otce byl v rámci dřívějších molekulárně genetických analýz prokázán heterozygotní stav pro patogenní sekvenční variantu c.1330G>C (p.D444H) v exonu 4 genu BTD a všichni tři synové nesou tuto variantu v homozygotním stavu. Všichni jedinci mají normální karyotyp. Proband 14 byl vyšetřen metodou array-CGH, bez nálezu CNV v rámci rozlišení metody. Metodou cíleného NGS byla u probandů 14 a 14_B1 nalezena hemizygotní delece 2 bp v kódující oblasti genu IQSEC2 (Xp11.22, OMIM *300522) v exonu 5 v pozici chrX:53279944-53279945 (obr. 26-28). U matky byl prokázán heterozygotní stav pro tuto variantu.

Obrázek 26: Vizualizace 2-bp deleční sekvenční varianty (delece TC) na chromosomu X v pozici chrX:53279944-53279945 (gen IQSEC2) v programu IGV 2.3.82. Šedé linie představují jednotlivá mapování readů do dané oblasti. Jednotlivá mapování jsou seřazena shora dolů - proband 14_B1, proband 14, otec, matka. U probandů jsou černými liniemi vyznačeny delece TC ve všech readech (tj. hemizygotní delece TC), u matky je přítomna heterozygotní delece TC. 94

Obrázek 27: Vizualizace deleční varianty TC na chromosomu X v pozici chrX:53279944- 53279945 (gen IQSEC2) ve webové aplikaci gene.iobio. V tabulce jsou prezentovány jednotlivé varianty nalezené v daném genu u probanda 14 a jsou seřazeny podle kauzality od nejzávažnější po nejméně závažnou (dle informací z databází a in silico predikcí, jež jsou integrovány v rámci této aplikace). Patogenní delece TC vedoucí k posunu čtecího rámce p.D605Pfs*3 je uvedena jako nejzávažnější a je vyznačena modrým rámečkem. Ve střední části obrázku jsou prezentovány patogenní a pravděpodobně patogenní varianty v genu IQSEC2 z databáze ClinVar. Ve spodní části obrázku je vizualizován gen IQSEC2 s nálezy sekvenčních variant u probanda 14. Patogenní varianta vedoucí k posunu čtecího rámce p.D605Pfs*3 je vyznačena modrým kroužkem.

Obrázek 28: Interpretace patogenní varianty p.D605Pfs*3 v genu IQSEC2 ve webové aplikaci gene.iobio.io. Prokliknutím v tabulce z předchozího obrázku jsou k dispozici informace o vybrané sekvenční variantě (v daném případě se jedná o patogenní variantu) s možnostmi prokliknutí do dalších online databází genomových variant.

Dodatečnou analýzou Sangerovým sekvenováním uvedená sekvenční varianta nebyla detekována u zdravého bratra 14_B2 (obr. 29 vlevo). V důsledku přítomnosti uvedené varianty je predikován frameshift v AMK pozici p.D605Pfs*3 s PTC v AMK pozici 607, avšak vzniku zkráceného proteinu pravděpodobně předchází proces NMD (výsledky in silico predikčního programu MutationTaster2 a webové platformy VarSome). Podle informací v databázi ClinGen je haploinsuficience genu IQSEC2 popsána jako mechanismus uplatňující se v asociovaných patologiích. V databázi ClinVar bylo pro gen IQSEC2 popsáno 22 frameshift variant, všechny byly klasifikovány jako patogenní, resp. pravděpodobně patogenní, stejně jako 20 nesmyslných variant a 8 sestřihových variant. Dále bylo popsáno 86 „missense“ variant s různou kauzalitou (údaje jsou platné ke dni 11.9.2019). Metodami cíleného NGS a Sangerovým sekvenováním byla nalezena patogenní sekvenční varianta v genu BTD (3p25.1, OMIM *609019), detekovaná již v rámci předchozích molekulárně genetických vyšetření v dané rodině – u rodičů v heterozygotním stavu, u jejich dětí v homozygotním stavu, přičemž syn 14_B2 byl vyšetřen dodatečně Sangerovým sekvenováním (obr. 29 vpravo).

Obrázek 29: Verifikace hemizygotní deleční sekvenční varianty v X-vázaném genu IQSEC2 u probandů 14 a 14_B1 a heterozygotního stavu této varianty u jejich matky (chromatogramy vlevo). U probandů 14 a 14_B1 byl prokázán maternální původ hemizygotní 2-bp delece (TC) v genu IQSEC2 v pozici chrX:53279944-53279945 (červený rámeček). Verifikace sekvenční varianty v genu BTD (chromatogramy vpravo). U probandů 14, 14_B1 a jejich bratra 14_B2 byl potvrzen homozygotní stav substituce G>C v pozici chr3:15686693, oba rodiče jsou heterozygotní přenašeči této varianty (červený rámeček).

Proband 414 Klinická data: jedná se o chlapce (*2012) s DID nejasné etiologie. Neurologicky byl diagnostikován kvadrupyramidový syndrom s paraparézou dolních končetin, konvergentní strabismus a mikrocefalie. MRI mozku prokázalo intrakraniální patologické změny bílé hmoty (demyelinizace) s podezřením na Pelizaeus Werzerbachovu chorobu, mnohočetná ložiska hemosiderinu a cavernomy. Nemluví plynule, pouze v jednoduchých slovech, dobře drží sociální kontakt. Klinicky se jeví jako dystrofický chlapec s diskrétní kraniofaciální stigmatizací, lokálními změnami v pigmentaci kůže. Trpí na recidivující respirační infekce, v moči byla detekována nespecifická hyperaminoacidurie. Rodiče (oba *1976) jsou zdraví. V rodinné anamnéze nejsou uvedeny žádné patologie, jež by mohly vysvětlit fenotyp probanda. Proband má normální mužský karyotyp a metodou array-CGH nebyly nalezeny žádné submikroskopické přestavby chromosomů v rámci rozlišení metody. Metodou cíleného NGS byly nalezeny vzácné heterozygotní SNVs v kódující oblasti genu SLC6A19 (5p15.33, OMIM *608893), které se nachází v pozicích chr5:1212453 (exon 4) a chr5:1216726 (exon 7). U obou variant byl prokázán familiální původ, přičemž SNV G>A v exonu 4 (p.D173N) je paternálního původu a SNV C>T v exonu 7 (p.S314L) je maternálního původu. Dle informací z relevantních databází (ClinVar, dbSNP) je varianta chr5:1212453G>A klasifikována jako patogenní či pravděpodobně patogenní, varianta chr5:1216726C>T je klasifikována jako varianta nejasného významu. Proband je tedy pro tyto varianty složený heterozygot. Metodou Sangerova sekvenování byly u probanda 414 a jeho rodičů tyto nálezy potvrzeny (obr. 30).

Obrázek 30: Verifikace SNVs v genu SLC6A19 u probanda 414 a jeho rodičů metodou Sangerova sekvenování. U probanda 414 byly prokázány heterozygotní substituce G>A paternálního původu v pozici chr5:1212453 a C>T maternálního původu v pozici chr5:1216726 v kódující oblasti genu SLC6A19 (červený rámeček). Chromatogram vlevo – „R“ představuje purin, chromatogram vpravo – „Y“ představuje pyrimidinovou bázi.

Proband 621 Klinická data: jedná se o chlapce (*2010) s agenezí corpus callosum. Manifestuje se Pierre- Robinova sekvence (mikrognácie, glossoptosis, rozštěp patra), výrazná faciální stigmatizace (široký kořen nosu, kapří ústa, nízko posazené ušní boltce) a hypertonus. Dle klinického obrazu je suponován vzácný Toriello-Carey syndrom. Rodiče (matka *1983, otec *1968) jsou zdraví. V rodinné anamnéze nejsou uvedeny žádné patologie, jež by mohly vysvětlit fenotyp probanda. Proband má normální mužský karyotyp a metodou array-CGH nebyly nalezeny žádné submikroskopické přestavby0 chromosomů v rámci rozlišení metody. Metodou cíleného NGS byla nalezena de novo heterozygotní SNV (G>A) v kódující oblasti genu TUBB3 (16q24.3, OMIM *602661), která se nachází v pozici chr16:900002087 (exon 4) a na úrovni proteinu vede k záměně p.E410K. Vyšetřením metodou Sangerova sekvenování byly uvedené závěry potvrzeny (obr. 31).

Obrázek 31: Verifikace sekvenční varianty v genu TUBB3 u probanda 621 a jeho rodičů metodou Sangerova sekvenování. U probanda 621 byla potvrzena de novo heterozygotní substituce (G>A) v kódující oblasti genu TUBB3 (červený rámeček).

4.4.1. Další nálezy sekvenčních variant s potenciálním klinickým významem 4.4.1.1. Sekvenční varianty nejasného významu Ve vyšetřovaném souboru dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými vadami byly identifikovány dva případy rodin s nálezem sekvenční varianty nejasného významu. Probandka 178 (*2015) byla diagnostikována s manifestací DID doprovázenou VVV CNS (ageneze vermis cerebelli), celkovým opožděním vývoje, výraznou faciální stigmatizací (ptóza očního víčka, rozštěp tvrdého a měkkého patra) a poruchou sluchu. Dle informací ze zdravotnické dokumentace probandka prodělala jeden epileptický záchvat. Její rodiče (matka *1985, otec *1983) jsou zdraví. U probandky byla vyšetřením karyotypu detekována de novo translokace 46,X,t(X;18)(p11.2;q21.1). Metodou array-CGH byla detekována mikrodelece oblasti 9q21.13 (468 kb) paternálního původu, klasifikována jako pravděpodobně benigní. Metodou cíleného NGS byla u probandky nalezena de novo heterozygotní sekvenční varianta v genu CACNA1H (NC_000016.9:g.1254397G>A, NM_021098.2:c.2390G>A, NP_066921.2:p.R797H). Gen CACNA1H (OMIM *607904) kóduje α-1H podjednotku komplexu vápníkového kanálu, jenž je lokalizován nejen na membráně neuronů, ale i na dalších typech buněk somatických tkání (srdeční svalovina, hladká svalovina, aj.). Patogenní sekvenční varianty byly popsány jako rizikový faktor u pacientů s idiopatickou generalizovanou epilepsí a epilepsií s dětskými absencemi. Uvedená varianta je publikována v databázi dbSNP pod identifikátorem rs200791167. Podle výstupů in silico predikčních programů je klasifikována jako patogenní, avšak o jejím klinickém významu nejsou dostupné žádné informace v literatuře ani v databázích. V databázi ClinVar je publikována AMK záměna p.Arg797Cys (číslo varianty - allele ID 529358), která je klasifikována jako varianta nejasného významu. Na základě webové platformy VarSome je proto klasifikována jako varianta nejasného významu, zejména z důvodu chybějící korelace s patologickým fenotypem probandky.

Proband 143 (*2005) byl diagnostikován se suspektním oculocerebrorenálním syndromem typu Lowe, spojeným s těžkou oční vadou (kongenitální katarakta, sekundární glaukom) a mnohočetnými metabolickými chorobami (hyperkalciurie, hyperaminoacidurie, hypercholesterolemie, proteinurie). Neurologicky vykazuje centrální hypotonický syndrom, na MRI mozku byla opakovaně pozorována atrofie bílé hmoty. Opožďuje se motoricky a logopedicky, z hlediska intelektuálních funkcí se pohybuje v pásmu dolní normy. Dále je u něj nápadná těžká somatická retardace (-5 směrodatných odchylek od normy), kostní věk je opožděn přibližně o 4 roky. Otec (*1955) a matka (*1976) jsou zdraví, v rodině nejsou známy

žádné klinicky významné skutečnosti, jež by mohly vysvětlit manifestaci daných patologií u probanda. Proband podstoupil odstranění očních čoček a byly mu implantovány umělé, nyní vidí a nosí brýle. Má normální mužský karyotyp, vyšetřením metodou array-CGH nebyly nalezeny žádné abnormality chromosomů v rámci rozlišení metody. Metodou cíleného NGS byla detekována sekvenční varianta v genu GUCA1A (NC_000006.11:g.42141500C>T, NM_000409.3:c.149C>T, NP_000400.2:p.P50L), následným Sangerovým sekvenováním byl prokázán její paternální původ. Gen GUCA1A (OMIM *600364) kóduje aktivátor enzymu guanylát cykláza. Daný enzym vykazuje proměnlivou aktivitu na základě koncentrace iontů Ca2+, uplatňuje se v obnově fotoreceptorů sítnice po jejím ozáření. Patogenní sekvenční varianty genu jsou spojeny s AD dystrofií čípků sítnice typu 3 (cone dystrophy 3) a dystrofií tyčinek a čípků sítnice typu 14 (cone-rod dystrophy 14). V případě varianty p.Pro50Leu byla pozorována variabilní expresivita fenotypu, od mírné fotofobie až po celkovou dystrofii tyčinek a čípků (Downes et al., 2001). V databázi dsSNP je daná varianta publikována pod identifikátorem rs104893968 jako patogenní, databáze ClinVar ji poté klasifikuje jako variantu nejasného významu. Podle webové platformy VarSome ji lze klasifikovat jako variantu nejasného významu. Dosud nebyla publikována její korelace s fenotypem kongenitální katarakty či glaukomu, v evropské populaci byla detekována v četnosti větší než 0,1 % (databáze ExAc).

4.4.1.2. Identifikace patogenních variant v heterozygotním stavu spojených s AR onemocněními pomocí „trio-based“ NGS Vedle identifikace patogenních sekvenčních variant u dětí s DID, PAS a asociovanými VVV poskytují NGS „trio-based“ analýzy rodin informace o sekvenční variabilitě v testovaných genech u jejich rodičů a současně o přítomnosti patogenních sekvenčních variant v heterozygotním stavu v genech významných v patogenezi AR onemocnění. Kromě výše uvedených případů rodin probandky 282 (gen TSEN54), probanda 414 (gen SLC6A19) a probandů 14 a 14_B1 (gen BTD) byly identifikovány patogenní sekvenční varianty v heterozygotním stavu u obou rodičů v další vyšetřované rodině. Rodina probandky 162 a jejího bratra 162_B byla vyšetřena na základě manifestace závažných klinických projevů těžké DID a mnohočetných VVV u probandky (*2014) a vrozené vady CNS a dalších mnohočetných VVV u jejího bratra 162_B (*2017). V rodině se vyskytují mnohočetné příbuzenské svazky, rodiče probandů jsou vzájemně příbuzní, rodiče matky jsou rovněž vzájemně příbuzní. Obě děti mají normální karyotyp. V roce 2015 bylo u probandky indikováno vyšetření array-CGH s využitím CGH+SNP mikročipů za účelem identifikace oblastí CNVs či cnnLOH důvodu konsanguinity rodičů. Bylo detekováno 17 100 oblastí cnnLOH > 5 Mb a v nich se nachází více než 250 klinicky významných genů. Metodou cíleného NGS byla identifikována patogenní sekvenční varianta v genu PAH (NC_000012.11:g.103246681G>A, NM_000277.1:c.754C>T, NP_000268.1:p.R252W) v heterozygotním stavu u probanda 162_B, matky a otce. Gen PAH (OMIM *612349) kódující enzym fenylalaninhydroxylázu se nachází v oblasti 12q23.2, mimo oblasti rozsáhlých cnnLOH dle výsledků SNP analýzy. Patogenní sekvenční varianty jsou spojeny s manifestací klinických projevů AR onemocnění fenylketonurie (OMIM #261600). Vzhledem k přítomnosti dané varianty v heterozygotním stavu u obou rodičů je riziko výskytu dané varianty v homozygotním stavu 25 % pro každého potomka.

101

5. Diskuze Zavedení metody array-CGH využívající oligonukleotidové DNA mikročipy představovalo zásadní průlom v identifikaci submikroskopických chromosomových přestaveb, které hrají klíčovou ulohu v patogenezi idiopatické DID, PAS a asociovaných VVV. Diagnostický přínos array-CGH je dokumentován výrazným zvýšením počtu případů s objasněnou molekulární podstatou uvedených patologií. Na základě uvedených skutečností byl celogenomový screening submikroskopických CNVs doporučen jako test první volby pro pacienty s DID, PAS a asociovanými VVV (Miller et al, 2010). Významný výzkumný a současně diagnostický potenciál metody spočívá v identifikaci unikátních, zpravidla non- rekurentních CNVs a na to navazující nalezení korelace genotypu a fenotypu u jedinců s danými CNVs.

Do naší studie bylo vybráno 724 dětí s DID, PAS a asociovanými VVV, které byly v průběhu 8 let vyšetřeny metodou olionukleotidové array-CGH na OLG FN Brno. Srovnáním s průměrným věkem rodičů pro JmK za jednotlivé roky věk rodičů z našeho souboru zřejmě nepředstavuje vyšší riziko narození dítěte s DID, PAS a VVV, nicméně vzhledem k nedostupnosti populačních dat (mediány věku rodičů z JmK pro jednotlivé roky) toto tvrzení nebylo statisticky prokázáno. Z dostupných údajů lze pozorovat všeobecný trend nárůstu průměrného věku rodičů v době narození dítěte v rámci obou srovnávaných skupin.

Vyšetřením metodou array-CGH byly detekovány nepolymorfní CNVs > 200 kb a cnnLOH > 5 Mb v 30 % případů (217/724). Nálezy v uvedených případech byly dále klasifikovány dle doporučení navržených ve studii Buysse et al. (2009), jež jsou rovněž uplatněna v „European guidelines for constitutional cytogenomic analysis“ (Silva et al., 2019). Daná klasifikační kritéria určila 17,3 % nálezů CNVs a cytogeneticky detekovatelných chromosomových aberací jako patogenní či pravděpodobně patogenní, což odpovídá obecným závěrům získaných v rámci rozsáhlých studií založených na analýze rozsáhlých kohort dětských pacientů s podobnými klinickými charakteristikami, které byly zohledněny v naší skupině pacientů (Miller et al., 2010; Carreira et al., 2015; Nowakowska, 2017).

V rámci diagnostického algoritmu vyšetřování dětských pacientů na OLG FN Brno cytogenetické vyšetření karyotypu předchází metodě array-CGH. Tímto způsobem jsou pro vyšetření array-CGH indikovány případy dětí s normálním karyotypem, rovněž děti s nálezem cytogeneticky balancované chromosomové přestavby a manifestací patologického fenotypu a dětí s abnormálním karyotypem nesoucím nebalancované přestavby chromosomů.

102

V posledním uvedeném případě metoda array-CGH slouží jako konfirmační metoda, pomocí níž je upřesněna velikost a lokalizace daných chromosomových přestaveb, což posléze umožňuje určení jednotlivých zasažených genů pro stanovení korelace genotypu s fenotypem. Do souboru našich pacientů bylo zařazeno 43 dětí s cytogenetickým nálezem abnormální konstituce gonosomů či nebalancovaných chromosomových přestaveb v karyotypu, tj. 5,9 %, přičemž vyšetření metodou array-CGH všechny nálezy potvrdilo a specifikovalo. Dle většiny studií je vyšetření metodou array-CGH uplatňováno v rutinním diagnostickém algoritmu zpravidla jen u dětí s normálním karyotypem, nicméně v rámci několika studií (Park et al., 2013; Carreira et al., 2015) bylo vyšetření metodou array-CGH realizováno rovněž u jedinců s abnormálním karyotypem s podobnými indikacemi jako u našich pacientů – potvrzení a upřesnění lokalizace nálezu delece či duplikace genetického materiálu, analýza míst zlomu za účelem detekce CNVs u zdánlivě balancovaných translokací či inverzí, přítomnost aneuploidie gonosomů spojená se závažnými atypickými fenotypovými projevy a přítomnost derivovaného chromosomu. V studii Carreira et al., 2015 byl tímto vyšetřením potvrzen a upřesněn cytogenetický nález u všech 14 jedinců s abnormálním karyotypem (4,3 %, 14/325), kteří byly do dané studie zařazeni. Přestože je rozlišení cytogenetického vyšetření karyotypu udáváno obecně 5-10 Mb, mohou i rozsáhlejší chromosomové aberace uniknout detekci, zejména v oblastech chromosomů bez výrazných pruhů či v případech kompaktnější struktury chromatinu (Di Gregorio et al., 2014). Bližší charakterizace rozsáhlých chromosomálních přestaveb metodou array-CGH je hojně využívána zejména v prenatální diagnostice a diagnostice příčin abortů (Menten et al., 2009; Wapner et al., 2012; Evangelidou et al., 2013; Dhillon et al., 2014). V případech neúspěšné kultivace biologického materiálu pro cytogenetické vyšetření karyotypu je potom metoda array-CGH jednoznačnou volbou pro celogenomový screening nebalancovaných chromosomových přestaveb s výjimkou změn ploidie a nízkého stupně mozaicismu (Gao et al., 2012).

Ve skupině dětí s normálním karyotypem či karyotypem nesoucím balancovanou chromosomovou přestavbu byly nalezeny submikroskopické patogenní či pravděpodobně patogenní CNVs ve 12,3 % případů, jež byly dále klasifikovány do skupin rekurentních či non-rekurentních CNVs. Takto bylo identifikováno 45 rekurentních CNVs, 31 non- rekurentních CNVs, 8 případů s nálezy dvou klinicky významných CNVs, přičemž submikroskopické klinicky významné CNVs byly rovněž detekovány u dalších 2 pacientů s abnormální konsittucí gonosomů. Byla pozorována významně vyšší četnost de novo patogenních/pravděpodobně patogenních mikrodelecí (44,8 %) ve srovnání s četností de novo mikroduplikací (14,8 %). Tyto závěry korespondují se závěry o efektu genové dávky na 103 fenotyp jedince. Haploinsuficience genů obvykle bývá spojena s nepříznivým vlivem na fenotyp jedince, a je proto považována za hlavní příčinu onemocnění s dominantní dědičností (Huang et al., 2010). V rámci analýz genomu jedinců s vrozenými onemocnění dosud bylo identifikováno několik stovek lidských genů, u nichž se uplatňuje haploinsuficience jako patogenní mechanismus. Tyto geny hrají významnou roli ve vývojových procesech, kdy musí být přísně kontrolován počet jejich kopií a rovněž časoprostorově regulována exprese. Ve výše uvedené studii Huang et al. (2010) byla analyzována četnost de novo patogenních (mikro)delecí publikovaných v databázi DECIPHER a de novo mikrodelecí u kontrolních jedinců z celogenomových asociačních studí (genome-wide association study, GWAS). Pro více než 92 % patogenních delecí byla prokázána menší než 5% pravděpodobnost, že bude přítomna u náhodného jedince z kontrolní skupiny. Dané závěry byly podpořeny a doplněny rozsáhlou studií Lek et al. (2016). Bylo prokázáno, že pro většinu lidských genů platí mechanismus intolerance „missense“ sekvenčních variant a variant zkracujících délku vznikajícího proteinu (PTV, protein-truncation variants). Intolerance PTV, jejichž důsledkem je 50% deficit exprese daného genu, je spojena se selekčním tlakem. Menší změny genové exprese jsou obvykle spojeny s klinickou manifestací patologických fenotypů. Závěry o intoleraci PTV v lidském genomu lze tedy rovněž vztáhnout na vyšší pravděpdoobnost intolerance mikrodelecí, neboť v jejich důsledku je v genomu přítomna pouze jedna funkční alela daného genu. Patogenita některých mikroduplikací může být vysvětlena přítomností triplosenzitivních genů, avšak u většiny (mikro)duplikací jejich patogenita spočívá zejména v jejich velikosti a z toho plynoucího zásahu více genů (Cooper et al., 2011; Newman et al. 2015). V naší studii nebyl nalezen statisticky významný rozdíl mezi velikostí patogenních/pravděpodobně patogenních mikrodelecí a mikroduplikací (p > 0,5), avšak byla prokázána vyšší četnost patogenních/pravděpodobně patogenních mikrodelecí oproti mikroduplikacím bez ohledu na jejich původ. Fenotypovou variabilitu patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs s familiálním výskytem lze vysvětlit prostřednictvím mechanismů prezentovaných v přehledové publikaci Girirajan and Eichler (2010). Byla dosud nejlépe popsána na případech rekurentních mikrodelečních syndromů. Může být proto důsledkem recesivní patogenní sekvenční varianty na alele v hemizygotním stavu, přítomnosti klinicky významné sekvenční varianty v regulační oblasti genu zasaženém mikrodelecí, rozdílné velikosti dané CNV, genomovým imprintingem v oblasti mikrodelece či modelem dvou zásahů. Model „dvou zásahů“ je v těchto případech chápán jako model interakce dvou různých lokusů s výskytem rozsáhlých CNVs, klinicky významných sekvenčních variant a nelze také opomenout negenetické environmentální vlivy. Na základě

104 frekvence výskytu rekurentních CNVs ve vzorcích více než 48 000 jedinců s indikacemi k vyšetření metodou array-CGH a frekvence výskytu v kontrolních populacích (> 22 000 jedinců) Rosenfeld et al. (2013b) vypočítali míru penetrance vybraných rekurentních patogenních CNVs. Ve své analýze se soustředili na zejména CNVs spojené s rizikem manifestace různých patologií s nástupem v dětském věku. Uvedená studie nezohledňuje míru expresivity daných patologií zejména z důvodu širokého spektra fenotypových projevů. Naopak uvedené analýzy mohou být poměrně přesné pro definované specifické patologie. Kritéria klasifikace CNVs vycházející z analýzy genového obsahu se však s nárůstem poznatků o genetické heterogenitě DID stávají nedostatečnými pro objasnění jejich klinického významu. Hlubší pochopení fenotypových dopadů CNVs vyžaduje vývoj a využití nových přístupů pro analýzu genomu a interakce mezi jeho jednotlivými oblastmi. Nové přístupy analýz genomu studující trojrozměrnou architekturu buněčného jádra odhalily abnormality ve struktuře chromatinu vlivem CNVs a jejich vliv na lokální a celkovou strukturu chromatinu. Specifita časoprostorové organizace chromatinu je spojena s distribucí regulačních oblastí se specifickými epigenetickými modifikacemi, s intrachromosomovými/interchomosomovými interakcemi mezi vzdálenými oblastmi a s udržováním chromatidových domén vyššího řádu (Zhang et al., 2018). Genom je organizován do topologicky asociovaných domén (TAD), uvnitř kterých se odehrávají interakce mezi promotory genů a jejich zesilovači (Spielmann et al., 2018). Jednotlivé TADs jsou od sebe odděleny prostřednictvím tzv. „boundaries“, čímž je udržován směr interakcí a je zabráněno ektopickým interakcím mezi jednotlivými TADs. Struktura a pozice většiny TADs vykazuje uniformitu a konzervovanost napříč různými buněčnými typy a během vývoje. CNVs zasahující TADs proto mohou interferovat s pozicemi či počtem regulačních oblastí a tím ovlivňovat expresi genů uvnitř CNVs či mimo ně. Vlivem mikrodelecí (fúze TADs) mohou vznikat ektopické interakce mezi oblastmi, jež jsou standardně strukturně a funkčně odděleny. Podobný efekt byl pozorován i v případech mikroduplikací, kdy může vznikat nová TAD nesoucí nové regulační sekvence. Tyto nové studie rovněž prokázaly patogenitu inverzí (otočení TADs) a translokací skrze ektopickou interakci vzájemně funkčně nesouvisejících oblastí genomu. Přítomnost inverzí a translokací může být rovněž příčinou disrupce kódujících sekvencí a tvorby fúzních transkriptů, avšak nelze opomenout ani výše uvedené narušení nekódujících oblastí genomu s regulačními funkcemi. Specifická architektura lidského genomu s výskytem LCR je vysvětlením pro výskyt reciprokých CNVs, tj. mikrodelecí a mikroduplikací ve stejném lokusu. V naší studii byly reciproké CNVs identifikovány v oblastech 1q21.1-q21.2 (distálně lokalizované CNVs),

105

15q11.2-q13.1, 16p11.2 (proximálně lokalizované CNVs), 17q11.2, 17q12, 22q11.21. U daných skupin reciprokých CNVs byla pozorována fenotypová variablita patologií vlivem neúplné penetrance a variabilní expresivity. Blíže budou diskutovány vybrané skupiny rekurentních, resp. reciprokých CNVs s vyšší četností (3 a více pacientů) v našem souboru. Studovaný soubor pacientů obsahuje 5 pacientů s mikrodelecí oblasti 15q11.2 (395- 875 kb), ve 4 případech byl prokázán její familiální výskyt, přičemž ve všech případech byla zděděna od rodiče s normálním fenotypem. Mikrodelece oblasti 15q11.2 je lokalizovaná mezi rekurentními místy zlomu BP1-BP2 a bývá označována jako Burnside-Butlerův syndrom či Burnside-Butlerův rizikový lokus („susceptibility locus“) (Butler, 2017). Byla pro ni vypočtena velmi nízká penetrance 10,4 % (Rosenfeld et al., 2013b). Stanovení korelace genotypu s fenotypem jedince je v uvedených případech navíc ztíženo parentálně-specifickým původem CNV (Davis et al., 2019). U jedinců s mikrodelecí oblasti 15q11.2 maternálního původu byly pozorovány asociace s makrocefalií, PAS a epilepsií, zatímco u jedinců nesoucí uvedenou CNV paternálního původu byla pozorována vyšší četnost vrozených srdečních vad (VSV) a abnormalit svalového aparátu. U všech našich pacientů s mikrodelecí 15q11.2 se manifestují DID, PAS, opoždění vývoje či faciální stigmatizace s různou mírou expresivity, avšak vzhledem k malému počtu jedinců s touto CNV v našem souboru nelze uplatnit výše uvedené obecné závěry. Dle dřívějších studií geny v oblasti mikrodelece 15q11.2 (NIPA1, NIPA2, TUBGCP5, CYFIP1) leží v oblasti chromosomu 15 nepodléhající genomovému imprintingu, avšak nové studie identifikovaly lokus poblíž genu TUBGCP5 podléhající metylaci (Joshi et al., 2016). Studie na myších modelech prokázaly nerovnoměrnou míru exprese genu CYFIP1 v kůře mozku závislosti na parentálním původu (Chung et al., 2015). Vlivy genomového imprintingu a parentálně-specifické genové exprese by mohly obecně vysvětlit rozdílné fenotypové projevy dané CNV v závislosti na parentálním původu.

V kontrastu s nízkou mírou penetrance mikrodelece 15q11.2 byla pozorována více než 46% penetrance proximální mikrodelece oblasti 16p11.2 (Rosenfeld et al., 2013b). Byla detekována u 3 dětí v našem souboru, ve dvou případech byl prokázán původ de novo a v jednom případě vyšetření rodičů nebylo realizováno. U všech dětí bylo pozorováno opoždění vývoje a faciální stigmatizace a u dvou dětí PAS. Kromě těchto patologií se rovněž u jednotlivců manifestovaly DID (proband 211) a VSV a porucha sluchu (proband 361). Manifestace PAS a dalších neurovývojových poruch u našich pacientů koreluje s manifestací patologií pozorovaných v rámci mnoha studií (Shinawi et al., 2010; Sahoo et al. 2011). V oblasti mikrodelece 16p11.2 bylo identifikováno 22 genů, z toho 5 OMIM genů s klinickým významem (KIF22, PRRT2, ALDOA, TBX6, CORO1A). Dle výsledků in silico 106 analýzy studující vztahy a interakce se dané genové produkty účastní mezibuněčných interakcí a signalizací. U tří genů v oblasti 16p11.2 (ALDOA, MAPK3, DOC2A) byl prokázán význam v patogenezi PAS (Geschwind and Levitt, 2007; Kumar et al., 2008). Rovněž na případu probanda 361 lze pozorovat variabilní expresivitu, neboť u jeho monozygotického dvojčete se stejnou CNV pozorujeme méně závažnou manifestaci patologií, zejména v oblasti psychomotoriky a somatické retardace. Podobná diskordance fenotypu u monozygotických (MZ) dvojčat byla pozorována v případech mikrodelece 22q11.21 (Goodship et al., 1995; Yamagishi et al., 1998). Diskordance fenotypu u MZ dvojčat může být důsledkem environmentálních faktorů ovlivňujících genovou expresi či postzygotických změn na úrovni sekvence DNA.

Mikrodelece 22q11.21 je popsána jako kauzální genetická příčina fenotypových projevů DiGeorgova syndromu (DGS) (OMIM #188400), někdy také uváděného jako velokardiofaciální syndrom (VCFS) (OMIM #192430). Vyznačuje se vysokou mírou penetrance, avšak významnou variabilitou fenotypových projevů. Míra penetrance a expresivity mikrodelece 22q11.21 je odrazem působení environmentálních faktorů, přítomností „druhého zásahu“ v genomu daného jedince, exprese hemizygotních genetických variant v oblasti mikrodelece 22q11.21 a také velikostí a přesnou lokalizací dané CNV (Michaelovsky et al., 2019). V přehledové práci Burnside (2015) jsou prezentovány různé typy mikrodelece oblasti 22q11.21 v závislosti na lokalizaci LCR. Jedinci nesoucí proximální mikrodeleci 22q11.21 menšího rozsahu (oblast LCR A-B) vykazují častěji mírnější fenotyp a uvedená mikrodelece se častěji vyskytuje familiálně. U jedinců s větší proximální mikrodelecí (oblast LCR A-D) byly pozorovány závažnější fenotypové projevy a častěji byly tyto CNVs detekovány de novo, což může souviset s hypotézou nižší plodnosti u mužů nesoucí tuto rozsáhlejší mikrodeleci (Costain et al., 2011).

Náš soubor 8 dětí s rekurentní mikrodelecí 22q11.21 doplňuje výsledky studií řešených v diplomové práci Mgr. et Mgr. Dity Kadlčíkové (Vystavělová, 2016) a prezentovaných Bc. Karolínou Smolkovou (Smolková, 2018). Celkem bylo mezi lety 1999- 2018 na OLG FN Brno metodou array-CGH vyšetřeno 42 pacientů s mikrodelecí oblasti 22q11.21, kdy u 12 % (5/42) pacientů byla detekována proximální mikrodelece (velikost 1,32-1,39 Mb) mezi LCR A-B a u 83 % (35/42) pacientů poté proximální mikrodelece (velikost 2,40-2,85 Mb) mezi LCR A-D. Vzácné případy distální mikrodelece mezi LCR C-E (velikost 1,44 Mb) a mezi LCR D-E (velikost 1,43 Mb) byly každá detekovány u 1 pacienta.

107

Ve skupině jedinců s proximální mikrodelecí mezi LCR A-B byla diagnostikována VSV pouze u 1 pacientky (20 %, 1/5), u níž se rovněž manifestovaly další patologie typické pro DGS výrazněji než u zbylých jedinců v dané skupině. Celkově tedy v této skupině byly pozorovány mírnější projevy patologií typických pro DGS. Největší variabilita fenotypových projevů byla pozorována mezi jedinci s mikrodelecí oblasti A-D. U 2 pacientů s distálními mikrodelecemi (LCR C-E, LCR D-E) byly pozorovány obdobné fenotypové projevy jako u jedinců s proximální mikrodelecí mezi LCR A-D. Nelze tedy jednoznačně korelovat velikost ani lokalizaci mikrodelece 22q11.21 se závažností fenotypových projevů, což je rovněž zmíněno i v uvedené přehledové práci Burnside (2015). Recentní studie Bertini et al. (2017) uvažuje vliv delece genu DGCR8 v oblasti 22q11.21 na biogenezi miRNAs a tím rovněž na genovou expresi, což se následně může projevit významnou fenotypovou variabilitou jedinců s DGS/VCFS.

Na vybraných příkladech jedinců s rekurentními mikroduplikačními syndromy lze demonstrovat mnohem nižší úroveň penetrance, než je pozorována u jedinců s reciprokými mikrodelecemi. V našem souboru pacientů byly identifikovány dva případy familiální rekurentní mikroduplikace 22q11.21 v oblasti LCR A-D (2,82 Mb maternálního původu a 2,91 Mb paternálního původu) a jeden případ de novo mikroduplikace 22q11.21 v oblasti LCR B-D (1,05 Mb). U všech dětí byla pozorována DID, vývojové opoždění a faciální stigmatizace. Na rozdíl od dětí s reciprokou mikrodelecí nebyla odhalena VSV ani diagnostikována PAS. Dle studie Rosenfeld et al. (2013b) se mikroduplikace oblasti 22q11.21 vyznačuje nízkou penetrancí kolem 22 %, což by mohlo vysvětlit familiální původ ve dvou našich případech. Nízkou penetranci a fenotypovou variabilitu, jež se odráží v časté familiální segregaci, dokládají rovněž další studie (Wentzel et al., 2008; Wincent et al., 2010; Sahoo et al., 2011).

Vyšší penetrance pro DID, PAS a VVV v rámci rekurentních mikroduplikací byla vypočítána pro mikroduplikace oblasti 15q11.2-q13.1 maternálního původu přibližně na 50 % (Isles et al., 2016), kdežto u jedinců s mikroduplikací oblasti 15q11.2-q13.1 paternálního původu dojde k manifestaci uvedených patologií jen přibližně v 21 %. U jedinců nesoucí mikroduplikaci maternálního původu bylo rovněž pozorováno vyšší zastoupení jedinců se schizofrenií (přibližně 12 %). V tomto lokusu se pravděpodobně uplatňuje vliv genomového imprintingu odrážející se v parentálně specifické expresi genů v dané oblasti. Nižší míru patogenity paternální mikroduplikace lze objasnit vyšším selekčním tlakem a nižší plodností mužů s danou mikroduplikací. Podobný jev popisující nižší plodnost nositelů patogenní CNV

108 byl rovněž zaznamenán u případů mužů nesoucí mikrodelece oblasti 22q11.21 (Costain et al., 2011). Přesto jsou mikroduplikace 15q11.2-q13.1 paternálního původu stále udržovány v populaci právě kvůli své nízké penetranci pro DID a PAS a kvůli odehrávajícím se epigenetickým změnám parentálního původu při přenosu do dalších generací. V našem souboru pacientů byly zaznamenány 3 případy mikroduplikace oblasti 15q11.2-q13.1 (maternální, paternální, neurčený původ), jak je blíže prezentováno na vybraných kazuistikách. V případě rodiny probandky 154 se DID a PAS manifestují pouze u ní a jejího bratra, u dalších členů rodiny nesoucí danou CNV nebyly pozorovány žádné významné patologie. V této rodině se tedy zřejmě projevily výše uvedené předpoklady o vyšší patogenitě mikroduplikace 15q11.2-q13.1 maternálního původu. Naopak v rodině probanda 411 se patologie ve formě PAS a poruch chování manifestují u probanda a jeho bratra, u sestry se manifestují spíše psychiatrické poruchy. Lehkou DID je postižen rovněž jejich otec. V rodině tedy pozorujeme manifestaci různých patologií u všech nositelů mikroduplikace 15q11.2- q13.1. Na uvedených příkladech rodin lze pozorovat předpokládaný vliv genomového imprintingu, stejně tak i neúplnou penetranci a variabilní expresivitu patologických fenotypových projevů. Nálezy rekurentních klinicky významných CNVs s nízkou mírou penetrance obecně představují komplikace v rámci genetického poradenství z hlediska stanovení prognózy pro daného jedince a další členy rodiny.

Diagnostický a zejména výzkumný potenciál metody array-CGH tkví kromě identifikace rekurentních CNVs zejména v detekci vzácných non-rekurentních CNVs. Místa zlomů v těchto případech obvykle nekopírují architekturu genomu z hlediska lokalizace LCRs. Proto v případech nepříbuzných jedinců s nálezy překrývajících se lokusů nesoucí CNV nelze očekávat identická místa zlomů.

V analyzovaném souboru pacientů bylo identifikováno 24 non-rekurentních patogenních či pravděpodobně patogenních mikrodelecí a 7 non-rekurentních mikroduplikací (viz Tab. 7). Tyto CNVs byly studovány z hlediska svého genového obsahu za účelem identifikace kauzálních či kandidátních genů, jejichž odchylky od standardního počtu kopií by mohly vysvětlit fenotyp daného jedince. Stejně jako u rekurentních CNVs nelze opomenout vlivy neúplné penetrance a variability fenotypového projevu patologií. V případě identifikace non-rekurentních CNVs s parciálním překryvem s oblastmi známých patogenních CNVs lze jejich klinický význam posoudit rovněž na základě analýzy oblasti překryvu. Této skutečnosti bylo využito například v případě mikrodelece oblasti 6q15-q16.1 (2,14 Mb) u probanda 490. Jedná se o chlapce (*2012) s PAS a vývojovým opožděním. Vyšetření rodičů nebylo

109 realizováno z důvodu umístění chlapce do pěstounské péče a ztráty kontaktu s biologickými rodiči. Oblast mikrodelece 6q15-q16.1 obsahuje OMIM gen EPHA7 (OMIM *602190). Traylor et al. (2009) popsali případ chlapce s de novo mikrodelecí oblasti 6q16.1 (2,16 Mb), jež zasahuje gen EPHA7. Manifestují se u něj mírná celková hypotonie, mikrocefalie, opoždění psychomotoriky a malá postava. Byla u něj pozorována faciální stigmatizace (mírná ptóza víček, preaurikální výrůstky, abnormality ušních boltců). Vyšetření zobrazovací metodou magnetické resonance (magnetic resonance imaging, MRI) odhalilo mírné strukturní abnormality CNS. Gen EPHA7 kóduje protein podrodiny ephrinových receptorů z rodiny protein-tyrosinových kináz. Účastní se vývojových procesů zahrnující signalizace v apoptických kaskádách. Depaepe et al. (2005) prokázali význam této signalizace při vývoji CNS, kdy se podílí na regulaci počtu neurálních progenitorů v procesech změn velikosti a tvaru mozku.

Pro případy interpretace klinického významu non-rekurentních mikroduplikací lze předpokládat obecnou nižší míru jejich penetrance než u mikrodelecí, zejména z důvodu obecně vyšší tolerance nadbytečných kopií genetického materiálu a jejich menší klinické závažnosti. V souboru pacientů nesoucí patogenní či pravděpodobně patogenní CNV bylo identifikováno 7 pacientů s non-rekurentními mikroduplikacemi oproti 24 pacientům s non- rekurentními mikrodelecemi, tedy přibližně 3krát méně. Současně byl dosud prokázán familiální přenos non-rekurentní mikroduplikace v 43 % případů (3/7), oproti 21 % případům (5/24) non-rekurentní mikrodelece s familiálním výskytem. Objasnění patogenity familiálních non-rekurentních mikroduplikací u jedinců s manifestací patologií může spočívat v identifikaci druhého zásahu, jehož přítomnost zvýší míru manifestace patologického fenotypu. V případech de novo non-rekurentních mikroduplikací lze v daných CNV identifikovat gen, pro nějž je triplosenzitivita kauzálním patogenním mechanismem. Tato situace byla popsána u případu probandky 723. Haploinsuficience genu NSD1 byla popsána jako příčina manifestace patologií u jedinců s rekurentním mikrodelečním Sotosovým syndromem (OMIM #117550, oblast 5q35.3), nicméně další práce dokumentují rovněž triplosenzitivitu toho genu (Zhang et al., 2011; Rosenfeld et al., 2013a; Sachwitz et al., 2017).

Interpretace vzácných non-rekurentních CNVs by tedy dle doporučení shrnutých v práci Nowakowské (2017) měly reflektovat kvantitu genového obsahu, jeho relevanci k fenotypu jedince a citlivost ke změně počtu kopií jednotlivých genů. V případě identifikace genů s klinickým významem je nutné zvažovat patogenní mechanismus vedoucí k manifestaci patologií. Parciální delece genů mohou odkrýt patogenní sekvenční variantu na druhé alele,

110 zatímco změna kódující sekvence genů či její disrupce může být důsledkem parciální duplikace genů.

V našem souboru pacientů bylo rovněž identifikováno celkem 10 pacientů s nálezy dvou rozsáhlých CNVs klinickým významem či nálezem abnormální konstituce gonosomů a patogenní CNV. V těchto případech tedy byly metodou array-CGH detekovány oba zásahy, jež jsou dle modelu „dvou zásahů“ nezbytné pro manifestaci patologií. Role zásahů dvou klinicky významných CNVs bude následně popsána ve dvou vybraných případech.

V případě probandky 604 byly obě klinicky významné CNVs (mikrodelece oblastí 10p15.1-p15.3 a 15q13.2-q13.3) původu de novo. Jejich jednotlivý příspěvek na fenotyp probandky lze odvodit analýzou případů jedinců nesoucí jednotlivé CNVs. Mikrodelece oblasti 15q13.2-13.3 (1,5 Mb, zahrnující geny CHRNA7 a OTUD7A) se vyznačuje fenotypovou variabilitou projevů a častou familiální segregací. Penetrance dané CNV je proto velmi variabilní, od přibližně 2,5 % pro výskyt VSV až po přibližně 80% penetranci pro neurovývojová postižení a neuropsychiatrická onemocnění (Gillentine and Schaaf, 2015; Lowther et al., 2015). Interpretace kauzality mikrodelece oblasti 10p15.1-p15.3 (6,13 Mb) se omezuje zejména na analýzu izolovaných oblastí rekurentní mikrodelece 10p15.3 a mikrodelece oblasti 10p15.1 (DeScipio et al., 2012; Eggert et al., 2016). Mikrodelece oblasti 10p15.3 je spojena s projevy DID, vadami řeči a poruchami chování, faciální stigmatizací a vzácněji i se srdeční vadou, mikrodelece oblasti 10p15.1 potom zejména s DID a vadami řeči (Lindstrand et al., 2010). V oblasti 10p15.3 se nachází geny ZMYND11 a DIP2C, jejichž haploinsuficience byla potvrzena jako patogenní mechanismus v popsaných patologiích. V našem souboru pacientů se nachází probandka 500 s de novo mikrodelecí oblasti 10p15.1- p15.3 (6,10 Mb) a podobnými fenotypovými projevy, které byly pozorovány u probandky 604 (faciální stigmatizace a VSV), u probandky 604 navíc bylo zaznamenáno opoždění vývoje.

Kauzalitu současného výskytu rozsáhlé familiální CNV a de novo patogenní CNV lze demonstrovat na případu pacientky 451, u níž byla detekována mikroduplikace oblasti 11p14.3-p15.1 (6,67 Mb) maternálního původu a de novo mikrodelece oblasti 10q26.2-q26.3 (6,23 Mb). Mikrodelece oblasti 10q26.2-q26.3 byla popsána jako „10q26 deleční syndrom“ (OMIM #609625), spojený s DID, vývojovým opožděním a významnou faciální stigmatizací. Všechny tyto patologie pozorujeme i u probandky 451. U jedinců s 10q26 delečním syndromem byla zaznamenána široká škála míry manifestace uvedených patologií (Lin et al., 2016). Mikroduplikace oblasti 11p14.3-p15.1 maternálního původu byla popsána v práci Wyandt et al. (2006) jako patogenní u probanda s anamnézou intrauterinní růstové retardace a 111 neprospíváním v kojeneckém období, následně se manifestující jako závažná DID, hypotonie a faciální stigmatizace. Na rozdíl od matky probandky 451 matka popisovaného jedince trpěla mírnou DID. Tento případ je tedy modelem dvou zásahů rozsáhlé non-rekurentní mikroduplikace s neúplnou penetrancí a variabilní expresivitou a patogenní mikrodelece.

Z analýz velikostních charakteristik CNVs byly prokázány statisticky významné rozdíly mezi velikostmi jednotlivých CNVs mezi hodnocenými klasifikačními kategoriemi, přičemž největší rozdíl byl logicky pozorován mezi skupinami patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs a pravděpodobně benigními CNVs. Dále bylo zaznamenáno významně vyšší zastoupení CNVs > 1 Mb v kategorii patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs oproti dalším dvěma kategoriím. Naopak ve skupině pravděpodobně benigních CNVs a CNVs nejasného významu se vyskytují převážně CNVs < 1 Mb s menším genovým obsahem, resp. s geny s klinickým významem. Tyto závěry jsou v souladu se závěry prezentovanými v přehledové práci Rice and McLysaght (2017). Geny v klinicky významných CNVs vykazují citlivost na změny počtu svých kopií, a proto jsou tyto CNVs obvykle spojeny s manifestací klinicky závažných fenotypových projevů, jež negativně ovlivňují celkovou kvalitu života svých nositelů včetně reprodukční schopnosti (Kirov et al., 2014). S rostoucí velikostí CNV lze očekávat vyšší pravděpodobnost výskytu klinicky významného genu a následný fenotypový projev v důsledku abnormálního počtu kopií. Negativní selekci často unikají CNVs s nízkou penetrancí a variabilní expresivitou, jak lze rovněž demonstrovat na případech jedinců se zděděnými CNVs s klinickým významem. Odlišné genetické pozadí mezi jedinci s danými CNVs může být příčinou variability klinické manifestace Rovněž nelze opomenout epigenetické vlivy, jež mohou měnit míru genové exprese, či interakce environmentálních a idiopatických sporadických efektů ve funkci modulátorů (Capalbo et al., 2017).

Přehledy nálezů patogenních CNVs a uvedené příklady demonstrují a podtrhují významnou genetickou heterogenitu neurovývojových onemocnění, jež se odráží ve fenotypu jedinců s manifestací daných patologií. V případech nálezů VOUS, pravděpodobně benigních variant a u jedinců s bez nálezu CNVs se jako další krok v diagnostickém algoritmu nabízí přístupy analýzy genomu metodami sekvenování „nové generace“ (NGS). Zejména přístupy WES a WGS se mohou rovněž významně podílet na identifikaci „druhého zásahu“, jež podmiňuje či potencuje manifestaci patologického fenotypu, kdy prvním „zásahem“ je CNV nejasného významu či patogenní/pravděpodobně patogenní CNV s nízkou penetrancí.

Přístupy komplexní analýzy genomu pomocí technologií NGS znamenaly revoluci v molekulární diagnostice onemocnění s významnou genetickou heterogenitou, mezi něž patří 112 i široké spektrum neurovývojových onemocnění (Harripaul et al., 2017). Současné trendy v molekulární diagnostice DID, PAS a asociovaných VVV preferují spíše komplexní přístupy WES a WGS, přesto však i cílené NGS využívající komerční panely genů či „custom“ panely genů stále nachází uplatnění jako jejich alternativa (Grozeva et al., 2015; Martínez et al., 2017; Di Resta et al., 2018; Han et al., 2018).

V průběhu čtyřletého projektu bylo metodou cíleného NGS pomocí komerčního panelu genů ClearSeq Inherited Disease (Agilent Technologies) vyšetřeno celkem 35 dětí s DID, PAS a asociovanými VVV. Komerční panel genů byl vybrán na základě srovnání obsažených genů s jinými komerčně nabízenými panely obsahující geny spojené s DID, PAS, dalšími neurovývojovými poruchami a asociovanými VVV (TruSight Inherited Disease Sequencing Panel, Illumina Inc., San Diego, CA, USA), respektive s panely genů využívanými pro studie či rutinní klinické analýzy, publikovanými v relevantní literatuře (Najmabadi et al., 2011; Athanasakis et al., 2014; Brett et al., 2014; Redin et al., 2014; Grozeva et al., 2015; Lim et al., 2015; Sun et al., 2015; Vrijenhoek et al., 2015; Lelieveld et al., 2016). Srovnávací analýzou bylo zjištěno, že v námi použitém panelu jsou souborně obsaženy bezmála všechny geny přítomné v jednotlivých panelech, resp. ve studiích. Celkový souhrnný překryv činí více než 40 %. Z toho lze odvodit, že přibližně nejméně 1200 genů v použitém panelu vykazuje klinickou relevanci ke sledovaným neurovývojovým onemocněním vzhledem k jejich výskytu v panelech genů využívaných v rámci uvedených studií či rutinních analýzách. V rámci bioinformatického zpracování dat a následné analýzy včetně filtrování variant byly však analyzovány varianty ve všech obsažených genech.

Projekt byl rozdělen do dvou částí: 1) cílené NGS u souboru 16 dětí, 2) cílené NGS u souboru 14 rodin s 19 dětmi. Zařazení vyšetření rodičů představuje časově a interpretačně efektivnější analýzu variant, spočívající v identifikaci patogenních de novo variant, homozygotních variant či variant ve stavu složené heterozygotnosti, což bylo prokázáno prostřednictvím výstupů první rozsáhlé multicentrické „trio-based“ WES studie (Wright et al., 2015). V rámci této studie byla potvrzena diagnóza DID a asociovaných VVV na molekulární úrovni u 27 % vyšetřovaných jedinců (311/1133). Její součástí bylo rovněž srovnání „trio- based“ a „proband-only“ přístupu z hlediska filtrování a analýz sekvenčních variant včetně jejich interpretace, pomocí něhož prokázali výhodu „trio-based“ přístupu z hlediska automatické eliminace benigních variant parentálního původu. Z výstupů dále vyplynuly de novo varianty jako výrazně převažující varianty s klinickým významem, což dále podtrhuje efektivitu „trio-based“ sekvenačních analýz. V současnosti je proto základním přístupem

113 uplatňovaným ve výzkumných studiích i v molekulárně genetické diagnostice příčin DID, PAS a asociovaných VVV.

Srovnatelný diagnostický záchyt 25,7 % (9/35) byl výstupem sekvenačního projektu prezentovaného v druhé části této práce. Z hlediska diagnostického významu lze tedy metodou cíleného NGS dosáhnout podobného diagnostického záchytu (25% - Redin et al., 2014; 39 % - Martínez et al., 2017; 29 % - Han et al., 2018), jako bylo dosaženo v řadě projektů využívajících WES (Harripaul et al., 2017). Vzhledem k pokrytí kódujících oblastí všech genů lze však metodou WES obecně dosáhnout vyššího diagnostického záchytu až přes 50 % (Snoeijen-Schouwenaars et al., 2019).

V průběhu sekvenačního projektu byly detekovány de novo patogenní či pravědepodobně sekvenční varianty v genech MED13L, ASXL3, SCN2A, TUBB3. Dále byly rovněž detekovány varianty v genech spojených s patogenezí AR onemocnění, tedy TSEN54, SLC6A19, BTD, a taktéž v patogenezi XL-DID (gen IQSEC2).

De novo sekvenční varianty charakteru záměny AMK v kódovaném proteinu byly detekovány v genech TUBB3 (proband 621) a SCN2A (probandka 201, proband 233). Gen TUBB3 kóduje β-tubulin, který společně v heterodimeru s α-tubulinem vytváří polymerní strukturu mikrotubulů (Leandro-García et al., 2010), jeho abundantní exprese byla pozorována v tkáních neurálního původu, vzácněji pak v testes, placentě, tenkém a tlustém střevě (Person et al., 2017). Protein TUBB3 se uplatňuje v neurogenezi, tvorbě a navádění axonů. Patogenní sekvenční varianty v genech kódující tubulinové proteiny byly popsány v široké škále geneticky heterogenních poruch vývoje a funkcí CNS (Bahi-Buisson et al., 2014). Na rozdíl od variant v dalších tubulinových genech byla v případech patogenních variant v genu TUBB3 kromě sporadického výskytu de novo původu zaznamenána také familiální segregace. Manifestují se spektrem hetetogenních neurologických abnormalit. Fenotypové projevy rekurentní patogenní sekvenční varianty p.E410K v sobě kombinují DID, Kallmannův syndrom, vrozenou fibrózu okohybných svalů, slabost svalů obličeje, poruchy hlasového vyjadřování, později se přidává cyklické zvracení a progresivní periferní sensorimotorická neuropatie. Zobrazovací metody ukazují ztenčení corpus callosum a abnormality obličejových a okohybných svalů. Těmito charakteristickými abnormalitami byl definován „syndrom TUBB3 E410K“ (Chew et al., 2013). Substituce p.E410K přímo narušuje interakci mikrotubulů s kinesinem a zpomaluje axonální transport veziklů a mitochondrií v periferních neuronech, což vysvětluje pozorované patologie u jedinců s nálezem uvedené varianty (Niwa et al., 2013). 114

Gen SCN2A kóduje alfa-podjednotku sodíkového kanálu s abundantní expresí v mozku, kde hraje roli v iniciaci a vedení akčního potenciálu. V neuronech je jeho exprese lokalizována do iniciálních segmentů a Ranvierových zářezů v axonech myelinizovaných nervových vláken v průběhu raného vývoje (Boiko et al., 2001; Kaplan et al., 2001). V dospělém mozku se jeho exprese soustředí do iniciálních segmentů a axonů bez myelinizace. Protein SCN2A tvoří strukturu čtyř opakujících se domén, každá doména je potom složena z šesti membránových segmentů. Patogenní sekvenční varianty genu ovlivňují zejména období raného vývoje, nicméně jejich negativní efekt byl zaznamenán rovněž u neurologických onemocnění s pozdním nástupem (Wolff et al., 2017). Patogenní varianty jsou příčinou fenotypově heterogenních záchvatů a epileptických encefalopatií a neurovývojových onemocnění. Variabilita fenotypových projevů je pozorována i mezi jedinci nesoucími stejné patogenní varianty. Na základě genotypově-fenotypové korelace byly rozlišeny dvě základní skupiny variant. První skupina zahrnuje substituce charakteru „gain-of- function“ (GoF), kdy závažnost jejich vlivu na fenotyp koreluje s mírou závažnosti působení dané varianty na funkci sodíkového kanálu. U jedinců nesoucí tyto varianty nastupují fenotypové projevy několik měsíců po narození, avšak vykazují poměrně dobrou odpověď na antiepileptickou terapii. Ve druhé skupině jsou zařazeni jedinci s pozdějším nástupem epilepsie. Patogenní varianty mají charakter LoF (sestřihové a zkracující varianty nebo substituce), u jejich nositelů je pozorována horší odpověď na antiepileptickou terapii. Rovněž byla popsána minoritní skupina jedinců, u nichž se manifestují DID a PAS bez epilepsie. U těchto jedinců jsou detekovány zkracující LoF varianty. Efektivita antiepileptických léčiv, která fungují na principech blokátorů sodíkových kanálů, je ovlivněna konkrétním typem varianty měnící fungování sodíkových kanálů. Do výčtu variant, jež mohou být předmětem cílené antiepileptické terapie, patří i patogenní de novo varianta p.Met1545Val (Dilena et al., 2017), detekovaná u probandky 201. Pozice p.Met1545 se nachází v membránovém segmentu S1 ve čtvrté doméně proteinu, na základě komparativních analýz byla prokázána evoluční konzervovanost. Je spojena s projevy časné infantilní epileptické encefalopatie, na jejímž podkladě se manifestuje závažné opoždění vývoje, hypotonie a celkové neprospívaní (Dilena et al., 2017; Wolff et al., 2017; Bruun et al., 2018). Patogenní varianta p.A263V, detekovaná u probanda 233, je lokalizována v mutačním „hotspot“ v segmentu S5 v první doméně, má charakter GoF způsobující hyperexcitabilitu neuronů a je provázena velmi závažnou časnou infantilní epileptickou encefalopatií s širokým spektrem záchvatů (Liao et al., 2010; Baasch et al., 2014; Schwarz et al., 2019). Na jejich podkladě se manifestuje závažné opoždění psychomotorického vývoje.

115

Na rozdíl od varianty p.M1545V nevykazuje příliš dobrou odpověď na léčbu, v rámci své studie Schwarz et al. (2019) zaznamenali pozitivní odpověď na antiepileptickou terapii pouze u 1 ze 7 jedinců nesoucích tuto variantu. U jedinců s variantou p.A263V je proto velmi často pozorována progrese projevů neurodegenerace, jejich závažnost je opět velmi variabilní v závislosti na zvolené antiepileptické terapii.

De novo sekvenční deleční varianty spojené s posunem čtecího rámce (frameshift) byly detekovány v genech MED13L (proband 64) a ASXL3 (probandka 196). Deleční varianty narušující čtecí rámec spouští proces nonsense-mediated mRNA decay (NMD), jež vede k degradaci zkráceného transkriptu a tím je zabráněno produkci zkrácených aberantních proteinů (Isken and Maquat, 2007; Miller and Pearce, 2014). Byly však popsány mechanismy úniku NMD následně vedoucí k tvorbě zkrácených proteinů, které mohou působit toxicky skrze GoF nebo dominantně-negativní působení. NMD často unikají transkripty s PTC na 3‘ konci, resp. v posledním exonu (Holbrook et al., 2004; Bainbridge et al., 2013; Shashi et al., 2016). Procesy NMD se navíc vyznačují časoprostorovou závislostí a tkáňovou specifitou a na základě in vitro studií melze vyloučit ani odlišnosti v NMD uplatňující se na aberantní mRNA různých genů (Trcek et al., 2013; Shashi et al., 2016). Gen MED13L kóduje podjednotku velkého mediátorového komplexu, který interaguje s DNA-vazebnými transkripčními faktory a RNA polymerázou II, čímž se podílí na regulaci genové exprese (Utami et al., 2014). Vykazuje vysokou míru konzervovanosti napříč eukaryoty. Jeho nejvyšší exprese byla pozorována v cerebellu fetálního a dospělého mozku a v srdeční aortě (Muncke et al., 2003). Haploinsuficience genu MED13L byla popsána jako patogenní mechanismus vedoucí ke komplexním fenotypovým projevům syndromické DID, výrazné faciální stigmatizace (makroglosie, hypotonická otevřená ústa, kulatá špička nosu, zvětšené oční štěrbiny) a případným vrozeným defektům srdce (Asadollahi et al., 2013; van Haelst et al., 2015). V práci Asadollahi et al. (2013) byly publikovány první 3 případy dětí s rozsáhlými přestavbami genu MED13L, zahrnující delece jeho exonů či naopak triplikaci celého genu. V důsledku pozorované korelace genotypu s fenotypem byl charakterizován „MED13L (haploinsufficiency) syndrome“. V navazujících pracích byly popsány další intragenové přestavby vedoucí k posunu čtecího rámce (frameshift) či ztrátě části proteinové domény v důsledku delece exonů. U jedinců s patogenními variantami genu MED13L byla stejně jako v předchozích případech popsána významná alelická heterogenita, jež se posléze odráží i ve fenotypu. Patogenní varianty vedoucí k substitucím AMK byly asociovány s odlišnými fenotypovými projevy oproti projevům typickým pro „MED13L syndrome“.

116

Zahrnovaly zejména izolované AD srdeční vady nebo izolovanou AR DID (Muncke et al., 2003; Najmabadi et al., 2011).

Gen ASXL3 spolu s geny ASXL1 a ASXL2 kóduje proteiny s předpokládanou funkcí regulátorů transkripce (Katoh and Katoh, 2004). Jednotlivé domény proteinu ASXL3 se účastní procesů regulace genové exprese na různých úrovních: N-koncové domény ASXN a ASXH zprostředkovávají interakce s proteinovými komplexy, domény ASXM2 a PHD na C- konci rozeznávají posttranslační modifikace histonů v chromatinu. Proteiny rodiny ASX se vyznačují podobnou doménovou strukturou s vysokou mírou konzervovanosti (Katoh, 2013). Poruchy funkce proteinů ASX v základních buněčných procesech jsou proto spjaty s širokým spektrem vrozených i nádorových onemocnění. Gen ASXL3 je exprimován nejvíce v ovariích a dospělém a fetálním mozku a vzhledem ke své klíčové úloze v indiviuálním vývoji je citlivý ke sníženému počtu funkčních kopií. Bainbridge et al. (2013) definovali první soubor pacientů s nálezem patogenních variant v genu ASLX3 a na základě podobností v klinickém obraze byl definován Bainbridge-Ropers syndrom (BRS). Pacienti sdílejí podobné fenotypové charakteristiky zahrnující celkové vývojové opoždění, DID, mikrocefalii, absenci řeči, svalovou hypotonii s opožděním motorického vývoje a faciální stigmatizaci (Srivastava et al., 2016; Kuechler et al., 2017). V recentní literatuře bylo dosud popsáno kolem 40 pacientů s LoF variantami v genu ASXL3, manifestujícími se ve fenotypu BRS (Contreras-Capetillo and Abreu-González, 2019). V genu ASXL3 není definován žádný mutační „hotspot“, patogenní varianty byly identifikovány ve všech oblastech pro strukturní a funkční domény a jsou pacient-specifické (Kuechler et al., 2017). Rovněž nebyla prokázána korelace závažnosti fenotypových projevů s pozicí dané varianty (Balasubramanian et al., 2017). U jedinců s BRS byly detekovány frameshift varianty nebo nonsense varianty vedoucí k tvorbě PTC. Transkripty nesoucí PTC jsou předmětem výše popsaného procesu NMD, přičemž byly detekovány rovněž varianty na 3‘ konci genu unikající NMD (Bainbridge et al., 2013). Haploinsuficience genu ASXL3 je proto považována za pravděpodobný patogenní mechanismus vedoucí k manifestaci patologií (Srivastava et al., 2016). Varianta p.R1004Efs*21, detekovaná u probandky 196, se nachází v 3’ části exonu 11. Dle srovnání s variantami z databáze ClinVar v programu gene.iobio byly v exonech 11 a 12 detekovány deleční a inserční varianty spojené s posunem čtecího rámce a prezentovány jako klinicky významné v patogenezi BRS. Stejně jako v případě patogenních variant v genu MED13L lze pozorovat fenotypovou variabilitu patologií v důsledku alelické heterogenity. Varianty vedoucí k záměně AMK beze změny čtecího rámce byly popsány u jedinců vykazujících PAS (De Rubeis et al., 2014; Srivastava et al., 2016). Giri et al. (2017) 117 prezentovali atypický případ patogenních variant ve stavu složené heterozygotnosti v genu ASXL3 a fenotypovými projevy podobnými BRS a primární IGF1 deficiencí, kdy následná analýza prokázala jejich vliv na dvě odlišné efektorové dráhy.

Stav složené heterozygotnosti definuje přítomnost sekvenčních variant na dvou místech v genu, kdy každá alelická varianta má odlišný parentální původ. Jejich společný efekt se u autosomálních genů funkčně projevuje identicky jako homozygotní sekvenční varianta. Využití trio-based NGS analýz spočívá ve stanovení alelické fáze sekvenčních variant v genech asociovaných s AR onemocněními a stanovení jejich parentálního původu (Christensen and Lambert, 2011).

U probandky 282 byly detekovány klinicky významné sekvenční varianty v genu TSEN54 ve stavu složené heterozygotnosti bez využití trio-based NGS (1. fáze projektu) a následně jejich přítomnost byla cíleně verifikována rovněž u jejích rodičů. Varianta p.A307S (rs113994152) je variantou s prokázaným patogenním vlivem a je prevalentní patogenní variantou v patogenezi pontocerebellárních hypoplázií (pontocerebellar hypoplasia, PCH) různých typů s populační frekvencí 0,1-0,2 % dle databází dbSNP a ExAc. Putativní sestřihová intronová varianta c.56+2T>G se nachází na rozhraní exonu 1 a intronu 1 a dle informací z webového rozhraní vytváří aberantní donorové místo sestřihu na 5‘ místě intronu. Podle dostupných údajů z literatury tato varianta dosud nebyla detekována ani verifikována pomocí funkčních analýz. Ve webové platformě VarSome je uvedena sestřihová varianta c.56+2T>A pod identifikátorem rs937164753, klasifikovaná jako patogenní. Téměř 99 % analyzovaných donorových míst sestřihu obsahuje sekvenci GT na 5‘ místě intronu, méně než 2 % nekanonických donorových sestřihových sekvencí bylo identifikováno například při studiu exprese genů pro imunoglobuliny (Burset et al., 2000). Ke stanovení vlivu sestřihových variant na sestřih a na genovou expresi obecně jsou nezbytné verifikační funkční analýzy na úrovni RNA. Funkční význam sestřihových variant může být rovněž ovlivněn typem tkáně, v níž je primární transkript exprimován, a na dostupnosti faktorů sestřihu a jejich vazbě na abnormální místo sestřihu (Abramowicz and Gos, 2018). Patogenní sekvenční varianty v sestřihových oblastech mají za následek přeskočení exonu, zahrnutí intronu do vznikajícího transkriptu nebo vznik nového sestřihového místa uvnitř exonu či intronu. Vlivem detekované SNV c.56+2T>G lze predikovat zahrnutí intronu 1 do vznikajícího transkriptu. Zahrnutí intronu do vznikajícího transkriptu je obvykle spojeno s narušením čtecího rámce a se vznikem PTC. Abnormální transkripty nesoucí PTC mohou být odbourávány procesem NMD, či mohou vznikat zkrácené formy proteinu s dominantně negativním efektem. Vzhledem 118 k nálezu uvedené sestřihové varianty v heterozygotním stavu u zdravé matky probandky 282 lze spíše predikovat proces NMD či jiný mechanismus vedoucí k degradaci abnormálního transkriptu. Varianta p.R54G dosud nebyla popsána jako klinicky významná v patogenezi PCH, dle výstupů in silico predikcí ji lze klasifikovat jako variantu nejasného významu či potenciálně patogenní variantu. Dle databáze UCSC se pozice substituce chr17:73512930 nevyznačuje vysokou konzervovaností. Substituce AMK prezentované v databázi ClinVar nacházející se v blízkosti pozice p.R54 (p.R59Q, p.E61K) jsou rovněž samy o sobě klasifikovány jako VOUS. V databázi ExAc jsou dále prezentovány vzácné varianty p.A50P, p.Q51H, p.Q51E, u nichž nelze vyloučit klinický význam. Lze očekávat expresi abnormální alely se substitucí p.R54G v případě, pokud by se neprojevil efekt putativní sestřihové varianty c.56+2T>G s predikovanou degradací abnormálního transkriptu. Ve stavu složené heterozygotnosti sestřihové varianty c.56+2T>G, či substituce p.R54G (c.160C>G) spolu s p.A307S pak lze předpokládat manifestaci patologického fenotypu PCH (Namavar et al., 2011a; Namavar et al., 2011b). Gen TSEN54 kóduje podjednotku tRNA sestřihové endonukleázy, jež katalyzuje odstranění intronů (Paushkin et al., 2004). Je abundatně exprimován v neuronech Varolova mostu, mozečku a v prodloužené míše ve druhém trimestru gravidity (Budde et al., 2008). Celý komplex t-RNA sestřihové endonukleázy je složen ze čtyř typů podjednotek: TSEN2 a TSEN34 s katalytickou funkcí a strukturních podjednotek TSEN15 a TSEN54. Patogenní sekvenční varianty v genech kódující jednotlivé podjednotky jsou příčinou několika typů AR PCH (Namavar et al., 2011a; Budde et al., 2008). PCH představují skupinu geneticky a klinicky heterogenních onemocnění spojených s výrazně velikostně redukovaným mozečkem a mozkovým kmenem a dalšími patologiemi na podkladě vrozené vady CNS. Dodnes bylo klasifikováno 7 geneticky a klinicky heterogenních subtypů PCH (Namavar et al., 2011a). Patogenní varianty genu TSEN54 byly popsány jako klinicky významné v patogenezi PCH typů 1, 2A, 4 a 5. Mezi uvedenými subtypy lze identifikovat široké spektrum patogenních variant. PCH1 patří k nejvíce geneticky heterogenním PCH, kromě homozygotní varianty p.A307S v genu TSEN54 byly rovněž identifikovány patogenní varianty v genech RARS2 a VRK1 (Namavar et al., 2011a; Simonati et al., 2011). V patogenezi podtypu PCH2A se uplatňuje vliv prevalentní homozygotní varianty p.A307S v genu TSEN54, vzácněji se pak uplatňují další „missense“ varianty (Battini et al., 2014; Sánchez-Albisua et al., 2014; Namavar et al., 2011b). PCH4 se obvykle projevuje nejzávažnějším průběhem s časnou letalitou. U jedinců PCH4 byly identifikovány patogenní varianty ve stavu složené

119 heterozygotnosti, přičemž p.A307S je detekována v kombinaci s nesmyslnou nebo sestřihovou variantou (Namavar et al., 2011a). PCH5 představuje raritní závažný subtyp PCH s manifestací klinických příznaků vykazujícím částečnou podobnost s PCH4. Dosud byl prezentován jeden případ suspektní PCH5 s familiálním výskytem p.A307S ve stavu složené heterozygotnosti se sestřihovou variantou c.468+2T>C bez průkazu její patogenity pomocí funkčních analýz (Patel et al., 2006; Namavar et al., 2011c). Nástup fenotypových projevů ve formě aktivity podobné záchvatům („seizure-like“) byl pozorován již v průběhu prenatálního vývoje a v jednom případě vedl k letalitě 3. den po narození, u zbývajících dvou případů v dané rodině bylo zvoleno umělé ukončení těhotenství ve 20. a 27. týdnu gravidity.

V případě pacienta 414 byly detekovány v genu SLC6A19 dvě SNVs (p.D173N s prokázaným klinickým významem a p.S314L s potenciálním klinickým významem) ve stavu složené heterozygotnosti. Gen SLC6A19 kóduje aminokyselinový transportér B(0)AT1, člen rodiny transportérů neurotransmitterů, který řídí epiteliální resorpci neutrálních AMK skrze apikální membránu v ledvinách a střevě (Bröer et al., 2004). Jeho patogenní sekvenční varianty byly popsány v patogenezi AR Hartnupovy choroby (Nozaki et al., 2001). Jedná se o fenotypově heterogenní onemocnění spojené s kožní vyrážkou v důsledku fotosenzitivity, aminoacidurií, cerebellární ataxií a dalšími neurologickými a psychiatrickými poruchami zahrnujícími emoční labilitu. Většina jedinců s nefunkčním proteinem nevykazuje významné klinické projevy, pravděpodobně se zde uplatňuje vliv výživy, což řadí Hartnupovu chorobu mezi multifaktoriální onemocnění (Wilcken et al., 1977; Scriver et al., 1987). V literatuře jsou prezentovány případy pacientů s manifestací závažných či atypických patologií neurologického charakteru s nástupem projevů během dětství, dospívání či dospělého věku (Zhu et al., 2018). Závažné fenotypové projevy Hartnupovy choroby s časným nástupem byly popsány Cheonem et al. (2010) u chlapce se záchvaty, ADHD a DID, avšak bez známky kožní vyrážky či ataxie. DID není obvykle uváděna jako typický fenotypový projev Hartnupovy choroby (Hersov and Rodnight, 1960; van Karnebeek and Stockler, 2012). Pomocí zobrazovacích metod Erly et al. (1991) prokázali u chlapce s Hartnupovou chorobou poruchy myelinizace a dysgenezi corpus callosum. Rovněž u něj pozorovali somatickou retardaci a opoždění vývoje spolu s ataxií. I přes adekvátní klinickou odpověď na terapii derivátem tryptofanu u něj nedošlo k potlačení progrese atrofie CNS. Substituce p.D173N (rs121434346) je prevalentní patogenní variantou s populační frekvencí 0,1-0,2 % (dle databází ExAc a dbSNP). Na základě populačních dat ze Severní Ameriky a Austrálie se vyskytuje přibližně u 42 % jedinců s Hartnupovou chorobou (Azmanov et al., 2007). Varianta

120 p.S314L je klasifikována jako VOUS. Její chromosomová pozice chr5:g.1216726C>T (rs369804798) je popsána jako evolučně konzervované místo (dle UCSC Genome Browser), populační frekvence alely T je udávána menší než 0,02 %. Ve stejné nukleotidové pozici byla detekována varianta chr5:1216726C>A vedoucí ke stop kodonu (p.S314*) a klasifikována jako pravděpodobně patogenní (databáze ClinVar, dbSNP). Hartnupova choroba pravděpodobně zcela nevysvětluje závažnost neurovývojových poruch pozorovaných u probanda 414, zejména z hlediska závažné DID s časným nástupem a přítomnosti cavernomů a depozice hemosiderinu v CNS. Jeho případ může být však příkladem atypických závažných klinických projevů Hartnupovy choroby a nelze vyloučit přítomnost dalších faktorů ovlivňujících fenotyp.

Recentní údaje popisují kolem 140 genů na chromosomu X s významem v patogenezi X-vázané DID (Jamra, 2018; Wieczorek, 2018). Jejich patogenní varianty jsou příčinou DID u přibližně 16 % mužů. Vzhledem k odlišné konstituci gonosomů je stejná genová dávka udržována prostřednictvím inaktivace jednoho chromosomu X (X chromosome inactivation, XCI) u žen během embryogeneze. XCI je popisována jako náhodná a udržuje se v průběhu mitotických dělení. Recentní práce Shvetsové et al. (2019) však popisuje dysbalanci mezi aktivními chromosomy X maternálního a paternálního původu v populaci zdravých žen. Nenáhodná XCI je vysvětlena negativní selekcí v případě výskytu patogenní genetické varianty spojené s letalitou, nebo se uplatňují přirozené stochastické vlivy v důsledku omezeného počtu buněk v embryogenezi (van den Veyver, 2001; Orstavik, 2009). Genová exprese z inaktivního chromosomu X není zcela umlčena, přibližně 15 % genů této inaktivaci uniká. Jsou většinou lokalizovány na krátkém raménku chromosomu X a jsou sdruženy v klastrech (Disteche, 1999; Carrel and Willard, 2005). Míra úniku z XCI je variabilní a závisí na konkrétním genu, typu tkáně, vývojovém období a samotném jedinci (Deng et al., 2014). Variabilita v úniku XCI je pozorována na úrovni exprese přibližně 10 % X-vázaných genů mezi jednotlivými tkáněmi i mezi jednotlivými ženami (Peeters et al., 2014; Shoubridge et al., 2019). V uvedených studiích jsou shrnuty specifické faktory podílející se na úniku X- vázaných genů z XCI. Některé geny unikající XCI jsou paralogy genů lokalizovaných na chromosomu Y. Dále se jejich regulační a kódující sekvence vyznačují modifikacemi histonů specifickými pro aktivní chromatin, nemethylovanou sekvencí DNA v promotorech a nepřítomností XIST RNA. V DNA sekvencích unikajících XCI byly identifikovány specifické „escape elements“ a jejich prostorové vymezení prostřednictvím „boundary elements“. Analýza trojrozměrné struktury neaktivního chromosomu X prokázala specifické klastrování

121 oblastí unikajících XCI zvlášť od oblastí XIST a genu PRC2, jehož protein je součástí komplexu zahajujícho a udržujícího XCI. Peeters et al. (2014) rovněž předpokládájí současný vliv všech uvedených faktorů a nevylučují význam dalších mechanismů. Studium X-vázaných genů unikajících inaktivaci je klíčové z hlediska klinické interpretace X-vázaných onemocnění a následného genetického poradenství. V rodině probandů 14 a 14_B1 byl prokázán familiální výskyt patogenní varianty v genu IQSEC2 vedoucí k posunu čtecího rámce p.D605Pfs*3 v důsledku hemizygotní delece 2 bp, matka probandů 14 a 14_B je její asymptomatickou heterozygotní přenašečkou. Varianta p.D605Pfs*3 dosud nebyla popsána v patogenezi asociovaných patologií a na proteinové úrovni je v důsledku posunu čtecího rámce predikován vznik PTC v proteinové pozici 607. Gen IQSEC2 kóduje GEF (guanine nucleotide exchange factor) pro rodinu adenosin- difosfát-ribosylačních faktorů (ARF) patřících ke GTP-vazebným proteinům (Shoubridge et al., 2010). Je exprimován v neuronech, účastní se organizace cytoskeletu a excitačních synapsí, podílí se na morfologii dendritů (Kalscheuer et al., 2016; Hinze et al., 2017). Protein IQSEC2 má doménovou strukturu: na N’ konci mezi AMK pozicemi 23-74 je lokalizována doména CC, nezbytná pro samosestavování proteinu. Dále se nachází IQ-like motiv (AMK 347-376) pro interakci s kalmodulinem, v pozicích 746-939 byla identifikována doména Sec7 a na ni navazuje PH doména (pozice 951-1085), na C‘ konci je lokalizován PDZ vazebný motiv (1486-1488) (Kalscheuer et al., 2016; Levy et al., 2019). Doména Sec7 zajišťuje vazbu GTP a výměnu GDP-GTP na GTPázách rodiny ARF, proto patogenní varianty v této doméně mohou narušovat interakci s GTPázami rodiny ARF nebo bránit správnému prostorovému složení domény Sec7 (Kalscheuer et al., 2016; Shoubridge et al., 2019). Pozice patogenní varianty p.D605 se nenachází v žádné významné strukturní či funkční doméně, přesto se vyznačuje vysokou evoluční konzervovaností dle databáze UCSC. V důsledku zkracující varianty p.D605Pfs*3 lze předpokládat ztrátu domén Sec7, PH a C‘ koncového vazebného motivu PDZ, pokud by byl zkrácený transkript translatován do proteinu. Byly popsány nejméně tři isoformy proteinu IQSEC2, přičemž pro CNS je specifická nejdelší isoforma obsahující terminální PDZ vazebný motiv, skrze něhož je realizována interakce se synaptickými PSD-95 proteiny nesoucími doménu PDZ (Mignot et al., 2019). Proteiny PSD- 95 se účastní klastrování receptorů NMDA (N-methyl D-aspartate) na synaptické membráně neuronů. Zbylé isoformy jsou výrazně exprimovány zejména v tkáních mimo CNS. V CNS byla rovněž prokázána exprese nejkratší isoformy o délce 73 AMK.

122

Gen IQSEC2 patří do skupiny X-vázaných genů unikajících inaktivaci u žen, proto se u žen nesoucích patogenní varianty genu IQSEC2 manifestuje patologický fenotyp, obvykle méně závažný než u mužů nesoucí stejnou variantu. Patogenní varianty zasahují gen IQSEC2 jsou spojeny zejména s projevy nesyndromické dominantní X-vázané DID, avšak byl pozorován fenotypový překryv se známými syndromy spojenými s opožděním vývoje a epilepsiemi (Shoubridge et al., 2010). Patogenní substituční varianty v genu IQSEC2 u žen se projevují širokým spektrem patologií, u některých žen byl pozorován normální fenotyp nebo jen velmi mírné projevy poruch učení či mírného snížení intelektu (Shoubridge et al., 2019). Varianty spojené s posunem čtecího rámce či nesmyslné varianty se projevují i u žen závažnými patologiemi. V DNA sekvenci genu nebyl dosud identifikován žádný mutační „hotspot“, patogenní varianty byly detekovány po celé kódující oblasti. Na základě lokalizace specifických patogenních variant byly pozorovány korelace s fenotypem. SNVs v doméně Sec7 nebo interferující s její aktivitou vykazují familiální segregaci, muži vykazují závažnější fenotyp než ženy-přenašečky (Helbig et al., 2016; Ewans et al., 2017; Shoubridge et al., 2019). Tuto skutečnost lze konstatovat obecně pro missense varianty s familiální segregací. Posunové nebo nesmyslné varianty se projevují širokým spektrem DID, regresí vývoje, poruch chování, záchvatů a epilepsií jak u mužů i u žen, v literatuře dosud nejsou zaznamenány případy asymptomatických přenašeček. Variabilitu fenotypových projevů pozorujeme i ve studované rodině mezi probandy 14 a 14_B1, zejména v období nástupu a závažnosti epilepsie. U žen-přenašeček představuje haploinsuficience genu IQSEC2 mechanismus vysvětlující manifestaci patologií, nebo dané zkracující varianty mohou mít dominantně negativní efekt skrze interferenci s proteinem IQSEC2 exprimovaným z normální alely. Tyto mechanismy odpovídají X-vázané dominantní dědičnosti. Naopak nález substitučních variant u asymptomatických žen by vedl k vysvětlení skrze X-vázanou recesivní dědičnost. V těchto případech lze podle Radleyové et al. (2019) variabilitu fenotypu u žen nesoucích patogenní varianty v genu IQSEC2 vysvětlit typem dané patogenní varianty. V rodině probandů 14 a 14_B1 je matka asymptomatickou přenašečkou varianty měnící čtecí rámec. Její přenašečství bez patologických dopadů na fenotyp ženy by mohlo být na základě studií Radleyové et al. (2019) vysvěleno variabilní inaktivací, stejně jako je pro prezentováno v případě dalších genů (TIMP1, REP1) (Anderson and Brown, 1999; Carrel and Willard, 1999). Nicméně v přehledových studiích Tukiainen et al. (2017) a Shoubridge et al. (2019) je gen IQSEC2 prezentován jako gen unikající XCI bez pozorované variability úniku XCI, a to napříč 27 typy studovaných tkání. Mezi geny v lokusu Xp11.22 byla však pozorována nejvýraznější

123 variabilita exprese genu IQSEC2 mezi muži a ženami v rámci různých tkání. V mozkové tkáni je míra exprese genu IQSEC2 mezi muži a ženami přibližně stejná, naopak ve fibroblastech a kosterních svalech byly pozorovány nejvyšší rozdíly v míře exprese mezi pohlavími. U matky probandů 14 a 14_B1 lze očekávat existenci mechanismu udržujícího standardní míru exprese genu IQSEC2 i z jedné alely genu. Bez funkčních studií nelze přesněji stanovit osud pozměněného genu a následného transkriptu - zda je translatován do zkráceného proteinu, či je abnormální transkript nesoucí PTC cílem NMD, jak je prezentováno ve studiích Kalscheuerové et al. (2016) a Ewansové et al. (2017). Rovněž zde může hrát roli nejkratší isoforma proteinu IQSEC2 (73 AMK) přítomná v CNS, jež spolu s nejdelší isoformou exprimovanou z normální alely genu IQSEC2 může zajistit dostatečné množství proteinu pro zachování normálních kognitivních funkcí. Tuto hypotézu podporuje fakt, že dosud nebyly zaznamenány případy mužů s kompletní delecí genu IQSEC2 (Mignot et al., 2019). Současně byla v uvedené rodině detekována patogenní sekvenční varianta v genu BTD. Gen BTD kóduje enzym biotinidázu, jež katalyzuje hydrolýzu biocytinu na lysin a biotin. Kromě katalytické funkce vykonává také biotinyltransferázovou aktivitu (Hymes et al., 1995). Patogenní sekvenční varianty genu BTD jsou spojeny s AR deficiencí biotinidázy. V dané rodině segreguje varianta p.D444H, vyznačující se vysokou prevalencí v populaci (až 4 % v evropské populaci). V homozygotním stavu je projevuje parciální deficiencí biotinidázy, kdy je aktivita enzymu většinou snížena na 45-50 % své normální aktivity (Küry et al., 2016; Borsatto et al., 2017). Parciální deficit enzymu se projevuje symptomaticky (hypotonie, kožní vyrážka, ztráta vlasů) obvykle při stresových situacích (infekce), po nasazení léčby biotinem obtíže vymizí. U homozygotů pro p.D444H obvykle léčba biotinem není nezbytná.

Přístupy cíleného NGS reflektují současné trendy a potřeby v molekulární diagnostice jak v geneticky a klinicky heterogenních patologiích (DID, PAS a neurovývojová onemocnění), tak i v klinicky definovaných, relativně homogenních patologiích (porucha sluchu, kardiomyopatie, poruchy pojivové tkáně). K jejich přednostem patří zejména časová efektivita, kvantita a různorodost dat ve srovnání s parametry dat z klasického Sangerova sekvenování za stejný časový úsek. Za předpokladu nastavení vhodného diagnostického algoritmu a důkladné diferenciální diagnostiky mohou s sebou nést i významný ekonomický benefit. V neposlední řadě představují i jistou prestiž v portfoliu služeb a vyšetřeních nabízených na daném pracovišti. Strategie cíleného NGS využívající specifické panely genů se v současnosti uplatňují zejména v molekulární diagnostice klinicky definovaných skupin patologií. Přesto však 124 nachází uplatnění i v molekulární diagnostice geneticky heterogenních onemocnění, kdy dané panely zahrnují stovky až tisíce genů. Jejich předností je v tomto ohledu analýza sekvence DNA v definovaných oblastech genomu, kde lze identifikovat suspektní patogenní genetickou variantu. Tato přednost může však představovat i nevýhodu, neboť cílenou analýzou je ztracena možnost identifikace patogenních variant mimo definované oblasti genomu, avšak není vyloučena možnost identifikace nových patogenních genetických variant v analyzovaných genech. Stejně tak je výrazně omezena možnost identifikace nových kandidátních lokusů s potenciálním klinickým významem. Tyto nevýhody odpadají spolu s využitím WES a především WGS, které umožňují analýzu kódujících oblastí genomu (WES), v případě WGS současnou analýzu kódujících i nekódujících oblastí genomu. Vývoj nových bioinformatických přístupů směřuje k detekci CNVs ze sekvenačních dat, což pro NGS představuje potenciál stát se univerzálním přístupem v molekulární diagnostice (de Ligt et al., 2013; Yao et al., 2019). Nevýhodou daných přístupů je vysoká komplexita dat spojená s nutností vývoje mnohastupňové bioinformatické série programů pro efektivní zpracování základních sekvenačních dat za účelem zisku souboru variant, mezi nimiž bude možno identifikovat klinicky významné varianty s vysokou přesností a spolehlivostí. Rozvoj bioinformatických nástrojů pro zpracování základních sekvenačních dat a in silico predikčních programů, aktualizace databází genomových variant, recentní data vztahující se k dané problematice a klinický vývoj pacientova zdravotního stavu mohou být impulsem pro reanalýzu sekvenčních variant u již dříve vyšetřených pacientů (Al-Nabhani et al., 2018). Každoročně je reportováno přibližně 250 nových klinicky významých genových variant a 9 200 variant asociovaných v patologických stavech (Wenger et al., 2017). Dle doporučení by se k reanalýze mělo přistupovat jedenkrát za rok až 3 roky. Implementace reanalýzy dat u případů bez nálezu patogenní sekvenční varianty může kromě objasnění molekulární přičiny patologického fenotypu a zvýšení diagnostického záchytu také přispět ke zvýšení kvality genetického poradenství a následné multioborové lékařské péče. Bez ohledu na zvolený přístup NGS se předpokládá vysoká úroveň klinicko- genetického vyšetření za účelem diferenciální diagnostiky a výběru pacientů, kteří by mohli ze zvolené molekulárně diagnostické strategie metodou NGS profitovat. Současně je přenos výzkumných poznatků do prostředí molekulární diagnostiky spojen s potřebou diskuze vzhledem k množství etických aspektů spojených s dostupností a vhodným využití technologií NGS, interpretací získaných dat a související ochranou jedince před potenciálním zneužitím. Tato problematika je ošetřena prostřednictvím informovaného souhlasu, kde vyšetřovaný jedinec či jeho zákonný zástupce jasně vyjádří svá přání a postoje ke sdílení genomických dat

125 a jejich potenciálnímu anonymnímu využití (Wright et al., 2017). Seznámení vyšetřovaného jedince s nabízeným vyšetřením metodou NGS musí být provedeno kvalifikovaně a srozumitelně. Interpretace dat by měla respektovat klinické a laboratorní standardy ACMG pro NGS (Rehm et al., 2013) a doporučení ACMG pro reportování náhodných nálezů při analýzách metodami NGS (Green et al., 2013; Kalia et al., 2017).

126

Závěr Moderní metody molekulární cytogenetiky založené na celogenomovém screeningu nebalancovaných submikroskopických přestaveb chromozomů zcela zásadně pozvedly úroveň diagnostiky DID, PAS a asociovaných VVV. V současnosti představují standardní metodu v rutinním diagnostickém algoritmu pro vyšetřování jedinců s manifestací neurovývojové poruchy a dalších patologií, jež jsou charakteristické výraznou heterogenitou na úrovni genomu i na úrovni fenotypu. Nachází své uplatnění jako metoda první volby či jako konfirmační metoda pro potvrzení a upřesnění nálezů detekovaných ostatními metodami klasické a molekulární cytogenetiky. V řadě laboratoří zaujímá druhé místo v diagnostickém algoritmu, kdy bývá indikována po cytogenetickém vyšetření karyotypu. Na základě výsledků v této práci lze metodu array-CGH potvrdit jako vysoce efektivní přístup pro detekci a charakterizaci klinicky významných přestaveb chromosomů u dětí s DID, PAS a asociovanými VVV. Skrze své široké použití a mnohostrannou efektivitu z hlediska interpretace, časové a finanční náročnosti nyní array-CGH představuje nejvíce efektivní celogenomovou screeningovou metodu. Technologický rozvoj vysokokapacitních sekvenátorů znamenal revoluční krok v molekulární diagnostice vrozených i nádorových onemocnění, pro něž metoda array-CGH dosud představovala jeden z mála komplexních přístupů analýzy genomu. Metody sekvenování „nové generace“, zejména WES a WGS, nyní představují výzvu zejména z hlediska rozvoje bioinformatických nástrojů, webových rozhraní a platforem pro interpretace nálezů z důvodu vysoké komplexity sekvenančních dat. Ruku v ruce s těmito daty vyvstává nutnost tvorby legislativních opatření o nakládání se získanými informacemi a o jejich ochraně proti zneužití, neboť správné a uvážlivé nakládání s citlivými genomickými daty přináší benefity ze získaných informací všem zúčastněným stranám. Implementací technologií NGS do vyšetřovacího algoritmu se významně prohlubují poznatky o etiopatogenezi vzácných onemocnění s nepříznivým dopadem na zdraví jedince a otevírají se možnosti klinického výzkumu pro vývoj nových terapeutik „na míru“ za účelem zlepšení zdravotního stavu jedince a celkové úrovně jeho života. Poznání příčiny zdravotních obtíží a objasnění její podstaty na molekulární úrovni je silně provázáno s psychologickými aspekty vedoucími k vyrovnání se s nepříznivou diagnózou, což je opět spojeno s lepší kvalitou života jedince a jeho okolí. Význam získaných informací má přesah rovněž do oblasti reprodukční medicíny, kdy výstupy z genomických analýz mohou přispět k narození zdravého jedince v rodině s výskytem vzácného onemocnění.

127

Přehled literatury 1000 Genomes Project Consortium, Auton A, Brooks LD, Durbin RM, Garrison EP, Kang HM, Korbel JO, Marchini JL, McCarthy S, McVean GA et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 2015;526(7571):68-74. Abramowicz A and Gos M. Splicing mutations in human genetic disorders: examples, detection, and confirmation. J Appl Genet. 2018;59(3):253-68. Acuna-Hidalgo R, Veltman JA, Hoischen A. New insights into the generation and role of de novo mutations in health and disease. Genome Biol. [online]. 2016;17(1):241 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/s13059-016-1110-1. Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, Ramensky VE, Gerasimova A, Bork P, Kondrashov AS, Sunyaev SR. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods. 2010;7(4):248-9. Al-Nabhani M, Al-Rashdi S, Al-Murshedi F, Al-Kindi A, Al-Thihli K, Al-Saegh A, Al- Futaisi A, Al-Mamari W, Zadjali F, Al-Maawali A. Reanalysis of exome sequencing data of intellectual disability samples: yields and benefits. Clin Genet. 2018;94(6):495-501. Alonso-Gonzalez A, Rodriguez-Fontenla C, Carracedo A. De novo mutations (DNMs) in autism spectrum disorders (ASD): Pathway and network analysis. Front Genet. [online]. 2018;9:406 [cit. 24.6.2019]. doi: 10.3389/fgene.2018.00406. Anderson CL and Brown CJ. Polymorphic X-chromosome inactivation of the human TIMP1 gene. Am J Hum Genet. 1999;65(3):699-708. Andrews S. FastQC: a quality kontrol tool for high throughput sequence data. 2010. [online]. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc [cit. 23.6.2019]. Asadollahi R, Oneda B, Sheth F, Azzarello-Burri S, Baldinger R, Joset P, Latal B, Knirsch W, Desai S, Baumer A et al. Dosage changes of MED13L further delineate its role in congenital heart defects and intellectual disability. Eur J Hum Genet. 2013;21(10):1100-4. Athanasakis E, Licastro D, Faletra F, Fabretto A, Dipresa S, Vozzi D, Morgan A, d’Adamo AP, Pecile V, Biarnés X et al. Next generation sequencing in nonsyndromic intellectual disability: from a negative molecular karyotype to a possible causative mutation detection. Am J Med Genet A. 2014;164A(1):170-6. Azmanov DN, Rodgers H, Auray-Blais C, Giguère R, Bailey C, Bröer S, Rasko JE, Cavanaugh JA. Persistence of the common Hartnup disease D173N allele in populations of European origin. Ann Hum Genet. 2007;71(Pt 6):755-61. Baasch AL, Hüning I, Gilissen C, Klepper J, Veltman JA, Gillessen-Kaesbach G, Hoischen A, Lohmann K. Exome sequencing identifies a de novo SCN2A mutation in a 128 patient with intractable seizures, severe intellectual disability, optic atrophy, muscular hypotonia, and brain abnormalities. Epilepsia. 2014;55(4):e25-9. Bahi-Buisson N, Poirier K, Fourniol F, Saillour Y, Valence S, Lebrun N, Hully M, Bianco CF, Boddaert N, Elie C et al. The wide spectrum of tubulinopathies: what are the key features for the diagnosis? Brain. 2014;137(Pt 6):1676-700. Bainbridge MN, Hu H, Muzny DM, Musante L, Lupski JR, Graham BH, Chen W, Gripp KW, Jenny K, Wienker TF et al. De novo truncating mutations in ASXL3 are associated with a novel clinical phenotype with similarities to Bohring-Opitz syndrome. Genome Med. [online]. 2013;5(2):11 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/gm415. Baio J, Wiggins L, Christensen DL, Maenner MJ, Daniels J, Warren Z, Kurzius- Spencer M, Zahodorny W, Robinson Rosenberg C, White T et al. Prevalence of Autism spectrum disorder among children aged 8 years – Autism and Developmental Disabilities Monitoring network, 11 sites, United States, 2014. MMWR Surveill Summ. 2018;67(6):1-23. Balasubramanian M, Willoughby J, Fry AE, Weber A, Firth HV, Deshpande C, Berg JN, Chandler K, Metcalfe KA, Lam W et al. Delineating the phenotypic spectrum of Bainbridge-Ropers syndrome: 12 new patients with de novo, heterozygous, loss-of-function mutations in ASXL3 and review of published literature. J Med Genet. 2017;54(8):537-43. Battaglia A and Carey JC. Diagnostic evaluation of developmental delay/mental retardation: An overview. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2003;117C(1):3-14. Battaglia A, Doccini V, Bernardini L, Novelli A, Loddo S, Capalbo A, Filippi T, Carey JC. Confirmation of chromosomal microarray as a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental delay, intellectual disability, autism spectrum disorders and dysmorphic features. Eur J Pediatr Neurol. 2013;17(6):589-99. Battini R, D’Arrigo S, Cassandrini D, Guzzetta A, Fiorillo C, Pantaleoni C, Romano A, Alfei E, Cioni G, Santorelli FM. Novel mutations in TSEN54 in pontocerebellar hypoplasia type 2. J Child Neurol. 2014;29(4):520-5. Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, Milton J, Brown CG, Hall KP, Evers DJ, Barnes CL, Bignell HR et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008;456(7218):53-9. Bertini V, Azzarà A, Legitimo A, Milone R, Battini R, Consolini R, Valetto A. Deletion extents are not the cause of clinical variability in 22q11.2 deletion syndrome: does the interaction between DGCR8 and miRNA-CNVs play a major role? Front Genet. [online]. 2017;8:47 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.3389/fgene.2017.00047.

129

Biesecker LG and Spinner NB. A genomic view of mosaicism and human disease. Nat Rev Genet. 2013;14(5):307-20. Boiko T, Rasband MN, Levinson SR, Caldwell JH, Mandel G, Trimmer JS, Matthews G. Compact myelin dictates the differential targeting of two sodium channel isoforms in the same axon. Neuron. 2001;30(1):91-104. Borsatto T, Sperb-Ludwig F, Lima SE, S Carvalho MR, S Fonseca PA, S Camello J Jr, M Ribeiro E, F V de Medeiros P, M Lourenço C, F M de Souza C et al. Biotinidase deficiency: genotype-biochemical phenotype association in Brazilian patients. PLoS One. [online]. 2017;12(5):e0177503 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pone.0177503. Brett M, McPherson J, Zang ZJ, Lai A, Tan ES, Ng I, Ong LC, Cham B, Tan P, Rozen S et al. Massively parallel sequencing of patients with intellectual disability, congenital anomalies and/or autism spectrum disorders with a targeted gene panel. PLoS One. [online]. 2014;9(4):e93409 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pone.0093409. Bröer A, Klingel K, Kowalczuk S, Rasko JE, Cavanaugh J, Bröer S. Molecular cloning of mouse amino acid transport system B0, a neutral amino acid transporter related to Hartnup disorder. J Biol Chem. 2004;279(23):24467-76. Bruun TUJ, DesRoches CL, Wilson D, Chau V, Nakagawa T, Yamasaki M, Hasegawa S, Fukao T, Marshall C, Mercimek-Andrews S. Prospective cohort study for identification of underlying genetic causes in neonatal encephalopathy using whole-exome sequencing. Genet Med. 2018;20(5):486-94. Budde BS, Namavar Y, Barth PG, Poll-The BT, Nürnberg G, Becker C, van Ruissen F, Weterman MA, Fluiter K, te Beek ET et al. tRNA splicing endonuclease mutations cause pontocerebellar hypoplasia. Nat Genet. 2008;40(9):1113-8. Budworth H and McMurray CT. A brief history of triplet repeats diseases. Methods Mol Biol. 2013;1010:3-17. Burnside RD. 22q11.21 deletion syndromes: a review of proximal, central, and distal deletions and their associated features. Cytogenet Genome Res. 2015;146(2):89-99. Burset M, Seledtsov IA, Solovyev VV. Analysis of canonical and non-canonical splice sites in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(21):4364-75. Butler MG. Clinical and genetic aspects of the 15q11.2 BP1-BP2 microdeletion disorder. J Intellect Disabil Res. 2017;61(6):568-79. Buysse K, Delle Chiaie B, Van Coster R, Loeys B, De Paepe A, Mortier G, Speleman F, Menten B. Challenges for CNV interpretation in clinical molecular karyotyping: lessons learned from a 1001 sample experience. Eur J Med Genet. 2009;52(6):398-403.

130

Capalbo A, Rienzi L, Ubaldi FM. Diagnosis and clinical management of duplications and deletions. Fertil Steril. 2017;107(1):12-8. Carreira IM, Ferreira SI, Matoso E, Pires LM, Ferrão J, Jardim A, Mascarenhas A, Pinto M, Lavoura N, Pais C et al. Copy number variants prioritization after array-CGH analysis – a cohort of 1000 patients. Mol Cytogenet. [online]. 2015;8:103 [cit. 21.6.2019]. doi: 10.1186/s13039-015-0202-z. Cingolani P, Patel VM, Coon M, Nguyen T, Land SJ, Ruden DM, Lu X. Using Drosophila melanogaster as a model for genotoxic chemical mutational studies with a new program, snpSift. Front Genet. [online]. 2012a;3:35. doi: 10.3389/fgene.2012.00035. Cingolani P, Platts A, Wang le L, Coon M, Nguyen T, Wang L, Land SJ, Lu X, Ruden DM. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 2012b;6(2):80-92. Cirulli ET, Singh A, Shianna KV, Ge D, Smith JP, Maia JM, Heinzen EL, Goedert JJ, Goldstein DB; Center for HIV/AIDS Vaccine Immunology (CHAVI). Screening for human exome: a comparison of whole genome and whole transcriptome sequencing. Genome Biol. [online]. 2010;11(5):R57 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1186/gb-2010-11-5-r57. Carrel L and Willard HF. X-inactivation profile reveals extensive variability in X-linked expression in females. Nature. 2005;434(7031):400-4. Carrel L and Willard HF. Heterogeneous gene expression from the inactive X chromosome: an X-linked gene that escapes X inactivation in some human cell lines but is inactivated in others. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96(13):7364-9. Conrad DF, Pinto D, Redon R, Feuk L, Gokcumen O, Zhang Y, Aerts J, Andrews TD, Barnes C, Campbell P et al. Origins and functional impact of copy number variation in the human genome. Nature. 2010;464(7289):704-12. Contreras-Capetillo SN and Abreu-González M. From next generation sequence to the phenotype: exploring the Bainbridge-Ropers syndrome with loss of function variants in ASXL3. J Rare Dis Res Treat. 2019;4(1):61-5. Cooper CM, Coe BP, Girirajan S, Rosenfeld JA, Vu TH, Baker C, Williams C, Stalker H, Hamid R, Hannig V et al. A copy number variation morbidity map of developmental delay. Nat Genet. 2011;43(9):838-46. Costain G, Chow EW, Silversides CK, Bassett AS. Sex differences in reproductive fitness contribute to preferential maternal transmission of 22q11.2 deletions. J Med Genet. 2011;48(12):819-24.

131

D’Amours G, Langlois M, Mathonnet G, Fetni R, Nizard S, Srour M, Tihy F, Phillips MS, Michaud JL, Lemyre E. SNP arrays: comparing diagnostic yields for four platforms in children with developmental delay. BMC Med Genomics. [online]. 2014;7:70 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/s12920-014-0070-0. Danecek P, Auton A, Abecasis G, Albers CA, Banks E, DePristo MA, Handsaker RE, Lunter G, Marth GT, Sherry ST et al. The variant call format and VCFtools. Bioinformatics. 2011;27(15):2156-8. Davis KW, Serrano M, Loddo S, Robinson C, Alesi V, Dallapiccola B, Novelli A, Butler MG. Parent-of-origin effects in 15q11.2 BP1-BP2 microdeletion (Burnside-Butler) syndrome. Int J Mol Sci. [online]. 2019;20(6):1459 [cit. 21.6.2019]. doi: 10.3390/ijms20061459. Davis MP, van Dongen S, Abreu-Goodger C, Bartonicek N, Enright AJ. Kraken: a set of tools for quality control and analysis of high-throughput sequence data. Methods. 2013;63(1): 41-9. Dawson AJ, Putnam S, Schultz J, Riordan D, Prasad C, Greenberg CR, Chodirker BN, Mhanni AA, Chudley AE. Cryptic chromosome rearrangements detected by subtelomere assay in patients with mental retardation and dysmorphic features. Clin Genet. 2002;62(6):488-94. De Leeuw N, Hehir-Kwa JY, Simons A, Geurts van Kessel A, Smeets DF, Faas BH, Pfundt R. SNP array analysis in constitutional and cancer genome diagnostics—copy number variants, genotyping and quality control. Cytogenet Genome Res. 2011;135(3-4):212-21. De Ligt J, Boone PM, Pfundt R, Vissers LE, Richmond T, Geoghegan J, O’Moore K, de Leeuw N, Shaw C, Brunner HG et al. Detection of clinically relevant copy number variants with whole-exome sequencing. Hum Mutat. 2013;34(10):1439-48. Den Dunnen JT, Dalgleish R, Maglott DR, Hart RK, Greenblatt MS, McGowan-Jordan J, Roux AF, Smith T, Antonarakis SE, Taschner PE. HGVS recommendations for the description of sequence variants: 2016 update. Hum Mutat. 2016;37(6):564-9. Deng X, Berletch JB, Nguyen DK, Disteche CM. X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease. Nat Rev Genet. 2014;15(6):367-78. Depaepe V, Suarez-Gonzalez N, Dufour A, Passante L, Gorski JA, Jones KR, Ledent C, Vanderhaeghen P. Ephrin signalling controls brain size by regulating apoptosis of neural progenitors. Nature. 2005;435(7046):1244-50. De Rubeis S, He X, Goldberg AP, Poultney CS, Samocha K, Cicek AE, Kou Y, Liu L, Fromer M, Walker S et al. Synaptic, transcriptional and chromatin genes disrupted in autism. Nature. 2014;515(7526):209-15.

132

DeScipio C, Conlin L, Rosenfeld J, Tepperberg J, Pasion R, Patel A, McDonald MT, Aradhya S, Ho D, Goldstein J et al. Subtelomeric deletion of chromosome 10p15.3: clinical findings and molecular cytogenetic characterization. Am J Med Genet A. 2012;158A(9):2152-61. De Vries BB, Winter R, Schinzel A, van Ravenswaaij-Arts C. Telomeres: a diagnosis at the end of the chromosomes. J Med Genet. 2003;40(6):385-98. Dhillon RK, Hillman SC, Morris RK, McMullan D, Williams D, Coomarasamy A, Kilby MD. Additional information from chromosomal microarray analysis (CMA) over conventional karyotyping when diagnosing chromosomal abnormalities in miscarriage: a systematic review and meta-analysis. BJOG. 2014;121(1):11-21. Di Gregorio E, Savin E, Biamino E, Belligni EF, Naretto VG, D'Alessandro G, Gai G, Fiocchi F, Calcia A, Mancini C et al. Large cryptic genomic rearrangements with apparently normal karyotypes detected by array-CGH. Mol Cytogenet. [online] 2014;7(1):82 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/s13039-014-0082-7. Dikow N, Maas B, Gaspar H, Kreiss-Nachtsheim M, Engels H, Kuechler A, Garbes L, Netzer C, Neuhann TM, Koehler U et al. The phenotypic spectrum of duplication 5q35.2- q35.3 encompassing NSD1: is it really a reversed Sotos syndrome? Am J Med Genet A. 2013;161A(9):2158-66. Dilena R, Striano P, Gennaro E, Bassi L, Olivotto S, Tadini L, Mosca F, Barbieri S, Zara F, Fumagalli M. Efficacy of sodium channel blockers in SCN2A early infantile epileptic encephalopathy. Brain Dev. 2017;39(4):345-8. Di Resta C, Galbiati S, Carrera P, Ferrari M. Next-generation sequencing approach for the diagnosis of human diseases: open challenges and new opportunities. EJIFCC. 2018;29(1):4- 14. Disteche CM. Escapees on the X chromosome. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96(25):14180- 2. Doernberg E and Hollander E. Neurodevelopmental disorders (ASD and ADHD): DSM-5, ICD-10, and ICD-11. CNS Spectr. 2016;21(4):295-9. Dolk H, Loane M, Garne E, De Walle H, Queisser-Luft A, De Vigan C, Addor MC, Gener B, Haeusler M, Jordan H et al. Trends and geographic inequalities in the prevalence of Down syndrome in Europe, 1980-1999. Rev Epidemiol Sante Publique. 2005;53(S2):2S87- 95. Donate A, Estop AM, Giraldo J, Templado C. Paternal age and numerical chromosome abnormalities in human spermatozoa. Cytogenet Genome Res. 2016;148(4):241-8.

133

Dowle M and Srinivasan A. data.table: Extension of `data.frame`. R package version 1.9.6. 2017. https://CRAN.R-project.org/package=data.table. Downes SM, Holder GE, Fitzke FW, Payne AM, Warren MJ, Bhattacharya SS, Bird AC. Autosomal dominant cone and cone-rod dystrophy with mutations in the guanylate cyclase activator 1A gene-encoding guanylate cyclase activating protein-1. Arch Ophthalmol. 2001;119(1):96-105. Durkin M. The epidemiology of developmental disabilities in low-income countries. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 2002;8(3):206-11. Durkin MS, Bilder DA, Pettygrove S, Zahodorny W. The validity and usefulness of public health surveillance of autism spectrum disorder. Autism. 2015;19(1):118-9. Eggermann T, Perez de Nanclares G, Maher ER, Temple IK, Tümer Z, Monk D, Mackay DJ, GrØnskov K, Riccio A, Linglart A et al. Imprinting disorders: a group of congenital disorders with overlapping patterns of molecular changes affecting imprinted loci. Clin Epigenetics. [online]. 2015;7:123 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1186/s13148-015-0143-8. Eggert M, Müller S, Heinrich U, Mehraein Y. A new familial case of microdeletion syndrome 10p15.3. Eur J Med Genet. 2016;59(4):179-82. Erickson RP. Somatic gene mutation and human disease other than cancer. Mutat Res. 2003;543(2):125-36. Erly W, Castillo M, Foosaner D, Bonmati C. Hartnup disease: MR findings. AJNR Am J Neuroradiol. 1991;12(5):1026-7. Evangelidou P, Alexandrou A, Moutafi M, Ioannides M, Antoniou P, Koumbaris G, Kallikas I, Velissariou V, Sismani C, Patsalis PC. Implementation of high resolution whole genome array CGH in the prenatal clinical setting: advantages, challenges, and review of the literature. Biomed Res Int. [online]. 2013;2013:346762 [cit. 10.7.2019]. doi: 10.1155/2013/346762. Ewans LJ, Field M, Zhu Y, Turner G, Leffler M, Dinger ME, Cowley MJ, Buckley MF, Scheffer IE, Jackson MR et al. Gonadal mosaicism of a novel IQSEC2 variant causing female limited intellectual disability and epilepsy. Eur J Hum Genet. 2017;25(6):763-7. Firth HV, Richards SM, Bevan AP, Clayton S, Corpas M, Rajan D, Van Vooren S, Moreau Y, Pettett RM, Carter NP. DECIPHER: Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources. Am J Hum Genet. 2009;84(4):524-33. Fonseka KG and Griffin DK. Is there a paternal age effect for aneuploidy? Cytogenet Genome Res. 2011;133(2-4):280-91.

134

Friedman DJ, Parrish RG, Fox MH. A review of global literature on using administrative data to estimate prevalence of intellectual and developmental disabilities. J Policy Pract Intellect Disabil. 2018;15(1):43-62. Frye RE, Delatorre R, Taylor H, Slattery J, Melnyk S, Chowdhury N, James SJ. Redox metabolism abnormalities in autistic children associated with mitochondrial disease. Transl Psychiatry. [online]. 2013;3:e273 [cit. 24.6.2019]. doi: 10.1038/tp.2013.51 Fu W and Akey JM. Selection and adaptation in the human genome. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2013;14:467-89. Gajecka M. Unrevealed mosaicism in the next-generation sequencing era. Mol Genet Genomics. 2016;291(2):513-30. Gao J, Liu C, Yao F, Hao N, Zhou J, Zhou Q, Zhang L, Liu X, Bian X, Liu J. Array- based comparative genomic hybridization is more informative than conventional karyotyping and fluorescence in situ hybridization in the analysis of first-trimester spontaneous abortion. Mol Cytogenet. [online]. 2012;5(1):33 [cit. 23.6.2019]. doi: doi: 10.1186/1755-8166-5-33. Gao Z, Wyman MJ, Sella G, Przeworski M. Interpreting the dependence of mutation rates on age and time. PLoS Biol. [online]. 2016;14:e1002355 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pbio.1002355. Gao Z, Moorjani P, Sasani TA, Pedersen BS, Quinlan AR, Jorde LB, Amster G, Przeworski M. Overlooked roles of DNA damage and maternal age in generating human germline mutations. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116(19):9491-500. Geschwind DH and Levitt P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 2007;17(1):103-11. Gilissen C, Hehir-Kwa JY, Thung DT, van de Vorst M, van Bon BW, Willemsen MH, Kwint M, Janssen IM, Hoischen A, Schenck A. Genome sequencing identifies major causes of severe intellectual disability. Nature. 2014;511(7509):344-7. Gillentine MA and Schaaf CP. The human clinical phenotypes of altered CHRNA7 copy number. Biochem Pharmacol. 2015;97(4):352-62. Girard SL, Bourassa CV, Lemieux Perreault LP, Legault MA, Barhdadi A, Ambalavanan A, Brendgen M, Vitaro F, Noreau A, Dionne G et al. Paternal age explains a major portion of de novo germline mutation rate variability in healthy individuals. PLoS One. [online]. 2016;11(10):e0164212 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pone.0164212. Giri D, Rigden D, Didi M, Peak M, McNamara P, Senniappan S. Novel compound heterozygous ASXL3 mutation causing Bainbridge-ropers like syndrome and primary IGF1

135 deficiency. Int J Pediatr Endocrinol. [online]. 2017;2017:8 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/s13633-017-0047-9. Girimaji SC and Pradeep AJ. Intellectual disability in International classification of Diseases-11: A developmental perspective. Indian J Soc Psychiatry. 2018;34(S1):68-74. Girirajan S and Eichler EE. Phenotypic variability and genetic susceptibility to genomic disorders. Hum Mol Genet. 2010;19(R2):R176-87. Girirajan S, Rosenfeld JA, Cooper GM, Antonacci F, Siswara P, Itsara A, Vives L, Walsh T, McCarthy SE, Baker C et al. A recurrent 16p12.1 microdeletion supports a two- hit model for severe developmental delay. Nat Genet. 2010;42(3):203-9. Girirajan S, Rosenfeld JA, Coe BP, Parikh S, Friedman N, Goldstein A, Filipink RA, McConnell JS, Angle B, Meschino WS et al. Phenotypic heterogeneity of genomic disorders and rare copy-number variants. N Engl J Med. 2012;367(14):1321-31. Goldmann JM, Wong WS, Pinelli M, Farrah T, Bodian D, Stittrich AB, Glusman G, Vissers LE, Hoischen A, Roach JC et al. Parent-of-origin-specific signatures of de novo mutations. Nat Genet. 2016;48(8):935-9. Goodship J, Cross I, Scambler P, Burn J. Monozygotic twins with chromosome 22q11 deletion and discordant phenotype. J Med Genet. 1995;32(9):746-8. Green RC, Berg JS, Grody WW, Kalia SS, Korf BR, Martin CL, McGuire AL, Nussbaum RL, O’Daniel JM, Ormond KE et al. ACMG recommendations for reporting of incidental findings in clinical exome and genome sequencing. Genet Med. 2013;15(7):565-74. Grozeva D, Carss K, Spasic-Boskovic O, Tejada MI, Gecz J, Shaw M, Corbett M, Haan E, Thompson E, Friend K et al. Targeted next-generation sequencing analysis of 1,000 individuals with intellectual disability. Hum Mutat. 2015;36(12):1197-204. Gu W, Zhang F, Lupski JR. Mechanisms for human genomic rearrangements. Pathogenetics. [online] 2008;1(1):4 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/1755-8417-1-4. Hamosh A, Scott AF, Amberger J, Bocchini C, Valle D, McKusick VA. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), a knowledgebase of human genes and genetic disorders. Nucleic Acids Res. 2002;30(1):52-5. Han JY, Jang JH, Park J, Lee IG. Targeted next-generation sequencing of Korean patients with developmental delay and/or intellectual disability. Front Pediatr. [online]. 2018;6:391 [cit. 19.6.2019]. Harel T and Lupski JR. Genomic disorders 20 years on-mechanisms for clinical manifestations. Clin Genet. 2018;93(3):439-449.

136

Harripaul R, Noor A, Ayub M, Vincent JB. The use of next-generation sequencing for research and diagnostics for intellectual disability. Cold Spring Harb Perspect Med. [online]. 2017;7(3):pii.a026864 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1101/cshperspect.a026864. Hassold T and Hunt P. To err (meiotically) in human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2001;2(4):280-91. Hastings PJ, Lupski JR, Rosenberg SM, Ira G. Mechanisms of change in gene copy number. Nat Rev Genet. 2009;10(8):551-64. Hehir-Kwa JY, Rodríguez-Santiago B, Vissers LE, de Leeuw N, Pfundt R, Buitelaar JK, Pérez-Jurado LA, Veltman JA. De novo copy number variants associated with intellectual disability have a paternal origin and age bias. J Med Genet. 2011;48(11):776-8. Hehir-Kwa JY, Pfundt R, Veltman JA. Exome sequencing and whole genome sequencing for the detection of copy number variation. Expert Rev Mol Diagn. 2015;15(8):1023-32. Helbig KL, Farwell Hagman KD, Shinde DN, Mroske C, Powis Z, Li S, Tang S, Helbig I. Diagnostic exome sequencing provides a molecular diagnosis for a significant proportion of patients with epilepsy. Genet Med. 2016;18(9):898-905. Helguera P, Seiglie J, Rodriguez J, Hanna M, Helguera G, Busciglio J. Adaptive downregulation of mitochondrial function in Down syndrome. Cell Metab. 2013;17(1):132- 40. Hersov LA and Rodnight R. Hartnup disease in psychiatric practice: clinical and biochemical features of three cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1960;23:40-5. Heuvelman H, Abel K, Wicks S, Gardner R, Johnstone E, Lee B, Magnusson C, Dalman C, Rai D. Gestational age at birth and risk of intellectual disability without a common genetic cause. Eur J Epidemiol. 2018;33(7):667-78. Hinze SJ, Jackson MR, Lie S, Jolly L, Field M, Barry SC, Harvey RJ, Shoubridge C. Incorrect dosage of IQSEC2, a known intellectual disability and epilepsy gene, disrupts dendritic spine morphogenesis. Transl Psychiatry. [online] 2017;7(5):e1110 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1038/tp.2017.81. Hoang S, Ahn J, Mann K, Bint S, Mansour S, Homfray T, Mohammed S, Ogilvie CM. Detection of mosaicism for genome imbalance in a cohort of 3,042 clinical causes using an oligonucleotide array CGH platform. Eur J Med Genet. 2011;54(2):121-9. Holbrook JA, Neu-Yilik G, Hentze MW, Kulozik AE. Nonsense-mediated decay approaches the clinic. Nat Genet. 2004;36(8):801-8.

137

Huang J, Zhu T, Qu Y, Mu D. Prenatal, perinatal and neonatal risk factors for intellectual disability: A systemic review and meta-analysis. PLoS One. [online]. 2016;11(4):e0153655 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pone.0153655. Huang N, Lee I, Marcotte EM, Hurles ME. Characterising and predicting haploinsufficiency in the human genome. PLoS Genet. [online]. 2010;6(10):e1001154. [cit. 21.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pgen.1001154. Hunter J, Rivero-Arias O, Angelov A, Kim E, Fotheringham I, Leal J. Epidemiology of fragile X syndrome: a systematic review and meta-analysis. Am J Med Genet A. 2014;164A(7):1648-58. Hurst LD. Fundamental concepts in genetics: genetics and the understanding of selection. Nat Rev Genet. 2009;10(2):83-93. Hymes J, Fleischhauer K, Wolf B. Biotinylation of histones by human serum biotinidase: assessment of biotinyl-transferase activity in sera from normal individuals and children with biotinidase deficiency. Biochem Mol Med. 1995;56(1):76-83. Cheon CK, Lee BH, Ko JM, Kim HJ, Yoo HW. Novel mutation in SLC6A19 causing late- onset seizures in Hartnup disorder. Pediatr Neurol. 2010;42(5):369-71. Chew S, Balasubramanian R, Chan WM, Kang PB, Andrews C, Webb BD, MacKinnon SE, Oystreck DT, Rankin J, Crawford TO et al. A novel syndrome caused by the E410K amino acid substitution in the neuronal β-tubulin isotype 3. Brain. 2013;136(Pt 2):522-35. Chiang T, Schultz RM, Lampson MA. Meiotic origins of maternal age-related aneuploidy. Biol Reprod. 2012;86(1):1-7. Choi Y, Sims GE, Murphy S, Miller JR, Chan AP. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PLoS One. [online]. 2012;7(10):e46688 [cit. 22.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pone.0046688. Christensen GB and Lambert CG. Search for compound heterozygous effect in exome sequence of unrelated subjects. BMC Proc. [online]. 2011;5(Suppl 9):S95 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/1753-6561-5-S9-S95. Chrystoja CC and Diamandis EP. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 2014;60(5):724-33. Chung L, Wang X, Zhu L, Towers AJ, Cao X, Kim IH, Jiang YH. Parental origin impairment of synaptic functions and behaviors in cytoplasmic FMRP interacting protein 1 (Cyfip1) deficient mice. Brain Res. 2015;1629:340-50. Isken O and Maquat LE. Quality control of eukaryotic mRNA: safeguarding cells from abnormal mRNA function. Genes Dev. 2007;21(15):1833-56.

138

Isles AR, Ingason A, Lowther C, Walters J, Gawlick M, Stöber G, Rees E, Martin J, Little RB, Potter H et al. Parental origin of interstitial duplications at 15q11.2-q13.1 in schizophrenia and neurodevelopmental disorders. PLoS Genet. [online]. 2016;12(5):e1005993 [cit. 21.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pgen.1005993. Jamra R. Genetics of autosomal recessive intellectual disability. Med Genet. 2018;30(3):323- 7. Janecka M, Mill J, Basson MA, Goriely A, Spiers H, Reichenberg A, Schalkwyk L, Fernandes C. Advanced paternal age effects in neurodevelopmental disorders-review of potential underlying mechanisms. Transl Psychiatry. 2017;7(1):e1019. Janyšková H. Zavedení relativní qPCR pro ověřování nálezů nebalancovaných chromozomových abnormalit detekovaných pomocí aCGH [online]. Brno, 2016 [cit. 10.9.2019]. Dostupné z: . Diplomová práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Vedoucí práce Petr Kuglík. Joshi RS, Garg P, Zaitlen N, Lappalainen T, Watson CT, Azam N, Ho D, Li X, Antonarakis SE, Brunner HG et al. DNA methylation profiling of uniparental disomy subjects provides a map of parental epigenetic bias in the human genome. Am J Hum Genet. 2016;99(3):555-66. Kahrizi K, Ku H, Hosseini M, Kalscheuer VM, Fattahi Z, Beheshtian M, Suckow V, Mohseni M, Lipkowitz B, Mehvari S et al. Effect of inbreeding on intellectual disability revisited by trio sequencing. Clin Genet. 2019;95(1):151-9. Kalia SS, Adelman K, Bale SJ, Chung WK, Eng C, Evans JP, Herman GE, Hufnagel SB, Klein TE, Korf BR et al. Recommendations for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing, 2016 update (ACMG SF v2.0): a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics. Genet Med. 2017;19(2):249-55. Kalscheuer VM, James VM, Himelright ML, Long P, Oegema R, Jensen C, Bienek M, Hu H, Haas SA, Topf M et al. Novel missense mutation A789V in IQSEC2 underlies X- linked intellectual disability in the MRX78 family. Front Mol Neurosci. [online]. 2016;8:85 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.3389/fnmol.2015.00085. Kaplan MR, Cho MH, Ullian EM, Isom LL, Levinson SR, Barres BA. Differential control of clustering of the sodium channels Na(v)1.2 and Na(v)1.6 at developing CNS nodes of Ranvier. Neuron. 2001;30(1):105-19. Karaca E, Posey JE, Coban Akdemir Z, Pehlivan D, Harel T, Jhangiani SN, Bayram Y, Song X, Bahrambeigi V, Yuregir OO et al. Phenotypic expansion illuminates multilocus pathogenic variation. Genet Med. 2018;20(12):1528-37.

139

Katoh M. Functional and cancer genomics of ASXL family members. Br J Cancer. 2013;109(2):299-306. Katoh M and Katoh M. Identification and characterization of ASXL3 gene in silico. Int J Oncol. 2004;24(6):1617-22. Kaufman L, Ayub M, Vincent JB. The genetic basis of non-syndromic intellectual disability: a review. J Neurodev Disord. 2010;2(4):182-209. Kerkhof J, Schenkel LC, Reilly J, McRobbie S, Aref-Eshghi E, Stuart A, Rupar CA, Adams P, Hegele RA, Lin H et al. Clinical validation of copy number variant detection from targeted next-generation sequencing panels. J Mol Diagn 2017, 19(6):905-20. King M and Bearman P. Diagnostic change and the increased prevalence of autism. Int J Epidemiol. 2009;38(5):1224-34. Kirchhoff M, Bisgaard AM, Bryndorf T, Gerdes T. MLPA analysis for a panel of syndromes with mental retardation reveals imbalances in 5.8% of patients with mental retardation and dysmorphic features, including duplications of the Sotos syndrome and Williams-Beuren syndrome regions. Eur J Med Genet. 2007;50(1):33-42. Kirov G, Rees E, Walters JT, Escott-Price V, Georgieva L, Richards AL, Chambert KD, Davies G, Legge SE, Moran JL et al. The penetrance of copy number variations for schizophrenia and developmental delay. Biol Psychiatry. 2014;75(5):378-85. Koboldt DC, Zhang Q, Larson DE, Shen D, McLellan MD, Lin L, Miller CA, Mardis ER, Ding L, Wilson RK. VarScan2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 2012;22(3):568-76. Kochinke K, Zweier C, Nijhof B, Fenckova M, Cizek P, Honti F, Keerthikumar S, Oortveld MA, Kleefstra T, Kramer JM et al. A systematic phenomics analysis deconvolutes genes mutated in intellectual disability into biologically coherent modules. Am J Hum Genet. 2016;98(1):149-64. Kong A, Frigge ML, Masson G, Besenbacher S, Sulem P, Magnusson G, Gudjonsson SA, Sigurdsson A, Jonasdottir A, Jonasdottir A et al. Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk. Nature. 2012;488(7412):471-5. Kopanos C, Tsiolkas V, Kouris A, Chapple CE, Albarca Aguilera M, Meyer R, Massouras A. VarSome: the human genomic variant search engine. Bioinformatics. 2019;35(11):1978-80. Kuechler A, Czeschik JC, Graf E, Grasshoff U, Hüffmeier U, Busa T, Beck-Woedl S, Faivre L, Rivière JB, Bader I et al. Bainbridge-Ropers syndrome caused by loss-of-function variants in ASXL3: a recognizable condition. Eur J Hum Genet. 2017;25(2):183-91.

140

Kumar RA, KaraMohamed S, Sudi J, Conrad DF, Brune C, Badner JA, Gilliam TC, Nowak NJ, Cook EH Jr, Dobyns WB et al. Recurrent 16p11.2 microdeletions in autism. Hum Mol Genet. 2008;17(4):628-38. Kuhn RM, Haussler D, Kent WJ. The UCSC genome browser and associated tools. Brief Bioinform. 2013;14(2):144-61. Küry S, Ramaekers V, Bézieau S, Wolf B. Clinical utility gene card for: Biotinidase deficiency-update 2015. Eur J Hum Genet. [online]. 2016;24(7) [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1038/ejhg.2015.246. Kutteh WH. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 2015;33(3):161-8. Lai DC, Tseng YC, Guo HR. Trends in the prevalence of childhood disability: analysis of data from the national disability registry of Taiwan, 2000-2011. Res Dev Disabil. 2013;34(11):3766-72. Lam AC, Lam ST, Lai KK, Tong TM, Chau TC. High rate of detection of subtelomeric aberration by using combined MLPA and subtelomeric FISH approach in patients with moderate to severe mental retardation. Clin Biochem. 2006;39(3):196-202. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K, Dewar K, Doyle M, FitzHugh W et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001;409(6822):860-921. Landrum MJ, Lee JM, Benson M, Brown G, Chao C, Chitipiralla S, Gu B, Hart J, Hoffman D, Hoover J et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 2016;44(D1):D862-8. Leandro-García LJ, Leskelä S, Landa I, Montero-Conde C, Lopéz-Jiménez E, Letón R, Cascón A, Robledo M, Rodríguez-Antona C. Tumoral and tissue-specific expression of the major human beta-tubulin isotypes. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(4):214-23. Lee JA, Carvalho CM, Lupski JR. A DNA replication mechanism for generating nonrecurrent rearrangements associated with genomic disorders. Cell. 2007;131(7):1235-47. Lee S, Rudd S, Gratten J, Visscher PM, Prins JB, Dawson PA. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 2018;32(1):6-14. Lek M, Karczewski KJ, Minikel EV, Samocha KE, Banks E, Fennell T, O'Donnell-Luria AH, Ware JS, Hill AJ, Cummings BB et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 2016;536(7616):285-91.

141

Lelieveld SH, Reijnders MR, Pfundt R, Yntema HG, Kamsteeg EJ, de Vries P, de Vries BB, Willemsen MH, Kleefstra T, Löhner K et al. Meta-analysis of 2,104 trios provides support for 10 new genes for intellectual disability. Nat Neurosci. 2016;19(9):1194-6. Leonard H and Wen X. The epidemiology of mental retardation: challenges and opportunities in the new millennium. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 2002;8(3):117–34. Levy NS, Umanah GKE, Rogers EJ, Jada R, Lache O, Levy AP. IQSEC2-associated intellectual disability. Int J Mol Sci. [online] 2019;20(12):E3038 [cit. 26.7.2019]. doi: 10.3390/ijms20123038. Li H and Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 2009;25(14):1754-60. Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009;25(16):2078-9. Liao Y, Anttonen AK, Liukkonen E, Gaily E, Maljevic S, Schubert S, Bellan-Koch A, Petrou S, Ahonen VE, Lerche H et al. SCN2A mutation associated with neonatal epilepsy, late-onset episodic ataxia, myoclonus, and pain. Neurology. 2010;75(16):1454-8. Liehr T, Schreyer I, Kuechler A, Manolakos E, Singer S, Dufke A, Wilhelm K, Jančušková T, Čmejla R, Othman MAK et al. Parental origin of deletions and duplications – about the necessity to check for cryptic inversions. Mol Cytogenet. [online]. 2018;11:20 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/s13039-018-0369-1. Lim EC, Brett M, Lai AH, Lee SP, Tan ES, Jamuar SS, Ng IS, Tan EC. Next-generation sequencing using a pre-designed gene panel for the molecular diagnosis of congenital disorders in pediatric patients. Hum Genomics. [online]. 2015;9:33 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/s40246-015-0055-x. Lin S, Zhou Y, Fang Q, Wu J, Zhang Z, Ji Y, Luo Y. Chromosome 10q26 deletion syndrome: two new cases and a review of the literature. Mol Med Rep. 2016;14(6):5134-40. Lindstrand A, Malmgren H, Verri A, Benetti E, Eriksson M, Nordgren A, Anderlid BM, Golovleva I, Schoumans J, Blennow E. Molecular and clinical characterization of patients with overlapping 10p deletions. Am J Med Genet. 2010;152A(5):1233-43. Lipsker CW, Bölte S, Hirvikoski T, Lekander M, Holmström L, Wicksell RK. Prevalence of autism traits and attention-deficit hyperactivity disorder symptoms in a clinical sample of children and adolescents with chronic pain. J Pain Res. 2018;11:2827-36. Liu P, Carvalho CM, Hastings PJ, Lupski JR. Mechanisms for recurrent and complex human genomic rearrangements. Curr Opin Genet Dev. 2012;22(3):211-20.

142

Lowther C, Costain G, Stavropoulos DJ, Melvin R, Silversides CK, Andrade DM, So J, Faghfoury H, Lionel AC, Marshall CR et al. Delineating the 15q13.3 microdeletion phenotype: a case series and comprehensive review of the literature. Genet Med. 2015;17(2):149-57. Lucito R, Healy J, Alexander J, Reiner A, Esposito D, Chi M, Rodgers L, Brady A, Sebat J, Troge J et al. Representational oligonucleotide microarray analysis: a high- resolution method to detect genome copy number variation. Genome Res. 2003;13(10):2291- 305. Lunter G and Goodson M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 2011;21(6):936-9. Lupski JR. Genomic disorders ten years on. Genome Med. [online]. 2009;1(4):42 [cit. 20.7.2019]. doi: 10.1186/gm42. Luzzatto L. Somatic mutations in cancer development. Environ Health. [online]. 2011;10(Suppl1):S12 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1186/1476-069X-10-S1-S12. Ma R, Deng L, Xia Y, Wei X, Cao Y, Guo R, Zhang R, Guo J, Liang D, Wu L. A clear bias in parental origin of de novo pathogenic CNVs related to intellectual disability, developmental delay and multiple congenital anomalies. Sci Rep. [online]. 2017;7:44446 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1038/srep44446. Majewski J, Schwartzentruber J, Lalonde E, Montpetit A, Jabado N. What can exome sequencing do for you? J Med Genet. 2011;48(9):580-9. Maki H. Origins of spontaneous mutations: specificity and directionality of base-substitution, frameshift, and sequence-substitution mutageneses. Annu Rev Genet. 2002;36:279-303. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 2011;17(1):10-12. Martínez F, Caro-Llopis A, Roselló M, Oltra S, Mayo S, Monfort S, Orellana C. High diagnostic yield of syndromic intellectual disability by targeted next-generation sequencing. J Med Genet. 2017;54(2):87-92. Marx A, Backes C, Meese E, Lenhof HP, Keller A. EDISON-WWW: Exact Dynamic Programing Solution of the Wilcoxon-Mann-Whitney Test. Genomics Proteomics Bioinformactics. 2016;14(1):55-61. Matson JL and Shoemaker M. Intellectual disability and its relationship to autism spectrum disorders. Res Dev Disabil. 2009;30(6):1107-14. Matson JL and Cervantes PE. Comorbidity among persons with intellectual disabilities. Res Autism Spectr Disord. 2013;7(11):1318-22.

143

Matthijs G, Souche E, Alders M, Corveleyn A, Eck S, Feenstra I, Race V, Sistermans E, Sturm M, Weiss M et al. Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. Eur J Hum Genet. 2016;24(1):2-5. Mau UA, Bäckert IT, Kaiser P, Kiesel L. Chromosomal findings in 150 couples referred for genetic counselling prior to intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 1997;12(5):930- 7. Maulik PK, Mascarenhas MN, Mathers CD, Dua T, Saxena S. Prevalence of intellectual disability: a meta-analysis of population-based studies. Res Dev Disabil. 2011;32(2):419-36. Mayo S, Monfort S, Roselló M, Oltra S, Orellana C, Martínez F. In pursuit of new imprinting syndromes by epimutation screening in idiopathic neurodevelopmental disorder patients. Biomed Res Int. [online]. 2015;2015:341986 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1155/2015/341986. McKenna A, Hanna M, Banks E, Sivachenko A, Cibulskis K, Kernytsky A, Garimella K, Altshuler D, Gabriel S, Daly M et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010;20(9):1297-303. McMurray CT. Mechanisms of trinucleotide repeat instability during human development. Nat Rev Genet. 2010;11(11):786-99. Menten B, Swerts K, Delle Chiaie B, Janssens S, Buysse K, Philippé J, Speleman F. Array comparative genomic hybridization and flow cytometry analysis on spontaneous abortions and mors in utero samples. BMC Med Genet. [online]. 2009;10:89 [cit. 21.6.2019]. doi: 10.1186/1471-2350-10-89. Mignot C, McMahon AC, Bar C, Campeau PM, Davidson C, Buratti J, Nava C, Jacquemont ML, Tallot M, Milh M et al. IQSEC2-related encephalophaty in males and females: a comparative study including 37 novel patients. Genet Med. 2019;21(4):837-49. Michaelovsky E, Carmel M, Frisch A, Salmon-Divon M, Pasmanik-Chor M, Weizman A, Gothelf D. Risk gene-set and pathways in 22q11.2 deletion-related schizophrenia: a genealogical molecular approach. Transl Psychiatry. [online]. 2019;9(1):15 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1038/s41398-018-0354-9. Miller DT, Adam MP, Aradhya S, Biesecker LG, Brothman AR, Carter NP, Church DM, Crolla JA, Eichler EE, Epstein CJ et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet. 2010;86(5):749-64.

144

Miller JN and Pearce DA. Nonsense-mediated decay in genetic disease: friend or foe? Mutat Res Rev Mutat Res. 2014;762:52-64. Mir YR and Kuchay RAH. Advances in identification of genes involved in autosomal recessive intellectual disability: a brief review. J Med Genet. 2019;0:1-7. Muncke N, Jung C, Rüdiger H, Ulmer H, Roeth R, Hubert A, Goldmuntz E, Driscoll D, Goodship J, Schön K et al. Missense mutations and gene interruption in PROSIT240, a novel TRAP240-like gene, in patients with congenital heart defect (transposition of the great arteries). Circulation. 2003;108(23):2843-50. Najmabadi H, Hu H, Garshasbi M, Zemojtel T, Abedini SS, Chen W, Hosseini M, Behjati F, Haas S, Jamali P et al. Deep sequencing reveals 50 novel genes for recessive cognitive disorders. Nature 2011;478(7367):57-63. Namavar Y, Barth BG, Poll-The BT, Baas F. Classification, diagnosis and potential mechanisms in pontocerebellar hypoplasia. Orphanet J Rare Dis. [online]. 2011a;6:50 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/1750-1172-6-50. Namavar Y, Barth PG, Kasher PR, van Ruissen F, Brockmann K, Bernert G, Writzl K, Ventura K, Cheng EY, Ferriero DM et al. Clinical, neuroradiological and genetic findings in pontocerebellar hypoplasia. Brain. 2011b;134(Pt 1):143-56. Namavar Y, Chitayat D, Barth PG, van Ruissen F, de Wissel MB, Poll-The BT, Silver R, Baas F. TSEN54 mutations cause pontocerebellar hypoplasia type 5. Eur J Hum Genet. 2011c;19(6):724-6. Neale BM, Kou Y, Li L, Ma’ayan A, Samocha KE, Sabo A, Lin CF, Stevens C, Wang LS, Makarov V et al. Patterns and rates of exonic de novo mutations in autism spectrum disorders. Nature. 2012;485(7397):242-5. Nelson DL, Orr HT, Warren ST. The unstable repeats—three evolving faces of neurological disease. Neuron. 2013;77(5):825-43. Neri G, Schwartz CE, Lubs HA, Stevenson RE. X-linked intellectual disability update 2017. Am J Med Genet A. 2018;176A(6):1375-88. Newman S, Hermetz KE, Weckselblatt B, Rudd MK. Next-generation sequencing of duplication CNVs reveals that most are tandem and some create fusion genes at breakpoints. Am J Hum Genet. 2015;96(2):208-20. Ng PC and Henikoff S. Predicting deleterious amino acids substitutions. Genome Res. 2001;11(5):863-74. Nielsen J and Sillesen I. Incidence of chromosome aberrations among 11 148 newborn children. Humangenetik. 1975;30(1):1-12.

145

Niwa S, Takahashi H, Hirokawa N. β-Tubulin mutations that cause severe neuropathies disrupt axonal transport. EMBO J. 2013;32(10):1352-64. Nowakowska B. Clinical interpretation of copy number variants in the human genome. J Appl Genet. 2017;58(4):449-57. Nozaki J, Dakeishi M, Ohura T, Inoue K, Manabe M, Wada Y, Koizumi A. Homozygosity mapping to chromosome 5p15 of a gene responsible for Hartnup disease. Biochem Biophys Res Commun. 2001;284(2):255-60. Obenchain V, Lawrence M, Carey V, Gogarten S, Shannon P, Morgan M. VariantAnnotation: a Bioconductor package for exploration and annotation of genetic variants. Bioinformatics. 2014;30(14):2076-8. Olusanya BO, Davis CA, Wertlieb D, Boo N-Y, Nair MKC, Halpern R, Kuper H, Breinbauer C, de Vries PJ, Gladstone M et al. Developmental disabilities among children younger than 5 years in 195 countries and territories, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Glob Health. 2018;6(10):E1100-21. Orstavik KH. X chromosome inactivation in clinical practice. Hum Genet. 2009;126(3):363- 73. Owczarzy R, Tataurov AV, Wu Y, Manthey JA, McQuisten KA, Almabrazi HG, Pedersen KF, Lin Y, Garretson J, McEntaggart NO et al. IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers. Nucleic Acids Res. 2008;36(Web Server issue):W163-9. Park SJ, Jung EH, Ryu RS, Kang HW, Chung HD, Kang HY. The clinical application of array CGH for the detection of chromosomal defests in 20,126 unselected newborns. Mol Cytogenet. [online]. 2013;6(1):21 [cit. 10.7.2019]. doi: 10.1186/1755-8166-6-21. Patel MS, Becker LE, Toi A, Armstrong DL, Chitayat D. Severe, fetal-onset form of olivopontocerebellar hypoplasia in three sibs: PCH type 5? Am J Med Genet A. 2006;140(6):594-603. Paushkin SV, Patel M, Furia BS, Peltz SW, Trotta CR. Identification of a human endonuclease complex reveals a link between tRNA splicing and pre-mRNA 3’ end formation. Cell. 2004;117(3):311-21. Peeters SB, Cotton AM, Brown CJ. Variable escape from X-chromosome inactivation: identifying factors that tip the scales towards expression. Bioessays. 2014;36(8):746-56. Penrose LS. The relative effects of paternal and maternal age in mongolism. 1933. J Genet. 2009;88(1):9-14.

146

Perez JD, Rubinstein ND, Dulac C. New perspectives on genomic imprinting, an essential and multifaceted mode of epigenetic control in the developing and adult brain. Annu Rev Neurosci. 2016;39:347-84. Person F, Wilczak W, Hube-Magg C, Burdelski C, Möller-Koop C, Simon R, Noriega M, Sauter G, Steurer S, Burdak-Rothkamm S et al. Prevalence of βIII-tubulin (TUBB3) expression in human normal tissues and cancers. Tumour Biol. [online]. 2017;39(10):1010428317712166 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1177/1010428317712166. Pfundt R, De Rosario M, Vissers LELM, Kwint MP, Janssen IM, de Leeuw N, Yntema HG, Nelen MR, Lugtenberg D, Kamsteeg EJ et al. Detection of clinically relevant copy- number variants by exome sequencing in a large cohort of genetic disorders. Genet Med. 2017;19(6):667-75. Picker JD and Walsh CA. New innovations: therapeutic opportunities for intellectual disabilities. Ann Neurol. 2013;74(3):382-90. Pieras JI, Muñoz-Cabello B, Borrego S, Marcos I, Sanchez J, Madruga M, Antiñolo G. Somatic mosaicism for Y120X mutation in MECP2 gene causes atypical Rett syndrome in male. Brain Dev. 2011;33(7):608-11. Platzer K, Yuan H, Schütz H, Winschel A, Chen W, Hu C, Kusumoto H, Heyne HO, Helbig KL, Tang S et al. GRIN2B encephalopathy: novel findings on phenotype, variant clustering, functional consequences and treatment aspects. J Med Genet. 2017;54(7):460-70. Poláčková H. Detekce patogenních genetických variant pomocí sekvenování nové generace u dětských pacientů s mentální retardací [online]. Brno, 2019 [cit. 10.9.2019]. Dostupné z: . Diplomová práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Vedoucí práce Petr Kuglík. Quinlan AR and Hall IM. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 2010;26(6):841-2. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria: the R Foundation for Statistical Computing. 2016; ISBN: 3-900051-07-0. http://www.R-project.org/. Radley JA, O’Sullivan RBG, Turton SE, Cox H, Vogt J, Morton J, Jones E, Smithson S, Lachlan K, Rankin J et al. Deep phenotyping of 14 new patients with IQSEC2 variants, including monozygotic twins of discordant phenotype. Clin Genet. 2019;95(4):496-506.

147

Ratan ZA, Zaman SB, Mehta V, Haidere MF, Runa NJ, Akter N. Application of Fluorescence in situ hybridization (FISH) technique for the detection of genetic aberration in medical science. Cureus. [online]. 2017;9(6):e1325 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.7759/cureus.1325. Rauch A, Hoyer J, Guth S, Zweier C, Kraus C, Becker C, Zenker M, Hüffmeier U, Thiel C, Rüschendorf F et al. Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation. Am J Med Genet A. 2006; 140(19):2063-74. Ravnan JB, Tepperberg JH, Papenhausen P, Lamb AN, Hedrick J, Eash D, Ledbetter DH, Martin CL. Subtelomere FISH analysis of 11 688 cases: an evaluation of the frequency and pattern of subtelomere rearrangements in individuals with developmental disabilities. J Med Genet. 2006;43(6):478-89. Redin C, Gérard B, Lauer J, Herenger Y, Muller J, Quartier A, Masurel-Paulet A, Willems M, Lesca G, El-Chehadeh S et al. Efficient strategy for the molecular diagnosis of intellectual disability using targeted high-throughput sequencing. J Med Genet. 2014;51(11):724-36. Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, Feuk L, Perry GH, Andrews TG, Fiegler H, Shapero MH, Carson AR, Chen W et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 2006;444(7118):444-54. Rehm HL, Bale SJ, Bayrak-Toydemir P, Berg JS, Brown KK, Deignan JL, Friez MJ, Funke BH, Hedge MR, Lyon E et al. ACMG clinical laboratory standards for next- generation sequencing. Genet Med. 2013;15(9):733-47. Rehm HL, Berg JS, Brooks LD, Bustamante CD, Evans JP, Landrum MJ, Ledbetter DH, Maglott DR, Martin CL, Nussbaum RL et al. ClinGen—the Clinical Genome resource. N Engl J Med. 2015;372(23):2235-42. Reis FG, Pinto IP, Minasi LB, Melo AV, Cunha DM, Ribeiro CL, da Silva CC, Silva DM, da Cruz AD. A rare case of a boy with de novo microduplication at 5q35.2q35.3 from central Brazil. Genet Mol Rers. [online]. 2017;16(1) [cit. 19.6.2019]. doi: 10.4238/gmr16019197. Reizel Y, Itzkovitz S, Adar R, Elbaz J, Jinich A, Chapal-Ilani N, Maruvka YE, Nevo N, Marx Z, Horovitz I et al. Cell lineage analysis of the mammalian female germline. PLoS Genet. [online]. 2012;8(2):e1002477 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1371/journal.pgen.1002477.

148

Rice AM and McLysaght A. Dosage sensitivity is a major determinant of human copy number variant pathogenicity. Nat Commun. [online]. 2017;8:14366 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1038/ncomms14366. Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, Grody WW, Hedge M, Lyon E, Spector E et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-24. Ritz A, Paris PL, Ittmann MM, Collins C, Raphael BJ. Detection of recurrent rearrangement breakpoints from copy number data. BMC Bioinformatics. [online]. 2011;12:114 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/1471-2105-12-114. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Winckler W, Guttman M, Lander ES, Getz G, Mesirov JP. Integrative genomic viewer. Nat Biotechnol. 2011;29(1):24-6. Rodrigues M, Nunes J, Figueiredo S, Martins de Campos A, Geraldo AF. Neuroimaging assessment in Down syndrome: a pictorial review. Insights Imaging. [online]. 2019;10(1):52 [cit. 8.9.2019]. doi: 10.1186/s13244-019-0729-3. Rosenfeld JA, Kim KH, Angle B, Troxell R, Gorski JL, Westemeyer M, Frydman M, Senturias Y, Earl D, Torchia B et al. Further evidence of contrasting phenotypes caused by reciprocal deletions and duplications: duplication of NSD1 causes growth retardation and microcephaly. Mol Syndromol. 2013a;3(6):247-54. Rosenfeld JA, Coe BP, Eichler EE, Cuckle H, Shaffer LG. Estimates of penetrance for recurrent pathogenic copy-number variations. Genet Med. 2013b;15(6):478-81. Ross CA and Poirier MA. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nat Med. 2004;10(Suppl):S10-7. Sahoo T, Theisen A, Rosenfeld JA, Lamb AN, Ravnan JB, Schultz RA, Torchia BS, Neill N, Casci I, Bejjani BA et al. Copy number variants of schizophrenia susceptibility loci are associated with a spectrum of speech and developmental delays and behavior problems. Genet Med. 2011;13(10):868-80. Sachwitz J, Meyer R, Fekete G, Spranger S, Matulevičiené A, Kučinskas V, Bach A, Luczay A, Brüchle NO, Eggermann K et al. NSD1 duplication in Silver-Russell syndrome (SRS): molecular karyotyping in patients with SRS features. Clin Genet. 2017;91(1):73-8. Sánchez-Albisua I, Frölich S, Barth PG, Steinlin M, Krägeloh-Mann I. Natural course of pontocerebellar hypoplasia type 2A. Orphanet J Rare Dis. [online]. 2014;9:70 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1186/1750-1172-9-70.

149

Scriver CR, Mahon B, Levy HL, Clow CL, Reade TM, Kronick J, Lemieux B, Laberge C. The Hartnup phenotype: Mendelian transport disorder, multifactorial disease. Am J Hum Genet. 1987;40(5):401-12. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 1971;2(7731):971-2. Ségurel L, Wyman MJ, Przeworski M. Determinants of mutation rate variation in the human germline. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2014;15:47-70. Shashi V, Pena LD, Kim K, Burton B, Hempel M, Schoch K, Walkiewicz M, McLaughlin HM, Cho M, Stong N et al. De novo truncating variants in ASXL2 are associated with a unique and recognizable clinical phenotype. Am J Hum Genet. 2016;99(4):991-9. Shattuck PT. The contribution of diagnostic substitution to the growing administrative prevalence of autism in US special education. Pediatrics. 2006;117(4):1028-37. Sherry ST, Ward MH, Kholodov M, Baker J, Phan L, Smigielski EM, Sirotkin K. dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucleic Acids Res. 2001;29(1):308-11. Shevell M, Ashwall S, Donley D, Flint J, Gingold M, Hirtz D, Majnemer A, Noetzel M, Sheth RD; Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology; Practice Committee of the Child Neurology Society. Practice parameter: evaluation of the child with global developmental delay: report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and The Practice Committee of the Child Neurology Society. Neurology. 2003;60(3):367-80. Shinawi M, Liu P, Kang SH, Shen J, Belmont JW, Scott DA, Probst FJ, Craigen WJ, Graham BH, Pursley A et al. Recurrent reciprocal 16p11.2 rearrangements associated with global developmental delay, behavioural problems, dysmorphism, epilepsy, and abnormal head size. J Med Genet. 2010;47(5):332-41. Shogren KA and Turnbull HR. Public policy and outcomes for persons with intellectual disability: extending and expanding the public policy framework of AAIDD's 11th Edition of Intellectual Disability: Definition, Classification, and Systems of Support. Intellect Dev Disabil. 2010;48(5):375-86. Shoubridge C, Tarpey PS, Abidi F, Ramsden SL, Rujirabanjerd S, Murphy JA, Boyle J, Shaw M, Gardner A, Proos A et al. Mutations in the guanine nucleotide exchange factor gene IQSEC2 cause nonsyndromic intellectual disability. Nat Genet. 2010;42(6):486-8.

150

Shoubridge C, Harvey RJ, Dudding-Byth T. IQSEC2 mutation update and review of the female-specific phenotype spectrum including intellectual disability and epilepsy. Hum Mutat. 2019;40(1):5-24. Shvetsova E, Sofronova A, Monajemi R, Gagalova K, Draisma HHM, White SJ, Santen GWE, Chuva de Sousa Lopes SM, Heijmans BT, van Meurs J et al. Skewed X- inactivation is common in the general female population. Eur J Hum Genet. 2019;27(3):455- 65. Schaaf CP, Wiszniewska J, Beaudet AL. Copy number and SNP arrays in clinical diagnostics. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2011, 12:25-51. Schwarz N, Bast T, Gaily E, Golla G, Gorman KM, Griffiths LR, Hahn A, Hukin J, King M, Korff C et al. Clinical and genetic spectrum of SCN2A-associated episodic ataxia. Eur J Paediatr Neurol. 2019;23(3):438-47. Schwarz JM, Cooper DN, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster2: mutation prediction for the deep-sequencing age. Nat Methods. 2014;11(4):361-2. Silva M, de Leeuw N, Mann K, Schuring-Blom H, Morgan S, Giardino D, Rack K, Hastings R. European guidelines for constitutional cytogenomic analysis. Eur J Hum Genet. 2019;27(1):1-16. Simonati A, Cassandrini D, Bazan D, Santorelli FM. TSEN54 mutation in a child with pontocerebellar hypoplasia type 1. Acta Neuropathol. 2011;121(5):671-3. Smolková K, Kadlčíková D, Wayhelová M, Filková H, Zrnová E, Smetana J, Budinská E, Gaillyová R, Kuglík P. Přínosy molekulárně cytogenetických metod při vyšetřování pacientů s DiGeorgeovým syndromem na OLG FN Brno v letech 1998-2018. In 51. výroční cytogenetická konference (Ostrava, 6.-7.9.2018). Snoeijen-Schouwenaars FM, van Ool JS, Verhoeven JS, van Mierlo P, Braakman HMH, Smeets EE, Nicolai J, Schoots J, Teunissen MWA, Rouhl RPW et al. Diagnostic exome sequencing in 100 consecutive patients with both epilepsy and intellectual disability. Epilepsia. 2019;60(1):155-64. Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A, Döhner H, Cremer T, Lichter P. Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalances. Genes Chromosomes Cancer. 1997;20(4):399-407. Speir ML, Zweig AS, Rosenbloom KR, Raney BJ, Paten B, Nejad P, Lee BT, Learned K, Karolchik D, Hinrichs AS et al. The UCSC Genome Browser database: 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016;44(D1):D717-25.

151

Spielmann M, Lupiáñez DG, Mundlos S. Structural variation in the 3D genome. Nat Rev Genet. 2018;19(7):453-67. Srivastava AK and Schwartz CE. Intellectual disability and autism spectrum disorders: causal genes and molecular mechanisms. Neurosci Biobehav Rev. 2014;46(Pt 2):161-74. Srivastava A, Ritesh KC, Tsan YC, Liao R, Su F, Cao X, Hannibal MC, Keegan CE, Chinnaiyan AM, Martin DM et al. De novo dominant ASXL3 mutations alter H2A deubiquitination and transcription in Bainbridge-Ropers syndrome. Hum Mol Genet. 2016;25(3):597-608. Stankiewicz P and Lupski JR. Genomic architecture, rearrangements and genomic disorders. Trends Genet. 2002;18(2):74-82. Sun Y, Ruivenkamp CA, Hoffer MJ, Vrijenhoek T, Kriek M, van Asperen CJ, den Dunnen JT, Santen GW. Next-generation diagnostics: gene panel, exome, or whole genome? Hum Mutat. 2015;36(6):648-55. Tassé MJ, Luckasson R, Nygren M. AAIDD proposed recommendations for ICD-11 and the condition previously known as mental retardation. Intellect Dev Disabil. 2013;51(2):127- 31. Thuresson AC, Bondeson ML, Edeby C, Ellis P, Langford C, Dumanski JP, Annerén G. Whole-genome array-CGH for detection of submicroscopic chromosomal imbalances in children with mental retardation. Cytogenet Genome Res. 2007;118(1):1-7. Traylor RN, Fan Z, Hudson B, Rosenfeld JA, Shaffer LG, Torchia BS, Ballif BC. Microdeletion of 6q16.1 encompassing EPHA7 in a child with mild neurological abnormalities and dysmorphic features: case report. Mol Cytogenet. [online]. 2009;2:17 [cit. 11.7.2019]. doi: 10.1186/1755-8166-2-17. Trcek T, Sato H, Singer RH, Maquat LE. Temporal and spatial characterization of nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev. 2013;27(5):541-51. Tukiainen T, Villani AC, Yen A, Rivas MA, Marshall JL, Satija R, Aguirre M, Gauthier L, Fleharty M, Kirby A et al. Landscape of X chromosome inactivation across human tissues. Nature. 2017;550(7675):244-8. UniProt Consortium. The universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 2008;36(Database issue):D190-5. Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. [online]. 2012;40(15):e115 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1093/nar/gks596.

152

Utami KH, Winata CL, Hillmer AM, Aksoy I, Long HT, Liany H, Chew EG, Mathavan S, Tay SK, Korzh V et al. Impaired development of neural-crest cell-derived organs and intellectual disability caused by MED13L haploinsufficiency. Hum Mutat. 2014;35(11):1311- 20. Valenti D, Manente GA, Moro L, Marra E, Vacca RA. Deficit of complex I activity in human skin fibroblasts with chromosome 21 trisomy and overproduction of reactive oxygen species by mitochondria: involvement of the cAMP/PKA signalling pathway. Biochem J. 2011;435(3):679-88. Valenti D, de Bari L, De Filippis B, Henrion-Caude A, Vacca RA. Mitochondrial dysfunction as a central actor in intellectual disability-related diseases: an overview of Down syndrome, autism, Fragile X and Rett syndrome. Neurosci Biobehav Rev. 2014;46(Pt 2):202- 17. Valiente-Pallejà A, Torrell H, Muntané G, Cortés MJ, Martínez-Leal R, Abasolo Y, Alonso Y, Vilella E, Martorell L. Genetic and clinical evidence of mitochondrial dysfunction in autism spectrum disorder and intellectual disability. Hum Mol Genet. 2018;27(5):891-900. van Dijk EL, Jaszczyszyn Y, Naguin D, Thermes C. The third revolution in sequencing technology. Trends Genet. 2018;34(9):666-81. van den Veyver IB. Skewed X inactivation in X-linked disorders. Semin Reprod Med. 2001;19(2):183-91. van Haelst MM, Monroe GR, Duran K, van Binsbergen E, Breur JM, Giltay JC, van Haaften G. Further confirmation of the MED13L haploinsufficiency syndrome. Eur J Hum Genet. 2015;23(1):135-8. van Karnebeek CD and Stockler S. Treatable inborn errors of metabolism causing intellectual disability: a systematic literature review. Mol Genet Metab. 2012;105(3):368-81. Vavouri T, Semple JI, Garcia-Verdugo R, Lehner B. Intristic protein disorder and interaction promiscuity are widely associated with dosage sensitivity. Cell. 2009;138(1):198- 208. Veitia RA. Exploring the etiology of haploinsufficiency. Bioessays. 2002;24(2):175-84. Vermeesch JR, Brady PD, Sanlaville D, Kok K, Hastings RJ. Genome-wide arrays: quality criteria and platforms to be used in routine diagnostics. Hum Mutat. 2012;33(6):906- 15. Volpi EV and Bridger JM. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. Biotechniques. 2008;45(4):385-409.

153

Vrijenhoek T, Kraaijeveld K, Elferink M, de Ligt J, Kranendonk E, Santen G, Nijman IJ, Butler D, Claes G, Costessi A et al. Next-generation sequencing-based genome diagnostics across clinical genetics centers: implementation choices and their effects. Eur J Hum Genet. 2015;23(9):1142-50. Vystavělová D. Analýza genetických abnormalit u pacientů s DiGeorgeovým syndromem pomocí celogenomových metod [online]. Brno, 2016 [cit. 14.8.2019]. Dostupné z: . Diplomová práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Vedoucí práce Petr Kuglík. Wang R, Carter J, Lench N. Evaluation of real-time quantitative PCR as a standard cytogenetic diagnostic tool for confirmation of microarray (aCGH) results and determination of inheritance. Genet Test Mol Biomarkers, 2013;17(11):821-5. Wapner RJ, Martin CL, Levy B, Ballif BC, Eng CM, Zachary JM, Savage M, Platt LD, Saltzman D, Grobman WA et al. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med. 2012;367(23):2175-84. Wayhelova M, Oppelt J, Smetana J, Hladilkova E, Filkova H, Makaturova E, Nikolova P, Beharka R, Gaillyova R, Kuglik P. Novel de novo frameshift variant in the ASXL3 gene in a child with microcephaly and global developmental delay. Mol Med Rep. 2019;20(1):505- 512. Weise A, Mrasek K, Klein E, Mulantinho M, Llerena JC Jr, Hardekopf D, Pekova S, Bhatt S, Kosyakova N, Liehr T. Microdeletion and microduplication syndromes. J Histochem Cytochem. 2012; 60(5):346-58. Wells RD. Molecular basis of genetic instability of triplet repeats. J Biol Chem. 1996;271(6):2875-8. Wenger AM, Guturu H, Bernstein JA, Bejerano G. Systematic reanalysis of clinical exome data yields additional diagnoses: implications for providers. Genet Med. 2017;19(2):209-14. Wentzel C, Fernström M, Ohrner Y, Annerén G, Thuresson AC. Clinical variability of the 22q11.2 duplication syndrome. Eur J Med Genet. 2008;51(6):501-10. Westerfield L, Darilek S, van den Veyver IB. Counseling challenges with variants of uncertain significance and incidental findings in prenatal genetic screening and diagnosis. J Clin Med 2014;3(3):1018-32. Wieczorek D. Autosomal dominant intellectual disability. Med Genet. 2018;30(3):318-22. Wilcken B, Yu JS, Brown DA. Natural history of Hartnup disease. Arch Dis Child. 1977;52(1):38-40.

154

Wincent J, Bruno DL, van Bon BW, Bremer A, Stewart H, Bongers EM, Ockeloen CW, Willemsen MH, Keays DD, Baird G et al. Sixteen new cases contributing to the characterization of patients with distal 22q11.2 microduplications. Mol Syndromol. 2010;1(5):246-54. Wolff M, Johannesen KM, Hedrich UBS, Masnada S, Rubboli G, Gardella E, Lesca G, Ville D, Milh M, Villard L et al. Genetic and phenotypic heterogeneity suggest therapeutic implications in SCN2A-related disorders. Brain. 2017;140(5):1316-36. Wong WS, Solomon BD, Bodial DL, Kothiyal P, Eley G, Huddleston KC, Baker R, Thach DC, Iyer RK, Vockley JG et al. New observations on maternal age effect on germline de novo mutations. Nat Commun. [online]. 2016;7:10486 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1038/ncomms10486. Wright CF, Fitzgerald TW, Jones WD, Clayton S, McRae JF, van Kogelenberg M, King DA, Ambridge K, Barrett DM, Bayzetinova T et al. Genetic diagnosis of developmental disorders in the DDD study: a scalable analysis of genome-wide research data. Lancet. 2015;385(9975):1305-14. Wright CF, Middleton A, Barrett JC, osh HV, FitzPatrick DR, Hurles ME, Parker M. Returning genome sequences to research participants: Policy and practice. Wellcome Open Res. [online]. 2017;2:15 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.12688/wellcomeopenres.10942.1. Wright CF, McRae JF, Clayton S, Gallone G, Aitken S, FitzGerald TW, Jones P, Prigmore E, Rajan D, Lord J et al. Making new genetic diagnoses with old data: iterative reanalysis and reporting from genome-wide data in 1,133 families with developmental disorders. Genet Med. 2018;20(10):1216-23. Wyandt HE, Shim SH, Mark HF, Huang XL, Milunsky JM. Duplication of 11p14.3-p15.1 in a mentally retarded proband and his mother detected by G-banding and confirmed by high- resolution CGH and BAC FISH. Exp Mol Pathol. 2006;80(3):262-6. Yamagishi H, Ishii C, Maeda J, Kojima Y, Matsuoka R, Kimura M, Takao A, Momma K, Matsuo N. Phenotypic discordance in monozygotic twins with 22q11.2 deletion. Am J Med Genet. 1998;78(4):319-21. Yao R, Yu T, Qing Y, Wang J, Shen Y. Evaluation of copy number variant detection from panel-based next-generation sequencing data. Mol Genet Genomic Med. [online]. 2019;7(1):e00513 [cit. 19.6.2019]. doi: 10.1002/mgg3.513. Epub Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S, Madden TL. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. [online]. 2012;13:134 [cit. 23.6.2019]. doi: 10.1186/1471-2105-13-134.

155

Yu S, Kielt M, Stegner AL, Kibiryeva N, Bittel DC, Cooley LD. Quantitative real-time polymerase chain reaction for the verification of genomic imbalances detected by microarray- based comparative genomic hybridization. Genet Test Mol Biomarkers. 2009;13(6):751-60. Zhang H, Lu X, Beasley J, Mulvihill JJ, Liu R, Li S, Lee JY. Reversed clinical phenotype due to a microduplication of Sotos syndrome region detected by array CGH: microcephaly, developmental delay and delayed bone age. Am J Med Genet A. 2011;155A(6):1374-8. Zhang X, Zhang Y, Zhu X, Purmann C, Haney MS, Ward T, Khechaduri A, Yao J, Weissman SM, Urban AE. Local and global chromatin interactions are altered by large genomic deletions associated with human brain development. Nat Commun. [online]. 2018;9(1):5356 [cit. 11.7.2019]. doi: 10.1038/s41467-018-07766-x. Zhu Y, Chen L, He J, Chen Y, Gou H, Ma L, Qu Y, Liu Y, Wang D, Zhu Y. Study of seizure-manifested Hartnup disorder case induced by novel mutations in SLC6A19. Open Life Sci. 2018;13(1):22-7.

156

Seznam obrázků

strana

Obrázek 1 Světová prevalence DID na 100 000 dětí mladších 5 let 19

Obrázek 2 Srovnání základních mechanismů vzniku CNVs 24

Obrázek 3 Příčiny fenotypové variability u jedinců s rekurentními patogenními 32 CNVs Obrázek 4 Diagnostický algoritmus vyšetření dětí s DID, PAS a asociovanými 43 VVV na OLG FN Brno Obrázek 5 Věkové rozložení dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými 50 VVV v době vyšetření metodou array-CGH Obrázek 6 Schéma získání oblastí zájmu pomocí systému SureSelect Target 55 Enrichment Obrázek 7 Vývoj průměrného věku rodičů v době narození dítěte v JmK (2000- 60 2018) a v našem souboru (1995-2018) Obrázek 8 Přehled zastoupení jednotlivých kategorií nálezů detekovaných 61 metodou array-CGH u souboru 724 dětí s DID, PAS a asociovanými VVV Obrázek 9 Rodokmen rodiny probandky 154 s mikroduplikací oblasti 15q11.2- 66 q13.3 (4,87 Mb) a její familiální segregace Obrázek 10 Rodokmen rodiny probanda 411 s mikroduplikací oblasti 15q11.2- 67 q13.1 (4,79 Mb) a její familiální segregace Obrázek 11 Profil array-CGH chromosomu 12 s non-rekurentní 68 mikrodelecí oblasti p12.3-p13.2 (4,95 Mb) Obrázek 12 Profil array-CGH chromosomu 5 s non-rekurentní mikroduplikací 69 oblasti q35.2-q35.3 (495 kb) Obrázek 13 Chromosomální lokalizace submikroskopických 72 patogenních/pravděpodobně patogenních CNVs Obrázek 14 Vztah mezi velikostmi CNVs a jejich klinickým významem 77

Obrázek 15 Vztah mezi klinickým významem a velikostmi CNVs 78

Obrázek 16 Příklad kontroly kvality sekvenačních dat po jejich zpracování a 84 mapování na referenční genom hg19 Obrázek 17 Srovnání celkového počtu sekvenčních variant v rámci rodinných 85 („trio-based“) analýz Obrázek 18 Verifikace deleční sekvenční varianty v genu MED13L u probanda 64 87 a jeho rodičů metodou Sangerova sekvenování Obrázek 19 Verifikace deleční sekvenční varianty v genu ASXL3 u probandky 196 88 a jejích rodičů metodou Sangerova sekvenování Obrázek 20 Vizualizace heterozygotní sekvenční varianty A>G na chromosomu 2 89 v pozici chr2:166243337 genu SCN2A v programu IGV 2.3.82

157

Obrázek 21 Vizualizace sekvenční varianty A>G na chromosomu 2 v pozici 90 chr2:166243337 (gen SCN2A) ve webové aplikaci gene.iobio Obrázek 22 Interpretace patogenní varianty p.M1545V v genu SCN2A ve webové 90 aplikaci gene.iobio.io Obrázek 23 Verifikace SNV v genu SCN2A u probandky 201 a jejích rodičů 91 metodou Sangerova sekvenování Obrázek 24 Verifikace SNV v genu SCN2A u probanda 233 a jeho rodičů 92 metodou Sangerova sekvenování Obrázek 25 Verifikace SNVs v genu TSEN54 u probandky 282 a jejích rodičů 93 metodou Sangerova sekvenování Obrázek 26 Vizualizace 2-bp deleční sekvenční varianty (delece TC) na 94 chromosomu X v pozici chrX:53279944-53279945 (gen IQSEC2) v programu IGV 2.3.82 Obrázek 27 Vizualizace deleční varianty TC na chromosomu X v pozici 95 chrX:53279944-53279945 (gen IQSEC2) ve webové aplikaci gene.iobio. Obrázek 28 Interpretace patogenní varianty p.D605Pfs*3 v genu IQSEC2 ve 95 webové aplikaci gene.iobio.io Obrázek 29 Verifikace hemizygotní deleční sekvenční varianty v X-vázaném 96 genu IQSEC2 u probandů 14 a 14_B1 a heterozygotního stavu této varianty u jejich matky Verifikace sekvenční varianty v genu BTD Obrázek 30 Verifikace SNVs v genu SLC6A19 u probanda 414 a jeho rodičů 97 metodou Sangerova sekvenování Obrázek 31 Verifikace sekvenční varianty v genu TUBB3 u probanda 621 a jeho 98 rodičů metodou Sangerova sekvenování

158

Seznam tabulek

strana

Tabulka 1 Klasifikace závažnosti DID podle různých klasifikačních kritérií 18

Tabulka 2 Soubor kritérií pro klasifikaci patogenních variant. 45

Tabulka 3 Soubor kritérií pro klasifikaci benigních variant 46

Tabulka 4 Pravidla kombinace kritérií pro klasifikaci sekvenčních variant 47

Tabulka 5 Klinická charakteristika souboru 724 dětí s DID a asociovanými 50 VVV Tabulka 6 Nálezy rekurentních mikrodelecí a mikroduplikací 63-64

Tabulka 7 Nálezy non-rekurentních mikrodelecí a mikroduplikací. 65

Tabulka 8 Nálezy dvou submikroskopických CNVs 70

Tabulka 9 Srovnání rozsahu a původu patogenních/pravděpodobně 75 patogenních CNVs Tabulka 10 Srovnání velikostních charakteristik submikroskopických CNVs a 76 přehled jejich původu na základě vyšetření rodičů daných jedinců Tabulka 11 Statistické srovnání velikostí CNVs mezi jednotlivými 76 klasifikačními skupinami Tabulka 12 Srovnání velikosti mikrodelecí a mikroduplikací v jednotlivých 79 kategoriích CNVs podle klinické významnosti Tabulka 13 Přehled patogenních či pravděpodobně patogenních sekvenčních 82-83 variant detekovaných metodou cíleného NGS v souboru 35 dětských pacientů s DID, PAS a asociovanými VVV

159

Seznam publikací a konferenčních příspěvků

Prvoautorské publikace k tématu disertační práce v časopise s IF

IF (2017) = 3,317 (v době odeslání k recenznímu řízení, podzim 2018) IF (2018) = 2,568

Další prvoautorské publikace v časopise s IF

Prvoautorské publikace v časopise bez IF

Wayhelova M, Oppelt J, Smetana J, Filkova H, Hladilkova E, Soukalova J, Gaillyova R, Kuglik P. Two distinct de novo pathogenic sequence variants in the SCN2A gene on children with early infantile epileptic encephalopathy/Ohtahara syndrome. J Neurol Disord. 2017, vol. 5, no. 6, p.369. ISSN: 2329-6895. doi: 10.4172/2329-6895.1000369

Zahraniční konference s abstraktem - poster

Wayhelova M, Hladilkova E, Vallova V, Smetana J, Filkova H, Gaillyova R, Kuglik P. "Two-hit" model as an explanation of variable expressivity of recurrent submicroscopic chromosomal rearrangements in children with intellectual disability and developmental delay. In 12th European Cytogenetics Conference. 2019. (Salzburg, Rakousko, 6.-9.7.2019).

160

Hruzova D, Wayhelova M, Koristek Z, Jureckova L. Combination of different techniques for genetic stability analysis of cell based medicinal product. Relevance of array-CGH. In 10th ISABS Conference on Forensic and Anthropologic Genetics and Mayo Clinic Lectures in Individualized Medicine. Presentation number MG 20. 2017. (Dubrovník, Chorvatsko, 19.- 24.6.2017).

Wayhelova M, Oppelt J, Vesela D, Smetana J, Pardy F, Filkova H, Matuchova D, Soukalova J, Gaillyova R, Kuglik P. The clinical utility of array-CGH and targeted NGS in idiopathic intellectual disabilities and developmental delays: a case report of SCN2A p.Ala263Val variant. 2017. In European Human Genetics Conference 2017. Eur. J. Hum. Genet. 2018. doi: 10.1038/s41431-018-0247-7. ISSN 1018-44813. (Kodaň, Dánsko, 27.–30. 5. 2017)

Wayhelova M, Mikulasova A, Vallova V, Kasikova K, Smetana J, Gaillyova R, Kuglik P. Whole-genome screening in a set of Czech patients with mental retardation and developmental abnormalities using array-CGH technique: our experience from 2007 to 2014. In 10th European Cytogenetics Conference. 2015. Chromosome Res. 23(Suppl. 1): S37-S38. ISSN: 0967-3849. (Štrasburg, Francie, 4.-7.7.2015).

Tuzemské konference bez abstraktu – přednáška

Wayhelová M, Hladílková E, Smetana J, Filková H, Gaillyová R, Kuglík P. Model dvou zásahů jako vysvětlení variabilní expresivity rekurentních submikroskopických přestaveb genomu u dětských pacientů s vývojovým postižením. 2018. In 51. výroční cytogenetická konference (Ostrava, 6.-7.9.2018).

Smolková K, Kadlčíková D, Wayhelová M, Filková H, Zrnová E, Smetana J, Budinská E, Gaillyová R, Kuglík P. Přínosy molekulárně cytogenetických metod při vyšetřování pacientů s DiGeorgeovým syndromem na OLG FN Brno v letech 1998-2018. 2018. In 51. výroční cytogenetická konference (Ostrava, 6.-7.9.2018).

Wayhelová M, Filková H, Hladílková E, Smetana J, Šoukalová J, Prášilová Š, Gaillyová R, Kuglík P. Rekurentní mikroduplikační syndrom 15q11-q13 v rodinách dětí s mentálními retardacemi a poruchami autistického spektra. 2018. In XII. Hradecký genetický den (Hradec Králové, 10.5.2018).

Wayhelová M, Oppelt J, Veselá D, Smetana J, Pardy F, Filková H, Matuchová D, Gaillyová R, Kuglík P. Klinické využití komparativní genomové hybridizace na mikročipech a cíleného sekvenování „nové generace“ u dětí s mentálními retardacemi a vývojovými vadami. 2017. In 50. výroční cytogenetická konference (Praha, 7.-8.9.2017).

Hanáková M, Wayhelová M, Oppelt J, Hladílková E, Filková H, Vilémová M, Králová M, Kalina Z, Kuglík P, Gaillyová R. Komplexní analýza genomu - klíč k vysvětlení příčin postižení pacientů nosičů balancovaných přestaveb? Kazuistika. 2017. In 50. výroční cytogenetická konference (Praha, 7.-8.9.2017).

161

Wayhelová M, Matuchová D, Hanáková M, Gaillyová R, Kuglík P. Vzácné mikrodeleční a mikroduplikační syndromy detekované pomocí metody array-CGH. 2016. In Brněnský genetický den (Brno, 6.10.2016).

Hanáková M, Wayhelová M, Blažková D, Vilémová M, Makaturová E, Večerková P, Kuglík P, Němečková J, Prášilová Š, Gaillyová R. De novo vzniklé chromosomové aberace postihující chromosom 18 u dvou pacientů vyšetřených na OLG FN Brno (kazuistiky). 2016. In 49. výroční cytogenetická konference a XI. Hradecký genetický den (Hradec Králové, 22.- 23.9.2016).

Tuzemské konference s abstraktem - přednáška

Wayhelová M, Oppelt J, Smetana J, Pardy F, Filkova H, Gaillyova R, Kuglik P. The clinical impact of targeted „next-generation“ sequencing in molecular diagnostics of intellectual disabilities and multiple congenital abnormalities. 2017. In The Biomania Student Scientific Meeting 2017. ISBN 978-80-210-8737-8. (Brno, 3.10.2017).

Wayhelová M, Mikulášová A, Smetana J, Kašíková K, Vallová V, Filková H, Blažková D, Gaillyová R, Kuglík P. Účinnost různých platforem DNA mikročipů při vyšetřování dětí s MR a vrozenými vývojovými vadami na OLG FN Brno v letech 2007-2015. 2015. In Celostátní sjezd Společnosti lékařské genetiky ČLS JEP a 48. výroční cytogenetická konference, Sborník abstraktů Brno 21.-25.9.2015. ISBN 978-80-210-7933-5. (Brno, 23.- 24.9.2015).

Tuzemské konference s abstraktem – poster

Hanáková M, Vaňásková M, Gromesová B, Vilémová M, Nikolová P, Wayhelová M, Filková H, Hladílková E, Němečková J, Kalina Z, Sobotka J, Kuglík P, Gaillyová R. De novo nebalancovaná komplexní přestavba zahrnující chromosomy 3, 7, 14 nalezená u postižených dvojčat narozených po IVF – kazuistika. 2019. In Celostátní sjezd Společnosti lékařské genetiky a genomiky ČLS JEP a 52. Výroční cytogenetická konference (Plzeň, 11.- 13.9.2019).

Hladílková E, Filková H, Wayhelová M, Vallová V, Valášková I, Kuglík P. Mikrodelece/mikroduplikace oblasti 17q11.2 zahrnující NF1 gen – korelace genotypu s fenotypem. 2019. In Celostátní sjezd Společnosti lékařské genetiky a genomiky ČLS JEP a 52. Výroční cytogenetická konference (Plzeň, 11.-13.9.2019).

Kuglík P, Veselá D, Wayhelová M, Filková H, Smetana J, Matuchová D, Hladílková E, Vallová V, Gaillyová R. Význam mikroduplikací u dětských pacientů s mentální retardací a vrozenými vývojovými vadami vyšetřených pomocí techniky array-CGH. 2017. In 50. výroční cytogenetická konference (Praha, 7.-8.9.2017).

162

Další tuzemské akce - přednáška

Wayhelová M, Filková H, Matuchová D, Vilémová M, Gaillyová R, Kuglík P. Genetická vyšetření dětí s mentálními retardacemi a vrozenými vadami. 2016. In Brněnské dny pro zdraví. (Brno, 27.9.2016).

Wayhelová M. Cvičení z cytogenetiky. 2016. In Workshop „Univerzitní vzdělávání genetiky“. (Brno, 26.5.2016).

163

Seznam příloh strana

Příloha 1 Produktový leták ClearSeq Inherited Disease (Agilent 165-167 Technologies, Santa Clara, CA, USA) Příloha 2 Seznam genů v panelu ClearSeq Inherited Disease (Agilent 168-174 Technologies, Santa Clara, CA, USA) Příloha 3 Přehled DNA primerů pro verifikace nálezů sekvenčních variant 175 metodou Sangerova sekvenování Příloha 4 Medián a průměrný věk rodičů dětí narozených v JmK a průměrný 176 věk rodičů v roce narození dětí v našem souboru Příloha 5 Potvrzení a upřesnění cytogenetického nálezu v karyotypu 43 dětí 177-178 s DID, PAS a VVV Příloha 6 Případy nálezů CNVs VOUS 179

Příloha 7 Případy nálezů oblastí cnnLOH 180-181

Příloha 8 Případy nálezů pravděpodobně benigních CNVs 182-183

164

Příloha 1: Produktový leták ClearSeq Inherited Disease (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)

Zdroj: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/Public/SSLT%20Inherited%20Disease%20Dat a%20Sheet%205991-4962EN.pdf (přístup dne 13.9.2019)

165

NGS Disease Research Panels ClearSeq Inherited Disease The answer at your ﬁngertips

Overview Benefits There are roughly over 7,000 known rare inherited disorders. Though the frequency of Expert-defined content these disorders in the population is extremely low, collectively they affect about 8% of • Developed in collaboration with the general population. To date, despite research efforts to better understand the genetic researchers from Medical Genetics, basis of these diseases, only about 4,000 of these disorders have been linked to a genetic Charite Berlin defect. The challenge in this effort is the syndromic nature of these diseases and highly variable penetrance and expressivity of these disorders which confound conventional • Highly targeted content enabling disease classification and candidate gene identification. As a result, out of the 20,000 or analysis of regions implicated in rare so genes in the human genome, only about 2,700 genes have been directly implicated in disease pathogenesis the pathogenesis of inherited diseases. Deep coverage The ClearSeq Inherited Disease, developed in collaboration with researchers from Medical • Optimized design enables trio analysis Genetics, Charite Berlin, is a highly targeted panel that enables analysis of these genes or deep sequencing of one sample by providing deep coverage or trio analysis even on a benchtop sequencer, allowing for • Compatible with high throughput or the focused yet comprehensive variant profiling of only those regions known to cause rare benchtop sequencers inherited disorders (Fig 1).

Fast track to answers • 3.5x faster sample to sequencing with Performance at 1 Gb 3 Gb SureSelectQXT 100% 100% • Accelerated sample to categorized 90% 90% variants with SureCall 80% 80% 70% 70% 60% 60% 50% 50% 40% 40% 30% 30% 20% 20% 10% 10% 0% 0% NA10830 NA10831 NA12878 NA12891 NA18507 NA18953 NA18956 NA18997 Ave for 8 HapMaps on-target ±100bp % bases at 1x % bases at 20x % bases at 30x % duplicates Figure 1. The ClearSeq Inherited Disease design provides excellent on-target that ensures deep coverage of regions of interest with only 1 Gb of sequencing, enabling compatibility with benchtop sequencers (SureSelectXT, MiSeq)

See Deeper. Reach Further. ClearSeq Inherited Disease

Highly targeted design for Deep Coverage of More Targets 100% deeper coverage 90% 80% ClearSeq Current methods used in identifying the 70% Inherited Disease underlying genetic basis of rare diseases 60% 50% Competitor I are challenged by the lack of sufficient 40% sensitivity and resolution. Whole genome 30% sequencing, though offering the single- 1x 20x 30x 40x 50x molecule resolution of NGS has the Figure 2. The ClearSeq Inherited Disease, designed in collaboration with researchers from Medical Genetics, Charite drawback of having an extremely high Berlin, provides a single assay to analyze only those regions known to cause inherited diseases. Coupled with the number of variants identified from the many highly efficient SureSelect workflows, this design enables deep coverage of more targets compared to similar capture solutions within overlapping targeted regions with equivalent sequencing (ClearSeq Inherited Disease, XT: 2 Gb, 2x76 bp; coding regions in the genome. The ClearSeq Competitor I: 2.5 Gb, 2x150 bp) Inherited Disease Panel enables targeted analysis of only those 2,742 regions that SNPs have been shown to underlie rare disorders. When compared with other similar targeted solutions, the highly optimized and curated design of this panel coupled with the proven SureSelect technology, provides a single assay that enables deep coverage of more Import InDels Describe Run pre-conﬁgured FASTQ or targets compared to similar solutions with Samples analysis workﬂows BAM equivalent sequencing, greatly facilitating variant calling (Fig 2). Addition of custom content using SureDesign lets you tailor this panel to meet your specific design requirements. Figure 3. Faster time from sample to results are enabled not only by the highly efficient SureSelect workflows but also by SureCall, a software for facilitated raw data to variant calling. SureCall enables the import and analysis of FASTQs or BAMs using guided single-sample, paired or trio analysis workflows that allow for review and categorization of all or just the known variants within the sample. Faster answers with Part Number Description confidence 5190-7518 ClearSeq Inherited Disease, XT, 16 Reduced turn-around time to answers is 5190-7519 ClearSeq Inherited Disease, XT, 96 important in clinical research sequencing. 5190-7520 ClearSeq Inherited Disease, auto, XT, 96 auto Highly targeted analysis using this curated 5190-7521 ClearSeq Inherited Disease Plus, XT, 16 5190-7522 ClearSeq Inherited Disease Plus, XT, 96 design, paired with efficient workflows that 5190-7523 ClearSeq Inherited Disease Plus, auto, XT, 96 auto implement greatly reduced hybridization times, as little as 90 minutes for sample 5190-7524 ClearSeq Inherited Disease, XT2, 16 5190-7525 ClearSeq Inherited Disease, XT2, 96 to sequencing in a day, enable the quick 5190-7526 ClearSeq Inherited Disease, auto, XT2, 96 auto turn-around time that facilitates greater 5190-7527 ClearSeq Inherited Disease Plus, XT2, 16 sample throughput and less overall costs for 5190-7528 ClearSeq Inherited Disease Plus, XT2, 96 sample processing. Data analysis, another 5190-7529 ClearSeq Inherited Disease Plus, auto, XT2, 96 auto bottleneck in clinical research, is greatly facilitated by SureCall which provides guided Request more information at www.Agilent.com/genomics/inherited or call your workflows for single sample, paired or trio Agilent service representative for a demo. analysis from raw data to variants enabling expeditious and accurate identification of Find an Agilent customer center in your country: disease variants (Fig 3). www.genomics.agilent.com/contactUs.jsp U.S. and Canada: 1–800–227–9770 | [email protected] For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. PR7000-0533 © Agilent Technologies, Inc. 2015 , 2016 Printed in USA, June 24, 2016 5991-4962EN

See Deeper. Reach Further. Příloha 2: Seznam genů v panelu ClearSeq Inherited Disease (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Staženo z webu SureDesign s autorizovaným přístupem.

Kromě cílových genů jsou v seznamu zahrnuty i případné geny pro antisense RNA, geny pro přirozeně se vyskytující alternativní fúzní transkripty či miRNA, jež jsou lokalizovány v DNA sekvenci cílových genů.

Dle informací výrobce: #This file lists the unique gene symbols that served as targets for Agilent's ClearSeq Inherited Disease Catalog design. #In addition, target.txt lists accession ids from RefSeq, Ensembl, CCDS, Gencode, GenBank, and VEGA that map to these gene symbols.

A2M, A2M-AS1, AAAS, AAGAB, AARS, AARS2, AASS, ABAT, ABCA1, ABCA12, ABCA3, ABCA4, ABCB1, ABCB11, ABCB4, ABCB6, ABCB7, ABCC11, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCC9, ABCD1, ABCD3, ABCD4, ABCG5, ABCG8, ABHD12, ABHD14A, ABHD14A-ACY1, ABHD5, ABL1, ACACA, ACAD11, ACAD8, ACAD9, ACADL, ACADM, ACADS, ACADSB, ACADVL, ACAN, ACAT1, ACAT2, ACBD6, ACE, ACO2, ACOX1, ACP2, ACP5, ACSF3, ACSL4, ACTA1, ACTA2, ACTB, ACTC1, ACTG1, ACTN2, ACTN4, ACVR1, ACVR2B, ACVRL1, ACY1, ADA, ADAM17, ADAM9, ADAMTS10, ADAMTS13, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS2, ADAMTSL2, ADAMTSL4, ADAR, ADCK3, ADCY5, ADIPOQ, ADIPOQ-AS1, ADK, ADORA2A, ADRA2B, ADSL, AFF1, AFF2, AFG3L2, AFP, AGA, AGK, AGL, AGO1, AGPAT2, AGPS, AGRN, AGT, AGTR1, AGTR2, AGXT, AHCY, AHI1, AICDA, AIFM1, AIMP1, AIP, AIPL1, AIRE, AK1, AK2, AKAP9, AKR1C2, AKR1D1, AKT1, AKT2, AKT3, ALAD, ALAS2, ALDH18A1, ALDH1A1, ALDH2, ALDH3A2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH6A1, ALDH7A1, ALDOA, ALDOB, ALG1, ALG10, ALG10B, ALG11, ALG12, ALG13, ALG2, ALG3, ALG6, ALG8, ALG9, ALK, ALLC, ALMS1, ALOX12B, ALOXE3, ALPL, ALS2, ALX1, ALX3, ALX4, AMACR, AMELX, AMELY, AMER1, AMH, AMHR2, AMN, AMPD1, AMT, ANG, ANGPT2, ANGPTL3, ANK1, ANK2, ANKH, ANKRD11, ANKRD26, ANO10, ANO5, ANO6, ANTXR2, AP1S2, AP2A1, AP3B1, AP4B1, AP4B1-AS1, AP4E1, AP4M1, AP4S1, AP5Z1, APC, APCDD1, APIP, APOA1, APOA4, APOA5, APOB, APOC2, APOC3, APOC4-APOC2, APOE, APOF, APOL1, APP, APRT, APTX, AQP2, AR, ARAF, ARFGEF2, ARG1, ARHGAP26, ARHGAP31, ARHGEF10, ARHGEF12, ARHGEF6, ARHGEF9, ARID1A, ARID1B, ARID5A, ARIH1, ARL13B, ARL14EP, ARL6, ARSA, ARSB, ARSE, ARVCF, ARX, ASAH1, ASCC1, ASCC3, ASCL1, ASH1L, ASL, ASNS, ASPA, ASPM, ASPSCR1, ASS1, ASTE1, ASXL1, ASXL3, ATCAY, ATIC ATL1, ATM, ATN1, ATP13A2, ATP1A2, ATP1A3, ATP2A1, ATP2A2, ATP2B3, ATP2C1, ATP5E, ATP5SL, ATP6AP2, ATP6V0A2, ATP6V0A4, ATP6V1B1, ATP7A, ATP7B, ATP8B1, ATPAF2, ATR, ATRX, ATXN1, ATXN10, ATXN2, ATXN3, ATXN7, AUH, AURKC, AVIL, AVP, AVPR2, AXDND1, AXIN1, AXIN2, B2M, B3GALNT2, B3GALTL, B3GAT3, B4GALT1, B4GALT1-AS1, B4GALT7, B9D1, B9D2, BAAT, BAG3, BANF1, BAP1, BBS1, BBS10, BBS12, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS9, BCAN, BCHE, BCKDHA, BCKDHB, BCKDK, BCL10, BCL11A, BCL2, BCL2L2-PABPN1, BCL3, BCMO1, BCOR, BCR, BCS1L, BDNF, BDNF-AS, BDP1, BEAN1, BEST1, BFSP1, BFSP2, BHLHA9, BIN1, BIVM, BIVM-ERCC5, BLK, BLM, BLNK, BLOC1S1-RDH5, BLOC1S3, BLOC1S6, BLVRA, BMP1, BMP15, BMP2, BMP4, BMPER, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BOLA3, BPGM, BRAF, BRAT1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, BRWD3, BSCL2, BSND, BTD, BTK, BUB1B, C10orf105, C10orf2, C10orf53, C10orf55, C11orf91, C12orf29, C12orf43, C12orf57, C12orf65, C16orf58, C16orf93, C17orf107, C19orf12, C1GALT1C1, C1orf145, C1QA, C1QB, C1QC, C1QTNF1, C1QTNF3-AMACR, C1QTNF5, C1R, C1S, C2, C22orf39, C2orf71, C3, C4A, C4B, C4B_2, C4orf26, C5, C5orf42, C6, C7, C8A, C8B, C8orf37, C9, C9orf66, C9orf72, CA12, CA2, CA4, CA8, CABP2, CABP4, CACNA1A, CACNA1C, CACNA1C-AS1, 168

CACNA1D, CACNA1F, CACNA1G, CACNA1H, CACNA1S, CACNA2D4, CACNB2, CACNB4, CACNG2, CALM1, CALR3, CALU, CAMK1, CAMK2G, CAMTA1, CANT1, CAPN10, CAPN3, CARD14, CARD9, CASC5, CASK, CASP10, CASP2, CASP8, CASQ2, CASR, CAT, CATSPER1, CAV1, CAV3, CBFB, CBL, CBS, CBX2, CC2D1A, CC2D2A, CCBE1, CCDC103, CCDC11, CCDC176, CCDC39, CCDC40, CCDC50, CCDC6, CCDC78, CCDC8, CCDC88C, CCL11, CCM2, CCNA2, CCND1, CCNT2, CCT5, CD151, CD19, CD247, CD2AP, CD320, CD36, CD3D, CD3E, CD3EAP, CD3G, CD4, CD40, CD40LG, CD59, CD79A, CD79B, CD81, CD81-AS1, CD82, CD8A, CD96, CDAN1, CDC27, CDC6, CDC73, CDCA7L, CDH1, CDH15, CDH23, CDH3, CDHR1, CDK11A, CDK11B, CDK16, CDK18, CDK19, CDK4, CDK5RAP2, CDKL5, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2AIP, CDKN2B-AS1, CDON, CDR1, CDSN, CDT1, CEACAM16, CEACAM5, CEBPA, CEBPE, CEBPG, CEL, CENPJ, CEP135, CEP152, CEP164, CEP290, CEP41, CEP57, CEP63, CERKL, CERS1, CES1, CETP, CFC1, CFC1B, CFD, CFH, CFHR5, CFI, CFL2, CFP, CFTR, CHAT, CHD2, CHD7, CHEK2, CHKB, CHKB-CPT1B, CHM, CHMP1A, CHMP2B, CHMP4B, CHN1, CHPT1, CHRDL1, CHRFAM7A, CHRM2, CHRM3, CHRNA1, CHRNA2, CHRNA4, CHRNA7, CHRNB1, CHRNB2, CHRND, CHRNE, CHRNG, CHST14, CHST3, CHST6, CHSY1, CHUK, CIB2, CIITA, CIRH1A, CISD2, CITED2, CLCC1, CLCF1, CLCN1, CLCN2, CLCN4, CLCN5, CLCN7, CLCNKA, CLCNKB, CLDN1, CLDN14, CLDN16, CLDN19, CLDN23, CLEC7A, CLIC2, CLIP1, CLMP, CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CLRN1, CLRN1-AS1, CNBP, CNGA1, CNGA3, CNGB1, CNGB3, CNKSR1, CNKSR2, CNNM2, CNNM4, CNTN1, CNTNAP2, COA5, COCH, COG1, COG4, COG5, COG6, COG7, COG8, COL10A1, COL11A1, COL11A2, COL14A1, COL17A1, COL18A1, COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A1, COL4A2, COL4A2-AS1, COL4A3, COL4A3BP, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL7A1, COL8A2, COL9A1, COL9A2, COL9A3, COLEC11, COLQ, COMP, COMT, COPA, COQ2, COQ5, COQ6, COQ9, CORIN, CORO1A, COX10, COX14, COX15, COX4I2, COX6B1, COX7B, CP, CPA6, CPN1, CPOX, CPS1, CPT1A, CPT2, CR2, CRADD, CRB1, CRBN, CREB1, CREBBP, CRELD1, CRH, CRLF1, CRTAP, CRX, CRYAB, CRYBA1, CRYBA4, CRYBB1, CRYBB2, CRYBB3, CRYGC, CRYGD, CRYL1, CSF1R, CSF2RA, CSF2RB, CSF3R, CSHL1, CSRP3, CST3, CSTA, CSTB, CSTF2, CT47A1, CT47A10, CT47A11, CT47A12, CT47A2, CT47A3, CT47A4, CT47A5, CT47A6, CT47A8, CT47A9,CTC1, CTD-2258A20.5, CTDP1, CTGF, CTH, CTHRC1, CTLA4, CTNNB1, CTNND2, CTNS, CTSA, CTSC, CTSD, CTSK, CTXN2, CUBN, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL7, CUX2, CXCR4, CYB5A, CYB5R3, CYBA, CYBB, CYCS, CYLD, CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP19A1, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP21A1P, CYP21A2, CYP24A1, CYP26B1, CYP27A1, CYP27B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, CYP2D7P, CYP2R1, CYP4F22, CYP4V2, CYP7B1, D2HGDH, DAAM2, DACT1, DAG1, DARS2, DAZ1, DAZ4, DBH, DBH-AS1, DBI, DBT, DCAF17, DCBLD1, DCC, DCHS2, DCK, DCLRE1C, DCN, DCTN1, DCX, DCXR, DDB1, DDB2, DDC, DDHD1, DDIT3, DDOST, DDR2, DDX11, DEAF1, DEC1, DECR1, DES, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DGKE, DGUOK, DGUOK-AS1, DHCR24, DHCR7, DHDDS, DHFR, DHH, DHODH, DHTKD1, DIABLO, DIAPH1, DIAPH2, DIAPH3, DIAPH3-AS1, DICER1, DIO1, DIP2B, DIRC2, DIS3L2, DISP1, DKC1, DLAT, DLD, DLEC1, DLG1, DLG3, DLG4, DLG5, DLL3, DLX3, DLX5, DMD, DMGDH, DMP1, DMPK, DMRT1, DMRT2, DNAAF1, DNAAF2, DNAAF3, DNAH11, DNAH5, DNAI1, DNAI2, DNAJB2, DNAJB6, DNAJB7, DNAJC19, DNAJC5, DNAL1, DNASE1L1, DNASE1L3, DNM1L, DNM2, DNMT1, DNMT3B, DOCK6, DOCK8, DOK7, DOLK, DPAGT1, DPEP1, DPM1, DPM2, DPM3, DPP6, DPY19L2, DPYD, DPYD-AS1, DPYS, DRD2, DSC2, DSC3, DSG1, DSG2, DSG4, DSP, DSPP, DST, DTNA, DTNBP1, DUOX2, DUOXA1, DUOXA2, DUS4L, DUX2, DUX4, DUX4L2, DUX4L3, DUX4L5, DUX4L6, DYM, DYNC1H1, DYNC2H1, DYRK1A, DYRK4, DYSF, EARS2, EBP, ECE1, ECM1, EDA, EDAR, EDARADD, EDN3, EDNRA, EDNRB, EEF1A2, EEF1B2, EFCAB13, EFEMP1, EFEMP2, EFHC1, EFNA4, EFNB1, EFTUD2, EGF, EGFR, EGFR-AS1, EGLN1, EGR2, EHMT1, EIF2AK3, EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4, EIF2B5, EIF2S3,

169

EIF4G1, ELANE, ELK1, ELN, ELOVL4, ELP2, EMD, EMG1, EMX2, ENAM, ENG, ENO3, ENPP1, ENTPD1, ENTPD1-AS1, EP300, EPAS1, EPB41, EPB41L1, EPB42, EPCAM, EPHA2, EPHB2, EPHX1, EPHX2, EPM2A, EPPK1, EPX, ERBB2, ERBB3, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERCC6, ERCC6-PGBD3, ERCC8, ERLIN2, ERMAP, ESCO2, ESPN, ESRRB, ETFA, ETFB, ETFDH, ETHE1, ETV1, ETV6, EVC, EVC2, EWSR1, EXOSC3, EXOSC5, EXT1, EXT2, EYA1, EYA4, EYS, EZH2, F10, F11, F11-AS1, F12, F13A1, F13B, F2, F5, F7, F8, F9, FA2H, FADD, FAH, FAM104A, FAM126A, FAM134B, FAM161A, FAM161B, FAM20A, FAM20C, FAM58A, FAM83H, FAM86A, FAN1, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCD2OS, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCL, FANCM, FARS2, FAS, FASLG, FASN, FASTKD2, FBLN1, FBLN5, FBN1, FBN2, FBP1, FBXO7, FBXW4, FCGR2C, FCN3, FECH, FERMT1, FERMT3, FES, FGA, FGB, FGD1, FGD4, FGF10, FGF14, FGF23, FGF3, FGF8, FGF9, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FHL1, FHL2, FIG4, FIGLA, FKBP10, FKBP14, FKBPL, FKRP, FKTN, FLCN, FLG, FLG-AS1, FLNA, FLNB, FLNC, FLT3, FLT4, FLVCR1, FLVCR2, FMO3, FMR1, FMR1-AS1, FN1, FOLR1, FOXC1, FOXC2, FOXE1, FOXE3, FOXF1, FOXG1, FOXH1, FOXI1, FOXL2, FOXN1, FOXO1, FOXO4, FOXP1, FOXP2, FOXP3, FOXRED1, FRA10AC1, FRAS1, FREM1, FREM2, FRG1, FRMD7, FRMPD4, FRY, FSCN2, FSHB, FSHR, FTCD, FTL, FTO, FTSJ1, FUCA1, FUCA2, FUNDC2, FUS, FUT1, FUT6, FUZ, FXN, FXYD2, FXYD6-FXYD2, FYCO1, FZD4, FZD6, G6PC, G6PC3, G6PD, GAA, GABRA1, GABRA3, GABRB3, GABRD, GABRG2, GAD1, GALC, GALE, GALK1, GALNS, GALNT3, GALT, GAMT, GAN, GARS, GATA1, GATA2, GATA3, GATA4, GATA6, GATAD1, GATAD2B, GATM, GBA, GBE1, GBGT1, GCDH, GCH1, GCK, GCLC, GCM2, GCNT2, GCSH, GDAP1, GDF1, GDF3, GDF5, GDF6, GDF9, GDI1, GDNF, GFAP, GFER, GFI1, GFM1, GFM2, GFPT1, GGACT, GGCX, GH1, GHR, GHRH, GHRHR, GHSR, GIF, GIGYF2, GIP, GIPC3, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB6, GJC2, GK, GK2, GLA, GLB1, GLDC, GLE1, GLI2, GLI3, GLIS2, GLIS3, GLIS3- AS1, GLMN, GLRA1, GLRB, GLRX5, GLUD1, GLUL, GLYAT, GLYCTK, GM2A, GMPS, GNAI2, GNAI3, GNAS, GNAT1, GNAT2, GNE, GNMT, GNPAT, GNPTAB, GNPTG, GNRH1, GNRHR, GNS, GOLGA5, GON4L, GOPC, GORAB, GOSR2, GOT1, GP1BA, GP1BB, GP6, GP9, GPC3, GPC6, GPD1, GPD1L, GPHN, GPI, GPR143, GPR179, GPR35, GPR56, GPR98, GPSM2, GPX1, GRHL2, GRHPR, GRIA1, GRIA3, GRID1, GRIK2, GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, GRIP1, GRK1, GRM1, GRM6, GRN, GRPR, GRXCR1, GSN, GSN-AS1, GSR, GSS, GTF2H5, GTF2I, GUCA1A, GUCA1B, GUCY2C, GUCY2D, GUSB, GYG1, GYS1, GYS2, H6PD, HACE1, HACL1, HADH, HADHA, HADHB, HAGH, HAMP, HARS, HARS2, HAX1, HBA1, HBA2, HBB, HBD, HBE1, HBEGF, HBG1, HBG2, HBQ1, HBZ, HCCS, HCFC1, HCN4, HCRT, HDAC4, HDAC8, HEATR2, HEPACAM, HEPN1, HES7, HESX1, HEXA, HEXB, HFE, HFE2, HGD, HGF, HGSNAT, HIBCH, HINT1, HIP1, HIRA, HIST1H4B, HIST2H4A, HIST2H4B, HIST3H3, HIVEP2, HK1, HLA-A, HLA-DOB, HLA-DQB1, HLA- DQB2, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLCS, HMBS, HMGA1, HMGA2, HMGCL, HMGCS2, HMOX1, HMX1, HNF1A, HNF1B, HNF4A, HNRNPUL2-BSCL2, HOGA1, HOXA1, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXB1, HOXC13, HOXC13-AS, HOXD10, HOXD13, HPD, HPGD, HPRT1, HPS1, HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, HPSE2, HR, HRAS, HRG, HS6ST1, HSD11B1, HSD11B2, HSD17B10, HSD17B3, HSD17B4, HSD3B2, HSD3B7, HSF4, HSPB1, HSPB3, HSPB8, HSPD1, HSPG2, HTR1A, HTRA1, HTRA2, HTT, HUWE1, HVCN1, HYAL1, HYDIN, HYLS1, ICAM1, ICK, ICOS, IDH2, IDH3B, IDS, IDUA, IER3IP1, IFITM5, IFNAR2, IFNG, IFNGR1, IFNGR2, IFRD1, IFT122, IFT140, IFT43, IFT80, IFT88, IGBP1, IGF1, IGF1R, IGF2, IGF2-AS, IGFBP7, IGFBP7-AS1, IGHMBP2, IGLL1, IGSF1, IHH, IKBKAP, IKBKG, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12B, IL12RB1, IL17F, IL17RA, IL1RAPL1, IL1RN, IL21R, IL21R-AS1, IL2RA, IL2RG, IL31RA, IL36RN, IL3RA, IL4R, IL6, IL7R, ILDR1, ILK, IMPAD1, IMPDH1, IMPG2, INF2, ING1, INPP4A, INPP5E, INS, INS-IGF2, INSL3, INSR, INSRR, INVS, IPP, IQCB1, IQSEC2, IRAK4, IRF1, IRF4, IRF6, IRF8, IRGM, IRX5, ISCA2, ISCU, ISPD, ITCH, ITGA2, ITGA2B, ITGA3, ITGA6, ITGA7, ITGAM, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITK, ITM2B, ITPR1, IVD, IYD, JAG1, JAK2, JAK3, JAM3, JPH2, JPH3, JUP, KAL1, KANK1, KANSL1,

170

KARS, KAT6B, KBTBD13, KCNA1, KCNA5, KCNC3, KCNE1, KCNE1L, KCNE2, KCNE3, KCNE4, KCNH2, KCNJ1, KCNJ10, KCNJ11, KCNJ13, KCNJ2, KCNJ5, KCNJ8, KCNK9, KCNMA1, KCNQ1, KCNQ1OT1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNT1, KCNV2, KCTD7, KDM5A, KDM5C, KDM5D, KDM6A, KDM6B, KDM7A, KDR, KERA, KHDC3L, KIAA0196, KIAA0226, KIAA1279, KIAA1614, KIAA2022, KIF11, KIF1A, KIF1B, KIF21A, KIF22, KIF4A, KIF5A, KIF5C, KIF7, KIRREL3, KISS1, KISS1R, KIT, KITLG, KL, KLF1, KLF11, KLF6, KLF8, KLHDC8B, KLHL15, KLHL3, KLHL41, KLHL7, KLK4, KLKB1, KMT2A, KMT2D, KRAS, KRIT1, KRT1, KRT10, KRT12, KRT13, KRT14, KRT16, KRT17, KRT2, KRT3, KRT4, KRT5, KRT6A, KRT6B, KRT74, KRT81, KRT83, KRT85, KRT86, KRT9, L1CAM, L2HGDH, LAMA1, LAMA2, LAMA3, LAMA4, LAMB1, LAMB2, LAMB3, LAMC2, LAMC3, LAMP2, LAMTOR2, LARGE, LARP7, LAS1L, LBR, LCA5, LCAT, LCT, LDB3, LDHA, LDHB, LDLR, LDLRAD2, LDLRAP1, LEMD3, LEP, LEPR, LEPRE1, LEPREL1, LEPROT, LFNG, LGI1, LHB, LHCGR, LHFPL5, LHX3, LHX4, LIAS, LIFR, LIG4, LILRB2, LIN28B, LINS, LIPA, LIPC, LIPH, LIPN, LITAF, LMAN1, LMAN2L, LMBR1, LMBRD1, LMF1, LMNA, LMNB1, LMX1B, LOC100129427, LOC100129518, LOC100130744, LOC100132529, LOC100287042, LOC100289092, LOC100294362, LOC100505549, LOC100505666, LOC100506071, LOC100506136, LOC100506801, LOC100507308, LOC100507346, LOC100507600, LOC100527964, LOC100652770, LOC101448202, LOC101926943, LOC101927318, LOC101927718, LOC101928371, LOC101928882, LOC101929387, LOC101929680, LOC101929829, LOC102724058, LOC102724153, LOC257396, LOC284889, LOC606724, LOR, LOXHD1, LOXL3, LPA, LPAR6, LPIN1, LPIN2, LPL, LPP, LRAT, LRBA, LRFN4, LRP1, LRP2, LRP4, LRP4-AS1, LRP5, LRPPRC, LRRC6, LRRC8A, LRRK1, LRRK2, LRSAM1, LRTOMT, LSMEM1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, LTC4S, LYL1, LYSMD3, LYST, LYZ, LZTFL1, LZTS1, MAD1L1, MAF, MAFB, MAGEL2, MAGI1, MAGT1, MAK, MAK16, MAMLD1, MAN1B1, MAN2B1, MANBA, MAOA, MAOB, MAP2K1, MAP2K2, MAP3K1, MAP3K8, MAPK1, MAPK10, MAPT, MARVELD2, MASP1, MASP2, MASTL, MAT1A, MATN3, MATR3, MBD5, MBTPS2, MC1R, MC2R, MC4R, MCCC1, MCCC2, MCEE, MCF2, MCFD2, MCM4, MCM6, MCM7, MCOLN1, MCPH1, MECP2, MED12, MED13L, MED17, MED23, MED25, MEF2C, MEFV, MEGF10, MEN1, MERTK, MESP2, MET, METTL8, MFN2, MFRP, MFSD8, MGAT2, MGP, MIB1, MICAL1, MID1, MIF, MINPP1, MIPOL1, MIR1273H, MIR1292, MIR3606, MIR3911, MIR4253, MIR4260, MIR4315-1, MIR4315-2, MIR4321, MIR4709, MIR4721, MIR4761, MIR5004, MIR555, MIR6084, MIR6511B1, MIR6800, MIR711, MIR7855, MIR936, MIR943, MITF, MKKS, MKS1, MLC1, MLF1, MLH1, MLH3, MLLT1, MLLT10, MLLT3, MLPH, MLX, MLYCD, MMAA, MMAB, MMACHC, MMADHC, MMP1, MMP13, MMP2, MMP20, MMP9, MN1, MNX1, MOCS1, MOCS2, MOG, MOGS, MPC1, MPDU1, MPI, MPL, MPLKIP, MPO, MPV17, MPZ, MRAP, MRE11A, MRPL3, MRPS12, MRPS16, MRPS22, MS4A1, MS4A2, MSH2, MSH6, MSR1, MSRB3, MSTN, MSTO2P, MSX1, MSX2, MTAP, MTF1, MTFMT, MTHFR, MTM1, MTMR2, MTO1, MTPAP, MTR, MTRR, MTTP, MUSK, MUT, MUTYH, MVK, MYB, MYBPC1, MYBPC3, MYC, MYCN, MYD88, MYF6, MYH11, MYH14, MYH2, MYH3, MYH4, MYH6, MYH7, MYH8, MYH9, MYL2, MYL3, MYLK, MYLK2, MYLK-AS1, MYO15A, MYO1A, MYO1E, MYO1G, MYO3A, MYO5A, MYO5B, MYO6, MYO7A, MYOC, MYOT, MYOZ2, MYPN, MYT1L, NAA10, NAGA, NAGLU, NAGS, NAT1, NAT8L, NBAS, NBEAL2, NBN, NCAPH2, NCF1, NCF2, NCF4, NCK2, NCOA4, NCSTN, NDE1, NDN, NDP, NDRG1, NDST1, NDUFA1, NDUFA10, NDUFA11, NDUFA12, NDUFA2, NDUFA7, NDUFA9, NDUFAF1, NDUFAF2, NDUFAF3, NDUFAF4, NDUFAF5, NDUFAF6, NDUFB3, NDUFS1, NDUFS2, NDUFS3, NDUFS4, NDUFS5, NDUFS6, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1, NDUFV2, NEB, NECAB2, NEFL, NEK1, NEK8, NELFA, NEU1, NEUROD1, NEUROG3, NEXN, NF1, NF2, NFIX, NFKBIA, NFU1, NGF, NHEJ1, NHLRC1, NHP2, NHS, NICN1, NIN, NIP7, NIPA1, NIPAL4, NIPBL, NKX2-1, NKX2-1-AS1, NKX2-5, NKX2-6, NKX3-2, NLGN3, NLGN4X, NLRP1, NLRP12, NLRP3, NLRP7, NME1, NME1-NME2, NME8, NMNAT1, NNT, NOA1, NOBOX, NOD2, NODAL, NOG, NOL3, NOP10, NOP56, NOTCH1,

171

NOTCH2, NOTCH3, NPC1, NPC2, NPEPL1, NPHP1, NPHP3, NPHP3-ACAD11, NPHP3-AS1, NPHP4, NPHS1, NPHS2, NPM1, NPPA, NPPA-AS1, NPR2, NR0B1, NR0B2, NR1D1, NR1H3, NR2C2AP, NR2E3, NR3C1, NR3C2, NR4A3, NR5A1, NRAS, NRG3, NRL, NRTN, NRXN1, NSD1, NSDHL, NSMF, NSUN2, NT5C3A, NT5E, NTF4, NTNG1, NTRK1, NTRK2, NUBPL, NUP214, NUP62, NYX, OAT, OBSCN, OBSL1, OCA2, OCLN, OCRL, OFD1, OGDH, OGG1, OPA1, OPA1- AS1, OPA3, OPHN1, OPLAH, OPN1LW, OPN1MW, OPN1MW2, OPN1SW, OPTN, ORAI1, ORC1, ORC4, ORC6, OSMR, OSTM1, OTC, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, OTX2, OXCT1, OXCT1-AS1, P2RY12, P4HB, PABPN1, PAFAH1B1, PAH, PAK3, PAK6, PALB2, PANK2, PAPPA, PAPSS2, PARK2, PARK7, PARP1, PAX2, PAX3, PAX4, PAX6, PAX7, PAX8, PAX8-AS1, PAX9, PBX1, PC, PCBD1, PCCA, PCCB, PCDH15, PCDH19, PCDHGA1, PCDHGA10, PCDHGA11, PCDHGA12, PCDHGA2, PCDHGA3, PCDHGA4, PCDHGA5, PCDHGA6, PCDHGA7, PCDHGA8, PCDHGA9, PCDHGB1, PCDHGB2, PCDHGB3, PCDHGB4, PCDHGB5, PCDHGB6, PCDHGB7, PCDHGC3, PCDHGC4, PCDHGC5, PCID2, PCK1, PCK2, PCM1, PCNT, PCSK1, PCSK9, PDCD10, PDE11A, PDE4D, PDE6A, PDE6B, PDE6C, PDE6G, PDE6H, PDE8B, PDF, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PDGFRL, PDHA1, PDHB, PDHX, PDLIM3, PDP1, PDSS1, PDSS2, PDX1, PDYN, PDZD7, PECR, PEMT, PEPD, PER2, PEX1, PEX10, PEX11B, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX2, PEX26, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PFKFB1, PFKM, PFN1, PGAM2, PGBD3, PGD, PGK1, PGM1, PGR, PHACTR1, PHB, PHEX, PHF6, PHF8, PHGDH, PHIP, PHKA1, PHKA2, PHKA2-AS1, PHKB, PHKG2, PHOX2A, PHOX2B, PHYH, PI3, PICALM, PIGA, PIGL, PIGM, PIGN, PIGO, PIGV, PIK3CA, PIK3R2, PIKFYVE, PINK1, PINK1-AS, PINX1, PIP5K1C, PITPNM3, PITX1, PITX2, PITX3, PKD1, PKD2, PKHD1, PKLR, PKP1, PKP2, PLA2G5, PLA2G6, PLA2G7, PLAG1, PLAT, PLAU, PLCB1, PLCB4, PLCD1, PLCE1, PLCE1-AS1, PLCG2, PLEC, PLEKHG4, PLEKHG5, PLEKHM1, PLG, PLIN1, PLN, PLOD1, PLOD2, PLOD3, PLP1, PMM2, PMP22, PMPCA, PMS2, PNKD, PNKP, PNLIP, PNMT, PNP, PNPLA1, PNPLA2, PNPLA6, PNPO, PNPT1, POC1A, POF1B, POLA1, POLG, POLG2, POLH, POLK, POLR1C, POLR1D, POLR3A, POLR3B, POLR3D, POLR3H, POMC, POMGNT1, POMGNT2, POMP, POMT1, POMT2, PON1, PON3, POR, PORCN, POU1F1, POU3F4, POU4F3, POU6F2, PPARG, PPIB, PPM1D, PPM1E, PPOX, PPP1R3A, PPP2R1B, PPP2R2B, PPP2R5D, PPT1, PQBP1, PRCC, PRCD, PRDM5, PREPL, PRF1, PRG4, PRICKLE1, PRICKLE2, PRICKLE2-AS1, PRICKLE2-AS3, PRKAG2, PRKAR1A, PRKAR1B, PRKCA, PRKCG, PRKCSH, PRKDC, PRKRA, PRMT9, PRNP, PROC, PRODH, PROK2, PROKR2, PROM1, PROP1, PROS1, PROX2, PRPF3, PRPF31, PRPF6, PRPF8, PRPH2, PRPS1, PRPS2, PRRT2, PRRX1, PRSS1, PRSS12, PRSS56, PRSS58, PRX, PSAP, PSAT1, PSEN1, PSEN2, PSENEN, PSG1, PSG2, PSG7, PSG8, PSMA7, PSMB8, PSMC3IP, PSPH, PSTPIP1, PTCH1, PTCH2, PTCHD1, PTEN, PTF1A, PTGIS, PTH, PTH1R, PTHLH, PTOV1-AS1, PTPN11, PTPN13, PTPN14, PTPN2, PTPRC, PTPRJ, PTPRO, PTPRQ, PTPRR, PTRF, PTS, PUS1, PUS10, PVR, PVRL1, PVRL4, PYCR1, PYGL, PYGM, QDPR, RAB18, RAB23, RAB27A, RAB39B, RAB3GAP1, RAB3GAP2, RAB40AL, RAB7A, RABEP2, RABGEF1, RABL6, RAC2, RAD21, RAD50, RAD51, RAD51C, RAD54L, RAF1, RAG1, RAG2, RAI1, RALGDS, RANBP2, RANGRF, RAPGEF1, RAPSN, RARA, RARA-AS1, RARS2, RASA1, RASSF1, RASSF1-AS1, RAX, RAX2, RB1, RB1CC1, RBBP8, RBM10, RBM20, RBM28, RBM8A, RBP3, RBP4, RBPJ, RCVRN, RD3, RDH12, RDH5, RDX, RECQL4, REEP1, REG1A, RELN, REN, RENBP, RET, RFT1, RFX5, RFX6, RFXANK, RFXAP, RGR, RGS7, RGS9, RGS9BP, RHAG, RHBDD2, RHBDF2, RHO, RIMS1, RIN2, RIPK4, RLBP1, RLIM, RMND1, RNASE4, RNASEH2A, RNASEH2B, RNASEH2C, RNASEL, RNASET2, RNF135, RNF139, RNF168, RNF170, RNF212, RNF213, RNF6, ROBO2, ROBO3, ROGDI, ROM1, ROR2, RP1, RP1L1, RP2, RP9, RPE65, RPGR, RPGRIP1, RPGRIP1L, RPIA, RPL10, RPL11, RPL21, RPL21P28, RPL26, RPL35A, RPL5, RPS10, RPS10-NUDT3, RPS14, RPS17, RPS17L, RPS19, RPS24, RPS26, RPS4X, RPS4Y1, RPS6KA3, RPS7, RPSA, RRM2B, RS1, RSPH4A, RSPH9, RSPO1, RSPO4, RTN2, RTTN, RUNX1, RUNX2, RXFP2, RYR1, RYR2, RYR3, S100G, SACS, SAG, SALL1, SALL4, SAMD9, SAMHD1, SAR1B, SARM1, SARS,

172

SARS2, SART3, SAT1, SATB2, SBDS, SBF2, SBF2-AS1, SC5D, SCAPER, SCARB2, SCARF2, SCN1A, SCN1B, SCN2A, SCN2B, SCN3B, SCN4A, SCN4B, SCN5A, SCN8A, SCN9A, SCNN1A, SCNN1B, SCNN1G, SCO1, SCO2, SCP2, SDCCAG8, SDHA, SDHAF1, SDHAF2, SDHB, SDHC, SDHD, SEC23A, SEC23B, SEC63, SECISBP2, SEMA3A, SEMA3E, SEMA4A, SEMA4C, SENP1, SEPN1, SEPSECS, SEPT12, SEPT5, SEPT5-GP1BB, SEPT9, SERAC1, SERPINA1, SERPINA6, SERPINA7, SERPINB6, SERPINC1, SERPIND1, SERPINE1, SERPINF1, SERPINF2, SERPING1, SERPINH1, SERPINI1, SETBP1, SETD5, SETX, SF3B1, SF3B4, SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC, SFTPD, SGCA, SGCB, SGCD, SGCE, SGCG, SGSH, SH2B3, SH2D1A, SH3BP2, SH3GL1, SH3PXD2B, SH3TC2, SHANK2, SHANK3, SHFM1, SHH, SHOC2, SHOX, SHROOM4, SI, SIGMAR1, SIL1, SIM1, SIX1, SIX3, SIX5, SIX6, SKI, SKIV2L, SLC10A2, SLC10A3, SLC11A2, SLC12A1, SLC12A3, SLC12A4, SLC12A6, SLC16A1, SLC16A12, SLC16A2, SLC17A5, SLC17A8, SLC19A2, SLC19A3, SLC1A1, SLC1A3, SLC20A2, SLC22A12, SLC22A18, SLC22A18AS, SLC22A5, SLC24A1, SLC25A12, SLC25A13, SLC25A15, SLC25A19, SLC25A20, SLC25A22, SLC25A3, SLC25A35, SLC25A38, SLC25A4, SLC26A1, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A4-AS1, SLC26A5, SLC27A4, SLC29A3, SLC2A1, SLC2A10, SLC2A2, SLC2A9, SLC30A10, SLC30A2, SLC31A1, SLC33A1, SLC34A1, SLC34A2, SLC34A3, SLC35A1, SLC35C1, SLC35D1, SLC36A2, SLC37A4, SLC39A13, SLC39A4, SLC3A1, SLC40A1, SLC45A2, SLC46A1, SLC4A1, SLC4A11, SLC4A4, SLC52A2, SLC52A3, SLC5A1, SLC5A2, SLC5A5, SLC5A7, SLC6A1, SLC6A17, SLC6A19, SLC6A2, SLC6A20, SLC6A3, SLC6A5, SLC6A8, SLC7A7, SLC7A9, SLC9A3R1, SLC9A6, SLC9A7, SLC9B1, SLCO1B1, SLCO1B3, SLCO1B7, SLCO2A1, SLITRK1, SLMO2-ATP5E, SLURP1, SLX4, SMAD3, SMAD4, SMAD6, SMAD9, SMARCA2, SMARCA4, SMARCAD1, SMARCAL1, SMARCB1, SMARCE1, SMC1A, SMC3, SMN1, SMN2, SMOC1, SMOC2, SMPD1, SMPX, SNAI2, SNAP29, SNAPC5, SNCA, SNCB, SNHG4, SNIP1, SNRNP200, SNRPN, SNTA1, SNURF, SNX22, SOBP, SOD1, SOS1, SOST, SOX10, SOX15, SOX17, SOX18, SOX2, SOX3, SOX7, SOX9, SP110, SP7, SPAG8, SPAST, SPATA16, SPATA7, SPECC1L, SPECC1L-ADORA2A, SPG11, SPG20, SPG21, SPG7, SPINK1, SPINK5, SPINT2, SPR, SPRED1, SPTA1, SPTAN1, SPTB, SPTBN2, SPTLC1, SPTLC2, SQSTM1, SRCAP, SRD5A2, SRD5A3, SRP19, SRP72, SRPX2, SRY, SSTR5, ST14, ST3GAL3, ST3GAL5, STAB2, STAG1, STAR, STAT1, STAT3, STAT5B, STIL, STIM1, STK11, STK4, STOM, STOX1, STRA6, STRADA, STRC, STRN3, STS, STX11, STX16, STX16-NPEPL1, STXBP1, STXBP2, SUCLA2, SUCLG1, SUFU, SUMF1, SUMO1, SUOX, SURF1, SYCP3, SYN1, SYNCRIP, SYNE1, SYNE2, SYNGAP1, SYP, SYP-AS1, SYT14, TAB2, TAC3, TACR1, TACR3, TACSTD2, TAF1, TAF15, TAF1C, TAF2, TAF6, TAF7L, TAL1, TALDO1, TANC2, TAP1, TAP2, TAPBP, TAPSAR1, TARDBP, TAT, TAZ, TBC1D24, TBCE, TBCK, TBP, TBX1, TBX15, TBX19, TBX20, TBX21, TBX22, TBX3, TBX4, TBX5, TBXAS1, TCAP, TCF4, TCIRG1, TCL1A, TCN2, TCOF1, TCP1, TCTN1, TCTN2, TCTN3, TDGF1, TDP1, TDRD7, TEAD1, TECR, TECTA, TEK, TERT, TET2, TF, TFAP2A, TFAP2A-AS1, TFAP2B, TFE3, TFG, TFR2, TG, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGIF1, TGM1, TGM5, TGM6, TH, THAP1, THBD, THOC2, THPO, THRA, THRB, TICAM1, TIGD6, TIMM8A, TIMP3, TINF2, TJP2, TK2, TLDC2, TLL1, TLR3, TLX1, TMC1, TMC6, TMC8, TMCO1, TMEM114, TMEM126A, TMEM135, TMEM138, TMEM165, TMEM216, TMEM231, TMEM237, TMEM43, TMEM5, TMEM50B, TMEM67, TMEM69, TMEM70, TMEM99, TMIE, TMLHE, TMPO, TMPO-AS1, TMPRSS15, TMPRSS3, TMPRSS6, TNF, TNFRSF10B, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF1A, TNFRSF25, TNFSF11, TNNC1, TNNI2, TNNI3, TNNT1, TNNT2, TNNT3, TNPO2, TNXA, TNXB, TOE1, TOPORS, TOPORS-AS1, TOR1A, TP53, TP63, TPBG, TPI1, TPK1, TPM1, TPM2, TPM3, TPMT, TPO, TPP1, TPR, TPRN, TPTE2P5, TRAPPC2, TRAPPC9, TRDN, TREH, TREM2, TREX1, TRH, TRHR, TRIM24, TRIM32, TRIM33, TRIM37, TRIO, TRIOBP, TRIP11, TRMT1, TRMT10A, TRMU, TRPC6, TRPM1, TRPM4, TRPM6, TRPS1, TRPV3, TRPV4, TSC1, TSC2, TSEN2, TSEN34, TSEN54, TSFM, TSG101, TSHB, TSHR, TSHZ1, TSPAN12, TSPAN7, TSPEAR, TSPEAR-AS1, TSPYL1, TST, TTBK2, TTC19, TTC21B, TTC37, TTC5, TTC7A, TTC8, TTI2, TTLL5, TTN, TTN-AS1, TTPA, TTR, TUBA1A, TUBA8,

173

TUBAL3, TUBB1, TUBB2B, TUBB3, TUBGCP6, TUFM, TULP1, TUSC3, TWIST1, TWIST2, TXNRD2, TYK2, TYMP, TYR, TYROBP, TYRP1, UBA1, UBB, UBE2A, UBE3A, UBIAD1, UBL4A, UBQLN2, UBR1, UBR7, UFD1L, UGT1A1, UGT1A10, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT2A3, ULK4P1, ULK4P2, UMOD, UMPS, UNC119, UNC13D, UNC93B1, UNG, UPB1, UPF3B, UPK3A, UQCRB, UQCRC1, UQCRQ, URB1, UROC1, UROD, UROS, USB1, USH1C, USH1G, USH2A, USP27X, USP9Y, UTP14C, UVSSA, VANGL1, VAPB, VAX1, VCAN, VCL, VCP, VDR, VHL, VIPAS39, VKORC1, VLDLR, VLDLR-AS1, VMA21, VPS13A, VPS13A-AS1, VPS13B, VPS33B, VPS35, VPS37A, VRK1, VRK2, VSX1, VSX2, VWF, WAC, WAS, WDPCP, WDR11, WDR19, WDR35, WDR36, WDR45B, WDR62, WDR65, WDR72, WDR81, WFS1, WHSC1, WHSC1L1, WIPF1, WISP3, WNK1, WNK4, WNT10A, WNT10B, WNT3, WNT4, WNT5A, WNT7A, WRAP53, WRN, WT1, WTAPP1, WWOX, XDH, XIAP, XK, XPA, XPC, XPNPEP3, YARS, YARS2, YWHAE, ZAP70, ZBTB11, ZBTB11-AS1, ZBTB12, ZBTB16, ZBTB18, ZBTB24, ZBTB40, ZC3H14, ZC4H2, ZCCHC12, ZCCHC8, ZDHHC15, ZDHHC9, ZEB1, ZEB2, ZFHX4, ZFP57, ZFPM2, ZFX, ZFY, ZFYVE26, ZFYVE27, ZIC2, ZIC3, ZMPSTE24, ZMYM3, ZMYM6, ZMYM6NB, ZNF276, ZNF33A, ZNF35, ZNF41, ZNF423, ZNF454, ZNF469, ZNF513, ZNF526, ZNF592, ZNF610, ZNF644, ZNF674, ZNF711, ZNF750, ZNF81, ZNHIT1, ZSWIM7

174

Příloha 3: Seznam DNA primerů pro verifikaci sekvenčních variant Sangerovým sekvenováním

gen ověřovaá typ sekvence primeru 5' -> 3' délka sekvečí primeru produktu varianta (bp) SCN2A p.M1545V F GCTCTCCAATCACTGGTTTTGC 456 R GCACCTCTTCTTACCTACAATGG TUBB3 p.E410K F TCCACCTTCATCGGGAACAG 469 R GCCTGGAGCTGCAATAAGAC IQSEC2 p.D605Pfs*3 F CTTCAGGGGCTGGGTAGTG 471 R TGGAGAAGCGGGAGTCAAAG SLC6A19 p.D173N F GTGTCACTGGTGTCAAGGC 267 R ACATGTACAGGACGCTCCAT p.S314L F CCATGACACTGGTCTCGTCT 409 R TGAGAGGAAGGCGTTGATGT BTD p.D444H F TCCAATGGCCTCTGCTGTTA 450 R GCTTGTAGCCTGTGGAAGTG TSEN54 c.56+2T>G F CTAGGACCGGGGACAATCAG 415 R AGAAAGTCCTTGGGGCCATG p.R54G F ATGGCCCCAAGGACTTTCTG 268 R GGGAGACTTCAACTCCACGA p.A307S F CACGTCCCTCAGGTCCATTA 498 R GGATCGGCGTTGACATCTTC SCN2A p.A263V F TGCCGGTAAAATAGCTGTTGAG 311 R CCAGTTAAATATGCTCACTGTCCTA MED13L p.Q473Kfs*11 F CCTCCCACAGTATCTCAACCA 448 R GGAGTTCTAGTCCATTTCCATAAAG ASXL3 p.R1004Efs*21 F CAGAGCAACACAGCTTTGGA 394 R GGAGACATTTCCAGGCCCTAT

175

Příloha 4: Medián a průměrný věk rodičů dětí narozených v JmK a průměrný věk rodičů v roce narození dětí v našem souboru. Pro období let 1995-1999 nebyla k dispozici data o věku rodičů dětí narozených v JmK. Ve sloupcích počet matek, resp. otců je uveden počet jedinců, od nichž byl získán údaj o věku v době narození svého potomka (probanda).

ediá průěr ediá průěr

počet věk věk atek věk počet věk věk otů věk otů matek matek (roky) matek otů otů (roky) (JM kraj)

rok arozeí arozeí rok probanda (soubor) (roky) (JM kraj) (soubor) (roky) 1995 4 22 22,3 - 2 23 24,5 - 1996 2 26,5 26,5 - 2 25 25 - 1997 3 26 28,7 - 2 34,5 34,5 - 1998 3 25 25 - 3 30 28,3 - 1999 8 26,5 27,8 - 7 33 33,1 - 2000 12 24 25 26,9 11 26 29 29,9 2001 11 25 26,3 27,3 11 29 30,3 30,4 2002 11 26 25,4 27,7 10 30 31,4 30,8 2003 17 25 26,3 28,1 17 30 31,3 31,2 2004 15 28 29,2 28,5 14 31,5 33,5 31,7 2005 22 29,5 28,8 28,8 22 34 35 32 2006 31 30 28,9 29,2 28 31 32,4 32,4 2007 23 27 28,8 29,5 23 33 34,9 32,6 2008 36 31 29,6 29,8 34 31,5 31,3 32,8 2009 42 29 29,3 30 44 33,5 33,1 33,1 2010 45 30 28,8 30,2 43 31 32,3 33,4 2011 46 31 30,3 30,4 43 33 32,7 33,6 2012 62 31 30,6 30,6 61 33 33,2 33,9 2013 65 31 31,1 30,7 62 34 34,5 33,9 2014 48 31 31,7 30,8 44 34 33,8 34,1 2015 49 31 31 30,9 45 32 32,9 34,2 2016 48 32 31,5 30,9 45 36 35,8 34,1 2017 32 29,5 30,1 31,1 32 32 33,1 34,3 2018 15 32 33,1 31,1 15 37 36,6 34,2 celkem 650 620

Statistické zpracování dat nebylo realizováno kvůli nedostupnosti populačních dat (mediány věku pro jednotlivé roky) pro neparametrický jednovýběrový Wilcoxonův test (nenormální rozložení věku rodičů v našem souboru)

176

Příloha 5: Potvrzení a upřesnění cytogenetického nálezu v karyotypu 43 dětí s DID, PAS a VVV metodou array-CGH pacient karyotyp výsledek arra-CGH 301 46,XY,der(10) arr[hg19] 1q32.1q44(203676159_249212668)x3,10q26.3(132932808_135434178)x1 179 46,XY,der(5) arr[hg19] 2p25.3p25.1(30341_9425957)x3,5p15.33(26142_2079895)x1 575** 46,XX[15]/47,XX,+mar[15] arr[hg19] 2q11.1q12.1(95529039_104922105)x2~3,22q13.2(41734325_42556331)x3 464 46,XY,der(3) arr[hg19] 3p14.2(61125147_61673611)x1,3q26.2q26.31(169272415_174713426)x1 638 46,XY,der(3)?inv(3)(q23q27)t(3;14)(q2?7;q?12) arr[hg19] 14q13.2q21.2(37099933_44935036)x1 del14(q13.3q21.2),der(7)t(3;7)(q2?7;q3?5), der(14)t(7;14)(q3?5;q?12) 655 46,XY,der(3)?inv(3)(q23q27)t(3;14)(q2?7;q?12) arr[hg19] 14q13.2q21.2(37099933_44935036)x1 del14(q13.3q21.2),der(7)t(3;7)(q2?7;q3?5), der(14)t(7;14)(q3?5;q?12) 19 46,XX,der(4) arr[hg18] 4p16.3p16.1(62320_8783335)x1,8p23.3p23.1(63884_8083696)x3 74 46,XY,del(4) arr[hg19] 4q13.2q21.22(67587132_83722722)x1 634 46,XY,der(5) arr[hg19] 5q31.3q33.2(140260081_154433622)x3 22 46,XY,del(6)(q24.3-q25.2) arr[hg18] 6q24.3q25.2(148854541_154562359)x1 351 46,XY,dup(7)(q?31q?32) arr[hg19] 7q22.3q32.2(104516030_129950217)x3 61 46,XY,der(7) arr[hg19] 7q32.1q34(128274116_139667914)x1 94A 46,XX,der(8) arr[hg18] 8p23.1(7123638_7880603)x1,18p11.32p11.22(123155_9665062)x3 572 46,XY,del(9)(p?22-pter) arr[hg19] 3p21.31(44997133_45313328)x3,9p24.3p23(271257_13595914)x1 690 46,XY,der(9)(Xpter-Xp11.4::9p24-9qter) arr[hg19] 5p13.2(37121845_37516662)x3,Xp11.4p11.1(40534726_58051765)x1, Xq11.1q28(61931689_154908471)x1,(Y)x1 289 46,XY,der(13)t(9;13)(p11;p11.1)pat arr[hg19] 9p24.3p11.2(204193_44259464)x3 166 46,XX,der(12) de novo arr[hg19] 12p13.33p13.31(194249_5421087)x1,18p11.32p11.21(118760_14951330)x3 281 46,XX,der(18)t(12;18) arr[hg19] 12q24.33(130706081_133779076)x3,18q21.2q23(49305962_78010032)x1 90 46,XX,del(13) arr[hg19] 13q14.13q22.3(46740711_77772666)x1 4 46,XY,add(13) arr[hg19] 13q31.1q31.2(83155143_89693730)x1,15q14q22.31(36319140_64610099)x3

177

460 46,XY,r(13)(p11.2q33.2)[23]/45,XY,-13[7] arr[hg19] 13q33.2q34(106850332_115059020)x1 80 46,XY,dup(14) arr[hg19] 14q32.2q32.33(96769347_107287505)x3 449 46,XY,del(16)(q23.1-q24.1) arr[hg19] 16q23.1q24.1(75281808_85508509)x1 170 46,XX,der(17)t(17;22)(p13.3;q13.32)mat arr[hg19] 17p13.3(51885_1405714)x1,22q13.2q13.33(43653392_51219009)x3 401 46,XY,dic(18;18)(18pter-18q2?3::18q2?3- arr[hg19] 18p11.32p11.21(14316_14928854)x3,18q11.1q22.3(18620055_70659074)x3, 18pter)[21]/46,XY,del(18)(q2?3)[9] 18q22.3q23(70799747_77982126)x1 202 46,XX,der(18) arr[hg19] 18p11.32p11.21(118760_14966054)x3,18q11.1q12.1(18529851_26141056)x3, 18q22.2q23(67017890_78011032)x1 76 45,XY,t(18;21)(q11;q11?) arr[hg19] 18p11.32p11.21(148963_14158122)x1 557 46,XY,der(20) arr[hg19] 20p12.3p11.1(8099741_26128919)x3 227 47,XY,+r(20)[25]/46,XY[5] arr[hg19] 20p13p11.1(4102354_26199171)x3,20q11.21(29857590_30800011)x3 48 46,XX,der(20)t(20;22)(q13.3;p11.2)pat arr[hg19] 20q13.33(61209409_62949149)x1 463** 47,XY,+mar[6]/46,XY[4] arr[hg19] 21q11.2q21.1(14640392_20672710)x2~3 12 46,XY,r(22)[34]/46,XY[66] arr[hg19] 22q13.2q13.33(44013344_51063485)x1~2 105 47,XY,+dic(X)(Xpter-Xq27.1::Xq27.1-Xpter) arr[hg19] Xp22.33p11.21(61529_57931761)x3,Xq11.1q27.1(61931689_140030900)x3 169 45,X[5]/46,X,r(x)[5] arr[hg19] Xp22.33p22.2(2634959_15859056)x1,Xp22.2p11.21(16468882_58002177)x1~2, Xq11.1q21.1(61998756_76089015)x1~2,Xq21.1q28(76142027_151647157)x1 280 46,der(X)t(X;Y),Y arr[hg19] 4q22.1(92854003_93398483)x3,Xp22.33p22.31(2701273_8531171)x0, Yq11.221q12(15991426_59002403)x2 717 45,X arr(X)x1 430* 46,XY arr[hg19] 9p24.3p23(204193_10036486)x1,16q23.3q24.3(82006620_90163114)x3,(X)x1,(Y)x1 29A 46,XY arr(1-22)x2,(X)x1,(Y)x1 234 47,XXX arr(X)x3 488 47,XXX arr(X)x3 619 47,XXY arr(1-22)x2,(X)x2,(Y)x1 714* 47,XXY arr[hg19] 7q11.23(72726578_74339044)x1,(X)x2,(Y)x1 413 47,XYY arr(1-22)x2,(X)x1,(Y)x2 * označuje pacienty s dalšími nálezy patogenních CNVs, ** označují pacienty s nálezem markerového chromosomu v mozaice (klasifikovány jako VOUS)

178

Příloha 6: Případy nálezů CNVs VOUS

pacient pacient pohlaví věk Výsledek arra-CGH Velikost (k OMIM geny s spojeé patologiemi původ 368 F 4 arr[hg19] 1p22.1(92204897_92713550)x3 509 2 - 533 M 1 arr[hg19] 2p16.3(50850691_51260612)x1 410 1 - 668 M 0 arr[hg19] 2p16.3(51037104_51260612)x1 224 1 mat 652 M 2 aa[hg19] 534 1 - 2q13q14.1(113937556_114471793)x3 624 M 5 arr[hg19] 2q14.3(125058848_125952612)x3 894 0 mat 610 M 9 arr[hg19] 3p12.1(83938767_85161728)x1 1 223 0 mat 32 M 4 arr[hg18] 3p25.3(9526409_9912749)x1 386 5 - 626 M 4 arr[hg19] 6q15(90707046_92723830)x3 2 017 2 pat 379 M 12 arr[hg19] 243; 0; 1 7q11.21(63534208_63777259)x3,11p11.2(481 442 - 47111_48588943)x3 555 M 4 arr[hg19] 7q31.1(108040004_108672760)x3 633 1 - 521 M 8 arr[hg19] 1 979 1 mat 7q35q36.1(145971019_147949754)x1 681 F 11 arr[hg19] 9p24.2(3569883_4156648)x3 587 1 - 359 M 5 arr[hg19] 9p23(9972017_10212135)x3 240 0 - 418 M 1 arr[hg19] 11q14.1(79715447_82534416)x3 2 819 0 - 304 M 4 arr[hg19] 14q13.1(81362045_81651933)x3 290 1 - 382 M 5 arr[hg19] 15q13.3(31972646_32510863)x3 538 1 - 732 F 4 arr[hg19] 15q13.3(32021733_32510863)x3 489 1 mat 135 F 4 arr[hg19] 713; 5; 0 de novo; 17p13.1(6941198_7654181)x3,21q22.3(44032 266 de novo 842_44298520)x3 233 M 9 arr[hg19] 18q21.32(57291428_57830158)x3 539 1 de novo 200A M 4 arr[hg19] 18q23(77120073_77565208)x3 445 1 - 674 F 6 arr[hg19] 19q13.42(53759522_54697399)x3 938 5 - 309 F 0 arr[hg19] 596 0 - 22q13.32q13.33(49399646_49995182)x3 312 F 13 arr[hg19] Xp22.32(4619762_4995869)x3, 376; 0; 1;1 Xp22.32p22.31(5989509_6278616)x3, 289; - Xq21.33(95689_96205743)x3 516 156 M 0 arr[hg19] Xp22.31(7533820_8135071)x2 601 0 mat 508 M 1 arr[hg19] Yq11.221(16495813_16992595)x2 497 0 pat 38 M 18 arr[hg18] 3 238 1 - Yq11.223q11.23(23067250_26304851)x2 Zkratky: F – female (žena), M – male (muž), mat – maternální, pat – paternální

179

Příloha 7: Případy nálezů oblastí cnnLOH velikost jedotlivýh olastí pacient cnnLOH (Mb), pohlaví počet OMIM geů spojeýh s věk Výsledek arra-CGH patologiemi 10 F 5 arr[hg19] 4q28.3(132016289_137201050)x2 hmz,10q11.22q21.2(49866332_60049524)x2 5,185; 10,183; 5,726; 0; 7; 9; 16 hmz,11q22.1q22.3(101577612_107304006)x2 hmz,12q24.23q24.32(119025696_126698616)x2 7,673 hmz 16 M 13 arr[hg19] 11q21q22.3(94748136_106284835)x2 hmz 11,537 13 89* M 11 arr[hg19] 1p36.33p36.23(1089699_7501658)x2 hmz,1p31.1p22.3(80444614_85530186)x2 6,412; 5,086; 9,032; hmz,1q32.2q41(210216731_219248727)x2 hmz,2p25.1p22.2(8375089_37735241)x2 29,360; 7,230; 5,232; hmz,2p21p16.3(45448525_52678323)x2 hmz,4p16.1p15.33(7792662_13025034)x2 6,241; 5,666; 6,235; hmz,5q23.3q31.1(128726060_134966735)x2 hmz,7p22.3p22.1(1629376_7295613)x2 11,496; 20,818; hmz,7p12.1p11.2(51325464_57560040)x2 hmz, 7q33q35(136072453_147568530)x2 26,815; 6,063; hmz,9q21.11q22.2(71998391_92816053)x2 hmz,9q31.3q34.3(112290716_139105940)x2 20,003; 23,161; hmz,11p12p11.2(42165001_48228497)x2 hmz,11q11q13.5(55196818_75200301)x2 10,265; 7,233; hmz,12q13.13q21.2(53013574_76174264)x2 hmz,12q23.3q24.21(106113863_116378716)x2 18,604; 7,376; 8,371; > geů > hmz,12q24.23q24.32(119764430_126997063)x2 hmz,14q13.3q22.3(37424844_56029175)x2 5,629 hmz,16p12.1p11.1(27371949_34748045)x2 hmz,16q11.2q12.2(46615096_54986139)x2 hmz,18q11.1q11.2(18559675_24188204)x2 hmz

93* F 9 arr[hg19] 1q42.13q42.2(228854703_234605153)x2 hmz,2q11.1q11.2(95665733_102291421)x2 5,750; 6,626; 6,791; hmz,3p24.3p24.1(21802251_28592900)x2 hmz,5q34q35.1(162909687_169213476)x2 6,304; 5,543; 6,013; hmz,6q22.2q22.31(118415513_123958572)x2 hmz,7p12.1p11.2(51546916_57560040)x2 7,723; 5,880; 7,316;

hmz,7q21.3q22.1(93561860_101284930)x2 hmz,7q33q34(136072453_141952110)x2 5,393; 5,182; 9,498; hmz,7q36.1q36.3(151569824_158885928)x2 hmz,8q24.21q24.22(128946538_134339916)x2 20,003; 23,950; hmz,10q25.2q26.11(114426859_119609014)x2 hmz,11p12p11.12(42008101_51505725)x2 11,031; 11,062; hmz,11q11q13.5(55196818_75200301)x2 hmz,12q13.13q21.2(53013574_76963662)x2 5,870; 9,765; 5,108; > geů > hmz,14q11.2q13.1(23045952_34076561)x2 hmz,14q21.2q22.3(44967082_56029175)x2 6,010 hmz,14q31.3q32.12(86976061_92846294)x2 hmz,14q32.2q32.33(97422988_107187899)x2 hmz,21q22.2q22.3(41171685_46279804)x2 hmz,Xq27.2q28(141670437_147680647)x2 hmz

180

118 M 8 arr[hg19] 1p13.2p11.2(113340306_121346616)x2 hmz,1q21.1q23.1(144945737_157998327)x2 8,006; 13,053; 18 hmz,11q14.1q22.1(85596924_100988034)x2 hmz 15,391 162 F 1 arr[hg19] 2p12p11.2(76582327_88739337)x2 hmz,2q14.3q22.1(128290114_141496284)x2 12,157; 13,206; hmz,3p22.3p22.1(36311925_42686001)x2 hmz,4p15.31p14(20821110_40170101)x2 6,374; 19,349; hmz,5p15.1p13.3(16455266_32109122)x2 hmz,5q15q22.3(97965990_113285239)x2 15,654; 15,319;

hmz,5q23.2q33.2(125842775_155027469)x2 hmz,7p21.3p15.3(8568574_21824986)x2 29,185; 13,256; hmz,7p12.3p11.2(48281178_57560040)x2 hmz,7q11.21q11.22(62260197_67891700)x2 9,279; 5,632; 12,203; hmz,9p21.3p13.3(21760639_33964118)x2 hmz,11q13.5q23.1(75946955_111094596)x2 35,148; 20,649;

hmz,13q14.3q21.33(51873714_72522782)x2 hmz,19q11q13.11(28292029_34221350)x2 5,929; 5,278; 15,340; geů >

hmz,19q13.11q13.2(34789008_40066819)x2 hmz,Xp11.3p11.21(42659478_57999932)x2 23,575 hmz,Xq11.1q21.31(62850896_86425426)x2 hmz

247 M 10 arr[hg19] 11p11.2p11.12(44071371_51505725)x2 hmz 7,434 16 330 M 1 arr[hg19] 1p32.1p31.1(59464487_77291188)x2 hmz,2p22.2p13.3(37735864_70801709)x2 17,827; 33,066; hmz,3q28q29(188105056_197802470)x2 hmz,5p15.2p14.1(14474678_24773509)x2 9,697; 10,299; hmz,5q23.2q31.2(123210031_316761392)x2 hmz,6p21.2p21.1(38290860_44422466)x2 13,551; 6,132; 7,108; hmz,6q16.1q16.3(93642677_100750261)x2 hmz,7p22.3p21.3(891338_8266420)x2 7,376; 6,060; 5,766;

hmz,8q23.1q23.3(108977050_115037278)x2 hmz,8q24.21q24.22(128150161_133916504)x2 24,250; 19,093; hmz,9p22.3p13.1(14461188_38710922)x2 hmz,9q21.11q21.33(71046583_90139405)x2 9,028; 6,675; 14,659; eů hmz,9q31.2q33.1(110788378_119816270)x2 hmz,10p12.31p12.1(19294220_25969102)x2 9,627; 10,734; hmz,10q22.3q23.33(80978586_95637267)x2 hmz,11q14.1q21(83673221_93299721)x2 12,244; 27,382; > 250 g > 250 hmz,12q21.2q21.33(78964958_89698922)x2 hmz,12q23.2q24.21(103798853_116042518)x2 6,672; 8,710; 24,562; hmz,13q14.11q21.33(43877535_71259218)x2 hmz,13q22.1q31.1(75243802_81916187)x2 8,125; 8,398 hmz,15q23q25.1(70777379_79486924)x2 hmz,17q12q22(31892865_56455260)x2 hmz,18q21.32q22.1(57235031_65360334)x2 hmz,20p13p12.2(1066580_9464399)x2 hmz Zkratky: F – female (žena), M – male (muž), * sourozenci

181

Příloha 8: Případy nálezů pravděpodobně benigních CNVs

pacient pacient pohlaví věk Výsledek arra-CGH Velikost (k OMIM geny s spojeé patologiemi původ 201 F 1 arr[hg19] 1p36.32(2694731_3202657)x3 508 1 mat 711 M 0 arr[hg19] 1p34.1(46204885_46427003)x3 222 0 - 316 M 10 arr[hg19] 1q25.1(175448847_175726866)x3 278 0 pat 116 M 2 arr[hg19] 1q43(241482239_241688890)x3 207 1 - 113 M 10 arr[hg19] 1q44(245365578_245706269)x3 341 0 mat 153 M 6 arr[hg19] 2p22.3(35688544_36439754)x1 751 0 pat 66 M 17 arr[hg19] 2p24.3(14147182_15577591)x3 1 430 1 mat 443 M 2 arr[hg19] 2q11.1(95529039_96040185)x3 511 0 pat 72 M 18 arr[hg19] 3q26.32(176694370_176917249)x3 223 1 de novo 238 M 15 arr[hg19] 4q21.22(82614627_82833333)x3, 219; 0; 0 mat; 4q22.3q23(98722563_98959662)x1 237 mat 52 M 3 arr[hg19] 4q28.3(135880364_137349407)x1 1 469 0 pat 713 M 0 arr[hg19] 5q23.2(122361449_122770927)x3 409 2 mat 369 M 4 arr[hg19] 6p12.1(53908951_54614050)x3 705 0 pat 221 F 11 arr[hg19] 6q11.1(61982931_62707643)x3 725 0 mat 131 F 9 arr[hg19] 6q12(65566720_65794081)x1 227 1 pat 272 M 9 arr[hg19] 6q13(74476489_75033762)x3, 557; 0; 0 mat; pat 12q24.13q24.21(114269080_114518222)x3 249 271 F 9 arr[hg19] 6q24.1(140639636_140863429)x1 224 0 - 477 M 6 arr[hg19] 6q25.1(149904823_150354051)x3 0.449 0 mat 374 M 6 arr[hg19] 6q27(169936233_170228733)x3 0.293 1 pat 322 F 7 arr[hg19] 7p22.2(3872452_4091514)x1 0.219 0 mat 248 M 4 arr[hg19] 7p21.3(8970993_9175833)x1 0.205 0 mat 320 F 8 arr[hg19] 7p21.2(15593270_16255671)x1 0.662 1 mat 526 F 11 arr[hg19] 7p15.3(23564766_24126388)x3 0.562 0 pat 290 M 7 arr[hg19 7q11.23(72808001_73357258)x1 0.549 0 mat 605 F 1 arr[hg19] 7q31.1(111274604_111741479)x3 0.467 0 pat 565 M 7 arr[hg19] 7q36.3(155850685_156407387)x3, 557; 0; 0 mat; 7q36.3(158201462_158445135)x3 244 mat 336 F 1 arr[hg19] 8q24.21(130818619_131107320)x3 289 0 mat 115 M 7 arr[hg19] 694 0 mat 8q24.23q24.3(139709084_140403084)x3 459 F 7 arr[hg19] 659 0 pat 8q24.23q24.3(139769115_140427744)x3 157 F 1 arr[hg19] 9p21.2(27458043_27773010)x3 315 1 pat 178 F 0 arr[hg19] 9q21.13(77992580_78460683)x1 468 0 pat 721 M 5 arr[hg19] 9q22.33(100433630_100702889)x3 269 2 mat 426 M 1 arr[hg19] 10p15.3(2245932_2581063)x1 335 0 -

182

307 M 0 arr[hg19] 10p15.1(4875224_5139909)x1 265 1 pat 520 F 11 arr[hg19] 10q11.23(51664020_52153320)x3 489 0 mat 596 M 7 arr[hg19] 10q11.23(51804961_52153320)x3 348 0 pat 573 M 5 arr[hg19] 11q13.4(73714700_73915436)x3 201 2 - 209 F 4 arr[hg19] 11q14.1(84133039_84349772)x1 217 0 mat 340 M 15 arr[hg19] 11q22.3(106068153_107006870)x1 939 0 pat 341 F 16 arr[hg19] 12q21.31(85949922_86293633)x3 344 0 pat 437 M 12 arr[hg19] 374 0 mat 12q24.13q24.21(114259761_114634079)x3 159 F 2 arr[hg19] 12q24.33(133153200_133819092)x1 666 3 pat 267 M 5 arr[hg19] 14q12(27305851_27651439)x3 346 0 mat 100 M 0 arr[hg19] 14q23.3(67176479_67449489)x1, 273; 1; 0 pat; mat Xq28(148651627_149158219)x2 507 136 M 11 arr[hg19] 14q32.31(102488934_102991553)x3 503 2 mat 230 F 3 arr[hg19] 16q23.1(78084187_78706022)x3, 622; 1; 1 pat; pat Xp11.22(50352493_50608326)x3 256 73 F 1 arr[hg19] 17q11.2(31359863_31685464)x1 326 0 mat 142 F 8 arr[hg19] 17q22(50983095_51313628)x1 331 0 pat 68 F 5 arr[hg19] 18q12.1(29394209_29621304)x3 227 1 mat 146 M 2 arr[hg19 20q11.21(29842786_30118643)x3 276 0 mat 165 M 16 arr[hg19] 866 0 pat 22q13.32q13.33(49315595_50181440)x3 390 F 5 arr[hg19] Xp22.32(4619762_4995869)x3,Xp22 376; 0; 1 pat; pat .32p22.31(5989509_6278616)x3 289 632 F 2 arr[hg19] Xq21.33(96138895_96975370)x3 836 1 pat 101 M 1 arr[hg19] Xq25(126400932_126802840)x2,Xq 402; 0; 0 mat; 26.2(131697460_132385040)x2 688 mat 275 F 0 arr[hg19] 693 0 mat Xq27.1q27.2(140226100_140919037)x3 511 M 4 arr[hg19] Yq11.222(21116119_21510513)x2 394 0 pat Zkratky: F – female (žena), M – male (muž), mat – maternální, pat - paternální

183