Jurnal AgroBiogen 4(1):35-40

ULASAN Kajian Filogenetika Molekuler dan Peranannya dalam Menyediakan Informasi Dasar untuk Meningkatkan Kualitas Sumber Genetik Anggrek

Topik Hidayat1 dan Adi Pancoro2 1Jurusan Pendidikan Biologi, Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr. Setiabudhi No. 229, Bandung 40154 2Sekolah Ilmu Teknologi dan Hayati, Institut Teknologi Bandung, Jalan Ganesha No. 10, Bandung 40132

ABSTRACT oleh para pelaku hortikultura melalui kawin silang antarjenis anggrek (hibridisasi) dalam upaya mening- Molecular Phylogenetic Studies in Providing Basic Knowledge to Improve Quality of Genetic Resources of katkan kualitas anggrek yang baru dihasilkan untuk Orchid. Topik Hidayat and Adi Pancoro. Early information memenuhi kebutuhan dan selera pasar (market pull). resulted from molecular phylogenetic studies of many im- Namun demikian, seringkali para pelaku hortikultura portant ornamental crops is often less attention to many menemui kendala bahwa anggrek baru yang dihasil- growers and farmers. Phylogenetics is one of the most pre- kan sangat sensitif terhadap perubahan lingkungan ferable method in systematics to reconstruct evolutionary dan tidak berumur panjang meskipun memiliki sifat- relationships of groups of biological organisms in order to sifat vegetatif lain yang unggul (Frowine 2005). Bahkan understand their biodiversities. This has been revolutionized pada beberapa kasus, dua jenis anggrek tidak bisa di- by DNA sequences data. In this method, a group of organ- isms that shares many identical characteristics are con- hibridisasi. Para petani atau pelaku hortikultura yang sidered to be closely related; deriving from a common lain tidak menyadari bahwa hal ini mungkin karena ancestor and is assumed to have similar genetic patterns adanya ketidakcocokan dalam hal genetik (genetic and biochemical properties. By these basic principles, incompatibility) dan evolusi dari kedua tanaman molecular phylogenetics plays important roles in revealing a anggrek tersebut. Untuk itu perlu diupayakan informasi basic knowledge on pattern of relationships to which awal mengenai hubungan genetik dan/atau evolusi genetic resources can be improved. Over the past decade, dari tanaman-tanaman yang akan dihibridisasi. botanists have done several thousand phylogenetic analyses based on molecular data of economically and horticulturally Filogenetika merupakan salah satu metode yang important crops. Orchids are the best example for this. paling sering digunakan dalam sistematika untuk me- There is no doubt that most orchid had played roles in mahami keanekaragaman makhluk hidup melalui horticulture and hybridization. At present, many infrageneric rekonstruksi hubungan kekerabatan (phylogenetic and intergeneric hybrids are available commercially. Suc- relationship). Seiring dengan kemajuan pesat biologi cessful hybridization can be achieved if two or more individ- molekuler, data DNA saat ini telah digunakan dalam ual plants understudy are closely related in respect to their banyak penelitian filogenetika untuk menghasilkan genetics and evolution. informasi yang lebih akurat. Makalah ini mendeskripsi- Key words: Hybridization, molecular phylogenetics, orchid kan prinsip-prinsip dasar filogenetika molekuler dan subtribe , quality of genetic resources. aplikasi kajiannya dalam usaha meningkatkan kualitas sumber daya genetik tanaman, dalam hal ini anggrek. PENDAHULUAN Selain itu, dalam makalah ini juga dibahas beberapa hasil penelitian yang relevan. Khusus bagi negara berkembang seperti Indone- sia, sektor pertanian merupakan tulang punggung yang SISTEMATIKA DAN FILOGENETIKA MOLEKULER menyokong kehidupan bangsa dengan segala aspek- aspeknya. Salah satu bidang pertanian yang saat ini Dalam ilmu biologi, sistematika memiliki peran sedang mengalami pertumbuhan dan perkembangan utama menyediakan perangkat pengetahuan untuk yang sangat pesat adalah hortikultura, terutama budi mengkarakterisasi organisme dan sekaligus menge- daya tanaman hias. Tidak diragukan lagi, tanaman nalinya dalam rangka memahami keanekaragaman. anggrek merupakan salah satu primadona tanaman Secara fundamental, sistematika bertujuan untuk me- hias. Budidaya tanaman anggrek biasanya dilakukan mahami dan mendeskripsikan keanekaragaman suatu organisme dan merekonstruksi hubungan kekerabatan

Hak Cipta © 2008, BB-Biogen dengan organisme lainnya (Gravendeel 2000) serta 36 JURNAL AGROBIOGEN VOL. 4 NO. 1 mendokumentasikan perubahan-perubahan yang ter- yang terdapat pada outgroup. Karakter sinapomorfik jadi selama evolusi dan mengubahnya ke dalam se- adalah karakter yang diturunkan dan terdapat pada buah sistem klasifikasi yang mencerminkan evolusinya kelompok monofiletik. Gambar 1 memperlihatkan se- (Systematics Agenda 2000). Oleh karena itu, salah satu buah pohon kekerabatan sebagai hasil dari analisis tugas penting dari sistematika adalah merekonstruksi filogenetika. hubungan evolusi (evolutionary relationship) dari ke- lompok-kelompok organisme biologi. Sebuah hubung- Penggunaan DNA dalam Studi Filogenetik an evolusi yang direkonstruksi dengan baik dapat digu- Karakter morfologi telah lama digunakan dalam nakan sebagai landasan untuk melakukan penelitian- banyak penelitian filogenetika. Dengan pesatnya per- penelitian komparatif (comparative investigations) kembangan teknik-teknik di dalam biologi molekuler, misalnya dalam bidang ekologi dan biogeografi. seperti polymerase chain reaction (PCR) dan sequen- Ada dua metode untuk merekonstruksi hubungan cing DNA, penggunaan sekuen DNA dalam penelitian evolusi dari sebuah kelompok organisme biologi, yaitu filogenetik telah meningkat pesat dan telah dilakukan fenetika dan kladistika. Kalau metode pertama me- pada semua tingkatan taksonomi, misalnya famili, naksir hubungan evolusi berdasarkan kepemilikan ka- marga, dan spesies. Filogenetik molekuler mengombi- rakter atau ciri yang sama (overall similarity) dari ang- nasikan teknik biologi molekuler dengan statistik gota-anggota suatu kelompok, maka yang kedua men- untuk merekonstruksi hubungan filogenetika. dasari sebuah hubungan pada perjalanan evolusi ka- Pemikiran dasar penggunaan sekuen DNA dalam rakter atau ciri dari setiap anggota suatu kelompok studi filogenetika adalah bahwa terjadi perubahan yang sedang dipelajari. Kladistika sering disebut atau basa nukleotida menurut waktu, sehingga akan dapat ditulis di dalam literatur ilmiah sebagai filogenetika diperkirakan kecepatan evolusi yang terjadi dan akan dan merupakan metode yang umum digunakan di dapat direkonstruksi hubungan evolusi antara satu dalam banyak penelitian sistematika. kelompok organisme dengan yang lainnya. Beberapa Di dalam filogenetika, sebuah kelompok organis- alasan penggunaan sekuen DNA (Hillis et al. 1996), yaitu (1) DNA merupakan unit dasar informasi yang me yang anggota-anggotanya memiliki banyak kesa- mengkode organisme, (2) lebih memudahkan dalam maan karakter atau ciri dianggap memiliki hubungan mengekstrak dan menggabungkan informasi menge- yang sangat dekat dan diperkirakan diturunkan dari nai proses evolusi suatu kelompok organisme, sehing- satu nenek moyang; nenek moyang dan semua turun- ga mudah untuk dianalisis, (3) memudahkan dalam annya akan membentuk sebuah kelompok monofiletik pembuatan model dari peristiwa evolusi secara kom- (Gambar 1). Oleh karena itu, anggota-anggota di da- paratif, dan (4) menghasilkan informasi yang banyak lam kelompok monofiletik ini diasumsikan membawa dan beragam, dengan demikian akan ada banyak sifat atau pola genetik dan biokimia yang sama (Topik bukti tentang kebenaran suatu hubungan filogenetika. 2005). Sekuen DNA telah menarik perhatian para prakti- Dalam analisis filogenetika kelompok outgroup si taksonomi dunia untuk dijadikan karakter dalam sangat dibutuhkan dan menyebabkan polarisasi karak- penelitian filogenetika karena beberapa fakta. Perta- ter atau ciri, yaitu karakter apomorfik dan plesiomor- ma, sekuen DNA menawarkan data yang akurat me- fik. Karakter apomorfik adalah karakter yang berubah lalui pengujian homologi yang lebih baik terhadap ka- dan diturunkan dan terdapat pada ingroup, sedangkan rakter-karakter yang ada (Baldwin et al. 1995). Kedua, karakter plesiomorfik merupakan karakter primitive sekuen DNA menyediakan banyak character states ka- rena perbedaan laju perubahan basa-basa nukleotida di dalam lokus yang berbeda adalah besar (Moritz dan Karakter sinapomorfik/ Hillis 1996). Ketiga, sekuen DNA telah terbukti meng- apomorfik Kelompok hasilkan sebuah hubungan kekerabatan yang lebih monofiletik alami (Chase et al. 1993, Topik 2005).

Sumber karakter DNA dapat diperoleh dari inti (nDNA), kloroplas (cpDNA), dan mitokondria Outgroup (mtDNA). Tabel 1 memuat beberapa sistem gen dan genom yang telah digunakan dalam penelitian filo-

Karakter genetika molekuler. plesiomorfik Analisis filogenetika molekuler merupakan proses Gambar 1. Pohon kekerabatan dan polarisasi karakter dalam anali- sis filogenetika. bertahap untuk mengolah data sekuen DNA atau pro- Sumber: Topik (2005). tein sehingga diperoleh suatu hasil yang menggambar- 2008 T. HIDAYAT DAN A. PANCORO: Kajian Filogenetika Molekuler dan Peranannya 37

Tabel 1. Beberapa sistem gen dan genom dalam studi filogenetik Selain rutin dilakukan pada anggrek, hibridisasi de- molekuler ngan teknik ini juga telah diterapkan pada tanaman Gen atau genom Metode buah-buahan, misalnya jeruk dan apokat (Witjaksono DNA kloroplas Analisis restriksi dan Litz 2002). Gen rbcL dari DNA kloroplas Analisis sekuen DNA Karena dalam hibridisasi terjadi penggabungan Gen matK dari DNA kloroplas Analisis sekuen DNA DNA mitokondria Analisis sekuen DNA dua atau lebih sifat dari jenis tanaman yang berbeda, Gen RNA inti Analisis sekuen DNA maka prasyaratnya adalah tanaman-tanaman tersebut Daerah ITS dari nrDNA Analisis sekuen DNA harus memiliki pola genetik yang sama (Frowine Kelompok gen repetitive: Knob heterokromatin Analisis sekuen DNA 2005), sehingga memiliki kecenderungan untuk men- Gen CAB Analisis sekuen DNA jalani jalur evolusi yang sama (Li dan Graur 1991). Gen rbcS Analisis sekuen DNA Dengan kata lain bahwa tanaman-tanaman yang akan Gen kopi tunggal Analisis sekuen DNA dihibridisasi harus memiliki hubungan evolusi atau

kekerabatan (filogenetika) yang dekat. Dalam konteks filogenetika, tanaman-tanaman ini harus memiliki kan estimasi mengenai hubungan evolusi suatu ke- hubungan monofiletik, yaitu berasal dari satu nenek lompok organisme. Menurut Hershkovitz dan Leipe moyang yang sama. Sebaliknya, jika hubungan keke- (1998) ada sejumlah asumsi yang harus diperhatikan rabatan tanaman-tanaman yang akan dihibridisasi sebelum menggunakan data sekuen DNA atau protein adalah non monofiletik maka salah satu yang timbul dalam analisis filogenetika, di antaranya, yaitu (1) se- adalah reaksi penolakan karena tidak ada kecocokan kuen berasal dari sumber yang spesifik, yaitu dari inti, genetik seperti yang sering terjadi dalam banyak kegi- kloroplas atau mitokondria, (2) sekuen bersifat homo- atan hibridisasi (Frowine 2005). log (diturunkan dari satu nenek moyang), (3) sekuen memiliki sejarah evolusi yang sama (misalnya bukan dari campuran DNA inti dan mitokondria), dan (4) se- HUBUNGAN FILOGENETIK PADA ANGGREK tiap sekuen berkembang secara bebas. SUBTRIBE AERIDINAE Paling sedikit ada tiga tahap penting dalam ana- Subtribe Aeridinae merupakan salah satu kelom- lisis filogenetika molekuler, yaitu sequence alignment, pok tanaman anggrek dengan jumlah anggota besar, rekonstruksi pohon filogenetika, dan evaluasi pohon sangat beranekaragam, dan rumit dalam konteks tak- filogenetika dengan uji statistik. Untuk merekonstruksi sonomi. Kelompok, yang kebanyakan anggotanya me- pohon filogenetika, saat ini telah tersedia beraneka ra- miliki nilai komersial tinggi sebagai tanaman hias tum- gam program komputer, misalnya Phyllip, PAUP, dan buh secara monopodial dan kebanyakan hidup seba- MrBayes. gai epifit yang menyebar luas di daerah temperata, daerah tropis Asia, Australia, kepulauan pasifik di se- HIBRIDISASI PADA ANGGREK DAN KUALITAS belah timur, bahkan sampai ke Afrika di sebelah barat. SUMBER GENETIK Analisis filogenetika molekuler terhadap anggrek Peningkatan kualitas sumber genetik melalui hi- subtribe Aeridinae dengan menggunakan sekuen DNA bridisasi pada tanaman anggrek telah lama dilakukan dari inti dan kloroplas menghasilkan beberapa kelom- orang. Pada prinsipnya, hibridisasi adalah mengga- pok monofiletik, yang disebut dengan istilah alliance bungkan sifat unggul dari dua jenis tanaman, atau bah- (Topik et al. 2005, Gambar 2). Kebanyakan sampel kan lebih, melalui berbagai teknik. Hibridisasi pada anggrek yang digunakan dalam penelitian ini hidup liar anggrek umum terjadi di alam dengan bantuan polina- di hutan-hutan belantara hutan hujan tropis. Selain tor (Dressler 1993), dan secara buatan manusia dapat memiliki implikasi terhadap dunia taksonomi anggrek menjadi fasilitator untuk terjadinya penyerbukan. Aeridinae itu sendiri, hasil penelitian ini diharapkan berimplikasi positif terhadap upaya-upaya berbagai Secara sederhana, hibridisasi dilakukan dengan pihak untuk meningkatkan kualitas sumber genetiknya mengambil serbuk sari menggunakan kuas, selanjut- melalui kegiatan hibridisasi. nya serbuk sari tersebut dengan hati-hati diletakkan di atas putik tanaman anggrek yang berbeda jenis. De- Berdasarkan Gambar 2, maka dapat direkomen- ngan pesatnya kemajuan bioteknologi melalui hibridi- dasikan bahwa hibridisasi dapat dilakukan antarjenis sasi somatik, dapat dilakukan fusi sel somatik, yang di- di dalam alliance yang sama, misalnya pada alliance sebut dengan fusi protoplas. Melalui fusi protoplas, . Pada alliance ini terdapat beberapa jenis dari maka sifat-sifat unggul dari dua jenis tanaman dapat marga Aerides, , Ascocentrum, Trudelia, Chris- digabungkan, yang tidak dapat digabungkan secara tensonia, , Rhyncostilis, Seidenfade- seksual maupun aseksual (Witjaksono et al. 1998). nia, , dan , yang satu dengan 38 JURNAL AGROBIOGEN VOL. 4 NO. 1

Topik H & Adi P 12 84 Cryptopylos clausus 62 philippinensis fesselii Alliance monticola escritorii 100 javanica struthio 91 Saccolabium pusillum 66 deliciosa Lesliea mirabilis 89 100 Phalaenopsis chibae Doritis pulcherrima Alliance Phalaenopsis 93 100 Phalaenopsis wilsonii 99 zhejiangensis Phalaenopsis fasciata Phalaenopsis amabilis 100 100 emarginatus 100 decipiens Alliance callifera 60 100 indusiata Brachypeza zamboangensis Cabang 4 100 Pteroceras pallidum 62 aphyllum 68 tridentata 96 Plectorrhiza erecta 70 Plectorrhiza brevilabris beckleri 57 Schistotylus purpuratus 80 isosepala hamatum hillii 76 minimus Alliance begaudii divitiflora armitii 63 Sarcochilus hirticalcar 54 Sarcochilus spathulatus Sarcochilus weinthalii 57 Rhinerrrhiza moorei 97 Sarcochilus moorei 63 raciborskii Sarcochilus hartmannii japonica 100 paniculata 75 ctenoglossum 73 scolopendrifolium Cleisostoma fuerstenbergium Alliance Pelatantheria 100 Cleisostoma williamsonii helferi Smitinandia micrantha 100 95 Cleisostoma aff. gjellerupii 79 merrillianum 66 viridiflava Alliance 100 Ornithochilus difformis 97 comberi Arachnis flosaeris parishii succisa 100 truncata 94 baliensis Alliance Diploprora Robiquetia bertholdii philippinensis Cabang 3 aff. dalatensis 95 pilosulum 67 100 Sarcochilus chrysanthus Abdominea minimiflora 68 99 griffithii Alliance 88 100 Thrixspermum subulatum Thrixspermum centipeda lowii 86 Ceratochilus biglandulosus 87 tenuicaulis Alliance 68 100 Trichoglottis latisepala ionosma lissochiloides 100 ochracea 88 Acampe rigida Alliance Acampe 99 parviflora pallida 97 81 kunstleri Pomatocalpa diffusa Alliance Pomatocalpa Haraella retrocalla 100 Aerides flabellata 100 Aerides odorata 100 80 Christensonia vietnamica 74 100 Vanda hindsii 100 Vanda tricolor Planilabre Trudelia pumila Cabang 2 91 Vanda coerulea 100 Ascocentrum pusillum 100 Ascocentrum christensonianum Alliance Aerides 59 Neofinetia falcata 96 69 Holcoglossum amesianum Holcoglossum tsii subulata mitrata Paraphalaenopsis labukensis Rhyncostylis retusa 58 100 japonicus Cabang 1 83 Gastrochilus calceolaris sullingi 76 Lusia teres 98 100 Lusia amesiana Alliance 74 Dryadorchis singularis clarkei 77 Renanthera angustifolia calopterum 100 Jumellea sagittata Angraecum scottianum Outgroup Microterangis hariotiana Gambar 2. Pohon filogenetika berdasarkan data gabungan dari sekuen DNA kloroplas (gen matK) dan inti (daerah ITS) menggunakan program PAUP. Angka menunjukkan nilai bootstrap (Topik et al. 2005). lainnya dapat dihibridisasi. Di pasar tanaman anggrek dan Rhyncostilis. Persilangan dengan anggrek liar hias, banyak sekali hibrid-hibrid yang diperoleh dari dalam alliance ini seperti Christensonia, Seidenfa- hibridisasi antarmarga (intergeneric) atau antarjenis denia, dan Paraphalaenopsis telah menambah plasma dalam satu marga (infrageneric) dalam alliance ini, nutfah anggrek Aeridinae (Topik 2005). misalnya yang paling populer adalah Aerides, Vanda, 2008 T. HIDAYAT DAN A. PANCORO: Kajian Filogenetika Molekuler dan Peranannya 39

Tabel 2. Contoh anggrek hibrid intergenerik dan infragenerik dalam alliance Aerides.

Nama hibrid Simbol Marga-marga yang dihibridisasi Aerdv Aerides x Vanda Asco Ascocentrum x Vanda Chtra Aerides x Ascocentrum x Vanda Darwinara Dar Ascocentrum x Neofinetia x Rhyncostylis x Vanda Micholitzara Mchza Aerides x Ascocentrum x Neofinetia x Vanda Nakamotoara Nak Ascocentrum x Neofinetia x Vanda Prra Aerides x Rhyncostylis x Vanda Rhv Rhyncostylis x Vanda Ronnyara Rnya Aerides x Ascocentrum x Rhyncostylis x Vanda Sanjumeara Sjma Aerides x Neofinetia x Rhyncostylis x Vanda Vanda V Vanda x Vanda Vandaeranthes Vths Aerides x Vanda Vandofinetia Vf Neofinetia x Vanda Vandofinides Vfds Aerides x Neofinetia x Vanda Vasco Ascocentrum x Rhyncostylis x Vanda Viraphandhuara Vpda Aerides x Ascocentrum x Neofinetia x Vanda Yonezawaara Yzwr Neofinetia x Rhyncostylis x Vanda

Contoh lainnya yang menarik untuk dibahas ada- Masih banyak petani, dalam hal ini sebagai pelaku lah alliance Phalaenopsis. Biasanya para pelaku horti- hortikultura, yang tidak acuh terhadap perkembangan kultura hanya melakukan hibridisasi antarjenis dalam ilmu, mungkin karena keterbatasan ilmu dan penge- marga Phalaenopsis. Tetapi, seperti dapat dilihat pada tahuan yang mereka miliki. Kolaborasi antara Gambar 2, dapat direkomendasikan bahwa jenis dari stakeholders dapat ditingkatkan di masa yang akan marga Phalaenopsis juga dapat dihibridisasi dengan datang. Kolaborasi ini hendaknya diwujudkan dengan jenis dari marga Lesliea, Doritis, dan Nothodoritis. Da- membentuk jejaring antara peneliti botani di lembaga lam konteks taksonomi, Yukawa et al. (2005) bahkan penelitian maupun di perguruan tinggi dengan petani mengusulkan unifikasi dari marga-marga dalam Pha- di lapang sebagai ajang pertukaran informasi. Melalui laenopsis alliance menjadi satu marga, yaitu Doritis. jejaring ini diharapkan penelitian yang dilakukan pene- Hal ini disebabkan karena sangat dekatnya hubungan liti botani sinergis dengan yang dibutuhkan oleh genetik dan evolusi mereka. petani. Tabel 2 menyajikan beberapa contoh anggrek hibrid dari kelompok monofiletik alliance Aerides. DAFTAR PUSTAKA Baldwin, B.G., M.J. Sanderson, J.M. Porter, M.F. UPAYA UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS Wojciechowski, C.S. Campbell, and M.J. Donoghue. SUMBER DAYA GENETIK TANAMAN ANGGREK 1995. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evidence on Angiosperm phylogeny. Pada bagian terakhir makalah ini disampaikan Annual Missouri Botanic Garden 82:247-277. bahwa upaya peningkatan kualitas sumber genetik Chase, M.W., D.E. Soltis, and R.G. Olmstead. 1993. dan plasma nutfah dari berbagai produk pertanian Phylogenetics of seed plants: An analysis of nucleotide tidak akan berjalan baik tanpa kerja sama yang baik sequences from the plastid gene rbcL. Annual Missouri dan berkelanjutan antara para stakeholders seperti Botanic Garden 80:528-580. peneliti, petani, dan pemerintah. Sebenarnya berbagai Dressler, R.L. 1993. Phylogeny and classification of the model aktivitas kolaborasi untuk kegiatan serupa su- orchid family. Dioscorides Press, Portland, Oregon. dah dibangun dan dikembangkan. Pemerintah pusat pada beberapa tahun ke belakang telah menawarkan Frowine, S.A. 2005. Orchids for Dummies. Wiley Publishing, Indianapolis. hibah-hibah penelitian yang mensyaratkan adanya kolaborasi antara peneliti, petani, perusahaan, dan Gravendeel, B. 2000. Reorganising the orchid Coelo- pemerintah setempat, tetapi implementasi di lapang gyne: A phylogenetic classification based on morph- menemui banyak kendala. ology and molecules. National Herbarium Nederland. Peneliti, dalam hal ini peneliti dalam bidang bo- Hershkovitz, M.A. and D.D. Leipe. 1998. Phylogenetic tani, mengalami kesulitan dalam melakukan kajian analysis. In Baxevanis, A.D. and B.F. Oullette (Eds.). Bioinformatics a Practical Guide to The Analysis of dan mendiseminasi hasil-hasil kajian mereka yang Genes and Proteins. John Wiley and Sons, New York. relevan karena terbatasnya sarana dan prasarana. 40 JURNAL AGROBIOGEN VOL. 4 NO. 1

Hillis, D.M., C. Moritz, and B.K. Mable. 1996. Molecular Topik H. 2005. Systematic study of subtribe Aeridinae Systematic. 2nd Ed. Sinauer Assocites, Massachusetts. (). Disertasi The University of Tokyo, Japan. Li, W-H. and D. Graur. 1991. Fundamentals of Molecular Biology. Sinauer Associates. Massachusetts. Witjaksono, R.E. Litz, and J.W. Grosser. 1998. Protoplast isolation, culture and somatic embryo regeneration in Moritz, C. and D.M. Hillis. 1996. Molecular systematics: avocado (Persea americana Mill.). Cell Rep. Context and controversies. In Hillis, D.M., C. Moritz, 18:235-242. B.K. Mable. (Eds.). Molecular Systematics, 2nd edition, Sinauer Associate, Sunderland, MA, USA. p. 1-13. Witjaksono and R.E. Litz. 2002. Somatic embryogenesis of avocado and its application for plant improvement. Systematics Agenda. 2000. Charting the Biosphere. Tech- Proceeding of the International Symposium on Tropical nical Report. Herbarium, New York Botanical Garden, and Subtropical Fruits. 26th November-1st December USA. 2000. Cairns, Australia. Acta Hort. 575:133-138. Topik, H., T. Yukawa, and M. Ito. 2005. Molecular phylo- Yukawa, T., K. Kita, T. Handa, H. Topik, and M. Ito. 2005. genetics of subtribe Aeridinae (Orchidaceae): Insights Molecular phylogenetics of Phalaenopsis (Orchidaceae) from plastid matK and nuclear ribosomal ITS and allied genera: Re-evaluation of generic concepts. sequences. J Plant Res. 18:271-284. Acta Phytotaxonomi et Geobotany 56:141-162.