Entwicklung von Screeningverfahren für Arzneistoffe und Metaboliten mittels LC-MS und LC-MS/MS
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
2004
vorgelegt von Claudia Müller
aus Freiburg
Die vorliegende Arbeit entstand im Zeitraum von Oktober 2001 bis Mai 2004 am Institut für Rechtsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg.
Dekan: Prof. Dr. K. Bucher Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. G. E. Schulz Betreuer der Arbeit und Referent: PD Dr. W. Weinmann Koreferent: Prof. Dr. R. Schubert Bekanntgabe der Prüfungsergebnisse: 08.07.2004 Danksagung:
Herrn PD Dr. W. Weinmann danke ich für die Überlassung des Themas, für seine Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit, für seine Hilfsbereitschaft und die zahlreichen Anregungen, die zum Gelingen dieser Doktorarbeit beitrugen.
Herrn Prof. R. Schubert danke ich für die Aufnahme in seinen Arbeitskreis.
Herrn Prof. Dr. S. Pollak danke ich für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit am Institut für Rechtsmedizin durchführen zu können sowie für die finanzielle Unterstützung, die die Teilnahme an zahlreichen interessanten Kongressen und Tagungen im In– und Ausland ermöglichte.
Herzlichen Dank an meine Kollegen Ana Baranda González, Patrick Schäfer, Haiko Schlögl und Sebastian Dresen für ihre Anregungen und Diskussionsbereitschaft, die gute Zusammenarbeit, die heitere, produktive Arbeitsatmosphäre & die netten Stunden außerhalb des Instituts.
Jürgen Kempf, Dr. Thomas Dern und Dr. Veit Mylius danke ich für die Geduld und Hilfestellung bei Softwareproblemen.
Bei allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des Instituts bedanke ich mich für die entgegengebrachte Kollegialität und Hilfsbereitschaft.
Besonders bedanke ich mich bei meinen Eltern, meinem Bruder Matthias und meinen Freunden, die mich zur Durchführung dieser Arbeit ermutigten sowie für ihre Unterstützung, Verständnis und Hilfsbereitschaft.
meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ...... I
Abkürzungsverzeichnis ...... IV
1. Einleitung...... 1
1.1. Problemstellung ...... 1 1.1.1. Stand der Technik und Ziel der Arbeit...... 2 1.2. Massenspektrometrie ...... 4 1.2.1. Probeneinführung in das Massenspektrometer ...... 4 1.2.2. Ionenquellen...... 4 1.2.2.1. Elektrosprayionisation (ESI) ...... 5 1.2.2.2. Atmosphärendruck Chemische Ionisation (APCI)...... 6 1.2.2.3. Vergleich ESI – APCI...... 7 1.2.3. Massenspektrometer...... 8 1.2.3.1.Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer...... 8 1.2.3.2. Lineare Ionenfalle...... 9 1.2.4. Messtechniken mit Quadrupol Massenspektrometern ...... 10 1.2.4.1. Single-Quadrupol-Massenspektrometer ...... 10 1.2.4.2. Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer...... 10 1.2.4.3. In–source collision induced dissociation...... 12 1.2.5. Software Funktionen zur Automatisierung der Spektrenaufnahme...... 13 1.2.5.1. Information Dependent Acquisition ...... 13 1.2.5.2. Dynamic Exclusion...... 14 1.2.6. Matrixeffekte...... 14 1.3. LC/MS und LC-MS/MS Spektrenbibliotheken...... 16 1.3.1. ESI–CID / APCI-CID LC-MS Spektrenbibliotheken...... 17 1.3.2. MS/MS Bibliotheken ...... 18 1.3.3. Übertragbarkeit von Spektrenbibliotheken ...... 18 1.3.4. Bibliothekssuche mit „Analyst“...... 19 1.4. Gezielte Suche nach Substanzklassen...... 21
1.4.1. Verordnungshäufigkeit von 1,4-DHP, Angiotensin-AT1-Rezeptor- Antagonisten und oralen Antidiabetika...... 21 1.4.2. Calciumantagonisten...... 22 1.4.3. Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten...... 25 1.4.4. Orale Antidiabetika ...... 26 2. Experimenteller Teil ...... 29
2.1. Geräte/Materialien ...... 29 2.1.1. Extraktion...... 29 2.1.2. HPLC...... 29
I Inhaltsverzeichnis
2.1.3. Massenspektrometrie ...... 30 2.1.4. Sonstige Geräte ...... 30 2.1.5. Reagenzien...... 31 2.2. Methoden...... 33 2.2.1. Extraktionsmethoden ...... 33 2.2.2. HPLC-Parameter...... 36 2.2.3. Massenspektrometrische Geräte-Parameter...... 40 3. Ergebnisteil ...... 45
3.1. Optimierung einer LC/MS-Methode für ein “General Unknown“ Screening- verfahren...... 45 3.1.1. Untersuchung von Suppressionseffekten bei verschiedenen Extraktions- verfahren...... 45 3.1.2. Vergleich des Retentionsverhaltens verschiedener Säulen...... 46 3.1.3. Qualitätskriterium: Reproduzierbarkeit der Fragmentierung ...... 49 3.1.4. Untersuchung der Ionenintensitäten ...... 50 3.2. Aufbau einer ESI-CID Q1-Scan Bibliothek ...... 56 3.2.1. Verkürzung des Gradienten zur Aufnahme von Bibliotheksspektren ...... 56 3.2.2. Kombination einer UV- Spektren-Datenbank mit einer ESI–CID Q1- Massenspektrenbibliothek...... 58 3.2.3. Bibliothekssuche mit der Access Datenbank...... 61 3.3. Erweiterung einer MS/MS Spektrenbibliothek ...... 63 3.3.1. Bibliothekssuche mit Analyst 1.4 (+ Library Patch) ...... 63 3.4. Bestimmung von Metaboliten aus Körperflüssigkeiten ...... 64 3.4.1. Citalopram und Metaboliten ...... 64 3.4.2. Zopiclon und Metaboliten...... 70 3.4.3. Doxepin und Metaboliten ...... 74 3.4.4. Sildenafil und Metaboliten...... 78 3.4.5. Quetiapin und Metaboliten ...... 83 3.4.6. Promethazin und Metaboliten...... 88 3.4.7. Verapamil und Metaboliten ...... 92 3.4.8. Trimipramin und Metaboliten...... 96 3.5. Entwicklung eines „Multi Target“ Screeningverfahrens mittels LC-QTrap /MS und Bibliothekssuche ...... 100 3.5.1. Entwicklung der MTS-Methode ...... 100 3.5.2. Diskussion der MTS-Methode...... 102 3.6. Entwicklung eines Screeningverfahrens für 1,4-Dihydropyridin Calciumantagonisten ...... 104 3.6.1. Flüssigkeitschromatographische Trennung der 1,4-DHP...... …..104 3.6.2. Massenspektrometrische Untersuchungen der 1,4-DHP ...... 106
II Inhaltsverzeichnis
3.6.3. Auswahl einer geeigneten Extraktionsmethode...... 116 3.6.4. Charakterisierung der entwickelten LC-MS/MS Methode...... 118 3.6.5. Diskussion der entwickelten LC-MS/MS Methode zur Bestimmung von 1,4-DHP...... 123
3.7. Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten ...... 124 3.7.1. Vergleich von ESI-CID mit APCI-CID Spektren...... 124 3.7.2. Entwicklung einer HPLC-MS/MS Methode zum Nachweis von Angiotensin- AT1-Rezeptor-Antagonisten...... 131 3.7.3. Untersuchung der Signalintensität in Abhängigkeit von der „Post Column“ Zugabe organischen Lösungsmittels ...... 133 3.8. Orale Antidiabetika ...... 135 3.8.1. Vergleich von ESI-CID und APCI-CID Spektren ...... 135 3.8.2. Untersuchung derAuswirkung von Matrix und SPE auf die Bildung von Natrium- und Kalium-Addukten...... 147 4. Zusammenfassung...... 151
5. Literatur...... 153
6. Anhang ...... 167
III Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
µg Mikrogramm 1,4-DHP 1,4-Dihydropyridin Calciumantagonisten ACE-Hemmer Angio-Converting-Enzym Hemmer ACN Acetonitril amu atomic mass unit (Atomare Massen Einheit) APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (Atmosphärendruck Chemische Ionisation) API Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (Atmosphärendruck Ionisation) CE Collision Energy CEM Channel Electron multiplier CEP Cell Entrance Potential CID Collision Induced Dissociation cps counts per second CUR Curtain Gas CXP Cell Exit Potential DAD Dioden-Array-Detektor DDA Data Dependent Acquisition DP Declustering Potential EP Entrance Potential ESI Elektrospray Ionisation FAM Fertigarzneimittel FIA Fließinjektionsanalyse FM Fließmittel FP Focusing Potential GC Gaschromatographie GTFCh Gesellschaft für Toxikologisch und Forensische Chemie GUS “General Unknown Screening” HPLC / LC High Performance Liquid Chromatography (Hochdrucksflüssigkeitchromatographie) I.S. Interner Standard IS Ion Spray IDA Information Dependent Acquisition IQ Interquad Linse LLE Liquid–Liquid-Extraction (Flüssig–Flüssig-Extraktion) Mmono Monoisotopische Masse m/z Masse zu Ladungsverhältnis MeOH Methanol min Minute ml Milliliter MPEOS Methylpolyethoxysilan MRM Multiple Reaction Monitoring MS Massenspektrometrie MS/MS Tandemmassenspektrometrie
IV Abkürzungsverzeichnis
NEB Nebulizer Gas PC Post Column Q Quadrupol RP Reversed Phase (Umkehrphase) s Sekunde s.o. siehe oben S/N Signal to Noise (Signal-Rausch-Verhältnis) SIM Selected Ion Monitoring SPE Solid Phase Extraction (Festphasenextraktion) ST Stubby STA Systematische Toxikologische Analyse TIC Total Ion Current (Totaler Ionenstrom) TOF Time-of-Flight tR Retentionszeit
V Einleitung
1. Einleitung
1.1. Problemstellung
In der Bundesrepublik Deutschland gelten derzeit ca. 2,5 – 4 Mio. Menschen als alkohol-, ca. 120 000 Menschen als drogen- und 1,5 Mio. Menschen als medikamentenabhängig. Zu den typischen rechtsmedizinischen Aufgaben zählt neben der Aufklärung von Todesursachen auch der Nachweis von Alkohol, Drogen und Medikamenten in verschiedenen biologischen Matrices z.B. zur Beurteilung der tatzeitrelvanten psychophysischen Beeinträchtigung und Schuldfähigkeit oder zur Beurteilung der Fahrtüchtigkeit [Musshoff et al., 2003]. Die oben aufgeführten Zahlen begründen die Notwendigkeit der Entwicklung von Screeningverfahren mit spezifischen Analysenmethoden zum Nachweis von Alkohol, Medikamenten, Drogen, Giften und Metaboliten in Körperflüssigkeiten für die klinische und forensische Toxikologie. Neben ungerichteten Screeningverfahren mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie/Dioden Array-Detektion [Pragst et al., 1995, Pragst et al., 2001; Maier, Bogusz, 1995; Gaillard, Pepin, 1997; Elliott, Hale, 1998] und mit Dünnschicht-Chromatographie [Demme et al., 1995] stellt die Gaschromatographie/Massenspektrometrie [Pfleger et al., 1992; Foltz, 1992; Koeppel, Tenczer 1995] wegen ihrer Empfindlichkeit, Spezifität, Universalität und ihrem
Trennvermögen immer noch die Methode der Wahl dar [Maurer et al., 2002a]. Seit Entwicklung der Electrospray (ESI)- und der Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)-Ionenquelle, die eine Direktkopplung der HPLC mit dem Massenspektrometer ermöglichen, erfolgt immer häufiger der routinemäßige Einsatz der LC-MS ergänzend zu den anderen genannten Methoden. Die LC-MS ist vor allem zur Bestimmung polarer sowie bei Verwendung einer ESI-Ionenquelle auch thermolabiler und hochmolekularer Substanzen geeignet [Fenn et al., 1989; Yamashita, Fenn, 1984] - im Gegensatz zur GC-MS. Benzodiazepine, Neuroleptika, Antidiabetika, β–Blocker sowie Phase-II-Metaboliten (Glucuronide und Sulfate) können mittels LC-MS ohne Derivatisierung nachgewiesen werden.
1 Einleitung
Die Identifizierung der Substanzen erfolgt bei allen Verfahren mit Hilfe von Spektrenbibliotheken, die eine Identifizierung von chromatographisch aufgetrennten Analyten durch Vergleich mit Referenzspektren in der Bibliothek ermöglichen. Während für die übrigen Verfahren bereits Bibliotheken kommerziell erhältlich waren [Pragst et al., 1994; Pfleger et al., 1992; Demme et al., 1995], war das bis vor einigen Jahren für die LC-MS nicht der Fall. Mittlerweile sind jedoch von einigen Autoren sowohl Bibliotheken für LC-MS [Weinmann et al., 1999; Kratzsch et al., 2003; Marquet et al.; 2000; Gergov et al. 2000], als auch für LC-MS/MS Spektren erstellt worden, [Gergov et al., 2000; Baumann et al., 2000; Weinmann et al., 2000a]. Neben der Möglichkeit, die LC-MS zur ungerichteten Analyse von Substanzen zu verwenden, kann sie auch zur gezielten Analyse von Substanzen eingesetzt werden, z.B. wenn sich aus der Fragestellung eine Beschränkung auf einzelne Substanzgruppen oder eine limitierte Anzahl von Substanzen ergibt. Die Sicherheit des qualitativen Analysenergebnisses ist umso größer, je mehr analytische Daten der für eine Intoxikation in Frage kommende Substanz zur Verfügung stehen. Neben der Suche nach Wirkstoffen können auch Metaboliten wichtige Hinweise auf die Einnahme einer Substanz geben. Für diese stehen jedoch nur in seltenen Fällen kommerziell erhältliche Vergleichssubstanzen zur Verfügung, so dass sie erst aus biologischen Matrices extrahiert und identifiziert werden müssen, bevor deren Massenspektren in Bibliotheken abgelegt werden können.
1.1.1. Stand der Technik und Ziel der Arbeit Für die Substanzidentifizierung bei einem LC-MS Analysenverfahren auf Medikamente, Drogen und organische Gifte ist es möglich ESI-CID zur strukturspezifische Fragment-Ionenbildung in Kombination mit einer
Massenspektrenbibliothek einzusetzen [Weinmann, 2001b]. Eine unter standardisierten Bedingungen erstellte MS Bibliothek kann zur Identifizierung mit unterschiedlichen Quadrupol-Geräten eingesetzt werden. ESI-CID kann dabei so justiert werden, dass eine Bibliothekssuche möglich ist [Weinmann et al., 2001c; Weinmann et al., 2001d; Hough et al., 2000]. Mit den herkömmlichen Quadrupol-Geräten können jedoch
2 Einleitung
Substanzen, die in sehr niedrigen therapeutischen Spiegeln vorliegen, nicht ausreichend empfindlich im Scan Modus detektiert werden. Deshalb müssen gezielte Verfahren entwickelt werden, z.B. im Selected Ion oder Multiple Reaction Monitoring, um sie nachweisen zu können. Bisher wurden meistens Verfahren zur Detektion von Wirkstoffgruppen entwickelt, z.B. [Gergov et al., 2000; Gergov et al., 2001; Maurer et al., 1998; Maurer et al., 2002b]. Tandemmassen-Spektrenbibliotheken, deren Reproduzierbarkeit durch Vergleich in drei Laboratorien sichergestellt werden konnte [Weinmann et al., 2000a], können für ein gezieltes Screening auf Wirkstoffe mit bekannten MS/MS-Spektren eingesetzt werden. Mit der Entwicklung der linearen Ionenfalle (QTrap), bei der die Nachweisempfindlichkeit bei Einsatz des Quadrupols Q3 im Produkt-Ionen Scan gegenüber herkömmlichen Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern als Ionenfalle deutlich gesteigert werden kann, bieten sich neue Möglichkeiten zur Entwicklung von Screeningverfahren in Kombination mit IDA und MS/MS Spektrenbibliotheken. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung einer LC–MS Methode für ein „General-Unknown-Screening“-Verfahren für Arzneistoffe und Metaboliten. Basis dieser Entwicklung war ein bereits bestehendes Screeningverfahren mit einer ESI-CID
Spektrenbibliothek [Weinmann, 2001b]. Darüber hinaus sollte ein Nachweisverfahren für 1,4-DHP entwickelt werden. Das Fragmentierverhalten von 1,4-DHP, Angiotensin- II-Rezeptor-Antagonisten und oralen Antidiabetika in einer ESI- und einer APCI- Ionenquelle sollte untersucht und verglichen werden. Eine ESI-CID Spektrenbliothek für Wirkstoffe und Metaboliten sollte wegen des Wechsels auf ein neues Betriebssystem neu aufgebaut und eine MS/MS Bibliothek erweitert werden, um die Identifizierung von Substanzen zu ermöglichen. Mit Hilfe eines Tandemmassenspektrometers mit linearer Ionenfalle, das die Detektion und Identifizierung in einem Lauf mit der höheren Spezifität, Selektivität und Nachweisempfindlichkeit der LC-MS/MS ermöglicht, sollte in Kombination mit IDA und MS/MS Bibliothekssuche ein neuartiges, gezieltes Screeningverfahren auf forensisch relevante Substanzen entwickelt werden.
3 Einleitung
1.2. Massenspektrometrie
1.2.1. Probeneinführung in das Massenspektrometer Bei der Infusion mit einer Spritzenpumpe wird eine Probenlösung kontinuierlich in das Interface gepumpt. Bei der Fließinjektion wird die Probenlösung durch eine pfropfartige Injektion in einen kontinuierlichen Lösungsmittelfluss, z.B. mit Hilfe eines wie bei der HPLC gebräuchlichen Injektionsventils, in das Interface überführt. Für die Analyse von komplexen Gemischen wird üblicherweise die Direktkopplung von HPLC und MS verwendet und die Eluenten direkt oder mit Split ins Interface geleitet.
1.2.2. Ionenquelle (Interface) Mit Hilfe der Ionenquelle wird die flüssige Phase in die Gasphase überführt und Analyten ionisiert. Die Ionisierung einer Substanz ist die Vorraussetzung zur Detektion mit einem Massenspektrometer. Die Quelle muss den aus der HPLC austretenden Eluentenstrom (mobile Phase und Puffer) verdampfen, überschüssiges Lösungsmittel muss abgepumpt werden, um das im Massenspektrometer notwendige Hochvakuum aufrecht zu erhalten. Für die vorliegende Arbeit wurde mit einer Elektrospray (Turboionspray) und einer Atmosphärendruck Chemische Ionisation Ionenquelle gearbeitet, die wegen ihrer Robustheit und der hohen Empfindlichkeit für eine Vielzahl von polaren und mittelpolaren Analyten die heutzutage am häufigsten eingesetzten Kopplungstechniken darstellen.
4 Einleitung
1.2.2.1. Elektrosprayionisation (ESI)
Abb. 1-1: Prinzip der Elektrosprayionisation (Ionenspray-Ionisation) (Applied Biosystems 2001)
Bei der ESI wird der Analyt in der Ionenquelle bei Atmosphärendruck versprüht und dann in das Hochvakuum des Massenspektrometers geleitet [Whitehouse et al., 1985]. Die Flüssigkeit aus der HPLC wird durch eine auf einem hohen Potential (ca. + 5 bzw. - 5 kV) liegende Metallkapillare gepumpt, dabei entsteht ein Nebel aus hochgeladenen, feinst verteilten Tröpfchen mit der Größe von 0,5 – 1 µm. Bei den heute verwendeten Ionenquellen wird der Sprühvorgang an der Metallkapillare zusätzlich durch Hilfsgas
(z.B. N2) unterstützt („nebulizer assisted“ ESI, auch Ionenspray genannt), wodurch ein konstantes Spray erzielt wird. Die Polarität der anliegenden Hochspannung bestimmt, ob ein Überschuss positiver oder negativer Ladung erzeugt wird. Der Mechanismus wie Ionen von der flüssigen in die Gasphase gelangen ist bis heute noch nicht vollständig geklärt. Es werden zwei Theorien diskutiert: das „charge residue model“ (CRM) von Röllgen et al. [Röllgen et al., 1996] und das „ion desorption model“ (IDM) von Iribane und Thomson [Iribarne, Thomson, 1976; Thomson, Iribarne, 1979]: auf dem Weg durch das elektrische Feld zur Gegenelektrode reduziert sich die Größe des geladenen Tröpfchens auf ca. 10 nm durch Lösungsmittelverdampfung bei Atmosphärendruck. Bei dieser Größe ist das Raleigh–Stabilitätslimit erreicht, die Abstoßungskräfte der Ionen an der Oberfläche der Tröpfchen werden größer als die Oberflächenspannung. Die Tröpfchen zerplatzen in einer Coulomb Explosion in kleinere Tröpfchen. Diese schrumpfen und platzen in weiteren Zyklen, bis sie so klein sind, dass bei den herrschenden hohen Feldstärken Ionen aus den Tröpfchen desorbiert werden können („ion desorption model“) [Vogel,
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Kibat, 1998]. Das „charge residue model“ propagiert, dass die Verdampfung von Lösungsmittel zur Bildung von Tröpfchen führt, die nur noch ein einziges Molekül des Analyten enthalten. Der Prozess der Tröpfchenverkleinerung kann thermisch unterstützt werden (z.B. durch einen heißen Stickstoffgasstrom, „Turboionspray“), was eine splittlose Kopplung von HPLC und MS auch bei größeren Flussraten ermöglicht (bis 1 ml/min). Die Höhe der Ionenemission hängt von der Solvatisierungsenergie der einzelnen Ionen ab, so dass Ionen, die eine niedrigere Solvatisierungsenergie besitzen, bevorzugt in die Gasphase übertreten [Sciex, 1991]. Die Protonierung in der Lösung spielt beim Prozess der Ionenentstehung die bedeutendste Rolle [Fenn et al., 1989]. Die entstandenen Ionen [M+nH]n+/[M-nH]n- werden durch das elektrische Feld in Richtung Massenanalysator beschleunigt. Moleküle mit einem Molekulargewicht unter 500 g/mol sind meist einfach geladenen (n=1), höhermolekulare liegen meist vielfach geladen vor. Neutrale Lösungsmittelmoleküle können den Ionen angelagert sein [Vogel, Kibat, 1998]. Diese so genannten „Cluster“ passieren bei Sciex Massenspektrometern einen schwachen Gegenstrom von Stickstoffgas („Curtain Gas“) und werden damit zerschlagen. Bei anderen Herstellern (z.B. Agilent, Finnigan) werden die Cluster durch eine beheizte Metallkapillare („Heated Capillary“) gesaugt oder durchlaufen ein Z-Spray (Thermoquest) und werden dadurch zerstört.
1.2.2.2. Atmosphärendruck Chemische Ionisation (APCI)
Abb. 1-2: Prinzip der Atmosphärendruck Chemischen Ionisation (Applied Biosystems 2001)
6 Einleitung
Bei der APCI verdampft der Eluentenstrom in einem 400 – 500 °C heißen Rohr [Vogel, Kibat;1998] und wird anschließend mit Hilfe eines beheizten, pneumatisch unterstützten Verneblers gegen eine Coronaentladungsnadel (6 µA) geleitet. Die Polarität der Nadelspannung bestimmt, ob positive oder negative Ionisierung erfolgt. + + - - Zunächst bilden sich als Primärionen Gasionen (z.B. N2 , O2 bzw. O2 , NO2 ). Die Primärionen übertragen ihre Ladung auf so genannte Reaktandionen, die aus dem + + - - Lösungsmittel oder zugesetztem Puffer stammen (z.B. CH3OH , H3O , CH3O , OH ) [Hornig et al., 1973]. Danach erfolgt die Ladungsübertragung vom Reaktandion auf das Analytmolekül über Ladungstransfer oder Protonentransfer [SCIEX, 1991]. Im positiven Modus können + basische Zentren z.B. durch NH4 protoniert werden oder das Ammoniumion kann sich als Cluster anlagern. Cluster werden wie bereits oben beschrieben entfernt.
1.2.2.3. Vergleich ESI - APCI
Tabelle 1-1: Vergleich ESI - APCI ESI APCI Flussraten [µl/min] 10 – 50 500 – 2000 Turboion: 200 – 1000 Thermolabile Verbindungen + - Mehrfach geladene + - Moleküle Ionensuppression ++ +
Sowohl ESI als auch APCI zählen zu den schonenden Ionisationsmethoden, d.h. außer dem (de-) protonierten Molekül [M+nH]n+/[M-nH]n- sind in der Regel bei niedriger Spannung kaum Fragment-Ionen vorhanden. Möchte man über die Molmasse hinausgehende Strukturinformationen, so müssen durch stoßinduzierte Fragmentierung Bruchstücke erzeugt werden [Cappiello et al., 2001] (siehe Kapitel 1.2.4.3.).
7 Einleitung
1.2.3. Massenspektrometer Prinzipiell lassen sich inzwischen alle bekannten Massenspektrometer-Typen mit einer HPLC kombinieren [Vogel, Kibat, 1998]. Die für die vorliegende Arbeit verwendeten Massenspektrometer waren ein Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer sowie eine lineare Quadrupol Ionenfalle.
1.2.3.1. Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer
FP
DP Abb. 1-3: Aufbau eines Tripel-Quadrupol-Massenspektrometers (Applied Biosystems 2001)
Die Abbildung 1-3 zeigt den Aufbau eines Tripel Quadrupol Massenspektrometers. Es besteht aus einer Ionenquelle (siehe 1.2.2.), mehreren Linsen und Quadrupolen und einem Detektor. Das an der „Orifice Plate“ anliegende „Declustering“ Potential (DP) hat den größten Effekt auf die Stärke der Fragmentierung in der Übergangsregion zwischen Ionenquelle und Massenspektrometer [PE SCIEX, 2000]. Das „Focusing“ Potential (FP), die Q0– und die IQ1-Spannung fokussieren den Ionenstrahl vor dem Eintritt in den Massenanalysator (Quadrupol Q1). Diese drei Parameter gleichen den Jet-Expansions-Effekt aus, der beim Übergang in ein höheres Vakuum auftritt [Schreiber, 2001]. Der Quadrupol Q2 dient der Fokussierung und als Kollisionszelle, in der die in Q1 selektierten Ionen durch Gasmoleküle (z.B. N2) fragmentiert werden können. Nach dem Verlassen des zweiten Massenanalysators Quadrupol Q3 werden die Ionen durch die Deflektorspannung (DF) und die am Channel-Electron-Detektor anliegende Spannung beschleunigt. Ein Quadrupol besteht aus vier parallelen, im Querschnitt runden Metallstäben, die gleichmäßig um eine zentrale Achse angeordnet sind. Die Ionen werden entlang dieser
8 Einleitung
Achse geleitet. Die jeweils gegenüberliegenden Stäbe sind elektrisch leitend verbunden. An diese Elektrodenanordnung wird eine Gleichspannung angelegt. Durch Überlagerung mit einer Wechselspannung kommt es zur Oszillation der Ionen, die von der angelegten Spannung, der Frequenz und der Ionenmasse abhängt. Je nach Verhältnis der angelegten Gleich- und Wechselspannung gelangen nur Ionen mit einem bestimmten Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) durch den Quadrupol. Alle anderen Ionen beginnen zu oszillieren und werden schließlich durch Berührung mit einem Quadrupolstab neutralisiert. Ein Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer kann auch als Single-Quadrupol-Gerät eingesetzt werden, wenn nur Quadrupol Q1 oder Q3 zum Messen verwendet wird.
1.2.3.2. Lineare Ionenfalle Der Aufbau einer linearen Quadrupol Ionenfalle (QTrap) [Hager, 2002] entspricht dem des Tripel-Quadrupol-Massenspektrometers. In der zur Messung verwendeten QTrap kann der Quadrupol Q3 als herkömmlicher Massenanalysator jedoch auch als Ionenfalle eingesetzt werden. Beim Einsatz als Ionenfalle werden die aus der Kollisionszelle ankommenden Ionen in Q3 getrappt. Dann erfolgt der Massenscan, schließlich die Entleerung des Quadrupols und die Detektion. Der Vorteil dieser linearen Ionenfalle liegt gegenüber der herkömmlichen Ionenfalle in der höheren Trappkapazität, da der Quadrupol ein deutlich größeres Hohlraumvolumen besitzt als die Letztgenannte. Außerdem kommt es durch die völlig andere Konstruktion auch nicht zu einem Verlust der Ionen beim Trappvorgang wie das bei der herkömmlichen Ionenfalle der Fall ist. Die Messempfindlichkeit kann dadurch deutlich gesteigert werden. Zugleich besitzt das Gerät die Empfindlichkeit und das Auflösungsvermögen des konventionellen Tripel-Quadrupol-Massenspektrometers. Eine Messtechnik, die auf diesem Gerät unter Einsatz der Ionenfalle stattfindet, wird mit der Bezeichnung „enhanced“ charakterisiert, z.B. „enhanced“ Produkt-Ionen Scan.
9 Einleitung
1.2.4. Messtechniken mit Quadrupol Massenspektrometern
1.2.4.1. Single-Quadrupol-Massenspektrometer Bei einem Single-Quadrupol-Massenspektrometer sind zwei Messtechniken möglich, der Q1-Scan und das Single Ion Monitoring (SIM).
Q1-Scan Im Q1-Scan Modus wird ein ausgewählter Massenbereich von einer Start- bis zu einer Endmasse mit einer bestimmten Schrittgröße (engl. step size) untersucht. Die „Scan Speed“ gibt die Zeit an, die benötigt wird, um den definierten Massenbereich einmal „abzuscannen“. Dieser Modus wird hauptsächlich für qualitative Fragestellungen verwendet, da sich mit ihm Informationen über alle gebildeten (de-) protonierten Moleküle und Fragment-Ionen, wie Abb.1-4 verdeutlichen soll, gewinnen lassen.
Selected Ion Monitoring (SIM) Beim „Selected Ion Monitoring“ wird ein bzw. wenige Ionen selektiv durch den Quadrupol durchgelassen (s. Abb. 1-5). Die „Dwell Time“ (Messzeit pro Messpunkt) kann deshalb erhöht werden, wodurch wiederum die Empfindlichkeit gesteigert werden kann. Diese Messtechnik wird zur quantitativen Analyse sowie zur zielgerichteten Analyse eingesetzt.
Q1-Scan SIM
Abb.1-4 Meßtechnik: Q1–Scan Abb. 1-5: Meßtechnik: Selected Ion (Applied Biosystems 2001) Monitoring (Applied Biosystems 2001)
1.2.4.2. Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer Im Vergleich zu einem Single-Quadrupol-Massenspektrometer bietet das Tripel Quadrupol-Massenspektrometer, auch Tandemmassenspektrometer genannt, durch eine Kollisionszelle und einen weiteren analytischen Quadrupol mehr Selektivität.
10 Einleitung
Durch die Selektion bestimmter Ionen durch Q1 wird das Rauschen unterdrückt, weshalb geringe Substanzkonzentrationen bei hohem Matrixbackground im Tripel- Quadrupol-Modus noch gut detektiert werden können. Mit einem Tandemmassenspektrometer können vier Messtechniken ausgeführt werden, die in Abb. 1-6 dargestellt sind.
Produkt-Ionen Scan Beim Produkt-Ionen Scan wird in Quadrupol Q1 ein Precursorion, vorzugsweise das (de-) protonierte Molekül, herausgefiltert, welches in der Kollisionszelle fragmentiert wird. Die entstandenen Fragment-Ionen werden in Quadrupol Q3 gescannt. Mit Hilfe dieser Technik können über die Masse der Fragment-Ionen Rückschlüsse auf die Struktur des Moleküls gezogen werden.
Precursor-Ionen Scan Beim Precursor-Ionen Scan kann die Herkunft eines ausgewählten Fragment-Ions zu dem entsprechenden Precursorion ausfindig gemacht werden. Im Quadrupol Q3 wird ein in der Kollisionszelle entstandenes Fragment-Ion analysiert, von dem aus auf das Precursor-Ion zurückgerechnet wird. Dieser Scan Modus wird häufig bei der Identifizierung von Metaboliten eingesetzt.
Neutral Loss Scan Mit dem Neutral Loss Scan wird die Abspaltung von Neutralteilchen bestimmt. Die Quadrupol Q1 und Q3 scannen simultan mit einer konstanten Massendifferenz, die der Masse des abgespaltenen Neutralteilchens entspricht, über einen ausgewählten Massenbereich.
Multiple Reaction Monitoring (MRM) Beim Multiple Reaction Monitoring wird in Quadrupol Q1 ein Precursorion, meistens das (de-) protonierte Molekül selektiert, welches in der Kollisionszelle fragmentiert wird. Quadrupol Q3 selektiert wiederum nur ein bestimmtes Fragment-Ion. Ein Signal
11 Einleitung im Chromatogramm erscheint nur, wenn der spezielle Massenübergang Q1 → Q3 auftritt, die Messtechnik ist aus diesem Grund sehr selektiv. Durch die wesentlich längere Messzeit pro m/z Verhältnis im Vergleich zu der kontinuierlichen Erfassung resultiert eine höhere Empfindlichkeit. Des Weiteren wird störendes Rauschen unterdrückt. Diese Messtechnik wird hauptsächlich in der quantitativen Analytik eingesetzt.
Produkt-Ionen Scan Precursor-Ionen Scan
Multiple Reaction Neutral Loss Loss Scan Monitoring (MRM)
Abb. 1-6: Messtechniken: Produkt-Ionen Scan, Precursor-Ionen Scan, Neutral Loss Scan, Multiple Reaction Monitoring (MRM) (Applied Biosystems 2001)
1.2.4.3. In–source collision induced dissociation In-source collision induced dissociation (in-source CID) ist die Fragmentierung von Molekülen im Bereich des Übergangs von Atmosphärendruck ins Hochvakuum. Sie wird bei Messungen im Single-Quadrupol-Modus eingesetzt wird, um die Stöße zwischen Analyt-Ion und dem zur „Entclusterung“ verwendeten „Curtain“ Gas zur Fragmentierung auszunutzen. Die Stärke der Fragmentierung kann durch eine Spannung beeinflusst werden, die je nach Gerätetyp eine unterschiedliche Bezeichnung hat: Declustering Potential, Fragmentor Voltage, Cone-, Skimmer- oder Noozle-Spannung. Die in-source CID produziert in der Regel die gleichen Fragmente
12 Einleitung wie die gewöhnliche CID in der Kollisionszelle des Tandemmassenspektrometers jedoch nicht in der gleichen Intensität [Schreiber et al., 2003]. Bei den meisten Quadrupolgeräten kann inzwischen während einer LC-MS Analyse von einem registrierten Spektrum zum nächsten sehr schnell zwischen unterschiedlichen Fragmentierungsspannungen und Polaritäten zur Erzeugung von ESI-CID / APCI-CID Spektren umgeschaltet werden. Dadurch können von einer chromatographisch isolierten Substanz gleich mehrere Massenspektren mit unterschiedlichen Fragmentierungsgraden registriert werden.
1.2.5. Software Funktionen zur Automatisierung der Spektrenaufnahme
1.2.5.1. Information Dependent Acquisition Im Rahmen dieser Arbeit wurde die QTrap in Kombination mit „Information Dependent Acquisition“ (IDA) verwendet. Ein IDA Experiment besteht aus einem „Survey“ Scan und einem „Dependent“ Scan. Tritt ein im „Survey“ Scan programmiertes Ereignis ein, z.B. ein Ionenübergang in einem MRM Experiment, so schaltet die IDA-Software das Massenspektrometer in einen anderen Messmodus, z.B. den Produkt-Ionen Scan, um. Nachdem dieser erfolgt ist, wird im vorherigen Messmodus weiter gemessen. Fitzgerald et al. entwickelten eine LC-MS/MS Methode mit einer Ionenfalle mit „Data Dependent Acquisition“ (DDA) [Fitzgerald et al., 1999]. Decaestecker et al. beschrieben eine Methode bei dem ein TOF- Massenspektrometer bei Überschreiten eines eingestellten Schwellenwertes automatisch vom MS in den MS/MS Modus wechselte [Decaestecker et al., 2000]. Der Vorteil von IDA Experimenten liegt im geringeren Verbrauch an Probe, sowie an der schnelleren Durchführung der Messung, da die Probe nur einmal injiziert werden muss. Bei der herkömmlichen Methode, wie sie beispielsweise Gergov et al. [Gergov, 2003] beschrieben, muss die Probe zweimal injiziert werden. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Messtechniken der QTrap in einem IDA Experiment miteinander zu verknüpfen. Marquet et al. beschrieben eine Methode für ein „General Unknown Screening” bei der der Q1-Scan als „Survey“ Scan eingesetzt
13 Einleitung wurde [Marquet et al., 2003]. Hopfgartner et al. [Hopfgartner et al., 2003] identifizierten Metaboliten im Picogrammbereich mit verschiedenen IDA Experimenten auf einer QTrap.
1.2.5.2. Dynamic Exclusion Die in der Analyst Software enthaltene Funktion „Dynamic Exclusion“ bietet die Möglichkeit, bestimmte Ionen oder Ionenübergänge für eine bestimmte Zeit oder generell automatisch auszuschalten. Sinnvoll ist der Einsatz dieser Funktion, um coeluierende Substanzen mit einer schwächeren Intensität neben Signalen mit hohen Intensitäten detektieren zu können.
1.2.6. Matrixeffekte Die Nachweisbarkeit von Substanzen mit LC-MS(/MS) kann durch Matrixeffekte eingeschränkt werden [King et al., 2000]. Matrixeffekte sind definiert als Auswirkungen coeluierender Substanzen auf die Ionisierung des gesuchten Analyten [Dams et al., 2003]. Daraus resultiert einmal die Ionensuppression, zum anderen kann auch ein erhöhtes Analytsignal die Folge sein. Beides verursacht geringere Präzision und Genauigkeit von Messungen. Matrixeffekte limitieren somit den Gebrauch der LC-MS(/MS) für die Quantifizierung von Substanzen. Jedoch kann schwere Ionensuppression auch die qualitative Bestimmung einer Substanz verhindern. Bei Verwendung einer ESI-Ionenquelle ist eine Ionensuppression häufiger zu beobachten als bei Verwendung einer APCI-Ionenquelle [Bonfiglio et al., 1999; King et al., 2000]. Ionische Substanzen (Salze) oder Substanzen, welche die Oberflächenspannung der geladenen Tröpfchen beeinflussen, beeinflussen so entweder einen Ladungstransfer- Prozess in der Gas Phase oder sind in den Elektrospray-Prozess involviert [King et al., 2000] und führen dadurch zur Suppression anderer Komponenten. Eine große Bedeutung kommt dabei der Probenvorbereitung zu, die zur Reduktion dieser Matrixeffekte durch Aufreinigen der Probe oder durch die Aufkonzentrierung der Probe auch zur Verstärkung führt. Die verschiedenen Körperflüssigkeiten (z.B.
14 Einleitung
Speichel, Urin, Serum) enthalten unterschiedliche Substanzen, die diese Effekte hervorrufen, so dass verschiedene Extraktionsmethoden entsprechend vorteilhaft sein können [Dams et al., 2003]. Die chemische Natur des Analyten spielt ebenfalls eine Rolle bei der Suppression. Bonfiglio et al. beobachteten weniger Empfindlichkeit gegenüber Suppression bei apolaren als bei polaren Analyten [Bonfiglio et al., 1999]. Es ist somit unvermeidlich, bei der Entwicklung von neuen Methoden auf Matrixeffekte zu prüfen. Versuche zur Prüfung verschiedener Extraktionsverfahren und Auswirkung auf Suppressionseffekte bei LC-ESI MS wurden durchgeführt. Diese zeigten, dass bei verschiedenen Extraktionsmethoden für Serum besonders in der LC- Front Suppressionseffekte zu beobachten waren. Diese sind in [Müller et al., 2002] und Kapitel 3.1.1. zusammengefasst. Ionensuppression kann jedoch auch später und mehrmals auftreten [Bonfiglio et al., 1999, Dams et al., 2003].
15 Einleitung
1.3. LC/MS und LC-MS/MS Spektrenbibliotheken
Screening Analysen auf Substanzen verschiedener Klassen lassen sich durch Nutzung von Spektrenbibliotheken effektiv und zeitsparend gestalten. Für die GC-MS, die weltweit seit ca. 30 Jahren in der klinischen Forschung und Analytik eingesetzt wird, existieren für die systematisch toxikologische Analyse (STA) neben der sehr umfangreichen Spektrenbibliothek von Pfleger/Maurer/Weber [Pfleger et al., 1992] weitere Massenspektrenbibliotheken mit über 300 000 EI Massenspektren von organischen Substanzen [Mc Lafferty, 1997; Stein, 1999]. Aufgrund der universellen Reproduzierbarkeit der Massenspektren bei standardisierten Bedingungen mit der bei der GC-MS verwendete Elektronenstoßionisierung, gilt diese Technik als „Goldstandard“ [Marquet et al., 2002]. Anfang der neunziger Jahre besaßen die meisten der forensisch-toxikologischen Labors ein oder mehrere GC/MS. Die Entwicklung der ESI- und APCI-Quellen, die die Kopplung von HPLC und Massenspektrometer möglich machten, führten in der letzten Dekade zu einem zunehmenden Einsatz der LC-MS Technik und wird immer mehr in der analytischen Toxikologie in der Routine, speziell zur Analyse von Blut und Plasma jedoch auch von weiteren Matrices, eingesetzt wie zahlreiche Publikationen belegen z.B. [Maurer,
1991; Weinmann et al., 2000b; Maurer et al., 2002a,b,c; Gergov et al., 2001; Kollroser,
Schober 2002a-d; Weinmann et al., 2002]. Bei der GC-MS verwendeten Elektronenstoßionisierung werden wenig radikalische Molekülionen und viele Fragment-Ionen gebildet, die bei der LC-MS eingesetzten ESI- und APCI-Quellen bilden hauptsächlich protonierte und deprotonierte Moleküle. Diese unterschiedlichen Fragmentierungsmechanismen verhinderten die Übertragung bereits bestehender, umfangreicher GC-MS Spektrenbibliotheken auf die LC-MS, deshalb mussten für diese Technik neue Bibliotheken aufgebaut werden [Schreiber et al., 1999]. Verschiedene API-Ionenquellen, negativer und positiver Ionenmodus, der Einfluss von Parametern der Ionenoptik sowie unterschiedliche Zusammensetzung des Eluenten können zu unterschiedlichen Massenspektren führen. Für reproduzierbare Spektrenaufnahmen müssen deshalb reproduzierbare Ionisierungsbedingungen, Fließmittelzusammensetzung etc. vorliegen, damit eine Substanzidentifizierung
16 Einleitung möglich ist. Lange Zeit war die Standardisierung des Fragmentierungsvorgangs ESI- Quelle nicht durchführbar. Bis 1998 war es nur bei den Geräten eines Herstellers möglich, während einer LC/MS Analyse von einem registrierten Spektrum zum nächsten zwischen unterschiedlichen Fragmentierungsspannungen und -polaritäten zur
Erzeugung von ESI/CID umzuschalten [Weinmann et al., 2001b]. Diese Option war zur Erstellung von ESI/CID Spektrenbibliotheken jedoch entscheidend, damit von einer chromatographisch isolierten Substanzgleich mehrere Massenspektren mit unterschiedlichen Fragmentierungsgraden registriert werden konnten.
1.3.1. ESI–CID / APCI-CID LC-MS Spektrenbibliotheken Mittlerweile existieren unterschiedliche ESI/APCI in-source CID Spektrenbibliotheken, die von verschiedenen Autoren [Josephs, 1995; Weinmann et al., 1999; Marquet et al., 2000; Schreiber et al., 2000; Hough et al., 2000; Gergov et al., 2000; Maurer et al., 2002; Kratzsch et al., 2003] erstellt worden sind. Gemeinsam ist den Bibliotheken, dass die Spektren bei zwei oder drei verschiedenen Fragmentierungsenergien aufgenommen worden sind. Sonst unterscheiden sie sich in der Art der verwendeten Ionenquellen, der getrennten oder aufsummierten Betrachtungsweise der aufgenommenen Massenspektren, in der Polarität des Aufnahmemodus, ihrem Umfang und der Art der gemessenen Substanzen sowie der Art des verwendeten Massenspektrometers und der verwendeten Software. Die ESI-CID Bibliotheken von Marquet und Weinmann eignen sich aufgrund ihrer Größe zum Einsatz für eine ungezielte Analyse auf Substanzen. Schreiber et al. verwenden ihre Bibliothek zur Detektion von Pestiziden und Sprengstoffen. Josephs, Kratzsch, Maurer und Hough demonstrieren mit den von ihnen entwickelten Bibliotheken die Nützlichkeit dieser zur Identifizierung innerhalb bestimmter Substanzklassen. Die Bibliotheken können zur gezielten oder zur ungezielten Suche nach Substanzen eingesetzt werden. Beispiele für deren Anwendung findet man z.B. in
[Weinmann et al., 2000b; Müller et al., 2000].
17 Einleitung
1.3.2. MS/MS Bibliotheken Zur gezielten Suche nach Substanzen (Target Analyse) und auch zum Target Screening [Gergov et al., 2003] oder seit der Entwicklung der IDA zur ungerichteten Analyse [Marquet et al., 2003] werden MS/MS Spektrenbibliotheken eingesetzt. Sie enthalten Massenspektren, die im Produkt-Ionen Scan Modus bei verschiedenen Kollisionsenergien aufgenommen wurden. Solche Bibliotheken wurden sowohl mit Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern z.B. [Gergov et al., 2000; Weinmann et al., 2000; Kienhuis, Geerdink, 2002] mit 3D-Ionenfallen [Baumann et al., 2000; Fitzgerald et al., 1999] und mittlerweile auch mit der linearen Quadrupol Ionenfalle, [Josephs, Sanders, 2004] bzw. s. Kapitel 3.5, erstellt.
1.3.3. Übertragbarkeit von Spektrenbibliotheken Die Ionisierung und Fragmentierung bei Verwendung von API Quellen hängt, wie bereits erwähnt, von den gegebenen Bedingungen ab, so dass Bibliotheksspektren zur Identifizierung nur verwendet werden können, wenn die Aufnahmebedingungen identisch sind. Das zur Fragmentierung wichtige „Declustering“ Potential (DP) lässt sich bei standardisierten Quellenparametern so einstellen („tunen“), dass auf verschiedenen Single- bzw. Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern des gleichen, wie auch eines anderen Herstellers ähnliche Fragmentierung erzielen lässt [Weinmann et al., 2001a; Weinmann et al., 2001b; Hough et al., 2000]. Dadurch ist die Übertragbarkeit von bereits erstellten ESI in-source CID Bibliotheken auf baugleichen Geräten zumindest des gleichen Herstellers generell möglich. Diese Feststellung steht in scheinbarem Widerspruch zu einer Studie, an der vier verschiedene Labors beteiligt waren und bei der eine schlechte Reproduzierbarkeit der in-source Fragmentierung festgestellt wurde [Bogusz et al., 1999]. Bei diesen Untersuchungen wurden jedoch die Quellenparameter nicht, wie oben aufgeführt standardisiert, sondern nur mit betragsmäßig gleichen Quellenpotentialen gearbeitet. Das führte bei unterschiedlichem Zustand der Ionenquelle (z.B. Verschmutzungsgrad, unterschiedliche Druckverhältnisse, geometrische Unterschiede durch Korrosion etc.), gerade bei den
18 Einleitung dort verwendeten Geräten mit Transferkapillare in der Transport-Region, zu keiner befriedigenden Reproduzierbarkeit der Fragmentierung. Für MS/MS Bibliotheken wurde demonstriert, dass sich diese ohne weiteres auf die Geräte des gleichen Herstellers übertragen lassen, wenn die Geräte die gleiche oder eine sehr ähnliche Quellengeometrie und Transportregion aufweisen. [Weinmann et al., 2000a, Schreiber et al., 2003; Gergov et al., 2004]. Bei Verwendung Geräte anderer Hersteller muss ebenfalls die Parametereinstellung mit Hilfe einer Tune-Substanz erfolgen [Weinmann et al., 2000a].
1.3.4. Bibliothekssuche mit „Analyst“ Das Suchverfahren der Analyst Software ist patentgeschützt, beruht aber vermutlich auf dem INCOS Suchverfahren. Dieses wurde von der Fa. Incos entwickelt und war z.B. in der Software des MS-Herstellers Finnigan enthalten. Dieses wichtet die Signifikanz der Massensignale nach Massenzahlen und Intensität (I) mit Hilfe der Gleichung der Wurzel aus dem Produkt von Masse (m) und Intensität (m x I)0,5. Der nächste Schritt ist eine Reduktion der Daten durch einen Rauschfilter und einen Redundanzfilter. Nach der „Pre-Search“, bei der das Suchkriterium das Vorhandensein von acht signifikanten Massensignalen ist, erfolgt die „Main Search“, bei der die in der „Pre–Search“ ausgewählten Spektren mit dem unbekannten Spektrum verglichen und in einer Hitliste von ähnlichen Spektren ausgegeben werden [Hübschmann, 1992]. Das Resultat einer Bibliothekssuche spiegelt sich in den „Fit“-Werten wieder. Der „Fit“-Wert gibt an wie gut das Bibliotheksspektrum in das zu identifizierende Spektrum passt, der „Reverse Fit“ -Wert gibt an, wie hoch die Übereinstimmung des zu identifizierenden Spektrums mit dem Bibliotheksspektrum ist. Die Kombination beider Werte, der „Purity Fit“-Wert, gibt Auskunft darüber, mit welcher Reinheit (engl. purity) das unbekannte Spektrum vorliegt. Die anfängliche Sortierung nach dem „Purity Fit“-Wert ist sinnvoll, da mit diesem Wert die beste Aussage über eine mögliche Identität gemacht werden kann. Bei einem ungünstigen Signal – Rauschverhältnis und der Coelution mit weiteren Substanzen werden vermehrt Störsignale in die Bibliotheksuche mit einbezogen: niedrige Werte für den „Reverse
19 Einleitung
Fit“- und somit auch für den „Purity Fit“-Wert sind die Folge, obwohl das unbekannte und das Bibliotheksspektrum rein optisch sehr ähnlich aussehen. Hier ist der „Fit“- Wert eine zuverlässigere Größe. Bei Untersuchungen von Metaboliten, die häufig ein sehr ähnliches Massenspektrum aufweisen, da sie gleiche Fragment-Ionen bilden, kann der „Fit“-Wert andererseits falsch positive Ergebnisse vortäuschen. [Hübschmann, 1992; Schreiber et al., 2000].
20 Einleitung
1.4. Gezielte Suche nach Substanzklassen
Richtet sich die Fragestellung auf einzelne Substanzen oder Substanzklassen, z.B. im Rahmen von forensischen Fällen, bei denen im Polizeiprotokoll gezielt die Einnahme von Medikamenten erwähnt wurde, bzw. gruppenspezifische immunologische Testverfahren positiv waren, die zu Beeinträchtigungen führen können, muss gegebenenfalls eine gezielte Analyse auf diese Substanzen durchgeführt werden. Zu den etablierten gezielten Analysenmethoden zählen jene GC/MS oder LC/MS- Methoden zum Nachweis von illegalen Drogen (Opiaten, Cocain und Cocainmetaboliten, Amphetaminderivate, Cannabinoide) und Ausweichdrogen, z.B. Benzodiazepine. Herz-Kreislauf-Mittel und Antidiabetika spielen in forensischen Fällen zunehmend eine Rolle aufgrund deren steigenden Verordnungshäufigkeit.
Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten und orale Antidiabetika sollten mit LC-MS bzw. LC-MS/MS untersucht werden. Für 1,4-DHP sollte im Rahmen dieser Arbeit eine Nachweismethoden mit LC-MS(/MS) für die Anwendung in der klinischen und forensischen Toxikologie entwickelt werden. Für die systematisch toxikologische Analyse stehen bei Klinikfällen meist Urin, Blut/Serum und Mageninhalt zur Verfügung. Bei forensischen Fällen erhält man als Untersuchungsmaterial häufig nur Blut- bzw. bei den Obduktionen auch Organ– und Gewebeproben als Untersuchungsmaterial. Urin ist im Vergleich zu Blut in Deutschland bei Verkehrsdelikten seltener vorhanden (<10 %).
1.4.1. Verordnungshäufigkeit von 1,4-DHP, Angiotensin-AT1-Rezeptor- Antagonisten und oralen Antidiabetika
Unter den 3000 verordnungshäufigsten Arzneimitteln befanden sich im Jahr 2002
86 Präparate mit Calciumantagonisten [Scholz, 2003] sowie die Angiotensin-AT1- Rezeptor-Antagonisten Candesartan, Eprosartan, Irbesartan, Losartan, Telmisartan und Valsartan [Anlauf, 2003]. Die Verordnungszahl der letztgenannten Substanzgruppe lag in Deutschland im Jahr 1993 bei einer Mio. definierter Tagesdosen und im Jahr 2002 bereits bei 682 Mio. definierter Tagesdosen [Anlauf, 2003] (s. Abb. 1-7).
21 Einleitung
Verordnung von Angiotensin AT1- Rezeptorantagonisten in definierten Tagesdosen (DDD)
800 600 400 200
DDD [Mio] 0 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 Jahr
Abb. 1-7: [Anlauf, 2003].
Die Verordnungshäufigkeit von oralen Antidiabetika ist ebenfalls beachtlich. Von den insulinotropen Antidiabetika (Sulfonylharnstoffe, Glinide) wurden 2002 in Deutschland ca. 500000 Tagesdosen verschrieben. Die zur Kombinationstherapie mit Sulfonylharnstoffen zugelassenen Glitazone, die seit 2000 (Rosiglitazon) bzw. seit 2001 (Pioglitazon) auf dem Markt sind, waren bereits 2001 in der Gruppe der 2500 meistverordneten Arzneimittel. Die Biguanidverordnungen (Metformin) sind in den letzten zehn Jahren achtfach angestiegen [Joost, 2004].
1.4.2. Calciumantagonisten Neben den Calciumkanalblockern vom Verapamil-Typ (Verapamil und Gallopamil) und Diltiazem-Typ (Diltiazem) besitzt der 1,4-Dihydropyridin-Typ die meisten Vertreter. In Deutschland sind momentan elf Substanzen der 1,4-DHP auf dem Markt: Amlodipin, Felodipin, Isradipin, Lacidipin, Lercanidipin, Nicardipin, Nifedipin, Nilvadipin, Nisoldipin, Nimodipin und Nitrendipin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein gezieltes Screeningverfahren auf 1,4-DHP entwickelt, deshalb wird im Folgenden nur auf diesen Typ eingegangen.
Der molekulare Angriffspunkt der 1,4-DHP ist die α1-Untereinheit der spannungsabhängigen Calciumkanäle vom L-Typ, dem vorherrschenden Kanaltyp in der Zellmembran von Muskelzellen. Die 1,4-DHP werden als Antihypertensiva und
22 Einleitung einige auch als Antianginosa eingesetzt. Nimodipin, das aufgrund seiner hohen Lipophilie schnell ins Zentralnervensystem penetriert, wird zur Verhinderung cerebraler Spasmen nach Subarachinoidalblutungen [Förstermann, 2001b] sowie bei hirnorganischen Leistungsstörungen im Alter eingesetzt [Fachinformation Nimotop, 2001/2002]. 1,4-DHP werden bei Bluthochdruck auch in Kombination mit anderen Präparaten wie Diuretika, Betablockern, ACE-Hemmern, Angiotensin-II-Antagonisten, Vasodilatoren wie Dihydralazin aber auch α1-Antagonisten verordnet, wobei sich die blutdruck- senkenden Wirkungen verstärken können.
Therapeutische Plasmaspiegel der 1,4-DHP Die Einnahme von 1,4-DHP resultiert in sehr geringen therapeutischen Plasmaspiegeln (s.Tabelle 1-2.) . Tabelle 1-2: Plasmaspiegel der 1,4-DHP Substanz Therapeutische Plasma- Handelsnamen von FAM Konzentrationen [ng/ml] (Beispiele) Amlodipin 5 – 15 Norvasc Felodipin 1 – 12 Munobal, Modip Isradipin 0,5 – 2 Lomir, vascal Lacidipin 3 – 6 Motens Lercanidipin 1,2 -13,6 Carmen Nicardipin 70 – 100 Antagonil Nifedipin 25 – 100 Adalat, Aprical Nilvadipin < 10 Escor, Nivadil Nimodipin 10 – 50 Nimotop, Nimodipin Hexal Nisoldipin 0,3 – 1 Baymycard Nitrendipin 10 – 50 Bayotensin, Nitrendimerck
Pharmakokinetik von 1,4–DHP, unerwünschte Wirkungen, Toxizität und Wechselwirkungen
Die pharmakokinetischen Eigenschaften der 1,4-DHP sind in den meisten Punkten ähnlich. Nach einer guten Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt, unterliegen sie einem starken First–pass Metabolismus, so dass die Bioverfügbarkeit relativ gering ist.
23 Einleitung
Eine intensive hepatische Biotransformation führt in der Regel zu unwirksamen Metaboliten [Roth, 1994]. Die meisten unerwünschten Wirkungen und Intoxikationen resultieren aus einer
übermäßigen Vasodilation [Goodman et al., 1999; Förstermann, 2001b]. In den Fachinformationen der Calciumantagonisten-Präparate wird vor einer Veränderung der Reaktionsfähigkeit gewarnt, die, besonders zu Beginn der Behandlung, bei Dosiserhöhung sowie bei Präparatewechsel, die aktive Teilnahme am Straßenverkehr, das Bedienen von Maschinen sowie Arbeiten ohne sicheren Halt beeinträchtigen kann. Zur Therapie von Intoxikationen werden die üblichen Maßnahmen wie Magenspülung, Gabe von Aktivkohle und Laxantien empfohlen, des Weiteren wird symptomatisch therapiert [Pearigen, Benowitz, 1991]. 1,4-DHP werden über das Cytochrom P 450 System (CYP3A4) metabolisiert [Bertsche, Scholz; 2002; Arand, Oesch, 2004]. Der Metabolismus von Comedikationen muss deshalb ebenfalls berücksichtigt werden.
Detektion in Körperflüssigkeiten In der Literatur sind zahlreiche Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung von 1,4-DHP beschrieben. Es wurden gaschromatographische Methoden mit Elektroneinfang-Detektor, Stickstoff-selektivem Detektor oder massenspektrome- trischer Detektion [Martens et al., 1994; Rosseel, Lefebvre, 1994; Scharpf et al., 1994] und HPLC Methoden mit verschiedenen Detektoren (UV oder elektrochemischem Detektor) eingesetzt [Josefsson et al., 1995; Abou-Auda et al., 2000; Heining et al., 1994; Lopez et al., 2000]. Für einzelne Calciumkanalblocker (Amlodipin, Barnidipin, Nimodipin, Lacidipin, Felodipin, Nifedipin) wurden auch LC-MS/MS Methoden beschrieben [Yasuda et al., 1996; Marzo et al., 2000; Pawula et al., 1998; Mück, 1995; Rossato et al., 1993; Hamdan et al., 1992; Lindmark et al., 2002; Streel et al., 1998]. Ein Screeningverfahren für Metaboliten von 1,4-DHP in Urin mittels GC-MS wurde von Maurer und Arlt [Maurer, Arlt, 1999] entwickelt. Ein Screeningverfahren mittels LC-MS bzw. LC-MS/MS zur Bestimmung von allen elf im Handel befindlichen 1,4- DHP in Serum bzw. Plasma wurde bisher in der Literatur noch nicht beschrieben.
24 Einleitung
1.4.3. Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten Durch den Einsatz von Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten bietet sich die Möglichkeit, der blutdrucksteigernden Wirkung von Angiotensin II entgegenzuwirken. Da alle für die Blutdruckregulation wesentlichen Wirkung von Angiotensin II über
AT1-Rezeptoren vermittelt werden, wurden gezielt Angiotensin-AT1-Rezeptor
Antagonisten entwickelt [Förstermann, 2001a].
Die Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten, deren erster Vertreter Losartan Anfang der neunziger Jahre auf den Markt kam, gehören zu den besonders erfolgreichen Arzneimitteln, bezogen auf ihre Verordnungshäufigkeit (s.o.), der Behandlung von kardiovaskulären und renalen Krankheiten.
Dosierung der Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten Tabelle 1-3 Substanz Therapeutische Handelsnamen von FAM Dosierung [mg/d] Candesartan cilexitil 1 x 4 – 16 Atacand, Blopress Eprosartan 1 x 600 - 800 Teveten Irbesartan 1 x 150 - 300 Aprovel, Karvea Losartan 1 – 2 x 25 - 50 Lozaar Telmisartan 1 x 20 - 80 Kinzal mono Valsartan 1 x 80 - 160 Diovan
Die sechs untersuchten Substanzen Candesartan, Eprosartan, Irbesartan, Losartan Telmisartan und Valsartan besitzen die gleiche pharmakologische Wirkung – Unterschiede bestehen vor allem in der Pharmakokinetik. Aufgrund der unterschiedlichen oralen Bioverfügbarkeit der Substanzen reichen die therapeutischen Dosen von 1 x 4 - 16 mg/d (Candesartan cilexetil) bis 800 mg/d (Eprosartan) (s. Tabelle 1-3), so dass maximale therapeutische Plasmaspiegel in Bereichen von ng/ml (z.B. Losartan und Candesartan) bis µg/ml (z.B. Irbesartan, Valsartan) resultieren [Gonzalez et al., 2002].
25 Einleitung
Detektion in Körperflüssigkeiten
Zur Identifizierung und Quantifizierung von Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten sind für Plasma in der Literatur folgende Methoden beschrieben HPLC und Fluoreszenzdetektor [Daneshtalab et al., 2002; Stangier et al., 2000; Gonzalez et al., 2002] und die Detektion mit GC-MS [Maurer et al., 1998] beschrieben. Cagigal et al. bestimmten Losartan und Valsartan im Urin spektrofluorimetrisch [Cagigal et al., 2001]. Krämer et al. bestimmten den aktiven Losartan-Metaboliten EXP3179 mittels LC-MS im Serum [Krämer et al., 2002]. Eine Screeningmethode mittels LC-MS für die sechs aufgeführten Sartane in Serum oder Plasma wurde bisher noch nicht in der Literatur beschrieben.
1.4.4. Orale Antidiabetika Die unter dem Begriff „oralen Antidiabetika“ zusammengefassten Substanzen sind die insulinotrop wirkenden Sulfonylharnstoffe (z.B. Glibenclamid, Glimepirid, Gliquidon, Glibornurid, Glipizid, Gliclazid, Tolbutamid) und Glinide (Repaglinid, Nateglinid), die das Insulin schnell freisetzen und sehr rasch verstoffwechselt werden [Landgraf, 2000], das Biguanidderivat Metformin, das die hepatische Glucoseabgabe senkt [Stumvoll et al., 1995] und die auch als Insulinsentisizer bezeichneten Glitazone (Rosiglitazon, Pioglitazon), die die Insulinresistenz, den Nüchternblutzucker sowie den HbA1cWert senken [Fenske, Husmann, 2003; Phillips et al., 2001, Fuchs et al., 2001]. Die α-Glucosidasehemmer Arcabose und Miglitol, die den Abbau von Di- und Polysacchariden im Darm hemmen und somit die Resorption von Glucose [Richter, 2000], gehören ebenfalls zu den oralen Antidiabetika, wurden jedoch im Folgenden nicht untersucht.
26 Einleitung
Dosierung der untersuchten oralen Antidiabetika Tabelle 1-4 Substanz Therapeutische Dosis [mg/d] Handelsnamen von FAM (Beispiele) Glibenclamid 3,5 – 10,5 Euglucon Glibornurid 12,5 - 75 Glutril Glimepirid 1 - 4 Amaryl Gliquidon 15 - 120 Glurenorm Glipizid* 5 – 20 Glibenese* Gliclazid 40 - 160 Diamicron Metformin 0,78 – 2,34 Glucophage Nateglinid 180 – 360 Starlix Pioglitazon 15 - 30 Actos Repaglinid 1,5 - 16 NovoNorm Rosiglitazon 1 - 8 Avandia Tolbutamid 500 - 3000 Orabet * in Deutschland nicht mehr im Handel.
Unerwünschte Wirkungen Die schwerwiegendsten Nebenwirkungen, die auch forensisch bedeutungsvoll sein können, ist bei den Sulfonylharnstoffen die Hypoglykämie und bei dem Biguanid Metformin das Auftreten einer Laktatazidose. Die Benzoesäurederivate Repaglinid und Nateglinid werden unmittelbar vor den Hauptmahlzeiten eingenommen. Ihre Wirkung ist auf die Verdauungsphase beschränkt, wodurch hypoglykämische Reaktionen vermieden werden können.
Detektion in Körperflüssigkeiten In der Literatur wurden bereits zahlreiche Detektionsmöglichkeiten für orale Antidiabetika in Körperflüssigkeiten beschrieben. Für Sulfonylharnstoffe wurden Methoden zur gleichzeitigen Bestimmung mehrerer Substanzen mit HPLC (Glibenclamid, Glipizid, Gliclazid, Gliquidon) [Sener et al., 1995], APCI-LC-MS
[Maurer et al., 2002b], ESI-LC-MS (Tolbutamid, Chlorpropramid, Glibenclamid, Glipizid) [Magni et al., 2000], APCI-MS/MS [Ramos et al., 1999], Kapillarelektrophorese (Chlorpropramid, Tolbutamid, Glipizid, Gliclazid, Glibenclamid) [Paroni et al., 2000] sowie Einzelbestimmungen z.B. Glibenclamid
27 Einleitung
[Valdes Santurio, Gonsalez, 1996] beschrieben. Pioglitazon und Rosiglitazon wurden mit HPLC UV-Detektor (Pioglitazon und Metaboliten) [Zhong, Williams, 1996], Fluoreszenzdetektion (Rosiglitazon) [Muxlow et al., 2001] und LC-MS/MS (Pioglitazon und Metaboliten) [Lin et al., 2003], (Glipizid und Rosiglitazon) [Lin et al., 2004] bestimmt. Für Metformin wurden Methoden mit HPLC-UV [Zarghi et al., 2003], spektrophotometrischer Detektion [Cheng, Chou, 2001, Zhang et al., 2002] beschrieben. Für die Nateglinid ist der Nachweis mit HPLC und UV-Detektion beschrieben [Bauer et al., 2003]. Ein Screeningverfahren zum Nachweis der verschiedenen unter dem Begriff „orale Antidiabetika“ zusammengefassten Substanzen in Serum bzw. Plasma mit LC-MS bzw. LC-MS/MS wurde bisher in der Literatur noch nicht beschrieben.
28 Geräte/Material
2. Experimenteller Teil
2.1. Geräte/Materialien
2.1.1. Extraktion Automat für Festphasenextraktion: Rapid Trace SPE Modul, Zymark, Idstein Software: Zymark Rapid Trace SPE Workstation 1.20 Verwendete Säulen: Chromabond Drug 200 mg /3 ml, Machery-Nagel, Düren; (modifiziertes Kieselgel basierte Mischphasensäule + C8 RP-Material + Kationenaustauscher); OASIS MCX (3cc/30 mg), Waters, Eschborn Filter: Micro Spin Filter 45 µm (Polytetrafluorethylen), Alltech GmbH, Unterhaching
2.1.2. HPLC HPLC-System (gekoppelt mit API 365) HPLC-System (gekoppelt mit API 365) HTC PAL Autosampler, Chromtech GmbH, Idstein Hamilton 100 µl Spritze, Chromtech GmbH, Idstein Degasser, ERC-3415, ERC Incorporation System Controller: SCL-10A VP, Shimadzu Duisburg drei Pumpen LC 10AD VP, hochdruckseitiger Gradientenmischung, Shimadzu Duisburg Post Column Pump, Pharmacia/LKB, Freiburg CTO-10AC Säulenofen, Shimadzu Duisburg Diodenarray Detektor: DAD 1100 Agilent Series, Waldbronn Software: ChemStation Rev A. 08.03 Agilent Technologies, Waldbronn
HPLC-System (gekoppelt mit QTrap) 1100 Agilent Series, Agilent, Waldbronn: Autosampler, Säulenofen, binäre Pumpe
HPLC-Säulen Luna C18 (2) 150 x 2,0 mm, 3 µm Phenomenex, Aschaffenburg Luna C8 50 x 2,0 mm, 3 µm, Phenomenex, Aschaffenburg Synergi Polar-RP 80 A, 150 x 2,0 mm, 4 µm Phenomenex, Aschaffenburg Synergi Polar-RP 80 A, 50 x 2,0 mm, 4 µm, Phenomenex, Aschaffenburg X-Terra MS C18, 1 mm x 100 mm, 3,5 µm, Waters, Milford, MA, USA Vorsäulenkartuschen, (Guard) Cartridge mit entsprechenden Vorsäulen: Polar RP 4 mm L X 2 mm ID, C18 ODS Octadecyl 4mm L X 2 mm ID, Phenomenex Aschaffenburg
29 Geräte/Material
Fließmittel -Fließmittel A: 0,1% Ameisensäure, 1 mM (FM A) bzw. 10 mM Ammoniumformiat, pH 2,7 -Fließmittel B: Acetonitril,0,1% Ameisensäure, 1 mM (FM B) bzw. 10 mM Ammoniumformiat, 95:5, v/v -Acetonitril -Acetonitril/MeOH 1:1, v/v
2.1.3. Massenspektrometrie Massenspektrometer API 365, Applied Biosystems/SCIEX, Darmstadt QTrap, Applied Biosystems/SCIEX, Darmstadt
Software Masschrom 1.1.1,SCIEX, Toronto, Canada Multiview 1.4, SCIEX, Toronto, Canada Analyst Software 1.1, 1.3, 1.4, Applied Biosystems, Darmstadt
2.1.4. Sonstige Geräte Analysenwaage SBC 32, Scaltec, Heiligenstadt Biofuge B, Heraeus Christ GmbH, Osterode Centrifuge 5415 D, Eppendorf Laborfuge Ae, Heraeus Christ GmbH, Osterode Megafuge 1.0, Heraeus Christ GmbH, Osterode Schüttelgerät Relax 2000, Heidolph, Kelheim Thermoblock, Bioblock Scientific C092607, Thermodyne Cor. USA Digital pH-Meter pH 525, Wissenschaftlich Technische Werkstätten, Weilheim i. O. Spritzenpumpe, Harvard, Quebec, Canada Hamilton 1 ml Spritze, Chromtech GmbH, Idstein
30 Geräte/Material
2.1.5. Reagenzien
Tabelle 2-1 1-Chlorbutan Merck, Darmstadt 2-Propanol p.a. Merck, Darmstadt Aceton p.a. Merck, Darmstadt Acetonitril (Gradient Grade) Merck, Darmstadt Ameisensäure p.a. 98 – 100% Merck, Darmstadt Amiodaron Sanofi-Synthelab, München Amlodipinbesilat Pfizer, Karlsruhe Ammoniaklösung p.a. 25% Merck, Darmstadt Ammoniumformiat Sigma-Aldrich, Steinheim Brotizolam Radian/Promochem, Wesel Candesartan Astra Zeneca, Mölndal, Schweden Codein Radian/Promochem, Wesel Coffein AK Prof. Pragst, Berlin Diazepam-D5 Radian/Promochem, Wesel Dichlormethan p.a. Merck, Darmstadt Diethylether Merck, Darmstadt Dikaliumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt Dinatriumhydrogenphosphat–12-hydrat Merck, Darmstadt Doxepin-D3 Radian/Promochem, Wesel Eprosartan (aus Teveten mono® 600 mg) Aventis, Frankfurt Essigsäure p.a. 99% Aldrich, Steinheim Ethylacetat Fluka, Buchs, Schweiz Felodipin Aventis, Frankfurt Glafenin AK Prof. Pragst, Berlin Glibenclamid Aventis, Frankfurt Glibornurid Yamanouchi Pharma, Heidelberg Gliclazid AK Prof. Pragst, Berlin Glimepirid Aventis, Frankfurt Glipizid AK Prof. Pragst, Berlin Gliquidon Boehringer, Ingelheim Haloperidol Radian/Promochem, Wesel Irbesartan (aus Aprovel® 150 mg) Sanofi Pharma, Paris, Frankreich Isradipin Schwarz Pharma, Monheim Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt Lacidipin Boehringer, Ingelheim Lercanidipin Berlin Chemie, Berlin Losartan MDS Sharp & Dohme GmbH, Haar Metformin Merck, Darmstadt Methanol p.a. Merck, Darmstadt Morphin Radian/Promochem, Wesel Nateglinid (aus Starlix® 120 mg) Novartis, Basel, Schweiz Natriumchlorid Fluka, Buchs, Schweiz Nicardipin Novartis, Basel, Schweiz Nifedipin Bayer, Leverkusen
31 Geräte/Material
Nilvadipin Trommsdorf, Alsdorf Nimodipin Bayer, Leverkusen Nisoldipin Bayer, Leverkusen Nitrendipin Bayer, Leverkusen Pioglitazon (aus actos®15 mg ) Takeda Pharma, Aachen Repaglinid (aus NovoNorm® 0,5 mg) Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark Rosiglitazon GlaxoSmithKline, West Sussex,Grossbritannien Stickstoff 4.6 Messer, Griesheim Telmisartan (aus Kinzal mono® 80 mg) Bayer, Leverkusen Tetrahydrocannabinol Radian/Promochem, Wesel Tetrahydrocannabinolcarbonsäure Radian/Promochem, Wesel Tolbutamid Berlin Chemie, Berlin TRIZMA Base (für TRIS-Puffer) Sigma-Aldrich, Steinheim Valsartan Novartis, Basel, Schweiz Warfarin Aglukon GmbH, Düsseldorf
Plasma Humanplasma mit 20% (17–24%) Citrat–Phosphat–Dextrose Lösung (Phar. Eur. 1997) stabilisiert. (Transfusionsmedizin, Universitätsklinikum Freiburg)
Serum Humanserum (drogenfrei) ohne Zusätze
32 Methoden
2.2. Methoden
2.2.1. Extraktionsmethoden Automatisierte Methode zur Mischphasen-SPE von sauren, neutralen und basischen Substanzen aus Serum/Urin nach Chen et al. [Chen et al., 1992]
1 ml Probe wird mit je 100 ng/ml I.S. D3-Doxepin und D5-Diazepam versetzt, und mit 2 ml Phosphatpuffer verdünnt. Die Probe wird mit dem Rapid Trace SPE Modul (s. Tabelle 2-2) unter Verwendung der Chromabond Drug Säulen extrahiert.
Tabelle 2-2 Schritt Reservoir Volumen Flussrate Abfallbehälter [ml] [ml/min] oder Zeit [min] 1 Konditionieren Methanol 2,0 2,0 org. LM, 2 Konditionieren 0,1 M Phosphat- 2,0 2,0 wässrig puffer pH 6 * 3 Beladen Probe 3,0 0,5 wässrig 4 Spülschritt 0,1 M Essigsäure 2,0 1,0 wässrig 5 Trocknen Stickstoff 1 [min] - 6 Spülen Methanol 0,1 2 org. LM ** 7 Trocknen Stickstoff 8 Elution 1 Aceton: Dichlor- 1,5 1,0 Fraktion 1 methan 1:1,v/v (sauer/neutral) 9 Trocknen Stickstoff l [min] - 10 Elution 2 DIA** 1,5 1,0 Fraktion 2 (basisch) 11 Kanüle spülen Methanol 4 30 org. LM
Eluate bei 40 °C unter Stickstoff eindampfen und in 100 µl Fließmittel (A:B 80:20, v/v) bzw. für Suppressionsversuch Kapitel 3.1.1 (A:B 1:1, v/v) aufnehmen.
*0,1 M Phosphatpuffer pH 6: 13,61 g KH2PO4, ca. 950 ml destilliertes Wasser, pH- Wert Einstellung mit 1 M KOH, mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzen. **org. LM: organische Lösungsmittel **DIA: Dichlormethan Isopropanol:Ammoniaklösung 25% (80:20:2, v/v/v)
Festphasenextraktion mit OASIS Säulen
Säule mit 1 ml Methanol und 1 ml H2O dest. konditionieren, 1 ml Serum extrahieren. Säule waschen mit 1 ml 0,1 M HCl, mit Stickstoff 1 min trocknen. Elution mit 1 ml Methanol:Ammoniaklösung 25 %, (98:2, v/v). Eluat bei 40 °C unter Stickstoff eindampfen. In 100 µl Fließmittel (A:B 1:1, v/v) aufnehmen.
33 Methoden
Proteinfällung 100 µl Serum + 100 µl ACN schütteln (Vortexer Stufe 5, 2 min), zentrifugieren ( Bio- fuge Stufe, 2 min). Überstand entweder direkt ins LC-MS injizieren (20 µl) oder mit 100 µl Überstand das eingedampfte OASIS Eluat aufnehmen.
Chlorbutanextraktion modifiziert nach Vorschrift des Arbeitskreis Extraktion der GTFCh [Demme et al., 1999; Demme et al., 2003]
- 1 ml Serum + 200 ng/ml I.S. Brotizolam (Variante: D3-Doxepin als I.S). + 0,5 ml Boratpuffer pH 9 (Variante, sonst NaH2PO3-Puffer) und 1,5 ml 1-Chlorbutan schütteln - 3 min zentrifugieren (Megafuge 4000 x g ) - organische Phase abnehmen und auf dem Heizblock bei 40 °C unter Stickstoff eindampfen - Probe in 100 µl Fließmittel (A:B 80:20, v/v) aufnehmen
Boratpuffer pH 9: a) 61,8 g H3BO3, 74,6 KCl in einem 1l H2O lösen. b) 106 Na2CO3 in 1l H2O lösen 630 ml Lösung a) mit 370 ml Lösung b) versetzen pH 9 mit überschüssiger Lösung b) einstellen.
Ethylester–Diethyletherextraktion nach Maurer [Maurer et al., 2002b]
- 1 ml Serum, 200 ng/ml I.S. (z.B. D5-Diazepam und D3-Doxepin), +1 ml gesättigte Na2SO4 Lösung + 5 ml Diethylether:Etylacetat 1:1, v/v - schütteln (Vortexer, Stufe 5, 2 min.) - 3 min zentrifugieren (Megafuge 4000 x g ) - organische Phase abnehmen und auf dem Heizblock bei 40 °C unter Stickstoff eindampfen (Extrakt 1) - wässrige Phase + 0,1 ml 1 M NaOH + 5 ml Diethylether:Etylacetat 1:1, v/v schütteln - 3 min zentrifugieren (Megafuge 4000 x g ) - organische Phase abnehmen, zu Extrakt 1 geben und auf dem Heizblock bei (40 °C) unter Stickstoff eindampfen
34 Methoden
Flüssig-Flüssig Extraktion nach Gergov et al. [Gergov et al., 2001a] (modifiziert) Basische Extraktion: - I.S.: D3-Doxepin (200 ng/ml) - 1 ml Blut/Serum + basischer I.S. + 300 ml 1 M TRIS-Puffer pH 11 + 500 µl Butylacetat, Extraktion 2 min dabei mit Vortex Mixer schütteln (Stufe 7) - zentrifugieren, organische Schicht abnehmen und in anderes Reagenzglas überführen + 75 µl Ammoniumacetat Puffer (10 mmol, 0,1% Ameisensäure, pH 3,2) unter Stickstoff bei 40 °C im Wasserbad einengen - Zugabe von 75 µl ACN, 5 min mit dem Vortex Mixer schütteln (Stufe 7) - 5 min zentrifugieren (4000 x g, Megafuge 1.0) - Extrakt in Autosamplergläschen überführen
Saure Extraktion: - I.S.: D3- THC-COOH (200 ng/ml) - 120 mg NaCl zur wässrigen Phase + I.S. zugeben, ansäuern mit 500 µl 1 M Phosphatpuffer (pH 3) u. 600 µl Phosphorsäure 8,5% - Extraktion mit 5 ml Dichlormethan:Isopropanol 95:5, v/v - 30 min auf Benchtop Shaker 250/min - 5 min zentrifugieren (4000 x g, Megafuge 1.0) - Organische Schicht abnehmen und im Abzug zur Trockene im Wasserbad bei 40 °C eindampfen - Rückstand in 150 µl mobiler Phase aufnehmen (FM A:B 80:20, v/v) schütteln, - 2 min zentrifugieren (Laborfuge Ae), mit dem basischen Extrakt vereinigen
1 M TRIS-Puffer pH 11: 121,1 g Tris(hydroxy)aminomethan, ca. 830 g destilliertes Wasser, pH-Wert Einstellung (falls nötig) mit NaOH, mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzen.
35 Methoden
2.2.2. HPLC-Parameter
Ionensuppressions-Experiment für verschiedene Extraktionsmethoden Gradient: 0-1 min: 5 % B, 1-5 min: 5-30 % B (linear), 5-19 min: 30-90% B (linear), 19-21 min: 90% B.
Fluss: 250 µl/min Säulenofen: 40 °C Injektionsvolumen: 20 µl
Säule: Synergi Polar RP 150 x 2mm, 4 µm Flussrate: Spritzenpumpe 20 µl/min ACN PC: 180 µl/min
Experimente zur Untersuchung von „Post Column“ Fließmittelzusätzen Isokratische Fließmittelzusammensetzung [FM A:B, v/v]: Morphin 30:70, Tetrazyklin 53:47, Benzylpenicillin 40:60, Warfarin 24:76, Enalapril 46:54, alle 3 min.
Tabelle 2-3 Versuch Flussrate [µl/min] MeOH MeOH:ACN 1:1, v/v, ACN [µl/min] [µl/min] PC [µl/min] PC PC 1 250 - - - 2 310 - - - 3 400 - - - 4 250 60 - 5 250 - 60 - 6 250 - - 60 7 250 150 - - 8 250 - 150 - 9 250 - - 150
Säulenofen: 40 °C FIA: Injektionsvolumen: 20 µl Säule: Synergi Polar RP 150 x 2mm, 4 µm
36 Methoden
Bibliotheksspektren-Aufnahme
Gradientenmethode zur Erstellung der Fluss: 250 µl/min Bibliotheksspektren Säulenofen: 40 °C 100 Injektionsvolumen: 20 µl 80 Säule: Synergi Polar RP 50 x 60 Reihe1 2mm, 4 µm 40 20 ESI: FM A und B Konzentration Konzentration Fließmittel B [%] B Fließmittel 0 APCI: FM 0,1% HCOOH und 051015 ACN Zeit [min]
Abb. 2-1: Gradient zur Aufnahme von Q1-Scan Bibliotheksspektren Gradient: 0-0,3 min: 5 % B, 0,3-2 min: 5-30 % B (linear), 2-5 min: 30-70% B (linear), 5-6,5 min: 70-95% B (linear), 6,5-7,5 min: 95%, 7,5-8 min: 95-5% B (linear) 8–11 min: 5%
Q1-Scan Screeningmethode
HPLC Gradient für 28 min. Screening Methode
10 0 Fluss: 250 µl/min 80 Säulenofen: 40 °C 60 Injektionsvolumen: 20 µl 40 Totzeit: 1,2 min 20 Säule: Synergi Polar RP 250 Konzentration Konzentration
Fließmittel B [%] B Fließmittel 0 0 5 10 15 20 25 30 x 2 mm, 4 µm Zeit [m in] FM: A und B
Abb. 2-2: Gradient zur Aufnahme von Q1-Scan Spektren mit der Screeningmethode Gradient: 0-1 min: 5 % B, 1-5 min: 5-30 % B (linear), 5-15 min: 30-70% B (linear), 15-19 min: 70-95% B (linear), 19-22 min: 95% B, 22-24 min: 95-5% B (linear), 24 min: 5% B
Metabolitenbestimmung Fluss: 250 µl/min Säulenofen: 40 °C (Trimipramin 20°C) Injektionsvolumen: 20 µl Fließmittel: A und B Luna C18 (2), 150 x 2mm, 3 µm: Quetiapin, Doxepin, Promethazin, Verapamil, Trimipramin Synergi Polar RP 150 x 2 mm, 4 µm: Citalopram, Zopiclon, Sildenafil
37 Methoden
- Citalopram und Metaboliten Gradient: isokratisch, FM A:B 70:30, v/v, 28 min - Zopiclon und Metaboliten Gradient: 0-1 min: 5% B, 1-5 min: 5-15% B (linear), 5-6 min: 15 % B, 6–12 min: 15–20 %B (linear), 15–20 min: 20 % B - Doxepin und Metaboliten Gradient: isokratisch, FM A:B 75:25, v/v, 28 min - Sildenafil und Metaboliten Gradient: s.o. Q1-Scan Screeningmethode - Quetiapin und Metaboliten Gradient: isokratisch, FM A:B 85:15, v/v, 60 min - Promethazin und Metaboliten Gradient: isokratisch, FM A:B, 72:28, v/v, 28 min - Verapamil und Metaboliten Gradient: isokratisch, FM A:B, 72:28, v/v, 28 min - Trimipramin und Metaboliten Gradient: isokratisch, FM A:B, 75:25, v/v, 28 min
„Multi Target“ Screeningmethode
Gradient für das "Multi target Screening"
100 90 80 70 Fluss: 250 µl/min 60 50 Säulenofen: 40 °C [%] 40 30 Injektionsvolumen: 20 µl 20 Totzeit: 2,4 min 10
Konzentration Fließmittel B 0 Säule: Synergi Polar RP 150 x 2 0 5 10 15 20 25 30 35 mm, 4 µm Zeit [min] FM: A und B Abb.2-3: Gradient für MTS-Verfahren Gradient: 0-20 min: 20-95 % B (linear), 20-23 min: 95% B (linear), 23–23,1 min: 20% B (linear), 23,1-33,1 min: 20% B
1,4–DHP
Gradient für Calciumantagonistenscreening
100 90 80 Fluss: 400 µl/min 70 60 Säulenofen: 40 °C 50 [%] 40 Injektionsvolumen: 20 µl 30 Totzeit: 1,7 min 20 10 Säule: Luna C18 (2), 150 x 2 mm,
Konzentration Fließmittel B B Fließmittel Konzentration 0 0 5 10 15 20 3 µm Zeit [min] FM: A und B
Abb. 2-4: Gradient für die 1,4-DHP Screening Methode Gradient: 0-1 min: 20 % B, 1-3 min: 20-40 % B (linear), 3-11 min: 40-70% B (linear), 11-12 min: 70-95% B (linear), 12-12,5 min: 95% B, 12,5-13,5 min: 95-20%B (linear), 13,5–15,5 min: 20% B
38 Methoden
Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten
Gradient AT1-Antagonisten Screening
80 60 Fluss: 250 µl/min 40 Säulenofen: 40 °C
20 Injektionsvolumen: 20 µl Konzentration
Fließmittel B [%] B Fließmittel Säule: Luna C8, 50 x 2,0 mm 0 0 5 10 15 FM: A und B Zeit [min]
Abb. 2-5: Gradient für die Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten Methode Gradient: 0-2 min: 15-20 % B (linear), 2-4,5 min: 20-40 % B (linear), 4,5-8 min: 40- 70% B (linear), 8-8,2 min: 70-15% B (linear), 8,2-10 min: 15% B
39 Methoden
2.2.3. Massenspektrometrische Geräte-Parameter
Ionensuppressions-Experiment für verschiedene Extraktionsmethoden Massenspektrometer: API 365 TurboIonSpray Quelle Q1-Scan Modus Massenbereich: 50 – 600 amu Declustering Potential: +/-20 V und +/- 80 V alternierend Turbogas (N2): 4 l/min Temperatur: 350° C Step size: 0,1 amu Curtaingas: 10 Nebulizergas: 11 Restl. Parameter (FP, EP) mit Haloperidol optimiert. Masschrom 1.1.1 und Multiview Software
Experimente zur Untersuchung von „Post Column“ Fließmittelzusätzen Massenspektrometer: API 365 TurboIonSpray Quelle Single Quadrupol Modus: SIM Declustering Potential: für jede Substanz einzeln optimiert s.u. Focusing Potential: für jede Substanz einzeln optimiert s.u. Entrance Potential: für jede Substanz einzeln optimiert s.u. Scan Zeit: 2 sec pro Scan je Declustering Potential s.u. Massenbereich: 50 – 700 amu (bei Bedarf auch höher) Step size: 0,1 amu Nadelspannung: 5,25 kV Turbogas (N2): 3 l/min Temperatur: 350° C Curtaingas: 10 Nebulizergas: 11 Messzeit: 3 min Analyst Software 1.3
Optimierte Parameter: Morphin: DP 20 V, FP 250 V, EP 3 V Tetrazyklin: DP 6 V, FP 110 V, EP 5,5 V Benzylpenicillin: DP 26 V, FP 150 V,EP 6,3 V Warfarin: DP 16 V, FP 140 V, EP 10 V Enalapril: DP 7 V, FP 36 V, EP 2,5 V
40 Methoden
ESI-CID Q1-Scan Bibliotheksspektren / Screening Methode Massenspektrometer: API 365 TurboIonSpray Quelle DP Switching: + 20, 50, 80 V FP: 200 V EP: 7 V Scan Zeit: 2 sec pro Scan je Declustering Potential Massenbereich: 50 – 700 amu (bei Bedarf auch höher) Step size: 0,1 amu Nadelspannung: 5,25 kV Turbogas (N2): 3 l/min Temperatur: 350° C Nebulizergas:10 Curtaingas:11 Messzeit: 11 min / 28 min Analyst Software 1.1/ 1.3
ESI-CID Q1-Scan negativer Modus Single-Quadrupol-Modus: Q1-Scan negativ DP Switching: - 20, 50, 80 V FP: -200 V EP: -7 V Nadelspannung: - 4,2 kV sonstige Parameter s.o. ESI-CID Q1-Scan Bibliotheksspektren / Screening Methode
APCI-CID Q1-Scan Massenspektren Massenspektrometer: API 365 DP Switching: + 20, 50, 80 V FP: 200 V EP: 10 V Scan Zeit: 2 sec pro Scan je Declustering Potential Massenbereich: 50 – 700 amu Step size: 0,1 amu Nadel: 6 µA Nebulizer (N2): 1 l Temperatur: 350° C Curtaingas: 14 Nebulizergas: 8 Messzeit: 11 min / 28 min bzw. abhängig von der gewählten HPLC-Methode, ist bei der HPLC Methode angegeben Analyst Software 1.1
41 Methoden
MS2-2004 Tandemmassenspektrenbibliothek Massenspektrometer: API 365 TurboIonSpray Quelle Messmodus: Produkt-Ionen Scan DP Switching: + 20 V FP: 230 V EP: 10 V CEP: 9,73 V CE: alternierend 20, 35, 50 eV CXP: 15 V Scan Zeit: 2 sec pro Scan je CE Massenbereich: 33 amu – Masse des Precursor-Ions + 5 amu Step size: 0,1 amu Nadelspannung: 5,25 kV Turbogas (N2): 3 l/min Temperatur: 350° C Curtain Gas: 11 Nebulizer Gas: 10 Messzeit: abhängig von der gewählten HPLC-Methode, ist bei den Versuchen angegeben Analyst Software 1.1, 1.3
Metabolitenbestimmung
Massenspektrometer: API 365 TurboIonSpray Quelle Analyst Software 1.1/ 1.3
- Citalopram, Doxepin und Metaboliten, Zopiclon und Metaboliten Sildenafil, Quetiapin, Promethazin, Verapamil, Trimipramin und deren Metaboliten: Q1-Scan: s.o. ESI-CID Bibliotheksspektren / Screening Methode
- Citalopram, Doxepin, Zopiclon und Metaboliten, Sildenafil, Verapamil und Metaboliten, Quetiapin und Metaboliten: MS/MS: s.o. MS2-2004 Tandemmassenspektrenbibliothek
- Doxepin Metaboliten MS/MS: Scan Zeit: 2 sec pro Scan je CE Massenbereich: 33 amu – Masse des Precursor-Ions + 5 amu, Step size: 0,1 amu Nadelspannung: 5,25 kV, CAD Gas: 4;Turbogas (N2): 3 l/min, Temperatur: 300°C, Curtain Gas: 11, Nebulizer Gas: 10; Analyst 1.1 N-Desmethyldoxepin: DP 20 V, FP 200 V, EP 7 V, CE 20/35/50 V (alternierend), CEP 8,02 V, CXP (5/20/35 V) Hydroxydoxepin: DP 20 V, FP 230 V, EP 10 V, CE 20/35/50 V (alternierend), CEP 9,32 V, CXP (5/20/35 V)
- Sildenafil Metaboliten MS/MS: Scan Zeit: 2 sec pro Scan je CE Massenbereich: 33 amu – Masse des Precursor-Ions + 5 amu, Step size: 0,1 amu
42 Methoden
Nadelspannung: 5,25 kV, CAD Gas: 4, Turbogas (N2): 3 l/min, Temperatur: 300°C, Curtain Gas: 11, Nebulizer Gas: 10; Analyst 1.1 Hydroxypropylsildenafil: DP 20 V, FP 200 V, EP 7 V, CE 20/35/50 V (alternierend), Desmethylsildenafil: DP 20 V, FP 200 V, EP 7 V, CE 20/35/50 V (alternierend), CEP 13,67 V, CXP (15/15/15 V) (Exp.: 1/2/3) Desethylsildenafil: DP 20 V, FP 200 V, EP 7 V, CE 20/35/50 V (alternierend), CEP 8,02 V, CXP (15/20/35 V) (Exp.: 1/2/3)
„Multi Target” Screeningmethode Massenspektrometer: QTrap TurboIonSpray Quelle Messmodi: MRM („Survey“ Scan), Produkt-Ionen Scan („Dependent” Scan) DP: 40 V EP: 10 V Cycle time: 3,7939 s Dwell Zeit: 5 msec Pause: 2 msec Nadelspannung ESI: 5,4 kV Curtain Gas: 20 psi Nebulizer Gas: 30 psi Turbogas (N2): 70 psi CAD Druck (N2): 4 x 10-5 Torr CE: +20, 35,oder 50 eV im MRM Modus CE: +20, 35, 50 eV alternierend im EPI Modus Temperatur: 400° C LIT – Füllzeit (Füllzeit von Q3): 50 ms Analyst 1.4 Software Scan region: 50-700 amu Dynamic Exclusion Time: 60 s Schwellenwert: 500 cps
1,4–DHP / Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten Massenspektrometer: API 365 Declustering Potential: für jede Substanz einzeln optimiert, s. Abschnitt 3.6.3 / 3.7.2 Tabelle 3-43 / Tabelle 3-54. Ring Spannung: für jede Substanz einzeln optimiert, s. Tabelle S. 115 bzw. S.132 Eingangsspannung: für jede Substanz einzeln optimiert, s. Tabelle S. 115 bzw. S.132 Dwell Zeit: 200 ms Step size: 0,1 amu Kollisionsgas Druck (N2): 0,27 Torr Nadelspannung ESI: 5,25 kV Nebulizergas: 10 Curtaingas: 11 Temperatur: 400° C / 350° C Messzeit: 16 min / 10 min Analyst Software 1.1 /1.1 und 1.3
43 Methoden
Orale Antidiabetika Addukt Bildungs-Experiment Massenspektrometer: API 365 TurboIonSpray Quelle Single Quadrupol Modus: Q1-Scan DP Switching: + 20, 65, 110 V FP (Experiment 1/2/3): 230 V/260 V/300 V EP (Experiment 1/2/3): 8 V /7 V/8 V Scan Zeit: 2 sec pro Scan je Declustering Potential Massenbereich: 50 – 700 amu Restl. Parameter s. Screeningmethode (Änderung der Parameter nach Tuning mit Haloperidol)
44 Ergebnisse und Diskussion
3. Ergebnisteil
3.1. Optimierung einer LC/MS-Methode für ein “General Unknown” Screeningverfahren
3.1.1. Untersuchung von Suppressionseffekten bei verschiedenen Extraktions- verfahren
Versuche zur Prüfung der Auswirkung verschiedener Extraktionsverfahren auf Suppressionseffekte bei LC-ESI-MS wurden durchgeführt (n=3). Kontinuierlich wurde eine Lösung (Konzentration 10 µg/ml) mit Codein bzw. Glafenin in das Massenspektrometer infundiert (Fließgeschwindigkeit 20 µl/min), während die Serumextrakte auf der Säule aufgetrennt wurden. Codein wurde im positiven Modus und Glafenin im negativen Modus gemessen. Die extrahierten Ionenchromatogramme von Codein [M+H]+ 300 und Glafenin [M-H]- 371 wurden verwendet, um Suppressionseffekte zu untersuchen.
Tabelle 3-1: Ergebnisse Suppression bei verschiedenen Extraktionsverfahren Extrahierte Extraktionsmethode Suppressionseffekte in der Front Flüssigkeit Morphin Glafenin Serum LLE nach Maurer ++ ++ snb1: ++ snb1: ++ Serum Mischphasen-SPE snb2: - snb2: - SPE mit OASIS Serum Säulen & ++ ++ Proteinfällung Serum Proteinfällung ++ ++
Ergebnis Besonders in der LC-Front zwischen 2–3 min wurden starke Ionensuppressionseffekte für Codein im positiven Modus und für Glafenin im negativen Modus festgestellt. Zunehmende Suppressionseffekte mit Zunahme der im Extrakt enthaltenen Verunreinigungen, in der Reihenfolge: Mischphasenextraktion (basischer Extrakt < saurer/neutraler Extrakt) < Flüssig-Flüssig-Extrakt < Proteinfällung wurden beobachtet. In der basischen Fraktion der Mischphasen-SPE fand in der LC-Front
45 Ergebnisse und Diskussion praktisch keine Suppression statt. Für den restlichen Gradienten wurden bei allen Extrakten keine spezifischen Suppressionseffekte festgestellt [Müller et al., 2002]. Die Ergebnisse zeigten, dass polare Substanzen und Metaboliten, die von der Säule nicht zurückgehalten werden und in der LC-Front eluieren, bei Verwendung der untersuchten Extraktionsmethoden nicht bzw. schwerer detektiert werden können. Auch bei sehr schnellen LC-MS Methoden mit sehr kurzen Retentionszeiten oder für Fließinjektionsanalysen ohne LC-Auftrennung muss die Ionensuppression des Analyten in Betracht gezogen werden. Bei Entwicklung einer Methode muss diese so optimiert werden, dass die polaren Substanzen möglichst spät eluieren. Diese Suppressionstest wurden ebenfalls für die Entwicklung der Screeningmethode für 1,4-DHP (s. Abschnitt 3.6.) eingesetzt. Suppressionstest, wie die hier vorgestellten sind noch nicht Standard für eine Methodenvalidierung, wurden aber inzwischen auch von anderen Arbeitsgruppen [Dams et al., 2003] durchgeführt, um eine Methode mit LC-MS (mit ESI und APCI) auf ihre Anwendbarkeit zu testen.
3.1.2. Vergleich des Retentionsverhaltens verschiedener Säulen Es wurden drei unterschiedliche Säulen bezüglich ihres Retentionsverhaltens getestet: eine X-Terra MS C18, (3,5 µm, 100 mm x 1 mm) eine Luna C18 (150 x 2mm, 3 µm) und eine Synergi Polar RP (150 x 2 mm, 4 µm) die bereits für ein bestehendes GUS verfahren eingesetzt wurde. Tabelle 3-2: Gegenüberstellung der Säulencharakteristika Luna C18 (2) Synergi Polar RP X-Terra Reversed C18 Phenylpropyl C18 Phase C Gehalt:17,5 % C Gehalt: 11 % C Gehalt: 15,5% Quer- monomer Mit Ethergruppen quervernetzter Monomer gebun- vernetzung gebunden Phenylrest den Phenylrest: π-π Wechselwir- zusätzlich:Substitu kungen mit aromat. Ring der - tion von 1/3 der Analyten Silanolgruppen mit → 100 % wässrige Phase als MPEOS Fließmittel möglich pH-Bereich 1,5 - 10 1,5 - 7,0 1 - 12 Endcapping Ja, keine Polares Endcapping Ja, keine weiteren weiteren Vorteil: besonders gut für polare Herstellerangabe Hersteller- Substanzen aufgrund von H-
angaben Brücken Wechselwirkungen.
46 Ergebnisse und Diskussion
Substanzen mit unterschiedlicher Polarität wurden ausgewählt, um das Retentions- verhalten der Säulen zu charakterisieren. Morphin, Codein, Coffein, D3-Doxepin, D5- Diazepam, Amiodaron, THC und THC-COOH. Von diesen wurde ein Gemisch 10 µg/ml je Substanz in Fließmittel A:B 80:20, v/v, hergestellt. 20 µl Substanzgemisch wurden in das LC-MS injiziert. Eine 28 min dauernde Gradientenmethode (s. Abschnitt 2.2.2. Screeningmethode) wurde verwendet. Ziel war die möglichst späte Elution der polarsten Substanz, da bei Messungen von Serumextrakten in der Front Suppression stattfindet (s. Kapitel 3.3.1). Die apolarste Substanz sollte nicht zu spät eluieren, da bei der verwendeten Gradientenmethode im letzten Drittel der Messung ein Anstieg des Backgrounds zu beobachten ist. a) b) c) Morphin Morphin THC
THC Morphin THC Intensität [cps]
Zeit [min] Abb 3-1: Extrahierte Ionenchromatogramme von Morphin und THC a) Luna C18 b) Polar RP c) XTerra
Intensität [cps] Zeit [min] Abb. 3-2 a): Luna C18 Säule: Q1-Scan Chromatogramm von Humanplasmaextrakt (snb 2)
Intensität [cps]
Zeit [min] Abb. 3-2 b): Polar RP Säule: Q1-Scan Chromatogramm von Humanplasmaextrakt (snb 2)
47 Ergebnisse und Diskussion
s] p
Intensität [c Zeit [min] Abb.3-2 c): XTerra Säule: Q1-Scan Chromatogramm von Humanplasmaextrakt (snb 2)
a) b) c)
Intensität [cps] Abb. 3-3: Chromatogramm von Fließmittel: a) Luna C18, b) Synergi Polar RP, c) XTerra Säule
Morphin, die polarste der getesteten Substanzen, eluierte auf der Luna C18 Säule bereits nach 2,21 min, auf der Polar RP nach 4,65 min und auf der XTerra nach 2,34 min (s. Abb. 3-1 a) –c)). Die apolarste verwendete Substanz, THC, eluierte auf der Luna C18 nach 21,76 min, auf der Polar RP nach 18,38 min und auf der XTerra Säule erst nach 21,66 min. Die Elution von THC erfolgte bei der Polar RP im Gegensatz zu den anderen beiden getesteten Säulen vor der Erhöhung des Backgrounds. Die Polar RP Säule entsprach somit am besten den gewünschten Eigenschaften, da die polarste Substanz im Vergleich zu den anderen beiden Säulen am spätesten eluierte und die apolarste deutlich früher. Generell wurde im Q1-Scan Modus bei Verwendung einer Elektrospray Quelle ein hoher Background beobachtet, der Signale mit geringen Intensitäten unterdrücken kann, dieses Phänomen beschreiben auch Venisse et al. [Venisse, 2003]. Die Abb. 3-2 a) – c) (Chromatogramm von Humanplasmaextrakt, aufgenommen in Fließmittel (A:B 80:20, v/v) und 3-3 a) - c) (Chromatogramm von Fließmittel (A:B 80:20, v/v)) zeigten zwischen ca. 19 - 25 min einen Anstieg des Backgrounds. Die dort erhaltenen Massenspektren lassen auf höher molekulare Substanzen schließen. Zum einen kommt Säulenmaterial dafür in Frage, da der Background ohne zwischengeschaltete Säule
48 Ergebnisse und Diskussion
nicht zu beobachten war und, zusätzlich bei Messungen von Plasmaextrakten, endogenen Substanzen.
3.1.3. Qualitätskriterium: Reproduzierbarkeit der Fragmentierung Eine Testlösung aus Haloperidol für den positiven Modus und Warfarin für den negativen Modus wurde zur Prüfung des Fragmentierungsverhaltens eingesetzt. Damit sollte die Reproduzierbarkeit der Fragmentierung gewährleistet und somit die Möglichkeit der Identifizierung einer Substanz mit Spektrenbibliotheken sichergestellt werden. Vor der Aufnahme von Bibliotheksspektren und Fällen, bei denen ein “General Unknown Screening” mittels LC-MS durchgeführt wurde, wurde ein Massenspektrum der entsprechenden Testlösung aufgenommen (Konzentration 10 µl/ml, 20 µl injizieren). Falls sich das Verhältnis der relativen Intensitäten von der in Abb. 3-4 bzw. 3-5 abwich, mussten entsprechende Maßnahmen (z.B. Quellenreinigung, Justierung von Parametern) ergriffen werden. Bei 20 V DP sollte das protonierte Molekül [M+H]+ 376 die höchste rel. Intensität vorweisen bei Warfarin das deprotonierte Molekül [M-H]-. Bei 50 V DP sollte bei Haloperidol Fragment-Ion m/z 165 und bei Warfarin m/z 161 in höchster rel. Intensität vorliegen und bei 80 V DP Fragment-Ion m/z 123 und bei Warfarin m/z 117.
[M+H]+ [M-H]-
-20 V 20V
-50 V 50 V
-80 V 80 V
Abb. 3-4: Q1-Scan Massenspektren Abb. 3-5: Q1-Scan Massenspektren von, von Haloperidol bei 20, 50, 80 V DP Warfarin bei -20, -50, -80 V DP
49 Ergebnisse und Diskussion
3.1.4. Untersuchung der Ionenintensitäten Bei Verwendung eines rein wässrigen Fließmittels entstehen, bedingt durch die hohe Oberflächenspannung von Wasser, größere Tröpfchen in der ESI Quelle als beim Versprühen von organisch–wässrigen Fließmittelgemischen. Wegen der hohen Oberflächenspannung erfolgt die Coloumbexplosion später, wodurch sich eine geringere Ionenintensität bei den zu bestimmenden Substanzen ergibt. Daher sollten immer mind. 5% organisches Lösungsmittel in Form von Acetonitril oder Methanol im Fließmittel vorhanden sein (Empfehlung der Fa. Applied Biosystems). Falls die chromatographische Trennung nur ein rein wässriges Fließmittel erlaubt, besteht die Möglichkeit, das organische Lösungsmittel nach Auftrennung des Stoffgemischs auf der HPLC Säule und vor Eintritt in die ESI Quelle („Post Column“) zuzuführen. Ziel der folgenden Versuche war es, den Einfluss der Höhe der Flussrate auf die Ionenintensität zu ermitteln. Der Einfluss unterschiedlicher Volumina organischer Lösungsmittel (Acetonitril und/oder MeOH) „Post Column“ auf die Ionenintensität sollte ebenfalls untersucht werden. Die Versuche sind in Abschnitt 2.2.2. aufgelistet. Morphin, Tetrazyklin, Benzylpenicillin, Warfarin und Enalapril wurden als Testsubstanzen verwendet. Anhand der Ergebnisse sollte entschieden werden, ob generell die Zugabe eines organischen Lösungsmittels bei einem Screeningverfahren mit einer Flussrate von 250 µl/min sinnvoll ist. Eine isokratische Fließmittelzusammensetzung, die der entspricht, bei der die Substanzen jeweils beim GUS von der Säule eluieren, wurde für die Messung verwendet. Je Substanz wurden 200 ng pro Messung injiziert (n=6).
HPLC ESI MS Quelle
FM FM org. LM
A B
Abb. 3-6: Schema der „Post Column“ Zugabe von organ. Lösungsmittel (LM)
50 Ergebnisse und Diskussion
CH Morphin 3 N
H
HO O OH Die Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 286 wurde bei Erhöhung der Flussrate geringer. Mit der „Post Column“ Zugabe organischen Lösungsmittels ergaben sich sowohl bei der Zugabe von 60 µl/min als auch bei 150 µl/min höhere Ionenintensitäten als beim Ausgangswert, der Flussrate von 250 µl/min. Die PC Zugabe von ACN zeigte gegenüber dem Methanol/ACN Gemisch und reinem Methanol keine Vorteile. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abb. 3-7 dargestellt.
SIM Morphin MH+ 286: Vergleich der Intensitäten mit/ohne "Post Column" Zugabe von org. Lösungsmittel
[M+H]+ 286
6,00E+07 5,00E+07 4,00E+07 3,00E+07 2,00E+07 1,00E+07 0,00E+00 Intensität [cps] Intensität 250 µl/ min 310 µl/ min 400 µl/min M eOH A CN ACN:MeOH M eOH A CN ACN:MeOH 60 µl/min PC 60 µl/min PC 1: 1 6 0 µ l / mi n 15 0 µ l / mi n 15 0 µ l / mi n 1: 1 150 µ l / mi n PC PC PC PC
Abb. 3-7: Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 286 in Abhängigkeit von der Flussrate und dem Zusatz verschiedener org. Lösungsmittel „Post Column“.
Tetrazyklin OHO OH O OH CONH 2
OH HO H H CH3 N(CH3)2 Die Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 455 von Tetrazyklin wurde mit zunehmender Flussrate geringer. Bei der „Post Column“ Zugabe von organischem Lösungsmittel (Gesamtfluss 310 bzw. 400 µl/min) wurden ungefähr die gleichen Ionenintensitäten wie bei der Flussrate von 250 µl/min ohne PC-Lösungsmittelzugabe erzielt. Die PC Zugabe von ACN zeigte gegenüber dem Methanol/ACN Gemisch und reinem Methanol keine Vorteile. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abb. 3-8 dargestellt.
51 Ergebnisse und Diskussion
SIM Tetrazyklin [M+H]+445: Vergleich der Intensitäten mit/ohne"Post Column" Zugabe von org. Lösungsmittel
[M+H]+ 455
6.00E+07 5.00E+07 4.00E+07 3.00E+07 2.00E+07
Intensität [cps] 1.00E+07 0.00E+00 250 µl/min 310 µl/min 400 µl/min M eOH ACN ACN:M eOH M eOH ACN ACN:MeOH 1:1 60 µl/min PC 60 µl/min PC 1: 1 6 0 µ l / mi n 150 µ l / mi n P C 15 0 µ l / mi n P C 150 µ l / mi n P C PC
Abb. 3-8: Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 455 in Abhängigkeit von der Flussrate und dem Zusatz verschiedener org. Lösungsmittel „Post Column“.
COOH O Benzylpenicillin CH O N 3 CH C NH 2 S CH3 H H
In Abhängigkeit von der Zunahme der Flussrate wurde die Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 335 von Benzylpenicillin deutlich geringer. Bei einer Flussrate von 400 µl/min betrug die Ionenintensität nur noch ca. 50 % von der bei einer Flussrate von 250 µl/min gemessenen. Die erzielte Ionenintensität bei Zugabe von 60 µl/min organischem Lösungsmittel „Post Column“ war geringer und bei Zugabe von 150 µl/min etwas geringer wie bei der Flussrate von 250 µl/min. Bei der Bestimmung von Benzylpenicillin bei einer hohen Flussrate sollte somit organisches Lösungsmittel zugegeben werden, um eine ausreichend hohe Ionisierung der Substanz zu gewährleisten. Die Zugabe von ACN zeigte gegenüber dem Methanol/ACN Gemisch und reinem Methanol keine Vorteile. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abb. 3-9 dargestellt.
52 Ergebnisse und Diskussion
SIM Benzylpenicillin [M+H]+ 335: Vergleich der Intensitäten m it/ohne "Post Colum n" Zugabe von org. Lösungsmittel
[M+H]+ 335 4,00E+06 3,50E+06 3,00E+06 2,50E+06 2,00E+06 1,50E+06 1,00E+06
Intensität [cps] Intensität 5,00E+05 0,00E+00 250 µl/ min 310 µl/ min 400 µl/min M eOH A CN ACN:M eOH M eOH A CN ACN:M eOH 60 µl/min PC 60 µl/min PC 1: 1 6 0 µ l / mi n 15 0 µ l / mi n P C 150 µ l / mi n P C 1: 1 15 0 µ l / mi n PC PC
Abb. 3-9: Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 335 in Abhängigkeit von der Flussrate und dem Zusatz verschiedener org. Lösungsmittel „Post Column“.
Warfarin OH O CH CH C CH 2 3 O O Bei Erhöhung der Flussrate sank die Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 309 von Warfarin (s. Abb. 3-10). Die „Post Column“ Zugabe von organischem Lösungsmittel war für die Warfarinbestimmung generell von Vorteil. Sowohl bei 60 µl/min als auch bei 150 µl/min waren die Ionenintensitäten höher als bei der Flussrate von 250 µl/min. Die Intensitätssteigerung war bei beiden zugeführten Mengen an organischem Lösungsmittel ungefähr gleich. Die Zugabe von ACN zeigte gegenüber dem Methanol/ACN Gemisch und reinem Methanol keine Vorteile. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abb. 3-10 dargestellt.
SIM Warfarin [M+H]+309: Vergleich der Intensitäten mit/ohne "Post Column" Zugabe von org. Lösungsmittel
[M+H]+309
5.00E+07 4.00E+07 3.00E+07 2.00E+07 1.00E+07
Intensität [cps] Intensität 0.00E+00 250 µl/ min 310 µl/min 400 µl/min M eOH ACN ACN:M eOH M eOH ACN ACN:M eOH 60 µl/min PC 60 µl/min PC 1:1 60 µl/min 150 µ l / mi n P C 15 0 µ l / mi n P C 1: 1 15 0 µ l / mi n PC PC
Abb. 3-10: Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 309 in Abhängigkeit von der Flussrate und dem Zusatz verschiedener org. Lösungsmittel „Post Column“.
53 Ergebnisse und Diskussion
Enalapril O C OC H 2 5 CH2 CH2 C H CH3 NH C H C N O COOH Bei Erhöhung der Flussrate sank die Intensität des protonierten Moleküls [M+H]+ 377. Die Zugabe von organischem Lösungsmittel erhöhte die Ionenintensität gegenüber der der bei der Flussrate von 250 µl/min geringfügig. Die Zugabe von ACN zeigte gegenüber dem Methanol/ACN Gemisch und reinem Methanol keine Vorteile. Die Intensitätszunahme war bei Zugabe von 60 bzw. 150 µl/min org. Lösungsmittel gleich hoch. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abb. 3-11 dargestellt.
SIM Enalpril MH+ 377: Vergleich der Intensitäten mit/ohne"Post Column" Zugabe von org. Lösungsmitteln
[M+H]+ 377
1.20E+08 1.00E+08 8.00E+07 6.00E+07 4.00E+07 2.00E+07
Intensität [cps] 0.00E+00 250 µl/ min 310 µl/ min 400 µl/ min MeOH A CN A C : M e OH 1: 1 M e OH A CN ACN:MeOH 60 µl/min PC 60 µl/ min PC 60 µl/ min PC 150 µl/min PC 150 µl/ min PC 1:1 15 0 µl / m i n PC
Abb. 3-11: Intensität protonierten Molküls [M+H]+ 377 in Abhängigkeit von der Flussrate und dem Zusatz verschiedener organischer Lösungsmittel „Post Column“.
Zusammenfassung Mit Zunahme der Flussrate wurden durch den Verdünnungseffekt die Ionenintensitäten geringer. Die Zugabe eines organischen Lösungsmittels „Post Column“ verbesserte die Verdampfbarkeit des Lösungsmittels und erhöhte die Intensität der untersuchten Ionen in unterschiedlichem Ausmaß. Während für Morphin und Warfarin höhere Signalintensitäten zu beobachten waren, führte bei Benzylpenicillin selbst die Zugabe der höheren Menge organischen Lösungsmittels nicht zum Ausgangswert. Bei den weiteren untersuchten Substanzen wurde die gleiche Signalintensität wie beim Ausgangwert ermittelt. Für die bestehende „General Unknown Screening” Methode mit einer Flussrate von 250 µl/min wurde eine generelle „Post Column“ Zugabe organischen Lösungsmittels für die STA aufgrund dieser Ergebnisse unterlassen. Bei den hier aufgeführten Versuchen zeigte keines der
54 Ergebnisse und Diskussion verwendeten organischen Lösungsmittel (–gemische) besonders herausragende Eigenschaften. Für gezielte Nachweisverfahren von Substanzen ist es sinnvoll zu testen, ob und in welcher Volumenverhältnis die Zugabe eines organischen Lösungsmittels einen Effekt auf die Höhe der Ionisationsausbeute erzielt: Weinmann et al. [Weinmann et al.,
2001e] erzielten bei der „Post Column“ Zugabe von 200 µl/min ACN eine Intensitätsteigerung von einer Zehnerpotenz für das sehr polare Ethylglucuronid, einem Abbauprodukt von Ethanol, das als Alkoholkonsummarker inzwischen routinemäßig mit LC-MS/MS bestimmt wird.
55 Ergebnisse und Diskussion
3.2. Aufbau einer ESI-CID Q1-Scan Bibliothek
Ein Ziel dieser Dissertation war der Aufbau einer ESI-CID Q1-Scan Bibliothek für Arzneistoffe, Pestizide und Metaboliten. Ca. 430 Substanzen wurden im Q1-Scan Modus gleichzeitig bei drei verschiedenen Kollisionsenergien, einer niedrigen (+ 20 V DP) einer mittleren (+ 50 V DP) und einer hohen (+ 80 V DP), vermessen. Durch die Umstellung von Macintosh auf das Windowsbetriebssystem war eine bereits vorhandene Bibliothek in der Software Multiview nicht mehr einsatzfähig. Die Aufnahme der Spektren erfolgte mit der neuen Software Analyst 1.1 und später dann mit Version 1.3. Von den Reinsubstanzen wurden Stammlösungen mit einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. Die Stammlösungen wurden mit Fließmittelgemisch A:B 80:20, v/v, auf 10 µg/ml verdünnt und davon wurden 200 ng Substanz injiziert. Bei Messungen mit LC-MS ist über mehr als vier Zehnerpotenzen in der Konzentration die Fragmentierung einer Substanz konstant [Weinmann, 1999]. Somit können Massenspektren von Substanzen, die beispielsweise innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 1–10000 ng/ml im Serum vorliegen mit Bibliotheksspektren verglichen werden. Für die Aufnahme von Bibliotheksspektren von Metaboliten wurden diese aus Serum oder Urin extrahiert und jeweils mit einer speziell erstellten HPLC Methode von coeluierenden Substanzen getrennt (s. Kapitel 3.4.).
3.2.1. Verkürzung des Gradienten zur Aufnahme von Bibliotheksspektren Zur Beschleunigung der Aufnahme von Bibliotheksspektren wurde eine schnelle Gradientenmethode mit einer kürzeren analytischen HPLC-Säule (Synergi Polar RP, 50 x 2 mm, 4 µm) entwickelt. Dazu wurde der nicht-lineare Gradientenanstieg, welcher sich bei der längeren Säule als vorteilhaft erwies (s. Kapitel 2.2.2 Q1-Scan Screeningmethode), beibehalten und die Methode auf insgesamt elf Minuten Gesamtzeit reduziert. Zur Einführung von relativen Retentionszeiten in die Bibliothek, wurden sechs Referenzsubstanzen als Marker eingeführt (Morphin, Codein, Coffein,
D3-Doxepin, D5-Diazepam, Amiodaron). Dadurch entstanden sieben Retentionszeitfenster (0-6) über das Chromatogramm verteilt, die für die
56 Ergebnisse und Diskussion
Identifizierung von Analyten zusätzlich zu den Massenspektren genutzt werden können. Die Abbildungen 3-12 und 3-13 zeigen die in Retentionszeitfenster aufgeteilten Chromatogramme der 28 minütigen Methode und der 11 minütigen Methode. Das Fenster, in dem eine Substanz eluierte, wurde in die Bibliothek eingetragen. Nur wenige der für die Q1-Scan Bibliothek gemessenen Substanzen eluierten in Fenster sechs, die meisten eluierten früher. Somit erschien es nicht notwendig dieses Fenster weiter zu unterteilen. Vorteile der Verwendung von relativen Retentionszeiten und Retentionszeitfenstern sind, dass man vom Totvolumen der verwendeten HPLC Anlage unabhängig ist und dass man ein weiteres Charakteristikum für die Substanzidentifizierung hat. Auch beim GC/MS-Screening nach Pfleger/Maurer/Weber [Pfleger et al., 1992] führt die Einbeziehung von gaschromatographischen Retentionsindeces zu einer sicheren Identifizierung, wenn Retentionszeitmarker mitgeführt werden. Ebenso kann das Retentionszeitfenster bei der Bibliothekssuche mit LC-MS als zusätzliches Selektivitätsmerkmal einbezogen werden, sofern die Suchfunktion – wie in der zukünftigen Version Analyst 1.4.1., dies erlaubt (z.B. „Search with Constraints“- Funktion. Die Pragst UV-Spektrenbibliothek [Pragst et al., 1994] bietet ebenfalls die Möglichkeit der Identifikation mit Hilfe von Retentionszeiten. Elliott und Hale [Elliott, Hale, 1997] zeigten, dass Retentionszeitmarker für ein GUS mittels HPLC-DAD die Selektivität des Verfahrens erhöhte. Ein weiterer Vorteil ist, dass bei der Erstellung von Methoden, die in Retentionzeitfenster unterteilt sind, die Ionen bzw. Ionenübergänge leicht mit Hilfe des Retentionzeitfenster-Eintrags aus der Bibliothek entsprechend in das richtige Zeitfenster programmiert werden können. Für die “General Unknown Screening” Methode auf Arzneistoffe und Metaboliten wurde die 28 min Q1-Scan Screeningmethode mit einer Synergi Polar RP, 150 x 2 mm, 4 µm beibehalten, um die komplexen Matrices besser abtrennen zu können.
57 Ergebnisse und Diskussion
0 1 2 3 4 5 6 D3-Dox. D5-Diaz. Amiodaron
Morphin Cod. Cof. Intensität [cps]
Zeit [min] Abb. 3-12: 28 min Q1-Scan Chromatogramm mit den Retentionszeitmarkern Morphin, Codein (Cod.), Coffein (Cof.), D3-Doxepin (D3-Dox.), D5-Diazepam (D5-Diaz.), Amiodaron, die zur Einteilung der sieben Retentionszeitfenstern (0 - 6) dienen.
0 1 2 3 4 5 6 D3-Doxepin
D5-Diaz. Amiodaron
] s p
c Cod. [ Morphin Cof. Intensität
Zeit [min] Abb. 3-13: 11 min Q1-Scan Chromatogramm mit den Retentionszeitmarkern Morphin, Codein (Cod.), Coffein (Cof.), D3-Doxepin, D5-Diazepam (D5-Diaz.), Amiodaron, die zur Einteilung der sieben Retentionszeitfenstern (0-6) dienen.
3.2.2. Kombination einer UV- Spektren-Datenbank mit einer ESI–CID Q1- Massenspektrenbibliothek
Die bereits von Pragst et al. [Pragst et al, 2001] aufgebaute Datenbank von UV- Spektren, welche Name, Molekulargewicht, CAS–Nummer, sowie UV-Charakteristika von ungefähr 2900 Medikamenten, Metaboliten und Pestiziden enthält, wurde um bis zu fünf charakteristische m/z-Werte Werte (protoniertes Molekül und Fragment-Ionen)
58 Ergebnisse und Diskussion aus mit ESI–CID Massenspektren (20, 50, 80 V DP) aufgenommen Massenspektren ergänzt. Die erhaltenen Massenspektren wurden als Graphik (GIF)-Dateien in die bestehende Pragst–UV-Spektren Bibliothek eingebunden, da zunächst eine Bibliotheksfunktion mit Analyst 1.1. – 1.3 nicht zur Verfügung stand. (Mittlerweile bietet das Upgrade der Analyst Version 1.4 eine Bibliotheksfunktion für Massenspektren). Die Suche mit der erweiterten Datenbank im MS Accessformat kann nach den Charakteristika der Substanz (Name, CAS-Nummer, Molekulargewicht) oder nach den charakteristischen m/z Werten, von denen bis zu fünf hinterlegt wurden, durchgeführt werden. Die Kriterien zur Auswahl dieser m/z Werte wurden wie folgt festgelegt: Von jedem Massenspektrum, das bei 20, 50 oder 80 V DP aufgenommen wurde, wurden ein oder zwei Werte in die Datenbank eingegeben. Werte von hohen Massen und hoher Intensität wurden bevorzugt. Das protonierte Molekül [M+H]+ aus dem 20 V Spektrum wurde in jedem Fall in die Tabelle eingetragen, auch wenn es im Spektrum nicht zu sehen war. Falls es in diesem Spektrum zusätzlich ein weiteres signifikantes Signal mit hoher Intensität gab, wurde dieses ebenfalls selektiert. Aus den Spektren, die bei mittlerer bzw. hoher Energie aufgenommen worden sind, konnten ein oder zwei m/z Werte für den Eintrag in die Datenbank ausgewählt werden. Bevorzugt wurden jedoch die Werte aus den Spektren mit mittlerer Energie. Natrium–, Ammonium- oder Kalium-Addukte wurden beim Eintrag nicht berücksichtigt. Signale von Isotopen wurden vernachlässigt. Die Tabelle 3-3 zeigt einen Ausschnitt aus der Access Datenbank, in dem als Beispiel die ausgewählten m/z Werte von Doxepin, N- Desmethyldoxepin und die Verknüpfungspfade für die Erstellung des Berichts mit Hilfe der Reportfunktion von Access zu sehen sind.
Tabelle 3-3: Ausschnitt aus Access Datenbank Tabelle Compound Type ESI_ ESI_ ESI_ ESI_ ESI_ pathStruct nameStruct Path Name Pos Pos Pos Pos Pos b) c) EsiP EsiP M1a) M2a) M3a) M4a) M5a) d) e) Doxepin Antide- 280 235 207 202 107 Structures\ D056-S.gif Spectra\ D056- pressant D\ D\ EP.gif Doxepin (N- Antide- 266 235 207 202 107 Structures\ D181-S.gif Spectra\ D181- Desmethyl-) pressant D\ D\ EP.gif metabolite
59 Ergebnisse und Diskussion
Die Bezeichnung D056, die auch in den Verknüpfungspfaden auftaucht, ist der Code für Doxepin, der von den Autoren der UV-Spektrenbibliothek festgelegt worden war. Generell bestand für die in der Pragst UV-Spektrenbibliothek vorkommenden Substanzen ein vierstelliger Code, der aus dem Anfangsbuchstaben der Substanz und einer dreistelligen Nummer zusammengesetzt wurde. Zusätzlich wurde der Buchstabe b zugefügt, wenn ein zweites Fließmittelgemisch zur Messung verwendet wurde (z.B. E023b). Substanzen, von denen Massenspektren aufgenommen wurden und die noch nicht in der UV-Spektrenbibliothek vorlagen, wurden folgendermaßen codiert: Es wurde der Anfangsbuchstabe der gemessenen Substanz verwendet und eine fünfstellige Nummer vergeben, die mit 99 beginnt und fortlaufend durchnummeriert wurde. Pioglitazon beispielsweise war die erste Substanz mit P, die einen neuen Code erhielt: P99001. Deuterierte Substanzen erhielten siebenstellige Codes, um angeben zu können wie vielfach deuteriert die Substanz vorlag. Der ursprüngliche Code der nicht deuterierten
Substanz wurde übernommen: Methadon M014, D3-Methadon M993014, D9- Methadon M999014. Die aufgenommenen Spektren wurden als „Grafik“-Files (.gif-Files) hinterlegt. Die Strukturformel wurden aus „.SKC-Files (ISIS DRAW, MDL Information Systems GmbH, Theodor-Heuss-Allee 108, 60486 Frankfurt) ebenfalls in Grafik-Files konvertiert. Mit Hilfe der Datenbank kann ein Bericht (Report) von jeder Substanz generiert werden, der das jeweilige 20, 50, 80 V Massenspektrum, sowie die Strukturformel enthält. Die Einzelberichte lassen sich mit der Access Funktion zusammenstellen und als PDF-File ausdrucken. Eine Zusammenstellung als PDF-File befindet sich auf der Homepage des Instituts für Rechtsmedizin: http://www.uniklinik- freiburg.de/i/rme/de/pix/in-source-cid-mueller.pdf Der Vorteil dieser Art der Bibliothekssuche ist die Unabhängigkeit von der zu der Erstellung der Massenspektren verwendeten Software, kann aber auch als Notlösung wegen fehlender Bibliotheksfunktion in Analyst 1.1 – 1.3 angesehen werden. Ein weiterer Vorteil dieser Art der Bibliothekssuche ist die Publikationsmöglichkeit als Report.
60 Ergebnisse und Diskussion
3.2.3. Bibliothekssuche mit der Access Datenbank Die Suche nach einem Bibliotheksspektrum anhand vorliegender m/z Werte erfolgt unter Objekte / Formulare durch Anklicken von frmSetFilterESI_Pos: Es erscheint ein Formular, in dem bis zu fünf m/z Werte eingegeben werden können. Für die Suche nach einer Substanz müssen m/z Werte nicht in einer bestimmten Reihenfolge eingegeben werden. Die Abb. 3-14 zeigt das Formular der Suchfunktion in der die m/z Werte eingegeben werden können. Die Abfragefunktion wurde von Ursula Weinmann programmiert. Nach dem Starten der Suchfunktion erscheint im Fenster mit dem Bibliothekssuch- ergebnis der Name der Substanz, deren Strukturformel sowie die bei 20, 50 und 80 V DP aufgenommenen Massenspektren (s. Abb. 3-15). Beim Vorliegen mehrerer Ergebnisse müssen die weniger intensiven Signale verglichen werden, oder eventuell gleichzeitig aufgenommene UV-Spektren mit der Datenbank von Pragst [Pragst et al, 2001] zu Rate gezogen werden.
Abb. 3-14: Formular der Suchfunktion
61 Ergebnisse und Diskussion
Abb. 3-15: Ergebnisformular: Strukturformel, Substanzname und ESI-CID Spektren bei 20, 50, 80 V DP von Doxepin
62 Ergebnisse und Diskussion
3.3. Erweiterung einer MS/MS Spektrenbibliothek
Die MS/MS Bibliothek “MS2-2004“ (W. Weinmann, B. Maralíková und C. Müller) wurde mit Analyst 1.4 neu erstellt und gegenüber der Vorgängerversion im Macintosh Format deutlich erweitert. Diese Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit B. Maralíková durchgeführt. Von den Reinsubstanzen wurden zunächst Stammlösungen mit einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. Diese wurden verdünnt zu Lösungen mit einer Konzentration von 10 µg /ml Fließmittelgemisch A:B 80:20, v/v. Je 200 ng wurden mittels FIA (ohne Chromatographie) ins MS injiziert. Die Flussrate betrug 250 µl/min, die Fließmittelzusammensetzung war A:B 50:50, v/v. Die Produkt-Ionen Spektren (von [M+H]+ oder [M-H]- wurden bei drei verschiedenen Kollisionsenergien (20, 35, 50 eV) im Produkt-Ionen Scan mit einem API 365 gemessen. Die dazu verwendete MS Methode ist im Methodenteil (2.2.3.) beschrieben. Für die Aufnahme von Produkt- Ionen Spektren von Metaboliten wurden Extrakte aus Realproben analysiert. Verschiedene HPLC-Methoden und Säulen wurden benutzt, um Muttersubstanz und Metaboliten chromatographisch zu trennen (s. Kapitel 3.4.). Die Spektren wurden in die Bibliothek „MS2-2004“ eingebunden.
3.3.1. Bibliothekssuche mit Analyst 1.4 (+ Library Patch) Nach Abziehen des Rauschens wird ein gesuchtes Spektrum mit den Bibliotheks- spektren verglichen. Als Suchergebnis wird sowohl das Spektrum mit höchster Ähnlichkeit als auch eine Liste mit weiteren ähnlichen Spektren ausgegeben mit Fit- Werten, Struktur- und Summenformel, CAS Nummer sowie Angabe der Kollisionsenergie. Die Substanz mit dem höchsten „Purity Fit“-Wert steht an oberster Stelle. UV-Spektren wurden bisher noch nicht hinterlegt, da die Software noch über keine geeignete Suchfunktion für UV-Spektren verfügt. Für die Aufnahme von UV- Spektren wurde ein „On-Line“-System (Chemstation Software + PC + Agilent Detektor) verwendet. Die Suche kann zur Bestätigung des Ergebnisses bei den anderen beiden Kollisionsenergien wiederholt werden. Im Anhang finden sich Formulare mit Suchergebnissen (s.6. III. Abb. 6-2 – 6-5 und Abb. 6-7 - 6-9).
63 Ergebnisse und Diskussion
3.4. Bestimmung von Metaboliten aus Körperflüssigkeiten
Ziel dieses Teils der Arbeit war die Einbindung von Metaboliten von Medikamentenwirkstoffen in die Spektrenbibliotheken für eine spätere Bibliotheks- basierte Identifizierung. Die im Folgenden analysierten Phase-I-Metaboliten stammten aus Urin oder Serum bzw. Herzblut forensischer Proben oder Patienten-Urin. Die Substanzen wurden anhand der in den Spektren vorhandenen m/z Werte und Literaturdaten identifiziert. In manchen Fällen wurde zusätzlich ein UV-Spektrum der analysierten Substanzen aufgezeichnet und mit der UV-Spektren-Bibliothek verglichen. Metaboliten, die keine Veränderung am Chromophor erfahren, unterscheiden sich im UV-Spektrum nicht von der Ausgangssubstanz. Massenspektren sind zur Differenzierung in dieser Hinsicht deutlich besser geeignet, falls das protonierte Molekül zur Unterscheidung vorliegt. In vielen Fällen waren keine UV- Spektren von Metaboliten in der Bibliothek vorhanden, so dass zu Vergleichszwecken die UV-Spektren der Muttersubstanz verwendet wurden. Die im Folgenden aufgeführten Fragmentierungen, sind Strukturvorschläge, die sich aus der Berechnung der verbliebenen Massen ergaben. Es wurde kein Wert auf die endeutige massenspektrometrische Fragmentanalyse gelegt, welche den Einsatz von zusätzlichen Scantechniken, z.B. Precursor Ion Scan und Neutral Loss Scan bedarf. Die abgespaltenen Bruchstücke wurden mit Buchstaben gekennzeichnet, der verbleibende Teil ist Bestandteil des Fragmentions. Dies gilt auch für die Abschnitte 3.6.2, 3.7.1. und 3.8.1.
3.4.1. Citalopram und Metaboliten Citalopram ist ein selektiver und potenter Serotonin Reuptake–Hemmer, der zur Behandlung depressiver Erkrankungen sowie Panikstörungen zugelassen ist. In Deutschland befinden sich das Racemat Citalopram und das pharmakologisch wirksame S-Enantiomer Escitalopram im Handel. In der Leber werden die Substanzen unter Einfluss des Cytochrom P 450 Systems (CYP2D6, CYP2C19) verstoffwechselt. In der Literatur wurde der Nachweis der drei aktive Metaboliten, eines inaktiver Metaboliten bzw. deren Glucuronide (Didesmethylglucuronid und das Glucuronid des
64 Ergebnisse und Diskussion
Citaloprampropionsäure Derivats) und beschrieben [Oyehaug et al., 1982, Oyehaug et al., 1984] [Dalgaard, Larsen; 1999]. Die Extraktion erfolgte mittels Mischphasen-SPE aus 2 ml Urin eines forensischen Falls. Mittels ESI-CID LC-MS bzw. LC-MS/MS konnten neben der Ausgangssubstanz die drei aktiven Metaboliten mit schwächerer antidepressiver Wirkung Desmethylcitalopram, Didesmethylcitalopram und Citalopram N-oxid im basischen Extrakt identifiziert werden. Mittels HPLC-UV konnten nur Citalopram und Desmethylcitalopram nachgewiesen werden, die vorliegenden Konzentrationen der anderen beiden Metaboliten lag unter dem Detektionslimit.
Tabelle 3-4: Protoniertes Molekül und Fragment-Ionen von Citalopram und dessen Metaboliten und Retentionszeiten
tR [min] Charakteristische m/z- Werte Citalopram 10,2 325, 262, 234, 116, 109 Desmethylcitalopram 9,2 311, 262, 234, 116, 109 Didesmethylcitalopram 8,5 297, 262, 234, 166, 156, 129, 109 Citalopram N-Oxid 12,8 341, 280, 262, 234, 116, 109
Citalopram und seine Metaboliten zeigten eine hohe Übereinstimmung in der Fragmentbildung. Die aufgeführten Fragmentionen sind charakteristisch - da vermutlich eine Umlagerung des Moleküls stattfindet, konnte die Struktur der meisten der entstandenen Fragmentionen nicht identifiziert werden.
65 Ergebnisse und Diskussion
Citalopram
[M+H]+ Citalopram aus Urin
Citalopram
200 15 0 10 0 50 [mAU] 0
Absorption Absorption 190 240 290 340 390 440 Wellenlänge [nm ]
Abb. 3-18: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem Citalopram
Citalopram
F Abb. 3-16: Q1-Scan Spektren von aus Urin extrahiertem Abb. 3-17: Produkt-Ionen Spektren von aus Urin extra- Citalopram bei 20, 50, 80 V DP hiertem Citalopram bei 20, 35, 50 eV CE *: chirales Zentrum A
Tabelle 3-5: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation N(CH ) * 3 2 Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation O + NC [M+H] 325 m/z 58: A(58)
Fragment-Ionen: 262, 234, 116, 109 Mmono = 324,1637 g/mol
66 Ergebnisse und Diskussion
N-Desmethylcitalopram
[M+H]+ Desm ethylcitalopram aus Urin
Desmet hylcit alopram
50 40 30 20 [mAU] 10
Absorbtion Absorbtion 0 190 240 290 340 390 440 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-21: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem Desmethylcitalopram
Abb. 3-19: Q1-Scan Spektren von aus Urin extra- Abb. 3-20: Produkt-Ionen Spektren von aus Urin extra- N-Desmethylcitalopram hiertem N-Desmethylcitalopram bei 20, 50, 80 V DP hiertem N-Desmethylcitalopram bei 20, 35, 50 eV CE F
A
CH2-CH2-CH2-NH(CH)3 Tabelle 3-6: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation O NC Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation [M+H]+ 311 m/z 44: A(43) + H Fragment-Ionen: 262, 234, 166, 116, 109 Mmono = 310,1481 g/mol
67 Ergebnisse und Diskussion
Citalolpram N-Oxid
[M+H]+
Citalopram N-Oxid
Abb. 3-22: Q1-Scan Spektren von aus Urin extra- Abb. 3-23: Produkt-Ionen Spektren von aus Urin F hiertem Citalopram N-Oxid bei 20, 50, 80 V DP extrahiertem Citalopram N-Oxid bei 20, 35, 50 eV CE
A
(CH ) 2 3 N(CH3)2 Tabelle 3-7: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation O O Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation NC [M+H]+ 341 m/z 280: 341 - A(60) – H Mmono = 340,15706 g/mol Fragment-Ionen: 280, 262,
234, 116, 109
68 Ergebnisse und Diskussion
Didesmethylcitalopram
Didesmethylcitalopram mit dem protonierten Molekül [M+H]+ 297 eluierte gleichzeitig mit Desmethylcitalopram
Desmethylcitalopram und lag in einer deutlich geringeren Didesmethylcitalopram Konzentration vor (s. Abb. 3- s] p 24). Die Q1-Scan Massenspektren der beiden Metaboliten überlagerten sich.
Die gebildeten Fragment-Ionen Intensität [c der beiden Metaboliten waren die gleichen. Im Produkt-Ionen Zeit [min] Abb. 3-24: Extrahiertes Ionen Chromatogramm der Scan Spektrum bildete + Didesmethylcitalopram protonierten Moleküle [M+H] 311 und 297 zusätzlich das Fragment-Ion m/z Abb. 3-25: Produkt-Ionen-Spektren von aus 279. Urin extrahiertem Didesmethylcitalopram bei 20, 35, 50 eV CE
Tabelle 3-8: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Didesmethylcitalopram F Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation *: chirales Zentrum [M+H]+ 297 A m/z 279: 297 - A(16) – 2 H Fragment-Ionen: m/z 279, NH 262, 234, 166, 156, * 2 O 129, 109 NC
Mmono = 296,132491g/mol
69 Ergebnisse und Diskussion
3.4.2. Zopiclon und Metaboliten Bei der Verstoffwechselung des Hypnotikums Zopiclon entsteht der im Tiermodell aktive Metabolit Zopiclon N-oxid und das nicht aktive Desmethylzopiclon. [Fachinformation Zopiclon ratiopharm, 2001/02]. Die Extraktion erfolgte mittels SPE nach Chen [Chen et al.] aus 2 ml Urin eines forensischen Falls. Neben der Muttersubstanz konnten die beiden Metaboliten im basischen Extrakt nachgewiesen werden.
Tabelle 3-9: Protoniertes Molekül und Fragment-Ionen von Zopiclon und seinen Metaboliten und Retentionszeiten
tR [min] Charakteristische m/z-Werte 389, 347/345, 265/263, 247/245, Zopiclon 14,7 219/217, 114/112 375, 333/331, 247/245, 219/217, N-Desmethylzopiclon 14,0 114/112 Zopiclon N-Oxid 17,5 405, 314/312, 247/245, 219/217
Nach Abspaltung der den Piperazinring enthaltenen Seitenkette war eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen zu beobachten. Bestätigt wurde das Vorliegen der Zopiclon Metaboliten neben der Identifizierung durch die LC-MS bzw. LC-MS/MS Spektren durch Vergleich der aufgenommenen UV-Spektren der Metaboliten mit dem von Zopiclon.
70 Ergebnisse und Diskussion
Zopiclon
[M+H]+
Zopiclon
C Abb. 3-26: Q1-Scan Spektren von aus Urin Abb. 3-27: Produkt-Ionen Scan Spektren D extrahiertem Zopiclon bei 20,50, 80 V DP von aus Urin extrahiertem Zopiclon bei 20, 35, 50 eV CE O B O C NCHN 3 A Tabelle 3-10: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation N N N Cl Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation CH3 E m/z 345: 389 – A(43) – H O
+ m/z 345: 389 – A(43) – H [M+H] 389 M mono = 388,1051 g/mol m/z 263: 389 – C(127) + H Fragment-Ionen: 347/345, 265/263, 247/245, m/z 245: 389 – D(143) – H 219/217, 114/112 m/z 217: 389 – D(143) – E(28) – H m/z 112: 389 - D(143) – F(133) – H
71 Ergebnisse und Diskussion
Desmethylzopiclon
+ UV-Spektren Zopiclon - [M+H] Desm ethylzopiclon
Zopiclon Desmet hylzopiclon
600 400 200 [mAU] 0
Absorption Absorption 190 240 290 340 390 440 Wellenlänge [nm ]
Abb. 3-30: UV-Spektrum von aus Urin extra- hiertem Zopiclon und N-Desmethylzopiclon
Desmethylzopiclon Abb. 3-28: Q1-Scan Spektren von aus Urin extra- Abb. 3-29: Produkt-Ionen Scan Spektren von aus Urin hiertem Desmethylzopiclon bei 20, 50, 80 V DP extrahiertem Desmethylzopiclon 20, 35, 50 eV CE. C D B O
Tabelle 3-11: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation O C N NH2 A Charakteristerische m/z mögliche Strukturinterpretation N N N Cl
m/z 331: 375 – A(44) N E [M+H]+ 375 m/z 331: 375 – B(44) O Fragmentionen: 333/331, 247/245, 219/217, m/z 245: 375 - D(130) 112 m/z: 217: 375 - D(130) – B(28) Mmono = 374,0894 g/mol m/z: 112: 375 - D(130) – F(133) – 2 H
72 Ergebnisse und Diskussion
Zopiclon N-oxid
+ UV -Spektren: Zopiclon - Zopiclon N-oxid extrahiert aus [M+H] Ur in
Zopiclon Zopiclon N-oxid
6000
4000 [mAU] 2000 Absorption Absorption 0 190 240M 290mono =374,0894 340 g/mol 390 440
Wellenlänge [nm]
Abb. 3-32: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem Zopiclon und Zopiclon N-oxid
Zopiclon N-oxid
A B O Abb. 3-31: Q1-Scan Spektren von aus Urin extrahiertem O C NCHN Zopiclon N-oxid bei 20, 50, 80 V DP 3 N F N O Tabelle 3-11: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation N Cl Charakteristerische m/z mögliche Strukturinterpretation N + O C [M+H] 405 m/z 314: 405 - (87) – 4 H Fragmentionen: m/z 245: 405 - B(159) – H 314/312, 247/245, m/z 217: 405 - B(159) – C(28) – H Mmono = 404,0999 g/mol 219/217
73 Ergebnisse und Diskussion
3.4.3. Doxepin und Metaboliten
N-Desmethyldoxepin Doxepin Doxepin N-oxid
Zeit [min] Abb. 3-33: Chromatogramm des Urinextrakts
Das trizyklische Antidepressivum Doxepin bildet mehrere Metaboliten: Der Hauptmetabolit ist das N-Desmethyldoxepin. Des Weiteren erfolgt die Verstoffwechselung zu Doxepin N-oxid, Hydroxydoxepin, Hydroxydoxepinglucuronid und weiteren Glucuronide [Demling et al., 1995]. In der GC-MS Massenspektrenbibliothek Pfleger/Maurer/Weber [Pfleger et al. 1992] befindet das Spektrum von Doxepin N-oxid. Die Extraktion erfolgte aus Urin mittels LLE mit Chlorbutan. Doxepin, der pharmakologisch wirksame Metabolit N-Desmethyldoxepin und Doxepin N-oxid konnten nachgewiesen werden (s. Abb. 3-33). Mittels LC-DAD konnten nur Doxepin und N-Desmethyldoxepin nachgewiesen werden. In den Produkt-Ionen Spektren von Doxepin N-oxid konnte die Entstehung des Signals m/z 123 nicht eindeutig geklärt werden. Denkbar ist eine Überlagerung des Doxepin N-oxid mit Hydroxydoxepin, das das gleiche Molekulargewicht besitzt und bei dem die Entstehung des Signals m/z 123 erklärbar wäre. Tabelle 3-13: Protoniertes Molekül und Fragment-Ionen von Doxepin und seinen Metaboliten und Retentionszeiten
tR [min] Charakteristische m/z-Werte Doxepin 12,8 280, 235, 207, 220, 202, 178 N-Desmethyldoxepin 11,7 266, 235, 207, 220, 202, 178 Doxepin N-oxid 2,6 296, 282, 235, 207, 220, 202, 123, 107
Hohe Übereinstimmung bestand in der Fragmentierung.
74 Ergebnisse und Diskussion
Doxepin
Doxepin aus UV- Spektrenbibliothek [M+H]+ Doxepin aus UV- Spektrenbibliothek
90 70 50 30 10
Absorption [mAU] 195 245 295 345 395 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-36: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem Doxepin
Abb. 3-34: Q1-Scan Spektren von aus Urin extra- Abb. 3-35: Produkt-Ionen Spektren von Doxepin hiertem Doxepin bei 20, 50, 80 V DP Doxepin in FM bei 20, 35, 50 eV CE C B A D
CH CH2 CH2 N(CH3)2 Tabelle 3-14: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + [M+H] 280 m/z 235: 280 – A(44) – H O Fragment-Ionen: 235, 207, 220, m/z 220: 280 – B(60) 202, 178 m/z 207: 280 – C(72) – H
m/z 107: 280 – D(173) Mmono = 279,162314 g/mol
75 Ergebnisse und Diskussion
N-Desmethyldoxepin
[M+H]+ N-Desmethyldoxepin Doxepin N-oxid N-Desmethyldoxepin 60 40 20 [mAU] 0 Absorption 190 230 270 310 350 390 Wellenlänge [nm ]
Abb. 3-39: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem N-Desmethyldoxepin
N-Desmethyldoxepin Abb. 3-37: Q1-Scan Spektren von aus Urin extra- Abb. 3-38: Produkt-Ionen Spektren von aus Urin hiertem N-Desmethyldoxepin bei 20, 50, 80 V DP extrahiertem N-Desmethyldoxepin bei 20, 35, 50 eV CE C B A CH CH2 CH2 NHCH3
Tabelle 3-15: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation O [M+H]+ 266 m/z 235: 266 – A(30) – H Fragment-Ionen: m/z 220: 266 – B(46) M mono= 265,14664 g/mol 235, 207, 220, 202, 178 m/z 107: 266 – C(159)
76 Ergebnisse und Diskussion
Doxepin N-oxid
[M+H]+
Doxepin N-oxid
D C B A
CH3 CH CH2 CH2 N
CH3 O E F O
Mmono = 295,165054 g/mol
Abb. 3-40: Q1-Scan Spektren von aus Urin Abb. 3-41: Produkt-Ionen Spektren aus extrahiertem Doxepin N-oxid bei 20, 50, 80 V DP extrahiertem Urin Doxepin N-oxid bei 20, 35, 50 eV CE Tabelle 3-16: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation [M+H]+ 296 m/z 282: 296 – A(15) + H m/z 207: 296 – D(88) - H Fragment-Ionen: 282, 235, 207, 220, m/z 235: 296 – B(60) – H m/z 107: 296 – E(101) - F(88) 202, 123, 107 m/z 220: 296 – C(74) -2 H
77 Ergebnisse und Diskussion
3.4.4. Sildenafil und Metaboliten Sildenafil, ein Phosphordiesterase Hemmer, der bei erektiler Dysfunktion eingesetzt wird, bildet bei der Verstoffwechselung im Körper vier Metaboliten [Goldenberg, 1998]. Aufgrund zahlreicher Todesfälle bei Einnahme dieses Präparates, ist diese Substanz in der Forensik von Bedeutung wie in Fallberichten dokumentiert ist
[Weinmann et al., 2001a; Dumestre-Toulet et al. 2002; Tracqui et al., 2002]. Die Extraktion erfolgte aus Urin eines forensischen Falls mit der LLE nach Maurer. Mittels ESI-CID LC-MS bzw. LC-MS/MS im positiven Modus konnten Sildenafil sowie die drei Metaboliten N-Desmethylsildenafil, N-Desethylsildenafil und Hydroxypropylsildenafil im Extrakt identifiziert werden, die in den
Spektrenbibliotheken hinterlegt wurden. Weinmann et al. [Weinmann et al., 2001a] analysierten bereits Sildenafil und diese drei Metaboliten mittels LC-MS und LC- MS/MS. Für die Erstellung der Bibliothek mit der Analyst Software mussten jedoch nochmals die Substanzen extrahiert und gemessen werden.
Tabelle 3-17: Protoniertes Molekül und Fragment-Ionen von Sildenafil und seinen Metaboliten und Retentionszeiten
tR [min] Charakteristische m/z-Werte Sildenafil 9,6 475, 416, 311, 284, 214, 99 Hydroxypropylsildenafil 7,7 491, 473, 445, 310, 281, 100 Desethylsildenafil 8,8 449, 311, 283, 254, 58 Desmethylsildenafil 9,4 461, 311, 283, 255, 85
Sildenafil und seine Metaboliten bildeten teilweise die gleichen Fragment-Ionen. Eine hohe Übereinstimmung der Fragmentierung zeigten die beiden Metaboliten Desmethyl- und Desethylsildenafil. Dass Signale im Massenspektrometer um eine Atommasseneinheit bei verschiedenen Spannungen schwanken, konnte bei Sildenafil und seinen Metaboliten gut beobachtet werden.
78 Ergebnisse und Diskussion
Sildenafil
[M+H]+
Sildenafil D O CH3 B O HN N N H C N N S 3 N O A C3H7 OC H C 2 5 Abb. 3-42: Q1-Scan Spektren von aus Urin Abb. 3-43: Produkt-Ionen Spektren von extrahiertem Sildenafil bei 20, 50, 80 V DP in FM gelösten Sildenafil bei 20, 35, 50 eV CE M = 474,204924 g/mol mono Tabelle 3-18: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation [M+H]+ 475 m/z 416: 475 – A(57) –H
Fragment-Ionen m/z 311: 475 – C(163) – H 416, 311, 284, 214, 99 m/z 284: 475 – D(191) + H m/z 99: 475 – B(375) – H
79 Ergebnisse und Diskussion
Hydroxypropylsildenafil
[M+H]+
Hydroxypropylsildenafil
Abb. 3-44: Q1-Scan Massenspektren von Abb. 3-45: Produkt-Ionen Spektren von aus ausUrin extrahiertem Hydroxypropylsildenafil Urin extrahiertem Hydroxypropylsildenafil bei O CH3 bei 20, 50, 80 V DP 20, 35, 50 eV CE D O HN N N B A Tabelle 3-19: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation H3C N N S N O CH -CH -CH -OH Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation 2 2 2 OC H [M+H]+ 491 m/z 473: 491 – A (17) – D(99) – 2 H C 2 5 Fragment-Ionen: 473, 445, 310, m/z 445: 491 – B(44) –2 H 281, 100 m/z 310: 491 – C(163) – A(17) – H Mmono = 490,199839 g/mol m/z 281: 491 – C(163) – B(44) – 3 H m/z 100: D(99) + H
80 Ergebnisse und Diskussion
Desethylsildenafil
[M+H]+
Desethylsildenafil
C O CH3 O HN N N H C N N S 3 H N O CH2-CH2-CH3 OC H D 2 5 B A
Mmono = 448,1893 g/mol Abb. 3-46: Q1-Scan Massenspektren von aus Abb. 3-47: Produkt-Ionen Spektren von aus Urin extrahiertem Desethylsildenafil Urin extrahiertem Desethylsildenafil bei 20, bei 20, 50, 80 V DP 35, 50 eV CE
Tabelle 3-20: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + [M+H] 449 m/z 311: 449 – C(137) –H Fragment-Ionen: m/z 283: 449 – C(137) – B (29) od. A(29) 311, 283, 254, 58 m/z 254: 449 – C(137) – B (29) - A(29) m/z 58: D(58)
81 Ergebnisse und Diskussion
Desmethylsildenafil
[M+H]+
Desmethylsildenafil
O D CH3 O HN N N H N N S N A O CH2-CH2-CH3 C OC2H5 B
Mmono = 460,1893 g/mol
Abb. 3-48: Q1-Scan Massenspektren von aus Urin Abb. 3-49: Produkt-Ionen Spektren von aus Urin extrahiertem Desmethylsildenafil bei 20, 50, 80 V DP extrahiertem Desmethylsildenafil bei 20, 35, 50 eV CE
Tabelle 3-21: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation
+ [M+H] 461 m/z 311: 461 – C (149) – H Fragment-Ionen: m/z 283: 461 – C (149) – A(29) oder B(29) + H 311, 283, 255 , 85 m/z 255: 461 – C (149) – A(29) – B(29) + 2 H m/z 85: D(85)
82 Ergebnisse und Diskussion
3.4.5. Quetiapin und Metaboliten Quetiapin ist eine atypische antipsychotisch wirkende Substanz und wird zur Behandlung der Schizophrenie eingesetzt. Es unterliegt einer komplexen Verstoffwechselung in der Leber. DeVane et al. beschrieben die Bildung von elf Metaboliten [DeVane et al., 2001]. Neben Quetiapin konnten die drei aktiven Metaboliten N-Desalkylquetiapin, O- Desalkylquetiapin sowie das Quetiapin Carbonsäurederivat (zwitterionische Substanz) im basischen Serumextrakt der Mischphasen-SPE nachgewiesen werden.
Tabelle 3-22: Protoniertes Molekül und Fragment-Ionen von Quetiapin und seinen Metaboliten und Retentionszeiten
tR [min] Charakteristische m/z-Werte Quetiapin 40,5 384, 279, 253, 221, 70 N-Desalkylquetiapin 34,2 296, 253, 210 183, 70 O-Desalkylquetiapin 38,6 340, 279, 253, 221, 114 Quetiapin 56,2 398, 279, 253, 221, 183, 172, 146, 103 Carbonsäurederivat
Quetiapin und seine Metaboliten wiesen teilweise die gleichen Fragment-Ionen auf.
83 Ergebnisse und Diskussion
Quetiapin
+ [M+H] Quetiapin aus Serum
Quet iap in
300
200
100 [mAU]
Absorption Absorption 0 190 290 390 490 Wellenlänge [nm ]
Abb. 3-52: UV-Spektrum von aus Serum extrahiertem Quetiapin
Quetiapin
Abb. 350: Q1-Scan Spektren von aus Serum Abb. 3-51: Produkt-Ionen Spektren von aus CH CH O CH CH OH extrahiertem Quetiapin 20, 50, 80 V DP Serum extrahiertem Quetiapin bei 20, 35, 50 eV CE A 2 2 2 2 B N C
Tabelle 3-23: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation N D N E Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation
[M+H]+ 384 m/z 279: 384 – A(103) – 2 H Fragment-Ionen: 279, 253, 221, 183, m/z 253: 384 – A(103) - B(28) bzw. C(28) S 70 m/z 183: 384 - (199)
m/z 221 ist charakteristisch aber m/z 70: 384 – D(210) - A(103) – H Mmono = 383,166747 g/mol nicht identifizierbar 84 Ergebnisse und Diskussion
O-Desalkylquetiapin
[M+H]+ O-Desalkylquetiapin aus Serum O-Desalkylquetiapin
10 0 80 60 40 [mAU] 20 Absorption 0 190 240 290 340 390 440 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-55: UV-Spektrum von aus Serum extrahiertem O-Desalkylquetiapin
O-Desalkylquetiapin
CH CH OH Abb. 3-53: Q1-Scan Spektren bei 20, 50, 80 V DP Abb. 3-54: Produkt-Ionen Spektren bei A 2 2 aus Serum extrahiertem O-Desalkylquetiapin von aus Serum extrahiertem B N C O-Desalkylquetiapin 20, 35, 50 eV CE Tabelle 3-24: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation N D Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation E
[M+H]+ 340 m/z 279: 340 – A(59) – 2 H N Fragment-Ionen: m/z 253: 340 – A(59)-B(28) bzw. C(28)
279, 253, 221, 183, 114 m/z 183: 340 – E(155) – 2H S m/z 221 ist charakteristisch aber m/z 114: D(115) – H nicht identifizierbar Mmono=339,140532 g/mol
85 Ergebnisse und Diskussion
N-Desalkylquetiapin
[M+H]+ N-Desalkylquetiapin aus Serum
N-Desalkylquetiapin 60 50 40 30 20 10
Absorption [mAU] Absorption 0 190 240 290 340 390 Wellenlänge [nm ]
Abb. 3-58: UV-Spektrum von aus Serum extrahiertem N-Desalkylquetiapin
Abb. 3-56: Q1-Scan Spektren bei 20, 50, 80 V DP Abb. 3-57: Produkt-Ionen Spektren bei von aus Serum extrahiertem N-Desalkyl- 20, 35, 50 eV CE von aus Serum extrahiertem quetiapin N-Desalkylquetiapin N-Desalkylquetiapin H N B Tabelle 3-25: Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation A
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation N E C D m/z 253: 296 – A(43) N [M+H]+ 296 m/z 227: 296 - A(43) - B(28) +2 H Fragment-Ionen: 253, 210 183, m/z 210: 296 – C(85) – H S 70 m/z 183: 296 – D(111) m/z 70: C(85) – E(14) - H Mmono = 295,114317 g/mol 86 Ergebnisse und Diskussion
Quetiapin Carbonsäurederivat
Quetiapin - Carbonsäurederivat [M+H]+ Quetiapin - Carbonsäurederivat
14 0 12 0 10 0 80 60
[mAU] 40 20 Absorption Absorption 0 190 240 290 340 390 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-61: UV-Spektrum von aus Serum extrahiertem Quetiapin Carbonsäurederivat
Quetiapin Carbonsäurederivat Abb. 3-59: Q1-Scan Spektren bei 20, 50, 80 V DP Abb. 3-60: Produkt-Ionen Spektren bei CH CH O CH COOH Serum extrahiertem Quetiapin Carbonsäurederivat von Serum extrahiertem Quetiapin Carbonsäure- A 2 2 2 derivat bei 20, 35, 50 eV CE N B Tabelle 3-26: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation N C mögliche N Charakteristische m/z-Werte Strukturinterpretation [M+H]+ 398 S m/z 279: 398 – A(117) – H Fragment-Ionen: 279, 253, 221, 183, m/z 253: 398 – B(145) – H 172, 146, 103 m/z 183: 398 – D(213) – 2 H Mmono = 397,146012 g/mol m/z 221, 172 und 103 sind m/z 146: B(145) + H charakteristisch aber nicht identifizierbar 87 Ergebnisse und Diskussion
3.4.6. Promethazin und Metaboliten Promethazin gehört zu der Gruppe der Phenothiazine und wird zur Behandlung von allergischen Erkrankungen sowie Unruhe und Erregungszuständen eingesetzt. Es bildet zahlreiche Metabolite. Der Hauptmetabolit ist das Promethazinsulfoxid, des Weiteren werden das N-Desmethylpromethazin und ein Hydroxyderivat gebildet. Desmethylpromethazinsulfoxid wird als weiterer Metabolit beschrieben, der von Song et al. [Song et al., 2001] untersucht wurde. Die Extraktion erfolgte mittels LLE mit Chlorbutan aus Urin eines forensischen Falls. Nachgewiesen werden konnten: Promethazin, Promethazinsulfoxid, N-Desmethylpromethazin.
Tabelle 3-27: Protoniertes Molekül und Fragment-Ionen von Promethazin und seinen Metaboliten und deren Retentionszeit
tR [min] Charakteristische m/z-Werte Promethazin 6,3 285, 240, 198, 86 Promethazinsulfoxid 2,2 301, 264, 214, 198, 86 N-Desmethylpromethazin 5,8 271, 198, 72
Nur Fragment-Ion m/z 198 war bei allen drei Substanzen vorhanden. Fragment-Ionen m/z 86 bei Promethazin und Promethazinsulfoxid sowie m/z 72 bei N- Desmethylpromethazin resultierten aus der gleichen Abspaltung.
88 Ergebnisse und Diskussion
Promethazin
UV Spektrum Promethazin [M+H]+ Promethazin
150
100
50
0 Absorption [mAU] Absorption 190 240 290 340 390 440 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-63: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem Promethazin
PromethazinCH A B 3 CH2 CH N(CH3)2 Abb. 3-62: Q1-Scan Massenspektren von aus Urin C N extrahiertem Promethazin bei 20, 50, 80 V DP
S Tabelle 3-28: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation Mmono = 284,134718 g/mol + [M+H] 285 m/z 240: 284 – A(44) Fragment-Ionen: 240, 198, 86 m/z 198: 284 – B(86) m/z 86: 284 – C(198) 89 Ergebnisse und Diskussion
Promethazinsulfoxid
Promethazin S-Oxid aus Urin
Promethazin S-Oxid [M+H]+ 4000 3000 2000
[mAU] 1000
Absorption 0 190 240 290 340 390 440 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-65: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem Promethazin - sulfoxid
Promethazinsulfoxid A CH3 Abb. 3-64: Q1-Scan Massenspektren bei 20, 50, 80 V DP von B CH2 CH N(CH3)2 aus Urin extrahiertem Promethazinsulfoxid N Tabelle 3-29: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation C
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation S m/z 264: 301 – A(44) – H [M+H]+ 301 D m/z 214: 301 – B(86) – H O Fragment-Ionen: m/z 198: 301 – B(186) – D(16) - H Mmono = 300,134718 g/mol 264, 214, 198, 86 m/z 86: 301 – C(214) – H
90 Ergebnisse und Diskussion
Desmethylpromethazin N-Desmethylpromethazin N-Desmethylpromethazin [M+H]+ 150
100
50
Absorption [mAU] 0 190 240 290 340 390 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-67: UV-Spektrum von aus Urin extrahiertem Desmethyl- promethazin
Desmethylpromethazin
CH3 Abb. 3-66: Q1-Scan Spektren bei 20, 50, 80 V DP von A CH CH NH(CH ) aus Urin extrahiertem Desmethylpromethazin 2 3 N B Tabelle 3-30: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z- S mögliche Strukturinterpretation Werte Mmono = 270,119068 g/mol [M+H]+ 271 m/z 198: 271 – A(72) – H Fragment-Ionen: m/z 198, 72 m/z 72: 271 – B(198) – H
91 Ergebnisse und Diskussion
3.4.7. Verapamil und Metaboliten Verapamil gehört zur Gruppe der Calciumantagonisten und wird als Antiarrhythmikum, bei Angina pectoris und bei Hypertonie eingesetzt Verapamil bildet zahlreiche Metaboliten in der Leber, von denen nur noch das Norverapamil nennenswerte pharmakologische Wirkung (ca. 20 % der Muttersubstanz) besitzt [Fachinformation Isoptin, 2001/2]. Dabei sind N-Desmethylierung und N- Desalkylierung dominierend, was zur Bildung von Norverapamil, N- Desalkylverapamil und N-Desalkyl-, N-Desmethylverapamil führt [Borlak et al., 2003]. Weitere Metaboliten sind N-Desmethylverapamil, O–Desmethylverapamil, O- Desmethyl-, N-Desalkylverapamil. Verapamil besitzt ein Chiralititätszentrum, die Enatiomeren weisen unterschiedliche pharmakodynamische Eigenschaften und Bioreaktivitäten auf [Hoon et al., 1986]. Aus dem Extrakt der Mischphasen-SPE einer Urinprobe konnten Verapamil, Norverapamil und N-Desalkylverapamil identifiziert werden. Maurer [Maurer et al., 1992] identifizierte neben den genannten zusätzlich das N-Bis-Desalkylverapamil mittels GC-MS aus Urin für die Spektrenbibliothek Pfleger, Maurer, Weber [Pfleger et al., 1992]. Tabelle 3-31: Protoniertes Molekül und Fragment-Ionen von Verapamil und seinen Metaboliten und Retentionszeiten
tR [min] Charakteristische m/z-Werte Verapamil 9,4 455, 303, 165, 150 Norverpamil 8,5 441, 398, 289, 165, 150, 135, 105 N-Desalkylverapamil 2,7 291, 260, 233, 177, 165, 151, 122, 81, 70, 44
Die Fragment-Ionen m/z 165 und 150 bzw. 151 wurden von allen drei Substanzen gebildet. Die auf den folgenden Seiten vorgeschlagene Bildung der Fragment-Ionen beruhte auf der Überlegung, dass gleiche m/z Werte der verschiedenen Metaboliten und der Muttersubstanz aus den gleichen Fragmenten resultieren. Borlak et al. [Borlak et al., 2003] propagieren für die Bildung der Fragment-Ionen m/z 303 bzw. 289, 165 und 150 bzw. 151 bei Norverapamil und Verapamil andere Spaltungen, gehen aber nicht auf die Bildung der m/z-Werte 150 bzw. 165 bei N-Desalkylverapamil ein, bei dem die zur Abspaltung vorgeschlagenen Gruppen nicht vorhanden sind.
92 Ergebnisse und Diskussion
Verapamil
[M+H]+
Verapamil
CH3 E OCH3 CH - CH3 CH3 NC C CH -CH -CH -N CH CH OCH * 2 2 2 2 2 3 D C B A
OCH3 *: chirales OCH 3 Zentrum
Mmono = 454,283158 g/mol Abb. 3-68: Q1-Scan Spektren von aus Abb. 3-69: Produkt-Ionen Spektren von Urin extrahiertem Verapamil bei 20, 50, 80 V DP aus Urin extrahiertem Verapamil bei 20, 35, 50 eV CE
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation [M+H]+455 m/z 303: 455 – A(151) – H
Fragment-Ionen: 303, 165, 150 m/z 165: 455 – B(222) – D(26) – E(43) m/z 150: 455 – C(236) – D(26) – E(43)
93 Ergebnisse und Diskussion
Norverpamil
+ [M+H] Norverapamil
CH E 3 OCH3 CH-CH3 H NC C CH -CH -CH -N CH CH OCH * 2 2 2 2 2 3 D B C A F OCH 3 *: chirales
G OCH3 Zentrum
Mmono = 440,267508 g/mol
Abb. 3-70: Q1-Scan Spektren von aus Urin Abb. 3-71: Produkt-Ionen Spektren von aus Urin extrahiertem Norverapamil bei 20, 50, 80 V DP extrahiertem Norverapamil bei 20, 35, 50 eV CE
Tabelle 3-33: Charakteristische und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation
m/z 289: 441 – A(151) – H [M+H]+ 441 m/z 165: 441 – B(208) – D(26) – E(43) + H Fragment-Ionen: 398, 289, 165, 150, 135, m/z 150: 441 - C(222) – D(26) – E(43) 105 m/z 135: 441 - C(222) – D(26) – E(43) – F(15) m/z 105: 441 - C(222) – D(26) – E(43) – F(15) – G(31) - H
94 Ergebnisse und Diskussion
N-Desalkylverapamil
[M+H]+ N-Desalkylverapamil
CH E 3 A CH-CH 3 B H C NC C CH2-CH2-CH2-N-CH3 * D F
OCH3 OCH *: chirales 3 Zentrum G Abb. 3-72: Q1-Scan Spektren von aus Urin extra- Abb. 3-73: Produkt-Ionen Spektren von aus hiertem N-Desalkylverapamil bei 20, 50, 80 V DP Urin extrahiertem N-Desalkylverapamil 20, 35, 50 eV CE Mmono = 290,1994 g/mol Tabelle 3-34: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation m/z 260: 291 – A(30) – H
m/z 248: 291 – E(43) + H + [M+H] 291, m/z 233: 291 – B(58) + H Fragment-Ionen: 260, 233,177, m/z 177: 291 - C(72) – E(43) 165, 151, 122, 81, 70, 44 m/z 165: 291 – B(58) – D(26) – E(43) + H m/z 151: 291 - C(72) – D(26) – E(43) + H m/z 122: 291 - C(72) – D(26) – E(43) – G(15) - F(15) +2 H
95 Ergebnisse und Diskussion
3.4.8. Trimipramin und Metaboliten Das trizyklische Antidepressivum bildet die Hauptmetaboliten N- Desmethyltrimipramin, 2-Hydroxytrimipramin, 2-Hydroxydesmethyltrimipramin und Didesmethyltrimipramin [Eap et al., 1992]. Weitere Metaboliten wurden von Maurer bestimmt [Maurer, 1989]. Aus Herzblut eines forensischen Falls konnten N-Desmethyltrimipramin und ein Hydroxytrimipraminderivat identifiziert werden. Die gemessenen UV-Spektren der Metaboliten wiesen Ähnlichkeit mit dem von Trimipramin auf, die Schulter bei 220 nm war bei den Metaboliten jedoch weniger ausgeprägt.
Tabelle 3-35: Retentionszeiten, Molekül und Fragment-Ionen von Trimipramin und seinen Metaboliten und deren Retentionszeit
tR [min] Charakteristische m/z-Werte
Trimipramin 17,1 295, 208, 193, 100, 58 N-Desmethyltrimipramin 16,0 281, 208, 193, 86 Hydroxytrimipramin 5,3 311, 224, 209, 100, 58
Trimipramin und die beiden Metaboliten zeigten partielle Übereinstimmung in den gebildeten Fragment-Ionen.
96 Ergebnisse und Diskussion
Trimipramin
Trim ipram in aus Herzblut [M+H]+ 45 40 35 30 25 20 15 10 5
Absorption[mAU] 0 190 240 290 340 390 440 W ellenlänge [nm]
Abb 3-75: UV-Spektrum aus von aus Herzblut extrahiertem Trimipramin
Trimipramin Abb. 3-74:Q1-Scan Spektren von aus Herzblut A extrahiertemTrimipramin bei 20, 50, 80V DP B CH3
CH2 CH CH2 N(CH3)2 Tabelle 3-36: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation * C N Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation m/z 208: 295 – B(86) – H *: chirales [M+H]+ 295 m/z 193: C(194) – H Zentrum Fragment-Ionen: 208, 193, 100, m/z 100: 295 – C(194) – H 58 m/z 58: 295 – A(236) – H Mmono = 294,209598 g/mol
97 Ergebnisse und Diskussion
N-Desmethyltrimipramin
[M+H]+ Desm ethyltrim ipram in aus Herzblut
600 500 400 300 200 100 0
Absorption [mAU] 190 240 290 340 390 440 Wellenlänge [nm]
Abb. 3-77: UV-Spektrum von aus Herzblut extrahiertem N-Desmethyltrimipramin
N-Desmethyltrimipramin A Abb. 3-76: Q1-Scan Massenpektren von aus Herzblut *chirales CH3 extrahiertem N-Desmethyltrimipramin bei 20, 50, 80 V DP Zentrum CH CH CH NHCH3 B 2 * 2 Tabelle 3-37: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation m/z 208: 281 – A(72) – H [M+H]+ 281 m/z 193: B(194) – H Fragment-Ionen: 208, 193, 86 m/z 86: 281 – B(194) – 2 H Mmono = 280,193948 g/mol
98 Ergebnisse und Diskussion
Hydroxytrimipramin
+ [M+H] Hydroxytrim ipram in aus Herzblut
30
25
20
15
10
5
0 190 240 290 340 390 440 Absorption [mAU] -5
Wellenlänge [nm]
Abb. 3-79: UV-Spektrum von aus Herzblut extrahiertem Hydroxytrimipramin
Hydroxytrimipramin
Abb. 3-78: Q1-Scan Massenspektren von aus Herzblut extra- B hiertem N-Desmethyltrimipramin bei 20, 50, 80V DP A CH3 CH CH CH N(CH ) C 2 * 2 3 2 Tabelle 3-38: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation N D Charakteristische m/z mögliche Strukturinterpretation *chirales m/z 224: 311 – B(86) – H HO Zentrum [M+H]+ 311 m/z 209: 311 – B(86) – H O (D) Fragment-Ionen: 224, 209, 2 m/z 100: 311 - C(211) 100, 58 M = 310,212338 g/mol m/z 58: 311 – A(253) – H mono
99 Ergebnisse und Diskussion
3.5. Entwicklung eines „Multi Target“ Screeningverfahrens mittels LC- QTrap MS/MS und Bibliothekssuche
In diesem Projekt sollte ein gezieltes Screeningverfahren auf eine Vielzahl von forensisch relevante Substanzen, z.B. Psychopharmaka, Benzodiazepine, illegale Drogen, Herz-Kreislaufmittel, orale Antidiabetika und Antihistaminika, mit einer linearen Quadrupol Ionenfalle mit IDA und MS/MS Spektrenbibliothekssuche entwickelt werden.
3.5.1. Entwicklung der MTS-Methode Die verwendeten Extraktionsmethoden waren die im Methodenteil beschriebenen LLE nach Gergov und die am Institut etablierte SPE mit Mischphasen Säule und zwei Fraktionen nach Chen et al [Chen et al. 1992]. Für die HPLC wurde, wie beim Q1-Scan, eine Synergi Polar RP Säule 150 x 2 mm, 3 µm, und dieselben Fließmittel FM A und B gewählt. Eine 33 minütige Gradientenmethode wurde verwendet. Für die Identifizierung mittels IDA wurde als „Survey“ Scan der Multiple Reaction Monitoring Modus verwendet, da dieser die höchste Selektivität und Sensitivität bietet. Als Faustregel gilt, dass für ein positives Screening pro Peak fünf Datenpunkte vorhanden sein müssen, für die Quantifizierung von Substanzen sind > 7 Datenpunkte nötig. Die experimentell ermittelte minimale „Dwell Time“ war fünf Millisekunden pro Ionenübergang. Dies ergab eine ausreichende Menge an Datenpunkten (14 Stück in 30 s) für 300 Substanzen. Zwischen den Übergängen wurde eine „Pause Time“ von zwei Millisekunden kalkuliert, so dass pro Übergang sieben Millisekunden nötig waren. Die „Scan Time“ für die ausgewählten 298 Übergänge betrug somit 2,086 s. Die Auswahl geeigneter Ionenübergänge erfolgte mit der MS/MS Bibliothek: “MS2-2004“ (W. Weinmann, B. Maralíková und C. Müller). Die Liste mit den ausgewählten 302 Substanzen, den 298 Übergängen und den Kollisionsenergien befindet sich im Anhang. Die Ionenübergänge
100 Ergebnisse und Diskussion mit der entsprechenden Kollisionsenergie wurden in die Analyst Software 1.4 eingegeben und entsprechend nach ansteigender Q1-Masse geordnet. Für den „Dependent“ Scan wurde der „enhanced“ Produkt-Ionen (EPI) Scan mit Ionenfalle gewählt. Um eine Substanz sicher identifizieren zu können, wurden drei EPI Scans durchgeführt bevor das Gerät wieder in den MRM Modus zurückschaltete. Die Zeit, die dafür benötigt wurde betrug 0,5693 pro Scan inkl. „Pause Time“. Die totale „Cycle Time“ (MRM + 3 EPI) betrug 3,7939 s. Die 302 Substanzen wurden bei drei verschiedenen Kollisionsenergien (20, 35, 50 eV) mit der QTrap im „enhanced“ Produkt-Ionen Scan Modus gemessen, die erhaltenen Spektren in Analyst 1.4 als Bibliothek hinterlegt. Die „Dynamic Exclusion“ wurde auf 60 s programmiert. Die Abb. 3-80 verdeutlicht das Prinzip der erstellten IDA Methode.
Survey Scan (MRM für 300 Substanzen)
IDA Kriterium MRM: Dynamic Exclusion ausgewählte m/z vorheriger m/z Übergänge Übergang wird für oberhalb eines Schwellenwertes 60 s ignoriert von 500 cps
Dependent Scan EPI 3 CE:+ 20, + 35, + 50 eV
Bibliothekssuche
Abb. 3-80: Schema der IDA
101 Ergebnisse und Diskussion
Die entwickelte Methode wurde an dreißig forensischen Fallproben erfolgreich getestet. Die gefundenen Substanzen wurden mittels GC-MS oder HPLC–DAD Analyse bestätigt. Beispiele für erfolgreiche Bibliothekssuche aus forensischen Realproben (Amitriptyllin, Codein) und ein Beispiel für „Dynamic Exclusion“ (Metformin) finden sich im Anhang 6.II. und III.
3.5.2. Diskussion der MTS-Methode Mit den technischen Möglichkeiten der QTrap Massenspektrometrie können im Gegensatz zur bisherigen Tripel-Quadrupol-Massenspektrometrie automatisch Precursor-Ionen ausgewählt und fragmentiert werden. Durch den Einsatz der linearen Ionenfalle werden eine wesentlich höhere Empfindlichkeit (50 – 100fach) und ein höheres Auflösungsvermögen im Vergleich zum herkömmlichen Tripel-Quadrupol- Massenspektrometer erzielt, so dass pro Analyse mehr Substanzen detektiert werden können. Die Vorteile dieser Methode gegenüber der herkömmlichen von Gergov et al [Gergov et al., 2003], bei der, wie bereits erwähnt, die Probe zwei Mal injiziert werden muss, einmal zur Detektion und einmal zur Identifizierung, liegt in der Möglichkeit, mehr als 300 Substanzen in einem einzigen Lauf detektieren und gleichzeitig identifizieren zu können, was ein Zeit und Kosten sparender Faktor ist. Der „enhanced“ Produkt-Ionen Scan Modus bietet zudem eine signifikant höhere Empfindlichkeit gegenüber dem gewöhnlichen mit einem Tandemmassenspektrometer aufgenommenen Produkt-Ionen Scan. Die „enhanced“ Produkt-Ionen Spektren sind jedoch sehr ähnlich, weshalb prinzipiell auch die auf dem API 365 erstellte „MS-2004“ Bibliothek zur Identifizierung der Substanzen verwendet werden kann. Bei den bisherigen gezielten Screeningverfahren war die Messung zur Substanzidentifizierung im MS/MS Modus durch die Elimination des Rauschens besser geeignet als die Messung im MS-Modus. Um eine ausreichende Empfindlichkeit zu gewährleisten, war jedoch eine Beschränkung auf wenige Substanzen (20 – 30) pro Analyse nötig. (Die oben aufgeführte Methode von Gergov et al. mit 238 Substanzen stellt eine Ausnahme dar).
102 Ergebnisse und Diskussion
Die Wahl der „Dynamic Exclusion“ Zeit ist ein Kompromiss bei einer Screeningmethode. Zum einen bietet diese Funktion die Möglichkeit neben Substanzen, die in sehr hoher Konzentration vorliegen durch Ausschalten des Ionenübergangs für eine bestimmte Zeit, nachfolgende Substanzen in geringer Konzentration zu detektieren. Jedoch können innerhalb der „Exclusion Time“ (60 s), Substanzen „übersehen“ werden. Deshalb ist das Ziel weiterer Arbeiten, die MRM- Methode mit Hilfe der oben beschriebenen Retentionszeitmarker (vgl. 3.2.1.) in Retentionsfenster zu unterteilen, so dass die Übergange von Substanzen nur in diesem Retentionszeitfenster erfolgen, in dem die gesuchte Substanz eluiert. Damit wird die Wahrscheinlichkeit der Detektion erhöht.
103 Ergebnisse und Diskussion
3.6. Entwicklung eines Screeningverfahrens für 1,4-Dihydropyridin Calciumantagonisten
Ziel dieses Projekts war die Entwicklung einer empfindlichen, gezielten Screeningmethode für therapeutische und toxische Konzentrationen der elf in Deutschland zugelassenen 1,4-Dihydropyridin Calciumantagonisten (Amlodipin, Felodipin, Isradipin, Lacidipin, Lercanidipin, Nicardipin, Nilvadipin, Nifedipin, Nimodipin, Nisoldipin, Nitrendipin in Serum und Plasma mittels LC-MS bzw. LC- MS/MS.
3.6.1. Flüssigkeitschromatographische Trennung der 1,4-DHP Für die Beurteilung einer chromatographischen Trennung bei der LC-MS spielen vor allem Kriterien wie die Signalintensität und die Analysenzeit eine wichtige Rolle, um für die Spurenanalytik niedrige Nachweisgrenzen und einen möglichst hohen Probendurchsatz zu erzielen. Durch die Wahl einer geeigneten Trennsäule, eines optimalen Eluentensystems und Gradienten kann dies erreicht werden. Die chromatographische Auflösung spielt jedoch aufgrund der Selektivität des Massenspektrometers als Detektor eine untergeordnete Rolle.
Entwicklung der LC-Methode Für die flüssigchromatographische Trennung der 1,4-Dihydropyridin Calciumantagonisten wurde eine Luna C18 (2) Säule verwendet (vgl. Tabelle 3-2). Folgender Gradient erwies sich zur Trennung der Analyten als geeignet: 0-1 min: 20 % B, 1-3 min: 20-40 % B (linear), 3-11 min: 40-70% B (linear), 11-12 min: 70-95% B (linear), 12-12,5 min: 95% B, 12,5-13,5 min: 95-20% B (linear), 13,5–15,5 min: 20% B. Zur Reequilibrierung der Säule war eine Zeit von 3 min ausreichend. Die Flussrate wurde für diesen Gradienten auf 400 µl/min gesetzt, damit die Analysenzeit kurz gehalten werden konnte. Zur besseren Verdampfung des größeren Flusses wurde die Temperatur auf 400 °C eingestellt. Mit dieser Methode eluierten die 1,4-DHP zwischen ca. 4,2 und 13,2 min (s. Tabelle 3-39).
104 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 3-39: Retentionszeiten der 1,4-DHP Substanz Retentionszeit [min] Amlodipin 4,23 Nicardipin 4,27 Lercarnidipin 6,26 Nifedipin 7,94 Nitrendipin 9,94 Isradipin 10,12 Nilvadipin 10,34 Nimodipin 10,66 Nisoldipin 11,21 Felodipin 11,73 Lacidipin 13,20
Ionisierungsverhalten in Abhängigkeit vom Eluenten Chromatographische Parameter wie Fließmittelzusammensetzung, pH-Wert, Puffer– bzw. Salzgehalt (z.B. Ammoniumformiat), Art und Anteil des org. Lösungsmittels sowie die Flussrate haben einen Einfluss auf die Signalintensität bei Verwendung einer ESI Quelle. In der Umkehrphasenchromatographie (RP) sind Fließmittelgemische aus Wasser und Methanol (MeOH) bzw. Acetonitril (ACN) üblich [Zwanziger, 2003]. Um die Ionisation der 1,4-DHP zu optimieren, wurden die Fließmittelgemische A und B getestet. Einmal enthielten beide FM 1 mM Ammoniumformiat und beim zweiten Versuch 10 mM Ammoniumformiat (s. Abb. 3-81).
1 mM Ammoniumformiat versus 10 mM Ammoniumformiat
1,8 1,6 1,4 1,2 1 1 mM 0,8 10 mM 0,6
Intensität, cps 0,4 0,2 0 347/290 361/290 372/290 419/290 389/290 384/290 354/290 409/283 480/283 612/283
Abb. 3-81: Intensität in Abhängigkeit von der Ionenkonzentration
Es zeigte sich kein Trend für eine signifikant bessere Ionisierung der 1,4–DHP bei einer der beiden getesteten Ammoniumformiatkonzentrationen. Aus diesem Grund
105 Ergebnisse und Diskussion wurden die herkömmlichen Fließmittel A und B mit 1 m Ammoniumformiat weiterverwendet.
3.6.2. Massenspektrometrische Untersuchungen der 1,4-DHP
Auswahl der Ionenquelle Von den elf 1,4-DHP wurden zunächst Q1-Scan Spektren bei 20, 50 und 80 V DP im positiven Modus jeweils mit einer ESI und APCI-Ionenquelle aufgenommen. Die Substanzen fragmentierten schon bei 20 V in beiden Quellen sehr stark. In der APCI Quelle war die Fragmentierung so stark, dass in den meisten Spektren der untersuchten Calciumantagonisten kein protoniertes Molekül [M+H]+ gefunden werden konnte (s. Abb. 3-82). Dagegen konnten für alle der untersuchten 1,4-DHP das protonierte Molekül [M+H]+, die Alkali-Addukte [M+Na]+ und/oder [M+K]+ bzw. das + Ammonium-Addukt [M+NH4] bei Verwendung der ESI Quelle detektiert werden. Da die ESI Spektren somit spezifischer waren, wurde die ESI-Ionenquelle für die weitere Methodenentwicklung verwendet.
106 Ergebnisse und Diskussion
a) Nifedipin (ESI) Nifedipin (APCI)
[M+H]+
[M+K] +
[M+Na]+ Intensität [cps] Intensität
b) Nisoldipin (ESI) Nisoldipin (APCI)
c) Nitrendipin (ESI) Nitrendipin (APCI)
d) Amlodipin (ESI) Amlodipin (APCI)
m/z [amu] m/z [amu]
107 Ergebnisse und Diskussion
e) Lercanidipin (ESI) Lercanidipin (APCI)
f) Nilvadipin (ESI) Nilvadipin (APCI)
g) Isradipin (ESI) Isradipin (APCI)
h) Nimodipin (ESI) Nimodipin (APCI)
m/z [amu] m/z [amu]
108 Ergebnisse und Diskussion i) Felodipin (ESI) Felodipin (APCI) Intensität [cps]
j) Nicardipin (ESI) Nicardipin (APCI)
k) Lacidipin (ESI) Lacidipin (APCI)
m/z [amu] m/z [amu]
Abb. 3-82: ESI-CID und APCI-CID 20 V DP Massenspektren der elf untersuchten 1,4-DHP.
Fragmentierung der 1,4-DHP Das in-source Fragmentierungsverhalten der 1,4-DHP wurde untersucht. Bei Betrachtung der in Abb. 3-82 gezeigten 20 V Q1–Scan Massenspektren fiel auf, dass bei den Substanzen Nifedipin, Nisoldipin, Nicardipin, Lacidipin, Isradipin und Nilvadipin, die Ionen mit der höchsten relativen Intensität aus der Spaltung einer der beiden Estergruppen in Position 3 oder 5 des Dihydropyridinrings resultierten. (s. Abb.
109 Ergebnisse und Diskussion
3-83): Felodipin m/z 338, Nifedipin m/z 315, Nisoldipin m/z 343, Nicardipin m/z 315, Lacidipin m/z 310, Isradipin m/z 312 und Nilvadipin m/z 326.
H H C N R2 3 1
O 5 3 O R1 C C R3 O O R4 R5 Abb. 3-83
Bei Nimodipin und Lercanidipin ergaben sich die Ionen mit der höchsten rel. Intensität m/z 343 bzw. m/z 280 aus der Abspaltung des Esters in Position 3 des Dihydropyridin- rings (s. Abb. 3-84). H N R2 H3C 1
5 O 3 O R1 C C R3 O O R4
R5 Abb. 3-84
Bei Amlodipin stammten die zwei intensivsten Fragmente (m/z 294 und 238) (s. Abb. 3-85) von einer molekularen Umlagerung nach erfolgter Protonierung der Aminogruppe des Dihydropyridin Rings [Yasuda et al., 1996].
O O + N N NH3 CH + 2 -NH3 + CH O O O 2 + C C NH 3 CH O O 2 H CH -CH3C2COOCH3 H C N 2 Cl + Cl CH2 O 3 O O H CH2 H CO C C OC H H3C N 3 2 5 O O Cl m/z 294
H3CO C C OC2H5 Cl
+ NH3 CH 2 CH protoniertes 2 O NH NH 2 2 Amlodipin H CH - NH2(CH2)2CH2(CH)2COOC2H5 H C N 2 O O 3 + O O O O Cl Cl H3CO C C OC2H5 + Cl m/z 238
Abb. 3-85. Molekularer Umlagerungsmechanismus und Bildung der zwei intensivsten Fragment-Ionen m/z 294 und 238 von Amlodipin [Yasuda et al., 1996].
110 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 3-40 Fragmentierung der 1,4-DHP Fragmentierung der 1,4-DHPs Mögliche Strukturvorschläge Amlodipin
E m/z 392: 409 – D(16) – H H m/z 377: 409 – A(31) – H H3C N CH2 OCH2 CH2NH2 O O m/z 294: s. S. 102 Abb. 3-85 D H3CO C C OC2H5 m/z 238: s. S. 103 Abb. 3-85 B Cl A m/z 207: 238 – A(31) C
M mono= 408,148122 g/mol
Felodipin
H H3C N CH3 O O m/z 353: 384 - A(31) H CO C C OC H m/z 325: 384 – B(59) 3 2 5 m/z 338: 384 – E(45) – H Cl m/z 307: 384 – A(31) – E(45) A E m/z 278: 384 – B(59) - E(45) B Cl m/z 207: 384 – C(145) - A(31) C D M mono= 383,069113 g/mol
Isradipin
H H3C N CH3 E A m/z 340: 372 – B(31) – H H CO CCO CH(CH ) 3 3 2 m/z 312: 372 – D(59) – H B O O N D m/z 280: 372 – B(31) - D(59) - 2 H O m/z 254: 372 – B(31) – E(87) N m/z 181: 372 – A(59) – C(44) – E(87) + H C M mono= 371,148122 g/mol
Lacidipin H CH H3C N 3 O O E m/z 410: 456 – A(45) – H H C O C C OC H 5 2 2 5 m/z 382: 456 – D(73) – H A O B F CH CH C O C(CH ) m/z 354: 456 - C(101) – H 3 3 m/z 310: 456 - B(73) - F(73) D C M mono= 455,230789 g/mol
111 Ergebnisse und Diskussion
Lercanidipin C B N CH H3C 3
O O m/z 298: 612 – A(315) + 2H H3C N H C CH O O 3 3 CH3 m/z 315: 612 – B(296) D m/z 280: 612 – B(296) NO 2 m/z 100: 612 - C(331) – D(181) A M mono= 611,299537 g/mol
Nicardipin H H3C N CH3 F E CH 3 H3CO C C OCH CH N CH 2 2 2 m/z 359 : 480 – E(120) – H A O O m/z 315: 480 - C(164) – H B m/z 166: C(164) + 2 H NO2 D
C M mono= 479,205637 g/mol
Nifedipin H H C N CH 3 3 E O O D m/z 315: 347 – A(31) H CO CCOCH 3 3 m/z 315: 347 – D(31) A NO B 2 m/z 284: 347 - A(31)- – D(31)
C m/z 195: 347 – C(122) – A oder D(31) + H
M mono= 346,116488 g/mol
Nilvadipin H NC N CH3 D m/z 343: 386 – E(43) H CO CCO CH(CH ) 3 3 2 E m/z 326: 386 – B oder C(59) – H A O O C m/z 298: 386 – D(87) - H+
B NO 2 M mono= 385,127387 g/mol
Nimodipin H H C N CH 3 3 A E m/z 343: 419 – D(75) – H
(H3C)2HCO C C O CH2 CH2 OCH3 m/z 301: 419 – B(43) – D(75) B O O D m/z 284: 419 – C(59) – D(75) – H C m/z 255: 419 – A(87) – D(75) – H NO 2 m/z 255: 419 - C(59) – E(103) – 2 H M mono= 418,174003 g/mol
112 Ergebnisse und Diskussion
Nisoldipin H H3C N CH3 F H O O E H CO CCO CH CH(CH ) m/z 357: 389 – A(31) – H 3 2 3 2 A NO 2 D m/z 315: 389 – E(73) – H B G m/z 239: 389 – A(31) – E(73) - G(46) m/z 211: 389 – A(31) – F(101) – G(46) C M mono= 388,163438 g/mol
Nitrendipin H H C N CH 3 3 E
H CO CCOC H m/z 329: 361 - A(31) – H 3 2 5 A O O D m/z 315: 361 - D(45) – H m/z 283: 361 - A(31) – D(45) - 2 H B NO2 m/z 255: 361 - A(31) - E (73) - 2 H C M mono= 360,132138 g/mol
Auswahl der Messmethode Die resultierenden Plasmaspiegel für die meisten der untersuchten 1,4–DHP sind sehr niedrig und somit im Q1-Full Scan nicht zu detektieren. Deshalb wurden Messungen im empfindlicheren Single Ion Monitoring (SIM) Modus sowie Multiple Reaction Monitoring (MRM) Modus durchgeführt und verglichen. Für den SIM Modus wurden die Spektren mittels in source CID Ionen generiert. Für das protonierte Molekül [M+H]+ wurden 20 V DP, für die Fragment-Ionen wurden 50 V bzw. 80 V DP verwendet. Die ausgewählten m/z für die SIM – Methode sind in Tabelle 3-41 aufgeführt. Für die Entwicklung einer MRM Methode wurden ausgehend vom protonierten Molekül [M+H]+ sowie von den intensivsten Fragment-Ionen Produkt-Ionen Scans im positiven Modus bei drei verschiedenen Kollisionsenergien (20, 35, 50 eV) gemessen. Die intensivsten Fragment-Ionen wurden ausgewählt (Produkt-Ionen Spektren s. Anhang 6. IV). Zur Entwicklung einer MRM Methode wurden Übergänge vom protonierten Molekül [M+H]+ als Precursor-Ion sowie auch Übergänge von anderen signifikanten Ionen getestet. Diese sind in der Tabelle 3-42 dargestellt.
113 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 3-41: ausgewählte m/z im SIM Modus Substanz ausgewählte m/z Amlodipin 20V: 409, 294, 238 80V: 208 Felodipin 20V: 384, 352 50V: 338 Isradipin 20V: 372, 340, 312, 298 Lacidipin 20V: 456, 400, 310, 268 Lercanidipin 20V: 612 50V: 212, 280 Nicardipin 20V: 400 50V: 315, 166 Nifedipin 20 V: 347, 329, 315 50V: 284 Nilvadipin nicht durchgeführt Nimodipin 20V: 419, 343, 50V: 301 80V: 255 Nisoldipin 20V: 389, 357, 315 50V: 239 Nitrendipin 20V: 361,329 50V: 301
Weitere Parameter: FP 200, EP -7, Nebulizer Gas 10, Curtain Gas 11, IS 5,25 kV, T 350 °C.
Tabelle 3-42: getestete Ionenübergänge im MRM-Modus Substanz getestete Ionenübergänge [m/z] Amlodipin 409 → 294, 238 294 → 248, 220 Felodipin 384 → 352, 338 Isradipin 372 → 340, 312 Lacidipin 456 → 354, 310 354 → 310, 268 Lercanidipin 612 → 280, 100, 298 Nicardipin 480 → 359, 315, 166 Nifedipin 347 → 254 Nilvadipin 386 → 326 Nimodipin 419 → 343, 301 Nisoldipin 389 → 357 Nitrendipin 361 → 329, 315
Zur Optimierung der MRM Parameter DP, FP, EP, CE und CXP mit Hilfe des Software Tools „Manual Tuning“ wurden alle 1,4-DHP mit Konzentrationen von 1 µg/ml bis 10 µg/ml im Fließmittelgemisch A:B 80:20, v/v, mittels Spritzenpumpe
114 Ergebnisse und Diskussion infundiert. Das Turbogas war wegen der geringen Fließgeschwindigkeit (20 µl/min) bei der Optimierung nicht zugeschaltet, ebenso wurde die Quelle nicht beheizt. Bis auf Lacidipin war die maximale Empfindlichkeit für den Ionenübergang Molekül [M+H]+ als Precursor-Ion auf ein Fragment-Ion am höchsten. Für Lacidipin wurde als Precursorion das Fragment-Ion m/z 354 gewählt. Die Tabelle 3-43 präsentiert die optimierten Parameter.
Tabelle 3-43: Ionenübergänge und optimierte Parameter für MRM-Methode Substanz [M+H]+ Ionenübergang DP FP EP CE CXP [m/z] [V] [V] [V] [V] [V] Amlodipin 409 409 → 238 5 150 -2 13 27 D3-Doxepin 283 283 → 107 20 230 -7 35 20 D5-Diazepam 290 290 →198 20 200 -7 35 20 Felodipin 384 384 → 338 16 190 -4 16 30 Isradipin 372 372 → 312 20 180 -3 13 28 Lacidipin 456 354 → 310 30 215 -7 16 30 Lercanidipin 612 612 → 280 27 210 -7 30 29 Nicardipin 480 480 → 315 25 200 -5 30 28 Nifedipin 347 347 → 254 10 147 -3 22 26 Nilvadipin 386 386 → 326 20 230 -10 20 15 Nimodipin 419 419 → 343 18 200 -3 31 30 Nisoldipin 389 389 → 357 10 147 -2 12 32 Nitrendipin 361 361 → 329 10 210 -5 15 33
Die SIM und die MRM-Methode wurden mit verschiedenen Zeitfenstern programmiert. Pro Fenster wurden weniger Ionen (-übergänge) detektiert, jedoch mit einer höheren „Dwell Time“, was die Empfindlichkeit erhöhte. Mit 1,4-DHP aufdotierte Humanplasmaextrakte in den Konzentrationen 1 und 5 ng/ml wurden mit beiden Aquisitions-Modi (SIM und MRM) vermessen. Störende Matrixeffekte verhinderten bei den meisten 1,4-DHP bei einer Konzentration von 5 ng/ml die Detektion im SIM. Für die weitere Entwicklung der Screeningmethode wurde deshalb der MRM Modus gewählt. Die meisten 1,4-DHP konnten im MRM Modus in einer Konzentration von 1 ng/ml (Ausnahme: Nilvadipin 5 ng/ml) nachgewiesen werden.
115 Ergebnisse und Diskussion
3.6.3. Auswahl einer geeigneten Extraktionsmethode Drei bereits etablierte Methoden, wurden für die Extraktion der 1,4-DHP getestet: die LLE nach Maurer, die Chlorbutanextraktion sowie die Mischphasen-SPE (s. Abschnitt 2.2.1.): 1 ml Plasma wurden mit 5 ng (Nilvadipin 10 ng) bzw. 50 ng 1,4-DHP versetzt (jeweils n=6) und 100 ng/ml der interner Standard zugegeben. Deuterierte 1,4-DHP zur Verwendung als I.S. waren nicht verfügbar, deshalb wurde auf D3-Doxepin für die basischen Fraktionen und D5-Diazepam für die sauren/neutralen Fraktionen als I.S. verwendet, die sich als I.S. bei der SPE für die ungerichtete Analyse bereits bewährt hatten. Zur Bestimmung der Extraktionsausbeute wurden je zwei Leerplasmen mit internem Standard versetzt, extrahiert und vor dem Eindampfen mit den Analyten in der Konzentration 5 ng/ml (10 ng/ml Nilvadipin) bzw. 50 ng/ml versetzt. Nach dem Eindampfen unter Stickstoff wurden die Substanzen in 80 µl Fließmittel A:B 70:30, v/v, aufgenommen. Wegen besserer Löslichkeit der 1,4-DHP in organischem Lösungsmittel wurde der organische Anteil des Fließmittels erhöht. Bei der Festphasenextraktion erfordert die saure/neutrale Fraktion wegen unlöslicher Matrixbestandteile eine Filtration. Alle erhaltenen Extrakte wurden in Microspin Filtern (0,45 µm) filtriert. Mit der automatischen SPE wurden die besten Extraktionsausbeuten erzielt. Amlodipin, Lercanidipin und Nicardipin eluierten in der basischen Fraktion, Felodipin, Isradipin, Lacidipin, Nimodipin, Nilvadipin, Nifedipin, Nisoldipin und Nitrendipin in der sauer/neutralen. Die Tabellen 3-44 und 3-45 zeigen die Extraktionsausbeuten bei 5 ng/ml und 50 ng/ml 1,4-DHP.
116 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 3-44: Bestimmung der Extraktionsausbeute mit SPE: Plasmaproben mit 5 ng/ml 1,4-DHP aufdotiert. (Nilvadipin 10 ng/ml); (n=6). Extraktionsausbeute Extraktionsausbeute [%] in [%] in der der basischen Fraktion Substanz Übergang sauren/neutralen Mittelwert ± sdv Fraktion Mittelwert ± sdv Amlodipin 409→238 - 61 ± 8 Felodipin 384→338 95 ± 16 - Isradipin 372→312 101 ± 22 - Lacidipin 354→310 76 ± 14 - Lercanidipin 612→280 - 58 ± 4 Nicardipin 480→315 - 71 ± 12 Nifedipin 347→254 86 ± 30 - Nimodipin 419→343 80 ± 11 - Nisoldipin 389→357 82 ± 19 - Nitrendipin 361→329 115 ± 29 - Nilvadipin 386→326 144 ± 36 -
Tabelle 3-45: Bestimmung der Extraktionsausbeute mit SPE: Plasmaproben mit 50 ng/ml 1,4-DHP aufdotiert. (n=6). Extraktionsausbeute Extraktionsausbeute [%] in [%] in der der basischen Fraktion Substanz Übergang sauren/neutralen Mittelwert ± sdv Fraktion Mittelwert ± sdv Amlodipin 409→238 - 83 ± 1 Felodipin 384→338 85 ± 10 - Isradipin 372→312 100 ± 5 - Lacidipin 354→310 88 ± 6 - Lercanidipin 612→280 - 160 ± 6 Nicardipin 480→315 - 91 ± 1 Nifedipin 347→254 92 ± 11 - Nimodipin 419→343 87 ± 3 - Nisoldipin 389→357 130 ± 8 - Nitrendipin 361→329 94 ± 13 - Nilvadipin 386→326 145 ± 10 -
117 Ergebnisse und Diskussion
3.6.4. Charakterisierung der entwickelten LC-MS/MS Methode Inklusiv Probenvorbereitung, Festphasenextraktion und Analyse dauerte die entwickelte LC-MS/MS Methode ungefähr 2 h und ermöglichte ein Screening auf 1,4- DHP innerhalb ihrer therapeutischen und toxischen Plasmaspiegel. Abbildung 3-86 zeigt die extrahierten MRM Chromatogramme der 1,4-DHP bei einer Konzentration von 4 ng/ml (5 ng/ml Nilvadipin) und der verwendeten internen Standards (100 ng/ml).
Suppression Die Methode wurde auf Suppressionseffekte untersucht. Dazu wurden die elf 1,4-DHP in einer kontinuierlichen Infusion (Konzentration 2,5 µg/ml, Fließgeschwindigkeit 20 µl/min) „Post Column“ dem von der Säule eluierenden Plasmaextrakt zugeführt (sauer/neutraler und basischer Extrakt, je n=3. Anhand der Intensitäten der Ionenübergänge der einzelnen 1,4-DHP wurde auf das Vorliegen von Suppressionseffekten geprüft. Im basischen Extrakt war im Chromatogramm Suppression nach 0,75 – 0,9 min und 1,25 – 1,44 min zu beobachten. Die Substanzen, die in diesem Extrakt vorlagen
(Amlodipin, Nicardipin und der I.S. D3-Doxepin), eluierten jedoch später, so dass ihre Signalintensität bei der entwickelten Methode nicht beeinflusst wurde. Im sauer/neutralen Extrakt war im Chromatogramm Suppression nach 0,75 – 0,9 min und 11,48 – 11,65 min zu beobachten. Die Analyten, die in diesem Extrakt vorlagen, eluierten später (ab 6 min), so dass der frühe Suppressionseffekt deren Nachweis nicht beeinflusste. Für die charakteristischen Übergänge von Nisoldipin und Felodipin, die beide zwischen 11 und 12 min eluieren (s. Tabelle 3-47) wurde keine Suppression im entsprechenden Retentionszeitfenster festgestellt, was die Schlußfolgerung zulässt, dass Suppressionseffekte auch von den chemischen Eigenschaften des Analyten (z.B. Lipophilie) abhängen können. Dies zeigten , wie bereits in Abschnitt 1.2.6. erwähnt auch [Bonfiglio et al., 1999].
118 Ergebnisse und Diskussion
a) 5.04e4 3,92 I.S.: D3-Doxepin
Intensität [cps] b) 4,30 3025
c) 4.1e4 4,35
d)
466 6,51
e)
758 8,10
f) I.S.: D -Diazepam 2.04e4 8,29 5
10,15 g) 320
h) 40 10,36
i)
1000 10,37
1 3 5 7 9 11 13
Zeit [min] 119 Ergebnisse und Diskussion
j) 200 10,90
Intensität [cps] k) 4995 11,47
l) 11,73 315
m) 1000 13,31 13.31
Zeit [min]
Abb. 3-86: ESI (+) LC/MRM Chromatogramme mit Signalen der 1,4-DHP mit einer Konzentration von 4 ng/ml (Nilvadipin 5 ng/ml) und der internen Standards mit einer Konzentration von 100 ng/ml in Plasma: a) D3-Doxepin (I.S.), m/z 283→107, b) Amlodipin m/z 409 → 238, c) Nicardipin m/z 480→ 315, d) Lercanidipin m/z 612→ 280, e) Nifedipin m/z 347 → 254, f) D5-Diazepam (I.S.) m/z 290 → 198, g) Nitrendipin m/z 361 → 329 h) Nilvadipin m/z 386→ 326, i) Isradipin m/z 372 → 312, j) Nimodipin m/z 419 → 343, k) Nisoldipin m/z 389→ 357, l) Felodipin m/z 384→ 338, m) Lacidipin m/z 354 →310.
Spezifität Interferenzen mit endogen im Plasma vorkommenden Substanzen waren nicht zu beobachten, wie die mit internem Standard versetzten Chromatogramme von Leerproben (Humanplasma) zeigen (s. Abb. 3-87) (n=3).
120 Ergebnisse und Diskussion a)
D5-Diazepam 500
Intensität [cps] b) D3-Doxepin 500
Zeit [min]
Abb. 3-87: ESI (+) LC/MRM Chromatogramm von mit internem Standard (I.S.) versetzter Leerprobe. a) Sauer /neutrale Fraktion mit I.S. D5-Diazepam, Ionenübergang m/z 290 → 198, tR 8,29 min. b) Basische Fraktion mit I.S. D3-Doxepin, Ionenübergang m/z 283→ 107, tR 3,93 min. Robustheit des Systems Die Identifizierung der Analyten erfolgte anhand der Retentionszeiten und der gewählten Ionenübergänge. Deshalb wurde die Robustheit des chromatographischen Systems, welches durch die Stabilität der Retentionszeit ausgedrückt wird, für jede Substanz überprüft (n=6). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3-46 aufgeführt:
Tabelle 3-46: Stabilität der Retentionszeit Substanz Retentionszeit [min] (Mittelwert ± sdv) Amlodipin 4,23 ± 0,08 Nicardipin 4,27 ± 0,09 Lercanidipin 6,26 ± 0,26 Nifedipin 7,94 ± 0,09 Nitrendipin 9,94 ± 0.11 Isradipin 10,12 ± 0,11 Nilvadipin 10,34 ± 0,11 Nimodipin 10,66 ± 0,11 Nisoldipin 11,21 ± 0,12 Felodipin 11,73 ± 0,12 Lacidipin 13,20 ± 0,06
121 Ergebnisse und Diskussion
Detektionsgrenze Die Detektionsgrenze, welche die niedrigste Konzentration eines Analyten darstellt, die die analytische Methode zuverlässig vom Rauschen unterscheiden kann, liegt bei den untersuchten 1,4-DHP unter 1 ng/ml und bei Nilvadipin unter 5 ng/ml (n=3). Daher kann die entwickelte Methode zur Detektion der 1,4-DHP innerhalb ihrer therapeutischen und toxischen Plasmaspiegel verwendet werden, mit Ausnahme des unteren therapeutischen Spiegels von Nilvadipin, der unter 5 ng/ml liegen kann, sowie für Isradipin und Nisoldipin, deren therapeutische Plasmaspiegel sogar unter 1 ng/ml liegen können. Die Signal–Rausch Verhältnisse (S/N) der aufdotierten Plasmaproben sind in Tabelle 3-47 aufgelistet.
Tabelle 3-47: Signal-Rausch-Verhältnisse der 1,4-DHP
Substanz Konzentration [ng/ml] S/N Amlodipin 1 33,3 Felodipin 1 4,3 Isradipin 1 7,6 Lacidipine 1 7,2 Lercanidipin 1 10,4 Nicardipin 1 62,5 Nifedipin 1 7,7 Nilvadipin 5 3,9 Nimodipin 1 4,4 Nisoldipin 1 9,6 Nitrendipin 1 6,2
Anwendung der Methode Die entwickelte Methode wurde an mehreren Realproben von Patienten, die mit 1,4- DHP behandelt wurden, getestet. Die Abb. 3-88 zeigt Chromatogramme von drei Serumproben dieser Patienten, welche mit 1,4-DHP therapiert wurden.
122 Ergebnisse und Diskussion
a)
b)
Abb. 3-88: ESI(+) LC/MRM Chromatogramme von Serumproben von mit 1,4-DHP behandelten Patienten: a) Signal 1: I.S. der basischen Fraktion D3-Doxepin, Signal 2: Amlodipin. b) Signal 1: I.S der basischen Fraktion D3-Doxepin, Signal 2: Lercanidipin. c) Signal 1: I.S. der sauer/neutralen Fraktion D5-Diazepam, Signal 2: Nimodipin.
3.6.5. Diskussion der entwickelten LC-MS/MS Methode zur Bestimmung von 1,4-DHP
Das Ziel dieses Projekts war die Entwicklung einer Screeningmethode zur Detektion von therapeutischen und toxischen Plasmaspiegel der in Deutschland zugelassenen 1,4–DHP. Mit der entwickelten LC-MS/MS Methode ist die Detektion der therapeutischen Plasmaspiegel der 1,4–DHP mit Ausnahme der unteren Plasmaspiegel von Nilvadipin, Isradipin und Nisoldipin möglich. Ein Grund für die schwankende Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Festphasenextraktion kann die Verwendung der beiden internen Standards mit völlig 123 Ergebnisse und Diskussion unterschiedlich chemischer Struktur im Vergleich zu den 1,4-DHP sein. Grundsätzlich sollten immer Substanzen mit gleichen oder sehr ähnlichen Eigenschaften wie der Analyt als I.S. verwendet werden – am besten ein stabil isotopen-markierter Analyt, da dieser die gleichen Extraktionsausbeuten, gleiches Ionisationsverhalten sowie praktisch gleiche chromatographische Eigenschaften aufweist. Deuterierte 1,4-DHP waren jedoch nicht verfügbar, so dass auf die bereits etablierten Standard-Substanzen der Mischphasen-SPE nach Chen (s. Abschnitt 2.2.1.), D3–Doxepin für die basische
Fraktion und D5–Diazepam für die sauer/neutrale Fraktion, zurückgegriffen wurde. Damit diese Methode auch zur Quantifizierung von Substanzen eingesetzt werden kann, bedarf sie einer vollständigen Validierung. Dazu ist es aufgrund der Lichtempfindlichkeit der meisten 1,4-DHP notwendig, deren Stabilität und in der präanalytischen Phase (Probenentnahme und Lagerung) während der Probenaufarbeitung (SPE, Einengen, Auflösen) und bis zur Analyse (Verweilzeit im Autosampler) zu untersuchen. Diese Stabilitätsuntersuchungen wurden, basierend auf der Screeningmethode, von A. Baranda Gonzalez durchgeführt [Weinmann, Baranda
González 2003; Baranda Gonzalez, Weinmann eingereicht 2004a] und dann zur Validierung eines quantitativen Verfahrens von 1,4-DHP eingesetzt [Baranda
Gonzalez, Weinmann eingereicht 2004b].
3.7. Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten
3.7.1. Vergleich von Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren Q1 Scan ESI-CID und APCI-CID Spektren wurden bei 20, 50 und 80 V DP im positiven Modus aufgenommen und bezüglich der Intensität und der gebildeten Fragment-Ionen miteinander verglichen, um die geeignete Quelle für die Entwicklung einer Methode zu finden. Das Signal m/z 130, das in den ESI-Spektren auftaucht stammt nicht von den Substanzen.
124 Ergebnisse und Diskussion
Candesartan: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+K]+ [M+H]+ 20 V Candesartan 441.2 [M+K]+ 20 V
479.1 F A OH
B O C CH2
[M+Na]+ N E OCH 50 V 50 V 5 463.2 N N NH D NN G C
I H
80 V M mono = 440,159689 g/mol 80 V
Abb. 3-89: Candesartan ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-90: Candesartan APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-48: Charakteristischen m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + + + ESI: [M+H] 441, [M+Na] 463 [M+K] 479, Fragment-Ionen: 423, 395, 338, 263, m/z 423: 441 – H20 (A) 235, 207 m/z 395: 441 – B(45) – H APCI: [M+H]+ 441(wenig), [M+K]+ 479, Fragment-Ionen 423, 395, 338, 263, 235, m/z 309: 441 – C(134) + 2 H 207, 190, 178, 161 m/z 235: 441 – E(205) – H Ergebnis: Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und APCI m/z 263: 441 – C(134) – D(45)+ H Spektren zu finden. Stärkere Fragmentierung bei APCI, daher waren dort zusätzliche m/z 190: 441 – F(220) – G(15) + H Fragment-Ionen zu finden. Natrium-Addukt [M+Na]+ 463 ist nur bei ESI vorhanden. m/z 207: 441 – F(220) – G(15) - H(14) Insgesamt waren die Ionenintensitäten in den APCI Spektren geringer. m/z 178: 441 – F(220) – G(15) – H(14) - I(14)
125 Ergebnisse und Diskussion
Eprosartan: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
+ + [M+H] [M+H] Eprosartan
B C A COOH D CH C CH2 E S CH N I 2 N
H COOH G F
Mmono = 424,145678 g/mol Abb. 3-91: Eprosartan ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-92: Eprosartan APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-49: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + ESI: [M+H] 425, Fragment-Ionen: 425, 407, 381, 341, 273, 245, 207, 163, 135 m/z 407: 425 – H2O (B oder F) APCI: [M+H]+ 425, Fragment-Ionen: 425, 407, 381, 341, 273, 245, 207, 163, m/z 341: 425 – A(83) – H 135, 107 m/z 381: 425 – C(45) + H Ergebnis: m/z 273: 425 – I(149) – H Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und APCI m/z 107: 425 – E(135) – D(167) – H(15) – H Spektren zu finden. Stärkere Fragmentierung bei APCI, daher waren dort zusätzliche Fragment-Ionen zu finden. Insgesamt waren die Ionenintensitäten in den APCI Spektren geringer.
126 Ergebnisse und Diskussion
Irbesartan: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
+ [M+H] [M+Na]+ [M+H]+ 451.3 Irbesartan
H D N E N 3.0e7 [M+K]+ NN F O
CH2 N C N A B
Mmono = 428,2324 g/mol Abb. 3-93: Irbesartan ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-94: Irbesartan APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-50: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation ESI: [M+H]+429, [M+Na]+ 451, [M+K]+ 467, Fragment-Ionen: 386, 235, 207, m/z 386: 429 – A(43) 195, 84 m/z 235: 429 – B(207) – H APCI: [M+H]+429, Fragment-Ionen: 386, 235, 207 ,192, 178, 165, 84 m/z 207: 429 – C(207) - D(15) + H m/z 192: 429 – C(207) - D(15) – E(14) Ergebnis: Stärkere Fragmentierung mit der APCI-Ionenquelle – daher waren m/z 178: 429 – C(207) - D(15) – E(14) –F(14) - G(14) dort zusätzliche Fragment-Ionen (m/z 178, 165) in den Spektren zu finden. Keine Alkali-Addukte waren in den APCI-Spektren zu finden.
127 Ergebnisse und Diskussion
Losartan: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+K]+ Losartan [M+H]+
A
CH2OH Cl C CH N 2 N D C4H9 E B N F HN N G N H
Mmono = 422,162186 g/mol
Abb. 3-95: Losartan ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-96: Losartan APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-51: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + + ESI: [M+H] 423, [M+K] 461, Fragment-Ionen: 405, 377, 235, 207, m/z 405: 423 – H2O (A) 192, 178 m/z 377: 423 – B(57) + 2 H APCI: [M+H]+ 423, Fragment-Ionen: 405, 377, 235, 207, 192, 178 m/z 235: 423 – C(187) - H m/z 207: 423 – D(201) - E(15) Ergebnis: Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den m/z 192: 423 – D(201) - E(15) - F(14) – H ESI und APCI Spektren zu finden. Bei APCI wurde zusätzlich m/z 165 m/z 178: 423 – D(201) - E(15) - F(14) - G(14) – H gebildet, jedoch waren keine Alkali-Addukte bei APCI zu finden. m/z 165: 423 – D(201) - E(15) - F(14) - G(14) – H(14)
128 Ergebnisse und Diskussion
Telmisartan: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+
[M+Na]+ Telmisartan [M+Na]+
A
B COOH
CH 3 CH2 N N N N C CH +Q1 3 3.0e6 M mono = 514,236876 g/mol
Abb. 3-97: Telmisartan ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-98: Telmisartan APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-52: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + + ESI: [M+H] 515, [M+Na] 537, Fragment-Ionen: 497,471, 305, 276 m/z 497: 515 – H2O (A) + APCI: [M+H] 515, Fragment-Ionen: 497, 305, 276. m/z 471: 515 - CO2 (B) Ergebnis: Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und APCI m/z 305: 515 – C(211) + H Spektren zu finden. Bei APCI war zusätzlich m/z 107 zu sehen; jedoch waren keine Alkali- m/z 276: 515 – C(211) – D(29) +H Addukte bei APCI zu finden.
129 Ergebnisse und Diskussion
Valsartan: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+K]+ Valsartan [M+H]+ A O B C H C C COOH 9 4 CH N C CH(CH ) F 2 3 2 H D E + [M+Na] G I H N N N J N
K [M+K]+
M = 435,227040 g/mol mono
Abb.3-99: Valsartan ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-100: Valsartan APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-53: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + + + ESI: [M+H] 436, [M+Na] 458, [M+K] 474, Fragment-Ionen: 418, 291, m/z 418: 436 –– H2O (A) 207, 192 m/z 306: 436 – B(45) - C (85) APCI: [M+H]+ 436, [M+K]+474, Fragment-Ionen: 418, 362, 306, 291, m/z 235: 436 – E(200) – H 235, 207, 192, 178, 165 m/z 262: 436 – B(45) - C(85) – D(43) + H Ergebnis: Bei APCI waren mehr Fragment-Ionen zu finden; jedoch war m/z 207: 436 – F(213) - G(15) - H kein Natrium-Addukt in den APCI Spektren zu finden. m/z 192:: 436 – F(213) - G(15) – I(14) – H m/z 178: 436 – F(213) - G(15) – I(14) – J(14) m/z 165: 436 – F(213) - G(15) – I(14) – J(14) - K(14) +H
130 Ergebnisse und Diskussion
Ergebnis des Vergleichs von ESI-CID mit APCI-CID Spektren
Die Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten ließen sich mit beiden Ionenquellen ionisieren. Bei Verwendung der APCI Quelle war die Fragmentierung stärker als bei
Verwendung der ESI Quelle. Für vier der sechs Angiotensin-AT1-Rezeptor- Antagonisten waren die Intensitäten für das protonierte Molekül im 20 V Spektrum bei Verwendung der ESI Quelle deutlich höher als bei der APCI Quelle. Deshalb wurde für die weiteren Untersuchungen die ESI Quelle verwendet.
3.7.2. Entwicklung einer HPLC-MS/MS Methode zum Nachweis von Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten
Zur chromatographischen Trennung der Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten wurde eine Luna C 8 50 x 2 mm, 3 µm Säule verwendet und eine 10 Minuten dauernde LC-Methode mit einer Flussrate von 250 µl/min und folgendem Gradienten entwickelt: 0–2 min: 15–20% B (linear); 2–4,5 min: 20-40 % B (linear); 4,5–8 min 40-70 % (linear) 8–8,2 min: 70–15 %B (linear); 8,2–10 min: 15 % B. Die Substanzen eluierten zwischen 3,6 min (Eprosartan) und 7,2 min (Valsartan) (s. Abb. 3-101). Aufgrund der teilweise recht niedrig liegenden therapeutischen Plasmaspiegel der
Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten (z.B. Candesartan 5 – 50 ng/ml) wurde der MRM Modus gewählt. Anhand der bei drei Kollisionsenergien aufgenommenen Produkt-Ionen Spektren (s. Anhang V.) wurden für jede Substanz zwei Ionenübergänge ausgewählt, für die die entsprechenden MS-Parameter mit Hilfe der automatischen „Quantitative Optimization“ in Analyst 1.3 optimiert wurden (s. Tabelle 3-54). Bei der entwickelten HPLC-MS/MS Methode resultierte nach Injektion eines Gemischs der sechs Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten (je 200 ng Substanz) das in Abb. 3-101 dargestellte Chromatogramm. Die MRM Methode wurde mit vier Fenstern programmiert, um eine hohe Empfindlichkeit zu erzielen.
131 Ergebnisse und Diskussion
Irbesartan
Losartan Eprosartan Valsartan Telmisartan Candesartan
Abb. 3-101: MRM-Chromatogramm von sechs Angiotensin-AT1-Rezptor-Antagonisten
Die Signale der untersuchten Substanzen zeigten teilweise eine recht unterschiedliche Intensität.
Tabelle 3-54: optimierte Parameter für MRM-Methode Substanz [M+H]+ Ionenübergang DP FP EP CE CXP [m/z] [V] [V] [V] [V] [V] Candesartan 441 441 → 423 21 210 4 30 32 Candesartan 441 441 → 263 26 230 10 30 32 Eprosartan 425 290 →198 20 200 7 35 20 Eprosartan 425 384 → 338 16 190 4 16 30 Irbesartan 429 429 → 207 20 230 10 30 15 Irbesartan 429 429 → 195 20 230 10 30 15 Losartan 423 423 → 207 16 180 10 30 34 Losartan 423 423 → 233 26 230 10 30 34 Telmisartan 515 515 → 276 20 230 3 30 46 Telmisartan 515 515 → 497 20 230 11 30 46 Valsartan 436 436→ 306 20 230 10 30 15 Valsartan 436 436 → 235 20 230 10 30 15
132 Ergebnisse und Diskussion
3.7.3. Untersuchung der Signalintensität in Abhängigkeit von der „Post Column“ Zugabe organischen Lösungsmittels
Da besonders die Substanzen, deren Plasmaspiegel im therapeutischen Bereich (je nach Dosierung) sehr niedrig sind (Candesartan cmin: ca. 5 ng/ml, Losartan cmin: ca. 5 ng/ml, Telmisartan cmin: ca. 18 ng/ml), eine geringe Intensität zeigten, wurde in einem weiteren Experiment die Auswirkung der „Post Column“ Zugaben von organischem Lösungsmittel auf die Signalintensität untersucht.
20 µl eines Lösungsgemischs der sechs Angiotensin-AT1-Rezeptoren-Antagonisten mit einer Konzentration von 1 µg/ml (n=6) wurde mittels Autosampler ins LC-MS/MS injiziert und mit der MRM-Methode gemessen (absolute Menge auf der Säule 20 ng). Der Effekt der Zugabe von 60 µl/min bzw. 150 µl/min MeOH und ACN „Post Column“ auf die Intensität von zwei ausgewählten Ionenübergängen wurde für jede Substanz untersucht.
Ergebnis der Untersuchung der Signalintensität
Die „Post Column“ Zugabe von organischem Lösungsmittel für die Angiotensin-AT1- Rezeptor-Antagonisten führte zu einer unterschiedlichen Erhöhung der Intensität der
Signale bei den einzelnen Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten. Die Intensität der Ionenübergänge konnte bei Losartan und Candesartan am meisten durch die Zugabe 150 µl/min ACN gesteigert werden. Bei Epro-,Val-, Irbe– und Telmisartan war die Intensitätssteigerung bei Zugabe von 150 µl/ml für MeOH und ACN ungefähr gleich hoch. Für die Entwicklung eines gezielten Screeningverfahrens auf Sartane sollte die Zugabe von 150 µl/min ACN nach der Säule Bestandteil der Methode werden, da die Plasmaspiegel im therapeutischen Bereich je nach Dosierung recht niedrig sind. Die präsentierten Ergebnisse sind Daten auf deren Basis eine LC-MS/MS
Screeningmethode für die sechs Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten weiterent- wickelt werden kann.
133 Ergebnisse und Diskussion
Candesartan Irbesartan
441/423 441/263 429/195 429/207
4.50E+04 2.50E+06 4.00E+04 3.50E+04 2.00E+06 3.00E+04 2.50E+04 1.50E+06 2.00E+04 1.50E+04 1.00E+06 1.00E+04 5.00E+05 5.00E+03 0.00E+00 0.00E+00
C C C P C C C C C P P P P P P P in in in PC n e n n n n m mi n i i i i ohne PC l/ /m l/m / h m m m m µl o l/ l/ l/ l/ µ µ µl µ µ µ µ 0 0 0 0 0 0 6 6 5 5 H 6 1 1 CN 60 N H A eO C O N H M ACN15 A e C O MeOH 150 M A e M
Valsartan Telmisartan
436/306 436/235 515/276 515/497
8.00E+04 7.00E+04 4.00E+04 6.00E+04 3.50E+04 5.00E+04 3.00E+04 4.00E+04 2.50E+04 3.00E+04 2.00E+04 2.00E+04 1.50E+04 1.00E+04 1.00E+04 0.00E+00 5.00E+03 0.00E+00 C C C P C P PC P P C C C . in in n in C P P P .. e P n in n i n /m l/m l/m e i i /m h n m l/m m l Intensität [cps] o µl µ h l/ l/ µ µl/mi 0µ o µ µ µ 0 0 0 0 0 5 60 6 6 5 1 N 15 H 15 N H 1 H OH 60 N C O N O AC e eO A e C e M AC M M A M
Ep r o s ar t an Losartan
425/207 425/135 423/377 423/405
7.00E+05 2.00E+04 6.00E+05 5.00E+05 1.50E+04 4.00E+05 3.00E+05 1.00E+04 2.00E+05 5.00E+03 1.00E+05 0.00E+00 0.00E+00 C C C C C C C C P P P P n P in PC in in i min P m min / /m / hne PC / /m l/m ohne µl µl µl o µl µ 60 µl 0 50 60 1 H 150 15 H 150 N H ACN 60 µl/min P ACN 60 µl/mineOH P C MeO ACN eO M A M MeO
Abb. 3-102: Signalintensität verschiedener Ionenübergänge der Angiotensin-AT1-Rezeptor- Antagonisten Cande-, Irbe-, Val-, Telmi-, Epro- und Losartan in Abhängigkeit von der „Post Column“ Zugabe unterschiedlicher organischer Lösungsmittel in unterschiedlichen Mengen.
134 Ergebnisse und Diskussion
3.8. Orale Antidiabetika
3.8.1. Vergleich von ESI-CID und APCI-CID Spektren
Wie bereits bei den 1,4-DHP und den Angiotensin-AT1-Antagonisten sollten auch für die oralen Antidiabetika Vergleichsuntersuchungen von ESI und APCI durchgeführt werden. Mit ESI und APCI bei 20, 50 und 80 V DP aufgenommene Q1-Scan Spektren der oralen Antidiabetika (Pioglitazon, Rosiglitazon, Nateglinid, Repaglinid, Glibenclamid, Gliquidon, Gliclazid, Glipizid, Tolbutamid, Glimepirid, Glibornurid) (Konzentration der Lösung 10 µg/ml, FM A:B 80:20, v/v, Injektionsvolumen 20 µl) wurden miteinander verglichen. Alle untersuchten Substanzen waren sowohl mit ESI- bzw. APCI-CID LC-MS zu detektieren. Die ESI-CID Spektren wurden in der Q1-Scan Bibliothek abgelegt. Mit ESI wurden intensivere Quasimolekülionen erhalten als mit APCI. Die APCI-CID Spektren der Sulfonylharnstoffe, die von Maurer et al. [Maurer et al., 2002] mit einem AT 1100 Massenspektrometer bei niedriger (100 V) und hoher Spannung (200 V) aufgenommen wurden, zeigten im Vergleich mit dem API 365 aufgenommenen Spektren meistens ein höheres Signal des protonierten Moleküls und weniger Signale von Fragment-Ionen. Selbst bei hoher Fragmentorspannung lag häufig noch ein Signal des protonierten Moleküls vor.
135 Ergebnisse und Diskussion
Pioglitazon: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+ Pioglitazon
O O H N N O B A S D C
Mmono = 356,119463 g/mol
Abb. 3-105: Pioglitazon ESI-CID Spektren Abb. 3-106: Pioglitazon APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-55: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation ESI: [M+H]+ 357, Fragment-Ionen: 134, 119, 106 m/z 134: 357 – A(222) - H APCI: [M+H]+357, Fragment-Ionen: 134, 119, 106, 91 m/z 119: 357 – B(236) – 2 H Ergebnis: Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und APCI m/z 106: 357 – B(236) – D(15) Spektren zu finden. Bei APCI wurde zusätzlich m/z 91 gebildet. Alkali-Addukte wurden m/z 91: 357 – B(236) – C(29) – H weder bei ESI noch bei APCI gebildet.
136 Ergebnisse und Diskussion
Rosiglitazon: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+ Rosiglitazon
c
A B H O N O O S N N
Mmono = 357,114712 g/mol 107.0 119.0
Abb. 3-105: Rosiglitazon ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-106: Rosiglitazon APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-56: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation ESI: [M+H]+ 358; Fragment-Ionen: 135, 119, 107 m/z 135: 358 – A(224) + H APCI: [M+H]+ 358; Fragment-Ionen: 135,119, 107 m/z 119: 358 – B(238) – H Ergebnis: Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und APCI m/z 107: 358 – C(252) + H Spektren zu finden. Alkali-Addukte wurden weder bei ESI noch bei APCI gebildet.
137 Ergebnisse und Diskussion
Nateglinid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+
Nateglinid
A D H N C
B COOH O
Mmono = 317,199094 g/mol
Abb. 3-107: Nateglinid ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-108: Nateglinid APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-57: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation ESI: [M+H]+ 318, [M+Na]+ 340, Fragment-Ionen: 272, 166, 120, 77, 69 m/z 272: 318 – B(45) – H APCI: [M+H]+ 318, Fragment-Ionen: 272,166, 120, 77, 69 m/z 166: 318 – A(153) + H Ergebnis: Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und m/z 120: 318 – A(153) - B(45) APCI Spektren zu finden. Natrium-Addukt [M+Na]+ 340 wurde nur bei ESI m/z 69: 318 – C(98) - D(149) – 2 H gefunden.
138 Ergebnisse und Diskussion
Repaglinid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
Repaglinid [M+H]+ [M+H]+ [M+Na]+
A C N O
CH2 C NH CH 3.0e7Q1: B CH2
CH(CH3)2 COOH D OC2H5
Mmono = 452,267508 g/mol
Abb. 3-109: Repaglinid ESI-CID Spektren 20, 50 ,80 V DP Abb. 3-110: Repaglinid APCI-CID Spektren 20, 50 ,80 V DP
Tabelle 3-58: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation ESI: [M+H]+ 453, [M+Na]+ 475, Fragment-Ionen: 292, 230, 174, 162, 106, 86 APCI: [M+H]+ 453, Fragment-Ionen: 292, 230,174, 162, 106, 86 Ergebnis: m/z 294: 453 – A(160) + H
Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und APCI m/z 163: 453 – C(245) - D(45) – H + Spektren zu finden. Natrium-Addukt [M+Na] 475 wurde nur bei ESI gefunden m/z 230: 453 – B(222) – H jedoch nur in geringer Intensität. m/z 174 ist charakteristisch aber nicht eindeutig identifizierbar. 139 Ergebnisse und Diskussion
Glibenclamid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+ Glibenclamid
C O
C NH CH2 CH2 H CO 3 B A [M+Na]+ Cl O
SO2 NH C NH
Mmono = 493,143819 g/mol
Abb 3-111: Glibenclamid ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-112: Glibenclamid APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-59: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation + ESI: [M+H] 494, Fragment-Ionen: 395, 369, 304, 169 + APCI: [M+H] 494, Fragment-Ionen: 395, 369, 304, 169 m/z 395: 494 – A(98) Ergebnis: Eine hohe Übereinstimmung der Fragment-Ionen war in den ESI und APCI m/z 368: 494 – B(126) Spektren zu finden. Natrium-Addukt [M+Na]+ 516 wurde nur bei ESI gefunden. m/z 169: 494 – C(324) - H m/z 304 ist charakteristisch aber nicht eindeutig identifizierbar.
140 Ergebnisse und Diskussion
Gliquidon: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+ [M+Na]+ Gliquidon
F
H C CH 3 3 E O [M+K]+ N CH2 CH2 H3CO H O A D O
C SO2 NH C NH
B
Mmono = 527,209007 g/mol
Abb. 3-113: Gliquidon ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-114: Gliquidon APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-60: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation ESI: [M+H]+ 528 (wenig), [M+Na]+ 550, [M+K]+ 566, Fragment-Ionen: 403, m/z 403: 528 – A(126) – H 386, 322, 202, 167, 131, 117, 103 + m/z 386: 528 - B(141) - H APCI: [M+H] 528 (wenig), Fragment-Ionen: 403, 386, 322, 202, 167, 131, m/z 322: 528 - C(205) - H 117, 103 m/z 149: 528 - D(379) Ergebnis: Keine Alkali-Addukte wurden bei APCI gefunden, sonst bestand m/z 134: 528 - D(379) – E(15) eine hohe Übereinstimmung der gebildeten Fragment-Ionen m/z 117: 528 - D(379) – E(15) – F(15) - 2H m/z 202 und m/z 103 sind charakteristisch aber nicht eindeutig identifizierbar.
141 Ergebnisse und Diskussion
Gliclazid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+
Gliclazid
B A O D NNHC NH SO2 C
CH3
Mmono = 323,130362 g/mol
Abb. 3-115: Gliclazid ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-116: Gliclazid APCI–CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-61: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte ESI: [M+H]+ 324, [M+Na]+ 346, [M+K]+ 362, Fragment-Ionen: 153, 127, 110, 91 m/z 153: 324 –A(170) –H APCI: [M+H]+324, Fragment-Ionen: 153, 127, 110, 91. m/z 127: 324 –B(198) + H+
Ergebnis: Hohe Übereinstimmung in der Spektren bei ESI und APCI. Natrium m/z 110: 324 –C(213) – H+ + + Addukt [M+Na] 346 und Kalium-Addukt [M+K] 362 nur bei ESI. m/z 91: 324 – D(232)
142 Ergebnisse und Diskussion
Glipizid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ [M+Na]+ Glipizid
O C
CNHCH2 CH2 + [M+K] N
N O
SO2 NH C NH CH3 A
B
Mmono = 445,178375g/mol
Abb. 3-117: Glipizid ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-118: Glipizid APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-62: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation ESI: [M+H]+ 446, [M+Na]+468, Fragment-Ionen: 369, 347, 321, 304, 286, 167, m/z 347: 446 - C(98) – H 120, 103 m/z 321: 446 - B(126) + H APCI: [M+H]+ 446 (kaum); Fragment-Ionen: 369, 321, 304, 286, 167, 120, 103 m/z 304: 446 - C(141) – H Ergebnis: Bis auf m/z 242 hohe Übereinstimmung der gebildeten Fragment- m/z 167: 446 - D(281) + 2 H Ionen bei ESI und APCI. Natrium Addukt [M+Na]+ 468 nur bei ESI.
143 Ergebnisse und Diskussion
Tolbutamid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+
Tolbutamid
O
SO2 NH C NH A B C D
CH3
Mmono = 270,103813 g/mol
Abb. 3-119: Tolbutamid ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-120: Tolbutamid APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-63: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation
ESI: [M+H]+ 271 Fragment-Ionen: 242, 172, 155, 119, 91 m/z 242: 271 – D(29) APCI: [M+H]+ 271; Fragment-Ionen: 172, 155, 119, 91 m/z 172: 271 - C(100) + H
m/z 155: 271 - B(115) - H Ergebnis: Bis auf m/z 242 hohe Übereinstimmung der gebildeten m/z 91: 271 - A(179) - H Fragment-Ionen bei ESI und APCI. Kalium Addukt [M+K]+ 309 nur bei
ESI.
144 Ergebnisse und Diskussion
Glimepirid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
[M+H]+ [M+H]+ Glimepirid
O
SO2 NH C NH CH3 A
D O C O C2H5
CH2 CH2 NH C N CH E 3 B
Mmono = 490,224991 g/mol
Abb. 3-121: Glimepirid ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb. 3-122: Glimepirid APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-64: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation
Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation m/z 352: 491 – A(140) ESI: [M+H]+ 491, Fragment-Ionen: 352, 335,181, 152, 126 m/z 335: 491 – F(155) - 2H APCI: [M+H]+ 491, Fragment-Ionen: 352, 335, 152, 126 m/z 181: 491 – B(309) – H Ergebnis: Hohe Übereinstimmung in den Spektren bezüglich der Fragment-Ionen m/z 152: 491 – D(338) – H bei ESI und APCI – Ausnahme m/z 181 nur bei ESI. m/z 126: 491 – E(366) + H
145 Ergebnisse und Diskussion
Glibornurid: Vergleich ESI-CID mit APCI-CID Spektren
Glibornurid C
CH3 H3C E A O F H3C NH CNHSO 2 OH B D
CH3
M = 366,224991 g/mol mono
Abb. 3-123: Glibornurid ESI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP Abb.3-124: Glibornurid APCI-CID Spektren 20, 50, 80 V DP
Tabelle 3-65: Charakteristische m/z-Werte und mögliche Strukturinterpretation Charakteristische m/z-Werte mögliche Strukturinterpretation m/z 349: 367 –A(15) +H ESI [M+H]+ 367, [M+Na]+ 389, Fragment-Ionen: 349, 253, 196, 170, 152, 135, 107, 91 m/z 196: 367 – E(170) – H APCI [M+H]+ 367, Fragment-Ionen: 349, 253, 196, 170, 152, 135, 107, 91 m/z 170: 367 – D(196) – H
m/z 152: C(153) – H Ergebnis: Hohe Übereinstimmung in der Spektren bezüglich der Fragment-Ionen bei m/z 135: C(153) – H O (B) ESI und APCI Natrium Addukt [M+Na]+ 389 nur bei ESI. 2 m/z 91: 367 – F(275) - H
146 Ergebnisse und Diskussion
3.8.2. Untersuchung derAuswirkung von Matrix und SPE auf die Bildung von Natrium- und Kalium-Addukten
Die Auswirkung von Matrix und Festphasenextraktion auf die Bildung von Natrium- und Kalium-Addukten wurde an ausgesuchten Beispielen (Glibornurid, Glipizid, Glimepirid, Rosiglitazon, Repaglinid) im Vergleich zu in Fließmittel gelösten Wirkstoff (Konzentration 10 µg/ml in FM A:B 80:20, v/v) untersucht (n=3). Dafür wurden mit 10 µg/ml Wirkstoff aufdotiertes Plasma und Fließmittel mit der Mischphasen–SPE extrahiert und mit der 28 min LC-MS Screeningmethode analysiert.
Ergebnis der Untersuchungen derAuswirkung von Matrix und der SPE auf die Bildung von Natrium- und Kalium-Addukten
Die Massenspektren von in Fließmittel gelösten oralen Antidiabetika (Glibornurid, Glipizid, Glimepirid, Rosiglitazon und Repaglinid) wurde mit Plasma- bzw. aus Fließmittelextrakten verglichen (Abb. 3-125 – 3–129). Bei Glibornurid, Glipizid, Rosiglitazon und Repaglinid zeigten die Massenspektren eine hohe Übereinstimmung. Bei Glimepirid fehlte im Plasmaextrakt das Kalium-Addukt, dafür war zusätzlich ein Signal m/z 522 zu finden, welches vermutlich von einer coeluierenden Substanz aus dem Plasma stammt. Plasma und die Extraktionsmethode hatten somit keinen Einfluss auf die Bildung der Alkali-Addukte. Die Signale der Alkali-Addukte besaßen eine deutlich geringere relative Ionenintensität als das Signal der protonierten Moleküle. Rosiglitazon bildete keine Alkali-Addukte. Für die Entwicklung einer MS/MS Methode ist daher das protonierte Molekül als Precursor-Ion zu verwenden.
147 Ergebnisse und Diskussion Glibornurid
+ + + [M+H] [M+H] [M+H] a) b) c)
+ + [M+K] [M+Na] + + + [M+K] [M+K] [M+Na] + [M+Na]
Abb. 3-125: 20V ESI CID Spektren: a) Glibornurid FM gelöst, b) snb 1 Extrakt Glibornurid Serum, c) snb 1 Extrakt Glibornurid FM Glipizid
a) [M+H] + b) [M+H] + c) [M+H]+ [M+Na]+
[M+Na]+ [M+Na]+ [M+K]+ [M+K]+ [M+K]+
Abb. 3-126: 20V ESI CID Spektren: a) Glipizid in FM gelöst , b) snb 1 Extrakt: Glipizid Serum, c) snb 1 Extrakt: Glipizid FM
In allen drei Spektren waren bei Glibornurid sowie bei Glipizid protoniertes Molekül, Natrium-Addukt und Kalium-Addukt in den gleichen relativen Intensitäten zu sehen.
148 Ergebnisse und Diskussion Glimepirid [M+H]+ [M+H]+ [M+H]+ a) b) c)
+ + [M+K] + [M+Na] [M+Na]+ [M+K] [M+Na]+
Abb. 3-127: 20V ESI CID Spektren: a) Glimepirid in FM gelöst, b) snb 1 Extrakt: Glimepirid Serum, c) snb 1 Extrakt: Glimepirid FM Im Spektrum des Serumextrakts wurde kein Kalium-Addukt gebildet. Fragment-Ion m/z 522 stammt vermutlich aus der Matrix. Die rel. Intensität des Signals des Natrium-Addukts war im Vergleich zum protonierten Molekül etwas höher als in Spektren a) und c). Protoniertes Molekül [M+H]+ 491, Natrium-Addukt [M+H]+ 513 und Kalium-Addukt [M+H]+ 575 besaßen in den Spektren a) und c) gleiche relative Intensitäten.
Rosiglitazon
a) [M+H] + b) [M+H] + c) [M+H]+
Abb. 3-128: 20V ESI-CID Spektren: a) Rosiglitazon in FM, b) snb 1 Extrakt Rosiglitazon Serum, c) snb 1 Extrakt: Rosiglitazon FM
Rosiglitazon bildete in keinem der Spektren Alkali-Addukte sondern nur das protonierte Molekül [M+H]+ 358.
149 Ergebnisse und Diskussion Repaglinid
+ + [M+H] a) [M+H] b) [M+H]+ c)
+ + [M+Na] [M+Na]+ [M+Na]
Abb.3-129: 20V ESI-CID Spektren: a) Repaglinid FM, b) snb 1 Extrakt Repaglinid Serum, c) snb 1 Extrakt Repaglinid FM
In allen drei Spektren waren das protonierte Molekül [M+H]+ 453 und das Natrium-Addukt [M+Na]+ 475 (wenig) von Repaglinid in den gleichen relativen Intensitäten zu sehen.
150 Zusammenfassung
4. Zusammenfassung
Zunächst wurde ein LC/MS Screeningverfahren weiterentwickelt basierend auf einer bereits existierenden Screening Methode auf körperfremde Substanzen mit einer ESI- CID Massenspektrenbibliothek. Diese Bibliothek musste neu erstellt werden wegen Umstellung von der Software-Version eines Macintosh basierten Computersystems auf ein Windows NT basiertes System durch Einführung der „Analyst 1.1“ Software im Jahr 2001. Die Ionisierbarkeit von in-source CID mit ESI und APCI für ausgewählte Substanzen, wurde verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass bei APCI häufig stärkere
Fragmentierung auftrat (z.B. 1,4-DHP, Antidiabetika, Angiotensin-AT1-Rezeptor- Antagonisten), während bei ESI mehr protonierte Moleküle und in geringem Maß eine zusätzliche Alkali-Adduktbildung zu beobachten war. Wegen der höheren Spezifität der ESI-Spektren wurde die Bibliothek mittels in-source ESI-CID bei drei unterschiedlichen Kollisionsenergien erstellt: von ca. 430 Substanzen wurden Q1-Scan Massenspektren mit jeweils drei Spektren pro Substanz aufgenommen. Weitere Entwicklung beinhaltete die Untersuchung von möglicher Ionensuppression bei ESI in Abhängigkeit von Extraktionsverfahren. Festgestellt wurden zunehmende Suppressionseffekte mit Zunahme der im Extrakt enthaltenen Verunreinigungen, in der Reihenfolge: Mischphasenextraktion (basischer Extrakt < saurer/neutraler Extrakt) < Flüssig-Flüssig-Extrakt < Proteinfällung. Zur Entwicklung einer geeigneten chromatographischen Trennung wurden Retentionszeitmarker eingeführt, mehrere Säulen (zwei RP C18 und eine Phenylpropyl-Phase mit polarem Endcapping) mit unterschiedlichen Gradienten getestet. Am besten geeignet war die Synergi Polar RP Säule mit der Phenylpropyl-Phase, da hiermit die beste Retention von polaren Komponenten und Abtrennung von der LC-Front, sowie die optimale Abtrennung von lipophilen Komponenten von spät eluierenden Matrixbestandteilen erreicht wurde. Die Auswirkungen der Eluentenzusammensetzung auf die Ionisierbarkeit von ausgewählten Substanzen wurde mit Hilfe der „Post Column“ (PC) Zugabe von organischen Lösungsmitteln (Methanol und Acetonitril bzw. Gemischen) untersucht. Steigende Lösungsmittelvolumina wirkten sich bei gleich bleibender Zusammensetzung tendenziell negativ auf die Ionenausbeute aus, während bei einigen 151 Zusammenfassung
Substanzen durch organischen Modifierzusatz die Ionenausbeute zunahm. Für die Screeningmethode wurde die PC-Zugabe nicht generell empfohlen. Die in-source CID Spektren, Strukturformeln, Substanz- und Retentionszeitdaten wurden in einer Access-Datenbank zusammengefasst, welche eine Suchfunktion nach Substanzkriterien (protoniertem Molekül, Fragmentionen etc.) enthält und zur Publikation der Massenspektren dient (http://www.uniklinik- freiburg.de/i/rme/de/pix/in-source-cid-mueller.pdf). Der Grund der Erstellung der Bibliothek im Access-Format war, dass die Analyst Software 1.1 2001 noch keine Bibliotheksfunktion besaß. Eine funktionsfähige Bibliothekserstellung war erst mit einer späteren Upgrade-Version ab Sommer 2003 möglich (Version 1.4). Für beide Bibliotheken wurden neben Massenspektren von Reinsubstanzen auch welche von Metaboliten aufgenommen. Diese wurden dafür aus Serum/Plasma, Herzblut bzw. Urin forensischer Proben bzw. Proben von Klinikfällen extrahiert. Basierend auf dieser Methodenentwicklung wurde mit Hilfe einer in Zusammenarbeit mit B. Maralíková erstellten MS/MS-Bibliothek („MS2-2004“, 730 Substanzen) und einer neuen linearen Ionenfalle (QTrap) ein „Multi Target Screeningverfahren“ auf 302 forensisch relevante Substanzen mit „Information Dependent Acquisition“ und anschließender Identifizierung durch MS/MS Bibliothekssuche entwickelt. Dazu wurde MRM als „Survey-Scan“ und EPI als „Dependent Scan“ zur Aufnahme der Produkt-Ionen Spektren verwendet. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Substanzen in einem Lauf identifizieren und detektieren zu können. Das Verfahren wurde erfolgreich in 30 forensischen Fällen getestet. Für klinische und forensische Fragestellungen wurde eine gezielte Methode für 1,4- Dihydropyridin Calciumantagonisten mit MRM erstellt. Mit Hilfe dieser Methode war der Nachweis von elf 1,4-DHP in therapeutischer und toxischer Konzentration im Serum möglich.
152 Literatur
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166 Anhang
6. Anhang
I. Multi Target Screening Tabelle 6-1 MTS: Substanzen, Übergange, Kollisionsenergien
Name Q1 * Q3* CE* Name Q1* Q3* CE*
6-O-monoacetylmorphine 328 165.0 50 mde2) 208.2 163.2 20 acebutolol 337.0 319.0 20 mdma3) 194.2 163 20 aceprometazine 327.1 239.8 35 meclozine 391.2 201 20 acrivastine 349.2 278.0 20 medazepam 271.1 91 35 ajmalin 327.2 158.2 50 meloxycam 352 115 35 alprazolam 325.2 297.0 35 melperone 264 165 35 alprenolol 250.2 173.0 20 mepindolol 263.2 116.1 20 amantadine 152.2 135.3 20 meprobamate 241.2 139 20 amiloride 230.2 171 20 mescaline 195.1 165.1 35 aminopenazone 232.2 113 20 mesoridazine 387.2 372.3 35 aminopromazine 328.1 238.1 20 metaclazepam 395 241.2 50 amiodarone 646 100.0 35 metamphetamine 150.2 91.0 20 amitriptyline 278.0 233.0 20 metformin 130.1 60.1 20 amlodipine 409 238.1 20 methadone 310 265.0 20 amphetamine 136 119.0 20 methadone, nor- 296.2 251 20 apomorphine 268.1 237.1 20 methylphenidat 234.2 84.1 35 aprinidin 323.2 114.1 20 methylscopolamine 318.2 152.1 35 astemizol 459.2 218.0 35 metipranol 310.2 191.2 35 atenolol 267.2 225.0 20 metoclopramide 300.2 227.0 20 atropine 290.1 124.1 35 metoprolol 268.2 191.0 20 befunolol 292.1 177 35 metronidazol 172.2 128 20 benazepril 424.9 351.1 35 mexiletine 180.2 58 20 benzatropine 308.2 167.1 35 mianserine 265.2 208.0 20 benzocaine 166.2 138.1 20 midazolam 326 291 35 benzoctamine 250.1 191.1 20 mirtazapine 266.2 195.0 35 benzoylecgonine 290.2 168.0 20 mizolastine 433.2 308.4 20 betaxolol 308.2 116.3 35 moclobemide 269 182 20 biperiden 312.2 98 35 molindone 277.2 100 35 bisoprolol 326.2 116.0 20 molsidomine 242.8 86.1 20 bromazepam 316 182.1 35 morphine 286 201.0 35 bromipheniramine 319.2 274.2 20 morphine-3-β-D- 462 285.8 20 glucuronide bromocriptine 655.2 346 35 naloxone 328.2 310.3 35 brotizolam 395 315.2 35 naltrexone 342.3 324.3 35 bunitrolol 249.2 193.2 20 Nateglinid 318.8 166.2 20 bupivacaine 289.2 140.3 35 nicardipine 480 314.9 35 bupranolol 272.1 216.1 20 nicotine 163.2 132.0 20 buprenorphine 468.2 396.3 50 nifedipine 347.2 254.0 20 buspirone 386.2 122 50 nilvadipine 386 326.0 20 butaperazine 410.1 141.2 35 nimodipine 419 343.1 20 caffein 195 138.0 35 nisoldipine 389 357.0 20 candesartan 441 263.2 20 nitrazepam 282.2 236 35 captopril 218.1 116.2 20 nitrendipine 361 314.8 20 carazolol 299.2 116.1 20 nizatidine 332.2 286 20 carbamazepine 237.0 194.0 20 norbuprenorphine 414.2 187.1 50 carbimazol 187.1 115 20 normorphine 272 272.0 35 carbinoxamine 291.2 202.0 20 nortriptyline 264.2 233.3 20 167 Anhang
Name Q1 * Q3* CE* Name Q1* Q3* CE* carbuterol 268.1 194.1 20 noscapine 414.1 220.1 35 carisoprodol 261.2 176 20 obidoxime 288.3 135.1 20 carteolol 293.2 237.1 20 OH-THC 331 313.0 20 carvedilol 407.2 222.0 35 olanzapine 313.2 256.0 35 celiprolol 380.2 251.0 35 ondansetrone 294.2 170 35 cetirizine 389.2 201.2 35 opipramol 364.1 171.2 20 chlorcyclizine 201 166 20 orphenadrine 270.4 181.2 20 chlordiazepoxide 300.2 282.0 35 oxazepam 287.0 269.0 20 chloroquine 320 247 35 oxcarbazepine 253.2 236 20 chlorpheniramine 275.2 230.2 20 oxitropium 332.2 166.2 35 chlorphenthiazine 305 72 50 oxprenolol 266.2 225.3 20 chlorpromazine 319 246 35 oxycone 316.2 298.3 20 chlorprothixene 316.0 231.0 35 papaverine 340.2 202 35 cinnarizine 369.2 167.0 20 paracetamol 152.0 110.0 20 citalopram 325.0 109.0 35 paroxetine 330.2 192 35 clemastine 344.2 215.2 20 penbutolol 292.3 236.2 20 clenbuterol 260.1 169.1 35 pentoxyverine 334.2 100 35 clobazam 301.2 259 35 perazine 340.2 141.1 35 clobazam, nor- 287 245 35 perphenazine 404.2 171.3 35 clobutinol 256.2 238 20 pethidine 248.2 220.3 35 clomethiazol 162 113 35 phenazone 189.2 147 35 clomipramine 315 86 35 phenylbutazone 309.2 160.3 35 clomipramine,desmethyl- 301.2 270.3 20 phenylpropanolamine 152.2 134.2 20 clonazepam 316 270 35 phenyltoloxamine 256.2 72 35 clonidine 230 213 35 phenytoin 253.2 182.3 20 clozapine 327.1 270.1 35 pilocarpin 209.2 95.1 35 cocain 304.2 182.0 35 pindolol 249.2 172.0 20 codeine 300.2 215.0 35 pioglitazon 357 134.2 35 coumatetralyl 293 175 35 Pirbuterol 241.1 167.2 20 cyclizine 267.4 167.2 20 piroxycam 332 164 20
D3-doxepin 283.1 107 35 practolol 267.2 225.0 20 D5-diazepam 290.1 198.1 50 prajmalium 369.2 158.2 50 demoxepam 287 269 20 prazepam 325 271 35 dextropropoxyphen 340.0 266.0 20 prazosin 384 247 35 diazepam 285.0 222.0 35 prilocaine 221.2 86 20 dibenzepin 296 251 20 primidone 219.2 162.3 20 dihydrocodeine 302 199.0 50 procainamide 236 163 20 dihydroergotamine 584.2 270.2 35 procaine 237 164 20 dilazep 605.2 195 50 promazine 285.0 86.0 20 diltiazem 415 178.0 35 prometazin 285.2 240 20 diphenhydramine 256.0 167.2 20 prometryn 242.2 158.2 35 dipyridamole 505.2 429.3 50 propafenone 342.2 324 20 disopyramine 340.2 239 20 propionylpromazine 341.2 86.1 20 dixyrazine 428.2 229 35 propranolol 260.2 155.0 35 doxapram 379.2 292.3 35 propyphenazone 231.1 56.1 50 doxepine 280.2 235.0 20 prothiopendyl 285.9 241.1 20 ebastine 470.2 203.0 35 protriptyline 264.2 191.2 35 ecgoninemethylester 200 81.0 35 pseudoephedrine 166.2 148 20 embutramide 294.2 208 20 quetiapine 384.1 253.1 20 enalapril 377.1 234.2 35 quinapril 439.3 234.1 20 eprosartan 425 207.3 35 quinine 325.2 307 35 ergotamine 582.2 564.3 20 ramipril 417.1 234.3 35 esmolol 296.2 145.2 35 ranitidine 315.2 176 20 ethenzamide 166.2 149 20 repaglinid 453.3 230.3 35 168 Anhang
Name Q1 * Q3* CE* Name Q1* Q3* CE* ethylmorphine 314.2 229.0 35 reproterol 390.1 372.2 20 ethylparathion 292 236 20 risperidone 411 191 35 felodipine 384.2 338.2 20 rocurone 529.4 487.2 35 fenazepam 351 206 50 ropivacaine 275.2 126 35 fendiline 316.1 212.4 20 rosiglitazone 358 135.4 35 fenetyllin 342.2 207 35 scopolamine 304.2 138.2 35 fenfluramine 232 159 35 sertindol 441.2 113 35 fentanyl 337.2 188.3 35 sertraline 306 275.2 20 fexofenadine 502.2 466.2 35 sildenafil 475.1 100.1 35 flecainide 415.2 398.3 35 sisapride 466.2 184 35 fluconazole 307.2 238 20 sotalol 273.2 255.0 20 flunitrazepam 314.2 268.3 35 sulindac 357 233 35 fluoxetine 310.2 148.0 20 sulpride 342.2 214 35 flupentixol 435.2 390.3 35 talinolol 364.2 308.3 20 fluphenazin 438.1 171.2 35 telmisartan 515 497.1 50 flurazepam 388 315 20 temazepam 301.0 255.0 35 fluvoxamine 319.2 259 20 terfenadine 472.2 436.4 35 gallopamil 485 165.0 35 tertalolol 296.3 240.2 20 glibenclamide 494.4 369.0 20 tetracaine 265.2 176 20 glibornuride 367.1 152.2 35 tetrahydrocannabinol 315.2 193.2 20 gliclazide 324.4 127.1 35 THC-COOH4) 345 327.0 20 glimepirid 491.1 352.1 20 theobromine 181 138 20 glipizide 446.2 321 20 theophylline 181.2 124.2 20 gliquidon 528 403.4 20 thioridazine 371.0 126.0 35 haloperidol 376.0 165.0 35 tilidine 274.2 155.1 20 heroin 370 165.0 50 timolol 317.2 261.0 20 hydrocodone 300.2 199.0 35 tiothixene 444.2 98.1 50 hydroxychloroquine 336.2 247 35 titzanidine 254 210 35 hydroxyzine 375.2 201 35 tocainide 193.5 122.2 20 imipramine 281.2 208 35 tolbutamide 271.1 155.0 20 indomethacine 358 138.8 20 toliprolol 224.2 147.1 20 irbesartan 429.3 207.3 35 tolubuterol 228.1 154.1 20 isoniazide 138.2 121 20 tramadol 264.0 58.0 20 isradipine 372.4 340.0 20 trazodone 372 176 35 ketamine 238.2 220 20 triamteren 253.8 237 35 ketoprofen 255 209 35 triazolam 343 308 35 ketorolac 256.2 105 20 trifluorperazin 408.2 141.2 35 labetalol 329.2 311.0 20 trifluperidol 410.1 165.2 20 lacidipine 354 310.1 35 trimethoprim 291.2 230.0 35 lamotrigine 256 211 35 trimipramine 295.2 100 20 lercarnidipine 612.1 280.1 35 valsartan 436 306.0 20 levobunolol 292.2 236.1 20 vardenafil 489 151.1 50 levocabastine 421.2 375.0 35 venlafaxine 278.2 260.3 20 levomepromazine 329.0 242.0 35 verapamil 455.2 165.0 35 lidocaine 235.2 86.0 20 warfarine 309.2 251.0 20 lisinopril 406.2 246.1 35 zolpidem 308.2 235.3 35 loratadine 383.0 337.0 35 zopiclone 389.0 245.0 20 lorazepam 321.2 303.0 20 zuclopenthixol 401.1 231 35 losartan 423 405.3 20 miconazole 416.9 159.1 35 lysergic acid diethylamide 324.2 223.0 35 vincamine 355.1 337.2 35 malathion 331.2 127 20 zimeldine 318.9 274 20 mda 1) 163.1 133.2 20
169 Anhang
Q1 [amu], Q3 [amu], CE [eV],1) mda 3,4 methylenedioxyamphetamine ,2) mde 3,4- methylenedioxy- ethamphetamine,3) mdma 3,4-methylendioxyamphetaminamphetamine4), THC-COOH Tetrahydrocannabinol Carbonsäure
170 Anhang
II. Multi Target Screening: Beispiele Realproben a) Amtriptyllin aus Realprobe (Serum):
MRM Chromatogramm
Enhanced Produkt
Ionen Scan bei
+ 20 eV CE
Enhanced Produkt Ionen Scan bei + 35 eV CE
Enhanced Produkt Ionen Scan bei + 50 eV CE
Abb. 6-1: TIC und die Produkt-Ionen Spektren bei 20, 35, 50 eV CE
Bibliotheksuche für die bei 12,88 min eluierende Substanz (Amitriptyllin): Vergleich der Produkt-Ionen Spektren der Realprobe (oben) und dem Bibliothekseintrag (Abb. 6-2 - 6-4).
Realprobe Spektrum
Bibliotheksspektrum
Abb.6-2: Ergebnisformular der Bibliothekssuche: Amtriptyllin 20 eV CE
171 Anhang
Abb. 6-3: Ergebnisformular der Bibliothekssuche: Amtriptyllin 35 eV CE
Abb. 6-4: Ergebnisformular der Bibliotheksuche: Amitriptyllin 50 eV CE
172 Anhang b) Codein aus Realprobe (Serum) extrahiert:
Codein MRM Chromatogramm
Enhanced Produkt Ionen Scan bei + 20 eV CE
Enhanced Produkt Ionen Scan bei + 35 eV CE
Enhanced Produkt Ionen Scan bei + 50 eV CE
Abb. 6-5: TIC und die Produkt-Ionen Spektren bei 20, 35, 50 eV CE
Bibliothekssuche für die bei 2,01 min eluierende Substanz (Codein) Vergleich der Produkt-Ionen Spektren der Realprobe (oben) und dem Bibliothekseintrag (Abb. 6-6 - 6-8).
Realprobe Spektrum
Bibliotheksspektrum
Abb. 6-6: Ergebnisformular der Bibliothekssuche Codein: 20 eV CE 173 Anhang
Abb. 6-7: Ergebnisformular der Bibliotheksuche: Codein 35 eV CE
Abb. 6-8: Ergebnisformular der Bibliothekssuche: Codein 50 eV CE
174 Anhang
III. Multi Target Screening: Beispiel für Dynamic Exclusion
Metformin
60 s Übergang wird ignoriert.
Abb. 6-9: Nach demÜbergang m/z 130,1 → 60,1, erfolgt Abb. 6-10: Nach Detektion eines gemessenen Übergangs die Ausblendung des Übergangs für 60 s. Metformin das von m/z 130,1 → 60,1 wird der Übergang für die restl. Zeit den gleichen Übergang besitzt und deutlich später eluiert, ignoriert – Metformin kann nicht detektiert werden. kann detektiert werden.
175 Anhang
IV. Produkt-Ionenspektren der 1,4-DHP bei 20 eV CE Amlodipin Felodipin Isradipin Lacidipin Lercanidipin Nicardipin MS2: m/z 409 MS2: m/z 384 MS2: m/z 372 MS2: m/z 456 MS2: m/z 612 MS2: m/z 480
] s p c [
t
Intensitä
m/z [amu] m/z [amu] m/z [amu] m/z [amu] m/z [amu] m/z [amu]
Nifedipin Nilvadipin Nimodipin Nisoldipin Nitrendipin MS2: m/z 347 MS2: m/z 386 MS2: m/z 419 MS2 :m/z 389 MS2: m/z 361
] s p c [
Intensität
m/z [amu] m/z [amu] m/z [amu] m/z [amu] m/z [amu]
Abb. 6-11 Produkt-Ionen Spektren der 1,4-DHP bei 20 V, Konzentration der Lösungen 10 µg/ml, Nilvadipin 1mg/ml, 100 ng injiziert (10µg Nilvadipin).
176 Anhang
V. Tabelle 6-2 Produkt-Ionenspektren der Angiotensin-AT1-Rezeptor-Antagonisten bei 20, 35, 50 eV
Konzentration der Lösungen 10 µg/ml, Candesartan und Valsartan 100 µg/ml, Injektionsvolumen je 20 µl Candesartan Eprosartan Irbesartan
20 eV
35 eV
50 eV
Losartan Telmisartan Valsartan
20 eV
35 eV
50 eV
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Lebenslauf
Persönliche Daten Name: Claudia Andrea Müller Geburtsdatum: 18.09.1972 Geburtsort: Freiburg i. Br. Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch
Ausbildung
Schule 09/1979 – 07/1983 Weiherhof-Grundschule, Freiburg 09/1983 – 06/1992 Droste-Hülshoff-Gymnasium, Freiburg 06/1992 Abitur 09/1992 – 04/1993 Walther-Rathenau-Gewerbeschule, Freiburg Beginn einer Ausbildung zur PTA, Abbruch wegen Erhalt eines Studienplatzes
Studium 05/1993 – 10/1997 Pharmaziestudium an der Bayerischen Julius- Maximilians-Universität, Würzburg 12/1998 Approbation als Apothekerin
Praktika 11/1997 – 04/1998 St. Vitus Apotheke, Rottendorf 05/1998 – 10/1998 Department of Psychiatry, Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, USA
Arbeitsstellen 03/1999 – 03/2001 Zentralapotheke Klinikum Offenburg 04/2001 – 09/2001 Apotheke St. Josefskrankenhaus, Freiburg
Promotionsstudium 10/2001 – 07/2004 Anfertigung der Dissertation mit dem Thema “Entwicklung von Screeningverfahren für Arzneistoffe und Metaboliten mittels LC-MS und LC-MS/MS“ am Institut für Rechtsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg unter Leitung von PD Dr. Wolfgang Weinmann
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Veröffentlichungen im Rahmen der Promotion
Vorträge Müller C. A., Weinmann W., Entwicklung einer ESI-CID Massenspektrenbibliothek für LC-MS zum General-Unknown-Screening und zur gezielten toxikologischen Analyse. 2003; (82. Jahrestagung der DGRM, 17.-20.09., Münster)
Müller C. A. Schreiber A., Gergov M., Maralikova B., Weinmann W., Improvement of Mass Spectra Libraries for LC-MS / LC-MS/MS and their Applications in Forensic Toxikology for General Unknown Screening and Target Compound Analysis. 2003 (41. TIAFT, Melbourne, 16.-21.11)
Müller C. A., Thierauf A., Weinmann W., Der Alkoholkonsummarker Ethylglucuronid 5. Pharmazieworkshop, 2003 (Oberjoch 24.03. – 28.03.)
Müller C. A., Kempf J., Weinmann W., Liquid Ecstasy 6. Pharmazieworkshop, 2004 (Oberjoch 29.03. – 2.04.)
Poster Müller C. A., Vogt S., Schäfer P., Weinmann W., Combining an ESI-CID massspectra and a UV-spectra library of drugs with an Access database for clinical and forensic-toxicological analysis. 2002 (50. Jahrestagung der American Society of Mass Spectrometry (ASMS), 2.-6.06.,Orlando, Florida)
Müller C. A., Schäfer P., Weinmann W., General-unknown-Screening mit LC-DAD und online LC-MS mit Spektrenbibliothekssuche 2002; (81. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Rechtsmedizin, 24.-28.09., Rostock-Warnemünde)
Müller C. A., Slawik M., Petersen J., Weinmann W., Detection of Pergolide in Breastmilk and Plasma by LC-MS/MS 2003 (Jahrestagung der American Society of Mass Spectrometry (ASMS) 6.-12.06., Montréal, Canada)
Publikationen Müller C., Schäfer P., Störtzel M., Vogt S., Weinmann W., Ion Suppression Effects in Liquid Chromatography-Electrospray-Ionisation Transport-Region Collision Induced Dissociation Mass Spectrometry with Different Serum Extraction Methods for Systematic Toxicological Analysis with Mass Spectra Libraries, Journal of Chromatography B Analyt Technol Biomed Life Sci 773 47-52 (2002).
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Im Druck:
Müller C. A., Baranda González A. B., Weinmann W., Screening for dihydropyridine calcium channel blockers in plasma by automated solid phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry
Eingereicht Journal of Clinical Endocrinology (März 2004):
Slawik M., Müller C. A., Weinmann W., Reincke M., Petersen J., Treatment of macroprolactinoma: pergolide passes into breast milk.
Weitere Publikationen Klein U., Müller C., Chu P., Birnbaumer M., von Zastrow M,. Heterologous inhibition of G protein-coupled receptor endocytosis mediated by receptor-specific trafficking of beta-arrestins. Journal of Biological Chemistry 276 (20) 17442- 17447 (2001)
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