Universidad Nacional de Luján

Estudios Básicos y de Aplicación de una aspartil peptidasa de Salpichroa origanifolia

Tesis para Optar al Grado de Doctor Gabriela Fernanda Rocha

Directora: Dra Mónica G. Parisi Co-Directora: Dra Adriana M. Rosso

2014

“Empieza por hacer lo necesario, luego lo posible y de pronto te encontrarás haciendo lo imposible”

Francisco de Asís

A mis hijos

AGRADECIMIENTOS

Quisiera expresar mi más profundo agradecimiento a todas las personas e instituciones que de una forma u otra han tenido que ver con el desarrollo de esta Tesis Doctoral.

A quien me permitió comenzar este camino: gracias Graciela, en primer lugar y antes que nada por su incondicional ayuda.

A Mónica y Adriana, quienes decidieron continuar la dirección de mi trabajo de investigación en forma tan profesional como amorosa y fueron mi sostén y conducción en todas las situaciones.

A Susana por su calidez y preocupación.

A Norberto por su agradable presencia, nunca olvidaré sus anécdotas y la pasión que dejaba ver en ellas. He aprendido mucho en esta etapa, gracias por aceptarme en su grupo de trabajo, por su confianza, por sus conocimientos, dedicación y preocupación.

A los miembros evaluadores por aceptar la oposición de este trabajo.

A las autoridades de la Universidad Nacional de Luján por darme la oportunidad de ser parte de ella y por el financiamiento para llevar a cabo esta investigación.

De manera especial a los integrantes de nuestro laboratorio: Jorgelina, Eugenia, Francisco, Anabella, Hernán, y Natalia los que siempre están dispuestos a colaborar, a brindar su opinión y a escuchar, por el apoyo incondicional que me han dado en todo momento.

A Laura, Ana Lía, Edith y Nancy por su ayuda y calidez.

A mis nuevas compañeras: Emilia, Natalia y Sofía, una bendición haberlas conocido.

A David, Mariana y Sebastián, que aunque estén lejos sé que puedo contar con ustedes, gracias también por los buenos momentos compartidos.

Al grupo de investigación de la Prof. Beatriz González, en especial a Josefina, Sebastián y Camila, al Prof. Oscar López y a Lali por su colaboración y por su inestimable ayuda.

Al personal técnico de la Universidad Nacional de Luján, en especial a Claudia, Víctor y Cacho por el esfuerzo y colaboración desinteresada, son una parte esencial de nuestra Universidad.

A mi familia, que ha estado siempre, que me dejo SER.

i Mi mamá: mi cómplice.

Mi papá: la fuerza y la perseverancia.

Mis hermanas: Pao, mi niña y Bell definitivamente mi alma gemela, maestra e incondicional en todas las formas posibles.

Mis hijos: Nacho, Fede y Sebas el reflejo de lo que SOY, mis guías y camino a seguir, su esencia es AMOR en estado puro, únicos y eternos.

¡LOS AMO!

ii RESUMEN

“Estudios básicos y de aplicación de una aspartil peptidasa de Salpichroa origanifolia”

Este trabajo de investigación se inicia con el hallazgo de una enzima proteolítica con actividad coagulante de la leche en los frutos maduros de la especie Salpichroa origanifolia. En ensayos preliminares se encontró que el extracto crudo enzimático presentaba un pH óptimo de naturaleza ácida, mostraba buena estabilidad térmica a temperaturas moderadas y que la actividad enzimática era inhibida por pepstatina, un inhibidor específico de las endopeptidasas aspárticas.

Mediante un esquema de purificación simple que combinó la precipitación etanólica seguida por la cromatografía de intercambio aniónico en columnas de Mono Q en FPLC, se purificó una peptidasa aspártica a la que nombramos salpichroína, con un 32.1% de rendimiento y un grado de purificación de 13.4 veces.

Para evaluar la pureza de esta fracción activa, se aplicaron técnicas de electroforesis SDS-PAGE y zimogramas con gelatina polimerizada en la matriz del gel y se encontró que la enzima pura migraba como una única banda de peso molecular aparente de 32 kDa.

Salpichroína presentó valores óptimos de actividad proteolítica con hemoglobina a pH 3.0-4.5 y con caseína a pH 5.5-6.0, a temperaturas moderadas (40°C); sin embargo mostró baja estabilidad térmica comparada con el extracto crudo. Por este motivo, se desarrollaron técnicas de inmovilización de la enzima en soportes glutaraldehído–agarosa que permitieron incrementar su estabilidad térmica 60 veces respecto de la enzima libre a 50°C. El comportamiento enzimático de la enzima pura frente a inhibidores diagnóstico mostró que era inhibida por pepstatina pero no por PMSF, E64, EDTA o 1,10-fenantrolina, confirmando que se trataba de una peptidasa aspártica.

Los estudios cinéticos demostraron que salpichroína presentaba baja afinidad por el sustrato sintético H-Pro-Thr-Glu-Phe-p-(NO2)-Phe-Arg-Leu-OH, específico de aspartil peptidasas con valor de Km de 494 µM y elevada afinidad por caseína con valores de Km de 164 µM. Salpichroína hidrolizó la cadena β de la insulina oxidada en seis enlaces peptídicos, mostrando especificidad de clivaje similar a la de la quimosina bovina.

El análisis de la enzima por PMF-MALDI-TOF/MS y MALDI-TOF-TOF/MS-MS y su comparación con bases de datos mostró que la peptidasa aislada está emparejada con otras peptidasas de plantas que pertenecen a la familia A1 de las aspartil peptidasas y aunque el

iii análisis filogenético la ubicó en el subgrupo Ia, no se le pudo asignar una función específica en la planta.

Se analizó la posible aplicación del extracto crudo, de la enzima inmovilizada y de la enzima pura en procesos relacionados con los alimentos. Se encontró que el extracto crudo producía la coagulación de la leche bovina con tiempo de coagulación superior al producido por un cuajo comercial (FPC). Además, las características del coágulo formado por el extracto crudo era diferente, obteniéndose un gel con menor consistencia y menor grado de sinéresis. Esto se confirmó al analizar los sitios de clivaje de la κ-caseína ya que, a diferencia de la quimosina, salpichroína no hidrolizaba específicamente el enlace Phe105-

Met106.

Se estudió luego la actividad hidrolítica de la enzima libre e inmovilizada sobre proteínas lácteas (caseínas bovina, caprina y ovina, fracciones α-, β- y ĸ- de la caseína bovina y proteínas del lactosuero) y se evaluó la actividad antimicrobiana, antioxidante y antihipertensiva de los péptidos obtenidos por hidrólisis enzimática con el propósito de analizar el uso potencial como ingredientes alimentarios.

En la hidrólisis de las proteínas del lactosuero bovino con la enzima libre e inmovilizada en glutaraldehído-agarosa se alcanzó un grado de hidrólisis cercano al 6% a las 20 horas de reacción. Las fracciones de los hidrolizados con peso molecular inferior a 10 kDa mostraron actividad antioxidante y antimicrobiana in vitro, mientras que los de peso molecular inferior a 3 kDa mostraron elevada actividad antihipertensiva in vitro con un valor de IC50 de 5 µg.mL-1. Los péptidos de peso molecular inferior a 10 kDa separados por ultrafiltración fueron encapsulados con β-ciclodextrinas y el análisis por calorimetría diferencial de barrido permitió inferir la formación de complejos de inclusión entre dichos compuestos. Con el fin de analizar la estabilidad y biodisponibilidad de los péptidos, se evaluó la actividad antioxidante de los mismos por el método del DPPH y se analizó la variación de esta actividad en condiciones de digestión gastrointestinal simulada, utilizando pepsina y pancreatina como enzimas digestivas. Se encontró que la actividad antioxidante disminuyó luego de la digestión tanto en las muestras de péptidos libres como en complejos. La actividad antioxidante de los péptidos libres no varió significativamente durante la digestión gástrica, sin embargo luego de la digestión pancreática la actividad antioxidante relativa disminuyó un 90% respecto del valor inicial. Los complejos de inclusión péptidos– β CD mostraron el mismo comportamiento durante la simulación de la digestión ácida pero retuvieron más del 50% de la actividad inicial durante la digestión intestinal. Estos

4 resultados demostraron que la formación de complejos de inclusión permite preservar la funcionalidad de los biopéptidos.

Por último se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de salpichroína frente a bacterias potencialmente patógenas del hombre y a hongos contaminantes de los cultivos. Se observó un importante efecto inhibitorio sobre cepas bacterianas de Staphylococcus aureus y Serratia marcescens y sobre el oomicete Phytophthora capsici, causante de la putrefacción y tizón tardío de vegetales de interés agroeconómico como los zapallitos verdes, los pimientos, el tomate y las berenjenas entre otros. La enzima pura fue aplicada en bioensayos de control de la contaminación de zapallitos verdes y se obtuvo un fuerte efecto citotóxico aun en bajas concentraciones, convirtiéndola en un compuesto de interés para ser empleada en la conservación de estos vegetales.

Palabras claves: actividad proteolítica, salpichroína, proteínas lácteas, hidrólisis, péptidos bioactivos.

5 ABREVIATURAS

α-La: α-Lactoalbúmina

ANOVA: Analysis of Variance (Análisis de la varianza)

AP: Aspartil peptidasa

β-CD: β-Ciclodextrina

β-Lg: β-Lactoglobulina

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

CBB-R250: Coomassie Brillant Blue R250

DEAE-Sepharose: Dietilaminoatil-Sepahorose

DSC: Differential Scanning Calorimetry (Calorimetría diferencial de barrido)

E-64: Ácido Trans-epoxisuccinil-L-leucil-amido (4-guanidinio) enediamintetraacético

EC: Enzyme commission

EDTA: Ácido Etilen Diamin Tetraacético

FPC: Quimosina producida por fermentación

FPLC: Fast-Performance Liquid Chromatography (Cromatografía líquida rápida)

GH%: Grado de hidrólisis porcentual

HPLC: High-Performance Liquid Chromatography (Cromatografía líquida de alto rendimiento)

IC50: Concentración inhibitoria media

IUBMB: International Union of Biochemistry and Molecular Biology

LC/MS/MS: Liquid Chromatography/Mass Spectroscopy/Mass Spectroscopy (Cromatografía Líquida/Espectrometría de Masas/Espectrometría de Masas)

MALDI-TOF MS: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight Mass

Spectroscopy (Espectroscopía de Masa Laser de Desorción/Ionización Asistida por Matriz-Analizador de Tiempo de Vuelo)

Medio PDA: Potato Dextrose Agar (agar papa dextrosa)

6 Medio TSA: Tryptic Soy Agar (medio agarizado, digerido de soja y caseína)

Medio TSB: Tryptic Soy Broth (medio líquido, digerido de soja y caseína)

Medio V8: medio compuesto por ocho vegetales m/z: Relación masa/carga+1

OD: Densidad óptica

OPA: ácido o-ftalaldehído

PEI-agarosa: Polietilénimina-agarosa

PMF: Peptide Mass Finger Print (Huella Peptídica)

PMSF: Fenilmetilsulfonilfluoruro

PNPE: sustrato sintético para AP (H-Pro-Thr-Glu-Phe-p-(NO2)-Phe-Arg-Leu-OH)

PSI: Plant Specific Insert (Inserto Específico de Plantas)

RP-HPLC: Reversed phase HPLC (HPLC de Fase Reversa)

SAPLIPs: Saposin-Like Protein Family (Familia de Proteínas Similares a Saposinas)

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Electroforesis Desnaturalizante en Geles de Poliacrilamida)

SEC-FPLC: Size exclusion FPLC (FPLC de exclusión molecular)

TC: Tiempo de coagulación

TCA: ácido tricloro acético

TEMED: N,N,N´,N´-tetrametiletilenodiamina

WPC: Whey Protein concentrate (Concentrado de proteínas del lactosuero)

vii

ÍNDICE GENERAL

Contenido AGRADECIMIENTOS ...... i RESUMEN ...... iii ABREVIATURAS ...... vi ÍNDICE GENERAL...... viii INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LAS PEPTIDASAS ...... 1 GENERALIDADES ...... 1 CLASIFICACIÓN ...... 2 Peptidasas serínicas y treonínicas ...... 6 Peptidasas cisteínicas ...... 7 Peptidasas aspárticas ...... 8 Metalopeptidasas ...... 11 Peptidasas glutámicas ...... 11 Peptidasas de mecanismo catalítico desconocido ...... 12 APLICACIONES INDUSTRIALES Y BIOTECNOLÓGICAS DE LAS PEPTIDASAS ...... 12 Elaboración de quesos ...... 15 Tiernizado de carnes ...... 16 Elaboración de cerveza...... 17 Panificación ...... 17 Obtención de proteínas modificadas para la industria alimenticia ...... 18 Otros usos industriales ...... 18 Usos bioquímicos, farmacológicos y médicos ...... 19 PROTEASAS ASPÁRTICAS DE PLANTAS ...... 20 Organización de la Estructura Primaria ...... 20 Estructura Secundaria y Terciaria ...... 25 Activación de la proenzima ...... 26 Distribución en los tejidos y función ...... 27 La familia Solanaceae ...... 29 Salpichroa origanifolia ...... 32 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 36 OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS ...... 48 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 50

viii MATERIAL VEGETAL ...... 50 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO CRUDO ENZIMÁTICO ...... 50 MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ...... 51 Actividad proteolítica ...... 51 Actividad coagulante ...... 53 CONTENIDO DE PROTEÍNAS ...... 53 ENSAYOS DE CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA ...... 54 Efecto del pH sobre la actividad proteolítica ...... 54 Efecto de la temperatura sobre la actividad proteolítica ...... 54 Ensayos de estabilidad térmica ...... 55 Estabilidad en el almacenamiento prolongado a bajas temperaturas ...... 55 Efecto de compuestos reductores sobre la actividad proteolítica ...... 55 Efecto de inhibidores ...... 56 ESTRATEGIAS DE PURIFICACIÓN ...... 56 Cromatografía de intercambio aniónico en columnas DEAE-Sepharose Fast Flow ...... 56 Cromatografía de intercambio iónico en una columna Mono Q con un equipo FPLC ...... 57 TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA ...... 58 Electroforesis en condiciones nativas y desnaturalizantes ...... 58 Determinación de actividad enzimática en geles de poliacrilamida ...... 60 ENSAYOS DE CARACTERIZACIÓN CINÉTICA ...... 60 Determinación de las constantes cinéticas ...... 60 Cinética de inhibición con Pepstatina ...... 61 Especificidad de clivaje de la enzima purificada sobre la cadena β de la insulina oxidada 61 ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN POR TÉCNICAS PROTEÓMICAS ...... 61 CONSTRUCCIÓN DEL ÁRBOL FILOGENÉTICO ...... 62 TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS ...... 63 Preparación de soportes para la inmovilización de la enzima ...... 63 Preparación de los derivados inmovilizados ...... 64 Caracterización bioquímica de los derivados inmovilizados ...... 66 ACTIVIDAD COAGULANTE DEL EXTRACTO CRUDO ...... 66 Diseño de experimentos para determinar las condiciones de coagulación ...... 67 Microscopía óptica de la formación del coágulo lácteo ...... 68 ACTIVIDAD HIDROLÍTICA SOBRE PROTEÍNAS LÁCTEAS ...... 69 Hidrólisis de caseínas bovina, ovina y caprina ...... 69 Hidrólisis de α-, β- y κ-caseína bovina ...... 70

9 Hidrólisis de las proteínas del lactosuero ...... 71 Electroforesis Tricina SDS PAGE ...... 74 ACTIVIDADES BIOLÓGICAS DE LOS PÉPTIDOS OBTENIDOS POR HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA ..... 75 Actividad antimicrobiana de los hidrolizados ...... 76 Actividad antihipertensiva de los hidrolizados ...... 77 Actividad antioxidante de los hidrolizados ...... 77 FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE INCLUSIÓN EN CICLODEXTRINAS ...... 78 Preparación de complejos β-ciclodextrina y péptidos obtenidos por hidrólisis del WPC .. 78 Análisis de los complejos por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) ...... 80 Simulación de la digestión gastrointestinal de la fracción de péptidos y de sus complejos ...... 80 Cromatografía de exclusión molecular (SEC-FPLC) ...... 81 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO DE LA ENZIMA SALPICHROÍNA ...... 81 Actividad antibacteriana in vitro ...... 82 Actividad antifúngica in vitro ...... 83 Inoculación controlada del fitopatógeno Phytophthora capsici sobre zapallitos verdes ... 84 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...... 85 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 86 CAPÍTULO I: ESTUDIOS BÁSICOS...... 90 INTRODUCCIÓN AL CAPÍTULO I ...... 90 Estrategias para el aislamiento y purificación de enzimas vegetales ...... 90 Análisis e identificación por técnicas proteómicas ...... 93 Inmovilización de proteínas y enzimas...... 97 RESULTADOS DEL CAPÍTULO I ...... 105 Elección del material de trabajo ...... 105 Obtención del extracto crudo ...... 105 Purificación de la aspartil peptidasa ...... 111 Caracterización de la enzima pura ...... 117 Inmovilización de salpichroína ...... 132 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 141 CAPÍTULO II: ESTUDIOS APLICADOS ...... 152 INTRODUCCIÓN AL CAPÍTULO II ...... 152 COAGULACIÓN DE LA LECHE ...... 152 Fracciones caseínicas de la leche bovina ...... 154 Etapas de la coagulación de la leche ...... 155

1 0 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS DE INTERÉS PARA LA INDUSTRIA ALIMENTICIA ... 158 Sustratos proteicos ...... 159 Las proteínas lácteas ...... 161 Péptidos bioactivos ...... 163 Ciclodextrinas ...... 170 PEPTIDASAS VEGETALES COMO ANTIMICROBIANOS NATURALES ...... 175 Mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos (AMP) ...... 178 Campo de aplicación de los AMP naturales ...... 180 RESULTADOS DEL CAPÍTULO II ...... 182 ENSAYOS DE COAGULACIÓN DE LA LECHE ...... 182 Microscopía de la formación del coágulo lácteo ...... 187 HIDRÓLISIS DE LAS PROTEÍNAS LÁCTEAS ...... 189 Hidrólisis de caseinatos ...... 190 Hidrólisis de las proteínas del lactosuero bovino ...... 199 CAPACIDAD ANTIMICROBIANA DE LA ENZIMA SALPICHROINA ...... 222 Actividad antibacteriana de salpichroína ...... 222 Actividad antifúngica de salpichroína ...... 226 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 233 CONCLUSIONES GENERALES ...... 253

1 1

Introducción General

INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LAS PEPTIDASAS

GENERALIDADES

Las peptidasas, también denominadas enzimas proteolíticas o proteasas, son enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace peptídico en proteínas o sustratos peptídicos. Están ampliamente distribuidas en la naturaleza y tienen como función principal la degradación de las proteínas intracelulares o extracelulares que cumplen roles fisiológicos importantes en el crecimiento y en la adaptación al medio ambiente de numerosos organismos. Intervienen en una gran variedad de procesos fisiológicos tales como la homeostasis, digestión, remodelado tisular, ciclo celular, inmunidad, fertilización y apoptosis. En algunos microorganismos la secreción extracelular de peptidasas interviene en el establecimiento de relaciones de amensalismo o como factor de virulencia necesario para la infección (Bostanci y Belibasakis, 2012).

Las peptidasas pueden actuar sobre un sustrato de manera específica produciendo proteólisis limitada que permita generar una especie activa a partir de un zimógeno o en forma no específica, degradando completamente el sustrato (Trillo Muyo, 2013; Barrett y col., 1998). En general, las peptidasas se unen al sustrato apropiado a través de los sitios activos que permiten luego catalizar la hidrólisis de la unión peptídica específica. El sitio activo de las peptidasas tiene una doble función: participar en la unión enzima-sustrato y catalizar la hidrólisis del enlace peptídico; por eso la eficiencia de ambas funciones determinará la actividad de la peptidasa frente a un sustrato. La zona de unión en el sitio activo puede ser dividida en subsitios o sitios específicos (S), cada uno de los cuáles permite la ubicación de un residuo aminoacídico o de un grupo bloqueante del sustrato. Los subsitios están ubicados a ambos lados del sitio catalítico y a partir de él son numerados correlativamente, ya sea en dirección al dominio N-terminal (S1, S2, S3, etc.) o hacia el C- terminal (S´1 S´2, S´3, etc.). Los aminoácidos de la zona del sustrato que interactúan con la peptidasa son numerados como P1, P2, P3, P´1, P´2, etc., de acuerdo a los subsitios en los cuales se ubican, como se observa en la Figura I (Baker y Numata, 2013).

1

Figura I.-. Hidrólisis del enlace peptídico por acción de una peptidasa. A) Esquema de la reacción hidrolítica. B) El sitio activo de las peptidasas está compuesto por subsitios (S). Cada S tiene afinidad por un residuo (P). Este mecanismo “llave y cerradura” determina la especificidad de la enzima. Fuente: Baker y Numata (2013).

CLASIFICACIÓN

Existen diferentes formas para ordenar y clasificar la información acerca de las peptidasas. Los más difundidos son el sistema de la Enzyme Commission (EC) y la Base de datos de peptidasas MEROPS, los cuales emplean diferentes criterios.

El sistema de clasificación EC utiliza la nomenclatura recomendada por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology; NC-IUBMB) con el asesoramiento de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (International Union of Pure and Applied Chemistry; IUPAC). Una de las características más interesantes de este sistema es que para cada peptidasa existe un único código EC asignado, de manera que puede ser utilizado como referencia inequívoca para la enzima. Además de este código, también se indica el nombre recomendado, así como la lista de otros nombres posibles presentes en la literatura científica. Siguiendo las recomendaciones de la EC del NC-IUBMB el término peptidasa está reservado a todas las hidrolasas que actúan sobre los enlaces peptídicos (NC-IUBMB, 2006). Las peptidasas pertenecen a la clase de las hidrolasas EC 3 y dentro de esta clase, a la subclase EC 3.4 que contiene las enzimas que catalizan la hidrólisis de la unión peptídica. Esta base de datos puede ser consultada en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/

El sistema EC tiene la desventaja de no tener en cuenta la existencia de grupos estructurales que reflejen las relaciones evolutivas de las peptidasas miembro de cada clase.

2 Por esta causa en 1993, Rawlings y Barrett comenzaron el diseño de un sistema de clasificación de peptidasas que las agrupa teniendo en cuenta esta característica fundamental.

La base de datos de MEROPS comenzó a funcionar en 1996, y actualmente puede ser consultada en la página web http://merops.sanger.ac.uk. De acuerdo a este sistema existen tres criterios para clasificar a las peptidasas: a) según su mecanismo catalítico, b) según la reacción que catalizan o c) según su estructura y homología.

a) Peptidasas clasificadas de acuerdo al mecanismo catalítico

Las peptidasas se diferencian de casi todas las enzimas por su especificidad de sustrato. En 1960 Hartley propuso una forma de clasificación basada en las características de los mecanismos catalíticos, introduciendo el concepto de tipo catalítico. En la actualidad se conocen seis tipos catalíticos de peptidasas, cuyos nombres derivan de los aminoácidos que se encuentran en el sitio activo: peptidasas serínicas, cisteínicas, treonínicas, aspárticas, glutámicas y metalopeptidasas. Recientemente, Rawlings y col. (2011) demostraron la existencia de un séptimo tipo catalítico en el cual la enzima que actúa no es una hidrolasa sino una liasa que emplea un residuo de asparragina como nucleófilo de la reacción. Estos hallazgos permitieron a los autores considerar la existencia de enzimas proteolíticas que no son peptidasas. b) Peptidasas clasificadas de acuerdo a las características de la reacción que catalizan

A pesar de que las peptidasas catalizan la reacción de hidrólisis del enlace peptídico mediante un mecanismo general de ataque nucleofílico en el carbono carbonílico del enlace amida, cada enzima particular presenta selectividad por el enlace peptídico que hidroliza. Esta selectividad está relacionada con la posición del enlace que escinden en la cadena polipeptídica del sustrato. De esta manera se dividen en dos grupos: exopeptidasas y endopeptidasas. La mayoría de las peptidasas son claramente endopeptidasas o exopeptidasas, pero algunas de ellas exhiben actividad de ambos tipos. Por convención, cualquier enzima que tenga acción endopeptidásica es considerada como una endopeptidasa, aún cuando muestre además acción exopeptidásica.

Las exopeptidasas son aquellas enzimas que ejercen su acción a partir de los extremos de las cadenas polipeptídicas. Su especificidad requiere que uno de dichos

3 extremos ocupe un lugar específico dentro del sitio activo, por lo cual estas enzimas tienen poco efecto degradativo sobre la proteína intacta (Kervinen, 2013). Se clasifican teniendo en cuenta el tamaño del mismo, la identidad y el estado del extremo atacable, es decir si es C- ó N-terminal, si está o no bloqueado y el tamaño del fragmento escindido. De este modo se denominan aminopeptidasas a aquellas enzimas que remueven aminoácidos desde el dominio N-terminal y carboxipeptidasas a las que lo hacen desde el dominio C-terminal libre. Ambos tipos de enzimas pueden remover aminoácidos simples, dipéptidos ó tripéptidos a partir de cadenas polipeptídicas y esto permite separar a las di y tripeptidasas del resto.

Las endopeptidasas son aquellas enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos en el interior de las cadenas polipeptídicas. Los sitios activos no tienen afinidad por los grupos terminales de la cadena polipeptídica, por lo cual estas enzimas actúan bien sobre cadenas largas en puntos alejados de los extremos.

c) Peptidasas clasificadas de acuerdo a su estructura molecular y homología

Esta es una forma relativamente nueva de clasificar a las peptidasas que data de la década de 1990 porque depende de la disponibilidad de datos de secuencias de aminoácidos y estructuras tridimensionales. En la Tabla I se presenta el sistema de clasificación propuesto por Rawlings y Barrett en 1993, que tiene en cuenta los conceptos de clan, familia, peptidasa y tipo catalítico.

Tabla I.- Sistema MEROPS de clasificación de peptidasas.

Nivel Descripción

Peptidasas Las peptidasas se distinguen entre sí por diferencias en la actividad enzimática, por la estructura y por el origen genético

Familia Una familia incluye a todas las peptidasas que presentan homología de su secuencia aminoacídica, particularmente en la región de la molécula responsable de la actividad enzimática

Clan Un clan es un conjunto de familias en las que todas las peptidasas han evolucionado a partir de un único ancestro. Las familias en el mismo clan tienen en común que las peptidasas que las integran exhiben tipos de plegamiento similares

4 De acuerdo a esta clasificación, las peptidasas se agrupan en familias, las cuales a su vez se organizan en clanes. La nomenclatura de las familias y los clanes siguen el sistema introducido por Rawlings y Barrett (1993) donde ambos se identifican con una letra que denota el tipo catalítico seguida de un número o letra arbitrarios respectivamente. Las letras empleadas son: A (aspárticas), C (cisteínicas), S (serínicas), M (metalo), T (treonínicas), G (glutámicas), P (serínicas, treonínicas y cisteínicas), U (tipo catalítico no asignado). Algunas familias se dividen en subfamilias debido a que, desde hace mucho tiempo, hay evidencia de divergencias dentro de una misma familia, por ejemplo, familias S1A y S1B.

El concepto de tipo catalítico de una peptidasa mencionado anteriormente depende de la naturaleza química de los grupos responsables de la catálisis (Rawlings y col., 2014). Si bien cada uno de los tipos catalíticos de las endopeptidasas posee un mecanismo distintivo, éstos pueden agruparse en dos grandes categorías: peptidasas que forman complejos covalentes entre la enzima y el sustrato (S, C y T) y las que no forman complejos enzima-sustrato covalentes (A, G y M). La similitud fundamental es la estabilización del intermediario tetraédrico en la catálisis, mientras que difieren en si la peptidasa participa durante la catálisis covalente a través de uno de sus residuos (S, C o T) o si polariza una molécula de agua para llevar a cabo la catálisis (A, G o M). Los nucleófilos que participan en la catálisis covalente son serina, cisteína o treonina y la base es generalmente, pero no siempre, un residuo de histidina. En la catálisis ácido-base en general los ácidos y bases son las cadenas laterales de los residuos de aspártico o glutámico y en el caso de las metalopeptidasas participa el zinc (Figura II).

5

Figura II.- Las proteasas con distinto tipo catalítico se agrupan de acuerdo a dos mecanismos de acción: covalente y no covalente. El sombreado marca la superficie de la enzima, átomos procedentes de la proteasa o el agua unida a la proteasa se muestran en rojo; y los átomos originarios del sustrato se muestran en negro. Fuente: Turk (2006).

Peptidasas serínicas y treonínicas

Las peptidasas serínicas (EC 3.4.21) se caracterizan por la presencia de un residuo de serina en el sitio activo, que actúa como nucleófilo sobre el enlace peptídico que será escindido. Están presentes en virus, bacterias y en eucariotas y cumplen roles vitales en los organismos. Son activas generalmente en pH alcalino o neutro (7.0 - 11.0) y no requieren de activadores aunque algunas proenzimas son activadas por iones calcio. El peso molecular aparente oscila entre 18 y 35 kDa y el punto isoeléctrico entre 4.0 y 6.0. Presentan actividad amidolítica y esterolítica (Rawlings y Barrett, 2013).

De acuerdo a sus ancestros comunes se dividen en 16 clanes, que a su vez se subdividen en más de 30 familias según su estructura (Rawlings y col., 2014). Se destacan las familias de la quimotripsina (EC 3.4.21.1), de la tripsina (EC 3.4.21.4), de la trombina (EC 3.4.21.5), de la plasmina (EC 3.4.21.7) y de la subtilisina (EC 3.4.21.62).

Los miembros de los clanes de la quimotripsina (SA), subtilisina (SB), carboxipeptidasa Y (SC) y Escherichia D-Ala-D-Ala-peptidasa C (SE) no están relacionados a nivel de su estructura primaria, lo cual sugiere que han evolucionado a partir de 4 ancestros

6 diferentes. Sin embargo, los clanes SA, SB y SC tienen un mecanismo de reacción común que consiste en una tríada catalítica donde un residuo de serina actúa como nucleófilo, el aspartato como electrófilo y la histidina como base (Page y Di Cera, 2008).

Aunque estas enzimas son las más estudiadas en el campo de las proteasas, son relativamente pocas las que se han aislado y caracterizado en plantas (Obregón, 2008).

Las peptidasas treonínicas (EC 3.4.25) poseen el aminoácido treonina en su sitio activo y su mecanismo de catálisis es similar al de las peptidasas serínicas. Existen pocos ejemplos descriptos de este grupo, el más estudiado es el Complejo Multicatalítico del Proteosoma 26S (MCP), el cual escinde el compuesto conjugado de ubiquitina en plantas. El sistema MCP está formado por la fracción o núcleo de 20S que contiene a la peptidasa treonínica y por las partículas reguladoras de 19S (Smalle y Vierstra, 2004; Seemüler y col., 1995). Estudios recientes indican que el sistema proteolítico está implicado en la degradación específica de proteínas dañadas y en el recambio proteico, y no participa en la degradación de proteínas durante la senescencia foliar (Gan, 2007).

Peptidasas cisteínicas

Las peptidasas cisteínicas (EC 3.4.22) son enzimas caracterizadas por la presencia de un residuo de cisteína en su sitio activo. Presentan gran analogía en el mecanismo catalítico con las peptidasas serínicas y treonínicas ya que la enzima y el sustrato forman un complejo covalente donde el grupo tiol del residuo de cisteína actúa como nucleófilo y la histidina actúa como dador de protones; por lo tanto, la formación del anión tiolato es crítica para poder ejercer su acción catalítica (Rawlings y Barrett, 2013).

Las peptidasas cisteínicas presentan actividad enzimática en un rango de pH variable. Así, las peptidasas de la familia de la papaína son activas en pH neutro o alcalino y las calpaínas a pH superior a 7.5, mientras que las peptidasas lisosomales de naturaleza cisteínica son activas en valores de pH ácido.

Están presentes tanto en organismos procariotas como eucariotas y han sido clasificadas en más de 40 familias diferentes. Las más importantes son la familia de la papaína (EC 3.4.22.2), de las calpaínas (EC 3.4.22.52/53), de la clostripaína (Ec 3.4.22.8), de la interleukina 1 convertasa o de las caspasas (EC 3.4.22.36), estudiadas por su relación

7 con la muerte celular programada o apoptosis (Coll y col., 2014; Escamez y Tuominen, 2014).

Peptidasas aspárticas

Las peptidasas aspárticas (EC 3.4.23) son enzimas de naturaleza ácida que utilizan dos residuos de ácido aspártico (Asp) para activar una molécula de agua, la cual produce el ataque nucleofílico sobre el enlace peptídico escindible. Están formadas por dos lóbulos homólogos con el sitio activo localizado entre ambos. Cada lóbulo contribuye con un residuo de Asp de la díada activa de Asp, cada uno contenido en un motivo catalítico conservado Asp-Thr/Ser-Gly (DT/SG) cuya función es establecer y mantener el entorno apropiado (Rawlings y Barrett, 2013; Tang y col., 1978).

El mecanismo catalítico de las peptidasas aspárticas (APs) ha sido determinado a partir de estructuras cristalográficas de complejos enzima-sustrato en el estado de transición. El mecanismo de acción aceptado es una catálisis general ácido-base que implica la coordinación de una molécula de agua entre los dos Asp (Figura III).

En un principio estas enzimas eran conocidas como peptidasas ácidas debido a que los valores de pH óptimo (3.0-5.5) hacían suponer la intervención de grupos carboxilo en la catálisis enzimática. Luego fueron denominadas peptidasas aspárticas al comprobar que en la pepsina de origen porcino los residuos Asp32 y Asp215 formaban parte del sitio activo. Teniendo en cuenta esta numeración, el Asp215 actúa como base general y tiene carga negativa mientras que el Asp32 actúa como ácido general y está protonado. La molécula de agua activada por el aspartato realiza el ataque nucleofílico sobre el carbono carbonílico del enlace escindible del sustrato generando el intermediario tetraédrico de la reacción. El intermediario es estabilizado mediante una extensa red de puentes de hidrógeno que conecta el residuo conservado de Ser35 con el Asp32 del sitio activo y el grupo oxhidrilo del residuo Thr218 con el carboxilo del Asp215, el cual protege a este carboxilo de la protonación en medio ácido. El reordenamiento de este intermediario conduce a la protonación de la amida escindible (James, 2013).

8

Figura III.- Mecanismo catalítico de las peptidasas aspárticas, A: La molécula de agua, activada por los residuos de Asp, se ubica en la posición correcta para realizar el ataque nucleofílico en el carbono carbonílico del enlace peptídico que será escindido. B: Formación del intermediario tetraédrico. C: Protonación del grupo saliente. D: Liberación de los productos de reacción. Fuente: James (2013)

Las APs en general son inhibidas por un pentapéptido natural denominado pepstatina (Figura IVA), el cual contiene estatina (ácido (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-6- metilheptanoico), un aminoácido poco frecuente (Rawlings y col., 2013; Swain, 2011; Umezawa y col., 1972). La pepstatina se une al sitio activo de la enzima mediante la formación de un puente de hidrógeno entre el grupo oxhidrilo del inhibidor y un residuo de ácido aspártico del sitio activo de la enzima. De esta manera, simula el estado de transición de la reacción de hidrólisis e impide la unión del sustrato (Figura IVB).

9

A B

Figura IV.- Pepstatina A) Estructura. B) Unión de pepstatina al sitio activo de una AP. En la imagen se muestra la pepstatina (verde) unida a un ácido aspártico (amarillo) del sitio activo de la enzima. La superficie de la proteína se encuentra coloreada según su carga (rojo positivo y azul negativo). Fuente: Swain (2011)

Las APs se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, desde virus hasta plantas y mamíferos. Actualmente se hayan descriptos 6535 miembros en la base de datos MEROPS agrupados en 6 clanes y 16 familias.

Existen dos familias importantes de APs; las APs cuyo mecanismo catalítico es similar al de la pepsina (Clan AA, familia A1) y las enzimas retrovirales (Clan AA, familia A2). La mayoría de las APs estudiadas pertenecen al primer grupo. Este grupo incluye enzimas digestivas tales como pepsina, catepsina D y algunas proteasas fúngicas. El segundo grupo incluye proteínas virales tales como la proteasa del virus del SIDA, llamada retropepsina.

Las APs vegetales conocidas han sido aisladas y caracterizadas a partir de hojas, flores y semillas de diferentes especies. Entre ellas se destacan las proteasas aisladas a partir de especies pertenecientes a los géneros Arabidopsis, Brassica, Centaurea, Cynara, Hordeum, Lycopersicum , Oryza y Vigna, (Kulkarni y Rao, 2007), ciprosinas (Cordeiro y col., 1998) y cardosina A y cardosina B (Pires, 1998) aisladas de Cynara cardunculus, la AP aislada de la especie Silybum marianum (L.) Gaertn. (Vairo Cavalli y col., 2005) y una AP de Arabidopsis thaliana implicada en procesos de defensa (Simões y col., 2007).

10 Metalopeptidasas

Las metalopeptidasas (EC 3.4.24) son hidrolasas que realizan el ataque nucleofílico sobre el enlace peptídico mediante una molécula de agua que está activada por uno o dos cationes metálicos divalentes, usualmente zinc. En algunos casos, el zinc puede ser reemplazado por otro metal como cobalto o níquel sin pérdida de la actividad. La mayoría de las metalopeptidasas monometálicas comprende un motivo catalítico conservado (HEXXH) formado por dos residuos histidina que se unen al catión y un residuo glutamato (Cerdá- Costa y Gomis-Rüth, 2014). Las metalopeptidasas con un ion metálico catalítico pueden ser exo o endopeptidasas mientras que todas las metalopeptidasas con iones metálicos co- catalíticos son exopeptidasas.

Actualmente en la base de datos MEROPS se encuentran registrados 16 clanes y más de 60 familias. A pesar del gran número de estas enzimas presente en la base de datos, las metalopeptidasas constituyen el grupo menos estudiado en los vegetales (Obregón, 2008).

Peptidasas glutámicas

Las peptidasas glutámicas (EC 3.4.23.19) en un principio fueron denominadas carboxilpeptidasas insensibles a la pepstatina. Son activas a pH ácido y son inhibidas por el 1,2-epoxi-3-(p-nitrofenoxi) propano (EPNP), el cual reacciona covalentemente con el residuo Glu136. Están clasificadas en dos clanes: GA y GB. El clan GA está integrado por las enzimas de la familia G1, representado por endopeptidasas fúngicas, como la peptidasa aspergiloglutámica y la scytalidoglutámica. El mecanismo sugerido para estas enzimas es el ataque nucleofílico por una molécula de agua activada por el Glu136 de la cadena lateral, sobre el carbono del enlace peptídico que será escindido con la formación de un intermediario tetraédrico. La asistencia electrofílica y la estabilización del oxianión son provistas por la amida de la Gln53 (Fujinaga y col., 2004). La importancia de los residuos de ácido glutámico y glutamina en el sitio activo de estas enzimas llevó a proponer el término familia EQolisina para referirse a las mismas.

El clan GB está representado por una única enzima: el dominio C-terminal de la proteína que forma parte de los apéndices de la cola del Bacteriófago Φ29. Estas proteínas que están unidas a los apéndices de la partícula del virus son importantes para el

11 reconocimiento del hospedador y para el ingreso del virus al mismo. Cada proteína es procesada por autolisis para liberar el extremo carboxilo, donde el sitio activo se encuentra localizado en el mismo dominio que es liberado. Se ha identificado que el residuo Glu695 actúa como el nucleófilo del sitio activo y el procesamiento ocurre en el enlace Trp690- Ser691. Debido a que estas proteínas forman homotrímeros, el dominio C-terminal funciona como chaperona para el correcto plegamiento (Rawlings y Barrett, 2013; Xiang y col., 2009).

Peptidasas de mecanismo catalítico desconocido

Existe un número de peptidasas para las cuales el mecanismo catalítico no ha sido elucidado aún (EC 3.4.99). Aquellas sobre las cuales se conoce la secuencia de aminoácidos se han denominado con la letra “U” (“unclassified”) sin considerar el mecanismo catalítico y se les asigna además un número arbitrario, como por ejemplo la familia U28 que contiene la dipeptidasa E de Escherichia coli. Las bases de datos muestran nueve familias de peptidasas no clasificadas aún.

APLICACIONES INDUSTRIALES Y BIOTECNOLÓGICAS DE LAS PEPTIDASAS

Debido al acelerado incremento de la población se está comenzando a experimentar un vacio entre la oferta y la demanda de varios productos como alimentos y bebidas, agentes de limpieza, textiles, etc. El incremento del costo de las materias primas combinado con la necesidad de disminuir los gastos ha generado la necesidad de acelerar los procesos industriales utilizando la menor cantidad posible de recursos. En este sentido, las enzimas permiten aumentar el rendimiento de los procesos a partir de las mismas materias primas en un 8-10%. Por esta razón, el incremento en la demanda de enzimas industriales ha impulsado la necesidad de incentivar las actividades de investigación y desarrollo para lograr mejorar su producción y disminuir los costos.

Hasta la fecha se conocen alrededor de cuatro mil enzimas, de las cuales aproximadamente veinte se producen en escala verdaderamente industrial. A medida que fue aumentando la comprensión de los procesos bioquímicos de producción de enzimas, de fermentación y de los métodos de recuperación, se fueron sumando un número creciente

12 de enzimas en la industria. Los avances en diversos campos de la biotecnología, como la ingeniería genética y la ingeniería de proteínas han proporcionado una base sólida para la investigación y el desarrollo que a su vez permite a la industria hacer uso de tecnologías innovadoras para impulsar la producción y por lo tanto el beneficio (Kirk y col., 2002). Esto ha permitido identificar diferentes tipos de enzimas a partir de nuevas fuentes naturales, que a su vez ha permitido la reducción de costos, el desarrollo y la producción de enzimas.

En la actualidad, la demanda mundial de enzimas se satisface con unos doce grandes productores y cuatrocientos proveedores de menor importancia. Casi el 75% de las enzimas totales son producidas por tres empresas: DuPont (con sede en Dinamarca), Novozymes (con sede en EE.UU.) y Roche (con sede en Suiza). El mercado actual exige una constante innovación tecnológica para asegurar la competitividad y mantener márgenes de ganancia adecuados (Li y col., 2013).

Las principales aplicaciones de enzimas industriales incluyen la elaboración de productos lácteos, de productos de panadería, de productos para alimentación animal y el procesamiento de alimentos y bebidas en general, así como también la fabricación de agentes de limpieza, de biocombustibles y otras aplicaciones como la industria textil, del cuero y del papel. La elaboración de alimentos y bebidas es una de las principales aplicaciones de las enzimas empleadas en la industria, debido a su aplicación versátil, así como también a las estrictas normas que existen con respecto a la utilización de los ingredientes alimentarios sintéticos. En la Figura V se muestran los valores de mercado, según datos estadísticos, correspondientes al año 2013 y según una proyección al año 2018, para la comercialización de las enzimas industriales contemplando su campo de aplicación. En el año 2013 el segmento de las enzimas empleadas en la industria de los alimentos y bebidas alcanzaba alrededor de $ 1.3 mil millones, mientras que para el año 2018 se espera que las ventas se incrementen con una tasa anual de 8.0% alcanzando un valor de $ 2.5 mil millones, con las mayores ventas en la industria láctea (Enzymes in Industrial Applications: Global Markets, 2011).

13

Figura V.- Mercado mundial de las enzimas industriales por aplicación, según datos estadísticos del año 2013 y la proyección al año 2018, considerando las tasas de crecimiento anual (CAGR %) para cada segmento (en $ millones). Fuente: Industrial Enzymes Market by Types, Applications, Geography Global Trends & Forecasts to 2018 (2014)

La tendencia actual indica que se producirá una pequeña disminución de las ventas de enzimas en la industria de la panificación, mientras que el surgimiento de los alimentos saludables promoverá el crecimiento positivo en el conjunto del mercado de enzimas alimentarias.

En el Mercado mundial, el 75% de las enzimas industriales son hidrolíticas (carbohidrolasas, proteasas y lipasas). Dentro de este grupo, las proteasas son las más importantes ya que representan alrededor del 60% del mercado mundial de enzimas (Sawant y Nagendran, 2014) y tienen una gran variedad de usos resultando irremplazables especialmente en las industrias de los detergentes, alimentaria y farmacéutica (Jisha y col., 2013).

La proteólisis ha sido utilizada por años para la modificación de las propiedades funcionales y nutricionales de las proteínas en la producción de alimentos tradicionales como quesos y de alimentos vegetales fermentados, como vinos. De este modo, las peptidasas pueden ser empleadas con el objeto de mejorar las características de los alimentos tradicionales aumentando la solubilidad, modificando la formación de espuma, logrando propiedades emulsificantes y gelificantes y liberando péptidos biológicamente activos encriptados en proteínas alimentarias (Spellman y col., 2003) o para elaborar nuevos ingredientes proteicos a partir de fuentes no convencionales. Como por ejemplo, la

14 proteína de soja hidrolizada puede ser utilizada para mejorar la calidad nutricional de ciertos alimentos como helados, salsas, productos de repostería, fórmulas infantiles y clínicas, etc (McCarthy y col., 2013; Tomar y col., 2008). Por otra parte son considerados como productos de la química verde ya que su producción es segura y no genera residuos tóxicos o patógenos (Sawant y Nagendran, 2014; Gupta y col., 2002)

Elaboración de quesos

La industria quesera emplea actualmente cuatro fuentes de enzimas coagulantes de la leche: animal, microbiana, recombinante obtenida por ingeniería genética y vegetal, las cuales están compuestas por APs.

La quimosina, enzima tradicionalmente empleada para la coagulación láctea, es obtenida a partir del cuajo de terneros y produce un elevado rendimiento en la obtención de quesos. La elevada especificidad sobre κ-caseína y la baja actividad proteolítica sobre el resto de las proteínas genera una masa de buena consistencia y adecuadas propiedades organolépticas. Se sabe que la quimosina aislada de diferentes especies de origen animal (camello, cabra, cordero y búfalo) tienen propiedades diferentes a las de la quimosina bovina (Kumar y col., 2010).

Las peptidasas microbianas utilizadas en los procesos de coagulación son obtenidas a partir de Rhizomucor spp., Aspergillus spp., Mucor spp. y Bacillus spp. (Jisha y col., 2013; Vishwanatha y col., 2010; Kumar y col., 2005). El empleo de estos coagulantes microbianos produce bajos rendimientos en el proceso de elaboración de quesos y la presencia de sabores amargos en el producto final debido a la menor especificidad de clivaje, sin embargo siguen empleándose como sustituto de la quimosina bovina (Yegin y col., 2011; Dutt y col., 2009; Shieh y col., 2009).

Debido a la creciente demanda de quesos a nivel mundial y a ciertos cuestionamientos éticos asociados al empleo de coagulantes de origen animal en ciertas comunidades, la Food and Drug Administration (FDA) aprobó en el año 1990 el empleo de quimosina obtenida por fermentación a partir de un microorganismo genéticamente modificado como coagulante de la leche y se estima que actualmente el 80% de enzimas coagulantes son producidas de esta forma. A las enzimas obtenidas con esta tecnología también se las denomina enzimas sintéticas (Jacob y col., 2011; Johnson y Lucey, 2006).

15 Con respecto a las peptidasas vegetales se ha reportado actividad coagulante en extractos de varias especies, como por ejemplo Ananas comosus, Ficus carica, Euphorbia spp. (Mahajan y Chaudhari, 2014), Cynara spp. (Llorente y col., 2014; Sidrach y col., 2005), Calotropis gigantea (Anusha y col., 2014), Whitania coagulans (Beigomi y col., 2013), Solanum spp (Néstor y col., 2012; Guiama y col., 2010) y Bromelia hieronymi (Bruno y col., 2010), entre otras. Si bien algunas de estas enzimas son empleadas en distintas regiones para la elaboración de quesos de tipo artesanal, como por ejemplo la AP obtenida de Cynara cardunculus, su obtención aún no ha sido estandarizada.

A pesar de que las enzimas microbianas y las sintéticas son las que producen los mayores beneficios económicos, determinados sectores de la población prefiere alternativas naturales. Por esta razón continúa la búsqueda de enzimas coagulantes de fuentes vegetales que generen productos similares a los obtenidos con quimosina (Almeida y col., 2014).

Tiernizado de carnes

La terneza de la carne es uno de los factores más importantes y complejo que afecta a la percepción del sabor del producto y la satisfacción del consumidor. Según la FDA sólo cinco enzimas pueden considerarse GRAS (FDA: 21 CFR 184, 2014) para el tiernizado de las carnes. Estas son la papaína, la ficina, la bromelina y las APs de Aspergillus oryzae y de Bacillus subtilis, aunque las características de las proteasas cisteínicas actinidina y zingibaína indican que también podrían ser empleadas para el tiernizado de carnes (Bekhit y col., 2014; Sullivan y Calkins, 2010; Naveena y col., 2004). De todas las enzimas mencionadas, la papaína posee la mayor capacidad de ablandamiento aunque en exceso puede producir un cambio de la jugosidad y textura que afectan negativamente al producto. La bromelina aumenta la terneza degradando al colágeno en mayor proporción que a las proteínas contráctiles, mientras que la ficina produce una degradación más balanceada de dichas proteínas (Sullivan y Calkins, 2010). La bromelina y la papaína también son empleadas en la elaboración de salsas y en el curado del jamón (Arshad y col., 2014; Scannell y col., 2004).

16 Elaboración de cerveza

La cerveza es una bebida obtenida por la fermentación alcohólica de una solución de azúcares extraídos de los granos de cebada. Las peptidasas que se encuentran en el grano actúan sobre las proteínas de reserva solubilizándolas y transformándolas en péptidos de cadena larga, péptidos pequeños y aminoácidos. Los primeros actúan como fuente de proteínas, importante componente de la espuma formada cuando se vierte la cerveza. Los productos más pequeños de la digestión son la fuente de nitrógeno indispensable para el desarrollo de las levaduras durante la fermentación. Cuando la cantidad de proteínas en la cerveza es muy elevada se forma un complejo tanino-proteína el cual es soluble a temperatura ambiente pero tiende a precipitar en frío, produciendo turbidez y sedimentos. Para eliminar este inconveniente se agregan peptidasas de modo de producir hidrólisis de las proteínas. Este proceso debe ser controlado para que la cerveza mantenga una adecuada proporción de proteínas coloidales ya que estas tienen una importante influencia sobre algunos parámetros del producto, como el color, la transparencia, la formación de espuma, el sabor y el aroma. Los extractos crudos de papaína, bromelina y ficina suele emplearse en la industria cervecera para obtener buenas propiedades coloidales a bajas temperaturas (Jones, 2005), aunque en algunos países de Europa se están produciendo cervezas libres de aditivos (Feijoo-Siota y Villa, 2011).

Panificación

Durante la preparación de una masa a partir de harina de trigo, las proteínas del gluten (glutenina y gliadina) forman una red que le otorga estructura a la misma. La presencia de puentes disulfuro hace que esta sea más fuerte. Las peptidasas actúan rompiendo dicha red, atacando a los enlaces peptídicos por lo cual el agregado de estas enzimas a las masas duras aumenta su elasticidad y mejora la textura del gluten y las propiedades de manejabilidad de la masa. El empleo de peptidasas tiene otras ventajas como el aumento del volumen de la masa, la liberación de aminoácidos que influyen en el flavor del producto final, el aumento de la crocancia en la corteza del pan y la obtención de productos libres de gluten (Miguel y col., 2013).

Las peptidasas utilizadas en la industria panadera son de origen fúngico (Aspergillus oryzae), de origen bacteriano (Bacillus subtilis) y de origen vegetal (bromelina y papaína),

17 las cuales tienen la ventaja de actuar rápidamente en un amplio rango de pH y temperatura (Polaína y McCabe, 2007). Por otro lado, la bromelina puede escindir el epítope IgE de la glutenina de trigo (Gln Gln Gln Pro Pro); por ese motivo está siendo empleada para obtener productos de baja alergenicidad y en consecuencia, de mayor valor agregado (Feijoo-Siota y col., 2011, Tanabe y col., 1996).

Obtención de proteínas modificadas para la industria alimenticia

Las peptidasas se utilizan también para obtener proteínas parcialmente hidrolizadas o hidrolizados proteicos que pueden ser utilizados en la elaboración de otros alimentos ya que la hidrólisis parcial permite modificar ciertas propiedades fisicoquímicas de las mismas. De esta manera se ha logrado incrementar la solubilidad de las proteínas de semillas de soja, de algodón y de maní para lo cual se han utilizado papaína, bromelina y ficina. Los productos obtenidos pueden ser utilizados en la elaboración de bebidas, sopas y salsas. También se ha logrado incrementar la capacidad emulgente de las proteínas de soja y trigo, las cuales se utilizan en mayonesa, salsas y aderezos, y se han obtenido proteínas modificadas de estos cereales que producen espuma abundante y estable, lo cual resulta muy importante en la elaboración de soufflés, mousses, merengues, helados y cremas (Tavano, 2013).

En los últimos años ha cobrado relevancia la producción de hidrolizados proteicos para la obtención de péptidos bioactivos de particular interés en la ciencia alimenticia y nutrición.

Otros usos industriales

Detergentes

En la actualidad la utilización de enzimas como aditivos de detergentes representa la mayor aplicación a nivel industrial, tanto en volumen como en valor monetario. El mayor componente son las peptidasas pero existen diferentes hidrolasas que proveen varios beneficios, como la remoción eficiente de manchas específicas. Se generan constantemente

18 nuevas versiones del detergente enzimático tradicional, el cual contiene peptidasas y amilasas (Sawant y Nagedran, 2014; Feijoo-Siota y Villa, 2011; Kirk y col., 2002).

Industria del cuero

El tratamiento del cuero es una importante actividad industrial estrechamente relacionada con la vida cotidiana. Sin embargo, a pesar de su significativa contribución a la economía, ocasiona grave contaminación del medio ambiente por el empleo de altas cantidades de sulfuro y cromo, lo que contribuye al 80 - 90% de la carga total de la contaminación en la industria del cuero, generando gases nocivos y residuos sólidos (Thanikaivelan y col., 2004).

El empleo de enzimas para el proceso de depilado del cuero se presenta como una alternativa al método tradicional altamente contaminante (Sawant y Nagendran, 2014). Las ventajas del método enzimático son la reducción significativa o incluso completa de sulfuro de sodio en el proceso, la recuperación total de cabello que resulta de buena calidad y la creación de un ambiente ecológicamente favorable para los trabajadores y la población en general (Arunachalam y Saritha, 2009).

Usos bioquímicos, farmacológicos y médicos

La gran diversidad y especificidad de las peptidasas representa una valiosa ventaja en el desarrollo de agentes terapéuticos efectivos. Algunas peptidasas suelen utilizarse como drogas para el tratamiento oral sistemático de ciertas enfermedades inflamatorias, enfermedades relacionadas con la coagulación de la sangre y enfermedades malignas. Este grupo comprende peptidasas vegetales como bromelina y papaína y peptidasas extraídas de órganos de origen animal como tripsina y quimotripsina, las cuales ofrecen un amplio espectro de acción terapéutica, demostrada en ensayos in vitro e in vivo, como la acción antiinflamatoria, antiedematosa, antitrombótica y fibrinolítica. Se utilizan en Estados Unidos y Europa como alternativa o en forma complementaria con otros medicamentos, como glucocorticoides, antirreumáticos no esteroides y agentes inmunoreguladores. Su baja toxicidad permite que se utilicen en enfermedades inflamatorias crónicas.

19 Recientemente se han realizado estudios in vivo empleando mezclas de proteasas (tripsina, quimotripsina y papaína) y bromelina en pacientes con cáncer de mama, cáncer de colon y plasmocitoma, obteniéndose buenos resultados (Feijoo-Siota y Villa, 2011).

PROTEASAS ASPÁRTICAS DE PLANTAS

Las APs de plantas han sido escasamente estudiadas en comparación con sus contrapartes de origen no vegetal. Una excepción a esta afirmación, lo constituyen las cardosinas del cardo (Cynara cardunculus) usadas en la manufactura de quesos y la fitepsina de cebada (Hordeum vulgare), que al día de hoy continúa siendo una de las pocas proteasas de esta clase caracterizada estructuralmente y por tanto, el modelo utilizado en esta área.

El nombre fitepsina (EC 3.4.23.40) fue adoptado en el año 1997 por el Comité de Nomenclatura de la IUBMB para referirse a todas las APs de origen vegetal (NC-IUBMB, 2006). Sin embargo, en la literatura no es común emplear este nombre para referirse a estas peptidasas sino que el nombre de la enzima suele derivar de la especie o el tejido a partir del cual se la purifica. Como ejemplo pueden citarse a las cardosinas y ciprosinas obtenidas a partir a Cynara cardunculus, cirsina de Cirsium vulgare, onopordosina de Onopordum acanthium (Vairo Cavalli y col., 2013), nepenthesina de Nepenthes spp (Hatano y Hamada, 2012), oryzasina de Oryza sativa (Huang y col., 2013), etc.

De acuerdo a la base de datos MEROPS las APs de plantas están distribuidas entre las familias A1, A3, A11 y A12 del clan AA, y la familia A22 del clan AD. La mayoría de las APs de plantas pertenecen a la familia A1, junto con las enzimas similares a pepsina de diversos orígenes (Rawlings y col., 2014).

Organización de la Estructura Primaria

En general, las APs vegetales comparten una elevada similitud de la secuencia de aminoácidos en sus dominios N- y C-terminales (identidad mayor al 60%) y alrededor de un 45% de identidad con la catepsina D, la AP de origen no vegetal más cercana. Los dos residuos de Asp que intervienen en la catálisis están contenidos en los motivos catalíticos conservados: Asp-Thr-Gly (DTG) y Asp-Ser-Gly (DSG) en todas las APs vegetales de la familia

20 A1 a excepción de la clapsina (de Chlamydomonas reinhardtii) que contiene las secuencias DTG/DTG, como las APs microbianas y de animales (Almeida y col., 2012). En algunas APs de hongos y protozoos, los residuos Asp catalíticos también se encuentran comprendidos dentro de los motivos DTG/DSG. El significado evolutivo o biológico de esta variación observada en los diferentes reinos aún no se ha establecido (Almeida y col., 2012; Rawlings y Barrett, 2013; Simões y Faro, 2004; Davies, 1990; Tang y Wong, 1987).

Las APs de origen vegetal son sintetizadas como un precursor inactivo de cadena simple, denominado zimógeno, el cual es convertido en enzima madura que puede ser monomérica o heterodimérica. Los precursores se caracterizan por la presencia de una secuencia señal de direccionamiento hacia el retículo endoplasmático (presegmento) seguida de un propéptido de alrededor de cuarenta aminoácidos, la región N-terminal de la enzima madura, el PSI (inserto específico de planta) y el dominio C-terminal (Figura VI).

Figura VI.- Representación esquemática de la organización de la estructura primaria de las APs típicas de plantas. Los rectángulos representan la región pre: péptido señal, la región pro: propéptido, el PSI: inserto específico de plantas; en blanco se observan los dos dominios de la enzima madura. Las posiciones motivos catalíticos conservados DTG y DSG están señaladas. Fuente: esquema adaptado de Faro y Gal (2005)

El propéptido está implicado en la inactivación, en el correcto plegamiento y en la estabilidad de la enzima (Vairo Cavalli y col., 2013; Simões y Faro 2004).

El PSI es un dominio identificado exclusivamente en zimógenos de APs vegetales y presenta una elevada homología de secuencia con saposinas y proteínas similares como las Saposin-like Proteins denominadas SAPLIPs (Figura VII A). Su caracterización estructural, como la de otras proteínas SAPLIPs, muestra que comparten una estructura globular compacta, con cinco α-hélices anfipáticas unidas entre sí por tres puentes disulfuro, un sitio de glicosilación conservado y la presencia de prolina y tirosina (Bryksa y col.; 2011; Simões y Faro, 2004). A pesar de las similitudes mencionadas, el PSI no puede ser definido como una verdadera saposina debido a que presenta un intercambio de los extremos amino y

21 carboxilo respecto de las SAPLIPs, es decir que comprenden la porción C-terminal de un dominio de saposina seguido por una secuencia de unión o “linker” y la porción N-terminal del dominio subsiguiente dentro de la prosaposina. Por esta razón han sido también llamados swaposinas (Figura VII B). Este evento de intercambio es un claro ejemplo de un proceso evolutivo en el cual una de las secuencias homólogas tiene exactamente los mismos dominios conservados de otras secuencias, pero se presentan en un orden diferente (Martins Dias Pedroso, 2013; Simões y Faro, 2004).

Figura VII.- A) Comparación de la estructura de la saposina B (Protein Data Bank code 1N69), saposina C (Protein Data Bank code 2QYP) y StAP PSI (Protein Data Bank code 3RFI). B) Los PSIs han sido llamados swaposinas debido a que comprenden la porción C-terminal de un dominio de saposina seguido por una secuencia de unión o “linker” y la porción N-terminal del dominio subsiguiente dentro de la prosaposina. Fuente: Bryksa y col. (2011)

La función del PSI aún se encuentra en estudio. Varios autores han informado que, al igual que las saposinas, el PSI puede interactuar con la bicapa fosfolipídica de las

22 membranas (Bryksa y col.; 2011; Egas y col.; 2000). Otros autores sugirieron que el PSI podría estar involucrado con el direccionamiento de zimógenos durante el transporte intracelular hacia las vacuolas, permitiendo la interacción del precursor de la proteína con el retículo endoplasmático y luego con membranas y proteínas receptoras de membrana en el aparato de Golgi (Törmäkangas y col., 1994). El rol de las moléculas de direccionamiento hacia las vacuolas también fue descrito para la saposina C de mamíferos (Simões y Faro, 2004). Otros resultados indican que la capacidad del PSI para interactuar con las membranas lo convierten en un potente inductor de la ruptura de vesículas, lo que sugiere que puede ser parte de un mecanismo de defensa contra agentes patógenos o incluso puede ser un efector de muerte celular (Muñoz y col., 2011; Simões y Faro, 2004). Los resultados de los estudios realizados por Muñoz y col (2014) sugieren que el PSI de la AP aislada de Solanum tuberosum (StAsp-PSI) induce la desestabilización de las membranas debido a que interactúa en forma directa con los fosfolípidos de carga neutra o negativa que la componen, modula su comportamiento polimórfico y se incrusta diferencialmente en la membrana dependiendo de la presencia de fosfolípidos con carga negativa. Estos sucesos llevarían a la permeabilidad y la lisis del microorganismo.

A partir de la identificación del genoma de algunas especies vegetales, se han podido analizar los genes que codifican para APs. Se ha informado que el genoma de Arabidopsis thaliana contiene 51-69 genes de APs. Esto permitió clasificar a las APs en tres grupos dependiendo de la organización de sus dominios y de los motivos de las secuencias catalíticas: APs típicas, APs similares a nucelina y APs atípicas (Faro y Gal, 2005).

Los miembros del grupo de las APs típicas presentan la estructura primaria básica descripta anteriormente. La mayoría de las APs estudiadas y caracterizadas hasta la fecha pertenecen a este grupo y hasta hace poco esta organización era empleada para definir a las APs de plantas en general.

El descubrimiento de la existencia de las APs atípicas y similares a nucelina reescribe el concepto de APs vegetales. Estas APs se diferencian de las APs típicas en que no tienen un dominio PSI (Figura VIII).

Las APs de tipo nucelina codifican proteínas similares a la nucelina detectada por primera vez en las células nucelares de la cebada. De acuerdo a sus patrones de expresión así como a su localización específica, se les ha asignado un posible rol en la muerte celular en plantas. Estas peptidasas presentan supresiones significativas en la región del prosegmento (Faro y Gal, 2005).

23

A Pre Pro DTG Y DSG PSI

B Pre Pro DTG NAP Y DSG

C Pre Pro DTG NAP Y DSG

C

Figura VIII.- Aspectos distintivos de las APs típicas (A), APs similares a nucelina (B) y APs atípicas (C). Secuencia del centro activo: se destacan los principales componentes de las APs vegetales (Pre: péptido señal; Pro: prosegmento; DTG: primer motivo catalítico; NAP: inserto específico de APs de tipo Nepenthesina; Y: Tyr conservada; DSG: segundo motivo catalítico; C: Cys). Fuente: adaptado de Faro y Gal (2005)

Las APs atípicas muestran características intermedias entre las secuencias de las APs típicas y las de tipo nucelina. La mayoría de las APs atípicas caracterizadas hasta el momento siguen una arquitectura estructural definida con algunas variaciones: un péptido señal, seguido por un prosegmento y un dominio que corresponde a la proteína madura. De acuerdo a Faro y Gal (2005), la longitud del prosegmento puede presentar pequeñas variaciones. Así por ejemplo, la AP de Arabipdosis thaliana que está involucrada en la resistencia a la Enfermedad Constitutiva-1 y es denominada CDR1 tiene un prosegmento putativo de 46 aminoácidos y la enzima es activa sin su eliminación irreversible (Simões y col., 2007) mientras que la AP presente en los nódulos de las raíces del frijol (Phaseolus vulgaris L.) denominada nodulin 41 (PvNod41) tiene un prosegmento de 50 aminoácidos (Olivares y col., 2011). Las APs presentes en los fluidos digestivos de la planta carnívora Nepenthes alata, denominadas nepenthesina I y II presentan un prosegmento de 56 y 55 aminoacidos respectivamente (Athauda y col., 2004).

Las APs de la familia A1 poseen una región rica en restos de cisteína cuya distribución es también una característica considerada en la clasificación de estas proteasas. Mientras que en las APs típicas el dominio PSI contiene un “cluster” de seis residuos de cisteína, en las aspárticas similares a nucelina y las atípicas el cluster de cisteínas también existe en una región localizada entre el primer residuo de Asp catalítico y el residuo Tyr75 (numeración de pepsina) conservado en la porción conocida como flap que cubre la hendidura del sitio activo (Lufrano y col., 2012).

24 Estructura Secundaria y Terciaria

Si bien hasta el momento se ha obtenido la estructura tridimensional de varias APs de la familia A1, sólo se ha determinado la estructura tridimensional de dos APs vegetales, ambas pertenecientes al grupo de las APs típicas: la cadena madura de la cardosina A (Frazao y col., 1999) y la profitepsina de cebada con su prosegmento y dominio PSI (Kervinen y col., 1999). En la Figura IX se observa que la estructura es similar entre dichas enzimas al igual que con otras APs. Se componen de una estructura bilobular formada por dos cadenas polipeptídicas, con hojas plegadas β y algunas α-hélices. Las dos mitades de la enzima actúan como estructuras de plegado independientes moviéndose una respecto a la otra y aportando cada una un Asp del sitio catalítico (Asp36 y Asp223, según la numeración de la fitepsina de cebada). Dichos Asp están contenidos en los dos motivos catalíticos conservados, DTG/DSG. Además presenta una estructura flexible sobre la hendidura catalítica denominada “flap”, que interfiere directamente con la especificidad de la peptidasa permitiendo la entrada del sustrato (Vairo Cavalli y col., 2013; Simões y Faro, 2004). La estructura es estabilizada por tres puentes disulfuro conservados y por interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno.

Figura IX.- Representación de cintas de la estructura cristalina de cardosina A y profitepsina. (A)Estructura de cardosina A madura (código de PDB: 1B5F), la cadena pesada se indica en azul y la liviana en rojo; en amarillo se representan los puentes disulfuros. (B) Estructura de profitepsina (código de PDB: 1QDM), en azul se muestra el propéptido del zimógeno, las cadenas correspondientes a la proteína madura se encuentran coloreadas en celeste (cadena pesada) y en rojo (cadena liviana), mientras que el inserto PSI está indicado en verde; en amarillo se representan los puentes disulfuro Fuente: Simões y Faro (2004).

25 Por otro lado, se ha reportado que las APs vegetales caracterizadas a nivel molecular contienen uno o más sitios consenso de N-glicosilación. En particular la cardosina A presenta diecinueve anillos de azúcar unidos a los residuos Asn67 y Asn257. Debido a que se encuentran alejados del sitio activo, es improbable que los oligosacáridos jueguen un rol importante en la actividad y especificidad enzimática aunque pueden actuar estabilizando la conformación. La existencia de un puente de hidrógeno entre la Gln126 y la Manβ4 vuelve estéricamente inaccesible al oxígeno O-2 del monosacárido para aceptar un residuo xilosil conformando un nuevo tipo de complejo glicano de plantas. (Vairo Cavalli, 2013; Frazão y col., 1999). Hasta ahora no se ha obtenido la estructura de ninguna AP atípica, por lo que todas las consideraciones sobre su estructura y las implicaciones relacionadas con ella se hacen teniendo en cuenta la estructura de las APs típicas.

Activación de la proenzima

Los precursores de las APs vegetales sufren varios procesamientos proteolíticos para llegar a su forma madura, luego de los cuales pueden presentar una única cadena polipeptídica o dos cadenas polipeptídicas. Como ejemplos de única cadena se pueden citar las APs de pepino, de calabaza, de espinaca, de papa, de sorgo, de arroz, de trigo, de tomate y de tabaco; y como ejemplos de estructura dimérica, se pueden mencionar las APs de cebada, de hoja de parra, de ricino, de girasol, de cacao, de Centaurea calcitrapa, de cardo, de Arabidopsis thaliana y de maíz (Kervinen, 2013; Mutlu y Gal, 1999). En general, las APs monoméricas conservan el PSI aún en su forma madura mientras que en las APs heterodiméricas el PSI se remueve de manera completa o parcial generando las dos cadenas de la proteína madura. Aún no se han podido establecer las causas que determinan el procesamiento adicional de la enzima desde la cadena simple a su forma activa de dos cadenas. Algunos autores sugieren que esta diferencia en el procesamiento está relacionada con la presencia o ausencia de enzimas responsables de dicha conversión, debido a que la organización de la estructura primaria de las APs vegetales en general es muy similar (Kervinen, 2013).

26 Distribución en los tejidos y función

Las APs vegetales han sido detectadas y purificadas a partir de una amplia variedad de plantas comunes y exóticas (Chen y col., 2009; Faro y Gal, 2005; Mutlu y Gal, 1999; Kervinen y col., 1995). Además estas enzimas fueron encontradas en numerosos tejidos, motivo por el cual se cree que cumplen roles importantes en una amplia variedad de procesos proteolíticos dentro de la célula y en el espacio extracelular.

Si bien se ha logrado definir la localización de las APs en muchas especies vegetales, la función biológica de la mayoría de ellas aún es hipotética (Olivares y col., 2011). En general, las APs vegetales están involucradas en el procesamiento proteolítico en diversos órganos de la planta como así también en la muerte celular programada, en la senescencia, en la reproducción, en la respuesta al estrés y en la defensa de la planta frente a microorganismos patógenos (Olivares y col., 2011; Tang, 2010; Simões y Faro, 2004). Las APs presentes en semillas probablemente participan en la modificación de las proteínas de reserva y en la regulación de su desarrollo así como también en su germinación (Domínguez y Cejudo, 2014; Tormakangas y col., 1994; Runeberg-Ross y col., 1994). Se ha informado que las APs presentes en arroz y trigo participan de la degradación de las proteínas de reserva durante su movilización en la germinación de las semillas. En las semillas de arroz la enzima podría estar involucrada en la hidrólisis de c-globulina durante el estadio inicial de la germinación ya que ambas proteínas están distribuidas de forma similar en las semillas. Del mismo modo, la AP del grano de trigo podría cumplir una función similar debido a su capacidad hidrolítica in vitro sobre la proteína de reserva, gliadina, y a la localización de ambas en el endosperma. Timotijevic y col. (2010) aislaron el gen de una AP de las semillas de alfalfa germinadas y encontraron que el mismo se expresa específicamente en las semillas lo cual sugiere el rol potencial en la degradación del tejido nucelar. Existe evidencia de la participación de las APs en los procesos de respuesta de la planta al estrés biótico y abiótico. Guo y col. (2013) informaron que dieciocho genes de la AP de Vitis vinifera, VvAP son expresados en respuesta a un factor de estrés abiótico, indicando que dichas enzimas juegan un rol importante en la protección de la planta.

La expresión del gen de una AP extracelular fue detectada en hojas de tabaco y tomate, cuya función se asoció con la degradación de proteínas relacionadas con la patogénesis (PRP). Se ha sugerido que dichas APs jugarían un rol importante en los mecanismos del recambio proteico, previniendo la acumulación y regulando de esta manera la cantidad de proteínas inductoras del estrés (Rodrigo y col., 1991; Rodrigo y col., 1989).

27 Dichas APs también han sido expresadas en las hojas sanas e infectadas de la planta, fortaleciendo la hipotética función asignada.

El nivel de expresión de las APs de papa, denominadas StAPs, fue asociado con el grado de resistencia de la planta frente a Phytophthora infestans, sugiriendo su participación en los mecanismos de defensa de la planta (Guevara y col., 2002). La acumulación de estas enzimas en el apoplasto de los tubérculos y de las hojas es inducida luego de producirse la herida y posterior infección del órgano vegetal. Los glicanos, componentes de la estructura de estas glicoproteínas son esenciales para que pueda producirse su acumulación. De esta manera, la glicosilación tendría un rol de protección de la enzima frente a la proteólisis prematura y, por lo tanto, sobre la estabilidad intracelular previniendo su degradación. Xia y col. (2004) han observado la acumulación de una AP en Arabipdosis thaliana, denominada CDR1, en respuesta al ataque de patógenos. En el arroz esta enzima podría estar relacionada con la señalización asociada a la resistencia a enfermedades. Otros autores han informado que el PSI de las APs típicas participa en los mecanismos de defensa contra patógenos y como efector de la muerte celular (Muñoz y col., 2014; Bryksa y col., 2011; Muñoz y col., 2010).

Bhalerao y col. (2003) estudiaron la expresión de determinados genes durante la senescencia de las hojas de árboles en otoño y encontraron dos genes que codifican para AP. De acuerdo a esta información, los autores informaron que dichas APs podrían cumplir un rol importante durante la degradación de los cloroplastos. Dos estudios independientes demostraron que la fitepsina y la nucelina de cebada eran expresadas durante la senescencia de diferentes tejidos, sugiriendo su participación en la muerte celular programada.

28 La familia Solanaceae

Las Solanáceas (Solanaceae) conforman una familia cosmopolita con gran representación en los Trópicos y Subtrópicos. Se hallan concentradas en Australia y en América Central y del Sur y están ausentes en las regiones árticas (Figura X). Los neotrópicos, particularmente Sudamérica, son un claro centro de diversidad tanto genérica como específica y cerca de un tercio de los géneros que allí se encuentran son endémicos. La gran abundancia de esta familia en dicho territorio ha dado lugar a la hipótesis de que pudo originarse en este continente (Heywood, 1991).

Esta familia comprende 102 géneros y 2460 especies en todo el mundo (Stevens, 2012), mientras que en Argentina viven 33 géneros y 337 especies (Zuloaga y col., 2014).

Figura X.- Distribución mundial de las especies que conforman la familia Solanácea. Mapa perteneciente a Heywood (1991)

En esta familia se incluyen especies de importancia en alimentación como la papa (Solanum tuberosum), el tomate (Solanum lycopersicum), el pimiento (Capsicum annuum) y la berenjena (Solanum melongena), todas de origen americano a excepción de la última, nativa del sur de Asia. Muchas son ricas en alcaloides, entre los que pueden destacarse los

29 derivados del tropano (como la hiosciamina, atropina y escopolamina), la nicotina y diversos glucoalcaloides esteroídicos (solaninas), de gran importancia desde el punto de vista farmacológico. Pertenecen también a esta familia las plantas ornamentales populares como las pertenecientes a los géneros Petunia, Schizanthus, Salpiglossis y Datura (Tablas IIA y IIB). La mayoría de las especies son mundialmente conocidas tanto por sus usos medicinales como por sus efectos psicotrópicos o tóxicos. Finalmente, las solanáceas incluyen muchos organismos modelo para investigar cuestiones biológicas fundamentales a nivel celular, molecular y genético, tales como el tabaco y la petunia (López-Muñoz y col., 2011; Álvarez Mejía, 2008; Fernández-Alonso y col., 2007; Cárdenas Támara, 2005).

Tabla IIA.- Especies relevantes de la familia Solanaceae exóticas de Sudamérica

ESPECIES EXÓTICAS NOMBRE VULGAR

Atropa belladonna belladona

Brugmansia arborea floripón

Capsicum annuum ají pimiento

Datura ferox chamico

Lycopersicum esculentum tomate

Mandragora officinarum mandrágora

Nicotiana tabacum tabaco

Solanum melongena berenjena

30 Tabla IIB.- Especies relevantes de la familia Solanaceae nativas de Sudamérica

ESPECIE NOMBRE DISTRIBUCIÓN NATIVA VULGAR

Brunfelsia jazmín del En Argentina: Chaco, Corrientes, Formosa, Misiones, Santa Fe. Brasil, Paraguay, australis Paraguay Uruguay

Capsicum ají del En Argentina: Catamarca, Chaco, Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, Formosa, Jujuy, chacoënse monte Salta, La Pampa, Sgo del Estero, La Rioja, Santa Fe, SanJuan, San Luis, Tucumán. Paraguay Cestrum parqui duraznillo En Argentina: Buenos Aires, Catamarca, Chaco, Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, negro Formosa, Jujuy, La Rioja, Mendoza, Misiones, Río Negro. Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay, Uruguay Grabowskia - En Argentina: Buenos Aires, Catamarca, Chaco, Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, duplicata Formosa, La Pampa, Sgo. del Estero, Santa Fe, San Luis, Tucumán. Brasil, Paraguay, Uruguay Datura - En Argentina: Buenos Aires, Corrientes, Neuquén, Salta, San Juan. Brasil, Chile stramonium

Nicotiana flor de Chubut, Mendoza, Neuquen, Río Negro, Salta, San Juan, Chile acuminata sapo

Nicotiana flor de Buenos Aires, Catamarca, Chaco, Córdoba, Corrientes, Distrito Federal, Entre Ríos, longiflora. sapo Formosa, Jujuy, La Pampa, La Rioja, Mendoza. Bolivia, Brasil, Paraguay, Uruguay

Nierembergia chucho Catamarca, Chaco, Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, Jujuy, La Pampa, Misiones, linariaefolia Salta, Sgo. del Estero, San Luis, Tucumán. Brasil, Paraguay, Uruguay

Petunia petunia Brasil heterophylla

Petunia petunia En Argentina: Corrientes, Entre Ríos, Misiones. Brasil, Paraguay,Uruguay integrifolia

Physalis viscosa camambú En Argentina: Buenos Aires, Catamarca, Chaco, Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, Formosa, Jujuy, La Pampa, La Rioja, Mendoza, Misiones. Brasil, Chile, Paraguay, Uruguay Salpichroa huevito de En Argentina: Buenos Aires, Catamarca, Chaco, Córdoba, Corrientes, Distrito origanifolia gallo Federal, Entre Ríos, Formosa, Jujuy, La Rioja, Río Negro, Salta. Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay, Uruguay Schwenckia - En Argentina: Chaco, Corrientes, Formosa, Jujuy, Misiones, Salta americana

Solanum - En Argentina: Buenos Aires, Chaco, Corrientes, Entre Ríos, Misiones. Brasil commersonii

Solanum - En Argentina: Buenos Aires, Chaco, Corrientes, Entre Ríos, Formosa, Misiones, granulosum- Salta, Santa Fe. Brasil, Paraguay, Uruguay leprosum Solanum tutiá Buenos Aires, Catamarca, Chaco, Corrientes, Entre Rios, Formosa, Jujuy, La Rioja, sisymbriifolium Misiones, Salta, Sgo del Estero, Santa Fe, San Luis, Tucumán. Brasil, Chile, Uruguay, Paraguay Solanum papa Chile tuberosum

Vassobia yu-a Buenos Aires, Catamarca, Chaco, Corrientes, Cordoba, Entre Rios, Formosa, Jujuy, breviflora La Rioja, Misiones, Slata, Sgo del Estero, San Luis, Santa Fe, Tucumán, Brasil, Paraguay, Uruguay Fuente: http://www2.darwin.edu.ar/Proyectos/FloraArgentina/FA.asp

31 Salpichroa origanifolia

Salpichroa es uno de los géneros de la familia Solanaceae presente en Argentina, el cual presenta cinco especies: S. origanifolia, S. ramosissima, S. scandens, S. tristis var. tristis y S. tristis var. lehmanni. La primera especie conocida fue descrita por Lamarck (1793) como Physalis origanifolia. Lamarck aparentemente confundió Salpichroa por Physalis, un género caracterizado por los frutos incluidos en el cáliz inflado. Posteriormente en Catalogus Plantarum Horti Regii Parisiensis, Desfontînes (1829) la citó bajo dos nombres: Atropa origanifolia y Physalis origanifolia. Entre 1829 y 1837 cuatro especies nuevas, posteriormente transferidas al género Salpichroa, fueron descriptas como Atropa rhomboidea Hooker (1829 [1830]= Salpichroa origanifolia), A. glandulosa Hooker (1831), A. hirsuta Meyen (1834) y A. dependens Hooker (1837). En 1845 Miers remueve varias especies del género Atropa y propone un nuevo género, Salpichroa. Dunal (1852) realiza la primera monografía de Salpichroa donde fueron propuestas 26 especies nuevas pero actualmente varias de ellas son sinónimos. Keel (1984) reporta en su Tesis Doctoral titulada «A Revision of the genus Salpichroa (Solanaceae)» que el género consta de 15 especies distribuidas en los Andes de Sudamérica, con la excepción de una especie cosmopolita S. origanifolia. En 1993, en otro trabajo “A New Species and a New Combination in Salpichroa (Solanaceae)” publica una nueva especie Salpichroa microloba propia de Perú. Hunziker (2001) en su libro Genera Solanacearum confirma que el género consta de 15 especies en los Andes de Sudamérica, entre los 2400-4700 m de elevación.

Etimológicamente Salpichroa es una palabra que deriva del griego salpinx, que significa tubo/trompeta y chroma/chroa que significa color/superficie de la piel/tinte de un cuerpo, en referencia a las vistosas flores en forma de trompeta. El epíteto origanifolia que designa la especie, alude a cierta similitud con las hojas del orégano.

Salpichroa origanifolia, también conocida popularmente en Argentina como huevito de gallo, es una hierba perenne, pubescente, rizomatosa con tallos ascendentes, a veces apoyantes de 15 a 60 centímetros de alto, ramificados. Sus hojas son pecioladas y de forma ancha y ovalada-orbiculares a ovado-lanceoladas o romboidales. Las hojas inferiores son opuestas y las superiores alternas, con borde entero o sinuado, de 1,5-5 cm de largo. Sus flores son solitarias, axilares, largamente pedunculadas, con corola gamopétala, pentadentada, blanca y con un largo aproximado de 6 a 8 milímetros. Su fruto es una baya ovoide, blanca-opalescente y dulce, de sabor azucarado a la madurez, de 1.5 a 2 centímetros

32 de largo, ovoide a ovoide-oblongas o elipsoides, glabras, pluriseminadas (Figuras XIA, B, C y D).

A

B

C

D

Figura XI.- Salpicrhoa origanifolia: fotografías de la planta completa (A), flores (B), frutos verdes (C) y maduros (D)

33 Esta especie florece y fructifica en primavera- verano y suele verse en fruto aún hasta mediados de otoño. Los frutos maduros son comestibles (Hurrel y col., 2010) y sus reservas son azúcares (mono y disacáridos), responsables del sabor agradable. Debido a que el fruto tiene una gran cantidad de agua todos sus componentes se encuentran en baja concentración, siendo el calcio el mineral que se destaca respecto a los demás. Se ha informado la presencia de cristales de oxalato de calcio en tallos, hojas y frutos (Wiemer y col., 2004).

En la Tabla III se presenta la composición de frutos maduros en base fresca y seca (Kinupp, 2007).

Tabla III.- Composición porcentual (g%) de los frutos maduros de S. origanifolia

Composición % Composición %

(base fresca) (base seca)

Proteínas 1.1-2.9 18.4

Azúcares totales 0.8-4.5 -

Calcio 0.010-0.024 0.18

En la etnomedicina se indica el empleo de diferentes partes de la planta con fines curativos y algunas de estas recetas aún son empleadas. Por ejemplo el zumo de la planta se utiliza para evitar la caída del cabello, la decocción de las raíces cura enfermedades de la piel como sabañones y escoriaciones y se encuentra registrado su uso entre los indios Mocovíes como anticonceptivo. La infusión obtenida de la decocción de hojas y flores mezcladas con raíces de tasi se emplea como galactógena, la decocción de la planta verde es narcótica y los frutos poseen propiedades diuréticas. (Wiemer y col., 2004).

Se han realizado estudios referidos a la anatomía del fruto y semilla (Pabón-Mora y Litt, 2011; Weimer y col., 2004), a caracteres epidérmicos generales (Freire y col., 2005) y a la anatomía caulinar y foliar en forma general (Colares y col., 1999). Por otro lado, Omezine y Skiri-Harzalla (2009) han estudiado las características morfológicas y de propagación de los rizomas y Galetto y col. (1999) informaron sobre la biología reproductiva de la especie. Se han estudiado también aspectos fitoquímicos y actividades biológicas in vitro

34 relacionadas con la salud humana en los extractos de diversas partes de la planta, con el fin de aislar e identificar los compuestos activos responsables de dichos atributos.

Wiemer y col. (2004) informaron que las particularidades del fruto lo ubican entre las bayas más primitivas de la familia y que el alto porcentaje de germinación de las semillas es compatible con el carácter de maleza que presenta la planta. Bado y col. (2004) y Boeris y col. (2004) informaron que las hojas contienen withanólidos denominados salpichrólidos A, B, C, D, E, F, G, H, J y K, los cuales presentan efectos letales y subletales sobre dos dípteros braquíceros: Musca domestica y Ceratitis capitata. Otros autores determinaron la presencia de flavonoides en las hojas y del alcaloide cuscohigrina en la raíz (Boeris y col., 2004). Estos autores estudiaron el efecto antiinflamatorio in vivo de extractos hidroalcohólicos de las partes aéreas de la planta, encontrando que presentan actividad antiinflamatoria sin provocar daños gástricos.

En un intento por identificar nuevas fuentes vegetales de peptidasas, fueron probados en ensayos de actividad proteolítica los extractos de varias especies nativas de Argentina y empleadas en la medicina popular. Una de las especies que mostró esta actividad fue Salpichroa origanifolia comúnmente conocida como huevito de gallo y considerada una maleza en nuestra región. Debido a la disponibilidad de la especie y a la ausencia de estudios sobre sus peptidasas, se decidió emplear esta especie como material vegetal de partida. En este contexto, este trabajo de tesis intenta generar un aporte al conocimiento de las peptidasas de origen vegetal y, considerando sus características, evaluar la posibilidad de su aplicación en procesos industriales.

35 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Almeida, C.M.; Pereira, C.; Da Costa, D.S.; Pereira, S.; Pissarra, J.; Simoes, I.; Faro, C. (2012) Chlapsin, a chloroplastidial aspartic proteinase from the green algae Chlamydomonas reinhardtii. Planta, 236(1):283-299.

Almeida, C.M.; Gomes, D.; Faro, C.; Simões, I. (2014) Engineering a cardosin B-derived rennet for sheep and goat cheese manufacture. Applied Microbiology and Biotechnology. 2014 Jul 2 [Epub ahead of print].

Álvarez Mejía, L. M. (2008) Borrachero, Cacao sabanero o floripondio (Brugmansia spp.) un grupo de plantas por redescubrir en la biodiversidad. Latinoamericana, 77-93.

Anusha, R.; Singh, M.K.; Bindhu, O. S. (2014) Characterisation of potential milk coagulants from Calotropis gigantean plant parts and their hydrolytic pattern of bovine casein. European Food Research and Technology, 238(6):997-1006.

Arshad, Z.I.M.; Amid, A.; Yusof, F.; Jaswir, I.; Ahmad, K.; Loke, S.P. (2014) Bromelain: an overview of industrial application and purification strategies. Applied Microbiology and Biotechnology, 98:7283–7297.

Arunachalam, C.; Saritha, K. (2009) Protease Enzyme: an Eco-friendly Alternative for Leather Industry. Indian Journal of Science and Technology, 2(12):29-32.

Athauda, S.; Matsumoto, K.; Rajapakshe, S.; Kuribayashi, M.; Kojima, M.; Kubomura-Yoshida, N.; Takahashi, K. (2004) Enzymic and structural characterization of nepenthesin, a unique member of a novel subfamily of aspartic proteinases. Biochemical Journal, 381:295-306.

Bado, S.; Mareggiani, G.; Amiano, N.; Burton, G.; Veleiro, A.S. (2004) Lethal and sublethal effects of withanolides from Salpichroa origanifolia and analogues on Ceratitis capitata. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 52:2875-2878.

Baker, P.J.; Numata, K. (2013) Polymerization of Peptide Polymers for Biomaterial Applications, Polymer Science, Dr. Faris Yılmaz (Ed.). ISBN: 978-953-51-0941-9, InTech, doi: 10.5772/46141.

Barrett, A.J., Rawlings, A.N.D.; Woessner, J.F. (1998) Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press, London.

36 Beigomi, M.; Mohammadifar, M.A.; Rohani, M.G.; Hashemi, M.; Valizadeh, M. (2013) Partial purification and characterization of milk-clotting enzyme extracted from Withania coagulans fruit. Iranian Journal of Nutrition Sciences and Food Technology, 8(2):31-40.

Bekhit, A.A.; Hopkins, D.L.; Geesink, G.; Bekhit, A.A.; Franks, P. (2014) Exogenous proteases for meat tenderization. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 54(8):1012- 1031. doi: 10.1080/10408398.2011.623247.

Bhalerao, R.; Keskitalo, J.; Sterky, F.; Erlandsson, R.; Björkbacka, H.; Birve, S.J.; Karlsson, J.; Gardeström, P.; Gustafsson, P.; Lundeberg, J.; Jansson, S. (2003) Gene expression in autumn leaves. Plant Physiology, 131(2):430-442.

Boeris, M.A.; Toso, R.E.; Skliar, M.I. (2004) Actividad Antiinflamatoria de Salpichroa origanifolia. Acta Farmacéutica Bonaerense, 23(2):138-141.

Bostanci, N.; Belibasakis, G. N. (2012) Doxycycline inhibits TREM-1 induction by Porphyromonas gingivalis. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 66:37–44.

Bruno, M. A.; Lazza, C. M.; Errasti, M. E.; López, L. M.; Caffini, N. O.; Pardo, M. F. (2010) Milk clotting and proteolytic activity of an enzyme preparation from Bromelia hieronymii fruits. LWT-Food Science and Technology, 43(4):695-701.

Bryksa, B. C.; Bhaumik, P.; Magracheva, E.; De Moura, D. C.; Kurylowicz, M.; Zdanov, A.; Yada, R. Y. (2011). Structure and mechanism of the saposin-like domain of a plant aspartic protease. Journal of Biological Chemistry, 286(32):28265-28275.

Cárdenas Támara, F. (2005) La materia médica homeopática: la familia de las solanáceas. http://www.homeoint.org/articles/cardenas/solanaceas.htm

Cerdá-Costa, N.; Gomis-Rüth, F.X. (2014) Architecture and function of metallopeptidase catalytic domains. Protein Science, 23:123–144.

Chen, J.; Ouyang, Y.; Wang, L.; Xie, W.; Zhang, Q. (2009) Aspartic proteases gene family in rice: gene structure and expression, predicted protein features and phylogenetic relation. Gene, 442(1):108-118.

Colares, M. N.; Bayón, N.D.; Stenglein, S.A.; Arambarri, A. M. (1999) Anatomía y etnobotánica de las especies medicinales de la Provincia Pampeana: Solanaceae (excepto Grabowskia y Solanum). Acta Farmacéutica Bonaerense, 18: 171-182.

Coll, N.S.; Smidler, A.; Puigvert, M.; Popa, C.; Valls M.; Dangl, J.L. (2014) The plant metacaspase AtMC1 in pathogen-triggered programmed cell death and aging:

37 functional linkage with autophagy. Cell Death and Differentiation, doi:10.1038/cdd.2014.50.

Cordeiro, M.C., Pais, M.S.; Brodelius, P.E. (1998) Cynara cardunculus subsp. flavescens (Cardoon): in vitro culture and the production of cyprosins—milk-clotting enzymes. En Medicinal and Aromatic Plants X (pp. 132-153). Springer Berlin Heidelberg.

Davies, D.R. (1990) The structure and function of the aspartic proteinases. Annual review of Biophysics and Biophysical Chemistry, 19(1):189-215.

Desfontînes R. (1829) Catalogus Plantarum Horti Regii Parisiensis. Apud Editorem J.S. Chaude, Paris, pp. 396.

Domínguez, F.; Cejudo, F.J. (2014) Programmed cell death (PCD): an essential process of cereal seed development and germination. Frontiers in Plant Science, 5, article 366.

Dunal, M.F. (1852). Solanaceae. En: de Candolle, A. P. Prodomus Systematis Naturalis Regni Vegetabilis.

Dutt, K.; Gupta, P.; Saran, S.; Misra, S.; Saxena, R.K. (2009) Production of milk-clotting protease from Bacillus subtilis. Applied Biochemistry and Biotechnology, 158:761–772.

Egas, C.; Lavoura, N.; Resende, R., Brito. R.M.; Pires, E.; De Lima, M.C.; Faro, C. (2000) The saposin-like domain of the plant aspartic proteinase precursor is a potent inducer of vesicle leakage. Journal of Biological Chemistry, 275(49):38190–38196.

Escamez , S.; Tuominen, H. (2014) Programmes of cell death and autolysis in tracheary elements: when a suicidal cell arranges its own corpse removal. Journal of Experimental Botany, 65(5): 1313-1321; doi: 10.1093/jsb/eru057.

Faro, C.; Gal, S. (2005) Aspartic proteinase content of the Arabidopsis genome. Current Protein and Peptide Science, 6(6):493-500.

Feijoo-Siota, L.; Villa, T.G. (2011) Native and biotechnologically engineered plant proteases with industrial applications. Food and Bioprocess Technology, 4(6):1066-1088.

Fernández-Alonso, J.L.; Galindo Bonilla, A.; Idrobo, J.M. (2007) Las plantas como evidencia legal. Desarrollo de la Botánica Forense en Colombia. Revista de la Academia Colombiana de Ciencias, 31(119):181-198.

Frazão, C., Bento, I., Costa, J., Soares, C.M., Verıs simo, P., Faro, C.; Carrondo, M.A. (1999) Crystal Structure of Cardosin A, a Glycosylated and Arg-Gly-Asp-containing Aspartic

38 Proteinase from the Flowers of Cynara cardunculus L. Journal of Biological Chemistry, 274(39):27694-27701.

Freire, S.E., Arambarri, A.M., Bayón, N.D., Sancho, G., Urtubey, E., Monti, C.; Novoa, M.C.; Colares, M.N. (2005) Epidermal characteristics of toxic plants for cattle from the Salado River Basin (Buenos Aires, Argentina). Boletín de la Sociedad Argentina de Botánica, 40(3-4):241-281.

Fujinaga, M., Cherney, M. M., Oyama, H., Oda, K.; James, M.N. (2004) The molecular structure and catalytic mechanism of a novel carboxyl peptidase from Scytalidium lignicolum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(10):3364-3369.

Galetto, L.; Morales, C.L.; Torres, C. (1999) Biología reproductiva de Salpichroa origanifolia (Solanaceae). Kurtziana, 27(1): 211-224.

Gan, S (2007) Senescence processes in plants. Annual plant reviews. V.26. Annals of Botany, 101(1):197.

Guevara, M.G., Oliva, C.R., Huarte, M.; Daleo, G.R. (2002) An aspartic protease with antimicrobial activity is induced after infection and wounding in intercellular fluids of potato tubers. European Journal of Plant Pathology, 108(2):131-137.

Guiama, V.D.; Libouga, D.G.; Ngah, E.; Mbofung, C.M. (2010) Milk-clotting activity of berries extracts from nine Solanum plants. African Journal of Biotechnology, 9(25): 3911-3918.

Guo, R., Xu, X., Carole, B., Li, X., Gao, M., Zheng, Y.; Wang, X. (2013). Genome-wide identification, evolutionary and expression analysis of the aspartic protease gene superfamily in grape. BMC Genomics, 14(1):554. doi:10.1186/1471-2164-14-554.

Gupta, R., Beg, Q.; Lorenz, P. (2002) Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 59(1):15-32.

Hartley, B.S. (1960) Proteolytic enzymes. Annual Reviews of Biochemistry, 29: 45-72.

Hatano, N.; Hamada, T. (2012). Proteomic analysis of secreted protein induced by a component of prey in pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes alata. Journal of Proteomics, 75(15):4844-4852.

Heywood, V. (1991) Botanic gardens and the conservation of medicinal plants. In Akerele, O., Heywood, V., and Synge, H. (eds.) Conservation of medicinal plants. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 213–228.

39 Huang, J.; Zhao, X.; Cheng, K.; Jiang, Y.; Ouyang, Y.; Xu, C.; Li, X.; Xiao, X.; Zhang, Q. (2013) OsAP65, a rice aspartic protease, is essential for male fertility and plays a role in pollen germination and pollen tube growth. Journal of Experimental Botany, 64 (11):3351- 3360.

Hunziker, A.T. (2001) Genera Solanacearum. A.R.G. Gantner Verlag K.G. Alemania. pp. 500.

Hurrell, J.A.; Ulibarri, E.A.; Delucchi, G. (2010) Biota Rioplatense XV: Frutas frescas, secas y preservadas 1ra. ed. - Buenos Aires: L.O.L.A. - Literature of Latin America, pp. 120-121.

Jacob, M.; Jaros, D.; Rohm, H. (2011) Recent advances in milk clotting enzymes. International Journal of Dairy Technology, 64: 14–33.

James, M. (2013) Catalytic Pathways of Aspartic Peptidases. In: Neil D. Rawlings and Guy S. Salvesen, ed. Handbook of Proteolytic Enzymes, Oxford: Academic Press, pp. 19-26.

Jisha, V.N.; Smitha, R.B.; Pradeep, S.; Sreedevi, S.; Unni, K.N.; Sajith, S.; Priji, P.; Josh, M.S.; Benjamin, S. (2013) Versatility of microbial proteases. Advances in Enzyme Research, 1(3):39-51. http://dx.doi.org/10.4236/aer.2013.13005

Johnson M.E.; Lucey, J.A.(2006) Major technological advances and trends in cheese. Journal of Dairy Science, 89:1174–1178.

Jones, B. L. (2005). The endogenous endoprotease inhibitors of barley and malt and their roles in malting and brewing. Journal of Cereal Science, 42(3):271-280.

Keel, S.H. (1984) A Revision of Genus Salpichroa (Solanaceae) Dissertation Doctor of Philosophy the City University of New York, U.S.A.

Keel, S.H. (1993) A New Species and a New Combination in Salpichroa (Solanaceae). Novon 3(1): 46-48.

Kervinen, J., Törmäkangas, K., Runeberg-Roos, P., Guruprasad, K., Blundell, T.; Teeri, T. H. (1995). Structure and possible function of aspartic proteinases in barley and other plants. In Aspartic Proteinases (pp. 241-254). Springer US.

Kervinen, J., Tobin, G.J., Costa, J., Waugh, D.S., Wlodawer, A., ; Zdanov, A. (1999) Crystal structure of plant aspartic proteinase prophytepsin: inactivation and vacuolar targeting. The EMBO Journal, 18(14):3947-3955.

Kervinen (2013) Phytepsin. En: Neil D. Rawlings and Guy S. Salvesen, editors, Handbook of Proteolytic Enzymes. Oxford: Academic Press, pp. 118-124.

40 Kinupp, V.F. (2007) Riqueza de plantas alimentícias não-convencionais na região metropolitana de Porto Alegre. En: Plantas alimentícias não-convencionais da Região Metropolitana de Porto Alegre, RS. Porto Alegre, pp 562 p. Tese - (Doutorado em Fitotecnia), Faculdade Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Kirk, O.; Borchert, T.V.; Fugesang, C.C. (2002) Industrial Enzyme Applications. Current Opinion in Biotechnology, 13:345-351.

Kulkarni, A.; Rao, M. (2007). Biochemical characterization of an aspartic protease from Vigna radiata: Kinetic interactions with the classical inhibitor pepstatin implicating a tight binding mechanism. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, 1774(5):619-627.

Kumar, S.; Sharma, N.S.; Saharan, M.R.; Singh, R. (2005) Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae: purification and characterization. Process Biochemistry, 40:1701- 1705.

Kumar, A.; Grover, S., Sharma, J.; Batish, V.K. (2010) Chymosin and other milk coagulants: sources and biotechnological interventions. Critical Reviews in Biotechnology, 30:243– 258.

Lamarck, C. (1793) Tableau Encyclepedique et Methodique des Trois Reqnes de la Nature, Botanique 2: 28. Paris.

Li, S.; Yang, X.; Yang, S.; Zhu, M.; Wang, X. (2012) Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. CSBJ, 2(3): e201209017, http://dx.doi.org/10.5936/csbj.201209017.

Li, Q., Yi, L., Marek, P.; Iverson, B.L. (2013) Commercial proteases: Present and future. FEBS Letters, 587(8):1155-1163.

Llorente, B.E., Obregón, W.D., Avilés, F.X., Caffini, N.O.; Vairo-Cavalli, S. (2014) Use of artichoke (Cynara scolymus) flower extract as a substitute for bovine rennet in the manufacture of Gouda-type cheese: Characterization of aspartic proteases. Food chemistry, 159:55-63.

López-Muñoz, F.; Álamo, M.; García-García, N. (2011) Tósigos y antídotos en la literatura cervantina: Sobre los venenos en la España tardorrenacentista Revista de Toxicología, 28(2):119-134.

41 Lufrano, D.; Faro, R.; Castanheira, P.; Parisi, G.; Veríssimo, P.;Vairo-Cavalli, S; Faro, C. (2012). Molecular cloning and characterization of procirsin, an active aspartic protease precursor from Cirsium vulgare (Asteraceae).Phytochemistry, 81:7-18.

Mahajan, R.T.; Chaudhari, G.M. (2014) Plant latex as vegetable source for milk clotting enzymes and their use in cheese preparation. International Journal of Advanced Research, 2(5):1173-1181.

Martins Dias Pedroso, D.P. (2013) Tesis de Maestría en Bioquímica: A Chloroplastidial Atypical Aspartic Protease from Arabidopsis thaliana: Optimization of Heterologous Expression, Purification and Biochemical Characterization. Departamento de Ciências da Vida, Faculdade de Ciências e Tecnología, Universidade de Coimbra.

McCarthy, A.L.; O’Callaghan, Y.C.; O’Brien, N.M. (2013) Protein Hydrolysates from Agricultural Crops—Bioactivity and Potential for Functional Food Development. Agriculture, 3:112-130.

Miguel, A.S.M.; Souza Martins-Meyer, T.; Verıs simo da Costa Figueiredo, E.; Waruar Paulo Lobo, P.; Dellamora-Ortiz, G.M. (2013). Enzymes in Bakery: Current and Future Trends, Food Industry, Dr. Innocenzo Muzzalupo (Ed.), ISBN: 978-953-51-0911-2, InTech, doi: 10.5772/53168.

Muñoz, F.F., Mendieta, J.R., Pagano, M.R., Paggi, R.A., Daleo, G.R. ; Guevara, M.G. (2010). The swaposin-like domain of potato aspartic protease exerts antimicrobial activity on plant and human pathogens. Peptides, 31(5):777-785.

Muñoz, F.; Palomares-Jerez, M. F.; Daleo, G.; Villalaín, J. ; Guevara, M. G. (2011). Cholesterol and membrane phospholipid compositions modulate the leakage capacity of the swaposin domain from a potato aspartic protease . Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular and Cell Biology of Lipids, 1811(12):1038-1044.

Muñoz, F.; Palomares-Jerez, M.F.; Daleo, G.; Villalaín, J.; Guevara, M.G. (2014) Possible mechanism of structural transformations induced by StAsp-PSI in lipid membranes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 1838(1) Part B:339-347.

Mutlu, A.; Gal, S. (1999). Plant aspartic proteinases: enzymes on the way to a function. Physiologia Plantarum, 105(3):569-576.

Naveena, B.M., Mendiratta, S.K.; Anjaneyulu, A.S.R. (2004) Tenderization of buffalo meat using plant proteases from Cucumis trigonus Roxb (Kachri) and Zingiber officinale roscoe (Ginger rhizome). Meat Science, 68(3):363-369.

42 Néstor, G.M.; Dely Rubí, C.G.; Héctor, J.C. (2012) Exploring the Milk-Clotting Properties of a Plant Coagulant from the Berries of S. elaeagnifolium var. Cavanilles. Journal of Food Science, 77: 89–94.

Obregón, W.D. (2008) Hidrolasas de látex de especies del género Araujia. purificación y caracterización de las enzimas proteolíticas. Tesis para optar al grado de Dr. de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata.

Olivares, J.E.; Díaz-Camino, C.;Estrada-Navarrete, G.; Alvarado-Affantranger, X.; Rodríguez- Kessler, M.; Zamudio, F.; Olamendi-Portugal, T.; Márquez, Y.; Servín, L.D.; Sánchez, F. (2011) Nodulin 41, a novel late nodulin of common bean with peptidase activity. BMC Plant Biology, 11:134.

Omezine, A.; Skiri-Harzalla, F. (2009), Distribution du système souterrain et régénération végétative (à partir des fragments de rhizome) de Salpichroa origanifolia (Lamarck) Baillon/Thellung (Solanaceae). EPPO Bulletin, 39: 194–200.

Pabón-Mora, N.; Litt, A. (2011). Comparative anatomical and developmental analysis of dry and fleshy fruits of Solanaceae. American Journal of Botany, 98(9):1415-1436.

Page, M.J.; Di Cera, E. (2008) Serine peptidases: Classification, structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 65(7):1220-1236.

Pires, E.M.V. (1998) Cardosin B. En: A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (Eds.) Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press, San Diego, CA; 1998: 843– 846.

Polaina, J.; McCabe, A.P. (2007) Industrial Enzymes: Structure, Function, and Applications. New York: 1030 Springer; 654 pp.

Rawlings, A.N.D.; Barrett, A.J. (1993) Evolutionary families of peptidases. Biochemical Journal, 290: 205-218.

Rawlings, N.D.; Barrett, A.J.; Bateman, A. (2011) Asparagine peptide lyases. A seventh catalytic type of proteolytic enzymes. Journal of Biological Chemistry, 286(44):38321–38328.

Rawlings, A.N.D.; Barret, A.J. (2013) Handbook of Proteolytic Enzymes. 3rd. Ed. Rawlings, N.D.; Salvesen, G. (Eds.) Elsevier. Amsterdam.

43 Rawlings, A.N.D.; Waller, M.; Barrett, A.J.; Bateman, A. (2014) MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Research, 42:503- 509.

Rodrigo, I.; Vera, P.; Conejero, V. (1989) Degradation of tomato pathogenesis-related proteins by an endogenous 37 kDa aspartyl endoproteinase. European Journal of Biochemistry, 184: 663–669.

Rodrigo, I.; Vera, P.; van Loon, L.C.; Conejero, V. (1991) Degradation of tobacco pathogenesis-related proteins in plants. Plant Physiology, 95: 616-622.

Runeberg-Roos, P.; Kervinen, J.; Kovaleva, V.; Reikhel, N.V.; Gal, S. (1994) The aspartic proteinase of barley is a vacuolar enzyme that processes lectin in vitro. Plant Physiology, 105:321-329.

Sawant, R.; Nagendran, S. (2014) Protease: an enzyme with multiple industrial applications. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(6):568-579.

Scannell, A.G.M.; Kenneally, P.M.; Arendt, E.K. (2004) Contribution of started cultures to the proteolytic process of a fermented non-dried whole muscle ham product. International Journal of Food Microbiology, 93:219–230.

Seemuller, E.; Lupas, A.; Stock, D.; Lowe, J.; Huber, R.; Baumeister, W. (1995) Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science, 268(5210):579-582.

Smalle, J.; Vierstra, R.D. (2004) The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway. Annual Reviews in Plant Biology, 55: 555-590.

Shieh, C-J; Phan Thi, L-A; Shih, I-L (2009) Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis natto. Biochemical Engineering Journal, 43:85–91.

Sidrach, L.; Garcia-Canovas, F.; Tudela, J.; Neptuno Rodríguez-Lopez, J. (2005) Purification of cynarases from artichoke (Cynara scolymus): enzymatic properties of cynarase A. Phytochemistry, 66:41-49.

Simões, I.; Faro, R.; Bur, D.; Faro, C. (2007) Characterization of recombinant CDR1, an Arabidopsis aspartic proteinase involved in disease resistance. Journal of Biological Chemistry, 282(43):31358-31365.

Simões, I.; Faro, C. (2004) Structure and function of plant aspartic proteinases. European Journal of Biochemistry, 271(11):2067-2075.

44 Spellman, D.; McEvoy, E.; O´Cuinn, G.; FitzGerald, R.J. (2003) Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of the TNSB, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis. International Dairy Journal, 13:447-453.

Stevens, P.F. (2012) Angiosperm Phylogeny Website

http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/

Stevens, P.F. (2001 en adelante). Angiosperm Phylogeny Website. Version 12, July 2012 [continuamente actualizado].

http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/Consulta: Julio 2014

Sullivan, G.A.; Calkins, C.R. (2010) Application of exogenous enzymes to beef muscle of high and low-connective tissue. Meat Science, 85(4):730-734.

Swain, Ch. (2011) http://www.cambridgemedchemconsulting.com/DDResources/Hit_iden/Focus/aspartic_ protease_inhibitors.html

Tanabe, S.; Arat, S.; Watanabe, M. (1996) Modification of wheat flour with bromelain and baking hypoallergenic bread with added ingredients. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 60:1269-1272.

Tang, J.; James, M.N.; Hsu, I.N.; Jenkins, J.A.; Blundell, T.L.(1978) Structural evidence for gene duplication in the evolution of the acid proteases. Nature, 271:618–621.

Tang, J., Wong, R.N. (1987) Evolution in the structure and function of aspartic proteases. Journal of Cellular Biochemistry, 33:53–63.

Tang, J. (2010) Aspartic proteases: structure, function, and inhibition. In: Ghosh AK (ed) Aspartic acid proteases as therapeutic targets. Wiley-VCH Verlag GmbH; Co. KgaA, Weinheim, Germany - doi:10.1002/9783527630943.

Tavano, O.L. (2013) Protein hydrolysis using proteases: An important tool for Food Biotechnology. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 90:1-11.

Thanikaivelan, P.; Rao, J. R.; Nair, B. U.; Ramasami, T. (2004) Progress and recent trends in biotechnological methods for leather processing. Trends in Biotechnology, 22(4):181- 188.

45 Timotijević, G.S.; Milisavljević, M.D.; Radović, S.R.; Konstantinović, M.M.; Maksimović, V.R. (2010) Ubiquitous aspartic proteinase as an actor in the stress response in buckwheat. Journal of Plant Physiology, 167(1):61-68.

Törmäkangas, K.; Kervinen, J.; Östman, A.; Teeri, T. (1994) Tissue-specific localization of aspartic proteinase in developing and germinating barley grains. Planta, 195(1):116- 125.

Tomar, R.; Kumar, R.; Jagannadham, M.V.. (2008) A stable serine protease, wrightine, from latex of plant Wrightia tinctoria [Roxb].R.Br: purification and biochemical properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 5(6):1479–1487.

Trillo-Muyo, S. (2013) Tesis: Estudio estructural y funcional de un inhibidor proteínico monodominio de doble faz, sermetstatina, en complejo con dos peptidasas de diferente clase, subtilisina y esnapalisina. Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA Barcelona.

Turk, B. (2006) Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nature Reviews Drug Discovery, 5:785-799.

Umezawa, H. (1972) Enzyme Inhibitors of Microbial Origin, pp. 34-50, University Park Press, Baltimore, London and Tokyo.

Vairo Cavalli, S.; Claver, S.; Priolo, N.; Natalucci, C.L. (2005) Extraction and partial characterization of a coagulant preparation from Silybum marianum flowers. Its action on bovine caseinate. Journal of Dairy Research, 72(3): 271-275.

Vairo Cavalli, , S.; Lufrano, D.; Cimino, C.V.; Faro, C.; Veríssimo, P.; Pires, E. (2013) Properties and applications of phytepsins from thistle flowers. Phytochemistry, 92:16–32.

Vishwanatha, K.S.; Rao, A.G. ; Singh, S.A. (2010) Production and characterization of a milk- clotting enzyme from Aspergillus oryzae MTCC 5341. Applied Microbiology and Biotechnology, 85:1849-1859.

Wiemer, A.P.; Cosa, M.T.; Dottori, N. (2004) Desarrollo y estructura de fruto y semilla de Salpichroa origanifolia (Solanaceae). Boletín de la Sociedad Argentina de Botánica, 39:41–50.

Xia, Y.; Suzuki, H.; Borevitz, J.; Blount, J., Guo, Z.; Patel, K.; Lamb, C. (2004). An extracellular aspartic protease functions in Arabidopsis disease resistance signaling. The EMBO journal, 23(4):980-988.

46 Xiang, Y.; Leiman, P.G.; Li, L.; Grimes, S.; Anderson, D.L.; Rossmann, M.G. (2009) Crystallographic Insights into the Autocatalytic Assembly Mechanism of a Bacteriophage Tail Spike. Molecular Cell, 34(3):375-386.

Yegin, S.; Fernandez-Lahore, M.; Jose Gama Salgado, A.; Guvenc, U.M.; Goksungur, Y.; Tari, C. (2011) Aspartic proteinases from Mucor spp. in cheese manufacturing. Applied Microbiology and Biotechnology, 89:949–960.

Zuloaga, F.O.; Morrone, O.; Belgrano, M.J. (1994 en adelante). Catálogo de las Plantas Vasculares Del Cono Sur. Website: http://www.floraargentina.edu.ar/ Consultado en Julio de 2014.

47

Objetivos

48

OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS

Las enzimas proteolíticas de origen vegetal han recibido especial atención en el campo de la fitoterapia y en la industria en general debido a su propiedad única y distintiva de ser activas en amplios rangos de pH y temperatura. Es por ello que existe un interés creciente en identificar nuevas especies vegetales que puedan ser fuente de enzimas proteolíticas más potentes, más activas y más específicas. Existen más de 10.000 especies vegetales y solo el 1% de ellas han sido estudiadas en profundidad.

Nuestro país dispone de una gran variedad de plantas nativas o cultivadas que pueden ser potenciales fuentes de peptidasas, por lo tanto el estudio y caracterización bioquímica de una nueva enzima proteolítica contribuiría al aprovechamiento de nuestros recursos sustentables.

Por estos motivos, se plantearon dos objetivos generales y objetivos particulares que contribuyeran al estudio básico y de aplicaciones potenciales de una nueva peptidasa presente en los frutos de una especie vegetal nativa de Argentina.

El objetivo general de este trabajo de tesis doctoral comprende estudios básicos y aplicados.

 Estudios básicos que incluyen el aislamiento, purificación y caracterización de la enzima proteolítica presente en frutos maduros de Salpichroa origanifolia.

 Estudios aplicados para evaluar la utilización de la aspartil peptidasa sobre proteínas de uso alimentario tanto para la coagulación de la leche como para la producción de péptidos con actividad biológica y para evaluar la actividad de la enzima como antimicrobiano natural.

Los objetivos particulares propuestos fueron:

Estudios básicos

 Aislar la enzima proteolítica de diferentes órganos de la planta y con diferentes condiciones de extracción y caracterizar los extractos crudos.

 Diseñar una estrategia de purificación para obtener una preparación homogénea.

49

 Caracterizar bioquímica y cinéticamente la enzima pura.

 Estabilizar la enzima por inmovilización en diferentes soportes.

Estudios aplicados

 Analizar la actividad coagulante de la leche aplicando modelos matemáticos para optimizar los parámetros fisicoquímicos que intervienen en el proceso de coagulación de la leche.

 Estudiar la actividad hidrolítica de la enzima libre e inmovilizada sobre proteínas lácteas.

 Evaluar la actividad antioxidante, antimicrobiana y antihipertensiva de los péptidos obtenidos por hidrólisis enzimática.

 Realizar ensayos preliminares para la formulación de complejos de inclusión entre ciclodextrinas y los péptidos bioactivos obtenidos a partir de los hidrolizados de proteínas lácteas para su incorporación en alimentos.

 Evaluar la actividad antimicrobiana de la enzima sobre bacterias potencialmente patógenas del hombre, contaminantes de los alimentos y sobre microorganismos que infectan los cultivos.

Materiales y Métodos

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL VEGETAL

Salpichroa origanifolia, popularmente conocida como «uvita del campo» o «huevito de gallo», es una especie herbácea perenne de la familia de las Solanaceae. Es nativa del norte y centro de Argentina, donde suele considerarse como una maleza invasora o como una planta silvestre. El fruto es una baya ovoide que emblanquece al madurar y tiene sabor dulce que recuerda al de la uva, a lo que alude uno de sus nombres vulgares, y es comestible.

En el presente trabajo se empleó como material vegetal un pool clonal de la especie Salpichroa origanifolia recolectado en la localidad de Luján, provincia de Buenos Aires, República Argentina.

PREPARACIÓN DEL EXTRACTO CRUDO ENZIMÁTICO

Para la preparación del extracto crudo se trituraron los frutos enteros, frescos y maduros con etanol a -10°C. Se separó el precipitado por filtración al vacío y se secó a temperatura ambiente. El material sólido se solubilizó en buffer de fosfato de sodio 50 mM de pH 7.0 con el agregado de 5 mM de EDTA, para evitar la acción de las fenoloxidasas (Anderson, 1968). De esta manera se obtuvo una preparación enzimática parcialmente purificada al 15% (p/V) que recibió el nombre de extracto crudo. El EXTRACTO CRUDO fue fraccionado y conservado a –20°C hasta el momento de ser utilizado en estudios posteriores.

Este método de extracción fue empleado porque permite obtener una preparación enzimática parcialmente purificada ya que en el proceso se eliminan gran parte de los contaminantes (polifenoles, etc.).

50

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Actividad proteolítica

La actividad proteolítica de las preparaciones enzimáticas (extractos crudos, enzima pura o inmovilizada) fue estimada con sustratos proteicos naturales (hemoglobina y caseína) y con un sustrato sintético.

Hemoglobina

El sustrato se preparó de acuerdo a la técnica descripta por Anson (1938) con algunas modificaciones. La hemoglobina se preparó disolviendo 200 mg de hemoglobina bovina (Sigma) en una solución de 80 g de urea y 80 mL de agua. Luego de incubar a 40°C durante 30 minutos, se filtró la solución con papel, se ajustó el pH con buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de pH 4.0 y se completó el volumen a 100 mL para obtener una solución al 1% (p/V).

En el ensayo se incubaron 200 L del extracto crudo a 40°C y luego de 5 minutos se agregaron 200 L de solución de hemoglobina desnaturalizada al 1% (p/V) en buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de sodio pH 4.0. Luego de 10 minutos de incubación, la reacción se detuvo con el agregado de 700 L de ácido tricoloroacético (TCA) al 5% (p/V). La mezcla se mantuvo en reposo durante 20 minutos en baño de hielo y luego se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos. Sobre 0.5 mL del sobrenadante se adicionaron 0.5 mL de NaOH (0.5 M) y 0.3 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se midió la absorbancia de la solución resultante en un espectrofotómetro Hitachi U-2000.

La unidad de actividad proteolítica (Uhem) fue definida como la cantidad de enzima requerida para lograr un incremento de una unidad de absorbancia por minuto a 750 nm en las condiciones del ensayo.

Caseína

La caseína bovina fue empleada como sustrato proteico utilizando el protocolo desarrollado por Parisi y col. (2008). La reacción se inició con el agregado de 100 L de la preparación

51

enzimática (extracto crudo o fracción purificada) a 900 L de solución de caseína al 0.5% (p/V) en buffer fosfato de sodio 50 mM de pH 6.0 y luego de 15 minutos de incubación a 40°C, la reacción se detuvo con el agregado de 1 mL de TCA al 5% (p/V). La suspensión se dejó en reposo durante 20 minutos en baño de hielo y luego fue centrifugada durante 10 min a 14000 rpm. Se midió la absorbancia del sobrenadante a 280 nm para determinar los péptidos solubles obtenidos por digestión proteolítica.

Para medir la actividad caseinolítica de la enzima inmovilizada se incubaron 25 mg del derivado y 1000 µL de la solución de caseína durante 30 minutos a 40°C y 100 rpm. Luego se procedió según el procedimiento descripto en el párrafo anterior.

La Unidad de actividad caseinolítica (Ucas) fue definida como la cantidad de enzima necesaria para producir un incremento de una unidad de absorbancia por minuto a 280 nm en las condiciones del ensayo.

Sustrato sintético

El péptido H-Pro-Thr-Glu-Phe-p-(NO2)-Phe-Arg-Leu-OH (PNPE) provisto por la firma Bachem (#H-1002, Bachem, USA) fue empleado como sustrato sintético para los ensayos de actividad proteolítica con la enzima pura (Dunn y col., 1986).

En el ensayo, se adicionaron 100 µL de la enzima pura (50 µg.mL-1) a 1 mL de solución del sustrato (PNPE 0.2 mM) preparado en buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de pH 3.5 en distintas concentraciones (25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 500 y 700 µM). Se agitó la mezcla obtenida y se midió la absorbancia producida por los productos p- nitrofenilados a 310 nm en un espectrofotómetro GeneQuant 1300 UV/visible (GE, USA). Para los cálculos se consideró el coeficiente de absorción molar del p-nitrofenol de valor 1800 M-1.cm-1 a 310 nm.

La Unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1 mmol.seg-1 del sustrato PNPE en las condiciones del ensayo.

52

Actividad coagulante

Los ensayos de coagulación se realizaron de acuerdo a normas FIL (IDF Standard 157A: 1997). Como testigo se utilizó una solución del cuajo obtenido por fermentación de Aspergillus niger denominado FPC.

En el ensayo se incubaron en un baño termostático a 37°C, 500 µL del extracto enzimático con 5 mL de leche descremada en polvo (Molico) reconstituida al 12% (p/V) y con el agregado de CaCl2 20 mM. Para visualizar la formación del coágulo, los tubos se rotaron manualmente mientras permanecían sumergidos en el baño. Se registró el tiempo en el cual se observaron coágulos sobre la pared del tubo.

CONTENIDO DE PROTEÍNAS

El contenido de proteínas en el extracto crudo y en las muestras purificadas fue estimado por el método de Bradford (1976) empleando albúmina sérica bovina (BSA) como proteína patrón para la construcción de la curva de calibración.

Para el método estándar, se adicionaron 50 μL de la muestra a 2.5 mL del reactivo y se midió la absorbancia de la solución resultante a 595 nm. El rango de concentraciones empleado en la curva de calibración para el macrométodo fue de 100 a 1000 μg de proteína.mL-1. Para el micrométodo se adicionaron 100 μL de la muestra a 1 mL de reactivo y luego se procedió como se explicó anteriormente. El rango de concentraciones empleadas para el micrométodo fue de 1 a 100 μg.mL-1 de proteína.

En los ensayos de purificación, el contenido de proteínas se estimó por medida de la absorbancia a 280 nm.

La concentración de proteínas en los hidrolizados de proteínas lácteas se estimó por el método de Lowry con algunas modificaciones (Lowry y col., 1951). La técnica consistió en adicionar 1 mL de muestra de hidrolizados a 1 mL de la solución alcalina de cobre al 0.25% (p/V). La solución resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 minutos luego del cual se agregaron 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu (1:3). Una vez transcurridos 20 minutos se midió la absorbancia a 750 nm. Se empleó BSA como patrón para la curva de calibración en un rango de 5 a 200 μg.min-1 de proteína.

53

ENSAYOS DE CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA

Se estudió el efecto del pH, de la temperatura, la estabilidad térmica, el almacenamiento prolongado, de compuestos reductores y de inhibidores específicos de peptidasas sobre la actividad proteolítica del extracto crudo y de la enzima pura.

Efecto del pH sobre la actividad proteolítica

Para estudiar el efecto del pH sobre la actividad proteolítica se emplearon dos sustratos proteicos naturales: caseína y hemoglobina, cubriendo un rango de pH comprendido entre 2.0 y 8.0. En las determinaciones se emplearon como soluciones buffer glicina – HCl 50 mM (pH 2.0 y 2.5), buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM (pH 3.0 a 5.5) y buffer fosfato de sodio 50 mM (pH 6.0 a 8.0).

El efecto del pH con hemoglobina como sustrato se evaluó entre pH 2.0 y 8.0 ya que no se encontró actividad proteolítica a pH superiores.

El ensayo con caseína como sustrato se estudió entre pH 5.5 y 8.0. El rango de pH para este sustrato se estableció en función del pH de coagulación de las proteínas lácteas. Se sabe que la precipitación de las caseínas de la leche por acidificación comienza a pH 5.3 y se completa cuando el pH alcanza su punto isoeléctrico (pH 4.6). A valores de pH inferiores a 5.5 la caseína no es estable, por este motivo, la actividad proteolítica con caseína como sustrato se midió en el rango de pH de 5.5 a 8.0.

Efecto de la temperatura sobre la actividad proteolítica

El comportamiento enzimático a distintas temperaturas se determinó midiendo la actividad proteolítica frente a una solución de caseína preparada en buffer fosfato 50 mM de pH 6.0 y en un rango de temperaturas comprendido entre 20°C - 55°C y a intervalos de 5°C.

54

Ensayos de estabilidad térmica

Para analizar la estabilidad térmica de las preparaciones enzimáticas se incubaron las distintas muestras (extracto crudo y enzima pura) durante 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 y 120 minutos a 40, 45, 50 y 55°C. Luego de cada tratamiento térmico las muestras fueron conservadas en baño de hielo hasta la medición de la actividad proteolítica empleando caseína como sustrato (página 51).

Estabilidad en el almacenamiento prolongado a bajas temperaturas

Se estudió también el efecto del almacenamiento prolongado de los extractos crudos conservados a -20°C durante 6 meses. Para el ensayo se fraccionaron alícuotas de 1 mL de extracto crudo y se conservaron a -20°C en freezer durante 6 meses. Se retiraron fracciones en distintos tiempos (1, 2, 4 y 6 meses) y en ellas se midió la actividad proteolítica residual empleando caseína como sustrato (página 51). Los resultados se expresaron como un porcentaje de la actividad residual respecto de la obtenida con los extractos recién preparados.

La estabilidad de la enzima pura conservada a bajas temperaturas se evaluó durante 30 días por técnicas electroforéticas. En el ensayo se realizó la electroforesis nativa (10%) de muestras de enzima pura conservadas a -20°C durante 7, 14 y 30 días y se visualizó el perfil proteico en función del tiempo. Los geles fueron coloreados con Coomasie Brilliant Blue R-250 (Laemmli, 1970) y por tinción con plata (Blum y col, 1987).

Efecto de compuestos reductores sobre la actividad proteolítica

Se estudió el efecto de compuestos reductores como β-mercaptoetanol y ditiotreitol sobre la actividad proteolítica del extracto crudo. Para ello se preincubó el extracto crudo con los compuestos reductores (10 mM final) y la solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los controles se realizaron preincubando el extracto crudo en las mismas condiciones y utilizando el mismo volumen de agua que el de las soluciones reductoras empleadas. Luego se midió la actividad proteolítica de las soluciones empleando caseína como sustrato (página 51).

55

Efecto de inhibidores

La acción de los inhibidores específicos de peptidasas se estudió en tubo de ensayo y por técnicas de zimografía (página 60).

Para evaluar el efecto de inhibidores diagnósticos, se realizaron electroforesis del extracto crudo en condiciones nativas preparando geles de poliacrilamida al 10% y con gelatina al 0.1% polimerizada en el gel. Se sembraron 20 μL de extracto crudo en todas las calles del gel. Luego del desarrollo de la electroforesis, se cortaron los geles y se colocaron las tiras de gel en solución buffer ácido acético/acetato de sodio, 50 mM de pH 4.0 que contenían pepstatina (1 μM), 1,10-fenantrolina (10 mM), PMSF (1 mM) y E64 (10 μM). Los geles sumergidos en las soluciones fueron incubados durante 12 horas a 40°C y una vez transcurrido este tiempo, fueron coloreados con una solución de Coomasie Brilliant Blue R- 250 (CBB R-250).

Para confirmar el grupo catalítico de la enzima purificada se realizaron también ensayos de inhibición en tubo de ensayo empleando inhibidores específicos: Pepstatina A

(para enzimas aspárticas), PMSF (para serínicas y cisteínicas), E64 (para cisteínicas) y 1,10- fenantrolina (para proteasas metálicas) en las concentraciones indicadas y a pH 6.0. El extracto crudo fue preincubado con la solución del inhibidor durante 30 minutos a 30°C y luego se determinó su actividad residual sobre caseína (página 51).

ESTRATEGIAS DE PURIFICACIÓN

Cromatografía de intercambio aniónico en columnas DEAE-Sepharose Fast Flow

La primera estrategia de purificación aplicada fue la cromatografía de intercambio aniónico con resinas de DEAE-Sepharose Fast Flow de Sigma).

Se partió de un extracto crudo de Salpichroa origanifolia con una concentración de proteínas de 0.5 mg.mL-1y 145 Ucas.mL-1. El ensayo se realizó en batch para favorecer el contacto entre la resina intercambiadora y el extracto crudo. En un tubo tipo Falcon de 100 mL con tapa a rosca, se colocaron 40 mL de la resina de DEAE-Sepharose Fast Flow equilibrada en 85 mL buffer de equilibrio (buffer fosfato de sodio 50 mM de pH 7.0) y se le

56

agregaron 15 mL del extracto crudo. El tubo se colocó en un agitador horizontal a baja velocidad durante 1 hora y a temperatura ambiente. El contenido del tubo se empaquetó en una columna de vidrio de 2 x 20 cm. La elución de las proteínas que no fueron retenidas por el intercambiador fue realizada con el buffer de equilibrio hasta que la absorbancia a 280 nm del buffer de lavado alcanzara valores cercanos a 0 (espectrofotómetro GeneQuant 1300, GE). A continuación, para la elución de las proteínas retenidas por la resina, se aplicó un gradiente lineal de NaCl entre 0-0.6 M y a una velocidad de 1 mL.min-1. Se recogieron fracciones de 2.4 mL cada una. El contenido de proteínas de las fracciones colectadas fue estimado por lectura de la absorbancia a 280 nm y la actividad proteolítica fue determinada con caseína como sustrato (página 51). El pico con actividad caseinolítica fue desalado por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-15 y almacenado a -20°C para futuros estudios.

Cromatografía de intercambio iónico en una columna Mono Q con un equipo FPLC

Se empleó una columna Mono-Q (5/50 GL, GE) en un sistema FPLC (ÄKTA purifier, GE Healthcare Bio Sciences, Uppsala, Sweden) equilibrada con buffer de fosfatos de sodio 50 mM de pH 7.0.

Se sembraron 5 mL del extracto crudo de Salpichroa origanifolia (pH 7.0) previamente filtrado (0.2 μm, Minisart®, Sartorius Corp.). Los compuestos retenidos por la resina intercambiadora fueron eluidos con un gradiente lineal de NaCl (0.15-0.5 M) a una velocidad de 0,6 mL.min-1. La fracción activa fue desalada por cromatografía de exclusión molecular por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-15. La fracción purificada con actividad caseinolítica se conservó a -20°C para posteriores estudios.

57

TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

Electroforesis en condiciones nativas y desnaturalizantes

Se desarrollaron técnicas de electroforesis nativa y desnaturalizante, tanto en condiciones reductoras como no reductoras (Laemmli, 1970).

Se prepararon geles verticales en un equipo Mini Protean III de BioRad. La composición de los geles, de los buffers de muestra y del reservorio y de las soluciones de teñido y decoloración se detallan en la tabla que se adjunta en la siguiente página.

Las muestras se concentraron por precipitación con tres volúmenes de acetona fría (-20°C), se redisolvieron los precipitados en un volumen de buffer de muestra de modo de obtener una concentración final de 1-10 μg.μL-1 de proteínas.

Para la electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras, las muestras fueron llevadas a ebullición durante 5 min y centrifugadas a 14000 rpm. Los sobrenadantes obtenidos fueron las muestras a sembrar. Los volúmenes de siembra fueron de 5 μL para los patrones de peso molecular y en el caso de las muestras, se calculó el volumen necesario para sembrar entre 10 y 20 μg de proteína por cada calle (volumen máximo 20 μL). La electroforesis se desarrolló con un voltaje constante de 80 V durante el apilado y de 100 V hasta la finalización de la corrida (frente de corrida al borde inferior del gel).

Luego de la corrida electroforética, los geles se colorearon con CBB R-250 a temperatura ambiente durante 10 horas o a 40°C durante 2 horas y. posteriormente se decoloraron con solución decolorante hasta que se observaron las bandas de proteína sobre el fondo claro.

En el caso de las muestras purificadas con bajo contenido proteico se realizó la tinción argéntica (Blum y col., 1987) por su alta sensibilidad para detectar bajas concentraciones proteicas.

En la electroforesis SDS-PAGE se emplearon patrones de bajo peso molecular (Low Molecular Weight Range Sigma Marker producto N° 3913M) constituidos por: albúmina sérica bovina (66 kDa), ovoalbúmina de pollo (45 kDa), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (36 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa), tripsinógeno de páncreas bovino (24 kDa), inhibidor de tripsina de soja (20 kDa), -lactoalbúmina (14.2 kDa) y aprotinina de corazón bovino (6.5 kDa).

58

Composición de los geles de poliacrilamida

Solución Tipo de electroforesis

Nativa (10%) SDS-PAGE no reductora SDS-PAGE reductora (15%) (15%) Gel de stacking Acril-Bis (30:0,8) 670 μL Acril-Bis (30:0,8) 670 μL Buffer Tris HCl 500 μL Buffer Tris HCl 500 μL

pH 6.8 pH 6.8

H2Od 2,7 mL SDS 10% 40 μL

PSA 10% 40 μL H2Od 2.7 mL TEMED 4 μL PSA10% 40 μL TEMED 4 μL Gel de Acril-Bis (30:0,8) 1.7 mL Acril-Bis (30:0,8) 2.2 mL resolución Buffer Tris HCl 1.3 mL Buffer Tris HCl 1.3 mL

pH 8.8 pH 8.8

H2Od 1.9 mL SDS 10% 50 μL

PSA 10% 50 μL H2Od 1.4 mL TEMED 8 μL PSA 10% 50 μL TEMED 4 μL Buffer de Buffer Tris HCl 2.5 mL Buffer Tris HCl 2.5 mL Buffer Tris HCl 2.5 mL muestra pH 6.8 de pH 6.8 pH 6.8

Glicerol 2.0 mL Glicerol 2.0 mL Glicerol 2.0 mL Azul de bromofenol 0.1 mg Azul de 0.1 mg Azul de bromofenol 0.1 mg

H2Od 5.5 mL bromofenol β- mercaptoetanol 500 μl

H2Od 5.5 mL H2Od 5.5 mL Buffer del Tris base 6 g Tris base 3 g reservorio Glicina 28.8 g Glicina 14 g

H2Od 1000 mL SDS 1 g

H2Od 1000 mL Solución para Coomassie Brillant Blue R250 0.5 g teñir Metanol 125 mL Acido acético 50 mL

H2Od 325 mL Solución Metanol 25 mL decolorante Acido acético 10 mL

H2Od 65 mL

Las imágenes escaneadas fueron procesadas mediante el software Gel-Pro Analyzer® v.4.0.00.001 para Windows (Media Cybernetics) para la obtención de los correspondientes densitogramas.

59

Determinación de actividad enzimática en geles de poliacrilamida

Zimogramas en condiciones nativas

Se realizaron electroforesis en condiciones nativas con geles de poliacrilamida al 10% y gelatina al 0.1% polimerizada en el gel. Luego del desarrollo de la electroforesis, los geles fueron incubados en buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de pH 4.0 durante 12 horas y a 40°C. Una vez transcurrido este tiempo, los geles de actividad fueron coloreados con una solución de CBB R-250.

Zimogramas en condiciones desnaturalizantes (con SDS)

Para detectar y visualizar la actividad proteolítica en zimogramas preparados en condiciones desnaturalizantes, se prepararon geles de resolución con poliacrilamida al 10%, con 0.1% de SDS y gelatina 0.1 % polimerizada en la matriz del gel de acuerdo al protocolo de Kleiner y Stetler-Stevenson (1994). Luego de la corrida electroforética, se lavaron los geles con agua bidestilada durante 2 minutos y luego con 5% de Tritón X-100 durante 20 minutos y con agitación para favorecer la renaturalización de las proteínas. Los geles de actividad se incubaron durante toda la noche en estufa a 40°C en buffer ácido acético/acetato de sosio 100 mM de pH 4.0 y, una vez transcurrido este tiempo, los geles fueron coloreados con una solución de CBB R-250.

ENSAYOS DE CARACTERIZACIÓN CINÉTICA

Determinación de las constantes cinéticas

Se estudiaron las constantes cinéticas Km y Vmáx empleando sustratos proteicos naturales como hemoglobina (en un rango de concentraciones entre 64 y 1000 μM, preparadas en buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de pH 4.0), α-caseína (en un rango de concentraciones entre 40 y 250 μM, preparadas en buffer de fosfatos 50 mM de pH 6.0), y el péptido sintético PNPE (en un rango de concentraciones entre 25 y 700 μM en buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de pH 4.0) según el protocolo de Kirschke y col. (1999).

60

Los parámetros cinéticos Km y Vmáx se calcularon a partir de los gráficos de las dobles recíprocas de Lineweaver- Burk, realizando regresión lineal con el software GraphPad Prism v .01 - (http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/).

Cinética de inhibición con Pepstatina

Para determinar la concentración del sitio catalítico de la enzima, se estudió la cinética de inactivación con pepstatina, inhibidor específico de las peptidasas aspárticas (Barrett y Kirschke, 1981). En los experimentos se incubaron 200 L de la enzima con 2 L de distintas concentraciones de Pepstatina (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75 y 1 M) durante 30 min a 30°C y se determinó luego la actividad residual con el péptido sintético PNPE a 40°C (página 52).

Especificidad de clivaje de la enzima purificada sobre la cadena β de la insulina oxidada

Se incubó una solución de la cadena oxidada de la β-insulina (1 mg.mL-1) con la enzima purificada en una relación 100:1 (p/p) en buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de pH 4.0. La mezcla de reacción se incubó toda la noche a 40°C y luego fue centrifugada a 12000 rpm durante 6 minutos. Los fragmentos peptídicos obtenidos fueron separados por RP-HPLC empleando una columna Brownlee C18. La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente y la columna fue equilibrada con 0.1% (V/V) de ácido trifluoroacético (TFA). Los péptidos fueron eluidos con un gradiente lineal de acetonitrilo (0-80%) en 0.1% (V/V) de TFA a una velocidad de 0.2 mL.min-1. Los péptidos aislados fueron analizados por espectrometría de masas.

ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN POR TÉCNICAS PROTEÓMICAS

Para obtener la huella peptídica (Peptide Mass Fingerprint, PMF) por espectrometría de masa MALDI-TOF (PMF MALDI-TOF MS) se hizo una digestión tríptica in situ de la proteína a partir de los geles SDS PAGE siguiendo el protocolo que se describe a continuación.

61

La banda proteica obtenida en la electroforesis SDS PAGE correspondiente a la fracción purificada eluída de la columna de intercambio aniónico, fue recortada con bisturí y conservada en tubos eppendorf a -20 °C hasta su procesamiento. Se realizó la reducción y carbamidometilación de la muestra con DTT 10 mM y con iodoacetamida 50 mM. Seguidamente se realizó la digestión enzimática con 0,3 μg de tripsina a 37 °C durante toda la noche. Los péptidos obtenidos fueron disueltos en TFA 0,1% (V/V) y analizados por MALDI-TOF/MS en el Instituto Pasteur de Montevideo (Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Facultad de Ciencias Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas) empleando una matriz de HCCA (α-ciano-4-hidroxicinámico).

Los espectros de masas denominados Peptide Mass Fingerprint o PMF fueron analizados con el software MASCOT http://www.matrixscience.com, mediante el cual se compararon los espectros de masas de digeridos trípticos teóricos de enzimas cuya secuencia era conocida con los espectros de masas obtenidos en forma experimental, con el fin de predecir la identidad de la proteína analizada.

CONSTRUCCIÓN DEL ÁRBOL FILOGENÉTICO

La construcción del árbol filogenético tiene como objeto poder predecir la historia evolutiva de familias de enzimas aspárticas que contienen el PSI. En este trabajo se construyó el árbol filogenético por el método de Máxima Parsimonia (MP). El árbol de MP se obtuvo utilizando el algoritmo Close-Neighbor-Interchange con un nivel de búsqueda 1, en el que los árboles iniciales se obtuvieron por la adición aleatoria de secuencias (10 repeticiones). El análisis incluyó a 20 secuencias de aminoácidos. El conjunto de datos final tuvo un total de 229 posiciones. El análisis evolutivo se realizó empleando el software MEGA 5 de acuerdo al protocolo descripto por Tamura y col. (2011).

62

TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Preparación de soportes para la inmovilización de la enzima

Soportes activados con grupos amino primarios

Se sintetizaron soportes aminados mediante la activación de soportes glioxil agarosa recubiertos con polímeros hidrofílicos policatiónicos con grupos aminos primarios. El polímero elegido fue polietilenimina (PEI) de peso molecular 25 kDa. La preparación de este soporte, denominado PEI-agarosa, fue llevada a cabo siguiendo el protocolo descrito por Mateo (2000).

Se suspendieron 10 g de PEI y 10 mL de glioxil agarosa en 80 mL de buffer de bicarbonato 100 mM de pH 11.0. La suspensión se mantuvo en agitación suave a temperatura ambiente durante 3 horas. Se agregó luego borohidruro de sodio (10 mg.mL-1) y la suspensión resultante se mantuvo en agitación suave durante 2 horas. El sólido se filtró y lavó con buffer ácido acético/acetato de sodio 100 mM de pH 4.0, seguido de buffer borato sódico 100 mM de pH 9.0, solución 1 M de cloruro de sodio y con agua destilada (csp) con el fin de eliminar cualquier molécula de PEI adsorbida sobre el soporte.

Soportes con grupos glioxilo

El proceso de activación consiste en la esterificación de los grupos hidroxilo de la agarosa comercial con glicidol (2,3-epoxipropanol) y la posterior oxidación de los grupos glicol resultantes para dar lugar a grupos glioxilo reactivos (Guisán, 1988). La etapa de oxidación es la que permite el control estequiométrico del proceso de activación para obtener los geles de agarosa con la densidad de grupos reactivos deseada.

A 150 mL de agarosa comercial empaquetada y suspendida en 30 mL de agua se le añadieron 50 mL de NaOH (1.7 M) y de NaBH4 (28.5 mg.mL-1). Se agregó glicidol lentamente y con agitación suave hasta una concentración final de 2.0 M, controlando la temperatura de la mezcla entre 20-25°C. Transcurridas 18 horas de agitación constante, se filtró y lavó el gel con abundante agua. El soporte obtenido se resuspendió en 1.5 L de agua y se agregó NaOH 0,1 M para oxidar estequiométricamente los grupos glicol y obtener la densidad de grupos glioxilo deseada. El gel de glioxil-agarosa resultante se lavó con agua y se filtró.

63

Soportes activados con grupos glutaraldehído

Los soportes modificados con glutaraldehído fueron preparados mediante la activación total de los grupos aminos primarios de los soportes monoaminoetil-N-aminoetil agarosa (MANAE-agarosa). Para llevar a cabo la síntesis de estos soportes, se suspendió el gel MANAE-agarosa en buffer de fosfatos de sodio 200 mM de pH 7.0 en relación 1:1.8 (V:V) y, agitando suavemente, se le añadió glutaraldehído al 25% hasta una relación final 1:3 (V:V). Se mantuvo el pH en 7.0 y la temperatura entre 18 y 20°C. Luego de 12-14 horas, el gel de glutaraldehído-agarosa, se filtró y se lavó con abundante agua (Betancor y col., 2006).

Preparación de los derivados inmovilizados

El curso de inmovilización se controló midiendo la actividad caseinolítica de alícuotas tomadas del sobrenadante a diferentes tiempos (30, 60 y 180 minutos). Además, como referencia se empleó la solución enzimática en ausencia del soporte sometida a las mismas condiciones de inmovilización (agitación y temperatura). Esta referencia permitió determinar la inactivación de la enzima soluble en las condiciones de inmovilización.

El rendimiento de inmovilización (R%) se calculó de la siguiente manera:

R%= Actividad de la referencia – Actividad del sobrenadante *100 Actividad de la referencia

El factor de estabilización (FE) fue calculado mediante el cociente entre el tiempo de vida media de cada uno de los derivados y el tiempo de vida media de la enzima libre, sometidos a las mismas condiciones.

Inmovilización covalente sobre glioxil-agarosa a pH 10.0

Se realizó una dilución al medio del extracto enzimático con buffer bicarbonato de sodio 100 mM de pH 10.0 y se agregó glioxil-agarosa en relación 1:10, separándose una pequeña fracción como control del comportamiento de la enzima en solución. Se controló que el pH y la temperatura se mantuvieran constantes evaluando en el tiempo las actividades enzimáticas del sobrenadante y de la solución enzimática control. Cuando se consideró

64

alcanzado el rendimiento de inmovilización deseado, se agregó NaBH4 (1 mg.mL-1) y luego de 30 minutos a temperatura ambiente se lavó con abundante buffer de fosfatos de sodio 100 mM de pH 7.0 y posteriormente con agua (Guisán y col., 1991).

Inmovilización covalente sobre glioxil-agarosa a pH neutro

El proceso de inmovilización se llevó a cabo en las condiciones expresadas en el punto anterior pero el extracto crudo se diluyó con buffer de fosfatos de sodio 100 mM de pH 7.0 adicionado con ditiotreitol (DTT) en una relación 1:4.

Inmovilización covalente sobre soportes de glutaraldehído-agarosa

Se preparó una solución de extracto crudo en buffer de fosfatos de sodio 100 mM de pH 7.0, se agregó el gel de glutaraldehído-agarosa en una relación 1:10 y se continuó como en el punto pre-anterior (Lamas y col., 2001).

Inmovilización por adsorción iónica en soportes PEI – agarosa

Se diluyó el extracto crudo en buffer de fosfatos de sodio 100 mM de pH 7.0 en una relación 1:4. A 0,5 g del soporte PEI-agarosa se le adicionaron 5 mL de esta solución lentamente y con agitación. Cuando se consideró alcanzado el rendimiento de inmovilización deseado con esta técnica, la suspensión se filtró y el derivado obtenido se lavó con abundante buffer de fosfatos de pH 7.0 y posteriormente con agua.

Entrecruzamiento de derivados PEI-agarosa con glutaraldehído

Este tratamiento fue llevado a cabo con los derivados obtenidos en el punto anterior. Se adicionó el derivado PEI-agarosa a una solución de glutaraldehído al 0.5 % en 5 mM de buffer de fosfato de sodio 100 mM de pH 7.0 en una relación 1:4 (V/V), manteniendo la temperatura ambiente en agitación suave. Luego de 1 hora, el sólido fue filtrado y lavado con buffer. Luego de cada proceso de inmovilización los derivados obtenidos fueron conservados a 4°C.

65

Caracterización bioquímica de los derivados inmovilizados

Se estudió el efecto del pH, la estabilidad térmica y la capacidad de reúso de los derivados obtenidos por inmovilización en los distintos soportes, empleando caseína como sustrato.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Para estudiar el efecto del pH sobre la actividad proteolítica se empleó caseína (pH 6.0 a 8.0) como sustrato. El pH de la mezcla de reacción se ajustó con buffer fosfatos de sodio 50 mM de pH 6.0 a 8.0. El procedimiento se ajustó a lo descripto en la página 51.

Estabilidad térmica

Para realizar los estudios de estabilidad térmica de la enzima inmovilizada, se incubaron muestras de los distintos derivados durante 15, 30, 60, 90 y 120 minutos a distintas temperaturas (40, 45 y 50°C). Luego de cada tratamiento las muestras fueron conservadas en baño de hielo hasta la medición de la actividad enzimática, empleando caseína como sustrato.

Capacidad de reúso

Para el estudio de los ciclos de reúso se evaluó la actividad caseinolítica de la enzima inmovilizada. Luego de la hidrólisis enzimática, el derivado fue separado del medio de reacción mediante técnicas de filtración al vacío, lavado con buffer de fosfato de sodio 100 mM de pH 6.0 y reutilizado en otro proceso de hidrólisis enzimática.

ACTIVIDAD COAGULANTE DEL EXTRACTO CRUDO

Se estudiaron los parámetros que influyen sobre la actividad coagulante de la enzima presente en los frutos maduros de Salpichroa origanifolia de manera tal de obtener el tiempo de coagulación más conveniente para su aplicación en la elaboración de quesos. En estos ensayos se empleó el extracto crudo enzimático.

66

Diseño de experimentos para determinar las condiciones de coagulación

Para hallar la combinación de las variables que permitiera obtener el menor tiempo de coagulación de la leche, se empleó un diseño factorial completo de tres variables independientes (pH, temperatura de coagulación y concentración de cloruro de calcio) a dos niveles cada una, es decir un diseño factorial completo 23. La variable dependiente medida fue el tiempo de coagulación, medido según el protocolo descripto en la página 53. En la siguiente tabla se muestran los valores de las variables para cada ensayo, de acuerdo al diseño aplicado.

Temperatura Concentración Ensayo pH (°C) de CaCl2 (mM)

1 6.0 32 10

2 6.0 32 20

3 6.0 40 10

4 6.0 40 20

5 6.5 32 10

6 6.5 32 20

7 6.5 40 10

8 6.5 40 20

67

Los datos experimentales fueron ajustados a expresiones polinómicas del siguiente tipo:

3 3 2 Y    i    0 i xi ii x ij xi x j  i1 i1 ij    Donde Y es la respuesta medida, tiempo de coagulación, X representa a las variables codificadas y corresponde a las variables independientes. Los coeficientes β corresponden a los efectos directos de cada variable o a los de sus interacciones (Araujo y Brereton, 1996). Los coeficientes de dichos polinomios se calcularon por ANOVA (factoriales completos) y por análisis de regresión lineal múltiple con software Statistica® (Statistica para Windows, versión 8.0 Copyright Stat Soft, Inc. 2007). La estimación del error estándar en las medidas de actividad coagulante fue realizada usando muestras por triplicado.

Microscopía óptica de la formación del coágulo lácteo

Se realizó la observación del proceso de coagulación de la leche por acción del extracto crudo de Salpichroa origanifolia utilizando un microscopio óptico convencional conectado a una cámara fotográfica (microscopio óptico UNICO con sistema computarizado de captación de imágenes Intellcam y procesador de imágenes OPTIMA 6.5).

En el ensayo se incubaron 500 µL del extracto enzimático con 5 mL de leche

descremada en polvo reconstituida al 12% (p/V) con 20 mM de CaCl2 en un baño termostático (37°C). Se tomaron alícuotas de la mezcla de reacción en distintos tiempos y se colocaron en un portaobjetos para su observación en el microscopio óptico. Se fotografiaron las imágenes observadas con un aumento de 10X (Lagaude y col., 2004).

El mismo procedimiento se realizó con el coagulante testigo FPC.

68

ACTIVIDAD HIDROLÍTICA SOBRE PROTEÍNAS LÁCTEAS

Hidrólisis de caseínas bovina, ovina y caprina

Se estudió la hidrólisis producida por el extracto crudo de Salpichroa origanifolia sobre las caseínas bovina, ovina y caprina. Para estos ensayos se utilizó caseína bovina comercial (Calbiochem®), caseína caprina extraída a partir de leche de cabra entera en polvo (Abradacabra®) reconstituida y caseína ovina extraída a partir de leche de oveja fluida provista por el tambo de la Facultad de Agronomía de la UBA, respectivamente.

El procedimiento de extracción de las caseínas caprina y ovina consistió en separar la grasa por centrifugación (4500 rpm, 30°C durante 30 minutos) y precipitar las caseínas en forma isoeléctrica empleando buffer ácido acético/acetato de sodio, 3.3 M de pH 4.6. La solución se centrifugó a 2000 rpm durante 20 minutos y el precipitado obtenido se lavó tres veces con agua destilada (Trujillo y col., 2000).

Las caseínas se resuspendieron en concentración del 1% (p/V) en buffer ácido acético/acetato de sodio 50 mM de pH 6.2. Las soluciones resultantes fueron calentadas a 80°C durante 20 minutos y luego enfriadas rápidamente. La hidrólisis enzimática se realizó a pH 6.2 y 40°C (Rocha y col., 2010). En los ensayos se incubaron 3 mL del sustrato con 120 μL de la solución enzimática a 40°C y se tomaron alícuotas en distintos tiempos de incubación (0, 1, 2, 4, 8 y 20 horas) a los que se les adicionó TCA al 5% en una relación 1:2. La mezcla se centrifugó a 10000 rpm durante 10 minutos y se determinó la actividad proteolítica midiendo la absorbancia de los péptidos solubles en el sobrenadante a 280 nm (Silva y Malcata, 2005). Los ensayos se realizaron por duplicado y con 3 mediciones.

Los datos se analizaron considerando un diseño de medidas repetidas en el tiempo y los factores analizados fueron el tipo de caseína y el tiempo de hidrólisis empleando el software Statistica®. Se realizó un ANOVA y se empleó el test de Tukey para el análisis post- hoc. Se verificó el supuesto de normalidad por el test de Kolmogorov-Smirnov y la homocedasticidad por el test de Levene, con un nivel de significancia del 5%.

Separación de los hidrolizados de las distintas caseínas

Se realizó la hidrólisis de cada caseína de acuerdo al protocolo mencionado en el punto anterior. Luego de 20 horas de incubación, la reacción se detuvo calentando en baño de agua

69

a 80°C durante 20 minutos para inactivar la enzima. Se centrifugaron los hidrolizados a 16000 rpm durante 15 minutos, se ajustó el pH del sobrenadante a 7.0 y se realizó un proceso de ultrafiltración utilizando membranas con valores de corte que permitieron separar los componentes de peso molecular inferior a 3 kDa y de 3 a 10 kDa (AMICON® YM-3 e YM-10, Millipore, USA) (Pouliot y col., 2005).

Hidrólisis de α-, β- y κ-caseína bovina

Se realizó la hidrólisis de las fracciones α-, β- y κ- de la caseína bovina (Sigma, USA. Cat. N° C6780, C6905 y C0406 respectivamente) con la enzima pura, en dos ensayos independientes y por triplicado.

En los ensayos se incubaron 10 mL de las distintas fracciones de la caseína (0.5% p/V, pH 6.20) con 1 mL de solución de salpichroína en una baño termostático a 40°C. Se tomaron alícuotas de la mezcla de reacción a los 30, 60, 90 y 120 minutos de incubación. La reacción se detuvo con el agregado de TCA 10% (p/V). La mezcla se centrifugó a 1000 rpm por 10 minutos y se midió la absorbancia del sobrenadante a 280 nm.

El grado de hidrólisis (GH%) se define como el porcentaje de enlaces peptídicos rotos, asumiendo que los aminoácidos aromáticos fueron particionados de manera equivalente durante la hidrólisis (D´Ambrosio y col., 2003).

Separación y caracterización de los hidrolizados de las fracciones caseínicas α-, β- y κ-

Se realizó la hidrólisis de cada fracción caseínica durante 120 minutos, del modo descripto en el párrafo anterior. La reacción se detuvo calentando en baño de agua a 80°C durante 20 minutos. El pH se ajustó a 7.0 y luego de centrifugar el hidrolizado (16000 rpm, 15 minutos), se separó el sobrenadante para ser sometido a un proceso de ultrafiltración diferencial con membranas AMICON de 10 kDa de tamaño de poro (Pouliot y col., 2005). El permeado (fracción del hidrolizado con peso molecular menor a 10 kDa) fue enviado al LANAIS-PRO, Laboratorio Nacional de Investigación y Servicios en Péptidos y Proteínas, para realizar el servicio de separación de péptidos por HPLC (columna C18 Vydac, 250 x 2,1 mm),

70

determinación de peso molecular por espectrometría de masa (MALDI TOF TOF 4800 plus) y secuenciación amino terminal de los péptidos obtenidos (Recio Sanchez y col., 2006).

Hidrólisis de las proteínas del lactosuero

El sustrato utilizado fue un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC), LacProdan 80®, suministrado por ARLA FOODS (Buenos Aires, Argentina) cuyo contenido en proteínas era de 80 % (p/p).

Las proteínas del lactosuero están constituidas principalmente por la α- lactoalbúmina (α-La), β-lactoglobulina (β-Lg) y albúmina sérica bovina (BSA). Poseen una estructura terciaria de tipo globular muy compacta y compleja que le confiere elevada resistencia a la hidrólisis. La desnaturalización de estas proteínas favorece el proceso de hidrólisis enzimática ya que los enlaces peptídicos quedan expuestos al eventual ataque enzimático contrario a lo que ocurre con las formas nativas y con los agregados.

Stanciuc y col. (2010) demostraron que la susceptibilidad de las proteínas del lactosuero a la hidrólisis enzimática estaba relacionada con el tratamiento térmico aplicado. Encontraron que una determinada combinación tiempo-temperatura aumentaba significativamente el grado de hidrólisis. Es así que en este trabajo se aplicaron dos tratamientos térmicos a las soluciones acuosas de WPC con el fin de mejorar la hidrólisis del sustrato.

Preparación de las muestras de WPC

Tratamiento 1 - ST1

Se prepararon tres soluciones de WPC (0.25 % p/V) en buffer fosfato de sodio 50 mM de pH 3.0, 5.0 y 7.0. Las soluciones fueron calentadas en baño termostático a 75°C durante 15 minutos y luego enfriadas rápidamente.

Las soluciones resultantes se emplearon como sustrato del tratamiento 1 (ST1).

71

Tratamiento 2 – ST2

Se prepararon tres soluciones de WPC (0.25 % p/V) en buffer fosfato de sodio 50 mM de pH 8.0. Las soluciones fueron calentadas en baño termostático a 75°C durante 15 minutos y luego de ser enfriadas rápidamente se ajustó el pH de cada una de las soluciones a pH 3.0, 5.0 y 7.0.

Las soluciones resultantes se emplearon como sustrato del tratamiento 2 (ST2).

Diseño de experimentos para establecer las condiciones de hidrólisis con la enzima libre

Se aplicó un diseño factorial completo 33 para la hidrólisis del WPC de acuerdo a las condiciones del ST1 y ST2. Se seleccionaron tres variables independientes a tres niveles cada una: distinta relación Ucas.mg-1 de proteínas de los sustratos (5, 10 y 15 Ucas) para los tratamientos ST1 y ST2, el pH (3.0, 5.0 y 7.0) y el tiempo de hidrólisis (1, 2 y 3 horas). La variable dependiente medida fue la ∆ absorbancia (280 nm) de los péptidos solubles en TCA producidos por hidrólisis enzimática del WPC.

En la siguiente tabla se muestra el detalle del diseño de experimentos aplicado para la hidrólisis de ST1 y ST2.

Factores Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

Tiempo de hidrólisis 1 h 2 h 3 h

Enzima:sustrato 5 Ucas.mg-1 10 Ucas.mg-1 15 Ucas.mg-1

pH 3.0 5.0 7.0

La reacción se llevó a cabo en un baño termostático con agitación (40°C y 100 rpm). Los datos obtenidos en los ensayos (27 ensayos, cada uno con dos réplicas) fueron analizados por ANOVA y análisis de regresión múltiple. Los coeficientes del polinomio de segundo orden obtenido fueron calculados con el software Statistica® (v. 8). Mediante la

72

expresión polinómica se obtuvo la función desirability la cual es útil para analizar la relación entre la respuesta y los niveles de cada variable y deducir las condiciones más favorables.

Hidrólisis de WPC con la enzima inmovilizada

Se realizaron también ensayos de hidrólisis con la enzima inmovilizada en glutaraldehído- agarosa. La reacción se llevó a cabo en un baño termostático a 40°C, con agitación constante (100 rpm) considerando una relación de 1 Ucas.mg-1. Se tomaron alícuotas del sobrenadante a 1, 2, 3, 10 y 20 horas de incubación y se estimó el grado de hidrólisis (GH%) empleando el método de ácido o-ftalaldehído (OPA) descripto por Spellman (2003).

El reactivo de OPA (100 mL) fue preparado mezclando 25 mL de tetraborato de sodio 100 mM, 2.5 mL de SDS al 20% (p/V), 40 mg de reactivo de OPA (disuelto en 1 mL de metanol) y 100 µL de β-mercaptoetanol de acuerdo al protocolo de Church y col. (1983).

La reacción se inició con la adición de 118 µL de muestra a 882 µL de reactivo de OPA y se midió la absorbancia de la solución a 340 nm en un espectrofotómetro GeneQuant (GE®). Los valores de absorbancia producidos por la reacción entre los grupos amino libres de las proteínas y el reactivo de OPA fueron determinados espectrofotométricamente luego de 2 minutos. El GH % se calculó con la siguiente fórmula:

GH (%)= ∆ Abs*1.934d c

Donde ∆ Abs es la diferencia de absorbancia a 340 nm del hidrolizado y del sustrato sin hidrolizar, d es el factor de dilución y c es la concentración de proteínas (g.L-1).

Separación y caracterización de los hidrolizados de WPC

Se realizó la hidrólisis de las proteínas del WPC de acuerdo a los procedimientos descriptos. La reacción se detuvo calentando en baño de agua a 80°C durante 20 minutos para inactivar la enzima. Se centrifugaron los hidrolizados a 16000 rpm durante 15 minutos, se ajustaron el pH a 7.0 y fueron sometidos a un proceso de ultrafiltración con membranas AMICON de 10 kDa de tamaño de poro. Los permeados con peso molecular menor a 10 kDa fueron conservados a -20°C para posteriores análisis.

73

Sólo para las determinaciones de actividades biológicas, los hidrolizados fueron sometidos a procesos sucesivos de ultrafiltración con membranas de 10 y 3 kDa. Los permeados con peso molecular inferior a 3 kDa y la fracción de 3-10 kDa fueron conservadas a -20°C.

Electroforesis Tricina SDS PAGE

Los productos de hidrólisis de los distintos ensayos (caseínas, fracciones de la caseína bovina y WPC) fueron caracterizados por electroforesis Tricina SDS-PAGE en un equipo Bio- Rad Miniprotean III (Schagger, 2006). Se utilizaron minigeles SDS–PAGE al 16.5% en el gel separador con urea 6 M en buffer Tris/HCL (3M, pH 8.45) y 0.3% SDS, gel espaciador al 10% y gel de concentración al 4% en el mismo buffer.

Las muestras se prepararon en buffer no reductor y la corrida electroforética se desarrolló durante 120 min. Las proteínas se colorearon con CBB R-250 (Vairo Cavalli y col., 2008). Se emplearon marcadores de ultra bajo peso molecular: triosa fosfato isomerasa de músculo de conejo (26.6 kDa), mioglobina de corazón equino (17.0 kDa), α-lactoalbúmina bovina (14.2 kDa), aprotinina de pulmón bovino (6.5 kDa), cadena B oxidada de insulina (3.496 kDa) y bradiquinina (1.060 kDa) (Ultra Low Molecular Weight Range Sigma Marker, producto N° 3546M).

Los geles fueron escaneados y las imágenes se analizaron para generar un perfil densitométrico de las bandas mediante el software GelPro Analyzer para Windows (v.4.0.00.00.001, Media Cibernetic).

74

Solución Tipo de electroforesis Tricina SDS PAGE (16%, Urea 6M) Gel de stacking Acril-Bis (48:1.5) 500 μL Buffer gel 3X 1.5 mL pH 8.45 AD 2,0 mL PSA 10% 50 μL TEMED 5 μL Gel de separación Acril-Bis (46.5:3) 5.0 mL Buffer gel 3X 5.0 mL pH 8.45 Ure 5.2 g a AD 5.0 mL PSA 10% 50 μL TEMED 8 μL Buffer de muestra Buffer Tris HCl 150 mM 7.62 mL pH 6.8 Glicerol 2.38 mL SDS 10% 1.2 g CBB R-250 5 mg Buffer del Cátodo Tris 3.03 g reservori Tricina 4.48 g o HCl 0.25 g SDS Ánodo Tris –Tricina HCl 6.058 g

SDS 0.93 mL

ACTIVIDADES BIOLÓGICAS DE LOS PÉPTIDOS OBTENIDOS POR HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

Los hidrolizados enzimáticos de las caseínas bovina, ovina y caprina, de las fracciones caseínicas y de las proteínas del WPC fueron separados por ultrafiltración y en las fracciones ultrafiltradas obtenidas se realizaron ensayos in vitro para evaluar las actividades antimicrobiana, antioxidante y antihipertensiva.

75

Actividad antimicrobiana de los hidrolizados

Se evaluó la actividad antibacteriana de los hidrolizados de caseínas y proteínas del WPC frente a microorganismos potencialmente patógenos del hombre. En los ensayos microbiológicos se emplearon cepas de Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Pseudomona aeruginosa y Pseudomona fluorescens pertenecientes al cepario de la Universidad Nacional de Luján.

Los cultivos fueron incubados en caldo nutritivo durante 24 horas a 40°C, excepto los de Serratia marcescens y Pseudomona fluorescens que fueron incubados a temperatura ambiente. Se agregaron 100 µL de cada cultivo bacteriano a 3 tubos de hemólisis conteniendo cada uno 2.5 mL de caldo tripteína soja y se incubaron por 30 minutos a 37°C (Pseudomona fluorescens y Serratia marcescens se incubaron a temperatura ambiente). Luego del tiempo mencionado se agregó formol en el primer tubo, nada al segundo (testigo no inhibido) y 200 µL de solución proveniente de la hidrólisis de las caseínas al tercero y se incubaron durante 20 horas.

Los tubos fueron examinados en base a la evidencia macroscópica de crecimiento visualizada por la presencia de turbidez, velo o sedimento (Araujo Díaz y Salas Asencio, 2008). La densidad microbiana se determinó en forma indirecta por turbidimetría (Isenberg, 1984), midiendo la absorbancia de las soluciones a 650 nm antes y después de la incubación de 20 horas. Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibición del crecimiento bacteriano por acción de los hidrolizados de acuerdo a la siguiente fórmula (Ballows, 1976):

I%= [1 - (AH – A 0)] *100

(A – A 0)

Donde AH= densidad óptica (650 nm) del cultivo bacteriano en presencia de los hidrolizados luego de 20 horas de incubación. A= densidad óptica (650 nm) del cultivo bacteriano en ausencia de los hidrolizados luego de 20 horas de incubación. A0= densidad óptica (650 nm) antes de la incubación.

76

Actividad antihipertensiva de los hidrolizados

La actividad inhibidora de la Enzima Convertidora de la Angiotensina, ECA, fue estimada de acuerdo con el método colorimétrico de Chang (2001). El sustrato Histidil-Hipuril-Leucina (HHL) es escindido por la ECA en ácido hipúrico (H) e histidil-leucina (HL). A valores de pH> 11.0, el dipéptido HL reacciona con el reactivo o-ftalaldehído (OPA) formando un producto de color amarillo, cuya absorbancia puede medirse a 390 nm.

El ensayo se realizó incubando 100 µL de la enzima ECA con 100 µL 100 µL del sustrato HHL durante 2 horas a 37°C, en presencia de 100 µL de las fracciones de los hidrolizados (mezcla 1) y en ausencia de las mismas (mezcla 3). Como blanco de muestra se empleó una solución de los hidrolizados en ausencia de la ECA y del sustrato HHL (mezcla 2) y como blanco de la reacción de OPA se utilizó buffer pH 8.3 (mezcla 4). La reacción de la ECA se detuvo mediante la adición de 3 mL del reactivo OPA. La absorbancia a 390 nm de la mezcla 1 (A1), mezcla de 2 (A2), mezcla de 3 (A3, y mezcla de 4 (A4) se midió después de 20 min de incubación a 25° C. El porcentaje de inhibición de la enzima ECA se calculó mediante la siguiente ecuación:

I%= [1 – (A1 – A2)] * 100

(A3 – A4)

La curva dosis-respuesta se generó evaluando la concentración proteica de los hidrolizados (µg.mL-1) frente a la actividad inhibidora de ECA (I%). Los datos fueron analizados aplicando el software GraphPad Prism v .01 (http://www.graphpad.com/scientific- software/prism/). La inhibición fue expresada como la concentración de péptidos en la muestra de hidrolizados que inhibió el 50% de la actividad de la ECA (IC50). Los valores se basan en tres repeticiones del ensayo completo.

Actividad antioxidante de los hidrolizados

La actividad antioxidante se determinó de acuerdo a la técnica descripta por Brand- Williams y colaboradores (1995). El método se basa en la captura del radical 2,2-difenil-1-

77

picrilhidracil (DPPH) por los compuestos antioxidantes que produce un descenso de la absorbancia a 517 nm.

La solución del reactivo DPPH se utilizó con una concentración 0.5 mM en metanol. La reacción consistió en adicionar alícuotas de 500 µL de muestra a 200 µL de una solución metanólica de DPPH 0.5 mM. El volumen final se ajustó a 1 mL y la mezcla de reacción se agitó vigorosamente y se dejó durante 30 minutos en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 517 nm utilizando MeOH como blanco y DPPH 0.1 mM como control.

La neutralización del radical DPPH (S%) se calculó de la siguiente manera:

S% = (Ablanco - Amuestra)*100 Ablanco donde Ablanco es la absorbancia de la reacción de control (que contiene todos los reactivos, excepto el compuesto de ensayo) y Amuestra es la absorbancia del compuesto de ensayo. Las pruebas se llevaron a cabo por triplicado (Stef y col., 2009).

FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE INCLUSIÓN EN CICLODEXTRINAS

Preparación de complejos β-ciclodextrina y péptidos obtenidos por hidrólisis del WPC

La formación de complejos de inclusión de la fracción de los hidrolizados de WPC (peso molecular inferior a 10 kDa) en β-ciclodextrina (β-CD) se realizó según el método de solución dinámica.

Se aplicó un diseño factorial completo 23 para determinar las mejores condiciones de formación de complejos. Se seleccionaron tres variables independientes: relación β-CD: péptidos, temperatura y tiempo cuyas combinaciones dieron lugar a ocho ensayos, mostrados en la tabla siguiente.

78

Relación T Tiempo Ensayo β-CD: péptidos (°C) (horas)

1 2 25 24

2 2 25 48

3 2 37 24

4 2 37 48

5 1 25 24

6 1 25 48

7 1 37 24

8 1 37 48

La variable dependiente empleada fue la proporción de β-CD complejada respecto de la cantidad inicial calculada según la siguiente ecuación:

β-CD complejada%= (concentración de β-CD inicial – concentración de β-CD libre final) * 100

Concentración de β-CD inicial

Todos los ensayos se prepararon de igual forma. Se mantuvo la mezcla de los dos componentes en agitación durante 10 minutos, con el objetivo de que se pongan en contacto y formen una pasta. Luego se añadió el agua, se dejó en agitación otros 10 minutos, y se llevaron a un baño termostatizado a la temperatura correspondiente y agitación a 100 rpm. La concentración de β-CD libre luego del proceso de formación se cuantificó por el método de Wikmon modificado (Goel y Nene, 1995; Makela, 1987). Este método se basa en la disminución de la absorbancia a 550 nm debido a la formación de un complejo de inclusión de la β-CD libre con fenolftaleína.

Los resultados fueron analizados con el software Statistica ® (v. 8). Los complejos formados fueron liofilizados y conservados a -20°C para su posterior análisis.

79

Análisis de los complejos por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)

El comportamiento térmico de los péptidos, de la β-CD y de los diferentes complejos se determinaron en un calorímetro diferencial de barrido ( DSC 50, Shimatzu) en un intervalo de temperaturas entre 0 y 350°C con una tasa de calentamiento de 10°C.min-1 bajo atmósfera de nitrógeno y a un flujo de 50 mL.min-1. Se realizó el enfriamiento en las mismas condiciones.

Simulación de la digestión gastrointestinal de la fracción de péptidos y de sus complejos

La simulación de la digestión gastrointestinal de los péptidos y de los complejos de inclusión en β-CD se llevó a cabo de acuerdo con el método de Hernández-Ledesma (2002) utilizando pepsina y pancreatina como enzimas digestivas.

Para ello, se prepararon soluciones acuosas de la fracción de péptidos inferior a 10 kDa liofilizada a una concentración de 5 mg.mL-1 de péptidos. El pH de las soluciones se ajustó a 2.0 con HCl 1 M. Inicialmente, la hidrólisis se llevó a cabo con pepsina (EC 3.4.4.1; 1:60000; 3400 UI.mg-1 de proteína, Sigma) en relación 182 U.mg-1 de péptidos. Se mantuvo en agitación a 200 rpm,en baño de agua a 37ºC durante dos horas. Luego, para detener la reacción enzimática se llevó a pH 5.3 con NaHCO3 0.,5 M y a pH 7,5 con NaOH 2,5 N. Se agregó la enzima pancreatina en una relación de 35 U.mg-1 de péptidos. Se dejó en agitación durante 3 horas, en iguales condiciones a las anteriores. La reacción se detuvo en principio mediante un calentamiento a ebullición de 10 minutos. Debido a que este tratamiento podría afectar en forma negativa a los péptidos, se reemplazó por un enfriamiento rápido en baño de hielo. Los hidrolizados obtenidos fueron liofilizados y conservados a -20°C para posteriores análisis.

El ensayo de digestibilidad sobre los complejos formados entre péptidos y β- ciclodextrinas, también liofilizados, se realizó de igual manera. En ambos casos se siguió el proceso a través de la medición de la actividad antioxidante de los péptidos, la cual se midió por reacción con el radical DPPH, de acuerdo al procedimiento detallado en la página 77).

80

Se tomaron 4 fracciones de péptidos o complejos, a saber:

1) Tiempo cero: solución inicial. 2) Tiempo uno: a las dos horas, una vez detenida la digestión ácida. 3) Tiempo dos: a las tres horas y media, en la mitad de la segunda digestión, inactivando luego la enzima. 4) Tiempo tres: a las 5 horas, tras finalizar todo el proceso de digestión.

Cromatografía de exclusión molecular (SEC-FPLC)

El análisis de la fracción de péptidos menor a 10 kDa, obtenida por hidrólisis del WPC y posterior ultrafiltración, de sus complejos con β-CD y de dichas muestras sometidas al proceso de digestión gastrointestinal simulada se llevó a cabo mediante el método cromatográfico SEC-FPLC puesto a punto en el laboratorio. El procesamiento de datos se realizó con el software Unicorn® (GE).

Las muestras liofilizadas se prepararon a una concentración de 5 mg.mL-1 en agua destilada y se filtraron a través de filtros de 0.2 µm (SFCA Minisart® plus, Sartorius corp.). Se inyectaron 100 µL de las muestras en una columna Superdex 75 G de 10 × 300 mm (GE). Para la elución se utilizó buffer fosfatos de sodio 50 mM de pH 7.0 con 0.15 M de NaCl. El flujo fue de 0.8 mL.min-1 y la temperatura de 20°C. Antes de cada inyección la columna se acondicionó con la solución buffer durante 30 minutos, aplicando un flujo de 0.5 mL.min-1. La detección de los péptidos se llevó a cabo por medida de absorbancia a 280 y 215 nm.

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO DE LA ENZIMA SALPICHROÍNA

Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de la enzima purificada. Los microorganismos utilizados se detallan en la Tabla presentada a continuación. Entre ellos se encuentran cepas bacterianas potencialmente patógenas del hombre, suministradas por el Laboratorio de Microbiología de los Alimentos y de Microbiología General de la Universidad Nacional de Luján. También se incluyeron aislados naturales de hongos, relacionados con las enfermedades de vegetales de importancia agronómica, suministrados por el Laboratorio de Fitopatología de la misma Universidad.

81

Clasificación Procedencia

Staphylococcus aureus Lab. Microbiología de Alimentos Salmonella enteritidis Lab. Microbiología de Alimentos Salmonella gallinarum Lab. Microbiología General Escherichia coli Lab. Microbiología de Alimentos Pseudomona aeruginosa Lab. Microbiología de Alimentos Pseudomona fluorescens Lab. Microbiología General Serratia marcescens Lab. Microbiología General Enterobacter aerogenes Lab. Microbiología General Klebsiella pneumoniae Lab. Microbiología General Phytophthora capsici Lab. Fitopatología Macrophomina phaseolina Lab. Fitopatología Sclerotium rolfsii Lab. Fitopatología

Actividad antibacteriana in vitro

La inhibición del crecimiento in vitro de bacterias se determinó en medio líquido. El crecimiento se siguió por la medida de la variación de la absorbancia del cultivo a 650 nm (OD). Esta técnica es particularmente útil para la obtención de curvas dosis-respuesta además de ser rápida, sensible y analizar un amplio intervalo de concentraciones. El ensayo de crecimiento de los microorganismos se realizó en tubos de hemólisis. Se agregaron 100 µL de cultivo bacteriano (0.5 McFarlan) a 2.5 mL de caldo de tripteína soja estéril y se incubaron por 30 minutos a 37°C (Pseudomona fluorescens y Serratia marcescens se incubaron a temperatura ambiente). A continuación, se adicionaron 200 µL de la solución de salpichroína con distintas concentraciones: 0.7, 1.4, 2.8, 5.6 μg.mL-1. Los tubos fueron incubados a la temperatura apropiada para cada microorganismo en estufa y sin agitación. La evolución del incremento de la biomasa fue determinada mediante el registro de la OD luego 20 horas de incubación. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Además, se preparó un control positivo sin la solución de salpichroína, y un control negativo en ausencia de microorganismos. Con estos datos se calculó la OD media y la desviación estándar (SD) para cada tratamiento.

El valor IC50 de la solución de enzima se definió como la concentración requerida para obtener un 50% de inhibición en el crecimiento del microorganismo en relación al crecimiento final en los controles positivos (ausencia de la enzima).

82

El valor IC50 para cada experimento se estimó mediante una regresión no lineal de los datos experimentales con una curva sigmoide de cuatro parámetros (Ecuación 1) usando el software GraphPad Prism v .01.Este modelo de ajuste se usa para curvas en donde los datos no muestran una tendencia lineal, por ejemplo en curvas sigmoides. El valor estimado se consideró valido sólo si el ajuste a la curva de los datos experimentales tuvo un coeficiente de regresión superior a 0.95 y la estimación del valor IC50 una p < 0.05. La ecuación utilizada para el cálculo del valor IC50 es la siguiente:

Y= Min + Max – Min

1+( IC50 )p X

donde los valores de x e y son los de concentración de salpichroína y OD, respectivamente.

A partir de los datos experimentales se obtuvo la concentración inhibitoria mínima (CIM) de salpichroína para un microorganismo dado, definida como la mínima concentración que no mostró crecimiento al final del experimento.

Actividad antifúngica in vitro

Los fitopatógenos empleados en este estudio (Phythophthora capsici, Macrophomina phaseolina y Sclerotium rolfsii) fueron aislados y caracterizados por el grupo de investigación de Fitopatología de la Universidad Nacional de Luján, a partir de vegetales de producción local, de la zona Noreste de la provincia de Buenos Aires. P. capsici es un conocido patógeno de vegetales de las familias Cucurbitaceae, Solanaceae y Leguminosae, como zapallo, zucchini, berenjena, tomate, etc. M. phaseolina causa la podredumbre carbonosa del tallo y afecta principalmente los cultivos de soja, en algunos casos asociado a pérdidas totales de cultivos. S. rolfsii es un hongo fitopatógeno, habitante del suelo con un amplio rango de hospedador entre los cuales se destacan judía, manzano, girasol, fresa y remolacha. Todos ellos producen importantes pérdidas de las cosechas. Se estudió la actividad microbicida de salpichroína, sobre P. capsici, M. phaseolina y S. rolfsii. En tres tubos eppendorf estériles, se colocaron 3 discos de agar de 0.5 cm de diámetro con crecimiento de micelio de cada cepa fúngica estudiada, cortado de las placas de Petri en

83

las cuáles se realizó el crecimiento de cada hongo. En el primer tubo eppendorf se agregó 1 mL de solución de salpichroína (296 Ucas.mg-1 de proteínas), en el segundo 1 mL del buffer en el cual está solubilizada la enzima (buffer fosfato de sodio 50 mM de pH 7.0) y en el tercero se agregó igual volumen de agua. Los tubos fueron incubados durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, los discos de agar se retiraron de los tubos eppendorf y fueron colocados en placas de Petri que contenían medio agar dextrosa papa (PDA, Britania) para el crecimiento de M. phaseolina y S. rolfsii y medio V8 (34% de jugo de ocho vegetales V8® y 3% de agar) específico para el crecimiento de P. capsici. Se colocó un disco de agar por placa y los ensayos se realizaron por duplicado. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 10 días. Al cabo de 3 y 10 días se controló el efecto inhibitorio de la enzima sobre el crecimiento del micelio de cada especie fúngica.

Inoculación controlada del fitopatógeno Phytophthora capsici sobre zapallitos verdes

Para evaluar el efecto de salpichroína sobre el desarrollo de P.capsici en vegetales se realizaron bioensayos de inoculación controlada. Para el bioensayo se emplearon zapallitos verdes (Curcubita máxima var zapallito), adquiridos en comercios de la ciudad de Luján, Bs As. En primer lugar se limpió cuidadosamente la superficie del vegetal para no producir lesiones. Se hicieron heridas en la región ecuatorial del vegetal de 3 mm de profundidad con una aguja de disección estéril para favorecer la infección. En cada herida se depositó un disco de agar con micelio del cultivo del fitopatógeno P. capsici.

Se realizaron tres tratamientos:

- Tratamiento 1: Inoculación del fitopatógeno - Tratamiento 2: Inoculación del fitopatógeno + solución de salpichroína - Tratamiento 3: Control negativo, en el que se inoculó un disco de agar estéril, sin el fitopatógeno y sin salpichroína. Para cada tratamiento se hicieron tres réplicas y el ensayo completo se repitió dos veces. En los zapallitos del tratamiento 1 y 2 se colocó un disco de agar del medio de cultivo V8 con micelio del fitopatógeno en activo crecimiento. En el tratamiento 1 se agregó sobre el inóculo 50μl de agua estéril y en el tratamiento 2 el mismo volumen de una solución estéril de salpichroína (72 μg.mL-1). En los zapallitos del tratamiento 3 se colocó un disco de

84

agar estéril. Todos los vegetales fueron incubados a 25ºC en cámara húmeda y con luz alternada.

El desarrollo de la infección se determinó diariamente desde los 2 días después de la inoculación, registrándose como el porcentaje de heridas infectadas por réplica, y calculando la media y la desviación estándar para cada tratamiento.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los ensayos propuestos fueron diseñados para su posterior análisis estadístico seleccionando el método adecuado para cada experimento. Todos los experimentos se realizaron en dos ensayos independientes y por triplicado cada uno de ellos.

85

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Anderson, J.W. (1968) Extraction of enzyme s and subcellular organelles from plant tissues. Phytochemistry, 7:1973-1988.

Anson, L. (1938) The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin. Journal of General Physiology, 22:79-89.

Araujo Diaz, J.; Salas Asencios R. (2008) Actividad antimicrobiana de plantas. Revista Científica del Sur, 6(2):6-18.

Araujo, P.; Brereton, R. (1996) Experimental design I. Screening. Trends Analytical Chemistry, 15(1):26-31.

Barrett A.J.; Kirschke H. (1981) Cathepsin B, cathepsin H. & cathepsin L. Methods in Enzymology, 80:535–561.

Ballows, A. (1976) Automatización de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, En: Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos. Técnicas actualizadas, Ed. Médica Panamericana (pp 125-135), Buenos Aires, Argentina.

Betancor, L.; López-Gallego, F.; Alonso-Morales, L.; Dellamora, G.; Mateo, C.; Fernández- Lafuente, R.; Guisán, J.M. (2006) Glutaraldehyde in Protein immobilization. Methods in Biotechnology, 22:57-64.

Blum, H.; Beier, H.; Gross, H.J. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis, 8: 93-99.

Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, 72:248-254.

Brand-Williams, W.; Cuvelier, M.E.; Berset, C. (1995) Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT Food Science and Technology, 28:25-30.

Chang, B.W.; Chen, R.L.C.; Huang, I-J.; Chang Chang, H. (2001) Assays for Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Activity. Analytical Biochemistry, 291(1): 84-88.

Church, F.C.; Swaisgood, H.E.; Porter, D.H.; Oatignani, G.L. (1983) Spectrophotometric assay using o.-phtaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. Journal of Dairy Science, 66: 1219-1227.

86

D’ Ambrosio, A.; Rossano, R.; Ungaro, N.; Riccio, P. (2003) Proteolytic and milk clotting activities in extracts obtained from the crustaceans Munida. Journal of Molecular Catalysis (B), 22:145-150.

Goel, A.; Nene S. (1995) Modifications in the Phenolphtalein Method for Spectrophotometric Estimation of Beta Cyclodextrin. Starch, 47:399-400.

Guisán, J.M. (1988) Aldehide-agarose gels as activated supports for immobilization stabilization of enzymes. Enzyme and Microbial Technology, 10:375-382.

Guisán, J.M.; Bastida, A.; Cuesta, C.; Fernández-Lafuente, R.; Rosell, C.M. (1991) Inmobilization-stabilization of α-chimotripsin by covalent attachment to aldehyde agarose gels. Biotechnology and Bioengineering, 38:1144-1152.

Hernández Ledesma, B. (2002) Tesis Doctoral: caracterización y bioactividad de péptidos obtenidos a partir de proteínas lácteas mediante hidrólisis enzimática y procesos fermentativos.

IDF Standard 157A: 1997 – Bovine rennets. Determination of total milk-clotting activity.

Isenberg, H.D. (1984) Automated Methods of Bacterial Testing. Ann. N.Y. Acad. Sci., 428(1):236-242.

Kleiner, D.E.; Stetler-Stevenson, W.G. (1994) Quantitative zymography: detection of picogram quantities of gelatinases. Analytical Biochemistry, 218(2):325-9.

Kirschke, H.; Wiederanders, B. (1999) Chromogenic Peptide Substrates. Capítilo 2: Proteolytic Enzymes. Tools and Targest. Sterchi, E.E. y Stocker, W. (eds.) Springer- Verlag, Berlin Heidelberg

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227:680-685.

Lagaude, A.; Fernandez, L.; Cuq, J.L.; Marchesseau, S. (2004) Characterization of curd formation during the rennet coagulation of milk by an optical microscopic method. nternational Dairy Journal, 14:1033-1039.

Lamas, E.M.; Barros, R.M.; Balcao, V.M.; Malcata, F.X. (2001) Hydrolysis of whey proteins by proteases extracted from Cynara cardunculus and inmobilized onto highly activated supports. Enzyme and Microbial Technology, 28:642-652.

87

Lowry, O. H.; Rosenbrough, N.J.; Farrar, A.L.; Randall; R.J. (1951) Protein measurement with folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193(1):265-175.

Makela, M.; Korpela, T.; Laakso, S. (1987) Colorimetric determination of -cyclodextrin: two assay modifications based on molecular complexation of phenolphthalein. Journal of Biochemistry and Biophysical Methods, 14:85-92.

Mateo, C.; Abian, O.; Fernandez-Lafuente, R.; Guisán, J. M. (2000) Reversible enzyme immobilization via a very strong and nondistorting ionic adsorption on support polyethylenimine composites. Biotechnology Bioengineering, 68:98-105.

Parisi, M.; Moreno, S.; Fernández, G. (2008) Isolation and characterization of a dual function protein from Allium sativum bulbs which exhibits proteolytic and hemagglutinating activities. Plant Physiology and Biochemistry, 46(4):403-413.

Rawlings, N.D.; Barrett, A.J.; Bateman, A. (2011) Asparagine peptide lyases. A seventh catalytic type of proteolytic enzymes the journal of biological chemistry. Journal of Biological Chemistry. 286(44):38321–38328.

Rocha, G.F.; Fernández, G.; Parisi, M. (2010) Estudios de caracterización cinética y fisicoquímica de una proteinasa aspártica aislada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia. Información Tecnológica, 21(2):21-28.

Silva, S.; Malcata, F.X. (2005) Caseins as source of bioactive peptides. International Dairy Journal, 15:1-15.

Spellman, D.; McEvoy, E.; O´Cuinn, G.; FitzGerald, R.J. (2003) Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of the TNSB, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis. Int Dairy J, 13:447-453.

Stanciuc, N.; Hintoui, A.; Rapeanu, G. (2010) Thermal treatment can modify the susceptibility of whey protein concentrate to enzymatic hydrolysis. Innovative Romain Food Biotechnology, 7:30-36.

Ştef, D.S.; Gergen, I.; Traşcă, T.I.; Monica Hărmănescu, Ş. L.; RAMONA, B.; HEGHEDUŞ, M. (2009). Total antioxidant and radical scavenging capacities for different medicinal herbs. Romanian Biotechnological Letters, 14(5):4705-4710.

Tamura, K.; Peterson, D; Peterson, N.; Stecher, G.; Nei, M.; Kumar, S. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary

88

Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution, 28:2731-2739.

Trujillo, A. J.; Guamis, B.; Laencina, J.; López, M. B. (2000). Proteolytic activities of some milk clotting enzymes on ovine casein. Food chemistry, 71(4):449-457.

Vairo Cavalli, S.; Silva, S.; Cimino, C.; Malcata, F.X.; Priolo, N. (2008) Hydrolysis of caprine and ovine milk proteins, brought about by aspartic peptidases from Silybum marianum flowers. Food Chemistry, 106:997-1003.

89

Capítulo I: Estudios Básicos

 Extracto crudo  Purificación de la enzima  Caracterización de la enzima purificada  Inmovilización de la enzima

Estudios Básicos

CAPÍTULO I: ESTUDIOS BÁSICOS

INTRODUCCIÓN AL CAPÍTULO I

Las enzimas son los catalizadores biológicos responsables del metabolismo celular. Las células de los seres vivos fueron, son y serán su principal fuente. Pueden ser obtenidas a partir de cualquier organismo vivo y el método de extracción dependerá en gran medida de su localización intracelular o extracelular. En el comienzo de la era de la biotecnología, los tejidos vegetales y los órganos animales eran las fuentes más importantes de enzimas, principalmente de proteasas o peptidasas. Aunque en la actualidad, una gran parte de las enzimas empleadas en la industria son producidas por microorganismos, las de origen vegetal siguen teniendo una buena participación en ciertos procesos. Por otro lado, la ingeniería genética ha permitido resolver la falta de abastecimiento de las enzimas utilizadas en gran cantidad o mejorar su eficiencia, como es el caso de la quimosina empleada para elaborar quesos y de las proteasas alcalinas empleadas en la industria de los detergentes (Illanes, 2008; Maurer, 2004).

Estrategias para el aislamiento y purificación de enzimas vegetales

La estrategia de aislamiento de una enzima vegetal depende de sus características específicas y de su localización. El primer paso para la obtención de enzimas a partir de tejidos vegetales requiere de la disrupción de la pared celular (Illanes, 2008). Algunos de los métodos empleados para tal fin son la trituración con arena o alúmina, la trituración en mezclador de alta velocidad, el homogeneizador a pistón, la prensa francesa, la sonicación y la congelación con nitrógeno líquido y macerado. El proceso de extracción de la proteína se completa empleando diferentes métodos, entre los que se destacan la extracción con buffer acuoso, la extracción con detergentes, la precipitación directa con ácido tricloroacético (TCA), la precipitación con acetona y la precipitación con TCA-acetona (Benchabane y col., 2008; Michaud y Asselin, 1995). Una vez que la proteína de interés se separa de su entorno natural queda expuesta a factores que la pueden dañar en forma irreversible. Estos factores deben controlarse para no reducir o anular el rendimiento y la actividad de la enzima. Así por ejemplo, para la extracción suelen emplearse soluciones buffer a pH neutro adicionadas con agentes protectores como dimetilsulfóxido o glicerol, agentes reductores como ditiotreitol, L-

Estudios Básicos

cisteína o β-mercaptoetanol o agentes quelantes como EDTA para remover cationes divalentes que son cofactores de metalopeptidasas y de varias peptidasas serínicas (Michaud y Asselin, 1995). Para prevenir la autolisis suele agregarse un cóctel de inhibidores de peptidasas y cuando se realiza la extracción con TCA o solventes orgánicos se trabaja a temperaturas bajo cero. En general, todos los procedimientos se realizan a baja temperatura durante períodos cortos de tiempo. En cuanto a las estrategias de purificación, las enzimas son purificadas por procedimientos de fraccionamiento. En una serie de pasos independientes, se aprovechan las propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés para separarla de manera progresiva y selectiva de otras sustancias. El objetivo es eliminar otros componentes de la mezcla de manera que solo quede la sustancia requerida con la menor pérdida de proteína y conservando la actividad enzimática. Las características fisicoquímicas de las proteínas o enzimas que se utilizan en los métodos de separación son la solubilidad, la carga iónica, la polaridad, el tamaño molecular y la especificidad de unión a otras moléculas biológicas (Tabla 1).

Tabla 1.- Características de las proteínas y técnicas de purificación

CARACTERÍSTICA TÉCNICA DE PURIFICACIÓN

Solubilidad Precipitación salina (Salting out)

Tamaño Diálisis y ultrafiltración Cromatografía de exclusión molecular Carga iónica Cromatografía de intercambio iónico

Polaridad Cromatografía de interacción hidrofóbica

Especificidad de unión Cromatografía de afinidad

La precipitación salina está relacionada con la baja solubilidad que en general presentan la mayoría de las proteínas en presencia de altas concentraciones de sal, debido a la neutralización de sus cargas y a la disminución de la actividad del agua favoreciendo la interacción proteína-proteína y por consiguiente, su precipitación (salting out). Como se sabe, las propiedades de solubilidad de las proteínas varían en un amplio rango y esta característica permite precipitarlas selectivamente. El fraccionamiento salino con sulfato de amonio es una técnica muy empleada debido a que es económica, sencilla y permite conservar la conformación nativa de la proteína.

91

Estudios Básicos

Las proteínas pueden separarse de las moléculas pequeñas por medio de diálisis a través de una membrana semipermeable, tal como una membrana porosa de celulosa. Esta técnica es útil para retirar las sales u otras moléculas pequeñas, pero no discrimina de forma efectiva entre las proteínas. Se pueden conseguir separaciones más selectivas basadas en métodos cromatográficos. En la cromatografía de exclusión molecular los componentes de una muestra se separan de acuerdo a su forma y tamaño. La matriz está formada por esferas de gel que contiene poros de un rango de tamaño relativamente estrecho. Las moléculas grandes no pueden ingresar en las esferas del gel y atraviesan la columna más rápidamente que las moléculas pequeñas que ingresan en los poros, y de esta manera se puede conseguir su separación. En la cromatografía de intercambio iónico la proteína cargada se une a grupos con cargas opuestas que están inmovilizados en la matriz y luego es eluída por un aumento de la fuerza iónica o por un cambio de pH del buffer de elución. La densidad de carga de las proteínas determina el orden de elución. Para separar las proteínas aniónicas usualmente se emplean matrices con grupos amino terciario como la matriz de dietilaminoetilo (DEAE) o cuaternario como la matriz de amonio cuaternario (Q cuaternario), y para las proteínas catiónicas se emplean intercambiadores débiles con grupos carboximetilo (CM) y fuertes con grupos sulfopropilo (SP) o metil sulfonato (S). En la cromatografía de interacción hidrofóbica se establecen interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la matriz con grupos octilo y fenilo. A altas concentraciones de sales, los grupos no polares de la superficie de las proteínas interactúan con los grupos hidrofóbicos de la matriz. La elución se realiza con concentraciones decrecientes de sal, concentraciones crecientes de detergente o cambios de pH. La cromatografía de afinidad es otro medio selectivo y específico de purificación, ya que aprovecha la alta afinidad de las proteínas por grupos químicos específicos que forman parte de la matriz. Las proteínas pueden visualizarse fácilmente e individualizarse utilizando métodos electroforéticos. Estos además sirven para obtener pequeñas cantidades de proteínas y péptidos purificados. Así por ejemplo la cantidad de proteína que se obtiene por este método es menor a la que se obtiene por exclusión molecular pero el poder resolutivo es mayor. Esta técnica permite además analizar el grado de pureza, el tamaño de la proteína y su composición en subunidades.

92

Estudios Básicos

Análisis e identificación por técnicas proteómicas

La Proteómica es, junto a la Genómica, una de las nuevas tecnologías de mayor interés en los últimos años. La importancia de las técnicas proteómicas como herramientas para el análisis e identificación de proteínas se debe a dos razones fundamentales. Por un lado, los grandes proyectos de secuenciación de genomas han generado una enorme cantidad de información. En base a los datos disponibles al mes de julio de 2014 se tiene constancia de la existencia de 54830 proyectos de secuenciación (completados ya 6416) siendo en total 8505 de eucariotas (fuente GOLD: www.genomesonline.org). Esto ha fomentado la necesidad de descifrar e interpretar esta información genómica estimulando considerablemente el estudio directo y a gran escala de las proteínas. Por otra parte, en los últimos años las técnicas de análisis químico de proteínas han experimentado un gran desarrollo. Hasta hace muy poco las herramientas que se disponían para este fin (principalmente el análisis de aminoácidos y la Secuenciación de Edman) sólo permitían el análisis de proteínas de una forma poco sensible y excesivamente lenta y costosa. El desarrollo de las llamadas técnicas de “ionización suave” (MALDI y electrospray) abrió el camino al estudio de macromoléculas mediante espectrometría de masas. Estos métodos de ionización, en combinación con diversas técnicas de análisis de masas (tales como el “TOF”, el cuadrupolo o la trampa iónica) permiten la identificación y secuenciación de proteínas en forma rápida y con elevados niveles de sensibilidad y versatilidad (Ahmad y Lamond, 2014). La aparición de herramientas que por primera vez en la historia de las biociencias permiten el análisis sistemático de las proteínas, ha dado lugar al desarrollo de la moderna Proteómica. En el campo de la Proteómica existen distintas estrategias entre las que se destacan la estrategia Bottom-up y la estrategia Top-down. Ambas se diferencian en función de lo que se analiza, siendo el análisis de las partes (péptidos) en el primer caso y el análisis del todo (proteínas) en el segundo. En este momento se considera que estas técnicas son compatibles, complementarias, y no excluyentes. Los proyectos de Proteómica se basan en el uso sinérgico de herramientas para el análisis global y la separación de los componentes del Proteoma, herramientas para el análisis individual de los componentes del proteoma y técnicas para el proceso e interpretación de los datos. En la primera categoría, las herramientas más empleadas son las técnicas electroforéticas y las técnicas cromatográficas. La etapa inicial correspondiente a la estrategia Bottom-up es la separación de los componentes del proteoma mediante

93

Estudios Básicos

cromatografía líquida o electroforesis bidimensional (2-DE). Otras separaciones monodimensionales, como la electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) o el isoelectroenfoque (IEF), también pueden ser comunes para la realización de esta primera etapa. Las proteínas así separadas pueden ser analizadas directamente mediante espectrometría de masas, que constituye en sus múltiples variantes, la herramienta fundamental de la segunda categoría. De esta manera, la banda de interés de un gel de electroforesis es digerida con proteasas específicas como la tripsina con lo cual se obtiene una mezcla de péptidos, específicos y reproducibles para cada proteína, que son directamente analizados mediante MALDI-TOF (Matrix Asisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight). Este análisis del digerido proporciona la masa de cada uno de los péptidos contenidos, obteniéndose así el espectro de masas, mapa peptídico o Peptide Mass Fingerprint (PMF) completo específico para esa determinada proteína. Alternativamente, los péptidos producidos, tras un proceso de eliminación de contaminantes, pueden ser analizados mediante espectrometría de masas en tándem. Esta técnica utiliza la capacidad de un espectrómetro de masas para aislar un ión con una m/z específica (ión precursor), posteriormente fragmentarlo en una segunda etapa, y analizar la relación de m/z de los iones fragmento o iones producto (McLafferty, 1981). El espectro de masas obtenido es llamado espectro de fragmentación o espectro MS/MS (Figura I). La correcta interpretación de los espectros de fragmentación permite identificar no sólo la secuencia ordenada de los aminoácidos de un péptido sino que además se puede lograr su secuenciación de novo. La identificación de péptidos por MS/MS ha sustituido casi completamente a la identificación tradicional por Degradación de Edman. Los espectros de PMFs son característicos de cada una de las proteínas y permiten identificar las proteínas en bases de datos mediante la aplicación de técnicas bioinformáticas, herramientas de la tercera categoría. De esta manera, los espectros obtenidos experimentalmente se contrastan con los millones de espectros teóricos generados por la digestión in silico con la enzima utilizada de las secuencias proteicas contenidas en las bases de datos. Mediante el empleo de determinados softwares informáticos (MASCOT, ProFound, MS-FIT, PepSea, etc) se comparan y ordenan las proteínas en función del número y tipo de péptidos coincidentes. A cada uno de los resultados se le asigna un valor probabilístico que podrá ser significativo o no, dependiendo principalmente de la calidad de los datos y del tamaño de la base de datos (Figura 1).

94

Estudios Básicos

Figura 1.- Esquema de procedimiento para la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas

De la misma manera, los espectros MS/MS son también característicos de cada uno de los péptidos, y permiten su identificación in silico en la base de datos. En este caso, los espectros de fragmentación son utilizados para la identificación de péptidos y proteínas con ayuda de una serie de softwares bioinformáticos como el MASCOT (Perkins y col., 1999) y el SEQUEST (Eng y col., 2008), que utilizan los datos de la fragmentación in silico de las proteínas contenidas en bases de datos como SwissProt y NCBInr, para asignar una determinada secuencia a un determinado espectro de fragmentación (Kwon y col., 2010). Según el Dr. Jesús Vázquez, Director del Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa de España, ninguna de las dos técnicas (PMF o fragmentación) es de aplicabilidad universal sino que la disponibilidad sinérgica de ambas hace de la espectrometría de masas una buena herramienta para la identificación sistemática de proteínas. Por otra parte, Kwon y col. (2010) sugieren que en comparación con el PMF, el espectro de fragmentación reduce la ambigüedad en la secuenciación de péptidos y mejora la precisión en la identificación de proteínas. Como se mencionó anteriormente, los resultados generados por la espectrometría de masas deben ser analizados empleando softwares bioinformáticos específicos. La Bioinformática es, según una de las definiciones más sencillas dada por el European Bioinformatics Institute (EBI), la aplicación de tecnología computacional a la

95

Estudios Básicos

gestión y análisis de datos biológicos (http://www.ebi.ac.uk/2can/bioinformatics/bioinf_what_1.html). Según el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/): "Bioinformática es un campo de la ciencia en el cual confluyen varias disciplinas tales como: biología, computación y tecnología de la información. El fin último de este campo es facilitar el descubrimiento de nuevas ideas biológicas así como crear perspectivas globales a partir de las cuales se puedan discernir principios unificadores en biología”. Inicialmente, cuando comenzó esta rama de la ciencia, el concepto de Bioinformática se refería sólo a la creación y mantenimiento de bases de datos donde se almacena información biológica tales como secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Pero actualmente, la aplicación de la Bioinformática implica solucionar o investigar problemas sobre escalas de tal magnitud que sobrepasan las capacidades humanas usando para esto herramientas de sistemas y computación. Para ello se procede a la colección, organización, almacenamiento y recuperación de la información biológica que se encuentra en distintas bases de datos mediante el desarrollo de distintas técnicas: informática, matemática aplicada, estadística, ciencias de la computación, inteligencia artificial, química y bioquímica y simulación de sistemas, mecanismos todos ellos imprescindibles en Bioinformática y sin cuyo aporte no existiría esta rama de la ciencia. Las herramientas de software para Bioinformática van desde simples herramientas de línea de comandos hasta complejos softwares gráficos y servicios web autónomos situados en compañías de bioinformática o instituciones públicas (Chicano Gálvez, 2010). Los principales campos de la Bioinformática incluyen alineamientos de secuencias, predicción de genes, montaje de genomas, alineamientos estructurales de proteínas, predicciones de estructura de proteínas, predicciones de expresión génica, interacciones proteína-proteína y modelado de la evolución. Para la identificación en las distintas bases de datos existentes hay muchos algoritmos informáticos disponibles en la web que ayudan a identificar proteínas en base a las secuencias peptídicas que se obtienen de un espectrómetro de masas. La identificación de estas proteínas se lleva a cabo mediante el análisis y correlación de los espectros experimentales con los espectros teóricos simulados a partir de los datos de secuencia contenidos en las distintas bases de datos o bien mediante la búsqueda de esas secuencias en las bases de datos. De esta manera, es posible la identificación por similitud de la proteína de la que procede el fragmento peptídico que se ha secuenciado, para luego llegar a deducir la función de las proteínas dentro de un organismo o tejido.

96

Estudios Básicos

Inmovilización de proteínas y enzimas

La inmovilización de enzimas o proteínas, según la definición establecida en la 1a Conferencia sobre Ingeniería Enzimática, se define como “el proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte (Arroyo Sánchez, 1995; Gerhartz 1990). El proceso de inmovilización de enzimas presenta una serie de ventajas y desventajas. Los principales aspectos positivos son el aumento de la estabilidad operacional y durante el almacenamiento respecto de la que presentan las enzimas libres, la fácil separación del catalizador al final del proceso, empleando métodos sencillos como centrifugación o filtración para separarlos y la capacidad de reúso. El reúso de la enzima presenta ventajas económicas, lo cual en algunos casos es fundamental para la viabilidad del proceso (Sheldon, 2007; Guisán, 2006). Los principales aspectos negativos están relacionados con la posibilidad de alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo, la gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte, la pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización y el mayor costo del biocatalizador respecto de la enzima libre.

Métodos de inmovilización

Existen tres métodos tradicionales de inmovilización: el confinamiento, el entrecruzamiento y la unión de la enzima a un soporte (Figura 2).

97

Estudios Básicos

Figura 2.- Diferentes métodos de inmovilización. Fuente: López-Gallego (2007)

Confinamiento o entrampamiento

El confinamiento o entrampamiento consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros foto-entrecruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede realizarse en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. Desde el punto de vista experimental, el entrampamiento es de gran sencillez y requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. Sin embargo requiere del control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína (Arroyo, 2008). Dentro de esta categoría también se encuentra la inclusión en membranas, donde a su vez se distinguen dos tipos, la microencapsulación y los reactores de membrana, los cuales han despertado gran interés en la industria.

98

Estudios Básicos

Entrecruzamiento

Este método también denominado reticulado o cross-linking es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de enzimas. El método consiste en el uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bis-diazonio e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El agente reticulante más empleado es el glutaraldehído. El resultado del reticulado es un entramado de enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. El co-reticulado permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional. Dos métodos interesantes de inmovilizar enzimas sin soportes, son el entrecruzamiento con reactivos bifuncionales (por ejemplo glutaraldehído) de cristales de enzimas puras (“crosslinked enzyme crystals”, CLECs) o de agregados de enzimas formados en condiciones experimentales suaves (crosslinked enzyme aggregates, CLEAs). Estos son 10-20 veces más activos que los mejores derivados preparados sobre soportes pre- existentes (Guisán, 2012).

Unión a soportes

Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separables del medio líquido para que pueda ser reutilizado. La enzima se puede unir al soporte mediante adsorción de manera reversible o por unión covalente irreversible. En la primera la enzima puede ser desorbida del soporte recuperándolo una vez que el catalizador se haya inactivado (Gupta, 1991). Por el contrario,

99

Estudios Básicos

en la segunda opción, la enzima se une de forma irreversible y cuando esta se inactiva, todo el biocatalizador (enzima y soporte), debe ser eliminado (López-Gallego, 2007; Gupta, 1991). Con la inmovilización reversible no se logran grandes factores de estabilización debido a que no puede lograr una estructura terciaria rígida, excepto para el caso de enzimas multiméricas en las que se puede evitar la disociación de subunidades, porque estos sistemas son capaces de estabilizar la estructura cuaternaria (Torres y col., 2004; Torres y col., 2002). Solo la inmovilización covalente multipuntual promueve una rigidificación de la estructura terciaria, lo que se traduce en una mayor estabilización de la enzima.

Unión no covalente a soportes

La unión no covalente a soportes es una técnica muy simple en la cual se ponen en juego interacciones iónicas y otras uniones débiles como puentes de hidrógeno e interacciones de Van der Walls entre enzima y soporte. Esta inmovilización es una técnica suave y en general no afecta la actividad enzimática. El proceso depende de las propiedades físicas y químicas del soporte y de las características del medio (pH, fuerza iónica). Las ventajas asociadas con esta técnica son su bajo costo, fácil preparación, ausencia de cambios de especificidad enzimática y la obtención de derivados estables en medios con bajo contenido acuoso. En tanto que la débil unión de la enzima al soporte, la obtención de derivados poco estables mecánicamente y la complejidad de optimizar las variables que controlan dicho proceso, son claros inconvenientes que limitan su aplicación.

Unión covalente a soportes

La unión covalente de una enzima a un soporte es quizás el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. Su metodología se basa en la reactividad de grupos químicos existentes en el soporte para que reaccionen con grupos nucleófilos de la enzima expuestos hacia el exterior de la superficie proteica. La lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina son los aminoácidos que intervienen más comúnmente en este enlace y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico. Los demás aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica y en consecuencia, no pueden intervenir en la unión covalente (Arroyo, 1998). En este tipo de inmovilización, no existe ninguna regla que

100

Estudios Básicos

permita seleccionar el mejor soporte para una determinada aplicación industrial, sin embargo, existen soportes comerciales activados con grupos epóxido (Fernández-Lafuente, 2009; Boller y col., 2002; Mateo y col., 2002 Katchalski-Katzir y Kraemer, 2000) y con grupos aldehído (Rodrigues y col., 2011; Mateo y col., 2007) que han resultado muy eficientes en la inmovilización de enzimas de interés industrial (Fernández-Lucas y col., 2011; Hormigo y col., 2010; Hormigo y col., 2009; Kunamneni y col., 2008). Durante el proceso de acoplamiento, las condiciones de inmovilización deben ser las adecuadas para favorecer la unión covalente de la enzima al soporte (Figura 3A). En el caso de que la unión al soporte se establezca preferentemente a través de las lisinas, el pH del buffer de inmovilización debe ser 10 de tal manera que permita que los grupos ε-amino de las lisinas estén desprotonados y, por lo tanto, tengan el carácter nucleofílico necesario para que se establezca la unión covalente (Figura 3B).

Figura 3.- Inmovilización de enzimas por unión covalente a soportes. (A) Unión covalente a soportes epoxidados y glioxilados (B) Efecto del pH en el carácter nucleofílico del grupo ε-amino de las lisinas situadas en la superficie de la enzima.

La unión covalente de enzimas a soportes tiene como ventajas la sencilla manipulación de los derivados inmovilizados, que la carga de enzima permanece constante después de la inmovilización, que los derivados pueden utilizarse en reactores en sistemas continuos, empaquetados, de lecho fluidizado o de tanque agitado y en general presentan

101

Estudios Básicos

una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgánicos o del pH al tener estabilizada su estructura terciaria. Sin embargo, esta técnica también presenta algunos inconvenientes ya que es necesario conocer la densidad de grupos activos por superficie de soporte para no distorsionar la estructura de la enzima y generar derivados inactivos. El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo y este tipo de inmovilización puede afectar la actividad de aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH y/o fuerza iónica.

Inmovilización covalente multipuntual a través de la química del glutaraldehído

El glutaraldehído es un agente muy versátil y reactivo para inmovilizar enzimas en forma covalente, las cuales pueden ser inmovilizadas en soportes preactivados con glutaraldehído (López-Gallego, 2007; Magnan y col., 2004; Tukel y Alptekin, 2004; Barros y col., 2003; Dos Reis-Costa y col.,2003; Lamas y col., 2001; Zhou y Chen, 2001;Burteau ycol., 1989). Se pueden también entrecruzar con glutaraldehído las enzimas previamente adsorbidas a soportes con grupos amino primarios (Hwang y col., 2004; D`Souza y Kubal, 2002). En ambos protocolos, se adsorbe primero la enzima en forma iónica y posteriormente reacciona con el glutaraldehído quedando inmovilizada covalentemente al soporte (Guisán, 2012; Mielgo y col., 2003; Balcao y col., 2001). Sin embargo, hay una diferencia importante entre estas dos estrategias ya que la modificación química de la enzima usando soportes preactivados es mucho menor que cuando la enzima previamente inmovilizada es tratada con glutaraldehído (Figura 4).

102

Estudios Básicos

Figura 4.- Estrategias de inmovilización covalente multipuntual a través de la química del glutaraldehído. Fuente: López-Gallego (2007)

Los soportes preactivados (soportes aminados) son muy estables y podrían ser almacenados durante prolongados períodos de tiempo. La activación de estos soportes con glutaraldehído es muy sencilla y puede ser utilizado en procesos alimentarios. El glutaraldehído queda unido al soporte a través de aminos secundarios que están ionizados a pH neutro. Por este motivo, el proceso de inmovilización de enzimas sobre estos soportes suele ocurrir por un proceso en dos etapas, en primer lugar ocurre una adsorción iónica muy rápida a través de las regiones de la enzima con mayor densidad de carga negativa sobre los grupos amino ionizados del soporte y en la segunda etapa una reacción covalente intramolecular adicional entre grupos amino de la enzima y los grupos glutaraldehído del soporte. Estos grupos aldehído, son bastante inestables a pH alcalino y por ello esta inmovilización no suele promover una intensa estabilización de las enzimas por inmovilización covalente multipuntual. Sin embargo, el primer proceso de adsorción iónica muy rápido permite preparar derivados de enzimas altamente cargadas (Guisán, 2012). Por el contrario, cuando la enzima primero se adsorbe a un soporte con grupos amino primarios mediante un mecanismo de intercambio aniónico y el derivado es tratado luego con glutaraldehído en condiciones suaves de reacción, todos los grupos amino de la enzima y del soporte son modificados con una molécula de glutaraldehído. Esto puede

103

Estudios Básicos

favorecer la reactividad entre dos moléculas de glutaraldehído, una del soporte y otra de la enzima en un rango más amplio de condiciones de reacción (López-Gallego, 2007; Fernández-Lafuente y col., 1995). De esta manera, los grupos ε-amino de las lisinas de la enzima quedarán unidos covalentemente a los grupos amino primarios del soporte a través de dos moléculas de glutaraldehído estableciendo uniones covalentes multipuntuales entre la enzima y el soporte.

104

Estudios Básicos

RESULTADOS DEL CAPÍTULO I

Elección del material de trabajo

Este trabajo se inicia con la evaluación de la actividad proteolítica en frutos de la especie Salpichroa origanifolia, debido a que en estudios previos se encontró que dicha actividad se expresaba sólo en los frutos y no en otros órganos, como hojas, tallos y flores. En primer lugar se evaluó la actividad proteolítica y coagulante en los extractos de frutos verdes y maduros para decidir cual sería el material vegetal que se utilizaría. De este modo, se encontraron valores similares de actividad proteolítica en ambos extractos, sin embargo sólo los frutos maduros produjeron la coagulación de las proteínas de la leche (Tabla 2). Por este motivo, los frutos maduros fueron seleccionados para realizar los estudios de este trabajo de tesis.

Tabla 2.- Comparación de la actividad proteolítica y el poder coagulante en extractos de frutos verdes y frutos maduros de Salpichroa origanifolia

Características del fruto Actividad específica Tiempo de coagulación de (UHem.mg-1) la leche (min)

Fruto inmaduro 272 + 25 NC

Fruto maduro 270 + 18 40 + 5

NC: no coagula la leche. Los datos resultan de promediar 2 ensayos independientes, cada uno de ellos realizado por triplicado. Se indica la desviación estándar de la media

Obtención del extracto crudo

Para la preparación del extracto crudo se seleccionó la precipitación etanólica como estrategia de extracción enzimática pues permite obtener una preparación con bajo contenido de carbohidratos solubles y compuestos fenólicos que pudieran oxidar o afectar irreversiblemente el sitio catalítico de las enzimas proteolíticas presentes. Por otro lado, los frutos maduros tienen una vida útil muy corta luego de ser cosechados ya que su estructura con alto contenido acuoso es muy frágil.

Este método permitió realizar una rápida y sencilla extracción enzimática y conservarla por largos períodos de tiempo a bajas temperaturas (-20°C). La elección de

105

Estudios Básicos

etanol en lugar de acetona como agente precipitante se debe a que el uso de este último solvente está restringido en la industria de alimentos. El extracto crudo de los frutos maduros presentó una concentración de proteínas de 0.5 mg.mL-1 y actividad proteolítica frente a hemoglobina de 135 UHem.mL -1 y frente a caseína de 145 Ucas.mL-1 (Rocha y col., 2010).

Caracterización de los extractos crudos

Con el objeto de analizar la posible aplicación de los extractos crudos de Salpichroa origanifolia en procesos industriales y de acuerdo a los criterios establecidos por Illanes (2008) se estudiaron los diferentes parámetros bioquímicos que afectan la actividad proteolítica de las preparaciones crudas, ya que la pureza de una enzima no es un factor limitante para su aplicación. Se evaluaron las condiciones de conservación y estabilidad de los extractos crudos: el efecto del pH, de la temperatura y de moduladores de la actividad proteolítica.

Efecto del pH sobre la actividad proteolítica

Las determinaciones se llevaron a cabo empleando hemoglobina (pH 2.0 - 8.0) y caseína (pH 5.5 – 8.0) como sustrato. Como se indica en la Figura 5, la máxima actividad proteolítica se observó en un rango de pH comprendido entre 3.5 y 6.0 con una pérdida de actividad del 50% por debajo de pH 2.5 y por encima de pH 7.0. Cuando se empleó hemoglobina como sustrato la máxima actividad se registró a pH 3.5-4.0 mientras que con caseína el máximo de actividad se desplazó a pH 5.5-6.0 (Rocha y col., 2010).

C a s e ín a 1 0 0 H e m o g lo b in a 1 0 0

7 5 7 5

%

%

d

d

a

a

d

d

i

i

v

v

i

i

t

t

5 0 5 0

c

c

A A

2 5 2 5

0 0 2 3 4 5 6 7 8 5 . 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5

p H p H

Figura 5.- Variación de la actividad proteolítica del extracto crudo en función del pH. Los datos obtenidos resultan de promediar 2 experimentos independientes (n=3)

106

Estudios Básicos

Efecto de la temperatura sobre la actividad proteolítica

La actividad proteolítica del extracto crudo a distintas temperaturas empleando hemoglobina y caseína como sustratos se muestra en la Figura 6. La máxima actividad proteolítica se registró entre 35° y 45°C. A temperaturas inferiores a 35°C, la actividad proteolítica del extracto crudo con cada sustrato fue diferente ya que cuando se empleó caseína, la actividad residual disminuyó solo un 25%, en cambio cuando se empleó hemoglobina, la actividad residual alcanzó un 50% de la actividad inicial a 20°C. A temperaturas superiores a los 55°C se observó una importante pérdida de la actividad enzimática con ambos sustratos, reteniendo aproximadamente el 25% de la actividad inicial (Rocha y col., 2010).

H e m o g lo b in a C a s e ín a 1 0 0 1 0 0

7 5 7 5

%

%

d

d

a

a

d

d

i

i

v

v

i

i

t t

5 0 5 0

c c

A A

2 5 2 5

0 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0

T e m p e r a tu r a ° C T e m p e r a tu r a ° C

Figura 6- Efecto de la temperatura sobre la actividad proteolítica del extracto crudo, sobre caseína y hemoglobina como sustrato. Los datos obtenidos para cada temperatura resultan de promediar 2 experimentos independientes (n=3).

Aunque la enzima pudo hidrolizar hemoglobina y caseína, en la mayor parte de los ensayos de caracterización bioquímica y cinética se empleó caseína ya que fue el sustrato utilizado en los estudios aplicados, en particular en los ensayos de coagulación e hidrólisis de proteínas lácteas.

Estabilidad del extracto crudo

Los estudios de estabilidad enzimática brindan información acerca de los tiempos y las condiciones (por ejemplo temperatura) en los cuales puede trabajarse con una enzima sin que haya una pérdida importante de su actividad proteolítica. Es necesario tener esta información cuando se quiere utilizar una enzima en aplicaciones industriales ya que permite optimizar su actividad y establecer los parámetros adecuados para el proceso. Es así que se evaluó la estabilidad térmica de los extractos crudos.

107

Estudios Básicos

Estabilidad térmica

El extracto crudo se incubó a diferentes temperaturas a pH 6.0 durante 2 horas y se evaluó la actividad proteolítica residual en función del tiempo. En la Figura 7 se observa que el extracto crudo mantuvo el 90% de la actividad proteolítica original cuando fue incubado durante 2 horas a 40°C pero a 45°C disminuyó al 70% de su actividad inicial en el mismo período de tiempo. Sin embargo se observó que a 50°C se producía una pérdida abrupta de la actividad, reteniendo sólo el 20% del valor inicial. El extracto crudo se inactivó totalmente a 55°C y durante 1 hora de incubación (Rocha y col., 2010).

4 0 ° C

1 0 0 4 5 ° C

5 0 ° C

7 5

% 5 5 ° C

d

a

d

i

v

i

t

5 0

c

A

2 5

0 0 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5 1 2 0

T ie m p o ( m in )

Figura 7.- Estabilidad térmica del extracto crudo. Se midió la actividad residual % sobre caseína como sustrato. Los datos obtenidos resultan de promediar 2 experimentos independientes (n=3).

Estabilidad a bajas temperaturas

Se evaluó el efecto del almacenamiento a baja temperatura (-20°C) sobre la actividad proteolítica del extracto crudo durante seis meses. En la Figura 8 se puede observar que los extractos crudos presentaron una elevada estabilidad cuando fueron conservados a baja temperatura teniendo la actividad proteolítica una pérdida del 16%, en las condiciones del ensayo.

108

Estudios Básicos

1 0 0

7 5

%

d

a

d

i

v

i t

5 0

c

A

2 5

0

T ie m p o ( m e s e s )

Figura 8.- Estabilidad del extracto crudo conservado a -20°C durante 0, 1, 2, 4 y 6 meses, empleando caseína como sustrato. Los datos obtenidos resultan de promediar 2 experimentos independientes (n=3).

Efecto de compuestos reductores

Se evaluó el efecto de dos compuestos reductores: β-mercaptoetanol y ditiotreitol sobre la actividad proteolítica del extracto crudo y se encontró que ambos compuestos reducían la actividad enzimática (Tabla 3).

Tabla 3.- Efecto de compuestos reductores sobre la actividad proteolítica del extracto crudo de Salpichroa origanifolia

Concentración Actividad Compuesto reductor (mM) residual (%) β-mercaptoetanol 10 48 + 1 Ditiotreitol (DTT) 10 75 + 2

Una posible explicación podría considerar la presencia de puentes disulfuro estabilizando la estructura terciaria de la enzima y en consecuencia la actividad proteolítica.

109

Estudios Básicos

Efecto de inhibidores

Para examinar el comportamiento catalítico del extracto crudo, se realizaron ensayos con distintos inhibidores de la actividad proteolítica. Inicialmente se realizó una electroforesis nativa en geles de poliacrilamida con gelatina polimerizada en el gel para visualizar la actividad enzimática. Luego de la corrida electroforética, los geles fueron incubados durante 20 horas a 40°C en buffer ácido acético/acetato de sodio de pH 4.0 al cual se le adicionaron los distintos inhibidores: 1,10- fenantrolina (inhibidor de metalopeptidasas), E64 (inhibidor de peptidasas cisteínicas) PMSF (inhibidor de peptidasas serínicas) y Pepstatina (inhibidor de peptidasas aspárticas). Luego de teñir los geles con una solución de CBB R-250 se encontró que la actividad gelatinolítica sólo era inhibida por pepstatina a pH ácido (Figura 9, calle 2).

Figura 9.- Zimograma del extracto crudo en condiciones nativas al 10% con gelatina incluida, incubado en buffer ácido acético/acetato de sodio de pH 4.0, en presencia de inhibidores diagnósticos de peptidasa: pepstatina (1 µM), 1,10-fenantrolina (10 mM), PMSF (1 mM) y E64 (10 µM)

Se realizó luego el ensayo de inhibición de la actividad proteolítica en el extracto crudo en tubo de ensayos a pH 6.0 para evaluar la posible presencia de peptidasas de distinto mecanismo catalítico que no se hubiese expresado en medio ácido. En la Tabla 4 se observa que la actividad caseinolítica del extracto crudo sólo fue inhibida significativamente por pepstatina. El PMSF, la 1,10-fenantrolina y el E64 no provocaron pérdidas significativas de la actividad.

110

Estudios Básicos

Tabla 4. - Efecto de inhibidores específicos de la actividad proteolítica en el extracto crudo de Salpichroa origanifolia

Concentración Actividad Modulador (mM) residual(%)

Sin inhibidor - 100 + 3 1,10- 10.000 102.3 + 0.2 fenantrolina

PMSF 1.000 92.9 + 9.9

E64 0.010 102.6 + 3.7

Pepstatina 0.001 15.8 + 11.2

Estos resultados son coincidentes con los obtenidos por técnicas electroforéticas y permiten confirmar la presencia de actividad de aspartil peptidasa (AP) en el extracto crudo de los frutos maduros de Salpichroa origanifolia.

Purificación de la aspartil peptidasa

En la búsqueda de una estrategia de purificación que permitiera aislar la enzima en estudio con el mayor rendimiento y el menor grado de impurezas se desarrollaron diferentes técnicas de purificación, sin embargo solo se obtuvieron buenos resultados con las técnicas de cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico es una técnica comúnmente empleada por su alta capacidad de resolución, bajo costo y por la ventaja adicional de concentrar las soluciones proteicas. En un principio se utilizó una columna abierta con relleno de DEAE- Sepharose Fast Flow y luego se empleó una columna Mono Q en un sistema FPLC que permitieron comparar el rendimiento y el grado de purificación alcanzado con ambas técnicas. El empleo de una u otra metodología para purificar la enzima estuvo condicionado por la cantidad de masa de enzima pura requerida para el ensayo en el que fuera utilizada.

Cromatografía de intercambio aniónico en columnas de DEAE-Sepharose Fast Flow

El extracto crudo fue sometido a un proceso de purificación cromatográfica en una columna de DEAE-Sepharose Fast Flow. Se empleó buffer de fosfatos 50 mM de pH 7.0 como buffer

111

Estudios Básicos

de equilibrio y de elución. Se realizó una preincubación en batch del relleno de la columna con el extracto crudo (15 mL de extracto crudo con 7.5 mg de contenido proteico) y se mantuvo en agitación durante 60 minutos para favorecer el contacto entre la enzima y la resina. Se realizó luego la elución de las proteínas, primero en forma isocrática y luego con un gradiente lineal de NaCl (0-0.6 M). Se obtuvieron cinco picos de absorbancia, de los cuales sólo uno de ellos presentó actividad caseinolítica (Figura 10). La fracción activa fue desalada mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna de Sephadex G-15.

0 .6 0 .6

)

m

n

0 .4 0 .4

0

N

8

a

2

(

C

l a

i

(

c

M

n

) a

b

r

o

0 .2 0 .2

s

b

A

0 .0 0 .0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

V o lú m e n d e e lu c ió n ( m l)

Figura 10.- Cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-Sepharose Fast Flow) del extracto crudo de Salpichroa origanifolia. Se sembraron 7.5 mg de proteína del extracto crudo y se eluyó inicialmente en forma isocrática con 40 mL del buffer de equilibración y luego con 60 mL de un gradiente lineal de NaCl (0-0.6 M)en buffer de fosfatos 50 mM de pH 7.0 y a una velocidad de 1 mL.min-1. Se colectaron fracciones de 2.4 mL.

Los resultados de la purificación se muestran en la Tabla 5. Con este procedimiento, la enzima fue purificada 7.9 veces con un rendimiento del 20%.

112

Estudios Básicos

Tabla 5.- Tabla de purificación de la enzima proteolítica aislada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia empleando la cromatografía de intercambio aniónico en resinas de DEAE-Sepharose Fast Flow como paso de purificación.

Unidades Proteínas Actividad Volumen Rendimiento Purificación Paso totales totales específica (mL) (%) (veces) (Ucas.min-1) (mg) (Ucas.mg-1 )

Extract 15.0 2175.0 7.5 290.0 100.0 1.0 o crudo

DEAE- Sepharose 2.4 434.0 0.2 2284.2 20.0 7.9 FAst Flow

El perfil electroforético de la fracción activa obtenido por SDS-PAGE con tinción con CBB R-250 mostró la presencia de una banda de 30-32 kDa y dos bandas más tenues de menor peso molecular. Se realizó también un gel de actividad en condiciones desnaturalizantes pero no reductoras (gel de poliacrilamida con gelatina al 0.1% polimerizada en el gel) y se observó que la fracción activa se resolvía en una única banda con actividad proteolítica cuya movilidad electroforética era similar a la banda de mayor peso molecular obtenida por SDS-PAGE (Figura 11, calles 2 y 3). Para comprobar que la presencia de las bandas de peso molecular inferior a 17 kDa era consecuencia del proceso de autolisis de la enzima, la fracción con actividad proteolítica eluída de la columna fue colectada sobre una solución de pepstatina (1 μM). La electroforesis SDS-PAGE con posterior tinción con plata mostró que en presencia del inhibidor no se visualizaban las bandas de menor peso molecular indicando la ausencia de autodigestión de la enzima (Figura 11, calle 5).

113

Estudios Básicos

kDa kDa 66.0— 66.0--

45.0-- 36.0-- 45.0--

29.0-- 36.0-- 24.0-- 29.0-- 24.0-- 20.1-- 20.1-- 14.2-- 14.2--

1 2 3 4 5

Figura 11.- SDS-PAGE (15%) de la fracción activa obtenida por cromatografía de intercambio aniónico, en ausencia y presencia de pepstatina. Calles 1 y 4: Marcadores de bajo peso molecular (M3913, Sigma), calle 2: fracción activa en ausencia de inhibidor (tinción con CBB R250), calle 3: Zimograma SDS-PAGE (10%) en ausencia del inhibidor y calle 5: fracción activa en presencia de inhibidor (tinción con plata).

Cromatografía de intercambio aniónico en columna Mono Q

El extracto crudo fue también purificado por cromatografía de intercambio aniónico (FPLC) utilizando como intercambiador una resina Mono Q equilibrada en buffer de fosfatos 50 mM de pH 7.0. La elución se realización mediante un gradiente lineal de NaCl (0.15-0.5M) con un flujo de 0.6 mL min-1 en el mismo buffer (Figura 12).

3 0 0

0 .4 5

)

m

n

2 0 0

0

N

8

a 2

0 .3 5 (

C

a

l

i

( c

M

n

) a

b

r

o

1 0 0

s

b 0 .2 5

A

0 0 .1 5 0 2 0 4 0 6 0 8 0

V o lú m e n d e e lu c ió n ( m l)

Figura 12.- Cromatografía de intercambio aniónico (columna de Mono Q) del extracto crudo de Salpichroa origanifolia en un sistema FPLC. Se sembraron 5.0 ml de extracto crudo (0.5 mg mL-1 de contenido proteico) y se eluyó inicialmente en forma isocrática con 40 mL del buffer de equilibración y luego con 60 mL de un gradiente lineal de NaCl (0.15-0.5 M) en buffer de fosfatos 50 mM de pH 7.0 y a una velocidad de 0.6 mL min-1. Se colectaron fracciones de 2 mL.

114

Estudios Básicos

En el perfil cromatográfico se observan siete picos de los cuales sólo uno presentó actividad caseinolítica. La fracción activa fue desalada por cromatografía de exclusión molecular en una columna de Sephadex G-15. De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 6, con este método la enzima fue purificada 13.4 veces y se obtuvo un rendimiento del 32%. Se observa que cuando se empleó la columna de Mono Q se alcanzó mayor rendimiento y grado de purificación de la enzima. Esto está relacionado con la eficiencia del método sin embargo, el uso de uno u otra metodología para la purificación de la enzima se adecuó a las necesidades específicas del ensayo, empleándose la cromatografía con resinas DEAE-Sepharose cuando fue necesario obtener mayor cantidad de masa.

Tabla 6.- Tabla de purificación de la enzima proteolítica aislada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia empleando un intercambiador fuerte (Mono Q)

Unidades Actividad Volumen Proteínas Rendimiento Purificación Paso totales específica (ml) totales (mg) (%) (veces) (Ucas.min-1) (Ucas mg-1 )

Extract 5 598.3 2.5 239.3 100.0 1.0 o crudo

Mono Q 2 192.2 0.1 3203.3 32.1 13.4

Diversas APs han sido purificadas a partir del material vegetal, empleando procedimientos de uno o más pasos de purificación. Las cardosinas A y B fueron purificadas de los extractos de flores de Cynara cardunculus en dos etapas, por cromatografía de exclusión molecular (Superdex 200) seguida de intercambio aniónico (Mono Q) obteniéndose rendimientos del 14 y 46%, con factor de purificación de 0.5 y 5.6, respectivamente (Verissimo y col., 1996). Las APs presentes en el látex de Ficus racemosa fueron purificadas por cromatografía de exclusión molecular (BioSep-SEC-S2000) seguida por intercambio iónico (DEAE-Sephadex), con un rendimiento de 19.3% y una eficiencia de 7.1 veces (Devaraj y col., 2008). Del mismo modo, una AP extraída de tubérculos de papa (Solanum tuberosum) fue purificada 38 veces por cromatografía de intercambio aniónico (Mono Q) seguido por cromatografía de afinidad en una columna de pepstatina-agarosa, con un rendimiento de 12% (Guevara y col., 1999) y la AP aislada de semillas de Vigna radiata fue sometida a fraccionamiento salino seguido de cromatografía de afinidad en una columna

115

Estudios Básicos

de pepstatina-agarosa con rendimiento mayor al 100% y eficiencia de 48.8 (Kulkarni y Rao, 2007). Por otro lado, algunas pocas APs fueron purificadas en una única etapa. Así la AP de semillas de Arabipdosis thaliana fue purificada por cromatografía de afinidad con una matriz de pepstatina-agarosa, alcanzando un rendimiento del 58% y una eficiencia de 1000 veces (Mutlu y col., 1998). Las cinarasas A, B y C fueron purificadas por cromatografía de intercambio iónico (Q-Sepharose) a partir de extractos de flores de Cynara scolymus con un rendimiento de 5.0, 16.8 y 4.2% y una eficiencia de 31.2, 205 y 190, respectivamente (Sidrach y col., 2005). La fracción con actividad proteolítica obtenida de la cromatografía de intercambio aniónico con columna Mono Q fue analizada por electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Se observó una única banda con peso molecular aparente de 32kDa cuando la muestra se preparó en condiciones no reductoras (Figura 13 A, calle 2). No se observaron diferencias en condiciones reductoras y calentadas a 90°C (dato no mostrado).

A B

Figura 13.- A: Electroforesis SDS-PAGE (15%) en condiciones no reductoras. Calle 1: marcador de bajo peso molecular (M3913, Sigma), calle 2: fracción activa de la cromatografía de intercambio aniónico Mono Q, en presencia de pepstatina (1 μM) y teñido con plata, Calle 3: zimograma de dicha fracción en ausencia de pepstatina B: Electroforesis nativa (10%). Calle 1: fracción purificada, eluída de la columna de Mono Q, calle 2: zimograma de la enzima pura.

La pureza de la enzima fue evaluada también por electroforesis nativa y se observó la presencia de una única banda proteica (Figura 13B, calle 1). De la misma manera, en el zimograma correspondiente se observó una única banda con movilidad relativa similar a la obtenida en el gel, indicando la homogeneidad de la enzima purificada.

116

Estudios Básicos

En función de los resultados obtenidos por electroforesis, se estimó el peso molecular de la enzima salpichroína en 32 kDa, valor que es del mismo orden que el obtenido para otras AP de origen vegetal como las APs de tomate (37 kDa) y tabaco (36-40 kDa) descriptas por Rodrigo y col., (1989; 1991), la AP de papa (38 kDa) descripta por Guevara y col., (1999) y la AP de Ficus racemosa (44 kDa) informada por Devaraj y col. (2008). Se propone como denominación para esta nueva peptidasa aislada de los frutos maduros de Salpichroa origanifolia el nombre de salpichroína, según las recomendaciones de Kervinen (2013).

Caracterización de la enzima pura

La enzima purificada por intercambio aniónico y denominada salpichroína fue caracterizada bioquímica, estructural y funcionalmente. Se estudió la estabilidad térmica, la estabilidad en el almacenamiento y la especificidad de clivaje sobre la cadena β de la insulina oxidada. Se caracterizó cinéticamente la enzima frente a dos sustratos naturales como caseína y hemoglobina y un sustrato sintético específico de APs. Se estudió también la estructura primaria empleando técnicas proteómicas y se realizaron estudios filogenéticos con el objeto de intentar asignar una función a la enzima en estudio.

Efecto del pH

Las determinaciones se llevaron a cabo empleando dos sustratos proteicos: caseína entre pH 5.5- 8.0 y hemoglobina entre pH 2.0 - 8.0. Los perfiles de pH obtenidos para la enzima purificada resultaron similares a los del extracto crudo. Como se indica en la Figura 14, la máxima actividad proteolítica con hemoglobina se observó en el rango de pH 3.0-4.5 y con caseína a pH 5.5-6.0. También se encontró que la actividad enzimática frente a ambos sustratos disminuía a valores inferiores al 20% cuando el pH era mayor de 7.0.

117

Estudios Básicos

1 0 0 H e m o g lo b in a 1 0 0 C a s e ín a

7 5 7 5

%

%

d

d

a

a

d

d

i

i

v v

i

i

t

t

5 0 c 5 0

c

A A

2 5 2 5

0 0 2 3 4 5 6 7 8 5 . 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 pH pH

Figura 14.- Variación de la actividad proteolítica de la enzima pura en función del pH. Los datos obtenidos resultan de promediar 2 experimentos independientes (n=3)

Este comportamiento enzimático es coincidente con el informado para otras APs. La AP aislada de semillas de Cucumis sativus presentó un valor de pH óptimo de 3.2 frente a hemoglobina (Wilimowska y col., 1983), la AP purificada a partir del látex de Ficus racemosa exhibió su mayor actividad frente a azocaseína en el rango de pH 4.5-6.5 (Devaraj y col., 2008). El pH óptimo de actividad de la AP purificada a partir de las flores de Cynara scolymus denominada Cinarasa A frente a un sustrato sintético estuvo en el rango 3.5-5.0 (Sidrach y col., 2005).

Estabilidad térmica y durante el almacenamiento

Los resultados del estudio de estabilidad térmica se detallan en la Figura 15. Luego de incubar la enzima purificada a 40°C durante 15 minutos se observó que la misma retenía aproximadamente el 50% de su actividad proteolítica inicial pero se inactivaba a 45°C en el mismo período de tiempo. Se observó también que la enzima pura se inactivaba completamente a los 60 minutos de incubación y a ambas temperaturas.

118

Estudios Básicos

1 0 0 4 0 ° C

4 5 ° C

)

7 5

%

(

d

a

d i

v i

t 5 0

c

A

2 5

0 0 5 0 1 0 0

T ie m p o ( m in )

Figura 15.- Estabilidad térmica de la enzima purificada por cromatografía de intercambio aniónico determinada a 40° y 45°C, empleando caseína como sustrato. Los datos obtenidos resultan de promediar 2 experimentos independientes (n=3).

El análisis comparativo de la estabilidad térmica a 40°C del extracto crudo y de la enzima purificada muestra que el extracto crudo presenta muy buena estabilidad térmica, mientras que la enzima purificada se vuelve térmicamente inestable (Figura 16). Estos resultados pueden deberse a la estabilización de los azúcares y otros compuestos presentes en el extracto crudo que podrían estar protegiendo la estructura de la enzima y por ende preservando su actividad proteolítica. La remoción de estos compuestos durante el proceso de purificación dejaría a la enzima vulnerable frente al efecto de inactivación térmica (Suzuki y col., 1997). Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de observaciones experimentales relacionadas con la estabilidad de diversos biomateriales en presencia de azúcares, los fundamentos fisicoquímicos y los mecanismos moleculares involucrados aún están en discusión (Santagapita, 2010).

119

Estudios Básicos

E x tra c to c ru d o

1 0 0

E n z im a p u r i fic a d a

)

%

(

d

a

d

i

v i

t 5 0

c

A

0 0 5 0 1 0 0

T ie m p o ( m in )

Figura 16.- Estabilidad térmica del extracto crudo y de la enzima purificada por cromatografía de intercambio aniónico determinada a 40°C empleando caseína como sustrato. Los datos obtenidos resultan de promediar 2 experimentos independientes (n=3).

Se evaluó luego el autoprocesamiento proteolítico de la enzima purificada a baja temperatura ya que las peptidasas son propensas a sufrir autolisis. En la Figura 17 se muestra la electroforesis nativa con el perfil de autoprocesamiento de la enzima almacenada durante 30 días a -20°C. La escisión proteolítica aumentó con el tiempo de almacenamiento y así salpichroína muestra un elevado grado de autolisis a los 30 días de almacenamiento. Estos sucesos fueron evidenciados por la aparición de dos bandas adicionales y de menor masa a la banda correspondiente a la enzima en la electroforesis nativa.

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 17.- Electroforesis en condiciones nativas (10%) del proceso de autodegradación de la enzima salpichroína almacenada a bajas temperaturas (-20°C). Calle 1: Fracción purificada, calle 2: día 7, calle 3: día 14, calle 4: día 30 y calle 5: zimograma de la fracción purificada. Gel nativo teñido con plata: calles 6, 7 y 8: días 7, 14 y 30 respectivamente.

120

Estudios Básicos

Ensayos de inhibición

Para caracterizar el comportamiento catalítico de salpichroína frente a inhibidores diagnóstico, se realizaron ensayos con distintos moduladores de la actividad proteolítica. En la Tabla 7 se observa que la actividad proteolítica de la enzima pura fue inhibida significativamente por pepstatina (aproximadamente 93%). En cambio, la incubación con

1,10-fenantrolina, PMSF y E64 no tuvo un mayor efecto.

Tabla 7. - Efecto de inhibidores específicos de la actividad proteolítica de salpichroína.

Modulador Concentración (mM) Actividad residual (%)

Sin inhibidor - 100 + 2

1,10-fenantrolina 10.000 90 + 3

PMSF 1.000 84 + 2

E64 0.010 95 + 1

Pepstatina 0.001 7 + 2

La inhibición de la actividad proteolítica de salpichroína con pepstatina permitió clasificar a la enzima en el grupo de las peptidasas aspárticas (Rawlings y col., 2011).

Titulación del sitio activo de la enzima

Para la titulación del sitio activo se emplearon siete concentraciones de pepstatina (entre 0.1 y 1.0 M) y la concentración del sitio catalítico de la enzima se obtuvo por análisis de regresión lineal a partir de la ecuación de la recta y de acuerdo al protocolo descripto por Barrett y Kirschke (1981). La concentración del sitio activo obtenida a partir de la titulación con pepstatina fue 0.88 M (Figura 18).

121

Estudios Básicos

1 0 0 Y= -111,1x + 98,711

R2=0,9814

7 5

%

d

a

d

i

v

i 5 0

t

c

A

2 5

0 0 .0 0 0 .2 5 0 .5 0 0 .7 5 1 .0 0

P e p s ta t in a (µ M )

Figura 18 - Titulación del sitio activo de salpichroína con pepstatina. La reacción de inhibición, se midió la actividad enzimática remanente empleando el péptido sintético H-Pro-Thr-Glu-Phe-p- (NO2)-Phe-Arg-Leu-OH como sustrato en buffer ácido acético/acetato de sodio de pH 4.0.

Determinación de parámetros cinéticos

Las peptidasas en general siguen la cinética clásica de Michaelis Menten y sus reacciones pueden ser caracterizadas mediante la determinación de las constantes cinéticas Km, Vmáx, kcat y fundamentalmente por la relación kcat/Km a la que se denomina eficiencia catalítica. En este trabajo se determinaron los parámetros cinéticos con dos sustratos naturales (α-caseína y hemoglobina) y con el sustrato sintético [H-Pro-Thr-Glu-Phe-p-(NO2)-Phe-Arg- Lue-OH] específico de peptidasas aspárticas (Dunn y col., 1986). Los sustratos sintéticos son muy valiosos para realizar estudios cinéticos en las reacciones enzimáticas debido a su especificidad en el sitio de clivaje por acción de la enzima proteolítica, ya que presentan un único enlace peptídico que puede ser escindido por la enzima. A partir de la hidrólisis enzimática del péptido se liberan los residuos cromogénicos que pueden ser determinados por métodos espectroscópicos (espectrofotométricos o fluorométricos). Los resultados de los estudios cinéticos para cada sustrato fueron descriptos por la clásica curva hiperbólica consistente con el modelo de Michaelis-Menten (Figuras 19 A, B y C).

122

Estudios Básicos

A 0 . 6

6

)

1

-

)

s 0 . 4

1

-

M

s

4

µ

(

M

d

µ

a (

d

i

d

c

a

o

l

d

i

e

c v

0 . 2

/

o 2

l

1

e

v

0

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 - 0 . 0 1 0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 3

[ s u s tr a to ] ( µ M ) 1 / S u s t r a t o ( µ M ) K m = 1 6 4 µ M - 1 V m á x = 1 0 . 5 µ M s

B

0 . 8 6

)

)

1

1

-

-

s

s

0 . 6

M M

µ 4

µ

(

(

d

d

a

d

a

i

0 . 4

c

d

i

o

l

c

e

o

v

l

/

2

1 e

v 0 . 2

0 . 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 - 0 . 0 0 5 0 . 0 0 0 0 . 0 0 5 0 . 0 1 0 0 . 0 1 5 0 . 0 2 0

1 / [ S u s tr a to ] ( µ M ) s u s tr a to ( µ M ) K m = 3 7 8 µ M - 1 V m á x = 1 . 2 µ M s

C

1 . 5 6

)

)

1

-

1

-

s 1 . 0

s

4

M

M

µ

(

µ

(

d

a

d

d

i

a

c

d o

l

i

e

c

0 . 5

v

/ o

2

l

1

e

v

0 0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 2 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 / [ S u s tr a to ] ( µ M ) [ s u s tr a to ] ( µ M ) K m = 4 9 4 µ M - 1 V m á x = 9 . 1 µ M s

Figura 19- Representación de la velocidad inicial de la hidrólisis enzimática con diferentes concentraciones de sustrato. Determinación de los parámetros cinéticos Vmáx y Km de la hidrólisis de la enzima salpichroína con los sustratos (A) -caseína, (B) hemoglobina y (C) péptido sintético PNPE.

123

Estudios Básicos

Por otra parte, en la Tabla 8 se indican los valores de las constantes obtenidas tanto para salpichroína como para otras APs. Los parámetros cinéticos fueron calculados por análisis de regresión lineal utilizando la ecuación de Lineweaver-Burk, derivación matemática de la ecuación de Michaelis-Menten. Se observó que la enzima pura tenía comportamiento michaeliano frente a los sustratos naturales y al péptido sintético. Salpichroína presentó un valor de Km de 164 µM para α-caseína, el cual resultó del mismo orden que el valor de Km (370 µM) para quimosina bovina (Carles y Ribadeau-Dumas, 1985). Por otro lado, el valor de Km obtenido frente a hemoglobina fue de 378 µM, el cual resultó similar al valor de Km (538 µM) de la AP obtenida de las larvas de la polilla de la col (Kumar y col., 2012) y superior al de la AP aislada de las vísceras de sardina cuyo valor es 73 µM cuando se emplea hemoglobina como sustrato (Ben Khaled y col., 2011). El valor de Km obtenido para el sustrato sintético fue 494 M. Este valor resultó del mismo orden que el de otras enzimas proteolíticas informadas por Dunn y col. (1986) que además presentan actividad coagulante de la leche, como por ejemplo la quimosina bovina (460 M) y la pepsina humana (170 M) y superior al de la enzima vegetal Cinarasa A cuyo valor de Km es 58 M (Sidrach y col., 2005; Dunn y col., 1986). Para expresar los valores de kcat en relación a Vmax se consideró el valor de la concentración de la enzima activa de 0.88 μM obtenida por titulación del sitio catalítico con pepstatina (Figura 18). El cociente kcat/Km se considera la mejor relación cinética para expresar la eficiencia catalítica. Según puede observarse en la Tabla 8, el valor de dicha relación fue mayor para α-caseína (72.0 s-1 mM-1) que para hemoglobina (3.6 s-1 mM-1) y para el sustrato sintético (20.9 s-1 mM-1) demostrando mayor eficiencia de la enzima con α-caseína. Al comparar la cinética de salpichroína con otras APs de distinto origen frente al sustrato sintético, se observó que salpichroína presentaba una baja afinidad (494 μM) y baja eficiencia catalítica (20.9 s-1 mM-1) por el sustrato sintético PNPE, similar a lo que ocurre con la quimosina bovina. En cambio, cuando se empleó α-caseína como sustrato, la enzima mostró elevada afinidad y eficiencia catalítica (164.0 μM y 72.0 s-1 mM-1, respectivamente).

124

Estudios Básicos

Tabla 8.- Constantes cinéticas para la hidrólisis del sustrato sintético H-PRO-THR-GLU-PHE-(p-NO2)- PHE-ARG-LEU-OH y de los sustratos naturales α-caseína y hemoglobina por salpichroína y enzimas aspárticas de distinto origen.

Kcat Km Kcat/Km Ki (mM) Sustrato Enzima (µM) (s-1 mM-1) Referencias (s-1)

α-caseína Salpichroína 164 11.9 72.0 - Quimosina bovina 370 0.7 1.9 - Carles y Ribadeau- Dumas, 1985

Hemoglobina Salpichroína 378 1.4 3.6 - AP Sardinella aurita 73 - - - Ben Khaled y col., 2011

AP Plutella xylostella 538 - - - Kumar y col., 2012

PNPE Salpichroína 494 10.3 20.9 500.0 -

Pepsina Humana 170 72.0 425.0 57.2 Dunn y col., 1986

Quimosina bovina 460 51.0 110.0 10.5 Sidrach y col., 2005

Cinarasa A 58 2.6 45.3 30.0 Sidrach y col., 2005

Especificidad de clivaje sobre la cadena β de la insulina oxidada

En este trabajo se evaluaron los sitios de clivaje de la cadena β de la insulina oxidada para establecer la especificidad de clivaje de salpichroína. Los productos de la hidrólisis del sustrato fueron separados por RP-HPLC y los picos predominantes se analizaron por LC/MS/MS. Como se muestra en la Tabla 9 se reconocieron seis sitios de clivaje entre los enlaces Phe1-Val2, Leu11-Val12, Leu15-Tyr16, Tyr16-Leu17, Phe24-Phe25 y Phe25-Tyr26. Se encontró que la enzima salpichroína era capaz de clivar este sustrato en enlaces peptídicos similares a los obtenidos para quimosina. Se observó además que salpichroína hidrolizaba el enlace peptídico entre los aminoácidos Leu15-Tyr16, el cual es también hidrolizado por otras APs de plantas como las Cardosinas A y B (Verissimo y col., 1995), las Cardosinas E, F, G y H presentes en las flores del cardo (Sarmento y col., 2009), la Procirsina aislada de inflorescencias del cardo negro (Lufrano y col., 2012), la fitepsina de semillas de cebada (Kervinen y col., 1993) y las StAP1 y StAP3 de tubérculo y hojas de papa (Guevara y col., 2004).

125

Estudios Básicos

Por otro lado, se encontró que salpichroína clivaba el enlace peptídico entre los aminoácidos Phe1-Val2 de la insulina, sugiriendo que esta enzima presenta no sólo actividad endoproteolítica sino también exoproteolítica (Guevara y col., 2004).

Tabla 9- Sitios de clivaje de la enzima salpichroína sobre la cadena β de la insulina oxidada y comparación con otras enzimas. La columna central muestra la secuencia de la β –insulina y en recuadros grises se señalan los aminoácidos del enlace peptídico escindido.

Salpichroína F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A

Foltman, 1964 Quimosina F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A Sanger y Tuppy, 1981 Pepsina F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A Lufrano y col., 2012 Procirsina F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A Sarmento y col., 2009 Cardosinas E, F, G, H F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A Sarmento y col., 2009 Cardosina B F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A Kervinen y col., 1993 Fitepsina (cebada) F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A Guevara y col., 2004 StAP1 F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A Guevara y col., 2004 StAP3 F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K A

Análisis e identificación por técnicas proteómicas

En este trabajo se emplearon técnicas proteómicas como Peptide Mass Fingerprint (PMF) y secuenciación de novo de péptidos por espectrometría de masas en tándem con el fin de identificar la proteína en estudio. Para los estudios de la huella peptídica (PMF), se cortó la banda de 32 kDa del gel SDS-PAGE, se digirió con tripsina y se sometió a MALDI-TOF/MS. El PMF obtenido fue utilizado para buscar en la base de datos del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI) utilizando el software MASCOT (http://www.matrixscience.com). Luego se comparó el PMF obtenido con el de proteasas conocidas presentes en las bases de datos disponibles y se encontró que no presentaba identidad con ninguno de ellos. En la Figura 20 se muestra el PMF de salpichroína y en la tabla inserta en el gráfico, el valor m/z de los 5 picos más prominentes de dicho PMF (m/z: 1,294.6 para P1, 1,743.7 para P2, 1,970.9 para P3, 2,317.1 para P4 y 2,611.2 para P5) los cuales luego fueron sometidos a MS/MS.

126

Estudios Básicos

Figura 20.- Espectro de masas obtenido por MALDI-TOF/MS provenientes de la digestión tríptica de salpichroína. Se muestra una lista de los péptidos más prominentes (inserto en el gráfico)

La Tabla 10 muestra que los resultados de búsqueda para los valores MS/MS de los P1 y P2 presentan coincidencia (P < 0.05) con los iones teóricos de péptidos resultantes de la digestión tríptica de una AP de Nepenthes alata denominada NaAP3 y de una AP potencial de Solanum lycopersicum denominada SlAP1; GenBank acc. number: XP_004231616.1. Por otro lado, los espectros MS/MS de los péptidos P3 y P4 no arrojaron coincidencias en los resultados de búsqueda con el software MASCOT. Sin embargo, por secuenciación de novo a partir de los espectros se pudieron obtener las secuencias parciales, FTVVFDTGSSNLWVPSSK y NTEEEQGGEIIFGGVDPNHFK respectivamente, las cuales coinciden con los péptidos trípticos calculados, FTVIFDTGSSNLWVPSSK y NTEEEQGGEIVFGGVDPNHFK, de la secuencia de SlAP1-like, donde aparecen claramente las sustituciones V→I y I→V, respectivamente (Tabla 10). Finalmente, el péptido P5, cuya secuencia fue obtenida por secuenciación de novo, FSEDNVKVGDLVVTDQEFIEATR, fue originado por un corte semitríptico. El análisis revela que la enzima en estudio pertenece a la familia A1 de las AP, con una elevada similitud con SlAP1-like. Esta enzima no ha sido caracterizada aun, pero su estructura deriva de una secuencia genómica (NW_004194303.1, BioProject: PRJNA66163). La estructura del zimógeno de la enzima contiene una pre-prosecuencia de 65 aminoácidos y unos 441 residuos que corresponderían a la proteína madura, aproximadamente el mismo tamaño que también poseen las AP del arroz y del cardo (Kervinen y col., 1995). Adicionalmente, el análisis por HPLC-MS de la enzima purificada por intercambio aniónico mostró dos picos, uno correspondiente a salpichroína (32 kDa) y el segundo, de 9

127

Estudios Básicos

kDa, probablemente correspondiente a un fragmento liberado por un proceso auto- catalítico (dato no mostrado). Debido a que el dominio N-terminal de la fracción de 32 kDa se encontraba bloqueado, no fue posible obtener su secuencia aminoacídica. Por otro lado, la secuencia N-terminal de la segunda fracción obtenida (9 kDa) coincidió con un fragmento del dominio C-terminal de la enzima SlAP1-like y posiblemente corresponda a una fracción del PSI presente en las APs monoméricas.

Tabla 10.- Identificación de salpichroína por análisis PMF MALDI- TOF/MS

Masa Masa MASCOT Ion Observada Predicha Secuencia Coincide con (kDa) (kDa) Score

1294.6 1293.6 K.EPVFSFWLNR.K AP 3 de Nepenthes alata 126 AP similar a la AP A1 de 1743.8 1742.8 K.GYWQFDMGDVLIDGK.A Solanum lycopersicum

AP-similar a isoforma X1 1743.8 1742.8 94 K.GYWQFDMGDVIIDGK.S de Cicer arietinum

1294.6 1293.6 K.EPVFSFWLNR.N AP Brassica olearacea; 85 AP Brassica napus; AP Arabidopsis thaliana 1970.9 1969.9 K.FTVVFDTGSSNLWVPSSK.C

1743.8 1742.8 82 K.GYWQFDMGDVLIGDK.T AP Helianthus annuus

Los fragmentos peptídicos que presentaron una identidad de secuencia del 95% con SlAP1-like se muestran en la Figura 21.

128

Estudios Básicos

Figura 21.- Alineamiento de la secuencia aminoacídica de salpichroína y SlAP1-like. Las secuencias fueron alineadas automáticamente empleando el algoritmo CLUSTAL W. Los residuos idénticos se encuentran resaltados con color negro, los residuos similares están señalados con color gris y los gaps se indican mediante guiones.

129

Estudios Básicos

Se realizó el análisis filogenético para determinar la relación entre los fragmentos identificados de salpichroína y otras APs que contuvieran el dominio PSI, empleando el método de Neighbor-Joining (árbol no enraizado y aditivo) y el software MEGA 5 (Tamura y col., 2011). El árbol filogenético resultante se divide en dos grandes grupos: I y II (Figura 22). El grupo I se divide a su vez en dos subgrupos (a y b). El subgrupo Ia que incluye los fragmentos de salpichroína, contiene las peptidasas de Arabidopsis thaliana (AtAsp1, AtAsp2, AtAsp3), Brassica oleracea (BoAsp) y Brassica napus (BnAsp), a las que aun no se les podido atribuir una función específica en la planta. Sin embargo otras APs pertenecientes al mismo grupo tienen asignadas funciones específicas, como por ejemplo la peptidasa del pepino (CpAsp) ha sido relacionada con la maduración de las proteínas (Yamauchi y col., 1996), las peptidasas FeAsp1 y FeAsp2 de trigo sarraceno están implicadas en la germinación de las semillas y en la maduración de proteínas (Timotijevic y col., 2010), la peptidasa NaAsp4 identificada en las flores de la planta carnívora Nepenthes alata participa en la digestión de las presas (An y col., 2002), la peptidasa GmAsp2 que podría estar implicada en la muerte celular programada (Terauchi y col., 2004), la peptidasa VuAsp del caupí o frijol chino participa en la regulación en hojas senescentes (Cruz de Carvalho y col., 2004) y la peptidasa VvAsp de la uva se relaciona con las respuestas al estrés abiótico (Guo y col., 2013). De esta manera, el análisis filogenético ha permitido incluir a salpichroína en el grupo Ia aunque no ha permitido encontrar su función específica. Para poder asignar la función biológica de la enzima en estudio se deberán realizar estudios adicionales.

130

Estudios Básicos

Figura 22.- Árbol filogenético de APs vegetales que contienen el dominio PSI. Las secuencias obtenidas de las bases de datos fueron alineadas utilizando el algoritmo Clustal W (Thompson y col., 1994) y la búsqueda de homología de secuencias de proteínas se realizó empleando el software

131

Estudios Básicos

GeneDoc editor de la versión 2.6.002 (Nicholas y col., 1997). El análisis filogenético se realizó utilizando el software MEGA versión 5 (Tamura y col., 2011). El árbol filogenético fue inferido por el método de agrupamiento de vecinos (Saitou y Nei 1987) y la robustez de cada nodo se evaluó mediante remuestreo bootstrap (1000 repeticiones) (Felsenstein 1985). Las secuencias de aminoácidos de las APs empleadas en el análisis fueron las reportadas en trabajos previos por otros autores o las obtenidas de la traducción de las secuencias de ADNc reportadas en el NCBI: StAsp (S.tuberosum, AY672651); SlAsp (S. lycopersicum, AAB18280); IbAsp (I. batatas, DQ903691); NaAsp1 a NaAsp4 (N. alata, AB045894, AB045891, AB045892, AB045893); GmAsp1 y GmAsp2 (G. max, AB070857, AB069959); ZmAsp (Z. mays, EU960771); CaAsp (C. arietinum, AB024999); OsAsp1 a OsAsp3 (O. sativa, D32144, NP_001042785, AAS98423); TaAsp1 y TaAsp2 (T. aestivum, AB219968, AB219969); HvAsp (H. vulgare, X56136); FeAsp1 y FeAsp2 (F. esculentum, AY826351, AAV84086); TcAsp1 y TcAsp2 (T. cacao, AJ313384, AJ313385); VvAsp (V. vinifera, EF123256); AtAsp1 a AtAsp3 (A. thaliana, U51036, AAL49856, NP_192355); CcAsp (C. calcitrapa, Y09123); BoAsp (B. oleracea, X77260); BnAsp (B. napus, AAB03108); HaAsp (H. annuus, AB025359); NtAsp (N. tabacum, DQ648018); CpAsp (C. pepo, AB002695); VuAsp (V. unguiculata, U61396) y CysAsp1 a CysAsp5 (C. cardunculus, CAA57510, CAL07969, CAA48939, AJ132884, AJ237674).

Inmovilización de salpichroína

En estudios previos se observó que los extractos crudos presentaban buena estabilidad térmica, sin embargo, cuando se purificaba la enzima se perdía drásticamente esa estabilidad. Con el objetivo de estabilizar a la enzima para poder utilizarla en procesos continuos o en ciclos sucesivos de hidrólisis, se ensayaron diferentes técnicas de inmovilización. La inmovilización de enzimas es una herramienta útil porque presenta una serie de ventajas tecnológicas: las enzimas inmovilizadas forman una fase heterogénea que les permite separarlas fácilmente del medio de reacción, minimizando o eliminando la contaminación del producto. Por otro lado permite el uso repetido de las enzimas y el desarrollo de procesos continuos con todas las ventajas operacionales asociadas, haciendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable (Liese y col., 2000). En los ensayos, se puso en contacto el extracto crudo con los distintos soportes empleados siguiendo el protocolo de inmovilización correspondiente para cada caso. Se estimó el rendimiento de inmovilización evaluando la actividad caseinolítica del sobrenadante en relación a la actividad del extracto crudo. Cuando se produjo la inmovilización de la enzima en el soporte, se evaluó la actividad caseinolítica de los derivados inmovilizados (Tabla 11).

132

Estudios Básicos

Tabla 11- Rendimiento de inmovilización (R %) y actividad caseinolítica de los derivados obtenidos (Ucas %)

Soporte R %a Ucas %b

Glioxil agarosa (pH 10) 0 -

Glioxil agarosa (pH neutro) 0 -

Glutaraldehído-agarosa 61 40

PEI-agarosa 92 95

PEI-agarosa entrecruzado 92 0 con glutaraldehído

aActividad de la solución control – actividad del sobrenadante/ Actividad de la solución control bActividad caseinolítica ensayada con respecto a la cantidad de enzima inmovilizada en cada derivado

El soporte glioxil-agarosa produce la inmovilización a través de las áreas ricas en residuos reactivos de la proteína (grupos ε-amino de los residuos de lisina) los cuales presentan valores altos de pK (10.5-10.8) y son poco reactivos a pH inferior a 9.0. En el ensayo, luego de mantener el extracto crudo en contacto con el soporte a pH 10, se observó una pérdida irreversible de la actividad proteolítica. El empleo de soluciones de pH de valores alcalinos representa una condición de estrés para determinadas enzimas produciendo su inactivación (Mateo y col., 2006). Lamas y col. (2001) observaron que en valores alcalinos de pH, la actividad proteolítica de las cardosinas A y B disminuía debido a cambios en la forma iónica de los residuos aminoacídicos involucrados en el mecanismo de catálisis y a una distorsión de la estructura tridimensional de las enzimas. En los casos en donde trabajar a pH alcalino no es posible, los compuestos con grupos tioles permite la inmovilización de enzimas en soportes de glioxil-agarosa a pH neutro. El ensayo se llevó a cabo en presencia de 50 mM de acetilcisteína en el medio donde se encontraban el extracto crudo y el soporte (Bolívar y col., 2009). Se observó una importante pérdida de la actividad proteolítica probablemente debida a la alteración de la estructura tridimensional de la enzima causada por la presencia del compuesto reductor. Al no poder obtener derivados activos utilizando el soporte glioxil-agarosa tanto a pH alcalino como a pH neutro en presencia de compuestos reductores, se evaluaron otras técnicas de inmovilización.

133

Estudios Básicos

La inmovilización covalente multipuntual a través de la química del glutaraldehído puede lograrse entrecruzando las enzimas previamente adsorbidas a soportes con grupos aminos primarios con glutaraldehído, como ejemplo se puede citar los soportes de Polietilenimina-agarosa o PEI-agarosa (Hwang y col., 2004; D`Souza y Kubal, 2002) o bien empleando soportes preactivados con glutaraldehído (Tukel y Alptekin, 2004; Barros y col., 2003; Dos Reis-Costa y col., 2003; Lamas y col., 2001). Los soportes compuestos por PEI- agarosa son adecuados para alcanzar una inmovilización fuerte y reversible de enzimas sin distorsionar su conformación tridimensional (Mateo y col., 2000). Esto permite mantener la especificidad por su sustrato y una buena actividad catalítica tras el proceso de inmovilización. De esta manera, cuando se empleó el soporte PEI-agarosa se observó que el 92 % de la enzima ofrecida en el extracto crudo fue inmovilizada. Debido a que la estabilidad mecánica de estos inmovilizados no suele ser muy elevada ya que la enzima puede desprenderse parcial o totalmente en determinadas circunstancias, como cambio de pH o de la fuerza iónica del medio (Sheldon, 2007), se realizó el entrecruzamiento del derivado con glutaraldehído. Luego de aplicar esta técnica se observó la pérdida casi completa de la actividad enzimática probablemente causada por la modificación química de la enzima en este proceso (Fernández-Lafuente y col., 1995). Se estudió luego la inmovilización del extracto crudo sobre el soporte glutaraldehído-agarosa 6BCL altamente activado (6% de entrecruzamiento). La gran reactividad de este tipo de soportes permite que a pH neutro, los grupos amino de pK bajo como el amino terminal de la cadena peptídica y posiblemente algún otro que por su disposición en la estructura pudiera ver disminuído su pK, puedan atacar nucleofílicamente dichos grupos del soporte y dar lugar a enlaces irreversibles. Cuando se empleó el soporte glutaraldehído-agarosa, en un medio con baja fuerza iónica, se encontró que el derivado formado presentaba el 61 % de la actividad ofrecida por el extracto crudo (Tabla 11). Este resultado fue similar al reportado para la inmovilización de una mezcla de cardosinas A y B (66.5%) y para cardosina A (35 %) (Barros y col., 2003; Lamas y col., 2001) e inferior al reportado para renina (91%) en el mismo soporte (Penzol, 1996).

Caracterización de los derivados de glutaraldehído-agarosa y PEI-agarosa

De todos los soportes empleados sólo se lograron derivados activos a partir de PEI-agarosa y Glutaraldehído-agarosa. La enzima inmovilizada por adsorción mostró una elevada retención de su actividad caseinolítica (95%), mientras que la enzima inmovilizada en

134

Estudios Básicos

forma covalente solo retuvo el 40% de la actividad. Esto puede deberse a una obstrucción parcial del sitio activo de la enzima, lo cual estaría dificultando el acceso al sustrato, o a una alteración de su conformación. Se evaluó la cinética de la inmovilización a partir del porcentaje de enzima inmovilizada considerando la actividad caseinolítica residual del sobrenadante a distintos tiempos en relación a la actividad del extracto crudo sometido al mismo tratamiento en ausencia del soporte (Figura 23). De esta manera se determinó el curso de la inmovilización de la enzima en cada uno de los soportes mencionados y se observó que la mayor proporción de la enzima activa en el extracto crudo era inmovilizada a la media hora de iniciado el proceso, en ambos casos. Si bien la insolubilización de la enzima fue muy rápida, se decidió mantener la incubación en las mismas condiciones durante 20 horas, ya que en general este procedimiento suele favorecer la multi-interacción enzima-soporte y por lo tanto la estabilidad del derivado.

C o n tr o l 1 0 0 P E I- a g a ro s a

G lu ta r a ld e h íd o - a g a r o s a

)

7 5

%

(

d

a

d

i

v i

t 5 0

c

A

2 5

0 0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0 T ie m p o ( m in )

Figura 23.- Curso de inmovilización de salpichroína en el soporte glutaraldehído-agarosa (en buffer fosfato 100 mM de pH 7.0 y a temperatura ambiente) y en el soporte PEI-agarosa (en buffer fosfatos 50 mM de pH 7.0 y a temperatura ambiente). En el ensayo se realizó un control de la enzima en las mismas condiciones de temperatura y agitación que en presencia de los soportes

Efecto del pH en la actividad enzimática de los derivados

Cuando una enzima se ha inmovilizado en un determinado soporte, ésta se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados. Este efecto, denominado de microentorno, puede producir un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática y muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar (Arroyo, 1998).

135

Estudios Básicos

Para conocer el comportamiento de los derivados obtenidos sobre la hidrólisis de la caseína a distintos valores de pH se realizaron las mediciones de la actividad caseinolítica de cada derivado y de la enzima libre en el rango de pH de 6.0-8.0 (Figura 24).

G lu ta r a ld e h íd o - a g a r o s a

1 0 0 P E I- a g a ro s a

7 5 E n z im a lib re

%

d

a

d i

v

i

t

5 0

c

A

2 5

0 6 .0 6 .5 7 .0 7 .5 8 .0 8 .5 p H

Figura 24.- Actividad enzimática de una solución de la enzima salpichroína purificada y de derivados en soportes glutaraldehído–agarosa y PEI-agarosa a distintos valores de pH.

Se encontró que el derivado inmovilizado en glutaraldehído-agarosa presentaba la mayor actividad caseinolítica y esta actividad enzimática era superior a la de la enzima libre en la mayoría de los valores de pH evaluados. En todos los casos, la mayor actividad caseinolítica se observó a pH 6.0. A pH 7.0, la enzima libre mostró un 30% de su actividad caseinolítica inicial y la enzima inmovilizada en glutaraldehído–agarosa un 70% de la misma actividad. A valores mayores de pH tanto la enzima libre como inmovilizada presentaron una disminución drástica de su actividad, reteniendo menos del 10% de la actividad enzimática inicial. Este hecho puede estar relacionado con el mecanismo catalítico de la enzima, ya que se trata de una aspartil proteasa, la cual requiere un medio ácido para producir la hidrólisis del sustrato.

Estabilidad térmica

En la inmovilización unipuntual la enzima es inmovilizada por un punto de unión al soporte y esto le confiere características estructurales similares a la enzima en solución, pero en la inmovilización multipuntual, es decir a través de varios enlaces con el soporte, la estructura se vuelve más rígida. Las distancias relativas entre todos los residuos involucrados en la inmovilización multipuntual se mantienen inalteradas frente a cualquier cambio

136

Estudios Básicos

conformacional que pudieran inducir los agentes distorsionantes (calor, solventes orgánicos, valores extremos de pH). En consecuencia se reducen los cambios de la estructura tridimensional de la enzima que pudieran producir su inactivación y se incrementa su estabilidad. El estudio de la termoestabilidad se realizó por incubación de los dos derivados y de la enzima libre en el rango de temperaturas de 40° a 50°C (Figuras 25). Se observó la estabilización de la enzima en ambos soportes. Ambos derivados retuvieron su actividad a 40°C (Figura 25A), pero a mayores temperaturas el derivado cuya interacción enzima- soporte era covalente presentó mayor estabilidad que aquel donde la enzima solo estaba adsorbida iónicamente de forma reversible al soporte (Figuras 25B y C). A

E n z im a s o lu b le 4 0 ° C 1 0 0 P E I- a g a ro s a

G lu ta r a ld e h íd o - a g a r o s a

)

7 5

%

(

d

a

d

i

v i

t 5 0

c

A

2 5

0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5

T ie m p o ( m in )

B

E n z im a s o lu b le 4 5 ° C 1 0 0 P E I- a g a ro s a

G lu ta r a ld e h íd o - a g a r o s a

)

7 5

%

(

d

a

d

i

v i

t 5 0

c

A

2 5

0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5

T ie m p o ( m in )

137

Estudios Básicos

C

E n z im a s o lu b le

1 0 0 5 0 ° C P E I- a g a ro s a

G lu ta r a ld e h íd o - a g a r o s a

)

7 5

%

(

d

a

d

i

v i

t 5 0

c

A

2 5

0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5

T ie m p o ( m in )

Figura 25.- Estabilidad térmica de diferentes preparaciones de salpichroína soluble y libre, derivados enzimáticos en glutaraldehído-agarosa y PEI-agarosa. Los cursos de inactivación de enzima soluble e inmovilizada fueron realizados en buffer de fosfatos 50 mM de pH 7.0 y 40°C (A), 45°C (B) y 50°C (C).

Se comparó el grado de estabilización alcanzado por la enzima a 50°C en los soportes empleados aplicando el factor de estabilización (FE). El FE se define como la relación entre el tiempo de vida media de los derivados respecto del correspondiente a la enzima libre. De este modo la enzima inmovilizada en glutaraldehído-agarosa y en PEI-agarosa presentó un FE de 60 y 10 veces mayor que la enzima libre, respectivamente. A partir de estos resultados se puede concluir que la inmovilización de la enzima salpichroína en el soporte glutaraldehído-agarosa permitió incrementar su vida media en un factor seis veces superior al inmovilizado en el soporte PEI-agarosa y 60 veces respecto de la enzima libre (Figura 25 C). En la literatura se encuentran muchos ejemplos de la estabilización alcanzada por la inmovilización de enzimas en diferentes soportes. Mateo y col. (2000) obtuvieron que el factor de estabilización para la lipasa de Cándida rugosa y la oxidasa ácida de Rodhosporidium gracilis inmovilizadas en soportes PEI-agarosa oscilaba en el rango 5-10, similar al resultado obtenido para la inmovilización de salpichroína en el mismo soporte. Se informaron valores en el mismo orden de magnitud para la estabilización de enzimas unidas covalentemente en soportes activados con grupos epóxido, como por ejemplo para las enzima dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides y glutaril-acilasa cuyos valores de FE fueron de 40 y 25, respectivamente (Mateo y col., 2007, Mateo y col., 2003). Por otro lado, en varias investigaciones se informó que la inmovilización covalente multipuntual de

138

Estudios Básicos

enzimas en soportes glioxil-agarosa generaba una elevada estabilización con valores de FE superiores a 103. Como ejemplo se pueden citar a las enzimas Penicilina G acilasa, Tripsina y Quimotrisina (Otero y col., 1988; Guisán y col., 1991; López-Gallego y col., 2005; Marques y col., 2011). En cambio, Goulart y col. (2008) informaron que la invertasa de Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en glutaraldehído-agarosa era más estable que aquella inmovilizada en glioxil-agarosa.

Capacidad de reúso

Una característica importante desde el punto de vista económico, reside en la capacidad de reúso también denominada estabilidad operacional de los derivados enzimáticos porque disminuye los costos de producción debido al reciclado eficiente del catalizador y a un mejor control del proceso. Por esta razón se evaluó la actividad de los derivados PEI-agarosa y glutaraldehído- agarosa sobre caseína en ciclos repetidos de hidrólisis (Figura 26).

G lu ta r a ld e h íd o - a g a r o s a 1 0 0 P E I- A g a ro s a

7 5

%

d

a

d i

v

i

t

5 0

c

A

2 5

0

N ú m e ro d e c ic lo s

Figura 26.- Actividad residual de derivados de glutaraldehído-agarosa y PEI-agarosa luego de distintos ciclos de uso.

En los ensayos se encontró una elevada pérdida de la actividad de la enzima inmovilizada por adsorción en el soporte PEI-agarosa luego de su empleo en ciclos repetidos, reteniendo el 20% de su actividad inicial luego del cuarto reúso. Debido que las

139

Estudios Básicos

fuerzas de unión con dicho soporte son no covalentes, probablemente la enzima se desorbe durante el proceso de hidrólisis y los lavados posteriores, lo cual se ve reflejado como una pérdida de la actividad en el derivado (Rocha y col, 2011). Prasad y Nair (2013) observaron resultados similares cuando evaluaron la posibilidad de reúso de una proteasa neutra de Bacillus sp. inmovilizada en DEAE celulosa. Estos autores reportaron que luego del cuarto reúso el derivado mantenía el 31.6% de su actividad inicial. Por otro lado, la actividad de la enzima salpichroína inmovilizada en glutaraldehído- agarosa fue superior a lo largo de todos los ciclos evaluados, manteniendo el 54 % de su actividad inicial luego del décimo ciclo. Este comportamiento ha sido informado para otras enzimas inmovilizadas por unión covalente a un soporte. Pal y Khanum (2011) encontraron que una xilanasa inmovilizada covalentemente en un soporte de alginato activado con glutaraldehído mantenía más del 85% de su actividad inicial luego del quinto ciclo de uso. Del mismo modo, Silva y col. (2006) informaron que la proteasa comercial Esperasa unida covalentemente al soporte Eupergit S-100 retenía el 72% de su actividad inicial luego de cinco ciclos de uso repetido. Rocha y col. (2011) evaluaron la estabilidad operacional de la tripsina inmovilizada por adsorción y por unión covalente en distintos soportes, luego de cuatro ciclos de uso. Obtuvieron que la mayor pérdida de actividad enzimática se producía en la enzima inmovilizada por adsorción (superior al 50%), mientras que la enzima unida en forma covalente al soporte mantenía cerca del 100% de su actividad inicial. En este trabajo se encontró que la enzima salpichroína inmovilizada en el soporte glutaraldehído-agarosa presentaba las mejores características para su empleo en procesos de hidrólisis. Entre las principales ventajas se pueden mencionar la estabilidad térmica a temperaturas moderadas y la capacidad de reúso, las cuales son características útiles para usos industriales y para su empleo a mayor escala.

140

Estudios Básicos

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Ahmad, Y.; Lamond, A.I. (2014) A perspective on proteomics in cell biology. Trends in Cell Biology, 24( 4):257-264.

An, C.; Takekawa, S.; Okazawa, A.; Fukusaki, E.; Kobayashi, A. (2002) Degradation of a peptide in pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes alata Blanco. Planta, 215:472-477.

Arroyo, M. (1998). Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones. Ars Pharmaceutica, 39(2):23-39.

Arroyo, M. (2008) Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid, España.

Arroyo Sánchez, M. (1995) Tesis Doctoral: Síntesis de ácidos 2-aril-propiónicos homoquirales mediante esterificación enantioselectiva catalizada por lipasas inmovilizadas. Director: José Vicente Sinisterra Gago. Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Facultad de Farmacia Universidad Complutense.

Balcao, V.M.; Mateo, C.; Fernandez- Lafuente, R.; Malcata, F.X.; Guisan, J.M. (2001) Structural and functional stabilization of L-asparaginase via multisubunit immobilization onto highly activated supports. Biotechnology Progress, 17:537-542.

Barros, R.M.; Extremina, C.I.; Gonçalves, I.C.; Braga, B.O.; Balcão, V.M.; Malcata, F.X. (2003) Hydrolysis of α-lactalbumin by cardosin A immobilized on highly activated supports. Enzyme and Microbial Technology, 33(7):908-916.

Benchabane, M.; Goulet, C.; Rivard, D.; Gomord, V.; Faye, L.; Michaud, D. (2008) Preventing unintended proteolysis in plant protein biofactories. Plant Biotechnology Journal, 6: 633-648.

141

Estudios Básicos

Ben-Khaled, H.B.; Ghorbel-Bellaaj, O.; Hmidet, N.; Jellouli, K.; El-Hadj Ali, N.; Ghorbel, S.; Nasri, M. (2011) A novel aspartic protease from the viscera of Sardinelle (Sardinella aurita) Purification and characterization. Food Chemistry, 128:847-853.

Bolivar, J. M., López-Gallego, F., Godoy, C., Rodrigues, D. S., Rodrigues, R. C., Batalla, P., Rocha- Martín, J.; Mateo, C.; Giordano, R.L.C.; Guisán, J. M. (2009). The presence of thiolated compounds allows the immobilization of enzymes on glyoxyl agarose at mild pH values: New strategies of stabilization by multipoint covalent attachment. Enzyme and Microbial Technology, 45(6):477-483.

Boller, T.; Meier, C.; Menzler, S. (2002) Eupergit oxirane acrylic beads: how to make enzymes fit for biocatalysis. Organic Process Research and Development, 6(4):509-519.

Burteau, N.; Burton, S.; Crichton, R.R. (1989) Stabilisation and immobilisation of penicillin amidase. FEBS Letters, 258:185-189.

Carles, C.; Ribadeau-Dumas, B. (1985) Kinetics of the action of chymosin (rennin) on a peptide bond of bovine αs1-casein, comparison of the behavior of this substrate with β-casein and κ-casein. FEBS Letters, 185:282-286.

Chicano Gálvez, E. (2010). Tesis Doctoral: BlaSTorP: herramienta NCBI-BLAST a nivel local. Directores: Antonio Jesús Pérez Pulido y Juan Falgueras Cano. Repositorio abierto. Universidad Internacional de Andalucía.

Cruz de Carvalho, M.H.; d’Arcy-Lameta, A.; Roy-Macauley, H.; Gareil, M.; El Maarouf, H.; Pham-Thi, A.T.; Zuily-Fodil, Y. (2001) Aspartic protease in leaves of common bean (Phaseolus vulgaris L.) and cowpea (Vigna unguiculata L. Walp): enzymatic activity, gene expression and relation to drought susceptibility. FEBS Letters, 492(3):242-246.

Devaraj, K.B.; Lalitha, R.; Gowda, R.; Prakash, V. (2008) An unusual thermostable aspartic protease from the latex of Ficus racemosa (L.). Phytochemistry, 69:647-655.

Dos Reis-Costa, L.; Soares, A.M.; França, S.C.; Trevisan, H.C.; Roberts, T.J. (2003) Immobilization of lipases and assay in continuous fixed bed reactor. Protein and Peptide Letters, 10(6):619-628.

142

Estudios Básicos

D'Souza, S.F.; Kubal, B.S. (2002) A cloth strip bioreactor with immobilized glucoamylase. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 51(2):151-159.

Dunn, B.M.; Jiménez, M.; Parten, B.F.; Valler, M.J.; Rolph, C.E.; Kay, J. (1986) A systematic series of synthetic chromophoric substrates for aspartic proteinases. Biochemical Journal, 237: 899-906.

Eng, J.K.; Fischer, B.; Grossmann, J.; Mac Coss, M. J. (2008) A fast SEQUEST cross correlation algorithm. Journal of Proteome Research, 7(10):4598-4602.

Felsenstein, J. (1985) Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution, 39:783-791.

Fernández-Lafuente, R.; Rosell, C.M.; Rodriguez, V.; Guisan, J.M. (1995). Strategies for enzyme stabilization by intramolecular crosslinking with bifunctional reagents. Enzyme and Microbial Technology, 17(6):517-523.

Fernández-Lafuente, R. (2009). Stabilization of multimeric enzymes: strategies to prevent subunit dissociation. Enzyme and Microbial Technology, 45(6):405-418.

Fernández-Lucas, J.; Fresco-Taboada, A.; Acebal, C.; de la Mata, I.; Arroyo, M. (2011) Enzymatic synthesis of nucleoside analogues using immobilized 2′- deoxyribosyltransferase from Lactobacillus reuteri. Applied Microbiology and Biotechnology, 91(2):317-327.

Foltman, B. (1964) On the amino acid composition of prorennin, rennin and of peptides liberated during the activation of prorennin. C R Travaux Lab Carlsberg, 34:275-286.

Gerhartz, W. (1990) Enzymes in industry. Production and applications. Ed. Síntesis, Madrid.

Goulart, A. J.; Benedetti, A. C. E. P.; Tavano, O. L.; Marques, D. P.; Contiero, J.; Carmona, E. C.; Monti, R. (2008). Multipoint Immobilization of Invertase on Agarose: Stability and Kinetic Properties. Current Trends in Biotechnology and Pharmacy, 2(3):462-470.

143

Estudios Básicos

Guevara, M.G.; Oliva, C.R.; Machinandiarena, M.; Daleo, G.R. (1999) Purification and properties of an aspartic protease from potato tuber that is inhibited by a basic chitinase. Physiology Plantarum, 106:164–169.

Guevara, M.G.; Veríssimo, P.; Pires, E.; Faro, C.; Daleo, G.R. (2004) Potato aspartic proteases: induction, antimicrobial activity and substrate specificity. Journal of Plant Pathology, 86: 233–238.

Guisán, J.M.; Bastida, A.; Cuesta, C.; Fernández-Lafuente, R.; Rosell, C.M. (1991) Inmobilization-stabilization of α-chimotripsin by covalent attachment to aldehyde agarose gels. Biotechnology and Bioengineering, 38:1144-1152.

Guisán, J.M. (2006) Immobilization of enzymes and cells, 22:15-30. Totowa, NJ: Humana Press.

Guisán, J.M. (2012) Purificación e inmovilización de enzimas industriales. En: Monografías de la Real Academia Nacional de Farmacia, Monografía XXXV: Biocatálisis aplicada a la obtención de fármacos y productos de alto valor añadido. Real Academia Nacional De Farmacia, Madrid. España: 105-129.

Guo, R.; Xu, X.; Carole, B.; Li, X.; Gao, M.; Zheng, Y.; Wang, X. (2013) Genome-wide identification, evolutionary and expression analysis of the aspartic protease gene superfamily in grape. BMC Genomics, 14:554 - doi:10.1186/1471-2164-14-554

Gupta, M.N. (1991) Thermostabilization of proteins. Biotechnology and Applied Biochemistry, 14:1-11.

Hormigo, D.; De La Mata, I.; Castillón, M.; Acebal, C.; Arroyo, M. (2009) Kinetic and microstructural characterization of immobilized penicillin acylase from Streptomyces lavendulae on Sepabeads EC-EP. Biocatalysis and Biotransformations, 27(4):271-281.

Hormigo, D.; de la Mata, I.; Acebal, C.; Arroyo, M. (2010). Immobilized aculeacin A acylase from Actinoplanes utahensis: Characterization of a novel biocatalyst. Bioresource Technology, 101(12):4261-4268.

144

Estudios Básicos

Hwang, S.; Lee, K.T.; Park, J.W.; Min, B.R.; Haam, S.; Ahn, I. S.; Jung, J.K. (2004) Stability analysis of Bacillus stearothermophilus L1 lipase immobilized on surface-modified silica gels. Biochemical Engineering Journal, 17(2):85-90.

Illanes, A. (2008). Enzyme Biocatalysis: Principles and Applications. Springer.

Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. (2000) Eupergit® C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 10(1):157-176.

Kervinen, J.; Sarkkinen, P.; Kalkkinen, N.; Mikola, L.; Saarma, M. (1993) Hydrolytic specificity of the barley grain aspartic proteinase. Phytochemistry, 32:799–803.

Kervinen, J.; Törmäkangas, K.; Runeberg-Roos, P.; Guruprasad, K.; Blundell, T.; Teeri, T.H. (1995) Structure and possible function of aspartic proteinases in barley and other plants. Advances in Experimental Medicine and Biology, 362:241–254.

Kervinen, J. (2013) En: Phytepsin. Handbook of Proteolytic Enzymes; Neil D. Rawlings and Guy S. Salvesen, eds.; Academic Press, Oxford; 1:118-124.

Kulkarni, A.; Rao, M. (2007) Biochemical characterization of an aspartic protease from Vigna radiata: Kinetic interactions with the classical inhibitor pepstatin implicating a tight binding mechanism. Biochimica et Biophysica Acta, 1274:619-627.

Kumar, A.; Khan, F.; Rao, M. (2012) Biochemical Characterization of a Novel Aspartic Peptidase from Plutella xylostella, Diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae) Midgut: Inactivation by an Aspartic Peptidase Inhibitor. International Journal of Innovative Biological Research, 1(1):9-19.

Kunamneni, A.; Ghazi, I.; Camarero, S.; Ballesteros, A.; Plou, F.J.; Alcalde, M. (2008) Decolorization of synthetic dyes by laccase immobilized on epoxy-activated carriers. Process Biochemistry, 43(2):169-178.

145

Estudios Básicos

Kwon, K-H.; Kim, J.Y.; Park, G.W.; Yoo, J.S. (2010) Analytical Methods for Proteome Data Obtained from SDS-PAGE Multi-dimensional Separation and Mass Spectrometry. Journal of Agricultural Science and Technology, 1(1):1-14.

Lamas, E.M.; Barros, R.M.; Balcao, V.M.; Malcata, F.X. (2001) Hydrolysis of whey proteins by proteases extracted from Cynara cardunculus and inmobilized onto highly activated supports. Enzyme and Microbial Technology, 28:642-652.

Liese, A.; Seelbach, K.; Wandrey, C. (2000). Industrial Biotransformations. Weinheim: Wiley VCH

López-Gallego, F.; Montes, T.; Fuentes, M.; Alonso, N.; Grazu, V.; Betancor, L; Guisán, J.M.; Fernández-Lafuente, R. (2005). Improved stabilization of chemically aminated enzymes via multipoint covalent attachment on glyoxyl supports. Journal of Biotechnology, 116(1):1-10.

López-Gallego, F. (2007) Tesis Doctoral: Desarrollo de nuevos catalizadores enzimáticos para la producción directa de cefalosporinas semisintéticas a partir de Cefalosporina C. Directores: José Manuel Guisán Seijas, Roberto Fernández-Lafuente. Instituto de Catálisis y Petroleoquímica C.S.I.C., Universidad Autónoma de Madrid.

Lufrano, D.; Faro, R.; Castanheira, P.; Parisi, G.; Verissimo, P.; Vairo-Cavalli, S.; Simöes, I.; Faro, C. (2012) Molecular cloning and characterization of procirsin, an active aspartic protease precursor from Cirsium vulgare (Asteraceae). Phytochemistry, 81:7-18.

Magnan, E.; Catarino, I.; Paolucci-Jeanjean, D.; Preziosi-Belloy, L.; Belleville, M.P. (2004) Immobilization of lipase on a ceramic membrane: activity and stability. Journal of Membrane Science, 241(1):161–166.

Marqués, D.; Pessela, B.C.; Betancor, L.; Monti, R.; Carrascosa, A.V.; Rocha-Martin, J.; Guisán, J.M.; Fernandez-Lorente, G. (2011) Protein hydrolysis by immobilized and stabilized trypsin. Biotechnology Progress, 27(3):677-683.

146

Estudios Básicos

Mateo, C.; Abian, O.; Fernandez-Lafuente, R.; Guisan, J. M. (2000) Reversible enzyme immobilization via a very strong and non-distorting ionic adsorption on supported polyethyleneimine composites. Biotechnology and Bioengineering, 68:98-105.

Mateo, C.; Abian, O.; Fernández-Lorente, G.; Pedroche, J.; Fernández-Lafuente, R.; Guisan, J.M. (2002) Epoxy Sepabeads: a novel epoxy support for stabilization of industrial enzymes via very intense multipoint covalent attachment. Biotechnology Progress, 18(3): 629- 634.

Mateo, C.; Torres, R.; Fernández-Lorente, G.; Ortiz, C.; Fuentes, M.; Hidalgo, A.; López- Gallego, F.; Abian, O.; Palomo, J.M.; Betancor, L.; Pessela, B.C.C.; Guisán, J.M.; Fernández- Lafuente, R. (2003) Epoxy-amino groups: a new tool for improved immobilization of proteins by the epoxy method. Biomacromolecules, 4(3):772-777.

Mateo, C.; Palomo, J. M.; Fuentes, M.; Betancor, L.; Grazu, V.; López-Gallego, F.; Pessela, B.C.C.; Hidalgo, A.; Fernández-Lorente, G.; Fernández.Lafuente, R.; Guisán, J. M. (2006). Glyoxyl agarose: a fully inert and hydrophilic support for immobilization and high stabilization of proteins. Enzyme and Microbial Technology, 39(2):274-280.

Mateo C.; Palomo J.M.; Fernandez-Lorente G.; Guisán J.M.; Fernández-Lafuente R. (2007) Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme and Microbial Technology, 40:1451-1463.

Maurer, K.H. (2004). Detergent proteases. Current Opinion Biotechnology, 15(4):330-334.

Mc Lafferty, F.W. (1981). Tandem mass spectrometry. Science, 214(4518):280-287.

Michaud, D.; Asselin, A. (1995) Application to plant proteins of gel electrophoretic methods. Journal of Chromatography A, 698: 263-279.

Mielgo, I.; Palma, C.; Guisán, J. M.; Fernández-Lafuente, R.; Moreira, M. T.; Feijoo, G.; Lema, J. M. (2003) Covalent immobilisation of manganese peroxidases (MnP) from Phanerochaete chrysosporium and Bjerkandera sp. BOS55. Enzyme and Microbial Technology, 32:769-775.

147

Estudios Básicos

Mutlu A.; Gal S. (1999) Plant aspartic proteinases: enzymes on the way to a function. Physiologia Plantarum, 105(3): 569-576.

Nicholas, K.B.; Nicholas Jr, H.B.; Deerfield, D.W. (1997) GeneDoc: analysis and visualization of genetic variation. EMBNEW.NEWS, 4-14.

Otero, C.; Ballesteros, A.; Guisán, J. M. (1988). Immobilization/stabilization of lipase from Candida rugosa. Applied Biochemistry and Biotechnology, 19(2): 163-175.

Pal, A.; Khanum, F. (2011) Covalent immobilization of xylanase on glutaraldehyde activated alginate beads using response surface methodology: Characterization of immobilized enzyme. Process Biochemistry, 46(6):1315-1322.

Penzol Alonso, G. (1996) Tesis Doctoral: Diseño de herramientas bioquímicas para la ingeniería molecular de derivados inmovilizados de Renina y Beta-Galactosidasa. Director: José Manuel Guisan Seijas. Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Farmacia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II. Prasad, R.; Jayakumaran Nair, A. (2013) Immobilization of Bacillus sp. Protease on different matrices and its enzymatic characterization. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 4(4):(B)155–161.

Rawlings, N.D.; Barrett, A.J.; Bateman, A. (2011) Asparagine peptide lyases. A seventh catalytic type of proteolytic enzymes. Journal of Biological Chemistry, 286(44):38321– 38328.

Rocha, G.; Fernández, G.; Parisi, M. (2010) Estudios de caracterización cinética y fisicoquímica de una proteinasa aspártica aislada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia. Información Tecnológica, 21(2):21-28.

Rocha, G.; Fernández, G.; Rosso, A., Parisi, M. (2011) Biochemical studies of an aspartic peptidase isolated from Salpichroa origanifolia fruits. Memorias del VIII Congreso de Biotecnología Vegetal, Bioveg 2011. Cayo Coco, Cuba.

Rodrigo, I.; Vera, P.; van Loon, L.C.; Conejero, V. (1991) Degradation of tobacco pathogenesis-related proteins in plants. Plant Physiology, 95: 616-622.

148

Estudios Básicos

Rodrigo, I.; Vera, P.; Conejero, V. (1989) Degradation of tomato pathogenesis-related proteins by an endogenous 37-kDa aspartyl endoproteinase. European Journal of Biochemistry, 184(3):663-669.

Rodrigues, R.C.; Berenguer-Murcia, A.; Fernandez-Lafuente, R. (2011) Coupling chemical modification and immobilization to improve the catalytic performance of enzymes. Advanced Synthesis Catalysis, 353(13):2216-2238.

Saitou, N.; Nei, M. (1987) The Neighbor-Joining Method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology Evolution, 4: 406-425.

Sanger, F.; Tuppy, H. (1981) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin: II. The investigation of peptides from enzymatic hydrolyzate. Biochemical Journal, 49:481-490.

Santagapita, P.R. (2010) Tesis Doctoral: Estabilidad de enzimas en medios de distinta movilidad molecular. Impacto de interacciones con azúcares y biopolímeros y de la encapsulación. Director: Buera, M.P. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Sarmento, A.C.; Lopes, H.; Oliveira, C.; Vitorino, R.; Samyn, B.; Sergeant, K.; Debyser, G.; Beeumen, J.; Domingues, P.; Amado, F.; Pires, E.; Domingues, M.R.M.; Barros, M.T. (2009) Multiplicity of aspartic proteinases from Cynara cardunculus L. Planta, 230:429-439.

Sheldon, R.A. (2007) Enzyme Immobilization: The Quest for Optimum Performance. Advanced Synthesis Catalysis, 349:1289–1307.

Sidrach, L;. Garcia-Cánovas, F.; Tudela, J.; Rodriguez-López, J.N. (2005) Purification of cynarases from artichoke (Cynara scolymus L.): enzymatic properties of cynarase A. Phytochemistry, 66:41-49.

149

Estudios Básicos

Silva, C.; Zhangb, Q.; Shenb, J.; Cavaco-Paulo, A .(2006) Immobilization of proteases with a water soluble–insoluble reversible polymer for treatment of wool. Enzyme and Microbial Technology, 39: 634–640.

Tamura, K.; Peterson, D.; Peterson, N.; Stecher, G.; Nei, M.; Kumar, S. (2011) MEGA 5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology Evolution, 28:2731- 2739.

Tamura, T.; Terauchi., K.; Kiyosaki, T.; Asakura, T.; Funaki, J.; Matsumoto, L.; Misaka, T.; Abe, K. (2007) Differential expression of wheat aspartic proteinases, WAP1 and WAP2, in germinating and maturing seeds. Journal of Plant Physiology, 164:470-477.

Terauchi, K.; Asakura, T.; Nishizawa, N.K.; Matsumoto, I.; Abe, K. (2004) Characterization of the genes for two soybean aspartic proteinases and analysis of their different tissue- dependent expression. Planta, 218:947-957.

Timotijević, G.S.; Milisavljević, M.D.; Radović, S.R.; Konstantinović, M.M.; Maksimović, V.R. (2010) Seed-specific aspartic proteinase feap12 from buckwheat (Fagopyrum esculentum moench). Archives of Biological Science, 62:143-151.

Thompson, J.D.; Higgins, D.G.; Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position- specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22(22):4673– 4680.

Torres, R.; Mateo, C.; Fuentes, M.; Palomo, J.M.; Ortiz, C.; Fernández-Lafuente, R.; Guisan, J. M. (2002) Reversible immobilization of invertase on Sepabeads coated with polyethyleneimine: Optimization of the biocatalyst's stability. Biotechnology Progress, 18(6):1221-1226.

Torres, R.; Pessela, B.C.; Mateo, C.; Ortiz, C.; Fuentes, M.; Guisan, J.M.; Fernández-Lafuente, R. (2004) Reversible immobilization of glucoamylase by ionic adsorption on sepabeads coated with polyethyleneimine. Biotechnology Progress, 20(4):1297-1300.

150

Estudios Básicos

Tukel, S.S.; Alptekin, O. (2004) Immobilization and kinetics of catalase onto magnesium silicate. Process Biochemistry, 39(12):2149-2155.

Verissimo, P.; Esteves, C.; Faro, C.; Pires, E. (1995) The vegetable rennet of Cynara cardunculus L. contains two proteinases with chymosin and pepsin-like specificities. Biotechnology Letters, 17:621–626.

Veríssimo, P.; Faro, C.; Moir, A. J.; Lin, Y.; Tang, J.; Pires, E. (1996). Purification, characterization and partial amino acid sequencing of two new aspartic proteinases from fresh flowers of Cynara cardunculus L. European Journal of Biochemistry, 235(3):762-768.

Wilimowska-Pelc, A.; Polanowski, A.; Kolaczkowska, M.K.; Wieczorek, M.; Wilusz, T. (1983) Aspartyl proteinase from cucumber (Cucumis sativus) seeds. Preparation and characteristics. Acta Biochimica Polonica, 30(1):23-31.

Yamauchi., Y.; Sugimoto, T.; Sueyoshi, K.; Oji,. Y. (1996) Emergence of proteases in germinating cucumber cotyledons and their roles in the two-step degradation of storage protein. Plant Cell Physiology, 37:279–284.

Zhou, Q.Z.K.; Chen. X.D. (2001) Immobilization of [beta]-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde. Journal of Food Engineering, 48:69-74.

151

Capítulo II: Estudios Aplicados

 Actividad coagulante  Actividad hidrolítica  Actividad antimicrobiana

Estudios Aplicados

CAPÍTULO II: ESTUDIOS APLICADOS

INTRODUCCIÓN AL CAPÍTULO II

En la introducción general se mencionaron las aplicaciones más relevantes que tienen las peptidasas en los procesos industriales. En este capítulo se desarrollan aquellas aplicaciones que fueron estudiadas en este trabajo de tesis: ensayos de coagulación de la leche, hidrólisis de las proteínas lácteas y actividad antimicrobiana de la enzima en estudio.

COAGULACIÓN DE LA LECHE

Desde la antigüedad, se emplearon el cuajo y los coagulantes como enzimas proteolíticas en la industria quesera. Los primeros indicios de la elaboración de quesos provienen de las pinturas de arte rupestre de las cavas hace unos 5000 años antes de Cristo (Szecsi, 1992). Se cree que la elaboración de quesos surgió por accidente, en pobladores nómades que viajaban en días calurosos manteniendo la leche en sacos fabricados con estómagos de rumiantes. La compañía Chr. Hansen de Dinamarca fue la primera en introducir el cuajo bovino estandarizado en 1874. Originalmente se emplearon las enzimas extraídas de los rumiantes jóvenes, las que luego fueron caracterizadas. Deschamps, en 1840, utilizó el nombre quimosina (Chymosin), derivado de la palabra griega Chyme que significa líquido gástrico, para nombrar a la principal enzima extraída del cuarto estómago de los terneros, con capacidad coagulante de la leche. En 1890 los países de habla inglesa adoptaron el término renina derivado de la palabra rennet que significa cuajo, y más tarde este concepto se trasladó a la nomenclatura internacional (Foltmann, 1966). Debido a la confusión generada, en 1992 la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB) dispuso nuevamente denominar quimosina a la principal enzima extraída del estómago de los rumiantes jóvenes, que posee propiedades coagulantes de la leche. Para mantener uniformidad y claridad de criterios, la International Dairy Federation (IDF) propuso que el nombre cuajo o rennet se reserve para la preparación de enzimas de estómagos de rumiantes, mientras que las enzimas coagulantes de la leche extraídas de otros orígenes se denominen coagulantes. La Quimosina bovina se produce de forma recombinante en Escherichia coli, Aspergillus niger y Kluyveromyces lactis como recurso alternativo. Se la

Estudios Aplicados

denomina “quimosina producida por fermentación” o su sigla en inglés FPC. El FPC ofrece varias ventajas a los productores de queso en comparación con el cuajo animal o microbiano, como mayor rendimiento de producción, mejor textura de la cuajada y reducción de sabores amargos. En general, las enzimas activas contenidas en los cuajos y coagulantes empleados para la elaboración de quesos a escala industrial pertenecen al grupo de las aspartil peptidasas, EC 3.4.23 (IUBMB, 1992) y pueden categorizarse de acuerdo a su origen (Tabla 1).

Tabla 1.- Cuajos y coagulantes de uso común en la industria quesera

Origen Fuente Ejemplos Enzima activa

Quimosina A y B, Estómago bovino Cuajo de ternero y bovino pepsina A y gastricina

Estómago ovino Cuajo de cordero u oveja Quimosina y pepsina Animal Estómago caprino Cuajo de cabrito o cabra Quimosina y pepsina Pepsina A y B y Estómago porcino Cuajo porcino gastricina Rhizomucor miehei Hannilase® AP de R. miehei Rhizomucor pusillus Coagulante pusillus AP de R. pusillus Microbiano Cryphonectria Coagulante de parasítica AP de C. parasítica parasítica Aspergillus niger FPC (Chymax®) Quimosina B GMO Kluyveromyces - Quimosina B lactis Ciprosina 1, 2 y 3 y/o Vegetal Cynara cardunculus Cardo cardosina A y B

Si bien la mayoría de las enzimas utilizadas en quesería han sido extractos de estómagos de rumiantes, se han empleado también los extractos microbianos y vegetales para tal fin. La primera referencia donde se hace alusión al empleo de los extractos vegetales se atribuye a Lucius Junius Columella en su tratado De Re Rustica (c. 50 a.C.): “…aunque puede ser cuajado con la flor del cardo silvestre o las semillas del girasol e igualmente con el líquido que fluye de la higuera” (Robinson y Wilber, 1998). Los coagulantes deben cumplir con determinados requisitos, como poseer un elevado grado de especificidad y baja actividad proteolítica, elevada estabilidad en los

Estudios Aplicados

valores de pH de elaboración del queso, baja estabilidad térmica durante el tratamiento del lactosuero, no reducir el rendimiento quesero ni producir sabores amargos o indeseables ni defectos de cuerpo y ser estable durante su almacenamiento y fácil de usar en la planta productora (Shah y col., 2014; Jacob y col., 2011). Muchas de las enzimas vegetales con actividad coagulante poseen elevada actividad proteolítica y en consecuencia producen sabores amargos, defectos de textura y tendencia a la contaminación. Los coagulantes obtenidos a partir de Cynara spp son la excepción y se destacan dado que son utilizados desde hace más de 2000 años en la zona sur de Europa para la elaboración de quesos de cabra y oveja (Tejada y col, 2008; Esteves y col., 2002; Fox, 1993). Actualmente el empleo de Cynara spp. está restringido a la producción de quesos artesanales en Portugal, protegidos por la Unión Europea bajo el rótulo Designación de Origen Protegida (EEC, 1996). De esta manera, se elaboran los quesos Queijo de Azeitao, Queijo de Evora y Queijo Serra da Estrela en Portugal y el Queso de Flor, las tortas de La Serena y del Casar en España. En los últimos años se ha avanzado en el estudio de la actividad coagulante de algunas plantas de la familia Solanaceae, para la elaboración de quesos artesanales. Entre ellas podemos mencionar las APs de Solanum ealegantifolium, Solanum torvum y Solanum dubium. En Sudán se utilizan los frutos de Solanum dubium para obtener quesos crema a partir de leches de cabra y oveja (Yousif y col., 1996) y en México los frutos de Solanum ealegantifolium para la elaboración de queso asadero tipo filata (Martinez-Ruiz y col., 2013, Néstor y col., 2012; Martinez-Ruiz y col., 2008). Guiama y col. (2010) estudiaron la actividad coagulante de los extractos de frutos de 9 plantas de la familia Solanaceae utilizadas en la medicina popular o como alimentos. Observaron que los extractos de S. aethiopicum presentaban la mayor actividad coagulante y menor actividad proteolítica.

Fracciones caseínicas de la leche bovina

La leche bovina contiene dos diferentes grupos de proteínas, la caseína y las proteínas séricas, en una relación aproximada 4:1. La caseína está compuesta principalmente por cuatro cadenas polipeptídicas, αs1-, αs2-, β- y κ- caseína, y polipéptidos de menor tamaño procedentes de la hidrólisis de las caseínas por las enzimas endógenas de la leche. Todas las caseínas son fosforiladas y están ligadas al calcio. La αs1-, αs2- y β-caseína están fuertemente ligadas a los iones de calcio, mientras que la κ- caseína fija calcio débilmente. Además la κ-caseína es de naturaleza glicoproteica ya que se encuentra unida a diferentes

Estudios Aplicados

azúcares, como N-acetil-galactosamina, galactosa y ácido N-acetil-neuramínico. Aproximadamente el 95 % de las caseínas se encuentran formando micelas, constituidas por un 94 % de proteínas y 6 % de sales, principalmente calcio y fósforo, refiriéndose a ellas como fosfato de calcio coloidal, con algunas trazas de magnesio y citrato (Figura 1). La estructura micelar está formada por submicelas unidas por puentes de fosfato de calcio coloidal, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. El residuo N-terminal de la κ- caseína es hidrofóbico y se encuentra unido al cuerpo de la micela, mientras que el dominio C-terminal se mantiene en la superficie. Las cadenas de Κ-caseína en la superficie de la micela le confieren el aspecto velloso y otorgan un elevado potencial eléctrico negativo, lo cual sumado a la intensa hidratación otorgan estabilidad a la solución coloidal (Dalgleish y Corredig, 2012; Schmidt, 1982).

Figura 1.- Representación esquemática de la micela caseínica

Etapas de la coagulación de la leche

La coagulación enzimática de la leche es la primera etapa en la elaboración de quesos que afecta directamente la calidad del producto final (Harboe, 2010).

El proceso de coagulación de la leche ocurre en dos fases. Durante la primera fase la

κ-caseína es hidrolizada en el enlace Phe105 - Met106, generándose dos cadenas residuales de la fracción caseínica: la fracción 1-105 denominada para-κ-caseína, la cual se mantiene

Estudios Aplicados

unida a la micela y por lo tanto permanece insoluble, y la fracción 106-169 denominada glicomacropéptido o caseinomacropéptido (CMP), que es eliminada de ésta (Figura 2).

1ra

F A S E

2da

F A

S E

Figura 2.- Primera y segunda fase del proceso de coagulación enzimática de la leche

Una vez liberadas las cargas negativas de la fracción hidrofílica de la κ-caseína (CMP) y reducido el potencial eléctrico de la superficie de la micela, disminuye la repulsión intermicelar y por lo tanto disminuye también su estabilidad. Cuando el 80-85 % de la κ- caseína situada en la superficie de la micela ha sido hidrolizada la caseína comienza a agregarse y flocular bajo la influencia de los iones de calcio. De esta manera comienza a formarse el gel con el desarrollo de una red tridimensional, producto de la agregación de las micelas caseínicas, dando formación al coágulo y reteniendo la grasa (Jacob y col., 2011). Esto corresponde a la fase secundaria no enzimática del proceso de coagulación. De esta manera la leche queda separada en cuajada y suero. Para establecer el punto de gelificación de la leche durante la coagulación enzimática, tradicionalmente se recurre a la determinación del tiempo de coagulación (TC). El más común de todos los métodos propuestos se basa en la observación visual de los primeros flóculos de caseína adheridos a la pared de vidrio de una botella (Sommer y Matsen, 1935) o de un tubo de ensayo (Berridge, 1952). Por su sencillez y exactitud, el

Estudios Aplicados

tiempo de coagulación propuesto por Berridge (TCB) se ha venido utilizando habitualmente como método de referencia para la medida de la actividad de las enzimas coagulantes (norma FIL/IDF 110A:1987). Posteriormente ha servido de base para elaborar otras técnicas más específicas y complejas, pero que siguen empleando TCB para estimar el punto de gelificación (Benlounissi y col., 2014; Zerrin, 2013; Castillo y col., 2003). Merin y col. (1989) consideran que el TCB es el tiempo de latencia que separa la adición de la enzima y la formación de flóculos aparentes de caseína. Según McMahon y col. (1984), se corresponde con la suma del tiempo mínimo empleado por la enzima para hidrolizar el porcentaje de caseína, capaz de desencadenar la reacción de agregación, y del tiempo necesario para que dicha reacción avance hasta ser captada por el ojo humano. En definitiva, TCB es una estimación del tiempo transcurrido hasta el “punto de gelificación teórico” definido por McMahon (1984) como el preciso momento en el que la leche deja de comportarse como un líquido y por Ross-Murphy (1995) como la transición entre el estado sol, donde el peso molecular medio de la molécula gelificante (Mw) es finito, hasta el estado gel que supone un valor infinito de Mw.

La especificidad de la quimosina por el enlace Phe105 – Met106 ha sido objeto de muchas investigaciones (Shah y col., 2014; Jacob y col., 2011; Gustchina y col., 1996; Drohse y Foltmann, 1989). Visser y col. (1980) reportaron la importancia de la secuencia His98-

Lys111 en la κ-caseína para que se produzca la interacción de la enzima con el sustrato. La enzima reconoce específicamente la secuencia desde His98 a Lys111 y escinde el enlace peptídico entre Phe105 y Met106 en la cadena proteica (Figura 3).

Figura 3.- Modelo de la escisión del enlace Phe105-Met106 de la κ-caseína

Como se mencionó, durante la etapa enzimática los cuajos y sustitutos deben hidrolizar a la κ-caseína en el enlace Phe105-Met106, pero debido a que los coagulantes

Estudios Aplicados

vegetales estudiados hasta el momento presentan mayor actividad proteolítica sobre las fracciones αs- y β- de la caseína, las características de agregación de las micelas son diferentes de las hidrolizadas por la quimosina. Estos aspectos disminuyen el rendimiento del queso, afectan la maduración del producto y modifican las características sensoriales y es por ese motivo que continúa la búsqueda de coagulantes de origen vegetal que cubran la demanda mundial de diversos tipos de quesos de alta calidad (Hashim y col., 2011; Jacob y col., 2011).

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS DE INTERÉS PARA LA INDUSTRIA ALIMENTICIA

En los últimos años, las preferencias de los consumidores se han inclinado hacia los alimentos con bajo grado de procesamiento. Esto está relacionado con un cambio de criterios en la población, cobrando importancia la relación de la alimentación con la salud, lo cual ha incrementado la demanda de los ingredientes alimentarios funcionales, nutracéuticos y suplementos dietarios de origen natural. Por tal motivo, en los últimos años la investigación se ha orientado hacia la búsqueda de compuestos de origen natural que cumplan las funciones de sus contrapartes sintéticas.

Siguiendo esta línea, los hidrolizados de proteínas presentan un amplio rango de aplicaciones en la industria de los alimentos, farmacéutica y cosmética, microbiológica y clínica, entre otras, debido a sus propiedades nutricionales o funcionales (Pasupuleti y Braun, 2010; Adler Nissen, 1986). En relación a los alimentos, se los utiliza para modificar sus propiedades funcionales (solubilidad, adsorción, poder emulsificante y espumante), como suplemento en determinados alimentos y como fuente de nitrógeno en la preparación de dietas enterales para lactantes y adultos enfermos (Tavano, 2013; Alashi y col., 2013; Pires y Batista, 2013; Foegeding y Davies, 2011; Neklyudov y col., 2000). Estas dietas entéricas se diseñan para ser absorbidas en el intestino sin una digestión previa en el estómago y son esenciales en el tratamiento de pacientes con desórdenes estomacales o problemas de la mucosa intestinal, así como en lactantes con síndrome de malabsorción- malnutrición, con cuadros alergénicos en la mayoría de los casos (Cai y col., 2013). En un trabajo reciente, Pexe-Machado y col. (2013) informaron que la ingestión de una bebida que contenía un 11% de hidrolizados de proteínas de guisantes en pacientes sometidos a una cirugía mayor, había disminuido la respuesta inflamatoria y reducido el tiempo de estancia post-operatoria.

Estudios Aplicados

El tipo y grado de hidrólisis (GH%) de una proteína determinan las propiedades del hidrolizado y a su vez condicionan la aplicabilidad del mismo. El GH% se define como el porcentaje de enlaces peptídicos escindidos en relación a la proteína original. La hidrólisis del enlace peptídico produce cambios fundamentales que influyen en la modificación de las propiedades de la proteína original. Se incrementa el número de grupos ionizados (NH4+ y COO-) y en consecuencia disminuye la hidrofobicidad y aumenta la carga total de la molécula. Esto provoca la disminución en el tamaño de las cadenas proteicas y ocasiona una disminución de la alergenicidad (Tavano, 2013).

El GH% final está determinado por las condiciones utilizadas, siendo estas la concentración de sustrato, la relación enzima/sustrato, el tiempo de incubación y las condiciones fisicoquímicas tales como el pH y la temperatura. Otro factor que determina el GH% es la naturaleza de la enzima, caracterizada por su especificidad de hidrólisis. Así, la naturaleza de la enzima no solo influye en el GH, sino también en el tipo de péptidos producidos (Amiza y col., 2012).

Los hidrolizados que se producen para ser usados en alimentación se pueden agrupar en hidrolizados con bajo grado de hidrólisis (entre el 1% y el 10%) los cuales se utilizan para mejorar las propiedades funcionales; hidrolizados con grados de hidrólisis variable para su uso como saborizantes y por último hidrolizados extensivos con grado de hidrólisis superior al 10%, para su uso en alimentación especializada (Benítez y col., 2008, Neklyudov y col., 2000).

Sustratos proteicos

La fuente proteica y enzimática que se utilice en el proceso de hidrólisis define el uso final que vaya a tener el hidrolizado y el valor añadido conseguido con respecto al sustrato de partida.

La ovoalbúmina es una proteína valiosa funcionalmente (Miguel y col., 2004; Davalos y col., 2004), aunque su hidrólisis se ve dificultada por la presencia de inhibidores enzimáticos. Por este motivo, es necesario realizar un pretratamiento térmico y enzimático con pancreatina o por sonicación que permita obtener hidrolizados solubles y de buen sabor (Knežević-Jugović y col., 2012; You y Wu, 2011).

Estudios Aplicados

Los hidrolizados de colágeno son muy utilizados debido a la propiedad de formar geles transparentes (Langmaier y col. ,2008; Adler-Nissen y Olsen, 1979). Por otro lado, la hidrólisis limitada mejora la capacidad emulsificante de las proteínas de carne (Smith y Brekke, 1984). Su tratamiento es más extenso y genera hidrolizados solubles y carentes de amargor. La sangre procedente de los mataderos es una fuente muy utilizada de proteína alimentaria y el suero obtenido por centrifugación presenta propiedades emulsificantes y termocoagulantes (Ofori y Hsieh, 2012).

Dentro de las proteínas de cereales, el gluten de trigo se destaca por sus propiedades viscoelásticas. La hidrólisis parcial del gluten mejora la capacidad emulsificante. Las proteínas del maíz son también un subproducto interesante para la producción de péptidos (Joyce y McClements, 2014).

Las proteínas de pescado cobraron interés en los años 60, manteniéndose desde entonces. El mayor inconveniente que se produce en la preparación de productos funcionales está relacionado con los sabores que se generan, aunque este inconveniente puede solucionarse empleando enzimas comerciales. Son ampliamente utilizadas como fuente de nitrógeno para alimentación animal (Pires y Batista, 2013; Mackie, 1982).

Los hidrolizados de proteínas de soja y de proteínas lácteas son empleados en alimentación humana debido a su alto valor biológico. De las proteínas lácteas, los hidrolizados del lactosuero son la materia prima ideal para alimentación infantil y dietas enterales, ya que en general poseen un elevado valor nutritivo, bajo amargor y baja alergenicidad (Soo y col., 2013; Sun, 2011; Guadix y col., 2000).

En los últimos años han ganado importancia los hidrolizados obtenidos a partir de los desechos que dejan la industria láctea y cárnica principalmente ya que pueden llegar a tener un contenido proteico del 50%. Los conceptos de ecología industrial y economía circular se consideran el principio de liderazgo para la innovación ecológica, cuyo principal objetivo es "basura cero", donde los residuos se utilizan como materia prima para nuevos productos y aplicaciones. La gran cantidad de residuos producidos por la industria de alimentos, además de ser una pérdida de materiales valiosos, plantea serios problemas de gestión tanto desde el punto de vista económico como ambiental. Muchos de estos residuos, sin embargo, tienen el potencial para ser reutilizados en otros sistemas de producción, como por ejemplo en los sectores de las industrias nutracéuticas y farmacéuticas (Mirabella y col., 2014).

Estudios Aplicados

Las proteínas lácteas

El contenido de caseína en la leche de vaca y de cabra representa entre el 79- 83% de las proteínas totales (Tabla 2). En cambio, la leche de oveja presenta el mayor porcentaje de caseína, lo cual explica mayor rendimiento en la elaboración de quesos de leche ovina (Wolker Fava, 2012; Assenat, 1985). La proporción de las fracciones caseínicas es diferente en cada tipo de leche (Hinz y col., 2012; Ono y co., 1989; Assenat, 1985). Esta variación depende de factores individuales y raciales como también de la fase de lactación de las hembras. En general, en las leches de cabra y oveja la proporción de αs-caseína es menor respecto del contenido de caseína total y esto es debido a que las αs-caseína son más susceptibles a la hidrólisis por el cuajo que la β-caseína. Esta es la razón por la cual no se producen sabores amargos en los quesos madurados de estas leches (Wolker Fava, 2012; Assenat, 1985).

Tabla 2.- Contenido de caseínas de las leches de vaca, cabra y oveja.

Componente Vaca Cabra Oveja

% Caseína en la leche 2.6 2.3 4.5

% Caseína respecto de proteína total 79.5 82.7 82.4

% Caseína respecto de caseína total

αs -caseína 45.5 12.6 30.2

β-caseína 33.0 75.3 47.1

κ-caseína 6.8 3.9 15.4

Por otro lado, Masoodi y Shafi (2010) compararon las secuencias de las fracciones αs1- y αs2 de las caseínas de cabra, oveja y vaca y observaron que las caseínas caprina y ovina presentaban un 99% de similitud entre sí pero ambas diferían significativamente de las caseínas bovinas.

En la leche de vaca la fracción proteica se encuentra en una concentración de 30-35 g.L-1, donde las proteínas mayoritarias son las caseínas y las proteínas del lactosuero (Tabla 3).

Estudios Aplicados

Tabla 3.- Distribución de proteínas de la leche bovina

Contenido en leche Punto Peso molecular Proteína entera (g/l) isoeléctrico (kDa)

Proteínas totales 36.0

Caseínas totales 28.3 αs1-caseína 11.9 4.1 23.0-27.0 αs2-caseína 3.1 4.1 23.0 β-caseína 9.8 4.5 24.0 κ-caseína 3.5 4.1 19.0

Proteínas de lactosuero 6.3 α-La 1.2 4.2-4.5 14.4 β-Lg 3.2 5.3 39.0 Seroalbúmina 0.4 4.7 69.0 Inmunoglobulina 0.8 5.6-6.0 150.0-1000.0

Proteosas-peptonas 1.0 3.3.-3.7 4.1-20.0

Como se mencionó anteriormente, las caseínas incluyen cuatro tipos de cadenas polipeptídicas: αs1-, αs2-, β- y κ-caseína, las cuales permanecen insolubles a pH 4.6 y 20°C. Presentan una compleja estructura primaria que difiere de otras proteínas por su elevado contenido de prolina y por la presencia de regiones ácidas con residuos de fosfoserina. Su estructura secundaria es poco organizada y es similar a la estructura de las proteínas globulares desnaturalizadas (Dalgleish, 2011; Walstra y Jennes, 1987).

Las proteínas del lactosuero son aquellas que permanecen solubles a pH 4,6 y 20°C. Las proteínas séricas mayoritarias son la α-Lactoalbúmina (α-La), β-lactoglobulina (β-Lg), seroalbúmina (BSA) e inmunoglobulinas (Ig). Su concentración diefiere de unas especies a otras, siendo mayor en la leche de oveja y similar en leche de vaca y cabra. Las proteínas minoritarias incluyen la lactoferrina (Lf) y distintas enzimas como la plasmina y la lactoperoxidasa (Hinz y col., 2012; Walstra y Jenness, 1984).

El lactosuero es el producto secundario de la industria láctea y constituye uno de los desechos más contaminantes de la industria en general. Webb y Whittier (1970) determinaron que 100 kg de lactosuero proveniente de la elaboración de quesos contenía

162

Estudios Aplicados

un poder contaminante equivalente a las aguas residuales producidas por 45 personas. En el siglo XX comenzaron a establecerse regulaciones que impidieron su descarte sin tratamiento. Los avances tecnológicos permitieron explotar los conocimientos acerca del valor nutritivo y funcional de las proteínas del lactosuero, desarrollando métodos avanzados para lograr su procesamiento. Estos avances han continuado a través del siglo XXI con el foco más en la funcionalidad biológica de sus componentes (Smithers, 2008). La rentabilidad ha sido un factor determinante en el desarrollo del procesamiento del suero de leche ya que debido al cambio de la perspectiva original que se tenía del mismo ha pasado de considerarse un descarte a materia prima para la obtención de otros productos de interés en las distintas industrias. Actualmente, cerca de la mitad del lactosuero obtenido no produce contaminación porque es utilizado como materia prima de otro proceso. Sin embargo, la producción anual de queso a nivel mundial es cada vez mayor, con el consiguiente aumento de la obtención de lactosuero. Por lo tanto continúa la búsqueda de nuevas aplicaciones empleando la biotecnología con el fin de conseguir la plena utilización del suero de leche producido (Mirabella y col., 2014; Illanes, 2011; Gonzalez Siso, 1996).

Las proteínas del lactosuero son consideradas superiores a las caseínas porque presentan un perfil aminoacídico de mayor valor biológico que la caseína y similar al de la leche humana, motivo por el cual es utilizado en la elaboración de leches maternizadas como sustituto de la leche bovina (Hambraeus, 1982). Es así que las caseínas y proteínas del lactosuero son consideradas como una completa fuente de aminoácidos. Por otro lado, los péptidos obtenidos por hidrólisis de las caseínas han sido extensamente estudiados debido a que fueron demostrados los efectos benéficos que producía su consumo, en la promoción de la salud y en la prevención de enfermedades (Power y col., 2013; Correa y col., 2011).

Péptidos bioactivos

En 1979 se describió por primera vez la presencia de péptidos bioactivos en la secuencia aminoacídica de las proteínas lácteas. Aunque otras proteínas, tanto de origen animal como vegetal contienen secuencias biológicamente activas, la leche constituye la principal fuente de péptidos bioactivos (Oliva y Vega, 2004). Generalmente estos péptidos son inactivos dentro de la secuencia de la proteína precursora y pueden ser liberados y activados por proteólisis enzimática, por ejemplo durante la digestión gastrointestinal o el procesamiento de los alimentos. Por estos motivos, los péptidos bioactivos producidos in vitro están en

163

Estudios Aplicados

estudio y son de interés de la industria alimentaria con el fin de mejorar su biodisponibilidad a partir de su fuente natural o crear nuevos alimentos empleando fracciones aisladas o enriquecidas de péptidos bioactivos (Phelan y col., 2009).

En la actualidad, compañías como Tatúa Cooperative Dairy Co. Ltd, (Nueva Zelanda) y Arla Foods Ingredients (Suecia) están produciendo y comercializando caseína hidrolizada que contiene fosfopéptidos denominados CPP, los cuales favorecen la absorción de calcio, hierro, cobre, zinc y manganeso en el intestino y muestran efecto anticaries cuando se añade a pastas dentífricas o productos para el cuidado de la salud bucal. Del mismo modo, se ha afirmado que gomas de mascar y productos de confitería que contienen bicarbonato de sodio y una combinación de CPP unido a calcio (ACP) como ingredientes activos pueden proporcionar beneficios en la salud dental. En experimentos con seres humanos se ha informado que los enjuagues bucales y las gomas de mascar sin azúcar que contienen nanocomplejos de ACP presentan una potencial actividad anticaries (Pinto y col., 2012).

Los péptidos bioactivos pueden tener efecto de regulación positiva en alguno de los principales sistemas del organismo, entre ellos el sistema cardiovascular, endócrino, nervioso, gastrointestinal e inmune. En muchos trabajos de investigación se han reportado péptidos inmunomoduladores que estimulan las actividades de las células del sistema inmunológico, péptidos citomoduladores que inhiben el crecimiento de células cancerígenas, péptidos antimicrobianos que actúan inhibiendo el desarrollo de microorganismos sensibles, péptidos inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina-I que ejercen efecto hipotensor en la sangre, péptidos opioides que son ligando de receptores específicos y que pueden modular los procesos de absorción en el tracto intestinal, péptidos que se unen a minerales y funcionan como portadores especialmente de calcio, péptidos antioxidantes que brindan un beneficio adicional a las estrategias endógenas de defensa contra el estrés oxidativo y péptidos antiinflamatorios los cuales ayudarían a combatir las enfermedades producidas por inflamación crónica (aterosclerosis, enfermedades vasculares, artritis, cáncer, diabetes, osteoporosis, demencia, obesidad y síndromes metabólicos) entre otros (Hernández-Ledesma y col., 2014; Nagpal y col., 2011; Carrasco y Guerra, 2010; Korhonen, 2009; Hartmann y Meisel, 2007). Además, existen evidencias considerables de que muchos péptidos bioactivos son multifuncionales (Pinto y col., 2012). Se están realizando estudios in vitro e in vivo para identificar nuevos péptidos bioactivos y para analizar su biodisponibilidad y su mecanismo de acción in vivo (Darewicz y col., 2014).

164

Estudios Aplicados

En las Tablas 4 y 5 se presentan ejemplos de algunos péptidos bioactivos obtenidos a partir de las fracciones caseínicas y de proteínas del lactosuero.

Tabla 4.- Péptidos biológicamente activos derivados de las caseínas de leche bovina. Fuente: Nagpal y col. (2011)

Proteína Fragmento Secuencia del péptido Nombre Función precursora

αs1-caseína 90–96 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu α-Casein exorfina Agonista Opioide 90–95 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu α-Casein exorfina Agonista Opioide 91–96 Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu α-Casein exorfina Agonista Opioide Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe- 23–34 Inhibición de la ECA Gly-Lys 23–27 Phe-Phe-Val-Ala-Pro α- Casokinina-5 Inhibición de la ECA 104–109 Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu Inhibición de la ECA Inhibición de la ECA, 194–199 Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp α-Casokinina-6 immunomodulación β -caseína Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser- 60–70 β-Casomorfina-11 Agonista Opioide Leu Agonista Opioide, 60–66 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile β-Casomorpfina-7 inhibición de la ECA, immunomodulación 60–64 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly β-Casomorfina-5 Agonista Opioide 177–183 Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg β-Casokinina-7 Inhibición de la ECA Inhibición de la ECA, 193–202 Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg β-Casokinina-10 immunomodulación 169–175 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln Inhibición de la ECA 63–68 Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn Immunomodulación 191–193 Leu-Leu-Tyr Immunomodulación Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly- Casein Estimulación de la 1–25 Glu-Ile-Val-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)- fosfopéptido absorción mineral Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg k-Caseina 33–39 Ser-Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-OH Casoxina Antagonista Opioide 25–34 Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg Casoxina C Antagonista Opioide Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp- 106–116 Casoplatelina Antitrombótico Lys

165

Estudios Aplicados

Tabla 5.- Péptidos biológicamente activos derivados de las proteínas del lactosuero bovino. Fuente: Nagpal y col. (2011)

Proteína Fragmento Secuencia del péptido Nombre Función precursora

α-La agonista, inhibición de la 50–53 Tyr-Gly-Leu-Phe α-Lactorfina ECA β-Lg Efecto estimulador no 102–105 Tyr-Leu-Leu-Phe β-Lactorfina opioide sobre el íleon inhibición de la ECA 142–148 Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg Inhibición de la ECA 146–149 His-Ile-Arg-Leu β-Lactotensina Contracción del íleon BSA 399–404 Tyr-Gly-Phe-Gln-Asn-Ala Serorfina Opioide Contracción del íleon, 208–216 Ala-Leu-Lys-Ala-Trp-Ser-Val-Ala-Arg α-Albutensina inhibición de la ECA Lf Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Glu-Trp-Arg-Met- 17–41 Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Pro-Ser- Lactoferricina Antimicrobiana Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe

Actividades biológicas de los péptidos bioactivos

Aunque son muchas las actividades biológicas encontradas en los hidrolizados de proteínas lácteas, se desarrollan aquellas que han sido estudiadas en este trabajo: actividad antimicrobiana, antihipertensiva y antioxidante.

Actividad antimicrobiana

Algunos péptidos encriptados en las proteínas lácteas presentan actividad antimicrobiana (AMP). Estos compuestos pueden actuar sobre distintos microorganismos (virus, bacterias, protozoos y hongos) algunos de los cuales presentan resistencia a los antibióticos convencionales. El aumento en la resistencia de los microorganismos a estos agentes ha generado la necesidad de encontrar opciones terapéuticas no convencionales, en cuyo caso los AMP podrían ser empleados con este fin. Los AMP son péptidos de cadena corta provistos de cargas positivas, anfipáticos y que presentan tamaño y secuencia de aminoácidos variable. En particular, aquellos producidos por hidrólisis de las proteínas lácteas derivan fundamentalmente de la Lactoferrina (Lf) aunque también se ha encontrado actividad antimicrobiana en derivados de otras lactoproteínas. La secuencia responsable de la actividad en la Lf está localizada en

166

Estudios Aplicados

regiones próximas al dominio N-terminal, el cual presenta carga neta positiva y aminoácidos de carácter hidrofóbico. El fragmento f(17-41) denominado lactoferricina (Lfcina) es obtenido por hidrólisis enzimática de la Lf con pepsina y posee un puente disulfuro intramolecular. Debido a que la actividad antimicrobiana del péptido es superior a la de la proteína de la cual deriva se cree que su menor tamaño facilita el acceso a los sitios blanco sobre la superficie del microorganismo. Sin embargo, la producción de este péptido in vivo mediante la digestión gastrointestinal es limitada, sobre todo en niños (Oliva y Vega, 2004). Además de los péptidos mencionados en las Tablas IV y V, se ha informado que el fragmento f(1-23) de la αs1-caseína, llamado isracidina y obtenido por hidrólisis con quimosina ejerce actividad antimicrobiana in vivo frente a cepas de Staphylococcus aureus y Candida albicans en concentraciones comparables con antibióticos conocidos (Bhardwaj y Singh, 2013; Lahov y Regelson, 1996). Paralelamente se han descripto distintos fragmentos derivados de la αs2-caseína con actividad antimicrobiana, como el fragmento f(165-203) llamado casocidina-I que inhibe el crecimiento de Escherichia coli y Staphylococcus carnosus (Norberg y col., 2011; Zucht y col., 1995). Las secuencias peptídicas f(164-179) y f(183-207) aisladas a partir de hidrolizados de αs2-caseína con pepsina presentan actividad antibacteriana frente a Bacillus cereus y Escherichia coli (Alvarez- Ordoñez y col., 2013; Recio y Visser, 1999a).

Por otro lado, los fragmentos derivados de la β-caseína humana ejercen efectos protectores frente a Klebsiella pneumoniae en ratones (Mc Clean y col., 2014; Migliore- Samour y col., 1989).

Actividad antihipertensiva

La hipertensión arterial es una de las patologías prevalentes en el ser humano adulto que genera grave trastornos en la salud humana. Es un proceso multifactorial, sin embargo el mecanismo de acción más estudiado ha sido la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA).

La enzima ECA (polipéptido hidrolasa, EC 3.4.15.1) juega un papel importante en la regulación de la presión sanguínea en mamíferos, catalizando la conversión de la angiotensina I (un decapéptido) en el potente vasoconstrictor angiotensina II (un octapéptido) y al mismo tiempo inactivando al vasodilatador bradiquinina (Erdman y col., 2008). El sitio activo de esta enzima está constituido por tres subsitios (S1, S1´, S2´) en los

167

Estudios Aplicados

cuales se acoplan los tres residuos hidrofóbicos C-terminal de la angiotensina I, donde son luego escindidos produciendo la angiotensina II. De acuerdo a la evidencia acumulada en múltiples investigaciones, la actividad inhibitoria de los péptidos sobre la ECA es mayor si el dominio C-terminal posee residuos aromáticos (Trp, Tyr o Phe), hidrofóbicos (Pro) o básicos (Lys o Arg), mientras que la presencia de Glu en dicha posición puede disminuir la actividad inhibitoria (Nagpal y col., 2011; Vinderola, 2008; Murakami y col., 2004). Por otro lado, la presencia de residuos dicarboxílicos o de cadenas ramificadas (Val o Ileu) en la posición N-terminal del péptido también aumenta su actividad inhibitoria (Morais y col., 2014; Hernandez Ledesma y col., 2008). En general, los péptidos que poseen mayor actividad inhibitoria de la ECA presentan peso molecular inferior a 3 kDa (Lignitto y col., 2010).

Las proteínas más estudiadas como fuente de péptidos inhibidores de la ECA son las proteínas lácteas, caseínas y proteínas del lactosuero, tanto bovinas (Morais y col., 2014; Nagpal y col., 2011; Maruyama y col., 1987) como humanas (Wada y Lönnerdal, 2014; Hernández-Ledesma y col., 2005).

Las fracciones f(23-34), f(23-27) y f(194-199) de la αs1-caseína, las fracciones f(177-183) y f(193-202) de la β-caseína y la fracción f(108-110) de la κ-caseína bovina presentan un potente efecto inhibidor in vitro, mientras que el fragmento opioide de la β- casomorfina-7 posee baja actividad (McClean y col., 2014; Migliore-Samour y col., 1989).

Fuglsang y col. (2003) evaluaron por primera vez la actividad inhibitoria de péptidos derivados de la leche sobre la ECA in vivo y encontraron que tenían una moderada actividad. La disminución del efecto in vivo fue atribuida a la degradación de los péptidos en el sistema digestivo.

Las proteínas del lactosuero también poseen péptidos encriptados en su estructura que una vez liberados exhiben propiedades antihipertensivas. En la β-Lg se han identificado la β-lactosina A y B correspondiente a las fracciones f(78-80) y f(142-145) con potente efecto inhibidor (Murakami y col., 2004). En particular, Malkoski y col. (2001) informaron que la β-lactosina B puede modular la liberación del vasoconstrictor endotelina-1 que podría ser otro posible mecanismo que explique su efecto antihipertensivo. Otte y col. (2007) aislaron cuatro potentes péptidos inhibidores de la ECA a partir de hidrolizados de α-La que contenían la secuencia Pro-Glu-Trp en su dominio C-terminal.

168

Estudios Aplicados

Actividad antioxidante

En los organismos aerobios y como resultado de las reacciones metabólicas, se generan constantemente especies reactivas de oxígeno (ROS). Una excesiva producción de ROS puede sobrepasar la capacidad antioxidante fisiológica. Como consecuencia de este daño oxidativo, las proteínas, los lípidos y el ADN se convierten en blanco del ataque de los radicales libres dañando las enzimas, las membranas celulares y el material genético. Este daño está relacionado con el desarrollo de enfermedades como cáncer, enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoidea y con el proceso de envejecimiento (Chirino y col., 2006). Análogamente a otros sistemas biológicos, el daño oxidativo también tiene importancia en los alimentos. Una consecuencia habitual es la peroxidación lipídica que produce rancidez, aparición de sabores desagradables y la disminución de la vida útil del producto (Liu y col., 2005). Para evitar estos efectos negativos, en la industria alimentaria se emplean antioxidantes sintéticos, entre los que se encuentran el 2,6-bis (1,1-dimetil)-4- 4metilfenol (BHT) y el 2-tert-butil-4-hidroxianisol (BHA). Debido a la posible toxicidad de estos compuestos sobre el organismo humano, se está incentivando la búsqueda de antioxidantes de fuentes naturales.

Se han descripto péptidos antioxidantes con capacidad de secuestrar radicales libres y formar complejos con los iones metálicos que catalizan las reacciones de los radicales libres. Muchos péptidos antioxidantes que actúan evitando la oxidación de ácidos grasos esenciales son obtenidos a partir de las proteínas lácteas. Rival y col. (2001) informaron que estos compuestos inhiben la peroxidación lipídica tanto enzimática como no enzimática constituyéndose en blancos preferenciales para los radicales libres intermediarios.

Mediante la aplicación de un modelo estadístico multivariado Peña-Ramos y col. (2004) observaron que el tamaño y la secuencia aminoacídica de los péptidos eran importantes para la expresión de su actividad. En general, los péptidos que son ricos en restos de His y residuos de aminoácidos hidrofóbicos cuyo peso molecular es inferior a 5 kDa muestran mayor actividad antioxidante.

La mayoría de los péptidos con actividad antioxidante se encuentran contenidos en la secuencia de la α-caseína aunque se ha reportado actividad en péptidos derivados de otras proteínas lácteas (Hartman y Meisel, 2007; Fitzgerald y Murray, 2006). Kumar y col. (2002) encontraron que la f(39-42) de la Lf humana inhibía los efectos tóxicos de los radicales libres mediante el incremento de los niveles de antioxidantes en un modelo de ratas con artritis inducida. Adicionalmente, Hernández-Ledesma y col (2005) identificaron tres secuencias con elevada actividad antioxidante en hidrolizados de α-La y β-Lg. Zhang y

169

Estudios Aplicados

col. (2013) identificaron siete secuencias y Mann y col. (2014) identificaron 16 secuencias peptídicas con potente actividad antioxidante obtenidas por hidrólisis de lactosuero con las enzimas alcalsa y con corolasa, respectivamente.

Ciclodextrinas

Las ciclodextrinas (CD) son una familia de oligosacáridos cíclicos naturales, formados por un número variable de unidades de D-glucopiranosa unidas por enlaces α- (1-4). Las CD más comunes son la α-CD, β-CD y γ-CD de seis, siete y ocho unidades de glucosa, respectivamente (Figura 4). Se obtienen como resultado de una reacción de transglicosilación intramolecular en la degradación del almidón, llevada a cabo por la enzima ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa) de diversos microorganismos (Hanumegowda y col., 2014; Szejtli, 1998).

α β γ

Figura 4.- Estructura de α-, β- y γ-CD. Detalle de las dimensions de las moléculas. Fuente: Zhang y Ma (2013)

Los tres tipos de CD presentan características similares: tienen estructura troncocónica o de cono truncado debido a la conformación en forma de silla de las unidades de glucopiranosa. Su cavidad interior es hidrófoba por lo que estos compuestos son capaces de albergar moléculas hidrofóbicas más pequeñas para formar complejos del tipo “anfitrión-huésped“, en los que la molécula huésped queda encapsulada por la CD (Figura 5).

170

Estudios Aplicados

Figura 5.- Estructura de las CD

Las CD pueden formar compuestos cristalinos a partir de moléculas orgánicas o inorgánicas huésped en estado sólido, líquido e incluso gaseoso. El ajuste de la molécula de sustrato a la cavidad de la CD es un proceso decisivo y en cierta medida independiente del carácter de la molécula huésped (Mura, 2014). Sin embargo, esta independencia es relativa debido a que para la formación del complejo es necesaria la deshidratación total o parcial del sustrato, seguida de la rehidratación que se produce tras el proceso de incorporación siendo estos procesos características de los sustratos. El proceso de inclusión transcurre gracias a la interacción -energéticamente favorable- entre la molécula huésped, relativamente apolar, y la cavidad hidrofóbica –imperfectamente solvatada- de las CD. La unión resultante entre la CD y la molécula huésped no es fija o permanente sino que es un equilibrio dinámico gobernado por una constante, cuya fuerza depende del tamaño relativo de la molécula complejada y de las interacciones que establezca con las CD (Figura 6).

Kc

Molécula CD Complejo huesped

Figura 6.- Formación del complejo huésped-CD. Fuente: Mura, 2014

171

Estudios Aplicados

A las α-, β- y γ-CD se las denomina de primera generación, parentales o naturales. Las β-CD son el tipo más utilizado debido a su bajo costo. A partir de las CD naturales se han sintetizado otros tipos de CD llamadas derivadas o modificadas que son obtenidas por procesos de acilación, esterificación o eterificación de los OH- de los carbonos primarios y secundarios de las CD naturales. La solubilidad de las CD modificadas será diferente a las de su parental dependiendo del sustituyente adicionado.

Recientemente se han revisado los perfiles de seguridad de las CD naturales y algunas modificadas. Los estudios de toxicidad han demostrado que las CD administradas por vía oral no son tóxicas, debido a su escasa o nula absorción en el tracto gastrointestinal. Actualmente, las CD parentales se encuentran en más de 200 alimentos y son consideradas como productos naturales (Japón), aditivos alimentarios (Unión Europea) y productos seguros o Generally Regarded as Safe (GRAS) para su empleo como aditivos protectores de flavors en alimentos (Estados Unidos). El hecho de que estos compuestos sean considerados GRAS permite su empleo en la industria alimenticia, farmacológica y cosmética (Hanumewoda y col., 2014; Kurkov y Loftsson, 2013; Marques, 2010).

Las α-CD se absorben entre el 2 y 3% tras su administración vía oral en ratas. No son metabolizadas en el tracto intestinal superior pero sí son degradadas por la flora intestinal del ciego y del colon (Hanumewoda y col., 2014; Del Valle, 2004). Las β-CD cuando se ingieren por la vía oral se unen al colesterol absorbiéndose en el tracto gastrointestinal superior en cantidades muy pequeñas (1-2%). Al igual que en el caso de α-CD no son metabolizadas en el tracto intestinal superior pero sí son degradadas por las bacterias del ciego y colon. Actualmente, son las CD más comunes en formulaciones farmacéuticas y por lo tanto mejor estudiadas en humanos. Las γ-CD son las que presentan menos efectos adversos por lo que son promovidas activamente como aditivo alimentario por sus principales fabricantes, a pesar de ser las más costosas (Hanumewoda y col., 2014; Szente y col., 1998). Son rápidamente degradadas a glucosa en el tracto intestinal superior por las enzimas intestinales (incluso a altas dosis, por ejemplo, 10-20 g/kg/día). Su habilidad para formar complejos, en general, es menor que las β-CD y sus derivadas modificadas. Con frecuencia, sus complejos tienen una solubilidad limitada en medio acuoso tendiendo a precipitar y generando soluciones opalescentes (Szente y col., 1998).

172

Estudios Aplicados

Complejos de inclusión de péptidos bioactivos con β-ciclodextrinas

Los hidrolizados proteicos con actividad biológica son incorporados en una serie de productos alimenticios. El efecto potencial de dichos péptidos depende de su capacidad para llegar activos a los órganos blanco luego de su administración oral. El tracto gastrointestinal (GI) es la mayor barrera que tiene el cuerpo humano. Las condiciones del sistema, como la presencia de enzimas y los valores de pH, pueden influir en la estructura y función de los péptidos. Sin embargo, el empleo de péptidos bioactivos es limitado debido a que las características de higroscopicidad, reactividad y flavor (aromas desagradables y sabores amargos) dificultan su manipulación. Esta última característica es el obstáculo más importante en el empleo de los hidrolizados en alimentos (Lin y col, 2006).

La encapsulación es una tecnología que resuelve los inconvenientes que limitan el uso de ingredientes y aditivos alimentarios. Se puede definir como la técnica por la cual gotas líquidas, partículas sólidas o gaseosas son cubiertas con una película polimérica porosa conteniendo una sustancia activa (Valenzuela y Araneda, 2009). Esta membrana, barrera o película esta generalmente hecha de componentes que permiten crear una red con propiedades hidrofóbicas y/o hidrofílicas (Fuchs y col., 2006). Su empleo presenta muchas ventajas, debido a que permiten enmascarar flavors y reducir la volatilidad, higroscopicidad y reactividad de los compuestos, incrementando a su vez la estabilidad del producto bajo condiciones adversas. Esta técnica también evita la formación de aromas indeseables producidos por interacciones entre componentes de los alimentos, otorga protección frente a la oxidación inducida como consecuencia de la radiación UV, minimiza la interacción entre componentes aromáticos, aumenta la vida útil de los aromas y/o controla la liberación de los mismos dentro de un producto (Tari y Singhal, 2002; Reineccius, 1991).

El tamaño de la cápsula formada puede variar desde unos cuantos milímetros al orden de los nanómetros. La cápsula más simple consiste en una molécula huésped rodeada de una cubierta. Los métodos de encapsulación son limitados, sin embargo existe una extensa variedad de materiales que pueden ser utilizados como agentes encapsulantes, entre ellos se destacan proteínas, carbohidratos, lípidos y gomas. Todos presentan ventajas e inconvenientes y su elección depende del objetivo del producto, del proceso de encapsulación utilizado y de aspectos legales relacionados con la aprobación del agente encapsulante por la European Food Safety Autority, en la Unión Europea, o la Food and Drug Administration, en EEUU. Es así que las ciclodextrinas (CD) podrían ser empleadas con el

173

Estudios Aplicados

fin de proteger a los péptidos biológicamente activos de modo de preservar su actividad in vivo, ya que está demostrado que son efectivas en el transporte específico de compuestos hacia el colon.

Métodos de preparación y detección de complejos de inclusión con CD

Existen diversas técnicas que permiten adaptar el proceso de formación de complejos según las características del compuesto que va a ser incluido. La solución dinámica es un método muy empleado ya que el complejo se forma en solución. La co-precipitación es un método similar con la diferencia que se emplea una concentración elevada de CD y se enfría la solución durante el proceso permitiendo que precipite el complejo formado. Luego el complejo es separado por distintos métodos como decantación, centrifugación o filtración. En la formación de complejos de inclusión por el método slurry se trabaja con una solución sobresaturada de CD en la cual se encuentra disuelto el analito. La molécula huésped es complejada por las CD en solución y, cuando el complejo satura la fase acuosa, cristaliza o precipita pudiendo recoger los precipitados como se describe en el método de co- precipitación. Cuando se realiza la formación del complejo en pasta se añade una pequeña cantidad de agua para formar una masa entre las CD y el analito. Si el analito resiste altas temperaturas, se puede emplear la mezcla húmeda y aplicar calor para permitir la formación del complejo. Algunos compuestos pueden formar complejos simplemente al mezclarlos con las CD como ocurre con los aceites.

Una vez que los complejos están formados y han sido secados (en horno, en secador de lecho fluido o por liofilización) son muy estables a temperatura ambiente y en condiciones de baja humedad, alargando la vida del analito. Cuando los complejos se disuelven en agua se produce la liberación controlada del analito. En primer lugar se disuelve el complejo y seguidamente se libera el compuesto encapsulado hasta su límite de solubilidad en agua, ocupando las moléculas de agua su lugar en la cavidad interna de las CD y estableciéndose un equilibrio entre analito libre y complejado.

La formación de complejos de inclusión puede detectarse por métodos muy diversos gracias a las modificaciones que se producen en las propiedades de la molécula complejada. Estas modificaciones pueden ser físicas (solubilidad, tensión superficial), químicas (reactividad, variaciones en el valor de las constantes de ionización ácido-base) o espectroscópicas; las cuales pueden ser cualitativas (posición de los máximos) o

174

Estudios Aplicados

cuantitativas (variaciones en el coeficiente de absorción molar o en la intensidad de fluorescencia) de los parámetros espectrales. Los métodos espectroscópicos son los más adecuados para la detección de estos complejos en disolución, teniendo en cuenta que la naturaleza de las fuerzas involucradas en su formación son débiles. Cuando el complejo se encuentra en estado sólido su detección se puede realizar aplicando espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear, de Absorción Infrarroja y Raman, difracción de Rayos-X y métodos térmicos. Dentro de la última categoría, las técnicas más empleadas son la Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC), el Análisis Térmico Diferencial (DTA), la Termogravimetría (TG) y la Termogravimetría Diferencial (OTGL). Cuando se produce la inclusión en la CD, el punto de fusión o ebullición de la molécula encapsulada se desplaza a temperaturas más elevadas, pudiendo desaparecer o bien quedar enmascarado en torno a la temperatura de descomposición de las CD (300°C). Este desplazamiento implica una mejora en las características de estabilidad de numerosos principios activos, especialmente en el caso de aceites y líquidos volátiles (Uekama y col., 1998). La mayoría de los métodos de detección de complejos en solución permiten la caracterización del complejo mediante el cálculo de su estequiometría y sus constantes de asociación. En general puede hablarse de estequiometría 1:1 para la mayoría de los complejos con CD. Sin embargo, si la molécula huésped es demasiado grande para el tamaño de la cavidad pueden producirse asociaciones de dos moléculas de CD por cada molécula huésped. Si por el contrario la cavidad es lo suficientemente grande como para alojar a dos moléculas huésped, la estequiometría anteriormente citada se invierte.

PEPTIDASAS VEGETALES COMO ANTIMICROBIANOS NATURALES

Desde el año 1976 la Organización Mundial de la Salud viene promoviendo el uso de las medicinas tradicionales en los distintos países, en especial a la fitoterapia como parte de los programas de Atención Primaria de la Salud pues el 80% de la población mundial utiliza las plantas medicinales en la cura de enfermedades y el alivio de los síntomas perjudiciales para su salud. Sin embargo y frente a la gran biodiversidad vegetal disponible, se calcula que sólo el 1% de las especies botánicas conocidas en el mundo ha sido estudiado desde el punto de vista fitoterapéutico (Alonso y col., 2005; Alonso, 1998). Las plantas medicinales constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países en desarrollo. Estas especies vegetales tienen aplicaciones en la medicina

175

Estudios Aplicados

moderna, de igual forma se emplean como materia prima para la fabricación de medicamentos semisintéticos más complejos, la estructura química de sus principios activos puede servir de modelo para la elaboración de drogas sintéticas y tales principios se pueden utilizar como marcadores taxonómicos en la búsqueda de nuevos medicamentos (Akerele 1993). Específicamente, en Argentina es casi inexistente la agroindustria farmacéutica. De los más de 5000 medicamentos que se dispensan, se ha estimado que solamente un 3% de los mismos se elaboran con alguna droga vegetal y menos del 0.5% con especies autóctonas. En la medicina tradicional argentina se utilizan unas 750 especies, entre nativas y espontáneas, la mayoría de las cuales proviene del acopio de materiales silvestres o de importación (Cañigueral y col., 2003). El uso de los productos naturales en terapéutica se ha visto favorecido por diversos factores como el descubrimiento de efectos secundarios graves causados por fármacos sintéticos, el mayor conocimiento químico, farmacológico y clínico de las drogas vegetales y sus derivados, el impulso de nuevas formas de preparación y administración de las drogas vegetales y el desarrollo de métodos analíticos que garantizan un mejor control de calidad. En particular, la búsqueda de nuevas fuentes de agentes antimicrobianos se hace imprescindible debido el creciente aumento en la resistencia de microorganismos a los antibióticos tradicionales. En los extractos vegetales con actividad antimicrobiana se han identificado numerosos compuestos fitoquímicos a los cuales se les atribuye dicha actividad. Entre ellos podemos mencionar los polifenoles, las quinonas, los flavonoides, los tanimos, las cumarinas, los terpenoides, los alcaloides y los péptidos y proteínas entre otros (Araujo Diaz y Salas Asencios, 2008). Los compuestos antimicrobianos del género Solanum son considerados los más potentes (Sheikh y col., 2012 Silva y Fernández Júnior, 2010). Solanum incanum (L) es una de las especies más importante de la medicina popular dentro de la familia Solanaceae. La actividad antibacteriana de sus extractos fue extensamente estudiada (Pavithra y col., 2010; Britto y Senthilkumar, 2001) así como también la presencia de fitoquímicos en los mismos (Pavithra y col., 2012). Se ha encontrado actividad antimicrobiana en extractos de otras especies de Solanaceae, como por ejemplo actividad antibacteriana y antifúngica en hojas, tallos, semillas, frutos y planta entera de Solanum nigrum (Parameswari y col., 2012; Zubair y col., 2011), al igual que en frutos de Solanum xanthocarpum, en hojas y tallos de Solanum trilobatum (Nagarajan y col., 2009; Subashini y col., 2013), en hojas de Physalis mínima (Gavimath y col., 2012) y en hojas y raíces de Withania somnifera (Kumar y col., 2011). Se encontró también actividad antimicrobiana en extractos hojas y planta entera de la especie Solanum surattense (Sheeba, 2010; Suhas y col., 2009).

176

Estudios Aplicados

A diferencia de los animales, las plantas carecen de sistema inmunológico y la respuesta inmunitaria de ellas comprende mensajeros químicos sistémicos que se distribuyen por toda la planta. En los últimos años se ha reportado el aislamiento de diferentes tipos de proteínas vegetales con actividad antimicrobiana, entre ellas quitinasas, β-1,3-glucanasas, defensinas, tioninas, inhibidores de peptidasas e incluso enzimas proteolíticas (Rocha y col., 2013; Muñoz y col., 2010, Rojas y col., 2006). Touch y col. (2009) reconocieron cinco clases de compuestos: las proteínas que ligan iones metálicos, las bacteriocinas, los sistemas antimicrobianos de oxidoreductasas, los péptidos antimicrobianos y las hidrolasas. Las enzimas hidrolíticas como lisozimas, quitinasas y glucanasas actúan degradando componentes fundamentales de la pared celular de bacterias y hongos. La lizosima de huevo de gallina ha sido muy estudiada para aplicarla en las industrias de los alimentos y farmacéutica debido a que su estructura es conocida y su obtención es económica. Se atribuye la actividad antimicrobiana de la lisozima a la degradación de los peptidoglicanos que forman la pared celular, a la disrupción de las membranas y a la inducción de autolisinas bacterianas.

En este contexto, la investigación en compuestos vegetales biológicamente activos de naturaleza proteica resulta de gran interés.

Entre los antimicrobianos de naturaleza peptídica se ha observado que algunas peptidasas aspárticas están involucradas en procesos de inhibición del desarrollo microbiano Mendieta y col. (2006) reportaron la presencia de actividad proteolítica y antimicrobiana de tres peptidasas aspárticas aisladas de Solanum tuberosum, una de tubérculo (StAP1) y dos de hojas (StAP2 y StAP3). Estas enzimas son inducidas frente al daño mecánico y frente a la infección por patógenos en cultivares de papa y presentan actividad antimicrobiana sobre hongos patógenos del género Phytophthora y Fusarium, confirmando el rol de estas enzimas en el mecanismo de defensa de las plantas frente a situaciones de estrés y frente a la infección por agentes patógenos (Guevara y col., 2004- 2002). Asimismo se ha informado la presencia de una AP en el espacio extracelular de hojas de tomate infectadas con un viroide, cuyo peso molecular era de 37 kDa y el pH óptimo de actividad estaba en el rango ácido (2.5 a 3.5). Otra AP con características similares fue encontrada en hojas de tabaco infectadas con el virus del mosaico (TMV). Ambas enzimas son capaces de hidrolizar a las proteínas vegetales relacionadas a la patogénesis denominadas PR (Pathogenesis Related) las cuales juegan un rol importante en la protección frente a microorganismos fitopatógenos y tienen elevada resistencia a otras proteasas. La colocalización de las APs y las proteínas PR en el espacio extracelular sugiere

177

Estudios Aplicados

que estas enzimas juegan un rol importante en el mantenimiento de niveles adecuados de las proteínas PR, al menos en plantas de la familia Solanaceae. Adicionalmente, el gen de una AP fue encontrado en Arabipdosis thaliana. La AP expresada a partir de dicho gen, denominada CDR1, se acumulaba en el espacio intercelular luego de la infección del tejido con Pseudomona Syringae. Xia y col. (2004) informaron que dicha AP produce la liberación de un inductor de naturaleza peptídica, hecho que no ocurre en presencia del inhibidor específico de APs (pepstatina) o cuando se produce una mutación en el sitio activo de la enzima. Guevara y col. (2005) observaron que los niveles de una AP en el fluido intercelular de tubérculos de papa (StAP) se incrementaba cuando eran infectados con P. infestans y que dicho incremento era más pronunciado en las variedades resistentes. Recientemente, Muñoz y col. (2010) atribuyeron el efecto antimicrobiano de StAP al PSI de las APs típicas. Observaron que dicho péptido presentaba actividad microbicida frente a microorganismos patógenos humanos y fitopatógenos en forma dependiente de la dosis y sin causar citotoxicidad en las células de la sangre humana en las concentraciones ensayadas.

Por otra parte, se ha descripto también la participación de una leucin- aminopeptidasa y de una carboxipeptidasa de tomate en el mecanismo de defensa de la planta ya que serían las responsables de la inactivación de proteínas esenciales para el crecimiento de hongos, insectos y otros patógenos durante la infección (Grandillo y col., 2011; Schaller y Ryan, 1996).

Mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos (AMP)

Los péptidos antimicrobianos presentan un mecanismo general de inhibición mediante el cual producen la disrupción de las membranas y la formación de poros en las células microbianas. En general, el mecanismo consta de la formación de un bucle en forma de α-hélice en el dominio C-terminal del péptido que provoca la formación de canales iónicos en la membrana celular (Figura 7). De esta manera, se establece un pseudo-equilibrio dinámico entre el péptido y la superficie de la membrana. Como resultado, las moléculas de péptidos se ensamblan para formar poros transitorios en la membrana externa y luego trasladarse a la membrana interna de las bacterias Gram negativas. En teoría, estos poros transitorios no debieran afectar en gran medida la viabilidad de la célula aunque su naturaleza dinámica

178

Estudios Aplicados

permite la fuga de contenido citoplasmático del microorganismo y la posible muerte celular (Gee y col., 2013; Benkerroum, 2010; Agawa y col., 1991).

Figura 7.- Mecanismo de formación de poros de los AMP sobre la membrana de bacterias Gram negativas. Fuente: Gee y col. (2013)

Existe evidencia de que los péptidos presentan mecanismos adicionales o complementarios, como por ejemplo la unión a componentes citoplasmáticos cuyas funciones son esenciales (Nguyen y col., 2011). Peters y col. (2010) informaron que la interacción inicial entre los péptidos y la membrana microbiana permitiría su ingreso a la célula y la posterior interrupción de procesos vitales, como por ejemplo la biosíntesis de la pared celular y de las moléculas de ácidos nucleicos y proteínas (Figura 8).

179

Estudios Aplicados

Figura 8.- Mecanismo de acción de los AMP. A Ruptura de la integridad de la membrana: (1) los péptidos se insertan al azar en la membrana, (2) e interaccionan entre sí a través de sus secuencias hidrofóbicas lo que causa (3) que una parte de la membrana sea removida y se forme un poro. B Inhibición de la síntesis de ADN. C Bloqueo de la síntesis de RNA. D Inhibición de las enzimas necesarias para la síntesis de la estructura de la pared celular. E Inhibición de los ribosomas. F Bloqueo de las chaperonas impidiendo el plegamiento de las proteínas. G Inactivación de la mitocondria. (1) inhibición de la cadena respiratoria, (2) ruptura de la membrana mitocondrial. Fuente: Peters y col. (2010)

Campo de aplicación de los AMP naturales

Las proteínas y péptidos con actividad antimicrobiana aislados a partir de fuentes naturales, además de su potencial empleo en la industria farmacológica para la promoción de la salud humana, pueden aplicarse también en otros campos como por ejemplo en la industria alimentaria.

En los últimos años se ha instalado una tendencia a la elaboración de alimentos naturales y saludables con el fin de disminuir el consumo de aditivos sintéticos y el empleo de tratamientos térmicos severos en el procesamiento que garanticen la inocuidad y estabilidad del alimento.

De los compuestos antimicrobianos presentes en la naturaleza con potencial empleo en alimentos, las proteínas y los péptidos son los mejor estudiados (Nakatsuji y Gallo, 2012; Masschalck y Michiels, 2003; Ibrahim y col., 2000). El interés en estos compuestos se debe a su elevada digestibilidad, a que producen pocos defectos sensoriales en el alimento comparado con otros sistemas antimicrobianos como fenoles y aceites y a que poseen una

180

Estudios Aplicados

rápida acción, con una selectiva toxicidad y bajo potencial en el desarrollo de resistencia (Suay-García y Perez-García, 2014; Hancock y Scott, 2000; Gould, 1996).

El control de plagas en los sistemas agroproductivos es otra posible aplicación de estos compuestos ya que son elevados los gastos económicos que se producen anualmente a escala mundial en concepto de pérdidas en diversos cultivos de importancia agroeconómica debido al ataque de plagas y enfermedades así como por el uso de productos químicos destinados a prevenirlas y controlarlas. Es importante resaltar el papel que ocupan las enfermedades fúngicas dentro del conjunto de afecciones que producen daños en las plantaciones, causada fundamentalmente por la diversidad y la dificultad en el control de las plagas (Kotowicz y col., 2014; Pane y col., 2013; Goodwin, 1997).

A nivel mundial las enfermedades causadas por hongos han ido en aumento y la terapéutica se ha visto limitada por la falta de efectividad de los fármacos, por los efectos adversos que producen sobre la salud y el medio ambiente y por la resistencia de los hongos. En particular, los microorganismos Fusarium spp., Macrophomina spp., Phytophthora capsici, Pytium spp., Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii causan marchitez y pérdida en la producción de cultivos de numerosos vegetales (Iribarren y col., 2013; González-Pérez y col, 2004). Por estos motivos se hace necesaria la búsqueda de nuevas alternativas biológicas para el control de las infecciones fúngicas (Rustagi y col., 2014; Mendieta y col., 2007; Pagano y col., 2007).

181

Estudios Aplicados

RESULTADOS DEL CAPÍTULO II

ENSAYOS DE COAGULACIÓN DE LA LECHE

La coagulación enzimática de la leche para la elaboración de quesos es una práctica común en la industria de la alimentación. El rendimiento quesero y las características reológicas del producto final están fuertemente afectados por el proceso de coagulación. Los factores que intervienen en dicho proceso son el pH, la temperatura, la concentración de enzima y de iones de calcio. Estos factores han sido extensamente estudiados, sin embargo, pocos autores han investigado acerca de sus interacciones y la influencia que ejercen en las propiedades coagulantes de la leche (Nájera y col., 2003).

Es así que en este trabajo se estudió el efecto de la interacción del pH, la temperatura y la concentración de los iones de calcio sobre el tiempo de coagulación de la leche, empleando como coagulante una cantidad fija del extracto crudo de frutos de Salpichroa origanifolia.

En la Tabla 6 se muestran los resultados obtenidos en la evaluación del pH, la temperatura, la concentración de los iones de calcio y sus interacciones, sobre el tiempo de coagulación de la leche. Se utilizó un diseño experimental 23, es decir tres parámetros (pH, temperatura de coagulación y concentración de cloruro de calcio) a dos niveles. Se realizaron dos réplicas del ensayo completo.

Tabla 6.- Diseño factorial completo 23, combinación de los parámetros en cada ensayo y valor de la variable dependiente para cada experimento

TC (min) Experimento pH T(°C) Ca (mM) Réplica I Réplica II

1 6.0 35 10 26.01 26.03 2 6.0 35 20 19.05 19.44 3 6.0 40 10 12.65 13.28 4 6.0 40 20 8.00 8.20 5 6.5 35 10 23.81 24.25 6 6.5 35 20 22.92 23.04 7 6.5 40 10 21.94 22.03 8 6.5 40 20 9.50 11.62

T: temperatura de coagulación, Ca: concentración de cloruro de calcio, TC: tiempo de coagulación.. Los valores representan el promedio de 2 ensayos independientes, realizados por triplicado.

182

Estudios Aplicados

En la Tabla 7 se muestra el análisis de varianza donde se consideraron todos los efectos lineales, las interacciones dobles y la triple.

Tabla 7.- Análisis de varianza de los factores e interacciones considerados en el modelo estadístico para la coagulación de la leche

ANOVA R2=0.99589; Aj=0.9923 Factor SS df MS F p (1) pH 43,7252 1 43,7252 132,003 0,000003 (2) Temperatura (°C) 373,7456 1 373,7456 1128,310 0,000000 (3) Ca (mM) 145,3833 1 145,3833 438,901 0,000000 1 by 2 23,6926 1 23,6926 71,526 0,000029 1 by 3 0,1743 1 0,1743 0,526 0,488875 2 by 3 17,9141 1 17,9141 54,081 0,000080 1*2*3 37,7303 1 37,7303 113,905 0,000005

Los resultados del ANOVA muestran que todos los factores fueron significativos para el proceso de coagulación excepto la interacción (pH x Ca). Por otro lado, en el diagrama de Pareto (Figura 9) se observa que el tiempo de coagulación fue altamente dependiente de la temperatura y la concentración de iones calcio, mientras que el efecto de interacción (pH x Ca) no fue significativo. Estos resultados coinciden parcialmente con los informados por Nájera y col. (2003), quienes encontraron que la temperatura, el pH, la concentración de calcio y todas las interacciones de dos y tres factores afectaban notablemente al tiempo de coagulación de la leche de vaca empleando un cuajo comercial con 80% de quimosina. En cambio, Castillo y col. (2000) no observaron efectos de interacción de los factores mencionados sobre el tiempo de coagulación de la leche de cabra con quimosina recombinante.

183

Estudios Aplicados

(2)T

(3)CaCl2

1*2*3

(1)pH

2by3

1by2

1by3

p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 9.- Diagrama de Pareto. Las variables de entrada se encuentran categorizadas en orden de importancia (p≤0,0001).

De acuerdo a los niveles de significancia alcanzados en el ANOVA se obtuvo un modelo de regresión múltiple para el rango establecido de los parámetros (Tabla 8). En el modelo se muestran las variables e interacciones de dos y tres factores, cuyos efectos fueron significativos.

Tabla 8.- Modelo de regresión lineal múltiple (p≤0,001) en el que se consideran los efectos del pH, la concentración de CaCl2 (Ca), la temperatura (T) y las interacciones significativas sobre el tiempo de coagulación (TC).

Ecuación R2 Aj. E

TC= 18.00 + 1.57 pH – 5.00 T – 3.10 Ca + 1.13 (pH x T) 0.993 2.64 - 1.17 (T x Ca) – 1.74 (pH x T x Ca)

R2Aj: coeficiente de determinación corregido, E: error de la determinación.

Los coeficientes de los efectos lineales en orden decreciente de influencia fueron: la temperatura, después el Ca y por último el pH. Los dos primeros fueron negativos; es decir que su aumento produjo la disminución del tiempo de coagulación, mientras que el pH tuvo un efecto contrario. Los coeficientes de las interacciones fueron similares entre sí e inferiores a los coeficientes de los efectos lineales. Los efectos de las interacciones doble

184

Estudios Aplicados

(T x Ca) y triple fueron negativos, es decir que su aumento produjo la disminución del tiempo de coagulación, al contrario de lo que se obtuvo con la interacción (pH x T).

Con el modelo ajustado se evaluó cada uno de los puntos experimentados, lo cual permitió predecir el comportamiento del tiempo de coagulación (Figuras 10 A, B y C).

A B C

25,00

TC (min)

15,00

0,00 6,00 6,25 6,50 30,0 36,0 42,0 7,5 15,0 22,5 pH T°C Ca mM

Figura 10.- Evolución del tiempo de coagulación respecto del pH (A), de la temperatura (B) y de la concentración del Ca. Las curvas fueron ajustadas con la ecuación de regresión.

Como se muestra en la Figura 10B, el tiempo de coagulación disminuyó significativamente al aumentar la temperatura. Estos resultados son coincidentes con los informados por Chazarra y col. (2007) y por Mazorra-Manzano y col. (2013) quienes estudiaron la coagulación de la leche bovina con extractos de flores de alcaucil y de frutos de kiwi respectivamente.

Por otra parte, el pH mostró un efecto menos pronunciado y opuesto ya que a medida que se incrementaba el valor del pH aumentaba el tiempo de coagulación (Figura 10A). Castillo y col. (2003) atribuyeron el afecto de la temperatura y el pH a la modificación de la cinética de las reacciones de hidrólisis enzimática y agregación micelar, aunque el efecto sobre la reacción de agregación era predominante. Con respecto al calcio, se observó un comportamiento similar a la temperatura, produciendo una disminución del tiempo de coagulación a medida que aumentaba la concentración de calcio (Figura 10C). Por el contrario, Chazarra y col. (2007) no encontraron diferencias significativas en el tiempo de coagulación con el agregado de calcio.

185

Estudios Aplicados

La Figura 11 muestra los valores del tiempo de coagulación calculados a partir de la ecuación del modelo informado en la Tabla 8. Como se observa en el gráfico, los mayores valores de TC (>19 min) se obtuvieron a la menor temperatura evaluada (32°C) mientras que los menores valores (< 18,8 min) están relacionados con la temperatura más alta del ensayo (40°C). Por otro lado, se observa que el valor mínimo para TC (7,22 min) se obtuvo en la mayor temperatura y concentración de Ca y menor pH, lo cual evidencia el fenómeno de interacción de los tres factores.

CaCl2 Ca 7,22

12,612 19,425 20

20,308 13,43

18,822 25,635 10 40

6 26,518

6,5 32 pH T

Figura 11.- Valores de tiempo de coagulación (min) calculados a partir de la ecuación del modelo de regresión múltiple presentado en la Tabla 8, considerando todas la interacciones significativas de los factores (pH, temperatura y concentración de calcio).

Los niveles de los factores que contribuyeron a la disminución del tiempo de coagulación de la leche fueron los valores máximos considerados de temperatura y concentración de Calcio, es decir 40°C y 20 mM, y el valor mínimo de pH 6.0.

En condiciones ideales, la leche debería ser coagulada en forma rápida luego de la adición del coagulante, para obtener una cuajada firme que drene bien el suero y retenga una alta proporción de grasa de la leche. El tiempo de coagulación de una solución de cuajo comercial (FPC, Chr. Hansen Dinamarca) medido por el método de referencia (norma FIL/IDF 110A:1987) fue de 3 minutos. Por lo tanto, el tiempo mínimo de coagulación obtenido para el extracto crudo de frutos de Salpichroa origanifolia y considerando los niveles de los factores evaluados, fue mayor al producido por el FPC en iguales condiciones.

186

Estudios Aplicados

Microscopía de la formación del coágulo lácteo

En la actualidad existen numerosas técnicas para monitorear el proceso de coagulación, basadas en métodos ópticos no destructivos que permiten analizar el tiempo de coagulación y la velocidad de crecimiento de la cuajada (Sbodio y Revelli, 2012).

Lagaude y col. (2004) desarrollaron una técnica simple para caracterizar el proceso de coagulación basada en la observación microscópica del proceso de coagulación de la leche tratada con el coagulante.

Es así que en este trabajo se estudió la cinética del proceso de coagulación de la leche de origen bovino con el extracto crudo de los frutos maduros de Salpichroa origanifolia por microscopía óptica y los resultados fueron comparados con los producidos por el cuajo comercial FPC (quimosina recombinante). Si bien no pudieron observarse microscópicamente las micelas de caseína, la resolución del microscopio fue suficiente como para poder observar la formación de la red en el gel. En la Figura 12 se observa que la formación del coágulo con el extracto vegetal fue más lenta que la obtenida con el cuajo testigo. Por otra parte, se observaron cambios en la textura de los coágulos formados con cada uno de los coagulantes ya que el coágulo formado por el extracto vegetal formaba un gel con una elevada retención de suero lácteo. El gel producido por la quimosina recombinante era más compacto y con baja retención de líquido en su matriz (Figura 12-4).

187

Estudios Aplicados

1 2

3 4

Figura 12.- Imágenes del proceso de coagulación de la leche por la acción enzimática, observadas en el microscopio óptico (10x), tratamiento con el extracto crudo de Salpichroa origanifolia a los 5 minutos (1), 15 minutos (2) y 30 minutos de incubación (3) y tratamiento con FPC a los 10 minutos de incubación (4).

Estos resultados son coincidentes con los observados macroscópicamente en tubos de ensayo (Figura 13) donde se observan las diferencias en la apariencia del coágulo lácteo obtenido con el extracto vegetal y con quimosina, corroborando los resultados obtenidos por microscopía óptica.

Figura 13.- Coagulación de la leche producida por una solución de FPC (Tubo I) y por el extracto crudo de Salpichroa origanifolia (tubo II). El ensayo se realizó incubando a 37 °C la leche descremada 12% (p/V) reconstituida en CaCl2 20 mM de pH Tubo I 6.0, con el coagulante correspondiente. La formación del coágulo se evaluó mediante observación visual. Tubo II

188

Estudios Aplicados

Una posible explicación surge de considerar las diferencias en la especificidad de clivaje de ambas enzimas. Como se describió anteriormente, una característica importante

de la quimosina es su elevada especificidad de hidrólisis del enlace Phe105-Met106 de la κ- caseína, lo cual permite que se desencadene el proceso de coagulación de la leche. Como es sabido, la κ-caseína es una molécula compleja que presenta puentes disulfuro y se encuentra glicosilada y fosforilada en varios sitios. Esto genera dificultad para predecir los sitios específicos de corte que producirá una enzima.

Con el fin de evaluar la especificidad de clivaje de la enzima salpichroína se realizó la hidrólisis enzimática de la fracción κ- de la caseína bovina. Los péptidos producidos se identificaron por Degradación de Edman. Se encontraron varios sitios de digestión

enzimática, sin embargo el enlace Phe105-Met106 no fue hidrolizado (Figura 14).

QEQNQEQPI RCEKDERFFS DKIAKYIPIQ YVLSRYPSYG LNYYQQKPVA

LINNQFLPYP YYAKPAAVRS PAQILQWQVL SNTVPAKSCQ AQPTTMARHP

HPHLSFMAIP PKKNQDKTEI PTINTIASGE PTSTPTTEAV ESTVATLEDS

PEVIESPPEI NTVQVTSTAV

Figura 14. Hidrólisis producida por salpichroína sobre la cadena de κ-caseína. Los recuadros grises indican el aminoácido a la derecha del enlace peptídico escindido por la enzima, en color rojo se indican los aminoácidos fosforilados y en verde los puntos de glicosilación, el recuadro rojo indica el enlace Phe105-Met106 de la proteína.

La ausencia de hidrólisis en el enlace Phe105-Met106 de la κ-caseína sumado a la extensiva hidrólisis en el resto de los enlaces peptídicos probablemente esté relacionado con las características del gel lácteo formado por el extracto vegetal, mostrando diferencias significativas con el gel obtenido por la acción de quimosina.

HIDRÓLISIS DE LAS PROTEÍNAS LÁCTEAS

Además del valor nutricional determinado por la composición y adecuada digestibilidad de los aminoácidos constituyentes (Schlimme y Meisel, 1995), las proteínas lácteas poseen distintas propiedades biológicas. En estudios recientes se ha descrito el papel fisiológico

189

Estudios Aplicados

de las proteínas lácteas como fuente de “péptidos bioactivos o funcionales”. Estos péptidos se definen como secuencias de aminoácidos inactivas en el interior de la proteína precursora, pero que ejercen determinadas actividades biológicas tras su liberación durante el procesado industrial de los alimentos o bien, durante la digestión gastrointestinal (Benkerroum, 2010).

Hidrólisis de caseinatos

Hidrólisis de las caseínas bovina, ovina y caprina

En este trabajo se evaluó la hidrólisis de las caseínas de distinto origen por acción de las peptidasas aspárticas contenidas en el extracto de frutos de Salpichroa origanifolia (Rocha y col., 2013).

La hidrólisis enzimática se expresó en función del cambio en las lecturas de absorbancia a 280 nm, producida por la formación de péptidos solubles en TCA a partir de la proteína de origen (Silva y Malcata, 2005). En la Figura 15 se observa la curva correspondiente con el ajuste polinómico de los resultados.

1,6

1,4

1,2

1,0

)

m 0,8

n

0 8

2

(

s 0,6 b

A

0,4

0,2

0,0

Caseína bovina -0,2 Caseína caprina -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Caseína ovina Tiempo (horas)

Figura 15.- Variación de la absorbancia 280 nm en función del tiempo de incubación de las caseínas bovina, caprina y ovina, incubadas a 40°C y pH 6.20. Las barras de error indican la desviación estándar del ajuste matemático.

En el análisis de los mismos, los datos fueron transformados para evitar las interacciones en el modelo. El ANOVA resultó significativo para el tiempo de hidrólisis y el tipo de caseína (p<0.05). Se verificaron los supuestos de normalidad y

190

Estudios Aplicados homocedasticidad a un nivel del 5% con el test de Levene y Kosmogorov-Smirnow, respectivamente. Se encontró que durante las primeras 2 horas de incubación no existieron diferencias significativas en la hidrólisis de las distintas caseínas (p=0.1663), en cambio si la hubo para los siguientes tiempos de reacción (p<0.01). Se observó una mayor hidrólisis en el siguiente orden 20 hs > 8 hs > 4 hs. También existieron diferencias significativas para la degradación enzimática de las distintas caseínas (p<0.01), resultando ordenadas de mayor a menor caprina>ovina>bovina (Punto crítico de Tukey=3.5638 para α=0.05). Por lo tanto, durante las 2 primeras horas de reacción, la hidrólisis producida fue independiente del tipo de caseína. Sin embargo, en tiempos de hidrólisis más largos (superiores a 4 horas) la mayor hidrólisis se produjo sobre la caseína caprina.

Estos resultados fueron similares a los obtenidos con un extracto de flores del cardo Cynara cardunculus (Sousa y Malcata, 1998). Estos autores han informado que la susceptibilidad diferencial frente a la hidrólisis está relacionada a la similitud en las secuencias aminoacídicas de la β-caseína ovina y bovina y a la conservación de los enlaces peptídicos escindidos por la enzima.

La sensibilidad a la hidrólisis enzimática de las fracciones caseínicas de distinto origen se analizó también por Tricina-SDS-PAGE y densitometría. En la Figuras 16, 17 y 18 se muestran los perfiles electroforéticos de las caseínas bovina, ovina y caprina respectivamente (calle 1) y de los hidrolizados enzimáticos obtenidos en los distintos tiempos de incubación (calles 2 a 5). La hidrólisis producida en los tres tipos de caseínas durante las primeras 2 horas fue similar, sin embargo, la fracción α-caseína fue hidrolizada en mayor medida que las demás fracciones. La banda correspondiente a la α-caseína ovina es degradada completamente a las 2 horas, en cambio la banda de la misma fracción de origen bovino y caprino no aparece en el gel a partir de calle correspondiente a las 4 horas de hidrólisis. Con respecto a las fracciones β- y κ- de las caseínas bovina, ovina y caprina no se observan cambios significativos en los perfiles de degradación hasta las 8 horas, permaneciendo una banda tenue aún a las 20 horas.

191

Estudios Aplicados

Figura 16.- Electroforesis Tricina-SDS-PAGE y densitograma de los hidrolizados de caseína bovina. Calles 1 a 5: hidrólisis en tiempo de incubación 0, 1, 2, 4, 8 y 20 horas respectivamente.

Figura 17.- Electroforesis Tricina-SDS-PAGE y densitograma de los hidrolizados de caseína ovina. Calles 1 a 5: hidrólisis en tiempo de incubación 0, 1, 2, 4, 8 y 20 horas respectivamente.

Figura 18.- Electroforesis Tricina-SDS-PAGE y densitograma de los hidrolizados de caseína caprina. Calles 1 a 5: hidrólisis en tiempo de incubación 0, 2, 4, 8 y 20 horas respectivamente.

192

Estudios Aplicados

Sousa y Malcata (1997) han informado que el extracto enzimático de Cynara cardunculus hidroliza más rápidamente la fracción α- de las caseínas en forma coincidente con los resultados indicados en este trabajo. El mismo perfil de degradación fue presentado por Vairo Cavalli (2008) con una peptidasa aspártica de extractos de flores de Silybum marianum. La quimosina, componente principal del cuajo animal, presenta un perfil de degradación similar al indicado anteriormente. Por otro lado se observó que la proteasa serínica extraída de semillas de Solanum dubium tiene un comportamiento catalítico diferente pues hidroliza preferentemente las fracciones β- y κ- de las caseínas (Ahmed y col., 2011).

Actividad antimicrobiana de los hidrolizados de caseínas de distinto origen

En numerosos artículos científicos se ha informado que algunos péptidos encriptados en las proteínas lácteas producen la inhibición in vitro del crecimiento de microorganismos patógenos y que el efecto bactericida de estos péptidos parece estar correlacionado con la carga neta positiva de los mismos que provoca la formación de canales iónicos en la membrana celular, alterando su permeabilidad y provocando la muerte de los microorganismos susceptibles (Jabbari y col., 2012; Benkerroum, 2010; López Expósito y Recio, 2006). En este trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana de los hidrolizados de las caseínas de distinto origen y se encontró que producían la inhibición in vitro del desarrollo de Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens y Pseudomonas fluorescens (Tabla 9)

Tabla 9.- Inhibición del desarrollo microbiano dado por los hidrolizados de caseína bovina, ovina y caprina

Origen de los hidrolizados Microorganismo Caseína bovina Caseína ovina Caseína caprina Staphylococcus aureus + + + Klebsiella pneumoniae + + + Serratia marcescens + + + Enterobacter aerogenes + + - Escherichia coli - + - Salmonella enteritidis + - - Salmonella gallinarum + - - Pseudomona aeruginosa + + - Pseudomona fluorescens + + +

193

Estudios Aplicados

El hidrolizado de caseína caprina no tuvo efecto inhibitorio sobre las enterobacterias (Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis y gallinarum) como tampoco sobre Pseudomonas aeruginosa. Escherichia coli sólo fue inhibida por los hidrolizados de caseína ovina y Salmonella enteritidis y gallinarum fueron inhibidas únicamente por los hidrolizados de caseína bovina. Los hidrolizados fueron separados por ultrafiltración obteniéndose fracciones de peso molecular de 3-10 kDa e inferior a 3 kDa. En estas fracciones se determinó la actividad antimicrobiana (Figura 19 y 20). Se encontró que los péptidos de peso molecular inferior a 3 kDa provenientes de la hidrólisis de las caseínas bovina y ovina presentaron el mayor efecto inhibitorio sobre las bacterias ensayadas. Staphylococcus aureus sólo fue inhibida por las fracciones de bajo peso molecular (Rocha y col., 2013). López-Expósito y Recio (2008) han informado que la acción inhibitoria sobre este microorganismo puede atribuirse a la isracidina, péptido de bajo peso molecular proveniente del dominio N-terminal de la -caseína f(1-23). El efecto antibacteriano de péptidos de bajo peso molecular provenientes de hidrolizados de - y - caseína sobre bacterias del género Staphylococcus también fue mencionado por Szwajkowska (2011). Por otra parte, solo los ultrafiltrados de peso molecular entre 3-10 kDa e inferior a 3 kDa de la caseína ovina mostraron inhibición del crecimiento de Escherichia coli. En este sentido, Atanasova e Ivanova (2010) afirmaron en un estudio preliminar, que un hidrolizado de β-caseína ovina había inhibido el crecimiento de Escherichia coli, sin identificar aún el péptido responsable de esta actividad.

194

Estudios Aplicados

S t a p h y lo c o c c u s a u re u s

K le b s ie l la p n e u m o n ia e

S e rra t ia m a rc e s c e n s

E n t e ro b a c t e r a e ro g e n e s

C a s e ín a b o v in a E s c h e ric h ia c o l i C a s e ín a o v in a S a lm o n e l la e n t e rit id is C a s e ín a c a p r in a S a lm o n e l la g a l l in a ru m

P s e u d o m o n a a e ru g in o s a

P s e u d o m o n a f lu o re s c e n s

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0

In h ib ic ió n %

Figura 19.- Inhibición del desarrollo microbiano dado por la fracción de peso molecular inferior a 3 kDa de los hidrolizados ultrafiltrados de las caseínas bovina, ovina y caprina.

S t a p h y lo c o c c u s a u re u s

K le b s ie l la p n e u m o n ia e

S e rra t ia m a rc e s c e n s

E n t e ro b a c t e r a e ro g e n e s

C a s e ín a b o v in a E s c h e ric h ia c o l i C a s e ín a o v in a S a lm o n e l la e n t e rit id is C a s e ín a c a p r in a S a lm o n e l la g a l l in a ru m

P s e u d o m o n a a e ru g in o s a

P s e u d o m o n a f lu o re s c e n s

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0

In h ib ic ió n %

Figura 20.- Inhibición del desarrollo microbiano dado por la fracción de peso molecular entre 3- 10 kDa de los hidrolizados ultrafiltrados de las caseínas bovina, ovina y caprina.

195

Estudios Aplicados

Hidrólisis de las fracciones α-, β-, κ- de la caseína bovina

Se estudió luego la capacidad de hidrólisis (GH%) de salpichroína, la enzima purificada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia, sobre las fracciones α-, β-, κ- de la caseína bovina. Las condiciones de hidrólisis fueron pH 6.20 a 40°C durante 2 horas.

En la Figura 21 se observa que en las condiciones propuestas, el grado de hidrólisis producido sobre la fracción αs-caseína era mayor que para el resto de las fracciones, obteniéndose en consecuencia, valores de GH% superiores a los observados con β- y κ-

caseína (αs-caseína > β-caseína > κ-caseína). Más aún, el GH% de la αs-caseína se incrementó durante los 120 minutos en que se realizó el ensayo en una relación casi lineal y con un incremento sostenido. En cambio, el GH% de las fracciones β- y κ-caseína alcanzaron su máximo valor (16% y 6%, respectivamente) durante los primeros 30 minutos de la reacción y luego se mantuvieron con poca variación en el tiempo.

50

45

40

35

30

25

H% G 20

15

10

5

0 Alfa-caseína -5 Beta-caseína 0 30 60 90 120 Kapa-caseína

Tiempo (min)

Figura 21.- Grado de hidrólisis (GH%) de las fracciones αs-, β- y - de la caseína bovina a 40°C y pH 6.20 con la enzima salpichroína purificada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia (las barras corresponden al error estándar α=5%).

196

Estudios Aplicados

Caracterización de los hidrolizados por electroforesis

Los productos de hidrólisis obtenidos a partir de la α- y β-caseína fueron analizados por electroforesis Tricina-SDS-PAGE (Figuras 22 y 23). En las condiciones de reacción, no se observó hidrólisis significativa de la fracción κ de la caseína, por lo tanto dicho hidrolizado no fue caracterizado por electroforesis. En las calles 3, 4 y 5 de la Figura 22 (hidrolizados de α-caseína), se observó la aparición de numerosas bandas de bajo peso molecular debido al alto grado de hidrólisis que produjo la enzima sobre dicha fracción. Por otra parte, en las calles 3, 4 y 5 de la Figura 23 (hidrolizados de β-caseína) se obtuvieron sólo dos bandas bien definidas de bajo peso molecular.

Los resultados de las electroforesis refuerzan los mostrados en la Figura 21 donde

se observa que la enzima produce un mayor grado de hidrólisis sobre la fracción αs- respecto de las otras fracciones.

A B

Figura 22.- (A) Electroforesis Tricina-SDS-PAGE - Calle1: Marcadores de peso molecular (Sigma), calle 2: solución patrón de αs-caseína bovina, calles 3, 4 y 5: hidrolizados de α- caseína luego de 30, 60 y 120 minutos de digestión enzimática respectivamente y (B) densitograma de los hidrolizados de caseína en tiempo 0, 30, 60 y 120 minutos.

197

Estudios Aplicados

A B

Figura 23.- (A) Electroforesis Tricina-SDS-PAGE – Calle 1: Marcadores de peso molecular (Sigma), calle 2: solución patrón de β-caseína bovina, calles 3, 4 y 5: hidrolizados de β- caseína luego de 30, 60 y 120 minutos de digestión por acción enzimática respectivamente y (B) densitograma de los hidrolizados de caseína en tiempo 0, 30, 60 y 120 minutos.

Separación y análisis de los hidrolizados

Los productos de hidrólisis de las fracciones caseínicas fueron separados por ultrafiltración usando membranas de 10 kDa de tamaño de poro (Pouliot y col., 2005). Los péptidos separados en el permeado (péptidos con PM ≤ 10 kDa) fueron separados por RP- HPLC y analizados por espectrometría de masas (MALDI TOF/ TOF) con el objeto de determinar la masa molecular de estos péptidos aislados. Aquellas fracciones aisladas por HPLC, cuya secuencia peptídica no pudo ser determinada a partir del peso molecular informado en las bases de datos disponibles, fueron secuenciadas parcial o totalmente por degradación de Edman. Estos estudios fueron llevados a cabo en el Laboratorio de Análisis e Identificación de Proteínas (LANAIS PRO) de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires.

Se identificaron 5 péptidos a partir de la fracción α-caseína y sólo un péptido a partir de la β-caseína (Tabla 10).

198

Estudios Aplicados

Tabla 10.- Péptidos identificados en los hidrolizados de las fracciones α- y β- caseína

N° Secuencia peptídica Fragmento

1 FRQFYQLDAYPSGAW α-CN f (149-164)

2 YQLDAYPSGAW.. α-CN f (154-199)

3 FRQFYQLDAYPSGAWYY.. α-CN f (149-199)

4 YYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIPNPIGSENSEKTTMPLW α-CN f (165-199)

5 RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF α-CN f (1-23)

6 YQEPVLGPVRGPFPIIV β-CN f (193-209)

Al analizar los resultados se observa que los enlaces clivados en la cadena de la α- caseína se encuentran en la región C-terminal, entre los aminoácidos 149-199 (fracción 1: 149-164, fracción 2: 154-199, fracción 3: 149-199 y fracción 4: 165-199) y sólo uno en la región N-terminal (fracción 5: 1-23). No se produjo clivaje en la región interna de la cadena ni en las cercanías de aminoácidos fosforilados o glicosilados. El fragmento 2 contiene la secuencia (f: 157-164) a la que se le atribuye actividad antihipertensiva: (Pihlanto-Leppala y col., 1998). El fragmento 5 contiene el péptido conocido como isracidina, con actividad inmunomoduladora (Minkiewicz y col., 2000) y antimicrobiana (Lahov y Regelson, 1996). Por otra parte, en la hidrólisis de la β-caseína se aisló sólo un fragmento en el permeado que corresponde a la región C-terminal de la proteína (fragmento 6: 193-209). Este fragmento contiene el péptido β-casoquinina con actividad inmunomoduladora (Minkiewicz y col, 2000; De Felice, 1995), actividad antimicrobiana (Sandre y col., 2001) y actividad antihipertensiva (Otte y col., 2007; Yamamoto y col., 1999).

Hidrólisis de las proteínas del lactosuero bovino

El lactosuero derivado de la elaboración de quesos siempre ha sido considerado como un desecho con poco valor comercial. Su destino sigue siendo uno de los problemas más serios que enfrenta la industria láctea a nivel mundial. En los últimos años, se han incrementado las aplicaciones de este contaminante orgánico como ingrediente funcional por ser fuente de péptidos con actividad biológica (antihipertensiva, antioxidante,

199

Estudios Aplicados

antitrombótica, opioide, inmunomoduladora, antimicrobiana y antidiabética, entre otras) y por sus aplicaciones nutricionales como fuente de energía, aminoácidos esenciales y de vitaminas (Carrasco y Guerra, 2010). Las principales proteínas presentes en este subproducto son la α-La y la β-Lg que se caracterizan por poseer una estructura globular compleja que dificulta el acceso de las enzimas proteolíticas en el interior de las cadenas polipeptídicas para ser hidrolizadas cuando las proteínas están plegadas en conformación nativa. Stanciuc y col. (2010) demostraron que la susceptibilidad de las proteínas del WPC a la hidrólisis enzimática podía modificarse aplicando tratamientos térmicos.

Con el objetivo de hallar las condiciones de preparación del WPC que permitieran aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis enzimática, se evaluó la hidrólisis del sustrato sometido a dos tratamientos térmicos diferentes. El Tratamiento 1 (ST1) consistió en la desnaturalización térmica de las proteínas de un concentrado de proteínas del lactosuero (WPC) en el pH en el cuál luego se realizó la hidrólisis enzimática. Por otro lado, el Tratamiento 2 (ST2) consistió en realizar la desnaturalización térmica del WPC en solución a pH 8 y posterior ajuste del pH al valor en el que se realizó la hidrólisis enzimática. Se aplicó la metodología de diseño experimental (Montgomery, 2002), para la hidrólisis de los sustratos ST1 y ST2 preparados de acuerdo a los tratamientos térmicos ya mencionados. Se definió un diseño factorial completo 33 de tres variables independientes (pH, relación enzima:sustrato E:S y tiempo de hidrólisis T) evaluadas a tres niveles y una variable dependiente (absorbancia a 280 nm de los péptidos solubles en TCA provenientes de la hidrólisis del sustrato UA280).

Tratamiento 1 – ST1 El resultado del análisis de varianza del diseño correspondiente al 1° tratamiento se muestra en la Tabla 11.

200

Estudios Aplicados

Tabla 11.- Análisis de varianza de los factores e interacciones considerados en el modelo estadístico para la hidrólisis del ST1.

Factor ANOVA R2=0.99488; Aj=0.98336 ( ST1)

SS df MS F p (1)pH (L) 116,03 1 116,03 3,5102 0,097871 pH (Q) 18995,42 1 18995,42 574,6740 0,000000 (2)E:S(L) 1032,31 1 1032,31 31,2307 0,000517 E:S(Q) 4833,49 1 4833,49 146,2291 0,000002 (3)Tiempo 1517,85 1 1517,85 45,9200 0,000141 (hs)(L) Tiempo (hs)(Q) 14,85 1 14,85 0,4492 0,521585 1L by 2L 984,64 1 984,64 29,7886 0,000603 1L by 2Q 1,25 1 1,25 0,0377 0,850839 1Q by 2L 3,60 1 3,60 0,1089 0,749843 1Q by 2Q 19610,83 1 19610,83 593,2922 0,000000 1L by 3L 12,00 1 12,00 0,3630 0,563508 1L by 3Q 42,68 1 42,68 1,2913 0,288693 1Q by 3L 187,00 1 187,00 5,6575 0,044647 1Q by 3Q 71,40 1 71,40 2,1601 0,179831 2L by 3L 565,81 1 565,81 17,1177 0,003265 2L by 3Q 3,74 1 3,74 0,1131 0,745315 2Q by 3L 48,53 1 48,53 1,4683 0,260183 2Q by 3Q 1,56 1 1,56 0,0473 0,833204

Se encontró que los efectos lineales y cuadráticos resultaron significativos, a excepción del pH (p= 0,098) y de T2 (p= 0,52). Por otro lado, solo tres interacciones fueron significativas, pH x (E:S)2 (p=0,000…), pH x T (p= 0,045) y E:S x T (p= 0,003). Además, la interpretación del R²ajustado, cuyo valor fue 98,336, indica que el modelo ajustado explica el 98,3% de la variabilidad de la respuesta, lo que en pocas palabras significa un buen ajuste del modelo.

De acuerdo a los niveles de significancia alcanzados en el ANOVA se obtuvo un modelo de regresión múltiple para el rango establecido de los parámetros (Tabla 12), en el que se pueden apreciar las variables e interacciones de dos y tres factores, cuyos efectos resultaron significativos.

201

Estudios Aplicados

Tabla 12.- Modelo de regresión múltiple (p≤0,005) en el que se consideran los efectos de las variables y las interacciones significativas sobre la variable respuesta (Unidades de absorbancia a 280 nm o UA280).

Ecuación R2 Aj. E

UA280= 37.43 + 29.28 pH2 – 7.73 E:S + 14.48 E:S2 + 9.37 T 0.983 33.05

– 9.06 (pH x E:S) + 31.56 (pH2 x E:S2) + 3.56 (pH2 x T) –6.87 (E:S x T)

R2Aj: coeficiente de determinación corregido, E: error de la determinación.

Para obtener los valores de las variables que produjeran la máxima respuesta, es decir la máxima absorbancia a 280 nm se empleó la función desirability, la cual se obtiene estandarizando la respuesta con una función matemática cuyo valor varía de 0 (fuera del rango deseado) a 1 (en el rango deseado). La función desirability considera tres casos distintos según sea el carácter de la función objetivo. Por una parte puede ser deseable que la respuesta alcance un determinado valor objetivo, o bien se persiga la maximización o minimización de la respuesta. En este ensayo nos propusimos maximizar la respuesta, es decir la Abs a 280 nm y para eso se establecieron cotas mínimas y máximas. Los valores por encima a la cota superior fueron considerados por la función como deseables, mientras que por el contrario, valores por debajo del límite inferior fueron poco deseables como respuesta.

En la Figura 24A se observa el comportamiento de la función en el rango de valores evaluado para cada factor. En los mismos se muestra un área de máxima hidrólisis del sustrato en valores intermedios de pH y relación E:S. La Figura 24B indica que la hidrólisis también resultó ser máxima en valores intermedios de pH y que luego aumentó levemente a medida que transcurrió el tiempo de reacción. La Figura 24C muestra que la hidrólisis fue mayor a medida que aumentaba la relación E:S y el tiempo de hidrólisis.

202

Estudios Aplicados

Desirability Surface/Contours; Method: Quadratic Fit

Desirability A

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 > 0,6 0,2 < 0,6 0,1 0,0 < 0,5 -0,1 < 0,4 16

-0,2 < 0,3

14

5

, 0

12 < 0,2

,

5

2

,

0

3 ,

5 10

3

,

0 < 0,1

4

,

5

4 8

,

0

5

,

5 5

< 0

, 6

0

6

, 5 6 4, 7 < -0,1 pH 7 E:S

Desirability Desirability

B C

0,8 0,7 0,6 0,6 0,4 0,5 0,4 0,2 0,3

0,0 0,2

> 0,6

-0,2 2

2 0,1

, ,

0 0

, ,

8 8

3 3

> 0,6 < 0,6

, ,

6 6

3 3

5 , ,

4 4

2 2

,

0

, ,

2 2 2 2

, < 0,6 < 0,5

5

2 , ,

0 2 0 2

, 4

0

3

, ,

,

5 2 2 8

8 6 3

8

,

, ,

0

2 2

6 6

4 < 0,4

< 0,4

,

, ,

5 10

4 1 1

4 4

,

0

, ,

5

1 1

2 2

,

5

, ,

5

1 1 < 0,3

, < 0,2

0 0 0

6 12

, ,

1 1

,

8 8 5

6

, ,

, 14

1 1

7 < 0 16 < 0,2

0 0 7 pH Tiempo (hs) E:S Tiempo (hs)

Figura 24.- Gráficos de la función desirability para la hidrólisis del sustrato ST1, en función de relación E:S y pH (A), pH y tiempo de hidrólisis (B) y relación E:S y tiempo de hidrólisis (C)

Empleando el software Statistica se encontró que para los rangos pre-establecidos, las condiciones que favorecían la hidrólisis eran: pH 5.0, relación E:S de 10 Ucas/mg y tiempo de 3 hs.

Tratamiento 2 – ST2

Para el estudio de la hidrólisis del ST2 se procedió de la misma forma que para la hidrólisis del ST1. El análisis de la varianza mostrado en la Tabla 13 mostró que la mayoría de los factores e interacciones resultaron significativas, a excepción de T2 (p= 0,22) y las interacciones pH x (E:S)2 (p=0,34), pH x T2 (p=0,41), pH2 x T2 (p=0,16), E:S x T (p=0,32) y (E:S)2 x T2 (p=0,30). Al igual que el modelo obtenido para la hidrólisis del ST1, el modelo del ST2 presentó un buen ajuste (R2=0,90065).

203

Estudios Aplicados

Tabla 13- Análisis de varianza de los factores e interacciones considerados en el modelo estadístico para la hidrólisis del ST2.

ANOVA R2=0.92329; Aj=0.90065 ( ST2)

SS df MS F p

(1)pH (L) 24789,8 1 24789,8 42,4101 0,000000

pH (Q) 108605,4 1 108605,4 185,8007 0,000000

(2)Relación E:S(L) 195722,2 1 195722,2 334,8392 0,000000

Relación E:S(Q) 2983,6 1 2983,6 5,1043 0,027451

(3)Tiempo (Hs)(L) 16652,3 1 16652,3 28,4886 0,000001

Tiempo (Hs)(Q) 892,1 1 892,1 1,5261 0,221434

1L by 2L 41888,4 1 41888,4 71,6622 0,000000

1L by 2Q 542,3 1 542,3 0,9277 0,339267

1Q by 2L 7939,6 1 7939,6 13,5830 0,000487

1Q by 2Q 4890,2 1 4890,2 8,3661 0,005292

1L by 3L 2516,7 1 2516,7 4,3055 0,042214

1L by 3Q 404,5 1 404,5 0,6919 0,408752

1Q by 3L 4381,6 1 4381,6 7,4961 0,008092

1Q by 3Q 1153,9 1 1153,9 1,9741 0,165088

2L by 3L 576,0 1 576,0 0,9854 0,324787

2L by 3Q 5320,0 1 5320,0 9,1015 0,003722

2Q by 3L 5119,5 1 5119,5 8,7584 0,004383

2Q by 3Q 652,1 1 652,1 1,1157 0,295021

De acuerdo a los niveles de significancia alcanzados en el ANOVA en este caso también se obtuvo un modelo de regresión múltiple para el rango establecido de los parámetros (Tabla 14). En el modelo se muestran las variables e interacciones de dos y tres factores, cuyos efectos fueron significativos.

204

Estudios Aplicados

Tabla 14.- Modelo de regresión lineal múltiple (p≤0,005) en el que se consideran los efectos de las variables y las interacciones significativas sobre la variable respuesta (Unidades de absorbancia a 280 nm o UA280).

Ecuación R2 Aj. E

UA280= 112.40 + 22.42 pH + 39.46 pH2 + 60.20 E:S –6.54 E:S2+ 17.77 T - 0.900 33.05 34.11 (pH x E:S) -12.86 (pH2 x E:S) - 9.02 (pH2 x E:S2) + 8.36 (pH x T)+ 9.78 (pH2 x T – 10.53 (E:S2 x T2)+ 8.36 8pH x T) + 9.78 (pH2 x T) – 10.53 E:S2´+ 10.57 (E:S2 x T)

R2Aj: coeficiente de determinación corregido, E: error de la determinación

Aplicando la función desirability, se encontró que la hidrólisis fue máxima en valores intermedios de pH y aumentó a medida que se incrementó la relación E:S (Figura 25A). En la Figura 25B se observa que la hidrólisis disminuyó cuando aumentó el pH y se incrementó levemente cuando también lo hizo el tiempo de hidrólisis. La Figura 25C indica que la hidrólisis se modificó positivamente con la relación E:S y el tiempo de reacción.

Desirability Surface/Contours ; Method: Quadratic Fi

Desirability A

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

-0,2 16

14

,5

,0

2 12

,5

3

3 ,0

10

,5

4

,0 4

8

,5

5

5 ,0

,5

6 6

,0

6 ,5

7 4 7 pH Relación E:S Desirability Desirability C B

1,0 1,0 0,9 0,8 0,8

0,6 0,7 0,6 0,4 0,5 0,4 0,2 0,3

0,2

0,0

,2 ,2

3 ,0 3

,0 0,1

,8 3 ,8 3

2 2

,6 ,6

,5

2 ,4 2

,4 4

,0

2

2 2

,2 ,2

,5

3

6

2 2

,0 ,0 ,0

3

2 2

,8 ,8

,5 8

4

,0

1 1

4

,6 ,6

10

,5

5

1 1

,4 ,4

5 ,0

12

1 1 ,2

,2

,5

6

1 1

,0 ,0

,0 14

6

1 1

,8 ,8 ,5

7 16

0 0 7 pH Tiempo (Hs) Relación E:S Tiempo (Hs)

Figura 25. Gráficos de la función desirability para la hidrólisis del sustrato ST2, en función de la relación E:S y pH (A), pH y tiempo de hidrólisis (B) y relación E:S y tiempo de hidrólisis (C)

205

Estudios Aplicados

Las mejores condiciones de hidrólisis encontradas para el segundo diseño fueron: pH 4.0, relación E:S de 10 Ucas/mg y tiempo de 3 hs.

Con estos resultados y considerando las mejores condiciones para cada diseño, se realizó la hidrólisis enzimática de los sustratos ST1 y ST2 preparados de acuerdo a los 2 tratamientos durante 20 horas.

El GH% producido en cada caso se estimó con el método de OPA con algunas modificaciones. Como se muestra en la Figura 26, el GH% obtenido fue superior para el ST2 con un valor máximo del 9%. Se observó que la hidrólisis de ambos sustratos fue máxima a las 3 horas de reacción y luego se mantuvo constante hasta las 20 hs.

1 0

8 S T 1

6 S T 2

%

H

G 4

2

0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 T ie m p o ( h o ra s )

Figura 26.- Valores de GH% obtenidos por el método de OPA para la hidrólisis de los tratamientos ST1 y de ST2 a pH 4.0 y con una relación E:S de 10 Ucas.mg-1 de WPC durante 1, 2, 3, 10 y 20 horas. Los valores representan el promedio de tres determinaciones y las barras corresponden a la desviación estándar.

Se realizó también el análisis por electroforesis Tricina-SDS-PAGE para complementar la información referida a la hidrólisis del WPC con ambos tratamientos. En la Figura 27 se muestran los geles Tricina-SDS-PAGE correspondientes a los hidrolizados producidos por cada uno de los tratamientos y sus respectivos densitogramas. En la preparación ST2 se observó la mayor hidrólisis del sustrato, en particular de la α-La que fue hidrolizada casi completamente en las primeras 10 horas, siendo poco visible luego de las 20 horas de hidrólisis. La intensidad de la banda correspondiente a la β-Lg disminuyó levemente durante el tiempo en que se llevó a cabo el ensayo.

206

Estudios Aplicados

Este comportamiento es similar al informado para las cardosina A y B, las cuales hidrolizaron en mayor medida a la α-La. La cardosina B produjo la hidrólisis completa de esta proteína al cabo de 10 horas de reacción, mientras que la cardosina A lo hizo luego de 24 horas (Barros y Malcata, 2006).

De esta manera, se comprobó que la segunda forma de preparar el sustrato (ST2) aumentaba la susceptibilidad de las proteínas del lactosuero a la hidrólisis enzimática con el extracto crudo en las condiciones del ensayo.

M 0 1 2 3 10 20

ST1

Β Lg

α La

ST2

Β

Lg

αL

a

Figura 27.- Electroforesis Tricina- SDS-PAGE (del hidrolizado de WPC de acuerdo a los tratamientos ST1 y ST2 con el extracto crudo de Salpichroa origanifolia- Calle1: Marcadores de peso molecular (Sigma), calle 2: solución patrón de α-lactoalbúmina y -lactoglobulina, calles 3 a 7: hidrolizados de lactosuero luego de 0, 1, 2, 3, 10 y 20 hs. de digestión enzimática respectivamente. Al lado de cada gel de electroforesis se muestra su respectivo densitograma

Se sabe que el empleo de enzimas inmovilizadas en los procesos hidrolíticos presenta numerosas ventajas respecto a las enzimas libre. Es por eso que se evaluó la hidrólisis del WPC con la enzima salpichroína inmovilizada en el soporte glutaraldehído- agarosa. En primer lugar se estudió la cinética de la hidrólisis de dichas proteínas respetando las condiciones óptimas obtenidas para la hidrólisis con la enzima en solución, es decir tiempo de incubación entre 0 y 20 horas, pH 4.0 aunque en este caso se empleó una relación enzima inmovilizada: sustrato de 0.5% (p/V) equivalente a una relación de 1

207

Estudios Aplicados

Ucas.mg-1 de WPC. En forma paralela, se realizó la hidrólisis del sustrato con el extracto crudo empleando la misma relación de enzima y sustrato (Figura 28).

1 0

8

6

%

H

G 4

2 E n z im a lib re

E n z im a in m o v iliz a d a 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

T ie m p o ( h o ra s )

Figura 28.- Valores de GH% obtenidos por el método de OPA para la hidrólisis del ST2 a pH 4.0 y con una relación E:S de 1 Ucas/mg de proteínas en el lactosuero, durante 1, 2, 3, 10 y 20 horas, empleando el extracto crudo de Salpichroa origanifolia y la enzima salpichroína inmovilizada en el soporte glutaraldehído-agarosa. Los valores representan el promedio de tres determinaciones y las barras corresponden a la desviación estándar

En la Figura 28 se observa que el grado de hidrólisis alcanzado con la enzima libre aumentó linealmente durante las primeras 3 horas alcanzando un GH del 4%. Transcurrido este tiempo, la velocidad de hidrólisis disminuyó observándose un incremento del GH% hasta el 7% a las 10 horas del proceso y manteniéndose sin cambios significativos hasta las 20 horas. En cambio, cuando se empleó la enzima inmovilizada, la velocidad de hidrólisis aumentó en forma progresiva y sostenida durante las 20 horas del proceso, alcanzándose un valor final del 6% de GH%.

Una posible explicación a estas diferencias está fundamentada en las limitaciones difusionales del sustrato. La disminución de la actividad catalítica de las enzimas inmovilizadas cuando se emplean sustratos voluminosos y de alto peso molecular ha sido exhaustivamente estudiada, encontrándose que la actividad de las enzimas inmovilizadas disminuye respecto de la actividad de las mismas enzimas en solución, debido a que la unión del sustrato al sitio activo de la enzima se ve dificultada por restricciones

208

Estudios Aplicados difusionales o por obstrucción parcial del sitio activo (Rocha y col., 2011; Illanes, 2008; Jia y col., 2003).

Los resultados obtenidos en estos ensayos son similares a los informados por otros autores para la hidrólisis del lactosuero con enzimas inmovilizadas en distintos soportes. Así, por ejemplo Barros y col. (2003) obtuvieron que la enzima cardosina A inmovilizada en el soporte glutaraldehído-agarosa producía el mayor GH% luego de 5 horas de reacción, con un valor del 5.3%. Rocha y col (2010) encontraron un GH% del 4.8%, similar al informado para la hidrólisis con tripsina inmovilizada en glioxil-agarosa, luego de tres horas de reacción.

Los perfiles obtenidos por cromatografía de exclusión molecular en FPLC (SEC- FPLC) de las proteínas del lactosuero y de sus hidrolizados con la enzima inmovilizada se muestran en la Figura 29. A las 20 horas de reacción, la α-La ha sido hidrolizada completamente mientras que el pico correspondiente a la β-Lg ha disminuido en baja proporción respecto al pico de esa proteína en el sustrato sin hidrolizar. Este resultado demuestra que la enzima inmovilizada, al igual que la enzima libre, tienen preferencia para hidrolizar la α-La respecto de la β-Lg.

mAU

25.0

25.0

Β-Lg

20.020.0

Lactosuero

15.015.0

Hidrolizado

10.010.0 α-La

5.05.0

0.0 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 ml 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 ml

Figura 29.- Perfiles SEC-FPLC de una solución de WPC y de un hidrolizado de WPC con la enzima salpichroína inmovilizada en glutaraldehído-agarosa.

209

Estudios Aplicados

Actividades biológicas de los hidrolizados de lactosuero

Los hidrolizados obtenidos de las proteínas del lactosuero bovino con la enzima salpichroína inmovilizada en el soporte glutaraldehído-agarosa fueron separados secuencialmente por ultrafiltración con membranas AMICON® de 10 y 3 kDa de corte. De esta manera se obtuvieron tres fracciones, con péptidos de peso molecular mayor a 10 kDa, entre 3-10 kDa y menor a 3 kDa. La primera fracción fue descartada, mientras que en las dos restantes se evaluaron in vitro las actividades antihipertensiva, antioxidante y antimicrobiana.

Actividad antihipertensiva

La inhibición de la Enzima Convertidora de la Angiotensina (ECA) provoca un efecto antihipertensivo ya que está asociada con el sistema renina-angiotensina, regulador de la presión sanguínea periférica.

Se estudió la capacidad inhibitoria de la ECA de las fracciones de los hidrolizados de WPC cuyo peso molecular era inferior a 3 kDa y la fracción entre 3-10 kDa. Se encontró que ambas fracciones inhibían la actividad de la ECA en las condiciones del ensayo.

Como los péptidos de peso molecular inferior a 3 kDa produjeron inhibición

completa de la actividad de la enzima, se calculó el valor de IC50, cuyo valor fue de 5 µg.mL-

1. En la Tabla 15 se comparan los valores de la IC50 del lactosuero bovino y caprino hidrolizados con distintas enzimas proteolíticas de distintas fuentes.

210

Estudios Aplicados

Tabla 15.- Valores de IC50 de hidrolizados de lactosuero con distintas proteasas.

IC50 Origen Referencia (µg.mL-1)

Lactosuero caprino 81 Hernández-Ledesma, 2006 (Termolisina, 24 hs)

Lactosuero caprino (Proteinasa K) 38 Hernández-Ledesma, 2006

Lactosuero caprino 296 Hernández-Ledesma, 2006 (Quimotripsina, 24 hs)

Lactosuero caprino (Tripsina, 24 hs) 196 Hernández-Ledesma, 2006

Lactosuero bovino (GH: 18%) 202 Van der Ven, 2002

Lactosuero bovino (GH:31%) 155 Van der Ven, 2002

Lactosuero bovino (salpichroína,GH: 5 Rocha y col., 2013 6%)

Se observó que el valor de IC50 obtenido con los hidrolizados cuando se empleaba salpichroína era inferior al producido por los otros hidrolizados, sugiriendo una actividad inhibitoria más potente. Estos resultados podrían completarse con estudios in vivo.

Actividad antioxidante

Se evaluó también la actividad antioxidante, definida como la capacidad de neutralizar el radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), de los péptidos presentes en las fracciones de peso molecular inferior a 3 kDa y en la de 3-10 kDa. En forma paralela se midió la actividad antioxidante de las fracciones ultrafiltradas del WPC sin hidrolizar y se compararon los resultados. Como se muestra en la Figura 30, el WPC sin hidrolizar no presentó actividad antioxidante mientras que ambas fracciones del hidrolizado mostraron una elevada actividad.

211

Estudios Aplicados

L a c to s u e r o

6 7 .0 0 % + 1 .4 1 H id ro liz a d o

F ra c c ió n 3 -1 0 k D a

0 .6 0 % + 0 ,7 1

6 4 .0 0 % + 1 .4 1 F ra c c ió n < 3 k D a

0 .5 0 % + 0 .1 4

N e u tra l iz a c ió n d e l ra d ic a l D P P H %

Figura 30.- Actividad antioxidante (definida como la capacidad de neutralizar el radical DPPH) de las fracciones obtenidas por ultrafiltración (<3 y 3-10 kDa) del hidrolizado de WPC con la enzima salpichroína inmovilizada en el soporte glutaraldehído-agarosa. El ensayo se realizó por triplicado. Las barras indican la desviación estándar.

Peng y col. (2009) separaron cuatro fracciones de péptidos con actividad antioxidante a partir de la hidrólisis del WPC con la enzima alcalasa, encontrándose que la fracción peptídica con mayor actividad fue la que contenía péptidos entre 0.1-2.8 kDa.

Actividad antimicrobiana

Se evaluó la actividad antibacteriana de los hidrolizados del lactosuero sobre cepas de Staphyloccocus aureus, Pseudomona fluorescens, Pseudomona aeruginosa, Salmonella gallinarum, Salmonella enteritidis y Escherichia coli. Se encontró que la fracción del retenido de la ultrafiltración (3-10 kDa) presentaba una elevada inhibición del crecimiento de S. aureus (100%) y de P. fluorescens (60%) y que el permeado (< 3 kDa) producía inhibición moderada (menor del 50%) de ambas cepas microbianas. Ninguna de las fracciones mostró efecto inhibitorio significativo sobre S. gallinarum ni E. coli en las condiciones del ensayo (Figura 31).

212

Estudios Aplicados

E s c h e ric h ia c o li F ra c c ió n 3 - 1 0 k D a

F r a c c ió n < 3 k D a S a lm o n e lla g a llin a ru m

S a lm o n e lla e n te rid it is

P s e u d o m o n a f lu o re s c e n s

P s e u d o m o n a a e ru g in o s a

S ta p h ylo c o c c u s a u re u s

In h ib ic ió n %

Figura 31.- Actividad antimicrobiana de las fracciones de peso molecular inferior a 3 kDa y de 3- 10 kDa de los hidrolizados ultrafiltrados de las proteínas del lactosuero bovino.

Pellegrini y col. (2001) aislaron cuatro péptidos con actividad inhibitoria de bacterias Gram positivas a partir de hidrolizados de β-Lg con tripsina. En un trabajo posterior los mismos autores informaron que dichos péptidos además tenían efecto inhibitorio sobre ciertas bacterias patógenas contaminantes de los alimentos como Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Escherichia coli O157 (Pellegrini y col., 2001). Los estudios sobre hidrolizados de α-La con tripsina y quimotripsina mostraron que los mismos tenían actividad antimicrobiana contra hongos, virus y bacterias Gram positivas (Kamau y col., 2010; Fiat y col., 1993). Los hidrolizados de dicha proteína con pepsina no produjeron inhibición (Pellegrini y col., 1999).

Se sabe que la lactoferrina presente en el WPC es considerada como defensa natural porque es una proteína inhibitoria del desarrollo de bacterias Gram negativas (Ward y col., 2005). La hidrólisis enzimática produce la lactoferricina, péptido con actividad antimicrobiana sobre bacterias Gram positivas y Gram negativas (Oo y col., 2010; Farnaud y Evans, 2003).

213

Estudios Aplicados

Complejos de inclusión de los hidrolizados de lactosuero en β-cd

Preparación de complejos de inclusión

Con el fin de proteger la estructura de los péptidos biológicamente activos obtenidos por hidrólisis del WPC con la enzima salpichroína inmovilizada en el soporte glutaraldehído- agarosa, se evaluó la posible formación de complejos de inclusión utilizando β- ciclodextrina (β-CD) como molécula encapsulante. En este ensayo se empleó la fracción de péptidos cuyo peso molecular era inferior a 10 kDa.

La Tabla 16 muestra los resultados obtenidos del diseño de experimentos aplicado, en el cual se consideraron la temperatura, la relación β-CD:péptidos (p/p), el tiempo de contacto y sus interacciones en la formación de complejos de inclusión de péptidos y β- CD.

La variable respuesta se expresó como la proporción de β-CD que se encuentra formando complejos respecto de la cantidad inicial (C%). Se utilizó un diseño experimental 23, es decir los tres parámetros a dos niveles. Se realizaron dos réplicas del ensayo completo.

Tabla 16.- Diseño factorial completo 23, combinación de los parámetros en cada ensayo y valor de la variable dependiente para cada experimento

C (%) Experimento T R Tpo Réplica I Réplica II 1 25 1 24 53 54

2 25 1 48 63 69

3 25 2 24 52 56

4 25 2 48 69 65

5 37 1 24 37 48

6 37 1 48 64 58

7 37 2 24 94 95

8 37 2 48 100 100

T: temperatura (°C), R: relación CD:P (p/p), Tpo: tiempo (horas), C%: porcentaje de β-CD que se encuentra complejada respecto de la cantidad original.

214

Estudios Aplicados

En la Tabla 17 se muestra el análisis de varianza donde se consideraron todos los efectos lineales, las interacciones dobles y la triple.

Tabla 17.- Análisis de varianza de los factores e interacciones considerados en el modelo estadístico para la formación de complejos de los péptidos con β-CD

ANOVA R2=0.98036; Aj=0.96318

SS df MS F p (1)T 826,562 1 826,562 58,2599 0,000061 (2)R 2139,063 1 2139,063 150,7709 0,000002 (3)Tpo 612,563 1 612,563 43,1762 0,000175 1 by 2 2002,563 1 2002,563 141,1498 0,000002 1 by 3 0,562 1 0,562 0,0396 0,847139 2 by 3 39,062 1 39,062 2,7533 0,135637 1*2*3 45,562 1 45,562 3,2115 0,110891

En la Tabla se observa que los efectos principales y la interacción (T x R) fueron significativos, pero el resto de las interacciones fueron no significativas. Considerando únicamente las variables significativas se obtuvo la ecuación del modelo de regresión (Tabla 18).

Tabla 18.- Modelo de regresión lineal múltiple en el que se consideran los efectos de la relación CD:P (R), el tiempo de contacto (Tpo), la temperatura (T) y las interacciones significativas sobre la proporción de β-CD formando complejo (C).

Ecuación R2 Aj. ET C= 67.31 + 7.19T+ 1.56R + 6.19Tpo + 11.19(TxR) 0.953 18.06

R2Aj: coeficiente de determinación corregido, E: error de la determinación.

Luego se evaluó cada uno de los puntos experimentados con el modelo ajustado, lo cual permitió predecir el comportamiento de la formación de complejos (Figura 32).

215

Estudios Aplicados

Tpo 67,73

102,48 64,31 48

43,00 57,26

92,02 53,84 24 2

25 32,5

37 1 T R

Figura 32.- Valores de β-CD complejada (%) calculados a partir de la ecuación del modelo de regresión múltiple informado en la Tabla 12, considerando todas la interacciones significativas de los factores (tiempo, Temperatura y relación P:β-CD ).

Del análisis de la Figura 32 deriva que la formación de complejos fue máxima en los valores más elevados de temperatura (40°C) y relación β-CD: péptido (2:1). Del mismo modo, la formación del complejo resultó mayor para los valores más elevados de tiempo de incubación (48 horas) y temperatura.

Debido a que en los valores más altos de los rangos considerados para las variables se observó la completa formación del complejo de inclusión de la β-CD y los péptidos, esta fue la condición que se empleó para la formulación de complejos:

Relación β-CD: péptidos tiempo Temperatura

2:1 48 horas 40°C

Por otro lado, se compararon los perfiles cromatográficos (SEC-FPLC) de la fracción peptídica de peso molecular inferior a 10 kDa y de sus complejos con β-CD. Se observó la disminución de la altura de determinados picos y la aparición de otros con distintos tiempos de retención (Figura 33).

216

Estudios Aplicados

P é p t id o s

C o m p le jo s

0

4

)

A

U

m

(

0

8

0

2

2 A

0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

T ie m p o ( m in )

Figura 33.- Perfiles cromatográficos SEC-FPLC de la fracción peptídica en solución y de sus complejos con β-CD

Al comparar los cromatogramas se observó la disminución de la altura de los cinco picos presentes en la solución de péptidos correspondientes a los tiempos de retención de 20, 22, 24, 26 y 35 minutos. Por otro lado, también se apreció la aparición de tres picos prominentes con tiempos de retención de 29, 30 y 31 minutos y dos picos de menor altura pero con menores tiempos de retención (9 y 13 minutos). La aparición de dichos picos en el cromatograma, sumado a la disminución en la altura de los picos de la muestra de péptidos, sugiere la formación de nanocomplejos entre péptidos y β-CD, como los formados por β-CD con el tripéptido modelo [Ace Phe Nme] (Yeguas y col., 2011) o con el heptapéptido de veneno de serpiente Bothrops jararacá [p-Glu Asp Gly Pro Ile Pro Pro] (Lula y col., 2011). Además, los picos del cromatograma cuyos tiempos de retención fueron inferiores a 13 minutos podrían corresponder a complejos de orden superior o agregados de complejos, como los que se forman entre el compuesto antibacteriano triclocarban y HPβCD, una CD modificada (Duan y col., 2005). En este sentido, Messner y col. (2011) estudiaron el fenómeno de agregación de nanocomplejos con CD y obtuvieron que la teoría que mejor se ajusta a los datos experimentales es aquella que considera la agregación de los complejos de CD con moléculas huésped.

217

Estudios Aplicados

Los complejos liofilizados fueron analizados por calorimetría diferencial de barrido (DSC). En la Figura 34 se muestran los termogramas obtenidos de la β-CD libre, la mezcla de péptidos, el complejo de β-CD-péptidos y la mezcla física de los compuestos.

Figura 34.- Curvas de DSC de a) β-CD, b) la fracción de péptidos de peso molecular inferior a 10 kDa, c) el complejo de β-CD-péptidos y d) mezcla física.

En el termograma de la β-CD se observaron dos intensos picos endotérmicos, centrados en 91,36°C y en 321,67°C. El primero de ellos corresponde a la desolvatación de las moléculas de agua presentes en la cavidad de la β-CD, mientras que el segundo pico se atribuye al punto de fusión de la CD (Patel y col., 2008). La fracción de péptidos de peso molecular inferior a 10 kDa presentó un importante pico endotérmico centrado en 182,69°C (posible pico de fusión). Además se obtuvieron otros picos endotérmicos centrados en: 96.98°C, 110.87°C, 142.29°C, 166.05°C y 172.73°C.

La interacción entre componentes puede evidenciarse a través del análisis de un termograma de DSC. Cuando la molécula huésped se aloja dentro de la cavidad de la CD su punto de fusión, ebullición y sublimación cambia a diferentes temperaturas o desaparece. Como se observa en la figura correspondiente al termograma de la mezcla física, no

218

Estudios Aplicados

aparecen los picos de la β-CD libre, lo cual indicaría que se estableció algún tipo de interacción entre los compuestos en dicha mezcla. Por otro lado, en la figura se puede observar que el termograma correspondiente al complejo es diferente al de la mezcla física, ya que no aparecen los picos endotérmicos de los péptidos. Esto establece que hubo algún cambio en las estructuras, relativo a la formación del complejo.

Simulación del proceso de digestión gastrointestinal de los péptidos y de los complejos de inclusión.

Con el fin de producir péptidos bioactivos para su empleo como ingredientes funcionales, se evaluó el efecto de la digestión gastrointestinal simulada sobre la funcionalidad de los péptidos.

Estudios previos demostraron que las fracciones peptídicas peso molecular inferior a 3 kDa y entre 3-10 kDa presentan actividad antihipertensiva, antioxidante y antimicrobiana in vitro, sin embargo poco se sabe de la biodisponibilidad de estos péptidos ya que la actividad biológica in vivo depende de la capacidad de llegar activos a los órganos blanco luego de ser ingeridos. Por este motivo se prepararon complejos de inclusión de péptidos lácteos con β-ciclodextrinas ya que estas moléculas encapsulantes podrían preservar la estabilidad estructural y funcional de los péptidos frente al proceso de digestión gastrointestinal.

Se simuló el proceso de digestión gastrointestinal in vitro de la fracción de péptidos de peso molecular inferior a 10 kDa liofilizados y de sus complejos de inclusión en β-CDs utilizando pepsina (pH 2.0, 2 horas, 37°C, 200 rpm, relación 182 U/mg de péptidos) y pancreatina (pH 7.5 ,3 horas, 37°C, 200 rpm y relación 35 U/mg de péptidos) como enzimas digestivas. (Hernández-Ledesma, 2002) El curso del proceso se evaluó mediante la determinación de la actividad antioxidante, cuantificada por la reacción con el radical DPPH y expresada como S% (Figura 35).

Se observó que los valores de S% inicial de los péptidos y de sus complejos fueron similares del 83.3% y 88.9% respectivamente y que el valor de S% disminuyó luego de la digestión tanto en las muestras de péptidos libres como en complejos. La actividad antioxidante de los péptidos libres (hidrolizados de peso molecular inferior a 10 kDa) no varió significativamente durante la digestión gástrica (62%), sin embargo luego de la digestión pancreática disminuyó un 90% respecto del valor inicial. Los complejos de inclusión péptidos–βCD mostraron el mismo comportamiento durante la simulación de la

219

Estudios Aplicados digestión ácida pero retuvieron más del 50% de la actividad inicial durante la digestión intestinal (Figura 35).

1 0 0

%

P é p t id o s

H

P C o m p le jo s

P 8 0

D

l

a

c i

d

a 6 0

r

l

e

d

n

ó

i 4 0

c

a

z

i l

a

r t

2 0

u

e

N

0 1 2 3 4 5 T ie m p o ( h o ra s )

Figura 35.- Cambios en la capacidad secuestrante de radicales libres (DPPH) de la fracción peptídica durante la simulación de la digestión gastrointestinal

Se evaluaron también mediante SEC-FPLC los cambios producidos sobre el perfil de los péptidos y los complejos tras la acción de pepsina durante 120 minutos y de pancreatina (solución de tripsina y quimotripsina) durante 90 y 120 minutos. En el perfil cromatográfico de los péptidos libres de peso molecular inferior a 10 kDa, se observó la presencia de cinco picos correspondientes a los tiempos de retención de 20, 22, 24, 26 y 35 minutos. La pepsina eluyó en un único pico con tiempo de retención de 14 minutos mientras que la quimotripsina y la tripsina eluyeron a los 15 y 16 minutos (Figura 36).

Luego de la digestión gástrica in vitro no se observaron cambios significativos en el perfil de los péptidos. Esto puede estar relacionado con la similitud en el patrón de clivaje de pepsina y de salpichroína. Por otra parte, luego de la digestión con las enzimas pancreáticas se observó la desaparición del pico con tiempo de retención de 24 minutos y la disminución de la altura del pico que eluyó a los 22 minutos. Se observó además el aumento de los picos con mayor tiempo de retención (26 y 35 minutos) asociado con el proceso de hidrólisis y acumulación de péptidos de menor peso molecular. Estos resultados son coincidentes con los informados por Chen y Li (2012) quienes observaron que los péptidos derivados de caseínas eran hidrolizados en mayor medida por la digestión intestinal que por la digestión gástrica.

220

Estudios Aplicados

Por otro lado, en los perfiles correspondientes al proceso de digestión de los complejos de inclusión se observa la disminución de los picos con tiempos de retención 29, 30 y 31 minutos los cuales, como fue descripto en la sección anterior, corresponderían a los complejos formados (Figura 37). Este hecho podría estar relacionado con la liberación del complejo debido a un desplazamiento del equilibrio.

P é p t id o s

D ig e r id o s 2 h s

D ig e r id o s 5 h s

)

A

U

m

(

0

8

2

A

0 1 0 2 0 3 0 4 0

T ie m p o ( m in )

Figura 36.- Perfiles cromatográficos SEC-FPLC de la fracción peptídica sin digerir y sometida al proceso de digestión gastrointestinal in vitro.

C o m p le jo s D ig e r id o s 2 h s D ig e r id o s 5 h s

)

A

U

m

(

0

8

2

A

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

T ie m p o ( m in )

Figura 37.- Perfiles cromatográficos SEC-FPLC de los complejos de los péptidos con β-CDs sin digerir y sometidos al proceso de digestión gastrointestinal in vitro.

221

Estudios Aplicados

La preparación de complejos de inclusión en ciclodextrinas se presenta como una buena alternativa para la protección de péptidos antioxidantes frente al proceso digestivo para la formulación de alimentos saludables.

CAPACIDAD ANTIMICROBIANA DE LA ENZIMA SALPICHROINA

Teniendo en cuenta que algunas APs vegetales presentan actividad antimicrobiana, en este trabajo se evaluó la actividad antibacteriana de la enzima salpichroína frente a microorganismos Gram (+) y Gram (-) potencialmente patógenos para el hombre y la actividad antifúngica frente a hongos o pseudohongos que producen podredumbre en cultivos de interés agronómico.

Actividad antibacteriana de salpichroína

Se prepararon cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomona fluorecens, Pseudomona aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum. Los ensayos antibacterianos se realizaron en medio líquido y se determinó el grado de multiplicación o inhibición bacteriana por turbidimetría.

En la Figura 38 se muestran los resultados del efecto inhibitorio del desarrollo de las bacterias empleadas en este estudio. Se encontró que salpichroína (en concentración de 4 µg.mL-1) inhibió casi el 100% de la multiplicación celular de S. aureus, E. coli, S. marcescens y P. fluorecens. La misma concentración de enzima produjo un grado de inhibición del 70 al 80% del crecimiento de P. aeruginosa y K. pneumoniae y una baja inhibición de S. enteritidis y S. gallinarum.

Se ha demostrado el potencial antimicrobiano de muchas especies de la familia Solanaceae particularmente sobre E. coli y S. aureus. Silva y col. (2007) encontraron que los extractos de la especie Datura stramonium inhibía la multiplicación de cepas de P.aeruginosa, K. Pneumoniae y E. coli. Los extractos de Solanum tomentosum mostraron actividad antimicrobiana tanto frente a bacterias Gram negativas como a bacterias Gram positivas (Aliero y Afolaya, 2006). Por otra parte, los extractos de Physalis angulata, una especie ampliamente distribuida en América del Norte y del Sur, mostraron actividad

222

Estudios Aplicados inhibitoria de S. aureus y N. gonorrhoeae (Silva y col., 2005a). La mayoría de las investigaciones se han centrado en el estudio de los metabolitos secundarios como compuestos responsables de la actividad antimicrobiana de los extractos. Sin embargo, se han identificado peptidasas aspárticas en especies de Solanáceas que también exhiben actividad antimicrobiana (Pestana-Calsa y Calsa Jr., 2011). Muñoz y col. (2010) atribuyeron dicha actividad a la presencia del PSI en la estructura de la StAP de papa.

S a lm o n e l la e n te r i tid i s

S a lm o n e l la g a l l in a ru m

K le b s ie l la p n e u m o n ia e

E n te ro b a c te r a e ro g e n e s

P s e u d o m o n a a e ru g in o s a

E s c h e r i c h ia c o l i

S e r ra tia m a rc e s c e n s

P s e u d o m o n a flu o re s c e n s

S ta p h y lo c o c c u s a u re u s

In h ib ic ió n %

Figura 38.- Efecto antibacteriano de salpichroína sobre el desarrollo de cepas de S. aureus, K. pneumoniae, E. coli, S. marcescens, P. fluorecens, P. aeruginosa, S. enteritidis, y S. gallinarum. Los resultados provienen de realizar dos ensayos independientes, por triplicado cada uno. En el gráfico se muestran la media y la desviación estándar.

Para las bacterias con elevado grado de inhibición se calculó la concentración inhibitoria mínima (CIM) de salpichroina por el método de dilución. En la Figura 39 se muestra el ensayo realizado sobre Staphylococcus aureus y Serratia marcescens.

223

Estudios Aplicados

Staphylococcus aureus Serratia marcescens

11.2 5.6 2.8 1.4 0 μg.mL-1 5.6 2.8 1.4 0.7 0 μg.mL-1

Figura 39.- Concentración inhibitoria mínima de salpichroína sobre cepas de S. aureus y S. marcescens. En las imágenes se puede observar el efecto inhibitorio de la enzima en la multiplicación celular de los cultivos bacterianos

Además, para completar el ensayo se registró la absorbancia a 650 nm (OD) de las cepas bacterianas en presencia de distintas concentraciones de la enzima. Los datos fueron analizados por regresión no lineal aplicando la ecuación de los cuatro parámetros con el software GraphPad. Se obtuvieron las curvas dosis-respuesta de salpichroína frente a las distintas cepas bacterianas (Figura 40).

E s c h e r ic h ia c o li 1 0 0 S ta p h y lo c o c c u s a u re u s

S e r ra t ia m a r c e s c e n s 7 5 P s e u d o m o n a a e ru g in o s a

P s e u d o m o n a f lu o re s c e n s %

D

5 0 O

2 5

0 0 1 2 3 4

C o n c e n tra c ió n d e s a lp ic h r o ín a (µ g / m L )

Figura 40. – Ajuste de las curvas dosis-respuesta de salpichroína frente a S. aureus, E. coli, S. marcescens, P. aeruginosa, P. fluorescens, empleando un modelo de cuatro parámetros. En todos los casos se obtuvieron valores de R=0.999

224

Estudios Aplicados

En la Tabla 19 se observan los valores de IC50 y CIM para los microorganismos con alto porcentaje de inhibición del desarrollo (Tabla 19).

Tabla 19.- Propiedades antimicrobianas in vitro de salpichroína frente a las distintas cepas bacterianas

Microorganismo IC50 a (μg.mL-1) CIM b (μg.mL-1)

S. marcescens 0.93 2.1

P. aeruginosa 0.65 C.N.D.

P. fluorescens 1.04 C.N.D.

S. aureus 1.49 2.6

E. coli 1.60 C.N.D.

a IC50 (μg.mL-1) es el valor medio para cada combinación salpichroína-microorganismo, obtenido por el cálculo promedio del valor estimado IC50 en al menos dos experimentos independientes. El coeficiente de variación entre los experimentos fue siempre menor del 20%. b CIM (μg.mL-1) es la concentración mínima que produce una inhibición completa en todos los experimentos independientes para cada combinación salpichroína-microorganismo. C.N.D., no determinado

Los valores de IC50 de salpichroína obtenidos frente a S. aureus, E. coli, S. marcescens, P. aeruginosa y P. fluorecens estuvieron en el rango de 0.65 a 1.60 μg.mL-1, resultando los valores más bajos para S. marsescens y P. aeruginosa.

Los valores de la CIM de salpichroína fueron de 2.1 y 2.6 μg.mL-1 para S. marcescens y S. aureus, respectivamente.

La ciprofloxacina es un antibiótico de amplio espectro y presenta una CIM de 0.005 a 0.8 μg.mL-1 frente al 90% de las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Específicamente tiene un valor de CIM de 0.01 a 0.02 μg.mL-1 frente a S. typhi y E. coli y de 0.1 a 0.8 μg.mL-1 frente a S. aureus (Chin y Neu, 1984). Estos valores son levemente inferiores a las CIM calculadas para salpichroína frente a S. aureus.

Con estos experimentos se comprobó que salpichroína inhibe el desarrollo de bacterias potencialmente patógenas para el hombre de manera dosis-dependiente. Del mismo modo, Muñoz y col. (2010) informaron que las APs de papa StAp1 y StAp3

225

Estudios Aplicados

producen la inhibición de S. aureus con un valor de CIM inferior al obtenido para salpichroína (0.4 y 0.25 μg.mL-1, respectivamente).

Actividad antifúngica de salpichroína

Se estudió también el efecto de salpichroína sobre la inhibición del desarrollo miceliar de Phytophthora capsici, Macrophomina phaseolina y Sclerotium rolfsii aplicando un método de dos etapas. En la primera etapa se sumergieron tres discos de agar cortados con sacabocados y con crecimiento de micelio, en agua, en buffer de fosfatos de pH 7.0 y en una solución de la enzima salpichroína de concentración 72 μg.mL-1. Se incubaron las muestras durante 24 horas y se evaluó luego la viabilidad celular colocando los discos incubados en cada una de las tres soluciones en el centro de una placa de Petri con el medio de cultivo agarizado y estéril correspondiente (V8 para Phytophthora capsici y PDA para Macrophomina phaseolina y Sclerotium rolfsii). Las placas fueron incubadas durante 10 días a temperatura ambiente.

En las Figuras 41, 42 y 43 se muestran los resultados de los ensayos. Como era esperable, los discos sumergidos en agua y en buffer mostraron desarrollo miceliar de las cepas en las placas agarizadas. Los discos incubados en la solución de salpichroína mostraron diferente capacidad fungicida sobre los hongos fitopatógenos estudiados.

El hongo Sclerotium rolfsii es un fitopatógeno que afecta más de 100 especies de plantas y se encuentra ampliamente distribuido a nivel mundial. La característica más importante es que produce el marchitamiento de las plantas que afecta, produciendo un abundante micelio blanco en torno a los tejidos muertos. Entre las especies de interés agroindustrial, las más afectadas son el maní, el girasol, la papa, la zanahoria, el tomate, el olivo, el ajo y la soja.

En el ensayo encontramos que la solución de salpichroína no produjo inhibición del crecimiento miceliar de S. rolfsii, sin embargo encontramos que el crecimiento fue más lento durante los primeros 3 días aunque a los 10 días no se observaron diferencias de crecimiento en las muestras (Figura 41).

226

Estudios Aplicados

Sclerotium rolfsii

3 días

1 2 3 10 días

Figura 41.- Desarrollo de S. rolfsii en medio de cultivo PDA incubado durante 3 y 10 días a temperatura ambiente. El tratamiento 1 corresponde a la preincubación de un disco con micelio fúngico en agua, el 2 en solución 50 mM de buffer fosfatos pH 7.0 y el 3 en solución de salpichroína.

Macrophomina phaseolina es el hongo causante de la pudrición carbonosa del tallo de algunas especies de importancia agronómica. Entre ellas podemos citar al maíz, la soja, el frijol, el sorgo, el algodón y el girasol. La infección por este hongo está ampliamente distribuida en el mundo y genera muchas pérdidas económicas pues resiste altas temperaturas y condiciones de estrés hídrico.

En estos ensayos no se observaron efectos inhibitorios del crecimiento del micelio cuando fueron tratados con la enzima salpichroína. El micelio proveniente de los tres tratamientos creció en forma uniforme en cada placa durante los tiempos de incubación considerados. Se observa el aspecto carbonoso en las placas, típico de la infección por este hongo (Figura 42).

227

Estudios Aplicados

Macrophomina phaseolina

3 días

1 2 3 10 días

Figura 42.- Desarrollo de M. phaseolina en medio de cultivo PDA incubados durante 3 y 10 días a temperatura ambiente. El tratamiento 1 corresponde a la preincubación de un disco con micelio fúngico en agua, el 2 en solución 50 mM de buffer fosfatos pH 7.0 y el 3 en solución de salpichroína.

Phytophthora capsici es un oomicete patógeno de plantas que causa la putrefacción y tizón tardío de una gran variedad de huéspedes, incluidos muchos de los miembros de la familia Solanaceae y Cucurbitaceae así como Fabaceae. Entre los cultivos de interés agroeconómico afectados se encuentran los cultivos de papa, de batata, de tomate, de pimiento, de berenjena y de zapallitos.

En los ensayos microbiológicos, se encontró que la enzima salpichroína ejercía un fuerte efecto citotóxico sobre cepas de P. capsici ya que no se observó desarrollo del micelio luego de la incubación en la solución enzimática durante los 10 días del ensayo (Figura 43).

228

Estudios Aplicados

Phytophthora capsici

3 días

1 2 3 10 días

Figura 43.- Desarrollo de P. capsici en medio de cultivo V8 incubados durante 3 y 10 días a temperatura ambiente. El tratamiento 1 corresponde a la preincubación de un disco con micelio fúngico en agua, el 2 en solución 50 mM de buffer fosfatos pH 7.0 y el 3 en solución de salpichroína.

Estos resultados son similares a los informados por Guevara y col. (2006) quienes encontraron que las aspartil peptidasas de hoja y tubérculos de papa, StAP1 y StAP3, mostraban acción fungicida frente a Phythophtora infestans y Fusarium solani, plagas que infectan los cultivos de papa.

Una posible explicación a este efecto podría considerar a las peptidasas aspárticas de origen vegetal como parte fundamental del mecanismo de defensa de las plantas ya que se ha observado que, frente a la infección por microorganismos patógenos, cumplen un rol activo en respuesta a distintos estímulos bióticos y abióticos (Hatsugai y col., 2009; Mosolov y Valueva, 2006). Por otra parte, Muñoz y col. (2014) comprobaron que la actividad antifúngica de StAp1 y StAP3 estaba relacionada con la presencia del PSI, dominio específico de las APs, que presenta alta homología estructural con las proteínas del tipo saposinas (SAPLIPs) y que actúa desestabilizando la membrana fosfolipídica del

229

Estudios Aplicados

oomicete, provocando la formación de poros y la pérdida de viabilidad celular del patógeno.

Comprobada la actividad citotóxica de la enzima sobre P. capsici, se determinó la CIM de salpichroína sobre el crecimiento in vitro del microorganismo. En la Figura 44 se muestra la capacidad antimicrobiana de la enzima frente a este patógeno. El valor de la

CIM fue de 36 μg.mL-1, similar al informado por Mendieta y col. (2006) para StAP1 y StAP3 sobre P. infestans.

-1 0 18 36 72 μg.mL

Figura 44.- Concentración inhibitoria mínima de salpichroína (µg.mL-1) sobre P. capsici

Evaluación de la citotoxicidad in vivo de salpichroína sobre la infección causada por Phythophtora capsici en zapallitos verdes (Cucurbita maxima, var. zapallito)

En base a los resultados obtenidos previamente, podemos considerar que salpichroína presenta interesantes propiedades antimicrobianas sobre el crecimiento in vitro del fitopatógeno P. capsici, oomicete que genera grandes pérdidas en la producción de vegetales como zapallitos, pimientos y berenjenas entre otros.

Con el fin de comprobar la actividad citotóxica in vivo de la enzima, se llevaron a cabo experimentos de inoculación controlada de salpichroína sobre zapallitos verdes infectados por P. capsici.

Se sabe que en este tipo de ensayos influyen muchos factores que pueden provocar una importante variabilidad experimental, entre ellos el inóculo inicial del hongo, la variabilidad genética y procedencia de los zapallitos, las condiciones medioambientales de cultivo y la manipulación post-cosecha.

230

Estudios Aplicados

Teniendo en cuenta estos factores los ensayos se realizaron con vegetales de diferentes comercios.

El bioensayo consistió en colocar un disco de agar con micelio de Phytophthora capsici en activo crecimiento en la piel de zapallitos limpios. Sobre el cultivo se colocó una solución estéril de salpichroina (72 μg.mL-1) o el mismo volumen de agua estéril para el caso del control positivo. Para los controles negativos se usó agar. Se incubó a 24°C en cámara húmeda durante 4 días y se registró la severidad de la lesión.

Luego de la incubación se observaron signos de patogenicidad sobre todos los controles positivos. Las muestras tomadas de la superficie de dichos frutos confirmaron que se trataba de P. capsici, debido a la presencia de esporangios con pedicelos típicamente largos (Figura 45 A). Los zapallitos sobre cuyos inóculos fue colocada la solución de enzima no presentaron signos de infección, y al igual que los controles negativos permanecieron asintomáticos (Figura 45 B). Este comportamiento se repitió en todas las réplicas del ensayo.

231

Estudios Aplicados

Figura 45.- Fotografías de una de las réplicas de 3 zapallitos utilizadas en el experimento de biocontrol. A: imagen al microscopio óptico (40x) de P. capsici tomada de la superficie de los controles positivos. B: bioensayo constituido por control positivo (agua y P. capsici), muestas (salpichroína y P. capsici) y control negativo (agua y agar esteril, sin P. capsici) sobre zapallitos verdes.

Como conclusión de estos ensayos podemos afirmar que salpichroína, la AP aislada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia, puede controlar la infección de P. capsici sobre zapallitos verdes, probablemente por efecto citotóxico, ya a que el PSI de las APs puede interaccionar con la membrana celular del oomicete provocando la pérdida de viabilidad celular (Muñoz y col., 2014; Bryksa y col., 2011).

Estos resultados son muy promisorios ya que la búsqueda de compuestos naturales para el control de plagas que afectan cultivos de importancia agroalimentaria es un tema de interés social y económico.

232

Estudios Aplicados

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adler-Nissen, J. (1986) Enzymic hydrolysis of food proteins. Elsevier Applied Science Publishers.

Adler-Nissen J; Olsen H.S. (1979) The influence of peptide chain length on taste and functional properties of enzymatically modified soy protein. ACS Symposium Series, 92:125-146.

Agawa,Y.; Lee,S.; Ono,S.; Aoyagi,H.; Ohno,M.; Taniguchi,T.; Anzai,K.; Kirino,Y. (1991) Interaction with phospholipid bilayers, ion channel formation, and antimicrobial activity of basic amphipathic α-helical model peptides of various chain lengths. Journal of Biological Chemistry, 266:20218-20222.

Ahmed, A.B.F.; Babiker, E.E.; Mori, N.; Mohamed Ahmed, I.A. (2011) Hydrolysis of Ovine and Caprine Caseins by Enzymatic Extract from Solanum dubium Seeds. Australian Journal of Basic and Applied Science, 5(3):331-336.

Akerele, O. (1993) Las plantas medicinales: Un tesoro que no debemos desperdiciar. Foro Mundial de la Salud, 14(4):390-395.

Alashi, A.M.; Blanchard, C.L.; Mailer, R.J.; Agboola, S.O. (2013) Technological and Bioactive Functionalities of Canola Meal Proteins and Hydrolysates. Food Reviews International, 29(3):231-260.

Aliero, A. A.; Afolayan, A. J. (2006). Antimicrobial activity of Solanum tomentosum. African Journal of Biotechnology, 5(4):369-372.

Alonso J. (1998) Tratado de Fitomedicina. Bases clínicas y farmacológicas. ISIS Ed., Buenos Aires, Argentina.

Alonso, J.; Desmarchelier, C. (2005) Plantas medicinales autóctonas de la Argentina: Bases Científicas para su Aplicación en Atención Primaria de la Salud. Fitociencia Ed., Buenos Aires, Argentina. Primera Edición.

Alvarez-Ordóñez, A.; Máire Begley, Tanya Clifford. (2013) Casein f(183−207) α s2 Peptide Variants of the Milk-Derived Antimicrobial. Applied and Environmental Microbiology, 79(17):5179-5185.

Amiza, M. A.; Kong, Y.L.; Faazaz, A. L. (2012) Effects of degree of hydrolysis on physicochemical properties of Cobia (Rachycentron canadum) frame hydrolysate, International Food Research Journal, 19(1): 199-206

233

Estudios Aplicados

Araujo Diaz, J.; R. Salas Asencios; (2008) Actividad antimicrobiana de plantas. Revista Científica del Sur, 6(2):6-18.

Assenat, L. (1985) Le lait de brebis:composition et proprietes. En: Laits et Produits Laitiers: Vache, Brebis, Chevre”. F. M. Luquet Edt., Technique et Documentation Lavoisier, Paris, France.

Atanasova, J; Ivanova, I. (2010) Antibacterial peptides from goat and sheep milk proteins. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 24(2):1799-1803.

Barros, R.M.; Malcata, F.X. (2006). Molecular Characterization of Peptides Released from β- Lactoglobulin and α-Lactalbumin via Cardosins A and B. Journal of Dairy Science, 89(2):483-494.

Benítez, R.; Ibarz, A.; Pagan, J. (2008) Hidrolizados de proteína: procesos y aplicaciones. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, 42 (2): 227-36

Benkerroum, N. (2010) Antimicrobial peptides generated from milk proteins: a survey and prospects for application in the food industry. International Dairy Journal, 63(3):320- 338

Benlounissi, A.; Mechakra-Maza, A.; Blum, L. J.; Marquette, C.A. (2014). Identification and characterization of milk-clotting proteases produced by two species of mold. African Journal of Biotechnology, 13(11):1275-1280.

Berridge, N.J. (1952) An improved method of observing the clotting of milk containing rennin. Journal of Dairy Research, 19(03):328-329.

Bhardwaj, G.; Singh, Ḃ. (2013) Optimization of conditions for production of bioactive peptides showing antimicrobial effect on bacterial pathogens during fermentation of bovine milk with Lactic Acid Bacteria. International Journal of Cell Science and Biotechnology, 2:11-14

Britto, S.J.; Senthilkumar, S. (2001) Antibacterial activity of Solanum incanum L. leaf extracts. Asian Journal of Microbiology, Biotechnology and Environmental Sciences, 3(1):65-66.

Cai, B.; Pan, J.; Wu, Y.; Wan, P.; Sun, H. (2013) Immune functional impacts of oyster peptide- based enteral nutrition formula (OPENF) on mice: a pilot study. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 31(4):813-820

234

Estudios Aplicados

Canigueral, S.; Dellacassa, E.; Bandoni, A.L. (2003). Plantas Medicinales y Fitoterapia:¿ indicadores de dependencia o factores de desarrollo? Acta Farmacéutica Bonaerense, 22(3):265-279.

Carrasco, C.A.; Guerra, M.; (2010) Lactosuero como fuente de péptidos bioactivos. Anales Venezolanos de Nutrición, 23(1): 42-49.

Castillo, M.: Payne, F.A.; Hicks, C.L.; Lopez, M.B. (2000). Predicting cutting and clotting time of coagulating goat's milk using diffuse reflectance: effect of pH, temperature and enzyme concentration. International Dairy Journal, 10(8):551-562.

Castillo, M.; Payne, F. A.; Hicks, C. L.; Laencina, J.; López, M. B. (2003). Effect of protein and temperature on cutting time prediction in goats' milk using an optical reflectance sensor. Journal of Dairy Research, 70(02):205-215.

Chazarra, S.; Sidrach, L.; López-Molina, D.; Rodríguez-López, J. N. (2007). Characterization of the milk-clotting properties of extracts from artichoke (Cynara scolymus, L.) flowers. International Dairy Journal, 17(12):1393-1400.

Chen, M.; Li, B. (2012) The effect of molecular weights on the survivability of casein-derived antioxidant peptides after the simulated gastrointestinal digestion, Innovative Food Science and Emerging Technologies, 16: 341-348

Chin, N.X.; Neu, H.C. (1984). Ciprofloxacin, a quinolone carboxylic acid compound active against aerobic and anaerobic bacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 25(3):319-326.

Chirino, Y. I.; Orozco-lbarra, M.; Pedraza-Chaverrí, J. (2006) Evidencias de la participación del peroxinitrito en diversas enfermedades. Revista de Investigación Clínica, 58(4):350-358.

Correa, A.P.F.; Daroit, D.J.; Coelho, J.; Meira, S.M.; Lopes, F.C.; Segalin, J.; Risso, P.H.; Brandelli, A. (2011) Antioxidant, antihypertensive and antimicrobial properties of ovine milk caseinate hydrolyzed with a microbial protease. Journal of the Science of Food and Agriculture, 91 (12): 2247–2254.

Dalgleish, D.G. (2011) On the structural models of bovine casein micelles—review and possible improvements. Soft Matter, 7(6):2265-2272.

Dalgleish, D.G.; Corredig, M. (2012) The structure of the casein micelle of milk and its changes during processing. Annual Review of Food Science and Technology, 3:449- 467.

235

Estudios Aplicados

Darewicz, M.; Iwaniak, A.; Minkiewicz, P. (2014) Biologically active peptides derived from milk proteins. Medycyna Weterynaryjna, 70(6):348-352

Dávalos, A.; Miguel, M.; Bartolomé, B.; López-Fandiño, R. (2004) Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis. Journal of Food Protection, 67(9):1939-44

DeFelice, S.L. (1995) The nutraceutical revolution: its impact on food industry. Trends in Food Science and Technology, 6:59-61.

Del Valle, E. M. (2004) Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochemistry, 39(9):1033-1046.

Drøhse, H.B.; Foltmann, B. (1989). Specificity of milk-clotting enzymes towards bovine κ- casein. Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 995(3):221-224.

Duan, M.S., Zhao, N., Össurardóttir, Í.B., Thorsteinsson, T., Loftsson, T. (2005). Cyclodextrin solubilization of the antibacterial agents triclosan and triclocarban: formation of aggregates and higher-order complexes. International Journal of Pharmaceutics, 297(1):213-222.

Erdmann, K.; Cheung, B. W.; Schröder, H. (2008) The possible roles of food-derived bioactive peptides in reducing the risk of cardiovascular disease. The Journal of Nutritional Biochemistry, 19(10):643-654.

Esteves, C. L.; Lucey, J. A.; Pires, E. (2002). Rheological properties of milk gels made with coagulants of plant origin and chymosin. International Dairy journal, 12(5):427-434.

Farnaud, S., Evans, R. W. (2003). Lactoferrin—a multifunctional protein with antimicrobial properties. Molecular Immunology, 40(7):395-405.

Fiat, A.M., Migliore-Samour, D., Jollès, P., Drouet, L., Sollier, C.B.D.; Caen, J. (1993). Biologically active peptides from milk proteins with emphasis on two examples concerning antithrombotic and immunomodulating activities. Journal of Dairy Science, 76(1):301-310.

Fitzgerald, R.J.; Murray, B.A. (2006) Bioactive peptides and lactic fermentations. International Journal of Dairy Technology, 59(2):118-125.

236

Estudios Aplicados

Fitzgerald, P.; Cotter, D. (2011) Altering the Composition of Caseicins A and B as a Means of Determining the Contribution of Specific Residues to Antimicrobial Activity. Applied and Environmental Microbiology, 77(7): 2496–2501.

Foegeding, E. A.; Davis, J.P. (2011) Food protein functionality: A comprehensive approach. Food Hydrocolloids, 25(8):1853-1864,

Foltmann, B.F. (1966) A review on prorennin and rennin. Compets Rendun des travaux des laboratories Carlsberg, 35(8): 143-231.

Fox, P.F. (1993). Cheese: an overview. En: Cheese: chemistry, physics and microbiology. Springer, Estados Unidos.

Fuchs, M.; Turchiuli, C.; Bohin, M.; Cuvelier, M.E.; Ordonnaud, C.; Peyrat-Maillard, M.N.; Dumoulin, E. (2006). Encapsulation of oil in powder using spray drying and fluidised bed agglomeration. Journal of Food Engineering, 75(1):27-35.

Fuglsang, A.; Rattray, F. P.; Nilsson, D.; Nyborg, N. C. (2003) Lactic acid bacteria: inhibition of angiotensin converting enzyme in vitro and in vivo. Antonie Van Leeuwenhoek, 83(1):27-34.

Gee, M. L.; Burton, M.; Grevis-James, A.; Hossain, M. A.; McArthur, S.; Palombo, E. A.; Wade, J.D.; Clayton, A. H. (2013). Imaging the action of antimicrobial peptides on living bacterial cells. Scientific Reports, 3: doi:10.1038/srep01557

Gonzalez-Perez, E.; Yanez-Morales, M. J.; Santiago-Santiago, V.; Montero-Pineda, A. (2004). Fungi biodiversity on pepper wilt and some related factors, in Tlacotepec de Jost Manzo, El Verde, Puebla. Agrociencia, 38(6), 653-661.

Gonzalez Siso, M.I. (1996). The biotechnological utilization of cheese whey: A review. Bioresource Technology, 57 (1): 1–11.

Grandillo, S.; Chetelat, R.;Knapp, S.; Spooner, D.; Peralta, I.; Cammareri, M.; Perez, O.; Termolino, P.; Tripodi, P.; Chiusano, M.L.; Ercolano, M.R.; Frusciante, L.; Monti, L.; Pignone, D. (2011) Solanum sect. Lycopersicon. En: Wild Crop Relatives: Genomic and Breeding Resources. Kole, C. Edt. Springer, Berlin Heidelberg

Guadix, A.; Guadix, E.M.; Páez-Dueñas, M. P.; González-Tello, P.; Camacho, F. (2000) Procesos tecnológicos y métodos de control en la hidrólisis de proteínas. Ars Pharmaceutica, 41:1:79-89.

237

Estudios Aplicados

Guevara, M. G.; Oliva, C. R.; Huarte, M.; Daleo, G. R. (2002). An aspartic protease with antimicrobial activity is induced after infection and wounding in intercellular fluids of potato tubers. European journal of Plant Pathology, 108(2):131-137.

Guevara, M. G.; Veríssimo, P.; Pires, E.; Faro, C.; Daleo, G. R. (2004) Potato aspartic proteases: induction, antimicrobial activity and substrate specificity. Journal of Plant Pathology, 86: 233–238.

Guevara, M.G.; Almeida, C.; Mendieta, J.R.; Faro, C.J.; Verissimo, P.; Pires, E.V.; Daleo, G.R. (2005) Molecular cloning of a potato leaf cDNA encoding an aspartic protease (StAsp) and its expression after P.infestans infection. Plant Physiology and Biochemistry, 43:882-889.

Guiama, V. D.; Libouga, D. G.; Ngah, E.; Mbofung, C. M. (2010). Milk-clotting activity of berries extracts from nine Solanum plants. African Journal of Biotechnology, 9(25):3911- 3918.

Gustchina, E.; Rumsh, L.; Ginodman, L.; Majer, P.; Andreeva, N. (1996). Post X-ray crystallographic studies of chymosin: the existence of two structural forms and the regulation of activity by the interaction with the histidine-proline cluster of κ-casein. FEBS Letters, 379(1):60-62.

Hambraeus, L (1982). Nutritional Aspects of Milk Proteins. Fox, P.F. Edt., Developments in Dairy Chemistry–1: Proteins. Applied Science Publishers, London.

Hanumegowda, U.M.; Wu, Y.; Adams, S.P. (2014) Potential Impact of Cyclodextrin- Containing Formulations in Toxicity Evaluation of Novel Compounds in Early Drug Discovery. Journal of Pharmaceutical Sciences and Pharmacology, 2(1):1-5.

Harboe, M.; Broe, M. L.; Qvist, K. B. (2010) The Production, Action and Application of Rennet and Coagulants, in Technology of Cheesemaking, B. A. Law y A. Y. Tamime Eds, Wiley- Blackwell, Oxford, Inglaterra.

Hartmann, R.; Meisel, H. (2007) Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current Opinion in Biotechnology, 18(2):163-169

Hashim, M. M.; Mingsheng, D.; Iqbal, M. F.; Xiaohong, C. (2011) Ginger rhizome as a potential source of milk coagulating cysteine protease. Phytochemistry, 72(6):458-464.

Hatsugai, N., Iwasaki, S., Tamura, K., Kondo, M., Fuji, K., Ogasawara, K.; Hara-Nishimura, I. (2009). A novel membrane fusion-mediated plant immunity against bacterial pathogens. Genes and Development, 23(21):2496-2506.

238

Estudios Aplicados

Hernández-Ledesma, B. (2002) Tesis Doctoral: Caracterización y bioactividad de péptidos Obtenidos a partir de proteínas lácteas Mediante hidrólisis enzimática y procesos Fermentativos Directores: Lourdes Amigo Garrido y María Isidra Recio Sánchez, Facultad De Farmacia, Departamento de Nutrición y Bromatología II, Universidad Complutense De Madrid.

Hernández-Ledesma, B.; Dávalos, A.; Bartolomé, B.; Amigo, L. (2005). Preparation of antioxidant enzymatic hydrolysates from α-lactalbumin and β-lactoglobulin. Identification of active peptides by HPLC-MS/MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(3):588-593.

Hernández-Ledesma, B.; Ramos, M.; Recio, I.; Amigo, L. (2006). Effect of β-lactoglobulin hydrolysis with thermolysin under denaturing temperatures on the release of bioactive peptides. Journal of Chromatography A., 1116: 31-37.

Hernández-Ledesma, B.; Quirós, A.; Amigo, L.; Recio, I. (2007). Identification of bioactive peptides after digestion of human milk and infant formula with pepsin and pancreatin. International Dairy Journal, 17(1):42-49.

Hernandez-Ledesma, B.; Recio, I.; Amigo, L. (2008). β-Lactoglobulin as source of bioactive peptides. Amino Acids, 35(2):257-265.

Hernández-Ledesma, B..; García-Nebot, M.J.; Fernández-Tomé, S.; Amigo, L.; Recio, I. (2014) Dairy protein hydrolysates: Peptides for health benefits, International Dairy Journal, 38(2):82-100

Hinz, K.; O'Connor, P.M.; Huppertz, T.; Ross, R.P.; Kelly, A.L. (2012). Comparison of the principal proteins in bovine, caprine, buffalo, equine and camel milk. Journal of Dairy Research, 79:185-191.

Ibrahim, H. R.; Sugimoto, Y.; Aoki, T. (2000). Ovotransferrin antimicrobial peptide (OTAP- 92) kills bacteria through a membrane damage mechanism. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1523(2):196-205.

IDF standard 110A (1987). Calf rennet and adult bovine rennet determination of chymosin and bovine pepsin contents (Chromatographic method).

Illanes, A. (2008). Enzyme Biocatalysis: Principles and Applications. Springer, Londres.

Illanes, A. (2011) Whey upgrading by enzyme biocatalysis. Electronic Journal of Biotechnology, 14(6) DOI: 10.2225/vol14-issue6-fulltext-11

239

Estudios Aplicados

Iribarren M.J.; González B.A.; Steciow, M.M. (2013) Patogenicidad de aislamientos de Phytophthora capsici en Solanáceas y Cucurbitáceas XXXIV Jornadas Argentinas de Botánica, Lugar: La Plata.

Jabbari, S.; Hasani, R.; Kafilzadeh, F.; Janfeshan, S. (2012) Antimicrobial Peptides from Milk Proteins: A Prospectus. Annals of Biological Research, 3 (11):5313-5318.

Jacob, M.; Jaros, D.; Rohm, H. (2011), Recent advances in milk clotting enzymes. International Journal of Dairy Technology, 64: 14–33.

Jia, H., Zhu, G., Wang, P. (2003). Catalytic behaviors of enzymes attached to nanoparticles: the effect of particle mobility. Biotechnology and Bioengineering, 84(4):406-414.

Joye, I. J.; McClements, D. J. (2014). Emulsifying and Emulsion-Stabilizing Properties of Gluten Hydrolysates. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 62(12):2623-2630

Knežević-Jugović, Z. D.; Stefanović, A. B.; Žuža, M. G.; Milovanović, S. L.; Jakovetić, S. M.; Manojlović, V. B.; Bugarski, B. M. (2012). Effects of sonication and high-pressure carbon dioxide processing on enzymatic hydrolysis of egg white proteins. Acta Periodica Technologica, (43):33-41.

Korhonen, H. (2009). Milk-derived bioactive peptides: From science to applications. Journal of Functional Foods, 1(2):177-187.

Kotowicz, N. K.; Frąc, M.; Lipiec, J. (2014). The Importance of Fusarium Fungi in Wheat Cultivation–Pathogenicity and Mycotoxins Production: A Review. Journal of Animal and Plant Sciences, 21(2):3326-3343.

Kumar, D. A.; Manikandan, P.; Sumitra, M.; Raju, K. V. N.; Gayathri, C.; Arutselvan, N.; Puvanakrishnan, R. (2002). A novel peptide derivative exhibits antiinflammatory and antioxidant activity in adjuvant induced arthritis in rats .Molecular and Cellular Biochemistry, 229(1-2):9-17.

Kumar, M. S.; Kumar, D. V.; Kumar, A. S.; Aslam, A.; Shajahan, A. (2011). The phytochemical constituents of Withania somnifera and Withania obtusifolia by GCMS analysis. International Journal of Pharamacognosy and Phytochemical Research, 3(3):31-34.

Kamau, S. M., Cheison, S. C., Chen, W., Liu, X. M., Lu, R. R. (2010). Alpha-Lactalbumin: Its Production Technologies and Bioactive Peptides. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 9(2):197-212.

240

Estudios Aplicados

Kurkov, S.V.; Loftsson, T. (2013) Cyclodextrins. International Journal of Pharmaceutics, 453(1):167-180

Lahov, E; Regelson, R. (1996) Antibacterial and immunostimulating casein-derived substances from milk: casecidin, isracidin peptides. Food and Chemical Toxicology, 34:131-145.

Lagaude, A.; Fernandez, L.; Cuq, JL.; Marchesseau, S. (2004) Characterization of curd formation during the rennet coagulation of milk by an optical microscopic method. International Dairy Journal, 14:1033-1039.

Langmaier, F.; Mokrejs, P.; Kolomaznik, K.; Mládek, M. (2008). Biodegradable packing materials from hydrolysates of collagen waste proteins. Waste Management, 28(3):549-556

Lignitto, L.; Cavatorta, V.; Balzan, S.; Gabai, G.; Galaverna, G.; Novelli, E.; Sforza, S.; Segato, S. (2010). Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of water-soluble extracts of Asiago d'allevo cheese. International Dairy journal, 20(1):11-17.

Lin, R. F.; Wang, L.; and Liu, X. F. (2006). Study on the preparation of paprika pigment-β- cyclodextrin inclusion compound and the physicochemical test. Food Research and Development, 3:72.

Liu, J. R.; Chen, M. J.; Lin, C. W. (2005). Antimutagenic and antioxidant properties of milk- kefir and soymilk-kefir. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(7):2467- 2474.

López-Expósito, I.; Recio, I. (2006). Antibacterial activity of peptides and folding variants from milk proteins. Int. Dairy J. 16:1294-1305. Mackie I.M. (1982). Fish protein hydrolysates. Process Biochemistry, 31:26-28

López-Expósito, I.; Recio, I. (2008) Protective effect of milk peptides: Antibacterial and antitumor properties. In Advances in experimental medicine and biology: Bioactive components of milk. Z. Bösze Ed. Springer, Newyork, USA.

Lula, I., Denadai, Â. L., Resende, J. M., de Sousa, F. B., de Lima, G. F., Pilo-Veloso, D., Heine, T.; Duarte, H.A.; Santos, R.A.S.; Sinisterra, R. D. (2007). Study of angiotensin-(1–7) vasoactive peptide and its β-cyclodextrin inclusion complexes: complete sequence- specific NMR assignments and structural studies. Peptides, 28(11), 2199-2210.

241

Estudios Aplicados

Malkoski, M.; Dashper, S.G.; O’Brien-Simpson, N.M.; Talbo, G.H.; Macris, M.; Cross, K.J. (2001) Kappacin, a novel antibacterial peptide from bovine milk. Antimicrobial Agents in Chemotherapy, 45:2309–2315.

Mann, B.; Kumari, A.; Kumar, R.; Sharma, R.; Prajapati, K.; Mahboob, S.; Athira, S. (2014). Antioxidant activity of whey protein hydrolysates in milk beverage system. Journal of Food Science and Technology, 1-7.

Marques, H.M.C. (2010) A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and volatiles. Flavour and Fragrance Journal, 25: 313–326

Martinez-Ruiz, N.R.; Vargas-Requena, C.L.; López-Díaz, J.A.; Aquino-Favela, A. (2008). Ma- nufacture of Asadero Cheese with a vegetable rennet from Solanum elaeagnifolium. Memories. Article in extenso presented in 3rd International Congress Food Science and Food Biotechnology in Developing Countries. AMECA/Food Science and Food Biotechnology in Developing Countries. FP-14:75-79.

Martínez-Ruiz, N.R.; Enriquez, S. F.; Vázquez-Nájera, R. E.; López-Díaz, J. A. (2013). Microbiological Quality of Asadero Cheese Manufactured with a Plant Based Coagulant from Solanum elaeagnifolium. Food and Nutrition Sciences, 4: 75.

Maruyama, S.; Mitachi, H.; Tanaka, H.; Tomizuka, N.; Suzuki, H. (1987). Angiotensin I- converting enzyme inhibitors derived from an enzymatic hydrolysate of casein. Part IV Studies on the active site and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitors derived from casein. Agricultural and Biological Chemistry, 51(6):1581-1586.

Masoodi, T. A.; Shafi, G. (2010). Analysis of casein alpha S1 and S2 proteins from different mammalian species. Bioinformation, 4(9):430.

Masschalck, B.; Michiels, C. W. (2003). Antimicrobial properties of lysozyme in relation to foodborne vegetative bacteria. Critical reviews in microbiology, 29(3):191-214.

Mazorra-Manzano, M. A., Perea-Gutiérrez, T. C., Lugo-Sánchez, M. E., Ramirez-Suarez, J. C., Torres-Llanez, M. J., González-Córdova, A. F., Vallejo-Cordoba, B. (2013). Comparison of the milk-clotting properties of three plant extracts. Food chemistry, 141(3):1902- 1907.

McClean, S.; Beggs, L.B.; Robert, W. (2014) Welch, Antimicrobial activity of antihypertensive food-derived peptides and selected alanine analogues. Food Chemistry, 146(1):443- 447.

242

Estudios Aplicados

McMahon, D. J.; Brown, R. J.; Richardson, G. H.; Ernstrom, C. A. (1984). Effects of calcium, phosphate, and bulk culture media on milk coagulation properties. Journal of Dairy Science, 67(5), 930-938.

Mendieta, J.R.; Pagano, M.R.; Munoz, F.F.; Daleo, G.R.; Guevara, M.G. (2006) Antimicrobrial activity of potato aspartic proteases (StAPs) involves membrane permeabilization. Microbiology. 152:2039-2047

Mendieta, J. R.; Muñóz, F. F.;Daleo, G. R.; Guevara, M. G. (2007). Actividad citotóxica de staps (Solanum tuberosum aspartic proteases) sobre bacterias patógenas de humanos. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 6(5):258- 259.

Merin, U.; Talpaz, H.; Fishman, S. (1989). A mathematical model for the description of chymosin action on casein micelles. Journal of Dairy Research, 56(01):79-86.

Messner, M., Kurkov, S. V., Brewster, M. E., Jansook, P., Loftsson, T. (2011). Self-assembly of cyclodextrin complexes: aggregation of hydrocortisone/cyclodextrin complexes. International Journal of Pharmaceutics, 407(1):174-183.

Miguel, M.; Recio, I.; Gómez-Ruiz. J.A.; Ramos, M.; López-Fandiño, R. (2004). Angiotensin I- converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis. .Journal of Food Proection, 67(9):1914-20

Migliore-Samour, D.; Floc'h, F.; Jolles, P. (1989). Biologically active casein peptides implicated in immunomodulation. Journal of Dairy Research, 56(03):357-362.

Minkiewicz, P., Slangen, C.J., Dziuba, J., Visser, S., Mioduszewska, H. (2000). Identification of peptides obtained via hydrolysis of bovine casein by chymosin using HPLC and mass spectrometer. Milchwissenschaft, 55:14-17

Mirabella,N.; Castellani, V.; Sala, S. (2014) Current options for the valorization of food manufacturing waste: a review, Journal of Cleaner Production, 65:28-41

Montgomery, D. C.; Loredo, E. N.; Jearkpaporn, D.; Testik, M. C. (2002). Experimental designs for constrained regions. Quality Engineering, 14(4):587-601.

Moore, D. R.; Camera, D. M.; Areta, J. L.; Hawley, J. A. (2014). Beyond muscle hypertrophy: why dietary protein is important for endurance athletes 1.Applied Physiology, Nutrition and Metabolism, 39(999):1-11.

243

Estudios Aplicados

Morais, H. A.; Silvestre, M. P.; Amorin, L. L.; Silva, V. D.; Silva, M. R.; Simões e Silva, A. C.; Silveira, J. N. (2014). Use of Different Proteases to Obtain Whey Protein Concentrate Hydrolysates with Inhibitory Activity toward Angiotensin-Converting Enzyme. Journal of Food Biochemistry, 38(1):102-109.

Mosolov, V. V., and Valueva, T. A. (2006). Participation of proteolytic enzymes in the interaction of plants with phytopathogenic microorganisms. Biochemistry (Moscow), 71(8):838-845.

Muñoz, F. F.; Mendieta, J. R.; Pagano, M. R.; Paggi, R. A.; Daleo, G. R.; Guevara, M. G. (2010). The swaposin-like domain of potato aspartic protease StAsp-PSI) exerts antimicrobial activity on plant and human pathogens. Peptides, 31(5):777-785.

Muñoz, F.; Palomares-Jerez, M.F.; Daleo, G.; Villalaín, J.; Guevara, M.G. (2014) Possible mechanism of structural transformations induced by StAsp-PSI in lipid membranes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 1838(1) Part B:339-347

Mura, P. (2014). Analytical techniques for characterization of cyclodextrin complexes in aqueous solution: A review. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. En prensa.

Murakami, M.; Tonouchi, H.; Takahashi, R.; Kitazawa, H.; Kawai, Y.; Negishi, H.; Saito, T. (2004). Structural Analysis of a New Anti-Hypertensive Peptide (β-Lactosin B) Isolated from a Commercial Whey Product. Journal of Dairy Science, 87(7):1967- 1974.

Nagarajan, S.; Kandasamy, S.; Chinnappa, R. (2009). Comparative antimicrobial activity of callus and natural plant extracts of Solanum trilobatum L. Ancient Science of

Life, 28(3):3-5.

Nájera, A.; Renobales, M.; Barron, L. (2003) Effects of pH, temperature, CaCl2 and enzyme concentrations on the rennet clotting properties of milk: a multifactorial study, Food Chemistry, 80:345-352.

Nagpal, R.; Behare, P.; Rana, R.; Kumar, A.; Kumar, M.; Arora, S.; Morotta F.; Jain, S.; Yadav, H. (2011). Bioactive peptides derived from milk proteins and their health beneficial potentials: an update. Food and Function, 2(1):18-27.

Nakatsuji, T; Gallo, R. L. (2012). Antimicrobial peptides: old molecules with new ideas. Journal of Investigative Dermatology, 132:887-895.

244

Estudios Aplicados

Neklyudov, A. D.; Ivankin, A. N.; Berdutina, A. V. (2000). Production and purification of protein hydrolysates (review). Applied Biochemistry and Microbiology, 36(4):317- 324.

Néstor, G. M.; Dely Rubí, C. G.; Héctor, J. C. (2012). Exploring the Milk-Clotting Properties of a Plant Coagulant from the Berries of S. elaeagnifolium var. Cavanilles. Journal of Food Science, 77(1):89-94.

Nguyen, L.T.; Haney, E.F.; Vogel, H.J. (2011) The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action, Trends in Biotechnology, 29(9):464-472.

Norberg, S.; O'Connor, P.M.; Stanton, C.; Ross, P.; Hill, C.; Fitzgerald,G.F.; Cotter, T.D. (2011) Altering the Composition of Caseicins A and B as a Means of Determining the Contribution of Specific Residues to Antimicrobial Activity. Applied and Environmental Microbiology, 77(7): 2496–2501.

Ofori, J. A.; Hsieh, Y. H. P. (2014). Issues related to the use of blood in food and animal feed. Critical reviews in food science and nutrition, 54(5):687-697.

Oliva, Y. y S. Vega; (2004) Péptidos bioactivos derivados de las proteínas lácteas: propiedades y aplicaciones principales, Revista de Salud Animal, 26 (3): 151-162

Ono, T.; Kohno, H.; Odagiri, S.; Takagi, T. (1989). Subunit components of casein micelles from bovine, ovine, caprine and equine milks. Journal of Dairy Research, 56(01):61-68.

Oo, T. Z., Cole, N., Garthwaite, L., Willcox, M. D., and Zhu, H. (2010). Evaluation of synergistic activity of bovine lactoferricin with antibiotics in corneal infection. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65(6):1243-1251.

Otte, J.; Shalaby, S.M.A.; Zakora, M.; Schou Nielsen, M. (2007) Fractionation and identification of ACE-inhibitory peptides from α-lactalbumin and β-casein produced by thermolysin-catalysed hydrolysis. International Dairy journal, 17(12):1460-1472

Pagano, M. R.; Mendieta, J. R.; Muñoz, F. F.; Daleo, G. R.; Guevara, M. G. (2007). Roles of glycosylation on the antifungal activity and apoplast accumulation of StAPs (Solanum tuberosum aspartic proteases). International Journal of Biological Macromolecules, 41(5):512-520.

Pane, C.; Piccolo, A.; Spaccini, R.; Celano, G.; Villecco, D.; Zaccardelli, M. (2013). Agricultural waste-based composts exhibiting suppressivity to diseases caused by the phytopathogenic soil-borne fungi Rhizoctonia solani and Sclerotinia minor. Applied Soil Ecology, 65:43-51

245

Estudios Aplicados

Parameswari, K.; Sudheer, A.; Kishori, B. (2012). In Vitro Antibacterial Activity In The Extracts Of Solanum Nigrum. Indian Streams Research Journal, 2(7):1-4.

Patel A.K., V.K. Singh and M.V. Jagannadham (2007) “Carnein, a serine protease

from noxious plant weed Ipomoea carnea (morning glory)” .Journal og Agriculture Food Chemistry, 55:5809-18.

Pasupuleti, V. K.; Braun, S. (2010). State of the art manufacturing of protein hydrolysates. En: Protein hydrolysates in biotechnolog. Springer, Netherlands.

Pavithra, P. S.; Janani, V. S.; Charumathi, K. H.; Indumathy, R.; Potala, S.; Verma, R. S. (2010). Antibacterial activity of plants used in Indian herbal medicine. International Journal of Green Pharmacy, 4(1):22.

Phelan,M.; Aherne, A.; FitzGerald, R.J.; O'Brien, N.M. (2009)Casein-derived bioactive peptides: Biological effects, industrial uses, safety aspects and regulatory status, International Dairy Journal, 19(11):643-654.

Peng, X., Xiong, Y. L., Kong, B. (2009). Antioxidant activity of peptide fractions from whey protein hydrolysates as measured by electron spin resonance. Food Chemistry, 113(1):196-201.

Pellegrini, A., Thomas, U., Bramaz, N., Hunziker, P., and von Fellenberg, R. (1999). Isolation and identification of three bactericidal domains in the bovine α-lactalbumin molecule. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1426(3):439-448.

Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., Hunziker, P. (2001). Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1526(2):131-140.

Peña-Ramos, E. A.; Xiong, Y. L.; Arteaga, G. E. (2004). Fractionation and characterisation for antioxidant activity of hydrolysed whey protein. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84(14):1908-1918.

Pestana-Calsa, M. C.; Calsa Jr, T. (2011). In silico identification of plant-derived antimicrobial peptides. Systems and computational biology–molecular and cellular experimental systems. Rijeka, Croatia, InTech :249-272.

Peters, B. M.; Shirtliff, M. E.; Jabra-Rizk, M. A. (2010). Antimicrobial peptides: primeval molecules or future drugs? PLoS Pathogens, 6(10): e1001067.

246

Estudios Aplicados

Pexe-Machado, P.A.; de Oliveira, B.D.; Borges Dock-Nascimento, D.; de Aguilar-Nascimento, J.E. (2013) Shrinking preoperative fast time with maltodextrin and protein hydrolysate in gastrointestinal resections due to cancer. Nutrition, 29(7–8):1054- 1059

Pinto, G.; Caira, S.; Cuollo, M.; Lilla, S.; Chianese, L.; Addeo, F. (2012) CapítuloI: Bioactive Casein Phosphopeptides in Dairy Products as Nutraceuticals for Functional Foods. En: Milk Protein. Hurley, W.L. Ed. Intech, Croacia.

Pires, C.; Batista, I. (2013). Functional Properties of Fish Protein Hydrolysates. En: Utilization of Fish Waste, Raul Perez Galvez y Jean Pascal Berge Eds. CRC Press

Pouliot, Y.; Gauthier, S.F.; Groleau, P.E. (2005) En: Nutraceutical Proteins and Peptides in Health and Disease. Mine, Y.; Shahidi, F. Eds, Marcel Dekker Inc., New York

Power, O.; Jakeman, P.; FitzGerald, R.J. (2013) Antioxidative peptides: enzymatic production, in vitro and in vivo antioxidant activity and potential applications of milk- derived antioxidative peptides. Journal of Amino Acids, 44(3):797-820

Recio, I.; Visser, S. (1999). Identification of two distinct antibacterial domains within the sequence of bovine αs2-casein. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1428(2):314-326.

Reineccius, G. A. (1991). Carbohydrates for flavor encapsulation. Food Technology, 45(3):144-146.

Rival,S.G; Boeriu, C.G.; Wichers, H.J. (2001) Caseins and Casein Hydrolysates. 2. Antioxidative Properties and Relevance to Lipoxygenase Inhibition. Journal of Agriculture Food Chemistry; 49:295−302

Rocha, C., Goncalves, M. P., Teixeira, J. A. (2011). Immobilization of trypsin on spent grains for whey protein hydrolysis. Process Biochemistry, 46(2):505-511.

Rocha, G.F.; Kise, F.; Rosso, A.M.; Parisi, M.G.; (2013) Péptidos con actividad antimicrobiana obtenidos de proteínas lácteas con extractos de Salpichroa origanifolia. Información Tecnológica: 24(2):23-30

Robinson, R. K.; Wilbey, R. A. (1998) Cheesemaking Practice. R. Scott Ed. Aspen Publishers, Gaithersburg, Estados Unidos.

Rojas, J.J.; Ochoa, V.J.; Ocampo, S.A.; Muñoz, J.F. (2006) Screening for antimicrobial activity of ten medicinal plants used in Colombian folkloric medicine: A possible alternative

247

Estudios Aplicados

in the treatment of non-nosocomial infections. BMC Complement. Alternative Medicine, 6(2):1-6

Ross-Murphy, S. B. (1995). Structure–property relationships in food biopolymer gels and solutions. Journal of Rheology, 39(6):1451-1463.

Rustagi, A.; Kumar, D.; Shekhar, S.; Yusuf, M.A.; Misra, S.; Sarin. N.B. (2014) Transgenic Brassica juncea Plants Expressing MsrA1, a Synthetic Cationic Antimicrobial Peptide, Exhibit Resistance to Fungal Phytopathogens. Molecular Biotechnology, 56(6): 535- 545

Sandre,C., Gleizes,A., Forestier,F., Gorges-Kergot,R., Chilmonczyk,S., Leonil,J., Moreau, M.C., Labarre,C. (2001) A peptide derived from bovine β-casein modulates functional properties of bone marrow-derived macrophages from germfree and human flora- associated mice. Journal of Nutrition, 131:2936-2942.

Sbodio, O.A.; Revelli, G.R. (2012) Coagulación de la leche. Desarrollo de un dispositivo para el “monitoreo” online del proceso. Avances en la Argentina. Revista de Investigación Agropecuaria, 38(3):236-246

Schaller, A.; Ryan, C.A. (1996) Systemin – a polypeptide defense signal in plants. BioEssays, 18(1):27-33.

Schlimme, E.; Meisel, H. (1995). Bioactive peptides derived from milk proteins. Structural, physiological and analytical aspects. Food/Nahrung, 39(1):1-20.

Schmidt, D. G. (1982). Association of caseins and casein micelle structure. Developments in dairy chemistry. Vol. IPE Fox ed. American Journal of Applied Sciences. Essex, Inglaterra.

Shah, N. H. (2014). Effect of health on Nutrition. Dairy Foods and Human Nutrition, 2(1): Paper ID: B00208V2I12014.

Sheeba, E. (2010). Antibacterial activity of solanum surattense burm. f. Journal of Science, Engineering and Technology, 6(1):1-4.

Sheikh, M.; Malik, A.R.; Meghavanshi, M.K.; Mahmood, I. (2012) Studies on Some Plant Extracts for Their Antimicrobial Potential against Certain Pathogenic Microorganisms. American Journal of Plant Sciences, 3:209-213.

248

Estudios Aplicados

Silva, N. C. C.; Fernandes Júnior, A. (2010). Biological properties of medicinal plants: a review of their antimicrobial activity. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, 16(3):402-413.

Silva, S. V., and Malcata, F. X. (2005). Studies pertaining to coagulant and proteolytic activities of plant proteases from Cynara cardunculus. Food chemistry, 89(1):19-26.

Silva, M. T., Simas, S. M., Batista, T. G., Cardarelli, P., and Tomassini, T. C. (2005-a). Studies on antimicrobial activity, in vitro, of Physalis angulata L.(Solanaceae) fraction and physalin B bringing out the importance of assay determination. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 100(7):779-782.

Silva, K. N., de F. Agra, M., Baracho, G. S., and Basílio, I. J. L. D. (2007). Estudo farmacobotânico de folhas de Nicotiana glauca (Solanaceae). Latin American Journal of Pharmacy, 26(4):499.

Smith D.M. y Brekke C.J. (1984). Functional properties of enzymatically modified beef heart protein. Journal of Food Science, 49:1525-1528.

Smithers, G.W. (2008). Whey and whey proteins—From ‘gutter-to-gold’ International Dairy Journal, 18 (7): 695–704.

Sommer, H.H.; Matsen, H.J. (1935) The relation of mastitis to rennet coaguability and curd strength of milk, Journal of Dairy Science, 18:741.

Sousa, M. J., Malcata, F. X. (1997). Comparison of plant and animal rennets in terms of microbiological, chemical, and proteolysis characteristics of ovine cheese. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45(1):74-81.

Sousa, M.J.; Malcata, F.X. (1998) Proteolysis of ovine and caprine caseins in solution by enzymatic extracts from flowers of Cynara cardunculus. Enzyme and Microbial Technology, 22 (5):305-314.

Stanciuc, N.; Hintoui, A.; Rapeanu, G. (2010) Thermal treatment can modify the susceptibility of whey protein concentrate to enzymatic hydrolysis. Innovative Romain Food Biotechnology, 7:30-36

Suay-García, B.; Pérez-Gracia, M. T. (2014). The Antimicrobial Therapy of the Future: Combating Resistances. Journal of Infectious Diseases and Therapy, 2:146.

Subashini, R.; Mahesh, V.; Kavitha, A.; Geethanjali, B.; Umamaheshwari, S. (2013). Comparative Evaluation of Antimicrobial Activity of Selected Three Herbal Plants

249

Estudios Aplicados

Extract with Digital Image Processing. European Journal for Biomedical Informatics, 9(2):14-26

Suhas, P.; Vijaya, J.; Prasanna, S.; Sudhir, S.; India, K. (2009). Screening of whole plant extract of Solanum surattense for antibacterial activity. International Journal of Pharmaceutical Sciences, 1(1):110-114.

Sun, X. D. (2011). Enzymatic hydrolysis of soy proteins and the hydrolysates utilisation. International Journal of Food Science and Technology, 46(12):2447-2459.

Szecsi, P. B. (1992). The aspartic proteases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 52:5–22.

Szejtli, J. (1998) Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry, Chemical Reviews, 98: 1743-1753.

Simoes, I. and Faro, C. (2004) Structure and function of plant aspartic proteinases. European Journal of Biochemistry, 271:2067-2075.

Szwajkowska, M., Wolanciuk, A., Barłowska, J., Król, J., and Litwinczuk, Z. (2011). Bovine milk proteins as the source of bioactive peptides influencing the consumers’ immune system–a review. Animal Science Papers and Reports, 29:269-280.

Szente, L.; Szejtli, J.; Kis, G. L. (1998). Spontaneous opalescence of aqueous γ-Cyclodextrin solutions: Complex formation or self-aggregation? Journal of Pharmaceutical Sciences, 87(6):778-781.

Tari, T. A.; Singhal, R. S. (2002). Starch-based spherical aggregates: stability of a model flavouring compound, vanillin entrapped therein. Carbohydrate Polymers, 50(4):417-421.

Tavano, O. L. (2013). Protein hydrolysis using proteases: An important tool for food biotechnology. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 90:1-11.

Tejada, L.; Abellan, A.; Cayuela, J.M.; Martınez-Cacha, A. Fernandez-Salguero, J. (2008) Proteolysis in goats' milk cheese made with calf rennet and plant coagulant. International Dairy journal, 18:139–146.

Touch, V.; Hayakawa, S.; Commins, T. (2009). Natural antimicrobial proteins: a review of current challengers and solutions for food applications. Asian Journal of Food and Agro-Industry, 2(01):1-16

250

Estudios Aplicados

Uekama, K.; Hirayama, F.; Irie, T. (1998). Cyclodextrin drug carrier systems. Chemical Reviews, 98(5):2045-2076.

Vairo Cavalli, S.; Silva, S.; Cimino, C.; Malcata, F. X.; Priolo, N.; (2008) Hydrolysis of caprine and ovine milk proteins, brought about by aspartic peptidases from Silybum marianum flowers. Food Chemistry, 106:997-1003

Valenzuela, F.; Araneda, C.; Vargas, F.; Basualto, C.; Sapag, J. (2009). Liquid membrane emulsion process for recovering the copper content of a mine drainage. Chemical Engineering Research and Design, 87(1):102-108.

Van der Ven, C. (2002) Tesis Doctoral: Biochemical and functional characterization of casein and whey protein hydrolysates. Wageningen Universiteit, The Netherlands

Vinderola, G. (2008). Dried cell-free fraction of fermented milks: new functional additives for the food industry. Trends in Food Science and Technology, 19(1):40-46.

Visser, S.; Rooijen, P. J.; Slangen, C. J. (1980). Peptide Substrates for Chymosin (Rennin) Isolation and Substrate Behaviour of Two Tryptic Fragments of Bovine ϰ Casein. European Journal of Biochemistry, 108(2):415-421.

Wada, Y.; Lönnerdal, B. (2014). Bioactive peptides derived from human milk proteins— mechanisms of action. The Journal of Nutritional Biochemistry, 25(5):503-514.

Walstra, P.; Jenness, R. (1984). Dairy Chemistry and Physics. John Wiley and Sons.

Walstra, P.; Jenness, R.; Badings, H. T.; Pérez, B. S. (1987). Química y física lactológica. , Acribia, Zaragoza

Wang, J.; Cao, Y.; Sun, B.; Wang, C. (2011). Physicochemical and release characterisation of garlic oil-β-cyclodextrin inclusion complexes. Food Chemistry, 127(4):1680-1685.

Ward, P. P., Paz, E., Conneely, O. M. (2005). Lactoferrin. Cellular and Molecular Life Sciences, 62(22):2540-2548.

Webb, B.H.; Whittier, E.O. (1970) By products of Milk. Segunda edición, B.H.Webb y E.O. Whittier editors. Avi Publishing Co.; Westport, Conn.

Wolker Fava, L. (2012) Tesis de maestría: Caracterização físico-química do leite de ovelhas da raça Lacaune e análise do rendimento de coalhada com Caracterização física do soro obtido. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Faculdade de Veterinária. Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

251

Estudios Aplicados

Xia, Y.; Suzuki, H.; Borevitz, J.; Blount, J.; Guo, Z.; Patel, K.; Lamb, C. (2004) An extracellular aspartic protease functions in Arabidopsis disease resistance signaling. The EMBO Journal, 23(4):980-988.

Yamamoto, N., Maeno, A., Takano, T. (1999) Purification and characterization of an antihypertensive peptide from a yoghurt-like product fermented by Lactobacillus helveticus CPN4. Journal of Dairy Science, 82:1388-1393

Yeguas, V., Altarsha, M., Monard, G., López, R., Ruiz-López, M. F. (2011). Peptide Binding to β-Cyclodextrins: Structure, Dynamics, Energetics, and Electronic Effects. The Journal of Physical Chemistry A, 115(42):11810-11817.

You, S.-J.; Wu, J. (2011), Angiotensin-I Converting Enzyme Inhibitory and Antioxidant Activities of Egg Protein Hydrolysates Produced with Gastrointestinal and Nongastrointestinal Enzymes. Journal of Food Science, 76:C801–C807

Yousif, B. H.; McMahon, D. J.; Shammet, K. M. (1996). Milk-clotting enzyme from Solanum dobium plant. International Dairy

Journal, 6(6):637-644.

Zhang, Q-X.; Wu, H.; Ling, Y-F.; Lu, R-R. (2013) Isolation and identification of antioxidant peptides derived from whey protein enzymatic hydrolysate by consecutive chromatography and Q-TOF MS. Journal of Dairy Research, 80(3): 367-373

Zerrin, Y. (2013). Determination of Rennet Clotting Time by Texture Analysis Method. Food and Nutrition Sciences, 2013.

Zubaır, M.; Rızwan, K.; Rasool, N.; Afshan, N.; Shahid, M.; Ahmed, V.U. (2011) Antimicrobial potential of various extract and fractions of leaves of Solanum nigrum. International Journal of Phytomedicine, 3(1):63-67.

Zucht, H. D.; Raida, M.; Adermann, K.; Mägert, H. J.; Forssmann, W. G. (1995) Casocidin-I: a casein-αs2 derived peptide exhibits antibacterial activity. FEBS Letters, 372(2):185- 188.

252

Conclusiones

Conclusiones

CONCLUSIONES GENERALES

En esta Tesis Doctoral una nueva aspartil peptidasa presente en el extracto crudo de frutos maduros de Salpichroa origanifolia fue aislada, estabilizada y caracterizada con el fin de analizar la posible aplicación en procesos industriales.

La extracción enzimática por precipitación etanólica permitió obtener el extracto crudo que fue caracterizado bioquímicamente.

 Se encontró que la máxima actividad proteolítica se obtenía a temperaturas moderadas (40°C) y a pH ácido (3.5 a 4.0) cuando se empleaba hemoglobina como sustrato. Cuando el sustrato era caseína, se obtuvo un pH óptimo de 5.5-6.0 ya que a valores de pH inferiores a 5.0 las caseínas precipitan.

 El extracto crudo presentó buena estabilidad térmica durante 2 horas a temperaturas moderadas (40°C y 45°C) pero se inactivó totalmente a 55°C en la primera hora de incubación.

 Se evaluó la estabilidad del extracto crudo conservado a bajas temperaturas (-20°C). Se encontró que a los seis meses de almacenamiento, el extracto crudo conservaba el 84% de la actividad inicial.

 La actividad proteolítica de los extractos crudos fue inhibida por pepstatina, inhibidor específico de las aspartil peptidasas.

La peptidasa aspártica presente en el extracto crudo fue purificada por cromatografía de intercambio aniónico con resinas de DEAE-Sepharose Fast Flow y Mono Q en un sistema FPLC. Se obtuvieron rendimientos de proceso del 20% y 32.1% y factor de purificación de 7.1 y 13.4 respectivamente.

Los estudios electroforéticos demostraron que es una enzima monomérica con peso molecular aparente de 32 kDa a la cuál nombramos como salpichroína.

Al igual que otras aspartil peptidasas, salpichroína presentó actividad proteolítica frente a sustratos proteicos naturales como hemoglobina y caseína y frente al

sustrato sintético -Pro-Thr-Glu-Phe-p-(NO2)-Phe-Arg-Leu-OH. Los valores de las constantes cinéticas mostraron que la enzima presentaba baja afinidad por el sustrato sintético y baja eficiencia catalítica (Km de 494 µM y Kcat/Km de

Conclusiones

20.9 µM.mL-1) y elevada afinidad y eficiencia catalítica con caseína, con un valor de Km de 164 M y de Kcat/Km de 72.0 µM.mL-1.

Salpichroína hidrolizó la cadena β de la insulina oxidada en seis enlaces peptídicos, mostrando un patrón de clivaje similar al de la quimosina bovina.

Los parámetros bioquímicos de la enzima pura (pH y temperatura óptima) fueron similares a los obtenidos con el extracto crudo, sin embargo se observó muy baja estabilidad térmica de la enzima en comparación con el extracto crudo. Por este motivo se desarrollaron técnicas de inmovilización:

 La inmovilización de la enzima en soportes de glutaraldehído-agarosa incrementó 60 veces su estabilidad térmica respecto de la enzima pura a 50°C. Se obtuvo también una buena capacidad de reúso de los derivados inmovilizados en glutaraldehído-agarosa. La enzima inmovilizada fue reutilizada nueve veces con una retención del 54% de la actividad inicial.

Los ensayos realizados con inhibidores específicos confirmaron que se trataba de una aspartil peptidasa ya que era inhibida por pepstatina pero no por PMSF, E64, EDTA o 1,10-fenantrolina.

Salpichroína fue identificada con herramientas proteómicas: Peptide Mass Fingerprint (PMF), secuenciación de novo y degradación de Edman. A partir de estos estudios se encontró que la enzima mostraba elevada identidad de secuencia con SlAP A1-like, una peptidasa aspártica aislada de Solanum lycopersicum aún no caracterizada bioquímicamente.

El análisis filogenético permitió incluir a la enzima salpichroína en el grupo Ia junto a las APs de de Arabidopsis thaliana (AtAsp1, AtAsp2, AtAsp3), Brassica oleracea (BoAsp) y Brassica napus (BnAsp) aunque no ha permitido atribuirle una función específica en la planta.

Se realizaron también estudios aplicados para evaluar la posible utilización de la enzima (extracto crudo, enzima pura libre o inmovilizada) sobre proteínas lácteas y como antimicrobiano natural:

 El extracto crudo presentó actividad coagulante de la leche, sin embargo el tiempo de coagulación fue significativamente superior al producido por el cuajo comercial. El coágulo formado mostró diferencias en la consistencia y menor grado de sinéresis que el producido por los coagulantes. Estas características probablemente estén relacionadas con la ausencia de hidrólisis del enlace

254

Conclusiones

PHE105 MET106 de la κ-caseína y la hidrólisis poco específica producida en otros enlaces de la proteína.

 Se estudió la actividad hidrolítica de los extractos de frutos de Salpichroa origanifolia sobre caseínas de origen bovino, ovino y caprino y se encontró que todas las caseínas presentaban un perfil de hidrólisis similar durante las primeras 2 horas, sin embargo la hidrólisis de la caseína caprina se incrementaba notablemente desde las 4 horas y hasta las 20 horas de incubación respecto de las otras caseínas.

 Se evaluó la actividad antimicrobiana de los hidrolizados de caseína y se encontró que los mismos producían algún efecto inhibitorio de la multiplicación celular en las cepas de Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens y Pseudomona fluorescens.

 Además se analizó la inhibición producida por las fracciones separadas por ultrafiltración y se encontró que los péptidos de peso molecular inferior a 3 kDa provenientes de la hidrólisis de las caseínas bovina y ovina presentaron el mayor efecto inhibitorio sobre las bacterias ensayadas.

 Se estudió la hidrólisis producida por el extracto crudo sobre cada una de las fracciones α-, β- y κ- de la caseína bovina y se obtuvo que la α-caseína era hidrolizada en mayor proporción. Los péptidos identificados por HPLC-MS en los hidrolizados coincidieron con secuencias peptídicas cuyas actividades biológicas habían sido informadas por otros autores.

 El extracto crudo y la enzima inmovilizada en el soporte glutaraldehído.-agarosa fueron empleados para hidrolizar las proteínas del WPC a pH 4.0, obteniéndose un grado de hidrólisis similar en ambos casos. De la misma forma, tanto el extracto crudo como la enzima inmovilizada produjeron la hidrólisis completa de la α-La al cabo de 20 horas. Las fracciones de peso molecular de 3-10 kDa e inferior a 3 kDa, obtenidas por ultrafiltración de los hidrolizados del WPC con la enzima inmovilizada presentaron:

 Actividad antihipertensiva con valores de IC50 inferiores a los informados en la bibliográfia para hidrolizados con otras enzimas.  Actividad antioxidante con elevada capacidad para neutralizar el radical DPPH  Actividad antimicrobiana, principalmente sobre Staphylococus aureus

255

Conclusiones

 Los péptidos contenidos en la fracción de hidrolizados de proteínas del WPC, cuyo peso molecular era menor a 10 kDa, fueron encapsulados en β-CD. La formación de los complejos pudo ser constatada por Calorimetría Diferencial de Barrido junto al análisis por técnicas cromatográficas (SEC- FPLC).

 La simulación de la digestión gastrointestinal in vitro de los péptidos y de sus complejos permitió concluir que la formación de complejos de inclusión de los biopéptidos en β-CD preservaba la actividad biológica de los mismos actuando como agente protector frente a los procesos de digestión gastrointestinal simulada.

 La enzima purificada por intercambio aniónico presentó una importante actividad antimicrobiana in vitro sobre bacterias potencialmente patógenas del hombre, especialmente sobre Staphylococus aureus y Serratia marcescens, y sobre un fitopatógeno que infecta cultivos de interés agroeconómico (Phytophtora capsici).

 La evaluación de la actividad antimicrobiana de salpichroína a través de bioensayos de inoculación sobre zapallitos ha demostrado la importancia de las propiedades de la enzima en el control de las infecciones fúngicas. Estos resultados hacen de salpichroína un compuesto de interés para el diseño de estrategias de aplicación de compuestos naturales en protección vegetal y en el control de patologías causadas Phytophthora casici.

256

Conclusiones

Este trabajo de Tesis Doctoral ha dado origen a la publicación de los siguientes trabajos:

Publicaciones en revistas nacionales e internacionales con referato

 Péptidos con actividad antimicrobiana obtenidos de proteínas lácteas con extractos de Salpichroa origanifolia (2013). Rocha, G.; Kise, F.; Rosso, A.; Parisi, M. Información Tecnológica, 24 (2):23-30. ISSN 0718-0764.

 Estudios de caracterización cinética y fisicoquímica de una proteinasa aspártica aislada de frutos maduros de Salpichroa origanifolia (2010). Rocha, G.; Fernández, G.; Parisi, M. Información Tecnológica, 21 (2):21-28 ISSN: 0718-5006.

Publicaciones en actas o proceedings

 Rocha, G.; Kise, F.; Blotta, E.; Rosso, A.; Parisi, M. (2013) Inmovilización de una fitoproteasa para la producción de péptidos lácteos con actividad antihipertensiva. Memorias del XIV Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de Alimentos, CYTAL 2013.

 Rocha, G.; Blotta, M.E.; Kise, F.; Rosso, A.; Fernández, G.; Parisi, M. (2011). Evaluación de los productos de hidrólisis de las fracciones α-, β- y κ- de la caseína bovina con proteasas de Salpichroa origanifolia. Trabajo completo publicado en el XVII Congreso Argentino de Catálisis (XVII CAC) y VI Congreso de Catálisis del Mercosur (VI Mercocat)

 Rocha, G.; Fernández, G.; Rosso, A., Parisi, M. (2011) Biochemical studies of an aspartic peptidases isolated from Salpichroa origanifolia fruits. Trabajo completo publicado en Memorias en el VIII Congreso de Biotecnología Vegetal, Bioveg 2011. Cayo Coco, Cuba.

 Rocha, G.; López, O.; Fernandez, G. (2006) Elaboración de queso de pasta blanda con enzima vegetal de Salpichroa origanifolia (Huevito de gallo). Ciencia Actual, 1(3):851- 857.

MANUSCRITOS EN EVALUACIÓN

 Proteomic analysis of an aspartic protease from Salpichroa origanifolia fruits. Rocha, G.F.; Obregón, W.D.; Muñoz, F.; Guevara, M.G.; Rosso, A.M.; Parisi, M.G. Protein & Peptide Letters -En evaluación (BSP-PPL-2014-813)

257