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Estudios Básicos Y De Aplicación De Una Aspartil Peptidasa De Salpichroa Origanifolia

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Estudios Básicos Y De Aplicación De Una Aspartil Peptidasa De Salpichroa Origanifolia Universidad Nacional de Luján Estudios Básicos y de Aplicación de una aspartil peptidasa de Salpichroa origanifolia Tesis para Optar al Grado de Doctor Gabriela Fernanda Rocha Directora: Dra Mónica G. Parisi Co-Directora: Dra Adriana M. Rosso 2014 “Empieza por hacer lo necesario, luego lo posible y de pronto te encontrarás haciendo lo imposible” Francisco de Asís A mis hijos AGRADECIMIENTOS Quisiera expresar mi más profundo agradecimiento a todas las personas e instituciones que de una forma u otra han tenido que ver con el desarrollo de esta Tesis Doctoral. A quien me permitió comenzar este camino: gracias Graciela, en primer lugar y antes que nada por su incondicional ayuda. A Mónica y Adriana, quienes decidieron continuar la dirección de mi trabajo de investigación en forma tan profesional como amorosa y fueron mi sostén y conducción en todas las situaciones. A Susana por su calidez y preocupación. A Norberto por su agradable presencia, nunca olvidaré sus anécdotas y la pasión que dejaba ver en ellas. He aprendido mucho en esta etapa, gracias por aceptarme en su grupo de trabajo, por su confianza, por sus conocimientos, dedicación y preocupación. A los miembros evaluadores por aceptar la oposición de este trabajo. A las autoridades de la Universidad Nacional de Luján por darme la oportunidad de ser parte de ella y por el financiamiento para llevar a cabo esta investigación. De manera especial a los integrantes de nuestro laboratorio: Jorgelina, Eugenia, Francisco, Anabella, Hernán, y Natalia los que siempre están dispuestos a colaborar, a brindar su opinión y a escuchar, por el apoyo incondicional que me han dado en todo momento. A Laura, Ana Lía, Edith y Nancy por su ayuda y calidez. A mis nuevas compañeras: Emilia, Natalia y Sofía, una bendición haberlas conocido. A David, Mariana y Sebastián, que aunque estén lejos sé que puedo contar con ustedes, gracias también por los buenos momentos compartidos. Al grupo de investigación de la Prof. Beatriz González, en especial a Josefina, Sebastián y Camila, al Prof. Oscar López y a Lali por su colaboración y por su inestimable ayuda. Al personal técnico de la Universidad Nacional de Luján, en especial a Claudia, Víctor y Cacho por el esfuerzo y colaboración desinteresada, son una parte esencial de nuestra Universidad. A mi familia, que ha estado siempre, que me dejo SER. i Mi mamá: mi cómplice. Mi papá: la fuerza y la perseverancia. Mis hermanas: Pao, mi niña y Bell definitivamente mi alma gemela, maestra e incondicional en todas las formas posibles. Mis hijos: Nacho, Fede y Sebas el reflejo de lo que SOY, mis guías y camino a seguir, su esencia es AMOR en estado puro, únicos y eternos. ¡LOS AMO! ii RESUMEN “Estudios básicos y de aplicación de una aspartil peptidasa de Salpichroa origanifolia” Este trabajo de investigación se inicia con el hallazgo de una enzima proteolítica con actividad coagulante de la leche en los frutos maduros de la especie Salpichroa origanifolia. En ensayos preliminares se encontró que el extracto crudo enzimático presentaba un pH óptimo de naturaleza ácida, mostraba buena estabilidad térmica a temperaturas moderadas y que la actividad enzimática era inhibida por pepstatina, un inhibidor específico de las endopeptidasas aspárticas. Mediante un esquema de purificación simple que combinó la precipitación etanólica seguida por la cromatografía de intercambio aniónico en columnas de Mono Q en FPLC, se purificó una peptidasa aspártica a la que nombramos salpichroína, con un 32.1% de rendimiento y un grado de purificación de 13.4 veces. Para evaluar la pureza de esta fracción activa, se aplicaron técnicas de electroforesis SDS-PAGE y zimogramas con gelatina polimerizada en la matriz del gel y se encontró que la enzima pura migraba como una única banda de peso molecular aparente de 32 kDa. Salpichroína presentó valores óptimos de actividad proteolítica con hemoglobina a pH 3.0-4.5 y con caseína a pH 5.5-6.0, a temperaturas moderadas (40°C); sin embargo mostró baja estabilidad térmica comparada con el extracto crudo. Por este motivo, se desarrollaron técnicas de inmovilización de la enzima en soportes glutaraldehído–agarosa que permitieron incrementar su estabilidad térmica 60 veces respecto de la enzima libre a 50°C. El comportamiento enzimático de la enzima pura frente a inhibidores diagnóstico mostró que era inhibida por pepstatina pero no por PMSF, E64, EDTA o 1,10-fenantrolina, confirmando que se trataba de una peptidasa aspártica. Los estudios cinéticos demostraron que salpichroína presentaba baja afinidad por el sustrato sintético H-Pro-Thr-Glu-Phe-p-(NO2)-Phe-Arg-Leu-OH, específico de aspartil peptidasas con valor de Km de 494 µM y elevada afinidad por caseína con valores de Km de 164 µM. Salpichroína hidrolizó la cadena β de la insulina oxidada en seis enlaces peptídicos, mostrando especificidad de clivaje similar a la de la quimosina bovina. El análisis de la enzima por PMF-MALDI-TOF/MS y MALDI-TOF-TOF/MS-MS y su comparación con bases de datos mostró que la peptidasa aislada está emparejada con otras peptidasas de plantas que pertenecen a la familia A1 de las aspartil peptidasas y aunque el iii análisis filogenético la ubicó en el subgrupo Ia, no se le pudo asignar una función específica en la planta. Se analizó la posible aplicación del extracto crudo, de la enzima inmovilizada y de la enzima pura en procesos relacionados con los alimentos. Se encontró que el extracto crudo producía la coagulación de la leche bovina con tiempo de coagulación superior al producido por un cuajo comercial (FPC). Además, las características del coágulo formado por el extracto crudo era diferente, obteniéndose un gel con menor consistencia y menor grado de sinéresis. Esto se confirmó al analizar los sitios de clivaje de la κ-caseína ya que, a diferencia de la quimosina, salpichroína no hidrolizaba específicamente el enlace Phe105- Met106. Se estudió luego la actividad hidrolítica de la enzima libre e inmovilizada sobre proteínas lácteas (caseínas bovina, caprina y ovina, fracciones α-, β- y ĸ- de la caseína bovina y proteínas del lactosuero) y se evaluó la actividad antimicrobiana, antioxidante y antihipertensiva de los péptidos obtenidos por hidrólisis enzimática con el propósito de analizar el uso potencial como ingredientes alimentarios. En la hidrólisis de las proteínas del lactosuero bovino con la enzima libre e inmovilizada en glutaraldehído-agarosa se alcanzó un grado de hidrólisis cercano al 6% a las 20 horas de reacción. Las fracciones de los hidrolizados con peso molecular inferior a 10 kDa mostraron actividad antioxidante y antimicrobiana in vitro, mientras que los de peso molecular inferior a 3 kDa mostraron elevada actividad antihipertensiva in vitro con un valor de IC50 de 5 µg.mL-1. Los péptidos de peso molecular inferior a 10 kDa separados por ultrafiltración fueron encapsulados con β-ciclodextrinas y el análisis por calorimetría diferencial de barrido permitió inferir la formación de complejos de inclusión entre dichos compuestos. Con el fin de analizar la estabilidad y biodisponibilidad de los péptidos, se evaluó la actividad antioxidante de los mismos por el método del DPPH y se analizó la variación de esta actividad en condiciones de digestión gastrointestinal simulada, utilizando pepsina y pancreatina como enzimas digestivas. Se encontró que la actividad antioxidante disminuyó luego de la digestión tanto en las muestras de péptidos libres como en complejos. La actividad antioxidante de los péptidos libres no varió significativamente durante la digestión gástrica, sin embargo luego de la digestión pancreática la actividad antioxidante relativa disminuyó un 90% respecto del valor inicial. Los complejos de inclusión péptidos– β CD mostraron el mismo comportamiento durante la simulación de la digestión ácida pero retuvieron más del 50% de la actividad inicial durante la digestión intestinal. Estos 4 resultados demostraron que la formación de complejos de inclusión permite preservar la funcionalidad de los biopéptidos. Por último se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de salpichroína frente a bacterias potencialmente patógenas del hombre y a hongos contaminantes de los cultivos. Se observó un importante efecto inhibitorio sobre cepas bacterianas de Staphylococcus aureus y Serratia marcescens y sobre el oomicete Phytophthora capsici, causante de la putrefacción y tizón tardío de vegetales de interés agroeconómico como los zapallitos verdes, los pimientos, el tomate y las berenjenas entre otros. La enzima pura fue aplicada en bioensayos de control de la contaminación de zapallitos verdes y se obtuvo un fuerte efecto citotóxico aun en bajas concentraciones, convirtiéndola en un compuesto de interés para ser empleada en la conservación de estos vegetales. Palabras claves: actividad proteolítica, salpichroína, proteínas lácteas, hidrólisis, péptidos bioactivos. 5 ABREVIATURAS α-La: α-Lactoalbúmina ANOVA: Analysis of Variance (Análisis de la varianza) AP: Aspartil peptidasa β-CD: β-Ciclodextrina β-Lg: β-Lactoglobulina BLAST: Basic Local Alignment Search Tool CBB-R250: Coomassie Brillant Blue R250 DEAE-Sepharose: Dietilaminoatil-Sepahorose DSC: Differential Scanning Calorimetry (Calorimetría diferencial de barrido) E-64: Ácido Trans-epoxisuccinil-L-leucil-amido (4-guanidinio) enediamintetraacético EC: Enzyme commission EDTA: Ácido Etilen Diamin Tetraacético FPC: Quimosina producida por fermentación FPLC: Fast-Performance Liquid Chromatography (Cromatografía líquida rápida) GH%: Grado de hidrólisis porcentual HPLC: High-Performance Liquid Chromatography
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