Cc By-Nc-Nd 2.0)

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Creative commons : Paternité - Pas d’Utilisation Commerciale - Pas de Modification 2.0 France (CC BY-NC-ND 2.0)

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MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1 FACULTE DE PHARMACIE INSTITUT DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES

2016 THESE n°43

T H E S E

pour le DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE

présentée et soutenue publiquement 20 juin 2016 par Mme MASSON Clémence Née le 7 novembre 1990 A Viriat (Ain)

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LES AMANITES TOXIQUES : DERNIERES AVANCEES SUR LES SYNDROMES ET AMELIORATION DE LA BASE DE DONNEES DU SITE INTERNET DE FORMATION EN MYCOLOGIE DE L’UNIVERSITE

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JURY

Mme RODRIGUEZ-NAVA Veronica, Maître de Conférences M. BLAHA Didier, Maître de Conférences Mme PALIARD Caroline, Docteur en Pharmacie Mme MIRABEL-CHAMBAUD Eléa, Docteur en Pharmacie

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

 Président de l’Université M. Frédéric FLEURY  Présidence du Conseil Académique M. Hamda BEN HADID  Vice-Président du Conseil d’Administration M. Didier REVEL  Vice-Président de la Commission Recherche M. Fabrice VALLEE  Vice-Président de la Formation et de la Vie Universitaire M. Philippe CHEVALIER

Composantes de l’Université Claude Bernard Lyon 1

SANTE

UFR de Médecine Lyon Est Directeur : M. Jérôme ETIENNE

UFR de Médecine Lyon Sud Charles Directeur : Mme Carole BURILLON Mérieux

Institut des Sciences Pharmaceutiques Directrice : Mme Christine VINCIGUERRA et Biologiques

UFR d'Odontologie Directeur : M. Denis BOURGEOIS Institut des Techniques de Réadaptation Directeur : M. Yves MATILLON

Département de formation et centre Directeur : Anne-Marie SCHOTT de recherche en Biologie Humaine

SCIENCES ET TECHNOLOGIES

Faculté des Sciences et Technologies Directeur : M. Fabien DE MARCHI

UFR de Sciences et Techniques des Directeur : M. Yannick VANPOULLE Activités Physiques et Sportives(STAPS)

Ecole Polytechnique Universitaire de Lyon Directeur : M. Pascal FOURNIER (ex ISTIL)

I.U.T. LYON 1 Directeur : M. Christophe VITON Institut des Sciences Financières Directeur : M. Nicolas LEBOISNE et d'Assurance (ISFA)

ESPE Directeur : M. Alain MOUGNIOTTE

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) ISPB – Faculté de Pharmacie Lyon LISTE DES DEPARTEMENTS PEDAGOGIQUES

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DE SCIENCES PHYSICO-CHIMIQUE ET PHARMACIE GALENIQUE

 CHIMIE ANALYTIQUE, GENERALE, PHYSIQUE ET MINERALE Monsieur Raphaël TERREUX (Pr) Monsieur Pierre TOULHOAT (Pr - PAST) Madame Julie-Anne CHEMELLE (MCU) Monsieur Lars-Petter JORDHEIM (MCU-HDR) Madame Christelle MACHON (AHU)

 PHARMACIE GALENIQUE -COSMETOLOGIE Madame Marie-Alexandrine BOLZINGER (Pr) Madame Stéphanie BRIANCON (Pr) Madame Françoise FALSON (Pr) Monsieur Hatem FESSI (Pr) Monsieur Fabrice PIROT (PU - PH) Monsieur Eyad AL MOUAZEN (MCU) Madame Sandrine BOURGEOIS (MCU) Madame Ghania HAMDI-DEGOBERT (MCU-HDR) Monsieur Plamen KIRILOV (MCU) Monsieur Damien SALMON (AHU)

 BIOPHYSIQUE Monsieur Richard COHEN (PU – PH) Madame Laurence HEINRICH (MCU) Monsieur David KRYZA (MCU – PH - HDR) Madame Sophie LANCELOT (MCU - PH) Monsieur Cyril PAILLER-MATTEI (MCU-HDR) Madame Elise LEVIGOUREUX (AHU)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE PHARMACEUTIQUE DE SANTE PUBLIQUE

 DROIT DE LA SANTE Monsieur François LOCHER (PU – PH) Madame Valérie SIRANYAN (MCU - HDR)

 ECONOMIE DE LA SANTE Madame Nora FERDJAOUI MOUMJID (MCU - HDR)

Madame Carole SIANI (MCU – HDR) Monsieur Hans-Martin SPÄTH (MCU)

 INFORMATION ET DOCUMENTATION Monsieur Pascal BADOR (MCU - HDR)

 HYGIENE, NUTRITION, HYDROLOGIE ET ENVIRONNEMENT Madame Joëlle GOUDABLE (PU – PH)

 INGENIERIE APPLIQUEE A LA SANTE ET DISPOSITIFS MEDICAUX Monsieur Gilles AULAGNER (PU – PH) Monsieur Daniel HARTMANN (Pr)

 QUALITOLOGIE – MANAGEMENT DE LA QUALITE Madame Alexandra CLAYER-MONTEMBAULT (MCU) Monsieur Vincent GROS (MCU-PAST) Madame Audrey JANOLY-DUMENIL (MCU-PH) Madame Pascale PREYNAT (MCU PAST)

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)  MATHEMATIQUES – STATISTIQUES Madame Claire BARDEL-DANJEAN (MCU-PH) Madame Marie-Aimée DRONNE (MCU) Madame Marie-Paule PAULTRE (MCU - HDR)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE SCIENCES DU MEDICAMENT

 CHIMIE ORGANIQUE Monsieur Pascal NEBOIS (Pr) Madame Nadia WALCHSHOFER (Pr) Monsieur Zouhair BOUAZIZ (MCU - HDR) Madame Christelle MARMINON (MCU) Madame Sylvie RADIX (MCU -HDR) Monsieur Luc ROCHEBLAVE (MCU - HDR)

 CHIMIE THERAPEUTIQUE Monsieur Roland BARRET (Pr) Monsieur Marc LEBORGNE (Pr) Monsieur Laurent ETTOUATI (MCU - HDR) Monsieur Thierry LOMBERGET (MCU - HDR) Madame Marie-Emmanuelle MILLION (MCU)

 BOTANIQUE ET PHARMACOGNOSIE Madame Marie-Geneviève DIJOUX-FRANCA (Pr) Madame Marie-Emmanuelle HAY DE BETTIGNIES (MCU) Madame Isabelle KERZAON (MCU) Monsieur Serge MICHALET (MCU)

 PHARMACIE CLINIQUE, PHARMACOCINETIQUE ET EVALUATION DU MEDICAMENT Madame Roselyne BOULIEU (PU – PH) Madame Magali BOLON-LARGER (MCU - PH) Madame Christelle CHAUDRAY-MOUCHOUX (MCU-PH) Madame Céline PRUNET-SPANO (MCU) Madame Catherine RIOUFOL (MCU- PH-HDR)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DE PHARMACOLOGIE, PHYSIOLOGIE ET TOXICOLOGIE

 TOXICOLOGIE Monsieur Jérôme GUITTON (PU – PH) Madame Léa PAYEN (PU-PH) Monsieur Bruno FOUILLET (MCU) Monsieur Sylvain GOUTELLE (MCU-PH)

 PHYSIOLOGIE Monsieur Christian BARRES (Pr) Monsieur Daniel BENZONI (Pr) Madame Kiao Ling LIU (MCU) Monsieur Ming LO (MCU - HDR)

 PHARMACOLOGIE Monsieur Michel TOD (PU – PH) Monsieur Luc ZIMMER (PU – PH) Monsieur Roger BESANCON (MCU) Monsieur Laurent BOURGUIGNON (MCU-PH) Madame Evelyne CHANUT (MCU) Monsieur Nicola KUCZEWSKI (MCU) Madame Dominique MARCEL CHATELAIN (MCU-HDR)

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)  COMMUNICATION Monsieur Ronald GUILLOUX (MCU)

 ENSEIGNANTS ASSOCIES TEMPORAIRES Monsieur Olivier CATALA (Pr-PAST) Madame Corinne FEUTRIER (MCU-PAST) Madame Mélanie THUDEROZ (MCU-PAST)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DES SCIENCES BIOMEDICALES A

 IMMUNOLOGIE Monsieur Jacques BIENVENU (PU – PH) Monsieur Guillaume MONNERET (PU-PH) Madame Cécile BALTER-VEYSSEYRE (MCU - HDR) Monsieur Sébastien VIEL (AHU)

 HEMATOLOGIE ET CYTOLOGIE Madame Christine VINCIGUERRA (PU - PH) Madame Brigitte DURAND (MCU - PH) Monsieur Yohann JOURDY (AHU)

 MICROBIOLOGIE ET MYCOLOGIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE AUX BIOTECHNOLOGIE INDUSTRIELLES Monsieur Patrick BOIRON (Pr) Monsieur Jean FRENEY (PU – PH) Monsieur Frédéric LAURENT (PU-PH-HDR) Madame Florence MORFIN (PU – PH) Monsieur Didier BLAHA (MCU) Madame Ghislaine DESCOURS (MCU-PH) Madame Anne DOLEANS JORDHEIM (MCU-PH) Madame Emilie FROBERT (MCU - PH) Madame Véronica RODRIGUEZ-NAVA (MCU-HDR)

 PARASITOLOGIE, MYCOLOGIE MEDICALE Monsieur Philippe LAWTON (Pr) Madame Nathalie ALLIOLI (MCU) Madame Samira AZZOUZ-MAACHE (MCU - HDR)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DES SCIENCES BIOMEDICALES B

 BIOCHIMIE – BIOLOGIE MOLECULAIRE - BIOTECHNOLOGIE Madame Pascale COHEN (Pr) Monsieur Alain PUISIEUX (PU - PH) Madame Emilie BLOND (MCU-PH) Monsieur Karim CHIKH (MCU - PH) Madame Carole FERRARO-PEYRET (MCU - PH-HDR) Monsieur Boyan GRIGOROV (MCU) Monsieur Hubert LINCET (MCU-HDR) Monsieur Olivier MEURETTE (MCU) Madame Caroline MOYRET-LALLE (MCU – HDR) Madame Angélique MULARONI (MCU) Madame Stéphanie SENTIS (MCU) Monsieur Anthony FOURIER (AHU)

 BIOLOGIE CELLULAIRE Madame Bénédicte COUPAT-GOUTALAND (MCU) Monsieur Michel PELANDAKIS (MCU - HDR)

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)  INSTITUT DE PHARMACIE INDUSTRIELLE DE LYON

Madame Marie-Alexandrine BOLZINGER (Pr) Monsieur Daniel HARTMANN (Pr) Monsieur Philippe LAWTON (Pr) Madame Sandrine BOURGEOIS (MCU) Madame Marie-Emmanuelle MILLION (MCU) Madame Alexandra MONTEMBAULT (MCU) Madame Angélique MULARONI (MCU) Madame Valérie VOIRON (MCU - PAST)

 Assistants hospitalo-universitaires sur plusieurs départements pédagogiques

Madame Florence RANCHON

 Attachés Temporaires d’Enseignement et de Recherche (ATER)

Madame Charlotte BOUARD (86ème section) Madame Laure-Estelle CASSAGNES (85ème section) Monsieur Karim MILADI (85ème section) Madame Laurence PAGES (87ème section)

Pr : Professeur PU-PH : Professeur des Universités, Praticien Hospitalier MCU : Maître de Conférences des Universités MCU-PH : Maître de Conférences des Universités, Praticien Hospitalier HDR : Habilitation à Diriger des Recherches AHU : Assistant Hospitalier Universitaire PAST : Personnel Associé Temps Partiel

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)

REMERCIEMENTS

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) A Madame Veronica RODRIGUEZ-NAVA, Je vous remercie sincèrement d’avoir accepté la présidence de mon jury.

A Monsieur Didier BLAHA, Je vous remercie d’avoir dirigé ma thèse avec pédagogie et gentillesse. Merci pour votre disponibilité, votre écoute et votre soutien continue durant l’élaboration de ce travail.

A Madame Caroline PALIARD, Je vous remercie également d’avoir dirigé cette thèse avec beaucoup d’efficacité. Merci pour votre disponibilité et votre aide précieuse notamment dans la finalisation de cette thèse.

A Madame Elea MIRABEL-CHAMBAUD, Pour l’honneur de t’avoir dans mon jury de thèse. Merci pour ton amitié.

Je remercie l’équipe de l’ICAP et notamment Antony Masson, toujours réactif à mes questions d’ordre technique. Je remercie Nadine Beysseriat qui a réalisé la majorité des clichés illustrant les « Fiches d’identité » de la base de données mycologique de l’ISPB.

A mes parents, Merci d’avoir toujours été là pour moi, de m’avoir encouragé coûte que coûte dans chacun de mes choix. La fin du marathon étude approche, quel soulagement. Merci de m’avoir donné des ailes et de m’avoir façonné aujourd’hui telle que je suis, heureuse et épanouie.

A ma sœur, Merci Syssy pour ton soutien indéfectible dans toutes mes actions. Merci d’être aussi formidable et merci pour tous ces moments sublimes passés ensembles et à venir. Quelle chance de t’avoir !

A ma famille en or : Merci à ma petite mamie de Lyon d’être toujours à l’écoute et aussi bienveillante et attentionnée envers ses petits-enfants.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Merci à mon Papy et ma Mamie de Louhans de m’avoir permis de vivre autant de moments de joie. Merci à ma siamoise préférée, Stéphanie. A notre future escalade du mont Karasia. Merci à Joelle et Jean Claude d’être tout simplement là tout le temps et de m’avoir hébergé de nombreuses fois. Merci à Alexis pour tes petites attentions envers chacun de nous et à très vite dans les îles. Merci à François d’avoir cru en nous. Tu es le meilleur et bravo pour ta force de caractère. Merci à Antoine pour ta douceur et ton écoute. Merci à Anna, ma douce marraine pour ta gentillesse et bienveillance envers moi. Merci à la petite famille de l’Est, Clotilde, Alexandre, Anne et Denis.

A Jean, Merci de m’avoir supporté et rassuré dans tous ces moments d’examen. J’espère que notre vie future sera à l’image de notre vie présente, heureuse.

A mes amies du Lycée, Plus de 10 ans déjà et toujours au rendez-vous. Anne Lise, Cindy, Eugénie, Léa, Marie, Pauline et Victoire. Aux folles années qui nous attendent.

A ma bande de pharma, Merci à Chloé, JP, Julien, Max, Pauline, Steff et Stéphane pour tous ces moments de bonheur partagés ensemble. Vivement notre prochaine escapade.

A Louise et Mathilde, Merci à mes deux amies fidèles, mes confidentes. A nos futurs weekends réussis.

A mes deux acolytes de tous les instants Eléa et Gladys. Encore de belles années à magouiller ensembles.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)

SOMMAIRE

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) REMERCIEMENTS ...... 7 SOMMAIRE ...... 10 INTRODUCTION ...... 19 .1. PARTIE 1 : Les toxines impliquées dans les syndromes phalloïdien, proximien et panthérinien ou myco-atropinique ...... 22 1.1. Généralités sur les syndromes liés au mycétisme ...... 22 .1.1.1. Classification des syndromes ...... 22 .1.1.2. Incidence ...... 24 .1.1.3. Toxines responsables ...... 26 .1.1.4. Prise en charge ...... 26 1.2. Le syndrome phalloïdien ...... 28 .1.2.1. Espèces responsables ...... 28 .1.2.2. Clinique ...... 29 .1.2.2.1. Phase de latence ...... 29 .1.2.2.2. Phase cholériforme ...... 29 .1.2.2.3. Phase de rémission ...... 30 .1.2.2.4. Atteinte hépatorénale ...... 30 .1.2.3. Molécules mises en cause ...... 32 .1.2.3.1. Les amanitines ...... 33 .1.2.3.1.1. Structure, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques ..... 33 .1.2.3.1.2. Mécanisme de toxicité ...... 35 .1.2.3.2. Phallotoxines ...... 39 .1.2.3.2.1. Structures propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques ..... 39 .1.2.3.2.2. Mécanisme de toxicité ...... 40 .1.2.3.3. Virotoxines ...... 40 .1.2.3.3.1. Structure, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques ..... 40 .1.2.3.3.2. Mécanisme de toxicité ...... 41 .1.2.4. Dosages / quantification ...... 41 .1.2.5. Traitements ...... 42 .1.2.5.1. Traitement symptomatique avec réajustement et surveillance des constantes biologiques ...... 43 .1.2.5.2. Traitement épuratif digestif et rénale ...... 44 .1.2.5.3. Traitement spécifique par chimiothérapie antitoxique ...... 45 11

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.2.5.3.1. La benzylpénicilline ou pénicilline G ...... 45 .1.2.5.3.2. La ceftazidime ...... 46 .1.2.5.3.3. La silymarine ...... 46 .1.2.5.3.4. La N-acétylcystéine ...... 46 .1.2.5.3.5. La polymyxine B ...... 47 .1.2.5.4. Traitement de l’insuffisance hépatique et transplantation hépatique .. 48 1.3. Le syndrome proximien ...... 52 .1.3.1. Espèce responsable ...... 52 .1.3.2. Clinique ...... 53 .1.3.2.1. Etat des lieux ...... 53 .1.3.2.2. Une potentielle toxicité cardiaque d’apparition tardive ...... 54 .1.3.3. Toxines mises en cause ...... 56 .1.3.4. Dosage / Quantification ...... 56 .1.3.5. Traitements ...... 56 1.4. Focus sur le syndrome panthérinien ou myco-atropinique ...... 57 .1.4.1. Les espèces responsables ...... 57 .1.4.2. Clinique ...... 58 .1.4.2.1. Etat des lieux ...... 58 .1.4.2.2. Un nouveau symptôme clinique décrit : suppression-burst ...... 59 .1.4.2.3. Vers deux syndromes distincts ...... 60 .1.4.3. Toxines mises en cause ...... 61 .1.4.3.1. Acide iboténique ...... 62 .1.4.3.1.1. Structure, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques ..... 62 .1.4.3.1.2. Mécanisme de toxicité ...... 63 .1.4.3.2. Muscimol ...... 64 .1.4.3.2.1. Structure, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques ..... 64 .1.4.3.2.2. Mécanisme de toxicité ...... 65 .1.4.3.3. Les autres toxines identifiées ...... 66 .1.4.4. Propriétés pharmacologiques d’Amanita muscaria et d’Amanita pantherina ... 66 .1.4.4.1. L’acide iboténique, un agent provoquant des lésions cérébrales ...... 66 .1.4.4.2. Le muscimol, une molécule GABAergique expérimentale ...... 67 .1.4.4.3. Les polysaccharides d’Amanita muscaria, des molécules anti- inflammatoires et anti-nociceptives ...... 67 12

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.4.5. Dosage / Quantification ...... 68 .1.4.5.1. A partir de matériel végétal ...... 69 .1.4.5.2. A partir de matériel biologique ...... 70 .1.4.6. Traitements ...... 70 .2. PARTIE 2 : Amélioration de la base de données du site web « Les macromycètes dans tous leurs états » ...... 72 2.1. Etude critique du site internet ...... 73 .2.1.1. Arborescence du site ...... 73 .2.1.2. Design du site ...... 74 .2.1.3. Analyse de la visibilité du site via Google tendances ...... 76 .2.1.3.1. Gestion des mots clés...... 76 .2.1.3.2. Référencement des images dans google image ...... 80 .2.1.3.3. Méthode du backlink ...... 81 .2.1.3.4. Mise à jour de contenu ...... 81 .2.1.3.5. Aspect communautaire ...... 82 .2.1.3.6. Conclusion de l’analyse de visibilité et perspectives d’amélioration . 82 .2.1.4. Quantification du trafic et analyse de l’audience via Google Analytics ...... 83 .2.1.5. Identification et résolution des problèmes techniques ...... 83 .2.1.6. Identification et résolution des erreurs de contenu ...... 84 2.2. Etude statistique du site internet et des vidéos YouTube ...... 85 .2.2.1. Partie site internet ...... 86 .2.2.1.1. Répartition saisonnière et mensuelle du nombre et type d’actions sur le site « Les Macromycètes dans tous leurs états » ...... 86 .2.2.1.2. Evolution du nombre d’actions, du nombre d’étudiants ayant consultés le site et du temps moyen passé par étudiant en fonction de l’année scolaire .. 88 .2.2.2. Partie Cinémathèque ...... 91 .3. PARTIE 3 : Conception des fiches ...... 93 3.1. Méthodologie pour la conception des fiches ...... 93 3.2. Les fiches réalisées ...... 94 CONCLUSIONS ...... 95 ANNEXES ...... 98 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 133

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Classification des différents syndromes en fonction des symptômes et de leur apparition dans le temps (4) ...... 23 Figure 2 : Espèces de champignons des genres Amanita, Galerina et Lepiota contenant des amatoxines (14)...... 29 Figure 3 : Manifestation clinique du syndrome phalloïdien ...... 32 Figure 4 : Concentration des toxines dans le tissu d'Amanita phalloides var. alba (mg/g) (20)...... 33 Figure 5 : Structure chimique des amatoxines (8)...... 33 Figure 6 : Modèle simplifié du transport de l'α-amanitine et principal mécanisme de toxicité dans les hépatocytes (8)...... 36 Figure 7 : Structure cristallographique de 10 sous-unités de l'ARN-polymérase II et intéraction avec l'α-amanitine à l’échelle atomique (8)...... 37 Figure 8 : Structure chimique des phallotoxines (8) ...... 39 Figure 9 : Structure chimique des virotoxines (8) ...... 40 Figure 10 : Evolution des symptômes dans le temps du syndrome d'intoxication lié à l’ingestion d’Amanita muscaria (80) ...... 59 Figure 11 : Structure développée de l'acide iboténique...... 62 Figure 12 : Récepteur métabotropiquespécifique de l'acide iboténique (22)...... 63 Figure 13 : Réaction de décarboxylation de l'acide iboténique en muscimol (89)...... 64 Figure 14 : Trois formes du muscimol avec le nombre d'atomes ...... 65 Figure 15: Arborescence du site internet "Les macromycètes dans tous leurs états" à la date du 21/01/2016 ...... 73 Figure 16 : Commentaire sur le Forum Errata d'un usager du site "Les macromycètes dans tous leurs états" ...... 74 Figure 17 : Comparaison des pages d’accueil des sites « Les macromycètes dans tous leurs états » et de « Clic’Amanites » ...... 75 Figure 18 : Recherches associées aux termes saisis dans Google ...... 77 Figure 19 : Courbe du nombre de recherches sur Google des termes « champignons comestibles », « champignons toxiques », « mycologie », « macromycètes » en fonction du temps et zoom sur le mois d’octobre 2013 ...... 78

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Figure 20 : Comparaison entre les mots clés de la page d'acceuil du site "Les macromycètes dans tous leurs états" à la date du 04 juin 2016 et une nouvelle proposition. Les mots inutiles ont été supprimés (PDF / zoom / image etc.) ...... 79 Figure 21 : Inspection du code de l’image de la fiche d’identité de Agaricus arvensis sur le site « Les macromycètes dans tous leurs états » ...... 81 Figure 22 : Répartition saisonnière des actions sur le site internet ...... 87 Figure 23 : Nombre d'actions des étudiants sur le site web "Les macromycètes dans tous leurs états" par mois ...... 88 Figure 24: Evolution du nombre moyen d’actions par étudiant en fonction de l’année scolaire ...... 89 Figure 25 : Evolution du nombre d'étudiants ayant consulté le site par année scolaire ...... 90 Figure 26 : Evolution du temps moyen d’un étudiant passé sur le site en fonction de l’année scolaire...... 90 Figure 27 : Chaine YouTube « Les Macromycètes » ...... 91 Figure 28 : Top 10 des vidéos YouTube les plus vues sur la chaine "Les Macromycètes" ..... 92

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Répartition du nombre de personnes intoxiquées selon le type de syndrome (en pourcentage par rapport au total) – Etude multicentrique des centres antipoison et de toxicovigilance français de 1998 (5)...... 25 Tableau 2 : Bilan du CAP de Lyon 2014 - Répartition du type de syndrome mycotoxique sur les cas d’exposition alimentaire (6)...... 26 Tableau 3 : Evolution des symptômes dans le temps du syndrome proximien (66)...... 53 Tableau 4 : Etat des lieux des erreurs techniques identifiées sur le site "Les macromycètes dans tous leurs états"...... 84 Tableau 5 : Etat des lieux des erreurs et éléments manquants identifiées sur le contenu et la charte graphique du site "Les macromycètes dans tous leurs états"...... 85 Tableau 6 : Statistiques de la chaine YouTube « Les macromycètes » ...... 91 Tableau 7 : Liste des fiches rédigées pour ce travail de thèse...... 94

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 : Rappel sur la transmission d'un signal électrique ...... 99 Annexe 2 : Le cycle du glutamate et de l’excitation d’une jonction synaptique ...... 100 Annexe 3 : Schéma de purification et d'extraction d'hétérogalactane et de β-D-gluacane chez Amanita muscaria (97) ...... 101 Annexe 4 : Détermination du muscimol et de l'acide iboténique chez le genre Amanita par électrophorèse capillaire ...... 102 Annexe 5 : Critères de transplantation en urgence chez les patients atteints d'insuffisance hépatite aiguë (18) ...... 104 Annexe 6 : Analyse Google Tendance des mots clés pour les fiches d’identité ...... 105 Annexe 7 : Liste des vidéos YouTube de la chaine "Les macromycètes" ...... 106 Annexe 8 : Maquette d’une fiche d’identité d’un macromycète ...... 107 Annexe 9 : Termes ajoutés au glossaire du site « Les macomycètes dans tous leurs états »(157) ...... 108 Annexe 10 : Charte graphique d’une fiche d’identité d’un macromycète ...... 109 Annexe 11 : Fiche Amanita proxima mise en ligne le 11/06/2016 ...... 111 Annexe 12 : Fiches corrigées à mettre en ligne ...... 111

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) LISTE DES ABBREVIATIONS

ADN Acide Désoxyribonucléique ALAT Alanine Amino Transférase ARN Acide Ribonucléique ARNm Acide Ribonucléique Messager ARN pol II ARN polymérase II ASAT Aspartate Amino Transférase BMR Biological Response Modifiers CAPTV Les Centres Antipoison et de Toxicovigilance CAP Centre Antipoison CAT Catalase DMSO Diméthylsulfoxyde ECG Electroencéphalogramme ECLS Extracorporeal Life Support ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FMG Fucomannogalactan GABA Acide Gamma-Amino Butyrique GLC Glucane GSH-Px Glutathion Peroxydases HPLC-EC-UV High Performance Liquid Chromatography - Electrochemical Detection – Ultraviolet IBO Acide iboténique iCAP Innovation, Conception et Accompagnement pour la Pédagogie INR International Normalized Ratio InVS Institut de Veille Sanitaire IRC Insuffisance Rénale Chronique ISPB Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques LC/ESI-TOF-MS Liquid chromatography / electrospray ionization time-of-flight-Mass spectrometry LC-HR-MS Liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry LC-MS Liquid chromatography-mass spectrometry LOD Limit of detection 17

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) MARS® Molecular Adsorbents Recirculating System MS Mass spectrometry MUS Muscimol OATP1B3 Organic anion-transporting polypeptide 1B3 OATPs Organic anion-transporting polypeptide ROS Reactive Oxygen Species RMN Résonnance Magnétique Nucléaire RP-HPLC Reversed Phase - High-performance liquid chromatography SNC Système nerveux central SOD Superoxyde Dismutases SPE Solid phasis extraction SPIRAL Connect Serveur Pédagogique Interactif de Ressources d'Apprentissage de Lyon 1 TAS Statut Antioxydant Total TOS Statut Oxydant Total UCBL Université Claude Bernard Lyon 1 UNF3S Université Numérique Francophone des Sciences, de la Santé et du Sport UPLC-MS/MS Ultra-performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry URL Uniform Resource Locator

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)

INTRODUCTION

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) La cueillette des champignons, bien que pratiquée depuis la nuit des temps, n’a pas fini d’évoluer au gré des changements climatiques, des évènements qui affectent l’écosystème des macromycètes et des avancées scientifiques dans le domaine de la Mycologie. La classification des macromycètes est aujourd’hui de plus en plus fondée sur des affinités réelles, géniques des espèces et non plus seulement sur des ressemblances morphologiques. Celle-ci est parfois bouleversée par des remaniements de groupes entiers qui changent de place dans la classification et parfois même de nom. La mycologie est donc une science en progression constante où les connaissances dans le domaine de la toxicité ont aussi fortement évolué.

Ainsi des espèces considérées comme comestibles changent de statut pour devenir toxiques voire mortelles. Chaque année, de nouvelles espèces toxiques sont identifiées et de nouveaux syndromes sont suspectés. En plus du problème de la toxicité intrinsèque due à la présence d’une toxine produite par certains champignons, il faut se soucier désormais de la toxicité acquise par des phénomènes de pollution. En effet les champignons sont connus pour être des bio accumulateurs capables d’emmagasiner des métaux lourds et autres produits toxiques contenus naturellement ou par pollution industrielle dans le sol, l’eau et l’air qui les environnent. Cette pollution peut engendrer de lourdes pathologies dommageables sur le long terme. L’évolution rapide de nos connaissances fait que les traditions orales, les habitudes familiales ou locales doivent être remises en cause pour déterminer la comestibilité ou non d’un champignon. La Mycologie nécessite une formation continue où il faut rester informé des dernières découvertes. C’est dans cette idée de mise à jour que la synthèse actuelle de nos connaissances sur les syndromes dus à l’ingestion des champignons dits « supérieurs » ou mycétisme a été traité dans la première partie de ce travail. Nous nous limiterons à trois syndromes importants liés principalement à des espèces du genre Amanita : le syndrome phalloïdien, le syndrome proximien et le syndrome panthérinien ou myco-atropinique.

En plus de cette évolution constante et rapide des connaissances, le patrimoine mycologique français dénombre aujourd’hui plus de 35 000 espèces de macromycètes et ce chiffre est toujours en progression. Confronté à cette incroyable diversité, la détermination des champignons peut s’avérer compliqué et des confusions peuvent être commises. Il est alors essentiel de fournir à tous les passionnés, amateurs ou professionnels, des clés pour parvenir à l’identification la plus précise possible des champignons macroscopiques les plus communs. 20

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) C’est l’ambition du site internet de l’Université Lyon 1 « Les macromycètes dans tous leurs états » depuis sa mise en ligne en 2011. Mis à jour et alimenté chaque année par les travaux de thèse des étudiants, cet outil présente l’avantage de fournir aux pharmaciens, aux étudiants et au grand public, une formation à distance, de qualité et actualisée fréquemment. Le site présente des photos en haute définition, des fiches descriptives précises et complètes sur la comestibilité, l’anatomie, l’habitat, la saison d’apparition etc. d’un nombre important de champignons. De plus, des vidéos commentées illustrent une clé d’orientation générale, quelques genres et une trentaine d’espèces de champignons. Cet outil est destiné en premier lieu aux enseignants comme support aux cours magistraux, aux étudiants pour se former à l’identification mycologique et aux pharmaciens et amateurs comme outil de comparaison entre les champignons d’une récolte et ceux présentés sur le site internet. Dans le cadre d’une amélioration permanente du site « Les macromycètes dans tous leur états » nous avons réalisé une étude critique du site, une étude statistique sur les habitudes des usagers du site et sur les vidéos de la chaine YouTube « Les macromycètes ». Enfin nous alimenterons la base de données du site par une vingtaine de nouvelles fiches descriptives de champignons.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1. PARTIE 1 : Les toxines impliquées dans les syndromes phalloïdien,

proximien et panthérinien ou myco-atropinique

Les intoxications suite à l’ingestion de champignons représentent un motif régulier de consultations dans les structures d’urgence. Ces intoxications sont le plus souvent de faible gravité et un traitement symptomatique est alors suffisant. Cependant, des atteintes plus graves peuvent survenir mettant en danger la vie du patient. Les Centres Antipoison et de Toxicovigilance (CAPTV) français recensent chaque année de 1300 à 1500 cas (1) soit une incidence de 18 cas d’intoxication par million d’habitants. Chaque année, environ trois décès et plus d’une vingtaine de cas graves sont observés par les CAPTV (2). Suite à des alertes sanitaires régulières, l’Institut de Veille Sanitaire (InVS) a débuté en 2010 une surveillance saisonnière (du 1er juillet au 31 décembre) et annuelle des intoxications par champignons, à partir des cas enregistrés par les CAPTV et du réseau Oscour® (réseau de surveillance coordonnée des passages aux urgences, couvrant actuellement environ 90% des services d’urgences hospitalières en 2015) (2). Actuellement on dénombre une quinzaine de syndromes toxicologiques associés aux intoxications par les champignons en France. Dans le cadre de cette thèse, nous nous limiterons aux syndromes liés à l’ingestion des champignons dits « supérieurs » ou mycétisme, à l’exclusion de ceux qui peuvent survenir lors d’une ingestion de denrées alimentaires contaminées par des toxines émises par des micromycètes, qui auraient produit des mycotoxicoses.

1.1. Généralités sur les syndromes liés au mycétisme

.1.1.1. Classification des syndromes

La classification habituelle des syndromes de type mycétisme se fait en fonction du délai d’apparition des symptômes (Figure 1). Il est à noter que plus le temps entre l’ingestion du champignon et l’apparition des premiers symptômes est long, plus les conséquences risquent d’être graves allant jusqu’à engager le pronostic vital.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) En pratique, c’est l’analyse des symptômes et du délai entre la consommation du champignon et l’apparition des premiers symptômes qui va permettre l’identification du syndrome d’intoxication. La classification des syndromes de mycétisme permet le plus souvent de distinguer les syndromes fonctionnels dits « à latence courte » ou « mineurs » de gravité bénigne ou modérée des syndromes lésionnels dits « à latence longue » ou « majeurs ». Le délai d’incubation est inférieur à 6 heures pour les syndromes fonctionnels et il est supérieur à 6 heures pour les syndromes lésionnels. Cette règle des 6 heures peut être mise en défaut en cas de consommation de champignons lors de plusieurs repas consécutifs, lors de la consommation de grosses quantité de champignons ou lors de l’ingestion de plusieurs champignons toxiques ; une espèce de champignon engendrant un syndrome à latence courte pouvant masquer l’apparition d’éventuels signe d’intoxication à latence longue (3).

Figure 1 : Classification des différents syndromes en fonction des symptômes et de leur apparition dans le temps (4)

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.1.2. Incidence

Il est difficile d’estimer l’incidence des intoxications par les champignons car tous les cas ne sont pas signalés aux CAPTV ou ne nécessitent pas de prise en charge aux urgences. Les intoxications sont en majorité d’évolution bénigne et spontanée, avec une guérison en quelques heures. Une analyse multicentrique réalisée en France auprès des CAPTV recense 1675 appels concernant des intoxications par champignons (5) sur une période d’avril à janvier 1998. Elle répartie le nombre de personnes intoxiquées selon le type de syndrome identifié (Tableau 1). On constate que les syndromes mineurs représentent presque 90% de l’ensemble des intoxications par champignons. Ces données traduisent le nombre important d’espèces responsables de ces syndromes impliquant parfois des champignons reconnus comme comestibles mais pouvant engendrer des symptômes suite à une surconsommation du champignon, une mauvaise cuisson ou des intolérances interindividuelles. Ces chiffres peuvent aussi traduire les résultats des campagnes de prévention organisées par les pharmaciens d’officine, les sociétés de mycologie, les médias qui alertent les consommateurs sur les risques de la consommation des champignons. Le syndrome résinoïdien ou gastro- intestinal est le plus fréquent, il se caractérise par des troubles digestifs tels que la gastroentérite aiguë et représente plus de 60% de l’ensemble des intoxications par champignons. Le second syndrome en fréquence est le syndrome sudorien ou muscarinique qui comptabilise environ 16% des cas. Il est lié à la muscarine présente dans la chair de certains champignons et son tableau clinique se caractérise par un syndrome hyper sécrétoire, des troubles digestifs type gastroentérite associés à des signes cholinergiques tels que le myosis et la bradycardie. Les syndromes majeurs ou à latence longue représentent une faible part des intoxications par champignons, soit moins de 4% dans notre étude. Le syndrome phalloïdien comptabilise seulement 2,6% des cas d’intoxication mais il est responsable de 90 à 95% des décès liés à la consommation des champignons. Les autres syndromes majeurs sont plus exceptionnels : le syndrome orellanien et le syndrome gyromitrien.

Pourcentage par rapport au total Syndromes Total (n= 1675 cas) Résinoïdien 68,6% Muscarinique 16,1% Syndromes mineurs 89,2% Panthérinien 2,2% Narcotinien 1,4%

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Coprinien 0,9% Phalloïdien 2,6% Syndromes majeurs Orellanien 0,0% 3,3% Gyromitrien 0,7% Autres 7,5% 7,5% Tableau 1 : Répartition du nombre de personnes intoxiquées selon le type de syndrome (en pourcentage par rapport au total) – Etude multicentrique des centres antipoison et de toxicovigilance français de 1998 (5).

Une analyse rétrospective des cas rapportés au Centre Antipoison (CAP) de Lyon a été réalisé en 2014 (6) afin d’établir un bilan sur les intoxications par champignons supérieurs dans cette région. Sur 304 patients issus de 157 foyers d’intoxication localisés en majorité en Rhône Alpes et recensés par l’étude, 266 patients, soit 87,5% des cas sont concernés par une exposition alimentaire. 35 patients, soit 11,5% des cas, sont concernés par une exposition accidentelle non alimentaire, typiquement le cas d’enfants ayant ingérer de petites quantités de champignons par manque de surveillance. Parmi ces 35 cas, 29 sont restés asymptomatiques et six ont été jugés sans gravité. Sur les 266 cas causés par intoxication alimentaire, 162 patients ont présenté des symptômes. Le syndrome résinoïdien est le plus fréquent avec 48% des cas symptomatiques (Tableau 2). Le syndrome sudorien arrive en deuxième position avec environ 15% des cas. Les syndromes phalloïdien et panthérinien concernent moins de 5% des cas. On note que dans 30,2% des cas, les syndromes n’ont pas pu être identifiés ce qui témoigne de la difficulté de poser le diagnostic dans ces cas de mycétisme. Les intoxications ont été évaluées sur un critère de gravité définie selon la cotation du Poison Severity Score (PSS) établi par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) en collaboration avec l’International Program on Chemical Safety (IPCS). Il se base sur la symptomatologie du patient au moment de l’appel au CAP et lors de son suivi médical. Un cas grave est défini par un PSS supérieur ou égal à trois. La gravité globale de l’intoxication est égale à la gravité la plus forte des symptômes développés par le patient (7). Ainsi huit cas ont été classés comme graves dont cinq sont dû au syndrome phalloïdien engendrant deux décès, deux sont dû au syndrome sudorien et un au syndrome résinoïdien.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Syndrome Foyers Exposés Cas graves Résinoïdien 41 78 48,1% 1 Sudorien 16 25 15,4% 2 Panthérinien 1 3 1,9% 0 Neurologique dû aux morilles 1 2 1,2% 0 Phalloïdien 4 5 3,1% 5 Non identifié - 49 30,2% 0 TOTAL 162 100,0% 8 Tableau 2 : Bilan du CAP de Lyon 2014 - Répartition du type de syndrome mycotoxique sur les cas d’exposition alimentaire (6).

Pour conclure on constate donc qu’en région lyonnaise, les statistiques sont en accord avec celles établis en 1998, le syndrome résinoïdien est le plus fréquemment identifié et le syndrome phalloïdien est de loin le plus dangereux avec 100% des cas identifiés ont été classé comme graves et ont abouti à deux décès.

.1.1.3. Toxines responsables

Les champignons toxiques peuvent être regroupés selon la ou les toxines(s) qu’ils renferment : cyclopeptides, gyromytrine, muscarine, coprine, isoxazoles, orellanine, psilocybine, et des irritants gastro-intestinaux (8). Les champignons contenant des cyclopeptides sont les plus toxiques au monde et sont responsables de 90 à 95% des décès dus à une intoxication par les champignons. Les cyclopeptides principaux sont les amatoxines et on considère que 90% des intoxications mortelles par les champignons sont dus à des espèces présentant des amatoxines (9).

.1.1.4. Prise en charge

Lors de l’arrivée d’un patient à l’hôpital, le diagnostic d’espèces consommées est souvent inconnu bien qu’il soit indispensable pour la prise en charge rapide du patient et l’anticipation de l’évolution de ses symptômes. En effet l’identification du champignon ingéré par le patient est souvent délicate voire impossible compte tenu : (i) des confusions / doutes possibles entre plusieurs espèces, (ii) des descriptions imprécises du patient, (iii) des échantillons souvent non disponibles ou encore (iv) des mélanges de champignons dans un même panier. Dans l’idéal un Mycologue serait indispensable pour chaque cas d’intoxication mais en pratique les Centres Antipoison régionaux ne sont pas toujours disponibles et ne disposent pas de 26

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Mycologues à demeure du fait de la saisonnalité des intoxications. Pour aider le médecin à identifier le syndrome et établir un pronostic en l’absence de l’espèce, on s’appuie sur trois critères (10): - L’analyse du temps de latence pour identifier le type de syndrome : à latence courte ou à latence longue. - L’analyse syndromique qui va l’orienter sur le genre et l’espèce. - L’analyse du terrain du patient qui peut interférer sur le pronostic tels que l’âge, le diabète, l’insuffisance hépatique ou rénale, l’épilepsie, la dénutrition, les traitements par cardiotropes ou les modificateurs du transit. Le praticien hospitalier doit aussi se méfier des multiples syndromes ; un syndrome d’incubation courte pouvant masquer une intoxication plus sévère telle qu’un syndrome à latence longue dans le cas d’une ingestion d’un mélange de champignons. Après l’évaluation clinique et le soutien des voies respiratoires, de la respiration et de la circulation si besoin, le clinicien doit anticiper et gérer les pertes liquidiennes causées par les troubles digestifs (vomissements, diarrhées). Le clinicien doit se tenir prêt à traiter les symptômes intrinsèques à chaque syndrome. Une surveillance hospitalière de 48 heures s’impose assez fréquemment et une admission à l’hôpital se justifie chez les patients suivants (11) (12) : - Les patients présentant des symptômes plus de 6 heures après l’ingestion de champignons. - Les patients présentant des symptômes précoces de moins de 3 heures après l'ingestion de champignons et qui restent symptomatiques après 6 heures malgré la mise en place des premiers soins ou ceux qui ont ingéré plus d’une espèce de champignon. - Les patients présentant des signes évidents de rhabdomyolyse, de toxicité hépatique ou d'insuffisance rénale. - Les patients asymptomatiques chez qui l'ingestion de champignons contenant des amatoxines est fortement suspectée.

Comme vu précédemment les intoxications mycotoxiques les plus graves sont celles dues au genre Amanita. Dans ce travail de thèse nous avons choisi de nous concentrer sur trois syndromes liés principalement à l’ingestion d’amanites : le syndrome phalloïdien, le syndrome proximien et le syndrome panthérinien ou myco-atropinique.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) 1.2. Le syndrome phalloïdien

Le syndrome phalloïdien est responsable de 90 à 95% des décès liés à la consommation de champignons et c’est l’atteinte hépatique la plus fréquente en Europe occidentale. Malgré une diminution significative du taux de mortalité ces dernières années grâce notamment au progrès de la transplantation et de la réanimation, le syndrome phalloïdien a tout de même le pronostic le plus sévère avec un taux de mortalité global de 15% (13) : 10% chez les adultes et 30% chez les enfants. Il doit être suspecté chaque fois que le délai entre l’ingestion et les premiers symptômes est supérieur à 6 heures. L’intoxiqué doit, dans tous les cas, être hospitalisé en service de réanimation. Trois groupes de toxines sont impliqués dans ce syndrome : les amanitines ou amatoxines, les phallotoxines et les virotoxines. Les organopeptides bicycliques appelés amatoxines (α, β et γ-amanitines) sont présents chez 35 espèces réparties dans trois genres différents : Amanita, Galerina et Lepiota. Ils sont responsables de l’hépatite toxique (14).

.1.2.1. Espèces responsables

L’Amanite phalloïdes ou Amanita phalloides est en cause dans 90% des intoxications mortelles par des champignons. L’ingestion d’un seul chapeau peut engager le pronostic vital d’un adulte. D’autres amanites entièrement blanches telles que l’Amanite printanière ou Amanita verna, l’Amanite vireuse ou Amanita virosa et l’Amanita bisporigera aux Etats Unis sont aussi responsables d’intoxications (Figure 2). Elles ont en commun la présence de lames blanches, d’un anneau blanc et d’une volve en sac blanche. Des petites Lépiotes rosissantes contenant des amatoxines peuvent aussi causer des intoxications phalloïdiennes et font surtout l’objet de consommations accidentelles par les enfants dans les parcs et les jardins en milieu urbain. C’est le cas notamment de Lepiota subincarnata, Lepiota brunneoincarnata, Lepiota brunneolilacea, Lepiota josserandii et Lepiota helveola. Certaines Galères telles que la Galère marginée ou Galerina marginata et Galerina autumnalis contiennent aussi des amatoxines et peuvent facilement être confondues avec la Pholiote changeante comestible. D’autres espèces appartenant à ces trois genres peuvent aussi causer des intoxications phalloïdiennes (Figure 2).

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Figure 2 : Espèces de champignons des genres Amanita, Galerina et Lepiota contenant des amatoxines (14).

.1.2.2. Clinique

L’intoxication à l’Amanite phalloïde entraine une entérohépatite sévère comprenant quatre phases (Figure 3).

.1.2.2.1. Phase de latence

La première phase se caractérise par une incubation silencieuse asymptomatique (Figure 3). C’est une période de latence de 6 à 24 heures se terminant par l’apparition des premiers symptômes cliniques, en moyenne, 10 à 12 heures après l’ingestion. La courte latence entre l’ingestion et le début des signes constitue un facteur de gravité (15).

.1.2.2.2. Phase cholériforme

La seconde phase survient donc 12 heures à trois jours après l’ingestion et se caractérise par une gastro-entérite aiguë de type « syndrome cholériforme » (16) (Figure 3). Les premiers symptômes consistent en une gêne respiratoire, des vertiges, un malaise et des troubles gastro-

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) intestinaux. On observe une agression digestive avec apparition brutale de vomissements alimentaires douloureux et importants (plusieurs fois par heure entre 2 et 4 litres par jour) pouvant durer plusieurs jours et devenant progressivement moins abondants et uniquement composés de liquides acides et de sels biliaires. Une à trois heures après les premiers symptômes, viennent s’ajouter des douleurs abdominales de types crampes ou brûlures et des diarrhées profuses, fétides et afécales qui s’arrêteront entre le cinquième et le sixième jour dans 90% des cas et entre le huitième et dixième jour dans les formes les plus graves (17). L’ensemble de ces pertes digestives peuvent entrainer une asthénie musculaire généralisée et constante dès la sixième heure ainsi qu’une tachycardie précoce allant en s’aggravant. Des signes de déshydratation extra et intracellulaire sévères tels qu’une soif intense, une sécheresse des muqueuses, une hyperthermie, une hypotonie des globes oculaires et une hypotension artérielle font leur apparition 12 à 18 heures après l’ingestion. Cette deuxième phase aussi nommée phase cholériforme s’accompagne d’un bilan biologique perturbé dès l’apparition des premiers symptômes avec notamment : une hypokaliémie, une hyperglycémie, une hémoconcentration, une hyperprotidémie, une hyperazotémie, une hypercréatinémie modérée, une natriurie basse, une acidose métabolique dans 10 % des cas et une hyperleucocytose à polynucléaires neutrophiles dans 60 % des cas. Cette phase, en l’absence de prise en charge rapide en réanimation, peut être responsable du décès entre le deuxième et le cinquième jour surtout chez l’enfant. Les décès à ce stade sont plus rares chez l’adulte mais ils peuvent survenir par collapsus cardiovasculaire avec insuffisance cardiaque et insuffisance rénale aiguë.

.1.2.2.3. Phase de rémission

S’ensuit une phase de rémission des symptômes trompeuse où l’état clinique du patient s’améliore transitoirement entre la trente-sixième et la quarante-huitième heure (Figure 3). Biologiquement on observe cependant une augmentation des transaminases.

.1.2.2.4. Atteinte hépatorénale

Une atteinte hépatorénale trois jours à six jours après l’ingestion marque la quatrième phase du syndrome (Figure 3). Elle s’organise en trois étapes successives : un syndrome de cytolyse, une insuffisance hépatocellulaire et une rétention biliaire. La cytolyse hépatique est marquée biologiquement par une augmentation de toutes les enzymes cytoplasmiques avec notamment 30

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) des pics plasmatiques significatifs de concentration des ALAT (< 2000 UI/L). On observe également une augmentation des taux de fer sérique, de bilirubine et de vitamine B12. L’insuffisance hépatique est caractérisée par l’altération brutale et globale des fonctions hépatiques. La sévérité de l’insuffisance hépatique est classiquement estimée par la diminution des facteurs de coagulation synthétisés par le foie et en parallèle une augmentation de l’International Normalized Ratio (INR), un des indicateurs de la coagulation sanguine. Une hypocholestérolémie, une hypoalbuminémie ainsi qu’une élévation du taux sérique des pseudocholinestérases sont également corrélés à cette insuffisance hépatocellulaire mais ils sont plus tardifs et moins sensibles. Dans la majorité des cas, le processus de destruction des hépatocytes s’interrompt, une régénération hépatocellulaire s’installe rapidement conduisant à la correction de l’insuffisance hépatique et à une guérison sans séquelles. Dans les cas où l’insuffisance hépatique s’aggrave et où il apparait une encéphalopathie, le pronostic vital est engagé à court terme. Elle peut en effet se compliquer très rapidement avec un œdème cérébral, une hypertension intracrânienne et une défaillance multiviscérale associant défaillance circulatoire et insuffisance rénale aiguë (18). Les signes de rétention biliaire apparaissent ensuite de façon inconstante et d’intensité variable. Les cellules endommagées ne sont plus capables d’évacuer les sels biliaires du foie dans les canaux biliaires. Ces sels s’accumulent dans les hépatocytes et finissent par passer dans la circulation sanguine colorant les tissus en jaune.

Dans les formes les plus graves, la cytolyse hépatique est maximale au troisième / cinquième jour. A partir du quatrième / cinquième jour, s’installent une hémorragie digestive, une encéphalopathie hépatique, une hypoglycémie, une coagulopathie de consommation et une insuffisance rénale aiguë organique. Après trois jours d’évolution, l’hépatite toxique se manifeste par une asthénie intense généralisée, des douleurs hépatiques, une hépatomégalie, un subictère léger évoluant vers un ictère généralisé dans 11% des cas. Ces signes persistent huit à 21 jours. A ce stade le pronostic peut s’améliorer avec une régression de la cytolyse et une augmentation des taux de prothrombines ou évoluer vers le décès du patient. Quatre signes d’aggravation précèdent en général ces cas mortels : un ictère avec un taux de bilirubine totale supérieur à 30 mg/l, une hémorragie, une oligo-anurie par insuffisance rénale chronique et un coma de stade IV. Selon Serne et al., 1996 (19), environ 20 à 79% des patients intoxiqués développent une hépatite chronique.

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1 Phase de latence o Incubation silencieuse asymptomatique

2 Phase cholériforme o Douleurs abdominales o Vomissements o Diarrhées

Guérison Décès 3 Phase de rémission o Amélioration trompeuse de l’état général

4 Atteinte hépatorénale o Cytolyse hépatique o Insuffisance hépatocellulaire o Rétention biliaire

Guérison Décès Hépatite chronique active

Figure 3 : Manifestation clinique du syndrome phalloïdien

.1.2.3. Molécules mises en cause

Trois groupes de cyclopeptides sont impliqués dans le syndrome phalloïdien : les amatoxines, les phallotoxines et les virotoxines. Il existe une inégalité entre leur répartition et concentration dans les champignons (20). La plus grande quantité d’amanitines serait ainsi contenue dans l’anneau, les lames et le chapeau tandis que la volve contiendrait une plus forte concentration de phallotoxines (Figure 4). Les lieux de collecte et l’âge du champignon influent sur la quantité de toxines en présence. Les caractéristiques du sol peuvent déterminer la composition en toxine de chaque champignon et notamment la prédominance de phallotoxines acides ou neutres. Concernant le stade de maturation, la concentration en amatoxines est plus importante chez des sujets jeunes, elle décroit ensuite avec l’âge (20).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 4 : Concentration des toxines dans le tissu d'Amanita phalloides var. alba (mg/g) (20).

.1.2.3.1. Les amanitines

.1.2.3.1.1. Structure, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques

Les principales amanitines ou amatoxines sont au nombre de neuf : l’α-amanitine, la β- amanitine, la γ-amanitine, l’ε-amanitine, l’amanine, l’amaninamide, l’amanulline, l’acide amanullique et la proamanulline. Ce sont des octapeptides bicycliques qui diffèrent par leurs groupements R1, R2, R3, R4 et R5 (Figure 5).

Amatoxines R1 R2 R3 R4 R5

α-amanitine CH2OH OH NH2 OH OH

β-amanitine CH2OH OH OH OH OH

γ-amanitine CH3 OH NH2 OH OH

ε-amanitine CH3 OH OH OH OH

Amanine CH2OH OH OH H OH

Amaninamide CH2OH OH NH2 H OH

Amanulline CH3 H NH2 OH OH

Acide CH3 H OH OH OH amanullique

Proamanulline CH3 H NH2 OH H Figure 5 : Structure chimique des amatoxines (8).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)

Les amatoxines sont thermostables (elles résistent plusieurs minutes à 100°C) et de poids moléculaire égal à 900 g/mol. Elles se présentent sous forme de cristaux incolores solubles dans l’eau, le méthanol et les solvants polaires. Cette bonne stabilité à la chaleur couplée à leur solubilité dans l’eau en fait des molécules extrêmement toxiques car elles ne sont pas détruites à la cuisson ou par séchage. Elles sont aussi résistantes aux enzymes et acides de dégradation et ne sont donc pas inactivées dans le tractus gastro-intestinal.

Les amanitines bénéficient d’une absorption intestinale importante et rapide et ne sont pas liées à l’albumine plasmatique (21). La fixation hépatique est médiée par un système de transport situé sur le versant sinusoïdal des hépatocytes (22). Avec les amatoxines comme substrats, le système de transport fonctionne plus lentement mais assez efficacement pour entraîner des concentrations toxiques dans l’hépatocyte (23). Par ailleurs, les amatoxines libres hépatocytaires sont facilement excrétées dans la bile et réabsorbées par le cycle entéro- hépatique, entretenant ainsi pendant un à trois jours un taux sérique d’amanitines favorisant la nécrose hépatocytaire (17). Environ 85% des toxines absorbées sont éliminées dans les urines, les 15% restants sont fixés aux tissus à renouvellement cellulaire rapide comme le foie en majorité (17). Les taux plasmatiques d’amatoxines ne sont donc jamais élevés avec des taux allant de 5 à 15 ng/ml pour l’α-amanitine ou la β-amanitine de 14 à 48 heures après l’ingestion. Les concentrations sont élevées du troisième au cinquième jour dans le liquide d’aspiration gastroduodénale, mais les quantités éliminées par cette voie restent mineures (24). Les amatoxines n’empruntent aucune voie métabolique connue. Les protéases ne peuvent pas les dégrader et elles se retrouvent sous leur forme native dans les urines (25). Elles sont excrétées dans les urines dès le premier jour suivant l’ingestion, en quantité environ cent fois supérieure à la concentration plasmatique (24). Elles peuvent être détectées par radio-immunologie au plus tôt 90 à 120 minutes après l’ingestion (26). Le pic de concentration en amanitines est atteint dans les 72 heures après l’ingestion et devient nulle à partir du cinquième jour (24). L’élimination rénale par filtration glomérulaire est limitée par une réabsorption tubulaire des toxines (21).

Les amatoxines sont excrétées dans le lait maternel et pourraient traverser la barrière fœtoplacentaire. Aucun symptôme d’intoxication phalloïdienne chez le fœtus n’a encore été décrit à l’exception d’une légère augmentation de l’activité des enzymes hépatiques chez un 34

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) nouveau-né accouché par césarienne deux jours après l’intoxication de sa mère. Une étude réalisée par Wacker et al., 2009 (27) ne révèle aucune conséquence fœtale dans sept cas sur huit d’intoxication pendant une grossesse. Le dernier cas correspond à un avortement thérapeutique 25 jours après l’ingestion d’Amanita phalloides ayant causé une encéphalopathie phalloïdienne à la neuvième semaine de grossesse, des lésions hépatiques ayant été objectivées. Malgré le peu de cas documentés et un manque de connaissances certain, le risque d’intoxication fœtale ne peut donc pas être écarté.

L’α-amanitine est la plus puissante des toxines soit 10 à 20 fois plus que les phallotoxines (28). Les concentrations en amatoxines dans l’Amanite phalloïde sont de l’ordre de 0,2 à 0,4 mg/g (29). La dose létale 50 (DL 50) chez l’homme est estimée à 0,1 mg/kg (25) et 0,3-0,6 mg/kg chez la souris (8). Ainsi 30 à 50 g d’Amanite phalloïde pourraient occasionner le décès d’une personne de 60 à 120 kg (25).

.1.2.3.1.2. Mécanisme de toxicité

Plusieurs mécanismes de toxicité sont attribués aux amatoxines. Le principal mécanisme semble être leur habilité à se lier de façon non-covalente à l’ARN polymérase II (ARN pol II). L’α-amanitine est la toxine principale d’Amanita phalloides et représente 40% des amanitines. Elle a une action toxique directement au sein de la cellule en inhibant la transcription de l’ADN en ARN messager (ARNm) par fixation sur l’ARN pol II extranucléaire. Cela induit un blocage de l’ensemble de la synthèse protéique cellulaire et par conséquence la mort des cellules par carence protéique. Les cellules impactées sont les hépatocytes, les cellules rénales des tubes contournés proximaux et les cellules des muqueuses gastriques, duodénales et intestinales. Le foie est l’organe le plus touché par les amatoxines. Les effets hépatocellulaires sont les plus importants et la manifestation toxique la moins curable conduisant souvent au décès du patient. En effet, suite à leur absorption intestinale rapide, les amatoxines s’accumulent dans le foie par l’intermédiaire de polypeptides transporteurs d’anions organiques (OATP1B3) situés dans la membrane sinusoïdale des hépatocytes (Figure 6). Le foie est donc le premier organe à entrer en contact avec une large quantité d’amatoxines. La concentration intracellulaire critique d’amatoxines peut être atteinte dans l’heure suivant l’ingestion du champignon. Plusieurs études expérimentales ont été conduites afin de mieux comprendre l’interaction entre l’α-amanitine et l’ARN pol II dans le noyau. Dans une récente étude in silico, Garcia et 35

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) al., 2015 (30) ont montré que l’α-amanitine interfère spécifiquement avec l’hélice de pontage de l’ARN polymérase II avec le sillon ce qui altère le processus d’élongation et contribue à une inhibition de la synthèse de l’ARNm. L’ARN pol II est constituée de 10 à 12 sous-unités qui forment des domaines avec différentes fonctions. Par exemple, les sous-unités Rpb1 et Rpb2 forment le centre catalytique de l’enzyme, Rpb9 est impliquée dans l’élongation à travers les sites d’arrêts, Rpb3 et Rpb11 sont impliquée dans l’assemblage de l’enzyme. L’enzyme contient un sillon (Rpb1) bordé à son entrée par une paire de mâchoires, supérieure (partie de Rpb1 et Rpb9) et inférieure (Rbp5), et au fond duquel se trouvent deux ions Mg2+ qui indiquent l’emplacement du site actif où l’ADN se fixe. Près du site actif, l’hélice de pontage (Rpb1) traverse le sillon où prendrait place les acides nucléiques pour rejoindre Rpb2 et permettre à l'ARN pol II sa translocation le long de l'ADN (31).

Figure 6 : Modèle simplifié du transport de l'α-amanitine et principal mécanisme de toxicité dans les hépatocytes (8).

Les résultats révèlent que l’α-amanitine se fixe au niveau des sous-unités Rpb1 et Rpb2 de l’ARN pol II. L’α-amanitine se lie en particulier directement via une liaison hydrogène au résidu Glu822 de l’hélice de pontage et indirectement au résidu His816 (Figure 7). Il a aussi été montré que l’α-amanitine inhiberait l’ARN pol II par interférence directe avec le sillon. La fixation simultanée de l’α-amanitine à l’hélice de pontage et au sillon de l’ARN pol II altère donc l’étape d’élongation et inhibe ainsi la synthèse de l’ARNm. En outre, la liaison entre l’α-

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) amanitine et la sous unité Rpb1 entrainerait la dégradation irréversible de cette sous-unité. Ce mécanisme de toxicité nécessite cependant d’autres investigations (32).

Figure 7 : Structure cristallographique de 10 sous-unités de l'ARN-polymérase II et intéraction avec l'α-amanitine à l’échelle atomique (8).

Des études in vitro ont montré que l’apoptose pouvait aussi jouer un rôle important dans les lésions hépatiques sévères observées sur des cellules hépatocytaires humaines et de chiens exposées à l’α-amanitine (33). La toxine induirait un signal de stress à la cellule, provoquant l’augmentation de la protéine p53 dans le cytoplasme et entrainant sa translocation du cytoplasme vers la mitochondrie. La protéine p53 formerait un complexe avec des protéines de la membrane cytoplasmique (Bcl-xL et Bcl-2) altérant la perméabilité de la membrane. La formation de ce complexe induirait la libération du cytochrome C dans le cytosol qui déclencherait à son tour l’apoptose de la cellule (34).

D’autres mécanismes de toxicité ont été suggérés tels que le stress oxydant qui jouerait un rôle critique dans les mécanismes d’intoxication phalloïdienne. L’étude réalisée par Ergin et al., 2015 (35) investiguant in vivo sur les lésions rénales dues à l’α-amanitine et leur lien avec le stress oxydant a montré une relation de cause à effet entre les α-amanitines et des espèces réactives de l’oxygène sur un groupe de souris exposées à l’α- amanitine par injection intrapéritonéale (IP). Au cours de l’évolution, les espèces vivantes se sont adaptées à l’oxygène par l’apparition d’enzymes facilitant sa consommation et sa 37

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) - detoxification des métabolites réduits que sont le radical superoxyde O2 , le peroxyde d’hydrogène H2O2, le radical hydroxyle et l’oxyde nitrique (36). Ces métabolites sont appelés espèces réactives de l’oxygène (ROS en anglais : Reactive Oxygen Species) car ils sont beaucoup plus toxiques que l’oxygène lui-même. Les ROS sont des radicaux produits normalement par tous les organismes vivants en aérobie et ne constituent pas en soi une situation de stress oxydant. La cellule possède un système enzymatique complexe de détoxification contre les ROS telles que les superoxydes dismutases (SOD), la catalase (CAT) et les glutathion peroxydases (GSH-Px). Le stress oxydant devient une situation pathologique dès que les systèmes de protection antioxydants et les mécanismes de réparation de l’ADN dans la cellule sont submergés par les ROS. L’analyse de biomarqueurs du stress oxydant (SOD, CAT, GSH-Px, Statut Antioxydant Total TAS, Statut Oxydant Total TOS) chez les souris exposées à l’α-amanitine par injection IP confirme le développement d’un stress oxydant dans leurs hépatocytes. L’étude de Ergin et al., 2015 (35) confirme ainsi le lien entre le stress oxydant chez des souris exposées à l’α-amanitine et les lésions rénales. Elle apporte ainsi une base pour la recherche physiopathologique des lésions rénales causées par l’intoxication par l’α-amanitine et sur la recherche de traitements améliorant le dysfonctionnement des systèmes antioxydants induits par la toxine. Il faut cependant noter que la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de l’α-amanitine administrée oralement diffère de celle injectée en IP. Un modèle animal ne présente pas non plus la même réponse antioxydante que celle induite chez l’homme.

Il existe ainsi de nombreuses études disponibles concernant l’α-amanitine mais elles sont plus limitées quant à la β-amanitine présente chez Amanita phalloides. Il a été montré dans une étude d’Kaya et al., 2014 (37) que la β-amanitine a une part de responsabilité dans la toxicité d’Amanita phalloides. Sur une lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7, l'α-amanitine a montré une toxicité plus élevée à 36 heures tandis qu’une plus forte inhibition de la synthèse protéiques a été observée à 24 heures et par lala β-amanitine. L'inhibition précoce de la synthèse des protéines par la β-amanitine pourrait être utile pour des expériences et des recherches futures.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.2.3.2. Phallotoxines

.1.2.3.2.1. Structures propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques

Les phallotoxines sont au nombre de sept classées en deux groupes (38): - Les phallotoxines neutres comprenant la phalloïdine, la phalloïne, la prophalloïne et la phallisine. - Les phallotoxines acides comprenant la phallacine, la phallacidine et la phallisacine. Ce sont des heptapeptides bicycliques, isolés pour la première fois en 1938 de l’Amanita phalloides. Elles diffèrent par leurs groupements R1, R2, R3, R4 et R5 (Figure 8).

Phallotoxines R1 R2 R3 R4 R5

Phalloïdine OH H CH3 CH3 OH

Phalloïne H H CH3 CH3 OH

Prophalloïne H H CH3 CH3 H

Phallisine OH OH CH3 CH3 OH

Phallacine H H CH(CH3)2 COOH OH

Phallacidine OH H CH(CH3)2 COOH OH

Phallisacine OH OH CH(CH3)2 COOH OH

Figure 8 : Structure chimique des phallotoxines (8)

Leur poids moléculaire avoisine les 900g/mol (39) et elles sont solubles dans l’eau, le méthanol et les solvants polaires (40). Les phallotoxines sont peu résorbées dans le tube digestif, la toxine s’exprime essentiellement lors d’une administration parentérale des toxines. Toutes les phallotoxines présentent une DL 50 chez la souris comprise entre 1,5 à 4,5 mg/kg, à l'exception de la prophalloïne, qui semble être moins toxique (plus de 20 mg/kg de DL 50) (41). Aucune différence significative de toxicité entre les phallotoxines neutres et acides n’a encore été établie chez l’homme (8).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.2.3.2.2. Mécanisme de toxicité

L’action in vivo des phallotoxines est complètement connue (8). Elles ont une affinité prononcée pour le foie et se fixent sur les membranes plasmatiques des hépatocytes, détruisant ainsi le réticulum endoplasmique et les mitochondries hépatocytaires. Elles se lient aussi avec les protéines d’actines F dans les cellules hépatiques et « accélèrent leur polymérisation sous forme de filaments qu’elles stabilisent, entraînant ainsi une augmentation de la perméabilité membranaire, un œdème puis la mort cellulaire » (17).

.1.2.3.3. Virotoxines

.1.2.3.3.1. Structure, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques

Les virotoxines sont des peptides monocycliques au nombre de six : l’alaviroïdine, l'aladéoxoviroïdine, la viroïsine, la déoxoviroïsine, la viroïdine et la déoxoviroïdine (38). Leur structure (Figure 9) et activité biologique est similaire à celle des phallotoxines ce qui suggèrerait que les virotoxines seraient des dérivés de la biosynthèse des phallotoxines ou partageraient un précurseur commun (8). Comme les phallotoxines, elles ne sont pas considérées comme ayant des effets toxiques significatifs après administration orale puisqu’elles sont peu résorbées dans le tube digestif (42).

Virotoxines X R1 R2

Viroïsine SO2 CH3 CH(CH3)2

Déoxoviroïdine SO2 CH3 CH(CH3)2

Alaviroïdine SO2 CH3 CH3

Viroïdine SO2 CH2OH CH(CH3)2

Déoxoviroïsine SO2 CH2OH CH(CH3)2 Aladéoxoviroïdine ? ? ?

Figure 9 : Structure chimique des virotoxines (8)

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.2.3.3.2. Mécanisme de toxicité

Tout comme les phallotoxines elles interagiraient avec l’actine F des hépatocytes, stabilisant les microfilaments et empêchant la dépolymérisation. Cependant cette interaction moléculaire serait différente de l’intéraction actine-phallotoxine. À ce stade, le rôle des virotoxines dans la toxicité humaine n’est pas encore établi. En raison de sa mauvaise absorption orale, peu d’importance clinique est donnée à cette classe de toxines.

.1.2.4. Dosages / quantification

Si l’ingestion d’une espèce contenant des amatoxines ou phallotoxines est fortement probable, la recherche de toxines peut être faite par analyse du contenu gastrique, à partir d’un échantillon de champignon ingéré ou d’un échantillon de selles, par analyse plasmatique et par test dans les urines. L’évaluation de ces toxines directement sur un échantillon du champignon peut être réalisée par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC), électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse (MS), chromatographie en phase liquide couplée ou en tandem avec la spectrométrie de masse (LC- MS) et la chromatographie en phase liquide electrospray ionization time-of-flight-MS (LC/ESI-TOF-MS). La RP-HPLC est la méthode la plus couramment utilisée, bien que la méthode LC-MS semble fournir des résultats plus fiables et plus sensibles (8). La présence d'amatoxines dans des échantillons de champignons peut aussi être détectée par le test de Wieland-Meixner. Un fragment de champignon est écrasé sur du papier journal non imprimé et contenant obligatoirement de la lignine. Une goutte d’acide chlorhydrique qui catalyse la formation d’un complexe bleu entre la lignine et l’amatoxine est ensuite déposée sur la tâche séchée.. Néanmoins, l'efficacité de ce test est limitée par des résultats faussement positifs en présence notamment de psilocine.

L’analyse d’urines est un outil essentiel pour la détection d’empoisonnement à l’amatoxine. Si l’analyse est effectuée dans les 36 heures suivant l’ingestion, l’α-amanitine peut être détectée dans les urines. Après 36 heures, l’analyse est peu fiable et un résultat négatif ne peut exclure l’empoisonnement. Il existe différentes méthodes pour l’analyse d’urine : dosage radio-immunologique, technique immunoenzymatique ELISA, chromatographie liquide de

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) haute performance (UPLC-MS/MS) (43), chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse exacte par technologie Orbitrap (LC-HR-MS) (44). La méthode LC-HR-MS semble être la technique de choix par rapport à la technique immunoenzymatique ELISA. En effet, sur les urines de 43 patients suspectés d’être intoxiqués par les champignons, la méthode LC-HR-MS s’est révélée plus spécifique, plus rapide et plus sensible que la technique ELISA. La méthode LC-HR-MS est particulièrement bien adaptée aux cas d’analyse toxicologique d’urgence dans le cadre d’intoxication par les champignons (44).

Une méthode de chromatographie liquide haute performance couplée à la détection UV par barrettes de diodes et détection électrochimique (HPLC-EC-UV) a été développée et validée par Garcia et al., 2015 (45) pour la mesure quantitative d’α-amanitine dans 5% d’acide perchlorique dans le foie et les reins de rats. L'extraction d’α-amanitine à partir d'homogénats de tissus a était réalisée par une étape de déprotéinisation simple avec un taux de récupération élevé de substance à analyser. Pour valider la méthode, il a été prouvé que l’extraction était linéaire dans la gamme de concentration étudiée, sélective, exacte, précise et sensible. Ces caractéristiques couplées à un temps de réalisation court (22 minutes) de la chromatographie (HPLC) montrent le potentiel prometteur de cette méthode dans la détermination de l’α-amanitine du foie, des reins et d'autres échantillons biologiques humains.

Il n’existe malheureusement pas encore de méthode rapide et sensible à effectuer directement au chevet du patient ou en quelques minutes dans une structure hospitalière idéale pour améliorer l’évaluation clinique du syndrome phalloïdien.

.1.2.5. Traitements

Autrefois basé sur le principe du « plus on en fait, mieux c’est », le traitement des intoxications phalloïdiennes pouvait comporter jusqu’à 30 médicaments afin de ne pas risquer de perdre le bénéfice d’aucun d’entre eux. Cependant aucun de ces traitements n’était basé sur des essais cliniques démontrant une modification de la morbidité et de la mortalité. C’est l’hospitalisation et le traitement symptomatique précoce en milieu de réanimation qui a permis de réduire significativement la mortalité supérieure à 50% dans les années 50. Aujourd’hui la prise en charge des patients est encore variée et très controversée. 42

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) L’ingestion d’Amanita phalloïde, Amanita verna ou Amanita virosa nécessite une hospitalisation en réanimation dans les plus brefs délais. Les individus asymptomatiques sont hospitalisés dans un service de médecine et surveillés pendant 48 heures. Si l’on suspecte une intoxication à l’amatoxine, il est important de commencer immédiatement le traitement sans attendre la détection fiable de l’amatoxine dans les urines au minimum 6 heures après l’ingestion. Si le test d’amatoxines s’avère négatif, il faut arrêter le traitement de suite. En cas de doute sur un dommage hépatique, une consultation précoce en service d’hépatologie est nécessaire, éventuellement dans un centre de transplantation hépatique. La prise en charge usuelle consiste en : - Un traitement symptomatique avec un réajustement etune surveillance des constantes biologiques - Le traitement épuratif digestif et rénal - Le traitement spécifique par chimiothérapie antitoxique - Le traitement de l’insuffisance hépatique avec transplantation hépatique si nécessaire

.1.2.5.1. Traitement symptomatique avec réajustement et surveillance des constantes

biologiques

A l’entrée du patient, il est primordial de pallier les pertes hydro-électrolytiques massives dues aux diarrhées et vomissements de la phase cholériforme pour stabiliser l’état général du patient, éviter le choc hypovolémique et prévenir l’insuffisance rénale fonctionnelle. La précocité de cette réhydratation est un facteur pronostic diminuant la mortalité. Par contre, tous les protocoles de prise en charge du syndrome contre-indiquent l’utilisation d’anti- diarrhéiques et préconisent le respect des diarrhées pour favoriser l’élimination de résidus. Les avis sont controversés quant au traitement des vomissements prônant soit leur respect soit leur soulagement par des administrations en intra veineuse d’antiémétiques. Ils peuvent être ainsi partiellement contrôlés par le métoclopramide (Primpéran®) et le métopimazine (Vogalène®). La prévention des hémorragies digestives est assurée par l’administration d’antihistaminiques H2.

Les surveillances biologiques peuvent inclure (17): - Une surveillance de la tension artérielle normalisée par perfusion de substitut de plasma type Plasmagel®. 43

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) - Une surveillance de la Pression Veineuse Centrale par pose d’une voie centrale. - Une administration de sérum glucosé contre l’hypoglycémie. - Un apport de bicarbonates variable selon les perturbations de l’équilibre acido- basique. - Une surveillance de la coagulation et une éventuelle compensation des facteurs déficitaires par une perfusion de plasma frais congelé, l’injection de vitamine K et éventuellement l’administration d’un concentré de fibrinogène. - Une surveillance hépatique clinique et biologique avec notamment le suivi des taux d’enzymes hépatiques (ASAT, ALAT, etc.). - Une correction et une prévention de l’hyperammoniémie. - Un dosage des concentrations en amanitines et phalloïdines.

.1.2.5.2. Traitement épuratif digestif et rénale

Chez des patients admis à l’hôpital en phase de vomissements intenses, la détoxification gastro-intestinale par lavage gastrique ne présente pas d’intérêt. Le lavage gastrique n’est indiqué que lors d’une prise en charge précoce du syndrome en phase préclinique. Il s’agit de cas pris en charge exceptionnellement précocement lorsqu’il y a un doute sur la nature du champignon, en cas de tentative de suicide ou lors d’ingestion accidentelle par un enfant d’une espèce identifiée comme responsable d’un syndrome lésionnel par exemple. Dans ces cas le lavage gastrique s’accompagne de l’administration de charbon activé. Il permet d’adsorber les toxiques dans la lumière intestinale après l’ingestion. Son effet est d’autant plus efficace que son administration est précoce. Plus tardivement le charbon activé permet d’interrompre le cycle entéro-hépatique de certaines toxines excrétées dans la bile et réabsorbées par l’intestin grêle. Cependant l’efficacité de son administration répétée, toutes les 4 à 6 heures, dans les cas d’empoisonnement par amatoxines et phallotoxines reste à démontrer (15). Il serait sans intérêt à distance de l’ingestion ou lorsque les vomissements sont importants. Comme vu précédemment les études sur la cinétique des amatoxines ont montré qu’elles ne sont présentes dans le plasma qu’à des concentrations très faibles et pendant une brève période de 24 à 48 heures. L’efficacité des techniques d’épuration extra-rénales telles que l’hémodialyse, l’hémodiafiltration ou l’hémoperfusion est donc discutée. Ainsi l’amatoxine se fixe bien sur le charbon activé et des séries de cas ont montré une survie de 65% à 100% avec

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) l’hémoperfusion sur colonne à charbon (46) mais toujours dans des conditions méthodologiques controversés. Ces deux méthodes de prise en charge seraient donc justifiées uniquement en phase précoce durant les premières heures d’une intoxication certaine par une espèce contenant des amatoxines ou lors d’une insuffisance rénale préexistante.

.1.2.5.3. Traitement spécifique par chimiothérapie antitoxique

Il n’existe à ce jour aucun véritable antidote reconnu de l’intoxication phalloïdienne qui soit capable d’inverser à lui seul le pronostic. Les traitements médicamenteux sont dits « chimiothérapies antitoxiques ». Parmi les nombreux traitements testés depuis de nombreuses années, seuls quatre ont été reconnus comme ayant une efficacité expérimentale et clinique : la benzylpenicilline, la ceftazidime, la silymarine et la N-acétylcystéine. Cependant un nouveau médicament semble très prometteur : la polymyxine B qui agirait comme véritable antidote des amatoxines de l’Amanita phalloides.

.1.2.5.3.1. La benzylpénicilline ou pénicilline G

Les béta-lactamines (benzylpénicilline, ceftazidime) peuvent être prescrites dans les trois premiers jours suivant l’ingestion. Leur efficacité expérimentale est aujourd’hui bien documentée mais leur efficacité en clinique est encore débattue. La benzylpénicilline ou pénicilline G est le traitement le plus utilisé pour le management des empoisonnements aux amatoxines. Elle a une action antagoniste des toxines phalloïdiennes en se fixant au niveau des transporteurs d’anions organiques (OATP1B3) situés dans la membrane sinusoïdale des hépatocytes. Elle engendre ainsi une diminution de la pénétration intracellulaire des amanitines et la limitation de leur cycle entéro-hépatique par compétition au niveau de la sécrétion biliaire. Elle entrainerait aussi la diminution de la concentration plasmatique en acide gamma-amino butyrique (GABA) sur la flore bactérienne, prévenant ainsi la survenue d’encéphalopathies. La posologie recommandée varie de 300 000 à 1 million UI/kg/j (47) bien que ces doses puissent potentiellement induire des effets neurologiques centraux. Ce traitement est contre indiqué en cas d'allergie et plutôt déconseillé en cas d'insuffisance rénale car cela favorise les convulsions à ces doses.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.2.5.3.2. La ceftazidime

La ceftazidime peut aussi être utilisée dans la prise en charge du syndrome phalloïdien cependant le nombre de cas traités est encore limité (48). On ne peut donc pas encore statuer sur son mécanisme d’action et son efficacité d’autant plus qu’elle a été prescrite dans la majorité des cas en parallèle avec la silymarine (14).

.1.2.5.3.3. La silymarine

La silymarine est une molécule extraite des graines du Chardon-Marie, une plante courante en Europe et largement étudiée pour les traitements des maladies hépatiques. Elle est constituée de quatre flavonoïdes : l’isosilybine, la silychristine, la silydianine et la silybine ou silibinine (49). La silybine est le composant ayant la plus forte activité antioxydante. Elle agirait en (i) diminuant la capture hépatocytaire des α-amanitines par inhibition des transporteurs (OATPs), (ii) en piégeant les radicaux libres, (iii) en stimulant l'activité de la SOD et (iv) en augmentant les taux de glutathion. En outre, Pradhan et al., 2006 (50) suggèrent que la silymarine est capable de pénétrer dans le noyau et de stimuler en particulier l'activité de l'ARN polymérase I. Cela augmenterait la transcription de l'ARN ribosomique et contrebalancerait l'inhibition de la ARN pol II induite par les amatoxines. L’injection de silymarine (Legalon®) se fait dès l’arrivée du patient à l’hôpital à raison de 25 à 50 mg/kg/j en quatre doses par voie intraveineuse. Elle est poursuivie de 48 à 96 heures après l’ingestion (8). La silymarine semble plus efficace en monothérapie plutôt que lorsqu’elle est combinée avec la benzylpénicilline. En effet dans une étude récente de Mengs et al., 2012 (51) basée sur 1500 cas documentés d’intoxication à Amanita phalloides, il a été conclu que la mortalité globale chez les patients intoxiqués traités par Legalon® était inférieure à 10% contre 20% lors d’un traitement par benzylpénicilline en monothérapie ou par silymarine combinée à la benzylpénicilline.

.1.2.5.3.4. La N-acétylcystéine

La N-acétylcystéine est utilisée depuis plus de 50 ans comme agent mucolytique, exportant et fluidifiant des sécrétions bronchiques (52). Elle est également connue comme traitement des surdosages de paracétamol. En raison de la similitude clinique entre le surdosage au paracétamol et l’empoisonnement aux amatoxines causant tous les deux la nécrose hépatique et rénale, la N-acétylcystéine a été impliqué dans la prise en charge des intoxications 46

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) phalloïdiennes. Elle joue en effet un rôle hépato protecteur en compensant la perte probable en glutathion, due au déséquilibre du métabolisme protéique hépatique. Il en découle la potentialisation du rôle protecteur des enzymes glutathion-dépendants lors de la détoxification (diminution de l’accumulation des métabolites hépatotoxiques). L’utilisation de la N- acétylcystéine (Mucomyst®, Fluimicil®) dans le management du syndrome phalloïdien est encore controversée puisque son efficacité n’a pas encore été prouvée cliniquement. Certaines institutions préconisent son administration en intraveineuse à la dose de 150 mg/kg diluée dans 200 mL de solution (eau + 5% de dextrose) pendant 15 min à 1 heure heurepuis de 50 mg/kg diluée dans 500 mL solution pendant 4 heures suivi par 100 mg/kg diluée dans 1000 mL de solution pendant plus de 16 heures. Ensuite, 300 mg/kg/j en perfusion IV continue (53)

.1.2.5.3.5. La polymyxine B

Une étude de Garcia et al, 2015 (54) marque un véritable tournant dans le traitement contre les intoxications phalloïdiennes en prouvant l’efficacité d’un premier antidote contre l’ingestion d’Amanita phalloides: la polymyxine B. Des études in silico réalisées par l’équipe ont ainsi mis en évidence la liaison potentielle de la polymyxine B, de caractéristiques chimiques similaires à l’α-amanitine, avec l’ARN pol II au même niveau que l’α-amanitine, empêchant ainsi la liaison de la toxine à l’ARN pol II. In vivo, les analyses ont montré que l’inhibition de la transcription de l’ARNm induite par l’α- amanitine était efficacement contrée par la polymyxine B dans les reins. De plus, l’étude histologique et le suivi des aminotransférases hépatiques ont démontré que la polymyxine B réduisait de façon significative les lésions induites par l’α-amanitine sur le foie et les reins. Dans le test de survie, toutes les souris exposées à l’α-amanitine sont mortes dans les cinq jours tandis que 50% ont survécu jusqu’à 30 jours après administration de polymyxine B 4, 8 à 12h après l’exposition à l’α-amanitine. En outre, une dose unique de polymyxine B administrée concomitamment à l’α-amanitine a garanti la survie de 100% des souris. La polymyxine B empêche donc l’inactivation de l’ARN pol II par l’α-amanitine prévenant ainsi efficacement les dommages potentiels engendrés sur les organes vitaux, améliorant ainsi le taux de survie des animaux intoxiqués. Les résultats probants obtenus par les études in vitro et in vivo permettent aux auteurs de suggérer l’utilisation immédiate de la polymyxine B comme antidote de l’α-amanitine en complément des autres mesures thérapeutiques, d’autant plus du fait que la polymyxine B est un antibiotique usuel dont l’utilisation thérapeutique est déjà bien établie. 47

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.2.5.4. Traitement de l’insuffisance hépatique et transplantation hépatique

Comme vu précédemment, l’usage des techniques classiques d’hémodialyse et/ou d’hémoperfusion pour traiter l’insuffisance hépatique est très limité même si elles sont appliquées dans les 24 heures suivant l’ingestion. On utilisera des techniques de suppléance artificielle du foie reposant sur une épuration extracorporelle modifiée telle que le MARS® (Molecular Adsorbents Recirculating System) liée à un effet sur la fonction hépatique plutôt qu’à une épuration de l’amanitine. Le système MARS® est « un procédé conçu pour éliminer de manière sélective les substances toxiques fixées sur l’albumine dans le sang des malades atteints d’une insuffisance hépatique. Il s’agit d’une assistance hépatique extracorporelle

(55) ». Dans le cas de l’insuffisance hépatique aiguë, le système MARS® a pour objectifs théoriques de « corriger les trouble circulatoires (hyperkinésie et vasoplégie) ; de corriger l’encéphalopathie métabolique ; de prévenir ou de corriger l’œdème cérébral de la phase terminale ; de favoriser la régénération hépatique et la guérison spontanée ou pour les patients dont la régénération est insuffisante, de favoriser l’accès à la transplantation aux urgences » (56). L’épuration extra-rénale MARS® comporte un circuit sanguin extracorporel, une membrane semi perméable et un dialysat enrichi en albumine. Au cours de l’insuffisance hépatique, de nombreuses substances potentiellement toxiques hydrosolubles ainsi que des médiateurs non hydrosolubles ayant une forte affinité pour les protéines s’accumulent sans le sang, faute d’une élimination rénale suffisamment importante. La richesse en albumine du dialysat permet ainsi de faire passer à travers la membrane semi-perméable par principe de diffusion et de convection les molécules hydrosolubles, les toxines hépatiques fortement liées à l’albumine du sang ainsi que les substances libres de faibles poids moléculaire. L’albumine ainsi chargée passe alors dans une colonne contenant des particules de charbon activé puis dans une colonne échangeuse d’anions où l’albumine subit un traitement qui élimine les toxines et autres substances, permettant ainsi l’épuration de l’albumine du circuit albumine. L’albumine ainsi libérées des toxines passe alors à nouveau le long de la membrane semi perméable pour de nouveaux échanges avec le sang. On préconise une épuration extra-rénale en cas d’hépatite sévère ou d’encéphalite hépatique avec des séances d’hémodialyse prolongée (8 à 24 heures). Au moins 48 cas de patients souffrant d’insuffisance hépatique aiguë due à Amanita phalloides et traité par le MARS® ont été décrits (57). Dans la majorité des cas, la technique MARS® a été un succès dans l’amélioration des symptômes et des paramètres biologiques. Dans 23 cas sur 35, le système MARS® a permis aux patients de se 48

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) remettre de leur fonction hépatique détériorée ou de subir une greffe de foie dans de meilleures conditions. Dans une étude Finlandaise (58), neuf patients intoxiqués par Amanita phalloides présentant une insuffisance hépatique aiguë ont été mis sous thérapie MARS® en l’absence d’encéphalopathie ; ils ont tous survécus cependant le nombre de patient ayant récupérés spontanément ou par transplantation hépatique n’est pas connu. Malheureusement aucune de ces études n’a été contrôlée ou randomisée. Tous les patients ont été traités tardivement après l’ingestion avec une hépatite aiguë déjà bien en place. Son indication dans les cas d’intoxication par amatoxine est donc encore controversée faute d’études contrôlées et randomisées.

Lorsque l’insuffisance hépatique persiste et s’aggrave, la transplantation hépatique reste le seul recours pour restaurer les fonctions hépatiques et interrompre la progression des complications. Il existe deux types de critères pour prendre une décision quant à la transplantation du foie : les critères de Clichy et les critères du King’s College de Londres (Annexe 5). En pratique les critères du King’s College basés sur des critères plus complexes seraient les plus performants bien qu’aucune analyse statistique rigoureuse ne confirme les facteurs prédictifs. Une étude datant de 2007 (59) sur l’évaluation des facteurs pronostics de greffe hépatique sur 27 cas d’intoxication par amatoxines retient l’apparition de diarrhée moins de 8 heures après l’ingestion ainsi qu’un taux de prothrombine inférieur à 10% (ou INR > 6) quatre jours après l’ingestion indiquent qu’une transplantation hépatique doit être envisagée. L’encéphalopathie n’est pas un critère requis pour juger d’une transplantation. En 2005, une autre équipe (60) suite à l’évaluation de 198 intoxications par amatoxines avait retenu l'association concomitante d'un taux de prothrombine inférieur à 25% et d'une créatinine supérieur à 106 µmol/l trois jours ou plus après l'ingestion des champignons comme critères pour indiquer une transplantation hépatique. Les critères permettant d’identifier clairement les cas de transplantation hépatique ne sont donc pas clairement définis et en pratique ils sont discutés au cas par cas.

Pour conclure sur le traitement des intoxications phalloidien, il me semblerait pertinent que les services d’urgences appliquent des mesures plus systématiques et suivent un protocole bien défini comme ci-après :

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) (i) En cas d’hospitalisation de patients asymptomatiques moins de 6 heures après l’ingestion : - Lavage gastrique - Charbon activé

(ii) En cas d’hospitalisation d’un patient en phase cholériforme : - Respect des diarrhées - Rééquilibrage electolytique - Lavage gastrique et/ou charbon activé à la posologie de 1g/kg puis 25g toutes les 4 à 6 heures afin de limiter le recyclage entéro-hépatique de la toxine. - Antiémétique en IV si nécessaire - Surveillance biologique toutes les 6 heures pendant 48 heures : fibrinogènes, plaquettes, glycémies, créatinine, lactates, gazométrie artérielle, transaminases, temps de Quick et facteur V - Traitement spécifique par chimiothérapie antitoxique, plusieurs possibilités discutées : o Pénicilline G dès l’arrivée du patient : De 300 000 à 1 million UI/kg/j pendant 3 jours après l’ingestion o Silymarine en monothérapie dès l’arrivée du patient : 25 à 50 mg/kg/j en quatre doses par voie intraveineuse (en général 5mg/kg en perfusion IV de 2h toutes les 6h jusqu’à amélioration des symptômes). (8) (61) o Ceftazidime en monothérapie o N-acéthylcystéine : perfusion IV de 150 mg/kg sur 1 heure puis 50mg/kg sur 4h et 100mg/kg sur 16h. Ensuite : 300 mg/kg/j en perfusion IV continue o Polymyxine B en complément du traitement symptomatique mais cela reste encore un traitement expérimental

(iii) Si le patient est hospitalisé en phase hépatocellulaire : - Rééquilibrage electolytique - Charbon activé - Traitement spécifique par chimiothérapie antitoxique (ii) - Surveillance biologique toutes les 6 heures pendant 48 heures : fibrinogènes, plaquettes, glycémies, créatinine, lactates, gazométrie artérielle, transaminases, temps de Quick et facteur V

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) (iv) Dans les cas (ii) et (iii), si le patient évolue vers une atteinte hépatocellulaire grave : - Hospitalisation en centre de transplantation hépatique - Surveillance clinique et biologique toutes les 6 h - Traitement de l’encéphalopathie et des déficits en facteurs de coagulation - Traitement de l’insuffisance hépatocellulaire : o Epuration extra hépatique avec le MARS® o Transplantation hépatique s’il n’y a pas d’amélioration avec le MARS®

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) 1.3. Le syndrome proximien

Le syndrome proximien a été décrit pour la première fois en 1994 à Montpellier (62) et fait partie de la catégorie des « nouveaux syndromes » décrits en France depuis moins d’une vingtaine d’années. Plusieurs dizaines de cas ont été décrits à partir des années 90 dans le sud de la France (Provence, Côte-d’Azur, Languedoc), en Italie, en Espagne, au Japon et en Amérique du nord.

.1.3.1. Espèce responsable

En 1994 et 1995, dans le sud de la France, le lien est fait entre le syndrome proximien et Amanita proxima ou Amanite à volve rousse. Elle peut facilement être confondue avec Amanita ovoidea ou Amanite ovoïde, très commune dans le Sud de la France. Amanita proxima est beaucoup plus rare. La première publication concernant ce syndrome remonte à 1968. Cependant il aura fallu attendre les années 90 pour que le syndrome proximien soit clairement identifié et précisé (47). Une série rétrospective d’appels au centre antipoison de Marseille a permis de préciser en 1998 la description clinique du syndrome et d’évaluer l’importance de la confusion entre Amanita proxima et Amanita ovoidea (63). Ainsi sur 53 patients, on recense 31 cas de syndrome proximien. Dans 83% des cas l’ingestion d’Amanita proxima est due à une confusion avec Amanita ovoidea. Amanita proxima pousse sur le pourtour méditerranéen, en France, en Italie et en Espagne. C’est une grande espèce de 10 à 25 cm de haut, avec un chapeau de 3 à 15 cm de diamètre, lisse, parfois recouvert de quelques lambeaux de voile générale colorés, blanc à ivoire et à marge non striée. Sa chair est blanche épaisse. La saveur est douce et l’odeur plus ou moins iodée mais vite désagréable. Les lames sont libres blanches puis crème rosé. Le pied est blanc, floconneux et peu renflé à la base. On constate la présence d’un anneau blanc, presque membraneux, mince et finement strié. La volve ocre est en forme de sac. L’Amanita proxima est présente typiquement sur les plateaux calcaires des régions chaudes de la France surtout sous les chênes et les pins de août à décembre (64). En comparaison, Amanita ovoidea est consommée traditionnellement dans le midi, elle est strictement liée aux chênes mais pousse très souvent avec Amanita proxima dans les pinèdes mêlées. La distinction s’avère d’autant plus difficile qu’Amanita proxima peut se développer au milieu d’un groupe d’Amanita 52

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) ovoidea (63). Des syndromes très proches du syndrome proximien ont été décrit au nord-ouest des Etats Unis et au sud-ouest du Japon et sont imputés à deux espèces : Amanita smithiana pour les Etats-Unis et Amanita pseudoporphyria pour le Japon (65).

.1.3.2. Clinique

.1.3.2.1. Etat des lieux

Le délai moyen d’apparition des symptômes est de 13 heures (63). Le tableau clinique associe habituellement des troubles digestifs modérés de type nausées et vomissements 8 à 14 heures après l’ingestion et des troubles rénaux d’apparition plus tardive soit un à quatre jours après l’ingestion dans 40% des cas (Tableau 3). Ces troubles rénaux sont caractérisés par une néphropathie tubulo-interstitielle aiguë (nécrose tubulaire à la biopsie) d’évolution le plus souvent favorable avec nécessité d’épuration extra-rénale dans 65% des cas. Une cytolyse hépatique modérée sans cholestase ni insuffisance hépatocellulaire complète souvent le tableau clinique (66). Elle se traduit par une élévation maximale des ALAT et ASAT de 15 fois la valeur normale (67). Cette cytolyse hépatique est rapidement réversible. L’évolution est favorable en deux ou trois semaines.

Délai Symptômes Constante mesurées Constantes normales d’apparition T0 Ingestion du champignon 8 à 14h Troubles digestifs : nausées, - (2 à 48h) (63) vomissements 1 à 4j Troubles digestifs - (1 à 5j) Insuffisance rénale aiguë oligo- Créatinine Homme : 80 à anurique (67) augmentée d’au 110mol/L moins 26mol/L en Femme : 60 à 48h 95µmol/L (68) Débit urinaire : 100 à 800 à 1500mL/24h 500 mL/24h Cytolyse hépatique modérée ALAT jusqu’à 6 fois la Homme : 8 à 35UI/L valeur normale Femme : 6 à 25 UI/L ASAT jusqu’à 6 fois la Homme : 8 à 30UI/L valeur normale Femme : 6 à 25UI/L 2 à 3sem Guérison sans séquelles UI/L : Unité internationale par Litre Tableau 3 : Evolution des symptômes dans le temps du syndrome proximien (66).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Le syndrome proximien se différencie du syndrome orellanien par une apparition des troubles digestifs et de l’insuffisance rénale aiguë plus courte, la présence d’une hépatite cytolytique modérée et surtout par l’absence d’évolution vers l’insuffisance rénale chronique (IRC). Un seul cas pédiatrique chez un enfant de 11 ans a été décrit jusqu’à aujourd’hui par Marquant et al., 2011 (69). L’enfant a présenté, sept heures après l’ingestion d’Amanita proxima, une symptomatologie digestive aiguë assez brutale associant des douleurs abdominales et des vomissements. L’examen clinique a révélé une asthénie, une oligurie et des signes de déshydratation extracellulaire. Le bilan biologique a mis en évidence une insuffisance rénale aiguë, une cytolyse hépatique sans cholestase ni insuffisance hépatocellulaire et une rhabdomyolyse modérée. Après réhydratation, diurèse forcée et une épuration extra-rénale, l’enfant s’est rétabli sans aucunes séquelles au bout d’un mois. La mère ayant aussi consommé le champignon mais en moindre quantité a aussi subit un bilan biologique de contrôle. Elle a révélé une atteinte rénale légère, une cytolyse et une rhabdomyolyse modérée mais sans aucune symptomatologie clinique. Ces deux cas illustrent la sévérité potentielle du syndrome proximien mais aussi le fait que le dépistage d’anomalies biologiques doit être systématique chez tous les convives même s’ils ne présentent aucun symptôme.

Aux Etats Unis, le même type de syndrome a été décrit après l’ingestion d’Amanita smithiana (70). On constate un délai d’apparition des premiers signes gastro-intestinaux de 20 minutes à 12 heures après l’ingestion incluant des nausées, des vomissements, des diarrhées, des douleurs abdominales, de la fièvre et un malaise général (71). La seconde phase de l’empoisonnement consiste en une hausse des transaminases hépatiques asymptomatique suivie d’une insuffisance rénale aiguë se manifestant par une oligo-anurie avec des taux de créatinine, ASAT et ALAT élevés au bout de deux à quatre jours. L’évolution est généralement favorable.

.1.3.2.2. Une potentielle toxicité cardiaque d’apparition tardive

Besancon et al., 2012 (72) décrivent pour la première fois deux cas de survenue d’une atteinte cardiaque sévère au cours du syndrome proximien. Le premier patient arrive aux urgences quatre jours après la consommation de champignon blancs et ronds identifiés comme Amanita proxima avec une asthénie intense associée à des nausées et vomissements et une

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) créatininémie près de 12 fois supérieure à la limite supérieure normale. Il est admis en réanimation huit jours après son repas pour une décompensation cardiaque. Sa compagne est adressée aux urgences une semaine après l’ingestion du même repas, mais en quantité moindre, avec des douleurs abdominales et une détresse respiratoire aiguë, probablement secondaire à un œdème aigu du poumon, associée à un collapsus cardiovasculaire. Le bilan hépatique du premier patient n’est que très légèrement modifié tandis que le deuxième patient présente une atteinte hépatique modérée une semaine après l’ingestion. Enfin les deux patients ont développé une insuffisance rénale aiguë, réversible en trois semaines. La clinique et la chronologie ont semblé compatible avec la séméiologie du syndrome proximien sus- décrit. Outre la symptomatologie classique et donc imputable au syndrome proximien, les patients indemnes de toute tare cardiaque ont présentés, de manière retardée et de façon concomitante à l’insuffisance rénale aiguë, une altération aiguë et sévère de la fonction ventriculaire gauche et un choc cardiogénique dont la sévérité a nécessité une prise en charge en réanimation. Il semblerait que l’atteinte cardiaque, tout comme l’atteinte rénale, soit réversible en quelques semaines à la suite d’un traitement symptomatique à base d’inotropes cardiaques et assistance extracorporelle. Bien que cette pathologie cardiaque soit inédite puisqu’elle n’avait encore jamais été rapportée dans le cas de syndrome proximien, il est important de noter que l’identification mycologique du champignon n’a pas été réalisée. Tout doute diagnostic ne peut donc être écarté. Les auteurs préconisent cependant fortement d’explorer systématiquement la fonction cardiaque lors d’une intoxication par Amanita proxima au même titre que les autres organes cibles afin de mettre en place une thérapeutique appropriée et d’améliorer le pronostic du patient.

Un troisième cas décrit par Machado et al., 2014 (73) vient conforter cette hypothèse qu’Amanita proxima pourrait avoir un tropisme cardiaque. Le cas clinique est rapporté chez une patiente arrivée à l’hôpital avec des symptômes gastro-intestinaux dans les 24 heures ayant suivies l’ingestion de champignon et avec une insuffisance rénale aiguë traitée avec une hémodialyse. Le tableau clinique a inclus aussi un arrêt cardiaque prolongé avec contraction ventriculaire secondaire altérée. L’évolution a été favorable grâce à un traitement par assistance cardio-respiratoire percutanée (ECLS : Extracorporeal Life Support). La description physique du champignon et la séméiologie ont confirmé une intoxication par Amanita proxima. Ce nouveau cas vient ainsi confirmer la nécessité d’une exploration cardiaque en cas d’empoisonnement par Amanita proxima. 55

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .1.3.3. Toxines mises en cause

La ou les substance(s) responsable(s) de la toxicité rénale d’Amanita proxima n’ont pas encore été identifiées. Pour les cas d’intoxication à Amanita smithiana et Amanita pseudoporphyria (71) (74), il s’agirait de l’acide 2-amino-4,5-hexadienoïque. Cette toxine thermostable a démontré une certaine toxicité rénale sur des cultures cellulaires ou des modèles animaux (75). Elle serait donc responsable des dommages rénaux engendrés chez l’homme. Aucune étude n’a identifié jusqu’à ce jour, sa présence chez Amanita proxima.

.1.3.4. Dosage / Quantification

La toxine présente chez Amanita proxima n’étant pas connue, il n’existe pas encore de méthode de dosage ou de quantification. L’interrogatoire du patient est donc le moment clé de la prise en charge. Il doit faire préciser le type de champignon consommé, les délais d’apparition des symptômes et leur chronologie. Une méthode de Chromatographie en Couche Mince a été récemment décrite pour identifier spécifiquement Amanita smithiana à partir d’échantillons de champignon fournis par le patient (71).

.1.3.5. Traitements

Le traitement est uniquement symptomatique. Il consiste en une rééquilibration hydroélectrique, un traitement des signes digestifs et éventuellement une hémodialyse en cas d’atteinte rénale (66). La dialyse dépend du degré d’insuffisance rénale. Une épuration extra- rénale est pratiquée dans un quart des cas bien que son intérêt pour l’élimination de la toxine n’ait pas encore été démontré. Aucune séquelle hépatique ou rénale n’a été à ce jour mise en évidence. En cas de décompensation cardiaque, on administre des inotropes telles que la dobutamine ou l’adrénaline (72). Une détresse respiratoire aiguë peut entrainer la mise en place d’une ventilation artificielle. Le traitement par assistance cardio-respiratoire percutanée s’est révélé être un succès en cas d’atteinte cardiaque potentiellement causée par Amanita proxima. Des examens sanguins avec une mesure de la créatininémie doivent être prescrits à tous les convives même s’ils sont asymptomatiques (69).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) 1.4. Focus sur le syndrome panthérinien ou myco-atropinique

Le syndrome panthérinien ou myco-atropinique est moins fréquent que le syndrome phalloïdien et représente environ 2 à 5% des syndromes mineurs dits à latence courte (5).

.1.4.1. Les espèces responsables

Les espèces responsables sont essentiellement Amanita pantherina ou amanite panthère à qui l’on doit l’appellation de ce syndrome et qui est considérée comme l’espèce majeure de ce type d’intoxication pour sa teneur élevée en substances toxiques. Et Amanita muscaria ou amanite tue-mouches qui se caractérise par son large usage ethno-mycologique (étude du rôle culturel des champignons). D’autres espèces telles que Amanita gemmata ou amanite jonquille, Amanita regalis, Amanita cothurnata ou Amanita strobiliformis ont été aussi rapportées comme potentiellement responsables de syndrome panthérinien mais leur concentration en substances toxiques reconnue comme active chez l’homme est encore discutée. Les intoxications dues à Amanita pantherina sont plutôt accidentelles car on peut facilement la confondre avec des espèces comestibles telles que Amanita rubescens, Amanita spissa ou Macrolepiota procera. Les intoxications à Amanita muscaria sont en majorité intentionnelles à but récréatifs (76) chez des sujets recherchant des effets ébrieux et psychotoniques. Elle est consommée depuis plus de 3 000 ans dans la cadre de rites divinatoires pour ses propriétés hallucinogènes (77). Ces dernières années, on constate un intérêt grandissant, surtout de la part des jeunes pour ces champignons à effets hallucinogènes. Les bouleversements technologiques qu’a subi le XXème siècle comme la naissance d’internet ont rendu l’achat et la détention de champignons toxiques très faciles et sans limitations. Ainsi dans la plupart des pays, les champignons du genre Amanita et leurs substances actives ne sont pas contrôlés par le gouvernement, ce qui contribue fortement à leur propagation. En France, le nombre de saisies et d’interpellations pour usage simple et ou trafic-revente de substances hallucinogènes est très faible car il n’existe pas encore de trafic structuré. En outre ces substances hallucinogènes échappent encore aux kits utilisés lors des contrôles routiers (78). Cet intérêt grandissant pour les champignons psychotropes et leur consommation excessive sont devenus un sérieux problème médical de notre génération, résultant parfois à une fin tragique.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Amanita muscaria et Amanita pantherina ne sont pas considérés comme mortelles selon la Société Mycologique de France (79) mais comme des champignons toxiques, ils « génèrent des accidents graves qui se soldent en général par une guérison » (13). Ainsi les empoisonnements par ces deux champignons sont moins mortels comparés à d’autres espèces du genre Amanita sus-citées et les patients se rétablissent généralement sans aucunes séquelles (77). Les effets toxiques dus à l’ingestion de ces champignons sont parfois similaires aux symptômes induits par les plantes contenant de l’atropine telles que le datura, la belladone ou la jusquiame noire et c’est pour cela qu’on nomme ce syndrome « myco- atropinique ». Cet effet psychotrope est causé principalement par deux toxines actives : l’acide iboténique et son produit de dégradation le muscimol.

.1.4.2. Clinique

.1.4.2.1. Etat des lieux

Le délai d’incubation du syndrome panthérinien est de 30 min à 4 heures (Figure 10).

Le début est marqué par un état ébrieux, très semblable à celui provoqué par les intoxications éthyliques aiguës (Figure 10) (5). Il s’accompagne de troubles de la vision, d’un état d’obnubilation avec agitation psychomotrice, d’un délire onirique avec des illusions sensorielles de toutes natures, surtout visuelles avec une hypersensitivité (80), qui sont vécues par le patient. Il n’y aurait pas d’hallucinations vraies. Le patient souffre de distorsion de l’espace et du temps. Très fréquemment il existe une alternance de phase de léthargie et de phase d’agitation marquée par des cris et des propos incohérents, une confusion mentale et une irritabilité. Une sécheresse de la bouche et une mydriase ont été rapportées chez certains patients (80). Une période de somnolence s’installe deux heures après l’ingestion. La phase d’état est atteinte vers la cinquième-sixième heure (81). Dans les formes graves, plus fréquemment avec Amanita pantherina, des convulsions pouvant être répétées et des troubles de la conscience marqués ainsi qu’un coma sont possibles notamment chez l’enfant (15). Les manifestations digestives sont inconstantes et le plus souvent limitées à quelques nausées et vomissements. Des signes anticholinergiques, à type de mydriase et de tachycardie, ont été rapportés, mais sont peu fréquents. Certaines observations rapportent l’association de

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) bradycardie et d’hypersialorrhée, mais avec une mydriase ou une alternance de myosis et de mydriase. Les signes cliniques persistent entre 6 et 12 heures.

S’ensuit une phase d’épuisement marquée par un sommeil de 12 à 15 heures et souvent d’une amnésie rétrograde (Figure 10) (5).

Figure 10 : Evolution des symptômes dans le temps du syndrome d'intoxication lié à l’ingestion d’Amanita muscaria (80)

Des décès peuvent résulter de l’ingestion d’Amanita muscaria marqués par le délire, des convulsions, le coma profond et la mort par arrêt cardiaque (82). Deux cas d’évolution mortelle ont été rapportés avec Amanita pantherina : un homme souffrant d’insuffisance cardiaque a présenté une fibrillation ventriculaire et un enfant de deux ans, des convulsions. En général le patient récupère après 24 heures sans aucunes séquelles.

.1.4.2.2. Un nouveau symptôme clinique décrit : suppression-burst

Un tout premier cas de suppression-burst induit par l’ingestion d’un champignon toxique, en l’occurrence Amanita pantherina, a été décrit récemment par Ogwa et al., 2015 (77) au Japon. La patiente âgée de soixante-huit ans est arrivée aux urgences de l’Hôpital Aizawa, trois heures après l’ingestion d’Amanita pantherina, dans un état comateux aigu et présentant des vomissements. Son empoisonnement à cette espèce a été diagnostiqué par l’analyse macroscopique des restes de champignons consommés par la patiente et par l’examen 59

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) clinique sans confirmation chromatographique. L’électroencéphalogramme (ECG) réalisé 4 heures après son arrivée à l’hôpital a révélé un tracé typique de suppression-burst, « un modèle d’électroencéphalogramme se caractérisant par une alternance de bouffées d’activité paroxystique avec des périodes de silence ou d’hypoactivité » (83). La patiente a finalement récupéré du coma 18 heures après son entrée à l’hôpital à la suite d’un traitement symptomatique. Son ECG a finalement retrouvé une activité normale 29 heures après l’ingestion du champignon. La patiente a pu retourner chez elle sans aucunes séquelles une semaine après l’ingestion. Le mécanisme synaptique de suppression-burst est marqué par des transmissions de glutamate et de GABA dans le néocortex. Le muscimol serait à l’origine de ce phénomène de suppression-burst comme l’a révélé une expérience réalisée sur une portion de néocortex de rat (84). Selon les auteurs, il s’agirait de l’association des deux molécules, l’acide iboténique et le muscimol, qui auraient provoqué ce phénomène de suppression-burst sur l’ECG.

.1.4.2.3. Vers deux syndromes distincts

Bien que le syndrome panthérinien soit décrit clairement, il n’existe pas de consensus quant à son examen clinique. D’après Lukasik-Glebocka et al., 2011 (85), il existerait une véritable différence entre le syndrome causé par Amanita pantherina avec laprésence de coma et celui causé par Amanita muscaria avec lanon présence de coma. En partant de ce postulat datant de 2011, Vendramin et al., 2014 (86) conduisent une étude avec la plus large cohorte de patients empoisonnés par Amanita muscaria et Amanita pantherina afin de comparer ces deux syndromes. Ainsi 49 patients dont 21 femmes et 28 hommes, de 45 ans d’âge moyenont été intégrés à l’étude sur une période rétrospective de 30 ans. Dans l’analyse des signes et symptômes d’empoisonnement, l’équipe a choisi de se limiter aux symptômes neurologiques dus à une atteinte du système nerveux central (SNC) et plus particulièrement aux symptômes suivants : confusion, agitation, hallucinations, convulsions et troubles de la conscience. En conclusion sur l’analyse de 32 cas d’intoxication par Amanita pantherina et de 17 cas d’intoxication par Amanita muscaria, une différence significative entre le tableau clinique de ces deux espèces a pu être établie. Dans le cas d’intoxication par Amanita muscaria les patients étaient plus agités et confus ce qui peut s’expliquer par l’effet excitant de l’acide iboténique sur le SNC présent en concentration plus importante que le muscimol à l’effet dépresseur. D’autre part la fréquence plus élevée de coma dans les cas d’intoxication par

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Amanita pantherina peut s’expliquer par la présence en plus grande concentration de muscimol par rapport à celle de l’acide iboténique. Chez les patients empoisonnés par Amanita muscaria, un état de somnolence a été constaté plus tardivement après l’ingestion du champignon se justifiant probablement par le fait que l’acide iboténique se dégrade spontanément en muscimol par décarboxylation dans le cerveau. Amanita muscaria contient aussi de la muscazone, un isomère du muscimol qui agit avec une période de latence plus longue. Cependant la somnolence n’est pas un critère clinique significatif qui différencie les intoxications par ces deux espèces de champignons. Ainsi d’après leur conclusion et la lecture de la littérature scientifique, Vendramin et al., 2014 (86) proposent de séparer le syndrome panthérinien ou myco-atropinique en deux syndromes distincts en fonction de l’espèce de champignon ingérée. Ces différences cliniques constatées pourraient s’expliquer par la variation des ratios de concentration en acide iboténique et en muscimol. Ainsi la concentration en acide iboténique est presque 10 fois plus élevée chez Amanita muscaria que chez Amanita pantherina : 10 – 2845 ppm contre 188 – 269 ppm sur des spécimens séchés. Les ratios s’inversent dans le cas du muscimol : 46 – 1052 ppm chez Amanita pantherina contre 1554 – 1880 ppm chez Amanita muscaria (87). Cependant il faut noter que ce ne sont que des hypothèses puisque l’étude se base sur des ratios de concentration entre les différentes molécules toxiques et non sur leur concentration absolue. En effet la quantité de champignon toxique ingérée par le patient n’était pas connue dans la majorité des cas analysés par l’étude et la quantité d’acide iboténique et de muscimol véritablement présente dans l’organisme du patient non plus. Il est aussi à noter que la concentration en acide iboténique et en muscimol varie d’un champignon à l’autre donc les ratios évoqués précédemment ne permettent pas de confirmer l’hypothèse des auteurs qui dissocierait le syndrome panthérinien en fonction des taux d’acide iboténique et de muscimol.

.1.4.3. Toxines mises en cause

Comme vu précédemment, les principales molécules actives identifiées chez Amanita muscaria et Amanita pantherina sont l’acide iboténique et le muscimol. Leurs concentrations et leurs distributions dans les champignons du genre Amanita sont variables et dépendent de plusieurs facteurs, principalement de l’origine du champignon, de son stade de croissance et de ses conditions de stockage. Par exemple, la concentration en acide iboténique diminue dans le temps en raison de sa transformation en muscimol pendant le séchage des 61

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) champignons. Le muscimol et l’acide iboténique ont aussi été isolé en quantité significative chez d’autres espèces d’amanites telles que Amanita strobiliformis, Amanita cothurnata et Amanita gemmata. La purification de ces molécules et la détermination de leurs structures datent rétrospectivement de 1964 et 1965 et sont depuis étudiées par de nombreuses équipes de recherche. D’autres molécules telles que la muscazone et la muscarine sont présentes sous la forme de traces dans les champignons et ne sont pas considérées comme actives chez l’homme. Les effets anticholinergiques sont mal expliqués par l’action de ces substances. La pharmacologie d’Amanita muscaria et d’Amanita pantherina n’est donc pas entièrement comprise mais les molécules décrites par la suite sont considérés comme les principaux candidats responsables de leur toxicité.

.1.4.3.1. Acide iboténique

.1.4.3.1.1. Structure, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques

L'acide iboténique (Figure 11) ou acide α-amino-3-hydroxy-5-isoxazole acétique (C5H6N2O4) est un acide aminé, précurseur du muscimol et de la muscazone, qui se forme lors du séchage du champignon. C’est un composé organique de type alcaloïde appartement à la famille des isoxazoles. Il a été isolé en 1960 de l’Amanita ibotengutake au Japon, une amanite très semblable à Amanita pantherina.

Figure 11 : Structure développée de l'acide iboténique.

Il est thermostable, sa température de fusion est supérieure à 100°C (88). Son poids moléculaire est de 158 g/mol et il se présente sous la forme de cristaux incolores solubles dans le méthanol. L’acide iboténique est rapidement décarboxylé en muscimol dans l’organisme. Après ingestion du champignon, l’acide iboténique et le muscimol sont rapidement absorbés par le tractus gastro-intestinal et peuvent être détectés dans l’urine au

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) bout d’une heure. Ces deux molécules sont capables de traverser facilement la barrière hémato-encéphalique via un système de transport actif et exercent leurs effets toxiques sur le SNC où elles agissent comme des agonistes de neurotransmetteurs.

.1.4.3.1.2. Mécanisme de toxicité

L’acide iboténique est responsable d’une phase précoce d’excitation et exercerait des effets toxiques principalement sur la circulation périphérique (89). C’est un agoniste des récepteurs spécifiques du glutamate mimant les effets de ce neurotransmetteur le plus répandu dans le SNC. En condition physiologique, lorsqu’un potentiel d’action arrive à l’extrémité de l’axone, le glutamate est déversé par exocytose dans la fente synaptique (90). Il se lie alors à divers récepteurs de la membrane post-synaptique neuronale et crée un potentiel d’action (Annexe 1). Il est ensuite soit recapté directement et mis en réserve dans les vésicules synaptiques soit converti en glutamine par les cellules gliales puis transporté dans les neurones présynaptiques où la glutamine est reconvertie en glutamate dans les mitochondries (22) (Annexe 2). Au moins cinq sous classe de récepteurs synaptiques du glutamate ont été identifiés par les effets d’antagonistes spécifiques du glutamate. Le récepteur stimulé par l’acide iboténique est un récepteur métabotrophique couplé à une protéine G (Figure 12).

Figure 12 : Récepteur métabotropiquespécifique de l'acide iboténique (22).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) L’acide iboténique va se lier spécifiquement à ce récepteur et déclencher un potentiel d’action en entrainant la libération de Ca2+. En temps normal, l’action excitatrice du glutamate est contrebalancée par les effets inhibiteurs du GABA dont il est d’ailleurs le précurseur principal. L’acide iboténique dans la fente synaptique rompt cet équilibre et provoque un processus d’excitotoxicité (« processus pathologique d'altération et de destruction neuronale »

(91)) délétère, voire mortel, pour les neurones. Les symptômes typiques d’une intoxication par l’acide iboténique sont des convulsions, des spasmes musculaires et des hallucinations. Il produit des effets psychotiques chez l’homme à des doses de 30 à 100 mg (27) (80).

.1.4.3.2. Muscimol

.1.4.3.2.1. Structures, propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques

L’acide iboténique se dégrade rapidement en muscimol par décarboxylation (Figure 13).

Figure 13 : Réaction de décarboxylation de l'acide iboténique en muscimol (89).

Le muscimol ou 5-(aminométhyl)-3(2H)-isoxazolone (C4H6N2O2) est le principal alcaloïde psychoactif des champignons du genre Amanita (80). C’est une molécule polaire, de poids moléculaire 114.1 g/mol (93), facilement soluble dans l’eau, l’alcool éthylique et le sulfoxide de diméthyle (DMSO) (80). Tout comme l’acide iboténique, il passe la barrière hémato- encéphalique et agit principalement comme agoniste sur les récepteurs GABA. En considérant que les récepteurs du GABA sont largement distribués dans le cerveau, le muscimol altère l’activité neuronal dans de nombreuses régions. Donc son spectre d’action est plus intense que l’acide iboténique. Une étude de Kupka et al., 2015 (94) apporte une véritable 64

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) amélioration de la compréhension atomistique des caractéristiques de base du muscimol. Des études de résonnance magnétique nucléaire ont été menées pour expliquer la coexistence de plusieurs formes de muscimol  non ionisée, NH, zwitterion (Figure 14)  dans une solution de DMSO. Les énergies totales des trois formes de muscimol dans les solvants polaires ont montré des résultats à peu près identiques mais avec une forme zwitterion beaucoup moins stable. Ces résultats constituent une véritable avancée scientifique puisqu’ils fournissent un support d’aide à la compréhension de l’action biologique des analogues du GABA et à l’amélioration des techniques de détection des différentes formes du muscimol en solution.

Figure 14 : Trois formes du muscimol avec le nombre d'atomes

Pour un effet psychotrope équivalent à celui provoqué par l’acide iboténique, on considère que les doses actives chez l’être humain sont cinq fois moindre et de l’ordre de 6 à 15 mg (27) (80).

.1.4.3.2.2. Mécanisme de toxicité

Le muscimol est connu comme responsable de la phase de dépression du SNC (15). Il agit comme neurotransmetteur agoniste des récepteurs spécifiques du GABA. Il peut traverser la barrière hémato-encéphalique et inhiber le neurone post-synaptique qui ne peut plus transmette l’influx nerveux provenant d’autres neurones. Ainsi en se fixant par compétition sur les récepteurs du GABA, il déclenche l’ouverture des canaux spécifiques de l’ion chlorure (Cl-) et du ligand-dépendant, et la membrane post-synaptique devient perméable aux ions Cl-. L’entrée du Cl- provoque une hyperpolarisation (le potentiel de membrane est encore plus négatif qu’à l’état de repos) de la membrane post-synaptique. Cette hyperpolarisation élève le seuil de déclenchement du potentiel d’action du neurone, ce qui le rend résistant à la stimulation par le neurotransmetteur excitant. Les récepteurs du GABA sont principalement présents dans le cerveau. Le muscimol agit donc par blocage compétitif des récepteurs

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) cérébraux du GABA lui conférant des propriétés neurotoxiques tels que des troubles de l’accommodation visuelle, des pertes de l’équilibre, des contractions musculaires et une hypersensibilité (80).

.1.4.3.3. Les autres toxines identifiées

La muscazone, dérivé de l’acide iboténique, aurait aussi un rôle important dans le syndrome panthérinien mais celui-ci n’a pas encore été précisé. Elle posséderait cependant les mêmes activités sur la circulation périphérique que l’acide iboténique et semblerait jouer un rôle de potentialisateur du muscimol.

Des acides distizolopique et stizolopilique ont aussi été isolés dans les années 70-80 à partir d’Amanita muscaria à des quantités suffisamment importantes pour provoquer des effets cliniques de type anticholinergiques (5). En effet ces molécules présentent des analogies structurelles avec les produits d’oxydation de la L-Dopa, précurseur de la dopamine (neurotransmetteur important du SNC).

La muscarine a été initialement isolée et identifiée à partir d’Amanita muscaria qui est à l’origine de son nom. Cependant les publications récentes s’accordent sur des concentrations de muscarine très faible de l’ordre de 2mg / 100g soit 0,002 % de poids sec (80). Les concentrations très faibles chez Amanita muscaria seraient donc insuffisantes pour expliquer le tableau clinique du syndrome. Il est tout de même connu que la muscarine agit en mimant les effets de l’acétylcholine sur les récepteurs muscariniques post-synaptiques. Ces récepteurs sont des protéines transmembranaires en interaction avec des protéines G présents sur les muscles lisses et dans les glandes. Lors d’une intoxication par syndrome panthérinien, cette action cholinergique est très peu marquée, généralement inexistante.

.1.4.4. Propriétés pharmacologiques d’Amanita muscaria et d’Amanita pantherina

.1.4.4.1. L’acide iboténique, un agent provoquant des lésions cérébrales

Les propriétés neurotoxiques de l’acide iboténique sont utilisées en recherche pharmaceutique et toxicologique pour provoquer des lésions cérébrales. Il est nommé « agent provoquant des 66

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) lésions cérébrales » et mime ainsi les symptômes de maladies neurodégénératives. On l’utilise sur des modèles animaux pour tester et développer de nouveaux médicaments à visée thérapeutique du SNC telle que pour la maladie d’Alzheimer (95). Il est trois à 10 fois plus puissant que l’acide glutamique et permet donc d’étudier les mécanismes excitateurs de la voie de neurotransmission du glutamate (96). Malgré la simplicité de structure de l’acide iboténique, sa synthèse est très complexe et aujourd’hui seule l’extraction est possible. Il faut environ 100 kilogrammes de champignons frais pour obtenir environ 1 gramme de substance active pure.

.1.4.4.2. Le muscimol, une molécule GABAergique expérimentale

Le muscimol est principalement étudié pour sa forte ressemblance structurelle et ses caractéristiques de répartition de densité électronique similaires à celles du GABA. En effet ces molécules contiennent deux pôles bien séparés capables d’interagir spécifiquement avec des récepteurs du cerveau portant des groupes terminaux de charge opposée. Un analogue du muscimol, le THIP, est étudié pour son activité analgésique proche de la morphine.

.1.4.4.3. Les polysaccharides d’Amanita muscaria, des molécules anti-inflammatoires et

anti-nociceptives

Les polysaccharides contenus dans la majorité des champignons sont aujourd’hui reconnus comme biologiquement actifs et dont les vertus médicinales et thérapeutiques sont prouvées. Les béta-glucanes sont les polymères les plus abondants et largement distribués dans le squelette pariétal de la paroi cellulaire des champignons. Ils sont parfois considérés comme les composés les plus intéressants isolés à partir des champignons et principalement pour leur rôle de modificateurs de la réponse biologique (BMR : Biological Response Modifiers). A l’inverse, les hétérogalactanes, en particulier ceux contenant du fucose, stimulerait l’activité biologique. Plusieurs propriétés physiques et chimiques, telles que la composition en monosaccharides, le poids moléculaire, le degré de ramification, les liaisons glycosidiques et les substituants, peuvent influencer les activités biologiques des polysaccharides. La connaissance des caractéristiques structurales des polysaccharides est importante pour comprendre et étudier leurs propriétés biologiques. Dans ce but, l’équipe de Ruthes et al., 2013 (97) s’est penchée sur l’étude structurale des polymères d’Amanita muscaria encore peu

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) étudiées et sur l’évaluation de leur activité anti-inflammatoire et anti-nociceptive – deux activités déjà attribués à des polysaccharides isolés à partir d’autres champignons. En utilisant la spectroscopie RMN mono- et bidimensionnelle, l’analyse de méthylation et le protocole Smith-degradation, les auteurs ont isolés et extraits un fucomannogalactane (FMG-Am) et un (1→ 3), (1→ 6) β-D-glucane (GLC-Am) (Annexe 3). Ces deux molécules ont ensuite été évaluées pour leurs potentielles activités anti-inflammatoires et anti-nociceptives sur des souris par le test à la formaline. Ce test largement utilisé consiste à injecter une solution diluée de formaline dans la patte arrière de l’animal ce qui provoque une réponse nociceptive diphasique. La première phase est dite aiguë et la deuxième est dite inflammatoire (98). Ces deux phases sont entrecoupées par une interphase où il y a une inhibition des comportements douloureux. Ce test permet ainsi une analyse rapide et efficace du potentiel analgésique du composé en question. Les résultats de l’étude ont montré que l’administration intrapéritonéale de GLC-Am réduisait significativement la douleur aiguë de la première phase avec une DI50 (dose de substance qui entraîne des signes cliniques sur 50 % des animaux) de 16,4 mg kg-1 et une inhibition de la douleur de 64 ± 3% à des doses de 30 mg kg-1. Le FMG-Am n’a démontré aucun effet inhibiteur de douleur sur la phase I du test. Cependant le GLC-Am et le FMG-Am ont démontré une efficacité plus importante sur la douleur inflammatoire avec respectivement -1 -1 une DI50 de 2,41 mg kg et 3,41 mg kg et une inhibition de la douleur d’environ 91 ± 8% à des doses de 30 mg kg-1 de GLC-Am et de 88 ± 7% à des doses de 10 mg kg-1 de FMG-Am. Après comparaison avec le même test de l’activité anti-inflammatoire et anti-nociceptive d’un β-D-glucane isolé de Lactaria rufus, les auteurs ont observé que le degré de ramification et la solubilité de la molécule avait une importance essentielle dans la réponse à la douleur anti- inflammatoire. Les polysaccharides ont donc des propriétés thérapeutiques avérées. Certains béta-glucanes isolés à partir de champignons sont déjà sur le marché depuis une vingtaine d’années au Japon pour traiter certains cancers (99). Les polysaccharides ont donc un rôle pharmaceutique important à jouer aujourd’hui et dans l’avenir puisqu’ils couvrent un large éventail de fonctions et ne présentent aucune toxicité avérée pour l’être humain.

.1.4.5. Dosage / Quantification

Habituellement, l'intoxication par un champignon est prouvée par un examen microscopique des spores dans l'estomac et / ou dans le contenu intestinal (100). Cependant ce type d'investigation requiert un personnel qualifié et expérimenté qui n'est pas toujours formé à ce 68

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) type d'analyse. Jusqu'à aujourd'hui il n'existe pas de méthode analytique efficace et rapide pour le dépistage d'une intoxication et pour la détermination des toxines en présence (101). Il existe plusieurs méthodes analytiques traitant de la séparation et de la détermination de l'acide iboténique, du muscimol et de la muscarine à partir de différentes matrices incluant des échantillons de matériel végétal et biologique.

.1.4.5.1. A partir de matériel végétal

Plusieurs rapports ont décrit des méthodes de détermination de la muscarine, de l’acide iboténique et du muscimol à partir d’échantillons de champignon. Grâce à leur polarité élevée et à la nature amphotère de ces composés, certaines études utilisent la méthode de chromatographie sur papier 2D (102) ou la méthode de chromatographie en couche mince sur gel de silice avec la nihydrine comme révélateur chimique (103). La méthode de chromatographie liquide à haute performance couplée avec différents types de détecteur. Gonmori et al., 2012 (104) ont ainsi analysé l’acide iboténique et le muscimol chez les Amanites par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS / MS). Tsujikawa et al., 2007 (105) ont développé une méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à un détecteur ultra-violet (HPLC-UV) pour quantifier l’acide iboténique et le muscimol ainsi qu’une méthode LC-MS pour les identifier. Tsujikawa et al., 2006 (87), dans un autre article, utilisent la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC/MS) pour identifier l’acide iboténique et le muscimol. Poliwoda et al., 2014 (106) déterminent ces deux molécules dans les champignons du genre Amanita par électrophorèse capillaire. Cette technique d’électrophorèse apporte plusieurs avantages pour la détermination d’isoxazoles dans les champignons. Les auteurs présentent ainsi une méthode sensible avec une bonne résolution et une suppression des étapes de dérivation ou de prétraitement de l’échantillon nécessaires pour les extractions en phase solide (SPE). Parmi les autres critères de qualité pris en compte dans le choix d’une technique d’analyse on se base sur la limite de détection (LOD), c’est-à-dire « la mesure de la plus petite concentration détectable avec une incertitude acceptable, mais non quantifiée dans les conditions expérimentales décrites de la méthode analytique » (107). Ainsi dans les conditions expérimentales optimisées (Annexe 4), l’acide iboténique et le muscimol ont été détectés dans les 20 minutes avec une LOD détectée de 1,5 µg/mL pour l’IBO et de 1,8 µg/mL pour le MUS. La sensibilité de cette méthode est comparable aux méthodes HPLC-UV

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) et HPLC-MS décrites dans la littérature. Cette méthode d’électrophorèse par capillaire serait donc une technique de choix en médecine pour détecter le muscimol et l’acide iboténique de façon rapide et efficace.

.1.4.5.2. A partir de matériel biologique

Dans le cas d’échantillons biologiques, plusieurs méthodes de détection des toxines dans les urines et dans le sérum ont été étudié. Merovà et al., 2011 (108) utilisent une méthode LC-MS/MS pour détecter la muscarine dans les urines humaines. Stribrny et al., 2011 (76) développent par la suite une méthode GC-MS pour la détermination de l’acide iboténique et du muscimol dans les urines de patients intoxiqués par Amanita pantherina. L’analyse de l’acide iboténique et du muscimol à partir du sérum humain a été proposé pour la première fois par Hasegawa et al., 2013 (109) avec une méthode LC-MS/MS. Il existe à ce jour seulement deux méthodes connues qui traitent de la séparation simultanée des trois toxines responsables du syndrome panthérinien : l’acide iboténique, le muscimol et la muscarine. La première a été élaborée par Merovà et al., 2008 (110) et se base sur la méthodologie LC-MS à partir d’échantillons d’urine. Plus récemment Ginterovà et al., 2014 (101) publient une étude sur l’identification, la séparation et la détermination de l’acide iboténique, du muscimol et de la muscarine par électrophorèse capillaire couplée avec la spectroscopie de masse (CE-ESI-MS/MS). Cette méthode présente une alternative efficace aux chromatographies en phase liquide et une simplification de certaines étapes longues de prétraitement des échantillons. Les trois toxines ont été séparées en 24 minutes à des niveaux de concentration molaire de l’ordre du nanomètre. Cette méthode a également prouvé son efficacité sur des échantillons d’urine humaine après intoxication par Amanita muscaria, Amanita pantherina ou Amanita Gemmata.

.1.4.6. Traitements

Il n’existe pas d’antidote spécifique pour le syndrome panthérinien et le traitement est essentiellement symptomatique. La conduite à tenir est dépendante de l’intensité des symptômes. La surveillance doit cependant se faire jusqu’à disparition des symptômes, environ 24 heures après l’ingestion. Le traitement symptomatique consiste en une rééquilibration hydroélectrique éventuelle consécutive aux troubles digestifs. Les

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) recommandations du Vidal (111) préconisent le respect des vomissements. Un lavage d’estomac ainsi qu’une administration de charbon activé peuvent être prescrits pour éliminer la toxine (89). Contrairement aux recommandations du Vidal, le sirop d’Ipeca est parfois prescrit pour encourager les vomissements. L’administration de sédatifs à faibles doses tels que le diazépam (Valium®), la chlorpromazine (Largactil®) sont utiles en cas d’hallucination, d’agitation importante (112). Les convulsions sont traitées efficacement avec le diazépam (Valium®), le phénobarbital (Gardenal®) ou la phénytoïne (Dilantin®) (82). Benjamin, 1992 (81) recommandent cependant la prudence quant à l’utilisation du diazépam dans ce genre d’intoxication car des études chez l’animal suggèrent que le diazépam potentialise l’effet du muscimol. Il conviendra de ne pas administrer d’alcool, d’atropine ou de teinture de Belladone afin d’éviter une exacerbation des symptômes (112).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .2. PARTIE 2 : Amélioration de la base de données du site web « Les

macromycètes dans tous leurs états »

A l’heure du numérique où les cours en visio-conférence et les examens sur iPad sont devenus monnaie courante, le site internet est devenu un support de travail indispensable pour les enseignants et les étudiants. Il donne une véritable plus-value pour le partage de la connaissance mycologique. Le site internet « Les macromycètes dans tous leurs états » a été mis en ligne en juin 2011 et est aujourd’hui consultable depuis l’URL http://macromycetes.univ-lyon1.fr/. Il sert de support principal aux enseignements de mycologie de la faculté de pharmacie de Lyon 1 et est ainsi directement accessible via la plate-forme pédagogique SPIRAL Connect (Serveur Pédagogique Interactif de Ressources d'Apprentissage de Lyon 1). Il se compose aujourd’hui de photos, de fiches d’identification et de vidéos explicatives permettant aux étudiants, pharmaciens et particuliers de se former à distance et d’identifier facilement les différents champignons en présence. En collaboration avec le service iCAP de l’université Lyon 1 œuvrant pour la modernisation et l’amélioration de la qualité des enseignements, les enseignants du réseau STOLON et plusieurs étudiants en thèse d’exercice ont participé à l’élaboration, la mise en œuvre et à l’amélioration continue du site depuis sa création. Grâce à une analyse non exhaustive, réalisée en thèse d’exercice par François et al., 2011 (113), d’une trentaine de sites internet considérés comme fiables et référençant le plus grand nombre de champignons d’une liste préétablie, les critères suivants ont été pris en compte dans la construction du site : - Qualité des photos - Description précise, claire et complète du champignon concerné - Charte graphique simple et intuitive - Présence de vidéos explicatives Le site de l’Université Claude Bernard Lyon 1 (UCBL) comprend aujourd’hui 82 fiches d’identité de champignons, 178 espèces dans La Macrothèque comptant des photos en haute définition facilitant l’identification du champignon et 79 vidéos répertoriées dans la rubrique Cinémathèque. Depuis 2014, la rubrique Macrothèque compte un nouvel onglet « Visualisation 360° ». Aujourd’hui 27 espèces peuvent ainsi être visualisées en 3D et de façon animée selon une vue à 360°. 72

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) 2.1. Etude critique du site internet

.2.1.1. Arborescence du site

Le site est construit sur 4 niveaux (Figure 15). La page d’accueil présente une interface simple et intuitive pour tout utilisateur.

Clé d’orientation

Banque vidéo

Comestibles Comestibles sous condition Mauvais mais pas toxique Toxiques Mortels

Figure 15: Arborescence du site internet "Les macromycètes dans tous leurs états" à la date du 21/01/2016

La barre de navigation du site est claire et le titre des différentes rubriques est explicite. J’émettrais cependant deux réserves quant à l’architecture du site internet.

Le forum Errata est à mon sens mal placé. C’est un outil de grande qualité pour les étudiants car il permet une interaction directe et facile avec les professeurs sans pour autant fixer un rendez-vous ou rencontrer de visu un membre du corps enseignant pour une réponse. Il mériterait ainsi d’être mis en valeur et surtout plus accessible. En effet il se situe au niveau 2

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) dans l’architecture du site et se consulte via l’onglet « nous écrire » qui selon moi ne correspond pas à la fonction du forum. De plus le titre « Errata » restreint son usage et freine les étudiants ou particuliers qui voudraient simplement poser une question, éclaircir certaines informations ou laisser un commentaire. D’autant plus que les erratas du type erreurs d’orthographe, problème de téléchargement etc. n’ont pas forcément besoin d’être discutés sur un forum. On compte à ce jour seulement quatre commentaires sur le forum et aucun ne fait référence à un errata (Figure 16). Le titre est donc mal approprié et limitant pour des usagers voulant simplement partager leur enthousiasme quant à la qualité du site.

Figure 16 : Commentaire sur le Forum Errata d'un usager du site "Les macromycètes dans tous leurs états"

Comme solution nous pourrions envisager de : - Remplacer le titre de l’onglet « Nous écrire » par « Forum ». - Supprimer les onglets « Forum errata » et « Contact ».

- Ajouter un onglet « Contact » ou un symbole avec pour légende « Nous contacter » dans la barre de navigation du site.

L’accès aux fiches ou à la macrothèque par ordre alphabétique est très commode mais elle implique cependant que l’usager connaisse le nom latin du champignon qu’il recherche. Une barre de recherche serait idéale pour identifier les champignons par leur nom vernaculaire ou par leur genre. Actuellement la mise en place d’une telle barre de recherche est limitée par la technique mais elle fera peut-être l’objet d’une prochaine thèse.

.2.1.2. Design du site

Le design (Figure 17, partie gauche) est simple, épuré et les couleurs choisies sont en rapport avec le thème. Le choix des couleurs est important dans la construction d’un site internet et 74

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) connaitre leur signification est essentiel pour les utiliser à bon escient et constituer une charte graphique cohérente. Le blanc, présent en majorité dans notre site, est un symbole de pureté et de propreté. Il installe un gage de clarté et de neutralité (114). Le vert et le marron sont des couleurs liées la nature, apaisantes et donc appropriées à notre thème. Il n’existe pas de règles prédéfinies concernant le choix des couleurs dans le monde du Web cependant lorsque l’on compare notre interface à celle du site « Clic’ Amanite » (Figure 17, partie droite) créée aussi par l’Institut des Sciences Biologiques et Pharmaceutiques (ISPB), on se rend compte de l’importance du design. En effet les fonds bleu et jaune avec un personnage de super Mario en transparence ne renvoient pas des codes sérieux. A première lecture et sans connaitre la source, le site semble créé par un amateur et la fiabilité des informations est remise en cause.

Figure 17 : Comparaison des pages d’accueil des sites « Les macromycètes dans tous leurs états » et de « Clic’Amanites »

Cette comparaison nous permet aussi de constater que la police a son importance en fonction du message que l’on souhaite adresser à l’internaute. Sur le site « Les macromycètes dans tous leurs états », la police choisie est parfaitement adaptée et lisible. Il y a cependant un peu trop de tailles et de styles de police différents. Le lecteur est noyé et les informations essentielles ne sont finalement pas mises en valeur. Nous constatons aussi une disproportion entre la taille de l’image à gauche et la taille du texte qui mériterait d’être plus importante.

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) .2.1.3. Analyse de la visibilité du site via Google tendances

Etre visible sur internet est un atout pour augmenter le partage et la propagation de l’information. Le fait d’être bien référencé, c’est-à-dire d’avoir une bonne position dans les moteurs de recherches avec certains mots clés (115), est primordial aujourd’hui et notamment en mycologie, une discipline qui véhicule une image peu moderne. Aujourd’hui le site « Les Macromycètes dans tous leurs états » est principalement utilisé par les étudiants qui ont connaissance de l’existence du site via leurs cours de mycologie. Pour une utilisation par les particuliers, le site pâti d’une mauvaise visibilité sur les moteurs de recherche et ce critère mériterait d’être amélioré. Une simple recherche des mots « champignons », « identification de champignons », « fiches champignons », « champignons comestibles » etc. sur le moteur de recherche Google ne nous permet pas de trouver le site internet dans les 30 premières pages. Il existe de nombreux paramètres qui influencent le référencement de notre site internet.

.2.1.3.1. Gestion des mots clés

Lors de la création d’un site Web, il est important d’utiliser des mots clés approprié à divers emplacements dans le site internet. Ces mots clés peuvent être insérés stratégiquement dans le titre de la page, dans l’URL de la page ou encore dans le nom de domaine du site. Afin d’évaluer la fréquence à laquelle le terme « macromycètes » est googlelisé et de le comparer aux autres mots clés susceptibles d’être cherchés pour accéder à l’information de notre site, nous avons utilisé l’outil Google tendance. Une liste de mots susceptibles d’être saisis dans le moteur de recherche pour aboutir aux informations relayées par le site « Les macromycètes dans tous leurs états » est établie : « champignons comestibles », « champignons toxiques », « mycologie », « identification champignon » et « macromycètes ». Le mot « champignon(s) » a volontairement été exclu car les termes associés à sa recherche font référence en majorité à des recettes culinaires (Figure 18).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Termes saisis* champignons comestibles champignon mycologie Recherches associées**

* Pour les termes « champignons toxiques », « macromycètes » et « identification champignons » le volume de recherche est insuffisant pour afficher les résultats **Les personnes ayant effectuées des recherches similaires ont également souvent recherché ces termes Figure 18 : Recherches associées aux termes saisis dans Google

Google tendance permet de visualiser une courbe représentant le nombre de recherches d’un terme sur Google en fonction du temps (Figure 19). Afin d’évaluer la fréquence de recherche du mot « macromycètes », nous l’avons comparé à l’ensemble des mots associés, analysés par Google tendance, et résumés ci-dessus. En fonction du volume de recherche et de la pertinence des mots proposés, nous avons choisi de retenir la courbe comparant les termes « champignons comestibles », « champignons toxiques » et « mycologie » avec le mot « macromycètes » sur une période de janvier 2011 à février 2016.

Termes de recherche

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) Figure 19 : Courbe du nombre de recherches sur Google des termes « champignons comestibles », « champignons toxiques », « mycologie », « macromycètes » en fonction du temps et zoom sur le mois d’octobre 2013

D’après la Figure 19, les recherches internet concernant les champignons, hors recherches culinaires, sont cycliques et saisonnières. On observe ainsi un pic d’activité chaque année pour les mois d’automne : septembre, octobre et novembre. La recherche la plus fréquente concerne les termes « champignons comestibles » tandis que le nombre de recherches du terme « macromycètes » est considéré comme nul par l’outil de tendance. Il faut cependant noter que le nombre de recherches n’est pas forcément égal à zéro mais que l’outil se concentre sur les termes de recherche populaires, ceux dont le volume de recherche est insuffisant sont donc considérés comme nuls (116).

Le mot « macromycètes » qui nous renvoie directement sur le site internet est donc très peu utilisé et ne correspond pas, à mon sens, à une recherche faite par des novices de la mycologie. Même si le titre du site ne peut pas techniquement être changé, nous avons décidé de remplacer le mot « macromycète » par les termes tendances directement dans le texte de la page d’accueil. Afin de mieux référencer le site dans le moteur de recherche, il est également possible d’utiliser la balise html dans le code du site Web. Ainsi, nous avons réajusté la liste des mots clés "Keywords" dans la page d’accueil (Figure 1Figure 20).

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 20 : Comparaison entre les mots clés de la page d'acceuil du site "Les macromycètes dans tous leurs états" à la date du 04 juin 2016 et une nouvelle proposition. Les mots inutiles ont été supprimés (PDF / zoom / image etc.)

Cependant, nous constatons que les mots clés renseignés dans la balise de la page d’accueil n’ont pas permis un meilleur référencement. En effet google notamment ne prend en compte les mots clés en meta-données que s’ils sont présents à la fois dans les mots clefs et dans la page elle-même afin d’éviter les système qui génèrent des mots clefs automatiques pour améliorer la fréquentation. Stratégie qui a été largement utilisée par les sites « pour adultes » au début de l’utilisation des meta-données. Pour un meilleur référencement, il faudrait, renseigner pour chaque fiche champignon la liste des mots clés pertinente. Après une recherche des termes tendance sur l’outil Google Tendance (Annexe 6), il apparait que les catégories suivantes sont importantes : - Le nom vernaculaire - Le nom latin - Le genre en latin et en français

MASSON (CC BY-NC-ND 2.0) - La comestibilité telle que « bolet comestible », « bolets comestibles », « champignons comestibles », « champignon comestible ». En se référant au contenu de la fiche. - La couleur telle que « champignons rouges », « champignon rouge », « bolet rouge ». - L’habitat s’il est pertinent tel que « champignon du chêne ».

Les mots clés cités ci-dessus sont à titre indicatif. Il convient de faire une recherche sur Google Tendance au cas par cas. Jusqu’à présent ce choix n’avait pas été fait car les porteurs de projets avaient pensé qu’il était important que les internautes arrivent sur le site par la page d’accueil afin de lire les mises en garde. Il se trouve que ce choix a eu pour conséquence directe la diminution caractéristique de la fréquentation à cause du manque d’indexage par les moteurs de recherche.

.2.1.3.2. Référencement des images dans google image

Google se base sur les balises html contenu dans le code d’une page pour référencer les images d’un site web. Une fois qu’il a trouvé ces balises, il analyse le contexte sémantique qui entoure cette image (titre, légende de l’image, etc.) et l’attribut « alt » de la balise qui décrit l’image, pour la référencer dans Google image (117).

Concernant les images de la macrothèque et de la « Visualisation 360° » de notre site ; elles sont utilisées par des applications Flash et Zoomify et n’apparaissent donc pas sous la forme de balise image : . Ces images ne peuvent donc pas être trouvé par Google image. Cependant, il est possible d’ajouter un texte alternatif dans la balise