Mikológiai Közlemények, Clusiana 48(1): 69–80. (2009) TUDOMÁNYOS DOLGOZATOK RESEARCH ARTICLES MAGYARORSZÁG TERÜLETÉRŐL LEÍRT KÉT AGARICUS FAJ ÖSSZEHASONLÍTÓ MORFOLÓGIAI ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI VIZSGÁLATA VASAS Gizella1 és ERŐS-HONTI Zsolt2 1Magyar Természettudományi Múzeum, Növénytár, 1476 Budapest, Pf. 222; [email protected] 2BCE Kertészettudományi Kar, Növénytani Tanszék és Soroksári Botanikus Kert, 1118 Budapest, Ménesi út 44; [email protected] Magyarország területéről leírt két Agaricus faj összehasonlító morfológiai és molekulá- ris biológiai vizsgálata. – Magyarország, természeti adottságainak köszönhetően igen gaz- dag Agaricus fajokban. Jelen cikkünkben két, a tudomány számára újként Bohus Gábor és munkatársai által leírt faj (A. macrosporoides és az A. annulospecialis) rendszertani kapcso- latait tárgyaljuk molekuláris taxonómiai, részletes termőtest- és micéliummorfológiai, illetve élettani bélyegek tükrében. Az A. macrosporoides nagyon közeli rokonságban áll az A. arvensis és az A. fissuratus fa- jokkal. A közeli rokonság miatt több szerző az A. fissuratus-t már beolvasztotta az A. arven- sis-be, az A. macrosporoides esetében azonban ez nem tehető meg egyértelműen az in vitro tenyészetekben megfigyelhető tulajdonságai miatt. A vizsgált faj micéliumnövekedése lénye- gesen gyorsabb, sőt a táptalaj felületén micéliumistrángokat képez, melyekből primordiumok is fejlődnek. Az A. macrosporoides ezen tulajdonságai miatt könnyen termesztésbe vonható. A három faj kölcsönös rendszertani viszonyának tisztázása további molekuláris vizsgálato- kat igényel. Az A. annulospecialis-t Parra morfológiai alapon az A. altipes szinonimjának tekinti, melyet azonban molekuláris biológiai vizsgálatokkal megerősíteni nem tudunk, mivel nincs hozzá- férhető szekvencia ebből a fajból. A morfológiai bélyegek és a molekuláris biológiai vizs- gálatok alapján az A. annulospecialis az A. campestris rokonsági körébe tartozik. Comparative morphological and molecular taxonomic description of two Agaricus spe- cies described from Hungary. – Due to the climatic conditions of Hungary, the macrofunga of the country contains several Agaricus species. In the present article, we discuss the tax- onomic position of two of them (A. macrosporoides and A. annulospecialis), described pre- viously as new species by Bohus and coauthors. We carried out the molecular phylogenetic analysis of the ITS region, in addition to comparing the physiological and detailed morphol- ogical traits of the basidiocarps and the in vitro cultures to those of closely related species. A. macrosporoides is in very close relation with A. arvensis and A. fissuratus. Several au- thors have already disagreed with the fact that A. fissuratus was a valid individual species. However, we think that A. macrosporoides should be kept in its position owing to the char- acteristics of its in vitro mycelial cultures. Growth intensity of its hyphae is rather high, and it forms mycelial strings on the surface of the substratum, that give rise to primordia. These features of A. macrosporoides make it easy to cultivate. To clarify the phylogenetic relation- ships of the three species, further molecular investigations are required. Based on their common morphological characteristics, Parra regards A. annulospecialis as a synonym of A. altipes. Unfortunately, we cannot examine this hypothesis with molecular methods, because no sequence is available from the latter species. Both the comparison of Mikológiai Közlemények, Clusiana 48(1), 2009 Magyar Mikológiai Társaság, Budapest 70 VASAS G. és ERŐS-HONTI ZS. the morphological features and our molecular results proved that A. annulospecialis is among the closest relatives of A. campestris. Kulcsszavak: Agaricus altipes, A. annulospecialis, A. macrosporoides, ITS-szekvenciaanalízis Key words: Agaricus altipes, A. annulospecialis, A. macrosporoides, ITS sequence analyses BEVEZETÉS Az Agaricus nemzetség napjaink molekuláris taxonómiai vizsgálatokkal felállí- tott gombarendszereiben a Basidiomycota törzs Agaricomycotina altörzsébe (HIB- BETT és mtsai 2007), azon belül az Agaricales rendbe (MATHENY és mtsai 2007), az Agaricaceae osztályba (MATHENY és mtsai 2006) tartozik. A nemzetség mono- filetikusságát már a korai DNS-alapú vizsgálatok is megkérdőjelezték (MONCALVO és mtsai 2002): az Agaricus fajok közös, önmagában parafiletikus csoportja csak a Longula és Gyrophragmium szekocioid nemzetségek bevonásával tehető kladiszti- kai értelemben elfogadhatóvá (GEML és mtsai 2004, MONCALVO és mtsai 2002). Az Agaricus nemzetség képviselőire vonatkozóan Geml József végzett részletes, átfogó molekuláris biológiai vizsgálatokat, ám ezek nem terjednek ki a hazánk te- rületéről leírt valamennyi, a tudományra nézve új gombafajra (GEML 2002, GEML és mtsai 2004). Magyarország, természeti adottságainak köszönhetően igen gazdag csiperkefajok- ban, ezért Bohus Gábornak egyik legfontosabb kutatási területe az Agaricus nem- zetség vizsgálata volt. Munkáiban összesen 25 Agaricus taxont írt le, köztük 12 új fajt (VASAS és DIMA 2005). Vizsgálataink középpontjában az A. macrosporoides Bohus (BOHUS 1974) és az A. annulospecialis Bohus, Locsmándi et Vasas (BOHUS és mtsai 1999) korábban csak morfológiai bélyegek alapján leírt fajok állnak. Cé- lunk annak kiderítése volt, hogy faji rangjukat molekuláris biológiai vizsgálatok megerősítik-e. ANYAG ÉS MÓDSZER Herbáriumi anyagok A molekuláris biológiai vizsgálatra felhasznált minták a Magyar Természettudo- mányi Múzeum Növénytárának Makrogomba-gyűjteményében lévő, módosított Her- pell-féle módszerrel (BOHUS 1963, LOWY 1958, VASAS 1993), az Agaricus fajokból készített preparátumokból származtak (a gyűjtési adatokat az 1. táblázat tartalmazza). Az A. macrosporoides esetében a molekuláris biológiai vizsgálatokat, a Babos Margit által 1974-ben a Hortobágyi Nemzeti Parkban, Nagyiván térségében levő réten gyűjtött paratípusanyagból (BP 49969) végeztük. Az A. annulospecialis esetében két anyagot vizsgáltunk meg. Az egyik az 1998- ban Gyula közelében, a Mályvádi-erdő (Körös–Maros Nemzeti Park) lomberdejé- ben (Acer campestre, A. tataricum, Fraxinus angustifolia, Quercus robur) Vasas Gizella és Locsmándi Csaba által gyűjtött típusanyagból (BP 92518), míg a másik a 2003-ban, ugyanarról a területről (megközelítően 6,5 km-re a típus gyűjtési he- lyétől), Nagy István gyűjtötte paratípusból (BP 97333) származik. Mikol. Közlem., Clusiana 48(1), 2009 Két Agaricus faj összehasonlító morfológiai és molekuláris biológiai vizsgálata 71 1. táblázat. A vizsgálatba bevont minták herbáriumi adatai (BG = Bohus G., BM = Babos M., BP = MTM Növénytár, HNP = Hortobágyi Nemzeti Park, KMNP = Körös–Maros Nemzeti Park, LCs = Locsmándi Cs., NI = Nagy I., VG = Vasas G.). Table 1. Collection data of the specimens involved in the present study (BG = Bohus, G.; BM = Babos, M.; BP = Hungarian Natural History Museum, Department of Botany; HNP = Hortobágy National Park; KMNP = Körös–Maros National Park; LCs = Locsmándi, Cs.; NI = Nagy, I.; VG = Vasas, G.). Herbáriumi szám Határozott fajnév Gyűjtés ideje Gyűjtés helye Leg. / Det. BP 49969 A. macrosporoides 1974.06.24. HNP, Nagyiván BM / BG BP 92518 A. annulospecialis 1998.04.27. KMNP, Gyula VG, LCs / (Mályvádi-erdő) BG, VG, LCs BP 97333 A. annulospecialis 2003.05.03. KMNP, Gyula (Körös-erdő) NI Morfológiai vizsgálatok Az Agaricus fajok meghatározását CAPPELLI (1984), MOSER (1983) és BOHUS (1995), a nómenklatúrai revíziót KNUDSEN és VESTERHOLT (2008), illetve PARRA (2008) alapján végeztük. Molekuláris vizsgálatok A DNS kinyerése és felszaporítása során GARDES és mtsai (1991) eljárását kö- vettük, kisebb módosításokkal (KOVÁCS és mtsai 2001, JAKUCS és mtsai 2005). A DNS kinyerését minden esetben a termőrétegből végeztük, ügyelve, hogy steril eszközeinkkel minél kisebb méretű, tehát a lehető legkevesebb esetleges szennye- ződést tartalmazó darabokat válasszunk le a herbáriumi anyagokból. A DNS kivonását megelőzően a mintákat legalább egy napon át CTAB-puffer- ben áztattuk, majd kloroformos feltárást végeztünk. A további vizsgálatokhoz a ribo- szomális génkomplex (rDNS) ITS-régióját amplifikáltuk az ITS1f–ITS4 primerpár alkalmazásával (GARDES és BRUNS 1993, WHITE és mtsai 1990). A reakciókörül- mények megegyeztek a JAKUCS és mtsai (2005) vizsgálataiban alkalmazottakkal. A direkt szekvenálást megelőzően a nagy mennyiségben felszaporított DNS-ter- mékeket PCR Clean Up-M Kit (Viogene) segítségével tisztítottuk (követve a termék- leírásban szereplő instrukciókat). A ciklikus szekvenálási reakciót az ABI PRISM 3.1 BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems) felhasználásával végeztük, a gyár- tó utasításai szerint. Az elektroforetikus elválasztást a Szegedi Biológiai Kutatóin- tézet szolgáltató laboratóriumában végeztettük el. A kiválasztott génszakaszok szek- venálását a PCR-hez használt primerekkel, mindkét irányban elvégeztük. Az elekt- roforegramokat a Staden programcsomag (STADEN és mtsai 2000) Pregap4 és Gap4 nevű programjaival értékeltük ki. A filogenetikai vizsgálatokhoz a saját mintáink szekvenciáihoz hasonló szekven- ciákat a GenBank molekuláris adatbázisból BLAST-algoritmussal (ALTSCHUL és mtsai 1990) kerestük ki. A törzsfák gyökereztetéséhez külcsoportul egy Chlorophyl- lum faj ITS-szekvenciáját választottuk. A szekvenciák illesztéséhez a ClustalX programot használtuk (THOMPSON és mtsai 1997). A filogenetikai rekonstrukciókat a Neighbour-joining (NJ) és a maximá- lis parszimónia (MP) módszereivel, és Bayes-i filogenetikával (Bayes-módszer) egyaránt elvégeztük. Az NJ és az MP vizsgálatokat a PAUP* 4.0 beta programmal