Détection Et Culture Des Archaea Associées Aux Muqueuses
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AIX-MARSEILLE UNIVERSITE FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE DE DOCTORAT Présentée par Saber KHELAIFIA En vue de l'obtention du grade de Docteur de l'Université Aix-Marseille Spécialité: Maladies Transmissibles et Pathologies Tropicales Détection et culture des archaea associées aux muqueuses intestinale et orale humaines Soutenue le 07 Juin 2013 COMPOSITION DU JURY Mr le Professeur Jean-Louis Mège Président du jury Mr le Docteur Bruno Franzetti Rapporteur Mr le Professeur Max Maurin Rapporteur Mr le Professeur Michel Drancourt Directeur de thèse Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes, UMR CNRS6236 Prof – Didier Raoult 2013 Avant propos Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation de la spécialité Maladies Infectieuses et Microbiologie du Master des Sciences de la Vie et de la Santé qui dépend de l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie de Marseille. Le candidat est amené à respecter des règles qui lui sont imposées et qui comportent un format de thèse utilisé dans le Nord de l’Europe et qui permet un meilleur rangement que les thèses traditionnelles. Par ailleurs, la partie introduction et bibliographie est remplacée par une revue publiée dans un journal scientifique afin de permettre une évaluation extérieure de la qualité de la revue et de permettre à l’étudiant de commencer le plus tôt possible une bibliographie exhaustive sur le domaine de cette thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée sur article publié, accepté ou soumis associé d’un bref commentaire donnant le sens général du travail. Cette forme de présentation a paru plus en adéquation avec les exigences de la compétition internationale et permet de se concentrer sur des travaux qui bénéficieront d’une diffusion internationale. Prof. Didier Raoult Sommaire Résumé ...........................................................................................................................…..p.01 Abstract ...........................................................................................................................….p.05 Introduction .........................................................................................................................p.08 Chapitre.1: Methanogenic archaea in subgingival sites: a review…...........................…....p.13 Chapitre.2: Susceptibility of Archaea to antimicrobial agents: applications to clinical microbiology...............................................................................................................……...p.26 Chapitre.3: A semi-automated protocol for Archaea DNA extraction from stools……….p.36 Chapitre.4: Real-time PCR quantification of Methanobrevibacter oralis in periodontitis.............................................................................................................................p.5 Chapitre.5: Tungsten-enhanced growth of Methanosphaera stadtmanae….…….....……..p.63 Chapitre.6: A versatile medium for cultivating methanogenic archaea…...........................p.69 Chapitre.7: Culturomics reveals hidden intestinal archaea........................................……..p.76 Chapitre.8: Imidazole derivatives hydrophobicity correlates with improved activity against human methanogenic archaea ……………...…………………………………………........p.89 Chapitre.9: In-vitro archaeacidal activity of biocides against human-associated archaea...................................................................................................................................p.95 Conclusion et perspectives.................................................................................................p.101 Références ..................................................................................................................…....p.104 _________________________________________________________________________________________________________Résumé Résumé Les archaea constituent l’un des quatre domaines connus du vivant. Contrairement à ce que leur nom laisse supposer, elles ont colonisé tous les écosystèmes et les microbiotes de certains hôtes dont l’Homme. Chez l’homme, certaines espèces d’archaea méthanogènes ont été associées aux muqueuses orale, intestinale et vaginale. Ces archaea méthanogènes sont des procaryotes anaérobies stricts et leurs conditions de culture restent fastidieuses et très mal connues. Quatre archaea methanogènes seulement ont été isolées à partir de prélèvements humains y compris dans le microbiote digestif Methanobrevibacter smithii détectée dans 95,7% des individus, Methanosphaera stadtmanae retrouvée chez environ un tiers des individus et plus récemment dans notre laboratoire Methanomassilicoccus luminyensis détectée en moyenne chez 4% des individus avec une prévalence liée à l'âge ; et dans le microbiote orale Methanobrevibacter oralis isolée à partir de la plaque dentaire. Après l’isolement de M. luminyensis, nous nous sommes intéressés à l’importance des éléments nutritifs et des facteurs de croissance dans la culture des archaea méthanogènes de l’homme et notre travail de these a porté sur les techniques d’isolement et de culture de ces microorganismes fastidieux, et leur sensibilité aux biocides et aux agents antimicrobiens. Nous avons testé l’effet d’une solution de tungstate/sélénate sur une culture de M. stadtmanae qui présente un métabolisme similaire à celui de M. luminyensis. Toutes les deux produisent du méthane en réduisant le méthanol en présence d’hydrogène comme donneur d’électrons. Dans ces conditions, nous avons observé une accélération de la vitesse de croissance de M. stadtmanae par un facteur 3. Les observations citées précédemment nous ont incités à nous intéresser à l’optimisation d’un milieu de culture polyvalent avec pour objectif de cultiver toutes les archaea méthanogènes de l’Homme en utilisant un seul milieu. Les résultats obtenus ont 1 _________________________________________________________________________________________________________Résumé montré que non seulement il était possible d’utiliser un seul milieu de culture polyvalent pour cultiver toutes les archaea méthanogènes de l’Homme mais que ce milieu améliorait la croissance de toutes les souches testées en réduisant leur temps de génération. En outre, basée sur la détection moléculaire par PCR, d’autres espèces d’archaea ont été détectées chez l’Homme. Methanobrevibacter arboriphilicus et Methanosaeta concilii ont été détectées dans des biopsies de la muqueuse intestinale en association avec certaines archaea halophiles, mais aucune souche n’a été cultivée. Les connaissances actuelles sur la diversité des archaea méthanogènes associées à l’homme et le rôle potentiel qu’elles ont sur la santé humaine restent limitées aux seules informations apportées par les techniques de détection moléculaire par PCR. Ces techniques fondées sur la détection de l’ADN ribosomal 16S et du gène mcrA codant la sous-unité alpha du methyl-coenzyme M reductase, ont montré que M. smithii colonisait le tube digestif de 95,7% des individus et M. stadtmanae de 29,4 % des individus. Ces techniques ne reflètent pas la diversité des archaea qui colonisent le tube digestif et la cavité buccale, suggérant ainsi la mise au point de nouvelles méthodes de détection moléculaire et de culture adaptées aux caractéristiques des parois de ces organismes fastidieux. Dans ce travail, nous nous sommes fixés comme objectif de mettre au point une méthode de détection moléculaire basée sur l’extraction et la détection par PCR de l’ADN ribosomal 16S à partir des selles en prenant comme témoin d’extraction M. smithii présente chez tous les individus. Ce protocole nous a permis d’obtenir des résultats comparables à ceux déjà publiés en termes de prévalence mais aussi il nous a permis d’augmenter considérablement le rendement d'extraction de l'ADN d’archaea à partir des selles humaines et de diminuer la charge de travail. En utilisant ce protocole et moyennant une approche moléculaire basée sur une PCR universelle ciblant l’ADN ribosomal 16S, le séquençage et le clonage, nous avons également détecté Methanobrevibacter arboriphilicus, 2 _________________________________________________________________________________________________________Résumé Methanobrevibacter oralis et Methanobrevibacter millerae pour la première fois dans des selles humaines. Nous avons procédé par la suite à l’isolement de ces souches par les techniques d’anaérobie mises au point par Hungate en 1969 sous une atmosphère composée de 80% H2 et 20% CO2 nécessaire à la croissance des archaea méthanogènes. Ce travail a permis d’élargir de trois à sept le nombre des archaea cultivées du tube digestif humain. Concernant la muqueuse orale, les archaea méthanogènes ont été impliquées dans la parodontite depuis plus de deux décennies et M. oralis est considérée comme l'archaea méthanogène dominante au cours de cette infection. Cependant, les études antérieures n’avaient pas quantifié avec précision M. oralis dans les poches parodontales et la corrélation de M. oralis avec la sévérité de la parodontite n’était pas démontrée. Dans cette étude, nous avons cherché à corréler la sévérité de la parodontite avec la charge de M. oralis quantifiée par PCR en temps réel dans des prélèvements de plaques sous-gingivale de patients atteints de parodontites et de sujets sains avec la sévérité de la parodontite. Les résultats obtenus indiquent qu'il est possible de mesurer la charge de M. oralis dans la plaque sous-gingivale à l'aide de PCR en temps réel et de corréler cette