Mechanism-Specific Toxicity Bioassays for Water Quality Assessment and Effect-Directed Analysis” Supervisor: Prof
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Mechanism-specific toxicity bioassays for water quality assessment and effect-directed analysis Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von MSc Carolina Di Paolo aus São Paulo, Brasilien Berichter: Universitätsprofessor Dr. Henner Hollert Privatdozent Dr. Werner Brack Professor Dr. Frederic Silvestre Tag der mündlichen Prüfung: 20.Oktober.2016 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Universitätsbibliothek online verfügbar. Nothing is softer or more flexible than water, yet nothing can resist it (Lao Tzu) Even small fish are fish (Czech Proverb) i ii Summary Biological assays have been applied to investigate freshwater quality for more than a century, and the public awareness of the threats of aquatic pollution has motivated advances in water quality regulations. In Europe, such a scenario led to the establishment of the Water Framework Directive (WFD) as a unified and harmonised framework for water protection, with the main objective to achieve a good water ecological and chemical status. Despite the recognized relevance of bioassays by scientists and national authorities, until now they are not recommended for direct application in the WFD monitoring activities. A reason for that is that there are remaining research questions that need further clarification before bioassays are integrated in water quality monitoring. The EDA-EMERGE Marie Curie Initial Training Network, in which context the present thesis was developed, was set up to investigate and answer some of these questions. The project aimed at the assessment, monitoring and management of water quality in European river basins through different approaches, including the investigation and development of new effect-directed analysis (EDA) methods for the identification of toxicants in surface waters. For that, new bioanalytical, chemical and hyphenated methods were developed. In this thesis, mechanism-specific bioassays were newly developed, advanced or adapted for the assessment of emerging pollutants or water samples, and as guiding tools in EDA investigations. The research questions guiding this thesis were: (i) How can mechanism-specific bioassays adequately be integrated into EDA?; (ii) How to advance aquatic relevant mechanism-specific bioassays?; (iii) Are mechanism-specific bioassays able to properly evaluate emerging pollutants as single compounds and as mixtures?; and (iv) How to efficiently apply bioassay battery approaches and what are their benefits for the water quality assessment? In order to answer these questions, the overall objectives of this thesis were: (1) To adapt bioassay protocols and develop respective testing strategies for application as guiding tools in EDA studies; (2) To develop aquatic relevant mechanism-specific bioassays utilizing zebrafish early life stages and zebrafish liver cell lines; (3) To evaluate the effects of emerging pollutants as single chemicals and as mixtures on aquatic organisms and in vitro bioassays; and (4) To apply and evaluate bioassays and bioassay battery approaches to investigate water sample extracts and emerging aquatic pollutants. These objectives were explored in complementary studies focusing on bioassay development and adaptation, followed by the application of bioassays to evaluate diverse aquatic pollutants and water samples, and iii ultimately leading to a comprehensive multi-organism and multi-mechanism aquatic toxicity assessment approach. In parallel, other activities were developed in the context of the project, including an intensive training in EDA-related methods and a joint monitoring study for evaluating water samples from different European river basins in bioassays and chemicals analysis. Initially, a literature review provided an overview of EDA investigations that applied bioassays with zebrafish as guiding tools, with mechanism-specific bioassays being identified as particularly useful for EDA investigations. Subsequently, mechanism-specific assays with zebrafish models were developed in the context of this thesis. One study focused on the development of a new method to evaluate chronic, delayed toxicity using zebrafish early life stages, which also identified early endpoints that can potentially predict later effects. Another study developed protocols to evaluate micronucleus occurrence in a zebrafish liver cell line and zebrafish larvae as a robust genotoxicity endpoint, and applied the methods to investigate genotoxic compounds. Further, the effects of neuroactive and neurotoxic compounds on the behavioural response of zebrafish larvae following a light-dark transition stimulus were also investigated. Additionally, antiandrogenicity and the induction of the p53 protein pathway were assessed by using respective reporter gene cell-based assays. A testing strategy utilizing the p53 assay and a bioassay for cell viability assessment was applied to investigate genotoxic compounds as single exposures and mixtures. Antiandrogenicity assessment of surface water samples identified a particularly active sample, which was selected for a follow-up EDA investigation. Since only a limited sample volume was left, downscaled methods of dosing and exposure procedures had to be developed and validated using model (anti)androgenic compounds. Afterwards, the developed tools were applied in the EDA study. Finally, an interlaboratory study involving different collaborating partners was organized within this PhD project. A basic bioassay battery containing organism-level and in vitro mechanism-specific assays was applied to investigate a pristine water extract spiked with emerging pollutants as single chemicals or mixtures. This study is expected to support and promote the use of a basic bioassay battery for water quality monitoring. In summary, this thesis developed new and improved existing bioassays and bioassay testing strategies for future mechanism-specific toxicity investigations of aquatic emerging pollutants, chemical mixtures or water samples; or as guiding tools in effect-directed analysis. iv Zusammenfassung Biologische Tests werden seit mehr als hundert Jahre angewandt, um die Wasserqualität zu untersuchen, und das öffentliche Bewusstsein für die Gefahren durch Wasserverschmutzungen hat Fortschritte in der Trinkwasserverordnung herbeigeführt. In Europa kam es so zu Etablierung der Wasserrahmenrichtlinie (WRRL) als gemeinsamer Rahmen für den Gewässerschutz mit dem Ziel, einen guten ökologischen und chemischen Zustand zu erreichen. Trotz der anerkannten Bedeutung von Biotests durch Wissenschaftler und nationalen Behörden, werden sie bis heute nicht in den WRRL Überwachungsmaßnahmen für die direkte Anwendung empfohlen. Ein Grund dafür ist, dass offene Forschungsfragen bestehen, die zuerst einer Klärungen bedürfen, bevor Biotests in die Überwachung der Wasserqualität integriert werden können. Die EDA-EMERGE Marie Curie Initial Training Network, in dessen Zusammenhang diese Arbeit entstanden ist, wurde gegründet, um einige dieser Fragen zu untersuchen und zu beantworten. Das Projekt war ausgerichtet auf die Bewertung, Überwachung und das Management der Wasserqualität in europäischen Flussgebieten, und schloss die Untersuchung und Entwicklung von neuen, Wirkungsorientierten Analyse (Effect-Directed Analysis - EDA) Methoden mit ein, zur Identifizierung von Schadstoffen in Oberflächengewässern. Dafür wurden neue bio- und chemisch-analytische und kombiniert-analytische („hyphenated“) Methoden entwickelt. Mit dieser Arbeit wurden Mechanismus-spezifische Biotests verbessert, neu entwickelt oder angepasst für die Bewertung von neuartigen Schadstoffe und Wasserproben, auch als Leitinstrumente für EDA-Untersuchungen. Diese Doktorarbeit wurde von den folgenden Forschungsfragen geleitet: (i) Wie können Mechanismus-spezifische Biotests angemessen in eine EDA integriert werden?; (ii) Wie können aquatisch relevante, Mechanismus-spezifische Biotests weiterentwickelt werden?; (iii) Sind die Mechanismus-spezifischen Biotests in der Lage, neuartige Schadstoffe als Einzelverbindungen und als Mischungen angemessen zu bewerten?; und (iv) wie kann man Biotest-Batterien am effizientesten einsetzen und welche die Vorteile haben sie für die Wasserqualitätsbeurteilung? Um diese Fragen zu beantworten, ergaben sich für dieser Arbeit die folgenden übergeordneten Zielstellungen: (1) Anpassung von Biotest-Protokollen und Entwicklung entsprechende Teststrategien für die Anwendung in EDA-Studien; (2) Entwicklung von aquatisch relevanten Mechanismus-spezifischen Biotests mit frühen Lebensstadien des Zebrabärblings und mit Zebrabärblings-Leberzelllinien; (3) Bewertung der v Schadstoffwirkungen von neuartigen Schadstoffen, als einzelne Chemikalien und in Mischungen, auf Wasserorganismen und in den in-vitro-Biotests; und (4) Anwendung und Bewertung von Biotests und Biotest Batterien für die Untersuchung von Wasserprobenextrakte und neuartige Wasserschadstoffen. Diese Ziele wurden anhand von komplementären Studien zu Biotest-Entwicklung und Anpassung verfolgt, anschließend mit Anwendungsstudien für die Biotests zur Bewertung diverser Wasserschadstoffen und Wasserproben untermauert, was schließlich zu einem umfassenden Multi-Organismus und Multi-Mechanismus Bewertungskonzept für aquatische Toxizität führte. Parallel dazu wurden im Rahmen des Projekts andere Aktivitäten durchgeführt, darunter ein intensive Fortbildungen und eine gemeinsame Monitoringstudie zur