Corrigiendo Tesis Doctorado Paloma Casas Junco

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO Instituto Tecnológico de Tepic

EFECTO DE PLASMA FRÍO EN LA REDUCCIÓN DE OCRATOXINA A EN CAFÉ DE NAYARIT (MÉXICO)

TESIS

Por: MCA. PALOMA PATRICIA CASAS JUNCO

DOCTORADO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS

Director: Dra. Montserrat Calderón Santoyo

Co - director: Dr. Juan Arturo Ragazzo Sánchez

Tepic, Nayarit Febrero 2018

RESUMEN Casas-Junco, Paloma Patricia. DCA. Instituto Tecnológico de Tepic. Febrero de 2018. Efecto de plasma frío en la reducción de ocratoxina A en café de Nayarit (México). Directora: Montserrat Calderón Santoyo. La ocratoxina A (OTA) se considera uno de los principales problemas emergentes en la industria del café, dado que el proceso de tostado no asegura su destrucción total. El objetivo de este estudio fue identificar las especies fúngicas productoras de OTA en café tostado de Nayarit, así como evaluar el efecto de plasma frío en la inhibición de esporas de hongos micotoxigénicos, detoxificación de OTA, así como en algunos parámetros de calidad del café. Se aislaron e identificaron hongos micotoxigénicos mediante claves dicotómicas, después se analizó la producción de OTA y aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG2, AFG1) por HPLC con detector de fluorescencia. Las cepas productoras de toxinas se identificaron por PCR utilizando los primers ITS1 e ITS4. Después se aplicó plasma frío en muestras de café tostado inoculadas con hongos micotoxigénicos (A. westerdijikiae, A. steynii, A. niger y A. versicolor) a diferentes tiempos 0, 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 min, con una potencia de entrada 30 W y un voltaje de salida de 850 voltios y helio publicitario (1.5 L/min). El café tostado fue contaminado artificialmente con hongos micotoxigénicos (1x105 esporas/g) a 27 ºC (21 días). Las muestras fueron tratadas con plasma frío a las mismas condiciones, pero a 0, 1, 4, 8, 12, 16, 20, 24 y 30 min. OTA fue cuantificada por HPLC acoplado a MS. Se realizaron pruebas de toxicidad mediante el bioensayo de Artemia salina. Finalmente se investigó actividad antioxidante, polifenoles solubles totales, perfil aromático y características sensoriales en muestras de café tratadas con plasma frío. Se detectó producción de OTA en las cepas R16, 6N y 11 con una concentración en µg/kg de micelio de 0.33, 1.16 y 0.36, respectivamente. Estas fueron identificadas como A. niger, A. versicolor y Byssochlamys spectabilis. La tecnología emergente de plasma frío mostró una disminución de 4 log en 6 min en los hongos micotoxigénicos. Referente a la detoxificación de OTA, en los tratamientos aplicados por 30 min, se obtuvieron reducciones aprox. del 50 %. Esto se pueda atribuir a las diferentes especies reactivas formadas + + − − + durante el proceso de plasma como son iones (H3O , O , O , OH , N2 ), especies moleculares (O3, H2O2), radicales reactivos (O•, OH•, NO•) e irradiación UV. Mediante análisis por HPLC-MS se determinó que OTA da origen a dos fragmentos principales, el anillo de isocumarina clorada y el grupo amino de la molécula L - b fenilalanina. El café tostado sin tratar se determinó como “tóxico”, mientras que la toxicidad para el café tratado con plasma frío se redujo a “ligeramente tóxico”. El perfil aromático de café tratado con plasma no presentó diferencias significativas (p < 0.05) respecto al café sin tratamiento. De acuerdo a la evaluación sensorial los panelistas calificaron “me gusta moderadamente” en los parámetros de olor, color, sabor y aceptación general, para ambos tratamientos con y sin plasma, sin haber diferencia significativa entre ambos (p<0.05). La diferencia de color ∆E determinada entre café tratado con plasma frío y sin tratar, fue inferior a 1, por lo que es difícilmente perceptible por el ojo humano. En cuanto a los fenoles solubles totales, se determinó una reducción del 12 %, mientras en la actividad antioxidante hubo aumento del 14 %. Por lo tanto, se concluye que el plasma frío es un método prometedor para la destrucción de hongos micotoxigénicos y para la degradación de OTA en café tostado, por lo que podría ser útil en la cadena de procesamiento de este producto alimenticio. Palabras claves: Café tostado, Aspergillus, OTA, plasma frío, Artemia salina.

CONTENIDO

LISTA DE CUADROS ...... v LISTA DE FIGURAS ...... vii INTRODUCCIÓN ...... 1 CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES ...... 4 1.1 Fruto de café (Coffea arábica L.) ...... 4 1.2 Composición química del café en grano ...... 4 1.3 Micotoxinas ...... 5 1.3.1 Los factores que influyen en el crecimiento fúngico y la producción de micotoxinas ...... 6 1.4 Hongos productores de ocratoxina A (OTA) ...... 7 1.5 Ocratoxinas ...... 12 1.5.1 Ocratoxina A (OTA) ...... 13 1.5.2 Propiedades fisicoquímicas de OTA ...... 15 1.5.3 Toxicocinética de la OTA ...... 16 1.5.3.1 Absorción y distribución ...... 16 1.5.3.2 Metabolismo ...... 17 1.5.3.3 Eliminación ...... 17 1.5.4 Toxicodinámica: mecanismo de acción ...... 20 1.5.5 Toxicidad ...... 21 1.5.5.1 Toxicidad aguda ...... 22 1.5.5.2 Toxicidad crónica ...... 23 1.6 Métodos de análisis para la determinación de ocratoxina (OTA) ...... 24 1.7 Plasma frío ...... 27 1.7.1 Reactor de plasma ...... 29 1.8 Mecanismo de inhibición de la tecnología emergente plasma frío ...... 30

1.9 Efecto de plasma en micotoxinas ...... 31 CAPÍTULO 2. JUSTIFICACIÓN ...... 34 CAPÍTULO 3. HIPÓTESIS ...... 36 CAPÍTULO 4. OBJETIVOS ...... 38 4.1 Objetivo general ...... 38 4.2 Objetivos específicos ...... 38 CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 41 5.1 Metodología ...... 41 5.2 Diseño estadístico y experimental ...... 43 5.3 Materia prima ...... 44

5.4 Actividad de agua (aw) ...... 44 5.5 Aislamiento e identificación de hongos relacionados con muestras de café tostado en grano y café molido...... 44 5.6 Identificación de hongos ...... 45 5.7 Determinación de ocratoxina A (OTA) y aflatoxinas totales (AFLA) en hongos micotoxigenéticos ...... 47 5.7.1 Extracción y purificación de ocratoxina A (OTA) y aflatoxinas totales (AFLA) ...... 47 5.7.2 Método de cuantificación de ocratoxina A (OTA) y aflatoxinas totales por HPLC ...... 47 5.7.3 Curva de calibración para la cuantificación de OTA y AFLA ...... 48 5.8 Análisis molecular ...... 48 5.8.1 Identificación de género y especie de cepas ...... 48 5.9 Contaminación de café tostado (Coffea arábica L.) con hongos micotoxigénicos ...... 51 5.10 Contaminación de café tostado (Coffea arábica L.) con OTA ...... 53 5.11 Método de cuantificación de OTA por HPLC –MS ...... 54 5.11.1 Solución de trabajo estándar ...... 54

iii

5.11.2 Fase móvil LC ...... 54 5.11.3 Curva de calibración ...... 54 5.11.4 Extracción de OTA de café tostado ...... 55 5.11.5 Determinación de OTA ...... 56 5.12 Determinación de humedad en café (pérdida de peso) ...... 56

5.13 Actividad de agua (aw) ...... 57 5.14 Color ...... 57 5.15 Evaluación sensorial ...... 58 5.16 Evaluación de actividad antioxidante ...... 58 5.17 Determinación de fenoles totales ...... 59 5.17.1 Extracción acuosa orgánica de polifenoles ...... 59 5.17.2 Análisis cuantitativo de polifenoles extraíbles ...... 59 5.18 Determinación del perfil aromático de café tostado ...... 60 5.19 Identificación de los compuestos aromáticos de café tostado ...... 62 CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSÍON ...... 64 6.1.- Determinación de hongos potencialmente micotoxigénicos en café (Coffea arábica L.) de Nayarit ...... 64 6.1.1 Introducción al tema ...... 64 6.2 Detoxificación de ocratoxina A e inhibición de hongos micotoxigénicos en café tostado a través de plasma frío ...... 91 6.2.1 Introducción al tema ...... 91 6.3 Propiedades fisicoquímicas y compuestos antioxidantes en café tostado (Coffea arábica L.) tratados con tecnología de plasma frío ...... 118 6.3.1 Introducción al tema ...... 118 CAPÍTULO 7.- CONCLUSIONES ...... 152 CAPÍTULO 8. BIBLIOGRAFÍA ...... 156

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1.1 Principales especies productoras de micotoxinas de mayor interés. 5 Cuadro 1.2 Métodos analíticos utilizados para detectar micotoxinas. 26 Cuadro 5.1 Diseño experimental. 43 Cuadro 5.2 Condiciones de la reacción para la amplificación por el método 1 en 50 la prueba de PCR. Cuadro 5.3 Condiciones de la reacción para la amplificación por el método 2 en 50 la prueba de PCR. Cuadro 5.4 Condiciones de operación del cromatógrafo de gases acoplado a un 61 espectro de masas para la determinación del perfil aromático de café tostado y análisis del coeficiente de actividad.

Cuadro 6.1.1 Relationship between levels of contamination of aflatoxin B1 73

(AFB1), aflatoxin B2 (AFB2), aflatoxin G2 (AFG2), aflatoxin G1 (AFG1) and ochratoxin A (OTA) and toxigenic filamentous fungi in roasted coffee beans.

Cuadro 6.1.2 Sequence homology of toxigenic fungi isolated from coffee (Coffea 76 arabica L.), according to N.C.B.I. (National Center for Biotechnology Information).

Cuadro 6.1.3 Level of OTA production (µg/kg) for A. niger, A. versicolor and 82 Byssochlamys spectabilis.

Cuadro 6.2.1 D values for A. westerdijikiae, A. steynii, A. versicolor and A. niger 102 inhibited by cold plasma treatment (cold plasma at different exposure times, 30

W input power and an output voltage of 850 volts with Helium 1.5 LPM flow) on roasted coffee samples. Cuadro 6.2.2 Effect of cold plasma applied for different times on OTA in roasted 107 coffee Cuadro 6.2.3 Toxic activity against brine shrimp (Artemia salina) for extracts 110 from artificially inoculated coffee and cold plasma (30 min, 30 V, Helium 1.5 LPM) treated and untreated. Cuadro 6.3.1 Surface color values of roasted coffee treated with cold plasma 132

Cuadro 6.3.2 Identified aroma compounds in roasted coffee 133

Cuadro 6.3.3 Total phenolic concentration (TPS) (mg GAE/g DW) and ABTS 137 value (mmol TAE/g DW of the roasted coffe after the cold plasma treatment.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Ocratoxina A y sus análogos. 12 Figura 1.2 Estructura molecular de ocratoxina A. 13 Figura 1.3 Metabolismo de ocratoxina A. 20 Figura 1.4 Representación esquemática del sistema de generación del plasma 29 frío. Figura 5.1 Diagrama del desarrollo general del proyecto. 42 Figura 6.1.1 Amplification of ITS1-5.8S-ITS2 rDNA region from mycotoxigenic 75 fungi isolated from roasted coffee from Nayarit, Mexico. A) Molecular weight marker, 1KB plus DNA ladder (Invitrogen)., B) A. niger., C) A. versicolor., D) Molecular weight marker, 1KB plus DNA ladder (Invitrogen)., E) Byssochlamys spectabilis. Figura 6.1.2 Mycotoxigenic fungi isolated from roasted coffee. 1) A.niger 80 colonies on CYA, 2) A.versicolor on CYA, 3) Byssochlamys spectabilis on CYA. A) macroscopic morphology, B) optical microscopic 40x. Figura 6.1.3 LC – MS chromatograms – (a) standard solution (OTA 0.021 82 µg/ml), roasted coffee sample contaminated with: (b) A. niger, (c) A. versicolor, (d) Byssochlamys spectabilis. Figura 6.2.1 Logarithmic survival curves of A. westerdijikiae, A. steynii, A. 101 versicolor and A. niger spores on roasted coffee samples by using cold plasma at different time with 30 W input power and an output voltage of 850 volts with He-air mixture 1.5 LPM flow. Figura 6.3.1 Sensory evaluation of coffee roasted (cold plasma treatment and 128

vii

untreated) on a 9-point hedonic scale (1=dislike extremely, 2=dislike very much, 3=dislike moderately,4=dislike slightly, 5=neither like nor dislike, 6=like slightly, 7=like moderately, 8=like very much, 9=like extremely). Figura 6.3.2 The aroma compounds detected in untreated roasted coffee and cold 133 plasma treated samples during 30 min.

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INTRODUCCIÓN

El café tostado arábica es considerado una de las principales bebidas consumidas en el mundo (Bokhari, 2007). México ocupa el 9° lugar en producción mundial de café cereza (FAOSTAT, 2014). Sin embargo, el café por ser un producto tropical es susceptible al crecimiento de hongos micotoxigénicos esto debido a las condiciones de humedad óptimas para el crecimiento de estos hongos (Paterson y cols., 2014; Mantle y cols., 2000). Actualmente la contaminación de Ocratoxina A (OTA) se consideran uno de los principales problemas emergentes en la industria del café (Paterson y cols., 2014).

La OTA es un metabolito fúngico tóxico clasificado por el Centro Internacional de Investigación contra el Cáncer (CIIC) como posible carcinógeno humano. Producido principalmente por Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius y Penicillum verrucosum, así como por Aspergillus niger pero con una menor producción [(JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 2002)]. La Unión Europea (UE) estableció que el límite máximo admisible de OTA presente en café tostado en grano y café molido es de 5 µg/kg y en café soluble (café instantáneo) 10 µg/kg (Comisiones de regulación (CE) 2006, 2010).

Recientemente se han realizado estudios en todo el mundo con respecto al café. Robledo y cols. (2002) identificaron micotoxinas (OTA) en café verde del estado de Nayarit, analizando 21 municipios, de los cuales un 67 % mostraron contaminación por OTA en café verde, con un promedio de 30.1 µg/kg. En Brasil, Leoni y cols. (2000) encontraron OTA en 16 muestras de cafés instantáneos en niveles que oscilan entre 0.5 y 5.1 µg/kg.

INTRODUCCIÓN

Más recientemente en Japón, Aoyama y cols. (2010) encontraron OTA en 90 % de 63 muestras analizadas en el período de 2004/07, en niveles que van de 0.1 a 4.23 µg/kg. Cabe señalar que en el proceso de tostado del café no se asegura la total destrucción de esta toxina, habiéndose incluso demostrado que en café verde sometido a un tratamiento térmico de 200 ºC durante 20 min, no se consigue reducir una concentración inicial de 114 µg/kg de OTA en más de un 12 % (Tsubouchi y cols., 1987; Carrillo, 2003). Estas micotoxinas presentan gran afinidad con las proteínas plasmáticas, lo que les permite asegurar su persistencia en el organismo (López de Ceraín, 2000).

Una alternativa para la detoxificación de OTA en café podría ser la aplicación de plasma frío, éste consiste en especies activas antimicrobianas que son producidas al aplicar gas al sistema, como consecuencias de esto se puede causar la destrucción microbiana debido a una fotodisociación de oxígeno molecular, ozono, oxígeno atómico, así como otros radicales de óxido, que puede tomar papel importante en la destrucción de microorganismos (Marsili y cols., 2002).

Es por esto que resulta de gran interés evaluar la detoxificación de hongos micotoxigénicos en café, con plasma frío, así mismo determinar el efecto de este tratamiento en los parámetros como perfil aromático, actividad antioxidante y análisis organoléptico en café tostado (Coffea arábica L.). Con la generación de esta información se podrá sugerir su aplicación en la industria con la finalidad de que el café pueda ser comercializado nacional e internacionalmente brindando seguridad al consumidor.

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

1.1 Fruto de café (Coffea arábica L.) El café se define como la semilla seca de la planta del café sin importar que haya sido tostada o molida. El café pertenece a la familia Rubiaceae; existen más de treinta especies, de las cuales las más importantes son: la arábica, la canephora y la libérica (Pérez y cols., 2011).

El fruto es a menudo llamado cereza, consta de una serie de capas que envuelven generalmente dos granos de café. Está conformado por capas externas las cuales son: cáscaras, pulpa, mucilago, pergamino, cutícula (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación SAGARPA) (PC-010-2004) (Pérez y cols., 2011).

El cafeto es uno de los principales productos agrícolas de más peso en el comercio. En producción mundial México ocupa el 9° lugar con 253,800 toneladas de producción anual (FAOSTAT, 2014). A nivel nacional cabe resaltar que el estado Nayarit ocupada el 7° lugar con 24, 634, 91 toneladas de producción (SIAP, 2016).

1.2 Composición química del café en grano El café verde sin procesar contiene agua, proteínas, cafeína, lípidos, diversos carbohidratos y ácidos (principalmente solubles y no volátiles), trigonelina y minerales. El café tostado contiene azúcares reductores, azúcares caramelizados, hemicelulosas, fibra, proteínas, ácidos no volátiles (caféico, clorogénico, cítrico, málico, oxálico, quínico y tartárico), cafeína, lípidos, trigonelina, y sus cenizas están constituidas, principalmente por potasio, fósforo y magnesio (Cinza Borrelli y cols., 2002; Badui, 1993).

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

1.3 Micotoxinas Las micotoxinas son estructuralmente un grupo diverso de compuestos de bajo peso molecular, producido por metabolismo secundario de algunos hongos filamentosos, o mohos, que, en condiciones de temperatura y humedad adecuadas, se pueden desarrollar en diversos alimentos y ocasionar graves riesgos para los humanos y la salud animal (Zain, 2011). A continuación se muestran (cuadro 1.1) las principales micotoxinas y especies fúngicas que son capaces de producirlas.

Cuadro 1.1.- Principales especies productoras de las micotoxinas de mayor interés. Micotoxinas Especies productoras Aflatoxinas Género Aspergillus: A. arachidicola, A. bombycis, A. flavus, A. minisclerotigenes, A. nomius, A. parasiticus, A. parvisclerotigenus, A. pseudotomarii, A. rambellii, A. toxicarius, A. ochraceoroseus. Género Emericella: E. astellata, E. venezuelensis. Ocratoxina A Género Aspergillus: A. carbonarius, A. cretensis, A. flocculosus, A. fresenii, A. mellus, A. niger, A. ochraceus, A. ostianus, A. persii, A. petrakii, A. pseudoelegans, A. roseoglobulosos, A. sclerotiorum, A. steynii, A. sulphureus, A. terreus, A. westerdijkiae. Género Penicillium: P. nordicum, P. verrucosum. Otros: Neopetromyces muricatus, petromyces alliaceus. Patulina Género Aspergillus: A. clavatus, A. giganteus, A. terreus. Género Byssochlamycs: B. fulva, B. nivea. Género Paecilomyces: P. variotii. Género Penicllium: P. carneum, P. claverigeru, P. concentricum, P. coprobium, P. dipodomycola, P. expansum, P. formosanum, P. gladioli, P. glandicola, P. griseofulvum, P. marium, P. paneum, P. sclerotigenum, P. vulpinum. Zeralenona GéneroFusarium: F. culmorum, F. graminearum, F. semitectuum. Fumonisinas Género Fusarium: F. nygamai, F. proliferatum, F. verticilliodes.

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

Género Alternaría: A. alternata f.sp. lycopersici. Deoxinivalenol Género Fusarium: F. culmorum, F. graminearum (=Gibberella zeae). Toxinas T-2 y HT- 2 Género Fusarium: F. acuminatum, F. equiseti, F. equiseti, F. langsethide, F. poae, F. sporotrichioides. FUENTE: (Girona, 2012).

Cabe señalar que no todas las cepas de una especie fúngica son capaces de producir micotoxinas y la proporción de cepas toxigénicas y atoxigénicas en la naturaleza es variable, lo que es aprovechado en ocasiones, en determinadas estrategias de control biológico. Una cepa potencialmente micotoxigénica puede no producir la toxina si las condiciones ecofisiológicas (temperatura, actividad de agua y pH, entre otras) que le rodean no son adecuadas. Sin embargo, una misma cepa fúngica puede producir diferentes micotoxinas. Así mismo una micotoxina determinada puede ser producida por diversas especies de mohos, incluso de géneros diferentes (Girona, 2012).

1.3.1 Los factores que influyen en el crecimiento fúngico y la producción de micotoxinas Entre los hongos filamentosos inicialmente presentes en un alimento, sólo una determinada fracción de los mismos altera típicamente el alimento y produce en el mismo, determinadas micotoxinas. Esa fracción es la denominada “asociación microbiana alterante”. Varios son los factores que determinan el desarrollo de esta microbiota determinada:

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

1) Factores intrínsecos, relacionados con la composición química y las propiedades físicas o biológicas del propio alimento. Este apartado incluye, entre otros, la composición del alimento, así como la actividad de agua y pH. 2) Factores extrínsecos o propios del ambiente, en donde se conserva el alimento. Están integrados principalmente por la temperatura de almacenamiento, humedad ambiental, tensión de oxígeno y presencia o ausencia de luz. 3) Factores tecnológicos, relacionados con los factores a los que ha estado sometido el producto. Estos tratamientos pueden ser físicos, químicos y biológicos. Sobre todo, los primeros, relacionados con los tratamientos a altas temperaturas, pueden tener efectos letales directos sobre muchos hongos filamentosos, pero en muchos casos tienen efecto leve sobre las micotoxinas. 4) Factores implícitos, referentes a las relaciones de dependencia o competencia entre los diferentes microorganismos que se encuentren en un alimento (Girona, 2012).

Todos estos factores pueden ejercer una presión sobre el desarrollo de los mohos micotoxigénicos, y por tanto, sobre la producción de micotoxinas (Sanchis y cols., 2007).

1.4 Hongos productores de ocratoxina A (OTA) La OTA es una toxina nefrotóxica y mutagénica producida principalmente por A. ochraceus, A. westerdijikiae, A. niger y A. carbonarius, en el café (Joosten y cols., 2001; Noonim y cols., 2008; Taniwaki y cols., 2003).

Taniwaki y cols. (2003) analizaron cerezas y granos en diferentes etapas: cerezas inmaduras y cerezas maduras de los árboles, cerezas muy maduras caídas en el suelo,

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

granos durante el secado y almacenamiento en la granja. De los cuales se identificaron más de 800 aislamientos de especies fúngicas como A. niger (63 % de los aislados) de las cuales el 3 % produjo OTA, A. ochraceus (31 % de los aislados) con un 75 % de los aislamientos con capacidad de producir OTA, A. carbonarius (6 % de los aislados) de los cuales el 77 % produjo OTA. La concentración promedio de OTA de 135 muestras de cerezas inmaduras, cerezas maduras, cerezas demasiadas maduras caídas de los árboles, patio de secado y almacenamiento fue de 0.1, < 0.2, 1.6, 2.1 y 3.3 µg/kg, respectivamente. Aunque el nivel de OTA es variado, sólo 9 de 135 muestras analizadas superó el 5 µg/kg de OTA (límite máximo admisible por la UE), que corresponde a una muestra de café seco de mala calidad con 100 µg/kg de OTA. Iamanaka y cols. (2014) analizaron la microbiota de café Arábica y de café Robusta demostrando una correlación positiva entre la presencia de defectos y el nivel de infección por hongos. En las muestras con granos defectuosos hubo un incremento de infección por hongos de 18-33 % en Arábica y 92 a 98 % en el café Robusta. Los autores también estudiaron la presencia de OTA que produjeron los hongos en estas muestras y encontraron que los granos defectuosos negros o amargos tenían la más alta infección por Aspergillus niger y Aspergillus westerdijikiae. Los granos de café negros y amargos tuvieron alto nivel de OTA, 11.3 µg/kg y 25.7 µg/kg, respectivamente (Taniwaki y cols., 2014). La causa de estos dos defectos está relacionada con el contacto amplio de estos granos de café con el suelo, lo que puede explicar la infección alta de hongos.

Bokhari (2007) analizó 48 muestras de café obtenidas en mercados locales de la ciudad saudí de Jeddah de los cuales se identificaron 46 cepas toxigénicas relacionadas a los géneros Aspergillus y Penicillium. De estas muestras ocho aislamientos de A. flavus producen aflatoxinas B1 y cuatro de A. ochraceus producen OTA. La cuantificación de las

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

aflatoxinas B1 osciló entre 2.1 y 219 µg/kg, mientras que la OTA osciló entre 3.77 y 25.9 µg/kg. Esto indica que el café más popular en Arabia Saudita, tiene un alto nivel de contaminación por toxinas cuando se almacena o se encuentra en condiciones menos higiénicas. Iamanaka y cols. (2014) investigaron la microbiota de los granos de café recolectados en diferentes etapas de la cadena de su producción, en donde encontraron 22 muestras de café infectados por hongos. Se recolectaron muestras de los árboles (cerezas maduras), desde la base, desde el patio (maduros, inmaduros y secos o cerezas muy maduras en el árbol) y las instalaciones de almacenamiento. Las muestras de café de esta región mostraron alta infección fúngica y la contaminación fue mayor que 70 % en aproximadamente 45 % de las muestras. Una gran diversidad de hongos fue aislada de todas las muestras analizadas del café y el más común fue Penicillium brevicompactum, Aspergillus sección Nigri, Penicillium sp. nov. (estrechamente relacionado con Penicillium crustosum) y Fusarium sp. Tanto P. brevicompactum como para Penicillium sp. nov. se encontraron en todas las etapas de procesamiento, incluso en las cerezas, lo que demuestra que estos hongos se encuentran naturalmente en los granos de café de la región.

Batista y cols. (2003) identificaron contaminación en granos verde de café (Coffea arábica L.) donde se encontraron especies de los géneros Aspergillus y Penicillium con un 96 y 42 %, respectivamente, de 45 muestras de 11 localidades de Brasil. Ciento ochenta muestras fueron identificadas a nivel especie como Aspergillus sección Circumdati (10 especies), Flavi (3), Nigri (3), Versicolores (4), mientras que dos fueron especies teleomórficas (Aspergillus) y ocho especies fueron aislados pertenecientes al género Penicillium. Dentro de la sección Circumdati, el 75 % de los aislados producen OTA, y todos, excepto

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

Aspergillus elegans y Aspergillus insulicola, han sido reportados como productores de OTA. Un tercio de las 18 cepas de Aspergillus flavus produce aflatoxinas B1 y B2. Ninguno de los aislamientos pertenecientes a Aspergillus sección Nigri o Penicillium produjeron OTA. De las 40 muestras de granos analizados, el 58 % estaban infectados por hongos potencialmente ocratoxigénos pero sólo el 22 % de ellos estaban contaminados con OTA en los niveles que variaron desde 0.47 hasta 4.82 ng/g, con un nivel medio de contaminación de 2.45 ng/g.

Noonim y cols (2008) evaluaron la distribución de los hongos con potencial de producir OTA en los granos de café (café Arábica y café canephora var. Robusta) de Tailandia, tanto de la región Norte (Chiang Mai) como de la región del Sur (Chumphon) de Tailandia y también evaluaron la presencia de OTA en muestras de granos de café. Donde identificaron que los granos de café Arábica mostraron un 78 % de incidencia de colonización por Aspergillus de la sección Circumdati con A. westerdijkiae y A. melleus como la especie predominante. Aspergillus spp de la sección Nigri se encontraron en el 75 % de las muestras, mientras que no se detectó A. ochraceus. En los granos de café Robusta del Sur se encontró 98 – 100 % de contaminados con A. carbonarius y A. niger. A. westerdijkiae sólo se encontró en una muestra. La diversidad de la población de hongos probablemente se correlacionó con el origen geográfico del café, cultivar el café y el método de procesamiento. Los aislamientos representativos de la sección Circumdati (52) y Nigri (82) fueron examinados por su producción de OTA mediante HPLC con detección por fluorescencia. Los resultados mostraron que el 100 % de los aislamientos produjeron OTA, A. westerdijkiae (42 aislamientos de 42), A. steynii (13/13) y A. carbonarius (35/35), en general, produjeron grandes cantidades de OTA, mientras que una cepa de A.

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

sclerotiorum produjo cantidades intermedias de OTA. Así como el 13 % de los aislados de A. niger produjeron OTA en cantidades intermedias. Los niveles de OTA en muestras de granos de café se analizaron utilizando los kits Ridascreen ® OTA ELISA. De las 64 muestras de granos de café analizadas, el 98 % estaban contaminados con OTA en niveles de 0.6 - 5.5 µg/kg (café Arábica) y 1-27 µg/kg (café Robusta). La presencia de OTA en muestras de café fueron confirmadas por LC-MS/MS tras la purificación por intercambio iónico.

En Japón, Aoyama y cols. (2010) encontraron OTA en 90 % de 63 muestras analizadas en el período de 2004/07, en niveles que van 0.1 a 4.23 µg/kg. Kawamura (2005) observó la presencia de OTA en 12 muestras de café, en niveles que van desde 0.11 hasta 4.41 µg/kg y, más recientemente Tabata y cols. (2008) detectaron la toxina OTA en 5 de 7 muestras de café soluble, en los niveles de 0.16 - 1.1 µg/kg. En Brasil, Leoni y cols. (2000) encontraron OTA en 16 muestras de cafés instantáneos en los niveles oscilan entre 0.5 y 5.1 µg/kg. Prado y cols. (2000) observaron la presencia de OTA en niveles entre 0.31 y 1.78 µg/kg en 8 de 10 muestras analizadas. de Almeida y cols. (2007) reportaron que de un total de 82 muestras analizadas, 81 (98.8 %) contenían OTA en niveles que van desde 0.17 hasta 6.29 µg/g. En un estudio canadiense de cafés instantáneos, Lombaert y cols. (2002) observaron niveles cuantificables de OTA, < 0.1 y 3.1 µg/kg, en 20 de 30 cafés instantáneos.

Estudios realizados por Robledo y cols. (2002) identificaron micotoxinas (OTA) en café verde del estado de Nayarit, analizando 21 municipios, de los cuales un 67 % mostraron contaminación por OTA en café verde, con un promedio de 30.1 µg/kg.

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1.5 Ocratoxinas Las ocratoxinas son un grupo de siete micotoxinas de las cuales la OTA es la más tóxica y, por lo tanto, es la que ha sido mejor estudiada (Morello y cols., 2007). Su estructura molecular consiste en un núcleo de isocumarina unido a una molécula de L-fenilalanina mediante un enlace amida (Fig. 2.2). De todas ellas, la más importante es la OTA (C.A. No.303-47-9), aislada por primera vez a partir de cultivos de Aspergillus ochraceus (López de Ceraín y cols., 2000).

Fig. 1.1. Ocratoxina A y sus análogos (Tuner y cols., 2009).

La OTA es una micotoxina mayoritariamente presente en las contaminaciones primarias por mohos de muchos productos vegetales y de modo particular en cereales y legumbres de regiones geográficas tanto templadas como frías y húmedas. Puede considerarse como

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una de las micotoxinas más frecuentes en la contaminación de los granos de cereales, junto a las aflatoxinas y las toxinas del género Fusarium y Alternaria. La ocratoxicosis parece ser un fenómeno mundial, aunque la magnitud de estas contaminaciones puede mostrar variaciones según países y años. Las condiciones necesarias para que los micomicetos filamentosos produzcan metabolitos tóxicos, cuando se desarrollan sobre las materias primas alimenticias, suelen ser bastante complejas. Debido a los riesgos que el consumo crónico de OTA, a través de los alimentos como constituye, representa para la salud humana, algunos países han establecido niveles máximos permisibles en alimentos. La UE ha establecido el límite máximo admisible de contaminación OTA en café tostado en granos y café tostado molido de 5 µg/kg y en café soluble (café instantáneo) de 10 µg/kg (López de Ceraín y cols., 2000; European Commission, 2006).

1.5.1 Ocratoxina A (OTA)

OTA (C20 H18 O6 NCl) es una estructura que se deriva de la familia de pentacétida de dihidrocumarina unida a-fenilalanina, L-fenilalanina-N-[(5-8-hidroxi-dihidro-cloro-3.3-3- metil-1-oxo-1 h-2-benzopireno-7-il) carbonil]-(R) - isocumarina (fig. 2.3). La ocratoxina α es producto de la hidrólisis de OTA como consecuencia de la falta de molécula fenilalanina. Su nombre deriva del hongo Aspergillus ochraceus aislado por primera vez (Marín y cols., 2013).

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Fig. 1.2. Estructura molecular OTA (Duarte y cols., 2010).

OTA es producida por hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium. Las principales especies implicadas en la producción de OTA incluye A. ochraceus, A. carbonarius, A. melleus, A. sclerotiorum, A. sulphureus, P. verrucossum, A. cretensis, A. flocculus, A. fresenii, A. mellus, A. ostions, A. persi, A. petrakii, A. pseudoelegans, A. roseoglobulosus, A. steynii, A. sulphureus, A. terrus y A. westerdijkiae. Sin embargo, A. niger y Pichia purpurescens son menos importantes productores de OTA (Benford y cols., 2001; Girona, 2012).

La OTA es un contaminante natural frecuente de muchos alimentos como los granos de cacao, granos de café, la harina de yuca, cereales, pescado, cacahuates, frutos secos, vino, huevos de aves de corral y la leche (Weidenborner, 2001). En las zonas tropicales, OTA se produce principalmente en los granos de café por A. ochraceus, A. carbonarius y A. westerdijkiae (sección Circumdati) (Nganou y cols., 2014).

Esta micotoxina ha sido clasificada como un posible carcinógeno humano (grupo 2B) por la agencia internacional de investigación en cáncer (IARC). El comité colectivo FAO/OMS expertos en aditivos de alimentos (JECFA) ha establecido la tolerancia

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provisional de la ingesta semanal (PTWI) de OTA en 100 ng/kg de peso proporcional (bw) que corresponde a aproximadamente 14 ng/kg por peso corporal/día (JECFA, 2002).

1.5.2 Propiedades fisicoquímicas de OTA La OTA es un ácido orgánico débil con un valor de pKa 7.1 y una masa molar de 403.8 g/mol. Con estructura cristalina, varía de incoloro a blanco, esta molécula posee una intensa fluorescencia verde bajo luz UV en medio ácido y fluorescencia azul en condiciones alcalinas. En pH ácido y neutro, OTA es soluble en disolventes orgánicos polares (alcoholes, cetonas, cloroformo), ligeramente soluble en agua e insoluble en éteres de petróleo e hidrocarburos saturados. Mientras que, en condiciones alcalinas, esta molécula es soluble en solución acuosa de bicarbonato de sodio y en todas las soluciones alcalinas en general. Tienen un punto de fusión alrededor de 90 ºC cuando se cristaliza. (El Khoury y Atoui, 2010).

La partícula de la OTA es altamente estable. Se ha demostrado que posee una resistencia a la acidez y altas temperaturas. Por lo tanto, una vez que se contaminan los alimentos, es muy difícil de eliminar esta partícula totalmente (El Khoury y Atoui, 2010).

En 1982, Muller demostró que la OTA sólo se degrada parcialmente a unas condiciones normales de cocción. Además, esta molécula puede resistir tres horas de alta presión de esterilización con vapor a 121º C, e incluso a 250 ºC su destrucción no es completa. La radiación gama (hasta 7.5 Mrad) de OTA en etanol no causa ninguna degradación. Sin embargo, la degradación es observada a bajo nivel de humedad, cuando OTA ha sido

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tratada con un exceso de hipoclorito de sodio (NaOCI). Además, la exposición a la luz fluorescente es un factor de degradación (El Khoury y Atoui, 2010).

1.5.3 Toxicocinética de la OTA 1.5.3.1 Absorción y distribución La mayoría de las especies animales estudiadas presentan una primera y rápida absorción de la OTA en el estómago facilitada por sus propiedades ácidas, seguida de una absorción intestinal lenta, cuando entre la sangre y la luz intestinal se da un gradiente de concentración favorable. En el caso de los rumiantes, la OTA es rápidamente hidrolizada a amina (OTα) por la población microbiana del rumen. No obstante, se ha detectado que e1 porcentaje de toxina que desde los alimentos pasa a la circulación general difiere ampliamente de unas especies a otras, y en general, los mamíferos presentan una biodisponibilidad superior al 50 % con la referida excepción de los rumiantes.

Una de las propiedades toxicocinéticas más significativas de la OTA es su alta afinidad por proteínas plasmáticas. Esta unión será determinante en la persistencia de la toxina en la sangre y por lo tanto de su toxicidad. El porcentaje de toxina unida a proteínas es muy alto en la mayoría de los casos y ello hace que en casi todas las especies estudiadas, incluido el hombre, la fracción libre sea menor del 0.2 %. También, otras proteínas presentes en plasma humano y porcino, diferentes a la albúmina, han demostrado, in vitro, cierta capacidad para unirse a la OTA con gran afinidad. En la administración por vía oral o intravenosa en peces, codorniz, ratón, rata y mono, la OTA se comporta de acuerdo con un modelo cinético bicompartimental, con la excepción del mono para la administración oral, que responde a un modelo monocompartimental (López de Ceraín y cols., 2000).

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En la mayoría de los mamíferos la acumulación de la OTA se da principalmente en el riñón, seguido de otros órganos como hígado, páncreas e intestino. Sin embargo en las aves, la toxina no presenta una acumulación importante en ningún órgano particular. Aun cuando existen resultados contradictorios al respecto, parece demostrada la transmisión de la OTA al feto a través de la placenta en cerdos y ratones.

1.5.3.2 Metabolismo Los principales metabolitos derivados de la OTA son los siguientes: el producto de su hidrólisis OTα, los derivados hidroxilados 4-OH-OTA y 10-OH-OTA, y los productos de conjugación (Fig. 2.3). De todos ellos la OTα y 4-OH-OTA son los más significativos. La población microbiana intestinal es capaz de metabolizar la OTA hasta OTα y fenilalanina principalmente por la actividad de la enzima carboxipeptidasa A. Los principales metabolitos hepáticos parecen ser los epímeros (4R y 4S)-OH-OTA en cuya formación está implicado el sistema citocromo P450. Se ha demostrado que en la formación de estos metabolitos, principalmente el epímero R y en menor medida el S, participan las isoformas de P450 1A1/1A2, 2B1 y 3A1/3A2. El otro metabolito hidroxilado, la 10-OH- OTA, solamente ha sido descrito in vitro después de la incubación de la OTA con microsomas de hígado de conejo (López de Ceraín y cols., 2000).

1.5.3.3 Eliminación El aclaramiento de la micotoxina por filtración renal está supeditado al valor de las respectivas constantes de unión con macromoléculas específicas, por lo que se favorece la eliminación por otras rutas en casi todas las especies. Tanto en los peces como en la codorniz, donde el aclaramiento renal supone únicamente el 4 y 0.3 % del aclaramiento

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total, respectivamente, el sistema de excreción hepatobiliar es más importante que el urinario. Por este motivo, estas dos especies presentan un aclaramiento plasmático de OTA superior a las otras especies estudiadas y por consiguiente su permanencia sanguínea tiene una vida media menor. Para la administración intravenosa de 50 ng OTA/g pc en peces, codorniz, ratón, rata y mono se han obtenido vidas medias de 8.3, 12, 48, 170 y 840 h, respectivamente.

Para comprobar la importancia de la unión de la OTA a proteínas en la eliminación de la misma, se ha llevado a cabo un estudio con ratas normales frente a ratas deficientes en albúmina, y se ha observado que la concentración de OTA en la orina y bilis de ratas carentes de albúmina es 20-70 veces mayor que en ratas normales. También se ha estudiado la eliminación de la OTA a través de otras vías como la leche, habiéndose encontrado niveles bajos de OTA en leche de vacas, conejos, cabras y cerdos. Se ha comprobado que los metabolitos OTα y OH-OTA desaparecen más rápidamente que su precursor. Así, en un estudio realizado con ratas, se puso de manifiesto que tanto la OTA como la OTα se eliminan principalmente por la orina mientras que para la OH-OTA tiene lugar por la vía biliar. Las vidas medias para estos tres compuestos fueron 3, 9, y 6 h, respectivamente (López de Ceraín y cols., 2000).

Se desconocen los parámetros cinéticos de la OTA en humanos, pero si se asume la hipótesis de que el hombre presenta una biodisponibilidad en torno al 90 % y habiéndose comprobado, in vitro, una gran capacidad de unión de la toxina a proteínas plasmáticas humanas, únicamente se puede deducir que la vida media plasmática de la OTA será muy

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elevada, lo cual supone evidentemente un riesgo mayor para la salud (López de Ceraín y cols., 2000).

En cuanto a su eliminación, la excreción renal parece ser el principal mecanismo, condicionado como ya se ha indicado por la unión de la OTA a proteínas plasmáticas. Se ha comprobado sin embargo mediante el análisis de muestras de leche humana en diversos estudios realizados en Suecia, Sierra Leona e Italia, que la eliminación de la OTA también se da por esta vía en una pequeña medida. Debido a que la leche materna es el primer y único alimento de los niños, podría suponer un peligro para lactantes pudiendo incluso superar en algunos casos los niveles máximos tolerados (López de Ceraín y cols., 2000).

La OTA se absorbe en el tracto gastrointestinal y pasa a la circulación sistémica, detectándose en sangre y tejidos. Las concentraciones más altas se detectan en los órganos de mayor actividad metabólica como riñón, hígado, músculo y grasa (Martínez y cols., 2003). Durante su distribución, la OTA tiene una alta capacidad de fijación a las proteínas plasmáticas, y presenta una vida media de eliminación larga, con valores en el cerdo de 72-120 horas y en el hombre 840 horas (35 días), siendo la fracción libre de toxina < 0.2 % (Studer y cols., 2000; López de Ceraín y cols., 2000). Tanto la OTA como sus metabolitos se excretan por vía renal y hepatobiliar. También se han observado niveles de OTA en las secreciones lácteas (López de Ceraín y cols., 2007) lo cual constituye un riesgo para el recién nacido afectándolo de manera directa en su crecimiento y desarrollo (Breitholtz y cols., 1993; Gareis, 1998). Un caso excepcional es el de los rumiantes ya que la OTA no es excretada por vía láctea debido a su previa degradación por acción de la microbiota del rumen (Creppy, 2002).

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El metabolismo de OTA genera derivados hidroxilados (4-OH-OTA y 10-OH-OTA) y productos de conjugación con glutatión (Fig. 2.4). La OTA puede actuar como sustrato de la enzima fenilalanina hidroxilasa dando lugar como producto final a la Tyr-OTA que es metabolizada a 4R/S-hidroxitirosin-OTA y otros metabolitos (López de Ceraín y cols., 2002).

Fig. 1.3 Metabolismo de OTA.

1.5.4 Toxicodinámica: mecanismo de acción Los principales mecanismos de acción de la OTA mediante los cuales ejerce su toxicidad son:

Alteración sobre la respiración celular: La OTA actúa inhibiendo competitivamente la actividad de la ATPasa, la succinato deshidrogenasa y el citocromo C oxidasa lo que

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genera efectos similares a los producidos en una lesión celular, obteniendo como productos finales radicales hidroxilados por peroxidación lipídica (Abreu y cols., 2011).

Alteración de la síntesis de proteínas: Este mecanismo se produce a nivel post- transcripcional por inhibición competitiva de la Phe-ARNt sintetasa. Estudios in vitro con células renales demuestran un efecto inductor de la OTA sobre la caspasa y la proteína kinasa que inducen la alteración de la síntesis de ADN con sus consiguientes lesiones (Abreu y cols., 2011).

Secuestro de calcio microsomal: este mecanismo constituye una reacción temprana y ligada al fenómeno de peroxidación lipídica. Diversos estudios tanto in vitro como in vivo demuestran que la OTA produce una inhibición en el bombeo y captación del calcio a través del retículo endoplasmático del hepatocito. Experimentalmente, se ha demostrado que los niveles de calcio descienden entre un 43.5 % (al tratar ratas con 10 mg/kg p.c) y un 80 % (al tratar con 10 M de OTA en un cultivo de microsomas hepáticos de rata) (Abreu y cols., 2011).

1.5.5 Toxicidad La OTA es nefrotóxica, inmunosupresora, genotóxica, carcinógena, teratogénica y neurotóxica. Respecto a la actividad carcinogénica, la Agencia Internacional de Investigación contra el Cáncer (IARC) ha clasificado a esta micotoxina en la categoría 2B, es decir, como posible carcinógeno humano.

Esta micotoxina se absorbe rápidamente en el tracto gastrointestinal en cantidades apreciables y se eliminan lentamente. Los datos de disponibilidad varían desde el 40 % en

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gallinas hasta el 66 % en cerdos, tras su administración por vía oral. Después de una única dosis oral de OTA, se ha observado que la máxima concentración de esta toxina en suero puede darse en tiempos tan cortos como 20 min (gallinas), pasando por 1h (conejos), 2- 4 h (rumiantes), 4 – 10 h (ratas) hasta 10 h (cerdos) (Aish y cols., 2004).

La máxima absorción de la OTA es aun objeto de controversia, algunos estudios sugieren que se da una mayor absorción a través de la mucosa gástrica, ya que el bajo pH del estómago favorece que la toxina se encuentre en su forma no ionizada y, por lo tanto, sea más liposoluble. Sin embargo, otros autores indican que es el intestino el lugar de máxima absorción, especialmente el yeyuno.

La OTA presenta una alta afinidad por las proteínas plasmáticas y no se encuentran como toxina libre en el plasma (menor del 0.02 % en humanos). El hecho de que la toxina quede ligada a la albumina sanguínea y a otras moléculas provoca que exista una reserva móvil de OTA que puede liberarse hacia los tejidos durante un largo periodo. Se excreta por heces y por orina.

1.5.5.1 Toxicidad aguda Dosis elevadas y únicas de la toxina pueden dar lugar a una intoxicación aguda cuyos principales signos clínicos son anorexia, pérdida de peso, poliuria, polidipsia, hemorragias digestivas y deshidratación, que provocan la muerte pocas semanas después de la administración (López de Ceraín y cols., 2000).

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Los estudios de toxicidad aguda causada por la OTA ofrecen valores de DL50 muy variables, que dependen de la especie animal y de la vía de administración de la toxina.

Así, los perros y los cerdos parecen ser muy sensibles, con DL50 por vía oral de 0.2 y 1.0 mg/kg de peso corporal, respectivamente. En el caso de pollos la DL50 es de 3.3 mg/kg, en ratas recién nacidas es de 3.9 mg/kg, y en ratas y ratones adultos aumenta a 20 – 58 mg/kg. Estos valores son inferiores si su administración es intraperitoneal o intravenosa (Girona, 2012).

1.5.5.2 Toxicidad crónica Los efectos crónicos de la OTA son más preocupantes. En animales se ha comprobado que la ingesta prolongada de OTA produce una nefropatía ligada a la degeneración de los túbulos contorneados de las nefronas y una fibrosis intersticial renal, seguida por una disminución del grosor de la membrana basal y una hialinización de los glomérulos renales. Las lesiones renales observadas en aves, cerdos y roedores son muy parecidas entre si (López de Ceraín y cols., 2000).

En el caso del ser humano, la OTA se ha relacionado con Nefropatia Endémica de los Balcanes (NEB). Los síntomas externos de NEB suelen ser anemia, proteinuria, amarilleamiento de la piel, dolor de cabeza, anorexia y uremia. Los síntomas patológicos se caracterizan por una nefropatía túbulo – intersticial progresiva que deriva en una atrofia tubular y fibrosis periglomerular, a menudo acompañada de tumores malignos muy agresivos del tracto urinario superior, una marcada reducción del tamaño del riñón y ciertos cambios en el córtex renal como fibrosis intersticial, hialinización glomerular,

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degeneración del epitelio tubular y pérdida del borde en cepillo del tubo renal (López de Ceraín y cols., 2000).

1.6 Métodos de análisis para la determinación de ocratoxina (OTA) Los métodos más comúnmente utilizados para detectar la presencia de OTA a partir de un extracto de una muestra son las técnicas de cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), LC/espectroscopia de masas, ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) y reacción de cadena de la polimerasa a tiempo real (PCR).

La TLC es un método que utiliza un adsorbente de gel sílice y un sistema de disolvente ácido. El TLC consiste en una detección visual de OTA por su fluorescencia verdosa bajo luz ultravioleta de onda larga, cambia de color azul después de pulverizar la placa cromatográfica con una solución de bicarbonato de sodio metanólico o la exposición a vapores de amoniaco; análisis densitométrico también puede llevarse a cabo (el Khoury y Atoui, 2010).

El análisis por medio de HPLC es el método moderno para identificación de micotoxinas empleando varios adsorbentes dependiendo de la estructura física y química de la micotoxina. Se utiliza columnas de fase inversa para la separación y purificación de las toxinas, dependiendo de la polaridad. La detección más comúnmente encontrada es el detector UV o de fluorescencia, dependen de la presencia de un cromóforo en las moléculas. Un número de toxinas ya tienen fluorescencia natural (por ejemplo: OTA,

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AFT, citrinina) y pueden ser detectadas directamente por cromatografía líquida de alta resolución con detector de fluorescencia (HPLC-FD) (Turner y cols., 2009).

En el caso de la determinación de OTA, la cromatografía líquida de alta eficacia con detección fluorimétrica ha sido el método más utilizado en los últimos diez años. Para la detección de OTA generalmente se utilizan columnas de fase reversa. Debido a las características ligeramente ácidas de la OTA, la fase móvil empleada en el HPLC de fase reversa debe ser ácida para evitar una adsorción inespecífica o metanol con ácido acético diluido o ácido fosfórico. La utilización del acetonitrilo es más frecuente, debido a que las mezclas de éste con agua tienen una menor viscosidad y mejor eficacia en la separación que las mezclas de metanol con agua. De forma general se utiliza una elución isocrática y las longitudes de onda de excitación y emisión son de 330 nm y 460 nm, respectivamente. La confirmación se realiza mediante derivatización de la OTA en su metil-éster tras un tratamiento con trifluoroboro al 14 % en metanol o bien mediante técnicas ELISA (Martínez, 2003).

La cromatografía de gases no es un método empleado en la detección de OTA, ya que ésta no es volátil. Sin embargo, a veces es utilizado como detector derivatización de OTA con el fin de obtener material volátil y confirmar resultados positivos (Turner y cols., 2009; Martínez, 2003).

En el caso de las técnicas moleculares, están proporcionando nuevas herramientas esto debido a que la comparación de la secuencia del ADN genómico se utiliza para identificarlas especies de los hongos responsables de la síntesis de cDNA de las

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micotoxinas. El enfoque de cDNA puede ser utilizado para determinar el gen que expresa los grupos de genes para la biosíntesis de las micotoxinas específicas por ejemplo OTA, aflatoxina, patulina (Rai y cols., 2012).

En el siguiente cuadro (1.2) se muestran las ventajas y desventajas de algunos métodos analíticos utilizados para detectar micotoxinas.

Cuadro 1.2.- Métodos analíticos utilizados para detectar micotoxinas. Técnica analítica Ventajas Desventajas Cromatografía de capa Sencillo Baja sensibilidad (para fina (TLC) Bajo costo de operación algunas micotoxinas) Rápida detección Requiere grandes cantidades (ocratoxina y aflatoxinas) de disolventes Análisis simultáneo de El procedimientos es múltiples micotoxinas intensivo Se caracteriza por falta de automatización Cromatografía líquida de Buena sensibilidad Instrumentación costosa alta resolución (HPLC) Buena selectividad Personal especializado Puede ser automatizado Requiere derivatización (pre- Corto tiempo de análisis columna o postcolumna) Método oficial disponible

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LC/ espectroscopía de Buena sensibilidad Alto costo de equipo masas Alta precisión Personal especializado Análisis simultaneo de Curva de calibración asistida múltiples micotoxinas por matriz (para análisis Proporciona confirmación cualitativo) No requiere derivatización requisitos complejos de (pre-columna o laboratorio postcolumna) limitaciones en el tipo de disolventes utilizados en la extracción y la separación Reacción de cadena de la Buena sensibilidad Tiempo de análisis largo polimerasa a tiempo real Preciso Error durante el proceso de (PCR) Alto rendimiento reacción de cadena polimerasa sin cuidado adecuado

Ensayo por Fácil de usar Problema de interface matrix inmunoabsorción ligado a Equipos de bajo costo Semi-cuantitativa (evaluación enzimas (ELISA) Se puede analizar hasta 90 visible) muestras en cada kit de Resultados dudosos ELISA en 45 minutos Reactividad cruzada con Análisis simultáneo de micotoxinas relacionadas múltiples micotoxinas Un factor clave es la No requiere ningún especificidad del anticuerpo procedimiento de limpieza Fuente: Kaushik y cols. (2013); Turner y cols. (2009).

1.7 Plasma frío El término de plasma se introdujo en 1928 por Irving Langmuir como un gas ionizado (Langmuir, 1928). A través de una fuente de energía aplicada, las moléculas de gas se

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excitan por lo tanto se ionizan o se disocian por colisiones de electrones formando plasma (Ben Gadri y cols., 2000).

El plasma es el cuarto estado de la materia y se define como un gas neutro ionizado, puede ser generado por la aplicación de un campo eléctrico inicialmente de un gas eléctricamente neutro (Gaunt y cols., 2006; Wan y cols., 2009). El plasma está formado por especies eléctricamente activa incluyendo fotones, electrones, iones positivos y negativos, radicales libres, moléculas excitadas o moléculas no excitadas y átomos (Deng y cols., 2006; Laroussi, 2005; Moisan y cols., 2002). Así como también diferentes sustancias antimicrobianas incluyendo fotones UV, partículas cargadas, especies reactivas como superóxido, radicales hidroxilo, óxido nítrico y ozono (Daeschlein y cols., 2010; Deng y cols., 2006; Gaunt y cols., 2006; Laroussi y Leipold, 2004). Las propiedades del plasma, tales como la densidad de las partículas cargadas (densidad de cargas negativas y positivas son iguales) y sus energías, dependen de la potencia aplicada, tipo de poder (por ejemplo pulso de frecuencia) tipo de gas, etc. (Bardos y Baránková., 2010).

Cabe mencionar que el plasma frío es nueva tecnología que se lleva a cabo a temperatura por debajo de 33 ± 3 ºC y a tiempos cortos de esterilización, es rápida, efectiva y rentable (Wintenberg y cols., 1999; Laroussi y cols., 2000; Purevdorj y cols; 2002; Feichtingery cols; 2003; Moreira y cols., 2004; Choi y cols., 2006). Así como también reduce el uso de gases tóxicos tanto para impactos ambientales como para riesgosa la salud, mantiene bajas temperaturas durante las operaciones. En el caso de materiales de plásticos no hay degradación de térmica (Rossi y cols., 2008).

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1.7.1 Reactor de plasma El reactor fue diseñado y construido en el laboratorio de física de plasmas en el Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares. Una representación del diagrama del sistema del equipo utilizado, se muestra en la Figura 1.4. El equipo contiene un generador de radio frecuencia de 13.56 megaciclos, que suministra directamente a las placas en paralelo del reactor (Descarga de Barrera Dieléctrica). La energía en el sistema se puede ajustar a diferentes voltajes, fue diseñado para conducir estudios en la caracterización y las interacciones de especies activas y de descargas de radiación ultravioleta hacia microorganismos y procesos de esterilización. El equipo incluye una entrada del gas y conectores con cable coaxiales con una salida a tierra.

La estructura de la Celda de Barrera Dieléctrica (BDB), está constituida por un par de electrodos horizontales de acero inoxidable de forma circular. La circular mide 80 milímetros de diámetro y aproximadamente 2 milímetros de separación entre electrodos, conteniendo un cilindro de vidrio. El electrodo inferior, se fija a la parte inferior del reactor mediante un eje, mientras que el otro, se puede ajustar por medio de un tornillo de precisión, unido a la parte superior. El eje tubular superior permite proveer de administración de gas, dirigiéndola hacia el centro del electrodo. De este modo, se alcanza una descarga simétrica y uniforme para la generación del plasma. Toda esta estructura se aísla por medio de una estructura cilíndrica larga de cuarzo de 200 milímetros con un diámetro interno de 120 milímetros (Eguiluz y cols., 2010).

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Fig. 1.4.- Representación esquemática del sistema de generación del Plasma Frío (Eguiluz y cols., 2010).

1.8 Mecanismo de inhibición de la tecnología emergente plasma frío Existen tres mecanismos involucrados en la inactivación de microorganismos por plasma frío: a) Destrucción directa por radiación UV del material genético de los microorganismos. b) Erosión de los microorganismos átomo por átomo mediante la luz UV para romper vínculos químicos en el material del microorganismo y que llevan a la formación de compuestos volátiles de los átomos intrínsecos. Los subproductos volátiles del desequilibro son pequeñas moléculas (CO y CHx). c) Erosión de los microorganismos átomo por átomo como resultado de la ionización utilizando átomos de oxígeno o radicales que emanan del plasma (Moisan y cols., 2002).

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1.9 Efecto de plasma en micotoxinas

Basaran y cols. (2008) aplicaron plasma frio con gases de aire (20 % O2 y 78 % N) y hexafluoruro de azufre (SP6) con tratamiento de 0 y 20 min en avellanas inoculadas con 106 conidio esporas de A. parasiticus y 950 ng/g de aflatoxinas. Los resultados mostraron una reducción del 50 % en el total de aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2) en muestras de gases de aire de 470 ng/g de contenido de aflatoxinas. En muestras tratadas con SP6 redujeron el 20 % obteniendo un total de 751 ng/g. En este estudio, un método de limpieza rápida, funcional para la eliminación dela producción de aflatoxina por hongo en nueces con cáscara y sin cáscara fue investigado como un método adecuado de descontaminación de hongos.

Por lo tanto, el efecto del gas con hexafluoruro de azufre (SP6) que se utilizó en la aplicación con plasma, logró reducir un valor D (tiempo necesario para inactivar el 90 % de la población microbiana en escala logarítmica) cercano a 1.1 min, mientras que con los gases del aire el valor D fue de 4.2 min. En este estudio reduce la mitad de la contaminación por aflatoxinas. SF6 es un gas inerte, incoloro, inodoro y no tóxico. Es uno de los gases aislantes más populares con rigidez dieléctrica de aproximadamente tres veces mayor que la de aire y gases utilizados mundialmente en industria de servicios eléctricos (Lee y Kim, 2007; Villa nueva, 2010).

Los gases principales de subproductos de plasma SP6 son SF4, SOF2 y SO2F2. Los átomos de flúor son las principales especies de grabado, producidos por la ionización y disociación de especies neutras de SP6 (Basaran y cols., 2008).

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

Los gases de aire contienen casi el 20 % de O2y 78 % N2. El gas de plasma que contienen oxígeno es conocido por producir especies activas anti-microbiana, fotodisociación de oxígeno molecular, tal como ozono, oxígeno atómico, así como otros radicales de óxido, que puede tomar papel importante en la destrucción de microorganismos (Marsili y cols., 2002).

Park y cols. (2007) estudiaron el efecto de microondas a presión atmosférica sobre las micotoxinas: aflatoxina B1 (AFB1), deoxinivalenol (DON) y nivalenol (NIV) las cuales fueron expuestas a 1, 3, 5 y 10 min. El sistema consistió en una fuente de alimentación de 2.45 GHz y 1 kW. Se reportó una disminución en las concentraciones de aflatoxina B1, DON y NIV. Mientras que AFB1, DON y NIV fueron eliminadas por completo después de 5s de argón plasma inducido por microondas a presión atmosférica. El sistema de plasma inducido por microondas utilizado en este estudio requiere mucho menos tiempo de exposición para la degradación de micotoxinas que otros métodos, tales como la luz visible o UV y rayos gamma. La irradiación UV y el grabado por plasma pueden ser responsables de la degradación y la eliminación de las micotoxinas. Este sistema de plasma tiene muchas ventajas, como una mayor ionización por especies reactivas y relativamente alta intensidad de la luz UV (75-102 mW/cm2), la temperatura media baja (75 a 130 °C) y una fácil operación. Estos resultados sugieren que los sistemas de plasma pueden tener potenciales fuertes para degradar las micotoxinas y puede ser usado efectivamente en el proceso de alimentos.

Ouf y cols. (2014) evaluaron fumonisina B2 (FB2) y OTA en dátiles, los cuales fueron tratados con plasma Jet con gas argón y un caudal de 1.5, 2.5, 3.5 y 4.5 L/min a los

CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

tiempos 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.5 y 9 min. En las muestras inoculadas con A. niger, el hongo se inhibió a los 9 min con 3.5 L/min, FB2, se logró reducir a los 6 min, mientras que para OTA completamente estuvo ausente a los 7.5 min, para ambos a 3.5 L min-1.

CAPÍTULO 2. JUSTIFICACIÓN

JUSTIFICACIÓN

El café es uno de los principales productos agrícolas. Su preferencia le ha otorgado el segundo lugar en la lista de los productos de mayor importancia económica a nivel mundial, ocupando México el noveno lugar en exportaciones a nivel mundial.

El café se distingue por sus constituyentes como son la cafeína, ácidos fenólicos, melanoidinas y ligninas, que en su conjunto poseen propiedades antioxidantes además del aroma y el sabor.

Sin embargo, el café es susceptible a la contaminación por hongos y por las toxinas producidas por estos organismos, esto puede ocurrir antes de la cosecha y/o durante los tratamientos posteriores. Cabe mencionar que el proceso de tostado de café no asegura una total destrucción de toxinas. Por lo tanto, debido a que el café constituye uno de los productos de mayor consumo comercial, representa una preocupación tanto para los investigadores como para los organismos responsables de velar por la salud pública.

Por consiguiente, es importante identificar genotípicamente las especies fúngicas que producen estas micotoxinas, así como aplicar métodos de control que sean eficaces, con tiempos cortos, compatibles con el medio ambiente y seguridad para el operario. La tecnología de plasma frío es una operación emergente que últimamente está tomando mucho auge debido a que es efectiva a tiempos cortos, sin afectar propiedades sensoriales y nutricionales de los productos procesados. Una alternativa para detoxificación, podría ser la aplicación de plasma frío en el procesamiento en café tostado de Nayarit.

CAPÍTULO 3. HIPÓTESIS

El tratamiento con plasma frío aplicado a muestras de café de la región de Nayarit, inhibirá hongos micotoxigénicos y permitirá la detoxificación de ocratoxina A (OTA).

CAPÍTULO 4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general Determinar el efecto de plasma frío sobre la reducción de micotoxinas en muestras de café de Nayarit, e identificar las especies fúngicas productoras de ocratoxina A (OTA)

4.2 Objetivos específicos • Aislar e identificar hongos micotoxigénicos (Aspergillus spp y Penicillium spp) a

partir de café tostado de la región de Nayarit, empleando técnicas de biología

molecular (PCR).

• Detectar la presencia de ocratoxina A (OTA) en café tostado por cromatografía

líquida acoplado a masas.

• Evaluar el efecto de la aplicación de plasma frío en la inhibición de hongos

micotoxigénicos aislados del café tostado.

• Evaluar el efecto de la aplicación de plasma frío en la detoxificación de ocratoxina

A (OTA) en muestras de café tostado.

• Evaluar la actividad antioxidante de las muestras de café tostado después del

tratamiento con plasma frío.

• Evaluar la calidad sensorial de las muestras de café tostado tratado con plasma frío

sin presencia de hongos micotoxigénicos ni ocratoxina A (OTA),

CAPÍTULO 4. OBJETIVOS

• Identificar y cuantificar el perfil aromático de muestras tratadas con plasma frío.

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Metodología Para alcanzar los objetivos planteados en el presente trabajo, la metodología fue dividida en dos partes: primeramente se realizó el aislamiento e identificación de hongos micotoxigénicos productores de OTA en el café tostado, posteriormente se investigó el efecto de la tecnología emergente de plasma frío tanto en la inhibición de hongos micotoxigénicos como en la detoxificación de OTA en café tostado, y finalmente se evaluaron los parámetros organolépticos, aromáticos y actividad antioxidante de café de Nayarit.

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

Fig. 5.1 Diagrama del desarrollo general de la investigación.

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.2 Diseño estadístico y experimental Para la realización de este proyecto se planteó un diseño unifactorial completamente aleatorizado donde el factor es el tiempo de irradiación con plasma frío y los niveles fueron 0, 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 minutos. Posteriormente los resultados obtenidos se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA) y se utilizó la prueba de LSD para comparación de medias con un nivel de significancia de α = 0.05, utilizando el paquete estadístico SAS versión 9.

Una vez obtenido el tiempo de reducción logarítmico se realizó un diseño completamente aleatorizado para las determinaciones químicas del café. Donde el factor fue el tipo de tratamiento, con dos niveles: tiempo óptimo de tratamiento con café irradiado con plasma frío y café sin irradiar. Las variables de respuesta fueron aw, humedad, actividad antioxidante, fenoles totales, perfil aromático. Los resultados obtenidos se analizarán con una prueba de t-student para comparación de medias con un nivel de significancia de α = 0.05, utilizando el paquete estadístico STATISTICA versión 8.

Cuadro 5.1.- Diseño experimental.

Tratamientos aw humedad Actividad Fenoles Perfil antioxidante totales aromático Café sin irradiar (Tmt 1) Tmt 1 Tmt 1 Tmt 1 Tmt 1 Tmt 1 Café irradiado (Tmt 2) Tmt 2 Tmt 2 Tmt 2 Tmt 2 Tmt 2

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

Para el análisis sensorial se utilizó un diseño de bloques con la participación de 40 jueces no entrenados. La prueba consistió en señalar el nivel de agrado de cada atributo (apariencia, color, sabor, olor y aceptabilidad general) mediante una escala hedónica del 1 al 9, para tratamientos de café sin irradiar y café irradiado, ambos sin micotoxinas.

5.3 Materia prima Se recolectaron 14 muestras de café tostado de marcas comerciales con presentación en polvo y grano del Estado de Nayarit. Las muestras se colocaron en bolsas plásticas con cierre hermético hasta el momento de sus análisis.

5.4 Actividad de agua (aw) La actividad de agua se determinó por medio de un higrómetro de la marca AquaLab series 3 (Decagon Devices, Inc), previamente calibrado con una solución saturada de NaCl (grado reactivo) y agua destilada.

5.5 Aislamiento e identificación de hongos relacionados con muestras de café tostado en grano y café molido. Los granos de café tostado se desinfectaron de manera superficial por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio (1 %) durante 2 min. Posteriormente se enjuagaron con agua destilada estéril, se colocaron en papel filtro para eliminar el exceso de agua. Una vez que estuvieron parcialmente secos, se colocaron en el centro de las placas con agar papa dextrosa (PDA/rosa de bengala 1/5000). Las placas se incubaron a 28 ºC durante 7 – 10 días en estufa digital Novatech E160-A10 (Bokhari, 2007).

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

Para la muestra de café molido se tomaron diez gramos de café molido y fueron transferidos a un frasco que contenía 90 mL de agua destilada estéril. Los frascos se agitaron durante 15 min. Posteriormente se realizaron diluciones aproximadas de 10-1, 10-2 y 10-3. Luego se añadió 1 mL de cada dilución a las placas agar de extracto de malta (MEA), agar Czapek con extracto de levadura (CYA), agar Czapek Dox (CDOX) y se distribuyeron homogéneamente. Las placas fueron incubadas (25 ºC/7-14 días) en estufa digital Novatech E160-A10. Se adicionó a las placas estreptomicina como antibacteriano

(300 pp) y bicarbonato de sodio (NaHCO3 0.11 M) para inhibir el crecimiento de A. niger (Depasquale y cols., 1990). Una vez aislados los hongos se procedió a observar y contabilizar el total de hongos (TFC), finalmente se purificaron las cepas desarrolladas en las placas con CYA. Se determinó el número de colonias/g y se calculó el porcentaje de cada especie fúngica con la siguiente ecuación:

Especies fúngicas % = (No. de cada especie de hongo/contenido total de hongo) x 100 (Nehad y cols., 2007).

5.6 Identificación de hongos Para la identificación de las cepas aisladas se utilizó la técnica de microcultivo, la cual consiste en cultivar la cepa del hongo en un bloque de CYA de 2 x 2 cm colocada en un portaobjeto estéril. La inoculación del hongo se realizó mediante la técnica de picadura en los márgenes del bloque de agar, se colocó sobre cada bloque de agar un cubreobjetos. Los bloques fueron soportados por una varilla de vidrio doblada en U, los cuales se colocaron dentro de cajas Petri estériles (con un algodón humedecido en la parte inferior, para proporcionar humedad al medio). Se incubó a 30 °C durante 3-5 días y se observó el crecimiento y con la ayuda de un estereoscopio (marca Wesco) se observaron

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

características macroscópicas del hongo. Posteriormente se retiró el agar del cubreobjetos con la ayuda de unas pinzas estériles y cuidando de no romper el micelio que se adhiere en el cubreobjetos. Finalmente se adicionó una gota de colorante azul de lactofenol y se observaron las estructuras miceliales de los hongos en un microscopio (marca LEICA DM500) (Ahmed y cols., 2006; Serra y cols., 2006; Antolin-Ayala y cols., 2008).

Para la identificación del género Aspergillus y Penicillium se consideraron de forma minuciosa, las siguientes características macroscópicas y microscópicas:

Las principales características macroscópicas: • Diámetro de las colonias • Coloración del anverso y del reverso de la colonia • Textura de la colonia • Presencia de surcos • Presencia de gotas de exudado • Presencia de pigmento difusible en el medio de cultivo • Presencia de esclerocios

Las principales características microscópicas: • Número de puntos ramificación presentes en los conidióforos • Longitud y textura del estipe • Número, disponibilidad, longitud y textura de las ramas (en su caso) • Número, disponibilidad, longitud y textura de las métulas (en su caso) • Número, forma, longitud y textura de las fiálides

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

• Forma, tamaño, textura y color de los esclerocios (en su caso) • Forma, tamaño, textura y color de las ascas (en su caso) • Forma, tamaño, textura y color de las ascosporas (en su caso) (Benítez, 2003; Afzal y cols., 2013).

5.7 Determinación de ocratoxina A (OTA) y aflatoxinas totales (AFLA) en hongos micotoxigenéticos

5.7.1 Extracción y purificación de ocratoxina A (OTA) y aflatoxinas totales (AFLA) Las cepas fueron aisladas en agar PDA incubadas a 25 ºC durante 10 días. Posteriormente se llevó a cabo la extracción directa a partir de 3 discos de agar tomados desde el centro de la colonia. Las cuales se colocaron en un vial y fueron pesados (g). Enseguida se agregó 2.5 mL de disolvente (metanol/ácido fórmico 25:1 v/v), se sónico durante 15 min y fue filtrado con una membrana de 0.45 µm (Mounjouenpou y cols., 2008).

5.7.2 Método de cuantificación de ocratoxina A (OTA) y aflatoxinas totales por HPLC Para la determinación de OTA y AFLA (AFLA G2, AFLA G1, AFLA B2, AFLA B1). Se utilizó un equipo de HPLC Schimadzu LC610ADVP System (Shimadzu Corporation, Japan) con un detector de fluorescencia utilizando las siguientes condiciones: volumen de inyección 100 µl, columna C18 de ODS, fase reversa, 5 µm (Supelco, Interchim, Montluçon, France) con una pre-columna, con un termostato a 40 ºC, una presión del orden 145 –165 Bar y un flujo isocrático de 1 mL/min; como fase móvil se utilizó para el solvente A: agua destilada 55 %, metanol 45 %, 119 mg/L, bromuro de potasio, 350 µl de ácido nítrico 4 M. En el solvente B: se preparó la siguiente mezcla: agua destilada 20 %,

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

metanol 80 %, 119 mg/L, bromuro de potasio, 350 µl de ácido nítrico 4 M (reactivos marca Aldrich y 99.9 % de pureza). La longitud de onda usada en el equipo para la detección de aflatoxina fue de excitación 362 nm y de emisión 425 nm adicionando bromuro. En el caso de ocratoxina la excitación fue de 333 nm y 460 emisión.

5.7.3 Curva de calibración para la cuantificación de OTA y AFLA Los resultados se calcularon con respecto a la curva de calibración y se expresaron en g/kg. Las soluciones se prepararon a partir de soluciones de concentración conocida. Para aflatoxinas 20 ng/mL y OTA 12 ng/mL .

SM: 100 µl de aflatoxinas y 60 µl de OTA en 4.840 ml de solvente MeOH/H2O

S1: 250 µl de SM + 1.750 ml de disolvente MeOH/H2O

S2: 1 ml de S1 + 1 ml de disolvente MeOH/H2O

S3: 1 ml de S2 + 1 ml de disolvente MeOH/H2O

S4: 800 µl de S3 + 1.2 ml de disolvente MeOH/H2O

5.8 Análisis molecular 5.8.1 Identificación de género y especie de cepas Las cepas fueron cultivadas en agar Czapek con extracto de levadura a 25 ºC durante 5 - 7 días. Luego del tiempo de incubación se procedió a la extracción de ADN. Se adicionó a los tubos eppendorfÒ materia fúngica (100 - 150 mg) y se re-suspendieron en buffer de lisis (500 µL), luego se adicionaron perlas de vidrio (sigma). Posteriormente se centrifugó durante 60 s a 6.0 m/s (60 segundos max velocidad fastprep). Finalmente, para la primera extracción se agregaron 5 µL de proteinasa K y se incubó a temperatura ambiente (25 ºC)

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

durante 24 horas a agitación constante. Posteriormente se agregaron 100 µl de cloruro de sodio 5M y se mezcló suavemente. En seguida se adicionaron 500 µl de fenol cloroformo. Una vez mezclado se centrifugó durante 8 minutos a 13000 rpm (4 ºC). Luego se procedió a recuperar el sobrenadante del buffer de lisis con ADN (100 – 150 µl) y se agregaron 10 µL de acetato de amonio 5M. Una vez homogenizado se adicionaron 700 µl de isopropanol. Las muestras fueron colocadas a -80 ºC durante 30 min y se centrifugaron a 14,000 rpm durante 10 min a 4 ºC. En seguida se descartó el sobrenadante teniendo cuidado que el pellet se encuentra fijo en el tubo eppendorf, se agregaron 500 µL de alcohol etílico al 70 % y se agito suavemente. Luego se descartó el sobrenadante y se dejó en evaporación en campana de flujo laminar durante aproximadamente 10 min. Después se re-suspendió el ADN en 50 µL de agua MQ. Una vez obtenido el ADN se procedió a cuantificarlo con el equipo espectrofotómetro nanoprop 1000 con 1.5 µL de muestra.

Para la identificación molecular se realizó la mezcla de los siguientes reactivos para la reacción de PCR (Polymerase chain reaction, por sus siglas en inglés) con un volumen de

22 µL establecido: 12.25 µL H2O MQ, 5 µL buffer 5X, 2 µL MgCl2 (50 mM), 1 µL Oligos (primer’s), 0.5 µL dNTP’s (10 mM),0.25 µL Taq, 1 µL muestra. Se acondicionaron en tubos de eppendorf y se mantuvieron en baño de hielo. Una vez obtenido el DNA de los hongos, se procedió a su amplificación por el método de PCR convencional o punto final de la región intergénica ITs (ITs1-5.8s-ITs-2) del DNA ribosomal, utilizando primer’s universales ITS1 e ITS 4 para hongos. Las condiciones de amplificación utilizadas por el método de PCR que se muestra en el cuadro 5.2 y 5.3. Posteriormente los productos de PCR obtenidos de los hongos fueron enviados a Genewiz Inc (USA), para la secuenciación e identificación de las especies.

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

Cuadro 5.2.- Condiciones de la reacción para la amplificación por el método 1 en la prueba de PCR.

Proceso Tiempo Temperatura Inicio 2 min 95 ºC 30 ciclos de: Desnaturalización 1 min 95 ºC Alineación 30 s 50 ºC Extensión 2 min 72 ºC Extensión final 10 min 72 ºC

Cuadro 5.3.- Condiciones de la reacción para la amplificación por el método 2 en la prueba de PCR. Proceso Tiempo Temperatura Inicio 5 min 95 ºC 30 ciclos de: Desnaturalización 1 min 95 ºC Alineación 30 s 56.5 ºC Extensión 1 min 72 ºC Extensión final 10 min 72 ºC

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

Una vez que se procedió con la amplificación de los segmentos, los productos de la PCR se analizaron mediante una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1 %, teñido con syber safe (Sigma-Aldrich), utilizando como amortiguador TAE 1X, a 60 volts durante 1 hora y media, en cámara de electroforesis (Bio-Rad). Se cargaron 3.5 µL de muestra de DNA. Las bandas fueron visualizadas mediante un transiluminador de luz UV - visible adaptado a un equipo fotodocumentador Bio - Rad Gel DocTM XR + molecular imager. Para comprobar que las bandas amplificadas correspondían a los fragmentos esperados, se utilizó 1 µL del marcador kbplus de peso molecular de 100 - 1000 pb.

5.9 Contaminación de café tostado (Coffea arábica L.) con hongos micotoxigénicos Las muestras de café tostado soluble se esterilizaron mediante calor húmedo (autoclave) a 121 ºC por 15 min a 15 libras de presión. Una vez esterilizadas se dejaron secar en una campana de flujo laminar durante 1 hora aprox. Después se llevó a cabo la preparación de esporas mediante el cultivo en agar papa dextrosa durante 5 a 7 días de incubación. Posteriormente se adicionaron 10 mL de agua estéril al medio de cultivo y se realizó un barrido con una varilla de vidrio, se filtró con una gasa estéril para retener el micelio y así obtener solamente el líquido filtrado con esporas. El contenido de esporas por mililitro de la suspensión, se determinó utilizando la cámara de Neubauer Loptik Labor y un microscopio LEICA DM500, empleando la siguiente ecuación.

!". %& &'(")*' . &'(")*' ∗ 2.5 . 104 . %56785ó: = +, !". %& 87*%)"' 8":;*%"' Donde: x = Número de esporas observadas en la cámara de Neubauer. 2.5 x 105= Volumen que ocupan los 25 cuadros en la cámara de Neubauer (mL).

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

No. de cuadros contados = número de cuadros observados en la cámara de Neubauer. Para ajustar la suspensión a la concentración deseada en esporas mL-1.

Posteriormente para ajustar las suspensiones a las concentraciones deseadas en esporas/mL (1 x 107), se realizaron diluciones con agua destilada estéril (Hernández- Montiel y cols., 2010; Nehad y cols., 2007) de acuerdo a la siguiente ecuación.

V1C1 V2 = C2

Donde: V1 = Volumen final de la solución preparada (mL). C1 = Concentración de la solución requerida (esporas o células mL-1). V2 = Volumen de la solución concentrada (madre) a partir de la cual se prepararon las soluciones de trabajo (mL). C2 = Concentración de la solución madre a partir de la cual se prepararon las soluciones de trabajo (esporas o células mL-1).

Después se inocularon 0.1 g de muestras de café tostado con 5 µL de la solución de esporas del hongo (1.5 x 107 esporas mL-1), hasta una concentración final de 5 x 105 esporas g. Una vez inoculadas, las muestras fueron expuestas a temperatura ambiente en la campana de flujo laminar durante 1 h aprox. con la finalidad de eliminar la humedad extra como resultado durante la inoculación del hongo. Posteriormente las muestras fueron expuestas a energía de plasma frío con los siguientes tiempos 0, 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14,

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

16 y 18 min, aplicando una potencia de entrada 30 W y un voltaje de salida de 850 voltios, con un flujo de gas helio publicitario (1.5 L/min).

Las muestras irradiadas se diluyeron en 1 mL de agua peptonada (0.1 %), se homogenizaron en stomacher (Model N° STO-400) por 10 segundos, después se realizaron las diluciones con agua peptonada de acuerdo a los tiempos irradiados. Al minuto cero la dilución fue 1:500, y del minuto 1 al minuto 6 la dilución fue 1:100, del minuto 8 al minuto 12 la dilución fue 1:50, y para los tiempos 14 a 18 no se realizaron diluciones adicionales. Se tomó 1 mL de la dilución y se sembró mediante la técnica de vertido en placa en Agar Papa Dextrosa (conteniendo ampicilina al 2 % y rosa de bengala al 0.6 %). Las cajas se incubaron (TERLAB Modelo MAI 60) a 30 °C/48h.

5.10 Contaminación de café tostado (Coffea arábica L.) con OTA En una caja petri se pesó 1 g de café tostado soluble, se le adicionaron 3 mL de agua desionizada y se esterilizó mediante una autoclave durante 15 min (121 ºC). Después el café se inoculó con 2 discos del cultivo de las cepas a evaluar obtenidos a partir de una colonia de 7 días, desarrollada sobre agar papa dextrosa. Este procedimiento se repitió para cada hongo, según se describe en el método recomendado por la Food and Drug Administration (FDA).

Una vez inoculados, las cajas petri se incubaron a 27ºC durante 21 días. Una vez finalizado el período de incubación, se comprobó si las cepas han produjeron la micotoxina de interés (OTA) mediante un método de análisis cromatográfico acoplado a masas que permite identificarlas simultáneamente. Como controles positivos se usaron las cepas Aspergillus steynii FM956458.1 y Aspergillus westerdijikiae KP329736.1, las

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

cuales tienen la capacidad para producir OTA.

Posteriormente las muestras fueron expuestas a energía de plasma frío a los siguientes tiempos 0, 1, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 30 min a 30 voltios, con un flujo de gas helio publicitario (1.5 L/min). Posteriormente se realizó la cuantificación de OTA por HPLC acoplado a masas mediante el método de Siato y cols. (2012) con modificaciones posteriores.

5.11 Método de cuantificación de OTA por HPLC –MS 5.11.1 Solución de trabajo estándar Se partió de una solución estándar OTA de 10 µg/mL en acetonitrilo (Sigma-Aldrich) y se realizaron diluciones con fase móvil para tener una solución madre de 21 ng/mL.

5.11.2 Fase móvil LC La fase móvil consistió en una mezcla de acetato de amonio 5 mM (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) a un caudal de 0.200 mL/min en un sistema isocrático (65:35). La fase móvil se filtró con membrana de esteres de celulosa (0.22 µm) y se desgasificó por sistema ultrasónico.

5.11.3 Curva de calibración La curva de calibración se preparó a partir de la solución madre de 21 ng/mL de OTA. Esta solución sirvió para la preparación de las soluciones de estándares (STD) 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 21.0 ng/mL.

Todas las STD fueron preparadas a partir de una dilución con los volúmenes de la fase

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

móvil (agua + acetonitrilo, 50 + 50) y a su vez estos fueron filtrados mediante filtros millex de jeringa con membrana de nylon (0.45 µm).

Las condiciones de operación cromatográfica (Agilent Tecnologies 1260) fueron las siguientes: volumen de inyección de 20 µL, flujo isocrático de 0.200 mL/min por 3 min, fase móvil 5 mM de acetato de amonio/acetonitrilo (65/35, v/v), una columna de HPLC fase reversa columna zorbax SB-C18 (2.1 X 50 mm id: 1.8 µm), calentamiento de columna a 40 ºC, una presión de bar 280.

Se prosiguió al análisis de espectrometría de masas en su modo ion positivo con ionización por electrospray (ESI +) para confirmar la identidad OTA, utilizando un cuadrupolo (Agilent Tecnologies 6120).

5.11.4 Extracción de OTA de café tostado Para la extracción de OTA se realizó mediante la técnica de Mounjouenpou y cols. (2007) donde se desarrollaron algunas modificaciones. A 0.5 g de café tostado se le adicionaron 50 mL de solución metanol grado HPLC/bicarbonato de sodio al 3 % (20/80, v/v), los cuales fueron agitados durante 50 min a 60 ºC. Enseguida de la extracción, 10 mL del extracto fueron centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos y una alícuota de 5 mL del sobrenadante del centrifugado fue diluido con 40 mL de solución tampón PBS (Solución tampón de fosfato a pH 7.3) y purificado por columna de inmunoafinidad (Ochrastar R). La recuperación de la OTA se realizó con una elución de 6 mL de metanol grado HPLC, posteriormente, el eluyente fue eliminado a sequedad utilizando un rotavapor a una temperatura de 60 ºC. Luego, para eliminar los residuos, se dejaron secando en un horno convencional (40 ºC) por 15 min. El residuo fue re-suspendido con 1 mL de la fase móvil constituida por agua y acetonitrilo (50:50) y finalmente fue cuantificado por HPLC-MS.

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.11.5 Determinación de OTA La espectrometría de masas se realizó en un cuadrupolo (agilent Tecnologies 6120) equipado con interfaz de electrospray. El análisis fue llevado a cabo en modo positivo (ESI +), utilizando un inyector automático, un termostato de columna y bomba cuaternaria de fase móvil. Las separaciones cromatográficas se realizaron con una columna zorbax SB-C18 (2.1 X 50 mm id: 1.8 µm) a 40 ºC. El volumen de inyección fue de 20 µL. Los parámetros a utilizados fueron los siguientes: gas de secado 9 I/min, presión del nebulizador 25 psi, gas de secado 350 ºC, capilar 3500, fragmentador 95 Ion SIM 404.10.

5.12 Determinación de humedad en café (pérdida de peso) Para realizar la determinación del contenido de humedad en el café tostado (como determinación de la pérdida de masa), se procedió de acuerdo a la NMX-F-139-SCFI 2004. Se colocaron 5 g de la muestra en una cápsula de acero inoxidable (previamente secada durante 24 horas a 100 °C) la cual se introdujo en una estufa a 105 °C por 4 horas. Una vez transcurrido el tiempo, se dejó enfriar en un desecador por 30 min y posteriormente se pesó y por diferencia de pesos se realizó el cálculo del porcentaje de humedad.

Los cálculos se realizarán con la siguiente fórmula:

% Humedad = +< - += *100 / +< - +>

Donde: mo: masa en gramos de la cápsula sin tapa. m1: masa, en gramos de la cápsula con tapa y la muestra antes del secado.

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

m2: masa, en gramos de la cápsula con tapa y la muestra después del secado.

5.13 Actividad de agua (aw) La actividad de agua se determinó por medio de un higrómetro de la marca AquaLab series 3 (Decagon Devices, Inc), previamente calibrado con una solución saturada de NaCl (grado reactivo) y agua destilada.

5.14 Color Se realizó en el colorímetro MINOLTA CR300, utilizando la escala de Hunter donde se obtuvieron los parámetros de L, a, b. Los datos se reportaron de la siguiente manera (www.hunterlab.com, 2017):

L* = luminosidad C* = croma (grado de saturación) C* = (* ∗)= + (B ∗)= h = ángulo de tono

E∗ h = tan CD< F∗ Para calcular la diferencia de color (∆E) se utilizó la siguiente ecuación: ∆H = (∆,)= + (∆*)= + (∆B)= Donde: L = luminosidad (0=negro, 100=blanco). a = rojo-verde (los valores positivos son rojos, los negativos son verdes y 0 es neutro). b = azul-amarillo (los valores positivos son azules, los negativos son amarillos y 0 es neutro).

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.15 Evaluación sensorial La evaluación sensorial se llevó a cabo en el laboratorio de análisis sensorial en el Laboratorio Integral de Investigación en Alimentos (LIIA), contando con la participación de 40 jueces no entrenados. Se analizaron muestras de café natural (1:4 p/v) adicionado con 5 % azúcar, tratadas con plasma frío (30 min con gas helio 1.5 L/min a 30 w de potencia de entrada y voltaje de salida de 850 voltios). La primera prueba consistió en un ensayo sensorial triangular, se presentaron tres muestras codificadas simultáneamente. Dos de ellas son idénticas entre si y una de formulación diferente. El juez identificó cuál de las tres es la muestra diferente. Posteriormente analizaron la prueba de nivel de agrado (también llamada escala hedónica), evaluando la muestra C201(tratamiento con plasma frío de barrera dieléctrica irradiada a 30 min) y la muestra C685 (sin tratamiento de plasma frío). Los panelistas calificaron los siguientes parámetros: apariencia, color, sabor, olor, aceptabilidad general. Los resultados obtenidos se analizaron con una escala hedónica estructurada del 1 al 9 (1.-me disgusta muchísimo, 2.-me disgusta mucho, 3.-me disgusta moderadamente, 4.- me disgustas un poco, 5.-Ni me gusta ni me disgusta, 6.-Me gusta un poco, 7.-Me gusta moderadamente, 8.-Me gusta mucho, 9.-Me gusta muchísimo), según su preferencia (Kumar y cols., 2012; Pedrero y Pangbron, 1989; Nava, 2012).

5.16 Evaluación de actividad antioxidante La capacidad antioxidante se determinó por el método propuesto por Re y cols. (1999), ésta se determinó en los sobrenadantes resultantes de la extracción de polifenoles, por

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

medio del método de ABTS (2,2'-azino-bis- (3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de amonio). Se preparó una solución de ABTS 7 mM a la que se le agregó el persulfato de potasio (2.42 mM) y se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 14 h. La solución se ajustó con tampón fosfato a una absorbancia de 0.700 ± 0.02. Se utilizó Trolox como estándar y metanol como blanco. Los extractos de las muestras (10 µl) se leyeron en un lector de microplaca (Biotek, Synergy HT, Winooski, VT, USA) con capacidad de 300 µL y se añadieron 280 µL del radical ABTS. Luego se incubó a 37 ºC en la oscuridad y se procedió a su lectura durante 6 min a 754 nm. Se preparó una curva de calibración usando una solución acuosa de Trolox como estándar. Los resultados fueron expresados en mmol de trolox por 100 g de muestra húmeda.

5.17 Determinación de fenoles totales

5.17.1 Extracción acuosa orgánica de polifenoles Se pesaron 0.5 g de muestra a los cuales se le adicionaron 20 mL de solución metanol acidificado (0.8 M HCl, 50:50, v/v) y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de agitación, se centrifugó a 6000 rpm (4 ºC) por 15 min para obtener el sobrenadante, al residuo restante se le añadieron 20 mL de solución acetona (70:30, v/v) y nuevamente se agitó. Se centrifugó y recolectó el sobrenadante el cual se aforó con una solución acetona (50:50, v/v) (Pérez y cols., 2008).

5.17.2 Análisis cuantitativo de polifenoles extraíbles La cuantificación de los polifenoles extraíbles se realizó de acuerdo a la técnica establecida por Montreau (1972), modificado por Mercado y cols. (2015). Se colocaron en

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

un tubo de ensayo 250 µL del extracto y se agregaron 1000 µL de solución carbonato de sódio (7.5, v/v) y 1250 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu. Posteriormente se agitó y se dejó reposar en baño maría durante 15 min. Transcurrido el tiempo, se tomó una alícuota (270 µL) y depositó en una placa de 96 pocillos para tomar la lectura en un lector de microplacas (Biotek, Synergy HT, Winooski, VT, USA) para la detección espectrofotométrica multimodo y un programa Gen5. La curva de calibración se realizó a partir de la solución patrón de ácido gálico. Los resultados se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico (mg EAG/100g bs).

5.18 Determinación del perfil aromático de café tostado Se llevó a cabo mediante la técnica de microextracción en fase sólida utilizando un cromatógrafo de gases marca Agilent Technologies 7890A acoplado a un detector de masas y un analizador de trampa de iones marca Agilent Technologies 240, utilizando una columna capilar de sílica fundida CP-Wax, con una longitud de 60 m y 0.25 µm de diámetro. El gas acarreador utilizado fue helio con un flujo de 1.6 mL/min. La temperatura del inyector fue de 250 ºC. Se empleó una fibra Divinilbenceno/carboxen/ polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) con diámetro de 50/30 µm y 2 cm de largo (Akiyama y cols., 2008).

Las condiciones de operación del cromatógrafo de gases acoplado a detector de masas con un analizador de trampa de iones (GC/MS) se muestran en el siguiente cuadro (5.4).

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

Cuadro 5.4.- Condiciones de operación del cromatógrafo de gases acoplado a un detector de masas (trampa de iones) para la determinación del perfil aromático de café tostado y análisis del coeficiente de actividad.

Temperatura Velocidad Tiempo total (ºC) (ºC/min) (Min) 50 2 2 104 0 20 220 0 88

Para el aislamiento de compuestos volátiles se utilizó el método de microextracción en fase sólida (SPME), se pesaron 0.5 g de café en polvo y se adicionó 1.6 mL de agua desionizada y 0.1 g NaCl, se incubó a 40 ºC durante 30 min con agitación constante con la finalidad de alcanzar el primer equilibrio termodinámico entre el espacio de cabeza y la muestra. Una vez transcurrido el primer tiempo de equilibrio se insertó la aguja de la jeringa SPME y se expuso la fibra en el espacio libre de cabeza dentro del vial durante 30 min (con agitación), en este tiempo se alcanzó el segundo equilibrio entre el espacio de cabeza y la fibra. Después se extrajo la fibra y se inyectó la muestra inmediatamente al cromatógrafo de gases Agilent Technologies 7890A acoplado a un detector de masas (trampa de iones), exponiendo la fibra durante 10 min. Esta técnica se llevó a cabo de acuerdo con la metodología reportada por Sánchez y cols. (2011), con algunas modificaciones.

CAPÍTULO 5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.19 Identificación de los compuestos aromáticos de café tostado La identificación de los compuestos aromáticos se realizó en un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 7890A; con la biblioteca NIST por comparación de cada espectro de masas con los espectros de compuestos auténticos o con espectros de acuerdo a la biblioteca de referencia.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSÍON

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSÍON

6.1.- Determinación de hongos potencialmente micotoxigénicos en café (Coffea arábica L.) de Nayarit

6.1.1 Introducción al tema El café es uno de las bebidas más populares del mundo y su comercialización ha crecido de manera constante. Desafortunadamente, frecuentemente presenta contaminación por hongos micotoxigénicos, principalmente de los géneros Aspergillus y Penicillium. Estos pueden estar presentes en diferentes etapas: cultivo, cosecha, procesamiento, transporte y almacenamiento. La OTA es una micotoxina que se encuentra de forma natural en diversos productos alimenticios, como café verde, café tostado y/o café instantáneo. La Agencia Internacional del Cáncer ha clasificado la OTA en el grupo 2B de sustancias, lo que significa que es posiblemente carcinógeno para el ser humano por sus propiedades carcinogénicas, mutagénicas, teratogénicas siendo específicamente nefrotóxica e inmunotóxica. De acuerdo con el reglamento de la comisión europea los niveles máximos permitidos de OTA son 5 µg/kg para granos de café tostado y café molido, y 10 µg/kg para café soluble.

Por todo lo anterior, se llevó acabo el aislamiento de cepas productoras de micotoxinas en café tostado (Coffea arabica L.) de Nayarit. La identificación preliminar de los hongos aislados se realizó mediante claves taxonómicas basadas en características macroscópicas (color, tamaño y forma) y microscópicas (morfología, tamaño de conidios y morfología de conidióforo). Después se identificaron por técnicas moleculares de PCR convencional utilizando iniciadores universales ITS1 e ITS4 para hongos. Una vez identificados los

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

hongos micotoxigénicos, se evaluó la capacidad de producir micotoxinas durante 21 días (27 ºC), se utilizo la técnica de cromatografía líquida acoplado a detector de masas

(HPLC-MS) para la identificación de OTA y en el caso de aflatoxinas (AFB1, AFB2,

AFG2, AFG1) un equipo HPLC con detector de fluorescencia.

Se aislaron e identificaron morfológicamente 22 cepas de hongos del genero Aspergillus y Penicillium. De las cuales sólo 3 cepas evidenciaron la producción de OTA. El análisis de la secuencia de la región (ITS1–5.8S-ITS2 del rDNA) demostró que las cepas aisladas y que produjeron OTA en café tostado fueron A. niger, A. versicolor y Byssochlamys spectabilis, los cuales produjeron OTA en café tostado.

Por lo tanto, este estudio sugiere la necesidad de mejorar las buenas prácticas de manufactura en toda la producción de café para prevenir o reducir la presencia de hongos toxigénicos. Además, la formación de micotoxinas implica la necesidad de desarrollar y aplicar tecnologías efectivas para la detoxificación en los productos de café.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determination of potentially mycotoxigenic fungi in coffee (Coffea arabica L.) from Nayarit

Mycotoxigenic fungi in Nayarit’s roasted coffee

ABSTRACT

A total of fourteen roasted coffee samples were collected from different local markets in Nayarit, Mexico. Twenty-two fungi isolates were related to the genera Aspergillus (54.54%) and Penicillium (4.5%). The strains R16 (0.33 g/kg), 6N (1.16 g/kg) and 11 (0.36 g/kg) tested positive for OTA (ochratoxin A) production in PDA, the other fungi samples were not toxigenic. According to the sequence analysis of their ITS1-5.8S-ITS2- rDNA region, fungi OTA producers correspond to A. niger, A. versicolor and Byssochlamys spectabilis. These three strains were able to produce OTA when inoculated in roasted coffee in concentrations ranging from 75 to 90 g/kg, after 21 days. Different production stages of roasted coffee (crop management, postharvest practices and storage) along with environmental conditions do not ensure mycotoxigenic fungi free products. This is the first report of OTA natural occurrence in roasted coffee from Nayarit.

Keywords: Roasted Coffee, Byssochlamys spectabilis, toxigenic fungi, ochratoxin A, immunoaffinity column.

Introduction Coffee is one of the most widely-consumed food products, with an important economic and cultural role. However, coffee beans, like other crops, can be contaminated by microorganisms during the different stages of growing, harvesting, processing, transport

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

and storage. Many studies have revealed that important toxigenic fungal genera (Aspergillus and Penicillium) are natural coffee contaminants [1-3]. OTA is a mycotoxin naturally found in various food products including green coffee beans, roasted coffee and instant coffee [2]. This mycotoxin produced by toxigenic fungi has been shown to exhibit hepatotoxic, nephrotoxic, teratogenic, and carcinogenic properties [4]. The International Agency for Research on Cancer (IARC) classified OTA as carcinogenic for humans (group 2B) [5, 6]. According to the European Commission Regulation [7], the maximum levels for OTA are 5 µg/kg for roasted coffee beans and ground roasted coffee, and 10 µg/kg for soluble coffee [8].

One of the main economic activities in Nayarit is coffee production. Environmental conditions such as high temperatures and humidity favor fungal development in coffee beans. De Lourdes et al. [9], reported the presence of OTA in 70% of green coffee samples with an average concentration of 30.1 µg/kg. Franco et al. [10] detected OTA from 4.90 to 37.73 µg/kg and total aflatoxins were found from 1.51 to 1.93 µg/kg. It was found that four out of the 21 samples in Panamanian exportation coffee tested positive for OTA and three tested positive for presence of total aflatoxins. These findings highlight the importance of determining the presence of potential ochratoxin and aflatoxin producing fungi in roasted coffee beans (Coffea arabica L.) from Nayarit, an important coffee producer in Mexico.

Materials and methods

Roasted Coffee

Experiments were carried out using 14 ground roasted coffee samples (Coffea arabica L.)

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

from different local markets in Nayarit, Mexico.

Identification of fungal isolates

Two methods were employed for fungal isolation. In the first method, processed coffee beans were plated directly onto filter paper moistened with sterile distilled water. The beans were collected randomly from each coffee bean sample; they were then disinfected by immersion in a 1% hypochlorite solution for 2 min (w/v). The beans were then put on the surface of potato dextrose agar (PDA) medium and Rose-Bengal (1/15000) was added as a bacteriostatic agent. Plates were incubated at 28°C for 7-10 days [11]. In the second method, ten grams of ground roasted coffee were transferred to a wide mouth reagent bottles containing 90 ml sterile distilled water. The bottles were shaken for 15 min. This gave an approximate dilution of 1/10. Sterile dilutions from 1/100 to 1/10000, were made using test tubes containing 9 ml sterilized distilled water. One ml of each selected dilution was put in a sterile petri dish and 10 ml of the medium (Czapek Yeast Extract Agar, Malt Extract Agar, Czapek Dox Agar) were poured, the plate was then gently moved for homogeneous distribution. The plates were incubated at 28ºC for 7 to 14 days. Bacterial growth was inhibited by using streptomycin (300 ppm). Sodium bicarbonate (NaHCO3) was added to 50% of the plates in order to substantially inhibit growth of A. niger [12].

Isolates were purified on Czapek Yeast Extract Agar. The fungi were allowed to grow at 25°C for 7 days, and were then pre-identified following the traditional morphological methods. Macroscopic (mycelium type, color and growth type) as well as microscopic optical characteristics (at 40x, mycelium type, conidiophores morphology and spore morphology) were considered for identification [13, 14].

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Ochratoxin and Aflatoxin production ability of the isolates

Mycotoxin production by isolated fungal strains was determined using HPLC following the methodology described by Mounjouenpou et al. [15]. After 10 days of incubation on PDA agar (25ºC), direct extraction was carried out on 3 agar discs taken from the center of the colony. Extraction was carried out in 2.5 mL of solvent (methanol/formic acid 25:1 v/v) for 15 min in an ultrasound bath.

The production of OTA was detected and quantified by reversed phase high (zorbax SB- C18 2.1 X 50 mm id: 1.8 µm) HPLC with electrospray ion (ESI) MS (Agilent Technologies), in ionization mode, positive mode capillary 3500 V, nebulizer 25 psi (nitrogen), dry gas nitrogen at 9 L/min, dry gas temperature 350ºC, fragmentor voltage 95; selected ion monitoring (SIM), m/z 404 (OTA). The mobile phase (5 mM ammonium acetate / acetonitrile, 65: 35 at 40ºC) was pumped at a rate of 0.2 mL/min. The injection volume was 20 µL and the retention time was around 4±1 min.

In all cases, aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin B2 (AFB2), aflatoxin G2 (AFG2), aflatoxin G1

(AFG1) were quantified on extracts by HPLC with fluorometric detection (Shimadzu LC- 10 ADVP, Japan) [1]. The operating conditions were as follows: 100 µL injection loop, C18 reverse phase HPLC column, ODS 5 µm (Supelco, Interchim, Montluçon, France) with an identical pre-column thermostatically controlled at 35 °C, an isocratic flow of 1 mL/min, an excitation wavelength of 362 nm and an emission wavelength of 425nm were used. Aflatoxins were carried out with potassium bromide. Contents were calculated from a calibration curve established from a standard (1 µg/mL; ref PD 226 R. Biopharm Rhône Ltd, Glasgow, UK).

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

PCR Identification

Fungi were grown in Potato Dextrose Agar at 28ºC for 5 to 7 days. DNA extraction was then performed according to the protocol proposed by Sambrook and Russell [16]. PCR was conducted using the primers ITS1 (ITS1-5, 8s-ITS-2) of ribosomal DNA using universal primers ITS1 (5’CAACTCCCAAACCCCTGTGA-3’) and ITS4 (5’- GCGACGATTACCAGTAACGA-3’) for molds [17]. Two amplifications were carried out in a Technethermocycler (iCycler Biorad, USA). Thermal cycling parameters for first amplification were: initial denaturation at 95ºC for 2 min, followed by 30 cycles of heat denaturation at 95ºC for 1 min, annealing at 50ºC for 30 s, extension at 72ºC for 2 min and final extension at 72ºC for 10 min. Thermal cycling parameters for second amplification were: initial denaturation at 95ºC for 5 min, followed by 30 cycles of heat denaturation at 95ºC for 1 min, annealing at 56.5ºC for 30 s, extension at 72ºC for 1 min and final extension at 72ºC for 10 min. PCR products from these amplifications were separated by electrophoresis on 1% (w/v) agarose gel, stained in syber safe (Sigma-Aldrich), the sample was mixed with buffer TAE 1X. A molecular marker from 100 to 1000 bp was used. Electrophoresis was performed under the following conditions: 1 h and 30 min, 60 volts and 400 mA. PCR products were visualized using a UV transilluminator (UVP BioDoc-IT Imaging System, USA). The PCR products were sent to GENEWIZ Inc. (USA), for sequencing and species identification. The results were analyzed using the BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool) of NCBI (National Center for Biotechnological Information) with the support of Codon Code Aligner 2.0 editing program sequences.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

OTA production by fungi isolates

Isolates of A. niger, A. versicolor and Byssochlamys spectabilis were grown on PDA, at 27ºC for 7 days. Secondly, deionized water (3 ml) was added to each coffee sample (1 g) and autoclaved at 121°C for 15 min. The coffee was inoculated with 2 culture discs of the strain [18]. After 21 days, OTA production was detected and quantified by HPLC system 1260 series Agilent Technologies model consisting of a quaternary pump, autosampler, a column thermostat and a Quadrupole detector (6120).

OTA production was analyzed according to Mounjouenpou et al. [19] with some modifications. Samples were extracted for 50 min (60ºC) with a solution of methanol/ 3% sodium bicarbonate (20:80), the extracts were filtered and diluted with phosphate-buffered saline and applied to an immunoaffinity column (Ochrastar R). OTA was eluted with 6 mL HPLC grade methanol. The eluate was evaporated to dryness (3 min) under an oven at 70°C, re-dissolved in 1 mL of HPLC mobile phase water/acetonitrile (50/50, v/v) and then quantified by LC-MS.

Chromatographic and spectrometric conditions

Chromatographic separation was performed on a zorbax SB-C18 (2.1 X 50 mm id: 1.8 µm) column (Agilent Technologies) using a mobile phase of 5 mM ammonium acetate/ acetonitrile (65/35, v/v) at 40ºC with a flow rate of 0.2 mL/min for 3 min run. The detection of OTA was performed in LC- MS system model 6120 series LC quadrupole equipped with an electrospray ion (ESI) MS (Agilent Technologies), in ionization mode, positive mode (capillary 3500 V, nebulizer 25 psi (nitrogen), dry gas nitrogen at 9 L/min, dry gas temperature 350ºC, fragmentor voltage 95); selected ion monitoring (SIM), m/z

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

404 (OTA) [20].

Results and Discussion

Isolation and identification of fungi

Macroscopic and microscopic presumptive identification revealed two fungal genera: Aspergillus and Penicillium. Aspergillus was predominant in roasted coffee samples with a recovery of 95.43% and Penicillium with 4.54%. From the 22 isolates, the predominant species determined by dichotomous characters were Aspergillus ochraceus (4.54%), Aspergillus carbonarius (4.54%), A. niger (27.27%), Aspergillus fumigatus (4.54%) and other Aspergillus spp. (54.54%). Aspergillus spp. propagules get on grain in different ways, most often with dust from soil, from the surface of plant remnants during harvesting, transportation, storage, and processing [21]. It has great metabolic versatility and ability to disperse conidia in the environment to such an extent that it can sustain growth even under adverse conditions such as low humidity and low water activity [22].

Table 1 shows the production of mycotoxins by isolates from roasted coffee beans inoculated in PDA. Three fungi isolates produced OTA. Strain 11 with a concentration of 0.36 µg/kg, R16 with 0.33 µg/kg and 6N with 1.16 µg/kg mycelium. No OTA or aflatoxin were detected in the rest of the isolates.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Table 1. Relationship between levels of contamination of aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin

B2 (AFB2), aflatoxin G2 (AFG2), aflatoxin G1 (AFG1) and ochratoxin A (OTA) and toxigenic filamentous fungi in roasted coffee beans.

AFG1 AFG2 AFB1 AFB2 OTA Strain (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)

A ND ND ND ND ND A-B ND ND ND ND ND 2B ND ND ND ND ND R5 ND ND ND ND ND R10 ND ND ND ND ND R11 ND ND ND ND ND R14 ND ND ND ND ND R15 ND ND ND ND ND R161 ND ND ND ND 0.33 R17 ND ND ND ND ND R18 ND ND ND ND ND 2 ND ND ND ND ND 3 ND ND ND ND ND 4 ND ND ND ND ND 5 ND ND ND ND ND 6N2 ND ND ND ND 1.162 7 ND ND ND ND ND

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8-2 ND ND ND ND ND 9 ND ND ND ND ND 10 ND ND ND ND ND 113 ND ND ND ND 0.36 V ND ND ND ND ND ND—not detectable. 1A. niger, 2Byssochlamys spectabilis, 3A. versicolor

Therefore, as was observed, the strains vary in their capacity to produce OTA, as well as in the quantity produced. This is because fungal growth occurs under favorable environmental conditions and is associated with the production of a wide range of secondary metabolites. There are more important factors that rule the growth of fungi and the production of mycotoxins such as the amount of nutrients available, the ambient temperature, water activity and available oxygen [23]. In spite of OTA being a stable metabolite, in some cases OTA content decreased considerably as incubation time increased or just at the final incubation time. Some authors have suggested that this may be due to the fact that the strains remove and assimilate the phenylalanine moiety from the OTA molecule as well as nitrogen sources in the culture media when they become exhausted [24].

Fungal growth and mycotoxin production are influenced by numerous abiotic and biotic parameters and their complex interactions. Water availability is probably the single most important factor affecting germination, growth and establishment of fungi on nutrient rich substrates. The second most important is temperature (22–30ºC) [8, 25]. It has been shown

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

that both factors influence interactions between different mycotoxigenic and non- mycotoxigenic fungi [26]. The next most important factors for mycotoxin production and mold growth are high moisture content (20–25%) and high relative humidity (70–90%) [8].

The strains that tested positive for OTA production were molecularly analyzed, the amplification of the ITS1-5.8S-ITS2 region of rDNA from the two relevant Aspergillus strains generated PCR products of 550 bp and were detected as A. niger and A. versicolor (Fig. 1).

Fig. 1

Figure 1. Amplification of ITS1-5.8S-ITS2 rDNA region from mycotoxigenic fungi isolated from roasted coffee from Nayarit, Mexico. A) Molecular weight marker, 1KB plus DNA ladder (Invitrogen)., B) A. niger., C) A. versicolor., D) Molecular weight marker, 1KB plus DNA ladder (Invitrogen)., E) Byssochlamys spectabilis.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Another PCR product of 500 bp was observed and identified as Byssochlamys spectabilis

(Fig. 1).

Sequences reported at BLAST v2.3.0 (Basic Local Alignment Search Tool http://www.ncbi.nlm. nih.gov/) at the National Center for Biotechnology Information, NCBI, USA, were used to compare the obtained sequences (Table 2).

Table 2. Sequence homology of toxigenic fungi isolated from coffee (Coffea arabica L.), according to N.C.B.I. (National Center for Biotechnology Information).

Strain Homology Sequence Access number R16 95% 1 tacgagcgcg aggtctttgg gccacctccc atccgtgtct JN226991.1 A. niger attgtaccct gttgcttcgg 61 cgggcccgcc gcttgtcggc cgccgggggg gcgcctctgc cccccgggcc cgtgcccgcc 121 ggagacccca acacgaacac tgtctgaaag cgtgcagtct gagttgattg aatgcaatca 181 gttaaaactt tcaacaatgg atctcttggt tccggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 241 cgataactaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga gtctttgaac gcacattgcg 301 ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

tgctgccctc aagcccggct 361 tgtgtgttgg gtcgccgtcc ccctctccgg ggggacgggc ccgaaaggca gcggcggcac 421 cgcgtccgat cctcgagcgt atggggcttt gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc 481 tgccgacgtt ttccaaccat tctttccagg ttgacctcgg

11 99% 1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ctgagtgcgg NR_131277.1 A. versicolor gctgcctccg ggcgcccaac 61 ctcccacccg tgactaccta acactgttgc ttcggcgggg agccctctcg ggggcgagcc 121 gccggggact actgaacttc atgcctgaga gtgatgcagt ctgagtctga atataaaatc 181 agtcaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaact 241 gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc 301 gccccctggc attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca ttgctgccca tcaagcccgg 361 cttgtgtgtt gggtcgtcgt cccccccggg ggacgggccc gaaaggcagc ggcggcaccg 421 tgtccggtcc tcgagcgtat ggggctttgt cacccgctcg atttagggcc ggccgggcgc 481 cagccgacgt ccaaccattt ttcttcaggt tgacctcgga

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

tcaggtaggg atacccgctg 541 aacttaagca tatcaataag cggaggaaaa gaaaccaacc gggattgccc c

6N 100% 1 ctgcggaagg atcattaccg agtgagggtc cctcggggcc KC157703.1 Byssochlamys caacctccca tccgtgttgt spectabilis 61 cctgacacct gttgcttcgg cgggcccgcc gtggttcacg ccccggccgc cggggggttc 121 acgcccccgg gcccgcgccc gccgaagacc cctggaacgc tgcctggaag gttgccgtct 181 gagtatacaa tcaatcaatt aaaactttca acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg 241 aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc 301 tttgaacgca cattgcgccc cctggcattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc 361 taaccctcca gcccggctgg tgtgttgggc cgccgtcccc ccccccgggg gacgggcccg 421 aaaggcagcg gcggcgtcgc gtccggtcct cgagcgtatg gggctttgtc acacgcttca 481 gtagaaccgg ccggcttgct ggccacacga ccttcacggt cacctatatt tctcttaggt 541 tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaataag cg

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

The strain A. niger presented a colony on CYA 65.6 ± 1.75 mm (7 days/25ºC); conidia coffee brown to black and white mycelium. Its texture is irregular, plane and velvety; reverse pale yellow; it formed radial furrows very close to each other. The conidial heads were smooth and pigmented brown, vesicle is globose and produces phallus around it, phialides are biseriate and conidia are globose and smooth. Conidiophore size is 538.03 ± 113.34 µm x 6.5 ± 0.30 µm, phialides 7.9 ± 1.00 µm x 3.36 ± 0.25 µm, vesicles 44.7± 10.25 µm, conidia 4.5 ± 0.05 µm (Fig. 2).

The morphological characteristics of A. versicolor show colony diameter on CYA, 14 ± 1.80 mm (7 days/25ºC). The colonies were initially colored white, though they gradually turned grayish-green with white edges, granular shape, convex elevation, rough texture. Reverse is brownish orange or reddish brown. No exudates. Conidiophore were smooth to slightly rough walls. The conidia head is biseriate, phialides radially cover the vesicle. Conidia are spherical. Conidiophore size is 370.91 ± 220.01 x 9.82 ± 3.73 µm, vesicle 24.33 ± 0.90 µm, conidia 2.6 ± 0.2 µm. Another fungal species detected was Byssochlamys spectabilis whose colony diameter on CYA was 78.43 ± 3.30 mm, plane and filamentous (7 days/25ºC). The colonies are pale yellow - brown, dusty texture with white border. Reverse is white color. No exudates. Conidiophores biverticilate and have smooth and thick wall. Conidia are ellipsoidal. Conidiophore size is 173.09 ± 110.01 x 3.1 ± 1.1 µm, phialides 21.30 ± 3.06 µm x 2.5 ± 3.0 µm, conidia 4.23 ± 0.25 µm (Fig. 2).

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Fig.2

Figure 2. Mycotoxigenic fungi isolated from roasted coffee. 1) A.niger colonies on CYA, 2) A.versicolor on CYA, 3) Byssochlamys spectabilis on CYA. A) macroscopic morphology, B) optical microscopic 40x.

Gautam and Bhadauria [27] characterized at the molecular level the identification of mycoflora associated with Aspergillus species in samples of Triphala churn and ingredients (mixture of dry fruits of medicinal plants: Embilica officinalis, Terminalia bellirica, Terminalia chebula) and obtained the amplified product of 500, 700 and 1110 bp for A. versicolor.

According to the identification, only the strain of A. niger produced OTA in the analyzed sample of roasted coffee, the production of OTA in coffee by A. versicolor has not been reported before, but it has been reported in wheat, where the strain produced 0.01 to 0.07 µg/g [28].

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

In this study, Byssochlamys spectabilis was first identified in roasted coffee using primers ITS1 and ITS4 amplified with 500 bp approximately. Byssochlamys species are abundant in soil and recognized as important spoilage molds in fruit and fruit products [29]. Byssochlamys spectabilis (anamorph P. variotii s.s.) commonly occurs in air, compost, various foodstuffs (including pasteurized fruit juices, rye bread) [30]. In general, this fungus can survive considerable periods of heat above 85°C and can grow under very low oxygen conditions, produce mycotoxins such as vomitoxin and deoxynivalenol; the production of OTA by this strain had not been reported before [30, 31].

The occurrence of OTA in all inoculated roasted coffee samples demonstrates fungi isolated may produce this mycotoxin in this kind of food product. A mycotoxin may be produced by several different fungi (Table 3, Fig. 3). The mycotoxigenic potential depends on species and strain of fungus, matrix composition and environmental factors (temperature and moisture).

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Table 3. Level of OTA production (µg/kg) for A. niger, A. versicolor and Byssochlamys spectabilis.

OTA production (µg/kg)

Isolate Coffee medium

A. niger 91.03

A. versicolor 76.74

Byssochlamys spectabilis 81.97

Fig. 3

Figure 3. LC – MS chromatograms – (a) standard solution (OTA 0.021 µg/ml), roasted coffee sample contaminated with: (b) A. niger, (c) A. versicolor, (d) Byssochlamys spectabilis.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

According to these results, it can be concluded that the fungi with the potential to produce OTA in roasted coffee samples (Coffea arabica L.) are A. niger, A. versicolor and Byssochlamys spectabilis. It was also observed that once a toxigenic strain was isolated from a coffee sample, they were able to produce OTA in roasted coffee samples. The presence of toxigenic strains implicates a great risk of OTA presence.

OTA is a stable compound not destroyed by common food preparation procedures. Temperatures above 250°C for several minutes are necessary to reduce the concentration of this toxin [32]. Roasting treatment for green coffee at 200ºC for 20 min reduced levels of OTA by only 0 – 12% in the dried whole beans [33]. Therefore, there is a high chance that the population get contaminated by this toxin, since the roasting of coffee does not assure its total destruction. Consequently, a cup of coffee could contain high amounts of ochratoxin. Because of its high affinity with plasma proteins, their persistence in the organism (average 840 hours) is ensured [34]. OTA is efficiently absorbed from the gastrointestinal tract, mainly in the small intestine and distributed via the blood, mainly to the kidneys, with lower concentrations found in liver, muscle and fat. Specific transporters may be involved in the cellular uptake of OTA into the kidney, where it accumulates. OTA could be implicated in the pathogenesis of some renal diseases including kidney tumors and chronic interstitial nephropathy [35].

Good manufacturing practices and hygiene throughout the coffee production and processing chain is highly recommended in order to reduce the risk of contamination of processed coffee. Furthermore, the OTA presence risk implies the necessity to develop effective technologies to detoxify coffee products.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

In Mexico, there are no legal limits established for ochratoxin contamination and there are few studies on the occurrence of OTA in foods and beverages. More research is necessary to evaluate the real exposure of the population to this mycotoxin through the ingestion of contaminated food.

Acknowledgements This study was carried out with the support of the “Tecnologico Nacional de Mexico” (Project No. 5851.16-P). The authors thank CONACYT (Mexico) for the scholarship granted to Paloma Patricia CASAS-JUNCO.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.2 Detoxificación de ocratoxina A e inhibición de hongos micotoxigénicos en café tostado a través de plasma frío

6.2.1 Introducción al tema Teniendo en cuenta la amplia existencia de ocratoxina A (OTA) en café, encontrar la manera de detoxificar OTA durante la cadena de producción de café tostado sería de gran importancia para disminuir riesgo a la salud humana y reducir pérdidas económicas que afectan tanto a los países desarrollados como los que están en vías de desarrollo. Hoy en día la tecnología emergente de plasma frío ha demostrado tener el potencial para reducir o eliminar por completo micotoxinas en alimentos. Resulta seguro debido a su eficacia, su aplicación a bajas dosis, tiempos cortos y rentabilidad, sin generar residuos en el producto o el medio ambiente, así como rentable.

En esta parte del estudio, se evaluó la detoxificación de OTA, así como la inhibición de hongos micotoxigénicos (A. westerdijikiae, A. steynii, A. versicolor y A. niger) aplicando plasma frío a diferentes tiempos con una potencia de entrada 30 W y un voltaje de salida de 850 voltios, con un flujo de gas helio publicitario de 1.5 L/min.

La aplicación de plasma frío logró una inhibición total de las esporas de hongos micotoxigénicos durante 6 min (reducción de 4 log). Estos resultados mostraron una cinética de muerte bifásica, es decir, presentaron dos pendientes. La primera pendiente mostró una cinética de muerte más lenta (0 a 5 min) mientras la segunda pendiente proporciona una mayor tasa de destrucción (5 a 6 min). Esto se atribuye a que en la primera fase se da la formación de especies tóxicas activas (moléculas excitadas, partículas cargadas, especies reactivas de oxigeno (ROS), especies reactivas de nitrógeno

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

(RNS), fotones UV), sin embargo, en esta primera fase, la cantidad de éstas no es suficiente para lograr una inhibición total. En la segunda fase, estas especies reactivas ya acumuladas pueden ser más efectivas y ocasionan una alteración mayor en la estructura celular de las esporas, provocando una completa desintegración de su membrana celular.

En lo que respecta al estudio de la detoxificación de OTA en café tostado, se redujo un 50% de concentración inicial de OTA producido por los hongos micotoxigénicos al aplicar tratamientos con plasma frío durante 30 min. Estos resultados sugieren que las especies generadas durante los tratamientos de plasma frío promueven la apertura del anillo de isocumarina clorada o bien el grupo amino de la molécula L - b fenilalanina de la molecula de OTA. Respecto a la toxicidad determinada con Artemia salina, para el café tostado sin tratar, se determinó como “tóxico”, mientras que la toxicidad para el café tratado con plasma frío se catalogó como “ligeramente tóxico”.

Por lo tanto, la tecnología de plasma frío podría ser útil en el procesamiento del café para eliminar hongos micotoxigénicos, así como para la reducción de OTA.

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Detoxification of ochratoxin A and inhibition of mycotoxigenic fungi in roasted coffee by cold plasma treatment

Paloma Patricia Casas-Junco1, Josué Raymundo Solís-Pacheco2, Juan Arturo Raggazzo- Sánchez1, Blanca Rosa Aguilar-Uscanga2, Montserrat Calderón-Santoyo1.

1Laboratorio Integral de Investigación en Alimentos. Instituto Tecnológico de Tepic. Av. Tecnológico #2595, Col. Lagos del Country, C.P. 63175, Tepic, Nayarit, México. 2Laboratorio de Microbiología Industrial. Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingeniería. Universidad de Guadalajara, Jalisco, México. Boulevard Marcelino García Barragán #1421, Col. Olímpica, C.P. 44430 Guadalajara, Jalisco, México.

* Corresponding authors. Tel.: +52 311 211 94 00 ext. 230; fax: +52 311 211 94 01

E-mail addresses: [email protected] (M. Calderon-Santoyo)

Ochratoxin A (OTA) produced by mycotoxigenic fungi (Aspergillus and Penicillium) is an extremely toxic and carcinogenic metabolite. Because of this, the use of cold plasma for the elimination of toxin-producing microorganisms in coffee, becomes an important alternative to preserve and avoid the contamination from mycotoxigenic fungi. Roasted coffee samples were artificially inoculated with A. westerdijikiae, A. steynii, A. versicolor and A. niger and incubated at 27 ºC during 21 days for OTA production. Samples were cold plasma treated at different time intervals, 30 W input power and an output voltage of 850 volts with He-air mixture 1.5 L/min flow. Production of OTA in coffee by

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mycotoxigenic strains were analysed by high performance liquid chromatography with mass detector (HPLC-MS). After 6 min of treatment with cold plasma, the fungi were completely inhibited (4 log reduction). Cold plasma reduces 50 % of OTA content after 30 min treatment. Toxicity was estimated for extracts of artificially contaminated roasted coffee samples, using the brine shrimp (Artemia salina) lethality assay. Toxicity for untreated roasted coffee showed to be “toxic”, while toxicity for cold plasma treated coffee was reduced to “slightly toxic”. These results suggested that cold plasma may be considered as an alternative method for degradation and reduction of toxin production of mycotoxigenic fungi in the process of foods and feedstuffs.

Key words Roasted coffee, Mycotoxigenic fungi, Ochratoxin A, cold plasma, detoxification, brine shrimp bioassay

1.Introduction

Ochratoxins belong to a family of structurally related, secondary fungal metabolites produced by various Penicillium and Aspergillus strains. Among them, Ochratoxin A (OTA) is recognized as a contaminant of coffee. OTA has been shown to possess nephrotoxic, carcinogenic, immunosuppressive and teratogenic properties and was classified as carcinogenic for humans (group 2B) (Nganou et al. 2014; Organization and Cancer 1993).

According to the European Commission Regulation (Commission 2006) the maximum accepted levels for OTA are 5 µg/kg for roasted coffee beans and ground roasted coffee,

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

and 10 µg/kg for soluble coffee. A study shown that the roasting treatment of green coffee at 200 ºC for 20 min reduced the levels of OTA by only 0 – 12 % in the dried whole beans (Tsubouchi et al. 1987). It should be mentioned that OTA can be “masked” during roasting. OTA could be bound to the coffee components, for example, OTA binds to the plasma proteins (Il'ichev et al. 2002) and coffee does contain proteins. Changes to OTA during heat treatment have been studied; a partial isomerization of OTA in position C3 into a diastereomer occurred at high temperatures (Suárez-Quiroz et al. 2005). Therefore, the relative heat stability of OTA can cause toxicological problems during the consumption of coffee products entraining a health risk.

Several strategies are available for the detoxification of mycotoxins and inhibition of fungi growth, which includes physical methods, chemical treatments, thermal inactivation, food preservatives, antifungal agents, irradiation, ultrasound treatment, and biological control agents as well (Basaran et al. 2008). Although these are widely used methods, they are time consuming and tedious processes. On the other hand, possible losses in the nutritional quality of treated commodities, poor consumer acceptance and cost implications can occur.

Cold plasma is an innovative technology, which has recently drawn considerable attention of food scientists and researchers, shows potential for inactivation of various pathogenic, spoilage microorganism and degradation of various toxins in the food products (Pankaj and Keener 2017). Cold plasma is the fourth state of matter, is an ionized gas containing atoms or molecules in a metastable state with a net electric charge zero (Misra et al. 2016). The cold plasma generation yields a rich mixture of reactive neutral species, energetic charged particles, UV photons and intense transient electric fields, which can interact

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simultaneously and synergistically at the food (Guo et al. 2015). Ionization is the first important step for the plasma chemistry. Plasma chemistry depends on the several factors such as feed gas composition, relative humidity, power supplied and treatment time (Devi et al. 2017).

Various studies showed the potential of cold plasma to inactivate toxigenic fungi and detoxification on hazelnuts, peanuts, pistachio and nuts (Basaran et al. 2008; Siciliano et al. 2016), date palm fruits (Ouf et al. 2015), groundnuts (Devi et al. 2017). Solis-Pacheco, et al. (2013), carried out a study of sterilization of cinnamon and chamomile, to eliminate fungi and yeasts by the use of cold plasma, obtaining that plasma energy reduced < 1.0 log CFU/g at 750 and 850 for chamomile and 0.68±0.18 log CFU/g for cinnamon at 850 V after 10 min of treatment, respectively. They conclude that the best treatment to obtain significant reductions on yeasts and molds counts in chamomile and cinnamon samples with the lowest degradation of antioxidant compounds was the application of plasma energy at 750 V for 10 min.

Then, the objective of this study was to explore the cold plasma as a process to inhibit toxigenic fungi and to detoxify OTA in roasted coffee, as well as to prove the reduction in toxicity for the cold plasma treated samples.

2.Materials and methods

2.1 Materials

Coffee roasted was procured from local market in Nayarit, Mexico. The roasted coffee was autoclaved for 20 min at 121 °C and 15 psi. The samples were dried in a laminar flow hood (CFLV-120, NOVATECH) for 1 hr.

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2.2. Plasma apparatus

The plasma generator was designed and built at the Laboratory of Plasma Physics of the National Nuclear Research Institute in Toluca, Mexico. Plasma reactor described by Solis- Pacheco et al. (2017) consists of a pair of horizontal stainless steel circular parallel electrodes, 80 mm in diameter and 2 to 5 mm regulated spacing. The electrode below is fixed to the lower lid of the reactor by a shaft, while the upper one, in order to fix the gap, can be adjusted by means of a precision screw coupled to a similar shaft attached to the upper lid, the last is constituted by a tubular shaft allowing gas admission. The entire structure is insulated by means of a Pyrex® 200 mm long cylindrical structure with a 120 mm internal diameter. A Petri dish, containing the coffee roasted sample, is placed between both electrodes, acting as a dielectric barrier. The specially designed 13.56 MHz radio frequency (RF) generator directly supplies the reactor parallel plates, applying a 30 W input power and an output voltage of 850 volts with He-air mixture 1.5 L/min flow. The power in the system can be adjusted with a resolution in the order of milliwatts, as it has been designed to conduct studies on the characterization and interactions of active species and UV radiation from discharges with the microorganisms.

2.3 Inhibition of toxigenic fungal using cold plasma treatment on roasted coffee

2.3.1 Microbial culture

OTA producing strains of A. westerdijikiae (KP329736.1), A. steynii (FM956458.1), A. niger (JN226991.1) and A. versicolor (NR131277.1) were isolated from roasted coffee (Coffea arabica L.) from a coffee-growing region of Nayarit, Mexico.

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Individual fungal cultures were grown on potato dextrose agar (PDA) for 7 days at 28 ºC. Spore suspension was prepared by flooding the mycelia surface with 10 ml of sterile distilled water. The suspension was filtered and spores were counted at Neubauer camera. The suspension was adjusted to a final value of 5 x105 spores ml-1.

2.3.2 Artificial inoculation of roasted coffee

The roasted coffee (0.5 g) was inoculated with 5 µl of spores suspension (5 x105 spores g- 1) onto the surface of each of sterilized sample and allowed to stand for 30 min to facilitate proper attachment of spores on the surface of coffee. Coffee samples were allowed to dry in a laminar flow hood. After, the samples were exposed to plasma using a commercial Helium gas (Praxair, Mexico) at a constant flow of 1.5 L/min, applied at different time volts. Before and after plasma treatment, the enumeration of fungi (log CFU/g) were determined. The samples were diluted in 1 ml of 0.1 % peptone water and homogenized for 10 s. Decimal dilutions were performed and pour plated with potato dextrose agar (PDA, Bioxon, Mexico) containing 2 % ampicillin (Bayer, México) and 0.6 % Bengal rose (Analytyka, Mexico). All plates were incubated at 28 °C for 48 h. Fungi colonies were enumerated and results reported in log CFU/g of sample. Each experiment was conducted in triplicate and the whole analysis was performed in duplicate.

2.3.4 Production of OTA by fungi.

Isolated fungi were inoculated in the centre of a dish containing PDA medium and incubated at 27 ºC for 5 days. The roasted coffee (1 g) was added with 3 ml of distilled water and autoclaved 15 min at 121°C and 15 psi. After, the samples were inoculated with

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3 agar discs taken from the centre of the colony (Food and Administration 1998). Once inoculated, the roasted coffee samples were incubated at 27 ºC for 21 days.

2.3.5 Detoxification of OTA by cold plasma.

The exposure time of cold plasma for detoxification of OTA in the samples of coffee was: 0, 1, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 30 min, using commercial Helium gas to 1.5 L/min, 30 W input power and a voltage of 850 volts.

By the end of incubation period, extraction was carried out in an alkaline solvent (pH 9.4) consisting of methanol and sodium bicarbonate at 3 % (20/80; v/v), suspension was homogenized during 50 min at 60 ºC. The extract was centrifuged (model EBA 21, heittich) at 1036.386 x g for 5 min. Ten ml of filtered extract were diluted in 40 ml phosphate buffer. The mixture was purified on an immunoaffinity column (Ochrastar R) purchased from Romer Labs (Tulin, Austria). OTA was eluted by 6 ml of methanol and evaporated to dryness in a rotary evaporator (Mounjouenpou et al. 2007). The residue was re-suspended in 1 ml of the mobile phase (water/acetonitrile, 50:50). Quantification was by LC/MS (Agilent Technologies).

The operating conditions were as follows: mobile phase of 5 mM ammonium acetate/acetonitrile (65/35, v/v) at 40 ºC with a flow rate of 0.2 mL/min for 4 min run. A column Agilent Technologies, zorbax SB-C18 (2.1 X 50 mm id: 1.8 µm) was used. The detection of OTA was performed in a LC- MS system model 6120 series LC quadrupole equipped with an electrospray ion (ESI) MS (Agilent Technologies), in ionization mode, positive mode (capillary 3500 V, nebulizer 25 psi (nitrogen), dry gas nitrogen at 9 L/min, dry gas temperature 350 ºC, fragmentor voltage 95); selected ion monitoring (SIM), m/z

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404 (OTA).

2.4 Brine shrimp bioassay

Brine shrimp eggs (Artemia salina) were incubated in artificial seawater illuminated by artificial light (60 W lamp) and gently aerated for 24 h at 28 ºC (Metcalf et al. 2002). After, the nauplii (larvae) were collected by pipette from the lighted side whereas their shells were left in the dark side. The test sample (extract from roasted coffee inoculated with toxigenic fungi) were prepared in acetonitrile-water (50:50). The actual concentrations of the whole solutions were determined by LC/MS analyses (quantitation based on OTA as internal standard) and considered with the data evaluation. This bioassay was done by disc and solutions.

Filter paper discs (d=0.5 cm) were submerged in microtubes containing 30 µl of OTA extracts and air-dried. Then, each disc was transferred into a 6-well microtitrate plate containing artificial sea water (2 ml) and 10 nauplii, plates were maintained at room temperature for 48 h under light and dead larvae were counted by examination under a binocular stereoscope (Harwig and Scott 1971; Sharififar et al. 2009).

OTA toxicity was rated as follows: 0 to 9 % mortality, nontoxic (NT); 10 to 49 % mortality, slightly toxic (ST); 50 to 89 % mortality, toxic (T); 90 to 100% mortality, very toxic (VT) (Lawton et al. 1999).

2.5 Statistical Analysis

Statistical analysis was performed using STATISTICA version 9.0. Analysis of variance (ANOVA) and multiple comparison procedures (Least Significant Difference–LSD) test

100

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

were conducted to determine whether there were significant differences (p<0.05) among treatments for spores inhibition or OTA detoxification.

3. Result and discussion

3.1 Inhibition of fungal spores in roasted coffee by cold plasma treatment

The results of the inhibition kinetics of A. westerdijikiae, A. steynii, A. versicolor and A. niger are presented in Fig. 1. After 6 min of exposure to cold plasma treatment a complete inhibition of fungi spores was achieved (4 log reduction). The statistical results showed a significant difference (p<0.05) among treatments in the inhibition between 0 and 6 minutes.

Figure 1. Logarithmic survival curves of A. westerdijikiae, A. steynii, A. versicolor and A. niger spores on roasted coffee samples by using cold plasma at different time with 30 W

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

input power and an output voltage of 850 volts with He-air mixture 1.5 LPM flow.

As can be seen in Table 1, the inhibition kinetics of fungal spores showed a biphasic behaviour, two calculating the decimal reduction in each of the slopes of the biphasic function, it can be observed that the time of inhibition D are different between species fungi dependent of the resistance to cold plasma.

Table 1. D values for A. westerdijikiae, A. steynii, A. versicolor and A. niger inhibited by cold plasma treatment (cold plasma at different exposure times, 30 W input power and an output voltage of 850 volts with Helium 1.5 LPM flow) on roasted coffee samples.

D value (min)

Toxigenic fungi D1 D2

A. steynii 5.93 ± 0.03 0.30 ± 0.02

A. westerdijikiae 4.66 ± 0.18 0.32 ± 0.09

A. niger 4.22 ± 0.10 0.28 ± 0.05

A. versicolor 3.64 ± 0.04 0.32 ± 0.09

This process could be attributed to an interaction of different components inside the plasma. A possible hypothesis for having two slopes according to Moisan et al. (2001) is that there is a first phase of exposition to the cold plasma where the toxic species are being generated and accumulated (hydroxyl (OH), singlet oxygen, ozone, oxide nitrogen) (Korachi and Aslan 2013). These species cause alterations to the cell membrane and high values of D1 are observed. At this state, the differences in D1 values and resistance to the

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

reactive species for the different spores fungi are attributed to the complex cell structure. These differences in reduction of D constant among fungal spores are related to their properties, including hydrophobicity and size of spores. After this process is advanced enough, the reactive species can then quickly cause cell death, hence the rapidity of the second phase.

Fungal spores/cells are enveloped by a thick cell wall (60–80 nm) that is made of chitin, α-β glucans and mannoproteins. The cell wall provides structure and protection from the external environment. Thus, the physical and functional barrier may limit the simple diffusion of plasma active species into the fungal cytoplasm (Alasmari et al. 2017). Some fungal species have thin-walled, hyaline conidia and some have melanin-containing pigmented and sporopollenin (which is a polymer of cross-linked xanthophylls). The melanins absorb radiation and dissipate energy which protects the spore membrane (Begum et al. 2009) . Additionally, some spores are released or extruded from the parent fungus in large quantities of mucilage (extracellular matrix). This mucilaginous matrix also provides protection against ultraviolet radiation (Isaac 1994).

Probably we think that the first phase interaction of toxic species with pigments a- carotene (orange – yellow) presence is response of different values “D”. These pigments do have a role in the cell, protecting them from the potentially damaging effects of cold plasma. Studies show that pigments (melanin) may provide protection to the spore fungi against harmful effect of ultraviolet radiation (Isaac 1994; Valero et al. 2007). After completion of time process the effect of cold plasma are cumulative and viability can be reduced markedly after a critical dose has been received.

Studies have shown that the integrity of the spore cells were broken down after plasma

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

treatment because of the damage caused by plasma active species, and the cell contents were dispersed to the environment after leakage of their cytoplasm. The antimicrobial effect of cold plasma is the result of the action of charged particles and reactive species generated in the plasma that can cause damages to the cell membrane, which can lead to further penetration of reactive species into the cell, DNA damage, and breaking of chemical bonds (Dasan et al. 2016; Moisan et al. 2002). The interaction cold plasma with DNA is sensible to short term exposures to low energy, ions and excited neutral species as well as to UV light, which are all components of cold plasma by helium. The presence of proteins around DNA molecules may shield them from the plasma generated species and so reduce the amount of damage (Ptasińska et al. 2009).

Moreover, cold plasma have been shown to be capable of inactivating a wide range of microorganisms including viruses, bacteria and fungi (Iza et al. 2008; Shaw et al. 2015).

Solis-Pacheco et al. (2017), reported that the inactivation of microorganisms is related to the content of lipid and polysaccharide in the cell wall. Then, the inactivation may depend on the thickness of the cell wall and lipid peroxidation, due to that composition of the cell wall of each microorganism is different, this being probably the cause of the different decimal reduction values (D), observed in the different treatments with cold plasma.

The different inhibition kinetics by cold plasma depend on a complex process as type of microorganism, working gas, application of voltage, distance of the microorganism from the discharge glow, plasma agents: UV radiation, charges particles, reactive species, etc. (Afshari and Hosseini 2012; Guo et al. 2015; Laroussi 2002).

The cell structure of fungi is more sophisticated than the bacterial cell structure.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Concerning the spores, a thick wall protecting the spores from the environment surrounds them. That outer cell wall contains lipids and proteins that confers it a hydrophobic nature. The inner wall of the cell is similar to the mycelial wall and consists of a β(1-3) glucan matrix reinforced with chitin fibrils, mannan and galactofuran (Eduard 2009; Eisenman and Casadevall 2012). It is noteworthy that the spores contain a cell wall thicker than the mycelia; also the nuclear membrane that protects the DNA is composed of small acid soluble proteins (αβ -type SASP), low-core water content and an increased amount of dipicolinic acid (Muranyi et al. 2007).

The penetration limitation of the active species formed during plasma process is the biggest restricting factor for the use of plasma technology in sterilization and decontamination treatments (Butscher et al. 2016). The lethal effect could be restricted by eventual organic materials covering the spores and by stacking or aggregation of spores (Dasan et al. 2016).

Recent studies have shown microbial community that respond to effect of plasma (plasma – cell interactions), starting with the emergence of discrete isles of cell aggregates, through their evolution into what we refer to as ‘‘cell refuges’’ that protect viable cells from subsequent plasma treatment and finally, the disintegration of the cell refuges leaving only a thin layer of fragmented cell debris (Bayliss et al. 2012).

3.2 Effect of cold plasma on detoxification of OTA produced in roasted coffee by mycotoxigenic fungi.

The OTA production in roasted coffee artificially contaminated and incubated during 21 days was as follows: A. westerdijikiae 96.45 µg/kg, A.steynii 67.79 µg/kg, A.niger 91.03

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

µg/kg and A.versicolor 76.74 µg/kg. After 30 min of cold plasma exposure, treated samples had a 50% aprox. reduction of OTA (P <0.05) (Table 2). These results suggest the application of cold plasma may have a strong potential, not only in mycotoxins degradation but also in fungi development and subsequently in reduction of toxin production by mycotoxigenic fungi, then this process can be effectively used in the industrial food production.

106

CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Table 2. Effect of cold plasma applied for different times on OTA in roasted coffee.

OTA (µg/kg)

A.westerdijik Reduction Reduction Reduction Reduction

Time (min) iae (%) A. steynii (%) A.niger (%) A.versicolor (%)

0 96.45 ± 3.08 a,1 67.69 ± 3.66a 91.03 ± 12.06a 76.741 ± 10.12a

1 89.86 ± 4.43 a 6.83 64.57 ± 1.92ab 4.61 87.31 ± 3.56a 4.09 76.61 ± 1.91a 0.17

4 81.34 ± 16.91ab 15.67 59.07 ± 4.97bc 12.73 72.81 ± 1.99b 20.02 75.44 ± 10.96a 1.69

8 77.17 ± 14.79bac 19.99 55.17 ± 1.63dc 18.50 71.77 ± 1.28b 21.16 69.19 ± 22.76a 9.84

12 73.62 ± 8.43bac 23.67 49.48 ± 5.49de 26.90 69.50 ± 2.86b 23.65 68.36 ± 2.38a 10.91

16 62.89 ± 22.09bdc 34.80 43.48 ± 1.75ef 35.37 66.4 ± 1.99cb 27.06 67.08 ± 8.85a 12.59

20 51 ± 5.26bdc 47.12 41.42 ± 0.69f 38.31 65.37 ± 9.97cb 28.19 63.67 ± 1.29a 17.02

24 54.39 ± 1.08dc 43.61 38.28 ± 1.59fg 43.45 63.76 ± 3.40cb 29.96 63.28 ± 13.36a 17.53

30 38 ± 4.20d 60.60 31.39 ± 0.03g 52.86 54.34 ± 0.85c 40.31 51.18 ± 6.64a 33.31

1Different letters for column indicate significant difference (p≤ 0.05).

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Despite an absence of total reduction of OTA, the achieved reduction of 50% could be high enough to meet the requirements stablished by the European Union legislation which established for OTA 5 µg/kg for roasted coffee beans and ground roasted coffee and 10 µg/kg for soluble coffee (J.Eur 2005). Therefore, this technique can be promising for mycotoxin detoxification in coffee industry being an alternative to prevent or eliminate OTA and toxigenic fungi.

The effect of cold plasma on OTA detoxification could be attributed to the generation of + + − − + different reactive gas species like ions (H3O , O , O , OH , N2 ), molecular species (O3,

H2O2), and reactive radicals (O•, OH•, NO•), UV irradiation and etching (Pankaj and Keener 2017; Park et al. 2007). These species could promote the opening of the chlorophenolic group containing a dihydro-isocoumarin and/or amide-linked to L-phenylalanine.

Some studies have reported the efficacy of cold plasma on detoxification of mycotoxins in food products. Basaran et al. (2008) indicated a 50% reduction in the total aflatoxins (AFB1, AFB2, AFG1, and AFG2) after 20 min exposure of air gases plasma, while only a 20% reduction in total aflatoxin was observed after 20 min of sulfur hexafluoride plasma treatment. Ouf et al. (2015) demonstrated inhibition of the synthesis of fumonisin B2 and ochratoxin A by A. niger after treatment for 6 and 7.5 min with an atmospheric pressure argon plasma jet. Devi et al. (2017) showed a 70% and 90% reduction on groundnuts samples treated with plasma at 60 W (12 min) and 40 W (15 min).

During the generation of cold plasma, the UV radiation is a component for the detoxification of mycotoxins. In the literature, Jalili et al. (2012) report that the addition of

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

free radicals to double bonds, especially to those in aromatic or heterocyclic rings of mycotoxins, is an energetically positive reaction that can be considered responsible to reduction of AFB1 and AFG1 levels. Atalla et al. (2004) attribute the effects of UV and fluorescent light in reduction of

Aflatoxin B1 to its high sensitivity to UV radiation affecting the structure of the terminal furan ring and subsequent elimination of the active binding site which the oxygen appears to enhance UV- mediated free radical degradation of aflatoxin crystal.

3.3 Sensitivity of brine shrimp larvae to OTA

According to the obtained results for OTA detoxification by cold plasma (DBD) dielectric barrier discharge system, it was desirable to study the toxicity of structures resulted from application of this technology in order.

Brine shrimp incubated with untreated OTA extracts showed a level of toxicity classified as “toxic”. On the other hand, larval mortality for cold plasma treated OTA extracts was significantly reduced and a level of toxicity of “slightly toxic” was obtained for the whole samples (Table 3). When mycotoxins are irradiated, three possible results can be obtained; first, the resulted structures are more toxigenic than the original molecule; second, the resulted molecules are equally toxigenic as the original toxin and; third, the resulted fragments present a lower toxicity comparing with the original toxin molecule (Moreau et al. 2013). Then, in this study a lower degree of toxicity was obtained when OTA was cold plasma treated.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Table 3.- Toxic activity against brine shrimp (Artemia salina) for extracts from artificially inoculated coffee and cold plasma (30 min, 30 V, Helium 1.5 LPM) treated and untreated.

Mycotoxigenic OTA in solvent Treatment Mortality Toxicity fungi extraction (ng/ml) (%) Degree1 A. westerdijikiae 1.19 Untreated 55% T 30 min cold 21.66% ST plasma treatment A. steynii 1.23 Untreated 76.66% T 30 min cold 33.33% ST plasma treatment A. niger 1.57 Untreated 88.33% T 30 min cold 10% ST plasma treatment A. versicolor 1.27 Untreated 50% T 30 min cold 16% ST plasma treatment 1OTA toxicity was rated: Nontoxic (NT), slightly toxic (ST), toxic (T), very toxic (VT)

The toxicity for OTA molecules is conferred by the isocoumarin moiety (Heussner et al.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2006), then a diminution in toxicity may be accompanied by a fragmentation of this structure. The effect of OTA nephrotoxicityhas been proven in experimental animals, inhibition of protein synthesis, but other important effects are lipid peroxidation, DNA damage and oxide reductive stress (Battacone et al. 2010). Then, the fact that cold plasma technology could reduce the toxicity of preformed OTA is a promising result.

In conclusion, cold plasma is a novel non-thermal technology, which has shown significant potential for applications in food industries for food safety and shelf life extension. The recent research in cold plasma detoxification on OTA in roasted coffee could be a viable option for commercial application in the food industry. The effect of cold plasma treatment on ochratoxin A on roasted coffee can be considered promising in terms of safety and process efficiency. However, the application of cold plasma needs further extensive research of mechanism of detoxification.

Acknowledgmens:

Support for this research was provided by the Tecnologico Nacional de Mexico through the project 5851.16-P. “Aplicación de plasma frío para el control microbiano en alimentos” and by CONACYT through the fellowship 374701 granted to P. P. Casas Junco.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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6.3 Propiedades fisicoquímicas y compuestos antioxidantes en café tostado (Coffea arábica L.) tratados con tecnología de plasma frío

6.3.1 Introducción al tema El café es una de las bebidas más populares y apreciadas en todo el mundo, siendo económicamente Coffea arábica L. el más importante, debido a su sabor característico que lo distingue y a su aroma que lo convierte en una bebida única, con casi mil compuestos volátiles identificados en el café tostado. Además, el café se considera un alimento funcional, principalmente debido al alto contenido de compuestos que ejercen actividad antioxidante, entre otras propiedades beneficiosas. Sin embargo, hoy en día la industria del café presenta una problemática ocasionada por la presencia de ocratoxina A (OTA) y aflatoxinas (AFB1), (AFB2), (AFG2), (AFG1) producidas por hongos micotoxigénicos como son Aspergillus spp. y Aspergillus spp., siendo éstos un riesgo para salud humana.

En esta etapa del estudio, se evaluó el efecto de plasma frío generado con barrera dieléctrica (DBD) y generador de radio frecuencia (RF) sobre algunas propiedades fisicoquímicas (perfil aromático y sensorial), compuestos antioxidantes y contenido total de fenoles, en café tostado.

De acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba triangular, no hubo diferencia entre las muestras presentadas a los panelistas (no entrenados). En la evaluación hedónica, se evaluaron los parámetros de color, olor, sabor y aceptabilidad general en las muestras C201 (café tostado tratado con plasma frío a 30 W de potencia de entrada y un voltaje de salida de 850 voltios, Helio 1.5 L/min durante 30 min) y muestra C685 (café tostado sin

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tratamiento). Los panelistas asignaron el valor “me gusta moderadamente” para ambas muestras, sin haber una diferencia significativa.

No hubo diferencias significativas en los parámetros expresados como L* (luminosidad/oscuridad), a* (enrojecimiento/verde) y b* (amarillez/azul) determinados en las muestras de café tratado con plasma frío y sin tratar. La diferencia de color total (TDC) fue inferior a 1 por lo que se encontró dentro de los límites permisibles para ambos casos, por lo que es difícilmente perceptible por el ojo humano.

Con respecto al perfil aromático de las muestras de café tostado tratadas con plasma frio y sin tratar, no se presentaron diferencias significativas. De acuerdo a investigaciones realizadas, se han identificado más de 800 compuestos volátiles en café tostado. En este estudio se identificaron 9 compuestos (Furfural, Furan 2-methyl, 2-furancarboxaldehyde, 5–methyl, Phenylic acid, 2-furanmethanol, acetate, 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde, Limonene, 2-Acetylpyrrole, 2-furfurylfuran) que se detectaron en ambas muestras.

En cuanto a la actividad antioxidante, se observó un incremento del 14 %, mientras que en los compuestos fenólicos hubo una reducción significativa del 12 %, en muestras de café tostado tratadas con plasma frío durante 30 min, en comparación con las muestras sin tratar.

A partir de estos resultados, es posible evidenciar que plasma frío es una tecnología novedosa en el procesamiento de café tostado con mínimos cambios en el producto. Sin

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

embargo, es importante investigar la interacción de las especies reactivas individuales, así como las vías de reacción de oxidación en los alimentos.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Physicochemical properties, sensorial analysis and antioxidant compounds of roasted coffee (Coffea arábica L.) treated with cold-plasma technology

Abstract

Cold plasma is one of the emerging novel technologies in the food technology, effective at ambient temperature, with minimum thermal effects on nutritional and sensory quality parameters of food and with no chemical residues. The aim of this research was to study the physicochemical and sensorial properties and the antioxidant activity of roasted coffee treated with cold plasma. The cold plasma was generated with a dielectric barrier discharged (DBD) at 30W input power and an output voltage of 850 volts, applied at different times with helium gas (1.5 L/min). No differences in colour parameters were produced by cold plasma treatment. Roasted coffee samples under plasma exposure during 30 min were not significant different in aromatic profile or sensory evaluation comparing with not treated coffee samples. A reduction of total phenolic content of 12 % and an increase of 14 % in antioxidant activity was observed in cold plasma treated samples.

Key words: Dielectric Barrier Discharge (DBD) plasma, reactive species, UV, food quality

Introduction

Coffee is one of the most popular and appreciated beverages around the world, Coffea arábica L., also known as Arabica coffee, is responsible for approximately 70 % of the global coffee market (1-2) (Clarke 2003). The characteristic flavor and richness of coffee aroma make it a unique beverage. These properties are determined directly by the

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

composition of the green beans and the changes that occur during roasting (Esquivel and Jiménez 2012). Roasted coffee is mainly composed by carbohydrates (38-42 % dry basis), melanoidins (23%), lipids (11-17%), protein (10%), minerals (4.5-4.7 %), phenolic compounds (PC) (2.7-3.1%), aliphatic acids (2.4-2.5%), and caffeine (1.3-2.4 %) (Belitz 2009).

Coffee contains over 800 volatile compounds that belong to different chemical families, including furans, pyrazines, ketones, thiazoles, pyrroles, thiophenes, phenols, hydrocarbons, acids and anhydrides, aldehydes, esters, alcohols, sulfur compounds, and others (Cecilia et al. 2012; Mondello et al. 2005).

Nowadays, coffee is considered a functional food, primarily due to its high content of compounds that exert antioxidant and other beneficial biological properties. For example phenolic acids components, especially chlorogenic acid, which is found abundantly in coffee beans, could assert neuroprotective effects that may prevent diseases like Alzheimer´s disease (Bröhan et al. 2009). Other possible benefits associated with coffee consumption are the stimulating effects observed on gastrointestinal tract and liver, probably from caffeine, chlorogenic and caffeic acids, inhibition of the onset of liver cirrhosis and alcohol- associated pancreatitis, reduction of the odds of having asthma symptoms and prevention of clinical manifestations of bronchial asthma. Furthermore, reduction in plasma glucose level, inverse association to prevalence of fasting hyperglycemia and lower risk of clinical type 2 diabetes have been associated to increased coffee consumption (Dórea and da Costa 2005). Regarding other compounds present in the brew, it has been observed that carbohydrates have various biological activities, such as diminishing colon cancer risk (Arya and Rao 2007).

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Unfortunately, contamination of coffee roasted by ochratoxin A (OTA) and aflatoxins

(AFB1, AFB2, AFG2, AFG1) produced from the fungus Aspergillus spp. and Penicillium spp. is a serious problem because of the potential threat to health. Inhibition of fungus before the toxins are produced is more important than the removal of toxins once produced. It is of interest to develop processes to reduce or completely eliminate fungus before mycotoxins are produced during storage (Noonim et al. 2008). Cold plasma is an ionized gas that contains ions, electrons and reactive neutral species such as radicals, and excited atoms and molecules. Some researchers reported that cold plasma could reduce mycotoxin levels in various foods (Amini and Ghoranneviss 2016; Ziuzina et al. 2014). Devi et al. (2017) showed degraded of aflatoxin B1, produced by A. parasiticus and A. flavus, on groundnuts treated at 40 W 15 min and 60 W 12 min plasma by 70 % and 90 %, respectively. Inhibition effect of cold argon plasma on fumonisin B2 and ochratoxin A contamination on date fruits were reported by Ouf et al. (2015). Fumonisin B2 was not detected after 6 min of plasma treatment, whereas ochratoxin A was completely removed when the fungus was treated for 7.5 min. In view of all mentioned before, it would be interesting to obtain a roasted coffee treated with cold plasma discharges to preserve its hygienic and quality as much as possible. Then, the aim of this work was to evaluate the phenolic compounds content and antioxidant activity, as well as aromatic and sensorial parameters for cold plasma treated roasted coffee (Coffea arábica L.).

Materials and methods

Roasted coffee (Coffea arábica L.) grains produced in the region of Nayarit, Mexico, was obtained from local markets for this study.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Plasma apparatus

The plasma generator is formed by dielectric barrier discharge (DBD) and radio frequency (RF). It was designed and built at the Laboratory of Plasma Physics of the National Nuclear Research Institute in Toluca, Mexico. The device comprises a power source of 13.56 MHz and a RF RDBD constituted by a pair of parallel electrodes in a stainless steel circular cylinder contained in a Pyrex ® glass. One of the electrodes can be moved to adjust the distance between plates. The upper tubular shaft allows gas application directly to the sample creating an electrical discharge between both electrodes (Solis-Pacheco et al. 2017).

Treatment of roasted coffee powder with plasma energy

Roasted coffee (Coffea arábica L.) grains were milled and 0.5 g powder samples were placed on plate petri on thin layers, they had approximately 1 mm of thickness) and were immediately treated with plasma energy at atmospheric pressure. Plasma was generated using a commercial helium gas (Praxair, Mexico) at a constant flow of 1.5 L/min and applied at different time intervals (0, 1, 4, 8, 12, 16, 20, 24 and 30 min) and 30 W input power and an output voltage of 850 volts.

Before and after each plasma treatment, physicochemical properties, antioxidant activity and total polyphenol content were determined, as well as the sensory attributes of coffee beverage prepared from treated roasted coffee.

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Sensory evaluation

The roasted coffee (untreated control and 30 min cold plasma treated) was prepared by adding this coffee powder (1:4 w/v) and sugar (5 %) in boiling water. Prepared coffee was evaluated for sensory attributes by 40 untrained judges. The experiment was divided in two phases: (1) triangular test was performed to compare between three samples simultaneously, two samples untreated and one treated with 30 min cold plasma, without having to specify the sensory characteristic(s) that differ; (2) test was based on the evaluation of colour, odour, taste and overall acceptability parameters, a 9- point hedonic scale (1: dislike extremely to 9: like extremely) was used to analyse the sensory score corresponding to each tasted sample (Kumar et al. 2012; Radovich et al. 2004; Salvador et al. 2007).

Physicochemical quality parameters

Surface colour Colour assessment was evaluated with a Hunter Lab MINOLTA Chroma Meter CR300 colorimeter (Hunter Laboratory, México) in the reflectance mode for roasted coffee. Colour was expressed as L (brightness), a (redness) and b (yellowness) values. Results were expressed as the average of four measurements. In addition, total colour difference (ΔE) was calculated as below (Eq. 1) (Kovačević et al. 2015) :

* * * ∆E = (L' − L) + (a' − a) + (b' − b) (1)

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Where L0, a0 and b0 were the values of the untreated control, and L*, a*, and b* were the values for treated roasted coffee.

Aroma compounds determination Samples cold plasma treated for 30 min were analysed with a gas chromatograph (GC- 7890) coupled to mass spectrometry (NIST) system with ion trap mass spectrometer from Agilent Technologies Instruments operated in the split mode. A CP- Wax (60 m × 0.25 mm i.d.) column with a 0.25 µm film thickness was employed for chromatographic separation of aromatic compounds. Ion trap mass spectrometer was operated in the electron ionization (EI) mode. The NIST library was used to detect possible intermediates, and also our own mass library was created with this program. The free volatile compounds were characterized by GC/MS by means of retention time and mass spectrum. Helium at 1.6 mL/min was used as carrier gas. Divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) fiber with coating thicknesses of 50 and 30 µm was used (Akiyama et al. 2008).

The oven temperature program was as follow: 50 ºC for 2 min (rate 2 ºC min-1) to 220 ºC for 85 min. Hydrogen was used as the carrier gas at 100 kPa; the injector temperature and the split flow were set at 260 ºC and 30 mL min−1, respectively, after a splitless time of 1 min.

Headspace-solid phase (SPME) microextration was carried the method proposed by Solis- Solis et al. (2007) with some modifications. Samples of 0.5 g of non-treated and treated coffee roasted were put in 1 g NaCl and 1.6 mL deionized water and subsequently sealed

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

with PTFE-silicone septa. Sample vial equilibration was incubated at 40 ºC for 30 min; the DVB/CAR/PDMS fibre was then exposed to the headspace above the sample for 30 min followed by 10 min thermal desorption of the adsorbed substances in the injector port.

Extraction of polyphenols

Aliquots of 0.5 g of roasted coffee were mixed with 20 mL of acidified methanol solution (0.8 M HCl, 50:50, v/v, 60 min) and extracted by shaking. The extracts were then centrifuged (Hermle, Z32HK, Labortechnik GmbH, Wehingen, Germany) at 6000 × g for 15 min at 4 °C. The supernatants were recovered and the residues were re- extracted by means of 20 mL of an acetone solution (70:30, v/v, 60 min), supernatants were collected in a flask with the combination of acidified methanol solution and acetone solution (50:50, v/v). The crude extracts were collected, labelled as TPC (Total Polyphenols Compounds) and stored at 4°C in the dark (Pérez-Jiménez et al. 2008).

Determination of total soluble polyphenols (TSP)

An aliquot of 250 µl of TPC extracts (roasted coffee) were added with 1000 µL Na2CO3 (sodium carbonate, 7.5, w/v). After 3 min, Folin–Ciocalteu’s reagent (1250 µL) was added and heated in water bath for 15 min. A microplate reader (Bio-Tek®, Synergy HT, Winooski, VT, USA) in a multi-mode spectrophotometric detection with 96-well plates and the Gen5 Program were used. Gallic acid was used as standard (0.0125 – 0.2 mg/mL, R2 ≥ 0.9997) and results were expressed as mg of gallic acid equivalents (mg GAE/g db), the absorbance was read at 750 nm against a blank (Montreau 1972) and modified by de Lourdes Robledo et al. (2001).

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Antioxidant capacity

This assay was based on the ability of different substances to scavenge 2,2´-Azinobis-3- ethylbenzotiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) radical cation. The method proposed by Re et al. (1999), with some modifications was used. The radical cation was prepared by mixing 7 mM stock solution with 2.42 mM potassium persulphate and kept in the dark at room temperature for 14 h. The ABTS solution was adjusted with phosphate buffer at an absorbance of 0.70 (± 0.02). Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid) was used as a standard and methanol as a blank. Samples of 20 µL of the extract were read on a microplate reader (Biotek, Synergy HT, Winooski, VT, USA) of 300 µL capacity, and 280 µL of the ABTS radical was added. Then, it was incubated at 37 °C in the dark and read for 6 min at 734 nm; a calibration curve was prepared using an aqueous solution of Trolox as a standard. The results are reported in mmol TE per 100 g sample DW.

Results and discussion

Sensory evaluation

In a sensory experiment, 40 untrained panelists were asked to evaluate triangle test. Three samples were presented simultaneously to each panelist. 15 untrained panelists correctly (C201 coffee roasted treated with cold plasma at 30 W input power and a voltage of 850 volts, Helium 1.5 L/min during 30 min) chose the different samples. It was concluded that

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the probability from the table of “probability of X or more correct judgements in n trials (p=1/3)” would be 0.342. Since a probability of 0.05 or less is usually required for significance, it would be concluded that there was no significant difference between the samples (Watts et al. 1989).

Figure 1 shows the results of hedonic test for colour, odour, taste and overall acceptability of sample C201 (roasted coffee treated with cold plasma at 30 W input power and a voltage of 850 volts, Helium 1.5 L/min during 30 min) and sample C685 (untreated roasted coffee). The judges evaluated “like moderately” for both samples. There were no significant differences between cold plasma treated and untreated samples (p < 0.05). Thus, cold plasma treated roasted coffee samples were found to be organoleptically acceptable for the whole evaluated attributes.

9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 Sample C201 (Cold plasma treatment) 4.00 Sample C685 (Untreated) 3.00 Hedonic scale scale Hedonic 2.00 1.00 0.00 Odor Color Taste Overall acceptibility

Fig. 1 Sensory evaluation of roasted coffee (cold plasma treated and untreated) on a 9- point hedonic scale (1=dislike extremely, 2=dislike very much, 3=dislike moderately,

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4=dislike slightly, 5=neither like nor dislike, 6=like slightly, 7=like moderately, 8=like very much, 9=like extremely).

Basaran et al. (2008) obtained an overall acceptance during the sensory analysis of nuts (hazelnuts, peanuts and pistachio nut) treated with low pressure cold plasma (LPCP) using air gases or sulfur hexafluoride (SF6) at 300 W and room temperature (20–30 °C). Not significant difference (p > 0.05) was obtained between the treated and not treated samples in the appearance, colour, odour and texture touch with a hedonic scale ranging from 1 to 5. On the other hand, studies conducted on meat revealed that cold plasma can have negative impacts on several sensory parameters of this product. Kim et al. (2013) reported that sensory parameters such as appearance, colour, odour, and acceptability in DBD –treated fresh pork Loin had significantly lower scores than non treated samples. Lipid oxidation byproducts such as alkanes, alkenes, aldehydes, alcohols, ketones, and acids generated during plasma treatment may produce off flavours, which are sensorially described as a fish, metallic, rancid, and oxidized flavour. Thus lower sensory quality may be due to the high fat content in meat products which leads to increased production of lipid oxidation by-products during plasma treatment (Jayasena et al. 2015; Lee et al. 2012).

No perceivable changes in the texture and appearance were detected during sensory studies applied to microwave plasma treated apple slices (Schnabel et al. 2015). However, a “sour” or “chemical” type of odour has been associated with plasma treated apple slices during the descriptive sensory analysis. Due to the plasma set-up and dry air (below 32 % relative humidity) as working gas chemical reactions and species mainly based on RNS (reactive nitrogen species) are expected. Nitrogen and oxygen in air react to nitrogen

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monoxide (NO*), which further leads to the generation of nitrogen dioxide (NO2*) with oxygen (O2). NO* and NO2* are two stabile radicals with known antimicrobial effectivity. Another product could be peroxynitrite (ONOO-) throughout the reaction of NO* with - superoxide radical (O2* ) (Oehmigen et al. 2010; von Woedtke et al. 2012). All these reactions are possible in dry air after plasma ignition. Taking into account that fresh fruits and vegetables contain high amounts of water, other chemical reactions may happen. The experiments showed a strong acidification which might be a result of the final end product + of all reactions nitrous acid (HNO2). Usually HNO2 decays to hydrogen (H ) and nitrite - (NO2 ) but a pH-value beneath 2.75 could lead to a spontaneous forming of OH* and NO* radicals.

It should be mentioned that coffee bean have low content of aw (10 %) and lipids (16 %) (Puerta 2013). Then, the probability of generation of new compounds with sensorial impact was reduced, and no differences in sensory attributes were observed.

In conclusion, some factors need to be consider in order to have an impact in sensory attributes such as input power and voltage applied, used gas, flow, time of exposure and food matrix, as well.

Colour measurement

The colour of the coffee bean is related to beverage quality and is an important factor in the valuation of the product (Borém et al. 2013). Hunter colour parameters for roasted coffee treated with cold plasma (30 W input power and a voltage of 850 volts, Helium 1.5 L/min during 30 min) and untreated are shown in table 1. No differences in the surface measured parameters were observed and a value of DE of 0.78 was obtained. In conditions

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of ideal vision, values of DE ≤1 represent a minimum difference of colour, hardly perceptible for human eye (Vervoort et al. 2012).

Sarangapani et al. (2017) indicated that DBD generated cold plasma on blueberries showed no change in colour.

Table 1.- Surface colour values of roasted coffee treated with cold plasma

Treatments L* a* b* Rosted coffee untreated 22.85 ± 0.02a 11.36 ± 0.03a 17.16 ±0.05a (0 min)

Roasted coffee with 22.89 ±0.05a 10.90 ± 0.03a 17.02 ± 0.01a cold plasma treatment (30 min) a=Similar letters uppercase indicates no significant difference (p < 0.05) between treatments.

Insignificant changes in colour of carrots and tomates following cold argon plasma treatment using a plasma needle array (3.95 – 12.83 kV, 60 Hz, 0.5 – 10 min exposure time) has been report Bermúdez-Aguirre et al. (2013). Ramazzina et al. (2015) evaluate the effect of atmospheric double barrier discharge (DBD) plasma treatment on the quality maintenance of fresh-cut kiwifruit. According to the

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

obtained results, plasma treatments positively influenced the quality maintenance of the product, by improving colour retention.

Aroma compounds determination Aromatic components are particularly important in coffee beverages as they are the main constituents of the sensory experience of coffee drinkers (Bhumiratana et al. 2011). More than 900 volatile compounds have been identified in roasted coffee. These can be divided into different classes, including (in order of abundance) furans, pyrazines, ketones, pyrroles, phenols, hydrocarbons, acids and anhydrides, aldehydes, esters, alcohols, sulfur compounds, and others (Toledo et al. 2016).

The result showed that similar volatiles profile was obtained between cold plasma treated and untreated samples (Fig. 2). Then, a total of 9 volatile compounds were identified for both samples (Table 2). Thus, suggest that cold plasma treatment did not significantly affect the covalent bonds responsible for the integrity of aroma compounds.

Table 2.- Identified aroma compounds in roasted coffee. No. Compounds Retention time 1 Furfural 5.24 2 Furan 2-methyl 9.97 3 2-furancarboxaldehyde, 5 – methyl 10.48 4 Phenylic acid 11.39 5 2-furanmethanol, acetate 12.15

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6 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde 12.71 7 Limonene 14.18 8 2-Acetylpyrrole 16.24 9 2-furfurylfuran 17.41 (Akiyama et al. 2008; Bressanello et al. 2017; Cheong et al. 2013; Sanz et al. 2001)

Fig. 2 GC-MS chromatograms of aroma compounds detected in untreated roasted coffee and cold plasma treated samples during 30 min.

Van Durme et al. (2014) identified, qualitatively and semi-quantitatively, volatile compounds of oxidation byproducts in vegetable oil sample (fresh and naturally) treated with non-thermal plasma for 20 min with different gas mixtures: plasma 0.3 % Ar, O2/ Ar

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

plasma and 0.3 % H2O/Ar plasma. According to the results obtained, after the plasma treatments, 0.3 % Ar gas showed no volatile compounds were produced after exposing the vegetable oil to non-thermal plasma. This suggest that excited argon species are insufficiently reactive to initiate lipid oxidation. It is also known that UV radiation can initiate lipid photo-oxidation. However, based on the experiments it can be concluded that the induced UV emission did not result in measurable photo-oxidation by-products on cold plasma treated coffee. Previous experiments on the RF plasma setup revealed that the emitted radiation at identical experimental conditions was in the range of 700–800 nm

(Nikiforov et al. 2011). In the case of 0.3 % O2/Ar identified a large number of newly formed typical secondary volatile lipid oxidation products for example n-heptanal, 2- heptenal, n-octanal and nonanal. As well as the following compounds were formed 2- methyl-2-butene, 1-octene, 2,4-octadiene. Therefore, singlet oxygen is formed inducing particular lipid oxidation chemistry. Exposed to 0.3 % H2O/Ar significantly lower amounts of secondary volatile lipid oxidation compounds were measured. Despite the high reactivity of hydroxyl radicals than additional emission of UV radiation in the range of 287–312 nm was measured corresponding to emission band of OH radicals. However, the range of UV has been quantified about 2 mW m-2, which, compared the dose with the commercial mercury lamp, is very low. It can be concluded that photo-oxidation may be less effective (Yi et al. 2013).

Another experiment with cold plasma on fish oil samples showed a significant increase of several lipid oxidation products detected which were also found in the naturally aged fish oil. 2- Propenal, 1-penten-3-one, pentanal,2-undecanone, (E)- 3-hexanal, nonal, hexanoic acid, butanoic and heptanal were the compounds that increased in concentration following

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the cold plasma treatment. These oxidation products are formed as a result of the reactive species present in the plasma, in particular atomic oxygen and singlet oxygen. On the contrary, it was observed a number of volatile lipid oxidation markers (e.g. (E,E)-2,4- heptadienal, (E)-2-decenal and 1-octen-3-ol) that did not show significant increase after cold plasma exposure. This result could be explained by the fact that the plasma jet was sustained by an argon gas flow of 2 SLM, which creates a very turbulent atmosphere near the contact zone, causing a partial stripping of volatile compounds. This depends on several parameters as is coefficient, temperature, turbulence. Therefore, when the stripping effect is more dominant than the formation of specific oxidation products, a decrease in concentration is observed (Vandamme et al. 2015).

Then, the principal parameters involved in byproducts formation are food matrix, voltage, treatment time, oxygen concentration, configuration, concentration of water and carrier gas, etc. From those parameters, high lipid content in food matrices is critical for the formation of off-flavour during cold plasma treatment, as coffee beans has a low content, no formation of this kind of aroma molecules were observed.

Total soluble phenols (TSP) and antioxidant activity

The total soluble phenols content in roasted coffee showed significant variations during the cold plasma treatment and decreased from 67.74 ± 2.31 GAE/g to 59.12 ± 3.92 GAE/g (12 %) after 30 min of treatment (P < 0.05) (Table 3).

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Table 3.-Total phenolic concentration (TPS) (mg GAE/g DW) and ABTS value (mmol TAE/g DW of the roasted coffee during cold plasma treatment.

Treatment Total phenolic concentration ABTS value time (min) (TPS) (mmol TAE/g DW) (mg GAE/g DW) 0 67.74±2.31b 528.96f 1 65.06±0.31a.b 438.94ª,b 4 63.27±4.52a,b 418.27b 8 58.12±5.76a 306.36d 12 59.42±5.24a 361.92e 16 60.06±0.47a,b 480.65a 20 61.36±0.17a,b 593.59c 24 60.78±1.02a,b 464.55a 30 59.12±3.92a 604.06c

The TSP interaction with plasma discharges generates reactive oxygen species (ROS), such as hydroxyl radicals, atomic oxygen and singlet oxygen (Brandenburg et al. 2007) and ozone.

Although the mechanism is still unclear, we anticipate that polyphenols degradation results from the known ability of phenolic compounds to scavenge free radicals (antioxidative capacity). In a coupled electron/proton-transfer, a phenoxyl radical is formed after tautomerization undergoes cleavage of the aromatic ring and leads to the

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formation of small phenolic acids. As well as degradation of phenolic acids results from the ability of phenolic compounds to scavenge free radicals generated by cold plasma (Makris and Rossiter 2002).

Our hypothesis is that the TSP have ability to scavenge free radicals that subsequently leads to cleavage of the central heterocycle in polyphenolic skeleton and oligomerization, caused by oxidative degradation or by matrix interactions during exposures to high diversity of plasma-generated reactive species. For instance, highly reactive atomic oxygen, metastable oxygen molecules, ozone and hydroxyl radicals indeed can be commonly found in a gas discharge and possible decrease in TPC is due to the reaction of these phenolic compounds with the free radicals which leads to possible oxidation of phenolic compounds and could produce the differences in total polyphenol content.

Some major phenolic compounds in roasted coffee are vanillic acid, chlorogenic acid and caffeic acid (Cheong et al. 2013; Zanin et al. 2016).

Vanillic acid Chlorogenic acid Caffeic acid

Amini and Ghorannevis (2006) studied the effect of cold plasma on the stability of the

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total phenolic content and antioxidant activity in walnut. They observed that a change in voltage and input gas cause changes in the chemical components of walnuts and the variation in the volume (different contact surface) of different walnut cultivars can affect the results of cold plasma treatment in the different cultivars (Amini and Ghoranneviss 2016).

According to Perez et al. (2002) ozone reacts very efficiently on degradation of aromatic compounds of the phenolic compounds. The molecular ozone action on the aromatic compound favors the formation of hydroxylated and quinone compounds, because the formation of aliphatic compounds is originated from the rupture of the aromatic ring.

Almeida et al. (2015) showed that the total phenolic content was affected (p<0.05) only after 60 seconds under plasma indirect exposure on orange juice. Solis-Pacheco et al. (2013) observed a reduction of 38 % in total polyphenol content in chamomile samples with 10 min of plasma energy at 750 volts and a reduction of 33.1 % in cinnamon samples treated at 650 v.

In case of fresh lettuce leaves, cold plasma treatment decreased the content of all investigated phenolic acid. We showed that the degradation was not caused by photo- or thermodesorption processes at the surface but by the combined interaction of various reactive plasma species. They suggested, that the combined interactions of AR+ and . reactive oxygen species like OH, O and O2 may lead to an erosion of epidermal tissue layers of lettuce by which flavonoids and other compounds accumulated in the central vacuoles of guard cells and epidermal cells are released and degraded (Grzegorzewski et al. 2011).

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On the other hand, the antioxidant activity in roasted coffee increased in 14 % after 30 min of treatment (p<0.05) (Table). The process of etching and radiations UV occurred during plasma treatments could facilitate the increment of antioxidants (others than polyphenols) from roasted coffee. Due to the surface etching caused by the reacting species of plasma, penetration of UV radiations into the cells is facilitated and the synthesis of these secondary metabolites may be enhanced. Several studies reported that plants exposed to artificial UV-B radiations showed changes in the flavonoids biosynthesis pathway (Grzegorzewski et al. 2010; Harborne and Williams 2000).

Solís-Pacheco et al. (2013) reported increase of antioxidant activity at 750 V (21.4 %), 850 V (12.2 %) and 650 V (14.4 %) during 10 min of treatment in cinnamon samples. Thirumdas et al. (2016) observed an increase in the antioxidant properties of plasma treated basmati rice.

Antioxidant properties for polyphenols vary according to their chemical structure (Vajragupta et al. 2000; van Acker et al. 1996) and the functional OH groups in molecules (Trouillas et al. 2006). These chemical conditions influence the ability of polyphenols to scavenge free radicals, changing their biological activity.

Then, the conditions for application of cold plasma need further optimization in order to assure optimal roasted coffee quality during treatments (input gas, voltage, time treatment, gas type or gas mixture, food matrix, etc.). It is also important to elucidate the molecule fragments resulted from the erosion and UV radiations produced during cold plasma treatments to better understand the relationship between antioxidant activity and polyphenols content resulted on treated coffee samples.

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Conclusion

The emergent technology cold plasma processing is an innovative technology with potential on industrial applications. This research demonstrated that plasma treatment during 30 min at 30 W input power and a voltage of 850 volts with Helium gas 1.5 L/min can be employed to preserved sensory and aromatic properties. However, the total soluble phenol compounds contained in roasted coffee was reduced by 12 %, while the antioxidant activity increase in 14 % after 30 min of treatment. Cold plasma is an eco- friendly technique with minimal changes to food products, making it a befitting alternative to traditional techniques. However, it is important to investigated the interaction of individual reactive species and /or unravel oxidation reaction pathways in food.

Acknowledgments

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References

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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CAPÍTULO 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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CAPÍTULO 7. CONCLUSIONES

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CAPÍTULO 7. CONCLUSIONES

CAPÍTULO 7.- CONCLUSIONES

En el presente estudio se aislaron 22 hongos de café tostado de la región de Nayarit, se detectó la presencia del género Aspergillus (54.54 %) con mayor porcentaje de incidencia. Dentro del género Aspergillus spp. se encontraron diferentes especies que fueron clasificadas según sus características macroscópicas y microscópicas, y a su vez comparadas con claves taxonómicas.

De acuerdo al análisis en HPLC con detector de fluorescencia. sólo tres cepas presentaron producción de OTA, mientras que las demás cepas se consideraron como no productoras de OTA o AFLA (AFLA G2, AFLA G1, AFLA B2, AFLA B1). Los hongos micotoxigénicos que presentaron OTA fueron las cepas 11 con una concentración de 0.36 µg/kg, R16 0.36 µg/kg y 6N 1.162 µg/kg.

Para la identificación molecular, las cepas fueron amplificadas a 550 pares de bases mediante la secuenciación de la región ITS1- 5.8S-ITS2 de ADNr con PCR. La cepa R16 mostró similitud del 95 % con Aspergillus niger, la cepa identificada con el numero 11, presentó el 99 % con Aspergillus versicolor. Las cepas de referencia 12 y 13 ambas mostraron similitud del 100 % con Aspergillus steynii y Aspergillus westerdijikiae, respectivamente. La cepa 6N mostró 100 % de similitud con el hongo Byssochlamys spectabilis, esta especie fue identificado por primera vez en café tostado utilizando los cebadores ITS1 e ITS4 amplificado con 500 pb aprox.

Se logró una esterilización de las muestras de café tostado inoculadas con hongos micotoxigenicos (1x105 esporas/mL) y tratadas con plasma frío, a partir de 6 min de

152

CAPÍTULO 7. CONCLUSIONES

tratamiento, correspondiente a una reducción aproximada de 4 Log, con un flujo de gas helio de 1.5 (L/min) a 30 W de entrada y 850 voltios de salida.

Se obtuvieron tiempos de reducción decimal del hongo Aspergillus steynii de D1= 5.91 min y D2= 0.30 min, seguido de Aspergillus westerdijikiae D1= 4.33 min y D2= 0.33 min, luego Byssochlamys spectabilis D1= 4.30 min y D2=0.28 min, posterior Aspergillus niger con D1= 4.14 y D2= 0.28 min, finalmente Aspergillus versicolor D1= 3.67 min y D2= 0.33 min.

Los hongos micotoxigénicos evaluados durante 21 días (27 ºC) presentaron producción significativa de ocratoxina A significativa en el café tostado. El hongo A. westerdijikiae mostró una producción de 87.88 µg/kg-1, A. steynii 58.87 µg/kg-1, A. niger 79.17 µg/kg-1 y A. versicolor 66.73 µg/kg-1.

Las muestras irradiadas en periodos de 30 min, presentaron una reducción parcial de ocratoxina A. Para OTA producida por A. westerdijikiae se obtuvo una reducción más alta de 60.60 %, seguida de la producida por A. steynii con 52.86 %, A. niger con 40.31 % y A. versicolor con una disminución del 33.31 %.

El ensayo con Artemia salina mostró la toxicidad en las muestras, el café tostado sin tratar se determinó como “tóxico”, mientras que la toxicidad para el café tratado con plasma frío se redujo a “ligeramente tóxico”.

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CAPÍTULO 7. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos a partir de las pruebas sensoriales nos permiten concluir que las muestras de café tostado tratadas con gas helio irradiada a 30 min no mostraron diferencia significativa (P > 0.05) con las muestras no tratadas con respecto a los atributos de olor, color, sabor y aceptación general.

La diferencia de color ∆E determinada entre café tratado con plasma frío y sin tratar, fue inferior a 1, por lo que es difícilmente perceptible por el ojo humano.

En lo que respecta a los compuestos aromáticos, no se alteró sensiblemente el perfil aromático de las muestras tratadas con plasma frío, respecto a las no tratadas.

En cuanto a la actividad antioxidante observamos un aumento del 14 %, mientras en los compuestos fenólicos hubo una reducción significativa del 12 % en muestras de café tostado tratadas con plasma frío durante 30 min.

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