Molekularsystematische Studien in der Subtribus Thrinacinae, mit besonderer Berücksichtigung der Gattung Trachycarpus H. Wendl. (Arecaceae)

Diplomarbeit im Studienfach Biologie

vorgelegt von Chris Stührk

Biozentrum Klein Flottbek und Botanischer Garten Hamburg, 2006 Gutachter: Prof. Dr. Hans-Peter Mühlbach Prof. Dr. Jens G. Rohwer I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Die Familie der Arecaceae 1 1.2 Subtribus Thrinacinae Becc. (1907) 6 1.3 Die Gattung Trachycarpus H. Wendl. (1861) 10 1.4 Fragestellung 18 1.5 ITS Analyse 18

1.6 AFLP, RAPD, ISSR & cpSSR 20 1.7 AFLP Analyse 20 2 Material und Methoden 22 2.1 Material 22 2.1.1 Pflanzenmaterial und Herkunft 22 2.1.2 Chemikalien und Enzyme 22 2.1.3 Behandlung von Geräten und Lösungen 22 2.1.4 DNA-Längenmarker 22 2.1.5 Oligonucleotide (ITS) 23 2.1.6 Oligonucleotide für AFLP Analyse 23 2.2 Methoden 27 2.2.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen 27 2.2.2 Karyologische Untersuchungen 27 2.3 Molekularbiologische Untersuchungen 28 2.3.1 DNA-Isolierung 28 2.3.2 Gelelektrophorese 29 2.3.3 Konzentrationsbestimmungen von DNA-Lösungen 30 2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion für die ITS Untersuchungen 30 2.4.2 Aufreinigung der PCR Produkte 32 2.4.3 Sequenzierungsreaktion 32 2.4.4 Fällung der Sequenzreaktion 33 2.4.5 Auftrennung der Sequenzreaktion 33 II

2.4.6 Auswertung der Sequenzen 34 2.4.7 Phylogenetische Analyse 34 2.5.1 AFLP 35 2.5.2 Restriktionsverdau 36 2.5.3 Ligation der Adapter 36 2.5.4 Präamplifikation 37 2.5.5 Selektive Amplifikation 38 2.5.6 Längenstandards für den ALFTMexpress 38 2.5.7 Aufbau des Polyacrylamidgels 40 2.5.8 Probenvorbereitung und Beladung des Gels 40 2.5.9 Gellauf am automatischen Sequenzierer 41 2.5.10 Auswertung der AFLP-Gele am Computer 41 2.5.11 Berechnung der Daten 42 3 Ergebnisse 43 3.1 Morphologische Untersuchungen 43 3.2 Karyologische Untersuchungen 46 3.3 ITS 49 3.3.1 Ergebnisse der ITS Analyse 49 3.4 AFLP 52 3.4.1 Ergebnisse der AFLP Analyse 52 3.4.2 Phylogramme der AFLP Analyse 53 4 Diskussion 70 4.1 Diskussion der morphologischen Untersuchungen 70 4.2 Diskussion der karyologischen Untersuchungen 71 4.3 Diskussion der ITS Analyse 73 4.4 Diskussion der AFLP Analyse 76 4.4.1 Diskussion der AFLP Analyse und ITS Analyse 78 5 Zusammenfassung 86 5.1 Zusammenfassung 86 5.2 Abstract 86 6 Literaturverzeichnise 88 7 Anhang 95 8 Danksagung 128 9 Eidesstattliche Erklärung 129 III

Abkürzungsverzeichnis

AFLP amplified fragment length polymorphism bp Basenpaar cf. conferre, vergleiche! cpDNA Chloroplasten-DNA cpSSR Chloroplasten simple sequence repeats Cy5 Indodicarbocyanin-Fluorochrom DAPI Diamidino-2-phenylindol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotid-5´-Triphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alteri/et alii (und andere) ISSR inter simple sequence repeats ITS internal transcribed spacer µM mikromolar mA milliAmpere ng Nanogramm NJ Neighbor-joining nm Nanometer PCR polymerase chain reaction pers. Mitt. Persönliche Mitteilung pg Picogramm Primerkombi A Primerkombination Eco ATG + Mse AAT Primerkombi B Primerkombination Eco ATG + Mse AGG RAPD random amplified polymorphic DNA REM Rasterelektronenmikroskop RNA Ribonukleinsäure RNAse Ribonuklease SSR simple sequence repeats TBE Tris-Borat-EDTA Tris Tris-(Hydroxymethyl-)Aminomethan IV

UPGMA unweighted pair group method using arithmetic averages Upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett µm Mikrometer v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen V

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Verbreitung der Arecaceae welweit. 1 Abbildung 1.2: Strict consensus tree der trnL-trnF Analyse von Baker et al. (1999). 4 Abbildung 1.3: Strict consensus tree der kombinierten rps16 und trnL-trnF Analyse von Asmussen et al. (2000). 5 Abbildung 1.4: Typische Blattsegmenteinteilung von Fächerpalmen. 7 Abbildung 1.5: Hastula-Typen verschiedener Fächerpalmen 8 Abbildung 1.6: Prophyll einer Infloreszenz einer Fächerpalme (Schippia). 9 Abbildung 1.7: Eophyll (erstes Sämlingsblatt) von Phoenix. 9 Abbildung 1.8: Verbreitung der Thrinacinae weltweit. 10 Abbildung 1.9: Trachycarpus takil im Habitat, Oktober 2005. 15 Abbildung 1.10: Oval-kaffeebohnenförmige Samen der Trachycarpus sp. ’Nagaland’ 16 Abbildung 1.11: Reniforme Samen der Trachycarpus geminisectus. 16 Abbildung 1.12: Trachycarpus fortunei Typuspflanze in den Royal Botanic Gardens, Kew. 17 Abbildung 1.13: Relative Lage der ETS, ITS- und IGS Abschnitte innerhalb eines rDNA Operons. 19 Abbildung 2.1: Die relative Lage der ITS Primerbinderegionen – schematisch. 23 Abbildung 3.1: Epicuticulare Wachsablagerungen auf der Unterseite eines Blattsegments von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43. 43 Abbildung 3.2: Epicuticulare Wachsabsonderung im Querschnitt von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM, Schrägansicht). 44 Abbildung 3.3: Epicuticulare Wachsabsonderung in Aufsicht von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM). 44 Abbildung 3.4: Epicuticulare Wachsabsonderung in Nahansicht von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM). 45 Abbildung 3.5: Trachycarpus princeps # 2 (Typuspflanze) im BG Hamburg 46 Abbildung 3.6: DNA-Histogramm von Trachycarpus nanus # 8. 47 Abbildung 3.7: DNA-Histogramm von Trachycarpus fortunei x takil # 16. 47 Abbildung 3.8: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 15. 48 Abbildung 3.9: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 21. 48 Abbildung 3.10: Phylogramm der exhaustive search Analyse (ITS). 50 Abbildung 3.11: ITS Bootstrap 50% majority-rule consensus tree (100 replicates). 51 VI

Abbildung 3.12: Phylogramm 5 des Sets 3. 54 Abbildung 3.13: Phylogramm 6 des Sets 3. 55 Abbildung 3.14: Phylogramm 9 des Sets 5. 56 Abbildung 3.15: Phylogramm 10 des Sets 5. 57 Abbildung 3.16: Phylogramm 11 des Sets 6. 59 Abbildung 3.17: Phylogramm 12 des Sets 6. 61 Abbildung 3.18: Gesamtphylogramm 1 der Sets 3, 5 und 6. 63 Abbildung 3.19: Gesamtphylogramm 2 der Sets 3, 5 und 6. 65 Abbildung 3.20: Gesamtphylogramm 3 der Sets 3, 5 und 6. 67 Abbildung 3.21: Gesamtphylogramm 4 der Sets 3, 5 und 6. 69 Abbildung 4.1: Ansichtskarte aus Lugano (1913). 72 Abbildung 4.2: Ansichtskarte aus Lugano (1927). 72 Abbildung 4.3: Die Verteilung der Kontinente vor ca. 135 Millionen Jahren. 74 Abbildung 4.4: Verbreitung der T. princeps entlang des Nujiang (Yunnan, China) 79 Abbildung 4.5: Herbarblatt (Holotyp) der Trachycarpus takil Becc. 80 Abbildung 7.1: Phylogramm 1 des Sets 1. 114 Abbildung 7.2: Phylogramm 2 des Sets 1. 115 Abbildung 7.3: Phylogramm 3 des Sets 2. 116 Abbildung 7.4: Phylogramm 4 des Sets 2. 117 Abbildung 7.5: Phylogramm 7 des Sets 4. 118 Abbildung 7.6: Phylogramm 8 des Sets 4. 119 Abbildung 7.7: Phylogramm 13 des Sets 7. 120 Abbildung 7.8: Phylogramm 14 des Sets 7. 121 Abbildung 7.9: Phylogramm 15 des Sets 7. 122 Abbildung 7.10: Phylogramm 16 des Sets 7. 123 Abbildung 7.11: Phylogramm 17 des Sets 7. 124 Abbildung 7.12: Phylogramm 18 des Sets 7. 125 Abbildung 7.13: Phylogramm 19 des Sets 7. 126 Abbildung 7.14: Phylogramm 20 des Sets 7. 127 VII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Klassifikation der Arecaceae nach Dransfield und Uhl. 2 Tabelle 1.2: Subtribus Thrinacinae. 10 Tabelle 1.3: Kurzbeschreibungen der Arten der Gattung Trachycarpus. 11 Tabelle 2.1: Bezeichnung und Sequenz der verwendeten ITS-Primer. 23 Tabelle 2.2: Primer zur Amplifikation des Internen Standards nach Rudolph (2001). 24 Tabelle 2.3: AFLP-Adapter nach Vos et al. (1995). 24 Tabelle 2.4: AFLP-Primer nach Vos et al. (1995). 25 Tabelle 2.5: Primerkombinationen zur Herstellung von PCR-Produkten definierter Länge. 39 Tabelle 3.1: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AAT. 52 Tabelle 3.2: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AGG. 52 Tabelle 7.1: Gesamtaufsammlung – nach laufender Labornummer geordnet. 95 Tabelle 7.2: Gesamtaufsammlung – alphabetisch. 98 Tabelle 7.3: Gesamtaufsammlung Thrinacinae – alphabetisch. 102 Tabelle 7.4: Angaben und Koordinaten der Herkünfte. 105 Tabelle 7.5: Händler- und Sammlerverzeichnis. 106 Tabelle 7.6: Taxa der ITS Analyse. 107 Tabelle 7.7: Sets der AFLP Analyse (Primerkombinationen und Taxa). 108 Tabelle 7.8: Chemikalienliste. 112 Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Die Familie der Arecaceae

Die Palmen (Arecaceae oder auch Palmae) sind eine Familie der Monokotylen (Liliopsida) und einzige Familie der Ordnung der Palmenartigen (Arecales), die schon vor etwa 70 Millionen Jahren in der Kreidezeit weit verbreitet war. Die Arecaceae zeigen einen pantropischen Verbreitungsschwerpunkt, vor allem im malesischen Raum und in Amazonien. Relativ artenarm an Palmen dagegen ist Afrika, wie die Abbildung 1.1 veranschaulicht.

Abbildung 1.1: Verbreitung der Arecaceae weltweit (Lötschert, 1985).

Die Angaben über die Anzahl der Palmenarten variieren zwischen 2.500 und 3.500, und über die der Gattungen zwischen 210 und 236 (Jones, 2000). In der Familie der Palmen findet sich das längste Blatt (bei Palmen der Gattung Raphia mit bis zu 25 m Länge), der größte Same (von der Seychellenpalme Lodoicea mit bis zu 22 kg Gewicht), sowie die blütenreichste terminale Infloreszenz (des Pflanzenreichs in der Gattung Corypha mit geschätzten 10 Millionen Blüten pro Infloreszenz). Das Ziel einer allumfassenden Einleitung 2

Klassifikation der Palmen, eines „Genera Palmarum“, verfolgte Harold E. Moore Junior vom L.H. Bailey Hortorium der Cornell University. Moore verstarb 1980, bevor sein Werk vollendet werden konnte. Die Aufzeichnungen wurden jedoch von John Dransfield von den Royal Botanical Gardens Kew und Nathalie Uhl von der Cornell University verwendet, um die erste umfassende Monographie aller bekannten Palmengattungen fertig zu stellen, die unter dem Namen „Genera Palmarum – A classification of palms based on the work of Harold E. Moore, Jr.” erschien (Uhl et al., 1987). Nach dieser Klassifikation werden die Arecaceae in sechs Unterfamilien gegliedert, mit 200 Gattungen und ca. 2.675 Arten. Tabelle 1.1 veranschaulicht dieses Konzept.

Tabelle 1.1: Klassifikation der Arecaceae nach Dransfield und Uhl (Uhl et al., 1987). Unterfamilie Tribus Beispiele von Gattungen Coryphoideae Corypheae Brahea, Chamaerops, Corypha, Livistona, Sabal, Trachycarpus Phoeniceae Phoenix Borasseae Borassus, Hyphaene, Latania, Lodoicea Calamoideae Calameae Calamus, Metroxylon, Raphia, Salacca, Lepidocaryum Lepidocaryeae Nypoideae Nypa Ceroxyloideae Cyclospatheae Pseudophoenix Ceroxyleae Chamaedorea, Ceroxylon Hyophorbeae Hyophorbe Arecoideae Caryoteae Arenga, Caryota Iriarteeae Iriartea Podococceae Podococcus Areceae Archontophoenix, Areca, Chrysalidocarpus, Cyrtostachys, Euterpe, Howea, Roystonea Cocoeae Bactris, Cocos, Elaeis, Jubaea, Orbignya, Syagrus Geonomeae Geonoma Phytelephantoideae Phytelephas Einleitung 3

Nach neueren molekularen Studien sind die Corypheae (Coryphoideae), Podococceae, Areceae und Cocoeae (Arececoideae) keine monophyletischen Gruppen. Henderson (2002) unterteilt die Cocoeae in „nonspiny cocosoids“ und in „spiny cocosoids“. Die „nonspiny cocosoids“ entsprechen den Subtriben Beccariophoenicinae, Butiinae, Attaleinae und Elaeidinae. Für diese Gruppe gibt es keine offensichtliche Apomorphie. Jedoch bilden die „spiny cocosoids“, die der Subtribus Bactridinae entsprechen, eine monophyletische Gruppe, die durch Dornen und knochiges Endokarp gestützt wird. Untersuchungen der größten Tribus der Palmen, der Areceae, mit Hilfe zweier nukleärer „low-copy“ Gene, der Malatsynthase (MS) und Phosphoribulokinase (PRK) ergaben, dass die Subtriben Iguanurinae, Dypsidinae, Oncospermatinae und Arecinae polyphyletische Gruppen bilden (Lewis & Doyle, 2002). Eine Untersuchung der trnL-trnF Region der cpDNA der Arecaceae (Baker et al., 1999) erbrachte eine basale Polytomie in der Innengruppe, besonders in der Unterfamilie Coryphoideae (Abb. 1.2). Jedoch formten in dieser Studie die neuweltlichen Thrinacinae eine moderat unterstützte monophyletische Gruppe mit einem Jackknife Wert von 86%. Die altweltlichen Thrinacinae dagegen konnten nicht aufgelöst werden, bis auf Chamaerops humilis L., welche als Schwester von Phoenix reclinata Jacq. auflöste mit einem Jackknife-Wert von 88%. Die Thrinacinae, welche zu den Fächerpalmen gehören, sind aufgrund des Blütenbaues (apokarpe Karpelle) mit den Phoeniceae (Fiederpalmen) verwandt. Die Thrinacinae zeichnen sich durch eine recht ursprüngliche trimere Blüte aus (Uhl et al., 1987). Einleitung 4

Thrinacinae

Abbildung 1.2: Strict consensus tree der trnL-trnF Analyse von Baker et al. (1999). Zahlen unterhalb der Zweige stellen Jackknife Werte dar.

Die Analyse von Baker et al. (1999) konnte nicht alle Unterfamilien stützen, die im „Genera Palmarum“ (Uhl et al., 1987) vorgeschlagen wurden. Die Unterfamilie Arecoideae bildet keine monophyletische Gruppe. Caryota, Wallichia, Arenga und Iriartea bilden einen vom Rest der Arecoideae getrennten „clade“. Eine Studie, basierend auf einer Kombination der Sequenzen des rps16 Introns und des trnL-trnF spacers (beides cpDNA), ergaben eine etwas bessere Auflösung, auch wenn die Kerngruppe der Einleitung 5

Coryphoideae nicht weiter aufgelöst werden konnte (Asmussen et al., 2000, siehe Abb. 1.3).

Thrinacinae

Thrinacinae

Abbildung 1.3: Strict consensus tree der kombinierten rps16 und trnL-trnF Analyse von Asmussen et al. (2000). Zahlen unterhalb der Zweige stellen Jackknife Werte dar. Einleitung 6

1.2 Subtribus Thrinacinae Becc. (1907)

Die Subtribus Thrinacinae gehört zur Tribus Corypheae, Unterfamilie Coryphoideae. Vierzehn Gattungen werden dieser Subtribus zugerechnet. Tabelle 1.2 gibt die Gattungen der Thrinacinae wieder, deren Zahl der Arten und ungefähre Verbreitung (Dransfield & Uhl, 1998). Davon sind acht Gattungen neuweltlich und sechs Gattungen altweltlich. Rhapidophyllum hystrix wird - obwohl in Florida beheimatet - zur altweltlichen Gruppe gerechnet (Shuey & Wunderlin, 1977). Die hauptsächlichen evolutionären Trends in der neuweltlichen Gruppe sind die Reduktion der Karpelle auf eines und die Reduktion des Perianths zu einer einzelnen Cupula. In der altweltlichen Gruppe sind die Haupttrends der Spezialisierung der Diözie und Fusion der Segmente des Perianths. Die Thrinacinae sind pollakanth und besitzen palmate oder costapalmate Blätter, die in der Regel induplikat sind, nur bei Guihaia reduplikat (siehe Abb. 1.4). Die Hastula ist adaxial gut entwickelt, oftmals dreieckig, abaxial dagegen klein oder ganz fehlend (siehe Abb. 1.5, Rhapis). Die Infloreszenzen sind interfoliar inseriert, jede trägt ein tubuläres bicarinates (zweifach gekieltes) Prophyll und keine bis (gewöhnlich) sieben pedunculäre Brakteen (siehe Abb. 1.6). Die Antheren sind latrors. Die Pollenkörner sind elliptisch, sulkat (pantoperkulat in Chamaerops, gelegentlich trichotomosulcat in Cryosophila) mit einer feinen reticulaten oder seltener tectaten Exine. Die Karpelle sind frei, gewöhnlich sind es drei, seltener eins bis vier. Das Endosperm ist homogen und in Chamaerops ruminiert. Die Eophylle (siehe Abb. 1.7) sind einfach und bifid in Chelyocarpus (Uhl et al., 1987). Abbildung 1.8 zeigt die Verbreitung auf einer Weltkarte. Einleitung 7

Abbildung 1.4: Typische Blattsegmenteinteilung von Fächerpalmen (Uhl et al., 1987). Einleitung 8

Abbildung 1.5: Hastula-Typen verschiedener Fächerpalmen (Uhl et al., 1987). Einleitung 9

Abbildung 1.6: Prophyll einer Infloreszenz einer Fächerpalme (Schippia) (Uhl et al., 1987).

Abbildung 1.7: Eophyll (erstes Sämlingsblatt) von Phoenix (Uhl et al., 1987). Tabelle 1.2: Subtribus Thrinacinae (Dransfield & Uhl, 1998). Einleitung 10

Gattung # Arten Verbreitung

1. Trithrinax Mart. 4 Bolivien, S Brasilien 2. Chelyocarpus Damm. 4 Bolivien, Brasilien, Peru 3. Cryosophila Blume 10 W Mexiko, NO Kolumbien 4. Itaya H. E. Moore 1 Peru, Brasilien 5. Schippia Burret 1 Belize, Guatemala 6. Thrinax O. Swartz 7 Jamaika, Karibik, Kuba 7. Coccothrinax Sargent 49 Kuba 8. Zombia L.H. Bailey 1 Hispaniola 9. Trachycarpus H. Wendl. 6 S Himalaya, N Thailand, China 10. Rhapidophyllum H. Wendl. & Drude 1 SO USA 11. Chamaerops L. 1 W Mittelmeer 12. Maxburretia Furtado 3 Malaysia, S Thailand 13. Guihaia J. Dransf., SK. Lee & F.N. Wei 2 S China, N Vietnam 14. Rhapis L. f. ex W. Aiton 12 S China, Indochina, Thailand

Abbildung 1.8: Verbreitung der Thrinacinae weltweit (Uhl et al., 1987).

1.3 Die Gattung Trachycarpus H. Wendl. (1861)

Der Name Trachycarpus stammt aus dem Griechischen und leitet sich von „trachos“ = „rauh“ und „karpos“ = „Frucht“ ab. Trachycarpus ist solitär, in der Regel diözisch, manchmal polygamo-diözisch. Die Chromosomenzahl beträgt n = 18 (Uhl et al., 1987). Die Gattung Trachycarpus umfasst je nach Autor sechs bis neun Arten (Kimnach, 1977; Einleitung 11

Uhl et al, 1987; Jones, 2000). Die „World Checklist of Monocotyledons“ (Govaerts & Dransfield, 2006) gibt acht Arten an. Beccari (1931) hat in seiner Revision der Gattung Trachycarpus, die bereits bekannten Arten T. martianus und T. excelsa (= T. fortunei) ausführlicher sowie T. takil, T. wagnerianus, T. nanus und T. caespitosa neu beschrieben. In den 90iger Jahren des letzten Jahrhunderts und Anfang dieses Jahrhunderts wurden T. princeps, T. oreophilus, T. latisectus und T. geminisectus neu beschrieben (Gibbons et al., 1995, 2003; Gibbons & Spanner, 1997, 1998; Spanner et al., 1997). Die Typusart ist Trachycarpus fortunei (Hook.) H. Wendl. Tabelle 1.3 fasst kurz die Arten und deren hauptsächliche morphologische Unterscheidungsmerkmale aus den Beschreibungen zusammen. Die floralen Strukturen unterscheiden sich in den Beschreibungen kaum. Trachycarpus wagnerianus Becc. wird von Govaerts & Dransfield (2006) inzwischen als Synonym von Trachycarpus fortunei (Hook.) H. Wendl. angesehen. Ebenso wird die horstbildende T. caespitosa Becc. nicht akzeptiert; vermutlich handelte es sich um mehrere zusammen gepflanzte Exemplare, die nur den Eindruck eines Horstes erweckten.

Tabelle 1.3: Kurzbeschreibungen der Arten der Gattung Trachycarpus. Spezies Blätter Stamm Frucht und Same T. fortunei ½ bis ¾ kreisförmig. Dicht mit Fasern Frucht bläulich, H. Wendl. Segmente zerteilen das bedeckt, teilweise Samen nierenförmig, Blatt sehr tief und „wollig“. Alte Blätter ca. 12 mm lang. unregelmäßig. Auf jeden und Blattbasen sehr tiefen Einschnitt verbleiben permanent folgen 2-3 weniger tief am Stamm. eingeschnittene Im hohen Alter kann Segmente. der untere Teil des Segmente 50 bis 90 cm Stammes auch nackt lang. Blattdurchmesser sein. ca. 90 cm bis 1,5 m. Max. Stammhöhe: 12 – 13 m. T. takil ½ bis ¾ kreisförmig. Dicht mit eng Frucht bläulich, Becc. Segmente zerteilen das anliegenden Fasern Samen nierenförmig, Blatt unregelmäßig bedeckt. Alte Blätter und ca. 12 mm lang. etwas tiefer als bis zur Blattbasen verbleiben Hälfte. permanent am Stamm. Segmente 50 bis 90 cm Im hohen Alter kann lang. der untere Teil des Blattdurchmesser ca. 90 Stammes auch nackt cm bis 1,5 m. sein. Max. Stammhöhe 12 – 13 m. (Fortsetzung nächste Seite) Einleitung 12

T. wagnerianus ½ bis ¾ kreisförmig. Dicht mit Fasern Frucht bläulich, Becc. Segmente zerteilen das bedeckt, teilweise Samen nierenförmig, Blatt sehr tief und „wollig“. Alte Blätter ca. 12 mm lang. (Synonym: unregelmäßig. Auf jeden und Blattbasen T. fortunei) sehr tiefen Einschnitt verbleiben permanent folgen 2-3 weniger tief am Stamm. eingeschnittene Im hohen Alter kann Segmente. der untere Teil des Segmente ca. 30 -45 cm Stammes auch nackt lang. sein . Blattdurchmesser ca. Max. Stammhöhe: ca. 8- 50 – 75 cm. 10 m. T. princeps ½ bis ¾ kreisförmig. Mit alten Blattbasen Frucht hellgelb, wenn M. Gibbons, T.W. Segmente teilen das bedeckt oder völlig reif. Blatt ziemlich nackt mit nur wenigen Samen 6 mm lang und 9 Spanner & San Y. regelmäßig bis zur alten Blättern direkt mm breit. Chen Hälfte. 45-50 Segmente, unter der Krone. 60-80 cm lang. Höhe bis 10 m. Durchmesser ca. 100- 120 cm .

T. oreophilus ¾ bis vollkreisförmig, Schlanker, aufrechter, Frucht grün, wenn unreif M. Gibbons & T.W. ca. 70 cm lang gemessen bis zu 10 Meter hoher, Die Samen sind von der Hastula. Ca. 100 unbefaserter, nackter reniform, breiter als lang Spanner cm im Durchmesser. Stamm, mit bräunlicher (ca. 6 mm lang und 11 Die etwa 60 steifen und Farbe und einem mm breit). tief gefalteten Segmente Durchmesser von 10 bis teilen die Blattfläche 16 cm, der bei noch ziemlich regelmäßig bis jungen Exemplaren etwas tiefer als zur gelegentlich auch noch Hälfte. mit alten Blattbasen bedeckt ist. T. geminisectus fächerförmig, ¾ bis Kleinwüchsig, reniform, breiter als Spanner, Gibbons, völlig kreisförmig, und vermutlich erreicht der lang, mit homogenem ca. 85 cm lang gemessen Stamm nur eine Höhe Endokarp V.D. Nguyen & T.P. von der Hastula, sowie von 2 Metern und ist Anh 130 cm breit. Sehr umhüllt von lederig, oberseits, und dauerhaften, faserigen wachsig unterseits. Ca. Blattscheiden, welche 40 Blattsegmente teilen einen Durchmesser von das Blatt auf einer Länge ca. 25 cm haben. von ¾ oder tiefer. Sie sind auf der ganzen Länge in Gruppen von 2, selten 3 Segmenten ungeteilt verbunden. T. nanus Blattsegmente steif, auf Buschartiger Wuchs, Samen ausgeprägt Becc. der Unterseite bläulich oder nur kleiner, meist nierenförmig. 10 mm bereift. Die unterirdischer Stamm. breit und 7 mm dick. Blattsegmente teilen das Blatt bis zu einer Entfernung von 5 – 10 cm zur Hastula. Blatt etwas kleiner als T. fortunei. (Fortsetzung nächste Seite) Einleitung 13

T. ukhrulense ¾ kreisförmig, 65-70 8 Meter hoch, meist Gelb bis braun, wenn Lorek & Pradhan steife Segmente, 2 – 3,5 nackt bis ca. 1,5 m reif. reniform, ca. 10 mm cm breit, teilen das Blatt unterhalb der Krone. lang, 7 mm breit. unregelmäßig 1/3 bis 2/3 Dort dann mit tief, 65-70 Segmente, Blattbasen und rauen weißlichbläulich auf Fasern bedeckt. Unterseite bereift, Durchmesser bis 30 cm. Oberseite grün. T. martianus ¾ kreisförmig, ca. 60 Schlank, 15 – 17 m Frucht gelb, wenn reif. H. Wendl. bis 80 cm lang von der hoch, aufrecht oder Konvex auf der Hastula bis zur Spitze auch verdreht, Rückseite mit einer der mittleren größtenteils nackt, da die tiefen Furche über fast Blattsegmente. Die älteren Blätter vom die gesamte Länge der Blätter werden durch die Stamm fallen. Vorderseite (wie eine Segmente regelmäßig Halbkugelförmige Kaffeebohne), länglich- bis etwa zur Blatthälfte Blätterkrone, unterhalb elliptisch, länger als geteilt, zumindest die derer ein kurzes Stück breit. 10-12 mm lang, 7- mittleren der insgesamt des Stammes aber noch 8 mm breit, leicht ca. 60 Blattsegmente. mit kurzen alten abgeflacht, gleichmäßig Danach werden die Blattbasen besetzt ist, an beiden Seiten Einschnitte ins Blatt welche an den Rändern gerundet. allmählich tiefer. in ein Netz aus Fasern übergehen, das diesen Teil des Stammes eng umspannt. T. latisectus ¾ bis völlig kreisförmig, schlanker, aufrechter, bis Frucht gelblich-braun T.W. Spanner, 65-85 cm lange 12 Meter hoher, wenn reif. 16-18 mm Segmente, je 3,5 bis 5 nackter, hellgrauer lang. Konvex auf der Noltie & M. cm breit, Stamm, der sichtbare Rückseite mit einer Gibbons Blattdurchmesser 110- Ringe zeigt. tiefen Furche über fast 135 cm. Ledrig, mit Durchmesser bis 17 cm, die gesamte Länge der weißem Tomentum in einem Bereich von Vorderseite (wie eine bedeckt. Segmente teilen 0,6 bis 2 Metern Kaffeebohne). 14-16mm das Blatt sehr unterhalb der Blattkrone lang, länglich-oval, regelmäßig bis zur mit alten, faserigen länger als breit. Hälfte Blattbasen bedeckt.

Trachycarpus wagnerianus unterscheidet sich von T. fortunei durch kleinere Blätter und kürzeren Petiolus. Trachycarpus takil Becc. (Abb. 1.9) ist endemisch in Kumaon, Indien und kommt in Höhenlagen bis zu 2400 m vor (Beccari, 1931). Diese Spezies ist selten und wurde in Indien unter Schutz gestellt (Singh et al., 1995). Trachycarpus martianus und Trachycarpus latisectus bilden kaffeebohnen- oder dattelförmige Samen (Abb. 1.10) aus, der Rest der Gattung dagegen reniforme (nierenförmige) Samen (Beccari, 1931; Abb. 1.11). Trachycarpus ukhrulense aus Manipur wurde 2004 näher beschrieben (Lorek & Pradhan, 2004). Zuvor war diese Herkunft unter den Arbeitsnamen Trachycarpus ’Manipur’ und Trachycarpus ’Naga Hills’ bekannt. In der Online-Version der „World Monocot Checklist of Monocotyledons“ (Govaerts & Dransfield, 2006) taucht diese Art jedoch nicht auf. Der Typus der T. fortunei (Hook.) H. Wendl. steht heute noch in den Royal Botanic Gardens von Kew und wurde 1846 aus China eingeführt (Baker, pers. Mitt., siehe Abb. 1.9). Einleitung 14

Die ornamentale Hanfpalme Trachycarpus fortunei H. Wendl. ist eine häufige Erscheinung an den vom Golfstrom umspülten Küsten Irlands, Cornwalls und der Bretagne. Jedoch erreicht Trachycarpus auch in der Bundesrepublik in milden Lagen ein reproduktionsfähiges Alter, welches durchschnittlich nach 10 Jahren eintritt. Adulte Blätter dieser Art zeigten erste Schädigungen zwischen -11°C und -14°C im Experiment (Larcher, 1980; Larcher & Winter, 1981; Larcher & Sakai, 1987). Auf der Krim wurden Schäden an Trachycarpus im Winter 1949 nach 35 Tagen Dauerfrost und Tiefsttemperaturen von -17°C festgestellt, die diese jedoch überlebten (Saakov, 1963). Eine ähnliche Frostresistenz besitzt Sabal minor (Jacq.) Pers., die im Südosten der Vereinigten Staaten von Amerika beheimatet ist. Walther berichtet (2003) von einem massiven Vordringen von Trachycarpus und weiterer laurophyller Arten in die Kraut- und Baumschicht des Kantons Tessin seit einigen Dekaden. Dieses ist ein weiterer Beleg für die fortschreitende Klimaerwärmung, die vom „Third assessment report“ des „Intergovernmental Panel On Climate Change“ (IPCC) dokumentiert und von der Mehrheit der Wissenschaftler anerkannt wird (IPCC, 2001). Wildstandorte von Trachycarpus fortunei sind unbekannt, aber im subtropischen China ist sie überall kultiviert zu finden. Kommerziell werden die Fasern zu Umhängen, Besen, Bürsten und Fußmatten verarbeitet (Jones, 2000). Einleitung 15

Abbildung 1.9: Trachycarpus takil im Habitat, Oktober 2005 (Foto: Tobias W. Spanner, Kalamuni, westlicher Himalaya). Einleitung 16

Abbildung 1.10: Oval-kaffeebohnenförmige Samen der Trachycarpus sp. ’Nagaland’ (unbeschrieben).

Abbildung 1.11: Reniforme Samen der Trachycarpus geminisectus. Einleitung 17

Abbildung 1.12: Trachycarpus fortunei Typuspflanze in den Royal Botanic Gardens, Kew (Foto: Bill Baker, Kew). Einleitung 18

1.4 Fragestellung

Es sollte die Frage geklärt werden, welche Arten bzw. Gruppen innerhalb der Gattung Trachycarpus existieren und dazu neben den beschriebenen Arten weitere neue unbeschriebene Herkünfte von Trachycarpus in dieser Arbeit phylogenetisch untersucht werden. Bisher gibt es hierzu keine molekularen Untersuchungen. Seltene Arten wie T. takil, welche unter Schutz gestellt wurden (Singh et al., 1995), könnten mit einem genetischen Fingerabdruck leichter identifiziert werden, da im nordindischen Habitat T. fortunei zu Zierzwecken in räumlicher Nähe zu T. takil kultiviert wird und somit Hybridisierungen zwischen diesen beiden Arten nicht ausgeschlossen werden können (Singh et al., 1995). Als erster Ansatz einer molekularen Charakterisierung der Gattung Trachycarpus und einiger Vertreter der Thrinacinae wurden ITS Untersuchungen gewählt und durchgeführt. In einem zweiten Ansatz wurden AFLP Untersuchungen mit weiteren Trachycarpus Herkünften und weiteren Thrinacinae durchgeführt.

1.5 ITS Analyse

Die ribosomale DNA (rDNA) ist im Kerngenom lokalsiert und kodiert für die Ribosomen. Sie wird biparental vererbt. Da die Ribosomen unentbehrlich für die Proteinbiosynthese sind, sind sie in allen Organismen in großen Mengen vorhanden. Bedingt durch ihre Schlüsselfunktion sind die für die Ribosomen kodierenden Gene hoch konserviert, während die dazwischen geschalteten Intergen-Regionen eine hohe Mutationsrate und somit eine hohe Variabilität aufweisen können. Bedingt durch diese Eigenschaften, bietet die rDNA ein geeignetes Werkzeug für phylogenetische Analysen, oder allgemeiner, zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen in und zwischen fast allen systematischen Kategorien. (Baldwin et al., 1995; Soltis & Soltis, 1998; Hershkovitz & Zimmer, 1996).

Das rDNA Operon ist in sechs Abschnitte gegliedert (Abb. 1.13):

- Die ETS Region (external transcribed spacer)

- das für die kleine Ribosomenuntereinheit kodierende 18S Gen

- die nicht kodierende ITS1 Region

- die kodierende 5,8S Region (Komponente der großen Ribosomenuntereinheit)

- die nicht kodierende ITS2 Region

- das für die große Ribosomenuntereinheit kodierende 26S Gen Einleitung 19

Auf die 26S Einheit folgt der non transcribed spacer (NTS), auch intergenic spacer genannt, welcher ein Operon von dem nächsten trennt. Dieses Motiv wird vielfach tandemartig wiederholt, bis zu 19.000 rDNA Operons können auf diese Weise aufeinander folgen.

Abbildung 1.13: Relative Lage der ETS, ITS- und IGS Abschnitte innerhalb eines rDNA Operons (Soltis & Soltis, 2000).

Bedingt durch ihre erforderliche Funktionalität, sind die 18S, 5.8S und 26S rDNA Regionen hoch konserviert und eignen sich potentiell für Untersuchungen hoher taxonomischer Ränge (Soltis & Soltis, 1999). Da die ITS1 und ITS2 Region lediglich transkribiert, aber nicht translatiert werden und Mutationsereignisse somit im Regelfall nicht letal sind, können Mutationen in viel stärkerem Maße akkumuliert werden, womit sie wiederum für Untersuchungen zur Phylogenie und Systematik niedriger taxonomischer Ränge von Interesse sind.

Als Ursachen der konzertierten Evolution von Genfamilien, sind hauptsächlich Genkonversionen, gefolgt von wiederholten inäqualen crossing-over Ereignissen zu sehen (Dover, 1982). Die diversen Kopien einer Genfamilie können bedingt durch diese Prozesse, innerhalb eines Genoms vollständig homogenisiert werden. Bezogen auf die ITS Region (ITS1, 5,8S und ITS2), bedeutet das, das alle Genkopien innerhalb eines Organismus identisch sein können. Trotz ihres biparentalen Vererbungsmodus können sie sich, ebenfalls durch konzertierte Evolution, auch innerhalb aller kreuzbaren Individuen einer Art angleichen. Dies sollte im Idealfall zu einer einzigen identischen ITS Sequenz innerhalb einer Art führen. Es aber ebenfalls möglich, dass eine Organismengruppe, Einleitung 20

gemessen an der Zeitskala der Evolution, erst im Artbildungsprozess begriffen ist und die Prozesse der konzertierten Evolution noch nicht abgeschlossen sind (Mayol & Rosselló, 2001). Dies kann zu einem verfälschten phylogenetischen Signal führen, bedingt durch das Vorhandensein von Pseudogenen, paralogen Genen und auch infraspezifischen Polymorphismen. So weisen z.B. innerhalb der Arecaceae die Unterfamilie Calamoideae einen hohen Grad an Polymorphie auf (Baker et al., 2000, siehe auch Kap. 4.3).

1.6 AFLP, RAPD, ISSR & cpSSR

Im Rahmen einer Vorstudie zu dieser Arbeit wurden weitere DNA-Marker, die innerhalb der Gattung Trachycarpus eine weitere Auflösung auf Populationsebene ermöglichen sollten von Dipl.-Biol. Sabrina Schmidt getestet. Getestet wurden AFLP (Zabeau & Vos, 1993; Vos et al., 1995), RAPD (Williams et al., 1990), ISSR (Litt & Luty, 1989; Weber & May, 1989; Zietkiewitz et al., 1994) und cpSSR Marker (Wang et al., 1994; Provan et al., 2001). Als Methode der Wahl erwiesen sich AFLP, da sie die beste Reproduzierbarkeit und Auswertmöglichkeit zeigten.

1.7 AFLP Analyse

Zur Analyse der Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb einer Art werden auch sog. AFLPs („amplified fragment length polymorphisms“, Zabeau & Vos, 1993) verwendet. AFLPs sind hypervariable Marker, die viele individuelle Loci in einer Reaktion amplifizieren (Gillet, 1999). Die DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten, die überhängende Enden („sticky ends“) erzeugen. Dabei erkennt eines der Restriktionsenzyme vier Basenpaare lange Sequenzen („frequent cutter“), die statistisch im Genom alle 256 bp vorkommen. Ein weiteres Restriktionsenzym, das sechs Basenpaare erkennt und schneidet („rare cutter“), kommt statistisch alle 4096 bp im Genom vor. Nach dem Doppelverdau werden an die überhängenden Enden der DNA Adapter mit einer bekannten Sequenz ligiert. Diese dienen in einer PCR den Primern als Ansatzstelle. Durch Verwendung zusätzlicher Basen an den Primern wird die Zahl der zu amplifizierenden Banden selektiv verringert. Bei je drei selektiven Basen pro Primer wird die Gesamtzahl der Fragmente um das 64fache reduziert. Diese Selektion erfolgt in zwei aufeinander folgenden PCR- Reaktionen, der Präamplifikation und der selektiven Amplifikation. Die PCR-Produkte Einleitung 21

werden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt. Auf einem Polyacrylamidgel können die Fragmente auf eine Base genau aufgetrennt werden. Diese Auftrennung der AFLPs erfolgt an einem automatischen Sequenzierer. Dabei ermöglicht eine Fluoreszenzmarkierung an dem Primer, der komplementär zum „rare cutter“ Enzym ist, die Detektion von Fragmenten, die mindestens eine Schnittstelle dieses seltener schneidenden Restriktionsenzyms enthalten. Die oft vorkommenden Fragmente, die nur durch das „frequent cutter“ Enzym geschnitten wurden, werden dadurch nicht erfasst. Aus dem Bandenmuster der AFLPs wird eine binäre Matrix aufgebaut, die als Grundlage zur Berechnung von Distanzmatrizen und Distanzbäumen dienen. AFLP Analysen wurden erfolgreich an Cocos nucifera (Perera et al., 1998; Teulat et al., 2000), Euterpe edulis (Cardoso et al., 2000) und Bactris gasipaes Populationen (Adin, et al., 2004) durchgeführt (siehe auch Kap. 4.4). Material und Methoden 22

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Pflanzenmaterial und Herkunft

Die Liste des für diese Arbeit verwendeten Pflanzenmaterials befindet sich im Anhang mit Angaben zur Herkunft und zum Sammler bzw. Händler. Soweit vorhanden, wurden die genauen Herkünfte in Tabelle 7.4 im Anhang mit Koordinaten spezifiziert. Das Lebendmaterial befindet sich im Palmengewächshaus des Botanischen Gartens Klein Flottbek. Das Herbarmaterial besteht aus getrockneten Blattsegmenten. Frische Blattproben wurden nach Erhalt auf Silica Gel getrocknet. Die Proben wurden mittels einer Stereolupe (Wild Heerbrugg, Heerbrugg, Schweiz) auf Pilz– und Parasitenbefall untersucht und gereinigt.

2.1.2 Chemikalien und Enzyme

Eine Chemikalienliste ist im Anhang (Tab. 7.8) aufgeführt. Die verwendeten Chemikalien hatten den Reinheitsgrad „pro analysis“.

2.1.3 Behandlung von Geräten und Lösungen

Lösungen und Geräte wurden für 20 min bei 121 °C und 2 x 105 Pa zur Dekontamination und Nukleaseinaktivierung sterilisiert, sofern sie hitzestabil waren. Hitzelabile Lösungen wurden steril filtriert. Das eingesetzte Wasser wurde mit der Wasseraufbereitungsanlage „Milli-RX 45 Water Purifikation System“ (Millipore Corporation Bedford, MA, USA) demineralisiert und anschließend wie oben beschrieben sterilisiert.

2.1.4 DNA-Längenmarker

Als DNA-Längenmarker wurden für Agarosegele alternativ „Smart Ladder“ (Eurogentec, Köln) oder der „1 kb Ladder“ von GeneCraft (Münster) für die Agarosegele verwendet. Material und Methoden 23

2.1.5 Oligonucleotide (ITS)

Die Sequenzen der ITS-Primer sind in Tabelle 2.1 aufgeführt.

Tabelle 2.1: Bezeichnung und Sequenz der verwendeten ITS-Primer. Name Sequenz von 5’ nach 3’ Autor ITS 1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al., 1990 ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al., 1990

Synthetisiert wurden die Primer von der Firma Sigma Genosys (Steinheim). Die lyophilisierten Primer wurden in sterilem Wasser gelöst, die Lagerung erfolgte bei –20 °C. Die Konzentration der Primerstammlösungen betrug 100 µM, die der Arbeitslösungen 10 µM. Die Ansatzstellen der Primer im Genom/ and die genomische DNA sind in der Abbildung 2.1 dargestellt. Jeder spacer ist in Angiospermen typischerweise weniger als 300 bp lang (Baldwin et al., 1995). Das 18S Gen besitzt eine Länge von 1800 bp, das 26S Gen eine Länge von 3300 bp und das 5,8S Gen ist 160 bp lang (Soltis & Soltis, 2000).

ITS 1

ITS 4 Abbildung 2.1: Die relative Lage der ITS Primerbinderegionen – schematisch (modifiziert nach: http://hermes.bionet.nsc.ru/pg/32/42.htm).

2.1.6 Oligonucleotide für AFLP Analyse

Für die AFLP-Analysen wurden Oligos verwendet, die zum einen als Adapter für die Restriktionsschnittstellen dienten. Zum anderen wurden Oligos als Primer für die sog. Präamplifikation, die selektive Amplifikation, sowie für die Herstellung von internen Standards zum Abgleich der Polyacrylamidgele benötigt. Die Zusammenstellung der Primerkombinationen für die Herstellung des internen Standards erfolgte nach Rudolph (2001). Die Sequenzen der Oligos sind in den Tabellen 2.2 bis 2.4 aufgeführt. Je ein Material und Methoden 24

Primer für die PCR zur Herstellung des internen Standards sowie für die selektive Amplifikation waren Cy5-markiert. Dieser Indodicarbocyanin-Fluorochrom-Farbstoff kann von dem Laser des automatischen Sequenzierers (ALFexpress, Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) erkannt, und damit die markierten PCR-Produkte detektiert werden. Alle verwendeten Primer wurden von der Firma Sigma-ARK (Steinheim) synthetisiert.

Tabelle 2.2: Primer zur Amplifikation des Internen Standards nach Rudolph (2001). Primer Sequenz 5’ – 3’ Verwendung KS TCG AGG TCG ACG GTA TC Primer für den 71 bp Standard M13seq GTA AAA CGA CGG CCA GT Primer für den 140 bp Standard M13seqCy5 GTA AAA CGA CGG CCA GT Cy5-markierter Primer für den 300 bp Standard M300 ACC CCA GGC TTT ACA CTT TA Primer für den 300 bp Standard SKCy5 CGC TCT AGA ACT AGT GGA TC Cy5-markierter Primer für den 71, 140 bp Standard

Tabelle 2.3: AFLP-Adapter nach Vos et al. (1995). Adapter Sequenz 5’ – 3’ Verwendung AdEcoO CTC GTA GAC TGC GTA CC Adapter zur Ligation an die EcoRI- Schnittstelle AdEcoU AAT TGG TAC GCA GTC TAC Adapter zur Ligation an die EcoRI- Schnittstelle AdMseO GAC GAT GAG TCC TGA G Adapter zur Ligation an die MseI- Schnittstelle AdMseU TAC TCA GGA CTC AT Adapter zur Ligation an die MseI- Schnittstelle Material und Methoden 25

Tabelle 2.4: AFLP-Primer nach Vos et al. (1995). Primer Sequenz 5’ – 3’ Markierung Verwendung PEcoRI+A GAC TGC GTA CCA - Präamplifikationsprimer ATT CA passend EcoRI-Adapter, +A als selektive Base

PMseI+A GAT GAG TCC TGA - Präamplifikationsprimer GTA AA passend MseI-Adapter, +A als selektive Base PEcoRI+C GAC TGC GTA CCA - Präamplifikationsprimer ATT CC passend EcoRI-Adapter, +C als selektive Base PMseI+C GAT GAG TCC TGA - Präamplifikationsprimer GTA AC passend MseI-Adapter, +C als selektive Base

SEcoRI+ATG GAC TGC GTA CCA Cy5 Primer für die Selektive ATT CAT G Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert SMseI+AAT GAT GAG TCC TGA - Primer für die Selektive GTA AAA T Amplifikation mit 3 selektiven Basen SEcoRI+ACG GAC TGC GTA CCA Cy5 Primer für die Selektive ATT CAC G Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert SMseI+ATG GAT GAG TCC TGA - Primer für die Selektive GTA AAT G Amplifikation mit 3 selektiven Basen SMseI+ACA GAT GAG TCC TGA - Primer für die Selektive GTA AAC A Amplifikation mit 3 selektiven Basen Material und Methoden 26

SEcoRI+CC GAC TGC GTA CCA Cy5 Primer für die Selektive ATT CCC Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert SMseI+CC GAT GAG TCC TGA - Primer für die Selektive GTA ACC Amplifikation mit 3 selektiven Basen SMseI+CG GAT GAG TCC TGA - Primer für die Selektive GTA ACG Amplifikation mit 3 selektiven Basen SEcoRI+CG GAC TGC GTA CCA Cy5 Primer für die Selektive ATT CCG Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert SMseI+AGG GAT GAG TCC TGA - Primer für die Selektive GTA AAG G Amplifikation mit 3 selektiven Basen

Zur Herstellung der Primerstammlösungen wurden die lyophilisierten mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100 µM gebracht und kräftig gemischt. Die Stammlösung wurde übernacht bei 4 °C resuspendiert, bevor Arbeitslösungen angesetzt wurden. Die Arbeitslösungen wurden in unterschiedlichen Konzentrationen angesetzt: Die Konzentrationen der Primer für die Prä- und die selektiven Amplifikationen betrugen 50 µM, mit Ausnahme der Cy5-markierten Primer. Hier lag die Konzentration bei 2 µM. Die Lagerung der Primerlösungen erfolgte bei –20 °C. Material und Methoden 27

2.2 Methoden

2.2.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen

Zum Studium der epicuticularen Wachse auf der abaxialen Seite der herbarisierten Palmenblätter wurden rasterelektronische Aufnahmen angefertigt. Hierzu wurde das Material mit einem Sputter (Bal-Tec Sputter-Anlage SCD 050, Witten) mit Gold bedampft (40 mA, 200 sec). Die so präparierten Proben konnten mit dem REM (Philipps XL-20, Fei Company, Oregon, USA) aufgenommen werden.

2.2.2 Karyologische Untersuchungen

Die Durchflußzytometrie (engl.: Flow Cytometry, kurz: FCM) ist eine Methode zur automatisierten Differenzierung und Zählung von Zellen und Mikropartikeln. Zellen in Suspension passieren in einem engen Strom eine Durchflußküvette. Die hochempfindliche Interaktionszone ist hierbei der Schnittpunkt zwischen dem Probenstrom und einem bzw. mehreren fokussierten Lichtstrahlen (Laser, UV-Lampe) oder einem elektrischen Feld. Optische (Streulicht, Fluoreszenz) oder elektrische Signale werden sequentiell für jeden einzelnen Partikel bzw. jede einzelne Zelle generiert. Diese Signale werden optoelektronisch detektiert und in Form einer Zellverteilung angezeigt. Messungen nukleärer DNA Mengen putativer Hybriden wurden im Labor der Abteilung Ökologie und Nutzpflanzenbiologie von Frau Dr. Schwarz mittels eines Flowcytometers (PA-II, Partec, Münster, siehe: http://www.partec.com/de/products/ploidy.html ) nach Angaben des Herstellers vorgenommen. Die Kerne wurden mit DAPI, einem Fluorochrom, AT- spezifisch gefärbt. Als Referenz wurde der 4C-Wert = 22,18 pg von Trachycarpus nanus verwendet (Röser et al., 1997). Der C-Wert (1C-Wert) eines Genotyps ist die DNA-Menge des unreplizierten haploiden Chromosomensatzes. Ein diploider Nucleus (2n = 2x) zu Beginn der Prophase und ein tetraploider Nucleus (2n = 4x) in der frühen Interphase enthalten beide eine DNA-Menge von 4C (Durka, 2002). Material und Methoden 28

2.3 Molekularbiologische Untersuchungen

2.3.1 DNA-Isolierung

Die genomische DNA wurde mit dem „Invisorb® Spin Plant Mini Kit“ der Firma Invitek (Berlin) isoliert. Die DNA Isolierung wurde modifiziert nach dem Protokoll von Rohwer & Rudolph (2005) durchgeführt. Etwa 30 mg getrocknetes Blattmaterial wurde unter Zugabe von flüssigem Stickstoff und einer Spatelspitze Seesand im Mörser mit einem Pistill zerrieben. Das fein gemahlene Blattmaterial wurde in ein Reaktionsgefäß überführt. Alternativ wurde für den physikalischen Aufschluss des Blattmaterials eine Retschmühle (Retsch GmbH, Haan) verwendet. Hierzu wurde das Material in safe-lock Reaktionsgefäße der Firma Eppendorf (Wesseling-Berzdorf) überführt und jeweils zwei Stahlkugeln zugegeben. Die safe-lock Reaktionsgefäße wurden vor dem Einsetzen in die Retschmühle in flüssigem Stickstoff gefroren. Für den chemischen Aufschluss wurden 400 µl Lysispuffer P sowie 4 µl Proteinase K (10 mg/ml) dazugegeben und kurz gemischt. Die Proben wurden für 30 min bei 65° C in einem Heizblock inkubiert und gelegentlich gemischt. Für den RNA-Verdau wurde das Lysat mit 40 µl RNase (10 mg/ µl) versetzt, kurz gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Lysat wurde 1 min bei 12.000 Upm und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert (Biofuge fresco, Rotor: 75003325, Heraeus, Hanau) und der Überstand auf die Säulen pipettiert. Diese wurden 1 min bei 12.000 Upm und RT zentrifugiert. Dem Filtrat wurden 200 µl Bindepuffer P zugesetzt und gründlich gemischt. Die Suspension wurde auf eine neue Säule gegeben und 1 min inkubiert. Für 1 min wurde bei 12.000 Upm und RT zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und die Säule wieder auf das Reaktionsgefäß gesetzt. Anschließend wurde auf die Säule 550 µl Waschpuffer I pipettiert, 1 min bei 12.000 Upm (RT) zentrifugiert und das Filtrat verworfen. Auf die Säule wurde 550 µl Waschpuffer II pipettiert, 1 min bei 12.000 Upm (RT) zentrifugiert und das Filtrat wieder verworfen. Um den restlichen Alkohol zu entfernen, wurde 2 min bei 12.000 Upm und RT zentrifugiert. Zur Elution der DNA wurden auf die Säulen 50 µl auf 65°C vorgewärmter Elutionspuffer gegeben und 5 min bei RT inkubiert. Die Proben wurden 2 min bei 12.000 Upm und RT zentrifugiert. Zur Erhöhung der Ausbeute wurden auf die Säulen weitere 50 µl des vorgewärmten Elutionspuffers pipettiert, diese ein weiteres Mal für 5 min bei RT inkubiert, 2 min bei 12000 Upm und RT zentrifugiert. Die eluierte DNA-Lösung wurde bei 4°C gelagert. Material und Methoden 29

2.3.2 Gelelektrophorese

Zur quantitativen und qualitativen Überprüfung der DNA Isolierung wurden jeweils 2 µl Probe zusammen mit 2 µl Ladepuffer auf einem 0,8%igen Agarosegel, angesetzt in 0,5x TBE aufgetragen und mittels einer Gelelektrophorese Kammer aufgetrennt. Als Marker wurden die in Kapitel 2.1.4 erwähnten Längenstandards verwendet. Die Elektrophorese wurde in einer Mini-Sub®Cell GT der Firma BioRad Laboratories GmbH (Karlsruhe) durchgeführt. Als Laufpuffer diente 0,5x TBE. Die Elektrophorese erfolgte bei 70 V für 30 min. Das Agarosegel wurde im Ethidiumbromidbad etwa 10 min gefärbt und anschließend im Wasserbad circa 10 min entfärbt. Das Ergebnis wurde unter UV-Licht (UVP Transilluminator, Kodak, Upland, USA) analysiert und mittels Digitalkamera (Olympus, Camedia Zoom 5050, Hamburg) dokumentiert.

5x TBE-Puffer, pH 8,4 (Sambrook & Russel, 2001) Tris 890 mM Borsäure 890 mM EDTA 20 mM

Ladepuffer 30% Glycerin (v/v) 0,25% Bromphenolblau (w/v)

Ethidiumbromidbad Ethidiumbromid-Stammlösung 10 mg/ml

75 µl Ethidiumbromid-Stammlösung in 250 ml H2O bidest. Material und Methoden 30

2.3.3 Konzentrationsbestimmungen von DNA-Lösungen

Neben der Absch€tzung der DNA-Konzentration im Agarosegel nach F€rbungsintensit€t des L€ngenmarkers wurde die DNA-Konzentration photometrisch mit einem Bio- Photometer (Eppendorf, Hamburg) gemessen. Hierbei wurde die optische Dichte der DNA bei einer Wellenl€nge von 260 nm gemessen. Die Berechnung der DNA-Konzentration erfolgte nach folgender Formel:

CDNA = 50 x (A260 • A260/ 0) x Verd‚nnung [ƒg/ ƒl] 1000

= 50 x „A260 x Verd‚nnung [ƒg/ ƒl] 1000

Diese Berechnungen f‚hrte das Photometer automatisiert durch. Die Qualit€t der DNA wird durch das Verh€ltnis A260 nm/ A280 nm ausgedr‚ckt. Die Ratio sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Zur Messung wurden 5 ƒl der DNA-L…sung in 45 ƒl (Verd‚nnung 1:10) Tris-HCl (pH 9,0) verd‚nnt und kr€ftig 30 sec gemischt. Der Leerwert wurde mit dem reinen Puffer abgeglichen. Die Messung wurde dreimal wiederholt und der Mittelwert berechnet. F‚r die Populationsanalysen wurden die DNA-L…sungen auf 30 ng/ƒl mit H2O bidest. verd‚nnt.

2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion für die ITS Untersuchungen

Zur Vervielf€ltigung des zu untersuchenden DNA Abschnitts wurden PCR Analysen mit den in Kapitel 2.1.5 angef‚hrten Primer durchgef‚hrt. Der Reaktionsansatz wurde in einem Volumen von 10 ƒl wie folgt zusammengestellt: Material und Methoden 31

Reaktionsansatz 1x Puffer (zur Biotherm Polymerase von GeneCraft, Münster)

5 mM MgCl2 1% DMSO 0,2 mM dNTPs 0,1 µM Primer F 0,1 µM Primer R 0,5 U Biotherm DNA-Polymerase (GeneCraft) 1 µl DNA (10 bis 30 ng/ µl)

Die Polymerase-Kettenreaktionen wurden im Thermocycler der Firma Biometra, Göttingen, Typ T personal® oder T gradient® durchgeführt. Es wurde eine „Touch-down“- PCR durchgeführt. Das Programm durchlief 39 Zyklen nach folgendem Schema, wobei die Schritte 2-4 38 mal durchlaufen wurden:

1. initiale Denaturierung bei 95 °C für 4 min

2. Denaturierung bei 95 °C für 30 sec

3. Annealing bei 50 °C für 30 sec, bei jedem weiteren Zyklus -0,1 °C

4. Elongation bei 72 °C für 60 sec, bei jedem weiteren Zyklus + 5 sec

5. 72 °C für 6 min

Die PCR-Produkte wurden nach Abschluss der Reaktion im Thermocycler bei 10 °C gekühlt.

Zur darauf folgenden Aufreinigung der PCR Produkte wurden ca. 40 µl Probe benötigt, daher wurden mehrfache 10 µl PCR Reaktionsansätze angesetzt. Eine Qualitäts- und Quantitätsprüfung der PCR Produkte wurde entsprechend den Ausführungen in Kapitel 2.3.2 vorgenommen. Material und Methoden 32

2.4.2 Aufreinigung der PCR Produkte

Die PCR Produkte wurde mit dem „Montage PCR Device Kit“ nach den Angaben des Herstellers (Millipore, Bedford, USA) aufgereinigt.

Es wurden 40 µl der Probe auf die Filter pipettiert und mit 1 x TE-Puffer auf ein Volumen von 400 µl gebracht. Die PCR-Produkte wurden bei 3.200 Upm (Biofuge fresco, Rotor: 75003325, Heraeus, Hanau) und RT für 15 min zentrifugiert und die DNA auf den Filter der Säule pipettert. Zur Resuspendierung der PCR Produkte wurden 20 µl 1x TE-Puffer auf die Filter gegeben, die Säule umgedreht und in neuen Reaktionsgefäßen für 2 minbei Raumtemperautr inkubiert. Die aufgereinigte DNA wurde bei 3.200 Upm und RT für 2 min abzentrifugiert und bei 4°C gelagert. Es wurde erneut eine Qualitäts- und Quantitätsprüfung der PCR Produkte entsprechend den Ausführungen in Kapitel 2.3.2 vorgenommen und mit einer Referenzprobe (Laurus, Cassytha) deren Größe bekannt ist, verglichen.

1x TE-Puffer, pH 8,0 (Sambrook & Russel, 2001) Tris HCl pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0 1 mM Sterilisieren unter Druck und Hitze

2.4.3 Sequenzierungsreaktion

Die Sequenzierungsreaktion erfolgte im Thermocycler unter den nachfolgend angeführten Parametern, wobei die Schritte 2 - 4 24 mal oder alternativ bis zu 30 mal durchlaufen wurden:

? initiale Denaturierung bei 96 °C, 4 min ? Denaturierung bei 96 °C, 30 sec ? Annealing bei 50 °C, 15 sec ? Elongation bei 60 °C, 4 min Material und Methoden 33

Je nach DNA-Konzentration des aufgereinigten PCR-Produkts wurden 2 bis 8,5 µl eingesetzt, bzw. etwa 500ng. Diese wurden mit H2O bidest. auf ein Gesamtvolumen von 8,5 µl gebracht und pro Ansatz wurden 2 µl DMSO, 2 µl Primer (10 µM), 2,3 µl „Big Dye“ (Abi Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) sowie 5,7 µl 2,5 x Sequenzierungspuffer hinzugefügt.

Nach Ablauf der Reaktion wurden die Proben auf 10°C abgekühlt und bis zur Fällung bei 4 °C gelagert.

2.4.4 Fällung der Sequenzreaktion

Die 20 µl Ansätze der Sequenzierungsreaktion wurden mit 80 µl 0,3 M Natriumacetat pH 5,2 und 300 µl 99,8% Ethanol versetzt, gemischt und etwa 20 min bei RT inkubiert. Der Fällungsansatz wurde bei 13.000 Upm für 60 min bei 4°C zentrifugiert (Biofuge fresco, Rotor: 75003325, Heraeus, Hanau). Der wurde Überstand verworfen und das Pellet mit 1 ml 76% Ethanol (-20°C) gewaschen und erneut 60 min mit 13.000 Upm bei 4 C° zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet etwa 5 min bei 65°C im Heizblock getrocknet.

2.4.5 Auftrennung der Sequenzreaktion

Die Auftrennung der Proben nach der Sequenzierung wurde mit dem „Abi PrismTM 3770“ Kapillarsequenzierer des Universitätsklinikums Eppendorf (Hamburg) durchgeführt. Die Kapillaren dieses Geräts sind mit einer Gelmatrix gefüllt, in dem die Einzelfragmente der Proben mit 1 bp Unterschied durch Elektrophorese voneinander getrennt wurden. Beim verwendeten Reaktionskit (Abi Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) sind an die ddNTPs entsprechend der vier verschiedenen Basen vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gebunden. Beim Durchlaufen der Kapillare wandern die kleinsten Fragmente am schnellsten und werden sukzessive durch Anregung mit Laserlicht detektiert. Material und Methoden 34

2.4.6 Auswertung der Sequenzen

Die Sequenzdaten wurden mit dem Programm „Bio Edit 5.0.9“ (Department of Microbiology North Carolina State University) umformatiert um sie mit dem Programm „SequencherTM 3.1.1“ (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA) bearbeiten zu können. Mit diesem Programm wurden die Sequenzdaten mit den dazugehörigen Chromatogrammen verglichen und manuell editiert. Die Sequenzen wurden durch Abgleich mit Datenbanken (Genbank) überprüft um eine mögliche Kontamination auszuschließen, da ITS Bereiche in allen Eukaryoten vorkommen und somit Kontaminationen durch Mikroorganismen wie z.B. Pilze oder Algen potenziell mitamplifiziert werden können.

Die Sequenzen wurden in ein Alignment gebracht, unter Berücksichtigung der größtmöglichsten Übereinstimmung aller Taxa. Gaps (Lücken) wurden nach Möglichkeit vermieden und entstandene Datenmatrix bildete die Grundlage der Berechnungen und Auswertungen.

2.4.7 Phylogenetische Analyse

Die phylogenetischen Analysen und die graphische Darstellung als Kladogramme, bzw. Phylogramme, wurden mit dem Programm PAUP (Version 4.0b10 for Macintosh™, Swofford, D. L. © 2002, Sinauer Associates Inc. Publishers, Sunderland, MA, USA) durchgeführt. Es wurde die parsimony Methode gewählt mit der Funktion exhaustive search, da die geringe Anzahl der Taxa es ermöglichte, sämtliche topologisch möglichen Kladogramme zu berechnen. ’MaxTrees’ wurde initial gleich 100 gesetzt (ohne Limit). Falls die maximale Zweiglänge gleich Null wurde, kollabierte der Zweig. Gaps wurden als ’missing Data’ behandelt. Die Bäume wurden durch Definition von Außengruppen bewurzelt. Zur statistischen Unterstüzung der Zweige wurde ein Bootstrap mit der Funktion ’branch-and-bound’ mit 100 ’replicates’ durchgeführt. Die ’upper bound’ wurde heuristisch ermittelt. Die entfernteste Sequenz wurde addiert und Zweiglängen gleich Null kollabierten. Das Ergebnis wurde als 50% majority rule consensus tree dargestellt, d.h. nur die Gruppen, die in mehr als 50% der Topologien vorkommen, wurde als Monophylum dargestellt. Die Bootstrap-Werte geben in Prozent an, wie oft ein Monophylum in Dendrogrammen wiederzufinden ist, die mit Modifikationen des ursprünglichen Material und Methoden 35

Datensatzes gewonnen wurden (Wiederfindungswahrscheinlichkeit). Der Wiederfindungstest besteht darin, aus einem Datensatz zufällig Merkmale (Spalten) auszuwählen, um einen neuen Datensatz gleichen Umfangs zusammenzustellen. In diesem neuen Datensatz fehlen naturgemäß einige Merkmale, andere treten doppelt oder mehrfach auf. Für jeden Datensatz wird die optimale Topologie (beim Maximum Parsimony- Verfahren der ’kürzeste Baum’) berechnet. Wiederholt man diese Schritte z.B. 100, 500 oder 1000 mal, dann kann man in Prozent angeben, wie oft ein Monophylum in diesen Wiederholungen vorkommt. Es kann bei einer bestimmten Zusammensetzung eines Datensatzes dazu kommen, dass nur solche Monophyla Werte über 95% erhalten, die z.B. von mehr als 3 potentiellen Apomorphien gestützt werden (Wägele, 2000). Als monophyletische Aussengruppe zur Gattung Trachycarpus wurden die Taxa Rhapidophyllum hystrix, Guihaia argyrata, Chamaerops humilis und Trithrinax campestris gewählt.

2.5.1 AFLP

Für die Populationsanalysen wurden AFLPs („amplified fragment length polymorphisms“) nach dem Protokoll von Vos et al. (1995) verwendet. Bei dieser Methode werden mittels PCR-Amplifikationen selektiv Restriktionsfragmenten genomischer DNA vervielfältigt. Dadurch können im gesamten Genom polymorphe Merkmale identifiziert werden. AFLPs können in der Regel höher auflösen als Sequenzenanalysen. Aus diesem Grund werden AFLPs auch für genetische „Fingerprints“ innerhalb einer Art eingesetzt (siehe auch Kap. 1.7 AFLP Analyse). Material und Methoden 36

2.5.2 Restriktionsverdau

Bei der Restriktion wird die genomische DNA mit den Enzymen EcoRI („rare cutter“) und Tru9I (frequent cutter, Isoschizomer MseI, beides GeneCraft, Münster) geschnitten. Der Doppelverdau wurde in zwei aufeinander folgen Reaktionen wie folgt durchgeführt:

EcoRI-Verdau 1x Puffer H passend zu EcoRI 10 µl DNA (ca. 30 ng DNA) 10 U EcoRI ad 25 µl H2O

Die Inkubation erfolgte mindestens 1 h bei 37 °C.

MseI-Verdau 25 µl EcoRI-Verdau

5 U MseI in 4,5 µl H H2O

Der Verdau wurde über Nacht bei 65 °C inkubiert.

2.5.3 Ligation der Adapter

Die einzelsträngigen Adapter (s. Kap. 2.1.6) wurden in Doppelstränge überführt, bevor sie an die Restriktionsfragmente ligiert wurden. Für den Adaptermix AdEco O + U wurden zu je 7,6 µl der beiden einzelsträngigen Eco-Adapter AdEcoO und AdEcoU 128 µl steriles Wasser gegeben. Für den Adaptermix AdMse O + U wurden 15 µl AdMseO und 15,5 µl AdMseU gemischt. Nach einer Inkubation der beiden Adaptermix-Lösungen bei 70 °C für 5 min wurden diese im ausgeschalteten Heizblock über Nacht langsam abgekühlt.

Die Ligation der Adaptermix-Lösungen an die geschnittene DNA erfolgte in folgendem Reaktionsansatz: Material und Methoden 37

Ligationsansatz 0,4 pmol AdEcoO+U 4,0 pmol AdMseO+U 3,8x Puffer+ATP (GeneCraft) 0,5 U T4 Ligase (GeneCraft) ad 6,3 µl H2O Der Ligationsmix wurde zum gesamten Restriktionsansatz pipettiert. Der Ansatz wurde 3,5 h bei 37 °C inkubiert.

2.5.4 Präamplifikation

In der Präamplifikation wurden Primer eingesetzt, die an den Adaptern und der Restriktionsschnittstelle ansetzten. Die Primer besaßen eine zusätzliche selektive Base „A“ oder „C“, um die Zahl der zu untersuchenden Restriktionsfragmente einzugrenzen. Die Sequenzen der Primer sind in Kap. 2.1.6. aufgeführt. Der PCR-Ansatz wurde nach folgendem Schema zusammengesetzt:

PCR-Ansatz: 10 µl Ligationsansatz 0,93x 10x Puffer

15 mM MgCl2 0,19 mM dNTPs 1,4 µM Primer PEcoRI+A oder C 1,4 µM Primer PMseI+A oder C 2,5 U Biotherm Polymerase (GeneCraft) ad 53,5 µl H2O

Die PCR-Reaktion erfolgte in einem Tgradient oder Tpersonal Thermocycler (Biometra, Göttingen) mit folgendem Programm: 94 °C 30 sec 20 x 60 °C 30 sec 72 °C 60 sec 1 x 10 °C 8 Material und Methoden 38

2.5.5 Selektive Amplifikation

Bei der selektiven Amplifikation wurden Primer verwendet, die zwei weitere zusätzliche Basen (YZ) besaßen. Durch diese weiteren selektiven Basen wurde die Anzahl der PCR- Produkte zusätzlich erniedrigt. Die genauen Sequenzen der selektiven Primer sind in Kap. 2.1.6 aufgeführt. Der PCR-Ansatz wurde wie folgt zusammengesetzt:

PCR-Ansatz: 1µl Präamplifikationsansatz 0,96x 10x Puffer

15 mM MgCl2 0,19 µM dNTPs 0,48 µM SEcoRI+XYZ 1,44 µM SMseI+XYZ 0,25 U Biotherm Polymerase (GeneCraft) ad 10,45 µl H2O

Für die selektive Amplifikation wurde eine „Touch-down“-PCR in einem Tgradient oder Tpersonal Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt. Der erste Zyklus des Programms bestand aus einer Denaturierung bei 94 °C für 50 sec, einem Annealing-Schritt bei 65 °C für 60 sec und einer Elongation bei 72 °C für 90 sec. Die Annealingtemperatur wurde schrittweise von 65 °C auf 56 °C abgesenkt. In den ersten drei Zyklen wurde die Temperatur um je 1 °C abgesenkt, der dritte Zyklus wurde wiederholt. In den folgenden beiden Zyklen wurde die Temperatur wieder um je 1 °C gesenkt, der letzte Zyklus wurde wiederholt. In den nächsten zwei Zyklen wurde die Annealingtemperatur wieder um je 1 °C gesenkt, und der letzte wurde wiederholt. Drei weitere Zyklen folgten mit einer Temperaturreduktion um je 1 °C. Der letzte Schritt wurde 23 x bei einer Annealingtempertur von 56 °C wiederholt. Die PCR-Produkte wurden nach Abschluss der Reaktion im Thermocycler bei 10 °C gekühlt.

2.5.6 Längenstandards für den ALFTMexpress

Zum basengenauen Abgleich der PCR-Produkte auf dem Polyacrylamidgel wurde zu jeder Probe interne Standards mit bekannter Größe gegeben. Hierfür wurden Standards der Material und Methoden 39

Größe 71 bp, 140 bp und 300 bp nach Rudolph (2001) selbst hergestellt. Als Template für die PCR diente das Phagmid pBluescript II KS (+) mit einer Länge von 2961 bp (Stratagene, La Jolla, USA). Die für die Herstellung des internen Standards benötigten Primersequenzen sind in Kap. 2.1.6 aufgelistet. Die Primerkombinationen für die Amplifikation der internen Standards sind in Tab. 2.5 aufgeführt.

Tabelle 2.5: Primerkombinationen zur Herstellung von PCR-Produkten definierter Länge. Als DNA- Template diente das Phagmid pBluescript II KS (+) (nach Rudolph, 2001). Fragmentgröße Primer Cy5-markiert Primer unmarkiert 71 bp SKCy5 KS 140 bp SKCy5 M13seq 300 bp M13seqCy5 M300

Der PCR-Ansatz wurde wie folgt zusammengesetzt (Rudolph, 2001):

1x 10x Puffer

1,5 mM MgCl2 0,2 mM dNTPs 0,2 µM Primer F Cy5-markiert 0,2 µM Primer R 2,5 U Biotherm Polymerase (GeneCraft, Münster) 30 ng Phagmid DNA ad 100 µl H2O

Die Reaktion wurde im Tgradient oder Tpersonal Thermocycler (Biometra, Göttingen) unter folgenden Reaktionsbedingungen nach Rudolph (2001) durchgeführt: 1 x 94 °C 2 min 94 °C 1 min 25 x 50 °C 1 min 72 °C 1 min 1 x 72 °C 5 min 1 x 10 °C 8 Material und Methoden 40

Je ein PCR-Ansatz (100 µl) der fertigen 71 bp, 140 bp und 300 bp Standards wurden mit 600 µl oder 300 µl ALF-Ladepuffer versetzt.

ALF-Ladepuffer (Rudolph, 2001): 5 mg Dextranblau ad 1 ml deionisiertes Formamid über Nacht schütteln, aliquotieren bei -20 °C lagern

2.5.7 Aufbau des Polyacrylamidgels

Die AFLP-Reaktion wurde auf einem automatischen Sequenzierer ALFexpress™ (Amersham Biosciences, Uppsala) basengenau aufgetrennt. Hierfür wurde ein Gel der Größe „Standard“ und einer Dicke von 0,3 mm verwendet. Die Glasplatten wurden unter fließendem Wasser gereinigt, mit H2O bidest abgewischt und mit Ethanol entfettet. In der Region des Kamms wurden nach jedem dritten Lauf 30 µl Bindesilan aufgetragen und streifenfrei verrieben, um gute Taschen zum Auftragen der Proben zu erhalten. Die Glasplatten und Spacer wurden fusselfrei zusammengesetzt und mit Klemmen befestigt. Als Gelmatrix wurde das „ReproGelTM High Resolution Kit“ der Firma Amersham Biosciences (Uppsala) verwendet. Es besteht aus zwei Lösungen, die miteinander gemischt wurden, ohne Luftblasen zu bilden. Die Gelmatrix wurde langsam zwischen die Glasplatten gegossen. Die Polymerisation des Acrylamids im Gel wurde durch UV-Licht (ReproSet UV-Tisch, Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) gestartet. Das nach ca. 10 min auspolymerisierte Gel musste innerhalb einer Stunde verwendet werden. Das Gel wurde in den automatischen Sequenzierer gehängt und mit dem Wassertank verbunden. Als Laufpuffer wurde 0,5x TBE verwendet. Der Kamm wurde vorsichtig entfernt und die Taschen mit Hilfe einer Spritze mit Laufpuffer gespült. Der Laser wurde durch Schließen des Deckels des automatischen Sequenzierers aktiviert und ausgerichtet.

2.5.8 Probenvorbereitung und Beladung des Gels

Die Proben wurden mit dem ALF-Ladepuffer mit internen Standards (Kap. 2.5.6) in einem Verhältnis von 1:1 bis 2:1 gemischt, 5 min bei 97 °C denaturiert und sofort bis zum Material und Methoden 41

Auftragen auf das Gel auf Eis gelagert. Pro Geltasche wurden maximal 8 µl der Lösung aufgetragen. In die erste und letzte Tasche des Gels, die beide unbeleuchtet waren, wurden bis zu 8 µl ALF-Ladepuffer aufgetragen, um einen gleichmäßigeren Gellauf zu erreichen. In die erste beleuchtete Tasche wurden 4 µl des Internen Standards ohne Probe pipettiert, ab der zweiten Tasche wurden jeweils bis zu 8 µl der denaturierten Proben aufgetragen. Jeweils bis zu 19 Taxa wurden ab Tasche 2 aufgetragen. In Tasche 21 wurde wieder der interne Standard allein aufgetragen und ab Tasche 22 die Wiederholung der 19 Taxa als Kontrolle.

2.5.9 Gellauf am automatischen Sequenzierer

Für die Populationsanalysen mittels AFLP wurden insgesamt 33 Gel-Läufe mit dem automatischen Sequenzierer ALFexpress mit jeweils stichprobenartiger Zusammenstellung der Taxa aus der Gesamtaufsammlung in sieben verschiedenen Sets durchgeführt. Die sieben Sets (siehe Tab. 7.7 im Anhang) wurden jeweils mit zwei Primerkombinationen getestet (Eco ATG + Mse AAT und Eco ATG + Mse AGG). Diese beiden Primerkombinationen erwiesen sich aus den getesteten Primerkombinationen (Tab. 2.4) als auswertbar.

Die Gelelektrophorese zur Auftrennung der AFLP-Proben wurde mit folgenden Laufparametern am ALFexpress™ durchgeführt: Spannung: 1500 V Stromstärke: 60 mA Leistung: 25 W Laufzeit: 700 min Temperatur: 55 °C Probenintervall: 2 sec

2.5.10 Auswertung der AFLP-Gele am Computer

Zur Auswertung der AFLP-Gele wurde das Programm ALFwinTMFragment Analyser Version 1.03 der Firma Amersham Biosciences (Uppsala, Schweden) verwendet. Das Vorhandensein einer Bande mit einer bestimmten Größe wurde als 1, das Fehlen als 0 kodiert. Material und Methoden 42

Alle Banden wurden ausgewertet, die an einem Individuum vorhanden waren. Diese wurden mit der Kontrolle auf demselben Gel überprüft. Nur PCR-Produkte, die auch in der Wiederholung vorkamen und damit reproduzierbar waren, wurden in die späteren Auswertungen übernommen. Mögliche Verschiebungen (sog. „Shifts“) der Banden von 1 – 2 bp wurden berücksichtigt und korrigiert. Zweifelhafte Banden wurden aus der Auswertung ausgeschlossen. Polymorphe Banden (Banden die nicht bei allen Taxa/Herkünften vorkommen) und monomorphe Banden (Banden die bei allen Taxa/Herkünften vorkommen) wurden gezählt. Monomorphe Banden kann man weglassen, da sie keine phylogenetische Information tragen. Bei der weiteren Auswertung wurde vorausgesetzt, dass Fragmente mit gleicher Länge homolog sind, und dass diese PCR- Produkte nicht zufälligerweise dieselbe Größe aufweisen. Die 1/0-Matrizen wurden ins Nexus-Format überführt, welches in PAUP gelesen werden kann. Taxa/Herkünfte aus mehreren Gelen wurden zu einer Gesamtmatrix kombiniert, wenn gleiche Taxa/Herkünfte aus verschiedenen Gelen reproduzierbare Bandenmuster aufwiesen.

2.5.11 Berechnung der Daten

Zur Berechnung der Distanzbäume wurde das Programm PAUP (siehe Kapitel 2.6.8) verwendet. Es wurden die Distanz-Analysen UPGMA sowie Neighbor-Joining genutzt. UPGMA steht für: „unweighted pair-group method using arithmetic averages“. Mit diesem Verfahren vergleicht man Distanzen von Objekten paarweise und berechnet für die einander nächsten Paare die gemeinsame Distanz zu den anderen Objekten mit dem arithemtischen Mittel. Neighbor Joining: Dieses Clusterverfahren benötigt nicht ultrametrische Distanzen, toleriert also auch taxaspezifische Abweichungen in den Substitutionsraten (Wägele, 2000). Einige Bäume wurden durch Aussengruppen bewurzelt. Als Aussengruppe wurde Rhapidophyllum hystrix gewählt. Ergebnisse 43

3 Ergebnisse

3.1 Morphologische Untersuchungen

Epicuticulare Wachse wurden an der Unterseite von herbarisierten Blattsegmenten der Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (Labornummern korrespondieren mit der Aufsammlungsliste Tab. 7.1 im Anhang) fotografiert (Abb. 3.1) sowie REM-Aufnahmen angefertigt. Die REM-Aufnahmen (Abb. 3.2, Abb. 3.3.) zeigen einzelne Wachsinseln in 1150facher Vergrößerung und in 5510facher Vergrößerung (Abb. 3.4). Die Wachsinseln treten linear entlang verdickter Rippen der Blattsegmente auf.

Abbildung 3.1: Epicuticulare Wachsablagerungen auf der Unterseite eines Blattsegments von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (3,7x vergrössert). Ergebnisse 44

Abbildung 3.2: Epicuticulare Wachsabsonderung im Querschnitt von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM, Schrägansicht, siehe Pfeil).

Abbildung 3.3: Epicuticulare Wachsabsonderung in Aufsicht von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM, siehe Pfeil). Ergebnisse 45

Abbildung 3.4: Epicuticulare Wachsabsonderung in Nahansicht von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM).

Beobachtet wurden die epicuticularen Wachse auch an herbarisierten Blättern der Trachycarpus latisectus #44 (Bengalen, Indien), T. fortunei #45 (Kultivar aus Bengalen, Indien), T. cf. princeps #34 (Yunnan, China), T. takil #105, T. geminisectus #64 (Vietnam) und schwach ausgeprägt an frischen Blattproben von T. princeps #2 (Yunnan, China, siehe Abb. 3.5). Nähere ökologische Angaben siehe Tab. 7.1 – 7.5. Weder an weiteren Lebendpflanzen konnten (aufgrund der Juvenilität ?) diese Wachse beobachtet werden noch an anderen herbarisierten Blättern. Ergebnisse 46

Abbildung 3.5: Trachycarpus princeps # 2 (Typuspflanze) im BG Hamburg

3.2 Karyologische Untersuchungen

Die DNA-Histogramme (Abbildungen 3.6 – 3.9) zeigen eine Verteilungskurve der gemessenen Kerne. Die Fläche des Peaks enspricht der Anzahl gemessener Partikel. Der peak bei ca. 100% relativer Einheiten der x-Achse entspricht dem externen Referenzwert von 22,18 pg 4C-DNA von Trachycarpus nanus (Röser, et al., 1997) (siehe auch Kap. 2.2.2). Analysiert wurden Trachycarpus nanus #8 (Yunnan, China), T. fortunei x takil #16 (Tessin), T. takil #15 (Beccari-Garten, Florenz) und T. takil #21. Der einzelne peak in den Histogrammen stellt einen diploiden Zustand der Probe dar. Ergebnisse 47

File: Tnanus_b.FCS Date: 27-11-2003 Time: 13:58:27 Particles: 971 Acq.-Time: 13 s partec PAS 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu. 1 1.000 81.43 743 100.00 7.30 0.12

80

60 s t n u o c

40

20

0 0 200 400 600 800 1000 FL4 Abbildung 3.6: DNA-Histogramm von Trachycarpus nanus # 8.

Detektiert wurden 971 Kerne, der 4C DNA-Gehalt betrug 18,06 pg pro Kern (22,18 pg x 81,43%).

File: TfxtTessin_2.FCS Date: 27-11-2003 Time: 13:53:08 Particles: 511 Acq.-Time: 24 s partec PAS 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu. 1 1.000 95.94 321 100.00 2.32 0.08

80

60 s t n u o c

40

20

0 0 200 400 600 800 1000 FL4 Abbildung 3.7: DNA-Histogramm von Trachycarpus fortunei x takil # 16.

Detektiert wurden 511 Kerne, der 4C DNA-Gehalt betrug 21,28 pg pro Kern (22,18 pg x 95,94%). Ergebnisse 48

File: TtakilBeccari_2.FCS Date: 27-11-2003 Time: 13:49:00 Particles: 485 Acq.-Time: 38 s partec PAS 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu. 1 1.000 101.09 351 100.00 1.93 0.05

80

60 s t n u o c

40

20

0 0 200 400 600 800 1000 FL4 Abbildung 3.8: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 15.

Detektiert wurden 485 Partikel, der 4C DNA-Gehalt betrug 22,42 pg pro Kern (22,18 pg x 101,09%).

File: TtakilPPP.FCS Date: 27-11-2003 Time: 13:32:03 Particles: 444 Acq.-Time: 65 s partec PAS 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu. 1 1.000 98.33 294 100.00 2.41 0.06

80

60 s t n u o c

40

20

0 0 200 400 600 800 1000 FL4 Abbildung 3.9: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 21.

Detektiert wurden 444 Partikel, der 4C DNA-Gehalt betrug 21,81 pg pro Kern (22,18 pg x 98,33%). Ergebnisse 49

3.3 ITS

Tabelle 7.6 im Anhang gibt die Taxa wieder, die einer ITS Analyse unterzogen wurden.

3.3.1 Ergebnisse der ITS Analyse

Die genetische Distanz (P-Distanz) zwischen den Taxa T. ’x takaghii’ #9, T. nanus #8 und Trachycarpus takil #15 betrug Null. Trachycarpus fortunei #20 und T. fortunei #11 zeigten ebenfalls keine genetische Differenz, ebenso war keine Distanz zwischen T. latisectus #26 und Trachycarpus martianus #23 vorhanden. Zur Optimierung der Berechnungen wurden Trachycarpus „x takaghii“, T. nanus #8, T. fortunei #20 sowie T. latisectus #26 nicht in die Analyse mit einbezogen. Abbildung 3.10 repräsentiert das Phylogramm der ITS Analyse gerechnet nach der Methode exhaustive search in PAUP (siehe Kapitel 2.4.7). Insgesamt wurden 713 Merkmale verrechnet. Davon waren 563 konstant und 113 variabel aber für die Parsimony uninformativ. Siebenunddreißig Merkmale waren parsimony informativ. Die Länge des kürzesten Baums (1) von insgesamt 2027025 berechneten Bäumen betrug 184 Schritte. Das Phylogramm der ITS Analyse (Abb. 3.9) bildet zwei Cluster ab. Im oberen Cluster erscheinen die untersuchten Arten der Gattung Trachycarpus und im unteren Cluster die ausgewählten Vertreter aus der Subtribus Thrinacinae. Im Trachycarpus Cluster bilden T. wagnerianus #7, T. geminisectus #29, T. fortunei #11, T. takil #15 (nicht sicher als T. takil bestimmt) und T. takil x fortunei #16 (nicht sicher als Hybride bestimmt) eine Polytomie. Basal dazu gruppiert T. martianus #23 (Nepal-Form). Trachycarpus martianus (und Trachycarpus latisectus) bilden oval-kaffeebohnenförmige Samen, die restlichen Vertreter der Gattung jedoch reniforme (nierenförmige) Samen aus. Im zweiten Cluster bildet Chamaerops humilis #5 mit Trithrinax campestris #18 einen clade, als Schwestergruppen erscheinen (unaufgelöst) Guihaia argyrata #19 und Rhapidophyllum hystrix #18. In der bootstrap Analyse (Abb. 3.11) wird die nahe Verwandtschaft der reniformen Trachycarpus mit 99% unterstützt. Der gesamte Trachycarpus Cluster wird mit 97% unterstützt. Der Chamaerops humilis #5, Trithrinax campestris #18 Clade wird mit 61% gestützt. Der Guihaia argyrata #19 Knoten kollabiert. Werte unter 50% werden auf den Zweigen nicht angezeigt. Ergebnisse 50

T wagnerianus#7

T geminisectus#29

T fortunei#11

T takil#15

T fortunei x takil#16

T martianus#23

R hystrix#4

G argyrata#19

C humilis#5

T campestris#18 10 changes

Abbildung 3.10: Phylogramm der exhaustive search Analyse (ITS). Ergebnisse 51

Bootstrap T wagnerianus#7

T geminisectus#29

99 T fortunei#11

T takil#15

T fortunei x takil#16

T martianus#23

97

R hystrix#4

G argyrata#19

C humilis#5

61

T campestris#18 Abbildung 3.11: ITS Bootstrap 50% majority-rule consensus tree (100 replicates). Ergebnisse 52

3.4 AFLP

3.4.1 Ergebnisse der AFLP Analyse

Mit PAUP (Version 4.0b10) wurden die Rechenmethoden UPGMA und Neighbor-Joining verwendet für die Berechnung der Dendrogramme. Die Tabelle 3.1 gibt Gesamtzahl detektierter Banden sowie den Anteil monomorpher Banden aus den ausgewählten sieben Sets wieder mit der Primerkombination Eco ATG + Mse AAT.

Tabelle 3.1: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AAT. Set # Gesamtzahl Banden Zahl monomorpher Zahl monomorpher Primerkombination Banden Banden in Prozent [%] Eco ATG + Mse AAT 1 553 12 2,17 2 441 6 1,36 3 478 12 2,51 4 217 1 0,37 5 293 16 5,46 6 365 2 0,55 7 317 0 0 3, 5 und 6 324 1 0,31 Durchschnitt 373,5 6,25 1,59

Die Tab. 3.2 gibt die Gesamtzahl detektierter Banden sowie den Anteil monomorpher Banden aus den ausgewählten sieben Sets wieder mit der Primerkombination Eco ATG + Mse AGG.

Tabelle 3.2: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AGG. Set # Gesamtzahl Banden Zahl monomorpher Zahl monomorpher Primerkombination Banden Banden in Prozent [%] Eco ATG + Mse AGG 1 228 34 14,91 2 198 2 1,01 3 508 12 2,36 4 492 1 0,20 5 320 11 3,44 6 276 0 0 7 407 0 0 3, 5 und 6 315 0 0 Durchschnitt 343 7,5 2,74 Ergebnisse 53

3.4.2 Phylogramme der AFLP Analyse

Die Primerkombination „Eco ATG + Mse AAT“ wird im folgenden mit „PK A“ und die Primerkombination „Eco ATG + Mse AGG“ mit „PK B“ angegeben. Die Kladogramme wurden mit der UPGMA Methode berechnet, wenn nicht anders angegeben.

Es wurden sieben Sets ausgewertet. Set 1 besteht aus verschiedenen T. fortunei Herkünften. Set 2 vergleicht Repräsentanten der „Kaffebohnen“ Gruppe (T. martianus und T. latisectus) mit Vertretern der reniformen Samen Gruppe. Set 3 beinhaltet T. wagnerianus Herkünfte (aus Korea und Japan), T. nanus Herkünfte (aus Südchina) und T. princeps aus Südchina. Set 4 vergleicht T. princeps Herkünfte mit T. wagnerianus, T. fortunei und T. takil Herkünfte sowie T. nanus. Trachycarpus wagnerianus gilt als Synonym von T. fortunei (Govaerts & Dransfield, 2000). Set 5 vergleicht T. princeps und putative T. princeps Individuen mit T. oreophilus Individuen sowie Individuen von T. geminisectus, T. ’Manipur’ und T. ’NagaHills’. Trachycarpus ukhrulense ist der gültige Name für die älteren Arbeitsnamen T. ’Manipur’ und T. ’NagaHills’ (Lorek & Pradhan, 2004). Trachycarpus ukhrulense wird aber nicht in der ’Monocot Checklist’ aufgeführt (Govaerts & Dransfield, 2006). Set 6 stellt Vertreter der „Kaffeebohnen“ Gruppe mit neueren unbeschriebenen Herkünften (T. ’Nagaland’ und T. ’Lushai’) Individuen der T. ukhrulense Gruppe sowie T. takil und T. fortunei Individuen gegenüber. In Set 7 wurden weitere Vertreter der Thrinacinae (Chamaerops humilis, Guihaia argyrata, Rhapis, Coccothrinax und Cryosophlia warscewiczii) mit Individuen der reniformen Trachycarpus verglichen. Bestimmte Proben wurden aus den Datensätzen ausgeblendet, da aufgrund degradierter DNA die Ergebnisse nicht reproduzierbar waren. Nähere Details siehe in den Beschreibungen zu den Dendrogrammen und im Diskussionsteil. Eingehend diskutiert werden die Set 3, 5 und 6, da aus ihnen kombinierte Bäume berechnet wurden (Abb. 3.12 bis 3.21). Die Bäume der Sets 1, 2, 4 und 7 befinden sich im Anhang (Abb. 7.1 bis 7.14). Ergebnisse 54

Das Phylogramm 5 (Abb. 3.12) bildet den Datensatz des Sets 3 ab (PK A). Individuen von Trachycarpus wagnerianus (#70, #106, #7 und #27), T. nanus (#33, #25, #75, #8 und #116a) und T. princeps (#10, #28, #76, #31a, #31b, #69, #35 und #71) bilden jeweils getrennte Schwesterclades. Ein Individuum von T. cf. princeps #120a clustert in dem T. wagnerianus Grade (1). Trachycarpus wagnerianus x fortunei #92 ist Schwestergruppe von 1 bis 3.

T. wagnerianus x fortunei #92

T. wagnerianus #70

T. cf. princeps #120a

T. wagnerianus #106 1 = T. wagnerianus Gruppe T. wagnerianus #7

T. wagnerianus #27

T. nanus #33

T. nanus #25

T. nanus #75 2 = T. nanus Gruppe T. nanus #8

T. nanus #116a

T. princeps #10

T. princeps #28

T. cf. princeps #76

T. princeps #31a 3 = T. princeps T. princeps #31b Gruppe

T. princeps #69

T. princeps #35

T. cf. princeps #71 10 Abbildung 3.12: Phylogramm 5 des Sets 3 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Ergebnisse 55

In Phylogramm 6 (Abb. 3.13, PK B, Set 3) bilden T. wagnerianus Exemplare (#7, #27, #70 und #106) einen Clade (1) getrennt von einem Cluster bestehend aus einem T. princeps (#10, #31a, #31b, #69, #28, #35, #71 und #76) Clade (2) und T. nanus (#116a, #33, #75, #120a, #8 und #25) Clades (3 und 4 9. Trachycarpus cf. princeps #120a gruppiert in dem T. nanus (#8 und #25) Clade 4. Trachycarpus wagnerianus x fortunei #92 ist Schwestergruppen zu allen Gruppen.

T. wagnerianus x fortunei #92

T. wagnerianus #7

T. wagnerianus #27 1 = T. wagnerianus T. wagnerianus #70 Gruppe

T. wagnerianus #106

T. princeps #10

T. princeps #31a

T. princeps #31b

T. princeps #69 2 = T. princeps Gruppe T. princeps #28

T. princeps #35

T. cf. princeps #71

T. cf. princeps #76

T. nanus #116a

T. nanus #33 3 = T. nanus Gruppe I T. nanus #75

T. cf. princeps #120a 4 = T. nanus T. nanus #8 Gruppe II

T. nanus #25 10 Abbildung 3.13: Phylogramm 6 des Sets 3 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Ergebnisse 56

In Phylogramm 9 (Abb. 3.14, PK A, Set 5) wird Cluster 1 von T. princeps #61b mit T. cf. princeps #120b sowie b#120a gebildet. Der nächste Clade mit T. princeps #109 (Dulong river Population, Yunnan) und #118 sind Schwestergruppe dazu. Ein weiterer Clade bestehend aus T. princeps #69 und T. cf. princeps #71 ist Schwestergruppe zu den vorhergehenden. Trachycarpus oreophilus (#24 und #30) bildet zu den vorhergehenden Gruppen einen Clade (2). Ein T. geminisectus Clade (3) (#63, #29, #64 und #72) grenzt sich als Schwestergruppe zu 1 und 2 ab. Der T. ’Manipur’ #46 mit T. ’NagaHills’ (#43 und #62) Clade (4) wiederum ist Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 3.

T. cf. princeps #120a

T. princeps #61b

T. cf. princeps #120b

T. princeps #109 1 = T. princeps Gruppe

T. princeps #118

T. princeps #69

T. cf. princeps #71

T. oreophilus #24 2 = T. oreophilus T. oreophilus #30 Gruppe

T. geminisectus #63

T. geminisectus #29 3 = T. geminisectus Gruppe T. geminisectus #64

T. geminisectus #72

T. Manipur #46

T. NagaHills #43 4 = T. ukhrulense Gruppe T. NagaHills #62 10 Abbildung 3.14: Phylogramm 9 des Sets 5 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 16 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Ergebnisse 57

In Phylogramm 10 (Abb. 3.15, PK B, Set 5) treten drei Cluster auf. (1) Der T. princeps Grade (#118, #109, #61b, #120a und #120b) erscheint als Schwesterclade zum (2) T. oreophilus (#24 und #30) und (3) T. ’NagaHills’ und T. ’Manipur’ (#62, #43 und #46) Clade. Basal dazu gruppiert ein T. princeps (#69 und #71) Clade (4). Schwestergruppe (5) zu den Gruppen 1 bis 4 ist der T. geminisectus Cluster (#29, #72, #63 und #64).

T. princeps #118

T. princeps #109

T. princeps #61b 1 = T. princeps Gruppe I

T. cf. princeps #120a

T. cf. princeps #120b

T. oreophilus #24 2 = T. oreophilus Gruppe T. oreophilus #30

T. NagaHills #62

T. NagaHills #43 3 = T. ukhrulense Gruppe

T. Manipur #46

T. princeps #69 4 = T. princeps

T. cf. princeps #71 Gruppe II

T. geminisectus #29

T. geminisectus #72 5 = T. geminisectus T. geminisectus #63 Gruppe

T. geminisectus #64 10 Abbildung 3.15: Phylogramm 10 des Sets 5 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 16 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Ergebnisse 58

In Phylogramm 11 (Abb. 3.16, PK A, Set 6) sind drei Gruppen zu verzeichnen. Die erste Gruppe besteht aus einem Grade (1) T. ukhrulense Clade (#122B und #122A) mit T. ’NagaHills’ #62, T. ’Manipur’ #46 (T. ’Manipur’ und T. ’NagaHills’ sind ältere unbeschriebene Synonyme von T. ukhrulense) und als „indischen“ Schwesterclade T. takil (#136 und #135). Zu diesen Clades bilden T. ’Myanmar’ #96 (unbeschriebene Herkunft) und T. takil #130 (Kumaon, Indien) sukzessiv Schwestergruppen. Clade 2 bestehend aus T. fortunei #134 (Nainital Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typuspflanze, Kew Gardens) ist Schwestergruppe zu Gruppe 1. Schwestergruppe zu den Gruppen 1 und 2 ist der T. martianus Cluster bestehend aus T. martianus #131 (Khasia Hills, Indien), T. ’Lushai’ (Lushai Hills, Indien, unbeschriebene Form) und Trachycarpus ’Nagaland’ (Nagaland, Indien, unbeschriebene Form) sowie T. ’sikkimensis’ (älterer Arbeitsname für T. latisectus) und T. latisectus #78 (Sikkim, Indien). T. ’Lushai’ und T. ’Nagaland’ gehören ebenfalls wie T. martianus und T. latisectus zur kaffebohnenförmigen Samen ausbildenden Gruppe. Basal zu diesen Gruppen tritt Rhapidophyllum hystrix #4 (Florida, USA) als Aussengruppe und unaufgelöst T. ’Doi Ang’ #97 (Doi Ang Khang, Thailand, unbeschriebene Form) auf. Ergebnisse 59

T. Doi Ang #97

Rhapidophyllum hystrix #4

T. takil Kaushani #130

T. Myanmar #96

T. takil Kalamuni #136

T. takil Thalkedar #135 1 = T. takil & T. Manipur #46 T. ukhrulense Gruppe

T. NagaHills #62

T. ukhrulense #122B

T. ukhrulense #122A

T. fortunei Nainital #134 2 = T. fortunei Gruppe

T. fortunei Kew #124

T. martianus #131

T. Lushai #113A

T. Nagaland #114A 3 = T. martianus Gruppe

T. sikkimensis #44

T. latisectus #78 10

Abbildung 3.16: Phylogramm 11 des Sets 6 (PK A; unbewurzelt; Aussengruppe: Rhapidophyllum hystrix; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Ergebnisse 60

Phylogramm 12 (Abb. 3.17) repräsentiert Set 6 mit PK B. Hier treten drei Gruppen auf, ähnlich zu Kladogramm 11. Gruppe 1 besteht aus T. takil #136 (Kalamuni, Kumaon) mit T. takil #135 (Thalkedar, Kumaon) mit dem Schwesterclade T. ukhrulense #122B mit T. ukhrulense #122A (Manipur, Indien) und als dritten Clade T. ’NagaHills’ #62 mit T. ’Manipur’ #46. Sukzessive treten als Schwestergruppen zu den erwähnten T. ’Myanmar’ und T. takil Kaushani #130 (Kumaon, Indien) auf. Als Schwestergruppe zu Gruppe 1 erscheint ein Cluster (2) aus T. ’Doi Ang’ #97, T. fortunei #134 (Nainital Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typuspflanze, Kew Gardens). Basal hiervon bildet ein Cluster (3) zwei Schwestergruppen zum einen bestehend aus T. ’Lushai’ #113A mit T. ’Nagaland’ #114A und zum anderen T. ’sikkimensis’ #44 mit T. latisectus #78. Gruppe 3 steht als Schwestergruppe zu den Gruppen 1 und 2. Sukzessive gliedern als basale Schwestergruppen von den Gruppen 1 bis 3 T. martianus #131 der Herkunft Khasia Hills (Indien) ab und als Aussengruppe zu allen vorherigen Gruppen erscheint Rhapidophyllum hystrix #4. Ergebnisse 61

Rhapidophyllum hystrix #4

T. martianus #131

T. takil Kaushani #130

T. Myanmar #96

T. takil Kalamuni #136

T. takil Thalkedar #135 1 = T. takil & T. ukhrulense Gruppe T. ukhrulense #122B

T. ukhrulense #122A

T. NagaHills #62

T. Manipur #46

T. Doi Ang #97

T. fortunei Nainital #134 2 = T. fortunei Gruppe

T. fortunei Kew #124

T. Lushai #113A

T. Nagaland #114A 3 = T. martianus Gruppe T. sikkimensis #44

T. latisectus #78 10 Abbildung 3.17: Phylogramm 12 des Sets 6 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Ergebnisse 62

In Gesamtphylogramm 1 (Abb.3.18, PK A, Sets 3, 5 und 6 kombiniert) finden sich acht Gruppen. Gruppe 1 setzt sich aus Aufsammlungen von T. wagnerianus (#106, #70, #7 und #27) zusammen. Gruppe 1 ist Schwestergruppe zu Gruppe 2, bestehend aus T. cf. princeps (#120a und #120b) und T. princeps (#61b, #120b, #109 und #118). Aus diesem bildet T. fortunei #134 (Nainital, Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typus, Kew) einen Clade 3. Gruppe 4 mit T. geminisectus (#63, #29, #64 und #72) steht als Schwestergruppe zu Gruppe 1 bis 3. Als Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 4 stehen Cluster 5 und 6. Cluster 5 besteht aus T. wagnerianus x fortunei #92 und T. nanus (#25, #75, #8 und #116a). Cluster 6 ist Schwestergruppe von (5) mit folgenden Exemplaren: T. cf. princeps (#76 und #71), T. princeps (#31a, #10, #28, #31b, #35 und #69), T. nanus #33 und T. ’Manipur’ #46. Cluster 7 ist Schwestergruppe zu den vorhergehenden Gruppen 1 bis 6 und umfasst T. takil (#130, #136 und #135), T. oreophilus (#10 und #30), T. ’Myanmar’ #96, T. ’NagaHills’ (#43 und #62) und T. ukhrulense (#122B und #122A). Die zu den Gruppen 1 bis 7 basal stehende Gruppe 8 wird gebildet von T. martianus #131, T. ’Lushai’ #113A (Lushai Hills, unbeschriebene Form), T. ’Nagaland’ (Nagaland, unbeschriebene Form), T. ’sikkimensis’ #44 (älterer Arbeitstitel von T. latisectus) und T. latisectus #78. Basal gliedern sich Rhapidophyllum hystrix #4 und T. ’Doi Ang’ #97 (Doi Ang Khang, Thailand, unbeschriebene Form) ab. Ergebnisse 63

T. Doi Ang #97 R. hystrix #4 T. wagnerianus #106 T. wagnerianus #70 1 = T. wagnerianus T. wagnerianus #7 Gruppe T. wagnerianus #27 T. cf. princeps #120a T. princeps #61b T. cf. princeps #120b 2 = T. princeps T. princeps #109 Gruppe I T. princeps #118 T. fortunei Nainital #134 3 = T. fortunei Gruppe T. fortunei Kew #124 T. geminisectus #63 T. geminisectus #29 4 = T. geminisectus T. geminisectus #64 T. geminisectus #72 Gruppe T. wagnerianus x fortunei #92 T. nanus #25 5 = T. nanus Gruppe T. nanus #75 T. nanus #8 T. nanus #116a T. cf. princeps #76 T. princeps #31a T. princeps #10 T. princeps #28 T. princeps #31b 6 = T. princeps Gruppe II T. princeps #35 T. princeps #69 T. cf. princeps #71 T. nanus #33 T. Manipur #46 T. takil Kaushani #130 T. oreophilus #24 T. oreophilus #30 T. Myanmar #96 T. NagaHills #43 7 = T. oreophilus, T. NagaHills #62 T. takil & T. ukhrulense #122B T. ukhrulense T. ukhrulense #122A Gruppe T. takil Kalamuni #136 T. takil Thalkedar #135 T. martianus #131 T. Lushai #113A T. Nagaland #114A 8 = T. martianus Gruppe T. sikkimensis #44 T. latisectus #78 10

Abbildung 3.18: Gesamtphylogramm 1 der Sets 3, 5 und 6 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 47 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP- Version 4.0b10). Ergebnisse 64

Gesamtphylogramm 2 (Abb. 3.19) spiegelt den Probensatz von Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.17) wieder, vermindert um die Taxa: T. ’Doi Ang’ #97, T. wagnerianus (#106, #70, #7 und #27), T. wagnerianus x fortunei #92, T. cf. princeps (#76 und #71), T. princeps (#31a, #10, #28, #31b, #35 und #69) und T. ’Manipur’ #46. T. ’Doi Ang’ #97 wurde entfernt, da diese Herkunft in Abbildung 3.17 als Schwestergruppe zu Rhapidopyhllum hystrix #4 erscheint. Bei T. wagnerianus handelt es sich um ein Synonym von T. fortunei. Die T. princeps Individuen der Gruppe 6 in Abbildung 3.17 wurden entfernt, da sie einen getrennten Cluster von T. princeps Exemplaren des Clusters 2 in Abbildung 3.17 bildeten. Trachycarpus takil #130 (Kaushani, Kumaon) positioniert nun als Schwestergruppe zum Rest der Gattung Trachycarpus. Trachycarpus nanus #33 gruppiert mit dem T. nanus Cluster (5). Der T. nanus Cluster erscheint hier als Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 4. Die Gruppen sind weitestgehend identisch mit den Gruppen in Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.17). Ergebnisse 65

R. hystrix #4

T. takil Kaushani #130

T. cf. princeps #120a

T. princeps #61b

T. cf. princeps #120b 1 = T. princeps Gruppe I

T. princeps #109

T. princeps #118

T. fortunei Nainital #134 2 = T. fortunei Gruppe T. fortunei Kew #124

T. geminisectus #63

T. geminisectus #29 3 = T. geminisectus T. geminisectus #64 Gruppe T. geminisectus #72

T. oreophilus #24

T. oreophilus #30

T. Myanmar #96

T. NagaHills #43

T. NagaHills #62 4 = T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense #122B T. ukhrulense T. ukhrulense #122A Gruppe

T. takil Kalamuni #136

T. takil Thalkedar #135

T. nanus #25

T. nanus #33

T. nanus #75 5 = T. nanus Gruppe

T. nanus #8

T. nanus #116a

T. martianus #131

T. Lushai #113A T. Nagaland #114A 6 = T. martianus Gruppe T. sikkimensis #44

T. latisectus #78 10 Abbildung 3.19: Gesamtphylogramm 2 der Sets 3, 5 und 6 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 32 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP- Version 4.0b10). Ergebnisse 66

Das Gesamtphylogramm 3 (Abb. 3.20, PK B, Sets 3, 5 und 6 kombiniert) repräsentiert den Probensatz aus Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.18). Die Gruppen 1 bis 3 und die Gruppen 4 bis 9 stehen in einem Schwestergruppenverhältnis zueinander. Gruppe 1 beinhaltet Individuen der T. wagnerianus (#7, #27, #70 und #106). Gruppe 2 setzt sich aus T. wagnerianus x fortunei #92, T. nanus #8, T. princeps (#31b, #10, #31a, #28 und #35) und T. cf. princeps #76 zusammen. Gruppe 3 besteht aus T. nanus (#25, #116a, #33 und #75). Gruppe 4 beinhaltet Individuen von T. princeps #69 sowie T. cf. princeps (#120a und #71), welche als Schwester zu den Gruppen 5 bis 9 steht. Gruppe 5 setzt sich aus T. princeps (#118, #109 und #61) sowie T. cf. princeps #120b zusammen, der Schwestergruppe der Gruppen 6 bis 9 ist. Gruppe 6 formt sich aus den Individuen T. oreophilus (#24 und #30), T. ’NagaHills’ (#43 und #62), T. ’Manipur’ #46, T. takil #130 (Kaushani, Kumaon), T. ’Myanmar’ #96, T. takil #136 (Kalamuni, Kumaon), T. takil #135 (Thalkedar, Kumaon). T. ukhrulense (#122B und #122A). Gruppe 6 steht als Schwestergruppe zu Gruppe 7 7 mit den folgenden Individuen: T. ’Doi Ang’ #97, T. ’sikkimensis’ #44, T. latisectus #78, T. ’Lushai’ #113A und T. ’Nagaland’ #114A. Gruppe 8 mit T. fortunei #134 (Nainital, Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typus, Kew) erscheint als Schwestergruppe zu den Gruppen 6 und 7. Gruppe 9 bestehend aus T. geminisectus (#63, #64, #29 und #72) ist Schwestergruppe zu den Gruppen 5 bis 8. Trachycarpus martianus #131 steht basal zu den Gruppen 6 bis 8. Rhapidophyllum hystrix #4 (als Aussengruppe gewählt) erscheint basal unaufgelöst neben den neben allen Gruppen. Die Gruppen sind gegenüber den Gruppen in Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.18) weitestgehend erhalten, allerdings variieren die Beziehungen der Gruppen zueinander. Ergebnisse 67

R. hystrix #4 T. wagnerianus #7 T. wagnerianus #27 T. wagnerianus #70 1 = T. wagnerianus Gruppe T. wagnerianus #106 T. wagnerianus x fortunei #92 T. nanus #8 T. cf. princeps #76 T. princeps #31b T. princeps #10 2 = T. princeps Gruppe II T. princeps #31a T. princeps #28 T. princeps #35 T. nanus #25 T. nanus #116a T. nanus #33 3 = T. nanus Gruppe T. nanus #75 T. cf. princeps #120a T. princeps #69 4 = T. princeps Gruppe II T. cf. princeps #71 T. princeps #118 T. princeps #109 5 = T. princeps Gruppe I T. princeps #61b T. cf. princeps #120b T. martianus #131 T. oreophilus #24 T. oreophilus #30 T. NagaHills #43 T. NagaHills #62 T. Manipur #46 T. takil Kaushani #130 6 = T. oreophilus, T. Myanmar #96 T. takil & T. takil Kalamuni #136 T. ukhrulense T. takil Thalkedar #135 Gruppe T. ukhrulense #122B T. ukhrulense #122A T. Doi Ang #97 T. sikkimensis #44 T. latisectus #78 7 = T. martianus Gruppe T. Lushai #113A T. Nagaland #114A T. fortunei Nainital #134 8 = T. fortunei Gruppe T. fortunei Kew #124 T. geminisectus #63 T. geminisectus #64 9 = T. geminisectus T. geminisectus #29 Gruppe T. geminisectus #72 10 Abbildung 3.20: Gesamtphylogramm 3 der Sets 3, 5 und 6 (PK B; unbewurzelt; Aussengruppe: Rhapidophyllum hystrix; 47 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Ergebnisse 68

Das Gesamtphylogramm 4 (Abb. 3.21, PK B, Sets 3, 5 und 6 kombiniert) entspricht dem reduzierten Probensatz aus Gesamtphylogramm 2 (Abb. 3.19) mit PK B (ohne die Taxa T. ’Doi Ang’ #97, T. wagnerianus (#106, #70, #7 und #27), T. wagnerianus x fortunei #92, T. cf. princeps (#76 und #71), T. princeps (#31a, #10, #28. #31b, #35 und #69) und T. ’Manipur’ #46). Gruppe 1 bildet einen Grade aus T. princeps (#118, #109, #61b) und T. cf. princeps (#120a und #120b), welche Schwestergruppe zu den Gruppen 4, 3 und 2 ist. Gruppe 2 besteht aus T. oreophilus (#24 und #30), T. ’NagaHills’ (#43 und #62), T. takil (#130, #136 und #135), T. ’Myanmar’ #96, und T. ukhrulense (#122B und #122A) (entspricht Cluster 6 aus Gesamtphylogramm 3 in Abb. 3.20). Als Schwestergruppe dazu erscheint T. fortunei (#134 und #124) mit Clade 3 (entspricht Clade 8 in Abb. 3.19). Cluster 4 repräsentiert die T. martianus Gruppe mit T. martianus #131, T. ’Lushai’ #113A, T. ’Nagaland’ #114A, T. ’sikkimensis’ #44 und T. latisectus #78, diese steht als Schwestergruppe zu den Gruppen 2 und 3. Die T. geminisectus Gruppe 5 bildet einen Grade (entspricht Grade 9 in Abb. 3.19) mit T. geminisectus (#63, #64, #29 und #72), dieser ist Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 4. Rhapidophyllum hystrix #4 (hier als Aussengruppe gewählt) und die T. nanus Gruppe 6 (entspricht Grade 3 in Abb. 3.19) mit T. nanus (#8, #25, #116a, #33 und #75) erscheinen unaufgelöst als Schwestergruppen. Die Gruppen sind weitestgehend mit den Gruppen im Gesamtphylogramm 2 (Abb. 3.19) identisch, ihre Beziehungen zueinander sind aber verändert. Ergebnisse 69

R. hystrix #4

T. cf. princeps #120a

T. princeps #118

T. princeps #109 1 = T. princeps T. princeps #61b Gruppe I

T. cf. princeps #120b

T. oreophilus #24

T. oreophilus #30

T. NagaHills #43

T. NagaHills #62

T. takil Kaushani #130

T. Myanmar #96 2 = T. oreophilus, T. takil & T. takil Kalamuni #136 T. ukhrulense T. takil Thalkedar #135 Gruppe

T. ukhrulense #122B

T. ukhrulense #122A

T. fortunei Nainital #134 3 = T. fortunei Gruppe T. fortunei Kew #124

T. martianus #131

T. Lushai #113A

T. Nagaland #114A 4 = T. martianus Gruppe T. sikkimensis #44

T. latisectus #78

T. geminisectus #63

T. geminisectus #64 5 = T. geminisectus T. geminisectus #29 Gruppe

T. geminisectus #72

T. nanus #8

T. nanus #25

T. nanus #116a 6 = T. nanus Gruppe T. nanus #33

T. nanus #75 10

Abbildung 3.21: Gesamtphylogramm 4 der Sets 3, 5 und 6 (PK B; unbewurzelt; Aussengruppe: Rhapidophyllum hystrix; 32 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10. Diskussion 70

4 Diskussion

4.1 Diskussion der morphologischen Untersuchungen

Epicuticulare Wachse sind mikromorphologische Strukturen, die als erhabene oberflächliche Strukturen kristallähnliche Eigenschaften aufweisen. Form und Struktur der Wachse können diagnostischen Wert besitzen (Barthlott & Frölich, 1983). Barthlott & Frölich (1983) unterscheiden vier verschiedene Typen von Wachsen. Zu Typ I gehören „durchgehende Wachsschichten“ mit dünnen Filmen auf den Oberflächen (Monokotyle). Typ II sind „nicht-orientierte Wachs-Kristalloide“ (Monokotyle und Dikotyle). Typ III entspricht dem Convallaria-Wachs-Typ, der durch feine schuppenförmige Kristalloide, die parallel und gerichtet verlaufen, gekennzeichnet ist. Der Strelitzia-Wachs-Typ (Typ IV) wird repräsentiert durch lange stäbchenförmige Kristalloide, die meist verwachsen oder zu massive Wachs-Projektionen verschmelzen. Die Arecaceae sind hauptsächlich dem Typ IV zuzuordnen. Beispiele sind die „Wachspanzer“ der Gattungen Ceroxylon und Copernicia (Barthlott & Frölich, 1983). Die Wachse bestehen generell aus einer komplexen Mischung langkettiger aliphatischer Komponenten, wie beispielsweise primärer und sekundärer Alkohole, Aldehyde und Ketone, während andere Wachse dominiert werden von zyklischen Komponenten wie Triterpenen oder Flavonoiden (Koch et al., 2004). Anhand der REM-Aufnahmen (Abb. 3.2-3.4) konnten die auftretenden Wachsinseln auf der Blattunterseite von Trachycarpus ’NagaHills’ #43 dem Strelitzia-Wachs-Typ zugeordnet werden. Da diese Wachsinseln auch an herbarisierten Blättern von T. latisectus #44 (Bengalen, Indien), T. fortunei #45 (Kultivar aus Bengalen), T. cf. princeps #34 (Yunnan, China), T. takil #105, T. geminisectus #64 (Vietnam) sowie schwach ausgeprägt an einer T. princeps #2 Lebendpflanze (Yunnan, China, siehe Abb. 3.5) zu erkennen waren, bleibt fraglich, ob diese Wachse nicht mehr oder weniger an allen Trachycarpus-Arten auftreten, in Abhängigkeit von Klima und Standort. Daher kann der diagnostische Wert dieser epicuticularen Wachse für T. ’NagaHills’ #43 möglicherweise relativ gering ausfallen. Diskussion 71

4.2 Diskussion der karyologischen Untersuchungen

Nukleäre DNA Gehalte von Palmen wurden von 83 Spezies und 53 Gattungen berichtet, aus allen sechs Unterfamilien. Die in der Literatur (Röser et al., 1997) genannten 4C DNA Gehalte variieren zwischen 3,89 und 55,62 pg bei diploiden Palmen. Polyploide Palmen besitzen DNA Gehalte von bis zu 156,40 pg/4C. Diploide Palmen mit hohen DNA Gehalten treten in drei Unterfamilien auf (Coryphoideae, Calamoideae, Arecoideae) und scheinen weiter auf einige Tribus und Subtribus eingegrenzt zu sein (Thrinacinae, Borasseae, Lepidocaryeae, Caryoteae, einige Subtribus der Areceae). Die Mehrheit der Palmen sind diploid mit Chromosomenzahlen zwischen 2n = 36 und 2n = 26 in einer gewöhnlich absteigenden dysploiden Reihe. Polyploide sind selten, können aber extrem hohe Chromosomenzahlen aufweisen, zum Beispiel Voanioala gerardii mit 2n = 596 bis 606 ± 3. Der 4C DNA Gehalt von Trachycarpus nanus wurde mit 22,18 pg ± 0,53 gemessen (Röser et al., 1997). Die mit dieser Referenz verglichenen und untersuchten Proben von T. nanus #8 (Yunnan, China) mit 18,06 pg, T. fortunei x takil #16 (Tessin Kultivar) mit 21,28 pg, T. takil #15 (Beccari-Garten, Florenz) mit 22,42 pg und T. takil #21 mit 21,81 pg, geben keine Hinweise auf Polyploidisierungen. Es gibt keine Belege dafür, daß T. fortunei x takil #16 tatsächlich eine Hybride aus dem Tessin darstellt. Postkarten aus der Zeit des frühen zwanzigsten Jahrhunderts zeigen schon große Trachycarpus fortunei im Tessin (Abb. 4.1, Abb. 4.2). Trachycarpus takil wurde 1905 von Odoardo Beccari beschrieben. Beccari zog diese Art aus einigen Samen selbst heran, die er direkt aus Indien bekam (Beccari, 1905). Die Möglichkeit der „Introgression“ von T. takil Erbgut in bestehende T. fortunei Bestände im Tessin ist daher eher gering einzuschätzen. Diskussion 72

Abbildung 4.1: Ansichtskarte aus Lugano (1913) (Quelle:http://www.Ansichtskartenversand.com)

Abbildung 4.2: Ansichtskarte aus Lugano (1927) (Quelle: http://www.Ansichtskartenversand.com). Diskussion 73

4.3 Diskussion der ITS Analyse

Die Aufklärung der Systematik von Palmen basierend auf ITS kann schwierig sein, da Palmengenome einen hohen Grad an Polymorphie innerhalb der ITS Region offenbaren und die Interpretation auf Artniveau und oberhalb davon erschweren (Asmussen, 1999; Lewis & Doyle, 2001). ITS Analysen der Unterfamilie Calamoideae offenbarten einen hohen Grad an Polymorphie innerhalb der ITS Region (Baker et al., 2000). Für die ITS Analysen der Gattung Trachycarpus und Vertretern der Thrinacinae (siehe Tab. 7.6, Anhang) trifft diese Aussage nicht zu. Die genetischen Distanzen der Arten T. „x takaghii“ #9, T. nanus #8 und T. takil #15 sind gleich Null, d.h. die erhaltenen ITS Sequenzen sind identisch. Die Sequenzen von T. fortunei #20 und T. fortunei #11 waren ebenso identisch. Trachycarpus latisectus #26 und T. martianus #23 zeigten ebenfalls keinen Unterschied in der Sequenz, unterschieden sich aber zu den vorgenannten Arten. Die weiteren Vertreter der Thrinacinae lieferten dagegen Sequenzunterschiede. Trachycarpus unterschied sich in 45 bp von Rhapidophyllum hystrix gefolgt von Chamaerops humils (61 bp), Guihaia argyrata (75 bp) und Trithrinax campestris mit 192 bp. Die exhaustive search Analyse (Abb. 3.10, Abb. 3.11) belegte die Homogenität der reniformen Trachycarpus, die hier unaufgelöst als Polytomie abgebildet wurden. Die Identität von T. fortunei x takil #16 wurde nicht zweifelsfrei bestimmt (siehe Kapitel 4.2 Diskussion der karyologischen Untersuchungen). Trachycarpus takil Becc. ist ein Vertreter der Gattung aus dem westlichen Himalaya (Kumaon) und Saat dieser Palmenart wurde nach ihrer Beschreibung im Jahre 1905 (Beccari, 1905) lange Zeit nicht nach Europa eingeführt. Trachycarpus takil unterscheidet sich von T. fortunei in der breiteren Ligula und stärker angepressten Fasern, die aus sich auflösenden Blattbasen gebildet werden. Die Blätter sind im Alter typischerweise herzförmig im Gegensatz zu den kreisrunden Blättern der T. fortunei. Jedoch ist oberflächlich kaum ein Unterschied zu T. fortunei festzustellen, wie das Foto (Abb. 1.9) aus Kalamuni (Kumaon) belegt, welches auf einer Expedition von Gibbons und Spanner im Oktober 2005 aufgenommen wurde (Spanner, pers. Mitt.). Daher kann nicht ausgeschlossen werden, daß fehlbestimmtes Material unter den Namen T. takil in den Handel gelangte. Diskussion 74

Da T. wagnerianus inzwischen als Synonym von T. fortunei angesehen wird (Govaerts & Dransfield, 2006), überrascht die Homogenität der Sequenz von T. fortunei #11 mit T. wagnerianus #8 ebenfalls nicht. Proben der T. takil aus Kalamuni und Thalkedar (Kumaon) konnten erst in der folgenden AFLP Analyse miteinbezogen werden. Eine ITS Analyse dieser Herkünfte wäre sicher interessant. Die nahe Verwandtschaft der reniformen Trachycarpus wird in der Bootstrap Berechnung mit 99% gestützt (Abb. 3.11). Trachycarpus martianus #23 repräsentiert die kaffeebohnenförmige Samen ausbildende Gruppe und steht als Schwestergruppe zu den reniformen Trachycarpus.

Rhapidophyllum hystrix #18 als Vertreter der Thrinacinae in der neuen Welt gehört morphologisch in die altweltliche Gruppe der Thrinacinae (Uhl et al., 1987). Im Cluster der Aussengruppen, bestehend aus Rhapidophyllum hystrix #4, Guihaia argyrata #19, Chamaerops humilis #5 und Trithrinax campestris #18 (Abb. 3.9), steht Rhapidophyllum dem Trachycarpus Clade am nächsten. Eine Erklärung kann die Kontinentalverschiebung darstellen. Vor ungefähr 135 Millionen Jahren brach der Kontinent Laurasia auseinander, woraus Nord-Amerika und Asien entstanden (Abb. 4.3).

Abbildung 4.3: Die Verteilung der Kontinente vor ca. 135 Millionen Jahren (Quelle:http://volcano.und.edu/vwdocs/vwlessons/lessons/Pangea/Pangea7.html)

Möglicherweise existierten damals Vorfahren der heutigen Gattungen Trachycarpus und Rhapidophyllum im Bruchbereich und evoluierten getrennt auf den separaten Kontinenten. Trithrinax campestris #18 ist eine Art aus Südamerika und gruppiert in der exhaustive search Analyse mit Chamaerops humilis #5, einer Vertreterin der Thrinacinae aus Süd- Europa. Dieser Clade wird in der Bootstrap Berechnung mit nur 61% gestützt. Der Guihaia argyrata #19 Zweig aus Süd-China kollabiert hier. Die gesamte Aussengruppe ist gegenüber dem Trachycarpus Cluster mit 97% abgestützt. Diskussion 75

Die ITS Analyse erbrachte keine nennenswerte Auflösung innerhalb der Trachycarpus Gruppe mit reniformen Samen. Als Ursache ist ein hoher Grad an Konservierung der ITS Region der Gattung Trachycarpus zu nennen. Es ist auch nicht auszuschließen, dass Probenmaterial von T. fortunei als T. takil bzw. T. fortunei x takil deklariert wurde.

Die Hybridisierungsfähigkeit einzelner Arten untereinander ist auch nicht ausschöpfend ermittelt worden, um klären zu können, ob es sich um Morpho- oder Biospezies handelt. Trotz unterscheidbarer Sequenzen lösten innerhalb der Aussengruppen nur Chamaerops humilis #19 mit Trithrinax campestris #18 klar auf (Abb. 3.11). ITS Sequenzierungen innerhalb der Subtribus Thrinacinae scheinen keine Probleme zu bereiten. Da die Thrinacinae hauptsächlich Zierpalmen umfassen von wirtschaftlich geringerem Wert, scheint es keine eingehenderen Studien zu geben. Diskussion 76

4.4 Diskussion der AFLP Analyse

AFLP Analysen sind allgemein schneller etablierbar als Mikrosatelliten Analysen, da sie keine zusätzlichen Sequenzinformationen erfordern. In der Regel stellen AFLP dominante Marker dar, d. h. es kann nicht zwischen homozygoten und heterozygoten Loci unterschieden werden. Sie erreichen eine hohe Multiplex-Ratio, da sie in einer PCR Reaktion verschiedenste Bereiche der Genome amplifizieren. AFLPs erzeugen einen hohen Grad an Polymorphie, die besonders bei entfernt verwandten Taxa zur unpräzisen Aufklärung der verwandtschaftlichen Beziehungen führen können. Ein weiteres Problem sind nicht-homologe Fragmente, die als homolog betrachtet werden, da sie zufällig die gleiche Länge besitzen. Dies trifft häufiger bei entfernt verwandten Taxa auf. Hier würde nur Sequenzierung der erhaltenen DNA-Fragmente helfen. Neben der Mutation einer Restriktionsschnittstelle können Deletionen, Insertionen und Duplikationen (beispielsweise eines Mikrosatelliten-Motivs) zur Veränderung der Fragmentlängen führen. Verschiedene Ursachen können also zufällig zu Veränderung von Fragmenten mit gleicher Länge führen. Ein weiterer Hauptfaktor für verfälschte Analysen ist methylierte oder verunreinigte DNA. Methylierungen der DNA bewirken, daß Restriktionsschnittstellen nicht mehr erkannt und geschnitten werden. Verunreinigte DNA kann auch zu einem partiellem Verdau während der Reaktion führen, so daß Fragmente größerer Länge amplifiziert werden. AFLP können jedoch eine Phylogenie aufklären, wenn Sequenzen zu konserviert sind, um phylogenetische Signale zu beinhalten (Robinson & Harris, 1999). Die Isolierung genomischer DNA aus alten Herbarproben ist meist erschwert, da die DNA sehr oft degradiert ist. Dies hängt in erster Linie nicht vom Alter der Proben, sondern von der Art der Konservierung ab. Von Extraktion über 100 Jahre alter DNA wurde berichtet (Jankowiak et al., 2005).

Eine weitere Fehlerquelle stellen Kontaminationen mit fremder Eukaryoten-DNA dar, daher sollten Proben eingehend darauf überprüft werden. Die DNA Isolierungsmethode entscheidet besonders bei AFLP Analysen ebenfalls über die Qualität der DNA, da verschiedene DNA Isolierungskits die DNA unterschiedlich gut aufreinigen und enzymatisch behandeln (Elling, 2004). Daher sollte für die untersuchten Taxa möglichst eine Isolierungsmethode benutzt werden. Diskussion 77

Für die Distanzberechungsmethoden UPGMA und Neighbor joining kann die Reihenfolge der Taxa in einer Matrix-Tabelle Einfluß auf das Ergebnis haben (Wägele, 2000). Weitere Schwierigkeiten kann der „Smiley-Effekt“ bereiten, wenn dieser nicht schon von einer guten Auswertungssoftware ausgeglichen wird.

AFLPs wurden u.a. erfolgreich zur Aufklärung verwandtschaftlicher Beziehungen und genetischer Variation von Populationen von Euterpe edulis eingesetzt, einer Palmenart, deren Palmenherzen in Südamerika verspeist werden. In jener Studie ergaben fünf getestete Primerkombinationen an 150 Individuen 429 Marker, davon waren 92,07% polymorph (Cardoso et al., 2000). In einer anderen Studie wurde nachgewiesen, daß Samen der Bactris gasipaes (Pfirsichpalme) durch den Handel weiter verbreitet wurden als durch natürliche Vektoren wie Vögel und Nagetiere (Adin et al., 2004). Mittels AFLP wurden auch die Cocos nucifera Formen Typica (lange Form), Aurantiaca (intermediär) und Nana (Zwergform) auf Sri Lanka molekular typisiert (Perera et al., 1998). In einer weiterführenden SSR und AFLP Untersuchung wurden Cocos nucifera Populationen aus dem gesamten Verbreitungsgebiet untersucht. Analysiert wurden 31 Individuen aus 14 Populationen. AFLP Daten ermöglichten eine bessere Auflösung zwischen Populationen, während SSR Daten einen genaueren Einblick innerhalb von Populationen gewährten. Cocos nucifera ließ sich grob in die südostasiatisch-pazifische und südasiatisch- westafrikanische Gruppe einteilen. Durch den Handel an der ostafrikanischen Küste gelangten Kokosnüße aus anderen Gebieten in die indigenen Populationen (Teulat et al., 2000). Da Trachycarpus Arten in ITS Sequenzen einen hohen Grad an Konservierung offenbarten, erschien es zweckmäßig höherauflösende AFLP zur Untersuchung dieser Gattung zu verwenden. Diskussion 78

4.4.1 Diskussion der AFLP Analyse und ITS Analyse

Die folgenden Phylogramme wurden mit der UPGMA Methode berechnet, wenn nicht anderes angegeben wird. Die einzelnen Trachycarpus Arten lassen sich wiederkehrenden Gruppen und Clustern zuordnen. In Phylogramm 5 und 6 (Abb. 3.12, PK A und Abb. 3.13. PK B) tauchen T. wagnerianus, T. princeps und T. nanus als Gruppen auf. In Phylogramm 6 bilden T. nanus zwei Clades, da T. cf. princeps #120a hier gruppiert, jedoch in Phylogramm 5 jedoch mit der T. wagnerianus Gruppe. Vermutlich ist dieses „Springen“ auf die DNA Qualität dieser Probe zurückzuführen. Da T. wagnerianus als Form der T. fortunei gilt (Govaerts & Dransfield, 2006), bilden T. wagnerianus Exemplare Gruppen mit T. fortunei (Abb. 7.5, Phylogramm 7, PK A; Abb. 7.6, Phylogramm 8, PK B). In Phylogramm 9 und 10 (Abb. 3.14, PK A und Abb. 3.15, PK B) bilden Individuen von T. princeps, T. oreophilus, T. geminisectus und T. ukhrulense abgrenzbare Cluster. T. ’Manipur’ und T. ’NagaHills’ sind ältere Arbeitsnamen der beschriebenen T. ukhrulense. In Phylogramm 10 (Abb. 3.15) bildet T. princeps zwei Clades. Trachycarpus princeps Gruppe I besteht aus Individuen der Firma Rarepalmseeds (Ausnahme T. princeps #118, diese stammt von Europalms). Trachycarpus princeps Gruppe II beinhaltet Individuen der Firma Europalms (Belgien). Abbildung 4.4 veranschaulicht das Verbreitungsgebiet der T. princeps. Diskussion 79

Abbildung 4.4: Verbreitung der T. princeps entlang des Nujiang (Yunnan, China) (Karte: James Verhaegen).

Die Phylogramme 11 und 12 bilden die T. takil & T. ukhrulense, T. fortunei und T. martianus Gruppen ab (Abb. 3.16, PK A und Abb. 3.17, PK B). Die T. ukhrulense Gruppe bildet einen Schwesterclade zu T. takil aus Indien (Kalamuni und Thalkedar, Kumaon). Proben dieser T. takil stammen von Spanner & Gibbons aus einer Expedition im Wildhabitat im Oktober 2005 (Spanner, pers. Mitt.). Trachycarpus ’Myanmar’ (unbeschriebene Form) fällt ebenfalls in die T .takil & T. ukhrulense Gruppe. DNA der T. takil #130 (Kaushani, Kumaon) wurde als DNA Isolat von den Royal Botanic Gardens Kew zur Verfügung gestellt. DNA dieser Proben wurden mit einem Qiagen Kit isoliert (Kapinos, pers. Mitt.). Geographisch ist diese Herkunft eng benachbart mit den Herkünften aus Kalamuni und Thalkedar. DNA aus Proben von T. takil Herbarmaterial aus Rom und Florenz (#137 - #140) erwiesen sich als zu degradiert, bildeten aber eigene Cluster (Abb. 7.5, Phylogramm 7, PK A; Abb. 7.6, Phylogramm 8, PK B). Sie wurden in den Gesamtphylogrammen daher ausgeschlossen. Abbildung 4.5 zeigt das Trachycarpus takil Diskussion 80

Becc. Herbarblatt (Holotyp) des Herbariums der Universität Florenz, von der die Probe #139 stammt.

Abbildung 4.5: Herbarblatt (Holotyp) der Trachycarpus takil Becc. (Quelle: Herbarium der Universität Florenz, Cuccuini). Diskussion 81

Klar abgegrenzt sind die T. fortunei und T. martianus Gruppe (Phylogramm 11, Abb. 3.16, PK A). Die unbeschriebene T. ’Doi Ang’ #97 (Doi Ang Khang, Thailand; Don Hodel, University of California) springt in den Phylogrammen 11 und 12. Die Ursache ist wahrscheinlich in der DNA Qualität zu suchen, da das Probenmaterial schlecht konserviert war und die DNA nicht sauber isoliert werden konnte. Die monotypische Rhapidophyllum hystrix bildet die Aussengruppe zu Trachycarpus. Die unbeschriebenen Formen T. ’Lushai’ und T. ’Nagaland’ bilden kaffeebohnenförmige Samen und clustern dementsprechend in die T. martianus Gruppe (Abb. 3.16, PK A und Abb. 3.17. PK B). Trachycarpus ’sikkimensis’ ist ein älterer Arbeitsname für die gültig beschriebene T. latisectus. Trachycarpus latisectus unterscheidet sich hauptsächlich in breiteren Blattsegmenten von T. martianus. In Phylogramm 3 (Abb. 7.3, PK A) steht T. martianus paraphyletisch zu T. latisectus; in Phylogramm 4 (Abb. 7.4, PK B) dagegen als Schwestergruppe. Die geographischen Formen T. martianus ’KhasiaHills’ (#13a und #13b) und T. martianus ’Nepal’ (#110, #111 und #115) bilden in den Phylogrammen 3 und 4 eigene Clades. Trachycarpus martianus ’KhasiaHills’ wurde 1845 von Griffith (1845) als Chamaerops khasyana beschrieben und wird spätestens seit Beccari (1905) als Synonym von T. martianus aufgefaßt.

Die „indische“ reniforme T. takil & T. ukhrulense Gruppe findet sich als solche auch im Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.18, PK A) wieder. Hier clustert T. oreophilus zusätzlich in die T. takil & T. ukhrulense Gruppe. Trachycarpus oreophilus ist am Doi Chiang Dao, einem Gebirge in Thailand, beheimatet. Das Gesamtphylogramm 1 liefert abgrenzbare Gruppen von T. wagnerianus, T. princeps, T. fortunei, T. geminisectus, T. nanus, T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense und T. martianus. Trachycarpus princeps bildet zwei Clades, was aber nicht mit der geographischen Verbreitung in Einklang gebracht werden kann. Proben von T. ’Manipur’ #46 zwecks DNA Isolierung wurden aus eingekochtem Herbarmaterial entnommen. Möglicherweise sind die PCR Produkte dieses DNA Isolats zu degradiert, um einen eindeutigen fingerprint zu liefern. Dieses würde erklären, wieso T. ’Manipur’ #46 zusammen mit T. nanus #33 in die T. princeps Gruppe II fällt. Die gleiche Ursache mag für T. ’Do Ang’ #97 gelten, die hier basal zu allen anderen Taxa erscheint. Die Aussengruppe bildet Rhapidophyllum hystrix, die als enge Verwandte von Trachycarpus gilt (Uhl et al., 1987). Trachycarpus wagnerianus x fortunei #92 bildet mit T. nanus #25 einen Clade in der T. nanus Gruppe. Dies mag im Hybridstatus (Kembrey, pers. Mitt.) begründet liegen, so dass keine klare Zuordnung ermöglicht wird. Diskussion 82

In Gesamtphylogramm 2 (Abb. 3.19, PK A) wurde die T. wagnerianus Gruppe, T. princeps Gruppe II, T. ’Doi Ang’ #97, T. ’Manipur’ #46 und T. wagnerianus x fortunei #92 aus den vorgenannten Gründen aus dem Probensatz ausgeblendet. Der Ausschluß von T. ’Manipur’ #46 führte dazu, dass Trachycarpus nanus #33 nun korrekt in die T. nanus Gruppe positioniert. Trachycarpus takil #130 (Kaushani, Kumaon) erscheint nun als Schwestergruppe zu allen anderen Trachycarpus, möglicherweise aufgrund der veränderten DNA Qualität (siehe oben).

Das Gesamtphylogramm 3 (Abb. 3.20, PK B) präsentiert die Gruppen in ähnlicher Zusammensetzung wie in Gesamtphylogramm 1. Abweichend davon bildet T. princeps hier drei getrennte Cluster, wobei T. princeps Gruppe II in zwei getrennten Clades auftritt. Entweder löste der Marker (PK B) die Individuen der T. princeps nicht richtig auf oder die unter dem Namen T. princeps deklarierten Proben gehörten anderen Arten, beispielsweise T. fortunei, an. Trachycarpus wagnerianus x fortunei #92 bildet einen Clade mit T. nanus #8 als Schwestergruppe zur T. princeps Gruppe II. Ursache mag auch hier der Hybridcharakter der T. wagnerianus x fortunei darstellen. Trachycarpus martianus #131 steht in Gesamtphylogramm 3 als Schwestergruppe zu den Gruppen 6 bis 8. Die T. martianus Gruppe 7 erscheint hier nur als Schwestergruppe zur Gruppe 6 der „indischen“ reniformen Trachycarpus. Dieses Verhältnis wird aber nicht durch das Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.18, PK A) und die ITS Analyse (Abb. 3.10 und Abb. 3.11) gestützt, wo die Gruppe der kaffeebohnenförmige Samen ausbildende Trachycarpus basal zu allen reniformen Trachycarpus steht. Trachycarpus ’Manipur’ #46 formt einen Clade mit T. ’NagaHills’ #62 innerhalb der Gruppe 6 (T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense). Hier scheint sich das Problem der „eingekochten“ DNA nicht bemerkbar zu machen, da diese Zuordnung mit der geographischen Verbreitung übereinstimmt. Trachycarpus ’Doi Ang’ #97 positioniert abweichend in die T. martianus Gruppe 7. Dieses liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit an der DNA Qualität (siehe oben).

In Gesamtphylogramm 4 (Abb. 3.21, PK B) wurde entsprechend Gesamtphylogramm 2 die T. wagnerianus Gruppe, T. princeps Gruppe II, T. ’Doi Ang’ #97, T. ’Manipur’ #46 und T. wagnerianus x fortunei #92 aus dem Probensatz entfernt. Gegenüber Gesamtphylogramm 3 sind die Gruppen weitgehend erhalten. Der Ausschluß von T. wagnerianus x fortunei #92 erzielt eine zutreffende Gruppierung von Trachycarpus nanus #8 in die T. nanus Gruppe 6. Diskussion 83

Auch wenn die Gruppen in den Gesamtphylogrammen 1 und 2 (PK A) sowie 3 und 4 (PK B) erhalten werden, ist doch die Struktur verändert. In Gesamtphylogramm 1 und 2 (Abb. 3.18 und Abb. 3.19) steht die T. martianus Gruppe (kaffeebohnenförmige Gruppe) als Schwestergruppe zu den restlichen Trachycarpus der reniformen Gruppe. In den Gesamtphylogrammen 3 und 4 (Abb. 3.20 und Abb. 3.21) positioniert die T. martianus Gruppe innerhalb der reniformen Gruppe als Schwestergruppe zur T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe. In Gesamtphylogramm 1 ist die T. geminisectus Gruppe (4) Schwestergruppe zur T. wagnerianus (1) und T. princeps Gruppe (3). In Gesamtphylogramm 3 dagegen erscheint sie als Schwestergruppe zur T. princeps Gruppe I (5), T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe (6), T. martianus Gruppe (7) und T. fortunei Gruppe (8). Trachycarpus geminisectus unterscheidet sich hauptsächlich von den anderen Trachycarpus Arten der reniformen Gruppe in der Ausbildung von zwei bis drei Blattsegmenten, die auf ganzer Länge ungeteilt verbunden sind. Aufgrund der veränderten Beziehungen der Gruppen zueinander in den Phylogrammen, kann eine Phylogenie der Gruppen nicht erreicht werden.

Die T. fortunei Gruppe (3) in Gesamtphylogramm 1 ist Schwestergruppe zur T. princeps Gruppe I (2). In Gesamtphylogramm 3 dagegen ist T. fortunei Gruppe (8) Schwestergruppe zur T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe (6) und T. martianus Gruppe (7). Die T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe (7) in Gesamtphylogramm 1 ist Schwestergruppe zu allen anderen reniformen Trachycarpus. In Gesamtphylogramm 3 ist sie nur Schwestergruppe zur T. martianus (7) und T. fortunei Gruppe (8). Eine exakte Beziehung der T. fortunei Gruppe zu den genannten Gruppen kann somit nicht dargestellt werden. Dieses kann in den unterschiedlichen Markern begründet liegen oder in den generell geringen genetischen Distanzen der Gruppen zueinander.

Die T. nanus Gruppe (5) ist in Gesamtphylogramm 1 Schwestergruppe zur T. princeps Gruppe II. In Gesamtphylogramm 2 mit reduziertem Probensatz ist die T. nanus Gruppe (5) Schwestergruppe zu allen anderen reniformen Trachycarpus mit Ausnahme von T. takil #130. Die T. nanus Gruppe (3) erscheint in Gesamtphylogramm 3 als Schwestergruppe der T. wagnerianus (1) und T. princeps Gruppe II (erster Teil der Gruppe II, 2). In Gesamtphylogramm 4 (Abb. 3.21, PK B) mit reduziertem Probensatz kollabiert der Zweig des T. nanus Clusters (6) und erscheint unaufgelöst neben der Aussengruppe Rhapidophyllum hystrix. Trachycarpus nanus ist eine Art, die einen kleinen unterirdischen Diskussion 84

Stamm ausbildet. Ihre enge Verwandtschaft mit den reniformen Trachycarpus kann eine Erklärung liefern für die wechselnde Beziehung zu anderen Gruppen.

In Phylogramm 13 (Abb. 7.7, PK A) bilden Individuen von T. fortunei, Rhapis, Cryosophila und Coccothrinax distinkte Gruppen. Als Schwestergruppe zu T. fortunei (1) steht Chamaerops humilis #17. Die Rhapis, Cryosophila und Coccothrinax Gruppen sowie Guihaia argyrata #19 sind Schwestergruppen zum T. fortunei Clade. In Phylogramm 17 (Abb. 7.11, PK B) ist Rhapis engste Schwester von Trachycarpus gefolgt von Guihaia argyrata und Chamaerops humilis. In den Neighbor-joining Berechnungen von Phylogramm 15 (Abb. 7.9, PK A) ist Chamaerops humilis Schwestergruppe zur Rhapis, Cryosophila und Coccothrinax Gruppe. Phylogramm 17 (Abb. 7.11, PK B, UPGMA Berechnung) bildet Cryosophila als eigenen Clade ab. In der Neighbor-joining Berechnung (Phylogramm 19, Abb. 7.13, PK B) bildet Cryosophila einen Cluster mit Chamaerops humilis und Guihaia argyrata. In den Phylogrammen 14, 16, 18 und 20 wurde Rhapis subtilis #82 und T. wagnerianus x fortunei #92 aus den Probensätzen entfernt, da diese Taxa gemeinsame Clades bildeten. Ursache dafür sind vermutlich unsaubere DNA bzw. möglicherweise der Hybridcharakter der T. wagnerianus x fortunei #92, die eine genaue Gruppierung erschwerte. Die Struktur der Gruppen zueinander ist nicht konsistent, die verschiedenen Arten als solche aber werden meistens korrekt gruppiert. Im Vergleich zur eigenen ITS Analyse (Abb. 3.10 und Abb. 3.11) erscheint Guihaia enger verwandt zu sein mit Trachycarpus als Chamaerops, was von den Phylogrammen 17 und 18 (Abb. 7.11, PK B und Abb. 7.12, PK B) gestützt wird. Dieses wird auch von der kombinierten rps16 und trnL-trnF Analyse (Abb. 1.3) von Asmussen et al. (2000) etwas gestützt, wo Trachycarpus nanus mit Guihaia argyrata einen Clade bildet, im strict consensus tree mit einem Jackknife Wert von 59 Prozent.

Mit Hilfe der AFLP Analyse ist es erfolgreich gelungen die einzelnen Arten der Gattung Trachycarpus inklusive der hortikulturellen Form T. wagnerianus, T. martianus ’KhasiaHills’ und T. martianus ’Nepal’ aufzulösen. Damit sind diese Arten und Formen identifizierbar. Trachycarpus takil Becc. als indigene Form konnte ebenso gestützt werden, da der taxonomische Status der T. takil als eigene Art in Zweifel gezogen wurde (Jones, 2000). Trachycarpus ukhrulense (Synonym von T. ’NagaHills’ und T. ’Manipur’) hingegen scheint wie auch T. oreophilus eng mit T. takil verwandt wie die Gesamtphylogramme 1 bis 4 zeigten (Abb. 3.18 bis 3.21). Diese „indische“ Gruppe der Diskussion 85

reniformen Trachycarpus könnten ein Hinweis auf eine genetische Isolation der reniformen Trachycarpus südlich des Himalayas darstellen. Kultivierte T. fortunei (#134) in Indien, deren Heimat im subtropischen China vermutet wird, indes lassen sich klar von indigenen T. takil (#135 und #136) abgrenzen (Phylogramm 11, Abb. 3.16, PK A; Phylogramm 12, Abb. 3.17, PK B; Gesamtphylogramm 1 bis 4, Abb. 3.18 bis 3.21). Trachycarpus fortunei #134 (Nainital, Kumaon) bildete in den Gesamtphylogrammen Clades mit der Typuspflanze Trachycarpus fortunei #124. Samen dieser Pflanze wurde 1846 aus China von Robert Fortune nach Kew geschickt (Abb. 1.12).

Eine Phylogenie innerhalb der Gattung Trachycarpus und zwischen den weiteren Vertretetn der Thrinacinae gelang mit AFLP nicht (Phylogramme 13 bis 20, Abb. 7.7 bis 7.14, im Anhang). Als Ursachen sind zufällig gleich lange aber nicht-homologe Fragmente und die Rate der Homoplasie zu nennen, die bei Taxa aus verschiedenen Gattungen zunimmt, so dass phylogenetische Beziehungen nicht mehr reproduziert werden können (Robinson & Harris, 1999; Wägele, 2000). Die Zuordnung einzelner Individuen einer Art zu einer Gruppe dagegen gelang sehr gut, so dass die einzelnen Arten sehr gut auf molekularer Ebene zu identifizieren sind. Insbesondere gelang die Zuordnung einzelner Trachycarpus Arten zu Gruppen dann, wenn Frischmaterial zur DNA Isolierung verwendet wurde. DNA aus altem Herbarmaterial konnte in einigen Fällen, wie ausgeführt wurde, zu einem „Springen“ in andere Arten bzw. Gruppen in den Phylogrammen führen.

Lewis & Doyle (2001; 2002) berichten von der phylogenetischen Nützlichkeit der Anwendung der nukleären „low-copy“ Gene Malatsynthase (MS) und Phosphoribulokinase (PRK). Die Exon Regionen dieser Gene sind phylogenetisch informativ innerhalb der Arecaceae. Im Vergleich zu nicht-kodierenden Bereichen des Chloroplastengenoms sind Malatsynthase Sequenzen variabler und enthalten potentiell mehr phylogenetische Information (Lewis & Doyle, 2001). Eine Untersuchung dieser Genregionen in der Tribus Corypheae bzw. der Subtribus Thrinacinae wäre sicherlich in einer zukünftigen Studie hochinteressant, um weitere Vergleiche ziehen zu können. Zusammenfassung 86

5 Zusammenfassung

5.1 Zusammenfassung

Verschiedenste Akzessionen aus der gesamten Gattung Trachycarpus (T. fortunei, T. wagnerianus, T. nanus, T. takil, T. geminisectus, T. martianus und T. latisectus) und Vertreter der Thrinacinae (Chamaerops humilis, Guihaia argyrata, Rhapidophyllum hystrix und Trithrinax campestris) wurden einer ITS Analyse unterzogen. In einer umfangreichen AFLP Analyse wurden weitere Arten aus der Gattung Trachycarpus (T. oreophilus, T. princeps und T. ukhrulense) sowie weitere Vertreter der Thrinacinae (Coccothrinax, Cryosophila und Rhapis) untersucht. Die ITS Resultate belegen eine Trennung der Trachycarpus in eine „kaffeebohnenförmige“ Samen und eine „reniforme“ Samen ausbildende Gruppe. Eine weitere Auflösung innerhalb der reniformen Gruppe wurde mit ITS nicht erreicht. Die AFLP Analyse löste dagegen zwischen den einzelnen Arten auf. Wildherkünfte von T. takil differenzierten sich von putativen T. takil und T. fortunei. Überdies wurden Varietäten der T. martianus (’Khasia Hills’ und ’Nepal’) und Individuen der T. wagnerianus, die als Synonym von T. fortunei betrachtet wird, aufgelöst. Ein Gesamtdendrogramm der Gattung Trachycarpus mit den weiteren Vertretern der Thrinacinae konnte dagegen mit AFLP nicht erfolgreich reproduziert werden.

5.2 Abstract

Several different samples of the entire genus Trachycarpus (T. fortunei, T. wagnerianus, T. nanus, T. takil, T. geminisectus , T. oreophilus, T. princeps, T. ukhrulense, T. martianus and T. latisectus) and representatives of other Thrinacinae, viz. Chamaerops humilis, Guihaia argyrata, Rhapidophyllum hystrix and Trithrinax campestris were investigated by ITS analysis. In a large AFLP analysis some additional species of the genus Trachycarpus (T. oreophilus, T. princeps and T. ukhrulense) as well as further representatives of the Thrinacinae (Coccothrinax, Cryosophila and Rhapis) were analysed. The ITS sequence data indicate a separation of Trachycarpus into a group of species forming reniform seeds and a group forming coffee bean shaped seeds. Further resolution within the reniform group of Trachycarpus could not be achieved by means of ITS sequence analysis, whereas by means of AFLP analysis it was possible to resolve the individiual species. Samples of T. takil collected in the wild differentiated from putative T. takil and T. fortunei. Moreover, Zusammenfassung 87

variants of T. martianus (’Khaisa Hills’ and ’Nepal’) and individual plants of T. wagnerianus which are subsumed under T. fortunei, could be resolved. However, the analyses did not yield a consistent, reproducible result as to the relationships both within the genus Trachycarpus and among the other Thrinacinae. Literaturverzeichnis 88

6 Literaturverzeichnis

Adin, A., Weber, J.C., Sotelo Montes, C., Vidaurre, H., Vosman, B. & Smulders, M.J.M. 2004. Genetic differentiation and trade among populations of peach palm (Bactris gasipaes Kunth) in the peruvian Amzon - implications for genetic resource management. Theor. Appl. Genet. 108: 1564-1573

Asmussen, C.B. 1999. Toward a chloroplast DNA phylogeny of the tribe Geonomeae (Palmae). In: Henderson, A. & Borchsenius, F. (eds.). Evolution, Variation, and Classification of Palms. New York. 1999. Vol. 83 of memoirs of the New York Botanical Garden

Asmussen, C.B., Baker, W.J. & Dransfield, J. 2000. Phylogeny of the palm family (Arecaceae) based on rps16 intron and trnL-trnF plastid DNA sequences. In: Wilson, K.L. & Morrison, D.A. (eds.). Monocots - Systematics and Evolution. Sydney. 1998 Vol. 1 of proceedings of the second international conference on the comparative biology of the monocots. (CSIRO: Melbourne): 525-537.

Baker, W.J., Asmussen, C.B., Barrow, S.C., Dransfield, J. & Hedderson, T.A. 1999. A phylogenetic study of the palm family (Palmae) based on chloroplast DNA sequences from the trnL-trnF region. Plant Syst. Evol. 219: 111-126

Baker, W.J., Hedderson, T.A. & Dransfield, J. 2000. Molecular phylogenetics of subfamily Calamoideae (Palmae) based on nrDNA ITS and cpDNA rps16 intron sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution. Vol. 14. 2: 195-217

Baldwin, B. G., Sanderson, M. J., Porter, J. M., Vojciechowski, M. F., Campbell, C. S. & Donoghue, M. J. 1995. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden 82: 247 – 277

Barthlott, W. & Frölich, D. 1983. Mikromorphologie und Orientierungsmuster epicuticularer Wachs-Kristalloide: Ein neues systematisches Merkmal bei Monokotylen. Plant Systematics and Evolution. Springer. Berlin: 171-185

Beccari, O. 1905. Le Palme del genere “Trachycarpus”. Webbia 1. Florenz. Italien Literaturverzeichnis 89

Beccari, O. 1910. Descrizione die una nuova specie di Trachycarpus. Webbia 3. Florenz. Italien: 187-190

Beccari, O. 1931. Asiatic Palms – Corypheae. Annals of the Royal Botanical Garden 13. Calcutta. Indien: 272-286

Cardoso, S.R.S., Eloy, N.B., Provan, J., Cardoso, M.A. & Ferreira, P.C.G. 2000. Genetic differentiation of Euterpe edulis Mart. populations estimated by AFLP analysis. Molecular Ecology 9: 1753-1760

Dransfield, J. & Uhl, N.W. 1998. Subtribe Thrinacinae Becc. (1907) In: Kubitzki, K., Huber, H., Rudall, P.J., Stevens, P.S. & Stützel, T. (eds.). The families and genera of vascular plants. IV Flowering Plants – Monocotyledons. Alismatanae and Commelinanae (except Gramineae). Springer. Berlin: 326 - 329

Dover, G. 1982. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution. Nature 299: 111– 117

Durka, W. 2002. Chromosomenzahlen, Ploidiestufen und DNA-Gehalt. Schriftenreihe für Vegetationskunde 38. Bundesamt für Naturschutz. Bonn: 57-73

Elling, B. 2004. Untersuchungen zur weltweiten Verbreitung von Mesembryanthemum crystallinum L. (Aizoaceae) mit molekularen Methoden. Diplomarbeit. Biozentrum Klein- Flottbek. Hamburg

Gibbons, M., Spanner, T.W. & Chen, S.Y. 1995. Trachycarpus princeps, the Stone Gate Palm, an Exciting New Species from China. Principes 39(2): 65-74

Gibbons, M. & Spanner, T.W. 1997. Trachycarpus oreophilus – The Thailand Trachycarpus. Principes 41(4): 201-207

Gibbons, M. & Spanner, T.W. 1998. Trachycarpus latisectus: The Windamere Palm. Principes 42(1): 24-29 Literaturverzeichnis 90

Gibbons, M., Spanner, T.W., Nguyen, V.D. & Phuong, A. 2003. Trachycarpus geminisectus, the Eight Peaks Fan Palm, a New Species from Vietnam. Palms 47(3): 143- 148

Gillet, E.M. 1999. DNA-Markers - concepts and characteristics. In: EU compendium: Which DNA Marker for Which Purpose? Chapter 2. http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/1999/whichmarker/index.htm (Zugriff: Februar 2006)

Govaerts, R. & Dransfield, J. 2006. World Checklist of Monocotyledons. The Board of Trustees of the Royal Botanic Gardens, Kew. GB http://www.kew.org/wcsp/monocots/ (Zugriff: Februar 2006)

Griffith, W. 1845. Chamaerops khasyana Griff. Calcutta Journal of natural history and miscellany of the arts and sciences in India 5. Calcutta: 341-342

Henderson, A. 2002. Evolution and ecology of palms. The New York Botanical Garden Press. NY. USA: 12-14

Hershkovitz, M. A. & Lewis, L. A. 1996. Deep-level diagnostic value of the rDNA-ITS region. Mol. Biol. Evol. 13: 1276 – 1295

Hershkovitz, M. A. & Zimmer, E. A. 1996. Conservation patterns in angiosperm rDNA – ITS 2 sequences. Nucleic Acids Research 24: 2857 – 2867

Holmgren, P.K. & Holmgren, N. H. 2006. Index Herbariorum. New York Botanical Garden.USA http://sciweb.nybg.org/science2/IndexHerbariorum.asp (Zugriff: Februar 2006)

Hooker, W.J. 1860. Chamaerops fortunei. Curtis’s botanical magazine 86. Reeve. London: t. 5221

IPCC. 2001. Third assessment report (TAR). Intergovernmental Panel On Climate Change http://www.grida.no/climate/ipcc_tar/ (Zugriff: Februar 2006)

Jones, D. 2000. Palmen. Könnemann. Köln. Literaturverzeichnis 91

Jankowiak, K., Buczkowska, K. & Szweykowska-Kulinska, Z. 2005. Successful extraction of DNA from 100-year-old herbarium specimens of the liverwort Bazzania trilobata. Taxon 54 (2): 335-336

Kimnach, M. 1977. The species of Trachycarpus. Principes 21: 155-160

Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H.J. & Barthlott, W. 2004. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). Journal of Experimental Botany. Vol. 55. 397:711-718

Larcher, W. 1980. Untersuchungen zur Frostresistenz von Palmen. Anzeiger der Österreichischen Akademie der Wissenschaften. Nr.3. Österreich: 37-49

Larcher, W. & Winter, A. 1981. Frost susceptibility of palms: experimental data and their interpretation. Principes 25 (4): 143-152.

Larcher, W. & Sakai, A. 1987. Frost survival of plants. Springer. Berlin: 181-184

Lewis, C.E. & Doyle, J.J. 2001. Phylogenetic utility of the nuclear gene Malate Synthase in the palm family (Arecaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution. Vol. 19. 3:409- 420

Lewis, C.E. & Doyle, J.J. 2002. A phylogenetic analysis of tribe Areceae (Arecaceae) using two low-copy nuclear genes. Plant Syst. Evol. 236: 1-17

Litt, M. & Luty, J.A. 1989. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet. 44: 397-401

Lorek, M. & Pradhan, K.C. 2004. Trachycarpus ukhrulense, the survivor palm. The Palmateer. Central Florida Palm & Cycad Society 24(2): 13, 22-23

Lötschert, W. 1985. Palmen. Verlag Eugen Ulmer. Stuttgart Literaturverzeichnis 92

Mayol, M., Rosselló, J.A. 2001. Why nuclear ribosomal DNA spacers (ITS) tell different stories in Quercus. Molecular Phylogenetics and Evolution 19: 167-176

Perera, L., Russell, J.R., Provan, J., McNicol, J.W., Powell, W. 1998. Evaluating genetic relationships between indigenous coconut (Cocos nucifera L.) accessions from Sri Lanka by means of AFLP profiling. Theor. Appl. Genet. 96: 545-550

Provan, J., Powell, W., Hollingsworth, P.M. 2001. Chloroplast microsatellites:new tools for studies in plant ecology and evolution. Trends Ecol. Evol. 16: 142-147

Robinson, J.P., Harris, S. 1999. Amplified fragment length polymorphisms and microsatellites: A phylogenetic perspective. In: EU compendium: Which DNA Marker for Which Purpose? Chapter 12. http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/1999/whichmarker/index.htm (Zugriff: Mai 2006)

Röser, M., Johnson, M.A.T. & Hanson, L. 1997. Nuclear DNA Amounts in Palms (Arecaceae). Bot. Acta 110. Georg Thieme Verlag. Stuttgart – New York: 79-89

Rudolph, B. 2001. Entwicklung, Charakterisierung und genetische Kartierung von Mikrosatelliten-Markern beim Raps (Brassica napus L.). Dissertation. Cuvillier Verlag. Göttingen

Saakov, S.G. 1963. Introduction of palms in the U.S.S.R. Principes 7: 88-99

Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. & Arnheim, N. 1985. Enzymatic amplification of ?-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350 – 1354

Saiki, R. K., Gelfand, D. H, Stoffel, S., Scharf, S., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. & Erlich, H. A. 1988. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487 – 491

Sambrook, J. & Russel, D.W. 2001. Molecular cloning - A laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. USA Literaturverzeichnis 93

Singh, D.K., Singh, S. & Murti, S.K. 1995. Trachycarpus takil Becc. (Arecaceae) – A rare, endemic palm of Kumaon Himalaya, India. Indian Journal of Forestry 18(4): 332-336

Soltis, D. E. & Soltis, P. S. 2000. Choosing an approach and an appropriate gene for phylogenetic analysis. In: Soltis, D. E., Soltis, P. S. & Doyle, J. J. (eds.). Molecular systematics of plants II. Kluver Academic Publishers. Third edition. New York: 1-42

Spanner, T.W., Noltie, H.J. & Gibbons M. 1997. A new species of Trachycarpus (Palmae) from W Bengal, India. Edinburgh Journal of Botany 54(2): 257-259

Teulat, B., Aldam, C., Trehin, R., Lebrun, P., Barker, J.H.A., Arnold, G.M., Karp, A., Baudouin, L. & Rognon, F. 2000. An analysis of genetic diversity in coconut (Cocos nucifera) populations from across the geographic range using sequence-tagged microsatellites (SSRs) and AFLPs. Theor. Appl. Genet. 100: 764-771

Uhl, N.W., Dransfield, J. & Scheehan, M.R. 1987. Genera Palmarum: A Classification of Palms Based on the Work of Harold E. Moore, Jr. The L.H. Bailey Hortorium and The International Palm Society. Lawrence. Kansas. USA

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. & Zabeau, M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res. 23: 4407-4414

Wägele, J.W. 2000. Grundlagen der Phylogenetischen Systematik. Verlag Dr. Friedrich Pfeil. München

Wallich, N. 1831. Chamaerops martiana Wall. ex Mart. Plantae asiaticae rariores 3. Treuttel and Würtz. London. GB: 5-7, t. 211

Walther, G.R. 2003. Wird die Palme in der Schweiz heimisch ? Botanica Helvetica. 113/2. Schweiz: 159-180

Wang, Z., Weber, J.L., Zhong, G. & Tanksley, S.D. 1994. Survey of plant short tandem repeats. Theor. Appl. Genet. 88 : 1-6 Literaturverzeichnis 94

Weber, J.L. & May, P.E. 1989. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet. 44 : 88-396

Wendland, H. 1861. Trachycarpus. Bulletin de la Societe Botanique de France. Au Bureau de la Societe. Paris. Frankreich: 410-430

White, T.J., Bruns, T.D., Lee, S.B. & Taylor, J.W. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics. In: PCR - Protocols and Applications - A Laboratory Manual. (Eds) Innis, N., Gelfand, D., Sninsky, J. & White, T. Academic Press. New York.USA: 315-322

Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Kenneth, J.L., Rafalski, J.A. & Tingey, S.V. 1990. DNA poylmorphisms amplified by arbitrary primers are usefull as genetic markers. Nucl. Acids Res. 18: 6531-6535

Zabeau, M. & Vos, P. 1993. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Application: No. 92402629.7, publication No.: EP 0534858-A1

Zietkiewitz, E., Rafalski, A. & Labuda, D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomes 20: 176-183

Zonneveld, B.J.M., Van Iren, F. 2001. Genome size and pollen viability as taxonomic criteria: application to the genus Hosta. Plant Biol. 3. Georg Thieme Verlag. Stuttgart – New York: 176-185 Anhang 95 4 7 Anhang

Tabelle 7.1: Gesamtaufsammlung – nach laufender Labornummer geordnet. # Labornr. Gesamtaufsammlung / Angabe zur Herkunft /Sammler Zustand Grösse/Probe 1 Trachycarpus fortunei Sichuan China Spanner Lebend adult 2 Trachycarpus princeps Yunnan China Spanner Lebend juvenil 3 Trachycarpus wagnerianus Japan Spanner Lebend adult 4 Rhapidophyllum hystrix Florida Spanner Lebend adult 5 Chamaerops humilis San Remo Spanner Lebend adult 6 Chamaerops humilis var. cerifera Hoher Atlas Spanner Lebend adult 7 Trachycarpus wagnerianus Japan Lorek Lebend juvenil 8 Trachycarpus nanus SW China Lorek Lebend Sämling 9 Trachycarpus cf. „x takaghii“ F1? Californien Lorek Lebend juvenil 10 Trachycarpus princeps SW China Lorek Lebend juvenil 11 Trachycarpus fortunei Devon GB Lorek Lebend juvenil 12 Trachycarpus oreophilus Thailand Lorek Lebend Sämling 13 2 x Trachycarpus martianus Khasia Sandeman Seeds a + b Lebend Sämlinge 14 Trachycarpus latisectus N Indien Lorek Lebend 15 Trachycarpus takil F1? Beccari-Garten Florenz Lorek Lebend adult 16 Trachycarpus fortunei x takil? Tessin Lorek Lebend adult 17 Chamaerops humilis S Portugal Lorek Lebend Sämling 18 Trithrinax campestris Argentinien Lorek Lebend Sämling 19 Guihaia argyrata Guangxi China Coca Lebend Sämling 20 Trachycarpus fortunei (Kübel) BG HH Lebend Bestand 21 Trachycarpus takil N Indien (BG HH) Spanner Lebend Bestand 22 Trachycarpus cf. takil Nainital? N Indien Ganesh Mani Herbar 1 Fächer Pradhan 23 Trachycarpus martianus Nepal Rogez Lebend adult 24 Trachycarpus oreophilus Doi Chiang Dao Thailand Meeldijk Lebend adult 25 Trachycarpus nanus China Gibbons Herbar 26 Trachycarpus latisectus N Indien Gibbons Herbar 27 Trachycarpus wagnerianus Korea Gibbons Herbar 28 Trachycarpus princeps SW China Gibbons Herbar 29 Trachycarpus geminisectus Vietnam Gibbons Herbar 30 Trachycarpus oreophilus Doi Chiang Dao Thailand Gibbons Herbar 31 2 x Trachycarpus princeps Stonegate China Lorek a + b Herbar 2 Herbarblätter 32 Trachycarpus oreophilus Thailand Lorek (Penninckx) Herbar 1 Herbarblatt 33 Trachycarpus nanus YuccaDo USA Herbar 1 Herbarblatt 34 Trachycarpus cf. princeps Pengdang? China Herbar Segmente 35 Trachycarpus princeps Stonegate China Lorek (Meeldjik) Herbar 1 Herbarblatt 36 Trachycarpus cf. takil Nepal? Belgien Lorek Herbar 1 Fächer 37 Rhapis excelsa cult. Malaysia SP 04031 Spanner Herbar 1 Fächer 38 Thrinax radiata Key Largo Florida SP 04033 Spanner Herbar 1 Fächer 39 Thrinax morrisii Key Largo Florida SP 04032 Spanner Herbar 1 Fächer 40 Coccothrinax barbadensis cult. Florida SP 04035 Spanner Herbar 1 Fächer 41 Crysophila warscewiczii Belize SP 04034 Spanner Herbar 1 Fächer 42 Trachycarpus fortunei Zwergform Italien? Nold Herbar kurze Segmente 43 Trachycarpus sp. “Naga Hills“ Saramati Indien SP 04036 Herbar 1 Fächer Spanner 44 Trachycarpus „sikkimensis“ Kalimpong Indien Lorek Herbar 1 Fächer 45 Trachycarpus cf. fortunei Peshot Indien Lorek Herbar 1 Fächer 46 Trachycarpus „Manipur“ Manipur Maku Indien Lorek Herbar 1 Fächer Anhang 96 4

47 Trachycarpus „ukhrulense“ Manipur Indien Lorek Lebend Sämling 48 2 x Coccothrinax crinita Guajabon W-Cuba BG Jena a+ b Herbar Segmente 49 Coccothrinax cupularis BG Jena Herbar Segmente 50 2 x Coccothrinax miraguama Matanzas Cuba BG Jena a + b Herbar Segmente 51 2 x Coccothrinax littoralis BG Jena a + b Herbar Segmente 52 Coccothrinax clarensis BG Jena Herbar Segmente 53 Coccothrinax crinita ssp. brevicrinis BG Jena Herbar Segmente 54 2 x Coccothrinax borhidiana BG Jena a + b Herbar Segmente 55 3 x Thrinax parviflora BG Jena a, b + g Herbar Segmente 56 2 x Thrinax radiata BG Jena a + b Herbar Segmente 57 Thrinax punctulata BG Jena Herbar Segmente 58 3 x Thrinax morrisii BG Jena a, b + g Herbar Segmente 59 4 x Thrinax sp.? BG Jena a, b, g + d Herbar Segmente 60 Trachycarpus cf. takil Nainital N Indien Spanner Lebend adult 61 2 x Trachycarpus cf. princeps Yunnan China Spanner a + b Lebend Sämlinge 62 Trachycarpus sp. “Naga Hills“ Indien/Burma Spanner Lebend Sämling 63 Trachycarpus geminisectus Vietnam Spanner Lebend 2 Fächer 64 Trachycarpus geminisectus Vietnam Spanner Herbar 2 Fächer 65 Zombia antillarum FG4718A Fairchild Tropical Garden Isolat 66 Chelyocarpus ulei 67291D Fairchild Tropical Garden Isolat 67 Cryosophila warscewiczii 86149A Fairchild Tropical Garden Isolat 68 Itaya amicorum 90420 Fairchild Tropical Garden Isolat 69 Trachycarpus princeps Stonegate China Verhaegen Herbar 1 kleiner Fächer 70 Trachycarpus wagnerianus Kultivar GB Verhaegen Herbar 1 kleiner Fächer 71 Trachycarpus cf. princeps China Verhaegen Herbar 1 Minisegment 72 Trachycarpus geminisectus Vietnam Verhaegen Herbar 1 kleiner Fächer 73 Trachycarpus latisectus Darjeeling Indien Verhaegen Herbar ½ Segment 74 Trachycarpus cf. martianus Darjeeling Indien Verhaegen Herbar ½ Segment 75 Trachycarpus nanus Yunnan China Verhaegen Herbar 1 Minisegment 76 Trachycarpus cf. princeps Pengdang? China Verhaegen Herbar kleine Segmente 77 Trachycarpus nanus China Spanner Lebend adult 78 Trachycarpus latisectus N Indien Spanner Lebend adult 79 Rhapis humilis 2004-48 Singapore BG Herbar Blattsegmente 80 Zombia antillarum 2004-44 Singapore BG Herbar Segment/ Fasern 81 Cryosophila warscewiczii 2004-47 Singapore BG Herbar Segmente/ Fasern 82 Rhapis subtilis 2004-43 Singapore BG Herbar Blattsegmente 83 Thrinax parviflora 2004-46 Singapore BG Herbar Blattsegmente 84 Thrinax radiata Singapore BG Herbar Segmente/ Fasern 85 Sabal palmetto Statesboro Georgia USA McCartney Herbar ½ Segmente 86 Sabal minor Manning South Carolina USA McCartney Herbar ½ Segmente 87 Sabal etonia Ocala Florida USA McCartney Herbar Blattsegmente 88 Sabal rosei Augusta Georgia USA McCartney Herbar Blattsegmente 89 Sabal ‘louisiana’ (S. x texensis) Brazoria Texas USA Herbar Blattsegmente McCartney 90 Sabal sp. ‘Birmingham’ Birmingham Alabama USA McCartney Herbar Blattsegmente Anhang 97 4

91 Trachycarpus fortunei Zwergform Abbotsbury GB Kembrey Herbar ½ Segment/ 2 Fächer 92 Trachycarpus wagnerianus x fortunei F1 Wick S Lebend Sämling Gloucestershire GB Kembrey 93 Trachycarpus oreophilus Doi Chiang Dao Thailand Gibbons Lebend Sämling 94 2 x Sabal ‘Birmingham’ (x S. minor?) Raleigh N.C. USA Hollar Lebend Segment a + b 95 Sabal ‘Birmingham’ Birmingham Alabama USA Hollar Herbar ½ Segmente 96 Trachycarpus sp. Mount Victoria Myanmar Don Hodel & Aye Herbar ½ Blattsegment Pe 1929 NYBG USA Henderson 97 Trachycarpus sp. Doi Ang Khang Thailand Don Hodel 1945 Herbar Blattsegmente University of California USA Don Hodel 98 Trachycarpus fortunei Lugano Tessin Krüger Herbar 1 Blattsegment 99 Trachycarpus fortunei x wagnerianus? Kalifornien St. Gelais Herbar Blattsegmente 100 Trachycarpus fortunei x martianus? Kalifornien St. Gelais Herbar 1 Blattsegment 101 Nannorrhops ritchiana Iran Spanner Herbar 1 Blattsegment 102 Nannorrhops ritchiana Iran Gutleb Herbar 2 Blattsegmente 103 Nannorrhops ritchiana grüne Form Pakistan Spanner Herbar 1 Blattsegment 104 Trachycarpus takil F1? Florenz Federico Oste Herbar 1 Blattsegment 105 Trachycarpus takil Spanner Herbar 1 Blattsegment 106 Trachycarpus wagnerianus S Frankreich Lackner Herbar 1 Blattsegment 107 Trachycarpus takil BG Rom Beccari Quercellini Herbar 1 Fächer 108 Trachycarpus takil Becc. Orto Botanico di Roma Fabrini Herbar Blattsegmente 109 Trachycarpus princeps Dulong River population, Prof Dong, Lebend Sämling Spanner 110 Trachycarpus martianus Nepal, Locus typicus, Spanner Lebend Sämling 111 Trachycarpus martianus Nepal, Locus typicus, Spanner Lebend Sämling 112 Trachycarpus takil Roma, Beccari, Danilo Bitetti Herbar 1 Fächer 113 3 x Trachycarpus sp. ‘Lushai-Hills’ Lorek A, B, C Lebend Sämlinge 114 3 x Trachycarpus sp. ‘Nagaland’ Spanner A, B, C Lebend Sämlinge 115 Trachycarpus martianus Nepal Spanner Lebend Sämling 116 2 x Trachycarpus nanus Spanner a + b Lebend Sämling 117 Trachycarpus takil Jürgen Haak Herbar 1 Blattsegment 118 Trachycarpus princeps (Europalms) Albert Reuten Herbar 1 Blattsegment 119 3 x Trachycarpus fortunei Darjeeling (Europalms) Reuten a,b Herbar 3 + g Blattsegmente 120 2 x Trachycarpus princeps (Rarepalmseeds) Albert Reuten a Herbar 2 + b Blattsegmente 121 Trachycarpus latisectus RPS Lebend Sämling 122 7 x Trachycarpus ukhrulense Lorek A,B,C,D,E,F,G Lebend Sämlinge 123 2 x Trachycarpus fortunei Tessin Gianinazzi A,B Lebend Sämlinge 124 Trachycarpus fortunei Fortune Kew Isolat 125 Trachycarpus cf. takil Wilko Karmelk Florenz Herbar 1 Fächer 126 Trachycarpus cf. takil Wilko Karmelk Florenz Herbar 1 Fächer 127 Trachycarpus fortunei Geert de Maerschalck Herbar 1 Fächer 128 Trachycarpus cf. takil Gibbons Mt. Thakil Herbar 1 Blattsegment 129 Trachycarpus cf. takil F1? Quercellini Roma Herbar 1 Blattsegment 130 Trachycarpus takil Kausani Gibbons Isolat 131 Trachycarpus martianus Khasia Lackner PPP Herbar 1 Blattsegment 132 Nannorrhops ‘Iran’ Gutleb Lackner Herbar 1 Blattsegment 133 Trachycarpus takil Lackner Rom BG Herbar Segmente Anhang 98 4

134 Trachycarpus fortunei Nainital Spanner Herbar Segmente 135 Trachycarpus takil Thalkedar Spanner Herbar Segmente 136 Trachycarpus takil Kalamuni Ridge Spanner Herbar Segmente 137 Trachycarpus takil Beccari Rom BG Herbar 3 Fächer + Fasern 138 Trachycarpus takil Beccari La Sapienza Universität Rom Herbar Fasern 139 Trachycarpus takil Becc. Holotypus Museo Botanico Florenz Herbar Segment + Blüte 140 Trachycarpus takil Nainital Topotypus Museo Botanico Herbar Segment Florenz 141 Trachycarpus fortunei Tessin Gianinazzi Herbar Segmente 142 Trachycarpus fortunei Dover Gianinazzi Herbar Segmente 143 Trachycarpus fortunei Plovdiv Gianinazzi Herbar Segmente Angaben: Trachycarpus „sikkimensis“ = Trachycarpus latisectus Trachycarpus ukhrulense = Trachycarpus „Naga Hills“ = Trachycarpus „Manipur“

Tabelle 7.2: Gesamtaufsammlung – alphabetisch. Labornr. Art Herkunft/Sammelnr. Sammler/Händler/ Institution 17 Chamaerops humilis S Portugal Lorek 5 Chamaerops humilis San Remo Italien Spanner 6 Chamaerops humilis var. cerifera Hoher Atlas Marokko Spanner 66 Chelyocarpus ulei 67291 D FTG USA 40 Coccothrinax barbadensis (cult.) Florida SP 04035 Spanner 54 Coccothrinax borhidiana (a, b) N Kuba BG Jena 52 Coccothrinax clarensis Kuba BG Jena 48 Coccothrinax crinita (a, b) Guajabon W Kuba BG Jena 53 Coccothrinax crinita ssp. brevicrinis Kuba BG Jena 49 Coccothrinax cupularis Kuba BG Jena 51 Coccothrinax littoralis (a, b) Matanzas Kuba BG Jena 50 Coccothrinax miraguama (a, b) Kuba BG Jena 81 Cryosophila warscewiczii 2004-47 BG Singapur 67 Cryosophila warscewiczii 86149 A FTG USA 41 Cryosophila warscewiczii Belize SP 04034 Spanner 19 Guihaia argyrata Guangxi China Coca 68 Itaya amicorum 90420 FTG USA 132 Nannorrhops ritchiana ‘Iran’ Iran Gutleb 103 Nannorrhops ritchiana ’grüne Form’ Pakistan Spanner 102 Nannorrhops ritchiana ’Iran’ Iran Gutleb 101 Nannorrhops ritchiana Iran Spanner 4 Rhapidophyllum hystrix Florida USA Spanner 37 Rhapis excelsa (cult.) Malaysia SP 04031 Spanner 79 Rhapis humilis 2004-48 BG Singapur 82 Rhapis subtilis 2004-43 BG Singapur Raleigh 94 Sabal ‘Birmingham’ (a, b) North Carolina USA Hollar Birmingham 95 Sabal ‘Birmingham’ Alabama USA Hollar 89 Sabal ‘louisiana’ (= S. x texensis) Brazoria Texas USA McCartney 87 Sabal etonia Ocala Florida USA McCartney Manning 86 Sabal minor South Carolina USA McCartney Statesboro 85 Sabal palmetto Georgia USA McCartney Anhang 99 4

88 Sabal rosei Augusta Georgia USA McCartney Birmingham 90 Sabal ‘Birmingham’ Alabama USA McCartney 58 Thrinax morrisii (a, b, g) Kuba BG Jena Key Largo Florida 39 Thrinax morrisii SP 04032 Spanner 83 Thrinax parviflora 2004-46 BG Singapur 55 Thrinax parviflora (a, b, g) Jamaika BG Jena 57 Thrinax punctulata (= T. morrisii) Kuba BG Jena 56 Thrinax radiata (a, b) Bahamas BG Jena Key Largo Florida 38 Thrinax radiata SP 04033 Spanner 84 Thrinax radiata Bahamas BG Singapur 59 Thrinax sp. (a, b, g, d) BG Jena 46 Trachycarpus ’Manipur’ Maku Manipur Indien Lorek 44 Trachycarpus ’sikkimensis’ Kalimpong Indien Lorek Pradhan, Keshow 47 Trachycarpus ’ukhrulense’ Manipur Indien Chandra Trachycarpus ’x takaghii’ (= T. fortunei x 9 wagnerianus) Kalifornien USA Lorek 45 Trachycarpus cf. fortunei Peshot Sikkim Indien Lorek 74 Trachycarpus cf. martianus Darjeeling Indien Verhaegen 76 Trachycarpus cf. princeps Pengdang? China Verhaegen 71 Trachycarpus cf. princeps S China Verhaegen 34 Trachycarpus cf. princeps Pengdang? China Lorek 61 Trachycarpus cf. princeps (a,b) Yunnan China Spanner Quercellini 129 Trachycarpus cf. takil Indien (Rom Italien) Mt. Thakil Kumaon 128 Trachycarpus cf. takil Indien Gibbons Nainital Kumaon Spanner 60 Trachycarpus cf. takil Indien Nainital? Kumaon Pradhan, Ganesh 22 Trachycarpus cf. takil Indien Mani 36 Trachycarpus cf. takil Nepal? Penninckx Karmelk 125, 126 Trachycarpus cf. takil Indien (Florenz Italien) 20 Trachycarpus fortunei China BG HH 119 Trachycarpus fortunei (a, b, g) Darjeeling Indien Verhaegen 11 Trachycarpus fortunei Devon GB Lorek 142 Trachycarpus fortunei Dover GB Gianinazzi Fortune, Robert 124 Trachycarpus fortunei Nanjing China (Kew) 127 Trachycarpus fortunei China De Maerschalck 98 Trachycarpus fortunei Lugano Schweiz Krüger Nainital 134 Trachycarpus fortunei Kumaon Indien Spanner 143 Trachycarpus fortunei Plovdiv Bulgarien Gianinazzi 1 Trachycarpus fortunei Sichuan China Spanner 141 Trachycarpus fortunei Tessin Gianinazzi 123 Trachycarpus fortunei (A, B) Tessin Gianinazzi 100 Trachycarpus fortunei x martianus ? Kalifornien USA St. Gelais 16 Trachycarpus fortunei x takil ? Tessin Lorek 99 Trachycarpus fortunei x wagnerianus ? Kalifornien USA St. Gelais 91 Trachycarpus fortunei ’Zwergform’ Abbotsbury GB Kembrey 42 Trachycarpus fortunei ’Zwergform’ China Nold (Italien ?) 29 Trachycarpus geminisectus Vietnam Gibbons 63, 64 Trachycarpus geminisectus Vietnam Spanner Anhang 100 4

72 Trachycarpus geminisectus Vietnam Verhaegen 73 Trachycarpus latisectus Darjeeling Indien Verhaegen 26 Trachycarpus latisectus N Indien Gibbons 14 Trachycarpus latisectus N Indien Lorek 78 Trachycarpus latisectus N Indien Spanner 121 Trachycarpus latisectus N Indien Rarepalmseeds 131 Trachycarpus martianus ’Khasia’ Khasia Hills Indien PalmePerPaket 13 Trachycarpus martianus ‘Khasia’ (a, b) Khasia Hills Indien Sandeman Seeds 23 Trachycarpus martianus ’Nepal’ Nepal Rogez 115 Trachycarpus martianus ’Nepal’ Nepal Spanner Locus typicus 110, 111 Trachycarpus martianus ’Nepal’ Nepal Spanner 25 Trachycarpus nanus Yunnan China Gibbons 77 Trachycarpus nanus Yunnan China Spanner 116 Trachycarpus nanus (a, b) Yunnan China Spanner 8 Trachycarpus nanus SW China Lorek 33 Trachycarpus nanus China YuccaDo USA 75 Trachycarpus nanus Yunnan China Verhaegen Doi Chiang Dao 30, 93 Trachycarpus oreophilus Thailand Gibbons

Doi Chiang Dao 24 Trachycarpus oreophilus Thailand Meeldijk 12 Trachycarpus oreophilus Thailand Lorek 32 Trachycarpus oreophilus Thailand Penninckx 118 Trachycarpus princeps China Verhaegen 120 Trachycarpus princeps (a, b) China Rarepalmseeds Dulong River, Yunnan 109 Trachycarpus princeps China Prof Dong 35 Trachycarpus princeps Yunnan China Meeldjik 31 Trachycarpus princeps (a, b) Yunnan China Lorek 69 Trachycarpus princeps Yunnan China Verhaegen Locus typicus Gibbons 28 Trachycarpus princeps SW China 10 Trachycarpus princeps SW China Lorek Locus typicus 2 Trachycarpus princeps Yunnan China Spanner Assam/Manipur 113 Trachycarpus ‘Lushai-Hills’ (A, B, C) Indien Lorek 114 Trachycarpus ‘Nagaland’ (A, B, C) Nagaland Indien Spanner 62 Trachycarpus ’Naga Hills’ Indien/Burma Spanner Saramati Indien 43 Trachycarpus ’Naga Hills’ SP 04036 Spanner Doi Ang Khang 97 Trachycarpus ‘Doi Ang Khang’ Thailand 1945 Don Hodel Don Hodel & Aye Mt. Victoria Pe (Henderson 96 Trachycarpus ’Myanmar’ Myanmar 1929 NYBG USA) Fabrini (Orto Botanico di Roma 108 Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien Italien) Cuccuini (Museo Botanico Firenze 139 Trachycarpus takil Beccari (Holotypus) Kumaon Indien Italien) “La Sapienza” 138 Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien Universität Rom 137 Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien BG Rom Italien Quercellini 107 Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien (BG Rom Italien) Anhang 101 4

Lorek (Beccari Garten Florenz 15 Trachycarpus takil ? Indien Italien) Oste (Florenz 104 Trachycarpus takil ? Indien Italien) Haak 117 Trachycarpus takil N Indien (PalmePerPaket) Kausani Kumaon 130 Trachycarpus takil Indien Gibbons Locus typicus Kalamuni Ridge 136 Trachycarpus takil Kumaon Indien Spanner Lackner 133 Trachycarpus takil Kumaon Indien (BG Rom Italien) 21 Trachycarpus takil N Indien Spanner (BG HH) Cuccuini (Museo Botanico Firenze 140 Trachycarpus takil (Topotypus) Nainital Kumaon Italien) Bitetti (Orto Botanico di Roma 112 Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien Italien) 105 Trachycarpus takil N Indien Spanner Locus typicus Thalkedar (Mt. Thakil) 135 Trachycarpus takil Kumaon Indien Spanner Trachycarpus ukhrulense 122 (A, B, C, D, E, F, G) Manipur Indien Lorek 7 Trachycarpus wagnerianus Japan Lorek 3 Trachycarpus wagnerianus Japan Spanner 27 Trachycarpus wagnerianus Korea Gibbons 70 Trachycarpus wagnerianus (cult.) GB Verhaegen 106 Trachycarpus wagnerianus S Frankreich Lackner Wick 92 Trachycarpus wagnerianus x fortunei F1 S Gloucestershire GB Kembrey 18 Trithrinax campestris Argentinien Lorek 80 Zombia antillarum 2004-44 BG Singapur 65 Zombia antillarum FG 4718A FTG USA Anhang 102 4 Tabelle 7.3: Gesamtaufsammlung Thrinacine – alphabetisch. Labornr. Art Herkunft/Sammelnr. Sammler/Händler/ Institution 17 Chamaerops humilis S Portugal Lorek 5 Chamaerops humilis San Remo Italien Spanner 6 Chamaerops humilis var. cerifera Hoher Atlas Marokko Spanner 66 Chelyocarpus ulei 67291 D FTG USA 40 Coccothrinax barbadensis (cult.) Florida SP 04035 Spanner 54 Coccothrinax borhidiana (a, b) N Kuba BG Jena 52 Coccothrinax clarensis Kuba BG Jena 48 Coccothrinax crinita (a, b) Guajabon W Kuba BG Jena 53 Coccothrinax crinita ssp. brevicrinis Kuba BG Jena 49 Coccothrinax cupularis Kuba BG Jena 51 Coccothrinax littoralis (a, b) Matanzas Kuba BG Jena 50 Coccothrinax miraguama (a, b) Kuba BG Jena 81 Cryosophila warscewiczii 2004-47 BG Singapur 67 Cryosophila warscewiczii 86149 A FTG USA 41 Cryosophila warscewiczii Belize SP 04034 Spanner 19 Guihaia argyrata Guangxi China Coca 68 Itaya amicorum 90420 FTG USA 4 Rhapidophyllum hystrix Florida USA Spanner 37 Rhapis excelsa (cult.) Malaysia SP 04031 Spanner 79 Rhapis humilis 2004-48 BG Singapur 82 Rhapis subtilis 2004-43 BG Singapur 58 Thrinax morrisii (a, b, g) Kuba BG Jena Key Largo Florida 39 Thrinax morrisii SP 04032 Spanner 83 Thrinax parviflora 2004-46 BG Singapur 55 Thrinax parviflora (a, b, g) Jamaika BG Jena 57 Thrinax punctulata (= T. morrisii) Kuba BG Jena 56 Thrinax radiata (a, b) Bahamas BG Jena Key Largo Florida 38 Thrinax radiata SP 04033 Spanner 84 Thrinax radiata Bahamas BG Singapur 59 Thrinax sp. (a, b, g, d) BG Jena 46 Trachycarpus ’Manipur’ Maku Manipur Indien Lorek 44 Trachycarpus ’sikkimensis’ Kalimpong Indien Lorek Pradhan, Keshow 47 Trachycarpus ’ukhrulense’ Manipur Indien Chandra Trachycarpus ’x takaghii’ (= T. fortunei x 9 wagnerianus) Kalifornien USA Lorek 45 Trachycarpus cf. fortunei Peshot Sikkim Indien Lorek 74 Trachycarpus cf. martianus Darjeeling Indien Verhaegen 76 Trachycarpus cf. princeps Pengdang? China Verhaegen 71 Trachycarpus cf. princeps S China Verhaegen 34 Trachycarpus cf. princeps Pengdang? China Lorek 61 Trachycarpus cf. princeps (a,b) Yunnan China Spanner Quercellini 129 Trachycarpus cf. takil Indien (Rom Italien) Mt. Thakil Kumaon 128 Trachycarpus cf. takil Indien Gibbons Nainital Kumaon Spanner 60 Trachycarpus cf. takil Indien Nainital ? Kumaon Pradhan, Ganesh 22 Trachycarpus cf. takil Indien Mani 36 Trachycarpus cf. takil Nepal ? Penninckx Karmelk 125, 126 Trachycarpus cf. takil Indien (Florenz Italien) Anhang 103 4

20 Trachycarpus fortunei China BG HH 119 Trachycarpus fortunei (a, b, g) Darjeeling Indien Verhaegen 11 Trachycarpus fortunei Devon GB Lorek 142 Trachycarpus fortunei Dover GB Gianinazzi Fortune, Robert 124 Trachycarpus fortunei Nanjing China (Kew) 127 Trachycarpus fortunei China De Maerschalck 98 Trachycarpus fortunei Lugano Schweiz Krüger Nainital 134 Trachycarpus fortunei Kumaon Indien Spanner 143 Trachycarpus fortunei Plovdiv Bulgarien Gianinazzi 1 Trachycarpus fortunei Sichuan China Spanner 141 Trachycarpus fortunei Tessin Gianinazzi 123 Trachycarpus fortunei (A, B) Tessin Gianinazzi 100 Trachycarpus fortunei x martianus ? Kalifornien USA St. Gelais 16 Trachycarpus fortunei x takil ? Tessin Lorek 99 Trachycarpus fortunei x wagnerianus ? Kalifornien USA St. Gelais 91 Trachycarpus fortunei ’Zwergform’ Abbotsbury GB Kembrey 42 Trachycarpus fortunei ’Zwergform’ China Nold (Italien ?) 29 Trachycarpus geminisectus Vietnam Gibbons 63, 64 Trachycarpus geminisectus Vietnam Spanner 72 Trachycarpus geminisectus Vietnam Verhaegen 73 Trachycarpus latisectus Darjeeling Indien Verhaegen 26 Trachycarpus latisectus N Indien Gibbons 14 Trachycarpus latisectus N Indien Lorek 78 Trachycarpus latisectus N Indien Spanner 121 Trachycarpus latisectus N Indien Rarepalmseeds 131 Trachycarpus martianus ’Khasia’ Khasia Hills Indien PalmePerPaket 13 Trachycarpus martianus ‘Khasia’ (a, b) Khasia Hills Indien Sandeman Seeds 23 Trachycarpus martianus ’Nepal’ Nepal Rogez 115 Trachycarpus martianus ’Nepal’ Nepal Spanner Locus typicus 110, 111 Trachycarpus martianus ’Nepal’ Nepal Spanner 25 Trachycarpus nanus Yunnan China Gibbons 77 Trachycarpus nanus Yunnan China Spanner 116 Trachycarpus nanus (a, b) Yunnan China Spanner 8 Trachycarpus nanus SW China Lorek 33 Trachycarpus nanus China YuccaDo USA 75 Trachycarpus nanus Yunnan China Verhaegen Doi Chiang Dao 30, 93 Trachycarpus oreophilus Thailand Gibbons Doi Chiang Dao Meeldijk 24 Trachycarpus oreophilus Thailand 12 Trachycarpus oreophilus Thailand Lorek 32 Trachycarpus oreophilus Thailand Penninckx 118 Trachycarpus princeps China Verhaegen 120 Trachycarpus princeps (a, b) China Rarepalmseeds Dulong River, Yunnan 109 Trachycarpus princeps China Prof Dong 35 Trachycarpus princeps Yunnan China Meeldjik 31 Trachycarpus princeps (a, b) Yunnan China Lorek 69 Trachycarpus princeps Yunnan China Verhaegen Locus typicus Gibbons 28 Trachycarpus princeps SW China 10 Trachycarpus princeps SW China Lorek Locus typicus 2 Trachycarpus princeps Yunnan China Spanner Anhang 104 4

Assam/Manipur 113 Trachycarpus ‘Lushai-Hills’ (A, B, C) Indien Lorek 114 Trachycarpus ‘Nagaland’ (A, B, C) Nagaland Indien Spanner 62 Trachycarpus ’Naga Hills’ Indien/Burma Spanner Saramati Indien 43 Trachycarpus ’Naga Hills’ SP 04036 Spanner Doi Ang Khang 97 Trachycarpus ‘Doi Ang Khang’ Thailand 1945 Don Hodel Don Hodel & Aye Pe Mt. Victoria (Henderson NYBG 96 Trachycarpus ’Myanmar’ Myanmar 1929 USA) Fabrini (Orto Botanico di Roma 108* Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien Italien) Cuccuini (Museo Botanico Florenz 139 Trachycarpus takil Beccari (Holotypus) Kumaon Indien Italien) “La Sapienza” 138 Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien Universität Rom 137* Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien BG Rom Italien Quercellini 107* Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien (BG Rom Italien) Lorek (Beccari Garten Florenz 15 Trachycarpus takil ? Indien Italien) 104 Trachycarpus takil ? Indien Oste (Florenz Italien) Haak 117 Trachycarpus takil N Indien (PalmePerPaket) Kausani Kumaon 130 Trachycarpus takil Indien Gibbons Locus typicus Kalamuni Ridge 136 Trachycarpus takil Kumaon Indien Spanner Lackner 133* Trachycarpus takil Kumaon Indien (BG Rom Italien) 21 Trachycarpus takil N Indien Spanner (BG HH) Cuccuini (Museo Botanico Florenz 140 Trachycarpus takil (Topotypus) Nainital Kumaon Italien) Bitetti (Orto Botanico 112* Trachycarpus takil Beccari Kumaon Indien di Roma Italien) 105 Trachycarpus takil N Indien Spanner Locus typicus Thalkedar (Mt. Thakil) 135 Trachycarpus takil Kumaon Indien Spanner Trachycarpus ukhrulense 122 (A, B, C, D, E, F, G) Manipur Indien Lorek 7 Trachycarpus wagnerianus Japan Lorek 3 Trachycarpus wagnerianus Japan Spanner 27 Trachycarpus wagnerianus Korea Gibbons 70 Trachycarpus wagnerianus (cult.) GB Verhaegen 106 Trachycarpus wagnerianus S Frankreich Lackner Wick 92 Trachycarpus wagnerianus x fortunei F1 S Gloucestershire GB Kembrey 18 Trithrinax campestris Argentinien Lorek 80 Zombia antillarum 2004-44 BG Singapur 65 Zombia antillarum FG 4718A FTG USA * Trachycarpus takil Becc. Proben stammen vom selben Individuum Anhang 105 4 Tabelle 7.4: Angaben und Koordinaten der Herkünfte (soweit vorhanden). Labor Spezifikationen zur Herkunft nr. 1 China, Sichuan, nahe Chengdu (aus Samen), 30.6701 N, 104.071 O 3 Japan, Tokyo, aus Samen, 35.6831 N, 139.809 O 4 USA, Florida, Christmas, 28.5289 N, -80.9947 W 5 Italien, San Remo, 43.8195 N, 7.7634 O 6 Marokko, Hoher Atlas, nahe Tizi-n-Test, Passhöhe, ca.2000 m, 30.785 N, -8.428 W 9 USA, Kalifornien, Patterson (Kultivar), 37.4714 N, -121.1395 W 11 GB, Devon, Bere Alston (Kultivar), 50.4186 N, -4.1862 W 16 CH, Tessin, Monte Bre, 600m über NN (Kultivar), 46.0084 N, 8.9863 O 17 S Portugal, ca. 15 km N von Portimao, Wildstandort, 37.2323 N, -8.5371 W 18 Argentinien, Cordoba, Capilla del Monte, Wildstandort, -30.8586 S, -64.5236 W 25 China, W Yunnan, ca. 4 km östlich von Yongsheng (Yongbei), 26.6895 N, 100.7789 O 26, 78 Indien, W Bengal, Kalimpong, Ganesh Villa, ca. 1200m, 27°04’7.22’’ N, 088°29’9.70’’ O Wildstandort Mirik Busty ist degradiert, 26.9 N, 88.1667 O 27 Südkorea, Cheju-Do, Insel (kultiviert), 33.5122 N, 126.526 O 28, 2, SW China, Yunnan, ca. 48 km nördlich von Gongshan, 3 km NW von Bingzhongluo, nahe 35, 69 der Grenze zu Tibet und Burma an östlicher Klippe am Nujiang (Salween-Fluß), das Stonegate (Shi Men Guan), 27.981 N, 98.5014 O 29, Vietnam, Nördlich Ha Giang Provinz (Grenzgebiet Vietnam/China (Yunnan), Quan Ba Distrikt, 63, Bat Dai Son, am Chong To Tien, 200 m über Talgrund und ca. 2 km von Thong Hoa Long, 64, 72 über 1100 m über NN, 23°08’70.4’’ N, 104°59’7.20’’ O 30, Thailand, Doi Chiang Dao, ca. 2000 m über NN, 19.34 N, 98.8459 O 24, 93 34, 76 China, Yunnan, Pengdang (andere Flußseite), 27.8838 N, 98.5845 O 37 Malaysia, Johar Baharu (bei Singapur), 1.5005 N, 103.76 O 40 USA, Florida, Homestead (südlich von Miami), Kultivar Florida, 25.4771 N, 80.4774 W 41 Belize, Belmopan, 17.2617 N, 88.7785 W 43, 62 Indien, Nagaland, Mount Saramati, 25.7335 N, 95.0071 O 44, Indien, Sikkim, Darjeeling, 27.04 N, 88.2636 O 73, 74 45 Indien, Sikkim, Peshot, 27.062 N, 88.3841 O 46, 47 NO Indien, Manipur, Distrikt Ukhrul, Maku, ca 1.600 bis 2.100 m über NN, steile Hügel im offenen Grasland, magerer Boden, 24.71 N, 94.47 O 48 Pinar del Rio, Sierra de Los Organos, Kuba 50 Mittelkuba 52 Santa Clara Berge, Kuba 54 Klippe an Nordküste, Kuba 60 Indien, Nainital, 29.3981 N, 79.4445 O 61, 71 China, Yunnan, nahe Mudong, 27.9953 N, 98.4919 O 70 GB, Kultivar (möglicherweise auch US Kultivar, Peter Jenkins, London GB) 75 China, NW-Yunnan, Dengchuan, 1900-2300 m über NN, 25.9821 N, 100.069 O 77 China, Yunnan, ca. 8 km östlich von Yongsheng in hügeligem Buschland, 26.69 N, 100.82 O 85 32.4486 N, 81.7835 W 86 33.7017 N, 80.2103 W 87 29.1855 N, 82.1361 W 88 33.4676 N, 82.0168 W 89 29.0489 N, 95.5711 W 90 33.5268 N, 95.5711 W 91 50.6655 N, 2.6006 W 92 GB, South Gloucestershire, Bristol, Wick, 51.451 N, 2.422 W 96 Myanmar, Mount Victoria, 21.2334 N, 93.9167 O Myanmar. Chin State: 8 mile, 1 furlong marker above Kanpetlet on road to Mt. Victoria trailhead, 200 m SW of road on very steep grassy slopes in ravine. 2650 m elev. 97 Thailand, Doi Ang Khang, 19.8 N, 98.9834 O Changwat Chiang Mai: Doi Ang Khang, cultivated at Agriculture Station, in front of restaurant/hotel, said to come from limestone mountain and ridgetops 2-3 kms west on the Myanmar border. 102 Iran, Belutschistan, Ney Padan, 27.852 N, 60.756 O Anhang 106 4

110 Nepal, Banepa, 27.5693 N, 85.5645 O 128 Indien, Kumaon, Mt. Thakil? Probe von Herrn Kembrey, Bristol, Wick, GB 130 Indien, Kumaon, Kaushani 142 GB, Dover “trunky Trachycarpus” Nachkomme

Tabelle 7.5: Händler- und Sammlerverzeichnis. David Coca = Amazonia Martin Gibbons = The Palmcentre Gary Hollar = Gary´s Nursery Wilko Karmelk = Ferdinandushof Robert Lackner = Palmengarten Michael Lorek = Tropengarten Bob McCartney = Woodlanders Ruud Meeldijk = Golden Lotus Penninckx = Pepinieres Penninckx Keshow Chandra Pradhan = Kenibreed Plants Ganesh Mani Pradhan = Ganesh Mani Pradhan & Son Leon Rogez = Palmaris Tobias Spanner = PPP = Rarepalmseeds = RPS James Verhaegen = Europalms

Institutionen: FTG = Fairchild Tropical Garden Kew = Royal Botanic Gardens Kew Herbarium Universitatis Florentinae Singapore BG BG Jena Anhang 107 4 Tabelle 7.6: Taxa der ITS Analyse. Taxa Labornr. # Herkunft Trachycarpus fortunei 11 Devon, GB, kultiviert Trachycarpus fortunei 20 BG Hamburg, kultiviert Trachycarpus fortunei x takil 16 Tessin, Schweiz, kultiviert Trachycarpus geminisectus 29 Vietnam, wild Trachycarpus latisectus 26 N Indien, wild Trachycarpus martianus 23 Nepal, wild ? Trachycarpus nanus 25 S China, wild Trachycarpus nanus 8 SW China, wild ? Trachycarpus takil 15 Beccari-Garten, kultiviert Trachycarpus wagnerianus 7 Japan, wild ? Trachycarpus ’x takaghii’ 9 Kalifornien, USA, kultiviert Chamaerops humilis var. humilis 5 San Remo, Italien, kultiviert Chamaerops humilis var. cerifera 6 Hoher Atlas, Marokko, wild Guihaia argyrata 19 S China, wild ? Rhapidophyllum hystris 4 Florida, USA, wild Trithrinax campestris 18 Cordoba, Argentinien, wild Anhang 108 4 Tabelle 7.7: Sets der AFLP Analyse (Primerkombinationen und Taxa). Set # Primerkombination: Primerkombination: Eco ATG + Mse AAT Eco ATG + Mse AGG

1 Alf-Lauf # 13: Alf-Lauf # 26: Taxa Labornr. Taxa Labornr. Trachycarpus fortunei 1 Trachycarpus fortunei 1 T. cf. x takaghii T. cf. x takaghii (=T. wagnerianus x (=T. wagnerianus x fortunei) 9 fortunei) 9 T. fortunei Devon 11 T. fortunei Devon 11 T. cf. fortunei x takil 16 T. cf. fortunei x takil 16 T. cf. fortunei 45 T. cf. fortunei 45 T. fortunei dwarf 91 T. fortunei dwarf 91 T. fortunei Lugano 98 T. fortunei Lugano 98 T. cf. fortunei x T. cf. fortunei x wagnerianus 99 wagnerianus 99 T. cf. fortunei x martianus 100 T. cf.fortuneixmartianus 100 T. fortunei Darjeeling 119a T. fortunei Darjeeling 119a T. fortunei Darjeeling 119b T. fortunei Darjeeling 119b T. fortunei Darjeeling 119g T. fortunei Darjeeling 119g T. fortunei 123A T. fortunei 123A T. fortunei 123B T. fortunei 123B T. fortunei Kew 124 T. fortunei Kew 124

2 Alf-Lauf # 16: Alf-Lauf # 17 (Wiederholung): Taxa Labornr. Taxa Labornr. T. martianus 13a T. martianus 13a T. martianus 13b T. martianus 13b T. cf. martianus 74 T. cf. martianus 74 T. martianus 110 T. martianus 110 T. martianus 111 T. martianus 111 T. martianus 115 T. martianus 115 T. latisectus 14 T. latisectus 14 T. latisectus 26 T. latisectus 26 T. latisectus 73 T. latisectus 73 T. takil F1? 15 T. takil F1? 15 T. cf. takil 22 T. cf. takil 22 T. cf. takil 60 T. cf. takil 60 T. cf. takil 104 T. cf. takil 104 T. takil 105 T. takil 105 T. cf. takil 125 T. cf. takil 125 T. cf. takil 126 T. cf. takil 126 T. cf. takil 128 T. cf. takil 128 Anhang 109 4 3 Alf-Lauf # 19: Alf-Lauf # 18 (Wiederholung): Taxa Labornr. Taxa Labornr. T. wagnerianus 7 T. wagnerianus 7 T. wagnerianus 27 T. wagnerianus 27 T. wagnerianus 70 T. wagnerianus 70 T. wagnerianus x T. wagnerianus x fortunei 92 fortunei 92 T. wagnerianus 106 T. wagnerianus 106 T. princeps 10 T. princeps 10 T. princeps 28 T. princeps 28 T. princeps 31a T. princeps 31a T. princeps 31b T. princeps 31b T. princeps 35 T. princeps 35 T. princeps 69 T. princeps 69 T. cf. princeps 71 T. cf. princeps 71 T. cf. princeps 76 T. cf. princeps 76 T. cf. princeps 120a T. cf. princeps 120a T. nanus 8 T. nanus 8 T. nanus 25 T. nanus 25 T. nanus 33 T. nanus 33 T. nanus 75 T. nanus 75 T. nanus 116a T. nanus 116a

4 Alf-Lauf # 24: Alf-Lauf # 22: Taxa Labornr. Taxa Labornr. T. fortunei 127 T. fortunei 127 T. fortunei Nainital 134 T. fortunei Nainital 134 T. wagnerianus 3 T. wagnerianus 3 T. wagnerianus 70 T. wagnerianus 70 T. nanus 77 T. nanus 77 T. cf. takil 36 T. cf. takil 36 T. takil Kaushani 130 T. takil Kaushani 130 T. takil Thalkedar 135 T. takil Thalkedar 135 T. takil Kalamuni 136 T. takil Kalamuni 136 T. takil Becc. BG Rom 137 T. takil Becc. BG Rom 137 T. takil Becc. Uni Rom 138 T. takil Becc. Uni Rom 138 T. takil Becc. Florenz 139 T. takil Becc. Florenz 139 T. takil Becc. Florenz 140 T. takil Becc. Florenz 140 T. princeps 2 T. princeps 2 T. princeps 34 T. princeps 34 T. princeps 61a T. princeps 61a T. princeps 61b T. princeps 61b Anhang 110 4 5 Alf-Lauf # 27: Alf-Lauf # 25: Taxa Labornr. Taxa Labornr. T. princeps 61b T. princeps 61b T. princeps 69 T. princeps 69 T. cf. princeps 71 T. cf. princeps 71 T. princeps 109 T. princeps 109 T. princeps 118 T. princeps 118 T. cf. princeps 120a T. cf. princeps 120a T. cf. princeps 120b T. cf. princeps 120b T. geminisectus 29 T. geminisectus 29 T. geminisectus 63 T. geminisectus 63 T. geminisectus 64 T. geminisectus 64 T. geminisectus 72 T. geminisectus 72 T. oreophilus 24 T. oreophilus 24 T. oreophilus 30 T. oreophilus 30 T. ‘NagaHills’ 43 T. ‘NagaHills’ 43 T. ‘NagaHills’ 62 T. ‘NagaHills’ 62 T. ‘Manipur’ 46 T. ‘Manipur’ 46

6 Alf-Lauf # 30: Alf-Lauf # 28: Taxa Labornr. Taxa Labornr. T. takil Kalamuni 136 T. takil Kalamuni 136 T. takil Thalkedar 135 T. takil Thalkedar 135 T. takil Kaushani 130 T. takil Kaushani 130 T. fortunei Nainital 134 T. fortunei Nainital 134 T. fortunei Kew 124 T. fortunei Kew 124 T. NagaHills 62 T. NagaHills 62 T. Manipur 46 T. Manipur 46 T. ukhrulense 122B T. ukhrulense 122B T. ukhrulense 122A T. ukhrulense 122A T. martianus 131 T. martianus 131 T. ‘Myanmar’ 96 T. ’Myanmar’ 96 T. ‘Doi Ang’ 97 T. ’Doi Ang’ 97 T. ‘Lushai’ 113A T. ’Lushai’ 113A T. ‘Nagaland’ 114A T. ’Nagaland’ 114A T. ‘sikkimensis’ 44 T. ’sikkimensis’ 44 T. latisectus 78 T. latisectus 78 Rhapidophyllum Rhapidophyllum hystrix 4 hystrix 4 Anhang 111 4 7 Alf-Lauf # 33: Alf-Lauf # 31: Taxa Labornr. Taxa Labornr. T. takil Thalkedar 135 T. takil Thalkedar 135 T. cf. takil 128 T. cf. takil 128 T. cf. takil 36 T. cf. takil 36 T. fortunei Kew 124 T. fortunei Kew 124 T. wagnerianus x T. wagnerianus x fortunei 92 fortunei 92 T. fortunei Abbotsb. 91 T. fortunei Abbotsb. 91 Rhapis excelsa 37 Rhapis excelsa 37 Rhapis humilis 79 Rhapis humilis 79 Rhapis subtilis 82 Rhapis subtilis 82 Guihaia argyrata 19 Guihaia argyrata 19 Chamaerops humilis 17 Chamaerops humilis 17 Cryosophila Cryosophila warscewiczii 67 warscewiczii 67 Cryosophila Cryosophila warscewiczii 81 warscewiczii 81 Coccothrinax Coccothrinax barbadensis 40 barbadensis 40 Coccothrinax crinita 48a Coccothrinax crinita 48a Coccothrinax crinita Coccothrinax crinita brevicrinis 53 brevicrinis 53 Coccothrinax Coccothrinax cupularis 49 cupularis 49 Coccothrinax Coccothrinax miraguama 50a miraguama 50a Coccothrinax Coccothrinax borhidiana 54a borhidiana 54a * Trachycarpus takil Becc. Proben vom selben Individuum Anhang 112 4 Tabelle 7.8: Chemikalienliste. Chemikalien Hersteller 1 kb DNA Ladder GeneCraft GmbH Münster

10x BioTherm buffer, 15 mM MgCl2 GeneCraft GmbH Münster 10x buffer H (zu EcoRI) GeneCraft GmbH Münster Agarose (ultra pure) Life Technologies Paisley Scotland Agarose PeqLab, Erlangen Bind-Silane plusOne Amersham Biosciences Uppsala/ Schweden BioTherm™ DNA-Polymerase GeneCraft GmbH Münster Borsäure Carl Roth GmbH Karlsruhe Bromphenolblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen deionisiertes Formamid Carl Roth GmbH Karlsruhe Dextranblau Amersham Biosciences, Uppsala/ Schweden Dimethylsulfoxid (DMSO) VWR International Darmstadt dNTPs GeneCraft GmbH Münster EcoRI Restriktionsendonuklease GeneCraft GmbH Münster Ethanol 99.8% Carl Roth GmbH Karlsruhe Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Glycerin Carl Roth GmbH Karlsruhe Invisorb® Spin Plant Mini Kit Invitek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign GmbH Berlin MseI Restriktionsendonuklease Fermentas GmbH St. Leon-Rot

MgCl2 25 mM Bio-Budget Technologies GmbH Krefeld

MgCl2 50 mM GeneCraft GmbH Münster Millipore Montage PCR Device (ehemals Microcon PCR) Millipore, Bedford, USA Natriumacetat VWR International Darmstadt

Na2EDTA, Tiriplex® III VWR International Darmstadt ReproGel High Resolution Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden Anhang 113 4 Tabelle 7.8: Chemikalienliste (Fortsetzung)

Silica Gel Orange Carl Roth GmbH Karlsruhe Smart Ladder Eurogentec Deutschland GmbH Köln T4 DNA Ligase GeneCraft GmbH Münster T4 DNA Ligase 10x buffer with ATP GeneCraft GmbH Münster

Tris Base (Tris-(Hydroxymethyl-) Aminomethan) Q.Bio gene North America Carlsbad, CA, USA Tris HCl (Tris-Hydrochlorid) Carl Roth GmbH Karlsruhe Anhang 114 4

T.fortunei #1

T.fortunei Darjeeling #119a

T.cf.x takaghii #9

1 = T. fortunei Gruppe I T.fortunei Devon #11

T.cf.fortuneix takil #16

T.fortunei Darjeeling #119g

T.cf.fortunei #45

T.fortunei #123A

T.fortunei Darjeeling #119b 2 = T. fortunei Gruppe II

T.fortunei #123B

T.fortunei Kew #124

T.cf.fortunei x wagnerianus #99

T.fortunei dwarf #91 3 = T. fortunei Gruppe III

T.fortunei Lugano #98

T.cf.fortunei x martianus #100 10 Abbildung 7.1: Phylogramm 1 des Sets 1 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 15 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 115 4

T. fortunei #1

T. fortunei Kew #124

T. fortunei dwarf #91

T. cf. x takaghii #9

T. fortunei Devon #11

T. cf. fortunei x takil #16 1 = T. fortunei Gruppe I

T. fortunei #123A

T. fortunei #123B

T. cf. fortunei #45

T. fortunei Darjeeling #119b

2 = T. fortunei Gruppe II T. fortunei Darjeeling #119a

T. fortunei Darjeeling #119g

T. cf. fortunei x wagnerianus #99

T. fortunei Lugano #98 3 = T. fortunei Gruppe III

T. cf. fortunei x martianus #100 1 Abbildung 7.2: Phylogramm 2 des Sets 1 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 15 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 116 4

T. cf. martianus #74

T. martianus #13a

T. martianus #13b

T. martianus #111

T. martianus #110 1 = T. martianus & T. latisectus Gruppe T. martianus #115

T. latisectus #26

T. latisectus #14

T. latisectus #73

T. cf. takil #125

T. cf. takil #104

T. takil F1? #15

T. cf. takil #22 2 = T. cf. takil Gruppe T. cf. takil #60

T. cf. takil #126

T. takil #105

T. cf. takil #128 10 Abbildung 7.3: Phylogramm 3 des Sets 2 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 117 4

T. martianus #13a

T. martianus #13b 1 = T. martianus Gruppe

T. cf. martianus #74

T. martianus #110

T. martianus #111

T. martianus #115 2 = T. martianus & T. latisectus T. latisectus #14 Gruppe

T. latisectus #26

T. latisectus #73

T. takil F1? #15

T. cf. takil #22

T. cf. takil #60

T. cf. takil #104 3 = T. cf. takil Gruppe T. takil #105

T. cf. takil #128

T. cf. takil #125

T. cf. takil #126 10 Abbildung 7.4: Phylogramm 4 des Sets 2 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 118 4

T. nanus #77

T. fortunei #134

T. wagnerianus #3

T. fortunei #127 1 = T. fortunei & T. princeps T. cf. takil #36 Gruppe

T. princeps #61a

T. princeps #61b

T. princeps #2 2 = T. princeps Gruppe T. princeps #34

T. wagnerianus #70

T. takil #130 3 = T. takil „Indien“ Gruppe

T. takil #135

T. takil #136

T. takil #137

T. takil #140 4 = T. takil „Rom & Florenz“ Gruppe T. takil #138

T. takil #139 10 Abbildung 7.5: Phylogramm 7 des Sets 4 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 119 4

T. nanus #77

T. cf. takil #36

T. fortunei #127 1 = T. fortunei Gruppe

T. wagnerianus #3

T. princeps #34

T. takil #138

T. wagnerianus #70

T. princeps #2

T. fortunei #134

T. princeps #61a 2 = T. princeps Gruppe

T. princeps #61b

T. takil #137

T. takil #139 3 = T. takil „Rom & Florenz“ Gruppe T. takil #140

T. takil #135

T. takil #130 4 = T. takil „Indien“ Gruppe

T. takil #136 10 Abbildung 7.6: Phylogramm 8 des Sets 4 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 120 4

Chamaerops humilis #17

T. takil Thalkedar #135

T. cf. takil #128

T. fortunei Abbotsb. #91 1 = T. fortunei Gruppe

T. cf takil #36

T. fortunei Kew #124

T. wagnerianus x fortunei #92

Rhapis subtilis #82

Guihaia argyrata #19

Rhapis excelsa #37 2 = Rhapis Gruppe Rhapis humilis #79

Coccothrinax barbadensis #40

3 = Cryosophila Gruppe Cryosophila warscewiczii #67

Cryosophila warscewiczii #81

Coccothrinax cupularis #49

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax crinita brevicrinis #53 4 = Coccothrinax Gruppe Coccothrinax crinita #48a

Coccothrinax borhidiana #54a 10 Abbildung 7.7: Phylogramm 13 des Sets 7 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 121 4

Chamaerops humilis #17

T. takil Thalkedar #135

T. cf. takil #128

T. fortunei Abbotsb. #91 1 = T. fortunei Gruppe

T. cf takil #36

T. fortunei Kew #124

Guihaia argyrata #19

Rhapis excelsa #37 2 = Rhapis Gruppe Rhapis humilis #79

Coccothrinax barbadensis #40

Cryosophila warscewiczii #67 3 = Cryosophila Gruppe

Cryosophila warscewiczii #81

Coccothrinax cupularis #49

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax crinita brevicrinis #53 4 = Coccothrinax Gruppe Coccothrinax crinita #48a

Coccothrinax borhidiana #54a 10 Abbildung 7.8: Phylogramm 14 des Sets 7 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 122 4

T. takil Thalkedar #135

T. cf. takil #128

T. fortunei Abbotsb. #91 1 = T. fortunei Gruppe

T. cf takil #36

T. fortunei Kew #124

T. wagnerianus x fortunei #92

Rhapis subtilis #82

Chamaerops humilis #17

Guihaia argyrata #19

Rhapis excelsa #37 2 = Rhapis Gruppe

Rhapis humilis #79

Coccothrinax barbadensis #40

Cryosophila warscewiczii #67 3 = Cryosophila Gruppe Cryosophila warscewiczii #81

Coccothrinax cupularis #49

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax crinita #48a 4 = Coccothrinax Gruppe Coccothrinax crinita brevicrinis #53

Coccothrinax borhidiana #54a 10 Abbildung 7.9: Phylogramm 15 des Sets 7 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; Neighbor-joining-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 123 4

T. takil Thalkedar #135

T. cf. takil #128

T. fortunei Abbotsb. #91 1 = T. fortunei Gruppe T. cf takil #36

T. fortunei Kew #124

Chamaerops humilis #17

Guihaia argyrata #19

Rhapis excelsa #37 2 = Rhapis Gruppe

Rhapis humilis #79

Coccothrinax barbadensis #40

Cryosophila warscewiczii #67 3 = Cryosophila Gruppe

Cryosophila warscewiczii #81

Coccothrinax cupularis #49

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax crinita #48a 4 = Coccothrinax Gruppe

Coccothrinax crinita brevicrinis #53

Coccothrinax borhidiana #54a 10 Abbildung 7.10: Phylogramm 16 des Sets 7 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; Neighbor-joining-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 124 4

Chamaerops humilis #17

Guihaia argyrata #19

Rhapis humilis #79

Rhapis excelsa #37

Rhapis subtilis #82

T. takil Thalkedar #135

T. wagnerianus x fortunei #92

T. cf. takil #36

T. fortunei Abbots. #91 1 = T. fortunei Gruppe T. cf. takil #128

T. fortunei Kew #124

Coccothrinax barbadensis #40

Coccothrinax crinita #48a

Coccothrinax crinita brevicrinis #53 2 = Coccothrinax Coccothrinax cupularis #49 Gruppe

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax borhidiana #54a

Cryosophila warscewiczii #67 3 = Cryosophila Gruppe

Cryosophila warscewiczii #81 10 Abbildung 7.11: Phylogramm 17 des Sets 7 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 125 4

Chamaerops humilis #17

Guihaia argyrata #19

Rhapis humilis #79

Rhapis excelsa #37

T. takil Thalkedar #135

T. cf. takil #36

T. fortunei Abbots. #91 1 = T. fortunei Gruppe

T. cf. takil #128

T. fortunei Kew #124

Coccothrinax barbadensis #40

Coccothrinax crinita #48a

Coccothrinax crinita brevicrinis #53 2 = Coccothrinax Coccothrinax cupularis #49 Gruppe

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax borhidiana #54a

Cryosophila warscewiczii #67 3 = Cryosophila Gruppe

Cryosophila warscewiczii #81 10 Abbildung 7.12: Phylogramm 18 des Sets 7 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 126 4

T. takil Thalkedar #135

Rhapis subtilis #82

T. wagnerianus x fortunei #92

T. cf. takil #36

T. fortunei Abbots. #91 1 = T. fortunei Gruppe

T. cf. takil #128

T. fortunei Kew #124

Rhapis excelsa #37

Rhapis humilis #79

Coccothrinax barbadensis #40

Coccothrinax crinita #48a

Coccothrinax crinita brevicrinis #53 2 = Coccothrinax Coccothrinax cupularis #49 Gruppe

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax borhidiana #54a

Guihaia argyrata #19

Chamaerops humilis #17

Cryosophila warscewiczii #67 3 = Cryosophila Gruppe

Cryosophila warscewiczii #81 10 Abbildung 7.13: Phylogramm 19 des Sets 7 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; Neighbor-joining-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Anhang 127 4

T. takil Thalkedar #135

T. cf. takil #36

T. fortunei Abbots. #91 1 = T. fortunei Gruppe T. cf. takil #128

T. fortunei Kew #124

Rhapis excelsa #37

Rhapis humilis #79

Coccothrinax barbadensis #40

Coccothrinax crinita #48a

Coccothrinax crinita brevicrinis #53 2 = Coccothrinax Coccothrinax cupularis #49 Gruppe

Coccothrinax miraguama #50a

Coccothrinax borhidiana #54a

Guihaia argyrata #19

Chamaerops humilis #17

Cryosophila warscewiczii #67 3 = Cryosophila Gruppe

Cryosophila warscewiczii #81 10 Abbildung 7.14: Phylogramm 20 des Sets 7 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; Neighbor-joining-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10). Danksagung 128 4 8 Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Rohwer für die Annahme eines „auswärtigen“ Themas und Klärung fachlicher Fragen sowie Herrn Prof. Mühlbach für seine Geduld.

Mein herzlicher Dank gilt auch Frau Dr. Rudolph für endlose Unterstützung und Hilfe.

Tiefsten Dank möchte ich auch an Sabrina Schmidt richten für die Voruntersuchungen zu dieser Arbeit. Weiterhin großen Dank möchte ich auch an Cyrille Claudel richten.

Frau Dr. Schwarz gebührt mein Dank für die karyologischen Messungen genauso wie Karen Dehn für die Präparation von Blattproben sowie REM-Aufnahmen.

Anna Maria Vogt und Andrea Jounais danke ich für die Geduld meine endlosen Fragen zu beantworten.

Dr. Björn Herber und Dr. Joachim Thiede danke ich für Aufmunterung und Interesse an dem Thema.

Tobias und Christian danke ich für die Pflege der Untersuchungsobjekte im Gewächshaus.

Meiner Mitkombattantin Ina danke ich ebenso für ein offenes Ohr.

Einen ausschließlichen Dank gebührt Herrn Tobias W. Spanner und Dr. Michael Lorek, die diese Arbeit mit Spenden und Sachspenden überhaupt erst ermöglicht haben.

Ich danke weiterhin allen, die in irgendeiner Weise zu dieser Arbeit beigetragen, ohne sie hier explizit aufzuführen. Eidesstattliche Erklärung 129 4 9 Eidesstattliche Erklärung

Hiermit versichere ich, die vorliegende Diplomarbeit selbständig angefertigt und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet zu haben. Sämtliche Textstellen dieser Arbeit, die sinngemäß oder dem Wortlaut nach anderer Literatur entnommen worden sind, wurden als solche unter Angabe der Quelle kenntlich gemacht.

Ich erkläre mich damit einverstanden, dass diese Diplomarbeit nach ihrer Bewertung veröffentlicht werden darf.

Hamburg, im Mai 2006

Chris Stührk